RS60928B1 - Antitela koja vezuju il-23 - Google Patents

Description

Opis

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na antitela koja vezuju humani interleukin-23 (IL-23) i njihovu upotrebu.

[0002] Interleukin-23 (IL-23) je disulfidno povezani heterodimerni citokin sastavljen od p19 i p40 subjedinice. Deo je familije citokina interleukina-12 (IL-12). IL-12 je heterodimerni citokin od 70kDa koji se sastoji od kovalentno vezanih p40 i p35 subjedinica. IL-12 igra kritičnu ulogu u razvoju zaštitnih urođenih i stečenih imunih odgovora i u nadzoru tumora. IL-12 je takođe uključen u inflamatorni odgovor preko svoje sposobnosti da promoviše odgovor T pomoćnih ćelija tipa 1 (Th1). Međutim, funkcionalna uloga IL-12 u inflamatornom odgovoru je ponovo procenjena sa otkrićem srodnog citokina, IL-23. IL-23 je sastavljen od iste p40 podjedinice kao IL-12 ali je kovalentno uparen sa p19 podjedinicom. Mnogi od reagenasa korišćenih za procenu uloge IL-12 su usmereni protiv zajedničke IL- 12/IL-23 p40 subjedinice, što zači da aktivnost prethodno pripisavana IL-12 može biti posredovana preko IL-23. Razvoj IL-23 deficijentnih miševa omogućio je istraživačima da naprave razliku između aktivnosti IL-12 i IL-23 i identifikuju IL-23 kao esencijalni posrednik autoimunog/inflamatornog odgovora.

[0003] Funkcionalni IL-23 receptor je heterodimer od IL-12Rβ1 subjedinice, koja je deljena sa IL-12 receptorom, i IL-23R podjedinice. Receptor za IL-23 je konstitutivno povezan sa Janus kinazom 2 (Jak2) i predominantno aktivira STAT3, sa manje STAT4 aktivacije od IL-12.

[0004] IL-23 receptor je eksprimiran na aktiviranim/memorijskim T-ćelijama i ćelijma prirodnim ubicama (NK). Monociti, makrofagi i dendritske ćelije takođe eksprimiraju IL-23 receptor na niskom nivou. IL-23 pomaže diferencijaciju i održavanje naivnih CD4+ T-ćelija u novi subset ćelijna nazvan Th17 ćelije, koje se razlikuju od klasičnih Th1 i Th2 ćelija. Th17 ćelije proizvode interleukin-17A (IL-17A) i interleukin-17F (IL-17F). Thl7 ćelije proizvode opseg drugih faktora za koje je poznato da upravljaju infalamatornim odgovorima, uključujući faktore nekroze tumora za koje je poznato da upravljaju inflamatornim odgovorima, uključujući faktor nekroze tumora alfa (TNF-α), interleukin-6 (IL-6), faktor stimulisanja kolonije granulocita-makrofaga (GM-CSF), CXCL1 i CCL20. NK ćelije i i urođene limfoidne ćelije kao što je limfoidno tkivo indukuju (LTi)-slični da eksprimiraju IL-23 receptor i orfan receptor povezan sa gama retinoinskom kiselinom (ROR) i proizvode IL-17 kao odgovor na IL-23. IL-1β i IL-23 takođe ko-stimulišu gama-delta T ćelije da indukuju IL-17 proizvodnju bez angažovanja T ćelijskog receptora.

[0005] Postoje značajni dokazi da su IL-23 responsivne ćelije povezane sa autoimunim inflamatornim bolestima i kancerom. Naročito, IL-23 specifični inhibitor (tj. inhibitor koji inhibira IL-23 ali ne IL-12) bio bi naročito koristan jer se pretpostavlja da inhibicija IL-23 bez uticaja na IL-12 maksimizuje terapeutsku korist uz minimizovanje rizika od supresije odbrane domaćina.

[0006] Antitela koja se specifično vezuju za p19 subjedinicu IL-23 su potencijalno korisni inhibitori, videti, na primer, WO 2007/024846 i WO 2007/027714. Problem sa antitelima opisanim u WO 2007/024846, najmanje, je potencijal za tkivnu unakrsnu reaktivnost, naročito, potencijal da se vezuje tkivo retine, što se tiče bezbednosti. Dodatno, antitela opisana u WO 2007/024846, najmanje, imaju sub-optimalne fizičko-hemijske osobine, na primer, ekstremnu hidrofobnost koja dovodi do agregacije, koja predstavlja značajnu barijeru za proizvodnju antitela u industrijskoj razmeri. Dodatno, nijedno antitelo koje ciljno deluje na p19 subjedinicu IL-23 nije odobreno za terapeutsku upotrebu.

[0007] Stoga, ostaje potreba za IL-23 antitelima. Naročito, ostaje potreba za IL-23 antitelima koja se vezuju sa visokim afinitetom sa p19 subjedinicom IL-23, naročito, humanog IL-23, i ne vezuju se sa p40 subjedinicom srodnog člana familije citokina, IL-12. Specifičnije, ostaje potreba za IL-23 antitelima koja se vezuju sa visokim afinitetom za p19 subjedinicu IL-23 i ne prikazuju uočljivu tkivnu unakrsnu reaktivnost, naročito, unakrsnu reaktivnost u retinalnom tkivu. Takođe postoji potreba za IL-23 antitelima koja poseduju farmaceutski prihvatljive fizičko-hemijske osobine koje olakšavaju razvoj, proizvodnju ili formulaciju.

[0008] Opisano je antitelo koje vezuje p19 subjedinicu humanog IL-23 koja sadrži laki lanac i teški lanac, gde laki lanac sadrži varijabilni region lakog lanca (LCVR) i teški lanac sadrži varijabilni region teškog lanca (HCVR), gde LCVR sadrži aminokiselinske sekvence LCDR1, LCDR2, i LCDR3, i HCVR sadrži aminokiselinske sekvence HCDR1, HCDR2, i HCDR3, gde LCDR1 je SEQ ID NO:4, LCDR2 je SEQ ID NO:5, LCDR3 je SEQ ID NO:6, HCDR1 je SEQ ID NO:1, HCDR2 je SEQ ID NO:2, i HCDR3 je SEQ ID NO:3.

[0009] Predmetni pronalazak sadrži antitelo koje se vezuje za p19 subjedinicu humanog IL-23 koja sadrži laki lanac i teški lanac, gde laki lanac sadrži varijabilni region lakog lanca (LCVR) i teški lanac sadrži varijabilni region teškog lanca (HCVR), gde aminokiselinska sekvenca LCVR je SEQ ID NO: 8 i aminokiselinska sekvenca HCVR je SEQ ID NO: 7.

[0010] U sledećem primeru izvođenja predmetnog pronalaska, antitelo sadrži dva varijabilna regiona lakog lanca (LCVRs) i dva varijabilna regiona teškog lanca (HCVRs), gde aminokiselinska sekvenca svakog LCVR je SEQ ID NO: 8 i aminokiselinska sekvenca svakog HCVR je SEQ ID NO: 7.

[0011] U sledećem primeru izvođenja predmetnog pronalaska, antitelo sadrži laki lanac i teški lanac, gde aminokiselinska sekvenca lakog lanca je SEQ ID NO: 10 i aminokiselinska sekvenca teškog lanca je SEQ ID NO: 9.

[0012] U sledećem primeru izvođenja predmetnog pronalaska, antitelo sadrži dva laka lanca i dva teška lanca, gde aminokiselinska sekvenca svakog lakog lanca je SEQ ID NO: 10 i aminokiselinska sekvenca svakog teškog lanca je SEQ ID NO: 9.

[0013] Opisano je antitelo koje se vazuje za p19 subjedinicu humanog IL-23 koj asadrži laki i teški lanac gde laki lanac sadrži varijabilni region lakog lanca (LCVR) i teški lanac sadrži varijabilni region teškog lanca (HCVR), gde LCVR sadrži regione koji određuju komplementarnost LCDR1, LCDR2, i LCDR3, i HCVR sadrži regione koji određuju komplementarnost HCDR1, HCDR2, i HCDR3, i gde LCDR1 se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:4, LCDR2 se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:5, LCDR3 se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:6, HCDR1 se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:1, HCDR2 se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:2, i HCDR3 se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:3.

[0014] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje antitelo koje se vezuje za p19 subjedinicu humanog IL-23 koja sadrži laki lanac i teški lanac, gde laki lanac sadrži varijabilni region lakog lanca (LCVR) i teški lanac sadrži varijabilni region teškog lanca (HCVR), gde LCVR lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 8 i HCVR lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 7.

[0015] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje antitelo koje se vezuje za p19 podjedinicu humanog IL-23 koja sadrži laki lanac i teški lanac, gde laki lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 10 i teški lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 9.

[0016] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje antitelo koje se vezuje za p19 podjedinicu humanog IL-23 koja sadrži dva laka lanca i dva teška heavy lanca, gde svaki laki lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 10 i svaki teški lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 9.

[0017] Aminokiselinske sekvence antitela prema predmetnom pronalasku su obezbeđena u nastavku.

[0018] Opisano je antitelo koje se vezuje za p19 subjedinicu humanog IL-23 na konformacionom epitopu unutar aminokiselinskih položaja 81-99 i 115-140 iz SEQ ID NO: 15.

[0019] Anitelo prema predmetnom pronalasku je selektivno prema p19 subjedinici humanog IL-23.

[0020] Kada je vezano za p19 subjedinicu humanog IL-23, antitelo prema predmetnom pronalasku sprečava vezivanje humanog IL-23 sa IL-23 subjedinicom IL-23 receptora. Shodno tome, antitelo prema predmetnom pronalasku inhibira aktivnost humanog IL-23 na humanoj IL-23 subjedinici IL-23 receptora.

[0021] Anitelo prema predmetnom pronalasku ne sprečava vezivanje humanog IL-23 sa IL-12Rβ1 subjedinicom IL-23 receptora i, stoga, ne inhibira aktivnost humanog IL-23 na IL-12Rβ1 subjedinici IL-23 receptora.

[0022] Antitelo se ne vezuje detektabilno sa p40 subjedinicom koja je zajednička za humani IL-23 i humani IL-12.

[0023] U sledećem primeru izvođenja pronalaska, antitelo ima neutralizujuću aktivnost prem p19 subjedinici humanog IL-23.

[0024] U sledećem primeru izvođenja pronalaska, anitelo prema predmetnom pronalasku ima IC50od manje od ili jednako oko 90 pM. Poželjno, anitelo prema predmetnom pronalasku ima IC50od manje od ili jednako oko 74 pM. IC50vrednosti su merene u in vitro analizi mišjih splenocita kao što je opisano u odeljku pod naslovom "In Vitro neutralizacija humonog ili makaki IL-23 sa antitelom I u mišjim splenocitama" u Primeru 1.

[0025] U sledećem primeru izvođenja pronalaska, anitelo prema predmetnom pronalasku je selektivno i ima neutralizujuću aktivnost ne p19 subjedinicu humanog IL-23.

[0026] U sledećem primeru izvođenja pronalaska, anitelo prema predmetnom pronalasku ima ravnotežnu konstantu disocijacije, KD, od oko 10 pM do oko 30 pM za humani IL-23. Poželjno, anitelo prema predmetnom pronalasku ima KDod oko 21 pM za humani IL-23. KDvrednosti su ustanovljene kinetikom vezivanja na 37°C kao što je opisano u odeljku pod naslovom "Merenje afiniteta vezivanja sa rezonanacom površinskog plazmona (BIAcore za antitelo I" u Primeru 1. Anitelo prema predmetnom pronalasku je dodatno karakterisano konstopom za p19 subjedinicu humanog IL-23 od oko 2.2 x 10<6>M<-1>sec<-1>do oko 2.6 x 10<6>M<-1>sec<-1>. Poželjno, anitelo prema predmetnom pronalasku ima konstopu za p19 subjedinicu humanog IL-23 od oko 2.43 x 10<6>M<-1>sec<-1>. Anitelo prema predmetnom pronalasku je dodatno karakterisano sa koffstopom za p19 subjedinicu humanog IL-23 od oko 0.30 x 10<-4>sec<-1>do oko 0.70 x 10<-4>sec<-1>. Poželjno, anitelo prema predmetnom pronalasku ima koffstopu za p19 subjedincu humanog IL-23 od oko 0.52 x 10<-4>sec<-1>.

[0027] Anitelo prema predmetnom pronalasku se vezuje za p19 subjedinicu humanog IL-23 sa visokim afinitetom. Za svrhe predmetnog opisa, termin "visoki afinitet" odnosi se na KDod najmanje oko 21 pM. KDvrednosti su ustanovljene kinetikom vezivnja na 37°C kao što je opisano u odeljku pod naslovom "Merenje afiniteta vezivanja sa rezonanacom površinskog plazmona (BIAcore za antitelo I" u Primeru 1.

[0028] Za razliku od određenih antitela iz prethodne tehnike koja se vezuju za humani IL-23, anitelo prema predmetnom pronalasku ne pokazuje uočljivu tkivnu unakrsnu reaktivnost. Naročito, anitelo prema predmetnom pronalasku ne vezuje se uočljivo za tkivo retine.

[0029] Anitelo prema predmetnom pronalasku poseduje farmaceutski prihvatljive fizičkohemijske osobine, uključujući farmaceutski prihvatljivu rastvorljivost u fiziološkim i laboratorijskim uslovima, i farmaceutski prihvatljivu hemijsku i fizičku stabilnost gde antitelo ostaje u monomernom obliku i uočava se veoma malo agregata visoke molekulske težine (HMW) pod opsegom uslova kao što je opisano u odeljku pod naslovom "Fizičko-hemijske osobine IL-23 antitela" u Primeru 1.

[0030] Predmetni pronalazak dodatno obezbeđuje farmaceutske kompozicije koje sadrže antitelo prema predmetnom pronalasku i jedan ili više farmaceutski prihvatljivih nosača, razblaživača ili ekscipijenata. Specfičnije, farmaceutske kompozicije prema predmetnom pronalasku dodatno sadrže jedno ili više dodatnih terapeutskih sredstava.

[0031] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje postupak za tretiranje ili prevenciju stanja kod pacijenta, koji sadrži primenu na pacijenta kome je to potreno efikasne količine antitela prema predmetnom pronalasku, gde je stanje autoimuno ili inflamatorno stanje izabrano iz grupe koja se sastoji od multiple skleroze, reumatoidnog artritisa, psorijaze, inflamatorne bolesti creva, ankiloznog spondilitisa, bolesti graft-protiv-domaćina, lupusa i metaboličkog sindroma.

[0032] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje postupak za tretiranje ili sprečavanje stanja kod pacijenta, koji sadrži primenu na pacijenta kome je to potrebno efikasne količine antitela prema predmetnom pronalasku, gde stanje je kancer.

[0033] U primeru izvođenja predmetnog pronalaska, kancer je melanom, kancer debelog creva, jajnika, glave i vrata, pluća, dojke, ili želudca.

[0034] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje anitelo prema predmetnom pronalasku za upotrebu u terapiji.

[0035] Specifičnije, predmetni pronalazak obezbeđuje anitelo prema predmetnom pronalasku za upotrebu u tremanu ili prevenciji autoimunog ili inflamatornog stanja izabranog iz grupe koja se sastoji od multiple skleroze, reumatoidnog artritisa, psorijaze, inflamatornih bolesti creva, ankiloznog spondilitisa, bolesti graft-protiv-domaćina, lupusa i metaboličkog sindroma.

[0036] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje anitelo prema predmetnom pronalasku za upotrebu u tretmanu ili prevenciji kancera.

[0037] U primeru izvođenja predmetnog pronalaska, kancer je melanom, kancer debelog creva, jajnika, glave i vrata, pluća, dojke, ili želudca.

[0038] Predmetni pronalazak obezbeđuje upotrebu antitela prema predmetnom pronalasku u proizvodnji medikamenta za tretman ili prevenciju stanja izabranih iz grupe koja se sastoji od multiple skleroze, reumatoidnog artritisa, psorijaze, inflamatorne bolesti creva, ankiloznog spondilitisa, bolesti graft-protiv-domaćina, lupusa i metaboličkog sindroma.

[0039] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje upotrebu antitela prema predmetnom pronalasku u proizvodnji medikamenta za tretman ili prevenciju kancera.

[0040] U primeru izvođenja predmetnog pronalaska, kancer je melanom, kancer debelog creva, jajnika, glave i vrata, pluća, dojke, ili želudca.

[0041] Predmetni pronalazak takođe se odnosi na polinukleotide koji kodiraju prethodno opisano antitelo prema predmetnom pronalasku.

[0042] Predmetni pronalazak obezbeđuje DNK molekul koji sadrži polinukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 10.

[0043] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje DNK molekul koji sadrži polinukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 9.

[0044] U jednom primeru izvođenja, predmetni pronalazak obezbeđuje polinukleotid koji kodira antitela prema predmetnom pronalasku, gde HCVR je kodiran sa SEQ ID NO: 11 i LCVR je kodiran sa SEQ ID NO: 12.

[0045] U sledećem primeru izvođenja, predmetni pronalazak obezbeđuje polinukleotid koji kodira antitela prema predmetnom pronalasku, gde teški lanac je kodiran sa SEQ ID NO: 13 i laki lanac je kodiran sa SEQ ID NO: 14.

[0046] Polinukleotidi prema predmetnom pronalasku mogu biti u obliku RNK ili u obliku DNK, pri čemu DNK uključuje cDNK, i sintetičku DNK. DNK može biti dvolančana ili jednolančana. Kodirajuće sekvence koje kodiraju anitelo prema predmetnom pronalasku mogu varirati kao rezultat redundancije ili degenerisanosti genetskog koda.

[0047] Polinukleotidi koji kodiraju anitelo prema predmetnom pronalasku mogu uključivati sledeće: samo kodirajuću sekvencu za antitelo, kodirajuću sekvencu za antitelo i dodatnu kodirajuću sekvencu kao što je lider ili sekretorna sekvenca ili pro-protein sekvenca; kodirajuću sekvencu za antitelo i ne-kodirajuću sekvencu, kao što su introni ili ne-kodirajuća sekvenca 5’ i/ili 3’ od kodirajuće sekvence za protein. Stoga termin "polinukleotid koji kodira antitelo" obuhvata polinukleotid koji mne uključuje samo kodriajuću sekvencu za protein već takođe polinukleotid koj uključuje dodatnu kodirajuću i/ili ne-kodirajuću sekvencu.

[0048] Polinukleotidi prema predmetnom pronalasku će biti eksprimirani u ćeliji domaćinu nakon što su sekvence operativno vezane sa sekvencom za kontrolu ekspresije. Ekspresioni vektori se tipično mogu replicirati u organizmima domaćinima ili kao epizomi ili kao integralni deo hromozomske DNK domaćina. Uobičajeno, ekspresioni vektori će sadržati selekcione markere, npr., tetraciklin, neomicin, i dihidrofolat reduktazu, da bi se omogućila detekcija onih ćelija transformisanih sa željenim DNK sekvencama.

[0049] Predmetni pronalazak obezbeđuje rekombinantnu ćeliju domaćina koja sadrži DNK molekul koji sadrži polinukleotidnu sekvencu koja kodria polipeptisd lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 10 i DNK molekul koji sadrži polinukelotidnu sekvencu koja kodira polipeptid teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 9, pri čemu je ćelija sposobna da eksprimira antitelo koje sadrži teški lanac i laki lanac, gde aminokiselinska sekvenca teškog lanca je SEQ ID NO: 9 i aminokiselinska sekvenca lakog lanca je SEQ ID NO: 10.

[0050] Anitelo prema predmetnom pronalasku može se lako proizvesti u sisarskim ćelijama kao što su CHO, NS0, HEK293 ili COS ćelije; u bakterijskim ćelijama kao što su E. coli, Bacillus subtilis, ili Pseudomonas fluorescence; ili u ćelijama gljiva i kvasca. Ćelije domaćini su kultivisani korišćenjem tehnika dobro poznatih u tehnici.

[0051] Vektori koji sadrže polinukleotidne sekvence od interesa (npr., polinukleotide koji kodiraju polipeptide antitela i sekvence koje kontrolišu ekspresiju) mogu se preneti u ćeliju domaćina dobro poznatim postupcima, koji variraju u zavisnosti od ćelijskog domaćina. Na primer, transformacija kalcijum hloridom se uobičajeno koristi za prokariotske ćelije, dok se tretman kalcijum fosfatom ili elektroporacija mogu koristiti za druge ćelijske domaćine.

[0052] Različiti postupci prečišćavanja proteina mogu se koristiti i takvi postupci su poznati u tehnici i opisani su, na primer, u Deutscher, Methods in Enzymology 182: 83-89 (1990) i Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, 3rd Edition, Springer, NY (1994).

[0053] Dodatno, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak za proizvodnju antitela koje se vezuje za p19 subjedinicu humanog IL-23 koja ima teški lanac i laki lanac, gde aminokiselinska sekvenca teškog lanca je SEQ ID NO: 9 i aminokiselinska sekvenca lakog lanca je SEQ ID NO: 10, pri čemu pomenuti postupak koji sadrži korake:

a) kultivisanja rekombinanatne ćelije domaćina koja sadrži prvu polinukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptidnu sekvencu datu sa SEQ ID NO: 9 i drugu polinukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptidnu sekvencu datu sa SEQ ID NO: 10, pod takvim uslovima da su pomenute polipeptidne sekvence eksprimirane; i

b) rekuperacije antitela iz pomenute ćelije domaćina koje sadrži teški lanac i laki lanac, pri čemu polipeptidna sekvenca pomenutog teškog lanca je data sa SEQ ID NO: 9 i polipeptidna sekvenca pomenutog lakog lanca je data sa SEQ ID NO: 10.

[0054] U jednom primeru izvođenja prethodno opisanog postupka, prva nukleotidna sekvenca koja kodira polipeptidnu sekvencu datu sa SEQ ID NO: 9 i druga polinukelotidna sekvenca koja kodira polipeptidnu sekvencu datu sa SEQ ID NO: 10 su deo istog molekula nukleinske kiseline.

[0055] U primeru izvođenja, predmetni pronalazak obezbeđuje antitelo proizvedeno sa pretohodno pomenutim postupkom.

[0056] U sledećem primeru izvođenja, antitelo proizvedeno sa prethodno pomenutim postupkom ima dva teška lanca i laka lanca, gde polipeptidna sekvenca svakog teškog lanca je data sa SEQ ID NO: 9 i polipeptidna sekvenca svakog lakog lanca je data sa SEQ ID NO: 10.

[0057] Anitelo prema predmetnom pronalasku je antitelo IgG tipa i ima četiri aminokiselinska lanca (dva "teška" lanca i dva "laka" lanca) koji su unakrsno vezani preko intra- i inter-lančanih disulfidnih veza. Kada su eksprimirana u određenim biološkim sistemima, antitela koja imaju nativne humane Fc sekvence su glikozilovana u Fc regionu. Antitela mogu takođe biti glikozilovana na drugim položajima.

[0058] Svaki teški lanac se sastoji od N-terminalnog HCVR i konstantnog regiona teškog lanca ("HCCR"). Humani teški lanci su klasifikovani kao gma, mu, alfa, delta, ili epsilon, i definišu izotip antitela kao IgG, IgM, IgA, IgD, ili IgE, respektivno. Humana IgG antitela mogu biti dodatno podeljena u potklase, npr., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4.

[0059] Poželjno, anitelo prema predmetnom pronalasku sadrži Fc deo koji je izveden iz humanog IgG4 Fc regiona usled smanjene sposobnosti da angažuje Fc receptor-posredovane inflamatorne mehanizme ili da aktivira komplement što rezultuje u smanjenoj efektornoj funkciji.

[0060] Poželjnije, anitelo prema predmetnom pronalasku sadrži IgG4-PAA Fc deo. IgG4-PAA Fc deo ima serin u prolin mutaciju na položaju 223 (S223P; SEQ ID NO: 9), fenilalanin u alanin mutaciju na položaju 229 (F229A; SEQ ID NO: 9) i leucin u alanin mutaciju na položaju 230 (L230A; SEQ ID NO: 9). S223P mutacija je zglobna mutacija koja sprečava formiranje poluantitela (fenomen dimaničke izmene polumolekula u IgG4 antitelima). F229A i L230A mutacije dodatno smanjuju efektornu funkciju koja je već niska kod humanog IgG4 izotipa.

[0061] Svaki tip teškog lanca je takođe karakterisan sa specifičnim konstantnim regionom sa sekvencom koja je dobro poznata u tehnici. Konstantni region teškog lanca se sastoji od tri domena (CH1, CH2, i CH3) za IgG.

[0062] Laki lanci su klasifikovani kao kapa ili lambda, pri čemu je svaki karakterisan sa naročitim konstantnim regionom kao što je poznato u tehnici. Svaki laki lanac se sastoji od LCVR i konstantnog regiona lakog lanca ("LCCR"). Poželjno, anitelo prema predmetnom pronalasku sadrži kapa laki lanac.

[0063] Varijabilni regioni svakog para laki/teški lanac formiraju mesto vezivanja antitela. HCVR i LCVR regioni mogu dodatno biti podeljeni u regione hiper-varijabilnosti, koji se nazivaju regioni koji određuju komplementarnost ("CDRs"), raštrkani sa regionima koji su konzervativniji, nazvani okvirni regioni ("FR"). Svaki HCVR i LCVR je sastavljen od tri CDRs i četiri FRs, aranžirana od amino-terminusa do karboksi-terminusa sledećeim redosledom: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Ovde, tri CDRs teškog lanca označavaju se kao "HCDR1, HCDR2, i HCDR3" i tri CDRs lakog lanca označavaju se kao "LCDR1, LCDR2 i LCDR3". CDRs sadrže najviše ostataka koji formiraju specifične interakcije sa antigenom. Postoje tri sistema CDR obeležavanja za antitela koja se koriste za opisivanje sekvence. Kabat CDR definicija (Kabat et al., "Sequences of Proteins of Imunological Interest," National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)) zasnovana je na varijabilnosti sekvence antitela. Chothia CDR definicija (Chothia et al., "Canonical structures for the hypervariable regions of imunoglobulins", Journal of Molecular Biology, 196, 901-917 (1987); Al-Lazikani et al., "Standard conformations for the canonical structures of imunoglobulins", Journal of Molecular Biology, 273, 927-948 (1997)) zasnovana je na trodimenzionalnim strukturama antitela i topologijama CDR petlji. Chothia CDR definicije su identične sa Kabat CDR definicijama uz izuzetak HCDR1 i HCDR2. North CDR definicija (North et al., "A New Clustering of Antitelo CDR Loop Conformations", Journal of Molecular Biology, 406, 228-256 (2011)) zasnovana je na klasterovanju propagacije afiniteta sa velikim brojem kristalnih struktura.

[0064] Za svrhe predmetnog pronalaska, konsenzus tri postupka je korišćen za definisanje CDRs. U slučaju CDRs lakog lanca, korišćene su Kabat i Chothia CDR definicije. U slučaju HCDR1, korišćen je hibrid Kabat i Chothia CDR definicija. Kabat definicija HCDR1 počinje osam ostataka nakon prvog cisteina teškog lanca i dužine je pet ostataka, dok Chothia definicija HCDR1 počinje tri ostataka nakon ovog cisteina i dužine je sedam ostataka. HCDR1 anitela prema predmetnom pronalasku je definisan prema Chothia početnom položaju i Kabat krajnjem položaju. U slučaju HCDR2, korišćena je Kabat CDR definicija. U slučaju HCDR3, korišćen je hibrid North, Kabat i Chothia CDR definicija. Kabat definicija HCDR3 sadrži ostatake 95-102 teškog lanca (SEQ ID NO: 13 za anitelo prema predmetnom pronalasku) i tipično počinje tri ostataka nakon cisteina. Chothia definicija HCDR3 je ista kao Kabat definicija. North definicija HCDR3 sadrži ostatke 93-102 teškog lanca (SEQ ID NO: 13 za anitelo prema predmetnom pronalasku) i tipično počinje odmah nakon cisteinskog ostatka. HCDR3 anitela prema predmetnom pronalasku je definisan sa North počenim položajem i Kabat/Chothia/North krajnjim položajem.

[0065] Tabela 1 prikazuje primer označavanja CDR anitela prema predmetnom pronalasku.

Tabela 1: Označavanje CDR

[0066] Antitelo prema predmetnom pronalasku je konstruisano antitelo koje je dizajnirano da ima okvirne regione, zglobne regione, i konstantne regione humanog porekla koji su identični sa ili suštinski identični (suštinski humani) sa okvirnim regionima i konstantnim regionima izvedenim iz humanih genomskih sekvenci. Potpuno humani okvirni regioni, zglobni regioni, i konstantni regioni su one sekvence humane klicine linije kao i sekvence sa mutacijama koje se javljaju u prirodi i one sa konstruisanim mutacijama. Antitela prema predmetnom pronalasku mogu sadržati okvirne regione, zglobne regione, i konstantne regione izvedene iz potpuno humanih okvirnih regiona, zglobnih regiona, i konstantnih regiona koji sadrže jednu ili više aminokiselinskih supstitucija, delecija, ili adicija u njima. Dodatno, antitelo prema predmetnom pronalasku je poželjno suštinski neimunogeno u ljudima.

[0067] Brojne različite sekvence humanog okvirnog regiona mogu se koristiti pojedinačno ili u kombinaciji kao osnova za antitela prema predmetnom pronalasku. Poželjno, okvirni regioni antitela prema predmetnom pronalasku su humanog porekla ili suštinski humana (najmanje 95%, 97% ili 99% humanog porekla.) Sekvence okvirnih regiona humanog porekla mogu se dobiti iz The Imunoglobulin Factsbook, by Marie-Paule Lafranc, Gerard Lefranc, Academic Press 2001, ISBN 012441351.

[0068] Sekvenca okvirnog regiona za antitela prema predmetnom pronalasku služi kao "donor" varijabilnog okvirnog regiona i može se koristiti da se stvore dodatna antitela sa istim CDRs specificiranim ovde korišćenjem metodologije poznate u tehnici. Dodatno, okvirna sekvenca za antitela prema predmetnom pronalasku može se uporediti sa drugim poznatim humanim okvirnim sekvencama da bi se stvorila dodatna antitela. Stoga, ova informacija se može koristiti da se "povratno mutira" drugi izabrani homologi humani okvirni region u donor aminokiselinskom ostatku na ovim položajima. Dodatno, bilo koje "retke" aminokiseline se mogu detektovati u dodatnim humanim okvirnim regionima tako da se konsenzus ili donor aminokselinski ostatak može koristiti na relevantnom položaju.

[0069] Postupci za proizvodnju i prečišćavanje antitela su dobro poznati u tehnici i mogu se naći, na primer, u Harlow and Lane (1988) Antibodies. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York, Chapters 5-8 and 15. Na primer, miševi mogu biti imunizovani sa humanim IL-23, ili njegovim fragmentima, i rezultujuća antitela se zatim mogu rekuperovati, prečistiti i odrediti aminokiselinske sekvence korišćenjem konvencionalnih postupaka dobro poznatih u tehnici. Anitelo prema predmetnom pronalasku je konstruisano da sadrži jedan ili više humanih okvirnih regiona koji okružuju CDRs izveden iz ne-humanog antitela. Sekvence humanog okvirnog regiona klicine linije mogu se dobiti od ImunoGeneTics (IMGT) preko njihovog internet sajta http://imgt.cines.fr, ili od The Imunoglobulin Facts Book od strane Marie-Paule Lefranc and Gerard Lefranc, Academic Press, 2001, ISBN 012441351. Naročito, okvirni regioni lakog lanca klicine linije za upotrebu u antitelu prema predmetnom pronalasku uključuju 02.

[0070] Specifični okvirni regioni teškog lanca klicine linije za upotrebu u anitelu prema predmetnom pronalasku uključuju VH1-69.

[0071] Konstruisana antitela prema predmetnom pronalasku mogu se pripremiti i prečistiti korišćenjem poznatih postupaka. Na primer, cDNK sekvence koje kodiraju teški lanac (na primer, aminokiselinska sekvenca data u SEQ ID NO: 9) i laki lanac (na primer, aminokiselinska sekvenca data u SEQ ID NO: 10) mogu se klonirati i konstruisati u GS (glutamin sintetaza) ekspresioni vektor. Konstruisani imunoglobulinski ekspresioni vektor može se zatim stabilno transficirati u CHO ćelije. Sisarska ekspresija antitela će rezultovati u glikozilaciji, tipično na visoko konzervativnim N-glikozilacioonim mestima u Fc regionu. Stabilni klonovi mogu se verifikovati u odnosu na ekspresiju antitela koje se specifično vezuje za humani IL-23. Pozitivni klonovi se mogu raširiti u medijumu kulture bez seruma za proizvodnju antitela u bioreaktorima. Medijum, u koji je izlučeno antitelo, može se prečistiti konvencionalnim tehnikama. Na primer, medijum može biti konvencionalno primenjen na Protein A ili G sefaroza FF kolonu koja je ekvilibrisana sa kompatibilnim puferom, kao što je fosfatno puferovani fiziološki rastvor. Kolona je isprana da bi se uklonile komponente koej se nespecifično vezuju. Vezano antitelo je eluirano, na primer, sa pH gradijentom i frakcije antitela su detektovane, kao što je sa SDS-PAGE, i zatim pulovane. Antitelo može biti koncentrovano i/ili sterilno filtrirano korišćenjem uobičajenih tehnika. Rastvorljivi agregat i multimeri mogu se efikasno ukloniti uobičajenim tehnikama, uključujući ekskluzionu, sa hideofobnom interakcijom, jono-izmenjivačku, ili hidroksiapatitinu hromatografiju. Proizvod može biti odmah zamrznut, na primer na -70°C, ili može biti liofilizovan.

[0072] Antitela prema predmetnom pronalasku su monoklonska antitela. "Monklonsko antitelo" ili "mAb", kao što je ovde korišćeno, odnosi se na antitelo koje je izvedeno iz jedne kopije ili klona uključujući, na primer, bilo koji eukariotski, prokariotski, ili fagni klon, i ne na postupak kojim je proizvedeno. Njihova monoklonska antitela mogu se proizvesti, na primer, tehnologijama hibridoma, rekombinantnim tehnologijama, tehnologijama fagnog prikaza, sintetčkim tehnologijama, npr., CDR graftovanje, ili kombinacijama takvih ili drugih tehnologija poznatih u tehnici. U sledećem primeru izvođenja antitelo prema pronalasku, ili nukleinska kiselina koja kodira isto, obezbeđeno je u izolovanom obliku.

[0073] Anitelo prema predmetnom pronalasku, ili farmaceutske kompoziicje koje sadrže isto, mogu se primeniti parenteralnim putevima (npr., potkožno, intravenski, intraperitonealno, intramuskularno, ili transdermalno).

[0074] Farmaceutske kompozicije prema predmetnom pronalasku mogu se pripremiti postupcima koji su dobro poznati u tehnici (npr., Remington: The Science and Practice a/Pharmacy, 19th edition (1995), (A. Gennaro et al., Mack Publishing Co.) i sadrže antitelo kao što je ovde opisano, i jedan ili više farmaceutski prihvatljivih nosača, razblaživača, ili ekscipijenata. Na primer, antitela prema predmetnom pronalasku mogu se formulisati sa sredstvima kao što su natrijum citrat, limunska kiselina, polisorbat 80, natrijum hlorid i saharoza i rezultujuća kompozicija se zatim može liofilizovati i uskladištiti na 2°C - 8°C. Liofilizovana kompozicja se zatim može rekonstituisati sa sterilnom vodom za injekciju pre primene.

[0075] Termin "veže (ili "vezuje") sa p19 subjedinicom humanog IL-23", kao što je ovde korišćeno, odnosi se na detektabilnu interakciju anitela prema predmetnom pronalasku sa epitopom na p19 subjedinici humanog IL-23 datom sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 15. Interakcija između anitela prema predmetnom pronalasku i p19 subjedinice humanog IL-23 merena je kintikom vezivanja na 37°C kao što je opisano u odeljku pod naslovom "Merenje afiniteta vezivanja sa površinskom plazmon rezonanacom (BIAcore) za antitelo I" u Primeru 1.

[0076] Termin "epitop" kao što je ovde korišćeno odnosi se na aminokiselinske ostatke koji se nalaze u međusobnoj blizini na površini proteina (antigena) i interaguju sa antitelom. Postoje dve široke klase epitopa: linearni epitopi i konformacioni epitopi.

[0077] Termin "linearni epitop" kao što je ovde korišćeno odnosi se na kontinuiranu primarnu aminokiselinsku sekvencu određenog regiona proteina.

[0078] Termin "konformacioni epitop" kao što je ovde korišćeno odnosi se na diskontinuirane delove aminokiselinske sekvence antigena koje su u kontaktu sa antitelom prema pronalasku. Konformacioni epitopi su definisani strukturom kao i sekvencom nativnog proteina; ovi epitopi mogu biti kontinuirani ili diskontinuirani. Komponente epitopa mogu se nalaziti na različitim delovima proteina, koji su dovedeni u međusobnu blizinu u savijenoj strukturi nativnog proteina.

[0079] Termin " uočljivo ne vezuje tkivo retine", kao što je ovde korišćeno, odnosi se na odsustvo detektabilne interakcije anitela prema predmetnom pronalasku sa humanim ili makaki tkivom retine. Interakcija između anitela prema predmetnom pronalasku i humanog i makaki tkiva retine procenjena je imunohistohemijskom analizom kao što je opisano u odeljku pod naslovom "Unakrsna reaktivnost tkiva retine: In vitro analiza sa imunohistohemijom" u Primeru 1. Termin "uočljivo" kao što je korišćeno u predmetnom kontekstu odnosi se na vizuelnu procenu humanog i makaki tkiva retine da bi se odredilo da li se anitelo prema predmetnom pronalasku vezuje za pomenuto humano i makaki tkivo retine.

[0080] Termin "selektivno" kao što je ovde korišćeno u odnosu na antitela prema predmetnom pronalasku odnosi se na antitelo oje se vezuje za p19 subjedinicu humanog IL-23 ali se ne vezuje za p40 subjedinicu zajedničku za humani IL-23 i humani IL-12.

[0081] Termin "neutralizuje" odnosi se na "neutrališuće antitelo", kao što je ovde korišćeno, namera je da se odnosi na inhibiciju biološke aktivnosti humanog IL-23. Merenje jednog ili više indikatora IL-23 biološke aktivnosti kao što je određeno korišćenjem ili bioanalize sa mišjim splenocitama (videti odeljak pod naslovom "In vitro neutralizacija humanog ili makaki IL-23 sa antitelom I u mišjim splenocitama u Primeru 1) ili analiza neutralizacije humanog IL-23 (videti odeljak pod naslovom "Neutralizacija humanog IL-23: akutna, lokalna" u Primeru 1) može procenit ou inhibiciju biološke aktivnosti humanog IL-23.

[0082] Namera je da se termin "KD", kao što je ovde korišćeno, odnosi na konstantu disocijacije određene antitelo-antigen interakcije. Izračunata je iz formule:

[0083] Namera je da se termin "kon", kao što je ovde korišćeno, odnosi na konstantu stope asocijacije ili on, ili specifičnu reakcionu stopu, reakcije formiranja kompleksa, merene u jedinicama: M<-1>sek<-1>.

[0084] Namera je da se termin "koff", kao što je ovde korišćeno, odnosi na konstantu stope disocijacije ili off, ili specifičnu reakcionu stopu, za disocijaciju antitela sa antitelo/antigen kompleksa, mereno u jedinicama: sek<-1>.

[0085] Namera je da se termin "IC50", kao što je ovde korišćeno, odnosi na efiaksnu koncentraciju antitelo prema predmetnom pronalasku koja je potrebna da neutralizuje 50% bioaktivnosti IL-23 na mišjim splenocitama u bioanalizi opisanoj u odeljku pod naslovom "In vitro neutralizacija humanog ili makaki IL-23 sa antitelom I u mišjim splenocitama u Primeru 1.

[0086] Namera je da termin "polinukleotid", kao što je ovde korišćeno, uključuje DNK molekule i RNK molekule. Molekul nukleinske kiseline može biti jednolančani ili dvolančani.

[0087] Termin "izolovan", kao što je ovde korišćeno, odnosi se na protein, peptid ili nukleinsku kiselinu koji su oslobođeni ili suštinski oslobođeni od drugih makromolekulskih vrsta koje se nalaze u ćelijskom okruženju.

[0088] Termin "suštinski oslobođen", kao što je ovde korišćeno, znači da protein, peptid ili nukleinska kiselina od interesa sadrži više od 80% (na molarnoj osnovi) prisutnih makromolekulskih vrsta, poželjno više od 90% i poželjnije više od 95%.

[0089] "Pacijent" je sisar, poželjno čovek.

[0090] Termin "tretiranje" (ili "tretirati" ili "tretman") odnosi se na usporavanje, prekidanje, zaustavljanje, ublažavanje, stopiranje, smanjenje, ili reverziju napredovanja ili težine bilo kog postojećeg simptoma, poremećaja, stanja, ili bolesti.

[0091] Termin "efikasna količina", kao što je ovde korišćeno, odnosi se na količinu ili dozu antitela prema predmetnom pronalasku koja, po primeni jedne ili više doza na pacijenta, obezbeđuje željeni efekat kod pacijenta pod tretmanom. Efikasna količina može se lako odrediti od strane zaduženog dijagnostičara, kao što je stručnjak, uz razmatranje brojnih faktora kao što su vrsta sisara; njegova veličina, starost, i opšte zdravstveno stanje; specifične bolesti koja je uključena; stepena ili težine bolesti; odgovora pojedinačnog pacijenta; određenog primenjenog antitela; načina primene; karakteristika bioraspoloživosti primenjenog preparata; izabranog doznog režima; i istovremene upotrebe bilo kojih medikamenata.

PRIMER

[0092] Sledeći Primer dodatno ilustruje pronalazak.

Primer 1

Proizvodnja antitela

[0093] Antitelo I iz ovog primera sadrži dva teška lanca i dva laka lanca, svaki težak lanac ima aminokiselinsku sekvencu datu u SEQ ID NO: 9 i svaki laki lanac ima aminokiselinsku sekvencu datu u SEQ ID NO: 10. Antitelo I može se stvoriti i prečistiti kao što sledi. Odgovarajuća ćelija domaćin, kao što je HEK 293 ili CHO, je ili prolazno ili stabilno transfektovana sa ekspresionim sistemom za izlučivanje antitela korišćenjem optimalnog prethodno određenog odnosa HC:LC vektora ili jednog vektorskog sistema koji kodira i teški lanac (SEQ ID NO: 9) i laki lanac (SEQ ID NO: 10). Izbistreni medijum, u koji je izlučeno antitelo, prečišćen je korišćenjem bilo koje uobičajeno korišćene tehnike. Na primer, medijum može biti pogodno primenjen na Protein A ili G kolonu koja je ekvilibrisana sa kompatibilnim puferom, kao što je fosfatno puferovani fiziološki rastvor (pH 7.4). Kolona je isprana da se uklone nespecifično vezane komponente. Vezano antitelo je eluirano, na primer, sa pH gradijentom (kao što je 0.1 M natrijum fosfatni pufer pH 6.8 do 0.1 M natrijum citratni pufer pH 2.5). Frakcije antitela su neutralizovane (na primer dodavanjem 1/10 zapremine 1M TRIS na pH 8.0), detektovane, kao što je sa SDS-PAGE, i zatim pulovane. Dodatno prečišćavanje je izborno, u zavisnosti od nameravane upotrebe. Antitelo može biti koncentrovano i/ili sterilno filtrirano korišćenjem uobičajenih tehnika. Rastvorljivi agregat i multimeri mogu se efikasno ukloniti uobičajenim tehnikama, uključujući eksklzionu, sa hidrofobnom interakcijom, jono-izmenjivačku, ili hidroksiapatitnu hromatografiju. Čistoća antitela nakon ovih hromatografskih koraka je veća od 99%. Proizvod može biti odmah zamrznut na -70°C ili može biti liofilizovan.

Merenje afiniteta vezivanja sa rezonancom površinskog plazmona (BIAcore)

[0094] Afinitet antitela (KD) prema humanom, makaki ili zečijem IL-23 određen je korišćenjem BIAcore Biosensor 2000 i BIAevaluation softvera sa 1:1 vezivanjem sa modelom transfera mase. Protein za hvatanje (Protein A, Calbiochem) je kuplovan preko slobodnih amino grupa sa karboksilnim grupama na prtočnim ćelijama 1 i 2 CM4 biosenzor čipa korišćenjem smeše N-etil-N-(dimetilaminopropil)-karbodidimida (EDC) i N-hidroksisukcinimida (NHS). Protočne ćelije su praćene sa stopom protoka od 80 µL/minutu korišćenjem pufera koji sadrži 0.01 M HEPES, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.005 % surfaktant P20. Antitelo I je uhvaćeno na protočnoj ćeliji 2 da bi se dobilo ukupno 40 do 60 responsivnih jedinica (RU). Više ciklusa rastućih koncentracija IL-23 je zatim injektirano preko protočnih ćelija 1 i 2 (0.62 nM do 30 nM za humani i majmunski IL-23 i 30 nM do 240 nM za zečiji IL-23) praćeno sa korakom regeneracije korišćenjem glicin-HCl (pH 1.5) između svakog ciklusa. Protočna ćelija 1 je korišćena kao kontrola da bi se pratilo nespecifično vezivanje IL-23 i podaci odražavaju protočnu ćeliju 2 minus protočna ćelija 1. Svaki ciklus uključuje korak hvatanja antitela praćeno sa injekcijom IL-23 na jednoj koncentraciji sa periodom disocijacije od 30 minuta, zatim regeneraciju. Dva ciklusa gde je pufer injektiran umesto IL-23, služe kao kontrola za referentno oduzimanje i korekciju za odstupanja povezana sa disocijacijom Antitela I sa površine proteina A. Afinitet je merene na 37 °C. Analiza je izvedena 2 puta sa humanim, majmunskim ili zečijim IL-23. Antitelo I je testirano 2 puta svako sa mišjim IL-23 na 333 nM, pacovskim IL-23 na 200 nM, humanim IL-12 na 333 nM, humanim IL-27 na 500 nM ili humanim IL-35 na 833 nM.

[0095] On-stopa (kon) i off-stopa (koff) za svaki antigen su procenjene korišćenjem 1:1 vezivanja sa modelom transfera mase. Afinitet (KD) je izračunat iz kinetike vezivanja prema odnosu: KD= koff/kon.

Tabela 2 – Parametri vezivanja za Antitelo I

[0096] Antitelo I proizvodi vezujući odgovor zavisan od koncentracije sa humanim, makaki, i zečijim IL-23 korišćenjem ovog postupka. Zasićenost vezivanja IL-23 je zadržana na koncentraciji od 30 nM (humani i majmunski) i 240 nM (zečiji) korišćenjem 80-100 responsivnih jedinica Antitela I uhvaćenih na površini čipa. Pod testiranim uslovima, afinitet vezivanja (KD) humanog, majmunskog, ili zečijeg IL-23 sa antitelom I je 21, 55 ili 53,000 pM respektivno (Tabela 1). Mišji IL-23, pacovski IL-23, humani IL-12, humani IL-27 ili humani IL-35 ne vezuju se za antitelo I pod ovim uslovima.

In Vitro inhibicija IL-23 vezivanja za IL-23 receptor

[0097] Rekombinantni humani IL-23R/Fc je kuplovan preko slobodnih amino grupa sa karboksilnim grupama na protočnoj ćeliji 2 CM4 biosenzor čipa korišćenjem smeše N-etil-N-(dimetilaminopropil)-karbodiimida (EDC) i N-hidroksisukcinimida (NHS). Rekombinantni humani IgG1 Fc (R&D Systems, Inc.) je kuplovan korišćenjem istog postupka sa protočnom ćelijom 1 na istom čipu. Mišje anti-6X HIS antitelo (R&D Systems, Inc.) je kuplovano korišćenjem istog postupka sa protočnom ćelijom 4 na istom čipu. Mišje anti-6X HIS is je korišćeno za prethodno hvatanje humanog IL-12Rβ1/Fc (R&D Systems, Inc.) koji sadrži HIS tag. Protočne ćelije su praćene sa stopom protoka od 30 µL/minutu korišćenjem pufera koji sadrži 0.01 M HEPES, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.005% surfaktant P20. Rekombinantni humani IL-23 je pre-inkubiran 90 minuta sa ili bez dodavanja 16X molarnog viška antitela I. Svaka kombinacija je injektirana preko protočnih ćelija 1, 2 i 4 u ukupnoj zapremini od 150 µL praćeno sa korakom regeneracije korišćenjem glicin-HCl (pH 1.5) između svakog testa. Protočna ćelija 1 je korišćena kao kontrola za praćenje nespecifičnog vezivanja IL-23 sa čipom. BIAevaluation softver je korišćen da se pripreme šeme za senzorgrame pojedinačnog vezivanja.

[0098] Antitelo I neutrališe humani IL-23 korišćenjem in vitro funkcionalnih analiza. Dodatno, Antitelo I sprečava vezivanje IL-23 sa IL-23R/Fc. Podaci u Tabeli 3 pokazuju:

(A) IL-23 se vezuje za IL-23R/Fc;

(B) Antitelo I/IL-23 kompleks se ne vezuje za IL-23R/Fc;

(C) IL-23 se vezuje za IL-12Rβ1/Fc; i

(D) Antitelo I/IL-23 kompleks se vezuje za IL-12Rβ1/Fc.

Tabela 3: Efekat antitela I na vezivanje IL-23 sa IL-23R

[0099] Stoga, antitelo I neutralizuje IL-23 jer inhibira vezivanje IL-23 sa IL-23R subjedinicom. Dodatno, antitelo I ne inhibira vezivanje IL-23 sa IL-12Rβ1 subjedinicom.

In Vitro neutralizacija humanog ili makaki IL-23 sa antitelom I u mišjim splenocitama

[0100] Za procenu antitela I, koncentracija humanog ili makaki IL-23 koja daje približno 50% maksimalne proizvodnje IL-17 je korišćena (16 pM). Procenjivan je odgovor na dozu u opsegu od 800,000 do 4.4 pM antitela I. Antitelo I ili IgG4 kontrolno antitelo je kombinovano sa humanim ili makaki IL-23 u zasebnom bunarčiću 90 minuta na 37°C pre dodavanja ćelijama (pre-inkubacioni miks).

[0101] Splenocite iz C57BL/6 miševa stimulisanih sa IL-23 i IL-2 proizvode IL-17 (Aggarwal, S. et al., "Interleukin- 23 Promotes a Distinct CD4 T Cell Activation State Characterized by the Production of Interleukin-17", Journal of Biological Chemistry, 278 (3): 1910-19142003). Mišje splenocite su re-suspendovane na 5x10<6>WBC/mL u medijumu za analizu (RPMI1640 sa L-glutaminom koji sadrži 10 % FBS, 1 % ne-esencijalnih aminoksielina, 1 mM natrijum piruvat, 100 U/mL penicilina, 100 µg/ml streptomicina, 0.00035 % 2-merkaptoetanola, 50 ng/mL humanog IL-2) i stavljene u zapreminama od 100 µL po bunarčiću u ploču za kulturu sa 96bunarčića. Pre-inkubacioni miks antitela I/ IL-23 je stavljen kao 100 µL po bunarčiću i inkubiran na 37 °C u 5 % CO2. Četvrdesetosam časova kasnije, supernatanti kulture su testirani za mIL-17 korišćenjem komercijalnog ELISA kita od R&D Systems (DY421) prema uputsvima u kitu korišćenjem duplikata bunarčića na svakom razblaženju. IC50je određena korišćenjem 4 parametarskog fitovanja podataka na krivu.

[0102] Mišje splenocite proizvode IL-17 u odgovoru na humani ili makaki IL-23. Antitelo I neutrališe humani ili makaki IL-23. Izračunata IC50je 82 ± 11 pM za humani i 120 ± 14 pM za makaki IL-23, n=2 za svaki (Tabela 4). Ovi rezultati pokazuju da je antitelo I sposobno da neutralizuje humani ili makaki IL-23 in vitro.

Tabela 4: IC50 u in vitro analizi neutralizacije humanih i makaki IL-23

Neutralizacija humanog IL-23: akutna, lokalna

[0103] Životinje (C57BL/šest ženki, starih osam nedelja od Jackson Labs) su smeštene (minimalno 72 časa nakon dolaska) i normalno hranjene pre eksperimenta i tokom trajanja studije. Dlaka je uklonjenja sa leđamiševa sa električnim brijačem, i 3 dana kasnije miševi (n=10 po grupi) su primili potkožnu injekciju Antitela I ili kontrolno antitelo IgG4 izotipa (0.54 mg po mišu). Sledeća 2 dana, miševima je intradermalno injektiran humani IL-23 u jedno mesto na jednoj strani leđa (1 mg u 50 mL razblažen sa sterilnim fiziološkim rastvorom) korišćenjem igle veličine 29. Sterilni fiziološki rastvor je korišćene kao vehikulum kontrola na drugoj strani leđa. Miševi su žrtvovatni 24 časa nakon poslednje injekcije humanog IL-23 i uzorci kože su uklonjeni sa strane gde je injektiran IL-23 i sa strane gde je injektiran sterilni fiziološki rastvor, održavajući najmanje 5 mm rastvojanje od granice dlake. Uzorci kože su direktno zamrznuti u tečnom azotu za studije iRNK.

[0104] Ukupna RNK je izolovana iz zamrznutog kožnog tkiva homogenizacijom u Lysing Matrix A shaker epruvetama (Qbiogene Inc./Bio101 Systems) nakon čega je primenjeno čišćenje sa RNeasy Mini kit (Qiagen, Inc.). Koncentracije RNK su određene iz spektrofotometrijske apsorpcije na 260 nm. RNK je reverzno prepisana u cDNK korišćenjem High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (PE Applied Biosystems). Sve reakcije su izvedene u triplikatu na ABI Prism 7900HT (PE Applied Biosystems) da bi se odredila realtivna abundanca analiziranih iRNK. Setovi test prajmera za mišji IL-17A (Mm00439618_ml), mišji IL-17F (Mm00521423_ml) i mišji keratin-16 (Mm00492979_gl) su dobijeni od PE Applied Biosystems. I 18S i GAPD su mereni kao endogene kontrole da bi se normalizovala varijabilnost u nivoima ekspresije gena. Podaci za ekspresiju su analizirani sa Delta (Δ-Δ) Ct postupkom. Pojedinačne Ct vrednosti su izračunate kao srednje vrednosti merenja u triplikatu. Eksperimenti su izvedeni dva puta. Korišćen je t-test za nezavisne uzorke gde je to odgovarajuće. P < 0.05 se smatralo statistički značajnom.

[0105] Da bi se istražilo da li je sistemska primena Antitela I sposobna da neutralizuje lokalni odgovor na humani IL- 23, humani IL-23 protein je intradermalno injektiran u miševe da bi se istražile nishodne sekvence kožnog izlaganja IL-23. Koža od miševa divljeg tipa dnevno tretiranih fiziološkim rastvorom ne pokazuje detektabilne nivoe mišjeg IL-17A ili mišjeg IL-17F.

[0106] Međutim, injekcija humanog IL-23 indukuje iRNK ekspresiju mišjeg IL-17A i mišjeg IL-17F (Tabela 5). Tretman sa antitelom I ali ne kontrolom izotipa ukinula je IL-17A i IL-17F ekspresiju iRNK indukovanu sa IL-23.

Tabela 5: In vivo neutralizacija mišjeg IL-17A indukovanog humanim IL-23 i ekspresija

iRNK za IL-17F

[0107] Dodatno, injekcija humanog IL-23 indukuje epidermalno zadebljanje povezano sa povežanom ekspresijom keratina-16, citokeratina povezanog sa proliferacijom. Indukcija keratina-16 je značajano inhibirana sa primenom antitela I (indukcija savijanja mišejg keratin-16 je 5.21 ± 2.72 za kontrolu sa izotipom antitela nasuprot 1.23 ± 0.72 za antitelo I; p = 0.0003).

[0108] Ukupno, ovi rezultati pokazuju da antitelo I efikasno inhibira proizvodnju mišjeg IL-17A, IL-17F i keratin-16 iRNK indukovanu sa humanim IL-23 u akutnoj lokalnoj in vivo analizi.

Unakrsna reaktivnost tkiva retine: In Vitro analiza sa imunohistohemijom

[0109] Preseci sveže zamrznutog humanog i makaki tkiva retine (5-7 mm debljine) isečeni su na kriostatu. Preseci su fiksirani u acetonu približno 10 minuta na sobnoj temperaturi, dozvoljeno je da se osuše preko noći na sobnoj temperaturi i uskladišteni na približno -80°C do upotrebe. Preseci fiksirani sa acetonom su nakon toga uklonjeni iz zamrzivača i dozvoljeno je da se osuše preko noći na sobnoj temperaturi. Sledeći koraci su izvedeni na sobnoj temperaturi. Mikroskopske pločice su inkubirane u 1X Morphosave™ približno 15 minuta da bi se očuvala morfologija. Mikroskopske pločice su isprane 10 minuta u 1X PBS i zatim inkubirane u 0.3% H2O2u 1X PBS na sobnoj temperaturi približno 20 minuta da bi se ugasila aktivnost endogene peroksidaze. Nakon inkubacije mikroskopske pločice su isprane dva puta približno 5 minuta u 1X PBS. Endogeni biotin je blokiran sekvencijalnom inkubacijom (približno 15 minuta svaka) u rastvorima avidina i biotina. Nakon inkubacije u biotinu, preseci tkiva su blokirani sa rastvorom blokirajućeg antitela 30 minuta. Antitelo I ili kontrolni humani IgG4 je primenjen na preseke u optimalnim koncentracijama (2.5 ili 5 mg/mL) ili pet puta većoj od optimalne koncentracije (25 mg/mL) i inkubirano je 1 čas na sobnoj temperaturi. Mikroskopske pločice su zatim isprane i inkubirane sa biotinilovanim mišjim anti-humanim IgG4 antitelom (2.5 mg/mL) 30 minuta. Vezani kompleksi primarnog/sekundarnog antitela su detektovani sa streptavidin-biotinperoksidaza rena konjugatom i diaminobenzidin hromagen supstratom.

[0110] CHO ćelije transfektovane sa humanim IL-23 su korišćene kao uzorak sa pozitivnom kontrolom u svim eksperimentima. Roditeljske CHO (ne-transfektovane) ćelije su korišćene kao uzorak sa negativnom kontrolom i nisu se bojile. Vezivanje nije uočeno u serijskim presecima obojenim sa kontrolnim izotip antitelom (humani IgG4). Antitelo I se ne vezuje uočljivo za tkivo retine.

Mapiranje epitopa za antitelo I: alanin skeniranje

Osnova za mapiranje epitopa korišćenjem antigen prikazanog od strane kvasca

[0111] Studije mapiranja epitopa su izvedene da bi se odredile specifične aminokiseline u p19 subjedinici humanog IL-23 (SEQ ID NO: 15) koje su neophodne za vezivanje antitela I. Mapiranje epitopa antitela I je završeno korišćenjem alanin skeniranja zajedno sa platformom prikaza kvasca.

[0112] Izloženi aminokiselinski položaji p19 subjedinice humanog IL-23 su identifikovane sa analizom u PyMOL. Izloženi ili delimično izloženi položaji p19 subjedinice IL-23 su prikazani u Tabeli 6. Oni položaji koji su određeni kao neizloženi izostavljeni su iz ove studije, tj. samo aminokiselinski položaji p19 subjedinice humanog IL- 23 koji su izloženi ili delimično izloženi su mutirani. U skladu sa tim, nisu istraživani svi položaji.

[0113] Iako je mapiranje epitopa izvedeno samo na p19 subjedinici IL-23 (mapiranje epitopa nije izvedeno na p40 subjedinici IL-23 jer se antitelo I ne vezuje detektabilno za p40 subjedinicu), i p19 subjedinica i p40 subjedinica humanog IL-23 moraju biti ko-ekspirimirane u platformi prikaza kvasca.

[0114] Konstruisani su pojedinačni alanin mutanti p19 subjedinice humanog IL-23 prikazani kvascem i vezivanje antitela je određeno da bi se identifikovao epitop. Merenjem afiniteta mutanata antitela u poređenjeu sa antigenom divljeg tipa prikazanim sa kvascem, moguće je odrediti energetski doprinos bočnog aminokiselinskog lanca vezivanju antitela.

Konstrukcija biblioteke mutanata

[0115] p40 gen je kloniran u rastvorljivi ekspresioni plazmid, pYKY, koji ima uracil selekcioni marker. Gen p19 subjedinice je kloniran u plazmid za prikaz sa kvascem, pEMD3, koji sadrži triptofan selekcioni marker i V5 tag na N-terminusu i GPDL2 protein za usidravanje na C-terminusu koji omogućava prikaz na površini kvasca pod triptofan selektabilnim markerom. Restrikciona mesta korišćena za kloniranje su XhoI i BamHI u pYKY plazmidu i AvrII i XmaI u pEMD3 plazmidu, respektivno.

[0116] Alanin mutacije su introdukovane na svaki izloženi položaj i testirane u odnosu na dvostruko pozitivno bojenje sa V5 antitelom i antitelom I. Paneli p19 alanin mutanata su konstruisani u pEMD3 plazmidima korišćenjem mutageneze usmerene na mesto (Kunkel Mutagenesis). Ukratko, ssDNK pEMD3 vektora koja sadrži uracil proizvedena je nakon transformacije u CJ236 (New England Biolabs). Jedna kolonija transformacije je rastla preko noći i ssDNK je rekuperovana nakon infekcije sa M13K07 pomoćnim fagom (New England Biolabs) i ssDNK je prečišćena korišćenjem QIAprep spin M13 kita. Oligonukleotidi koji kodiraju alanin mutacije su anilovani na 20:1 molarnom odnosu prema uracil templejtu denaturacijom na 85°C 5 minuta, rampom do 55°C tokom 1 časa, zadržavanjem na 55°C 5 minuta, i zatim hlađenjem na ledu. Sinteza drugog lanca je zatim završena sa T4 polimerazom, T4 ligazom i dNTPs (Invitrogen). Reakcija je elektroporisana u Top10 E.coli (Invitrogen) i pojedinačne kolonije su uzete, dsDNK pripremljena korišćenjem QIAprep miniprep kit (Qiagen) i mutacije su potvrđene sa sekvenciranjem, p19 mutanti su zatim ko-transformisani u BJ5464 kvasac (ATCC) sa p40 pYKY plazmidom i uzgajani u kompletnom minimalnom medijumu bez triptofana i uracila.

Selekcija biblioteke mutiranog antigena u odnosu na gubitak vezivanja antigena

[0117] Da bi se identifikovao epitop antitela, biblioteka mutiranog antigena je selektovana u odnosu na gubitak vezivanja antitela sa prtočnom citometrijom. Ćelije kvasca su obojene sa dva antitela, od kojih se jedno mapira a drugo ne. Antigen mutanti prikazani od strane kvasca su selektovani u odnosu na gubitak vezivanja za prvo antitelo, ali uz zadržavanje vezivanja za drugo antitelo. Zadržavanje vezivanja sa drugim antitelom osigurava da su mutanti selektovani na osnovu mutacija u epitopu, pre nego selekcijom nesavijenih ili loše prikazanih mutanata.

[0118] Za predmetnu analizu, prvo antitelo (tj. antitelo čije se epitop mapira) je antitelo I i drugo antitelo je anti-V5 antitelo. Kvasci su obojeni sa anti-V5 antitelom (Invitrogen) i antitelom I za početak i nakon toga sa sekundarnim kozjim anti-mišjim IgG2a (Invitrogen, Alexa Fluor® 647) da bi se detektovalo anti-V5 antitelo (ekspresija/prikaz) i kozjim anti-humanim kapa RPE (Southern Biotech) da bi se detektovalo antitelo I. Kvasci su analizirani protočnom citometrijom na Becton Dickinson LSRII, gde je 50,000 događaja sakupljeno na osnovu gejtinga ćelija preko rasipanja svetla, V5/Alexa647 i Antitelo I/PE bojenja. Anlaiza podataka vezivanja za svako od Antitela I i anti-V5 antitela je izvedena korišćenjem FACSDiva v6.1.2 softvera, koji izračunava procenat dvostruko obojenih ćelija kvasca.

Rezultati

[0119] Usled prikazanog dela proteina, u najboljem slučaju 50% kvasaca će prikazati IL-23 pl9. Detekcija dvostruko pozitivnih ćelija kvasca pokazuje da istraživani aminokiselinski položaj nije uključen u vezivanje antitela I sa IL-23. Detekcija samo V5 bojenja pokazuje da je protein eksprimiran i prikazan na površini kvasca i da je istraživani aminokiselinski položaj važan az vezivanje antitela I. Određeno je da su oni ostaci koji su pokazivali >50% smanjenja u dvostruko pozitivnom bojenjeu u poređenju sa susednim ostacima važni za vezivanje. Ovi ostaci su naglašeni u Tabeli 7. Neki položaji pokazuju nedostatak i V5 i antitelo I vezivanja, sugerišući da aminokiselinski ostatak može biti neophodan za konformaciju proteina. Sistemsko istraživanje svakog izloženog ili delimično izloženog aminokiselinskog položaja u p19 subjedinici IL-23 (SEQ ID NO: 15) pokazuje da položaji 94P, 95S, 97L, 98P, 99D, 123W, 130S, 133P, i 137W su važni za vezivanje antitela I sa humanim IL-23 na osnovu smanjene količine dvostruko pozitivnog bojenja za vezivanje V5 i antitela I binding (Tabela 7).

[0120] Mapiranje epitopa je takođe izvedeno korišćenjem vodonik-deuterijum razmene. Rezultati ovog mapiranja epitopa sa vodonik-deuterijum razmenom ilustruje da epitop antitela I je konformacioni epitop unutar ostataka 81-99 i 115-140 humanog IL-23 (SEQ ID NO: 15).

Tabela 6: Izložena ili delimično izložena aminokiselinska sekvenca p19 subjedinice zrelog humanog IL-23

Tabela 7. Podaci za mapiranje epitopa antitela

Fizičko-hemijske osobine IL-23 antitela

[0121] Antitelo I ima farmaceutski prihvatljivu rastvorljivost, hemijsku stabilnost i fizičku stabilnost.

A. Rastvorljivost

[0122] Dovoljno visoka rastvorljivost je poželjna da se omogući pogodno doziranje. Na primer, 1 mg/kg doza primenjena sa 1.0 mL injekcijom na pacijenta od 100 kg zahtevaće rastvorljivost od 100 mg/mL. Dodatno, održavanje antitela u monomernom stanju bez agregacije velike molekulske težine (HMW) na velikoj koncentraciji je takođe poželjno.

[0123] Antitelo I je formulisano na približno 1 mg/mL puferu sličnom fiziološkom (PBS, pH 7.4) i pod uslovima za formiranje dva proizvoda leka (10mM citrat, pH 6, plus i minus 150mM NaCl). Antitelo je centrifugirano na 2000xG preko Amicon Ultra filtera za molekulsku težinu od 30 kDa (Millipore, UFC803204) da bi se koncentrisalo antitelo uz održavanje istih uslova pufera.

Centrifugiranje je nastavljeno do granice rastvorljivosti ili do dostizanja minimalne zapremine za zadržavanje uređaja. Rastvorljivost veća od 100mg/mL je postignuta pod sva tri uslova.

[0124] Ekskluziona hromatografija (SEC) je korišćena za procenu da li se desilo povećanje u velikoj molekulskoj težini (HMW) polimera nakon koncentracije formulacija antitela do više od 100 mg/mL. Početni rastvor antitela i koncentrovani rastvor antitela su injektovani u TSK3000 SWXL kolonu (TOSOH Bioscience) korišćenjem pokretne faze koja se sastoji od 12 mM fosfata, 500 mM NaCl, pH 7.4. Nije uočena nikakvo veliko povećanje u rastvorljivom polimeru pod bilo kojim testiranim uslovima za formulaciju (< 0.6% HMW polymer by SEC).

B. Hemijska stabilnost

[0125] Antitelo I je formulisano na l mg/mL u 10mM puferu (10mM citrat za pH 4, 5, 6, i 7; 10 mM TRIS za pH 8) i inkubirano 4 nedelje na 4, 25, ili 40°C. Hemijska stabilnost je praćena sa SEC (videti prethodni postupak), katjon izmenjivačkom hromatografijom [CEX; Dionex, korišćenjem gradijenta između Pufera A (20mM natrijum fosfat, pH 5.8, 0.36% CHAPS) i Pufera B (20mM natrijum fosfat, pH 5.8, 0.36% CHAPS, 200mM natrijum hlorid)], CE-SDS (Agilent Bioanalyzer sa protein 230 čipom pod redukujućim uslovima) i sa LC-MS karakterizacijom enzimski digestovanog materijala.

[0126] Antitelo I je stabilno u odnosu na formiranje polimera (SEC) iznad pH 5-8 čak i nakon 4-nedelje na 40°C. Na pH 4, uočen je značajan polimer na 40°C ali ne na 25°C (4 nedelje). Očekivana hidroliza peptidne veze ili skraćivanje je evidentno na pH 4 (40°C) sa CE-SDS. Nivo degradacije na pH 4.0 je tipičan za IgG4 antitela. Iznad pH 4 (pH 5-8) nivoi su niski i ne menjju se konzistentno tokom vremena i stoga verovatno predstavljaju pozadinski šum.

[0127] Ova hipoteza je konzistentna sa LC-MS analizom koja ne detektuje skraćivanje na pH 6 uz merenje tipičnog nivoa skraćivanja antitela na pH 4. Promene u naelektrisanim varijantama su praćene sa CEX. Početni materijal se sastoji od tri značajan glavna pika koji minimizuju razdvajajuću moć ove analize. Generalno, 25°C i 40°C stresirani uzorci veći od kontrole na 4°C, ali se nivoi nisu povećavali sa vremenom inkubacije (zapravo su se smanjivali u mnogim slučajevima). Procenat promene na pH 6.0 (4 nedelje na 25°C minus 4°C kontrola) je 2.5%. LC-MS analiza ukazuje da je većina modifikacija izvan CDR regiona i da je na nivou tipičnom za druga IgG4 antitela. Identifikovana su tri mesta degradacije unutar CDRs koja su se promenila manje od 1% (pH 6; 4 nedelje na 25°C minus 4°C kontrola). Nedostatak mesta degradacije unutar CDRs je takođe konzistentan sa odsustvom značajne promene u BIACore afinitetu ili stehiometriji nakon četiri nedelje na 40°C inkubacije na ili pH 4, 6, ili 8.

C. Fizička stabilnost

i) Stabilnost pri zamrzavanju.-odmrzavanju

[0128] Antitelo I je formulisano pod sledećim uslovima:

a) l mg/mL u 10 mM Citrat, pH 6.0;

b) l mg/mL u 10 mM Citrat, pH 6.0, 0.02% Tween-80;

c) 1 ili 50 mg/mL u 10 mM Citrat, pH 6.0, 150 mM NaCl; i

d) 1 ili 50 mg/mL u 10 mM Citrat, pH 6.0, 150 mM NaCl, 0.02% Tween-80.

[0129] Ove formulacije su stavljene u 1 °C/min kontrolisani zamrzivač (Nalgene, 5100-0001) i zamrznute na -80°C u zamrzivaču najmanje osam časova i zatim su sklonjene i odmrznute na sobnoj temperaturi najmanje osam sati. Ovaj ciklus zamrzavanja/odmrzavanja je ponovljen do tri puta. Uzorci su uklonjeni nakon jednog i tri ciklusa zamrzavanja/odmrzavanja i analizirani u odnosu na HMW polimer sa SEC (videti SEC postupak opisan u delu A prethodno) i formiranje nerastvorljivih čestica sa brojačem čestica HIAC (Pacific Scientific model 9703 sa niskom zapreminom). Nije uočeno nikakvo značajno povećanje u formiranju HMW polimera nakon tri ciklusa zamrzavanja/odmrzavanja pod bilo kojim testiranim uslovima. Za 1 mg/ml formulacije značajno povećanje broja HIAC čestica je uočeno samo u formklacijama koje ne sadrže Tween-80. Na 50 mg/ml broj čestica je bio tipičan za druga IgG4 antitela dobrih performansi sa brojem čestica (≥ 10 mikrona) koji je bio 1500 izbrojanih/mL bez Tween-80 i spušten na približno 280 sa Tween-80.

ii) Statičko održavanje na visokoj koncentraciji

[0130] Antitelo je formulacija na 50 mg/mL pod sledećim uslovima:

a) 10 mM Citrate, pH 6.0, 150 mM NaCl; i

b) 10 mM Citrat, pH 6.0, 150 mM NaCl, 0.02% Tween-80

[0131] Ove formulacije su statički održavane 4-nedelje na 4 i 25°C. Promena u broju HIAC čestica (Pacific Scientific model 9703 sa niskom zapreminom) je merena nakon 4-nedelje na 25°C.

[0132] HIAC broj čestica (≥ 10 mikrona) za formulacije koje sadrže Tween u proseku je bila 290 izbrojanih/mL (270 i 310) i umereno viša, 804 izbrojanih/mL (728 i 880) za formulacije bez Tween. Ovi rezultati su tipični za druga IgG4 antitela koja imaju dobru fizičku stabilnost. Ove dve formulacije su takođe bile uskladoštene u staklenim umesto u standardnim plastičnim ependorf epruvetama. Broj čestica za uzorke uskladištene u staklu je 4 do 8 puta niži (u proseku 35 i 191 izbrojanih/mL respektivno za i bez Tween).

SEQ ID Listing

Claims (17)

Patentni zahtevi

1. Antitelo koje se vezuje za p19 subjedinicu humanog IL-23 koji sadrži laki lanac i teški lanac, naznačeno time da laki lanac sadrži varijabilni region lakog lanca (LCVR) i teški lanac sadrži varijabilni region teškog lanca (HCVR), pri čemu aminokiselinska sekvenca LCVR je SEQ ID NO: 8 i aminokiselinska sekvenca HCVR je SEQ ID NO: 7.

2. Antitelo prema patentnom zahtevu 1, koje sadrži dva varijabilna regiona lakog lanca (LCVRs) i dva varijabilna regiona teškog lanca (HCVRs), naznačeno time da aminokiselinska sekvenca svakog od LCVR je SEQ ID NO: 8 i aminokiselinska sekvenca svakog od HCVR je SEQ ID NO: 7.

3. Antitelo prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time da aminokiselinska sekvenca lakog lanca je SEQ ID NO: 10 i aminokiselinska sekvenca teškog lanca je SEQ ID NO: 9.

4. Antitelo prema patentnom zahtevu 3, koje sadrži dva laka lanca i dva teška lanca, naznačeno time da aminokiselinska sekvenca svakog lakog lanca je SEQ ID NO: 10 i aminokiselinska sekvenca svakog teškog lanca je SEQ ID NO: 9.

5. Izolovani polinukleotid koji kodira antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1-4.

6. Izolovani polinukleotid prema patentnom zahtevu 5, naznačen time da je varijabilni region teškog lanca (HCVR) kodiran sa SEQ ID NO: 11 i varijabilni region teškog lanca (LCVR) je kodiran sa SEQ ID NO: 12.

7. Izolovani polinukleotid prema patentnom zahtevu 5 ili 6, naznačen time da teški lanac je kodiran sa SEQ ID NO: 13 i laki lanac je kodiran sa SEQ ID NO: 14.

8. Polinukleotid prema bilo kom od patentnih zahteva 5-7, naznačen time da je pomenuti polinukelotid operativno vezan sa sekvencom za kontrolu ekspresije.

9. Vektor koji sadrži polinukleotid prema patentnom zahtevu 8.

10. Rekombinantna ćelija domaćin koja sadrži DNK molekul koji sadrži polinukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 10 i DNK molekul koji sadrži polinukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 9, pri čemu je ćelija sposobna da eksprimira antitelo koje sadrži teški lanac i laki lanac, naznačeno time da teški lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 9 i da laki lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 10.

11. Rekombinantna ćelija domaćin transformisana sa polinukelotidom prema bilo kom od patentnih zahteva 5-7, pri čemu je ćelija sposobna da eksprimira antitelo koje sadrži teški lanac i laki lanac, naznačeno time da aminokiselinska sekvenca teškog lanca je SEQ ID NO: 9 i aminokiselinska sekvenca lakog lanca je SEQ ID NO: 10.

12. Rekombinantna ćelija domaćin prema patentnom zahtevu 10 ili patentnom zahtevu 11, gde je ćelija domaćin sisarska ćelija domaćin izabrana iz grupe koja se sastoji od CHO, NS0, HEK293 i COS ćelija.

13. Postupak za proizvodnju antitela koje se vezuje za p19 subjedinicu humanog IL-23 koje sadrži teški lanac i laki lanac, naznačeno time da aminokiselinska sekvenca teškog lanca je SEQ ID NO: 9 i aminokiselinska sekvenca lakog lanca je SEQ ID NO: 10, pri čemu pomenuti postupak sadrži korake:

a) kultivisanja rekombinantne ćelije domaćina koja sadrži prvu polinukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptidnu sekvencu datu u SEQ ID NO: 9 i drugu polinukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptidnu sekvencu datu u SEQ ID NO: 10, pod takvim uslovima da su pomenute polipeptidne sekvence eksprimirane; i

b) rekuperacije iz pomenute ćelije domaćina antitela koje sadrži teški lanac i laki lanac, naznačeno time da polipeptidna sekvenca pomenutog teškog lanca je data u SEQ ID NO: 9 i polipeptidna sekvenca pomenutog lakog lanca je data u SEQ ID NO: 10.

14. Antitelo proizvedeno postupkom prema patentnom zahtevu 13.

15. Farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1-4 i 14 i jedan ili više farmaceutski prihvatljivih nosača, razblaživača ili ekscipijenata.

16. Antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1-4 i 14 za upotrebu u terapiji.

17. Antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1-4 i 14 za upotrebu u tretmanu autoimunog ili inflamatornog stanja, naznačeno time da je stanje izabrano iz grupe koja se sastoji od multiple skleroze, reumatoidnog artritisa, psorijaze, inflamatornih bolesti creva, ankiloznog spondilitisa, bolesti graft protiv domaćina, lupusa i metaboličkog sindroma.

Izdaje i štampa: Zavod za intelektualnu svojinu, Beograd, Kneginje Ljubice 5