RS60826B1

RS60826B1 - Postupci lečenja kancera upotrebom antagonista vezivanja pd-1 ose i tigit inhibitora

Info

Publication number: RS60826B1
Application number: RS20201096A
Authority: RS
Inventors: Jane Grogan; Robert J Johnston; Bryan Irving; Jason Hackney; Xin Yu; Dan Eaton; Kristin Bowles; Laetitia Comps-Agrar
Original assignee: Hoffmann La Roche
Priority date: 2013-07-16
Filing date: 2014-07-16
Publication date: 2020-10-30
Also published as: US20210340253A1; RU2019129525A; RU2016104880A3; US20210332132A1; US10626174B2; AU2014290069B2; MX2021008064A; AU2021202413B2; MY183503A; JP2020073497A; SG11201600310QA; CN121197418A; WO2015009856A3; JP2016525117A; LT3021869T; RU2016104880A; CN105492025A; US20170037127A1; KR20250007687A; PL3021869T3

Description

OPIS

OSNOVA PRONALASKA

Davanje dva različita signala T ćelijama je široko prihvaćen model za aktiviranje mirujućih T limfocita antigen-prezentujućim ćelijama (APC). Lafferty et al., Aust. J. Exp. Biol. Med. ScL 53: 27-42 (1975). Ovaj model nadalje obezbeđuje mogućnost diskriminacije sopstvenog od nesopstvenog, i imunološke tolerancije. Bretscher et al, Science 169: 1042-1049 (1970); Bretscher, P.A., P.N.A.S. USA96: 185-190 (1999); Jenkins et al, J. Exp. Med.

165: 302-319 (1987). Primarni signal, ili antigen specifični signal, prenosi se putem receptora T ćelije (TCR) nakon prepoznavanja peptida stranog antigena prezentovanog u kontekstu glavnog kompleksa histokompatibilnosti (MHC). Drugi ili kostimulatorni signal se dostavlja T ćelijama pomoću kostimulatornih molekula eksprimiranih na antigen-prezentujućim ćelijama (APC), i indukuje T ćelije za pospešivanje klonske ekspanzije, sekrecije citokina i efektorske funkcije. Lenschow et al., Ann. Rev. Immunol. 14:233 (1996). U nedostatku kostimulacije, T ćelije mogu postati otporne na stimulaciju antigenom, što dovodi do tolerogenog odgovora bilo na strane ili endogene antigene.

U modelu sa dva signala, T ćelije primaju i pozitivne kostimulatorne i negativne koinhibitorne signale. Regulacija takvih pozitivnih i negativnih signala je izuzetno važna za dobijanje maksimalnih zaštitnih imunskih odgovora domaćina, uz održavanje imune tolerancije i sprečavanje autoimunosti. Negativni signali su, čini se, potrebni za indukciju tolerancije T ćelija, dok pozitivni signali podstiču aktiviranje T ćelija.

I kostimulatorni i koinhibitorni signali se daju T ćelijama izloženim antigenu, a međusobna povezanost kostimulatornih i koinhibitornih signala je bitna za kontrolu jačine imunskog odgovora. Nadalje, signali koji se daju T ćelijama menjaju se kako se infekcija ili imunološka provokacija odstranjuje, pogoršava ili traje, a te promene snažno utiču na T ćelije koje reaguju, i iznova oblikuju imunski odgovor.

Mehanizam kostimulacije je od terapeutskog značaja, jer se pokazalo da manipulacija kostimulatornim signalima obezbeđuje povećanje ili ukidanje imunskog odgovora zasnovanog na ćeliji. Nedavno je otkriveno da se T ćelijska disfunkcija ili anergija javlja istovremeno sa indukovanom i produženom ekspresijom inhibitornog receptora, polipeptida 1 (PD-1) programirane ćelijske smrti. Kao rezultat toga, terapeutsko ciljanje PD-1 i drugih molekula koji proizvode signale putem interakcija sa PD-1, kao što su ligand 1 programirane ćelijske smrti (PD-L1) i ligand 2 programirane ćelijske smrti (PD-L2), predstavlja područje od velikog značaja.

PD-L1 je prekomerno eksprimiran kod mnogih kancera, i često je povezan sa lošom prognozom (Okazaki T et al., Intern. Immun. 200719(7):813) (Thompson RH et al., Cancer Res 2006, 66(7):3381). Zanimljivo je da većina T limfocita infiltriranih u tumorsko tkivo uglavnom ispoljava PD-1, za razliku od T limfocita u normalnim tkivima i T limfocita u perifernoj krvi, što ukazuje da povećanje PD-1 na tumorski reaktivnim T ćelijama može doprineti oslabljenim antitumorskim imunskim odgovorima (Blood 2009, 114(8): 1537). Do toga može doći zbog iskorišćavanja PD-L1 signalizacije posredovane PD-L1 ekspresionim tumorskim ćelijama koje međusobno deluju sa PD-1 ekspresionim T ćelijama, što dovodi do slabljenja aktivacije T ćelija i evazije imunološkog nadzora (Sharpe et al., Nat Rev 2002) (Keir ME et al., 2008 Annu. Rev. Immunol.26:677). Stoga, inhibicija interakcije PD-L1/PD-1 može poboljšati ubijanje tumora posredovano CD8+T ćelijom.

Inhibicija signalizacije PD-1 ose putem njenih direktnih liganada (npr. PD-L1, PD-L2) predložena je kao sredstvo za jačanje imuniteta T ćelija za lečenje raka (npr., imuniteta tumora). Pored toga, uočena su slična poboljšanja imuniteta T ćelije kada se inhibira vezivanje PD-L1 za veznog partnera B7-1. Nadalje, kombinovanje inhibicije PD-1 signalizacije sa drugim signalnim putevima koji se deregulišu u tumorskim ćelijama može dodatno poboljšati efikasnost lečenja. Inozume et al., Journal of Investigative Dermatology 2013, 133, Suppl. 1, str. S3, otkriva da je zajednička blokada signalnih puteva CD155/TIGIT i PD-1/PD-L1 imala aditivni efekat u indukovanju snažnog antimelanomskog imunskog odgovora in vitro. I dalje postoji potreba za takvom optimalnom terapijom za lečenje, stabilizovanje, sprečavanje i/ili odlaganje razvoja različitih vrsta raka.

KRATAK SAŽETAK PRONALASKA

Predmetni izum opisuje kombinovani tretman koji sadrži anti-PD-L1 antagonističko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment i anti-TIGIT antagonističko antitelo ili njegov fragment.

Ovde se obezbeđuje anti-PD-L1 antagonističko antitelo ili njegov antigen vezujući fragment te anti-TIGIT antagonističko antitelo ili njegov fragment, za upotrebu u postupcima lečenja ili odlaganja progresije raka kod pojedinca, koji obuhvataju davanje pojedincu efikasne količine anti-PD-L1 antagonističkog antitela ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta i anti-TIGIT antagonističkog antitela ili njegovog fragmenta.

Ovde se takođe obezbeđuje anti-PD-L1 antagonističko antitelo ili njegov antigen vezujući fragment te anti-TIGIT antagonističko antitelo ili njegov fragment za upotrebu u postupcima za smanjenje ili inhibiciju recidiva raka ili napredovanja raka kod pojedinca, koji se sastoje od davanja pojedincu efikasne količine anti-PD-L1 antagonističkog antitela ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta te anti-TIGIT antagonističkog antitela ili njegovog fragmenta.

Ovde se takođe obezbeđuje anti-PD-L1 antagonističko antitelo ili njegov antigen vezujući fragment te anti-TIGIT antagonističko antitelo ili njegov fragment za upotrebu u postupcima za lečenje ili odlaganje napredovanja bolesti povezane sa imunskim sistemom kod pojedinca, koji se sastoje od davanja pojedincu efikasne količine anti-PD-L1 antagonističkog antitela ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta te anti-TIGIT antagonističkog antitela ili njegovog fragmenta.

Ovde se takođe obezbeđuje anti-PD-L1 antagonističko antitelo ili njegov antigen vezujući fragment te anti-TIGIT antagonističko antitelo ili njegov fragment za upotrebu u postupcima za smanjenje ili inhibiranje napredovanja bolesti povezane sa imunskim sistemom kod pojedinca, koji se sastoje od davanja pojedincu efikasne količine anti-PD-L1 antagonističkog antitela ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta te anti-TIGIT antagonističkog antitela ili njegovog fragmenta.

U nekim otelotvorenjima, bolest povezana sa imunskim sistemom je vezana za disfunkcionalni poremećaj T ćelija. U nekim otelotvorenjima, T ćelijski disfunkcionalni poremećaj odlikuje se smanjenom reakcijom na antigenu stimulaciju. U nekim otelotvorenjima, T ćelijski disfunkcionalni poremećaj odlikuje se anergijom T ćelija ili smanjenom sposobnošću da luče citokine, razmnožavaju se ili izvršavaju citolitičku aktivnost. U nekim otelotvorenjima, disfunkcionalni poremećaj T ćelija odlikuje se iscrpljenošću T ćelija. U nekim otelotvorenjima, T ćelije su CD4+ i CD8+ T ćelije. U nekim otelotvorenjima, bolest povezana sa imunskim sistemom je odabrana iz grupe koja se sastoji od nerešene akutne infekcije, hronične infekcije i imuniteta tumora.

Ovde se takođe obezbeđuje anti-PD-L1 antagonističko antitelo ili njegov antigen vezujući fragment te anti-TIGIT antagonističko antitelo ili njegov fragment za upotrebu u postupcima za povećanje, pojačavanje ili stimulaciju imunskog odgovora ili funkcije kod pojedinca davanjem pojedincu efikasne količine anti-PD-L1 antagonističkog antitela ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta te anti-TIGIT antagonističkog antitela ili njegovog fragmenta.

Ovde se takođe obezbeđuje anti-PD-L1 antagonističko antitelo ili njegov antigen vezujući fragment te anti-TIGIT antagonističko antitelo ili njegov fragment za upotrebu u postupcima za lečenje ili odlaganje progresije raka kod pojedinca, koji obuhvataju davanje pojedincu efikasne količine anti-PD-L1 antagonističkog antitela ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta te anti-TIGIT antagonističkog antitela ili njegovog fragmenta.

U nekim otelotvorenjima, bolest povezana sa imunskim sistemom je vezana za disfunkcionalni poremećaj T ćelija. U nekim otelotvorenjima, T ćelijski disfunkcionalni poremećaj odlikuje se smanjenom reakcijom na antigensku stimulaciju. U nekim otelotvorenjima, T ćelijski disfunkcionalni poremećaj odlikuje se anergijom T ćelija ili smanjenom sposobnošću da luče citokine, razmnožavaju se ili izvršavaju citolitičku aktivnost. U nekim otelotvorenjima, disfunkcionalni poremećaj T ćelija odlikuje se iscrpljenošću T ćelija. U nekim otelotvorenjima, T ćelije su CD4+ i CD8+ T ćelije. U nekim otelotvorenjima, bolest povezana sa imunskim sistemom je odabrana iz grupe koja se sastoji od nerešene akutne infekcije, hronične infekcije i imuniteta tumora.

Predmetno otkriće takođe opisuje kombinovani tretman koji se sastoji od sredstva koje smanjuje ili inhibira ekspresiju i/ili aktivnost TIGIT, i sredstva koje smanjuje ili inhibira jedan ili više dodatnih imunskih koinhibitornih receptora.

Ovde se otkrivaju postupci za povećanje, pojačavanje ili stimulaciju imunskog odgovora ili funkcije kod pojedinca davanjem pojedincu efikasne količine agensa koji smanjuje ili inhibira ekspresiju i/ili aktivnost TIGIT, i agensa koji smanjuje ili inhibira jedan ili više dodatnih imunskih koinhibitornih receptora.

U nekim aspektima, jedan ili više dodatnih imunskih koinhibitornih receptora je izabran iz grupe koja se sastoji od PD-1, CTLA-4, LAG3, TIM3, BTLA i VISTA. U nekim otelotvorenjima, jedan ili više dodatnih imunskih koinhibitornih receptora je izabran iz grupe PD-1, CTLA-4, LAG3 i TIM3.

Otkriće takođe opisuje kombinovani tretman koji se sastoji od sredstva koje smanjuje ili inhibira ekspresiju i/ili aktivnost TIGIT, i sredstva koje povećava ili aktivira jedan ili više dodatnih imunskih kostimulatornih receptora.

Ovde se otkrivaju postupci za povećanje, pojačavanje ili stimulaciju imunskog odgovora ili funkcije kod pojedinca davanjem pojedincu efikasne količine agensa koji smanjuje ili inhibira ekspresiju i/ili aktivnost TIGIT, i agensa koji povećava ili aktivira jedan ili više dodatnih imunskih kostimulatornih receptora.

U nekim aspektima, jedan ili više dodatnih imunskih kostimulatornih receptora izabrani su iz grupe koja se sastoji od CD226, OX-40, CD28, CD27, CD137, HVEM i GITR. U nekim aspektima, jedan ili više dodatnih imunoloških kostimulatornih receptora izabrani su iz grupe CD226, OX-40, CD27, CD137, HVEM i GITR. U nekim aspektima, jedan ili više dodatnih imunoloških kostimulatornih receptora izabrani su iz grupe koja se sastoji od OX-40 i CD27.

U nekim aspektima, bilo koji od gorenavedenih postupaka nadalje podrazumeva primenu barem jednog hemoterapijskog agensa.

U nekim otelotvorenjima, pojedinac kod bilo kog od gore navedenih postupaka ima rak. U nekim otelotvorenjima, pojedinac u bilo kom od gorenavedenih postupaka je čovek.

U nekim aspektima, CD4 i/ili CD8 T ćelije kod pojedinca imaju povećano ili pojačano prajmovanje, aktivaciju, proliferaciju, oslobađanje citokina i/ili citolitičku aktivnost u odnosu na period pre primene date kombinacije.

U nekim aspektima, broj CD4 i/ili CD8 T ćelija je povećan u odnosu na period pre davanja date kombinacije. U nekim otelotvorenjima, broj aktiviranih CD4 i/ili CD8 T ćelija je povećan u odnosu na period pre davanja date kombinacije. U nekim aspektima, aktivirane CD4 i/ili CD8 T ćelije se odlikuju time što γ-IFN<+>proizvode CD4 i/ili CD8 T ćelije, i/ili pojačanom citolitičkom aktivnošću u odnosu na period pre primene date kombinacije. U nekim aspektima, CD4 i/ili CD8 T ćelije pokazuju pojačano otpuštanje citokina izabranih iz grupe koja se sastoji od IFN-γ, TNF-α, i interleukina.

U nekim aspektima, CD4 i/ili CD8 T ćelija je T ćelija efektorske memorije. U nekim aspektima, CD4 i/ili CD8 T ćelija efektorske memorije odlikuje se time što γ-IFN<+>proizvode CD4 i/ili CD8 T ćelije, i/ili pojačanom citolitičkom aktivnošću. U nekim aspektima, CD4 i/ili CD8 T ćelija efektorske memorije odlikuje se time što ima ekspresiju CD44<visok>CD62L<nizak>.

U nekim aspektima, rak u bilo kojm od gorenavedenih postupaka ima povišen nivo infiltracije T ćelija.

U nekim aspektima, anti-TIGIT antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži najmanje jedan HVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu od aminokiselinskih

U nekim aspektima, anti-TIGIT antitelo ili njegov antigen vezujući fragment sadrži laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u

U nekim aspektima, anti-TIGIT antitelo ili njegov antigen vezujući fragment sadrži teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u

a teški lanac antitela sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u

(SEQ ID NO: 16).

U nekim aspektima, anti-TIGIT antitelo ili njegov antigen vezujući fragment, pri čemu je antitelo izabrano od humanizovanog antitela, himernog antitela, bispecifičnog antitela, antitela heterokonjugata i imunotoksina.

U nekim aspektima, anti-TIGIT antitelo ili njegov antigen vezujući fragment sadrži najmanje jedan HVR koji je najmanje 90% identičan sa HVR-om navedenom u bilo kojoj od

U nekim aspektima, anti-TIGIT antitelo ili njegov fragment sadrži laki i/ili teški lanac koji sadrži aminokiselinske sekvence najmanje 90% identične sa aminokiselinskim sekvencama navedenim u

ID NO: 15), odnosno

(SEQ ID NO: 16).

U nekim aspektima, antagonist vezivanja PD-1 ose je antagonist vezivanja PD-L1. U nekim aspektima, antagonist vezivanja PD-L1 inhibira vezivanje PD-L1 za PD-1. U nekim aspektima, antagonist vezivanja PD-L1 inhibira vezivanje PD-L1 za B7-1. U nekim aspektima, antagonist vezivanja PD-L1 inhibira vezivanje PD-L1 i za PD-1 i za B7-1. U nekim otelotvorenjima, antagonist vezivanja PD-L1 je antitelo.

U nekim otelotvorenjima, antagonist vezivanja PD-L1 je izabran iz grupe koja se sastoji od: YW243.55.S70, MPDL3280A, MDX-1105 i MEDI 4736.

U nekim otelotvorenjima, anti-PD-L1 antitelo sadrži teški lanac koji sadrži HVR-H1 sekvencu sekvencu

ID NO: 18), i HVR-H3 sekvencu (SEQ ID NO: 19); i laki lanac koji sadrži HVR-L1 sekvencu sekvencu

NO:21), i HVR-L3 sekvencu

U nekim otelotvorenjima, anti-PD-L1 antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu

(SEQ ID NO: 23) i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu

24).

U nekim otelotvorenjima, kancer koji se leči izabran je iz grupe koja se sastoji od nemikrocelularnog kancera pluća, mikrocelularnog kancera pluća, kancera bubrežnih ćelija, kolorektalnog kancera, raka jajnika, raka dojke, raka gušterače, karcinoma želuca, raka mokraćne bešike, raka jednjaka, mezotelioma, melanoma, raka glave i vrata, raka štitne žlezde, sarkoma, raka prostate, glioblastoma, raka grlića materice, karcinoma timusa, leukemije, limfoma, mijeloma, fungoidne mikoze, raka Merkelove ćelije i drugih hematoloških maligniteta.

U nekim otelotvorenjima, anti-TIGIT antagonističko antitelo ili njegov fragment se daje kontinuirano. U nekim otelotvorenjima, anti-TIGIT antagonističko antitelo ili njegov fragment se daje povremeno. U nekim otelotvorenjima, anti-TIGIT antagonističko antitelo ili njegov fragment se daje pre anti-PD-L1 antagonističkog antitela ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta. U nekim otelotvorenjima, anti-TIGIT antagonističko antitelo ili njegov fragment se daje istovremeno sa anti-PD-L1 antagonističkim antitelom ili njegovim antigen vezujućim fragmentom. U nekim otelotvorenjima, anti-TIGIT antagonističko antitelo ili njegov fragment se daje posle anti-PD-L1 antagonističkog antitela ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta.

Ovde se obezbeđuju i kompleti koji sadrže anti-PD-L1 antagonističko antitelo ili njegov antigen vezujući fragment i anti-TIGIT antagonističko antitelo ili njegov fragment za lečenje ili odlaganje napredovanja raka kod pojedinca.

Ovde se obezbeđuju i kompleti koji sadrže anti-PD-L1 antagonističko antitelo ili njegov antigen vezujući fragment i anti-TIGIT antagonističko antitelo ili njegov fragment, i uložak u pakovanju koji sadrži uputstvo za upotrebu anti-PD-L1 antagonističkog antitela ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta i anti-TIGIT antagonističkog antitela ili njegovog fragmenta za lečenje ili odlaganje napredovanja raka kod pojedinca.

Ovde se obezbeđuju i kompleti koji sadrže anti-TIGIT antagonističko antitelo ili njegov fragment i uložak u pakovanju koji sadrži uputstvo za upotrebu anti-TIGIT antagonističkog antitela ili njegovog fragmenta u kombinaciji sa anti-PD-L1 antagonističkim antitelom ili njegovim antigen vezujućim fragmentom za lečenje ili odlaganje progresije raka kod pojedinca.

Ovde se obezbeđuju i kompleti koji sadrže anti-PD-L1 antagonističko antitelo ili njegov antigen vezujući fragment i uložak u pakovanju koji sadrži uputstvo za upotrebu anti-PD-L1 antagonističkog antitela ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta u kombinaciji sa anti-TIGIT antagonističkim antitelom ili njegovim fragmentom za poboljšanje imunološke funkcije pojedinca koji ima rak.

Ovde se obezbeđuju i kompleti koji sadrže anti-PD-L1 antagonističko antitelo ili njegov antigen vezujući fragment i anti-TIGIT antagonističko antitelo ili njegov fragment, i uložak u pakovanju koji sadrži uputstvo za upotrebu anti-PD-L1 antagonističkog antitela ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta i agensa koji smanjuje ili inhibira ekspresiju i/ili aktivnost TIGIT radi poboljšanja imunološke funkcije pojedinca koji ima rak.

Ovde se obezbeđuju i kompleti koji sadrže anti-TIGIT antagonističko antitelo ili njegov antigen vezujući fragment i/ili aktivnost, i uložak u pakovanju koji sadrži uputstvo za upotrebu anti-TIGIT antagonističkog antitela ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta u kombinaciji sa anti-PD-L1 antagonističkim antitelom ili njegovim antigen vezujućim fragmentom za poboljšanje imunološke funkcije pojedinca koja ima rak.

Ovde se takođe objavljuju kompleti koji sadrže anti-PD-L1 antagonističko antitelo ili

1

njegov antigen vezujući fragment i uložak u pakovanju koji sadrži uputstvo za upotrebu anti-PD-L1 antagonističkog antitela ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta u kombinaciji sa agensom koje moduliše ekspresiju i/ili aktivnost CD226 u svrhu lečenja ili odlaganja progresije raka kod pojedinca.

Ovde se takođe objavljuju kompleti koji sadrže anti-PD-L1 antagonističko antitelo ili njegov antigen vezujući fragment i agens koji moduliše ekspresiju i/ili aktivnost CD226, i uložak u pakovanju koji sadrži uputstvo za upotrebu anti-PD-L1 antagonističkog antitela ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta i agensa koji moduliše ekspresiju i/ili aktivnost CD226 u svrhu lečenja ili odlaganja progresije raka kod pojedinca.

Ovde se takođe objavljuju kompleti koji sadrže agens koji moduliše ekspresiju i/ili aktivnost CD226 i uložak u pakovanju koji sadrži uputstvo za upotrebu agensa koji moduliše ekspresiju i/ili aktivnost CD226 u kombinaciji sa anti-PD-L1 antagonističkim antitelom ili njegovim antigen vezujućim fragmentom u svrhu lečenja ili odlaganja progresije raka kod pojedinca.

Ovde se takođe objavljuju kompleti koji sadrže anti-PD-L1 antagonističko antitelo ili njegov antigen vezujući fragment i uložak u pakovanju koji sadrži uputstvo za upotrebu anti-PD-L1 antagonističkog antitela ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta u kombinaciji sa agensom koji moduliše ekspresiju i/ili aktivnost CD226 u svrhu poboljšanja imunološke funkcije pojedinca koji ima rak.

Ovde se takođe objavljuju kompleti koji sadrže anti-PD-L1 antagonističko antitelo ili njegov antigen vezujući fragment i agens koji moduliše ekspresiju i/ili aktivnost CD226, i uložak u pakovanju koji sadrži uputstvo za upotrebu anti-PD-L1 antagonističkog antitela ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta i agensa koji moduliše ekspresiju i/ili aktivnost CD226 u svrhu poboljšanja imunološke funkcije pojedinca koja ima rak.

Ovde se takođe objavljuju kompleti koji sadrže agens koji moduliše ekspresiju i/ili aktivnost CD226 i uložak u pakovanju koji sadrži uputstvo za upotrebu agensa koji moduliše ekspresiju i/ili aktivnost CD226 u kombinaciji sa anti-PD-L1 antagonističkim antitelom ili njegovim antigen vezujućim fragmentom u svrhu poboljšanja imunološke funkcije pojedinca koji ima rak.

U određenim aspektima, ovo otkriće obezbeđuje postupak za lečenje ili odlaganje progresije raka kod pojedinca, koji se sastoji od davanja pojedincu efikasne količine anti-PD-L1 antagonističkog antitela ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta i anti-TIGIT antagonističkog antitela ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta. U drugim aspektima, ovo otkriće obezbeđuje upotrebu efikasne količine anti-PD-L1 antagonističkog antitela ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta u proizvodnji medikamenta za lečenje ili odlaganje progresije raka kod pojedinca, pri čemu se anti-PD-L1 antagonističko antitelo ili njegov antigen vezujući fragment koristi u kombinaciji sa anti-TIGIT antagonističkim antitelom ili njegovim antigen vezujućim fragmentom. U drugim aspektima, ovo otkriće obezbeđuje upotrebu efikasne količine anti-TIGIT antagonističkog antitela ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta u proizvodnji medikamenta za lečenje ili odlaganje progresije raka kod pojedinca, pri čemu se anti-TIGIT antagonističko antitelo ili njegov antigen vezujući fragment koristi u kombinaciji sa anti-PD-L1 antagonističkim antitelom ili njegovim antigen vezujućim fragmentom. U drugim aspektima, ovo otkriće obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži anti-PD-L1 antagonističko antitelo ili njegov antigen vezujući fragment za upotrebu u lečenju ili odlaganju progresije raka u kombinaciji sa anti-TIGIT antagonističkim antitelom ili njegovim antigen vezujućim fragmentom. U drugim aspektima, ovo otkriće obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži anti-TIGIT antagonističko antitelo ili njegov antigen vezujući fragment za upotrebu u lečenju ili odlaganju progresije raka u kombinaciji sa anti-PD-L1 antagonističkim antitelom ili njegovim antigen vezujućim fragmentom.

U drugim aspektima, ovo otkriće obezbeđuje postupak za smanjenje ili inhibiciju recidiva raka ili napredovanja raka kod pojedinca, koja se sastoji od davanja pojedincu efikasne količine anti-PD-L1 antagonističkog antitela ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta i anti-TIGIT antagonističkog antitela ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta. U drugim aspektima, ovo otkriće obezbeđuje upotrebu efikasne količine anti-PD-L1 antagonističkog antitela ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta u proizvodnji leka za smanjenje ili inhibiranje recidiva raka ili napredovanja raka kod pojedinca, pri čemu se anti-PD-L1 antagonističko antitelo ili njegov antigen vezujući fragment koristi u kombinaciji sa anti-TIGIT antagonističkim antitelom ili njegovim antigen vezujućim fragmentom. U drugim aspektima, ovo otkriće obezbeđuje upotrebu efikasne količine anti-TIGIT antagonističkog antitela ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta u proizvodnji leka za smanjenje ili inhibiciju recidiva raka ili napredovanja raka kod pojedinca, pri čemu se anti-TIGIT antagonističko antitelo ili njegov antigen vezujući fragment koristi u kombinaciji sa anti-PD-L1 antagonističkim antitelom ili njegovim antigen vezujućim fragmentom. U drugim aspektima, ovo otkriće obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži anti-PD-L1 antagonističko antitelo ili njegov antigen vezujući fragment za upotrebu u svrhu smanjenja ili inhibicije relapsa ili progresije raka, u kombinaciji sa anti-TIGIT antagonističkim antitelom ili njegovim antigen vezujućim fragmentom. U drugim aspektima, ovo otkriće obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži anti-TIGIT antagonističko antitelo ili njegov antigen vezujući fragment za upotrebu u svrhu smanjenja ili inhibicije recidiva raka ili napredovanja raka, u kombinaciji sa anti-PD-L1 antagonističkim antitelom ili njegovim antigen vezujućim fragmentom.

U drugim aspektima, ovo otkriće obezbeđuje postupak za lečenje ili odlaganje progresije bolesti povezano sa imunskim sistemom kod pojedinca, koji se sastoji od davanja pojedincu efikasne količine anti-PD-L1 antagonističkog antitela ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta i anti-TIGIT antagonističkog antitela ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta. U drugim aspektima, ovo otkriće obezbeđuje upotrebu efikasne količine anti-PD-L1 antagonističkog antitela ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta u proizvodnji medikamenta za lečenje ili odlaganje progresije bolesti povezano sa imunskim sistemom, pri čemu se anti-PD-L1 antagonističko antitelo ili njegov antigen vezujući fragment koristi u kombinaciji sa anti-TIGIT antagonističkim antitelom ili njegovim antigen vezujućim fragmentom. U drugim aspektima, ovo otkriće obezbeđuje upotrebu efikasne količine anti-TIGIT antagonističkog antitela ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta u proizvodnji medikamenta za lečenje ili odlaganje progresije bolesti povezano sa imunskim sistemom, pri čemu se anti-TIGIT antagonističko antitelo ili njegov antigen vezujući fragment koristi u kombinaciji sa anti-PD-L1 antagonističkim antitelom ili njegovim antigen vezujućim fragmentom. U drugim aspektima, ovo otkriće obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži anti-PD-L1 antagonističko antitelo ili njegov antigen vezujući fragment za upotrebu u lečenju ili odlaganju progresije bolesti povezane sa imunskim sistemom u kombinaciji sa anti-TIGIT antagonističkim antitelom ili njegovim antigen vezujućim fragmentom. U drugim aspektima, ovo otkriće obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži anti-TIGIT antagonističko antitelo ili njegov antigen vezujući fragment, za upotrebu u lečenju ili odlaganju progresije bolesti povezane sa imunskim sistemom u kombinaciji sa anti-PD-L1 antagonističkim antitelom ili njegovim antigen vezujućim fragmentom.

U drugim aspektima, ovo otkriće obezbeđuje kombinaciju koja sadrži efikasnu količinu anti-PD-L1 antagonističkog antitela ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta i anti-TIGIT antagonističkog antitela ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta.

U drugim aspektima, ovo otkriće obezbeđuje postupak za smanjenje ili inhibiciju progresije bolesti povezane sa imunskim sistemom kod pojedinca, koji se sastoji od davanja pojedincu efikasne količine anti-PD-L1 antagonističkog antitela ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta i anti-TIGIT antagonističkog antitela ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta. U drugim aspektima, ovo otkriće obezbeđuje upotrebu efikasne količine anti-PD-

1

L1 antagonističkog antitela ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta u proizvodnji leka za smanjenje ili inhibiciju napredovanja bolesti povezane sa imunskim sistemom kod pojedinca, pri čemu se anti-PD-L1 antagonističko antitelo ili njegov antigen vezujući fragment koristi u kombinaciji sa anti-TIGIT antagonističkim antitelom ili njegovim antigen vezujućim fragmentom. U drugim aspektima, ovo otkriće obezbeđuje upotrebu efikasne količine anti-TIGIT antagonističkog antitela ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta u proizvodnji leka za smanjenje ili inhibiciju progresije bolesti povezane sa imunskim sistemom, pri čemu se anti-TIGIT antagonističko antitelo ili njegov antigen vezujući fragment koristi u kombinaciji sa anti-PD-L1 antagonističkim antitelom ili njegovim antigen vezujućim fragmentom. U drugim aspektima, ovo otkriće obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži anti-PD-L1 antagonističko antitelo ili njegov antigen vezujući fragment za upotrebu u smanjenju ili inhibiciji napredovanja bolesti povezanih sa imunskim sistemom u kombinaciji sa anti-TIGIT antagonističkim antitelom ili njegovim antigen vezujućim fragmentom. U drugim aspektima, ovo otkriće obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži anti-TIGIT antagonističko antitelo ili njegov antigen vezujući fragment za upotrebu u smanjenju ili inhibiciji napredovanja bolesti povezanih sa imunskim sistemom u kombinaciji sa anti-PD-L1 antagonističkim antitelom ili njegovim antigen vezujućim fragmentom.

U određenim otelotvorenjima koja se mogu kombinovati sa bilo kojim od prethodnih otelotvorenja, bolest povezana sa imunskim sistemom je vezana za disfunkcionalni poremećaj T ćelija. U određenim otelotvorenjima koja se mogu kombinovati sa bilo kojim od prethodnih otelotvorenja, disfunkcionalni poremećaj T ćelija odlikuje se smanjenom reakcijom na antigenu stimulaciju. U određenim otelotvorenjima koja se mogu kombinovati sa bilo kojim od prethodnih otelotvorenja, disfunkcionalni poremećaj T ćelija odlikuje se T ćelijskom anergijom ili smanjenom sposobnošću da luče citokine, razmnožavaju se ili izvršavaju citolitičku aktivnost. U određenim otelotvorenjima koja se mogu kombinovati sa bilo kojim od prethodnih otelotvorenja, disfunkcionalni poremećaj T ćelija odlikuje se iscrpljenošću T ćelija. U određenim otelotvorenjima koja se mogu kombinovati sa bilo kojim od prethodnih otelotvorenja, T ćelije su CD4+ i CD8+ T ćelije. U nekim otelotvorenjima koja se mogu kombinovati sa bilo kojim od prethodnih otelotvorenja, bolest povezana sa imunskim sistemom je izabrana iz grupe koja se sastoji od nerešene akutne infekcije, hronične infekcije i imuniteta tumora.

U drugim aspektima, ovo otkriće obezbeđuje postupak za povećanje, pojačavanje ili stimulisanje imunskog odgovora ili funkcije kod pojedinca, koji se sastoji od davanja pojedincu efikasne količine anti-PD-L1 antagonističkog antitela ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta i anti-TIGIT antagonističkog antitela ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta. U drugim aspektima, ovo otkriće obezbeđuje upotrebu efikasne količine anti-PD-L1 antagonističkog antitela ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta u proizvodnji leka za pojačavanje ili stimulaciju imunskog odgovora ili funkcije kod pojedinca, pri čemu se anti-PD-L1 antagonističko antitelo ili njegov antigen vezujući fragment koristi u kombinaciji sa anti-TIGIT antagonističkim antitelom ili njegovim antigen vezujućim fragmentom. U drugim aspektima, ovo otkriće obezbeđuje upotrebu efikasne količine anti-TIGIT antagonističkog antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta u proizvodnji leka za povećanje ili stimulisanje imunskog odgovora ili funkcije kod pojedinca, pri čemu se anti-TIGIT antagonističko antitelo ili njegov antigen vezujući fragment koristi u kombinaciji sa anti-PD-L1 antagonističkim antitelom ili njegovim antigen vezujućim fragmentom. U drugim aspektima, ovo otkriće obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži anti-PD-L1 antagonističko antitelo ili njegov antigen vezujući fragment, za upotrebu u svrhu poboljšanja ili stimulisanja imunskog odgovora ili funkcije u kombinaciji sa anti-TIGIT antagonističkim antitelom ili njegovim antigen vezujućim fragmentom. U drugim aspektima, ovo otkriće obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži anti-TIGIT antagonističko antitelo ili njegov antigen vezujući fragment za upotrebu u pojačavanju ili stimulaciji imunskog odgovora ili funkcije u kombinaciji sa anti-PD-L1 antagonističkim antitelom ili njegovim antigen vezujućim fragmentom. U drugim aspektima, ovo otkriće obezbeđuje kombinaciju koja sadrži efikasnu količinu anti-PD-L1 antagonističkog antitela ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta i anti-TIGIT antagonističkog antitela ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta.

U drugim aspektima, ovo otkriće obezbeđuje komplet koji sadrži anti-PD-L1 antagonističko antitelo ili njegov antigen vezujući fragment i uložak u pakovanju koji sadrži uputstvo za upotrebu anti-PD-L1 antagonističkog antitela ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta u kombinaciji sa anti-TIGIT antagonističkim antitelom ili njegovim antigen vezujućim fragmentom, za lečenje ili odlaganje progresije raka kod pojedinca.

U drugim aspektima, ovo otkriće obezbeđuje komplet koji sadrži anti-PD-L1 antagonističko antitelo ili njegov antigen vezujući fragment i anti-TIGIT antagonističko antitelo ili njegov antigen vezujući fragment, i uložak u pakovanju koji sadrži uputstvo za upotrebu anti-PD-L1 antagonističkog antitela ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta i anti-TIGIT antagonističkog antitela ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta u lečenju ili odlaganju napredovanja raka kod pojedinca.

U drugim aspektima, ovo otkriće obezbeđuje komplet koji sadrži anti-TIGIT

1

antagonističko antitelo ili njegov antigen vezujući fragment i uložak u pakovanju koji sadrži uputstvo za upotrebu anti-TIGIT antagonističkog antitela ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta u kombinaciji sa anti-PD-L1 antagonističkim antitelom ili njegovim antigen vezujućim fragmentom za lečenje ili odlaganje progresije raka kod pojedinca.

U drugim aspektima, ovo otkriće obezbeđuje komplet koji sadrži anti-PD-L1 antagonističko antitelo ili njegov antigen vezujući fragment i uložak u pakovanju koji sadrži uputstvo za upotrebu anti-PD-L1 antagonističkog antitela ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta u kombinaciji sa anti-TIGIT antagonističkim antitelom ili njegovim antigen vezujućim fragmentom za poboljšanje imunološke funkcije osobe koja ima rak.

U drugim aspektima, ovo otkriće obezbeđuje komplet koji sadrži anti-PD-L1 antagonističko antitelo ili njegov antigen vezujući fragment i anti-TIGIT antagonističko antitelo ili njegov antigen vezujući fragment i uložak u pakovanju koji sadrži uputstvo za upotrebu anti-PD-L1 antagonističkog antitela ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta i anti-TIGIT antagonističkog antitela ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta za poboljšanje imunološke funkcije pojedinca obolelog od raka.

U drugim aspektima, ovo otkriće obezbeđuje komplet koji sadrži anti-TIGIT antagonističko antitelo ili njegov antigen vezujući fragment i uložak u pakovanju koji sadrži uputstvo za upotrebu anti-TIGIT antagonističkog antitela ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta u kombinaciji sa anti-PD-L1 antagonističkim antitelom ili njegovim antigen vezujućim fragmentom u svrhu poboljšanja imunološke funkcije pojedinca koja ima rak.

U određenim otelotvorenjima koja se mogu kombinovati sa bilo kojim od prethodnih otelotvorenja, antagonist vezivanja PD-1 ose je anti-PD-L1 antitelo. U određenim otelotvorenjima koja se mogu kombinovati sa bilo kojim od prethodnih otelotvorenja, anti-PD-L1 antitelo je izabrano iz grupe koja se sastoji od YW243.55.S70, MPDL3280A, MDX-1105 i MEDI4736. U određenim otelotvorenjima koja se mogu kombinovati sa bilo kojim od prethodnih otelotvorenja, anti-PD-L1 antitelo sadrži teški lanac koji sadrži HVR-H1 sekvencu (SEQ ID NO: 17), HVR-H2 sekvencu

(SEQ ID NO: 18), i HVR-H3 sekvencu (SEQ ID NO: 19); i laki lanac koji sadrži HVR-L1 sekvencu (SEQ ID NO:20), HVR-L2 sekvencu

(SEQ ID NO:21), i HVR-L3 sekvencu (SEQ ID NO:22). U određenim otelotvorenjima koja se mogu kombinovati sa bilo kojim od prethodnih otelotvorenja, anti-PD-L1 antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu

1

(SEQ ID NO:23),

(SEQ ID NO:41), i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu

NO:24).

U drugim aspektima, ovo otkriće obezbeđuje komplet koji sadrži anti-TIGIT antagonističko antitelo ili njegov antigen vezujući fragment i uložak u pakovanju koji sadrži uputstvo za upotrebu anti-TIGIT antagonističkog antitela ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta u kombinaciji sa agensom koji smanjuje ili inhibira jedan ili više imunskih koinhibitornih receptora u svrhu lečenja ili odlaganja progresije raka kod pojedinca. U drugim aspektima, ovo otkriće obezbeđuje komplet koji sadrži anti-TIGIT antagonističko antitelo ili njegov antigen vezujući fragment i agens koji smanjuje ili inhibira jedan ili više dodatnih imunskih koinhibitornih receptora i uložak u pakovanju koji sadrži uputstvo za upotrebu anti-TIGIT antagonističkog antitela ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta i agensa koji smanjuje ili inhibira jedan ili više dodatnih imunskih koinhibitornih receptora, u svrhu lečenja ili odlaganja napredovanja raka kod pojedinca. U drugim aspektima, ovo otkriće obezbeđuje komplet koji sadrži agens koji smanjuje ili inhibira jedan ili više dodatnih imunskih koinhibitornih receptora i uložak u pakovanju koji sadrži uputstvo za upotrebu agensa koji smanjuje ili inhibira jedan ili više dodatnih imunskih koinhibitornih receptora u kombinaciji sa anti-TIGIT antagonističkim antitelom ili njegovim antigen vezujućim fragmentom, u svrhu lečenja ili odlaganja progresije raka kod pojedinca. U drugim aspektima, ovo otkriće obezbeđuje komplet koji sadrži anti-PD-L1 antagonističko antitelo ili njegov antigen vezujući fragment i uložak u pakovanju koji sadrži uputstvo za upotrebu anti-PD-L1 antagonističkog antitela ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta u kombinaciji sa agensom koji smanjuje ili inhibira jedan ili više dodatnih imunskih koinhibitornih receptora u svrhu poboljšanja imunološke funkcije pojedinca koji ima rak. U drugim aspektima, ovo otkriće obezbeđuje komplet koji sadrži anti-TIGIT antagonističko antitelo ili njegov antigen vezujući fragment i agens koji smanjuje ili inhibira jedan ili više dodatnih imunskih

1

koinhibitornih receptora i uložak u pakovanju koji sadrži uputstvo za upotrebu anti-TIGIT antagonističkog antitela ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta i agensa koji smanjuje ili inhibira jedan ili više dodatnih imunskih koinhibitornih receptora u svrhu poboljšanja imunološke funkcije pojedinca koji ima rak. U drugim aspektima, ovo otkriće obezbeđuje komplet koji sadrži agens koji smanjuje ili inhibira jedan ili više dodatnih imunskih koinhibitornih receptora i uložak u pakovanju koji sadrži uputstvo za upotrebu agensa koji smanjuje ili inhibira jedan ili više dodatnih imunskih koinhibitornih receptora u kombinaciji sa anti-TIGIT antagonističkim antitelom ili njegovim antigen vezujućim fragmentom u svrhu poboljšanja imunološke funkcije pojedinca koji ima rak. U određenim aspektima koji se mogu kombinovati sa bilo kojim od prethodnih otelotvorenja, jedan ili više dodatnih imunskih koinhibitornih receptora je odabran iz grupe koja se sastoji od PD-1, CTLA-4, LAG3, TIM3, BTLA, VISTA, B7H4 i CD96. U određenim otelotvorenjima koja se mogu kombinovati sa bilo kojim od prethodnih otelotvorenja, jedan ili više dodatnih imunskih koinhibitornih receptora je odabran iz grupe koja se sastoji od PD-1, CTLA-4, LAG3 i TIM3.

U drugim aspektima, ovo otkriće obezbeđuje komplet koji sadrži anti-TIGIT antagonističko antitelo ili njegov antigen vezujući fragment i uložak u pakovanju koji sadrži uputstvo za upotrebu anti-TIGIT antagonističkog antitela ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta u kombinaciji sa agensom koji povećava ili aktivira jedan ili više dodatnih imunskih kostimulatornih receptora, u svrhu lečenja ili odlaganja progresije raka kod pojedinca. U drugim aspektima, ovo otkriće obezbeđuje komplet koji sadrži anti-TIGIT antagonističko antitelo ili njegov antigen vezujući fragment i agens koji povećava ili aktivira jedan ili više dodatnih imunskih kostimulatornih receptora i uložak u pakovanju koji sadrži uputstvo za upotrebu anti-TIGIT antagonističkog antitela ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta i agensa koji povećava ili aktivira jedan ili više dodatnih imunskih kostimulatornih receptora, u svrhu lečenja ili odlaganja napredovanja raka kod pojedinca. U drugim aspektima, ovo otkriće obezbeđuje komplet koji sadrži agens koji povećava ili aktivira jedan ili više dodatnih imunskih kostimulatornih receptora i uložak u pakovanju koji sadrži uputstvo za upotrebu agensa koji povećava ili aktivira jedan ili više dodatnih imunskih kostimulatornih receptora u kombinaciji sa anti-TIGIT antagonističkim antitelom ili njegovim antigen vezujućim fragmentom, u svrhu lečenja ili odlaganja progresije raka kod pojedinca. U drugim aspektima, ovo otkriće obezbeđuje komplet koji sadrži anti-TIGIT antagonističko antitelo ili njegov antigen vezujući fragment i uložak u pakovanju koji sadrži uputstvo za upotrebu anti-TIGIT antagonističkog antitela ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta u kombinaciji sa agensom koji povećava ili aktivira jedan ili više dodatnih

1

imunskih kostimulatornih receptora, u svrhu poboljšanja imunološke funkcije pojedinca koji ima rak. U drugim aspektima, ovo otkriće obezbeđuje komplet koji sadrži anti-TIGIT antagonističko antitelo ili njegov antigen vezujući fragment i agens koji povećava ili aktivira jedan ili više dodatnih imunskih kostimulatornih receptora i uložak u pakovanju koji sadrži uputstvo za upotrebu anti-TIGIT antagonističkog antitela ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta i agensa koji povećava ili aktivira jedan ili više dodatnih imunskih kostimulatornih receptora, u svrhu poboljšanja imunološke funkcije pojedinca koji ima rak. U drugim aspektima, ovo otkriće obezbeđuje komplet koji sadrži agens koji povećava ili aktivira jedan ili više dodatnih imunskih kostimulatornih receptora i uložak u pakovanju koji sadrži uputstvo za upotrebu agensa koji povećava ili aktivira jedan ili više dodatnih imunskih kostimulatornih receptora u kombinaciji sa anti-TIGIT antagonističkim antitelom ili njegovim antigen vezujućim fragmentom, u svrhu poboljšanja imunološke funkcije pojedinca koji ima rak. U određenim aspektima koji se mogu kombinovati sa bilo kojim od prethodnih aspekata, jedan ili više dodatnih imunskih kostimulatornih receptora bira se iz grupe koja se sastoji od CD226, OX-40, CD28, CD27, CD137, HVEM, GITR, MICA, ICOS, NKG2D i 2B4. U određenim aspektima koji se mogu kombinovati sa bilo kojim od prethodnih aspekata, jedan ili više dodatnih imunskih kostimulatornih receptora bira se iz grupe koja se sastoji od CD226, OX-40, CD27, CD137, HVEM i GITR. U određenim aspektima koji se mogu kombinovati sa bilo kojim od prethodnih aspekata, jedan ili više dodatnih imunskih kostimulatornih receptora bira se iz grupe koja se sastoji od OX-40 i CD27.

KRATAK OPIS SLIKA

Sl. 1 prikazuje da je TIGIT visoko eksprimiran na iscrpljenim CD8+ i CD4+ T ćelijama. Sl. 1A prikazuje C57BL6/J CD8+ T ćelije slezine obogaćene sa MACS koje su in vitro stimulisane anti-CD3 i anti-CD28 vezanim za ploču tokom 24-48 sati. Histogrami protočne citometrije koji su reprezentativni za ekspresiju TIGIT (crveni) u odnosu na obojenje izotipa (siva). Takođe je prikazana kvantifikacija MFI TIGIT. ***, P <0,001. Podaci su reprezentativni za 2 nezavisna eksperimenta; n = 3. Na SL. 1B-1C, miševi C57BL6/J su zaraženi Armstrongovim sojem LCMV, a splenociti su analizirani 7 dana nakon infekcije. Podaci su reprezentativni za 2 nezavisna eksperimenta; n = 5. SL. 1B prikazuje histogram protočne citometrije koji je reprezentativan za ekspresiju TIGIT naivnim T ćelijama (CD44<nizak>CD62L<visok>) i ćelijama efektorske memorije (CD44<visok>CD62L<nizak>) CD4+ i CD8+. Takođe je prikazana kvantifikacija MFI TIGIT. ***, P <0,001. SL. 1C prikazuje histogram protočne citometrije koji je reprezentativan za ekspresiju TIGIT PD-1<visoki>i PD-1<niski>CD8+T ćelija efektorske memorije. Takođe je prikazana kvantifikacija MFI TIGIT. ***, P <0,001.

1

SL. 1D prikazuje da su C57BL6/J miševima na kratko proređene CD4+ T ćelije i da su bili inficirani klonom 13 soja LCMV. Splenociti su analizirani 42 dana nakon infekcije. Histogram protočne citometrije koji je reprezentativan za ekspresiju TIGIT naivnim (CD44<nizak>CD62L<visok>), centralnim memorijskim (CD44<visok>CD62L<visok>) i efektorskim memorijskim (CD44<visok>CD62L<nizak>) CD8+ T ćelijama. Takođe je prikazana kvantifikacija MFI TIGIT. ***, P <0,001. Podaci su reprezentativni za 2 nezavisna eksperimenta; n = 5. Trake grešaka prikazuju standardnu grešku srednje vrednosti.

SL. 2 prikazuje dizajn TIGIT<loxP/loxP>miševa. Egzon 1 TIGIT-a je bio okružen loxP lokacijama korišćenjem standardne tehnike.

SL. 3 prikazuje da CD8<+>i CD4<+>T ćelije sa nedostatkom TIGIT-a normalno reaguju na akutnu virusnu infekciju. TIGIT<fl/fl>CD4<cre>(CKO) i TIGIT<fl/fl>jedinke iz istog okota (WT) zaražene su Armstrongovim sojem LCMV. Splenociti su analizirani 7 dana nakon infekcije. Podaci su reprezentativni za dva nezavisna eksperimenta; n = 5. SL. 3A prikazuje reprezentativne FACS grafikone izdvojene za CD8<+>T ćelije, sa aktiviranim (CD44<visoki>) ćelijama koje su uokvirene. Kvantifikacija aktiviranih CD8<+>T ćelija u vidu procenta od ukupnih CD8<+>T ćelija. Sl.3B prikazuje reprezentativne FACS grafikone izdvojene za CD8<+>T ćelije nakon stimulacije in vitro, sa uokvirenim ćelijama koje proizvode IFNγ. Kvantifikacija ćelija koje proizvode IFNg u vidu procenta od ukupnih CD8<+>T ćelija. Sl. 3C prikazuje reprezentativne FACS grafikone izdvojene za CD4<+>T ćelije, sa aktiviranim (CD44<visokim>) ćelijama koje su uokvirene. Kvantifikacija aktiviranih CD4<+>T ćelija u vidu procenta od ukupnih CD4<+>T ćelija. Sl. 3D prikazuje reprezentativne FACS grafikone izdvojene za CD4<+>T ćelije nakon stimulacije in vitro, sa uokvirenim ćelijama koje proizvode IFNg. Kvantifikacija ćelija koje proizvode IFNg u vidu procenta od ukupnih CD4<+>T ćelija. Trake grešaka prikazuju standardnu grešku srednje vrednosti.

SL. 4 prikazuje da TIGIT i PD-1 sinergistički regulišu efektorsku funkciju iscrpljenih T ćelija in vivo. Na SL. 4A-4E, miševima TIGIT<fl/fl>CD4-cre- (WT) i TIGIT<fl/fl>CD4-cre+ (CKO) su na kratko proređene CD4+ T ćelije i zaraženi su klonom 13 soja LCMV. Analizirani su splenociti i virusni titri jetre 42 dana nakon infekcije. Podaci su reprezentativni za 2 nezavisna eksperimenta i n = 6-9 po grupi. SL. 4A prikazuje reprezentativne FACS grafikone izdvojene za CD8+T ćelije, sa aktiviranim ćelijama (CD44<visoki>CD62L<niski>) koje su uokvirene. Kvantifikacija aktiviranih ćelija u vidu procenta od ukupnih CD8+ T ćelija. SL.

4B prikazuje reprezentativne FACS grafikone izdvojene za CD8+ T ćelije nakon stimulacije in vitro, sa IFNγ+ ćelijama koje su uokvirene. Kvantifikacija ćelija koje proizvode IFNγ u vidu procenta CD8+ T ćelija. Sl. 4C prikazuje reprezentativne FACS grafikone izdvojene za

2

CD4+ T ćelije, sa aktiviranim ćelijama (CD44<visoki>CD62L<niski>) koje su uokvirene. Kvantifikacija aktiviranih ćelija u vidu procenta od ukupnih CD4+ T ćelija. SL.4D prikazuje reprezentativne FACS grafikone izdvojene za CD4+ T ćelije nakon stimulacije in vitro, sa IFNγ+ ćelijama koje su uokvirene. Kvantifikacija ćelija koje proizvode IFNγ u vidu procenta CD4+ T ćelija. SL. 4E prikazuje kvantifikaciju LCMV titra jetre. ***, P <0,0001. Na SL.

4F-4H, miševima C57BL6/J nakratko su proređene CD4+ T ćelije i inficirani su klonom 13 soja LCMV. Miševi su lečeni izotipskom kontrolom, anti-PD-L1, anti-TIGIT ili anti-PD-L1+ anti-TIGIT antitelima, a tretman je počeo 28 dana nakon infekcije. Analizirani su splenociti i virusni titri jetre 42 dana nakon infekcije. Podaci su reprezentativni za 2 nezavisna eksperimenta; n = 10. Sl.4F prikazuje reprezentativne FACS grafikone izdvojene za CD8+T ćelije, sa aktiviranim ćelijama (CD44<visoki>CD62L<niski>) koje su uokvirene. Kvantifikacija aktiviranih ćelija u vidu procenta od ukupnih CD8+ T ćelija. ***, P <0,0001. SL. 4G prikazuje reprezentativne FACS grafikone izdvojene za CD8+ T ćelije nakon stimulacije in vitro, sa IFNγ+ ćelijama koje su uokvirene. Kvantifikacija ćelija koje proizvode IFNγ u vidu procenta aktiviranih CD8+ T ćelija. *. P=0,0352. **, P = 0,0047. SL. 4H prikazuje kvantifikaciju LCMV titra jetre. P=0,0106. **, P = 0,0047. Trake grešaka prikazuju standardnu grešku srednje vrednosti.

SL. 5 prikazuje TIGIT/PD-L1 koblokada pojačava efektorsku funkciju CD4+ T ćelija tokom hronične virusne infekcije. Miševima C57BL6/J bile su proređene CD4+T ćelije i inficirani su klonom 13 soja LCMV. Miševi su lečeni izotipskom kontrolom, anti-PD-L1, anti-TIGIT ili anti-PD-L1+ anti-TIGIT antitelima, a terapija je počela 28 dana nakon infekcije. Analizirani su splenociti i virusni titri jetre 42 dana nakon infekcije. Podaci su reprezentativni za 2 nezavisna eksperimenta; n = 10. SL.5A prikazuje reprezentativne FACS grafikone izdvojene za CD4+T ćelije, sa aktiviranim ćelijama (CD44<visoki>CD62L<niski>) koje su uokvirene. Kvantifikacija aktiviranih CD4+ T ćelija u vidu procenta od ukupnih CD4+ T ćelija. SL. 5B prikazuje reprezentativne FACS grafikone izdvojene za CD4+T ćelije nakon stimulacije in vitro, sa uokvirenim ćelijama koje proizvode IFNγ. Kvantifikacija ćelija koje proizvode IFNγ u vidu procenta ukupnih CD4+ T ćelija. *, P = 0,019. Trake grešaka prikazuju standardnu grešku srednje vrednosti.

SL. 6 prikazuje ekspresiju TIGIT-a kod humanog raka dojke, povezanu sa ekspresijom CD8 i inhibitornih koreceptora. Analizirani su podaci mikročipa genske ekspresije raka dojke proizvedeni u sklopu Mreže za Atlas genoma raka. Podaci o genskoj ekspresiji su normalizovani i izraženi u vidu relativnog odnosa (log2). SL. 6A prikazuje ekspresiju TIGIT u normalnim uzorcima i svim uzorcima tumora dojke (levo) i u podtipovima tumora dojke (desno). ***, P = 6x10-12. Prikazani su kutijasti dijagrami. SL.

6B prikazuje korelaciju ekspresije TIGIT i CD3ε. R2 = 0,61. SL. 6C prikazuje korelaciju TIGIT-a i CD8α (levo, R2 = 0,80) ili CD4 (desno, R2 = 0,42). SL. 6D prikazuje korelaciju TIGIT i PD-1 (levo, R<2>= 0,87), LAG3 (centar, R<2>= 0,80), i CTLA4 (desno, R<2>= 0,76).

SL. 7 pokazuje da TIGIT i PD-1 inhibiraju odgovor antitumorske T ćelije. Na SL.

7A-7B, BALB/C miševi su inokulisani ćelijama CT26 kolorektalnog karcinoma. Splenociti i limfociti koji infiltriraju tumor (TIL) analizirani su 14 dana nakon inokulacije, kada su tumori dostigli veličinu oko 200 mm<3>. Podaci su reprezentativni za jedan eksperiment; n = 6. SL.7A prikazuje histogram protočne citometrije koji je reprezentativan za ekspresiju TIGIT od strane CD8+ T ćelija slezine i onih koje infiltriraju tumor. Takođe je prikazana kvantifikacija MFI TIGIT. **, P = 0,0023. SL. 7B prikazuje histogram protočne citometrije koji je reprezentativan za ekspresiju TIGIT od strane CD4+T ćelija slezine i onih koje infiltriraju tumor. Takođe je prikazana kvantifikacija MFI TIGIT. ***, P = 0,0002. Na SL. 7C-7E, BALB/C miševi su inokulisani ćelijama CT26 kolorektalnog karcinoma. Kada su tumori dostigli veličinu od oko 200 mm3, miševi su tokom tri nedelje tretirani izotipskom kontrolom, anti-PD-L1, anti-TIGIT ili anti-PD-L1+ anti-TIGIT antitelima. Podaci su reprezentativni za dva nezavisna eksperimenta; n = 10-20 (SL. 7C-7D) ili 7-10 (SL. 7E). SL.

7C prikazuje medijanu zapremine tumora CT26 tokom vremena. SL. 7D prikazuje preživljavanje miša. Sl. 7E prikazuje da su, približno 60 dana nakon početne inokulacije, miševi u potpunoj remisiji (CR) koji su primili anti-TIGIT anti-PD-L1, kao i naivni BALB/c miševi, bili inokulisani CT26 ćelijama u levim torakalnim bočnim delovima i EMT6 ćelijama karcinoma dojke u masnom tkivu dojke. Prikazana je medijana (levo) i pojedinačna (desno) zapremina tumora za CT26 (kvadratići) i EMT6 (trouglovi) za tumore kod CR miševa (ljubičasto i zeleno) i naivnih miševa (crno i narandžasto). SL. 7F prikazuje miševe koji su inokulisani CT26 tumorima i lečeni kao na SL. 7C. Rezidentne T ćelije koje infiltriraju tumor i T ćelije limfnog čvora koji drenira tumor analizirane su protočnom citometrijom. Reprezentativni FACS grafikoni sa CD8+ TIL nakon stimulacije in vitro, sa uokvirenim ćelijama koje proizvode IFNγ. Kvantifikacija CD8+TIL koji proizvode IFNγ u vidu procenta od ukupnih CD8+ TIL. ***, P = 0,0003. Podaci su reprezentativni za dva nezavisna eksperimenta; n = 5. Trake grešaka prikazuju standardnu grešku srednje vrednosti.

SL. 8 prikazuje da je ekspresija TIGIT za CT26 limfocite koji infiltriraju tumor u korelaciji sa ekspresijom Tim-3. BALB/C miševi su inokulisani ćelijama kolorektalnog karcinoma CT26. Splenociti i limfociti koji infiltriraju tumor (TIL) analizirani su otprilike 14 dana nakon inokulacije, kada su tumori dostigli veličinu od oko 200 mm<3>. Podaci su reprezentativni za jedan eksperiment; n = 6. SL. 8A prikazuje reprezentativni histogram ekspresije TIGIT CD8<+>T ćelijama slezine i onima koje infiltriraju tumor. Kvantifikacija MFI TIGIT. **, P = 0,0026. SL.8B prikazuje reprezentativni histogram ekspresije TIGIT CD4<+>T ćelija slezine i onih koje infiltriraju tumor. Kvantifikacija MFI TIGIT. ***, P < 0,0001. Trake grešaka prikazuju standardnu grešku srednje vrednosti.

SL. 9 prikazuje da je ekspresija TIGIT limfocita MC38 koji infiltriraju tumor u korelaciji sa ekspresijom PD-1 i Tim-3. Miševi C57BL6/J su inokulisani ćelijama MC38 kolorektalnog karcinoma. Splenociti i limfociti koji infiltriraju tumor (TIL) analizirani su otprilike 14 dana nakon inokulacije, kada su tumori dostigli veličinu od oko 200 mm<3>. Podaci su reprezentativni za jedan eksperiment; n = 5. SL. 9A prikazuje reprezentativni histogram ekspresije TIGIT CD8<+>T ćelijama slezine i onih koje infiltriraju tumor. Kvantifikacija MFI TIGIT. ***, P < 0,0001. SL. 9B prikazuje reprezentativni histogram ekspresije TIGIT CD4<+>T ćelija slezine i onih koje infiltriraju tumor. Kvantifikacija MFI TIGIT. *, P = 0,0136. **, P = 0,0029. Trake grešaka prikazuju standardnu grešku srednje vrednosti.

SL. 10 prikazuje rast tumora CT26 kod miševa koji su lečeni sa anti-PD-L1 i/ili anti-TIGIT. Naivni BALB/c miševi su inokulisani tumorskim ćelijama CT26 i lečeni sa anti-PD-L1 i/ili anti-TIGIT ili izotipski podudarnim kontrolnim antitelima, kao što je opisano na SL.

4D-4F. Prikazane su veličine tumora tokom vremena za pojedine miševe u svakoj grupi lečenja. Podaci su reprezentativni za dva nezavisna eksperimenta.

SL. 11 prikazuje protočnu citometrijsku analizu za CD4<+>TIL i T ćelije limfnih čvorova koji dreniraju tumor. BALB/C miševi su inokulisani ćelijama kolorektalnog karcinoma CT26. Kada su tumori dostigli veličinu otprilike 200 mm<3>, miševi su tokom 7 dana tretirani izotipskom kontrolom, anti-PD-L1, anti-TIGIT ili anti-PD-L1 anti-TIGIT antitelima. Sakupljeni su tumori i limfni čvorovi koji dreniraju tumor. Podaci su reprezentativni za dva nezavisna eksperimenta; n = 5. Reprezentativni FACS grafikoni izdvojeni za CD8<+>T ćelije limfnog čvora koji drenira tumor nakon stimulacije in vitro, sa uokvirenim ćelijama koje proizvode IFNγ. Kvantifikacija IFNγ<+>ćelija u vidu procenta od ukupnih CD8<+>T ćelija. ***, P < 0,001. Kvantifikacija CD8<+>T ćelija u vidu procenta od ukupnih TIL. **, P = 0,0065. Kvantifikacija aktiviranih (CD44<visoki>CD62L<niski>) CD8<+>T ćelija u vidu procenta od ukupnih CD8+ TIL. *, P = 0,012. Kvantifikacija CD8<+>T ćelija u vidu procenta od ukupnih ćelija limfnih čvorova koji dreniraju tumor. Kvantifikacija aktiviranih CD8+ T ćelija u vidu procenta od ukupnih CD8+ T ćelija u limfnom čvoru koji drenira tumor. *, P < 0,05. SL. 11C prikazuje kvantifikaciju CD4<+>T ćelija u vidu procenta od ukupnih TIL. *, P = 0,016. SL. 11D prikazuje kvantifikaciju aktiviranih CD4<+>T ćelija u vidu

2

procenta od ukupnih CD4<+>TIL. SL. 11E prikazuje kvantifikaciju CD4<+>T ćelija u vidu procenta od ukupnih ćelija limfnih čvorova koji dreniraju tumor. SL. 11F prikazuje kvantifikaciju aktiviranih CD4<+>T ćelija u vidu procenta od ukupnih CD4<+>T ćelija u limfnom čvoru koji drenira tumor. SL. 11A prikazuje kvantifikaciju IFNγ<+>ćelija u vidu procenta od CD4<+>TIL ćelija nakon stimulacije in vitro. SL. 11B prikazuje kvantifikaciju IFNγ<+>ćelija u vidu procenta od CD4<+>T ćelija u limfnom čvoru koji drenira tumor nakon stimulacije in vitro. Trake grešaka prikazuju standardnu grešku srednje vrednosti.

SL. 12 prikazuje sledeću protočnu citometrijsku analizu CD8<+>TIL. BALB/C miševi su inokulisani ćelijama kolorektalnog karcinoma CT26 i lečeni izotipskom kontrolom, anti-PD-L1, anti-TIGIT ili anti-PD-L1+ anti-TIGIT antitelima kao što je opisano na SL.4. Tumori su prikupljeni nakon 7 dana lečenja i analizirani protočnom citometrijom. Podaci su reprezentativni za dva nezavisna eksperimenta; n = 5. SL. 12A prikazuje kvantifikaciju TNFα<+>ćelija u vidu procenta od ukupnih CD8<+>TIL. **, P < 0,01. SL. 12B prikazuje kvantifikaciju CD8<+>TIL u vidu procenta od ukupnih TIL. **, P < 0,01. SL. 12C prikazuje kvantifikaciju aktiviranih (CD44<visokih>CD62L<niskih>) CD8<+>TIL u vidu procenta od ukupnih CD8<+>TIL. *, P < 0,05. Trake grešaka prikazuju standardnu grešku srednje vrednosti.

SL. 13 prikazuje protočnu citometrijsku analizu rezidentnih CD8<+>T ćelija limfnih čvorova koji dreniraju tumor. BALB/C miševi su inokulisani ćelijama kolorektalnog karcinoma CT26 i lečeni izotipskom kontrolom, anti-PD-L1, anti-TIGIT ili anti-PD-L1+ anti-TIGIT antitelima kao što je opisano na SL.4. Limfni čvorovi koji dreniraju tumor prikupljeni su nakon 7 dana lečenja i analizirani protočnom citometrijom. Podaci su reprezentativni za dva nezavisna eksperimenta; n = 5. SL. 13A prikazuje reprezentativne FACS grafikone izdvojene za rezidentne CD8<+>T ćelije limfnih čvorova koji dreniraju tumor nakon stimulacije in vitro, sa uokvirenim ćelijama koje proizvode IFNγ. Kvantifikacija IFNγ<+>ćelija u vidu procenta od ukupnih CD8<+>T ćelija. ***, P < 0,001. SL.13B prikazuje kvantifikaciju CD8<+>T ćelija u vidu procenta od ukupnih ćelija u limfnom čvoru koji drenira tumor. SL. 13C prikazuje kvantifikaciju aktiviranih (CD44<visokih>CD62L<niskih>) CD8<+>T ćelija u vidu procenta od ukupnih CD8<+>T ćelija. *, P < 0,05. Trake grešaka prikazuju standardnu grešku srednje vrednosti. SL. 13D prikazuje kvantifikaciju ćelija koje proizvode TNFα u vidu procenta od ukupnih CD8<+>T ćelija u limfnom čvoru koji drenira tumor.

SL. 14 prikazuje koekspresiju CD226 i TIGIT pomoću CD8+ T ćelija koje infiltriraju tumor. Miševi C57BF6/J su inokulisani ćelijama MC38 kolorektalnog karcinoma. Splenociti i limfociti koji infiltriraju tumor (TIL) analizirani su otprilike 14 dana nakon inokulacije, kada su tumori dostigli veličinu od oko 200 mm<3>. Reprezentativni histogram ekspresije CD226 od strane B ćelija slezine (sivo), CD8+ T ćelija slezine (plavo) i TIGIT+ CD8+T ćelija koje infiltriraju tumor (crveno). Podaci su reprezentativni za dva nezavisna eksperimenta; n = 5.

SL. 15 prikazuje CD226 i TIGIT koimunoprecipitat (co-IP) na transficiranim ćelijama. COS7 ćelije su kotransficirane ekspresionim plazmidima koji sadrže cDNK za proteine označene TIGIT-HA (5 ng) ili CD226-Flag (10 ng), ili kontrolni plazmid (pRK). Nakon transfekcije, ćelije su isprane i centrifugirane, a ćelijski pelet liziran. Nastali supernatant prethodno je očišćen i centrifugiran, a zatim podeljen podjednako u epruvete i imunoprecipitovan pomoću anti-HA ili anti-flag, korišćenjem standardnih postupaka. Imunoprecipitovani proteini su podvrgnuti metodama SDS-PAGE i vestern blot. Rezultati vestern blota su ispitivani sa anti-Flag-HRP ili anti-HA-HRP.

SL. 16 prikazuje TIGIT i CD226 koji interaguju u primarnim CD8+ T ćelijama. C57BL6/J CD8+ T ćelije slezine obogaćene putem MACS stimulisane su anti-CD3 i anti-CD28 antitelima vezanim za ploču i rekombinantnim IL-2 tokom 48 sati i lizirane. Ćelijski lizati su imunoprecipitovani pomoću anti-TIGIT i ispitivani pomoću anti-CD226. Redovi: marker molekulske težine (1), unos (2), protok koimunoprecipitacije (3) i koimunoprecipitat. Strelica označava očekivanu molekulsku težinu za CD226.

SL. 17 prikazuje detektovanje interakcije TIGIT/CD226 pomoću TR-FRET. SL.17A prikazuje disocijaciju Flag-ST-CD226 homodimera pomoću HA-TIGIT. FRET odnos između Flag-ST-CD226 izmeren na COS-7 ćelijama izražava konstantnu količinu Flag-ST-CD226 i rastuće koncentracije HA-TIGIT. SL. 17B prikazuje FRET odnos između Flag-ST-CD226 zabeležen nakon 15-minutne inkubacije bilo PBS (bela traka) ili anti-TIGIT antitela (crna traka). SL.17C prikazuje povezanost Flag-ST-CD226 sa HA-TIGIT. FRET intenzitet između Flag-ST-CD226 i HA-TIGIT u odnosu na ekspresiju Flag-ST-CD226 meren pomoću anti-Flag ELISA na istoj grupi transficiranih COS-7 ćelija. SL. 17D prikazuje FRET varijaciju između Flag-ST-CD226 i HA-TIGIT nakon 15-minutne inkubacije antitela PBS (bela traka) ili anti-TIGIT (crna traka). Podaci u A i C su reprezentativni za 4 nezavisna eksperimenta, od kojih je svaki izveden u tri primerka. Podaci u B i D su reprezentativni za 2 nezavisna eksperimenta, od kojih je svaki izveden u tri primerka.

SL. 18 prikazuje ekspresiju ćelijske površine za Flag-ST-CD226 i HA-TIGIT. Anti-Flag i anti-HA ELISA na netaknutim COS-7 ćelijama koje eksprimiraju navedene označene konstrukte. Podaci su reprezentativni za 3 nezavisna eksperimenta, od kojih je svaki izveden u tri primerka.

SL. 19 prikazuje da blokada CD226 preokreće pojačani antivirusni T ćelijski odgovor indukovan TIGIT/PD-L1 koblokadom. Na SL. 19A-19D, C57BF6/J miševima su nakratko

2

proređene CD4<+>T ćelije i inficirane su klonom 13 soja LCMV. Miševi su lečeni izotipski podudarnom kontrolom, anti-CD226, anti-PD-L1 anti-TIGIT ili anti-PD-L1 anti-TIGIT anti-CD226 antitelima počevši od 28. dana nakon infekcije. Analizirani su splenociti i virusni titri jetre 42 dana nakon infekcije. SL. 19A prikazuje kvantifikaciju CD8<+>T ćelija u vidu procenta splenocita. Sl. 19B prikazuje kvantifikaciju aktiviranih CD8<+>T ćelija u vidu procenta od ukupnih CD8<+>T ćelija. ***, P < 0,001. SL. 19C prikazuje kvantifikaciju ćelija koje proizvode IFNg u vidu procenta aktiviranih CD8<+>T ćelija. ***, P < 0,001. SL. 19D prikazuje kvantifikaciju LCMV titra jetre. ***, P < 0,001. Trake grešaka prikazuju standardnu grešku srednje vrednosti.

SL. 20 prikazuje da je ekspresija TIGIT povišena u humanom kanceru i da je u tesnoj korelaciji sa CD8 i PD-1. Analize genske ekspresije humanog raka izvršene su kao što je opisano u primeru 11. Tačkasti dijagrami prikazuju podatke o broju gena, normalizovane veličinom biblioteke. Kutijasti dijagrami pokazuju odnos ekspresije stabilizovane na varijansu za TIGIT i CD3e. SL. 20A prikazuje povezanost TIGIT i CD3e RNK ekspresije kod LUSC (sivo) i normalnih pluća (crno), ρ = 0,86. Prikazana je i kvantifikacija odnosa ekspresije TIGIT/CD3e. Povećanje odnosa LUSC = 372%. ***, P = 1,46 x 10<-46>. SL. 20B prikazuje povezanost TIGIT i CD3e RNK ekspresije kod COAD (sivo) i normalnog debelog creva (crno), ρ = 0,83. Prikazana je i kvantifikacija odnosa ekspresije TIGIT/CD3e. Povećanje odnosa COAD = 116%. ***, P = 3,66 x 10<-6>. SL. 20C prikazuje povezanost TIGIT i CD3e RNK ekspresije kod UCEC (sivo) i normalnog endrometrijuma materice (crno). ρ = 0,87. Prikazana je i kvantifikacija odnosa ekspresije TIGIT/CD3e. Povećanje odnosa UCEC = 419%. ***, P = 7,41 x 10<-5>. SL. 20D prikazuje povezanost TIGIT i CD3e RNK ekspresije kod BRCA (sivo) i normalne dojke (crno). ρ = 0,82. Prikazana je i kvantifikacija odnosa ekspresije TIGIT/CD3e. Povećanje odnosa BRCA = 313%. ***, P = 4,6 x 10<-44>. SL.20E prikazuje povezanost TIGIT i CD3e RNK ekspresije kod svetloćelijskog karcinoma bubrega (sivo) i normalnog bubrega (crno). ρ = 0,94. Prikazana je i kvantifikacija odnosa ekspresije TIGIT/CD3e. SL. 20F prikazuje povezanost TIGIT i CD8A (levo) ili TIGIT i CD4 (desno) kod karcinoma skvamoznih ćelija pluća (sivo) i normalnih pluća (crno). ρ = 0,77, odnosno 0,48. SL.20G prikazuje povezanost TIGIT i PD-1 (Pdcd1) kod karcinoma skvamoznih ćelija pluća (sivo) i normalnih pluća (crno). ρ = 0,82. SL. 20H prikazuje povezanost TIGIT i CD226 kod karcinoma skvamoznih ćelija pluća (crveno) i normalnih pluća (crno). ρ = 0,64.

SL. 21 prikazuje analizu genske ekspresije povezane sa T ćelijama kod karcinoma skvamoznih ćelija pluća (LUSC). Ekspresija gena kod LUSC i normalnih uzoraka tkiva

2

analizirana je kako je opisano u primeru 11 i generisana je toplotna mapa gena najbolje povezanih sa genskim potpisom u uzorcima LUSC. Geni i uzorci su klasterisani pomoću hijerarhijskog klasterisanja Vordovim postupkom na matrici euklidske udaljenosti za centrirane i skalirane podatke ekspresije.

SL. 22 prikazuje da su TIGIT i PD-1 koordinisano eksprimirani humanim i mišjim limfocitima koji infiltriraju tumor. SL. 22A-22C prikazuje analizu limfocita iz sveže reseciranog humanog NSCLC tumora, periferne krvi podudarne tumoru i normalne periferne krvi donora. Podaci su reprezentativni za dva nezavisno analizirana tumora. SL. 22A prikazuje FACS grafikone reprezentativne za TIGIT ekspresiju perifernim CD8<+>T ćelijama i onim koje infiltriraju tumor, sa TIGIT<+>ćelijama koje su uokvirene. SL.22B prikazuje FACS grafikone reprezentativne za ekspresiju TIGIT perifernim CD4<+>T ćelijama i onim koje infiltriraju tumor, sa TIGIT<+>ćelijama koje su uokvirene. SL. 22C prikazuje histogram protočne citometrije, reprezentativan za ekspresiju TIGIT PD-1<visoko>(crveno) i PD-1<nisko>(plavo) CD8<+>(levo) i CD4<+>(desno) T ćelijama koje infiltriraju NSCLS tumor. Na SL. 22D-22G, BALB/C miševi su inokulisani singenim CT26 ćelijama kolorektalnog karcinoma. Splenociti i limfociti koji infiltriraju tumor (TIL) analizirani su 14 dana nakon inokulacije, kada su tumori dostigli veličinu otprilike 200 mm<3>. Podaci su reprezentativni za dva nezavisna eksperimenta; n = 5-6. SL. 22D prikazuje FACS grafikon reprezentativan za ekspresiju TIGIT CD8<+>T ćelijama koje infiltriraju tumor, sa TIGIT<+>ćelijama koje su uokvirene. SL. 22E prikazuje FACS grafikon reprezentativan za ekspresiju TIGIT CD4<+>T ćelijama koje infiltriraju tumor, sa TIGIT<+>ćelijama koje su uokvirene. Kvantifikacija frekvencije TIGIT<+>T ćelija u vidu procenta od svih T ćelija. *, P = 0,0134. ***, P < 0,0001.

SL. 22F prikazuje histogram protočne citometrije koji je reprezentativan za ekspresiju TIGIT PD-1<visoko>i PD-1<nisko>CD8<+>T ćelijama koje infiltriraju tumor i CD8<+>T ćelijama slezine. Takođe je prikazana kvantifikacija MFI TIGIT. **, P = 0,0023. SL.22G prikazuje histogram protočne citometrije koji je reprezentativan za ekspresiju TIGIT PD-1<visoko>i PD-1<nisko>CD4<+>T ćelijama koje infiltriraju tumor i CD4<+>T ćelijama slezine. Takođe je prikazana kvantifikacija MFI TIGIT. ***, P = 0,0002. Trake grešaka prikazuju standardnu grešku srednje vrednosti.

Sl. Slika 23 prikazuje karakterizaciju ekspresije TIGIT humanim T ćelijama koje infiltriraju tumor. SL. 23A-23B prikazuje FACS grafikone koje pokazuju ekspresiju TIGIT CD8+ i CD4+ T ćelijama koje infiltriraju NSCLC tumor (SL.23A) i PBMC CD8+ i CD4+ T ćelijama podudarnim sa donorima (SL. 23B), sa TIGIT+ ćelijama koje su uokvirene. SL.

23C-23D prikazuju FACS grafikone koji pokazuju ekspresiju TIGIT CDC8+ i CD4+T ćelijama koje infiltriraju tumor (SL. 23C) i PBMC CD8+ i CD4+ T ćelijama podudarnim sa

2

donorima (SL. 23D), sa TIGIT+ ćelijama koje su uokvirene.

SL. 24 prikazuje da interakciju TIGIT:CD226 ne pokreće PVR TIGIT:CD226, a TIGIT Q56R:CD226 interakcije su detektovane pomoću TR-FRET, a FRET odnos između Flag-ST-CD226 i HA-TIGIT ili HA-TIGIT Q56R pokazuje da WT i Q56R TIGIT vezuju CD226 sa istom efikasnošću. Podaci su reprezentativni za tri nezavisna eksperimenta izvedena u tri primerka.

SL. 25 prikazuje efikasnost koblokade antitelima TIGIT/PD-L1 kod miševa koji nose MC38 tumore. Na SL.25A-25C miševi MC38 koji nose tumor generisani su kao što je gore navedeno i lečeni su blokirajućim antitelima na PD-L1 (crveno), TIGIT (plavo), TIGIT i PD-L1 (ljubičasto) ili izotipski podudarnim antitelima kontrole (crno) tokom tri nedelje. N = 10 (kontrola, samo anti-PD-L1, samo anti-TIGIT) ili 20 (anti-TIGIT anti-PD-L1). SL. 25A prikazuje medijanu (levo) i pojedinačne (desno) zapremine MC38 tumora tokom vremena.

SL. 25B prikazuje zapremine MC38 tumora nakon 14 dana lečenja antitelima. ***, P = 0,0005. **, P = 0,0093. *, P = 0,0433. SL. 25C prikazuje preživljavanje miševa tokom vremena. Trake grešaka prikazuju standardnu grešku srednje vrednosti.

SL. 26 prikazuje dalju karakterizaciju ekspresije TIGIT mišjim T ćelijama koje infiltriraju tumor. SL.26A prikazuje da su C57BL6/J CD8<+>T ćelije slezine obogaćene putem MACS i uzgajane na pločama obloženim anti-CD3 i anti-CD28 agonističkim antitelima. Reprezentativni histogrami bojenja TIGIT (crveno) i izotipski podudarne kontrole (sivo) tokom vremena. Kvantifikacija MFI TIGIT. ***, P < 0,001. Stimulisane ćelije su indukovano eksprimirale PD-1 i konstitutivno eksprimirale CD226 (podaci nisu prikazani). Podaci su reprezentativni za dva nezavisna eksperimenta; n = 5. Na SL. 26B-26E, miševi C57BL6/J divljeg tipa su supkutano inokulisani singenim MC38 ćelijama kolorektalnog karcinoma. Pušteno je da tumori rastu bez intervencije sve dok nisu dostigli veličinu od 150-200 mm<3>. Podaci su reprezentativni za dva nezavisna eksperimenta; n = 5. SL. 26B prikazuje reprezentativni FACS grafikon za CD8<+>T ćelije koje infiltriraju tumor, sa TIGIT<+>ćelijama koje su uokvirene. Kvantifikacija frekvencije TIGIT<+>ćelija u vidu procenta od svih CD8<+>T ćelija koje infiltriraju tumor ili CD8<+>T ćelija slezine. ***, P < 0,0001. SL. 26C prikazuje reprezentativni FACS grafikon CD4<+>T ćelija koje infiltriraju tumor, sa TIGIT<+>ćelijama koje su uokvirene. Kvantifikacija frekvencije TIGIT<+>ćelija u vidu procenta od svih CD4<+>T ćelija koje infiltriraju tumor ili T ćelija slezine. ***, P < 0,0001. SL.26D prikazuje reprezentativni histogram ekspresije TIGIT PD-1<visokim>i PD-1<niskim>CD8<+>T ćelijama koje infiltriraju tumor (crveno odnosno plavo) i CD8<+>T ćelijama slezine (sivo). Kvantifikacija MFI TIGIT. ***, P < 0,0001. SL. 26E prikazuje reprezentativni histogram ekspresije TIGIT PD-1<visokim>i PD-

2

1<niskim>CD4<+>T ćelijama koje infiltriraju tumor i CD4<+>T ćelijama slezine. Kvantifikacija MFI TIGIT. *, P = 0,0136. **, P = 0,0029. Trake grešaka prikazuju standardnu grešku srednje vrednosti.

SL. 27 prikazuje da CD8<+>i CD4<+>T ćelije koje infiltriraju tumor održavaju visok nivo ekspresije CD226. BALB/c miševi divljeg tipa su inokulisani CT26 tumorskim ćelijama kako je ovde opisano. Nakon što su tumori porasli na približno 150-200 mm<3>, tumori i slezine su analizirani protočnom citometrijom. SL. 27A prikazuje kvantifikaciju CD226<+>CD8<+>T ćelija, CD4<+>T ćelija i ne-T ćelija, u vidu procenta od svih CD8<+>T ćelija, CD4<+>T ćelija odnosno ne-T ćelija. SL. 27B prikazuje reprezentativne histograme ekspresije CD226 u tumoru i slezini. Podaci su reprezentativni za dva nezavisna eksperimenta; n = 5. Trake grešaka prikazuju standardnu grešku srednje vrednosti.

SL. 28 prikazuje da supresija TIGIT odgovora CD8<+>T ćelija zavisi od CD226. BALB/C miševi su supkutano inokulisani CT26 ćelijama kolorektalnog karcinoma u desnu torakalnu bočnu stranu. Kada su tumori dostigli veličinu od približno 200 mm<3>, miševi su lečeni izotipskim kontrolnim antitelima (crno), anti-CD226 antitelima (narandžasto), anti-PD-L1 antitelima (crveno), anti-TIGIT+ anti-PD-L1 antitelima (ljubičasto) ili anti -TIGIT anti-PD-L1 anti-CD226 antitelima (zeleno) tokom tri nedelje. Podaci su reprezentativni za jedan eksperiment; n = 10 (A-B) ili 5 (C-F). SL. 28A prikazuje medijanu (levo) i pojedinačne (desno) veličine CT26 tumora tokom vremena. SL. 28B prikazuje preživljavanje miševa tokom vremena. Na Sl. 28C-28F, nakon 7 dana lečenja, limfociti koji infiltriraju tumor i rezidentni limfociti limfnih čvorova koje dreniraju tumor procenjeni su protočnom citometrijom. Slika 28C prikazuje kvantifikaciju CD8<+>TIL koji proizvode IFNγ u vidu procenta od ukupnih CD8<+>TIL nakon stimulacije in vitro. **, P < 0,01. Slika 28D prikazuje kvantifikaciju ćelija koje proizvode IFNγ u vidu procenta od ukupnih CD8<+>T ćelija nakon stimulacije in vitro. *, P < 0,05. Slika 28E prikazuje kvantifikaciju CD8<+>TIL u vidu procenta od ukupnih TIL. **, P < 0,01. Slika 28F prikazuje kvantifikaciju CD8<+>T ćelija u vidu procenta od svih rezidentnih limfocita limfnih čvorova koji dreniraju tumor. Trake grešaka prikazuju standardnu grešku srednje vrednosti.

SL. 29 prikazuje da TIGIT narušava funkciju CD226 direktno ometajući homodimerizaciju CD226. SL. 29A prikazuje da su CD8<+>T ćelije bile obogaćene putem MACS od TIGIT<fl/fl>CD4<cre>(CKO) i TIGIT<fl/fl>CD4<wt>(WT) jedinki iz istog okota, i stimulisane u prisustvu anti-CD226 ili izotipski podudarnih kontrolnih antitela kako je naznačeno. Unos H<3>-timidina je prikazan kao odnos ćelija uzgojenih sa anti-CD3 PVR-Fc u odnosu na ćelije uzgojene samo sa anti-CD3. **, P = 0,0061. ***, P < 0,0001. Podaci su

2

reprezentativni za dva nezavisna eksperimenta; n = 5. SL. 29B prikazuje da su C57BL6/J CD8<+>T ćelije divljeg tipa obogaćene putem MACS i stimulisane u prisustvu anti-TIGIT, anti-CD226 i/ili izotipski podudarnih kontrolnih antitela, kako je naznačeno. Unos H<3>-timidina je prikazan kao odnos ćelija uzgojenih sa anti-CD3 PVR-Fc u odnosu na ćelije uzgojene samo sa anti-CD3. ***, P <0,001 u uparenim t testovima. SL. 29C prikazuje da su primarne humane CD8<+>T ćelije obogaćene putem MACS iz krvi i stimulisane suboptimalnim nivoima anti-CD3 vezanih za ploču u prisustvu ili odsustvu humanog rekombinantnog PVR-Fc. Anti-TIGIT ili izotipski podudarna kontrolna antitela dodata su kako je naznačeno. Kvantifikacija unosa H<3>-timidina. **, P = 0,0071 odnosno 0,0014. SL. 29D prikazuje da su CHO ćelije prolazno transficirane rastućim koncentracijama akceptorskih i donorskih FLAG-ST-CD226, kao što je naznačeno. Kvantifikacija intenziteta FRET u odnosu na emisiju donora. Podaci su reprezentativni za tri nezavisna eksperimenta; n = 3. Na SL. 29E-29F, CHO ćelije su prolazno transficirane sa FLAG-ST-CD226 i rastućim koncentracijama HA-TIGIT, kako je naznačeno. Podaci su reprezentativni za dva ili više nezavisnih eksperimenata; n = 4. Podaci se normalizuju na maksimalan signal. SL. 29E prikazuje kvantifikaciju odnosa CD226:CD226 FRET (FRET1 odnos). SL. 29F prikazuje kvantifikaciju odnosa TIGIT:CD226 FRET (FRET2 odnos). SL. 29G prikazuje anti-FLAG (levo) i anti-HA (desno) imunoblotove koji se sprovode bilo na anti-FLAG ili anti-HA imunoprecipitatima pripremljenim od COS-7 ćelija transficiranih bilo praznim pRK vektorom ili kombinacijom Flag-CD226 i HA-TIGIT. Podaci su reprezentativni za dva nezavisna eksperimenta. SL.29H prikazuje kvantifikaciju odnosa TIGIT:CD226 FRET nakon inkubacije sa PBS (belo) ili anti-TIGIT antitelima (crveno). ***, P < 0,001. Podaci su reprezentativni za 4 nezavisna eksperimenta; n = 3. Trake grešaka prikazuju standardnu grešku srednje vrednosti.

SL. 30 prikazuje da su primarne humane T ćelije obogaćene putem MACS iz krvi i stimulisane sa anti-CD3 i anti-CD28. TIGIT<+>i TIGIT<->ćelije su sortirane, odmarane, restimulisane i obeležene za FRET sa naznačenim antitelima. Podaci su reprezentativni za dva nezavisna eksperimenta. ***, P < 0,001. Trake grešaka prikazuju standardnu grešku srednje vrednosti.

SL. 31 prikazuje da koblokada TIGIT i PD-1 ne obnavlja efektorsku funkciju iscrpljenih CD4<+>T ćelija tokom hronične virusne infekcije. SL. 31A prikazuje kvantifikaciju CD8<+>T ćelija u vidu procenta od svih splenocita. SL. 31B prikazuje kvantifikaciju GP33 Pentamer<+>ćelija u vidu procenta od svih CD8<+>T ćelija slezine. **, P = 0,0040. SL. 31C prikazuje reprezentativne FACS grafikone izdvojene za gp33 pentamer<+>CD8<+>T ćelije nakon stimulacije in vitro, sa uokvirenim IFNγ<+>ćelijama. Kvantifikacija ćelija koje proizvode IFNγ u vidu procenta od svih gp33 pentamer<+>CD8<+>T ćelija. *, P = 0,0319. **, P = 0,0030. Trake grešaka prikazuju standardnu grešku srednje vrednosti.

SL. 32 prikazuje da efikasnost TIGIT/PD-L1 koblokade zavisi od CD8<+>T ćelija. Na SL. 32A-32B, BALB/c miševi divljeg tipa su inokulisani CT26 tumorima kako je opisano na SL. 7. Kada su tumori dostigli veličinu od 100-150 mm<3>, miševima su proređene CD8<+>T ćelije i lečeni su sa anti-TIGIT anti-PD-L1. Podaci su reprezentativni za jedan eksperiment; n = 10/grupa. SL. 32 A prikazuje medijanu (levo) i pojedinačne (desno) zapremine CT26 tumora tokom vremena. SL. 32B prikazuje kvantifikaciju za veličine CT26 tumora 17 dana nakon početka lečenja. ***, P = 0,0004. Na SL. 32C, miševi BALB/c divljeg tipa su inokulisani CT26 tumorima i tretirani sa anti-TIGIT anti-PD-L1, a zatim ponovo izloženi CT26 tumorima sa privremenim proređivanjem CD8<+>T ćelija u trenutku ponovnog izlaganja. Podaci su reprezentativni za dva nezavisna eksperimenta; n = 5. SL.32C prikazuje medijanu (levo) i pojedinačne (desno) zapremine tumora CT26 tokom vremena. Trake grešaka prikazuju standardnu grešku srednje vrednosti.

SL. 33 prikazuje da ekspresija PVR na tumorskim ćelijama nije neophodna za efikasnost koblokade TIGIT/PD-L1. BALB/c miševi divljeg tipa su inokulisani tumorima divljeg tipa ili PVR (PVR.KO) tumorima kao što je opisano. Kada su tumori dostigli veličinu od 150-200 mm<3>, miševi su lečeni sa anti-TIGIT anti-PD-L1 ili izotipski podudarnim kontrolnim antitelima. Podaci su reprezentativni za jedan eksperiment; n = 10/grupa. SL. 33 prikazuje medijanu (levo) i pojedinačne (desno) zapremine tumora CT26 tokom vremena.

SL. 34 prikazuje efikasnost koblokade TIGIT/PD-L1 antitela kod miševa koji imaju EMT6 tumore. Miševi koji imaju EMT6 tumore su generisani kao što je naznačeno gore, i lečeni blokirajućim antitelima na PD-L1 (crveno), TIGIT (plavo), TIGIT i PD-L1 (ljubičasto) i izotipski podudarnim kontrolnim antitelima (crno) tokom tri nedelje. N = 10 (kontrola, samo anti-PD-L1, samo anti-TIGIT) ili 20 (anti-TIGIT anti-PD-L1). SL. 34 prikazuje medijanu (levo) i pojedinačne (desno) veličine tumora EMT6 tokom vremena.

SL. Slika 35 prikazuje da TIGIT reguliše efektorsku funkciju CD8<+>T ćelija koje infiltriraju tumor. BALB/C miševi su supkutano inokulisani sa CT26 ćelijama kolorektalnog karcinoma u desnu torakalnu bokčnu stranu i lečeni sa anti-PD-L1, anti-TIGIT, ili anti-PD-L1 anti-TIGIT, kao što je opisano na SL. 7. Rezidentne T ćelije limfnog čvora koji drenira tumor (dLN) i T ćelije koje infiltriraju tumor su analizirane protočnom citometrijom 7 dana nakon početka lečenja. Podaci su reprezentativni za dva nezavisna eksperimenta; n = 5. SL.

35A prikazuje kvantifikaciju rezidentnih dvostruko proizvodećih IFNγ/TNFα dLN CD8<+>i CD4<+>T ćelija u vidu procenta od ukupnih dLN rezidentnih CD8<+>odnosno CD4<+>T ćelija.

1

Takođe je prikazana dvostruka proizvodnja citokina od strane nestimulisanih T ćelija. **, P = 0,002, 0,003, odnosno 0,001. SL. 35B prikazuje kvantifikaciju dvostruko proizvodećih IFNγ/TNFα CD8<+>i CD4<+>T ćelija koje infiltriraju tumor u vidu procenta od ukupnih CD8<+>i CD4<+>T ćelija koje infiltriraju tumor. Takođe je prikazana dvostruka proizvodnja citokina od strane nestimulisanih T ćelija. ***, P < 0,0001. Trake grešaka prikazuju standardnu grešku srednje vrednosti.

SL. 36 prikazuje analizu limfocita iz reseciranog humanog NSCLC tumora, iz periferne krvi podudarne tumoru i normalne periferne krvi donora. Podaci su prikupljeni iz tri nezavisno stečena skupa uzoraka. SL. 36A prikazuje kvantifikaciju TIGIT<+>ćelija u vidu procenta od svih CD8<+>T ćelija. *, P < 0,05. SL.36B prikazuje kvantifikaciju TIGIT<+>ćelija u vidu procenta od svih CD4<+>T ćelija.

SL. 37 prikazuje karakterizaciju ekspresije TIGIT kod humanih tumora. SL. 37A prikazuje reprezentativne histograme protočne citometrije ekspresije TIGIT rezidentnim limfocitima u tumoru NSCLC (crveno, CD45<+>FSC<nizak>), mijeloidnim ćelijama (plavo, CD45<+>FSC<visok>) i nehematopoetskim ćelijama (zeleno, CD45-) u odnosu na izotipsko bojenje podudarno podskupu (sivo). SL. 37B prikazuje "gejting" strategiju za PD-1<visoke>i PD-1<niske>CD8<+>i CD4<+>T ćelije koje infiltriraju NSCLC tumor.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

I. Opšte tehnike

Ovde opisane tehnike i postupci su po pravilu dobro razumljivi i uobičajeno ih koriste stručna lica iz ove oblasti uz pomoć konvencionalne metodologije, kao što su, na primer, široko korišćene metodologije opisane u Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3d edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, et al. eds., (2003)); the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.): PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds. (1995)), Harlow and Lane, eds. (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, and Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1987)); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney), ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, i D.G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons; Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Milleri M.P. Calos, eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain

2

Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway i P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd i C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow i D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti i J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995); i Cancer: Principles and Practice of Oncology (V.T. DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company, 1993).

II. Definicije

Izraz „antagonist vezivanja PD-1 ose“ se odnosi na molekul koji inhibira interakciju partnera koji vezuje PD-1 osu sa jednim ili više njegovih partnera za vezivanje, da se ukloni disfunkcija T ćelije koja je rezultat signalizacije na PD-1 signalnoj osi, što za rezultat ima obnavljanje ili poboljšanje funkcije T ćelija (npr. proliferacije, proizvodnje citokina, uništavanja ciljnih ćelija). U smislu ovog dokumenta, antagonist vezivanja PD-1 ose odnosi se na antagonist vezivanja PD-1, antagonist vezivanja PD-L1 i antagonist vezivanja PD-L2.

Termin "antagonisti vezivanja PD-1" se odnosi na molekul koji smanjuje, blokira, inhibira, ukida ili ometa transdukciju signala koji nastaje usled interakcije PD-1 sa jednim partnerom ili više partnera za vezivanje, kao što su PD-L1, PD-L2. U nekim aspektima, antagonist vezivanja PD-1 je molekul koji inhibira vezivanje PD-1 za njegove partnere za vezivanje. U specifičnom aspektu, antagonist vezivanja PD-1 inhibira vezivanje PD-1 za PD-L1 i/ili PD-L2. Na primer, antagonisti vezivanja PD-1 uključuju anti-PD-1 antitela, njihove fragmente koji vezuju antigen, imunoadhezine, fuzione proteine, oligopeptide i druge molekule koji smanjuju, blokiraju, inhibiraju, ukidaju ili ometaju transdukciju signala koji nastaje usled interakcije PD-1 sa PD-L1 i/ili PD-L2. U jednom otelotvorenju, antagonist vezivanja PD-1 smanjuje negativni kostimulatorni signal posredovan pomoću ili putem proteina na ćelijskoj površini eksprimiranih na signalizaciji putem PD-1 posredovanoj T limfocitima tako da se disfunkcionalna T ćelija učini manje disfunkcionalnom (npr. poboljšanjem efektorskih odgovora na prepoznavanje antigena). U nekim aspektima, antagonist vezivanja PD-1 je anti-PD-1 antitelo. U sledećem specifičnom aspektu, antagonist vezivanja PD-1 je MDX-1106, opisan u ovom dokumentu. U drugom specifičnom aspektu, antagonist vezivanja PD-1 je Merck 3745, opisan u ovom dokumentu. U sledećem specifičnom aspektu, antagonist vezivanja PD-1 je CT-011, opisan u ovom dokumentu. U sledećem specifičnom aspektu, antagonist vezivanja PD-1 je AMP-224, opisan u ovom dokumentu.

Termin „antagonist vezivanja PD-L1“ se odnosi na molekul koji smanjuje, blokira, inhibira, ukida ili ometa transdukciju signala koja nastaje usled interakcije PD-L1 sa jednim ili više njegovih partnera za vezivanje, kao što su PD-1, B7-1. U nekim aspektima, antagonist vezivanja PD-L1 je molekul koji inhibira vezivanje PD-L1 za njegove partnere za vezivanje. U specifičnom aspektu, antagonist vezivanja PD-L1 inhibira vezivanje PD-L1 za PD-1 i/ili B7-1. U nekim aspektima, u antagoniste vezivanja PD-L1 spadaju anti-PD-L1 antitela, njihovi antigen vezujući fragmenti, imunoadhezini, fuzioni proteini, oligopeptidi i drugi molekuli koji smanjuju, blokiraju, inhibiraju, ukidaju ili ometaju transdukciju signala koji nastaje usled interakcije PD-L1 sa jednim ili više njegovih partnera za vezivanje, kao što je PD-1, B7-1. U jednom aspektu, antagonist vezivanja PD-L1 smanjuje negativni kostimulatorni signal posredovan pomoću ili putem proteina na ćelijskoj površini eksprimiranih na signalizaciji putem PD-L1 posredovanoj T limfocitima tako da se disfunkcionalna T ćelija učini manje disfunkcionalnom (npr. poboljšanjem efektorskih odgovora na prepoznavanje antigena). U nekim otelotvorenjima, antagonist vezivanja PD-L1 je anti-PD-L1 antitelo. U specifičnom aspektu, anti-PD-L1 antitelo je YW243.55.S70, opisano u ovom dokumentu. U sledećem specifičnom aspektu, anti-PD-L1 antitelo je MDX-1105, opisano u ovom dokumentu. U još jednom specifičnom aspektu, anti-PD-L1 antitelo je MPDL3280A, opisano u ovom dokumentu. U drugom specifičnom aspektu, anti-PD-L1 antitelo je MEDI 4736, opisano u ovom dokumentu.

Termin „antagonisti koji vezuju PD-L2“ se odnosi na molekul koji smanjuje, blokira, inhibira, ukida ili ometa transdukciju signala koji nastaje usled interakcije PD-L2 sa jednim ili više njegovih partnera za vezivanje, kao što je PD-1. U nekim aspektima, antagonist vezivanja PD-L2 je molekul koji inhibira vezivanje PD-L2 za njegove partnere za vezivanje. U specifičnom aspektu, antagonist vezivanja PD-L2 inhibira vezivanje PD-L2 za PD-1. U nekim aspektima, antagonisti PD-L2 uključuju anti-PD-L2 antitela, njihove antigen vezujuće fragmente, imunoadhezine, fuzione proteine, oligopeptide i druge molekule koji smanjuju, blokiraju, inhibiraju, ukidaju ili ometaju transdukciju signala koji nastaje usled interakcije PD-L2 sa jednim ili više njegovih partnera za vezivanje, kao što je PD-1. U jednom aspektu, antagonist vezivanja PD-L2 smanjuje negativni kostimulatorni signal posredovan pomoću ili putem proteina na ćelijskoj površini eksprimiranih na signalizaciji putem PD-L2 posredovanoj T limfocitima tako da se disfunkcionalna T ćelija učini manje disfunkcionalnom (npr. poboljšanjem efektorskih odgovora na prepoznavanje antigena). U nekim otelotvorenjima, antagonist vezivanja PD-L2 je imunoadhezin.

4

Izraz „aptamer“ se odnosi na molekul nukleinske kiseline koja se može vezati za ciljni molekul, kao što je polipeptid. Na primer, aptamer u ovom otkriću se može specifično vezati za polipeptid TIGIT, ili za molekul u signalnom putu koji moduliše ekspresiju TIGIT-a. Generisanje i terapeutska upotreba aptamera dobro su poznati u struci. Vidi, na primer, U.S. Pat. br. 5,475,096, i terapijsku efikasnost Macugen® (Eyetech, New York) za lečenje starosne degeneracije makule.

Termin „antagonist“ se koristi u najširem smislu, i podrazumeva bilo koji molekul koji delimično ili potpuno blokira, inhibira ili neutrališe biološku aktivnost nativnog polipeptida koji se ovde objavljuje. Na sličan način, termin „agonist“ se koristi u najširem smislu, i odnosi se na bilo koji molekul koji oponaša biološku aktivnost prirodnog polipeptida koji se ovde objavljuje. Prikladni molekuli agonista ili antagonista posebno se odnose na agonistička ili antagonistička antitela ili fragmente antitela, fragmente ili varijante aminokiselinske sekvence prirodnih polipeptida, peptida antisens oligonukleotida, malih organskih molekula itd. Postupci za identifikaciju agonista ili antagonista nekog polipeptida mogu da se sastoje od dovođenja u kontakt polipeptida sa potencijalnim agonističkim ili antagonističkim molekulom i merenje detektovane promene u jednoj ili više bioloških aktivnosti koje su inače povezane sa tim polipeptidom.

Izrazi "antagonist TIGIT" i "antagonist aktivnosti TIGIT ili ekspresijeTIGIT" koriste se podjednako, i odnose se na jedinjenje koje ometa normalno funkcionisanje TIGIT-a, bilo smanjenjem transkripcije ili translacije nukleinske kiseline koja kodira TIGIT, bilo inhibicijom ili blokiranjem polipeptidne aktivnosti TIGIT, ili na oba ova načina. Primeri TIGIT antagonista uključuju, ali nisu ograničeni na, antisens polinukleotide, interferentne RNK, katalitičke RNK, RNK-DNK himere, TIGIT-specifične aptamere, anti-TIGIT antitela, TIGIT-vezujuće fragmente anti-TIGIT antitela, TIGIT-vezujuće male molekule, TIGIT-vezujuće peptide i druge polipeptide koji se specifično vezuju za TIGIT (uključujući, ali ne ograničavajući se na, TIGIT-vezujuće fragmente jednog ili više TIGIT liganada, opciono spojenih sa jednim ili više dodatnih domena), tako da interakcija između TIGIT-antagonista i TIGIT-a dovodi do smanjenja ili prestanka aktivnosti ili ekspresije TIGIT. Stručno lice iz ove oblasti će znati da u nekim slučajevima, TIGIT antagonist može antagonizovati jednu aktivnost TIGIT, a da ne utiče na drugu aktivnost TIGIT. Na primer, poželjan TIGIT antagonist za upotrebu u nekim od ovde navedenih postupaka je TIGIT antagonist koji antagonizuje aktivnost TIGIT kao odgovor na jednu od PVR interakcije, PVRL3 interakcije ili PVRL2 interakcije, npr. bez uticaja ili sa minimalnim uticajem na bilo koje druge interakcije TIGIT.

Izrazi „PVR antagonist“ i „antagonist aktivnosti PVR ili ekspresije PVR“ koriste se podjednako, i odnose se na jedinjenje koje ometa normalno funkcionisanje PVR, bilo smanjenjem transkripcije ili translacije nukleinske kiseline koja kodira PVR, ili inhibicijom ili blokiranjem aktivnosti PVR polipeptida, ili na oba načina. Primeri PVR antagonista uključuju, ali nisu ograničeni na, antisens polinukleotide, interferentne RNK, katalitičke RNK, RNK-DNK himere, PVR-specifične aptamere, anti-PVR antitela, PVR-vezujuće fragmente anti-PVR antitela, PVR-vezujuće male molekule, PVR-vezujuće peptide i druge polipeptide koji se specifično vezuju za PVR (uključujući, ali bez ograničenja na, PVR-vezujuće fragmente jednog ili više PVR liganada, opciono spojenih sa jednim ili više dodatnih domena), tako da interakcija između PVR antagonista i PVR dovodi do smanjenja ili prestanka aktivnosti ili ekspresije PVR. Stručno lice iz ove oblasti će znati da u nekim slučajevima PVR antagonist može antagonizovati jednu aktivnost PVR bez uticaja na drugu aktivnost PVR. Na primer, poželjan PVR antagonist za upotrebu u nekim od ovde opisanih postupaka je PVR antagonist koji antagonizuje PVR aktivnost kao odgovor na interakciju TIGIT bez uticaja na interakcije PVR-CD96 i/ili PVR-CD226.

Termin „disfunkcija“, u kontekstu imunske disfunkcije, odnosi se na stanje smanjene imunske reakcije na antigensku stimulaciju. Ovaj izraz se odnosi na uobičajene elemente iscrpljenosti i/ili anergije u kojima se može dogoditi prepoznavanje antigena, ali nastali imunski odgovor nije efikasan u kontroli infekcije ili rasta tumora.

Termin „disfunkcionalan“, kako se ovde koristi, odnosi se i na refraktornost ili neresponsivnost pri prepoznavanju antigena, posebno na umanjenu sposobnost translacije prepoznavanja antigena u nishodne efektorske funkcije T ćelija, kao što je proliferacija, proizvodnja citokina (npr. IL-2) i/ili ubijanje ciljnih ćelija.

Izraz „anergija“ se odnosi na stanje neodgovaranja na antigensku stimulaciju, koje je posledica nepotpunih ili nedovoljnih signala isporučenih putem T ćelijskog receptora (npr. porast intraćelijskog Ca<+2>u odsustvu ras-aktivacije). Anergija T ćelija može nastati i stimulacijom pomoću antigena u odsustvu kostimulacije, što dovodi do toga da ćelija postane refraktorna za dalju aktivaciju antigenom čak i u kontekstu kostimulacije. Stanje neodgovaranja se često može nadjačati prisustvom interleukina-2. Anergične T ćelije ne prolaze kroz klonsku ekspanziju i/ili ne stiču efektorske funkcije.

Izraz „iscrpljenost“ se odnosi na iscrpljenost T ćelija kao stanje disfunkcije T ćelija koje nastaje zbog produžene TCR signalizacije koja se javlja tokom mnogih hroničnih infekcija i raka. Od anergije se razlikuje po tome što ne nastaje zbog nepotpune ili neispravne signalizacije, već zbog produžene signalizacije. Odlikuje se lošom efektorskom funkcijom, produženom ekspresijom inhibitornih receptora i transkripcionim stanjem različitim od stanja funkcionalnih efektorskih ili memorijskih T ćelija. Iscrpljenost sprečava optimalnu kontrolu infekcije i tumora. Iscrpljenost može nastati i zbog spoljašnjih negativnih regulatornih puteva (npr. imunoregulacionih citokina) i zbog ćelijskih intrinzičnih negativnih regulatornih (kostimulatornih) puteva (PD-1, B7-H3, B7-H4, itd.).

„Poboljšanje funkcije T ćelija“ podrazumeva podsticanje, izazivanje ili stimulisanje T ćelije da ima produženu ili pojačanu biološku funkciju, ili obnavljanje ili ponovno aktiviranje iscrpljene ili neaktivne T ćelije. Primeri poboljšanja funkcije T ćelija obuhvataju: povećanu sekreciju γ-interferona iz CD8<+>T ćelija, pojačanu proliferaciju, povećanu reaktivnost na antigene (npr. klirens virusa, patogena ili tumora) u odnosu na iste nivoe pre intervencije. U jednom otelotvorenju, nivo poboljšanja je najmanje 50%, alternativno 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 120%, 150%, 200%. Postupak merenja ovog poboljšanja poznat je stručnim licima za ovu oblast.

„Disfunkcionalni poremećaj T ćelija“ je poremećaj ili stanje T ćelija koji se odlikuje smanjenim odgovorom na antigensku stimulaciju. U jednom posebnom aspektu, disfunkcionalni poremećaj T ćelija je poremećaj koji je posebno povezan sa neprimereno povećanom signalizacijom putem PD-1. U jednom drugom aspektu, disfunkcionalni poremećaj T ćelija je onaj u kojem su T ćelije anergične ili imaju smanjenu sposobnost da luče citokine, razmnožavaju se ili vrše citolitičku aktivnost. U jednom posebnom aspektu, smanjeni odgovor dovodi do neefikasne kontrole patogena ili tumora koji eksprimiraju imunogen. Primeri disfunkcionalnih poremećaja T ćelija koji se odlikuju disfunkcijom T ćelija obuhvataju nerešenu akutnu infekciju, hroničnu infekciju i imunitet tumora.

„Imunitet tumora“ se odnosi na proces u kome tumori izbegavaju imunsko prepoznavanje i klirens. Tako, kao terapijski koncept, imunitet tumora se "leči" kada je takvo izbegavanje oslabljeno, a imunski sistem prepoznaje i napada tumore. Primeri prepoznavanja tumora uključuju vezivanje tumora, skupljanje tumora i klirens tumora.

„Imunogenost“ se odnosi na sposobnost određene supstance da izazove imunski odgovor. Tumori su imunogeni, i pojačavanje imunogenosti tumora pomaže u klirensu tumorskih ćelija imunskim odgovorom. Primeri za poboljšanje imunogenosti tumora uključuju, ali nisu ograničeni, na lečenje antagonistom koji vezuje PD-1 osu (npr. anti-PD-L1 antitela i TIGIT inhibitor (npr. anti-TIGIT antitela).

„Produženi odgovor“ se odnosi na produženi efekat na smanjenje rasta tumora nakon prestanka lečenja. Na primer, veličina tumora može ostati ista ili se smanjiti u odnosu na veličinu na početku faze primene leka. U nekim otelotvorenjima, produženi odgovor ima trajanje najmanje isto kao i trajanje lečenja, najmanje 1,5x, 2,0x, 2,5x ili 3,0x od dužine trajanja lečenja.

Termin „antitelo“ obuhvata monoklonska antitela (uključujući antitela kompletne dužine koja imaju Fc region imunoglobulina), jedinjenja antitela sa poliepitopnom specifičnošću, multispecifična (npr. bispecifična antitela, dijatela i jednolančane molekule, kao i fragmente antitela (npr. Fab, F(ab')2i Fv). Termin „imunoglobulin“ (Ig) se ovde podjednako koristi kao i termin „antitelo“.

Osnovna 4-lančana jedinica antitela je heterotetramerni glikoprotein sastavljen od dva identična laka (L) lanca i dva identična teška (H) lanca. IgM antitelo se sastoji od 5 baznih heterotetramernih jedinica, i jednog dodatnog polipeptida koji se zove J lanac, i sadrži 10 antigen vezujućih mesta, dok IgA antitela sadrže od 2-5 baznih 4-lančanih jedinica koje mogu da polimerizuju proizvodeći polivalentne skupove u kombinaciji sa J lancem. U slučaju IgG, 4-lančana jedinica je obično oko 150.000 daltona. Svaki L lanac je povezan sa H lancem jednom kovalentnom disulfidnom vezom, dok su dva H lanca povezana jedan za drugi sa jednom ili više disulfidnih veza, u zavisnosti od izotipa H lanca. Svaki H i L lanac takođe ima pravilno razmaknute intralančane disulfidne mostove. Svaki H lanac ima na N-terminusu varijabilni domen (VH), a zatim tri konstantna domena (CH) za svaki od lanaca α i γ, i četiri CHdomena za izotip μ i izotip ε. Svaki L lanac ima na N-terminusu varijabilni domen (VL), a zatim i konstantni domen na svom drugom kraju. VLje poravnat sa VH, a CLje poravnat sa prvim konstantnim domenom teškog lanca (CH1). Veruje se da određeni aminokiselinski ostaci formiraju interfejs između varijabilnih domena lakog i teškog lanca. Upareni VHi VLčine jedinstveno mesto za vezivanje antigena. O strukturi i osobinama različitih klasa antitela pogledajte, na primer, Basic and Clinical Immunology, 8. izdanje, Daniel P. Sties, Abba I. Terr i Tristram G. Parsolw (ur.), Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994, str.71 i poglavlje 6. L lanac bilo koje vrste kičmenjaka može se pripisati jednom od dva jasno izražena tipa, koji se zovu kapa i lambda, na bazi aminokiselinskih sekvenci njihovih konstantnih domena. U zavisnosti od aminokiselinske sekvence konstantnog domena njihovih teških lanaca (CH), imunoglobulini mogu biti pripisani različitim klasama ili izotipovima. Postoji pet klasa imunoglobulina: IgA, IgD, IgE, IgG i IgM, koji imaju teške lance označene sa α, δ, ε, γ i µ, tim redom. Klasa γ i α su dalje podeljene na potklase na bazi relativno malih razlika CH sekvence i funkcije, npr. kod ljudi su eksprimirane sledeće potklase: IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3, IgG4, IgA1 i IgA2.

Izraz „varijabilni region“ ili „varijabilni domen“ antitela se odnosi na aminoterminalne domene teškog ili lakog lanca tog antitela. Varijabilni domeni teškog i lakog lanca označavaju se i sa „VH“, odnosno „VL“. Ti domeni su po pravilu najpromenljiviji delovi antitela (u odnosu na druga antitela iste klase) i sadrže mesta vezivanja antigena.

Termin „varijabilni“ se odnosi na činjenicu da se određeni segmenti varijabilnih domena u velikoj meri razlikuju po sekvenci u različitim antitelima. V domen posreduje u vezivanju antigena, i definiše specifičnost određenog antitela prema njegovom specifičnom antigenu. Međutim, varijabilnost nije ravnomerno raspoređena u celom rasponu varijabilnih domena. Koncentrisana je u tri segmenta koji se nazivaju hipervarijabilni regioni (HVR) u varijabilnim domenima kako lakog tako i teškog lanca. Više konzervirani delovi varijabilnih domena nazivaju se okvirni regioni (FR). Svaki varijabilni domen nativnih teških i lakih lanaca obuhvata četiri FR regiona, koji u velikoj meri zauzimaju konfiguraciju beta-ravni, povezanu sa tri HVR regiona, koji formiraju petlje koje povezuju, a u nekim slučajevima i formiraju, deo konfiguracije beta-ravni. HVR regioni u svakom lancu se drže zajedno u neposrednoj blizini FR regiona, a sa HVR regionima iz drugog lanca doprinose stvaranju antigen-vezujućih mesta (videti Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, peto izdanje, National Institute of Health, Bethesda, MD (1991)). Konstantni domeni nisu direktno uključeni u vezivanje antitela za antigen, ali pokazuju različite efektorske funkcije, kao što je učešće antitela u ćelijskoj citotoksičnosti zavisnoj od antitela.

Termin „monoklonsko antitelo“, kako se ovde koristi, odnosi se na antitelo dobijeno od populacije suštinski homogenih antitela, tj. pojedinačna antitela koja sadrže populaciju su identična, osim mogućih prirodnih mutacija i/ili posttranslacionih modifikacija (npr. izomerizacija, amidacija) koje mogu biti prisutne u manjim količinama. Monoklonska antitela su veoma specifična, usmerena su na jedno antigensko mesto. Nasuprot preparatima poliklonskih antitela, koji tipično sadrže različita antitela usmerena na različitih determinante (epitope), svako monoklonsko antitelo je usmereno na jednu determinantu na antigenu. Pored specifičnosti, prednost monoklonskih antitela je što su sintetisana kulturom hibridoma, i nisu kontaminirana drugim imunoglobulinima. Reč „monoklonsko“ ukazuje na karakter antitela koje je dobijeno iz suštinski homogene populacije antitela, i ne treba da se tumači tako da se zahteva proizvodnja antitela nekim određenim postupkom. Na primer, monoklonska antitela koja se koriste shodno ovom pronalasku se mogu proizvesti različitim tehnikama, uključujući, na primer, postupak hibridoma (npr. Kohler i Milstein., Nature, 256:495-97 (1975); Hongo et al., Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995), Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2. izd.1988); Hammerling et al., u: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)), rekombinantni DNK postupci (videti npr. U.S. Patent br.4,816,567), tehnologije displeja faga (videti npr. Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol.

340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); i Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132 (2004), i tehnologije za proizvodnju humanih antitela ili antitela poput humanih kod životinja koje imaju delove ili sve humane imunoglobulinske lokuse ili gene koji kodiraju ljudske imunoglobulinske sekvence (videti npr. WO1998/24893; WO1996/34096; WO1996/33735; WO1991/10741; Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature 362: 255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immunol. 7:33 (1993); U.S. Patent br.5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; i 5,661,016; Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368: 812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnol. 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996); i Lonberg i Huszar, Intern. Rev. Immunol.13: 65-93 (1995).

Termin „golo antitelo“ se odnosi na antitelo koje nije konjugovano sa citotoksičnim ostatkom ili radiooznakom.

Termini „antitelo pune dužine“, „netaknuto antitelo“ i „celo antitelo“ se u ovom dokumentu podjednako koriste za označavanje antitela u svom suštinski netaknutom obliku, suprotno od fragmenata antitela. Specifično cela antitela obuhvataju antitela sa teškim i lakim lancima, uključujući Fc region. Konstantni domeni mogu biti konstantni domeni nativne sekvence (npr. konstantni domeni humane nativne sekvence) ili varijante njihove aminokiselinske sekvence. U nekim slučajevima, netaknuto antitelo može imati jednu ili više efektorskih funkcija.

„Fragment antitela“ sadrži deo netaknutog antitela, poželjno antigen vezujući i/ili varijabilni region netaknutog antitela. Primeri za fragmente antitela uključuju Fab, Fab’, F(ab’)2i Fv fragmente; dijatela; linearna antitela (videti U.S. Patent 5,641,870, primer 2; Zapata et al., Protein Eng. 8(10): 1057-1062 [1995]); molekule antitela sa jednim lancem; i multispecifična antitela formirana iz fragmenata antitela. Digestija antitela papainom dala je dva identična antigen-vezujuća fragmenta, pod nazivom „Fab“ fragmenti, a ostatak je „Fc“ fragment, oznaka koja odražava sposobnost lake kristalizacije. Fab fragment se sastoji od čitavog L lanca uz domen variabilnog regiona H lanca (VH), i prvog konstantnog domena jednog teškog lanca (CH1). Svaki Fab fragment je jednovalentan u odnosu na vezivanje antigena, tj. ima jedno jedino mesto za vezivanje antigena. Obrada antitela pepsinom daje jedinstveni veliki F(ab’)2fragment koji približno odgovara dvema Fab fragmentima

4

povezanim disulfidom koji imaju različitu antigen vezujuću aktivnost, a koji je i dalje sposoban za unakrsno vezivanje antigena. Fab’ fragmenti se razlikuju od Fab fragmenata po tome što imaju nekoliko dodatnih ostataka na karboksi terminusu CH1 domena, uključujući jedan ili više cisteina iz regiona šarke antitela. Fab’-SH je ovde oznaka za Fab’ u kojoj ostatak cisteina konstantnih domena nosi slobodnu tiol grupu. F(ab’)2fragmenti antitela su prvobitno proizvedeni kao parovi Fab’ fragmenata koji imaju između sebe šarke cisteina. Takođe su poznati i drugi hemijski sklopovi fragmenata antitela.

Fc fragment sadrži karboksi-terminalne delove oba H lanca koji se drže zajedno disulfidima. Efektorske funkcije antitela se određuju sekvencama u Fc regionu, a region takođe prepoznaju Fc receptori (FcR) koji se nalaze na određenim vrstama ćelija.

„Fv“ je minimalni fragment antitela koji sadrži kompletno mesto za prepoznavanje i vezivanje antigena. Ovaj fragment se sastoji od dimera varijabilnog regiona domena jednog teškog i jednog lakog lanca u čvrstoj, nekovalentnoj asocijaciji. Iz preklapanja ova dva domena nastaje šest hipervarijabilnih petlji (po 3 petlje iz H i L lanca) koje pomažu aminokiselinskim ostacima za vezivanje antigena i pružaju specifičnost vezivanja antigena za antitelo. Međutim, čak i jedan varijabilni domen (ili polovina Fv koja sadrži samo tri HVR regiona specifična za antigen) ima sposobnost prepoznavanja i vezivanja antigena, ali sa nižim afinitetom od celog mesta vezivanja.

„Fv sa jednim lancem“, skraćeno „sFv“ ili „scFv“, su fragmenti antitela koji sadrže domene VHi VLantitela povezanih u jedan polipeptidni lanac. Poželjno, sFv polipeptid dalje sadrži polipeptidni linker između VHi VLdomena koji omogućava da sFv formira željenu strukturu za vezivanje antigena. Pregled fragmenata sFv potražite kod Pluckthun u The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg i Moore izd., Springer-Verlag, New York, str.269-315 (1994).

„Funkcionalni fragmenti“ antitela iz ovog otkrića se sastoje od dela netaknutog antitela, koje obično sadrži antigen vezujući ili varijabilni region netaknutog antitela ili Fc region antitela koji zadržava ili ima modifikovanu sposobnost vezivanja FcR. Primeri fragmenata antitela obuhvataju linearna antitela; jednolančane molekule antitela, i multispecifična antitela nastala od fragmenata antitela.

Termin „dijatela“ se odnosi na male fragmente antitela dobijene konstrukcijom fragmenata sFv (pogledajte prethodni pasus) sa kratkim linkerima (oko 5-10 ostataka) između VHi VLdomena, tako da se postigne interlančano, ali ne i intralančano uparivanje V domena, što daje dvovalentni fragment, tj. fragment koji ima dva mesta za vezivanje antigena. Bispecifična dijatela su heterodimeri od dva "ukrštena" sFv fragmenta u kojima su prisutni VHi VLdomeni dva antitela na različitim polipeptidnim lancima. Dijatela su detaljnije opisana, na primer, u EP404,097; WO93/11161; i Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993).

Monoklonska antitela iz ovog pronalaska specifično obuhvataju „himerna“ antitela (imunoglobuline), kod kojih je deo teškog i/ili lakog lanca identičan ili homolog sa odgovarajućim sekvencama antitela dobijenih od posebne vrste ili koji pripadaju posebnoj klasi ili potklasi antitela, dok je ostatak lan(a)ca identičan ili homolog sa odgovarajućim sekvencama antitela dobijenih od neke druge vrste, ili koje pripadaju drugoj klasi ili potklasi antitela, kao i fragmente takvih antitela, pod uslovom da ispoljavaju željenu biološku aktivnost (U.S. Patent br. 4,816,567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). Himerna antitela od interesa ovde uključuju PRIMATIZED<®>antitela, pri čemu je antigen-vezujući region antitela izveden iz antitela koje se proizvodi npr. imunizacijom makaki majmuna antigenom od interesa. Kako se ovde koristi, "humanizovano antitelo" se odnosi na podskup „himernih antitela“.

„Humanizovani“ oblici ne-humanih (npr. mišjih) antitela su himerna antitela koja sadrže minimalnu sekvencu dobijenu iz ne-humanog imunoglobulina. U jednom otelotvorenju, humanizovano antitelo je humani imunoglobulin (antitelo primalac) kod koga su ostaci iz HVR regiona primaoca (definisani u nastavku) zamenjeni ostacima HVR regiona vrste koja nije ljudskog porekla (antitelo donor), kao što je miš, pacov, kunić ili ne-humani primat koji ima željenu specifičnost, afinitet i/ili kapacitet. U nekim slučajevima, ostaci okvirnog regiona (FR) humanog imunoglobulina zamenjeni su odgovarajućim ne-humanim ostacima. Nadalje, humanizovana antitela mogu da sadrže ostatke koji nisu nađeni u antitelu primaocu ili u donorskom antitelu. Ovakve modifikacije se mogu izvoditi da se dodatno poboljšaju performanse antitela, kao što je afinitet vezivanja. Po pravilu, humanizovano antitelo će sadržati uglavnom sve od najmanje jednog, a obično dva varijabilna domena, u kojima sve ili gotovo sve hipervarijabilne petlje odgovaraju onima iz humane imunoglobulinske sekvence, i svi ili gotovo svi FR regioni su oni iz humane imunoglobulinske sekvence, iako FR regioni mogu sadržati jednu ili više pojedinačnih supstitucija za ostatak FR koje poboljšavaju performanse antitela, poput afiniteta vezivanja, izomerizacije, imunogenosti, itd. Broj ovih aminokiselinskih supstitucija u FR tipično nije veći od 6 u H lancu, i nije veći od 3 u L lancu. Humanizovano antitelo će opciono da sadrži i barem deo konstantnog regiona imunoglobulina (Fc), tipično humanog imunoglobulina. Za više detalja pogledajte: Jones et al. Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); i Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992). Takođe pogledajte, na primer, Vaswani i Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle i Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994); i U.S. Pat. br.6,982,321 i 7,087,409.

„Humano antitelo“ je ono antitelo koje poseduje aminokiselinsku sekvencu koja odgovara onoj u antitelu proizvedenom od strane čoveka i/ili napravljenoj pomoću bilo koje od tehnika za stvaranje ljudskih antitela kako se ovde objavljuje. Ova definicija humanog antitela specifično isključuje humanizovano antitelo koje sadrži antigen-vezujuće ostatke koji nisu ljudskog porekla. Humana antitela se mogu proizvoditi korišćenjem različitih tehnika poznatih u struci, uključujući biblioteke prikaza faga. Hoogenboom i Winter, J. Mo. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991). Takođe dostupni za pripremu humanih monoklonskih antitela su postupci opisani u radu Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, str. 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991). Takođe pogledajte van Dijk i van de Vinkel, Kur. Opin. Pharmacol., 5: 368-74 (2001). Ljudska antitela se mogu pripremiti davanjem antigena transgenoj životinji koja je modifikovana tako da proizvodi takva antitela kao odgovor na antigenski izazov, ali čiji endogeni lokusi su onemogućeni, npr. imunizovani ksenomiševi (videti npr. U.S. Pat. br.

6.075.181 i 6.150.584 u vezi sa tehnologijom XENOMOUSE™). Takođe pogledajte, na primer, Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006) vezano za ljudska antitela koja su generisana tehnologijom hibridoma humane B-ćelije.

Termin „hipervarijabilni region“, „HVR“ ili „HV“, kada se ovde koristi, odnosi se na regione varijabilnog domena antitela koji su hipervarijabilni u sekvenci i/ili formiraju strukturno definisane petlje. Generalno, antitela obuhvataju šest HVR regiona, tri u VH (H1, H2, H3) i tri u VL (L1, L2, L3). U nativnim antitelima, H3 i L3 pokazuju najviše raznolikosti od šest HVR regiona, a veruje se da naročito H3 ima jedinstvenu ulogu u dodeli fine specifičnosti antitelima. Pogledati, npr. Xu et al., Immunity 13:37-45 (2000); Johnson i Wu, u Methods in Molecular Biology 248:1-25 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003). Zapravo, antitela koja se prirodno pojavljuju kod vrsta iz porodice kamelida, koja se sastoje samo od teškog lanca su funkcionalna i stabilna u odsustvu lakog lanca. Pogledati npr. Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-448 (1993); Sheriff et al., Nature Struct. Biol. 3:733-736 (1996).

U upotrebi je određeni broj razgraničenja HVR regiona i ona su ovde obuhvaćena. Kabatovi regioni za određivanje komplementarnosti (CDR) bazirani su na varijabilnosti sekvence i najčešće se koriste (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. izd. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Za

4

razliku od toga, Čotija ukazuje na lokaciju strukturnih petlji (Chothia i Lesk, J. Mol. Biol.

196:901-917 (1987)). HVR regioni AbM predstavljaju kompromis između Kabatovih HVR regiona i Čotijinih strukturnih petlji, a koristi ih softver za modeliranje AbM antitela kompanije Oxford Molecular. HVR regioni „kontakta“ su bazirani na analizi raspoloživih kompleksnih kristalnih struktura. Ostaci iz svakog od ovih HVR regiona su navedeni u nastavku.

Petlja Kabat AbM Čotija Kontakt

L1 L24-L34 L24-L34 L26-L32 L30-L36

L2 L50-L56 L50-L56 L50-L52 L46-L55

L3 L89-L97 L89-L97 L91-L96 L89-L96

H1 H31-H35B H26-H35B H26-H32 H30-H35B (Kabatova numeracija)

H1 H31-H35 H26-H35 H26-H32 H30-H35 (Čotijina numeracija)

H2 H50-H65 H50-H58 H53-H55 H47-H58

H3 H95-H102 H95-H102 H96-H101 H93-H101

HVR regioni mogu sadržati „proširene HVR regione“ na sledeći način: 24-36 ili 24-34 (L1), 46-56 ili 50-56 (L2) i 89-97 ili 89-96 (L3) u VL lancu i 26-35 (H1), 50-65 ili 49-65 (H2) i 93-102, 94-102 ili 95-102 (H3) u VH lancu. Ostaci varijabilnog domena su numerisani prema Kabatu et al., supra, za svaku od ovih definicija.

Izrazi „numerisanje ostataka varijabilnog domena kao u Kabatu“ ili „numerisanje pozicije aminokiselina kao u Kabatu“, i njihove varijacije, odnose se na sistem numeracije koji se koristi za varijabilne domene teškog lanca ili varijabilne domene lakog lanca u kompilaciji antitela u Kabat et al. supra. Pri korišćenju ovog sistema numeracije, stvarna linearna aminokiselinska sekvenca može sadržati manje ili više aminokiselina što odgovara skraćivanju, odnosno umetanju u FR ili HVR varijabilnog domena. Na primer, varijabilni domen teškog lanca može da sadrži jedan pojedinačni aminokiselinski unos (ostatak 52a prema Kabatu) nakon ostatka 52 u H2, i ubačene ostatke (npr. ostaci 82a, 82b i 82c itd. prema Kabatu) nakon ostatka 82 FR teškog lanca. Numeracija ostataka prema Kabatu se može odrediti za dato antitelo poravnavanjem u oblastima homologije sekvence antitela sa „standardnom“ numerisanom Kabatovom sekvencom.

Ostaci „okvirnih“ ili „FR“ regiona su oni ostaci varijabilnog domena koji nisu ostaci HVR regiona, kako su ovde definisani.

„Humani okvir konsenzusa“ ili „akceptorski humani okvir“ je okvir koji predstavlja najčešće ostatke aminokiselina u izboru okvirnih sekvenci VL ili VH humanog imunoglobulina. Po pravilu, izbor VL ili VH sekvenci humanog imunoglobulina je iz podgrupe sekvenci varijabilnog domena. Po pravilu, podgrupa sekvenci je podgrupa kao u Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. izd. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991). Primeri za VL obuhvataju, podgrupa može biti podgrupa kapa I, kapa II, kapa III ili kapa IV kao u Kabat et al., supra. Uz to, za VH, podgrupa može biti podgrupa I, podgrupa II ili podgrupa III kao u Kabat et al., supra. Alternativno, humani okvir konsenzusa se može izvesti iz gorenavedenog, gde se određeni ostaci, na primer, kad se ostatak humanog okvira bira na osnovu svoje homologije sa okvirom donora usklađivanjem sekvence okvira donora sa zbirkom različitih sekvenci humanih okvira. Akceptorski humani okvir „izveden iz“ okvira humanog imunoglobulina ili humanog okvira konsenzusa može sadržati istu njegovu aminokiselinsku sekvencu ili može sadržati postojeće promene aminokiselinske sekvence. U nekim otelotvorenjima, broj postojećih aminokiselinskih promena je 10 ili manje, 9 ili manje, 8 ili manje, 7 ili manje, 6 ili manje, 5 ili manje, 4 ili manje, 3 ili manje, ili 2 ili manje.

„VH podgrupa III okvira konsenzusa“ podrazumeva sekvencu konsenzusa dobijenu iz aminokiselinskih sekvenci u varijabilnoj teškoj podgrupi III prema Kabat et al. supra. U jednom otelotvorenju, VH podgrupa III okvira konsenzusa aminokiselinske sekvence sadrži najmanje deo ili svaku od sledećih sekvenci: (HC-FR1)

„VL kapa I okvir konsenzusa“ podrazumeva sekvencu konsenzusa dobijenu iz aminokiselinskih sekvenci u varijabilnoj lakoj kapa podgrupi I prema Kabat et al., supra. U jednom otelotvorenju, VH podgrupa I okvira konsenzusa aminokiselinske sekvence sadrži najmanje deo ili svaku od sledećih sekvenci: (LC-FR1)

(LC-FR4) (SEQ ID NO:32).

„Modifikacija aminokiselina“ na određenom položaju, npr. u Fc regionu, odnosi se na supstituciju ili brisanje određenog ostatka, ili umetanje najmanje jednog aminokiselinskog ostatka pored navedenog ostatka. Umetanje „pored“ određenog ostatka znači umetanje unutar jednog do dva ostatka od njega. Umetanje može biti N-terminalno ili C-terminalno u odnosu

4

na određeni ostatak. Poželjna aminokiselinska modifikacija ovde je supstitucija. Antitelo „zrelog afiniteta“ je ono sa jednim ili više izmena u jednom ili više HVR-ova, što dovodi do poboljšanja afiniteta antitela prema antigenu, u poređenju sa matičnim antitelom koji ne poseduje te izmene. U jednom otelotvorenju, afinitetno zrelo antitelo ima nanomolarne ili čak pikomolarne afinitete prema ciljnom antigenu. Afinitetno zrela antitela se proizvode postupcima poznatim u struci. Na primer, Marks et al. Bio/Technology 10:779-783 (1992) opisuju sazrevanje afiniteta pomoću mešanja VH i VL domena. Slučajna mutageneza HVR-a i/ili okvirnih ostataka opisuje se, na primer, u: Barbas et al. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91:3809-3813 (1994); Schier et al. Gene 169:147-155 (1995); Yelton et al. J. imunol.

155:1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol.154(7):3310-9 (1995); and Hawkins et al, J. Mol. Biol.226:889-896 (1992).

Kako se ovde koristi, termin „specifično se vezuje za“ ili je „specifičan za“ odnosi se na merljive i reproduktivne interakcije poput vezivanja između cilja i antitela, što je odlučujuće za prisustvo cilja u prisustvu heterogene populacije molekula, uključujući i biološke molekule. Na primer, antitelo koje se specifično vezuje za cilj (što može biti epitop) je antitelo koje se vezuje za ovaj cilj sa većim afinitetom, aviditetom, lakše i/ili dugotrajnije nego što se vezuje za druge ciljeve. U jednom otelotvorenju, obim vezivanja antitela za nepovezani cilj manji je oko 10% od vezivanja antitela za cilj kao što je izmereno, npr., radioimunotestom (RIA). U određenim otelotvorenjima, antitelo koje se specifično vezuje za cilj ima konstantu disocijacije (Kd) ≤ 1μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM ili ≤ 0,1 nM. U određenim otelotvorenjima, antitelo se specifično vezuje za epitop na proteinu koji je konzerviran među proteinima različitih vrsta. U drugom otelotvorenju, specifično vezivanje može da podrazumeva, ali ne zahteva isključivo vezivanje.

Kako se ovde koristi, termin „imunoadhezin“ označava molekule slične antitelu koji kombinuju specifičnost vezivanja heterologog proteina („adhezin“) sa efektorskim funkcijama konstantnih domena imunoglobulina. Strukturno, imunoadhezini se sastoje od fuzije aminokiselinske sekvence sa željenom specifičnošću vezivanja koja je drugačija od mesta prepoznavanja i mesta vezivanja antigena nekog antitela (tj. „heterologa“) i sekvence konstantnog domena imunoglobulina. Adhezinski deo imunoadhezinskog molekula tipično je susedna aminokiselinska sekvenca koja sadrži najmanje mesto vezivanja receptora ili liganda. Sekvenca konstantnog domena imunoglobulina u imunoadhezinu može se dobiti iz bilo kog imunoglobulina, kao što su IgG-1, IgG-2 (uključujući IgG2A i IgG2B), IgG-3, ili IgG-4 podtipovi, IgA (uključujući IgA-1 i IgA-2), IgE, IgD ili IgM. Ig fuzije poželjno sadrže supstituciju domena ovde opisanog polipeptida ili antitela umesto najmanje jednog

4

varijabilnog regiona u molekulu Ig. U posebno poželjnom otelotvorenju, fuzija imunoglobulina sadrži region šarke, CH2 i CH3, ili region šarke, CH1, CH2 i CH3 molekula IgG1. Za proizvodnju fuzija imunoglobulina vidi i US Patent br. 5,428,130 od 27. juna1995. Na primer, korisni imunoadhezini kao drugi medikamenti korisni za kombinovanu terapiju ovde obuhvataju polipeptide koji sadrže vanćelijske ili PD-1 vezujuće delove PD-L1 ili PD-L2, ili vanćelijske delove ili PD-L1 ili PD-L2 vezujuće delove PD-1, fuzionisane u konstantni domen imunoglobulinske sekvence, kao što je PD-L1 ECD-Fc, PD-L2 ECD-Fc, odnosno PD-1 ECD-Fc. Kombinacije imunoadhezina Ig Fc i ECD receptora ćelijske površine ponekad se nazivaju i rastvorljivim receptorima.

„Fuzioni protein“ i „fuzioni polipeptid“ odnose se na polipeptid koji ima dva dela koja su kovalentno povezana, pri čemu, svaki deo je polipeptid koji ima neko različito svojstvo. Svojstvo može biti biološko, poput aktivnosti in vitro ili in vivo. Svojstvo može biti i jednostavno hemijsko ili fizičko svojstvo, poput vezivanja za ciljni molekul, katalize reakcije itd. Dva dela mogu biti direktno povezana jednom peptidnom vezom ili peptidnim linkerom, ali su jedan s drugim u okviru čitanja.

„PD-1 oligopeptid“, „PD-L1 oligopeptid“ ili „PD-L2 oligopeptid“ je oligopeptid koji se vezuje, poželjno specifično, za PD-1, PD-L1 odnosno PD-L2 negativni kostimulatorni polipeptid, uključujući receptor, ligand, odnosno signalnu komponentu, kako je ovde opisano. Takvi oligopeptidi se mogu hemijski sintetisati korišćenjem poznatih postupaka za sintezu oligopeptida, ili se mogu pripremiti i prečistiti pomoću rekombinantne tehnologije. Takvi oligopeptidi tipično imaju dužinu od najmanje oko 5 aminokiselina, alternativno najmanje oko 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, ili 100 aminokiselina, ili više. Takvi oligopeptidi se mogu identifikovati dobro poznatim tehnikama. U vezi s tim, napominje se da su tehnike za pretraživanje oligopeptidnih biblioteka radi pronalaženja oligopeptida koji su sposobni da se specifično vežu za polipeptidni cilj dobro poznate u struci (vidi npr. US Patent br. 5,556,762, 5,750,373, 4,708,871, 4,833,092, 5,223,409, 5,403,484, 5,571,689, 5,663,143; PCT Publication br. WO 84/03506 i WO84/03564; Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81:3998-4002 (1984); Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82:178-182 (1985); Geysen et al., u Synthetic Peptides as Antigens, 130-149 (1986); Geysen et al., J. Immunol. Meth., 102:259-274 (1987); Schoofs et al., J. Immunol., 140:611-616 (1988), Cwirla, S. E. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378 (1990); Lowman, H.B. et

4

al. Biochemistry, 30:10832 (1991); Clackson, T. et al. Nature, 352:624 (1991); Marks, J. D. et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991); Kang, A.S. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8363 (1991), i Smith, G. P., Current Opin. Biotechnol., 2:668 (1991).

„Blokirajuće“ antitelo ili „antagonističko“ antitelo je ono koje inhibira ili smanjuje biološku aktivnost antigena sa kojim se vezuje. U nekim otelotvorenjima, blokirajuća antitela ili antagonistička antitela značajno ili u potpunosti inhibiraju biološku aktivnost antigena. Anti-PD-L1 antitela iz pronalaska blokiraju signalizaciju putem PD-1 tako da obnavljaju funkcionalni odgovor T ćelija (npr. proliferaciju, proizvodnju citokina, ubijanje ciljnih ćelija) iz nefunkcionalnog stanja u stimulaciju antigenom.

„Agonist“ ili aktivirajuće antitelo je ono koje pojačava ili pokreće signalizaciju antigenom za koji se vezuje. U nekim otelotvorenjima, agonistička antitela uzrokuju ili aktiviraju signalizaciju bez prisustva prirodnog liganda.

Termin „Fc region“ ovde se koristi za definisanje C-terminalnog regiona teškog lanca imunoglobulina, uključujući Fc regione nativne sekvence i varijante Fc regiona. Iako granice Fc regiona teškog lanca imunoglobulina mogu da variraju, Fc region teškog lanca humanog IgG je obično definisan tako da se proteže od aminokiselinskog ostatka na položaju Cis226 ili od Pro230 do svog karboksi terminusa. C-terminalni lizin (ostatak 447 prema EU sistemu numerisanja) Fc regiona može da se ukloni, na primer, tokom stvaranja ili prečišćavanja antitela, ili rekombinantnim inženjeringom nukleinske kiseline koja kodira teški lanac antitela. Shodno tome, kompozicija netaknutih antitela može da sadrži populacije antitela sa uklonjenim ostacima K447, populacije antitela bez uklonjenih ostataka K447 i populacije antitela koja imaju smešu antitela sa ostacima i bez ostataka K447. Prikladni Fc regioni sa nativnom sekvencom za upotrebu u antitelima iz ovog pronalaska uključuju humani IgG1, IgG2 (IgG2A, IgG2B), IgG3 i IgG4.

„Fc receptor“ ili „FcR“ opisuje receptor koji se vezuje za Fc region antitela. Poželjni FcR je humani FcR nativne sekvence. Pored toga, poželjni FcR je onaj koji vezuje IgG antitelo (gama receptor), i uključuje receptore potklasa FcγRI, FcγRII i FcγRIII, uključujući alelne varijante i alternativno splajsovane oblike tih receptora, FcγRII receptori uključuju FcγRIIA („aktivacioni receptor“) i FcγRIIB („inhibitorni receptor“), koji imaju slične aminokiselinske sekvence koje se prvenstveno razlikuju po svojim citoplazmatskim domenima. Aktivacioni receptor FcγRIIA sadrži imunoreceptorski motiv za aktivaciju na bazi tirozina (ITAM) u svom citoplazmatskom domenu. Inhibitorni receptor FcγRIIB sadrži imunoreceptorski motiv za inhibiciju na bazi tirozina (ITIM) u svom citoplazmatskom domenu (videti M. Daëron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997). Pregled FcR daje se u

4

Ravetch i Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4: 25-34 (1994); i de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126: 330-41 (1995). Ostali FcR, uključujući i one koji će se identifikovati u budućnosti, ovde su obuhvaćeni izrazom „FcR“.

Termin „Fc receptor“ ili „FcR“ takođe obuhvata neonatalni receptor, FcRn, koji je odgovoran za transfer IgG majke na fetus. Guyer et al., J. Immunol.117: 587 (1976) i Kim et al., J. Immunol.24: 249 (1994). Postupci za merenje vezivanja za FcRn su poznati (vidi npr. Ghetie i Ward, Immunol. Today 18: (12): 592-8 (1997); Ghetie et al., Nature Biotechnology 15 (7): 637-40 (1997); Hinton et al., J. Biol. Chem.279 (8): 6213-6 (2004); WO 2004/92219 (Hinton et al.). Vezivanje za humani FcRn in vivo i serumski poluživot humanih FcRn polipeptida visokog afiniteta za vezivanje mogu se testirati npr. kod transgenskih miševa ili transficiranih humanih ćelijskih linija koje eksprimiraju humani FcRn, ili kod primata kojima se daju polipeptidi sa varijantom Fc regiona. WO2004/42072 (Presta) opisuje varijante antitela sa poboljšanim ili smanjenim vezivanjem za FcR. Videti takođe npr. Shields et al., J. Biol. Chem.9(2): 6591-6604 (2001).

Izraz „suštinski smanjen“ ili „suštinski drugačiji“, kako se ovde koristi, označava dovoljno visok stepen razlike između dve numeričke vrednosti (tipično jedne koja je povezana sa molekulom i druge povezane sa referentnim/komparatorskim molekulom) tako da stručno lice iz ove oblasti smatra razliku između dve vrednosti statistički značajnom u kontekstu biološke odlike merene navedenim vrednostima (npr. Kd vrednosti). Razlika između pomenute dve vrednosti je, na primer, veća od oko 10%, veća od oko 20%, veća od oko 30%, veća od oko 40% i/ili veća od oko 50% kao funkcija vrednosti za referentni/komparativni molekul.

Izraz „suštinski sličan“ ili „u suštini isti“, kako se ovde koristi, označava dovoljno visok stepen sličnosti između dve numeričke vrednosti (na primer, jedne koja je povezana sa antitelom iz ovog pronalaska i druge povezane sa referentnim/komparatornim antitelom) tako da stručno lice iz ove oblasti smatra razliku između dve vrednosti zanemarljivom ili bez biološkog i/ili statističkog značaja u kontekstu biološke odlike merene navedenim vrednostima (npr., Kd vrednosti). Razlika između pomenute dve vrednosti je, na primer, manja od oko 50%, manja od oko 40%, manja od oko 30%, manja od oko 20%, i/ili manja od oko 10% kao funkcija referentne/komparativne vrednosti.

„Nosači“, kako se ovde koristi, obuhvataju farmaceutski prihvatljive nosače, ekscipijense ili stabilizatore koji su netoksični za ćelije ili sisare koji su njima izloženi pri upotrebljenim dozama i koncentracijama. Često je fiziološki prihvatljiv nosač vodeni pH puferovani rastvor. Primeri za fiziološki prihvatljive nosače uključuju pufere, poput fosfata,

4

citrata i drugih organskih kiselina; antioksidanse, uključujući askorbinsku kiselinu; polipeptid male molekulske mase (manje od oko 10 ostataka); proteine, kao što su albumin iz seruma, želatin ili imunoglobulini; hidrofilne polimere, poput polivinilpirolidona; aminokiseline, kao što je glicin, glutamin, asparagin, arginin ili lizin; monosaharide, disaharide i druge ugljene hidrate, uključujući glukozu, manozu ili dekstrine; helatne agense, kao što je EDTA; šećerne alkohole, kao što je manitol ili sorbitol; kontrajone koji stvaraju soli kao što je natrijum; i/ili nejonske surfaktante kao što su TWEEN™, polietilen glikol (PEG) i PLURONICS™.

„Uložak u pakovanju“ se odnosi na uputstvo koje se obično nalazi u komercijalnim pakovanjima lekova koje sadrži informacije o indikacijama koje se obično nalaze u komercijalnim pakovanjima lekova koje sadrži informacije o indikacijama, upotrebi, doziranju, primeni, kontraindikacijama, drugim lekovima koje treba kombinovati sa pakovanim proizvodom, i/ili upozorenja koja se odnose na upotrebu takvih lekova, itd.

U smislu ovog dokumenta, termin „lečenje“ se odnosi na kliničku intervenciju namenjenu promeni prirodnog toka pojedinca ili ćelije koja se leči tokom kliničke patologije. Poželjni efekti lečenja uključuju smanjenje brzine napredovanja bolesti, poboljšanje ili ublažavanje bolesnog stanja i remisiju ili poboljšanu prognozu. Na primer, pojedinac se uspešno „leči“ ako se jedan ili više simptoma povezanih sa kancerom ublaži ili eliminiše, uključujući, ali ne ograničavajući se na smanjenje proliferacije (ili uništavanje) ćelija kancera, smanjenje simptoma kao rezultat bolesti, povećanje kvaliteta života obolelih, smanjenje doze drugih lekova potrebnih za lečenje bolesti, odlaganje napredovanja bolesti i/ili produženje života pojedinaca.

U smislu ovog dokumenta, „odlaganje napredovanja bolesti“ podrazumeva odgađanje, ometanje, usporavanje, nazadovanje, stabilizaciju i/ili prolongiranje razvoja bolesti (kao što je rak). Ovo odlaganje može biti različitog trajanja, u zavisnosti od istorije bolesti i/ili pojedinca koji se leči. Kao što je očigledno stručnjaku u ovoj oblasti, dovoljno ili značajno odlaganje može, u suštini, obuhvatiti prevenciju, u tom smislu što se kod pojedinca ne razvija bolest. Na primer, kasna faza kancera, kao što je razvoj metastaza, može biti odložena.

Kako se ovde koristi, „smanjenje ili inhibicija relapsa raka“ znači smanjenje ili inhibiciju recidiva tumora ili raka, ili napredovanja tumora ili raka.

Termini „kancer“ i „kancerogen“ opisuju ili se odnose na fiziološko stanje sisara koje se tipično odlikuje neregulisanim rastom ćelija. U ovu definiciju spadaju benigni i maligni kanceri, kao i uspavani tumori ili mikrometastaze. Primeri za kancer uključuju, bez ograničenja, karcinom, limfom, blastom, sarkom i leukemiju. Konkretniji primeri takvih kancera uključuju rak skvamoznih ćelija, rak pluća (uključujući mikrocelularni kancer pluća, nemikrocelularni kancer pluća, adenokarcinom pluća i skvamozni karcinom pluća), rak peritoneuma, hepatocelularni kancer, rak želuca (uključujući rak gastrointestinalnog sistema) karcinom pankreasa, glioblastom, rak grlića materice, rak jajnika, rak jetre, rak mokraćne bešike, hepatom, rak dojke, rak debelog creva, kolorektalni kancer, karcinom endometrijuma ili materice, karcinom pljuvačne žlezde, rak bubrega, rak jetre, rak prostate, rak vulve, rak štitne žlezde, karcinom jetre i razne vrste kancera glave i vrata, kao i B-ćelijski limfom (uključujući indolentni/folikularni non-Hodžkinov limfom (NHL); mali limfocitni (SL) NHL; srednji / folikularni NHL; difuzni NHL srednjeg stepena; imunoblastni NHL visokog stepena; limfoblastni visokog stepena NHL; NHL necepivih malih ćelija visokog stepena; NHL velike mase; limfom ćelije plašta; limfom povezan sa AIDS-om i Valdenstromova makrolobulinemija); hronična limfocitna leukemija (CLL); akutna limfoblastna leukemija (ALL); leukemija dlakastih ćelija; hronična mijeloblastna leukemija; i limfoproliferativni poremećaj nakon transplantacije (PTLD), kao i abnormalna vaskularna proliferacija povezana sa fakomatozama, edemima (poput onih povezanih sa tumorima mozga) i Meigsovim sindromom.

Kako se ovde koristi termini „metastaza“ ili „metastatski“ podrazumevaju širenje kancera sa svog primarnog mesta na druga mesta u telu. Ćelije kancera mogu se odvojiti od primarnog tumora, prodreti u limfne i krvne žile, cirkulisati kroz krvotok i rasti u udaljenom fokusu (metastazirati) u normalnim tkivima drugde u telu. Metastaze mogu biti lokalne ili udaljene. Metastaze su sekvencijalni procesi, uslovljeni odvajanjem tumorskih ćelija od primarnog tumora, koje putuju kroz krvotok i zaustavljaju se na udaljenom mestu. Na novom mestu, ćelije uspostavljaju dotok krvi i mogu narasti do mase koja je opasna po život. I stimulatorni i inhibitorni molekularni putevi unutar tumorske ćelije regulišu ovo ponašanje, a interakcije između ćelija tumora i ćelija domaćina na udaljenom mestu takođe su značajne.

„Efikasna količina“ je najmanje minimalna količina potrebna da izazove merljivo poboljšanje ili prevenciju konkretnog poremećaja. Efikasna količina iz ovog dokumenta može varirati u skladu sa faktorima kao što su stanje bolesti, starost, pol i težina pacijenta, kao i sposobnosti antitela da izazove željeni odgovor kod pojedinca. Efikasna količina je takođe ona pri kojoj su bilo koji toksični ili štetni uticaji lečenja manje važni u odnosu na terapeutski korisna dejstva. Za profilaktičku upotrebu, korisni ili željeni rezultati uključuju rezultate kao što su: eliminisanje ili smanjenje rizika, smanjenje ozbiljnosti ili odlaganje početka bolesti, uključujući biohemijske, histološke i/ili bihejvioralne simptome bolesti, njene komplikacije i posredne patološke fenotipove koji se javljaju tokom razvoja bolesti. Za

1

terapeutsku upotrebu, korisni ili željeni rezultati uključuju kliničke rezultate, kao što su: smanjenje jednog ili više simptoma koji su rezultat bolesti, povećanje kvaliteta života onih koji pate od bolesti, smanjenje doze drugih lekova potrebnih za lečenje bolesti, pojačavanje dejstva drugih lekova, kao putem ciljanja, odlaganje napredovanja bolesti i/ili produžetak preživljavanja. U slučaju kancera ili tumora, efikasna količina leka može redukovati broj ćelija kancera; smanjiti veličinu tumora; inhibirati (tj. do izvesne mere usporiti ili, poželjno, zaustaviti) infiltraciju ćelija kancera u periferne organe; inhibirati (tj. do izvesne mere usporiti ili, poželjno, zaustaviti) metastaze tumora; do izvesne mere inhibirati rast tumora; i/ili do izvesne mere ublažiti jedan ili više simptoma povezanih sa poremećajem. Efikasna količina se može dati u jednoj ili više primena. Za potrebe ovog pronalaska, efikasna količina leka, jedinjenja ili farmaceutske kompozicije predstavlja količinu dovoljnu za ostvarivanje profilaktičkog ili terapeutskog lečenja, bilo posredno ili neposredno. Kao što se podrazumeva u kliničkom kontekstu, efikasna količina leka, jedinjenja ili farmaceutske kompozicije se može ili ne mora postići u kombinaciji sa drugim lekom, jedinjenjem ili farmaceutskom kompozicijom. Shodno tome, „efikasna količina“ se može razmatrati u kontekstu davanja jednog ili više terapeutskih agensa, a može se razmotriti i davanje jednog agensa u efikasnoj količini ako, u kombinaciji sa jednim ili više drugih agensa, može da se postigne, ili je postignut željeni rezultat.

U smislu ovog dokumenta, „u kombinaciji sa“ se odnosi na primenu jednog načina lečenja pored drugog načina lečenja. Shodno tome, „u kombinaciji sa“ se odnosi na primenu jednog načina lečenja pre, tokom ili nakon primene drugog načina lečenja kod pojedinca.

Pod „ispitanikom“ se misli na sisara, uključujući, bez ograničenja, čoveka ili sisara koji nije čovek, kao što je govedo, konj, pas, ovca ili mačka. Poželjno, ispitanik je čovek. Pacijenti su takođe ispitanici, u smislu ovog dokumenta.

Kako se ovde koristi, „potpuni odgovor“ ili „CR“ se odnosi na nestanak svih ciljnih lezija; „delimični odgovor“ ili „PR“ se odnosi na najmanje 30% smanjenja zbira najdužih prečnika (SLD) ciljnih lezija, uzimajući osnovni SLD kao referentan; i „stabilna bolest“ ili „SD“ se odnosi na nedovoljno smanjivanje ciljnih lezija da bi se kvalifikovala za PR, i nedovoljan porast da bi se kvalifikovala za PD, uzimajući za referencu najmanji SLD od početka lečenja.

Kako se ovde koristi, „progresivna bolest“ ili „PD“ se odnosi na najmanje 20% povećanja SLD ciljnih lezija, uzimajući kao referencu najmanji SLD zabeležen od početka lečenja, ili prisutnost jedne ili više novih lezija.

Kako se ovde koristi, „preživljavanje bez progresije" (PFS) odnosi se na dužinu

2

vremena tokom i nakon lečenja kada se bolest koja se leči (npr. kancer) ne pogoršava. Preživljavanje bez progresije može uključivati količinu vremena u kome su pacijenti doživeli potpuni ili delimičan odgovor, kao i količinu vremena u kome su pacijenti doživeli stabilnu bolest.

Kako se ovde koristi, „ukupna stopa odgovora“ (ORR) se odnosi na zbir stope potpunog odgovora (CR) i stope delimičnog odgovora (PR).

Kako se ovde koristi, „ukupno preživljavanje“ se odnosi na procenat pojedinaca u grupi koji će verovatno biti živi nakon određenog vremena.

„Hemoterapeutski agens“ je hemijsko jedinjenje koje je od koristi u lečenju kancera. Primeri za hemoterapeutske agense uključuju alkilujuće agense, kao što je tiotepa i ciklosfosfamid (CYTOXAN®); alkil sulfonate, kao što je busulfan, improsulfan i piposulfan; aziridine, kao što je benzodopa, karbokvon, meturedopa i uredopa; etilenimine i metilamelamine, uključujući altretamin, trietilenmelamin, trietilenfosforamid, trietilentiofosforamid i trimetilomelamin; acetogenine (naročito bulatacin i bulatacinon); delta-9-tetrahidrokanabinol (dronabinol, MARINOL®); beta-lapahon; lapahol; kolhicine; betulinsku kiselinu; kamptotecin (uključujući sintetički analog topotekan (HYCAMTIN®), CPT-11 (irinotekan, CAMPTOSAR®), acetilkamptotecin, skopolektin i 9-aminokamptotecin); briostatin; pemetreksed; kalistatin; CC-1065 (uključujući njegove sintetičke analoge adozelesin, karzelesin i bizelesin); podofilotoksin; podofilinsku kiselinu; tenipozid; kriptoficine (naročito kriptoficin 1 i kriptoficin 8); dolastatin; duokarmicin (uključujući sintetičke analoge, KW-2189 i CB1-TM1); eleuterobin; pankratistatin; TLK-286; CDP323, oralni inhibitor alfa-4 integrin; sarkodiktiin; spongistatin; azotne iperite, kao što je hlorambucil, hlomafazin, holofosfamid, estramustin, ifosfamid, mehloretamin, mehloretamin oksid hidrohlorid, melfalan, novembihin, fenesterin, prednimustin, trofosfamid, uracil iperit; nitrozoureje kao što je karmustin, hlorozotocin, fotemustin, lomustin, nimustin i ranimnustin; antibiotike kao što su enediinski antibiotici (npr. kaliheamicin, naročito kaliheamicin gama 1I i kaliheamicin omegaI1 (videti npr. Nicolaou et al., Angew. Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)); dinemicin, uključujući dinemicin A; esperamicin; kao i neokarzinostatin hromofor i povezane hromofore hromoproteina endiinskih antibiotika), aklacinomisine, aktinomicin, autramicin, azaserin, bleomicine, kaktinomicin, karabicin, karminomicin, karzinofilin, hromomicine, daktinomicin, daunorubicin, detorubicin, 6-diazo-5-okso-L-norleucin, doksorubicin (uključujući ADRIAMICIN®, morfolino-doksorubicin, cijanomorfolino-doksorubicin, 2-pirolinodoksorubicin, doksorubicin HCl lipozom injekcije (DOKSIL®) i deoksidoksorubicin), epirubicin, esorubicin, idarubicin, marcelomicin, mitomicine kao što je mitomicin C, mikofenolnu kiselinu, nogalamicin, olivomicine, peplomicin, potfiromicin, puromicin, kvelamicin, rodorubicin, streptonigrin, streptozocin, tubercidin, ubenimeks, zinostatin, zorubicin; antimetaboliti kao što je metotreksat i 5-gemcitabin (GEMZAR®), tegafur (UFTORAL®), kapecitabin (KSELODA®), epotilon i 5-fluorouracil (5-FU); analozi folne kiseline kao što je denopterin, metotreksat, pteropterin, trimetreksat; purinski analozi kao što je fludarabin, 6-merkaptopurin, tiamiprin, tioguanin; pirimidinski analozi kao što je ancitabin, azacitidin, 6-azauridin, karmofur, citarabin, dideoksiuridin, doksifluridin, enocitabin, floksuridin i imatinib (derivat 2-fenilaminopirimidina), kao i drugi c-Kit inhibitori; antiadrenalni agensi kao što je aminoglutetimid, mitotan, trilostan; dopuna folne kiseline kao što je frolinska kiselina; aceglaton; aldofosfamid glikozid; aminolevulinska kiselina; eniluracil; amsakrin; bestrabucil; bisantren; edatraksat; defofamin; demekolcin; diazikvon; elfomitin; eliptinijum acetat; etoglucid; galijum nitrat; hidroksiurea; lentinan; lonidainin; majtanzinoidi kao što su majtanzin i ansamitocini; mitoguazon; mitoksantron; mopidanmol; nitraerin; pentostatin; fenamet; pirarubicin; losoksantron; 2-etilhidrazid; prokarbazin; PSK® polisaharidni kompleks (JHS Natural Products, Eugene, OR); razoksan; rizoksin; sizofiran; spirogermanijum; tenuazonska kiselina; triazikvon; 2,2’,2"-trihlortrietilamin; trihoteceni (naročito T-2 toksin, verakurin A, roridin A i anguidin); uretan; vindezin (ELDISINE®, FILDESIN®); dakarbazin; manomustin; mitobronitol; mitolaktol; pipobroman; gacitozin; arabinozid („Ara-C“); tiotepa; taksoidi, npr. paklitaksel (TAXOL®), formulacija nanočestica paklitaksela konstruisana sa albuminom (ABRAXANE™) i doksekseksel (TAXOTERE®); hloranbucil; 6-tioguanin; merkaptopurin; metotreksat; platinske analoge, kao što je cisplatin i karboplatin; vinblastin (VELBAN®); platina; etopozid (VP-16); ifosfamid; mitoksantron; vinkristin (ONCOVIN®); oksaliplatin; leukovovin; vinorelbin (NAVELBINE®); novantron; edatreksat; daunomicin; aminopterin; ibandronat; inhibitor topoizomeraze RFS 2000; difluormetlilornitin (DMFO); retinoidi poput retinske kiseline; farmaceutski prihvatljive soli, kiseline ili derivati bilo čega od gore navedenog; kao i kombinacije dva ili više gore navedenih, kao što je CHOP, skraćenica za kombinovanu terapiju ciklofosfamidom, doksorubicinom, vinkristinom i prednizolonom, i FOLFOX, skraćenica za režim lečenja oksaliplatinom (ELOXATIN™) u kombinaciji sa 5-FU i leukovovinom.

U ovu definiciju hemoterapeutskih agensa spadaju i antihormonski agensi čije dejstvo reguliše, smanjuje, blokira ili inhibira dejstvo hormona koji mogu da podstiču rast kancera, i često imaju oblik sistemskog lečenja, ili lečenja za ceo organizam. Oni i sami mogu biti hormoni. Primeri obuhvataju antiestrogene i selektivne modulatore estrogenskog receptora

4

(SERM), uključujući, na primer, tamoksifen (uključujući NOLVADEX® tamoksifen), raloksifen (EVISTA®), droloksifen, 4-hidroksitamoksifen, trioksifen, keoksifen, LY117018, onapriston i toremifen (FARESTON®); antiprogesterone; regulatore smanjenja receptora estrogena (ERD); antagoniste receptora estrogena kao što je fulvestrant (FASLODEX®); agense koji deluju tako što suzbijaju ili zatvaraju jajnike, na primer, agoniste hormona za oslobađanje leutinizujućeg hormona (LHRH) kao što je leuprolid acetat (LUPRON® i ELIGARD®), goserelin acetat, buserelin acetat i tripterelin; druge antiandrogene, kao što je flutamid, nilutamid i bikalutamid; i inhibitore aromataze koji inhibiraju enzim aromatazu, koji reguliše proizvodnju estrogena u nadbubrežnim žlezdama, kao što su, na primer, 4(5)-imidazoli, aminoglutetimid, megestrol acetat (MEGASE®), eksemestan (AROMASIN®), formestanie, fadrozol, vorozol (RIVISOR®), letrozol (FEMARA®) i anastrozol (ARIMIDEX®). Pored toga, takva definicija hemoterapeutskih agensa obuhvata bisfosfonate poput klodronata (na primer, BONEFOS® ili OSTAC®), etidronata (DIDROCAL®), NE-58095, zoledronske kiseline/zoledronata (ZOMETA®), alendronata (FOSAMAX®), pamidronata (AREDIA®), tiludronata (SKELID®) ili risedronata (ACTONEL®); kao i troksacitabina (1,3-dioksolanski analog nukleozida citozina); antisens oligonukleotide, posebno one koji inhibiraju ekspresiju gena u signalnim putevima uključenim u aberantnu proliferaciju ćelija, kao što je, na primer, PKC-alfa, Raf, H-Ras i receptor faktora epidermalnog rasta (EGF-R); vakcine poput vakcine THERATOPE® i vakcine za gensku terapiju, na primer, vakcina ALLOVECTIN®, vakcina LEUVECTIN® i vakcina VAXID®; inhibitor topoizomeraze 1 (npr. LURTOTECAN®); antiestrogen, kao što je fulvestrant; inhibitor Kit poput imatiniba ili EXEL-0862 (inhibitor tirozin kinaze); EGFR inhibitor poput erlotiniba ili cetuksimaba; inhibitor anti-VEGF kao što je bevacizumab; arinotekan; rmRH (npr. ABARELIX®); lapatinib i lapatinib ditozilat (inhibitor malih molekula ErbB-2 i EGFR dvostruke tirozin kinaze poznat i kao GW572016); 17AAG (derivat geldanamicina koji je otrov proteina toplotnog udara (Hsp) 90), i farmaceutski prihvatljive soli, kiseline ili derivati bilo čega od navedenog.

Kako se ovde koristi, termin „citokin“ se odnosi generički na proteine koje oslobađa jedna ćelijska populacija i koji deluju na drugu ćeliju kao međućelijski posrednici ili imaju autokrinski efekat na ćelije koje proizvode proteine. Primeri za takve citokine uključuju limfokine, monokine; interleukine kao što su IL-1, IL-1α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17A-F, IL-18 do IL-29 (poput IL-23), IL-31, uključujući PROLEUKIN® rIL-2; faktor nekroze tumora kao što je TNF-α ili TNF-β, TGF-β1-3; i drugi polipeptidni faktori, uključujući faktor inhibicije leukemije („LIF“), cilijarni neurotrofni faktor („CNTF“), citokin sličan CNTF („CLC“), kardiotropin („CT“), i kit ligand („KL“).

Kako se ovde koristi, pojam „hemokin“ se odnosi na rastvorne faktore (npr. citokine) koji imaju mogućnost selektivne indukcije hemotaksije i aktivacije leukocita. Oni takođe pokreću procese angiogeneze, upale, zarastanja rana i tumorigeneze. Primeri za hemokine uključuju IL-8, humani homolog hemoatraktanata mišjeg keratinocita (KC).

U smislu ovog dokumenta i priloženih patentnih zahteva, oblici u jednini uključuju i množinu, osim ako kontekst izričito ne nalaže drugačije.

Upotreba reči „oko“ za vrednosti ili parametre u ovom dokumentu obuhvata (i opisuje) varijacije koje se odnose na tu vrednost ili parametar. Na primer, opis koji sadrži „oko X“ uključuje opis „X“.

Izraz „farmaceutski prihvatljiva so“, kako se ovde koristi, odnosi se na farmaceutski prihvatljive organske ili neorganske soli jedinjenja ovog izuma. Primeri soli uključuju, ali nisu ograničeni na sulfate, citrate, acetate, oksalate, hloride, bromide, jodide, nitrate, bisulfate, fosfate, kisele fosfate, izonikotinate, laktate, salicilate, kisele citrate, tartarate, oleate, tanate, pantotenate, bitartarate, askorbate, sukcinate, maleate, gentizinate, fumarate, glukonate, glukuronate, saharate, formate, benzoate, glutamate, metansulfonate „mezilate“, etansulfonate, benzensulfonate, p-toluensulfonate i pamoate (tj. 1,1'-metilen-bis-(2-hidroksi-3-naftoat)), soli alkalnih metala (npr. natrijuma i kalijuma), soli zemnoalkalnih metala (npr. magnezijuma) i amonijumove soli. Farmaceutski prihvatljiva so može obuhvatati uključivanje drugog molekula kao što je acetatni jon, sukcinatni jon ili drugi kontra jon. Kontra jon može biti bilo koji organski ili neorganski ostatak koji stabilizuje naelektrisanje u matičnom jedinjenju. Nadalje, farmaceutski prihvatljiva so može imati više od jednog naelektrisanog atoma u svojoj strukturi. Primeri u kojima su atomi sa višestrukim naelektrisanjem deo farmaceutski prihvatljive soli mogu imati više kontra jona. Shodno tome, farmaceutski prihvatljiva so može imati jedan ili više naelektrisanih atoma i/ili jedan ili više kontra jona.

Ako je jedinjenje baza, željena farmaceutski prihvatljiva so može se pripremiti bilo kojim pogodnim postupkom koji je dostupan u struci, na primer, tretiranjem slobodne baze neorganskom kiselinom, kao što je hlorovodonična kiselina, bromovodonična kiselina, sumporna kiselina, azotna kiselina, metansulfonska kiselina, fosforna kiselina i slično, ili organskom kiselinom, kao što je sirćetna kiselina, maleinska kiselina, ćilibarna kiselina, bademova kiselina, fumarna kiselina, malonska kiselina, piruvinska kiselina, oksalna kiselina, glikolna kiselina, salicilna kiselina, piranozidna kiselina, kao što je glukuronska kiselina ili galakturonska kiselina, alfa hidroksi kiselina, kao što je limunska kiselina ili vinska kiselina, aminokiselina, kao što je asparaginska kiselina ili glutaminska kiselina, aromatična kiselina, kao što je benzojeva kiselina ili cimetna kiselina, sulfonska kiselina kao što je ptoluensulfonska kiselina ili etansulfonska kiselina, ili slično.

Ako je jedinjenje kiselina, željena farmaceutski prihvatljiva so se može pripremiti bilo kojim pogodnim postupkom, na primer, tretiranjem slobodne kiseline neorganskom ili organskom bazom, kao što je amin (primarni, sekundarni ili tercijarni), hidroksid alkalnog metala ili hidroksid zemnoalkalnog metala, ili slično. Ilustrativni primeri prikladnih soli uključuju, ali nisu ograničeni na, organske soli izvedene iz aminokiselina, kao što su glicin i arginin, amonijak, primarni, sekundarni i tercijarni amini i ciklični amini, kao što su piperidin, morfolin i piperazin, i neorganske soli dobijene iz natrijuma, kalcijuma, kalijuma, magnezijuma, mangana, gvožđa, bakra, cinka, aluminijuma i litijuma.

Izraz „farmaceutski prihvatljiv“ označava da supstanca ili kompozicija moraju biti hemijski i/ili toksikološki kompatibilne sa ostalim sastojcima koji sadrže formulaciju i/ili sa sisarom koji se tretira tom supstancom.

III. Postupci

U jednom aspektu, ovde se objavljuje postupak za lečenje ili odlaganje progresije raka kod pojedinca koji se sastoji od davanja pojedincu efikasne količine antagonista vezivanja PD-1 ose u kombinaciji sa agensom koji smanjuje ili inhibira ekspresiju i/ili aktivnost TIGIT.

U još jednom aspektu, ovde se objavljuje postupak za smanjenje ili inhibiranje relapsa ili napredovanje raka kod pojedinca koji se sastoji od davanja pojedincu efikasne količine antagonista vezivanja PD-1 ose u kombinaciji sa agensom koji smanjuje ili inhibira ekspresiju i/ili aktivnost TIGIT. Kako se ovde objavljuje, relaps i/ili progresija raka uključuju, bez ograničenja, metastazu raka.

U još jednom aspektu, ovde se objavljuje postupak za lečenje ili odlaganje progresije bolesti povezane sa imunolsim sistemom kod pojedinca, koji uključuje davanje pojedincu efikasne količine antagonista vezivanja PD-1 ose u kombinaciji sa agensom koji smanjuje ili inhibira ekspresiju i/ili aktivnost TIGIT.

U još jednom aspektu, ovde se objavljuje postupak za smanjenje ili inhibiciju progresije bolesti povezane sa imunoskim sistemom kod pojedinca, koji uključuje davanje pojedincu efikasne količine antagonista vezivanja PD-1 ose u kombinaciji sa agensom koji smanjuje ili inhibira ekspresiju -i/ili aktivnost TIGIT.

U nekim aspektima, bolest povezana sa imunskim sistemom je vezana za disfunkcionalni poremećaj T ćelija. U nekim aspektima, disfunkcionalni poremećaj T ćelija odlikuje se smanjenom reakcijom na antigensku stimulaciju. U nekim aspektima, disfunkcionalni poremećaj T ćelija odlikuje se anergijom T ćelija ili smanjenom sposobnošću da luče citokine, razmnožavaju se ili vrše citolitičku aktivnost. U nekim aspektima, disfunkcionalni poremećaj T ćelija se odlikuje iscrpljenošću T ćelija. U nekim aspektima, T ćelije su CD4+ i CD8+ T ćelije. U nekim aspektima, disfunkcionalni poremećaj T ćelija podrazumeva nerešenu akutnu infekciju, hroničnu infekciju i imunitet tumora.

U još jednom aspektu, ovde se objavljuje postupak za povećanje, pojačavanje ili stimulisanje imunskog odgovora ili funkcije kod pojedinca, koji se sastoji od davanja pojedincu efikasne količine antagonista vezivanja PD-1 ose u kombinaciji sa agensom koji smanjuje ili inhibira ekspresiju i/ili aktivnost TIGIT.

U još jednom aspektu, ovde se objavljuje postupak za lečenje ili odlaganje progresije raka kod pojedinca, koji se sastoji od davanja pojedincu efikasne količine antagonista vezivanja PD-1 ose i agensa koji moduliše ekspresiju i/ili aktivnost CD226.

U još jednom aspektu, ovde se objavljuje postupak za smanjenje ili inhibiranje recidiva raka ili napredovanja raka kod pojedinca koji se sastoji od davanja pojedincu efikasne količine antagonista vezivanja PD-1 ose i agensa koji moduliše ekspresiju i/ili aktivnost CD226.

U još jednom aspektu, ovde se objavljuje postupak za lečenje ili odlaganje progresije bolesti povezane sa imunskim sistemom kod pojedinca, koji se sastoji od davanja pojedincu efikasne količine antagonista vezivanja PD-1 ose i agensa koji moduliše ekspresiju i/ili aktivnost CD226.

U još jednom aspektu, ovde se objavljuje postupak za smanjenje ili inhibiranje progresije bolesti povezane sa imunskim sistemom kod pojedinca, koji uključuje davanje pojedincu efikasne količine antagonista vezivanja PD-1 ose i agensa koji moduliše ekspresiju i/ili aktivnost CD226.

U nekim aspektima, bolest povezana sa imunskim sistemom je vezana za disfunkcionalni poremećaj T ćelija. U nekim aspektima, disfunkcionalni poremećaj T ćelija odlikuje se smanjenom reakcijom na antigenu stimulaciju. U nekim aspektima, disfunkcionalni poremećaj T ćelija odlikuje se anergijom T ćelija, ili smanjenom sposobnošću da luče citokine, razmnožavaju se ili izvršavaju citolitičku aktivnost. U nekim aspektima, disfunkcionalni poremećaj T ćelija se odlikuje iscrpljenošću T ćelija. U nekim aspektima, T ćelije su CD4+ i CD8+ T ćelije. U nekim aspektima, imunski povezana bolest odabrana je iz grupe koja se sastoji od nerešene akutne infekcije, hronične infekcije i imunosti tumora.

U još jednom aspektu, ovde se objavljuje postupak za povećanje, pojačavanje ili stimulisanje imunskog odgovora ili funkcije kod pojedinca, davanjem pojedincu efikasne količine antagonista vezivanja PD-1 ose i agensa koji moduliše ekspresiju i/ili aktivnost CD226.

U nekim aspektima, agens koji moduliše ekspresiju i/ili aktivnost CD226 može povećati i/ili stimulisati ekspresiju i/ili aktivnost CD226; povećati i/ili stimulisati interakciju CD226 sa PVR, PVRL2 i/ili PVRL3; i povećati i/ili stimulisati intraćelijsku signalizaciju posredovanu vezivanjem CD226 za PVR, PVRL2 i/ili PVRL3. Kako se ovde koristi, agens koji može povećati i/ili stimulisati ekspresiju i/ili aktivnost CD226 obuhvata, bez ograničenja, agense koji povećavaju i/ili stimulišu ekspresiju i/ili aktivnost CD226. Kako se ovde koristi, agens koji može povećati i/ili stimulisati interakciju CD226 s PVR, PVRL2 i/ili PVRL3 uključuje, bez ograničenja, agense koji povećavaju i/ili stimulišu interakciju CD226 sa PVR, PVRL2 i/ili PVRL3. Kako se ovde koristi, agens koji može povećati i/ili stimulisati intraćelijsku signalizaciju posredovanu vezivanjem CD226 za PVR, PVRL2 i/ili PVRL3 uključuje, bez ograničenja, agense koji povećavaju i/ili stimulišu intraćelijsku signalizaciju posredovanu vezivanjem CD226 za PVR, PVRL2 i/ili PVRL3.

U nekim aspektima, agens koji moduliše ekspresiju i/ili aktivnost CD226 odabran je od agensa koji inhibira i/ili blokira interakciju CD226 sa TIGIT, antagonista ekspresije i/ili aktivnosti TIGIT, antagonista ekspresije i/ili aktivnosti PVR, agensa koji inhibira i/ili blokira interakciju TIGIT-a sa PVR-om, agensa koji inhibira i/ili blokira interakciju TIGIT-a sa PVRL2, agensa koji inhibira i/ili blokira interakciju TIGIT-a sa PVRL3, agensa koji inhibira i/ili blokira intraćelijsku signalizaciju posredovanu vezivanjem TIGIT za PVR, agensa koji inhibira i/ili blokira intraćelijsku signalizaciju posredovanu vezivanjem TIGIT za PVRL2, agensa koji inhibira i/ili blokira intraćelijsku signalizaciju posredovanu vezivanjem TIGIT za PVRL3, i njihovih kombinacija.

U nekim aspektima, agens koji inhibira i/ili blokira interakciju CD226 sa TIGIT-om je inhibitor malih molekula, inhibitorno antitelo ili njegov antigen vezujući fragment, aptamer, inhibitorna nukleinska kiselina i inhibitorni polipeptid. U nekim aspektima, agens koji inhibira i/ili blokira interakciju CD226 sa TIGIT je anti-TIGIT antitelo ili njegov antigen vezujući fragment. U nekim aspektima, agens koji inhibira i/ili blokira interakciju CD226 sa TIGIT-om je inhibitorna nukleinska kiselina izabrana od antisens polinukleotida, interferentne RNK, katalitičke RNK i himere RNK-DNK.

U nekim aspektima, antagonist ekspresije i/ili aktivnosti TIGIT je inhibitor malih molekula, inhibitorno antitelo ili njegov antigen vezujući fragment, aptamer, inhibitorna nukleinska kiselina i inhibitorni polipeptid. U nekim aspektima, antagonist ekspresije i/ili aktivnosti TIGIT je anti-TIGIT antitelo ili njegov antigen vezujući fragment. U nekim aspektima, antagonist ekspresije i/ili aktivnosti TIGIT je inhibitorna nukleinska kiselina odabrana od antisens polinukleotida, interferentne RNK, katalitičke RNK i himera RNK-DNK.

U nekim aspektima, antagonist ekspresije i/ili aktivnosti PVR je inhibitor malih molekula, inhibitorno antitelo ili njegov antigen vezujući fragment, aptamer, inhibitorna nukleinska kiselina i inhibitorni polipeptid. U nekim aspektima, antagonist ekspresije i/ili aktivnosti PVR je izabran između inhibitora malih molekula, inhibitornog antitela ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta, aptamera, inhibitorne nukleinske kiseline i inhibitornog polipeptida.

U nekim aspektima, agens koji inhibira i/ili blokira interakciju TIGIT-a sa PVR-om je inhibitor malih molekula, inhibitorno antitelo ili njegov antigen vezujući fragment, aptamer, inhibitorna nukleinska kiselina i inhibitorni polipeptid. U nekim otelotvorenjima, agens koji inhibira i/ili blokira interakciju TIGIT-a s PVR-om odabran je između inhibitora malih molekula, inhibitornog antitela ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta, aptamera, inhibitorne nukleinske kiseline i inhibitornog polipeptida.

U nekim aspektima, agens koji inhibira i/ili blokira interakciju TIGIT-a sa PVRL2 bira se između inhibitora malih molekula, inhibitornog antitela ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta, aptamera, inhibitorne nukleinske kiseline i inhibitornog polipeptida.

U nekim aspektima, agens koji inhibira i/ili blokira interakciju TIGIT-a sa PVRL3 bira se između inhibitora malih molekula, inhibitornog antitela ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta, aptamera, inhibitorne nukleinske kiseline i inhibitornog polipeptida.

U nekim aspektima, agens koji inhibira i/ili blokira intraćelijsku signalizaciju posredovanu vezivanjem TIGIT za PVR je inhibitor malih molekula, inhibitorno antitelo ili njegov antigen vezujući fragment, aptamer, inhibitorna nukleinska kiselina i inhibitorni polipeptid. U nekim aspektima, agens koji inhibira i/ili blokira intraćelijsku signalizaciju posredovanu putem TIGIT vezivanjem za PVR bira se između inhibitora malih molekula, inhibitornog antitela ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta, aptamera, inhibitorne nukleinske kiseline i inhibitornog polipeptida.

U nekim aspektima, agens koji inhibira i/ili blokira intraćelijsku signalizaciju posredovanu vezivanjem TIGIT-a za PVRL2 bira se između inhibitora malih molekula, inhibitornog antitela ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta, aptamera, inhibitorne nukleinske kiseline i inhibitornog polipeptida.

U nekim aspektima, agens koji inhibira i/ili blokira intraćelijsku signalizaciju posredovanu vezivanjem TIGIT-a za PVRL3 bira se između inhibitora malih molekula, inhibitornog antitela ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta, aptamera, inhibitorne nukleinske kiseline i inhibitornog polipeptida.

U još jednom aspektu, ovde se daje postupak za povećanje, pojačavanje ili stimulaciju imunskog odgovora ili funkcije kod pojedinca, davanjem pojedincu efikasne količine agensa koji smanjuje ili inhibira ekspresiju i/ili aktivnost TIGIT i agensa koji smanjuje ili inhibira ekspresiju i/ili aktivnost jednog ili više dodatnih imunskih koinhibitornih receptora. U nekim aspektima, jedan od više dodatnih imunskih koinhibitornih receptora bira se između PD-1, CTLA-4, LAG3, TIM3, BTLA VISTA, B7H4 i CD96. U nekim aspektima, jedan od više dodatnih imunskih inhibitornih receptora je odabran od PD-1, CTLA-4, LAG3 i TIM3.

U još jednom aspektu, ovde se daje postupak za povećanje, poboljšanje ili stimulaciju imunskog odgovora ili funkcije kod pojedinca, davanjem pojedincu efikasne količine agensa koji smanjuje ili inhibira ekspresiju i/ili aktivnost TIGIT i agensa koji povećava ili aktivira ekspresiju i/ili aktivnost jednog ili više dodatnih imunskih kostimulatornih receptora. U nekim aspektima, jedan od više dodatnih imunskih kostimulatornih receptora odabran je između CD226, OX-40, CD28, CD27, CD137, HVEM, GITR, MICA, ICOS, NKG2D i 2B4. U nekim aspektima, jedan ili više dodatnih imunskih kostimulatornih receptora odabran je između CD226, OX-40, CD28, CD27, CD137, HVEM i GITR. U nekim aspektima, jedan od više dodatnih imunoloških kostimulatornih receptora odabran je između OX-40 i CD27.

Postupci iz ovog otkrića se mogu koristiti u lečenju stanja gde je poželjna povećana imunogenost, poput povećavanja imunogenosti tumora za lečenje raka ili disfunkcionalnih poremećaja T ćelija.

Mogu se lečiti razne vrste kancera, ili se može odložiti njihovo napredovanje.

U nekim aspektima pojedinac ima nemikrocelularni kancer pluća. Nemikrocelularni kancer pluća može biti u ranoj ili u kasnoj fazi. U nekim otelotvorenjima, pojedinac ima mikrocelularni kancer pluća. Mikrocelularni kancer pluća može biti u ranoj ili u kasnoj fazi. U nekim aspektima, pojedinac ima rak bubrežnih ćelija. Rak bubrežnih ćelija može biti u ranoj ili u kasnoj fazi. U nekim aspektima, pojedinac ima kolorektalni kancer. Kolorektalni kancer može biti u ranoj ili kasnoj fazi. U nekim aspektima, pojedinac ima rak jajnika. Rak jajnika može biti u ranoj ili u kasnoj fazi. U nekim aspektima, pojedinac ima rak dojke. Rak dojke može biti u ranoj ili u kasnoj fazi. U nekim aspektima, pojedinac ima rak pankreasa. Rak pankreasa može biti u ranoj ili u kasnoj fazi. U nekim otelotvorenjima, pojedinac ima karcinom želuca. Karcinom želuca može biti u ranoj ili u kasnoj fazi. U nekim aspektima,

1

osoba ima rak mokraćne bešike. Rak mokraćne bešike može biti u ranoj ili u kasnoj fazi. U nekim aspektima, pojedinac ima rak jednjaka. Rak jednjaka može biti u ranoj ili u kasnoj fazi. U nekim aspektima, pojedinac ima mezoteliom. Mezoteliom može biti u ranoj ili u kasnoj fazi. U nekim aspektima, pojedinac ima melanom. Melanom može biti u ranoj ili u kasnoj fazi. U nekim aspektima, pojedinac ima kancer glave i vrata. Kancer glave i vrata može biti u ranoj ili u kasnoj fazi. U nekim aspektima, pojedinac ima rak štitne žlezde. Rak štitne žlezde može biti u ranoj ili u kasnoj fazi. U nekim otelotvorenjima, pojedinac ima sarkom. Sarkom može biti u ranoj ili kasnoj fazi. U nekim aspektima, pojedinac ima rak prostate. Rak prostate može biti u ranoj ili u kasnoj fazi. U nekim aspektima, pojedinac ima glioblastom. Glioblastom može biti u ranoj ili u kasnoj fazi. U nekim aspektima, pojedinac ima rak grlića materice. Rak grlića materice može biti u ranoj ili u kasnoj fazi. U nekim aspektima, pojedinac ima karcinom timusa. Karcinom timusa može biti u ranoj ili u kasnoj fazi. U nekim aspektima, pojedinac ima leukemiju. Leukemija može biti u ranoj ili u kasnoj fazi. U nekim aspektima, pojedinac ima limfome. Limfom može biti u ranoj ili u kasnoj fazi. U nekim aspektima, pojedinac ima mijelome. Mijelomi mogu biti u ranoj ili u kasnoj fazi. U nekim aspektima, pojedinac ima fungoidnu mikozu. Fungoidna mikoza može biti u ranoj ili u kasnoj fazi. U nekim aspektima, pojedinac ima rak Merkelovih ćelija. Rak Merkelovih ćelija može biti u ranoj ili u kasnoj fazi. U nekim aspektima, pojedinac ima hematološke malignitete. Hematološki maligniteti mogu biti u ranoj ili kasnoj fazi. U nekim otelotvorenjima, pojedinac je čovek.

U nekim aspektima postupaka iz ovog otkrića, CD4 i/ili CD8 T ćelije kod pojedinca imaju povećan ili pojačan prajming, aktivaciju, proliferaciju, oslobađanje citokina i/ili citolitičku aktivnost u odnosu na vreme pre primene kombinacije.

U nekim aspektima postupaka iz ovog otkrića, broj CD4 i/ili CD8 T ćelija je povećan u odnosu na vreme pre primene kombinacije. U nekim aspektima postupaka iz ovog otkrića, broj aktiviranih CD4 i/ili CD8 T ćelija je povećan u odnosu na vreme pre primene kombinacije.

U nekim aspektima postupaka iz ovog otkrića, aktivirane CD4 i/ili CD8 T ćelije se odlikuju γ-IFN<+>koji proizvodi CD4 i/ili CD8 T ćelije i/ili pojačanom citolitičkom aktivnošću u odnosu na vreme pre primene kombinacije.

U nekim aspektima postupaka iz ovog otkrića, CD4 i/ili CD8 T ćelije pokazuju povećano oslobađanje citokina odabranih iz grupe koja sadrži IFN-γ, TNF-α i interleukine.

U nekim aspektima postupaka iz ovog otkrića, CD4 i/ili CD8 T ćelija je T ćelija efektorske memorije. U nekim aspektima postupaka iz ovog otkrića, CD4 i/ili CD8 T ćelije

2

efektorske memorije odlikuju se γ-IFN<+>koji proizvodi CD4 i/ili CD8 T ćelije i/ili pojačanu citolitičku aktivnost. U nekim aspektima postupaka iz ovog otkrića, CD4 i/ili CD8 T ćelija efektorske memorije odlikuje se time što ima ekspresiju CD44<visok>CD62L<nizak>.

U nekim aspektima postupaka iz ovog otkrića, rak ima povišen nivo infiltracije T ćelija.

U nekim aspektima, postupci iz ovog otkrića mogu nadalje podrazumevati primenu dodatne terapije. Dodatna terapija može biti radioterapija, hirurški zahvat, hemoterapija, genska terapija, DNK terapija, virusna terapija, RNK terapija, imunoterapija, transplantacija koštane srži, nanoterapija, terapija monoklonskim antitelima, ili kombinacija prethodno navedenih. Dodatna terapija može biti u obliku adjuvantne ili neoadjuvantne terapije. U nekim aspektima, dodatna terapija se sastoji od davanja agensa za ograničavanje neželjenih dejstava (npr. agensi namenjeni za smanjivanje pojave i/ili težine neželjenih dejstava lečenja, kao što su agensi protiv mučnine, itd.). U nekim aspektima, dodatna terapija je radioterapija. U nekim aspektima, dodatna terapija je hirurški zahvat. U nekim aspektima, dodatna terapija može biti jedno ili više hemoterapeutskih sredstava opisanih gore.

Bilo koji od antagonista vezivanja PD-1 ose i agensa koji smanjuju ili inhibiraju ekspresiju i/ili aktivnost TIGIT opisanih u nastavku može se koristiti u postupcima ovog otkrića.

U nekim aspektima, bilo koji od ovde opisanih ciljeva (npr. PD-1, PD-L1, PD-L2, CTLA-4, LAG3, TIM3, BTLA, VISTA, B7H4, CD96, B7-1, TIGIT, CD226, OX-40, CD28, CD27, CD137, HVEM, GITR, MICA, ICOS, NKG2D, 2B4, itd.) je humani protein.

Antagonisti vezivanja PD-1 ose

Ovde se objavljuje postupak za lečenje ili odlaganje progresije raka kod pojedinca, koji podrazumeva davanje pojedincu efikasne količine antagonista vezivanja PD-1 ose u kombinaciji sa agensom koji smanjuje ili inhibira ekspresiju i/ili aktivnost TIGIT. Ovde se objavljuje i postupak za smanjenje ili inhibiranje recidiva raka ili napredovanje raka kod pojedinca, koji podrazumeva davanje pojedincu efikasne količine antagonista vezivanja PD-1 ose u kombinaciji sa agensom koji smanjuje ili inhibira ekspresiju i/ili aktivnost TIGIT. Ovde se objavljuje i postupak za lečenje ili odlaganje progresije bolesti povezanih sa imunskim sistemom kod pojedinca, koji podrazumeva davanje pojedincu efikasne količine antagonista vezivanja PD-1 ose u kombinaciji sa agensom koji smanjuje ili inhibira ekspresiju i/ili aktivnost TIGIT. Ovde se objavljuje i postupak za smanjenje ili inhibiciju progresije bolesti povezanih sa imunskim sistemom kod pojedinca, koji podrazumeva davanje pojedincu efikasne količine antagonista vezivanja PD-1 ose u kombinaciji sa agensom koji smanjuje ili inhibira ekspresiju i/ili aktivnost TIGIT. Ovde se objavljuje i postupak za povećanje, pojačavanje ili stimulisanje imunskog odgovora ili funkcije kod pojedinca, koji se sastoji od davanja pojedincu efikasne količine antagonista vezivanja PD-1 ose u kombinaciji sa agensom koji smanjuje ili inhibira ekspresiju i/ili aktivnost TIGIT.

U smislu ovog dokumenta, antagonist vezivanja PD-1 ose podrazumeva antagonist vezivanja PD-1, antagonist vezivanja PD-L1 i antagonist vezivanja PD-L2.

U nekim aspektima, antagonist vezivanja PD-1 je molekul koji inhibira vezivanje PD-1 za njegove partnere za vezivanje liganda. U specifičnom aspektu, partneri PD-1 za vezivanje liganda su PD-L1 i/ili PD-L2. U još jednom aspektu, antagonist vezivanja PD-L1 je molekul koji inhibira vezivanje PD-L1 za njegove partnere za vezivanje. U specifičnom aspektu, partneri PD-L1 za vezivanje su PD-1 i/ili B7-1. U drugom otelotvorenju, antagonist vezivanja PD-L2 je molekul koji inhibira vezivanje PD-L2 za njegove partnere za vezivanje. U specifičnom aspektu, partner PD-L2 za vezivanje je PD-1. Antagonist može biti antitelo, njegov fragment koji vezuje antigen, imunoadhezin, fuzioni protein ili oligopeptid.

U nekim aspektima, antagonist vezivanja PD-1 odabran je između MDX-1106 (nivolumab), Merck 3745 (lambrolizumab), CT-011 (pidilizumab) i AMP-224. U nekim otelotvorenjima, antagonist vezivanja PD-L1 je odabran od YW243.55.S70, MPDL3280A, MDX-1105 i MEDI4736. U nekim aspektima, antagonist vezivanja PD-L2 je AMP-224. U nekim aspektima, antagonist vezivanja PD-1 je AMP-224. MDX-1105, poznat i kao BMS-936559, je anti-PD-L1 antitelo opisano u WO2007/005874. Antitelo YW243.55.S70 (SEQ ID No. 20) je anti-PD-L1 opisan u WO 2010/077634 A1 i US8,217,149. MDX-1106, poznat i kao MDX-1106-04, ONO-4538, BMS-936558 ili nivolumab, je anti-PD-1 antitelo opisano u WO2006/121168. Merck 3745, poznat i kao MK-3475, MK-3475, SCH-900475 ili lambrolizumab, je anti-PD-1 antitelo opisano u WO2009/114335. CT-011, poznat i kao hBAT, hBAT-1 ili pidilizumab, je anti-PD-1 antitelo opisano u WO2009/101611. AMP-224, poznat i kao B7-DCIg, je PD-L2-Fc fuzioni rastvorljivi receptor opisan u WO2010/027827 i WO2011/066342.

Primeri anti-PD-L1 antitela korisnih za medicinsku upotrebu prema ovom izumu i postupci za njihovu proizvodnju opisani su u PCT patentnoj prijavi WO2010/077634 A1 i US 8,217,149.

U nekim aspektima, antagonist vezivanja PD-1 je anti-PD-1 antitelo. U nekim otelotvorenjima, anti-PD-L1 antitelo je sposobno da inhibira vezivanje između PD-L1 i PD-1 i/ili između PD-L1 i B7-1. U nekim otelotvorenjima, anti-PD-L1 antitelo je monoklonsko antitelo. U nekim aspektima, anti-PD-L1 antitelo je fragment antitela izabran iz grupe koja

4

sadrži Fab, Fab'-SH, Fv, scFv i (Fab')2fragmente. U nekim otelotvorenjima, anti-PD-L1 antitelo je humanizovano antitelo. U nekim otelotvorenjima, anti-PD-L1 antitelo je humano antitelo.

Anti-PD-L1 antitela korisna u ovom pronalasku, uključujući kompozicije koje sadrže takva antitela, kao što su ona opisana u WO2010/077634 A1 i US8,217,149, mogu se koristiti u kombinaciji sa agensom koji smanjuje ili inhibira ekspresiju i/ili aktivnost TIGIT sa dodatnom terapijom ili bez ikakve dodatne terapije (npr. hemoterapija) za lečenje raka ili bolesti povezane sa imunskim sistemom (npr. disfunkcionalni poremećaj T ćelija, virusna infekcija, hronična virusna infekcija itd.).

U jednom aspektu, anti-PD-L1 antitelo sadrži polipeptid varijabilnog regiona teškog lanca koji sadrži HVR-H1, HVR-H2 i HVR-H3 sekvencu, pri čemu:

(a) HVR-H1 sekvenca j (SEQ ID NO: 33); (b) HVR-H2 sekvenca

(c) HVR-H3 sekvenca j (SEQ ID NO: 19);

i pri čemu: X1je D ili G; X2je S ili L; X3je T ili S.

U jednom konkretnom aspektu, X1je D; X2je S i X3je T. U još jednom aspektu, polipeptid dalje sadrži okvirnu sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca postavljenu uporedo između HVR-ova prema formuli: (HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4). U još jednom aspektu, okvirne sekvence su izvedene iz sekvenci humanog okvira konsenzusa. U još jednom aspektu, okvirne sekvence su okvir konsenzusa VH podgrupe III. U još jednom aspektu, barem jedna od okvirnih sekvenci je sledeća:

U još jednom aspektu, polipeptid teškog lanca se nadalje kombinuje sa varijabilnim regionom lakog lanca koji sadrži HVR-L1, HVR-L2 i HVR-L3, pri čemu:

(a) HVR-L1 sekvenca (SEQ ID NO: 35);

(b) HVR-L2 sekvenca j (SEQ ID NO: 36);

(c) HVR-L3 sekvenca j (SEQ ID NO: 37);

i pri čemu: X4je D ili V; X5je V ili I; X6, je S ili N; X7je A ili F; X8je V ili L; X9je F ili T; X10je Y ili A; X11je Y, G, F, ili S; X12je L, Y, F ili W; X13je Y, N, A, T, G, F ili I; X14je H, V, P, T ili I; X15je A, W, R, P ili T.

U još jednom aspektu, X4 je D; X5 je V; X6 je S; X7 je A; X8 je V; X9 je F; X10 je Y; X11 je Y; X12 je F; X13 je Y; X14 je H; X15 je A. U još jednom aspektu, laki lanac nadalje sadrži okvirne sekvence varijabilnog regiona lakog lanca postavljene uporedo između HVR-ova prema formuli: (LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4). U još jednom aspektu, okvirne sekvence su izvedene iz sekvenci humanog okvira konsenzusa. U još jednom aspektu, okvirne sekvence su VL kapa I okvir konsenzusa. U još jednom aspektu, bar jedna od okvirnih sekvenci je sledeća:

U jednom drugom aspektu, obezbeđuje se izolovano anti-PD-L1 antitelo ili njegov antigen vezujući fragment koji sadrži teški lanac i sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca, pri čemu:

(a) teški lanac sadrži i HVR-H1, HVR-H2 i HVR-H3, i pri čemu:

(i) HVR-H1 sekvenca j (SEQ ID NO: 33)

(ii) HVR-H2 sekvenca

(iii) HVR-H3 sekvenca (SEQ ID NO: 19)

(b) laki lanac sadrži i HVR-L1, HVR-L2 i HVR-L3, i pri čemu:

(i) HVR-L1 sekvenca j (SEQ ID NO: 35)

(ii) HVR-L2 sekvenca j (SEQ ID NO: 36)

(iii) HVR-L3 sekvenca j (SEQ ID NO: 37)

i pri čemu: X1je D ili G; X2je S ili L; X3je T ili S; X4je D ili V; X5je V ili I; X6je S ili N; X7je A ili F; X8je V ili L; X9je F ili T; X10je Y ili A; X11je Y, G, F, ili S; X12je L, Y, F ili W; X13je Y, N, A, T, G, F ili I; X14je H, V, P, T ili I; X15je A, W, R, P ili T.

U posebnom aspektu, X1je D; X2je S i X3je T. U jednom drugom aspektu, X4je D; X5je V; X6je S; X7je A; X8je V; X9je F; X10je Y; X11je Y; X12je L; X13je Y; X14je H; X15je A. U još jednom aspektu, X1je D; X2je S i X3je T, X4je D; X5je V; X6je S; X7je A; X8je V; X9je F; X10je Y; X11je Y; X12je L; X13je Y; X14je H i X15je A.

U još jednom aspektu, varijabilni region teškog lanca sadrži jednu ili više okvirnih sekvenci smeštenih uporedo između HVR-ova kao: (HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4), a varijabilni regioni lakog lanca sadrže jednu ili više okvirnih sekvenci smeštenih uporedo između HVR-ova kao: (LC-FR1)-(HVR-L1)-(LCFR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4). U još jednom aspektu, okvirne sekvence su izvedene iz sekvenci humanog okvira konsenzusa. U još jednom aspektu, okvirne sekvence teških lanaca izvedene su iz Kabatove sekvence podgrupe I, II ili III. U još jednom aspektu, okvirna sekvenca teškog lanca je okvir konsenzusa VH podgrupe III. U još jednom aspektu, jedna ili više okvirnih sekvenci teškog lanca je sledeća:

U još jednom aspektu, okvirne sekvence lakog lanca izvedene su iz sekvenci Kabatovih podgrupa kapa I, II, II ili IV. U još jednom aspektu, okvirne sekvence lakog lanca su okvir konsenzusa VL kapa I. U još jednom aspektu, jedna ili više okvirnih sekvenci lakog lanca je sledeća:

U još jednom specifičnom aspektu, antitelo nadalje obuhvata humani ili mišji konstantni region. U nekim aspektima, humani konstantni region je odabran iz grupe koja se sastoji od IgG1, IgG2, IgG2, IgG3 i IgG4. U još jednom specifičnom aspektu, humani konstantni region je IgG1. U još jednom aspektu, mišji konstantni region je odabran iz grupe koja se sastoji od IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3. U još jednom aspektu, mišji konstantni region je IgG2A. U još jednom specifičnom aspektu, antitelo ima smanjenu ili minimalnu efektorsku funkciju. U još jednom specifičnom aspektu, minimalna efektorska funkcija rezultat je "Fc mutacije bez efektora" ili aglikozilacije. U još jednom otelotvorenju, Fc mutacija bez efektora je supstitucija N297A ili D265A/N297A u konstantnom regionu.

U još jednom aspektu, obezbeđuje se anti-PD-L1 antitelo koje sadrži sekvencu varijabilnog regiona teškog i lakog lanca, pri čemu:

(a) teški lanac nadalje sadrži i HVR-H1, HVR-H2 i HVR-H3 sekvencu koja je najmanje 85% identična sekvenci (SEQ ID NO: 17), ili (b) laki lanac nadalje sadrži HVR-L1, HVR-L2 i HVR-L3 sekvencu koja je najmanje 85% identična sekvencama

(SEQ ID NO:22), ovim redosledom.

(c) U jednom specifičnom aspektu, identičnost sekvenci je 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100%. U još jednom aspektu, varijabilni region teškog lanca sadrži jednu ili više okvirnih sekvenci smeštenih uporedno između HVR-ova kao: (HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4), a varijabilni regioni lakog lanca sadrže jednu ili više okvirnih sekvenci smeštenih uporedo između HVR-ova kao: (LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4). U još jednom aspektu, okvirne sekvence su izvedene iz sekvenci humanog okvira konsenzusa. U još jednom aspektu, okvirne sekvence teških lanaca izvedene su iz Kabatove sekvence podgrupe I, II ili III. U još jednom aspektu, okvirna sekvenca teškog lanca je okvir konsenzusa VH podgrupe III. U još jednom aspektu, jedna ili više okvirnih sekvenci teškog lanca je sledeća:

NO:25)

NO:26)

U još jednom aspektu, obezbeđuje se izolovano anti-PD-L1 antitelo koje sadrži sekvencu varijabilnog regiona teškog i lakog lanca, pri čemu:

(a) Sekvenca teškog lanca je najmanje 85% identična sekvenci teškog lanca:

(b) sekvence lakog lanca su najmanje 85% identične sekvenci lakog lanca:

NO:24).

U jednom specifičnom aspektu, identičnost sekvenci je 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100%. U još jednom aspektu, varijabilni region teškog lanca sadrži jednu ili više okvirnih sekvenci smeštenih uporedno između HVR-ova kao: (HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4), a varijabilni regioni lakog lanca sadrže jednu ili više okvirnih sekvenci smeštenih uporedo između HVR-ova kao: (LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4). U još jednom aspektu, okvirne sekvence su izvedene iz sekvenci humanog okvira konsenzusa. U još jednom aspektu, okvirne sekvence teškog lanca izvedene su iz sekvence Kabatove podgrupe I, II ili III. U još jednom aspektu, okvirna sekvenca teškog lanca je okvir konsenzusa VH podgrupe III. U još jednom aspektu, jedna ili više okvirnih sekvenci teškog lanca je sledeća:

U još jednom specifičnom aspektu, antitelo nadalje obuhvata humani ili mišji konstantni region. U nekim aspektima, humani konstantni region je odabran iz grupe koja se sastoji od IgG1, IgG2, IgG2, IgG3 i IgG4. U još jednom specifičnom aspektu, humani konstantni region je IgG1. U još jednom aspektu, mišji konstantni region je odabran iz grupe koja se sastoji od IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3. U još jednom aspektu, mišji konstantni region je IgG2A. U još jednom specifičnom aspektu, antitelo ima smanjenu ili minimalnu efektorsku funkciju. U još jednom specifičnom aspektu, minimalna efektorska funkcija nastaje stvaranjem u prokariotskim ćelijama. U još jednom specifičnom aspektu, minimalna efektorska funkcija rezultat je "Fc mutacije bez efektora" ili aglikozilacije. U još jednom otelotvorenju, Fc mutacija bez efektora je supstitucija N297A ili D265A/N297A u konstantnom regionu.

U još jednom aspektu, otkriće obezbeđuje kompozicije koje sadrže bilo koje od gore opisanih anti-PD-L1 antitela u kombinaciji sa najmanje jednim farmaceutski prihvatljivim nosačem.

U još jednom aspektu, obezbeđuje se izolovana nukleinska kiselina koja kodira sekvencu varijabilnog regiona lakog ili teškog lanca anti-PD-L1 antitela, pri čemu:

(a) teški lanac nadalje sadrži i HVR-H1, HVR-H2 i HVR-H3 sekvencu koja je najmanje 85% identična sekvenci

(SEQ ID NO: 18) odnosno

(b) laki lanac nadalje sadrži HVR-L1, HVR-L2 i HVR-L3 sekvencu koja je najmanje 85% identična sekvencama

ovim redosledom.

U jednom specifičnom aspektu, identičnost sekvenci je 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100%. U jednom aspektu, varijabilni region teškog lanca sadrži jednu ili više okvirnih sekvenci smeštenih uporedo između HVR-ova kao: (HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4), a varijabilni regioni lakog lanca sadrže jednu ili više okvirnih sekvenci smeštenih uporedo između HVR-ova kao: (LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4). U još jednom aspektu, okvirne sekvence su izvedene iz sekvenci humanog okvira konsenzusa. U još jednom aspektu, okvirne sekvence teškog lanca izvedene su iz sekvence Kabatove podgrupe I, II ili III. U još jednom aspektu, okvirna sekvenca teškog lanca je okvir konsenzusa VH podgrupe III. U još jednom aspektu, jedna ili više okvirnih sekvenci teškog lanca je sledeća:

U još jednom specifičnom aspektu, antitelo nadalje obuhvata humani ili mišji konstantni region. U nekim aspektima, humani konstantni region je odabran iz grupe koja se sastoji od IgG1, IgG2, IgG2, IgG3 i IgG4. U još jednom specifičnom aspektu, humani konstantni region je IgG1. U još jednom aspektu, mišji konstantni region je odabran iz grupe koja se sastoji od IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3. U još jednom aspektu, mišji konstantni region je IgG2A. U još jednom specifičnom aspektu, antitelo ima smanjenu ili minimalnu efektorsku funkciju. U još jednom specifičnom aspektu, minimalna efektorska funkcija nastaje stvaranjem u prokariotskim ćelijama. U još jednom specifičnom aspektu, minimalna efektorska funkcija rezultat je "Fc mutacije bez efektora" ili aglikozilacije. U još jednom aspektu, Fc mutacija bez efektora je supstitucija N297A ili D265A/N297A u konstantnom regionu.

U još jednom aspektu, obezbeđuje se izolovano anti-PDL1 antitelo koje sadrži sekvencu varijabilnog regiona teškog i lakog lanca, pri čemu:

(a) sekvenca teškog lanaca je najmanje 85% identična sekvenci teškog lanca:

1

(SEQ ID NO:41), ili

(b) sekvence lakog lanca su najmanje 85% identične sekvenci lakog lanca:

NO:24).

U još jednom specifičnom aspektu, antitelo nadalje obuhvata humani ili mišji konstantni region. U nekim aspektima, humani konstantni region je odabran iz grupe koja se sastoji od IgG1, IgG2, IgG2, IgG3 i IgG4. U još jednom specifičnom aspektu, humani konstantni region je IgG1. U još jednom aspektu, mišji konstantni region je odabran iz grupe koja se sastoji od IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3. U još jednom aspektu, mišji konstantni region je IgG2A. U još jednom specifičnom aspektu, antitelo ima smanjenu ili minimalnu efektorsku

2

funkciju. U još jednom specifičnom aspektu, minimalna efektorska funkcija nastaje stvaranjem u prokariotskim ćelijama. U još jednom specifičnom aspektu, minimalna efektorska funkcija rezultat je "Fc mutacije bez efektora" ili aglikozilacije. U još jednom otelotvorenju, Fc mutacija bez efektora je supstitucija N297A ili D265A/N297A u konstantnom regionu.

U još jednom aspektu, varijabilni region teškog lanca sadrži jednu ili više okvirnih sekvenci smeštenih uporedo između HVR-a kao: (HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4), a varijabilni regioni lakog lanca sadrže jednu ili više okvirnih sekvenci smeštenih uporedo između HVR-ova kao: (LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4). U još jednom aspektu, okvirne sekvence su izvedene iz sekvenci humanog okvira konsenzusa. U još jednom aspektu, okvirne sekvence teških lanaca izvedene su iz Kabatove sekvence podgrupe I, II ili III. U još jednom aspektu, okvirna sekvenca teškog lanca je okvir konsenzusa VH podgrupe III. U još jednom aspektu, jedna ili više okvirnih sekvenci teškog lanca je sledeća:

U još jednom aspektu, obezbeđuje se anti-PDL1 antitelo koje sadrži sekvencu varijabilnog regiona teškog i lakog lanca, pri čemu:

(d) teški lanac nadalje obuhvata HVR-H1, HVR-H2 i HVR-H3 sekvencu koja je najmanje 85% identična sekvencama (SEQ ID NO: 17), ili (e) laki lanac nadalje sadrži HVR-L1, HVR-L2 i HVR-L3 sekvencu koja je najmanje 85% identična sekvencama

ovim redosledom.

U jednom specifičnom aspektu, identičnost sekvenci je 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100%. U još jednom aspektu, varijabilni region teškog lanca sadrži jednu ili više okvirnih sekvenci smeštenih uporedno između HVR-ova kao: (HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4), a varijabilni regioni lakog lanca sadrže jednu ili više okvirnih sekvenci smeštenih uporedo između HVR-ova kao: (LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4). U još jednom aspektu, okvirne sekvence su izvedene iz sekvenci humanog okvira konsenzusa. U još jednom aspektu, okvirne sekvence teških lanaca izvedene su iz Kabatove sekvence podgrupe I, II ili III. U još jednom aspektu, okvirna sekvenca teškog lanca je okvir konsenzusa VH podgrupe III. U još jednom aspektu, jedna ili više okvirnih sekvenci teškog lanca je sledeća:

4

(a) sekvenca teškog lanca je najmanje 85% identična sekvenci teškog lanca:

(b) sekvence lakog lanca su najmanje 85% identične sekvenci lakog lanca:

NO:24).

U nekim aspektima, obezbeđuje se izolovano anti-PDL1 antitelo koje sadrži sekvencu varijabilnog regiona teškog i lakog lanca, pri čemu je sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca najmanje 85%, najmanje 86%, najmanje 87%, najmanje 88%, najmanje 89%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, ili najmanje 99% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO:24. U nekim aspektima, obezbeđuje se izolovano anti-PDL1 antitelo koje sadrži sekvencu varijabilnog regiona teškog i lakog lanca, pri čemu je sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca najmanje 85%, najmanje 86%, najmanje 87%, najmanje 88%, najmanje 89%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, ili najmanje 99% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO:40. U nekim aspektima, obezbeđuje se izolovano anti-PDL1 antitelo koje sadrži sekvencu varijabilnog regiona teškog i lakog lanca, pri čemu je sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca najmanje 85%, najmanje 86%, najmanje 87%, najmanje 88%, najmanje 89%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, ili najmanje 99% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO:24, a sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca je najmanje 85%, najmanje 86%, najmanje 87%, najmanje 88%, najmanje 89%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, ili najmanje 99% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO:40.

U još jednom aspektu, obezbeđuje se izolovano anti-PDL1 antitelo koje sadrži sekvencu teškog lanca i lakog lanca, pri čemu:

(a) sekvenca teškog lanca je najmanje 85% identična sekvenci teškog lanca:

NO:48), ili

(b) sekvence lakog lanca su najmanje 85% identične sekvenci lakog lanca:

U nekim aspektima, obezbeđuje se izolovano anti-PDL1 antitelo koje sadrži sekvencu teškog i lakog lanca, pri čemu je sekvenca lakog lanca najmanje 85%, najmanje 86%, najmanje 87%, najmanje 88%, najmanje 89%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, ili najmanje 99% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO:49. U nekim aspektima, obezbeđuje se izolovano anti-PDL1 antitelo koje sadrži sekvencu teškog i lakog lanca, pri čemu je sekvenca teškog lanca najmanje 85%, najmanje 86%, najmanje 87%, najmanje 88%, najmanje 89%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, ili najmanje 99% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO:48. U nekim aspektima, obezbeđuje se izolovano anti-PDL1 antitelo koje sadrži sekvencu teškog i lakog lanca, pri čemu je sekvenca lakog lanca najmanje 85%, najmanje 86%, najmanje 87%, najmanje 88%, najmanje 89%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, ili najmanje 99% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO:49, a sekvenca teškog lanca je najmanje 85%, najmanje 86%, najmanje 87%, najmanje 88%, najmanje 89%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, ili najmanje 99% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO:48.

U još jednom aspektu, nukleinska kiselina dalje sadrži vektor pogodan za ekspresiju nukleinske kiseline koja kodira bilo koje od prethodno opisanih anti-PD-L1 antitela. U još jednom specifičnom aspektu, vektor podrazumeva ćeliju domaćina pogodnu za ekspresiju nukleinske kiseline. U još jednom specifičnom aspektu, ćelija domaćina je eukariotska ili prokariotska ćelija. U još jednom specifičnom aspektu, eukariotska ćelija je ćelija sisara, poput jajnika kineskog hrčka (CHO).

Anti-PD-L1 antitelo ili njegov antigen vezujući fragment se mogu proizvesti pomoću postupaka poznatih u struci, na primer, procesom koji podrazumeva kultivaciju ćelije domaćina koja sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira bilo koje od prethodno opisanih anti-PD-L1 antitela ili njihov antigen vezujući fragment u obliku pogodnom za ekspresiju, pod pogodnim uslovima za proizvodnju takvog antitela ili fragmenta, i preuzimanje tog antitela ili fragmenta.

U još jednom aspektu, otkriće predviđa kompoziciju koja sadrži anti-PD-L1 antitelo ili njegov antigen vezujući fragment kako je ovde dato i najmanje jedan farmaceutski prihvatljiv nosač.

Agensi koji smanjuju ili inhibiraju ekspresiju i/ili aktivnost TIGIT

Ovde se objavljuje postupak za lečenje ili odlaganje progresije raka kod pojedinca, koji podrazumeva davanje pojedincu efikasne količine antagonista vezivanja PD-1 ose u kombinaciji sa agensom koji smanjuje ili inhibira ekspresiju i/ili aktivnost TIGIT. Ovde se obezbeđuje i postupak za smanjenje ili inhibiciju recidiva ili napredovanja raka kod pojedinca, koji se sastoji od davanja pojedincu efikasne količine antagonista vezivanja PD-1 ose u kombinaciji sa agensom koji smanjuje ili inhibira ekspresiju i/ili aktivnost TIGIT. Ovde se objavljuje i postupak za lečenje ili odlaganje napredovanja bolesti povezanih sa imunskim sistemom kod pojedinca, koji podrazumeva davanje pojedincu efikasne količine antagonista vezivanja PD-1 ose u kombinaciji sa agensom koji smanjuje ili inhibira ekspresiju i/ili aktivnost TIGIT. Ovde se objavljuje i postupak za smanjenje ili inhibiciju napredovanja bolesti povezanih sa imunskim sistemom kod pojedinca, koji podrazumeva davanje pojedincu efikasne količine antagonista vezivanja PD-1 ose u kombinaciji sa agensom koji smanjuje ili inhibira ekspresiju i/ili aktivnost TIGIT. Ovde se objavljuje i postupak za povećanje, pojačavanje ili stimulisanje imunskog odgovora ili funkcije kod pojedinca, koji podrazumeva davanje pojedincu efikasne količine antagonista vezivanja PD-1 ose u kombinaciji sa agensom koji smanjuje ili inhibira ekspresiju i/ili aktivnost TIGIT. Ovde se obezbeđuje i postupak za povećanje, pojačavanje ili stimulisanje imunskog odgovora ili funkcije kod pojedinca, koji se sastoji od davanja pojedincu efikasne količine agensa koji smanjuje ili inhibira ekspresiju i/ili aktivnost TIGIT i agensa koji smanjuje ili inhibira jedan ili više dodatnih imunskih koinhibitornih receptora. Ovde se takođe obezbeđuje postupak za povećanje, pojačavanje ili stimulisanje imunskog odgovora ili funkcije kod pojedinca, koji se sastoji od davanja pojedincu efikasne količine agensa koji smanjuje ili inhibira ekspresiju i/ili aktivnost TIGIT i agensa koji povećava ili aktivira jedan ili više dodatnih imunskih kostimulatornih receptora. Na primer, agens koji smanjuje ili inhibira ekspresiju i/ili aktivnost TIGIT obuhvata antagonista ekspresije i/ili aktivnosti TIGIT, antagonista ekspresije i/ili aktivnosti PVR, agens koji inhibira i/ili blokira interakciju TIGIT-a sa PVR, agens koji inhibira i/ili blokira interakciju TIGIT-a sa PVRL2, agens koji inhibira i/ili blokira interakciju TIGIT-a sa PVRL3, agens koji inhibira i/ili blokira intraćelijsku signalizaciju posredovanu TIGIT vezivanjem za PVR, agens koji inhibira i/ili blokira intraćelijsku signalizaciju posredovanu vezivanjem TIGIT za PVRL2, agens koji inhibira i/ili blokira intraćelijsku signalizaciju posredovanu vezivanjem TIGIT za PVRL3, i njihove kombinacije.

U nekim aspektima, antagonist ekspresije i/ili aktivnosti TIGIT obuhvata inhibitor malih molekula, inhibitorno antitelo ili njegov antigen vezujući fragment, aptamer, inhibitornu nukleinsku kiselinu i inhibitorni polipeptid.

U nekim aspektima, antagonist ekspresije i/ili aktivnosti PVR obuhvata inhibitor malih molekula, inhibitorno antitelo ili njegov antigen vezujući fragment, aptamer, inhibitornu nukleinsku kiselinu i inhibitorni polipeptid.

U nekim aspektima, agens koji inhibira i/ili blokira interakciju TIGIT-a sa PVR obuhvata inhibitor malih molekula, inhibitorno antitelo ili njegov antigen vezujući fragment, aptamer, inhibitornu nukleinsku kiselinu i inhibitorni polipeptid.

U nekim aspektima, agens koji inhibira i/ili blokira interakciju TIGIT-a sa PVRL2 obuhvata inhibitor malih molekula, inhibitorno antitelo ili njegov antigen vezujući fragment, aptamer, inhibitornu nukleinsku kiselinu i inhibitorni polipeptid.

U nekim aspektima, agens koji inhibira i/ili blokira interakciju TIGIT-a sa PVRL3 obuhvata inhibitor malih molekula, inhibitorno antitelo ili njegov antigen vezujući fragment, aptamer, inhibitornu nukleinsku kiselinu i inhibitorni polipeptid.

U nekim aspektima, agens koji inhibira i/ili blokira intraćelijsku signalizaciju posredovanu vezivanjem TIGIT za PVR obuhvata inhibitor malih molekula, inhibitorno antitelo ili njegov antigen vezujući fragment, aptamer, inhibitornu nukleinsku kiselinu i inhibitorni polipeptid.

U nekim aspektima, agens koji inhibira i/ili blokira intraćelijsku signalizaciju posredovanu vezivanjem TIGIT za PVRL2 obuhvata inhibitor malih ćelija, inhibitorno antitelo ili njegov antigen vezujući fragment, aptamer, inhibitornu nukleinsku kiselinu i inhibitorni polipeptid.

U nekim aspektima, agens koji inhibira i/ili blokira intraćelijsku signalizaciju posredovanu vezivanjem TIGIT za PVRL3 obuhvata inhibitor malih ćelija, inhibitorno antitelo ili njegov antigen vezujući fragment, aptamer, inhibitornu nukleinsku kiselinu i inhibitorni polipeptid.

U nekim aspektima, antagonist ekspresije i/ili aktivnosti TIGIT je inhibitorna nukleinska kiselina odabrana od antisens polinukleotida, interferentne RNK, katalitičke RNK i himera RNK-DNK.

U nekim aspektima, antagonist ekspresije i/ili aktivnosti TIGIT je anti-TIGIT antitelo ili njegov antigen vezujući fragment.

Anti-TIGIT antitela korisna u ovom pronalasku, uključujući kompozicije koje sadrže takva antitela, kao što su ona opisana u WO2009/126688, mogu se koristiti u kombinaciji sa antagonistima vezivanja PD-1 ose.

Anti-TIGIT antitela

Ovo otkriće obezbeđuje anti-TIGIT antitela. Primer antitela uključuje poliklonska, monoklonska, humanizovana, bispecifična i heterokonjugovana antitela. Stručno lice iz ove oblasti će znati da otkriće takođe obezbeđuje antitela na druge polipeptide (tj. anti-PVR antitela) i da će bilo koji od opisa ovde datih specifično za postupak stvaranja, proizvodnje, varijeteta, upotrebe ili drugih aspekata anti-TIGIT antitela biti takođe primenljiv na antitela specifična za ostale polipeptide koji nisu TIGIT.

Poliklonska antitela

Anti-TIGIT antitela mogu sadržati poliklonska antitela. Postupci pripreme poliklonskih antitela su poznati iskusnim stručnjacima iz ove oblasti. Poliklonska antitela se mogu povećati kod sisara, na primer, primenom jedne ili više injekcija imunizujućeg agensa i, ako je se to želi, adjuvansa. Tipično je da se imunizujući agens i/ili adjuvans ubrizgava u sisara višestrukim potkožnim ili intraperitonealnim injekcijama. Imunizujući agens može sadržati TIGIT polipeptid ili njegov fuzioni protein. Može biti korisno konjugovati imunizujući agens sa proteinom za koji se zna da je imunogen kod sisara koji se imunizuje.

Primeri takvih imunogenih proteina uključuju, ali nisu ograničeni na, hemocijanin školjke Megathura crenulata, albumin iz seruma, goveđi tiroglobulin i inhibitor tripsina iz soje. U primere za adjuvanse koji mogu da se upotrebe spadaju Frojndov kompletni adjuvans i MPL-TDM adjuvans (monofosforil Lipid A, sintetska trehaloza dikorinomikolat). Protokol za imunizaciju može odabrati stručno lice za ovu oblast bez nepotrebnih eksperimenata.

Monoklonska antitela

Anti-TIGIT antitela mogu alternativno biti i monoklonska antitela. Monoklonska antitela se mogu pripremiti korišćenjem postupaka hibridoma, poput onih koje su opisali Kohler i Milstein, Nature, 256:495 (1975). U postupku hibridoma, miš, hrčak, ili druga pogodna životinja domaćin imunizuje se imunizujućim agensom, kako bi se izazvali limfociti koji proizvode ili su sposobni da proizvode antitela koja će se specifično vezivati za imunizujući agens. Alternativno, limfociti mogu biti imunizovani in vitro.

Imunizujući agens tipično uključuje TIGIT polipeptid ili njegov fuzioni protein. Po pravilu, koriste se limfociti periferne krvi („PBL“), ako se žele ćelije humanog porekla, ili se koriste ćelije slezine ili limfnih čvorova, ako se žele ne-humani sisari kao izvor. Limfociti se onda fuzionišu sa imortalizovanom ćelijskom linijom pomoću prikladnog agensa za fuziju, kao što je polietilen glikol, dajući ćelije hibridoma [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) str. 59-103], Imortalizovane ćelijske linije tipično su transformisane ćelije sisara, naročito ćelije mijeloma glodara, goveda i ljudskog porekla. Tipično se koriste ćelijske linije mijeloma pacova ili miša. Ćelije hibridoma mogu se uzgajati u pogodnom medijumu za uzgajanje, koji poželjno sadrži jednu ili više supstanci koje inhibiraju rast ili preživljavanje nefuzionisanih, imortalizovanih ćelija. Na primer, ako matične ćelije mijeloma nemaju enzim hipoksantin guanin fosforibozil transferazu (HGPRT ili HPRT), medijum za uzgajanje hibridoma tipično će sadržati hipoksantin, aminopterin i timidin (HAT medijum), jer te supstance sprečavaju rast HGPRT-deficijentnih ćelija.

Poželjne imortalizovane ćelijske linije su one koje mogu efikasno da se fuzionišu, da podrže stabilnu proizvodnju velike koncentracije antitela od strane odabranih ćelija koje proizvode antitela, i osetljive su na medijum, kao što je HAT medijum. Poželjnije imortalizovane ćelijske linije su linije mišjeg mijeloma, koje se, na primer, mogu nabaviti od Distribucionog centra za ćelije Salkovog instituta (Salk Institute Cell Distribution Center), San Diego, California, i od American Type Culture Collection, Rockville, Maryland. Ćelijske linije humanog mijeloma i mišjeg-humanog heteromijeloma takođe su opisane za proizvodnju humanih monoklonskih antitela [Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) str.51-63].

Medijum za uzgajanje u kome se uzgajaju ćelije hibridoma može se onda ispitati na prisustvo monoklonskih antitela usmerenih na dati polipeptid. Poželjno se specifičnost vezivanja monoklonskih antitela koja proizvode ćelije hibridoma određuje imunoprecipitacijom ili in vitro testom vezivanja, kao što je radioimunotest (RIA) ili test sa imunoadsorbentom vezanim za enzim (ELISA). Takve tehnike i testovi poznati su u struci. Afinitet vezivanja monoklonskog antitela može, na primer, da se odredi Skačardovom analizom, koju su dali Munson i Pollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980).

Nakon što se identifikuju željene ćelije hibridoma, klonovi mogu biti potklonirani postupcima ograničavanja razblaženja, i uzgojeni standardnim postupcima [Goding, supra]. Pogodni medijumi za kulturu za ovu namenu uključuju, na primer, Dulbekov modifikovani Iglov medijum i medijum RPMI-1640. Alternativno, ćelije hibridoma se mogu uzgajati in vivo kao ascites u sisaru.

Monoklonska antitela koja izlučuju potklonovi mogu se izolovati i prečistiti iz medijuma kulture ili tečnosti ascitesa klasičnim postupcima za prečišćavanja imunoglobulina, kao što je, na primer, protein A sefaroza, hidroksilapatitna hromatografija, gel elektroforeza, dijaliza ili afinitetna hromatografija.

Monoklonska antitela se takođe mogu proizvesti rekombinantnim DNK postupcima, poput onih opisanih u US patentu br. 4,816,567. DNK koja kodira monoklonska antitela može biti lako izolovana i sekvencirana korišćenjem klasičnih postupaka (npr. korišćenjem oligonukleotidnih sondi koje mogu specifično da se vežu za gene koji kodiraju teške i lake lance mišjih antitela). Ćelije hibridoma iz ovog otkrića su poželjni izvor takve DNK. Kada se izoluje, DNK se može ubaciti u ekspresione vektore, koji se zatim transficiraju u ćeliju domaćina, kao što su majmunske COS ćelije, ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO) ili ćelije mijeloma koje inače ne proizvode protein imunoglobulina, da bi se dobila sinteza monoklonskih antitela u rekombinantnim ćelijama domaćina. DNK se takođe može modifikovati, na primer, zamenom kodirajuće sekvence za konstantne domene humanog teškog i lakog lanca umesto homolognih mišjih sekvenci [U.S. Patent br. 4,816,567; Morrison et al., supra], ili kovalentnim spajanjem sa kodirajućom sekvencom imunoglobulina cele ili dela kodirajuće sekvence za neimunoglobulinski polipeptid. Takav neimunoglobulinski polipeptid može biti supstituisan konstantnim domenima antitela iz ovog izuma, ili može biti supstituisan varijabilnim domenima jednog mesta za spajanje antigena antitela ovog izuma da bi se stvorilo himerno dvovalentno antitelo.

Antitela mogu biti jednovalentna antitela. Postupci za pripremu jednovalentnih

1

antitela su dobro poznati u struci. Na primer, jedan postupak uključuje rekombinantnu ekspresiju lakog lanca imunoglobulina i modifikovanog teškog lanca. Teški lanac se skraćuje po pravilu na bilo kojoj tački Fc regiona tako da se spreči unakrsno vezivanje teških lanaca. Alternativno, relevantni cisteinski ostaci supstituišu se drugim aminokiselinskim ostatkom ili se brišu tako da se spreči unakrsno vezivanje.

In vitro postupci su takođe pogodni za pripremu jednovalentnih antitela. Digestija antitela da bi se proizveli njihovi fragmenti, naročito Fab fragmenti, može se izvesti pomoću rutinskih tehnika poznatih u struci.

Humana i humanizovana antitela

Anti-TIGIT antitela iz ovog izuma mogu dalje da sadrže humanizovana antitela ili humana antitela. Humanizovane forme ne-humanih (npr., mišjih) antitela su himerni imunoglobulini, lanci imunoglobulina ili njihovi fragmenti (kao Fv, Fab, Fab’, F(ab’)2ili druge antigen vezujuće podsekvence antitela) koji sadrže minimalnu sekvencu dobijenu od ne-humanog imunoglobulina. Humanizovana antitela obuhvataju humane imunoglobuline (antitelo primalac) kod kojih su ostaci regiona koji određuje komplementarnost (CDR) primaoca zamenjeni ostacima CDR-a ne-humane vrste (donorsko antitelo), kao što je miš, pacov ili zec, koji imaju željenu specifičnost, afinitet i kapacitet. U nekim slučajevima, ostaci okvirnog regiona Fv humanog imunoglobulina zamenjeni su odgovarajućim ne-humanim ostacima. Humanizovana antitela mogu takođe da obuhvataju ostatke koji se ne nalaze ni u antitelu primaocu ni u uvezenim sekvencama CDR ili okvira. Uglavnom, humanizovano antitelo će da sadrži u suštini sve ili barem jedan, a tipično dva, varijabilna domena, u kojima svi ili suštinski svi CDR regioni odgovaraju onima iz ne-humanog imunoglobulina, a svi ili suštinski svi FR regioni su oni iz sekvence konsenzusa humanog imunoglobulina. Humanizovano antitelo će optimalno takođe da sadrži barem deo konstantnog regiona imunoglobulina (Fc), tipično deo humanog imunoglobulina [Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature. 332:323-329 (1988); i Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992)].

Postupci za humanizaciju ne-humanih antitela su dobro poznati u struci. Generalno, humanizovano antitelo ima jedan ili više ostataka aminokiseline uvedenih iz izvora koji nije ljudskog porekla. Ovi ne-humani aminokiselinski ostaci se često nazivaju „uvoznim“ ostacima, koji se tipično uzimaju iz „uvoznog“ varijabilnog domena.

Humanizacija može u suštini da se obavi postupkom koji su dali Winter i saradnici [Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)], zamenom sekvenci CDR regiona ili CDR

2

regiona glodara odgovarajućim sekvencama humanog antitela. Shodno tome, takva „humanizovana“ antitela su himerna antitela (U.S. Patent br. 4,816,567), naznačena time što se u značajno manjoj meri netaknuti humani varijabilni domen zamenjuje odgovarajućom sekvencom vrsta koje nisu ljudskog porekla. Tipično su humanizovana antitela humana antitela kod kojih su neki CDR ostaci i verovatno neki FR ostaci zamenjeni ostacima sa analognih mesta antitela glodara.

Humana antitela se mogu proizvoditi korišćenjem različitih tehnika poznatih u struci, uključujući biblioteke displeja faga [Hoogenboom i Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)]. Takođe, dostupne su i tehnike koje su dali Cole et al. i Boerner et al. za pripremu humanih monoklonskih antitela (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, str. 77 (1985) i Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991)]. Slično tome, humana antitela se mogu dobiti uvođenjem lokusa humanog imunoglobulina u transgene životinje, npr. miševe, kod kojih su endogeni geni imunoglobulina delimično ili potpuno inaktivirani. Prilikom izazova, primećena je proizvodnja humanog antitela, koje u svakom pogledu veoma liči na ljudsko, uključujući premeštanje gena, skup gena i repertoar antitela. Taj pristup opisuju, na primer, U.S. Patenti br. 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016 i sledeće naučne publikacije: Marks et al., Bio/Technology 10, 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368 856-859 (1994); Morrison, Nature 368, 812-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996); Lonberg i Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13 65-93 (1995).

Antitela takođe mogu biti afinitetno sazrela pomoću poznatih postupaka selekcije i/ili mutageneze kao što je gore opisano. Poželjna afinitetno sazrela antitela imaju afinitet koji je pet puta, poželjnije 10 puta, čak poželjnije 20 ili 30 puta veći nego kod polaznog antitela (uglavnom mišjih, humanizovanih ili humanih) iz koga je pripremljeno zrelo antitelo.

Bispecifična antitela

Bispecifična antitela su monoklonska antitela, poželjno humana ili humanizovana, koja imaju sposobnost specifičnog vezivanja za najmanje dva različita antigena. U ovom slučaju, jedna od specifičnosti vezivanja je za TIGIT, a druga za bilo koji drugi antigen, a poželjno za protein na površini ćelije ili receptor ili receptorsku podjedinicu.

Postupci za dobijanje bispecifičnih antitela su poznati u struci. Tradicionalno, rekombinantna proizvodnja bispecifičnih antitela se zasniva na koekspresiji dva para teški lanac-laki lanac imunoglobulina, pri čemu dva teška lanca imaju različite specifičnosti [Milstein i Cuello, Nature, 305:537-539 (1983)]. Zbog nasumičnog rasporeda teških i lakih lanaca imunoglobulina, ti hibridomi (kvadromi) proizvode potencijalnu smešu od 10 različitih molekula antitela, od kojih samo jedan ima ispravnu bispecifičnu strukturu. Prečišćavanje ispravnih molekula tipično se izvodi koracima afinitetne hromatografije. Slični postupci su otkriveni u WO93/08829 objavljenom 13. maja 1993. godine, i u Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991).

Varijabilni domeni antitela sa željenim specifičnostima vezivanja (mesta sa kombinacijom antitelo-antigen) mogu se fuzionisati u sekvence konstantnog domena imunoglobulina. Poželjna fuzija je sa konstantnim domenom teškog lanca imunoglobulina, koji obuhvata bar deo šarke, CH2 i CH3 regione. Poželjno je da postoji prvi konstantni region teškog lanca (CH1) koji sadrži mesto potrebno za vezivanje lakog lanca prisutno u bar jednoj fuziji. DNK koje kodiraju fuzije teškog lanca imunoglobulina, i, po želji, lakog lanca imunoglobulina, ubacuju se u odvojene ekspresione vektore i kotransficiraju se u pogodni organizam domaćina. Više detalja o dobijanju bispecifičnih antitela potražite, na primer, u Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986).

Prema drugom pristupu koji opisuje WO96/27011, može se konstruisati interfejs između para molekula antitela radi dobijanja maksimalnog procenta heterodimera koji su izolovani iz rekombinantne ćelijske kulture. Poželjni interfejs sadrži barem deo CH3 regiona konstantnog domena antitela. U ovom postupku, jedan ili više malih bočnih lanaca aminokiselina sa interfejsa prvog molekula antitela zamenjeni su dužim bočnim lancima (npr. tirozin ili triptofan). Kompenzujuće „šupljine“ iste ili slične veličine kao dugački bočni lanac (lanci) stvaraju se na interfejsu drugog molekula antitela, zamenom dugačkih bočnih lanaca aminokiselina kraćima (npr. alanin ili treonin). To obezbeđuje mehanizam za povećanje prinosa heterodimera u odnosu na druge neželjene krajnje proizvode, kao što su homodimeri.

Bispecifična antitela se mogu pripremiti kao antitela pune dužine ili kao fragmenti antitela (npr. F(ab’)2bispecifična antitela). Tehnike za dobijanje bispecifičnih antitela od fragmenata antitela opisane su u literaturi. Na primer, bispecifična antitela se mogu pripremiti primenom hemijskih veza. Brennan et al., Science 229:81 (1985) opisuju postupak u kome se netaknuta antitela proteolitički cepaju, dajući F(ab’)2fragmente. Ovi fragmenti su redukovani u prisustvu ditiol kompleksirajućeg agensa natrijum arsenita da bi se stabilizovali vicinalni ditioli i sprečilo stvaranje intermolekularnih disulfida. Nastali Fab’ fragmenti se zatim prevode u derivate tionitrobenzoata (TNB). Jedan od Fab'-TNB derivata se zatim ponovo konvertuje u Fab'-tiol redukcijom sa merkaptoetilaminom i meša se sa ekvimolarnom količinom drugog Fab'-TNB derivata da bi se formiralo bispecifično antitelo. Proizvedena bispecifična antitela mogu se koristiti kao agensi za selektivnu imobilizaciju enzima.

4

Fab’ fragmenti se mogu direktno izolovati iz E. coli i hemijski kuplovati, čime se formiraju bispecifična antitela. Shalaby et al., J. Exp. Med. 175:217-225 (1992) opisuju proizvodnju potpuno humanizovanih molekula F(ab’)2bispecifičnih antitela. Svaki Fab’ fragment se odvojeno luči iz E. coli i podvrgava usmerenom hemijskom kuplovanju in vitro da se dobije bispecifično antitelo. Tako formirano bispecifično antitelo je moglo da se veže za ćelije koje prekomerno eksprimiraju ErbB2 receptor i normalne humane T ćelije, kao i da aktivira liznu aktivnost humanih citotoksičnih limfocita protiv cilja, humanog tumora dojke.

Takođe su opisane različite tehnike za pripremu i izolovanje fragmenata bispecifičnih antitela direktno iz rekombinantne ćelijske kulture. Na primer, bispecifična antitela su proizvedena primenom leucinskih zatvarača. Kostelny et al., J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992). Peptidi leucinskog zatvarača iz Fos i Jun proteina vezani su za Fab' delove dva različita antitela putem fuzije gena. Homodimeri antitela su redukovani u regionu zgloba, dajući monomere, i ponovo oksidisani, formirajući heterodimere antitela. Ovaj postupak se takođe može koristiti za proizvodnju homodimera antitela. Tehnologija "dijatela" koju su opisali Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993) obezbeđuje alternativni mehanizam za proizvodnju bispecifičnih/dvovalentnih fragmenata antitela. Fragmenti obuhvataju varijabilni domen teškog lanca (VH) vezan za varijabilni domen lakog lanca (VL) preko linkera koji je prekratak da omogući sparivanje dva domena na istom lancu. Shodno tome, VHi VLdomeni jednog fragmenta su prisiljeni da se upare sa komplementarnim VLi VHdomenima drugog fragmenta, tako formirajući dva antigenvezujuća mesta. Druga strategija za dobijanje fragmenata bispecifičnih antitela upotrebom jednolančanih Fv (sFv) dimera je takođe objavljena. Videti, Gruber et al., J. Immunol.

152:5368 (1994).

Razmatrana su antitela sa više od dve valence. Jedan neograničavajući primer odnosi se na mogućnosti pripreme trispecifičnih antitela. Videti, npr. Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991).

Primeri bispecifičnih antitela mogu da se vežu za dva različita epitopa na datom TIGIT polipeptidu iz ovog dokumenta. Alternativno, anti-TIGIT polipeptidni krak se može kombinovati sa krakom koji se vezuje za aktivirajući molekul na leukocitu, kao što je molekul receptora T ćelije (npr., CD2, CD3, CD28 ili B7), ili Fc receptori za IgG (FcγR), kao što je FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) i FcγRIII (CD16), tako da se mehanizmi ćelijske odbrane usredsrede na ćeliju koja eksprimira konkretni TIGIT polipeptid. Bispecifična antitela mogu takođe da se upotrebe za lokalizaciju citotoksičnih agensa na ćelije koje eksprimiraju konkretni TIGIT polipeptid. Takva antitela imaju krak koji vezuje TIGIT i krak koji vezuje citotoksični agens ili radionuklidni helator, kao što je EOTUBE, DPTA, DOTA ili TETA. Drugo bispecifično antitelo od interesa vezuje se za TIGIT polipeptid i dalje se vezuje za tkivni faktor (TF).

Antitela heterokonjugati

Antitela heterokonjugati takođe ulaze u okvir predmetnog pronalaska. Antitela heterokonjugati su sastavljena od dva kovalentno vezana antitela. Takva antitela su, na primer, predložena da ciljaju ćelije imunološkog sistema na neželjene ćelije [US patent br.

4,676,980] i za lečenje HIV infekcije [WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089], Razmatrano je da antitela mogu biti pripremljena in vitro uz korišćenje poznatih postupaka u hemiji proteinske sinteze, uključujući one koje obuhvataju agense za unakrsno povezivanje. Na primer, imunotoksini mogu biti konstruisani reakcijom izmene disulfida, ili stvaranjem tioetarske veze. Primeri pogodnih reagensa za ovu namenu uključuju iminotiolat i metil-4-merkaptobutirimidat, kao i one koji su objavljeni, na primer, u U.S. Patentu br.4,676,980.

Inženjering efektorske funkcije

Može biti poželjno modifikovati antitelo iz ovog izuma u odnosu na efektorsku funkciju, tako da se poboljša npr. efikasnost antitela u lečenju raka. Na primer, cisteinski ostatak (ili ostaci) može biti uveden u Fc region, čime se omogućava formiranje međulančane disulfidne veze u ovom regionu. Tako generisano homodimerno antitelo stoga može imati poboljšanu sposobnost internalizacije i/ili povećano komplementom posredovano ubijanje ćelija i ćelijsku citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC). Videti Caron et al., J. Exp Med., 176: 1191-1195 (1992) i Shopes, J. Immunol., 148: 2918-2922 (1992). Homodimerna antitela sa pojačanom anti-tumorskom aktivnošću mogu takođe biti pripremljena korišćenjem heterobifunkcionalnih unakrsnih linkera, kao što je opisano u Wolff et al. Cancer Research, 53: 2560-2565 (1993). Alternativno, antitelo može biti konstruisano tako da ima dva Fc regiona i na taj način može imati poboljšanu lizu komplementa i ADCC sposobnosti. Videti Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design, 3: 219-230 (1989).

U nekom aspektu, stvorena su antitela protiv TIGIT-a koja su bila antitela hrčkaprotiv-miša. Dva antitela, 10A7 i 1F4, takođe se specifično vezuju za humani TIGIT. Aminokiselinske sekvence lakog i teškog lanca antitela 10A7 određene su standardnim tehnikama. Sekvenca lakog lanca ovog antitela je:

(SEQ ID NO:13), a sekvenca teškog lanca ovog antitela je: (SEQ ID NO:15), gde su regioni koje određuju komplementarnost (CDR) svakog lanca predstavljeni masnim slovima. Tako, CDR1 lakog lanca 10A7 ima sekvencu

CDR1 teškog lanca 10A7 ima sekvencu (SEQ ID NO:4), CDR2 teškog lanca 10A7 ima sekvencu (SEQ ID NO:5), i CDR3 teškog lanca 10A7 ima sekvencu

Određene su i aminokiselinske sekvence lakog i teškog lanca 1F4 antitela. Sekvenca lakog lanca ovog antitela je:

ID NO:14), a sekvenca teškog lanca ovog antitela je:

:16), gde su regioni koje određuju komplementarnost (CDR) svakog

asnim slovima. Tako, CDR1 lakog lanca 1F4 ima sekvencu

(SEQ ID NO:7), CDR2 lakog lanca 1F4 ima sekvencu

(SEQ ID NO:8), i CDR3 lakog lanca 1F4 ima sekvencu (SEQ ID NO:9). CDR1 teškog lanca 1F4 ima sekvencu (SEQ ID NO:10), CDR2 teškog lanca 1F4 ima sekvencu (SEQ ID NO:11), i CDR3 teškog lanca 1F4 ima sekvencu

Utvrđeno je da je nukleotidna sekvenca koja kodira laki lanac 1F4 sledeća

(SEQ ID NO:38), a nukleotidna sekvenca koja kodira teški lanac 1F4 sledeća

U nekim aspektima, anti-TIGIT antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže najmanje jedan HVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu od aminokiselinskih

U nekim aspektima, anti-TIGIT antitelo ili njegov antigen vezujući fragment, pri čemu laki lanac antitela sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u

U nekim aspektima, anti-TIGIT antitelo ili njegov antigen vezujući fragment, pri čemu teški lanac antitela sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u

(SEQ ID NO: 13) ili

(SEQ ID NO: 14), a teški lanac antitela sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u

U nekim aspektima, anti-TIGIT antitelo ili njegov antigen vezujući fragment je izabran između humanizovanog antitela, himernog antitela, bispecifičnog antitela, antitela heterokonjugata i imunotoksina.

U nekim aspektima, anti-TIGIT antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže najmanje jedan HVR koji je najmanje 90% identičan HVR-u navedenom u bilo kom od (1)

U nekim aspektima, anti-TIGIT antitelo ili njegov fragment sadrže laki lanac i/ili teški lanac koji sadrži aminokiselinske sekvence najmanje 90% identične aminokiselinskim sekvencama u

Agensi koji modulišu ekspresiju i/ili aktivnost CD226

Ovde se objavljuje postupak lečenja ili odgađanja progresije raka kod pojedinca, koji podrazumeva davanje pojedincu efikasne količine antagonista vezivanja PD-1 ose i agensa koji moduliše ekspresiju i/ili aktivnost CD226. Ovde se objavljuje postupak za smanjenje ili inhibiciju recidiva raka ili napredovanje kancera kod pojedinca, koji podrazumeva davanje pojedincu efikasne količine antagonista vezivanja PD-1 ose i agensa koji moduliše ekspresiju i/ili aktivnost CD226. Ovde se objavljuje postupak za lečenje ili odlaganje napredovanja bolesti povezanih sa imunskim sistemom kod pojedinca, koji podrazumeva davanje pojedincu efikasne količine antagonista vezivanja PD-1 ose i agensa koji moduliše ekspresiju i/ili aktivnost CD226. Ovde se objavljuje postupak za smanjenje ili inhibiranje progresije imunskog oboljenja kod pojedinca, koji obuhvata davanje pojedincu efikasne količine antagonista vezivanja PD-1 ose i agensa koji moduliše ekspresiju i/ili aktivnost CD226. Ovde se objavljuje postupak za povećanje, pojačavanje ili stimulaciju imunskog odgovora ili funkcije kod pojedinca, koji podrazumeva davanje pojedincu efikasne količine antagonista vezivanja PD-1 ose i agensa koji moduliše ekspresiju i/ili aktivnost CD226.

Na primer, agensi koji modulišu ekspresiju i/ili aktivnost CD226 su agensi koji mogu povećati i/ili stimulisati ekspresiju i/ili aktivnost CD226, povećati i/ili stimulisati interakciju CD226 sa PVR, PVRL2 i/ili PVRL3, i povećati i/ili stimulisati intraćelijsku signalizaciju posredovanu vezivanjem CD226 za PVR, PVRL2 i/ili PVRL3. U nekim aspektima, agensi koji mogu povećati i/ili stimulisati ekspresiju i/ili aktivnost CD226 su agensi koji povećavaju i/ili stimulišu ekspresiju i/ili aktivnost CD226. U nekim aspektima, agensi koji mogu povećati i/ili stimulisati interakciju CD226 sa PVR, PVRL2 i/ili PVRL3 su agensi koji povećavaju i/ili stimulišu interakciju CD226 sa PVR, PVRL2 i/ili PVRL3. U nekim aspektima, agensi koji mogu povećati i/ili stimulisati intraćelijsku signalizaciju posredovanu vezivanjem CD226 za PVR, PVRL2 i/ili PVRL3 su agensi koja povećavaju i/ili stimulišu intraćelijsku signalizaciju posredovanu vezivanjem CD226 za PVR, PVRL2 i/ili PVRL3.

U nekim aspektima, agens koji moduliše ekspresiju i/ili aktivnost CD226 odabran je od agensa koji inhibira i/ili blokira interakciju CD226 sa TIGIT, antagonista ekspresije i/ili aktivnosti TIGIT, antagonista ekspresije i/ili aktivnosti PVR, agensa koji inhibira i/ili blokira interakciju TIGIT-a sa PVR-om, agensa koji inhibira i/ili blokira interakciju TIGIT-a sa PVRL2, agensa koji inhibira i/ili blokira interakciju TIGIT-a sa PVRL3, agensa koji inhibira i/ili blokira intraćelijsku signalizaciju posredovanu vezivanjem TIGIT za PVR, agensa koji inhibira i/ili blokira intraćelijsku signalizaciju posredovanu vezivanjem TIGIT za PVRL2, agensa koji inhibira i/ili blokira intraćelijsku signalizaciju posredovanu vezivanjem TIGIT za PVRL3, i njihovih kombinacija. U nekim aspektima, agens koji inhibira i/ili blokira interakciju CD226 sa TIGIT-om bira se između inhibitora malih molekula, inhibitornog antitela ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta, aptamera, inhibitorne nukleinske kiseline i inhibitornog polipeptida. U nekim aspektima, agens koji inhibira i/ili blokira interakciju CD226 sa TIGIT je anti-TIGIT antitelo ili njegov antigen vezujući fragment. U nekim aspektima, agens koji inhibira i/ili blokira interakciju CD226 sa TIGIT-om je inhibitorna nukleinska kiselina izabrana od antisens polinukleotida, interferentne RNK, katalitičke RNK i himere RNK-DNK.

U nekim aspektima, antagonist ekspresije i/ili aktivnosti TIGIT je inhibitor malih molekula, inhibitorno antitelo ili njegov antigen vezujući fragment, aptamer, inhibitorna nukleinska kiselina i inhibitorni polipeptid. U nekim otelotvorenjima, antagonist ekspresije i/ili aktivnosti TIGIT je anti-TIGIT antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment. U nekim aspektima, antagonist ekspresije i/ili aktivnosti TIGIT je inhibitorna nukleinska kiselina odabrana od antisens polinukleotida, interferentne RNK, katalitičke RNK i himera RNK-DNK. U nekim otelotvorenjima, antagonist ekspresije i/ili aktivnosti PVR je inhibitor malih molekula, inhibitorno antitelo ili njegov antigen vezujući fragment, aptamer, inhibitorna nukleinska kiselina i inhibitorni polipeptid. U nekim aspektima, agens koji inhibira i/ili blokira interakciju TIGIT-a sa PVR-om je inhibitor malih molekula, inhibitorno antitelo ili njegov antigen vezujući fragment, aptamer, inhibitorna nukleinska kiselina i inhibitorni polipeptid. U nekim aspektima, agens koji inhibira i/ili blokira interakciju TIGIT-a sa PVRL2 je inhibitor malih molekula, inhibitorno antitelo ili njegov antigen vezujući fragment, aptamer, inhibitorna nukleinska kiselina i inhibitorni polipeptid. U nekim aspektima, agens koji inhibira i/ili blokira interakciju TIGIT-a sa PVRL3 je inhibitor malih molekula, inhibitorno antitelo ili njegov antigen vezujući fragment, aptamer, inhibitorna nukleinska kiselina i inhibitorni polipeptid. U nekim aspektima, agens koji inhibira i/ili blokira intraćelijsku signalizaciju posredovanu vezivanjem TIGIT za PVR je inhibitor malih molekula, inhibitorno antitelo ili njegov antigen vezujući fragment, aptamer, inhibitorna nukleinska kiselina i inhibitorni polipeptid. U nekim aspektima, agens koji inhibira i/ili blokira intraćelijsku signalizaciju posredovanu vezivanjem TIGIT za PVRL2 je inhibitor malih molekula, inhibitorno antitelo ili njegov antigen vezujući fragment, aptamer, inhibitorna nukleinska kiselina i inhibitorni polipeptid. U nekim otelotvorenjima, agens koji inhibira i/ili blokira intraćelijsku signalizaciju posredovanu putem TIGIT vezivanjem za PVRL3 je inhibitor malih molekula, inhibitorno antitelo ili njegov antigen vezujući fragment, aptamer, inhibitorna nukleinska kiselina i inhibitorni polipeptid.

1

U nekim aspektima, antagonist ekspresije i/ili aktivnosti TIGIT obuhvata inhibitor malih molekula, inhibitorno antitelo ili njegov antigen vezujući fragment, aptamer, inhibitornu nukleinsku kiselinu i inhibitorni polipeptid. U nekim aspektima, antagonist ekspresije i/ili aktivnosti PVR obuhvata inhibitor malih molekula, inhibitorno antitelo ili njegov antigen vezujući fragment, aptamer, inhibitornu nukleinsku kiselinu i inhibitorni polipeptid. U nekim aspektima, agens koji inhibira intraćelijsku signalizaciju posredovanu vezivanjem TIGIT-a za PVR izabran je iz grupe koja se sastoji od inhibitora malih molekula, inhibitora antitela ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta, aptamera, inhibitorne nukleinske kiseline i inhibitornog polipeptida. U nekim aspektima, antagonist ekspresije i/ili aktivnosti TIGIT je anti-TIGIT antitelo ili njegov antigen vezujući fragment. U nekim aspektima, antagonist ekspresije i/ili aktivnosti TIGIT je inhibitorna nukleinska kiselina odabrana od antisens polinukleotida, interferentne RNK, katalitičke RNK i himera RNK-DNK.

Kombinacije vanćelijskih ciljeva za imunoregulacionu terapiju antitelima

Pored specifičnog prepoznavanja antigena kroz TCR, aktivacija T ćelija se reguliše kroz ravnotežu pozitivnih i negativnih signala koje pružaju kostimulatorni receptori. Ti površinski proteini su tipično članovi TNF receptorskih ili B7 super porodica. U aktivacione kostimulatorne receptore spadaju CD226, CD28, OX40, GITR, CD137, CD27, HVEM, MICA, ICOS, NKG2D i 2B4. U inhibitorne kostimulatorne receptore spadaju CTLA-4, PD-1, TIM-3, BTLA, VISTA, LAG-3, B7H4 i CD96. Agonistička antitela usmerena protiv aktiviranja kostimulatornih molekula i blokiranja antitela protiv negativnih kostimulatornih molekula mogu pojačati stimulaciju T ćelija kako bi se pospešilo uništavanje tumora.

Ovde se obezbeđuje postupak za povećanje, pojačavanje ili stimulaciju imunskog odgovora ili funkcije kod pojedinca, davanjem pojedincu efikasne količine agensa koji smanjuje ili inhibira ekspresiju i/ili aktivnost TIGIT i agensa koji smanjuje ili inhibira jedan ili više dodatnih imunskih koinhibitornih receptora. U nekim otelotvorenjima, jedan ili više dodatnih imunskih koinhibitornih receptora odabrano je između PD-1, CTLA-4, LAG3, TIM3, BTLA, VISTA, B7H4 i CD96. U nekim aspektima, jedan ili više dodatnih imunskih koinhibitornih receptora je odabran od PD-1, CTLA-4, LAG3 i TIM3.

Ovde se obezbeđuje i postupak za povećanje, pojačavanje ili stimulaciju imunskog odgovora ili funkcije kod pojedinca, davanjem pojedincu efikasne količine agensa koja smanjuje ili inhibira ekspresiju i/ili aktivnost TIGIT i agensa koji povećava ili aktivira jedan ili više dodatnih imunskih kostimulatornih receptora. U nekim aspektima, jedan ili više dodatnih imunskih kostimulatornih receptora odabran je od CD226, OX-40, CD28, CD27, CD137, HVEM, GITR, MICA, ICOS, NKG2D i 2B4. U nekim aspektima, jedan ili više

2

dodatnih imunskih kostimulatornih receptora odabran je od CD226, OX-40, CD27, CD137, HVEM i GITR. U nekim aspektima, jedan ili više dodatnih imunskih kostimulatornih receptora je odabran od OX-40 i CD27.

IV Kompleti

U još jednom aspektu, objavljuje se komplet koji sadrži antagonist vezivanja PD-1 ose i uložak u pakovanju koji sadrži uputstvo za upotrebu antagonista vezivanja PD-1 ose u kombinaciji sa agensom koji smanjuje ili inhibira ekspresiju i/ili aktivnost TIGIT, za lečenje ili odlaganje progresije raka kod pojedinca ili radi poboljšanja imunološke funkcije osobe koja ima rak. Bilo koji od antagonista i/ili agensa vezivanja PD-1 ose koji smanjuje ili inhibira ovde opisanu ekspresiju i/ili aktivnost TIGIT može biti uključen u komplet.

U još jednom aspektu, objavljuje se komplet koji sadrži antagonist vezivanja PD-1 ose i agens koji smanjuje ili inhibira ekspresiju i/ili aktivnost TIGIT, i uložak u pakovanju koji sadrži uputstvo za upotrebu antagonista vezivanja PD-1 ose i agensa koji smanjuje ili inhibira ekspresiju i/ili aktivnost TIGIT za lečenje ili odlaganje progresije raka kod pojedinca ili za poboljšanje imunološke funkcije osobe koja ima rak. Bilo koji od antagonista i/ili agensa vezivanja PD-1 ose koji smanjuje ili inhibira ovde opisanu ekspresiju i/ili aktivnost TIGIT može biti uključen u komplet.

U jednom drugom aspektu, objavljuje se komplet koji sadrži agens koji smanjuje ili inhibira ekspresiju i/ili aktivnost TIGIT i uložak u pakovanju koji sadrži uputstvo za upotrebu agensa koji smanjuje ili inhibira ekspresiju i/ili aktivnost TIGIT u kombinaciji sa antagonistom vezivanja PD-1 ose, za lečenje ili odlaganje progresije raka kod pojedinca ili za poboljšanje imunološke funkcije osobe koja ima rak. Bilo koji od antagonista i/ili agensa vezivanja PD-1 ose koji smanjuje ili inhibira ovde opisanu ekspresiju i/ili aktivnost TIGIT može biti uključen u komplet.

U još jednom aspektu, objavljuje se komplet koji sadrži antagonist vezivanja PD-1 ose i uložak u pakovanju koji sadrži uputstvo za upotrebu antagonista vezivanja PD-1 ose u kombinaciji sa agensom koji moduliše ekspresiju i/ili aktivnost CD226 za lečenje ili odlaganje progresije raka kod pojedinca. Bilo koji od antagonista i/ili agensa vezivanja PD-1 ose koji moduliše ekspresiju i/ili aktivnost CD226 koji su ovde opisani može biti uključen u komplet.

U još jednom aspektu, objavljuje se komplet koji sadrži antagonist vezivanja PD-1 ose i agens koji moduliše ekspresiju i/ili aktivnost CD226 i uložak u pakovanju koji sadrži uputstvo za upotrebu antagonista vezivanja PD-1 ose i agens koji moduliše ekspresiju i/ili aktivnost CD226, za lečenje ili odlaganje progresije raka kod pojedinca. Bilo koji od antagonista i/ili agensa vezivanja PD-1 ose koji moduliše ekspresiju i/ili aktivnost CD226 koji su ovde opisani može biti uključen u komplet.

U još jednom aspektu, objavljuje se komplet koji sadrži agens koji moduliše ekspresiju i/ili aktivnost CD226 i uložak u pakovanju koji sadrži uputstvo za upotrebu agensa koji moduliše ekspresiju i/ili aktivnost CD226 u kombinaciji sa antagonistom vezivanja PD-1 ose, za lečenje ili odlaganje progresije raka kod pojedinca. Bilo koji od antagonista i/ili agensa vezivanja PD-1 ose koji moduliše ekspresiju i/ili aktivnost CD226 koji su ovde opisani može biti uključen u komplet.

U još jednom aspektu, objavljuje se komplet koji sadrži antagonist vezivanja PD-1 ose i uložak u pakovanju koji sadrži uputstvo za upotrebu antagonista vezivanja PD-1 ose u kombinaciji sa agensom koji moduliše ekspresiju i/ili aktivnost CD226 za poboljšanje imunološke funkcije pojedinca koji ima rak. Bilo koji od antagonista i/ili agensa vezivanja PD-1 ose koji moduliše ekspresiju i/ili aktivnost CD226 koji su ovde opisani može biti uključen u komplet.

U još jednom aspektu, objavljuje se komplet koji sadrži antagonist vezivanja PD-1 ose i agens koji moduliše ekspresiju i/ili aktivnost CD226 i uložak u pakovanju koji sadrži uputstvo za upotrebu antagonista vezivanja PD-1 ose i agensa koji moduliše ekspresiju i/ili aktivnost CD226, za jačanje imunološke funkcije osobe koja ima rak. Bilo koji od antagonista i/ili agensa vezivanja PD-1 ose koji moduliše ekspresiju i/ili aktivnost CD226 koji su ovde opisani može biti uključen u komplet.

U još jednom aspektu, objavljuje se komplet koji sadrži agens koji moduliše ekspresiju i/ili aktivnost CD226 i uložak u pakovanju koji sadrži uputstvo za upotrebu agensa koji moduliše ekspresiju i/ili aktivnost CD226 u kombinaciji sa antagonistom vezivanja PD-1 ose da bi se poboljšala imunološka funkcija pojedinca koji ima rak. Bilo koji od antagonista i/ili agensa vezivanja PD-1 ose koji moduliše ekspresiju i/ili aktivnost CD226 koji su ovde opisani može biti uključen u komplet.

U još jednom aspektu, objavljuje se komplet koji sadrži agens koji smanjuje ili inhibira ekspresiju i/ili aktivnost TIGIT i uložak u pakovanju koji sadrži uputstvo za upotrebu agensa koji smanjuje ili inhibira ekspresiju i/ili aktivnost TIGIT u kombinaciji sa agensom koji smanjuje ili inhibira jedan ili više dodatnih imunskih koinhibitornih receptora, za lečenje ili odlaganje progresije raka kod pojedinca ili za poboljšanje imunološke funkcije osobe koja ima rak. Svi agensi koji smanjuju ili inhibiraju ekspresiju i/ili aktivnost TIGIT, i/ili agensi koji smanjuju ili inhibiraju jedan ili više dodatnih imunskih koinhibitornih receptora, koji su opisani u ovom tekstu mogu biti uključeni u komplet.

4

U još jednom aspektu, objavljuje se komplet koji sadrži agens koji smanjuje ili inhibira ekspresiju i/ili aktivnost TIGIT i agens koji smanjuje ili inhibira jedan ili više dodatnih imunskih koinhibitornih receptora, i uložak u pakovanju koji sadrži uputstvo za upotrebu agensa koji smanjuje ili inhibira TIGIT ekspresiju i/ili aktivnost i agensa koji smanjuje ili inhibira jedan ili više dodatnih imunskih koinhibitornih receptora, u svrhu lečenja i odlaganja progresije kancera kod pojedinca ili za poboljšanje imunološke funkcije pojedinca koji ima rak. Svi agensi koji smanjuju ili inhibiraju ekspresiju i/ili aktivnost TIGIT, i/ili agensi koji smanjuju ili inhibiraju jedan ili više dodatnih imunskih koinhibitornih receptora, koji su opisani u ovom tekstu mogu biti uključeni u komplet.

U još jednom aspektu, objavljuje se komplet koji sadrži agens koji smanjuje ili inhibira jedan ili više dodatnih imunskih koinhibitornih receptora i uložak u pakovanju koji sadrži uputstvo za upotrebu agensa koji smanjuje ili inhibira jedan ili više dodatnih imunskih koinhibitornih receptora u kombinaciji sa agensom koji smanjuje ili inhibira ekspresiju i/ili aktivnost TIGIT-a, za lečenje ili odlaganje progresije raka kod pojedinca ili za povećanje imunološke funkcije osobe koja ima rak. Svi agensi koji smanjuju ili inhibiraju ekspresiju i/ili aktivnost TIGIT, i/ili agensi koji smanjuju ili inhibiraju jedan ili više dodatnih imunskih koinhibitornih receptora, koji su opisani u ovom tekstu mogu biti uključeni u komplet.

U još jednom aspektu, objavljuje se komplet koji sadrži agens koji smanjuje ili inhibira ekspresiju i/ili aktivnost TIGIT i uložak u pakovanju ikoj sadrži uputstvo za upotrebu agensa koji smanjuje ili inhibira ekspresiju i/ili aktivnost TIGIT u kombinaciji sa agensom koji povećava ili aktivira jedan ili više dodatnih imunskih kostimulatornih receptora, za lečenje ili odglaganje progresije raka kod pojedinca ili za poboljšanje imunološke funkcije osobe koja ima rak. Svi agensi koji smanjuju ili inhibiraju ekspresiju i/ili aktivnost TIGIT i/ili agensi koji povećavaju ili aktiviraju jedan ili više dodatnih imunskih kostimulatornih receptora opisanih ovde, mogu biti uključeni u komplet.

U još jednom aspektu, objavljuje se komplet koji sadrži agens koji smanjuje ili inhibira ekspresiju i/ili aktivnost TIGIT i agens koji povećava ili aktivira jedan ili više dodatnih imunskih kostimulatornih receptora, i uložak u pakovanju koji sadrži uputstvo za upotrebu agensa koji smanjuje ili inhibira ekspresiju i/ili aktivnost TIGIT-a i agensa koji povećava ili aktivira jedan ili više dodatnih imunskih kostimulatornih receptora, za lečenje ili odlaganje progresije raka kod pojedinca ili za povećanje imunološke funkcije osobe koja ima rak. Svi agensi koji smanjuju ili inhibiraju ekspresiju i/ili aktivnost TIGIT i/ili agensi koji povećavaju ili aktiviraju jedan ili više dodatnih imunskih kostimulatornih receptora opisanih ovde, mogu biti uključeni u komplet.

U još jednom aspektu, objavljuje se komplet koji sadrži agens koji povećava ili aktivira jedan ili više dodatnih imunskih kostimulatornih receptora i uložak u pakovanju koji sadrži uputstvo za upotrebu agensa koji povećava ili aktivira jedan ili više dodatnih imunkih kostimulatornih receptora u kombinaciji sa agensom koji smanjuje ili inhibira ekspresiju i/ili aktivnost TIGIT-a, za lečenje ili odlaganje progresije raka kod pojedinca ili za povećanje imunološke funkcije osobe koja ima rak. Svi agensi koji smanjuju ili inhibiraju ekspresiju i/ili aktivnost TIGIT i/ili agensi koji povećavaju ili aktiviraju jedan ili više dodatnih imunskih kostimulatornih receptora opisanih ovde, mogu biti uključeni u komplet.

U nekim aspektima, komplet sadrži pakovanje sa jednim ili više antagonista vezivanja PD-1 ose i agensima koji smanjuju ili inhibiraju ovde opisanu ekspresiju i/ili aktivnost TIGIT. U nekim aspektima, komplet sadrži pakovanje sa jednim ili više antagonista vezivanja PD-1 ose i agensa koji modulišu ovde opisanu ekspresiju i/ili aktivnost CD226. U nekim aspektima, komplet sadrži pakovanje sa jednim ili više agensa koji smanjuju ili inhibiraju ekspresiju i/ili aktivnost TIGIT i agensa koji smanjuju ili inhibiraju jedan ili više ovde opisanih dodatnih imunskih koinhibitornih receptora. U nekim aspektima, komplet sadrži pakovanje koje sadrži jedan ili više agensa koji smanjuju ili inhibiraju ekspresiju i/ili aktivnost TIGIT, i agense koji povećavaju ili aktiviraju jedan ili više ovde opisanih dodatnih imunskih kostimulatornih receptora. Pogodna pakovanja uključuju, na primer, boce, ampule (npr., dvampule sa dvostrukom pregradom), špriceve (kao što su špricevi sa jednom komorom ili dvostrukom komorom) i test epruvete. Pakovanje može biti od različitih materijala, kao što su staklo ili plastika. U nekim otelotvorenjima, komplet može da sadrži nalepnicu (npr. na pakovanju ili uz pakovanje) ili uložak u pakovanju. Nalepnica ili uložak u pakovanju mogu naznačiti da jedinjenje koje se nalazi unutra može biti korisno ili namenjeno za lečenje ili odlaganje progresije raka kod pojedinca ili za poboljšanje imunološke funkcije pojedinca koji ima rak. Paket može dalje sadržavati i druge materijale poželjne sa komercijalnog aspekta i aspekta upotrebe, uključujući druge pufere, razblaživače, filtere, igle i špriceve.

PRIMERI

Pronalazak se može dodatno upoznati kroz sledeće primere, koji su prikazani kao ilustracija i nisu ograničavajući.

Primer 1: TIGIT je visoko eksprimiran na iscrpljenim CD8<+>i CD4<+>T ćelijama i u korelaciji je sa ekspresijom PD-1.

Da bi se potvrdilo da su CD8<+>T ćelije kompetentne za ekspresiju TIGIT nakon stimulacije in vitro, C57BL6/J CD8<+>T ćelije slezine obogaćene putem MACS su stimulisane in vitro anti-CD3 i anti-CD28 vezanim za ploču tokom 24-48 sati. Protočna citometrija je korišćena za merenje ekspresije TIGIT. U skladu sa ekspresijom TIGIT od strane CD4<+>T ćelija (Yu, X., et al. The surface protein TIGIT suppresses T cell activation by promoting the generation of mature immunoregulatory dendritic cells. Nature imunology 10, 48-57 (2009)), mišje CD8<+>T ćelije su eksprimirale TIGIT u roku od 48 sati od stimulacije in vitro (SL.1A).

Za procenu TIGIT ekspresije aktiviranim CD8<+>T ćelijama in vivo, miševi C57BL6/J su bili zaraženi virusom limfocitnog koriomeningitisa (LCMV) soja Armstrong, a splenociti su analizirani 7 dana nakon infekcije. Ukratko, za akutne infekcije miševi su intravenski inficirani sa 2x10<6>jedinica koje stvaraju plak (PFU), Armstrongovim sojem LCMV. Protočna citometrija je korišćena za merenje ekspresije TIGIT naivnim (CD44<niski>CD62L<visoki>), i (CD44<visok>i CD62L<niski>) CD8<+>i CD4+ T ćelijama efektorske memorije. Na vrhuncu odgovora LCMV T ćelija, podskup CD4<+>T ćelija efektorske memorije (TEM) i gotovo sve CD8<+>TEMćelije snažno su eksprimirale TIGIT (SL. 1B). Protočna citometrija je korišćena za merenje ekspresije TIGIT PD-1<visokim>i PD-1<niskim>CD8<+>T ćelijama efektorske memorije. Zanimljivo je da je ekspresija TIGIT bila skoro savršeno u korelaciji sa ekspresijom PD-1 (SL.1C).

Kako je PD-1 povezan sa iscrpljivanjem T ćelija, ekspresija TIGIT je ispitivana na hronično stimulisanim T ćelijama. Ukratko, za hronične infekcije, C57BL6/J miševi su intravenski inficirani sa 2x10<6>PFU klona 13 soja LCMV i tretirani sa 500 ug i 250 ug proređujućih anti-CD4 antitela (klon GK1.5) 3 dana pre, odnosno 4 dana nakon infekcije. Tamo gde je naznačeno, miševi inficirani klonom 13 soja LCMV primali su intraperitonealne injekcije sa 200 ug izotipskih kontrolnih antitela, 200 ug anti-PD-L1 antitela i/ili 500 ug anti-TIGIT antitela 3 puta nedeljno, od 28. do 42. dana posle infekcije. Splenociti su analizirani 42 dana nakon infekcije. Protočna citometrija je korišćena za merenje ekspresije TIGIT naivnim CD8<+>T ćelijama (CD44<niski>CD62L<vsoki>), kao i ćelijama centralne memorije (CD44<visoki>CD62L<niski>) i efektorske memorije (CD44<visoki>CD62L<niski>). Zaista, kod miševa koji su hronično inficirani klonom 13 soja LCMV, TIGIT je bio izrazito eksprimiran pretežno na PD-1<visokim>T ćelijama, ali ne i na naivnim ćelijama, PD-1<niskim>TEMćelijama ili T ćelijama centralne memorije (SL.1D).

Primer 2: Uloga TIGIT-a u iscrpljivanju T ćelija kod TIGIT deficijentnih miševa.

Da bi se okarakterisala uloga TIGIT-a u iscrpljivanju T ćelija, stvoreni su miševi kod kojih je TIGIT uslovno izbrisan u T ćelijama (TIGIT<fl/fl>CD4-cre<+>(CKO), SL. 2). Ukratko, CD4<cre>miševi i Tigit<loxP/loxP>miševi su generisani na C57BL/6J osnovi poznatim tehnikama i ukršteni. ES ćelijska linija testirana kvalitetom (Art B6/3.6 (genetska osnova: C57BL/6 NTac) uzgajana je na mitotički inaktiviranom sloju hraniva koji se sastojao od mišjih embrionalnih fibroblasta u medijumu ES ćelijske kulture koji sadrži faktor inhibicije leukemije i fetalni goveđi serum. Ćelije su elektroporisane linearnim vektorima ciljanja DNK prema standardnim operativnim procedurama Taconic Artemis. Izbor G418 i ganciklovira korišćen je kao mehanizam za obogaćivanje homologno rekombinovanih klonova. Otporne kolonije ES ćelija (ES klonovi) sa izrazitom morfologijom izolovane su 8. dana nakon transfekcije i analizirane su tehnikom Sadern bloting i/ili PCR u primarnom pregledu. Homologni rekombinantni ES ćelijski klonovi su ekspandovani i zamrznuti u tečnom azotu nakon opsežne molekularne validacije. Neo kaseta je uklonjena flpE rekombinazom pre mikroinjekcije u B1/6 ženke albino donora. Nastalo je himerno potomstvo, a repovi su pregledani PCR-om radi otkrivanja prenosa germinativne linije. Ekspresija TIGIT je smanjena za 96% efikasnosti sa T ćelija kod Tigit<loxP/loxP>CD4<cre>miševa.

Miševi čijim T ćelijama nedostaje TIGIT stvorili su CD4<+>i CD8<+>T ćelijski odgovor na akutnu infekciju Armstrongovim sojem LCMV sličan miševima divljeg tipa (SL.3).

Da bi se procenio učinak u okruženju hronične infekcije, TIGIT<fl/fl>CD4-cre<->(WT) i TIGIT<fl/fl>CD4-cre<+>(CKO) miševima nakratko su proređene CD4<+>T ćelije i inficirani su klonom 13 soja LCMV. Analizirani su splenociti i virusni titri jetre 42 dana nakon infekcije. Nakon hronične infekcije klonom 13 soja LCMV, značajno više CD8<+>i CD4<+>T ćelija iz TIGIT<fl/fl>CD4-cre<+>(CKO) miševa bile su sposobne za proizvodnju interferona gama (IFN γ) nego T ćelije kod miševa iz legla divljeg tipa (TIGIT<fl/fl>CD4-cre<->(WT)) (82-86% porast, P <0,01, SL. 4A-4D). Pored toga, virusno opterećenje je značajno smanjeno kod hronično inficiranih miševa TIGIT<fl/fl>CD4-cre<+>(CKO) (smanjenje od 68%, P <0,0001, SL.4E).

Ovi rezultati ukazuju na to da TIGIT ima važnu ulogu u regulisanju aktivnosti T ćelija i odgovora tokom hroničnog imunskog odgovora, kao za vreme hronične virusne infekcije, i da TIGIT može regulisati efektorsku funkciju, posebno sposobnost za proizvodnju efektorskih citokina, poput IFNγ i TNFα, hronično stimulisanih ili iscrpljenih CD8<+>i CD4<+>T ćelija.

Primer 3: TIGIT i PD-1 sinergijski regulišu efektorsku funkciju iscrpljenih T ćelija in vivo.

Pošto je ekspresija TIGIT bila usko povezana sa ekspresijom PD-1, posebno u CD8<+>T ćelijama tokom akutne i hronične virusne infekcije (SL. 1), blokiranje TIGIT-a i PD-1 u kombinaciji može vratiti efektorsku funkciju T ćelija na viši nivo nego što bi se dobilo pojedinačnim blokiranjem koreceptora.

Za testiranje ove hipoteze, C57BL6/J miševima su nakratko proređene CD4<+>T ćelije i inficirani su klonom 13 soja LCMV. Za dobijanje hronične infekcije, miševi su intravenski inficirani sa 2x10<6>PFU klona 13 soja LCMV i tretirani sa 500 ug i 250 ug proređujućih anti-CD4 antitela (klon GK1.5) 3 dana pre, odnosno 4 dana nakon infekcije. Tamo gde je naznačeno, miševi inficirani klonom 13 soja LCMV primali su intraperitonealne injekcije sa 200 ug izotipskih kontrolnih antitela, 200 ug anti-PD-L1 antitela i/ili 500 ug anti-TIGIT antitela 3 puta nedeljno, od 28. do 42. dana posle infekcije. Lečenje je započeto 28 dana nakon infekcije, jer je odgovor T ćelija u ovom trenutku bio uglavnom iscrpljen u ovom modelu hronične virusne infekcije (Wherry et al, Molecular Signature of CD8+ T cell Exhaustion During Chronic Viral Infection, Immunity. 2007 Oct;27(4):670-84). Analizirani su splenociti i virusni titri jetre 42 dana nakon infekcije.

Kod ovih miševa, tretman anti-PD-L1 izazvao je snažniju aktivaciju CD8<+>T ćelija nego tretman podudarnim izotipskim kontrolnim antitelima (porast od 88%, P <0,0001, SL.

4F), kao što je ranije izveštavano (Barber, DL, et al. Restoring function in exhausted CD8 T cells during chronic viral infection. Nature 439, 682-687 (2006)). Tretman anti-TIGIT nije imao očigledan efekat na aktivaciju CD8<+>T ćelija sam ili u kombinaciji sa anti-PD-L1 (SL.

4F). Slično tome, blokada samo PD-1 umereno povećava citokinsku sposobnost CD8<+>T ćelija, dok sama blokada TIGIT-a nije imala efekta (SL. 4G). Međutim, frekvencija CD8<+>T ćelija koje proizvode IFNγ dramatično je povećana kod miševa koji su tretirani sa anti-TIGIT i anti-PD-L1, i u znatno većoj meri nego što je to vidljivo kod miševa koji su tretirani samo sa anti-PD-L1 (SL.4G porast od 93%, P = 0,0050). Sličan efekat je uočen kod CD4<+>T ćelija (SL. 5). Kao što je prikazano i na SL. 31, koblokada TIGIT/PD-L1 značajno je poboljšala efektorsku funkciju CD8<+>T ćelija, ali ne i efektorsku funkciju CD4<+>T ćelija, kod miševa u poređenju sa miševima koji su tretirani samo sa anti-PD-L1. Slični efekti su takođe primećeni na ekspanziji T ćelija i efektorskoj funkciji u LCMV gp33 antigen specifičnim T ćelijama (SL. 31). Ovi rezultati pokazuju snažnu sinergiju između PD-1 i TIGIT-a na iscrpljene CD8<+>T ćelije i pokazuju da TIGIT posebno reguliše citokinsku sposobnost CD8<+>T ćelija i njihovu efektorsku funkciju.

U skladu s ovim rezultatima, LCMV virusno opterećenje je umereno smanjeno kod miševa koji su tretirani samo sa anti-PD-L1, nije smanjeno kod miševa koji su tretirani samo sa anti-TIGIT, a značajno je smanjeno kod miševa koji su tretirani i sa anti-TIGIT i sa anti-PD-L1 (68% smanjenje virusnog titra kod anti-PD-L1 tretmana, P = 0,0004. 92% smanjenje virusnog titra kod anti-TIGIT anti-PD-L1 tretmana, P <0,0001, SL. 4H). Ovi podaci pokazuju snažnu sinergiju između inhibitornih efekata PD-1 i TIGIT-a, i upućuju na to da TIGIT za razliku od PD-1 nije široki inhibitor aktivacije efektorskih T ćelija, već ima ograničenu ulogu u ograničavanju citokinske sposobnosti i efektorske funkcije T ćelija.

Primer 4: Ekspresija TIGIT je povećana kod humanog raka dojke i povezana je sa ekspresijom CD8 i inhibitornih koreceptora.

Iscrpljivanje T ćelija je takođe glavno imunološko obeležje raka, pri čemu mnogi limfociti koji infiltriraju tumor (TIL) izražavaju visok nivo inhibitornih koreceptora i nedostatak sposobnosti za proizvodnju efektorskih citokina (Wherry, E.J. T cell exhaustion. Nature immunology 12, 492-499 (2011); Rabinovich, G.A., Gabrilovich, D. & Sotomayor, E.M. Immunosuppressive strategies that are mediated by tumor cells. Annual review of immunology 25, 267-296 (2007)).

Da bi se utvrdilo da li TIGIT inhibira efektorsku funkciju TIL, analizirani su podaci mikročipa genske ekspresije raka dojke proizvedeni u sklopu Mreže za Atlas genoma raka (CGAN) (Network, C.G.A. Comprehensive molecular portraits of human breast tumours. Nature 490, 61-70 (2012)).

Ekspresija TIGIT je sveukupno značajno povišena u tumorima dojke (135% porast u odnosu na normalne uzorke, P = 6x10<-12>, SL.6A) i u četiri glavne molekulske podvrste raka dojke (SL.6A) (Perou, C.M., et al. Molecular portraits of human breast tumours. Nature 406, 747-752 (2000); Sorlie, T., et al. Gene expression patterns of breast carcinomas distinguish tumor subclasses with clinical implications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 98, 10869-10874 (2001)). Ekspresija TIGIT je u visokoj korelaciji sa ekspresijom CD3ε, u skladu sa ekspresijom od strane TIL (R<2>= 0,61, SL. 6B). Zanimljivo je da je ekspresija TIGIT u značajnoj korelaciji sa CD8α, ali ne i sa CD4, ili samo umereno sa CD4, što ukazuje na to da TIGIT možda prvenstveno reguliše CD8<+>TIL funkciju (CD8α, R<2>= 0,80. CD4, R<2>= 0,42. SL.6C).

S obzirom na koekspresiju TIGIT i PD-1 tokom hronične virusne infekcije, procenili smo i povezanost PD-1 i drugih inhibitornih koreceptora sa TIGIT-om u karcinomu dojke. Korelacija između TIGIT-a i PD-1, CTLA4 i LAG3 je bilo vrlo velika (PD-1, R<2>= 0,87. CTLA4, R<2>= 0,76. LAG3, R<2>= 0,80. SL.6D). Zbirno, ovi podaci ukazuju na to da je TIGIT bio eksprimiran TIL-ovima, posebno CD8<+>T ćelijama, i da može potisnuti njihovu funkciju.

Primer 5: TIGIT i PD-1 inhibiraju antitumorski odgovor T ćelija.

Da bi se TIGIT bolje okarakterisao pomoću TIL-ova kod miševa, BALB/C miševi su inokulisani ćelijama CT26 kolorektalnog karcinoma. Ukratko, BALB/c miševi su supkutano inokulisani sa 1x10<5>CT26 ćelija karcinoma debelog creva suspendovanih u matrigelu (BD Biosciences) u desnu jednostranu torakalnu bočnu stranu. Nakon dve nedelje, miševi koji su nosili tumore veličine oko 200 mm<3>nasumično su izdvojeni u grupe za lečenje koje su

1

primale 35 mg/kg izotipskih kontrolnih antitela, anti-PD-L1 antitela i/ili anti-TIGIT antitela intraperitonealnom injekcijom 3 puta nedeljno tokom 3 nedelje. Tumori su mereni 2 puta nedeljno pomičnim merilom. Životinje čiji su tumori postali ulcerisani/nekrotični ili su porasli veći od 2000 mm<3>su eutanazirane. Splenociti i limfociti koji infiltriraju tumor (TIL) analizirani su 14 dana nakon inokulacije, kada su tumori dostigli veličinu oko 200 mm<3>.

U skladu sa ekspresijom TIGIT humanih tumora (SL. 6) i CD8<+>i CD4<+>CT26 TIL-ovi su eksprimirali visok nivo TIGIT (SL. 7A-7B). Nadalje, u skladu sa studijama hronične virusne infekcije, ekspresija TIL TIGIT-a bila je usko povezana sa ekspresijom drugih inhibitornih koreceptora, uključujući PD-1 (SL. 7A-7B) i Tim-3 (SL. 8). Sličan obrazac ekspresije TIGIT pronađen je u tumorima karcinoma MC38 debelog creva (SL.9).

Za testiranje fiziološke važnosti ekspresije TIGIT u kontekstu antitumorskog imunskog odgovora, BALB/C miševi sa utvrđenim CT26 tumorima (veličine oko 200 mm<3>) tretirani su sa 200 ug izotipske kontrole, 200 ug anti-PD-L1, 500 ug anti -TIGIT, ili 200 ug anti-PD-L1+500 ug anti-TIGIT antitela tokom tri nedelje.

Rast tumora CT26 bio je samo malo usporen kod lečenja sa anti-TIGIT ili anti-PD-L1, a oba su dovela do skromnog 3-dnevnog povećanja medijane preživljavanja (SL. 7C-7D). Međutim, kombinovana terapija sa anti-PD-L1 i sa anti-TIGIT dramatično je smanjila rast tumora (75% smanjenje medijane volumena tumora do 16. dana, P <0,0001, SL. 7C i SL.

10). Štaviše, 70% miševa koji su primali i anti-TIGIT i anti-PD-L1 doživeli su potpunu i trajnu remisiju tumora, i preživeli su tokom trajanja studije, čak i bez daljeg lečenja antitelima (SL. 7C-7D). Ovi efekti su takođe primećeni kod miševa koji su imali tumor i bili lečeni kombinacijom blokirajućih antitela na TIGIT i PD-1.

Za testiranje imuniteta ovih preživelih miševa na ćelije tumora CT26, otprilike 60 dana nakon početne inokulacije, miševi u potpunoj remisiji (CR) koji su primili anti-TIGIT+anti-PD-L1, kao i naivni BALB/c miševi, ponovo su inokulisani CT26 ćelijama u levu (prethodno inokulisanu) jednostranu torakalnu bočnu stranu. Ovi miševi su inokulisani sa 1X10<5>EMT6 ćelija karcinoma dojke u matrigelu u četvrto masno tkivo dojke. Tumori su mereni 2 puta nedeljno. Životinje čiji su tumori postali ulcerisani/nekrotični ili čije ukupno opterećenje tumora prešlo 2000 m<3>su eutanazirane.

Kao što je prikazano na SL. 7E, oba tumora su brzo rasla kod naivnih kontrolnih miševa, ali su samo EMT6 tumori rasli kod miševa koji su prethodno očistili CT26 tumor. Ovi rezultati su pokazali da je koblokada TIGIT i PD-1 tokom tumorigeneze stvorila stanje specifičnog imuniteta na ćelije tumora CT26.

Da bi se utvrdilo da li je efikasnost koblokade TIGIT/PD-L1 posredovana CD8<+>T

1 1

ćelijama, miševi koji su imali CT26 tumor podvrgnuti su ablaciji CD8<+>T ćelija upotrebom proređujućih antitela na početku tretmana anti-TIGIT i anti- PDL1 antitelima. Miševi lečeni anti-TIGIT i anti-PD-L1 antitelima nisu mogli da odbace CT26 tumore kad su im proređene CD8<+>T ćelije na početku lečenja (1532% povećanje prosečne zapremine tumora nakon 17 dana lečenja, P = 0,0004, SL. 32A-32B). Pored toga, proređivanje CD8<+>T ćelija smanjilo je sposobnost prethodno tretiranih CR miševa da kontrolišu ponovno inokulisane CT26 tumore (SL. 32C). Sveukupno, ovi rezultati pokazuju da anti-TIGIT i anti-PD-L1 deluju putem CD8<+>T ćelija kako bi izazvali efikasne primarne i sekundarne imunske odgovore na tumor.

Kako bi se utvrdilo da li je ekspresija PVR tumorskih ćelija neophodna za efikasnost koblokade TIGIT/PD-L1, BALB/c miševi divljeg tipa su inokulisani CT26 tumorima divljeg tipa (koji eksprimiraju PVR) ili PVR-deficijentnim CT26 tumorima. Ukratko, tumorske ćelije divljeg tipa CT26 prolazno su transficirane nukleinskom kiselinom koja smanjuje ekspresiju PVR. Otprilike dve nedelje nakon transfekcije, CT26 ćelije su subklonirane na osnovu gubitka ekspresije PVR protočnom citometrijom i qPCR. Kada su tumori dostigli veličinu od 150-200 mm<3>, miševi su tretirani anti-TIGIT i anti-PD-L1 antitelima, ili izotipski podudarnim kontrolnim antitelima. Miševi koji su tretirani anti-TIGIT i anti-PD-L1 antitelima bili su u stanju da odbace i tumore divljeg tipa i PVR-deficijentne tumore, u poređenju sa miševima koji su inokulisani tumorom i tretirani kontrolnim antitelima (SL.33). Ovi rezultati pokazuju da anti-TIGIT i anti-PD-L1 deluju nezavisno od tumorski eksprimiranog PVR.

Efikasnost koblokade TIGIT/PD-L1 takođe je testirana i potvrđena na modelu tumora MC38. C57BL6/J miševi divljeg tipa su supkutano inokulisani singeničkim ćelijama MC38 kolorektalnog karcinoma, a formirani tumori tretirani su kombinacijom TIGIT i PD-L1 blokirajućih antitela, kao i ranije. Za razliku od modela CT26, tretman samo sa anti-PD-L1 bio je dovoljan da indukuje potpuni odgovor kod nekih miševa (SL. 25). Međutim, kao u modelu CT26, lečenje miševa koji su nosili MC38 tumor sa anti-TIGIT i sa anti-PD-L1 sinergijski je preokrenulo rast tumora i indukovalo klirens tumora kod većine miševa (SL.

26). Ovi efekti su takođe primećeni kod miševa koji su inokulisani sinegeničkim ćelijama karcinoma dojke EMT6 (SL. 34).

Ovi rezultati su pokazali da koblokada TIGIT-a i PD-1 može izazvati trajni i antigen specifični antitumorski imunski odgovor. Ovi rezultati takođe su ukazali na to da su adaptivni antitumorski odgovori potpuno funkcionalni i reaktivirani kod terapeutski tretiranih miševa.

Da bi se procenili funkcionalni efekti TIGIT i PD-1 blokade na same limfocite koji infiltriraju tumor, miševi su inokulisani CT26 tumorskim ćelijama i tretirani sa anti-TIGIT i/ili anti-PD-L1 kao ranije. Sedam dana nakon početka lečenja, tumori i limfni čvorovi koji

1 2

dreniraju tumore prikupljeni su za analizu protočnom citometrijom.

CD4<+>T ćelije limfnih čvorova koji dreniraju tumor proizvele su malo IFNγ i nisu ih više proizvodile nakon blokade TIGIT/PD-1 (SL. 11). Međutim, CD8<+>T ćelije koje infiltriraju tumor miševa koji su tretirani i sa anti-TIGIT i sa anti-PD-L1, ali ne i kod miševa koji su tretirani samo sa anti-TIGIT ili samo sa anti-PD-L1, bile su značajno sposobnije za proizvodnju IFNγ nakon stimulacija in vitro (porast od 174% u odnosu na kontrolu, P = 0,0001, SL.13D). Slični rezultati primećeni su za CD8<+>TIF proizvodnju TNFα (SL.12).

Zanimljivo je da su miševi koji su tretirani ili sa anti-TIGIT ili sa anti-PD-L1, ili sa oba, sve više povećali citokinsku sposobnost rezidentnih CD8<+>T ćelija limfnih čvorova koji dreniraju tumor (porast od 75-113%, P <0,001, SL. 13), što ukazuje na to da su rezidentne CD8+ T ćelije limfnih čvorova bile pod manjim stepenom supresije nego odgovarajuće ćelije koje infiltriraju tumor. Akumulacija i fenotipska aktivacija CD8+ i CD4+ T ćelija koje infiltriraju tumor i rezidentnih T ćelija limfnih čvorova koji dreniraju tumor nepromenjeni su i slabo pojačani pojedinačnim tretmanom antitelima i dvostrukim tretmanom antitelima (SL.

12-13). Frekventnost CD8<+>T ćelija sa dvojnom proizvodnjom IFNγ/TNFα u tumorima i limfnim čvorovima koji dreniraju tumor sledi slične obrasce (SL. 35A-35B).

Prema tome, iako je blokada bilo samo TIGIT-a ili PD-L1 bila dovoljna da pojača efektorsku funkciju CD8<+>T ćelija u limfnim čvorovima koji dreniraju tumor, blokada oba receptora bila je potrebna za obnavljanje funkcije iscrpljenih CD8<+>T ćelija u samom tumoru, u skladu sa idejom da je mikrookolina tumora veoma imunosupresivna.

Primer 6: Koekspresija TIGIT sa CD226 na CD8+ T ćelijama koje infiltriraju tumor.

TIGIT je konkurentan kostimulatornom receptoru CD226 u vezivanju za receptor poliovirusa (PVR) (Yu, X., et al. The surface protein TIGIT suppresses T cell activation by promoting the generation of mature immunoregulatory dendritic cells. Nature immunology 10, 48-57 (2009). S obzirom da nedostatak CD226 može povećati iscrpljenost T ćelija tokom hronične virusne infekcije (Celia, M., et al. Loss of DNAM-1 contributes to CD8+ T-cell exhaustion in chronic HIV-1 infection. European Journal of Immunology 40(4), 949-954 (2010); Welch, M., et al. CD8 T cell defect of TNA-a and IL-2 in DNAM-1 deficient mice delays clearance in vivo of a persistent virus infection. Virology 429(2) 163-170 (2012)), moguće je da TIGIT inhibira odgovor T ćelija delimično tako što ometa aktivnost CD226.

Da bi se procenilo da li postoji veza između CD226 i TIGIT-a u inhibiranju odgovora T ćelija, ekspresija TIGIT-a i CD226 određena je na CD8+ T ćelijama koje infiltriraju tumor.

Kao što je prikazano na SL. 14, C57BL6/J miševi su inokulisani MC38 ćelijama

1

kolorektalnog karcinoma. Splenociti i limfociti koji infiltriraju tumor (TIL) analizirani su FACs analizom otprilike 14 dana nakon inokulacije, kada su tumori dostigli veličinu otprilike 200 mm3. Reprezentativni histogram ekspresije CD226 od strane B ćelija slezine (sivo), CD8+ T ćelija slezine (plavo) i TIGIT+ CD8+T ćelija koje infiltriraju tumor (crveno). Podaci su reprezentativni za dva nezavisna eksperimenta; n = 5. SL. 14 prikazuje da CD8+ T ćelije slezine jako eksprimiraju CD226, i nadalje da TIGIT+CD8+T ćelije koje infiltriraju tumor takođe jako eksprimiraju CD226. Podaci pokazuju da su TIGIT i CD226 koordinirano eksprimirani na mišjim CD8<+>T ćelijama koje infiltriraju tumor i mogu međusobno regulisati funkciju na CD8<+>T ćelijama. Ovo je opažanje slično onome u aktiviranim CD4<+>T ćelijama i NK ćelijama, koje takođe koeksprimiraju TIGIT i CD226.

Primer 7: Koimunoprecipitacija TIGIT-a i CD226 na transficiranim ćelijama. Da bi se utvrdila interakcija TIGIT-a sa CD226 na ćelijskoj površini, ćelije su kotransficirane sa humanim TIGIT i humanim CD226 i podvrgnute imunoprecipitaciji. Ukratko, COS7 ćelije na pločama od 15 cm kotransficirane su ekspresionim plazmidima koji sadrže cDNK, bilo za TIGIT-HA (5 ng) ili za CD226-Flag (10 ng) obeležene proteine, ili za kontrolni plazmid (pRK).23 sata nakon transfekcije ćelije su isprane PBS-om i skupljene u 4 ml ledeno hladnog PBS-a i centrifugirane na 300xg tokom 5 minuta, a ćelijski pelet je ponovo suspendovan u 2 ml pufera za lizu na 4 °C. Ćelije su lizirane tokom 50 min uz vrtloženje na svakih 15 minuta, i naknadno centrifugirane na 10,00xg tokom 15 min na 4 °C. Nastali supernatant je prethodno izbistren sa 160 µl suspenzije CL6B sepahroze rotiranjem 30 minuta na 4 °C i centrifugiran 2 min na 3000xg. Supernatant je podeljen podjednako u dve epruvete i imunoprecipitovan sa anti-HA ili sa anti-flag pomoću standardnih postupaka. Imunoprecipitovani proteini su podvrgnuti metodama SDS-PAGE i vestern blot. Rezultati vestern blota su ispitivani sa anti-Flag-HRP ili sa anti-HA-HRP.

Kao što je prikazano na SL. 15, anti-TIGIT je oborio CD226 i anti-CD226 je oborio TIGIT, što pokazuje da su TIGIT i CD226 u fizičkom kontaktu na površini ćelije.

Primer 8: TIGIT i CD226 interaguju u primarnim CD8+ T ćelijama.

Osim pokazivanja sposobnosti CD226 i TIGIT-a za interakciju u transficiranim ćelijama, ocenjena je i interakcija CD226 i TIGIT-a u primarnim CD8+ T ćelijama. Ukratko, C57BL6/J CD8+ T ćelije slezine obogaćene putem MACS stimulisane su antitelima vezanim za ploču anti-CD3 i anti-CD28 i rekombinantnim IL-2 tokom 48 sati i lizirane. Ćelijski lizati su imunoprecipitovani pomoću anti-TIGIT i ispitivani pomoću anti-CD226. SL. Slika 16 ilustruje da TIGIT i CD226 interaguju u aktiviranim primarnim CD8+ ćelijama, a oba su detektovana u_koimunoprecipitatu. Ovi podaci pokazuju da CD226 i TIGIT međusobno

1 4

deluju i na primarnim ćelijama.

Primer 9: Interakcija TIGIT/CD226 na transficiranim ćelijama pomoću TR-FRET (vremenski fluorescentno rezonantni energetski transfer)

Kako bi se procenilo da li je postojala bilo kakva molekulska interakcija između TIGIT-a i CD226, korišćena je TR-FRET metodologija. FRET (fluorescentno rezonantni energetski transfer) zasnovan je na prenosu energije između dva fluorofora, donora i akceptora, kada se nalaze u neposrednoj blizini. Molekulske interakcije između biomolekula se mogu proceniti povezivanjem svakog partnera sa fluorescentnom oznakom i otkrivanjem nivoa prenosa energije. Kad se dva entiteta dovoljno približe jedan drugom, pobuđivanje donora izvorom energije pokreće prenos energije prema akceptoru, koji zauzvrat emituje specifičnu fluorescenciju na zadatoj talasnoj dužini. Zbog ovih spektralnih odlika, kompleks donora i akceptora se može otkriti bez potrebe za fizičkim odvajanjem od nespojenih partnera. Kombinacija vremenskog (TR) merenja FRET omogućava uklanjanje pozadinske fluorescencije sa signala. To se tipično radi uvođenjem vremenskog kašnjenja između pobuđivanja sistema i merenja fluorescencije, kako bi se signal očistio od svih nespecifičnih kratkotrajnih emisija.

Koristeći TR-FRET, ovde pokazujemo da TIGIT i CD226 izazivaju FRET kada su ekspririmirani u istoj ćeliji, što ukazuje na molekulsku interakciju ova dva molekula. Ukratko, ćelije COS-7 transficirane su SNAP-označenim (ST) CD226 i HA-TIGIT korišćenjem Lipofectamine 2000 (Life Technologies) i zasejane na belu pločicu sa 96 bunarčića (Costar), sa 100.000 ćelija po bunarčiću. 24 sata kasnije, ćelije su obeležene sa 100 nM benzil-guanin SNAP-Lumi-4Tb konjugovanog sa donorom (Cisbio) i 1 µM benzil-guanin SNAP-A647 konjugovanog sa donorom (New England Biolabs) razblaženim u DMEM 10% FCS u trajanju od 1 h na 37 °C, 5% CO2. Nakon tri ispiranja pomoću PBS-a, FRET signal je zabeležen na 665 nm tokom 400 µs nakon kašnjenja od 60 µs, nakon laserskog pobuđivanja na 343 nm pomoću čitača ploča Safire2 (Tecan). Kada je testirano antitelo na TIGIT, nakon 15 min inkubacije zabeležen je i FRET signal. FRET odnos je zatim izračunat kao intenzitet FRET, podeljen sa emisijom donora na 620 nm. Intenzitet FRET je: (signal na 665 nm iz ćelija označenih SNAP-donorom i akceptorom) ─ (signal na 665 nm iz iste serije transficiranih ćelija označenih samo SNAP-donorom).

Kao što je prikazano na SL. 17, TIGIT je bio u stanju da direktno poremeti i izazove disocijaciju CD226 homodimera. Kao što je prikazano na SL. 17A, uočena je disocijacija Flag-ST-CD226 homodimera s rastućim koncentracijama HA-TIGIT, što je ilustrovano smanjenjem odnosa FRET između Flag-ST-CD226 izmerenog na COS-7 ćelijama koje

1

eksprimiraju konstantnu količinu Flag-ST-CD226 i rastuće koncentracije HA-TIGIT. Međutim, kao što je prikazano na SL. 17B, kada je anti-TIGIT antitelo dodato ćelijskoj kulturi, to je blokiralo sposobnost TIGIT-a i CD226 da se udružuju. Ovo je ilustrovano nedostatkom smanjenja intenziteta FRET Flag-ST-CD226 homodimera. Ovo pokazuje da su CD226 i TIGIT povezani kao kompleksi, ali da anti-TIGIT antitela mogu poremetiti ove interakcije (SL.17A i 17B).

Koristeći TR-FRET, sposobnost TIGIT-a da se poveže sa CD226 je takođe pokazana i prikazana na SL.17C i 17D. Ukratko, nakon obeležavanja SNAP-oznakom upotrebom 1 µM benzil-guanina konjugovanog sa donorom SNAP-A647 (vidi gore), ćelije su isprane tri puta sa PBS-om i inkubirane sa 2 nM anti-HA Lumi-4Tb konjugovanog sa donorom (Cisbio) razblaženim u PBS 0,2% BSA tokom 2 sata na sobnoj temperaturi. Tada je snimljen FRET signal. U tom slučaju, intenzitet FRET je: (signal na 665 nm iz ćelija označenih SNAP-akceptorom i anti-HA donorom) ─ (signal na 665 nm iz lažno transficiranih ćelija označenih SNAP-akceptorom i anti-HA donorom).

Kao što je prikazano na SL. 17C, uočeno je povezivanje Flag-ST-CD226 sa HA-TIGIT-om, što je prikazano povećanjem intenziteta FRET između Flag-ST-CD226 i HA-TIGIT mereno na COS-7 ćelijama koje eksprimiraju konstantnu količinu Flag-ST-CD226 i povećane koncentracije HA-TIGIT. Kada je dodato anti-TIGIT antitelo, intenzitet FRET je opadao između Flag-ST-CD226 sa HA-TIGIT, kao što je prikazano na SL. 17D, što ukazuje na to da interakcija TIGIT-a sa CD226 može biti blokirana anti-TIGIT blokirajućim antitelom.

Da bi se potvrdila ekspresija ćelijske površine Flag-ST-CD226 i HA-TIGIT u eksperimentima FRET, izvršen je anti-Flag i anti-HA ELISA test na netaknutim COS-7 ćelijama koje su eksprimirale označene konstrukte. Ukratko, COS7 ćelije su fiksirane 4% paraformaldehidom, isprane dva puta i blokirane u fiziološkom rastvoru puferovanom fosfatom 1% serumom fetusa teleta (FCS). Ćelije su zatim inkubirane sa anti-HA monoklonskim antitelom (klon 3F10, Roche applied science) ili anti-Flag-M2 monoklonskim antitelom (Sigma), oba konjugovana sa peroksidazom rena. Nakon ispiranja, ćelije su inkubirane sa supstratom SuperSignal ELISA (Pierce), a hemoluminescencija je detektovana na Safire2 čitaču ploča (Tecan). Specifični signal je izračunat oduzimanjem signala snimljenog na lažno transficiranim ćelijama. Kao što je prikazano na SL. 18, ćelijska ekspresija CD226 i TIGIT potvrđena je testom ELISA.

Kako bi potvrdili da interakcija TIGIT:CD226 nije pokrenuta PVR vezivanjem, generisani su Flag-ST-CD226 i HA-TIGIT (WT) ili HA-TIGIT Q56R kao što je opisano u

1

Stengel et al., (2012) PNAS 109(14):5399-5904 i FRET odnosi su određeni kako je opisano. Kao što je prikazano na SL. 24, WT TIGIT i Q56R TIGIT vezuju CD226 sa istom efikasnošću.

Ovi podaci ne samo da pokazuju da su CD226 i TIGIT povezani kao kompleksi, već da anti-TIGIT antitelo može poremetiti te interakcije i da interakcija TIGIT:CD226 nije podstaknuta PVR vezivanjem. Podaci podržavaju ulogu TIGIT u ograničavanju CD226-posredovane aktivacije T ćelija, i da ometanje aktivnosti CD226 može biti važan mehanizam delovanja kojim TIGIT inhibira reakcije i aktivnosti T ćelija.

Primer 10: Blokada CD226 preokreće efektore blokade TIGIT/PD-L1 in vivo. Da bi se ispitala fiziološka relevantnost interakcije CD226 i TIGIT, miševi su hronično inficirani klonom 13 LCMV, a zatim su tretirani sa anti-TIGIT anti-PD-L1 u odsustvu ili prisustvu antitela koja blokiraju anti-CD226. Ukratko, C57BL6/J miševima su nakratko proređene CD4<+>T ćelije i inficirani su klonom13 soja LCMV. Za hronične infekcije, miševi su intravenski inficirani sa 2x10<6>PFU klona 13 soja LCMV i tretirani su sa 500 ug i 250 ug proređujućih anti-CD4 antitela (klon GK1.5) 3 dana pre, odnosno 4 dana nakon infekcije. Gde je naznačeno, miševi inficirani klonom 13 soja LCMV primili su intraperitonealne injekcije sa 200 ug izotipskih kontrolnih antitela, 500 ug anti-CD226 antitela, 200 ug anti-PD-L1 antitela 500 ug anti-TIGIT antitela, ili 500 ug anti-CD-C226 antitela 200 ug anti-PD-L1 antitela 500 ug anti-TIGIT antitela 3 puta nedeljno od 28. do 42. dana nakon infekcije. Lečenje je započeto 28 dana nakon infekcije, jer je odgovor T ćelija u ovom trenutku bio uglavnom iscrpljen u ovom modelu hronične virusne infekcije (Wherry et al, Molecular Signature of CD8+ T cell Exhaustion During Chronic Viral Infection, Immunity. 2007 Oct;27(4):670-84). Analizirani su splenociti i virusni titri jetre 42 dana nakon infekcije.

Kod ovih miševa, samo anti-CD226 tretman je imao ograničene efekte na frekvenciju, aktivaciju ili kompetenciju citokina CD8<+>T (SL. 19A-19C). Međutim, anti-CD226 tretman je snažno preokrenuo porast aktivacije CD8<+>T ćelija i produkcije IFNg kod miševa koji su tretirani sa anti-PD-L1 anti-TIGIT (59% odnosno 58% smanjenja, P <0,001. SL 19B-19D).

U skladu sa ovim rezultatima, LCMV virusno opterećenje bilo je značajno veće kod miševa lečenih sa anti-CD226 anti-PD-L1 anti-TIGIT nego kod miševa koji su tretirani samo sa anti-PD-L1 anti-TIGIT (porast od 272%, P < 0,001, SL. 19D).

Ovi podaci upućuju na to da je primarni mehanizam kojim TIGIT ograničava hronični odgovor T ćelija interferencija sa CD226-posredovanom kostimulacijom. Ovi podaci identifikuju prethodno nepoznatu ulogu TIGIT-a u interakciji i ometanju CD226, što dovodi

1

do smanjenja ili gubitka ključnog kostimulacionog signala u CD8<+>T ćelijama. Podaci pokazuju da interferencija sa kostimulacijom T ćelija posredovanom putem CD226 može biti glavni mehanizam kojim TIGIT ograničava hronični odgovor T ćelija kao kod kancera ili hronične virusne infekcije. Podaci takođe definišu esencijalni parametar za anti-TIGIT antitela namenjena da povrate efektorsku funkciju hronično stimulisanih ili iscrpljenih CD8<+>ili CD4<+>T ćelija tako što ometaju sposobnost TIGIT-a da stupi u interakciju sa CD226 i/ili sposobnost TIGIT-a da poremeti dimerizaciju CD226.

Materijali i metode

Miševi. Miševi C57BL/6J i BALB/c kupljeni su od Jackson i Charles River Laboratories. CD4<cre>miševi i Tigit<loxP/loxP>miševi su nastali na osnovu C57BL/6J sa standardnim tehnikama, i ukršteni. Ekspresija TIGIT je smanjena za 96% efikasnosti sa T ćelija kod Tigit<loxP/loxP>CD4<cre>miševa.

Protočna citometrija. Jednoćelijske suspenzije slezine, limfnog čvora i tumora pripremljene su blagom mehaničkom disrupcijom. Površinsko bojenje je izvršeno komercijalnim antitelima na CD4, CD8, CD44, CD62L, PD-1 (eBiosciences) i CD226 (Biolegend). TIGIT antitela su generisana kod Genentech kao što je prethodno opisano (Yu, X. et al. The surface protein TIGIT suppresses T cell activation by promoting the generation of mature immunoregulatory dendritic cells. Nature imunology 10, 48-57 (2009)) i konjugovana na Alexa Fluor 647 prema uputstvu proizvođača (Molecular Probes).

Za intraćelijsko bojenje citokina (ICS), ćelije su stimulisane tokom 4 sata sa 20 ng/ml Phorbol 12-miristat 13-acetata (PMA, Sigma) i 1 µM jonomicina (Sigma) u prisustvu 3 µg/ml brefeldina A (eBiosciences). Nakon stimulacije, ćelije su obojene za površinske markere kao što je opisano, i fiksirane i permeabilizovane pomoću FoxP3 fiksacionog pufera proizvođača eBioscience postavljenog prema uputstvu proizvođača. Fiksirane ćelije su obojene antitelima na IFNγ i TNFα (eBiosciences).

Blokirajuća antitela. Blokirajuće anti-TIGIT IgG2a monoklonsko antitelo (klon 10A7, reaktivan protiv mišjeg i humanog TIGIT) generisano je kao što je prethodno opisano i klonirano na mišju podlogu IgG2a. Blokirajuće monoklonsko antitelo anti-PD-L1 IgG2a (klon 25A1) generisano je imunizovanjem miševa Pdl1<-/->sa PD-1-Fc fuzionim proteinom i klonirano na mišju IgG2a podlogu. Klon 25A1 je modifikovan prethodno opisanim mutacijama ukidanjem vezivanja za Fcγ receptore. Blokirajuće monoklonsko anti- CD226 IgG2a antitelo (klon 37F6) generisano je imunizacijom hrčaka rekombinantnim mišjim CD226 i klonirano na mišju podlogu IgG2a. Ova antitela su takođe korišćena u testovima opisanim u ostalim primerima koji su ovde opisani.

1

Virusne infekcije. Za akutne infekcije, miševi su intravenski inficirani sa 2x10<6>jedinica koje stvaraju plak (PFU), Armstrongovim sojem LCMV. Za dobijanje hronične infekcije, miševi su intravenski inficirani sa 2x10<6>PFU klona 13 soja LCMV i tretirani sa 500 ug i 250 ug proređujućih anti-CD4 antitela (klon GK1.5) 3 dana pre, odnosno 4 dana nakon infekcije. Tamo gde je naznačeno, miševi inficirani klonom 13 soja LCMV primali su intraperitonealne injekcije sa 200 ug izotipskih kontrolnih antitela, 200 ug anti-PD-L1 antitela i/ili 500 ug anti-TIGIT antitela 3 puta nedeljno, od 28. do 42. dana posle infekcije.

Analiza virusnog titra. Monoslojevi MC57 ćelija uzgajani su sa prevlakom od 1% metilceluloze i inficirani serijski razblaženim homogenatima jetre LCMV zaraženih miševa.

72 sata nakon infekcije, ćelije su fiksirane 4% paraformaldehidom i permeabilizovane sa 0,5% Triton-X. Virusni plakovi su obojeni sa anti-LCMV NP (klon VL-4) i HRP-konjugvanim anti-pacovskim IgG i vizuelizovani s O-fenilendiaminom (OPD, Sigma).

Bioinformatika. Podaci mikročipa genske ekspresije raka dojke dobijeni su iz Mreže za Atlas genoma raka (mreža, T.C.G.A. Comprehensive genomic characterization of squamous cell lung cancers. Nature 489, 519-525 (2012)). Obrada i normalizacija podataka iz mikročipa izvedena je korišćenjem R programskog jezika (http://r-project.org) i limma paketa Bioconductor (http://bioconductor.org). Vrednosti intenziteta mikročipa iz svakog kanala unapred su obrađene pomoću postupka normalne+eksponencijalne korektivne pozadine, kao što je prethodno opisano<22>. Korigovane vrednosti intenziteta su zatim normalizovane upotrebom kvantila, kao što je prethodno opisano<23>. Normalizovani podaci log-odnosa izračunati su oduzimanjem referentnog kanala od ispitnog kanala za svaki niz. Podaci su dodatno filtrirani pomoću nespecifičnog filtera, kako je prethodno opisano<24>, uz uklanjanje sondi koje se ne preslikavaju na poznate gene i smanjenje skupa podataka na jednu sondu po genu. Za analizu diferencijalne ekspresije, moderatorska t-statistika je izračunata pomoću limma paketa, kao što je prethodno opisano (Smyth, G.K. Linear models and empirical bayes methods for assessing differential expression in microarray experiments. Statistical applications in genetics and molecular biology 3, Article3 (2004)). Za procenu korelacije korišćeni su Pirsonovi koeficijenti korelacije.

Karcinom debelog creva CT26. BALB/c su supkutano inokulisani sa 1x10<5>CT26 ćelija karcinoma debelog creva suspendovanih u matrigelu (BD Biosciences) u desnu jednostranu torakalnu bočnu stranu. Nakon dve nedelje, miševi koji su nosili tumore veličine oko 200 mm<3>nasumično su izdvojeni u grupe za lečenje koje su primale 35 mg/kg izotipskih kontrolnih antitela, anti-PD-L1 antitela i/ili anti-TIGIT antitela intraperitonealnom injekcijom 3 puta nedeljno tokom 3 nedelje. Tumori su mereni 2 puta nedeljno pomičnim merilom.

1

Životinje čiji su tumori postali ulcerisani/nekrotični ili su porasli veći od 2000 mm<3>su eutanazirane.

EMT6 karcinom dojke. BALB/c miševi su supkutano inokulisani u četvrti jastučić masnog tkiva dojke sa 1x10<5>singeničkih EMT6 ćelija karcinoma dojke u matrigelu (BD Biosciences). Nakon dve nedelje, miševi koji su nosili tumore veličine 150-200 mm<3>nasumično su izdvojeni u grupe za lečenje koje su primale 35 mg/kg izotipskih kontrolnih antitela, anti-PD-L1 antitela i/ili anti-TIGIT antitela intraperitonealnom injekcijom 3 puta nedeljno tokom 3 nedelje. Tumori su mereni 2 puta nedeljno pomičnim merilom, a veličina tumora je izračunata pomoću modifikovane elipsoidne formule, 1⁄2 x (dužina x širina<2>). Za životinje čiji se tumor smanjio na 32 mm<3>ili manje smatra se da su u potpunom odgovoru (CR). Smatra se da su životinje čiji su tumori porasli na više od 2000 mm<3>progradirale, i bile su eutanazirane. Životinje čiji su tumori postali ulcerirani pre progresije ili potpunog odgovora eutanizirane su i uklonjene iz studije.

Ponovni izazov za CT26. Gde je naznačeno, BALB/c miševi prethodno inokulisani CT26 ćelijama karcinoma debelog creva, kao što je opisano gore, ponovo su inokulisani CT26 ćelijama u levu (koje prethodno nije bilo inokulisano) jednostranu torakalnu bočnu stranu. Ti miševi su inokulisani i sa 1x10<5>EMT6 ćelija karcinoma dojke u matrigelu u četvrti jastučić masnog tkiva dojke. Tumori su mereni 2 puta nedeljno. Životinje čiji su tumori postali ulcerirani/nekrotični ili čije je ukupno opterećenje tumora prelazilo 2000 mm<3>bile su eutanazirane.

Statistika. Statistički testovi izvedeni su korišćenjem neuparenih (uparenih gde je to specificirano) dvočlanih Studentovih t-testova. Trake grešaka prikazuju standardnu grešku srednje vrednosti.

Nadzor istraživanja na životinjama. Sve životinjske protokole odobrio je Odbor za zaštitu i korišćenje životinja kompanije Genentech.

Primer 11: Ekspresija TIGIT je povećana u humanom kanceru i povezana je sa ekspresijom CD8 i PD-1 i infiltracijom CD8+ T ćelija.

Materijali i metode

Bioinformatika. Obrada i analiza podataka o sekvenciranju RNK izvršena je korišćenjem R programskog jezika (http://www.r-project.org) zajedno sa nekoliko paketa iz projekta Bioconductor (http://www.bioconductor.org). Podaci iz RNK sekvence za kancer i podudarni normalni uzorci dobijeni su iz TCGA za pet različitih indikacija: rak dojke (Network, C.G.A. Comprehensive molecular portraits of human breast tumours. Nature 490, 61-70 (2012)), adenokarcinom debelog creva (Network, T.C.G.A. Comprehensive molecular

11

characterization of human colon and rectal cancer. Nature 487, 330-337 (2012)), karcinom bubrežnih svetlih ćelija (Network, C.G.A. Comprehensive molecular characterization of clear cell renal cell carcinoma. Nature 499, 43-49 (2013)), karcinom pluća skvamoznih ćelija (Network, T.C.G.A. Comprehensive genomic characterization of squamous cell lung cancers. Nature 489, 519-525 (2012)) i karcinom endometrijuma (Network, T.C.G.A. Integrated genomic characterization of endometrial carcinoma. Nature 497, 67-73 (2012)).

Sirova RNA-seq očitavanja su obrađena korišćenjem paketa HTSeqGenie Bioconductor. Ukratko, očitavanja su usklađena sa ljudskim genomom (NCBI build 37) pomoću GSNAP algoritma (Wu, T.D. & Nacu, S. Fast and SNP-tolerant detection of complex variants and splicing in short reads. Bioinformatics (Oxford, England) 26, 873-881 (2010)). Jedinstveno usklađeni očitani parovi koji spadaju u egzone prebrojani su da bi se dobila procena nivoa ekspresije gena za pojedine gene. Koristili smo procenu veličine biblioteke iz edgeR paketa (Robinson, M.D., McCarthy, D.J. & Smyth, G.K. edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics (Oxford, England) 26, 139-140 (2010)) da normalizujemo u različitim uzorcima njihove dubine sekvenciranja.

Da bismo dobili T ćelijski specifični genski potpis, ručno smo odabrali T ćelijske gene identifikovane projektom IRIS, uklanjajući gene povezane sa procesima ćelijskog ciklusa, gene izrazito eksprimirane u drugim tkivima i poznate receptore koaktiviranja i koinhibicije. Ovo daje 15-genski potpis specifičan za T ćelije. Da bismo izračunali rezultat potpisa ekspresije gena T ćelije u podacima karcinoma pluća skvamoznih ćelija, prvo smo izveli transformaciju stabilizujući varijansu na sirovim podacima brojanja pomoću funkcije voom iz paketa Bioconductor limma. Zatim smo izračunali prvi svojstveni vektor usmerenih i skaliranih podataka stabilizovanih varijansom iz 15-genskog potpisa T ćelija. Ovaj pristup daje čvrstu procenu relativnog obilja T ćelija po uzorku. Linearni model koji uključuje ocenu potpisa T ćelija tada je bio određen za svaki gen, ponovo pomoću limma paketa. Zatim smo gene rangirali po njihovoj korelaciji sa potpisom T ćelija u našem linearnom modelu, odabirajući samo gene koji su u pozitivnoj korelaciji sa potpisom T ćelija. Da bismo vizuelno prikazali gene povezane sa T ćelijama u vidu toplotne karte, centrirali smo i skalirali podatke stabilizovane na jedinicu varijanse, omogućavajući poređenje gena sa različitim prosečnim nivoima ekspresije.

Da bismo utvrdili povezanost između ekspresije TIGIT-a i drugih gena, normalizovali smo podatke o brojanju RNK sekvenciranja kako bismo uzeli u obzir varijacije u veličini biblioteke koristeći postupak iz edgeR Bioconductor paketa (Robinson, M.D., McCarthy, D.J.

& Smyth, G.K. edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics (Oxford, England) 26, 139-140 (2010)). Zatim smo izračunali Spirmanov koeficijent korelacije ranga na normalizovanim brojevima. Smatramo da je rho> 0,75 pokazatelj jake korelacije, rho ≤ 0,75 ali > 0,5, pokazatelj umerene korelacije, a rho ≤ 0,5 ali > 0,25 pokazatelj slabe korelacije.

Za izračunavanje odnosa TIGIT/CD3ε za svaku indikaciju, prvo smo izračunali podatke stabilizovane na varijansu za svaki skup podataka sekvenciranja RNK. Zatim smo izračunali odnos log2 podataka stabilizovanih na varijansu za TIGIT i CD3ε. Da bismo izračunali razliku između tumorskih i normalnih uzoraka, izveli smo standardnu linearnu analizu modela koristeći standardne R funkcije. Prihvatili smo p-vrednost <0,01 kao dokaz značajne razlike između tumora i normalnog.

Da bismo identifikovali gene povezane sa T ćelijama koje infiltriraju tumor, koristili smo pristup zasnovan na genskom potpisu za ispitivanje podataka o genskoj ekspresiji iz kolekcije Atlasa genoma raka (TCGA) za karcinom pluća skvamoznih ćelija (LUSC) (Network, T.C.G.A. Comprehensive genomic characterization of squamous cell lung cancers. Nature 489, 519-525 (2012)). Pomoću imunoloških ćelijskih specifičnih genskih skupova definisanih u projektu Immune Response In Silico (Abbas, A.R. et al. Immune response in silico (IRIS): immune-specific genes identified from a compendium of microarray expression data. Genes and immunity 6, 319-331 (2005)), i gore opisanih postupaka, stvorili smo visokospecifičan 15-genski potpis. Ispitujući gene koji su najviše povezani sa potpisom T ćelije, identifikovali smo nekoliko koinhibitornih receptora prethodno povezanih sa disfunkcijom T ćelija u tumorima, posebno PD-1 (SL.21). U LUSC-u je ekspresija TIGIT-a i CD3ε bila u značajnoj korelaciji, sa koeficijentom korelacije Spirmanovog ranga (ρ od 0,82 (SL. 20A). U stvari, ekspresija TIGIT-a i CD3ε takođe je bila u značajnoj korelaciji sa mnogim dodatnim skupovima podataka o ekspresiji tumorskog gena TCGA, uključujući adenokarcinom debelog creva (COAD), karcinom endometrijuma tela materice (UCEC), karcinom dojke (BRCA) i karcinom bubrežnih svetlih ćelija (KIRC), sa ρ u rasponu od 0,83 do 0,94 (SL. 20B-20E). Nadalje, ekspresija TIGIT-a je bila povišena u odnosu na ekspresiju CD3ε u mnogim uzorcima tumora, s povećanim odnosima TIGIT/CD3ε u uzorcima tumora LUSC, COAC, UCEC i BRCA u poređenju sa odgovarajućim normalnim tkivom (povećanje od 116%-419%, SL. 20A-20D). Odnos ekspresije TIGIT-a i CD3ε u uzorcima KIRC nije promenjen, iako je ekspresija TIGIT-a i CD3ε bila mnogo veća u uzorcima KIRC nego u normalnim uzorcima tkiva (SL. 20E). Ovi podaci pokazuju da je ekspresija TIGIT bila povećana limfocitima koji infiltriraju tumor (TIL) u širokom rasponu solidnih tumora.

TIGIT je prethodno opisan kao inhibitor prajmovanja CD4+ T ćelija, bez poznate funkcije u CD8+ T ćelijama. Međutim, ekspresija TIGIT u uzorcima LUSC bila je u značajnoj korelaciji sa CD8A i samo neznatnoj korelaciji sa CD4 (ρ = 0,77, odnosno 0,48, SL. 20F). Ekspresija TIGIT-a je takođe bila u korelaciji sa ekspresijom njegovog komplementarnog kostimulatornog receptora, CD226, kao i sa ekspresijom PD-1, ključnog posrednika supresije T ćelija u tumorima i u drugim hroničnim imunskim odgovorima (ρ = 0,64 odnosno 0,82, SL.20G-20H). Iako postoje neki ne-limfocitni ćelijski izvori ovih gena u tumorima, ovi podaci izričito ukazuju na to da su T ćelije koje infiltriraju tumor, posebno "iscrpljene" CD8<+>T ćelije, ekprimirale visok nivo TIGIT-a.

Primer 12: TIGIT i PD-1 se koordinirano eksprimiraju humanim i mišjim limfocitima koji infiltriraju tumor

Materijali i metode

Uzorci humanog tumora i PBMC. Odgovarajuća puna krv i sveže hirurško resecirano tkivo tumora dobijeno je od Conversant Biosciences ili Foundation Bio. Svi uzorci su dobijeni uz pismeni informisani pristanak i prikupljeni po protokolu koji je odobren od strane Odbora za reviziju ustanove (Institutional Review Board, IRB) Hartford Hospital (NSCLC pacijent 1, prikazano na SL.22) ili Western IRB (NSCLC pacijent 2 i CRC pacijent 1, prikazan na SL. 23 i SL. 37). Normalna puna krv odraslih osoba dobijena je od zdravog dobrovoljca. PBMC su prečišćeni iz pune krvi gradijentnim centrifugiranjem sa fikolom. Tumorsko tkivo je isečeno na male komade, inkubirano sa kolagenazom i DNAzom (Roche) i razdvojeno je pomoću gentleMACS disocijatora (Miltenyi).

Protočna citometrija. Jednoćelijske suspenzije mišje slezine, limfnog čvora i tumora pripremljene su blagom mehaničkom disrupcijom. Površinsko bojenje je izvršeno komercijalnim antitelima na CD4, CD8, CD44, CD62L, PD-1 (eBiosciences) i CD226 (Biolegend). TIGIT antitela su generisana u kompaniji Genentech i konjugovana sa Alexa Fluor 647 prema uputstvu proizvođača (Molecular Probes).

Za intraćelijsko bojenje citokina (ICS), ćelije su stimulisane tokom 4 sata sa 20 ng/ml Phorbol 12-miristat 13-acetata (PMA, Sigma) i 1 µM jonomicina (Sigma) u prisustvu 3 µg/ml brefeldina A (eBiosciences). Nakon stimulacije, ćelije su obojene na površinske markere kako je opisano, i fiksirane i permeabilizovane sa eBioscience FoxP3 fiksacionim puferom postavljenim prema uputstvu proizvođača. Fiksirane ćelije su obojene antitelima na IFNγ i TNFα (eBiosciences).

Uzorci humanog tumora i PBMC pripremljeni su kao što je gore opisano. Površinsko bojenje izvedeno je bojom za vijabilnost (Molecular Probes), komercijalnim antitelima na

11

CD45 (eBiosciences), CD3, CD4, CD8, PD-1 (BD Biosciences), i sa anti-TIGIT antitelima pripremljenim kako je gore opisano.

Svi uzorci su prikupljeni na instrumentima LSR-II ili LSR-Fortessa (BD Biosciences) i analizirani pomoću softvera FlowJo (Treestar).

Da bismo potvrdili povećanje TIGIT T ćelijama koje infiltriraju tumor, procenili smo proteinsku ekspresiju TIGIT na humanim T ćelijama koje infiltriraju tumor kod nemikrocelularnog karcinoma pluća, odgovarajućim perifernim T ćelijama i normalnim perifernim T ćelijama donora. TIGIT na površini ćelije je bio eksprimiran podskupovima NSCLC-infiltrirajućih CD8<+>i CD4<+>T ćelija (51% odnosno 39%, SL.22A-22B. SL. 36 dalje prikazuje da je TIGIT na površini ćelije bio eksprimiran velikim procentom NSCLC-infiltrirajućih CD8<+>i CD4<+>T ćelija (58% odnosno 28% TIGIT<+>, S.L. 36A-36B). Zanimljivo je da su periferne CD8<+>i CD4<+>T ćelije iz NSCLC davaoca tumora takođe eksprimirale više nivoe TIGIT-a od ćelija zdravih donora (SL. 22A-22B i SL. 36A-36B). Slični rezultati su dobijeni sa drugim skupom podudarnih uzoraka NSCLC i PBMC i u skupu uzoraka podudarnih kolorektalnih karcinoma (CRC) i PBMC (SL. 23 i SL. 37). Gotovo sve T ćelije koje infiltriraju tumor i koje eksprimiraju visok nivo TIGIT-a koeksprimirale su PD-1, što je u skladu s korelacijom između ekspresije TIGIT i PD-1 opisane na SL.1 (SL. 22C).

Kako bismo proširili naše humane nalaze na pretkliničke modele raka, okarakterisali smo ekspresiju TIGIT T ćelija koje infiltriraju subkutane CT26 i MC38 kolorektalne tumore u BALB/c miševima divljeg tipa odnosno C57BL6/J miševima. Dve nedelje nakon inokulacije, kada su se CT26 i MC38 tumori uspostavili i narasli do veličine od 150-200 mm<3>, TIGIT je bio eksprimiran sa oko 50% CD8<+>T ćelija koje infiltriraju tumor i 25% CD4<+>T ćelija koje infiltriraju tumor, na nivoima sličnim onima primarnih CD8<+>T ćelija stimulisanih in vitro (SL. 22D-22E i SL. 26). I kod CD8<+>i CD4<+>mišjih TIL, CD226 je bio konstitutivno eksprimiran, a ekspresija TIGIT i PD-1 su opet bile u tesnoj korelaciji (SL.

22F-22G).

Ovi rezultati su potvrdili da je TIGIT bio visoko eksprimiran T ćelijama koje infiltriraju tumor, i da se ekspresija TIGIT-a odvijala paralelno sa ekspresijom ostalih koinhibitornih receptora, najviše PD-1.

Primer 13: Supresija odgovora CD8+ T ćelija od strane TIGIT zavisi od CD226 Za razliku od PD-1 ili CTLA-4, nema direktnih biohemijskih dokaza inhibitorne signalne kaskade T ćelija koje je TIGIT pokrenuo u cisteinu. Međutim, koinhibitorni receptori mogu funkcionisati i tako što ograničavaju aktivnost komplementarnog kostimulatornog receptora, kao u slučaju supresije CD28 signala pomoću CTLA-4. Nakon što je TIGIT potvrđen kao negativni regulator antivirusnih CD8<+>T ćelija i onih koje infiltriraju tumor, upitali smo se da li je TIGIT indukovao iscrpljivanje T ćelija indirektnim putem preko supresije njihovog komplementarnog kostimulatornog receptora, CD226, koji je snažno eksprimiran perifernim CD8<+>T ćelijama i onim koje infiltriraju tumor (SL. 27).

BALB/c miševi divljeg tipa koji su imali tumor CT26 veličine 150-200 mm<3>tretirani su kombinacijom anti-PD-L1 i anti-TIGIT antitela u prisustvu ili odsustvu blokirajućeg anti-CD226 antitela, ili samo sa anti-CD226 antitelom. Tretman samo anti-CD226 antitelom je neznatno ubrzao rast tumora u odnosu na kontrolne miševe, što je rezultiralo smanjenom medijanom preživljavanja od 2 dana (samo anti-CD226 u odnosu na kontrolu, P = 0,0118, SL. 28A-28B). Ali je iznenađujuće bilo to da je dodavanje anti-CD226 blokirajućih antitela miševima koji su tretirani anti-TIGIT i anti-PD-L1 koblokadom značajno podstaklo rast tumora i potpuno preokrenulo efikasnost TIGIT/PD-L1 koblokade za regresiju tumora i preživljavanje (SL. 28A-28B). Slično delovanje je uočeno na LCMV titrima kod hronično inficiranih miševa lečenih anti-TIGIT, anti-PD-L1 i/ili anti-CD226 (SL. 19D). Ovi podaci su pokazali da je CD226 doprineo anti-tumorskim i drugim hroničnim odgovorima T ćelija i da je TIGIT ove odgovore potisnuo barem delimično suzbijanjem CD226.

Da bismo potpunije shvatili kako aktivnost TIGIT i CD226 utiče na antitumorske T ćelijske odgovore, testirali smo kako je CD226 sam i u saradnji sa TIGIT-om uticao na aktivaciju T ćelija, infiltraciju tumora i efektorsku funkciju. Analizirali smo tumore i limfne čvorove koji dreniraju tumor kod miševa koji su imali tumor CT26, tretiranih kao što je opisano iznad, tokom sedam dana. Kao i ranije, koblokada PD-L1 i TIGIT-a povećala je proizvodnju IFNγ CD8<+>T ćelija koje infiltriraju tumor i onih rezidentnih iz limfnih čvorova koji dreniraju tumor (povećanje od 130% odnosno 99%, P <0,001, SL. 28C-28D). Blokada samo CD226 nije imala uticaja na proizvodnju IFNγ pomoću CD8<+>T ćelija koje infiltriraju tumor i onih rezidentnih iz limfnih čvorova koji dreniraju tumor, što ukazuje na to da je efekat CD226 kostimulacije već bio ograničen u iscrpljenim T ćelijama (SL. 28C-28E). Međutim, CD226 blokada je narušila i frekvenciju i efektorsku funkciju CD8<+>T ćelija koja infiltriraju tumor kod miševa koji su tretirani kombinacijom anti-TIGIT i anti-PD-L1 (smanjenje od 57%, P = 0,0015, SL.28D). Tretman sa anti-CD226 nije imao takav efekat na rezidentne CD8<+>T ćelije u limfnim čvorovima koji dreniraju tumor, dok je samo anti-PD-L1 poboljšao efektorsku funkciju CD8<+>T ćelija, što ukazuje na to da je blokada PD-L1 bila dovoljna za pojačavanje efektorske funkcije CD8<+>T ćelija čak i u odsustvu CD226. CD226 blokada takođe je za rezultat imala smanjenu frekventnost CD8<+>T ćelija koje infiltriraju tumor (smanjenje od 53%, P = 0,0044, SL. 28E-28F). U zbiru, ovi podaci upućuju na to da

11

CD226 funkcioniše kao podrška akumulaciji i efektorskoj funkciji CD8<+>T ćelija koje infiltriraju tumor, a da TIGIT deluje protiv njih.

Primer 14: TIGIT narušava funkciju CD226 direktno ometajući homodimerizaciju CD226

Da bi se proverilo da li TIGIT antagonizuje CD226 aktivnost u cis, testirano je delovanje TIGIT-a na CD226 kostimulaciju in vitro. CD8<+>T ćelije sa deficitom TIGIT-a, stimulisane suboptimalnim nivoima anti-CD3, odgovorile su snažnije na PVR kostimulaciju nego CD8<+>T ćelije divljeg tipa, a taj pojačani odgovor je zavisio od CD226 (porast proliferacije od 46%, P = 0,0061, SL. 29A). U skladu sa ovim podacima, CD8<+>T ćelije divljeg tipa, stimulisane suboptimalnim anti-CD3 i PVR, razmnožavale su se snažnije u prisustvu anti-TIGIT antitela nego u prisustvu izotipski podudarnih kontrolnih antitela, a taj efekat je takođe zavisio od CD226 (porast proliferacije od 105%, P = 0,0010, SL.29B).

Da bi se proverila relevantnost TIGIT-a za primarne ljudske CD8<+>T ćelije, prečistili smo CD8<+>T ćelije iz krvi zdravog donora i stimulisali ih suboptimalnim nivoima anti-CD3 i rekombinantnog humanog PVR-Fc fuzionog proteina vezanog za ploču. U prisustvu izotipski podudarnih kontrolnih antitela, PVR kostimulacija je umereno pojačala stimulaciju i proliferaciju T ćelija. Nadalje, dodavanje blokirajućih anti-TIGIT antitela značajno je pojačalo efekte PVR kostimulacije, u skladu sa efektima TIGIT-a na primarne mišje CD8<+>T ćelije (porast proliferacije 69%, P = 0,0071, SL. 29C). Ovi podaci su pokazali intrinzičnu ćelijsku ulogu u TIGIT inhibiciji funkcije CD226 na primarnim mišjim i humanim CD8<+>T ćelijama.

TR-FRET (vremenski fluorescentno rezonantni energetski transfer) korišćen je za određivanje molekulskog mehanizma pomoću koga je TIGIT ometao aktivnost CD226. Prvo smo izrazili i označili humani ST-CD226 sa neprodirućim donorskim i akceptorskim fluoroforima. Te ćelije su proizvele snažan FRET signal, što je potvrdilo sposobnost CD226 za homodimerizaciju (SL. 29D). Da bismo pratili interakcije CD226 i TIGIT-a na površini ćelije, eksprimirali smo ST-CD226 u odsustvu ili u prisustvu ljudskog HA-TIGIT koji smo obeležili supstratom SNAP-oznaka odnosno anti-HA antitelom. Bilo je iznenađujuće što je koekspresija povećanih količina TIGIT-a (praćena pomoću ELISA testa) oslabila signal CD226/CD226 FRET, što ukazuje na to da TIGIT može poremetiti homodimerizaciju CD226 (SL. 29E). U stvari, akceptorski CD226 i donorski TIGIT takođe su proizveli značajan FRET signal, što ukazuje na postojanje direktne interakcije između ova dva proteina (SL. 29F). Ta interakcija je dodatno potvrđena koimunoprecipitacijom (SL. 29G). Ovi podaci su pokazali da su TIGIT i CD226 u direktnoj interakciji na ćelijskoj površini, i da ta interakcija može

11

ometati homodimerizaciju CD226.

Da bismo testirali efekte blokade TIGIT antitela na interakciju TIGIT-CD226, ponovo smo koeksprimirali humani ST-CD226 i HA-TIGIT, ovog puta u prisustvu ili odsustvu blokirajućih antitela na humani TIGIT. Dodavanje anti-TIGIT-a ćelijskim kulturama značajno je smanjilo sposobnost TIGIT i CD226 da se udružuju (SL. 29H). Ovi podaci upućuju na to da anti-TIGIT tretman može ograničiti interakciju TIGIT-a sa CD226, i u skladu su sa tvrdnjom da je supresija aktivnosti CD226 ključni mehanizam delovanja pomoću koga TIGIT dovodi do iscrpljivanja CD8<+>T ćelija. Ovo je takođe u skladu sa sposobnošću anti-TIGIT antitela da pojačaju CD226 kostimulaciju.

Zatim smo potvrdili sposobnost endogenih TIGIT i CD226 za interakciju (SL. 30). Primarne humane T ćelije su in vitro stimulisane anti-CD3 i anti-CD28 antitelima, sortirane na osnovu ekspresije TIGIT, odmorene, ponovo stimulisane i obeležene antitelima na endogeni TIGIT i CD226 koja su konjugovana sa fluoroforima kompatibilnim sa TR- FRET. T ćelije koje eksprimiraju TIGIT obeležene anti-TIGIT antitelima konjugovanim sa donorima i anti-CD226 antitelima konjugovanim sa akceptorima proizvele su jak FRET signal (SL.30). Suprotno tome, samo je zanemarljiv FRET signal otkriven na T ćelijama koje nisu eksprimirale TIGIT ili koje su bile označene anti-TIGIT antitelima konjugovanim sa donorima i anti-HVEM antitelima konjugovanim sa akceptorima (SL. 30), što potvrđuje specifičnost detektovane interakcije između endogenog TIGIT i CD226.

Ovi rezultati pokazuju da endogeni TIGIT i CD226 mogu direktno da komuniciraju na ćelijskoj površini, i da ta interakcija narušava homodimerizaciju CD226. S obzirom na ulogu CD226 kao kostimulatora odgovora T ćelija in vivo, i bez želje da se ograničimo teorijom, veruje se da supresija CD226 može biti ključni mehanizam delovanja pomoću koga TIGIT dovodi do iscrpljenosti CD8<+>T ćelija za vreme hronične virusne infekcije i raka.

Materijali i metode

Vremenski fluorescentno rezonantni energetski transfer sa transficiranim ćelijskim linijama. CHO ćelije su transficirane N-terminusom CD226 označenim sa SNAP (ST) i N-terminusom HA-TIGIT, pomoću Lipofectamine 2000 (Life Technologies) i zasejane na beloj ploči sa 96 bunarčića (Costar), sa 100.000 ćelija po bunarčiću. 24 sata kasnije, ćelije su obeležene za merenje TR-FRET, bilo između SNAP-donora / SNAP-akceptora ili između SNAP-akceptora / anti-HA donora.1) Obeležavanje SNAP-donor / SNAP-akceptor: Ćelije su inkubirane sa 100 nM donor-konjugovanog benzil-guanin-SN-LT-4Tb (Cisbio) i 1 µM akceptor-konjugovanog benzil-guanina SNAP-A647 (New England Biolabs), razblaženim u DMEM-u 10% FCS tokom 1 sata na 37 °C, 5% CO2. Ćelije su tada isprane tri puta u PBS-u

11

pre čitanja FRET signala. 2) SNAP-akceptor / anti-HA donor: Ćelije su inkubirane sa 1 μM akceptor-konjugovanim benzil-guaninom SNAP-A647 razređenim u DMEM 10% FCS tokom 1h na 37 °C, 5% CO2.Nakon tri ispiranja u PBS-u, ćelije su inkubirane tokom 2 sata sa 2 nM anti-HA Lumi-4Tb (Cisbio) u PBS-u 0,2% BSA na sobnoj temperaturi. FRET signal je tada snimljen na 665 nm tokom 400 µs nakon kašnjenja od 60 µs nakon laserskog pobuđivanja na 343 nm pomoću čitača ploče Safire2 (Tecan). Kada je anti-TIGIT testiran na krajnjih 10 µg/ml, FRET signal je zabeležen i nakon 15 min inkubacije. Za interakciju Flag-ST-CD226/Flag-ST-CD226, odnos FRET izračunat je kao intenzitet FRET podeljen sa donorskom emisijom na 620 nm, što je proporcionalno ekspresiji CD226. Intenzitet FRET je: (signal na 665 nm ćelija označenih SNAP-donorom i akceptorom) - (signal na 665 nm iz iste serije transficiranih ćelija označenih samo SNAP-donorom). Za interakciju Flag-ST-CD226/HA-TIGIT, odnos FRET predstavlja intenzitet FRET podeljen sa ekspresijom Flag-ST-CD226 mereno pomoću anti-Flag ELISA. U tom slučaju, intenzitet FRET = (signal na 665 nm iz ćelija označenih SNAP-akceptorom i anti-HA donorom) - (signal na 665 nm iz lažno transficiranih ćelija označenih SNAP-akceptorom i anti-HA donorom).

Vremenski fluorescentno rezonantni energetski transfer sa humanim T ćelijama.

Humana anti-TIGIT (Genentech klon 1F4), anti-CD226 (Santa Cruz Biotechnology) i anti-HVEM (eBioscience) antitela bila su konjugovani fluorofori kompatibilni sa TR-FRET (Cisbio). Primarne humane T ćelije bile su obogaćene sa MACS iz krvi, stimulisane in vitro anti-CD3 i anti-CD28 antitelima vezanim za ploču tokom 72 sata. T ćelije koje su eksprimirale i koje nisu eksprimirale TIGIT (a koje su sve eksprimirale CD226) su zatim sortirane, odmarane bez stimulacije tokom 72 sata, i ponovo stimulisane tokom 48 sati. Svaka populacija je zatim jednom isprana Tris-KREBS puferom (20 mM Tris pH7,4, 118 mM NaCl, 5,6 mM glukoze, 1,2 mM KH2PO4, 1,2 mM MgSO4, 4,7 mM KCl, 1,8 mM CaCl2) i uzgajana pod sledećim uslovima, u tri primerka: 1) Anti-TIGIT Ab-Lumi4-Tb (5 µg/ml), 2) Anti-TIGIT Ab-Lumi4-Tb (5 µg/ml) anti-HVEM-d2 (10 µg/ml), 3) Anti-TIGIT Ab-Lumi4-Tb (5 µg/ml) anti-CD226 (10 µg/ml), 4) Anti-TIGIT Ab-Lumi4-Tb (5 µg/ml) anti-CD226 (10 µg/ml) hladni anti-TIGIT Ab (klon 1F4) (50 µg/ml). Navedene koncentracije su optimizovane da osiguraju najveći FRET signal. Ćelije su inkubirane tokom 2 sata na sobnoj temperaturi na rotatoru, a zatim 3 puta isprane u Tris-KREBS puferu. Zatim su T ćelije posejane po 400.000 ćelija/bunarčiću na beloj ploči sa 96 bunarčića (Costar), a TR-FRET je zabeležen na 665 nm tokom 400 µs nakon odlaganja od 60 µs posle laserskog pobuđivanja na 343 nm pomoću PHERAstar čitača ploče (BMG Labtech). Intenzitet FRET izražen je kao signal na 665 nm iz ćelija označenih sa Ab-Lumi4-Tb Ab-d2 minus signal na 665 nm iz iste

11

serije ćelija označenih samo sa Ab-Lumi4-Tb. Nespecifični FRET signal su davale T ćelije inkubirane sa Lumi4Tb d2 viškom hladnog Ab.

Koimunoprecipitacija. Ukratko, COS7 ćelije na pločama od 15 cm kotransficirane su ekspresionim plazmidima koji sadrže cDNK, bilo za TIGIT-HA (5 ng) ili za CD226-Flag (10 ng) obeležene proteine, ili za kontrolni plazmid (pRK). 23 sata nakon transfekcije ćelije su isprane PBS-om i skupljene u 4 ml ledeno hladnog PBS-a i centrifugirane na 300xg tokom 5 minuta, a ćelijski pelet je ponovo suspendovan u 2 ml pufera za lizu na 4 °C. Ćelije su lizirane tokom 50 min vrtloženjem na svakih 15 minuta i naknadno centrifugirane na 10,00xg tokom 15 min na 4 °C. Nastali supernatant je prethodno izbistren sa 160 µl suspenzije CL6B sepahroze rotiranjem 30 minuta na 4 °C i centrifugiran tokom 2 min na 3000 x g. Supernatant je podeljen jednako u dve epruvete i imunoprecipitovan pomoću anti-HA ili anti-flag, uz korišćenje standardnih postupaka. Imunoprecipitovani proteini su podvrgnuti metodama SDS-PAGE i vestern blot. Rezultati vestern blota su ispitivani sa anti-Flag-HRP ili sa anti-HA-HRP.

11

12

1

11

12

1

14

1

Claims

PATENTNI ZAHTEVI 1. Anti-PD-L1 antagonističko antitelo ili njegov antigen vezujući fragment i anti-TIGIT antagonističko antitelo ili njegov antigen vezujući fragment za upotrebu kao lek.
2. Anti-PD-L1 antagonističko antitelo ili njegov antigen vezujući fragment i anti-TIGIT antagonističko antitelo ili njegov antigen vezujući fragment za upotrebu kao lek prema zahtevu 1, pri čemu, lek je namenjen za lečenje ili odlaganje progresije raka, smanjenje ili inhibiranje recidiva raka ili raka, lečenje ili odgađanje progresije bolesti povezane sa imunskim sistemom, ili smanjenje ili inhibiciju progresije bolesti povezane sa imunskim sistemom kod pojedinca, pri čemu, bolest povezana sa imunskim sistemom je nerešena akutna infekcija, hronična infekcija ili imunitet tumora.
3. Anti-PD-L1 antagonističko antitelo ili njegov antigen vezujući fragment i anti-TIGIT antagonističko antitelo ili njegov antigen vezujući fragment za upotrebu kao lek prema zahtevu 1 ili 2, pri čemu, lek je namenjen za kombinovanu primenu sa najmanje jednim hemoterapeutskim sredstvom.
4. Anti-PD-L1 antagonističko antitelo ili njegov antigen vezujući fragment i anti-TIGIT antagonističko antitelo ili njegov antigen vezujući fragment za upotrebu kao lek prema bilo kom od zahteva 1-3, pri čemu, anti-TIGIT antagonističko antitelo ili njegov antigen vezujući fragment je humanizovano antitelo, himerno antitelo, bispecifično antitelo, antitelo heterokonjugat ili imunotoksin.
5. Anti-PD-L1 antagonističko antitelo ili njegov antigen vezujući fragment i anti-TIGIT antagonističko antitelo ili njegov antigen vezujući fragment za upotrebu kao lek prema zahtevu 4, pri čemu, anti-PD-L1 antagonističko antitelo ili njegov antigen vezujući fragment inhibira vezivanje PD-L1 za PD-1, inhibira vezivanje PD-L1 za B7-1, ili inhibira vezivanje PD-L1 za PD-1 i B7-1.
6. Anti-PD-L1 antagonističko antitelo ili njegov antigen vezujući fragment i anti-TIGIT antagonističko antitelo ili njegov antigen vezujući fragment za upotrebu kao lek prema zahtevu 5, pri čemu, anti-PD-L1 antagonističko antitelo ili njegov antigen vezujući fragment sadrži teški lanac koji sadrži HVR-H1 sekvencu (SEQ ID NO:17), HVR-H2 sekvencu sekvencu

(SEQ ID NO:19); i laki lanac koji sadrži HVR-L1 sekvencu (SEQ ID NO:20), HVR-L2 sekvencu sekvencu

(SEQ ID NO:22).
7. Anti-PD-L1 antagonističko antitelo ili njegov antigen vezujući fragment i anti-TIGIT antagonističko antitelo ili njegov antigen vezujući fragment za upotrebu kao lek prema bilo kom od zahteva 2-6, pri čemu, kancer je nemikrocelularni karcinom pluća, mikrocelularni karcinom pluća, rak bubrežnih ćelija, kolorektalni kancer, rak jajnika, rak dojke, rak gušterače, karcinom želuca, rak mokraćne bešike, rak jednjaka, mezoteliom, melanom, kancer glave i vrata, rak štitne žlezde, sarkom, kancer prostate, glioblastom, rak grlića materice, karcinom timusa, leukemija, limfom, mijelom, fungoidna mikoza, rak Merkelovih ćelija ili hematološki malignitet.
8. Anti-PD-L1 antagonističko antitelo ili njegov antigen vezujući fragment i anti-TIGIT antagonističko antitelo ili njegov antigen vezujući fragment za upotrebu kao lek prema bilo kom od zahteva 1-7, pri čemu, anti-TIGIT antagonističko antitelo ili njegov antigen vezujući fragment se daje kontinuirano ili povremeno.
9. Anti-PD-L1 antagonističko antitelo ili njegov antigen vezujući fragment i anti-TIGIT antagonističko antitelo ili njegov antigen vezujući fragment za upotrebu kao lek prema bilo kom od zahteva 1-7, pri čemu, anti-TIGIT antagonističko antitelo ili njegov antigen vezujući fragment se daje pre anti-PD-L1 antagonističkog antitela ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta, istovremeno sa anti-PD-L1 antagonističkim antitelom ili njegovim antigen vezujućim fragmentom, ili nakon anti-PD-L1 antagonističkog antitela ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta.
10. Komplet koji sadrži anti-PD-L1 antagonističko antitelo ili njegov antigen vezujući fragment, anti-TIGIT antagonističko antitelo ili njegov antigen vezujući fragment i uložak u pakovanju koji sadrži uputstvo za upotrebu anti-PD-L1 antagonističkog antitela ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta i anti-TIGIT antagonističkog antitela ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta, za lečenje ili odlaganje progresije kancera kod pojedinca koji ima kancer.
11. Komplet prema zahtevu 10, pri čemu, anti-TIGIT antagonističko antitelo ili njegov antigen vezujući fragment je humanizovano antitelo, himerno antitelo, bispecifično antitelo, antitelo heterokonjugat ili imunotoksin.
12. Komplet prema zahtevu 10 ili 11, pri čemu, anti-PD-L1 antagonističko antitelo ili njegov antigen vezujući fragment sadrži teški lanac koji sadrži HVR-H1 sekvencu (SEQ ID NO:17), HVR-H2 sekvencu

NO:18) i HVR-H3 sekvencu (SEQ ID NO: 19); i laki lanac koji sadrži HVR-L1 sekvencu sekvencu (SEQ ID NO:21) i HVR-L3 sekvencu

1