RS60897B1 - Anti-vla-4 antitela - Google Patents

Description

Opis

SRODNE PRIJAVE

[0001] Ova prijava ima pravo prvenstva saglasno sa S.A.D. privremenom prijavom br.

61/324,944, podnetom 16. aprila 2010.

OBLAST PRONALASKA

[0002] Ovaj pronalazak se odnosi na alfa-4 vezujuća antitela, i njihove alfa-4 vezujuće fragmente.

POZADINA PRONALASKA

[0003] Humanizovana antitela se mogu upotrebljavati kao terapijski agensi umesto antitela murina da bi se izbegao nepoželjni imunski odgovor kod ljudi nazvan HAMA (humano antimišje antitelo) odgovor. Humanizovana antitela su generalno konstruisana zamenom regiona koji određuju komplementarnost (CDR) humanog antitela sa CDR druge vrste, tipično antitela miša.

[0004] VLA-4 (koji se takođe naziva α4β1) je član β1 integrin porodice receptora ćelijske površine. VLA-4 sadrži α4 lanac i β1 lanac i uključen je u interakcije ćelija-ćelija. Njegova ekspresija je uglavnom ograničena na limfoidne i mijeloidne ćelije. VLA-4 vezuje ligand endotelske ćelije VCAM-1 (vaskularni ćelijski adhezivni molekul-1 (Vascular Cell Adhesion Molecule-1)), i može posredovati u povezivanju T i B limfocita sa heparin II vezujućim fragmentom fibronektina humane plazme.

[0005] WO 2006/096653 objavljuje anti-VLA-4 antitelo zvano HP1/2 i njegove humanizovane varijante upotrebom varijabilnog akceptorskog regiona okvira teškog lanca iz IGHV1-f.

SAŽETAK PRONALASKA

[0006] Na osnovu objave koja je ovde sadržana, predmetni pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži molekul rekombinantnog antitela, ili njegov α4-vezujući fragment, koji sadrži varijabilni teški lanac i varijabilni laki lanac, pri čemu:

(a) varijabilni teški lanac sadrži sekvencu regiona okvira varijabilnog teškog lanca iz IGHV1-f i CDR iz VH lanca murinskog antitela HP1/2, pri čemu CDR1 sadrži sekvencu GFNIKDTYM, CDR2 sadrži sekvencu RIDPASGDTKYDPKFQV i CDR3 sadrži sekvencu GMWVSTGYALDF, i amino-kiselinski ostaci na pozicijama regiona okvira 24 i 94 varijabilnog teškog lanca u skladu sa Kabat šemom numeracije su supstituisani, pri čemu supstituisani ostatak na poziciji regiona okvira 24 je alanin (A) i supstituisani ostatak na poziciji regiona okvira 94 je asparaginska kiselina (D);

(b) varijabilni laki lanac sadrži sekvencu regiona okvira varijabilnog lakog lanca iz IGKV4-1 i CDR iz VL lanca murinskog antitela HP1/2, pri čemu CDR1 sadrži sekvencu KASQSVTNDVA, CDR2 sadrži sekvencu YASNRYT i CDR3 sadrži sekvencu QQDYSSPYT, i amino-kiselinski ostaci na pozicijama regiona okvira 1, 67 i 87 varijabilnog lakog lanca u skladu sa Kabat šemom numeracije su supstituisani, pri čemu supstituisani ostatak na poziciji regiona okvira 1 je serin (S), supstituisani ostatak na poziciji regiona okvira 67 je tirozin (Y) i supstituisani ostatak na poziciji regiona okvira 87 je fenilalanin (F);

i pri čemu molekul rekombinantnog antitela ili njegov α4-vezujući fragment vezuje VLA-4.

[0007] Predmetni pronalazak i njegovi primeri izvođenja su izloženi u priloženim patentnim zahtevima.

[0008] Pronalazači su otkrili da se regioni okvira varijabilnog regiona germinativne linije mogu upotrebiti za optimalizaciju CDR-graftovanih alfa-4 vezujućih antitela, kao što su anti-VLA-4 antitela. Shodno tome, pronalazak ističe varijabilne teške (VH) i varijabilne lake (VL) lance anti-VLA-4 i molekule antitela koji uključuju takve regione okvira.

[0009] U jednom aspektu, objava ističe VH lanac anti-α4 antitela koji ima CDR iz donorskog anti-α4 antitela, npr. anti-α4 antitela koje je ovde opisano, i region okvira VH koji ima regione 1, 2, 3, i 4 iz sekvence, ili koji ima ne više od 5, 10 ili 15 razlika od sekvence varijabilnog regiona germinativne linije za VH lanac. U jednom primeru izvođenja, varijabilni region okvira 4 (FR4) je humana konsenzus sekvenca. U jednom primeru izvođenja, prisutni su kompletni regioni okvira VH lanca FR1, FR2, FR3 i FR4. U drugom primeru izvođenja, lanac je antigen-vezujući fragment VH regiona.

[0010] U jednom primeru izvođenja, sekvenca germinativne linije je humano IGHV1-f (SEQ ID NO: 2), prikazana na SL. 1. U određenim primerima izvođenja, sekvenca regiona okvira VH može se razlikovati za najmanje jedan, ali ne za više od 2, 3, 4, 5, 10 ili 15 aminokiselinskih ostataka od sekvence germinativne linije, npr. SEQ ID NO: 2. U jednom primeru izvođenja, region okvira VH dodatno uključuje druge nego odgovarajuće humane ostatke. Na primer, VH lanac uključuje ne-humane ostatke, na jednoj ili više pozicija regiona okvira 24, 67, 76, 80 i 94 (Kabat numeracija) SEQ ID NO: 2.

[0011] U jednom primeru izvođenja, najmanje jedan ili više regiona koji određuju komplementarnost (CDR) varijabilnih domena su izvedeni iz donorskog ne-humanog α4-vezujućeg antitela. U jednom primeru izvođenja, antigen-vezujući regioni CDR-graftovanog varijabilnog domena teškog lanca uključuju CDR-ove koji odgovaraju pozicijama 26-34 (CDR1), 50-65 (CDR2) i 95-102 (CDR3) (Kabat numeracija; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., vol. 4, 1991, U.S. Department of Health and Human Services, NIH, SAD).

[0012] Stoga, u jednom primeru izvođenja, region okvira varijabilnog teškog lanca (VH) ima akceptorsku sekvencu izvedenu iz sekvence humanog antitela IGHV1-f germinativne linije.

[0013] U drugom primeru izvođenja, najmanje jedna amino-kiselina, i manje od 2, 3, 4, 5, ili 10 amino-kiselinskih ostataka, u FR1 regionu VH je druga nego odgovarajući ostatak humane germinativne linije. Jedan ili više takvih ostataka mogu, na primer, biti identični regionu okvira ne-humanog antitela iz kog su izvedene CDR sekvence. U jednom primeru izvođenja, amino-kiselinski ostatak na Kabat poziciji 24 mutiran je tako da bude identičan regionu okvira ne-humanog antitela.

[0014] U drugom primeru izvođenja, najmanje jedna amino-kiselina, i manje od 2, 3, 4, 5, ili 10 amino-kiselinskih ostataka, u FR2 regionu VH je druga nego odgovarajući ostatak humane germinativne linije. Jedan ili više takvih ostataka mogu, na primer, biti identični regionu okvira ne-humanog antitela iz kog su izvedene CDR sekvence.

[0015] U još jednom primeru izvođenja, najmanje jedna amino-kiselina, i manje od 2, 3, 4, 5, ili 10 amino-kiselinskih ostataka, u FR3 VH lanca je druga nego odgovarajući ostatak humane germinativne linije. Jedan ili više takvih ostataka mogu, na primer, biti identični regionu okvira ne-humanog antitela iz kog su izvedene CDR sekvence. U jednom primeru izvođenja, amino-kiselinski ostatak na Kabat poziciji 94 identičan je regionu okvira ne-humanog antitela. U još jednom primeru izvođenja, amino-kiselinski ostaci na Kabat pozicijama 67, 76, 80 i 94 identični su regionu okvira ne-humanog antitela.

[0016] U određenim primerima izvođenja, VH lanac antitela ima sekvencu SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, ili SEQ ID NO: 5.

[0017] U jednom aspektu, objava ističe, anti-VLA-4 VL lanac koji ima CDR-ove iz donorskog anti-VLA-4 antitela, npr. anti-VLA-4 antitela koje je ovde opisano, i region okvira VL koji ima regione 1, 2, 3, i 4 iz sekvence, ili koji ima ne više od 5, 10 ili 15 razlika (bilo po/regionu ili ukupno) od sekvence varijabilnog regiona germinativne linije za VL lanac. U jednom primeru izvođenja, varijabilni region okvira 4 (FR4) je humana konsenzus sekvenca. U jednom primeru izvođenja, prisutni su kompletni regioni okvira VL lanca FR1, FR2, FR3 i FR4. U drugom primeru izvođenja, lanac je antigen-vezujući fragment VL regiona.

[0018] U drugom primeru izvođenja, sekvenca germinativne linije je IGKV4-1 (SEQ ID NO: 7), prikazana na SL.2. U još drugim primerima izvođenja, sekvenca regiona okvira VL može se razlikovati za najmanje jedan, ali ne više od 2, 3, 4, 5, 10 ili 15 amino-kiselinskih ostataka od sekvence regiona okvira germinativne linije, npr. SEQ ID NO: 7. U drugom primeru izvođenja, VL dodatno uključuje druge nego odgovarajuće humane amino-kiselinske ostatke. Na primer, VL lanac dodatno uključuje ne-humane ostatke na jednoj ili više pozicija regiona okvira 1, 73, i 87 (Kabat numeracija) SEQ ID NO: 7.

[0019] U jednom primeru izvođenja, sekvenca je AAH7035.1 (SEQ ID NO: 12) ili njena projektovana verzija germinativne linije (SEQ ID NO: 13), prikazana na SL. 2. U nekim primerima izvođenja, sekvenca regiona okvira VL se može razlikovati za najmanje jedan, ali ne više od 5, 10, 15, 20, ili 25 amino-kiselinskih ostataka od sekvence projektovanog regiona okvira germinativne linije, npr. SEQ ID NO: 13. U jednom primeru izvođenja, VL lanac uključuje druge nego odgovarajuće humane ostatke. Na primer, VL lanac uključuje nehumane ostatke na jednoj ili više pozicija regiona okvira 1 i 87 (Kabat numeracija) SEQ ID NO: 12. U drugom primeru izvođenja, VL uključuje amino-kiselinske supstitucije u regionima okvira da liče na različitu sekvencu regiona okvira humane germinativne linije, kao što je ona iz sekvence IGKV4-1 germinativne linije. U određenim primerima izvođenja, sekvenca regiona okvira VL je izmenjena da bude identična sekvenci IGKV4-1 germinativne linije na pozicijama 1-3, 5-23, 35-37, 39-42, 45-49, 57, 59-61, 63-64, 70-72, 74-84, 86-88, 99-106 (Kabat numeracija) SEQ ID NO: 12.

[0020] U jednom primeru izvođenja, najmanje jedan ili više regiona koji određuju komplementarnost (CDR) varijabilnih domena su izvedeni iz donorskog ne-humanog α4-vezujućeg antitela. U drugom primeru izvođenja, antigen-vezujući regioni CDR-graftovanog varijabilnog domena teškog lanca uključuju CDR-ove koji odgovaraju pozicijama 24-31 (CDR1), 50-56 (CDR2) i 89-97 (CDR3) (Kabat numeracija). Stoga, u jednom primeru izvođenja, region okvira VL ima akceptorsku sekvencu konstruisanu iz sekvence IGKV4-1 germinativne linije, iz antitela AAH70335.1 ili iz projektovanog antitela AAH70335.1 germinativne linije.

[0021] U još jednom primeru izvođenja, najmanje jedna amino-kiselina, i manje od 2, 3, 4, 5, 10, ili 15 ostataka, u FR1 VL lanca je druga nego odgovarajući humani ostatak. Jedan ili više takvih ostataka mogu, na primer, biti identični regionu okvira ne-humanog antitela iz kog su izvedene CDR sekvence. U jednom primeru izvođenja, amino-kiselinski ostatak na poziciji N-terminusa FR1 mutiran je tako da bude identičan regionu okvira ne-humanog antitela.

[0022] U drugom primeru izvođenja, najmanje jedna amino-kiselina, i manje od 2, 3, 4, 5, 10, ili 15 ostataka, u FR2 VL lanca se raylikuje od odgovarajućeg humanog ostatka. Jedan ili više takvih ostataka mogu, na primer, biti identični regionu okvira ne-humanog antitela iz kog su izvedene CDR sekvence.

[0023] U još jednom primeru izvođenja, najmanje jedna amino-kiselina, i manje od 2, 3, 4, 5, 10, ili 15 ostataka, u FR3 VL je druga nego odgovarajući humani ostatak. Jedan ili više takvih ostataka mogu, na primer, biti identični regionu okvira ne-humanog antitela iz kog su izvedene CDR sekvence. U drugom primeru izvođenja, amino-kiselinski ostatak na Kabat poziciji 87 mutiran je tako da je identičan regionu okvira ne-humanog antitela. U još jednom primeru izvođenja, amino-kiselinski ostaci na Kabat pozicijama 67 i 87 mutirani su tako da budu identični sekvenci regiona okvira ne-humanog antitela. U još jednom primeru izvođenja, amino-kiselinski ostaci na Kabat pozicijama 67, 73, i 87 SEQ ID NO: 7 mutirani su tako da budu identični sekvenci regiona okvira ne-humanog antitela.

[0024] U drugim primerima izvođenja, VL lanac antitela ima sekvencu SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, ili SEQ ID NO: 11.

[0025] U jednom primeru izvođenja, CDR-ovi akceptorskih sekvenci regiona okvira VH i VL su odabrani da liče na CDR sekvence ne-humanog (npr. murinskog) antitela, gde ne-humano antitelo vezuje integrin alfa-4 ili njegov fragment. U drugom primeru izvođenja, sekvence CDR-ova su odabrane da liče na sekvence CDR-ova ne-humanog antitela koje vezuje B1 epitop VLA-4α4 lanca. U jednom primeru izvođenja, CDR-ovi su odabrani da liče na murinsko monoklonalno antitelo, npr. HP1/2, HP2/1, HP2/4, L25, P4C2, ili 21.6 (Pulido et al., J. Biol. Chem. 266:10241-10245. 1991; S.A.D. patent br. 6,033,665). Modifikacija može značiti, npr. isecanje i insertovanje ili izmenu, npr. pomoću usmerene mutageneze.

[0026] U drugom aspektu, objava ističe antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, uključujući:

- anti-VLA-4 VL lanac koji je ovde opisan, npr. anti-VLA-4 VL lanac koji ima CDR iz donorskog anti-VLA-4 antitela, npr. anti-VLA-4 antitela koje je ovde opisano, i region okvira VL koji ima regione okvira LC 1, 2 i 3 iz sekvence, ili koji ima ne više od 5, 10, ili 15 razlika od sekvence varijabilnog regiona germinativne linije za VL lanac. U jednom primeru izvođenja, varijabilni region 4 je humana konsenzus sekvenca; i - anti-VLA-4 VH lanac koji je ovde opisan, npr. anti-VLA-4 VL lanac koji ima CDR iz donorskog anti-VLA-4 antitela, npr. anti-VLA-4 antitela koje je ovde opisano, i region okvira VL koji ima regione okvira LC 1, 2 i 3 iz sekvence, ili koji ima ne više od 5, 10 ili 15 razlika od sekvence varijabilnog regiona germinativne linije za VL lanac. U jednom primeru izvođenja, varijabilni region 4 je humana konsenzus sekvenca.

[0027] U jednom primeru izvođenja, antitelo vezuje jedno ili oba od α4β1 i α4β7.

[0028] U drugom aspektu, VL ili VH lanac, ili antitelo, ili njegov fragment, koji su ovde opisani su detektabilno obeleženi.

[0029] U još jednom aspektu, objava ističe vektor koji sadrži DNK koja kodira teški lanac antitela, ili njegov α4 vezujući fragment, koji su ovde opisani. U nekim primerima izvođenja, DNK vektora kodira VH koji ima sekvencu SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, ili SEQ ID NO: 5.

[0030] U još jednom aspektu, objava ističe vektor koji sadrži DNK koja kodira laki lanac antitela, ili njegov α4 vezujući fragment, koji su ovde opisani. U nekim primerima izvođenja, DNK vektora kodira VL lanac koji ima sekvencu SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 ili SEQ ID NO: 11.

[0031] U još jednom aspektu, objava ističe vektor koji sadrži DNK koja kodira teški lanac antitela, ili njegov α4 vezujući fragment, koji su ovde opisani i laki lanac antitela, ili njegov α4 vezujući fragment, koji su ovde opisani.

[0032] U drugom aspektu, objava ističe ćeliju domaćina koja sadrži vektor koji je ovde opisan, tj. sposobnu da eksprimira teški i/ili laki lanac antitela ili fragment antitela koji su ovde opisani.

[0033] U jednom aspektu, objava ističe postupak pravljenja rekombinantnog anti-α4 antitela, ili njegovog α4-vezujućeg fragmenta, obezbeđivanjem ćelije domaćina transfektovane sa (a) DNK sekvencom koja kodira teški lanac antitela koje je ovde opisano, ili njegov α4-vezujući fragment, i (b) DNK sekvencom koja kodira laki lanac antitela, ili njegov α4-vezujući fragment, i uzgajanje transfektovane ćelije kako bi se proizveo rekombinantni molekul anti-α4 antitela ili njegov α4-vezujući fragment. DNK koja kodira teške i lake lance antitela može se proizvesti na istom vektoru ili na različitim vektorima.

[0034] U jednom aspektu, objava ističe postupak pravljenja rekombinantnog anti-α4 antitela ili njegovog α4-vezujućeg fragmenta, obezbeđivanjem ćelije domaćina transfektovane sa (a) DNK sekvencom koja kodira teški lanac antitela, ili njegov α4-vezujući fragment, npr. gde DNK sekvenca ima sekvencu SEQ ID NO: 3, 4, ili 5, i (b) DNK sekvencom koja kodira laki lanac antitela, ili njegov α4-vezujući fragment, npr. pri čemu DNK sekvenca ima sekvencu SEQ ID NO: 8, 9, 10, ili 11, i uzgajanje transfektovane ćelijske linije kako bi se proizveo rekombinantni molekul anti-α4 antitela ili njegov α4-vezujući fragment. DNK koja kodira teške i lake lance antitela može se proizvesti na istom vektoru ili na različitim vektorima.

[0035] U drugom aspektu, objava ističe postupak lečenja bolesti ili poremećaja posredovanih α4 integrinom, npr. α4β1 (VLA-4) ili α4β7 integrinom, primenom α4 antitela ili fragmenta antitela koji su ovde opisani, ili farmaceutske kompozicije koja sadrži antitelo ili fragment, subjektu kome je potrebno takvo lečenje. Subjekt može imati ili biti u riziku od razvoja, na primer, inflamatornih, imunskih, ili autoimunskih poremećaja (npr. inflamacije centralnog nervnog sistema, kao što su multipla skleroza, meningitis, neuromijelitis optika, neurosarkoidoza, vaskulitis CNS, encefalitis, i transverzalni mijelitis), odbacivanja graftova tkiva ili organa ili bolest graft-protiv-domaćina, akutne povrede CNS, kao što su moždani udar, traumatična povreda mozga (TBI), ili povreda kičmene moždine (SCI); hronične bolesti bubrega; alergije, npr. alergijska astma; dijabetes melitus tipa 1; inflamatornih poremećaja creva, kao što su Kronova (Crohn) bolest, ulcerozni kolitis; mijastenije gravis; fibromijalgije; artritičnih poremećaja, kao što su reumatoidni artritis, psorijatični artritis; inflamatornih/imunskih poremećaja kože, kao što su psorijaza, vitiligo, dermatitis, lichen planus; sistemskog eritemskog lupusa; Sjogrenovog sindroma; hematoloških kancera, kao što su multipli mijelom, leukemija, limfom; čvrstih kancera, kao što su sarkomi ili karcinomi, npr. pluća, dojke, prostate, mozga; i fibrotičkih poremećaja, kao što su pulmonarna fibroza, mijelofibroza, ciroza jetra, mezangijalni proliferativni glomerulonefritis, polumesečasti glomerulonefritis, dijabetička nefropatija, i renalna intersticijalna fibroza.

[0036] U drugom aspektu, objava ističe postupak lečenja pacijenta primenom pacijentu α4-vezujućeg antitela ili fragmenta antitela. U jednom primeru izvođenja, pacijent ima kancer, kao što je čvrsti tumor ili hematološki malignitet. Na primer, pacijent lečen α4-vezujućim antitelom ili fragmentom antitela može imati akutnu mijelogenu leukemiju (AML) ili multipli mijelom (MM).

[0037] U drugom primeru izvođenja, pacijent ima inflamatorni poremećaj, kao što su multipla skleroza, astma (npr. umerena do teška astma), reumatoidni artritis, dijabetes, ili Kronova bolest. U drugom primeru izvođenja, kompozicija se primenjuje kao režim. U još jednom primeru izvođenja, postupak dodatno uključuje odabir pacijenta pogodnog za lečenje kompozicijom. Pacijent pogodan za lečenje, na primer, pokazao je znak ili simptom pokazatelj nastanka bolesti, kao što je znak ili simptom koji ukazuje na MS.

[0038] U još jednom primeru izvođenja, postupak dodatno uključuje primenu pacijentu drugog terapijskog agensa, kao što su, hemioterapijski agens, trombolitički agens, neuroprotektivni agens, anti-inflamatorni agens, steroid, citokin, ili faktor rasta.

[0039] U jednom primeru izvođenja, pacijentu se primenuje humanizovano anti-VLA-4 antitelo, ili njegov fragment, koji su ovde opisani, kao što su HuHP1/2, H1L1, H1L2 ili H1L3.

[0040] U jednom primeru izvođenja, kompozicija koja sadrži α4-vezujuće antitelo primenjuje se kao režim, kao što je u regularnim intervalima. Na primer, kompozicija se može primenjivati jednom dnevno, nedeljno ili mesečno; jednom nedeljno, dva puta nedeljno, tri puta nedeljno, četiri puta nedeljno ili više; ili jednom svake dve nedelje, jednom svake tri nedelje, jednom svake četiri nedelje ili više.

[0041] U jednom primeru izvođenja, doziranje se može podesiti u skladu sa pacijentovom stopom klirensa prethodne primene anti-α4 antitela. Na primer, u jednom primeru izvođenja, pacijentu neće biti primenjena druga ili prateća (follow-on) doza pre nego što se nivo anti-α4 antitela u pacijentovom sistemu ne spusti ispod unapred određenog nivoa. U jednom primeru izvođenja, uzorak od pacijenta (npr. uzorak plazme, seruma, krvi ili urina) se testira na prisustvo anti-α4 antitela, i ukoliko je nivo anti-α4 antitela iznad unapred određenog nivoa, pacijentu neće biti primenjena druga ili prateća doza. Ukoliko je nivo anti-α4 antitela u pacijentovom sistemu ispod unapred određenog nivoa, onda se pacijentu primenjuje druga ili prateća doza.

[0042] U jednom primeru izvođenja, kompozicija se primenjuje kontinuirano, npr. tokom perioda dužeg od 30 minuta ali kraćeg od 1, 2, 4, ili 12 sati. Kompozicija koja sadrži antitelo i drugi agens može se primenjivati bilo kojim odgovarajućim postupkom, npr. subkutano, intramuskularno, ili intravenski.

[0043] U nekim primerima izvođenja, svako od antitela i drugog agensa se primenjuje u istoj dozi u kojoj je svako prepisano za monoterapiju. U drugim primerima izvođenja, antitelo se primenjuje u dozi koja je jednaka ili manja od količine potrebne za efikasnost ukoliko se primenjuje samo. Slično tome, drugi agens se može primenjivati u dozi koja je jednaka ili manja od količine koja je potrebna za efikasnost ukoliko se primenjuje sam.

[0044] Drugi aspekt istaknut u objavi je postupak procene pacijenta određivanjem da li pacijent ispunjava unapred odabrani kriterijum, i ukoliko pacijent ispunjava unapred odabrani kriterijum odobravajući, obezbeđujući, prepisujući, ili primenjujući formulaciju VLA-4 vezujućeg antitela koja je ovde opisana pacijentu. U jednom primeru izvođenja, unapred odabrani kriterijum je neuspeh pacijenta da adekvatno odgovori na prethodno drugačije terapijsko lečenje ili režim, npr. za lečenje MS. U drugom primeru izvođenja, unapred odabrani kriterijum je odsustvo bilo kojih znakova ili simptoma progresivne multifokalne leukoencefalopatije (PML), ili odsustvo bilo kakve dijagnoze PML. U nekim slučajevima, odabir se zasniva na odsustvu faktora rizika za PML, na primer, subjekt nije testiran pozitivno na DNK JC virusa ili nije testiran pozitivno na antitela na JC virus. U drugom primeru izvođenja, kriterijum je kao što je opisano u PCT/US07/75577 (objavljeno kao WO2008/021954) koji opisuje postupke i sisteme za distribuciju leka i obezbeđivanje lekova pacijentima.

[0045] U drugom aspektu, obezbeđen je postupak distribucije kompozicije koja je ovde opisana. Kompozicija sadrži alfa-4 vezujuće antitelo. Postupak uključuje obezbeđivanje primaocu (npr. krajnjem korisniku, pacijentu, lekaru, maloprodajnoj ili veleprodajnoj apoteci, distributeru, ili apoteci u bolnici, gerijatrijskoj klinici ili HMO) pakovanja koje sadrži dovoljne jedinične doze leka za lečenje pacijenta tokom najmanje 6, 12, 24, 36 ili 48 meseci. U drugom aspektu, objava ističe postupak procene kvaliteta pakovanja ili partije pakovanja (npr. da bi se odredilo da li je rok upotrebe istekao) kompozicije koja je ovde opisana koja sadrži alfa-4 vezujuće antitelo. Postupak uključuje procenu da li je rok upotrebe pakovanja istekao. Rok upotrebe je najmanje 6, 12, 24, 36, ili 48 meseci, npr. više od 24 ili 36 meseci, od unapred odabranog događaja, kao što su proizvodnja, testiranje, ili pakovanje. U nekim primerima izvođenja, odluka ili korak se preduzima kao rezultat analize. Na primer, u zavisnosti od ispravne analize, antitelo u pakovanju se upotrebljava ili odbacuje, klasifikuje, odabira, pušta ili zadržava, otprema, premešta na novu lokaciju, pušta u prodaju, prodaje, ili nudi na prodaju, povlači iz prodaje ili više ne nudi na prodaju, u zavisnosti da li je rok upotrebe proizvoda istekao.

[0046] U drugom aspektu, objava ističe pakovanje koje sadrži najmanje dve jedinične doze vodene kompozicije koja sadrži α4 vezujuće antitelo. U jednom primeru izvođenja, sve jedinične doze sadrže istu količinu antitela, i u drugim primerima izvođenja postoje jedinične doze sa dve ili više jačina, ili dve ili više različitih formulacija, npr. koje imaju različite jačine ili svojstva oslobađanja.

[0047] U drugom aspektu, objava uključuje postupak davanja uputstava primaocu o primeni formulacije koja sadrži α4 vezujuće antitelo. Postupak uključuje davanje uputstava primaocu (npr. krajnjem korisniku, pacijentu, lekaru, maloprodajnoj ili veleprodajnoj apoteci,

1

distributeru, ili apoteci u bolnici, gerijatrijskoj klinici ili HMO) da antitelo treba primeniti pacijentu u skladu sa režimom koji je ovde opisan. Postupak takođe može da uključuje davanje uputstava primaocu da antitelo treba primeniti pre isteka roka upotrebe. Datum isteka roka upotrebe je najmanje 6, 12, 24, 36, ili 48 meseci, npr. više od 24 ili 36 meseci, od unapred odabranog događaja, kao što su proizvodnja, testiranje, ili pakovanje. U jednom primeru izvođenja, primalac takođe dobija zalihu antitela, npr. zalihu jediničnih doza antitela.

[0048] U drugom aspektu, objava ističe postupak pravljenja antitela koje uključuje CDR-ove iz donorskog antitela, kao što je ne-humano, npr. murinsko antitelo, i jedan ili oba regiona okvira varijabilnog regiona teškog i lakog lanca izvedena iz jednog ili više regiona okvira varijabilnog regiona humane germinativne linije. Postupak uključuje jedan ili oba od 1 i 2, gde su 1 i 2 kao što sledi:

1. identifikovanje ili odabir stabilnog humanog akceptorskog regiona okvira varijabilnog teškog lanca koji ima iste ostatke kao ne-humani donorski teški lanac na jednom ili više ostataka u jednom ili više od a), b) i c):

a) VH Kabat # 2, 4, 24, 26, 27, 29, 36, 38, 46, 47, 48, 49, 66, 67, 69, 71, 78, 93, i 94, za koje se, bez vezivanja teorijom, veruje da su važni za održavanje konformacija CDR;

b) VH Kabat # 1, 2, 27, 28, 30, 43, 66, 68, 70, 72, 73, 74, i 75, za koje se, bez vezivanja teorijom, veruje da mogu interagovati sa antigenom; i

c) VH Kabat # 37, 39, 44, 45, 47, 91, 93 i 103, za koje se, bez vezivanja teorijom, veruje da su važni za integritet VH/VL interfejsa; i

2. identifikovanje ili odabir stabilnog akceptorskog regiona okvira varijabilnog lakog lanca koji ima iste ostatke kao donorski laki lanac na jednom ili više ostataka u jednom ili više od a), b) i c):

a) VL Kabat # 2, 4, 38, 43, 44, 48, 58, 64, 71, i 73, za koje se bez vezivanja teorijom, veruje da su važni za održavanje konformacija CDR;

b) VL Kabat # 1, 2, 49, 57, 60, 63, 65, 66, 67, 68, 69, i 70, za koje se bez vezivanja teorijom, veruje da potencijalno mogu interagovati sa antigenom; i c) VL Kabat # 36, 38, 43, 44, 46, 49, 87, i 98, za koje se bez vezivanja teorijom, veruje da su važni za integritet VH/VL interfejsa;

3. obezbeđivanje varijabilnog regiona koji ima donorske CDR i regiona okvira odabrane germinativne linije koji ima podudarne ostatke identifikovane u 1 ili 2, kao što je odabirom sekvence germinativne linije i daljim bekmutiranjem dodatnih ostataka identifikovanih u 1 ili 2 od germinativne linije do murinske sekvence tako da se dalje maksimalizuje podudaranje na ostacima identifikovanim u 1 i 2; i

4. procenjivanje svake podudarne pozicije, kao što je putem 3D strukturne analize ili modelovanja, i ukoliko pozicija zadovoljava unapred određen standard za rizik od, na primer, interferiranja sa CDR konformacijama, antigenskih interakcija ili integriteta VH/VL interfejsa, onda reintrodukovanje ekvivalentnog murinskog ostatka, ili ostatka uobičajenog humanog antitela, kompatibilnog sa strukturom antitela.

[0049] U jednom primeru izvođenja, najmanje 3, 4 ili 5 ostataka identifikovanih u (1.a) su podudarni. Na primer, u jednom primeru izvođenja, ostaci 24, 29, ili 94 su podudarni.

[0050] U jednom primeru izvođenja, najmanje 3, 4 ili 5 ostataka identifikovanih u (1.b) su podudarni. Na primer, u jednom primeru izvođenja, ostaci 1, 73, ili 75 su podudarni.

[0051] U jednom primeru izvođenja, najmanje 3, 4 ili 5 ostataka identifikovanih u (1.c) su podudarni. Na primer, u jednom primeru izvođenja, ostaci 37, 93, ili 103 su podudarni.

[0052] U jednom primeru izvođenja, najmanje 3, 4 ili 5 ostataka identifikovanih u (2.a) su podudarni. Na primer, u jednom primeru izvođenja, ostaci 2, 71 i 73 su podudarni.

[0053] U jednom primeru izvođenja, najmanje 3, 4 ili 5 ostataka identifikovanih u (2.b) su podudarni. Na primer, u jednom primeru izvođenja, ostaci 1, 68, ili 70 su podudarni.

[0054] U jednom primeru izvođenja, najmanje 3, 4 ili 5 ostataka identifikovanih u (2.c) su podudarni. Na primer, u jednom primeru izvođenja, ostaci 46, 87, ili 98 su podudarni.

[0055] U jednom primeru izvođenja, ostatak 6 u (1.a), ostatak 2 u (1.b), i ostatak 4 u (1.c) su podudarni.

[0056] U jednom primeru izvođenja, ostatak 4 u (2.a), ostatak 2 u (2.b), i ostatak 4 u (2.c) su podudarni.

[0057] U jednom primeru izvođenja, sekvenca teškog lanca germinativne linije je iz VH3, VH1 i VH5 klase germinativne linije. U drugom primeru izvođenja, sekvenca lakog lanca germinativne linije je Vkapa ili Vlambda sekvenca.

[0058] Termin "lečenje" označava primenu terapije u količini, na način, i/ili modus efikasan za poboljšanje stanja, simptoma, ili parametra povezanog sa poremećajem ili za sprečavanje napredovanja poremećaja, bilo za statistički značajan stepen ili stepen koji može detektovati stručnjak u oblasti. Efikasna količina, način, ili modus može varirati zavisno o subjektu i može se prilagoditi subjektu.

[0059] "α4 vezujuće antitelo" označava antitelo koje se vezuje za α4 podjedinicu VLA-4 (α4β1) integrina, i najmanje delimično inhibira aktivnost VLA-4, posebno aktivnost vezivanja VLA-4 integrina ili aktivnost signalizacije, npr. sposobnost transdukcije VLA-4 posredovanog signala. Na primer, VLA-4 vezujuće antitelo može inhibirati vezivanje VLA-4 za srodan ligand VLA-4, npr. protein ćelijske površine kao što je VCAM-1 (vaskularni ćelijski adhezivni molekul-1), ili za komponentu vanćelijskog matriksa, kao što je fibronektin ili osteopontin. Alfa-4 vezujuće antitelo može se vezati za oba α4β1 ili α4β7. Tipično, antitelo se vezuje za B1 epitop α4. α4 vezujuće antitelo može se vezati za VLA-4 sa Kdod manje od oko 10<-6>, 10<-7>, 10<-8>, 10<-9>, 10<-10>, ili 10<-11>M.

[0060] Kako se ovde upotrebljava, termin "antitelo" označava protein koji uključuje najmanje jedan varijabilni region imunoglobulina, npr. amino-kiselinsku sekvencu koja obezbeđuje varijabilni domen imunoglobulina ili sekvencu varijabilnog domena imunoglobulina. Na primer, antitelo može uključivati varijabilni region teškog (H) lanca (ovde skraćeno kao VH), i varijabilni region lakog (L) lanca (ovde skraćeno kao VL). U drugom primeru, antitelo uključuje varijabilne regione dva teška (H) lanca i varijabilne regione dva laka (L) lanca. Laki lanci imunoglobulina mogu biti tipa kapa ili lambda. U jednom primeru izvođenja, antitelo je glikozilovano. Antitelo može biti funkcionalno za citotoksičnost zavisnu od antitela i/ili citotoksičnost posredovanu komplementom, ili može biti nefunkcionalno za jednu ili obe ove aktivnosti.

[0061] VH i VL regioni se mogu dodatno podeliti u regione hipervarijabilnosti, koji su nazvani "regioni koji određuju komplementarnost" ("CDR"), koji su ispresecani sa regionima koji su više konzervirani, koji su nazvani "regioni okvira" (FR). Obim FR i CDR je precizno definisan (videti, Kabat, E.A., et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No.91-3242; i Chothia, C. et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917). Ovde se upotrebljavaju Kabat definicije. Svaki VH i VL su tipično sačinjeni od tri CDR i četiri FR, raspoređenih od aminoterminusa do karboksi-terminusa u sledećem redosledu: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.

[0062] "Domen imunoglobulina" označava domen iz varijabilnog ili konstantnog domena molekula imunoglobulina. Domeni imunoglobulina tipično sadrže dve β-ploče formirane od oko sedam β-lanaca, i konzerviranu disulfidnu vezu (videti npr. A. F. Williams i A. N. Barclay (1988), Ann. Rev. Immunol.6:381-405).

1

[0063] Kako se ovde upotrebljava, "sekvenca varijabilnog domena imunoglobulina" označava amino-kiselinsku sekvencu koja može formirati strukturu varijabilnog domena imunoglobulina. Na primer, sekvenca može uključivati celu ili deo amino-kiselinske sekvence varijabilnog domena koja se javlja u prirodi. Na primer, sekvenca može izostaviti jednu, dve ili više N- ili C-terminusne amino-kiseline, unutrašnje amino-kiseline, može uključivati jedno ili više insertovanja ili dodatne terminusne amino-kiseline, ili može uključivati druge izmene. U jednom primeru izvođenja, polipeptid koji uključuje sekvencu varijabilnog domena imunoglobulina se može povezati sa drugom sekvencom varijabilnog domena imunoglobulina da bi se formirala struktura za vezivanje cilja (ili "antigen-vezujuće mesto"), npr. struktura koja interaguje sa VLA-4.

[0064] VH ili VL lanac antitela može dodatno uključivati ceo ili deo konstantnog regiona teškog ili lakog lanca, da na taj način formira teški ili laki lanac imunoglobulina, respektivno. U jednom primeru izvođenja, antitelo je tetramer od dva teška lanca imunoglobulina i dva laka lanca imunoglobulina. Teški i laki lanci imunoglobulina mogu biti povezani disulfidnim vezama. Konstantni region teškog lanca tipično uključuje tri konstantna domena, CH1, CH2 i CH3. Konstantni region lakog lanca tipično uključuje CL domen. Varijabilni region teških i lakih lanaca sadrži vezujući domen koji interaguje sa antigenom. Konstantni regioni antitela tipično posreduju u vezivanju antitela za tkiva ili faktore domaćina, uključujući različite ćelije imunskog sistema (npr. efektorske ćelije) i prvu komponentu (Clq) klasičnog sistema komplementa.

[0065] Termin "imunoglobulin" sadrži različite široke klase polipeptida koji se mogu biohemijski razlikovati. Stručnjaci u ovoj oblasti će uvideti da su teški lanci klasifikovani kao gama, mu, alfa, delta ili epsilon (γ, μ, α, δ, ε), sa nekim potklasama (npr. γ1- γ4). Priroda ovog lanca određuje "klasu" antitela kao IgG, IgM, IgA IgD, ili IgE, respektivno. Potklase imunoglobulina (izotipovi) npr. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, itd. su dobro okarakterisani i poznato je da daju funkcionalnu specijalizaciju. Iskusnom stručnjaku je lako da uoči modifikovane verzije svake od ovih klasa i izotipova u pogledu trenutne objave i u skladu sa tim su unutar obima trenutnog pronalaska. Sve klase imunoglobulina su očigledno unutar obima predmetnog pronalaska. Laki lanci su klasifikovani ili kao kapa ili lambda (κ, λ). Svaka klasa teškog lanca može biti vezana bilo sa kapa ili lambda lakim lancem.

[0066] Termin "antigen-vezujući fragment" antitela pune dužine označava jedan ili više fragmenata antitela pune dužine koji zadržavaju sposobnost da se specifično vežu za cilj od interesa, npr. VLA-4. Primeri vezujućih fragmenata obuhvaćeni unutar termina "antigenvezujući fragment" antitela pune dužine uključuju (i) Fab fragment, monovalentni fragment koji se sastoji od VL, VH, CL i CH1 domena; (ii) F(abꞌ)2fragment, bivalentni fragment koji uključuje dva Fab fragmenta povezana disulfidnim mostom u regionu zgloba; (iii) Fd fragment koji se sastoji od VH i CH1 domena; (iv) Fv fragment koji se sastoji od VL i VH domena jedne grane antitela, (v) dAb fragment (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), koji se sastoji od VH domena; i (vi) izolovani region koji određuje komplementarnost (CDR) koji zadržava funkcionalnost. Osim toga, iako su dva domena Fv fragmenta, VL i VH, kodirana odvojenim genima, oni se mogu spojiti, upotrebom rekombinantnih postupaka, sintetičkim linkerom koji im omogućava da budu napravljeni kao jedan proteinski lanac u kom se VL i VH regioni udružuju da bi formirali monovalentne molekule poznate kao jednostruki lanac Fv (scFv). Videti npr. Bird et al. (1988) Science 242:423-426; i Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883.

[0067] U nekim primerima izvođenja, gore opisana antitela su pegilovana.

[0068] U nekim primerima izvođenja, gore opisana antitela ili njihovi fragmenti su multispecifični. U dodatnim primerima izvođenja, gore opisana antitela ili njihovi fragmenti su monovalentni ili bispecifični.

[0069] Detalji jednog ili više primera izvođenja pronalaska izneti su na pratećim crtežima i u opisu ispod. Ostale odlike, ciljevi, i prednosti pronalaska biće očigledni iz opisa i crteža, i iz patentnih zahteva.

KRATAK OPIS CRTEŽA

[0070]

SL. 1 prikazuje tri varijante sekvence teškog lanca HP1/2 u odnosu na humani teški IGHV1-f germinativne linije. Mala slova iznad sekvence predstavljaju insertovanja u skladu sa Kabat šemom numeracije.

SL. 2 prikazuje četiri varijante sekvence lakog lanca HP1/2 u odnosu na sekvencu IGKV4-1 antitela germinativne linije (Dizajn L0, L1, i L2) ili sekvencu humanog kapa projektovanog AAH7033.1 antitela germinativne linije (Dizajn L3). Mala slova iznad sekvence predstavljaju insertovanja u skladu sa Kabat šemom numeracije.

SL. 3 je grafikon koji prikazuje rezultate ELISA testova.

SL. 4 je grafikon koji prikazuje rezultate ELISA testova.

1

SL. 5 je amino-kiselinska sekvenca IgG4 Fc (zglob CH2 CH3 domen). Region zgloba je prikazan podebljano, i CH3 domen je podvučen. Uokvireno "S" je Ser228. Zaokruženo "N" je Asn297.

SL. 6 je grafikon koji prikazuje podatke protočne citometrije vezivanja HuHP1/2 za različite ćelijske linije tumora. "HP1/2" označava humanizovano HP1/2.

SL. 7A-7C je panel grafikona koji prikazuju inhibiciju vezivanja AML ćelijskih linija za bunariće obložene sa fibronektinom ili VCAM1-Ig od strane HuHP1/2. SL. 7A prikazuje inhibiciju vezivanja HL60 i KG1 ćelija za bunariće obložene sa FN. SL. 7B prikazuje inhibiciju vezivanja KG1 ćelija za bunariće obložene sa VCAM1-Ig. SL. 7C prikazuje inhibiciju vezivanja HL60 ćelija za bunariće obložene sa FN i VCAM1-Ig kada se inkubiraju sa 20 μg/mL HuHP1/2 (ispunjeni barovi). Neispunjeni barovi ukazuju na procenat ćelijske adhezije u prisustvu izotipske kontrole. "HP1/2" označava humanizovano HP1/2.

SL. 8A-8C čine panel grafikona koji prikazuju inhibiciju vezivanja MM ćelijskih linija za bunariće obložene sa fibronektinom ili VCAM1-Ig od strane HuHP1/2. SL. 8A prikazuje inhibiciju vezivanja U266 i H929 ćelija za bunariće obložene sa FN. SL. 8B prikazuje inhibiciju vezivanja U266 i H929 ćelija za bunariće obložene sa VCAM1-Ig. SL. 8C prikazuje inhibiciju vezivanja U266 ćelija za bunariće obložene sa FN- i VCAM1-Ig kada se inkubiraju sa 20 μg/mL HuHP1/2 (ispunjeni barovi). Neispunjeni barovi ukazuju na procenat ćelijske adhezije u prisustvu izotipske kontrole. "HP1/2" označava humanizovano HP1/2.

SL. 9A-9C čini panel grafikona koji prikazuju inhibiciju vezivanja CLL ćelijskih linija za bunariće obložene sa fibronektinom ili VCAM1-Ig od strane HuHP1/2. SL. 9A prikazuje inhibiciju vezivanja Mec1 i JM1 ćelija za bunariće obložene sa FN. SL. 9B prikazuje inhibiciju vezivanja Mec1 i JM1 ćelija za bunariće obložene sa VCAM1-Ig. SL. 9C prikazuje inhibiciju vezivanje Mec1 ćelija za bunariće obložene sa FN- i VCAM1-Ig kada se inkubiraju sa 20 μg/mL HuHP1/2 (ispunjeni barovi). Neispunjeni barovi ukazuju na procenat ćelijske adhezije u prisustvu izotipske kontrole. "HP1/2" označava humanizovano HP1/2.

DETALJAN OPIS

[0071] Za antitela prema VLA-4 se pokazalo da su korisna u lečenju bolesti. Na primer, natalizumab (Tysabri<®>), anti-VLA-4 antitelo se upotrebljava za lečenje relapsirajuće multiple

1

skleroze i Kronove bolesti. Međutim, za lečenje određenih stanja, na primer akutnih stanja kao što su povreda kičmene moždine (SCI) ili traumatična povreda mozga (TBI), ili lečenja koja se primenjuju u ograničenom broju kao što je lečenje kancera, može biti povoljno da se leči anti-VLA-4 antitelom koje se vezuje sa afinitetom različitim od natalizumaba, npr. višim afinitetom. Dodatno, lečenje anti-VLA-4 antitelima povezano je sa retkim ali ponekad fatalnim poremećajem, progresivnom multifokalnom leukoencefalopatijom (PML), za koji deo lečenja zahteva uklanjanje antitela iz lečenog subjekta, na primer upotrebom izmene plazme ili imunoapsorpcijom. Zbog potrebe za uklanjanjem antitela, takođe je poželjno izbalansirati prednosti antitela koje ima povećani afinitet za VLA-4 sa nedostatkom antitela koje se vezuje tako čvrsto da otežava uklanjanje ili stvara rizik povezan sa sporom stopom obrta. Takva antitela takođe mogu biti korisna za lečenje stanja kao što je multipla skleroza po tome što može biti potrebno manje učestalo lečenje ili primena na druge načine osim infuzije može biti efikasnija. Omogućavanje lečenja sa nižim dozama takođe može smanjiti rizik od neželjenih događaja kao što je PML. U skladu sa tim, predmetni pronalazak obezbeđuje antitela koja imaju takva poželjna svojstva.

[0072] Pronalazak se zasniva najmanje delom na neočekivanim karakteristikama novih dizajniranih humanizovanih α4-vezujućih antitela koja imaju afinitet vezivanja za α4 koji je 10 puta veći od onog anti-α4 antitela natalizumaba.

[0073] Alfa-4 vezujuća antitela, i njihovi fragmenti, obezbeđeni su tamo gde regioni okvira varijabilnog lakog lanca (VL) i varijabilnog teškog lanca (VH) imaju akceptorske sekvence konstruisane iz antitela germinativne linije ili sekvenci projektovanog antitela germinativne linije, kao što su IGKV4-1 ili geAAH70335.1 ili IGHV1-f antitela. CDR sekvence su izvedene iz ne-humanih anti-α4 vezujućih antitela kao što je anti-VLA-4 antitelo HP1/2. Antitela koja su ovde opisana mogu imati povećanje afiniteta od najmanje 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, puta npr. u odnosu na svog murinskog roditelja. U jednom primeru izvođenja, povećanje afiniteta je najmanje 1,5, 2,0, 2,5, 3,0 puta ali je respektivno, manje od 25, 20, ili 15 puta.

Farmaceutske kompozicije

[0074] α4 vezujući agens, kao što je VLA-4 vezujuće antitelo, se može formulisati kao farmaceutska kompozicija. Tipično, farmaceutska kompozicija uključuje farmaceutski prihvatljiv nosač. Kako se ovde upotrebljava, "farmaceutski prihvatljiv nosač" uključuje bilo koji i sve rastvarače, disperzione medijume, oblažuće materije, antibakterijske i antifungalne

1

agense, izotonične agense i agense za odlaganje apsorpcije, i slične koji su fiziološki kompatibilni.

[0075] "Farmaceutski prihvatljiva so" označava so koja zadržava željenu biološku aktivnost roditeljskog jedinjenja i ne daje nikakve neželjene toksikološke efekte (videti npr. Berge, S.M. et al., (1977), J. Pharm. Sci.66:1-19). Primeri takvih soli uključuju kisele adicione soli i bazne adicione soli. Kisele adicione soli uključuju one koje su izvedene iz netoksičnih neorganskih kiselina, kao što su hlorovodonična, azotna, fosforna, sumporna, bromovodonična, hidrojodna, i slične, kao i iz netoksičnih organskih kiselina kao što su alifatične mono- i dikarboksilne kiseline, fenil-supstituisane alkanoične kiseline, hidroksi alkanoične kiseline, aromatične kiseline, alifatične i aromatične sulfonske kiseline i slične. Bazne adicione soli uključuju one koje su izvedene iz zemnoalkalnih metala, kao što su natrijum, kalijum, magnezijum, kalcijum i slični, kao i iz netoksičnih organskih amina, kao što su N,N'-dibenziletilendiamin, N-metilglukamin, hloroprokain, holin, dietanolamin, etilendiamin, prokain i slični.

[0076] Kompozicije antitela koje su ovde opisane mogu se formulisati u skladu sa postupcima poznatim u struci. Farmaceutska formulacija je dobro uspostavljena struka, i dodatno je opisana u Gennaro (ed.), Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th ed., Lippincott, Williams & Wilkins (2000) (ISBN: 0683306472); Ansel et al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 7th Ed.., Lippincott Williams & Wilkins Publishers (1999) (ISBN: 0683305727); i Kibbe (ed.), Handbook of Pharmaceutical Excipients American Pharmaceutical Association, 3rd ed. (2000) (ISBN: 091733096X).

[0077] U jednom primeru izvođenja, α4 antitelo se može formulisati sa ekscipijentnim materijama, kao što su natrijum hlorid, natrijum dibazični fosfat heptahidrat, natrijum monobazični fosfat, i polisorbat 80. U još jednom primeru izvođenja, α4 antitelo se može formulisati u citratnom puferu, npr. na pH 5, 5,5, 6, 6,5, 7, ili 7,5. U još jednom primeru izvođenja, α4 antitelo se može formulisati u rastvoru koji uključuje 2, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 14, ili 15% saharoze. Ono se može obezbediti, na primer, u puferisanom rastvoru u koncentraciji od oko 20 mg/ml i može se skladištiti na 2-8°C.

[0078] Farmaceutske kompozicije takođe mogu biti u raznim drugim oblicima. Oni uključuju, na primer, tečne, polučvrste i čvrste dozne oblike, kao što su tečni rastvori (npr. rastvori za injektiranje i infuziju), disperzije ili suspenzije, tablete, pilule, praškovi, lipozomi i supozitorije. Oblik može zavisiti od planiranog načina primene i terapijske aplikacije. Tipično, kompozicije za agense koji su ovde opisani su u obliku rastvora za injektiranje ili infuziju.

1

[0079] Takve kompozicije mogu se primenjivati parenteralnim modusom (npr. intravenska, subkutana, intraperitonealna, ili intramuskularna injekcija). Fraze "parenteralna primena" i "primenjeno parenteralno" kako se ovde upotrebljavaju znače moduse primene druge nego enteralna i topikalna primena, uobičajeno injekcijom, i uključuju, bez ograničenja, intravensku, intramuskularnu, intraarterijsku, intratekalnu, intrakapsularnu, intraorbitalnu, intrakardijalnu, intradermalnu, intraperitonealnu, transtrahealnu, subkutanu, subkutikularnu, intraartikularnu, subkapsularnu, subarahnoidnu, intraspinalnu, epiduralnu i intrasternalnu injekciju i infuziju.

[0080] Farmaceutske kompozicije tipično moraju biti sterilne i stabilne u uslovima proizvodnje i skladištenja. Farmaceutska kompozicija se takođe može testirati da se osigura da ispunjava regulatorne i industrijske standarde za primenu.

[0081] Kompozicija se može formulisati kao rastvor, mikroemulzija, disperzija, lipozom, ili druga naručena struktura koja pogoduje visokoj koncentraciji leka. Sterilni rastvori za injektiranje se mogu pripremiti tako što će se agens koji je ovde opisan inkorporisati u potrebnoj količini u odgovarajući rastvarač sa jednim ili kombinacijom sastojaka nabrojanih iznad, kako je potrebno, praćeno filtriranom sterilizacijom. Generalno, disperzije se pripremaju inkorporisanjem agensa koji je ovde opisan u sterilni nosač koji sadrži osnovni disperzioni medijum i ostale neophodne sastojke od onih nabrojanih iznad. U slučaju sterilnih praškova za pripremu sterilnih rastvora za injektiranje, tipični postupci pripreme su vakuum sušenje i sušenje zamrzavanjem što daje prašak agensa koji je ovde opisan plus bilo koji dodatni željeni sastojak iz njihovog prethodno sterilno filtriranog rastvora. Odgovarajuća fluidnost rastvora može se održavati, na primer, upotrebom oblažuće materije kao što je lecitin, održavanjem potrebne veličine čestice u slučaju disperzije i upotrebom surfakanata. Produžena apsorpcija kompozicije za injektiranje može se postići uključivanjem u kompoziciju agensa koji odlaže apsorpciju, na primer, monostearatnih soli i želatina.

Primena

[0082] α4 vezujuće antitelo se može primenjivati subjektu, npr. humanom subjektu, raznim postupcima. Za mnoge aplikacije, put primene je jedan od: intravenske injekcije ili infuzije, subkutane injekcije, ili intramuskularne injekcije. α4 vezujuće antitelo se može primenjivati kao fiksna doza, ili u mg/kg dozi. Antitelo se može primenjivati intravenski (IV) ili subkutano (SC). Na primer, antitelo se može primenjivati u fiksnoj jediničnoj dozi od između oko 50-600 mg IV, npr. svake 4 nedelje, ili između oko 50-100 mg SC (npr. 75 mg), npr. najmanje

1

jednom nedeljno (npr. dva puta nedeljno). U jednom primeru izvođenja, antitelo se primenjuje IV u fiksnoj jediničnoj dozi od 50 mg, 60 mg, 80 mg, 100 mg, 120 mg, 130 mg, 140 mg, 150 mg, 160 mg, 180 mg, 200 mg, 300 mg, 400 mg, 500 mg, ili 600 mg ili više. Primena IV doze može biti jednom ili dva ili tri puta ili više nedeljno, ili jednom svake dve, tri, četiri, ili pet nedelja, ili manje učestalo.

[0083] U jednom primeru izvođenja, antitelo se primenjuje SC u fiksnoj jediničnoj dozi od 50 mg, 60 mg, 70 mg, 75 mg, 80 mg, 100 mg, ili 120 mg ili više. Primena SC doze može biti jednom ili dva ili tri puta ili više nedeljno, ili jednom svake dve, tri, četiri, ili pet nedelja, ili manje učestalo.

[0084] Anti-α4 antitelo takođe se može primenjivati u bolusu u dozi između oko 1 i 10 mg/kg, npr. oko 6,0 mg/kg, 4,0 mg/kg, 3,0 mg/kg, 2,0 mg/kg, 1,0 mg/kg. Modifikovani rasponi doza uključuju dozu koja je manja od oko 600 mg/subjektu, oko 400 mg/subjektu, oko 300 mg/subjektu, oko 250 mg/subjektu, oko 200 mg/subjektu, ili oko 150 mg/subjektu, tipično za primenu svake četvrte nedelje ili jednom mesečno. α4 vezujuće antitelo se može primenjivati, na primer, svake tri do pet nedelja, npr. svake četvrte nedelje, ili mesečno.

[0085] Doziranje se može podesiti u skladu sa pacijentovom stopom klirensa prethodne primene anti-α4 antitela. Na primer, pacijentu se ne može primenjivati druga ili prateća doza pre nego što nivo anti-α4 antitela u pacijentovom sistemu ne padne ispod unapred određenog nivoa. U jednom primeru izvođenja, uzorak od pacijenta (npr. plazma, serum, krv, urin, ili cerebrospinalna tečnost (CSF)) testira se na prisustvo anti-α4 antitela, i ukoliko je nivo antiα4 antitela iznad unapred određenog nivoa, pacijentu neće biti primenjivana druga ili prateća doza. Ukoliko je nivo anti-α4 antitela u pacijentovom sistemu ispod unapred određenog nivoa, onda se pacijentu primenjuje druga ili prateća doza. Pacijent za koga je određeno da ima previsok nivo anti-α4 (iznad unapred određenog nivoa) može se ponovo testirati nakon jednog ili dva ili tri dana, ili nedelje, i ukoliko je nivo anti-α4-antitela u uzorcima od pacijenta pao ispod unapred određenog nivoa, pacijentu se može primenjivati druga ili prateća doza antitela.

[0086] Doza se takođe može odabrati da smanji ili izbegne proizvodnju antitela prema α4 vezujućem antitelu, kako bi se postiglo zasićenje veće od 40, 50, 70, 75, ili 80% α4 subjedinicom, kako bi se postiglo zasićenje manje od 80, 70, 60, 50, ili 40% α4 subjedinicom, ili da se spreči povećanje nivoa cirkulišuíh belih krvnih zrnaca.

[0087] U određenim primerima izvođenja, aktivni agens se može pripremiti sa nosačem koji će zaštititi jedinjenje od brzog oslobađanja, kao što je formulacija sa kontrolisanim oslobađanjem, uključujući implantate i mikrokapsulirane sisteme za isporuku. Mogu se

2

upotrebljavati biorazgradivi, biokompatibilni polimeri, kao što su etilen vinil acetat, polianhidridi, poliglikolna kiselina, kolagen, poliortoestri, i polimlečna kiselina. Mnogi postupci za pripremu takvih formulacija su patentirani ili opšte poznati. Videti, npr. Controlled Drug Delivery (Drugs and the Pharmaceutical Sciences), Second Edition, J. Robinson and V. H. L. Lee, eds., Marcel Dekker, Inc., New York, 1987.

[0088] Farmaceutske kompozicije se mogu primenjivati medicinskim uređajem. Na primer, farmaceutske kompozicije se mogu primenjivati hipodermičkim uređajem za injektiranje bez igle, kao što su uređaji objavljeni u S.A.D. patentima br. 5,399,163; 5,383,851; 5,312,335; 5,064,413; 4,941,880; 4,790,824; ili 4,596,556. Primeri dobro poznatih implantata i modula su razmotreni u, npr. S.A.D. patentu br. 4,487,603, koji objavljuje implantabilnu mikroinfuzionu pumpu za izdavanje leka kontrolisanom stopom; S.A.D. patentu br.4,486,194, koji objavljuje terapijski uređaj za primenu lekova preko kože; S.A.D. patentu br.4,447,233, koji objavljuje pumpu za infuziju leka za isporuku leka preciznom stopom infuzije; S.A.D. patentu br. 4,447,224, koji objavljuje implantabilni infuzioni aparat sa varijabilnim protokom za kontinuiranu isporuku leka; S.A.D. patentu br. 4,439,196, koji objavljuje sistem za isporuku osmotskog leka koji ima višekomorne odeljke; i S.A.D. patentu br. 4,475,196, koji objavljuje sistem za isporuku osmotskog leka. Naravno, takođe su poznati i mnogi drugi takvi implantati, sistemi za isporuku, i moduli.

[0089] Ova objava takođe ističe uređaj za primenu prvog i drugog agensa. Uređaj može uključivati, na primer, jedno ili više kućišta za skladištenje farmaceutskih preparata, i može se konfigurisati tako da isporučuje jedinične doze prvog i drugog agensa. Prvi i drugi agens se mogu skladištiti u istim ili u odvojenim odeljcima. Na primer, uređaj može kombinovati agense pre primene. Takođe je moguće upotrebiti različite uređaje da bi se primenio prvi i drugi agens.

[0090] Režimi doziranja se podešavaju tako da obezbede željeni odgovor, kao što je terapijski odgovor ili kombinatorni terapijski efekat. Uopšteno, bilo koja kombinacija doza (bilo odvojena ili zajedno formulisana) VLA-4 vezujućeg agensa i drugog agensa se mogu upotrebljavati kako bi se subjekt obezbedio sa oba agensa u bioraspoloživim količinama.

[0091] Jedinični dozni oblik ili "fiksna doza" kako se ovde upotrebljava označava fizički diskretne jedinice pogodne kao unitarne doze za subjekte koji će se lečiti; svaka jedinica sadrži unapred određenu količinu aktivnog jedinjenja koja je preračunata da proizvede željeni terapijski efekat koje je povezano sa neophodnim farmaceutskim nosačem i opciono koje je povezano sa drugim agensom.

[0092] Farmaceutska kompozicija može uključivati "terapijski efikasnu količinu" agensa koji je ovde opisan. Takve efikasne količine mogu se odrediti na osnovu kombinatornog efekta primenjenog prvog i drugog agensa. Terapijski efikasna količina agensa može takođe varirati u skladu sa faktorima kao što su stanje bolesti, starost, pol, i težina pojedinca, i sposobnošću jedinjenja da izazove željeni odgovor kod pojedinca, kao što je amelioracija najmanje jednog parametra poremećaja, npr. parametra multiple skleroze, ili amelioracija najmanje jednog simptoma poremećaja, npr. simptoma multiple skleroze, kao što su mišićna atrofija, ataksija, i tremori. Terapijski efikasna količina je takođe ona u kojoj su terapijski korisni efekti prevagnuli nad bilo kakvim toksičnim ili štetnim efektima kompozicije.

Uređaji i kompleti

[0093] Formulacije koje sadrže antitelo koje je ovde opisano mogu se primenjivati medicinskim uređajem. Uređaj se može dizajnirati sa odlikama kao što su prenosivost, skladištenje na sobnoj temperaturi, i jednostavnost upotrebe tako da se može upotrebljavati u hitnim slučajevima, tako da ga može upotrebljavati neobučeni subjekt ili osoblje hitne službe na terenu, udaljeno od medicinskih ustanova i druge medicinske opreme. Uređaj može uključivati, na primer, jedno ili više kućišta za skladištenje farmaceutskih preparata koji uključuju α4-vezujuće antitelo, i može biti konfigurisan da isporuči jedni ili više jediničnih doza agensa.

[0094] Na primer, farmaceutska kompozicija se može primenjivati uređajem za transkutanu isporuku, kao što je špric, uključujući hipodermički ili špric sa više komora. Drugi pogodni uređaji za isporuku uključuju stentove, katetere, mikroigle, i implantabilne uređaje za kontrolisano oslobađanje. Kompozicija se može primenjivati intravenski standardnom IV opremom, uključujući npr. IV tube, sa ili bez linijskih filtera. U nekim primerima izvođenja, uređaj će biti špric za upotrebu u SC ili IM primeni.

[0095] Farmaceutske kompozicije se mogu primenjivati medicinskim uređajima. Na primer, farmaceutske kompozicije se mogu primenjivati hipodermičkim uređajem za injektiranje bez igle, kao što su uređaji objavljeni u S.A.D. patentima br. 5,399,163; 5,383,851; 5,312,335; 5,064,413; 4,941,880; 4,790,824; ili 4,596,556. Primeri dobro poznatih implantata i modula su razmotreni u, npr. S.A.D. patentu br. 4,487,603, koji objavljuje implantabilnu mikroinfuzionu pumpu za izdavanje leka kontrolisanom stopom; S.A.D. patentu br.4,486,194, koji objavljuje terapijski uređaj za primenu lekova preko kože; S.A.D. patentu br.4,447,233, koji objavljuje pumpu za infuziju leka za isporuku leka preciznom stopom infuzije; S.A.D. patentu br. 4,447,224, koji objavljuje implantabilni infuzioni aparat sa varijabilnim protokom za kontinuiranu isporuku leka; S.A.D. patentu br. 4,439,196, koji objavljuje sistem za isporuku osmotskog leka koji ima višekomorne odeljke; i S.A.D. patentu br.4,475,196, koji objavljuje sistem za isporuku osmotskog leka. Terapijska kompozicija takođe može biti u obliku biorazgradive ili nebiorazgradive formulacije neprekidnog oslobađanja za subkutanu ili intramuskularnu primenu. Postupci za takve kompozicije su poznati u struci. Kontinuirana primena se takođe može postići upotrebom implantabilne ili spoljne pumpe. Primena takođe može biti sprovedena isprekidano, kao što je jedna dnevna injekcija, ili kontinuirano u maloj dozi, kao što je formulacija sa neprekidnim oslobađanjem. Uređaj za isporuku se može modifikovati tako da bude optimalno pogodan za primenu α4-vezujućeg antitela. Na primer, špric se može silikonizovati do mere koja je optimalna za skladištenje i isporuku antitela. Naravno, poznati su i mnogi drugi takvi implantati, sistemi za isporuku, i moduli.

[0096] Ova objava takođe ističe uređaj za primenu prvog i drugog agensa (npr. antitelo i drugi agens). Uređaj može uključivati, na primer, jedno ili više kućišta za skladištenje farmaceutskih preparata, i može se konfigurisati za isporuku jediničnih doza prvog i drugog agensa. Prvi i drugi agens se mogu skladištiti u istim ili u odvojenim odeljcima. U jednom primeru izvođenja, uređaj kombinuje agense pre primene. U nekim primerima izvođenja, prvi i drugi agens se primenjuju pomoću različitih uređaja.

[0097] α4-vezujuće antitelo može biti obezbeđeno u kompletu. U jednom primeru izvođenja, komplet uključuje (a) kontejner koji sadrži kompoziciju koja uključuje visoku koncentraciju VLA-4-vezujućeg antitela, opciono (b) kontejner koji sadrži kompoziciju koja uključuje drugi agens, i opciono (c) informativni materijal. Informativni materijal može biti opisni, instruktivni, marketinški ili drugi materijal koji se odnosi na postupke koji su ovde opisani i/ili upotrebu agenasa za terapijsku korist. U jednom primeru izvođenja, komplet takođe uključuje drugi agens. Na primer, komplet uključuje prvi kontejner koji sadrži kompoziciju koja uključuje α4-vezujuće antitelo, i drugi kontejner koji uključuje drugi agens.

[0098] Informativni materijal kompleta nije ograničen u svom obliku. U jednom primeru izvođenja, informativni materijal može uključivati informacije o proizvodnji antitela, koncentraciji, datumu isteka roka upotrebe, informacije o seriji ili mestu proizvodnje, i tako dalje. U jednom primeru izvođenja, informativni materijal se odnosi na postupke primene α4-vezujućeg antitela, npr. u pogodnoj dozi, doznom obliku, ili modusu primene (npr. doza, dozni oblik, ili modus primene koji su ovde opisani), za lečenje subjekta koji ima akutni poremećaj kao što je povreda kičmene moždine ili traumatična povreda mozga, ili inflamatornu bolest (npr. MS), ili koji je u riziku da doživi epizodu povezanu sa

2

inflamatornom bolešću. Informacije se mogu obezbediti u različitim formatima, uključujući štampan tekst, materijal koji se može čitati na računaru, video snimak, ili audio snimak, ili informacije koje obezbeđuju link ili adresu do bitnog materijala.

[0099] Pored agensa, kompozicija u kompletu može uključivati druge sastojke, kao što su rastvarač ili pufer, stabilizator, ili konzervans. Agens može biti obezbeđen u bilo kom obliku, npr. tečnom, suvom ili liofilizovanom obliku, i u suštini čist i/ili sterilan. Kada se agensi obezbeđuju u tečnom rastvoru, tečni rastvor je tipično vodeni rastvor. Kada se agensi obezbeđuju kao suvi oblik, rekonstitucija je uglavnom dodavanjem pogodnog rastvarača. Rastvarač, npr. sterilna voda ili pufer, se opciono mogu obezbediti u kompletu.

[0100] Komplet može uključivati jedan ili više kontejnera za kompoziciju ili kompozicije koje sadrže agense. U nekim primerima izvođenja, komplet sadrži odvojene kontejnere, pregrade ili odeljke za kompoziciju i informativni materijal. Na primer, kompozicija može biti sadržana u boci, bočici, ili špricu, i informativni materijal može biti sadržan u plastičnom omotaču ili paketu. U drugim primerima izvođenja, odvojeni elementi kompleta su sadržani unutar jednog, nepodeljenog kontejnera. Na primer, kompozicija je sadržana u boci, bočici ili špricu koji ima na sebi prikačen informativni materijal u obliku etikete. U nekim primerima izvođenja, komplet uključuje mnoštvo (npr. pakovanje) pojedinačnih kontejnera, od kojih svaki sadrži jedan ili više jediničnih doznih oblika (npr. doznih oblika koji su ovde opisani) agenasa. Kontejneri mogu uključivati kombinovanu jediničnu dozu, npr. jedinicu koja uključuje i α4 vezujuće antitelo i drugi agens, kao što je u željenom odnosu. Na primer, komplet može uključivati mnoštvo špriceva, ampula, paketa u foliji, blister pakovanja, ili medicinskih uređaja od kojih svaki sadrži, na primer, jednu kombinovanu jediničnu dozu. Kontejneri kompleta mogu biti nepropusni za vazduh, vodootporni (npr. nepropustljivi za promene vlage ili isparenja), i/ili nepropusni za svetlost.

[0101] Komplet opciono uključuje uređaj pogodan za primenu kompozicije, npr. špric ili drugi pogodni uređaj za isporuku. Uređaj se može obezbediti unapred napunjen sa jednim ili oba agensa ili može biti prazan ali pogodan za punjenje.

Onkologija

[0102] Ovde opisana α4-vezujuća antitela i postupci mogu se upotrebljavati za lečenje kancera, uključujući čvrste kancere i hematološke malignitete. Kao primer čvrsti kanceri uključuju sarkome i karcinome, kao što su pluća, dojke, pankreasa, kolona, prostate, bešike i mozga. Hematološki maligniteti uključuju kancere kao što su multipli mijelom, leukemija, i limfom.

[0103] Obezbeđeni su postupci za lečenje pacijenta koji ima hematološki malignitet kompozicijom koja sadrži α4-vezujuće antitelo, kao što je anti-VLA-4 antitelo koje je ovde opisano. Hematološki maligniteti su kanceri telesnog sistema za formiranje krvi i imunskog sistema. Kanceri ovog tipa pogađaju krv, kostnu srž, i/ili limfne čvorove. Hematološki maligniteti uključuju leukemije, kao što su akutna limfoblastna leukemija (ALL), akutna mijelogena leukemija (AML), hronična mijelogena leukemija (CML), hronična limfocitna leukemija (CLL), akutna promijelocitna leukemija, akutna eritroleukemija, i leukemija vlasastih ćelija (HCL); limfome, kao što su Hočkinova (Hodgkinꞌs) bolest i ne-Hočkinov limfom; multipli mijelom; Valdenstromovu (Waldenstrom ꞌs) makroblobulinemiju; mijelodisplastični sindrom (MDS) (koji može kulminirati u AML); mijeloproliferativne bolesti, kao što su policitemija vera (koja se takođe naziva PV, PCV ili policitemija rubra vera (PRV)), esencijalna trombocitoza (ET), mijelofibroza, bolest teškog lanca; i amiloid usled bolesti lakog lanca.

[0104] Pacijenti koji imaju hematološki malignitet mogu se identifikovati analizom krvne slike i razmaza krvi pomoću, na primer, svetlosne mikroskopije, koja je korisna za identifikovanje malignih ćelija. Biopsija, kao što je iz kostne srži, takođe se može upotrebljavati za identifikovanje malignih ćelija, i biopsija iz limfnog čvora može biti korisna za identifikovanje limfadenopatije.

[0105] α4-vezujuće antitelo (npr. humanizovano anti-VLA-4 antitelo, kao što su HuHP1/2, H1L0, H1L1, H1L2 ili H1L3) je korisno za lečenje leukemije, kao što je AML. Leukemije su kanceri koji potiču iz kostne srži, gde su maligne ćelije bela krvna zrnca (leukociti). AML (koja se takođe naziva akutna mijelocitna leukemija, akutna mijeloblastna leukemija, akutna granulocitna leukemija, i akutna ne-limfocitna leukemija) je malignitet koji nastaje ili u granulocitima ili u monocitima. AML karakterišu nekontrolisani, preterani rast i akumulacija ćelija zvanih leukemijski blasti (leukemic blasts), koji ne uspevaju da funkcionišu kao normalne ćelije krvi, i blokada proizvodnje normalnih ćelija srži, što dovodi do nedostatka crvenih ćelija (anemija), i krvnih pločica (trombocitopenija) i normalnih belih ćelija (posebno neutrofila, tj. neutropenija) u krvi.

[0106] Svi podtipovi AML su pogodni za lečenje sa VLA-4 vezujućim antitelom. Podtipovi AML su klasifikovani na osnovu stadijuma razvoja koji su mijeloblasti dostigli u trenutku dijagnoze. Kategorije i podskupovi omogućavaju lekaru da odluči koje lečenje najbolje deluje na ćelijski tip i koliko brzo se bolest može razviti. Podskupovi su: M0, mijeloblastna, na

2

specijalnoj analizi; M1, mijeloblastna, bez sazrevanja; M2, mijeloblastna, sa sazrevanjem; M3, promijelocitna; M4, mijelomonocitna; M5, monocitna; M6, eritroleukemija; i M7, megakariocitna. VLA-4 antitelo se može primenjivati sa sekundarnim agensom koji je posebno pogodan za podtip AML. Na primer, akutna promijelocitna leukemija (APL) i akutna monocitna leukemija su podtipovi AML kojima je potreban drugačiji tretman nego drugim podtipovima AML. Drugi agens za lečenje APL može uključivati sve-trans retinoičnu kiselinu (ATRA) ili antimetabolit, kao što je citarabin. Drugi agens za lečenje akutne monocitne leukemije može uključivati analog dezoksiadenozina, kao što je 2-hloro-2ꞌ-dezoksiadenozin (2-CDA).

[0107] Faktori rizika za AML uključuju prisustvo određenih genetičkih poremećaja, kao što su Daunov (Down) sindrom, Fankonijeva (Fanconi) anemija, Švahman-Dajmond (Shwachman-Diamond) sindrom i drugi. Pacijentu koji ima AML i genetički poremećaj može se primenjivati VLA-4 vezujuće antitelo i drugi agens za lečenje simptoma genetičkog poremećaja. Na primer, pacijentu sa AML i Fankonijevom anemijom može se primenjivati VLA-4 vezujuće antitelo i antibiotik.

[0108] Drugi faktori rizika za AML uključuju hemioterapiju ili radioterapiju za lečenje različitog kancera, duvanski dim, i izloženost velikim količinama benzena.

[0109] Drugi kanceri pogodni za lečenje sa α4-vezujućim antitelom uključuju čvrste tumore kao što su sarkomi i karcinomi (npr. fibrosarkom, miksosarkom, liposarkom, hondrosarkom, osteogeni sarkom, hordom, angiosarkom, endoteliosarkom, limfangiosarkom, limfangioendoteliosarkom, sinoviom, mezoteliom, Juingov (Ewingꞌs) tumor, leiomiosarkom, rabdomiosarkom, kancer jajnika, karcinom pločastih ćelija, karcinom bazalnih ćelija, adenokarcinom, karcinom znojnih žlezda, karcinom lojnih žlezda, papilarni karcinom, papilarni adenokarcinomi, cistadenokarcinom, medularni karcinom, bronhogeni karcinom, karcinom bubrežnih ćelija, hepatom, karcinom žučnih kanala, horiokarcinom, seminom, embrionalni karcinom, Vilmov (Wilmꞌs) tumor, kancer grlića materice, kancer materice, kancer testisa, sitno ćelijski karcinom pluća, karcinom epitela, gliom, astrocitom, meduloblastom, kraniofaringiom, ependimom, pinealom, hemangioblastom, akustični neuromi, oligodendrogliom, švanom, meningiom, melanom, neuroblastom, i retinoblastom).

Drugi poremećaji

[0110] Formulacije i postupci koji su ovde opisani se takođe mogu upotrebljavati za lečenje drugih inflamatornih, imunskih, ili autoimunskih poremećaja, npr. inflamacije centralnog

2

nervnog sistema (npr. pored multipla skleroze, meningitis, neuromijelitis optika, neurosarkoidoza, vaskulitis CNS, encefalitis, i transverzalni mijelitis); odbacivanja graftova tkiva ili organa ili bolest graft-protiv-domaćina; akutne povrede CNS-a, npr. moždani udar ili povreda kičmene moždine (SCI); hronične bolesti bubrega; alergije, npr. alergijska astma, umereni do teški alergijski rinitis, okularna alergija; dijabetes melitus tipa 1; inflamatornih poremećaja creva, npr. Kronova bolest, ulcerozni kolitis (npr. za lečenje ili održavanje remisije); eozinofilnog gastroenteritisa; mijastenije gravis; fibromijalgije; poremećaja povezanih sa reumatologijom/imunologijom, kao što su artritični poremećaji, npr. reumatoidni artritis, psorijatični artritis; dermatoloških poremećaja, kao što su inflamatorni/imunski poremećaji kože, npr. psorijaza, vitiligo, dermatitis (npr. atopijski dermatitis), lichen planus, umerena do teška hronična urtikarija; sistemskog eritemskog lupusa (SLE; npr. lupus nefritis); skleroderme (npr. progresivna sistemska skleroza (PSS), kao što je PSS pluća); akutne ili hronične primarne eozinofilne pneumonije; Sjogrenovog sindroma; akutnog koronarnog sindroma (ACS); akutnog infarkta miokarda; ateroskleroze; i fibrotičkih poremećaja, npr. pulmonarna fibroza (npr. idiopatska pulmonarna fibroza), fibroza pluća (npr. XRT izazvana), mijelofibroza, ciroza jetre, mezangijalni proliferativni glomerulonefritis, polumesečasti glomerulonefritis, dijabetička nefropatija, i renalna intersticijalna fibroza.

[0111] Formulacije i postupci koji su ovde opisani se takođe mogu upotrebljavati za lečenje neuroloških poremećaja, kao što su cerebralna ishemija, uključujući prevenciju kod pacijenata sa prolaznim ishemijskim napadima i/ili arterijskom stenozom. Drugi primeri neuroloških poremećaja uključuju hroničnu inflamatornu demijelinizacionu polineuropatiju (CIDP); Gilen-Bareov (Guillian-Barre) sindrom (GBS); okularne bolesti, kao što su makularna degeneracija (npr. vlažna degeneracija makule) i prednja ishemična optička neuropatija; neuropatski bol (npr. simptomatski neuropatski bol); Alchajmerova (Alzheimerꞌs) bolest; amiotrofična lateralna skleroza (ALS) (npr. bolest koja modifikuje ALS)ꞌ i Parkinsonova (Parkinsonꞌs) bolest.

[0112] Formulacije i postupci koji su ovde opisani takođe se mogu upotrebljavati za lečenje pacijenata koji su bili podvrgnuti transplantaciji, kao što su transplantacija bubrega, srca, ili kostne srži.

Multipla skleroza

2

[0113] Formulacije koje sadrže alfa-4 vezujuće antitelo koje je ovde opisano su korisne za lečenje inflamatornih bolesti, kao što je multipla skleroza (MS). Multipla skleroza je bolest centralnog nervnog sistema koju karakterišu inflamacija i gubitak mijelinskog omotača.

[0114] Pacijenti koji imaju MS mogu se identifikovati pomoću kriterijuma koji uspostavljaju dijagnozu klinički nedvosmislene MS kao što je definisano u radionici o dijagnozi MS (Poser et al., Ann. Neurol. 13:227, 1983). Na primer, pojedinac sa klinički nedvosmislenom MS je imao dva napada i klinički dokaz bilo za dve lezije ili klinički dokaz za jednu leziju i paraklinički dokaz za drugu, odvojenu leziju. Nedvosmislena MS takođe se može dijagnostikovati pomoću dokaza za dva napada i oligoklonalnim trakama IgG u cerebrospinalnoj tečnosti ili pomoću kombinacije napada, kliničkim dokazom za dve lezije i oligoklonalnom trakom IgG u cerebrospinalnoj tečnosti. Mekdonald kriterijumi se takođe mogu upotrebljavati za dijagnozu MS. (McDonald et al., 2001, "Recommended diagnostic criteria for multiple sclerosis: guidelines from the International Panel on the Diagnosis of Multiple Sclerosis", Ann. Neurol. 50:121-127). Mekdonald kriterijumi uključuju upotrebu MRI dokaza o oštećenju CNS tokom vremena koji će biti upotrebljeni u dijagnozi MS, u nedostatku višestrukih kliničkih napada. Efikasno lečenje multiple skleroze može se procenjivati na više različitih načina. Sledeći parametri se mogu upotrebljavati za procenu efikasnosti lečenja. Dva kriterijuma koji služe kao primer uključuju: EDSS (proširena skala statusa invalidnosti), i pojava pogoršanja na MRI (magnetna rezonanca). EDSS je postupak za ocenjivanje kliničkog oštećenja usled MS (Kurtzke, Neurology 33:1444, 1983). Osam funkcionalnih sistema se procenjuje na tip i težinu neurološkog oštećenja. Ukratko, pre lečenja, pacijenti se procenjuju na oštećenje u sledećim sistemima: piramidalni, cerebella, moždano stablo, senzorni, creva i bešika, vizualni, moždani, i drugi. Kontrolnni pregledi se izvode u određenim intervalima. Skala je u rasponu od 0 (normalno) do 10 (smrt usled MS). Smanjenje za jedan ceo korak ukazuje na efikasno lečenje (Kurtzke, Ann. Neurol.36:573-79, 1994). Pacijenti takođe mogu biti dijagnostfikovani upotrebom drugih kriterijuma koje upotrebljavaju oni u struci.

[0115] Pogoršanja su definisana kao pojava novog simptoma koji se može pripisati MS-u i koja su praćena odgovarajućom novom neurološkom abnormalnošću (IFNB MS studijska grupa, supra). Pored toga, pogoršanje mora da traje najmanje 24 sata i da mu prethodi stabilnost ili poboljšanje tokom najmanje 30 dana. Ukratko, pacijentima se radi standardni neurološki pregled od strane lekara. Pogoršanja su ili blaga, umerena, ili teška u skladu sa promenama po neurološkoj skali ocenjivanja (Sipe et al., Neurology 34:1368, 1984). Određuju se godišnja stopa pogoršanja i proporcija pacijenata bez pogoršanja.

2

[0116] Terapija se može smatrati efikasnom ukoliko postoji statistički značajna razlika u stopi ili proporciji pacijenata bez pogoršanja ili bez relapsa između lečene grupe i placebo grupe za bilo koje od ovih merenja. Pored toga, takođe se mogu izmeriti vreme do prvog pogoršanja i trajanje i težina pogoršanja. Mera efikasnosti kao terapije u ovom pogledu je statistički značajna razlika u vremenu do prvog pogoršanja ili trajanju i težini u lečenoj grupi u poređenju sa kontrolnom grupom. Period bez pogoršanja ili bez relapsa duži od jedne godine, 18 meseci, ili 20 meseci su posebno vredni pažnje. Efikasnost se takođe može proceniti upotrebom bilo kog postupka koji se upotrebljava u struci, na primer za procenu simptoma MS, uključujući poboljšanje pokretljivosti upotrebom vremenskog testa hoda koji se upotrebljava sam ili u kombinaciji sa drugim kriterijumima.

[0117] Efikasnost primene prvog agensa i, opciono, drugog agensa, takođe se može proceniti na osnovu jednog ili više od sledećih kriterijuma: učestalost MBP reaktivnih T ćelija određena pomoću graničnog razblaženja, proliferativni odgovor MBP reaktivnih T ćelijskih linija i klonova, profili citokina T ćelijskih linija i klonova prema MBP uspostavljenih od pacijenata. Na efikasnost ukazuje smanjenje učestalosti reaktivnih ćelija, smanjenje inkorporacije timidina sa izmenjenim peptidom u poređenju sa nativnim, i smanjenje TNF i IFN-α.

[0118] Klinička merenja uključuju stopu relapsa u intervalima od jedne i dve godine, i promenu na EDSS, uključujući vreme do progresije od početne vrednosti od 1,0 jedinice na EDSS koja traje šest meseci. Na Kaplan-Majer krivoj, kašnjenje u stalnom napredovanju invalidnosti pokazuje efikasnost. Drugi kriterijumi uključuju promenu površine i zapremine T2 slika na MRI, i broj i zapreminu lezija određenih pomoću gadolinijumom pojačanih slika.

[0119] MRI se može upotrebljavati za merenje aktivnih lezija upotrebom gadolinijum-DTPA-pojačanog snimanja (McDonald et al. Ann. Neurol. 36:14, 1994) ili lokacije i obima lezija upotrebom T2-otežanih tehnika. Ukratko, dobijeni su osnovni MRI. Za svaku narednu studiju upotrebljava se ista ravan snimanja i pozicija pacijenta. Sekvence pozicioniranja i snimanja se mogu odabrati da maksimalizuju otkrivanje lezije i olakšaju praćenje lezije. Iste sekvence pozicioniranja i snimanja se mogu upotrebljavati u narednim studijama. Radiolozi mogu odrediti prisustvo, lokaciju i obim MS lezija. Površine lezija mogu se opcrtati i sumirati presek po presek za ukupnu površinu lezije. Mogu biti urađene tri analize: dokazi o novim lezijama, stopa pojave aktivnih lezija, procentualna promena u površini lezije (Paty et al., Neurology 43:665, 1993). Poboljšanje zahvaljujući terapiji može se utvrditi statistički značajnim poboljšanjem kod pojedinačnog pacijenta u poređenju sa početnom vrednošću ili u lečenoj grupi u odnosu na placebo grupu.

2

[0120] Primeri simptoma povezanih sa multipla sklerozom, koji se mogu lečiti postupcima koji su ovde opisani, uključuju: optički neuritis, diplopiju, nistagmus, okularnu dismetriju, internuklearnu oftalmoplegiju, fosfene pokreta i zvuka, aferentno oštećenje zenice, parezu, monoparezu, paraparezu, hemiparezu, kvadraparezu, plegiju, paraplegiju, hemiplegiju, tetraplegiju, kvadraplegiju, spastičnost, disartriju, mišićnu atrofiju, spazme, grčeve, hipotoniju, klonus, mioklonus, miokimiju, sindrom nemirnih nogu, pad stopala, disfunkcionalne reflekse, paresteziju, anesteziju, neuralgiju, neuropatski i neurogeni bol, lꞌhermite, proprioceptivnu disfunkciju, trigeminalnu neuralgiju, ataksiju, tremor namere, dismetriju, vestibularnu ataksiju, vrtoglavicu, ataksiju govora, distoniju, disdiadohokineziju, učestalu mikturaciju, spastičnost bešike, flakcidnu bešiku, dissinergiju detrusor-sfinktera, erektilnu disfunkciju, anorgazmiju, frigidnost, konstipaciju, fekalnu urgentnost, fekalnu inkontinenciju, depresiju, kognitivnu disfunkciju, demenciju, promene raspoloženja, emocionalnu labilnost, euforiju, bipolarni sindrom, anksioznost, afaziju, disfaziju, umor, uhthofov (uhthoffꞌs) simptom, gastroezofagealni refluks, i poremećaje sna.

[0121] Svaki slučaj MS prikazuje jedan od nekoliko obrazaca prezentacije i naknadnog toka. Najčešće, MS se najpre manifestuje kao serija napada koji su praćeni potpunim ili delimičnim remisijama kako se simptomi misteriozno umanjuju, samo da bi se vratili kasnije nakon perioda stabilnosti. Ovo se naziva relapsirajuća-remitentna (RR) MS. Primarno-progresivnu (PP) MS karakteriše postepeno kliničko slabljenje bez izrazitih remisija, iako mogu postojati privremeni platoi ili manje olakšanje simptoma. Sekundarno-progresivna (SP) MS započinje sa relapsirajuće-remitentnim tokom koji je praćen kasnijim primarno-progresivnim tokom. Retko, pacijenti mogu imati progresivno-relapsirajući tok (PR) u kome bolest ide progresivnim putem koji je naglašen akutnim napadima. PP, SP, i PR se ponekad nesrećno skupe zajedno i to se naziva hronična progresivna MS.

[0122] Nekoliko pacijenata ima malignu MS, koja je definisana kao brzo i nemilosrdno slabljenje što rezultira značajnom invalidnošću ili čak smrću ubrzo nakon početka bolesti. Ovo slabljenje se može zaustaviti ili usporiti primenom kombinovane terapije koja je ovde opisana.

[0123] Primena anti-α4 antitela koje je ovde istaknuto može biti efikasno za ublažavanje jednog ili više simptoma MS, kao što je jedan ili više gore opisanih simptoma. Na primer, primena anti-α4 antitela koje je ovde opisano se može upotrebljavati za lečenje primarne ili sekundarne progresivne multiple skleroze (PPMS ili SPMS, respektivno), i lečenje anti-α4 antitelom može biti efikasno u sprečavanju relapsa.

[0124] Pored ili pre studija na ljudima, životinjski model se može upotrebiti za procenu efikasnosti upotrebe dva agensa. Primer životinjskog modela multiple skleroze je mišji model eksperimentalnog autoimunskog encefalitisa (EAE), npr. kako je opisano u (Tuohy et al. (J. Immunol. (1988) 141: 1126-1130), Sobel et al. (J. Immunol. (1984) 132: 2393-2401), i Traugott (Cell Immunol. (1989) 119: 114-129). Miševima se mogu primenjivati prvi i drugi agens koji su ovde opisani pre EAE indukcije. Zatim se miševi procenjuju na karakteristične kriterijume za određivanje efikasnosti upotrebe dva agensa u modelu.

Generisanje antitela

[0125] Rekombinantna antitela koja se vezuju za alfa-4 mogu se generisati in vivo ili in vitro postupcima kao što je displej fag. Postupci se mogu upotrebljavati za snabdevanje anti-α4 CDR za upotrebu u CDR graftovanim antitelima koja su ovde opisana. Dodatno, postupci kao što je displej fag mogu se upotrebljavati za odabir takvih CDR u kontekstu regiona okvira germinativne linije koji su objavljeni ovde, kao što je upotrebom biblioteke u kojoj je region okvira region okvira germinativne linije.

[0126] EP 239 400 (Winter et al.) opisuje izmenu antitela supstitucijom (unutar datog varijabilnog regiona) njihovih regiona koji određuju komplementarnost (CDR) za jednu vrstu sa onima iz druge. Antitela sa supstituisanim CDR mogu imati manju verovatnoću da izazovu imunski odgovor kod ljudi u poređenju sa istinskim himernim antitelima pošto antitela sa supstituisanim CDR sadrže znatno manje ne-humanih komponenti. (Riechmann et al., 1988, Nature 332, 323-327; Verhoeyen et al., 1988, Science 239, 1534-1536). Tipično, CDR murinskog antitela supstituisana su u odgovarajuće regione humanog antitela upotrebom tehnologije rekombinantne nukleinske kiseline za proizvodnju sekvenci koje kodiraju željeno supstituisano antitelo. Mogu se dodati segmenti gena humanog konstantnog regiona željenog izotipa (uobičajeno gama I za CH i kapa za CL) i geni teškog i lakog lanca mogu se koeksprimirati u ćelijama sisara kako bi se proizvelo solubilno antitelo. Velike biblioteke neimunizovanog displej faga se takođe mogu upotrebljavati za izolovanje antitela visokog afiniteta koja se mogu razviti kao humani terapeutici upotrebom standardne tehnologije faga (videti, npr. Hoogenboom et al., (1998) Immunotechnology 4:1-20; i Hoogenboom et al. (2000) Immunol Today 2: 371-8; U.S.2003-0232333).

[0127] Ovde opisano anti-α4 antitelo ili fragment antitela može prepoznati epitope α4 subjedinice koji su uključeni u vezivanje za srodni ligand, npr. VCAM-1 ili fibronektin. Ovde

1

opisana antitela mogu inhibirati vezivanje za jedan ili više srodnih liganada (npr. VCAM-1 i fibronektin).

[0128] U nekim primerima izvođenja, antitela istaknuta ovde, mogu interagovati sa VLA-4 na ćelijama, npr. limfocitima, ali ne izazivaju ćelijsku agregaciju.

[0129] Primer α4 vezujućeg antitela ima jedan ili više CDR, npr. sva tri CDR teškog lanca (HC) i/ili sva tri CDR lakog lanca (LC) određenog antitela objavljenog ovde, ili CDR koji su, u zbiru, najmanje 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99% identični takvom antitelu. U jednom primeru izvođenja, hipervarijabilne petlje H1 i H2 imaju istu kanonsku strukturu kao ona od antitela koje je ovde opisano. U jednom primeru izvođenja, hipervarijabilne petlje L1 i L2 imaju istu kanonsku strukturu kao ona od antitela koje je ovde opisano.

[0130] U jednom primeru izvođenja, amino-kiselinska sekvenca sekvence varijabilnog domena HC i/ili LC je najmanje 70, 80, 85, 90, 92, 95, 97, 98, 99, ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci varijabilnog domena HC i/ili LC antitela koje je ovde opisano. Aminokiselinska sekvenca sekvence varijabilnog domena HC i/ili LC može se razlikovati za najmanje jednu amino-kiselinu, ali ne za više od deset, osam, šest, pet, četiri, tri, ili dve amino-kiseline od odgovarajuće sekvence antitela koje je ovde opisano. Na primer, razlike mogu biti primarno ili u potpunosti u regionima okvira.

[0131] Amino-kiselinske sekvence sekvenci varijabilnog domena HC i LC mogu biti kodirane sekvencom nukleinske kiseline koja hibridizuje pod uslovima visoke strogosti sa sekvencom nukleinske kiseline koja je ovde opisana ili onom koja kodira varijabilni domen ili aminokiselinsku sekvencu koja je ovde opisana. U jednom primeru izvođenja, amino-kiselinske sekvence jednog ili više regiona okvira (npr. FR1, FR2, FR3, i/ili FR4) varijabilnog domena HC i/ili LC su najmanje 70, 80, 85, 90, 92, 95, 97, 98, 99, ili 100% identične odgovarajućim regionima okvira varijabilnih domena HC i LC antitela koje je ovde opisano. U jednom primeru izvođenja, jedan ili više regiona okvira teškog ili lakog lanca (npr. HC FR1, FR2, i FR3) su najmanje 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, ili 100% identični sekvenci odgovarajućih regiona okvira iz antitela humane germinativne linije.

[0132] Izračunavanja "homologije" ili "identičnosti sekvence" između dve sekvence (termini se ovde upotrebljavaju naizmenično) se izvodi na sledeći način. Sekvence su poravnate u svrhe optimalnog poređenja (npr. razmaci mogu biti introdukovani u jednoj ili obe od prve i druge sekvence amino-kiseline ili nukleinske kiseline radi optimalnog poravnanja i nehomologne sekvence se mogu zanemariti u svrhe poređenja). Optimalno poravnanje se određuje kao najbolji rezultat upotrebom GAP programa u softverskom paketu GCG sa Blossum 62 matricom za ocenjivanje sa gap penalom od 12, gap produženim penalom od 4, i

2

penalom za pomeranje okvira čitanja razmaka (frameshift gap penalty) od 5. Amino-kiselinski ostaci ili nukleotidi na odgovarajućim pozicijama amino-kiselina ili pozicijama nukleotida se zatim upoređuju. Kada poziciju u prvoj sekvenci zauzima isti amino-kiselinski ostatak ili nukleotid kao odgovarajuća pozicija u drugoj sekvenci, onda su molekuli identični na toj poziciji (kako se ovde upotrebljava "identičnost" amino-kiseline ili nukleinske kiseline je ekvivalentna "homologiji" amino-kiseline ili nukleinske kiseline). Procenat identičnosti između dve sekvence je funkcija broja identičnih pozicija koje sekvence dele.

[0133] Kako se ovde upotrebljava, termin "hibridizuje pod uslovima visoke strogosti" opisuje uslove za hibridizaciju i ispiranje. Smernice za izvođenje reakcija hibridizacije mogu se pronaći u Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Vodeni i nevodeni postupci su opisani u toj referenci i bilo koji se mogu upotrebiti. Uslovi hibridizacije visoke strogosti uključuju hibridizaciju u 6X SSC na oko 45°C, nakon čega sledi jedno ili više ispiranja u 0,2X SSC, 0,1% SDS na 65°C, ili suštinski slične uslove.

Proizvodnja antitela

[0134] Antitela se mogu proizvesti u prokariotskim i eukariotskim ćelijama. U jednom primeru izvođenja, antitela (npr. scFvs) se eksprimiraju u ćeliji kvasca kao što je Pichia (videti npr. Powers et al. (2001) J. Immunol. Methods 251:123-35), Hanseula, ili Saccharomyces.

[0135] U jednom primeru izvođenja, antitela, posebno antitela pune dužine, npr. IgG, proizvode se u ćelijama sisara. Primeri ćelija domaćina sisara za rekombinantnu ekspresiju uključuju ovarijum kineskog hrčka (CHO ćelije) (uključujući dhfr- CHO ćelije, opisane u Urlaub i Chasin (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, upotrebljene sa DHFR selektabilnim markerom, npr. kako je opisano u Kaufman i Sharp (1982) Mol. Biol.159:601-621), limfocitne ćelijske linije, npr. NS0 ćelije mijeloma i SP2 ćelije, COS ćelije, K562, i ćelije iz transgene životinje, npr. transgenog sisara. Na primer, ćelija je epitelna ćelija sisara.

[0136] Pored sekvence nukleinske kiseline koja kodira domen imunoglobulina, rekombinantni ekspresioni vektori mogu da nose dodatne sekvence nukleinske kiseline, kao što su sekvence koje regulišu replikaciju vektora u ćelijama domaćina (npr. oridžini replikacije) i selektabilni marker geni. Selektabilni marker gen olakšava selekciju ćelija domaćina u koje je vektor introdukovan (videti npr. S.A.D. patente br. 4,399,216, 4,634,665 i 5,179,017). Primeri selektabilnih marker gena uključuju gen dihidrofolat reduktaze (DHFR) (za upotrebu u dhfr-ćelijama domaćina sa metotreksat selekcijom/amplifikacijom) i gen neo (za G418 selekciju).

[0137] U primeru sistema za rekombinantnu ekspresiju antitela (npr. antitelo pune dužine ili njegov antigen-vezujući deo), rekombinantni ekspresioni vektor koji kodira i teški lanac antitela i laki lanac antitela se introdukuje u dhfr- CHO ćelije transfektovanjem posredovanim kalcijum fosfatom. Unutar rekombinantnog ekspresionog vektora, geni teškog i lakog lanca antitela se svaki operativno povezuje sa enhanser/promotor regulatornim elementima (npr. izvedeni iz SV40, CMV, adenovirusa i slično, kao što je CMV enhanser/AdMLP promotor regulatorni element ili SV40 enhanser/AdMLP promotor regulatorni element) za pokretanje visokih nivoa transkripcije gena. Rekombinantni ekspresioni vektor takođe nosi DHFR gen, koji omogućava selekciju CHO ćelija koje su transfektovane sa vektorom upotrebom metotreksat selekcije/amplifikacije. Odabrane transformantne ćelije domaćina se uzgajaju da se omogući ekspresija teških i lakih lanaca antitela i intaktna antitela se izdvajaju iz medijuma kulture. Standardne tehnike molekularne biologije upotrebljavaju se za pripremu rekombinantnog ekspresionog vektora, za transfektovanje ćelija domaćina, za odabir transformanata, za uzgajanje ćelija domaćina, i za izdvajanje antitela iz medijuma kulture. Na primer, neka antitela se mogu izolovati afinitetnom hromatografijom sa Proteinom A ili Proteinom G. Na primer, prečišćena α4-vezujuća antitela mogu se koncentrovati na oko 100 mg/mL do oko 200 mg/mL upotrebom tehnika koncentrovanja proteina koje su poznate u struci.

[0138] Antitela takođe mogu uključivati modifikacije, npr. modifikacije koje menjaju funkciju Fc, npr. da smanje ili uklone interakciju sa Fc receptorom ili sa C1q, ili oba. Na primer, konstantni region humanog IgG4 može imati Ser u Pro mutaciju na ostatku 228 da fiksira region zgloba. Amino-kiselinska sekvenca IgG4 Fc (zglob CH2 CH3 domen) je obezbeđena na SL.5.

[0139] U drugom primeru, konstantni region humanog IgG1 može biti mutiran na jednom ili više ostataka, npr. jedan ili više ostataka 234 i 237, npr. u skladu sa numeracijom u S.A.D. patentu br. 5,648,260. Drugi primeri modifikacija uključuju one opisane u S.A.D. patentu br.

5,648,260.

[0140] Za neka antitela koja uključuju Fc domen, sistem za proizvodnju antitela može se dizajnirati da sintetiše antitela u kojima je Fc region glikozilovan. U drugom primeru, Fc domen IgG molekula je glikozilovan u asparaginu 297 u CH2 domenu (videti SL. 5). Ovaj asparagin je mesto za modifikaciju sa oligosaharidima biantenarnog tipa. Ova glikozilacija učestvuje u efektorskim funkcijama posredovanim Fcγ receptorima i nadopunjuje C1q (Burton i Woof (1992) Adv. Immunol. 51:1-84; Jefferis et al. (1998) Immunol. Rev. 163:59-76). Fc domen se može proizvoditi u ekspresionom sistemu sisara koji na odgovarajući način

4

glikoziluje ostatke koji odgovaraju asparaginu 297. Fc domen takođe može uključivati druge eukariotske post-translacione modifikacije.

[0141] Druge pogodne modifikacije Fc domena uključuju one koje su opisane u WO2004/029207. Na primer, Fc domen može biti XmAb<®>Fc (Xencor, Monrovia, CA). Fc domen, ili njegov fragment, može imati supstituciju u vezujućem regionu Fcγ receptora (FcγR), kao što su domeni i fragmenti koji su opisani u WO05/063815. U nekim primerima izvođenja, Fc domen ili njegov fragment, ima supstituciju u vezujućem regionu neonatalnog Fc receptora (FcRn), kao što su domeni i fragmenti koji su opisani u WO05047327. U drugim primerima izvođenja, Fc domen je jedan lanac, ili njegov fragment, ili njegova modifikovana verzija, kao što su oni opisani u WO2008143954. Druge pogodne modifikacije Fc su poznate i opisane u struci.

[0142] Antitela takođe mogu da proizvedu transgene životinje. Na primer, S.A.D. patent br.

5,849,992 opisuje postupak za ekspresiju antitela u mlečnoj žlezdi transgenog sisara. Transgen je konstruisan da uključuje promotor specifičan za mleko i sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju antitelo od interesa, npr. antitelo koje je ovde opisano, i signalnu sekvencu za sekreciju. Mleko koje proizvode ženke takvih transgenih sisara uključuje, sekretovano u njemu, antitelo od interesa, npr. antitelo koje je ovde opisano. Antitelo se može prečistiti iz mleka, ili za neke aplikacije, direktno upotrebljavati.

[0143] Antitela se mogu modifikovati, npr. sa delom koji poboljšava njegovu stabilizaciju i/ili zadržavanje u cirkulaciji, npr. u krvi, serumu, limfi, bronhoalveolarnoj lavaži, ili drugim tkivima, npr. najmanje 1,5, 2, 5, 10, ili 50 puta.

[0144] Na primer, VLA-4 vezujuće antitelo može biti povezano sa polimerom, npr. suštinski ne-antigenim polimerom, kao što je polialkilen oksid ili polietilen oksid. Pogodni polimeri će značajno varirati po težini. Mogu se upotrebljavati polimeri koji imaju prosečnu masu molekulskog broja koja je u rasponu od oko 200 do oko 35.000 daltona (ili oko 1.000 do oko 15.000, i 2.000 do oko 12.500).

[0145] Na primer, VLA-4 vezujuće antitelo može biti konjugovano sa polimerom rastvorljivim u vodi, npr. hidrofilnim polivinil polimerom, npr. polivinilalkoholom ili polivinilpirolidonom. Neograničavajući spisak takvih polimera uključuje homopolimere polialkilen oksida kao što su polietilen glikol (PEG) ili polipropilen glikoli, polioksietilenizovani polioli, njihovi kopolimeri i njihovi blok kopolimeri, pod uslovom da se održava rastvorljivost u vodi blok kopolimera. Dodatni korisni polimeri uključuju polioksialkilene kao što su polioksietilen, polioksipropilen, i blok kopolimeri polioksietilena i polioksipropilena (Pluronics); polimetakrilate; karbomere; granate ili negranate polisaharide koji sadrže saharidne monomere D-manozu, D- i L-galaktozu, fukozu, fruktozu, D-ksilozu, L-arabinozu, D-glukuronsku kiselinu, sijalinsku kiselinu, D-galakturonsku kiselinu, D-manuronsku kiselinu (npr. polimanuronska kiselina, ili alginska kiselina), D-glukozamin, D-galaktozamin, D-glukozu i neuraminsku kiselinu, uključujući homopolisaharide i heteropolisaharide, kao što su laktoza, amilopektin, skrob, hidroksietil skrob, amiloza, dekstran sulfat, dekstran, dekstrin, glikogen, ili polisaharidnu podjedinicu kiselih mukopolisaharida, npr. hijaluronsku kiselinu; polimere šećernih alkohola kao što su polisorbitol i polimanitol; heparin ili heparon.

Primeri drugih agenasa

[0146] U nekim slučajevima, formulacije koje su ovde opisane, npr. formulacije koje sadrže alfa-4 vezujuće antitelo, uključuju drugi agens, ili se primenjuju u kombinaciji sa formulacijom koja sadrži drugi agens.

[0147] U jednoj implementaciji, α4 vezujuće antitelo i drugi agens se obezbeđuju kao koformulacija, i ko-formulacija se primenjuje subjektu. Dodatno je moguće, npr. najmanje 24 sata pre ili posle primene ko-formulacije, primeniti odvojeno jednu dozu formulacije α4 vezujućeg antitela i zatim jednu dozu formulacije koja sadrži drugi agens. U drugoj implementaciji, antitelo i drugi agens se obezbeđuju kao odvojene formulacije, i korak primene uključuje uzastopnu primenu antitela i drugog agensa. Uzastopne primene mogu se obezbediti istog dana (npr. unutar jednog sata jedna od druge ili sa najmanje 3, 6, ili 12 sati razmaka) ili u različite dane.

[0148] Načelno, antitelo i drugi agens se svaki primenjuju kao mnoštvo doza razdvojenih u vremenu. Antitelo i drugi agens se načelno svaki primenjuju u skladu sa režimom. Režim za jedan ili oba može imati redovnu periodičnost. Režim za antitelo može imati različitu periodičnost od režima za drugi agens, npr. jedno se može primenjivati češće od drugog. U jednoj implementaciji, jedno od antitela i drugog agensa se primenjuje jednom nedeljno a drugo jednom mesečno. U drugoj implementaciji, jedno od antitela i drugog agensa se primenjuje kontinuirano, npr. tokom perioda dužeg od 30 minuta ali manjeg od 1, 2, 4, ili 12 sati, a drugi se primenjuje kao bolus. Antitelo i drugi agens mogu se primenjivati bilo kojim odgovarajućim postupkom, npr. subkutano, intramuskularno, ili intravenski.

[0149] U nekim primerima izvođenja, svako od antitela i drugog agensa se primenjuju u istoj dozi u kojoj je svako propisano za monoterapiju. U drugim primerima izvođenja, antitelo se primenjuje u dozi koja je jednaka ili manja od količine potrebne za efikasnost ukoliko se primenjuje samo. Slično tome, drugi agens se može primenjivati u dozi koja je jednaka ili manja od količine koja je potrebna za efikasnost ukoliko se primenjuje sam.

[0150] Neograničavajući primeri drugih agenasa za lečenje multiple skleroze u kombinaciji sa α4 vezujućim antitelom uključuju:

▪ interferone, npr. humani interferon beta-1a (npr. AVONEX® ili Rebif®) i interferon beta-1b (BETASERON™; humani interferon beta supstituisan na poziciji 17; Berlex/Chiron);

▪ glatiramer acetat (takođe nazvan kopolimer 1, Cop-1; COPAXONE™; Teva Pharmaceutical Industries, Inc.);

▪ Rituxan® (rituksimab) ili drugo anti-CD20 antitelo, npr. ono koje kompetira sa ili vezuje preklapajući epitop sa rituksimabom;

▪ mikstoksantron (NOVANTRONE®, Lederle);

▪ hemioterapeutike, npr. klabribin (LEUSTATIN®), azatioprin (IMURAN®), ciklofosfamid (CYTOXAN®), ciklosporin-A, metotreksat, 4-aminopiridin, i tizanidin;

▪ kortikosteroid, npr. metilprednizolon (MEDRONE®, Pfizer), prednizon;

▪ imunoglobulin, npr. Rituxan® (rituksimab); CTLA4 Ig; alemtuzumab (MabCAMPATH®) ili daklizumab (antitelo koje vezuje CD25);

▪ statine, i

▪ TNF antagoniste.

[0151] Glatiramer acetat je protein formiran od nasumičnog niza amino-kiselina -glutaminske kiseline, lizina, alanina i tirozina (otuda i GLATiramer). Glatiramer acetat se može sintetisati u rastvoru od ovih amino-kiselina u odnosu od otprilike 5 delova alanina prema 3 dela lizina, 1,5 deo glutaminske kiseline i 1 deo tirozina upotrebom anhidrida N-karboksiamino kiseline.

[0152] Dodatni drugi agensi uključuju antitela ili antagoniste drugih humanih citokina ili faktora rasta, na primer, TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-12 IL-15, IL-16, IL-18, EMAP-11, GM-CSF, FGF, i PDGF. Drugi pak primeri drugih agenasa uključuju antitela na molekule ćelijske površine kao što su CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80, CD86, CD90 ili njihove ligande. Na primer, daklizubmab je anti-CD25 antitelo koje može poboljšati multiplu sklerozu.

[0153] Drugi pak primeri antitela uključuju antitela koja obezbeđuju aktivnost agensa koji je ovde opisan, kao što je antitelo koje zauzima receptor za interferon, npr. interferon beta receptor. Tipično, u implementacijama u kojima drugi agens uključuje antitelo, ono se vezuje za ciljni protein drugi nego VLA-4 ili drugi nego α4 integrin, ili najmanje epitop na VLA-4 drugi nego onaj koji je prepoznao prvi agens.

[0154] Drugi pak dodatni primeri drugih agenasa uključuju: FK506, rapamicin, mikofenolat mofetil, leflunomid, nesteroidne anti-inflamatorne lekove (NSAID), na primer, inhibitore fosfodiesteraze, agoniste adenozina, antitrombotske agense, inhibitore komplementa, adrenergičke agense, agense koji interferiraju sa signalizacijom pro-inflamatornih citokina kako je ovde opisano, inhibitore IL-1β konvertujućeg enzima (npr. Vx740), anti-P7s, PSGL, TACE inhibitore, inhibitore T-ćelijskog signaliziranja kao što su inhibitori kinaze, inhibitori metaloproteinaze, sulfasalazin, azatloprin, 6-merkaptopurini, inhibitore angiotenzin konvertujućeg enzima, receptore rastvorljivih citokina i njihove derivate, kako je ovde opisano, anti-inflamatorne citokine (npr. IL-4, IL-10, IL-13 i TGF).

[0155] U nekim primerima izvođenja, drugi agens može se upotrebljavati za lečenje jednog ili više simptoma ili neželjenih efekata MS. Takvi agensi uključuju, npr. amantadin, baklofen, papaverin, meklizin, hidroksizin, sulfametoksazol, ciprofloksacin, dokusat, pemolin, dantrolen, dezmopresin, deksametazon, tolterodin, fenitoin, oksibutinin, bisakodil, venlafaksin, amitriptilin, metenamin, klonazepam, izoniazid, vardenafil, nitrofurantoin, psilijum hidrofilni muciloid, alprostadil, gabapentin, nortriptilin, paroksetin, propantelin bromid, modafinil, fluoksetin, fenazopiridin, metilprednizolon, karbamazepin, imipramin, diazepam, sildenafil, bupropion, i sertralin. Mnogi drugi agensi koji su mali molekuli imaju molekulsku masu između 150 i 5000 daltona.

[0156] Primeri TNF antagonista uključuju himerna, humanizovana, humana ili in vitro generisana antitela (ili njihove antigen-vezujuće fragmente) na TNF (npr. humani TNF α), kao što su D2E7, (humano TNFα antitelo, S.A.D. patent br. 6,258,562; BASF), CDP-571/CDP-870/BAY-10-3356 (humanizovano anti-TNFα antitelo; Celltech/Pharmacia), cA2 (himerno anti-TNFα antitelo; REMICADE™, Centocor); fragmente anti-TNF antitela (npr. CPD870); solubilne fragmente TNF receptora, npr. p55 ili p75 humani TNF receptori ili njihovi derivati, npr. 75 kdTNFR-IgG (75 kD TNF receptor-IgG fuzioni protein, ENBREL™; Immunex; videti npr. Arthritis & Rheumatism (1994) Vol. 37, S295; J. Invest. Med. (1996) Vol. 44, 235A), p55 kdTNFR-IgG (55 kD TNF receptor-IgG fuzioni protein (LENERCEPT™)); antagoniste enzima, npr. inhibitori TNFα konvertujućeg enzima (TACE) (npr. derivat alfasulfonil hidroksaminske kiseline, WO 01/55112, i N-hidroksiformamid TACE inhibitor GW 3333, -005, ili -022); i TNF-bp/s-TNFR (solubilni TNF vezujući protein; videti npr. Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, br. 9 (dodatak), S284; Amer. J. Phisiol. - Heart and Circulatory Physiology (1995) Vol.268, pp.37-42).

[0157] Pored drugog agensa, takođe je moguće isporučiti i druge agense subjektu. Međutim, u nekim primerima izvođenja, nikakav protein ili nikakav biološki, osim α4 vezujućeg antitela i drugog agensa, se ne primenjuju subjektu kao farmaceutska kompozicija. α4 vezujuće antitelo i drugi agens mogu biti jedini agensi koji se isporučuju injekcijom. U primerima izvođenja u kojima je drugi agens rekombinantni protein, α4 vezujuće antitelo i drugi agens mogu biti jedini rekombinantni agensi koji se primenjuju subjektu, ili najmanje jedini rekombinantni agensi koji moduliraju imunski ili inflamatorni odgovor. U drugim pak primerima izvođenja, samo α4 vezujuće antitelo je jedini rekombinantni agens ili jedini biološki koji se primenjuje subjektu.

[0158] Ukoliko nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni termini koji se ovde upotrebljavaju imaju isto značenje kao što ih obično razume neko prosečnih veština u struci kojoj ovaj pronalazak pripada. Iako se postupci i materijali slični ili ekvivalentni onima koji su ovde opisani mogu upotrebljavati u praksi ili testiranju pronalaska, pogodni postupci i materijali su opisani ispod. Pored toga, materijali, postupci, i primeri su samo ilustrativni i nije im namena da budu ograničavajući.

PRIMER

Primer 1. Varijantna anti-VLA-4 antitela su potentnija od humanizovanog HP1/2.

[0159] Anti-VLA-4 antitela su konstruisana upotrebom regiona okvira IGKV4-1 germinativne linije (za dizajn L1 i L2) ili projektovanog AAH7033.1 germinativne linije (za dizajn L3) za VL lanac i regiona okvira IGHV1-f germinativne linije za VH. Ova antitela imala su manje bekmutacija nego humanizovano HP1/2 antitelo koje je opisano u S.A.D. patentu br.6,602,503.

Varijacije teškog lanca

[0160] Sekvence tri varijacije teškog lanca prikazane su na SL.1 kao Dizajn H0, Dizajn H1 i Dizajn H2. Svaki dizajn ima CDR murinskog HP1/2 graftovane u region okvira IGHV1-f. Dizajn H0 ne uključuje bekmutacije regiona okvira, dok Dizajn H1 i H2 imaju različite stepene bekmutacija u sekvencama regiona okvira da bi se optimalizovao afinitet humanizovanog antitela.

Varijacije lakog lanca

[0161] Sekvence četiri varijacije lakog lanca prikazane su na SL.2 kao Dizajn L0, Dizajn L1, Dizajn L2 i Dizajn L3 (takođe se nazivaju L0, L1, L2, L3). Svaki dizajn ima CDR murinskog HP1/2 graftovane u region okvira germinativne linije. Region okvira IGKV4-1 germinativne linije upotrebljen je za Dizajn L0, L1, i L2, a za Dizajn L3 upotrebljen je region okvira projektovanog AAH70335 germinativne linije. Dizajn L0 ne uključuje bekmutacije regiona okvira, dok Dizajn L1, L2, i L3 imaju različite stepene bekmutacija u regionima okvira da bi se optimalizovao afinitet humanizovanog antitela.

[0162] Rezultati kompetitivnih ELISA testova prikazani su u Tabeli 1 i na SL. 3. U ovom eksperimentu α4β1 je bio preinkubiran sa testirajućim mAb i zatim je murinsko HP1/2 upotrebljeno kao kompetitivni reagens. Rezultati ovog eksperimenta ukazuju da su antitela koja imaju lake lance L2 ili L3 potentnija od humanizovanog antitela HuHP1/2 koje je opisano u S.A.D. patentu br. 6,602,503. Rezultati su prikazani u Tabeli 1 ispod, i na SL. 3. Teški lanac (H1) u antitelima za ovaj test imao je sekvencu "Dizajn H1" prikazanu na SL.1, dok L1 označava Dizajn L1 na SL.2.

Tabela 1. ELISA kompetitivni test

4

[0163] U Tabeli 1, himerno mAb je himerizovano HP1/2antitelo, gde su murinski varijabilni teški i laki lanci genetički fuzionisani sa konstantnim regionima humanog IgG1. Ovo antitelo je u osnovi identično po afinitetu vezivanja sa izvornim murinskim HP1/2 antitelom (Sanchez-Madrid et al., Eur. J. Immunol. 16:1343-1349, 1996). Rezultati eksperimenta ukazuju na to da je moguće poboljšati afinitet monoklonalnog antitela u odnosu na njegovu murinsku roditeljsku sekvencu preko humanizacije na akceptorskom regionu okvira projektovanog germinativne linije.

[0164] Drugi kompetitivni test upoređuje afinitet vezivanja novih antitela sa humanizovanim 21.6 anti-α4 antitelom (Tysabri<®>(natalizumab)) koje je opisano u S.A.D. 5,840,299. U ovom eksperimentu testirano je vezivanje smeše mišjeg HP1/2 sa testirajućim mAb za α4β1. Rezultati ovog eksperimenta su prikazani na SL. 4 i u Tabeli 2 ispod, i ukazuju da su nova dizajnirana antitela oko 10 puta potentnija od natalizumaba.

Tabela 2. ELISA kompetitivni test

Primer 2. Humanizovano HP1/2 (HuHP1/2) vezuje VLA-4 na tumorskim ćelijskim linijama.

[0165] Vezivanje anti-VLA-4 antitela HuHP1/2 za različite ćelijske linije testirano je protočnom citometrijom. Vezivanje je testirano na CLL (hronična limfocitna leukemija) ćelijskim linijama Mec1 i JM1; na MM (multipli mijelom) ćelijskim linijama U266 i H929; i na AML (akutna mijelogena leukemija) ćelijskim linijama HL60 i KG1. HuHP1/2 je vezalo sve testirane tumorske ćelijske linije (SL. 6). Podaci protočne citometrije upotrebljeni su za izračunavanje EC50 vrednosti za vezivanje antitela za svaku od različitih ćelijskih linija. Ove informacije su prikazane ispod u Tabeli 3.

[0166] Takođe je pronađeno da HuHP1/2 blokira adheziju AML ćelijskih linija za fibronektin (FN) i VCAM1-Ig fuzioni protein. Da bi se testiralo da li antitelo može da blokira adheziju, AML ćelijskim linijama HL60 ili KG1 je omogućeno da adheriraju na bunariće obložene sa FN (SL. 7A) ili bunariće obložene sa VCAM1-Ig (SL. 7B) u prisustvu rastućih koncentracija HP1/2 ili izotipskog kontrolnog antitela. HuHP1/2 blokira adheziju oba tipa ćelija za bunariće obložene sa FN i bunariće obložene sa VCAM1-Ig. Maksimalna inhibicija vezivanja HL60 ćelija za oba liganda je postignuta sa 20 μg/ml HuHP1/2 (SL.7C).

[0167] Takođe je pronađeno da HuHP1/2 blokira adheziju MM ćelijskih linija za FN i VCAM1-Ig fuzioni protein. MM ćelijskim linijama U266 i H929 je omogućeno da adheriraju na bunariće obložene sa FN (SL. 8A) ili bunariće obložene sa VCAM1-Ig (SL. 8B) u prisustvu rastućih koncentracija HP1/2 ili izotipskog kontrolnog antitela. HuHP1/2 blokira adheziju oba tipa ćelijskih linija za bunariće obložene sa FN- i VCAM1-Ig. Maksimalna inhibicija vezivanja U266 ćelija za oba liganda je postignuta sa 20 μg/ml HuHP1/2 (SL.8C).

[0168] Takođe je pronađeno da HuHP1/2 blokira adheziju CLL ćelijskih linija za FN i VCAM1-Ig fuzioni protein. CLL ćelijskim linijama Mec1 i JM1 je omogućeno da adheriraju na bunariće obložene sa FN (SL. 9A) ili bunariće obložene sa VCAM1-Ig (SL. 9B) u prisustvu rastućih koncentracija HP1/2 ili izotipskog kontrolnog antitela. HuHP1/2 blokira adheziju oba tipa ćelijskih linija za bunariće obložene sa FN- i VCAM1-Ig. Maksimalna inhibicija vezivanja Mec1 ćelija za oba liganda je postignuta sa 20 μg/ml HuHP1/2 (SL.9C).

[0169] IC50 vrednosti vezivanja HuHP1/2 za tumorske ćelijske linije izračunate su iz podataka prikazanih na SL.7-9. Ovi podaci su prikazani u Tabeli 3.

Tabela 3. Kvantifikacija HuHP1/2 na tumorskim ćelijskim linijama

[0170] Ostali primeri izvođenja su u patentnim zahtevima.

4

4

4

4

4

4

1

2

4

Claims (6)

Patentni zahtevi

1. Farmaceutska kompozicija koja sadrži molekul rekombinantnog antitela, ili njegov α4-vezujući fragment, koji sadrži varijabilni teški lanac i varijabilni laki lanac, naznačena time što:

(a) varijabilni teški lanac sadrži sekvencu regiona okvira varijabilnog teškog lanca iz IGHV1-f i CDR iz VH lanca murinskog antitela HP1/2, pri čemu CDR1 sadrži sekvencu GFNIKDTYM, CDR2 sadrži sekvencu RIDPASGDTKYDPKFQV i CDR3 sadrži sekvencu GMWVSTGYALDF, i amino-kiselinski ostaci na pozicijama regiona okvira 24 i 94 varijabilnog teškog lanca u skladu sa Kabat šemom numeracije su supstituisani, pri čemu supstituisani ostatak na poziciji regiona okvira 24 je alanin (A) i supstituisani ostatak na poziciji regiona okvira 94 je asparaginska kiselina (D);

(b) varijabilni laki lanac sadrži sekvencu regiona okvira varijabilnog lakog lanca iz IGKV4-1 i CDR iz VL lanca murinskog antitela HP1/2, pri čemu CDR1 sadrži sekvencu KASQSVTNDVA, CDR2 sadrži sekvencu YASNRYT i CDR3 sadrži sekvencu QQDYSSPYT, i amino-kiselinski ostaci na pozicijama regiona okvira 1, 67 i 87 varijabilnog lakog lanca u skladu sa Kabat šemom numeracije su supstituisani, pri čemu supstituisani ostatak na poziciji regiona okvira 1 je serin (S), supstituisani ostatak na poziciji regiona okvira 67 je tirozin (Y) i supstituisani ostatak na poziciji regiona okvira 87 je fenilalanin (F);

i pri čemu molekul rekombinantnog antitela ili njegov α4-vezujući fragment vezuje VLA-4.

2. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 1, za upotrebu kao medikament u lečenju pacijenta.

3. Farmaceutska kompozicija za upotrebu u skladu sa patentnim zahtevom 2, naznačena time što pacijent ima kancer.

4. Farmaceutska kompozicija za upotrebu u skladu sa patentnim zahtevom 3, naznačena time što pacijent ima čvrsti tumor, hematološki malignitet, multipli mijelom ili akutnu mijelogenu leukemiju (AML).

5. Farmaceutska kompozicija za upotrebu u skladu sa patentnim zahtevom 2, naznačena time što pacijent ima inflamatorni poremećaj, multipla sklerozu, astmu, reumatoidni artritis, dijabetes, optički neuritis, Kronovu bolest, akutni poremećaj, povredu kičmene moždine ili traumatsku povredu mozga.

6. Farmaceutska kompozicija za upotrebu u skladu sa patentnim zahtevom 2, naznačena time što lečenje dodatno sadrži primenu pacijentu drugog terapijskog agensa, opciono odabranog od trombolitičkog agensa, hemioterapijskog agensa, neuroprotektivnog agensa, anti-inflamatornog agensa, steroida, citokina, ili faktora rasta.