RS60825B1 - Aktivnost derivata 5-etiol-4-metil-pirazol-3-karboksamida kao agonista taar-a - Google Patents

Description

OPIS

Predmetni pronalazak se odnosi na jedinjenje formule

i njegovu farmaceutski prihvatljivu kiselu adicionu so.

Jedinjenje koje je ovde objavljeno i predstavljeno formulom I može pokazati tautomerizam. Namera je da predmetni pronalazak obuhvati svaki tautomerni izomerni oblik ovog jedinjenja, ili smešu takvih oblika, i nije ograničen ni na jedan tautomerni oblik predstavljen formulom u prethodnom tekstu.

Sada je pronađeno da jedinjenje formule I (5-etil-4-metil-N-[4-[(2S)morfolin-2-il]fenil]-1H-pirazol-3-karboksamid) ima dobar afinitet prema trag amin-asociranim receptorima (TAAR-ovima), posebno za TAAR1 i manje nuspojava u poređenju sa jedinjenjima iz prethodnih informacija.

Slični ligandi TAAR1 miša i TAAR1 pacova su objavljeni u WO2011/076678, WO2015/165835, WO 2016/016292 i WO2012/16826.

Jedinjenje formule I i njegove farmaceutski upotrebljive adicione soli poseduju vredne farmakološke osobine. Konkretno, utvrđeno je da je jedinjenje predmetnog pronalaska parcijalni agonist trag amin-asociranog receptora 1 kod ljudi (hTAAR1).

Jedinjenje predmetnog pronalaska ima značajne prednosti u odnosu na jedinjenja iz prethodnih informacija, a te prednosti su

- snažna agonistička aktivnost na TAAR1 receptoru kod ljudi,

- selektivnost prema dopaminskom transporteru (DAT),

- selektivnost prema hERG jonskom kanalu,

- nizak amfifilni vektor i time predstavlja nizak rizik od nastanka fosfolipidoze izazvane lekovima (DIPL) (vide infra).

Jedinjenje formule I može da se koristi kao bezbedan lek za lečenje depresije, poremećaja anksioznosti, bipolarnog poremećaja, hiperkinetičkog poremećaja (ADHD), poremećaja vezanih za stres, psihotičnih poremećaja, kao što je šizofrenija, neuroloških bolesti, kao što je Parkinsonova bolest, neurodegenerativnih poremećaja, kao što su Alchajmerova bolest, epilepsija, migrena, hipertenzija, zavisnost, zloupotreba supstanci, metaboličkih poremećaja, kao što su poremećaji u ishrani, dijabetes, dijabetičke komplikacije, gojaznost, dislipidemija, poremećaji potrošnje energije i asimilacija, poremećaji i zastoj homeostaze telesne temperature, poremećaji spavanja i cirkadijalnog ritma, i kardiovaskularnih poremećaja.

Klasični biogeni amini (serotonin, norepinefrin, epinefrin, dopamin, histamin) igraju važnu ulogu kao neurotransmiteri u centralnom i perifernom nervnom sistemu<[1]>. Njihova sinteza i skladištenje, kao i njihova razgradnja i ponovno preuzimanje nakon oslobađanja, se strogo regulišu. Za neravnotežu nivoa biogenih amina je poznato da je odgovorna za izmenjenu funkciju mozga u mnogim patološkim stanjima<[2-5]>. Druga klasa endogenih aminskih jedinjenja, takozvani trag amini (TA-i), značajno se preklapaju sa klasičnim biogenim aminima u pogledu strukture, metabolizma i subcelularne lokalizacije. TA-i uključuju p-tiramin, β-feniletilamin, triptamin i oktopamin, a prisutni su u nervnom sistemu sisara na generalno nižim nivoima od klasičnih biogenih amina<[6]>.

Disregulacija TA je povezana sa različitim psihijatrijskim bolestima, kao što su šizofrenija i depresija<[7]>, kao i sa drugim stanjima, kao što su hiperkinetički poremećaj, glavobolja sa migrenom, Parkinsonova bolest, zloupotreba supstanci i poremećaji u ishrani<[8,9]>.

Dugo vremena su TA-specifični receptori bili samo hipotetički na osnovu anatomski diskretnih mesta vezivanja TA visokog afiniteta u CNS-u kod ljudi i drugih sisara<[10,11]>. Shodno tome, veruje se da su farmakološki efekti TA-a posredovani pomoću poznatih mehanizama klasičnih biogenih amina, bilo aktiviranjem njihovog oslobađanja, inhibiranjem njihovog ponovnog preuzimanja ili „unakrsnim reagovanjem“ sa svojim receptorskim sistemima<[9,12,13]>. Ovaj pogled se značajno promenio sa identifikacijom nekoliko članova nove porodice GPCR-a, trag amin-asociranih receptora (TAAR)<[7>’<14]>. Postoji 9 TAAR gena kod ljudi (uključujući 3 pseudogena) i 16 gena kod miševa (uključujući 1 pseudogen). TAAR geni ne sadrže introne (sa jednim izuzetkom, TAAR2 sadrži 1 intron) i nalaze se jedni pored drugih na istom hromozomskom segmentu. Filogenetski odnos gena receptora, u saglasnosti sa detaljnim upoređivanjem sličnosti GPCR farmakofora i farmakoloških podataka, ukazuje na to da ovi receptori formiraju tri različite podporodice<[7,14]>. TAAR1 je u prvoj podklasi od četiri gena (TAAR1-4) koji je visoko konzervisan između ljudi i glodara. TA-i aktiviraju TAAR1 preko Gαs. Pokazalo se da disregulacija TA doprinosi etiologiji različitih bolesti poput depresije, poremećaja anksioznosti, bipolarnog poremećaja, hiperkinetičkog poremećaja (ADHD), poremećaja vezanih za stres, psihotičnih poremećaja, kao što je šizofrenija, neuroloških bolesti, kao što je Parkinsonova bolest, neurodegenerativnih poremećaja, kao što je Alchajmerova bolest, epilepsija, migrena, hipertenzija, zavisnost, zloupotrebe supstanci, metaboličkih poremećaja, kao što su poremećaji u ishrani, dijabetes, dijabetičke komplikacije, gojaznost, dislipidemija, poremećaji potrošnje energije i asimilacija, poremećaji i zastoj homeostaze telesne temperature, poremećaji spavanja i cirkadijalnog ritma, i kardiovaskularnih poremećaja.

Zbog toga postoji veliko interesovanje za povećanje znanja o trag amin-asociranim receptorima.

Literatura:

[1] Deutch, A.Y. i Roth, R.H.; „Neurotransmitters.“ U Fundamental Neuroscience (2<nd>Edn) (Zigmond, M.J., Bloom, F.E., Landis, S.C., Roberts, J.L, i Squire, L.R., Eds.), pp.

193-234, Academic Press (1999);

[2] Wong, M.L. i Licinio, J.; „Research and treatment approaches to depression.“ Nat. Rev. Neurosci.2001, 2, 343-351;

[3] Carlsson, A. i sar.; „Interactions between monoamines, glutamate, and GABA in schizophrenia: new evidence.“ Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol.2001, 41, 237-260;

[4] Tuite, P. i Riss, J.; „Recent developments in the pharmacological treatment of Parkinson's disease.“ Expert Opin. Investig. Drugs 2003, 12, 1335-1352;

[5] Castellanos, F.X. i Tannock, R.; „Neuroscience of attention-deficit/hyperactivity disorder: the search for endophenotypes.“ Nat. Rev. Neurosci.2002, 3, 617-628;

[6] Usdin, Earl; Sandler, Merton; Editors; Psychopharmacology Series, Vol.1: Trace Amines and the Brain. [Proceedings of a Study Group at the 14th Annual Meeting of the American College of Neuropsychoparmacology, San Juan, Puerto Rico] (1976);

[7] Lindemann, L. i Hoener, M.; „A renaissance in trace amines inspired by a novel GPCR family.“ Trends in Pharmacol. Sci.2005, 26, 274-281;

[8] Branchek, T.A. i Blackburn, T.P.; „Trace amine receptors as targets for novel therapeutics: legend, myth and fact.“ Curr. Opin. Pharmacol. 2003, 3, 90-97;

[9] Premont, R.T. i sar.; „Following the trace of elusive amines.“ Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2001, 98, 9474-9475;

[10]Mousseau, D.D. i Butterworth, R.F.; „A high-affinity [<3>H] tryptamine binding site in human brain.“ Prog. Brain Res.1995, 106, 285-291;

[11]McCormack, J.K. i sar.; „Autoradiographic localization of tryptamine binding sites in the rat and dog central nervous system.“ J. Neurosci.1986, 6, 94-101;

[12]Dyck, L.E.; „Release of some endogenous trace amines from rat striatal slices in the presence and absence of a monoamine oxidase inhibitor.“ Life Sci.1989, 44, 1149-1156;

[13]Parker, E.M. i Cubeddu, L.X.; „Comparative effects of amphetamine, phenylethylamine and related drugs on dopamine efflux, dopamine uptake and mazindol binding.“ J. Pharmacol. Exp. Ther.1988, 245, 199-210;

[14]Lindemann, L. i sar.; „Trace amine associated receptors form structurally and functionally distinct subfamilies of novel G protein-coupled receptors.“ Genomics 2005, 85, 372-385.

Ciljevi predmetnog pronalaska su novo jedinjenje formule I i njegove farmaceutski prihvatljive soli, njihova primena za lečenje bolesti povezanih sa biološkom funkcijom trag amin-asociranih receptora, njihova proizvodnja i lekovi na bazi jedinjenja prema pronalasku u kontroli ili prevenciji bolesti, kao što su depresija, poremećaji anksioznosti, bipolarni poremećaj, hiperkinetički poremećaj, poremećaji vezani za stres, psihotični poremećaji, kao što je šizofrenija, neurološka oboljenja, kao što je Parkinsonova bolest, neurodegenerativni poremećaji, kao što je Alchajmerova bolest, epilepsija, migrena, zloupotreba supstanci, zavisnost i poremećaji metabolizma, kao što su poremećaji u ishrani, dijabetes, dijabetičke komplikacije, gojaznost, dislipidemija, poremećaji potrošnje energije i asimilacija, poremećaji i zastoj homeostaze telesne temperature, poremećaji spavanja i cirkadijalnog ritma i kardiovaskularni poremećaji.

Predmetno jedinjenje formule I i njegove farmaceutski prihvatljive soli se mogu dobiti pomoću metoda dobro poznatih u struci, na primer, postupcima opisanim u nastavku, gde postupak obuhvata

a) cepanje N-zaštitne grupe (PG) iz jedinjenja formule

na jedinjenje formule

gde PG predstavlja N-zaštitnu grupu izabranu između −C(O)O-terc-butila (BOC), i, ako je poželjno, pretvaranje dobijenog jedinjenja u farmaceutski prihvatljive kisele adicione soli.

OPŠTI POSTUPAK

Šema 1

Početni materijali 1,1’ i 2 su komercijalno dostupni ili se mogu dobiti pomoću metoda dobro poznatih u struci. Racemski terc-butil 2-(4-aminofenil)morfolin-4-karboksilat (CAS RN: 1002726-96-6) je komercijalno dostupan. terc-butil (2R)-2-(4-aminofenil)morfolin-4-karboksilat (CAS RN: 1260220-42-5) je komercijalno dostupan. terc-butil (2S)-2-(4-aminofenil)morfolin-4-karboksilat (CAS RN: 1260220-43-6) je komercijalno dostupan ili se može pripremiti kao što je opisano u literaturi, na primer, kao što je opisano u Trussardi, R. & Iding, H, PCT Int. Appl. WO 2015/086495 A1.

Korak A: Formiranje amidne veze se može postići reakcijom kuplovanja između amina 2 i jedinjenja karboksilne kiseline 1 u prisustvu reagensa za kuplovanje, kao što su DCC, EDC, TBTU ili HATU u prisustvu organske baze, kao što je trietilamin, N,N-diizopropiletilamin ili N-metilmorfolin u halogenovanim rastvaračima, kao što su dihlorometan ili 1,2-dihloroetan ili eteričnim rastvaračima, kao što su dietil etar, dioksan, THF, DME ili TBME.

Poželjni uslovi su TBTU sa N-metilmorfolinom u THF-u na 50-60 °C tokom 12-48 sati. Alternativno, formiranje amidne veze se može postići reakcijom kuplovanja između amina 2 i jedinjenja acil hlorida 1’ u halogenovanim rastvaračima, kao što su dihlorometan ili 1,2-dihloroetan ili eteričnim rastvaračima, kao što su dietil etar, dioksan, THF, DME ili TBME, u prisustvu organske baze, kao što je trietilamin ili N,N-diizopropiletilamin.

Poželjni uslovi su trietilamin u THF-u na sobnoj temperaturi tokom 18 sati.

Ako je poželjno, jedinjenje acil hlorida 1’ može biti pripremljeno in situ od odgovarajuće karboksilne kiseline 1 tretiranjem sa oksalil hloridom u halogenovanim rastvaračima, kao što je dihlorometan ili 1,2-dihloroetan ili eteričnim rastvaračima, kao što su dietil etar, dioksan, THF, DME ili TBME u prisustvu katalizatora, kao što je DMF.

Poželjni uslovi su dihloretan na sobnoj temperaturi tokom 1 sata.

Alternativno, jedinjenje acil hlorida 1’ može biti pripremljeno in situ od odgovarajuće karboksilne kiseline 1 tretiranjem sa 1-hloro-N,N,2-trimetilpropenilaminom [CAS 26189-59-3] u dihlorometanu, nakon čega sledi uklanjanje rastvarača u vakuumu, prema metodi Ghoseza i saradnika (J. Chem. Soc., Chem. Commun. 1979, 1180; Org. Synth. 1980, 59, 26-34).

Korak B: Uklanjanje BOC N-zaštitne grupe se može izvršiti pomoću mineralnih kiselina, kao što su HCl, H2SO4ili H3PO4ili organskih kiselina, kao što su CF3COOH, CHCl2COOH, HOAc ili p-toluensulfonske kiseline u rastvaračima, kao što su CH2Cl2, CHCl3, THF, MeOH, EtOH ili H2O na 0 do 80 °C.

Poželjni uslovi su CF3COOH u vodenom acetonitrilu na 80 °C tokom 3 sata ili 4 N HCl u dioksanu na sobnoj temperaturi tokom 16 sati.

Tamo gde je korišćen racemski polazni materijal 2, dobijena racemska smeša morfolinskih jedinjenja I’ može da se razdvoji na njene sastavne enantiomere pomoću hiralnog HPLC-a. Alternativno, jedinjenje I može da se dobije u enantiomerno čistom obliku počevši od enantiomerno čistog jedinjenja 2.

Izolacija i prečišćavanje jedinjenja

Izolacija i prečišćavanje jedinjenja i intermedijara koji su ovde opisani može se izvršiti, po želji, bilo kojim odgovarajućim postupkom razdvajanja ili prečišćavanja kao što su, na primer, filtracija, ekstrakcija, kristalizacija, hromatografija na koloni, tankoslojna hromatografija, debeloslojna hromatografija, preparativna tečna hromatografija pod niskim ili visokim pritiskom ili kombinacijom ovih postupaka. Specifične ilustracije odgovarajućih postupaka razdvajanja i izolacije mogu se odnositi na preparate i primere navedene u nastavku. Međutim, naravno da se mogu koristiti i drugi ekvivalentni postupci razdvajanja ili izolacije. Racemske smeše hiralnih jedinjenja formule I mogu se razdvojiti pomoću hiralnog HPLC-a. Racemske smeše hiralnih sintetičkih intermedijara takođe mogu da se razdvoje pomoću hiralnog HPLC-a.

Soli jedinjenja formule I

Jedinjenje formule I je bazično i može da se pretvori u odgovarajuću kiselu adicionu so. Konverzija se postiže tretiranjem sa najmanje stehiometrijskom količinom odgovarajuće kiseline, kao što je hlorovodonična kiselina, bromovodonična kiselina, sumporna kiselina, azotna kiselina, fosforna kiselina i slično, i organskim kiselinama, kao što je sirćetna kiselina, propionska kiselina, glikolna kiselina, piruvinska kiselina, oksalna kiselina, jabučna kiselina, malonska kiselina, sukcinska kiselina, maleinska kiselina, fumarna kiselina, vinska kiselina, limunska kiselina, benzojeva kiselina, cinaminska kiselina, mandelinska kiselina, metansulfonska kiselina, etansulfonska kiselina, p-toluensulfonska kiselina, salicilna kiselina i slično. Obično se slobodna baza rastvara u inertnom organskom rastvaraču, kao što su dietil etar, etilacetat, hloroform, etanol ili metanol i slično, a kiselina se dodaje u sličnom rastvaraču. Temperatura se održava između 0 °C i 50 °C. Nastala so se spontano taloži ili se može izdvojiti iz rastvora manje polarnim rastvaračem.

Primer 1

5-etil-4-metil-N-[4-[(2S)-morfolin-2-il]fenil]-1H-pirazol-3-karboksamid

a) terc-butil (2S)-2-[4-[(5-etil-4-metil-1H-pirazol-3-karbonil)amino]fenil]morfolin-4-karboksilat

U mešani rastvor terc-butil (2S)-2-(4-aminofenil)morfolin-4-karboksilata (CAS RN: 1260220-43-6, 350 mg, 1,26 mmol, 1,00 ekv.) i 5-etil-4-metil-1H-pirazol-3-karboksilne kiseline (CAS RN: 957129-38-3, 245 mg, 1,51 mmol, 1,20 ekv.) u THF-u (8 ml) su dodati TBTU (807 mg, 2,51 mmol, 2,00 ekv.) i N-metilmorfolin (509 mg, 553 µl, 5,03 mmol, 4,00 ekv.). Reakciona smeša je mešana na 50 °C tokom 15 sati. TLC je na t = 15 sati pokazao da je reakcija završena. Reakciona smeša je koncentrovana u vakuumu. Sirovi materijal je prečišćen fleš hromatografijom (silika gel, eluent: 0% do 100% EtOAc u heptanu) da bi se dobio terc-butil (2S)-2-[4-[(5-etil-4-metil-1H-pirazol-3-karbonil)amino]fenil]morfolin-4-karboksilat kao sivkastobela čvrsta supstanca (501 mg, 96%). MS (ISP): 413,7 ([M-H]-). b) 5-etil-4-metil-N-[4-[(2S)-morfolin-2-il]fenil]-1H-pirazol-3-karboksamid

U mešani rastvor trifluorosirćetne kiseline (1,37 g, 918 µl, 12,0 mmol, 10 ekv.) u vodi (8 ml) dodata je suspenzija terc-butil (2S)-2-[4-[(5-etil-4-metil-1H-pirazol-3-karbonil)amino]fenil]morfolin-4-karboksilata (497 mg, 1,2 mmol, 1,00 ekv.) u acetonitrilu (4 ml). Reakciona smeša je mešana na 80 °C tokom 3 sati. MS je na t = 3 sati pokazao da je reakcija završena. Reakciona smeša je sipana u vodeni rastvor 1 M NaOH i ekstrahovana dva puta sa EtOAc. Organski slojevi su osušeni iznad Na2SO4i koncentrovani u vakuumu. Sirovi materijal je prečišćen fleš hromatografijom na koloni (SiliaSep™ uložak amina, eluent: 0% do 100% EtOAc u heptanu, zatim 0% do 10% MeOH u EtOAc) da bi se dobio 5-etil-4-metil-N-[4-[(2S)-morfolin-2-il]fenil]-1H-pirazol-3-karboksamid (327 mg, 87%) kao sivkastobela čvrsta supstanca. MS (ISP): 315,7 ([M+H]<+>).

Primer 2 (uporedni primer)

5-etil-4-metil-N-[4-[(2R)-morfolin-2-il]fenil]-1H-pirazol-3-karboksamid

Naslovno jedinjenje je dobijeno analogno primeru 1 primenom (2R)-2-(4-aminofenil)morfolin-4-karboksilata (CAS RN: 1260220-42-5) umesto (2S)-2-(4-aminofenil)morfolin-4-karboksilata u koraku (a). Bela čvrsta supstanca. MS (ISP): 315,6 ([M+H]<+>).

Primer 3 (uporedni primer)

N-[4-[(2S)-morfolin-2-il]fenil]-6-(2,2,2-trifluoroetoksi)piridin-3-karboksamid

Naslovno jedinjenje je dobijeno analogno primeru 1 primenom 6-(2,2,2-trifluoroetoksi)nikotinske kiseline (CAS RN: 159783-29-6) umesto 5-etil-4-metil-1H-pirazol-3-karboksilne kiseline u koraku (a). Bela čvrsta supstanca. MS (ISP): 382,1 ([M+H]<+>).

Primer 4 (uporedni primer)

6-hloro-N-[4-[(2S)-morfolin-2-il]fenil]piridin-3-karboksamid

Naslovno jedinjenje je dobijeno analogno primeru 1 primenom 6-hloro-nikotinske kiseline (CAS RN: 5326-23-8) umesto 5-etil-4-metil-1H-pirazol-3-karboksilne kiseline u koraku (a). Bela čvrsta supstanca. MS (ISP): 320,1 ([{<37>Cl}M+H]<+>), 318,2 ([{<35>Cl}M+H]<+>).

Primer 5 (uporedni primer)

2-hloro-N-[4-[(2S)-morfolin-2-il]fenil]piridin-4-karboksamid

Naslovno jedinjenje je dobijeno analogno primeru 1 primenom 2-hloro-izonikotinske kiseline (CAS RN: 6313-54-8) umesto 5-etil-4-metil-1H-pirazol-3-karboksilne kiseline u koraku (a). Bela čvrsta supstanca. MS (ISP): 320,1 ([{<37>Cl}M+H]<+>), 318,1 ([{<35>Cl}M+H]<+>).

Primer 6 (uporedni primer)

N-[4-[(2S)-morfolin-2-il]fenil]-2-fenil-1,3-tiazol-5-karboksamid

1

Naslovno jedinjenje je dobijeno analogno primeru 1 primenom 2-feniltiazol-5-karboksilne kiseline (CAS RN: 10058-38-5) umesto 5-etil-4-metil-1H-pirazola-3-karboksilne kiseline u koraku (a). Bela čvrsta supstanca. MS (ISP): 366,1 ([M+H]<+>).

Primer 7 (uporedni primer)

2,6-dihloro-N-[4-[(2S)-morfolin-2-il]fenil]piridin-4-karboksamid

Naslovno jedinjenje je dobijeno analogno primeru 1 primenom 2,6-dihloroizonikotinske kiseline (CAS RN: 5398-44-7) umesto 5-etil-4-metil-1H-pirazol-3-karboksilne kiseline u koraku (a).

Bela čvrsta supstanca. MS (ISP): 356,1 ([{<37>Cl}M+H]<+>), 354,1 ([{<37>Cl<35>Cl}M+H]<+>), 352,1 ([{<35>Cl}M+H]<+>).

Primer 8 (uporedni primer)

4-metil-N-[4-[(2S)-morfolin-2-il]fenil]-5-fenil-1H-pirazol-3-karboksamid

Naslovno jedinjenje je dobijeno analogno primeru 1 primenom 4-metil-5-fenil-1Hpirazol-3-karboksilne kiseline (CAS RN: 879770-33-9) umesto 5-etil-4-metil-1H-pirazol-3-karboksilne kiseline u koraku (a). Bela čvrsta supstanca. MS (ISP): 363,2 ([M+H]<+>).

Primer 9 (uporedni primer)

5,6-dihloro-N-[4-[(2S)-morfolin-2-il]fenil]piridin-3-karboksamid

Naslovno jedinjenje je dobijeno analogno primeru 1 primenom 5,6-dihloro-nikotinske kiseline (CAS RN: 41667-95-2) umesto 5-etil-4-metil-1H-pirazol-3-karboksilne kiseline u koraku (a). Bela čvrsta supstanca. MS (ISP): 356,1 ([{<37>Cl<35>Cl}M+H]<+>), 354,1 ([{<37>Cl}M+H]<+>), 352,1 ([{<35>Cl}M+H]<+>).

Primer 10 (uporedni primer)

6-cijano-N-[4-[(2S)-morfolin-2-il]fenil]piridin-3-karboksamid

Naslovno jedinjenje je dobijeno analogno primeru 1 primenom 6-cijano-nikotinske kiseline (CAS RN: 70165-31-0) umesto 5-etil-4-metil-1H-pirazol-3-karboksilne kiseline u koraku (a). Bela čvrsta supstanca. MS (ISP): 309,1 ([M+H]<+>).

Primer 11 (uporedni primer)

N-[4-[(2S)-morfolin-2-il]fenil]-6-(trifluorometil)piridin-3-karboksamid

Naslovno jedinjenje je dobijeno analogno primeru 1 primenom 6(trifluorometil)nikotinske kiseline (CAS RN: 158063-66-2) umesto 5-etil-4-metil-1H-pirazol-3-karboksilne kiseline u koraku (a). Bela čvrsta supstanca. MS (ISP): 352,2 ([M+H]<+>).

Primer 12 (uporedni primer)

5-hloro-N-[4-[(2S)-morfolin-2-il]fenil]piridin-2-karboksamid

Naslovno jedinjenje je dobijeno analogno primeru 1 primenom 5-hloro-pikolinske kiseline (CAS RN: 86873-60-1) umesto 5-etil-4-metil-1H-pirazol-3-karboksilne kiseline u koraku (a). Bela čvrsta supstanca. MS (ISP): 320,1 ([{<37>Cl}M+H]<+>), 318,2 ([{<35>Cl}M+H]<+>).

Primer 13 (uporedni primer)

5-hloro-N-[4-[(2S)-morfolin-2-il]fenil]piridin-3-karboksamid

Naslovno jedinjenje je dobijeno analogno primeru 1 primenom 5-hloro-nikotinske kiseline (CAS RN: 22620-27-5) umesto 5-etil-4-metil-1H-pirazol-3-karboksilne kiseline u koraku (a). Bela čvrsta supstanca. MS (ISP): 320,1 ([{<37>Cl}M+H]<+>), 318,1 ([{<35>Cl}M+H]<+>).

Primer 14 (uporedni primer)

2-hloro-6-metil-N-[4-[(2S)-morfolin-2-il]fenil]piridin-4-karboksamid

Naslovno jedinjenje je dobijeno analogno primeru 1 primenom 2-hloro-6-metilpiridin-4-karboksilne kiseline (CAS RN: 25462-85-5) umesto 5-etil-4-metil-1H-pirazol-3-

1

karboksilne kiseline u koraku (a). Bela čvrsta supstanca. MS (ISP): 334,1 ([{<37>Cl}M+H]<+>), 332,1 ([{<35>Cl}M+H]<+>).

Primer 15 (uporedni primer)

N-[4-[(2S)-morfolin-2-il]fenil]-2-fenil-1,3-oksazol-4-karboksamid

Naslovno jedinjenje je dobijeno analogno primeru 1 primenom 2-feniloksazol-4-karboksilne kiseline (CAS RN: 23012-16-0) umesto 5-etil-4-metil-1H-pirazol-3-karboksilne kiseline u koraku (a). Bela čvrsta supstanca. MS (ISP): 350,2 ([M+H]<+>).

Primer 16 (uporedni primer)

N-[4-[(2S)-morfolin-2-il]fenil]-2-fenil-1,3-tiazol-4-karboksamid

Naslovno jedinjenje je dobijeno analogno primeru 1 primenom 2-feniltiazol-4-karboksilne kiseline (CAS RN: 7113-10-2) umesto 5-etil-4-metil-1H-pirazol-3-karboksilne kiseline u koraku (a). Bela čvrsta supstanca. MS (ISP): 366,1 ([M+H]<+>).

Primer 17 (uporedni primer)

2-metil-N-[4-[(2S)-morfolin-2-il]fenil]piridin-4-karboksamid

Naslovno jedinjenje je dobijeno analogno primeru 1 primenom 2-metil-izonikotinske kiseline (CAS RN: 4021-11-8) umesto 5-etil-4-metil-1H-pirazol-3-karboksilne kiseline u koraku (a). Bela čvrsta supstanca. MS (ISP): 298,2 ([M+H]<+>).

Primer 18 (uporedni primer)

2,6-dimetil-N-[4-[(2S)-morfolin-2-il]fenil]piridin-4-karboksamid

Naslovno jedinjenje je dobijeno analogno primeru 1 primenom 2,6-dimetilizonikotinske kiseline (CAS RN: 54221-93-1) umesto 5-etil-4-metil-1H-pirazol-3-karboksilne kiseline u koraku (a). Bela čvrsta supstanca. MS (ISP): 312,2 ([M+H]<+>).

Primer 19 (uporedni primer)

N-[4-[(2S)-morfolin-2-il]fenil]-2-metil-1,3-tiazol-4-karboksamid

Naslovno jedinjenje je dobijeno analogno primeru 1 primenom 2-metiltiazol-4-karboksilne kiseline (CAS RN: 35272-15-2) umesto 5-etil-4-metil-1H-pirazol-3-karboksilne kiseline u koraku (a). Bela čvrsta supstanca. MS (ISP): 304,1 ([M+H]<+>).

Primer 20 (uporedni primer)

N-[4-[(2S)-morfolin-2-il]fenil]-1-fenilpirazol-3-karboksamid

1

Naslovno jedinjenje je dobijeno analogno primeru 1 primenom 1-fenil-1H-pirazol-3-karboksilne kiseline (CAS RN: 4747-46-0) umesto 5-etil-4-metil-1H-pirazol-3-karboksilne kiseline u koraku (a). Bela čvrsta supstanca. MS (ISP): 349,2 ([M+H]<+>).

Kao što je gore pomenuto, jedinjenje predmetnog pronalaska ima značajne prednosti u odnosu na jedinjenja iz prethodnih informacija, a to su prednosti snažne agonističke aktivnosti na TAAR1 receptoru kod ljudi, selektivnost prema dopaminskom transporteru (DAT), selektivnost prema hERG jonskom kanalu i nizak amfifilni vektor i time predstavlja nizak rizik od nastanka fosfolipidoze izazvane lekovima (DIPL) (vide infra).

Uporedivi podaci i komentari u nastavku se mogu dati da bi se pokazale superiorne prednosti jedinjenja formule I u poređenju sa poznatim jedinjenjima iz prethodnih informacija.

1. Farmakološki efekti i terapeutski potencijal parcijalnih agonista trag aminasociranog receptora 1 kod ljudi (hTAAR1)

Postoje dokazi o značajnim razlikama u vrstama u interakcijama liganda-receptora između TAAR1<[1]>kod glodara i ljudi. Zbog toga, prilikom izbora jedinjenja koja će se primenjivati kao humani terapeutici za lečenje bolesti povezanih sa TAAR1, važno je dati prioritet jedinjenjima kandidatima na osnovu potencijala njihove funkcionalne aktivnosti u obliku TAAR1 receptora kod ljudi (hTAAR1). hTAAR1 je G protein-kuplovani transmembranski receptor (GPCR), pri čemu ligandi mogu da funkcionišu kao antagonisti, agonisti, parcijalni agonisti ili inverzni agonisti receptora. Jedinjenje formule I i uporedni primeri testirani su in vitro na funkcionalnu aktivnost na hTAAR1, pri čemu je utvrđeno da je jedinjenje formule I parcijalni agonist hTAAR1. Eksperimentalno utvrđene vrednosti hTAAR1 EC50za jedinjenje formule I i izbor uporednih primera su prikazani u Tabeli 1 (vide infra). Utvrđeno je da je jedinjenje iz primera 1 naročito delotvoran parcijalni agonist hTAAR1 in vitro.

Ex vivo elektrofiziološki eksperimenti u ventralnom tegmentalnom području i

1

dorzalnim rafe jedrima su pokazali da parcijalni agonisti TAAR1 povećavaju stope aktiviranja DA i 5-HT neurona kod miševa divljeg tipa<[2,3]>, dok su puni agonisti poput ptiramina smanjili stope aktiviranja<[3,4]>. Međutim, pokazalo se da puni i parcijalni agonisti štite od korisnih i pojačavajućih efekata psihostimulativnog kokaina<[5]>. Dok puni agonisti poput amfetamina induciraju negativne povratne signale kako bi prikrili sopstveni efekat na DA i 5-HT sisteme<[6,7]>, parcijalni agonisti mogu da povećaju svoj efekat na prenos neuronskog signala povećanjem stopa aktiviranja preko TAAR1. Zbog ovih nalaza i izveštaja da parcijalni agonisti TAAR1 imaju bogatiju in vivo farmakologiju kod glodara od punih agonista<[3,8]>, pojavilo se snažno telo predkliničkih dokaza koji sugerišu da parcijalni agonisti TAAR1 pokazuju veoma obećavajući potencijal za primenu kao humanih terapeutika za lečenje bolesti CNS-a, uključujući, ali ne ograničavajući se na, šizofreniju, bipolarni poremećaj, depresiju, Parkinsonovu bolest, kao i za lečenje zavisnosti od alkohola i droga.

Na primer, za parcijalne agoniste TAAR1 se sugeriše da će biti superiorniji od postojećih atipičnih antipsihotika tako što pokazuju efikasnost antipsihotika uz poboljšanu kogniciju i raspoloženje, kao i uz smanjeni profil nuspojava (npr. bez indukcije metaboličkog sindroma koji se vidi sa trenutnim antipsihoticima)<[3,8]>. Druga literatura sugeriše da moguće indikacije uključuju bipolarni poremećaj,<[8]>zavisnost od droga<[5,9]>i dijabetes<[10]>.

Literatura:

[1] Simmler, L. D.; Buchy, D.; Chaboz, S.; Hoener, M.C.; Liechti, M. E.; „In vitro characterization of psychoactive substances at rat, mouse and human trace amine-associated receptor 1“.J. Pharmacol. Exp. Ther. 2016, Fast Forward article DOI: 10.1124/jpet.115.229765;

[2] Bradaia, A. i sar.; „The selective antagonist EPPTB reveals TAAR1-mediated regulatory mechanisms in dopaminergic neurons of the mesolimbic system“. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 2009, 106, 20081-20086;

[3] Revel, F. G. i sar.; „Trace amine-associated receptor 1 partial agonism reveals novel paradigm for neuropsychiatric therapeutics“. Biol. Psychiatry 2012, 72, 934-942;

[4] Revel, F. G. i sar.; „TAAR1 activation modulates monoaminergic neurotransmission, preventing hyperdopaminergic and hypoglutamatergic activity“. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 2011, 108, 8485-8490;

[5] Pei, Y.; Mortas, P.; Hoener, M. C.; Canales, J. J.; „Selective activation of the trace amine-associated receptor 1 decreases cocaine’s reinforcing efficacy and prevents cocaine-induced changes in brain reward thresholds“. Prog. Neuro-Psychopharmacol. & Biol. Psychiatry 2015, 63, 70-75;

1

[6] Lindemann, L. i sar.; „Trace amine-associated receptor 1 modulates dopaminergic activity“. J. Pharmacol. Exp. Ther.2008, 324, 948-956;

[7] Di Cara, B. i sar.; „Genetic deletion of trace amine 1 receptors reveals their role in auto-inhibiting the actions of ecstasy (MDMA)“. J. Neuroscience 2011, 31, 16928-16940;

[8] Revel, F. G. i sar.; „A new perspective for schizophrenia: TAAR1 agonists reveal antipsychotic- and antidepressant-like activity, improve cognition and control body weight“. Mol. Psychiatry 2013, 18, 543-556;

[9] Pei, Y.; Lee, J.; Feo, D.; Gainetdinov, R. R.; Hoener, M. C.; Canales, J. J.; „Activation of the trace amine-associated receptor 1 prevents relapse to cocaine seeking“. Neuropsychopharmacology 2014, 39, 2299-2308;

[10]Raab, S. i sar.; „Incretin-like effects of small molecule trace amine-associated receptor 1 agonists“. Mol. Metabolism 2016, 5, 47-56.

2. Dopaminski transporter (DAT) i pridružena mogućnost zloupotrebe leka i/ili potencijal zavisnosti

Farmakologija dopaminskog transportera (DAT) je inter alia podrazumevala psihostimulatorne efekte i mehanizam odgovornosti i zavisnosti od zloupotrebe nekih psihostimulantnih droga, kao što su kokain i MDPV.<[1-3]>Stoga, za novu terapiju predviđenu za primenu kod ljudi, poželjno je izbeći inhibiciju ili interakciju sa dopaminskim transporterom DAT kako bi se umanjio rizik od mogućnosti zloupotrebe ili potencijalne zavisnosti.

Na primer, dokazi ukazuju na to da pojačani efekti kokaina zavise od njegove sposobnosti da brzo blokira dopaminski transporter (DAT). U istraživanjima na životinjama, inhibitori ponovnog preuzimanja dopamina, osim kokaina, takođe se primenjuju samostalno, sa relativnom potencijom koja uglavnom ima pozitivan uzajamni odnos sa njihovom potencijom inhibicije DAT-a, ali ne i serotoninskim ili norepinefrinskim transporterima (SERT, NET)<[4-8]>. Životinje naučene da samostalno administriraju kokain takođe će samostalno da administriraju direktne agoniste dopamina<[9-11]>. Pored toga, uništavanje nervnih terminala dopamina može dovesti do ekstinkcije ponašanja samostalnog administriranja kokaina<[12,13]>, a ti efekti su primećeni čak i kada je očuvan odgovor koji su održavali drugi pojačivači<[14,15]>. Kod ljudi, „reakcija na lek“ izazvana kokainom je u korelaciji sa popunjenošću DAT-a u mozgu<[16]>.

Da bi se dodatno testirala hipoteza da je DAT od suštinskog značaja za pojačavajuće efekte kokaina, generisan je funkcionalan, ali „neosetljiv na kokain“ DAT i izražen kod miševa<[17,18]>. Ovaj mutirani DAT je pokazao 89 puta niži afinitet za kokain u odnosu na DAT

1

divljeg tipa, a kokain nije uspeo da poveća ekstracelularni dopamin u akumbensu jedra ili da indukuje povećanje lokomotorne aktivnosti, stereotipova ili preferencija uslovljenih mestom, kod „knock-in“ (DATki) miševa koji izražavaju ovaj mutirani DAT<[18-20]>. Pored toga, kokain nije uspeo da posluži kao pozitivni pojačivač kod ovih DATki miševa, dok su hrana, damfetamin i direktan dopaminski agonist pouzdano održavali operantno ponašanje kod ovih miševa, na nivoima uporedivim sa miševima divljeg tipa<[21]>. Ponovno uvođenje DAT-a divljeg tipa osetljivog na kokain u područja mozga, uključujući inter alia ventralno tegmentalno područje (VTA), dovelo je do obnavljanja ponašanja na kokainu kod DATki miševa<[22]>. Zaključno, sposobnost kokaina da blokira DAT je dovoljna da ukine pojačavajuće efekte kod miševa pružajući snažne dokaze da je blokada DAT-a presudna za pojačavajuće efekte kokaina.

Stoga, kada se gledaju zajedno, ovi nalazi sugerišu da je za novo terapeutsko sredstvo namenjeno primeni kod ljudi veoma poželjno izbeći inhibiciju ili interakciju sa dopaminskim transporterom DAT kako bi se smanjio rizik od mogućnosti zloupotrebe ili potencijalne zavisnosti.

Izmereni in vitro DAT Kiza niz jedinjenja TAAR1 su prikazani u Tabeli 1 (vide infra). Iznenađujuće, utvrđeno je da je Primer 1 značajno slabiji ligand na DAT-u u odnosu na druga jedinjenja, dok je istovremeno moćan parcijalni agonist hTAAR1, i stoga je odnos selektivnosti hTAAR1/DAT za primer 1 značajno veći nego za ostala jedinjenja.

Literatura:

[1] Meil, W. M. i Boja, J. W.; „The dopamine transporter and addiction.“ Poglavlje 1, pp.1-21 u Neurochemistry of Abused Drugs (Karch, S. B., Ed.), CRC Press (2008);

[2] Simmler, L. D. i sar.; „Pharmacological characterization of designer cathinones in vitro“. Brit. J. Pharmacol. 2013, 168, 458-470;

[3] Baumann, M. H.; Partilla, J. S.; Lehner, K. R.; „Psychoactive ‘bath salts’: not so soothing“. Eur. J. Pharmacol. 2013, 698, 1-5;

[4] Ritz., M. C.; Lamb, R. J.; Goldberg, S. R.; Kuhar, M. J.; „Cocaine receptors on dopamine transporters are related to self-administration of cocaine“. Science 1987, 237, 1219-1223;

[5] Bergmann., J.; Madras, B. K.; Johnson, S. E.; Spealman, R. D.; „Effects of cocaine and relared drugs in nonhuman primates. III. Self-administration by squirrel monkeys“. J. Pharmacol. Exp. Ther.1989, 251, 150-155;

[6] Howell., L. L. & Byrd, L. D.; „Serotonergic modulation of the behavioural effects of cocaine in the squirrel monkey“. J. Pharmacol. Exp. Ther.1995, 275, 1551-1559;

1

[7] Roberts, D. C. S. i sar.; „Self-administration of cocaine analogs by rats“. Psychopharmacology 1999, 144, 389-397;

[8] Wee, S. i sar.; „Relationship between serotonergic activity and reinforcing effects of a series of amphetamine analogs“. J. Pharmacol. Exp. Ther.2005, 313, 848-854;

[9] Woolverton, W. L.; Goldberg, L. I.; Ginos, J. Z.; „Intravenous self-administration of dopamine receptor agonists by Rhesus monkeys“. J. Pharmacol. Exp. Ther. 1984, 230, 678-683;

[10]Wise, R. A.; Murray, A.; Bozarth, M. A.; „Bromocriptine self-administration and bromocriptine-reinstatement of cocaine-trained and heroin-trained lever pressing in rats“. Psychopharmacology 1990, 100, 355-360;

[11]Caine, S. B. & Koob, G. F.; „Modulation of cocaine self-administration in the rat through D-3 dopamine receptors“. Science 1993, 260, 1814-1816;

[12]Roberts, D. C. S.; Corcoran, M. E.; Fibiger, H. C.; „On the role of ascending catecholaminergic systems in intravenous self-administration of cocaine“. Pharmacol. Biochem. Behaviour 1977, 6, 615-620;

[13]Roberts, D. C. S.; Koob, G. F.; Klonoff, P.; Fibiger, H. C.; „Extinction and recovery of cocaine self-administration following 6-hydroxydopamine lesions of the nucleus accumbens“. Pharmacol. Biochem. Behaviour 1980, 12, 781-787;

[14]Pettit, H. O.; Ettenberg, A.; Bloom, F. E.; Koob, G. F.; „Destruction of dopamine in the nucleus accumbens selectively attenuates cocaine but not heroin self-administration in rats“. Psychopharmacology 1984, 84, 167-173;

[15]Caine, S. B. & Koob, G. F.; „Effects of mesolimbic dopamine depletion on responding maintained by cocaine and food“. J. Exp. Anal. Behavior 1994, 61, 213-221;

[16]Volkow, N. D. i sar.; „Relationship between subjective effects of cocaine and dopamine transporter occupancy“. Nature 1997, 386, 827-830;

[17]Chen, R.; Han, D. D.; Gu, H. H.; „A triple mutation in the second transmembrane domain of mouse dopamine transporter markedly decreases sensitivity to cocaine and methylphenidate“. J. Neurochem.2005, 94, 352-359;

[18]Chen, R. i sar.; „Abolished cocaine reward in mice with a cocaine-insensitive dopamine transporter“. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 2006, 103, 9333-9338;

[19]Tilley, M. R. & Gu, H. H.; „Dopamine transporter inhibition is required for cocaine-induced stereotypy“. Neuroreport 2008, 19, 1137-1140;

[20]Tilley, M. R.; O’Neill, B.; Han, D.D.; Gu, H. H.; „Cocaine does not produce reward in absence of dopamine transporter inhibition“. Neuroreport 2009, 20, 9-12;

2

[21]Thomsen, M.; Han, D.D.; Gu, H. H.; Caine, S. B.; „Lack of cocaine selfadministration in mice expressing a cocaine-insensitive dopamine transporter“. J. Pharmacol. Exp. Ther.2009, 331, 204-211;

[22]Wu, H. i sar.; „Restoration of cocaine stimulation and reward by reintroducing wild type dopamine transporter in adult knock-in mice with a cocaine-insensitive dopamine transporter“. Neuropharmacology 2014, 86, 31-37.

3. blokada hERG-a i pridružena mogućnost produžavanja QT intervala srca Umanjivanje verovatnoće da izazove kardijalne neželjene efekte izazvane lekovima je veoma poželjno za terapeutsko sredstvo namenjeno bezbednoj primeni kod ljudi, posebno za lek koji je namenjen za primenu u hroničnim režimima lečenja. Poslednjih godina regulatorni organi odlažu odobrenje ili su uveli ograničenja primene, pa čak i uskratili odobrenje ili povukli sa tržišta terapeutska sredstva koja produžavaju QT interval srca. QT interval je vreme od početka QRS kompleksa do kraja T talasa elektrokardiograma (EKG) i meri trajanje ventrikularne depolarizacije i repolarizacije. Lekovi koji produžavaju QT interval su povezani sa polimorfnom ventrikularnom tahikardijom koja se naziva „Torsades de Pointes“ (TdP). Ova aritmija može da izazove ozbiljne kardiovaskularne ishode i može da napreduje do nepovratne ventrikularne fibrilacije i smrti. Regulativna smernica ICH S7B<[1]>preporučuje sveobuhvatnu nekliničku strategiju za procenu kardiovaskularnog rizika od novih molekularnih entiteta (NME) koja uključuje in vitro test IKr [struja kalijuma izvedena od humanog etar-a-go-go povezanog gena (hERG)]. Inhibicija hERG-a je identifikovana kao glavni mehanizam za produženje QT-a.<[2]>Stoga, preporučena strategija smanjenja rizika za minimalni neklinički QT interval je testiranje reprezentativnih jedinjenja iz određene hemijske serije u in vitro hERG testu.<[3]>Cilj je izabrati jedinjenja koja izazivaju ne više od 20% inhibicije hERG-a u koncentracijama najmanje 30 puta manjim od efikasne in vitro (ili in vivo ako je dostupno) koncentracije za terapeutsku aktivnost. U slučaju agonista TAAR1, hTAAR1 EC50se može smatrati relevantnom in vitro prediktivnom koncentracijom terapeutske aktivnosti (vide supra). Zbog toga je poželjno izabrati agoniste TAAR1 gde je odnos hERG IC20/hTAAR1 EC50najmanje 30.

Izmereni in vitro hERG IC20i IC50za niz TAAR1 jedinjenja su prikazani u Tabeli 1 (vide infra).

Poznato je da su osnovna jedinjenja posebno sklona izazivanju snažne inhibicije hERG kanala.<[4]>Sva TAAR1 jedinjenja nose istu glavnu morfolino grupu, pa se očekuje da će sva jedinjenja biti slično bazična. Osnovna grupa je potrebna za aktivnost agonista na hTAAR1. Iznenađujuće, utvrđeno je da je Primer 1 značajno slabiji inhibitor hERG kanala u odnosu na uporedna jedinjenja, i zato je odnos hERG IC20/hTAAR1 EC50za primer 1 značajno veći od preporučenog najmanje 30 puta.

Literatura:

[1] ICH smernica. „The nonclinical evaluation of the potential for delayed ventricular repolarization (QT interval prolongation) by human pharmaceuticals (S7B)” izdata kao CPMP/ICH/423/02, koju je usvojio CHMP maja 2005;

http://www.ich.org/products/guidelines/safety/safety-single/article/the-non-clinicalevaluation-of-the-potential-for-delayed-ventricular-repolarization-qt-interval-pro.html [2] Redfern, W. S.; Carlsson, L.; Davis, A. S.; Lynch, W. G.; MacKenzie, I.; Palethorpe, S.; Siegl, P.K.; Strang, I; Sullivan, A. T.; Wallis, R.; Camm, A.J.; Hammond, T. G.; „Relationships between preclinical cardiac electrophysiology, clinical QT interval prolongation and torsade de pointes for a broad range of drugs: evidence for a provisional safety margin in drug development“. Cardiovasc. Res.2003, 58, 32-45;

[3] Helliwell, R. M.: „Potassium Channels“. Methods in Molecular Biology (Totowa, NJ, United States) 2008, 491, 279-295;

[4] Zolotoy, A. B.; Plouvier, B. P.; Beatch, G. B.; Hayes, E. S.; Wall, R. A.; Walker, M. J. A.; „Physicochemical determinants for drug-induced blockade of hERG potassium channels: Effect of charge and charge shielding“. Curr. Med. Chem. - Cardiovascular & Hematological Agents 2003, 1, 225-241.

4. Amfifilnost i pridružena mogućnost nastanka fosfolipidoze izazvane lekovima (DIPL)

Fosfolipidoza (PLD) je lizosomalni poremećaj skladištenja koji je okarakterisan prekomernim nakupljanjem fosfolipida u tkivima<[1][2][3]>Izveštava se da mnogi katjonski amfifilni lekovi, uključujući antidepresive, antianginalne, antimalarijske lekove i sredstva za snižavanje holesterola izazivaju fosfolipidozu izazvanu lekovima (DIPL) kod životinja i ljudi. Mehanizmi DIPL-a uključuju hvatanje ili selektivni unos DIPL lekova unutar lizosoma i kiselih vezikula pogođenih ćelija. Nakon hvatanja lekova dolazi postepena akumulacija fosfolipidnih kompleksa lekova u unutrašnjim lizosomalnim membranama. Povećavanje nesvarenih materijala dovodi do nenormalnog nakupljanja multi-lamelarnih tela (mijeloidnih tela) u tkivima. Iako se fosfolipidoza prvenstveno smatra poremećajem skladištenja, kod nekih jedinjenja je poznato da je poremećaj skladištenja povezan sa upalom i nekrozom što dovodi do funkcionalnog oštećenja pogođenih tkiva. Izuzetno je poželjno da terapeutski lek ne predstavlja rizik za nastanak DIPL-a. Ovo se posebno odnosi na lekove koji su namenjeni za hroničnu primenu, na primer, lekovi namenjeni lečenju hroničnih psihijatrijskih poremećaja, kao što su šizofrenija, bipolarni poremećaj ili depresija, ili lekovi namenjeni lečenju hroničnih metaboličkih poremećaja, kao što je dijabetes.

DIPL predstavlja štetni efekat za koji se zna da je posebno povezan sa katjonskim amfifilnim lekovima (CAD).<[4]>Da bi se izbegao DIPL, osnovni pKa(osnovni pKa< 6,3) ili amfifilnost (ΔΔGam> − 6 kJ mol<-1>) jedinjenja se mora smanjiti (tj. ΔΔGamje potrebno povećati).<[5]>Jedinjenje se klasifikuje kao DIPL negativan ako je ili osnovna pKavrednost ispod 6,3 ili amfifilnost iznad ΔΔGam= -6 kJ mol<-1>. Amfifilnost određenog jedinjenja može da se izračuna in silico direktno iz molekularne strukturalne formule,<[6]>i stoga se predviđeni rizik za DIPL tog jedinjenja takođe može izračunati in silico,<[5]>pri čemu algoritam predviđanja koristi klasifikaciju rizika za DIPL definisanu prema sledećim kriterijumima, koji se zasnivaju na parametrima izdvojenim iz računarskog seta treninga koji sadrži eksperimentalno utvrđene rezultate fosfolipidoze za veliki skup jedinjenja:

AMFIFILNI VEKTOR > -5,0 kJ/mol i BPKA1 <= 5,60 rezultira NEGATIVNIM DIPL predviđanjem;

-7,0 kJ/mol < AMFIFILNI VEKTOR <-5,0 kJ/mol i/ili 7,0 > BPKA1 > 5,60 rezultira GRANIČNIM DIPL predviđanjem;

AMFIFILNI VEKTOR < -7,0 kJ/mol i BPKA1 >= 7,00 rezultira POZITIVNIM DIPL predviđanjem.

Izračunate amfifilnosti (ΔΔGamu kJ mol<-1>) kao i in silico predviđanja rizika za DIPL (negativna/granična/pozitivna) za niz TAAR1 jedinjenja su prikazani u Tabeli 1 (vide infra).

Sva TAAR1 jedinjenja nose istu morfološku glavnu grupu, i stoga je osnovni pKasvih jedinjenja veoma sličan i jasno iznad 6,3. Osnovna grupa je potrebna za aktivnost agonista na hTAAR1. Prema tome, jedini način da se izbegne DIPL je smanjenje lipofilnosti kičme molekula. Iznenađujuće, utvrđeno je da je za Primer 1 lipofilnost smanjena značajno više nego što se očekivalo na osnovu rezultata za slična jedinjenja, i stoga je amfifilnost primera 1 jasno smanjena, i kao posledica toga nije predviđeno da ovo jedinjenje izazove DIPL.

Literatura:

[1] Anderson, N.; Borlak, J.; „Drug-induced phospholipidosis“. FEBS Lett. 2006, 580, 5533-540;

[2] Reasor, M. J.; Hastings, K. L.; Ulrich, R. G.; „Drug-induced phospholipidosis: issues and future directions“. Expert Opin. Drug Safety 2006, 5, 567-83;

[3] Nonoyama, T.; Fukuda, R.; „Drug induced phospholipidosis pathological aspects and its prediction“. J. Toxicol. Pathol.2008, 21, 9-24;

[4] Lullmann, H.; Lullmann-Rauch, R.; Wassermann, O.; „Lipidosis induced by

2

amphiphilic cationic drugs.“ Biochem. Pharmacol. 1978, 27, 1103-8;

[5] Fischer, H.; Atzpodien, E. A.; Csato, M; Doessegger, L.; Lenz, B.; Schmitt, G.; Singer, T.; „In silico assay for assessing phospholipidosis potential of small drug like molecules: training, validation and refinement using several datasets.“ J. Med. Chem. 2012, 55, 126-139;

[6] Fischer, H.; Kansy, M.; Bur, D.; „CAFCA: a novel tool for the calculation of amphiphilic properties of charged drug molecules“. Chimia 2000, 54, 640-645.

Jedinjenja su ispitana u skladu sa testovima datim u daljem tekstu.

Materijali i metode

Humani TAAR1

Za konstrukciju ekspresijskih plazmida, kodirajuće sekvence humanog TAAR 1 su amplifikovane od genomske DNK u suštini kao što su to opisali Lindemann i sar. [14]. „Expand High Fidelity“ PCR sistem (Roche Diagnostics) je korišćen sa 1,5 mM Mg<2+>, a prečišćeni PCR proizvodi su klonirani u pCR2.1-TOPO vektor za kloniranje (Invitrogen) prema uputstvima proizvođača. PCR proizvodi su podklonirani u vektor pIRESneo2 (“BD Clontech“, Palo Alto, Kalifornija), a ekspresioni vektori su verifikovani sekvencom pre uvođenja u ćelijske linije.

HEK293 ćelije (ATCC br. CRL-1573) su kultivisane u suštini kao što su to opisali Lindemann i sar. (2005). Za generisanje stabilno transfektovanih ćelijskih linija HEK293 ćelije su transfektovane sa ekspresionim plazmidima pIRESneo2 koji sadrže sekvence kodiranja TAAR (opisane iznad) sa lipofektaminom 2000 (Invitrogen) u skladu sa uputstvima proizvođača, a 24 časa nakon transfekcije sredstvo za kultivisanje je dopunjeno sa 1 mg/ml G418 (Sigma, Buchs, Švajcarska). Nakon perioda kultivisanja oko 10 d klonova je izolovano, prošireno i testirano na reakciju na trag-amine (sva jedinjenja kupljena od Sigme) sa cAMP Biotrak enzimskim imunotestom (EIA) sistema (Amersham), nakon postupka neacetilacije EIA koju je obezbedio proizvođač. Linije monoklonalnih ćelija koje su pokazale stabilan EC50za period kultivisanja od 15 pasaža korišćene su za sve naredne studije.

cAMP merenja su izvedena kao što je prethodno opisano (Revel i sar., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2011, 108, 8485-8490). Ukratko, ćelije koje su izrazile humani TAAR1 su postavljene na ploče za mikrotitraciju sa 96 bunarčića (BIOCOAT 6640; „Becton Dickinson“, Alšvil, Švajcarska) i inkubirane su tokom 20 sati na 37 °C. Pre stimulacije ćelija sa širokim opsegom koncentracija agonista tokom 30 minuta na 37 °C, ćelije su isprane PBS-om i predinkubirane PBS-om koji je sadržavao 1 mM 3-izobutil-1-metilksantina tokom 10 minuta na 37 °C i 5% CO2. Stimulacija sa 0,2% DMSO je postavljena kao bazni nivo, a efekat 30 µM β-PEA je postavljen kao maksimalni odgovor. Nakon toga, ćelije su lizirane i cAMP testovi su izvedeni prema uputstvima proizvođača (cAMP komplet; „Upstate/Millipor“, Šafhausen, Švajcarska). Na kraju, ploče za mikrotitraciju su očitane luminometrom (1420 brojač za više nalepnica; „PerkinElmer“, Švercenbah, Švajcarska) i izračunata je količina cAMP-a. Rezultati su dobijeni iz najmanje tri nezavisna eksperimenta. Eksperimenti su rađeni dva ili tri puta. EC50vrednosti su predstavljene kao srednja vrednost ± standardna devijacija (u µM). Vrednost Emaxza podatke o funkcionalnoj aktivnosti u TAAR1 opisuje stepen funkcionalne aktivnosti u poređenju sa 100% za endogeni ligand i puni agonist β-PEA.

Humani DAT

Vezivanje za dopaminski transporter (DAT) in vitro. Kultivisane su 293 ćelije humanog embrionalnog bubrega (HEK) („Invitrogen“, Cug, Švajcarska) stabilno transfektovane humanim DAT-om. Ćelije su sakupljene i isprane tri puta fosfatom puferisanim fiziološkim rastvorom (PBS). Pelete su zamrznute na -80 °C. Zatim su resuspendirane u 400 ml 20 mM HEPES-NaOH, pH 7,4, koji je sadržavao 10 mM EDTA na 4 °C. Nakon homogenizacije Polytron-om („Kinematica“, Lucern, Švajcarska) pri 10000 obrtaja u minuti (o/min) tokom 15 s, homogenati su centrifugirani na 48000 x g tokom 30 minuta na 4 °C. Alikvoti membranskih zaliha su zamrznuti na -80 °C. Sva ispitivanja su izvršena najmanje tri puta. Ispitna jedinjenja su razblažena u 20 ml pufera za vezivanje (252 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 20 mM Na2HPO4, 3,52 mM KH2PO4, pH 7,4) i napravljene su krive za razblaživanje u 10 tačaka i prebačene na bele polistirenske ploče za mikrotitraciju sa 96 bunarčića („Sigma-Aldrich“, Buhs, Švajcarska). [<3>H]-WIN35,428 (~86 Ci /mmol; Perkin-Elmer) je radioligand za DAT test i imao je Kdod 12 nM. Pedeset mikrolitara [<3>H]-WIN35,428 (~40 nM koncentracija) je dodato u svaki bunarčić ploča za mikrotitraciju hDAT, ciljajući konačnu [<3>H]-WIN35428 koncentraciju od 10 nM. Dvadeset mikrolitara pufera za vezivanje, samostalno na ploči za mikrotitraciju, definisalo je ukupno vezivanje, dok je vezivanje u prisustvu 10 µM indatralina definisalo nespecifično vezivanje. Zamrznute DAT membranske zalihe su odmrznute i resuspendirane do koncentracije od približno 0,04 mg proteina/ml pufera za vezivanje (1:1 razblažen u H2O) pomoću polytron homogenizatora tkiva. Membranski homogenati (40 µg/ml) su zatim lagano mešani 5-30 min sa polivinil toluenom (PCT) scintilacijskim blizinskim testom pšenične klice obložene aglutininom (VGASPA; Amersham Biosciences) sa 7,7 mg zrna/ml homogenata. Dodato je sto trideset mikrolitara smeše membrane/zrna u svaki bunarčić ploče za mikrotitraciju koja je sadržala radioligand i ispitna jedinjenja (krajnja zapremina u svakom bunarčiću, 200 µl) da bi se

2

započeo test, pri čemu je inkubirana oko 2 sata na sobnoj temperaturi uz agitaciju. Ploče za mikotitraciju su zatim izbrojane u PVT SPA režimu brojanja „Packard Topcount“. Pedeset mikrolitara zaliha [<3>H]-WIN35428 je izbrojano u 5 ml „ReadySafe“ scintilacionog koktela (Beckman Industries) na tečnom scintilacionom brojaču „Packard 1900CA“ da bi se odredio ukupan broj koji je dodat odgovarajućim testovima. Nelinearna regresija je korišćena za prilagođavanje podataka sigmoidnim krivama i određivanje IC50vrednosti za vezivanje i unos. Kivrednosti za vezivanje i unos su izračunate korišćenjem sledeće „Cheng-Prusoff“ jednačine: Ki= IC50/(1+ [S]/Km).

Humani ERG (hERG)

Patch-clamp tehnika na celoj ćeliji je korišćena za ispitivanje uticaja ispitnih stavki na hERG (humani etar-a-go-go povezani gen) kalijumske kanale u stabilno transfektovanim CHO ćelijama blizu fiziološke temperature (36 ± 1 °C). Efekti jedinjenja na hERG K<+>-strujne parametre su procenjeni na 4 koncentracije (0,3-3-30-300 µM) u najmanje 3 CHO ćelije koje stabilno izražavaju hERG kanal. Ćelije su za elektrofiziološka merenja zasejane na sterilne Petrijeve posude za ćelijsku kulturu od 35 mm koje sadrže 2 ml medijuma kulture, bez higromicina B. Ćelije su kultivisane sa gustinom koja je omogućavala merenje pojedinačnih ćelija (bez vidljivih veza sa susednim ćelijama). Ćelije su inkubirane na 37 °C u vlažnoj atmosferi sa 5% CO2(relativna vlažnost oko 95%). Ćelije su neprekidno održavane u pasažiranim sterilnim bocama za ćelijsku kulturu koje sadrže hranljivu smešu F-12 (DMEM/F-12 sa L-glutaminom) dopunjenu sa 10% fetalnog goveđeg seruma i 10% rastvora penicilina/streptomicina. Svakog dana najmanje tri ćelije su tretirane selektivnim IKrblokatorom (E-4031, referentna supstanca) da bi se obezbedila tačnost metode. Petrijeve posude za ćelijsku kulturu od 35 mm, na koje su zasejane ćelije u gustini koja omogućava da se evidentiraju pojedine ćelije, koje su stavljene na držač Petrijeve posude za mikroskop i neprekidno perfuisane (približno 1 ml/min) rastvorom za kupku (natrijum hlorid 150 mM, kalijum hlorid 4 mM, kalcijum hlorid 1,2 mM, magnezijum hlorid 1 mM, HEPES 10 mM, pH (NaOH) 7,4) blizu fiziološke temperature (36 ± 1 °C). Nakon formiranja „Gigaohm“ zaptivke između patch elektroda i pojedinačnih hERG stabilno transfektovanih CHO ćelija (opseg otpora pipete: 2,0 MΩ − 7,0 MΩ; opseg otpora zaptivke: > 1 GΩ) ćelijska membrana preko vrha pipete je bila probušena kako bi se obezbedio električni pristup unutrašnjosti ćelije (patch konfiguracija cele ćelije). U slučaju da je kvalitet zaptivke bio loš, proces formiranja zaptivke se ponavlja sa drugom ćelijom i novom pipetom. Čim je uspostavljeno stabilno zatvaranje, izmerene su hERG spoljne repne struje nakon depolarizacije ćelijske membrane na -40 mV tokom 50 ms, a zatim 500 ms na 20 mV (aktiviranje kanala) iz potencijala

2

zadržavanja od -80 mV i nakon naknadne repolarizacije na -40 mV tokom 500 ms. Ovaj protokol napona je pokrenut najmanje 10 puta u intervalima od 10 sekundi. Ako se proceni da je gustina struje preniska za merenje, snima se druga ćelija. Kada se kontrolni snimci izvrše, ćelije su neprestano perfuzirane rastvorom za kupku koji sadrži ispitne stavke. Za vreme pranja ispitne stavke, gore navedeni protokol napona se neprekidno pokreće u intervalima od 10 sekundi dok se ne postigne nivo stabilnog stanja bloka. Četiri koncentracije ispitne stavke ovog jedinjenja su primenjene uzastopno na 3 ćelije na kumulativni način. Kako je hERG repna struja inhibirana ispitnom stavkom, generisana je kriva koncentracije-reakcije i izračunata je IC50vrednost. Na osnovu IC50vrednosti je procenjena IC20vrednost. Svaka koncentracija ispitne stavke je analizirana u tri eksperimenta (n=3).

Izračunavanje amfifilnog vektora (ΔΔ Gam) i in silico DIPL predviđanje Amfifilni vektor (ΔΔ Gam) i in silico DIPL predviđanje su računski određeni iz molekularne strukturne formule za jedinjenje formule I i uporedna jedinjenja prema objavljenim algoritmima (Fischer, H.; Kansy, M.; Bur, D.; „CAFCA: a novel tool for the calculation of amphiphilic properties of charged drug molecules“. Chimia 2000, 54, 640-645; Fischer, H.; Atzpodien, E. A.; Csato, M; Doessegger, L.; Lenz, B.; Schmitt, G.; Singer, T.; „In silico assay for assessing phospholipidosis potential of small drug like molecules: training, validation and refinement using several datasets.“ J. Med. Chem. 2012, 55, 126-139).

Jedinjenje formule I ima parcijalnu agonističku aktivnost na hTAAR1 (EC50u µM), afinitet vezivanja na hDAT (Kiu µM), i aktivnost blokiranja kanala na hERG (IC20i IC50u µM), kao što je prikazano u Tabeli 1. Tabela 1 takođe prikazuje izračunati amfifilni vektor (ΔΔGamu kJ mol<-1>) i in silico procenu silikofosfolipidoze (negativno/pozitivno/granično predviđanje za in vitro DIPL i in vivo DIPL) za jedinjenje formule I i uporedna jedinjenja, izračunato korišćenjem gore opisanog postupka.

2

�

�

�

�

Iznenađujuće, utvrđeno je da jedinjenje formule I (primer 1) pokazuje opštu superiornu kombinaciju svojstava u pogledu snažne agonističke aktivnosti na hTAAR1, visoku selektivnost prema hDAT-u, visoku selektivnost prema hERG-u, nizak amfifilni vektor i posledično nizak rizik od fosfolipidoze u poređenju sa drugim TAAR1 jedinjenjima iz prethodnih informacija. Uvid u Tabelu 1 otkriva da primer 1 ima snažnu parcijalnu agonističku aktivnost na hTAAR1 (EC50= 0,059 µM), veoma je selektivan prema hDAT (Ki= 27,5 µM; odnos selektivnosti = 471 puta u odnosu na hTAAR1 EC50), veoma je selektivan prema hERG (IC20= 36,2 µM; odnos selektivnosti = 619 puta u odnosu na hTAAR1 EC50) i ima nizak amfifilni vektor (ΔΔGam= − 3,47 kJ mol<-1>) znatno ispod praga zabrinutosti za fosfolipidozu (in silico predviđanje DIPL rizika = negativno).

Uvid u Tabelu 1 otkriva da bliski analozi iz primera 1 imaju lošija svojstva u poređenju sa primerom 1 u jednom ili više aspekata.

Na primer, uporedni primer 2, koji je R enantiomer primera 1, manje utiče na hTAAR1 (EC50= 0,2632 µM), što nam pokazuje da je poželjna S konfiguracija apsolutne stereohemije, kao u primeru 1, da bi se dobila veća potencija na hTAAR1.

Uporedni primer 3 značajno više utiče na hERG (IC20= 1-97 µM; odnos selektivnosti = 52 puta u odnosu na hTAAR1 EC50) i takođe ima značajno veći amfifilni vektor (ΔΔGam= − 6,3 kJ mol<-1>) i stoga daje pozitivno DIPL predviđanje.

Uporedni primer 4 značajno više utiče na DAT (Ki= 2,5 µM; odnos selektivnosti = 40 puta u odnosu na hTAAR1 EC50) i takođe ima veći amfifilni vektor (ΔΔGam= − 5,3 kJ mol<-1>) i stoga daje granično DIPL predviđanje.

Uporedni primer 5 značajno više utiče na DAT (Ki= 1,5 µM; odnos selektivnosti = 23 puta u odnosu na hTAAR1 EC50) i takođe ima veći amfifilni vektor (ΔΔGam= − 5,9 kJ mol<-1>) i stoga daje granično DIPL predviđanje.

Uporedni primer 6 značajno više utiče na hERG (IC20= 0,38 µM; odnos selektivnosti = 5 puta u odnosu na hTAAR1 EC50), više utiče na DAT (Ki= 5,9 µM; odnos selektivnosti = 74 puta u odnosu na hTAAR1 EC50) i takođe ima značajno veći amfifilni vektor (ΔΔGam= − 8,46 kJ mol<-1>) i stoga daje pozitivno DIPL predviđanje.

Uporedni primer 7 značajno više utiče na hERG (IC20= 3,57 µM; odnos selektivnosti = 43 puta u odnosu na hTAAR1 EC50), značajno više utiče na DAT (Ki= 0,79 µM; odnos selektivnosti = 9 puta u odnosu na hTAAR1 EC50) i takođe ima značajno veći amfifilni vektor (ΔΔGam= − 7,41 kJ mol<-1>) i stoga daje pozitivno DIPL predviđanje.

Uporedni primer 8 značajno više utiče na hERG (IC20= 3,01 µM; odnos selektivnosti = 28 puta u odnosu na hTAAR1 EC50).

4

Uporedni primer 9 koji manje utiče na hTAAR1 (EC50= 0,144 µM), značajno više utiče na hERG (IC20= 1,14 µM; odnos selektivnosti = 8 puta u odnosu na hTAAR1 EC50), značajno više utiče na DAT (Ki= 0,48 µM; odnos selektivnosti = 3 puta u odnosu na hTAAR1 EC50) i takođe ima značajno veći amfifilni vektor (ΔΔGam= − 8,83 kJ mol<-1>) i stoga daje pozitivno DIPL predviđanje.

Uporedni primer 10 manje utiče na hTAAR1 (EC50= 0,184 µM) i više utiče na hERG (IC20= 5,78 µM; odnos selektivnosti = 31 puta u odnosu na hTAAR1 EC50).

Uporedni primer 11 koji manje utiče na hTAAR1 (EC50= 0,203 µM), značajno više utiče na hERG (IC20= 2,59 µM; odnos selektivnosti = 13 puta u odnosu na hTAAR1 EC50), značajno više utiče na DAT (Ki= 2,33 µM; odnos selektivnosti = 12 puta u odnosu na hTAAR1 EC50) i takođe ima značajno veći amfifilni vektor (ΔΔGam= − 6,18 kJ mol<-1>) i stoga daje pozitivno DIPL predviđanje.

Uporedni primer 12 koji manje utiče na hTAAR1 (EC50= 0,212 µM), značajno više utiče na hERG (IC20= 3,21 µM; odnos selektivnosti = 15 puta u odnosu na hTAAR1 EC50), značajno više utiče na DAT (Ki= 1,78 µM; odnos selektivnosti = 8 puta u odnosu na hTAAR1 EC50) i takođe ima značajno veći amfifilni vektor (ΔΔGam= − 6,59 kJ mol<-1>) i stoga daje pozitivno DIPL predviđanje.

Uporedni primer 13 koji značajno manje utiče na hTAAR1 (EC50= 0,405 µM), više utiče na hERG (IC20= 9,14 µM; odnos selektivnosti = 23 puta u odnosu na hTAAR1 EC50), značajno više utiče na DAT (Ki= 1,31 µM; odnos selektivnosti = 3 puta u odnosu na hTAAR1 EC50) i takođe ima značajno veći amfifilni vektor (ΔΔGam= − 6,23 kJ mol<-1>) i stoga daje pozitivno DIPL predviđanje.

Uporedni primer 14 koji značajno manje utiče na hTAAR1 (EC50= 0,447 µM), značajno više utiče na DAT (Ki= 7,32 µM; odnos selektivnosti = 16 puta u odnosu na hTAAR1 EC50) i takođe ima značajno veći amfifilni vektor (ΔΔGam= − 6,96 kJ mol<-1>) i stoga daje pozitivno DIPL predviđanje.

Uporedni primer 15 koji značajno manje utiče na hTAAR1 (EC50= 0,663 µM), značajno više utiče na hERG (IC20= 2,40 µM; odnos selektivnosti = 4 puta u odnosu na hTAAR1 EC50) i takođe ima značajno veći amfifilni vektor (ΔΔGam= − 7,4 kJ mol<-1>) i stoga daje pozitivno DIPL predviđanje.

Uporedni primer 16 koji značajno manje utiče na hTAAR1 (EC50= 0,666 µM), značajno više utiče na hERG (IC20= 3,35 µM; odnos selektivnosti = 5 puta u odnosu na hTAAR1 EC50) i takođe ima značajno veći amfifilni vektor (ΔΔGam= − 8,48 kJ mol<-1>) i stoga daje pozitivno DIPL predviđanje.

Uporedni primer 17 značajno manje utiče na hTAAR1 (EC50= 0,673 µM) i više utiče na DAT (Ki= 10,32 µM; odnos selektivnosti = 15 puta u odnosu na hTAAR1 EC50).

Uporedni primer 18 značajno manje utiče na hTAAR1 (EC50= 0,827 µM) i takođe ima značajno veći amfifilni vektor (ΔΔGam= − 5,82 kJ mol<-1>) i stoga daje granično DIPL predviđanje.

Uporedni primer 19 značajno manje utiče na hTAAR1 (EC50= 1,025 µM) i više utiče na hERG (IC20= 8,32 µM; odnos selektivnosti = 8 puta u odnosu na hTAAR1 EC<50>).

Na kraju, uporedni primer 20 koji značajno manje utiče na hTAAR1 (EC50= 2,48 µM), značajno više utiče na hERG (IC20= 2,49 µM; odnos selektivnosti = 1 puta u odnosu na hTAAR1 EC50) i takođe ima veći amfifilni vektor (ΔΔGam= − 5,37 kJ mol<-1>) i stoga daje granično DIPL predviđanje.

Stoga, ako uzmemo u obzir sve podatke iz Tabele 1, jedinjenje formule I (primer 1) je opšte najpoželjnije jedinjenje za predviđenu primenu kao bezbedno i efikasno terapeutsko sredstvo za lečenje poremećaja povezanih sa TAAR1 kod ljudi, naročito za lečenje hroničnih poremećaja CNS-a, kao što su depresija, poremećaji anksioznosti, bipolarni poremećaj, hiperkinetički poremećaj (ADHD), poremećaji povezani sa stresom, psihotični poremećaji, kao što je šizofrenija, neurološka oboljenja, kao što je Parkinsonova bolest, neurodegenerativni poremećaji, kao što je Alchajmerova bolest, epilepsija, migrena, hipertenzija, zloupotreba supstanci, zavisnost i metabolički poremećaji, kao što su poremećaji u ishrani, dijabetes, dijabetičke komplikacije, gojaznost, dislipidemija, poremećaji potrošnje i asimilacije energije, poremećaji i zastoj homeostaze telesne temperature, poremećaji spavanja i cirkadijalnog ritma, i kardiovaskularni poremećaji. Najpoželjniji poremećaji su šizofrenija, bipolarni poremećaj ili depresija.

Jedinjenje formule I i farmaceutski prihvatljive soli jedinjenja formule I mogu da se koriste kao medikamenti, npr. u obliku farmaceutskih preparata. Ovi farmaceutski preparati se mogu davati oralno, npr. u obliku tableta, obloženih tableta, dražeja, tvrdih i mekih želatinskih kapsula, rastvora, emulzija ili suspenzija. Međutim, primena može da se obavlja i rektalno, npr. u obliku supozitorija ili parenteralno, npr. u obliku injekcionih rastvora.

Jedinjenje formule I može da se obrađuje farmaceutski inertnim, neorganskim ili organskim nosačima za proizvodnju farmaceutskih preparata. Laktoza, kukuruzni skrob ili njihovi derivati, talk, stearinska kiselina ili njene soli i slično mogu se koristiti, na primer, kao nosači za tablete, obložene tablete, dražeje i tvrde želatinske kapsule. Odgovarajući nosači lekovitih supstanci za meke želatinske kapsule su, na primer, biljna ulja, voskovi, masti, polučvrsti i tečni polioli, i slično. Međutim, u zavisnosti od prirode aktivnih supstanci, u slučaju mekih želatinskih kapsula obično nisu potrebni nosači. Pogodni nosači za proizvodnju rastvora i sirupa su, na primer, voda, polioli, glicerol, biljna ulja i slično. Odgovarajući nosači supozitorija su, na primer, prirodna ili čvrsta ulja, voskovi, masti, polučvrsti ili tečni polioli i slično.

Pored toga, farmaceutski preparati mogu da sadrže konzervanse, solubilizatore, stabilizatore, sredstva za kvašenje, emulgatore, zaslađivače, boje, arome, soli za izmenu osmotskog pritiska, pufere, agense za maskiranje ili antioksidanse. Mogu da sadrže i druge terapeutski korisne supstance.

Lekovi koji sadrže jedinjenje formule I ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so i terapeutski inertni nosač takođe su predmet predmetnog pronalaska, kao i postupak za njihovu proizvodnju, koji obuhvata dovođenje jedinjenja formule I i/ili farmaceutski prihvatljivih kiselih adicionih soli i, ako je poželjno, jednu ili više drugih terapeutski vrednih supstanci u galenski oblik primene zajedno sa jednim ili više terapeutski inertnih nosača.

Najpoželjnije indikacije prema predmetnom pronalasku su one koje uključuju poremećaje centralnog nervnog sistema, na primer tretman ili prevenciju depresije, psihoze, šizofrenije i bipolarnih poremećaja.

Doza može da varira u širokim granicama, te se svakako prilagođava individualnim potrebama u svakom pojedinačnom slučaju. U slučaju oralne primene, doza za odrasle može da varira od približno 0,01 mg do približno 1000 mg po danu jedinjenja formule I ili odgovarajuće količine njegove farmaceutski prihvatljive soli. Dnevna doza se može davati u jednoj dozi ili podeljenim dozama i, takođe, gornja granica može da se premaši ako se utvrdi da za to postoje indikacije.

Formulacija tableta (vlažna granulacija)

Proizvodni postupak

1. Mešati stavke 1, 2, 3 i 4 i granulirati sa prečišćenom vodom.

Proizvodni postupak

1. Mešati stavke 1, 2 i 3 u odgovarajućem aparatu za mešanje 30 minuta.

2. Dodati stavke 4 i 5, pa mešati 3 minuta.

3. Napuniti odgovarajuće kapsule.

Claims (22)

1. PATENTNI ZAHTEVI 1. Jedinjenje formule I:

   koje predstavlja 5-etil-4-metil-N-[4-[(2S) morfolin-2-il]fenil]-1H-pirazol-3-karboksamid ili njegovu farmaceutski prihvatljivu kiselu so.
2. 2. Jedinjenje formule I prema patentnom zahtevu 1,

   koje predstavlja 5-etil-4-metil-N-[4-[(2S) morfolin-2-il]fenil]-1H-pirazol-3-karboksamid.
3. 3. Postupak za proizvodnju jedinjenja formule I prema patentnim zahtevima 1 i 2, gde postupak obuhvata a) cepanje N-zaštitne grupe (PG) od jedinjenja formule 3

   na jedinjenje formule I

   gde PG predstavlja -C(O)O-terc-butil (BOC), i, ako je poželjno, pretvaranje dobijenog jedinjenja formule I u njegove farmaceutski prihvatljive kisele soli.
4. 4. Jedinjenje formule I prema patentnim zahtevima 1 i 2 za primenu kao terapeutski aktivna supstanca.
5. 5. Jedinjenje formule I prema patentnom zahtevu 1 za primenu u lečenju depresije, poremećaja anksioznosti, bipolarnog poremećaja, hiperkinetičkog poremećaja (ADHD), poremećaja vezanih za stres, šizofrenije, Parkinsonove bolesti, Alchajmerove bolesti, epilepsije, migrene, hipertenzije, zloupotrebe supstanci, zavisnosti, poremećaja u ishrani, dijabetesa, dijabetičkih komplikacija, gojaznosti, dislipidemije, poremećaja potrošnje energije i asimilacije, poremećaja i zastoja homeostaze telesne temperature, poremećaja spavanja i cirkadijalnog ritma i kardiovaskularnih poremećaja.
6. 6. Jedinjenje formule I prema patentnom zahtevu 2 za primenu u lečenju depresije, poremećaja anksioznosti, bipolarnog poremećaja, hiperkinetičkog poremećaja (ADHD), poremećaja vezanih za stres, šizofrenije, Parkinsonove bolesti, Alchajmerove bolesti, epilepsije, migrene, hipertenzije, zloupotrebe supstanci, zavisnosti, poremećaja u ishrani, dijabetesa, dijabetičkih komplikacija, gojaznosti, dislipidemije, poremećaja potrošnje energije i asimilacije, poremećaja i zastoja homeostaze telesne temperature, poremećaja spavanja i cirkadijalnog ritma i kardiovaskularnih poremećaja.
7. 7. Jedinjenje formule I prema patentnom zahtevu 1 za primenu u lečenju depresije.
8. 8. Jedinjenje formule I prema patentnom zahtevu 2 za primenu u lečenju depresije.
9. 9. Jedinjenje formule I prema patentnom zahtevu 1 za primenu u lečenju bipolarnog poremećaja.
10. 10. Jedinjenje formule I prema patentnom zahtevu 2 za primenu u lečenju bipolarnog poremećaja.
11. 11. Jedinjenje formule I prema patentnom zahtevu 1 za primenu u lečenju šizofrenije.
12. 12. Jedinjenje formule I prema patentnom zahtevu 2 za primenu u lečenju šizofrenije. 4
13. 13. Jedinjenje formule I prema patentnom zahtevu 1 za primenu u lečenju zloupotrebe supstanci.
14. 14. Jedinjenje formule I prema patentnom zahtevu 2 za primenu u lečenju zloupotrebe supstanci.
15. 15. Jedinjenje formule I prema patentnom zahtevu 1 za primenu u lečenju zavisnosti.
16. 16. Jedinjenje formule I prema patentnom zahtevu 2 za primenu u lečenju zavisnosti.
17. 17. Jedinjenje formule I prema patentnom zahtevu 1 za primenu u lečenju poremećaja u ishrani.
18. 18. Jedinjenje formule I prema patentnom zahtevu 2 za primenu u lečenju poremećaja u ishrani.
19. 19. Jedinjenje formule I prema patentnom zahtevu 1 za primenu u lečenju dijabetesa.
20. 20. Jedinjenje formule I prema patentnom zahtevu 2 za primenu u lečenju dijabetesa.
21. 21. Oralni farmaceutski preparat koji sadrži jedinjenje formule I prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što je oralni farmaceutski preparat u obliku izabranom iz grupe koja obuhvata tablete, obložene tablete, dražeje, tvrde i meke želatinske kapsule, rastvore, emulzije i suspenzije.
22. 22. Oralni farmaceutski preparat koji sadrži jedinjenje formule I prema patentnom zahtevu 2, naznačen time što je oralni farmaceutski preparat u obliku izabranom iz grupe koja obuhvata tablete, obložene tablete, dražeje, tvrde i meke želatinske kapsule, rastvore, emulzije i suspenzije. Izdaje i štampa: Zavod za intelektualnu svojinu, Beograd, Kneginje Ljubice 5