RS61742B1 - Imunomodulatori za pet-snimanje - Google Patents

Description

Opis

[0001] Predmetna objava se generalno odnosi na imunomodulatore koji sadrže<18>F-protetske grupe i sintezu i primenu<18>F-obeleženih imunomodulatora za snimanje različitih procesa u telu, za detektovanje lokacije molekula povezanih sa patologijom bolesti i za praćenje napredovanja bolesti.

[0002] Pozitronska emisiona tomografija (PET) je neinvazivna tehnika snimanja koja je postala jedna od najčešće primenjenih metoda u dijagnostičkoj medicini i razvoju lekova, sa visokom osetljivosti (fmolova), visokom rezolucijom (4-10 mm) i uvećanjem tkiva koje može biti kvantifikovano. Dragocene in vivo funkcionalne informacije o biološkim procesima kod živih subjekata koje obezbeđuje PET snimanje takođe pružaju jedinstvenu translacijsku medicinsku prednost u tome što se isti alat može primeniti i pretklinički i klinički.

[0003] PET se oslanja na dizajn i sintezu molekula obeleženih radioizotopima koji emituju pozitrone, uključujući<18>F,<64>Cu,<11>C,<15>0,<13>N,<66>Ga,<68>Ga,<76>Br,<89>Zr,<94>mTc,<86>Y i<124>I. In vivo, ovi radioobeleživači ili radioligandi emituju pozitrone iz jezgra izotopa sa različitim energijama u zavisnosti od izotopa koji se primenjuje. Energija izbačenog pozitrona kontroliše prosečnu razdaljinu koju pređe pre nego što se sudari sa elektronom što dovodi do emisije dva 511 keV gama zraka u suprotnim smerovima. Gama zraci proizvedeni događajem uništenja pozitrona se detektuju pomoću PET skenera za snimanje kako bi se proizveli planirani i tomografski snimci koji otkrivaju distribuciju radioobeleživača u funkciji vremena. Prema tome, izotopi koji su čisti emiteri pozitrona sa niskom energijom izbacivanja se preferiraju za PET snimanje kako bi se minimalizovao put koji je prešao pozitron pre uništenja i problemi sa dozimetrijom izazvani drugim emisijama poput gama zraka, alfa čestica ili beta čestica.

[0004] Pored toga, vreme poluraspada izotopa koji se primenjuje u PET snimanju mora biti dovoljno dugo da omogući sintezu i analizu molekula radioobeleživača, injektiranje u pacijenta, in vivo lokalizaciju, klirens iz neciljanih tkiva, i stvaranje čistog snimka.<18>F (β<+>635 keV 97%, t1/2110 min) je jedan od najčešće primenjivanih PET emitujućih izotopa zbog svoje niske energije pozitronskih emisija, nedostatka bočnih emisija i odgovarajućeg poluvremena.

[0005] Predmetna objava se odnosi na milamolekul (millamolecule) supstituisan sa<18>F-obeleženom protetskom grupom koja sadrži nitro-piridin vezan za polietilen glikol (PEG) segment i terminalni azid. U određenim tehničkim rešenjima, milamolekuli koji sadrže bifunkcionalne konjugovane segmente (npr., sa prstenom ograničenim alkinskim grupama) formiraju kovalentne veze sa terminalnim azidom<18>F-obeležene protetske grupe pomoću "klik" biotogonalne reakcije da proizvedu radiooznačene sonde koje su stabilne u fiziološkim uslovima. UV apsorbanca dobijenog proizvoda dalje obezbeđuje praktičnu, osetljivu i brzu analitičku metodu za određivanje radiohemijske čistoće proizvoda. Ove 18F obeleženi milamolekuli su korisni za detektovanje prisustva PD-L1 u ćelijama i tkivima kao što su tumori koji mogu obezbediti dragocene informacije o lečenju.

[0006] Dokumenti WO 2014/151634 i WO 2016/077518 stavljaju na uvid javnosti makrociklične peptide koji inhibiraju PD-1/PD-L1 i PD-L1/CD80 protein/protein interakciju. Takođe, dokument WO 2016/086021 opisuje anti-PD-Ll adnektine koji su pogodni za primenu kao sredstva za dijagnostiku i sredstva za snimanje. WO 2013/010573 stavlja na uvid javnosti jedinjenja sa matričnom inhibitornom aktivnošću metaloproteinaze kao terapijskih i dijagnostičkih sredstava. Maute i sar., PNAS, tom.112, br 47, (novembar 2015) str E6506-E6514, stavlja na uvid javnosti PD-1 varijante visokog afiniteta za optimizovanu imunoterapiju i imuno-PET snimanje.

[0007] Ostale karakteristike i prednosti ove objave biće očigledne iz sledećeg detaljnog opisa i primera.

[0008] Pronalazak je definisan patentnim zahtevima. Bilo koji predmet izvan obima patentnih zahteva dat je samo u informativne svrhe. Bilo koja referenca u opisu postupka lečenja ili dijagnostičkih metoda izvedenih in vivo odnosi se na jedinjenja, farmaceutske kompozicije i lekove predmetnog pronalaska za primenu u postupku lečenja ljudskog ili životinjskog tela terapijom ili za primenu u dijagnostičkoj metodi koja se vrši na telu čoveka ili životinje.

KRATAK OPIS SLIKA NACRTA

[0009]

Slika 1 su reprezentativni PET/CT snimci [<18>F]obeleženog makrocikličnog PD-L1 peptida kod miševa koji nose bilateralne PD-L1 (+) L2987 i PD-L1 (-) ksenograft tumore.

Slika 2 prikazuje krive prosečne vremenske aktivnosti za [<18>F]obeležene makrociklične PD-L1 peptidne radioobeleživače.

Slika 3 su reprezentativni PET snimci [<18>F]obeleženog mikrocikličnog PD-L1 peptidnog radioobeleživača u nehumanom primatu.

Slika 4 prikazuje autoradiogram snimke [<18>F]obeleženog mikrocikličnog PD-L1 peptidnog radioobeleživača u ksenograftu (A &B) i biopsiranim tkivima humanog nesitno ćelijskog kancera pluća (C &D).

[0010] U svom prvom aspektu predmetna objava obezbeđuje jedinjenje formule (I)

ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, pri čemu x je ceo broj od 1 do 8 i R je C1-C6alkil grupa.

[0011] U drugom aspektu predmetna objava obezbeđuje jedinjenje formule (II)

ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, pri čemu x je ceo broj od 1 do 8 i R je C1-C6alkil grupa.

[0012] U trećem aspektu predmetna objava obezbeđuje jedinjenje formule (III)

ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so.

[0013] U četvrtom aspektu predmetna objava obezbeđuje jedinjenje formule (IV)

ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, pri čemu x je ceo broj od 1 do 8.

[0014] U petom aspektu predmetna objava obezbeđuje jedinjenje formule (V)

ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so.

[0015] U šestom aspektu predmetna objava obezbeđuje postupak za dobijanje snimka jedinjenja formule (I)-(V), ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, pri čemu postupak obuhvata,

a) administriranje jedinjenja subjektu; i

b) snimanje in vivo distribucije jedinjenja snimanjem pozitronskom emisionom

tomografijom (PET).

[0016] U prvom tehničkom rešenju šestog aspekta snimak distribucije jedinjenja formule (I)-(V), ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, ukazuje na prisustvo ili odsustvo bolesti.

[0017] U sedmom aspektu, predmetna objava obezbeđuje jedinjenje formule (I)-(V) za primenu u praćenju napretka bolesti kod subjekta, pri čemu navedena primena obuhvata

(a) administriranje subjektu kome je to potrebno jedinjenja formule (I)-(V), ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, koje se vezuje za ciljani molekul povezan sa prisustvom bolesti u prvom trenutku i dobijanje snimka najmanjeg dela subjekta za određivanje količine obolelih ćelija ili tkiva; i

(b) administriranje subjektu jedinjenja u jednom ili više sledećih vremenskih tačaka i dobijanje snimka najmanjeg dela subjekta u svakoj vremenskoj tački; pri čemu dimenzija i lokacija obolelih ćelija ili tkiva u svakoj vremenskoj tački ukazuju na napredak bolesti.

[0018] U osmom aspektu predmetna objava obezbeđuje jedinjenje formule (I)-(V) za primenu u kvantifikovanju obolelih ćelija ili tkiva kod subjekta, pri čemu navedena primena obuhvata

(a) administriranje subjektu koji ima obolele ćelije ili tkiva jedinjenja formule (I)-(V) ili njegove farmaceutski prihvatljive soli koje se vezuje za ciljani molekul smešten u bolesnim ćelijama ili tkivima; i

(b) detektovanje radioaktivnih emisija<18>F u obolelim ćelijama ili tkivu, pri čemu nivo i distribucija radioaktivnih emisija u obolelim ćelijama ili tkivima je kvantitativna mera obolelih ćelija ili tkiva.

[0019] U prvom tehničkom rešenju osmog aspekta bolest je odabrana iz grupe koju čine solidni kanceri, hematopoetski kanceri, hematološki kanceri, autoimuna bolest, neurodegenerativna bolest, kardiovaskularna bolest, i patogena infekcija.

[0020] U devetom aspektu predmetna objava obezbeđuje postupak za dobijanje kvantitativnog snimka tkiva ili ćelija koje eksprimuju PD-L1, pri čemu postupak obuhvata kontakt ćelija ili tkiva sa jedinjenjem formule (I)-(V) ili njegovom farmaceutski prihvatljivom soli koje se vezuje za PD-L1, i detektovanje ili kvantifikovanje tkiva koje eksprimuje PD-L1 primenom pozitronske emisione tomografije (PET).

[0021] U desetom aspektu predmetna objava obezbeđuje dijagnostičko sredstvo ili farmaceutsku kompoziciju koja sadrži jedinjenje formule (I) ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so.

[0022] U drugom aspektu, predmetna objava obezbeđuje jedinjenje prema formuli (I)-(V) ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so za primenu kao sredstva za snimanje.

[0023] U drugom aspektu, predmetna objava obezbeđuje jedinjenje prema formuli (I)-(V) ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so za primenu u dijagnostikovanju bolesti kod subjekta. Tipično, dijagnostika uključuje detekciju ili praćenje napredovanja bolesti kod subjekta. Prema jednom tehničkom rešenju, jedinjenje prema formuli (I)-(V) se administrira subjektu koji zahteva dijagnostiku i direktna vizuelizacija obolelih ćelija i tkiva se vrši pomoću pozitronske emisione tomografije.

[0024] U drugom aspektu, predmetna objava obezbeđuje jedinjenje formule (I)-(V) ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so za primenu u dijagnostikovanju ex-vivo bolesti kod subjekta koje se odnosi na nivo i disribuciju PD-L1 espresije u tkivima i ćelijama.

[0025] U drugom aspektu, predmetna objava obezbeđuje jedinjenje formule (I)-(V) za primenu u praćenju in-vitro napretka bolesti kod subjekta, pri čemu navedena primena obuhvata:

(a) u prvoj vremenskoj tački; kontaktiranje uzorka ćelija ili tkiva jednog subjekta sa jedinjenjem formule (I)-(V) pri čemu se jedinjenje vezuje za ciljani molekul povezan sa prisustvom bolesti i dobijanje snimka primenom pozitronske emisione tomografije; i (b) u jednoj ili više sledećih vremenskih tačaka, kontaktiranje drugog uzorka ćelija ili tkiva sa jedinjenjem formule (I)-(V) i dobijanje snimka u svakoj vremenskoj tački;

pri čemu dimenzija i lokacija obolelih ćelija ili tkiva u svakoj vremenskoj tački ukazuju na napredak bolesti.

[0026] U drugom aspektu, predmetna objava obezbeđuje jedinjenje formule (I)-(V) ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so za primenu u kvantifikovanju in-vitro obolelih ćelija ili tkiva kod subjekta, pri čemu navedena primena obuhvata:

(a) kontaktiranje uzorka ćelija ili tkiva jednog subjekta sa jedinjenjem formule (I)-(V) pri čemu se jedinjenje vezuje za ciljani molekul povezan sa prisutnom bolesti i dobijanje snimka pomoću pozitronske emisione tomografije; i

(b) detektovanje radioaktivne emisije<18>F u obolelim ćelijama ili tkivu,

pri čemu nivo i raspodela radioaktivnih emisija u obolelim ćelijama ili tkivima je kvantitativna mera obolelih ćelija ili tkiva.

[0027] Prema jednom tehničkom rešenju bilo kog od aspekata predmetne objave, bolest je povezana sa nivoom i distribucijom u tkivima i ćelijama koje eksprimiraju PD-L1. Tipično, bolest je odabrana iz grupe koju čine solidni kanceri, hematopoetski kanceri, hematološki kanceri, autoimune bolesti, neurodegenerativna bolest, kardiovaskularna bolest i patogene bolesti. U drugom tehničkom rešenju, bolest je solidni kancer.

[0028] Ovde su opisane<18>F- protetske grupe i postupci za proizvodnju<18>F-protetskih grupa. Takođe ovde su opisane radiooznačene kompozicije koje sadrže<18>F-protetske grupe i primena ovih radiooznačenih kompozicija za dijagnostiku, lokalizaciju, praćenje i/ili procenu obolelih ćelija i/ili tkiva i srodnih bioloških stanja.

[0029] Da bi se predmetni opis mogao lakše razumeti, prvo se definišu određeni pojmovi. Dodatne definicije date su u detaljnom opisu. Ukoliko drugačije nije definisano, svi tehnički i naučni termini koji se ovde koriste imaju isto značenje kao što ih uobičajeno razume stručnjak u ovoj oblasti tehnike, i koriste se konvencionalne metode masene spektroskopije, NMR, HPLC, biohemija, tehnike rekombinantne DNK i farmakologija.

[0030] Kako se ovde koristi, oblici jednine "a", "an" i "the" uključuju množinu osim ako kontekst jasno ne nalaže drugačije. Primena "ili" ili "i" znači "i/ili" ukoliko nije drugačije naznačeno. Pored toga, primena termina "uključujući" kao i drugih oblika, kao što su "uključuju", "uključuje", i "uključeno", nije ograničavajuće.

[0031] Kako se ovde koristi, "oko" znači unutar plus ili minus deset procenata broja. Na primer, "oko 100" odnosi se na bilo koji broj između 90 i 110. Kako se ovde koristi, "medicinsko snimanje" odnosi se na tehnike i procese koji se primenjuju za stvaranje snimaka tela subjekta (ili njegovih delova) u kliničke svrhe (medicinske procedure kojima se želi otkriti, dijagnostikovati ili pratiti bolest) ili medicinsku nauku (uključujući proučavanje normalne anatomije i fiziologije).

[0032] Kako se ovde koristi, "pozitronska emisiona tomografija" ili "PET" odnosi se na neinvazivnu, medicinsku nuklearnu tehniku koja proizvodi trodimenzionalni snimak lokacije obeleživača u telu. Metoda detektuje parove gama zraka koje indirektno emituje radionuklid koji emituje pozitron (obeleživač), koji se uvodi u telo na biološki aktivnom molekulu. Alati za PET snimanje imaju široku primenu i pomažu u razvoju lekova i pretklinički i klinički. Primeri primene uključuju direktnu vizuelizaciju zasićenja ciljeva in vivo; praćenje preuzimanja u normalnim tkivima radi predviđanja toksičnosti ili varijacije od pacijenta do pacijenta; kvantifikovanje obolelog tkiva; metastaze tumora; i praćenje efikasnosti leka tokom vremena, ili otpornosti tokom vremena.

[0033] Termin "bioortogonalna hemija" se odnosi na bilo koju hemijsku reakciju koja se može dogoditi unutar živih sistema bez ometanja prirodnih biohemijskih procesa. Termin uključuje hemijske reakcije koje su hemijske reakcije koje se javljaju in vitro pri fiziološkom pH, ili u prisustvu vode. Da bi se smatrale bioortogonolnim, reakcije su selektivne i izbegavaju neželjene reakcije sa drugim funkcionalnim grupama koje se nalaze u početnim jedinjenjima. Pored toga, stvorena kovalentna veza između reakcionih partnera treba da bude jaka i hemijski inertna u odnosu na biološke reakcije i ne bi trebalo da utiče na biološku aktivnost željenog molekula.

[0034] Termin "klik hemija" se odnosi na skup pouzdanih i selektivnih bioortogonalnih reakcija za brzu sintezu novih jedinjenja i kombinatornih biblioteka. Osobine klik reakcija uključuju modularnost, širinu obima, visok prinos, stereospecifičnost i jednostavnu izolaciju proizvoda (odvajanje od inertnih nusproizvoda nehromatografskim metodama) da bi se dobila jedinjenja koja su stabilna u fiziološkim uslovima. U radiohemiji i radiofarmaciji, klik hemija je generički termin za skup reakcija obeležavanja koje koriste selektivne i modularno građene blokove i omogućavaju hemoselektivnim ligacijama radioaktivno obeležavanje biološki relevantnih jedinjenja u odsustvu katalizatora. "Klik reakcija" može biti sa bakrom ili klik reakcija bez bakra. Termin "protetska grupa" ili "bifunkcionalno sredstvo za obeležavanje" se odnosi na mali organski molekul koji sadrži radionuklid (npr.,<18>F) koji je sposoban da bude povezan sa milamolekulom.

[0035] Kako se ovde koristi, "cilj" kao opšta referenca na "biološki cilj" se odnosi na ćeliju, tkivo (npr., kancer ili tumor), patogeni mikroorganizam (npr., bakteriju, virus, gljivice, biljku, prion, protozou ili njihov deo) ili neki drugi molekul povezan sa biološkim putem, ili biološkim fenomenom, kao što je zapaljenje tkiva, stvaranja plaka, itd.

[0036] Termin "ciljni ligand", "ciljno sredstvo" ili "ciljni molekul" se primenjuje naizmenično da označi molekul kao što je peptid, milamolekul, itd., koji se vezuje za drugi molekul. U određenim tehničkim rešenjima, ciljno sredstvo je vezano za<18>F-protetsku grupu kako bi "ciljalo" molekul povezan sa određenom ćelijom, tkivom, patogenom ili biološkim putem.

[0037] Termini "specifično vezuje," "specifično vezivanje," "selektivno vezivanje, i "selektivno vezuje," kako se ovde naizmenično primenjuju se odnose na peptid ili polipeptid koji pokazuje afinitet za biološki cilj, ali se ne vezuje značajno (npr., manje od oko 10% vezivanja) za druge molekule mereno tehnikom koja je dostupna u oblasti tehnike, kao što je, ali bez ograničenja, Scatchard-ova analiza i/ili kompetitivni testovi vezivanja (npr., kompetitivni ELISA test, BIACORE test).

[0038] Termin "IC50", kako se ovde koristi se odnosi na koncentraciju sonde zasnovane na<18>F-radioaktivno obeleženom milamolekulu koji inhibira odgovor, bilo u testu in vitro ili in vivo, na nivo koji iznosi 50% od maksimalnog inhibitornog odgovora, tj., na pola puta između maksimalnog inhibitorskog odgovora i odgovora u odsustvu lečenja.

[0039] Kako se ovde koristi, termin "vezan" se odnosi na udruživanje dva ili više molekula. Veza može biti kovalentna ili nekovalentna.

[0040] Termini "diagnostika" ili "detekcija" mogu se primenjivati naizmenično. Dok se dijagnostika obično odnosi na definisanje specifičnog histološkog statusa tkiva, detekcija prepoznaje i locira tkivo, leziju ili organizam koji sadrži određeni detektabilni cilj.

[0041] Termin "detektabilan" se odnosi na sposobnost detekcije signala preko pozadinskog signala. Termin "detektabilni signal" kako se ovde koristi u kontekstu sredstava za snimanje i dijagnostiku, je signal izveden iz neinvazivnih tehnika snimanja kao što je, ali ne ograničavajući se, pozitronska emisiona tomografija (PET). Detektabilni signal se može detektovati i razlikuje se od ostalih pozadinskih signala koji se mogu generisati od subjekta. Drugim rečima, postoji merljiva i statistički značajna razlika (npr., statistički značajna razlika je dovoljna za razlikovanje između detektabilnog signala i pozadine, kao što je oko 0.1%, 1%, 3%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, ili 40% ili više razlike između detektabilnog signala i pozadine) između detektabilnog signala i pozadine. Standardi i/ili kalibracionih kriva mogu se primenjivati za određivanje relativnog intenziteta detektabilnog signala i/ili pozadine.

[0042] "Detektibilno efikasna količina" kompozicije koja sadrži sredstvo za snimanje koje je ovde opisano je definisana kao količina dovoljna da se dobije prihvatljiv snimak primenom opreme koja je dostupna za kliničku primenu. Detektibilno efikasna količina ovde obezbeđenog sredstva za snimanje može se administrirati u više od jedne injekcije. Detektibilno efikasna količina može da varira u zavisnosti od faktora kao što su stepen osetljivosti pojedinca, starost, pol, i masa pojedinca, idiosinkratski odgovori pojedinca, i slično. Detektibilno efikasne količine kompozicija za snimanje mogu da se razlikuju u zavisnosti od primenjenih instrumenata i metodologija. Optimizacija takvih faktora je u granicama nivoa stručnosti u ovoj oblasti tehnike.

[0043] Kako se ovde koristi, "administriranje," kao što se koristi u kontekstu sredstava za snimanje odnosi se na fizičko uvođenje subjektu kompozicije koja sadrži sredstvo za snimanje, primenjujući bilo koji od različitih postupaka i sistema za isporuku koji su poznati stručnjacima u datoj oblasti tehnike. Poželjni putevi administriranja za ovde opisana sredstva za snimanje uključuju intravenski, intraperitonealni, intramuskularni, potkožni, spinalni ili drugi parenteralni način administriranja, na primer injekcijom ili infuzijom. Fraza "parenteralna administracija" kako se ovde koristi podrazumeva načine administriranja koji nisu enteralna i topikalna administracija, obično injekcijom, i uključuju, bez ograničenja, intravensku, intraperitonealnu, intramuskularnu, intraarterijsku, intratekalnu, intralimfnu, intralezijsku, intrakapsularnu, intraorbitalnu, intrakardijalnu, intradermalnu, transtrahealnu, potkožnu, subkutikularnu, intraartikularnu, subkapsularnu, subarahnoidnu, intraspinalnu, epiduralnu i intrasternalnu injekciju i infuziju, kao i in vivo elektroporaciju. Alternativno, ovde opisano sredstvo za snimanje može se administrirati neparenteralnim putem, kao što je topikalni, epidermalni ili mukozni put adminitriranja, na primer, intranazalno, oralno, vaginalno, rektalno, sublingvalno ili topikalno. Administriranje se takođe može izvršiti, na primer, jednom, više puta i/ili tokom jednog ili više produženih perioda.

[0044] Termini "koadministriranje" ili slično, kako se ovde koriste, podrazumevaju da obuhvataju adminitriranje odabranih farmaceutskih sredstava jednom pacijentu, i podrazumevaju režime u kojima se sredstva administriraju istim ili drugačijim putem administracije u isto ili u različito vreme.

[0045] Termini "pacijent" i "subjekat" se odnose na bilo koju humanu ili nehumanu životinju koja prima kompoziciju koja sadrži ovde opisano sredstvo za snimanje. Za in vitro primene, kao što su in vitro dijagnostičke i istraživačke primene, telesne tečnosti i uzorci ćelija gore navedenih subjekata biće pogodni za upotrebu, kao što su uzorci krvi, urina, ili tkiva.

[0046] Termin "uzorak" može se odnositi na uzorak tkiva, uzorak ćelije, uzorak tečnosti i slično. Uzorak se može uzeti od subjekta. Uzorak tkiva može obuhvatati dlaku (uključujući korenje), briseve iz usta, krv, pljuvačku, spermu, mišiće, ili bilo koje unutrašnje organe. Tečnost može biti, ali nije ograničena na, urin, krv, ascites, pleuralnu tečnost, spinalnu tečnost, i slično. Telesno tkivo može uključivati, ali nije ograničeno na, tkivo kože, mišića, endometrijuma, materice, i grlića materice.

[0047] Termin "izotopski čist" znači da element, jedinjenje ili kompozicija sadrži veći udeo jednog izotopa u odnosu na druge izotope. U određenim tehničkim rešenjima, element, jedinjenje, ili kompozicija su više od oko 40%, 50%, ili 60% izotopski čisti.

[0048] Kako se ovde koristi, obeleženi molekul je "prečišćen" kada se obeleženi molekul delimično ili u potpunosti odvoji od neobeleženih molekula, tako da je udeo obeleženih molekula obogaćen u poređenju sa početnom smešom. "Prečišćen" obeleženi molekul može sadržati smešu obeleženih i neobeleženih molekula u gotovo bilo kom odnosu, uključujući, ali ne ograničavajući se na oko 5:95; 10:90; 15:85; 20:80; 25:75; 30:70; 40:60; 50:50; 60:40; 70:30; 75:25; 80:20; 85:15; 90:10; 95:5; 97:3; 98:2; 99:1 ili 100:0.

[0049] Grupa "OTf" se odnosi na triflat koji ima formulu CF3SO3ili trifluorometansulfat.

[0050] Termin "halo" ili, alternativno, "halogen" ili "halid" podrazumeva fluor, hlor, brom ili jod.

[0051] U ovoj specifikaciji, grupe i njeni supstituenti mogu biti odabrani od stručnjaka iz date oblasti tehnike da se obezbede stabilni segmenti i jedinjenja i jedinjenja koja se primenjuju kao farmaceutski prihvatljiva jedinjenja i/ili intermedijerna jedinjenja koja se primenjuju u dobijanju farmaceutski prihvatljivih jedinjenja.

[0052] Razni aspekti koji su ovde opisani detaljnije su opisani u sledećim pododeljcima.

<18>F radioobeležene protetske grupe

[0053] U jednom aspektu, ovde je obezbeđen PEGilovani<18>F-piridin kovalentno vezan za azid sledeće strukture,

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, pri čemu x je ceo broj od 1 do 8. U nekim tehničkim rešenjima, x je ceo broj od 2 do 6. U nekim tehničkim rešenjima x je ceo broj od 3 do 5. U nekim tehničkim rešenjima, x je 4. U srodnim tehničkim rešenjima,<18>F je vezan za piridin orto prema atomu N. U nekim tehničkim rešenjima, [O(CH2)2]xsegment je prisutan u 1-3 konfiguraciji u odnosu na azot na prstenu piridina. U nekim tehničkim rešenjima, [O(CH2)2]xsegment je prisutan u 1-2 konfiguraciji u odnosu na azot na prstenu piridina. U drugim tehničkim rešenjima, [O(CH2)2]xsegment je prisutan u 1-4 konfiguraciji u odnosu na azot na prstenu piridina.

[0054] U nekim tehničkim rešenjima,<18>F-radioobeleženo jedinjenje ima strukturu

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, pri čemu x je ceo broj od 1 do 8. U nekim tehničkim rešenjima, x je ceo broj od 2 do 6. U nekim tehničkim rešenjima x je ceo broj od 3 do 5. U nekim tehničkim rešenjima, x je 4. U nekim tehničkim rešenjima, [O(CH2)2]xsegment je prisutan u 1-3 konfiguraciji u odnosu na azot na prstenu piridina. U nekim tehničkim rešenjima, [O(CH2)2]xsegment je prisutan u 1-2 konfiguraciji u odnosu na azot na prstenu piridina. U drugim tehničkim rešenjima, [O(CH2)2]xsegment je prisutan u 1-4 konfiguraciji u odnosu na azot na prstenu piridina.

[0055] U nekim tehničkim rešenjima,<18>F-radioobeleženo jedinjenje ima strukturu

pri čemu x je ceo broj od 1 do 8. U nekim tehničkim rešenjima, x je ceo broj od 2 do 6. U nekim tehničkim rešenjima x je ceo broj od 3 do 5. U nekim tehničkim rešenjima, x je 4.

[0056] U nekim tehničkim rešenjima,<18>F-radioobeleženo jedinjenje je [<18>F]-3-(2-(2-(2-(2-azidoetoksi)etoksi)etoksi)etoksi)-2-fluoropiridin (<18>F-FPPEGA) i ima strukturu

[0057] U alternativnim tehničkim rešenjima,<18>F-radioobeležena protetska grupa može sadržati dodatne grupe na piridinskom prstenu koje ne ometaju reakciju fluorovanja. U određenim tehničkim rešenjima, dodaci piridinskom prstenu uključuju C1-6alkil grupe, na primer metil, etil i propil.

[0058] U još nekim tehničkim rešenjima,<18>F-radiobeležena protetska grupa je fuzionisani sistem prstena sledeće strukture:

pri čemu "OPEG" je [O(CH2)2]x, i x je ceo broj od 1 do 8. U nekim tehničkim rešenjima, x je ceo broj od 2 do 6. U nekim tehničkim rešenjima, x je ceo broj od 3 do 5. U nekim tehničkim rešenjima, x je 4.

[0059] U srodnom aspektu, ovde je obezbeđen postupak za pripremu<18>F-piridina kovalentno vezanog za azid sledeće strukture,

pri čemu x je ceo broj od 1 do 8, postupak obuhvata korake

(a) obezbeđivanje rastvora jedinjenja a sledeće strukture:

pri čemu x je ceo broj od 1 do 8, i R je NO2, Br, F ili

i orto je prema atomu N piridinskog prstena;

(b) obezbeđivanje smeše<18>F u<18>Ovodi, 4,7,13,16,21,24-heksaoksa-1,10-diazabiciklo[8.8.8]heksakosana i slabe baze;

(c) sušenje smeše iz koraka (b) da se dobije čvrsta supstanca; i

(d) reagovanje rastvora iz koraka (a) sa čvrstom supstancom iz koraka (c) da se dobije<18>F-obeleženo jedinjenje.

[0060] U određenim tehničkim rešenjima, postupkom se priprema<18>F-piridin protetska grupa sledeće strukture b

(gde<18>F je orto prema atomu N), i uključuje korake

(a) obezbeđivanje rastvora jedinjenja strukture

(gde X je orto prema atomu N) gde X je NO2, Br ili

(b) obezbeđivanje smeše<18>F u<18>Ovodi, 4,7,13,16,21,24-heksaoksa-1,10-diazabiciklo[8.8.8]heksakosana i slabe baze, kao što je K2CO3;

(c) sušenje smeše iz koraka (b) da se dobije čvrsta supstanca; i

(d) reagovanje rastvora iz koraka (a) sa čvrstom supstancom iz koraka (c) da se dobije<18>F-obeleženo jedinjenje.

[0061] U određenim tehničkim rešenjima, postupak dalje obuhvata korak pripreme jedinjenja sledeće strukture a

prema shemi I prikazanoj dole:

[0062] U određenim tehničkim rešenjima, postupak obuhvata pripremanje<18>F-piridin protetske grupe [<18>F]-3-(2-(2-(2-(2-azidoetoksi)etoksi)etoksi)etoksi)-2-fluoropiridin (<18>F-FPPEGA), e, do_d, prema sledećim reakcionim uslovima:

Formulacije

[0063] Dalje su date smeše, npr., farmaceutske kompozicije, koje sadrže jedno ili kombinaciju ovde opisanih<18>F-obeleženih sredstava za ciljanje, formulisanih zajedno sa farmaceutski prihvatljivim nosačem. Takve kompzicije mogu da sadrže jedno ili kombinaciju (npr., dva ili više različitih) ovde opisanih sredstava. Na primer, ovde opisana farmaceutska kompozicija može da sadrži kombinaciju<18>F-obeleženog sredstva za ciljanje i leka.

[0064] Kako se ovde koristi, "farmaceutski prihvatljiv nosač" uključuje bilo koji i sve rastvarače, disperzijski medijum, obloge, antibakterijska i antifungalna sredstva, izotonična sredstva i sredstva za usporavanje apsorpcije, i slično koji su fiziološki kompatibilni. Poželjno je da je nosač pogodan za intravensku, intramuskularnu, potkožnu, parenteralnu, spinalnu ili epidermalnu administraciju (npr., injekcijom ili infuzijom). U zavisnosti od puta administriranja,<18>F-obeleženo sredstvo za ciljanje može da bude obloženo materijalom da zaštiti jedinjenje od delovanja kiselina i drugih prirodnih uslova koji mogu inaktivirati jedinjenje.

[0065] Farmaceutska jedinjenja koja su ovde opisana mogu da sadrže jednu ili više farmaceutski prihvatljivih soli. "Farmaceutski prihvatljiva so" se odnosi na so koja zadržava željenu biološku aktivnost matičnog jedinjenja i ne daje neželjene toksikološke efekte (videti npr., Berge, S.M., i sar. (1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19). Primeri takvih soli uključuju kisele adicione soli i bazne adicione soli. Kisele adicione soli uključuju soli izvedene iz netoksičnih neorganskih kiselina, kao što su hlorovodonična, azotna, fosforna, sumporna, bromovodonična, jodovodonična, fosforasta i slično, kao i iz netoksičnih organskih kiselina kao što su alifatične mono- i dikarboksilne kiseline, fenil supstituisane alkanske kiseline, hidroksi alkanske kiseline, aromatične kiseline, alifatske i aromatične sulfonske kiseline i slično. Bazne adicione soli uključuju soli izvedene iz zemnoalkalnih metala, kao što su natrijum, kalijum, magnezijum, kalcijum i slično, kao i iz netoksičnih organskih amina, kao što su N,N'-dibenziletilendiamin, N-metilglukamin, hloroprokain, holin, dietanolamin, etilendiamin, prokain i slično.

[0066] Farmaceutska kompozicija koja je ovde opisana takođe može da sadrži farmaceutski prihvatljiv antioksidant. Primeri farmaceutski prihvatljivih antioksidanasa uključuju: (1) antioksidanse rastvorljive u vodi, kao što su askorbinska kiselina, cistein hidrohlorid, natrijum bisulfat, natrijum metabisulfit, natrijum sulfit i slično; (2) antioksidanti rastvorljivi u ulju, kao što su askorbil palmitat, butilisani hidroksianizol (BHA), butilisani hidroksitoluen (BHT), lecitin, propil galat, alfa-tokoferol, i slično; i (3) metalni helatni agensi, kao što su limunska kiselina, etilendiamin tetrasirćetna kiselina (EDTA), sorbitol, vinska kiselina, fosforna kiselina, i slično.

[0067] Primeri pogodnih vodenih i nevodnih nosača koji se mogu koristiti u ovde opisanim farmaceutskim kompozicijama uključuju vodu, etanol, poliole (kao što su glicerol, propilen glikol, polietilen glikol, i slično), i njihove odgovarajuće smeše, biljna ulja kao što su maslinovo ulje i organski estri za injekcije, kao što je etil oleat. Odgovarajuća fluidnost se može održavati, na primer, primenom materijala za oblaganje, kao što je lecitin, održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju disperzije, i primenom površinski aktivnih supstanci.

[0068] Ove kompozicije takođe mogu da sadrže adjuvanse kao što su konzervansi, sredstva za vlaženje, emulgatori i sredstva za dispergovanje. Sprečavanje prisustva mikroorganizama može se obezbediti kako postupcima sterilizacije, supra, tako i uključivanjem različitih antibakterijskih i antimikotičnih sredstava, na primer parabena, hlorobutanola, fenol sorbinske kiseline, i slično. Takođe može biti poželjno da kompozicije uključuju izotonična sredstva, kao što su šećeri, natrijum hlorid, i slično. Pored toga, produžena apsorpcija farmaceutskog oblika za injekcije može se postići uključivanjem sredstava koja odlažu apsorpciju kao što su aluminijum monostearat i želatin.

[0069] Farmaceutski prihvatljivi nosači uključuju sterilne vodene rastvore ili disperzije i sterilne praškove za privremenu pripremu sterilnih injekcionih rastvora ili disperzija. Primena takvih medijuma i sredstava za farmaceutski aktivne supstance je poznata u oblasti tehnike. Osim u slučaju da je bilo koji uobičajeni medijum ili sredstvo nekompatibilno sa aktivnim jedinjenjem, razmatra se njihova primena u ovde opisanim farmaceutskim kompozicijama. Dodatna aktivna jedinjenja se takođe mogu ugraditi u smeše.

[0070] Farmaceutske kompzicije tipično moraju biti sterilne i stabilne pod uslovima proizvodnje i skladištenja. Komozicija se može formulisati kao rastvor, mikroemulzija, lipozom, ili druga uređena struktura pogodna za visoku koncentraciju leka. Nosač može biti rastvarač ili disperzijski medijum koji sadrži, na primer, vodu, etanol, poliol (na primer, glicerol, propilen glikol, i tečni polietilen glikol, i slično), i njihove odgovarajuće smeše. Odgovarajuća fluidnost se može održavati, na primer, primenom obloge kao što je lecitin, održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju disperzije i primenom površinski aktivnih sredstava. U mnogim slučajevima poželjno je da komozicija uključuje izotonična sredstva, na primer, šećere, polialkohole poput manitola, sorbitola, ili natrijum hlorida. Produžena apsorpcija kompozicija za injekcije može se postići uključivanjem u kompoziciju sredstva koji odlaže apsorpciju, na primer, soli monostearata i želatin.

[0071] Sterilni rastvori za injekcije mogu se pripremiti tako što će se ugraditi<18>F-obeleženo sredstvo za ciljanje u potrebnoj količini u odgovarajućem rastvaraču sa jednim ili kombinacijom gore navedenih sastojaka, nakon čega sledi sterilizaciona mikrofiltracija. Generalno, disperzije se pripremaju ugrađivanjem aktivnog jedinjenja u sterilni nosač koji sadrži osnovni medijum za disperziju i potrebne ostale sastojke od gore navedenih. U slučaju sterilnih praškova za pripremu sterilnih rastvora za injekcije, poželjni postupci pripreme su vakuumsko sušenje i sušenje zamrzavanjem (liofilizacija) koji daju prašak aktivnog sastojka plus bilo koji dodatni željeni sastojak iz prethodno sterilnog filtriranog rastvora.

[0072] Količina<18>F-označenog ciljanog sredstva koji se može kombinovati sa materijalom nosača da se dobije jedinični oblik doziranja variraće u zavisnosti od subjekta koji se leči, i određenog načina administriranja. Količina<18>F-obeleženog sredstva za ciljanje koje se može kombinovati sa materijalom nosača da se dobije jedinični oblik doziranja generalno će biti ona količina kompozicije koja proizvodi detektovan efekat. Generalno, od sto posto, ova količina će se kretati od oko 0.01 procenata do oko devedeset i devet posto aktivnog sastojka, poželjno od oko 0.1 procenata do oko 70 procenata najpoželjnije od oko 1 procenata do oko 30 procenata aktivnog sastojka u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivim nosačem.

Administracija i snimanje

[0073]<18>F-označena sredstva za ciljanje ovde opisana se korisna u raznim in vivo primenama snimanja (npr., za snimanje tkiva ili celog tela). U određenim tehničkim rešenjima,<18>F-obeleženo sredstvo za ciljanje može se primenjujivati za snimak ciljano-pozitivnih ćelija ili tkiva, npr., ciljeva koji izrađavaju tumore. Na primer, obeleženo<18>F-obeleženo sredstvo za ciljanje se administrira subjektu u količini dovoljnoj da preuzme<18>F-obeleženo sredstvo za ciljanje u tkivo od interesa. Subjekat se zatim snima pomoću sistema za snimanje kao što je PET tokom odgovarajućeg vremena za<18>F radionuklid.<18>F-obeleženo sredstvo za ciljanje vezano za ćelije ili tkiva koja eksprimiraju sredstvo za ciljanje se zatim detektuju sistemom za snimanje.

[0074] Tipično, za potrebe snimanja poželjno je da se primaocu obezbedi doza milamolekula koja je u opsegu od oko 1 mg do 200 mg kao jedinačna intravenska infuzija, mada se može administrirati niža ili veća doza prema okolnostima. Tipično je poželjno da se primaocu obezbedi doza koja se kreće u opsegu od oko 1 mg do 10 mg po kvadratnom metru telesne površine proteina ili peptida za tipičnu odraslu osobu, mada niža ili veća doza takođe može da se administrira prema okolnostima. Primeri doziranja proteina ili peptida koji se mogu administrirati humanom subjektu u svrhu snimanja su oko 1 do 200 mg, oko 1 do 70 mg, oko 1 do 20 mg, i oko 1 do 10 mg, mada se mogu primenivati veće ili manje doze.

[0075] U određenim tehničkim rešenjima, administracija se dešava u količini<18>F-radioobeleženog - milamolekula između oko 0.005µg/kg telesne mase do oko 50µg/kg telesne mase dnevno, obično između 0.02µg/kg telesne mase do oko 3µg/kg telesne mase. Masa povezana sa PET obeleživačem je u obliku prirodnog izotopa, naime<19>F za<18>F PET obeleživač. Određena analitička doza za trenutnu kompoziciju uključuje od oko 05µg do oko 100µg<18>F-radioobeleženog milamolekula. Doziranje će obično biti od oko 1µg do oko 50µg<18>F-radioobeleženog milamolekula.

[0076] Režimi doziranja su prilagođeni da obezbede optimalnu detektiabilnu količinu za dobijanje jasnog snimka tkiva ili ćelija koje preuzima<18>F-obeleženo sredstvo za ciljanje. Naročito je korisno formulisati parenteralne kompozicije u doznom jediničnom obliku radi lakšeg administriranja i ujednačenosti doziranja. Dozni jedinični oblik, kako se ovde koristi, se odnosi na fizički odvojene jedinice koje odgovaraju jedinstvenim dozama za subjekte kojima treba administrirati<18>F-obeleženo sredstvo za ciljanje. Specifikacije za ovde opisane dozne jedinične oblike se izdaju i direktno zavise od (a) jedinstvenih karakteristika ciljanog dela<18>F-obeleženog sredstva za ciljanje; (b) tkiva ili ćelija koje treba ciljati; (c) ograničenja svojstvena tehnologiji snimanja koja se primenjuje.

[0077] Za administriranje<18>F-obeleženog sredstva za ciljanje, primenjena doza zavisi od vrste bolesti, primenjenog jedinjenja za ciljanje, starosti, fizičkog stanja, i pola subjekta, stepena bolesti, mesta koje treba ispitati, i drugih. Posebno se mora voditi računa o dozama izloženosti subjekta. Poželjno je da se doza zasićenja<18->F administrira pacijentu. Na primer, količina radioaktivnosti<18>F-obeleženog sredstva za ciljanje obično se kreće od 3.7 megabekerela do 3.7 gigabekerela, i poželjno od 18 megabekerela do 740 megabekerela. Alternativno, doziranje se može meriti, na primer, u milikirima. U nekim tehničkim rešenjima, količina<18>F za snimanje administrirana za ispitivanje snimanjem je 5 do 10 mCi. U drugim tehničkim rešenjima, efikasna količina će biti količina jedinjenja dovoljna za proizvodnju emisije u opsegu od oko 1-5 mCi.

[0078] Stvardni nivoi doziranja aktivnih sastojaka u ovde opisanim farmaceutskim kompozicijama mogu se menjati tako da se dobije količina aktivnog sastojka koja je efikasna za postizanje željenog preuzimanja<18>F-obeleženog sredstva za ciljanje u ćelijama i tkivima određenog pacijenta, komozicije, i načina administriranja, bez toksičnosti za pacijenta. Razume se, međutim, da će o ukupnoj dnevnoj primeni<18>F-obeleženog sredstva za ciljanje prema predmetnoj objavi, odlučiti lekar koji prisustvuje ili drugi lekar u okviru medicinske procene. Specifični efikasni nivo doze za bilo koji određeni subjekat zavise od različitih faktora, uključujući, na primer, aktivnost specifičnog korišćene kompozicije; specifične kompozicije koja se koristi; starosti, telesne mase, opšteg zdravlja, pola i ishrane domaćina; vremena administriranja; puta administriranja; brzine izlučivanja određenog jedinjenja koje se koristi; trajanja lečenja; drugih lekova, jedinjenja i/ili materijala koji se primenjuju u kombinaciji sa određenim upotrebljenim kompozicijama, uzrastom, polom, masom, stanjem, opštim zdravljem i prethodnom istorijom bolesti pacijenta koji se leči, i sličnih faktora dobro poznatih u medicinskoj oblasti tehnike. U određenim tehničkim rešenjima, količinu<18>F-radioobeležene sonde administrirane u humani subjekat koja je potrebna za snimanje odrediće lekar koji propisuje lekove, a doza se generalno razlikuje prema u zavisnosti od količine emisije od<18>F-radionuklida.

[0079] Kompozicija opisana ovde može se administrirati na jedan ili više puteva administriranja primenjujući jedan ili više različitih načina poznatih u oblasti tehnike. Kao što će proceniti stručnjak iz date oblasti tehnike, put i/ili način administriranja variraće u zavisnosti od željenih rezultata. Poželjni putevi administriranja za ovde opisano<18>F-obeleženo sredstvo za ciljanje uključuju intravenski, intramuskularni, intradermalni, intraperitonealni, potkožni, spinalni ili drugi parenteralni put administriranja, na primer injekcijom ili infuzijom. Fraza "parenteralna administracija" kako se ovde koristi podrazumeva načine administriranja osim enteralne i topikalne administracije, obično injekcijom, i uključuje, bez ograničenja, intravensku, intramuskularnu, intraarterijsku, intratekalnu, intrakapsularnu, intraorbitalnu, intrakardijalnu, intradermalnu, intraperitonealnu, transtrahealnu, potkožnu, subkutikularnu, intraartikularnu, subkapsularneu, subarahnoidnu, intraspinalnu, epiduralnu i intrasternalnu injekciju i infuziju. U određenim tehničkim rešenjima,<18>F-radioobeleženo jedinjenje za ciljanje se administrira intravenozno.

[0080] Alternativno, ovde opisano<18>F-obeleženo sredstvo za ciljanje može se administrirati neparenteralnim putem kao što je topikalni, epidermalni ili mukozni put administriranja, na primer intranazalni, oralni, vaginalni, rektalni, sublingvalni ili topikalni.

[0081] U odeređnim tehničkim rešenjima, ovde opisano<18>F-obeleženo sredstvo za ciljanje može se formulisati da obezbedi pravilnu distribuciju in vivo. Na primer, krvno-moždana barijera (BBB) isključuje mnoga visoko hidrofilna jedinjenja. Sredstva mogu preći BBB njihovim formulisanjem na primer, u lipozomima. Za postupke proizvodnje lipozoma, videti, npr., U.S. patente 4,522,811; 5,374,548; i 5,399,331. Lipozomi mogu da obuhvate jedan ili više delova koji se selektivno transportuju u određene ćelije ili organe, čime se poboljšava ciljana isporuka leka (videti, npr., V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685). Primeri delova za ciljanje uključuju folat ili biotin (videti, npr., U.S. patent 5,416,016 od Low i sar.); manozide (Umezawa i sar., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038); antitela (P.G. Bloeman i sar. (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais i sar. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180); receptor za surfaktant protein A (Briscoe i sar. (1995) Am. J. Physiol. 1233:134); p120 (Schreier i sar. (1994) J. Biol. Chem.269:9090); videti takođe K. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994) FEBS Lett.

346:123; J.J. Killion; I.J. Fidler (1994).

[0082] Sledeći ilustrativni postupak može se koristiti prilikom izvođenja studija PET snimanja na pacijentima u klinici. Pacijentu se prethodno pripremi neobeležena milamolekul neko vreme pre dana eksperimenta i bez unošenja hrane najmanje 12 sati omogućavajući unos vode po želji. Dvo-inčni venski kateter od 20 G ubacuje se u kontralateralnu ulnarnu venu radi koncentracije administriranja radioobeleživača u krvi.

[0083] Pacijent je smešten u PET kameru i doza PET obeleživača<18>F-radioobeleženog milamolekula (<20 mCi) se administrira putem i.v. katetera. Uzorci arterijske ili venske krvi uzimaju se u odgovarajućim vremenskim intervalima tokom PET skeniranja kako bi se analizirala i kvantifikovala frakcija nemetabolizovanog PET obeleživača [<18>F] Primera 2 jedinjenja u plazmi. Snimci se prikupljaju do 120 min. U roku od deset minuta od injekcije radioobeleživača i na kraju sesije snimanja dobijaju se uzorci krvi od 1 ml za određivanje koncentracije u plazmi bilo koje neobeležene milamolekula koja može biti adminitrirana pre PET obeleživača.

[0084] Tomografski snimci se dobijaju rekonstrukcijom snimka. Da bi se utvrdila distribucija radioobeleživača, na rekonstruisanom snimku se crtaju regioni od interesa (ROI) uključujući, ali bez ograničenja, pluća, jetru, srce, bubrege, kožu ili druge organe i tkiva. Preuzimanje radioobeleživača tokom vremena u ovim regionima primenjuje se za generisanje kriva vremenske aktivnosti (TAC) dobijenih u odsustvu bilo kakve intervencije ili u prisustvu neobeleženog milamolekula u različitim ispitivanim paradigmama doziranja. Podaci su izraženi kao radioaktivnost po jedinici vremena po jedinici zapremine (µCi/cc/mCi injektovane doze). TAC podaci se obrađuju sa različitim metodama dobro poznatim u oblastima tehnike da bi se dobili kvantitativni parametri, kao što su potencijal vezivanja (BP) ili zapremina raspodele (VT), koji su proporcionalni gustini nenastanjenog ciljanog pozitivnog tkiva.

Primene

[0085] Postupci snimanja koji primenjuju<18>F-obeležena sredstva za ciljanje su ovde obezbeđeni. Obeleživači pozitronske emisione tomografije (PET) kao što su predmetne PET sonde zasnovane na<18>F-radiobeleženom milamolekulu mogu se primeniti sa trenutno dostupnom PET tehnologijom za primenu u istraživačkim i dijagnostičkim primenama snimanja in vitro i in vivo. Tehnike snimanja i oprema za<18>F snimanje PET skeniranjem su dobro poznate u oblasti tehnike (videti, npr., U.S. pat. br. 6,358,489; 6,953,567; Page i sar., Nuclear Medicine And Biology, 21:911-919, 1994; Choi i sar., Cancer Research 55:5323-5329, 1995; Zalutsky i sar., J. Nuclear Med., 33:575-582, 1992) i bilo koja takva poznata tehnika PET snimanja ili aparat mogu se koristiti.

[0086] In vivo primene ovde obezbeđenih postupaka snimanja uključuju dijagnozu bolesti, praćenje progresije bolesti, prognozu, utvrđivanje verovatnoće da subjekat odgovori na lečenje, utvrđivanje podobnosti za lečenje, praćenje kliničkog odgovora na terapiju, kliničku procenu i izbor doze terapijskih jedinjenja, pretkliničke studije potencijalnih kandidata za lekove na životinjskim modelima, i proučavanje regionalne distribucije i koncentracije ciljanih molekula u tkivima i organima. In vitro primene uključuju skrining kandidata za lek u ćelijskim testovima (npr., kompetetivni testovi, testovi afiniteta, itd.).

[0087] U nekim tehničkim rešenjima,<18>F-obeležena sredstva za ciljanje mogu se primenjivati za utvrđivanje odnosa između nivoa zauzetosti tkiva od strane terapijskih jedinjenja i kliničke efikasnosti kod pacijenata; za utvrđivanje izbora doze za klinička ispitivanja kandidata za lek pre započinjanja dugoročnih kliničkih studija; i za upoređivanje potencijala različitih kandidata za lekove.

[0088] U nekim tehničkim rešenjima,<18>F-radioobeleženo jedinjene za ciljanje se primenjuje u postupku za in vivo snimanje normalnih ili bolesnih tkiva i/ili organa (npr., pluća, srca, bubrega, jetre, i kože). Na primer,<18>F-radioobeleženo jedinjenje za ciljanje se administrira subjektu u količini efikasnoj da dovede do preuzimanja<18>F-radioobeleženog jedinjenja za ciljanje u ćelije ili tkivo od interesa. Subjekat se zatim uvodi u odgovarajući sistem za snimanje (npr., PET sistem) tokom dovoljne količine vremena da omogući detektovanje<18>F-radioobeleženog jedinjenja za ciljanje. Lokacija detektovanog signala od<18>F-radioobeleženog jedinjenja za ciljanje može biti u korelaciji sa lokacijom ćelija ili tkiva od interesa. U nekim tehničkim rešenjima, mogu se utvrditi i dimenzije lokacije. In vivo snimanje je ovde opisano. Videti takođe U.S. pat. br. 6,126,916; 6,077,499; 6,010,680; 5,776,095; 5,776,094; 5,776,093; 5,772,981; 5,753,206; 5,746,996; 5,697,902; 5,328,679; 5,128,119; 5,101,827; i 4,735,210, svaki ovde inkoporiran referencom.

[0089] Prema tome, u određenim aspektima, obezbeđen je postupak za dobijanje snimka sonde zasnovane na<18>F-radioobeleženom milamolekulu, postupak obuhvata administriranje subjektu sonde zasnovane na<18>F-radioobeleženom milamolekulu, i snimanje in vivo distribucije sonde zasnovane na<18>F-radioobeleženom milamolekulu pomoću PET.

[0090] U određenim tehničkim rešenjima, subjekat je sisar, na primer, čovek, pas, mačka, majmun, majmun, pacov ili miš.

[0091] U određenim tehničkim rešenjima, obezbeđena je sonda zasnovana na<18>F-radioobeleženom milamolekulu koja se vezuje za ciljani molekul koji je povezan sa prisustvom bolesti za primenu u dijagnostikovanju prisustva bolesti kod subjekta, i dobijanje radio snimka najmanjeg dela subjekta za detektovanje prisustva ili odsustva sonde zasnovane na<18>F-radioobeleženom milamolekulu.

[0092] U nekim tehničkim rešenjima, bolest je solidni kancer, kancer hematopoeze, hematološki kancer, autoimuna bolest, neurodegenerativna bolest, kardiovaskularna bolest ili patogena infekcija.

[0093] PET snimanje sa<8>F-radioobeleženim jedinjenjem za ciljanje može se primenjivati za kvalitativno ili kvantitativno detektovanje ciljanog jedinjenja.<8>F-radioobeleženo jedinjenje za ciljanje kao sredstvo za snimanje može se primenjivati kao biomarker, i prisustvo ili odsustvo pozitivnog signala kod subjekta može biti indikativno da bi, npr., subjekat reagovao na datu terapiju, npr., terapiju kancera, ili da subjekat reaguje ili ne na terapiju.

[0094] U nekim tehničkim rešenjima, koraci ovog postupka mogu se ponoviti u određenim intervalima, tako da se lokacija i/ili veličina bolesti mogu pratiti u zavisnosti od vremena i/ili lečenja. U određenim tehničkim rešenjima,<18>F-radioobeleženo jedinjenje za ciljanje može se primenivati kod subjekta koji je na lečenju (npr., hemoterapiji, itd.), da bi pomogao u vizuelizaciji odgovora na lečenju. Na primer,<18>F-radioobeleženo jedinjenje za ciljanje se tipično vizualizuje i prilagođava pre terapije, i periodično (npr., dnevno, nedeljno, mesečno, intervali između njih, i slično) tokom lečenja za praćenje progresije ili regresije bolesti kod pacijenta.

[0095] Prema tome, u određenim aspektima, obezbeđena je sonda zasnovana na<18>F-radioobeleženom milamolekulu koja se vezuje za ciljani molekul koji je povezan sa prisustvom bolesti za primenu u praćenju napretka bolesti kod subjekta kojem je to potrebno u prvom trenutku i dobijanja snimka najmanjeg dela subjekta da bi se utvrdila količina obolelih ćelija ili tkiva, i administriranje subjektu sonde zasnovane na<18>F-radioobeleženom milamolekulu u jednoj ili više sledećih vremenskih tačaka i dobijanje snimka najmanjeg dela subjekta u svakoj sledećoj vremenskoj tački (npr., isti deo kao i prva vremenska tačka).

[0096] U određenim tehničkim rešenjima, veličina tumora može se pratiti kod subjekta koji se podvrgava terapiji kancera (npr., hemoterapiji, radioterapiji) a obim regresije tumora može se pratiti u realnom vremenu na osnovu detekcije<18>F-radioobeleženog ciljanog tumora.

[0097] U nekim tehničkim rešenjima, predmetni pronalazak se ovde primenjuje za procenu pacijentovog odgovora na terapiju. U nekim tehničkim rešenjima, pronalazak se primenjuje za odabir ili modifikovanje doze terapijskih jedinjenja. U nekim tehničkim rešenjima, pronalazak se primenjuuje za praćenje preuzimanja<18>F-radioobeleženog jedinjenja za ciljanje u normalna tkiva za analizu toksičnosti ili varijacije od pacijenta do pacijenta. U nekim tehničkim rešenjima, pronalazak se primenjuje za praćenje efikasnosti leka ili detektovanje rezistencije na lekove.

[0098] U nekim tehničkim rešenjima, radioobeležena jedinjenja se administriraju sisarima, poželjno ljudima, u farmaceutskoj kompoziciji, bilo samostalno ili u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivim nosačima ili razblaživačima, u skladu sa standardnom farmaceutskom praksom. Takve kompozicije se mogu administrirati oralno ili parenteralno, uključujući intravenske, intramuskularne, intraperitonealne, potkožne, rektalne i topikalne puteve administriranja. U određenim tehničkim rešenjima, administriranje je intravensko. U određenim tehničkim rešenjima radioobeležena jedinjenja se administriraju putem intravenske injekcije u roku kraćem od jednog sata od sinteze.

[0099] U nekim tehničkim rešenjima, biološka aktivnost<18>F-radioobeleženog sredstva za ciljanje in vivo može se meriti u smislu organskog preuzimanja pomoću studija biodistribucije i dinamičkih studija PET snimanja malih životinja u odgovarajućem životinjskom modelu. Na primer, za studije biološke raspodele, grupi životinja se injektira<18>F-radioobeleženo sredstvo za ciljanje i podskupovi životinja se žrtvuju u jednom ili više vremenskih intervala (npr., 5 minuta, 10 minuta, 30 minuta, 60 minuta, 2 h). Organi i tkiva od interesa se brzo isecaju i vagaju, i utvrđuje se radioaktivnost. Akumulirana radioaktivnost u organima i odabranim tkivima izračunava se kao procenat injektirane doze (%ID).

[0100] U nekim tehničkim rešenjima,<18>F-radioobeleženo sredstvo za ciljanje koje je ovde obezbeđeno se primenjuje in vitro kao alat za skrining za odabir jedinjenja za primenu u lečenju tkiva ili ćelija. Na primer, u nekim tehničkim rešenjima, bolesne ćelije se inkubiraju sa<18>F-radioobeleženim jedinjenjem za ciljanje tokom ili nakon izlaganja jednom ili više lekova kandidata. Sposobnost kandidata za lek da utiče na bolest može se vremenom prikazati primenom<18>F-radioobeleženog jedinjenja za ciljanje.

[0101] Na primer, integritet biološke aktivnosti<18>F-radioobeležnog sredstva za ciljanje in vitro u smislu specifičnog vezivanja za izabrani ciljani molekul i preuzimanja radioobeležene kompozicije procenjuje se u ćelijskoj liniji koja izražava ciljni molekul. Za testove vezivanja i ćelijske asocijacije, ćelije se inkubiraju na 4°C ili 37°C u odgovarajućem vremenu sa<18>F-radioobeleženom kompozicijom za ciljanje. Nespecifično vezivanje se utvrđuje dodavanjem viška neobeleženog sredstva za ciljanje. Obim specifičnog vezivanja izračunava se oduzimanjem nespecifičnog vezivanja od ukupnog vezivanja. Preuzimanje se izražava u procentima od ukupne dodate doze sredstva za ciljanje u ćelije po mikrogramu proteina (%ID/µg ćelijskog proteina).

[0102] U srodnom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje dijagnostičku ili radiofarmaceutsku kompoziciju za in vivo ili in vitro, koja uključuje sondu zasnovanu na<18>F-radioobeleženom milamolekulu, i farmaceutski prihvatljiv nosač.

[0103] Objava je sada opisana pozivanjem na sledeće primere, koji su samo ilustrativni, i nisu namenjeni ograničavanju predmetne objave..

Analitički uslov A:

[0104] Kolona: Waters BEH C18, 2.0 x 50 mm, čestice 1.7-µm; mobilna faza A: 5:95 acetonitril:voda sa 10 mM amonijum acetata; mobilna faza B: 95:5 acetonitril:voda sa 10 mM amonijum acetata; temperatura: 50 °C; gradijent: 0%B, 0-100% B u toku 3 minuta, zatim 0.5-minuta držanja na 100% B; protok: 1 mL/min; detekcija: UV na 220 nm.

Analitički uslov B:

[0105] Kolona: Waters BEH C18, 2.0 x 50 mm, čestice 1.7-µm; mobilna faza A: 5:95 metanol:voda sa 10 mM amonijum acetata; mobilna faza B: 95:5 metanol:voda sa 10 mM amonijum acetata; temperatura: 50 °C; gradijent: 0%B, 0-100% B u toku 3 minuta, zatim 0.5-minuta držati na 100% B; protok: 0.5 mL/min; detekcija: UV na 220 nm.

Postupak jedostrukog kuplovanja:

[0106] U reakcionu posudu koja sadrži smolu iz prethodnog koraka dodat je piperidin:DMF (20:80 v/v, 5.0 mL). Smeša se periodično meša 3 ili 5 minuta i zatim se rastvor isuši kroz frit. U reakcionu posudu dodat je rastvor piperidin:DMF (20:80 v/v, 5.0 mL). Smeša se periodično meša 3 ili 5 minuta i zatim se rastvor isuši kroz frit. Smola se opere uzastopno pet puta na sledeći način: za svako pranje, DMF (4.0 mL) se dodaje kroz vrh posude i dobijena smeša se periodično meša 60 sekundi pre nego što se rastvor isprazni kroz frit. U reakcionu posudu je dodata aminokiselina (0.2M u DMF, 5.0 mL, 10 ekv), zatim HATU ili HCTU (0.2M u DMF, 5.0 mL, 10 ekv), i na kraju NMM (0.8M u DMF, 2.5 mL, 20 ekv). Smeša se periodično meša 60 minuta, zatim se reakcioni rastvor isuši kroz frit. Smola se opere uzastopno četiri puta na sledeći način: za svako pranje, DMF (4.0 mL) se dodaje kroz vrh posude i dobijena smeša se periodično meša 30 sekundi pre nego što se rastvor isuši kroz frit. U reakcionu posudu je dodat rastvor anhidrid sirćetne kiseline:DIEA:DMF (10:1:89 v/v/v, 5.0 mL). Smeša se periodično meša 10 minuta, zatim se reakcioni rastvor isuši kroz frit. Smola se opere uzastopno četiri puta na sledeći način: za svako pranje, DMF (4.0 mL) se dodaje kroz vrh posude i dobijena smeša se periodično meša 90 sekundi pre nego što se rastvor isuši kroz frit. Dobijena smola se primenjuje direktno u sledećem koraku.

Postupak dvostrukog kuplovanja:

[0107] U reakcionu posudu koja sadrži smolu iz prethodnog koraka dodat je rastvor piperidin:DMF (20:80 v/v, 5.0 mL). Smeša se periodično meša 3 minuta i zatim se rastvor isuši kroz frit. U reakcionu posudu je dodat rastvor piperidin:DMF (20:80 v/v, 5.0 mL). Smeša se periodično meša 3 minuta i zatim se rastvor isuši kroz frit. Smola se opere uzastopno tri puta na sledeći način: pranje sa DMF (7 mL) pranje odozgo, zatim pranje sa DMF (7 mL) odozdo i na kraju pranje sa DMF (7 mL) odozgo. U reakcionu posudu je dodata aminokiselina (0.2M u DMF,2.5 mL, 5 ekv), HATU (0.5M u DMF, 1.0 mL, 5 ekv), i DIPEA (2M u NMP, 0.5 mL, 10 ekv). Smeša je mešana barbotiranjem N2tokom 5 minuta na 75 °C za sve aminokiseline, osim Fmoc-Cys(Trt)-OH i Fmoc-His(Trt)-OH koje se kupluju na 50 °C, reakcioni rastvor se isuši kroz frit. Smola se opere uzastopno tri puta na sledeći način: pranje sa DMF (7 mL) odozgo, zatim pranje sa DMF (7 mL)) odozdo i na kraju pranje sa DMF (7 mL) odozgo. U reakcionu posudu je dodata aminokiselina (0.2M u DMF,2.5 mL, 5 ekv), HATU (0.5M u DMF, 1.0 mL, 5 ekv), i DIPEA (2M u NMP, 0.5 mL, 10 ekv). Smeša se meša barbotiranjem N2tokom 5 minuta na 75 °C za sve aminokiseline, osim Fmoc-Cys(Trt)-OH i Fmoc-His(Trt)-OH koje se kupliju na 50 °C, reakcioni rastvor se isuši kroz frit. Smola se opere uzastopno tri puta na sledeći način: pranje sa DMF (7 mL) odozgo, zatim pranje sa DMF (7 mL) odozdo i na kraju pranje saDMF (7 mL) odozgo. U reakcionu posudu je dodat rastvor anhidrid sirćetne kiseline:DIEA:DMF (10:1:89 v/v/v, 5.0 mL). Smeša je povremeno ključala 2 minuta na 65 °C, zatim je rastvor isušen kroz frit. Smola se opere uzastopno tri puta na sledeći način: pranje sa DMF (7 mL) odozgo, zatim pranje sa DMF (7 mL) odozdo i na kraju pranje sa DMF (7 mL) odozgo. Dobijena smola se primenjuje direktno u sledećem koraku.

[0108] Sledeći peptid je sintetisan na a .1 mmola. Podvučeni koraci su koristili postupak dvostrukog kuplovanja, a ukošeno napisani ostaci su kuplovani sa 30 minutnim jednostrukim kuplovanjem. ClAc-Tyr-[N-Me]Ala-Asn-Pro-Dap-Leu-Hyp-Trp-Dab-[(S)-2-amino-3-(1-(karboksimetil)-1H-indol-3-il)propionska kiselina]--[N-Me]Nle-[N-Me]Nle-Leu-Cys-Gly-[(S)-propargilglicin]; pri čemu (S) propargilglicin je ugrađen u 2-hlorotritil smolu. Posle uklanjanja zaštite i ciklizacije prema gore navedenim postupcima, jedinjenje je prečišćeno na sledeći način: sirovi materijal je prečišćen preparativnom LC/MS pod sledećim uslovima: kolona: XBridge C18, 19 x 200 mm, čestice 5-µm; mobilna faza A: 5:95 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetata; mobilna faza B: 95:5 metanol: voda sa 10-mM amonijum acetata; gradijent: 45-85% B u toku 30 minuta, zatim 5-minuta držati na 100% B; protok: 20 mL/min. Frakcije koje sadrže željeni proizvod se kombinuju i osuše centrifugalnim isparavanjem. Prinos proizvoda je 16.4 mg, i njegova procenjena čistoća LCMS analizom je 96%. Analitički uslovi A: vreme zadržavanja = 1.49 min; ESI-MS(+) m/z 992.3 (M 2H), najzastupljeniji jon. Analitički uslovi B: vreme zadržvanja = 3.02 min; ESI-MS(+) m/z 992.3 (M 2H), najzastupljeniji jon; ESI-HRMS(+) m/z: izračunato: 991.9953 (M+2H)

Nađeno: 991.9926 (M+2H).

Sinteza [<18>F]-3-(2-(2-(2-(2-azidoetoksi)etoksi)etoksi)etoksi)-2-fluoropiridina

[0109]

Primer 1: Priprema 2-(2-(2-(2-azidoetoksi)etoksi)etoksi)etil 4-metilbenzensulfonata

[0110]

[0111] Smeša ((oksibis(etan-2,1-diil))bis(oksi))bis(etan-2,1-diil) bis(4-metilbenzensulfonata) (5 g, 9.95 mmol) i natrijum azida (0.647 g, 9.95 mmol) je rastvorena u etanolu (50 mL) i reakcija je refluksovana na 90 °C tokom perioda od 17 sati. Rastvarač je uklonjen delimičnim vakuumon i zatim napunjen na kertridž od 40 grama silika gela i prečišćen fleš hromatografijom (IscoCombiFlash – eluiran primenom metode linearnog gradijenta počev od 10% etil acetata u heksanima prelazeći na 90% etil acetata u heksanima tokom perioda od 45 minuta). Združene frakcije su proverene pomoću TLC i kombinovane da se dobije 2-(2-(2-(2-azidoetoksi)etoksi)etoksi)etil 4-metilbenzensulfonat u obliku bezbojnog ulja. Zbog reaktivne prirode proizvoda 2-(2-(2-(2-azidoetoksi)etoksi)etoksi)etil 4-metilbenzensulfonata, ovaj materijal je primenjivan "takav kakav je" bez dodatnih karakteristika.

Primer 2: Priprema 3-(2-(2-(2-(2-azidoetoksi)etoksi)etoksi)etoksi)-2-fluoropiridina

[0112]

[0113] U suspenziju natrijumhidrida (0.129 g, 3.21 mmol) u DMF (10 mL) na 0 °C je u kapima dodat uz mešanje rastvor 2-fluoropiridin-3-ol (0.363 g, 3.21 mmol) u DMF (5 mL), zatim je dodat u kapima rastvor 2-(2-(2-(2-azidoetoksi)etoksi)etoksi)etil 4-metilbenzensulfonata (1.00 g, 2.68 mmol) u DMF (5 mL). Suspenzija je držana 10 minuta na 0 °C, zatim je za 1 sat dovedena na sobnu temperaturu, zatim je dodatno zagrevana 4 sata na 60 °C. Rastvarač je uklonjen u vakuumu. Dodato je 100 ml etil acetata nakon čega su sledile 3 odvojene ekstrakcije za ispiranje koncentrovanim slanim rastvorom. Organski sloj je osušen natrijum sulfatom, filtriran, i koncentrovan. Sirovi materijal je prečišćen fleš hromatografijom (IscoCombiFlash – eluiran sa 10 - 50% EtOAc u Hex) dajući bezbojno ulje. 3-(2-(2-(2-(2-azidoetoksi)etoksi)etoksi)etoksi)-2-fluoropiridin (702 mg, 2.233 mmol, 83 % prinosa) je izolovan u obliku bistrog ulja.<1>H NMR (400MHz, HLOROFORM-d) δ 7.75 (dt, J=4.9, 1.6 Hz, 1H), 7.33 (ddd, J=10.0, 8.1, 1.5 Hz, 1H), 7.10 (ddd, J=7.9, 4.9, 0.7 Hz, 1H), 4.30 - 4.16 (m, 2H), 3.95 - 3.83 (m, 2H), 3.80 - 3.61 (m, 10H), 3.38 (t, J=5.1 Hz, 2H) 13C NMR (101MHz, HLOROFORM-d) d 142.3, 137.7, 137.5, 123.4, 123.4, 121.7, 121.6, 77.3, 76.7, 70.9, 70.7, 70.6, 70.0, 69.4, 69.0, 50.6 19F NMR (400MHz, HLOROFORM-d) δ -83.55. HRMS (ESI) Teorija:C13H20FN4O4+ m/z 315.464; nađeno 315.1463.

Primer 3: Priprema 3-(2-(2-(2-(2-azidoetoksi)etoksi)etosi)etoksi)-2-nitropiridina

[0114]

[0115] Natrijum hidrid (0.121 g, 3.01 mmol) (60% suspenzija u ulju) je rastvoren u DMF (7.0 mL) i dobijena suspenzija je ohlađena na 0 °C. Polako je dodat rastvor 2-nitropiridin-3-ola (0.384 g, 2.74 mmol) u DMF (1.5 mL), nakon čega je dodat u kapima rasvor 2-(2-(2-(2-azidoetoksi)etoksi)etoksi)etil 4-metilbenzensulfonata (1.023 g, 2.74 mmol) u DMF (1.5 mL). Suspenzija je držana 10 minuta na 0 °C, zatim je za 2 sata dovedena na sobnu temperaturu praćena zagrevanjem na 60 °C tokom perioda od 72 sata. Reakcija je ugašena sa 10 ml DI vode, zatim ekstrahovana etil acetatom (3 x 10 mL). Spojeni EtOAc ekstrakti su oprani sa koncentrovanim slanim rastvorom (10 mL), osušeni natrijum sulfatom, filtrirani, i upareni pod smanjenim pritiskom dajući svetlo žuto ulje. Sirovi proizvod je prečišćen fleš hromatografijom. Kertridž od 24 g silika gela, 25 mL/min, počev od 10% etil acetata u heksanima, praćen linearnom promenom na 50% etil acetata u heksanima tokom perioda od 25 minuta. Posle ovog vremena, gradijent se drži na ovoj kompoziciji rastvarača 10 minuta zatim se promeni na 100% etil acetata tokom perioda od 10 minuta. 3-(2-(2-(2-(2-azidoetoksi)etoksi)etoksi)etoksi)-2-nitropiridin je eluiran između dela hromatograma od 30-40 minuta i sakupljene frakcije su uparene pod smanjenim pritiskom, zatim pod vakuumom tokom 2 sata se dobija 3-(2-(2-(2-(2-azidoetoksi)etoksi)etoksi)etoksi)-2-nitropiridin (687 mg, 1.973 mmol, 72.0% prinosa) u obliku svetlo žutog ulja.<1>H NMR (400MHz, HLOROFORM-d) δ 8.11 (dt, J=4.9, 1.6 Hz, 1H), 7.60 (ddd, J=10.0, 8.1, 1.5 Hz, 1H), 7.52 (ddd, J=7.9, 4.9, 0.7 Hz, 1H), 4.30 - 4.16 (m, 2H), 3.95 -3.83 (m, 2H), 3.80 - 3.61 (m, 10H), 3.38 (t, J=5.1 Hz, 2H) 13C NMR (101MHz, HLOROFORM-d) d 147.3, 139.5, 128.4, 124.4. 71.1, 70.7, 70.6,70.0, 69.9, 69.3, 50.7. HRMS (ESI) Teorija:C13H20N5O6+ m/z 342.1408; nađeno 342.1409.

Primer 4: Sinteza 3-(2-(2-(2-(2-azidoetoksi)etoksi)etoksi)etoksi)-2-bromopiridina

[0116]

[0117] U suspenziju natrijum hidrida (NaH, 25.7 mg, 0.643 mmol) u dimetilformamidu (DMF, 5 mL) na 0 °C je dodat u kapima rastvor 2-bromopiridin-3-ola (112 mg, 0.643 mmol) u DMF (1 mL), nakon čega je dodat u kapima rastvor 2-(2-(2-(2-azidoetoksi)etoksi)etoksi)etil 4-metilbenzensulfonata (200 mg, 0.536 mmol) u DMF (1 mL). Suspenzija je 10 minuta držana na 0 °C, zatim je dovedena na sobnu temperaturu i držana 1 sat, nakon čega je zagrevana na 60 °C tokom 4 sata. Po završetku zagrevanja, rastvarač sirove reakcione smeše je uklonjen u vakuumu. Sirova reakcija je rekonstituisana u 50 mL etil acetata, oprana sa 2 x 50 mL vodenog slanog rastvora, i organski sloj je osušen magnezijum sulfatom, filtriran, i koncentrovan u vakuumu. Sirova reakcija je prečišćena primenom HPLC reverzne faze da se dobije 3-(2-(2-(2-(2-azidoetoksi)etoksi)etoksi)etoksi)-2-bromopiridin, TFA (112 mg, 0.229 mmol, 42.7 % prinosa) kao svetlo žuto ulje. HRMS ESI m/z (M+H), Teorija C13H20BrN4O4 375.0664 nađeno 375.0662;<1>H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ 7.97 (dd, J=4.6, 1.5 Hz, 1H), 7.54 (dd, J=8.2, 1.6 Hz, 1H), 7.40 (dd, J=8.1, 4.6 Hz, 1H), 4.24 (dd, J=5.3, 3.9 Hz,2H), 3.85 - 3.78 (m, 2H), 3.68 -3.62 (m, 2H), 3.62 - 3.52 (m, 8H), 3.42 - 3.34 (m, 2H).

Sinteza jedinjenja trimetilanilijuma

[0118]

Primer 5 : Sinteza 3-(2-(2-(2-(2-azidoetoksi)etoksi)etoksi)etoksi)-N,N-dimetilpiridin-2-amina

[0119]

[0120] Smeša 3-(2-(2-(2-(2-azidoetoksi)etoksi)etoksi)etoksi)-2-fluoropiridina (160 mg, 0.509 mmol), kalijum karbonata (K2CO3, 84 mg, 0.611 mmol), i dimetilamina (40% u vodi, 0.097 mL, 0.764 mmol) u dimetilsulfoksidu (DMSO, 2.5 mL) se zagreva na 110 °C tokom 14 sati u zatvorenoj posudi otpornoj na pritisak. Po završetku zagrevanja, rastvarač sirove reakcione smeše je uklonjen u vakuumu. Sirova reakcija je rekonstituisana u 50 mL etil acetata, oprana sa 2 x 50 mL vodenog slanog rastvora, i organski sloj je osušen magnezijum sulfatom, filtriran, i koncentrovan u vakuumu. Sirova reakcija je prečišćena primenom hromatografije sa normalnom fazom da se dobije 3-(2-(2-(2-(2-azidoetoksi)etoksi)etoksi)etoksi)-N,N-dimetilpiridin-2-amin (140 mg, 0.413 mmol, 81 % prinosa) u obliku bezbojnog ulja.<1>H NMR (400MHz, HLOROFORM-d) δ 7.86 (dd, J=4.9, 1.5 Hz, 1H), 7.02 (dd, J=7.8, 1.5 Hz, 1H), 6.73 (dd, J=7.8, 4.9 Hz, 1H), 4.20 - 4.07 (m, 2H), 3.98 - 3.86 (m, 2H), 3.81 - 3.61 (m, 9H), 3.38 (t, J=5.1 Hz, 2H), 3.13 - 2.94 (m, 6H), 1.69 (s, 2H). HRMS (ESI) Teorija:C15H26N5O4+ m/z 340.1980; nađeno 340.1979.

Primer 6: Sinteza 3-(2-(2-(2-(2-azidoetoksi)etoksi)etoksi)etoksi)-N,N,N-trimetilpiridin-2-aminijuma

[0121]

[0122] Metil trifluorometansufonat (0.065 mL, 0.589 mmol) je dodat u rastvor 3-(2-(2-(2-(2-azidoetoksi)etoksi)etoksi)etoksi)-N,N-dimetilpiridin-2-amina (40 mg, 0.118 mmol) u toluenu (1.5 mL) u zatvorenoj posudi pod ravnomernom strujom azota. Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom perioda od 14 sati. Rastvarač je uklonjen i dobijeni ostatak je opran sa 2x10 ml etra, azeotropno osušen sa 2 x 1 ml dihlormetana, i sušen pod vakuumom visokog pritiska preko noći da se dobije 3-(2-(2-(2-(2-azidoetoksi)etoksi)etoksi)etoksi)-N,N,N-trimetilpiridin-2-aminijum trifluorometansulfonatna so u kvantitativnom prinosu kao gusto bezbojno ulje.

LCMS m/z 354.33;<1>H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ 8.24 - 8.17 (m, 1H), 7.98 (d, J=8.3 Hz, 1H), 7.75 (ddd, J=8.2, 4.6, 3.2 Hz, 1H), 4.44 (br. s., 2H), 3.88 (d, J=3.9 Hz, 2H), 3.69 - 3.45 (m, 21H).

Primer 7: Sinteza [<18>F]-3-(2-(2-(2-(2-azidoetoksi)etoksi)etoksi)etoksi)-2-fluoropiridina primenom 3-(2-(2-(2-(2-azidoetoksi)etoksi)etoksi)etoksi)-N,N,N-trimetilpiridin-2-aminijum trifluorometansulfonatne soli

[0123]

[0124] Vodeni rastvor [<18>F]-fluorida (2.0 ml,33.3 GBq/ 900 mCi) je nabavljen od P.E.T. Net® Pharmaceuticals u Vest Point PA i direktno prebačen u Sep-Pak light QMA [The Sep-Pak light QMA kertridž je prethodno kondicioniran sa 5ml 0.5 M kalijum bikarbonata, 5 ml dejonizovane vode, i 5 ml MeCN pre primene.] Po završetku ovog prenosa, vodeni [<18>F] fluorid je oslobođen iz QMA Sep-Pak uzastopnim dodavanjem kalijum karbonata (15 mg/ml; 0.1ml) zatim smeše kalijum karbonata (30 mg/ml, 0.1 ml), 4,7,13,16,21,24-heksaoksa-1,10-diazabiciklo[8.8.8]heksakozana (15 mg, 0.04 mmol) i 1.2 ml MeCN. Rastvarač je uparen pod blagom strujom azota na 90°C i pod vakuumom. Azeotropno sušenje je ponovljeno dva puta sa porcijama od 1 ml acetonitrila da se dobije anhidrovani K.2.2.2/K[<18>F]F kompleks.3-(2-(2-(2-(2-azidoetoksi)etoksi)etoksi)etoksi)-N,N,N-trimetilpiridin-2-aminijum trifluorometansulfonatna so (2 mg, 5.6 µmol) je rastvorena u 500 mikrolitara DMSO i dodata u osušeni kriptand. Ovaj rastvor je zagrevan na 120°C tokom 10 minuta. Posle ovog vremena, sirova reakciona smeša je razblažena sa 3 ml DI vode. Celokupan sadržaj sirove reakcione smeše je zatim premešten, napunjen i prečišćen primenom HPLC reverzne faze pod sledećim uslovima: HPLC kolona: Luna C18 250 x 10 rastvarač A: 0.1% TFA u DI vodi; rastvarač B: 0.1% TFA u acetonitrilu pri brzini protoka od 4.6 ml/minutu primenom izokratske metode 32% B dok je UV praćen na 280 nm. [<18>F]-3-(2-(2-(2-(2-azidoetoksi)etoksi)etoksi)etoksi)-2-fluoropiridin je izolovan na 24 minutu oznake hromatograma i sakupljen tokom perioda od 2 minuta. Ovaj proizvod je sakupljen u bocu od 100 ml koja sadrži 10 ml DI vode i celokupan sadržaj je isporučen na Sep-Pak Vac tC18 6 cc 1g sep pakovanje od Waters. Iz ove reakcije je izolovano 6.1 GBq/164 mCi [<18>F]-3-(2-(2-(2-(2-azidoetoksi)etoksi)etoksi)etoksi)-2-fluoropiridina. Oslobođeno je iz sep-pak-a primenom 3 ml etanola i ovaj rastvor je redukovan sa izvorom toplote od 98°C, laganom strujom azota, i vakuumom tokom 15 minuta dok u bočici nije ostao samo film. Konačni proizvod je rekonstituisan u 100% 1x PBS puferu i bio je stabilan u ovom medijumu preko 1 sata na 37°C.

[0125] [<18>F]-3-(2-(2-(2-(2-azidoetoksi)etoksi)etoksi)etoksi)-2-fluoropiridin može se primeniti za stvaranje<18>F-obeleženih proizvoda (npr.,<18>F-obeleženi anti-PD-Ll makrociklični peptidi, kao što je opisano u nastavku) korišćenjem prednosti "klik" azid-alkinske reakcije sa odgovarajućim peptidima koji sadrže alkine.

Primer 8: Proizvodnja<18>F-radioobeležnog makrocikličnog peptida primenom "Klik hemije"

A. Fluorovanje 4-PEG-tozil-azidnog prekursora da se dobije [<18>F]-3-(2-(2-(2-(2-azidoetoksi)etoksi)etoksi)etoksi)-2-fluoropiridin

[0126] Vodeni rastvor [<18>F]-fluorida (2.0 ml, 29.6 GBq/ 800 mCi) je nabavljen od IBA u Tovadu i poslat na lokaciju BMS Prinston NJ i ovaj uzorak je prenet u okviru naše prilagođene sinteze na daljinsko upravljanje. Ovaj rastvor je isporučen na Sep-Pak light QMA [The Sep-Pak light QMA kertridž je prethodno kondicioniran sa 5ml 0.5 M kalijum bikarbonata, 5 ml dejonizovane vode, i 5 ml MeCN pre primene.] Po završetku ovog prenosa, vodeni rastvor [<18>F] fluorida je oslobođen iz QMA Sep-Pak dodavanjem smeše kalijum karbonata (30 mg/ml u destilovanoj vodi (DI), 0.1 ml), 4,7,13,16,21,24-heksaoksa-1,10-diazabiciklo[8.8.8]heksakozana (15 mg, 0.04 mmol) i 1.4 ml acetonitrila. Rastvarač je uparen pod blagom strujom azota na 90 °C i pod vakuumom. Azeotropno sušenje je ponovljeno dva puta sa porcijama 1 ml acetonitrila da se dobije anhidrovani K.2.2.2/K[<18>F]F kompleks. Nakon završetka ovog postupka, kriptand je dalje sušen u punom vakuumu tokom 15 minuta. Ceo postupak je završen za 35 minuta.

[0127] Ovoj osušenoj [<18>F]/kriptand čvrstoj supstanci je dodato 0.5 ml 2 mg 3-(2-(2-(2-(2-azidoetoksi)etoksi)etoksi)etoksi)-2-nitropiridina u DMSO i smeša je zagrevana na 120 °C tokom 10 minuta. Posle ovog vremena sirova reakciona smeša se razblaži sa 3 ml destilovane vode i celokupan sadržaj se zatim prenese i stavi na sledeću HPLC kolonu i uslove: HPLC kolona: Luna C18 250 x 10 mm; rastvarač A: 0.1 % trifluorosirćetne kiseline (TFA) u DI vodi; rastvarač B: 0.1 % TFA u acetonitrilu; brzina protoka 4.6 ml/min; pritisak 1820 PSI; izokratska metoda 32% B; UV - 280 nm. Proizvod [<18>F]-3-(2-(2-(2-(2-azidoetoksi)etoksi)etoksi)etoksi)-2-fluoropiridin([<18>F]-FPPEGA) je izolovan na 24 minutu oznake hromatograma i sakupljen tokom perioda od 2 minuta. Ovaj proizvod je sakupljen u bocu od 100 ml koja sadrži 15 ml DI vode i celokupan sadržaj je isporučen na Sep PakVac tC18 6 cc 1g sep pakovanje (PN WAT036795).

[<18>F]-FPPEGA je oslobođen iz Sep Pak-a primenom 2.5 ml etanola i ovaj rastvor je redukovan sa 98 °C N2i vakuumiran tokom 15 minuta do sušenja. Ovo jedinjenje je rastvoreno u 0.1 ml DI vode. Ovaj proizvod je analiziran primenom Varian HPLC HPLC kolone Luna C18 (2) 4.6 x 150 mm rastvarač A: 0.1 % TFA u DI vodi; rastvarač B: 0.1 % TFA u acetonitrilu; brzina protoka 1.0 ml/min; metoda gradijenta 0 minuta 90% A 10% B; 15 minuta 30% A 70% B; 17 minuta 30% A 70% B; 18 minuta 90% A 10% B; 20 minuta 90% A 10% B; UV - 280 nm.14.1 GBq (380 mCi) [<18>F]-FPPEGA je izolovan. Ovaj proizvod je prenet da završi "klik" hemiju sa alkinom koji sadrži makrociklični peptid koji veže PD-L.

B. Kuplovanje [<18>F]-FPPEGA sa makrocikličnim peptidom

Shema za sintezu [<18>F]- radioobeleženog makrocikličnog peptida je prikazana na slici (a)

[0128] (S)-2-(2-((6S,9S,12S,18R,21S,24S,27S,30S,33S,36S,38aS,40R,44R,47S,49aS)-36-((1H-indol-3-il)metil)-6-(2-amino-2-oksoetil)-33-(2-aminoetil)-47-(aminometil)-24,27-dibutil-30-((1-(karboksimetil)-1H-indol-3-il)metil)-40-hidroksi-12-(4-hidroksibenzil)-21,44-diizobutil-9,10,25,28-tetrametil-5,8,11,14,20,23,26,29,32,35,38,43,,46,49-tetradekaoksoheksatetrakontahidro-1H,5H-dipirolo[2,1-g1:2',1'-x][1]tia[4,7,10,13,16,19,22,25,31,34,37,40,43]tridekaazaciklopentatetrakontin-18-karboksamido)acetamido)pent-4-inska kiselina (0.75 mg, 0.378 □mol) je rastvorena u 0.250 ml DI vode i 0.25 ml terc-butil alkohola. Ovom rastvoru je dodato 0.250 ml DI vodenog rastvora koji sadrži 1 mg bakarnog sulfata i 1 mg natrijum askorbata. Na kraju, dodat je 0.1 ml rastvora 14.1 GBq (380 mCi) [<18>F]-FPPEGA (pripremljen kako je opisano u odeljku A) i reakcija je lagano mešana na sobnoj temperaturi 20 minuta. Sadržaju ove sirove reakcione smeše je dodato 0.5 ml acetonitrila zatim 1.5 ml DI vode i ova smeša je prečišćena primenom HPLC kolone reverzne faze. HPLC kolona: Luna C18 250 x 10 mm; rastvarač A: 0.1 % trifluorosirćetna kiselina (TFA) u DI vodi; rastvarč B: 0.1 % TFA u acetonitrilu; brzina protoka 4.6 ml/min; pritisak 1820 PSI; izokratska metoda 37% B; UV - 220 nm. Proizvod je izolovan između 27-31 minuta i sakupljan tokom perioda od 4 minuta kao što je prikazano na slici (b). 2.5 GBq (67 mCi) [<18>F]- (S)-2-(2-((6S,9S,12S,18R,21S,24S,27S,30S,33S,36S,38aS,40R,44S,47S,49aS)-36-((1H-indol-3-il)metil)-6-(2-amino-2-oksoetil)-33-(2-aminoetil)-47-(aminometil)-24,27-dibutil-30-((1-(karboksimetil)-1H-indol-3-il)metil)-40-hidroksi-12-(4-hidroksibenzil)-21,44-diizobutil-9,10,25,28-tetrametil-5,8,11,14,20,23,26,29,32,35,38,43,46,49

tetradekaoksoheksatetrakontahidro-1H,5H-dipirolo[2,1-g1:2',1'-x][1]tia[4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43]tetradekaazaciklopentatetrakontin-18-karboksamido)acetamido)-3-(1-(2-(2-(2-(2-((2-fluoropiridin-3-il)oksi)etoksi)etoksi)etoksi)etil)-1H-1,2,3-triazol-4-il)propionske kiseline je izolovano. Ovaj rastvor je dalje razblažen sa 20 ml DI vode i premešten u C-18 sep-pak (Waters 50 mg, koji je prethodno aktiviran sa 5 ml etanola, zatim sa 10 ml DI vodom) da se ukloni bilo koji organski rastvarač iz rastvora. Ovaj sep-pak je dalje opran sa 10 ml sterilne vode za injekcije. Ovaj proizvod je oslobođen iz sep-pak-a sa 0.5 ml etanola, sterilno filtriran u sterilnu bočicu i razblažen do 5% zapreminskog rastvora etanola sa rastvorom soli u vodi za injekcije. Ovaj proizvod je analiziran pomoću HPLC reverzne faze kako je prikazano na slici (b): hemijska identifikacija sa koinjekcijom neradioaktivnog standarda, radiohemijska čistoća i hemijska čistoća, specifična aktivnost. Izolovani proizvod koeluiran sa neradioaktivnim referentnim standardom je 100 % radiohemijski i 95% hemijski čist, sa specifičnom aktivnošću od 0.37 (10 mCi) GBq/nmol.

Analitička HPLC reverzne faze je izvedena sa sledećim parametrima: Zorbax SB-C18250 x 4.6 mm kolona; rastvarač A: 0.05% mravlje kiseline u DI vodi; rastvarač B: 0.05% u acetonitrilu; brzina protoka 1.0 ml/min; metoda gradijenta 30% do 50% B preko 20 minuta; UV - 220 nm.

Slika (a)

[0129] Shema za sintezu [<18>F]-radioobeleženog PD-L1 vezujućeg makrocikličnog peptida

[0130] [<18>F]- (S)-2-(2-((6S,9S,12S,18R,21S,24S,27S,30S,33S,36S,38aS,40R,44S,47S,49aS)-36-((1H-indol-3-il)metil)-6-(2-amino-2-oksoetil)-33-(2-aminoetil)-47-(aminomeil)-24,27-dibutil-30-((1-(karboksimetil)-1H-indol-3-il)metil)-40-hidroksi-12-(4-hidroksibenzil)-21,44-diizobutil-9,10,25,28-tetrametil-5,8,11,14,20,23,26,29,32,35,38,43,46,49-tetradekaoksoheksatetrakontahidro-1H,5H-dipirolo[2,1-g1:2',1'-x][1]tia[4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43]tetradekaazaciklopentatetrakontin-18-karboksamido)acetamido)-3-(1-(2-(2-(2-(2-((2-fluoropiridin-3-il)oksi)etoksi)etoksi)etoksi)etil)-1H-1,2,3-triazol-4-il)propionska kiselina može se koristiti u raznim in vitro i/ili in vivo primenama snimanje, uključujući dijagnostičko snimanje, osnovna istraživanja, i radioterapijske primene. Specifični primeri mogućih dijagnostičkih snimanja i radioterapijske primene, uključuju određivanje lokacije, relativne aktivnosti i/ili kvantifikovanje PD-L1 pozitivnih tumora, radioimunološki test PD-L1 pozitivnih tumora, i autoradiografiju za određivanje distribucije PD-L1 pozitivnih tumora kod sisara ili njegovog uzorka organa ili tkiva.

[0131] Konkretno, [<18>F]- (S)-2-(2-((6S,9S,12S,18R,21S,24S,27S,30S,33S,36S,38aS,40R,44S,47S,49aS)-36-((1H-indol-3-il)metil)-6-(2-amino-2-oksoetil)-33-(2-aminoetil)-47-(aminometil)-24,27-dibutil-30-((1-(karboksimetil)-1H-indol-3-il)metil)-40-hidroksi-12-(4-hidroksibenzil)-21,44-diizobutil-9,10,25,28-tetrametil-5,8,11,14,20,23,26,29,32,35,38,43,46,49-tetradekaoksoheksatetrakontahidro-1H,5H-dipirolo[2,1-g1:2',1'-x][1]tia[4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43]tetradekaazaciklopentatetrakontin-18-karboksamido)acetamido)-3-(1-(2-(2-(2-(2-((2-fluoropiridin-3-il)oksi)etoksi)etoksi)etoksi)etil)-1H-1,2,3-triazol-4-il)propionska kiselina je primenjiva za snimanje pozitronsko emisionom tomografijom (PET) PD-L1 pozitivnih tumora u plućima, srcu, bubrezima, jetri i koži i drugim organima ljudi i eksperimentalnih životinja. PET snimanje koje koristi [<18>F]- (S)-2-(2-((6S,9S,12S,18R,21S,24S,27S,30S,33S,36S,38aS,40R,44S,47S,49aS)-36-((1H-indol-3-il)metil)-6-(2-amino-2-oksoetil)-33-(2-aminoetil)-47-(aminometil)-24,27-dibutil-30-((1-(karboksimetil)-1H-indol-3-il)metil)-40-hidroksi-12-(4-hidroksibenzil)-21,44-diizobutil-9,10,25,28-tetrametil-5,8,11,14,20,23,26,29,32,35,38,43,46,49-tetradekaoksoheksatetrakontahidro-1H,5H-dipirolo[2,1-g1:2',1'-x][1]tia[4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43]tetradekaazaciklopentatetrakontin-18-karboksamido)acetamido)-3-(1-(2-(2-(2-(2-((2-fluoropiridin-3-il)oksi)etoksi)etoksi)etoksi)etil)-1H-1,2,3-triazol-4-il)propionsku kiselinu može se primeniti za dobijanje sledećih informacija: veza između nivoa zauzetosti tkiva kandidatima lekova za lečenje PD-L1 tumora i kliničke efikasnosti kod pacijenata; odabir doze za klinička ispitivanja lekova za lečenje PD-L1 tumora pre započinjanja dugoročnih kliničkih studija; uporedne potencije strukturno novih lekova za lečenje PD-L1 tumora; ispitivanje uticaja lekova za lečenje PD-L1 tumora na afinitet i gustinu transportera in vivo tokom lečenja kliničkih ciljeva lekovima za lečenje PD-L1 tumora; promene gustine i distribucije PD-L1 pozitivnih tumora tokom efikasnog i neefikasnog lečenja.

Primer 9: Automatizovana priprema [<18>F]-3-(2-(2-(2-(2-azidoetoksi)etoksi)etoksi)etoksi)-2-fluoropiridina prema opštem postupku sinteze radiosinteze na GE TRACERlab FX2 N jedinici za sintezu

[0132]

Automatizovana sinteza primenom komercijalnog modula za sintezu TRACERlab FX2 N (GE)

[0133] Automatizovana sinteza [<18>F]-3-(2-(2-(2-(2-azidoetoksi)etoksi)etoksi)etoksi)-2-fluoropiridina izvedena je primenom modula za sintezu GE TRACERlab FX2 N. Postavljanje jedinice za sintezu sažeto je prikazano u tabeli (). Vodeni rastvor [<18>F]-fluorida (2.0 ml, 29.6 GBq/ 800 mCi) je isporučen u Sep-Pak light QMA [Sep-Pak light QMA kertridž je unapred kondicioniran sa 5ml 0.5 M kalijum bikarbonata, 5 ml dejonizovane vode, i 5 ml acetonitrila pre primene.] Po završetku ovog prenosa, vodeni [<18>F] fluorid je oslobođen iz QMA Sep-Pak-a dodavanjem smeše za eluiranje (iz "V1") u reaktor. Rastvarač je uparen pod laganom strujom azota i vakuumom. Rastvor prekursora (iz "V3") je dodat osušenom ostatku kriptanda i ova reakciona smeša je zagrevana na 120 °C tokom 10 minuta. Zatim se sirovoj reakcionoj smeši u reaktoru doda 4 ml destilovane vode (iz "V4") i smeša se prebaci u petlju za injektiranje uzorka od 5 ml polupreparativne HPLC preko tečnog senzora koji kontroliše kraj punjenja. Smeša se nanese na polupreparativnu HPLC kolonu ( Luna C18(2). 250x10mm, Phenomenex). Smeša od 35% acetonitrila u vodenom 0,1% rastvoru trifluorosirćetne kiseline propuštena je kroz kolonu brzinom od 4.6 ml u minuti. Proizvod je sakupljen iz ove HPLC kolone u bocu za razblaživanje koja sadrži 15 ml destilovane vode i njegov celokupan sadržaj je prebačen u tC18 1 gramski, ekstrakcioni kertridž u čvrstoj fazi. 352 mCi (13 GBq) [<18>F]-3-(2-(2-(2-(2-azidoetoksi)etoksi)etoksi)etoksi)-2-fluoropiridina je oslobođeno iz ovog kertridža ( iz "V14") sa 3 ml etanola i može se primeniti za stvaranje 18F obeleženih peptidnih proizvoda koristeći prednost "klik" azid-alkinske reakcije sa odgovarajućim peptidom koji sadrži alkine.

Tabela (1).

Primer 10: Automatizovana priprema [<18>F]-3-(2-(2-(2-(2-azidoetoksi)etoksi)etoksi)etoksi)-2-fluoropiridina prema opštem postupku za sintezu radiosinteze na IBA Synthera jedinici za sintezu

[0134]

Automatizovana sinteza primenom komercijalnog Sinthera modula za sintezu (IBA)

[0135] Automatizovana sinteza [<18>F]-3-(2-(2-(2-(2-azidoetoksi)etoksi)etoksi)etoksi)-2-fluoropiridina je izvedena primenom IBA Synthera modula za sintezu tipa kasete i odgovarajućeg sklopljenog kita integratorskog fluidnog procesors. Kit integratorskog fluidnog procesora (IFP) je napunjen odgovarajućim prekursorima za ovu sintezu i razmatran u Tabeli (). Prečišćavanje je izvedeno na Varian HPLC jedinici. Punjenje HPLC injekcione petlje kontrolisano je stalnim tokom struje azota na HPLC jedinici. Postavljanje oba automata sažeto je prikazano u Tabeli (). Vodeni rastvor [<18>F]-fluorida (2.0 ml, 29.6 GBq/ 800 mCi) je isporučen u Sep-Pak light QMA [Sep-Pak light QMA kertridž je unapred kondicioniran sa 5ml 0.5 M kalijum bikarbonata, 5 ml dejonizovane vode, i 5 ml acetonitrila pre primene.] Po završetku ovog prenosa, vodeni [<18>F] fluorid se oslobođa iz QMA Sep-Pak-a dodavanjem smeše za eluiranje (iz "V1") u reaktor. Rastvarač je uparen pod laganom strujom azota i vakuumom. Rastvor prekursora (iz "V2") je dodat osušenom ostatku kriptanda i ova reakciona smeša je zagrevana na 120 °C tokom 10 minututa. Zatim se sirovoj reakcionoj smeši u reaktoru doda 3 ml destilovane vode (iz "V4") i smeša se prebaci u petlju za injektiranje uzorka polupreparativne HPLC preko tečnog senzora koji kontroliše kraj punjenja. Smeša se nanosi na polupreparativnu HPLC kolonu ( Luna C18(2).250x10mm, Phenomenex). Smeša od 35% acetonitrila u vodenom 0,1% rastvoru trifluorosirćetne kiseline propuštena je kroz kolonu brzinom od 4.6 ml u minuti. Proizvod je sakupljen iz ove HPLC kolone u bocu za razblaživanje koja sadrži 15 ml destilovane vode i njegov celokupan sadržaj je prebačen u tC181 gramski, ekstrakcioni kertridž u čvrstoj fazi.325 mCi (12 GBq) [<18>F]-3-(2-(2-(2-(2-azidoetoksi)etoksi)etoksi)etoksi)-2-fluoropiridina je oslobođeno iz ovog kertridža sa 3 ml etanola i može se primeniti za stvaranje 18F obeleženih peptidnih proizvoda koristeći prednost "klik" azid-alkinske reakcije sa odgovarajućim peptidom koji sadrži alkine.

Tabela (2).

Primer 11: Razlikovanje PD-L1 pozitivnih tumora od PD-L1 negativnih tumora sa anti-PD-L1 makrociklični peptidnim sredstvom za snimanje

[0136] Za PET snimanje, brze stope klirensa krvi pružaju prednost nad sporijim sredstvima za klirens, kao što su antitela, minimizovanjem vremena potrebnog da se signali sonde "u pozadini" iscrpe iz nerelevantnog tkiva. U klinici, PET obeleživači zasnovani na antitelima sa dugim poluživotom u krvi mogu zahtevati nekoliko dana čekanja nakon injekcije pre prikupljanja snimaka. Sonde za brzi klirens omogućavaju primenu snimaka sa visokim kontrastom koji se mogu prikupiti istog dana kada se sonda injektira, i što je veoma važno, mogu takođe da smanje ukupnu izloženost zračenju ispitivanih životinja ili pregledanih pacijenata.

[0137] U ovom eksperimentu, [<18>F]obeleženi PD-L1 makrociklični peptid je proizveden kako je opisano u gornjim primerima testiran je na svoju sposobnost da pravi razliku između hPD-L1-pozitivnih tumora i hPD-L1-negativnih tumora kod miševa.

[0138] Miševi koji su nosili bilateralne ksenograftske tumore proizvedeni su uvođenjem 2×10<6>hPD-L1(+) L2987 ćelija karcinoma pluća čoveka i 4×10<6>hPD-L1(-) HT-29 ćelija karcinoma debelog creva potkožno na suprotnim stranama miša. Kada su tumori dostigli približno 300 mm<3>(približno 2-3 nedelje nakon implantacije ćelija), životinje su odabrane za snimanje. Telesna masa i veličina tumora u svakoj studiji izmereni su i zabeleženi na dan snimanja pre postupka snimanja. Miševi su smešteni u indukcionu komoru za anesteziju i isporučena je 3% inhalaciona anestezija izofluranom u 100% O2brzinom od 1-1.5 L/min. Jednom kada su sedatirani, miševi su uklonjeni iz indukcione komore i stavljeni u smeštaj od pleksiglasa sa 4 komore (po narudžbini BMS- primenjene grupe za biotehnologiju), dok su i dalje primali 1-1.5% inhalacionu anesteziju izofluranom i isporučenu u 100% O2pri brzini od 2 L/min kroz konus nosa. Životinje su bile na toplom pomoću spoljne samostalne jedinice za regulaciju temperature (M2M Imaging Corp) kako bi se sprečila hipotermija tokom snimanja. Disanje miša se kontinuirano pratilo tokom postupaka snimanja i izofluran se može prilagoditi u zavisnosti od dubine anestezije. Miševi su zatim smešteni u prilagođeni držač za životinje kapaciteta za 4 životinje, gde su ostali pod anestezijom tokom trajanja studije. Držač za životinje prebačen je na skener microPET® F120™ (Siemens Preclinical Solutions, Knoksvile, TN). Aksijalno vidno polje ovog instrumenta je 7.6 cm. Sa ovim ograničenjem, životinje su bile postavljene tako da je područje skeniranja bilo neposredno ispred očiju do približno dna repa. Prenosni snimak od 10 minuta prvi put je dobijen primenom<57>Co tačkastog izvora u svrhu korekcije slabljenja konačnih PET snimaka. Nakon skeniranja prenosa, rastvori radioobeleživača su administrirani preko prethodno instaliranih katetera repne vene i dobijen je snimak emisije od 2 sata. Injektirani rastvori radioobeleživača injektirani su u ukupno 8 miševa (telesna masa: 22.2 ± 2.0 grama) sa zapreminama tumora 203.0 ± 51.4 mm<3>za HT-29 i 422.9 ± 128.4 mm<3>za L2987 snimani su 16-17 dana nakon implantacije ćelije. Svaki miš je primio jednu injekciju SC doze PD-L1 vezujućeg makrocikličnog peptida od 60 mg/kg (N=4) ili rastvora soli u vodi (N=4) 30 minuta pre [<18>F]obeleženog makrocikličnog PD-L1 peptida (124.0 ± 8.4 µCi, masa obeleživača: 1.0 ± 0.4 µg/kg) IV injekcijom. Snimci su rekonstruisani primenom maksimalnog a posteriori (MAP) algoritma sa korekcijom slabljenja primenjujući prikupljene prenosne snimke i korigovane za raspad radioizotopa. Na završnim slikama, regioni od interesa (ROI) su nacrtani oko granice tumora primenjujući ASIPro softver (Siemens Preclinical Solutions). Krive vremenske aktivnosti su izračunate za svaki ROI da se dobije kvantitativni prikaz radioobeleživača unutar zapremine tumora tokom 2 sata emisije snimka. Za konačno upoređivanje, pojedinačne krive vremenske aktivnosti su normalizovane na osnovu injektirane doze radioobeleživača za svaku određenu životinju. Preuzimanje radioobeleživača upoređena je među tumorima primenom poslednjih 10 minuta svake krive vremenske aktivnosti (90-100 minuta nakon injekcije radioobeleživača). Primena ove metodologije, preuzimanje radioobeleživača u hPD-L1(+) L2987 ksenografte je 8.1 × veći od onog kod hPD-L1(-) HT-29 ksenograftova kod životinja koje su primale samo [<18>F]-obeleženi makrociklični PD-L1 peptidni radioobeleživač. Kod životinja koje su primale SC dozu makrocikličnog peptida koji veže PD-L1 od 60 mg/kg 30 minuta pre injekcije radioobeleživača. Preuzimanje u hPD-L1(+) L2987 ksenograftovima je bilo samo 0.7 × nego ono viđeno u hPD-L1(-) HT-29 ksenograftovima (Slika 1, slika 2 i tabela 3).

Tabela 3: Vrednosti standardnog preuzimanja (SUV) u HT-29 i L2987 tumorima izvedene iz PET snimaka u Primeru 11

[0139] Ovi rezultati obezbeđuju direktnu vizuelizaciju diferencijacije hPD-L1(+) naspram hPD-L1(-) ksenograft tumora in vivo. Specifičnost je dalje demonstrirana predoziranjem PD-L1 vezujućim makrocikličnim peptidom sa 60 mg/kg 30 minuta pre injekcije radioobeleživača, što je dovelo do smanjenja preuzimanja radioobeleživača u hPD-L1(+) tumorima na nivo hPD-L1(-) ksenografta. Ovo dalje potvrđuje primenu PD-L1 makrocikličnih peptida za vizuelizaciju PD-L1 ekspresije u tkivu primenom PET snimanja.

Primer 12: PET snimanje kod nehumanih primata sa anti-PD-L1 makrocikličnim peptidnim sredstvom za snimanje

[0140] Sredstva za snimanje zasnovana na anti-PD-Ll milamolekulu takođe su pokazala slične rezultate kada su izvedena kod cinomolgus majmuna. U ovim studijama, [<18>F]obeleženi PD-L1 makrociklični peptid, proizveden kao što je opisano u gornjim primerima, testiran je na svoju sposobnost da proizvodi snimke visokog kontrasta kod cinomolgus majmuna. Ovde opisani anti-PD-Ll makrociklični peptidi održavaju visok afinitet za PD-L1 cinomolgusa (ali imaju nizak afinitet za PD-L1 glodara). Dalje, kako cinomolgus majmuni ne sadrže PD-L1(+) tumore kao na modelima miša, performanse snimanja procenjivane su prvenstveno na pozadinskim nivoima merenim na snimcima u kontekstu endogene PD-L1 ekspresije (sa niskom pozadinom koja omogućava potencijal za detekciju visoke osetljivosti PD-L1(+) tkiva). U ovim studijama, nivoi pozadine na dobijenim PET snimcima bili su vrlo niski, sa zapaženim nakupljanjem radioobeleživača, zabeleženim uglavnom u bubrezima, slezini i bešici.

[0141] Mužjaci cinomolgus majmuna sa prethodno instaliranim vaskularnim pristupnim priključkom (VAP) su anestezirani sa 0.02 mg/kg atropina, 5 mg/kg telazola i 0.01 mg/kg buprenorfina I.M. (svi uvučeni u jedan špric). I.v. kateter se zatim stavlja u cefaličnu posudu za administriranje tečnosti tokom postupka snimanja radi održavanja hidratacije. Životinje su intubirane endotrahealnom cevčicom - obično 3.0 mm i premeštene u krevet za snimanje microPET® F220™ PET instrumenta (Siemens Preclinical Solutions, Knoksvile, TN). Anestezija je održavana izofluranom i kiseonikom i I.V. tečnosti (LRS) su administrirane brzinom od 6 ml/kg/sat tokom postupka snimanja. Kako je aksijalno vidno polje microPET® F220™ instrumenta samo 7.6 cm, snimci preko 5 različitih položaja kreveta su bili potrebni kako bi se stvorila kompozitna slika životinja od neposredno iznad srca do približno karlice.

[0142] Za svako vidno polje, 10-minutni prenosni snimak je prvo stvoren primenom izvora<57>Co tačke u svrhu korekcije slabljenja konačnih PET snimaka. Jednom kada su dobijeni prenosni snimci za sve položaje u krevetu, približno 1.7 mCi (približno 0.12 µg/kg) [<18>F]obeleženog PD-L1 makrocikličnog peptidnog radioobeleživača se administrira pomoću instaliranog VAP. Skeniranja emisije u trajanju od 5 minuta su zatim uzastopno uzimana za svaki položaj kreveta, počevši od položaja 1 centriranog približno u srcu i krećući se prema karlici životinje. Jednom kada su slike dobijene u svakom položaju (od 1 do 5), krevet za snimanje je vraćen u položaj 1 i postupak je ponovljen. Primenjujući ovaj postupak, tokom trajanja studije snimanja dobijeno je ukupno 5 različitih snimaka za svaki položaj kreveta.

[0143] Pojedinačni snimci rekonstruisani su primenom algoritma filtrirane projekcije unazad (FBP) sa korekcijom slabljenja primenjujući prikupljene prenosne snimke i korigovane za raspad radioizotopa. Završni kompozitni snimci su zatim proizvedeni poravnavanjem snimka iz svih 5 položaja kreveta dobijenih u jednom prolazu (tj. proizveden je pojedinačni kompozitni snimak iz svakog skupa sekvencijalnih snimaka iz položaja kreveta od 1 do 5) koji pokrivaju trajanje studije snimanja. Konačni snimci su vizuelno pregledani kako bi se zabeležile oblasti vidljivog preuzimanja radioobeleživača (tj. slezina, jetra, bubreg) i pozadinsko tkivo (mišići) (slika 3). Pozadina akumulacije [<18>F]obeleženog PD-L1 makrocikličnog peptidnog radioobeleživača bila je vrlo niska, sa malo signala vidljivih u pozadinskim tkivima poput mišića. Pored toga, verifikovano je preuzimanje u slezini, što je PD-L1(+) zasnovano na imuno-histohemiji i mRNK ekspresiji. Dakle, studije na cinomolgus majmunima pokazuju potencijal za visoko osetljivo PD-L1 snimanje u kontekstu endogenog PD-L1. Da bi se utvrdila priroda specifičnog vezivanja u slezini cinomolgus majmuna, sprovedena je studija blokiranja na sledeći način.

[0144] Cinomolgus majmun (4.4 kg, mužjak) primio je pojedinačnu IV injekciju [<18>F]obeleženog PD-L1 makrocikličnog peptidnog radioobeleživača (∼1.7 mCi, masa: 0.21 µg/kg) na početku. Sledećeg dana (posle doze), isti NHP je primio pojedinačnu SC dozu od 2 mg/kg anti-PD-Llvezujućeg makrocikličnog peptida 2 sata pre injekcije radioobeleživača (∼1.7 mCi, masa: 0.12 µg/kg). Preuzimanje obeleživača u različitim organima navedeno je u tabeli 4. Reprezentativni PET snimci početne i post-doze ucrtane su na slici 3. Koncentracije anti-PD-Llvezujućeg makrocikličnog peptida u plazmi izmerene su na 0, 10, 30, 60, 90 minuta nakon injekcije radioobeleživača svakog dana snimanja (Tabela 4). Specifični signal vezivanja primećen u slezini nehumanog primata sa 93% preuzimanja obeleživača blokiran je sa 2 mg/kg određenog PD-L1 vezujućeg makrocikličnog peptida.

[0145] PET studije na glodarima i cinomolgus majmunima pokazuju da<18>F obeleženi antihumani PD-L1 makrociklični peptid obezbeđuje snažne i specifične sonde za in vivo obeležavanje PD-L1 pozitivnih tkiva sa potencijalom za detekciju visoko osetljivih tkiva sa niskim nivoom PD-L1 ekspresije.

[0146] In vivo eksperimenti za snimanje su takođe sprovedeni sa anti-PD-Ll antitelom, i oblasti koje je ovo sredstvo za snimanje detektovalo, su iste oblasti koje su detektovane sa PD-L1 sredstvom za snimanje, što potvrđuje da anti-PD-Ll milamolekulska sredstva za snimanje uspešno detektuju PD-L1 pozitivne ćelije in vivo.

Tabela 4. SUV obeleživača u svakom organu na početnoj osnovi i posle doze sa 2 mg/kg PD-Llvezujućeg makrocikličnog peptida.

Primer 13: In vitro autoradiografija sa [<18>F]obeleženim PD-L1 makrocikličnim peptidnim radioobeleživačem

[0147] Tkiva tumora pluća čoveka ugrađena su u OCT i ohlađena u 2-metilbutanu 2-5 minuta dok se ne smrznu. Uzorci su čuvani u zamrzivaču na -80 °C do primene. Humana ksenograft tkiva takođe su uključena u test. Miševi koji nose bilateralne ksenografte proizvedeni su unošenjem 2×10<6>hPD-L1(+) L2987 ćelija karcinoma pluća čoveka i 4×10<6>hPD-L1(-) HT-29 ćelija karcinoma debelog creva supkutano na suprotnim stranama miša. Jednom kada su dobijeni tumori ksenografta postigli odgovarajuću veličinu (približno 200-300 mm<3>), miševi su anestezirani sa 2% izoflurana i žrtvovani putem dislokacije grlića materice. Sveža tumorska tkiva su izrezana, uronjena u OCT i hlađena u 2-metilbutanu 2-5 minuta dok se ne smrznu. Tada su tkiva umotana u foliju/ZIPLOC® vreću i čuvana na -80 °C do primene. Za sva tkiva (humani tumor pluća i ksenografti) preseci 5 µm debljine (sakupljeni u obliku 2 preseka/dijapozitiva) su isečeni primenom kriostata, odmrznuti na staklenim mikroskopskim dijapozitivima, i ostavljeni da se suše na vazduhu približno 30 minuta. Studije blokiranja sa hladnim (neobeleženim) peptidom na 0.1 nM, 1 nM, i odnosno 10 nM. Pojedinačni dijapozitivi, 1 dijapozitiv po koncentraciji, premešteni su u staklene inkubacione komore za dijapozitive za inkubaciju. Odvojeno, osnovni rastvor 0.25 nM [<18>F]- (S)-2-(2-((6S,9S,12S,18R,21S,24S,27S,30S,33S,36S,38aS,40R,44S,47S,49aS)-36-((1H-indol-3-il)metil)-6-(2-amino-2-oksoetil)-33-(2-aminoetil)-47-(aminometil)-24,27-dibutil-30-((1-(karboksimetil)-1H-indol-3-il)metil)-40-hidroksi-12-(4-hidroksibenzil)-21,44-diizobutil-9,10,25,28-tetrametil-5,8,11,14,20,23,26,29,32,35,38,43,46,49-tetradekaoksoheksatetrakontahidro-1H,5H-dipirolo[2,1-g1:2',1'-x][1]tia[4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43]tetradekaazaciklopentatetrakontin-18-karboksamido)acetamido)-3-(1-(2-(2-(2-(2-((2-fluoropiridin-3-il)oksi)etoksi)etoksi)etoksi)etoksi)-1H-1,2,3-triazol-4-il)propionske kiseline je dobijen razblaživanjem 10.6 µl originalnog osnovnog rastvora radioliganda (7064 nM u vreme eksperimenta) sa 300 ml tween 80. Iz ovog osnovnog rastvora, 40 ml je dodato u svaku inkubacionu komoru. Jedna od ovih komora sadržala je samo puferski rastvor radioliganda, koji se naziva celokupnim odeljkom vezivanja. Druge inkubacione komore su dobile 40 ml ovog osnovnog rastvora zajedno sa odgovarajućom koncentracijom jedinjenja za blokiranje (neobeleženi peptid na 0.1 nM, 1 nM, or 10 nM). Dijapozitivi su inkubirani u pojedinačnim rastvorima pufera 1 sat na sobnoj temperaturi da bi se postiglo maksimalno vezivanje. Posle inkubacije, dijapozitivi iz svake tretirane grupe uklonjeni su iz rastvora za inkubaciju i stavljeni u ledeno hladni pufer za pranje (Tween 80) tokom 3 minuta i ispirani 4 odvojena puta. Zatim se dijapozitivi suše približno 30 minuta pod mlazom hladnog vazduha. Dijapozitivi osušeni na vazduhu su izloženi postavljanjem dijapozitiva na ploču za snimanje (BAS-SR 3545S) preko noći na sobnoj temperaturi. Ploča za snimanje je skenirana primenom analizatora biosnimaka (Fujifilm Fluorescent Image Analyzer, FLA-9000). Veličina snimaka autoradiograma bila je 100 µm. Analiza snimka izvršena je primenom Multi-Gauge softvera. Izvučeni su regioni od interesa (ROI) koji okružuju celokupno tkivo tumora u svim ispitivanim grupama. Signali autoradiografije iz radioaktivnosti povezane sa tkivima kvantifikovani su iz ovih ROI. Očigledno pomeranje [<18>F]obeleženog PD-L1 makrocikličnog peptidnog radioobeleživača u poređenju sa ukupnim delovima vezivanja određeno je za 3 različite koncentracije (0.1 nM, 1 nM, i 10 nM) neobeleženog peptida u oba preseka humanog tumora pluća kao i u presecima humanog ksenografta. Premeštanje u zavisnosti od doze [<18>F]-obeleženog PD-L1 makrocikličnog peptidnog radioobeleživača zabeleženo je u svim presecima tkiva uz dodatak neobeleženog peptida (slika 4). Serijski preseci tkiva od 5 µm iz svakog tkiva podvrgnuti su anti-humanom-PD-Ll imunohistohemijskom postupku da se verifikuje nivo ekspresije PD-L1 antigena u uzorcima koji su potvrdili PD-L1 ekspresiju u uzorcima pluća čoveka.

Claims (13)

1. Patentni zahtevi 1. Jedinjenje formule (I):

   ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, pri čemu x je ceo broj od 1 do 8 i R je C1-C6alkil grupa.
2. 2. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1 formule (II):

   ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, pri čemu x je ceo broj od 1 do 8 i R je C1-C6alkil grupa.
3. 3. Jedinjenje formule (III):

   ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.
4. 4. Jedinjenje formule (IV):

   ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, pri čemu x je ceo broj od 1 do 8.
5. 5. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 4 formule (V):

   ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.
6. 6. Jedinjenje prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5 ili njegova farmaceutski prihvatljiva so za primenu u dijagnostikovanju bolesti.
7. 7. Jedinjenje ili njegova farmaceutski prihvatljiva so za primenu prema patentnom zahtevu 6, pri čemu je bolest odabrana iz grupe koju čine solidni kanceri, hematopoetski kanceri, hematološki kanceri, autoimuna bolest, neurodegenerativna bolest, kardiovaskularna bolest, i patogena infekcija.
8. 8. Postupak za dobijanje snimka jedinjenja prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5, pri čemu postupak obuhvata: a) administriranje jedinjenja subjektu; i b) snimanje in vivo distribucije jedinjenja skeniranjem pozitronskom emisionom tomografijom (PET).
9. 9. Jedinjenje prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5 za primenu u dobijanju snimka, pri čemu navedena primena obuhvata: a) administriranje jedinjenja subjektu; i b) snimanje in vivo distribucije jedinjenja skeniranjem pozitronskom emisionom tomografijom (PET), pri čemu snimljena distribucija jedinjenja ukazuje na prisustvo ili odsustvo bolesti.
10. 10. Jedinjenje prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5 za primenu u praćenju napredovanja bolesti kod subjekta, pri čemu navedena primena obuhvata: (a) administriranje subjektu kome je to potrebno jedinjenja koje se vezuje za ciljani molekul povezan sa prisustvom bolesti u prvoj vremenskoj tački i dobijanje snimka najmanjeg dela subjekta radi određivanja količine obolelih ćelija ili tkiva; i (b) administriranje subjektu jedinjenja u jednoj ili više sledećih vremenskih tačaka i dobijanje snimka najmanjeg dela subjekta u svakoj vremenskoj tački; pri čemu dimenzija i lokacija obolelih ćelija ili tkiva u svakoj vremenskoj tački ukazuju na napredak bolesti.
11. 11. Jedinjenje prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5 za primenu u kvantifikovanju obolelih ćelija ili tkiva kod subjekta, pri čemu navedena primena obuhvata: (a) administriranje subjektu koji ima bolesne ćelije ili tkiva jedinjenja koje se vezuje za ciljni molekul smešten sa obolelim ćelijama ili tkivima; i (b) detektovanje radioaktivnih emisija<18>F u obolelim ćelijama ili tkivu, pri čemu nivo i raspodela radioaktivnih emisija u obolelim ćelijama ili tkivima je kvantitativna mera obolelih ćelija ili tkiva.
12. 12. Postupak za dobijanje kvantitativnog snimka tkiva ili ćelija koje eksprimiraju PD-L1, pri čemu postupak obuhvata kontakt ćelija ili tkiva sa jedinjenjem prema patentnom zahtevu 1 koje se vezuje za PD-L1, i detektovanje ili kvantifikovanje tkiva koje eksprimira PD-L1 primenom pozitronske emisione tomografije (PET).
13. 13. Farmaceutska kompozicija koja sadrži jedinjenje prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5.