RS61182B1 - Antagonisti integrina - Google Patents

Description

Opis

OBLAST TEHNIKE PRONALASKA

[0001] Ovaj predmetni pronalazak se odnosi na nove antagoniste integrina i primenu ovih jedinjenja kao leka, posebno za inhibiranje neovaskularizacije.

STANJE TEHNIKE PRONALASKA

[0002] Dijabetesni makularni edem (DME) je nakupljanje tečnosti u makuli pacijenta sa dijabetesnom retinopatijom (DR), koja se može pojaviti u bilo kojoj fazi bolesti. DR je jedna od najčešćih mikrovaskularnih komplikacija dijabetesa. DR koji ugrožava vid (tj. DME i proliferativna dijabetesna retinopatija (PDR) je vodeći uzrok oštećenja vida i slepila kod odraslih radno sposobnih ljudi širom sveta. Globalno, ukupna rasprostranjenost DR-a procenjuje se na 34.6% ljudi sa dijabetesom, dok se ukupna rasprostranjenost DME procenjuje na približno 20% osoba sa DR-om (Yau et al., 2012). Očekuje se da će rasprostranjenost DME-a i dalje rasti zbog sve veće rasprostranjenosti dijabetesa, starenja stanovništva i očekivano povećanog životnog veka osoba sa dijabetesom: broj odraslih sa dijabetesom širom sveta procenjen je na 425 miliona u 2017. i očekuje se da će se povećati na 629 miliona do 2045.

[0003] Iako tačni mehanizmi kojima dijabetes uzrokuje retinopatiju ostaju nejasni, nekoliko studija je pokazalo povećanje reaktivnih vrsta kiseonika, naprednih krajnjih glikacionih proizvoda i cirkulišućih citokina i hemokina staklastog tela u odnosu na bolest. Upala u mrežnjači je glavno rano patološko obeležje DR-a. Inflamatorni i vazodilatatorni faktori mogu modifikovati funkciju endotela, što dovodi do propadanja krvno-retinalne barijere, što rezultira nagomilavanjem proteina plazme i lipida u makuli. Kada zadebljanje zahvati foveu ili preti da zahvati foveu, pacijent postaje siptomatski sa metamorfopsijom i gubitkom vida.

[0004] Utvrdjeno je da je interakcija između staklastog tela i mrežnjače uključena u razvoj edema makule. Naročito, kada su staklasto telo i makularni deo mrežnjače čvrsto sjedinjeni, makularni edem se može promovisati u velikoj meri. Među pacijentima sa DR-om, DME je bio prisutan samo u 20% pacijenata sa zadnjim odvajanjem staklastog tela (posterior vitreous detachment - PVD) u poredjenju sa 55% pacijenata bez PVD-a, što ukazuje na snažan zaštitni efekat PVD-a. Predloženi mehanizam za potencijalnu korist PVD-a je ublažavanje vitreomakularne vuče, međutim, takođe se sugeriše da i transvitrealna oksigenacija i poboljšana difuzija faktora rasta (odvojeno od predmakularnog hijaloida) mogu imati korisne (blagotvorne) efekte.

[0005] Dobra kontrola glukoze u krvi, krvnog pritiska i lipida u krvi je od suštinskog značaja i može odložiti nastanak DR i usporiti njegovo napredovanje. Lečenje se u nekim slučajevima vrši fokalno/rešetkastom laserskom fotokoagulacijom korišćenjem male laserske opekotine sa intenzitetom svetlosti (50-100 µm) na mikroneurizmama ili difuznim područjima zadebljanja. Međutim, ovaj tretman može rezultovati komplikacijama poput gubitka centralnog vida, centralnih skotoma i smanjenjem vida u boji. U novije vreme je razvijen potgranični („subthreshold“) mikropulsni laser kao tretman kojim se teoretski izbegava oštećenje unutrašnje neurosenzorne mrežnjače, čime se smanjuju potencijalne komplikacije.

[0006] Nekoliko farmakoloških agenasa je sada dostupno za lečenje DME, uključujući agense protiv vaskularnog endotelijalnog faktora rasta (vascular endothelial growth faktor - VEGF) i kortikosteroide. VEGF je moćan faktor vazopropustljivosti koji doprinosi zadebljanju makule i oštećenju vida povezanim sa DME. Anti-VEGF jedinjenja smanjuju angiogenezu i vaskularnu propustljivost, uzrokujući regresiju neovaskularizacije i smanjenje edema. Nekoliko kliničkih studija pokazalo je da je anti-VEGF lečenje efikasnije od fokalnog/rešetkastog laserskog lečenja pri smanjenju debljine centralnog polja (central subfield thickness - CST) i poboljšanju vida kod pacijenata sa DME. Neželjeni događaji (AEs) povezani sa anti-VEGF lečenjem su retki i uglavnom se odnose na potrebu za ponovljenim intravitrealnim (IVT) injekcijama tokom dužeg vremenskog perioda.

[0007] Upala igra važnu ulogu u patogenezi DME. Citokini i hemokini koje leukociti oslobađaju u krv značajno povećavaju vaskularnu propustljivost što dovodi do nakupljanja više tečnosti ispod mrežnjače. Kortikosteroidne terapije mogu inhibirati medijatore upale. Nekoliko kliničkih studija pokazalo je da kortikosteroidi efikasno smanjuju CST i poboljšavaju vid kod DME. Iako je teret lečenja kortikosteroidnim implantima mnogo manji od opterećenja anti-VEGF agensima, intraokularni kortikosteroidi su povezani sa povećanim rizicima od razvoja katarakte i povišenja interokularnog pritiska. Sve u svemu, primena IVT kortikosteroida kod pacijenata sa DME je stoga rezervisana kao terapija druge linije kod onih koji slabo reaguju na IVT anti-VEGF terapiju i kontraindikovana je kod pacijenata sa osnovnim glaukomom.

[0008] Od gore navedenih mogućih lečenja DME, agensi protiv VEGF su trenutno zlatni standard prve linije lečenja za DME. Većina dosadašnjih studija izveštava da značajan udeo pacijenata sa DME, do 40%, ima trajni edem i gubitak vidne oštrine uprkos lečenju protiv VEGF. Ovi nalazi sugerišu da drugi putevi, nezavisno od VEGF, doprinose razvoju DME, pa stoga postoji važna klinička potreba za dodatnim efikasnim lečenjima DME.

[0009] Integrini čine familiju transmembranskih receptora na površini ćelije koji mogu da posreduju u interakcijama ćelija-ćelija i ćelija-vanćelijski matriks. Integrini su uključeni u različite biološke procese uključujući diferencijaciju ćelije, adheziju, oblik, migraciju, pokretljivost, invaziju, proliferaciju i preživljavanje. Zbog svoje uloge u ovim biološkim procesima, integrini su takođe povezani sa različitim patološkim stanjima, kao što su kancer i oftamološki poremećaji. Pokazalo se da u oku integrini igraju važnu ulogu u neovaskularizaciji, vaskularnoj propustljivosti i vitreoretinalnoj adheziji.

[0010] Integrini su obavezni heterodimerni receptori koji se sastoje od nekovalentno vezanih α i β podjedinica. Različite kombinacije 18α i 8 β poznatih podjedinica čine familiju od 24 heterodimernih članova integrina prepoznatih do sada. Familija integrinskih receptora može se široko kvalifikovati u 4 različite kategorije u zavisnosti od njihovog obrasca prepoznavanja liganda: 1) vezivanje tripeptida L-arginin-glicin-asparaginska kiselina (RGD), 2) vezivanje kolagena, 3) vezivanje laminina i 4) tipovi integrina koji vezuju leukocite.

[0011] Interakcija integrina sa ekstraćelijskim matriksom može dovesti do neovaskularizacije površine mrežnjače, koja se eventualno može proširiti prema regionu staklastog tela. Imunohistološko bojenje na humanim tkivima mrežnjače izvedeno od pacijenata sa PDR-om pokazalo je da aktivno proliferirajuće vaskularne endotelijalne ćelije eksprimiraju integrine αvβ3i αvβ5, koji nisu visoko eksprimirani u mirujućim endotelnim ćelijama (Friedlander et al., 1996; Ning et al., 2008). Pored toga, pokazalo se da su αvβ3i αIIbβ3eksprimirani u fibrovaskularnim epiretinalnim membranama pacijenata sa aktivnim PDR-om u fibrotičnom stanju (Ning et al., 2008; Abu El-Asrar, Missotten i Geboes, 2010), dok je pokazano da je α5β1 preterano eksprimiran u laserski-indukovanom mišjem modelu CNV-a (Umeda et al., 2006). U skladu sa ovim, nekoliko nekliničkih studija pokazalo je da inhibicija integrina umanjuje leukostazu i vaskularnu propustljivost mrežnjače (Santulli et al., 2008; Iliaki et al., 2009; Rao et al., 2010). Antagonizam αvβ3i αvβ5sprečio je neovaskularizaciju mrežnjače ali nije naštetio već postojećim krvnim sudovima (Friedlander et al., 1996; Hammes et al.,1996; Lahdenranta et al., 2007; Santulli et al., 2008), dok je inhibicija α5β1inhibirala endotelijalnu ćelijsku proliferaciju i proizvela regresiju horoidnih neovaskularnih membrana u različitim životinjskim modelima (Ramakrishnan et al., 2006; Umeda et al., 2006).

[0012] Motiv RGD se vrlo često nalazi u mnogim komponentama ekstraćelijskog matriksa, uključujući vitronektin, fibronektin i fibrinogen. Integrini su zbog toga tesno povezani sa proteinima ekstraćelijskog matriksa, čime posreduju u adheziji ćelija-ekstraćelijski matriks, na primer u vitreoretinalnom interfejsu. Poznato je da se analogi RGD motiv takmiči za RGD motiv proteina ekstraćelijskog matriksa da poremeti interakcije integrin-ekstraćelijski matriks i stoga olabavi vezivanje u in vitro eksperimentima (Gehlsen et al., 1988; Pierschbacher i Ruoslahti, 1987; Zhou, Zhang i Yue, 1996). U skladu sa ovim, pokazalo se da IVT injekcija rastvorljivih RGD peptida indukuje PVD u očima zeca (Oliveira et al., 2002). Štaviše, pokazano je da su, 3 IVT injekcije antagonista integrina ALG 1001 (Allegro Ophthalmics, LLC) kod ljudi indukovale ukupni PVD kod 6 od 11 pacijenata sa DME bez ili sa delimičnim PVD, na početku u inicijalnoj studiji dokazivanja koncepta (Kuppermann, 2013; Boyer et al., 2014).

[0013] Ova zapažanja potkrepljuju sklonost ka korišćenju pan-integrinskog antagonista koji cilja različite vrste integrina koji leže u osnovi različitih aspekata bolesti koja se leči, pre svega αvβ3, αvβ5i α5β1. Složenost je u tome što će takvi pan-integrinski antagonisti često antagonizovati i druge RGD-vezujuće integrine, što može prouzrokovati neželjene efekte. Najznačajniji je integrin trombocita, αIIbβ3, čiji antagonizam može ometati aktivaciju i agregaciju trombocita.

[0014] Objave patentnih prijava WO2011/119282 A1, WO2011/094285 A1, US2006/0052398 A1 i US2008/058348 A1 stavljaju na uvid javnosti jedinjenja kao potencijalne antagoniste integrina ili kao potencijalne antagoniste receptora vitronektina. Jedinjenja stavljena na uvid javnosti u ovim patentnim prijavama mogu se sumirati kao generalno odgovarajuća Formuli A

pri čemu, obično G1predstavlja supstituisani piridin ili tetrahidro naftiridin, R1i R2su vodonik, metil ili etil, i R3je hidrofobna repna grupa. Konkretno, u prikazanim jedinjenjima sa potvrđenom aktivnošću, R3sadrži alkil, cikloalkil ili (hetero)aromatičnu krajnju grupu.

[0015] Postoji potreba za novim antagonistima integrina, posebno antagonistima integrina koji istovremeno deluju na različite vrste integrina koji su uključeni u puteve bolesti, kao što su αvβ3, αvβ5i α5β1. ali koji imaju smanjeni rizik od ometanja agregacije trombocita svojim dejstvom na αIIbβ3.

SUŠTINA PRONALASKA

[0016] Predmetni pronalazak obezbeđuje jedinjenja prema formuli (I) ili farmaceutski prihvatljivu so, farmaceutski prihvatljiv solvat, izomer ili njihovu smešu,

pri čemu

R1i R2su nezavisno izabrani iz grupe koja se sastoji od vodonika, metila ili etila; i Alk je C1-4alkilen.

[0017] Predmetni pronalazak se dalje odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja sadrži jedinjenje predmetnog pronalaska, i jedan ili više farmaceutski prihvatljivih nosača.

[0018] Predmetni pronalazak se dalje odnosi na jedinjenja za primenu kao lek. Dalji cilj predmetnog pronalaska je da obezbedi jedinjenja koja inhibiraju patološku neovaskularizaciju.

[0019] Predmetni pronalazak se dalje odnosi na jedinjenja za primenu u lečenju i/ili prevenciji oftamoloških poremećaja, poput dijabetesnog makularnog edema i dijabetesne retinopatije.

KRATAK OPIS SLIKA NACRTA

[0020]

SLI. 1 Prikazuje EC50 odnose za cpd1, cpd2, cpd3 i uporedna jedinjenja cpdA i cpdB za integrin αvβ3prema αIIbβ3(niže vrednosti ukazuju na veću specifičnost za αvβ3).

SLI. 2 Prikazuje inhibiciju kapilarnog klijanja od strane cpd3 u testu murinskog horoidalnog eksplantata.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0021] Dalje se razume da se sve definicije i prednosti kako je opisano za gore navedena jedinjenja predmetnog pronalaska podjednako primenjuju i za ovo tehničko rešenje i za sva dalja tehnička rešenja, kao što je dole opisano.

[0022] Kao što se koristi u prethodnom i daljem tekstu, primenjuju se sledeće definicije ukoliko nije drugačije naznačeno.

[0023] Izraz "alkilen", sam ili u kombinaciji označava diradikal izveden iz alkana, koji može biti alkilen ravnog lanca ili razgranati alkilen, koji sadrži od 1 do 4 atoma ugljenika. Ravni lanac ili razgranata alkilenska grupa su vezani na bilo kojoj dostupnoj tački da bi se dobilo stabilno jedinjenje. Prema nekim tehničkim rešenjima CA-Balkilen definiše ravan ili razgranat alkilenski diradikal koji ima od A do B ugljenikovih atoma, npr. C1-4alkilen definiše ravan ili razgranat alkilenski diradikal koji ima od 1 do 4 ugljenikovih atoma, kao što su na primer metilen, etilen, 1-propilen, 2-propilen, I-butilen, 2-butilen, 2-metil-1-propilen.

[0024] Tamo gde se upućuje na procente, ovo se odnosi na masu u masenim procentima, osim ako kontekst jasno ne nalaže drugačije.

[0025] Kao što je ovde prethodno opisano, predmetni pronalazak obezbeđuje jedinjenja prema formuli (I) ili farmaceutski prihvatljivu so, farmaceutski prihvatljiv solvat, izomer ili njihovu smešu,

pri čemu

R1i R2su nezavisno izabrani iz grupe koji se sastoji od vodonika, metila ili etila; i Alk je C1-4alkilen.

[0026] Prema određenom tehničkom rešenju predmetnog pronalaska, ili su R1i R2oba metil, ili je R1vodonik a R2je etil.

[0027] Prema poželjnom tehničkom rešenju, predmetni pronalazak obezbeđuje ona jedinjenja u kojima su R1i R2oba metil.

[0028] Prema određenom tehničkom rešenju predmetnog pronalaska, Alk je C1-2alkilen.

[0029] Prema poželjnom tehničkom rešenju predmetnog pronalaska, jedinjenje je izabrano iz grupe koja se sastoji od

ili farmaceutski prihvatljive soli, farmaceutski prihvatljivog solvata, izomera ili njihove smeše.

[0030] Jedinjenje predmetnog pronalaska, kao što je detaljno objašnjeno gore, može da ima centar hiralnosti i postoji u stereohemijski izomernim oblicima. Izraz "stereohemijski izomerni oblici" kako se ovde koristi, definiše sva moguća jedinjenja koja se sastoje od istih atoma povezanih istim nizom veza ali koji imaju različite trodimenzionalne strukture koje nisu međusobno zamenljive, što može posedovati anti inflamatorno jedinjenje kako je ovde navedeno.

[0031] Ukoliko nije drugačije navedeno ili naznačeno, hemijska oznaka jedinjenja, kao što je gore detaljno opisano, obuhvata smešu svih mogućih stereohemijski izomernih oblika, koje navedena jedinjenja mogu da poseduju. Navedena smeša može da sarži sve dijastereomere i/ili enantiomere osnovne molekulske strukture pomenutih jedinjenja za primenu. Svi stereohemijski izomerni oblici jedinjenja predmetnog pronalaska kako u čistom obliku tako i međusobno pomešani, podrazumeva se da budu obuhvaćeni obimom zaštite predmetnog pronalaska.

[0032] U poželjnom tehničkom rešenju, predmetni pronalazak obezbeđuje (S) enantiomerne oblike jedinjenja prema Formuli I. Prema tome, u posebnom tehničkom rešenju, predmetni pronalazak obezbeđuje jedinjenje prema Formuli II,

gde su R1, R2i Alk kako je definisano u prijavi.

[0033] U daljem tehničkom rešenju, predmetni pronalazak obezbeđuje jedinjenje izabrano iz grupe koja se sastoji od

i

ili farmaceutski prihvatljive soli, farmaceutski prihvatljivog solvata, izomera ili njihove smeše.

[0034] Za terapijsku primenu, soli jedinjenja za primenu u predmetnom pronalasku, kao što je gore detaljno objašnjeno, su one gde je kontra jon farmaceutski prihvatljiv, te soli se mogu označi kao farmaceutski prihvatljive kisele ili bazne adicione soli. Međutim, soli kiselina i baza koje nisu farmaceutski prihvatljive mogu takođe naći primenu, na primer, u pripremi ili prečišćavanju farmaceutski prihvatljivog jedinjenja. Sve soli, bilo da su farmaceutski prihvatljive ili ne, uključene su u okvir predmetnog pronalaska.

[0035] Farmaceutski prihvatljive kisele i bazne adicione soli kao što je ovde gore pomenuto treba da sadrže terapijski aktivne netoksične oblike kisele i bazne adicione soli koje jedinjenja za primenu u predmetnom pronalasku, kao što je gore detaljno objašnjeno, mogu da formiraju. Farmaceutski prihvatljive kisele adicione soli mogu se pogodno dobiti tretiranjem baznog oblika sa odgovarajućom kiselinom u anjonskom obliku. Odgovarajući anjoni obuhvataju, na primer, trifluoroacetat, acetat, benzenesulfonat, benzoat, bikarbonat, bitartrat, bromid, kalcijum edetat, kamsijat, karbonat, hlorid, citrat, dihidrohlorid, edetat, edizilat, estolat, ezilat, fumarat, gluceptat, glukonat, glutamat, glikolilarsanilat, heksilresorcinat, hidrabamin, hidrobromid, hidrohlorid, hidroksinaftoat, jodid, izetionat, laktat, laktobionat, malat, maleat, mandelat, mezilat, metilbromid, metilnitrat, metilsulfat, mukat, napsilat, nitrat, pamoat (embonat), pantotenat, fosfat/difosfat, poligalakturonat, salicilat, stearat, subacetat, sukcinat, sulfat, tanat, tartrat, teoklat, trietijodid i slično. Kontra jon po izboru može da se uvede pomoću jonoizmenjivačkih smola. Suprotno tome, navedeni oblici soli mogu se pretvoriti tretiranjem odgovarajućom bazom u oblik slobodne baze. Poželjna so je hidrohloridna so ovde opisanih jedinjenja.

[0036] Jedinjenja za primenu kako je ovde naznačeno, koja sadrže kiseli proton takođe se mogu pretvoriti u njihove netoksične oblike adicionih soli metala ili amina tretiranjem odgovarajućim organskim i neorganskim bazama u obliku katjona. Odgovarajuće bazne soli uključuju soli formirane sa organskim katjonima kao što su benzatin, hloroprokain, holin, dietanolamin, etilendiamin, meglumin, prokain, i slično; i one nastale sa metalnim katjonima kao što su aluminijum, kalcijum, litijum, magnezijum, kalijum, natrijum, cink, i slično. Suprotno tome navedeni oblici soli mogu se pretvoriti, tretiranjem sa odgovarajućom kiselinom, u slobodni oblik.

[0037] Izraz adiciona so kako je ovde korišćeno u prethodnom tekstu takođe uključuje solvate koja jedinjenja za primenu, kao što je ovde naznačeno, kao i njihove soli mogu da formiraju. Takvi solvati su na primer hidrati, alkoholati i slično.

[0038] Kao što će se razumeti iz objava ovde, ovaj pronalazak posebno obezbeđuje izolovana jedinjenja i izolovane kompozicije. Jedinjenja se posebno dobijaju in vitro sintezom, kao što je hemijska sinteza. U daljem tehničkom rešenju, jedinjenja pronalaska imaju čistoću od najmanje 85%, naročito najmanje 90%, a tačnije najmanje 95%. U posebnom tehničkom rešenju, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak za dobijanje jedinjenja prema predmetnom pronalasku, postupak koji uključuje hemijsku sintezu jedinjenja predmetnog pronalaska i pakovanje sintetisanog jedinjenja u sterilnu posudu. U daljem tehničkom rešenju, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak za dobijanje jedinjenja prema predmetnom pronalasku, postupak koji uključuje hemijsku sintezu jedinjenja sa čistoćom od najmanje 85%, naročito najmanje 90%, tačnije najmanje 95%. Poželjno je da se sintetisano jedinjenje naknadno pakuje u sterilnu posudu.

KOMPOZICIJE

[0039] Predmetni pronalazak se dalje odnosi na farmaceutsku kompoziciju, kompozicija koja sadrži jedinjenje kako je gore definisano i kako je definisano u bilo kojem od ovde predstavljenih tehničkih rešenja.

[0040] U ostatku teksta, izraz "jedinjenje" ili "jedinjenje prema pronalasku" se razume, u svrhu ovog predmetnog pronalaska, i u množini i u jednini, što znači da inovativna kompozicija može da sadrži jedno ili više od jednog "jedinjenja prema pronalasku".

[0041] U posebnom tehničkom rešenju, predmetni pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži jedinjenje prema bilo kom od patentnih zahteva, i jedan ili više farmaceutski prihvatljivih nosača. Primeri farmaceutski prihvatljivih formulacija kao i postupka za njihovu izradu mogu se naći, npr., u Remington's s Pharmaceutical Sciences (npr.20. izdanje; Lippincott, Williams & Wilkins, 2000) ili u bilo kom priručniku o farmakopeji (npr. Američkoj-, Evropskoj- ili Međunarodnoj farmakopeji).

[0042] U još jednom tehničkom rešenju, predmetni pronalazak obezbeđuje kompoziciju koja sadrži vodeni pufer u kome je rastvoreno jedinjenje predmetnog pronalaska. U daljem tehničkom rešenju, predmetni pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži vodeni pufer u kome su rastvoreni jedinjenje predmetnog pronalaska i jedan ili više farmaceutski prihvatljivih nosača. U još jednom daljem tehničkom rešenju, predmetni pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja se sastoji od vodenog pufera, jedinjenje predmetnog pronalaska i jednog ili više farmaceutski prihvatljivih nosača.

[0043] U posebnom tehničkom rešenju, predmetni pronalazak obezbeđuje kompoziciju koja sadrži antagonist integrina, gde je najmanje 90% jedinjenja antagonista integrina u kompoziciji jedinjenje prema predmetnom pronalasku. Poželjno je da je najmanje 95%, naročito najmanje 99% jedinjenja antagonsta integrina pronalaska jedinjenje prema pronalasku. U još jednom posebnom tehničkom rešenju, kompozicije pronalaska su u suštini bez drugog antagonista integrina, kao što je jedinjenje A. U daljem tehničkom rešenju, odnos jedinjenja pronalaska u odnosu na druga jedinjenja antagonista integrina, kao što je jedinjenje A, je veći od 98:2, posebno veći od 99:1, naročitije veći od 99.9:0.1. U još jednom tehničkom rešenju, predmetni pronalazak obezbeđuje kompoziciju kako je ovde opisano, pri čemu je kompozicija u osnovi bez jedinjenja A, naročito gde kompozicija sadrži manje od 3%, posebno manje od 2%, poželjno manje od 1% jedinjenja A, tačnije pod uslovom da kompozicija ne sadrži jedinjenje A.

[0044] U još jednom tehničkom rešenju, ovaj pronalazak obezbeđuje kompoziciju koja sadrži prvi aktivni sastojak i drugi aktivni sastojak, pri čemu je prvi aktivni sastojak antagonist integrina prema pronalasku, a pri čemu je ta kompozicija u osnovi bez antagonista integrina osim prvog aktivnog sastojka. U daljem tehničkom rešenju, drugi aktivni sastojak je jedinjenje koje se vezuje za i inhibira aktivnost VEGF ili VEGF receptora.

[0045] Antagonist integrina ili jedinjenje antagonista integrina u ovoj prijavi se poželjno odnosi na jedinjenje koje ima polovinu maksimalne efikasne koncentracije (EC50) prema integrinskim receptorima manju od 1 µM, naročito EC50 prema αvβ3integrinskim receptorom. Pogodni postupci za određivanje EC50 vrednosti poznati su stručnjaku u oblasti. Jedan određen postupak za određivanje vrednosti za određeno jedinjenje je kompetitivni ELISA test u kome se ispitivani receptor za integrin (naročito humani αvβ3receptor za integrin) oblaže preko ploče sa više bunara pomoću rastvora od 4 µg/mL i bunari se blokiraju sa 5% govedjeg serumskog albumina. Koncentracija fibronektina koja će se koristiti u testu određuje se eksperimentalno u odvojenom eksperimentu ispitivanjem vezivanja različitih koncentracija fibronektina za obložen integrin koji se ispituje, pri čemu je koncentracija fibronektina u testu ona koja daje 80% maksimalnog vezivanja. Odredjena koncentracija humanog fibronektina se zatim dodaje u obložene i blokirane bunare u prisustvu rastućih koncentracija jedinjenja. Posle 2h inkubacije na 37°C, bunari se isperu i vezani fibronektin se detektuje uz pomoć određenog reagensa, kao što je detektibilno antitelo protiv fibronektina. Zatim se vrši kvantitativna analiza podataka da bi se odredile EC50 vrednosti, tj. koncentracija jedinjenja koja smanjuje vezivanje fibronektina za obloženi receptor za 50%.

[0046] U drugom tehničkom rešenju, predmetni pronalazak obezbeđuje kompoziciju koja sadrži vodeni pufer i jedinjenje pronalaska. U daljem tehničkom rešenju, predmetni pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži vodeni pufer, jedinjenje pronalaska i jedan ili više farmaceutski prihvatljivih nosača. U još jednom daljem tehničkom rešenju, predmetni pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja se sastoji od vodenog pufera, jedinjenja pronalaska i jednog ili više farmaceutski prihvatljivih nosača.

[0047] U posebnom tehničkom rešenju, predmetni pronalazak obezbeđuje kompoziciju koja sadrži između 0.1 i 1000 mg jedinjenja pronalaska po ml kompozicije, naročito između 1 i 500 mg/ml, tačnije 1 i 100 mg/ml. U daljem tehničkom rešenju, kompozicija sadrži između 10 i 100 mg/ml, kao što je između 20 i 75 mg/ml.

JEDINJENJA I/ILI KOMPOZICIJE ZA PRIMENU KAO LEK

[0048] Predmetni pronalazak se dalje odnosi na jedinjenje za primenu kao lek.

[0049] U posebnom tehničkom rešenju, predmetni pronalazak se odnosi na jedinjenje za primenu u inhibiranju neovaskularizacije.

[0050] U daljem tehničkom rešenju, predmetni pronalazak se odnosi na jedinjenje za primenu u lečenju i/ili prevenciji kancera. Naročito za inhibiciju rasta kancera i/ili metastaza.

[0051] U još jednom tehničkom rešenju, predmetni pronalazak se odnosi na jedinjenje za primenu u lečenju i/ili prevenciji oftamološkog poremećaja. Naročito za lečenje i/ili sprečavanje neovaskularizacije u oku. Uopštenije, predmetni pronalazak obezbeđuje farmaceutska jedinjenja i kompozicije za lečenje, smanjenje, poboljšanje, ili inhibiranje napredovanja, (patološke) očne neovaskularizacija. U drugom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje farmaceutska jedinjenja i kompozicije za lečenje, smanjenje, poboljšanje, ili inhibiranje napredovanja, oftamološkog poremećaja koji je posledica ili ima etiologiju neovaskularizacije oka.

[0052] U daljem tehničkom rešenju, predmetni pronalazak se odnosi na jedinjenje za primenu u lečenju i/ili prevenciji oftamoloških poremećaja, pri čemu je navedeni oftamološki poremećaj izabran iz grupe koja se sastoji od vlažne makularne degeneracije povezane sa starošću, odvajanja mrežnjače, zadnjeg uveitisa, neovaskularizacije rožnjače, neovaskularizacije irisa, dijabetesnog edema makule, i dijabetesne retinopatije.

[0053] U još jednom tehničkom rešenju, jedinjenja pronalaska su predviđena za primenu kao antagonist integrina, naročito antagonist receptor vitronektina, in vitro ili in vivo. U posebnom tehničkom rešenju, integrin je RGD-vezujući integrin. U daljem tehničkom rešenju, integrin je integrin koji sadrži αv, α5ili α8podjedinicu. U konkretnijem tehničkom rešenju, integrin je αvβ3, αvβ5ili α5β1receptor.

[0054] U drugom tehničkom rešenju, jedinjenja pronalaska su za primenu u smanjenju vaskularne propustljivosti, poželjno za smanjenje vaskularne propustljivosti mrežnjače. U daljem tehničkom rešenju, jedinjenja prema pronalasku su za primenu u lečenju i/ili prevenciji edema, naročito makularnog edema, tačnije dijabetesnog makularnog edema.

[0055] U drugom tehničkom rešenju, jedinjenja pronalaska su predviđena za primenu u indukovanju odvajanja zadnjeg staklastog tela (PVD). U drugom tehničkom rešenju, jedinjenja pronalaska su predviđena za primenu u lečenju vitreomakularne vuče.

[0056] Kao što je ranije pomenuto, predmetni pronalazak se odnosi na nova jedinjenja, njihove farmaceutski prihvatljive soli, farmaceutski prihvatljive solvate, izomere ili njihove smeše. Jedinjenje predmetnog pronalaska se takođe može formulisati u različite farmaceutske oblike u svrhu administriranja. Kao odgovarajuće kompozicije mogu se navesti sve kompozicije koje se obično koriste za sistemsko administriranje lekova. Da bi se pripremile farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska, efikasna količina određenog jedinjenja, po izboru u obliku adicione soli ili kompleksa metala, kao aktivni sastojak se kombinuje u prisnoj primesi sa farmaceutski prihvatljivim nosačem, a nosač može imati različite oblike u zavisnosti od oblika preparata koji se želi za administriranje. Ove farmaceutske kompozicije su poželjne u jediničnom doznom obliku pogodnom za, posebno oralno administriranje, rektalno, perkutano, parenteralnom ili intravitrealnom injekcijom. Na primer, u pripremi kompozicija u oralnom doznom obliku, može se koristiti bilo koji uobičajeni farmaceutski medijum kao što su, na primer, voda, glikoli, ulja, alkoholi i slično u slučaju oralnih tečnih preparata kao što su suspenzije, sirupi, eliksiri, emulzije i rastvori; ili čvrsti nosači kao što su skrobovi, šećeri, kaolin, lubrikanti, vezivna sredstva, dezintegrativni agensi i slično u slučaju praškova, pilula, kapsula i tabelata.

[0057] Naročito je korisno formulisati gore pomenute kompozicije u jediničnom doznom obliku radi lakšeg administriranja i ujednačenosti doziranja. Jedinični dozni oblik kako se ovde koristi odnosi se na fizički odvojene jedinice, pogodne kao jedinične doze, pri čemu svaka jedinica sadrži unapred određenu količinu aktivnog sastojka izračunatu da proizvede željeni terapijski efekat u saradnji sa potrebnim farmaceutskim nosačem. Primeri takvih jediničnih doznih oblika su tablete (uključujući tablete sa razrezima ili obložene tablete), kapsule, pilule, supozitorije, paketići praška, oblande, injektabilni rastvori ili suspenzije i slično, i njihovi odvojeni višestruki sastojci.

[0058] U jednom određenom tehničkom rešenju, predmetni pronalazak obezbeđuje paket koji sadrži jedinjenje pronalaska, i letak sa uputstvima za administriranje jedinjenja pacijentu koji ima oftamološki poremećaj kako je ovde navedeno, naročito pacijentu koji ima vlažnu makularnu degenaricuju povezanu sa starošću, diajbetesnu retinopatiju ili dijabetesni makularni edem, tačnije dijabetesnu retinopatiju ili diabetesni makularni edem.

[0059] Za sprovođenje lečenja i/ili prevencije, jedinjenja ili kompozicije kako je ovde opisano mogu se administrirati pacijentu bilo kojim postupkom koji dovodi do isporuke terapijskog agensa do mesta oftamološkog stanja, kao što je administriranje u oko. U drugom tehničkom rešenju, primena, lečenje i/ili prevencija obuhvata kontakt staklastog tela i/ili vodenog telesnog soka sa efikasnom količinom kompozicije koja sadrži jedinjenje pronalaska. Administriranje može biti očnim putem, kao što je lokalni, subkonjunktivni, sub-Tenonski, intraokularni, očnim implantima, itd. Lokalno administriranje može obuhvatiti administriranje u oko jedne ili nekoliko kapi kompozicije koja sadrži jedinjenje pronalaska. Isporuka u područja unutar oka, in situ može se izvršiti injekcijom, kanilom ili drugim invazivnim uređajem dizajniranim da uvede tačno odmerene količine željene oftamološke kompozicije u određeni odeljak ili tkivo u oku (npr.zadnja komora ili mrežnjača). Intraokularna injekcija može biti u staklasto telo (intravitrealno), ili ispod konjuktive (subkonjuktivalno), ili iza oka (retrobulbarno), u skleru, ili ispod kapsule Tenon (sub-Tenonsko). Takođe se razmatraju i drugi intraokularni putevi administriranja i mesta injektiranja i oblici koji su u okviru obima zaštite pronalaska. U poželjnom tehničkom rešenju, lečenje i/ili prevencija obuhvataju administriranje jedinjenja intravitrealnom injekcijom. Poželjno je da se to izvodi pomoću samozaptivajućih igala ili bilo kog drugog odgovarajućeg kalibrisanog uređaja za isporuku. Injekcija u oko može se izvršiti kroz pars plana pomoću samozaptivajuće igle.

[0060] Kada se kompozicija administrira intravitrealnom injekcijom, aktivni agensi treba da se koncentruju kako bi se smanjila zapremina za injekciju. Poželjno je da je zapremina za injekciju manja od oko 5 mL. Ovakve zapremine mogu zahtevati kompenzacijsku drenažu tečnosti staklastog tela bi se sprečilo povećanje očnog pritiska i curenje ubrizgane tečnosti kroz otvor formiran iglom za isporuku. Još poželjnije je da se injektirana zapremina kreće između okot 10 i 200 µL. Najpoželjnije, zapremina za injekciju je između 30 i 100 µL, naročito oko 50 µL.

[0061] U pogledu poželjnih puteva administriranja, farmaceutski prihvatljiva so, farmaceutski prihvatljiv solvat, izomer ili njihova smeša su takođe oftamološki prihvatljiva so, oftamološki prihvatljiv solvat, izomer ili njihova smeša. U poželjnom tehničkom rešenju, farmaceutska kompozicija sadrži jedinjenje i jedan ili više oftamološki prihvatljivih nosača. Zanimljivo je da je pronađeno da jedinjenja prema pronalasku imaju visoku rastvorljivost u vodi od preko 100 mg/ml, dok prethodna jedinjenja iz oblasti imaju jednocifren mg/ml ili manju rastvorljivost u vodi. U poželjnom tehničkom rešenju, kompozicija pronalaska kako je ovde stavljeno na uvid javnosti je vodeni rastvor koji sadrži jedinjenje pronalaska. U drugom tehničkom rešenju, predmetni pronalazak obezbeđuje kit delova koji sadrži kontejner koji sadrži jedinjenje pronalaska i još jedan kontejner koji sadrži vodeni pufer za rastvaranje jedinjenja pronalaska.

[0062] Kao što će biti razumljivo stručnjaku u oblasti, kompozicija ovde stavljena na uvid javnosti je poželjno sterilna kompozicija. U posebnom tehničkom rešenju, predmetni pronalazak obezbeđuje sterilni kontejner koji sadrži jedinjenje ili kompoziciju pronalaska. U daljem tehničkom rešenju, sterilni kontejner je bočica koja sadrži jedinjenje ili kompoziciju pronalaska. Bočica može da sadrži jedinjenje u obliku praška ili rastvora, poželjno vodenog rastvora. U konkretnijem tehničkom rešenju, predmetni pronalazak obezbeđuje sterilnu bočicu koja sadrži vodeni rastvor jedinjenja pronalaska. U još konkretnijem tehničkom rešenju, bočica kako je ovde opisano sadrži deo koji je dizajniran da se može probosti iglom šprica. U alternativnom tehničkom rešenju, predmetni pronalazak obezbeđuje kit koji sadrži bočicu sa jedinjenjem pronalaska u obliku praška i kontejner koji sadrži vodeni rastvor, posebno vodeni rastvor pufera. U drugom tehničkom rešenju, sterilni kontejner je špric napunjen sa farmaceutskom kompozicijom pronalaska, posebno vodenim rastvorom koji sadrži jedinjenje pronalaska. U još jednom tehničkom rešenju, sterilni kontejner je kontejner koji sadrži najmanje jednu tabletu koja sadrži farmaceutsku kompoziciju pronalaska. Naročito mehur (blister) pakovanje ili boca koja sadrži više tableta koje sadrže jedinjenje pronalazaska i jedan ili više farmaceutski prihvatljivih nosača. U jednom određenom tehničkom rešenju, bočica kako je opisano sadrži manje od 5 mL, posebno manje od 4 mL, tačnije manje od 3 mL rastvora koji sadrži jedinjenje pronalaska.

[0063] U poželjnom tehničkom rešenju, predmetni pronalazak se dalje odnosi na jedinjenje za primenu, gde lečenje, inhibicija i/ili prevencija prethodno pomenutih poremećaja dalje uključuje administriranje jedinjenja koje se vezuje i inhibira aktivnost VEGF ili VEGF receptora. Ovo jedinjenje može biti VEGF inhibitor, antitelo na VEGF receptor ili njegov fragment koji vezuje antigen, ili VEGF antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen. Pogodni primeri takvih jedinjenja uključuju bevacizumab, ranibizumab, brolucizumab ili konbercept. Drugo moguće dalje jedinjenje je VEGF zamka, koja sadrži VEGF vezujući domen, kao što je aflibercept.

[0064] Predmetni pronalazak se dalje odnosi na kombinaciju koja sadrži jedinjenje predmetnog pronalaska i dalje jedinjenje koje se vezuje i inhibira aktivnost VEGF ili VEGF receptora. Kao što je gore naznačeno, ovo dalje jedinjenje može biti VEGF inhibitor, antitelo na VEGF receptor ili njegov antigen-vezujući fragment, ili VEGF antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment kao što su bevacizumab, ranibizumab, brolucizumab ili konbercept. Drugo moguće dalje jedinjenje je VEGF zamka, koja sadrži VEGF vezujući domen, kao što je aflibercept.

[0065] Kad god se upućuje na kombinaciju aktivnih sastojaka, aktivni sastojci se mogu obezbediti u jednoj kompoziciji ili u odvojenoj kompoziciji. Pored toga, kombinacija aktivnih sastojaka takođe obuhvata aktivne sastojke koji su povezani nekovalentno ili kovalentno.

[0066] Predmetni pronalazak se dalje odnosi na kombinaciju kako je gore navedeno za primenu kao lek ili inhibiranje, lečenje i/ili prevenciju patološke neovaskularizacije, kancera ili oftamološkog poremećaja kao što je vlažna makularna degeneracija povezana sa starenjem, odvajanje mrežnjače, zadnji uveitis, neovaskularizacija rožnjače, neovaskularizacija irisa, diabetesni edem makule, i dijabetesna retinopatija.

[0067] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje postupak za antagonizaciju integrina, naročito receptora vitronektina, kod subjekta kome je to potrebno, postupak sadrži administriranje jedinjenja pronalaska. Konkretnije, i pronalazak obezbeđuje postupke za inhibiranje angiogeneze kod subjekta. Predmetni pronalazak se dalje odnosi na postupak za inhibiranje (patološke) neovaskularizacije kod subjekta kome je to potrebno, postupak obuhvata administriranje jedinjenja predmetnog pronalaska. U daljem tehničkom rešenju, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak za inhibiranje očne neovaskularizacije kod subjekta, postupak obuhvata administriranje jedinjenja pronalaska subjektu. U još jednom određenom tehničkom rešenju, postupak obuhvata administriranje jedinjenja ili kompozicije pronalaska u oko subjekta, kao što je intravitrealna injekcija. Posebno, postupak obuhvata intravitrealnu injekciju kompozicije kako je ovde opisano.

[0068] Predmetni pronalazak dalje obezbeđuje jedinjenja i kompozicije opisane ovde za primenu u proizvodnji leka za prevenciju i/ili lečenje poremećaja kako je ovde opisano.

PRIMERI

PRIMER 1 - Sinteza jedinjenja pronalaska

Sinteza benzil N-[(2S)-1-(terc-butoksi)-3-({2,5-dimetil-6-[4-(1,8-naftiridin-2-il)piperidin-1-il]pirimidin-4-il}amino)-1-hidroksipropan-2-il] karbamata

[0069]

[0070] 2-[1-(6-hloro-2,5-dimetilpirimidin-4-il)piperidin-4-il]-1,8-naftiridine i terc-butil (2S)-3-amino-2-{[(benziloksi)karbonil]amino}propanoat pripremljeni su u skladu sa postupkom opisanim u US2008/0058348 A1, koji je ovde uključen referencom. Oba molekula su sparena u reakciji Buchwald-Hartwig-ove aminacije katalizovanoj dihloro[1,1'-bis(difenilfosfino) ferocen] paladijum(II) dilormetanskim kompleksom (1:1), 1,1'-ferocendil-bis difenilfosfinom, fenilboronskom kiselinom, trietilaminom i cezijum fluoridom u 2-metiltetrahidrofuranu. Reakciona smeša je filtrirana kroz celit i ekstrahovana vodenom hlorovodoničnom kiselinom.

Vodeni ekstrakt je neutralisan vodenim natrijum acetatom i ekstrahovan dihlormetanom koji je ispran vodenim natrijum bikarbonatom i osušen iznad natrijum sulfata da se dobije sirovi proizvod koji je prečišćen hromatografijom na koloni silicijum dioksida koristeći toluen/etil acetat kao eluent. Hromatografisani materijal je rastvoren u etil acetatu i dalje prečišćen kristalizacijom kao so (-)-dibenzoil-L-vinske kiseline. Korišćenjem vodenog natrijum bikarbonata uklonjena je so vinske kiseline da bi se dobio prečišćen proizvod.

Sinteza terc-butil (2S)-2-amino-3-({2,5-dimetil-6-[4-(5,6,7,8-tetrahidro-1,8-naftiridin-2-il)piperidin-1-il]pirimidin-4-il}amino)propanoata

[0071]

[0072] Benzil N-[(2S)-1-(terc-butoksi)-3-({2,5-dimetil-6-[4-(1,8-naftiridin-2-il)piperidin-1-il]pirimidin-4-il}amino)-1-hidroksipropan-2-il] karbamat se hidrogenizuje iznad paladijuma na aktiviranom ugljeniku u 2-metiltetrahidrofuranu. Katalizator je uklonjen filtracijom kroz celit. Rastvarač je isparen da bi se dobio željeni proizvod

Sinteza terc-butil (2S)-3-({2,5-dimetil-6-[4-(5,6,7,8-tetrahidro-1,8-naftiridin-2-il)piperidin-1-il]pirimidin-4-il}amino)-2-{[(3-metoksi-3-oksopropoksi)karbonil]amino} npropanoata

[0073]

[0074] N,N-disukcinimidil karbonat je reagovao, u prisustvu trietilamina, sa metil 3-hidroksipropanoatom u dihlormetanu dajući metil 2-({[(2,5-dioksopirolidin-1-il)oksi] karbonil}oksi)acetat. Terc-butil (2S)-2-amino-3-({2,5-dimetil-6-[4-(5,6,7,8-tetrahidro-1,8-naftiridin-2-il)piperidin-1-il]pirimidin-4-il}amino)propanoat je dodat da bi se dobio željeni proizvod. Reakciona smeša je isprana vodenom hlorovodoničnom kiselinom i vodenim natrijum bikarbonatom i zatim osušena iznad natrijum sulfata da bi se dobio sirovi proizvod koji je prečišćen hromatografijom na koloni silicijum dioksida koristeći etil acetat/n-heptan/trietilamin kao eluent.

Sinteza (2S)-3-({2,5-dimetil-6-[4-(5,6,7,8-tetrahidro-1,8-naftiridin-2-il)piperidin-1-il]pirimidin-4-il}amino)-2-{[(3-metoksi-3-oksopropoksi)karbonil]amino}propanska kiselina trifluoro acetata

[0075]

[0076] Terc-butil (2S)-3-({2,5-dimetil-6-[4-(5,6,7,8-tetrahidro-1,8-naftiridin-2-il)piperidin-1-il]pirimidin-4-il}amino)-2-{[(2-metoksi-2-oksoetoksi)karbonil] amino} propanoat je rastvoren u dihlormetanu i tretiran sa trifluorosirćetnom kiselinom. Reakciona smeša je isprana fiziološkim rastvorom i rastvarač je isparen da bi se dobio željeni proizvod kao so trifluorosirćetne kiseline. Dobijeno jedinjenje se dalje naziva uporednim jedinjenjem A (cpd A).

Elektron Sprej (ES) niske rezolucije MS m/z: 556 [(M+1), 100%]

Sinteza (2S)-2-{[(2-karboksietoksi)karbonil]amino}-3-({2,5-dimetil-6-[4-(5,6,7,8-tetrahidro-1,8-naftiridin-2-il)piperidin-1-il]pirimidin-4-il}amino)propanske kiseline

[0077]

[0078] (2S)-3-({2,5-dimetil-6-[4-(5,6,7,8-tetrahidro-1,8-naftiridin-2-il)piperidin-1-il]pirimidin-4-il}amino)-2-{[(3-metoksi-3-oksopropoksi)karbonil]amino}propanska kiselina trifluoro acetat se rastvara u 2M vodenoj hlorovodoničnoj kiselini. Po završetku reakcije, rastvarač se liofilizuje dajući željeni proizvod. (2S)-2-{[(2-karboksietoksi)karbonil]amino}-3-({2,5-dimetil-6-[4-(5,6,7,8-tetrahidro-1,8-naftiridin-2-il)piperidin-1-il]pirimidin-4-il}amino)propanska kiselina, se dalje naziva jedinjenjem 1 (cpd1).

Elektron Sprej (ES) niske rezolucije MS m/z: 542 [(M+1), 100%]

Sinteza terc-butil (2S)-2-({[2-(terc-butoksi)-2-oksoetoksi]karbonil}amino)-3-({2,5-dimetil-6-[4-(5,6,7,8-tetrahidro-1,8-naftiridin-2-il)piperidin-1-il]pirimidin-4-il}amino)propanoata

[0080] N,N-disukcinimidil karbonat je reagovao, u prisustvu trietilamina, sa terc-butil 2-hidroksiacetatom u dihlormetanu da bi se dobio terc-butil 2-({[(2,5-dioksopirolidin-1-il)oksi] karbonil}oksi)acetat. Terc-butil (2S)-2-amino-3-({2,5-dimetil-6-[4-(5,6,7,8-tetrahidro-1,8-naftiridin-2-il)piperidin-1-il]pirimidin-4-il}amino)propanoat je dodat. Po završetku reakcije, reakciona smeša je isprana vodenom hlorovodoničnom kiselinom i vodenim natrijum bikarbonatom i zatim osušena iznad natrijum sulfata dajući sirovi proizvod. Sirovi proizvod je prečišćen hromatografiijom na koloni silicijum dioksida koristeći etil acetat / n-heptan / trietilamin kao eluent.

Sinteza (2S)-2-([(karboksimetoksi)karbonil]amino)-3-({2,5-dimetil-6-[4-(5,6,7,8-tetrahidro-1,8-naftiridin-2-il)piperidin-1-il]pirimidin-4-il}amino)propanska kiseline dihidrohlorida (THR-687)

[0081]

[0082] Terc-butil (2S)-2-({[2-(terc-butoksi)-2-oksoetoksi]karbonil}amino)-3-({2,5-dimetil-6-[4(5,6,7,8-tetrahidro-1,8-naftiridin-2-il)piperidin-1-il]pirimidin-4-il}amino)propanoat je hidrolizovan sa vodenom hlorovodoničnom kiselinom. Reakciona smeša je isprana sa n-heptanom da bi se nakon uparavanja dobilo jedinjenje 2 (cpd2).

<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 7.64 (d 1H), 6.71 (d 1H), 4.63 (d 1H), 4.46 (d 1H), 4.57 (dd 1H), 4.06 (dd 1H), 3.85 (dd 1H), 3.77 (m 2H), 3.53 (dd 2H), 3.27 (m, 2H), 3.01 (tt 1H), 2.84 (dd 2H), 2.58, (s 3H), 2.10 (dd, 2H), 2.07, (s 3H), 1.99 (t, 2H), 1.95 (td 2H)

Sinteza terc-butil (2S)-3-({2,5-dimetil-6-[4-(5,6,7,8-tetrahidro-1,8-naftiridin-2-il)piperidin-1-il]pirimidin-4-il}amino)-2-({[(1-etoksi-1-oksopropan-2-il)oksi]karbonil}

amino)propanoata

[0083]

[0084] N,N-disukcinimidil karbonat je reagovao, u prisustvu trietilamina, sa etil 2-hidroksipropanoatom u dihlormetanu dajući etil 2-({[(2,5-dioksopirolidin-1-il)oksi]karbonil}oksi)propanoat. Terc-butil (2S)-2-amino-3-({2,5-dimetil-6-[4-(5,6,7,8-tetrahidro-1,8-naftiridin-2-il)piperidin-1-il]pirimidin-4-il}amino)propanoat je dodat. Po završetku reakcije, reakciona smeša je isprana vodenom hlorovodoničnom kiselinom i vodenim natrijum bikarbonatom i zatim osušena iznad natrijum sulfata da bi se dobio sirovi proizvod. Sirovi proizvod je prečišćen hromatografijom na koloni silicijum dioksida koristeći dihlormetan / metanol kao eluent.

Sinteza (2S)-2-{[(1-karboksietoksi)karbonil]amino}-3-({2,5-dimetil-6-[4-(5,6,7,8-tetrahidro-1,8-naftiridin-2-il)piperidin-1-il]pirimidin-4-il}amino)propanske kiseline, dihidrohlorida

[0086] Terc-butil (2S)-3-({2,5-dimetil-6-[4-(5,6,7,8-tetrahidro-1,8-naftiridin-2-il)piperidin-1-il]pirimidin-4-il}amino)-2-({[(1-etoksi-1-oksopropan-2-il)oksi]karbonil} amino)propanoat je hidrolizovan vodenom hlorovodoničnom kiselinom. Reakciona smeša je isprana sa n-heptanom dajući proizvod isparavanjem, dalje nazvan jedinjenje 3 (cpd3).

<1>H NMR (400 MHz, D2O) δ: 7.5 (d 1H), 6.5 (d 1H), 4.5 (m 1H), 4.2 (m 1H), 3.9 (dd 1H), 3.5-3.7 (m 3H), 3.4 (t 2H), 3.1 (t 2H), 2.8 (m 1H), 2,7 (t 2H), 2.4 (s 3H), 1.9 (s 3H), 1.9-2.0 (m 3H), 1.7-1.9 (m 4H), 1.3 (d 3H).

[0087] Shodno tome, napravljena su sledeća jedinjenja pronalaska:

[0088] Ostala primerna jedinjenja prema pronalasku su:

[0089] Jedinjenje A (cpd A) je sintetisano kako je gore opisano:

[0090] Jedinjenje B (CpdB) je sintetisano u skladu sa postupcima iz US2008058348 A1:

PRIMER 2 - Integrinski antagonizam

[0091] Princip kompetitivnih ELISA testova koji su ovde korišćeni bio je sledeći: (1) integrinski receptor koji se ispituje je obložen na pločama sa 96-bunara i bunari su bili blokirani, (2) u odgovarajuće bunare je zatim dodat integrinski ligand (fibronektin) u prisustvu rastućih koncentracija datog antagonista integrina, (3) nakon određenog vremena, bunari su isprani i vezani ligand je detektovan uz pomoć specifičnog reagensa. Zatim je izvršena kvantitativna analiza podataka da bi se odredile EC50 vrednosti, tj. koncentracija antagonista integrina koja smanjuje vezivanje liganda za obložen receptor za 50%.

Tabela 1: EC50 za različite integrine i humane antagoniste integrina.

[0092] Jedinjenje prema formuli (I) inhibira interakcije između integrina i njihovih liganada. Pokazano je da jedinjenje prema formuli (I) antagonizuje nekoliko receptora za integrin, uključujući αvβ3, αvβ5i α5β1. sa jednocifrenim nanomolarnim afinitetom. Pokazano je da ovi integrinski receptori igraju ulogu u angiogenezi (αvβ3, αvβ5and α5β1), vaskularnoj propustljivosti (αvβ3and αvβ5) i vitreoretinalnoj adheziji (α5β1).

[0093] Primetno, jedinjenja pronalaska pokazaju značajno smanjeni antagonizam prema integrinu trombocita αIIbβ3, koji je uključen u agregaciju trombocita. Sl.1 prikazuje utvrđene odnose EC50 vrednosti za αvβ3prema αIIbβ3. Kao što se može izvesti iz ovih rezultata, jedinjenja predmetnog pronalaska pokazuju mnogo nižu aktivnost prrema integrinu trombocita u poređenju sa αvβ3integrinom. Nasuprot tome, jedinjenja kako su opisana u stanju tehnike pokazuju značajno veću aktivnost prema integrinu trombocita u poređenju sa αvβ3integrinom.

PRIMER 3 – Test migracije ćelija

[0094] Zaceljivanje rana endotelnih ćelija posreduje se migracijom i proliferacijom endotelnih ćelija, obe kritične komponente procesa angiogeneze, i rutinski se koristi kao surogat model za in vitro angiogeni potencijal. ORIS™ Test Migracije Ćelije korišćen je sa endotelnim ćelijama humane pupčane vene (HUVEC ćelijama).

[0095] HUVEC ćelije (SCCE-001, Kat br°1000519, Merck Chemicals) su kultivisane u T175 bocama (Kat br° 353112, falcon) u EndoGro Medijumu Rasta (SCME-003, Merck Chemicals) i podeljene kada su dostigle 90-100% spajanja.

[0096] Za test, ćelije su korišćene u pasažu 2 do 4 nakon odmrzavanja i na 80-90% spajanja. Početkom dana, ploče za test migracije ćelije Oris™, obložene fibronektinom (Kat br° #CMAFN.I01, AMS Biotechnology) uklonjene su iz frižidera i stavljene na RT tokom 1h. Maske za otkrivanje Oris isprane su etanolom i nanete na dno ploča sa 96-bunara, poravnavajući Al ugao maski sa Al uglom ploča. Ćelije su sakupljene tripsinizacijom (Kat br°25300, Gibco), centrifugirane na 250g tokom 5 mm i suspendovane na 0,4.10<6>po mL u kompletnom EndoGro medijumu rasta. 100 µL ćelijske suspenzije dodato je u bunare i ploče su inkubirane tokom 6h na 37°C i 5% C02 da bi se ćelije slepile.

[0097] Na kraju inkubacije, alat za zaustavljanje je ispran etanolom i korišćen za uklanjanje čepova iz svih bunara, osim referentnih bunara. Dodato je 100 µL medijuma za rast koji sadrži različite koncentracije jedinjenja (cpd2, cpd3, cpdB, cilengitid) u bunare i ploče su prenete u inkubator tokom 24h na 37°C i 5% CO2da bi se omogućila migracija.

[0098] Pred sam kraj inkubacije pripremljen je rastvor 4 µg/mL kalceina AM (Kat br° 354217, Beckton Dickinson) u prethodno zagrejanom HBSS-u (Kat br° 14025, Gibco). Čepovi su uklonjeni iz referentnih bunara i medijum je pažljivo uklonjen iz svih bunara sa multikanalom (bez vakumske aspiracije). Bunari su isprani sa 100 µL DPBS-a. Zatim je dodato 100 µL rastvora kalceina AM i ploče su inkubirane tokom 1 sata na 37°C i 5% CO2. Nakon inkubacije, fluorescencija je očitana pri talasnim dužinama pobuđivanja od 494 nm i emisije 517 nm koristeći Flexstation i SofiMax Pro 5.4.5 program (Molekularni Uređaj). Fluorescencija je očitana sa dna ploča sa poklopcem kako bi ostale sterilne. Maske su zatim uklonjene i slikane su Axiovert fluorescentnim mikroskopom (Zeiss) koristeći reflekovanu svetlost, GFP i 2.5x objektiv.

[0099] Vrednosti IC50 za cpdB, cpd2 i cpd3 su bile ispod 1 µM. IC50 za pozitivnu kontrolu Cilengitide bio je 100 µM. Može se zaključiti da jedinjenja Formule (I) zadržavaju snažnu aktivnost i inhibiraju migraciju ćelije sa IC50 vrednostima u nanomolarnom opsegu.

PRIMER 4 – Test murinskog horoidalnog eksplantata

[0100] Test se zasniva na murinskom modelu eksplantacije mikrovaskularne angiogeneze, koji blisko oponaša in viva horoidalnu angiogenezu. Glavna prednost ovog modela organotipske kulture je ta što se ćelije drže u svom normalnom okruženju, čime se održavaju interakcije ćelijaćelija, a istovremeno se održava viši nivo eksperimentalne kontrole nego na životinjskim modelima. Model horoidalnog eksplantata ili ukratko EMCA model omogućava brzu procenu novih anti-angiogenskih terapeutika, uz dodatnu korist isključujući potencijalni nedostatak izloženosti koji se često susreće prilikom testiranja malih molekula u očima životinja. Eksplantati RPE-horoidalne sklere (u daljem tekstu horoidalni eksplantati) ugrađeni su u u trodimenzionalni gel fibrinogen/fibrin. Dodavanje medijuma koji sadrži serum indukuje opsežni izdanak klice endotelnih ćelija u matriks nakon 3 do 4 dana u kulturi.

Životinje

[0101] Svi eksperimenti su izvedeni na muškim miševima C57BL/6J starim 4 do 5 nedelja (Charles River Laboratories France), smeštenim u standardnim laboratorijskim uslovima u skladu sa normalnim dnevno/noćnim ritmom sa ad libitum pristupom hrani i vodi. Sve eksperimente na životinjama odobrio je Institucionalni Etički Komitet KU Luven.

Disekcija horoidalnog tkiva i priprema kulture eksplanata

[0102] Nakon početne optimizacije, postavljen je opšti protokol. Ukratko, nakon eutanazije miševa upotrebom pentobarbitala (200 mg/kg, IP, Dolethal, Vetoquinol) praćene cervikalnom dislokacijom, oči su odmah izvađene sa zakrivljenim klještima i držane u ledeno hladnom DPBS-u (kat br° 14190-136, Gihco). Pod stereomikroskopom, oko je stavljeno u kap ledeno hladnog DPBS-a, i držano pincetom na ledeno hladnoj petri šolji. Rožnjača i sočivo su uklonjeni obodnim urezom na limbusu (granica rožnjače i sklere) pomoću Vannas opružnih makaza (Fine Science Tools). Dalje, suvišni mišići su uklonjeni sa preostale očne jabučice i napravljen je presek od ivice zadnje komore prema glavi vidnog nerva. Nakon pažljivog odvajanja RPE-horoidalnog-sklera kompleksa od mrežnjače, napravljeno je 6 do 8 eksplanata na periferiji ovog kompleksa pomoću udarne igle (750 µm prečnik, Mediquip Surgical). Eksplanti su preneti na ploču sa 48-bunara (BD Biosciences), prethodno napunjenu sa 350 µl DMEM-a bez seruma (kat br° 11995-065, Gibco) i 1% (v/v) Pen/Strep (kat br° 15140-122, Gibco), i inkubirani su preko noći na 37°C u 5% CO2.

Ugradnja horoidalnog eksplantata u fibrinogen/fibrin gel i uslovi kulture

[0103] Goveđi fibrinogen (3.1 mg/mi, kat br° F863, Sigma-Aldrich) je rastvoren u DMEM-u (kat br° 11995- 065, Gibco) koji sadrži 1% (v/v) Pen/Strep (kat br° 15140-122, Gibco), i naknadno filtriran kroz filter sa porama 0.22 µm (Corning). Sledeće, 10 µg/mL inhibitora serinske proteaze aprotinin (kat br°A6279, Sigma-Aldrich) je dodato u rastvor fibrinogena kako bi se blokirala fibrinolitička aktivnost. Nakon dodavanja 400 mU/mL goveđeg trombina (SRP6555, Sigma-Aldrich), ovaj rastvor fibrinogen-aprotinin-trombin je brzo dodat u ploče sa 48-bunara (100 µL per well), i ostavljen da se stvrdne na 37 °C tokom najmanje 5 mm. Na vrh bunara obloženih fibrinom, dodato je 175 µL rastvora fibrinogen plus aprotinin, praćeno prenošenjem pojedinačnih RPE-horoidalnih eksplantata u 175 µL DMEM medijuma posečenog vrha. Konačno, u svaki bunar je dodato 1.4 µL trombina (400 mU/nit) i ova smeša je ostavljena da se želira na 37°C i 5% CO2tokom 1 sata. Nakon zgrušavanja, na površinu gela je dodato 350 µL DMEM-a koji sadrži 10% FBS-a (SH30071.03, termički inaktiviran. HyClone) i molekul(i) koji se testiraju (cpd3, cpdB i cilengitid) i ploče su inkubirane na 37°C u 5% CO2.

Kvantifikacija kapilarnih klica

[0104] Posle 3 do 4 dana, napravljene su slike svetlog polja sa uvećanjem od 2.5x pomoću Axio Vert.A1 obrnutog mikroskopa (Zeiss) koristeći ZEN lite 2012 softvera za mikroskop (Zeiss). Analiza područja kapilarnog klijanja izvršena je ručno na ZVI slikama, tačnije ocrtavanjem tela eksplanta, kao i ukupne površine kapilarnog klijanja (uključujući telo eksplanta) pomoću Axiovision Rel 4.8 programa ("Measure > Outline", Zeiss). Dalja analiza je izvršena u Microsoft Excel-u, gde je područje klijanja endotelne organotipske kulture kvantifikovano oduzimanjem površine tkiva eksplantata od ukupne površine koju zauzimaju izdanci. Kako se apsolutna područja klijanja između nezavisnih eksperimenata malo razlikuju, svi podaci u okviru svakog eksperimenta su normalizovani na stanje tretirano transporterom i izračunate su IC50 vrednosti (GraphPad Prism 5).

Rezultati

[0105] Svi antagonisti integrina blokirani su stvaranjem endotelnih klica u zavisnosti od koncentracije. Ovo je u skladu sa studijama koje pokazuju da se endotelne ćelije mogu povezati sa fibrinogenom putem specifičnosti prepoznavanja ROD. Zapravo, fibrinogen sadrži više mesta vezivanja za αvβ3 i α5β1 integrine, za koje se zna da se eksprimiraju na endotelnim ćelijama i važnim regulatorima (patološke) angiogeneze. Cpd3 i CpdB inhibiraju kapilarno izrastanje sa IC50vrednostima oko 1 µM, dok je za pozitivnu kontrolu Cilengitide, izmereni IC50bio oko 300 µM. Reprezentativne slike svetlog polja za cpd3 prikazane su na Sl. 2. Ovi nalazi su u skladu sa rezultatima testa migracije ćelije, razmatranim u primeru 3.

[0106] U zaključku, jedinjenja predmetnog pronalaska su inhibitori pan-integrina koji pokazuju snažan antagonizam prema višestrukim receptorima integrina za koje je pokazano da igraju ulogu u angiogenezi (αvβ3, αvβ5i α5β1), vaskularnoj propustljivosti (αvβ3id αvβ5) i vitreoretinalnoj adheziji (α5β1). Sa druge strane, u odnosu na uporedna jedinjenja, jedinjenja pronalaska pokazuju mnogo niži antagonizam integrina trombocita (αIIbβ3), smanjujući tako rizik od ometanja agregacije trombocita i povećavajući terapijski prozor. Dalje, pokazano je da jedinjenja pronalaska inhibiraju migraciju ćelije i smanjuju kapilarno klijanje. Pronalazak obezbeđuje nove antagoniste integrina koji su korisni, između ostalog za lečenje neovaskularnih bolesti.

Claims (14)

1. Patentni zahtevi 1. Jedinjenje prema formuli (I), ili farmaceutski prihvatljiva so, farmaceutski prihvatljiv solvat, izomer ili njihova smeša,

   pri čemu R1i R2nezavisno izabrani iz grupe koja se sastoji od vodonika, metila i etila; i Alk je C1-4alkilen.
2. 2. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1, pri čemu oba R1i R2su metil.
3. 3. Jedinjenje prema bilo kom od patentnih zahteva 1 ili 2, pri čemu Alk je C1ili C2alkilen.
4. 4. Jedinjenje prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu je jedinjenje izabrano iz grupe koja se sastoji od:
5. 5. Farmaceutska kompozicija sadrži jedinjenje prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, i jedan ili više farmaceutski prihvatljivih nosača.
6. 6. Jedinjenje prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4, za primenu kao lek.
7. 7. Jedinjenje za primenu prema patentnom zahtevu 6, za primenu u inhibiranju neovaskularizacije.
8. 8. Jedinjenje za primenu prema patentnom zahtevu 6, za primenu u lečenju i/ili prevenciji kancera.
9. 9. Jedinjenje za primenu prema patentnom zahtevu 6, za primenu u lečenje i/ili prevenciji oftamološkog poremećaja.
10. 10. Jedinjenje za primenu prema patentnom zahtevu 9, pri čemu je navedeni oftamološki poremećaj izabran iz grupe koja se sastoji od vlažne makularne degeneracije povezane sa starošću, odvajanja mrežnjače, zadnjeg uveitisa, neovaskularizacije rožnjače, neovaskularizacije irisa, dijabetesnog edema makule, i dijabetesne retinopatije.
11. 11. Jedinjenje za primenu prema patentnom zahtevu 9 ili 10, pri čemu lečenje i/ili prevencija sadrži administriranje jedinjenja intravitrealnom injekcijom.
12. 12. Jedinjenje za primenu prema bilo kom od patentnih zahteva 7 do 10, pri čemu inhibicija, lečenje ili prevencija dalje sadrži administriranje jedinjenja koje se vezuje za i inhibira aktivnost vaskularnog endotelnog faktora rasta (VEGF) ili VEGF receptora.
13. 13. Kombinacija koja sadrži jedinjenje prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4; i jedinjenje koje se vezuje za i inhibira aktivnost vaskularnog endotelnog faktora rasta (VEGF) ili VEGF receptora.
14. 14. Kombinacija patentnog zahteva 13, za primenu kao što je definisano u bilo kom od patentnih zahteva 6 do 11.