RS61817B1

RS61817B1 - Poboljšani polipeptidni molekul sa dvojnom specifičnošću

Info

Publication number: RS61817B1
Application number: RS20210561A
Authority: RS
Inventors: Martin Hofmann; Felix Unverdorben; Sebastian Bunk; Dominik Maurer
Original assignee: Immatics Biotechnologies Gmbh
Priority date: 2017-07-14
Filing date: 2018-07-13
Publication date: 2021-06-30
Also published as: CO2020001029A2; LT3428194T; PE20200614A1; US20190016802A1; HUE054568T2; HRP20211744T1; KR20200026995A; US20190016804A1; TWI817302B; AU2018298881A1; US20220195044A1; BR112020000769A2; MX2020011744A; EP3985029A1; PL3652215T3; LT3652215T; CO2020001491A2; US20190016803A1; US20190016801A1; RS62544B1

Description

Opis

[0001] Predmetni pronalazak odnosi se na bispecifičan polipeptidni molekul koji sadrži prvi polipeptidni lanac i drugi polipeptidni lanac koji obezbeđuju vezujući region dobijen od T-ćelijskog receptora (TCR) koji je specifičan za virusni peptidni epitop asociran sa glavnim kompleksom gena tkivne podudarnosti (MHC), i vezujući region dobijen od antitela koje je sposobno da regrutuje humane imunske efektorske ćelije tako što se specifično vezuje za površinski antigen navedenih ćelija, kao i na postupke za pravljenje bispecifičnog polipeptidnog molekula i njegovu primenu.

Osnov pronalaska

[0002] Zahvaljujući razvoju tehnologije molekularnog kloniranja i dubokom razumevanju inženjeringa antitela, sada postoje različiti formati bispecifičnih antitela („bispecifika“) dostupnih za izbor radi postizanja optimalne biološke aktivnosti i kliničke svrhe. U terapiji malignih bolesti bispecifična antitela su razvijena sa ciljem da preusmere aktivnost imunskih efektorskih ćelija na lokaciju tumora preko prvog vezujućeg domena koji je specifičan za epitop na tumorskim ćelijama i drugog vezujućeg domena koji je specifičan za epitop na imunskim efektorskim ćelijama. Bispecifična antitela za ponovno ciljanje imunskih efektorskih ćelija su razvijena u različitim formatima, uključujući formate bez Fc (fragment koji kristališe u rastvoru) regiona i formate izvedene iz IgG sa simetričnim i asimetričnim dizajnom. Pored ponovnog ciljanja efektorskih ćelija na lokaciju tumora, za bispecifična antitela su ustanovljene nove primene. Mogu da se razviju bispecifici koji mogu da istovremeno inhibiraju dva povezana signalna molekula kako bi se nadvladao prirodna ili stečena otpornost i kako bi bili efikasniji inhibitori angiogeneze. Pored toga, bispecifična antitela mogu da se upotrebe kao obećavajući imunostimulatorni agensi za lečenje raznih bolesti kao što su maligne bolesti. Bispecifična antitela mogu takođe da se koriste za lečenje hemofilije A imitiranjem funkcije faktora VIII. Bispecifična antitela takođe imaju široku perspektivu primene u koštanim poremećajima i infekcijama i bolestima centralnog nervnog sistema (kratak prikaz u radu Yang F. i sar. Bispecific Antibodies as a Development Platform for New Concepts and Treatment Strategies. Int J Mol Sci.28. dec.2016;18(1)).

[0003] T ćelije eksprimiraju komplekse T-ćelijskih receptora (TCR) koji su u stanju da indukuju antigen-specifične imunske odgovore. Angažovanje kompleksa peptid antigena/klasa I glavnog kompleksa gena tkivne podudarnosti (MHC) na ciljnoj ćeliji sa TCR indukuje obrazovanje imunske sinapse i dovodi do signaliziranja putem CD3 ko-receptora koji su komponente TCR signalnog kompleksa. Ova signalna kaskada usmerava T-ćelijski posredovano ubijanje ćelija koje eksprimiraju antigen pomoću oslobađanja i prenosa granzima i perforina od T ćelije do ciljne ćelije.

[0004] Istorijski, otkriće i proizvodnja jednolančanih povezanih varijabilnih domena antitela (scFvs, opisanih od strane Bird i sar.1988) služili su kao glavni pokretač za razvoj bispecifičnih antitela. Ovaj koncept je na kraju doveo do stvaranja BiTE molekula i njihove kliničke validacije kao potentnog leka za lečenje leukemije (Baeuerle, P.A.; Reinhardt, C. Bispecific T-cell engaging antibodies for cancer therapy. Cancer Res.2009, 69, 4941–4944). Kod maligne bolesti, bispecifična antitela koja ko-angažuju CD3 epsilon podjedinicu i površinski antigen na tumorskoj ćeliji pokreću T-ćelijski posredovano ubijanje tumorske ćelije uz zaobilaženje potrebe za direktnom interakcijom TCR i MHC klasa I u kompleksu sa antigenom. Ovo proširuje repertoar T ćelija koje su u stanju da prepoznaju tumor i deluju kao efektorske ćelije (Baeuerle, P.A.; Reinhardt, C. Bispecific T-cell engaging antibodies for cancer therapy. Cancer Res. 2009, 69, 4941–4944).

[0005] Stieglmaier J., i sar. (u radu: Utilizing the BiTE (bispecific T-cell engager) platform for immunotherapy of cancer. Expert Opin Biol Ther. 2015;15(8):1093-9) opisuju da se trenutno ispituju razni pristupi imunoterapije malignih bolesti zasnovane na T ćelijama, među kojima su i konstrukti BiTE® (eng. bispecific T-cell engager) antitela koja imaju jedinstven dizajn i mehanizam delovanja. Oni se konstruišu genetskim povezivanjem minimalno vezujućih domena monoklonskih antitela za tumor-asocirane površinske antigene i za CD3 molekul asociran sa T-ćelijskim receptorom na jedan polipeptidni lanac. Istovremeno angažovanje antigena ciljne ćelije i CD3 dovodi do aktivacije poliklonalnih citotoksičnih T ćelija, što rezultuje lizom ciljne ćelije. Blinatumomab, BiTE® koje cilja CD19, ispituje se za širok spektar B-ćelijskih maligniteta, a nedavno je odobren u SAD od strane američke Uprave za hranu i lekove (US FDA) za relapsnu/refraktornu B-akutnu limfoblastnu leukemiju negativnu na Filadelfija hromozom pod zaštićenim nazivom BLINCYTO™. BiTE® platforma je jedna od klinički najnaprednijih opcija T-ćelijske imunoterapije.

[0006] Ipak, otkriveno je da su mane malih bispecifičnih molekula, poput BiTE®-ova, slabi prinosi proizvodnje, komplikovani postupci prečišćavanja, sklonost agregaciji kao i veoma kratak poluživot u serumu. U cilju prevazilaženja prirodnih ograničenja ove klase molekula razvijeni su različiti formati bispecifika zasnovanih na humanim IgG počevši sa konceptom rekombinantnih bispecifičnih prototipova imunoglobulinu (Ig)-G sličnih antitela koji su osmišljeni pre više od dve decenije, kada su Morrison i kolege fuzionisali fleksibilne linkerske peptide sa C krajem teških lanaca IgG nakon čega su sledili jednolančani varijabilni domeni sa različitim specifičnostima vezivanja (Coloma, M.J. and Morrison, S.L. (1997) Design and production of novel tetravalent bispecific antibodies. Nat. Biotechnol.15, 159–163). Molekuli su mogli da se razlikuju od „normalnih“ antitela zato što su imali dvojne funkcionalnosti. Tehničke prepreke su inicijalno kočile dalji razvoj, što je dovelo do toga da bispecifična antitela (bsAt) ostanu tema istraživanja i razvoja prvenstveno u akademskim i biotehnološkim krugovima. Međutim, tehnologije koje se brzo razvijaju koje su omogućile inženjering, proizvodnju i razvoj derivata rekombinantnih proteina, u kombinaciji sa obnovljenim interesovanjem farmaceutske industrije, ponovo su pokrenule polje istraživanja bsAt. Danas su dostupni mnogi različiti formati bsAt pogodni za razvoj terapeutskih proteina (za kratke prikaze, vidite radove Gramer, mAbs. 2013;5(6):962-973, Weidle, Cancer Genomics Proteomics. Nov–dec 2013;10(6):239-50, Brinkmann, MAbs. Feb/mar 2017;9(2):182-212.). Ukratko, uključivanje Fc-(fragment koji kristališe u rastvoru) delova, koji se sastoje od CH2 i CH3 domena dovelo je do povećane produktivnosti, pojednostavljenih postupaka prečišćavanja i poboljšane stabilnosti. Pored toga, poluživot u serumu takvih lekova zasnovanih na IgG je produžen zbog i) povećanja u veličini i ii) interakcije Fc-dela sa humanim Fc-receptorom FcRn. Razvoj formata bispecifika zasnovanih na IgG je dodatno podstaknut pojavom i inkorporiranjem mutacija dobijenih inženjeringom kako bi se olakšala heterodimerizacija dva različita CH3 domena čime su povezana dva različita polipeptidna lanca. Osnovni koncept uveli su Ridgway JB, i sar. (u radu: 'Knobs-into-holes' engineering of antibody CH3 domains for heavy chain heterodimerization. Protein Eng. Jul 1996;9(7):617-21) koji su predstavili pristup „ispupčenje u udubljenje“ kao novu i efikasnu strategiju dizajna za inženjering homodimera teškog lanca antitela za heterodimerizaciju. U ovom pristupu varijanta „ispupčenja“ je prvo dobijena zamenom male aminokiseline većom u CH3 domenu CD4-IgG imunoadhezina: T366Y. Ispupčenje je dizajnirano da se umetne u „udubljenje“ u CH3 domenu humanizovanog anti-CD3 antitela kreirano promišljenom zamenom velikog ostatka manjim: Y407T. Hibrid anti-CD3/CD4-IgG predstavlja do 92% pula prečišćenog proteina A nakon ko-ekspresije ova dva različita teška lanca zajedno sa lakim lancem anti-CD3. Suprotno tome, samo do 57% hibrida anti-CD3/CD4-IgG je bilo obnovljeno nakon ko-ekspresije u kojoj su teški lanci sadržali CH3 domen divljeg tipa. Tako inženjering „ispupčenja u udubljenja“ olakšava konstruisanje hibrida antitelo/imunoadhezin i verovatno drugih bifunkcionalnih terapeutika koji sadrže Fc, uključujući bispecifične imunoadhezine i bispecifična antitela. Rad Atwell i sar., 1997, J Mol Biol (Stable heterodimers from remodeling the domain interface of a homodimer using a phage display library) predstavlja mutaciju „ispupčenja u udubljenje“ (ispupčenje: T366W/udubljenje: T366S+L368A+Y407V) u CH3 domenu Fc domena za poboljšanu heterodimerizaciju. Ovaj koncept je dalje poboljšan dodatnim uvođenjem ostataka cisteina radi obrazovanja stabilizujuće disulfidne veze između heterodimernih CH3 domena kako je opisano u radu Merchant i sar. 1998, Nature Biotechnology (An Efficient Route to Human Bispecific IgG).

[0007] Dodatni koncepti za proizvodnju heterodimernih molekula predstavljeni su od strane Muda i sar. 2011, PEDS (Therapeutic assessment of SEED: a new engineered antibody platform designed to generate mono- and bispecific antibodies); Gunasekaran i sar. 2010, J Biol Chem (Enhancing antibody Fc heterodimer formation through electrostatic steering effects: applications to bispecific molecules and monovalent IgG); Moore i sar. 2011, MAbs (A novel bispecific antibody format enables simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of distinct target antigens); Von Kreudenstein i sar. 2013, MAbs (Improving biophysical properties of a bispecific antibody scaffold to aid developability: quality by molecular design). Ove koncepte su sumirali i recenzirali Ha i sar. 2016, Front Immunol (Immunoglobulin Fc Heterodimer Platform Technology: From Design to Application in Therapeutic Antibodies and Proteins) i Liu i sar. 2017, Front Immunol (Fc Engineering for Developing Therapeutic Bispecific Antibodies and Novel scaffolds).

[0008] Uvođenjem Fc delova koji sadrže domene šarki, CH2 i CH3, ili njihove delove, u bispecifične molekule, pojavio se problem nespecifične imobilizacije ovih molekula indukovane interakcijama Fc:Fc-gama receptor (FcgR). FcgR-ovi se sastoje od različitih ćelijskih površinskih molekula (FcgRI, FcgRIIa, FcgRIIb, FcgRIII) koji se sa različitim afinitetom vezuju za epitope koje prikazuju Fc delovi IgG molekula. Budući da je takva nespecifična (tj. nije indukovana bilo kojim od dva vezujuća domena bispecifičnog molekula) imobilizacija nepovoljna zbog i) uticaja na farmakokinetiku molekula i ii) vanciljne aktivacije imunskih efektorskih ćelija, identifikovane su razne varijante i mutacije Fc kako bi se uklonilo vezivanje FcgR.

[0009] Rad Morgan i sar. 1995, Immunology (The N-terminal end of the CH2 domain of chimeric human IgG1 anti-HLA-DR is necessary for C1q, FcyRI and FcyRIII binding) predstavlja zamenu ostataka 233-236 humanog IgG1 sa korespondentnom sekvencom dobijenom iz humanog IgG2 koja rezultuje ukidanjem vezivanja FcgRI, ukidanjem vezivanja C1q i smanjenim vezivanjem FcgRIII.

[0010] U patentu EP1075496 predstavljena su antitela i drugi molekuli koji sadrže Fc sa varijacijama u Fc regionu (233P, 234V, 235A i bez ostatka ili G na poziciji 236 i 327G, 330S i 331S) naznačeni time što je rekombinantno antitelo sposobno da veže ciljni molekul bez pokretanja značajne lize zavisne od komplementa ili ćelijski posredovanog uništavanja cilja.

[0011] Retargetirajući molekuli sa dvojnim afinitetom (eng. dual affinity retargeting, DART) se koriste da bi se postiglo, na primer, optimalno preusmereno T-ćelijsko ubijanje B-ćelijskog limfoma. Originalna DART tehnologija opisana je od strane Moore i sar. (u radu: Application of dual affinity retargeting molecules to achieve optimal redirected T-cell killing of B-cell lymphoma, Blood. 28 apr. 2011;117(17):4542-51). Poređenje sa jednolančanim, bispecifičnim antitelom koje nosi identične Fv sekvence CD19 i CD3 antitela otkrilo je da su DART molekuli potentniji u usmeravanju lize B ćelija. Dalja evolucija DART tehnologije postignuta je sa DART-Fc-molekulima koji su opisani u radu Root i sar., 2016 antibodies (Development of PF-06671008, a Highly Potent Anti-P-cadherin/Anti-CD3 Bispecific DART Molecule with Extended Half-Life for the Treatment of Cancer). Ovaj molekul je kombinovao visoku potentnost DART-ova sa, među ostalim pozitivnim karakteristikama, produženim poluživotom u serumu molekula zasnovanim na Fc.

[0012] αβTCR (TCR) prepoznaje antigene peptide koje prezentuje MHC i odgovoran je za specifičnost T ćelija. I α i β lanci TCR-a poseduju varijabilne (V) i konstantne domene. V domeni su uključeni u vezivanje antigenog peptida a konstantni domeni prolaze kroz membranu T ćelije. Na osnovu analize kristalne strukture TCR-a vezanog za kompleks peptid-MHC, regioni koji određuju komplementarnost (CDR) 3 i Vαi Vβlanaca radije interaguju sa peptidom, dok CDR-ovi 1 i 2 interaguju sa MHC. Ipak, takođe je opisano i prepoznavanje peptida od strane CDR 1 i prepoznavanje MHC od strane CDR 3 (Piepenbrink et al, The basis for limited specificity and MHC restriction in a T cell receptor interface, Nat Commun, 2013; 4, 1948). TCR αβ heterodimer je blisko povezan sa proteinima CD3, CD4 ili CD8, i drugim proteinima adhezije i prenosa signala. Vezivanje antigenog peptida od strane V regiona TCR pokreće aktivaciju T ćelija pomoću prenosa signala kroz konstantne domene TCR putem CD3 i CD4 ili CD8 citoplazmatskih proteina.

[0013] Jednolančani TCR-ovi (scTCR) pružaju značajne prednosti za razliku od formata TCR kompletne dužine u pogledu inženjeringa, ekspresije solubilnog proteina i kliničkog potencijala. Iz perspektive ekspresije solubilnog proteina (tj. proizvodnje), scTCR-ovi se proizvode kao pojedinačan polipeptid, čime se izbegava potreba za proizvodnjom svakog lanca TCR kao zasebnog polipeptida i omogućava proizvodnja većih količina pravilno sastavljenog scTCR koji se vezuje za svoj ligand peptid-MHC. Ova karakteristika može da omogući prinose proizvodnje koji su neophodni za kliničku upotrebu. Konačno, iz kliničke perspektive, scTCR-ovi koji sadrže samo V regione (scTv) mogu da se formatiraju kao terapeutici ili dijagnostički reagensi slično scFv fragmentima.

[0014] U patentu US 2006-0166875 predstavljen je jednolančani T-ćelijski receptor (scTCR) koji sadrži alfa segment koji čini sekvenca varijabilnog regiona alfa lanca TCR fuzionisana na N kraj vanćelijske sekvence konstantnog regiona alfa lanca TCR, beta segment koji čini varijabilni region beta lanca TCR fuzionisan na N kraj vanćelijske sekvence konstantnog regiona beta lanca TCR, linkersku sekvencu koja povezuje C kraj alfa segmenta sa N krajem beta segmenta, ili obrnuto, vanćelijske sekvence konstantnog regiona alfa i beta segmenata povezanih disulfidnom vezom, pri čemu su dužina linkerske sekvence i položaj disulfidne veze takvi da su sekvence varijabilnog regiona alfa i beta segmenata u značajnoj meri međusobno orijentisane kao u nativnim alfa/beta T-ćelijskim receptorima. Takođe su predstavljeni kompleksi dva ili više takvih scTCR-ova i upotreba scTCR-ova u terapiji i raznim skrining primenama. Za razliku od scTCR-ova opisanih u patentu US 2006-0166875, patent US 2012-0252742 predstavlja solubilni humani jednolančani TCR bez konstantnih domena, koji se sastoji samo od varijabilnih fragmenata TCR (scTv), koji je koristan za mnoge svrhe, uključujući lečenje malignih, virusnih i autoimunskih bolesti.

[0015] McCormack E, i sar. (u radu: Bi-specific TCR-anti CD3 redirected T-cell targeting of NY-ESO-1- and LAGE-1-positive tumors. Cancer Immunol Immunother. Apr. 2013;62(4):773-85) iznose da su NY-ESO-1 i LAGE-1 karcinom-testis antigeni sa idealnim profilom za imunoterapiju tumora, kombinujući ushodnu regulaciju u mnogim vrstama malignih tumora sa visoko restrikovanom ekspresijom u normalnim tkivima i deljenjem zajedničkog HLA-A*0201 epitopa, 157-165. Oni predstavljaju podatke da opišu specifičnost i antitumorsku aktivnost bifunkcionalnog ImmTAC, koji se sastoji od solubilnog, visokoafinitetnog T-ćelijskog receptora (TCR) specifičnog za NY-ESO-1157-165 fuzionisanog na anti-CD3 scFv. Pokazano je da ovaj reagens, ImmTAC-NYE, ubija HLA-A2, antigen-pozitivne tumorske ćelijske linije i sveže izolovane HLA-A2- i LAGE-1-pozitivne NSCLC ćelije. Primenom in vivo optičkog imidžinga, rezultati pokazuju in vivo ciljanje fluorescentno obeleženih visokoafinitetnih NYESO-specifičnih TCR-ova za HLA-A2-, NY-ESO-1157-165-pozitivne tumore kod ksenograftiranih miševa. In vivo efikasnost ImmTAC-NYE je testirana na tumorskom modelu u kojem su humani limfociti stabilno ko-graftirani u imunodeficijentne NSG miševe koji imaju ksenografte tumora; efikasnost je zabeležena i u prevenciji tumora i u ustanovljenim modelima tumora primenom očitavanja GFP fluorescencije. Kvantitativna RT-PCR je korišćena za analiziranje ekspresije i NY-ESO-1 i LAGE-1 antigena u 15 normalnih tkiva, 5 ćelijskih linija raka, 10 NSCLC i 10 uzoraka raka jajnika. Sveukupno, RNK LAGE-1 je bila eksprimirana sa većom efikasnošću i u većim nivoima nego NY-ESO-1 u uzorcima tumora. ImmTAC-ovi se sastoje od jednolančanog Fv dobijenog iz anti-CD3 antitela UCHT-1 kovalentno povezanog sa C- ili N-krajem alfa ili beta lanca TCR-a.

[0016] Patent EP1868650 je usmeren na molekule dijatela i njihove upotrebe u lečenju raznih oboljenja i poremećaja, uključujući imunološke poremećaje, infektivne bolesti, intoksikaciju i maligne bolesti. Molekuli dijatela se sastoje od dva polipeptidna lanca koja se povezuju da obrazuju najmanje dva mesta za vezivanje epitopa, koja mogu da prepoznaju iste ili različite epitope na istim ili različitim antigenima. Pored toga, antigeni mogu biti iz istog ili različitih molekula. Pojedinačni polipeptidni lanci molekula dijatela mogu biti kovalentno vezani pomoću nepeptidnih kovalentnih veza, kao što su, bez ograničenja, disulfidno vezivanje ostataka cisteina koji se nalaze u okviru svakog polipeptidnog lanca. U naročitim primerima izvođenja, molekuli dijatela dalje sadrže Fc region, koji je predstavljen u ovom dokumentu jer on omogućava ugradnju svojstava sličnih antitelu (npr. dug poluživot) u molekul. Patent EP1868650 zahteva prisustvo vezujućih regiona varijabilnih domena lakog lanca ili teškog lanca imunoglobulina i opširno raspravlja o funkcionalnim vezivačima Fc receptora.

[0017] Patent WO 2016/184592 A1 iznosi bispecifične molekule u kojima jednu specifičnost doprinosi TCR a drugu antitelo koje je usmereno protiv antigena ili epitopa na površini limfocita, ali ne iznosi specifični aranžman elemenata TCR-a i varijabilnih regiona antitela kako je izneto u ovom dokumentu.

[0018] Patent EP2258720A1 je usmeren na fuzioni protein (TFP) funkcionalnog T-ćelijskog receptora (TCR) koji prepoznaje i vezuje se za najmanje jedan MHC-prezentovan epitop, i koji sadrži najmanje jednu aminokiselinsku sekvencu koja prepoznaje i vezuje antigen.

[0019] Patent WO 2014/159940 iznosi dijatela koja sadrže za svaki vezujući region VL i VH domen antitela. Dijatelima nedostaju TCR Vα i TCR Vβ domeni.

[0020] Patent EP 2258 719 iznosi TCR-ove koji se sastoje od α i/ili β lanca kompletne dužine, naznačene time što su jedna ili više aminokiselinskih sekvenci koje vezuju antigen fuzionisane na N-kraj α i/ili β lanca, umetnute u konstantni ili varijabilni region navedenog α i/ili β lanca ili zamenjuju određeni broj aminokiselina u konstantnom ili varijabilnom regionu navedenog α i/ili β lanca. Ovi funkcionalni TCR-ovi su vezani za membranu, nisu bispecifični, a pored toga ne sadrže varijabilne domene antitela.

[0021] Imunski sistem je razvio mehanizme kojim dendritične ćelije i neki drugi fagociti uzorkuju i prezentuju antigene iz vanćelijskog miljea na MHC I preko procesa koji se zove unakrsna prezentacija (XPT). Ovaj put igra ključnu ulogu u imunskom odgovoru na određene infekcije, konkretno virusne infekcije.

[0022] Tokom rane faze infekcije, na primer, CD8+ T ćelije specifične za virus humane imunodeficijencije (HIV) su kritične za ograničavanje replikacije HIV-a in vivo. Kod osoba kod kojih bolest dugoročno ne progredira se održavaju HIV-specifične CD8<+>T ćelije sa superiornim funkcionalnim profilom za razliku od onih kod osoba čija bolest progredira. Tako, inicijalno snažna citoliza CD8<+>T ćelija i proizvodnja citokina opada tokom progresivne hronične HIV infekcije jer T ćelije ne uspevaju da prepoznaju varijante virusnog izbegavanja, postaju progresivno iscrpljene i konačno održavaju disfunkcionalne imunske odgovore protiv HIV-a. Održavanje potentnosti HIV-specifičnih CD8<+>T ćelija bi promovisalo uklanjanje ćelija inficiranih virusom, smanjilo viremiju i usporilo napredovanje bolesti.

[0023] Pasivna primena monoklonskih antitela (mAt) je obećavajuća terapeutska platforma za lečenje virusnih infekcija. U virusnoj imunoterapiji, inženjering bispecifičnog antitela pruža mogućnost da se naprave multifunkcionalni molekuli koji odgovaraju predloženom mehanizmu delovanja, na primer da istovremeno ciljaju i virusne i komponente domaćina.

[0024] Predmetni pronalazak ima za cilj da obezbedi poboljšane bispecifične molekule koji su sposobni da ciljaju komplekse virusni peptid-MHC, koji mogu lako da se proizvedu, pokazuju visoku stabilnost i takođe obezbeđuju visoku potentnost kada se vezuju za dotične epitope antigena. Drugi ciljevi i prednosti predmetnog pronalaska će postati očigledni prilikom proučavanja sledećeg opisa i poželjnih primera izvođenja, kao i odnosnih primera.

[0025] U prvom aspektu pronalaska, gore navedeni cilj se rešava obezbeđivanjem polipeptidnog molekula sa dvojnom specifičnošću u skladu sa patentnim zahtevom 1 koji sadrži prvi polipeptidni lanac i drugi polipeptidni lanac, pri čemu:

prvi polipeptidni lanac sadrži varijabilni domen (VD1) antitela koje se specifično vezuje za ćelijski površinski antigen humane imunske efektorske ćelije, i

prvi varijabilni domen (VR1) TCR-a koji se specifično vezuje za MHC-asocirani virusni peptidni epitop, i

prvi linker (LINK1) koji povezuje navedene domene;

drugi polipeptidni lanac sadrži drugi varijabilni domen (VR2) TCR-a koji se specifično vezuje za MHC-asocirani virusni peptidni epitop, i

drugi varijabilni domen (VD2) antitela koje se specifično vezuje za ćelijski površinski antigen humane imunske efektorske ćelije, i

drugi linker (LINK2) koji povezuje navedene domene;

gde se navedeni prvi varijabilni domen (VD1) i navedeni drugi varijabilni domen (VD2) povezuju da obrazuju prvo mesto vezivanja (VD1)(VD2) koje vezuje epitop ćelijskog površinskog molekula;

gde je prvi varijabilni domen (VR1) jedan od TCR Vα domena i TCR Vβ domena, a drugi varijabilni domen (VR2) je drugi od TCR Vα domena i TCR Vβ domena, navedeni prvi varijabilni domen (VR1) i navedeni drugi varijabilni domen (VR2) se povezuju da obrazuju drugo mesto vezivanja (VR1)(VR2) koje vezuje navedeni MHC-asocirani virusni peptidni epitop;

gde su navedena dva polipeptidna lanca fuzionisana na šarka domene humanih IgG i/ili Fc domene humanih IgG ili njihove dimerizacione delove;

gde su navedena dva polipeptidna lanca povezana kovalentnim i/ili nekovalentnim vezama između navedenih domena šarke i/ili Fc domena;

gde je navedeni polipeptidni molekul sa dvojnom specifičnošću sposoban da istovremeno vezuje ćelijski površinski molekul i MHC-asocirani virusni peptidni epitop, i

gde je redosled vezujućih regiona u polipeptidnim lancima izabran od VD1-VR1; VD1-VR2; VD2-VR1; VD2-VR2; VR1-VD1; VR1-VD2; VR2-VD1; VR2-VD2, i gde su domeni povezani pomoću LINK1 ili LINK2, poželjno

gde je redosled varijabilnih domena u dva polipeptidna lanca izabran od VD1-VR1 i VR2-VD2 ili VD2-VR2 i VR1-VD1.

[0026] Poželjno, polipeptidni molekul sa dvojnom specifičnošću u skladu sa predmetnim pronalaskom se sa visokom specifičnošću vezuje i za antigen imunske efektorske ćelije i za specifični epitop antigena prezentovan u vidu kompleksa peptid-MHC, npr. sa afinitetom vezivanja (KD) od oko 100 nmol/l ili manje, oko 30 nmol/l ili manje, oko 10 nmol/l ili manje, oko 3 nmol/l ili manje, oko 1 nmol/l ili manje, npr. mereno pomoću interferometrije biološkog sloja (BLI) kako je opisano u primeru 6 ili kako je utvrđeno protočnom citometrijom.

[0027] Inventivni polipeptidni molekuli sa dvojnom specifičnošću u skladu sa predmetnim pronalaskom su u ovom dokumentu prikazani kroz primere pomoću polipeptidnog molekula sa dvojnom specifičnošću koji sadrži prvi polipeptidni lanac koji sadrži SEQ ID No. 16, SEQ ID No. 43, SEQ ID No. 45, SEQ ID No.51, SEQ ID No.53, SEQ ID No.55, ili SEQ ID No. 57, i drugi polipeptidni lanac koji sadrži SEQ ID No. 17, SEQ ID No. 44, SEQ ID No. 46, SEQ ID No. 52, SEQ ID No.54, SEQ ID No.56, ili SEQ ID No.58.

[0028] U drugom aspektu pronalaska, gore navedeni cilj se rešava obezbeđivanjem nukleinske(ih) kiseline(a) koja(e) kodira(ju) prvi polipeptidni lanac i/ili drugi polipeptidni lanac kako su izneti u ovom dokumentu, ili vektora ekspresije koji sadrži takvu nukleinsku kiselinu. U

1

trećem aspektu pronalaska, gore navedeni cilj se rešava obezbeđivanjem ćelije domaćina koja sadrži vektor(e) kako je(su) definisan(i) u ovom dokumentu.

[0029] Takođe je predstavljen postupak za proizvodnju polipeptidnog molekula sa dvojnom specifičnošću u skladu sa predmetnim pronalaskom, koji sadrži prikladnu ekspresiju navedenog(ih) vektora ekspresije koji sadrži(e) nukleinsku(e) kiselinu(e) kako je(su) predstavljena(e) u pogodnoj ćeliji domaćinu, i prikladnog prečišćavanja molekula iz ćelije i/ili njenog medijuma.

[0030] U četvrtom aspektu pronalaska, gore navedeni cilj se rešava obezbeđivanjem farmaceutske smeše koja sadrži polipeptidni molekul sa dvojnom specifičnošću u skladu sa pronalaskom, nukleinsku kiselinu ili vektor(e) ekspresije u skladu sa pronalaskom, ili ćeliju u skladu sa pronalaskom, zajedno sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih nosača ili pomoćnih materija.

[0031] U petom aspektu pronalaska, pronalazak se odnosi na polipeptidni molekul sa dvojnom specifičnošću u skladu sa pronalaskom, nukleinsku kiselinu(e) ili vektor(e) ekspresije u skladu sa pronalaskom, ćeliju u skladu sa pronalaskom, ili farmaceutsku smešu u skladu sa pronalaskom, za upotrebu u medicini.

[0032] U šestom aspektu pronalaska, pronalazak se odnosi na polipeptidni molekul sa dvojnom specifičnošću u skladu sa pronalaskom, nukleinsku kiselinu ili vektor(e) ekspresije u skladu sa pronalaskom, ćeliju u skladu sa pronalaskom, ili farmaceutsku smešu u skladu sa pronalaskom, za upotrebu u lečenju bolesti ili poremećaja kako su iznete u ovom dokumentu, naročito izabrane iz malignih i infektivnih bolesti.

[0033] Takođe je predstavljen, ali ne obrazuje deo pronalaska, postupak za lečenje bolesti ili poremećaja koji se sastoji od davanja terapeutski efikasne količine polipeptidnog molekula sa dvojnom specifičnošću u skladu sa pronalaskom, nukleinske kiseline ili vektora ekspresije u skladu sa pronalaskom, ćelije u skladu sa pronalaskom, ili farmaceutske smeše u skladu sa pronalaskom.

[0034] Takođe je predstavljen, ali ne obrazuje deo pronalaska, postupak za izazivanje imunskog odgovora kod pacijenta ili ispitanika koji se sastoji od davanja terapeutski efikasne količine polipeptidnog molekula sa dvojnom specifičnošću u skladu sa pronalaskom ili farmaceutske smeše u skladu sa pronalaskom.

[0035] Takođe je predstavljen, ali ne obrazuje deo pronalaska, postupak za ubijanje ciljnih ćelija kod pacijenta ili ispitanika koji se sastoji od davanja pacijentu efikasne količine polipeptidnog molekula sa dvojnom specifičnošću u skladu sa predmetnim pronalaskom.

[0036] Kako je navedeno iznad, pronalazak obezbeđuje nove i poboljšane polipeptidne molekule sa dvojnom specifičnošću. Molekuli uopšteno sadrže prvi polipeptidni lanac i drugi polipeptidni lanac, naznačeno time što lanci zajedno obezbeđuju varijabilni domen antitela specifičnog za epitop površinskog antigena imunske efektorske ćelije, i varijabilni domen TCR-a koji je specifičan za MHC-asocirani peptidni epitop, npr. virusnu infekciju kao što je HIV. Varijabilni domeni dobijeni iz antitela i TCR se stabilizuju pomoću kovalentnih i nekovalentnih veza koje se obrazuju između Fc delova ili njihovih delova koji se nalaze na oba polipeptidna lanca. Polipeptidni molekul sa dvojnom specifičnošću je tada sposoban da istovremeno vezuje ćelijski receptor i MHC-asocirani peptidni epitop.

[0037] U kontekstu predmetnog pronalaska, varijabilni domeni (VD1) i (VD2) su dobijeni od antitela koja su sposobna da regrutuju humane imunske efektorske ćelije tako što se specifično vezuju za površinski antigen navedenih efektorskih ćelija. U jednom konkretnom primeru izvođenja, navedena antitela se specifično vezuju za epitope kompleksa TCR-CD3 humanih T ćelija, koji sadrži peptidne lance TCRalfa, TCRbeta, CD3gama, CD3delta, CD3epsilon i CD3zeta.

[0038] Polipeptidni molekul sa dvojnom specifičnošću u skladu sa predmetnim pronalaskom sadrži prvi polipeptidni i drugi polipeptidni lanac koji daju prvi (VD1) odnosno drugi (VD2) varijabilni domen, varijabilnog domena dobijenog od antitela koje je sposobno da regrutuje humane imunske efektorske ćelije tako što se specifično vezuje za površinski antigen navedenih ćelija. Prvi varijabilni domen (VD1) i navedeni drugi varijabilni domen (VD2) se povezuju da obrazuju prvo mesto vezivanja (VD1)(VD2) koje vezuje epitop ćelijskog površinskog antigena imunske efektorske ćelije. Pored toga, prvi i drugi polipeptidni lanac polipeptidnog molekula sadrže prvi (VR1) odnosno drugi (VR2) varijabilni domen, dobijen od TCR-a koji je specifičan za MHC-asocirani virusni peptidni epitop. Prvi varijabilni domen (VR1) je jedan od TCR Vα domena i TCR Vβ domena, a drugi varijabilni domen (VR2) je drugi od TCR Vα domena i TCR Vβ domena. Navedeni prvi varijabilni domen (VR1) i navedeni drugi varijabilni domen (VR2) se povezuju da obrazuju drugo mesto vezivanja (VR1)(VR2) koje vezuje navedeni MHC-asocirani peptidni epitop. U jednom primeru izvođenja polipeptidnog molekula sa dvojnom specifičnošću u skladu sa pronalaskom, redosled/orijentacija domena u prvom polipeptidnom lancu je izabran/a od VD1-LINK1-VR1 i VR1-LINK1-VD1, a redosled/orijentacija domena u drugom polipeptidnom lancu je izabran/a od VD2-LINK2-VR2 i VR2-LINK-VD2, to jest, aranžman mesta za vezivanje može da se rearanžira u „levi“ ili „desni“ molekul (vidite na primer sliku 5). Pored toga, konfiguracija alfa i beta lanaca TCR-povezanog dela može da se preokrene.

[0039] U kontekstu predmetnog pronalaska, dvojno afinitetan polipeptidni molekul u skladu sa pronalaskom prikazan je kroz primere pomoću konstrukata koji vezuju peptid SLYNTVATL dobijen od HIV-a (SEQ ID No. 7) kada je prezentovan u vidu kompleksa peptid-MHC. Bez obzira na to, koncept pronalaska očigledno nije ograničen na ovaj konkretan peptid, i načelno uključuje svaki epitop povezan sa virusnom infekcijom ili poremećajem koji je prezentovan u kontekstu sa MHC molekulom. Ova prezentacija može da bude povezana sa MHC klasa I ili klasa II. Molekuli glavnog kompleksa gena tkivne podudarnosti klase I (MHC-I) su prisutni na površini svih ćelija koje sadrže jedro i prikazuju veliki niz peptidnih epitopa za nadzor od strane repertoara CD8+ T ćelija. Odgovori CD8<+>T ćelija su esencijalni za kontrolu i uklanjanje virusnih infekcija kao i za eliminaciju transformisanih i tumorogenih ćelija. Primeri za poželjne peptidne epitope koji treba da se prepoznaju mogu se naći u odgovarajućoj literaturi, i posebno uključuju peptide koji su predstavljeni u tabelama 1 do 5 patenta WO 2016/170139; tabelama 1 do 5 patenta WO 2016/102272; tabelama 1 ili 2 patenta WO 2016/156202; tabelama 1 do 4 patenta WO 2016/146751; tabeli 2 patenta WO 2011/113819; tabelama 1 do 4b patenta WO 2016/156230; tabelama 1 do 4b patenta WO 2016/177784; tabelama 1 do 4 patenta WO 2016/202963; tabelama 1 i 2 patenta WO 2016/207164; tabelama 1 do 4 patenta WO 2017/001491; tabelama 1 do 4 patenta WO 2017/005733; tabelama 1 do 8 patenta WO 2017/021527; tabelama 1 do 3 patenta WO 2017/036936; tabelama 1 do 4 patenta PCT/EP2016/073416 za terapije maligniteta, SAD publikaciji 2016-0187351, SAD publikaciji 2017-0165335, SAD publikaciji 2017-0035807, SAD publikaciji 2016-0280759, SAD publikaciji 2016-0287687, SAD publikaciji 2016-0346371, SAD publikaciji 2016-0368965, SAD publikaciji 2017-0022251, SAD publikaciji 2017-0002055, SAD publikaciji 2017-0029486, SAD publikaciji 2017-0037089, SAD publikaciji 2017-0136108, SAD publikaciji 2017-0101473, SAD publikaciji 2017-0096461, SAD publikaciji 2017-0165337, SAD publikaciji 2017-0189505, SAD publikaciji 2017-0173132, SAD publikaciji 2017-0296640, SAD publikaciji 2017-0253633 i SAD publikaciji 2017-0260249. Dvojno afinitetan polipeptidni molekul u skladu sa pronalaskom može da prepozna peptid koji sadrži bilo koji od ovih peptida opisanih u gore navedenim patentnim aplikacijama.

[0040] Dvojno afinitetan polipeptidni molekul u skladu sa pronalaskom može da veže ili je sposoban da specifično prepozna/se veže za jedan ili više virusnih peptida sa ukupnom dužinom od 8 do 100 aminokiselina, od 8 do 30 aminokiselina, od 8 do 16 aminokiselina, poželjno od 8 do 14 aminokiselina, naime 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 aminokiselina, u slučaju elongiranih peptida koji se vezuju za klasu II dužina može biti i 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ili 22 aminokiseline. Konkretno, dvojno afinitetan polipeptidni molekul u skladu sa pronalaskom može da veže ili je

1

sposoban da specifično prepozna/se veže za jedan ili više virusnih peptida sa ukupnom dužinom od 8 do 12 aminokiselina, od 8 do 10 aminokiselina, od 9 do 15 aminokiselina, od 9 do 14 aminokiselina, od 9 do 13 aminokiselina, od 9 do 12 aminokiselina, od 9 do 11 aminokiselina; od 10 do 15 aminokiselina, od 10 do 14 aminokiselina, od 10 do 13 aminokiselina, ili od 10 do 12 aminokiselina.

[0041] Drugi prikladni epitopi se mogu identifikovati iz baza podataka, kao što je, na primer, Baza podataka imunskih epitopa (dostupna na veb stranici www.iedb.org).

[0042] Virusni peptidi koji treba da budu cilj konstrukta pronalaska mogu da se dobiju iz bilo koje virusne infekcije koja dovodi do prezentacije takvih peptida od strane MHC, kao što su HIV, HCV, HBV, herpes, HPV, EBV, i slični.

[0043] Termin „humana(e) imunska(e) efektorska(e) ćelija(e)“ odnosi se na ćeliju u okviru prirodnog repertoara ćelija u humanom imunskom sistemu koja je, kada se aktivira, sposobna da dovede do promene u vijabilnosti ciljne ćelije. Termin „vijabilnost ciljne ćelije“ može da se u obimu pronalaska odnosi na sposobnost ciljne ćelije da preživi, proliferiše i/ili interaguje sa drugim ćelijama. Takva interakcija može da bude direktna, na primer kada ciljna ćelija dolazi u kontakt sa drugom ćelijom, ili indirektna, na primer kada ciljna ćelija sekretuje supstance koje imaju uticaj na funkcionisanje druge udaljene ćelije. Ciljna ćelija može da bude ili nativna ili strana za ljude. U slučaju da je ćelija nativna za ljude, ciljna ćelija je pogodno ćelija koja je prošla transformaciju i postala maligna ćelija. Nativna ćelija može dodatno da bude patološki modifikovana nativna ćelija, na primer nativna ćelija inficirana organizmom kao što je virus, plasmodium ili bakterija. U slučaju da je ćelija strana za ljude, ciljna ćelija je pogodno invadirajući patogen, na primer invadirajuća bakterija ili plasmodium.

[0044] Poželjan je polipeptidni molekul sa dvojnom specifičnošću u skladu sa pronalaskom, naznačen time što navedeni prvi i drugi polipeptidni lanac dalje sadrže najmanje jedan domen šarke i/ili Fc domen ili njihov deo. Kod antitela, „šarka“ ili „region šarke“ ili „domen šarke“ se odnosi na fleksibilni deo teškog lanca koji se nalazi između domena CH1 i domena CH2. On je dužine približno 25 aminokiselina i podeljen je u „gornju šarku“, „srednju šarku“ ili „jezgrenu šarku“ i „donju šarku“. „Poddomen šarke“ odnosi se na gornju šarku, srednju (ili jezgrenu) šarku ili donju šarku. Sekvence aminokiselina šarki IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4 molekula su (naznačena EU numeracija):

IgG1: E216PKSCDKTHTCPPCPAPELLG (SEQ ID No.1)

IgG2: E216RKCCVECPPCPAPPVAGP (SEQ ID No.2)

IgG3: ELKTPLGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPE216PKSCDTPPPCPRCPAPELLG (SEQ ID No.3)

IgG4: E216SKYGPPCPSCPAPEFLG (SEQ ID No.4)

Region jezgrene šarke obično sadrži najmanje jedan cisteinski most koji povezuje dva teška lanca. Pored toga, mogu da se naprave mutacije u regionu donje šarke da bi se poboljšala neželjena ćelijski posredovana citotoksičnost zavisna od antitela (ADCC).

[0045] Poželjan je polipeptidni molekul sa dvojnom specifičnošću u skladu sa predmetnim pronalaskom, koji sadrži najmanje jedan Fc (fragment koji kristališe u rastvoru) domen IgG, tj. region fragmenta koji kristališe u rastvoru (Fc region), region repa antitela koji interaguje sa Fc receptorima i određene proteine sistema komplementa. Fc regioni sadrže dva ili tri konstantna domena teškog lanca (CH domene 2, 3 i 4) u svakom polipeptidnom lancu. Fc regioni IgG takođe nose visoko konzervirano mesto N-glikozilacije. Glikozilacija Fc fragmenta je esencijalna za aktivnost posredovanu Fc receptorom. Formati bispecifičnog antitela male veličine kao što su BiTE®-ovi i DART-ovi (~50 kD) mogu dovesti do brzog uklanjanja i kratkog poluživota. Stoga, radi poboljšanih farmakokinetičkih osobina, scTv-ćelijski receptor (npr. CD3) polipeptidni molekul sa dvojnom specifičnošću može da se fuzioniše na Fc domen (humanog IgG1) čime se povećava molekulska masa. Pokazano je da nekoliko mutacija koje se nalaze na spoju između domena CH2 i CH3, kao što su T250Q/M428L i M252Y/S254T/T256E H433K/N434F, povećavaju afinitet vezivanja za neonatalni Fc receptor (FcRn) i poluživot IgG1 in vivo. Ovim se može dodatno produžiti poluživot u serumu molekula koji sadrži Fc.

[0046] U polipeptidnim molekulima sa dvojnom specifičnošću pronalaska, navedeni Fc domen može da sadrži CH2 domen koji sadrži najmanje jednu mutaciju koja utišava efektorsku funkciju. Poželjno, ove mutacije se uvode u ELLGGP (SEQ ID No.50) sekvencu humanog IgG1 (ostaci 233-238) ili korespondentne ostatke drugih izotopa za koje se zna da su relevantni za efektorske funkcije. U principu, u IgG1 Fc se uvodi jedna ili više mutacija koje odgovaraju ostacima dobijenim od IgG2 i/ili IgG4. Poželjni su: E233P, L234V, L235A i bez ostatka ili G u položaju 236. Druga mutacija je P331S. U patentu EP1075496 je izneto rekombinantno antitelo koje sadrži himerni domen koji je dobijen od dva ili više CH2 domena teškog lanca humanog imunoglobulina, pri čemu su humani imunoglobulini izabrani od IgG1, IgG2 i IgG4, i koje je naznačeno time što je himerni domen CH2 domen teškog lanca humanog imunoglobulina koji ima sledeće blokove aminokiselina u navedenim položajima: 233P, 234V, 235A i bez ostatka ili G u položaju 236 i 327G, 330S i 331S u skladu sa sistemom numerisanja EU, i najmanje je 98% identičan CH2 sekvenci (ostaci 231-340) iz humanog IgG1, IgG2 ili IgG4 koji ima navedene modifikovane aminokiseline.

[0047] Primeri poželjnih CH2 delimičnih sekvenci koje će se koristiti mogu biti (kompletno ili parcijalno) sledeći:

1

APPVA-GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEK-334 (SEQ ID No.5); i

231-APPVA-GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEK-334 (SEQ ID No. 6), sa podvučenim izmenama, koje u položaju 297 nose N (glikoziliranu varijantu) ili ostatak izabran iz grupe koju čine A, G i Q (deglikozilirana varijanta).

[0048] U polipeptidnim molekulima sa dvojnom specifičnošću pronalaska, navedeni Fc domen može da sadrži CH3 domen koji sadrži najmanje jednu mutaciju koja olakšava obrazovanje heterodimera. Da bi se maksimalizovao prinos željenog heterodimernog Fc proteina sa dvojnom specifičnošću i da bi se pojednostavilo prečišćavanje, u Fc domen mogu inženjeringom biti uvedene mutacije „ispupčenje u udubljenje“. Sa ovim dizajnom Fc domeni su primorani da obrazuju heterodimere umesto njihovih normalnih homodimera dodavanjem izbočenih velikih hidrofobnih ostataka („ispupčenja“) na jedan lanac i kreiranjem komplementarnih hidrofobnih džepova („udubljenja“) na drugom. Varijanta „ispupčenja“ može da se dobije zamenjivanjem male aminokiseline većom koja će se umetnuti u „udubljenje“ u naspramnom domenu kreirano zamenjivanjem velikog ostatka manjim (Ridgway, J.B.B.; Presta, L.G.; Carter, P. “Knobs-intoholes” engineering of antibody CH3 domains for heavy chain heterodimerization. Protein Eng.

1996, 9, 617–621; WO 2002/002781).

[0049] Poželjan je polipeptidni molekul sa dvojnom specifičnošću u skladu sa pronalaskom, naznačen time što je navedena mutacija „ispupčenje u udubljenje“ izabrana od T366W kao ispupčenja, i T366S, L368A, i Y407’V kao udubljenja u CH3 domenu (vidite npr. WO 98/50431). Ovaj skup mutacija se može dodatno proširiti uključivanjem mutacija K409A i F405K koje je opisao Wei i sar. (Structural basis of a novel heterodimeric Fc for bispecific antibody production, Oncotarget. 2017). Drugo ispupčenje može biti T366Y a udubljenje je Y407T.

[0050] Polipeptidni molekuli sa dvojnom specifičnošću pronalaska mogu pored toga da sadrže veštački uvedene cisteinske mostove između najmanje jednog cisteinskog ostatka na prvom polipeptidnom lancu i najmanje jednog cisteinskog ostatka na drugom polipeptidnom lancu kako bi se poboljšala stabilnost molekula, optimalno bez ometanja karakteristika vezivanja bivalentnog molekula i/ili radi poboljšanja heterodimerizacije. Radi dodatne stabilnosti, može da se uvede disulfidna veza preko dodavanja jednog cisteina u CH3 domen i lanca ispupčenja i

1

lanca udubljenja. Poželjan je polipeptidni molekul sa dvojnom specifičnošću u skladu sa pronalaskom, naznačen time što Fc domen sadrži CH3 domen koji sadrži najmanje jedan dodatni ostatak cisteina, na primer S354C i/ili Y349C.

[0051] Poželjan je polipeptidni molekul sa dvojnom specifičnošću u skladu sa pronalaskom, naznačen time što je navedeni CD molekul izabran iz grupe koju čine CD molekuli povezani sa imunskim odgovorom, CD3, kao što su CD3γ, CD3δ i CD3ε lanci, CD4, CD7, CD8, CD10, CD11b, CD11c, CD14, CD16, CD18, CD22, CD25, CD28, CD32a, CD32b, CD33, CD41, CD41b, CD42a, CD42b, CD44, CD45RA, CD49, CD55, CD56, CD61, CD64, CD68, CD94, CD90, CD117, CD123, CD125, CD134, CD137, CD152, CD163, CD193, CD203c, CD235a, CD278, CD279, CD287, Nkp46, NKG2D, GITR, FcεRI, TCRalfa/beta, TCRgama/delta i HLA-DR. U zavisnosti od kombinacije dva entiteta koji vezuju antigen polipeptidnog molekula sa dvojnom specifičnošću u skladu sa pronalaskom, mogu da se postignu specifične prednosti u pogledu funkcije molekula, konkretno pojačana aktivnost.

[0052] Poželjan je primerni polipeptidni molekul sa dvojnom specifičnošću u skladu sa pronalaskom, naznačen time što regioni u prvom polipeptidnom lancu sadrže SEQ ID No.28 za VD1, SEQ ID No. 29 za VR1, SEQ ID No. 30 za LINK1; a regioni u drugom polipeptidnom lancu sadrže SEQ ID No.31 za VD2, SEQ ID No.32 za VR2 i SEQ ID No.30 za LINK2.

[0053] Dalje poželjan je primerni polipeptidni molekul sa dvojnom specifičnošću u skladu sa pronalaskom, naznačen time što FC region u prvom polipeptidnom lancu sadrži SEQ ID No. 26 (Fc1), a FC region u drugom polipeptidnom lancu sadrži SEQ ID No.27 (Fc2).

[0054] Dalje je poželjan polipeptidni molekul sa dvojnom specifičnošću u skladu sa pronalaskom koji sadrži prvi polipeptidni lanac koji sadrži SEQ ID No. 16 (1. lanac kompletnog molekula) i drugi polipeptidni lanac koji sadrži SEQ ID No.17 (2. lanac kompletnog molekula). Dalje je poželjan polipeptidni molekul sa dvojnom specifičnošću u skladu sa pronalaskom koji sadrži prvi polipeptidni lanac koji sadrži SEQ ID No. 51, 53, 55 ili 57 (1. lanac kompletnog molekula) i drugi polipeptidni lanac koji sadrži SEQ ID No. 52, 54, 56 ili 58 (2. lanac kompletnog molekula).

[0055] Još je više poželjan primerni polipeptidni molekul sa dvojnom specifičnošću u skladu sa pronalaskom, naznačen time što je navedeno prvo mesto vezivanja (VD1)(VD2) koje vezuje epitop površinskog antigena humanih imunskih ćelija (npr. CD3) humanizovano; i/ili je navedeno drugo mesto vezivanja (VR1)(VR2) koje vezuje navedeni MHC-asocirani virusni peptidni epitop afinitetno sazrelo.

[0056] Humanizovana antitela su antitela (ili njihovi delovi) iz neljudskih vrsta čije su proteinske sekvence modifikovane tako da se poveća njihova sličnost sa varijantama antitela koje se

1

prirodno proizvode kod ljudi. Postupak „humanizacije“ se obično primenjuje na monoklonska antitela razvijena za primenu kod ljudi (na primer, antitela razvijena kao antitumorski lekovi). Prikladni postupci za humanizaciju su poznati iz literature, i na primer, kratko prikazani u radu Olimpieri, Pier Paolo, Paolo Marcatili i Anna Tramontano. “Tabhu: Tools for Antibody Humanization.” Bioinformatics 31.3 (2015): 434-435. PMC; Safdari Y, Farajnia S, Asgharzadeh M, Khalili M. Antibody humanization methods – recenzija i ažuriranje. Biotechnol Genet Eng Rev. 2013;29:175-86; ili Ahmadzadeh V, Farajnia S, Feizi MA, Nejad RA. Antibody humanization methods for development of therapeutic applications. Monoclon Antib Immunodiagn Immunother. Apr. 2014;33(2):67-73.

[0057] Uopšteno, in vitro afinitetno sazrevanje TCR-ova i antitela može da se izvede u skladu sa postupcima opisanim u literaturi, konkretno, koristeći prikazivanje na površini kvasnica ili faga (zasnovano na, na primer, radu Holler PD, i sar. In vitro evolution of a T cell receptor with high affinity for peptide/MHC. Proc Natl Acad Sci USA. 9. maj 2000; 97(10):5387-92; Boder ET i sar., Directed evolution of antibody fragments with monovalent femtomolar antigen-binding affinity. Proc Natl Acad Sci USA. 26. sep. 2000; 97(20):10701-5; i, kao nedavni primer, radu Zhao Q, i sar. Affinity maturation of T-cell receptor-like antibodies for Wilms tumor 1 peptide greatly enhances therapeutic potential. Leukemia.2015; 29(11):2238-2247).

[0058] Mesta vezivanja (VD1)(VD2) i (VR1)(VR2) predmetnog opisa se poželjno specifično vezuju za površinski antigen humanih imunskih ćelija odnosno kompleks virusni peptid-HLA molekul. Na način kako je korišćen u ovom dokumentu u vezi sa mestima vezivanja predmetnog opisa, termin „specifično vezivanje“ i njegove gramatičke varijante koriste se da označe mesto koje ima afinitet vezivanja (KD) za kompleks peptid-HLA molekul i/ili epitop antitela od 100 µmol/l ili manje. Mesta vezivanja (VD1)(VD2) i (VR1)(VR2) predmetnog opisa se vezuju za CD epitop antitela, odnosno kompleks peptid-HLA molekul sa afinitetom vezivanja (KD) od oko 100 µmol/l ili manje, oko 50 µmol/l ili manje, oko 25 µmol/l ili manje, ili oko 10 µmol/l ili manje. Još poželjnija su visokoafinitetna mesta vezivanja koja imaju afinitete vezivanja od oko 1 µmol/l ili manje, oko 100 nmol/l ili manje, oko 50 nmol/l ili manje, oko 25 nmol/l ili manje, oko 10 nmol/l ili manje, oko 5 nmol/l ili manje, oko 2 nmol/l ili manje, oko 1 nmol/l ili manje, oko 500 pmol/l ili manje, oko 200 pmol/l ili manje, oko 100 pmol/l ili manje. Neograničavajući primeri poželjnih opsega afiniteta vezivanja za mesta vezivanja predmetnog pronalaska uključuju oko 10 pmol/l do oko 100 pmol/l, 100 pmol/l do oko 1 nmol/l, 1 nmol/l do oko 10 nmol/l; oko 10 nmol/l do oko 20 nmol/l; oko 20 nmol/l do oko 30 nmol/l; oko 30 nmol/l do oko 40 nmol/l; oko 40 nmol/l do oko 50 nmol/l; oko 50 nmol/l do oko 60 nmol/l; oko 60 nmol/l do oko 70 nmol/l; oko 70 nmol/l do oko 80 nmol/l; oko 80 nmol/l do oko 90 nmol/l; i oko 90 nmol/l

1

do oko 100 nmol/l, npr. mereno pomoću interferometrije biološkog sloja kako je opisano u primeru 6.

[0059] U ovom dokumentu je predstavljen polipeptid koji ima najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, ili najmanje 99% identiteta sekvence sa aminokiselinskom sekvencom opisanom u ovom dokumentu, na primer, aminokiselinske sekvence 1 do 58. U drugom aspektu, objava obezbeđuje za prvi ili drugi polipeptid koji ima najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, ili najmanje 99% identiteta sekvence sa aminokiselinskom sekvencom opisanom u ovom dokumentu. Takođe je predstavljen dvojno specifičan polipeptidni molekul koji ima identitet sekvence od najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, ili najmanje 99% identiteta sekvence sa jednom ili više aminokiselinskih sekvenci opisanih u ovom dokumentu. Procenat identičnosti od najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, ili najmanje 99% odnosi se na bilo koju od sekvenci strukturnih regiona opisanih na slici 1, na primer, VD1, VR1, Link1, VR2, VD2, Link2, ili region šarke, i kako su opisane ili koje su deo sekvenci iznetih u ovom dokumentu.

[0060] Polipeptidi ili dvojno specifični polipeptidni molekuli opisani u ovom dokumentu mogu biti izmenjeni na različite načine, uključujući supstitucije aminokiselina, delecije, skraćivanje i umetanje jedne ili više aminokiselina. Polipeptidi ili dvojno specifični polipeptidni molekuli opisani u ovom dokumentu mogu da obuhvataju 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, ili 50 ili više supstitucija, delecija ili insercija aminokiselina. Polipeptidi ili dvojno specifični polipeptidni molekuli opisani u ovom dokumentu mogu da obuhvataju 1 do 5, 1 do 10, 1 do 20, 2 do 5, 2 do 10, 5 do 20, 5 do 50, ili 10 do 100 supstitucija, delecija ili insercija aminokiselina. Prema jednom primeru 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ili 50, ili više supstitucija, delecija ili insercija aminokiselina odnosi se na bilo koji od strukturalnih regiona opisanih na slici 1, na primer, VD1, VR1, Link1, VR2, VD2, Link2, ili regione šarke. Dalje je predstavljeno 1 do 5, 1 do 10, 1 do 20, 2 do 5, 2 do 10, 5 do 20, 5 do 50, ili 10 do 100 supstitucija, delecija ili insercija aminokiselina koje se odnose na sekvence bilo kog od strukturalnih regiona opisanih na slici 1, na primer, VD1, VR1, Link1, VR2, VD2, Link2, ili region šarke, i kako su opisane ili koje su deo sekvenci iznetih u ovom dokumentu.

[0061] Prema jednom primeru, na N-kraj ili C-kraj polipeptida ili dvojno specifičnog polipeptidnog molekula koji je opisan u ovom dokumentu može da se doda 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8,

1

9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ili 50 ili više aminokiselina, na primer, aminokiselinske sekvence 1 do 58.

[0062] Na primer, VD1 može da ima najmanje 50%, najmanje 55%, najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID No: 28.

[0063] Na primer, VR1 može da ima najmanje 50%, najmanje 55%, najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID No: 29.

[0064] Na primer, LINK1 ili LINK2 može da ima najmanje 50%, najmanje 55%, najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID No: 30.

[0065] Na primer, VD2 može da ima najmanje 50%, najmanje 55%, najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID No: 31.

[0066] Na primer, VR2 može da ima najmanje 50%, najmanje 55%, najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID No: 32.

[0067] Na primer, šarka može da ima najmanje 50%, najmanje 55%, najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID No: 1, SEQ ID No: 2, SEQ ID No: 3, ili SEQ ID No: 4. U jednom aspektu, CH2 domen može da ima najmanje 50%, najmanje 55%, najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%,

2

najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID No: 5 ili SEQ ID No: 6. U jednom aspektu, Fc region može da ima najmanje 50%, najmanje 55%, najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID No: 26 ili SEQ ID No: 27.

[0068] Takođe je predstavljen polipeptid koji ima najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, ili najmanje 99% identiteta sekvence sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID No: 43, 44, 45 ili 46.

[0069] Polipeptidi ili dvojno specifični polipeptidni molekuli kako su opisani u ovom dokumentu mogu biti modifikovani supstituisanjem jednog ili više ostataka na različitim, po mogućstvu selektivnim, mestima u okviru polipeptidnog lanca. Takve supstitucije mogu biti konzervativne prirode, na primer, kada se jedna aminokiselina zamenjuje aminokiselinom slične strukture i sličnih karakteristika, kao kada se hidrofobna aminokiselina zamenjuje drugom hidrofobnom aminokiselinom. Još konzervativnija bi bila zamena aminokiselina iste ili slične veličine i hemijske prirode, kao kada se leucin zamenjuje izoleucinom. U studijama varijacija sekvenci u familijama prirodno javljajućih homolognih proteina, određene supstitucije aminokiselina se češće tolerišu od drugih, i one često pokazuju korelaciju sa sličnostima u veličini, naelektrisanju, polaritetu i hidrofobnosti između originalne aminokiseline i njene zamene, i kao takve predstavljaju osnovu za definisanje „konzervativnih supstitucija“.

[0070] Polipeptidni molekul sa dvojnom specifičnošću može da nosi aktivni agens ili njegov deo koji je pritom spojen ili konjugovan. Navedeni aktivni agens može biti izabran iz grupe koju čine detektabilna oznaka, imunostimulatorni molekul i terapijski agens.

[0071] Detektabilna oznaka može biti izabrana iz grupe koju čine biotin, streptavidin, enzim ili njegov katalitički aktivan fragment, radionuklid, nanočestica, paramagnetni jon metala, ili fluorescentni, fosforescentni ili hemiluminiscentni molekul. Detektabilne oznake za dijagnostičku upotrebu obuhvataju na primer, fluorescentne oznake, radiološke oznake, enzime, probe nukleinskih kiselina i kontrastne reagense.

[0072] Terapijski agensi koji mogu biti povezani sa molekulima pronalaska obuhvataju imunomodulatore, radioaktivna jedinjenja, enzime (na primer perforin), hemioterapeutike (na primer cisplatin) ili toksin. Drugi pogodni terapijski agensi uključuju citotoksične agense malih molekula, tj. jedinjenja koja imaju sposobnost da ubiju sisarske ćelije koja imaju molekularnu težinu manju od 700 daltona. Takva jedinjenja mogu takođe da sadrže toksične metale koji mogu da imaju citotoksičan efekat. Pored toga, treba podrazumevati da ovi citotoksični agensi malih molekula takođe obuhvataju prolekove, tj. jedinjenja koja se raspadaju ili se u fiziološkim uslovima konvertuju da oslobađaju citotoksične agense. Primeri takvih agenasa obuhvataju cisplatin, derivate maitanzina, rahelmicin, kaliheamicin, docetaksel, etopozid, gemcitabin, ifosfamid, irinotekan, melfalan, mitoksantron, fotofrin (porfimer natrijum) II, temozolomid, topotekan, trimetreat glukuronat, auristatin E vinkristin i doksorubicin; peptidne citotoksine, tj. proteine ili njihove fragmente koji imaju sposobnost da ubiju sisarske ćelije. Na primer, ricin, toksin difterije, pseudomonas bakterijski egzotoksin A, DNaza i RNaza; radionuklidi, tj. nestabilni izotopi elemenata koji se raspadaju sa istovremenom emisijom jedne li više α ili β čestica, ili γ zraka. Na primer, jod-131, renijum-186, indijum-111, itrijum-90, bizmut-210 i -213, aktinijum-225 i astatin-213; helirajući agensi mogu da se koriste da se olakša povezivanje ovih radionuklida sa molekulima, ili njihovim multimerima; imunostimulansi tj. imunski efektorski molekuli koji stimulišu imunski odgovor. Na primer, citokini poput IL-2 i IFN-γ, hemokini poput IL-8, faktor trombocita 4, stimulatorni protein rasta melanoma, aktivatori komplementa; ili domeni ksenogenih proteina, domeni alogenih proteina, domeni virusnih/bakterijskih proteina, virusni/bakterijski peptidi.

[0073] Drugi aspekt predmetnog pronalaska se zatim odnosi na molekul nukleinske kiseline koja kodira prvi polipeptidni lanac i/ili drugi polipeptidni lanac kako su izneti u ovom dokumentu, ili vektor ekspresije koji sadrži takvu nukleinsku kiselinu. Molekul nukleinske kiseline može biti DNK, cDNK, PNK, RNK i njihova kombinacija. Nukleotidna sekvenca koja kodira određeni peptid, oligopeptid ili polipeptid može biti prirodno postojeća ili mogu biti sintetički napravljene. Uopšteno, DNK segmenti koji kodiraju peptide, polipeptide i proteine ovog pronalaska sastavljaju se iz cDNK fragmenata i kratkih oligonukleotidnih linkera, ili iz serije oligonukleotida, kako bi se obezbedio sintetički gen koji je u stanju da bude eksprimiran u rekombinantnoj transkripcionoj jedinici koja sadrži regulatorne elemente dobijene iz mikrobnog ili virusnog operona. Termin „proizvod ekspresije“ označava polipeptid ili protein koji je prirodni proizvod translacije gena i bilo koje sekvence nukleinskih kiselina koja kodira ekvivalente koji nastaju iz degeneracije genetskog koda i tako kodiraju istu aminokiselinu(e). Termin „fragment“, kada se odnosi na kodirajuću sekvencu, označava deo DNK koji sadrži manje od kompletnog kodirajućeg regiona, čiji proizvod ekspresije esencijalno zadržava istu biološku funkciju ili aktivnost kao i proizvod ekspresije kompletnog kodirajućeg regiona. U zavisnosti od namene, nukleinska kiselina može biti kodonski optimizovana za ekspresiju u prikladnoj (npr. mikrobnoj) ćeliji domaćinu. Obilnost genetskog koda omogućava da neke aminokiseline budu kodirane pomoću više od jednog kodona, ali određeni kodoni su manje „optimalni‘‘ od drugih zbog relativne raspoloživosti podudarnih tRNK kao i drugih faktora (Gustafsson et al., 2004).

[0074] Nukleinska kiselina može biti, na primer, DNK, cDNK, PNK, RNK ili njihove kombinacije, bilo jedno- i/ili dvolančana, ili nativni ili stabilizovani oblici polinukleotida, kao što su, na primer, polinukleotidi sa fosforotioatnim kosturom i može i ne mora sadržati introne sve dok kodira polipeptidne lance.

[0075] Nukleinska kiselina (npr. DNK) zatim može biti sadržana i/ili eksprimirana u prikladnom domaćinu kako bi proizvela polipeptid koji sadrži polipeptidni lanac pronalaska. Tako, nukleinska kiselina (npr. DNK) koja kodira polipeptidni lanac pronalaska može da se koristi u skladu sa poznatim tehnikama, odgovarajuće modifikovanih u smislu ovde sadržanih učenja, da se konstruiše vektor ekspresije, koji se zatim koristi da se odgovarajuća ćelija domaćin transformiše za ekspresiju i proizvodnju polipeptida pronalaska, kako je poznato u predmetnoj oblasti. Nukleinska kiselina (npr. DNK, ili u slučaju retrovirusnih vektora, RNK) koja kodira polipeptidne lance koji sačinjavaju jedinjenje pronalaska može da se spoji sa širokim spektrom drugih sekvenci nukleinskih kiselina (npr. DNK) za uvođenje u odgovarajućeg domaćina. Pridružena nukleinska kiselina će zavisiti od prirode domaćina, načina uvođenja DNK u domaćina, i od toga da li se želi epizomalno održavanje ili integracija. Uopšteno, nukleinska kiselina se umeće u vektor ekspresije, kao što je plazmid, u pravilnoj orijentaciji i pravom okviru čitanja za ekspresiju. Ako je neophodno, nukleinska kiselina može da se poveže sa odgovarajućim regulatornim kontrolnim nukleotidnim sekvencama za transkripciju i translaciju koje prepoznaje željeni domaćin, iako su takve kontrole generalno dostupne u vektoru ekspresije. Vektor se zatim pomoću standardnih tehnika uvodi u domaćina. Uopšteno, vektor neće transformisati sve domaćine. Zato će biti neophodno da se izaberu transformisane ćelije domaćini. Jedna tehnika selekcije obuhvata inkorporiranje sekvence nukleinske kiseline u vektor ekspresije, sa svim neophodnim kontrolnim elementima, koja kodira osobinu po izboru u transformisanoj ćeliji, kao što je otpornost na antibiotike. Alternativno, gen za takvu osobinu po izboru može biti na drugom vektoru, koji se koristi za kotransformaciju željene ćelije domaćina. Ćelije domaćini koje su transformisane pomoću rekombinantne nukleinske kiseline pronalaska se zatim kultiviraju dovoljno dugo i u odgovarajućim uslovima koji su poznati osobama stručnim u predmetnoj oblasti, uzimajući u obzir učenja izneta u ovom dokumentu, kako bi se omogućila ekspresija polipeptida, koji nakon toga može da se prikupi.

[0076] Poznati su mnogi sistemi za ekspresiju, uključujući bakterije (na primer E. coli i Bacillus subtilis), kvasnice (na primer Saccharomyces cerevisiae), filamentozne gljivice (na primer

2

Aspergillus spec.), biljne ćelije, životinjske ćelije i ćelije insekata. Poželjno, sistem mogu biti ćelije sisara kao što su CHO ćelije dostupne iz ATCC kolekcije biologije ćelija.

[0077] Takođe je predstavljen postupak za proizvodnju molekula kakav je opisan u ovom dokumentu, a postupak obuhvata uzgajanje ćelije domaćina koja je sposobna da eksprimira polipeptidni(e) lanac(e) u uslovima pogodnim za promociju ekspresije navedenog(ih) lanca(lanaca).

[0078] Da bi se dobile ćelije koje eksprimiraju molekule predmetnog opisa, nukleinske kiseline koje kodiraju polipeptidne lance koji sadrže TCR-alfa i/ili TCR-beta vezujuće domene mogu da se kloniraju u vektore ekspresije, kao što su gama retrovirus ili lentivirus. Alternativno, da bi se dobile ćelije koje eksprimiraju molekule predmetnog opisa, pomoću tehnika poznatih u predmetnoj oblasti mogu da se sintetišu RNK, npr. u in vitro transkripcionim sistemima. In vitrosintetisane RNK se zatim elektroporacijom uvode u prikladne ćelije kako bi eksprimirale polipeptidne lance.

[0079] Radi povećanja ekspresije, nukleinske kiseline koje kodiraju lance predmetnog opisa mogu biti operabilno povezane sa snažnim promotorima, kao što su retrovirusni dugi terminalni ponovci (LTR-ovi), citomegalovirus (CMV), mišji virus matičnih ćelija (MSCV) U3, fosfoglicerat kinaza (PGK), ꞵ-aktin, ubikvitin i simijan virus 40 (SV40)/CD43 kompozitni promotor, faktor elongacije (EF)-1a i promotor virusa formiranja fokusa u slezini (SFFV). Promotor može biti heterologan u odnosu na nukleinsku kiselinu koja se eksprimira. Pored snažnih promotora, kasete ekspresije predmetnog opisa mogu da sadrže dodatne elemente koji mogu da pojačaju transgensku ekspresiju, uključujući centralni polipurinski trakt (cPPT), koji promoviše nukleusnu translokaciju lentivirusnih konstrukata (Follenzi et al., 2000), i posttranskripcioni regulatorni element hepatitis virusa mrmota (wPRE), koji povećava nivo transgenske ekspresije povećanjem stabilnosti RNK (Zufferey et al., 1999).

[0080] Alfa i beta lanci vezujućeg domena molekula predmetnog pronalaska mogu da budu kodirani nukleinskim kiselinama koje se nalaze u zasebnim vektorima, ili mogu da budu kodirani polinukleotidima koji se nalaze u istom vektoru.

[0081] Inženjeringom može da se napravi ćelija domaćin koja će da eksprimira molekul predmetnog opisa. Ćelije domaćini predmetnog opisa mogu da budu alogene ili autologne u odnosu na pacijenta koji će se lečiti.

[0082] Još jedan aspekt pronalaska odnosi se na farmaceutsku smešu koja sadrži polipeptidni molekul sa dvojnom specifičnošću u skladu sa predmetnim pronalaskom, nukleinsku(e) kiselinu(e) ili vektor(e) ekspresije u skladu sa predmetnim pronalaskom, ili ćeliju u skladu sa predmetnim pronalaskom, zajedno sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih nosača ili pomoćnih materija. Smeše pronalaska uključuju smeše lekova u rasutom stanju koje su korisne u proizvodnji farmaceutskih smeša (npr. nečiste ili nesterilne smeše) i farmaceutske smeše (tj. smeše koje su pogodne za davanje ispitaniku ili pacijentu) koje se mogu koristiti za pripremanje oblika za pojedinačno doziranje. Takve smeše sadrže profilaktički ili terapijski efikasnu količinu profilaktičnog i/ili terapijskog polipeptidnog molekula (agensa) sa dvojnom specifičnošću predstavljenog u ovom dokumentu ili kombinaciju agensa i farmaceutski prihvatljivog nosača. Poželjno, smeše pronalaska sadrže profilaktički ili terapijski efikasnu količinu jednog ili više molekula pronalaska i farmaceutski prihvatljiv nosač.

[0083] Farmaceutske smeše poželjno sadrže molekule ili u slobodnom obliku ili u vidu soli. Poželjno, soli su farmaceutski prihvatljive soli molekula, kao što su, na primer, hloridne ili acetatne (trifluoroacetat) soli. Neophodno je napomenuti da se soli molekula u skladu sa predmetnim pronalaskom značajno razlikuju od molekula u njihovim stanjima in vivo, zato što molekuli in vivo nisu soli.

[0084] Predmetni pronalazak se tako odnosi na molekul u skladu sa pronalaskom koji se ne javlja u prirodi koji je sintetički proizveden (npr. sintetizovan) kao farmaceutski prihvatljiva so. Postupci za sintetičku proizvodnju peptida i/ili polipeptida dobro su poznati u predmetnoj oblasti. Soli molekula u skladu sa predmetnim pronalaskom značajno se razlikuju od molekula u njihovim stanjima in vivo, zato što molekuli stvoreni in vivo nisu soli. Poželjno, soli su farmaceutski prihvatljive soli molekula. Ove soli u skladu sa pronalaskom obuhvataju alkalne i zemnoalkalne soli kao što su soli Hofmeister serije koja sadrži kao anjone PO 3- -4, SO 24, CH Br- , NO - -3COO- , Cl- ,3, ClO4, I- , SCN- i kao katjone NH

4, Rb+ , K+ , Na+ , Cs+ , Li+ , Zn2+ , Mg2+ , Ca2+ , Mn2+ , Cu2+ i Ba2+ . Konkretno soli su izabrane od (NH4)3PO4, (NH4)2HPO4, (NH4)H2PO4, (NH4)2SO4, NH4CH3COO, NH4Cl, NH4Br, NH4NO3, NH4CIO4, NH4I, NH4SCN, Rb3PO4, Rb2HPO4, RbH2PO4, Rb2SO4, Rb4CH3COO, Rb4Cl, Rb4Br, Rb4NO3, Rb4CIO4, Rb4I, Rb4SCN, K3PO4, K2HPO4, KH2PO4, K2SO4, KCH3COO, KCl, KBr, KNO3, KClO4, KI, KSCN, Na3PO4, Na2HPO4, NaH2PO4, Na2SO4, NaCH3COO, NaCl, NaBr, NaNO3, NaCIO4, NaI, NaSCN, ZnCI2Cs3PO4, Cs2HPO4, CsH2PO4, Cs2SO4, CsCH3COO, CsCl, CsBr, CsNO3, CsCIO4, CsI, CsSCN, Li3PO4, Li2HPO4, LiH2PO4, Li2SO4, LiCH3COO, LiCl, LiBr, LiNO3, LiClO4, LiI, LiSCN, Cu2SO4, Mg3(PO4)2, Mg2HPO4, Mg(H2PO4)2, Mg2SO4, Mg(CH3COO)2, MgCl2, MgBr2, Mg(NO3)2, Mg(ClO4)2, MgI2, Mg(SCN)2, MnCl2, Ca3(PO4), Ca2HPO4, Ca(H2PO4)2, CaSO4, Ca(CH3COO)2, CaCl2, CaBr2, Ca(NO3)2, Ca(ClO4)2, CaI2, Ca(SCN)2, Ba3(PO4)2, Ba2HPO4, Ba(H2PO4)2, BaSO4, Ba(CH3COO)2, BaCl2, BaBr2, Ba(NO3)2, Ba(ClO4)2, BaI2i Ba(SCN)2. Naročito poželjne su NH acetat, MgCl2, KH2PO4, Na2SO4, KCl, NaCl i CaCl2, kao, na primer, hloridne ili acetatne (trifluoroacetat) soli.

2

[0085] Polipeptid opisan u ovom dokumentu može biti u obliku farmaceutski prihvatljive soli. U drugom aspektu, polipeptid u obliku farmaceutske soli je u kristalnom obliku.

[0086] Farmaceutski prihvatljiva so opisana u ovom dokumentu može se odnositi na soli koje imaju profile toksičnosti u okviru opsega koji je prihvatljiv za farmaceutske primene.

[0087] Na način kako je korišćen u ovom dokumentu, termin „farmaceutski prihvatljiva so“ odnosi se na derivat predstavljenih peptida, naznačeno time što je peptid modifikovan pravljenjem kiselih ili baznih soli agensa. Na primer, kisele soli se dobijaju od slobodne baze (tipično naznačeno time što neutralni oblik leka ima neutralnu –NH2 grupu) što uključuje reakciju sa pogodnom kiselinom. Pogodne kiseline za dobijanje kiselih soli uključuju i organske kiseline, npr. sirćetna kiselina, propionska kiselina, glikolna kiselina, piruvična kiselina, oksalna kiselina, jabučna kiselina, malonska kiselina, ćilibarna kiselina, maleinska kiselina, fumarna kiselina, vinska kiselina, limunska kiselina, benzoeva kiselina, cimetna kiselina, bademova kiselina, metansulfonska kiselina, etansulfonska kiselina, p-toluensulfonska kiselina, salicilna kiselina i slične, kao i neorganske kiseline, npr. hlorovodonična kiselina, bromovodonična kiselina, sumporna kiselina, azotna kiselina, fosforna kiselina i slične. Obratno, preparati baznih soli iz kiselih delova koji mogu biti prisutni na peptidu dobijaju se upotrebom farmaceutski prihvatljive baze kao što je natrijum hidroksid, kalijum hidroksid, amonijum hidroksid, kalcijum hidroksid, trimetilamin ili slične. Farmaceutski prihvatljive soli mogu da povećaju rastvorljivost i/ili stabilnost peptida opisanih u ovom dokumentu. Farmaceutske soli opisane u ovom dokumentu mogu da se pripreme konvencionalnim sredstvima iz odgovarajućeg peptida nosača ili kompleksa dovođenjem u reakciju, na primer, odgovarajuće kiseline ili baze sa peptidima ili kompleksima opisanim u ovom dokumentu. Farmaceutski prihvatljive soli mogu da budu u kristalnom obliku ili polukristalnom obliku. U još jednom drugom aspektu, farmaceutski prihvatljive soli mogu da obuhvataju, na primer, one opisane u priručniku Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use autora P. H. Stahl i C. G. Wermuth (Wiley-VCH 2002), te u publikaciji L. D. Bighley, S. M. Berge, D. C. Monkhouse, “Encyclopedia of Pharmaceutical Technology”. Urednici J. Swarbrick i J. C. Boylan, knjiga 13, Marcel Dekker, Inc., New York, Basel, Hong Kong 1995, str.453–499.

[0088] Takođe su predstavljene farmaceutske smeše koje sadrže polipeptidni molekul sa dvojnom specifičnošću pronalaska i terapijsko antitelo (npr. tumor-specifično monoklonsko antitelo) koje je specifično za antigen konkretnog malignog tumora i farmaceutski prihvatljiv nosač.

[0089] Termin „farmaceutski prihvatljivo“ može da znači odobreno od strane regulatorne agencije federalne ili državne Vlade ili navedeno u Američkoj farmakopeji ili drugoj opšte

2

priznatoj farmakopeji za upotrebu kod životinja, i još konkretnije kod ljudi. Termin „nosač“ se odnosi na razblaživač, adjuvansnu pomoćnu materiju ili prenosioca sa kojim se terapeutik primenjuje. Takvi farmaceutski nosači mogu biti sterilne tečnosti, kao što su voda i ulja, uključujući ona petrolejskog, životinjskog, biljnog i sintetičkog porekla, kao što su ulje kikirikija, sojino ulje, mineralno ulje, susamovo ulje i slična. Voda je preferirani nosač kada se farmaceutska smeša primenjuje intravenski. Slani rastvori i vodeni rastvori dekstroze i glicerola mogu takođe da se upotrebe kao tečni nosači, naročito za injekcione rastvore. Prikladne farmaceutske pomoćne materije uključuju skrob, glukozu, laktozu, saharozu, želatin, slad, pirinač, brašno, kredu, silika gel, natrijum stearat, glicerol monostearat, talk, natrijum hlorid, natrijum fosfat, natrijum acetat, L-histidin, sušeno obrano mleko, glicerol, propilen, glikol, vodu, etanol i slične. Smeša, ako se to želi, može takođe da sadrži manje količine agenasa za ovlaživanje ili emulgaciju, ili agense za puferisanje pH. Ove smeše mogu biti u obliku rastvora, suspenzija, emulzija, tableta, pilula, kapsula, praškova, formulacija sa usporenim oslobađanjem i slično. Uopšteno, sastojci smeša pronalaska se dostavljaju ili zasebno ili su pomešani zajedno u obliku za pojedinačno doziranje, na primer, u vidu suvog liofiliziranog praška ili bezvodnog koncentrata u hermetički zatvorenom kontejneru kao što je ampula ili vrećica na koji se navodi količina aktivnog agensa. Kada smeša treba da se primeni pomoću infuzije, može se dati sa bocom infuzije koja sadrži sterilnu vodu farmaceutskog stepena ili fiziološki rastvor. Kada smeša treba da se primeni pomoću injekcije, može da se obezbedi ampula sterilne vode za injekcije ili fiziološkog rastvora kako bi sastojci mogli da se izmešaju pre primene.

[0090] Drugi aspekt predmetnog pronalaska se zatim odnosi na polipeptidni molekul sa dvojnom specifičnošću u skladu sa pronalaskom, nukleinsku kiselinu ili vektor ekspresije u skladu sa pronalaskom, ćeliju u skladu sa pronalaskom, ili farmaceutsku smešu u skladu sa pronalaskom, za upotrebu u medicini. Uopšteno, upotreba polipeptidnog molekula sa dvojnom specifičnošću zavisi od medicinskog konteksta peptida-antigena koji/koje navedeni molekul prepoznaje, kako je takođe opisano dalje u tekstu.

[0091] Poželjan je polipeptidni molekul sa dvojnom specifičnošću u skladu sa pronalaskom, nukleinska kiselina ili vektor ekspresije u skladu sa pronalaskom, ili ćelija u skladu sa pronalaskom, ili farmaceutska smeša u skladu sa pronalaskom, za upotrebu u lečenju ili prevenciji bolesti ili poremećaja koje su izabrane od virusnih infekcija, kako je takođe opisano dalje u tekstu.

[0092] Takođe su predstavljeni, ali ne obrazuju deo pronalaska, postupci za izazivanje imunskog odgovora kod pacijenta ili ispitanika koji se sastoje od davanja terapeutski efikasne količine polipeptidnog molekula sa dvojnom specifičnošću u skladu sa pronalaskom ili farmaceutske

2

smeše u skladu sa pronalaskom. Populacija polipeptidnog molekula sa dvojnom specifičnošću u skladu sa pronalaskom ili farmaceutska smeša u skladu sa pronalaskom mogu da se daju pacijentu ili ispitaniku kojem je to potrebno.

[0093] Takođe je predstavljen, ali ne obrazuje deo pronalaska, postupak za ubijanje ciljnih ćelija kod pacijenta ili ispitanika koji se sastoji od davanja pacijentu efikasne količine polipeptidnog molekula sa dvojnom specifičnošću u skladu sa predmetnim pronalaskom.

[0094] Takođe su predstavljeni, ali ne obrazuju deo pronalaska, postupci za sprečavanje, lečenje ili kontrolisanje jednog ili više simptoma povezanih sa virusnim bolestima. Virusne bolesti koje se mogu lečiti ili sprečiti primenom molekula pronalaska u sprezi sa postuocima predmetnog pronalaska uključuju, bez ograničavanja, one koje izazivaju hepatitis tip A, hepatitis tip B, hepatitis tip C, grip, varičela, adenovirus, herpes simpleks tip I (HSV-I), herpes simpleks tip II (HSV-II), rinderpest, rinovirus, ehovirus, rotavirus, respiratorni sincicijalni virus, papiloma virus, papova virus, citomegalovirus, ehinovirus, arbovirus, hantavirus, koksaki virus, mumps virus, virus morbila, rubela virus, polio virus, variola, Epštajn Bar virus, virus humane imunodeficijencije tip I (HIV-I), virus humane imunodeficijencije tip II (HIV-II), i uzročnici virusnih bolesti kao što su virusni meningitis, encefalitis, denga ili variola.

[0095] Takođe je predstavljen, ali ne obrazuje deo predmetnog pronalaska, postupak za lečenje bolesti ili poremećaja koji se sastoji od davanja terapeutski efikasne količine polipeptidnog molekula sa dvojnom specifičnošću u skladu sa pronalaskom, nukleinske kiseline ili vektora ekspresije u skladu sa pronalaskom, ćelije u skladu sa pronalaskom, ili farmaceutske smeše u skladu sa pronalaskom.

[0096] Polipeptidni molekul sa dvojnom specifičnošću pronalaska može da se koristi u postupku prevencije ili lečenja bolesti ili stanja koje se poboljšava usled primene polipeptidnog molekula sa dvojnom specifičnošću. Takve terapije mogu da se obezbede u farmaceutskoj smeši zajedno sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih nosača ili pomoćnih materija. Terapijski polipeptidni molekuli sa dvojnom specifičnošću će obično biti dostavljeni kao deo sterilne farmaceutske smeše koja će normalno uključivati farmaceutski prihvatljiv nosač. Ova farmaceutska smeša može biti u bilo kom prikladnom obliku (u zavisnosti od željenog metoda davanja pacijentu). Ona može biti obezbeđena u obliku za pojedinačno doziranje, generalno će biti obezbeđena u zatvorenom kontejneru i može biti obezbeđena kao deo kompleta. Takav komplet bi normalno (mada ne i nužno) sadržao uputstva za upotrebu. On može sadržati više navedenih oblika za pojedinačno doziranje. Farmaceutska smeša može biti adaptirana za primenu pomoću bilo kog prikladnog puta, kao što je parenteralni (uključujući potkožno, intramuskularno ili intravenski) put. Takve smeše mogu biti pripremljene pomoću bilo kog postupka poznatog u predmetnoj

2

oblasti farmacije, na primer mešanjem aktivnog sastojka sa nosačem(ima) ili pomoćnom(im) materijom(ama) u sterilnim uslovima.

[0097] Peptidi ili drugi molekuli opisani u ovom dokumentu mogu da se kombinuju sa vodenim nosačem. Vodeni nosač može biti izabran od grupe koju čine izmenjivači jona, glina, aluminijum stearat, magnezijum stearat, lecitin, proteini seruma, kao što su humani serumski albumin, puferske supstance kao što su fosfati, glicin, sorbinska kiselina, kalijum sorbat, parcijalne gliceridne mešavine zasićenih biljnih masnih kiselina, soli ili elektroliti, kao što su protamin sulfat, dinatrijum hidrogen fosfat, dikalcijum fosfat, kalijum hidrogen fosfat, natrijum hlorid, soli cinka, koloidna silika, magnezijum trisilikat, polivinil pirolidon, polivinilpirolidon-vinil acetat, supstance na bazi celuloze (npr. mikrokristalna celuloza, hidroksipropil metilceluloza, hidroksipropil metilceluloza acetat sukcinat, hidroksipropil metilceluloza ftalat), skrob, laktoza monohidrat, manitol, trehaloza natrijum lauril sulfat, i kroskarmeloza natrijum, polietilen glikol, natrijum karboksimetilceluloza, poliakrilati, polimetakrilat, voskovi, polietilen-polioksipropilenblok polimeri, polietilen glikol i lanolin.

[0098] Vodeni nosač može da sadrži više komponenti kao što je voda zajedno sa nevodenom komponentom nosačem, kao što su one komponente koje su opisane u ovom dokumentu. U drugom aspektu, vodeni nosač je sposoban da prenese poboljšana svojstva kada se kombinuje sa peptidom ili drugim molekulom opisanim u ovom dokumentu, na primer, poboljšanu rastvorljivost, efikasnost i/ili poboljšanu imunoterapiju. Pored toga, smeša može da sadrži pomoćne materije kao što su puferi, vezujući agensi, raspršivači, razblaživači, arome, lubrikanti itd. „Farmaceutski prihvatljiv razblaživač“ na primer može uključivati rastvarače, punioce, stabilizatore, medijume za disperziju, obloge, antibakterijske i antigljivične agense, izotonične i agense koji odlažu apsorpciju, i slične koji su fiziološki kompatibilni. Primeri farmaceutski prihvatljivih razblaživača obuhvataju jedan ili više od sledećih: fiziološki rastvor, fiziološki rastvor puferisan fosfatom, dekstrozu, glicerol, etanol i slične, kao i njihove kombinacije. U mnogim slučajevima će biti poželjno da se u smešu uključi jedan ili više izotoničan agens, na primer, šećeri kao što su trehaloza i saharoza, polialkoholi kao što su manitol, sorbitol ili natrijum hlorid. Farmaceutski prihvatljive supstance kao što su ovlaživači ili manje količine pomoćnih supstanci kao što su agensi za ovlaživanje ili emulgaciju, konzervansi ili puferi, takođe su obuhvaćeni obimom predmetnog pronalaska. Pored toga, smeša takođe može sadržati pomoćne materije, poput pufera, vezujućih agenasa, raspršivača, razblaživača, aroma i lubrikanata.

[0099] Doze polipeptidnih molekula sa dvojnom specifičnošću predmetnog pronalaska mogu varirati u širokim granicama, u zavisnosti od bolesti ili poremećaja koji treba da se tretira,

2

starosti i stanja pojedinca koji treba da se leči, itd.; na primer, prikladni opseg doze za polipeptidni molekul sa dvojnom specifičnošću može biti između 25 ng/kg i 50 μg/kg. Lekar je taj koji će konačno odrediti odgovarajuće doze koje treba da se koriste.

[0100] Farmaceutske smeše, vektori, nukleinske kiseline i ćelije pronalaska mogu biti obezbeđeni u značajno prečišćenom obliku, na primer najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% ili 100% prečišćeni.

[0101] Poželjne karakteristike svakog aspekta pronalaska su kao i za svaki od ostalih aspekata, kad se izvrše potrebne izmene. Predmetni pronalazak će dalje biti ilustrovan u sledećim primerima koji su dati isključivo u ilustrativne svrhe i nisu namenjeni da na bilo koji način ograniče pronalazak.

Na slici 1 je prikazan shematski pregled poželjnog primera izvođenja predmetnog pronalaska, humanog IgG1 Fc‐koji sadrži polipeptidni molekul sa dvojnom specifičnošću. VD1, VD2 = varijabilni domeni dobijeni od antitela; VR1, VR2 = varijabilni domeni dobijeni od TCR; Link1, Link2 = povezujući linkeri; Cys-Cys = cisteinski mostovi.

Na slici 2 je prikazan shematski pregled 4 različita konstrukta IgG Fc‐koji sadrže polipeptidne molekule sa dvojnom specifičnošću testirane u kontekstu predmetnog pronalaska. crno = varijabilni domeni dobijeni od TCR; svetlosivo = varijabilni domeni dobijeni od antitela; belo = konstantni domeni dobijeni od humanog IgG. Mutacije ispupčenje-udubljenje su naznačene cilindrom. Molekuli dijatela IA-ID su u skladu sa pronalaskom.

Na slici 3 je prikazana HPLC-SEC analiza različitih bispecifičnih TCR/mAt molekula sa molekularnim dizajnom u skladu sa konstruktima prikazanim na slici 2, koji su prečišćeni postupkom prečišćavanja na 2 kolone. Utvrđeni su sledeći sadržaji monomera različitih molekula. II: 93,84%; III: 96,54%; IV: 98,49%; IA_1: 95,48%; IA_3: 98,45%; ID_1: 95,75%; IC_4: 95,22%; IC_5: 92,76%; ID_4: 99,31%; ID_5: 99,44%.

Na slici 4 su prikazani rezultati eseja potentnosti sa različitim bispecifičnim TCR/mAt konstruktima (prikazanim na slici 2) dizajniranim kao molekuli zasnovani na IgG4. Jurkat_NFATRE_luc2 ćelije su ko-inkubirane sa T2 ćelijama napunjenim HIV-peptidom SLYNTVATL (SEQ ID No. 7) u prisustvu rastućih koncentracija bispecifičnih TCR (bssTCR) molekula. Molekul bispecifičnog TCR/mAt dijatela IA-IgG4 pokazao je veću potentnost nego dva alternativna TCR/mAt molekula sa dvojnom specifičnošću.

Na slici 5 su prikazani rezultati eseja potentnosti sa različitim bispecifičnim TCR/mAt konstruktima (prikazanim na slici 2) dizajniranim kao molekuli zasnovani na IgG1. Jurkat_NFATRE_luc2 ćelije su ko-inkubirane sa T2 ćelijama napunjenim HIV-peptidom SLYNTVATL (SEQ ID No. 7) u prisustvu rastućih koncentracija bispecifičnih TCR (bssTCR) molekula. Molekuli bispecifičnih TCR/mAt dijatela ID_1, IA_3 i IA1 su pokazali izrazito veću potentnost nego tri alternativna TCR/mAt molekula sa dvojnom specifičnošću.

Na slici 6 su prikazani rezultati eseja potentnosti sprovedenog sa različitim bispecifičnim TCR/mAt konstruktima zasnovanim na IgG1 (prikazanim na slici 2) koji koriste različite varijabilne domene antitela koji isto ciljaju TCR-CD3 kompleks. Konstrukt ID_1 sadrži varijabilne domene UCHT1(V9) antitela koje cilja CD3, dok konstrukti ID_4 i ID_5 sadrže varijabilne domene alfa/beta TCR-specifičnog antitela BMA031. Jurkat_NFATRE_luc2 ćelije su ko-inkubirane sa T2 ćelijama napunjenim HIV-peptidom SLYNTVATL (SEQ ID No. 7) u prisustvu rastućih koncentracija bispecifičnih TCR (bssTCR) molekula.

Na slici 7 je prikazan shematski pregled mogućih orijentacija VD i VR domena u molekulima predmetnog pronalaska. VH: VH-domen dobijen od antitela, VL: VL-domen dobijen od antitela; Vα: Valfa dobijen od TCR; Vβ: Vbeta dobijen od TCR.

Na slici 8 su prikazani rezultati HPLC-SEC analize agregata (HMWS – vrste visoke molekulske težine) u okviru različitih bispecifičnih TCR/mAt molekula zasnovanih na IgG1. Agregati su bili analizirani nakon prečišćavanja i nakon skladištenja molekula na 40 °C 1 nedelju odnosno 2 nedelje.

Na slici 9 su prikazani rezultati eseja potentnosti sprovedenog sa različitim bispecifičnim TCR/mAt molekulima zasnovanim na IgG1. Potentnost je analizirana nakon prečišćavanja i nakon skladištenja molekula na 40 °C 1 nedelju odnosno 2 nedelje. Stres skladištenje na 40 °C nije dovelo do značajnog gubitka potentnosti molekula ali je detektovano drastično povećanje nespecifične (tj. nezavisne od cilja) aktivacije Jurkat T ćelija za molekule III i IV.

1

Na slici 10 su prikazani rezultati eseja oslobađanja LDH sa različitim bispecifičnim TCR/mAt konstruktima (prikazanim na slici 2) dizajniranim kao molekuli zasnovani na IgG1. PBMC izolovane od zdravog donora su ko-inkubirane sa T2 ćelijama napunjenim HIV-peptidom SLYNTVATL (SEQ ID No. 7) u prisustvu rastućih koncentracija bispecifičnih TCR (bssTCR) molekula. Molekuli bispecifičnih TCR/mAt dijatela IA_3 i ID_1 su indukovali izrazito veću lizu ciljnih ćelija nego tri alternativna TCR/mAt molekula sa dvojnom specifičnošću. Kao što je prikazano na desnom grafikonu, nijedan od testiranih bispecifičnih TCR/mAt konstrukata nije indukovao detektabilnu lizu T2 ćelija napunjenih irelevantnim peptidom (SEQ ID No.49).

Na slici 11 su prikazani rezultati eseja oslobađanja LDH sa konstruktom bispecifičnog TCR/mAt dijatela IA_5 koji cilja tumor-asocirani peptid PRAME-004 (SEQ ID No. 49) prezentovan na HLA-A*02. CD8-pozitivne T ćelije izolovane od zdravog donora su bile ko-inkubirane sa tumorskim ćelijskim linijama UACC-257, SW982 i U2OS koje prezentuju različite količine kompleksa PRAME-004:HLA-A*02-1 na površini ćelije (pribl. 1100, pribl. 770 odnosno pribl.

240 kopija po ćeliji, što je utvrđeno M/S analizom) pri odnosu efektor:cilj od 5:1 u prisustvu rastućih koncentracija TCR/mAt molekula dijatela. Nakon 48 sati ko-kultivisanja, kvantifikovana je liza ciljnih ćelija primenom eseja oslobađanja LDH prema uputstvima proizvođača (Promega).

Na slici 12 su prikazani rezultati eseja oslobađanja LDH sa konstruktima bispecifičnih TCR/mAt dijatela IA_5 i IA_6 primenom TCR sazrelih u pogledu stabilnosti/afiniteta odnosno njihove poboljšane verzije, protiv tumor-asociranog peptida PRAME-004 (SEQ ID No. 49) prezentovanog na HLA-A*02. CD8-pozitivne T ćelije izolovane od zdravog donora su bile koinkubirane sa tumorskom ćelijskom linijom U2OS koja prezentuje pribl. 240 kopija po ćeliji kompleksa PRAME-004:HLA-A*02-1 ili nenapunjenim T2 ćelijama (odnos efektor:cilj od 5:1) u prisustvu rastućih koncentracija TCR/mAt molekula dijatela. Nakon 48 sati ko-kultivisanja, kvantifikovana je liza ciljnih ćelija primenom eseja oslobađanja LDH prema uputstvima proizvođača (Promega).

Na slici 13 su prikazani rezultati studije stabilnosti pri toplotnom stresu TCR/mAt konstrukata dijatela IA_5 i IA_6 primenom TCR sazrelih u pogledu stabilnosti/afiniteta odnosno njihove poboljšane verzije, protiv tumor-asociranog peptida PRAME-004 (SEQ ID No. 49) prezentovanog na HLA-A*02. Za ovo, proteini su formulisani u PBS pri koncentraciji od 1 mg/ml i nakon toga uskladišteni na 40 °C tokom dve nedelje. Integritet i oporavak proteina je

2

procenjen pomoću HPLC-SEC. Na taj način je količina vrsta visoke molekulske težine utvrđena prema procentu maksimalne oblasti koja eluira pre glavnog maksimuma. Oporavak monomernog proteina je izračunat poređenjem glavnih maksimalnih oblasti uzoraka koji nisu bili pod stresom i uzoraka koji su bili pod stresom.

PRIMERI

PRIMER 1

Dizajn bispecifičnih TCR/mAt dijatela koja sadrže Fc i kontrolnih molekula.

[0102] Bispecifična TCR/mAt dijatela koja sadrže Fc i kontrolni molekuli (prikazani na slici 2) su dizajnirani da se specifično vezuju za humani TCR-CD3 kompleks i za kompleks peptid:MHC koji sadrži peptid SLYNTVATL dobijen od HIV-a (SEQ ID No.7) vezan za HLA-A2*01. Za ciljanje TCR-CD3 kompleksa, korišćeni su VH i VL domeni dobijeni od CD3-specifičnog, humanizovanog antitela hUCHT1(V9) opisanog od strane Zhu i sar. (Identification of heavy chain residues in a humanized anti-CD3 antibody important for efficient antigen binding and T cell activation. J Immunol, 1995, 155, 1903–1910) ili VH i VL domeni dobijeni od alfa/beta TCR-specifičnog antitela BMA031 opisanog u radu Shearman i sar. (Construction, expression and characterization of humanized antibodies directed against the human alpha/beta T cell receptor. J Immunol, 1991, 147, 4366-73) i upotrebljenog u varijanti 10 humanizovane verzije (podaci generisani interno). Za ciljanje kompleksa peptid:MHC upotrebljeni su Valfa i Vbeta domeni prethodno opisanog, sazrelog u pogledu stabilnosti i afiniteta, humanog jednolančanog T-ćelijskog receptora 868Z11 iznetog od strane Aggen i sar. (Identification and engineering of human variable regions that allow expression of stable single-chain T cell receptors. PEDS, 2011, 24, 361 – 372).

[0103] U slučaju bispecifičnih TCR/mAt dijatela koja sadrže Fc, DNK sekvence koje kodiraju razne kombinacije VH i VL (koje odgovaraju VD1 odnosno VD2) i Va i Vb (koje odgovaraju VR1 odnosno VR2), kao i koje kodiraju linkere Link1 i Link2 dobijene su sintezom gena. Nastale DNK sekvence su klonirane u okviru u vektore ekspresije koji kodiraju region šarke, CH2 i CH3 domen dobijen od humanog IgG4 [pristupni broj: K01316] odnosno IgG1 [pristupni broj: P01857], i dalje su obrađene inženjeringom. Inženjering je obavljen kako bi se mutacije „ispupčenje u udubljenje“ inkorporirale u CH3 domene sa i bez dodatne međulančane stabilizacije disulfidnim vezama; uklonilo mesto N-glikozilacije u CH2 (npr. mutacija N297Q); uvele mutacije koje utišavaju Fc; uvela dodatna stabilizacija disulfidnim vezama u VL odnosno VH, u skladu sa postupcima koje su opisali Reiter i sar. (Stabilization of the Fv Fragments in Recombinant Immunotoxins by Disulfide Bonds Engineered into Conserved Framework Regions. Biochemistry, 1994, 33, 5451 – 5459). Kratak pregled proizvedenih bispecifičnih TCR/mAt dijatela, varijante kao i odgovarajuće sekvence su navedeni u tabeli 1.

Tabela 1: Pregled svih stvorenih i procenjenih bispecifičnih TCR/mAt dijatela koja sadrže Fc: KiH: Ispupčenje u udubljenje; K/O: Utišan Fc; KiH-ds: „Ispupčenje u udubljenje“ stabilizovano veštačkom disulfidnom vezom koja povezuje CH3:CH3’; ds-hUCHT1(V9): hUCHT1(V9) varijabilni domeni stabilizovani disulfidnom vezom; Link1: Linker koji povezuje VR1 i VD1.

[0104] Razni kontrolni molekuli koji ispoljavaju iste specifičnosti su konstruisani (tabela 2) korišćenjem navedenih VH, VL, Valfa i Vbeta domena u kombinacijama sa konstantnim

4

domenima dobijenim iz IgG1 ili IgG4 koji su sadržali inženjeringom uvedene karakteristike koje su opisane iznad.

Tabela 2: Pregled svih stvorenih i procenjenih bispecifičnih kontrolnih molekula koji sadrže Fc: KiH: Ispupčenje u udubljenje; K/O: Utišan Fc.

PRIMER 2

Proizvodnja i prečišćavanje bispecifičnih TCR/mAt dijatela koja sadrže Fc

[0105] Vektori za ekspresiju rekombinantnih proteina su dizajnirani kao mono-cistronski, kontrolisani pomoću elemenata promotora dobijenih od HCMV, derivata pUC19. Plazmidna DNK je amplifikovana u E. coli u skladu sa standardnim postupcima za kultivaciju i naknadno je prečišćena korišćenjem komercijalno dostupnih kompleta (Macherey & Nagel). Prečišćena plazmidna DNK je korišćena za prolaznu transfekciju CHO-S ćelija prema uputstvima proizvođača (ExpiCHO™ sistem; Thermo Fisher Scientific). Transficirane CHO ćelije su kultivisane 6–14 dana na 32 °C do 37 °C i dobile su jedno do dva hranjenja ExpiCHO™ hranljivim rastvorom.

[0106] Kondicionirani ćelijski supernatant je prikupljen centrifugiranjem (4000 x g; 30 minuta) i očišćen filtracijom (0,22 µm). Bispecifični molekuli su prečišćeni pomoću Äkta Pure 25 L FPLC sistema (GE Lifesciences) opremljenog da izvrši linijsku ekskluzionu hromatografiju prema afinitetu i veličini. Afinitetna hromatografija je izvršena na kolonama proteina A (GE Lifesciences) sledeći standardne protokole za afinitetnu hromatografiju. Ekskluziona hromatografija prema veličini je izvršena direktno nakon elucije (pH 2,8) sa afinitetne kolone kako bi se dobio visoko prečišćen monomerni protein primenom Superdex 200 pg 16/600 kolona (GE Lifesciences) sledeći standardne protokole. Koncentracije proteina su utvrđene na NanoDrop sistemu (Thermo Scientific) primenom izračunatih koeficijenata ekstinkcije u skladu sa predviđenim sekvencama proteina. Izmena koncentracije, ako je bila potrebna, i pufera su izvršeni primenom Vivaspin uređaja (Sartorius). Na kraju, prečišćeni molekuli su čuvani u fiziološkom rastvoru puferisanom fosfatom pri koncentracijama od oko 1 mg/ml na temperaturi od 2 do 8 °C.

[0107] Budući da terapijski proteini treba da ispoljavaju razumnu stabilnost prilikom izlaganja kiselini kako bi se olakšali pouzdani procesi industrijskog prečišćavanja, procenjen je procenat monomernog proteina koji eluira sa kolone za hvatanje proteina A (tabela 3). Očigledno je da uvođenje stabilizujućih mutacija u molekule kao i izbor osobenih orijentacija vezujućih domena primetno utiče na stabilnost prilikom izlaganja kiselini.

Tabela 3: Frakcija monomernog proteina nakon kisele elucije sa kolone za hvatanje:

[0108] Nakon ekskluzione hromatografije prema veličini, prečišćeni bispecifični molekuli su pokazali visoku čistoću (>93% monomernog proteina) što je utvrđeno pomoću HPLC-SEC na MabPac SEC-1 kolonama (5 µm, 7,8x300 mm) obrađenim u 50 mmol/l natrijum fosfata pH 6,8 koji je sadržao 300 mmol/l NaCl u okviru sistema Agilent 1100 (vidite sliku 3). Neredukujući i redukujući SDS‐PAGE potvrdio je čistoću i očekivanu veličinu različitih TCR/mAt molekula sa dvojnom specifičnošću (podaci nisu prikazani).

PRIMER 3

Specifična i aktivacija T ćelija zavisna od ciljne ćelije indukovana TCR/mAt dijatelima koja sadrže Fc

[0109] Potentnost TCR/mAt dijatela koja sadrže Fc u pogledu aktivacije T ćelija procenjena je primenom bioeseja aktivacije T ćelija (Promega). Esej se sastoji od Jurkat ćelijske linije napravljene genetskim inženjeringom koja eksprimira reporter luciferaze kojeg pokreće element NFAT odgovora (NFAT-RE). Eseji su izvršeni prema uputstvu proizvođača. Ukratko, T2 ćelije, ili napunjene HIV-specifičnim peptidom SLYNTVATL (SEQ ID No. 7) ili ostavljene bez peptidnog punjenja (nenapunjena kontrola), naknadno su ko-kultivisane sa modifikovanim Jurkat ćelijama kompanije Promega u prisustvu rastućih koncentracija bispecifičnih TCR/mAt molekula. Aktivacija Jurkat reporter T ćelija analizirana je nakon 16–20 sati merenjem intenziteta luminiscencije.

[0110] Reprezentativni rezultati eseja potentnosti su prikazani za bispecifične TCR/mAt molekule zasnovane na IgG4 (slika 4) odnosno zasnovane na IgG1 (slika 5). Podaci ukazuju na to da su, bez obzira na korišćeni IgG izotip konstantnih domena, konstrukti TCR/mAt dijatela koji sadrže Fc IA i ID pokazali superiornu aktivaciju T ćelija u poređenju sa alternativnim bispecifičnim konstruktima TCR/mAt dijatela II, III i IV što je izmereno veličinom aktivacije i/ili odgovarajućim EC50 vrednostima. Pored toga, nespecifična aktivacija T ćelija TCR/mAt dijatela koja sadrže Fc indukovana protiv nenapunjenih T2 ćelija je bila smanjena ili najmanje jednaka stepenu nespecifične aktivacije zabeležene za alternativne bispecifične konstrukte TCR/mAt dijatela. Prema gore navedenim rezultatima molekuli dvojno specifičnih TCR/mAt dijatela su poželjni molekuli za terapijsku intervenciju jer oni indukuju snažnu aktivaciju efektorskih T ćelija na visoko ciljno-zavisan način.

[0111] Pored toga esej oslobađanja LDH (Promega) je korišćen za kvantifikaciju PBMC-posredovane lize T2 ćelija napunjenih peptidom SLYNTVATL (SEQ ID No. 7) indukovane različitim bispecifičnim TCR/mAt molekulima (slika 10). U skladu sa gore navedenim rezultatima bioeseja aktivacije T ćelija, ponovo su konstrukti TCR/mAt dijatela koji sadrže Fc IA i ID bili superiorni u odnosu na alternativne bispecifične konstrukte TCR/mAt dijatela II, III i IV na šta ukazuje povećan apsolutni nivo lize ciljne ćelije i manja koncentracija TCR bispecifika koja je potrebna da se postigne polu-maksimalno (EC50) ubijanje ciljnih ćelija. Kao i za TCR/mAt konstrukte II, III i IV, konstrukti TCR/mAt dijatela IA i ID nisu indukovali lizu T2 ćelija napunjenih irelevantnim peptidom (SEQ ID No. 49) dokazujući ciljno-specifičnu lizu T2 ćelija.

PRIMER 4

Razvoj bispecifičnih TCR/mAt dijatela koja sadrže Fc kao molekularne platforme [0112] Konstrukti bispecifičnih TCR/mAt dijatela koja sadrže Fc su dizajnirani da služe kao molekularna platforma za obezbeđivanje skela za različite varijabilne domene dobijene od TCR i dobijene od mAt koji ciljaju različite komplekse peptid:MHC odnosno površinske antigene efektorske ćelije. Da bi se validirala prikladnost kao platforme, varijabilni domeni dobijeni od mAt su izmenjeni u prvom skupu molekula. Varijabilni domeni hUCHT1(V9) anti-CD3 antitela (konstrukt ID_1) su zamenjeni domenima hBMA031(var10) anti-TCR antitela uz korišćenje iste orijentacije domena (konstrukti ID_4 i ID_5) ili različite orijentacije (IC_4, IC_5) (vidite tabelu 1 i sliku 7 za detalje). Ekspresija, prečišćavanje i karakterizacija ovih molekula su izvršeni kako je opisano ranije. Čistoća i integritet konačnih preparata je premašila 92% prema HPLC-SEC analizama.

[0113] Rezultati eseja potentnosti su otkrili ciljno-zavisnu aktivaciju Jurkat reporter T ćelija i minimalnu nespecifičnu aktivnost protiv nenapunjenih T2 ćelija i za varijabilni domen antitela hUCHT1 (konstrukt ID_1) i za hBMA031 (konstrukti ID_4 i ID_5) što podržava prikladnost platforme konstrukata dvojno specifičnog TCR/mAt dijatela (slika 6). Posebno, kada su varijabilni TCR i mAt domeni konstrukata ID_4 i ID_5 prebačeni na svakom polipeptidnom lancu što je rezultovalo konstruktima IC_4 i IC_5 nije zapažena aktivacija T ćelija (podaci nisu prikazani). Kasniji nalazi ukazuju na to da je uprkos tome što bispecifična TCR/mAt dijatela mogu da se koriste kao konstrukt platforme za inkorporiranje različitih TCR i mAt varijabilnih domena neophodna temeljna optimizacija orijentacije domena kako bi se postigla optimalna aktivnost molekula.

PRIMER 5

Stabilnost bispecifičnih TCR/mAt dijatela koja sadrže Fc

[0114] Stabilnost bispecifičnih TCR/mAt molekula je inicijalno procenjena korišćenjem eseja toplotnog pomaka proteina (Thermo Fisher Scientific) prema uputstvima proizvođača primenom sistema za PCR u realnom vremenu 7500 (Applied Biosciences). Ukratko, prečišćeni molekuli su pomešani sa PTS puferom i PTS bojom i podvrgnuti rastućem gradijentu temperature uz konstantno praćenje fluorescencije uzoraka. Zabeleženi signali fluorescencije su analizirani pomoću PTS softvera (Thermo Fisher Scientific) a temperature topljenja (TM) su izračunate metodom derivacije.

[0115] Studije stabilnosti pod stresom su sprovedene skladištenjem prečišćenih molekula rastvorenih u PBS na 40 °C do dve nedelje. Uzorci su analizirani u pogledu integriteta proteina pomoću HPLC-SEC i potentnosti pomoću eseja aktivacije T ćelija (Promega) kako je opisano iznad.

[0116] Kako je bilo i očekivano, skladištenje na 40 °C je indukovalo obrazovanje agregata / vrsta visoke molekulske težine kako je utvrđeno HPLC-SEC analizama (vidite sliku 8). Rezultati eseja potentnosti molekula zasnovanih na IgG1 nakon prečišćavanja i inkubacije na 40 °C prikazani su na slici 9. Iako nijedan od testiranih molekula nije pokazao značajno smanjenje potentnosti nakon skladištenja na 40 °C, zapaženo je da su stresirani molekuli III i IV indukovali značajnu količinu nespecifične (tj. nezavisne od cilja) aktivacije Jurkat T ćelija. Nasuprot tome, bispecifična TCR/mAt dijatela su zadržala svoju ciljno-zavisnu potentnost, uprkos prisustvu određenih agregata koji su viđeni u HPLC-SEC.

PRIMER 6:

Stvaranje molekula bispecifičnih TCR/mAt dijatela koji ciljaju malignitete

[0117] Da bi se dalje validirale sposobnosti platforme konstrukata bispecifičnih TCR/mAt dijatela, varijabilni domeni dobijeni od TCR su izmenjeni sa varijabilnim domenima TCR, sazrelim u pogledu stabilnosti/afiniteta pomoću prikaza kvasnica u skladu sa ranije opisanim postupkom (Smith et al, 2015, T Cell Receptor Engineering and Analysis Using the Yeast Display Platform. Methods Mol Biol. 1319:95-141). Varijabilni domeni TCR koji se specifično vezuju za peptid SLYNTVATL dobijen od HIV-a (SEQ ID No. 7) u kontekstu HLA-A*02 su izmenjeni sa varijabilnim domenima TCR koji se specifično vezuju za tumor-asocirani peptid PRAME-004 (SEQ ID No. 49) vezan za HLA-A*02. Pored toga, varijabilni domeni humanizovanog antitela hUCHT1(V9) koje regrutuje T ćelije su izmenjeni sa varijabilnim domenima hUCHT1(Var17), nove humanizovane verzije antitela UCHT1, što je rezultovalo molekulom TCR/mAt dijatela koji cilja PRAME-004, IA_5 (koji sadrži SEQ ID No. 43 i SEQ ID No.44). Ekspresija, prečišćavanje i karakterizacija ovog molekula su izvršeni kako je opisano u primeru 2. Čistoća i integritet konačnog preparata je premašila 96% prema HPLC-SEC analizi.

[0118] Afiniteti vezivanja konstrukata bispecifičnih TCR/mAt dijatela prema PRAME-004:HLA-A*02 utvrđeni su pomoću interferometrije biološkog sloja. Merenja su izvršena na sistemu Octet RED384 koristeći postavke koje preporučuje proizvođač. Ukratko, prečišćeni molekuli bispecifičnih TCR/mAt dijatela su postavljeni

na biosenzore (AHC) pre analiziranja serijskih razblaženja HLA-A*02/PRAME-004.

[0119] Aktivnost ovog konstrukta TCR/mAt dijatela koji cilja PRAME-004 u pogledu indukcije lize tumorskih ćelija je evaluirana procenjivanjem lize posredovane humanim CD8-pozitivnim T ćelijama humanih tumorskih ćelijskih linija UACC-257, SW982 i U2OS koje prezentuju različite brojeve kopija peptida PRAME-004 u kontekstu HLA-A*02 na površini tumorske ćelije (UACC-257 – oko 1100, SW982 – oko 770, U2OS – oko 240 PRAME-004 kopija po ćeliji, što je utvrđeno kvantitativnom M/S analizom) koja je utvrđena pomoću eseja oslobađanja LDH.

[0120] Kako je prikazano na slici 11, konstrukt TCR/mAt dijatela koji cilja PRAME-004 IA_5 je indukovao lizu PRAME-004-pozitivnih tumorskih ćelijskih linija zavisnu od koncentracije. Čak i tumorske ćelije U2OS koje eksprimiraju samo 240 kopija PRAME-004 po tumorskoj ćeliji su bile efikasno lizirane od strane ovog molekula TCR/mAt dijatela. Ovi rezultati dalje pokazuju da je format TCR/mAt dijatela primenjiv kao molekularna platforma što omogućava uvođenje varijabilnih domena različitih TCR-ova kao i varijabilnih domena raznih antitela koja regrutuju T ćelije.

PRIMER 7:

Mogućnost stvaranja konstrukata TCR/mAt dijatela inženjeringom

[0121] Varijabilni TCR domeni korišćeni u konstruktu IA_5 su dodatno poboljšani u pogledu afiniteta prema PRAME-004 i stabilnosti TCR, i korišćeni za inženjering u skelu TCR/mAt dijatela što je rezultovalo konstruktom IA_6 (koji sadrži SEQ ID No. 45 i SEQ ID No. 46). Ekspresija, prečišćavanje i karakterizacija molekula TCR/mAt dijatela IA_5 i IA_6 su izvršeni kako je opisano u primeru 2. Čistoća i integritet konačnih preparata je premašila 97% prema HPLC-SEC analizi.

[0122] Potentnost varijante IA_6 TCR/mAt dijatela sa poboljšanom stabilnošću i poboljšanim afinitetom protiv PRAME-004 je procenjena u eksperimentima citotoksičnosti sa tumorskom ćelijskom linijom U2OS koja prezentuje male količine PRAME-004:HLA-A*02 ili nenapunjenim T2 ćelijama kao ciljnim ćelijama i humanim CD8-pozitivnim T ćelijama kao efektorskim ćelijama.

[0123] Kao što je prikazano na slici 12, pronalazači su zapazili povećanu citotoksičnu potentnost molekula TCR/At dijatela IA_6 koji sadrži varijabilne domene TCR varijante sa poboljšanom stabilnošću/afinitetom kada se poredi sa prekursorskim konstruktom IA_5. Za oba konstrukta,

4

IA_5 i IA_6, mogla je da se potvrdi PRAME-004-zavisna liza jer nije detektovana citoliza ciljno-negativnih T2 ćelija.

[0124] Konstrukti proteina su dalje podvrgnuti toplotnom stresu na 40 °C tokom do dve nedelje kako bi se analizirala stabilnost PRAME-004-specifičnih varijanti TCR/mAt dijatela IA_5 i IA_6. HPLC-SEC analize nakon toplotnog stresa su otkrile značajno poboljšanu stabilnost varijante IA_6 kada se poredi sa prekursorskim konstruktom IA_5 (vidite sliku 13). Povećanje visokomolekularnih vrsta indukovano temperaturom (tj. elucija pre glavnog maksimuma) konstrukata je bila manje izražena za IA_6 nego za IA_5. U skladu sa ovim rezultatom, oporavak intaktnog, monomernog proteina nakon toplotnog stresa iznosio je 87% za IA_5 odnosno 92% za IA_6.

[0125] Ovi primerni podaci o inženjeringu pokazuju da visoko potentni i stabilni konstrukti TCR/mAt dijatela mogu da se dodatno poboljšaju inkorporiranjem varijabilnih domena TCR sa poboljšanom stabilnošću/afinitetom što bi rezultovalo terapijskim proteinima sa superiornim karakteristikama.

[0126] PRIMER 8:

Primeri poželjnih konstrukata

[0127] Pored HIV-specifičnog TCR bispecifičnog konstrukta opisanog u ovom dokumentu (Seq ID No. 16 i Seq ID No. 17, u orijentaciji D), pronalazak dalje obezbeđuje nekoliko drugih primernih HIV-specifičnih konstrukata koji su bili testirani. Ovi konstrukti su zasnovani na poboljšanim humanizovanim varijantama osnovnog antitela protiv CD3 (UCHT1) koje su bile fuzionisane sa HIV-specifičnim TCR 868 koji je opisan u ovom dokumentu u sve četiri moguće orijentacije (Seq ID No.51 do Seq ID No.58, u orijentacijama A-D).

[0128] Humanizacija UCHT1 je izvršena korišćenjem VH-1-46 i VK1-018 kao akceptorskih okvira za CDR-ove teškog odnosno lakog lanca. Izabrani J segmenti su bili JK1 i JH4 za laki, odnosno teški lanac.

[0129] Dobijeni rezultati su prikazani u sledećoj tabeli 4:

[0130] Podaci u tabeli 4 pokazuju da je inventivna humanizacija potencijalno manje imunogena (manji DRB1 rezultat); molekuli su stabilniji (povećanje temperature topljenja od oko 3 °C); i potentniji (~8x smanjeno EC50), u poređenju sa standardom (V9) (za esej, vidite primer 3).

4

1

2

4

1

2

4

1

2

4

1

2

4

1

2

4

1

11

12

1

14

1

11

12

1

11

12

1

14

1

14

Claims

Patentni zahtevi

1. Polipeptidni molekul sa dvojnom specifičnošću koji sadrži prvi polipeptidni lanac i drugi polipeptidni lanac, naznačen time što:

a) prvi polipeptidni lanac sadrži

ai) prvi varijabilni domen (VD1) antitela,

aii) prvi varijabilni domen (VR1) T-ćelijskog receptora (TCR), i

aiii) prvi linker (LINK1) koji povezuje navedene domene;

b) drugi polipeptidni lanac sadrži

bi) drugi varijabilni domen (VR2) TCR-a,

bii) drugi varijabilni domen (VD2) antitela, i

biii) drugi linker (LINK2) koji povezuje navedene domene;

gde se navedeni prvi varijabilni domen (VD1) i navedeni drugi varijabilni domen (VD2) povezuju da obrazuju prvo mesto vezivanja (VD1)(VD2) koje specifično vezuje ćelijski površinski antigen humane imunske efektorske ćelije;

gde je prvi varijabilni domen (VR1) jedan od TCR Vα domena i TCR Vβ domena, a drugi varijabilni domen (VR2) je drugi od TCR Vα domena i TCR Vβ domena, navedeni prvi varijabilni domen (VR1) i navedeni drugi varijabilni domen (VR2) se povezuju da obrazuju drugo mesto vezivanja (VR1)(VR2) koje vezuje MHC-asocirani virusni peptidni epitop;

gde su navedena dva polipeptidna lanca fuzionisana na domene šarke humanih IgG i/ili Fc domene humanih IgG ili njihove dimerizacione delove;

gde je navedeni polipeptidni molekul sa dvojnom specifičnošću sposoban da istovremeno vezuje ćelijski površinski molekul i MHC-asocirani virusni peptidni epitop; i

2. Polipeptidni molekul sa dvojnom specifičnošću u skladu sa patentnim zahtevom 1, naznačen time što sekvence linkera LINK1 i/ili LINK2 sadrže najmanje jedan motiv sekvence izabran od GGGS, GGGGS, TVLRT, TVSSAS i TVLSSAS.

3. Polipeptidni molekul sa dvojnom specifičnošću u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 2, naznačen time što navedeni prvi i drugi polipeptidni lanac dalje sadrže najmanje domen šarke i Fc domen ili njihove delove dobijene od humanih IgG1, IgG2 ili IgG4, gde poželjno navedeni Fc domen sadrži najmanje jednu mutaciju koja utišava efektorsku funkciju u sekvenci SEQ ID No. 50 (ELLGGP) humanog IgG1, gde je poželjnije navedena mutacija koja utišava efektorsku funkciju stvorena jednom ili više mutacija E1P, L2V, L3A i bez ostatka na položaju 4 SEQ ID No.50.

4. Polipeptidni molekul sa dvojnom specifičnošću u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 2 do 3, naznačen time što navedeni Fc domen sadrži CH3 domen koji sadrži najmanje jednu mutaciju koja olakšava obrazovanje heterodimera, poželjno, gde navedene mutacije sadrže mutacije „ispupčenje u udubljenje“.

5. Polipeptidni molekul sa dvojnom specifičnošću u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 2 do 4, naznačen time što navedeni Fc domen sadrži CH2 i CH3 domene koji sadrže najmanje dva dodatna ostatka cisteina.

6. Polipeptidni molekul sa dvojnom specifičnošću u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 5, naznačen time što navedeni varijabilni domeni VD1 i VD2 antitela prikazuju inženjeringom stvoren disulfidni most koji uvodi kovalentnu vezu između VD1 i VD2 i u kojem se navedeni cisteini uvode u region okvira (FR) 4 u slučaju VL i region okvira 2 u slučaju VH.

7. Polipeptidni molekul sa dvojnom specifičnošću u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 6, naznačen time što je navedeni ćelijski površinski molekul onaj za koji je poznato da indukuje aktivaciju imunskih ćelija, ili je najmanje jedan izabran iz grupe koja se sastoji od CD3, CD4, CD7, CD8, CD10, CD11b, CD11c, CD14, CD16, CD18, CD22, CD25, CD28, CD32a, CD32b, CD33, CD41, CD41b, CD42a, CD42b, CD44, CD45RA, CD49, CD55, CD56, CD61, CD64, CD68, CD94, CD90, CD117, CD123, CD125, CD134, CD137, CD152, CD163, CD193, CD203c, CD235a, CD278, CD279, CD287, Nkp46, NKG2D, GITR, FcεRI, TCRα/β i TCRγ/δ, HLA-DR, gde je poželjno navedeni ćelijski površinski molekul CD3γ, CD3δ ili CD3ε.

8. Polipeptidni molekul sa dvojnom specifičnošću u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 7, naznačen time što regioni u prvom polipeptidnom lancu sadrže SEQ ID No.28, SEQ ID

14

No. 29, SEQ ID No.30; a regioni u drugom polipeptidnom lancu sadrže SEQ ID No.31, SEQ ID No. 32 i SEQ ID No.30.

9. Polipeptidni molekul sa dvojnom specifičnošću u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 2 do 8, naznačen time što Fc region u prvom polipeptidnom lancu sadrži SEQ ID No.26 ili SEQ ID No. 47 (Fc1), a Fc region u drugom polipeptidnom lancu sadrži SEQ ID No. 27 ili SEQ ID No. 48 (Fc2).

10. Polipeptidni molekul sa dvojnom specifičnošću patentnog zahteva 1, naznačen time što prvi polipeptidni lanac sadrži SEQ ID No.16, SEQ ID No.43, SEQ ID No.45, SEQ ID No. 51, SEQ ID No. 53, SEQ ID No. 55, ili SEQ ID No. 57, a drugi polipeptidni lanac sadrži SEQ ID No. 17, SEQ ID No. 44, SEQ ID No. 46, SEQ ID No. 52, SEQ ID No. 54, SEQ ID No. 56, ili SEQ ID No.58.

11. Polipeptidni molekul sa dvojnom specifičnošću u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 10, naznačen time što je navedeno prvo mesto vezivanja (VD1)(VD2) koje vezuje ćelijski površinski antigen navedenih imunskih ćelija humanizovano; i/ili navedeno drugo mesto vezivanja (VR1)(VR2) koje vezuje navedeni MHC-asocirani virusni peptidni epitop je afinitetno sazrelo i/ili je sazrelo u pogledu stabilnosti.

12. Nukleinska kiselina koja kodira prvi polipeptidni lanac i/ili drugi polipeptidni lanac u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 11, ili vektor ekspresije koji sadrži najmanje jednu od navedenih nukleinskih kiselina.

13. Ćelija domaćin koja sadrži i opciono eksprimira vektor kako je definisan u patentnom zahtevu 12.

14. Farmaceutska smeša koja sadrži polipeptidni molekul sa dvojnom specifičnošću u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 11, nukleinsku kiselinu ili vektor ekspresije u skladu sa patentnim zahtevom 12, ili ćeliju u skladu sa patentnim zahtevom 13, zajedno sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih nosača ili pomoćnih materija.

15. Polipeptidni molekul sa dvojnom specifičnošću u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 11, nukleinska kiselina ili vektor ekspresije u skladu sa patentnim zahtevom 12, ćelija u

14

skladu sa patentnim zahtevom 13, ili farmaceutska smeša u skladu sa patentnim zahtevom 14, za upotrebu u medicini, poželjno za upotrebu u prevenciji ili lečenju infektivnih bolesti.