RS61840B1

RS61840B1 - Sinteza zaštićenih 3'-amino 5'-fosforamidit nukleozidnih monomera

Info

Publication number: RS61840B1
Application number: RS20210593A
Authority: RS
Inventors: Sergei M Gryaznov; Krisztina Pongracz; Daria Zielinska
Original assignee: Geron Corp
Priority date: 2004-07-02
Filing date: 2005-06-30
Publication date: 2021-06-30
Also published as: US10035815B2; EP3296312A1; US20160362440A1; US10738073B2; CA2571601C; US20150038692A1; US8748593B2; LT1778711T; PT1778711T; DK3296312T3; KR20070042155A; ME02933B; US20190031707A1; PL1778711T3; US20240034748A1; PT3296312T; LT3296312T; US20230089101A1; HRP20210787T1; WO2006014387A1

Description

Opis

Oblast pronalaska

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na efikasne postupke sinteze ortogonalno zaštićenih 3'-amino nukleozidnih monomera, korisnih za sintetičku pripremu oligonukleotidnih analoga, i na ortogonalno zaštićene monomere pripremljene tim postupcima.

Reference

[0002]

Asai, A. i dr., Cancer Research 63(14):3931-9 (2003).

Carpino, L.A. i dr., J. Org. Chem.45:4250-2 (1980).

Carpino, L.A. i dr., J. Org. Chem.54:5887-97 (1989).

Cech, D. i dr., Coll. Czech. Chem. Comm.61:S297-S300 (1996).

Chen, J.-K., Schultz, R.G., Lloyd, D.H. and Gryaznov, S.M., Nucleic Acids Res.23: 2661-2668 (1994). Escude, C., Giovannageli, C., Sun, J.-S., Lloyd, D.-H., Chen, J.-K., Gryaznov, S.M., Garestier, T. and Helene, C., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:4365-4369 (1996).

Giovannangeli, C., Diviacco, S., Labrousse, V., Gryaznov, S.M., Charneau, P. and Helene, C., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:79-84 (1997).

Gryaznov, S.M. and Chen, J.-K. J. Am. Chem. Soc.116:3143-3144 (1994).

Gryaznov, S.M. i dr., Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids 22(5-8):577-581 (2003).

Gryaznov, S.M., Lloyd, D.H., Chen, J.-K., Schultz, R.G., DeDionisio, L.A., Ratmeyer, L. and Wilson, W.D., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:5798-5802 (1995).

Gryaznov, S.M., Pongracz, K., and Matray, T., PCT Pubn. No. WO 2001/018015 (Mar 152001).

Gryaznov, S.M., Skorski, T., Cucco, C., Nieborowska-Skorska, M, Chiu, C.Y., Lloyd, D.H., Chen, J. K., Koziolkiewicz, M. and Calabretta, B. Nucleic Acids Res.24:1508-1514 (1996).

Matray, J.C. i dr., Nucleic Acid Research 27(20):3976-3985 (1999).

Nelson, J.S. i dr., J. Org. Chem.62:7278-7287 (1997).

Pongracz, K. and Gryaznov, S.M., Tetrahedron Letters 40(43): 7661-7664 (1999).

Skorski, T., Perrotti, D., Nieborowska-Skorska, M., Gryaznov, S.M. and Calabretta, B., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:3966-3971 (1997).

Vincente, S. i dr., J. Org. Chem.64:991-997 (1999).

Vu, H. i dr., Tetrahedron Letters 31(5):7269-7272 (1990).

Wang, E.S. i dr., Blood 103(1):258-266 (2004).

Zaitseva, G.V. i dr., Nucleosides & Nucleotides 13(1-3):819-838 (1994).

Zaitseva, V.E. i dr., Sov. J. Bioorg. Chem.10(5)5:369-378 (transl. from Bioorg. Khim.10(5):670-680) (1984).

Pozadina

[0003] Intenzivno je istraženo korišćenje oligonukleotida i oligonukleotidnih analoga kao terapeutskih agenasa, zasnovano na specifičnom vezivanju za ciljne sekvence nukleinskih kiselina ili proteina. Dizajnirani su strukturno modifikovani oligonukleotidni analozi kojima nedostaje osetljivost na nukleazu prirodnih (fosfodiesterski povezanih) oligonukleotida i koji u nekim slučajevima pokazuju i druga korisna svojstva, kao što je poboljšano vezivanje za mete ili poboljšana specifičnost vezivanja. Jedna takva klasa oligonukleotidnog analoga je N3'→P5' fosforodiamidat-povezani oligonukleotid (Gryaznov and Chen, 1994; Chen i dr., 1994). Ova jedinjenja su otporna na nukleazu, formiraju stabilne duplekse sa komplementarnim RNK i dupleks DNK metama i pokazuju značajnu antisens aktivnu sekvencu kako in vitro tako i in vivo (Gryaznov i dr., 1995; Escude i dr., 1996; Gryaznov i dr., 1996; Giovannangeli i dr., 1997; Skorski i dr., 1997). Srodni N3'→P5' tiofosforamidatni oligonukleotidi zadržavaju visok afinitet vezivanja RNK za N3'→P5' fosforamidate i takođe pokazuju poboljšanu stabilnost kiselina (Pongracz and Gryaznov, 1999; Gryaznov i dr., 2001). Određeni N3'→P5' tiofosforamidat oligonukleotidi pokazali su terapeutski obećavajuću aktivnost inhibiranja telomeraze (Gryaznov i dr., 2003; Asai i dr., 2003; Wang i dr., 2004).

[0004] Po koracima, priprema N3'→P5' fosforamidat ili tiofosforamidat oligonukleotida kontrolisana sekvencom koristi 3'-amino nukleozidne monomere u kojima je 3'-amino grupa zaštićena tokom dodavanja, a zatim joj je uklonjena zaštita za dodavanje dodatnog monomera na rastući oligonukleotidni lanac (pogledati npr. Gryaznov and Chen, 1994; Pongracz and Gryaznov, 1999). Pošto su grupe na nukleozidnim bazama koje su tipično zaštićene tokom sinteze primarne amino grupe, potreba za zaštitom 3'-amino grupe u prisustvu ovih grupa je komplikovala pripremu ovih monomera. Postojeće procedure (pogledati npr. Nelson i dr., 1997; Matray i dr., 1999) podrazumevaju višestruke korake zaštite i uopšteno uključuju konverziju 3'-hidroksila u 3'-azido (-N3) grupu, koja je kasnije smanjena na 3'-amin. Ove procedure su dugotrajne, skupe i rezultuju u niskim ukupnim prinosima monomera. Prema tome, poželjno je poboljšanje efikasnosti ovih sinteza i olakšati dobijanje N3'→P5' fosforamidatnih ili tiofosforamidatnih oligonukleotida.

Sažetak pronalaska

[0005] Prvi aspekt pronalaska je adenozin ili gvanozin monomer koji sadrži:

zaštićenu 3'-amino grupu koja je zaštićena acidnom labilnom grupom;

nukleozidnu bazu koja je zaštićena dialkil-, di(cikloalkil) - ili di(aralkil)-formamidinilnu grupu; i 5'-O- (2-cijanoetil-N, N-diizopropilamino) fosforamiditnu grupu.

[0006] U jednom otelotvorenju prvog aspekta, dialkil ili dicikloalkil formamidinil grupa je takva da alkil je C1-C4alkil, a cikloalkil je C5-C6cikloalkil.

[0007] U jednom otelotvorenju prvog aspekta, zaštitna acidna labilna grupa je triarilmetil grupa.

[0008] U jednom otelotvorenju prvog aspekta, zaštitna acidna labilna grupa je trifenilmetil.

[0009] U jednom otelotvorenju prvog aspekta, nukleozidna baza je zaštićena dimetilformamidinil grupom ili dibenzilformamidinil grupom.

[0010] U jednom otelotvorenju prvog aspekta, navedena nukleozidna baza je zaštićena dialkilformamidinil grupom.

[0011] U jednom otelotvorenju prvog aspekta, navedeni monomer sadrži 2' grupu odabranu od vodonika, hidroksi, C1-C4alkoksi, C1-C4alkila i fluoro.

[0012] U jednom otelotvorenju prvog aspekta, 2'-grupa monomera je vodonik.

[0013] Drugi aspekt pronalaska je postupak za dobijanje monomera adenozina, gvanozina ili citidina koji ima zaštićenu nukleozidnu bazu i zaštićenu 3'-amino grupu,

pri čemu su navedena baza i navedena 3'-amino grupa ortogonalno zaštićene,

koji postupak sadrži:

obezbeđivanje 3'-amino-3'-deoksi adenozin, citidina ili gvanozinog monomera u kome su 5'-hidroksilna grupa, nukleozidna baza i 3'-amino grupa nezaštićeni;

selektivnu reakciju 3'-amino grupe sa prvom zaštitnom grupom koja se sastoji od acidne labilne grupe; reagovanje 5'-hidroksilne grupe sa drugom zaštitnom grupom koja se sastoji od acila, bazno labilnog trialkil silil etra ili fluorid labilnog silil etra; i

reagovanje nukleozidne baze sa trećom zaštitnom grupom koja je acil grupa ili formamidinil grupa; pri čemu se prva zaštitna grupa može ukloniti iz pomenute 3'-amino grupe pod uslovima koji ne uklanjaju zaštitu pomenute nukleozidne baze;

uklanjanje druge zaštitne grupe iz 5'-hidroksilne grupe pod uslovima koji ne uklanjaju zaštitu navedene nukleozidne baze ili pomenute 3'-amino grupe; i

fosfitilovanje 5'-hidroksilne grupe.

[0014] U jednom otelotvorenju drugog aspekta, treća zaštitna grupa je acil grupa.

[0015] Treći aspekt pronalaska je postupak za dobijanje adenozin, gvanozin ili citidin monomera koji ima fosfitiliranu 5'-hidroksilnu grupu, zaštićene nukleozidne baze i zaštićene 3'-amino grupe, pri čemu su navedena baza i navedena 3'-amino grupa ortogonalno zaštićene,

koji postupak sadrži:

(a) obezbeđivanje monomera 3'-amino-3'-deoksi adenozina, citidina ili gvanozina u kome 5'-hidroksilna grupa, nukleozidna baza i 3'-amino grupa nisu zaštićene;

(b) selektivnu reakciju pomenute 3'-amino grupe sa prvom zaštitnom grupom koja se sastoji od acidne labilne grupe; i

(c) selektivne reakcije pomenute nukleozidne baze sa daljom zaštitnom grupom koja se sastoji od formamidinil grupe gde je monomer gvanozin ili adenozin, ili acil grupe gde je monomer motiv citidina;

gde se navedena prva zaštitna grupa može ukloniti iz pomenute 3'-amino grupe pod uslovima koji ne uklanjaju zaštitu pomenute nukleozidne baze;

(d) fosfitiliranje 5'-hidroksilne grupe.

[0016] U jednom otelotvorenju drugog ili trećeg aspekta, acidna labilna grupa je triarilmetil.

[0017] U jednom otelotvorenju drugog ili trećeg aspekta, acidna labilna grupa je trifenilmetil.

[0018] U jednom otelotvorenju trećeg aspekta, pomenuti monomer je adenozin ili gvanozin, a navedena dodatna zaštitna grupa je dimetilformamidinil grupa ili dibenzilformamidinil grupa.

[0019] U jednom otelotvorenju trećeg aspekta, pomenuti monomer je monomer citidina, a navedena reakcija sa daljom zaštitnom grupom obuhvata reakciju sa acil anhidridom.

Kratak opis

[0020] Ovde je opisan postupak za pripremu adenozin, gvanozin ili citidin monomera koji imaju zaštićenu nukleozidnu bazu i zaštićenu 3'-amino grupu, pri čemu su baza i 3'amino grupa ortogonalno zaštićeni. Postupak može obuhvatati korake:

(a) pružanje 3'-amino-3'-deoksi adenozin, citidin ili gvanozin monomera u kome su 5'-hidroksilna grupa, nukleozidna baza i 3'-amino grupa nezaštićeni;

(b) selektivno reagovanje 3'-amino grupe sa prvom zaštitnom grupom koja se sastoji od acidno-labilne grupe ili fluorenilmetoksikarbonilne grupe ili derivata fluorenilmetoksikarbonil grupe;

reagovanje 5'-hidroksilne grupe sa drugom zaštitnom grupom koja se sastoji od acil, bazno-labilnog trialkil silil etra ili fluoridno labilnog silil etra; i

reagovanje nukleozidne baze sa trećom zaštitnom grupom koja je acil grupa ili formamidinil grupa; pri čemu se prva zaštitna grupa može ukloniti iz 3'-amino grupe pod uslovima koji ne uklanjaju zaštitu sa nukleozidne baze, i druga zaštitna grupa može biti uklonjena iz 5'-hidroksilne grupe pod uslovima koji ne uklanjaju zaštitu sa nukleozidne baze ili 3'-amino grupe. Ovaj postupak može dodatno da sadrži korak (c) uklanjanja druge zaštitne grupe od 5'-hidroksilne grupe, pod uslovima koji ne uklanjaju zaštitu sa nukleozidne baze ili 3'-amino grupe.

[0021] Prva zaštitna grupa može biti acidna labilna grupa; na primer triarilmetil grupa, kao što su trifenilmetil (tritil), monometoksitritel (MMT) ili dimetoksitril (DMT). Prva zaštitna grupa može biti fluorenilmetoksikarbonil (Fmoc) ili njegov derivat, koji se može ukloniti baznim aminom kao što je DBU ili piperidin.

[0022] Poželjno korišćene za adenozin ili citidin monomer, druga i treća zaštitna grupa mogu biti acil grupe, npr. benzoil grupe, i uslovi iz (c) sadrže blagi tretman sa hidroksidnim jonom.

[0023] Druga zaštitna grupa može biti bazno labilni trialkil silil etar, npr. trimetilsilil (TMS) etar, treća zaštitna grupa je acil grupa, i uslovi iz (c) sadrže blagi tretman sa hidroksidnim jonom.

[0024] Druga zaštitna grupa može biti fluoridno labilni silil etar, treća zaštitna grupa može biti acil grupa, i uslovi iz (c) mogu obuhvatati tretman sa fluoridnim jonom. Takvi fluoridno labilni silil eteri uključuju, na primer, terc-butildimetil silil etar, terc-butildifenil silil etar, difenilmetil silil etar i tri (izopropil) silil etar. Fluoridno labilni silil eter je terc-butildimetil silil (TBDMS) etar.

[0025] Ovde je takođe opisan postupak koji obuhvata korake:

(b) selektivno reagovanje 3'-amino grupe sa prvom zaštitnom grupom; i

selektivno reagovanje nukleozidne baze sa dodatnom zaštitnom grupom;

pri čemu se prva zaštitna grupa može ukloniti iz 3'-amino grupe pod uslovima koji ne uklanjaju nukleozidnu bazu.

[0026] 5'-OH grupa u ovom postupku ostaje u suštini neizreagovana u uslovima zaštite nukleozidne baze i ne zahteva odvojenu zaštitu. Monomer može biti citidinski monomer, prva zaštitna grupa može biti kao što je gore opisano, a dalja zaštitna grupa može biti acil grupa, poželjno benzoil grupa. Acil zaštitna grupa može poželjno biti ugrađena reakcijom sa acil anhidridom.

[0027] Monomer može biti gvanozin ili adenozin monomer, prva zaštitna grupa može biti kao što je prethodno opisano, a dalja zaštitna grupa može biti formamidinil grupa, kao što je dialkilformamidinil grupa.

[0028] Ovde je takođe opisan postupak za izradu timidin monomera koji ima slobodnu 5'-hidroksil grupu i zaštićenu 3'-amino grupu, gde postupak sadrži:

(a) pružanje 3'-amino-3'-deoksi timidin monomera u kome su 5'-hidroksilna grupa i 3'-amino grupa nezaštićeni; i

(b) selektivno reagovanje 3'-amino grupe sa prvom zaštitnom grupom.

[0029] Prva zaštitna grupa može biti acidno labilna; na pr. triarilmetil grupa, kao što je trifenilmetil (tritil). Prva zaštitna grupa može biti fluorenilmetoksikarbonil (Fmoc) ili njegov derivat, koji se može ukloniti baznim aminom kao što su DBU ili piperidin.

[0030] Početni i proizvodni monomeri u ovim sintetičkim postupcima poželjno sadrže 2' grupu izabranu od vodonika, hidroksija, nižeg alkoksija, nižeg alkila i fluoroa. Monomer može sadržati 2' grupu odabranu od vodonika, hidroksija, metoksija i fluoroa. Monomer može biti 2',3'didoksioksi monomer, tako da je 2' grupa vodonik.

[0031] Ovde je takođe opisan adenozin, gvanozin ili citidin monomer koji ima zaštićenu 3'-amino grupu i nukleozidne baze koja je (i) nezaštićena ili (ii) zaštićena tako da zaštićena 3'-amino grupa može biti uklonjena pod uslovima koji ne uklanjaju zaštitu nukleozidne baze.3'-amino grupa može biti zaštićena acidno labilnom zaštitnom grupom; na primer triarilmetil grupom, kao što je trifenilmetil (tritil). 3'-amino grupa može biti zaštićena fluorenilmetoksikarbonilom (Fmoc) ili njenim derivatom koji se može ukloniti sa baznim aminom kao što su DBU ili piperidin.

[0032] Nukleozidna baza može biti nezaštićena. Nukleozidna baza može biti zaštićena sa acil grupom. Poželjno je da acil grupa može biti benzoil kada je monomer adenomin ili citidin monomer i izobutiril kada je monomer gvanozin monomer. Nukleozidna baza može biti zaštićena formamidinil grupom, poželjno nukleozidna baza može biti zaštićena dialkilformamidinil grupom.

[0033] 5'-hidroksilna grupa monomera može biti nezaštićena ili može biti zaštićena tako da se zaštita može ukloniti pod uslovima koji ne uklanjaju zaštitu sa nukleozidne baze ili 3'-amino grupe. Na primer, može biti zaštićena sa silil etrom koji je labilan prema blagoj bazi ili fluoridnom jonu, kao što je gore navedeno.

[0034] Monomer poželjno sadrži 2' grupu odabranu od vodonika, hidroksija, nižeg alkoksija, nižeg alkila i fluoroa. Monomer može sadržati 2' grupu odabranu od vodonik, hidroksija, metoksija i fluoroa. Monomer može biti 2', 3'-dideoksi monomer, tako da je 2' grupa vodonik.

[0035] Ovi i drugi predmeti i karakteristike pronalaska će postati potpuno očigledni kada se sledeći detaljni opis čita zajedno sa pratećim crtežima.

Kratak opis crteža

[0036]

Slika 1 je šema koja prikazuje alternativne primere postupaka za sintezu 3'-amino adenozinskog monomera, koji se takođe mogu primeniti za sintezu 3'-amino citidin monomera, kako je ovde opisano; Slika 2A prikazuje primerni postupak za sintezu 3'-amino gvanozin monomera, kako je ovde opisano; Slika 2B prikazuje alternativni primerni postupak za sintezu 3'-amino gvanozin monomera, kako je ovde opisano;

Slika 2C prikazuje postupak za sintezu 3'-amino citidin monomera, kako je ovde opisano; i Slika 3 prikazuje primerni postupak za sintezu 3'-amino timidin monomera, kako je ovde opisano. Detaljan opis pronalaska

I. Definicije

[0037] Sledeći izrazi imaju sledeće značenje, osim ako nije drugačije naznačeno.

[0038] „Ortogonalno zaštićeno“, u odnosu na mnoštvo zaštićenih funkcionalnih grupa u istom molekulu, označava da je moguće ukloniti zaštitu sa bilo kog odabranog člana grupe bez uklanjanja zaštite drugih grupa.

[0039] „Selektivno zaštićen“, u odnosu na zaštitu ciljne funkcionalne grupe u molekulu koji ima mnoštvo nezaštićenih funkcionalnih grupa, ukazuje da je u reakciji molekula sa zaštitnim reagensom ciljana funkcionalna grupa zaštićena u većoj meri od bilo koje ne-ciljane funkcionalne grupe. Obim reakcije ciljane funkcionalne grupe u odnosu na one bilo koje ne-ciljane funkcionalne grupe je veći od 1:1, poželjno veći od 2:1, i poželjnije veći od 3:1 ili više, npr. veći od 9:1. Ista definicija se odnosi na terminologiju „selektivno reagovanje“ date funkcionalne grupe sa zaštitnom grupom.

[0040] „Reagovanje sa zaštitnom grupom“, kako se ovde koristi, ekvivalentno je „pružanje zaštitne grupe“, „zaštita sa zaštitnom grupom“ ili „reagovanje sa reagensom zaštitne grupe“.

[0041] „Alkil“ se odnosi na potpuno zasićeni aciklični deo koji se sastoji od ugljenika i vodonika, koji mogu biti linearni ili razgranati. Primeri alkil grupa su metil, etil, n-butil, t-butil, n-heptil i izopropil. Uopšteno poželjne su niže alkil grupe, sa jednim do šest atoma ugljenika, kao što su na primeri metil, etil, n-butil, i-butil, tbutil, izoamil, n-pentil i izopentil. U drugim otelotvorenjima, niži alkil uključuje grupe koje imaju jedan do četiri atoma ugljenika, ili 1-2 atoma ugljenika (metil i etil).

[0042] „Cikloalkil“ se odnosi na zasićeni ciklični ugljovodonik, koji poželjno ima 4 do 7 atoma ugljenika, poželjnije 5 ili 6 (tj. ciklopentil ili cikloheksil).

[0043] „Alkenil“ se odnosi na nezasićeni aciklični deo koji se sastoji od ugljenika i vodonika, koji mogu biti linearni ili razgranati, imaju jednu ili više dvostrukih veza. Generalno su poželjne niže alkenil grupe, koje imaju dva do šest ili dva do četiri atoma ugljenika. „Alkinil“ se odnosi na nezasićeni aciklični deo koji se sastoji od ugljenika i vodonika, koji mogu biti linearni ili razgranati, koji sadrže jednu ili više trostrukih veza. Generalno poželjne su niže alkinil grupe, sa dva do šest ili dva do četiri atoma ugljenika.

[0044] „Aril“ se odnosi na supstituisani ili nesupstituisani monovalentni aromatični radikal, obično koji ima jedan prsten (npr., benzen) ili dva kondenzovana prstena (na primer, naftil), gde su monociklične arilne grupe poželjne. Termin uključuje heteroaril grupe, koje su aromatične prstenaste grupe koje imaju jedan ili više atoma azota, kiseonika ili sumpora u prstenu, kao što su furil, pirol, piridil i indol. Pod pojmom „supstituisan“ podrazumeva se da se jedan ili više prstenova vodonika u aril grupi, poželjno jedan ili dva prstena vodonika, zamenjuju grupom poželjno izabranom od fluora, hlora, broma, metila, etila, metoksi, halometoksi i halometila. Poželjne aril grupe za upotrebu u zaštitnim grupama su karbociklični arili koji su nesupstituisani ili supstituisani sa nižim alkoksijem (pored supstituenta koji povezuje grupu sa zaštićenim delom).

[0045] „Aralkil“ se odnosi na alkil, poželjno niži (C1-C4, poželjnije C1-C2) alkil, supstituent koji je dalje supstituisan sa aril grupom, poželjno monocikličnom aril grupom; Primeri su benzil (-CH2C6H5) i fenetil.

[0046] „Acil“ se odnosi na supstituent oblika R (C=O)-, gde R je alkil, alkenil, alkinil, aralkil ili aril kao što je prethodno definisano i poželjno je izabran od niži alkil i monociklični karbociklični aril. Primeri uključuju benzoil (Ph(C=O)-), acetil (CH3(C=O)-) i izobutiril ((CH3)2CH(C=O)-).

II. Sinteza zaštićenih monomera

[0047] Ovde je takođe opisana efikasna sinteza ortogonalno zaštićenih 3'-amino-5'-hidroksil nukleozidnih monomera, u kojima su amino grupe na 3'-položaju i nukleozidnoj bazi zaštićene ortogonalno, počevši od odgovarajućih nezaštićenih 3'-amino nukleozida. Tipično, monomeri proizvoda se zatim fosfitilišu u slobodnom 5'-hidroksilu za upotrebu u sintezi N3'→P5' fosforamidata ili tiofosforamidatnih oligonukleotida. (pogledati npr. Sliku 2B i Sliku 3.)

A. Pokretni materijali

[0048] Početni materijal za sintezu monomera je 3'-amino nukleozid sa opštom formulom ispod:

gde je BAZA nezaštićena nukleozidna baza odabrana od guanina (G), adenina (A), timina (T) i citozina (C).

2'-supstituent X može biti vodonik, kao kod 2', 3'didoksioksi monomera, za proizvodnju DNK analoga. Alternativno, X može biti hidroksi ili niži alkoksi, kao što je metoksi, za proizvodnju RNK ili O-alkil RNK analoga. Podsubstituent takođe može biti fluor (pogledati npr. U.S. Patent No.5,684,143) ili niži alkil, kao što je metil.

[0049] 3'-amino-2',3'-dideoksi nukleozidi, korisni kao početni materijali u sintezama ovde, mogu se komercijalno dobiti od Metkinen Oy, koji se nalazi u Littoinenu, Finska. Početni materijal 3'-amino-2',3'-dideoksi timidina takođe je dostupan i iz različitih izvora kao što su Dalton Chemical Labs (Toronto, Kanada) i MP Biomedicals Inc. (Irvine, CA). U literaturi su prijavljene razne sintetičke pripreme 3'-amino-2',3'-dideoksi nukleozida (npr. Zaitseva i dr., 1994; Cech i dr., 1996; Zaitseva i dr., 1984). U skladu sa Zaitseva i dr., 1994, 3'-amino-2',3'didoksi-timidin može se pretvoriti u odgovarajuće adenozin ili gvanozin monomere putem enzimske transglikozilacije.

B1. Strategije zaštite: Pregled

[0050] Ovde je takođe opisana efikasna procedura za pretvaranje gore opisanih nukleozida u odgovarajuće bazno-zaštićene (u slučaju A, G i C), 3'-amino-zaštićene monomere. Zbog toga što su grupe na bazama koje moraju biti zaštićene takođe amino grupe, selektivna zaštita 3'amino grupe u prisustvu nezaštićene baze ili obrnuto, u prošlosti nije uspešno sprovedena, a postojeće procedure za pripremu ovih monomera (pogledati npr. Nelson i dr., 1997) podrazumevaju višestruke korake zaštite i uopšteno uključuju konverziju 3'-hidroksila u azido grupu, koja se kasnije redukuje na 3'-amin.

[0051] Predmetni pronalazači su obezbedili efikasne postupke selektivne zaštite 3'-amino grupe u prisustvu nukleozidnih baza, tako da nukleozidna baza može biti zaštićena sa ortogonalnom zaštitnom grupom; to jest, onom koja se ne uklanja pod odabranim uslovima koji su efikasni za uklanjanje 3'amino zaštitne grupe (ili grupe za zaštitu od 5'-hidroksil grupe, ako postoje).

[0052] Pored toga, 3'-amino grupa je takođe selektivno zaštićena u prisustvu 5'-hidroksilne grupe ili obrnuto. Prema tome, moguće je obezbediti slobodni 5'-hidroksil sa zaštitnom grupom koja se može ukloniti pod odabranim uslovima koji ne uklanjaju ili 3'-amino zaštitnu grupu ili bazu zaštitnu grupu. (Alternativno, kao u slučaju timidina, slobodni 5'-hidroksil može biti direktno fosfitiliran.)

[0053] Zaštitna grupa za 5'-hidroksil može biti, na primer, silil grupa koja se može ukloniti pod uslovima, kao što je blaga baza ili fluoridni jon, koji ne uklanjaju zaštitne grupe (tipično acil ili amidinil grupe ) koristi se za nukleotidnu bazu. Alternativno, ista zaštitna grupu (kao što je acil grupa) može se koristiti za 5'-hidroksilnu i nukleotidnu bazu, uz uslove korišćene za njeno uklanjanje (npr. blaga baza) koji će ukloniti hidroksil grupu, ali ne i amino grupe grupa nukleotida.

[0054] U daljoj strategiji, nukleotidna baza može biti zaštićena pod uslovima koji ostavljaju neizreagovani 5'-hidroksil i na taj način ne zahtevaju zaštitu.

[0055] U svim slučajevima, zaštitne grupe korišćene za nukleotidne baze su stabilne u uslovima reakcija vezivanja monomera korišćenih u sintezi oligonukleotida. Postupci za pripremu N3'→P5' fosforamidatnih ili tiofosforamidatnih oligonukleotida iz monomera opisanih ovde su opisani, na primer, u Gryaznov and Chen (1994) i Pongracz and Gryaznov (1999).

B2. Strategije zaštite: A, G i C monomeri

[0056] Ovde su takođe opisani adenozin, gvanozin ili citidin monomere, postupke za dobijanje navedenih monomera koji imaju slobodnu 5'-hidroksil grupu, zaštićenu bazu nukleozida i zaštićenu 3'-amino grupu, gde su baza i 3'- amino grupa ortogonalno zaštićene, kao što je prethodno definisano. Početni materijal je 3'-amino-3'deoksi adenozin, citidin ili gvanozin monomer u kome su 5'-hidroksilna grupa, nukleozidna baza i 3'amino grupa nezaštićeni.

[0057] U jednoj opštoj strategiji, postupak obuhvata selektivno reagovanje 3'-amino grupe sa prvom zaštitnom grupom, reagovanje 5'-hidroksilne grupe sa drugom zaštitnom grupom i reagovanje nukleozidne baze sa trećom zaštitnom grupom. Prva zaštitna grupa (za 3'-amino) je takva da se može ukloniti iz 3'-amino grupe pod uslovima koji ne uklanjaju nukleozidnu bazu. Štaviše, druga zaštitna grupa (za 5'-hidroksil), kada je prisutna, je takva da se može ukloniti iz 5'-hidroksilne grupe pod uslovima koji ne uklanjaju nukleozidnu bazu ili 3'-amino grupu.

[0058] Nakon što su željene reaktivne grupe zaštićene, u skladu sa gornjom opštom strategijom, druga zaštitna grupa, ako je prisutna, uklanja se iz 5'-hidroksilne grupe, pod uslovima koji ne uklanjaju nukleozidnu bazu ili 3'- amino grupu. Monomer se zatim može fosfitovati, npr. za upotrebu u sintezi oligonukleotida.

[0059] Tipično, prva, druga i treća zaštita grupe primenjuju se u tom redosledu, iako su druge i treće grupe u stvari iste, i stoga se primenjuju u jednoj reakciji. Pored toga, zaštita 5'-hidroksilne grupe, u strategijama koje koriste ovaj korak, može se desiti pre ili posle zaštite 3'-amino grupe. Ove dve reakcije se obično izvode u reakciji sa jednom posudom, iako reagensi nisu poželjno istovremeno dodati. Poželjno je prvo dodati reagens za zaštitu 3'-amino, kao što je ilustrovano u sintezama dole.

[0060] Tokom koraka zaštite baze može da se koristi transientna zaštita 5'-hidroksilne grupe sa bazno labilnim silil etrom (npr. TMS), kao što je prikazano, na primer, na Slici 1 (pretvaranje strukture 2 u strukturu 6) i na Slici 2B, kako je dalje navedeno u daljem tekstu.

[0061] 5'-hidroksilna grupa i nukleotidne baze mogu biti zaštićene su istim reagensom, praćeno selektivnim uklanjanjem zaštite hidroksilne grupe. Takav reagens je tipično acilujući reagens, npr. izobutiril halogenid ili benzoil halid. Primerna šema ove vrste prikazana je u konverziji strukture 2 do 3 na Slici 1, nakon čega sledi tretman sa bazom pod blagim uslovima kako bi se selektivno uklonila zaštita hidroksilne grupe (konverzija od 3 do 6).

[0062] Kao što je već napomenuto, prva zaštitna grupa za zaštitu 3'-amina je ona koja je stabilna u uslovima koji mogu ukloniti drugu zaštitnu grupu (za 5'-hidroksil), kada je prisutna, ali je labilna pod uslovima koji ne uklanjaju treću zaštitnu grupu (za nukleozidnu bazu). Prva zaštitna grupa može biti acidno labilna; na primer. triarilmetil grupa kao što su tritil (trifenilmetil), monometoksitritil (MMT) ili dimetoksitril (DMT).

[0063] Druga grupa korisna kao prva zaštitna grupa je fluorenilmetoksikarbonil (Fmoc), koji se može ukloniti putem nehidrolitičkog cepanja sa baznim aminom, kao što je DBU, morfolin ili piperidin. Baza hidroksida (npr. NaOH) nije pogodna za ovu svrhu, jer će ovaj reagens tipično ukloniti i druge zaštitne grupe u molekulu. Mogu se koristiti i derivati Fmoc koji se mogu ukloniti sličnim mehanizmom. Takvi derivati uključuju one u kojima je fluorenil grupa Fmoc supstituisana, tipično na položaju 2 i/ili 7, sa grupom, kao što je niža alkil grupa, koja neće uticati na mehanizam cepanja ili sa grupom za oduzimanje elektrona, kao što je halogen, što povećava osnovnu labilnost zaštitne grupe (Carpino i dr., 1980). Uključeni su i analozi tioksanten-dioksida opisani u Carpino i dr., 1989.

[0064] Slika 1 prikazuje primerne permutacije sintetičke strategije koja se može koristiti za pripremu predmetnih monomera. Ovi postupci su posebno pogodni za A (adenozin) i C (citozin) nukleozidne monomere. Kao što je opisano u daljem tekstu, postupci se takođe mogu koristiti, poželjno sa nekim modifikacijama, za G (gvanozin) monomere. U strategijama prikazanim na Slikama 1 i 2A-B, koristi se zaštita 5'-hidroksi. Slika 2C, o kojoj se govori dalje u nastavku, ilustruje strategiju u kojoj se ne koristi 5-hidroksi zaštita.

[0065] Kao što je gore navedeno, poželjna prva zaštitna grupa (za 3'-amin) je acidno labilna grupa, kao što su tritil, MMT ili DMT, ili grupa, kao što je Fmoc, koja je labilna prema baznom amin reagensu kao što je DBU. Poželjne druge i treće zaštitne grupe su i aracil grupe, npr. benzoil grupe. Uslovi koji su efikasni da sklone zaštitu sa 5'-hidroksil grupe pod uslovima koji ne uklanjaju zaštitu sa nukleozidne baze ili 3'-amino grupe, u ovom slučaju, poželjno sadrže blagi bazni tretman, kao što je tretman sa hidroksidom, npr. amonijum hidroksid. Takav postupak je efikasan za uklanjanje acil grupe od 5'-hidroksila i pretvaranje dijazilirane baze u monoacilovanu bazu. Ovakva šema je ilustrovana na Slici 1, u konverziji međuproizvoda 3 u proizvod 6.

[0066] Druga zaštitna grupa za zaštitu 5'-hidroksila može biti bazno labilni trialkil silil etar, poželjno TMS, a treća zaštitna grupa (za zaštitu nukleotidne baze) je acil grupa, kao što je alkanoil, poželjno izobutiril ili benzoil grupa. Opet, uslovi koji su efikasni da uklone zaštitu sa 5'-hidroksil grupu pod uslovima koji ne uklanjaju zaštitu sa nukleozidne baze ili 3'-amino grupe, u ovom slučaju, poželjno sadrže blagi bazni tretman, npr. tretman sa hidroksidom. Takav postupak je efikasan za odvajanje trimetilsilil etra i pretvaranje dijazilirane baze, ako je prisutna, u monoacilovanu bazu. Primer ove šeme je takođe prikazan na Slici 1, u konverziji međuproizvoda 2 u proizvod 6.

[0067] Još jedan poželjni tip zaštitne grupe nukleotidne baze, posebno za adenozin i gvanozin monomere, je formamidinil zaštitna grupa, kao što je dialkil-, di(cikloalkil)- ili di(aralkil)-formamidinil grupa, gde je „alkil“ poželjno C1-C4 i „cikloalkil“ je poželjno C5-C6. Specifični primeri uključuju dimetilformamidinil i dibenzilformamidinil. Ove zaštitne grupe se generalno mogu ukloniti iz nukleotidnih baza (npr. na kraju sinteze) pod blažim uslovima nego što se koriste za uklanjanje benzoil ili izobutil zaštitnih grupa. Pogledati, na primer, Vu i dr., 1990, Vincent i dr., 1999, i/ili U.S. Patent No.5,281,701. Kao što je opisano tamo, reakcija primarnog amina sa dialkilformamid dimetilacetalom, na primer, pruža diklofenamidinil-zaštićeni amin. Uklanjanje zaštite se generalno može izvršiti tretmanom vodenim ili alkoholnim amonijum hidroksidom na sobnoj temperaturi do oko 55°C.

[0068] Druga zaštitna grupa (za zaštitu 5'-hidroksila) može biti fluoridno-labilni silil etar, a treća zaštitna grupa (za nukleozidnu bazu) može biti acil grupa, kao što je benzoil grupa, ili formamidinil grupa kao što je gore opisano. U ovom slučaju, uslovi koji su efikasni za uklanjanje zaštite sa 5'-hidroksil grupe, pod uslovima koji ne uklanjaju zaštitu sa nukleozidne baze ili 3'-amino grupe, poželjno sadrže tretman sa fluoridnim jonom, npr. tetrabutilamonijum fluoridom (TBAF). Takav tretman je efikasan za odvajanje silil etra i pretvaranje dijazovane baze, ako je prisutna monoacilovana baza. Primer ove šeme je takođe prikazan na Slici 1, u konverziji međuproizvoda 5 u proizvod 6. Primeri fluoridno-labilnih silil etara uključuju, na primer, tercbutildimetil silil etar, tertbutilidifenil silil etar, difenilmetil silil etar, tri (izopropil) silil etar, i druge poznate u struci.

[0069] Gornji postupci se takođe mogu koristiti, uz neke modifikacije koje se prvenstveno odnose na rastvorljivost, za gvanozin (G) monomere. Kako je ilustrovano na Slici 2A, 5'-hidroksilna grupa početnog monomera 7 može biti zaštićena lipofilnom grupom, kao što je TBDMS, u ranoj fazi procesa, kako bi se olakšala rastvorljivost u konvencionalnom piridin rastvaraču.

[0070] Kao što je gore navedeno, poželjna prva zaštitna grupa (za 3'-amin) je acidno labilna grupa, kao što je tritil, DMT ili MMT, ili grupa, kao što je Fmoc, koja je labilna prema baznom amin reagensu kao što je DBU. Tritil grupa se koristi u otelotvorenju na slici 2A.

[0071] U zavisnosti od uslova reakcije, pored željenog 3'-monotritilovanog jedinjenja 8, mogu se posmatrati i male količine (npr. oko 5%) ditritilovanog jedinjenja 9. Shodno tome, „selektivna zaštita“ kako se ovde koristi pokazuje da je molekul koji ima željeno stanje zaštite formiran u većoj meri, tj. u odnosu većem od 1:1, od molekula u kojem su ne-ciljane funkcionalne grupe zaštićene, isključivo ili pored ciljane funkcionalne grupe. Poželjno, odnos je veći od 2:1, poželjnije veći od 3:1, i najpoželjnije veći od 9:1.

[0072] Druga zaštitna grupa (za 5'-hidroksil) može biti fluoridno-labilni silil etar, i poželjnije grupa koja promoviše rastvorljivost međuproizvoda. Za TBDMS eter, kao što je prikazano na Slici 2A, otkriveno je da promoviršerastvorljivost u piridin rastvaraču.

[0073] Treća zaštitna grupa je poželjno acil grupa, npr. izobutiril grupa ili formamidinil grupa kao što je gore

1

opisano. Uslovi koji su efikasni da uklone zaštitu sa 5'-hidroksil grupe, pod uslovima koji ne uklanjaju zaštitu sa nukleozidne baze ili 3'-amino grupe, poželjno sadrže tretman sa fluoridnim jonom, npr. tetrabutilamonijum fluoridom (TBAF). Takav tretman je efikasan da se sili eter ukloni u jedinjenju 10 bez uticaja na izobutiril ili tritilne grupe, kao što je prikazano na Slici 2A.

[0074] Kao što je ilustrovano na Slici 2B, polarniji rastvarač, kao što je DMF, može da se koristi za solubilizaciju početnog monomera 7, a reakciona šema može inače biti slična šemi „tranzijentne zaštite“ (koristeći TMS eter kao grupu za zaštitu 5'-hidroksil grupe) prikazanoj za adenozin monomer 1 na Slici 1.

[0075] Slika 2C ilustruje sintetičku strategiju, naročito primenljive na citidin monomere, u kojima se ne koristi 5-hidroksilna zaštita. U ovoj reakcionoj šemi, nakon selektivne zaštite 3'-amino grupe monomera 12 sa, na primer, tritil grupom, eksociklična amino grupa baze reaguje sa acil anhidridom, kao što je benzoil anhidrid. Rastvarač prvenstveno sadrži alkohol, za koji se veruje da se nadmeće sa suprotnom reakcijom 5'-hidroksilne grupe. Primeri uključuju metanol, etanol i smeše ovih rastvarača sa, na primer, acetonitrilom, DMF ili piridinom. U reakciji korišćenjem benzoil anhidrida u etanolu ili u acetonitrilu: metanolu od 9:1, kako je opisano u Sintezi 4, primećen je mali (<5%) 5'-benzoilovan proizvod. Pretežni 5'-hidroksil monomer 14 može onda biti fosfitilisan standardnim postupcima.

[0076] U još jednom otelotvorenju, naročito primenjivom na adenozin ili gvanozin monomere, nakon selektivne zaštite 3'-amino grupe monomera sa, na primer, tritil grupom, eksociklična amino grupa baze može biti zaštićena sa dialkilformamidinil, di(cikloalkil)formamidinil ili dibenzilformamidinil grupom, poželjno dimetilformamidinil grupom. 5'-hidroksilna grupa, za koju se očekuje da će ostati u suštini ili potpuno nereagovana tokom ovih koraka, može onda biti fosfitilisana standardnim postupcima.

B3. Strategije zaštite: T Monomer

[0077] Ovde je takođe opisan postupak za dobijanje timidin monomera koji ima slobodnu 5'-hidroksil grupu i zaštićenu 3'-amino grupu. Sintetička strategija se razlikuje od one opisane iznad, jer timinska baza generalno ne zahteva zaštitu u uslovima sinteze oligonukleotida. Početni materijal u ovom slučaju je 3'-amino-3'-deoksithimidinski monomer u kome su 5'-hidroksilna grupa i 3'amino grupa nezaštićene, i postupak obuhvata selektivno reagovanje pomenute 3'-amino grupe sa prvom zaštitnom grupom, tako da 5'-hidroksil grupa ostane u značajnoj meri nezaštićena.

[0078] Kao u prethodno opisanim sintezama, poželjna zaštitna grupa za 3'-amin je acidno labilna grupa, kao što je triarilmetil grupa ili grupa, kao što je Fmoc, koja je labilna za bazni amin reagens kao što je DBU. Tritil grupa se koristi u postupku prema Slici 3.

[0079] 5'-hidroksilna grupa može onda da bude fosfitilovana, kao što je opisano npr. u Sintezi 5 ispod. Treba imati na umu da je ovaj postupak fosfitacije takođe primenljiv na bilo koji od 5-hidroksil, 3'-amino-zaštićenih i bazno-zaštićenih monomera opisanih gore.

SINTEZE

[0080] Sledeće sinteze ilustruju, ali nisu namijenjeni da ograniče pronalazak. Na primer, uslovi reakcije, kao što je izbor rastvarača, katalizatora (npr. trietilamina ili diizopropil etil amina), reakcionih vremena i temperatura reakcije, uopšteno se mogu razlikovati od onih prikazanih u nastavku, prema saznanjima stručnjaka u ovoj oblasti, koristeći rutinsko eksperimentisanje. U nekim slučajevima redosled dodavanja reagensa može biti različit. Pogodni rastvarači za većinu ovih reakcija, gde nije drugačije naznačeno, uglavnom uključuju polarne aprotične rastvarače kao što su piridin, DMF, acetonitril ili njihove mešavine. Pogodne temperature su uglavnom u opsegu od -10°C do sobne temperature do oko 55°C.

Sinteza 1. Sinteza N6-benzoil-3'-aminotritil-2',3'didoksiadenozina iz 3'-amino-2', 3'-dideoksiadenozina A. Postupak 1: Perbenzoilacioni način (kao što je ilustrovano na Slici 1, 1→2→3→6)

[0081] Početni monomer, 3'-amino-2',3'-dideokiadenozin (1, 10 mmol), isparen je sa suvim piridinom, a zatim suspendovan u 100 ml suvog piridina koji sadrži 6 ekvivalenata trietilamina i smeša je zagrevana na 50°C uz mešanje. Dodan je tritilhlorid (1,1 ekv) i mešanje je nastavljeno tokom dva sata na 50°C. Dobijeni bistri rastvor koji sadrži 3'-tritilovani monomer 2 je ohlađen na 0°C, 5 ekv. benzoil hlorida je dodato u kapima i reakciona smeša je mešana tokom jednog sata, i zatim je sipana u 100 ml hladnog 5% natrijum bikarbonata. Taložena žuta guma je ekstrakovana etil acetatom i rastvor etil acetata isparen. Nastalo ulje (3, koje ima benzoil grupu na 5'-hidroksilu i dve na N6 bazi) je rastvoreno u 50 ml piridin:metanol:voda 65:35:5 v/v/v, rastvor je ohlađen na 0°C i dodato je 50 ml 2M natrijum hidroksida. Nakon 25 min mešanja na 0°C, reakciona smeša je neutralizovana sa piridinijum hidrohloridom, i zapremina smeše je smanjena isparavanjem. Nakon razblaživanja etil acetatom, organski sloj je odvojen i ispran sa zasićenim natrijum bikarbonatom i isparen u vakuumu. Proizvod je prečišćen hromatografijom na koloni sa silika gelom, korišćenjem metilen hlorid:metanol 95:5 v/v solventnog sistema. Izolovani prinos proizvoda (6), koji ima slobodnu 5'-hidroksilnu i monobenzoilovanu bazu, iznosio je 2,0 g (33,6%)

B. Postupak 2: Prelazni način zaštite (kao što je prikazano na Slici 1, 1→2→6)

[0082] Početni monomer, 3'-amino-2',3'-dideokiadenozin (1, 10 mmol), pretvoren je u 3'-zaštićeni monomer 2 kako je gore opisano, tj. tretiranjem sa 1,1 ekvivalenta tritil hlorida u suvom piridinu koji sadrži 6 ekv. trietilamina na 50°C.

[0083] Čisti rastvor 2 je ohlađen do 0°C i 5 ekv. hlorotrimetilsilana je dodat u kapima, a zatim se meša 30 minuta, stvarajući 5'-OTMS međuproizvod. Zatim je u kapima dodat benzoil hlorid (5 ekv.), nakon čega je mešano dva sata na sobnoj temperaturi, dobivši monobenzoil i/ili dibenzoil bazno-zaštićen međuproizvod.

[0084] Reakciona smeša je ohlađena na 0°C i dodato je 20 ml hladne vode, praćeno mešanjem od 20 minuta i dodavanjem 20 ml konc. amonijum hidroksida. Mešanje je nastavljeno 30 min, i rastvor se koncentriše u vakuumu. Uljni ostatak je odložen u etil acetatu i ispran sa zasićenim natrijum bikarbonatom i rastvor je osušen i isparen u vakuumu. Proizvod je prečišćen kao što je gore opisano hromatografijom na silika gelu. Izolovani prinos proizvoda (6) iznosi 3,6 g (60,2%).

[0085] U sledećim procedurama, DMF ili DMF/piridin, sa dodatim trietilaminom, korišćen je kao rastvarač za početnu reakciju tristilacije, a međuproizvod 2 je dalje reagovan, koristeći postupak A ili postupak B, kako bi proizvod 6 bio u oko 70% prinosa. Utvrđeno je da su prinosi donekle poboljšani uklanjanjem trietilamina (npr. vodenim ispiranjem) pre benzoilacije, naročito kada se koristi postupak A. Za ovaj tretman je primećeno da sprečava formiranje sporednog proizvoda za koji se veruje da je rezultat otvaranja prstena adeninske baze. Formiranje ovog sporednog proizvoda eliminisano je i izolovanjem tritilovanog proizvoda 2 pre daljeg reagovanja.

C. Postupak 3: Način TBDMS zaštite (kao što je prikazano na Slici 1, 1→2→4→5→6)

[0086] Početni monomer, 3'-amino-2',3'-dideokiadenozin (1, 10 mmol), pretvoren je u 3'-zaštićeni monomer 2 kako je gore opisano, tj. tretiranjem sa 1,1 ekv. tritil hlorida u suvom piridinu koji sadrži 6 ekv. trietilamina na 50°C.

[0087] U bistri rastvor je dodato 2 ekv. terc-butildimetilsilil hlorida (TBDMS Cl) i mešanje je nastavljeno preko noći na sobnoj temperaturi. Ovaj rastvor (3'-tritilamino-5'-TBDM sililoksi međuproizvoda 4) je ohlađen na -5°C i 3 ekv. benzoil hlorida je dodato u kapima, nakon mešanja na sobnoj temperaturi u trajanju od dva sata, pružajući N6-dibenzoil međuproizvod 5. Rastvor je koncentrovan u vakuumu, i uljni ostatak je premešten u etil acetat, ispran sa zasićenim natrijum bikarbonatom, osušen i isparen u vakuumu.

[0088] Dobijeni uljni ostatak je rastvoren u 100 ml THF i 2 ekv. TBAF (tetrabutilamonijum fluorida) je dodato. Smeša je mešana preko noći na sobnoj temperaturi. Etil acetat je dodat u reakcionu smešu i rastvor je ispran natrijum bikarbonatom, 0,5 M natrijum citratom (pH 4) i slanim rastvorom. Proizvod je prečišćen kao što je gore opisano hromatografijom na silika gelu, dajući 3.3 g (55.5%) čistog jedinjenja 6.

Sinteza 2. Sinteza N4-benzoil-3'-aminotritil-2',3'didoksoksitidina

[0089] Sinteza N4-benzoil-3'-aminotritil2',3'-dideokicitidin iz 3'-amino-2',3'-dideokicitidina može se izvršiti na sličan način, koristeći bilo koju od gore navedenih procedura, ili u skladu sa postupkom iz Sinteze 4, dole. Sinteza 3. Sinteza N2-izobutiril-3'-aminotritil2',3'-dideoksigvanozina iz 3'-amino-2',3'-dideoksigvanozina (Slika 2A)

[0090] Početni materijal, 3'-amino-2',3'-dideoksigvanozin (7, 2 g) je isparen sa suvim piridinom, zatim suspendovan u 100 ml suvog piridina i 6 ekv. diizopropiletilamina. Dodan je tert-butildimetilsilil hlorid (2 ekvivalenta), dobivši 5'-TBDM sililoksi intermedijar. Posle 30 min mešanja, 1,1 ekv. tritil hloridaa dodato je iz dva puta i mešanje je nastavljeno preko noći na sobnoj temperaturi. Dva jedinjenja su otkrivena pomoću TLC, niže pokretanje, obimniji proizvod 8 je željeni 5'-TBDMS-3'-aminotritil-2',3'-dideoksigvanozin. Više pokretanje, manje obimno jedinjenje 9, dodatno se tritira na bazi. Monotritil jedinjenje 8 je izolovano hromatografijom na silika gelu koristeći metilen hlorid:metanol:trietilamin 94:5:1 v/v/v sistem rastvarača.

[0091] Ovaj proizvod je isparen suvim piridinom i rastvoren u 100 ml piridina. Rastvor je ohlađen na 0°C i 1,1 ekv. izobutiril hlorida je dodato, praćeno mešanjem od 30 minuta. Posle gašenja reakcije sa metanolom i isparavanja pod vakuumom, reakcija je izgrađena od metilen hlorida-natrijum bikarbonata. Organska faza je osušena iznad natrijum sulfata i isparena u vakuumu. Maseni ostatak (potpuno zaštićeni monomer 10) je rastvoren u 100 ml tetrahidrofurana i 5 ekv. tetrabutilamonijum fluorida je dodato. Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi preko noći, zatim je razblažena etil acetatom, isprana natrijum bikarbonatom. Nakon sušenja preko natrijum sulfata, rastvarač je uparen u vakuumu da bi se dobilo 2 g 5'-hidroksil proizvoda 11 (46,1%).

[0092] U naknadnim procedurama, tritilacija od 7 izvedena je u DMF/piridinu na 50°C, i sporedni proizvod 9 (<5%) je uklonjen precipitacijom dominantnog proizvoda 8 iz dihlorometana ili vode. Nukleotidna baza je zaštićena korišćenjem ili prolazne zaštitne šeme na Slici 2B ili peracilacionom reakcijom (analogno Sintezi 1A). Proizvod 11 je izolovan, nakon kristalizacije iz CH3CN, u prinosima od oko 60% i 53%, respektivno. Prinosi su takođe primećeni da se poboljšavaju kada se vodi računa o tome da se izbegne hidroliza reagensa acil hlorida.

Sinteza 4. Sinteza N4-benzoil-3'-aminotritil-2',3'-dideokicitidina iz 3'-amino-2',3'-dideokicitidina (kao što je ilustrovano na Slici 2C)

[0093] 3'-amino grupa početnog materijala 12 reagovala je sa tritil hloridom u 1:4 piridin:DMF u prisustvu trietilamina. Međuproizvod 13 je reagovan sa benzoil anhidridom u 9:1 CH3CN:MeOH na 50°C. Željeni proizvod 14 je izolovan, nakon hromatografije na silika gelu, sa prinosom od 70%.

Sinteza 5. Sinteza 3'-aminotritil-3'-deoksi-timidin-5 '-(2-cianoetil, N, N-diizopropil)fosforamidita iz 3'-amino-3'-deoksietimidina, nakon čega sledi fosfitilacija (kako je ilustrovano na Slici 3)

[0094] Početni materijal, 3'-amino-3'-deoksietimidin (15, 1,3 g) je isparen sa suvim piridinom, a zatim rastvoren u 30 ml suvog piridina. Ovom rastvoru je dodato 5 ekv. diizopropiletilamina ili trietilamina, praćeno 10 minuta mešanja i dodavanjem od 1 do 1,1 ekv. tritil hlorida. Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi preko noći (ili, alternativno, na 50°C tokom 1 Sata). Nakon nestanka početnog materijala pomoću TLC, reakcija je ugašena sa metanolom i rastvor je uparen u vakuumu. Dobijeno ulje rastvara se u metilen hloridu, pere se sa zastićenim natrijum bikarbonatom, suši preko natrijum sulfata i koncentriše. Taloženje metilen hlorid-heksana dala je 2,2 g (85%) proizvoda 16 kao beli prah.

[0095] Proizvod 16 (1,7 g) isparen je sa suvim piridinom i rastvoren u 100 ml suvog metilen hlorida. Ovom rastvoru je dodato 4 ekv. diizopropiletilamina, praćeno 1,2 ekv. 2-cijanoetil-N,N-diizopropilhlorofosforamidita. Reakcija je praćena sa TLC, i nakon nestanka početnog materijala rastvor je ispran sa zasićenim natrijum bikarbonatom, osušen preko natrijum sulfata i isparen u vakuumu. Proizvod je prečišćen fleš hromatografijom na silika gelu koristeći metilen hlorid: trietilamin 10:1 v/v sistem rastvarača kako bi se dobilo 2 g (83,3%) zaštićenog monomera 17 fosfitabilnog kao čvrste pene. Ukupan prinos procedure bio je 70,8%.

1

Claims

Patentni zahtevi

1. Monomer adenozina ili gvanozina koji sadrži:

zaštićenu 3'-amino grupu koja je zaštićena acidno labilnom grupom;

nukleozidnu bazu koja je zaštićena dialkil-, di (cikloalkil) - ili di (aralkil) -formamidinil grupom; i i 5'-O- (2-cijanoetil-N, N-diizopropilamino) fosforamidit grupu.

2. Monomer prema patentnom zahtevu 1, gde je dialkil ili dicikloalkil formamidinil grupa takva da je alkil C1-C4alkil, a cikloalkil C5-C6cikloalkil..

3. Monomer prema patentnom zahtevu 1, gde je acidna labilna zaštitna grupa triarilmetil grupa.

4. Monomer prema patentnom zahtevu 1, gde je acidna labilna zaštitna grupa trifenilmetil.

5. Monomer prema patentnom zahtevu 1, gde je nukleozidna baza zaštićena dimetilformamidinil grupom ili dibenzilformamidinil grupom..

6. Monomer prema patentnom zahtevu 1, gde je navedena nukleozidna baza zaštićena dialkilformamidinil grupom.

7. Monomer prema patentnom zahtevu 1, gde pomenuti monomer sadrži 2' grupu odabranu između vodonika, hidroksi, C1-C4alkoksi, C1-C4alkila i fluoro.

8. Monomer prema patentnom zahtevu 1, gde je 2'-grupa monomera vodonik.

9. Postupak za dobijanje monomera adenozina, gvanozina ili citidina koji ima zaštićenu nukleozidnu bazu i zaštićenu 3'-amino grupu,

gde su navedena baza i navedena 3'-amino grupa ortogonalno zaštićene,

koji postupak sadrži:

selektivnu reakciju 3'-amino grupe sa prvom zaštitnom grupom koja se sastoji od acidne labilne grupe;

reagovanje 5'-hidroksilne grupe sa drugom zaštitnom grupom koja se sastoji od acila, bazno labilnog trialkil silil etra ili fluorid labilnog silil etra; i

reagovanje nukleozidne baze sa trećom zaštitnom grupom koja je acil grupa ili formamidinil grupa;

pri čemu se prva zaštitna grupa može ukloniti iz pomenute 3'-amino grupe pod uslovima koji ne uklanjaju zaštitu pomenute nukleozidne baze;

fosfitilovanje 5'-hidroksilne grupe.

10. Postupak prema patentnom zahtevu 9, gde je treća zaštitna grupa acil grupa.

11. Postupak za dobijanje adenozin, gvanozin ili citidin monomera koji ima fosfitiliranu 5'-hidroksilnu grupu, zaštićene nukleozidne baze i zaštićene 3'-amino grupe, pri čemu su navedena baza i navedena 3'-amino grupa ortogonalno zaštićene,

koji postupak sadrži:

(d) fosfitiliranje 5'-hidroksilne grupe.

12. Postupak prema patentnom zahtevu 9, 10 ili 11 gde je acid-labilna grupa triarilmetil.

13. Postupak prema patentnom zahtevu 9, 10 ili 11 gde je acid-labilna grupa trifenilmetil.

14. Postupak prema patentnom zahtevu 11 gde je navedeni monomer adenozin ili gvanozin, a navedena dodatna zaštitna grupa je dimetilformamidinil grupa ili dibenzilformamidinil grupa.

15. Postupak prema patentnom zahtevu 11 gde je navedeni monomer citidin monomer, a navedena reakcija sa daljom zaštitnom grupom uključuje reakciju sa acil anhidridom.

1