RS61013B1 - Terapeutski preparati zasnovani na lantionin sintetazi c- sličnom proteinu-2 - Google Patents

Terapeutski preparati zasnovani na lantionin sintetazi c- sličnom proteinu-2

Info

Publication number
RS61013B1
RS61013B1 RS20201226A RSP20201226A RS61013B1 RS 61013 B1 RS61013 B1 RS 61013B1 RS 20201226 A RS20201226 A RS 20201226A RS P20201226 A RSP20201226 A RS P20201226A RS 61013 B1 RS61013 B1 RS 61013B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
lancl2
compound
disease
mice
diabetes
Prior art date
Application number
RS20201226A
Other languages
English (en)
Inventor
Josep Bassaganya-Riera
Barrios Adria Carbo
Richard Gandour
Julian D Cooper
Raquel Hontecillas
Original Assignee
Landos Biopharma Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Landos Biopharma Inc filed Critical Landos Biopharma Inc
Publication of RS61013B1 publication Critical patent/RS61013B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D213/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/04—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D213/60—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D213/62—Oxygen or sulfur atoms
    • C07D213/69—Two or more oxygen atoms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/34—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having five-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom, e.g. isosorbide
    • A61K31/341—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having five-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom, e.g. isosorbide not condensed with another ring, e.g. ranitidine, furosemide, bufetolol, muscarine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/4164—1,3-Diazoles
    • A61K31/4184—1,3-Diazoles condensed with carbocyclic rings, e.g. benzimidazoles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/42—Oxazoles
    • A61K31/423—Oxazoles condensed with carbocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/4427—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof containing further heterocyclic ring systems
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/4427—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof containing further heterocyclic ring systems
    • A61K31/4439—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof containing further heterocyclic ring systems containing a five-membered ring with nitrogen as a ring hetero atom, e.g. omeprazole
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/496—Non-condensed piperazines containing further heterocyclic rings, e.g. rifampin, thiothixene or sparfloxacin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/4965—Non-condensed pyrazines
    • A61K31/497—Non-condensed pyrazines containing further heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C65/00—Compounds having carboxyl groups bound to carbon atoms of six—membered aromatic rings and containing any of the groups OH, O—metal, —CHO, keto, ether, groups, groups, or groups
    • C07C65/32—Compounds having carboxyl groups bound to carbon atoms of six—membered aromatic rings and containing any of the groups OH, O—metal, —CHO, keto, ether, groups, groups, or groups containing keto groups
    • C07C65/40—Compounds having carboxyl groups bound to carbon atoms of six—membered aromatic rings and containing any of the groups OH, O—metal, —CHO, keto, ether, groups, groups, or groups containing keto groups containing singly bound oxygen-containing groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D213/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/04—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D213/60—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D213/78—Carbon atoms having three bonds to hetero atoms, with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals
    • C07D213/79—Acids; Esters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D235/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazole or hydrogenated 1,3-diazole rings, condensed with other rings
    • C07D235/02—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazole or hydrogenated 1,3-diazole rings, condensed with other rings condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D235/04—Benzimidazoles; Hydrogenated benzimidazoles
    • C07D235/18—Benzimidazoles; Hydrogenated benzimidazoles with aryl radicals directly attached in position 2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D263/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-oxazole or hydrogenated 1,3-oxazole rings
    • C07D263/52—Heterocyclic compounds containing 1,3-oxazole or hydrogenated 1,3-oxazole rings condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D263/54—Benzoxazoles; Hydrogenated benzoxazoles
    • C07D263/56—Benzoxazoles; Hydrogenated benzoxazoles with only hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, directly attached in position 2
    • C07D263/57—Aryl or substituted aryl radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D307/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom
    • C07D307/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings
    • C07D307/34—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D307/56—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D307/60—Two oxygen atoms, e.g. succinic anhydride
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D307/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom
    • C07D307/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings
    • C07D307/34—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D307/56—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D307/68—Carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D401/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom
    • C07D401/14—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing three or more hetero rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D403/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00
    • C07D403/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings
    • C07D403/12—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D403/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00
    • C07D403/14—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing three or more hetero rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D413/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D413/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms containing two hetero rings
    • C07D413/04—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms containing two hetero rings directly linked by a ring-member-to-ring-member bond
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D413/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D413/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms containing two hetero rings
    • C07D413/12—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D413/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D413/14—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms containing three or more hetero rings

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Plural Heterocyclic Compounds (AREA)
  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Nitrogen And Oxygen As The Only Ring Hetero Atoms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Cosmetics (AREA)
  • Glass Compositions (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Furan Compounds (AREA)

Description

Opis
UNAKRSNE REFERENCE PREMA SLIČNIM PRIJAVAMA
Ova prijava zahteva prvenstvo prema 35 USC §119(e) u odnosu na U.S. Provisional Patent Application 62/068,322, koja je podnesena 24. oktobra 2014. god ne, U.S. Prov s ona Patent App cat on 62/101,164, koja je podnesena 8. januara 2015. god ne.
IZJAVA U VEZI SA FEDERALNO SPONZORISANIM ISTRAŽIVANJEM
Ovaj pronalazak je, delom, izrađen uz podršku vlade SAD od strane United States National Institutes of Health, uz SBIR dozvolu 1R43DK097940-01A1 i STTR dozvolu 1R41DK099027-01A1, koje su dodeljene kompaniji BioTherapeutics Inc. Vlada SAD poseduje određena prava u odnosu na pronalazak.
OBLAST PRONALASKA
Ovaj pronalazak se odnosi na oblast medicinskih tretmana bolesti i poremećaja. Određenije, ovaj pronalazak se odnosi na klase biološki aktivnih jedinjenja, koja leče i preveniraju inflamatorne i imuno-posredovane bolesti, kao što su: inflamatorna bolest creva, reumatoidni artritis, psorijaza, multipla skleroza i šećerna bolest tipa 1, kao i hronične inflamatorne bolesti i poremećaje, kao što su, između ostalih, insulinska rezistencija, poremećena tolerancija na glukozu, predijabetes, šećerna bolest tipa 2 i inflamacija povezana sa gojaznošću.
STANJE TEHNIKE
Lantioninu C-sličan protein 2 (LANCL2) (nazvan, takođe, "lantionin sintetazi C-sličan protein 2" ili "lantionin sintetaza komponenti C-sličan protein 2") je protein puta signalizacije, povezan sa ekspresijom imunih ćelija, gastrointestinalnog trakta, neurona, testisa i pankreasa [1]. Aktiviranjem LANCL2 puta pojačava se insulinska senzitivnost i umanjuje inflamacija, koja je udružena sa raznim autoimunim, inflamatornim i metaboličkim stanjima. Rezultati in vivo i in vitro ispitivanja na miševima pokazali su da se korišćenjem jedinjenja, koja ciljano deluju na ovaj put, smanjuju koncentracije glukoze 2x u testovima tolerancije na glukozu, ako se uporede sa kontrolama, i obezbeđuju se nivoi ekvivalentni onima koji se postižu kada se prepiše AVANDIA® (GlaxoSmithKline plc, Brentford, Engleska) - efektivan tretman, ali sa značajnim sporednim efektima. Ciljano delujući na LANCL2 put, takođe se smanjuje inflamacija creva za 90% sa odgovarajućim smanjenjem broja lezija za 4x. Rezultati ovog ispitivanja i ostale validacije puta publikovani su u prihvaćenim naučnim radovima [2-13].
U okviru kategorije zapaljenja, povezanih sa autoimunim procesom, trenutno se nalaze brojni autoimuni poremećaji globalno pandemijske raširenosti, kao što su: inflamatorna bolest creva (IBD), sistemski lupus, reumatoidni artritis, šećerna bolest tipa 1, psorijaza, multipla skleroza. Takođe postoji pandemija hroničnih metaboličkih inflamatornih bolesti, koje uključuju: metabolički sindrom, gojaznost, predijabetes, kardiovaskularne bolesti i šećernu bolest tipa 2. Trenutno raspoloživi tretmani su osrednje efektivnosti, ali su skupi i imaju ozbiljne sporedne efekte. Put primene za najdelotvornije tretmane za autoimune bolesti, kao što su anti-TNF antitela, jeste posredstvom IV ili subkutanih injekcija, što zahteva posete klinikama/hirurškim odeljenjima i često praćenje. Jedinstveni način dejstva LANCL2 zahteva obezbeđivanje terapeutskih sredstava za oralnu primenu, koji su efektivni kao anti-TNF antitela, ali bez sporednih efekata i visoke cene. Uzimajući u obzir epidemijski karakter inflamatornih i autoimunih bolesti u celini, put LANCL2 ima potencijal za značajni uticaj na milione pacijenata.
Apscisinska kiselina ("ABA") je jedno od prirodnih jedinjenja, koje se nalazi u originalnom skrining procesu, koja se vezuju za LANCL2.
Postoji enorman broj jedinjenja, opisanih u oblasti sintetske organske hemije. Razna jedinjenja su obezbeđena posredstvom sledećih referenci: WO1997/036866 Diane i saradnika, WO 2006/053109 Suna i saradnika, WO 2006/080821 Kima i saradnika, WO 2007/019417 Nunesa i saradnika, WO 2009/067600 i WO 2009/067621 Singha i saradnika, WO 2008/079277 Adamsa i saradnika, JP 2008/056615 Urasoe-a i saradnika, WO 2011/066898 Stoessela i saradnika, US 2013/0142825 Bassaganya-Riere i saradnika i U.S. Patent 7,741,367 Bassaganya-Riere i saradnika. Za neka od jedinjenja, opisanih u ovim referencama, poznato je da aktiviraju put LANCL2, a za neka ne.
US 2011/0275558 prikazuje proteine slične c komponenti lantionin sintetaze kao molekulske mete za prevenciju i lečenje bolesti i poremećaja.
Postoji potreba za razvijanjem novih liganada puta LANCL2 da bi se omogućili tretmani, specifično skrojeni za pojedinačne bolesti i da bi se potencijalno maksimizirala njihova efikasnost.
Ova prijava, sledstveno tome, opisuje serije klasa jedinjenja, koje su razvijene posredstvom novih pristupa medicinske hemije, i skrininga, koji koriste in silico, in vitro i in vivo tehnike, da bi se do maksimuma podigla njihova sposobnost vezivanja za LANCL2 protein i da bi se, sledstveno tome, ostvario povoljan odgovor u raznim stanjima bolesti, koja uključuju, ali ne ograničavajući se na njih, autoimune, hronične inflamatorne, metaboličke i infektivne bolesti.
SUŠTINA PRONALASKA
U skladu sa aspektom ovog pronalaska, obezbeđeno je jedinjenje, kao što je specifično naznačeno u patentnom zahtevu 1.
U nekim jedinjenjima, jedan ili oba od A1i A1’ su N. U nekim jedinjenjima, jedan ili oba od A2i A2’ su CH, A3je NH, A4je N, A5je CH, a A6je CH. U nekim jedinjenjima, jedan ili oba od A2i A2’ su CH, jedan ili oba od A3i A3’ su NH, jedan ili oba od A4i A4’ su N, jedan ili<oba od A>5<i A>5<’ su CH, jedan ili oba od A>5<i A>6<’ su CH. U nekim jedinjenjima, Q je: piperazin-1,4->diil; 2,5-diazabiciklo[2.2.1]heptan-2,5-diil; 2,5-diazabiciklo[2.2.2]oktan-2,5-diil; 1,4-d azepan-1,4-d ;
N<1>,N<2>-d a k etan-1,2-d am n-N<1>,N<2>-dii ; N<1>,N<3>-d a k propan-1,3-d am n-N<1>,N<3>-d ; 1,4-diaminoantracen-
9,10-dion-1,4-diil; C6aren-1,4-diamin-N<1>,N<4>-diil, pri čemu je aren supstitutisan sa jednim do četiri supstituenta na pozicijama 2, 3, 5 ili 6, a svaki supstituent je nezavisno odabran iz grupe koju čine: -C(O)O(C1do C6)alkil, OH, O(C1do C6)alkil, (C1do C6)alkil, CF3, F, Cl i Br; ili supstitutisani piperazin-1,4-diil, pri čemu je piperazin supstituisan sa jednim do osam supstituenata na pozicijama 2, 3, 5 ili 6, a svaki supstituent je nezavisno odabran iz grupe koju čine: (C1do C6)alkil, aril, aril(C1do C6)alkil, C(O)OH i C(O)O(C1do C6)alkil.
U nekim jedinjenjima, članovi jednog ili više parova, odabranih iz grupe koju sačinjavaju: A1i A1’, A2i A2’, A3i A3’, A4i A4’, A5i A5’, A6i A6’, R1i R1’, R2i R2’, R3i R3’, i R4i R4’ su isti. U nekim jedinjenjima, članovi svakog para, koji je odabran iz grupe koju sačinjavaju: A1i A1’, A2i A2’, A3i A3’, A4i A4’, A5i A5’, A6i A6’, R1i R1’, R2i R2’, R3i R3’, i R4i R4’ su isti.
Neka jedinjenja pronalaska imaju strukturu:
ili njihovih soli.
Takođe su prikazani postupci lečenja stanja kod životinje, sa jednim ili više, ovde opisanih, jedinjenja. Postupci uključuju primenu životinji efektivne količine jednog ili više jedinjenja, koja su ovde opisana. Stanje može biti odabrano iz grupe koju sačinjavaju: infektivna bolest, autoimuna bolest, šećerna bolest i hronična inflamatorna bolest. U nekim postupcima, infektivna bolest uključuje virusnu bolest, kao što je infekcija gripa. U nekim postupcima, autoimuna bolest uključuje autoimunu inflamatornu bolest, kao što je inflamatorna bolest creva, koja uključuje ulcerozni kolitis i/ili Crohn-ovu bolest. U nekim postupcima, dijabetes je odabran iz grupe koju sačinjavaju dijabetes tipa 1 i dijabetes tipa 2. U nekim postupcima, hronična inflamatorna bolest obuhvata metabolički sindrom. U nekim postupcima, postupci uključuju primenu količine jedinjenja, koja je efektivna u povećavanju aktivnosti LANCL2, smanjenju inflamacije i/ili povećavanju anti-inflamatornih efekata.
Prema drugom aspektu ovog pronalaska, obezbeđeno je jedinjenje, kako je prethodno specifično naznačeno, za korišćenje u postupku lečenja stanja, kako je specifično naznačeno u patentnom zahtevu 9. Korišćenje može uključiti primenu životinji efektivne količine jednog ili više jedinjenja, koja su ovde opisana, pri čemu je stanje odabrano iz grupe koju sačinjavaju: infektivna bolest, autoimuna bolest, šećerna bolest i hronična inflamatorna bolest. U nekim verzijama, infektivna bolest uključuje virusnu bolest, kao što je infekcija gripa. U nekim verzijama, autoimuna bolest uključuje autoimunu inflamatornu bolest, kao što je inflamatorna bolest creva, koja uključuje ulcerozni kolitis i/ili Crohn-ovu bolest. U nekim verzijama, dijabetes je odabran iz grupe koju sačinjavaju dijabetes tipa 1 i dijabetes tipa 2. U nekim verzijama, hronična inflamatorna bolest obuhvata metabolički sindrom. U nekim verzijama, jedinjenje je efektivno u povećavanju aktivnosti LANCL2, smanjenju inflamacije i/ili povećavanju anti-inflamatornih efekata.
Ciljevi i prednosti pronalaska postaće potpuniji nakon sledećeg detaljnog opisa poželjnog ostvarenja pronalaska, koji je povezan sa pridruženim slikama.
KRATAK OPIS SLIKA
Slike 1A i 1B. Kompjuterska predikcija vezivanja jedinjenja za LANCL2 i biohemijska eksperimentalna validacija korišćenjem SPR.
Slika 2. Klaster histogram za prvih pet klastera NSC6160. Stotina serija povezivanja izvršena je sa NSC6160, spojenim sa LANCL2, uz korišćenje AutoDock sredstava. Tolerancija RMSD klastera je bila 2 Å. Energije vezivanja su navedene u kJ/mol.
Slika 3. Klaster histogram za prvih pet klastera ABA. Stotina serija povezivanja izvršena je sa ABA, spojenom sa LANCL2, uz korišćenje AutoDock sredstava. Tolerancija RMSD klastera je bila 2 Å. Energije vezivanja su navedene u kJ/mol.
Slika 4. Klaster histogram za prvih pet klastera BT-11. Stotina serija povezivanja izvršena je sa BT-11, spojenim sa LANCL2, uz korišćenje AutoDock sredstava. Tolerancija RMSD klastera je bila 2 Å. Energije vezivanja su navedene u kJ/mol.
Slika 5. Klaster histogram za prvih pet klastera BT-6. Stotina serija povezivanja izvršena je sa BT-6, spojenim sa LANCL2, uz korišćenje AutoDock sredstava. Tolerancija RMSD klastera je bila 2 Å. Energije vezivanja su navedene u kJ/mol.
Slika 6. Klaster histogram za prvih pet klastera BT-15. Stotina serija povezivanja izvršena je sa BT-15, spojenim sa LANCL2, uz korišćenje AutoDock sredstava. Tolerancija RMSD klastera je bila 2 Å. Energije vezivanja su navedene u kJ/mol.
Slika 7. Klaster histogram za prvih pet klastera BT-ABA-5a. Stotina serija povezivanja izvršena je sa BT-ABA-5a, spojenim sa LANCL2, uz korišćenje AutoDock sredstava. Tolerancija RMSD klastera je bila 2 Å. Energije vezivanja su navedene u kJ/mol.
Slika 8. Kinetike vezivanje lantionin sintetaza C-sličnog proteina 2 (LANCL2) sa BT-11 i BT-15. Paneli A i C prikazuju senzorgrame površinske plazmon rezonance (SPR) za vezivanje varirajućih koncentracija BT-11 (A) i BT-15 (C) za imobilisani LANCL2. Paneli B i D prikazuju iscrtane krive jedinica maksimalne rezonance (RU) u odnosu na koncentraciju BT-11 (B) i BT-15 (D). Naznačene su konstante disocijacije stabilnog stanja (KD), uz korišćenje modela vezivanja 1:1.
Slike 9A i 9B. Kinetike vezivanje lantionin sintetaza C-sličnog proteina 2 (LANCL2) sa BT-6 (Slika 9A) i BT-ABA-5a (Slika 9B). Prikazani su senzorgrami površinske plazmon rezonance (SPR) za vezivanje varirajućih koncentracija BT-6 i BT-ABA-5a za imobilisani LANCL2. Slika 10. Efekat oralne primene na aktivnost bolesti i gros patologiju kod miševa sa kolitisom izazvanim dekstran natrijum sulfatom (DSS). Panel A prikazuje rezultate za skor indeksa aktivnosti bolesti kod miševa, tretiranih ili sa BT-11 ili sa samim vehikulumom. Paneli B-C prikazuju skorove gros patologije za uzorke (B) slezine, (C) mezenterijalnih limfnih čvorova (MLN) i (D) kolona kod miševa, tretiranih ili sa vehikulumom ili sa B-11. Statistički značajne razlike (P<0.05) su označene zvezdicom (n=10).
Slika 11. Efekat oralne primene BT-11 na inflamatorne lezije u kolonu kod miševa sa DSS kolitisom. Prikazani su reprezentativni mikrografici za (A,D) kontrole, (B, E) miševe sa DSS i (C, F) miševe sa DSS, koji su tretirani sa BT-11. Evaluacija histopatoloških lezija je izvršena na osnovu (G) leukocitne infiltracije, (H) erozije epitela i (I) mukoznog zadebljanja. Statistički značajne razlike (P<0.05) su označene zvezdicom (n=10).
Slika 12. Efekat, u smislu odgovora na dozu, za oralnu primenu BT-11, na postojanje inflamatornih lezija u kolonu kod miševa sa DSS kolitisom. Evaluacija histopatoloških lezija je izvršena na osnovu (A) leukocitne infiltracije, (B) mukoznog zadebljanja i (C) erozije epitela. Statistički značajne razlike (P<0.05) su označene zvezdicom (n=10).
Slika 13. Analiza ekspresije gena kolona za TNFa, nter euk n 10 (IL-10) i LANCL2. Prikazana je ekspresija gena kolona za procenu nivoa (A) pro nf amatonog TNFa, (B) IL-10 (C) LANCL2. Stat st čk značajne razlike (P<0.05) su označene zvezdicom (n=10).
Slika 14. Dozno-zavisni efekat oralne primene BT-11 na podgupe proinflamatornih i antiinflamatornih imunih ćelija kolona kod miševa sa DSS kolitisom. Analize protočne citometrije korišćene su za merenje (A) TNFa+ ćelija, (B) IL-10+ CD4+ T ćelija i (C) FOXP3+ CD4+ T ćelija u mukozi kolona.
Slika 15. Efekat oralne primene BT-11 na tkivnu gros patologiju lezija kod miševa divljeg tipa i LANCL2-/- miševa sa DSS kolitisom. Panel A prikazuje skorove indeksa aktivnosti bolesti kod miševa divljeg tipa u odnosu na LANCL2-/- miševe, tretirane sa BT-11 ili sa samim vehikulumom. Paneli B-D pokazuju skorove gros patologije uzoraka (B) kolona, (C) mezenterijalnih limfnih čvorova (MLN) i (D) slezine kod miševa divljeg tipa i LANCL2-/- miševa, tretiranih ili vehikulumom ili sa BT-11. Statistički značajne razlike (P<0.05) označene su zvezdicom (n=10).
Slika 16. Efekat oralne primene BT-11 na inflamatorne lezije kolona kod miševa divljeg tipa i LANCL2-/- miševa sa DSS kolitisom. Evaluacija histopatologije lezija je izvršena na osnovu (A) leukocitne infiltracije, (B) zadebljanja mukoze i (C) erozije epitela. Statistički značajne razlike između grupa (P<0.05) označene su zvezdicom.
Slika 17. Efekat oralne primene BT-11 na podgrupe imunih ćelija, koje se infiltriraju u laminu propria kolona, slezinu i mezenterijalne limfne čvorove (MLN) kod miševa divljeg tipa i LANCL2-/- miševa sa hroničnim kolitisom. Protočna citometrija je korišćena za ispitivanje nivoa (A) MCP1+ CD45+ ćelija kolona, (B) MCP1+ CD45+ ćelija u MLN, (C) TNFa+ CD45+ ćelija kolona, (D) MHC-II+ CD11c+ granulocita kolona, (E) IL-10+ CD45+ ćelija kolona i (F) IL-10+ CD45+ splenocita nakon tretmana sa BT-11. Statistički značajne razlike između grupa (P<0.05) označene su zvezdicom.
Slika 18. Efekat oralne primene BT-11 na skorove indeksa aktivnosti bolesti (DAI) kod IL-10-/- miševa sa hroničnim kolitisom. DAI skorovi za IL-10 nulte miševa koji su razvili spontani kolitis i koji su svakodnevno tretirani ili samim vehikulumom ili sa 20, 40 i 80 mg BT-11 po kg telesne težine (n=10). Statistički značajne razlike između grupa (P<0.05) označene su zvezdicom.
Slika 19. Efekat oralne primene BT-11 na makroskopsko bodovanje tkiva na modelu hroničnog kolitisa nakon tretmana sa BT-11. Makroskopsko bodovanje je izvršeno na tkivu (A) slezine, (B) mezenterijalnih limfnih čvorova (MLN) i (C) kolona miševa, koji su tretirani ili sa vehikulomom ili sa BT-11 u tri različite koncentracije (20, 40 i 80 mg/kg). Statistički značajne razlike između grupa (P<0.05) označene su zvezdicom.
Slika 20. Efekat oralne primene BT-11 na histopatološke lezije kolona na modelu IL-10-/-hroničnog IBD. Histopatologija lezija je procenjena na osnovu (A) leukocitne infiltracije, (B) erozije epitela i (C) zadebljanje mukoze. Statistički značajne razlike između grupa (P<0.05) označene su zvezdicom.
Slika 21. Efekat oralne primene BT-11 na podgrupe imunih ćelija koje infiltriraju u laminu propria kolona kod IL-10-/- sa hroničniim kolitisom. Protočna citometrija je korišćena za utvrđivanje nivoa (A) F4/80+ makrofaga, (B) MHC-II+ CD11c+ dendritičnih ćelija (DC), (C) CD4+ FOXP3+ regulatornih T ćelija i (D) T helper 1 (Th1) ćelija u LP kolona nakon tretmana sa BT-11. Statistički značajne razlike između grupa (P<0.05) označene su zvezdicom.
Slika 22. Efekat oralne primene BT-11 na podgrupe imunih ćelija koje infiltriraju u slezinu i mezenterijalne limfne čvorov kod IL-10-/- sa hroničnim kolitisom. Protočna citometrija je korišćena za utvrđivanje nivoa (A) CD4+ RORgt+ T ćelija, (B) CD4+ FOXP3+ T ćelija, (C) CD4+ CD45+ FOXP3+ regulatornih T ćelija i (D) T helper 1 (Th1) ćelija nakon tretmana sa BT-11. Statistički značajne razlike između grupa (P<0.05) označene su zvezdicom.
Slika 23. Efekat ora nog tretmana sa BT-11 na ekspresiju LANCL2 i TNFa u kolonu. Ekspresija gena kolona je korišćena za utvrđivanje nivoa (A) LANCL2 i (B) TNFa. Statistički značajne razlike između grupa (P<0.05) označene su zvezdicom.
Slika 24. Efekat oralne primene BT-11 na skorove indeksa aktivnosti bolesti kod miševa sa vehikulumom u odnosu na tretirane miševe na adoptivnom transfer modelu hroničnog kolitisa. RAG2-/- miševi su tretirani sa vehikulumom ili sa BT-11, nakon intraperitonealnog prenošenja 400,000 naivnih CD4+ T ćelija. Statistički značajne razlike između grupa (P<0.05) označene su zvezdicom.
Slika 25. Efekat oralne primene BT-11 na skorove indeksa aktivnosti bolesti kod miševa sa vehikulumom u odnosu na tretirane miševe divljeg tipa, i u odnosu na LANCL2-/- miševe sa urađenim transferom, na adoptivnom transfer modelu hroničnog kolitisa. RAG2-/- miševi su tretirani sa vehikulumom ili sa BT-11, nakon intraperitonealnog prenošenja 400,000 naivnih CD4+ T ćelija od donora divljeg tipa ili LANCL2-/- donora. Statistički značajne razlike između grupa (P<0.05) označene su zvezdicom.
Slika 26. Efekat oralne primene BT-11 na gubitak težine na modelu hroničnog IBD-a kod CD4+-indukovanog kolitisa. Miševima je merena težina i izračunat je procenat gubitka težine. Statistički značajne razlike između grupa (P<0.05) označene su zvezdicom.
Slika 27. Efekat oralne primene BT-11 na makroskopske tkivne skorove na modelu hroničnog kolitisa, indukovanog CD4+ T ćelijama, nakon podvrgavanja tretmanu sa BT-11. Prikazani su makroskopski skorovi za (A) slezinu, (B) MLN, (C) kolon i (D) ileum miševa, koji su tretirani ili sa vehikulumom ili sa BT-11 u dozi od 80 mg/kg. Statistički značajne razlike između grupa (P<0.05) označene su zvezdicom.
Slika 28. Efekat oralne primene BT-11 na makroskopske tkivne skorove na hroničom modelu kolitisa, indukovanog CD4+ T ćelijama na miševima divljeg tipa i LANCL2-/-miševima, nakon tretmana sa BT-11. Prikazani su makroskopski skorovi za (A) kolon, (B) MLN i (C) slezinu miševa divljeg tipa i LANCL2-/- miševa, koji su tretirani ili vehikulumom ili sa BT-11 u dozi od 80 mg/kg. Statistički značajne razlike između grupa (P<0.05) označene su zvezdicom.
Slika 29. Efekat oralne primene BT-11 na histopatologiju kolona i ileuma kod miševa sa vehikulumom u odnosu na miševe podvrgnute tretmanu na adoptivnom transfer modelu hroničnog kolitisa. Evaluacija histopatoloških lezija u kolonu (A, C, E) i ileumu (B, D, F) izvršena je na osnovu (A, B) leukocitne infiltracije, (C, D) erozije epitela i (E, F) zadebljanja mukoze. Statistički značajne razlike između grupa (P<0.05) označene su zvezdicom.
Slika 30. Efekat oralne primene BT-11 na histopatologiju kolona kod miševa sa vehikulumom u odnosu na tretirane miševe kojima su prenesene ili ćelije donora divljeg tipa ili LANCL2-/- CD4+ T ćelije na adoptivnom transfer modelu hroničnog kolitisa. Evaluacija histopatologije lezija izvršena je na osnovu (A) leukocitne infiltracije, (B) zadebljanja mukoze i (C) erozije epitela. Statistički značajne razlike između grupa (P<0.05) označene su zvezdicom.
Slika 31. Efekat oralne primene BT-11 na skorove indeksa aktivnosti bolesti kod miševa sa vehikulumom u odnosu na tretirane miševe na adoptivnom transfer modelu hroničnog kolitisa. Protočna citometrija je korišćena za utvrđivanje nivoa (A) F4/80+CD11b+ makrofaga, (B) CD45+ IFNg+ ćelija, (C) CD4+ FOXP3+ regulatornih T ćelija i (D) CD4+ IL-10+ anti-inflamatornih ćelija nakon tretmana sa BT-11. Statistički značajne razlike između grupa (P<0.05) označene su zvezdicom.
Slika 32. Efekat oralne primene BT-11 na skorove indeksa aktivnosti bolesti kod miševa sa vehikulumom u odnosu na tretirane miševe na adoptivnom transfer modelu hroničnog kolitisa. Protočna citometrija je korišćena za utvrđivanje nivoa (A) CD4+ FOXP3+ T ćelija, (B) CD4+ IL-10+ T ćelija, (C) CD45+ IFNg+ ćelija u MLN i (D) CD4+ FOXP3+ T ćelija, (E) CD4+ IL-10+ T ćelija, (F) CD45+ IFNg+ ćelija u slezini nakon tretmana sa BT-11. Statistički značajne razlike između grupa (P<0.05) označene su zvezdicom.
Slika 33. Efekat oralne primene BT-11 na skorove indeksa aktivnosti bolesti kod miševa sa vehikulumom u odnosu na tretirane miševe donora divljeg tipa prema miševima sa PPARg-/- transferom na adoptivnom transfer modelu hroničnog kolitisa. RAG2-/- miševi su tretirani sa vehikulumom ili sa BT-11, nakon intraperitonealnog prenošenja 400,000 naivnih CD4+ T ćelija, iz donora divljeg tipa ili PPARg-/- donora. (A) Prikazani su skorovi indeksa aktivnosti bolesti u odnosu na vreme nakon transfera. Evaluacija histopatologije lezija izvršena je na osnovu (B) leukocitne infiltracije, (C) zadebljanja mukoze i (D) erozije epitela. Statistički značajne razlike između grupa (P<0.05) označene su zvezdicom.
Slika 34. Efekat oralne primene BT-11 na koncentraciju glukoze u krvi natašte i nivoe insulina kod NOD miševa sa šećernom bolesti. (A) Koncentracije glukoze natašte utvrđene su nakon 0, 1, 3, 4, 5, 10 i 11 nedelja tretmana sa vehikulumom ili sa BT-11 (80 mg/kg/dnevno). (B) Serumske koncentracije insulina natašte utvrđene su 5 nedelja nakon tretmana sa vehikulumom ili sa BT-11 (80 mg/kg/dnevno). Statistički značajne razlike (P<0.05) su označene zvezdicom.
Slika 35. Efekat oralne primene BT-11 na formiranje lezija u pankreasu kod miševa sa dijabetesom tipa 1. Evaluacija histopatologije lezija izvršena je na osnovu leukocitne infiltracije, formiranje lezija i erozije tkiva. Statistički značajne razlike između grupa (P<0.05) označene su zvezdicom.
Slika 36. Efekat oralne primene BT-11 na (A) koncentracije glukoze u krvi natašte i (B) test tolerancije na glukozu. (A) Miševi su bili bez hrane tokom 12 h, a koncentracije glukoze su utvrđene nakon 2 i nakon 12 nedelja od započinjanja eksperimenta. (B) Miševima je, takođe,
1
data IP injekcija glukoze (2 g/kg) i izmeren je nivo glukoze. Statistički značajne razlike (P<0.05) su označene zvezdicom.
Slika 37. Efekat oralne primene BT-11 na pro-inflamatorne populacije koje vrše infiltraciju u belo adipozno tkivo (WAT). Izvrši se ekscizija i digestija WAT-a, a rezultati imunofenotipizacije se utvrđuju protočnom citometrijom. Prikazani su nivoi (A) infiltracijskih makrofaga i (B) Ly6c<high>GR1+ infiltracijskih ćelija. Statistički značajne razlike (P<0.05) su označene zvezdicom.
Slika 38. Efekat oralne primene BT-11 na homeostazu glukoze na db/db modelu dijabetesa. (A) Prikazane su koncentracije glukoze u krvi natašte (FBG) kod miševa sa deficijencijom leptinskog receptora (db/db), koji su tretirani ili sa BT-11 ili sa vehikulumom, 1 i 3 nedelje nakon postavljanja eksperimenta. (B) Prikazane su plazmatske koncentracije glukoze nakon intraperitonealnog primanja glukoze (1 g/kg telesne težine). Uzorci krvi su skupljeni pre (0) primanja glukoze, a zatim 15, 30, 60, 90, 120, 180, 220 i 265 minuta nakon injiciranja glukoze. Statistički značajne razlike između grupa (P<0.05) označene su zvezdicom.
Slika 39. Efekat ora ne pr mene BT-11 na ekspresiju LANCL2, TNFa i MCP-1 u belom adipoznom tk vu (WAT) kod miševa sa gojaznošću, indukovanom hranom. Analiza genske ekspresije LANCL2, TNFa i MCP-1 izvršena je upoređivanjem sa miševima koji nisu podvrgnuti tretmanu. Linija na nuli predstavlja bazalni nivo za miševe koji su primili samo vehikulum.
Slika 40. Efekat oralne primene BT-11 na kliničke skorove i morbiditet miševa, inficiranih virusom influence. Miševi su inficirani virusom influence i tokom eksperimenta je utvrđen klinički skor. Zabeleženi su klinički skorovi za (A) aktivnost i (B) fizički izgled. (C) Iscrtan je procenat miševa koji su izgubili više od 15% telesne težine, da bi se prikazale promene u morbiditetu. Statistički značajne razlike između grupa (P<0.05) označene su zvezdicom.
DETALJNI OPIS PRONALASKA
Opšte definicije
Ukoliko nije naznačeno drugačije, tokom tekuće prijave korišćene su definicije koje slede:
Analiza varijance (ANOVA): Aritmetički postupak za raspodeljivanje ukupne varijacije u postavci podataka na specifične komponente, na osnovu izvora varijacije. Koristi se za utvrđivanje da li su brojčane razlike između tretman grupa statistički značajne.
Adipogeneza: Proces razvijanja novih adipocita ili ćelija deponovanja masnog tkiva.
Alel: Jedan od brojnih vijabilnih DNK koji kodiraju isti gen.
Konjugovani dien: Molekul koji sadrži dve dvostruke veze, razdvojene jednogubom vezom. Db/db miševi: Naziv koji se koristi da bi se definisao tip miša, kome nedostaju oba alela duge izoforme leptinskog receptora. Ova deficijencija proizvodi visoku predispoziciju za razvijanje dijabetesa tipa 2. Pogledajte primere u nastavku radi daljeg razmatranja Db/db miševa.
Enantiomer: Optički izomer; hemijska klasifikacija molekula, na osnovu njihove sposobnosti rotiranja ravni polarizacije u smeru kazaljke na satu (+) ili u smeru obrnutom od smera kazaljki na satu (-). Glikemija: Koncentracija glukoze u krvi.
Hiperglikemija: Povišene koncentracije glukoze u krvi iznad normalnih raspona.
Hiperinsulinemija: Povišene koncentracije insulina u krvi iznad normalnih raspona.
Insulinemija: Koncentracija insulina u krvi.
Insulinska rezistencija: Nemogućnost tkiva da odgovori na insulin i prihvati glukozu iz krvi.
Suštinski čist: Posedovanje čistoće od najmanje 90% po težini, poželjno najmanje 95% po težini, kao što je, na primer, čistoća od najmanje 98%, 99% ili oko 100% po težini.
Dijabetes tipa 2 ili insulin-nezavisni dijabetes melitus: Naziv koji se odnosi na uobičajeni tip šećerne bolesti, uzrokovan nemogućnošću odgovora ćelija na delovanje insulina. U slučaju nemogućnosti odgovora ćelija na insulin, one nisu u stanju da prihvate glukozu iz krvi, što dovodi do glukotoksičnosti. Pored toga, ćelije ostaju bez energije, koja se dobija oksidacijom glukoze.
IBD: Inflamatorna bolest creva (IBD) obuhvata hroničnu inflamaciju digestivnog trakta, bilo celokupnog, bilo delimičnog. IBD prvenstveno uključuje ulcerozni kolitis i Crohn-ovu bolest. Oba stanja uključuju ozbiljnu dijareju, bol, umor i gubitak težine. IBD može biti iscrpljujuće stanje i ponekad dovodi do komplikacija opasnih po život.
Ulcerozni kolitis (UC): UC je IBD, koja izaziva dugotrajnu inflamaciju i rane (ulcere) u sluzokoži debelog creva (kolona) i rektuma.
Crohn-ova bolest: Crohn-ova bolest je IBD, koja dovodi do zapaljenja sluzokože probavnog trakta. U Crohn-ovoj bolesti, zapaljenje se često proširi u dubinu zahvaćenih tkiva. Zapaljenje može zahvatiti različite površine probavnog trakta – debelo crevo, tanko crevo ili oba.
IL-10: Interleukin-10 (IL-10), poznat, takođe, kao humani inhibitorni faktor sinteze citokina (CSIF), predstavlja anti-inflamatorni citokin. Kod ljudi, IL-10 je kodiran od strane IL10 gena.
FOXP3: FOXP3 (ʺforkhead boxʺ P3), poznat, takođe, kao skurfin, jeste protein, koji je uključen u odgovore imunog sistema. Izgleda da član familije FOX proteina, FOXP3, funkcioniše kao master regulator (transkripcioni faktor) u razvoju i funkcionisanju regulatornih T ćelija.
TNF-alfa: Tumor nekrozis faktor (TNF, kaheksin ili kahektin, ranije poznat kao tumor nekrozis faktor alfa ili TNFa) jeste citok n, koji je uključen u sistemsku nf amaciju, a predstavlja člana grupe citok na, koj st mu šu reakc ju akutne faze.
MCP1: Monocitni hemoatraktant protein-1. Stariji je naziv za CC citokin, koji je od presudne važnosti za razvijanje aterosklerotskih lezija, koji se nalazi u endotelnim ćelijama i makrofagima i u ćelijama vaskularnih glatkih mišića pacijenata, koji se podvrgavaju bajpas procedurama u koronarnim arterijama. Oficijelno poželjni naziv je trenutno hemokin (C-C motiv) ligand 2.
Interferon gama: Interferon gama je pro-inflamatorni dimerizovani rastvorljivi citokin, koji jedini pripada klasi interferona tipa II.
Dijabetes tipa 1: Dijabetes tipa 1, nekad poznat kao juvenilni dijabetes ili insulin-zavisni dijabetes, jeste hronično stanje u kome pankreas proizvodi nedovoljnu količinu insulina ili uopšte ne proizvodi insulin, hormon koji je neophodan za omogućavanje ulaska šećera (glukoze) u ćelije, da bi se proizvela energija.
Leukocitna infiltracija: Leukocitna infiltracija se odnosi na proces pomeranja ili infiltriranja leukocita u oštećeno tkivo, da bi se započeo proces reparacije istog.
Hemijske definicije
Naziv "alkil", ili sam ili kao deo drugog supstituenta, označava, ukoliko nije naznačeno drugačije, potpuno zasićeni, ravni, razgranati lanac, ili ciklični ugljovodonični radikal, ili njihove kombinacije, a može uključiti dvo- i multi-valentne radikale, koji poseduju naznačeni broj atoma ugljenika (npr., C1-C10znači da uključuje od jednog do deset atoma ugljenika). Primeri a k groupa uk jučuju, bez ogran čavanja, met , et , n-prop , zoprop , n-but , t-but , zobut , sek-but , cikloheksil, (cikloheksil)etil, ciklopropilmetil i njihove homologe i izomere, na primer, n-pentil, n-heksil, n- heptil, noktil i slične grupe. Naziv "alkil", ukoliko nije naznačeno drugačije, uključuje, takođe, derivate alkila, koji su detaljnije definisani u nastavku kao "heteroalkil" i "cikloalkil".
Naziv "alkenil" označava alkil grupu, kako je prethodno definisana, s izuzetkom što sadrži jednu ili više dvostrukih veza. Primeri alkenil grupa uključuju: vinil, 2-propenil, krotil, 2-izopentenil, 2-(butadienil), 2,4-pentadienil, 3-(1,4-pentadienil), itd., i više homologe i izomere.
Naziv "alkinil" označava alkil ili alkenil grupu kako je prethodno definisana, s izuzetkom što sadrži jednu ili više trostrukih veza. Primeri alkinil grupa uključuju: etinil, 1- i 3-propinil, 3-butinil, i slične grupe, uključujući više homologe i izomere.
Nazivi "alkilen", "alkenilen" i "alkinilen", sami ili kao deo drugog supstituenta, označavaju dvovalentni radikal, koji je izveden iz alkil, alkenil, odnosno alkinil grupe, kao što je primera radi, -CH2CH2CH2CH2-.
Uobičajeno, alkil, alkenil, alkinil, alkilen, alkenilen i alkinilen grupe će imati od 1 do 24 atoma ugljenika. Grupe koje imaju 10 ili manje atoma ugljenika su poželjne grupe u ovom pronalasku. Naziv "niži", kada se primeni na bilo koju od ovih grupa, kao u nazivima "niži alkil" ili "niži alkilen", označava grupu koja ima 10 ili manje atoma ugljenika.
Izraz "supstituisan" se odnosi na hemijsku grupu, kao što je ovde opisana, koja dalje uključuje jedan ili više supstituenata, kao što su: niži alkil, aril, acil, halogen (npr., alkilhalo, kao što je
1
CF3), hidroksi, amino, alkoksi, alkilamino, acilamino, tioamido, aciloksi, ariloksi, ariloksialkil, merkapto, tia, aza, okso, i zasićeni i nezasićeni ciklični ugljovodonici, heterociklusi i slični. Ove grupe se mogu vezivati za bilo koji ugljenik ili supstituent alkil, alkenil, alkinil, alkilen, alkenilen i alkinilen delova. Pored toga, ove grupe mogu biti pričvršćene za ili integrisane sa samim lancem ugljenika.
Naziv "aril" je ovde korišćen kako bi se odnosio na aromatični supstituent, koji može predstavljati jedan aromatični prsten ili više aromatičnih prstenova, koji su spojeni zajedno, povezani kovalentno ili vezani za zajedničku grupu, kao što je diazo, metilen ili etilen deo. Uobičajena vezujuća grupa može, takođe, biti karbonil, kao u benzofenonu. Aromatični prsten(prstenovi) može uključiti, na primer, fenil, naftil, bifenil, difenilmetil i benzofenon, između ostalih. Naziv "aril" uključuje "arilalkil" i "supstituisani aril". U slučaju fenil grupa, aril prsten može biti mono-, di-, tri-, tetra- ili penta-supstituisan. Veći prstenovi mogu biti nesupstituisani ili mogu nositi jedan ili više supstituenata.
"Supstituisani aril" se odnosi na aril, kao što je upravo opisan, koji uključuje jednu ili više funkcionalnih grupa, kao što su: niži alkil, acil, halogen, alkilhalo (npr., CF3), hidroksi, amino, alkoksi, alkilamino, acilamino, aciloksi, fenoksi, merkapto i zasićeni i nezasićeni ciklični ugljovodonici, koji su spojeni sa aromatičnim prstenom(prstenovima), kovalentno povezani ili vezani za zajedničku grupu, kao što je diazo, metilen ili etilen deo. Vezujuća grupa može, takođe, biti karbonil, kao u slučaju cikloheksil fenil ketona. Naziv "supstituisani aril" uključuje "supstituisani arilalkil".
Naziv "halogen" ili "halo" ovde je korišćen da bi se odnosio na atome fluora, broma, hlora i joda.
Naziv "hidroksi" ovde je korišćen da bi se odnosio na –OH grupu.
Naziv "amino" je korišćen da bi označio NRR’, pri čemu su R i R’ nezavisno: H, alkil, alkenil, alkinil, aril ili njihovi supstituisani analozi. "Amino" uključuje "alkilamino", koji označava sekundarne i tercijarne amine, i "acilamino", koji opisuje grupu RC(O)NR’.
Primena
U toku postupaka ovog pronalaska, terapeutski efektivna količina jedinjenja pronalaska može se primenjivati životinji, uključujući sisare i ljude, na mnogo načina. Dok su u poželjnom ostvarenju, jedinjenja pronalaska primenjivana oralno ili parenteralno, i oblici primene, kao što su oni koji se vrše posredstvom medicinskih jedinjenja ili aerosola, takođe su razmatrani.
U slučaju oralne primene, efektivna količina jedinjenja može se primenjivati, na primer, u čvrstom, polu-čvrstom, tečnom ili gasovitom stanju. Specifični primeri uključuju: tabletu, kapsulu, prašak, granulu, rastvor, suspenziju, sirup i eliksir sredstava. Međutim, jedinjenja nisu ograničena na ove oblike.
Da bi se jedinjenja pronalaska formulisala u tablete, kapsule, praškove, granule, rastvore ili suspenzije, jedinjenje se poželjno pomeša sa vezujućim sredstvom, dezintegrišućim sredstvom i/ili lubrikansom. Ukoliko je to potrebno, dobijena kompozicija se može pomešati sa razblaživačem, puferom, infiltracijskim sredstvom, konzervansom i/ili sredstvom za ukus, uz korišćenje poznatih postupaka. Pr mer vezujuć h sredstava uk jučuju: kr sta nu ce u ozu, der vate ce u oze, kukuruzn skrob, c k odekst ne že at n. Pr mer dez ntegr šuć h sredstava uk jučuju: kukuruzn skrob, krompirov skrob i natrijum karboksimetilcelulozu. Primeri lubrikanasa uključuju talk i magnezijum stearat. Pored toga, takođe se mogu upotrebiti aditivi, koji se uobičajeno koriste, kao što su laktoza i manitol.
U slučaju pareteralne primene, jedinjenja ovog pronalaska se mogu primenjivati rektalno ili posredstvom injekcije. Za rektalnu primenu, može se koristiti supozitorija. Supozitorija se može izraditi putem mešanja jedinjenja ovog pronalaska sa farmaceutski pogodnim ekscipijensom, koji se rastapa na temperaturi tela, ali na sobnoj temperaturi ostaje u čvrstom stanju. Primeri uključuju, ali se ne ograničavaju na njih, kakao puter, karbonski vosak i polietilen glikol. Koristeći postupke, poznate u ovoj oblasti, dobijena kompozicija se može oblikovati u bilo koji željeni oblik.
Za primenu posredstvom injekcije, jedinjenja ovog pronalaska se mogu injicirati hipodermalno, intrakutano, intravenski ili intramuskularno. Medicinska sredstva za lečenje za takvu injekciju mogu se pripremiti putem rastvaranja, suspendovanja ili emulogovanja jedinjenja pronalaska u vodenom ili ne-vodenom rastvaraču, kao što je biljno ulje, glicerid kiseline sintetske smole, estar viših masnih kiselina ili propilen glikol, korišćenjem poznatog postupka. Ukoliko se to želi, takođe se mogu dodati aditivi, kao što su: sredstvo za solubilizaciju, sredstvo za osmotsku regulaciju, emulgator, stabilizator ili konzervans, koji se uobičajeno koriste. Iako nije neophodno, poželjno je da kompozicija bude sterilna ili sterilisana.
Za formulisanje jedinjenja pronalaska u suspenzije, sirupe ili eliksire, može biti korišćen farmaceutski pogodan rastvarač. Između ostalih je, kao neograničavajući primer, uključena voda.
Jedinjenja pronalaska, takođe, mogu biti korišćena, zajedno sa dodatnim jedinjenjem, koje poseduje drugačiju farmaceutski pogodnu aktivnost, da bi se izradilo medicinsko sredstvo za lečenje. Lek, koji sadrži jedinjenje pronalaska kao samostalno jedinjenje ili kao deo kompozicije, može se koristiti u lečenju ispitanika kojima je to potrebno.
Jedinjenja pronalaska mogu se, takođe, primenjivati u obliku aerosola ili inhalacijskog sredstva, koje se priprema punjenjem jedinjenja, koja se nalaze u formi tečnosti ili finog praha, zajedno sa gasovitim ili tečnim sredstvom za raspršivanje, i, po potrebi, poznatim pomoćnim sredstvom, kao što je sredstvo za naduvavanje, u kontejner, koji nije pod pritiskom, kao što je kontejner za aerosol ili raspršivač. Kao sredstvo za raspršivanje može se koristiti gas pod pritiskom, na primer, dihlorofluorometan, propan ili azot.
Jedinjenja pronalaska se mogu primenjivati životinjama, uključujući sisare i ljude, kojima je to potrebno, u vidu farmaceutske kompozicije, kao što su tablete, kapsule, rastvori ili emulzije. U ovom pronalasku je, takođe, razmotrena primena drugih oblika jedinjenja, opisanih u ovom
1
pronalasku, uključujući, ali bez ograničavanja na njih, njihove estre, njihove farmaceutski prihvatljive soli, njihove metabolite, njihova strukturno srodna jedinjenja, njihove analoge i njihove kombinacije, u jednoj dozi ili u višestrukim dozama.
Jedinjenja pronalaska se, takođe, mogu primenjivati životinji kojoj je to potrebno, u vidu nutritivnog aditiva, ili kao hrana ili kao nutraceutski suplement.
Izrazi "prevencija", "lečenje" ili "ublažavanje" i slični izrazi, koji su ovde korišćeni, uključuju profilaksu i puni ili parcijalni tretman. Nazivi mogu, isto tako, uključiti smanjivanje simptoma, ublažavanje simptoma, umanjivanje ozbiljnosti simptoma, redukovanje učestalosti bolesti, ili bilo koju drugu promenu u stanju pacijenta, kojom se poboljšava terapeutski ishod.
Jedinjenja, opisana u ovom pronalasku, poželjno se koriste i/ili primenjuju u obliku kompozicije. Pogodne kompozicije su, poželjno, farmaceutska kompozicija, prehrambeni proizvod ili dodatak ishrani. Ove kompozicije se nalaze u pogodnom obliku iz koga se jedinjenje oslobađa. Kompozicije pronalaska mogu sadržavati antioksidans, u količini koja je delotvorna u povećanju stabilnosti jedinjenja, s obzirom na oksidaciju ili rastvorljivost.
Količina jedinjenja koja se primenjuje u postupku pronalaska ili koja je namenjena za primenu pri korišćenju pronalaska je bilo koja pogodna količina. Količina je, poželjno, od oko 0.0001 g do oko 20 g (još poželjnije, 0.01 g do 1 g, kao što je količina od 0.05 g do 0.5 g) jedinjenja na dan. Sledstveno tome se mogu formulisati pogodne kompozicije. Stručnjaci u oblasti doziranja biološki aktivnih sredstava biće u stanju da razviju posebne režime doziranja za razne ispitanike, na osnovu poznatih i dobrorazumljivih parametara.
Poželjna kompozicija u skladu sa pronalaskom, je farmaceutska kompozicija, primera radi, u formi tableta, pilula, kapsula, kapleta, višečestičnih formi (uključujući granule, zrnca, kuglice i mikro-inkapsulirane čestice), praškova, eliksira, sirupa, suspenzija i rastvora. Farmaceutske kompozicije će obično sadržavati farmaceutski prihvatljiv razblaživač ili nosač. Farmaceutske kompozicije su poželjno adaptirane za parenteralnu ili oralnu primenu. Kompozicije koje se primenjuju oralno, mogu biti u čvrstoj ili tečnoj formi, a mogu biti, između ostalog, u obliku tableta, praškova, suspenzija i sirupa. Opciono, kompozicije sadrže jedno ili više sredstava za ukus i/ili sredstava za boju. Uopšteno, terapeutske i nutritivne kompozicije mogu sadržavati bilo koju supstancu, koja ne interferira u značajnoj meri sa dejstvom jedinjenja na ispitanika.
Farmaceutski prihvatljivi nosači, pogodni za korišćenje u takvim kompozicijama, dobro su poznati u oblasti farmacije. Kompozicije pronalaska mogu sadržavati 0.01-99% po težini jedinjenja pronalaska. Kompozicije pronalaska se uopšteno pripremaju u formi jedinice dozaže. Poželjno, jedinica dozaže jedinjenja, opisanih u ovom pronalaska, je od 1 mg do 1000 mg (još poželjnije, od 50 mg do 500 mg). Ekscipijensi, koji su korišćeni u izradi ovih kompozicija, su ekscipijensi, poznati u struci.
Dalji primeri formi proizvoda za kompoziciju su dodaci hrani, kao što su, na primer, oblici mekih gel kapsula ili tvrdih kapsula, koje sadrže inkapsulirajući materijal, odabran iz grupe,
1
koju sačinjavaju: želatin, skrob, modifikovani skrob, derivati skroba, kao što su: glukoza, saharoza, laktoza i fruktoza. Inkapsulirajući materijal može, opciono, sadržavati unakrsno-povezane po mer z rajuće agense, stab zatore, ant oks danse, sredstva koja apsorbuju svet o za zašt tu punjenja oset j v h na svet ost, konzervanse slična sredstva. Poželjno, jedinica dozaže za jedinjenja u dodacima hrani je od 1 mg do 1000 mg (još poželjnije, od 50 mg do 500 mg).
Uopšteno, naziv nosač se tokom ove aplikacije, može koristiti da bi predstavio kompoziciju sa kojom se opisana jedinjenja mogu pomešati, tako da bude farmaceutski nosač, prehrambeni proizvod, nutritivni suplement, pomoćno sredstvo u ishrani, itd.. Prethodno opisani materijali se mogu smatrati nosačima za potrebe pronalaska. U određenim ostvarenjima pronalaska, nosač poseduje neznatno ili uopšte ne poseduje biološko dejstvo na jedinjenja pronalaska.
Doza: Postupci ovog pronalaska mogu uključiti primenu terapeutski efektivne količine jedinjenja životinji kojoj je to potrebno. Efektivna količina jedinjenja zavisi od oblika primenjenog jedinjenja, od trajanja primene, puta primene (npr., oralno ili parenteralno), od starosti ispitanika i stanja ispitanika, koji uključuju sisare i ljude.
Primera radi, količina jedinjenja, koja je efektivna za lečenje ili prevenciju dijabetesa tipa 2, predijabetesa, dijabetesa tipa 1, poremećene tolerancije na glukozu, insulinske rezistencije, ulceroznog kolitisa ili Crohonove bolesti, ili bilo kog drugog, ovde opisanog, stanja, kod životinje, može varirati u rasponu od 0.1-10,000 mg/kg/dnevno. Poželjna efektivna količina jedinjenja je 1 do 5,000 mg/kg/dnevno, pri čemu je poželjnija doza 2 do 100 mg/kg/dnevno. Gornji limit efektivne količine koja se primenjuje nije presudan, budući da su jedinjenja relativno ne-toksična, kako pokazuju naši rezultati toksikoloških ispitivanja. Efektivna količina jedinjenja je najdelotvornija u lečenju ili prevenciji ulceroznog kolitisa, Crohn-ove bolesti, dijabetesa tipa 2, dijabetesa tipa 1, pre-dijabetesa, metaboličkog sindroma, poremećene tolerancije na glukozu i insulinske rezistencije kod ispitanika, kada se ispitaniku primenjuje tokom perioda koji se kreću u rasponu od oko 7 do 100 dana, pri čemu je poželjni period od 15 do 50 dana, a najpoželjniji je period od 30 do 42 dana.
Količina jedinjenja, koja je najdelotvornija u prevenciji prekomerne aktivacije imunog sistema, može se kretati u rasponu od 0.1 do 500 mg/kg/dnevno, pri čemu je poželjna doza od 1 do 150 mg/kg/dnevno.
Kada se efektivna količina jedinjenja ovog pronalaska primenjuje u nutritivnoj, terapeutskoj, medicinskoj ili veterinarskoj kompoziciji, poželjna doza se kreće u rasponu od oko 0.01 do 2.0% tež/tež u odnosu na hranu ili nutraceutski proizvod.
U određenim drugim ostvarenjima, ovaj pronalazak obezbeđuje korišćenje LANCL2-vezujućih jedinjenja i, isto tako, strukturno srodnih jedinjenja, kao što je jedinjenje, koje je odabrano iz grupe, koju sačinjavaju: jedinjenje, njegovi estri, njegove farmaceutski prihvatljive soli ili njihove kombinacije, u lečenju i prevenciji IBD i zapaljenja GI trakta.
Pored toga, ovaj pronalazak se, uopšteno odnosi na inhibiciju inflamacije GI trakta,
1
pri čemu relevantne komponente istog uključuju: želudac, tanko crevo, debelo crevo i rektum. Efekat proističe iz izloženosti jedinjenju raznih vrsta ćelija u organizmu, što izaziva biološki efekat. Ćelije mogu uključiti ćelije tkiva GI trakta, imune ćelije (tj. makrofage, monocite, limfocite) ili epitelne ćelije. U određenim ostvarenjima, pronalazak obezbeđuje lečenje ispitanika korišćenjem jedinjenja pronalaska, na primer, u vidu dodatka ishrani, da bi se smanjilo ili preveniralo zapaljenje, povezano sa inflamatornom bolešću creva, ili Crohn-ovom bolešću ili ulceroznim kolitisom. Ovaj pronalazak, takođe, razmatra primenu jedinjenja pronalaska u GI trakt, kako bi se izvršila supresija ekspresije ćelijskih adhezivnih molekula u crevima.
Kada se praktično primenjuju, postupci pronalaska mogu biti izvršeni putem primene jedinjenja ispitaniku, posredstvom bilo kog prihvatljivog puta primene, uz korišćenje bilo kog prihvatljivog oblika, kao što je prethodno opisano, i omogućavanja organizmu ispitanika da jedinjenja distribuira do ciljanih ćelija korišćenjem prirodnih procesa. Kao što je prethodno opisano, primena može, isto tako, biti posredstvom direktnog injiciranja na poziciju (npr., organ, tkivo), koja uključuje ciljanu ćeliju (tj., ćeliju koja se podvrgava tretmanu).
Pored toga, primena može slediti bilo koji broj režima. Sledstveno tome, može uključivati jednu dozu ili doziranje eksperimentalnog jedinjenja, ili višestruke doze ili doziranje tokom određenog perioda. Sledstveno tome, tretman može uključivati ponavljanje koraka primene, jednom ili više puta, dok se ne postigne željeni rezultat. U određenim ostvarenjima, lečenje se može nastaviti tokom produženog vremenskog trajanja, kao što su nedelje, meseci ili godine. Stručnjaci u ovoj oblasti će biti u potpunosti spremni da jednostavno razviju pogodne režime doziranja za pojedine ispitanike, na osnovu parametara, poznatih u struci. Dozne količine za jedinjenja pronalaska mogu se koristiti u postupcima ovih ostvarenja pronalaska. Za lečenje IBD, inflamacije GI trakta ili supresije ekspresije ćelijskih adhezivnih molekula u crevima, poželjno je da se jedinjenja primenjuju u količinima od oko 1 mg/dnevno do 9,000 mg/dnevno.
Količina koja se primenjuje variraće u zavisnosti od ispitanika, stanja bolesti ili poremećaja, starosti ispitanika, opšteg zdravstvenog stanja ispitanika i raznih drugih poznatih parametara, koje stručnjaci u medicinskim oblastima rutinski uzimaju u razmatranje. Uopšteno govoreći, biće primenjena dovoljna količina jedinjenja da bi se postigla detektibilna promena stepena zapaljenja GI trakta, koje je kod pacijenata sa IBD često povezano sa nivom bola koje pojedinac oseća. Kod pacijenata koji u trenutku ispitivanja nemaju simptome IBD, promene koje ispitanik očekuje mogu uključiti parametre imunih ćelija, kao što je ekspresija TNFa na ćelijama imunog sistema ili procenat regu atorn h T-ćelija u krvi. Ovde su prikazane pogodne količine, a dodatne pogodne količine mogu utvrditi stručnjaci u ovoj oblasti bez podvrgavanja nepotrebnim ili prekomernim eksperimentima, na osnovu ovde izloženih količina.
U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje postupak lečenja ili preveniranja bolesti kod ispitanika koji boluje od IBD, ili, u drugom slučaju, kod zdravih ispitanika, kod koji postoji
1
mogućnost da imaju genetsku predispoziciju za Crohn-ovu bolest ili ulcerozni kolitis, da ne bi došlo do razvijanja IBD. Postupak može, isto tako, uključiti tretman ispitanika sa formama remisije IBD. U skladu sa ovim pronalaskom, izraz "ispitanik koji boluje od IBD" korišćen je da bi se označio ispitanik (npr., životinja, čovek), koji ima bolest ili poremećaj, sa ispoljavanjem jednog ili više kliničkih znakova, uobičajenih za IBD. Uopšteno, postupak lečenja ili preveniranja u skladu sa ovim aspektom pronalaska, uključuje primenu ispitaniku one količine terapijskog jedinjenja, koja je efektivna u tretmanu ili prevenciji jednog ili više simptoma ili kliničkih manifestacija IBD, ili u sprečavanju razvijanja jednog ili više takvih simptoma ili manifestacija.
Sledstveno tome, u skladu sa postupcima pronalaska, pronalazak može obezbediti postupke lečenja IBD, kao i lečenja zapaljenja povezanog sa infekcijama creva i zapaljenja, povezanog sa autoimunim bolestima. Postupci tretmana mogu biti profilaktički postupci. U određenim ostvarenjima, postupak je postupak lečenja IBD, kao i lečenja zapaljenja povezanog sa infekcijama creva i zapaljenja, povezanog sa autoimunim bolestima. U drugim ostvarenjima, postupak je postupak prevencije IBD. U ostvarenjima, postupak je postupak sprečavanja da oblici remisije IBD postanu aktivni oblici. U nekim drugim ostvarenjima, postupak je postupak poboljšanja zdravstvenog stanja ispitanika koji boluje od IBD, od inflamacije povezane sa crevnim infekcijama ili od inflamacije, udružene sa autoimunim bolestima. Organizmi koji su uzročnici gastrointestinalnih infekcija uključuju, ali bez ograničavanja na njih, sledeće organizme: Escherichia coli, Shigella, Salmonella, patogeni Vibrios, Campylobacter jejuni, Yersina enterocolitica, Toxoplasma gondii, Entamoeba histolytica i Giardia lamblia. Sledstveno tome, u određenim ostvarenjima, pronalazak obezbeđuje postupak zaštite zdravlja, odnosno zaštite organa i/ili tkiva ispitanika koji boluje od IBD, od zapaljenja povezanog sa infekcijama creva i zapaljenja, povezanog sa autoimunim bolestima, ili je pod rizikom od razvijanja IBD, zapaljenja povezanog sa infekcijama creva i zapaljenja, povezanog sa autoimunim bolestima.
U jednom ostvarenju pronalaska, postupak lečenja IBD obuhvata lečenje IBD bez izazivanja uočljivih sporednih efekata, kao što su značajno dobijanje na težini, sistemska supresija imunog sistema, pojava kušingoidnog izgleda, osteopenija/osteoporoza ili pankreatitis, koji se uobičajeno javljaju kod trenutno raspoloživih tretmana IBD (tj., kortikosteroidi, inhibitori tumor nekrozis faktora alfa). To jest, utvrđeno je da postupak lečenja u skladu ovim pronalaskom, koji pruže efekat tretmana, barem delimično, posredstvom uticaja na ekspresiju i/ili aktivaciju LANCL2 u nekim ćelijama, obezbeđuje povoljan efekat bez izazivanja značajnog dobijanja na težini, na primer, kao posledica zadržavanja tečnosti, kod ispitanika koji se podvrgava tretmanu, u poređenju sa drugim sličnim ispitanicima, koji nisu podvrgnuti tretmanu.
Kao takvi, postupci ovog pronalaska mogu obezbediti postupke za redukovanje zapaljenja. Postupcima se inflamacija može redukovati sistemski tj., delovanjem na organizam ispitanika) ili lokalno (npr., na poziciji primene ili na poziciji inflamatornih ćelija, koje uključuju, ali bez ograničavanja na njih, T ćelije i makrofage). U lečenju ili prevenciji inflamacije, u skladu sa postupcima
1
ovog pronalaska, jedan od efekata koji se može primetiti jeste smanjenje broja krvnih monocita ili makrofaga i limfocita, koji infiltriraju u creva. Drugi efekat može biti uvećavanje populacije regulatornih imunih ćelija, kao što su CD4+CD25+FoxP3+ regulatorne T-ćelije, ili povećavanje regulatornih karakteristika mfocita ili makrofaga (npr., povećanje nter euk na 4 (IL-4) ili IL-10 ili smanjenje TNF-a i IL-6). Drug efekat može b t smanjenje pr sustva gena nf amac je /ili adhezivnih molekula. Stoga se postupci takođe, mogu smatrati postupcima kojima se utiče na ili menja imuni odgovor ispitanika, kome se daje terapijsko jedinjenje. Ispitanik može imati inflamatornu bolest creva ili drugo stanje u kome je poželjan ishod imunomodulacija T- ćelija ili nishodna regulacija ćelijskih adhezivnih molekula.
Pronalazak, isto tako, obezbeđuje postupke lečenja infektivnih bolesti ovde opisanim jedinjenjima. Ne-ograničavajući primeri takvih infektivnih bolesti uključuju: virusne infekcije, bakterijske infekcije i gljivične infekcije.
Ne-ograničavajući primeri virusnih infekcija uključuju infekcije virusima iz familije adenoviridae, kao što je adenovirus; virusima iz familije herpesviridae, kao što su: virus herpes simpleksa tipa 1, herpes simpleksa tipa 2, varicella-zoster virus, epstein-barr virus, humani citomegalovirus, humani herpesvirus tipa 8; virusima iz familije papillomaviridae, kao što je humani papiloma virus; virusima iz familije polyomaviridae, kao što su BK virus i JC virus; virusima iz familije poxviridae, kao što je virus velikih boginja; virusima iz famillije hepadnaviridae, kao što je virus hepatitisa B; virusima iz familije parvoviridae, kao što je humani bokavirus i parvovirus B19; virusima iz familije astroviridae, kao što je humani astrovirus; virusima iz familije caliciviridae, kao što je norvalk virus; virusima iz familije picornaviridae, kao što su coxsackie virus, virus hepatitisa A, poliovirus i rinovirus; virusima iz familije coronaviridae, kao što je virus koji uzrokuje akutni respiratorni sindrom; virusima iz familije flaviviridae, kao što virus hepatitisa C, virus žute groznice, virus denge i virus zapadnog Nila, virusima iz familije togaviridae, kao što je rubela virus; virusima iz familije hepeviridae, kao što je virus hepatitisa E; virusima iz familije retroviridae, kao što je virus humane imunodeficijencije (HIV); virusima iz familije orthomyxoviridae, kao što je virus influence; virusima iz familije arenaviridae, kao što su: guanarito virus, junin virus, lassa virus, machupo virus i sabiá virus; virusima iz familije bunyaviridae, kao što je virus Krimsko-Kongoanske hemoragijske groznice; virusima iz familije filoviridae, kao što su ebola virus i marburg virus; virusima iz familije paramyxoviridae, kao što su: virus malih boginja, virus zauški, virus parainfluence, respiratorni sincicijalni virus, humani metapneumovirus, hendra virus i nipah virus; virusima iz familije rhabdoviridae, kao što je virus besnila; virusima koji nisu raspoređeni, kao što je virus hepatitisa D; i virusima iz familije reoviridae, kao što su, između ostalih, rotavirus, orbivirus, koltivirus i bana virus.
Ne-ograničavajući primeri bakterijskih infekcija uključuju infekcije prethodno opisanim bakterijama, koje pored ostalih uključuju i Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Bordetella pertussis, Borrelia burgdorferi, Brucella abortus, Brucella canis, Brucella melitensis, Brucella suis, Campylobacter jejuni, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatis, Chlamydophila
2
psittaci, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Corynebacterium diphtheriae, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Escherichia coli, Francisella tularensis, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Legionella pneumophila, Leptospira interrogans, Listeria monocytogenes, Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium ulcerans, Mycoplasma pneumoniae, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Pseudomonas aeruginosa, Rickettsia rickettsii, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Shigella sonnei, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophyticus, Streptococcus agalactiae, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Treponema pallidum, Vibrio cholerae, Yersinia pestis, Yersinia enterocolitica, Yersinia pseudotuberculosis, i ostale speciese rodova prethodno-pomenutih organizama.
Ne-ograničavajući primeri gljivičnih infekcija uključuju infekcije gljivicama roda Aspergillus, kao što je Aspergillus fumigatus, koji izaziva aspergilozu; gljivicama roda Blastomyces, kao što je Blastomyces dermatitidis, koji izaziva blastomikozu; gljivicama roda Candida, kao što je Candida albicans, koja izaziva kandidijazu; gljivicama roda Coccidioides, koji izaziva kokidiomikozu (groznicu doline); gljivicama roda Cryptococcus, kao što su Cryptococcus neoformans i Cryptococcus gattii, koji izazivaju kriptokokozu; gljivicama dermatofitima, koje izazivaju lišajeve; gljivicama koje izazivaju gljivični keratitis, kao što su: Fusarium species, Aspergillus species i Candida species; gljivicama roda Histoplasma, kao što je Histoplasma capsulatum, koja izaziva histoplazmozu; gljivicama iz roda Mucorales, koje izazivaju mukormikoze; gljivicama roda Saccharomyces, kao što je Saccharomyces cerevisiae; gljivicama roda Pneumocystis, kao što je Pneumocystis jirovecii, koji izaziva pneumocističnu pneumoniju i gljivicama roda Sporothrix, kao što je Sporothrix schenckii, koji izaziva sporotrihozu.
Pronalazak, takođe, obezbeđuje postupke lečenja autoimune inflamatorne bolesti jedinjenjima, koja su ovde opisana. Ne-ograničavajući primeri autoimunih inflamatornih bolesti uključuju, između ostalih, inflamatornu bolest creva (IBD), sistemski lupus, reumatoidni artritis, dijabetes tipa 1, psorijazu i multiplu sklerozu.
Pronalazak, isto tako, obezbeđuje postupke lečenja hroničnih inflamatornih bolesti jedinjenjima, koja su ovde opisana. Ne-ograničavajući primeri hroničnih inflamatornih bolesti uključuju, između ostalih, metabolički sindrom, gojaznost, predijabetes, kardiovaskularne bolesti i dijabetes tipa 2.
Pronalazak, takođe, obezbeđuje postupke lečenja dijabetesa jedinjenjima, koja su ovde opisana, uključujući dijabetes tipa 1, dijabetes tipa 2 i ostale tipove dijabetesa. Naziv "dijabetes" ili "diabetes mellitus" je korišćen da bi uključio metaboličke poremećaje, sa kojima ispitanik ima visoke koncentracije šećera u krvi (tj., ima hiperglikemiju). Stanja hiperglikemije imaju razne etiologije, kao što su stanja kada gušterača ne proizvodi dovoljno insulina ili ćelije ne odgovaraju na proizvedeni insulin.
Postoji nekoliko prepoznatih pod-tipova dijabetesa. Dijabetes tipa tipa 1 je karakterisan potpunom nesposobnošću organizma da proizvodi insulin ili nesposobnošću organizma da proizvede dovoljno insulina. Dijabetes tipa 2 uopšteno proizlazi iz insulinske rezistencije, stanja u kome ćelije nisu u stanju da koriste insulin na ispravan način. Dijabetes tipa 2 je ponekad prisutan uz insulinsku deficijenciju. Gestacioni dijabetes se javlja kada trudnice bez prethodne dijagnoze šećerne bolesti razviju hiperglikemiju. Ređi oblici dijabetesa uključuju: kongenitalni dijabetes (zbog genetskih defekata koji se odnose na sekreciju insulina), dijabetes udružen sa cističnom fibrozom, steroidni dijabetes, izazvan visokim dozama glukokortikoida, i nekoliko formi monogenskog dijabetesa (uključujući mladenački dijabetes koji započinje u zreloj dobi). Monogenski dijabetes uključuje nekoliko hereditarnih oblika dijabetesa, izazvanih mutacijama u jednom, autosomno dominantnom genu (kao suprotnost mnogo kompleksnijim, poligenskim etiologijama, koje dovode do hiperglikemije).
S obzirom na prethodne postupke, bilo bi očigledno da ovaj pronalazak obezbeđuje terapijsko jedinjenje koje se vezuje sa LANCL2, za korišćenje u kontaktu sa ćelijama, kao u slučaju tretmana ćelija ispitanika. Prethodna razmatranja su fokusirana na korišćenje jedinjenja ovog pronalaska kao dela kompozicije, koja bi se koristila u nečemu što bi se moglo podvesti pod farmaceutsko ili medicinsko korišćenje.
U ovom pronalasku opisana jedinjenja, namenjena tretmanu IBD, inflamacije GI trakta i drugih opisanih stanja, mogu biti formulisana u vidu farmaceutskih preparata, nutritivnih kompozicija, kompozicija funkcionalne hrane i sredstava koja su ispomoć ishrani, kao što je prethodno detaljnije opisano.
Elementi i koraci postupaka, koji su ovde opisani, mogu biti korišćeni u bilo kojoj kombinaciji, bez obzira da li je to eksplicitno opisano ili nije.
Sve kombinacije koraka postupaka, kao što su ovde korišćeni, mogu biti izvršene bilo kojim redosledom, osim ukoliko nije specifično naznačeno drugačije ili se jasno implikuje suprotno iz konteksta u kome se kombinacija, na koju se odnosi, izvodi.
Kako su ovde korišćeni, oblici u jednini uključuju oblike u množini, osim ukoliko sadržaj jasno ne nalaže drugačije.
Brojčani rasponi, kao što su ovde korišćeni, utvrđeni su kako bi uključili svaki broj i podgrupu brojeva, sadržanih unutar tog raspona, bez obzira da li su specifično navedeni ili ne. Pored toga, ovi numerički rasponi bi bili tumačeni kao obezbeđivanje potpore za zahtev, koji se odnosi na bilo koji broj ili podgrupu brojeva unutar tog raspona. Na primer, navodi koji se vode kao raspon od 1 do 10 tumačili bi se tako da podržavaju raspon od 2 do 8, od 3 do 7, od 5 do 6, od 1 do 9, od 3.6 do 4.6, od 3.5 do 9.9, i tako dalje.
Podrazumeva se da pronalazak nije ograničen na pojedinu konstrukciju i rasporede delova, koji su ovde ilustrativno prikazani i opisani, već obuhvata i njihove modifikovane oblike, koji spadaju unutar okvira patentnih zahteva.
PRIMERI MOLEKULSKOG MODELOVANJA
Primer 1: Molekulsko modelovanje vezivanja LANCL2 liganda
Uvod
Ustanovljeni agonisti LANCL2, kao što su apscisinska kiselina (ABA) i NSC61610, ispoljavaju anti-inflamatornu aktivnost na širokom spektru modela bolesti, u rasponu od IBD do šećerne bolesti i gripa. Vrednost LANCL2, kao nove terapeutske mete, zaslužuje napore za otkrivanje i razvijanje nove klase oralno aktivnih lekova za lečenje hroničnih metaboličkih, imuno-posredovanih i infektivnih bolesti. Kao što je u ovom primeru razmotreno, dodatni agonisti LANCL2 razvijeni su posredstvom racionalnog dizajniranja lekova, koje ponovljeno kombinuje kompjutersko modelovanje i eksperimentalnu validaciju. Ovaj primer predstavlja pristupe za uvećavanje racionalnog dizajniranja leka i napore medicinske hemije da bi se pojačala rastvorljivost, povećalo vezivanje za LANCL2, smanjili troškovi i povećalo razumevanje samog LANCL2 proteina.
Postupci
Struktura LANCL2. Ne postoji kristalna struktura LANCL2. Sledstveno tome, radi razumevanja strukture i funkcije LANCL2, izvršeno je homologno modelovanje humanog LANCL2, uz korišćenje kristalne strukture LANCL1, kao šablona. Procenjen je kvalitet modela, a poboljšanja su urađena posredstvom procedura minimiziranja energije. Modelovanje homologije predviđa 3D strukturu proteina posredstvom identifikovanja njihovih homolognih proteina u odnosu na druge članove familije proteina, čije strukture su razrešene eksperimentalnim putem. [52]. Kada proteini poseduju više od 35% istovetnosti sekvenci, verovatno su homologni. LANCL1 deli 54% istovetnosti sekvenci sa LANCL2 [15].
Razvijanje jedinjenja i struktura liganda. Proizvedene su strukture agonista LANCL2 (Slike 1A i IB). SMILES ovih agonista je razvijen korišćenjem NIH-ovog online programa SMILES Translator and Converter [53]. Istovremeno su razvijeni i preuzeti pojedinačni strukturni .pdb fajlovi. AutoDock Tools je korišćen za prevođenje pdb fajlova u .pdbqt, što je neophodno za virtuelno skriniranje.
Virtuelno skriniranje. Spajanje fajlova razvijenih derivata izvršeno je korišćenjem AutoDock Tools. Definisan je prostor pretraživanja, uključujući centar ʺmrežaste kockeʺ i x, y i z dimenzije. Povezivanje je aplikovano na ciljani puni protein sa koordinatnom mrežom koja pokriva površinu celog proteina. Koordinatna mreža je bila regularna kocka (77.8 Å x 77.8 Å x 77.8 Å) sa
2
tačkama koordinatne mreže, koje su razdvojene za 0.608 Å. Centar ove koordinatne mreže je postavljen u sredinu proteina. Ove dimenzije i razmaci omogućili su da mrežastom kockom bude pokrivena celokupna površina LANCL2. Genetički algoritam je korišćen za stohastičku globalnu optimizaciju. Za svako jedinjenje je, posredstvom AutoDock Tools, proizvedeno stotinu povezanih konformacija. 100 dobijenih postavki svakog derivata grupisano je u klastere sa RMSD klaster tolerancijom od 2.0 Å.
Analiza rezultata virtuelnog skriniranja. Pretraživanje najboljeg načina za podešavanje vezivanja svakog jedinjenja sa LANCL2, uz korišćenje AutoDock Vina, dovelo je do povezivanja log fajlova, koji sadrže zabeleške povezivanja, uključujući energiju vezivanja za svaki predviđeni način vezivanja za sva jedinjenja. Energije vezivanja predstavljaju zbir ukupne intermolekularne energije, ukupne interne energije i torzijske slobodne energije, uz umanjenje za energiju nevezanog sistema. Jedinjenja su razvrstana prema vrednosti najnegativnije energije. Postavka najniže energije vezivanja u prvom klasteru smatrana je najpovoljnijom postavkom povezivanja. Niža energija bez vezivanja ukazuje na stabilniji sistem protein-ligand i veći afinitet između proteina i liganda. Primeri jedinjenja su dalje validirani posredstvom in vitro testitranja i pre-kliničkih ispitivanja, uz korišćenje mišjih modela humanih bolesti.
Rezultati
Sažetak vezivanja NSC61610. Histogram prvih pet klastera NSC61610 sa energijom najniže energetske pozicije prikazan je na Slici 2. NSC61610 ima veoma visoki afinitet za ’centralni rascep’. Od prva dva klastera, koji predstavljaju 7% svih serija povezivanja, svaki je usmeren prema ovom položaju. Zbog tolerancije od dva angstrema, verovatno je da su i ostali klasteri usmereni prema ovom položaju. Sledeća dva klastera usmerena su prema ’alosteričkom položaju’, u blizini plavog nasumičnog klupka.
Sažetak vezivanja ABA. Histogram prvih pet klastera ABA sa energijom najniže energetske pozicije prikazan je na Slici 3. ABA ima srednji afinitet, ali veoma visoku specifičnost za ’alosterički’ položaj između svetlo zelenog heliksa i svetlo zelenog nasumičnog klupka. 29% serija povezivanja usmereno je prema ovom prvom klasteru. Drugi klaster je, takođe, usmeren prema ovom položaju. Zbog tolerancije od dva angstrema, verovatno je da su i ostali klasteri usmereni prema ovom položaju. Izgleda da se četvrti klaster nalazi u ’centralnom rascepu’. Ovo ostavlja otvorenim pitanje istinskog terapeutskog položaja ABA.
Sažetak vezivanja BT-11. Histogram prvih pet klastera BT-11 sa energijom najniže energetske pozicije, prikazan je na Slici 4. Prva dva klastera BT-11 usmerena su prema ’centralnom rascepu’, ali predstavljaju samo 2% serija povezivanja. Međutim, zbog tolerancije od dva angstrema, verovatno je da su i ostali klasteri usmereni prema ovom položaju. BT-11 ima neznatno niži afinitet prema ovom položaju nego NSC61610, ali ima veći afinitet nego ABA. BT-11 poseduje dokazanu terapeutsku efikasnost (pogledajte primere u nastavku).
Sažetak vezivanja BT-6. Histogram prvih pet klastera BT-6 sa energijom najniže energetske pozicije prikazan je na Slici 5. BT-6 ima najviši afinitet od svih vezanih jedinjenja. Prva dva, možda tri klastera, usmerena su prema ’centralnom rascepu’. Zbog tolerancije od dva angstrema, verovatno je da su i ostali klasteri usmereni prema ovom položaju. Klaster 4 je usmeren prema ’alosteričkom’ položaju duž plavog nasumičnog klupka.
Sažetak vezivanja BT-15. Histogram prvih pet klastera BT-15 sa energijom najniže energetske pozicije prikazan je na Slici 6. BT-15 ne poseduje afinitet vezivanja ni NSC61610 ni BT-11. Budući da izgleda da je usmeren prema ’centralnom rascepu’, to se ne čini izrazitim kao u slučaju NSC61610 ili BT-11.
Sažetak vezivanja BT-ABA-5a. Histogram prvih pet klastera BT-ABA-5a’ sa energijom najniže energetske pozicije prikazan je na Slici 7. Najviši afinitet BT-ABA-5a je na poziciji koja nije zapažena ni u jednom od prethodno ispitanih povezivanja. Međutim, klasteri 2 i 3 predstavljaju veliku većinu serija povezivanja, od 32%. Klaster 2 je usmeren prema alosteričkom položaju pozadi desno. Klaster 3 je usmeren prema ’alosteričkom’ položaju ABA. Klaster 4 je, takođe, usmeren prema ovom položaju. Zbog tolerancije od dva angstrema, verovatno je da su i ostali klasteri usmereni prema ovom položaju.
Diskusija
I ABA i NSC61610 ispoljavaju imuno-modulatorne LANCL2-zavisne, anti-inflamatorne i anti-dijabetične efekte, međutim, kompjuterske predikcije sugerišu da se oni vezuju za različite položaje LANCL2. Kao što se i očekivalo, racionalno dizajnirani ligandi su usmereni prvenstveno prema primarnim vezujućim položajima ABA i NSC61610. BT-ABA jedinjenja su manja po veličini i poseduju -COOH funkcionalne grupe; to pruža intuitivni osećaj da su navedena jedinjenja usmerena prema hidrofilnom džepu na površini. BT jedinjenja su mnogo hidrofobnija jedinjenja; sledstveno tome, to pruža intuitivni osećaj da bi jedinjenja mogla biti usmerena prema hidrofobnijem centralnom rascepu, koji je okružen alfa-heliksima.
Afiniteti vezivanja su u blagoj korelaciji sa podacima SPR (Slike 1A i 1B; pogledajte primere u nastavku). SPR podaci (sa vrednošću KD) sugerišu sledeći redosled jačine vezivanja: NSC61610 (2.3 & 6.3), BT-11 (6.3 & 7.7), BT-15 (11.4 & 21.4), BT-6 (18.2). Podaci modelovanja (sa najnižim BE) sugerišu sledeći redosled jačina vezivanja: BT-6 (-10.47), NSC61610 (-10.27), BT-11 (-9.39), BT-15 (-8.87). Pored ispada za BT-6 od najnižeg do prvog, SPR podaci i podaci modelovanja sugerišu istovetni redosled jačina vezivanja. Podaci molekulskog modelovanja, kombinovani sa racionalnim dizajnom leka, po svoj prilici će doprineti boljem razumevanju
2
LANCL2 proteina, što će omogućiti dalje razvijanje analoga, koji ciljano deluju i aktiviraju put LANCL2, da bi se iskoristile njihove snažne anti-dijabetične i anti-inflamatorne karakteristike.
PRIMERI MEDICINSKE HEMIJE
Primer 2: BT-11 i so
Kao što je prikazano u Šemi 2-1, rastvor 6-(1H-benzimidazol-2-il)piridin-2-karboksilne kiseline (12 g) u DMF (100 mL) je ohlađen do 0°C, nakon čega su uzasopno dodati EDC•HCl (1.5 eq), HOBt (1.5 eq) i DIPEA (1.2 eq., uzeti u zapreminama sa pretpostavljenom gustinom). Mešavina je mešana tokom 10 minuta na 0°C. Dodat je piperazin (0.5 eq.), a reakciona mešavina je ostavljena da se postepeno zagreva do RT i mešana je tokom 16 h. Nakon završetka reakcije (koji je praćen posredstvom TLC, e uent: 10% MeOH u DCM), reakciona mešavina je ulivena u ledenohladnu vodu (~300 mL), filtriranjem je izdvojena precipitirana čvrsta masa, koja je isprana ledeno-hladnom vodom i osušena, da bi se dobio BT-11 (10 g, 75%), u vidu bledo smeđe čvrste mase.<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6), d 13.0 (s, 1H), 12.8 (s, 1H), 8.38 (dd, 2H), 8.13 (dt, 2H), 7.73 (dd, 2H), 7.67 (d, 2H), 7.57 (dd, 2H), 7.25 (m, 4H), 3.90 (bs, 2H), 3.80 (bdd, 2H), 3.65 (bdd, 2H), 3.56 (bs, 2H). LCMS-ES 529.44 [M+H]<+>, 265.46 [(M+2H)/2]<++>.
Šema 2-1
Kao što je prikazano u Šemi 2-2, suspenzija BT-11 (1.0 eq.) u minimalnoj količini MeOH (5 mL) je ohlađena do 0°C, dodata je 4M metanolna HCl (višak, 15 mL/1 g), u vidu kapi tokom perioda od 15-20 minuta. Mešavina je ostavljena da se postepeno zagreva do RT tokom 3
2
h. Nakon završetka reakcije (koji je praćen posredstvom TLC, eluent: 10% MeOH u CH2Cl2), isparljivi delovi su upareni pod sniženim pritiskom. Sirovi materijal je ispran sa 10% MeOH u CH2Cl2i<izvršena je>liofilizacija, da bi se dobila zatvoreno bela čvrsta masa (850 mg, 75%).<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6), d 8.58 (dd, 2H), 8.29 (dt, 2H), 7.83 (m, 6H), 7.44 (bd, 4H), 3.91 (bs, 2H), 3.81 (bm, 2H), 3.64 (bm, 2H), 3.55 (bs, 2H). LCMS-ES 529.56 [M+H]<+>.
Šema 2-2
salt = so (prim. prev.)
Primer 3: BT-12
Kao što je prikazano u Šemi 3-1, rastvor 6-(benzoksazol-2-il)piridin-2-karboksilne kiseline (4.05 g) u 10% DMF u CH2Cl2obrađen je sa EDC•HCl (1.5 eq.), HOBt (1.5 eq.) i DIPEA (1.2 eq., uzeti u zapreminama sa pretpostavljenom gustinom) i 0.5 eq. piperazina na 0°C. Mešavina je ostavljena da se zagreva do RT tokom 16 h. Obrazovana je svetlo smeđa čvrsta masa, koja je filtrirana u levku od sinterovanog stakla, isprana je vodom i liofilizovana, da bi se proizvela svetlo smeđa čvrsta masa (3.2 g).<1>H NMR (300 MHz, CDCl3), d 8.45 (dd, 2H), 8.05 (m, 2H), 7.9 (d, 2H), 7.8 (dd, 2H), 7.6 (dd, 2H), 7.4 (m, 2H), 7.35 (m, 2H), 4.0 (bm, 8H).
Šema 3-1
2
1.5 eq EDC×HCl,
1.5 eq HOBT,
1.2 eq DIPEA,
Primer 4: BT-14 i so
Kao što je prikazano u Šemi 4-1, rastvor 6-(benzoksazol-2-il)piridin-2-karboksilne kiseline (500 mg) u DMF (10 mL) je obrađen sa EDC•HCl (1.5 eq.), HOBt (1.5 eq.), DIPEA (3 eq.) i terc-butil piperazin-1-karboksilatom (1.1 eq.) na 0°C. Mešavina je ostavljena da se zagreva do RT, tokom 16 h. Nakon uparavanja rastvarača, ostatatak je ekstrahovan u EtOAc i ispran je vodom. Organski sloj je uparen pod vakuumom, a sirovi ostatak je ispran pentanom, da bi se dobila svetlo smeđa čvrsta masa (120 mg, 48%).<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6), d 8.4 (d, 1H), 8.2 (t, 1H), 7.9 (t, 2H), 7.8 (d, 1H), 7.5 (dt, 2H), 3.7 (bm, 2H), 3.5 (bm, 4H), 3.4 (bm, 2H), 1.4 (s, 9H). LCMS-ES 409.49 [M+H]<+>, 431.37 [M+Na]<+>, 447.36 [M+K]<+>.
Šema 4-1
Kao što je prikazano u Šemi 4-2, jedinjenje, dobijeno u Šemi 4-1 (200 mg), obrađeno je sa metanolnom HCl (6 mL) na 0°C. Mešavina je ostavljena da se zagreva do RT, tokom 3 h. Nakon uparavanja rastvarača i ispiranja sa pentanom i etrom, dobijena je svetlo smeđa čvrsta masa (160
2
mg, kvantitativno.). H NMR (300 MHz, DMSO-d6), d 9.30 (bs, 2H), 8.45 (d, 1H), 8.25 (t, 1H), 7.9 (m, 3H), 7.5 (kvin, 2H), 3.7 (bm, 2H), 3.5 (bm, 2H), 3.3 (bm, 4H), 1.4 (s, 9H). LCMS-ES 309.26 [M+H]<+>.
Šema 4-2
salt = so (prim. prev.)
Kao što je prikazano u Šemi 4-3, so, (25 mg) dobijena u Šemi 4-2, neutralisana je zasićenim vodenim rastvorom NaHCO3nakon čega je sledilo sušenje u liofilizatoru, da bi se, na raspolaganju, dobilo 20 mg/96% BT-14. Prinos je bio 90%. H NMR (300 MHz, DMSO-d6), d 8.4 (d, 1H), 8.2 (t, 1H), 7.90 (t, 2H), 7.75 (d, 1H), 7.5 (kvin, 2H), 3.95 (bm, 2H), 3.8 (bm, 2H), 3.3 (bm, 2H), 3.2 (bm, 2H); 309.37 LCMS-ES [M+H]<+>.
Šema 4-3
zasićeni vodeni NaHCO3
salt = so (prim. prev.)
Primer 5: BT-15
2
Kao što je prikazano u Šemi 5-1, 6-(1H-benzimidazol-2-il)piridin-2-karboksilna kiselina (50 mg) u DMF (5 mL) je obrađena sa EDC•HCl (1.5 eq), HOBt (1.5 eq), DIPEA (3 eq) i 0.9 eq. HCl soli BT-14, na 0°C. Mešavina je ostavljena da se zagreva do RT, tokom 16 h. Filtriranjem preko levka od sinterovanog stakla, nakon čega je sledilo ispiranje vodom i liofilizacija, da bi se odstranila vlaga, dobijeno je 20 mg BT-15. H-NMR (400 MHz, DMSO-d6), d 12.93 (d, 1H), 8.44 (dd, 1H), 8.36 (t, 1H) 8.25 (t, 1H), 8.17 (m, 2H), 7.87 (m, 3H), 7.72 (m, 2H), 7.54 (m, 2H), 7.31 (m, 3H), 3.90 (s, 2H), 3.82 (bm, 2H), 3.67 (bm, 2H), 3.58 (bm, 2H). LCMS-ES 530.48 [M+H]<+>, 265.94 [(M+2H)/2]<++>.
Šema 5-1
salt = so (prim. prev.)
BT-15 je pokazao vezivanje za LANCL2 (Slika 1A). Njegov prediktivni afinitet vezivanja za LANCL2 je -9.9, a afinitet, potvrđen posredstvom SPR, ima vrednost Kd od 21.4.
Primer 6: BT-13 so
Kao što je prikazano u Šemi 6-1, 6-(1H-benzimidazol-2-il)piridin-2-karboksilna kiselina (500 mg) u DMF (10 mL) je obrađena sa EDC•HCl (1.5 eq), HOBt (1.5 eq), DIPEA (3 eq) i sa tercbutil piperazin-1-karboksilatom (1.1 eq) na 0°C. Mešavina je ostavljena da se zagreva do RT, tokom 16 h. Nakon ulivanja reakcione mešavine u ledeno-hladnu vodu, precipitat je filtriran i osušen, da bi se dobila bledo smeđa čvrsta masa (600 mg, 70%). TLC (100% etil acetat). HNMR & LCMS se slažu. (Prinos: 70%). H NMR (300 MHz, DMSO-d6), d 12.90 (s, 1H), 8.4 (d, 1H), 8.15 (t, 1H), 7.65 (td, 3H), 7.25 (kvin, 2H), 3.7 (bm, 2H), 3.5 (bm, 2H), 3.3 (bm, 4H), 1.4 (s, 9H). LCMS-ES 408.35 [M+H]<+>.
Šema 6-1
Kao što je prikazano u Šemi 6-2, jedinjenje, koje je dobijeno u Šemi 6-1 (600 mg), obrađeno je sa metanolnom HCl (6 mL), tokom 3 h, na 0°C. Mešavina je ostavljena da se postepeno zagreva do RT, tokom 3 sata. Nakon uparavanja viška metanolne HCl, dobijeno je jedinjenje BT-13 HCl (500 mg), u vidu svetlo smeđe čvrste mase.
Šema 6-2
HCl u MeOH,
0°C do RT, 3 h
1
salt = so (prim. prev.)
Primer 7: BT-4 i so
Kao što je prikazano u Šemi 7-1, 3-(1H-benzimidazol-2-il)benzojeva kiselina (100 mg) u DMF (6 mL) je obrađena sa EDC•HCl (1.5 eq), HOBt (1.5 eq), DIPEA (1 eq) i sa 0.5 eq. piperazina na 0°C. Mešavina je ostavljena da se zagreje do RT, tokom 16 h. TLC (10% metanol: DCM) je pokazala obrazovanje ne-polarne mrlje i odsustvo polaznog materijala. Nakon izrade i više ispiranja sa etrom, izdvojeno je 30 mg/95% BT-4. H NMR (400 MHz, DMSO-d6), d 13.0 (s, 2H), 8.3 (bm, 4H), 7.75 (bm, 4H), 7.60 (bm, 4H), 7.2 (bm, 4H), 3.65 (bm, 8H). LCMS-ES 527.36 [M+H]<+>, 264.50 [(M+2H)/2]<++>.
Šema 7-1
Kao što je prikazano u Šemi 7-2, 30 mg/95% BT-4 je obrađeno sa 4M HCl u dioksanu tokom 3 h. Nakon uparavanja rastvarača i ispiranja sa etrom, dobijeno je 10 mg/97% HCl soli BT-4. H NMR (400 MHz, DMSO-d6), d 8.45 (bm, 4H), 7.80 (bm, 8H), 7.50 (bm, 4H), 3.65 (bm, 8H). LCMS-ES 527.44 [M+H]<+>, 264.50 [(M+2H)/2]<++>.
Šema 7-2
2
4M HCl u
dioksanu RT, 3 h,
salt = so (prim. prev.)
Primer 8: BT-6 i so
Kao što je prikazano u Šemi 8-1, 3-(1H-benzimidazol-2-il)benzojeva kiselina (100 mg) u DMF (6 mL) obrađena je sa EDC•HCl (1.5 eq), HOBt (1.5 eq), DIPEA (1 eq) i sa benzen-1,4-diaminom (0.5 eq) na 0°C. Mešavina je ostavljena da se zagreva do RT, tokom 16 h. TLC (10% metanol: DCM) je pokazala obrazovanje ne-polarne mrlje i odsustvo polaznog materijala. Nakon izrade i više ispiranja sa etrom, izdvoji se svetlo smeđa čvrsta masa (60 mg).<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6), d 13.1 (s, 2H), 10.45 (s, 2H), 8.75 (s, 2H), 8.40 (d, 2H), 8.05 (d, 2H), 7.85 (s, 4H), 7.70 (t, 4H), 7.55 (d, 2H) 7.25 (kvin, 4H). LCMS-ES 549.0 [M+H]<+>275.1 [(M+2H)/2]<++>.
Šema 8-1
Kao što je prikazano u Šemi 8-2, 60 mg/98% BT-6 je obrađeno sa 4M HCl u dioksanu, tokom 3 h. Nakon uparavanja rastvarača i ispiranja sa etrom, dobijeno je 50 mg/96% HCl soli BT-6.<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6), d 10.60 (s, 2H), 9.00 (s, 2H), 8.55 (d, 2H), 8.30 (d, 2H), 7.90 (s, 4H), 7.85 m, 6H), 7.50 (m, 4H). LCMS-ES 549.3 [M+H]<+>275.3 [(M+2H)/2]<++>.
Šema 8-2
salt = so (prim. prev.)
Primer 9: BT-16 i so
Kao što je prikazano u Šemi 9-1, 6-(1H-benzimidazol-2-il)piridin-2-karboksilna kiselina (100 mg) u DMF (10 mL) je obrađena sa EDC•HCl (1.5 eq), HOBt (1.5 eq), DIPEA (3 eq) i sa benzen-1,4-diaminom (0.5 eq) na 0°C. Mešavina je ostavljena da se zagreje do RT, tokom 16 h. Nakon ulivanja reakcione mešavine u ledeno-hladnu vodu, precipitat je izdvojen filtriranjem i osušen je, da bi se dobila bledo smeđa čvrsta masa (60 mg).
Šema 9-1
1.5 eq EDC×HCl,
1.5 eq HOBT,
3.0 eq DIPEA,
0°C do RT, 16 h,
DMF
4
Kao što je prikazano u Šemi 9-2, jedinjenje BT-16 (50 mg) je tretirano sa HCl u dioksanu (3 mL) na 0°C. Mešavina je ostavljena da se zagreje do RT, u toku 4 h. Uparavanjem viška HCl u dioksanu, dobijeno je 30 mg smeđe čvrste faze (30 mg). H NMR (300 MHz, DMSO-d6), d 11.00 (s, 2H), 8.6 (bm, 2H), 8.35 (bm, 4H), 8.05 (s, 4H), 7.85 (bm, 4H), 7.40 (bm, 4H). LCMS-ES 551.84 [M+H]<+>.
Šema 9-2
salt = so (prim. prev.)
Primer 10: BT-3 i so
Kao što je prikazano u Šemi 10-1, 3-(2-benzoksazolil)benzojeva kiselina (50 mg) u DMF (10 mL) je obrađena sa EDC•HCl (1.25 eq), HOBt (1.25 eq), DIPEA (1 eq) i sa piperazinom (1 eq) na 0°C. Mešavina je ostavljena da se zagreje do RT, tokom 16 h. Nakon razblaživanja reakcione mešavine sa ledeno hladnom vodom, dobijena čvrsta masa se izdvoji i filtrira, a zatim osuši, da bi se dobilo 30 mg jedinjenja BT-3. H NMR (300 MHz, DMSO-d6), d 8.2 (bm, 4H), 7.8 (bm, 4H), 7.7 (bm, 4H), 7.45 (bm, 4H), 3.6 (bm, 8H). LCMS-ES 529.32 [M+H]<+>.
Šema 10-1
Kao što je prikazano u Šemi 10-2, jedinjenje BT-3 (30 mg) je obrađeno metanolnom HCl (5 mL) na 0°C. Mešavina je ostavljena da se zagreje do RT, tokom 4 h. Nakon uparavanja viška metanolne HCl pod vakuumom, obrazuje se smeđa čvrsta faza (15 mg).
Šema 10-2
salt = so (prim. prev.)
Primer 11: BT-5 i so
Kao što je prikazano u Šemi 11-1, 3-(2-benzoksazolil)benzojeva kiselina (50 mg) u DMF (10 mL) je obrađena sa EDC•HCl (1.25 eq), HOBt (1.25 eq), DIPEA (1 eq) i sa benzen-1,4-diaminom (0.5 eq) na 0°C. Mešavina je ostavljena da se zagreje do RT, tokom 16 h. Nakon razblaživanja reakcione mešavine sa ledeno hladnom vodom, izdvojeni su čvrsti delovi, koji su filtrirani, a zatim osušeni, da bi se dobila svetlo smeđa čvrsta masa (30 mg).<1>H NMR (300 MHz, TFA), d 9.2 (bs, 2H), 8.8 (bm, 2H), 8.6 (bm, 2H), 7.9 (bm, 14H).
Šema 11-1
(0<O>C do RT, 0<O>C do sobne temperature, prim. prev.)
Kako je prikazano u Šemi 11-2, 35 mg BT-5 je obrađeno sa HCl dioksanom (5 mL) na 0°C. Smeša se ostavlja da se zagreje na RT tokom 4 h. Posle uparavanja viška dioksana pod vakuumom, formira se svetlo smeđa čvrsta masa (15 mg).<1>H NMR (300 MHz, TFA), d 9.3 (bs, 2H), 8.8 (bm, 2H), 8.6 (bm, 2H), 7.9 (bm, 14H).
Šema 11-2
(in dioxane, u dioksanu; salt, so, prim. prev.)
Primer 12: BT-17 i so
Kako je prikazano u Šemi 12-1, 6-(benzoksazol-2-il)piridin-2-karboksilna kiselina (100 mg) u DMF-u (10 mL) seobradi sa EDC•HCl (1.5 eq), HOBt (1.5 eq), DIPEA (1.2 eq) i benzen-1,4-diaminom (0.5 eq) na 0 °C. Smeša se ostavlja da se zagreje na RT tokom 16 h. Razblaživanjem reakcione smeše sa ledeno-hladnom vodom,odbacivanjem čvrste materije, filtriranjem, a zatim, sušenjem, dobija se čvrsta materija svetlo smeđe boje (70 mg).<1>H NMR (400 MHz, TFA), d 8.85 (dd, 4H), 8.55 (t, 2H), 8.1 (bm, 4H), 7.95 (m, 4H), 7.85 (s, 4H). LCMS-ES 553.28 [M+H]<+>.
Šema 12-1
(0<O>C do RT, 0<O>C do sobne temperature, prim. prev.)
Kako je prikazano u Šemi 12-2, BT-17 (60 mg) je obrađeno sa HCl dioksanom (10 mL) na 0°C do RT tokom 4 h. Posle uparavanja rastvarača korišćenjem liofilizatora, formira se čvrsta materija svetlo smeđe boje (45 mg).<1>H NMR (400 MHz, TFA), d 8.90 (bm, 4H), 8.6 (bm, 2H), 8.0 (bm, 10H).
Šema 12-2
(in dioxane, u dioksanu; salt, so, prim. prev.)
Primer 13: BT-ABA-25
Struktura BT-ABA-25 je prikazana u Šemi 13-1. BT-ABA-25 je ligand LANCL2 (Slika 1B). Njegov prediktivni afinitet vezivanja za LANCL2 je -7.5 dok afinitet potvrđen putem SPR ima Kd vrednost od 1.77e-04.
Šema 13-1
Primer 14: BT-ABA-5a
Kako je prikazano u Šemi 14-1, rastvor 8-vinil-1,4-dioksaspiro[4.5]dekan-8-ola (200 mg, 1 eq) i metil 5- bromofuran-2-karboksilata (1.5 eq) u Et3N (2 mL) je degasiran pomoću argona u toku 10 min. Onda se dodaju Pd(OAc)2(0.025 eq), DPPF (0.05 eq) i ponovo se izvrši degasiranje u toku 10 min. Nastala reakciona smeša se greje na 100°C tokom 16 h. Izoluje se svetlo smeđa čvrsta masa (130 mg) na hromatografskoj koloni (EtOAx/Heksan 3:7).<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6), d 7.30 (d 1H), 6.60 (d 1H), 6.45 (dd, 2H), 4.75 (s, 1H), 3.85 (s, 4H), 3.80 (s, 3H), 1.85 (m, 2H), 1.65 (m, 2H), 1.50 (m, 4H), LCMS-ES 291.34 [M+H]<+>.
Šema 14-1
Kako je prikazano u Šemi 14-2, LiOH (3 eq) se doda u rastvor od 100 mg jedinjenja dobijenog u Šemi 14-1 (jedinjenje 4) u smeši THF: H2O: MeOH (2:1:0.5 mL) i, smeša se meša na RT tokom 16 h. Smeša se zatim ukoncentriše pod sniženim pritiskom i, sirovi proizvod se rastvori u minimalnoj količini vode i, zakiseli se sa 2N HCl do pH 4. Jedinjenja se ekstrahuju sa EtOAc i ukoncentrišu, kako se dobija čvrsta materija svetlo smeđe boje (54 mg), koja se u sledećoj reakciji (Šema 14-3) koristi bez prethodnog prečišćavanja.<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6), d 7.50 (d 1H), 6.60 (d 1H), 6.45 (dd, 2H), 4.75 (s, H), 3.85 (s, 4H), 3.80 (s, 3H), 1.85 (m, 2H), 1.65 (m, 2H), 1.50 (m, 4H). LCMS-ES 277.26 [M+H]<+>.
Šema 14-2
Kako je prikazano u Šemi 14-3, 3N HCl, 0.1 mL se doda jedinjenju 5 (50 mg) u THF-u, na 0°C uz mešanje. Smeša se ostavi da se zagreje do RT u toku 6 h. TLC pokazuje odsustvo SM i ne-polarne tačke. Smeša se ukoncentriše pod sniženim pritiskom, razblaži sa vodom, ekstrahuje sa EtOAc i ponovo ukoncentriše da bi se dobila smeđa čvrsta materija (20 mg).<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6), d 13.00 (bs 1H), 7.20 (d 1H), 6.95 (d 1H), 6.60 (d 1H), 6.45 (d, 1H), 6.10 (t, 1H), 3.05 (m, 2H), 2.65 (t, 2H), 2.5,(2H). LCMS-ES 233.21 [M+H]<+>LCMS-ES 231.27 [M-H]<->463.15 [2M-
4
H]-.
Šema 14-3
(0<O>C do RT, 0<O>C do sobne temperature, pr m. prev.)
Primer 15: BT-ABA-6
Kako je prikazano u Šemi 15-1, rastvor 8-vinil-1,4-dioksaspiro[4.5]dekan-8-ola (500 mg, 1 eq), etil 3-jodobenzoata (0.8 eq) i PPh3(0.02 eq) u Et3N (8 mL) se degasira sa argonom u toku 10 min. Zatim, doda se Pd(OAc)2(0.02 eq) i ponovo se izvrši degasiranje u toku 10 min. Nastala reakciona smeša se greje na 95°C tokom 16 h. Posle obrade, čvrsta masa bledo smeđe boje (500 mg) se izoluje pomoću hromatografije na koloni (EtOAc/heksan 3:7).<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6), d 7.95 (s 1H), 7.80 (d 1H), 7.71 (d 1H), 7.47 (t 1H), 6.65 (d 1H), 6.49 (d, 1H), 4.65 (bs 1H), 4.32 (q, 2H), 3.68 (s, 4H), 1.99-1.68 (m, 4H), 1.55-1.50 (m, 4H), 1.33 (t 3H). LCMS-ES 315.38 [M-17]<+>.
Šema 15-1
Kako je prikazano u Šemi 15-2, rastvor jedinjenja 4 (500 mg) u THF/H2O/EtOH (4:2:1, 17.5 mL) je ohlađen na 0°C; doda se LiOH (2.5 eq) i, smeša se meša dok se ne vrati na RT tokom 16 h. Smeša se ukoncentriše pod sniženim pritiskom i, sirovi proizvod se rastvori u minimalnoj količini vode i zakiseli sa 1N HCl do pH 3-4. Prečišćavanje hromatografijom na koloni (EtOAc/heksan 1:1) obezbeđuje čvrstu materiju bledo žute boje (220 mg).<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6), d 13.00 (bs 1H), 7.95 (s 1H), 7.78 (d 1H), 7.67 (d 1H), 7.44 (t 1H), 6.64 (d 1H), 6.48 (d, 1H), 4.65 (s 1H), 3.86 (s, 4H), 1.87-1.61 (m, 4H), 1.55-1.50 (m, 4H). LCMS-ES 287.34 [M-17]<+>.
Šema 15-2
Kako je prikazano u Šemi 15-3, 2N HCl (1.5 mL) se, uz mešanje, dodaje smeši od 100 mg jedinjenja 5 (100 mg) u THF-u na 0°C. Smeša se ostavi da se zagreje na RT u toku 6 h. Rastvor se ukoncentriše pod sniženim pritiskom, razblaži sa vodom, ekstrahuje sa EtOAc i, ponovo ukoncentriše da bi se dobila čvrsta masa bledo žute boje (20 mg). H NMR (400 MHz, DMSO-d6), d 13.00 (bs 1H), 8.00 (s, 1H), 7.80 (d 1H), 7.65 (d 1H), 7.45 (t 1H), 6.75 (d 1H), 6.45 (d, 1H), 6.10 (t, 1H), 5.15 (s 1H), 2.65 (m, 2H), 2.15 (m, 2H), 1.90 (m, 4H), LCMS-ES 259.37 [M-H]<->519.48 [2M-H]-.
Šema 15-3
(0<O>C do RT, 0<O>C do sobne temperature, prim. prev.)
Primer 16: BT-ABA-13
Kako je prikazano u Šemi 16-1, dihidropiran (1.3 eq) i TsOH (0.1 eq) se dodaju u rastvor jedinjenja 2 (2.5 g, 1 eq) u CH2Cl2(50 mL) na 0°C uz mešanje. Dobijeni rastvor se ostavi da se postepeno zagreje do RT u toku 14 h. Putem hromatografije na koloni se izoluje tečnost bledo žute boje (EtOAc/heksan 1:9). Jedinjenje se u sledećem koraku koristi bez prethodnog prečišćavanja.
Šema 16-1
(0<O>C do RT, 0<O>C do sobne temperature, prim. prev.)
Kako je prikazano u Šemi 16-2, jedinjenje 3 (2.5 g, 1.0 eq), 4,4,5,5-tetrametil-[1,3,2]dioksaborolan (1.2 eq) i bis(ciklopentadienil)cirkonijum hlorid hidrid (0.15 eq) se dodaju u Et3N. Dobijena reakciona smeša se greje na 60-70 °C u toku 16 h. Reakciona smeša se razblaži sa heksanima. Talog se ukloni filtriranjem kroz tanki sloj silika gela i, ispira se sa heksanima. Tokom ukoncentrisavanja heksanskog rastvora, dobija se bezbojna uljasta tečnost (1.3 g).<1>H NMR (400 MHz, CDCl3), d 6.60 (d 1H), 5.60 (d 1H), 6.35 (d, 1H), 4.75 (s, 1H), 3.85 (s, 3H), 2.80 (m, 2H), 2.35 (m, 2H), 2.05 (m, 4H).
Šema 16-2
4
Kako je prikazano u Šemi 16-3, rastvor jedinjenja 4 (550 mg, 1.1 eq), metil 6-bromopikolinata (1.0 eq), K2CO3(2.0 eq) u smeši DME/H2O 9:1 (8 mL) je degasiran sa argonom u toku 10 min. Onda, dodat je Pd[(P(Ph)3]4(0.04 eq). Dobijena reakciona smeša je grejana na 100 °C u toku 16 h. Ukoncentrisavanjem reakcionog rastvora i zatim, podvragavanjem hromatografiji na koloni
(EtOAc/heksan 1:3) dobija se čvrsta materija bledo žute boje (230 mg). LCMS-ES 404.39 [M+H]<+>,
302.26 [M-101]<+>.
Šema 16-4
Kako je prikazano u Šemi 16-5, TsOH (0.1 eq) se doda u rastvor jedinjenja 5 (230 mg, 1.0 eq) u smeši aceton/H2O 1:1 (6 mL). Dobijena reakciona smeša se meša na sobnoj temperaturi u toku 16 h. Ukoncentrisavanjem reakcione smeše i zatim, podvragavanjem hromatografiji
na koloni (EtOAc/heksan 7:3) dobija se bledo žuta tečnost (110 mg).<1>H NMR(400 MHz, CDCl3), d 8.00 (d 1H), 7.80 (t, 1H), 7.50 (d, 1H), 6.90 (m 2H), 4.00 (s, 3H), 2.80 (m, 2H), 2.35 (m, 2H), 2.10 (m, 4H), LCMS-ES 276.38 [M+H]<+>.
Šema 16-5
Kako je prikazano u Šemi 16-6, LiOH (2.5 eq) se doda rastvoru jedinjenja 6 (75 mg)<u smeši THF/H>2<O 3:1 (3 mL) na 0°C uz mešanje. Smeša je ostavljena da se zagreje do RT u toku 6>h. Reakciona smeša se zakiseli sa limunskom kiselinom i ekstrahuje sa smešom THF i EtOAc. Ukoncentrisavanjem organskog rastvora se dobija čvrsta materija zatvoreno-bele boje (10 mg).
<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6), d 13.05 (bs, 1H), 7.90 (m, 2H), 7.65 (d, 1H), 7.05 (d, 1H), 6.80 (d, 1H), 5.20 (s, 1H), 2.65 (m, 2H), 2.20 (bd 2H), 2.10-1.90 (m, 4H), LCMS-ES 262.27 [M+H]<+>.
Šema 16-6
(0<O>C do RT, 0<O>C do sobne temperature, prim. prev.)
Primer 17: BT-ABA-16
Kako je prikazano u Šemi 17-1, rastvor jedinjenja 4 (437 mg, 1.2 eq), metil 2-bromoizonikotinat (1.0 eq), K2CO3(2.0 eq) u smeši DME/H2O 9:1 (8 mL) se degasira sa argonom u toku 10 min. Zatim, doda se Pd[(P(Ph)3]4(0.04 eq). Dobijena reakciona smeša se greje na 90°C u toku 12 h. Ukoncentrisavanjem reakcionog rastvora i zatim, hromatografijom na koloni (EtOAc/heksan
4
1:3) dobija se bledo žuta tečnost (300 mg).<1>HNMR (300 MHz, CDCl3), d 8.70 (d, 1H), 7.85 (s, 1H), 7.65 (d, 1H), 6.85 (d, 1H), 6.65 (d, 1H), 4.70 (m, 1H), 3.95 (m, 4H), 2.20-1.40 (m, 16H), LCMS-ES 404.54 [M+H]<+>, 302.53 [M-101]<+>.
Šema 17-1
Kako je prikazano u Šemi 17-2, TsOH (0.1 eq) se doda u rastvor od jedinjenja 5 (300 mg, 1.0 eq) u smeši aceton/H2O 1:1 (6 mL). Dobijena reakciona smeša se meša na RT u toku 48 h. Ukoncentrisavanjem reakcione smeše i zatim, hromatografijom na koloni (EtOAc/heksan 7:3) dobija se čvrsta materija zatvoreno-bele boje (160 mg).<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6), d 8.70 (d, 1H), 7.85 (s, 1H), 7.65 (d, 1H), 7.05 (d, 1H), 6.85 (d, 1H), 5.20 (s, 1H), 3.90 (s, 3H), 2.65 (td, 2H), 2.15 (bd, 2H), 2.00 (m, 2H), 1.85 (m, 2H), LCMS-ES 276.22 [M+H]<+>.
Šema 17-2
Kako je prikazano u Šemi 17-3, LiOH (2.5 eq) se doda u rastvor jedinjenja 6 (100 mg)
4
u smeši THF/H2O 3:1 (3 mL) na 0°C uz mešanje. Smeša se ostavi da se zagreje na RT u toku 16 h. Reakciona smeša se zakiseli sa limunskom kiselinom i ekstrahuje sa smešom THF-a i EtOAc. Ukoncentrisavanjem pod sniženim pritiskom se dobija čvrsta materija zatvoreno-bele boje (20 mg).<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6), d 13.60 (bs, 1H), 8.70 (d, 1H), 7.85 (s, 1H), 7.60 (d, 1H), 7.00 (d, 1H), 6.85 (d, 1H), 5.20 (s, 1H), 2.65 (m, 2H), 2.20-1.80 (m, 6H), LCMS-ES 262.28 [M+H]<+>.
Šema 17-3
(0<O>C do RT, 0<O>C do sobne temperature, prim. prev.)
Primer 18: BT-ABA-14
Kako je prikazano u Šemi 18-1, rastvor jedinjenja 4 (300 mg, 1.2 eq), metil 4-bromopikolinat (1.0 eq), K2CO3(2.0 eq) u smeši DME/H2O 9:1 (8 mL) je degasiran sa argonom u toku 10 min. Onda, doda se Pd[(P(Ph)3]4(0.04 eq). Dobijena reakciona smeša se greje na 90°C u toku 12 h. Ukoncentrisavanjem reakcionog rastvora zatim, hromatografijom na kolini (EtOAc/heksan 1:3) dobija se bledo žuta tečnost (200 mg).<1>H NMR (300 MHz, CDCl3), d 8.50 (d, 1H), 8.20 (bs, 1H), 7.45 (d, 1H), 6.70 (d, 1H), 6.50 (d, 1H), 4.60 (m, 1H), 3.95 (m, 4H), 2.20-1.40 (m, 16H), LCMS-ES 390.35 [M+H]<+>.
Šema 18-1
4
Kako je prikazano u Šemi 18-2, TsOH (0.1 eq) se doda u rastvor jedinjenja 5 (200 mg, 1.0 eq) u smeši aceton/H2O 1:1 (6 mL). Dobijena reakciona smeša se meša na sobnoj temperaturi 48 h. Reakciona smeša se zakiseli sa limunskom kiselinom i ekstrahuje sa smešom THF-a i EtOAc. Rastvor se ukoncentriše, kako se dobija čvrsta materija zatvoreno-bele boje (18 mg).<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6), d 8.60 (d, 1H), 8.05 (s, 1H), 7.60 (d, 1H), 6.90 (d, 1H), 6.70 (d, 1H), 5.20 (bs, 1H), 2.65 (m, 2H), 2.15 (bd, 2H), 2.05-1.80 (m, 4H), LCMS-ES 262.27 [M+H]<+>.
PRIMERI VEZIVANJA RECEPTORA
Primer 19: Primer vezivanja LANCL2
Kombinovana su ispitivanja računarskog modelovanja i biohemijske validacije da bi se selekcija usmerila na jedinjenja koja se vezuju za LANCL2. Najnovija ponavljanja tehnologijom površinske plazmon rezonance (SPR) obezbeđuju in vitro, visoku propusnost, kvantitativne načine za određivanje molekulske interakcije između neobeleženih proteina i malih molekula (>25 Da) u realnom vremenu. BIACORE™ T200 (GE Healthcare, Piscataway, NJ) tehnologija dalje
4
obezbeđuje dodatnu korist od GMP/GLP usaglašenosti i autonomno sticanje široke skale podataka bilo skrinovima bilo detaljnim titracijama u periodu kraćem od 24-h. Molekulske interakcije od značaja se rutinski validiraju putem BIACORE™ T200 SPR tehnologije.
Postupci
Skrining visoke propustljivosti putem molekularnog modelovanja interakcije LANCL2-jedinjenje. Auto-Doc Vina [14] je oblik stručnog softvera koji može vršiti paralelna izračunavanja velike propusne moći za utvrđivanje vezivanja LANCL2-biljno jedinjenje. Softverski oblik prvo računa (i) sile slobodne energije povezane sa vezanim kompleksom i zatim (ii) konformacioni prostor koji je na raspolaganju za formiranje kompleksa između mete i liganda. Ovi postupci su po prirodi stohastički zbog čega zahtevaju ponovljene nezavisne skrinove da bi se u potpunosti pretražili svi parametarski prostori i obezbedila pouzdanost predikcije. Trenutno je dostupan model LANCL2 kroz homologiju modelovanja LANCL1 [15]. Korišćen je AutoDockTools, grafički front-end za AutoDock i AutoGrid, za definisanje pretraživačkog prostora, uključujući centar koordinacionog sistema (mrežasti kvadrat) i x,y,z-dimenzije [16]. AutoDock Vina je generisao pet vezanih konformacija za svako jedinjenje. Vezivanje se primenjuje na celu proteinsku metu, sa mrežom kvadrata koja pokriva celu površinu proteina. Log fajlovi veyivanja se generišu, sastojeći se od energija vezivanja svakog predviđenog načina vezivanja za sva jedinjenja za sve površine.
Kinetičko određivanje interakcije LANCL2-mali molekul. Korišćen je BIACORE™ T200 za određivanje kinetičkih parametara vezivanja malih molekula BT-11, BT-ABA-5a, BT-6 i BT-15 (analiti) za LANCL2 (ligand). Podaci su generisani u dozno-zavisnom (5-8 titracionih tački) maniru u triplikatu i, analizirani kako bi se odredio model vezivanja (Langmuir, konformaciono pomeranje, itd.), konstante asocijacije i disocijacije u realnom vremenu, kao i disocijaciona konstanta ekvilibrijuma. SPR tehnologija omogućava validaciju specifičnih LANCL2-fitohemijskih interakcija, kao i da se dobije zlatni-standard uvida u mehanizam i brzine vezivanja. Eksperimenti su izvedeni na karboksimetildekstranskim (CM5) senzornim čipovima kovalentnim vezivanjem LANCL2 putem aminskog kuplovanja. Protočne ćelije 1 i 2 senzornog čipa se aktiviraju tokom 720 sec pri protoku od 10 µl/min sa smešom 1:1 0.1 M N-hidroksisukcinimid (NHS) i 0.5 M 1-etil-3-(-3-dimetilaminopropil)-karbodiimid hidrohlorid (EDC). Matični LANCL2 (0.41 mg/mL) se razblaži na 8.2 µg/mL (1:50 razblaženje) u 10 mM natrijum acetatu, pH 5.0 i injektuje preko površine aktivirane protočne ćelije 2 u toku 1000 sec pri brzini protoka od 10µl/min. Posle zarobljavanja LANCL2 na protočnoj ćeliji 2 (11000 RU), površine protočnih ćelija 1 i 2 se deaktiviraju injektovanjem 1M etanolamina u toku 720 sec pri brzini protoka od 10 µl/min. Protočni pufer je bio 25 mM MOPS koji sadrži 0.05% T-20 i 0.15 M NaCl, pH 6.5. Kinetička ispitivanja su izvedena injektovanjem različitih koncentracija BT-11 (25 µM, 12.5 µM, 6.25 µM, 3.13 µM, 1.56 µM i 0.76 µM), BT-ABA-5a (40 µM,
4
20 µM, 10 µM, 5 µM, 2.5 µM i 1.25 µM) i BT-15/BT-6 (20 µM, 10 µM, 5 µM, 2.5 µM, 1.25 µM, 0.625 µM i 0.313 µM) u triplikatima. Svaki uzorak je injektovan tokom 60 sec (kontaktno vreme), potom je usledilo vreme disocijacije od 60 sec pri brzini protoka od 100 µL/min. Vreme stabilizacije od 180 sec je korišćeno pre sledećeg injektovanja. Podaci su analizirani pomoću BIACORE™ T200 Evaluation Software (verzija 1) da bi se odredila konstanta afiniteta vezivanja (KD) primenom 1:1 modela vezivanja.
Rezultati
Oba i BT-11 i BT-15 se snažno vezuju za LANCL2. U cilju da se potvrdi vezivanje BT-11 i BT-15 za LANCL2 protein, izveli smo SPR analize na BIACORE™ T-200 instrumentu. SPR, optička tehnika koja se koristi za detektovanje molekulskih interakcija, koristi se za merenje afiniteta vezivanja između LANCL2 i njegovih liganada (tj., BT-11 i BT-15). Imobilisali smo prečišćeni rekombinantni LANCL2 protein na BIACORE™ senzorne čipove i injektovali male molekule preko površine proteina korišćenjem mikrofluidnog sistema samog instrumenta. Merene su promene u ukupnoj masi na površini čipa, što odgovara malih vezivanja za protein. Injektovanjem serija koncentracija malih molekula bili smo u mogućnosti da izračunamo afinitete vezivanja u dinamičkoj ravnoteži za vezivanje BT-11 za LANCL2 i za vezivanje BT-15 za LANCL2. Senzogrami vezivanja pokazuju tipičnu interakciju malog molekula sa velikim brzinama vezivanja i velikim brzinama otpuštanja (Slika 8, paneli A i C). Ove brze interakcije su izvan tehničkih mogućnosti instrumenta. Zbog toga, nisu određene pouzdane konstante brzine asocijacije (ka) i brzine disocijacije (kd). Konstanta disocijacije ravnoteže (KD) se uobičajeno koristi da bi se opisao afinitet između liganda i proteina, kao što je koliko se čvrsto ligand vezuje za naročiti protein. Na afinitete ligand-protein utiču ne-kovalentne intermolekularne interakcije između dva molekula, kao što su vodonične veze, elektrostatičke interakcije, hidrofobne i Van der Waalsove sile. Postavljanjem nivoa ravnotežnog vezivanja prema koncentraciji jedinjenja, bili smo u mogućnosti da izmerimo afinitet u dinamičkoj ravnoteži (KD) za svaku interakciju (Slika 8, paneli B i D). Oba mala molekula su pokazala sličan afinitet vezivanja za LANCL2 (BT-11: 7.7 uM, BT-1511.4 uM).
BT-ABA-5a i BT-6 se snažno vezuju za LANCL2. Slično prethodno opisanim rezultatima i u cilju potvrde vezivanja BT-6 i BT-ABA-5a za LANCL2, izveli smo analize SPR na BIACORE™ T-200 instrumentu. U ovim slučajevima, takođe smo imobilisali prečišćeni rekombinantni LANCL2 protein na BIACORE™ senzorne čipove i injektovali male molekule preko površine proteina korišćenjem mikrofluidnog sistema samog instrumenta. Merene su promene u ukupnoj masi na površini čipa, što odgovara malih vezivanja malih za protein. Bližim uvidom u senzograme vezivanja (Slike 9A i 9B), naši rezultati pokazuju kako se BT-6 i BT-ABA-5a veoma brzo vezuju ali ne toliko brzo koliko je vreme otpuštanja, u poređenju sa BT-11/BT-15, koji se veoma brzo vezuju i veoma brzo otpuštaju. Važno, vreme okupiranja za BT-ABA-5a pokazuje najnižu “off” brzinu, što znači da BT-ABA-5a ostaje najduže u vezujućem položaju na LANCL2. Ovo duže zadržavanje može potencijalno uticati na aktivaciju LANCL2 puta okidanjem efikasnijih anti-inflamatornih i anti-dijabetskih i drugih terapeutskih odgovora.
Druga jedinjenja su testirana preko SPR, a rezultati su jasno prikazani na Slikama 1A i 1B.
PRIMERI EKSPERIMENTALNIH ISPITIVANJA
Primer 20: Primena BT-11 u modelu akutnog IBD
Uvod
Inflamatorna bolest creva (IBD), hronična, rekurentna bolest gastrointestinalnog trakta, pogađa 1.4 miliona ljudi u Sjedinjenim Državama. IBD obuhvata dve različite manifestacije: ulcerativni kolitis i Crohn-ovu bolest. Trenutne terapije protiv IBD postižu skroman uspeh i imaju značajne sporedne neželjene efekte u dugotrajnoj borbi protiv bolesti [17]. Dok Crohn-ova bolest predstavlja hronični stadijum bolesti, akutni ulcerativni kolitis (UC) se manifestuje kao rana patologija koja pogađa tkivo kolona. UC je hroničan idiopatski inflamatorni poremećaj GI trakta, koji se odlikuje upalom mukoze rektuma koja se širi proksimalno kroz kolon, na kontinuirani način, ali promenljivog stepena. Poremećaj se odlikuje povratnim i popuštajućim tokom varijabilne težine. Najveći broj pacijenata ima bolest na levoj strani ili distalno, slabe-do-umerene težine. Većina ostaje u remisiji tokom dužih vremenskih perioda uz primenu medicinske terapije. Ipak, ispitivanja realne istorije ukazuju na to da između 10 i 40% pacijenata podleže kolektomiji u nekoj fazi toka svoje bolesti.
Medicinski tretman steroid-refraktornog teškog UC se donekle poslednjih godina proširio primenom oba, i ciklosporina i infliksimaba kao spasonosnih agenasa; ipak, hirurški zahvat još uvek ostaje jedina "kurativna" opcija. Ovaj pronalazak obezbeđuje novi proizvod leka za lečenje UC čiji se mehanizam zasniva na targetiranju novog receptora nazvanog LANCL2. BT-11, naše vodeće jedinjenje, primenjuje se oralno i raspodeljuje sistemski i, ispoljava imune modulatorne efekte kod UC targetiranjem LANCL2 u imunim ćelijama creva. Naša pre-klinička ispitivanja efikasnosti u akutnom UC na miševima su pokazala da primenjivanje BT-11 smanjuje indeks aktivnosti bolesti i smanjuje upalu creva putem značajnog smanjenja infiltracije leukocita u mukozi creva, kao i putem smanjivanja zadebljanja mukoze i erozije epitela. Analizom genske ekspresije smo potvrdili da oralno primenjivanje BT-11 ushodno reguliše ekspresiju IL-10 i LANCL2, dok nishodno reguliše ekspresiju TNFa mRNA u modelu akutnog ulcerativnog kolitisa
1
izazvanog pomoću DSS kod miševa.
Postupci
Miševi. C57BL/6 miševi su nabavljeni od Jackson laboratorije i čuvani u specifičnim uslovima bez patogena, u ventiliranim stalcima. LANCL2-/- miševi su nabavljeni iz KOMP skladišta Univerziteta California Davis. Miševi su čuvani u opremi za životinje. Svi eksperimentalni protokoli su odobreni od strane institucija koje se bave brigom o životinjama i imali su komisiju i ispunjavali ili premašivali Vodiče nacionalnih instituta zdravstvene službe za dobrobit laboratorijskih životinja i politiku Službe za javno zdravlje.
DSS-indukovani kolitis. Kolitis je indukovan u C57BL/6J miševima primenjivanjem 5% (w/v) dekstran natrijum sulfata (DSS; molekulska težina 42 kDa; ICN Biochemicals, Aurora, OH), koji je dodat u vodu za piće. Inflamacija kolona je postignuta 7 dana nakon tretmana sa DSS. U DSS projektu, grupe su se sastojale od i. ne-DSS vehikulumom tretiranih miševa, ii. ne-DSS, BT-11 (80 mg/kg) tretiranih miševa, iii. DSS-tretiranih, vehikulumom-tretiranih miševa i iv. DSS-tretiranih, BT-11 (80 mg/kg) tretiranih miševa. Svaka grupa je obuhvatala dvanaest miševa.
Histopatologija. Isečci kolona u ispitivanjima IBD na miševima su fiksirani u 10% puferovanom neutralnom formalinu, potom kasnije zatopljeni u parafin i zatim isečeni (5 µm) i obojeni sa H&E bojom za histološka ispitivanja. Koloni su stepenovani sa histološkim skorom, koji je uključivao stepen (1) infiltracije leukocita, (2) zadebljanja mukoze i (3) erozije epitelnih ćelija. Isečci su stepenovani od 0-4, zavisno od infiltracije limfocita, oštećenja ćelija i erozije tkiva i, podaci su analizirani kao normalizovani izračunati skor.
Kvantitativni PCR u realnom vremenu. Ukupna RNA je izolovana iz kolona miševa pomoću RNEASY PLUS MINI KIT (Qiagen, Valencia, CA) prema uputstvima proizvođača. Ukupna RNA (1 µg) se koristi da bi se generisao cDNA templat pomoću ISCRIPT™ Kita za sintezu cDNA (Bio-Rad, Hercules, CA). Ukupna reakciona zapremina je bila 20 µL, a reakcija je inkubirana u MJ MINI™ termalnom ciklusaru (Bio-Rad) na sledeći način: 5 min na 25°C, 30 min na 52°, 5 min na 85°C, držana na 4°C. PCR je izveden na cDNA primenom Taq DNA polimeraze (Life Technologies, Carlsbad, CA). Svaki genski amplikon je prečišćen sa MINELUTE PCR Kitom za prečišćavanje (Qiagen) i kvantitativno određen i na agaroza gelu korišćenjem DNA mass ladder (Promega, Madison, WI) i putem nanokapi. Ovi prečišćeni amplikoni su korišćeni za optimizaciju uslova realtime PCR-a i za formiranje standardnih krivi za test PCR u realnom vremenu. Prajmeri su projektovani korišćenjem Oligo 6 softvera. Koncentracije prajmera i temperature rekombinovanja su optimizovane za ICYCLER IQ™ sistem (Bio-Rad) za svaki set prajmera primenom gradijent protokola sistema. Efikasnosti PCR su održavane između 92 i 105% i koeficijenti korelacije su tokom optimizacije podešeni na >0.98 za svaki set prajmera i, isto tako, tokom izvođenja real-time
2
PCR za uzorak DNA. Koncentracije cDNA za gene koji su značajni su određene qPCR-om u realnom vremenu, korišćenjem ICYCLER IQ™ Sistema i IQ™ SYBR® Green Supermix (Bio-Rad). Standardna kriva je generisana za svaki gen korišćenjem 10-ostrukih razblaženja prečišćenih amplikona, polazeći od 5 pg cDNA i, kasnije korišćena za izračunavanje polaznih količina ciljnih cDNA u nepoznatim uzorcima. SYBR® zeleno I je opšta interkalarna boja dvolančanih DNA i, na taj način se mogu detektovati nespecifični proizvodi i prajmer/dimeri pored amplikona koji su od značaja. Da bi se odredio broj sintetisanih proizvoda tokom PCR-a u realnom vremenu, za svaki proizvod je izvedena analiza krive topljenja. PCR u realnom vremenu je upotrebljen da se izmeri polazna količina nukleinske kiseline u svakom nepoznatom uzorku cDNA na istoj ploči sa 96 pozicija.
Statistička analiza. Parametarski podaci su analizirani pomoću ANOVA i zatim, postupkom Scheffeovog višestrukog poređenja. Neparametarski podaci su analizirani pomoću Mann-Whitney U testa, a zatim testom Dunnove višestruke komparacije. ANOVA je izvedena SAS procedurom opšteg linearnog modela, verzija 6.0.3 (SAS Institut). Procenjena statistička značajnost je bila na P≤0.05.
Rezultati
BT-11 poboljšava bolest i patologiju tkiva u DSS modelu kolitisa. Predmet ovog ispitivanja je bio da se istraži da li primenjivanje BT-11 aktivira LANCL2 i ispoljava antiinflamatorna svojstva u kontekstu IBD. Da bi se ispitala efikasnost našeg jedinjenja-primera BT-11 u modelu akutnog IBD, tretirali smo C57BL/6J miševe sa 5% DSS tokom 7-dnevnog izazivanja. Tokom perioda izazivanja, tretman sa BT-11 je značajno poboljšao skor aktivnosti bolesti (Slika 10, panel A). Dalje, makroskopske lezije u slezini (Slika 10, panel B), MLN (Slika 10, panel C) i kolonu (Slika 10, panel D) takođe su značajno smanjene posle aktivacije LANCL2 puta primenom BT-11 u 7. danu posle izazivanja.
BT-11 poboljšava histopatologiju kolona kod miševa sa akutnim inflamatornim kolitisom na dozno-zavisan način. Dalje smo ispitali efekat BT-11 na histopatološke inflamatorne lezije kolona. Uporedo sa našim zapažanjima o aktivnosti bolesti i veličinama lezija, histopatološke analize su potvrdile da tretman sa BT-11 značajno umanjuje i do 5 puta inflamaciju u mukozi creva na osnovu ispitivanja infiltracije leukocita (Slika 11, panel G), epitelne erozije (Slika 11, panel H) i zadebljanja mukoze (Slika 11, panel I). Reprezentativni mikrografi kolona pokazuju kako tretman sa BT-11 tokom DSS-indukovanog kolitisa kod miševa značajno poboljšava status mukoze creva poboljšanjem integriteta epitelnih ćelija i smanjivanjem uništenja arhitekture creva, kao i infiltracijom nekoliko imunskih podsetova (Slika 11, paneli A-F). Izveli smo studije doznog odgovora sa BT-11 i, došli do interesantnog nalaza kako su tri obeležja inflamacije kolona (infiltracija leukocita, zadebljanje mukoze i erozija epitela) snižena kod miševa sa kolitisom kada je doza BT-11 povišena od 10 do 80 mg/kg (Slika 12, paneli A-C).
Oralni tretman sa BT-11 umanjuje ekspresiju TNFa i ushodno reguliše LANCL2 i IL-10. Da bi se bliže istražio efekat BT-11 na modulaciju imunog sistema, ispitali smo ekspresiju gena IL-10, LANCL2 i TNFa. Rezultati pokazuju kako tretman sa BT-11 nishodno reguliše ekspresiju tumor nekrozis faktora alfa (TNFa) (Slika 13, panel A), kao i kako ushodno reguliše nivoe Interleukina 10 (IL-10) (Slika 13, panel B) i LANCL2 receptora (Slika 13, panel C), na koji način se stvara pozitivna povratna sprega koja podstiče anti-inflamatorne efekte i nishodno reguliše inflamatorni odgovor koji vodi TNFa. Izvođenjem studije dozne zavisnosti mogli smo postaviti hipotezu da naš ligand BT-11 i posledična aktivacija LANCL2 puta direktno povećava produkciju IL-10 u kolonu, jer njegova ekspresija ispitana protočnom citometrijom prati dinamiku doznog-odgovora sa BT-11 (Slika 14, panel B). Zapazili smo da je sniženje ćelija koje ekspresuju TNFa u kolonu bilo značajno drugačije i sa 40 i sa 80mg/kg BT-11, ali ne i na nižim dozama, kao 10 ili 20mg/kg (Slika 14, panel A). Takođe smo zapazili kako je FOXP3 ekspresija u MLN dozno zavisna (Slika 14, panel C).
Efekti BT-11 tokom akutnog kolitisa su zavisni od LANCL2. U cilju da se pokaže kako se ispoljavaju korisni efekti od primenjivanja BT-11 tokom akutnog kolitisa kod miševa, izveli smo ispitivanja poređenja takvih efekata kod divljeg-tipa miševa i miševa kojima je isključen LANCL2 (LANCL2-/-). Naši rezultati su pokazali da je LANCL2 neophodan da bi BT-11 ispoljio svoje antiinflamatorne benefite, jer je gubitak LANCL2 sprečio da miševi oporave od akutnog DSS-indukovanog kolitisa (Slika 15, panel A). Slično, gubitak LANCL2 anulira pad makroskopskog skora kod kolona (Slika 15, panel B), MLN (Slika 15, panel C) i slezine (Slika 15, panel D) kada se porede divlji-tip i LANCL2-/- srodnici iz legla. Dalje, efekat BT-11 u formiranju lezija u mukozi kolona je takođe LANCL2-zavisan, kako smo ispitali histopatološke analize iz LANCL2-/- miševa tretiranih bilo sa vehikulumom bilo sa BT-11 i zapazili smo kako je gubitak LANCL2 u potpunosti anulirao efekat BT-11 (Slika 16).
Da bi dalje opisali ćelijski odgovori posle tretmana sa BT-11, izveli smo sledeće studije isključivanja LANCL2 kako bi odredili da li je pad pro-inflamatornih proteina i porast antiinflamatornih faktora uklonjen. Naši rezultati protočne citometrije pokazali su da je sniženje proinflamatornog faktora MCP1 LANCL2-zavisno i u kolonu (Slika 17, panel A) i u MLN (Slika 17, panel B), s obzirom da gubitak LANCL2 gena anulira efekat BT-11. Takođe smo našli da je sekrecija TNFa u kolonu LANCL2-zavisna (Slika 17, panel C) kao i ushodna regulacija MHC-II+ CD11c+ populacija granulocita (Slika 17, panel D). Uporedo sa ovim rezultatima, našli smo da je ushodna regulacija IL-10 sekrecije posle tretmana sa BT-11 kompletno anulirana kod miševa kojima je isključen LANCL2 i to i u kolonu (Slika 17, panel E) i u slezini (Slika 17, panel F), pokazujući, još jednom, zavisnost našeg vodećeg jedinjenja od naše mete koja nas interesuje.
4
Diskusija
LANCL2 se pojavljuje kao nova terapeutska meta kod inflamatornih i imunoposredovanih bolesti [18]. Naši in vivo rezultati po prvi put pokazuju da oralni tretman sa LANCL2 ligandom BT-11 poboljšava crevnu imunopatologiju u mišijem modelu IBD, putem supresije inflamacije. Od nedavno, skrenuta je pažnja na LANCL2 kao na moguć terapeutski target zahvaljujući njegovoj funkciji, koja je u vezi sa ABA vezivanjem i signaliziranjem [19] i nedavnim otkrićem alternativnog mehanizma aktivacije PPARg na membranskoj osnovi [8]. Sem toga, odredili smo ekspresiju LANCL2 u serijama mišijeg tkiva, što je pokazalo da se, osim u mozgu i testisima, LANCL2 isto tako ekspresuje i u drugim tkivima, kao što su tkiva timusa, slezine, kolona i Peyerove ploče, što ukazuje na mogući odnos između LANCL2 i imunih odgovora i sugeriše na šire mogućnosti LANCL2 kao terapeutskog targeta.
Prethodno, objavili smo da ABA transaktivira PPARg in vitro i da vrši supresiju sistemske inflamacije slično drugim PPARg agonistima. Kako oba, i ABA i NSC61610 targetiraju LANCL2, NSC61610 bi takođe mogao delovati preko aktivacije PPARg. Eksperimentalni rezultati pokazuju da tretman sa NSC61610 aktivira PPARg u osnovnim makrofagima, čime je obezbeđen dokaz mogućeg odnosa signaliziranja između LANCL2 i PPARg i, ukazuju na to da bi NSC61610 mogao da targetira LANCL2-PPARg osu in vitro. Da bismo razmotrili značaj LANCL2 u aktivaciji PPARg koju posreduje NSC61610, odredili smo da li zaključavanje LANCL2 u osnovnim makrofagima pomoću primene siRNA narušava ili anulira efekat NSC61610 na reporter aktivnost PPARg. Naši nalazi ukazuju na to da zaključavanje LANCL2 značajno umanjuje efekat NSC61610 na PPARg aktivnost [12]. U ovom primeru, demonstrirali smo kako primenjivanje BT-11 ispoljava anti-inflamatorna svojstva putem snižavanja ne samo skora u indeksu aktivnosti bolesti i makroskopski skor u slezini, MLN i kolonu (Slika 10) već, isto tako, značajno umanjuje histopatološke lezije (Slika 11). Prikazali smo kako su ova dva specifična efekta zavisila od LANCL2 (Slika 15 i Slika 16). Takođe, demonstrirali smo da BT-11 smanjuje nivoe TNFa i ushodno reguliše i LANCL2 i IL-10 (Slika 13). Isto tako smo prikazali i da su efekti zavisni od LANCL2 kako ove trendove nismo zapazili kod LANCL2-/- miševa (Slika 17). Ovi rezultati potvrđuju da je LANCL2 nova terapeutska meta u inflamatornim bolestima i da je BT-11 jedinjenje koje ga targetira.
Primer 21: Primena BT-11 u modelu hronične Crohn-ove bolesti
Uvod
Kako je prethodno objašnjeno, inflamatorna bolest creva (IBD), sa svoje dve kliničke manifestacije, ulcerativnim kolitisom i Crohn-ovom bolesti, jeste imuno-posredovana bolest koja se odlikuje široko rasprostranjenom inflamacijom i infiltracijom imunih ćelija u gastrointestinalnom traktu. Etiologija IBD je multifaktorijalna i, zahteva interakciju genetske predispozicije, faktora okruženja i crevne flore.
Ovaj primer će se fokusirati na hroničnu manifestaciju IBD: Crohn-ovu bolest. Dok se upala u ulcerativnom kolitisu odlikuje kontinuiranim profilom, koji uključuje plitke slojeve mukoze i submukoze ali je ograničen na kolon, u Crohn-ovoj bolesti ova inflamacija se širi kroz zid i diskontinuirana je, a njome može biti pogođen svaki region creva iza ileuma, koji je najviše pogođen. Patogeneza Crohn-ove bolesti je kompleksna i na nju utiču genetski i faktori okruženja i imuno-posredovana oštećenja crevne mukoze, koja nastaju otprilike produženom aktivacijom imunog sistema mukoze.
Tretmani, usmereni da nishodno moduliraju imune i inflamatorne odgovore, kao što su sa kortikosteroidom prednizonom ili antitelom anti-tumor nekrozis faktora-a REMICADE® (Janssen Biotech, Inc., Horsham, PA) (infliksimab), pokazali su izglede za umanjivanje težine i povratka bolesti. Ovi tretmani, međutim, takođe su povezani sa različitim neželjenim sporednim efektima, kao što su kušingoidan izgled, dobijanje na telesnoj težini i sistemska imunosupresija, zbog čega se naglašava potreba za razvojem bezbednijih alternativa za dugotrajno lečenje IBD [20].
Ovaj pronalazak obezbeđuje novi proizvod leka za lečenje Crohn-ove bolesti putem targetiranja novog receptora nazvanog LANCL2. BT-11, jedinjenje-primer, oralno se primenjuje i distribuira sistemski i, ispoljava imune modulatorne efekte ne samo u slučaju UC već takođe i kod Crohn-ove bolesti, putem targetiranja LANCL2 u imunim ćelijama creva. Naša pre-klinička ispitivanja efikasnosti u modelima hronične Crohn-ove bolesti na miševima su pokazala da primenjivanje BT-11 smanjuje indeks aktivnosti bolesti i smanjuje upalu creva putem značajnog smanjenja infiltracije leukocita u mukozi creva, kao i putem smanjivanja zadebljanja mukoze i erozije epitela. Analizom genske ekspresije smo potvrdili da oralno primenjivanje BT-11 ushodno reguliše ekspresiju LANCL2, dok nishodno reguliše ekspresiju TNFa mRNA u modelu hronične IBD kod miševa. Sem toga, primenjivanje BT-11 snižava proinflamatorne makrofage i infiltraciju dendritskih ćelija u lamina propria kolona, kao i da ushodno reguliše FOXP3-ekspresiju CD4+ T ćelija i da nishodno reguliše broj efektornih Th1 ćelija u kolonu. Izveli smo, isto tako, ispitivanja knock-outa da bi potvrdili da su ovi efekti zavisni od LANCL2. Konačno, na indukcionim položajima, BT-11 može nishodno regulisati generisanje Th17 ćelija, kao i ushodno regulisati odeljak regulatornih CD4+ T ćelija putem ushodne regulacije FOXP3 ekspresije.
Postupci
Miševi. C57BL/6 and IL-10 knockout miševi su nabavljeni od Jackson laboratorije i čuvani u specifičnim uslovima bez patogena, u ventiliranim stalcima. LANCL2-/- miševi su nabavljeni iz KOMP skladišta Univerziteta California Davis. Miševi su čuvani u opremi za životinje. Svi eksperimentalni protokoli su odobreni od strane institucija koje se bave brigom o životinjama i imali su komisiju i ispunjavali ili premašivali Vodiče nacionalnih instituta zdravstvene službe za dobrobit laboratorijskih životinja i politiku Službe za javno zdravlje.
Obogaćivanje CD4+ T ćelijama i sortiranje. Splenociti dobijeni od C57BL/6J (divlji-tip) miševa su obogaćeni sa CD4+ T ćelijama putem magnetskog negativnog sortiranja, korišćenjem I-Mag ćelijskog separacionog sistema (BD Pharmingen). Ćelije su inkubirane sa smešom biotinizovanog Abs i zatim, u drugoj inkubaciji sa česticama streptavidina i izložene magnetu kako bi se uklonile neželjene ćelije. Čistoća CD4+-obogaćene ćelijske suspenzije je bila između 93 i 96%. CD4-obogaćene ćelije su korišćene za adoptivni prenos, ili su dalje prečišćene sa FACS. Za FACS sortiranje, ćelije su obeležene sa CD45RB, CD4 i CD25 i razdvojene u CD4+ CD45RBhigh CD25- ćelije (tj., efektorne T ćelije) u FACSARIA™ ćelijskom sorteru (BD Biosciences, San Jose, CA). Čistoća FACS-sortiranih CD4+ podsetova je bila ³98%.
Adoptivni prenos. Šest nedelja starim SCID i RAG2-/- miševima intraperitonealno (i.p.) je primenjeno 4x10<5>CD4+ CD45RBhigh CD25- od C57BL/6J (divlji-tip) ili LANCL2-/- miševa. Miševima je težina merena na nedeljnoj bazi i klinički znaci bolesti su beleženi svakog dana u toku 14 nedelja. Miševi koji su razvili teške znake propadanja od bolesti su žrtvovani. Inače, miševi su žrtvovani 90 dana posle prenosa. Grupe u studiji adoptivnog prenosa su bile: i. bez prenosa, tretirani vehikulumom, ii. bez prenosa, tretirani sa BT-11 (80 mg/kg), iii. sa prenosom, tretirani vehikulumom, iv. sa prenosom, tretirani sa BT-11 (80 mg/kg). Za svaku grupu je korišćeno po 12 miševa.
Histopatologija. Isečci kolona u ispitivanjima IBD na miševima su fiksirani u 10% puferovanom neutralnom formalinu, potom kasnije zatopljeni u parafin i zatim isečeni (5 µm) i obojeni sa H&E bojom za histološka ispitivanja. Koloni su stepenovani sa histološkim skorom, koji je uključivao stepen (1) infiltracije leukocita, (2) zadebljanja mukoze i (3) erozije epitelnih ćelija. Isečci su stepenovani od 0-4, zavisno od infiltracije limfocita, oštećenja ćelija i erozije tkiva i, podaci su analizirani kao normalizovani izračunati skor.
Ćelijska izolacija. Slezine i mezenterični limfni čvorovi (MLN) se izdvoje i usitne u 13PBS/5% FBS korišćenjem zamrznutih krajeva dva sterilna mikroskopska slajda. Suspenzije pojedinačnih ćelija se centrifugiraju na 300x g u toku 10 min i jednom isperu sa 1xPBS. Eritrociti se uklone osmotskim liziranjem pre koraka ispiranja. Sav ćelijski sediment se ponovo suspenduje u FACS puferu (1xPBS obogaćen sa 5% FBS i 0.09% natrijum azid) i podvrgne analizi na protočnom citometru. Paralelno, izdvoje se koloni i izoluju leukociti iz sloja lamina propria (LPL). Komadi tkiva se isperu u CMF (1x HBSS/10% FBS/25 mM Hepes) i, tkivo se inkubira dva puta sa CMF/5 mM EDTA tokom 15 min na 37°C uz mešanje. Posle ispiranja sa 1xPBS, tkivo se dalje podvrgne digestiji sa CMF koji je obogaćen sa 300 U/ml tip VIII kolagenazom i 50 U/ml DNAse I (oba od Sigma-Aldrich) tokom 1.5 h na 37°C uz mešanje. Posle filtriranja supernatanata, ćelije se isperu jednom u 1xPBS, sediment se ponovo suspenduje u FACS puferu i podvrgne analizi na protočnom citometru.
Imunofenotipizacija i analiza citokina protočnom citometrijom. Za fluorescentno bojenje podsetova imunih ćelija, 4-6x10<5>ćelija se inkubira u toku 20 min sa fluorohromkonjugovanim primarnim mišijim specifičnim antitelima: anti-CD3 PE-Cy5 klon 145-2C11 (eBioscience, San Diego, CA), anti-CD4 PE-Cy7 klon GK1.5 (eBioscience), anti-CD4 APC klon RM4-5 i anti-CD25 Biotin klon 7D4 (BD Biosciences). Ćelije se isperu sa FACS puferom (1xPBS obogaćen sa 5% FBS i 0.09% natrijum azida). Za unutarćelijsko bojenje transkripcionih faktora i citokina, ćelije se fiksiraju i permeabilizuju korišćenjem komercijalnog kita prema uputstvima proizvođača (eBioscience). Ukratko, ćelije se fiksiraju i permeabilizuju u toku 20 minuta, Fc receptori se blokiraju sa mišijim anti-CD16/CD32 FcBlock (BD Biosciences) i ćelije boje sa fluorohrom-konjugovanim antitelima protiv anti-mišijih, FOXP3 FITC klon FJK-16s, anti-mišije ROR gama (t) PE, klon B2B i anti-mišije IL17-A APC, klon eBio17B7 (eBioscience). Svi uzorci su čuvani fiksni na 4°C u mraku sve do stavljanja na FACS Aria protočni citometar (BD Biosciences). Aktivno izdvajanje ćelija (FSC-A, SSC-A) je primenjeno na sve uzorke, praćeno izdvajanjem pojedinačnih ćelija (FSC-H, FSC-W) pre nego što se ćelije analiziraju na ekspresiju specifičnih markera. Analiza podataka je izvedena sa FACS DIVA™ (BD Biosciences) i Flow Jo (Tree Star Inc.).
Kvantitativni PCR u realnom vremenu. Ukupna RNA je izolovana iz kolona miševa pomoću RNEASY PLUS MINI KIT (Qiagen) prema uputstvima proizvođača. Ukupna RNA (1 µg) se koristi da bi se generisao cDNA templat pomoću ISCRIPT™ Kita za sintezu cDNA (Bio-Rad). Ukupna reakciona zapremina je bila 20 µL, a reakcija je inkubirana u MJ MINI™ termalnom ciklusaru (Bio-Rad) na sledeći način: 5 min na 25°C, 30 min na 52°, 5 min na 85°C, držana na 4°C. PCR je izveden na cDNA primenom Taq DNA polimeraze (Invitrogen). Svaki genski amplikon je prečišćen sa MINELUTE PCR Kitom za prečišćavanje (Qiagen) i kvantitativno određen i na agaroza gelu korišćenjem DNA mass ladder (Promega) i putem nanokapi. Ovi prečišćeni amplikoni su korišćeni za optimizaciju uslova real-time PCR-a i za formiranje standardnih krivi za test PCR u realnom vremenu. Prajmeri su projektovani korišćenjem Oligo 6 softvera. Koncentracije prajmera i temperature rekombinovanja su optimizovane za ICYCLER IQ™ sistem (Bio-Rad) za svaki set prajmera primenom gradijent protokola sistema. Efikasnosti PCR su održavane između 92 i 105% i koeficijenti korelacije su tokom optimizacije podešeni na >0.98 za svaki set prajmera i, isto tako, tokom izvođenja real-time PCR za uzorak DNA. Koncentracije cDNA za gene koji su značajni su određene qPCR-om u realnom vremenu, korišćenjem ICYCLER IQ™ Sistema i IQ™ SYBR® Green Supermix (Bio-Rad). Standardna kriva je generisana za svaki gen korišćenjem 10-tostrukih razblaženja prečišćenih amplikona, polazeći od 5 pg cDNA i, kasnije korišćena za izračunavanje polaznih količina ciljnih cDNA u nepoznatim uzorcima. SYBR® zeleno I je opšta interkalarna boja dvolančanih DNA i, na taj način se mogu detektovati nespecifični proizvodi i prajmer/dimeri pored amplikona koju su od značaja. Da bi se odredio broj sintetisanih proizvoda tokom PCR-a u realnom vremenu, za svaki proizvod je izvedena analiza krive topljenja. PCR u realnom vremenu je upotrebljen da se izmeri polazna količina nukleinske kiseline u svakom nepoznatom uzorku cDNA na istoj ploči sa 96 pozicija.
Statistička analiza. Parametarski podaci su analizirani pomoću ANOVA i zatim, postupkom Scheffeovog višestrukog poređenja. Neparametarski podaci su analizirani pomoću Mann-Whitney U testa, a zatim testom Dunnove višestruke komparacije. ANOVA je izvedena SAS procedurom opšteg linearnog modela, verzija 6.0.3 (SAS Institut). Procenjena statistička značajnost je bila na P≤0.05.
Rezultati
BT-11 smanjuje aktivnost bolesti u IL-10-/- modelu hronične IBD. Brojne studije na životinjama za ispitivanje hroničnosti u Crohn-ovoj bolesti koristile su mišiji model sa interleukin-10 deficijentnim miševima (IL-10-/-), zbog činjenice da je poznato da IL-10 vrši supresiju sekrecije brojnih proinflamatornih citokina [21]. Da bi se ispitala efikasnost BT-11 ne samo u modelima akutnog kolitisa već i u modelima hronične bolesti, postavili smo studiju na modelu kolitisa na miševima bez IL-10 i tretirali miševe sa rastućim dozama BT-11 (20, 40 i 80 mg/Kg). Tretman sa BT-11 značajno snižava skorove indeksa aktivnosti bolesti kod tretiranih miševa u poređenju sa njihovim srodnicima iz istog legla koji su tretirani sa vehikulumom (Slika 18). Dalje, miševi tretirani sa najvišim dozama BT-11 (80 mg/kg) imali su značajno sniženje u skorovima u poređenju sa onima koji su tretirani sa bilo 20 bilo 40 mg/kg jedinjenja BT-11 polazeći od 13. nedelje pa sve do kraja eksperimenta.
BT-11 umanjuje mikroskopske lezije u slezini, MLN i kolonu u IL10-/- modelu hronične IBD. Da bi prvo odredili kliničku efikasnost, ispitali smo makroskopske tkivne lezije posle tretmana sa BT-11 i posledične aktivacije LANCL2 puta. Makroskopski smo po skorovima rangirali slezinu (Slika 19, panel A), MLN (Slika 19, panel B) i kolon (Slika 19, panel C) odmah posle eutanazije i sakupili tkiva 19. nedelje posle početka studije. Tretman sa BT-11 u niskim koncentracijama, kao 20 mg/kg, veoma i značajno snižava makroskopske skorove u tri tkiva demonstrirajući na taj način svoju moćnu efikasnost.
BT-11 smanjuje histopatološke lezije i inflamaciju u IL-10-/- modelu hronične IBD. Da bi ispitali histopatološke lezije i opštu patologiju mukoze creva, isečci kolona su obojeni sa H&E i posmatrani mikroskopski. Naši rezultati pokazuju kako tretman sa BT-11 značajno smanjuje inflamaciju na osnovu sniženja infiltracije leukocita (Slika 20, panel A), erozije epitela (Slika 20, panel B) i zadebljanja mukoze (Slika 20, panel C). Takođe smo zapazili dozno-zavisni mehanizam na količinu infiltracije u mukozi creva koja je u korelaciji sa zadebljanjem mukoze.
Tretman sa BT-11 izaziva moćan anti-inflamatorni odgovor i umanjuje proinflamatorne podsetove u lamina propria kolona, slezini i MLN. Da bi se odredio efekat BT-11 podsetove imunih ćelija, fenotipski smo opisali ćelije izolovane iz kolona, slezine i MLN. Naše analize ukazuju na to da BT-11 značajno snižava procenat pro-inflamatornih F4/80+ makrofaga (Slika 21, panel A), MHC-II+ CD11c+ dendritskih ćelija (Slika 21, panel B) i efektornih Th1 ćelija (Slika 21, panel D) u lamina propria kolona. Dalje, BT-11 ispoljava anti-inflamatorna svojstva putem ushodne regulacije CD4+ T ćelija koje ekspresuju FOXP3 u LP kolona (Slika 21, panel C).
Ushodna regulacija CD4+ T ćelija koje ekspresuju FOXP3 je takođe zapažena i u MLN (Slika 22, panel B) i u slezini (Slika 22, panel C), pokazujući i demonstrirajući kako BT-11 ima i sistemski efekat. Nishodna regulacija pro-inflamatornih Th1 ćelija je takođe zapažena u slezini u dozno-zavisnom maniru (Slika 22, panel D). Na kraju, efektorne Th17 ćelije, koje se odlikuju ekspresijom RORgt, bile su nishodno regulisane u MLN (Slika 22, panel A).
Dalje, analize ekspresije gena su potvrdile da tretman sa BT-11 ushodno reguliše ekspresiju LANCL2 u kolonu (Slika 23, panel A) i nishodno reguliše ekspresiju TNFa (Slika 23, panel B). Ovi efekti na ekspresiju su bili dozno-zavisni od količine primenjenog BT-11.
BT-11 je doveo do smanjenja aktivnosti bolesti u IBD modelu CD4+ T ćelijama indukovanog kolitisa. Da bi dalje potvrdili efikasnost BT-11 u drugom modelu hronične IBD, preneli smo naïve CD4+ T ćelije divljeg tipa miševa i LANCL2-/- miševa u RAG2-/- primaoce. RAG2-/-miševi su tretirani bilo sa vehikulumom bilo sa BT-11 prema dizajnu eksperimenta. Tretman sa našim vodećim jedinjenjem BT-11, značajno snižava skor indeksa aktivnosti bolesti kod tretiranih miševa u poređenju sa njihovim srodnicima iz legla divljeg tipa (Slika 24). Zaključili smo da su rezultati zavisni od LANCL2 jer je efekat BT-11 bio potpuno anuliran sa gubitkom LANCL2 (Slika 25).
Zanimljivo, gubitak težine kod miševa tretiranih sa BT-11 je bio značajno poboljšan u poređenju sa miševima koji su tretirani vehikulumom počevši od 7. nedelje pa do kraja eksperimenta (Slika 26).
BT-11 umanjuje makropskoske lezije u slezini, MLN i kolonu u modelu adoptivnog prenosa hronične IBD. Da bi se potvrdila klinička efikasnost u drugom modelu hroničnog kolitisa, odredili smo makroskopske tkivne lezije nakon tretmana sa BT-11 i rezultujuće aktivacije LANCL2 puta kod miševa, kojima su adoptivno prenesene ćelije divljeg-tipa ili LANCL2-/- i, koji su tretirani bilo sa vehikulumom bilo sa BT-11. Makroskopski smo napravili skorove za slezinu (Slika 27, panel A), MLN (Slika 27, panel B) i kolon (Slika 27, panel C) i ileum (Slika 27, panel D) odmah posle eutanazije i sakupljanja tkiva, 11 nedelja po otpočinjanju studije. Tretman sa BT-11 u koncentracijama od 80mg/kg veoma i značajno umanjuje makroskopske skorove u četiri tkiva, demonstrirajući svoju moćnu efikasnost. Našli smo da su ove opservacije zavisne od LANCL2 kako gubitak LANCL2 u potpunosti anulira efekat BT-11 (Slika 28).
BT-11 takođe umanjuje histopatološke lezije i inflamaciju u modelu adoptivnog prenosa hroničnog kolitisa. Slično eksperimentu u kom je IL-10-/- miševima indukovan kolitis, a da bi potvrdili histopatološke lezije i opštu patologiju u mukozi creva u drugom modelu IBD na miševima, isečci kolona su obojeni sa H&E i analizirani ispod mikroskopa. Naši rezultati potvrđuju kako tretman sa BT-11 značajno smanjuje upalu na osnovu smanjenja infiltracije leukocita i u kolonu i u ileumu (Slika 29, paneli A i B) i zadebljanje mukoze (Slika 29, paneli E i F). Važno, ileum je bio manje pogođen erozijom epitela (Slika 29, panel D) ali, nađeno je da je takva erozija u kolonu bila značajno manja kod miševa tretiranih sa našim vodećim jedinjenjem BT-11 (Slika 29, panel C).
Da bi se potvrdila zavisnost BT-11 od LANCL2, izveli smo studiju adoptivnog transfera i preneli CD4+ T ćelije od LANCL2-/- donora. Naši rezultati pokazuju kako je smanjenje infiltracije leukocita, erozije epitela i zadebljanja mukoze u najvećem anulirano kod primaoca prenetih LANCL2-/- (Slika 30).
BT-11 dosledno indukuje intenzivan anti-inflamatorni odgovor i nishodno reguliše pro-inflamatorne medijatore kod miševa. Da bi se opisao profil imunskih ćelija kod miševa tretiranih sa BT-11 u odnosu na one tretirane sa vehikulumom, izveli smo analize protočne citometrije sa ćelijama izolovanim iz kolona, slezine i mezenteričnih limfnih čvorova. U drugom modelu hronične IBD na miševima smo potvrdili da miševi primaoci, koji su tretirani sa BT-11 u periodu od 11 nedelja, imaju značajno niži nivo infiltriranih F4/80+ CD11b+ pro-inflamatornih makrofaga (Slika 31, panel A), kao i pad nivoa IFNg na osnovu analiza napravljenih na ukupnim CD45+ leukocitima (Slika 31, panel B) u kolonu. Dalje, tretman sa BT-11 dosledno ushodno reguliše CD4+ T ćelije, podstičući ekspresiju FOXP3 (Slika 31, panel C) i moćnog antiinflamatornog citokina IL-10 (Slika 31, panel D) na lokalnom mestu inflamacije, u ovom slučaju, mukozi kolona.
Slično profilu zapaženom kod ćelija lamina propria kolona, opisali smo ove populacije u položajima indukcije, kao što su slezina i MLN. Rezultati imunofenotipiziranja pokazuju kako tretman sa BT-11 takođe povećava nivoe FOXP3 i IL-10 u položajima indukcije, kao što su slezina i MLN (Slika 32, paneli A, B, D i E). Važno, tretmanom sa BT-11 se smanjuje ekspresija IFNg u CD45+ populaciji i u MLN i u slezini (Slika 32, paneli C i F).
Efekat LANCL2-targetiranja od strane BT-11 je nezavisan od PPARg. Aktivacijom
1
LANCL2 se aktivira pletora puteva koji odmah regulišu antiinflamatorne odgovore na bazi IL-10, koji regulišu upalu na sistemskom nivou, tvrdnja se zasniva na našim eksperimentalnim rezultatima. Jednom aktiviran nishodni LANCL2 put je PPARg put. Da bi se prevazišle moguće toksikološke posledice sekundarnom aktivacijom ovog nuklearnog i transkripcionog faktora, takođe smo RAG2-/- miševima preneli CD4+ T ćelije od PPARg -/- donora. Onda smo ove miševe tretirali ili sa vehikulumom ili sa BT-11 u količini od 80mg/kg. Naši rezultati jasno demonstriraju da se korisni efekti BT-11, preko aktivacije LANCL2, na aktivnost bolesti i histopatologiju javljaju na PPARgnezavisan način (Slika 33, paneli A-D). Ovi rezultati pokazuju da aktivacija LANCL2 isto tako reguliše druge puteve koji moduliraju anti-inflamatorne efekte LANCL2 aktivacije.
Diskusija
Sadašnje terapije protiv inflamatorne bolesti creva (IBD) postižu skroman uspeh i imaju značajne sporedne neželjene efekte u dugotrajnoj borbi protiv bolesti [17]. Biljno jedinjenje, abscisinska kiselina (ABA), ispoljava moćne anti-inflamatorne efekte u modelima kolitisa na miševima [22, 23]. Lantionin sintetaznoj komponenti C-sličan protein 2 (LANCL2) je meta za vezivanje i signaliziranje ABA [15, 19, 24]. Tako, pojavljuje se LANCL2 kao obećavajuća nova terapeutska meta protiv inflamacije [18]. Jedinjenje 61610, bis(benzimidazoil)tereftalanilid (BTT), je identifikovano da se vezuje za LANCL2 sa najvećim afinitetom u biblioteci nekoliko miliona hemikalija. Sem toga, 61610 ima moćne anti-inflamatorne efekte u modelima inflamacije creva na miševima [25]. Kreirana je tematska biblioteka 20 61610-izvedenih BTT jedinjenja i, BT-11 je identifikovan kao vrhunski primer jedinjenja. BT-11 se vezuje za LANCL2, oralno je aktivan, ispoljio je anti-inflamatornu efikasnost u 3 modela kolitisa na miševima, kao i naglašeni bezbednosni profil.
Prema Fondaciji Crohn i kolitis Amerike, IBD pogađa preko 1 milion ljudi u Severnoj Americi i 4 miliona širom sveta. Ova široko rasprostranjena i iznurujuća bolest dovodi do pada kvaliteta života i značajnih troškova povezanih sa zdravstvenom negom [26]. Prosečni medicinski troškovi za lečenje pojedinačne epizode IBD prevazilaze 55,000 dolara po pacijentu [27], sa ukupnim troškovima koji prevazilaze 15 milijardi dolara godišnje u U.S. Sem toga, indirektni troškovi obuhvataju troškove lečenja rekurentnog pankreatitisa [28] ili drugih IBD komplikacija, kao što su apscesi, intestinalne opstrukcije, anemija, tromboza, perianalne lezije, artritis, uveitis, iritis, ili lezije na koži [29]. IBD donosi značajan teret pacijentima, često ih socijalno izoluje, utiče na porodične odnose i ograničava njihove profesionalne mogućnosti [17]. U ovom smislu, pacijenti sa IBD imaju veću stopu neučestvovanja u radnoj snazi; ova visoka stopa opstaje tokom vremena [30]. Sem toga, intestinalna inflamacija (ulcerativni kolitis (UC) i Crohn-ova bolest (CD)) povećavaju rizik od razvoja kancera kolona, posebno u mladim godinama (< 30 godina starosti)
2
[31]. Svetsko IBD terapeutsko tržište očekuje da dostigne 4.3 milijarde dolara do 2015, prema novom izveštaju Analitičara Globalne Industrije.
Iako su današnji tretmani za IBD unapređeni [17, 32], oni su samo skromno uspešni za hroničnu borbu protiv bolesti i imaju značajne sporedne efekte, uključujući umanjenu sposobnost imunog sistema da podigne zaštitne imune odgovore protiv patogena ili maligniteta. Izbor tretmana za pacijente uključuje adresiranje simptoma inflamacije. Najveći broj farmakoloških tretmana koji se danas primenjuju obuhvataju aminosalicilate, kortikosteroide, imunomodulatore, antibiotike, biološke lekove (anti-tumor nekrozis faktor-alfa antitelo). Aminosalicilati su izuzetno efikasni i generalno se dobro podnose. Ipak, pacijenti sa rekurentnom bolesti ili više umerenom bolesti mogu zahtevati agresivniji tretman, koji obuhvata kratkotrajne doze kortikosterioda u kratkom periodu da bi se kontrolisali simptomi. Ovaj tip terapije sa sigurnim dejstvom se ne može tolerisati u dugačkim vremenskim periodima. Za održavanje stanja, obično se, isto tako, primenjuju imunomodulatori kod CD i UC, ali oni imaju spor početak dejstva (3 do 6 meseci za pun efekat). Ovi medikamenti imaju potencijalno značajne neželjene sporedne efekte, počevši od pankreatitisa do dijabetesa, do oštećenja jetre i zapaljenja pluća. Kod umerenih do teških slučajeva bolesti koje su neuspešno lečene drugim terapijama, pacijenti će biti podvrgnuti anti-TNF-a, koji se daje intravenski u regulisanim okvirima svakih 6-8 nedelja. Ova izuzetno skupa terapija, iako efikasna, teže se ostvaruje, s obzirom na to da je neophodan stručan personal i kliničko okruženje za primenjivanje. Dalje, postoje značajni sporedni efekti, kao što su Cushingov sindrom, manija, insomnija, hipertenzija, visoka glukoza u krvi, osteoporoza, maligniteti, infekcije i avaskularna nekroza dugačkih kostiju.
Jedinjenje-primer, BT-11, pokazalo je izuzetno bezbedan toksikološki profil. Naši podaci o efikasnosti u modelima hroničnog IBD pokazuju kako BT-11 poboljšava skorove aktivnosti bolesti u dva modela hroničnog IBD (Slika 18 i 24) kao i gubitak telesne težine (Slika 26). Naši podaci su demonstrirali kako su ovi efekti zavisni od LANCL2 (Slika 25). Naši podaci o efikasnosti isto tako su demonstrirali kako aktivacija LANCL2 puta pomoću BT-11 podstiče antiinflamatorni odgovor, koji se pre svega odlikuje proizvodnjom IL-10 i ekspresijom FOXP3 u CD4+ T ćelijama (Slike 21, 22, 31 i 32), kao i da značajno umanjuje inflamatorne makrofage, dendritske ćelije i pro-inflamatorne faktore kakav je IFNg (Slike 22, 23, 31 i 32). Sem toga, analize genske ekspresije potvrđuju ove nalaze dobijene na ćelijama, pokazujući kako tretman sa BT-11 snižava nivoe TNFa u kolonu (Slika 23). Svi ovi nalazi zajedno kao rezultat imaju dramatično LANCL2-zavisno poboljšanje mukoze kolona u smislu infiltracije leukocita, erozije epitela i zadebljanja mukoze u dva modela hroničnog IBD (Slike 20, 29 i 30). Takođe, demonstrirali smo da su efekti BT-11 nakon vezivanja za LANCL2 PPARg nezavisni (Slika 33). Ovi rezultati potvrđuju da aktivacija LANCL2 dovodi do aktivacije pletore nishodnih aktivatora koji regulišu inflamaciju preko PPARg nezavisnog mehanizma. Zajedno, ovi rezultati snažno podržavaju činjenicu da je LANCL2 nova terapeutska meta za inflamatorne bolesti i da je BT-11 koristan kao novi lek.
Primer 22: Primena BT-11 u lečenju dijabetesa tip 1 (T1D)
Uvod
Diabetes mellitus (DM), takođe nazivan jednostavno dijabetes, je grupa metaboličkih bolesti u kojima postoje visoki nivoi šećera u krvi tokom produženog vremenskog perioda. Dve vrste dijabetesa se označavaju kao tip 1 i tip 2. Ovi nazivi su za stanja u kojima postoji insulinska zavisnost i za ne-insulin-zavisni dijabet, ili za juvenilni početak bolesti i početak dijabetesa kod odraslih. U T1D, organizam ne proizvodi insulin. U odnosu na T2D, T1D nije ni blizu učestao kao T2D. Zaista, otprilike 10% svih slučajeva dijabetesa su tip 1. T1D pogađa 3 miliona Amerikanaca. Svake godine, u Sjedinjenim Državama više od 15,000 dece i 15,000 odraslih se dijagnostikuje kao T1D. Određeno je da stopa T1D incidence među decom starosti ispod 14 godina raste za 3% godišnje širom sveta. T1D pacijenti zahtevaju insulinske injekcije da bi ostali živi, ali ne izleče bolest niti spreče njene ozbiljne sporedne efekte.
Sadašnji anti-dijabetesni medikamenti su efikasni u poboljšavanju osetljivosti na insulin, ali njihovo stalno primenjivanje dovodi do značajnih sporednih efekata, kao što su kardiovaskularne komplikacije, hepatotoksičnost, gojaznost, retencija tečnosti i tumori bešike. Lantionin sintetaznoj komponenti C-sličan 2 (LANCL2) put ima anti-dijabetesna dejstva bez sporednih efekata [18]. BT-11 se vezuje za LANCL2, oralno je aktivan, pokazao je anti-dijabetesnu efikasnost kod miševa i ima vidno bezbedan profil.
Postupci
Miševi. NOD miševi su nabavljeni od Jackson laboratorije i čuvani u specifičnim uslovima bez patogena, u ventiliranim stalcima. Miševi su čuvani u opremi za životinje. Svi eksperimentalni protokoli su odobreni od strane institucija koje se bave brigom o životinjama i imali su komisiju i ispunjavali ili premašivali Vodiče nacionalnih instituta zdravstvene službe za dobrobit laboratorijskih životinja i politiku Službe za javno zdravlje.
Određivanje telesne težine i tolerancije glukoze. Pre otpočinjanja studije, određeno je da su svi miševi normoglikemijski (nivoi glukoze u krvi u gladovanju niži od 250 mg/dl) i da imaju slične težine (20±1.5 g). Miševima je merena težina na nedeljnoj bazi i pregledani su na kliničke znake bolesti postupkom slepih posmatrača. Posle standardnih 12 h gladovanja, određivana je glukoza korišćenjem ACCU-CHEK® glukometra (Indianapolis, IN). Krv je sakupljana preko
4
lateralne vene repa i stavljana u epruvete za sakupljanje kapilarne krvi.
Histopatologija. Isečci pankreasa u ispitivanjima NOD na miševima su fiksirani u 10% puferovanom neutralnom formalinu, potom kasnije zatopljeni u parafin i zatim isečeni (5 µm) i obojeni sa H&E bojom za histološka ispitivanja. Isečci su stepenovani sa skorom od 0-4, zavisno od infiltracije limfocita, oštećenja ćelija i erozije tkiva i, podaci su analizirani kao normalizovani izračunati skor.
Statistička analiza. Parametarski podaci su analizirani pomoću ANOVA i zatim, postupkom Scheffeovog višestrukog poređenja. Neparametarski podaci su analizirani pomoću Mann-Whitney U testa, a zatim testom Dunnove višestruke komparacije. ANOVA je izvedena SAS procedurom opšteg linearnog modela, verzija 6.0.3 (SAS Institut). Procenjena statistička značajnost je bila na P≤0.05.
Rezultati
BT-11 snižava nivoe glukoze u krvi u gladovanju i povećava insulin u modelu dijabeta tip 1 na miševima.
U cilju određivanja efekta BT-11 u modulaciji nivoa glukoze u modelu T1D na miševima, izveli smo test glukoze u krvi u gladovanju u nedeljama 0, 1, 3, 4, 5, 10 i 11 nakon početka ispitivanja. Naši rezultati su pokazali kako su miševi tretirani sa našim jedinjenjem BT-11 imali značajno niže nivoe glukoze u krvi posle perioda od 12h gladovanja (Slika 34, panel A).
Paralelno, ispitali smo nivoe insulina u 5. nedelji i naši rezultati su pokazali kako su miševi tretirani sa BT-11 imali značajno više nivoe insulina u plazmi (Slika 34, panel B).
BT-11 poboljšava kliničke histopatološke lezije u pankreasu i umanjuje inflamaciju u mišijem NOD modelu. Da bi se ispitale histopatološke lezije u mišijem modelu T1D, sakupljen je pankreas i fiksiran u 10% formalinu. Isečci pankreasa su zatim obojeni sa H&E i posmatrani pod mikroskopom. Naši rezultati su pokazali kako su kod miševa tretiranih sa BT-11 značajno smanjene kliničke histopatološke lezije u pankreasima miševa u poređenju sa miševima koji su tretirani vehikulumom (Slika 35).
Diskusija
Postoji potreba za efikasnijim i bezbednijim oralnim medikamentima za tip 1 dijabetesa (T1D), bolest koja pogađa preko 3 miliona Amerikanaca. ABA treatman ispoljava anti-dijabetske efekte [2]. Lantionin sintetaznoj komponenti C-sličan protein 2 (LANCL2) je meta za vezivanje i signalizaciju ABA [15, 19, 24]. Tako, pojavljuje se LANCL2 kao obećavajuća nova terapeutska meta protiv inflamacije [18]. ABA je efikasna u poboljšavanju dijabetesa [2, 33] i imunoposredovanih bolesti, kao što je inflamatorna bolest creva (IBD) [22, 23]. Jedinjenje 61610, bis(benzimidazoil) tereftalanilid (BTT), vezuje se za LANCL2 sa najvećim afinitetom, koji postoji u biblioteci nekoliko miliona hemikalija. Sem toga, 61610 ispoljava moćne imune modulatorne efekte u modelima inflamacije na miševima [25]. BT-11 ispoljava anti-dijabetske efekte kod NOD miševa (Slika 34 i 35). Sem toga, ABA povećava sekreciju insulina u pankreasnim beta-ćelijama ljudi [34], što ukazuje na moguću ABA primenu u lečenju tip 1 dijabetesa (T1D).
U imunskim ćelijama, ABA se prepoznaje pomoću LANCL2, G-protein kuplujući receptor se spaja sa ćelijskom membranom posle miristoilacije [19, 35]. ABA, vezujući se za LANCL2, povećava cAMP i otpočinje signaliziranje preko PKA i, modulira imune odgovore u makrofagima i T ćelijama [8]. Izveli smo modelovanje homologije kako bi konstruisali trodimenzionalnu strukturu LANCL2 korišćenjem kristalne strukture LANCL1 kao templata. Primenom molekularnog povezivanja, pokazano je da se prvo in silico a onda i in vitro ABA vezuje za LANCL2. Ova računarska predikcija je validirana pomoću SPR rezultata i testova vezivanja sa humanim LANCL2 [35]. Izveli smo LANCL2-bazirani virtualni skrining, korišćenjem strukture LANCL2, koja je dobijena putem homolognog modeliranja, kako bi otkrili nove LANCL2 ligande. Jedinjenja iz NCI Diversity Set II, ChemBridge i baze podataka ZINC prirodnih proizvoda su uneti u LANCL2 model sa Auto Dock i razvrstani prema izračunatom afinitetu. Dok je ABA imala visok afinitet za LANCL2, i za druga prirodna jedinjenja koja imaju diensku strukturu, kao što je 61610, takođe je bilo predviđeno da se vezuju u istom regionu i da mogu, takođe, da prate LANCL2-vezujuće lekove [12]. BT-11 je isto tako, pokazao snažno vezivanje za LANCL2 i terapeutsku efikasnost u modelu NOD miševa za T1D (Slika 34). Ovi podaci obezbeđuju izvesnu validaciju da su LANCL2 put i druga jedinjenja pronalaska korisna kao imunski modulatorni lekovi za T1D. Dalji dokazi podrške ulozi LANCL2 puta, kao načina za moduliranje imunih odgovora i poboljšanje autoimunih bolesti, obuhvataju LANCL2 vezivanje i zaštitne efekte ABA [22, 23], 61610 [12, 18] i BT-11 u modelima inflamatorne bolesti creva (IBD) na miševima.
Incidenca T1D je u porastu i, procenjeno je da je godišnja stopa 3% širom sveta [36-38]. Dok uspešna transplantacija pankreasnih ostrvaca može izlečiti T1D, nedostatak dovoljne količine ostrvaca, prateće imuno-posredovano uništavanje transplantiranih ostrvaca, kao i sporedni efekti imunosupresivnih lekova u mnogome ograničavaju široku primenu ovog pristupa [39]. Zbog toga, fundamentalna strategija za lečenje T1D jesu terapije koje bezbedno spajaju sposobnost podsticanja funkcije pankreasnih b-ćelija i imune modulacije. Naši podaci pokazuju da aktivacija LANCL2 pomoću BT-11 ne samo što poboljšava nivoe glukoze u krvi, već isto tako pobiljšava njeno normalizovanje posle uzimanja glukoze (Slika 34). Dalje, tretman sa BT-11 tokom otpočinjanja T1d poboljšava histopatologiju u pankreasu (Slika 35). Zaista, ABA preventivno i terapeutski suzbija inflamaciju i poboljšava toleranciju na glukozu [2, 3]. Tako, prirodna aktivacija LANCL2 dovodi i do imune modulacije, što je ilustrovano njegovim terapeutskim efektima kod IBD [12, 18, 22, 23] i do regulacije homeostaze glukoze zahvaljujući suzbijenoj inflamaciji i povećanoj osetljivosti na insulin [2, 3]. Na osnovu ovih saznanja i podataka predstavljenih na Slikama 34 i 35, važno je istraživanje uloge LANCL2 kao terapeutskog targeta za T1D.
Primer 23: Primena BT-11 u lečenju dijabetesa tip 2 (T2D)
Uvod
Dijabetes melitus (DM) je hronično stanje koje se javlja kada organizam ne može da proizvede dovoljno insulina ili da ga efikasno koristi i, indukovano je genetskom predispozicijom u sprezi sa faktorima okruženja. Za razliku od ljudi sa tipom 1 dijabetesom, tip 2 dijabetičari mogu da proizvedu insulin. Ipak, pankreas ovih pacijenata ne proizvodi dovoljno insulina ili organizam ne može dovoljno dobro da iskoristi insulin. Ovaj fenomen se zove insulinska rezistencija. Kada nema dovoljno insulina ili se insulin ne iskorišćava dobro, glukoza ne može da se obrađuje i koristi. Kao posledica, kada se glukoza nakuplja u krvotoku umesto da ulazi u ćelije i da se metaboliše, druge ćelije u sistemu ne mogu ispravno da funkcionišu. Zaista, hiperglikemija i dijabetes su značajni uzročnici morbiditeta i mortaliteta, zbog posledične kardiovaskularne bolesti (CVD), nefropatije, neuropatije, ulcera stopala i retinopatije.
Otprilike 28.3 miliona Amerikanaca ima tip 2 dijabetes (T2D) i preko 40.1% sredovečnih odraslih ljudi ima pre-dijabetes, stanje koje se odlikuje narušenom tolerancijom glukoze, sistemskom inflamacijom i insulinskom rezistencijom. Svetska zdravstvena organizacija je procenila da će broj ljudi sa T2D porasti na 366 miliona do 2030. godine.
Kako je prethodno objašnjeno, sadašnji anti-dijabetesni medikamenti su efikasni u poboljšavanju osetljivosti na insulin, ali njihovo stalno primenjivanje ima značajne sporedne efekte, kao što su kardiovaskularne komplikacije, hepatotoksičnost, gojaznost, zadržavanje tečnosti i tumori bešike. Lantionin sintetaznoj komponenti C-sličan 2 (LANCL2) put ispoljava antidijabetično dejstvo bez sporednih efekata [18]. BT-11 se vezuje za LANCL2, oralno je aktivan, ispoljio je anti-dijabetesnu efikasnost na miševima i ima naglašen bezbedan profil.
Postupci
Miševi i dijetarni tretmani. C57BL/6 i db/db miševi su nabavljeni od Jackson laboratorije i čuvani u specifičnim uslovima bez patogena, u ventiliranim stalcima. Miševi, u dijabetesnom modelu dijetom indukovane gojaznosti (DIO), hranjeni hranom sa visokim sadržajem masti (40Kcal % masnoće). Miševi su čuvani u opremi za životinje. Svi eksperimentalni protokoli su odobreni od strane institucija koje se bave brigom o životinjama i imali su komisiju i ispunjavali ili premašivali Vodiče nacionalnih instituta zdravstvene službe za dobrobit laboratorijskih životinja i politiku Službe za javno zdravlje.
Određivanje telesne težine i tolerancije glukoze. Pre otpočinjanja studije, određeno je da su svi miševi normoglikemijski (nivoi glukoze u krvi u gladovanju niži od 250 mg/dl) i da imaju slične težine (težina±1.5 g). Miševima je merena težina na nedeljnoj bazi i pregledani su na kliničke znake bolesti postupkom slepih posmatrača. Posle standardnih 12 h gladovanja, određivana je glukoza u različitim danima. Ukratko, krv je sakupljana preko lateralne vene repa i stavljana u epruvete za sakupljanje kapilarne krvi. Na miševima je onda izvođen test tolerancije glukoze putem intraperitonealne injekcije D- glukoze (2 g/kg telesne težine) i uzorci krvi sakupljani pre injektovanja (vreme 0) (odgovara baznoj liniji FBG nivoa nakon 12-h gladovanja počevši u 6 časova ujutru) i u 15., 60. i 90. minutu (db/db model) ili u 15., 30., 60., 90., 120., 180., 220. i 265. minutu (DIO model) posle injektovanja glukoze. Abdominalno (epididimsko) belo adipozno tkivo (WAT), subkutano WAT, i jetra su zatim izdvojeni i odvagani. Abdominalno (epididimsko) WAT je onda svareno i frakcionisano.
Digestija belog adipoznog tkiva. Abdominalno WAT se izdvoji, odvaže, usitni u male <10 mg delove i stavi u medijum za digestiju (1XHBSS (Mediatech, Herndon, VA) koji je obogaćen sa 2.5% HEPES (Mediatech) i 10% fetalnog goveđeg seruma, koji sadrži tip II kolagenazu (0.2%, Sigma-Aldrich)). Uzorci su inkubirani u inkubatoru na 37°C tokom 30 min, filtrirani kroz 100µm najlonsku cediljku za ćelije da bi se uklonile nesvarene čestice i, centrifugirani na 4°C pri 1000 x g tokom 10 min. Sediment, koji se sastoji od stromalni vaskularnih ćelija (SVCs), se ispere sa 1XHBSS i centrifugira na 4°C na 1000 x g u toku 10 min. Supernatant se odbaci i eritrociti liziraju inkubiranjem SVCs u 2 mL pufera za liziranje eritrocita tokom 2 min pre nego što se izvrši zaustavljanje reakcije sa 9 mL IX PBS. Ćelije se onda ponovo centrifugiraju na 4°C pri 1000 x g u toku 10 min, suspenduju u 1 mL IX PBS i, izbroje na aparatu Coulter Counter (Beckman Coulter, Fullerton, CA).
Imunofenotipizacija stromalnih vaskularnih ćelija. Za imunofenotipizaciju SVCs su zasejane u ploče sa 96 pozicija (Costar) u količini 2 x 10<5>ćelija/pozicija. Posle početne inkubacije od 20 min sa FcBlock (20 µg/mL; BD Biosciences - Pharmingen) kako se sprečava nespecifično vezivanje, ćelije se isperu u PBS koji sadrži 5% seruma i 0.09% natrijum azida (FACS pufer) i boje sa specifičnim primarnim anti-mišijim antitelima. Rezultati protoka su računati na protočnom citometru FacsAria dok je analiza podataka izvedena sa FACS DIVA™ (BD Biosciences) i FlowJo (TreeStar).
Kvantitativni PCR u realnom vremenu. Ukupna RNA je izolovana iz adipoznog tkiva pomoću RNEASY Lipid Mini Kit (Qiagen) i iz ćelija uz pomoć RNEASY Mini Kit (Qiagen) prema uputstvima proizvođača. Ukupna RNA se koristi da bi se generisao komplementarni DNA (cDNA) templat pomoću QSCRIPT™ Kita za sintezu cDNA (Quanta Bio-sciences, Gaithersburg, MD). Ukupna reakciona zapremina je bila 20 µL, a reakcija je inkubirana u MJ MINI™ termalnom ciklusaru (Bio-Rad) na sledeći način: 5 min na 25°C, 30 min na 52°, 5 min na 85°C, držana na 4°C. Svaki genski amplikon je prečišćen sa MINELUTE PCR Kitom za prečišćavanje (Qiagen) i kvantitativno određen na agaroza gelu korišćenjem DNA mass ladder (Promega) (Komercijalni proizvod za određivanje veličine i kvantitativnu procenu dvostrukih DNA lanaca, prim. prev.). Ovi prečišćeni amplikoni su korišćeni za optimizaciju uslova real-time PCR-a u PCR testu u realnom vremenu. Koncentracije prajmera i temperature rekombinovanja su optimizovane za CFX sistem (Bio-Rad) za svaki set prajmera primenom gradijent protokola sistema. Efikasnosti PCR su održavane između 92 i 105% i koeficijenti korelacije su tokom optimizacije podešeni na iznad 0.98 za svaki prajmer i, isto tako, tokom izvođenja real-time PCR za uzorak DNA. Podaci su prikazani korišćenjem postupka DDCt kvantifikacije.
Rezultati
BT-11 snižava nivoe glukoze u krvi u gladovanju u DIO modelu T2D na miševima. Da bi se ispitala efikasnost jedinjenja BT-11 koje je primer u modelu T2D, hranili smo C57BL/6 miševe ishranom sa visokim sadržajem masti (DIO model). Oralno primenjivanje BT-11 značajno snižava nivoe glukoze u krvi kod miševa tretiranih sa BT-11 u poređenju sa njihovim srodnicima iz legla koji su tretirani vehikulumom u 12. nedelji ishrane sa visokim sadržajem masti (Slika 36, panel A). Dalje, nakon 12h gladovanja i davanja glukoze u količini 2g/kg telesne težine preko IP, miševi koji su tretirani sa BT-11 su bili sposobni da normalizuju nivoe glukoze u krvi značajno brže od netretiranih miševa (Slika 36, panel B).
Tretman sa BT-11 umanjuje infiltraciju pro-inflamatornih makrofaga kao i proinflamatornih granulocita u belom adipoznom tkivu. U cilju opisivanja ćelijske infiltracije belog adipoznog tkiva, sakupili smo abdominalno WAT koje je potom svareno kako je navedeno u delu Postupci. Izvedene su analize protočne citometrije ispitivanja različitih pro-inflamatornih populacija u WAT. Naši rezultati pokazuju kako tretman sa BT-11 značajno snižava nivoe sa F4/80+ CD11b+ pro-inflamatornih makrofaga (Slika 37, panel A), kao i broj pro-inflamatornih granulocita sa visokim nivoima Ly6c (GR1+Ly6chigh) (Slika 37, panel B).
BT-11 snižava nivoe glukoze u krvi u gladovanju u modelu T2D na db/db miševima. Da bi se ispitala terapeutska efikasnost tretmana sa BT-11 oralnim putem u dva modela dijabetesa na miševima, takođe smo koristili i db/db miševe, koji spontano razvijaju T2D zbog mutacije u receptoru leptina. Db/db miševima su davane dnevne doze BT-11 od 80 mg/kg putem oralnog gutanja. Odredili smo efekat BT-11 na homeostazu glukoze merenjem koncentracija glukoze u krvi u gladovanju. Tretman sa BT-11 značajno snižava nivoe glukoze u krvi u poređenju sa njihovim srodnicima iz legla koji su tretirani vehikulumom čak već u prvoj nedelji, naglašavajući razlike tokom vremena u 3. nedelji (Slika 38, panel A). Da bi se odredilo da li tretman sa BT-11 oralnim putem modulira način na koji životinja otpočinje homeostazu glukoze, eksperimentalnim životinjama smo dali glukozu intraperitonealno i ispitali kinetike glukoze u plazmi od 0. do 265. minuta nakon injektovanja glukoze. Uzorci krvi su sakupljeni pre injektovanja glukoze (vreme 0) (odgovara baznoj liniji FBG nivo nakon gladovanja od 12- h). Naši rezultati su pokazali kako oralni tretman sa BT-11 značajno snižava nivoe glukoze u krvi pre davanja glukoze IP (Vreme 0, Slika 38, panel B). Posle davanja glukoze u db/db modelu, naši rezultati su pokazali kako su nivoi glukoze kod miševa tretiranih sa našim vodećim jedinjenjem BT-11 pali prema normalnim nivoima daleko brže nego kod miševa tretiranih vehikulumom (Slika 38, panel B).
BT-11 snižava nivoe mRNA TNFa i MCP-1 i ushodno reguliše LANCL2. Za dalju potvrdu antiinflamatornih svojstava BT-11, ispitali smo ekspresiju gena u WAT, kako je indikovano u delu Postupci. Naši rezultati su pokazali kako, kada se porede sa netretiranim miševima, miševi tretirani sa BT-11 imaju veće nivoe ekspresije LANCL2 i značajno niže nivoe mRNA proinflamatornih faktora TNFa i MCP-1 (Slika 39).
Diskusija
Kako stopa gojaznosti i dijabetesa tip 2 (T2D) u Sjedinjenim Državama nastavlja da raste, raste i broj ljudi koji počinju da se oslanjaju na oralne anti-dijabetske lekove. Otprilike 28.3 miliona (8.3% populacije) Amerikanaca ima T2D i preko 40.1% sredovečnih ljudi ima predijabetes, stanje koje se odlikuje narušenom tolerancijom glukoze i insulinskom rezistencijom [40]. Ukupni direktni i indirektni troškovi koji se mogu pripisati T2D u Sjedinjenim Državama iznose preko 132 milijarde $ [40]. Uprkos ovom narastajućem problemu, farmaceutski proizvođači nisu u mogućnosti da razviju lekove koji su istovremeno i efikasni i bezbedni. Jedan od najpopularnijih i najefikasnijih oralnih anti-dijabetesnih lekova je tiazolidindionska (TZD) grupa insulinsenzitizirajućih lekova. Iako TZD lekovi povećavaju osetljivost na insulin, oni ispoljavaju značajne sporedne neželjene efekte koji im ograničavaju upotrebljivost, a koji obuhvataju dobijanje na telesnoj težini, kongestivnu srčanu slabost, kancer bešike, hepatotoksičnost i retenciju tečnosti [41, 42]. Recimo, otprilike 10-15% pacijenata koji koriste TZD lekove su prinuđeni da prekinu lečenje zbog edema, a povećanje ekstracelularne zapremine zbog zadržavanja viška tečnosti, isto tako, pravi veliki problem pojedincima koji već imaju kongestivnu srčanu slabost.2000. godine, 3 godine nakon što se pojavio troglitazon (REZULIN®) je uklonjen sa tržišta, zbog prijavljenih slučajeva ozbiljnih oštećenja jetre i smrtnih slučajeva [43]. Bezbednosni koraci, koji se odnose na druge TZD lekove, doveli su do prinudnog obeležavanja crnim kvadratom i posledičnim ograničenjima upotrebe.
LANCL2 je drugi član LanC-slične proteinske familije koji je identifikovan. Prvi član, LANCL1, izolovan je iz membrana humanih eritrocita [44]. Potom je identifikovan LANCL2 i ekspresuje se duž organizma [1, 18], uključujući imunske ćelije, pankreas, pluća i crevo [1, 44]. Lantionin sintetaznom C-sličan 2 (LANCL2) put se pojavio kao nova terapeutska meta za T2D [18]. Široka pre-klinička testiranja su obezbedila opširan dokaz terapeutskog potencijala za LANCL2 ligande, kao što je abscisinska kiselina (ABA) kod dijabetesa i hroničnih inflamatornih bolesti [2, 3, 22, 23, 45]. Jedinjenje 61610, bis(benzimidazoil)tereftalanilid (BTT) se vezuje za LANCL2 sa najvećim afinitetom u biblioteci nekoliko miliona hemikalija.
Zbog činjenice da sadašnji lekovi za T2D ne zadovoljavaju prvu potrebu pacijenata, koja je kontrola glikemije bez sporednih efekata, BT-11 predstavlja veoma privlačnu moguću zamenu. Naši rezultati pokazuju kako primenjivanje BT-11 u različitim modelima T2D na miševima značajno snižava nivoe glukoze u krvi posle perioda gladovanja (Slike 36 i 38). Osim toga, primenjivanje ovog jedinjenja takođe pomaže normalizaciji nivoa glukoze posle uzimanja glukoze (Slike 36 i 38). U našim rezultatima imunofenotipiziranja, takođe se reflektuju i anti-inflamatorna svojstva koja ima BT-11. Zaista, primenjivanje BT-11 dovodi do sniženja infiltracije proinflamatornih makrofaga i pro-inflamatornih granulocita u abdominalnom WAT (Slika 37). Ove rezultate podržavaju i podaci o genskoj ekspresiji dva veoma bitna pro-inflamatorna faktora, TNFa i MCP-1, koji su kod miševa tretiranih sa BT-11 značajno sniženi (Slika 39).
Primer 24: Korišćenje BT-11 u toku infekcije gripom
Uvod
Respiratorni patogeni, koji dovode do pneumonije, u industrijskim zemljama su vodeći uzrok smrti koje se povezuju sa infekcijama. Nepostojanje efikasnih vakcina i anti-virusnih lekova u sprezi sa rastućom brigom o izbijanju rezistencije na anti-virusne lekove, ističe potrebu razvijanja host-targetiranog imunoterapeutskog pristupa. Patogeneza u plućima i klinička bolest povezana sa respiratornom infekcijom često nastaju iz kombinacije citopatskih efekata virusa i imunog odgovora domaćina. U ovom smislu, za lečenje gripa se razmatraju terapije usmerene na moduliranje prirodnog imunog odgovora [46].
Širom sveta, influenca ostaje glavni javni zdravstveni problem. Sezonski grip se povezuje sa procesom u gornjem respiratornom traktu, koji često onesposobljava i zahteva dane ograničene aktivnosti. Procenjeno je da samo u Sjedinjenim Državama, godišnje epidemije gripa dovedu do pregleda 30 miliona pacijenata i 300,000 hospitalizacija. Deo populacije (npr., mala deca, stariji i ljudi sa predispozionim medicinskim stanjima) je u većem riziku od razvijanja virusne pneumonije. Stručnjaci su procenili da u Sjedinjenim Državama 25,000 do 35,000 ljudi godišnje
1
umre od sezonskog gripa, a da su globalni finansijski troškovi izračunati na stotine milijardi dolara [47]. Ciklusi pandemijskog gripa se javljaju svakih 30-50 godina uz dodatnu kompleksnost zahvaljujući njihovoj nepredvidivoj prezentaciji i manjku prethodno utvrđenog imuniteta i, povezuju se sa visokim stopama smrtnosti [48]. Influenca se povezuje sa značajnim morbiditetom i mortalitetom ali, nedostaju efikasni i bezbedni lekovi za tretman.
Podaci ukazuju na to da je protein 2 sličan komponenti C lantionin sintetaze (LANCL2) meta za vezivanje i signaliziranje ABA [15, 19, 24]. Tako, LANCL2 se pojavljuje kao obećavajući novi terapeutski target za imunološku modulaciju. Korišćenjem molekularnog modelovanja i površinske plazmon rezonance (SPR), BTI je identifikovao jedinjenje BT-11, bis(benzimidazoil)tereftalanilid (BTT), koji se za LANCL2 vezuje velikim afinitetom. Isto tako, BT-11 ispoljava snažne pro-rezolutivne efekte u plućima i smanjuje morbiditet i mortalitet u modelima gripa na miševima.
Postupci
Miševi. C57BL/6 miševi su nabavljeni od Jackson laboratorije i čuvani u specifičnim uslovima bez patogena, u ventiliranim stalcima. Svi eksperimentalni protokoli su odobreni od strane institucija koje se bave brigom o životinjama i imali su komisiju i ispunjavali ili premašivali Vodiče nacionalnih instituta zdravstvene službe za dobrobit laboratorijskih životinja i politiku Službe za javno zdravlje.
Intranazalna infekcija miševa sa virusom influence. Miševi su anestezirani sa 2-5%<izofluoranom primenom inhalatora i, 50>µL razblaženja virusa u količini 10<3>TCID50 se aplikujekroz nozdrve (25 µL kroz svaku). Miševi se zatim stavljaju u svoje kaveze i posmatra se njihov oporavak od anestezije.
Oralna primena BT-11 orogastričnom sondom. BT-11 je primenjen miševima orogastričnom sondom korišćenjem komercijalno dostupnih bezbednih čiodastih sondi (18-24 širine, zavisno od težine životinje). Ova procedura ne prouzrokuje bol ili stres. Miševi su tretirani sa BT-11 u dozi od 80 mg/kg svaka 24h tokom trajanja eksperimenta.
Praćenje miševa i aktivnosti bolesti i merenje težine. Miševi su praćeni jednom u toku dana posle infekcije (svakih 4 sata ukoliko su razvili teške kliničke znake bolesti što bi bio ekvivalent skoru bolesti 2) i, eutanazirani su pre planirane završne tačke ukoliko su razvili značajne znakove bolesti mereno kao gubitak težine (tj., 25% postepenog gubitka početne telesne težine), dehidracija, gubitak pokretljivosti, oprezni/brane bolnu površinu, nabrano krzno (piloerekcija). Miševima je težina merena jednom dnevno tokom trajanja eksperimenta.
Rezultati
2
Oralno primenjivanje BT-11 smanjuje kliničke skorove i morbiditet kod miševa sa virusom influence.
Da bi se ispitala terapeutska efikasnost BT-11, koristili smo mišiji model infekcije gripa kod miševa. Ukratko, miševi su intranazalnim putem inficirani posle anestezije sa 5% izofluorana. Miševi su dalje dnevno tretirani sa oralnom suspenzijom BT-11 od 80 ili 40 mg/kg. Miševi su mereni i rangirani po skorovima tokom trajanja eksperimenta (16 dana). Rezultati pokazuju kako primenjivanje BT-11 značajno snižava skor kliničke aktivnosti polazeći od 3. dana i dalje tokom eksperimenta (Slika 40, panel A). Dalje, klinički skor za fizički izgled značajno je snižen kod miševa koji su primali tretman i od 40 i od 80 mg/kg BT-11 (Slika 40, panel B).
U cilju ispitivanja efekta tretmana na morbiditet bolesti, izračunali smo procenat gubitka težine i dalje ispitali broj miševa koji su izgubili više od 15% unutar svake eksperimentalne grupe. Počevši od 6. dana posle infekcije, tretman sa 80 mg/g BT-11 je doveo do manjeg morbiditeta u poređenju sa grupom koja je primala vehikulum. Razlike su naglašene počevši od 10. dana i sve do 12. dana (Slika 40, panel C).
Diskusija
Tradicionalni pristupi za kontrolu širenja gripa i bolesti su centrirani na stranu virusa preko vakcinacije i antivirusnog lečenja. Vakcine se moraju formulisati na godišnjem nivou, na osnovu sojeva koji cirkulišu iz prethodne sezone. Međutim, otprilike 4 do 6 meseci traje proizvodnja, dobijanje dozvola i testiranje efikasnosti nove vakcine [49], nezavisno od toga da li je u pitanju ona za sezonski ili za pandemijski grip. Glavna mana antivirusnih terapeutika je veoma česta pojava i izbor rezistentnih sojeva. Pored lečenja koje je usmereno na virus, velika je verovatnoća za usvajanje terpija koje se razvijaju, a usmerene su na kontrolu egzacerbacije odgovora domaćina radi upotpunjivanja anti-mikrobnih i profilaktičkih strategija. Host-targetirajući terapeutici imaju prednost u tome što nude unakrsnu zaštitu među različitim reasortmentima i na taj način su efikasni iz sezone u sezonu, mogu da se proizvedu i lageruju i, mogu se koristiti za lečenje bolesti nakon izlaganja virusu [46, 50, 51].
Otkrivanje LANCL2 kao nove terapeutske mete za influencu otvara nov put hosttargetirajućim terapeuticima. Demonstrirali smo da aktivacija LANCL2 pomoću BT-11 poboljšava ne samo aktivnost i kliničke rezultate, već isto tako smanjuje morbiditet prouzrokovan virusom influnce i ubrzava oporavak od infekcije gripom (Slika 33). Ovi rezultati čvrsto podržavaju LANCL2 kao novu terapeutsku metu za influencu i BT-11 kao moćan novi host-targetirajući lek.
REFERENCE
1. Mayer, H., M. Pongratz, and R. Prohaska, Molecular cloning, characterization, and tissuespecific expression of human LANCL2, a novel member of the LanC-like protein family. DNA Seq, 2001.12(3): p.161-6.
2. Guri, A.J., et al., Dietary abscisic acid ameliorates glucose tolerance and obesity-related inflammation in db/db mice fed high-fat diets. Clin Nutr, 2007.26(1): p.107-16.
3. Guri, A.J., et al., Loss of PPAR gamma in immune cells impairs the ability of abscisic acid to improve insulin sensitivity by suppressing monocyte chemoattractant protein-1 expression and macrophage infiltration into white adipose tissue. J Nutr Biochem, 2008.19(4): p.216-28.
4. Bassaganya-Riera, J., et al., Mechanisms of action and medicinal applications of abscisic Acid. Curr Med Chem, 2010.17(5): p.467-78.
5. Guri, A.J., R. Hontecillas, and J. Bassaganya-Riera, Abscisic acid synergizes with rosiglitazone to improve glucose tolerance and down-modulate macrophage accumulation in adipose tissue: possible action of the cAMP/PKA/PPAR gamma axis. Clin Nutr, 2010.29(5): p. 646-53.
6. Guri, A.J., R. Hontecillas, and J. Bassaganya-Riera, Abscisic acid ameliorates experimental IBD by downregulating cellular adhesion molecule expression and suppressing immune cell infiltration. Clin Nutr, 2010.29(6): p.824-31.
7. Guri, A.J., et al., Abscisic acid ameliorates atherosclerosis by suppressing macrophage and CD4+ T cell recruit- ment into the aortic wall. J Nutr Biochem, 2010.21(12): p.1178-85.
8. Bassaganya-Riera, J., et al., Abscisic acid regulates inflammation via ligand-binding domainindependent acti- vation of peroxisome proliferator-activated receptor gamma. J Biol Chem, 2011.286(4): p.2504-16.
9. Guri, A.J., et al., T cell PPARgamma is required for the anti-inflammatory efficacy of abscisic acid against experimental IBD. J Nutr Biochem, 2011.22(9): p.812-9.
4
Lu, P., et al., Molecular modeling of lanthionine synthetase component C-like protein 2: a potential target for the discovery of novel type 2 diabetes prophylactics and therapeutics. J Mol Model, 2011.17(3): p.543-53.
Hontecillas, R., et al., Dietary abscisic acid ameliorates influenza-virus-associated disease and pulmonary im- munopathology through a PPARgamma-dependent mechanism. J Nutr Biochem, 2013.24(6): p.1019-27.
Lu, P., et al., Computational modeling-based discovery of novel classes of anti-inflammatory drugs that target lanthionine synthetase C-like protein 2. PLoS One, 2012.7(4): p. e34643.
Lu, P., et al., Lanthionine synthetase component C-like protein 2: a new drug target for inflammatory diseases and diabetes. Curr Drug Targets, 2014.15(6): p.565-72.
Trott, O. and A.J. Olson, AutoDock Vina: improving the speed and accuracy of docking with a new scoring function, efficient optimization, and multithreading. J Comput Chem, 2010.
31(2): p.455-61.
Lu, P., et al., Molecular modeling of lanthionine synthetase component C-like 2: a potential target for the discovery of novel type 2 diabetes prophylactics and therapeutics. Journal of Molecular Modeling, 2011.17(3): p.543-53.
Morris, G.M., et al., AutoDock4 and AutoDockTools4: Automated docking with selective receptor flexibility. J Comput Chem, 2009.30(16): p.2785-91.
Lichtenstein, G.R., M. Abreu, and D. Present, Recent advances in the treatment of Crohn’s colitis, 2003, The center for health care education, LLC.
Lu, P., et al., Lanthionine Synthetase Component C-like Protein 2: A New Drug Target for Inflammatory Diseases and Diabetes. Curr Drug Targets, 2014.
Sturla, L., et al., LANCL2 is necessary for abscisic acid binding and signaling in human granulocytes and in rat insulinoma cells. J Biol Chem, 2009.284(41): p.28045-57.
Hanauer, S.B. and D.H. Present, The state of the art in the management of inflammatory bowel disease. Rev Gastroenterol Disord, 2003.3(2): p.81-92.
Lindsay, J.O. and H.J. Hodgson, Review article: the immunoregulatory cytokine interleukin-10--a therapy for Crohn’s disease? Aliment Pharmacol Ther, 2001.15(11): p.1709-16.
Guri, A.J., R. Hontecillas, and J. Bassaganya-Riera, Abscisic acid ameliorates experimental IBD by downregu- lating cellular adhesion molecule expression and suppressing immune cell infiltration. Clinical Nutrition, 2010.29(6):p.824-31.
Guri, A.J., et al., T cell PPAR gamma is required for the anti-inflammatory efficacy of abscisic acid against experimental inflammatory bowel disease. Journal of Nutritional Biochemistry, 2011.22(9): p.812-9.
Bassaganya-Riera, J., et al., Abscisic acid regulates inflammation via ligand-binding domainindependent acti- vation of PPAR gamma. Journal of Biological Chemistry, 2011. 286(4): p.
2504-16.
Lu, P., et al., Computational modeling-based discovery of novel classes of anti-inflammatory drugs that target LANCL2. PLoS One, 2012. In Press.
Stenson, W.F., Interleukin-4 hyporesponsiveness in inflammatory bowel disease: immune defect or physiological response? Gastroenterology, 1995.108(1): p.284-6.
Cohen, R.D., et al., The cost of hospitalization in Crohn’s disease. Am J Gastroenterol, 2000.
95(2): p.524-30.
Barba, G., et al., Recurrent pancreatitis revealing Crohn’s disease. Arch Pediatr, 2002.9(10): p. 1053-5.
Braverman, I.M., Skin signs of gastrointestinal disease. Gastroenterology, 2003. 124(6): p.
1595-614.
Marri, S.R. and A.L. Buchman, The education and employment status of patients with inflammatory bowel diseases. Inflamm Bowel Dis, 2005.11(2): p.171-7.
Spunt, S., et al., Cancer Epidemiology in Older Adolescents and Young Adults 15 to 29 Years of Age, in SEERAYA Monograph.2008, National Cancer Institute: Bethesda, MD. p.123-133.
Camilleri, M., GI clinical research 2002-2003: The year in review. Clinical Gastroenterology and Hepatology, 2003.1: p.415-420.
Guri, A.J., R. Hontecillas, and J. Bassaganya-Riera, Abscisic acid synergizes with rosiglitazone to improve glucose tolerance and down-modulate macrophage accumulation in adipose tissue: possible action of the cAMP/PKA/PPAR gamma axis. Clinical Nutrition, 2010.
29(5): p.646-653.
Bruzzone, S., et al., Abscisic Acid Is an Endogenous Stimulator of Insulin Release from Human Pancreatic Islets with Cyclic ADP Ribose as Second Messenger. J Biol Chem, 2008.283(47): p. 32188-32197.
Sturla, L., et al., Binding of abscisic acid to human LANCL2. Biochem Biophys Res Commun, 2011.415(2): p.390-5.
Sparre, T., et al., Unraveling the pathogenesis of type 1 diabetes with proteomics: present and future directions. Mol Cell Proteomics, 2005.4(4): p.441-57.
Vehik, K., et al., Increasing incidence of type 1 diabetes in 0- to 17-year-old Colorado youth. Diabetes Care, 2007.30(3): p.503-9.
Ma, R.C. and J.C. Chan, Diabetes: incidence of childhood type 1 diabetes: a worrying trend. Nat Rev Endocrinol, 2009.5(10): p.529-30.
Suarez-Pinzon, W.L., J.R. Lakey, and A. Rabinovitch, Combination therapy with glucagon-like peptide-1 and gastrin induces beta-cell neogenesis from pancreatic duct cells in human islets transplanted in immunodeficient diabetic mice. Cell Transplant, 2008.17(6): p.631-40.
CDC. National Diabetes Fact Sheet: general information and national estimates on diabetes in the United States, 2005. in U. S. Department of Health and Human Services, Center for Disease Control and Prevention, 2005.2005. Atlanta, Georgia.
Bassaganya-Riera, J., A. Guri, J. King, and R. Hontecillas, Peroxisome Proliferator-Activated Receptors: the Nutritionally Controlled Molecular Networks that Integrate Inflammation, Immunity and Metabolism. Current Nutrition & Food Science., 2005.1: p.179-187.
Nesto, R.W., et al., Thiazolidinedione use, fluid retention, and congestive heart failure: a consensus statement from the American Heart Association and American Diabetes Association. October 7, 2003. Circulation, 2003.108(23): p.2941-8.
ysowski, D.K., G. Armstrong, and L. Governale, Rapid increase in the use of oral antidiabetic drugs in the United States, 1990-2001. Diabetes Care, 2003.26(6): p.1852-5.
Mayer, H., et al., Isolation, molecular characterization, and tissue-specific expression of a novel putative G protein-coupled receptor. Biochim Biophys Acta, 1998.1395(3): p.301-8.
Hontecillas, R., et al., Dietary abscisic acid ameliorates influenza virus-associated disease and pulmonary immunopathology through a PPAR g-dependent mechanism. Journal of Nutritional Biochemistry, 2012.24(6): p.1019-27.
Enserink M. Infectious disease. Old drugs losing effectiveness against flu; could statins fill gap? Science.2005 Sep 23;309(5743):1976-7.
Rothberg, M.B., S.D. Haessler, and R.B. Brown, Complications of viral influenza. Am J Med.
2008.121(4): p.258-64.
Dawood FS, et al. Estimated global mortality associated with the first 12 months of 2009 pandemic influenza A H1N1 virus circulation: a modelling study. Lancet Infect Dis. 2012 Sep;12(9):687-95.
Quigley, E., Influenza therapies: vaccines and antiviral drugs. Drug Discov Today, 2006.11(11-12): p.478-80.
Butler D. Cheaper approaches to flu divide researchers. Nature.2007 Aug 30;448(7157):976-7.
Fedson DS. Confronting an influenza pandemic with inexpensive generic agents: can it be done? Lancet Infect Dis.2008 Sep;8(9):571-6.
Melo F, Feytmans E. Assessing protein structures with a non-local atomic interaction energy. J Mol Biol.1998 Apr 17;277(5):1141-52.
53. SMILES Translator and Converter. http://cactus.nci.nih.gov/translate/.

Claims (1)

  1. Patentni zahtevi 1. Jedinjenje formule:
    ili njegova farmaceutski prihvatljiva so ili estar, pri čemu: Q je: p peraz n-1,4-d ; 2,5-d azab c k o[2.2.1]heptan-2,5-d ; 2,5-d azab c k o[2.2.2]oktan-2,5-d ; 1,4-d -azepan-1,4-d ; benzen-1,4-d am n-N<1>,N<4>-d ; etan-1,2-d am n-N<1>,N<2>-d ; N<1>,N<2>-d a k etan-1,2-d am n-N<1>,N<2>-diil; propan-1,3-diamin-N<1>,N<3>-diil; N<1>,N<3>-dialkilpropan-1,3-diamin-N<1>,N<3>-diil; 1,4-diaminoantracen-9,10-dion-1,4-diil; C6aren-1,4-diamin-N<1>,N<4>-diil, pri čemu je aren supstituisan sa jednim do četiri supstituenta na pozicijama 2, 3, 5 ili 6, i pri čemu su supstituenti nezavisno odabrani iz grupe, koju sačinjavaju: -C(O)O(C1do C6)alkil, OH, O(C1do C6)alkil, (C1do C6)alkil, CF3, F, Cl i Br; ili supstituisani piperazin-1,4-diil, pri čemu je piperazin supstituisan sa jednim do osam supstituenata na pozicijama 2, 3, 5 ili 6, i pri čemu su supstituenti nezavisno odabrani iz grupe, koju sačinjavaju: (C1do C6)alkil, aril, aril(C1do C6)alkil, C(O)OH i C(O)O(C1do C6)alkil; A1i A1’ su, svaki nezavisno N ili CR<6>; A2i A2’ su, svaki nezavisno N ili CR<7>; A3je NR<8>; A3’ je NR<8>, O ili S; A4i A4’ su, svaki nezavisno N ili CR<9>; A5i A5’ su, svaki nezavisno N ili CR<0>; A6i A6’ su, svaki nezavisno N ili CR ; i R , R1’, R<2>, R<2’>, R<3>, R<3’>, R<4>, R<4’>, R<6>, R<7>, R<8>, R<9>, R<0>i R , su, ukoliko su prisutni, u svakom slučaju, nezavisno odabrani iz grupe, koju sačinjavaju: vodonik, alkil, halo, trifluorometil, dialkilamino, pri čemu je svaki alkil isti illi različit, -NH2, alkilamino i arilalkil. <2. Jedinjenje iz zahteva 1, pri čemu jedan ili oba od A>1<i A>1<’ su N.> <3. Jedinjenje iz zahteva 2, pri čemu jedan ili oba od A>2<i A>2<’ su CH, A>3<je NH, A>4<je N, A>5<je>CH, i A6je CH. <4. Jedinjenje iz zahteva 2, pri čemu jedan ili oba od A>2<i A>2<’ su CH, jedan ili oba od A>3<i A>3<’ su NH, jedan ili oba od A>4<i A>4<’ su N, jedan ili oba od A>5<i A>5<’ su CH, a jedan ili oba od A>6<i A>6<’ su CH.> 5. Jedinjenje iz bilo kog od zahteva 1-4, pri čemu Q je piperazin-1,4-diil; 2,5-diazabiciklo[2.2.1]heptan-2,5-diil; 2,5-diazabiciklo[2.2.2]oktan-2,5-diil; 1,4-diazepan-1,4-diil; N ,N<2>-dialkiletan-1,2-diamin-N ,N<2>-diil; N ,N<3>-dialkilpropan-1,3-diamin-N ,N<3>-diil; 1,4-diaminoantracen-9,10-dion-1,4-diil; C6aren-1,4-diamin-N ,N<4>-diil, pri čemu je aren supstituisan sa jednim do četiri supstituenta na pozicijama 2, 3, 5 ili 6, a svaki supstituent je nezavisno odabran iz grupe koju sačinjavaju: -<C(O)O(C>1<do C>6<)alkil, OH, O(C>1<do C>6<)alkil, (C>1<do C>6<)alkil, CF>3<, F, Cl i Br; ili supstituisani>piperazin-1,4-diil, pri čemu je piperazin supstituisan sa jednim do osam supstituenata na pozicijama 2, 3, 5 ili 6, a svaki od supstituenata je nezavisno odabran iz grupe, koju sačinjavaju: (C1do C6)alkil, aril, aril(C1do C6)alkil, C(O)OH i C(O)O(C1do C6)alkil. 6. Jedinjenje iz zahteva 1, pri čemu su, R , R1’, R<2>, R<2’>, R<3>, R<3’>, R<4>, R<4’>, R<6>, R<7>, R<8>, R<9>, R<0>i R , ukoliko su prisutni, u svakom slučaju, nezavisno odabrani iz grupe, koju sačinjavaju: vodonik, alkil, halo i trifluorometil. 7. Jedinjenje iz zahteva 1, pri čemu jedinjenje ima strukturu:
    1
    ili njihove soli. 8. Jedinjenje iz zahteva 1, pri čemu jedinjenje ima strukturu:
    ili njihove soli. 9. Jedinjenje kao što je zahtevano u bilo kom od prethodnih zahteva, za upotrebu u postupku lečenja infektivne bolesti, autoimune bolesti, dijabetesa ili hronične inflamatorne bolesti. 10. Jedinjenje za upotrebu iz zahteva 9, za upotrebu u postupku lečenja infektivne bolesti, pri čemu infektivna bolest obuhvata virusnu bolest, pri čemu, opciono, virusna bolest uključuje infekciju gripa. 11. Jedinjenje za upotrebu iz zahteva 9, za upotrebu u postupku lečenja autoimune bolesti, pri čemu autoimuna bolest obuhvata autoimunu inflamatornu bolest, i pri čemu autoimuna inflamatorna bolest uključuje inflamatornu bolest creva. 12. Jedinjenje za upotrebu iz zahteva 11, pri čemu je autoimuna inflamatorna bolest ulcerozni kolitis. 13. Jedinjenje za upotrebu iz zahteva 11, pri čemu je autoimuna inflamatorna bolest Crohnova bolest. 2 14. Jedinjenje za upotrebu iz zahteva 9, za upotrebu u postupku lečenja dijabetesa, pri čemu je dijabetes dijabetes tipa 1 ili dijabetes tipa 2. 15. Jedinjenje za upotrebu iz zahteva 9, za upotrebu u postupku lečenja hronične inflamatorne bolesti, pri čemu hronična inflamatorna bolest uključuje metabolički sindrom.
RS20201226A 2014-10-24 2015-03-19 Terapeutski preparati zasnovani na lantionin sintetazi c- sličnom proteinu-2 RS61013B1 (sr)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201462068322P 2014-10-24 2014-10-24
US201562101164P 2015-01-08 2015-01-08
PCT/US2015/021417 WO2016064445A1 (en) 2014-10-24 2015-03-19 Lanthionine synthetase c-like 2-based therapeutics
EP15714352.0A EP3209655B1 (en) 2014-10-24 2015-03-19 Lanthionine synthetase c-like 2-based therapeutics

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS61013B1 true RS61013B1 (sr) 2020-11-30

Family

ID=52811239

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20201226A RS61013B1 (sr) 2014-10-24 2015-03-19 Terapeutski preparati zasnovani na lantionin sintetazi c- sličnom proteinu-2

Country Status (21)

Country Link
US (10) US9556146B2 (sr)
EP (2) EP3757099B1 (sr)
JP (3) JP6499306B2 (sr)
KR (3) KR20200087273A (sr)
CN (2) CN111592508A (sr)
AU (3) AU2015337091B2 (sr)
BR (1) BR112017008416B1 (sr)
CA (1) CA2965472C (sr)
DK (1) DK3209655T3 (sr)
ES (1) ES2822987T3 (sr)
HR (1) HRP20201416T1 (sr)
HU (1) HUE051299T2 (sr)
IL (2) IL252630B (sr)
LT (1) LT3209655T (sr)
NZ (1) NZ732213A (sr)
PL (1) PL3209655T3 (sr)
PT (1) PT3209655T (sr)
RS (1) RS61013B1 (sr)
RU (3) RU2688677C2 (sr)
SI (1) SI3209655T1 (sr)
WO (1) WO2016064445A1 (sr)

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20200087273A (ko) * 2014-10-24 2020-07-20 란도스 바이오파마, 인크. 란티오닌 합성효소 c-유사 2-계 치료제
WO2019050890A1 (en) 2017-09-05 2019-03-14 President And Fellows Of Harvard College METHODS AND COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT OF TUBERCULOSIS
WO2019099426A1 (en) * 2017-11-17 2019-05-23 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Influenza virus inhibitor targeting nucleoprotein
BR112020010983A2 (pt) 2017-11-30 2020-11-17 Landos Biopharma, Inc método in vitro para gerar células preparadas a partir de células precursoras, células isoladas e método para tratar uma afecção em um animal com as células isoladas
ES2974634T3 (es) 2018-12-21 2024-06-28 Celgene Corp Inhibidores de tienopiridinas de RIPK2
BR112022002387A2 (pt) 2019-12-20 2022-09-06 Landos Biopharma Inc Composto da fórmula z-y-q-y' ou um sal ou éster farmaceuticamente aceitável do mesmo
US12234578B2 (en) 2020-01-29 2025-02-25 Wisconsin Alumni Research Foundation Tannin composite fibers
US20230107927A1 (en) 2020-02-28 2023-04-06 First Wave Bio, Inc. Methods of treating iatrogenic autoimmune colitis
EP4215526A4 (en) * 2020-09-18 2024-10-16 Shanghai Pharmaceuticals Holding Co., Ltd. HETEROCYCLIC CARBONYL COMPOUND AND ITS USE
WO2022057932A1 (zh) * 2020-09-18 2022-03-24 上海医药集团股份有限公司 一种羰基杂环类化合物及其应用
EP4214200A1 (en) 2020-10-22 2023-07-26 Nimmune Biopharma, Inc. Lancl ligands
EP4240735A1 (en) 2020-11-03 2023-09-13 Nimmune Biopharma, Inc. Crystalline forms of piperazine-1,4-diylbis((6-(1h-benzoi[d]imidazo-2-yl)pyridin-2yl)methanone) as lancl2 modulators
AU2021381325A1 (en) * 2020-11-19 2023-06-01 Nimmune Biopharma, Inc. Compounds, compositions, and methods for treating inflammatory or immune-mediated conditions of surface tissues
CN116670137B (zh) * 2020-12-15 2025-06-06 康百达（四川）生物医药科技有限公司 吡啶衍生物及其在医药上的应用
CN113908256B (zh) * 2021-11-26 2023-05-26 中国农业科学院兰州兽医研究所 Lancl1蛋白在制备抗病毒药物中的应用
WO2024155555A1 (en) * 2023-01-16 2024-07-25 Nimml Institute Neuroprotective compounds for therapeutic use

Family Cites Families (63)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0282643A3 (en) 1986-11-22 1990-08-22 The Green Cross Corporation Use of pharmaceutical compositions comprising cyclohexane derivatives in the treatment or prevention of peptic ulcers
AU708349B2 (en) * 1994-12-23 1999-08-05 Smithkline Beecham Corporation 4,4-(disubstituted)cyclohexan-1-one monomers and related compounds
US5856326A (en) 1995-03-29 1999-01-05 Merck & Co., Inc. Inhibitors of farnesyl-protein transferase
IL117580A0 (en) 1995-03-29 1996-07-23 Merck & Co Inc Inhibitors of farnesyl-protein transferase and pharmaceutical compositions containing them
US5633388A (en) 1996-03-29 1997-05-27 Viropharma Incorporated Compounds, compositions and methods for treatment of hepatitis C
ATE404527T1 (de) * 1996-10-11 2008-08-15 Kowa Co Neue diamidverbindungen und medikamente die diese enthalten
WO1999033822A1 (en) * 1997-12-24 1999-07-08 Smithkline Beecham Laboratoires Pharmaceutiques Indole derivatives useful a.o. for the treatment of osteoporosis
WO1999038514A1 (en) 1998-02-02 1999-08-05 Merck & Co., Inc. Cyclic amine modulators of chemokine receptor activity
GB9914825D0 (en) * 1999-06-24 1999-08-25 Smithkline Beecham Spa Novel compounds
JP2001247550A (ja) * 1999-12-27 2001-09-11 Japan Tobacco Inc 縮合環化合物及びその医薬用途
AU2001236048A1 (en) * 2000-03-02 2001-09-12 Kyowa Hakko Kogyo Co. Ltd. Oxygen-containing heterocyclic compounds
US20090124690A1 (en) 2000-04-03 2009-05-14 Alberte Randall S Generation of Combinatorial Synthetic Libraries and Screening for Novel Proadhesins and Nonadhesins
RU2297413C2 (ru) 2000-09-15 2007-04-20 Анормед, Инк. Гетероциклические соединения, моделирующие активность хемокинового рецептора, их применение и содержащая их фармацевтическая композиция
PT1317451E (pt) 2000-09-15 2006-12-29 Anormed Inc Compostos heterocíclicos que se ligam a receptores de quimioquinas
SE0100902D0 (sv) 2001-03-15 2001-03-15 Astrazeneca Ab Compounds
GB0112834D0 (en) 2001-05-25 2001-07-18 Smithkline Beecham Plc Medicaments
TW200406413A (en) 2002-06-26 2004-05-01 Glaxo Group Ltd Compounds
EP1679069A4 (en) 2003-10-21 2009-05-13 Dainippon Sumitomo Pharma Co NEW PIPERIDINE DERIVATIVE
JPWO2005082905A1 (ja) * 2004-02-26 2007-08-02 協和醗酵工業株式会社 二環性複素環化合物
US7674907B2 (en) 2004-07-23 2010-03-09 Amgen Inc. Furanopyridine derivatives and methods of use
WO2006052844A2 (en) 2004-11-04 2006-05-18 Medical College Of Georgia Research Institute Tolerogenic vaccine and method
WO2006053109A1 (en) 2004-11-10 2006-05-18 Synta Pharmaceuticals Corp. Heteroaryl compounds
PL1861387T3 (pl) 2005-01-28 2014-08-29 Dae Woong Pharma Pochodne benzoimidazolu i ich kompozycje farmaceutyczne
GB0508314D0 (en) * 2005-04-25 2005-06-01 Novartis Ag Organic compounds
CN100434419C (zh) 2005-06-03 2008-11-19 中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所 单环多取代饱和环已酮类化合物及其制备方法和用途
US7754724B2 (en) 2005-06-30 2010-07-13 Dow Agrosciences Llc N-substituted piperazines
JP5064219B2 (ja) 2005-07-22 2012-10-31 塩野義製薬株式会社 Ｐｇｄ２受容体アンタゴニスト活性を有するアザインドール酸誘導体
EP2397476A3 (en) 2005-07-22 2011-12-28 Shionogi & Co., Ltd. Indole derivative having PGD2 receptor antagonist activity
EP1910385B1 (en) 2005-08-04 2013-07-24 Sirtris Pharmaceuticals, Inc. Benzothiazoles and thiazolopyridines as sirtuin modulators
US8143285B2 (en) 2005-09-06 2012-03-27 Shionogi & Co., Ltd. Indolecarboxylic acid derivative having PGD2 receptor antagonistic activity
AU2006296004B2 (en) 2005-09-27 2011-11-17 Shionogi & Co., Ltd. Sulfonamide derivative having PGD2 receptor antagonistic activity
AR055669A1 (es) 2005-10-03 2007-08-29 Astrazeneca Ab Derivados de 3h - imidazo[4, 5 -b]piridina como inhibidores selectivos de gsk3, metodos e internediarios para su preparacion, composiciones farmaceuticas que los contienen y su uso para la elaboracion de un medicamento para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas y mentales.
US20070203236A1 (en) 2006-01-11 2007-08-30 Smith Jeffrey W Novel antagonists of the human fatty acid synthase thioesterase
US7741367B2 (en) 2006-02-08 2010-06-22 Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. Method of using abscisic acid to treat diseases and disorders
US8367727B2 (en) 2006-02-08 2013-02-05 Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. Method of using abscisic acid to treat diseases and disorders
JP2008056615A (ja) 2006-08-31 2008-03-13 Fujifilm Corp ビニルエチニルアリールカルボン酸類、その製造方法及びそれを用いた熱架橋性化合物の製造方法
US20100292157A1 (en) 2006-11-24 2010-11-18 Antonio Cruz Combination Treatments for Alzheimer's Disease and Similar Diseases
US7795249B2 (en) 2006-12-22 2010-09-14 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Certain pyrazoline derivatives with kinase inhibitory activity
US20090016990A1 (en) 2007-01-24 2009-01-15 Alberte Randall S Antimicrobial Compositions
MY146643A (en) 2007-07-30 2012-09-14 Dae Woong Pharma Novel benzoimidazole derivatives and pharmaceutical composition comprising the same
KR20100098653A (ko) 2007-11-21 2010-09-08 디코드 제네틱스 이에이치에프 염증의 치료를 위한 바이아릴 ｐｄｅ４ 억제제
CA2722582A1 (en) 2007-11-21 2009-05-28 Decode Genetics Ehf. Biaryl pde4 inhibitors for treating inflammation
RU2487124C2 (ru) 2008-10-27 2013-07-10 Мицубиси Танабе Фарма Корпорейшн Новое амидное производное и его использование в качестве лекарственного средства
CA2647900C (en) 2008-12-23 2017-05-16 National Research Council Of Canada Inhibitors of a 9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase
CA2740193A1 (en) 2008-12-23 2010-07-01 Abbott Laboratories Anti-viral compounds
EP2367823A1 (en) 2008-12-23 2011-09-28 Abbott Laboratories Anti-viral compounds
CN102459227B (zh) 2009-04-17 2014-08-20 詹森药业有限公司 Ccr2的4-氮杂环丁烷基-1-苯基-环己烷拮抗剂
US9062564B2 (en) * 2009-07-31 2015-06-23 General Electric Company Solvent based slurry compositions for making environmental barrier coatings and environmental barrier coatings comprising the same
JP5819305B2 (ja) * 2009-10-13 2015-11-24 リガンド・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 造血成長因子模倣小分子化合物およびそれらの使用
DE102009057167A1 (de) 2009-12-05 2011-06-09 Merck Patent Gmbh Elektronische Vorrichtung enthaltend Metallkomplexe
JP2011246461A (ja) 2010-04-27 2011-12-08 Mitsubishi Tanabe Pharma Corp 新規アミド誘導体を含有する医薬組成物
US9101573B2 (en) * 2010-05-04 2015-08-11 Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. Lanthionine synthetase component C-like proteins as molecular targets for preventing and treating diseases and disorders
US8993624B2 (en) 2010-05-26 2015-03-31 Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. Method of preventing and treating inflammatory diseases and disorders with abscisic acid
TW201211027A (en) 2010-06-09 2012-03-16 Janssen Pharmaceutica Nv Cyclohexyl-azetidinyl antagonists of CCR2
TW201204717A (en) 2010-06-17 2012-02-01 Janssen Pharmaceutica Nv Cyclohexyl-azetidinyl antagonists of CCR2
BR112013002112B1 (pt) 2010-07-29 2021-04-06 Rigel Pharmaceuticals, Inc. Composto, composição farmacêutica, e, uso de um composto, ou de um respectivo sal farmaceuticamente aceitável, ou de uma composição
KR20120035285A (ko) 2010-10-05 2012-04-16 에스케이이노베이션 주식회사 셀룰로오스아세테이트 필름
CN105658628A (zh) 2011-12-30 2016-06-08 北京赛林泰医药技术有限公司 新型芳基乙烯衍生物及其在选择性雌激素受体调节剂中的应用
CN103709115A (zh) 2012-10-09 2014-04-09 山东亨利医药科技有限责任公司 截短侧耳素类抗生素衍生物
RU2015134423A (ru) 2013-03-13 2017-04-26 Инфламматори Респонс Ресёрч, Инк. Применение левоцитиризина и монтелукаста при лечении аутоиммуных расстройств
WO2015048547A2 (en) 2013-09-26 2015-04-02 Rigel Pharmaceuticals, Inc. Methods for using and biomarkers for ampk-activating compounds
JP6150701B2 (ja) 2013-09-30 2017-06-21 キヤノン株式会社 電子写真感光体、プロセスカートリッジおよび電子写真装置
KR20200087273A (ko) * 2014-10-24 2020-07-20 란도스 바이오파마, 인크. 란티오닌 합성효소 c-유사 2-계 치료제

Also Published As

Publication number Publication date
JP6499306B2 (ja) 2019-04-10
AU2015337091B2 (en) 2018-11-22
RU2741576C2 (ru) 2021-01-27
KR20190112181A (ko) 2019-10-02
IL275155A (en) 2020-07-30
NZ746737A (en) 2021-06-25
HRP20201416T1 (hr) 2020-12-11
CN107108573A (zh) 2017-08-29
JP6806829B2 (ja) 2021-01-06
IL275155B (en) 2021-04-29
US20160115153A1 (en) 2016-04-28
ES2822987T3 (es) 2021-05-05
JP2017533263A (ja) 2017-11-09
PT3209655T (pt) 2020-11-13
BR112017008416B1 (pt) 2023-05-09
US9839635B2 (en) 2017-12-12
US10028950B2 (en) 2018-07-24
EP3209655A1 (en) 2017-08-30
RU2019110152A3 (sr) 2019-09-26
US10201538B2 (en) 2019-02-12
AU2021201405B2 (en) 2023-09-14
US11571419B2 (en) 2023-02-07
JP2021073170A (ja) 2021-05-13
WO2016064445A1 (en) 2016-04-28
JP2019142873A (ja) 2019-08-29
DK3209655T3 (da) 2020-09-28
CN107108573B (zh) 2020-06-16
RU2688677C2 (ru) 2019-05-22
US20170119762A1 (en) 2017-05-04
IL252630B (en) 2020-06-30
AU2021201405A1 (en) 2021-03-25
HUE051299T2 (hu) 2021-03-01
US20210046070A1 (en) 2021-02-18
US10493072B2 (en) 2019-12-03
KR20200087273A (ko) 2020-07-20
US20200261447A1 (en) 2020-08-20
KR102026342B1 (ko) 2019-09-27
US20180055841A1 (en) 2018-03-01
RU2019110152A (ru) 2019-05-21
LT3209655T (lt) 2021-01-11
US20230142910A1 (en) 2023-05-11
RU2017117562A (ru) 2018-11-26
RU2768888C1 (ru) 2022-03-25
EP3209655B1 (en) 2020-07-15
KR102134171B1 (ko) 2020-07-15
CA2965472A1 (en) 2016-04-28
NZ732213A (en) 2019-02-22
BR112017008416A2 (pt) 2018-01-23
US20260076962A1 (en) 2026-03-19
AU2015337091A1 (en) 2017-06-15
CN111592508A (zh) 2020-08-28
US20180289703A1 (en) 2018-10-11
US20190125744A1 (en) 2019-05-02
EP3757099B1 (en) 2022-06-01
US9556146B2 (en) 2017-01-31
IL252630A0 (en) 2017-07-31
KR20170084115A (ko) 2017-07-19
US10682349B2 (en) 2020-06-16
AU2019201231A1 (en) 2019-03-21
SI3209655T1 (sl) 2020-11-30
US20200046694A1 (en) 2020-02-13
PL3209655T3 (pl) 2020-12-28
RU2017117562A3 (sr) 2018-11-26
US12502388B2 (en) 2025-12-23
US10849895B2 (en) 2020-12-01
CA2965472C (en) 2021-08-24
EP3757099A1 (en) 2020-12-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2768888C1 (ru) Лекарственные средства на основе лантионинсинтетаза c-подобного белка 2
NZ746737B2 (en) Lanthionine synthetase c-like 2-based therapeutics
HK1240921A1 (en) Lanthionine synthetase c-like 2-based therapeutics