RS61095B1 - Prečišćavanje proteina - Google Patents

Description

Opis

OBLAST PRONALASKA

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na prečišć avanje proteina. Tačnije, odnosi se na postupak za prečiš ć avanje fragmenata antitela Z kako je definisano u zahtevima. Bilo koja stvar koja spada van obima zahteva je informativnog karaktera.

POZADINA PRONALASKA

[0002] Ekonomsko prečišć avanje proteina velikih razmera postaje sve važniji problem za biotehnološku industriju. Generalno, proteini se proizvode ć elijskom kulturom, koriste ć i ć elijske linije sisara ili bakterija stvorene da proizvedu protein od interesa umetanjem rekombinantnog plazmida koji sadrži gen za taj protein. S obzirom da su korišć ene ć elijske linije živi organizmi, moraju da se hrane složenim medijumom za rast, koji sadrži šeć ere, aminokiseline i faktore rasta. Protein od interesa mora biti izolovan iz smeše jedinjenja kojima se hrane ć elije i od nusproizvoda samih ć elija (tok ishrane) do čisto ć e dovoljne za upotrebu kao ljudski lek. Standardi koje su utvrdile zdravstvene vlasti za proteine namenjene za ljudsku primenu u pogledu nečistoć a iz toka ishrane su veoma visoki. Mnoge metode prečišć avanja proteina poznate u struci sadrže korake koji zahtevaju primenu, npr. niskog ili visokog pH, visoke koncentracije soli ili drugih ekstremnih uslova koji mogu nepovratno ugroziti biološku aktivnost proteina koji se prečišć ava i zbog toga nisu pogodni. Prema tome, odvajanje željenog proteina do dovoljne čisto ć e predstavlja veliki izazov. Istorijski gledano, šeme prečišć avanja proteina su zasnovane na razlikama u molekularnim svojstvima veličine, naelektrisanja i rastvorljivosti između proteina koji se prečišć ava i neželjenih zagađivača proteina. Protokoli zasnovani na ovim parametrima uključuju hromatografiju za isključivanje veličine, hromatografiju sa jonskom razmenom, diferencijalno taloženje i slično.

[0003] Antitela i fragmenti antitela imaju sve već i značaj u nizu terapijskih oblasti. Jedna od najvažnijih metoda za dobijanje fragmenata antitela je rekombinantna tehnologija. Takve tehnike koriste ć eliju doma ć ina za ekspresiju željenog antitela ili fragmenta antitela, koji se zatim odvaja od medijuma za proizvodnju i prečišć ava.

[0004] Antitela zahtevaju glikozilaciju i stoga se generalno eksprimiraju u eukariotskim sistemima ekspresije koji koriste eukariotske ć elije, posebno ć elije sisara kao što su CHO, PER.C6, NS0, BHK ili Sp2/0 ć elije. U eukariotskim sistemima ekspresije protein od interesa koji se izražava, poput antitela, se generalno izlučuje u medijum ć elijske kulture. Medijum se naknadno može lako odvojiti odć elija koje luče protein, npr. centrifugiranjem ili filtriranjem.

[0005] Skoro sve sadašnje platforme za prečišć avanje industrijskih antitela koriste protein A (opisan npr. U WO 98/23645). Protein A je protein na površini ć elije koji se nalazi u ć elijskom zidu bakterije staphilococcus aureus i koji se vezuje za Fc deo imunoglobulina sisara. Protein A ima visok afinitet prema ljudskim IgG1 i IgG2 i umereni afinitet prema ljudskim IgM, IgA i IgE antitelima. Shodno tome, prečišć avanje proteina A nije dobro pogodno za fragmente antitela kojima nedostaje Fc deo.

[0006] Protein koji ne zahteva glikozilaciju poželjno se eksprimira u prokariotskim sistemima ekspresije koji koriste prokariotske ć elije kao što su gram negativne bakterije. Naročito, antitelo koje ne zahteva glikozilaciju, na primer fragment antitela kao što je Fab, Fab ’ili scFv, poželjno je eksprimirano u takvim sistemima. Prokariotski sistemi ekspresije, a naročito sistemi Escherichia coli (E.coli) ili druge gram negativne bakterije omoguć avaju proizvodnju proteina kojima nije potrebna glikozilacija, kao što su na primer fragmenti antitela, na ekonomski atraktivan način. Proizvodnja proteina u E coli je korisna naročito zbog nižih troškova robe i bržih procesa razvoja lekova (Humphreys, 2003; Humphreys, 2003). Prokariotski i posebno sistemi ekspresije proteina E coli su dobro poznati u struci (Swartz, 2001; Jana i Deb, 2005; Terpe, 2006). Prokariotskeć elije ne luče aktivno heterologni protein od interesa izražen u ć eliji. Gram negativne prokariontske ć elije kao što je E. coli, međutim, se mogu konstruisati tako da se heterologni proteini ekspresovani u ć eliji, poput fragmenata antitela, izvoze u periplazmatski prostor gde mogu da formiraju disulfidne veze. Izolacija ovih heterolognih proteina iz periplazmatskog prostora zahteva narušavanje spoljne membrane prokariontskih ć elija što rezultira značajnim oslobađanjem i proteina ć elija doma ć ina (HCP). Postupci za remeć enje spoljne membrane gram negativne prokariotske ć elije i naknadno sakupljanje tečnosti ć elijske kulture koja sadrži heterologne dobro su poznati u tehnici. Proizvodnja fragmenata antitela u E. coli takođe rezultira proizvodnjom nusproizvoda kao što su zarubljeni laki lanci, adukti glutationa lakih lanaca i dimeri lakih lanaca (Battersby et al., 2001).

[0007] Tečnost za ć elijske kulture (tok ishrane) sakupljena iz prokariontskih sistema ekspresije kao što su sistemi ekspresije E. coli i posebno ekstrakt periplazmatskih ć elija iz gram negativnih bakterija bitno se razlikuje od tečnosti ć elijskih kultura sakupljenih iz eukariotskih sistema ekspresije u relativnoj količini i sastavu HCP-ova, bakterijska DNK i endotoksin koje treba odvojiti od heterolognog proteina od interesa koji se eksprimuje u prokariotskom ili eukariotskom sistemu ekspresije. Koncentracija HCP, kao i složenost i heterogenost HCP zavise od sistema ekspresije ili ć elijske linije i uslova ć elijske kulture (Arunakumari, 2009). Prečišć avanje fragmenata antitela eksprimovanih u prokariotskim ekspresijskim sistemima, posebno u gram negativnim prokariotskim ekspresijskim sistemima, suočava se, dakle, sa različitim nizom izazova i zahteva različite pristupe (Humphreys i Glover, 2001). Osnovni principi prečišć avanja fragmenata monoklonskih antitela poznati su u tehnici (Spitali, 2009). Trenutno postoje dva medicinska proizvoda koja su odobrili Američka agencija za hranu i lekove (FDA) i Evropska agencija za lekove (EMA) koji sadrže fragment antitela kao aktivni sastojak koji se proizvodi u mikrobnim ć elijama: certolizumab pegol (Cimzia®) sadrži vezivanje Fab-a konkretno za TNFa i ranibizumab (Lucentis®) je Fab fragment koji se specifično vezuje za vaskularni endotelni faktor rasta (VEGF). Prečišć avanje ranibizumaba iz mikrobiološkog hranjenja se vrši postupkom u četiri koraka hromatografije (Walsh, 2007). Lek abciksimab (ReoPro®) sadrži Fab fragment himernog humanog mišjeg monoklonskog antitela 7E3 koje se vezuje za glikoprotein (GP) IIb/IIIa receptor humanih trombocita i inhibira agregaciju trombocita. Himerno 7E3 antitelo nastaje kontinuiranom perfuzijom u ć elijskoj kulturi sisara. Fragment 48 Kd Fab dobijen je iz prečišć enog antitela pune dužine nakon varenja papainom i hromatografijom na stubu.

[0008] Afinitetna hromatografija razdvaja proteine na osnovu reverzibilne interakcije između proteina (ili grupe proteina) od interesa i specifičnog liganda povezanog sa hromatografskom matricom. Interakcija između proteina od interesa i liganda povezanog sa hromatografskom matricom može biti rezultat elektrostatičkih ili hidrofobnih interakcija, van der Waalsovih sila i/ili vodonične veze. Da bi se ciljni molekul eluirao iz afinitetnog medija, interakcija se može obrnuti, bilo specifično korišć enjem kompetitivnog liganda, bilo nespecifično, promenom pH, jonske snage ili polariteta. Prečiš ć avanje afiniteta zahteva biospecifični ligand koji može biti kovalentno vezan za matricu hromatografije. Upareni ligand mora zadržati svoj specifični afinitet za vezivanje za ciljne molekule i, nakon ispiranja nevezanog materijala, vezivanje između liganda i ciljnog molekula mora biti reverzibilno kako bi se omoguć ilo uklanjanje ciljnih molekula u aktivnom obliku. Uprkos svojoj uobičajenoj upotrebi, afinitetna hromatografija je skupa, posebno u industrijskim razmerama neophodnim za prečišć avanje terapijskih proteina.

[0009] Hromatografija za razmenu jona se može koristiti za prečišć avanje jonizuju ć ih molekula. Jonizovani molekuli se odvajaju na osnovu nespecifične elektrostatičke interakcije njihovih naelektrisanih grupa sa suprotno naelektrisanim molekulima vezanim za matricu nosača čvrste faze, čime se usporavaju oni jonizovani molekuli koji jače interaguju sa čvrstom fazom. Neto naelektrisanje svake vrste jonizovanog molekula i njegov afinitet prema matrici varira u zavisnosti od broja naelektrisanih grupa, naelektrisanja svake grupe i prirode molekula koji se takmiče za interakciju sa matricom napunjene čvrste faze. Ove razlike rezultiraju rezolucijom različitih tipova molekula pomoć u hromatografije za razmenu jona. Elucija molekula koji su vezani za čvrstu fazu se obično postiže poveć anjem jonske snage (tj. provodljivosti) pufera da bi se nadmetao sa rastvorenom supstancom za naelektrisana mesta matrice jonske razmene. Promena pH i time promena punjenja rastvorene supstance je drugi način za postizanje elucije rastvorene supstance. Promena provodljivosti ili pH može biti postupna (gradijentna elucija) ili postepena (stepenasta elucija). Poznate su dve opšte vrste interakcija: Anionska hromatografija za razmenu posredovana negativnim naelektrisanim bočnim lancima aminokiselina (npr. asparaginska kiselina i glutaminska kiselina) u interakciji sa pozitivno naelektrisanim površinama i kationska hromatografija za razmenu posredovana pozitivno naelektrisanim aminokiselinskim ostacima (npr. lizin i arginin) u interakciji sa negativno naelektrisanim površinama. Anionski razmenjivači se mogu klasifikovati ili kao slabi ili kao jaki. Grupa naelektrisanja na slabom razmenjivaču aniona je slaba baza koja postaje deprotonirana i zbog toga gubi svoj naboj pri visokom pH. Dietilaminoetil (DEAE) - celuloza je primer slabog razmenjivača anjona, gde amino grupa može biti pozitivno naelektrisana ispod pH ~ 9 i postepeno gubi svoj naboj pri višim pH vrednostima. DEAE ili dietil- (2-hidroksi-propil) aminoetil (KAE), na primer, imaju hlorid kao protiv-jon.

[0010] Alternativa eluciji poveć anjem jačine jona pufera za eluciju (eluciona hromatografija) je eluiranje koriš ć enjem molekula koji imaju već i dinamički afinitet za stacionarnu fazu od vezanog proteina. Ovaj način izvođenja hromatografije za razmenu jona se naziva pomerajuć a hromatografija. Pomerajuća hromatografija se fundamentalno razlikuje od bilo kog drugog načina hromatografije po tome što se rastvorene supstance ne desorbuju u modifikatoru mobilne faze i ne razdvajaju se razlikama u stopama migracije (Tugcu, 2008). U pomeranju, molekuli su prisiljeni da migriraju niz hromatografski stub naprednim udarnim talasom molekula za pomeranje koji ima već i afinitet za stacionarnu fazu od bilo koje komponente iz napojnog toka. Upravo ta prisilna migracija rezultira već im koncentracijama i čisto ć om proizvoda u poređenju sa drugim načinima rada visokog zadržavanja, prać eno stalnom infuzijom rastvora za pomeranje u stubu.

[0011] Kapacitet dinamičkog vezivanja opisuje količinu proteina od interesa koji ć e se vezati za hromatografsku smolu u stubu pod definisanim uslovima protoka. Kapacitet dinamičkog vezivanja za hromatografsku smolu zavisi od uslova rada (npr. brzine protoka, pH i provodljivosti), porekla uzorka, pripreme uzorka i ostalih prisutnih nečistoć a vezivanja. Kapaciteti dinamičkog vezivanja se određuju punjenjem uzorka koji sadrži poznatu koncentraciju proteina od interesa i prać enjem koncentracije u protoku stuba (Do et al., 2008). Kapacitet dinamičkog vezivanja smole za razmenu jona definisan je kao tačka tokom punjenja kada protein od interesa počinje da se oporavlja u protoku. Tipično se za definisanje ove tačke koristi vrednost od 10% za udeo proteina od interesa u protoku u poređenju sa optereć enjem (McCue et al., 2003). Za uklanjanje nečisto ć e, prag nečisto ć e u protoku se postavlja prema kriterijumima specifičnim za primenu.

[0012] WO 99/57134, WO 2004/024866 i WO 2007/117490 se odnose na procese za prečišć avanje proteina ili antitela koji uključuju hromatografiju za razmenu jona. Postupci su prikazani korišćenjem antitela proizvedenih u ć elijama sisara. WO 2009/058812 se odnosi na postupak prečišć avanja antitela koji uključuje hromatografiju za razmenu katjona. Postupak je prikazan na primeni antitela proizvedenih u ć elijama sisara. WO 2007/108955 se odnosi na dvostepeni postupak neafinitetne hromatografije za ramenu jona radi prečišć avanja proteina koji obuhvata hromatografiju za razmenu katjona pra ć enu hromatografijom za razmenu jona. Primer u WO 2007/108955 opisuje prečišć avanje potpuno ljudskih antitela proizvedenih u ć elijama sisara. Izvršeno je više koraka pranja tokom hromatografije za razmenu katjona, a eluat je razblažen pre hromatografije za razmenu anjona. Humphreys et al. opisuje prečišć avanje Fab ’u laboratorijskim razmerama koriš ć enjem hromatografije za razmenu katjona i hromatografije za razmenu jona (Humphreys et al., 2004). WO 2004/035792 se odnosi na stvaranje sojeva E. coli koji eksprimiraju mutirani PhoS protein kako bi se smanjile nečistoć e PhoS proteina u preparatima fragmenata antitela prečišć enim iz bakterijske ć elijske kulture.

[0013] CDP870 je genetski modifikovani fragment antitela (Fab ’) hemijski povezan sa PEG delom kao što je opisano u WO 01/94585. CDP870 ima moć na svojstva neutralizacije ljudskog TNFα.

[0014] U struci postoje potrebe za metodama prečišć avanja fragmenata antitela iz tečnosti ć elijske kulture sakupljene iz prokariotskih i posebno gram negativnih bakterija, kao što su sistemi ekspresije E. coli. U struci postoji posebna potreba za metodama prečišć avanja fragmenata antitela iz ekstrakata periplazmatskih ć elija izvađenih iz prokariontskih i posebno gram negativnih bakterija kao što su sistemi ekspresije E. coli koji su pogodni za rad sa ekstraktima ć elija koji sadrže veoma visok titar fragmenta antitela ili HCP ili i fragmenta antitela i HCP. Ekspresija fragmenata antitela sa visokim titrom zahteva metode pogodne za prečišć avanje velike količine fragmenata antitela na ekonomičan način: smanjenje veličine stuba, koriš ć enje pufera i vremena obrade (datoteka podataka GE Healthcare 11-0025-76 AE, 2007).

REZIME PRONALASKA

[0015] Zahtevi i izazovi prečišć avanja se bitno razlikuju za proteine koji su prečiš ć eni iz bakterijske ć elijske kulture od proteina koji moraju biti prečišć eni od eukariotske ć elijske kulture. Posebne poteško ć e nastaju se kada proteine treba prečistiti od ekstrakata periplazmatskih ć elija gram negativnih bakterija zbog npr. količina prisutnih proteina bakterijskih ć elija domać ina. Dalje poteško ć e moraju biti prevaziđene kada proteine treba prečistiti iz gram negativnih bakterijskih kultura koje eksprimiraju heterologne proteine do vrlo visoke koncentracije.

[0016] Izumitelji su iznenađujuć e pronašli novi postupak za prečiš ć avanje fragmenta antitela iz ekstrakta periplazmatske ć elije, pri čemu je postupak visoko efikasan i pogodan za ekstrakt periplazmatske ć elije koji sadrži fragment antitela u visokoj koncentraciji.

[0017] U aspektu pronalaska obezbeđuje se postupak za prečišć avanje fragmenta antitela iz ekstrakta periplazmatske ć elije, koji obuhvata prvi korak hromatografije za hvatanje fragmenta antitela, pri čemu je smeša koja sadrži fragment antitela podvrgnuta hromatografiji za razmenu katjona, a zatim eluirana da bi se dobio prvi eluat koji sadrži fragment antitela; i drugi korak hromatografije u kome se prvi eluat podvrgava hromatografiji za razmenu anjona da bi se uhvatile nečistoć e i proizveo protok koji sadrži fragment antitela, i oporavak navedenog fragmenta antitela, pri čemu postupak obuhvata ne više od dva koraka hromatografije.

[0018] U drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje postupak za prečišć avanje fragmenta antitela iz ekstrakta periplazmatske ć elije koji se sastoji u osnovi od prvog koraka hromatografije za hvatanje fragmenta antitela pri čemu je smeša koja sadrži fragment antitela podvrgnuta hromatografiji za razmenu kationa da bi se potom eluirala kako bi se proizveo prvi eluat koji sadrži fragment antitela; prva ultrafiltracija se primenjuje na prvi eluat; drugi korak hromatografije u kome je prečišć eni prvi eluat podvrgnut hromatografiji za razmenu anjona kako bi se uhvatile nečistoć e da bi se proizveo tok koji sadrži fragment antitela; i druga ultrafiltracija se primenjuje na protok i obnavlja pomenuti fragment antitela.

KRATAK OPIS SLIKA

[0019]

Slika 1 prikazuje hromatogram proteina (uključujuć i Fab') pra ć en apsorpcijom UV svetlosti [mereno u mili upijajućim jedinicama (tzv. mAU)] (puna linija) duž provodljivosti (isprekidana linija) od prvog koraka hvatanja na hromatografskom stubu za razmenu katjona ( Capto S™). Hromatogram pokazuje da se na stub može učitati velika zapremina tokom koje se neki proteini ne vezuju, nakon čega sledi oporavak vezanih proteina, uključujuć i Fab’ u maloj zapremini sa pove ć anjem provodljivosti.

Slika 2 prikazuje hromatogram iz koraka na hromatografskom stubu za razmenu aniona (Capto K ™). Hromatogram pokazuje nevezivanje Fab-a i njegov izgled u pranju posle punjenja sa vezanim nečistoć ama izdvojenim u vrhu regeneracije.

Slika 3 prikazuje SDS-PAGE analizu uhvaćenog punjenja, uhvaćenog eluata i protoka anionske razmene.

Slika 4 prikazuje Western-Blot za otkrivanje proteina ć elija doma ć ina prisutnih u uzorku pre (traka 2) i posle (traka 3) hromatografije za razmenu anjona.

Slika 5 prikazuje aminokiselinske sekvence CDP870.

KRATAK OPIS SEKVENCI

[0020]

SEQ ID NO: 1 prikazuje aminokiselinsku sekvencu CDRH1 CDP870.

SEQ ID NO: 2 prikazuje aminokiselinsku sekvencu CDRH2 CDP870.

SEQ ID NO: 3 prikazuje aminokiselinsku sekvencu CDRH3 CDP870.

SEQ ID NO: 4 prikazuje aminokiselinsku sekvencu CDRL1 CDP870.

SEQ ID NO: 5 prikazuje aminokiselinsku sekvencu CDRL2 CDP870.

SEQ ID NO: 6 prikazuje aminokiselinsku sekvencu CDRL3 CDP870.

SEQ ID NO: 7 prikazuje nukleotid i predviđenu aminokiselinsku sekvencu promenljivog regiona lakog lanca CDP870.

SEQ ID NO: 8 prikazuje nukleotid i predviđenu aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca CDP870.

SEQ ID NO: 9 prikazuje aminokiselinsku sekvencu kalemljenog lakog lanca anti-TNFa Fab CDP870.

SEQ ID NO: 10 prikazuje aminokiselinsku sekvencu kalemljenog teškog lanca anti-TNFa Fab CDP870.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0021] U prvom aspektu, pronalazak se odnosi na postupak za prečišć avanje fragmenta antitela iz ekstrakta periplazmatske ć elije, koji obuhvata prvi korak hromatografije za hvatanje fragmenta antitela, pri čemu je smeša, poput ekstrakta periplazmatske ć elije, koja sadrži fragment antitela, podvrgnuta hromatografija za razmenu katjona i potom eluirana da bi se dobio prvi eluat koji sadrži fragment antitela; i drugi korak hromatografije u kome se prvi eluat podvrgava hromatografiji za razmenu anjona da bi se uhvatile nečistoć e i proizveo protok koji sadrži fragment antitela, i oporavak navedenog fragmenta antitela, pri čemu postupak ne obuhvata više od dva koraka hromatografije.

[0022] U drugom aspektu, pronalazak se odnosi na proces za prečišć avanje fragmenta antitela iz ekstrakta periplazmatske ć elije koji se sastoji u osnovi od prvog koraka hromatografije za hvatanje fragmenta antitela u kome se smeša, poput ekstrakta periplazmatske ć elije koji sadrži fragment antitela podvrgava hromatografiji za razmenu katjona koja se naknadno eluira da bi se dobio prvi eluat koji sadrži fragment antitela; prva ultrafiltracija primenjena na prvi eluat; drugi korak hromatografije u kome je prečišć eni prvi eluat podvrgnut hromatografiji za razmenu anjona kako bi se uhvatile nečisto ć e da bi se proizveo tok koji sadrži fragment antitela; i druga ultrafiltracija naneta na protok i obnavljanje pomenutog fragmenta antitela.

[0023] U prvom izvođenju prvog aspekta pronalaska, postupak prema prvom aspektu pronalaska obuhvata samo dva koraka hromatografije.

[0024] U prvom izvođenju drugog aspekta pronalaska, postupak prema drugom aspektu pronalaska, ultrafiltracija nakon hromatografije za razmenu katjona i ultrafiltracija nakon hromatografije za razmenu anjona izvode se tangencijalnom protočnom filtracijom (tzv. TFF).

[0025] U drugom izvođenju prvog ili drugog aspekta pronalaska u procesu prema prvom izvođenju prvog ili drugog aspekta pronalaska, svi koraci hromatografije se izvode na hromatografskom stubu.

[0026] U treć em izvođenju prvog ili drugog aspekta pronalaska u postupku prema prvom ili drugom izvođenju prvog ili drugog aspekta pronalaska, hromatografija za razmenu katjona u prvom koraku hromatografije se izvodi u režimu elucije.

[0027] U četvrtom izvođenju prvog ili drugog aspekta pronalaska u postupku prema drugom ili treć em izvođenju prvog ili drugog aspekta pronalaska, hromatografija za razmenu katjona u prvom koraku hromatografije sadrži sledeć e korake u nizu: a ) punjenje smeše, kao što je ekstrakt periplazmatske ć elije, koja sadrži fragment antitela na stub za razmenu katjona, b) pranje stuba za razmenu katjona puferom za pranje pri čemu tokom pranja provodljivost, pH i koncentracija soli pufera za pranje nisu promenjeni i c) eluiranje fragmenta antitela puferom za eluciju.

[0028] U petom izvođenju prvog ili drugog aspekta pronalaska u postupku prema četvrtom izvođenju prvog ili drugog aspekta pronalaska, pH pufera za pranje je identičan pH smeše, kao što je ekstrakt periplazmatske ć elije, koji sadrži fragment antitela, pre prvog koraka hromatografije.

[0029] U šestom izvođenju prvog ili drugog aspekta pronalaska u postupku prema prvom, drugom, treć em, četvrtom ili petom izvođenju prvog ili drugog aspekta pronalaska smeša, poput ekstrakta periplazmatske ć elije, koja sadrži fragment antitela, pre prvog koraka hromatografije, ima pH između 4,0 do 5,0, poželjno pH između 4,3 do 4,7, još poželjnije pH između 4,3 do 4,5 i najpoželjnije 4,5.

[0030] U sedmom izvođenju prvog ili drugog aspekta pronalaska u postupku prema prvom, drugom, treć em, četvrtom, petom ili šestom izvođenju prvog ili drugog aspekta pronalaska smeša koja sadrži fragment antitela i koja je podvrgnuta hromatografiji za razmenu katjona kao primarni korak hvatanja sadrži ukupni protein u koncentraciji od najmanje 1,5 g/L, ili najmanje 3 g/L, ili najmanje 4 g/L, ili najmanje 5 g/L, ili najmanje 7,5 g/L, ili najmanje 10 g/L ili najmanje 20 g/L, ili najmanje 40 g/L, ili u koncentraciji između 3 i 40 g/L, ili u koncentraciji između 4 i 20 g/L, ili u koncentraciji između 5 i 15 g/L.

[0031] U osmom izvođenju prvog ili drugog aspekta pronalaska u postupku prema prvom, drugom, treć em, četvrtom, petom, šestom ili sedmom izvođenju prvog ili drugog aspekta pronalaska smeša koja sadrži fragment antitela i koja je podvrgnuta hromatografiji razmene katjona kao primarni korak hvatanja sadrži fragment antitela u koncentraciji od najmanje 3 g/L, ili najmanje 4 g/L, ili najmanje 5 g/L, ili najmanje 7,5 g/L, ili najmanje 10 g/L ili najmanje 20 g/L, ili u koncentraciji između 3 i 20 g/L, ili u koncentraciji između 4 i 50 g/L, ili u koncentraciji između 5 i 10 g/L.

[0032] U devetom izvođenju prvog ili drugog aspekta pronalaska u postupku prema prvom, drugom, treć em, četvrtom, petom, šestom, sedmom ili osmom izvođenju prvog ili drugog aspekta pronalaska, hromatografija za razmenu katjona primarnog koraka hvatanja se izvodi pri brzini protoka od najmanje 300 cm/h, poželjno između 300 i 2000 cm/h, još poželjnije između 350 i 1500 cm/h, još poželjnije između 350 i 1000 cm/h, a već ina po mogu ć nosti između 400 i 700 cm/h.

[0033] U desetom izvođenju prvog ili drugog aspekta pronalaska u postupku prema prvom, drugom, treć em, četvrtom, petom, šestom, sedmom, osmom ili devetom izvođenju prvog ili drugog aspekta pronalaska, hromatografija za razmenu katjona primarnog koraka hvatanja se izvodi pri provodljivosti ne već oj od 6 mS/cm, poželjno između 6 i 2 mS/cm, poželjnije između 5 i 3 mS/cm, a još poželjnije između 4,5 i 3,5 mS/cm.

[0034] U jedanaestom izvođenju prvog ili drugog aspekta pronalaska u postupku prema prvom, drugom, treć om, četvrtom, petom, šestom, sedmom, osmom, devetom ili desetom izvođenju prvog ili drugog aspekta pronalaska, hromatografija za razmenu katjona u primarnom koraku hvatanja izvodi se na smoli koja sadrži sulfonil, sulfopropil ili karboksimetil spregnutu sa smolom pogodnog materijala poznatog u tehnici, uključujuć i, ali ne ograničavaju ć i se na umrežene, zrnate oblike agaroze (npr. Sepharose™ ili Superose™) , modifikovani metakrilatni polimeri (npr. pipci, hidroksilirani); silicijum dioksid; keramika i stiren divinilbenzen.

[0035] U dvanaestom izvođenju prvog ili drugog aspekta pronalaska u procesu prema jedanaestom izvođenju prvog ili drugog aspekta pronalaska, smola hromatografije za razmenu katjona primarnog zahvata ima dinamički kapacitet vezivanja za fragment antitela od najmanje 50 g/L smole, ili najmanje 60 g/L smole, ili najmanje 75 g/L smole, ili najmanje 150 g/L smole, ili između 50 i 150 g/L smole, ili između 60 i 100 g/L smole ili između 50 i 75 g/L smole.

[0036] U trinaestom izvođenju prvog ili drugog aspekta pronalaska u postupku prema jedanaestom ili dvanaestom izvođenju prvog ili drugog aspekta pronalaska, smola hromatografije za razmenu katjona primarnog hvatanja ima srednju određenu veličinu najmanje 50 mm, poželjno između 60 i 300 mm, još poželjnije između 70 i 200 mm, a još poželjnije između 80 i 100 mm.

[0037] U četrnaestom izvođenju prvog ili drugog aspekta pronalaska u postupku prema prvom, drugom, treć em, četvrtom, petom šestom, sedmom, osmom, devetom, desetom, jedanaestom, dvanaestom ili trinaestom izvođenju prvog ili drugog aspekta pronalaska smeša koja sadrži fragment antitela koja je podvrgnuta hromatografiji za razmenu katjona u primarnom koraku hvatanja sadrži bakterijski protein ć elije doma ć ina u količini između oko 200 mg/ml do 10000 mg/ml, oko 500 mg/ml do 5000 mg/ml, oko 1000 mg/ml do 4000 mg/ml ili oko 2000 mg/ml do 4000 mg/ml.

[0038] U petnaestom izvođenju prvog ili drugog aspekta pronalaska u postupku prema prvom, drugom, treć em, četvrtom, petom, šestom, sedmom, osmom, devetom, desetom, jedanaestom, dvanaestom, trinaestom ili četrnaestom izvođenju prve ili drugi aspekt pronalaska, u hromatografiji za razmenu katjona u primarnom koraku hvatanja između 5 i 100 g fragmenta antitela po litru smole, između 10 i 90 g fragmenta antitela po litru smole ili između 20 i 75 g fragmenta antitela po litru smole je napunjeno.

[0039] U šesnaestom izvođenju prvog ili drugog aspekta pronalaska u postupku prema prvom, drugom, treć em, četvrtom, petom, šestom, sedmom, osmom, devetom, desetom, jedanaestom, dvanaestom, trinaestom, četrnaestom ili petnaestom izvođenju prvi ili drugi aspekt pronalaska, hromatografija za razmenu anjona u drugom koraku hromatografije izvodi se na smoli koja sadrži kvaternarni amonijum (K), dietilaminoetil (DEAE) ili trimetilaminoetil (TMAE), povezanu sa smolom odgovarajuć eg materijala poznatog u tehnici, uključujuć i, ali ne ograničavaju ć i se na umrežene, zrnaste oblike agaroze (npr. Sepharose™ ili Superose™), modifikovane metakrilatne polimere (npr. pipci, hidroksilirani); silicijum dioksid; keramika i stiren divinilbenzen. Drugi korak hromatografije takođe se može izvesti na membrani koja sadrži kvaternarni amonijum ili poli (alilamin) povezan sa membranom pogodnog materijala poznatog u tehnici, uključujuć i, ali ne ograničavaju ć i se na celulozu i polietilen.

[0040] U sedamnaestom izvođenju prvog ili drugog aspekta pronalaska u postupku prema prvom, drugom, treć em, četvrtom, petom, šestom, sedmom, osmom, devetom, desetom, jedanaestom, dvanaestom, trinaestom, četrnaestom, petnaestom ili šesnaestom izvođenju prvog ili drugog aspekta pronalaska, stub za hromatografiju za razmenu anjona u drugom koraku hromatografije ima srednju određenu veličinu od najmanje 50 mm, poželjno između 60 i 300 mm, a poželjnije između 70 i 200 mm, pa čak i više po moguć nosti između 80 i 100 mm.

[0041] U osamnaestom izvođenju prvog ili drugog aspekta pronalaska u postupku prema prvom, drugom, treć em, četvrtom, petom, šestom, sedmom, osmom, devetom, desetom, jedanaestom, dvanaestom, trinaestom, četrnaestom, petnaestom, šesnaestom ili sedamnaestom izvođenju prvog ili drugog aspekta pronalaska, hromatografija za razmenu anjona u drugom koraku hromatografije se izvodi pri pH između 6 do 10, poželjno pH između 7 do 9, još poželjnije između 8 do 9, pa čak i još poželjnije pri pH od 8,5.

[0042] U devetnaestom izvođenju prvog ili drugog aspekta pronalaska u postupku prema prvom, drugom, treć em, četvrtom, petom, šestom, sedmom, osmom, devetom, desetom, jedanaestom, dvanaestom, trinaestom, četrnaestom, petnaestom, šesnaestom, sedamnaestom ili osamnaestom izvođenju prvog ili drugog aspekta pronalaska izvodi se hromatografija za razmenu anjona u drugom koraku hromatografije koja ima kapacitet vezivanja za nečistoć e povezane sa procesom ve ć e od 20 g/L smole, poželjno već e od 30 g/L smole, i još poželjnije ve ć e od 40 g/L smole, ili između 20 i 80 g/L smole, ili između 20 i 40 g/L smole.

[0043] U dvadesetom izvođenju prvog ili drugog aspekta pronalaska, postupak prema prvom, drugom, treć em, četvrtom, petom, šestom, sedmom, osmom, devetom, desetom, jedanaestom, dvanaestom, trinaestom, četrnaestom, petnaestom, šesnaestom, sedamnaestom, osamnaestom ili devetnaestom izvođenju prvog ili drugog aspekta pronalaska ne uključuje korak tangiranja protoka visokih performansi (HPTFF).

[0044] U dvadeset prvoj realizaciji prvog ili drugog aspekta pronalaska u postupku prema prvom, drugom, treć em, četvrtom, petom, šestom, sedmom, osmom, devetom, desetom, jedanaestom, dvanaestom, trinaestom, četrnaestom, petnaestom , šesnaestom, sedamnaestom, osamnaestom, devetnaestom ili dvadesetom izvođenju prvog ili drugog aspekta pronalaska, oporavljeni fragment antitela sadrži protein ć elije doma ć ina (HCP) u količini ne ve ć oj od 150 delova na milion (ppm) ili ne već oj od 120 ppm ili ne više od 100 ppm.

[0045] U daljim izvođenjima postupak prema bilo kojem izvođenju prvog ili drugog aspekta pronalaska, gde je fragment antitela Fab, Fab ', F (ab') 2, Fv, scFv ili kamilje antitelo.

[0046] Termin "afinitetna hromatografija", kako se ovde koristi, se odnosi na tehniku odvajanja proteina u kojoj je protein od interesa ili antitelo od interesa reverzibilno i specifično vezano za biospecifični ligand. Poželjno je da je biospecifični ligand kovalentno vezan za hromatografski materijal čvrste faze i dostupan je proteinu od interesa u rastvoru dok rastvor dolazi u kontakt sa hromatografskim materijalom čvrste faze. Protein od interesa (npr. antitelo) zadržava svoj specifični afinitet vezivanja za biospecifični ligand (antigen, supstrat, kofaktor ili hormon, na primer) tokom hromatografskih koraka, dok se druge rastvorene supstance i/ili proteini u smeši ne vezuju znatno ili konkretno na ligand. Vezivanje proteina od interesa za imobilizovani ligand omoguć ava propuštanje zagađuju ć ih proteina ili proteinskih nečisto ć a kroz hromatografski medijum, dok protein od interesa ostaje specifično vezan za imobilizovani ligand na materijalu u čvrstoj fazi. Specifično vezani protein od interesa se zatim uklanja u aktivnom obliku iz imobilizovanog liganda sa niskim pH, visokim pH, visokom koncentracijom soli, konkurentskim ligandom i slično, i prolazi kroz hromatografski stub sa puferom za eluiranje, bez zagađujuć ih proteina ili proteinske nečistoć e kojima je ranije bilo dozvoljeno da prođu kroz stub. Svaka supstanca se može koristiti kao ligand za prečišć avanje njenog specifičnog vezuju ć eg proteina, npr. antitelo.

[0047] Izrazi "aglikozilirani" i "ne-glikozilirani" se ovde koriste naizmenično i odnose se na nedostatak specifičnog posttranslacionog dodavanja glikozil- ili ugljenohidratnog dela proteinu kao što je antitelo.

[0048] Termin "antitelo" ili "antitela", kako se ovde koristi, se odnosi na monoklonska ili poliklonalna tetramerna antitela pune dužine koja se sastoje od dva teška i dva laka lanca. Termin imunoglobulin ili imunoglobulini se koristi sinonimno sa „antitelom“, odnosno „antitelima“. Termin "antitelo" ili "antitela", kako se ovde koristi, uključuje, ali nije ograničen na rekombinantna antitela koja se generišu rekombinantnim tehnologijama, kao što je poznato u tehnici. "Antitelo" ili "antitela" mogu biti bilo kog porekla, uključujuć i vrste sisara, poput čoveka, nehumanog primata (npr. čoveka poput šimpanze, babuna, rezusa ili majmuna cinomolgus), glodara (npr. od miša, pacova, zeca ili zamorčeta), vrste koza, goveda ili konja. Ovde navedeno antitelo je usmereno protiv „antigena“ od interesa. Poželjno je da je antigen biološki važan polipeptid i davanje antitela sisaru koji pati od neke bolesti ili poremeć aja može rezultirati terapijski korisno za tog sisara. Međutim, takođe se razmatraju antitela usmerena na nepolipeptidne antigene. Tamo gde je antigen polipeptid, to može biti transmembranski molekul (npr. receptor) ili ligand kao što je faktor rasta ili citokin. Poželjne molekularne mete za antitela obuhvać ena ovim pronalaskom uključuju CD polipeptide kao što su CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD22, CD34, CD38, CD40 i CD40-L; FcRN; OKS40; članovi porodice HER receptora kao što su EGF receptor, HER2, HER3 ili HER4 receptor; molekuli ć elijske adhezije kao što su LFA-1, Mac1, p150,95, VLA-4, ICAM-1, VCAM i av/b3 integrin, uključujuć i ili njihove α ili β podjedinice (npr. anti-CD11 a, anti-CD18 ili anti-CD11b antitela); hemokini i citokini ili njihovi receptori kao što su IL-1 α i β, IL-2, IL-6, IL-6 receptor, IL-12, IL-13, IL-17 oblici, IL-18, IL-21, IL-23, TNFα i TNPβ; faktori rasta poput VEGF; IgE; antigeni krvnih grupa; flk2/flt3 receptor; receptor za gojaznost (OB); mpl receptor; CTLA-4; polipeptid C; itd.

[0049] Termin "fragment antitela" ili "fragmenti antitela", kako se ovde koristi, odnosi se na aglikozilirano antitelo ili njegov aglikozilirani deo antitela, generalno na vezivanje antigena ili njegov promenljivi region. Primeri fragmenata antitela uključuju bilo koje antitelo kojem nedostaje ili nema deo Fc. Primeri fragmenata antitela takođe uključuju fragmente Fab, Fab ’, F (ab’) 2, Fv i scFv; dijatela; trijatela; tetratela; minitela; antitela koja se u osnovi sastoje od jednog, dva ili tri domena imunoglobulina, kao što su tzv. Domain Antitela™; jednolančana antitela; bispecifične, trispecifične, tetraspecifične ili multispecifične varijante bilo kojeg od gore navedenih. Termin "fragment antitela" ili "fragmenti antitela", kako se ovde koristi, takođe se odnosi na kamilja antitela (npr. od kamila ili lama, kao što su tzv. Nanobodies™) i njihove derivate. Fragmenti antitela su dobro poznati u tehnici (Holliger i Hudson, 2005). Različite tehnike su razvijene za proizvodnju fragmenata antitela i poznate su u struci (Glover i Humphreis, 2004). Izraz "fragment antitela" ili "fragmenti antitela", kako se ovde koristi, obuhvata humane, humanizovane, primatizovane i himerne fragmente antitela.

[0050] Termin "pufer", kako se ovde koristi, se odnosi na supstancu koja svojim prisustvom u rastvoru poveć ava količinu kiseline ili alkalije koja se mora dodati da bi izazvala jedinstvenu promenu pH. Puferisani rastvor se odupire promenama pH dejstvom njegovih kiselinsko-baznih konjugovanih komponenti. Puferisani rastvori za upotrebu sa biološkim reagensima su generalno sposobni da održavaju konstantnu koncentraciju jona vodonika tako da je pH rastvora u fiziološkom opsegu. Tradicionalne puferske komponente uključuju, ali nisu ograničene na, organske i neorganske soli, kiseline i baze.

[0051] Termin "hromatografija", kako se ovde koristi, odnosi se na postupak kojim se supstanca od interesa u smeši odvaja od ostalih supstanci u smeši kao rezultat razlika u brzinama po kojima pojedinačni rastvoreni rastvori u smeši migriraju kroz nepokretni medijum pod uticajem pokretne faze ili u procesima vezivanja i eluiranja.

[0052] Izraz "hromatografski stub" ili "stub" u vezi sa hromatografijom kako se ovde koristi, odnosi se na posudu, često u obliku cilindra ili šupljeg stuba koji je ispunjen hromatografskom matricom ili smolom. Hromatografska matrica ili smola je materijal koji obezbeđuje fizička i/ili hemijska svojstva koja se koriste za prečišć avanje.

[0053] Termin "provodljivost", kako se ovde koristi, odnosi se na sposobnost vodenog rastvora da provodi električnu struju između dve elektrode. U rešenju, struja teče prenosom jona. Prema tome, sa sve već om količinom jona prisutnih u vodenom rastvoru, rastvorć e imati ve ć u provodljivost. Merna jedinica za provodljivost je tzv. miliSiemens po centimetru (mS/cm) i može se izmeriti pomoć u merača provodljivosti. Provodljivost rastvora se može promeniti promenom koncentracije jona u njemu. Na primer, koncentracija puferskog sredstva i/ili koncentracija soli (npr. NaCl ili KCI) u rastvoru može se promeniti kako bi se postigla željena provodljivost.

[0054] Termin "eluat", kako se ovde koristi, odnosi se na tečni sastav koji sadrži supstancu (npr. fragment antitela ili zagađujuć u supstancu) koja je dobijena nakon vezivanja pomenute supstance za hromatografski materijal i dodavanja pufera za eluciju da bi se disocirala supstanca iz hromatografskog materijala. Na eluate se može odnositi s obzirom na korak u procesu prečišć avanja. Na primer, termin "prvi eluat" se odnosi na eluat iz prvog hromatografskog koraka; izraz "drugi eluat" se odnosi na eluat iz drugog hromatografskog koraka, itd.

[0055] Termin "protok", kako se ovde koristi, odnosi se na tečni sastav koji sadrži supstancu (npr. fragment antitela ili zagađujuć u supstancu) koji je dobijen propuštanjem smeše koja sadrži pomenutu supstancu preko hromatografskog materijala tako da molekul prelazi preko materijala bez vezivanja.

[0056] Termin "smeša", kako se ovde koristi, se odnosi na barem delimično tečan sastav koji sadrži najmanje jedan fragment antitela od interesa za koji se želi da se prečisti od drugih supstanci koje takođe mogu biti prisutne. Smeše mogu, na primer, biti suspenzije, vodeni rastvori, sistemi organskih rastvarača ili smeše ili rastvori kao vodeni/organski rastvarači. Smeše su često složene smeše ili rastvori koji sadrže mnoge biološke molekule (kao što su proteini, antitela, hormoni i virusi), male molekule (kao što su soli, šeć eri, lipidi itd.), Pa čak i čestice. Iako tipična smeša biološkog porekla može započeti kao vodeni rastvor ili suspenzija, ona takođe može sadržati organske rastvarače koji su se koristili u ranijim koracima razdvajanja, poput taloženja rastvarača, ekstrakcije i slično.

[0057] Termin "ekstrakt periplazmatske ć elije", kako se ovde koristi, odnosi se na sastav dobijen iz ć elijske kulture gram negativnih prokariotskih ć elija nakon prekida spoljne membrane i oslobađanja materijala iz periplazmičnog prostora. Ekstrakt periplazmatske ć elije je često tečan i takođe može sadržati određenu materiju ili gas. Izraz "ekstrakt periplazmatske ć elije" takođe uključuje tečni sastav koji je možda dalje tretiran nakon sakupljanja iz periplazmičnog prostora, npr. za uklanjanje nerastvorljivog materijala.

[0058] Izraz "prečišć avanje" ili "prečiš ć ujući" ili "prečiš ć en" odnosi se na postupak u kome se iz smeše koja sadrži protein od interesa, kao što je antitelo ili fragment antitela, uklanjaju ili smanjuju neželjene supstance kao što su HCP, DNK ili soli. „Korak prečišć avanja“ može biti deo celokupnog postupka prečiš ć avanja koji rezultira „homogenim“ sastavom, koji se ovde koristi za označavanje sastava koji sadrži manje od 150 ppm HCP u sastavu koji sadrži protein od interesa, alternativno manje od 120 ppm , manje od 100 ppm, manje od 90 ppm, manje od 80 ppm, manje od 70 ppm, manje od 60 ppm, manje od 50 ppm, manje od 40 ppm, manje od 30 ppm, manje od 20 ppm, manje od 10 ppm , manje od 5 ppm ili manje od 3 ppm.

[0059] Termin "ultrafiltracija", kako se ovde koristi, odnosi se na postupak pod pritiskom, pri čemu smeša kao što je rastvor, npr. koji sadrži protein od interesa, prolazi kroz membranu radi koncentracije ili prečišć avanja. Ultrafiltracione membrane obično imaju srednju veličinu pora između 1 i 50 nm, što je između srednje veličine pora reverzne osmoze i membrana za mikrofiltraciju. Veličina pora se obično kvantifikuje njenom sposobnošć u da zadrži proteine određene molekulske težine i obično se navodi u vidu nominalne granične vrednosti molekulske težine (NMVCO) u kDa. Ultrafiltracija razdvaja rastvorene supstance na osnovu razlika u brzini filtracije različitih supstanci preko membrane kao odgovor na datu pokretačku silu pritiska čija brzina zavisi od veličine rastvorene supstance. Tako se rastvorene supstance u smeši ili rastvoru razdvajaju na osnovu razlika u veličini. Ultrafiltracija se često koristi u preradi za koncentraciju proteina, razmenu pufera i uklanjanje soli, prečišć avanje proteina, uklanjanje virusa i bistrenje. Izraz "ultrafiltracija" uključuje tangencijalnu protočnu filtraciju (TFF), pri čemu smeša poput rastvora prolazi vodoravno duž ultrafiltracione membrane. Izraz "ultrafiltracija" ne uključuje tangencijalnu filtraciju protoka visokih performansi (HPTFF) pri čemu se rastvorene supstance razdvajaju ne samo na osnovu veličine, već veličine i naelektrisanja.

[0060] Termin "ukupni protein", kako se ovde koristi, odnosi se u osnovi na sve proteine u uzorku, uključujuć i proteinske fragmente bilo koje veličine. Često se, u vezi sa ekstraktom periplazmatskih ć elija ili drugim ubiranjem ć elijske kulture, „ukupni protein“ odnosi i na HCP i na heterologni protein izražen u ć elijskoj kulturi sadržanoj u uzorku. Ukupni protein se može odrediti korišć enjem postupaka koji su dobro poznati u struci.

[0061] Fragment antitela koji se može prečistiti u skladu sa postupcima iz ovog pronalaska može se proizvesti kultivisanjem ć elija doma ć ina transformisanih sa jednim ili više ekspresijskih vektora koji kodiraju fragment rekombinantnog antitela. Ć elije domać ini su poželjno prokariotske ć elije, poželjno gram negativne bakterije. Još poželjnije, ć elije doma ć ini su ć elije E. coli. Prokariotske ć elije doma ć ina za ekspresiju proteina dobro su poznate u tehnici (Terpe, 2006). Ć elije doma ć ini su rekombinantne ć elije koje su genetski napravljene da proizvode protein od interesa kao što je fragment antitela. Rekombinantne ć elije doma ć ina E. coli mogu biti izvedene iz bilo kog pogodnog soja E. coli, uključuju ć i MC4100, TG1, TG2, DHB4, DH5α, DH1, BL21, K12, XL1Blue i JM109. Jedan primer je soj E. coli W3110 (ATCC 27,325), soj domać in koji se često koristi za fermentaciju rekombinantnih proteina. Fragmenti antitela se takođe mogu proizvesti kultivisanjem modifikovanih sojeva E. coli, na primer metaboličkih mutanata ili sojeva E. coli sa nedostatkom proteaze.

[0062] Fragment antitela koji se može prečistiti u skladu sa postupcima iz ovog pronalaska tipično se nalazi ili u periplazmi ć elije doma ć ina E. coli ili u supernatantu kulture ć elija doma ć ina, u zavisnosti od prirode proteina, obima proizvodnje i korišć eni soj E. coli. Metode za ciljanje proteina na ove odeljke su dobro poznate u tehnici (Makrides, 1996). Primeri pogodnih signalnih sekvenci za usmeravanje proteina na periplazmu E. coli uključuju E. coli PhoA, OmpA, OmpT, LamB i OmpF signalne sekvence. Proteini mogu biti ciljani na supernatant oslanjanjem na prirodne sekretorne puteve ili indukcijom ograničenog curenja spoljašnje membrane da bi izazvali sekreciju proteina, čiji su primeri upotreba pelB lidera, proteina A lidera, koekspresija protein koji oslobađa bakteriocin, protein koji oslobađa mitomicin izazvan bakteriocinom, zajedno sa dodatkom glicina u medijumu za kulturu i koekspresijom kil gena za permeabilizaciju membrane. Najpoželjnije, u postupcima prema pronalasku, rekombinantni protein se eksprimira u periplazmi domać ina E. coli.

[0063] Ekspresija rekombinantnog proteina u ć elijama doma ć ina E. coli takođe može biti pod kontrolom inducibilnog sistema, pri čemu je ekspresija rekombinantnog antitela u E. coli pod kontrolom inducibilnog promotera. Mnogi inducibilni promoteri pogodni za upotrebu u E. coli su dobro poznati u struci i zavisno od promotera; ekspresija rekombinantnog proteina može biti indukovana različitim faktorima kao što su temperatura ili koncentracija određene supstance u medijumu za rast. Primeri inducibilnih promotera uključuju E.coli lac, tac i trc promotere koji su inducibilni sa laktozom ili nehidrolizujuć i analog laktoze, izopropil-b-D-1-tiogalaktopiranozid (IPTG) i phoA, trp i araBAD promoteri koji su indukovani fosfatima, triptofanom i L-arabinozom. Izražavanje može biti indukovano, na primer, dodavanjem induktora ili promenom temperature tamo gde indukcija zavisi od temperature. Tamo gde se indukcija ekspresije rekombinantnog proteina postiže dodavanjem induktora u kulturu, induktor se može dodati bilo kojim pogodnim postupkom u zavisnosti od sistema fermentacije i induktora, na primer, dodavanjem jednog ili više hitaca ili postupnim dodavanjem induktora kroz feed. Podrazumeva se da može doć i do kašnjenja između dodavanja induktora i stvarne indukcije ekspresije proteina, na primer kada je induktor laktoza, može doć i do kašnjenja pre nego što se indukuje ekspresija proteina dok se koristi bilo koji postojeć i izvor ugljenika pre laktoze.

[0064] Kultura ć elija doma ć ina E. coli (fermentacije) se može kultivisati u bilo kom medijumu koji ć e podržati rast E. coli i ekspresiju rekombinantnog proteina. Medijum može biti bilo koji hemijski definisan medijum kao što je npr. opisano u (Durany O, 2004).

[0065] Kultura ć elija doma ć ina E. coli se može obaviti u bilo kom pogodnom kontejneru, kao što je boca za mućkanje ili fermentor, u zavisnosti od obima proizvodnje koji je potreban. Dostupni su razni fermentori velikih razmera, kapaciteta od preko 1.000 litara do oko 100.000 litara. Poželjno je da se koriste fermentori od 1.000 do 50.000 litara, još poželjnije 1.000 do 10.000 ili 12.000 litara. Mogu se koristiti i fermentori manjih razmera zapremine između 0,5 i 1000 litara.

[0066] Fermentacija E. coli se može izvoditi u bilo kom pogodnom sistemu, na primer u kontinuiranom, tzv. batch ili tzv. fedbatch režimu, u zavisnosti od proteina i potrebnih prinosa. Tzv. batch režim se može koristiti sa dodacima hranljivih sastojaka ili induktora kad je potrebno. Alternativno, može se koristiti tzv. fed-batch kultura i kulture uzgajane u preindukciji u batch režimu sa maksimalnom specifičnom stopom rasta koja se može održati korišć enjem hranljivih sastojaka koji su u početku prisutni u fermentoru i jednog ili više režima hranljivih sastojaka koji se koriste za kontrolu stope rasta dok se fermentacija ne završi. Za tzv. fed-batch režim se takođe može koristiti preindukcija za kontrolu metabolizma ć elija doma ć ina E. coli i omoguć avanje postizanja ve ć e gustine ć elija.

[0067] Po želji, ć elije doma ć ini mogu biti predmet sakupljanja iz podloge za fermentaciju, npr. ć elije doma ć ina mogu se prikupiti iz uzorka centrifugiranjem, filtriranjem ili koncentracijom. Naročito, postupci prema pronalasku su pogodni za industrijsku proizvodnju velikih dimenzija antitela terapijskog kvaliteta.

[0068] U jednom izvođenju, proces prema predmetnom pronalasku obuhvata pre koraka hvatanja hromatografijom za razmenu katjona korak centrifugiranja žetve ć elijske kulture, pra ć en suspenzijom ć elija doma ć ina dodavanjem pufera za ekstrakciju.

[0069] Za procese fermentacije E. coli u kojima se protein od interesa kao što je fragment antitela nalazi u periplazmatskom prostoru ć elije doma ć ina, potrebno je da se oslobodi protein iz ć elije doma ć ina. Oslobađanje se može posti ć i bilo kojim pogodnim postupkom kao što je liza ć elija mehaničkim tretmanom ili tretmanom pod pritiskom, tretmanom odmrzavanja, osmotskim šokom, agensima za ekstrakciju ili toplotnim tretmanom. Takve metode ekstrakcije za oslobađanje proteina su dobro poznate u tehnici.

[0070] U poželjnom izvođenju, uzorku se dodaje pufer za ekstrakciju i uzorak se zatim podvrgava koraku toplotnog tretmana. Korak toplotnog tretmana je poželjno onakav kako je detaljno opisano u US 5,655,866. Korak toplotnog tretmana omoguć ava dobijanje uzorka rastvorljivog, pravilno sklopljenog i sastavljenog fragmenta antitela olakšavajuć i uklanjanje drugog materijala povezanog sa antitelima.

[0071] Korak toplotnog tretmana se izvodi izlaganjem uzorka željenoj povišenoj temperaturi. Najpoželjnije, korak toplotnog tretmana se izvodi u opsegu od 30°C do 70°C. Temperatura se može odabrati po želji i može zavisiti od stabilnosti antitela za prečišć avanje. U još jednom izvođenju, temperatura je u opsegu od 40°C do 65°C, ili poželjno u rasponu od 40°C do 60°C, još poželjnije u opsegu od 45°C do 60°C, još poželjnije u opsegu 50°C do 60°C i najpoželjnije na 55°C do 60°C, 58°C do 60°C ili 59°C. Tako su minimalne temperature 30°C, 35°C ili 40°C, a maksimalne 60°C, 65°C ili 70°C.

[0072] Korak toplotnog tretmana je poželjno izvoditi duži vremenski period. Dužina toplotnog tretmana je poželjno između 1 i 24 sata, još poželjnije između 4 i 18 sati, još poželjnije između 6 i 16 sati i najpoželjnije između 10 i 14 sati ili između 10 i 12 sati, na primer 12 sati. Dakle, minimalno vreme toplotne obrade je 1, 2 ili 3 sata, a maksimalno 20, 22 ili 24 sata.

[0073] U posebnom izvođenju, toplotna obrada se izvodi na 50°C do 60°C tokom 10 do 16 sati, a još poželjnije na 59°C tokom 10 do 12 sati. Stručnjak u ovoj oblasti će razumeti da se temperatura i vreme mogu odabrati prema odgovarajuć em uzorku i karakteristikama antitela koje se proizvodi.

[0074] Posle koraka ekstrakcije, smeša koja sadrži protein od interesa, takav fragment antitela može biti podvrgnut koraku centrifugiranja i/ili filtracije pre koraka podešavanja pH.

[0075] U daljim izvođenjima, postupak prema bilo kojem izvođenju prvog ili drugog aspekta pronalaska se izvodi sa fragmentom antitela, na primer Fab ili s Fab', koji se specifično vezuje za VEGF-A, glikoprotein IIb/IIIa receptor, C5, HER2/neu, TNFα, IL1β, CD40-L, OX40 ili ICOS.

[0076] U poželjnom izvođenju pronalaska, postupak prema bilo kojem izvođenju prvog ili drugog aspekta pronalaska se izvodi sa ekstraktom periplazmatske ć elije koji sadrži fragment antitela koji je fragment antitela koji ima specifičnost za humani TNFα, poželjnije CDP870, kao opisano u Z WO 01/094585.

[0077] U jednom izvođenju fragment antitela koji ima specifičnost za humani TNFα, sadrži teški lanac u kome promenljivi domen sadrži CDR koji ima sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 1 za CDRH1, sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 2 za CDRH2 ili sekvenca prikazana u SEQ ID NO: 3 za CDRH3.

[0078] U jednom izvođenju fragment antitela sadrži CDR koji imaju sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 4 za CDRL1, sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 5 za CDRL2 ili sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 6 za CDRL3.

[0079] U jednom izvođenju fragment antitela sadrži CDR-ove koji imaju sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 1 za CDRH1, sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 2 za CDRH2 ili sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 3 za CDRH3 i CDR koji imaju sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 4 za CDRL1, sekvenca prikazana u SEQ ID NO: 5 za CDRL2 ili sekvenca prikazana u SEQ ID NO: 6 za CDRL3.

[0080] U jednom izvođenju fragment antitela sadrži SEQ ID NO: 1 za CDRH1, SEQ ID NO: 2 za CDRH2, SEQ ID NO: 3 za CDRH3, SEQ ID NO: 4 za CDRL1, SEQ ID NO: 5 za CDRL2 i SEQ ID NO : 6 za CDRL3.

[0081] Fragment antitela je poželjno CDR-kalemljeni molekul fragmenta antitela i tipično promenljivi domen sadrži ljudske prihvatne okvirne regione i ne-humane donorske CDR.

[0082] Poželjno je da fragment antitela sadrži promenljivi domen lakog lanca CDP870 (SEQ ID NO: 7) i varijabilni domen teškog lanca CDP870 (SEQ ID NO: 8).

[0083] Poželjno je da je fragment antitela modifikovani Fab fragment, pri čemu je modifikacija dodatak na C-terminalni kraj njegovog teškog lanca jedne ili više aminokiselina kako bi se omoguć ilo vezivanje efektorskog ili reporter molekula. Poželjno je da dodatne aminokiseline formiraju modifikovani zglobni region koji sadrži jedan ili dva ostatka cisteina na koji može biti vezan efektor ili reporter molekul. Takav modifikovani Fab fragment poželjno ima teški lanac koji sadrži sekvencu navedenu kao SEQ ID NO: 10 ili se sastoji od nje, a laki lanac koji sadrži sekvencu navedenu kao SEQ ID NO: 9 ili se sastoji od nje.

[0084] U daljim izvođenjima, postupak prema bilo kojem izvođenju prvog ili drugog aspekta pronalaska se izvodi sa abciksimabom, ranibizumabom, pekselizumabom, CDP484 ili CDP7657.

Izjednačavanje

[0085] U daljim izvođenjima pronalaska, hromatografski stub za razmenu katjona za primarni korak hvatanja izjednačena je sa anionskim puferom pogodnog sastava da se puferuje pri potrebnom pH i provodljivosti (na primer 50 mM natrijum acetata pri pH 5 ili 50 mM natrijum laktata pri pH 4.0 Izjednačavanje se može postić i upotrebom najmanje 2 zapremine stuba pufera za izravnavanje, ali takođe može uključivati postupak uravnoteženja u dva koraka sa dve zapremine stuba pufera koji sadrže 1 M NaCl (kako bi se osiguralo da je stub napunjen odgovarajuć im brojačem katjona) pra ć en sa najmanje 2 zapremine stuba pufera za uravnoteženje.

[0086] U daljim izvođenjima pronalaska, stub hromatografije za razmenu anjona u drugom koraku hromatografije uravnotežen je na isti način, osim što je pufer za ravnotežu idealno katjonski pufer, npr. 20 mM Tris HCl na pH 8,0 ili 20 mM bis-Tris HCl na pH 7,0. Uravnoteženje stuba sa hromatografijom za razmenu anjona se takođe može postić i koriš ć enjem dvostepenog postupka uravnoteženja sa puferom koji sadrži 1 M NaCl (kako bi se osiguralo da je stub adekvatno napunjen odgovarajuć im kontra anjonom), nakon čega sledi pufer za uravnoteženje; ili jedan korak direktno sa puferom za uravnoteženje.

Pranje

[0087] U daljim izvođenjima pronalaska, nakon punjenja hromatografskog stuba za razmenu katjona za primarni korak, ona se ispere sa najmanje 2 zapremine stuba pufera za uravnoteženje. Dodatne nečistoć e se mogu ukloniti upotrebom pufera za pranje već e provodljivosti, npr.0,5 mScm ili ve ć a provodljivost.

[0088] U daljim izvođenjima pronalaska, nakon punjenja stuba hromatografije za razmenu anjona za drugi korak hromatografije, stub se ispere sa do 2 zapremine stuba pufera za uravnoteženje. Takođe se mogu koristiti i drugi puferi sa sličnim pH i provodljivošć u. Ne preporučuju se puferi ve ć e provodljivosti ako se želi maksimalno uklanjanje procesnih nečistoć a.

Elucija

[0089] U daljim izvođenjima pronalaska, fragment antitela se eluira iz hromatografskog stuba sa izmenjivačkim katjonom u primarnom koraku hvatanja pomoć u pufera ili pri višem pH, ve ć oj provodljivosti ili njihovoj kombinaciji. Pove ć ana provodljivost se može postić i dodavanjem NaCl (ili druge soli) u pufer za uravnoteženje pri koncentraciji ve ć oj od 50 mM, poželjno ve ć oj od 100 mM i još poželjnije već oj od 200 mM.

[0090] U daljim izvođenjima pronalaska, elucija fragmenta antitela iz stuba hromatografije za razmenu anjona u drugom koraku hromatografije se dešava tokom koraka punjenja i pranja. Vezane nečistoć e povezane sa procesom se mogu eluirati upotrebom pufera ili pri nižem pH, već oj provodljivosti ili njihovoj kombinaciji. U idealnom slučaju, ve ć a provodljivost treba da bude najmanje 70 mS/cm.

[0091] Kako se ovde koristi, "a" ili "an" može značiti jedan ili više. Upotreba izraza "ili" ovde se koristi u značenju "i/ili" ukoliko nije izričito naznačeno da se odnosi samo na alternative ili se alternative međusobno isključuju, iako otkrivanje podržava definiciju koja se odnosi samo na alternative i "i/ili. " Kako se ovde koristi, „drugi“ može značiti najmanje sekundu ili više.

[0092] Kako se ovde koristi, „između X i Y“ može značiti opseg koji uključuje X i Y.

PRIMERI

Primer 1

[0093] CDP870 Fab’ je izražen kao heterologni protein u ć elijama doma ć inima E. coli W3110 pri koncentraciji od 1,9 g/L. Heterologni protein je oslobođen iz periplazmatskog prostora ć elija doma ć ina dodavanjem Tris-EDTA i toplotnim tretmanom na 50°C.Ć elijski materijal je uklonjen centrifugiranjem, a ć elijski ekstrakt koji sadrži heterologni protein je podešen dodavanjem sirć etne kiseline na pH 4,5. Ekstrakt ć elijskog podešenog pH je zatim razbistren upotrebom kombinacije centrifugiranja i dubinske filtracije sa filtriranjem od 0,2 mm.

[0094] Pročišć eni ekstrakt (dovodni tok) je razblažen vodom sa faktorom razblaženja od 4 da bi se postigla provodljivost od 3,5 mS/cm.

[0095] Tada je dovodni tok koji sadrži CDP870 Fab' napunjen na oko 75 g/L smole brzinom protoka od 400 cm/h na Capto S™ stub za razmenu katjona kompanije GE Healthcare [visoko umrežena kruta agarozna zrna (srednja veličina čestica) 90 mm) sa ligandom za razmenu sulfonatnog katjona pričvršć enim preko dekstran veznika (jonski kapacitet 0,11 - 0,14 mmol Na+/ml)]. Capto S™ stub za razmenu katjona je imao visinu sloja stuba od 20 cm i prečnika 7,7 mm. Stub je bio uravnotežen pre punjenja struje dovodnog toka sa 6 zapremina stuba od 50 mM pufera natrijum-acetata podešenog na pH 4.5 sa sir ć etnom kiselinom.

[0096] Posle punjenja stub je ispran sa 5 zapremina stuba 50 mM natrijum acetatnog pufera podešenog na pH 4,5 sirć etnom kiselinom, sve dok se sav nevezani materijal ne ispere. Frakcija CDP870 Fab’ eluirana je sa gradijentom zapremine 20 stubova do koncentracije od 50 mM natrijum acetata i 250 mM NaCl podešene na pH 4,5 sa sirć etnom kiselinom. Eluirani CDP870 Fab’ je sakupljen kada je UV apsorbancija na 280 nm premašila 0,26 AU/cm dok nije pala ispod 0,54 AU/cm.

[0097] CDP870 Fab’ bazen je podvrgnut ultrafiltraciji u centrifugalnom koncentratoru koristeć i ultrafiltracionu membranu na bazi polietera sulfona sa graničnom vrednosti nominalne molekulske težine od 10 kDa što je rezultiralo koncentracijom CDP870 Fab’ bazena na 6 mg/ml. Posle toga je izvršena diafiltracija sve dok CDP870 Fab’ bazen u 20 mM Tris nije dostigao pH 8,0 i provodljivost od 1,1 mS/cm. Za dialfiltraciju je bilo potrebno 6 zapremina pufera.

[0098] Skup CDP870 Fab' je napunjen na stubu Capto K™ hromatografije za razmenu anjona kompanije GE Healthcare [visoko umrežena kruta agarozna zrnca (srednja veličina čestica 90 mm) sa kvartarnim amin ligandom za razmenu anjona pričvršć enim putem dekstranskog veziva (jonski kapacitet 0,16 - 0,22 mmol Cl-/ml)] pri brzini protoka od 500 cm/h i nanošenjem oko 5 g CDP870 Fab' po litru smole. Capto K™ stub za razmenu anjona je imao visinu sloja stuba od 10 cm i prečnika 7,7 mm. Stub je bio uravnotežen pre koraka hromatografije za rzmenu anjona sa 3 zapremine stubova od 20 mM Tris/1M NaCl pufera podešenih na pH 8,0 sa hlorovodoničnom kiselinom i 5 zapremina stubova od 20 mM Tris pufera podešenih na pH 8,0 sa hlorovodoničnom kiselinom.

[0099] Stub je zatim ispran sa 5 zapremina stubova pufera za uravnoteženje da bi se dobio CDP870 Fab ’.

[0100] Sakupljanje frakcije CDP870 Fab’ započelo je kada je UV apsorbancija na 280 nm premašila 0,5 AU/cm ubrzo nakon početka punjenja. Kraj sakupljanja frakcije dogodio se tokom pranja kada je UV apsorbancija pala ispod 0,5 AU/cm. Prinos za fragment antitela u ovom koraku bio je 90,5%.

Primer 2

[0101] CDP870 Fab’ je izražen kao heterologni protein u ć elijama doma ć ina E. coli u koncentraciji od 1,9 g/L. Heterologni protein je oslobođen iz periplazmatskog prostora ć elija doma ć ina dodavanjem Tris-EDTA i toplotnim tretmanom na 50°C. Ć elijski materijal je uklonjen centrifugiranjem, a ć elijski ekstrakt koji sadrži heterologni protein je podešen dodavanjem sirć etne kiseline na pH 4,5. Ekstrakt ć elijskog podešenog pH je zatim razbistren upotrebom kombinacije centrifugiranja i dubinske filtracije sa filtriranjem od 0,2 mm.

[0102] Pročišć eni ekstrakt (dovodni tok) je razblažen vodom sa faktorom razblaženja od 4 da bi se postigla provodljivost od 3,5 mS/cm.

[0103] Zatim je dovodni tok koji sadrži CDP870 Fab' napunjen na oko 51 g/L smole brzinom protoka od 300 cm/h na Capto S stubu za razmenu katjona kompanije GE Healthcare [visoko umrežena kruta agarozna zrna (srednja veličina čestica 90 mm) sa ligandom za razmenu sulfonatnih katjona prikačenim preko dekstran veznika (jonski kapacitet 0,11 - 0,14 mmol Na /ml)] . Capto S stub za razmenu katjona je imao visinu sloja stuba od 20 cm i prečnika 16 mm. Stub je bio uravnotežen pre punjenja struje dovodnog toka sa 3 zapremine stuba od 50 mM natrijum acetata/1 M NaCl puferom podešenim na pH 4,5 sa sirć etnom kiselinom i zatim sa 4 zapremine stuba od 50 mM pufera natrijum acetata sa sirć etnom kiselinom na pH 4,5.

[0104] Posle punjenja stub je ispran sa 6 zapremina stuba 50 mM natrijum acetatnog pufera podešenog na pH 4,5 sirć etnom kiselinom, dok se sav nevezani materijal ne ispere. Frakcija CDP870 Fab je eluirana sa do 8 zapremina stuba pufera sa 50 mM natrijum acetata i 200 mM NaCl podešen na pH 4,5 sa sirć etnom kiselinom. Eluirani CDP870 Fab’ je prikupljen kada je UV apsorbancija na 280 nm premašila 0,5 AU/cm dok nije pala ispod 0,5 AU/cm.

[0105] CDP870 Fab' bazen je podvrgnut ultrafiltraciji u centrifugalnom koncentratoru (Amicon) koristeć i ultrafiltracionu membranu na bazi polieter sulfona sa graničnim prelazom od nominalne molekulske težine od 10 kD što je rezultiralo koncentracijom CDP870 Fab' bazena na 18 mg/ml . Posle toga je izvršena diafiltracija sve dok CDP870 Fab’ bazen u 20 mM Tris nije dostigao pH 8,3 i provodljivost 1,0 mS/cm. Za dialfiltraciju je bilo potrebno 6 zapremina pufera.

[0106] CDP870 Fab' bazen je napunjen na stub Capto K hromatografije za razmenu anjona iz kompanije GE Healthcare [visoko umrežena kruta zrna agaroze (srednja veličina čestica 90 mm) sa kvartarnim amin-izmenjivačkim anionskim ligandom pričvršć enim putem dekstranskog veziva (jonski kapacitet 0,16 - 0,22 mmol Cl-/ml)] pri brzini protoka od 250 cm/h i nanošenjem oko 30 g CDP870 Fab' po litru smole. Capto K ™ stub za razmenu anjona je imao visinu sloja stuba od 10 cm i prečnika 7,7 mm. Stub je bio uravnotežen pre koraka hromatografije za razmenu anjona sa 3 zapremine stuba 20 mM Tris/1 M NaCl puferom podešenim na pH 8,3 sa hlorovodoničnom kiselinom i 5 zapremina stuba 20 mM Tris puferom podešenim na pH 8,3 sa hlorovodoničnom kiselinom.

[0107] Stub je zatim ispran sa 5 zapremina stuba pufera za uravnoteženje da bi se dobio CDP870 Fab’.

[0108] Sakupljanje frakcije CDP870 Fab’ započelo je kada je UV apsorbancija na 280 nm prešla 0,5 AU/cm ubrzo nakon početka punjenja. Kraj sakupljanja frakcija dogodio se tokom pranja kada je UV apsorbancija pala ispod 2,0 AU/cm.

Primer 3

[0109] CDP870 Fab’ je izražen kao heterologni protein u ć elijama doma ć ina E. coli u koncentraciji od 2,5 g/L. Heterologni protein je oslobođen iz periplazmatskog prostora ć elija doma ć ina dodavanjem Tris-EDTA i toplotnim tretmanom na 50°C. Ć elijski materijal je uklonjen centrifugiranjem, a ć elijski ekstrakt koji sadrži heterologni protein je podešen dodavanjem sirć etne kiseline na pH 4,5. Ekstrakt ć elijskog podešenog pH je zatim razbistren upotrebom kombinacije centrifugiranja i dubinske filtracije sa filtriranjem od 0,2 mm.

[0110] Pročišć eni ekstrakt (dovodni tok) je razblažen vodom sa faktorom razblaženja od 4 da bi se postigla provodljivost od 4,0 mS/cm.

[0111] Zatim se dovodni tok koji sadrži CDP870 Fab' napuni na oko 60 g/L smole pri brzini protoka od 400 cm/h na Capto S stuba za razmenu katjona kompanije GE Healthcare [visoko umrežena kruta zrna agaroze (srednja veličina čestica 90 mm) sa ligandom za razmenu katjonskih sulfonata prikačenim preko dekstran veznika (jonski kapacitet 0,11 - 0,14 mmol Na /ml)]. Capto S stub za razmenu imao je visinu sloja stuba od 24 cm i prečnika 20 cm. Stub je bio uravnotežen pre punjenja struje dovodnog toka sa 3 zapremine stuba od 50 mM natrijum acetata/1 M NaCl puferom podešenim na pH 4,5 sa sirć etnom kiselinom i zatim sa 4 zapremine stuba od 50 mM pufera natrijum acetata sa sirć etnom kiselinom na pH 4,5.

[0112] Posle punjenja stub je ispran sa 6 zapremina stuba 50 mM natrijum acetatnog pufera podešenog na pH 4,5 sirć etnom kiselinom, dok se sav nevezani materijal ne ispere. Frakcija CDP870 Fab’ je eluirana sa do 5 zapremina stuba pufera sa 50 mM natrijum acetata i 250 mM NaCl podešen na pH 4,5 sa sirć etnom kiselinom. Eluirani CDP870 Fab’ je prikupljen kada je UV apsorbancija na 280 nm premašila 1,75 AU/cm dok nije pala ispod 0,55 AU/cm.

[0113] CDP870 Fab’ je bio podvrgnut ultrafiltraciji u režimu tangencijalnog protoka koristeć i polietersulfonsku membranu od 0,4 m2 sa nominalnom graničnom granicom od 10 kDa (Pall 10k Omega Centramate T-Series). CDP870 Fab’ je koncentrovan na 51 mg/mL pre diafiltracije sa 5,8 zapremina 20 mM Tris pH 8,5, sve dok pH rastvora Fab’ nije bio pH 8,5 i provodljivost 0,8 mS/cm. Fab’ je izvučen iz opreme za ultrafiltraciju i objedinjen sa 600 ml 20 mM Tris pH 8,5 pufera koji se koristi za pranje bilo kog preostalog Fab’ iz sistema.

[0114] CDP870 Fab' bazen je napunjen na stub Capto Q hromatografije za razmenu anjona iz kompanije GE Healthcare [visoko umrežena kruta agarozna zrna (srednja veličina čestica 90 mm) sa kvandarnim amin ligandom za razmenu anjona pričvršć enim putem dekstranskog veziva (jonski kapacitet 0,16 - 0,22 mmol Cl-/ml)] pri brzini protoka od 200 cm/h i nanošenjem oko 37 g CDP870 Fab' po litru smole. Capto Q™ stub za razmenu anjona je imao visinu sloja stuba od 24 cm i prečnika 20 cm. Stub je bio uravnotežen pre koraka hromatografije za razmenu anjona sa 3 zapremine stuba od 20 mM Tris/1M NaCl pufera prilagođenih na pH 8,5 sa hlorovodoničnom kiselinom i 5 zapremina stuba od 20 mM Tris pufera prilagođenih na pH 8,5 sa hlorovodoničnom kiselinom.

[0115] Stub je zatim ispran sa 5 zapremina stuba pufera za uravnoteženje da bi se dobio CDP870 Fab’.

[0116] Sakupljanje frakcije CDP870 Fab’ je započelo kada je UV apsorbancija na 280 nm prešla 0,5 AU/cm ubrzo nakon početka punjenja. Kraj sakupljanja frakcija dogodio se tokom pranja kada je UV apsorbancija pala ispod 2,0 AU/cm.

Lista Referenci

[0117] Battersby,J.E., Snedecor,B., Chen,C., Champion,K.M., Riddle,L., and Vanderlaan,M. (2001). Analiza tečne hromatografije sa reverznofaznim afinitetom za kvantifikovanje rekombinantnih antitela i fragmenata antitela u fermentacionom bujonu. J Chromatogr A 927, 61-76.

Do,T., Ho,F., Heidecker,B., Witte,K., Chang,L., and Lerner,L. (2008). Brza metoda za određivanje dinamičkog vezivnog kapaciteta smola za prečiš ć avanje proteina. Protein Expr. Purif.60, 147-150.

Durany O,C.G.d.M.C.L.-S.J. (2004). Studije o ekspresiji rekombinantne fukuloza-1-fosfat aldolaze u Escherichia coli. Process Biochem 39, 1677-1684.

GE Healthcare data fajl 11-0025-76 AE. Hromatografija za razmenu jona. [11-0025-76 AE].2007. Ref Type: Data Fajl

Glover,D.J. i Humphreys,D.P. (2004). Fragmenti Antitela. U Antitelima, Tom 1: Proizvodnja i prečišć avanje, G.Subramanian, ed. (New York: Kluwer Academic/Plenum Publishers), pp.25-73.

Holliger,P. i Hudson,P.J. (2005). Konstruisani fragmenti antitela i porast pojedinačnih domena. Nat Biotechnol 23, 1126-1136.

Humphreys,D.P. (2003). Proizvodnja antitela i fragmenata antitela u Escherichia coli i poređenje njihovih funkcija, upotreba i modifikacija. Curr Opin Drug Discov Devel 6, 188-196.

Humphreys,D.P. i Glover,D.J. (2001). Tehnologije terapijske proizvodnje antitela: molekuli, primena, ekspresija i prečišć avanje. Curr Opin Drug Discov Devel 4, 172-185.

Humphreys,D.P., Heywood,S.P., King,L.M., Bowering,L.C., Turner,J.P., and Lane,S.E. (2004). Inženjering Escherichia coli za poboljšanje prečišć avanja periplazmatičnih fragmenata Fab’ : promena pl hromozomski kodiranog proteina PhoS/PstS. Protein Expr. Purif. 37, 109-118.

Jana,S. and Deb,J.K. (2005). Strategije za efikasnu proizvodnju heterolognih proteina u Escherichia coli. Appl Microbiol Biotechnol 67, 289-298.

Makrides,S.C. (1996). Strategije za postizanje visokog nivoa ekspresije gena u Escherichia coli. Microbiol Rev 60, 512-538.

McCue,J.T., Kemp,G., Low,D., and Quinones-Garcia,l. (2003). Evaluacija proteina-A hromatografskog medija. J Chromatogr A 989, 139-153.

Spitali,M. (2009). Nizvodna obrada fragmenata monoklonskih antitela. U Procesnom prečišć avanju antitela, U.Gottschalk, ed. John Wiley & Sons, Inc.), pp.349-372.

Swartz,J.R. (2001). Napredak u proizvodnji terapijskih proteina Escherichia coli. Curr Opin Biotechnol 12, 195-201.

Terpe,K. (2006). Pregled bakterijskih ekspresijskih sistema za proizvodnju heterolognih proteina: od molekularnih i biohemijskih osnova do komercijalnih sistema. Appl Microbiol Biotechnol 72, 211-222.

Tugcu,N. (2008). Prečiš ć avanje proteina primenom pomeraju ć e hromatografije. Methods Mol Biol 421, 71-89.

Walsh,G. (2007). Biofarmaceutika: Trendovi odobrenja u 2006. BioPharm International 21.

Claims (18)

Patentni Zahtevi:

1. Proces za prečišć avanje fragmenta antitela iz ekstrakta periplazmatske ć elije iz gram negativnih bakterija odabranih iz sojeva E. coli MC4100, TG1, TG2, DHB4, DH5α, DH1, BL21, K12, XL1Blue, JM109 i W3110, koji sadrži:

a) prvi korak hromatografije za hvatanje fragmenta antitela pri čemu je smeša koja sadrži fragment antitela u koncentraciji od najmanje 1,5 g/L podvrgnuta hromatografiji za razmenu katjona i potom eluirana da bi se dobio prvi eluat koji sadrži fragment antitela; i

b) drugi korak hromatografije u kome se prvi eluat podvrgava hromatografiji za razmenu anjona da bi se uhvatile nečisto ć e i proizveo protok koji sadrži fragment antitela,

pri čemu postupak ne sadrži više od dva koraka hromatografije.

2. Proces prema patentnom zahtevu 1, pri čemu se svi koraci hromatografije izvode na hromatografskom stubu.

3. Proces prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 2, pri čemu se hromatografija za razmenu katjona izvodi u režimu elucije.

4. Proces prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 3, pri čemu prvi korak hromatografije katjona sadrži sledeć e korake u nizu:

a) punjenje smeše, kao što je ekstrakt periplazmatske ć elije, koja sadrži fragment antitela na stubu za razmenu katjona,

b) pranje stuba za razmenu katjona puferom za pranje pri čemu tokom pranja provodljivost, pH i koncentracija soli pufera ostaju u osnovi nepromenjene, i

c) eluiranje fragmenta antitela puferom za eluiranje.

5. Proces prema patentnom zahtevu 4, pri čemu je pH pufera za pranje identičan pH smeše koja sadrži fragment antitela pre prvog koraka hromatografije.

6. Proces prema patentnom zahtevu 4 ili 5, pri čemu smeša koja sadrži fragment antitela, pre prvog koraka hromatografije, ima pH između 4,0 i 5,0.

7. Proces prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 6, pri čemu u prvom koraku hromatografije smeša koja sadrži fragment antitela sadrži bakterijski protein ć elije doma ć ina u količini od oko 200 mg/ml do 10.000 mg/ml, pre nego što se podvrgne hromatografija za razmenu katjona.

8. Proces prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 7, pri čemu se hromatografija za razmenu katjona u prvom koraku hromatografije izvodi pri brzini protoka od najmanje 300 cm/h.

9. Proces prema bilo kojem od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu se hromatografija za razmenu katjona u prvom koraku hromatografije izvodi sa provodnošć u koja nije ve ć a od 6 mS/cm.

10. Proces prema bilo kojem od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu se hromatografija za razmenu katjona u prvom koraku hromatografije izvodi u hromatografskom stubu koji sadrži sulfonil, sulfopropil ili karboksimetil uparen sa smolom.

11. Proces prema bilo kojem od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu hromatografski stub za razmenu katjona u prvom koraku hromatografije ima dinamički kapacitet vezivanja za fragment antitela između 50 i 75 g/L smole.

12. Proces prema patentnom zahtevu 10 ili 11, pri čemu smola hromatografskog stuba za razmenu katjona u prvom koraku hromatografije ima srednju veličinu čestica od najmanje 50 µm.

13. Proces prema bilo kojem od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu se u hromatografiju za razmenu katjona u primarnom koraku hvatanja učitava između 5 i 100g fragmenta antitela po litru smole.

14. Proces prema bilo kojem od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu se hromatografija za razmenu anjona u drugom koraku hromatografije izvodi na smoli koja sadrži kvaternarni amonijum (Q), dietilaminoetil (DEAE) ili trimetilaminoetil (TMAE).

15. Proces prema bilo kojem od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu je fragment antitela Fab, Fab’ ili scFv.

16. Proces prema patentnom zahtevu 15, pri čemu se Fab ili Fab’ specifično vežu za VEGF-A, FcRn, OX40, glikoprotein IIb/IIIa receptor, C5, HER2/neu, TNFα, IL1β ili CD40-L.

17. Proces prema patentnom zahtevu 16, gde je Fab ili Fab’ abciksimab, ranibizumab, pekselizumab, CDP870, CDP484 ili CDP7657.

18. Proces prema bilo kojem od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu fragment antitela oporavljen iz postupka sadrži protein ć elije doma ć ina u količini ne ve ć oj od 150 delova na milion.