ES2901099T3 - Proceso mejorado para la preparación de imetelstat - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento para sintetizar el oligonucleótido de tiofosforamidato N3' → P5' de fórmula **(Ver fórmula)** comprendiendo el procedimiento a) proporcionar un primer nucleótido 3'-aminoprotegido unido a un soporte en fase sólida de fórmula (A) en el que PG es un grupo protector lábil con el ácido **(Ver fórmula)** b) desprotección del grupo 3'-amino protegido para formar un grupo 3'-amino libre **(Ver fórmula)** c) reaccionar el grupo 3'-amino libre con un monómero de 3'-aminonucleósido-5'-O-cianoetil-N,N- diisopropilaminofosforamidita de fórmula (B'n), en el que B'n con n = 2 es A protegido, para formar un enlace internucleósido N3' → P5'-fosforamidita **(Ver fórmula)** d) sulfurización del grupo fosforamidito internucleósido utilizando un disulfuro de acilo para formar un tiofosforamidato N3' → P5'; e) repetir 11 veces en orden sucesivo la etapa de desprotección b), la etapa de acoplamiento c) con un monómero de 3'-aminonucleósido-5'-O-cianoetil-N,N-diisopropilamino-fosforamidito de fórmula (B'n) en el que la base nucleósida B' del monómero (B'n) es B protegida, excepto cuando B es timina, y en el que Bn es sucesivamente la nucleobase B3 a B13 en las 11 etapas de acoplamiento respectivos, y la etapa de sulfurización d); f) eliminar el grupo protector lábil al ácido PG; y g) desproteger y escindir el imetelstat del soporte en fase sólida; caracterizado porque no se realiza ninguna etapa adicional de cubrimiento en ninguna de las etapas de reacción a) a e).
Description
DESCRIPCIÓN
Proceso mejorado para la preparación de imetelstat
La presente invención se refiere a un proceso para preparar el inhibidor de la telomerasa imetelstat utilizando un proceso de unión al soporte en fase sólida de 3 etapas por ciclo que comprende las etapas de desprotección del grupo 3-amino del oligonucleótido unido al soporte acoplamiento con un 5'-fosforamidito, y sulfurización con un disulfuro de acilo, caracterizado por la ausencia de una etapa adicional de cubrimiento en cada ciclo que se utiliza para evitar que los grupos 3'-amino del oligonucleótido que no han reaccionado reaccionen durante los ciclos posteriores.
Antecedentes
Imetelstat (SEQ ID NO:1) es un oligonucleótido de tiofosforamidato N 3'^P5' unido covalentemente a una fracción lipídica de palmitoilo y se ha descrito en WO-2005/023994 como compuesto (1F). La sal sódica de imetelstat actúa como un inhibidor potente y específico de la telomerasa y puede utilizarse para tratar trastornos mediados por la telomerasa, por ejemplo, el cáncer, incluidos trastornos como la mielofibrosis (MF), los síndromes mielodisplásicos (SMD) y la leucemia mielógena aguda (LMA).
La estructura del imetelstat sódico se muestra a continuación
La estructura del imetelstat también puede representarse como se muestra a continuación
El grupo LPT representa el lípido palmitoil que está unido covalentemente al oligonucleótido de tiofosforamidato N3'^P5'. La secuencia de bases de los trece nucleótidos es la siguiente : TAGGGTTAGACAA y está representado por las bases B1 a B13. Los grupos -NH-P(=S)(OH)- y -O-P(=S)(OH)- de la estructura pueden presentarse en forma de sal. Se entiende que las formas de sal de un compuesto en cuestión están incluidas en las estructuras representadas en el presente documento, incluso si no se indican específicamente.
El Imetelstat sódico también puede representarse de la siguiente manera
El grupo -NH-P(=S)(OH)- y las bases timina, adenina, guanina y citosina pueden presentarse en otras disposiciones tautoméricas que las utilizadas en las figuras de la descripción. Se entiende que todas las formas tautoméricas de un compuesto en cuestión están incluidas en una estructura en la que se describe una posible forma tautomérica del compuesto, aunque no se indique específicamente.
Técnica anterior
El esquema sintético utilizado en WO-2005/023994 para preparar imetelstat como compuesto (1F) se describe en el Esquema 1 y el Esquema 2. La síntesis de este oligonucleótido se realiza mediante la metodología de la fosforamida en fase sólida, con todas las reacciones que tienen lugar en un soporte en fase sólida. La síntesis del imetelstat se lleva a cabo en un vidrio de poro controlado (LCAA-CPG) cargado con 3-palmitoilamido-1-O-(4,4'-dimetoxitritilo)-2-O-succinil propanodiol. El oligonucleótido se ensambla desde el extremo 5' al 3' mediante la adición de nucleósidos 5'-fósforos-amiditos protegidos con la ayuda de un activador. Cada ciclo de elongación consta de 4 etapas distintas y muy controladas: desprotección, acoplamiento de amidita, sulfurización y una etapa de cubrimiento
Esquema 1: ciclo 1 de esquema sintético de imetelstat
n rimi n 4. rimi n 2. Acoplamiento NHTr
En el esquema 1, la síntesis con soporte en fase sólida comienza con la eliminación del grupo protector 4,4-dimetoxitrilo (DMT) lábil al ácido del palmitoilamidopropanodiol unido al soporte en fase sólida. El primer nucleótido fosforamido se acopla al soporte seguido de la sulfurización del fósforo utilizando una solución 0,1 M de disulfuro de fenilacetilo (PADS) en una mezcla de acetonitrilo y 2,6-lutidina (relación 1:1). A continuación, se aplica una etapa de cubrimiento para evitar que cualquier material de partida en fase sólida que no haya reaccionado se acople con un nucleótido fosforamido en los siguientes ciclos de reacción. El cubrimiento se realiza con una mezcla 18:1:1 de THF / anhídrido isobutírico/ 2 ,6-lutidina.
Tras el primer ciclo en el soporte en fase sólida, la elongación de la cadena se consigue mediante la reacción del grupo 3'-amino del oligonucleótido unido al soporte con un exceso de una solución del monómero de fosforamidita del nucleótido protegido correspondiente al siguiente nucleótido requerido en la secuencia, como se representa en el esquema 2
Esquema 2: ciclo 2-13 de esquema sintético de imetelstat
En el Esquema 2 se representa el primer ciclo del proceso de elongación de la cadena que se logra mediante la desprotección del grupo 3'-amino del oligonucleótido unido al soporte (a), seguido de una reacción de acoplamiento del grupo 3-amino del oligonucleótido unido al soporte (b) con un exceso de una solución de un monómero de 5'-fosforamidita correspondiente al siguiente nucleótido requerido en la secuencia de imetelstat. A la reacción de acoplamiento le sigue la sulfurización del fósforo del oligonucleótido unido al soporte (c) y una etapa de cubrimiento (véase el esquema 3) para evitar que cualquier material de partida en fase sólida (b) que no haya reaccionado se acople con un nucleótido 5'-fosforamidito en los siguientes ciclos de reacción. El ciclo de reacción del esquema 2 se repite 12 veces antes de que el oligonucleótido unido al soporte en fase sólida se trate con una mezcla 1:1 de etanol y amoníaco concentrado, seguido de una purificación por HPLC para obtener el imetelstat
La etapa de cubrimiento utilizando una mezcla 18:1:1 de THF / anhídrido isobutírico / 2,6-lutidina se realiza para convertir después de la etapa de acoplamiento cualquier oligonucleótido restante unido al soporte en fase sólida (b) con un grupo 3'-amino primario en un oligonucleótido (e) con un grupo 3'-amino protegido (o "con cubrimiento") para evitar que el grupo 3'-amino primario se acople con un nucleótido fosforamidito en los siguientes ciclos de reacción.
El documento WO-01/18015 divulga en el Ejemplo 3 con SEQ ID N° 2 un oligonucleótido de tiofosforamidato N3'^-P5' y un proceso para preparar este oligonucleótido que comprende una etapa de cubrimiento.
Herbert B-S et al. analiza la modificación lipídica de GRN163 (Oncogene (2005) 24, 5262-5268).
Makiko Horie et al. discute la síntesis y las propiedades de oligonucleótidos de ácido nucleico con puente de 2'-O,4'-C-etileno y dirigidos a la subunidad de ARN de la telomerasa humana (Nucleic Acids Symposium Series (2005) 49, 171-172).
Descripción de la invención
La reacción de acoplamiento en el proceso ligado a soporte en fase sólida divulgado en WO-01/18015 y WO-2005/023994 incluye una etapa de cubrimiento para evitar que cualquier grupo amino primario no reaccionado en el oligonucleótido unido al soporte reaccione durante los ciclos posteriores.
Ahora se ha encontrado sorprendentemente que el uso de una etapa de cubrimiento como se describe en el arte previo es superfluo y que el imetelstat puede ser preparado usando un ciclo de 3 etapas sin una etapa de cubrimiento adicional con un rendimiento y pureza casi idénticos comparados con el ciclo de 4 etapas del arte previo que usa una etapa de cubrimiento específico. La eliminación de la etapa de cubrimiento de cada ciclo beneficia al proceso global al reducir el número de etapas del ciclo en un 22 % (de 54 a 42 etapas) y la consiguiente reducción del tiempo de proceso. Además, el consumo de disolventes se reduce gracias a la disminución de las etapas del ciclo, lo que hace que el proceso sea más ecológico.
Cuando se utiliza el término "paso de cubrimiento" a lo largo de este texto, se pretende definir una etapa de proceso químico adicional en la que el grupo 3'-amino primario libre en el oligonucleótido unido al soporte en fase sólida se convierte en un grupo 3'-amino secundario o terciario sustituido que no es capaz de participar en la reacción de acoplamiento con un monómero 3'-aminonucleósido-5'-O-cianoetil-N,N-diisopropilamino-fosforamidita protegido en la etapa de acoplamiento subsiguiente.
En una realización, la presente invención se refiere a un procedimiento de síntesis de un oligonucleótido N3' ^ P5' tiofosforamidato de fórmula
el procedimiento comprende de
a) proporcionar un primer nucleótido 3'-aminoprotegido unido a un soporte en fase sólida de fórmula (A) en el que PG es un grupo protector lábil con el ácido
b) desprotección del grupo 3'-amino protegido para formar un grupo 3'-amino libre
c) hacer reaccionar el grupo 3'-amino libre con un monómero protegido de 3'-aminonucleósido-5'-O-cianoetil-N,N-diisopropilaminofosforamidita de fórmula (B'n), donde n = 2 , para formar un enlace internucleósido N3'^-P5'-fosforamidita
d) sulfurización del grupo fosforamidito internucleósido utilizando un disulfuro de acilo para formar un tiofosforamidato N3'^-P5';
e) repetir 11 veces en orden sucesivo la etapa de desprotección b), la etapa de acoplamiento c) con un monómero de 3'-aminonucleósido-5'-O-cianoetil-N,N-diisopropilamino-fosforamidita de fórmula (B'n) en el que la base nucleósida protegida B' en el monómero (B'n) es sucesivamente la nucleobase protegida B3 a B13 en las 11 etapas de acoplamiento respectivas, y la etapa de sulfurización d);
f) eliminar el grupo protector lábil al ácido PG; y
g) escindir y desproteger el imetelstat del soporte en fase sólida;
caracterizado porque no se realiza ninguna etapa adicional de cubrimiento en ninguna de las etapas de reacción a) a e).
En una realización, la presente invención se refiere a un procedimiento de síntesis del oligonucleótido de tiofosforamidato N3' ^ P5' de fórmula
el procedimiento comprende de
a) proporcionar un primer nucleótido 3'-aminoprotegido unido a un soporte en fase sólida de fórmula (A) en el que PG es un grupo protector lábil con el ácido
b) desprotección del grupo 3'-amino protegido para formar un grupo 3'-amino libre
c) hacer reaccionar el grupo 3-amino libre con un monómero de 3-aminonucleósido-5'-O-cianoetil-N,N-diisopropilaminofosforamidita de fórmula (B'n), en el que B'n con n = 2 es A protegido, para formar un enlace internucleósido N3— P5'-fosforamidita
d) sulfurización del 
acilo para formar un tiofosforamidato N3'- P5';
e) repetir 11 veces en orden sucesivo la etapa de desprotección b), la etapa de acoplamiento c) con un monómero 3'-aminonucleósido-5'-O-cianoetil-N,N-diisopropilamino-fosforamidito de fórmula (B'n) en el que la base nucleósida B' del monómero (B'n) es B protegida, excepto cuando B es timina, y en el que Bn es sucesivamente la nucleobase B3 a B13 en las 11 etapas de acoplamiento respectivos, y la etapa de sulfurización d);
f) eliminar el grupo protector lábil al ácido PG; y
g) desproteger y escindir el imetelstat del soporte en fase sólida;
caracterizado porque no se realiza ninguna etapa adicional de cubrimiento en ninguna de las etapas de reacción a) a e).
En una realización, la presente invención se refiere a un procedimiento de síntesis del oligonucleótido de tiofosforamidato N3' — P5' de fórmula
imetelstat
el procedimiento comprende de
a) proporcionar un primer 3'-amino nucleótido protegido unido a un soporte en fase sólida de fórmula (A) en el que PG es un grupo protector lábil al ácido
b) desproteger el 3-amino nucleótido protegido por PG para formar un 3-amino nucleótido libre de fórmula (A')
c) acoplar el 3'-amino nucleótido libre con un monómero de 3'-aminonucleósido-5'-O-cianoetil-N,N-diisopropilaminofosforamidita (B'n), en el que B'n con n = 2 está protegido A, para formar un enlace internucleósido N3'^P5'-fosforamidita
d) sulfurizar el enlace N3'^P5'-fosforamidito utilizando un disulfuro de acilo para formar un enlace internucleósido N 3'^P5' tiofosforamidato;
e) repetir 11 veces en orden sucesivo:
la etapa de desprotección b);
la etapa de acoplamiento c) con un monómero de 3'-aminonucleósido-5'-O-cianoetil-N,N-diisopropilamino-fosforamidita (B'n) protegido, en el que la base nucleósida B'del monómero (B'n) es
B protegida, excepto cuando B es timina, y en el que Bn es sucesivamente la nucleobase B3 a B13 en las 11 etapas de acoplamiento respectivos; y
la etapa de sulfuración d); para producir un oligonucleótido de tiofosforamidato N3’ ^ P5’ protegido unido al soporte en fase sólida;
f) eliminar el grupo protector 3-terminal de la etiqueta ácida PG del oligonucleótido de tiofosforamidato N3’ ^ P5’ protegido imetelstat; y
g) desproteger y escindir el oligonucleótido de tiofosforamidato N3’ ^ P5’ protegido del soporte en fase sólida para producir imetelstat;
caracterizado porque no se realiza ninguna etapa adicional de cubrimiento en ninguna de las etapas de reacción a) a e).
Una amplia variedad de soportes en fase sólida pueden ser utilizados con la invención, incluyendo pero no limitado a, tales como micropartículas hechas de vidrio de poro controlado (CPG), poliestireno altamente reticulado, vidrio de poro controlado híbrido cargado con soportes de poliestireno reticulado, copolímeros acrílicos, celulosa, nailon, dextrano, látex, poliacroleína, y similares.
El nucleótido 3-amino protegido unido a un soporte en fase sólida de fórmula (A)
puede prepararse como se describe en WO-2005/023994 en el que un soporte de vidrio de poro controlado cargado con 3-palmitoilamido-1-O-(4,4-dimetoxitril)-2-O-succinil propanodiol se ha acoplado con un monómero de 3’-aminonucleósido-5'-O-cianoetil-N,N-diisopropilaminofosforamidita protegido de fórmula (B’1)
en el que PG es un grupo protector lábil al ácido. Los grupos protectores 3-amino adecuados son, pero no se limitan a, por ejemplo, trifenilmetilo fes decir, tritilo o Tr), p-anisilmetilo (es decir, monometoxitritilo o MMT) y di-p-anisilmetilo fes decir, dimetoxitritilo o DMT).
Los monómeros protegidos de 3l-aminonucleósido-5'-O-cianoetil-N,N-diisopropilaminofosforamidita de fórmula (B’n) tienen un grupo protector 3-amino PG que es un grupo lábil al ácido, como trifenilmetilo fes decire. tritil o Tr), panisildifenilmetilo (es decir, monometoxitritilo o MMT), o di-p-anisilfenilmetilo (es decir, dimetoxitritilo o DMT). Además, la base de nucleósido Bl está protegida con un grupo protector de base lábil (excepto la timina)
B'i = T B'10= protegido A
B'2 = protegidoA B'n = protegido C
B'3 = protegido G B'12 = protegidoA
B'4 = protegido G B'13 = protegido A
m o n ó m e ro (B'n) B'5 = protegido G
B's = T j = timina
B's = protegidoA G = guanina
B'g = protegido G C = citosina
Los monómeros de nucleótidos B’1 y B’2 a B’13 se utilizan sucesivamente en las 13 etapas de acoplamiento que comienzan con el suministro de un soporte en fase sólida cargado con 3-palmitoilamido-1-O-(4,4’-dimetoxitrilo)-2-Osuccinil propanodiol y acoplado al monómero de nucleótidos B'i y el siguiente ciclo de 12 reacciones de desprotección, acoplamiento y sulfurización en las que se utilizan los monómeros de nucleótidos B'2 a B'13.
El grupo protector 3-amino PG puede eliminarse mediante tratamiento con una solución ácida como, por ejemplo, ácido dicloroacético en diclorometano o tolueno.
La base nucleósida B' en los monómeros protegidos de 3'-aminonucleósido-5'-O-cianoetil-N,N-diisopropilaminofosforamidita de fórmula (B'n) se protege con un grupo protector de base lábil que se elimina en la etapa g). Los grupos protectores lábiles para la base nucleósida adenina, citosina o guanina son, por ejemplo, grupos acilo como acetilo, benzoilo, isobutirilo, dimetilformamidinilo o dibencilformamidinilo. En las condiciones de reacción utilizadas en la síntesis de oligonucleótidos, la base nucleósida timina no requiere protección. Tales monómeros protegidos de 3'- amino-nucleósido-5'-O-cianoetil-N,N-diisopropilaminofosforamidita de fórmula (B'n) que tienen un 3'-amino protegido con un grupo protector de ácido-lábil PG y un nucleósido base B' protegido con un grupo protector de base-lábil están disponibles comercialmente o pueden ser preparados como se describe en WO-2006/014387.
El paso de acoplamiento c) se realiza añadiendo una solución de monómero de 3'-aminonucleósido-5'-O-cianoetil-N,N-diisopropilaminofosforamidita de fórmula (Bn) y una solución de un activador (o una solución que contiene el monómero de fosforamidita (Bn) y el activador) al recipiente de reacción que contiene el grupo amino libre de un (oligo)nucleótido unido covalentemente a un soporte sólido. A continuación, la mezcla se mezcla mediante procedimientos como el vórtex mecánico, el rociado con un gas inerte, etc. Alternativamente, la(s) solución(es) de monómero y activador pueden hacerse fluir a través de un recipiente de reacción (o columna) que contenga el (oligo)nucleótido soportado en fase sólida con un grupo 3'-amino libre. El monómero y el activador pueden estar premezclados, mezclados en el bloque de válvulas de un sintetizador adecuado, mezclados en un recipiente de preactivación y preequilibrados si se desea, o pueden añadirse por separado al recipiente de reacción.
Ejemplos de activadores para su uso en la invención son, pero no se limitan a, tetrazol, 5-(etiltio)-1H-tetrazol, 5-(4-nitro-fenil)tetrazol, 5-(2-tienil)-1H-tetrazol, triazol, cloruro de piridinio, y similares. Los disolventes adecuados son acetonitrilo, tetrahidrofurano, diclorometano y similares. En la práctica, el acetonitrilo es un disolvente comúnmente utilizado para la síntesis de oligonucleótidos.
El agente de sulfurización que se utiliza en la etapa d) es un disulfuro de acilo disuelto en un disolvente. Los disulfuros de acilo más conocidos son, por ejemplo, el disulfuro de dibenzoilo, el disulfuro de bis(fenilacetilo) (PADS), el disulfuro de bis(4-metoxibenzoilo), el disulfuro de bis(4-metilbenzoilo), el disulfuro de bis(4-nitrobenzoilo) y el disulfuro de bis(4-clorobenzoilo).
El disulfuro de fenilacetilo (PADS) es un agente comúnmente utilizado para las reacciones de sulfurización que se "envejece" mejor en una solución básica para obtener una actividad óptima de sulfurización (Scotson J.L. et al., Org. Biomol. Chem., vol. 14, 10840 - 10847, 2016). Un disolvente adecuado para la PADS es, por ejemplo, una mezcla de un disolvente básico como, por ejemplo, 3-picolina o 2,6-lutidina con un co-disolvente como acetonitrilo, tolueno, 1-metil-pirrolidinona o tetrahidrofurano. La cantidad de disolvente básico con respecto a la cantidad de cosolvente puede ser cualquier relación, incluida una relación de 1:1. Dependiendo del éster de fosfito que se vaya a convertir en su correspondiente tiofosfato, se puede utilizar tanto el PADS "fresco" como el "envejecido"; sin embargo, se ha demostrado que el PADS "envejecido" mejora la velocidad y la eficacia de la sulfuración. Las soluciones PADS "envejecidas" son soluciones PADS recién preparadas que se mantuvieron algún tiempo antes de su uso en la reacción de sulfurización. Los tiempos de envejecimiento pueden variar desde unas pocas horas hasta 48 horas y la persona experta puede determinar el tiempo de envejecimiento óptimo analizando la reacción de sulfurización en cuanto a rendimiento y pureza.
Para la preparación de imetelstat de acuerdo con la presente invención, se utiliza una solución de PADS en una mezcla de acetonitrilo y 2,6-lutidina, preferentemente en una relación 1:1, con un tiempo de envejecimiento de 4 a 14 horas. Se ha comprobado que cuando se utiliza la 2,6-lutidina, limitar la cantidad de 2,3,5-colidina (que suele encontrarse como impureza en la 2 ,6-lutidina) por debajo del 0,1 % mejora la eficacia de la sulfurización y se observa una menor oxidación indeseable del fósforo.
En la etapa g) se desprotege el imetelstat y se escinde del soporte en fase sólida. La desprotección incluye la eliminación de los grupos p-cianoetílicos y de los grupos protectores lábiles para las bases de los nucleótidos. Esto puede hacerse mediante un tratamiento con una solución básica como una solución de dietilamina (DEA) en acetonitrilo, seguido de un tratamiento con amoníaco acuoso disuelto en un alcohol como el etanol.
Las etapas de reacción a) a f) de la presente invención se llevan a cabo en el intervalo de temperatura de 10 °C a 40 °C. Más preferentemente, estas reacciones se llevan a cabo a una temperatura controlada que oscila entre 15 °C y 30 °C. En particular, la etapa de reacción b) de la presente invención se lleva a cabo en el intervalo de temperatura de 15 °C a 30 °C; más en particular de 17 °C a 27 °C. En particular, la etapa de reacción d) de la presente invención se lleva a cabo en el intervalo de temperatura de 17 °C a 25 °C; más en particular de 18 °C a 22 °C; incluso más en particular de 19 °C. La etapa g) en la que se desprotege el imetelstat y se escinde del soporte en fase sólida se lleva a cabo a una temperatura que oscila entre 30 °C y 60 °C. Dependiendo del equipo y de las condiciones específicas de reacción
utilizadas, el experto puede determinar la temperatura óptima de reacción para cada etapa a) a g) dentro de los intervalos indicados anteriormente.
Después de cada paso del ciclo de elongación, el soporte en fase sólida se enjuaga con un disolvente, por ejemplo acetonitrilo, en preparación para la siguiente reacción.
Después de la etapa g), se obtiene imetelstat crudo en su forma de sal de amonio, que luego se purifica mediante una cromatografía líquida de alto rendimiento en fase inversa preparatoria (RP-HPLC) utilizando resinas poliméricas o de sílice para obtener imetelstat purificado en forma de trietilamina. Se añade un exceso de sal de sodio y, a continuación, se desaliniza la solución por diafiltración, obteniendo así imetelstat sódico, que se liofiliza para eliminar el agua. Parte experimental
La "temperatura ambiente" o la "temperatura del ambiente" suele estar entre 21 y 25 °C.
Experimento 1 (sin etapa de cubrimiento)
Todos los reactivos y soluciones de material de partida se prepararon incluyendo 3 % de ácido dicloroacético (DCA) en tolueno, 0,5 M de 5-(etiltio)-1H-tetrazol en acetonitrilo, 015 M de los 4 monómeros de nucleótidos de fórmula (B'n) en acetonitrilo, 0,2 M de fenil acetil disulfuro (PADS) en una mezcla 1:1 de acetonitrilo y 2,6-lutidina y 20 % de DeA (dietilamina) en acetonitrilo.
continuación
La síntesis de oligonudeótidos se realizó en la dirección de 5' a 3' utilizando un ciclo de síntesis repetitivo que consistía en la detritinación seguida del acoplamiento, y la sulfurización realizada a temperatura del ambiente.
Una columna (diámetro: 3,5 cm) se empaquetó con un soporte sólido cargado con 3-palmitoilamido-1-O-(4, 4'-dimetoxitril)-2-O-succinil propanodiol (3,5 mmol basado en una capacidad de 400 ^mol/g) que se acopló con el monómero de nucleótidos B'i. La detritinación se realizó con ácido dicloroacético (DCA) al 3 % en tolueno (la cantidad está entre 6,5 y 13,4 volúmenes de columna en cada paso de detritinación) y el nucleótido unido al soporte sólido se lavó con acetonitrilo (cantidad: 5 volúmenes de columna). El acoplamiento con el siguiente monómero nucleotídico de fórmula (B'n) se consiguió bombeando una solución de 0,5 M de 5-(etiltio)-1H-tetrazol en acetonitrilo y 0,15 M del siguiente monómero nucleotídico de fórmula (B'n) de la secuencia, disuelto en acetonitrilo, a través de la columna. La columna se lavó con acetonitrilo (cantidad: 2 volúmenes de columna). A continuación se realizó la sulfurización bombeando una solución de disulfuro de fenilacetilo (PADS) 0,2 M en una mezcla 1:1 de acetonitrilo y 2,6-lutidina a través de la columna, seguida de un lavado de la columna con acetonitrilo (cantidad: 5 volúmenes de columna). El ciclo de síntesis de detritinación, acoplamiento con el siguiente monómero de nucleótidos de fórmula (B'n) y sulfurización se repitió 12 veces, seguido de la detritinación utilizando ácido dicloroacético (DCA) al 3 % en tolueno (la cantidad está entre 6,5 y 13,4 volúmenes de columna).
Una vez completado el ciclo de síntesis, el oligonucleótido crudo sobre el soporte sólido se trató con una solución de dietilamina (DEA) seguida de un tratamiento con solución de hidróxido de amonio: etanol (relación de volumen 3:1) a una temperatura de 55 °C. La mezcla de reacción se envejeció de 4 a 24 horas a 55 °C, se enfrió a temperatura ambiente y se filtró la suspensión para eliminar el soporte polimérico. La solución que comprende el imetelstat en su forma amoniacal se sometió al procedimiento de análisis por HPLC del Experimento 3.
Experimento 2 (con etapa de cubrimiento)
Todos los reactivos y soluciones de material de partida se prepararon incluyendo 3 % de ácido dicloroacético (DCA) en tolueno, 0,5 M de 5-(etiltio)-1H-tetrazol en acetonitrilo, 0,15 M de los 4 monómeros de nucleótidos de fórmula (B'n) en acetonitrilo, 0,2 M de fenil acetil disulfuro (PADS) en una mezcla 1:1 de acetonitrilo y mezcla de 2,6-lutidina, 20 % de N-metilimidazol (NMI) en acetonitrilo como agente de cubrimiento A, anhídrido isobutírico en una mezcla 1:1 de acetonitrilo y mezcla de 2,6-lutidina como agente de cubrimiento B y 20 % de DEA en acetonitrilo.
La síntesis de oligonucleótidos se realizó en la dirección de 5' a 3' utilizando un ciclo de síntesis repetitivo que consistía en la detritinación seguida del acoplamiento y la sulfurización realizada a temperatura ambiente.
Una columna (diámetro: 3,5 cm) se empaquetó con un soporte sólido cargado con 3-palmitoilamido-1-O-(4, 4'-dimetoxitril)-2-O-succinil propanodiol (3,5 mmol basado en una capacidad de 400 ^mol/g) que se acopló con el monómero de nucleótidos B'1. La detritinación se realizó con ácido dicloroacético (DCA) al 3 % en tolueno (la cantidad está entre 6,5 y 13,4 volúmenes de columna en cada paso de detritinación) y el nucleótido unido al soporte sólido se lavó con acetonitrilo (cantidad: 5 volúmenes de columna). El acoplamiento con el siguiente monómero nucleotídico de fórmula (B'n) se consiguió bombeando una solución de 0,5 M de 5-(etiltio)-1H-tetrazol en acetonitrilo y 0,15 M del siguiente monómero nucleotídico de fórmula (B'n) de la secuencia, disuelto en acetonitrilo, a través de la columna. La columna se lavó con acetonitrilo (cantidad: 2 volúmenes de columna). A continuación se realizó la sulfurización bombeando una solución de disulfuro de fenilacetilo (PADS) 0,2 M en una mezcla 1:1 de acetonitrilo y 2,6-lutidina a través de la columna, seguida de un lavado de la columna con acetonitrilo (cantidad: 5 volúmenes de columna). La sulfurización fue seguida por una etapa de cubrimiento. En cada cubrimiento de un ciclo determinado se utilizaron 37-47 equivalentes (eq.) del agente de cubrimiento NMI, y 9-11 equivalentes del agente de cubrimiento B anhídrido
isobutírico (IBA), y 1,4-1,8 equivalentes de 2,6 lutidina. Los agentes de cubrimiento A y B se bombeaban a través de la columna con bombas separadas en diferentes relaciones como 50:50, 35:65, 65:35.
El ciclo de síntesis de detritinación, acoplamiento con el siguiente monómero de nucleótidos de fórmula (B'n) y sulfurización, y paso de cubrimiento se repitió 12 veces, seguido de la detritinación utilizando ácido dicloroacético (DCA) al 3 % en tolueno (la cantidad está entre 6,5 y 13,4 volúmenes de columna).
Una vez completado el ciclo de síntesis, el oligonucleótido crudo sobre el soporte sólido se trató con una solución de dietilamina (DEA), seguida de un tratamiento con solución de hidróxido de amonio: etanol (relación de volumen 3:1) a una temperatura de 55 °C. La mezcla de reacción se envejeció de 4 a 24 horas a 55 °C, se enfrió a temperatura ambiente y se filtró la suspensión para eliminar el soporte polimérico. La solución que comprende el imetelstat en su forma amoniacal se sometió al procedimiento de análisis por HPLC del Experimento 3.
Experimento 3: comparación de sin cubrimiento y cubrimiento
El Imetelstat obtenido en el Experimento 1 y en el Experimento 2 se analizó por HPLC. Se determinó la cantidad del oligonucleótido de longitud completa deseada que tenía 13 nucleótidos y se enumeró en la tabla siguiente para el Experimento 1 y el Experimento 2. Además, se determinó la cantidad total de shortmer, específicamente el 12mer, y se enumeró en la tabla siguiente para el Experimento 1 y el Experimento 2.
Procedimiento de análisis HPLC :
tipo de columna: Kromasil C18, tamaño de partícula de 3,5 pm, eluyente de 4,6 X 150 mm:
A: 14,4 mM TEA/386 mM HFIP (hexafluoroisopropanol) /100 ppm(p/v) Na2EDTA en agua
B: 50 % MeOH, 50 % EtOH con 5 % IPA
Gradiente:
Tabla: experimentos con cubrimiento frente a los que no tienen cubrimiento (el experimento 1 se realizó dos veces y los resultados se enumeran como experimento 1a y 1b).
El análisis por HPLC del Experimento 1 y del Experimento 2 demuestra que el rendimiento y la pureza son comparables para el experimento sin cubrimiento frente al experimento con cubrimiento.
El pico principal % incluye el oligonucleótido de longitud completa impurezas PO impurezas depuradas.
Las impurezas PO son impurezas que incluyen uno o más enlaces internucleósidos de oxofosforamidato en lugar de enlaces internucleósidos de tiofosforamidato.
Claims (13)
1. Un procedimiento para sintetizar el oligonucleótido de tiofosforamidato N3' ^ P5' de fórmula
comprendiendo el procedimiento
a) proporcionar un primer nucleótido 3'-aminoprotegido unido a un soporte en fase sólida de fórmula (A) en el que PG es un grupo protector lábil con el ácido
b) desprotección del grupo 3'-amino protegido para formar un grupo 3'-amino libre
c) reaccionar el grupo 3'-amino libre con un monómero de 3'-aminonucleósido-5'-O-cianoetil-N,N-diisopropilaminofosforamidita de fórmula (B'n), en el que B'n con n = 2 es A protegido, para formar un enlace internucleósido N3'^P5'-fosforamidita
monómero (B'n)
d) sulfurización del grupo fosforamidito internucleósido utilizando un disulfuro de acilo para formar un tiofosforamidato N3'^P5';
e) repetir 11 veces en orden sucesivo la etapa de desprotección b), la etapa de acoplamiento c) con un monómero de 3'-aminonucleósido-5'-O-cianoetil-N,N-diisopropilamino-fosforamidito de fórmula (B'n) en el que la base nucleósida B' del monómero (B'n) es B protegida, excepto cuando B es timina, y en el que Bn es sucesivamente la nucleobase B3 a B13 en las 11 etapas de acoplamiento respectivos, y la etapa de sulfurización d);
f) eliminar el grupo protector lábil al ácido PG; y
g) desproteger y escindir el imetelstat del soporte en fase sólida;
caracterizado porque no se realiza ninguna etapa adicional de cubrimiento en ninguna de las etapas de reacción a) a e).
2. El procedimiento como se reivindica en la reivindicación 1, en el que el imetelstat se convierte además en su sal sódica.
3. El procedimiento como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en el que el disulfuro de acilo se selecciona entre el disulfuro de dibenzoilo, el disulfuro de bis(fenilacetilo) (PADS), el disulfuro de bis(4-metoxibenzoilo), el disulfuro de bis(4-metilbenzoilo), el disulfuro de bis(4-nitrobenzoilo) y el disulfuro de bis(4-clorobenzoilo).
4. El procedimiento como se reivindica en la reivindicación 3, en el que el disulfuro de acilo es PADS.
5. El procedimiento como se reivindica en la reivindicación 4, en el que el PADS se disuelve en una mezcla de 3-picolina o 2 ,6-lutidina con un codisolvente seleccionado entre acetonitrilo, tolueno, 1 -metilpirrolidinona y tetrahidrofurano.
6. El procedimiento según la reivindicación 5, en el que el PADS se disuelve en una mezcla de 2,6-lutidina con acetonitrilo.
7. El procedimiento como se reivindica en la reivindicación 6 , en el que la solución PADS se envejece entre 4 y 14 horas antes de su uso.
8. El procedimiento como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el grupo lábil al ácido PG se selecciona entre trifenilmetilo, p-anisildifenilmetilo y di-p-anisilfenilmetilo.
9. El procedimiento como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el grupo protector PG, que es lábil al ácido, se elimina por tratamiento con una solución ácida.
10. El procedimiento como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el grupo protector de base lábil sobre una base de adenina, citosina y guanina en el monómero de fórmula (B'n) se selecciona entre acetilo, benzoilo, isobutirilo, dimetilformamidinilo y dibencilformamidinilo.
11. El procedimiento como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la etapa de acoplamiento c) se realiza utilizando un activador seleccionado entre tetrazol, 5-(etiltio)-1H-tetrazol, 5-(4-nitrofenil)tetrazol, 5-(2-tienil)-1H-tetrazol, triazol y cloruro de piridinio.
12. El procedimiento como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la etapa g) se realiza mediante un tratamiento con una solución básica.
13. El procedimiento como se reivindica en la reivindicación 12, en el que la solución básica es dietilamina disuelta en acetonitrilo o amoníaco acuoso disuelto en un alcohol, o una combinación de ambos.
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