ES2246069T3 - Procedimiento de preparacion de anticuerpos multiespecificos que tienen componentes comunes y multimericos. - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a un procedimiento para preparar polipéptidos heteromultiméricos tales como anticuerpos biespecíficos, inmunoadhesinas biespecíficas y quimeras anticuerpo-inmunoadhesinas. La invención también se refiere a los heteromultímeros preparados usando el procedimiento. Generalmente, el procedimiento proporciona un anticuerpo multiespecífico que tiene una cadena ligera común asociada con cada polipéptido heteromérico que tiene un dominio de unión a anticuerpos. Además el procedimiento implica también la introducción en el anticuerpo multiespecífico de una interacción específica y complementaria en la interfase de un primer polipéptido y la interfase de un segundo polipéptido, para promover la formación de heteromultímeros e impedir la formación de homomultímeros; y/o un resto que contiene tiol libre en la interfase de un primer polipéptido y un residuo que contiene tiol libre correspondiente en la interfase de un segundo polipéptido, de tal forma que se forme un enlace disulfuro que no se produce de forma natural entre el primer y el segundo polipéptidos. El procedimiento permite aumentar la formación del heteromultímero deseado con respecto a los heteromultímeros y homomultímetros indeseados.

Description

Procedimiento de preparación de anticuerpos multiespecíficos que tienen componentes comunes y multiméricos.

Campo de la invención

Esta invención se refiere a un procedimiento para construir anticuerpos multiespecíficos que tienen componentes de cadena pesada heteromultiméricos y componentes de cadena ligera comunes, tales como los anticuerpos biespecíficos, las inmunoadhesinas biespecíficas, así como las quimeras anticuerpo-inmunoadhesina y los polipéptidos heteromultiméricos construidos usando el procedimiento.

Antecedentes de la invención Anticuerpos biespecíficos

Los anticuerpos biespecíficos (BsAbs) que tienen especificidades por al menos dos antígenos diferentes tienen un potencial significativo en un amplio rango de aplicaciones clínicas como agentes de apuntamiento para la inmunodiagnosis y terapia in vitro e in vivo, y para los inmunoensayos diagnósticos.

En las áreas de diagnóstico, los anticuerpos biespecíficos han sido muy útiles para probar las propiedades funcionales de las moléculas de la superficie celular, y para definir la capacidad de los diferentes receptores Fc para mediar la citotoxicidad (Fanger et al., Crit. Rev. Immunol., 12:101-124 (1992)). Nolan et al., Biochem. Biophys. Acta., 1040:1-11 (1990) describen otras aplicaciones diagnósticas para los BsAbs. En concreto, pueden construirse BsAbs para inmovilizar enzimas para su uso en inmunoensayos de enzimas. Para conseguir esto, puede diseñarse un brazo del BsAb para unirse a un epítopo específico del enzima de tal forma que la unión no cause la inhibición del enzima, el otro brazo del BsAb se une a la matriz de inmovilización asegurando una elevada densidad de enzima en el sitio deseado. Los ejemplos de tales BsAbs diagnósticos incluyen el BsAb anti-IgG/anti-ferritina descrito por Hammerling et al., J. Exp. Med., 128:1461-1473 (1968), el cual se usó para localizar antígenos de superficie. También se han desarrollado BsAbs que tienen especificidades de unión por la peroxidasa de rábano silvestre (HRP) así como por una hormona. Otra aplicación inmunoquímica potencial para los BsAbs implica su uso en inmunoensayos de dos sitios. Por ejemplo, se producen dos BsAbs que se unen a dos epítopos distintos sobre la proteína analito - un BsAb une al complejo a una matriz insoluble, el otro une un enzima indicador (ver Nolan et al., supra).

Los anticuerpos biespecíficos puede usarse también para la inmunodiagnosis in vitro o in vivo de varias enfermedades tales como el cáncer (Songsivilai et al., Clin. Exp. Immunol., 79:315 (1990)). Para facilitar este uso diagnóstico de los BsAb, un brazo del BsAb puede unir un antígeno asociado con el tumor y el otro brazo puede unir un marcador detectable tal como un quelante que une fuertemente un radionúcleo. Usando esta estrategia, Le Doussal et al. construyeron un BsAb útil para la radioinmunodetección de carcinomas colorectales y de tiroides, los cuales tenían un brazo que unía el antígeno carcinoembrionario (CEA) y el otro brazo unía el ácido dietilentriaminopentaacético (DPTA). Ver Le Doussal et al., Int. J. Cancer Suppl., 7:58-62 (1992) y Le Doussal et al., J. Nucl. Med., 34:1662-1671 (1993). De forma similar, Stickney et al. describen una estrategia para detectar, usando radioinmunodetección, cánceres colorectales que expresan el CEA. Estos investigadores describen un BsAb que une el CEA así como el hidroxibutiltiourea-bencil-EDTA (EOTUBE). Ver Stickney et al., Cancer Res. 51:6650-6655 (1991).

Los anticuerpos biespecíficos pueden usarse también para la terapia humana en la citotoxicidad redirigida proporcionando un brazo que une una diana (por ejemplo, un patógeno o célula tumoral) y otro brazo que une una molécula activadora citotóxica, tal como el receptor de la célula T o el receptor Fc\gamma. Por tanto, los anticuerpos biespecíficos pueden usarse para dirigir los mecanismos de defensa inmune celulares de un paciente contra la célula tumoral o agente infeccioso. Usando esta estrategia, se ha demostrado que los anticuerpos biespecíficos que se unen al Fc\gammaRIII (es decir, el CD16) pueden mediar la muerte celular por parte de células asesinas naturales (NK)/células de linfocito granular grandes (LGL) in vitro, y que son efectivos para impedir el crecimiento tumoral in vivo. Segal et al., Chem. Immunol., 47:179 (1989) y Segal et al., Biologic Therapy of Cancer 2(4), eds. DeVita et al., J. B. Lippincott, Philadelphia (1992) p. 1. De forma similar, se han desarrollado anticuerpos biespecíficos que tienen un brazo que une el Fc\gammaRIII y otro que se une al receptor HER2 para la terapia de tumores de ovarios y mama que sobreexpresan el antígeno HER2. (Hseih-Ma et al., Cancer Research 52:6832-6839 (1992) y Weiner et al., Cancer Research 53:94-100 (1993)). Los anticuerpos biespecíficos pueden mediar también la muerte por parte de células T. Normalmente, los anticuerpos biespecíficos unen el complejo CD3 sobre células T con un antígeno asociado a tumor. Se ha usado un BsAb F(ab')_{2} completamente humanizado consistente en un anti-CD3 unido a un to anti-p185^{HER2} para apuntar células T para matar células tumorales que sobreexpresan el receptor HER2. Shalaby et al., J. Exp. Med., 175(1):217 (1992). Los anticuerpos biespecíficos se han ensayado en varios ensayos clínicos en fase temprana con resultados alentadores. En un ensayo, 12 pacientes con cáncer de pulmón, ovario o mama, se trataron con infusiones de linfocitos T activados dirigidos con un anticuerpo biespecífico anti-CD3/anti-tumor (MOC31). deLeij et al., Bispecific Antibodies and Targeted Cellular Cytotoxicity, Eds. Romet-Lemonne, Fanger y Segal, Lienhart (1991) p. 249. Las células dirigidas inducen una lisis local considerable de células tumorales, una reacción inflamatoria suave, pero no efectos secundarios tóxicos o respuestas de anticuerpos anti-ratón. En un ensayo muy preliminar de un anticuerpo biespecífico anti-CD3/anti-CD19 en un paciente con cáncer de células B, también se consiguió una considerable reducción en los recuentos de células tumorales periféricas. Clark et al., Bispecific Antibodies and Targeted Cellular Cytotoxicity, Eds. Romet-Lemonne, Fanger y Segal, Lienhart (1991) p. 243. Ver también, Kroesen et al., Cancer Immunol. Immunother. 37:400-407 (1993), Kroesen et al., Br. J. Cancer, 70:652-661 (1994) y Weiner et al., J. Immunol., 152:2385 (1994) concernientes a las aplicaciones terapéuticas de los BsAbs.

Los anticuerpos biespecíficos podrían usarse también como agentes fibrinolíticos o adyuvantes de vacunas. Más aún, estos anticuerpos podrían usarse en el tratamiento de enfermedades infecciosas (por ejemplo, para el apuntamiento de células efectoras contra células infectadas viralmente, tales como por el VIH o el virus de la gripe, o protozoos tales Toxoplasma gondii, podrían usarse para suministrar inmunotoxinas a células tumorales, o para dirigir complejos inmunes contra receptores de la superficie celular (ver Fanger et al., supra).

El uso de los BsAbs ha sido impedido efectivamente por la dificultad para obtener BsAbs en cantidad y pureza suficiente. Tradicionalmente, los anticuerpos biespecíficos se preparaban usando la tecnología del hibridoma híbrido (Millstein y Cuello, Nature, 305:537-539 (1983)). Debido al surtido aleatorio de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina, estos hibridomas (quadromas) producen una mezcla potencial de 10 moléculas de anticuerpo diferentes, de las cuales sólo una tiene la estructura biespecífica correcta (ver la Figura 1A). La purificación de la molécula correcta, que usualmente se realiza mediante pasos de cromatografía de afinidad, es bastante pesada, y los rendimientos de producto son bajos. Ver, por ejemplo, (Smith, W., et al., (1992) Hybridoma, 4:87-98; y Massimo, Y. S., et al., (1997) J. Immunol. Methods, 201:57-66). En consecuencia, se han desarrollado técnicas para la producción de BsAb con rendimientos más elevados. Para conseguir el acoplamiento químico de fragmentos de anticuerpos, Brennan et al., Science. 229:81 (1985) describen un procedimiento en donde los anticuerpos intactos son cortados proteolíticamente para generar fragmentos F(ab')_{2}. Estos fragmentos se reducen en presencia del agente arsenito sódico, complejador de ditiol, para estabilizar los ditioles vecinos e impedir la formación de disulfuro intermolecular. Los fragmentos Fab' generados se convierten a continuación en derivados de teionitrobenzoato. Uno de los derivados de Fab'-TNF se reconvierte al Fab'-tiol mediante reducción con mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar del otro Fab'-TNB derivado
para forma el BsAb. Los BsAbs producidos pueden usarse como agentes para la inmovilización selectiva de enzimas.

El progreso reciente ha facilitado la recuperación directa de fragmentos Fab'-SH a partir de E. coli, los cuales se han acoplado químicamente para formar anticuerpos biespecíficos. Shalaby et al., J. Exp. Med., 175:217-225 (1992) describen la producción de una molécula BsAb F(ab')_{2} completamente humanizada que tiene un brazo que une el p185^{HER2} y otro brazo que une el CD3. Cada fragmento Fab' se secretó por separado a partir de E. coli y se sometió a acoplamiento químico dirigido in vitro para formar el BsAb. El BsAb formado de este modo fue capaz de unirse a células que sobreexpresaban el receptor HER2 y a células T humanas normales, así como de disparar la actividad lítica de linfocitos citotóxicos humanos contra dianas de tumores de mama humanos. Ver también Rodrigues et al., Int. J. Cancers (Suppl.), 7:45-50 (1992).

Se han descrito también varias técnicas para construir y aislar fragmentos de BsAb directamente a partir de cultivos de células recombinantes. Por ejemplo, se han producido heterodímeros biespecíficos de F(ab')_{2} usando cremalleras de leucina (Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)). Los péptidos de la cremallera de leucina procedentes de las proteínas Fos y Jun se unieron a las porciones Fab' de anticuerpos anti-CD3 y anti-receptor de interleukina-2 (IL-2R) mediante la fusión de genes. Los homodímeros de anticuerpo de redujeron en la región bisagra para formar monómeros y a continuación se reoxidaron para formar los heterodímeros de anticuerpo. Se halló que los BsAbs eran altamente efectivos in vitro para reclutar células T citotóxicas para lisar las células Hut-102. La llegada de la tecnología del "diacuerpo" descrita por Hollinger et al., PNAS (USA), 90:6444-6448 (1993) ha proporcionado un mecanismo alternativo para preparar fragmentos BsAb. Los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (V_{H}) conectado a un dominio variable de cadena ligera (V_{L}) por un eslabón que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre dos dominios sobre la misma cadena. En consecuencia, los dominios V_{H} y V_{L} de un fragmento están forzados a emparejarse con los dominios V_{H} y V_{L} complementarios de otro fragmento, formando de ese modo dos sitios de unión a antígeno. También se ha descrito otra estrategia para construir fragmentos BsAb mediante el uso de dímeros de Fv de cadena única (sFv). Consultar Gruber et al., J. Immunol. 152: 5368 (1994). Estos investigadores diseñaron un anticuerpo que comprendía dominios V_{H} y V_{L} de un anticuerpo, dirigido contra el receptor de la célula T, unidos mediante un eslabón de 25 residuos aminoácidos a los dominios V_{H} y V_{L} de un anticuerpo anti-fluoresceína. La molécula replegada se unía a fluoresceína y al receptor de la célula T, y redirigía la lisis de células tumorales humanas que tenían la fluoresceína unida covalentemente sobre su superficie.

Es evidente que se han descrito varias técnicas para preparar fragmentos de anticuerpo biespecíficos, los cuales pueden recuperarse directamente a partir del cultivo de células recombinantes. Sin embargo, los BsAbs de longitud completa podrían ser preferibles a los fragmentos de BsAb para muchas aplicaciones clínicas debido a su mayor vida media en suero y posibles funciones efectoras.

Inmunoadhesinas

Las inmunoadhesinas (Ia) son moléculas parecidas a los anticuerpos que combinan el dominio unidor de un proteína (una "adhesina"), tal como un receptor de superficie celular o un ligando, con las funciones efectoras de un dominio constante de inmunoglobulina. Las inmunoadhesinas pueden poseer muchas de las valiosas propiedades químicas y biológicas de los anticuerpos humanos. Puesto que las inmunoadhesinas pueden construirse a partir de una secuencia de proteína humana con un especificidad deseada unida a una secuencia apropiada de dominios constante y bisagra de inmunoglobulina (Fc), la especificidad de unión de interés puede conseguirse usando completamente componentes humanos. Tales inmunoadhesinas son mínimamente inmunogénicas para el paciente, y son seguras para un uso crónico o repetido.

Las inmunoadhesinas mencionadas en la literatura incluyen las fusiones del receptor de la célula T (Gascoigne et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:2936-2940 (1987)); del CD4 (Capon et al., Nature, 337:525-531 (1989); Traunecker et al., Nature, 339:68-70 (1989); Zettmeissl et al., DNA Cell Biol. USA, 9:347-353 (1990); y Byrn et al., Nature, 344:667-670 (1990)); del receptor de la L-selectin o "homing" (Watson et al., J. Cell. Biol., 110:2221-2229 (1990); y Watson et al., Nature, 349:164-167 (1991)); del CD44 (Aruffo et al., Cell, 61:1303-1313 (1990)); del CD28 y B7 (Linsley et al., J. Exp. Med., 173:721-730 (1991)); del CTLA-4 (Lisley et al., J. Exp. Med., 174:561-569 (1991)); del CD22 (Stamenkovic et al., Cell, 66:1133-1144 (1991)); del receptor del TNF (Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:10535-10539 (1991); Lesslauer et al., Eur. J. Immunol., 27:2883-2886 (1991); y Peppel et al., J. Exp. Med., 174:1483-1489 (1991)); de los receptores del NP (Bennett et al., J. Biol. Chem., 266:23060-23067 (1991)); del receptor del interferón-\gamma (Kurschner et al., J. Biol. Chem., 267:9354-9360 (1992)); del 4-1BB (Chalupny et al., PNAS (USA), 89:10360-10364 (1992)) y del receptor \alpha de la IgE (Ridgway y Gorman, J. Cell. Biol., Vol. 115, Abstract No. 1448 (1991)).

Los ejemplos de inmunoadhesinas que se han descrito para uso terapéutico incluyen la inmunoadhesina CD4-IgG para bloquear la unión del VIH al CD4 de la superficie celular. Los datos obtenidos de los ensayos clínicos de la Fase I en los que se administró CD4-IgG a mujeres embarazadas justo antes del parto sugieren que esta inmunoadhesina podría ser útil en la prevención de la transferencia materno-fetal del VIH. Ashkenazi et al., Intern. Rev. Immunol., 10:219-227 (1993). También se ha desarrollado una inmunoadhesina que une el factor de la necrosis del tumor (TNF). El TNF es una citoquina pro-inflamatoria que se ha mostrado es una mediadora importante del choque séptico. En base a un modelo tumoral de choque séptico, una inmunoadhesina del receptor del TNF se ha mostrado prometedora como candidata para su uso clínico en el tratamiento del choque séptico (Ashkenazi et al., supra). La inmunoadhesinas tienen también usos no terapéuticos. Por ejemplo, se usó una inmunoadhesina del receptor de la L-selectina como reactivo para la tinción histoquímica de vénulas endoteliales elevadas (HEV) de nódulo linfático periférico. Este reactivo puede usarse también para aislar y caracterizar el ligando L-selectina (Ashkenazi et al., supra). Si los dos brazos de la estructura de la inmunoadhesina tienen especificidades diferentes, la inmunoadhesina se denomina "inmunoadhesina biespecífica" por analogía con los anticuerpos biespecíficos. Dietsch et al., J. Immunol. Methods 162:123 (1993) describen una inmunoadhesina biespecífica así, que combina los dominios extracelulares de las moléculas de adhesión, E-selectina y P-selectina. Los estudios de unión indicaron que la proteína de fusión de inmunoglobulinas biespecífica formada de ese modo tenía una capacidad potenciada para unirse a una línea celular mieloide en comparación con las inmunoadhesinas monoespecíficas de las que se derivaba.

Quimeras anticuerpo-inmunoadhesina

Las quimeras de anticuerpo-inmunoadhesina (Ab/Ia) también se han descrito en la literatura. Estas moléculas combinan la región unidora de una inmunoadhesina con el dominio unidor de un anticuerpo.

Berg et al., PNAS (USA), 88:4723-4727 (1991) construyeron una quimera biespecífica de anticuerpo-inmunoadhesina que derivaba de la CD4-IgG de ratón. Estos investigadores construyeron una molécula tetramérica que tenía dos brazos. Un brazo estaba compuesto por CD4 fusionado con un dominio constante de cadena pesada de anticuerpo junto con una fusión de CD4 con un dominio constante de cadena ligera de anticuerpo. El otro brazo estaba compuesto por una cadena pesada complete de un anticuerpo anti-CD3 junto con una cadena ligera del mismo anticuerpo. Gracias al brazo de CD4-IgG, esta molécula biespecífica se une al CD3 la superficie de células T citotóxicas. La yuxtaposición de células citotóxicas y de células infectadas por el VIH resulta en la muerte específica de estas últimas células.

Aunque Berg et al., describen una molécula biespecífica que tiene una estructura tetramérica, es posible producir una molécula híbrida trimérica que contiene sólo una fusión CD4-IgG. Ver Chamow et al., J. Immunol., 153:4268 (1994). El primer brazo de esta construcción está formado por una cadena ligera \kappa anti-CD3 humanizada y una cadena pesada \gamma anti-CD3 humanizada. El segundo brazo es una inmunoadhesina CD4-IgG que combina parte del dominio extracelular del CD4, responsable de la unión del gp120, con el dominio Fc de IgG. La quimera de Ab/Ia resultante mediaba la muerte de células infectadas con el VIH usando, bien preparaciones puras de células T citotóxicas, o fracciones de linfocitos de sangre periférica (PBL) que incluían adicionalmente células efectoras de linfocitos granulares grandes portadores del receptor de Fc.

En la fabricación de los heteromultímeros de anticuerpo multiespecíficos, es deseable incrementar los rendimientos de los heterodímeros deseados respecto el(los) homomultímero(s). El procedimiento actual de elección para obtener BsAb que contienen Fc sigue siendo el del hibridoma híbrido, en el que dos anticuerpos se coexpresan (Milstein y Cuello, Nature, 305:537-540 (1983)).

En los hibridomas híbridos, las cadenas pesadas(H) típicamente forman homodímeros así como los heterodímeros deseados. Adicionalmente, las cadenas ligeras (L) frecuentemente se emparejan incorrectamente con cadenas pesadas no relacionadas. Por tanto, la coexpresión de dos anticuerpos podría expresar hasta diez emparejamientos de cadena pesada y ligera (Suresh, M. R., et al., Methods Enzymol., 121:210-228 (1986)). Estos emparejamientos de cadena no deseados comprometen el rendimientos del BsAb e imponen inevitablemente desafíos de purificación significativos y, a veces, insuperables (Smith, et al., (1992), supra; y Massimo, et al., (1997), supra).

Las cadenas pesadas de anticuerpo se han manipulado previamente, para dirigir la heterodimerización, introduciendo mutaciones estéricamente complementarias en dominios de multimerización de la interfaz del dominio C_{H}3 (Ridgway et al., Protein Eng., 9:617-621 (1996)), y por optimización mediante la exhibición en fagos tal como se describe en ésta. Las cadenas que contienen los dominios C_{H}3 modificados rinden hasta aproximadamente un 90% de heterodímero, según se juzga por la formación de un híbrido anticuerpo/inmunoadhesina (Ab/Ia). Las cadenas pesadas heterodimerizadas podrían aún emparejarse incorrectamente con la cadena ligera no relacionada, dificultando la recuperación del BsAb de interés.

Resumen de la invención

Esta solicitud describe una estrategia que sirve para potenciar la formación de un anticuerpo biespecífico heteromultimérico deseado a partir de una mezcla de monómeros, mediante la manipulación de una interfaz entre un primer y segundo polipéptido para la hetero-oligomerización, y proporcionando una cadena ligera variable común para interaccionar con cada una de las regiones de la cadena pesada variable heterodimérica del anticuerpo biespecífico. Hay tres posibles hetero- y homodímeros que pueden formarse a partir de un primer y segundo polipéptido, cada unos de los cuales está, a su vez, asociado respectivamente con una primera y segunda cadena ligera. Esto da lugar a un total de diez posibles emparejamientos de cadena (Figura 1A). Un procedimiento para potenciar la formación de los heterodímeros deseados puede potenciar enormemente el rendimiento respecto los heteromultímeros y homomultímeros no deseados.

La interfaz preferida entre un primer y segundo polipéptido del anticuerpo heteromultimérico comprende al menos una parte del dominio C_{H}3 de un dominio constante de anticuerpo. El dominio de cada uno de los primer y segundo polipéptidos que interacciona en la interfaz se denomina dominio de multimerización. Preferiblemente, el dominio de multimerización promueve la interacción entre un primer polipéptido específico y un segundo polipéptido, incrementando por tanto el rendimiento de heterodímero deseado (Figura 1B). La interacción podría promoverse en la interfaz mediante la formación de regiones complementarias del tipo protuberancia-en-cavidad; mediante la formación de puentes disulfuro que no ocurren de forma natural; mediante cremalleras de leucina; mediante regiones hidrofóbicas; y regiones hidrofílicas. Las "protuberancias" se construyen remplazando cadenas laterales de aminoácidos pequeñas de la interfaz del primer polipéptido con cadenas laterales más grandes (por ejemplo, tirosina y triptófano). Opcionalmente se construyen "cavidades" compensatorias sobre la interfaz del segundo polipéptido mediante la sustitución de cadenas laterales de aminoácidos grandes por otras más pequeñas (por ejemplo, alanina o treonina). Cuando existe una protuberancia o cavidad correctamente ubicada y dimensionada en la interfaz de cualquiera del primero o segundo polipéptido, sólo es necesario construir respectivamente una cavidad o protuberancia correspondiente en la interfaz adyacente. Los puentes disulfuro que no ocurren de forma natural se construyen remplazando sobre el primer polipéptido un aminoácido que ocurre de forma natural con un residuo que contiene un tiol libre, tal como la cisteína, de tal forma que el tiol libre interacciona con otro residuo que contiene tiol en el segundo polipéptido, de tal forma que se forma un enlace disulfuro entre el primer y segundo polipéptidos
(Figura 1B).

Los fragmentos Fv de cadena única procedentes de una biblioteca de exhibición sobre fagos inmunizados (Vaughan, T. J., et al., Nature Biotechnology 14:309-314 (1996), incorporada en ésta por referencia en su totalidad) revelaron el uso de los genes V, en los que predominaban las secuencias de V_{H} y V_{L} derivadas de ciertos segmentos del gen V de la línea germinal, en el repertorio. Se apreciaron ejemplos de promiscuidad de cadena en el repertorio, en los que una cadena pesada o ligera determinada se halla en combinación con diferentes cadenas relacionadas (Vaughan, T. J., et al., (1996), supra).

En ésta se descubre que la preparación de un anticuerpo heterodimérico y multiespecífico está potenciada cuando se proporciona una cadena ligera común para emparejarse con cualquiera de los cadenas pesadas variables del anticuerpo multiespecífico. El uso de una cadena ligera variable común reduce el número de monómeros que deben emparejarse correctamente ara formarse los dominios unidores de antígeno, al limitar el número de cadenas ligeras desde dos a más cadenas ligeras (respectivamente, en un anticuerpo biespecífico o multiespecífico, antes del descubrimiento de la presente invención) a una cadena ligera (en un anticuerpo multiespecífico de la invención, ver Figura 1C).

En consecuencia, la invención se refiere a un procedimiento para preparar un anticuerpo multiespecífico heteromultimérico, comprendiendo el anticuerpo, 1) un primer polipéptido y un segundo polipéptido (y polipéptidos adicionales de acuerdo con la multiplicidad del anticuerpo) que se reúnen en una interfaz, en donde los polipéptidos primero y adicionales (es decir, un primer y segundo polipéptido) incluyen cada uno un dominio de multimerización que forma una interfaz entre los polipéptidos primero y segundo (o al menos uno adicional), y los dominios de multimerización promueven la interacción estable entre el primer polipéptido y los polipéptidos adicionales, y 2) un dominio unidor en cada uno del primero y al menos un polipéptido adicional (es decir, un segundo polipéptido), comprendiendo cada dominio unidor una cadena pesada variable y una cadena ligera variable, en donde la cadena ligera variable del primer polipéptido y la cadena ligera variable del segundo polipéptido tienen una secuencia de aminoácidos común, la cual secuencia común tiene una identidad de secuencia con una cadena ligera original de cada unos de los polipéptidos de al menos el 80%, preferiblemente de al menos el 90%, más preferiblemente de al menos el 95%, y más preferiblemente del 100% de identidad de secuencia. El procedimiento comprende los pasos de:

i)

cultivar una célula huésped que comprende ácido nucleico que codifica el primer polipéptido, el segundo polipéptido, y la cadena ligera común, en donde el cultivo es tal que el ácido nucleico se expresa; y

ii)

recuperar el anticuerpo multiespecífico del cultivo de células huésped.

En una realización relacionada de la invención, el ácido nucleico que codifica el primer polipéptido o ácido nucleico que codifica el segundo polipéptido, o ambos, se ha alterado para formar respecto el ácido nucleico original para codificar la interfaz o una porción de la misma.

En otra realización del procedimiento, la interfaz del primer polipéptido comprende un residuo que contiene un tiol libre, el cual está posicionado para interaccionar con un residuo que contiene un tiol libre de la interfaz del segundo polipéptido, de tal forma que se forma un enlace disulfuro entre el primer y segundo polipéptidos. De acuerdo con la invención, el ácido nucleico que codifica el primer polipéptido ha sido alterado respecto el primer polipéptido para codificar el residuos que contiene el tiol libre, o el ácido nucleico del segundo polipéptido ha sido alterado respecto el ácido nucleico original para codificar el residuo que contiene el tiol libre, o ambos.

En otra realización del procedimiento, el ácido nucleico que codifica ambos, el primer polipéptido y al menos un polipéptido adicional (es decir, un segundo polipéptido) se altera para codificar respectivamente la protuberancia y la cavidad. Preferiblemente, el primer y segundo polipéptidos comprenden cada uno un dominio constante de anticuerpo, tal como el dominio C_{H}3 de una IgG_{1} humana.

En otro aspecto, la invención proporciona un heteromultímero (tal como un anticuerpo biespecífico, una inmunoadhesina biespecífica, o una quimera anticuerpo/inmunoadhesina) que comprende un primer polipéptido y un segundo polipéptido que se reúnen en una interfaz. La interfaz del primer polipéptido comprende un dominio de multimerización, el cual está posicionado para interaccionar con un dominio de multimerización sobre el al menos un polipéptido adicional (es decir, un segundo polipéptido) para formar una interfaz entre el primer y segundo polipéptidos. En las realizaciones preferidas de la invención, los dominios de multimerización se alteran para promover la interacción entre un primer polipéptido específico y un segundo polipéptido específico, alteraciones que incluyen, pero no se limitan a, la generación de una protuberancia o cavidad o ambas; la generación de enlaces disulfuro que no ocurren naturalmente; la generación de regiones hidrofóbicas complementarias; y la generación de regiones hidrofílicas complementarias. El anticuerpo multiespecífico heteromultimérico podría proporcionarse en forma de una composición que comprende además un portador farmacéuticamente aceptable.

La invención se refiere también a una célula huésped que comprende ácido nucleico que codifica el anticuerpo heteromultimérico multiespecífico del parágrafo precedente, en donde el ácido nucleico que codifica el primer polipéptido y al menos un polipéptido adicional (es decir, un segundo polipéptido) está presente en un único vector o en vectores distintos. La célula huésped puede usarse en procedimientos para preparar un anticuerpo heteromultimérico multiespecífico, el cual implica cultivar la célula huésped de forma que el ácido nucleico se expresa, y recuperar el anticuerpo heteromultimérico del cultivo de células.

En aún un aspecto adicional, la invención proporciona un procedimiento para preparar un anticuerpo heteromultimérico multiespecífico que comprende:

(a)

seleccionar un primer ácido nucleico que codifica un primer polipéptido que comprende un residuo aminoácido, en la interfaz del primer polipéptido, que está posicionado para interaccionar con un residuo aminoácido de la interfaz de al menos un polipéptido adicional. En una realización, el ácido nucleico está alterado respecto el original para codificar los residuos aminoácidos que interaccionan. En otra realización, el primer ácido nucleico se altera para codificar un residuo aminoácido que tiene un mayor volumen de cadena lateral, generándose de ese modo una protuberancia sobre el primer polipéptido;

(b)

alterar un segundo ácido nucleico que codifica un segundo polipéptido de forma que un residuo aminoácido en la interfaz del segundo polipéptido se remplaza con un residuo aminoácido que tiene un menor volumen de cadena lateral, generando de ese modo una cavidad en el segundo polipéptido, en donde la protuberancia está posicionada para interaccionar con la cavidad;

(c)

introducir en una célula huésped el primer y segundo ácidos nucleicos, y cultivar la célula huésped de forma que ocurra la expresión del primer y segundo ácidos nucleicos;

(d)

recuperar del cultivo celular el anticuerpo heteromultimérico formado.

Podría ser deseable también construir un anticuerpo multiespecífico (tal como un anticuerpo biespecífico) que incorpore un anticuerpo identificado previamente. En estas circunstancias, es deseable identificar una cadena pesada que, cuando se empareja con la cadena ligera original, se unirá específicamente a un segundo antígeno de interés. Los procedimientos de Figini et al. (Figini, M. et al., J. Mol. Biol., 239:68-78 (1994), incorporada en ésta por referencia en su totalidad) podrían usarse para identificar tal cadena pesada. Primero se trataría una biblioteca de fagos con hidrocloruro de guanidina para disociar la cadena ligera original. A continuación, las cadenas pesadas exhibidas sobre fago se reconstituirían con la cadena ligera de interés mediante la retirada del desnaturalizante (tal como mediante diálisis). A continuación podría realizarse el cribado respecto el segundo antígeno de interés para identificar la cadena pesada deseada. La invención abarca además un anticuerpo multiespecífico preparado mediante este procedimiento de selección una cadena pesada para emparejarla con una cadena ligera escogida, de ácido nucleico que codifica el anticuerpo, y una célula huésped que comprende el ácido nucleico.

La invención proporciona un mecanismo para incrementar los rendimientos del heteromultímero respecto otros productos finales no deseados, tales como los heteromultímeros no deseados y/o los homomultímeros (ver Figuras 1A-1C). Preferiblemente, los rendimientos del heteromultímero deseado recuperado a partir del cultivo de células recombinantes son al menos superiores al 80% en peso, y preferiblemente superiores al 90% en peso, en comparación con el subproducto de heterodímero(s) o homomultímero(s) no deseados.

Breve descripción de las figuras

Figuras 1A-1C. La Figura 1A es un diagrama de la formación de anticuerpos biespecíficos que contienen Fc cuando no se realiza ninguna manipulación para potenciar la heteropolimerización respecto la homopolimerización. La Figura 1B es un diagrama que muestra el emparejamiento que ocurre cuando se manipulan cadenas pesadas (H) de tal forma que la heteromultimerización está favorecida respecto la heteromultimerización no deseada y respecto la homopolimerización. La Figura 1C es un diagrama que ilustra el emparejamiento que ocurre cuando se escogen anticuerpos que comparten la misma cadena ligera (L) para evitar el problema de emparejamiento de cadenas ligeras con cadenas pesadas no relacionadas.

Figuras. 2A-2C. La Figura 2A ilustra un esquema de selección para un heterodímero C_{H}3 usando el vector de exhibición en fagos, pRA2. Los fagos que exhiben heterodímeros de C_{H}3 estables se capturan usando un anticuerpo dirigido contra la marca gD. La Figura 2B ilustra un operón dicistrónico en el que el C_{H}3 expresado a partir de un gen sintético se secreta conjuntamente con una segunda copia de C_{H}3 expresado a partir del gen natural (Ellison et al., Nucleic Acids Res., 10:4071-4079 (1982)) como una proteína de fusión con el de la proteína del gen III del M13. El gen de C_{H}3 sintético está precedido por una secuencia que codifica un péptido derivado de la glicoproteína D del virus herpes simplex (marca gD, Lasky, L.A. y Dowbenko, D.J., DNA, 3:23-29 (1984); Berman, P.W. et al., Science, 227:1490-1492 (1985) y un sitio de corte (G) para la proteasa específica de sitio Genenasa I (Carter, P., et al., Proteins: Structure, Function and Genetics, 6:240-248 (1989)). La Figura 2C es la secuencia de ácido nucleico del operón dicistrónico (SEC. Nº ID.:1) de la Figura 2B, en la cual los residuos en los genes de C_{H}3 traducidos se numeran de acuerdo con el sistema Eu de Kabat et al., en Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª edición, volumen 1, pp. 688-696, NIH, Bethesda, MD (1991). Se muestra la mutación T366W para protuberancia, así como los residuos apuntados para su aleatorización en el gen de C_{H}3 natural (366, 368, and 407).

Figuras 3A-3C. Las Figuras 3A y 3B son gráficas de barras de los resultados del análisis de barrido densitométrico del SDS-PAGE de los productos purificados con Proteína A procedentes de la cotransfección de las cadenas pesada y ligera de anticuerpo (Ab) con inmunoadhesina (Ia). Los datos presentados son la media de dos experimentos independientes. El eje x indica las proporciones de ADN de entrada en masa (Ia:H:L) y el eje y indica el porcentaje de cada tipo de multímero del producto con respecto a la proteína total del producto. La Figura 3C es un diagrama de los posibles multímeros del producto.

La Figura 4 es una comparación de las secuencia V_{L} de ocho anticuerpos diferentes con especificidades por Axl, Rse, IgER, Ob-R, y VEGF. La posiciones de los residuos del CDR unidores de antígeno de acuerdo con la definición de la secuencia (Kabat et al., (1991), supra) o la definición estructural (Chothia, C. y Lesk, A.M.J., Mol. Biol., 196:901-917 (1987)) se muestran respectivamente mediante subrayado y #. Los residuos que difieren de la secuencia Axl.78 se muestran mediante subrayado doble.

La Figura 5 es una comparación de las cadenas pesada y ligera de clones anti-Ob-R y anti-HER3 seleccionados. Se muestran las secuencias V_{H} y la V_{L} común del clona 26 anti-Ob-R y del clon 18 anti-HER3 usados para construir un anticuerpo biespecífico.

Fig. 6. ELISA sándwich para la detección de la unión simultánea a MpI-IgG y HER3-IgG. Los anticuerpos ensayados d fueron anti-Mp1 x anti-HER3 BsIgG que contenían las mutaciones Y349C:T366S:L368A:Y407V/T366'W:
S354'C junto con la correspondiente anti-MpI parental o IgG anti-HER3 con regiones Fc mutadas.

Fig. 7 es un gráfico de barras de los resultados de un estudio de citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo (ADCC). La ADCC fue mediada por huMAb4D5-5 (Carter, P. Et al. (1992) PNAS USA 89:4285-4289) que contenía o un mutante (S354C: T366W / Y349'C : T366'S : L368'A : Y407'V) o Fc de tipo salvaje o un anticuerpo control emparejado con un anticuerpo (E25, Presta, L. G. et al. (1993) J. Immunol. 151: 2623-2632). Los anticuerpos (125 ng/ml) se incubaron con células efectoras mononucleares de sangre periférica humana y células diana SK-BR-3 en las proporciones mostradas. Los datos presentados son la media de las mediciones por triplicado y representativos de tres ejemplos por separado.

La Figura 8 es una matriz que representa la identidad de secuencia de aminoácidos entre las cadenas ligeras de los anticuerpos generados contra el HER3 respecto las cadenas ligeras de los anticuerpos generados contra el Ob-R. Los anticuerpos que tienen cadenas ligeras con 100% de identidad de secuencia se indican mediante recuadros oscurecidos. Los anticuerpos que tienen cadenas ligeras con 98-99% de identidad de secuencia se indican con recuadros claros. La identidad del clon del anticuerpo se indica debajo de la matriz.

I. Definiciones

En general, las palabras o frases siguientes tienen las definiciones indicadas cuando se usan en la descripción, ejemplos y reivindicaciones.

Un "heteromultímero", "polipéptido heteromultimérico", o "anticuerpo multiespecífico heteromultimérico" es una molécula que comprende al menos un primer polipéptido y un segundo polipéptido, en donde el segundo polipéptido difiere en su secuencia de aminoácidos del primer polipéptido en al menos un residuo aminoácido. Preferiblemente, el heteromultímero tiene especificidad de unidad por al menos dos ligandos diferentes o sitios de unión. El heteromultímero puede comprender un "heterodímero" formado por el primer y segundo polipéptido, o puede formar estructuras terciarias de orden superior en donde hay presentes polipéptidos además del primer y segundo polipéptido. Las estructuras ilustrativas para el heteromultímero incluyen los heterodímeros (por ejemplo, la inmunoadhesina biespecífica descrita por Dietsch et al., supra), los heterotrímeros (por ejemplo, la quimera Ab/Ia descrita por Chamow et al., supra), los heterotetrámeros (por ejemplo, un anticuerpo biespecífico) y otras estructuras oligoméricas.

Tal como se usa en ésta, "dominio de multimerización" se refiere a una región de cada uno de los polipéptidos del heteromultímero. El "dominio de multimerización" promueve la interacción estable de las moléculas quiméricas dentro del complejo de heteromultímero. Preferiblemente, el dominio de multimerización promueve la interacción entre un primer polipéptido específico y un segundo polipéptido específico, potenciando de ese modo la formación del heteromultímero deseado y reduciendo sustancialmente la probabilidad de formación de heteromultímeros no deseados o de homomultímeros. Los dominios de multimerización podrían interactuar a través de una secuencia de inmunoglobulina, cremallera de leucinas, una región hidrofóbica, una región hidrofílica, o un tiol libre que forma un enlace disulfuro intermolecular entre las moléculas quiméricas del heteromultímero quimérico. El tiol libre podría introducirse en la interfaz de uno o más polipéptidos interactuando mediante la sustitución de un residuo del polipéptido, que ocurre de forma natural, con, por ejemplo, un cisteína, en una posición que permite la formación de un enlace disulfuro entre los polipéptidos. El dominio de multimerización podría comprender una región constante de inmunoglobulina. Un posible dominio de multimerización útil en la presente invención se descubre en la PCT/US90/06849 (incorporada en ésta por referencia en su totalidad) en la cual se describen inmunoglobulinas híbridas. Además, podría manipularse una región de multimerización de tal forma que las interacciones estéricas no sólo promuevan la interacción estable, sino que además promuevan la formación de heterodímeros respecto homodímeros a partir de una mezcla de monómeros. Ver, por ejemplo, la PCT/US96/01598 (incorporada en ésta por referencia en su totalidad) en la cual se descubre una estrategia "protuberancia-dentro-de-cavidad" para una interfaz entre un primer y segundo polipéptidos para una hetero-oligomerización. Las "protuberancias" se construyen remplazando cadenas laterales de aminoácidos pequeñas de la interfaz del primer polipéptido con cadenas laterales más grandes (por ejemplo, tirosina o triptófano). Opcionalmente se crean "cavidades" compensatorias, de tamaño idéntico o similar al de las protuberancias, remplazando cadenas laterales grandes de aminoácidos con unas más pequeñas (por ejemplo, alanina o treonina). La secuencia de inmunoglobulina, preferible pero no necesariamente, es un dominio constante de inmunoglobulina. La porción inmunoglobulina en las quimeras de la presente invención podría obtenerse de subtipos IgG_{1}, IgG_{2}, IgG_{3} o IgG_{4}, de IgA, IgE, IgD o IgM, pero preferiblemente de IgG_{1}, IgG_{2}, IgG_{3} o IgG_{4}.

Por "compuesto que contiene un tiol libre" se quiere indicar un compuesto que puede incorporarse en, o hacerse reaccionar con un aminoácido de una interfaz de polipéptido de la invención, de tal forma que la porción de tiol libre del compuesto se ubica para interaccionar con un tiol libre de una porción en la interfaz del polipéptido adicional de la invención para formar un enlace disulfuro. Preferiblemente, el compuesto que contiene el tiol libre es una cisteína.

El término "marcado con epítopo" cuando se usa en ésta se refiere a un polipéptido quimérico que comprende la heteroadhesina quimérica entera, o un fragmento de la misma, fusionada con un "polipéptido marca". El polipéptido marca tiene bastantes residuos como para proporcionar un epítopo contra el que puede prepararse un anticuerpo, aunque es lo bastante corto como para no interferir con la actividad de la heteroadhesina quimérica. El polipéptido marca preferible es bastante único, deforma que el anticuerpo contra el mismo no reacciona sustancialmente de forma cruzada con otros epítopos. Los polipéptidos marca apropiados generalmente tienen al menos 6 residuos aminoácidos, y usualmente entre aproximadamente 8-50 residuos aminoácidos (preferiblemente entre aproximadamente 9-30 residuos). Una realización de la invención abarca una heteroadhesina quimérica unida a una marca de epítopo, marca que se usa para detectar la adhesina en una muestra o recuperar la adhesina de una muestra.

Tal como se usa en ésta, "cadena ligera común" o "secuencia de aminoácidos común de la cadena ligera" se refiere a la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera en el anticuerpo multiespecífico de la invención. Se generaron paneles de anticuerpos contra al menos dos antígenos diferentes mediante cribado de una biblioteca de exhibición en fago, tal como la descrita por Vaughan, et al., (1996), supra, incorporada en ésta por referencia en su totalidad, con particular referencia al procedimiento de selección de la biblioteca de fagémidos). Las secuencias de cadena ligera se compararon con respecto las secuencias de aminoácidos de la cadena ligera variable. Las cadenas ligeras útiles procedentes de los paneles comparados son aquéllas que tienen una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos el 80%, preferiblemente de al menos el 90%, más preferiblemente de al menos el 95%, y lo más preferiblemente el 100% de identidad. Una secuencia de cadena ligera común es una secuencia diseñada para ser una aproximación de las dos secuencias de cadena ligera comparadas. Cuando las cadenas ligeras comparadas son 100% idénticas en su secuencia a nivel de aminoácidos, la cadena ligera común es idéntica a las cadenas ligeras procedentes de los clones de la biblioteca seleccionados, aunque la cadena ligera funciona en un dominio de unión diferente del anticuerpo multiespecífico. Cuando las cadenas ligeras comparadas difieren tal como se ha descrito más arriba, la cadena ligera común podría diferir de una u otra, o de ambas, de las cadenas ligeras comparadas procedentes de la biblioteca de clones. En un caso, en el que la cadena ligera común difiere de uno u otro, o de ambos de los clones de biblioteca, se prefiere que los residuos que difieren ocurran fuera de los residuos del CDR unidor de antígeno de la cadena ligera del anticuerpo. Por ejemplo, la posición de los residuos del CDR unidor de antígeno podrían determinarse de acuerdo con una definición
de secuencia (Kabat et al., (1991), supra) o definición estructural (Chothia y Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987)).

Tal como se usa en ésta "identidad de secuencia de aminoácidos" se refiere al porcentaje de los aminoácidos de una secuencia que son los mismos que los aminoácidos de una segunda secuencia de aminoácidos. Una identidad de secuencia del 100% entre cadenas polipeptídicas significa que las cadenas son idénticas.

Tal como se usa en ésta, "polipéptido" se refiere generalmente a péptidos y proteínas que tienen más de aproximadamente diez aminoácidos. Preferiblemente, se usan polipéptidos de mamíferos (polipéptidos que originalmente se derivaron de un organismo mamífero), más preferiblemente aquéllos que se secretan directamente al medio. Los ejemplos de polipéptidos bacterianos incluyen, por ejemplo, fosfatasa alcalina y \beta-lactamasa. Los ejemplos de polipéptidos de mamíferos incluyen las moléculas tales como la renina, una hormona de crecimiento, incluyendo la hormona del crecimiento humana; la hormona del crecimiento bovina; el factor liberador de la hormona del crecimiento; la hormona paratiroidea; la hormona estimuladora de la tiroides; las lipoproteínas; la \alpha-1-antitripsina; la cadena A de la insulina; la cadena B de la insulina; la proinsulina; la hormona estimuladora del folículo; la calcitonina; la hormona luteinizadora; el glucagón; factores coagulantes tales como el factor VIIIC, el factor IX, el factor de tejido, y el factor de von Willebrands; factores anti-coagulación tales como la Proteína C; factores natriurétricos atriales; tensioactivo pulmonar; un activador de plasminógeno, tal como la uroquinasa, o la orina humana, o el activador de plasminógeno del tipo de tejido (t-PA); la bombesina; la trombina; el factor de crecimiento hemopoyético; el factor-alfa y -beta de la necrosis del tumor; el RANTES (regulado en la activación, normalmente expresado y secretado por células T); la proteína inflamatoria de macrófago humano (MIP-1-alfa); una albúmina de suero tal como la albúmina de suero humana; la sustancia inhibidora de Muellerian; una cadena A de relaxina; una cadena B de relaxina; la prorelaxina; el péptido asociado a la gonadotropina del ratón; una proteína microbiana, tal como la beta-lactamasa; la ADNasa; la inhibina; la activina; el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF); los receptores para hormonas o factores del crecimiento; la integrina; la Proteína A ó D; los factores reumatoides; un factor neurotrófico tal como el factor neurotrófico derivado del hueso (BDNF), la neurotrofinas-3, -4, -5 o -6 (NT-3, NT-4, NT-5, o NT-6), o un factor de crecimiento del nervio, tal como el NGF-f; el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF); un factor de crecimiento de fibroblastos, tal como el aFGF y bFGF; el factor de crecimiento epidérmico (EGF); un factor de crecimiento transformante (TGF) tal como el TGF-alfa y TGF-beta, incluyendo el TGF-\beta1, TGF-\beta2, TGF-\beta3, TGF-\beta4, o TGF-\beta5; el factor de crecimiento parecido a la insulina I y II (IGF-I e IGF-II); el des(1-3)-IGF-I (IGF-I de cerebro), las proteínas unidoras de factor de crecimiento parecido a la insulina; proteínas CD tales como las CD-3, CD-4, CD-8, y CD-19; la eritropoyetina; los factores osteoinductores; las inmunotoxinas; una proteína morfogénica de hueso (BMP); un interferón tal como el interferón-alfa, -beta y -gamma; los factores estimuladores de colonias (CSF), por ejemplo, el M-CSF, GM-CSF y G-CSF; las interleukinas (IL), por ejemplo, de la IL-1 a la IL-10; la superóxido dismutasa; los receptores de células T; las proteínas de membrana de superficie; los factor acelerador de la degradación; un antígeno viral tal como, por ejemplo, una porción de la cápsula del SIDA; las proteínas de transporte; los receptores de asentamiento; las adresinas; las proteínas reguladoras; los anticuerpos; y fragmentos de cualquiera de los polipéptidos listados más arriba.

El "primer polipéptido" es cualquier polipéptido que va a asociarse con un segundo polipéptido. El primer y segundo polipéptido se encuentran en una "interfaz" (definida más abajo). Además de la interfaz, el primer polipéptido podría comprender uno o más dominios adicionales, tales como los "dominios unidores" (por ejemplo, un dominio variable de anticuerpo, un dominio unidor de receptor, un dominio unidor de ligando o un dominio enzimático), o dominios constantes de anticuerpo (o partes de los mismos) incluyendo los dominios C_{H}2, C_{H}1 y CL. Normalmente, el primer polipéptido comprenderá al menos un dominio que se deriva de un anticuerpo. Este dominio convenientemente es un dominio constante, tal como el dominio C_{H}3 de un anticuerpo, y puede formar la interfaz del primer polipéptido. Los polipéptidos primeros ilustrativos incluyen los polipéptidos de cadena pesada, las quimeras que contienen un dominio constante de anticuerpo con un dominio unidor de un polipéptido heterólogo (es decir, una inmunoadhesina, ver la definición más abajo), polipéptidos de receptor (especialmente aquéllos que forman dímeros con otro polipéptido de receptor, por ejemplo, heterodímeros del receptor de la interleukina-8 (IL-8R) e integrina (por ejemplo, LFA-1 o GPIIIb/IIIa)), polipéptidos de ligando (por ejemplo, el factor de crecimiento del nervio (NGF), la neurotrofina-3 (NT-3), y el factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) - - -ver Arakawa et al., J. Biol. Chem., 269(45):27833-27839 (1994) Y Radziejewski et al., Biochem., 32(48):1350 (1993)), y polipéptidos del dominio variable de anticuerpo (por ejemplo, diacuerpos). El polipéptido primero preferido se selecciona de una cadena pesada de anticuerpo fusionada con un dominio constante de una inmunoglobulina, en donde el dominio constante se ha alterado en la interfaz para promover la interacción preferencial con un polipéptido segundo de la invención.

El "segundo polipéptido" es cualquier polipéptido que va a asociarse con el primer polipéptido a través de una "interfaz". Además de la interfaz, el segundo polipéptido podría comprender dominios adicionales tales como un "dominio unidor" (por ejemplo, un dominio variable de anticuerpo, un dominio unidor de receptor, un dominio unidor de ligando o un dominio enzimático), o dominios constantes de anticuerpo (o partes de los mismos) incluyendo los dominios C_{H}2, C_{H}1 y CL. Normalmente, el segundo polipéptido comprenderá al menos un dominio que se deriva de un anticuerpo. Este dominio convenientemente es una región constante, tal como el dominio C_{H}3 de un anticuerpo, y puede formar la interfaz del segundo polipéptido. Los polipéptidos segundos ilustrativos incluyen los polipéptidos de cadena pesada, las quimeras que combinan un dominio constante de anticuerpo con un dominio unidor de un polipéptido heterólogo (es decir, una inmunoadhesina, ver la definición más abajo), polipéptidos de receptor (especialmente aquéllos que forman dímeros con otro polipéptido de receptor, por ejemplo, heterodímeros del receptor de la interleukina-8 (IL-8R) e integrina (por ejemplo, LFA-1 o GPIIIb/IIIa)), polipéptidos de ligando (por ejemplo, el factor de crecimiento del nervio (NGF), la neurotrofina-3 (NT-3), y el factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) - - -ver Arakawa et al., J. Biol. Chem., 269(45):27833-27839 (1994) Y Radziejewski et al., Biochem., 32(48):1350 (1993)), y polipéptidos del dominio variable de anticuerpo (por ejemplo, diacuerpos). El polipéptido segundo preferido se selecciona de una cadena pesada de anticuerpo fusionada con un dominio constante de una inmunoglobulina, en donde el dominio constante se ha alterado en la interfaz para promover la interacción preferencial con un primer polipéptido de la invención.

Un "dominio unidor" comprende cualquier región de un polipéptido que es responsable de la unión selectiva a una molécula de interés (por ejemplo, un antígeno, ligando, receptor, sustrato o inhibidor). Los dominios unidores ilustrativos incluyen un dominio variable de anticuerpo, un dominio unidor de receptor, un dominio unidor de ligando, y un dominio enzimático. En las realizaciones preferidas, el dominio unidor incluye un cadena pesada y cadena ligera de inmunoglobulina. De acuerdo con los anticuerpos biespecíficos de la invención y el procedimiento de prepararlos, la cadena ligera de cada dominio de unión del anticuerpo biespecífico es una cadena ligera común, evitándose de ese modo la formación de heteromultímeros no deseados en los que ocurre el emparejamiento incorrecto de cadenas pesadas y ligeras.

El término "anticuerpo" tal como se menciona en la invención, deberá significar un polipéptido que contiene uno o más dominios que une un epítopo sobre un antígeno de interés, en donde tal(es) dominio(s) se deriva(n) de, o tienen identidad de secuencia, con la región variable de un anticuerpo. Los ejemplos de anticuerpos incluyen los anticuerpos de longitud completa, los fragmentos de anticuerpo, las molécula de cadena única, las moléculas biespecíficas o bifuncionales, los diacuerpos, los anticuerpos quiméricos (por ejemplo, anticuerpos humanizados y PRIMATIZED™), y las inmunoadhesinas. Los "fragmentos de anticuerpo" incluyen los fragmentos Fv, Fv', Fab, Fab', y F(ab')_{2}.

Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, de roedor o primate) son inmunoglobulinas quiméricas específicas, cadenas de inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas que contienen una secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en el que residuos de una región determinante de la complementariedad (CDR) del receptor se remplazan con residuos procedentes de una CDR de una especie no humana (anticuerpo donante), tal como el ratón, rata, conejo o primate, que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseada. En algunos casos, se remplazan residuos de la región estructural (FR) Fv de la inmunoglobulina humana con los correspondientes residuos no humanos. Más aún, el anticuerpo humanizado podría comprender residuos que no se hallan ni en el anticuerpo receptor ni en las secuencias de la CDR o estructurales importadas. Estas modificaciones se hacen para refinar adicionalmente y maximizar las prestaciones del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos o al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los cuales todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana, y todas o sustancialmente todas las regiones FR son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado preferiblemente comprenderá también al menos una porción de una región constante (Fc) de inmunoglobulina, típicamente la de una inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado incluye un anticuerpo PRIMATIZED™, en donde la región unidora de antígeno del anticuerpo se deriva de un anticuerpo producido mediante la inmunización de monos macacos con el antígeno de
interés.

Un "anticuerpo multiespecífico" es una molécula que tienen especificidades de unión por al menos dos antígenos diferentes. Mientras que tales moléculas sólo unirán dos antígenos (es decir, anticuerpos biespecíficos, BsAbs), los anticuerpos con especificidades adicionales, tales como los anticuerpos triespecíficos, están abarcados por esta expresión cuando se usa en ésta. Los ejemplos de BsAbs incluyen aquéllos con un brazo dirigido contra un antígeno de célula tumoral y el otro brazo dirigido contra una molécula activadora citotóxica, tal como el anti-Fc\gammaRI/anti-CD15, el anti-p185^{HER2}/Fc\gammaRIII (CD16), el anti-CD3/anti-célula B cancerosa (1D10), el anti-CD3/anti-p185^{HER2}, el anti-CD3/anti-p97, el anti-CD3/anti-carcinoma de célula renal, el anti-CD3/anti-OVCAR-3, el anti-CD3/L-D1 (anti-carcinoma de colon), el anti-CD3/anti-análogo de la hormona estimuladora de melanocito, el anti-receptor del ECG/anti-CD3, el anti-CD3/anti-CAMA1, el anti-CD3/anti-CD19, el anti-CD3/MoV18, el anti-molécula de adhesión de célula neural (NCAM)/anti-CD3, el anti-proteína unidora de folato (FBP)/anti-CD3, el anti-pan antígeno asociado con carcinoma (AMOC-31)/anti-CD3; los BsAbs con un brazo que se une específicamente a un antígeno tumoral y un brazo que se une a una toxina, tales como el anti-saporina/anti-Id-1, el anti-CD22/anti-saporina, el anti-CD7/anti-saporina, el anti-CD38/anti-saporina, el anti-CEA/anti-cadena A de ricina, el anti-interferón-\alpha (IFN-\alpha)/anti-idiotipo de hibridoma, el anti-CEA/anti-alcaloide de vinca; los BsAbs para convertir prodrogas activadas por enzima, tales como el anti-CD30/anti-fosfatasa alcalina (el cual cataliza la conversión de la prodroga mitomicina fosfato a mitomicina alcohol); los BsAbs que pueden usarse como agentes fibrinolíticos, tales como el anti-fibrina/anti-activador del plasminógeno de tejido (tPA), el anti-fibrina/anti-activador del plasminógeno del tipo uroquinasa (uPA); los BsAbs para apuntar complejos inmunes hacia receptores de la superficie celular, tales como el anti-lipoproteína de baja
densidad (LDL)/anti-receptor de Fc (por ejemplo, Fc\gammaRI, Fc\gammaRII o Fc\gammaRIII); los BsAbs para uso en terapia de enfermedades infecciosas, tales como el anti-CD3/anti-virus del herpes simplex (HSV), anti-complejo receptor de la célula T:CD3/anti-gripe, anti-Fc\gammaR/anti-VIH; los BsAbs para la detección de tumores in vitro o in vivo, tales como el anti-CEA/anti-EOTUBE, el anti-CEA/anti-DPTA, el anti-p185^{HER2}/anti-hapteno; los BsAbs como adyuvantes de vacunas (ver Fanger et al., supra); y los BsAbs como herramientas diagnósticas, tales como el anti-IgG de conejo/anti-ferritina, el anti-peroxidasa del rábano silvestre (HRP)/anti-hormona, el anti-somatostatina/anti-sustancia
P, el anti-HRP/anti-FITC, el anti-CEA/anti-\beta-galactosidasa (ver Nolan et al., supra). Los ejemplos de anticuerpos triespecíficos incluyen el anti-CD3/anti-CD4/anti-CD37, el anti-CD3/anti-CD5/anti-CD37 y el anti-CD3/anti-CD8/
anti-CD37.

Tal como se usa en ésta, el término "inmunoadhesina" designa moléculas parecidas a anticuerpos, las cuales combinan el "dominio unidor" de una proteína heteróloga (una "adhesina", por ejemplo, un receptor, ligando o enzima) con las funciones efectoras del dominio constante de inmunoglobulina. Estructuralmente, las inmunoadhesinas comprenden una fusión de la secuencia de aminoácidos de la adhesina con la especificidad de unión deseada, la cual es distinta de la del sitio de reconocimiento y unión del antígeno (sitio de combinación con antígeno) de un anticuerpo (es decir, es "heteróloga"), y una secuencia de dominio constante de inmunoglobulina. La secuencia del dominio constante de inmunoglobulina en la inmunoadhesina podría obtenerse de cualquier inmunoglobulina, tal como los subtipos IgG_{1}, IgG_{2}, IgG_{3}, o IgG_{4}, la IgA, la IgE, la IgD o la IgM.

El término "dominio unidor de ligando" tal como se usa en ésta se refiere a cualquier receptor de superficie celular nativo, o a cualquier región o derivado del mismo que retiene al menos una capacidad de unión de ligando cualitativa, y preferiblemente la actividad biológica de un receptor nativo correspondiente. En una realización específica, el receptor procede de un polipéptido de superficie celular que tiene un dominio extracelular que es homólogo con un miembro de la superfamilia inmunoglobulina. Otros receptores típicos, que no son miembros de la superfamilia de genes de inmunoglobulina, pero que, sin embargo, están específicamente abarcados por esta definición, son los receptores de citoquinas, y en particular los receptores con actividad quinasa de tirosinas (receptores quinasas de tirosina), los miembros de las superfamilias de la hematopoyetina y del receptor del factor de crecimiento del nervio, y las moléculas de adhesión celular, por ejemplo, las (E-, L- y P-) selectinas.

El término "dominio unidor de receptor" se usa para designar cualquier ligando nativo para un receptor, incluyendo las moléculas de adhesión celular, o cualquier región o derivado de tal ligando nativo que retiene al menos una capacidad cualitativa de unión de receptor, y preferiblemente la actividad biológica de un ligando nativo correspondiente. Esta definición, entre otras, incluye específicamente las secuencias unidoras procedentes de ligandos para los receptores antes mencionados.

Tal como se usa en ésta, la frase "inmunoadhesina multiespecífica" designa inmunoadhesinas (tal como se han definido en ésta más arriba) que tienen al menos dos especificidades de unión (es decir, que combinan dos o más dominios unidores de adhesina). Las inmunoadhesinas multiespecíficas pueden ensamblarse como heterodímeros, heterotrímeros o heterotetrámeros, esencialmente tal como se descubre en WO 89/02922 (publicada el 6 de abril de 1989), en EP 314.317 (publicada el 3 de mayo de 1989), y en la patente estadounidenses nº 5.116.964 concedida el 2 de mayo de 1992. Las inmunoadhesinas multiespecíficas preferidas son biespecíficas. Los ejemplos de inmunoadhesinas biespecíficas incluyen la IgG-CD4/IgG-receptor del TNF y la IgG-CD4/IgG-L-selectina. La última molécula mencionada combina la función unidora de nódulo linfático del receptor de asentamiento (LHR, L-selectina), y la función de unión del CD4 del VIH, y halla aplicación potencial en la prevención o tratamiento de la infección por VIH, en condiciones relacionadas, o como un diagnóstico.

Una "quimera de anticuerpo-inmunoadhesina (quimera Ab/Ia)" comprende una molécula que combina al menos un dominio unidor de un anticuerpo (tal como se define en ésta) con al menos una inmunoadhesina (tal como se define en esta solicitud). Las quimeras Ab/Ia ilustrativas son las quimeras CD4-IgG biespecíficas descritas por Berg et al., supra, y Chamow et al., supra.

La "interfaz" comprende aquellos residuos aminoácidos de "contacto" (u otros grupos que no son aminoácidos, tales como los grupos carbohidratos, NADH, biotina, FAD o grupo hemo) en el primer polipéptido que interaccionan con uno o más residuos aminoácidos de "contacto" (u otros grupos que no son aminoácidos) en la interfaz del segundo polipéptido. La interfaz preferida es un dominio de una inmunoglobulina tal como un dominio variable o dominio constante (o regiones de los mismos), sin embargo, la interfaz entre los polipéptidos que forman un receptor heteromultimérico o la interfaz entre dos o más ligandos tales como el NFG, NT-3 y BDNF, se incluyen dentro del ámbito de este término. La interfaz preferida comprende el domino C_{H}3 de una inmunoglobulina, la cual preferiblemente se deriva de un anticuerpo IgG, y más preferible de un anticuerpo IgG humano.

Un residuo aminoácido "original" es uno que es remplazado por un residuo "importado", el cual puede tener un volumen de cadena lateral menor o mayor que el del residuo original. El residuo aminoácido importado puede ser un residuo aminoácido que ocurre de forma natural o no natural, pero preferiblemente es el primero. Los residuos aminoácidos que "ocurren de forma natural" son aquellos residuos codificados por el código genético y listados en la Tabla 1 de la PCT/US96/01598, incorporada en ésta por referencia en su totalidad. Por residuo aminoácido "que no ocurre de forma natural" se quiere indicar un residuo que no está codificado por el código genético, pero que es capaz de unir covalentemente residuos aminoácidos adyacentes en la cadena polipeptídica. Los ejemplos de residuos aminoácidos que no ocurren de forma natural son la norleucina, la ornitina, la norvalina, la homoserina, y otros análogos de residuos aminoácidos, tales como los descritos en Ellman et al., Meth. Enzym., 202:301-336 (1991), por ejemplo. Para generar tales residuos aminoácidos que no ocurren naturalmente, pueden usarse los procedimientos de Noren et al., Science, 244: 182 (1989) y Ellman et al., supra. De forma resumida, esto implica activar químicamente un ARNt supresor con un residuo aminoácido que no ocurre de forma natural, seguida por la transcripción y traducción del ARN in vitro. El procedimiento de la presente invención implica remplazar al menos un residuo aminoácido original, pero se pueden remplazar más de un residuo original. Normalmente, no más del total de residuos en la interfaz del primer y segundo polipéptido comprenderá residuos aminoácidos originales que se remplazan. Los residuos originales preferidos para la sustitución están "enterrados". Por "enterrado" se quiere indicar que el residuo es esencialmente inaccesible al solvente. El residuo importado preferido no es la cisteína para evitar la posible oxidación o emparejamiento incorrecto de puentes disulfuro.

Por "ácido nucleico original" se quiere significar el ácido nucleico que codifica un polipéptido de interés, el cual puede alterarse para codificar, dentro del dominio de multimerización, aminoácidos cuyas cadenas laterales interaccionan en la interfaz entre el primer y segundo polipéptidos, promoviendo la interacción estable entre los polipéptidos. Tales alteraciones podrían generar sin limitación interacciones estables tales como, protuberancia-dentro-de-cavidad, puentes disulfuro que no ocurren naturalmente, cremallera de leucinas, interacciones hidrofóbicas, e interacciones hidrofílicas. Preferiblemente, se escoge la alteración que promueve la interacción específica entre un primer y segundo polipéptidos de interés, y que excluye efectivamente las interacciones que resultan en emparejamiento de heterómero no deseado o en la formación de homómeros. El ácido nucleico original o de partida podría ser un ácido nucleico que ocurre naturalmente o podría comprender un ácido nucleico que se ha sometido a alteración previa (por ejemplo, un fragmento de anticuerpo humanizado). Por "alterar" el ácido nucleico se quiere indicar que el ácido nucleico original está genéticamente manipulado o mutado mediante la inserción, supresión, o sustitución de al menos un codón que codifica un residuo aminoácido de interés. Normalmente, un codón que codifica un residuo original es remplazado por un codón que codifica un residuo importado. Las técnicas para modificar genéticamente un ADN de esta forma han sido revisadas en Mutagenesis: a Practical Approach, Ed. M.J. McPherson, (IRL Press, Oxford, UK. (1991), e incluyen, por ejemplo, la mutagénesis dirigida a un sitio, la mutagénesis en casete, y la mutagénesis mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

La protuberancia, cavidad, o tiol libre (tal como un residuos cisteína para la formación de enlace disulfuro) puede "introducirse" en la interfaz del primero o segundo polipéptido mediante medios sintéticos, por ejemplo, mediante técnicas recombinantes, la síntesis de péptido in vitro, aquellas técnicas para introducir residuos aminoácidos que no ocurren naturalmente descritas previamente, mediante acoplamiento químico o enzimático de péptidos, o mediante alguna combinación de estas técnicas. En consecuencia, la protuberancia, cavidad o tiol libre que se "introduce" es "no existente de forma natural" o "no nativo", lo que significa que no existe en la naturaleza o en el polipéptido original (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal humanizado).

Preferiblemente, el residuo aminoácido importado para formar la protuberancia tiene un número de "rotámeros" relativamente pequeño (por ejemplo, aproximadamente 3-6). Un "rotámero" es una conformación energéticamente favorable de una cadena lateral de aminoácido. El número de rotámeros de los diversos residuos aminoácido está revisado en Ponders y Richards, J. Mol. Biol., 193:775-791 (1987).

Heteromultímero "aislado" significa un heteromultímero que se ha identificado y separado y/o recuperado a partir de un componente de su entorno de cultivo de células natural. Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que interferirían con los usos diagnóstico o terapéutico del heteromultímero, y podrían incluir enzimas, hormonas, y otros solutos proteicos y no proteicos. En realizaciones preferidas, el heteromultímero se purificará (1) hasta más del 95% en peso de proteína, según se determina mediante el procedimiento de Lowry, y más preferiblemente más del 99% en peso, (2) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de la secuencia de aminoácidos N-terminal o internal mediante el uso de un secuenciador de copa rotatoria, o (3) hasta la homogeneidad mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras o no reductoras usando azul de Coomassie o, preferiblemente, tinción de plata.

Los heteromultímeros de la presente invención generalmente se purifican hasta una homogeneidad sustancial. Las frases "sustancialmente homogéneo", "forma sustancialmente homogénea", y "homogeneidad sustancial" se usan para indicar que el producto carece sustancialmente de subproductos originados a partir de combinaciones de polipéptidos no deseadas (por ejemplo, los homomultímeros). Expresado en términos de pureza, homogeneidad sustancial significa que la cantidad de subproductos no excede del 10%, y preferiblemente es inferior al 5%, más preferiblemente inferior al 1%, y los más preferiblemente inferior al 0,5%, en donde los porcentajes son en peso.

La expresión "secuencias de control" se refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia codificante operativamente unida, en un organismo huésped. Las secuencias de control que son apropiadas para las procariotas incluyen, por ejemplo, un promotor, opcionalmente una secuencia de operador, un sitio de unión de ribosoma, y, posiblemente, otras secuencias aún poco comprendidas. Se sabe que las células eucariotas utilizan promotores, señales de poliadenilación, y potenciadores.

Un ácido nucleico está "unido operativamente" cuando está colocado en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN para una pre-secuencia o líder secretor está unido operativamente al ADN de un polipéptido si se expresa como una pre-proteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador está unido operativamente a una secuencia codificante si afecta la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión de ribosoma está unido operativamente a una secuencia codificante si está posicionado con objeto de facilitar la traducción. Generalmente, "unido operativamente" significa que las secuencias de ADN que están unidas son contiguas y, en el caso de un líder secretor, contiguas y en fase de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen porque ser contiguos. La unión se consigue mediante ligación en los sitios de restricción apropiados. Si tales sitios no existen, se usan adaptadores o eslabones de oligonucleótidos sintéticos de acuerdo con la práctica convencional.

II. Preparación del heteromultímero 1. Preparación de los materiales de partida

Normalmente, el ácido nucleico que codifica estos polipéptidos debe aislarse para que pueda alterarse para codificar la protuberancia o cavidad, o ambas, tal como se definen en ésta. Sin embargo, las mutaciones pueden introducirse usando medios sintéticos, por ejemplo, usando un sintetizador de péptidos. También, en el caso en que el residuo importado es un residuo que no ocurre de forma natural, está disponible el procedimiento de Noren et al., supra, para construir polipéptidos que tienen tales sustituciones. Adicionalmente, parte del heteromultímero se prepara convenientemente de forma recombinante en el cultivo de células, y otra(s) parte(s) de la molécula se prepara(n) mediante aquellas técnicas mencionadas más arriba.

A continuación siguen las técnicas para aislar anticuerpos y preparar inmunoadhesinas. Sin embargo, se apreciará que el heteromultímero puede formarse a partir, o incorporar, otros polipéptidos usando técnicas que son conocidas en el campo. Por ejemplo, el ácido nucleico que codifica el polipéptido de interés (por ejemplo, un ligando, receptor o enzima) puede aislarse de una biblioteca de ADNc preparada a partir de un tejido que se cree posee el ARNm del polipéptido, y para expresarlo a un nivel detectable. Las bibliotecas se examinan con sondas (tales como anticuerpos u oligonucleótidos de aproximadamente 20-80 bases) diseñadas para identificar el gen de interés o la proteína codificada por éste. El examen de la biblioteca de ADNc o genómica con la sonda seleccionada podría realizarse usando procedimientos estándares, tal como se describe en los capítulos 10-12 de Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Nueva York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).

(i) Preparación de anticuerpo

Se han descrito varias técnicas para la producción de anticuerpos, las cuales incluyen el procedimiento tradicional del hibridoma para preparar anticuerpos monoclonales, las técnicas recombinantes para preparar anticuerpos (incluyendo los anticuerpos quiméricos, por ejemplo, anticuerpos humanizados), la producción de anticuerpos en animales transgénicos, y la tecnología de exhibición en fagos recientemente descrita para preparar anticuerpos "completamente humanos". Estas técnicas se describirán brevemente más abajo.

Los anticuerpos policlonales contra el antígeno de interés pueden generarse en animales mediante múltiples inyecciones subcutáneas (sc) o intraperitoneales (ip) del antígeno y un adyuvante. Podría ser útil conjugar el antígeno (o un fragmento que contiene la secuencia de aminoácidos diana) con una proteína que es inmunogénica en la especie a inmunizar, por ejemplo, la hemocianina de lapa con forma de ojo de cerradura, la albúmina de suero, la tiroglobulina bovina, o el inhibidor de tripsina de soja, usando un agente bifuncional o derivatizador, por ejemplo, el éster maleimidobenzoil-sulfosuccinimida (conjugación a través de residuos cisteína), el anhídrido de glutaraldehído succínico, el SOCl_{2}, o el R^{1}N=C=NR, en donde R y R^{1} son grupos alquilo diferentes. Los animales se inmunizan contra los conjugados o derivados inmunogénicos combinando 1 mg o 1 \mug de conjugado (para conejos o ratones, respectivamente) con 3 volúmenes de adyuvante completo de Freund, e inyectando la solución intradérmicamente en múltiples sitios. Un mes más tarde, los animales se estimulan con de 1/5 a 1/10 de la cantidad original de conjugado en adyuvante completo de Freund mediante inyección subcutánea en múltiples sitios. De 7 a 14 días más tarde, se sangran los animales y se ensaya el título de anticuerpo en el suero. Los animales se estimulan hasta que el título se estabiliza. Preferiblemente, el animal se impulsa con el conjugado del mismo antígeno, pero conjugado con una proteína diferente y/o a través de reactivos de entrecruzado diferentes. Los conjugados pueden prepararse también en cultivo de células recombinantes como
proteínas de fusión. También, se usan agentes de agregación, tales como el alum, para potenciar la respuesta inmune.

Los anticuerpos monoclonales se obtienen a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea usando el procedimiento del hibridoma, descrito primero por Kohler y Milstein, Nature, 256:495 (1975), o podrían prepararse mediante procedimientos de ADN recombinante (Cabilly et al., patente estadounidense nº 4.816.567). En el procedimiento del hibridoma, una ratón, u otro animal huésped apropiado, tal como un ratón, se inmuniza tal como se ha descrito en ésta más arriba, para elicitar linfocitos que producen, o son capaces de producir, anticuerpos que se unirán específicamente a la proteína usada para la inmunización. Alternativamente, los linfocitos podrían inmunizarse in vitro. Los linfocitos se fusionan a continuación con células de mieloma usando un agente de fusión apropiado, tal como el polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)). Las células de hibridoma preparadas de este modo se siembran y cultivan en un medio de cultivo apropiado que preferiblemente contiene una o más sustancias que inhiben el crecimiento o supervivencia de las células de mieloma progenitoras no fusionadas. Por ejemplos, si las células progenitoras carecen del enzima fosforibosil transferasa de hipoxantina guanina (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas típicamente incluirá hipoxantina, aminopterina y timidina (medio HAT), sustancias que impiden el crecimiento de las células deficientes en HGPRT. Las células de mieloma preferidas son aquéllas que se fusionan eficientemente, soportan una expresión de anticuerpo estable con nivel elevado por parte de las células productoras de anticuerpo seleccionadas, y son sensibles a un medio tal como el medio HAT. Entre estas, las líneas celulares de mieloma preferidas son las líneas de mieloma de ratón, tales como las derivadas de los tumores de ratón MOPC-21 y MPC-11, disponibles en el Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, CA, EE.UU., y las células SP-2 disponibles en la American Type Culture Collection, Rockville, MD, EE.UU. También se han descrito líneas celulares de mieloma humanas y heteromieloma de ratón-humanas para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); y Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.51-63, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1987). Ver, también, Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991) y la WO 91/17769, publicada el 28 de noviembre de 1991, sobre técnicas para la producción de anticuerpos monoclonales humanos. El medio de cultivo en el que crecen las células de hibridoma se ensaya en busca de producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno de interés. Preferiblemente, la especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos por las células de hibridoma se determina mediante inmunoprecipitación o mediante un ensayo de unión in vitro, tal como el radioinmunoensayo (RIA) o el ensayo inmunoabsorbente unido a enzima (ELISA). La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal puede, por ejemplo, determinarse mediante el análisis Scatchard de Munson y Pollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980). Una vez se han identificado células de hibridoma que producen anticuerpos con la especificidad, afinidad y/o actividad deseada, los clones podrían subclonarse mediante procedimientos de dilución limitante y cultivarse mediante procedimientos estándares. Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-104 (Academic Press, 1986). Los medios de cultivo apropiados para este propósito incluyen, por ejemplo, el medio de Eagle modificado por Dulbecco, o el medio RPMI-1640. Además, las células de hibridoma podrían crecer in vivo en tumores ascites en un animal. Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se separan convenientemente del medio de cultivo, fluido de ascites, o suero, mediante procedimientos convencionales de purificación de inmunoglobulina, tales como, por ejemplo, la Proteína A-Sepharose, la cromatografía con hidroxilapatito, la electroforesis en gel, la diálisis, o la cromatografía de afinidad.

Alternativamente, ahora es posible producir animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que son capaces, a partir de su inmunización, de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de producción endógena de inmunoglobulina. Por ejemplo, se ha descrito que la supresión homocigótica del gen de la región unidora de la cadena pesada (J_{H}) de anticuerpo en ratones quiméricos y mutantes de la línea germinal, resulta en la inhibición completa de la producción endógena de anticuerpos. La transferencia del conjunto de genes de la inmunoglobulina de la línea germinal humana en tales ratones mutantes de la línea germinal resultará en la producción de anticuerpos humanos a partir del desafío con antígeno. Ver, por ejemplo, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551-255 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Fishwild, D.M., et al., Nat. Biotech, 14:845-851 (1996); y Mendez, M.J., et al., Nat. Genetics, 15:146-156 (1997)).

En una realización adicional, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo pueden aislarse a partir de bibliotecas de anticuerpos en fagos generadas usando las técnicas descritas en McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990), usando el antígeno de interés para seleccionar un anticuerpo o fragmento de anticuerpo apropiado. Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991) describen el aislamiento de anticuerpos de ratón y humanos, respectivamente, usando bibliotecas de fagos. Las publicaciones siguientes describen la producción de anticuerpos humanos de elevada afinidad (en el rango nM) mediante reordenación de la cadena (Mark et al., Bio/Technol., 10:779-783 (1992)), así como mediante infección combinatoria y recombinación in vivo como una estrategia para construir bibliotecas en fagos muy extensas (Waterhouse et al., Nuc. Acids Res., 21:2265-2266 (1993); Griffiths, A.D., et al., EMBO J., 13:3245-3260 (1994); y Vaughan, et al., (1996), supra). Por tanto, estas técnicas son alternativas viables a las técnicas tradicionales del hibridoma de anticuerpo monoclonal para el aislamiento de anticuerpos "monoclonales" (especialmente anticuerpos humanos), los cuales están abarcados por la presente invención.

El ADN que codifica los anticuerpos de la invención se aisla y secuencia fácilmente usando procedimientos convencionales (por ejemplos, usando sondas de oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos de ratón). Las células de hibridoma de la invención sirven como una fuente preferida de tal ADN. Una vez aislado, el ADN podría colocarse en vectores de expresión, los cuales se transfectan dentro de células huéspedes tales como las células COS de simios, las células ovárica de hámster chino (CHO), o células de mieloma que de otro modo no producen proteína inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células huéspedes recombinantes. El ADN también podría modificarse, por ejemplo, sustituyendo la secuencia codificante de los dominios constantes de cadenas pesada y ligera humanas en lugar las secuencias de ratón homólogas, Morrison et al., Proc. Nat. Acad. Sci., 81:6851 (1984). De esta manera, se preparan anticuerpos "quiméricos" que tienen la especificidad de unión de un anticuerpo monoclonal anti-antígeno en ésta.

Los procedimientos para humanizar anticuerpos no humanos son bien conocidos en la técnica. Generalmente, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos aminoácidos introducidos dentro de él y procedentes de una fuente que no es humana. La humanización puede realizarse esencialmente siguiendo el procedimiento de Winter y colaboradores (Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)), sustituyendo secuencias de CDR o CDRs de roedor en lugar de las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. De acuerdo con esto, tales anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (Cabilly, supra), en donde sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto ha sido sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son típicamente anticuerpos humanos en los que algunos residuos CDR, y posiblemente algunos residuos FR, se sustituyen por residuos procedentes de sitios análogos en anticuerpos de roedor. Es importante que los anticuerpos se humanicen con retención de la elevada afinidad por el antígeno y otras propiedades biológicas favorables. Para conseguir este objetivo, de acuerdo con un procedimiento preferido, los anticuerpos humanizados se preparan mediante un proceso de análisis de las secuencias progenitoras y de varios productos humanizados conceptuales usando modelos tridimensionales de las secuencias progenitora y humanizada. Los modelos tridimensionales de inmunoglobulina son familiares a los especialistas en la técnica. Hay disponibles programas de ordenador que ilustra y muestran estructuras conformacionales tridimensionales probables de las secuencias de inmunoglobulina candidatas seleccionadas. La inspección de estas presentaciones permite el análisis del probable rol de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de los residuos que influyen la capacidad de la inmunoglobulina candidata para unirse a su antígeno. De esta forma, pueden seleccionarse y combinarse residuos FR procedentes de la secuencia consenso e importada, de forma que se consiga la característica del anticuerpo deseada, tal como una afinidad incrementada
por el(los) antígeno(s) diana. Para más detalles, consultar WO 92/22653, publicada el 23 de diciembre de 1992.

(ii) Preparación de inmunoadhesina

Las inmunoglobulinas (Ig) y ciertas variantes de las mismas son conocidas, y muchas se han preparado en cultivos de células recombinantes. Por ejemplo, ver la patente estadounidense nº 4.745.055; la EP-256.654; Faulkner et al., Nature, 298:286 (1982); EP 120,694; EP 125,023; Morrison, J. Immun., 123:793 (1979); Kohler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:2197 (1980); Raso et al., Cancer Res., 41:2073 (1981); Morrison et al., Ann. Rev. Immunol., 2:239 (1984); Morrison, Science, 229:1202 (1985); Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984); la EP-255.694; la EP-266.663; y la WO88/03559. También se conocen las cadenas de inmunoglobulina reordenadas. Ver, por
ejemplo, la patente estadounidense nº 4.444.878; la WO88/03565; y la EP-68.763, y las referencias citadas en éstas.

Las quimeras construidas a partir de una secuencia de dominio unidor de adhesina unida a una secuencia de dominio constante de inmunoglobulina apropiado (inmunoadhesinas) son conocidas en la técnica. Las inmunoadhesinas mencionadas en la literatura incluyen fusiones del receptor de la célula T (Gascoigne et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:2936-2940 (1987)); del CD4 (Capon et al., Nature, 337:525-531 (1989); Traunecker et al., Nature, 339:68-70 (1989); Zettmeissl et al., DNA Cell Biol. USA, 9:347-353 (1990); y Byrn et al., Nature, 344:667-670 (1990)); de L-selectina (receptor de asentamiento) (Watson et al., J. Cell. Biol., 110:2221-2229 (1990); y Watson et al., Nature, 349:164-167 (1991)); del CD44 (Aruffo et al., Cell, 61:1303-1313 (1990)); del CD28 y B7 (Linsley et al., J. Exp. Med., 173:721-730 (1991)); del CTLA-4 (Lisley et al., J. Exp. Med., 174:561-569 (1991)); del CD22 (Stamenkovic et al., Cell, 66:1133-1144 (1991)); del receptor del TNF (Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:10535-10539 (1991); Lesslauer et al., Eur. J. Immunol., 27:2883-2886 (1991); y Peppel et al., J. Exp. Med., 174:1483-1489 (1991)); y del receptor \alpha de la IgE (Ridgway y Gorman, J. Cell. Biol., volumen 115, resumen nº 1448 (1991)).

El diseño de inmunoadhesina más simple y sencillo combina el(los) dominio(s) de unión de la adhesina (por ejemplo, el dominio extracelular (ECD) de un receptor) con las regiones bisagra y Fc de una cadena pesada de inmunoglobulina. Ordinariamente, cuando se preparan las inmunoadhesinas de la presente invención, el ácido nucleico que codifica el dominio unidor de la adhesina se fusionará de forma C-terminal con el ácido nucleico que codifica el extremo N-terminal de una secuencia de dominio constante de inmunoglobulina, no obstante, también son posibles las fusiones N-terminales.

Típicamente, en tales fusiones, el polipéptido quimérico codificado retendrá al menos los dominios bisagra, C_{H}2 y C_{H}3 funcionalmente activos de la región constante de una cadena pesada de inmunoglobulina. Las fusiones también se hacen con el extremo C-terminal de la porción Fc de un dominio constante, o inmediatamente N-terminales respecto el C_{H}1 de la cadena pesada o de la región correspondiente en la cadena ligera. El sitio preciso en el que se hace la fusión no es crítico; hay sitios particulares bien conocidos y podrían seleccionarse con objeto de optimizar la actividad biológica, la secreción, o las características unidoras de la Ia.

En una realización preferida, la secuencia de adhesina se fusiona al extremo N-terminal del dominio Fc de la inmunoglobulina G (IgG_{1}). Es posible fusionar en su totalidad la región constante de la cadena pesada. No obstante, más preferiblemente, se usa en la fusión una secuencia que empieza en la región bisagra, justo cadena arriba del sitio de corte con papaína que define químicamente la Fc de la IgG (es decir, el residuos 216, considerando que el primer residuo de la región constante de la cadena pesada es el 114), o sitios análogos de otras inmunoglobulinas. En una realización particularmente preferida, la secuencia de aminoácidos de la adhesina se fusiona a (a) la región bisagra y a los dominios C_{H}2 y C_{H}3 o (b) a los dominios C_{H}1, bisagra, C_{H}2 y C_{H}3, de una cadena pesada de IgG_{1}, IgG_{2}, o IgG_{3}. El sitio preciso
en el que se realiza la fusión no es crítico, y el sitio óptimo puede determinarse mediante experimentación de rutina.

Para las inmunoadhesinas biespecíficas, las inmunoadhesinas se ensamblan como multímeros y, particularmente, como heterodímeros o heterotetrámeros. Generalmente, estas inmunoglobulinas ensambladas tendrán estructuras unidad conocidas. Una unidad estructural básica de cuatro cadenas es la forma en que las IgG, IgD, e IgE existen. Una unidad de cuatro cadenas se repite en las inmunoglobulinas de peso molecular más elevado; la IgM generalmente existe como un pentámero de cuatro unidades básicas mantenidas juntas mediante enlaces disulfuro. La globulina IgA, y ocasionalmente la globulina IgG, podrían existir también en forma multimérica en el suero. En el caso del multímero, cada una de las cuatro unidades podría ser la misma o diferente.

Más abajo se representan esquemáticamente varias inmunoadhesinas ensambladas ilustrativas dentro del ámbito de ésta:

(a)

AC_{L}-AC_{L};

(b)

AC_{H}-[AC_{H}, AC_{L}-AC_{H}, AC_{L}-V_{H}C_{H}, o V_{L}C_{L}-AC_{H}];

(c)

AC_{L}-AC_{H}-[AC_{L}-AC_{H}, AC_{L}-V_{H}C_{H}, V_{L}C_{L}-AC_{H}, o V_{L}C_{L}-V_{H}C_{H}];

(d)

AC_{L}-V_{H}C_{H}-[AC_{H}, o AC_{L}-V_{H}C_{H}, o V_{L}C_{L}-AC_{H}];

(e)

V_{L}C_{L}-AC_{H}-[AC_{L}-V_{H}C_{H}, o V_{L}C_{L}-AC_{H}]; y

(f)

[A-Y]_{n}-[V_{L}C_{L}-V_{H}C_{H}]_{2},

en donde,

cada A representa secuencias de aminoácidos de adhesinas idénticas o diferentes;

V_{L} es un dominio variable de cadena ligera de inmunoglobulina;

V_{H} es un dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina;

C_{L} es un dominio constante de cadena ligera de inmunoglobulina;

C_{H} es un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina;

n es un entero mayor que 1;

Y designa el residuo de un agente entrecruzador covalente.

En interés de la brevedad, las estructuras anteriores sólo muestran características clave; y no indican el dominio de unión (J) u otros dominios de las inmunoglobulinas, ni se muestran los enlaces disulfuro. Sin embargo, cuando tales dominios son necesarios para la actividad de unión, debería construirse para que estén presentes en las ubicaciones ordinarias que ocupan en las moléculas de inmunoglobulina.

Alternativamente, las secuencias de adhesina pueden insertarse entre secuencias de la cadena pesada de inmunoglobulina y de la cadena ligera, de tal forma que se obtenga una inmunoglobulina que comprende una cadena pesada quimérica. En esta realización, las secuencias de adhesina se fusionan al extremo 3' de una cadena pesada de inmunoglobulina en cada brazo de una inmunoglobulina, bien entre la bisagra y el dominio C_{H}2, o entre los dominios C_{H}2 y C_{H}3. Construcciones similares han sido descritas por Hoogenboom, et al., Mol. Immunol., 28:1027-1037
(1991).

Una cadena ligera de inmunoglobulina podría estar presente, bien asociada covalentemente con un polipéptido de fusión de adhesina-cadena pesada de inmunoglobulina, o fusionada directamente a la adhesina. En el primer caso, el ADN que codifica una cadena ligera de inmunoglobulina se expresa típicamente con el ADN que codifica la proteína de fusión adhesina-cadena pesada de inmunoglobulina. A partir de la secreción, la cadena pesada hídrida y la cadena ligera se asociarán covalentemente para proporcionar una estructura similar a inmunoglobulina que comprende dos pares de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina unidos. Los procedimientos apropiados para la preparación de tales estructuras se descubren, por ejemplo, en la patente estadounidense nº 4.816.567, concedida el 28 de marzo de 1989.

En una realización preferida, las secuencias de inmunoglobulina usadas en la construcción de las inmunoadhesinas de la presente invención proceden de un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina. Para las inmunoadhesinas humanas, se prefiere el uso de secuencias de inmunoglobulinas humanas IgG_{1} e IgG_{3}. Una ventaja principal de usar la IgG_{1} es que las inmunoadhesinas de IgG_{1} pueden purificarse eficientemente sobre Proteína A inmovilizada. Por contra, la purificación de la IgG_{3} requiere Proteína G, un medio significativamente menos versátil. Sin embargo, deberían considerarse otras propiedades estructurales y funcionales de las inmunoglobulinas cuando se escogen la pareja de fusión de la Ig para una construcción de inmunoadhesina determinada. Por ejemplo, la bisagra de IgG_{3} es más larga y flexible, de forma que puede acomodar dominios "adhesina" mayores que podrían no plegarse o funcionar correctamente cuando se fusionan a IgG_{1}. Otra consideración podría ser la valencia; las inmunoadhesinas de IgG son homodímeros bivalentes, mientras que los subtipos de Ig como la IgA e IgM podrían dar lugar respectivamente a estructuras diméricas o pentaméricas, de la unidad de homodímero de Ig básica. Para las inmunoadhesinas diseñadas para una aplicación in vivo, las propiedades farmacocinéticas y las funciones efectoras especificadas por la región Fc son también importantes. Aunque la IgG_{1}, IgG_{2} e IgG_{4} tiene todas vidas medias de 21 días, sus potencias relativas para activar el sistema de complemento son diferentes. La IgG_{4} no activa el complemento, y la IgG_{2} es significativamente más débil en la activación del complemento que la IgG_{1}. Más aún, a diferencia de la IgG_{1}, la IgG_{2} no se une a receptores Fc sobre células monoclonales o neutrófilos. Mientras que la IgG_{3} es óptima para la activación del complemento, su vida media in vivo es aproximadamente una tercera parte de la de los otros isotipos de IgG. Otra consideración importante, para las inmunoadhesinas diseñadas para usarse como compuestos terapéuticos humanos, es el número de variantes alotípicas del isotipo concreto. En general, se prefieren los isotipos de IgG con menos alotipos definidos serológicamente. Por ejemplo, la IgG_{1} sólo tiene cuatro sitios alotípicos definidos serológicamente, dos de los cuales (G1m y 2) se localizan en la región Fc; y uno de estos sitios, G1m1, no es inmunogénico. Por contra, hay 12 alotipos definidos serológicamente en IgG3, todos los cuales están en la región Fc; sólo tres de estos sitios (G3 m5, 11 y 21) tienen un alotipo que no es inmunogénico. Por tanto, la inmunogenicidad potencial de una inmunoadhesina de \gamma3 es mayor que la de una inmunoadhesina de \gamma1.

Las inmunoadhesinas se construyen de forma más conveniente fusionando la secuencia de ADNc que codifica la porción adhesina en pauta con una secuencia de ADNc de Ig. No obstante, también puede usarse la fusión con fragmentos de Ig genómicos (ver, por ejemplo, Gascoigne et al., supra; Aruffo et al., Cell, 61:1303-1313 (1990); y Stamenkovic et al., Cell, 66:1133-1144 (1991)). El último tipo de fusión requiere la presencia de secuencias reguladoras de la Ig para la expresión. Los ADNc que codifican regiones constantes de cadena pesada pueden aislarse en base a secuencia publicadas procedentes de bibliotecas de ADNc derivadas de bazo o de linfocitos de sangre periférico, mediante técnicas de hibridación o de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Los ADNc que codifican la "adhesina" y las partes de Ig de la inmunoadhesina se insertan en tándem dentro de un vector plasmídico que dirige la expresión eficiente en las células huésped escogidas.

2. Generando la protuberancia y/o cavidad

Como primer paso para seleccionar residuos originales para formar la protuberancia y/o cavidad, se obtiene la estructura tridimensional del heteromultímero usando técnicas que son bien conocidas en la técnica, tales como la cristalografía de rayos X o la RMN. En base a la estructura tridimensional, aquéllos especialistas en el campo serán capaces de identificar los residuos de la interfaz.

La interfaz preferida es el dominio C_{H}3 de un dominio constante de inmunoglobulina. Los residuos de la interfaz de los dominios C_{H}3 de IgG, IgA, IgD, IgE e IgM han sido identificados (ver, por ejemplo, la PCT/US96/01598, incorporada en ésta por referencia en su totalidad), incluyendo aquellos que son óptimos para remplazar con residuos importados; como se identificaron los residuos de la interfaz de varios subtipos de la IgG y los residuos "enterrados". La base para manipular la interfaz de C_{H}3 es que la cristalografía de rayos X ha demostrado que la asociación intermolecular entre las cadenas pesadas de la IgG_{1} humana en la región Fc incluye la extensa interacción proteína/proteína entre dominios C_{H}3, mientras que los dominios C_{H}2 interaccionan a través de sus carbohidratos (Deisenhofer, Biochem. 20:2361-2370 (1981)). Además, hay dos enlaces disulfuro entre cadenas pesadas que se forman eficientemente durante la expresión del anticuerpo en células de mamífero, a menos que se trunque la cadena pesada para suprimir los dominios C_{H}2 y C_{H}3 domains (King et al., Biochem. J., 281:317 (1992)). Por tanto, el ensamblaje de la cadena pesada parece promover la formación de enlaces disulfuro en vez de lo contrario Considerados en conjunto, estos datos estructurales y funcionales condujeron a la hipótesis de que la asociación de la cadena pesada del anticuerpo está dirigida por los dominios C_{H}3. Se especuló además, que la interfaz entre dominios C_{H}3 podría manipularse para promover la formación de heteromultímeros de diferentes cadenas pesada y perjudicar el ensamblaje de los correspondientes homomultímeros. Los experimentos descritos en ésta demostraron que era posible promover la formación de heteromultímeros respecto los homomultímeros usando esta estrategia. Por tanto, es posible generar un polipéptido de fusión, que comprende un polipéptido de interés y el dominio C_{H}3 de un anticuerpo, para formar un primer o segundo polipéptido. El dominio C_{H}3 preferido se deriva de un anticuerpo IgG, tal como una IgG_{1} humana.

Aquellos residuos de la interfaz que pueden constituir potencialmente candidatos para la formación de protuberancia o cavidad se identifican. Es preferible seleccionar residuos "enterrados" para la sustitución. Para determinar si un residuo está enterrado, puede usarse el programa de accesibilidad a la superficie de Lee et al., J. Mol. Biol., 55:379-400 (1971) para calcular la accesibilidad al solvente (SA) de los residuos en la interfaz. Entonces, el SA para los residuos de cada uno de los polipéptidos primero y segundo puede calcularse por separado después de retirar el otro polipéptido. La diferencia en SA de cada residuo entre las formas monómero y dímero de la interfaz puede calcularse entonces usando la ecuación: SA (dímero)-SA (monómero). Esta proporciona una lista de residuos que pierden SA con la formación del dímero. El SA de cada residuo en el dímero se compara con el SA teórico del mismo aminoácido en el tripéptido Gly-X-Gly, en donde X es el aminoácido de interés (Rose et al., Science, 229:834-838 (1985)). Los residuos que (a) pierden SA en el dímero en comparación con el monómero y (b) tienen un SA menor del 26% de aquél en su correspondiente tripéptido se consideran como residuos de la interfaz. Podrían definirse dos categorías: aquéllos que tienen un SA < 10% en comparación con su correspondiente tripéptido (es decir, los "enterrados"), y aquéllos que tienen 25% > SA > 10% en comparación con su correspondiente tripéptido (es decir, los "parcialmente enterrados") (ver la Tabla 1 siguiente).

TABLA 1

	Pérdida de SA del monómero \rightarrow dímero	% del tripéptido
Residuo nº ^{+}	Polipéptido A	Polipéptido B	Polipéptido A	Polipéptido B
Q347	22,1	31,0	25,0	26,5
Y349	79,8	83,9	5,2	5,7
L351	67,4	77,7	3,9	2,0
S354	53,4	52,8	11,3	11,7
E357	43,7	45,3	0,4	1,3
S364	21,5	15,1	0,5	1,4
T366	29,3	25,8	0,0	0,1
L368	25,5	29,7	1,0	1,1
K370	55,8	62,3	11,5	11,0
T394	64,0	58,5	0,6	1,4
V397	50,3	49,5	13,2	11,0
D399	39,7	33,7	5,7	5,7
F405	53,7	52,1	0,0	0,0
Y407	89,1	90,3	0,0	0,0
K409	86,8	92,3	0,7	0,6
T411	4,3	7,5	12,7	9,8
^{+} numeración del residuo como en la estructura del cristal de IgG (Deisenhofer, Biochemistry, 20:2361-2370 (1981)).

El efecto de remplazar residuos en la estructura de la cadena del polipéptido puede estudiarse usando un programa de modelado gráfico molecular tal como el program a Insights (Biosym Technologies). Usando el programa, aquéllos residuos enterrados en la interfaz del primer polipéptido que tienen un volumen de cadena lateral pequeño pueden cambiarse, por ejemplo, por residuos que tienen un volumen de cadena lateral mayor (es decir, protuberancia). A continuación, los residuos en la interfaz del segundo polipéptido que están en la proximidad de la protuberancia se examinan para hallar un residuo apropiado para formar la cavidad. Normalmente, este residuo tendrá un volumen elevado de cadena lateral y se sustituye con un residuo que tiene un volumen de cadena lateral menor. En ciertas realizaciones, el examen de la estructura tridimensional de la interfaz revelará una protuberancia convenientemente ubicada y dimensionada sobre la interfaz del primer polipéptido o una cavidad sobre la superficie del segundo polipéptido. En estos casos, sólo es necesario modelar un único mutante, es decir, con una protuberancia o cavidad introducida sintéticamente.

Con respecto a seleccionar residuos originales potenciales para la sustitución cuando el primero y segundo polipéptidos comprenden cada uno un dominio C_{H}3, la interfaz C_{H}3/C_{H}3 de la IgG_{1} humana implica dieciséis residuos en cada dominio, ubicados en cuatro hebras-\beta antiparalelas, las cuales entierran 1090 angstroms^{2} de cada superficie (Deisenhofer, supra) y Miller, J., Mol. Biol., 216:965 (1990)). Las mutaciones se dirigen preferiblemente a residuos localizados sobre las dos hojas-\beta antiparalelas centrales. El objetivo es minimizar el riesgo de que las protuberancias que se crean puedan acomodarse metiéndose dentro del solvente que las rodea en vez de mediante cavidades compensatorias en el dominio C_{H}3 pareja.

Una vez los residuos original/importado se han identificado mediante modelado molecular, se introducen las sustituciones de aminoácidos en el polipéptido usando técnicas bien conocidas en el campo. Normalmente el ADN que codifica el polipéptido se manipula genéticamente usando las técnicas descritas en Mutagenesis: a Practical Approach, supra.

La mutagénesis mediada por oligonucleótido es un procedimiento preferido para preparar variantes por sustitución del ADN que codifica el primer y segundo polipéptidos. Esta técnica es bien conocida en el campo, tal como fue descrita por Adelman et al., DNA, 2:183 (1983). De forma resumida, se altera el ADN de un primer y segundo polipéptidos mediante la hibridación de un oligonucleótido que codifica la mutación deseada con una plantilla de ADN, en donde la plantilla es la forma de hebra sencilla de un plásmido o bacteriófago que contiene la secuencia de ADN nativa o inalterada del heteromultímero. Después de la hibridación, se usa una polimerasa de ADN para sintetizar una segunda hebra entera complementaria de la plantilla, la cual incorporará de ese modo el cebador oligonucleótido, y codificará la alteración seleccionada en el ADN del heteromultímero.

La mutagénesis en casete puede realizarse tal como describieron Wells et al., Gene, 34:315 (1985), sustituyendo una región del ADN de interés con un fragmento mutante sintético generado mediante hibridación de oligonucleótidos complementarios. La mutagénesis mediante PCR es también apropiada para construir variantes del ADN del primer y segundo polipéptido. Mientras que la discusión siguiente se refiere al ADN, se entenderá que la técnica halla uso también con el ARN. La técnica de la PCR generalmente se refiere al procedimiento siguiente (ver Erlich, Science, 252:1643-1650 (1991), el capítulo por R. Higuchi, pp. 61-70).

Esta invención también abarca, además de las mutaciones para protuberancia o cavidad, las variantes de secuencia de aminoácido del heteromultímero, las cuales pueden prepararse introduciendo los cambios de nucleótido apropiados en el ADN del heteromultímero, o mediante la síntesis del polipéptido de heteromultímero deseado. Tales variantes incluyen, por ejemplo, las supresiones, o las inserciones o sustituciones de residuos dentro de las secuencias de aminoácido de los polipéptidos primero y segundo que forman el heteromultímero. Se hace cualquier combinación de supresión, inserción, y sustitución para llegar a la construcción final, a condición de que la construcción final posea las características de unión de antígeno deseadas. Los cambios de aminoácidos podrían alterar también los procesos post-traducción del heteromultímero, tal como cambiar el número o posición de los sitios de
glicosilación.

Un procedimiento útil para la identificación de ciertos residuos o regiones de los polipéptidos del heteromultímero que son ubicaciones preferidas para la mutagénesis se denomina "mutagénesis de barrido con alanina", tal como la describieron Cunningham y Wells, Science, 244:1081-1085 (1989). En ésta, se identifica un residuo, o grupo de residuos, diana (por ejemplo, residuos cargados tales como arg, asp, his, lys, y glu) y se remplazan con aminoácidos neutros o cargados negativamente (más preferiblemente con alanina o polialanina) para afectar la interacción de los aminoácidos con el entorno acuoso que los rodea dentro o fuera de la célula. Aquellos dominios que demuestran sensibilidad funcional a las sustituciones se refinen a continuación introduciendo variantes adicionales o distintas en o para los sitios de sustitución. Por tanto, mientras que el sitio para introducir una variación en la secuencia de aminoácidos está predeterminado, la naturaleza de la mutación per se no tiene porque estar
predeterminada.

Normalmente las mutaciones implicarán sustituciones conversadoras de aminoácidos en las regiones no funcionales del heteromultímero. Las mutaciones de ejemplo se muestran en la Tabla 2.

TABLA 2

Residuo original	Sustituciones de ejemplo	Sustituciones preferidas
Ala (A)	Val; Leu; Ile	Val
Arg (R)	Lys; Gln; Asn	Lys
Asn (N)	Gln; His; Lys; Arg	Gln
Asp (D)	Glu	Glu
Cys (C)	Ser	Ser
Gln (Q)	Asn	Asn
Glu (E)	Asp	Asp
Gly (G)	Pro; Ala	Ala
His (H)	Asn; Gln; Lys; Arg	Arg
Ile (I)	Leu; Val; Met; Ala; Phe; Norleucina	Leu
Leu (L)	Norleucina; Ile; Val; Met; Ala; Phe	Ile
Lys (K)	Arg; Gln; Asn	Arg
Met (M)	Leu; Phe; Ile	Leu
Phe (F)	Leu; Val; Ile; Ala; Tyr	Leu
Pro (P)	Ala	Ala
Ser (S)	Thr	Thr
Thr (T)	Ser	Ser
Trp (W)	Tyr; Phe	Tyr
Tyr (Y)	Trp; Phe; Thr; Ser	Phe
Val (V)	Ile; Leu; Met; Phe; Ala; Norleucina	Leu

Las modificaciones covalentes de los polipéptidos heteromultímeros se hallan dentro del ámbito de esta invención. Las modificaciones covalentes del heteromultímero pueden introducirse en la molécula haciendo reaccionar determinados residuos aminoácidos del heteromultímero o de fragmentos del mismo con un agente orgánico derivatizador que es capaz de reaccionar con cadenas laterales seleccionadas o los residuos N- o C-terminales. Otro tipo de modificación covalente del polipéptido heteromultímero incluida dentro del ámbito de esta invención comprende alterar el patrón de glicosilación nativo del polipéptido. Por alterar se quiere significar suprimir uno o más grupos carbohidrato hallados en el heteromultímero original, y/o añadir uno o más sitios de glicosilación que no están presentes en el heteromultímero original. La adición de sitios de glicosilación al polipéptido heteromultímero es consigue convenientemente alterando la secuencia de aminoácidos de tal forma que contenga uno o más sitios de glicosilación unidos a N. La alteración podría hacerse también mediante la adición de, o sustitución por, uno o más residuos serina o treonina a la secuencia del heteromultímero original (para sitios de glicosilación unidos a O). Por facilidad, la secuencia de aminoácidos del heteromultímero se altera preferiblemente a través de cambios a nivel del ADN, particularmente mediante mutación del ADN que codifica el polipéptido heteromultímero en bases preseleccionadas, de tal forma que se generan codones que se traducirán en los aminoácidos deseados. Otros medios para incrementar el número de grupos carbohidratos en el polipéptido heteromultímero es mediante el acoplamiento químico o enzimático de glicósidos al polipéptido. Estos procedimientos se describen en WO-87/05330, publicada el 11 de septiembre de 1987, y en Aplin y Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981). La supresión de grupos carbohidrato presentes sobre el heteromultímero podría conseguirse química o enzimáticamente.

Otro tipo de modificación covalente del heteromultímero comprende enlazar el polipéptido de heteromultímero a uno de una variedad de polímeros no proteicos, por ejemplo, polietilenglicol, polipropilenglicol, o poloxialquilenos, en la manera detallada en las patentes estadounidenses nº 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 o 4.179.337.

Puesto que a menudo es difícil predecir por adelantado las características de un heteromultímero variante, se apreciará que será necesario cierto examen de la variante recuperada para seleccionar la variante óptima.

3. Expresión de heteromultímero que tiene cadenas ligeras comunes

A continuación de la mutación del ADN y de la selección de la cadena ligera común tal como se describe en ésta, el ADN que codifica las moléculas se expresa usando técnicas recombinantes, las cuales están ampliamente disponibles en el campo. A menudo, el sistema de expresión escogido implicará un vector de expresión y huésped de célula de mamífero, de forma que el heteromultímero sea convenientemente glicosilado (por ejemplo, en el caso de heteromultímeros que comprenden dominios de anticuerpo que están glicosilados). Sin embargo, las moléculas pueden también producirse en los sistemas de expresión procariotas elaborados más abajo. Normalmente, la célula huésped se transformará con ADN que codifica ambos, el primer polipéptido, el segundo polipéptido, el polipéptido de la cadena ligera común, y otro(s) polipéptido(s) requerido(s) para formar el heteromultímero, en un único vector o en vectores independientes. Sin embargo, es posible expresar el primer polipéptido, el segundo polipéptido, y el polipéptido de la cadena ligera común (los componentes del heteromultímero) en sistemas de expresión independientes y acoplar in vitro los polipéptidos expresados.

Los ácidos nucleicos (por ejemplo, el ADNc o ADN genómico) que codifican el heteromultímero y la cadena ligera común se insertan dentro de un vector replicable para su clonación adicional (amplificación del ADN) o para su expresión. Hay muchos vectores disponibles. Los componentes del vector incluyen generalmente, pero no se limitan a, uno o más de los siguientes: una secuencia de señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor, y una secuencia de terminación de la transcripción.

Los polipéptidos de los componentes del heteromultímero podrían producirse como polipéptidos de fusión con una secuencia señal u otro polipéptido que tenga un sitio de corte específico en el extremo N-terminal de la proteína o polipéptido maduro. En general, la secuencia señal podría ser un componente del vector, o podría ser parte del ADN que se inserta en el vector. La secuencia señal heteróloga seleccionada preferiblemente es una que es reconocida y procesada (es decir, cortada por una peptidasa de señal) por la célula huésped. Para las células huéspedes procariotas, la secuencia señal podría sustituirse por una secuencia señal procariota seleccionada, por ejemplo, del grupo de líderes de la fosfatasa alcalina, penicilinasa, Ipp, o enterotoxina II estable al calor. Para la secreción en levaduras, la secuencia señal nativa podría sustituirse por, por ejemplo, el líder de la invertasa de levadura, el líder del factor alfa (incluyendo los líderes de los factores alfa de Saccharomyces y Kluyveromyces, éste último descrito en la patente estadounidense nº 5.010.182 concedida el 23 de abril de 1991), o el líder de la fosfatasa ácida, el líder de la glucoamilasa de C. albicans (EP-362.179, publicada el 4 de abril de 1990), o la señal descrita en WO-90/13646, publicada el 15 de noviembre de 1990. En la expresión en células de mamífero la secuencia señal nativa (por ejemplo, la pre-secuencia del anticuerpo o adhesina que normalmente dirige la secreción de estas moléculas a partir de células humanas in vivo) es satisfactoria, aunque podrían ser apropiadas otras secuencias de señal humanas así como las líderes secretoras virales, por ejemplo, la señal gD del herpes simplex. El ADN para tal región precursora se liga en pauta al ADN que codifica los polipéptidos que forman el heteromultímero.

Ambos, los vectores de expresión y clonación contienen una secuencia de ácido nucleico que permite al vector replicarse en una o más células huéspedes seleccionadas. Generalmente, en los vectores de clonación esta secuencia es una que permite al vector replicarse independientemente del ADN cromosómico del huésped, e incluye orígenes de replicación o secuencias que se replican autónomamente. Tales secuencias son bien conocidas para una variedad de bacterias, levaduras y virus. El origen de replicación del plásmido pBR322 es apropiado para la mayoría de las bacterias Gram-negativas, el origen del plásmido 2 \mu es apropiado para levaduras, y varios orígenes virales (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) son útiles para los vectores de clonación en células de mamífero. Generalmente, el componente origen de replicación no es necesario para los vectores de expresión de mamíferos (el origen del SV40 podría usarse habitualmente sólo porque contiene el promotor temprano).

Los vectores de expresión y clonación deberían contener un gen de selección, también denominado marcador seleccionable. Los genes de selección típico codifican proteínas que (a) confieren resistencia respecto antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato, o tetraciclina, (b) complementan deficiencias auxotróficas, o (c) aportan nutrientes críticos no disponibles del medio complejo, por ejemplo, el gen que codifica la racemasa de D-alanina para Bacilli. Un ejemplo de esquema de selección utiliza una droga para detener el crecimiento de una célula huésped. Aquellas célula que son transformadas exitosamente con un gen heterólogo producen una proteína que confiere resistencia a la droga y, por tanto, sobreviven el régimen de selección. Los ejemplos de tal selección dominante usan las drogas neomicina (Southern et al., J. Molec. Appl. Genet., 1:327 (1982)), ácido micofenólico (Mulligan et al., Science, 209:1422 (1980)) o higromicina (Sugden et al., Mol. Cell. Biol., 5:410-413 (1985)). Los tres ejemplos proporcionados más arriba emplean genes bacterianos bajo control eucariota para conferir resistencia a la droga apropiada, respectivamente, G418 o neomicina (geneticina), xgpt (ácido micofenólico), o higromicina.

Otro ejemplo de marcadores seleccionables apropiados para las células de mamífero son aquellos que permiten la identificación de células competentes para captar el ácido nucleico del heteromultímero, tales como el DHFR o la quinasa de timidina. Los transformantes de células de mamífero se colocan bajo presión de selección que sólo los transformantes están adaptados para sobrevivir gracias a haber captado el marcador. La presión de selección se impone cultivando los transformantes en condiciones en las que la concentración del agente de selección en el medio se cambia sucesivamente, conduciendo de ese modo a la amplificación de ambos, el gen de selección y el ADN que codifica el heteromultímero. Se sintetizan cantidades crecientes de heteromultímero a partir del ADN amplificado. Otros ejemplos de genes amplificables incluyen los de la metalotioneína-I y -II, preferiblemente los genes de metalotioneína de primate, de la desaminasa de adenosina, de las descarboxilasa de ornitina, etc.

Por ejemplo, las células transformadas con el gen de selección de la DHFR se identifican primero cultivando todos los transformantes en un medio de cultivo que contiene metotrexato (Mtx), un antagonista competitivo de la DHFR. Una célula huésped apropiada cuando se emplea la DHFR del tipo salvaje es la línea celular de ovario de hámster chino (CHO) deficiente en actividad DHFR, preparada y propagada tal como describieron Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980). Las células transformadas se exponen a continuación a niveles incrementados de metotrexato. Esto conduce a la síntesis de múltiples copias del gen de la DHFR y, de forma concomitante, a múltiples copias de otro ADN comprendido en los vectores de expresión, tal como el ADN que codifica los componentes del heteromultímero. Esta técnica de amplificación puede usarse con cualquier huésped de otro modo apropiado, por ejemplo, la CHO-K1 ATCC nº CCL61, a pesar de la presencia de DHFR endógena, si, por ejemplo, se emplea un gen mutante de la DHFR que es altamente resistente al Mtx (EP-117.060).

Alternativamente, las células huéspedes (particularmente huéspedes del tipo salvaje que contienen DHFR endógena) transformadas con secuencias de ADN que codifican el heteromultímero, la proteína DHFR del tipo salvaje, y otro marcador seleccionable tal como la fosfotransferasa 3' de aminoglicósido (APH), pueden seleccionarse mediante cultivo celular en medio que contiene un agente de selección para el marcador seleccionable, tal como un antibiótico aminoglicosídico, por ejemplo, la kanamicina, neomicina, o G418. Ver la patente estadounidense nº 4.965.199.

Un gen de selección apropiado para su uso en levadura es el gen trp1 presente en el plásmido YRp7 de levadura (Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979); Kingsman et al., Gene, 7:141 (1979); o Tschemper et al., Gene, 10:157 (1980)). El gen trp1 proporciona un marcador seleccionable para una cepa mutante de levadura que carezca de la capacidad de crecer en triptófano, en, por ejemplo, la ATCC nº 44076 o en PEP4-1 (Jones, Genetics, 85:12 (1977)). La presencia de la lesión trp1 en el genoma de la célula huésped de levadura proporciona entonces un entorno efectivo para detectar la transformación mediante cultivo en ausencia de triptófano. De forma similar, las cepas de levadura deficientes en Leu2 (ATCC 20.622 ó 38.626) son complementadas por plásmidos conocidos portadores del gen Leu2.

Además, los vectores derivados del plásmido circular pKD1 de 1,6 \mum pueden usarse para la transformación de levaduras Kluyveromyces. Bianchi et al., Curr. Genet. 12:185 (1987). Más recientemente, se informó sobre un sistema de expresión para la producción a gran escala de quimosina recombinante de ternera para K. lactis. Van den Berg, Bio/Technology, 8:135 (1990). También se han descubierto vectores de expresión multi-copia estables para la secreción de albúmina de suero humana recombinante madura mediante cepas industriales de Kluyveromyces (Fleer et al., Bio/Technology, 9:968-975 (1991)).

Los vectores de clonación y expresión usualmente contienen un promotor que es reconocido por el organismo huésped y está unido operativamente al ácido nucleico del heteromultímero. Son bien conocidos un gran número de promotores reconocidos por una variedad de células huéspedes potenciales. Estos promotores se unen operativamente al ADN que codifica el heteromultímero retirando el promotor del ADN fuente mediante digestión con enzimas de restricción e insertando la secuencia el promotor aislado en el vector.

Los promotores apropiados para su uso con huéspedes procariotas incluyen los sistemas promotores de la \beta-lactamasa y lactosa (Chang et al., Nature, 275:615 (1978); y Goeddel et al., Nature, 281:544 (1979)), de la fosfatasa alcalina, un sistema promotor del triptófano (trp) (Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980) y la EP-36.776), y promotores híbridos tales como el promotor tac (deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)). No obstante, otros promotores bacterianos conocidos son apropiados. Sus secuencias de nucleótidos han sido publicadas, permitiendo, de ese modo, que un especialista capacitado la una operativamente al ADN que codifica el heteromultímero (Siebenlist et al., Cell, 20:269 (1980)) usando eslabones o adaptadores para proporcionar cualesquier sitios de restricción requeridos. Los promotores para uso en sistemas bacterianos también contendrán una secuencia Shine-Dalgarno (S.D.) unida operativamente al ADN que codifica el heteromultímero.

Las secuencias promotoras son conocidas para las eucariotas. Virtualmente todos los genes eucariotas tienen una región rica en AT ubicada aproximadamente 25 bases cadena arriba del sitio en el que se inicia la transcripción. Otra secuencia hallada 70 a 80 bases cadena arriba respecto el inicio de la transcripción de muchos genes es una región CXCAAT, en donde X podría ser cualquier nucleótidos. En el extremo 3' de la mayoría de los genes eucariotas hay una secuencia AATAAA que podría ser la señal para la adición de la cola poli-A al extremo 3' de la secuencia codificante. La totalidad de estas secuencias se insertan convenientemente en vectores de expresión en eucariotas.

Los ejemplos de secuencias promotoras apropiadas para su uso con huéspedes de levadura incluyen los promotores para la quinasa del 3-fosfoglicerato (Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)) u otros enzimas glicolíticos (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968); y Holland, Biochemistry, 17:4900 (1978)), tales como la enolasa, deshidrogenasa del gliceraldehído-3-fosfato, la hexoquinasa, la descarboxilasa del piruvato, la fosfofructoquinasa, la isomerasa de la glucosa-6-fosfato, la mutasa del 3-fosfoglicerato, la quinasa del piruvato, la isomerasa de la triosafosfato, la isomerasa de la fosfoglucosa, y la glucoquinasa.

Otros promotores de levadura, los cuales son promotores inducibles que tienen la ventaja adicional de una transcripción controlada por las condiciones de cultivo, son las regiones promotoras de la deshidrogenasa 2 de alcohol, del isocitocromo C, de la fosfatasa ácida, de los enzimas degradantes asociados con el metabolismo del nitrógeno, de la metalotioneína, de la deshidrogenasa del gliceraldehído-3-fosfato, y de los enzimas responsables de la utilización de la maltosa y galactosa. Los vectores y promotores apropiados para su uso en la expresión en levadura se describen adicionalmente en Hitzeman et al., EP-73.657A. Los potenciadores de levadura se usan también ventajosamente con promotores de levadura.

La transcripción del heteromultímero a partir de vectores de células huéspedes de mamíferos se controla, por ejemplo, mediante promotores obtenidos de los genomas de virus tales como el virus del polioma, el virus de la viruela aviar (UK-2.211.504, publicada el 5 de julio de 1989), el adenovirus (tal como el Adenovirus 2), el virus del papiloma bovino, el virus del sarcoma aviar, el citomegalovirus, un retrovirus, el virus de la hepatitis-B, y lo más preferiblemente el virus 40 de simios (SV40), de los promotores heterólogos de mamíferos, por ejemplo, el promotor de la activa o un promotor de inmunoglobulina, o de los promotores del choque térmico.

Los promotores temprano y tardío de los virus SV40 se obtienen convenientemente como un fragmento de restricción del SV40 que también contiene el origen de replicación viral del SV40. Fiers et al., Nature, 273:113 (1978); Mulligan y Berg, Science, 209:1422-1427 (1980); Pavlakis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:7398-7402 (1981). El promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano se obtiene convenientemente como un fragmento de restricción de HindIII E. Greenaway et al., Gene, 18:355-360 (1982). Un sistema para la expresión de ADN en huéspedes de mamífero usando el virus del papiloma bovino como un vector se descubre en la patente estadounidense nº 4.419.446. Una modificación de este sistema se descubre en la patente estadounidense nº 4.601.978. Ver también Gray et al., Nature, 295:503-508 (1982) sobre la expresión de ADNc que codifica el interferón inmune en células de mono; Reyes et al., Nature, 297:598-601 (1982) sobre la expresión del ADNc del interferón-\beta humano en células de ratón bajo el control de un promotor de la quinasa de timidina del virus herpes simplex; Canaani y Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:5166-5170 (1982) sobre la expresión del gen del interferón-\beta1 humano en células cultivadas de ratón y conejo; y Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:6777-6781 (1982) sobre la expresión de secuencias CAT bacterianas en células renales de mono CV-1, fibroblastos embrionarios de pollo, células ováricas de hámster chino, células HeLa, y célula NIH-3T3 de ratón, usando como promotor la repetición terminal larga del virus del sarcoma de Rous.

La transcripción de ADN que codifica los componentes del heteromultímero por parte de eucariotas superiores se incrementa a menudo insertando una secuencia potenciadora en el vector. Los potenciadores son relativamente independientes de la orientación y posición, habiéndose hallado 5' (Laimins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:993 (1981)) y 3' (Lusky et al., Mol. Cell Bio., 3:1108 (1983)) respecto la unidad de transcripción, dentro de un intrón (Banerji et al., Cell, 33:729 (1983)), así como dentro de la propia secuencia codificante (Osborne et al., Mol. Cell Bio., 4:1293 (1984)). Ahora se conocen muchas secuencias potenciadoras procedentes de genes de mamíferos (globina, elastasa, albúmina, \alpha-fetoproteína, e insulina). Sin embargo, típicamente, se usará un potenciador procedente de un virus de célula eucariota. Los ejemplos incluyen el potenciador del SV40 en el lado tardío del origen de replicación (p.b. 100-270), el potenciador del promotor temprano del citomegalovirus, el potenciador del polioma en el lado tardío del origen de replicación, y los potenciadores de adenovirus. Ver también Yaniv, Nature, 297:17-18 (1982) sobre elementos potenciadores para la activación de promotores eucariotas. El potenciador podría empalmarse en el vector en una posición 5' ó 3' respecto la secuencia codificante del heteromultímero, pero se ubica preferiblemente en un sitio 5' respecto el promotor.

Los vectores de expresión usado en células huéspedes eucariotas (de levaduras, hongos, insectos, plantas, animales, humanas, o células nucleadas procedentes de otros organismos multicelulares) también contendrán secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para la estabilización del ARNm. Tales secuencias están comúnmente disponibles de las regiones no traducidas 5' y, ocasionalmente 3', de ADN o ADNc eucariotas o virales. Estas regiones contienen segmentos de nucleótidos transcritos como fragmentos poliadenilados en la porción no traducida del ARNm que codifica el heteromultímero.

La construcción de vectores apropiados, que contienen uno o más de los componentes listados más arriba, emplea técnicas de ligación estándares. Los plásmidos o fragmentos de ADN aislados se cortan, ajustan, y religan en la forma deseada para generar los plásmidos requeridos.

Para el análisis para confirmar las secuencias correctas en los plásmidos construidos, se usan las mezclas de ligación para transformar la cepa 294 de E. coli K12 (ATCC nº 31.446), y los transformantes exitosos se seleccionan mediante resistencia a la ampicilina o tetraciclina según sea apropiado. Los plásmidos procedentes de los transformantes se preparan, analizan mediante digestión con endonucleasa de restricción, y/o se secuencian mediante el procedimiento de Messing et al., Nucleic Acids Res., 9:309 (1981) o mediante el procedimiento de Maxam et al., Methods in Enzymology, 65:499 (1980).

Particularmente útiles en la práctica de esta invención son los vectores de expresión que proporcionan la expresión transitoria en células de mamífero del ADN que codifica el heteromultímero. En general, la expresión transitoria implica el uso de un vector de expresión que es capaz de replicarse eficientemente en una célula huésped, de tal forma que la célula huésped acumula muchas copias del vector de expresión y, a su vez, sintetiza niveles elevados de un polipéptido deseado codificado por el vector de expresión. Sambrook et al., supra, pp. 16.17-16.22. Los sistemas de expresión transitoria, que comprenden un vector de expresión apropiado y una célula huésped, permiten la identificación positiva conveniente de polipéptidos codificados por los ADN clonados, así como el examen rápido de los heteromultímeros que tienen las especificidades/afinidades deseadas, o las características de migración en gel deseadas en relación a los heteromultímeros u homomultímeros que carecen de los enlaces disulfuro no naturales generados de acuerdo con la presente invención.

Otros procedimientos, vectores, y células huéspedes apropiados para la adaptación a la síntesis del heteromultímero en cultivo de células de vertebrado recombinantes se describen en Gething et al., Nature, 293:620-625 (1981); Mantei et al., Nature, 281:40-46 (1979); la EP-117.060; y la EP-117.058. Un plásmido particularmente útil para la expresión del heteromultímero en cultivos de células de mamífero es el pRK5 (EP-307.247) o pSVI6B (PCT, publicación nº WO-91/08291, publicada el 13 de junio de 1991).

La elección de la línea celular huésped para la expresión del heteromultímero depende principalmente del vector de expresión. Otra consideración es la cantidad de proteína que se requiere. Las cantidades de miligramos pueden producirse a menudo mediante transfecciones transitorias. Por ejemplo, la línea celular embrionaria renal humana 293 transformada con el adenovirus EIA puede transfectarse transitoriamente con vectores basados en pRJ5 mediante una modificación del procedimiento del fosfato cálcico para permitir la expresión eficiente del heteromultímero. Los vectores basados en CDM8 pueden usarse para transfectar células COS mediante el procedimiento de la DEAE-dextrano (Aruffo et al., Cell, 61:1303-1313 (1990); y Zettmeissl et al., DNA Cell Biol. (US), 9:347-353 (1990)). Si se desean cantidades de proteína mayores, la inmunoadhesina puede expresarse después de la transfección estable de una línea celular huésped. Por ejemplo, puede introducirse un vector basado en pRK5 en células ováricas de hámster chino (CHO) en presencia de un plásmido adicional que codifica la reductasa del dihidrofolato (DHFR) y confiere resistencia frente al G418. Los clones resistentes al G418 pueden seleccionarse en el cultivo. Estos clones se hacen crecer en presencia de niveles crecientes del inhibidor metotrexato de la DHFR, y se seleccionan clones en los que el número de copias de genes que codifican la DHFR y las secuencias del heteromultímero se coamplifican. Si la inmunoadhesina contiene una secuencia líder hidrofóbica en su extremo N-terminal, es probable que sea procesada y secretada por las células transfectadas. Las expresión de inmunoadhesinas con estructuras más complejas podría requerir células huéspedes especialmente adaptadas. Por ejemplo, los componentes tales como la cadena ligera o la cadena J podrían proporcionarse mediante ciertas células huéspedes de mieloma o hibridoma (Gascoigne et al., supra; y Martin et al., J. Virol., 67:3561-3568 (1993)).

Otras células huéspedes apropiadas para clonar o expresar los vectores en ésta son las células procariotas, de levadura, u otras eucariotas superiores descritas más arriba. Las procariotas apropiadas para este propósito incluyen las eubacterias, tales como los organismos Gram-negativos o Gram-positivos, por ejemplo, enterobacteriaceas tales como Escherichia, por ejemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por ejemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, por ejemplo, Serratia marcescans, y Shigella, así como Bacilli tales como B. subtilis y B. licheniformis (por ejemplo, el B. licheniformis 41P descubierto en DD-266.710, publicada el 12 de abril de 1989), Pseudomonas tales como P. aeruginosa, y Streptomyces. Un huésped de clonación E. coli preferido es la E. coli 294 (ATCC nº 31.446), aunque son apropiadas otras cepas tales como E. coli B, E. coli X1776 (ATCC nº 31.537), y E. coli W3110 (ATCC nº 27.325). Estos ejemplos son ilustrativos en vez de limitantes. La cepa W3110 es un huésped, o progenitor de huésped, preferido puesto que es una cepa huésped común para las fermentaciones de productos de ADN recombinante. Preferiblemente, la célula huésped debería secretar cantidades mínimas de enzimas proteolíticos. Por ejemplo, la cepa W3110 podría modificarse para efectuar una mutación genética en los genes que codifican las proteínas, los ejemplos de tales huéspedes incluyen la cepa 27C7 de E. coli W3110. El genotipo completo de la 27C7 es tonA\Delta ptr3 phoA\DeltaE15 \Delta(argF-lac)169 ompT\DeltadegP41kan^{r}. La cepa 27C7 se depositó el 30 de octubre de 1991 en la American Type Culture Collection como ATCC nº 55.244. Alternativamente, podría emplearse la cepa de E. coli que tiene una proteasa periplásmica mutante descubierta en la patente estadounidense nº 4.946.783 concedida el 7 de agosto de 1990. Alternativamente, son apropiados los procedimientos de clonación, por ejemplo, la PCR u otras reacciones de polimerasa de ácido nucleico.

Además de las procariotas, los microbios eucariotas tal es como los hongos filamentosos o levaduras son huéspedes de clonación o expresión apropiados para los vectores que codifican el heteromultímero. Saccharomyces cerevisiae, o levadura común de panadería, es el más comúnmente usado de entre los microorganismos huéspedes eucariotas inferiores. Sin embargo, un cierto número de otros géneros, especies y cepas están comúnmente disponibles y son útiles en ésta, tales como Schizosaccharomyces pombe (Beach y Nurse, Nature, 290:140 (1981); EP-139.383 publicada el 2 de mayo de 1985); los huéspedes de Kluyveromyces (patente estadounidense nº 4.943.529; Fleer et al., supra) tales como, por ejemplo, K. lactis (MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt et al., J. Bacteriol., 737 (1983)), K. fragilis (ATCC nº 12.424), K. bulgaricus (ATCC nº 16.045), K. wickeramii (ATCC nº 24.178), K. waltii (ATCC nº 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906; Van den Berg et al., supra), K. thermotolerans, y K. marxianus; yarrowia (EP-402.226); Pichia pastoris (EP-183.070; Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol., 28:265-278 (1988)); Candida; Trichoderma reesia (EP-244.234); Neurospora crassa (Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:5259-5263 (1979)); Schwanniomyces tales como Schwanniomyces occidentalis (EP-394.538 publicada el 31 de octubre de 1990); y los hongos filamentosos tales como, por ejemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (WO-91/00357 publicada el 10 de enero de 1991), y huéspedes de Aspergillus tales como A. nidulans (Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 112:284-289 (1983); Tilburn et al., Gene, 26:205-221 (1983); Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:1470-1474 (1984)) y A. niger (Kelly y Hynes, EMBO J. 4:475-479 (1985)).

Las células huéspedes apropiadas para la expresión del heteromultímero glicosilado se derivan de organismos multicelulares. Tales células huéspedes son capaces de procesado complejo y de actividades de glicosilación. En principio, es factible cualquier cultivo de células eucariotas superiores, proceda de un cultivo de vertebrados o de invertebrados. Los ejemplos de células de invertebrados incluyen las células vegetales y de insectos. Se han identificado numerosas cepas de baculovirus y variantes, y las correspondientes células huéspedes de insecto permisivas procedentes de huéspedes tales como Spodoptera frugiperda (oruga), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca del vinagre), y Bombyx mori. Ver, por ejemplo, Luckow et al., Bio/Technology, 6:47-55 (1988); Miller et al., en Genetic Engineering, Eds. Setlow et al., Vol. 8 (Plenum Publishing, 1986), pp. 277-279; y Maeda et al., Nature, 315:592-594 (1985). Hay disponibles una variedad de cepas virales para la transfección, por ejemplo, la variante L-1 del NPV de Autographa californica y la cepa Bm-5 del NPV de Bombyx mori, y tales virus podrían usarse como los virus en ésta de acuerdo con la presente invención, particularmente para la transfección de células de Spodoptera frugiperda.

Los cultivos de células vegetales de algodón, maíz, patata, soja, petunia, tomate y tabaco pueden utilizarse como huéspedes. Típicamente, las células vegetales se transfectan mediante incubación con ciertas cepas de la bacteria Agrobacterium tumefaciens, las cuales se han manipulado previamente para contener el ADN del heteromultímero. Durante la incubación del cultivo de células vegetales con A. tumefaciens, el ADN que codifica el heteromultímero se transfiere a la célula planta huésped que es transfectada y, en condiciones apropiadas, expresa el ADN del heteromultímero. Además, hay disponibles secuencias reguladores y de señal compatibles con las células vegetales, tales como las secuencias del promotor de la sintasa de nopalina y la señal de poliadenilación. Depicker et al., J. Mol. Appl. Gen., 1:561 (1982). Además, los segmentos de ADN aislados de la región cadena arriba del gen 780 del T-ADN son capaces de activar o incrementar los niveles de transcripción de genes expresables en plantas en tejido vegetal que contiene ADN. EP-321.196, publicada el 21 de junio de 1989.

Los huéspedes preferidos son células de vertebrados, y la propagación de las células de vertebrado en cultivo (cultivo de tejidos) ha pasado a ser un procedimiento rutinario en los últimos años (Tissue Culture, Academic Press, editores Kruse y Patterson, (1973)). Son ejemplos de líneas celulares de mamífero útiles la línea CV1 de riñón de mono transformada con SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); una línea embrionaria renal humana (células 293 o 293 subclonadas para su crecimiento en cultivo en suspensión, Graham et al., J. Gen. Virol., 36:59 (1977)); células renales de cría de hámster (BHK, ATCC CCL 10); células ováricas de hámster chino/-DHFR (CHO, Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)); células de sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)); células renales de mono (CV1 ATCC CCL 70); células renales de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); human cervical carcinoma cells (HELA, ATCC CCL 2); células renales caninas (MDCK, ATCC CCL 34); células hepático de hígado de rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células pulmonares humanas (W138, ATCC CCL 75); células hepáticas humanas (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51); células TR1 (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; y una línea de hepatoma humano (Hep G2).

Las células huéspedes de transfectan con los vectores de expresión o clonación de esta invención antes descritos, y se cultivan en medio nutriente convencional modificado según sea apropiado para inducir promotores, seleccionar transformantes, o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas. Dependiendo de la célula huésped usada, la transfección se realiza usando técnicas estándares apropiadas para tales células. El tratamiento con calcio que emplea cloruro cálcico, tal como se describe en la sección 1.82 de Sambrook et al., supra, o la electroporación se usan generalmente con procariotas u otras células que contienen barreras sustanciales en forma de pared celular. La infección con Agrobacterium tumefaciens se usa para transformar ciertas células vegetales, tal como describieron Shaw et al., Gene, 23:315 (1983) y WO-89/05859 publicada el 29 de junio de 1989. Además, las plantas podrían transfectarse usando el tratamiento con ultrasonidos tal como se describe en WO-91/00358 publicada el 10 de enero de 1991.

Para células de mamíferos sin tales paredes celulares, se prefiere el procedimiento de la precipitación con fosfato cálcico de Graham y van der Eb, Virology, 52:456-457 (1978). Los aspectos generales de las transformaciones de sistemas de células huéspedes de mamífero han sido descritos por Axel en la patente estadounidense nº 4.399.216 concedida el 16 de agosto de 1983. Las transformaciones en levaduras se realizan típicamente de acuerdo con el procedimiento de Van Solingen et al., J. Bact., 130:946 (1977) y Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76:3829 (1979). Sin embargo, también podrían usarse otros procedimientos para introducir ADN en las células, tales como mediante microinyección nuclear, electroporación, fusión de protoplasto bacteriano con células intactas, o policationes, por ejemplo, el polibreno, la poliornitina, etc. Ver Keown et al., Methods in Enzymology, (1989), Keown et al., Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990), y Mansour et al., Nature, 336:348-352 (1988), para varias técnicas para transformar células de mamíferos.

Las células procariotas usadas para producir el polipéptido heteromultímero de esta invención se cultivan en medio apropiado tal como se describe de forma general en Sambrook et al., supra.

Las células huéspedes de mamífero usadas para producir el heteromultímero de esta invención podrían cultivarse en una variedad de medios. Los medios disponibles comercialmente tales como el F10 de Ham (Sigma), el medio mínimo esencial ((MEM), Sigma), el RPMI-1640 (Sigma), y el medio de Eagle modificado por Dulbecco ((DMEM), Sigma) son apropiados para cultivar las células huéspedes. Además, cualquiera de los medios descritos en Ham y Wallace, Meth. Enz., 58:44 (1979), Barnes y Sato, Anal. Biochem., 102:255 (1980), en las patentes estadounidenses nº 4.767.704; 4.657.866; 4.927.762; o 4.560.655; WO-90/03430; WO-87/00195; en la patente estadounidense Re. 30.985; o en la patente estadounidense nº 5.122.469, los descubrimientos de todas las cuales se incorporan en ésta por referencia, podría usarse como medio de cultivo para las células huéspedes. Cualquiera de estos medios podría suplementarse según sea necesario con hormonas y/o otros factores de crecimiento (tales como la insulina, transferrina, o factor de crecimiento epidérmico), sales (tales como el cloruro sódico, calcio, magnesio, y fosfato), tampones (tales como el HEPES), nucleósidos (tales como la adenosina y timidina), antibióticos (tales como el fármaco Gentamicina™), elementos traza (definidos como compuestos inorgánicos usualmente presentes en concentraciones finales en el rango micromolar), y glucosa o una fuente de energía equivalente. También podrían incluirse cualesquier otros suplementos en las concentraciones apropiadas que serán conocidas por los especialistas en la técnica. Las condiciones de cultivo, tales como la temperatura, pH y similares, son aquéllas previamente usadas con la célula huésped seleccionada para la expresión, y serán evidentes al especialista con la formación ordinaria.

En general, los principios, protocolos, y técnicas prácticas para maximizar la productividad de los cultivos de células de mamífero pueden hallarse en Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, Ed. M. Butler, IRL Press, 1991.

Las células huéspedes citadas en este descubrimiento abarcan células en cultivo así como células que están dentro de un animal huésped.

4. Recuperación del heteromultímero

El heteromultímero preferiblemente se recupera de forma general del medio de cultivo como un polipéptido secretado, aunque también podría recuperarse de lisado de célula huésped cuando se produce directamente sin una señal secretora. Si el heteromultímero está unido a membrana, puede liberarse de la membrana usando una solución detergente apropiada (por ejemplo, el Triton-X 100).

Cuando el heteromultímero se produce en una célula recombinante distinta de una de origen humano, está completamente libre de proteínas o polipéptidos de origen humano. Sin embargo, es necesario purificar el heteromultímero de proteínas o polipéptidos de la célula recombinante para obtener preparaciones que son sustancialmente homogéneas como heteromultímero. Como un primer paso, el medio de cultivo o lisado se centrifuga normalmente para retirar restos celulares fragmentados.

Los heterodímeros que tienen dominios constantes de anticuerpo pueden purificarse convenientemente mediante cromatografía con hidroxilapatito, electroforesis en gel, diálisis, o cromatografía de afinidad, siendo la cromatografía de afinidad la técnica de purificación preferida. Cuando el heteromultímero comprende un dominio C_{H}3, la resina Bakerbond ABX™ (J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.) es útil para la purificación. Otras técnicas para la purificación de proteína, tales como el fraccionamiento en una columna de intercambio iónico, la precipitación con etanol, la HPLC en fase inversa, la cromatografía en sílice, la cromatografía en heparina-Sepharose, la cromatografía en una resina de intercambio aniónico o catiónico (tal como una columna de ácido poliaspártico), el cromatoenfoque, la SDS-PAGE, y la precipitación con sulfato amónico, están disponibles también dependiendo del polipéptido a ser recuperado. La idoneidad de la Proteína A como un ligando de afinidad depende de las especies e isotipo del dominio Fc de inmunoglobulina que se usa en la quimera. La Proteína A puede usarse para purificar inmunoadhesinas que se basan en las cadenas pesadas \gamma1, \gamma2, o \gamma4 humanas (Lindmark et al., J. Immunol. Meth., 62:1-13 (1983)). La Proteína G se recomienda para todos los isotipos de ratón y para la \gamma3 humana (Guss et al., EMBO J., 5:1567-1575 (1986)). La matriz a la que se une el ligando de afinidad es habitualmente agarosa, pero hay otras matrices disponibles. Las matrices mecánicamente estables tales como el vidrio de poro controlado o el poli(estirendivinil)benceno permiten velocidades de flujo más elevadas y tiempos de procesamiento más cortos que los que pueden conseguirse con agarosa. Las condiciones para la unión de una inmunoadhesina a la columna de afinidad de Proteína A o G están dictadas enteramente por las características del dominio Fc; es decir, sus especies e isotipo. Generalmente, cuando se escoge el ligando apropiado, la unión eficiente ocurre directamente desde el fluido de cultivo sin acondicionar. Una característica distinguida de las inmunoadhesinas es que, para las moléculas de \gamma1 humanas, la capacidad de unión para la Proteína A está algo disminuida en relación a un anticuerpo del mismo tipo de Fc. La inmunoadhesina unida puede eluirse eficientemente bien a pH ácido (a o por encima de 3,0), o en un tampón de pH neutro que contiene una sal suavemente caotrópica. Este paso de cromatografía de afinidad puede resultar en una preparación de heterodímero que es >95% pura.

5. Usos para un anticuerpo multiespecífico heteromultimérico que tiene cadenas ligeras comunes

Se contemplan muchas aplicaciones terapéuticas para el heteromultímero. Por ejemplo, el heteromultímero puede usarse para la citotoxicidad redirigida (por ejemplo, para matar células tumorales), como un adyuvante de vacuna, para suministrar agentes trombolíticos a los coágulos, para convertir prodrogas activadas por enzimas en un sitio diana (por ejemplo, un tumor), para tratar enfermedades infecciosas, para apuntar complejos inmunes hacia receptores de la superficie celular, o para suministrar inmunotoxinas a células tumorales. Por ejemplo, el apuntamiento a la vasculatura del tumor se ha conseguida apuntando a un antígeno endotelial modelo, el complejo de histocompatibilidad principal de clase II, con una inmunotoxina de anticuerpo-ricina (Burrows, F.J. y Thorpe, P.E., Proc Natl Acad Sci USA 90:8996-9000 (1993)). Se consiguió una eficacia significativamente mayor combinando la inmunotoxina anti-endotelial con una segunda inmunotoxina dirigida contra las propias células tumorales (Burrows, F.J. y Thorpe, P.E., (1993), supra). Recientemente, el factor de tejido se ha dirigido exitosamente hacia la vasculatura del tumor usando un anticuerpo biespecífico, activando la trombosis local que resultó en una eficacia anti-tumor significativa (Huang, X., et al., Science, 275:547-550 (1997)). Además, los diacuerpos biespecíficos se han usado exitosamente para dirigir células T citotóxicas para matar células de tumor de mama y células de linfoma de células B in vitro (Zhu, Z. et al., Bio/Technology, 14:192-196 (1996); y Holliger, P. et al., Protein Engin., 9:299-305 (1996)).

Las formulaciones terapéuticas del heteromultímero se preparan para su almacenamiento mezclando el heteromultímero que tiene el grado de pureza deseado con portadores opcionales fisiológicamente aceptables, excipientes, o estabilizadores (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16ª edición, Ed. Osol, A., (1980)), en forma de pastilla liofilizada o soluciones acuosas. Los portadores, excipientes o estabilizadores aceptables no son tóxicos para los receptores en las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen tampones tales como el fosfato, citrato, y otros ácidos orgánicos; antioxidantes, incluyendo el ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como la albúmina de suero, la gelatina, o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina, monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos, incluyendo glucosa, manosa, o dextrinas; agentes quelantes tales como el EDTA; azúcares alcohol tales como el manitol o sorbitol; contraiones formadores de sales tales como el sodio; y/o tensioactivos no iónicos tales como el Tween, Pluronics o polietilenglicol (PEG).

El heteromultímero también podría atraparse en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización en la interfaz (por ejemplo, respectivamente, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsulas de poli-[metilmetacilato]), el los sistemas de suministro de fármaco coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas), o en macroemulsiones. Tales técnicas se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, supra.

El heteromultímero a usarse para la administración in vivo debe ser estéril. Esto se consigue fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración estéril, antes o a continuación de la liofilización y reconstitución. El heteromultímero ordinariamente se almacenará en forma liofilizada o en solución.

Las composiciones terapéuticas de heteromultímero generalmente se colocan en un contenedor que tiene un puerto de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa de solución intravenosa o vial que tiene un tapón perforable mediante una aguja de inyección intravenosa.

La ruta de administración del heteromultímero está de acuerdo con los procedimientos conocidos, por ejemplo, inyección o infusión mediante rutas intravenosa, intraperitoneal, intracerebral, intramuscular, intraocular, intraarterial, o intralesional, o mediante sistemas de liberación continua, tal como se menciona más abajo. El heteromultímero se administra continuamente mediante infusión o inyección de bolo.

Los ejemplos de preparaciones de liberación ininterrumpida incluyen las matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen la proteína, matrices que están en forma de artículos moldeados, por ejemplo, películas o microcápsulas. Los ejemplos de matrices de liberación ininterrumpida incluyen los poliésteres, los hidrogeles (por ejemplo, el poli(2-hidroxietil-metacrilato), tal como fue descrito por Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15:167-277 (1981) y Langer, Chem. Tech., 12:98-105 (1982), o el poli(vinilalcohol)), los poliláctidos (patente estadounidense nº 3.773.919, y la EP-58.481), los copolímeros de ácido L-glutámico y gamma-etil-L-glutamato (Sidman et al., Biopolymers, 22:547-556 (1983)), el acetato de etilenvinilo no degradable (Langer et al., supra), los copolímeros degradables de ácido láctico-ácido glicólico, tales como el Lupron Depot™ (microesferas inyectables compuestas por copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprólido), y el ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico (EP-133.988).

Mientras que los polímeros tales como el acetato de etilenvinilo y el ácido láctico-ácido glicólico permiten la liberación de moléculas durante más de 100 días, ciertos hidrogeles liberan proteínas durante períodos de tiempo más cortos. Cuando las proteínas encapsuladas permanecen en el cuerpo durante un período prolongado, pueden desnaturalizarse o agregarse a resultas de la exposición a la humedad a 37ºC, lo que resulta en una pérdida de actividad biológica y en posibles cambios en la inmunogenicidad. Se pueden diseñar estrategias racionales para la estabilización de la proteína en función del mecanismo implicado. Por ejemplo, si se descubre que el mecanismo de agregación es la formación de enlaces S-S intermoleculares a través del intercambio tio-disulfuro, podría conseguirse la estabilización modificando los residuos sulfhidrilo, liofilizando a partir de soluciones ácidas, controlando el contenido en humedad, usando aditivos apropiados, y desarrollando composiciones de matriz de polímero específicas.

Las composiciones de heteromultímero de liberaciónininterrumpida también incluyen el heteromultímero atrapado liposomalmente. Los liposomas que contienen heteromultímero se preparan mediante procedimientos conocidos per se: DE-3.218.121; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688-3692 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4030-4034 (1980); EP-52.322; EP-36.676; EP-88.046; EP-143.949; EP-142.641; la solicitud de patente japonesa 83-118008; las patentes estadounidenses nº 4.485.045 y 4.544.545; y la EP-102.324. Ordinariamente, los liposomas son del tipo unilamelar pequeño (aproximadamente 200-800 Angstroms), en los cuales el contenido de lípido es mayor de aproximadamente 30 mol. % de colesterol, ajustándose la proporción seleccionada para la terapia con heteromultímero óptima.

Una cantidad efectiva de heteromultímero a emplearse terapéuticamente dependerá, por ejemplo, de los objetivos terapéuticos, la ruta de administración, y de la condición del paciente. En consecuencia, será necesario que el terapeuta valore la dosis y modifique la ruta de administración según se requiera para obtener el efecto terapéutico óptimo. Una dosis diaria típica podría oscilar desde aproximadamente 1 \mug/kg hasta 10 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados más arriba. Típicamente, el clínico administrará heteromultímero hasta que se alcance una dosis que consiga el efecto deseado. El progreso de esta terapia se monitoriza fácilmente mediante ensayos convencionales.

Los heteromultímeros descritos en ésta pueden también usarse en inmunoensayos con enzimas. Para conseguir esto, un brazo del heteromultímero puede diseñarse para que se una a un epítopo específico sobre el enzima, de forma que la unión no cause la inhibición del enzima, el otro brazo del heteromultímero puede diseñarse para unirse a la matriz inmovilizadora, asegurando una densidad elevada de enzima en el sitio deseado. Los ejemplos de tales heteromultímeros de diagnóstico incluyen, por ejemplo, aquellos que tienen especificidad por la IgG así como por la ferritina, y aquellos que tienen especificidades de unión por la peroxidasa del rábano silvestre (HRP) así como por una hormona.

Los heteromultímeros pueden diseñarse para su uso en inmunoensayos de dos sitios. Por ejemplo, se producen dos heteromultímeros biespecíficos uniendo dos epítopos separados sobre la proteína analito - un heteromultímero une el complejo a una matriz insoluble, el otro une un enzima indicador.

Los heteromultímeros pueden usarse también para la inmunodiagnosis in vitro o in vivo de varias enfermedades tales como el cáncer. Para facilitar el uso diagnóstico, un brazo del heteromultímero puede diseñarse para unir un antígeno asociado a tumor, y el otro brazo puede unir un marcador detectable (por ejemplo, un quelante que une un radionúcleo). Por ejemplo, un heteromultímero que tiene especificidades por el antígeno CEA asociado a tumor, así como por un hapteno bivalente, puede usarse para visualizar carcinomas colorectales y de la tiroides. Otros usos diagnósticos, no terapéuticos, para el heteromultímero serán evidentes para el especialista capacitado.

Para las aplicaciones diagnósticas, al menos un brazo del heteromultímero típicamente estará marcado directa o indirectamente con un grupo detectable. El grupo detectable puede ser cualquiera que es capaz de producir, bien directa o indirectamente, una señal detectable. Por ejemplo, la porción detectable podría ser un radioisótopo, tal como: ^{3}H, ^{14}C, ^{32}P, ^{35}S o ^{125}J; un compuesto fluorescente o quimioluminiscente, tal como el isotiocianato de fluoresceína, la rodamina, o luciferina; o un enzima, tal como la fosfatasa alcalina, la beta-galactosidasa o la peroxidasa de rábano silvestre (HRP).

Podría emplearse cualquier procedimiento conocido en la técnica para conjugar el heteromultímero a la porción detectable, incluyendo aquellos procedimientos descritos por Hunter et al., Nature, 144:945 (1962); David et al., Biochemistry, 13:1014 (1974); Pain et al., J. Immunol. Meth., 40:219 (1981); y Nygren, J. Histochem. and Cytochem., 30:407 (1982).

Los heteromultímeros de la presente invención podrían usarse en cualquier procedimiento de ensayo conocido, tal como los ensayos de unión competitiva, los ensayos sandwich directos e indirectos, y los ensayos de inmunoprecipitación. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp.147-158 (CRC Press, Inc., 1987).

Los ensayos de unión competitiva se basan en la capacidad de un estándar marcado para competir con el analito de la muestra de ensayo por la unión con una cantidad limitada de heteromultímero. La cantidad de analito en la muestra de ensayo es inversamente proporcional a la cantidad de estándar que se une al heteromultímero. Para facilitar la determinación de la cantidad de estándar que pasa a estar unido, los heteromultímeros generalmente se insolubilizan antes o después de la competición, de forma que el estándar y analito que están unidos a los heteromultímeros puedan separarse convenientemente del estándar y analito que permanecen sin unir.

Los heteromultímeros son particularmente útiles para los ensayos sandwich, los cuales implican el uso de dos moléculas, cada una capaz de unirse a dos porciones inmunogénicas, o epítopo, diferentes de la muestra a detectarse. En el ensayo sandwich, el analito de la muestra de ensayo se une mediante un primer brazo al heteromultímero, el cual se inmoviliza sobre un soporte sólido, y a continuación un segundo brazo del heteromultímero se une al analito. Ver, por ejemplo, la patente estadounidense nº 4.376.110. El segundo brazo del heteromultímero podría estar marcado él mismo con un grupo detectable (ensayos sandwich directos), o podría medirse usando un anticuerpo anti-inmunoglobulina que está marcado con un grupo detectable (ensayo sandwich indirecto). Por ejemplo, un tipo de ensayo sandwich es un ensayo ELISA, en cuyo caso el grupo detectable es un enzima.

Más abajo hay ejemplos de realizaciones específicas para llevar a cabo la presente invención. Los ejemplos se ofrecen sólo para propósitos ilustrativos, y no se pretende que limiten el ámbito de la presente invención en modo alguno.

Todas las publicaciones, patentes y solicitudes depatentes citadas en ésta, sea más arriba o más abajo, se incorporan en ésta por referencia en su totalidad.

Ejemplos

Se presenta una estrategia para preparar BsAb que contienen Fc (Figura 1C). En esta estrategia, hemos manipulado el dominio C_{H}3 de las cadenas pesadas del anticuerpo de forma que heterodimericen pero no homodimericen. Esto se consiguió instalando enlaces disulfuro entre cadenas en el dominio C_{H}3 en conjunción con mutaciones estéricamente complementarias obtenidas mediante diseño racional (Ridgway et al., supra (1996)) y selección mediante exhibición en fago tal como se describe en ésta. El uso de una única cadena ligera para ambas especificidades de unión de antígeno salva el problema de emparejamientos incorrectos de cadena ligera (Figuras 1A-1C). Los anticuerpos con la misma cadena ligera se aislaron fácilmente cribando una biblioteca de scFv humana muy extensa (Vaughan, T.J., et al., (1996) supra).

Ejemplo 1 Generación de inmunoadhesinas de heteromultímero con protuberancia-en-cavidad

La interfaz C_{H}3 entre la quimera anti-CD3/CD4-IgG humanizada descrita previamente por Chamow et al., J. Immunol., 153:4268 (1994) se manipuló para maximizar el porcentaje de heteromultímeros que podían recuperarse. Las variantes del C_{H}3 de la protuberancia-en-cavidad y del tipo salvaje se compararon según su capacidad para dirigir la formación de una quimera anticuerpo-inmunoadhesina humanizada (Ab/Ia) anti-CD3/CD4-IgG.

Así pues, se construyeron mutaciones en el dominio C_{H}3 de la cadena pesada del anticuerpo anti-CD3 humanizado y en la IgG-CD4 mediante mutagénesis dirigida a un sitio usando oligonucleótidos desemparejados (Kunkel et al., Methods Enzymol., 154:367 (1987) y P. Carter, en Mutagenesis: a Practical Approach, Ed. M.J. McPherson, IRL Press, Oxford, UK, pp. 1-25 (1991)), y se verificaron mediante secuenciación del dideoxinucleótido (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463 (1977)). Ver la Tabla 3 siguiente.

TABLA 3

Mutantes más preferidos
C_{H}3 de anti-CD3	C_{H}3 de CD4-IgG
T366Y	Y407T
T366W	Y407A
F405A	T394W
Y407T	T366Y
T366Y:F405A	T394W:Y407T
T366W:F405W	T394S:Y407A
F405W:Y407A	T366W:T394S
Mutantes preferidos
F405W	T394S

El residuo T366 se halla dentro de la distancia de puente de hidrógeno del residuo Y407 en el dominio C_{H}3 pareja. Además, el principal contacto intermolecular del residuo T366 es al residuo Y407 y viceversa. Se creo una protuberancia-en-cavidad invirtiendo estos residuos con las mutaciones recíprocas T366Y en un dominio C_{H}3 y Y407T en el dominio pareja, manteniendo de ese modo el volumen de las cadenas laterales en la interfaz. Las mutaciones se designan mediante el residuo del tipo salvaje, seguido por la posición usando el sistema de numeración de Kabat (Kabat et al., (1991) supra), y a continuación el residuo de remplazo en código de letra única. Las mutaciones múltiples se denotan listando las mutaciones sencillas componentes separadas por dos puntos.

Los fagémidos que codifican las variantes de la cadena ligera (L) y pesada (H) del anti-CD3 (Shalaby et al., J. Exp. Med., 175:217 (1992) y Rodrigues et al., Int. J. Cancer (Suppl.), 7:45 (1992)) se cotransfectaron en células renales embrionarias humanas, 293S, junto con un fagémido que codificaba una variante de la CD4-IgG (Byrn et al., Nature, 344:667 (1990)) tal como se había descrito previamente (Chamow et al., J. Immunol., 153:4268 (1994)). La cantidad total de ADN de fagémidos transfectados se fijo, mientras que la proporción de diferentes ADN se varió para maximizar el rendimiento de quimera Ab/Ia. La proporción (en masa) de Ia:cadena pesada:cadena ligera de los ADN de partida se varió para maximizar el rendimiento de quimera Ab/Ia. La proporción (en masa) de Ia:cadena pesada:cadena ligera de los ADN de partida (15 \mug en total) se varió como sigue: 8:1:3; 7:1:3; 6:1:3; 5:1:3; 4:1:3; 3:1:3; 1:0:0; 0:1:3.

Los productos se purificaron por afinidad usando la Proteína A estafilococal (ProSep A, BioProcessing Ltd, UK) antes del análisis mediante SDS-PAGE seguido por densitometría por barrido con láser. Se usó un exceso de luz sobre el ADN de la cadena pesada para evitar que la cadena ligera fuera limitante. La identidad de los productos se verificó mediante electrotransferencia sobre membrana de PVDF (Matsudaira, J. Biol. Chem., 262:10035 (1987)) seguida por secuenciación amino terminal.

La cotransfección de fagémidos para la cadena ligera junto con aquellos para la cadena pesada e Ia que incorporaban el C_{H}3 del tipo salvaje resultó en una mezcla de quimera Ab/Ia, productos homodímeros de IgG e Ia, tal como se esperaba (Chamow et al., J. Immunol., 153:4268 (1994)). Cuanto mayor era la fracción de ADN de partida que codifica las cadenas pesada y ligera del anticuerpo o la Ia, mayor era la fracción recuperada de los correspondientes homodímeros. Una proporción de ADN de partida de 6:1:3 de Ia:H:L rindió un 54,5% de quimera Ab/Ia con fracciones similares de homodímero de Ia (22,5%) e IgG (23,0%). Estas proporciones están de acuerdo con las esperadas a partir de la expresión equimolar de cada cadena, seguida por la colección aleatoria de las cadenas pesadas, sin introducción de sesgo por parte del procedimiento de análisis: 50% de quimera Ab/Ia, 25% de homodímero de Ia y 25% de IgG.

En contraste con las cadenas que contenían el C_{H}3 del tipo salvaje, la quimera Ab/Ia se recuperó con rendimientos de hasta el 92% a partir de cotransfecciones en las que la cadena pesada del anti-CD3 y la Ig de la IgD-CD4 contenían respectivamente las mutaciones de cavidad Y407T y de protuberancia T366Y. Se obtuvieron rendimientos similares de quimera anticuerpo/inmunoadhesina si estas mutaciones recíprocas se instalaban con la protuberancia en la cadena pesada y la cavidad en la Ia. En ambos casos se observó monómero para la cadena que contenía la protuberancia pero no para la cavidad. Sin estar limitados por teoría alguna, se cree que la protuberancia T366Y es más destructiva para la formación del homodímero que la cavidad Y407T. La fracción de híbrido Ab/Ia no cambio significativamente incrementando el tamaño de ambas, la protuberancia y la cavidad (Ab T366W, Ia Y407A). Un segundo par protuberancia y cavidad (Ab F405A, Ia T394W) rindió hasta un 71% de quimera Ab/Ia usando una pequeña fracción de ADN de partida para Ia para compensar la proclividad no anticipada a homodimerizar de la variante de protuberancia T394W de la Ia. La combinación de los dos pares de mutantes de protuberancia-en-cavidad independientes (Ab T366Y:F405A, Ia T394W:Y407T) no mejoró el rendimiento de híbrido Ab/Ia respecto el par Ab T366Y, Ia Y407T.

La fracción de quimera Ab/Ia obtenida con el par mutante T366Y y Y407T era virtualmente independiente de la proporción de ADN de partida a lo largo del rango ensayado. Además, las especies combinadas eran retiradas fácilmente de la quimera Ab/Ia mediante cromatografía de intercambio iónico (0-300 mM NaCl en 20 mM Tris-HCl, pH 8,0) en una columna mono S HR 5/5 (Pharmacia, Piscataway, N.J.). Esto proporciona esperanzas para la preparación de cantidades mayores de quimera Ab/Ia usando líneas celulares estables, en donde los niveles de expresión relativos de Ab e Ia se manipulan menos fácilmente que en los sistemas de expresión transitoria.

Se anticipa que las mutaciones de protuberancia-en-cavidad identificadas incrementarán las aplicaciones potenciales de los BsAb que contienen Fc, reduciendo la complejidad de la mezcla de productos obtenidos, desde unas posibles diez especies principales (Suresh et al., Methods Enzymol., 121:210 (1990)) hasta cuatro o menos (Figuras 1A-1B). Se espera que el par mutante T366Y e Y407T será útil para generar heteromultímeros de otros isotipos de IgG humana (tales como el IgG_{2}, IgG_{3} o IgG_{4}) puesto que la T366 e Y407 están completamente conservadas y otros residuos en el dominio C_{H}3 de la interfaz de la IgG_{1} están altamente conservados.

Ejemplo 2 Generación de enlaces disulfuro que no ocurren de forma natural en inmunoadhesinas heteromultiméricas A. Diseño de los enlaces disulfuro entre cadenas de C_{H}3

Se usaron tres criterios para identificar pares de residuos para construir un enlace disulfuro entre dominios C_{H}3 emparejados: i) la separación entre C\alpha preferiblemente es similar a las halladas en enlaces disulfuro naturales (5,0 a 6,8 A) (Srinivasan, N., et al., Int. J. Peptides Protein Res., 36:147-155 (1990)). Se permitieron distancias de hasta 7,6 A para permitir que el movimiento de la cadena principales y para tomar en consideración la incertidumbre en las posiciones atómicas en la estructura del cristal de baja resolución (Deisenhofer, Biochemistry, 20:2361-2370 (1981)). ii) Los átomos C\alpha deberían estar en residuos diferentes en los dos dominios C_{H}3. iii) Los residuos están ubicados para permitir los enlaces disulfuro (Srinivasan, N., et al., (1990) supra).

B. Modelado de los enlaces disulfuro

Los enlaces disulfuro se modelaron en la Fc de la IgG_{1} humana (Deisenhofer, supra) tal como se describió para el humAb4D5-Fv (Rodrigues et al., Cancer Res., 55:63-70 (1995)) usando la versión 95.0 de Insight II (Biosym/MSI).

C. Construcción de variantes del C_{H}3

Se introdujeron mutaciones en el dominio C_{H}3 de una cadena pesada anti-CD3 humanizada o IgG-CD4 mediante mutagénesis dirigida contra un sitio (Kunkel, et al., Methods Enzymol., 154:367-382 (1987)) usando los siguientes oligonucleótidos sintéticos:

Y349C, 5' CTCTTCCCGAGATGGGGGCAGGGTGCACACCTGTGG 3' (SEC. Nº ID.: 1)

S354C, 5' CTCTTCCCGACATGGGGGCAG 3' (SEC. Nº ID.: 2)

E356C, 5' GGTCATCTCACACCGGGATGG 3' (SEC. Nº ID.: 3)

E357C, 5' CTTGGTCATACATTCACGGGATGG 3' (SEC. Nº ID.: 4)

L351C, 5' CTCTTCCCGAGATGGGGGACAGGTGTACAC 3' (SEC. Nº ID.: 5)

D399C, 5' GCCGTCGGAACACAGCACGGG 3' (SEC. Nº ID.: 6)

K392C, 5' CTGGGAGTCTAGAACGGGAGGCGTGGTACAGTAGTTGTT 3' (SEC. Nº ID.: 7)

T394C, 5' GTCGGAGTCTAGAACGGGAGGACAGGTCTTGTA 3' (SEC. Nº ID.: 8)

V397C, 5' GTCGGAGTCTAGACAGGGAGG 3' (SEC. Nº ID.: 9)

D3995, 5' GCCGTCGGAGCTCAGCACGGG 3' (SEC. Nº ID.: 10)

K3925, 5' GGGAGGCGTGGTGCTGTAGTTGTT 3' (SEC. Nº ID.: 11)

C2315:C2345 5' GTTCAGGTGCTGGGCTCGGTGGGCTTGTGTGAGTTTTG 3' (SEC. Nº ID.: 12).

Las mutaciones se indican por el residuo aminoácido y el número (esquema de numeración Eu de Kabat et al., supra (1991)), seguido por el aminoácido de remplazo. Las mutaciones múltiples se representan por las mutaciones sencillas separadas por dos puntos. Los mutantes se verificaron mediante la secuenciación de dideoxinucleótido (Sanger et al., supra (1977)) usando la Sequenase versión 2.0 (United States Biochemicals, Cleveland, Ohio).

D. Un disulfuro entre cadenas potencia la formación de heterodímero

Se compararon seis pares de moléculas que contenían enlaces disulfuro entre cadenas en el dominio C_{H}3 (variantes de "disulfuro-C_{H}3"; v1-v6, Tabla 4) con las moléculas progenitoras por su capacidad para dirigir la formación de un híbrido Ab/Ia, anti-CD3/CD4-IgG (Chamow et al., supra (1994)). Los plásmidos que codificaban las variantes de la IgG-CD4 y de la cadena pesada de anti-CD3 se cotransfectaron en células 293S junto con un exceso de plásmido que codificaba la cadena ligera del anti-CD3. El rendimiento del heterodímero se optimizó mediante transfección con un rango de proporciones de ADN de Ia:cadena H:cadena L. Los productos heterodímero Ab/Ia y homodímero de IgG e Ia se purificaron por afinidad usando Proteína A estafilococal, y se cuantificaron mediante SDS-PAGE y densitometría de barrido de láser (Ridgway et al., supra (1996)).

Cada part disulfuro-C_{H}3 originó tres especies principales, de forma similar a las moléculas progenitoras. Sin embargo, el heterodímero Ab/Ia de las variantes de disulfuro-C_{H}3 estaba desplazado en su movilidad electroforética, de forma consistente con la formación de un disulfuro entre cadena en el dominio C_{H}3. Los disulfuros entre cadenas en la bisagra proporcionaron evidencia adicional de la formación de enlace disulfuro. Los híbridos Ab/Ia unidos covalentemente se observaron mediante SDS-PAGE para las variantes disulfuro-C_{H}3 pero no para moléculas con dominios C_{H}3 del tipo salvaje, en los que las cisteínas de la bisagra están mutadas a serinas. Se prepararon las variantes de disulfuro-C_{H}3 y se denominaron Y349C/S354'C, Y349C/E356'C, Y349C/E357'C, L351C/E354'C, T394C/E397'C, y D399C/K392C. Sólo una variante (D399C/K392'C) incrementó sustancialmente el rendimiento de híbrido Ab/Ia respecto el tipo salvaje (76% vs. 52%, respectivamente) según se determinó mediante análisis de SDS-PAGE de las variantes. Las mutaciones se indican mediante el residuo aminoácido y el número (esquema de numeración Eu de Kabat et al., (1991) supra), seguido por el aminoácido de remplazo. Las mutaciones en las primera y segunda copias del C_{H}3 aparecen antes y después de la barra inclinada. Los residuos en la segunda copia del C_{H}3 se indican con una tilde ('). Esta mejora refleja aparentemente la formación del enlace disulfuro en vez de la sustitución de los residuos K392 y D399, puesto que las mutaciones K392S/D399'S proporcionaron ambas un rendimiento de Ab/Ia y una movilidad electroforética de Ab/Ia relativa al tipo salvaje similares. Los homodímeros migraron de forma similar a aquellos con dominios Fc del tipo salvaje, demostrando la formación preferencial del enlace disulfuro entre cadenas construido en el dominio C_{H}3 de los heterodímeros. Todas las variantes de disulfuro-C_{H}3 se expresaron aproximadamente con el mismo nivel que las moléculas progenitoras en las células 293S.

E. Los disulfuros combinados con la construcción de protuberancia-en-cavidad incrementan el rendimiento de heterodímero hasta el 95%

El mejor par disulfuro incrementó el porcentaje de heterodímero hasta el 87% (Tabla 4; ver también Ridgway et al., (1996) supra). Estas dos estrategias se basan en principios diferentes para incrementará la probabilidad de generar heterodímero. Por tanto, combinados las dos estrategias anticipando una mejora adicional en el rendimiento de heterodímero. Dos de los disulfuros modelados, que contenían L351C o T394C, podían potencialmente forma homodímeros unidos mediante disulfuro así como heterodímeros unidos mediante disulfuro (L351C/S354'C y T394C/V397'C), disminuyendo de ese modo su utilidad. Los cuatro pares de disulfuro restantes se instalaron en el heterodímero seleccionado mediante fago (variantes v9-v16) y se ensayaron en función del rendimiento de heterodímero (Tabla 4). Se obtuvieron rendimientos de aproximadamente el 95% de heterodímero. De nuevo, el heterodímero presentó un desplazamiento en su movilidad electroforética en comparación con las variantes de tipo salvaje y v8.

TABLA 4

Rendimientos de heterodímeros procedentes de las variantes de C_{H}3
		Mutaciones
Variante	Subunidad A	Subunidad B	Rendimiento de heterodímero (%)
tipo salvaje	- -	- -	51 \pm 1
v1	Y349C	S354C	54 \pm 4
v2	Y349C	E356C	55 \pm 6
v3	Y349C	E357C	57 \pm 4
v4	L351C	E354C	56 \pm 3
v5	T394C	E397C	57 \pm 2
v6	D399C	K392C	73 \pm 3
v7	D399S	L392S	55 \pm 1
v8	T366W	T366S:L368A:Y407V	86,7 \pm 2,3
v9	T366W:D399C	T366S:L368A:K392C:Y407V	86,5 \pm 0,5
v11	S354C:T366W	Y349C:T366S:L368A:Y407V	95 \pm 2
v12	E356C:T366W	Y349C:T366S:L368A:Y407V	94 \pm 2
v13	E357C:T366W	Y349C:T366S:L368A:Y407V	93 \pm 2
v14	T366W:K392C	T366S:D399C:L368A:Y407V	92 \pm 1
v15	Y349C:T366W	S354C:T366S:L368A:Y407V	90 \pm 1
v16	Y349C:T366W	E356C:T366S:L368A:Y407V	95,5 \pm 0,5
v17	V349C:T366W	E357C:T366S:L368A:Y407V	91,0 \pm 1,0

Ejemplo 3 Selección guiada por la estructura de fagos de exhibición en busca de mutaciones complementarias que potencian la interacción proteína-proteína en heteromultímeros

La estrategia siguiente es útil en la selección de mutaciones complementarias en polipéptidos que interactúan en una interfaz a través de un dominio de multimerización. La estrategia se ilustra más abajo puesto que es aplicable a la selección de mutaciones de protuberancia-en-cavidad complementarias. No obstante, no se presente que el ejemplo sea limitante, y la estrategia podría aplicarse similarmente a la selección de mutaciones apropiadas para la formación de enlaces disulfuro que no ocurren de forma natural, motivos de cremallera de leucina, interacciones hidrofóbicas, interacciones hidrofílicas, y similares.

A. Selección del fago de exhibición

Se desarrolló una estrategia de exhibición en fago para la selección de heterodímeros de C_{H}3 estables y se esquematiza en la Figura 2. La selección usa un mutante de protuberancia, T366W (Ridgway et al., supra (1996)), fusionado a una marca de péptido (por ejemplo, marca de péptido gD, Lasky, L.A. y Dowbenko, D.J., DNA, 3:23-29 (1984); y Berman, P.W., et al., Science, 227:1490-1492 (1985)) que se coexpresa con una segunda copia de C_{H}3 fusionada a la proteína del gen III del M13. En esta segunda copia de C_{H}3 se creo una biblioteca de mutantes de cavidad mediante aleatorización de los residuos vecinos más cercanos a la protuberancia sobre el primer dominio C_{H}3. A continuación se capturaron los fagos que exhibían heterodímeros de C_{H}3 estables usando un Ab anti-marca.

Se construyó una biblioteca de exhibición en fago de C_{H}3 de 1,1\times10^{5} clones independientes mediante la sustitución de un segmento del gen de C_{H}3 natural con un fragmento de PCR. El fragmento se obtuvo mediante amplificación por PCR usando cebadores degenerados para aleatorizar las posiciones 366, 368 y 407 usando técnicas estándares.

Después de 2 a 5 rondas de selección, la fracción de clones de longitud completa era respectivamente del 90%, 60%, 50% y 10%, según se juzgó por la electroforesis en gel de agarosa del ADN hecho hebra única. Los fagémidos que contenían clones de longitud completa se purificaron después de 5 rondas de selección. Se obtuvieron dos mil transformantes después de transformar de nuevos células XL1-BLUE™ cells (Stratagene).

Se usó una media de >10^{6} copias de cada clon por ronda de criba. Por tanto, numerosas copias de cada clon en la biblioteca estaban probablemente disponibles para la selección, aunque algunos mutantes de supresión surgieron durante el cribado.

Después de 7 rondas de cribado, los mutantes de C_{H}3 obtenidos se aproximaban a una secuencia de aminoácidos consenso en los residuos aleatorizados. Virtualmente todos los clones tenían una serina o treonina en el residuo 366, indicando una preferencia muy fuerte por un \beta-hidroxilo en esta posición. Se observó una preferencia muy fuerte por residuos hidrofóbicos para los residuos 368 y 407, con valina y alanina predominando. Al menos dos veces se recuperaron seis combinaciones de aminoácidos diferentes, incluyendo el mutante triple T366S:L368A:Y407V, el cual se recuperó 11 veces. Ninguno de estos selectores de fago tenía una secuencia idéntica a un heterodímero previamente diseñado, T366W/Y407'A (Ridgway, J.B.B., et al., (1996), supra). Los selectores de fagos podrían estar menos estrechamente empaquetados que el homodímero de C_{H}3 del tipo salvaje a juzgar por una reducción de 40-80 angstroms^{3} en el volumen total de cadena lateral de los residuos en la interfaz del dominio.

Las variantes de C_{H}3 codificadas en el plásmido de expresión pAK19 (Carter et al., 1992) se introdujeron en la cepa 33B6 de E. coli, se expresaron y secretaron a partir de E. coli cultivada hasta densidad celular elevada en un fermentador. El mutante T366S:L368A:Y407V purificado mediante cromatografía con DEAD-Sepharose FF, ABx y Resource S, rindió una única banda principal a continuación de SDS-PAGE. Se recuperaron otras variantes de C_{H}3 con similar pureza. Las masas moleculares del C_{H}3 del tipo salvaje y de las variantes T366S:L368A:Y407V, T366W e Y407A, según se determinaron mediante espectrometría de masas con electrospray de alta resolución, eran como se esperaba.

B. Estabilidad del heterodímero seleccionado con fago

La estabilidad de los heterodímeros de C_{H}3 se verificó primero valorando el fago correspondiente con hidrocloruro de guanidina, seguida por dilución y cuantificación del heterodímero residual mediante ensayo inmunosorbente unido a enzima (ELISA). El ensayo de desnaturalización con hidrocloruro de guanidina con el fago-C_{H}3 proporciona un medio par examinar selectores rápidamente.

Se prepararon fagos a partir de clones individuales a continuación de 7 rondas de selección, y también a partir del vector control, pRAl. De forma resumida, se usaron fagémidos en XL1-BLUE™ para inocular 25 ml de caldo LB que contenía 50 \mug/ml de carbenicilina y 10 \mug/ml de tetraciclina en presencia de 10^{9} pfu/ml de M13K07, y se incubaron durante la noche a 37ºC. Las células se apelotonaron mediante centrifugación (6000 g, 10 minutos, 4ºC). Se recuperaron los fagos del sobrenadante mediante precipitación con 5 ml de PEG al 20% (p/v), NaCl 2,5 M, seguida por centrifugación (12000 g, 10 minutos, 4ºC), y a continuación se resuspendieron en 1 ml de PBS. Se añadieron 180 \mul de guanidina hidrocloruro 0-6 M en PBS a 20 \mul de preparaciones de fagos, y se incubaron durante 5,0 minutos a aproximadamente 25ºC. A continuación se diluyeron alícuotas (20 \mul) de cada muestra de fago 10 veces con agua. La presencia del heterodímero de C_{H}3 se ensayó mediante ELISA, usando placas recubiertas con 5B6 y detectando el fago con un Ab policlonal anti-M13 conjugado con peroxidasa de rábano silvestre, usando o-fenilendiamina como sustrato. La reacción se atenuó mediante la adición de 50 \mul de H_{2}SO_{4} 2,5 M y se midió la absorbancia a 492 nm. Los datos de absorbancia se representaron frente a la concentración de hidrocloruro de guanidina durante la fusión, y se ajustaron a un modelo de 4 parámetros mediante un procedimiento no lineal de mínimos cuadrados usando Kaleidagraph 3.0.5 (Synergy Software).

El heterodímero más frecuentemente recuperado, el T366W/T366'S:L368'A:Y407'V, es similar en estabilidad a otros heterodímeros seleccionados mediante fago. Este heterodímero seleccionado mediante fago es significativamente más estable que el heterodímero diseñado, T366W/Y407'A, pero menos estable que el C_{H}3 del tipo salvaje. Se halló que todas las variantes del C_{H}3, tanto individualmente como en combinación, eran dímeros mediante cromatografía de exclusión de tamaño, en las condiciones en que estas mismas moléculas se estudiaron mediante calorimetría (1,75 mg/ml, en solución salina tamponada con fosfato (PBS)). La única excepción fue el mutante T366S:L368A:Y407V solo, el cual tenía un tiempo de retención ligeramente más corto que los dímero de C_{H}3.

Una mezcla 1:1 de mutantes T366W, protuberancia, y T366S:L368A:Y407V, cavidad, fundió con una única transición a 69,4ºC, de forma consistente con el intercambio de subunidad y formación de un heterodímero estable. Por contra, el homodímero de la protuberancia T366W es mucho menos estable que el heterodímero de protuberancia-en-cavidad T366W/T366'S:L368'A:Y407'V (\DeltaT_{m} = -15,0ºC). El mutante de cavidad T366S:L368A:Y407V por sí mismo es proclive a agregarse cuando se caliente, y no experimenta una transición de fusión fluida.

El mutante de cavidad diseñado, Y407A, se funde a 58,8ºC y 65,4ºC en presencia y ausencia respectivamente del mutante de protuberancia T366W. Esto es consistente con el intercambio de subunidad y formación de un heterodímero T366W/Y407'A que tiene una estabilidad mayor que los homodímeros de T366W (\DeltaT_{m} = 11,0ºC) o Y407A (\DeltaT_{m} = 6,6ºC). El heterodímero seleccionado en fago T366W/T366'S:L368'A:Y407'V es más estable que el heterodímero diseñado T366W/Y407'A (\DeltaT_{m} = 4,0ºC), pero es menos estable que el homodímero de C_{H}3 del tipo salvaje (\DeltaT_{m} = -11,0ºC).

C. Multimerización in vivo de una anticuerpo inmunoadhesina (Ab/Ia) seleccionado en fago

Los mutantes del C_{H}3 diseñados y seleccionados en fagos se compararon por su capacidad para dirigir la formación de un híbrido Ab/Ia, anti-CD3/IgG-CD4 in vivo (Chamow et al., (1994), supra). Esto se consiguió mediante la coexpresión de cadenas anti-CD3 ligera (L) y pesada (H) junto con IgG-CD4. La formación de heterodímeros y homodímeros se verificó mediante purificación con Proteína A seguida por SDS-PAGE y densitometría de barrido de láser (Ridgway, et al., (1996), supra). Se recuperaron rendimientos comparables de híbrido Ab/Ia a partir de las cotransfecciones en las que la cadena pesada anti-CD3 contenía la mutación de protuberancia diseñada, T366W, y la Ia contenía, bien las mutaciones seleccionadas en fagos, T366S:L368A:Y407V, o una mutación de cavidad diseñada, Y407A (Figura 3).

Los mutantes de C_{H}3 diseñados y seleccionados en fagos se evaluaron a continuación por su propensión a formar homodímeros. La mutación de protuberancia T366W es aparentemente bastante destructiva para la homodimerización, puesto que la cotransfección de las correspondientes cadenas pesada y ligera de anticuerpo conduce a un exceso de monómero HL (podría incluir IgG no unida mediante disulfuro) respecto IgG. Por contra, se observan monómeros de IgG pero no de HL para el mismo anticuerpo que contiene dominios C_{H}3 del tipo salvaje. Las mutaciones de cavidad, T366S:L368A:Y407V, son algo destructivas para la homodimerización, puesto que la transfección de los correspondientes fagémidos conduce a una mezcla de predominantemente dímeros de Ia con algunos monómeros de Ia. La mutación de cavidad Y407A es mínimamente destructiva para la homodimerización, a juzgar por la presencia de un dímero de Ia, pero no de monómeros de Ia, a continuación de la transfección del fagémido correspondiente.

La estrategia de selección de la exhibición en fago descrita en ésta permite la selección en favor de mutantes del C_{H}3 que forman heterodímeros estables, y la selección respecto mutantes que forman homodímeros estables. La contra selección contra homodímeros ocurre porque los mutantes de C_{H}3 "libres" competirán con el mutante protuberancia de C_{H}3 marcado por la unión a la proteína de fusión C_{H}3 mutante-gen III. Los mutantes de C_{H}3 libres surgen como un resultado de la mutación ámbar entre el gen del C_{H}3 natural y el gen III del M13. En un huésped supresor de ámbar, tal como XL1-Blue, ambos, la proteína de fusión C_{H}3-gen III y el correspondiente C_{H}3 libre serán secretados.

La desnaturalización con hidrocloruro de guanidina ha probado ser una herramienta útil para el examen preliminar de la estabilidad de los heterodímeros de C_{H}3 en fagos. Los fagos mantienen la infectividad para E. coli incluso después de la exposición de hidrocloruro de guanidina 5 M (Figini et al., J. Mol. Biol., 239:68-78 (1994)). Por tanto, la guanidina podría ser útil también para incrementar la rigurosidad de la selección de mutantes.

El diseño racional y el examen de bibliotecas de exhibición en fagos son estrategias complementarias para remodelar una interfaz de dominio de un homodímero para promover la heterodimerización. En el caso de los dominios C_{H}3, los mutantes diseñados identificaron residuos en la interfaz del dominio que podían reclutarse para promover la heterodimerización. A continuación se uso la exhibición en fago para buscar permutaciones de 3 residuos vecinos a una protuberancia fijada para combinaciones que de la forma más eficiente formaran heterodímeros. Los selectores de fagos son útiles para facilitar el rediseño racional ulterior de la interfaz del dominio, mientras que la estrategia de selección en fagos descrita en ésta demuestra su utilidad para remodelar interfaces proteína-proteína.

Ejemplo 4 Generación y ensamblaje de anticuerpos heteromultiméricos o anticuerpos/inmunoadhesinas que tienen cadenas ligeras comunes

El ejemplo siguiente demuestra la preparación de un anticuerpo biespecífico heteromultimérico que comparte la misma cadena ligera de acuerdo con la invención, y la capacidad de ese anticuerpo para unir sus antígenos diana.

A. Identificación de anticuerpos que comparten la misma cadena ligera: Comparación de bibliotecas de anticuerpos generados contra once antígenos

Se cribó una biblioteca extensa humana de anticuerpos Fv de cadena sencilla (scFv) (Vaughan et al., (1996), supra) en busca de anticuerpos específicos para once antígenos, incluyendo el Axl(ECD del receptor humano quinasa de tirosina), el GCSF-R (ECD del receptor humano del factor estimulador de las colonias de granulocitos humano), la IgE (IgE de ratón), el IgE-R (cadena \alpha del receptor de la IgE humano), el MPL (ECD del receptor quinasa de tirosina humano de la trombopoyetina), el Musk (ECD del receptor quinasa de tirosina humano específico del músculo), el NpoR (ECD del receptor NpoR huérfano humano), el Rse (ECD del receptor quinasa de tirosina Rse humano), el HER3 (ECD del receptor quinasa de tirosina humano HER3/c-erbB3), el Ob-R (ECD del receptor de leptina humano), y el VEGF (factor de crecimiento endotelial vascular humano), en donde ECD se refiere al dominio extracelular. Los datos de la secuencia de nucleótidos para los fragmentos scFv procedentes de las poblaciones de anticuerpos generadas contra dicho antígeno se tradujeron para derivar las correspondientes secuencias de proteína. Las secuencias de V_{L} se compararon entonces usando el programa "align" con el algoritmo de Feng y Doolittle (1985, 1987, 1990) para calcular el porcentaje de identidad entre todas las combinaciones en pareja de las cadenas (Feng, D.F. y Doolittle, R.F., J. Mol. Evol., 21:112-123 (1985); Feng, D.F. y Doolittle, R.F., J. Mol. Evol., 25:351-360 (1987); y Feng, D.F. y Doolittle, R.F., Methods Enzymol., 183:375-387 (1990)). Los resultados del porcentaje de identidad de secuencia de cada comparación por parejas de las secuencias de aminoácidos de cadena ligera se dispusieron en formato de matriz (ver Apéndice).

Para la mayoría de las comparaciones por parejas, se halló al menos una secuencia de cadena ligera común. La Tabla 5 es una comparación de las cadenas de V_{L} mostrando las frecuencias de scFv que comparten cadenas ligeras idénticas (100% de identidad) determinada por el alineamiento de 117 secuencias de aminoácidos de V_{L}. Por ejemplo, la entrada 4/9 (HER3 \times Ob-R, destacada en un recuadro negro), denota que se halló que 4 clones que unen el HER3 comparten su secuencia V_{L} con uno o más clones de anti-Ob-R, mientras que 9 clones que unen el Ob-R comparten su secuencia V_{L} con uno o más clones anti-HER3. Las entradas en la diagonal representan el número de clones de anticuerpo dentro de una población que comparten una secuencia V_{L} con uno o más clones en la población. Por ejemplo, el examen de los clones MPL reveló 5 clones que comparten su secuencia V_{L} con uno o más clones MPL distintos. En los casos en que no se observó secuencia de cadena ligera en común, tales como para (IgE \times Axl) o (NpoR \times IgE-R), el número de fragmentos comparado para al menos una especificidad fue muy pequeño (5 ó menos). Dado el número de cadenas ligeras comunes halladas, es probable que puedan hallarse cadenas ligeras comunes para cualquier comparación de V_{L} si se compara un número suficiente de clones.

Las secuencias de aminoácidos de las cadenas ligeras se examinaron en busca de las posiciones de diferencias en residuos aminoácidos cuando la identidad de secuencia relativa a una cadena ligera común escogida era del 98% y 99%. La Figura 4 es una comparación de secuencias V_{L} de ocho anticuerpos diferentes con especificidades por el Axl (clon Axl.78), el Rse (clones Rse.23, Rse.04, Rse.20, y Rse.15), el IgER (clon IgER.MAT2C1G11), el Ob-R (clon obr.4), y el VEGF (clon vegf.5). La posición de los residuos CDR de unión al antígeno de acuerdo con una definición de secuencia (Kabat, G. A., et al., (1991) supra) o definición estructural (Chothia y Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987)) se muestra respectivamente mediante subrayado y #. Los residuos de la cadena ligera que difieren de la secuencia Axl.78 se muestran mediante subrayado doble. De las 9 cadenas ligeras comparadas, 6 son idénticas. Las cadenas ligeras de Rse.04 y obr.4 (aproximadamente 99% de identidad de secuencia) difieren por un residuo fuera de los CDR de unión al antígeno. La cadena ligera del Rse.20 (aproximadamente 98% de identidad de secuencia) difiere en dos residuos fuera de los CDR de unión al antígeno. Los cambios de residuo aminoácido podrían tener poco o ningún efecto sobre la unión al antígeno. Por tanto, la similitud de secuencia de estas cadenas las hace candidatas para la cadena ligera común de la invención. Alternativamente, de acuerdo con la invención, tales cadenas ligeras que tienen un 98-99% de identidad de secuencia con la cadena ligera de un scFv emparejado probable (por ejemplo, Axl.78) podrían sustituirse con la cadena ligera emparejada y retener la especificidad de unión.

B. Identificación de anticuerpos que comparten la misma cadena ligera, y construcción de un anticuerpo biespecífico que comparte esa cadena ligera: Anti-Ob-R/Anti-HER3

Los fragmentos scFv que unen el receptor de leptina humano (Ob-R) o el dominio extracelular del producto del gen HER3/c-erbB3 (HER3) se obtuvieron mediante tres rondas de cribado usando una extensa biblioteca en fago de scFv humana (Vaughan et al., (1996), supra). La IgG-receptor de leptina e IgG-HER3 (10 \mug en 1 ml de PBS) se usaron para recubrir Immunotubos separados (Nunc; Maxisorp) durante la noche a 4ºC. A continuación se realizaron el cribado y rescate de fagos tal como describieron Vaughan et al., (1996), supra, con las modificaciones siguientes. En cada paso de cribado se incluyó un anticuerpo humanizado huMAb4D5-8 (Carter, P., et al., PNAS USA, 89:4285-4289 (1992)) o anti-IgE humanizado (Presta, L., et al., J. Immunol., 151:2623-2632 (1993)) a una concentración de 1 mg/ml para absorber fago unidor de Fc. Además, también se uso el cribado en solución (Hawkins, R.E., et al., J. Mol. Biol., 226:889-896 (1992)) para identificar scFv unidores de receptor de leptina. El receptor de leptina se separó del Fc mediante proteolisis específica del receptor de leptina-IgG con la proteasa manipulada Genenase (Carter, P., et al., Proteins: Structure, Function and Genetics, 6:240-248 (1989)) seguida por cromatografía con Proteína A-Sepharose. El receptor de la leptina se biotiniló y usó a una concentración de 100 nM, 25 nM y 5 nM respectivamente la primera, segunda, y tercera ronda de cribado. Los fagos que unían el antígeno biotinilado se capturaron usando cuentas paramagnética recubiertas de estreptoavidina (Dynabeads, Dynal, Oslo, Noruega).

Los clones procedentes de las rondas 2 y 3 de cada cribado se examinaron mediante ELISA de fagos y scFv usando el antígeno correspondiente y también una inmunoadhesina o anticuerpo control. La diversidad de clones positivos para el antígeno se analizaron mediante amplificación con PCR del inserto de scFv usando los cebadores fdtetseq y PUC hacia atrás (Vaughan et al., (1996), supra) y mediante digestión con BstNI (Marks et al., (1991) supra). A continuación, de uno a cinco clones por huella de BstNI se secuenciaron en ciclos usando terminadores de cadena dideoxi fluorescentes (Applied Biosystems) usando cebadores de PCR de enlace pesado y mcy seq 10 (Vaughan et al., (1996), supra). Las muestras se analizaron usando un secuenciador de ADN automatizado de Applied Biosystems y las secuencias se analizaron usando SeqEd. Se destaca también que la desnaturalización del anticuerpo con hidrocloruro de guanidina y el procedimiento de reorganización de cadena in vitro de Figini, combinados con la selección por exhibición en fagos, es útil como procedimiento para seleccionar anticuerpos que tienen la misma cadena ligera (Figini, M., et al., (1994), supra, incorporada en ésta por referencia en su totalidad).

Usando el procedimiento descrito más arriba, se obtuvieron once clones anti-HER3 diferentes y 18 clones anti-Ob-R (11 a partir de cribado usando antígeno recubierto y 7 a partir de cribado con antígeno biotinilado). Los clones se secuenciaron mediante técnicas estándares para determinar las secuencias de las cadenas ligeras asociadas con cada dominio unidor (Figura 5). Las secuencias son las secuencias V_{H} y V_{L} común del clon 26 anti-Ob-R y del clon 18 anti-HER3 usadas para construir un anticuerpo biespecífico (ver más abajo). Los residuos se numeran de acuerdo con (Kabat, E.A., et al., (1991) supra). La posición de los residuos del CDR unidor de antígeno de acuerdo con una definición de secuencia (Kabat, et al., (1991) supra) o una definición estructural (Chothia y Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987)) se muestran respectivamente mediante subrayado y rayado por encima. La identidad entre residuos en las secuencias V_{H} se indica mediante *.

Las secuencias de las cadenas ligeras se compararon para múltiples clones anti-HER3 en relación a múltiples clones anti-Ob-R (Figura 6 y Tabla 5). Se observó que cuatro de once clones anti-HER3 comparten una V_{L} idéntica con uno o más clones anti-receptor Ob-R. De forma opuesta, nueve de dieciocho clones anti-Ob-R comparten la misma V_{L} que uno de los clones anti-HER3.

TABLA 5

100

La construcción de anti-Ob-R/anti-HER3, un anticuerpo biespecífico que tiene una cadena ligera común se realizó como sigue. Se usaron polipéptidos primero y segundo de C_{H}3 alterados que tienen protuberancias y cavidades complementarias, así como los enlaces disulfuro que no ocurren naturalmente, para la construcción de un anticuerpo biespecífico que contenía el Fc. La V_{L} del clon 26 anti-Ob-R y el clon 18 anti-HER3, los cuales clones comparten la misma cadena ligera, así como las cadenas pesadas de cada anticuerpo, se usaron para preparar el anticuerpo biespecífico de acuerdo con los procedimientos descubiertos en ésta.

Este anticuerpo tenía un desplazamiento de movilidad electroforética en si peso molecular aparente en relación a un anticuerpo biespecífico que difiere sólo por una ausencia de alteraciones para la generación de enlaces disulfuro no naturales. Un gel de 8% SDS-PAGE de variantes del anticuerpo heterodimérico con y sin enlaces disulfuro que no ocurren de forma natural mostró un desplazamiento en la movilidad desde un PM aparente de aproximadamente 230 para el heterodímero del tipo salvaje, hasta un PM aparente de aproximadamente 200 para un heterodímero que tiene un enlace disulfuro no natural. El desplazamiento del PM fue suficiente para permitir la determinación del porcentaje de cada variante que exitosamente formaba el enlace disulfuro no natural.

La especificidad de unión para ambos, el Ob-R y el HER3 del anticuerpo biespecífico se ensayó mediante procedimientos ELISA estándares, tales como el procedimiento siguiente. La unión de Ob-R se demostró en un ensayo ELISA con Ob-R presente como una proteína de fusión Ob-R-Ig. La proteína de fusión Ob-R-Ig se depositó sobre el pocillo de una placa de microvaloración de 96 pocillos, y se añadió el anticuerpo biespecífico.

El pocillo se lavó varias veces para eliminar la unión no específica al Ob-R-Ig. Como un segundo componente en el mismo ensayo, se añadió una proteína de fusión HER3-Ig biotinilada y se detectó por medio de la unión del complejo estreptoavidina-peroxidasa de rábano silvestre a la proteína de fusión HER3-Ig biotinilada. La unión se detecta mediante la generación de un cambio de color a partir de la adición de peróxido de hidrógeno y sustrato TMB de peroxidasa (Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD).

En las condiciones acabadas de describir, la unión de un anticuerpo biespecífico a ambas, a la Ob-R-Ig y a la HER3-Ig se observaría como marca detectable inmovilizada sobre la superficie del pocillo de microvaloración debido a la formación de un complejo que comprende la inmovilizada Ob-R-Ig/anticuerpo biespecífico/HER3-Ig biotina/estreptoavidina marcada detectablemente. Los anticuerpos que unen la HER3-Ig pero no la Ob-R-Ig no forman el complejo anterior y proporcionan un resultado negativo. Por contra, el anticuerpo biespecífico que se espera una tanto la Ob-R-Ig como la HER3-Ig, forma el complejo rindiendo un resultado positivo en el ensayo, demostrando que el anticuerpo biespecífico, que tiene una cadena ligera común, une ambos HER3 y Ob-R.

La expresión y purificación del anticuerpo biespecífico anti-(Ob-R/HER3) se realizó como sigue. Se transfectaron células 293S renales embrionarias humanas con tres ADN de plásmidos, codificando cada uno de ellos por separado la cadena pesada anti-Ob-R, la cadena pesada anti-HER3, o la cadena ligera del clon 26 a 18 que era común a cada uno de los anticuerpos, tal como se ha descrito más arriba. Para cada transfección, la proporción de ADN codificando cadena pesada respecto ADN codificando cadena ligera fue de 1:3 de forma que la cadena ligera no fuera limitante para el ensamblaje del anticuerpo biespecífico anti-Ob-R/anti-HER3. Ambas cadenas pesadas fueron transfectadas en una proporción 1:1 con respecto la una de la otra. A continuación se cotransfectaron 12 \mug de ADN de plásmido total en células 293S por medio de la precipitación con fosfato cálcico (Gorman, C., DNA Cloning, volumen II., Ed. D.M. Glover, IRL Press, Oxford, p. 143 (1985)). Las célula se lavaron con PBS antes de añadir medio de cultivo que se pretendía potenciara la expresión de proteína. Las proteínas que contenían Fc se purificaron de los sobrenadantes de células usando Proteína A inmovilizada (ProSep A, BioProcessing Ltd., UK) y tampón cambiado por PBS. Se añadió iodoacetamida a las preparaciones de proteína hasta una concentración final de 50 mM para impedir la reordenación de los puente disulfuro.

Como un ejemplo adicional, se realizó como sigue la expresión y purificación de un anticuerpo/inmunoadhesina anti-(CD3/CD4). Se transfectaron células 293S renales embrionarias humanas con tres ADN de plásmidos, codificando cada uno de ellos por separado la cadena pesada anti-CD3, la cadena pesada de IgG_{1} anti-CD4, o la inmunoadhesina de IgG_{1} anti-CD4. Para cada transfección, la proporción de ADN codificando la cadena ligera respecto al ADN codificando cadena la cadena pesada fue de 3:1, de forma que la cadena ligera no fuera limitante para el ensamblaje de la IgG anti-CD3. Adicionalmente, puesto que la inmunoadhesina se expresa pobremente, la proporción de plásmido codificando la inmunoadhesina se añadió en exceso respecto el plásmido codificando la cadena pesada. Las proporciones ensayadas oscilaban desde 3:1:3 hasta 8:1:3 para los fagémidos de inmunoadhesina:cadena pesada:cadena ligera. A continuación se cotransfectaron 10 \mug de ADN de plásmido total en células 293S por medio de la precipitación con fosfato cálcico (Gorman, C., (1985), supra), lavándose las célula con PBS antes de la transfección. Las proteínas que contenían Fc se purificaron de los sobrenadantes de células usando Proteína A inmovilizada (ProSep A, BioProcessing Ltd., UK) y tampón cambiado por PBS. Se añadió iodoacetamida a las preparaciones de proteína hasta una concentración final de 50 mM para impedir la reordenación de los puentes disulfuro.

En cada una de las preparaciones anteriores, las muestras de proteína se electroforaron en geles de poliacrilamida al 8% (Novex) y se visualizaron mediante tinción con azul Serva. Los geles se destiñeron dejando una fondo claro en un esfuerzo para permitir la visualización y cuantificación de los contaminantes menores. Los geles secados se escanearon con el densitómetro de barrido (GS-670, BioRad) y los productos de proteína se cuantificaron con el programa Molecular Analyst.

Se ha descubierto en ésta que los puentes disulfuro no naturales (construidos) introducidos en el dominio C_{H}3 potencian la formación de heterodímero. Una par de polipéptido, K292C/D399'C, potencian la formación de heterodímero generando hasta un 76% de heterodímero (Tabla 4, variante v6). Más aún, cuando se combinó la presencia de un enlace disulfuro entre cadenas con la tecnología de protuberancia-en-cavidad, se obtuvo aproximadamente un 95% de heterodímero (Tabla 4, variantes v11, v12 y v16). Por tanto, el procedimiento de la invención para incrementar la interacción proteína/proteína específica entre el primer y segundo polipéptidos de un anticuerpo biespecífico incrementa el rendimiento de heteromultímero deseado y minimiza la formación de heteromultímero no deseado o de homomultímeros.

Además, el procedimiento de caracterizar el producto de heteromultímeros mediante el análisis de movilidad electroforética permite la determinación de la cantidad relativa de heteromultímeros deseados en relación a los productos no deseados.

La selección de una cadena ligera común, tal como se describe en ésta, incrementa adicionalmente el rendimiento del heteromultímero deseado al eliminar la posibilidad de emparejamiento incorrecto entre cadenas pesadas variables y cadenas ligeras de un anticuerpo multiespecífico.

C. Identificación de anticuerpos que comparten la misma cadena ligera, y construcción de un anticuerpo biespecífico que comparte esa cadena ligera: Anti-MpI/Anti-HER3

La identificación, construcción y expresión de otro anticuerpo específico de la invención se demuestra en ésta. Los procedimiento descritos en las Partes A y B de este ejemplo se utilizaron para la preparación del anticuerpo biespecífico anti-Mpl/anti-HER3.

Usando los procedimientos descritos en la Sección A de este ejemplo (Comparación de bibliotecas de anticuerpos generadas contra once antígenos), supra, las secuencias de aminoácido de V_{H} y V_{L} del scFv anti-HER3 se compararon con 23 scFv que se unían al receptor de trombopoyetina humano, c-Mpl. Cinco de los once clones anti-HER3 compartían una secuencia de aminoácido de V_{L} idéntica con uno o más de los clones unidores de Mpl. A la inversa, siete de veintitrés scFv anti-Mpl compartían la misma V_{L} que uno de los clones anti-HER3 (ver Tabla 5, más arriba, recuadro sin fondo). Por contra, las secuencias de aminoácidos de V_{H} eran mucho más diversas, con un nivel de identidad del 40 a 90% entre cualquier clon anti-Mpl y anti-HER3.

El scFv anti-Mpl 12B5 (nº de acceso en Genebank AF048775; SEC. ID. Nº 27) y el clon G6 de scFv anti-HER3 (nº de acceso en Genebank AF048774; SEC. ID. Nº 28) utilizan secuencias V_{L} idénticas y secuencias V_{H} sustancialmente diferentes. Estos fragmentos scFv se usaron para construir el anticuerpo de IgG biespecífico anti-Mpl/anti-HER3, capaz de una heterodimerización eficiente debido a la cadena ligera compartida así como a través del uso de mutaciones de botones-en-agujeros (descritas en ésta) y un enlace disulfuro construido entre los dominios C_{H}3. Los anticuerpos que comparten la misma cadena L se escogieron para salvar el problema de cadenas L emparejándose con cadenas H no correspondientes. También estaban presentes dos enlaces disulfuro en la región bisagra que ocurren naturalmente. La cadena L común se cotransfectó con las dos cadenas H que contienen las mutaciones de C_{H}3 de la variante v11. Los productos de IgG se purificaron mediante cromatografía de afinidad con Proteína A y se analizaron mediante SDS-PAGE usando técnicas estándares.

La preparación de anticuerpo IgG biespecífico (BsIgG) proporcionó una única banda principal que mostraba una movilidad mayor que la IgG que contenía los dominios C_{H}3 del tipo salvaje. Este incremento en la movilidad electroforética fue consistente con la formación de un enlace disulfuro construido en el BsIgG, formándose una especie de proteína más compacta.

La capacidad del anticuerpo BsIgG anti-Mpl/anti-HER3 para unir ambos antígenos Mpl y HER3 se ensayó usando un ELISA como sigue. Usando tampón PBS en todos los pasos, se recubrieron durante la noche pocillos individuales en una placa de 96 pocillos (Maxisorp, Nunc) con IgG-HER3 o IgG-Mpl a 5 \mug/ml, se lavaron, y a continuación se bloquearon durante 1 hora con BSA al 0,5% (p/v), Los anticuerpos primarios eran el BsIgG anti-Mpl \times anti-HER3 que contenía las mutaciones Y349C:T366S:L368A:Y407V/T266'W:S354'C y la correspondiente IgG anti-Mpl o anti-HER3 con las regiones Fc mutadas. Los anticuerpos primarios (1 \mug/ml) se incubaron individualmente durante 2 horas a 23ºC con IgG-HER3 biotinilada y una dilución 1:5000 de conjugado de estreptoavidina:peroxidasa de rábano silvestre (Boehringer Mannheim), y a continuación se añadieron a los pocillos y se incubaron durante 1 hora adicional a 23ºC. La actividad peroxidasa se detectó con reactivos TMB según indicaba el vendedor (Kirkegaard and Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD).

Tal como se anticipaba, el IgG anti-Mpl/anti-HER3 unión eficiente y simultáneamente cada antígeno ECD de Mpl y HER3, individualmente así como ambos antígenos simultáneamente. Por contra, las IgG anti-Mpl y anti-HER3 progenitoras sólo se unían a su correspondiente antígeno relacionado (Figura 6).

D. Los anticuerpos que contienen una región Fc diseñada son capaces de eficiente citotoxicidad mediante por célula y dependiente de anticuerpo

Para demostrar que la región F_{c} manipulada (mutaciones del C_{H}3, más arriba) utilizada en la generación de los anticuerpos biespecíficos ilustrativos de la invención es capaz de citoxoticidad mediada por célula y dependiente de anticuerpo (ADCC), se realizó el experimento siguiente.

Las mutaciones del C_{H}3 mantienen la capacidad de soportar una eficiente citotoxicidad mediada por célula y dependiente de anticuerpo (ADCC) tal como se demostró usando el procedimiento de Lewis, G.D., et al., (Lewis, G.D., et al., Cancer Immunol. Immunother. 37:255-263 (1993)). De forma resumida, los ensayos de citotoxicidad se realizaron con células diana SK-BR-3 y HBL-100 marcadas con ^{51}Cr (números de acceso ATCC HTB-30 y 45509 respectivamente), y con linfocitos de sangre periférica humana como células efectoras. Sin embargo, a diferencia de Lewis et al., los linfocitos no se activaron con IL-2.

Las mutaciones del C_{H}3 S354:T366W y Y349:T366S;L268A;Y407V se introdujeron por separado en la cadena H del anticuerpo anti-HER2 humanizado huMAb4D5-5 preparado por Carter et al., (Carter, P., et al., PNAS USA 89:4285-4289 (1992)). Los anticuerpos que contienen regiones Fc remodeladas y del tipo salvaje tenían una potencia similar en la ADCC a la de la línea celular de cáncer de mama SK-BR-3 que expresa la HER2 (Figura 7). Ambos anticuerpos, el remodelado y el de tipo salvaje, mostraron una baja actividad comparable frente a la línea celular epitelial de mama normal. Los efectos en la cadena H son independientes de los dominios unidores, se prediciéndose que estos BsIgG funcionarán en la citotoxicidad mediada por célula y dependiente de anticuerpo.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SOLICITANTE: GENENTECH, INC.

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: PROCEDIMIENTO PARA CONSTRUIR ANTICUERPOS MULTIESPECÍFICOS QUE TIENEN COMPONENTES HETEROMULTIMÉRICOS Y COMUNES

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 28

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

DIRECCIÓN POSTAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESTINATARIO: Genentech, Inc.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

DIRECCIÓN: 1 DNA Way

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: South San Francisco

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO: California

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAIS: Estados Unidos de América

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

(ZIP): 94080

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

FORMATO LEGIBLE POR ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE MEDIO: Disquete de 3,5 pulgadas, 1,44 Mb

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: Compatible con PC de IBM

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

PROGRAMA: WinPatin (Genentech)

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: PCT/US98/08762

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE REGISTRO: 30-Abril-1998

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

DATOS DE LA SOLICITUD PREVIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: 08/850058

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE REGISTRO: 02-Mayo-1997

\vskip0.800000\baselineskip

(viii)

ABOGADO/AGENTE DE INFORMACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Conley, Deirdre L.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 36.487

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE REFERENCIA: P1099R2PCT

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

INFORMACIÓN PARA TELECOMUNICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TELÉFONO: 650/225-2066

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TELEFAX: 650/952-9881

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 36 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 1:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTCTTCCCGA GATGGGGGCA GGGTGCACAC CTGTGG

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 2:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTCTTCCCGA CATGGGGGCA G

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 3:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGTCATCTCA CACCGGGATG G

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 4:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTTGGTCATA CATTCACGGG ATGG

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTCTTCCCGA GATGGGGGAC AGGTGTACAC

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCCGTCGGAA CACAGCACGG G

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 39 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 7:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTGGGAGTCT AGAACGGGAG CCGTGGTACA GTAGTTCTT

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 33 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 8:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTCGGAGTCT AGAACGGGAG GACAGGTCTT GTA

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTCGGAGTCT AGACAGGGAG G

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 10:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCCGTCGGAG CTCAGCACGG G

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 11:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGAGGCGTG GTGCTGTAGT TGTT

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 38 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 12:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTTCAGGTGC TGGGCTCGGT GGGCTTGTGT GAGTTTTG

\hfill

38

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 821 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 13:

\vskip1.000000\baselineskip

1

2

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 50 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 14:

\vskip1.000000\baselineskip

3

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 50 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 15:

\vskip1.000000\baselineskip

4

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 50 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 16:

\vskip1.000000\baselineskip

5

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 50 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 17:

\vskip1.000000\baselineskip

6

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 50 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 18:

\vskip1.000000\baselineskip

7

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 50 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 19:

\vskip1.000000\baselineskip

8

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 50 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 20:

\vskip1.000000\baselineskip

9

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 21:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 50 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 21:

\vskip1.000000\baselineskip

10

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 22:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 50 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 22:

\vskip1.000000\baselineskip

11

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 23:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 122 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 23:

\vskip1.000000\baselineskip

12

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 24:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 123 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 24:

13

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 25:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 107 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 25:

\vskip1.000000\baselineskip

14

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 26:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 261 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 26:

15

16

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 27:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 717 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 27:

17

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 28:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 732 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 28:

\vskip1.000000\baselineskip

18

Claims (53)

1. Procedimiento para preparar un anticuerpo multiespecífico que comprende al menos dos dominios de unión diferentes, en donde

un primer dominio de unión une una primera molécula y un segundo dominio de unión une una segunda molécula diferente de dicha primera molécula;

cada dominio de unión comprende (i) un dominio variable de cadena pesada que es parte de un polipéptido que comprende además un dominio de multimerización, y (ii) un dominio variable de una cadena ligera,

el primer dominio de unión comprende un primer dominio variable de cadena pesada de un primer polipéptido, el segundo dominio de unión comprende un segundo dominio variable de cadena pesada de un segundo polipéptido, y el primer y segundo dominios variables de cadena pesada son diferentes, y

los polipéptidos multimerizan mediante la interacción de dichos dominios de multimerización,

y en donde,

o bien cada dominio variable de cadena ligera es idéntico,

o el anticuerpo multiespecífico comprende un primer dominio variable de cadena ligera y un segundo dominio variable de cadena ligera, el primer y segundo dominios variables de cadena ligera difieren el uno del otro pero tienen al menos un 80% de identidad de secuencia de aminoácidos, y dicho primer dominio de unión une dicha primera molécula, si dicho primer dominio de unión comprende el primer dominio variable de cadena ligera o comprende el segundo dominio variable de cadena ligera, y dicho segundo dominio de unión une dicha segunda molécula, si dicho segundo dominio de unión comprende el segundo dominio variable de cadena ligera o el primer dominio variable de cadena ligera,

comprendiendo el procedimiento los pasos de:

(i)

cultivar una célula hospedadora que comprende el ácido nucleico que codifica dichos polipéptidos y la cadena ligera o cadenas ligeras, en donde el cultivo es tal que el ácido nucleico se expresa y se producen los polipéptidos y la cadena ligera o las cadenas ligeras; y

(ii)

recuperar el anticuerpo multiespecífico del cultivo de células hospedadoras.

2. Procedimiento de la reivindicación 1, en donde el ácido nucleico que codifica el dominio de multimerización de dicho primer polipéptido, o el ácido nucleico que codifica el dominio de multimerización de dicho segundo polipéptido, o ambos, se proporcionan mediante la alteración del ácido nucleico para alterar la secuencia de aminoácidos codificada.

3. Procedimiento de la reivindicación 2, en donde el ácido nucleico que codifica el dominio de multimerización de dicho primer polipéptido, de dicho segundo polipéptido, o de ambos, se altera con el fin de que el dominio de multimerización de cada uno de dichos primer o segundo polipéptidos comprenda un residuo que contiene un tiol libre, el cual forma un enlace disulfuro con un residuo que contiene un tiol libre del dominio de multimerización del otro de dichos primer o segundo polipéptidos.

4. Procedimiento de la reivindicación 1, en donde la multimerización de dichos polipéptidos comprende una interacción protuberancia-en-cavidad, en donde el procedimiento comprende además, antes del paso (i):

proporcionar el ácido nucleico que codifica el primer polipéptido mediante la alteración del ácido nucleico para generar una protuberancia en el dominio de multimerización del polipéptido codificado mediante el reemplazo de un residuo aminoacídico con un residuo importado que tiene un mayor volumen de cadena lateral, y

proporcionar el ácido nucleico que codifica el segundo polipéptido mediante la alteración del ácido nucleico para generar una cavidad compensatoria en el dominio de multimerización del polipéptido codificado mediante el reemplazo de un residuo aminoacídico con un residuo importado que tiene un menor volumen de cadena lateral.

5. Procedimiento de la reivindicación 4, en donde se proporciona el ácido nucleico que codifica, un primer polipéptido que comprende un dominio de multimerización que tiene una protuberancia, un segundo polipéptido que comprende un dominio de multimerización que tiene una cavidad, o un primer polipéptido que comprende un dominio de multimerización que tiene una protuberancia y un segundo polipéptido que comprende un dominio de multimerización que tiene una cavidad, por medio de selección por exhibición en fago.

6. Procedimiento de la reivindicación 4, en donde el residuo importado que tiene un mayor volumen de cadena lateral se selecciona de entre el grupo que consiste en arginina (R), fenilalanina (F), tirosina (Y), (W), isoleucina (I) y leucina (L).

7. Procedimiento de la reivindicación 4, en donde el residuo importado que tiene un menor volumen de cadena lateral se selecciona de entre el grupo que consiste en glicina (G), alanina (A), serina (S), treonina (T), y valina (V), y en donde el residuo importado no es cisteína (C).

8. Procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde el primer y segundo polipéptido comprenden cada uno un dominio constante de anticuerpo.

9. Procedimiento de la reivindicación 8, en donde el primer y segundo polipéptido comprenden cada uno un dominio constante de anticuerpo seleccionado de entre el grupo que consiste en un dominio C_{H}3 y un dominio constante de IgG.

10. Procedimiento de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo multiespecífico es una inmunoadhesina.

11. Procedimiento de la reivindicación 1, que además comprende un paso que precede al paso (i) en donde dicho ácido nucleico se introduce en la célula hospedadora.

12. Procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en donde cada dominio variable de cadena ligera es idéntico.

13. Procedimiento de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo multiespecífico comprende un primer dominio variable de cadena ligera y un segundo dominio variable de cadena ligera, y el primer y segundo dominios variables de cadena ligera difieren el uno del otro, pero tienen al menos un 90% de identidad de secuencia de aminoácidos.

14. Procedimiento de la reivindicación 13, en donde el primer y segundo dominios variables de cadena ligera tienen al menos el 95% de identidad de secuencia de aminoácidos.

15. Procedimiento de la reivindicación 14, en donde el primer y segundo dominios variables de cadena ligera tienen al menos el 98% de identidad de secuencia de aminoácidos.

16. Procedimiento de la reivindicación 15, en donde el primer y segundo dominios variables de cadena ligera tienen al menos el 99% de identidad de secuencia de aminoácidos.

17. Anticuerpo multiespecífico que comprende al menos dos dominios de unión diferentes, en donde,

un primer dominio de unión une una primera molécula y un segundo dominio unidor une una segunda molécula diferente de dicha primera molécula,

cada dominio de unión comprende (i) un dominio variable de cadena pesada que es parte de un polipéptido que comprende además un dominio de multimerización, y (ii) un dominio variable de una cadena ligera,

el primer dominio de unión comprende un primer dominio variable de cadena pesada de un primer polipéptido, el segundo dominio de unión comprende un segundo dominio variable de cadena pesada de un segundo polipéptido, y el primer y segundo dominios variables de cadena pesada son diferentes, y

los polipéptidos multimerizan mediante la interacción de dichos dominios de multimerización,

y en donde,

o bien cada dominio variable de cadena ligera es idéntico,

o el anticuerpo multiespecífico comprende un primer dominio variable de cadena ligera y un segundo dominio variable de cadena ligera, el primer y segundo dominios variables de cadena ligera difieren el uno del otro pero tienen al menos un 80% de identidad de secuencia de aminoácidos, y dicho primer dominio de unión une dicha primera molécula, si dicho primer dominio de unión comprende el primer dominio variable de cadena ligera o el segundo dominio variable de cadena ligera, y dicho segundo dominio de unión une dicha segunda molécula, si dicho segundo dominio de unión comprende el segundo dominio variable de cadena ligera o el primer dominio variable de cadena ligera.

18. Anticuerpo multiespecífico de la reivindicación 17, en donde el dominio de multimerización del primer polipéptido, o el dominio de multimerización del segundo polipéptido, o ambos, se proporcionan mediante la alteración de un aminoácido.

19. Anticuerpo multiespecífico de la reivindicación 18, en donde el dominio de multimerización de cada uno de dichos primer o segundo polipéptidos comprende un residuo que contiene un tiol libre, el cual forma un enlace disulfuro con un residuo que contiene un tiol libre del dominio de multimerización del otro de dichos primer o segundo polipéptidos.

20. Anticuerpo multiespecífico de la reivindicación 18, en donde la multimerización de dichos polipéptidos comprende una interacción de protuberancia-en-cavidad, y el dominio de multimerización del primer polipéptido comprende una protuberancia, y el dominio de multimerización del segundo polipéptido comprende una cavidad compensatoria.

21. Anticuerpo multiespecífico de la reivindicación 20, en donde la protuberancia y la cavidad se generan mediante alteraciones en las que se importan, en el primer y segundo polipéptidos, aminoácidos que se encuentran de manera natural.

22. Anticuerpo multiespecífico de cualquiera de las reivindicaciones 17-21, en donde cada dominio variable de cadena ligera es idéntico.

23. Anticuerpo multiespecífico de la reivindicación 17, en donde el anticuerpo multiespecífico comprende un primer dominio variable de cadena ligera y un segundo dominio variable de cadena ligera, y el primer y segundo dominios variables de cadena ligera difieren el uno del otro, pero tienen al menos un 90% de identidad de secuencia de aminoácidos.

24. Anticuerpo multiespecífico de la reivindicación 23, en donde el primer y segundo dominios variables de cadena ligera tienen al menos un 95% de identidad de secuencia de aminoácidos.

25. Anticuerpo multiespecífico de la reivindicación 24, en donde el primer y segundo dominios variables de cadena ligera tienen al menos un 98% de identidad de secuencia de aminoácidos.

26. Anticuerpo multiespecífico de la reivindicación 25, en donde el primer y segundo dominios variables de cadena ligera tienen al menos un 99% de identidad de secuencia de aminoácidos.

27. Composición que comprende el anticuerpo multiespecífico de la reivindicación 17 y un portador.

28. Célula hospedadora que comprende ácido nucleico que codifica el anticuerpo multiespecífico de la reivindicación 17.

29. Célula hospedadora de la reivindicación 28, en donde la célula hospedadora es una célula de mamífero.

30. Procedimiento para preparar un anticuerpo multiespecífico que comprende un primer dominio de unión que une una primera molécula y un segundo dominio de unión que une una segunda molécula diferente de dicha primera molécula, comprendiendo el procedimiento:

(a)

seleccionar un primer ácido nucleico que codifica un primer polipéptido que comprende un primer dominio variable de cadena pesada y un dominio de multimerización, y seleccionar un segundo ácido nucleico que codifica un segundo polipéptido que comprende un segundo dominio variable de cadena pesada y un dominio de multimerización, en donde el primer y segundo dominios variables de cadena pesada son diferentes y el dominio de multimerización de cada uno de dichos primer y segundo polipéptidos comprende un residuo aminoácido que interacciona específicamente con un residuo aminoácido en el dominio de multimerización del otro de dichos primer y segundo polipéptidos, generando de esta manera una interacción estable entre el primer y segundo polipéptidos:

(b)

o

(i)

seleccionar ácido nucleico que codifica un dominio variable de cadena ligera, en donde la cadena ligera variable interacciona con cada primer y segunda polipéptidos para formar dichos primer y segundo dominios de unión, o

(ii)

seleccionar un ácido nucleico que codifica una primera cadena ligera variable y un ácido nucleico que codifica una segunda cadena ligera variable, en donde las primera y segunda cadenas ligeras variables difieren entre ellas pero tienen al menos un 80% de identidad de secuencia de aminoácidos, cada una de las primera y segunda cadenas ligeras variables interacciona con uno del primer y segundo polipéptidos para formar dichos primer y segundo dominios de unión, y dicho primer dominio de unión une dicha primera molécula, si dicho primer dominio de unión está formado por la interacción del primer polipéptido con la primera cadena ligera variable o por la interacción del primer polipéptido con la segunda cadena ligera variable, y dicho segundo dominio de unión une dicha segunda molécula, si dicho segundo dominio de unión está formado por la interacción del segundo polipéptido con la segunda cadena ligera variable o por la interacción del segundo polipéptido con la primera cadena ligera variable;

(c)

introducir dentro de una célula hospedadora el ácido nucleico que codifica el primer y segundo polipéptidos y la cadena ligera variable o las cadenas ligeras variables, y cultivar la célula de manera que tenga lugar la expresión del ácido nucleico, y que se produzcan los polipéptidos codificados y la cadena ligera variable o cadenas ligeras variables.

(d)

recuperar el anticuerpo multiespecífico del cultivo celular.

31. Procedimiento de la reivindicación 30, en donde dicho primer ácido nucleico que codifica el primer polipéptido, dicho segundo ácido nucleico que codifica el segundo polipéptido, o ambos, se seleccionan a partir de ácido nucleico para alterar la secuencia de aminoácidos codificada.

32. Procedimiento de la reivindicación 31, en donde el primer y segundo polipéptidos interaccionan mediante una interacción de protuberancia-en-cavidad.

33. Procedimiento de la reivindicación 31, en donde el ácido nucleico se altera para importar un residuo que contiene un tiol libre en la secuencia de aminoácidos codificada.

34. Procedimiento de la reivindicación 30, en donde el primer y segundo polipéptidos comprenden cada uno un dominio constante de anticuerpo.

35. Procedimiento de la reivindicación 34, en donde el dominio constante de anticuerpo es un dominio C_{H}3.

36. Procedimiento de la reivindicación 34, en donde el dominio constante de anticuerpo procede de una IgG humana.

37. Procedimiento de la reivindicación 30, en donde el ácido nucleico se selecciona de acuerdo con (i).

38. Procedimiento de la reivindicación 30, en donde el ácido nucleico se selecciona de acuerdo con (ii).

39. Procedimiento de la reivindicación 38, en donde la primera y segunda cadenas ligeras variables difieren la una de la otra pero tienen al menos un 90% de identidad de secuencia de aminoácidos.

40. Procedimiento de la reivindicación 39, en donde la primera y segunda cadenas ligeras variables tienen al menos un 95% de identidad de secuencia.

41. Procedimiento de la reivindicación 40, en donde la primera y segunda cadenas ligeras variables tienen al menos un 98% de identidad de secuencia.

42. Procedimiento de la reivindicación 41, en donde la primera y segunda cadenas ligeras variables tienen al menos un 99% de identidad de secuencia.

43. Procedimiento para medir la formación de un anticuerpo multiespecífico heteromultimérico a partir de una mezcla de polipéptidos, en donde el anticuerpo multiespecífico comprende al menos dos dominios de unión diferentes, en donde,

un primer dominio de unión une una primera molécula y un segundo dominio de unión une una segunda molécula diferente de dicha primera molécula,

cada dominio de unión comprende (i) un dominio variable de cadena pesada que es parte de un polipéptido que comprende además un dominio de multimerización, y (ii) un dominio variable de una cadena ligera,

el primer dominio de unión comprende un primer dominio variable de cadena pesada de un primer polipéptido, el segundo dominio de unión comprende un segundo dominio variable de cadena pesada de un segundo polipéptido, y el primer y segundo dominios variables de cadena pesada son diferentes, y

los polipéptidos multimerizan mediante la interacción de dichos dominios de multimerización, en donde el dominio de multimerización de cada uno de dichos primer o segundo polipéptidos comprende un residuo que contiene tiol libre, el cual forma un enlace disulfuro con un residuo que contiene tiol libre del dominio de multimerización del otro de dichos primer y segundo polipéptidos,

y en donde,

o bien cada dominio variable de cadena ligera es idéntico,

o el anticuerpo multiespecífico comprende un primer dominio variable de cadena ligera y un segundo dominio variable de cadena ligera, el primer y segundo dominios variables de cadena ligera difieren el uno del otro pero tienen al menos el 80% de identidad de secuencia, y dicho primer dominio de unión une dicha primera molécula, si dicho primer dominio de unión comprende el primer dominio variable de cadena ligera o el segundo dominio variable de cadena ligera, y dicho segundo dominio de unión une dicha segunda molécula, si dicho segundo dominio de unión comprende el segundo dominio variable de cadena ligera o el primer dominio variable de cadena ligera,

comprendiendo el procedimiento los pasos de:

(a)

causar que cada uno de los anticuerpos multiespecíficos migre en una matriz de gel; y

(b)

determinar la cantidad relativa de una banda correspondiente al anticuerpo multiespecífico que tiene un enlace disulfuro que no se encuentra de manera natural entre el primer y segundo polipéptidos, y una banda que migra más lentamente correspondiente a un heteromultímero que carece de enlaces disulfuro que no se encuentran de manera natural entre el primer y segundo polipéptidos.

44. Procedimiento de la reivindicación 43, en donde la multimerización de dichos polipéptidos está promovida mediante una interacción de protuberancia-en-cavidad entre los dominios de multimerización.

45. Procedimiento de la reivindicación 43, en donde cada dominio variable de cadena ligera es idéntico.

46. Procedimiento de la reivindicación 43, en donde el primer y segundo dominios variables de cadena ligera difieren entre ellos pero tienen al menos un 90% de identidad de secuencia de aminoácidos.

47. Procedimiento de la reivindicación 46, en donde el primer y segundo dominios variables de cadena ligera tienen al menos un 95% de identidad de secuencia de aminoácidos.

48. Procedimiento de la reivindicación 47, en donde la primera y segunda cadenas ligeras variables tienen al menos un 98% de identidad de secuencia.

49. Procedimiento de la reivindicación 48, en donde el primer y segundo dominios variables de cadena ligera tienen al menos un 99% de identidad de secuencia.

50. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el anticuerpo multiespecífico se selecciona de entre el grupo que consiste en el anti-ECD del receptor de leptina humano (Ob-R)/anti-HER3 quinasa de tirosina del receptor humano, y el anti-receptor quinasa de tirosina de la trombopoyetina humano (Mpi)/anti-HER3 quinasa de tirosina del receptor humano.

51. Anticuerpo multiespecífico de la reivindicación 17, el cual se selecciona de entre el grupo que consiste en anti-ECD del receptor de leptina humano (Ob-R)/anti-HER3 quinasa de tirosina del receptor humano, y el anti-receptor quinasa de tirosina de la trombopoyetina humano (Mpi)/anti-HER3 quinasa de tirosina del receptor humano.

52. Composición que comprende el anticuerpo multiespecífico de la reivindicación 51 y un portador.

53. Célula hospedadora de la reivindicación 28, en donde el anticuerpo multiespecífico se selecciona de entre el grupo que consiste en el anti-ECD del receptor de leptina humano (Ob-R)/anti-HER3 quinasa de tirosina del receptor humano, y el anti-receptor quinasa de tirosina de la trombopoyetina humano (Mpi)/anti-HER3 quinasa de tirosina del receptor humano.