RS61863B1 - Postupci proizvodnje tumor-infiltrirajućih limfocita i upotrebe istih u imunoterapiji - Google Patents

Postupci proizvodnje tumor-infiltrirajućih limfocita i upotrebe istih u imunoterapiji

Info

Publication number
RS61863B1
RS61863B1 RS20210622A RSP20210622A RS61863B1 RS 61863 B1 RS61863 B1 RS 61863B1 RS 20210622 A RS20210622 A RS 20210622A RS P20210622 A RSP20210622 A RS P20210622A RS 61863 B1 RS61863 B1 RS 61863B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
til
tils
expansion
days
population
Prior art date
Application number
RS20210622A
Other languages
English (en)
Inventor
Seth Wardell
James Bender
Michael T Lotze
Original Assignee
Iovance Biotherapeutics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=61569356&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS61863(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Iovance Biotherapeutics Inc filed Critical Iovance Biotherapeutics Inc
Publication of RS61863B1 publication Critical patent/RS61863B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C12N5/0638—Cytotoxic T lymphocytes [CTL] or lymphokine activated killer cells [LAK]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/10—Preservation of living parts
    • A01N1/16—Physical preservation processes
    • A01N1/162—Temperature processes, e.g. following predefined temperature changes over time
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/66—Phosphorus compounds
    • A61K31/675—Phosphorus compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. pyridoxal phosphate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
    • A61K31/7052—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides
    • A61K31/706—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom
    • A61K31/7064—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines
    • A61K31/7076—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines containing purines, e.g. adenosine, adenylic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A61K38/2013—IL-2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/10—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K40/11—T-cells, e.g. tumour infiltrating lymphocytes [TIL] or regulatory T [Treg] cells; Lymphokine-activated killer [LAK] cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
    • A61K40/41—Vertebrate antigens
    • A61K40/42—Cancer antigens
    • A61K40/428—Undefined tumor antigens, e.g. tumor lysate or antigens targeted by cells isolated from tumor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5154—Antigen presenting cells [APCs], e.g. dendritic cells or macrophages
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5156—Animal cells expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5158—Antigen-pulsed cells, e.g. T-cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55522—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K2039/55527—Interleukins
    • A61K2039/55533—IL-2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2121/00—Preparations for use in therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/21—Interferons [IFN]
    • A61K38/217—IFN-gamma
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/50—Cellular immunotherapy characterised by the use of allogeneic cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/90—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/04—Immunosuppressors, e.g. cyclosporin, tacrolimus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2302—Interleukin-2 (IL-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2315—Interleukin-15 (IL-15)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2321—Interleukin-21 (IL-21)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/24—Interferons [IFN]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/60—Transcription factors
    • C12N2501/603—Oct-3/4
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/11—Coculture with; Conditioned medium produced by blood or immune system cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/30—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from cancer cells, e.g. reversion of tumour cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

Opis
LISTA SEKVENCI
[0001] Sadašnja patentna prijava sadrži Listu sekvenci koja je podneta elektronski u ASCII formatu. Pomenuta ASCII kopija, kreirana 4. januara 2018. imenovana je kao 116983-5017_ST25.txt i ima veličinu 14 kilobajta.
OSNOV PRONALASKA
[0002] Lečenje masivnih, refraktornih kancera korišćenjem adoptivnog transfera tumorinfiltrirajućih limfocita (tumor infiltrating lymphocytes, TIL) predstavlja moćan pristup u lečenju pacijenata sa lošom prognozom. Gattinoni, et al., Nat. Rev. Immunol. 2006, 6, 383-393. Uspešna imunoterapija zahteva veliki broj TIL, a za komercijalizaciju potreban je robustan i pouzdan proces. Zbog tehničkih, logističkih i regulativnih problema vezanih za ekspanziju ćelija, postizanje ovoga predstavlja izazov. Zbog svoje brzine i efikasnosti, ekspanzija TIL bazirana na IL-2, praćena "procesom brze ekspanzije ("rapid expansion process", REP) postala je poželjan postupak ekspanzije TIL. Dudley, et al., Science 2002, 298, 850-54; Dudley, et al., J. Clin. Oncol. 2005, 23, 2346-57; Dudley, et al., J. Clin. Oncol.
2008, 26, 5233-39; Riddell, et al., Science 1992, 257, 238-41; Dudley, et al., J. Immunother.
2003, 26, 332-42. Rezultat REP može biti 1000-struka ekspanzija TIL tokom perioda od 14 dana, mada zahteva ozračene alogene mononuklearne ćelije periferne krvi (peripheral blood mononuclear ćelije, PBMC, poznate i kao mononuklearne ćelije, mononuclear ćelije (MNC)) u velikom višku (npr., 200 puta), često poreklom iz više donora, kao ćelija-hraniteljica, kao i anti-CD3 antitela (OKT3) i visokih doza IL-2. Dudley, et al., J. Immunother. 2003, 26, 332-42. Kod pacijenata sa melanomom, TIL koji su podvrgnuti proceduri REP doneli su uspešnu adoptivnu ćelijsku terapiju posle imunosupresije domaćina. Sadašnji parametri prihvatanja infuzije počivaju na očitavanjima kompozicije TIL (npr., CD28, CD8, ili CD4 pozitivnost) i na uvišestručenosti ekspanzije i vijabilnosti REP proizvoda. US patentna publikacija br.
2012/244133 objavljuje proces ekspandiranja TIL, koji uključuje korak procesa brze ekspanzije od oko 14 dana i ukupno trajanje od momenta dobijanja tumorskog uzorka do ekspandirane populacije TIL od oko 28 do 42 dana. WO2016/053338 objavljuje postupak ekspandiranja TIL koji uključuje prvu ekspanziju TIL koja traje između 2 i 3 nedelje i drugu ekspanziju koja traje oko dve nedelje, posle čega se TIL proizvedeni drugom ekspanzijom procenjuju u pogledu reaktivnosti na ERBB2P mutaciju.
[0003] Trenutni procesi proizvodnje TIL ograničeni su dužinom, cenom, pitanjima sterilnosti, i drugim faktorima opisanim u ovom tekstu, tako da je potencijalna komercijalizacija ovog procesa ozbiljno limitirana i zbog toga, kao i iz drugih razloga, komercijalni proces za sada nije raspoloživ. Postoji hitna potreba da se obezbede procesi proizvodnje TIL i terapije bazirane na takvim procesima pogodnim za proizvodnju u komercijalnim razmerama, kao i potreba za regulatornim odobrenjem za upotrebu kod ljudi u većem broju kliničkih centara.
KRATAK OPIS PRONALASKA
[0004] Predmetni pronalazak obezbeđuje poboljšane i/ili skraćene postupke ekspandiranja TIL i proizvodnje terapijskih populacija TIL. Predmetni pronalazak obezbeđuje postupak kako je zahtevano u patentnim zahtevima.
[0005] U ovom tekstu objavljen je, mada ne i zahtevan, postupak ekspandiranja tumorinfiltrirajućih limfocita (TIL) u terapijsku populaciju TIL koji uključuje:
(a) dobijanje prve populacije TIL iz tumora dobijenog od pacijenta resekcijom, obrađivanjem uzorka tumora dobijenog od pacijenta u više tumorskih fragmenata; (b) dodavanje tumorskih fragmenata zatvorenom sistemu;
(c) izvođenje prve ekspanzije kultivisanjem prve populacije TIL u medijumu za ćelijsku kulturu koji sadrži IL-2 da bi se proizvela druga populacija TIL, pri čemu se prva ekspanzija izvodi u zatvorenom kontejneru koji obezbeđuje prvu površinu permeabilnu za gas, pri čemu se prva ekspanzija izvodi tokom oko 3-14 dana da bi se dobila druga populacija TIL, pri čemu je druga populacija TIL najmanje 50 puta brojnija od prve populacije TIL, i pri čemu se prelaz iz koraka (b) u korak (c) dešava bez otvaranja sistema;
(d) izvođenje druge ekspanzije suplementacijom medijuma za kulturu ćelija druge populacije TIL dodatnim IL-2, OKT-3, i antigen-prezentujućim ćelijama (antigen presenting cells, APC), da bi se proizvela treća populacija TIL, pri čemu se druga ekspanzija izvodi tokom oko 7-14 dana da bi se dobila treća populacija TIL, pri čemu je treća populacija TIL terapijska populacija TIL, pri čemu se druga ekspanzija izvodi u zatvorenom kontejneru koji obezbeđuje drugu površinu permeabilnu za gas, i pri čemu se prelaz iz koraka (c) u korak (d) dešava bez otvaranja sistema;
(e) sakupljanje terapijske populacije TIL dobijene iz koraka (d), pri čemu se prelaz iz koraka (d) u korak (e) dešava bez otvaranja sistema; i
(f) prenošenje sakupljene TIL populacije iz koraka (e) u infuzionu kesicu, pri čemu se prelaz iz koraka (e) u (f) dešava bez otvaranja sistema.
[0006] Postupak može uključivati još i korak krioprezervacije infuzione kese koja sadrži sakupljenu TIL populaciju iz koraka (f), korišćenjem procesa krioprezervacije.
[0007] Proces krioprezervacije može da se izvede korišćenjem sakupljene populacije TIL i medijuma za krioprezervaciju u odnosu 1:1.
[0008] Antigen-prezentujuće ćelije mogu biti mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC). PBMC mogu biti ozračene i alogene. PBMC mogu da se dodaju ćelijskoj kulturi bilo kojeg od dana 9 do 14 u koraku (d). Antigen-prezentujuće ćelije mogu biti veštačke antigenprezentujuće ćelije.
[0009] Sakupljanje u koraku (e) može se izvesti korišćenjem sistema za obradu ćelija baziranog na membrani.
[0010] Sakupljanje u koraku (e) može se izvesti korišćenjem LOVO sistema za obradu ćelija.
[0011] Veći broj fragmenata može obuhvatati oko 4 do oko 50 fragmenata, pri čemu svaki fragment ima zapreminu od oko 27 mm3.
[0012] Veći broj fragmenata može obuhvatati oko 30 do oko 60 fragmenata sa ukupnom zapreminom od oko 1300 mm3 do oko 1500 mm3.
[0013] Veći broj fragmenata može obuhvatati oko 50 fragmenata sa ukupnom zapreminom od oko 1350 mm3.
[0014] Veći broj fragmenata može obuhvatati oko 50 fragmenata sa ukupnom masom od oko 1 grama do oko 1.5 grama.
[0015] Medijum za kulturu ćelija može biti obezbeđen u kontejneru odabranom iz grupe koja ses sastoji od G-kontejnera i Xuri kese za ćelije.
[0016] Medijum za kulturu ćelija u koraku (d) može uključivati još i IL-15 i/ili IL-21.
[0017] Koncentracija IL-2 može iznositi oko 10,000 IU/mL do oko 5,000 IU/mL.
[0018] Koncentracija IL-15 može iznositi oko 500 IU/mL do oko 100 IU/mL.
[0019] Koncentracija IL-21 može iznositi oko 20 IU/mL do oko 0.5 IU/mL.
[0020] Infuziona kesa u koraku (f) može biti infuziona kesa koja sadrži HypoThermosol.
[0021] Krioprezervacioni medijum može sadržati dimetilsulfoksid (DMSO). Krioprezervacioni medijum može sadržati 7% do 10% dimetilsulfoksid (DMSO).
[0022] Prvi period u koraku (c) i drugi period u koraku (e) mogu da se izvedu zasebno, unutar perioda od 10 dana, 11 dana, ili 12 dana.
[0023] Prvi period u koraku (c) i drugi period u koraku (e) mogu, svaki za sebe, da se izvedu u okviru perioda od 11 dana.
[0024] Koraci (a) do (f) mogu da se izvedu u okviru perioda od oko 10 dana do oko 22 dana.
[0025] Koraci (a) do (f) mogu, svaki, da se izvedu u okviru perioda od oko 20 dana do oko 22 dana.
[0026] Koraci (a) do (f) mogu, svaki, da se izvedu u okviru perioda od oko 15 dana do oko 20 dana.
[0027] Koraci (a) do (f) mogu, svaki, da se izvedu u okviru perioda od oko 10 dana do oko 20 dana.
[0028] Koraci (a) do (f) mogu, svaki, da se izvedu u okviru perioda od oko 10 dana do oko 15 dana.
[0029] Koraci (a) do (f) mogu, svaki, da se izvedu u roku od 22 dana ili manje.
[0030] Koraci (a) do (f) mogu, svaki, da se izvedu u roku od 20 dana ili manje.
[0031] Koraci (a) do (f) mogu, svaki, da se izveduu u roku od 15 dana ili manje.
[0032] Koraci (a) do (f) mogu, svaki, da se izvedu u roku od 10 dana ili manje.
[0033] Koraci (a) do (f) i krioprezervacija mogu, svaki, da se izvedu u roku od 22 dana ili manje.
[0034] Terapijska populacija TIL sakupljenih u koraku (e) može sadržati dovoljno TIL za terapijski efikasnu dozu TIL.
[0035] Broj TIL dovoljan za terapijski efikasnu dozu iznosi od oko 2.3 ×10<10>do oko 13.7 ×10<10>.
[0036] Koraci (b) do (e) mogu da se izvedu u jednom kontejneru, pri čemu izvođenje koraka (b) do (e) u jednom kontejneru rezultuje većim prinosom TIL po resektovanom tumoru u poređenju sa izvođenjem koraka (b) do (e) u više nego jednom kontejneru.
[0037] Antigen-prezentujuće ćelije mogu se dodati TIL tokom drugog perioda u koraku (d) bez otvaranja sistema.
[0038] Treća populacija TIL u koraku (d) može obezbediti povećanu efikasnost, povećanu proizvodnju interferona-gama, povećanu poliklonalnost, povećan prosečni IP-10, i/ili povećan prosečni MCP-1, kada se primeni kod subjekta.
[0039] Treća populacija TIL u koraku (d) može obezbediti najmanje upetostručenu ili veću proizvodnju interferona-gama, kada se primeni kod subjekta.
[0040] Treća populacija TIL u koraku (d) može biti terapijska populacija TIL koja uključuje povećanu potpopulaciju efektorskih T ćelija i/ili centralnih memorijskih T ćelija u odnosu na drugu populaciju TIL, pri čemu efektorske T ćelije i/ili centralne memorijske T ćelije u terapijskoj populaciji TIL ispoljavaju jednu ili više karakteristika odabranih iz grupe koja se sastoji od eksprimiranja CD27+, eksprimiranja CD28+, dužih telomera, povećane ekspresije CD57, i smanjene ekspresije CD56 u odnosu na efektorske T ćelije, i/ili centralne memorijske T ćelije dobijene iz druge populacije ćelija.
[0041] Efektorske T ćelije i/ili centralne memorijske T ćelije dobijene iz treće populacije TIL mogu ispoljiti povećanu ekspresiju CD57 i smanjenu ekspresiju CD56 u odnosu na efektorske T ćelije, i/ili centralne memorijske T ćelije dobijene iz druge populacije ćelija.
[0042] Rizik za kontaminaciju mikrobima može se smanjiti u poređenju sa otvorenim sistemom.
[0043] TIL iz koraka (g) mogu biti namenjeni za davanje pacijentu infuzijom.
[0044] Veći broj fragmenata može obuhvatiti oko 4 fragmenta.
[0045] U ovom tekstu je objavljen, ali ne i zahtevan postupak lečenja subjekta koji ima kancer, postupak koji podrazumeva primenu ekspandiranih tumor-infiltrirajućih limfocita (TIL) uključuje:
(a) dobijanje prve populacije TIL iz tumora dobijenog od subjekta resekcijom, obrađivanjem uzorka tumora dobijenog od pacijenta u više tumorskih fragmenata; (b) dodavanje tumorskih fragmenata zatvorenom sistemu;
(c) izvođenje prve ekspanzije kultivisanjem prve populacije TIL u medijumu za ćelijsku kulturu, koji sadrži IL-2 da bi se proizvela druga populacija TIL, pri čemu se prva ekspanzija izvodi u zatvorenom kontejneru koji obezbeđuje prvu površinu permeabilnu za gas, pri čemu se prva ekspanzija izvodi tokom oko 3-14 dana da bi se dobila druga populacija TIL, pri čemu je druga populacija TIL najmanje 50 puta brojnija od prve populacije TIL, i pri čemu se prelaz iz koraka (b) u korak (c) dešava bez otvaranja sistema;
(d) izvođenje druge ekspanzije suplementacijom medijuma za kulturu ćelija druge populacije TIL dodatnim IL-2, OKT-3, i antigen-prezentujućim ćelijama (APC), da bi se proizvela treća populacija TIL, pri čemu se druga ekspanzija izvodi tokom oko 7-14 dana, da bi se dobila treća populacija TIL, pri čemu je treća populacija TIL terapijska populacija TIL, pri čemu se druga ekspanzija izvodi u zatvorenom kontejneru koji obezbeđuje drugu površinu permeabilnu za gas, i pri čemu se prelaz iz koraka (c) u korak (d) dešava bez otvaranja sistema;
(e) sakupljanje terapijske populacije TIL dobijene iz koraka (d), pri čemu se prelaz iz koraka (d) u korak (e) dešava bez otvaranja sistema; i
(f) prenošenje sakupljene TIL populacije iz koraka (e) u infuzionu kesu, pri čemu se prelaz iz koraka (e) u (f) dešava bez otvaranja sistema.
(g) opcionu krioprezervaciju infuzione kese koja sadrži sakupljenu populaciju TIL iz koraka (f) korišćenjem procesa krioprezervacije; i
(h) primenu terapijski efikasne doze treće populacije TIL iz infuzione kese u koraku (g) kod pacijenta.
[0046] Terapijska populacija TIL sakupljenih u koraku (e) može sadržati dovoljno TIL za primenu terapijski efikasne doze TIL u koraku (h).
[0047] Broj TIL dovoljan za primenu terapijski efikasne doze u koraku (h) može biti od oko 2.3 ×10<10>do oko 13.7 ×10<10>.
[0048] Antigen-prezentujuće ćelije (APC) mogu biti PBMC.
[0049] PBMC se mogu dodati u ćelijsku kulturu bilo kojeg od dana 9 do14 u koraku (d).
[0050] Pre primene terapijski efikasne doze TIL ćelija u koraku (h), kod pacijenta se može primeniti režim nemijeloablativne limfodeplecije.
[0051] Režim nemijeloablativne limfodeplecije može uključivati korake primene ciklofosfamida u dozi od 60 mg/m2/dan tokom dva dana, što je praćeno primenom fludarabina u dozi od 25 mg/m2/dana tokom pet dana.
[0052] Postupak može uključivati još i korak tretiranja pacijenta režimom visoke doze IL-2 koji počinje dan posle primene TIL ćelija kod pacijenta u koraku (h).
[0053] Režim visoke doze IL-2 može uključivati 600,000 ili 720,000 IU/kg primenjenih u vidu 15-minutne bolusne intravenske infuzije svakih osam sati do postizanja tolerancije.
[0054] Treća populacija TIL u koraku (d) može biti terapijska populacija TIL koja uključuje povećanu potpopulaciju efektorskih T ćelija i/ili centralnih memorijskih T ćelija u odnosu na drugu populaciju TIL, pri čemu efektorske T ćelije i/ili centralne memorijske T ćelije u terapijskoj populaciji TIL ispoljavaju jednu ili više karakteristika odabranih iz grupe koja se sastoji od eksprimiranja CD27+, eksprimiranja CD28+, dužih telomera, povećane ekspresije CD57, i smanjene ekspresije CD56 u odnosu na efektorske T ćelije, i/ili centralne memorijske T ćelije dobijene iz druge populacije ćelija.
[0055] Efektorske T ćelije i/ili centralne memorijske T ćelije u terapijskoj populaciji TIL mogu ispoljiti povećanu ekspresiju CD57 i smanjenu ekspresiju CD56 u odnosu na efektorske T ćelije, i/ili centralne memorijske T ćelije dobijene iz druge populacije ćelija.
[0056] Kancer može da se bira iz grupe koju čine melanom, kancer ovarijuma, kancer cerviksa, nesitnoćelijski kancer pluća (nonsmall-cell lung cancer, NSCLC), kancer pluća, kancer mokraćne bešike, kancer dojke, kancer izazvan humanim papiloma virusom, kancer glave i vrata (uključujući karcinom skvamoznih ćelija glave i vrata (head and neck squamous cell carcinoma, HNSCC)), kancer bubrega, i karcinom ćelija bubrega.
[0057] Kancer može da se bira iz grupe koju čine melanom, HNSCC, kancer cerviksa i NSCLC.
[0058] Kancer može biti melanom.
[0059] Kancer može biti HNSCC.
[0060] Kancer može biti kancer cerviksa.
[0061] Kancer može biti NSCLC.
[0062] Predmetni pronalazak obezbeđuje postupke ekspandiranja tumor-infiltrirajućih limfocita (TIL) u terapijsku populaciju TIL, koji uključuje:
(a) dodavanje obrađenih fragmenata tumora dobijenih resekcijom tumora kod pacijenta, u zatvoreni sistem da se dobije prva populacija TIL;
(b) izvođenje prve ekspanzije kultivisanjem prve populacije TIL u medijumu za kulturu ćelija, koji sadrži IL-2 da bi se proizvela druga populacija TIL, pri čemu se prva ekspanzija izvodi u zatvorenom kontejneru koji obezbeđuje prvu površinu permeabilnu za gas, pri čemu se prva ekspanzija izvodi tokom oko 3-11 dana da bi se dobila druga populacija TIL, pri čemu je druga populacija TIL najmanje 50 puta brojnija od prve populacije TIL, i pri čemu se prelaz iz koraka (a) u korak (b) dešava bez otvaranja sistema;
(c) izvođenje druge ekspanzije suplementacijom medijuma za kulturu ćelija druge populacije TIL dodatnim IL-2, OKT-3, i antigen-prezentujućim ćelijama (APC), da bi se proizvela treća populacija TIL, pri čemu se druga ekspanzija izvodi tokom oko 7-11 dana da bi se dobila treća populacija TIL, pri čemu je treća populacija TIL terapijska populacija TIL, pri čemu se druga ekspanzija izvodi u zatvorenom kontejneru koji obezbeđuje drugu površinu permeabilnu za gas, i pri čemu se prelaz iz koraka (b) u korak (c) dešava bez otvaranja sistema;
(d) sakupljanje terapijske populacije TIL dobijene iz koraka (c), pri čemu se prelaz iz koraka (c) u korak (d) dešava bez otvaranja sistema;
(e) prenošenje sakupljene populacije TIL dobijene iz koraka (d) u infuzionu kesu, pri čemu se prelaz iz koraka (d) u korak (e) dešava bez otvaranja sistema; i
(f) krioprezervacija infuzione kese koja sadrži sakupljenu populaciju TIL korišćenjem procesa krioprezervacije
[0063] U nekim primerima izvođenja, terapijska populacija TIL sakupljenih u koraku (d) uključuje dovoljno TIL za terapijski efikasnu dozu TIL.
[0064] U nekim primerima izvođenja, broj TIL dovoljan za terapijski efikasnu dozu iznosi od oko 2.3 ×10<10>do oko 13.7 ×10<10>.
[0065] U nekim primerima izvođenja, proces krioprezervacije obavlja se korišćenjem sakupljene populacije TIL i medijuma za krioprezervaciju u odnosu 1:1.
[0066] U nekim primerima izvođenja, antigen-prezentujuće ćelije su mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC).
[0067] U nekim primerima izvođenja, PBMC su ozračene i alogene.
[0068] U nekim primerima izvođenja, antigen-prezentujuće ćelije su veštačke antigenprezentujuće ćelije.
[0069] U nekim primerima izvođenja, sakupljanje u koraku (d) obavlja se korišćenjem LOVO sistema za obradu ćelija.
[0070] U nekim primerima izvođenja, veći broj fragmenata obuhvata oko 4 do oko 50 fragmenata, pri čemu svaki fragment ima zapreminu od oko 27 mm<3>.
[0071] U nekim primerima izvođenja, veći broj fragmenata obuhvata oko 30 do oko 60 fragmenata sa ukupnom zapreminom od oko 1300 mm3 do oko 1500 mm3.
[0072] U nekim primerima izvođenja, veći broj fragmenata obuhvata oko 50 fragmenata sa ukupnom zapreminom od oko 1350 mm3.
[0073] U nekim primerima izvođenja, veći broj fragmenata obuhvata oko 50 fragmenata sa ukupnom masom od oko 1 grama do oko 1.5 grama.
[0074] U nekim primerima izvođenja, veći broj fragmenata obuhvata oko 4 fragmenta.
[0075] U nekim primerima izvođenja, drugi medijum za kulturu ćelija obezbeđen je u kontejneru odabranom iz grupe koju čine G-kontejner i Xuri kese za ćelije.
[0076] U nekim primerima izvođenja, kesa za infuziju u koraku (e) je infuziona kesa koja sadrži HypoThermosol.
[0077] U nekim primerima izvođenja, prvi period u koraku (b) i drugi period u koraku (c) se, svaki pojedinačno, obavljaju u okviru perioda od 10 dana ili 11 dana. Isto tako objavljen je, ali ne i zahtevan, postupak u kojem se prvi period u koraku (b) i drugi period u koraku (c) svaki pojedinačno, izvode u okviru perioda od 12 dana.
[0078] U nekim primerima izvođenja, prvi period u koraku (b) i drugi period u koraku (c) se, svaki pojedinačno, izvode u okviru perioda od 11 dana.
[0079] U nekim primerima izvođenja, koraci (a) do (e) se izvode u okviru perioda od oko 10 dana do oko 22 dana.
[0080] U nekim primerima izvođenja, koraci (a) do (e) izvode se u okviru perioda od oko 10 dana do oko 20 dana.
[0081] U nekim primerima izvođenja, koraci (a) do (e) izvode se u okviru perioda od oko 10 dana do oko 15 dana.
[0082] U nekim primerima izvođenja, koraci (a) do (e) izvode se u 22 dana ili manje.
[0083] U nekim primerima izvođenja, koraci (a) do (e) i krioprezervacija izvode se u 22 dana ili manje.
[0084] U nekim primerima izvođenja, koraci (b) do (e) izvode se u jednom kontejneru, pri čemu izvođenje koraka (b) do (e) u jednom kontejneru rezultuje povećanjem prinosa TIL po resektovanom tumoru u poređenju sa izvođenjem koraka (b) do (e) u više od jednog kontejnera.
[0085] U nekim primerima izvođenja, antigen-prezentujuće ćelije se dodaju u TIL tokom drugog perioda u koraku (c) bez otvaranja sistema.
[0086] U nekim primerima izvođenja, treća populacija TIL u koraku (d) je terapijska populacija TIL koja uključuje povećanu potpopulaciju efektorskih T ćelija i/ili centralnih memorijskih T ćelija u odnosu na drugu populaciju TIL, pri čemu efektorske T ćelije i/ili centralne memorijske T ćelije dobijene u terapijskoj populaciji TIL ispoljavaju jednu ili više karakteristika odabranih iz grupe koju čine eksprimiranje CD27+, eksprimiranje CD28+, duže telomere, povećana ekspresija CD57, i smanjena ekspresija CD56 u odnosu na efektorske T ćelije, i/ili centralne memorijske T ćelije dobijene iz druge populacije ćelija.
[0087] U nekim primerima izvođenja, efektorske T ćelije i/ili centralne memorijske T ćelije dobijene u terapijskoj populaciji TIL ispoljavaju povećanu ekspresiju CD57 i smanjenu ekspresiju CD56 u odnosu na efektorske T ćelije, i/ili centralne memorijske T ćelije dobijene iz druge populacije ćelija.
[0088] U nekim primerima izvođenja, rizik za kontaminaciju mikrobima smanjen je u poređenju sa otvorenim sistemom.
1
[0089] U nekim primerima izvođenja, TIL iz koraka (e) namenjeni su za davanje pacijentu infuzijom.
[0090] U nekim primerima izvođenja, zatvoreni kontejner uključuje jedan bioreaktor.
[0091] U nekim primerima izvođenja, zatvoreni kontejner uključuje G-REX-10.
[0092] U nekim primerima izvođenja, zatvoreni kontejner uključuje G-REX -100.
[0093] U nekim primerima izvođenja, u koraku (d) antigen-prezentujuće ćelije (APC) dodaju se ćelijskoj kulturi druge populacije TIL u odnosu APC:TIL od 25:1 do 100:1.
[0094] U nekim primerima izvođenja, ćelijska kultura ima odnos 2.5 ×10<9>APC prema 100 ×10<6>TIL.
[0095] U nekim primerima izvođenja, u koraku (c) ćelijskoj kulturi se dodaju druge populacije TIL u odnosu APC:TIL od 25:1 do 100:1.
[0096] U nekim primerima izvođenja, u ćelijskoj kulturi odnos APC i TIL je 2.5 ×10<9>APC prema 100 ×10<6>TIL.
[0097] Isto tako, u ovom tekstu objavljena je, ali ne i zahtevana populacija ekspandiranih TIL za upotrebu u lečenju subjekta sa kancerom, pri čemu je populacija ekspandiranih TIL treća populacija TIL koja se može dobiti postupkom koji uključuje:
(a) dobijanje prve populacije TIL iz tumora dobijenog od subjekta resekcijom, obrađivanjem uzorka tumora dobijenog od pacijenta u više tumorskih fragmenata; (b) dodavanje tumorskih fragmenata zatvorenom sistemu;
(c) izvođenje prve ekspanzije kultivisanjem prve populacije TIL u medijumu za ćelijsku kulturu koji sadrži IL-2 da bi se proizvela druga populacija TIL, pri čemu se prva ekspanzija izvodi u zatvorenom kontejneru koji obezbeđuje prvu površinu permeabilnu za gas, pri čemu se prva ekspanzija izvodi tokom oko 3-14 dana da bi se dobila druga populacija TIL, pri čemu je druga populacija TIL najmanje 50 puta brojnija od prve populacije TIL, i pri čemu se prelaz iz koraka (b) u korak (c) dešava bez otvaranja sistema;
(d) izvođenje druge ekspanzije suplementacijom medijuma za kulturu ćelija druge populacije TIL dodatnim IL-2, OKT-3, i antigen-prezentujućim ćelijama (APC), da bi se proizvela treća populacija TIL, pri čemu se druga ekspanzija izvodi tokom oko 7-14 dana da bi se dobila treća populacija TIL, pri čemu je treća populacija TIL terapijska populacija TIL, pri čemu se druga ekspanzija izvodi u zatvorenom kontejneru koji obezbeđuje drugu površinu permeabilnu za gas, i pri čemu se prelaz iz koraka (c) u korak (d) dešava bez otvaranja sistema;
(e) sakupljanje terapijske populacije TIL dobijene iz koraka (d), pri čemu se prelaz iz koraka (d) u korak (e) dešava bez otvaranja sistema; i
(f) prenošenje sakupljene TIL populacije iz koraka (e) u infuzionu kesu, pri čemu se prelaz iz koraka (e) u (f) dešava bez otvaranja sistema; i
(g) opcionu krioprezervaciju infuzione kesice koja sadrži sakupljenu populaciju TIL iz koraka (f) korišćenjem procesa krioprezervacije.
[0098] U nekim primerima izvođenja, populacija TIL namenjena je za korišćenje u lečenju subjekta sa kancerom prema postupcima opisanim gore i u ovom tekstu, pri čemu postupak uključuje još i jednu ili više odlika navedenih gore i u ovom tekstu.
KRATAK OPIS CRTEŽA
[0099]
Slika 1: Prikazuje dijagram primera izvođenja procesa 2A, 22-dnevnog procesa za proizvodnju TIL.
Slika 2: Prikazuje poređenje između procesa 1C i primera izvođenja procesa 2A za proizvodnju TIL.
Slika 3: Prikazuje vremenski tok procesa 1C.
Slika 4: Prikazuje proces primera izvođenja TIL terapije korišćenjem procesa 2A za proizvodnju TIL, koji uključuje primenu koraka koterapije, za veći broj ćelija.
Slika 5: Prikazuje proces primera izvođenja TIL terapije korišćenjem procesa 2A za proizvodnju TIL, koji uključuje primenu koraka koterapije, za manji broj ćelija.
Slika 6: Prikazuje detaljnu šemu primera izvođenja procesa 2A.
Slika 7: Prikazuje karakterizaciju TIL pripremljenih korišćenjem primera izvođenja procesa 2A upoređivanjem ekspresije interferona gama (IFN-γ) kod svežih TIL i odmrznutih TIL.
Slika 8: Prikazuje karakterizaciju TIL pripremljenih korišćenjem primera izvođenja procesa 2A ispitivanjem ekspresije CD3 u svežim TIL u poređenju sa odmrznutim TIL.
Slika 9: Prikazuje karakterizaciju TIL pripremljenih korišćenjem primera izvođenja procesa 2A ispitivanjem oporavka u svežim TIL u poređenju sa odmrznutim TIL.
Slika 10: Prikazuje karakterizaciju TIL pripremljenih korišćenjem primera izvođenja procesa 2A ispitivanjem vijabilnosti svežih TIL u poređenju sa odmrznutim TIL.
Slika 11: Prikazuje glavne korake primera izvođenja procesa 2A uključujući korake krioprezervacije.
Slika 12: Prikazuje podatke o broju ćelija dobijenih iz procesa 1C i primera izvođenja
Slika 13: Prikazuje procenat vijabilnosti ćelija dobijenih iz procesa 1C i primera izvođenja procesa 2A.
Slika 14: Prikazuje procente CD45 i CD3 ćelija (tj., T ćelija) posle merenja protočnom citometrijom za TIL dobijene procesom 1C i primerom izvođenja procesa 2A.
Slika 15: Prikazuje podatke o oslobađanju IFN-γ dobijene za proces 1C i primer izvođenja procesa 2A, posle merenja testom različitim od onog koji je upotrebljen za dobijanje podataka na Slikama 80 i 98.
Slika 16: Prikazuje podatke o oslobađanju IFN-γ dobijene za proces 1C i primer izvođenja procesa 2A, posle merenja testom različitim od onog koji je upotrebljen za dobijanje podataka na Slikama 80 i 98.
Slika 17: Prikazuje procente TCR a/b i NK ćelija dobijenih iz procesa 1C i primera izvođenja procesa 2A.
Slika 18: Prikazuje procente CD8+ i CD4+ ćelija posle merenja protočnom citometrijom za TIL dobijene procesom 1C i primerom izvođenja procesa 2A, kao i odnos između podgrupa.
Slika 19: Prikazuje procente memorijskih podgrupa posle merenja protočnom citometrijom za TIL dobijene iz procesa 1C i primera izvođenja procesa 2A.
Slika 20: Prikazuje procente ekspresije PD-1, LAG-3, i TIM-3, prema protočnoj citometriji, za TIL dobijene iz procesa 1C i primera izvođenja procesa 2A.
1
Slika 21: Prikazuje procente ekspresije 4-1BB, CD69, i KLRG1, prema protočnoj citometriji, za TIL dobijene iz procesa 1C i primera izvođenja procesa 2A.
Slika 22: Prikazuje procente ekspresije TIGIT, prema protočnoj citometriji, za TIL dobijene iz procesa 1C i primera izvođenja procesa 2A.
Slika 23: Prikazuje procente ekspresije CD27 i CD28, prema protočnoj citometriji, za TIL dobijene iz procesa 1C i primera izvođenja procesa 2A.
Slika 24: Prikazuje rezultate analize protočnom citometrijom u kombinaciji sa FISH (flow-FISH) za dužinu telomera.
Slika 25: Prikazuje rezultate flow-FISH analize za dužinu telomera (posle uklanjanja tačaka koje previše odstupaju od prosečne vrednosti).
Slika 26: Prikazuje dizajn kliničke studije koja uključuje kohorte tretirane proizvodom procesa 1C i primera izvođenja procesa 2A.
Slika 27: Karta primera procesa 2A daje pregled koraka A do F.
Slika 28: Protočni dijagram Procesa 2A.
Slika 29: Procesni protočni dijagram plana sakupljanja podataka za Proces 2A
Slika 30: Vijabilnost svežih u poređenju sa odmrznutim TIL
Slika 31: Ekspanzija svežih i odmrznutih TIL u re-REP kulturi
Slika 32: Normalne laboratorijske vrednosti krvnih metabolita.
Slika 33: Analiza metabolita pre-REP TIL iz procesa 2A.
Slika 34: Kvantifikacija IL-2 u ćelijskoj kulturi pre-REP TIL u procesu 2A.
Slika 35: Oslobađanje citotoksičnog citokina IFN-γ posle stimulacije TIL pomoću anti-CD3, anti-CD28 i anti-4-1BB.
Slika 36: Oslobađanje granzima B posle stimulacije TIL pomoću anti-CD3, anti-CD28, i anti-4-1BB.
Slika 37: TCR αβ+ TIL. Većina humanih CD3+ T-ćelija eksprimira receptore formirane od α i β lanaca, koji prepoznaju antigene na MHC-restriktivan način. A) Osim u M1061, sveži i odmrznuti TIL proizvod sadrži 80% ili više TIL koji eksprimiraju TCR αβ+. Sveži i odmrznuti TIL imaju uporedivu ekspresiju TCR αβ (pvrednost - 0.9582). Iako je posle Re-REP zapaženo smanjenje TCR αβ+-eksprimirajućih TIL, ovo smanjenje nije značajno u okviru Re-REP TIL (p = 0.24). B) Postoji smanjenje od 9.2% i 15.7% svežih i odmrznutih RE-REP TIL koji eksprimiraju TCR αβ u poređenju sa svežim, odnosno odmrznutim TIL.
Slika 38: TCRαβ-CD56+. Tumor-infiltrirajuće ćelije-prirodne ubice (natural killer, NK) i NKT-ćelije takođe imaju sposobnost da liziraju ćelije koje ne eksprimiraju MHC kao i CD1-prezentovani lipidni antigen i da obezbede imunoregulatorne citokine. Međutim, intenzivna infiltracija NK ćelija udružena je sa uznapredovalim oboljenjem i može da olakša razvoj kancera. Slika A prikazuje da u svim slučajevima, osim u M1063, postoji umereno, mada ne i značajno, smanjenje populacije NK u odmrznutim TIL u poređenju sa svežim TIL, (p = 0.27). Nije zapažena značajna razlika između re-REP TIL populacija (p = 0.88). Sveži TIL, sveži re-REP TIL, i odmrznuti re-REP TIL pokazuju sličnu ekspresiju CD56, kako je pokazano na Slici B. Odmrznuti TIL proizvod ima manje (1.9 ± 1.3) NK-eksprimirajućih ćelija nego sveži TIL (3.0 ± 2.2), što je moguće rezultat procedure kriozamrzavanja.
Slika 39: CD4+ ćelije. Nije zapažena značajna razlika u CD4 populaciji u pojedinačnim stanjima. Slika A predstavlja prosečnu CD4 populaciju za svaki od slučajeva. Tabela na Slici B prikazuje SD i SEM vrednosti. Postoji blago smanjenje populacije CD4 u svežoj re-REP populaciji, što je uglavnom posledica smanjenja CD4 u svežoj re-REP populaciji u EP11001T.
Slika 40: CD8+ ćelije. A) Svuda, osim EP11001T, sveži i odmrznuti TIL pokazali su uporedive CD8+ populacije (p=0.10, bez statističke značajnosti). U većini eksperimenata, postoji blago sniženje CD8+-eksprimirajućih TIL u svežem re-REP TIL proizvodu (izuzeci su bili M1061T i M1065T). Postojalo je smanjenje od približno 10-30% CD8+ populacije u odmrznutim re-REP TIL. Upoređivanje re-REP TIL iz svežih i odmrznutih TIL pokazalo je značajnu razliku (p = 0.03, Studentov ttest). Slika B prikazuje srednje vrednosti CD8+-eksprimirajućih TIL u svim uslovima. Sveži i odmrznuti TIL pokazuju slične rezultate. Međutim, postojalo je smanjenje od
1
10.8% CD8+ populacije u odmrznutom re-REP TIL proizvodu u poređenju sa svežim re-REP TIL.
Slika 41: CD4+CD154+ ćelije. CD154, poznat i kao CD40L, marker je aktiviranih T-ćelija. Slika A: Nije zapažena bitna razlika u CD4+CD154+ populaciji u različitim uslovima, međutim, bilo je zapaženo smanjenje od 34.1% za EP11001T sveže re-REP CD4+ TIL. Ekspresija CD154 nije merena u M1061T i M1062T jer su ovi eksperimenti izvedeni pre nego što je postavljen prošireni fenotipski panel. Slika B: Blago smanjenje u slučaju odmrznutih TIL moglo bi se pripisati CD154 koji nije meren u M1061T i M1062T. Svi uslovi pokazuju veoma uporedivu ekspresiju CD154 u populaciji CD4 što ukazuje na aktivirane CD4+ T ćelije.
Slika 42A-42B: CD8+CD154+ ćelije. Analiziran je i aktivacioni marker CD154 eksprimiran na CD8+ TIL. A) Ukupno, ekspresija CD154 bila je niža u populaciji CD8+ u svežem i odmrznutom TIL proizvodu. Ovo nije iznenađenje pošto se CD154 eksprimira uglavnom u aktiviranim CD4+ T ćelijama. Kada je ekspresija CD154 merena u svežem i odmrznutom TIL proizvodu, ili nije zapažena razlika ili je zapažen porast ekspresije CD154 u odmrznutim TIL proizvodima. Studentov t-test pokazao je da nije bilo značajne razlike između dva uslova. Porast ekspresije CD154 u odmrznutim re-REP u poređenju sa svežim re-REP bio je pokazan u svim eksperimentima (p = 0.02). B) Porast ekspresije CD154 zapažen je i u odmrznutim TIL i u odmrznutim re-REP TIL proizvodima u poređenju sa njihovim parnjacima. Odmrznuti re-REP TIL pokazali su porast od 29.1% ekspresije CD154 u poređenju sa svežim re-REP TIL.
Slika 43A-43B: CD4+CD69+ ćelije. CD69 je rani marker aktivacije T ćelija posle stimulacije ili aktivacije. A) U svim TIL izuzev EP11001T, i sveži i odmrznuti re-REP pokazali su umereni porast ekspresije CD69, verovatno zbog dužine re-REP (7 dana umesto 11 dana). Nije zapažena razlika između svežih i odmrznutih TIL (p = 0.89). Razlika između svežih i odmrznutih re-REP takođe nije bila zapažena (p = 0.82). B) Mali porast ekspresije CD69 zapažen je u re-REP TIL proizvodima. (Napomena: Nije vršeno bojenje CD69 ni za M1061T ni za M1062T odmrznuti TIL proizvod. Ekspresija CD69 M1061T svežeg TIL proizvoda bila je 33.9%).
1
Slika 44A-44B: CD8+CD69+ ćelije. Kako je zapaženo za CD4+ populaciju, Slika A prikazuje porast ekspresije CD69 u CD8+ re-REP TIL. Nije pokazana značajna razlika u ekspresiji CD69 između svežih i odmrznutih TIL (p = 0.68) ili svežih i odmrznutih re-REP TIL (p = 0.76). Slika B podržava zapažanje da postoji umereni porast ekspresije CD69 u re-REP TIL proizvodu.
Slika 45A-45B: CD4+CD137+ ćelije. CD137 (4-11313) je T-ćelijski kostimulatorni receptor koji se indukuje posle aktivacije TCR. On je aktiviran na CD4+ i CD8+ T ćelijama. A) Pokazan je upadljiv porast ekspresije CD137 kod populacije re-REP TIL posle 7 dana stimulacije. Međutim, nije zapažena razlika između svežih i odmrznutih TIL ili svežih i odmrznutih re-REP TIL (p < 0.05 u oba slučaja, Slika B podržava ovo zapažanje). Isto tako, odmrznuti TIL pokazali su umereno smanjenje ekspresije CD137. Porast ekspresije CD137 u re-REP TIL mogao bi da se pripiše drugom ciklusu stimulacije 7-dnevnog re-REP.
Slika 46A-46B: CD8+CD137+ ćelije. A) CD8+ populacija pokazala je ukupan porast re-REP proizvoda. B) Sveži re-REP proizvod imao je 33.4% porasta ekspresije CD8+CD137+ u poređenju sa svežim TIL proizvodom. Odmrznuti re-REP proizvod takođe je imao 33.15% porasta ekspresije CD137 u populaciji CD8+ u poređenju sa odmrznutim TIL. Nije bila zapažena značajna razlika između svežih i odmrznutih re-REP TIL. Slično se može videti upoređivanjem svežeg TIL i odmrznutog TIL proizvoda. Porast ekspresije CD137 može biti posledica drugog ciklusa aktivacije re-REP. (Napominje se da je samo 6 TIL upotrebljeno za analizu jer ekspresija CD137 nije merena u 3 eksperimenta.)
Slika 47A-47B: CD4+CM ćelije. Centralna memorijska (central memory, CM) populacija definiše se prema ekspresiji CD45RA- (negativna) i CCR7+ (pozitivna). A) Zapažen je porast CM populacije u re-REP uslovima. M1063T i M1064T pokazali su smanjenje ekspresije CM u CD4+ populaciji dobijenoj iz odmrznutih TIL u poređenju sa svežim TIL proizvodom. Sveži i odmrznuti TIL proizvod (p = 0.1658) i sveži i odmrznuti re-REP TIL (p = 0.5535) ne pokazuju značajnu razliku u CM populaciji. B) Porast od 14.4% i 15.4% u populaciji CM zapažen je u svežim i odmrznutim re-REP TIL u poređenju sa svežim i odmrznutim TIL, respektivno.
1
Slika 48A-48B: CD8+CM ćelije. A) U CD8+ populaciji, vidi se dramatičan porast ekspresije CM u svežem TIL proizvodu, što nije zapaženo u TIL proizvodu. Ovaj porast nije uticao na značajnost (p = 0.3086), što je sugerisalo odsustvo različitosti između svežih i odmrznutih TIL. Sličan trend viđen je i u re-REP TIL proizvodima. Slika 48B) Zapažen je ukupan porast CM populacije u svežim TIL u poređenju sa odmrznutim TIL. Brojevi pokazuju da je razlika između svežih TIL i re-REP TIL bila samo -2%; sveži TIL pokazali su veoma visoku standardnu devijaciju koja bi se mogla pripisati M1064T; isključivanje CM eskpresije u M1064T, rezultovalo je veoma sličnom ekspresijom CM kod svežeg i odmrznutog TIL proizvoda (nije prikazano).
Slika 49A-49B: CD4+EM ćelije. Efektorska memorijska (effector memory, EM) populacija definiše se odsustvom ekspresije CCR7 i CD45RA. A) Kao što je očekivano CD4+ populacija iz svežih i odmrznutih TIL imala je viši nivo efektorskog memorijskog fenotipa. Uočeno je drastično smanjenje efektorskih memorijskih ćelija u M1056T re-REP TIL populaciji. Isto tako, u 5 drugih eksperimenata pokazano je smanjenje efektorskog memorijskog fenotipa i u svežim i u odmrznutim re-REP TIL. B) I sveži i odmrznuti TIL pokazali su sličnu ekspresiju efektorskog memorijskog fenotipa. Poređenje svežih i svežih Re-REP TIL pokazalo je smanjenje od 16% u ovom drugom. Slično smanjenje zapaženo je u odmrznutim Re-REP TIL (9%) u poređenju sa odmrznutim TIL.
Slika 50A-50B: CD8+EM ćelije. A) Sličan obrazac porasta efektorskih memorijskih ćelija u svežim TIL zapažen je i u CD8+ populaciji. Izuzetak je zapažen u M1064T u kojima su samo sveži TIL imali profil efektorskih memorijskih ćelija od 20%; ovo je zato što je 73% tih TIL imalo CM fenotip, kako je opisano u A i B. Svi uzorci koji su pokazali smanjenje efektorske memorijske populacije među CD4+ TIL iz re-REP proizvoda pratili su isti trend u CD8+TIL. B) Za razliku od CD4+ TIL populacije, CD8+ TIL pokazali su sličan efektorski memorijski fenotip u svežim, odmrznutim i re-REP proizvodima. (Zapaziti visoku standardnu devijaciju u svežim i odmrznutim TIL, što je rezultat niske efektorske memorijske populacije u svežim M1064T TIL uzorcima, i odsustva ekspresije u odmrznutim M1061T TIL uzorcima.)
Slika 51A-51B: CD4+CD28+ ćelije. Ekspresija CD28 korelira sa mladim TIL, smanjujući se sa starenjem. A) Iako je zapažen porast CM populacije u re-REP TIL, smanjenje ekspresije CD28 viđeno je kao trend što sugeriše da sam CM-status ne
1
može da odredi sudbinu TIL. Smanjenje ekspresije CD28 bilo je zapaženo u -re-REP proizvodu, osim za M1061T CD4+ TIL. B) Smanjenje od 8.89% u svežim i 5.71% u odmrznutim TIL viđeno je u poređenju sa odmrznutim TIL proizvodom, respektivno.
Slika 52A-52B: CD8+CD28+ ćelije. A) Ekspresija CD28 u CD8+ TIL populaciji bila je viša u svežem i odmrznutom TIL nego u re-REP proizvodu. U većini slučajeva, odmrznuti re-REP TIL pokazali su drastično smanjenje u poređenju sa odmrznutim TIL i svežim re-REP TIL. Međutim, Studentov t-test nije pokazao značajnu razliku između svežih i odmrznutih TIL (p = 0.3668), kao ni između svežih i odmrznutih re-REP proizvoda (p - =0.7940). B) Kako je viđeno u CD4+ TIL populaciji, postojalo je smanjenje CD8+CD28+ populacije u svežim re-REP (21.5%) i odmrznutim re-REP (18.2%) u poređenju sa njihovim parnjacima koji nisu restimulisani.
Slika 53A-53B: CD4+PD-1+ ćelije. Ekspresija PD-1 u TIL korelisana je sa antigenreaktivnim i iscrpljenim T ćelijama. Prema tome, nije bilo iznenađujuće što je iscrpljnei fenotip zapažen u TIL koji su podvrgnuti REP u trajanju od 11 dana. A) Ovaj iscrpljeni fenotip održavao se ili se povećavao (specifično, EP11001T i M1056T) u odmrznutom TIL proizvodu. Nije uočena značajna razlika između svežeg i odmrznutog TIL proizvoda (p = 0.9809). Sličan trend pokazan je kod svežih u poređenju sa odmrznutim re-REP TIL (p = 0.0912). B) Sveži re-REP pokazali su umereno smanjenje ekspresije PD-1 u CD4+ TIL populaciji. Svi drugi uslovi održali su uporedivi obrazac ekspresije PD-1. Smanjenje ili izostanak promene ekspresije PD-1 zapaženo je u svežem re-REP proizvodu u poređenju sa svim drugim uslovima. Porast ekspresije PD-1 uočen je u M1062T, M1063T (CD4+) i EP11001T (CD8+) u odmrznutom re-REP proizvodu. Svaki drugi odmrznuti re-REP proizvod pokazuje rezultate uporedive sa odmrznutim proizvodom.
Slika 54A-54B: CD8+PD-1+ ćelije. A) CD8+ populacija iz svežeg TIL proizvoda pokazuje iscrpljeniji fenotip udružen sa povećanom ekspresijom PD-1. Izuzetak je zapažen u EP11001T gde su CD8+ odmrznutog TIL proizvoda imali umereni porast ekspresije PD-1 u poređenju sa svežim TIL proizvodom. Postoji mala, ne i značajna razlika u ekspresiji PD-1 u svežim TIL u poređenju sa odmrznutim TIL (p = 0.3144). B) Sveži TIL proizvod pokazao je blagi porast, ali bez značajnosti, ekspresije PD-1 u poređenju sa odmrznutim TIL (6.74%, ili 1.2 puta više nego kod odmrznutih TIL) što sugeriše da je odmrznuti TIL proizvod bio uporediv na osnovu fenotipskog obrasca.
1
Slika 55A-55B: CD4+LAG3+ ćelije. Iscrpljene T ćelije eksprimiraju visoke nivoe inhibitornog receptora LAG3 zajedno sa PD-1. A) CD4+ odmrznuti TIL pokazali su blago, ali ne i značajno povišene nivoe ekspresije LAG3 u poređenju sa svežim TIL (p = 0.52). Izuzetak je zapažen kod M1063T. U eksperimentima u kojima je merena ekspresija LAG3 u CD4+ svežim i svežim re-REP TIL, zapaženo je smanjenje ekspresije LAG3+ u svežim re-REP uzorcima u poređenju sa svežim TIL. B) Ukupno, postoji umereno smanjenje ekspresije LAG3 u svežem re-REP TIL proizvodu. Molimo da uočite da su na Slici B, da bi se održala konzistentnost, M1061T, M1062T i M1064T bili isključeni jer ekspresija LAG3 nije merena u svežem proizvodu.
Slika 56A-56B: CD8+LAG3+ ćelije. A) CD8+ LAG3+-eksprimirajući TIL pokazali su umereno smanjenje u eksperimentima, sa izuzetkom M1063T u kojima je upadljivo sniženje ekspresije LAG3 uočeno u svežim re-REP TIL. Ukupno, odmrznuti re-REP TIL pokazali su značajan porast od 1.5 puta u poređenju sa svežim re-REP TIL za ekspresiju LAG3 (p = 0.0154). Međutim, nije zapažena značajna razlika između svežih TIL i odmrznutih TIL proizvoda (p = 0.0884). B) Smanjenje od približno 30% ekspresije LAG3 u CD8+ TIL iz svežih re-REP zapaženo je u poređenju sa odmrznutim TIL proizvodom. I sveži i odmrznuti TIL bili su uporedivi sa odmrznutim TIL koji su pokazali umereni porast. (Na ovoj Slici, izostavljeni su M1061T, M1062T i M1064T jer ekspresija LAG3 nije bila merena ni u svežim ni u svežim re-REP TIL uzorcima.)
Slika 57A-57B: CD4+TIM-3+ ćelije. A) Kako je ranije zapaženo u slučaju PD-1 i LAG3, smanjenje ekspresije TIM-3 uočeno je u svežim reREP TIL u poređenju sa odmrznutim re-REP TIL. Bez obzira na to, nije postojala statistička značajnost između svežih i odmrznutih reREP TIL (p = 0.2007). B) Nisu zapažene velike promene u ekspresiji TIM-3 između svežih, odmrznutih i odmrznutih reREP TIL proizvoda. Umereno smanjenje od 9.2% ekspresije TIM-3 zapaženo je kod svežih reREP TIL u poređenju sa odmrznutim reREP proizvodom.
Slika 58A-58B: CD8+TIM-3+ ćelije. A) Sličan trend u ekspresiji TIM-3 koji je viđen u CD4+ populaciji uočen je i u CD8+ TIL. Sveži re-REP TIL imali su manje iscrpljeni fenotip sa niskom ekspresijom TIM-3, pokazujući značajnu razliku u poređenju sa odmrznutim re-REP TIL (p = 0.0147). Poređenje PD-1, LAG3 i TIM-3 sugeriše da su sveži re-REP TIL imali manje iscrpljeni fenotip, sa povećanim CM fenotipom. B) U
2
poređenju sa odmrznutim re-REP TIL proizvodom, sveži re-REP TIL pokazali su značajno smanjenje od 22% u ekspresiji TIM-3. I sveži i odmrznuti TIL pokazuju slične obrasce ekspresije TIM-3.
Slika 59: Citotoksični potencijal TIL prema P815 ciljnoj ćelijskoj liniji.
Slika 60A-60F: Metabolički respiracioni profil svežih TIL, svežih re-REP TIL, i odmrznutih re-REP TIL. Bazalni OCR (A), "Očiti" ("Overt") SRC (B), SRC2DG (C), "Prikriveni" ("Covert") SRC (D), Bazalni ECAR (E), i glikolitička rezerva (F).
Slika 61A-61B: Protočna citometrija u kombinaciji sa FISH tehnologijom upotrebljena je za merenje prosečne dužine telomernih ponovaka u 9 post-REP odmrznutih TIL proizvoda Procesa 2A. A) Podaci predstavljaju dužinu telomera merenu pomoću qPCR upoređujući TIL sa ćelijama 1301 B) Podaci prikazuju dužinu telomera merenu testom protočne citometrije u kombinaciji sa FISH, za TIL u poređenju sa ćelijama 1301. Podaci upotrebljeni za grafikone obezbeđeni su u formatu tabele (Tabele 25) u dodatnom odeljku 10. Ukupno uzevši, postojala je gruba sličnost u obrascu rezultata dva testa za dužinu telomera, ali eksperimenti će se nastaviti da bi se odredilo koji metod vernije odražava stvarnu dužinu telomera TIL. Ova tehnika bi mogla da se primeni na buduće kliničke uzorke da bi se odredio odnos između dužine telomera i pacijentovog odgovora na TIL terapiju.
Slika 62A-62B: Izbor dobavljača medijuma koji ne sadrži serum (zamenski serum). Svaki fragment se kultiviše u jednom bunarčiću G-Rex ploče sa 24 bunarčića u kvadriplikatima. Jedanaestog dana, REP se inicira korišćenjem 4<5>TIL with 10<6>hraniteljica da bi se imitirao 2A proces. A) Grafikon sa stubićima prikazuje prosečan broj vijabilnih ćelija zabeležen jedanaestog dana (preREP) za svaki od uslova. B) Grafikon sa stubićima prikazuje prosečan broj vijabilnih ćelija zabeležen dvadeset drugog dana (postREP). P vrednosti su izračunate korišćenjem Studentovog ’t’-testa. *P <0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, respektivno.
Slika 63A-63B: Izbor dobavljača medijuma koji ne sadrži serum (lizat krvnih pločica kao serum). Svaki fragment se kultiviše u jednom bunarčiću G-Rex ploče sa 24 bunarčića u triplikatima. Jedanaestog dana, REP se inicira korišćenjem 4e5 TIL sa 10e6 hraniteljica da bi se imitirao 2A proces. A) Grafikon sa stubićima prikazuje prosečan broj vijabilnih ćelija zabeležen jedanaestog dana (preREP) za svaki od uslova. B) Grafikon sa stubićima prikazuje prosečan broj vijabilnih ćelija zabeležen dvadeset drugog dana (postREP). P vrednosti su izračunate korišćenjem Studentovog ’t’testa. *P <0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 respektivno. ’#’ Nije bilo dovoljno fragmenata tumora.
Slika 64A-64B: Poređenje efikasnosti CTS Optimizera sa standardnim uslovom, korišćenjem 2A procesa u mini-razmerama (GRex 5M). Dva fragmenta / G-Rex 5M kultivišu se u triplikatima, REP se inicira korišćenjem 2<6>TIL sa 50<6>hraniteljica da se imitira 2A proces. Bar prikazan gore predstavlja broj vijabilnih ćelija dobijen na Dan 11 (A) ili Dan 22 (B).
Slika 65A-65C: Zbirni ektrapolirani prikaz pre i posle ekspanzije TIL upoređuje standardne uslove i CTS Optimizer. A) PreREP. B) PostREP. C) Zbirni prikaz TIL ekspanzije ekstrapoliran do ciklusa u punoj razmeri (Standard prema CTS Optimizer SR).
Slika 66: CD8+ se ograđuje na živim ćelijama. Sedam od devet tumora pokazuje porast apsolutne CD8+ populacije u CTS+SR uslovima.
Slika 67: Interferon-gama uporedivost. Interferon-gama ELISA (Quantikine). Proizvodnja IFN-γ meri se pomoću ELISA kita, R&D systems. CTS+SR proizvode uporedive količine IFN-γ kada se uporede sa našim standardnim uslovima.
Slika 68: Šema primera izvođenja Protokola brze ekspanzije (REP) datog kao primer. Posle izolovanja, tumor se fragmentiše, stavi u G-Rex flakone sa IL-2 za ekspanziju TIL (pre-REP ekspanzija), 11 dana. Za studije "trostrukog koktela", IL-2/IL-15/IL-21 dodaju se pri inicijaciji pre-REP. Za Protokol brze ekspanzije (REP), TIL se kultivišu sa hraniteljicama i OKT3 za REP ekspanziju, još 11 dana.
Slika 69: TIL poreklom iz melanoma (n=4), i pluća (n=7) procenjuju se fenotipski u pogledu CD4+ i CD8+ ćelija korišćenjem protočne citometrije posle pre-REP. *P-vrednosti predstavljaju razliku u CD8+ ćelijama između IL-2 i IL-12/IL-15/IL-21, korišćenjem Studentovog neparnog t-testa.
Slika 70: TIL poreklom iz melanoma (n=4), i pluća (n=7) procenjuju se fenotipski u pogledu CD27+ i CD28+ u CD4+ i CD8+ ćelijama, korišćenjem protočne citometrije posle pre-REP.
Slika 71A-71B: TIL se procenjuju fenotipski u pogledu efektorskih/memorijskih podgrupa (CD45RA i CCR7) u CD8+ ćelijama i CD4+ (podaci nisu prikazani) u uzorcima melanoma (n=4) (A) i pluća (n=8) (B). Ekspresija CXCR3 procenjuje se u melanomu i plućima. Fenotipska ekspresija procenjuje se korišćenjem protočne citometrije posle pre-REP. TCM=centralne memorijske, TSCM= memorijske matične ćelije, TEMRA (efektorske T ćelije), TEM=efektorske memorijske.
Slika 72A-72C: TIL poreklom iz (A) melanoma (n=4) i (B) pluća (n=5) procenjivani su u pogledu ekspresije CD107a+ u odgovoru na PMA stimulaciju u trajanju od 4 sata u CD4+ i CD8+ ćelijama, korišćenjem protočne citometrije. (C) pre-REP TIL (n=5) stimulisani su 24 sata solubilnim OKT3 (30 ng/ml) i supernatanti su procenjivani u pogledu sadržaja IFNγ, pomoću ELISA.
Slika 73A-73B: Repertoar TCRvβ (24 specifičnosti) procenjuje se u TIL poreklom iz melanoma (A) i pluća (B) korišćenjem Beckman Coulter kita za protočnu citometriju.
Slika 74: Primer procesa proizvodnje krioprezerviranih TIL (-22 dana).
Slika 75A-75B: Na Dan 22 ćelijski proizvod smanjene zapremine spoji se i uzorkuje da bi se odredile osobine kulture pre ispiranja i formulisanja. Uzorci se analiziraju na NC-200 automatskom brojaču ćelija, kako je ranije opisano. Ukupna gustina vijabilnih ćelija određuje se pomoću ukupne srednje (grand mean) duplikata brojanja za 4 nezavisna uzorka. Proces Generacije 2 (Gen 2) daje TIL proizvod slične doze kao Generacija 1 (Gen 1; Gen 1 srednja vrednost = 4.10 ×10<10>± 2.92 ×10<10>, Gen 2 srednja vrednost = 3.12 ×10<10>± 2.19 ×10<10>). B) Umnožak ekspanzije izračunava se za REP fazu kao količnik finalne gustine vijabilnih ćelija i inicijalne gustine zasejavanja vijabilnih TIL. Gen 2 TIL proizvodi imaju manji umnožak ekspanzije u odnosu na Gen 1 (Gen 1 srednja vrednost =1.40 ×10<3>± 9.86 ×10<2>, Gen 2 srednja vrednost = 5.11 ×10<2>± 2.95 ×10<2>).
Slika 76: Sveži formulisani lekoviti proizvodi testiraju se protočnom citometrijom u pogledu identičnosti za oslobađanje. Gen 1 i Gen 2 procesi proizvode kulture T-ćelija visoke čistoće, što se definiše pomoću CD45, CD3 dvostruko pozitivnog fenotipa (Gen1 # ± SD, Gen 2 # ± SD). P-vrednost se izračunava korišćenjem Mann-Whitney ’t’-testa.
2
Slika 77: Krioprezervirane satelitske fiole formulisanog lekovitog proizvoda odmrznu se i testiraju protočnom citometrijom u pogledu proširenog fenotipa, kako je ranije opisano. Proizvodi Gen 1 i Gen 2 eksprimiraju slične odnose CD8 i CD4 podtipova T-ćelija. P-vrednost se izračunava korišćenjem Mann-Whitney ’t’-testa.
Slika 78: Krioprezervirane satelitske fiole formulisanog lekovitog proizvoda odmrznu se i testiraju protočnom citometrijom u pogledu proširenog fenotipa, kako je ranije opisano. Proizvodi Gen 1 i Gen 2 eksprimiraju slične nivoe kostimulatornih molekula CD27 i CD28 na podgrupama T-ćelija. P-vrednost se izračunava korišćenjem Mann-Whitney ’t’-testa. Kostimulatorni molekuli kao što su CD27 i CD28 potrebni su za dopremanje sekundarnih i tercijarnih signala potrebnih za proliferaciju efektorskih ćelija posle angažovanja T-ćelijskih receptora.
Slika 79: Tehnologija protočne citometrije u kombinaciji sa FISH koristi se za merenje prosečne dužine telomernog ponovka, kako je ranije opisano. Gornja RTL vrednost koja označava prosečnu fluorescenciju telomera po hromozomu/genomu za Gen 1 (primer izvođenja procesa 1C) iznosi # % ± SD%, i za Gen 2 #% ± SD% od fluorescenciju telomera po hromozomu/genomu u kontrolnoj ćelijskoj liniji (ćelijska linija 1301 leukemijskih ćelija). Podaci pokazuju da Gen 2 proizvodi u proseku imaju dužinu telomera bar uporedivu sa Gen 1 proizvodima. Dužina telomera je surogatska mera dužine ex vivo ćelijske kulture.
Slika 80: Lekoviti proizvodi Gen 2 (primer izvođenja procesa 2A) pokazuju povećanu sposobnost proizvodnje IFN-γ u odnosu na lekovite proizvode Gen 1. Sposobnost lekovitog proizvoda da se reaktivira i sekretuje citokine je surogatska mera in-vivo funkcije posle TCR vezivanja sa srodnim antigenom u kontekstu HLA.
Slika 81: Diverzitet T-ćelijskih receptora: RNK iz 10x10<6>TIL iz Gen 1 (primer izvođenja procesa 1C) i Gen 2 (primer izvođenja procesa 2A) lekovitih proizvoda testirani su da bi se odredili ukupan broj i frekvencija jedinstvene CDR3 sekvence prisutne u svakom proizvodu. A) Ukupan broj jedinstvenih CDR3 sekvenci prisutnih u svakom proizvodu (Gen 1 n=#, srednja vrednost ± SD, Gen 2 n =#, srednja vrednost ± SD). B) Jedinstvene CDR3 sekvence indeksirane su u odnosu na frekvenciju u svakom proizvodu da bi se dobio skor koji predstavlja relativni diverzitet repertoara T-ćelija u proizvodu. TIL proizvodi iz oba procesa sačinjeni su od poliklonskih populacija Tćelija sa različitim antigenskim specifičnostima i aviditetima. Širina ukupnog repertoara T-ćelija može ukazivati na broj epitopa na tumorskim ćelijama sa kojima mogu ostvariti dejstvo.
Slika 82: Prikazuje dijagram primera izvođenja procesa 2A, 22-dnevni proces za izradu TIL.
Slika 83: Tabela upoređivanja Koraka A do F iz primera izvođenja procesa 1C i procesa 2A, datih za primer.
Slika 84: Detaljno poređenje primera izvođenja procesa 1C i primera izvođenja procesa 2A.
Slika 85: Detaljna šema primera izvođenja terapijskog procesa sa korišćenjem TIL.
Slike 86A-86C: Fenotipska karakterizacija TIL proizvoda protočno-citometrijskim testom uz korišćenje 10 boja. (A) Procenat podgrupa T-ćelija i ne-T-ćelija definisan je prema CD45+CD3+ i CD45- (nelimfociti) / CD45+CD3- (ne-T-limfociti), respektivno. Sveukupno, >99% testiranih TIL proizvoda sastoji se od T-ćelija (CD45<+>CD3<+>). Prikazan je prosek TIL proizvoda (n=10). (B) Procenat dve podgrupe T-ćelija uključujuči CD45<+>CD3<+>CD8<+>(plavi prazan kružić) i CD45<+>CD3<+>CD4<+>(ružičasti prazan kružić). Korišćenjem Studentovog neparnog T testa nije zapažena statistički značajna razlika u procentu podgrupa (P=0.68). (C) Populacija ne-T-ćelija okarakterisana je za četiri različite podgrupe uključujući: 1) Nelimfocite (CD45-), 2) NK ćelije (CD45<+>CD3CD16756<+>), 3) B-ćelije (CD45<+>CD19<+>), i 4) Ne-NK/B-ćelije (CD45+CD3-CD16-CD56-CD19-).
Slike 87A- 87B: Karakterizacija podgrupa T-ćelija u CD45+CD3+CD4+ i CD45+CD3+CD8+ ćelijske populacije. Podgrupe naivnih, centralnih memorijskih (TCM), efektorskih memorijskih (TEF), i efektorskih memorijskih RA+(EMRA) T-ćelija definisane su korišćenjem CD45RA i CCR7. Slike prikazuju reprezentativne podgrupe T-ćelija iz 10 finalnih TIL proizvoda u populacijama CD4+ (A), i CD8+ (B) ćelija. Podgrupa efektorskih memorisjkih T-ćelija (plavi prazan kružić) je glavna populacija (>93%) u CD4+ i CD8+ podgrupama finalnog TIL proizvoda. Manje od 7% TIL proizvoda ćelija predstavljeno je podgrupom centralnih memorijskih ćelija (ružičasti prazan kružić). Podgrupe EMRA (sivi prazan kružić) i naivnih (crni prazan
2
kružić) jedva da se detektuju u TIL proizvodu (<0.02%). p vrednosti predstavljaju razliku između EM i CM, korišćenjem Studentovog neparnog T testa
Slike 88A-88B: Detektovanje ekspresije MCSP i EpCAM u tumorskim ćelijama melanoma. Tumorske ćelijske linije melanoma (WM35, 526, i 888), ćelijske linije melanoma poreklom iz pacijenata (1028, 1032, i 1041), i ćelijska linija kolorektalnog adenokarcinoma (HT29 kao negativna kontrola) okarakterisane su bojenjem na MCSP (hondroitin-sulfatni proteoglikan udružen sa melanomom) i EpCAM (molekul adhezije epitelnih ćelija) markere. (A) U proseku 90% tumorskih ćelija melanoma eksprimira MCSP. (B) Ekspresija EpCAM nije detektovana u tumorskim ćelijskim linijama melanoma u poređenju sa pozitivnom kontrolom HT29, EpCAM+ tumorskom ćelijskom linijom.
Slike 89A-89B: Detekcija "spajkovanih" kontrola za određivanje pouzdanosti detekcije tumora. Test se izvodi dodavanjem poznatih količina tumorskih ćelija u suspenzije PBMC (n=10). MCSP+526 tumorske ćelije melanoma razblaže se u odnosima 1:10, 1:100, i 1:1,000, zatim pomešaju sa PBMC i boje anti-MCSP i anti-CD45 antitelima i live/dead bojom i analiziraju protočnom citometrijom. (A) Približno 3000, 300, i 30 ćelija detektuje se u razblaženju 1:10, 1:100, odnosno 1:1000. (B) Prosečna vrednost (average, AV) i standardna devijacija (standard deviation, SD) za ćelije dobijene u svakom od uslova koriste se za definisanje gornjeg i donjeg referentnog limita.
Slike 90A-90B: Ponovljivost studije gornjeg i donjeg limita u kontrolama sa poznatom količinom analita. Izvedena su tri nezavisna eksperimenta u triplikatu da bi se odredila ponovljivost testa sa poznatom količinom analita. (A) Broj MCSP<+>detektovanih tumorskih ćelija bio je konzistentno unutar gornjeg i donjeg referentnog limita. (B) Grafikon linearne regresije prikazuje korelaciju između MCSP<+>ćelija i "spajkujućih" rastvora sa poznatom količinom analita (R<2>=0.99) pri čemu crna linija pokazuje najbolje podešavanje. Zelena i siva isprekidana linija predstavljaju 95% limite predikcije za standardnu krivu odnosno uzorke (Eksp # 1 do 3).
Slike 91A-91B: Detekcija rezidualnog melanoma u TIL proizvodima. TIL proizvodi se procenjuju u pogledu kontaminacije rezidualnim tumorom korišćenjem razvijenog
2
testa (n=15). (A i B) Medijana broja i procenta detektabilnih MCSP+ događaja bila je 2 odnosno 0.0002%.
Slika 92: Procena potencije TIL proizvoda posle aktivacije T-ćelija. Sekrecija IFNγ posle restimulacije pomoću anti-CD3/CD28/CD137 u TIL proizvodima procenjena je pomoću ELISA u duplikatu (n=5). Sekrecija IFNγ u TIL proizvodima bila je značajno veća nego kod nestimulisanih kontrola, uz korišćenje Wilcoxonovog testa označenih rangova (P=0.02), i konzistentno >1000 pg/ml. Sekrecija IFNγ >200 pg/ml smatra se za potentnu, p vrednost <0.05 smatra se za statistički značajnu.
Slika 93: Prikaz primera izvođenja procesa izrade krioprezerviranih TIL (22 dana).
Slika 94: Tabela poboljšanja procesa od Gen 1 do Gen 2.
Slike 95A-95C: Ukupan broj vijabilnih ćelija, stopa rasta, i vijabilnost. Na Dan 22 zapremine redukovanog ćelijskog proizvoda se spajaju (puluju) i uzorkuju da bi se odredile osobine kulture pre ispiranja i formulisanja. (A) Uzorci se analiziraju na NC-200 automatizovanom brojaču ćelija, kako je opisano ranije. Ukupna gustina vijabilnih ćelija određuje se pomoću ukupne srednje vrednosti duplikata brojanja iz 4 nezavisna uzorka. Gen 2 proces daje TIL proizvod slične doze kao Gen 1 (Gen 1 srednja vrednost = 4.10x1010 ± 2.8x1010, Gen 2 srednja vrednost = 4.12x1010 ± 2.5x1010). B) Stopa rasta se izračunava za REP fazu kao gr = ln(N(t)/N(0))/t. (C) Vijabilnost ćelija procenjuje se iz 9 partija razvoja procesa korišćenjem Cellometer K2, kako je ranije opisano. Nije zapaženo značajno smanjenje vijabilnosti ćelija posle jednog ciklusa zamrzavanja-odmrzavanja formulisanog proizvoda. Prosečno smanjenje vijabilnosti posle odmrzavanja i uzorkovanja je 2.19%.
Slike 96A-96C: Gen 2 proizvodi su kulture T-ćelija visoke čistoće, koje eksprimiraju kostimulatorne molekule na nivoima uporedivim sa Gen 1. (A) Sveže formulisani lekoviti proizvodi testirani su protočnom citometrijom u pogledu identičnosti za oslobađanje. Gen 1 i Gen 2 procesi proizvode kulture T-ćelija visoke čistoće, kako je definisano prema CD45+,CD3+ (dvostruko pozitivnom) fenotipu. (B & C) Krioprezervirane satelitske fiole formulisanog lekovitog proizvoda odmrznu se i testiraju protočnom citometrijom u pogledu proširenog fenotipa, kako je raniije opisano. Gen 1 i Gen 2 proizvodi eksprimiraju slične nivoe kostimulatornih molekula CD27 i CD28 na podgrupama T-ćelija. Kostimulatorni molekuli kao što su CD27 i
2
CD28 potrebni su za obezbeđivanje sekundarne i tercijarne signalizacije neophodne za proliferaciju efektorskih ćelija posle angažovanja receptora na T-ćelijama. P-vrednost je izračunata korišćenjem Mann-Whitney ’t’ testa.
Slika 97: Proizvodi Gen 2 ispoljavaju slične dužine telomera. Međutim, u nekim TIL populacijama može postojati trend ka relativno dužim telomerama.
Slika 98: Lekoviti proizvodi Gen 2 sekretuju IFNγ u odgovoru na angažovanje CD3, CD28, i CD137.
Slike 99A-99B: Diverzitet T-ćelijskih receptora. (A) Jedinstvene CDR3 sekvence indeksirane su u odnosu na frekvenciju u svakom proizvodu da bi se dobio skor koji predstavlja ukupan diverzitet receptora T-ćelija u proizvodu. (B) Prosečan ukupan broj jedinstvenih CDR3 sekvenci prisutnih u svakom infuzionom proizvodu.
Slika 100: Primer izvođenja procesa proizvodnje TIL predmetnog pronalaska.
Slika 101: Pojačanje ekspanzije tokom pre-REP sa IL-2/IL-15/IL-21 u većem broju histološki različitih tumora.
Slike 102A-102B: IL-2/IL-15/IL-21 povećavaju procenat CD8+ ćelija u karcinomu pluća, ali ne i u melanomu. TIL poreklom iz (A) melanoma (n=4), i (B) pluća (n=7) procenjivani su fenotipski u pogledu CD4+ i CD8+ ćelija korišćenjem protočne citometrije posle pre-REP.
Slike 103A-103B: Ekspresija CD27 bila je blago pojačana u CD8+ ćelijama u kulturama tretiranim korišćenjem IL-2/IL-15/IL-21. TIL poreklom iz (A) melanoma (n=4), i (B) pluća (n=7) procenjivani su fenotipski u pogledu CD27+ i CD28+ u CD4+ i CD8+ ćelijama korišćenjem protočne citometrije posle pre-REP.
Slike 104A-104B: Podgrupe T ćelija ostale su neizmenjene posle dodavanja IL-15/IL-21. TIL su procenjivani fenotipski u pogledu efektorskih/memorijskih podgrupa (CD45RA i CCR7) u CD8+ i CD4+ (podaci nisu prikazani) ćelijama iz (A) melanoma (n=4), i (B) pluća (n=8) protočnom citometrijom posle pre-REP.
Slike 105A-105C: Funkcionalni kapacitet TIL bio je diferencijalno povećan sa IL-2/IL-15/IL-21. TIL poreklom iz (A) melanoma (n=4) i (B) pluća (n=5) procenjivani su
2
fenotipski protočnom citometrijom u pogledu ekspresije CD107a+ u odgovoru na PMA stimulaciju, tokom 4 sata, u CD4+ i CD8+ ćelijama. (C) pre-REP TIL poreklom iz melanoma i pluća stimulisani su 24 sata solubilnim anti-CD3 antitelom i procenjivano je prisustvo IFNγ u supernatantima, korišćenjem ELISA.
Slike 106A-106B: Repertoar TCRvβ (24 specifičnosti) procenjivan je kod TIL poreklom iz (A) melanoma i (B) tumora pluća korišćenjem Beckman Coulter kita za protočnu citometriju.
Slika 107: Šema Gen 2 procesa izrade krioprezerviranih LN-144.
Slika 108: Šema dizajna studije multicentričnog kliničkog ispitivanja faze 2 novih krioprezerviranih TIL koji se primenjuju kod pacijenata sa metastatskim melanomom.
Slika 109: Tabela koja ilustruje upoređivanje karakteristika pacijenata iz Kohorta 1 (ASCO 2017) i Kohorta 2.
Slika 110: Tabela ilustruje neželjene događaje tokom lečenja (≥ 30%).
Slika 111: Efikasnost infuzionog proizvoda i TIL terapije.
Slika 112: Klinički status pacijenata čiji je odgovor mogao biti procenjivan, sa SD ili boljim odgovorom.
Slika 113: Procenat promene sume dijametara.
Slika 114: Porast nivoa HMGB 1 bio je zapažen posle TIL tretmana.
Slika 115: Porast biomarkera IL-10 bio je zapažen posle infuzije LN-144.
Slika 116: Ažurirane karakteristike pacijenata Kohorta 2 kliničkog ispitivanja faze 2 u metastatskom melanomu iz drugog preseka podataka (N = 17 pacijenata).
Slika 117: Neželjeni efekti tokom lečenja za Kohortu 2 (≥ 30%) iz drugog preseka podataka (N = 17 pacijenata).
Slika 118: Vreme do odgovora za pacijente koji su mogli biti procenjivani (stabilna bolest ili bolje) u Kohortu 2 iz drugog preseka podataka (N = 17 pacijenata). Od 10
2
pacijenata u grupi efikasnosti, jedan pacijent (Pacijent 10) koji nije mogao da se procenjuje zbog smrti usled melanoma pre prve procene tumora, nije prikazan na Slici.
Slika 119: Ažurirani podaci o efikasnosti za Kohort 2 iz drugog preseka podataka (N = 17 pacijenata). Prosečan broj TIL unetih infuzijom je 34 × 10<9>. Medijana broja prethodnih terapija bila je 4.5. Pacijenti sa mutacijom BRAF odgovarali su podjednako dobro kao i pacijenti sa divljim tipom BRAF (* označava pacijente sa BRAF mutacijom). Jedan pacijent (Pacijent 10) nije mogao da se evaluira zbog smrti usled melanoma pre prve procene tumora, ali je i dalje razmatran u okviru grupe efikasnosti. Skraćenice: PR (partial response) delimičan odgovor; SD (stable disease) stabilna bolest; PD (progressive disease) progresivna bolest.
Slika 120: Ažurirani podaci o efikasnosti za pacijente koji su mogli biti procenjivani iz Kohorta 2, drugi presek podataka (N = 17 pacijenata). * označava pacijenta koji nije dostigao prvu procenu. Svi pacijenti koji su mogli biti evaluirani primili su ranije terapije anti-PD-1 i anti-CTLA-4 inhibitorima kontrolnih tačaka.
Slika 121: Reprezentativni skenovi kompjuterizovane tomografije pacijenata (003-015) sa PR iz Kohorta 2, drugi presek podataka.
Slika 122: Korelacija indukcije IFN-γ TIL proizvodom pre infuzije sa kliničkim smanjenjem veličine tumora na Dan 42 posle TIL infuzije.
Slika 123: IP-10 (CXCL10) nivoi (pg/mL, log10) pre i posle infuzije iz primera izvođenja TIL proizvoda Gen 2. IP-10 je marker ćelijske adhezije i udomljavanja.
Slika 124: IP-10 (CXCL10) nivoi (pg/mL, log10) pre i posle infuzije iz primera izvođenja TIL proizvoda Gen 1.
Slika 125: MCP-1 nivoi (pg/mL, log10) pre i posle infuzije iz primera izvođenja TIL proizvoda Gen 2. MCP-1 je marker ćelijske adhezije i udomljavanja.
Slika 126: MCP-1 nivoi (pg/mL, log10) pre i posle infuzije iz primera izvođenja TIL proizvoda Gen 1.
Slika 127: Podaci iz studije Faze 2 u cervikalnom karcinomu i karcinomu skvamoznih ćelija glave i vrata (HNSCC). SD = stabilna bolest. PD = progresivna bolest. PR = delimični odgovor.
KRATAK OPIS LISTE SEKVENCI
[0100] SEQ ID NO:1 je aminokiselinska sekvenca teškog lanca muromonaba.
[0101] SEQ ID NO:2 je aminokiselinska sekvenca lakog lanca muromonaba.
[0102] SEQ ID NO:3 je aminokiselinska sekvenca rekombinantnog humanog IL-2 proteina.
[0103] SEQ ID NO:4 je aminokiselinska sekvenca aldesleukina.
[0104] SEQ ID NO:5 je aminokiselinska sekvenca rekombinantnog humanog IL-4 proteina.
[0105] SEQ ID NO:6 je aminokiselinska sekvenca rekombinantnog humanog IL-7 proteina.
[0106] SEQ ID NO:7 je aminokiselinska sekvenca rekombinantnog humanog IL-15 proteina.
[0107] SEQ ID NO:8 je aminokiselinska sekvenca rekombinantnog humanog IL-21 proteina.
DETALJAN OPIS PRONALASKA
I. Uvod
[0108] Adoptivnom ćelijskom terapijom u kojoj se koriste TIL kultivisani ex vivo po protokolu brze ekspanzije (REP) proizvedena je uspešna adoptivna ćelijska terapija, posle imunosupresije, kod domaćina sa melanomom. Sadašnji parametri prihvatljivosti infuzije počivaju na očitavanjima kompozicije TIL (npr., CD28, CD8, ili CD4 pozitivnost) i na brojčano uvišestručenoj ekspanziji i vijabilnosti REP proizvoda.
[0109] Sadašnji REP protokoli daju malo uvida u zdravlje TIL koji će se infuzijom uneti u pacijenta. T ćelije podležu velikom metaboličkom pomaku tokom svog sazrevanja od naivnih do efektorskih T ćelija (vidi Chang, et al., Nat. Immunol. 2016,17, 364, posebno o razmatranju i markerima anaerobnog i aerobnog metabolizma). Na primer, naivne T ćelije se za proizvodnju ATP oslanjaju na mitohondrijalnu respiraciju, dok su zrele, zdrave efektorske T ćelije kao što su TIL visoko glikolitičke i za obezbeđivanje bioenergetskih supstrata potrebnih za proliferaciju, migraciju, aktivaciju i antitumorsku efikasnost oslanjaju se na aerobnu glikolizu.
[0110] Prethodni radovi saopštavaju da je limitiranje glikolize i promovisanje mitohondrijalnog metabolizma u TIL pre transfera poželjno, jer će ćelije koje se snažno oslanjaju na glikolizu patiti zbog lišavanja od nutrijenata posle adoptivnog transfera, što će rezultovati smrću većine transferisanih ćelija. Prema tome, struka ukazuje na to da
1
promovisanje mitohondrijalnog metabolizma može značiti i in vivo dugovečnost i zapravo sugeriše korišćenje inhibitora glikolize pre indukcije imunskog odgovora. Vidi Chang et al. (Chang, et al., Nat. Immunol. 2016, 17(364).
[0111] U ovom tekstu se objavljuju, ali ne i zahtevaju postupci za evaluaciju i kvantifikaciju ovog porasta metaboličkog zdravlja. Prema tome, u ovom tekstu se objavljuju, ali ne i zahtevaju postupci procene relativnog zdravlja TIL populacije korišćenjem jedne ili više opštih evaluacija metabolizma, uključujući, ali ne ograničavajući se na stopu i količinu glikolize, oksidativne fosforilacije, rezervnog respiratornog kapaciteta (spare respiratory capacity, SRC), i glikolitičke rezerve.
[0112] Pored toga, u ovom tekstu se objavljuju, ali ne i zahtevaju postupci za evaluaciju i kvantifikaciju ovog porasta metaboličkog zdravlja. Prema tome, u ovom teksu su objavljeni ali ne i zahtevani postupci procene relativnog zdravlja TIL populacije korišćenjem jedne ili više opštih evaluacija metabolizma, uključujući, ali ne ograničavajući se na stopu i količinu glikolize, oksidativne fosforilacije, rezervnog respiratornog kapaciteta (SRC), i glikolitičke rezerve.
[0113] Pored toga, opcione dodatne evaluacije uključuju, ali se ne ograničavaju na proizvodnju ATP, masu mitohondrija i preuzimanje glukoze.
II. Definicije
[0114] Ukoliko nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni izrazi upotrebljeni u ovom tekstu imaju značenja koja uobičajeno razume stručnjak u oblasti kojoj ovaj pronalazak pripada.
[0115] Izraz "in vivo" označava događaj koji se odvija u telu subjekta.
[0116] Izraz "in vitro" označava događaj koji se odvija izvan tela subjekta. In vitro testovi obuhvataju testove zasnovane na ćelijama, u kojima se koriste žive ili mrtve ćelije, a mogu obuhvatati i testove bez ćelija u kojima se ne koriste intaktne T-ćelije.
[0117] Izraz "ex vivo" označava događaj koji uključuje tretiranje ili izvođenje postupka na ćeliji, tkivu i/ili organu koji su uklonjeni iz tela subjekta. Pogodno, ćelija, tkivo i/ili organ mogu se vratiti u subjektovo telo u postupku operacije ili lečenja.
[0118] Izraz "brza ekspanzija" označava najmanje 3-struki porast broja antigen-specifičnih TIL (ili 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, ili 9-struki) tokom perioda od jedne nedelje, poželjnije najmanje oko 10-struki (ili 20-, 30-, 40-, 50-, 60-, 70-, 80-, ili 90-struki) tokom perioda od jedne nedelje, ili najpoželjnije najmanje oko 100-struki tokom perioda od jedne nedelje. Brojni protokoli brze ekspanzije navedeni su u nastavku.
2
[0119] Pod "tumor-infiltrajući limfociti" ili "TIL" u ovom tekstu podrazumeva se populacija ćelija koje su originalno dobijene kao bele krvne ćelije koje su napustile krvni tok subjekta i migrirale u tumor. TIL uključuju, ali se ne ograničavaju na CD8<+>citotoksične T ćelije (limfociti), Th1 i Th17 CD4+ T ćelije, ćelije prirodne ubice, dendritske ćelije i M1 makrofage. TIL uključuju i primarne i sekundarne TIL. "Primarni TIL" su oni koji su dobijeni iz uzoraka pacijentovog tkiva, kako je navedeno u ovom tekstu (ponekad označeni kao "sveže sakupljeni"), a "sekundarni TIL" predstavljaju svaku populaciju TIL ćelija koja je ekspandirana ili koja je proliferisala, kako se razmatra u ovom tekstu, uključujući, ali se ne ograničavajući na "bulk" TIL (TIL u masi) i ekspandirane TIL ("REP TIL" ili "post-REP TIL"). Ćelijske populacije TIL mogu uključivati genetički modifikovane TIL.
[0120] Pod "populacijom ćelija" (uključujući TIL) u ovom tekstu podrazumevaju se brojne ćelije koje dele zajedničke osobine. Uopšteno, brojnost populacija je obično u rangu od 1 X 106 do 1 X 1010, pri čemu različite TIL populacije sadrže različiti broj ćelija. Na primer, inicijalni rast primarnih TIL u prisustvu IL-2 rezultuje populacijom "bulk" TIL od, grubo, 1 × 108 ćelija. REP ekspanzija se obično vrši da bi se obezbedile populacije od 1.5 × 10<9>do 1.5 × 1010 ćelija za infuziju.
[0121] Pod "krioprezerviranim TIL" u ovom tekstu se podrazumeva da se TIL, bilo da su primarni, "bulk", ili ekspandirani (REP TIL), tretiraju i skladište na temperaturama u rasponu od oko -150°C do -60°C. Opšti metodi krioprezervacije takođe su opisani na drugom mestu u ovom tekstu, uključujući Primere. Radi objašnjenja, "krioprezervirani TIL" različiti su od zamrznutih uzoraka tkiva, koji mogu da se koriste kao izvor primarnih TIL.
[0122] Pod "odmrznuti krioprezervirani TIL" u ovom tekstu podrazumeva se populacija TIL koji su prethodno krioprezervirani i zatim obrađeni da bi se vratili na sobnu ili višu temperaturu, uključujući, ali ne ograničavajući se na temperaturu ćelijske kulture ili temperaturu na kojoj se TIL mogu dati pacijenatu.
[0123] TIL uopšteno mogu da se definišu biohemijski, korišćenjem ćelijskih površinskih markera, ili funkcionalno, prema sposobnosti da infiltriraju tumore i izvrše lečenje. TIL mogu uopšteno da se kategorizuju prema eksprimiranju jednog ili više od sledećih biomarkera: CD4, CD8, TCR αβ, CD27, CD28, CD56, CCR7, CD45Ra, CD95, PD-1, i CD25. Dodatno i alternativno, TIL mogu funkcionalno da se definišu prema sposobnosti da posle ponovnog uvođenja u pacijenta infiltriraju solidne tumore.
[0124] Izraz "krioprezervacioni medijumi" ili "krioprezervacioni medijum" označava svaki medijum koji može da se koristi za krioprezerviranje ćelija. Takvi medijumi mogu uključivati medijume koji sadrže 7% do 10% DMSO. Primeri medijuma uključuju CryoStor CS10, Hyperthermasol, kao i njihove kombinacije. Izraz "CS10" označava krioprezervacioni medijum koji se nabavlja od Stemcell Technologies ili Biolife Solutions. CS10 medijum može da se označi zaštićenim imenom "CryoStor® CS10". CS10 je medijum koji ne sadrži serum ni komponente životinjskog porekla, a sadrži DMSO.
[0125] Izraz "centralna memorijska T ćelija" označava podgrupu T ćelija koje su kod čoveka CD45R0+ i konstitutivno eksprimiraju CCR7 (CCR7hi) i CD62L (CD62hi). Površinski fenotip centralnih memorijskih ćelija uključuje i TCR, CD3, CD127 (IL-7R), i IL-15R. Transkripcioni faktori centralnih memorijskih T ćelija uključuju BCL-6, BCL-6B, MBD2, i BMI1. Centralne memorijske T ćelije prvenstveno sekretuju IL-2 i CD40L kao efektorske molekule posle pokretanja TCR. Centralne memorijske T ćelije su prevashodno u CD4 kompartmentu u krvi, i kod čoveka proporcionalno su obogaćene u limfnim čvorovima i krajnicima.
[0126] Izraz "efektorska memorijska T ćelija" označava podgrupu humanih ili sisarskih T ćelija koje su, kao i centralne memorijske T ćelije, CD45R0+, ali su izgubile konstitutivnu ekspresiju CCR7 (CCR7lo) i imaju heterogenu ili nisku ekspresiju CD62L (CD62Llo). Površinski fenotip centralnih memorijskih T ćelija takođe uključuje TCR, CD3, CD127 (IL-7R), i IL-15R. Transkripcioni faktori za centralne memorijske T ćelije uključuju BLIMP1. Efektorske memorijske T ćelije brzo sekretuju visoke nivoe inflamatornih citokina posle stimulacije antigenom, uključujući interferon-γ, IL-4, i IL-5. Eefektorske memorijske T ćelije prevashodno su u CD8 kompartmentu u krvi, i kod čoveka su proporcionalno obogaćene u plućima, jetri i crevu. CD8+ efektorske memorijske T ćelije nose velike količine perforina.
[0127] Izraz "zatvoreni sistem" označava sistem koji je zatvoren prema spoljašnjoj sredini. Sa postupcima predmetnog pronalaska može se koristiti svaki zatvoreni sistem pogodan za postupke kultivisanja ćelija. Zatvoreni sistemi uključuju, na primer, ali bez ograničavanja, zatvorene G-kontejnere. Kada se segment tumora unese u zatvoreni sistem, sistem se ne otvara prema spoljašnjoj sredini dok TIL ne budu spremni da se daju pacijentu.
[0128] Izrazi "fragmentisanje", "fragment" i "fragmentisan", kako se koriste u ovom tekstu, opisuju procese sečenja tumora, uključujući postupke mehaničke fragmentacije kao što su drobljenje, sečenje, deljenje, i morcelacija tumorskog tkiva, kao i bilo koji drugi postupak narušavanja fizičke strukture tumorskog tkiva.
[0129] Izrazi "mononuklearne ćelije periferne krvi" i "PBMC" označavaju ćelije periferne krvi koje imaju okrugli nukleus, uključujući limfocite (T ćelije, B ćelije, NK ćelije) i monocite. Poželjno, mononuklearne ćelije periferne krvi su ozračene, alogene mononuklearne ćelije periferne krvi. PBMC predstavljaju tip antigen-prezentujućih ćelija.
4
[0130] Izraz "anti-CD3 antitelo" označava antitelo ili njegovu varijantu, npr., monoklonsko antitelo i uključuje humana, humanizovana, himerna ili mišja antitela usmerena protiv CD3 receptora u T-ćelijskom antigenskom receptoru zrelih T ćelija. Anti-CD3 antitela uključuju OKT-3, poznat i kao muromonab. Anti-CD3 antitela uključuju i UHCT1 klon, poznat i kao T3 i CD3ε. Druga anti-CD3 antitela uključuju, na primer, oteliksizumab, teplizumab i visilizumab.
[0131] Izraz "OKT-3" (u ovom tekstu označen i kao "OKT3") označava monoklonsko antitelo ili njegov biosimilar ili njegovu varijantu, uključujući humana, humanizovana, himerna ili mišja antitela usmerena protiv CD3 receptora u T-ćelijskom antigenskom receptoru zrelih T ćelija, i uključuju komercijalno dostupne forme kao što su OKT-3 (30 ng/mL, MACS GMP CD3 čisti, Miltenyi Biotech, Inc., San Diego, CA, USA) i muromonab ili njihove varijante, konzervativne aminokiselinske supstitucije, glikoforme, ili biosimilare. Aminokiselinske sekvence teških i lakih lanaca muromonaba date su u Tabeli 1 (SEQ ID NO: 1 i SEQ ID NO:2). Hibridom sposoban da proizvodi OKT-3 deponovan je u Američkoj kolekciji kultura sojeva (American Type Culture Collection) i dodeljen mu je ATCC pristupni broj CRL 8001. Hibridom sposoban da proizvodi OKT-3 deponovan je i u Evropska kolekcija potvrđenih ćelijskih kultura (European Collection of Authenticated Cell Cultures, ECACC) i dodeljen mu je kataloški br.86022706.
TABELA 1. Aminokiselinske sekvence muromonaba
[0132] Izraz "IL-2" (ovde naveden i kao "IL2") označava faktor rasta T ćelija poznat kao interleukin-2, i obuhvata sve forme IL-2, uključujući humane i sisarske forme, konzervativne aminokiselinske supstitucije, glikoforme, biosimilare i njihove varijante. IL-2 je opisan, npr., u Nelson, J. Immunol. 2004, 172, 3983-88 i Malek, Annu. Rev. Immunol. 2008, 26, 453-79. Aminokiselinska sekvenca rekombinantnog humanog IL-2 pogodna za upotrebu u pronalasku data je u Tabeli 2 (SEQ ID NO:3). Na primer, izraz IL-2 obuhvata humane, rekombinantne forme IL-2 kao što je aldesleukin (PROLEUKIN, koji se komercijalno može nabaviti od više dobavljača, 22 miliona IU po fioli za jednu upotrebu), kao i forme rekombinantnog IL-2 koje se komercijalno mogu nabaviti od CellGenix, Inc., Portsmouth, NH, USA (CELLGRO GMP) ili ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA (kat. br. CYT-209-b), i druge komercijalne ekvivalente drugih prodavaca. Aldesleukin (desalanil-1, serin-125 humani IL-2) je neglikozilovana humana rekombinantna forma IL-2 sa molekulskom težinom od približno 15 kDa. Aminokiselinska sekvenca aldesleukina pogodna za upotrebu u pronalasku data je u Tabeli 2 (SEQ ID NO:4). Izraz IL-2 obuhvata i pegilisane forme IL-2, kako je opisano u ovom tekstu, uključujući pegilisani prolek IL2, NKTR-214, koji se može nabaviti od Nektar Therapeutics, South San Francisco, CA, USA. NKTR-214 i pegilisani IL-2 pogodni za upotrebu u pronalasku, opisani su u U.S. objavljenoj patentnoj prijavi br. US 2014/0328791 A1 i Međunarodnoj objavljenoj patentnoj prijavi br. WO 2012/065086 A1. Alternativne forme konjugovanog IL-2 pogodne za upotrebu u pronalasku opisane su u U.S. patentima br.
4,766,106, 5,206,344, 5,089,261 i 4902,502. Formulacije IL-2 pogodne za upotrebu u pronalasku opisane su u U.S. patentu br.6,706,289.
TABELA 2. Aminokiselinske sekvence interleukina.
[0133] Izraz "IL-4" (ovde naveden i kao"IL4") označava citokin poznat kao interleukin 4, koji proizvode Th2 T ćelije i eozinofili, bazofili i mastociti. IL-4 reguliše diferencijaciju naivnih T-pomažućih ćelija (Th0 ćelije) u Th2 T ćelije. Steinke and Borish, Respir. Res.2001, 2, 66-70. Pošto se aktiviraju pod delovanjem IL-4, Th2 T ćelije posledično, u regulaciji pozitivnom povratnom spregom, proizvode još IL-4. Pored toga, IL-4 stimuliše proliferaciju B ćelija i ekspresiju MHC klase II, i indukuje prebacivanje klasa antitela koja se eksprimiraju iz B ćelija, u IgE i IgG1. Rekombinantni humani IL-4 pogodan za upotrebu u pronalasku komercijalno se može nabaviti od većeg broja snabdevača, uključujući ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA (kat. br. CYT-211) i ThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA (humani IL-15 rekombinantni protein, kat. br. Gibco CTP0043). Aminokiselinska sekvenca rekombinantnog humanog IL-4 pogodna za upotrebu u pronalasku data je u Tabeli 2 (SEQ ID NO:5).
[0134] Izraz "IL-7" (ovde naveden i kao "IL7") označava glikozilovani citokin poreklom iz tkiva, poznat kao interleukin 7, koji se može dobiti iz ćelija strome i epitela, kao i iz dendritskih ćelija. Fry and Mackall, Blood 2002, 99, 3892-904. IL-7 može stimulisati razvoj T ćelija. IL-7 se vezuje za receptor za IL-7, heterodimer koji se sastoji od IL-7-receptora alfa i zajedničkog receptorskog gama lanca, koji je u nizu signala važnih za razviće T ćelija u timusu i preživljavanje na periferiji. Rekombinantni humani IL-7 pogodan za upotrebu u pronalasku komercijalno se može nabaviti od većeg broja snabdevača uključujući ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA (kat. br. CYT-254) i ThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA (humani IL-15 rekombinantni protein, kat. br. Gibco PHC0071). Aminokiselinska sekvenca rekombinantnog humanog IL-7 pogodna za upotrebu u pronalasku data je u Tabeli 2 (SEQ ID NO:6).
[0135] Izraz "IL-15" (ovde nazvan i "IL15") označava faktor rasta T ćelija poznat kao interleukin-15, i obuhvata sve forme IL-2, uključujući humane i sisarske forme, konzervativne aminokiselinske supstitucije, glikoforme, biosimilare, i njihove varijante. IL-15 je opisan, npr., u Fehniger and Caligiuri, Blood 2001, 97, 14-32. IL-15 deli β i γ signalnu receptorsku podjedinicu sa IL-2. Rekombinantni humani IL-15 je jedan neglikozilovani polipeptidni lanac koji sadrži 114 amino-kiselina (i N-terminalni metionin) sa molekulskom masom od 12.8 kDa. Rekombinantni humani IL-15 komercijalno se može nabaviti od većeg broja snabdevača, uključujući ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA (kat. br. CYT-230-b) i ThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA (humani IL-15 rekombinantni protein, kat. br. 34-8159-82). Aminokiselinska sekvenca rekombinantnog humanog IL-15 pogodna za upotrebu u pronalasku data je u Tabeli 2 (SEQ ID NO:7).
[0136] Izraz "IL-21" (ovde nazvan i "IL21") označava pleotropni citokinski protein poznat kao interleukin-21, i obuhvata sve forme IL-21 uključujući humane i sisarske forme, konzervativne aminokiselinske supstitucije, glikoforme, biosimilare, i njihove varijante. IL-21 je opisan, npr., u Spolski and Leonard, Nat. Rev. Drug. Disc. 2014,13, 379-95. IL-21 prvenstveno proizvode T ćelije-prirodne ubice i aktivirane humane CD4+ T ćelije. Rekombinantni humani IL-21 je jedan neglikozilovani polipeptidni lanac koji sadrži 132 amino-kiseline, sa molekulskom masom od 15.4 kDa. Rekombinantni humani IL-21 komercijalno se može nabaviti od većeg broja snabdevača, uključujući ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA (kat. br. CYT-408-b) i ThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA (humani IL-21 rekombinantni protein, kat. br. 14-8219-80). Aminokiselinska sekvenca rekombinantnog humanog IL-21 pogodna za upotrebu u pronalasku data je u Tabeli 2 (SEQ ID NO:8).
[0137] Kada je navedena "antitumorski efikasna količina", "tumor-inhibirajuća efikasna količina", ili "terapijska količina", preciznu količinu kompozicija predmetnog pronalaska koju treba primeniti može odrediti lekar, uz razmatranje pojedinačnih razlika u starosti, težini, veličini tumora, obimu infekcije ili metastaza, i stanju pacijenta (subjekta). Uopšteno, može se smatrati da farmaceutska kompozicija koja sadrži tumor-infiltrirajuće limfocite (npr. sekundarni TIL ili genetički modifikovani citotoksični limfociti) opisana u ovom tekstu može da se primeni u dozi od 104 do 1011 ćelija/kg telesne težine (npr., 10<5>do 10<6>, 10<5>do 10<10>, 10<5>do 1011 , 106 do 1010, 106 do 1011 ,107 do 1011 , 107 do 1010, 108 do 1011 , 108 do 1010, 109 do 1011 , ili 109 do 1010 ćelija/kg telesne težine), uključujući sve vrednosti u celim brojevima unutar ovih opsega. Kompozicije tumor-infiltrirajućih limfocita (uključujući u nekim slučajevima, genetički modifikovane citotoksične limfocite) mogu se u ovim dozama primeniti više puta. Tumor-infiltrirajući limfociti (uključujući, u nekim slučajevima, genetički modifikovane) mogu se primeniti korišćenjem infuzionih tehnika koje su opštepoznate u imunoterapiji (vidi, npr., Rosenberg et al., New Eng. J. of Med.319: 1676, 1988). Optimalnu dozu i režim tretmana za određenog pacijenta lako može odrediti stručnjak u oblasti medicine, praćenjem pacijenta u pogledu znakova bolesti i podešavanjem tretmana u skladu sa tim.
[0138] Izraz "hematološki malignitet" označava kancere sisara i tumore hematopoetskog i limfoidnog tkiva, uključujući, ali ne ograničavajući se na tkiva krv, kostnu srž, limfne čvorove, i limfni sistem. Hematološki maligniteti se označavaju i kao "tečni tumori". Hematološki maligniteti uključuju, ali se ne ograničavaju na akutnu limfoblastnu leukemiju (acute lymphoblastic leukemia, ALL), hronični limfocitni limfom (chronic lymphocytic lymphoma, CLL), limfom malih limfocita (small lymphocytic lymphoma, SLL), akutnu mijelogenu leukemiju (acute myelogenous leukemia, AML), hroničnu mijelogenu leukemiju (chronic myelogenous leukemia, CML), akutnu monocitnu leukemiju (acute monocytic leukemia AMoL), Hodgkinov limfom, i ne-Hodgkinove limfome. Izraz "hematološki malignitet B ćelija" označava hematološke malignitete koji zahvataju B ćelije.
[0139] Izraz "solidni tumor" označava nenormalnu masu tkiva koja občno ne sadrži ciste ili tečna područja. Solidni tumori mogu biti benigni ili maligni. Izraz "solidni tumorski kancer" označava maligne, neoplastične ili kancerozne solidne tumore. Solidni tumorski kanceri uključuju, ali se ne ograničavaju na sarkome, karcinome i limfome, kao što su kanceri pluća, dojke, prostate, kolona, rektuma, i mokraćne bešike. Tkivna struktura solidnih tumora obuhvata međusobno zavisne tkivne kompartmente uključujući parenhim (kancerske ćelije) i potporne ćelije strome u kojima su kancerske ćelije dispergovane i koje mogu obezbediti podržavajuće mikorookruženje.
[0140] Izraz "tečni tumor" označava nenormalnu masu ćelija koja je po prirodi fluidna. Tečni tumorski kanceri uključuju, ali se ne ograničavaju na leukemije, mijelome i limfome, kao i druge hematološke malignitete. TIL dobijeni iz tečnih tumora mogu da se označe u ovom tekstu i kao limfociti koji infiltriraju srž (marrow infiltrating lymphocytes, MIL).
[0141] Izraz "mikrookruženje", kako se koristi u ovom tekstu, može označavati mikrookruženje solidnog ili hematološkog tumora kao celine ili individualne podgrupe ćelija u mikrookruženju. Tumorsko mikrookruženje, kako se koristi u ovom tekstu, označava kompleksnu smešu "ćelija, solubilnih faktora, signalnih molekula, vanćelijskog matriksa i mehaničkih faktora koji promovišu neoplastičnu transformaciju, podržavaju tumorski rast i invaziju, štite tumor od imunskih mehanizama, održavaju rezistenciju na lečenja, i obezbeđuju niše za napredovanje dominantnih metastaza", kako je opisano u Swartz, et al., Cancer Res., 2012, 72, 2473. Iako tumori eksprimiraju antigene koje bi T ćelije trebalo da prepoznaju, klirens tumora imunskim sistemom je redak zbog imunosupresije mikrookruženjem.
[0142] U primeru izvođenja, pronalazak uključuje postupak lečenja kancera populacijom TIL, pri čemu je pacijent pre infuzije TIL prema pronalasku tretiran nemijeloablativnom hemioterapijom. U nekim primerima izvođenja, može se obezbediti populacija TIL, pri čemu je pacijent pre infuzije TIL prema predmetnom pronalasku tretiran nemijeloablativnom hemioterapijom. U primeru izvođenja, nemijeloablativna hemioterapiju čine ciklofosfamid 60 mg/kg/d tokom 2 dana (dani 27 i 26 pre TIL infuzije) i fludarabin 25 mg/m2/d tokom 5 dana (dani 27 do 23 pre TIL infuzije). U primeru izvođenja, posle nemijeloablativne hemioterapije i TIL infuzije (na dan 0) prema pronalasku, pacijent prima intravensku infuziju IL-2 u dozi od 720,000 IU/kg svakih 8 sati do fiziološke tolerancije.
[0143] Eksperimentalni rezultati ukazuju na to da limfodeplecija pre adoptivnog transfera tumor-specifičnih T limfocita igra ključnu ulogu u pojačavanju efikasnosti tretmana eliminisanjem regulatornih T ćelija i kompetirajućih elemenata imunskog sistema ("konzumacija citokina"). Prema tome, neki primeri izvođenja pronalaska koriste korak limfodeplecije (nekada nazvan i "imunosupresivno kondicioniranje") kod pacijenta pre uvođenja rTIL pronalaska.
[0144] Izrazi "koadministracija", "koadministriranje", "primenjen u kombinaciji sa", "primenjuje u kombinaciji sa", "uporedo" i "istovremeno", kako se koriste u ovom tekstu, obuhvataju primenu dva ili više aktivnih farmaceutskih sastojaka (u poželjnom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, na primer, najmanje jedan agonist kalijumovih kanala u kombinaciji sa velikim brojem TIL) kod subjekta, tako da oba aktivna farmaceutska sastojka i/ili njihovi metaboliti budu istovremeno prisutni u subjektu. Uporeda primena uključuje istovremenu primenu u različitim kompozicijama, primenu u različito vreme u odvojenim kompozicijama, ili primenu u kompoziciji u kojoj su prisutna dva ili više aktivnih farmaceutskih sastojaka. Poželjne su istovremena primena u odvojenim kompozicijama i primena u kompoziciji u kojoj su prisutna oba sredstva.
[0145] Izraz "efikasna količina" ili "terapijski efikasna količina" označava količinu jedinjenja ili kombinacije jedinjenja kako je opisano u ovom tekstu, koja je dovoljna da ostvari svrhu kojoj je namenjena uključujući, ali ne ograničavajući se na lečenje bolesti. Terapijski efikasna količina može varirati u zavisnosti od predviđene primene (in vitro ili in vivo), ili stanja subjekta i bolesnog stanja koje se leči (npr., težina, starost i pol subjekta), jačine bolesnog stanja, ili načina primene. Izraz se takođe odnosi na dozu koja će indukovati određeni odgovor u ciljnim ćelijama (npr., smanjenje adhezije pločica i/ili migracije ćelija). Specifična doza će varirati u zavisnosti od određenih odabranih jedinjenja, režima doziranja koji će se pratiti, da li se jedinjenje primenjuje u kombinaciji sa drugim jedinjenjima, vremena primene, tkiva na koje se vrši primena, i fizičkog sistema dostave koji nosi jedinjenje.
[0146] Izrazi "tretman/lečenje", "tretirati/lečiti", "tretira/leči", i slično, označavaju dobijanje željenog farmakološkog i/ili fiziološkog efekta. Efekat može biti profilaktički u smislu potpunog ili delimičnog preveniranja bolesti ili njenih simptoma i/ili može biti terapijski u smislu delimičnog ili potpunog izlečenja bolesti i/ili neželjenog efekta koji se može pripisati bolesti. "Tretman/lečenje", kako se koristi u ovom tekstu, pokriva svaki tretman bolesti kod sisara, posebno kod ljudi, i uključuje: (a) prevenciju pojave bolesti kod subjekta koji može biti
4
predisponiran za bolest, ali mu ona još uvek nije dijagnostikovana; (b) inhibiciju bolesti, tj., zaustavljanje njenog razvoja ili napredovanja; i (c) olakšavanje bolesti, tj., izazivanje regresije bolesti i/ili olakšavanje jednog ili više simptoma bolesti. "Tretman/lečenje" takođe treba da obuhvati dostavu sredstva sa ciljem obezbeđivanja farmakološkog efekta, čak i u odsustvu bolesti ili stanja. Na primer, "tretman/lečenje" obuhvata dostavu kompozicije koja može pobuditi imunski odgovor ili obezbediti imunost u odsustvu bolesnog stanja, npr., u slučaju vakcine.
[0147] Izraz "heterologno", kada se koristi u vezi sa delovima nukleinske kiseline ili proteina, označava da nukleinska kiselina ili protein sadrži dve ili više podsekvenci koje se ne nalaze u istom odnosu jedna sa drugom u prirodi. Na primer, nukleinska kiselina se tipično proizvodi rekombinantno, sa dve ili više sekvenci iz nesrodnih gena aranžirane tako da se napravi nova funkcionalna nukleinska kiselina, npr., promotor iz jednog izvora i kodirajući region iz drugog izvora, ili kodirajući regioni iz različitih izvora. Slično tome, heterologni protein označava da protein sadrži dve ili više podsekvenci koje se ne nalaze u istom odnosu jedna sa drugom u prirodi (npr., fuzioni protein).
[0148] Izrazi "identičnost sekvenci", "procenat identičnosti" i "procenat sekvencione identičnosti" (ili njihovi sinonimi, npr., "99% identičnosti") u kontekstu dve ili više nukleinske kiseline ili polipeptida, označava dve ili više sekvenci ili podsekvenci koje su iste ili imaju specifikovani procenat nukleotida ili aminokiselinskih rezidua koje su iste, kada se uporede i poravnaju (uz uvođenje procepa ako je potrebno) za maksimalno korespondiranje, ne uzimajući u obzir konzervativne aminokiselinske supstitucije kao deo sekvencione identičnosti. Procenat identičnosti može se meriti korišćenjem softvera ili algoritama za upoređivanja sekvenci ili vizuelnom inspekcijom. U struci su poznati različiti algoritmi i softveri koji se mogu koristiti za poravnavanje aminokiselinskih ili nukleotidnih sekvenci. Pogodni programi za određivanje identičnosti sekvenci uključuju na primer BLAST programski paket koji se može nabaviti preko BLAST veb-stranice Nacionalnog centra za biotehnološke informacije vlade SAD. Upoređivanje dveju sekvenci može se izvesti korišćenjem BLASTN ili BLASTP algoritma. BLASTN se koristi za upoređivanje sekvenci nukleinskih kiselina, dok se BLASTP koristi za upoređivanje aminokiselinskih sekvenci. ALIGN, ALIGN-2 (Genentech, South San Francisco, California) ili MegAlign, dostupni preko DNASTAR, su dodatni javno dostupni softverski programi koji se mogu koristiti za poravnavanje sekvenci. Stručnjak u oblasti može odrediti odgovarajuće parametre za maksimalno poravnavanje, određenim softverom za poravnavanje. U određenim primerima izvođenja, koriste se zadati parametri softvera za poravnavanje.
[0149] Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "varijanta" obuhvata, ali se ne ograničava na antitela ili fuzione proteine koji sadrže aminokiselinsku sekvencu koja se razlikuje od aminokiselinske sekvence referentnog antitela po jednoj ili više supstitucija, delecija i/ili adicija na određenim pozicijama unutar ili uz aminokiselinsku sekvencu referentnog antitela. Varijanta može sadržati jednu ili više konzervativnih supstitucija u aminokiselinskoj sekvenci u poređenju sa aminokiselinskom sekvencom referentnog antitela. Konzervativne supstitucije mogu uključivati, npr., supstituciju slično naelektrisanih ili nenaelektrisanih amino-kiselina. Varijanta zadržava sposobnost da se specifično veže za antigen referentnog antitela. Izraz varijanta uključuje i pegilisana antitela ili proteine.
[0150] Pod "tumor-infiltrirajući limfociti" ili "TIL" u ovom tekstu podrazumeva se populacija ćelija originalno dobijenih kao bele krvne ćelije koje su napustile subjektov krvni tok i migrirale u tumor. TIL uključuju, ali se ne ograničavaju na CD8<+>citotoksične T ćelije (limfociti), Th1 i Th17 CD4+ T ćelije, ćelije-prirodne ubice, dendritske ćelije i M1 makrofage. TIL uključuju i primarne i sekundarne TIL. "Primarni TIL" su oni koji su dobijeni iz uzoraka pacijentovog tkiva, kako je navedeno u ovom tekstu (ponekad označeni kao "sveže sakupljeni"), a "sekundarni TIL" predstavljaju svaku TIL ćelijsku populaciju koja je ekspandirana ili koja je proliferisala kako se razmatra u ovom tekstu, uključujući, ali ne ograničavajući se na "bulk" TIL i ekspandirane TIL ("REP TIL"), kao i "reREP TIL", kako se razmatra u ovom tekstu. reREP TIL mogu uključivati na primer TIL druge ekspanzije ili TIL druge dodatne ekspanzije (kao što su, na primer, oni koji su opisani u Koraku D Slike 27, uključujući TIL označene kao reREP TIL).
[0151] TIL mogu uopšteno da se definišu biohemijski, korišćenjem površinskih markera, ili funkcionalno, prema sposobnosti da infiltriraju tumore i ostvare lečenje. TIL mogu uopšteno da se kategorizuju prema eksprimiranju jednog ili više od sledećih biomarkera: CD4, CD8, TCR αβ, CD27, CD28, CD56, CCR7, CD45Ra, CD95, PD-1, i CD25. Dodatno i alternativno, TIL mogu funkcionalno da se definišu prema sposobnosti da infiltriraju solidne tumore posle ponovnog uvođenja u pacijenta. TIL mogu da se karakterišu i prema potenciji - na primer, TIL mogu da se smatraju potentnim ako je, na primer, oslobađanje interferona (IFN) veće od oko 50 pg/mL, veće od oko 100 pg/mL, veće od oko 150 pg/mL, ili veće od oko 200 pg/mL.
[0152] Izrazi "farmaceutski prihvatljivi nosač" ili "farmaceutski prihvatljivi ekscipijent" treba da uključuju bilo koji i sve rastvarače, disperzione medijume, obloge, antibakterijska i antigljivična sredstva, izotonična sredstva i sredstva za odlaganje apsorpcije, i inertne sastojke. Upotreba tih farmaceutski prihvatljivih nosača ili farmaceutski prihvatljivih ekscipijenata za aktivne farmaceutske sastojke dobro je poznato u struci. Osim ako je neki konvencionalni farmaceutski prihvatljivi nosač ili farmaceutski prihvatljivi ekscipijent nekompatibilan sa aktivnim farmaceutskim sastojkom, razmatra se njihova upotreba u terapijskim kompozicijama pronalaska. Dodatni aktivni farmaceutski sastojci, kao što su drugi lekovi.
[0153] Izrazi "oko" i "približno" znače unutar statistički smislenog opsega vrednosti. Taj opseg može biti unutar reda veličine, poželjno unutar 50%, poželjnije unutar 20%, poželjnije unutar 10%, i još poželjnije unutar 5% od date vrednosti ili opsega. Dopuštena varijacija obuhvaćena izrazima "oko" i "približno" zavisi od određenog sistema koji se izučava, i može je lako proceniti prosečno obučeni stručnjak u oblasti. Pored toga, kako se koriste u ovom tekstu, izrazi "oko" i "približno" znače da dimenzije, veličine, formulacije, parametri, oblici i drugi kvantiteti i karakteristike nisu i ne moraju biti tačni, već mogu biti približni i/ili veći ili manji, po želji, odražavajući toleranciju, faktore konverzije, zaokruživanja, greške u merenju i slično, i druge faktore poznate stručnjacima u oblasti. Uopšteno, dimenzija, veličina, formulacija, parametar, oblik i drugi kvantitet i karakteristika je "oko" ili "približno" bez obzira na to da li je to izričito navedeno. Napominje se da se u primerima izvođenja veoma različitih veličina, oblika i dimenzija mogu koristiti opisani aranžmani.
[0154] Prelazni izrazi "uključuje/sadrži", "sastoji se suštinski od" i "sastoji se od", kada se koriste u priloženim patentnim zahtevima, u originalnoj i dopunjenoj formi, definišu obim patentnog zahteva u odnosu na to koji su nenavedeni dodatni elementi ili koraci, ako postoje, izuzeti iz obima patentnog(-ih) zahteva. Izraz "uključuje/sadrži" treba da bude inkluzivan ili otvoren i ne isključuje nijedan dodatni nenavedeni element, postupak, korak ili materijal. Izraz "sastoji se od" isključuje svaki element, korak ili materijal različiti od onog koji je specifikovan u patentnom zahtevu i, u poslednjem slučaju, nečistoće uobičajeno udružene sa specifikovanim materijalom(-ima). Izraz "sastoji se suštinski od" ograničava obim patentnog zahteva na specifikovane elemente, korake ili materijal(-e) i ono što materijalno ne utiče na osnov i novu karakteristiku(-e) zahtevanog pronalaska. Sve kompozicije, postupci i kitovi opisani u ovom tekstu, koji predstavljaju primer izvođenja predmetnog pronalaska mogu, u alternativnim primerima izvođenja, biti određenije definisani nekim od prelaznih izraza "uključuje/sadrži", "sastoji se suštinski od" i "sastoji se od".
III. Procesi izrade TIL
[0155] Primer TIL procesa poznatog kao proces 2A koji sadrži neku od ovih osobina prikazan je na Slici 1, i neke od prednosti ovog primera izvođenja predmetnog pronalaska nad procesom 1C opisane su na Slici 2, kao i Slici 84. Proces 1C prikazan je radi poređenja na
4
Slici 3. Dve alternativne vremenske linije za TIL terapiju na bazi procesa 2A prikazane su na Slici 4 (veći broj ćelija) i Slici 5 (manji broj ćelija). Primer izvođenja procesa 2A prikazan je na Slici 6 kao i na Slici 27. Slike 83 i 84 obezbeđuju i primer procesa 2A u poređenju sa primerom procesa 1C.
[0156] Kako se razmatra u ovom tekstu, predmetni pronalazak može uključivati korak povezan sa restimulacijom krioprezerviranih TIL kako bi se povećala njihova metabolička aktivnost, a tako i relativno zdravlje, pre transplantacije u pacijenta, i postupke testiranja pomenutog metaboličkog zdravlja. Kao što je uopšteno naznačeno u ovom tekstu, TIL se obično uzimaju iz pacijentovog uzorka i obrađuju da bi se njihov broj povećao pre transplantiranja u pacijenta. U nekim primerima izvođenja, TIL mogu opciono da se obrade genetički, kao što će se razmatrati u nastavku ovog teksta.
[0157] U nekim primerima izvođenja, TIL mogu da se krioprezerviraju. Kada se odmrznu, mogu i da se restimulišu da bi im se povećao metabolizam pre nego što se infuzijom unesu u pacijenta.
[0158] U nekim primerima izvođenja, prva ekspanzija (uključujući procese označene kao preREP kao i procese pokazane na Slici 27 kao Korak A) skraćena je na 3 do 14 dana i druga ekspanzija (uključujući procese označene kao REP kao i procese pokazane na Slici 27 kao Korak B) skraćena je na 7 do 14 dana, kako se detaljnije razmatra u nastavku ovog teksta, kao i u primerima i slikama. U nekim primerima izvođenja, prva ekspanzija (na primer, ekspanzija opisana kao Korak B na Slici 27) skraćena je na 11 dana i druga ekspanzija (na primer, ekspanzija opisana u Koraku D na Slici 27) skraćena je na 11 dana, kako se razmatra u Primerima i kako je prikazano na Slikama 4, 5 i 27. U nekim primerima izvođenja, kombinacija prve ekspanzije i druge ekspanzije (na primer, ekspanzije opisane kao Korak B i Korak D na Slici 27) skraćena je na 22 dana, kako se razmatra detaljno u nastavku ovog teksta i u primerima i na slikama.
[0159] Oznake "koraka" A, B, C, itd., u nastavku, odnose se na Sliku 27 i na određene primere izvođenja opisane u ovom tekstu. Redosled Koraka u nastavku teksta i na Slici 27 je primer, a predmetna prijava i postupci objavljeni u ovom tekstu imaju u vidu svaku kombinaciju ili redosled koraka, kao i dodatne korake, ponavljanje koraka, i/ili izostavljanje koraka.
A. KORAK A: Dobijanje uzorka tumora od pacijenta
[0160] Uopšteno, TIL se inicijalno dobijaju iz uzorka pacijentovog tumora ("primarni TIL") i zatim se ekspandiraju u veću populaciju za dalju obradu, kako je opisano u ovom tekstu, opciono krioprezerviraju, restimulišu kako je navedeno u ovom tekstu i opciono evaluiraju u pogledu fenotipa i metaboličkih parametara kao pokazatelja zdravlja TIL.
[0161] Uzorak pacijentovog tumora može se dobiti korišćenjem postupaka poznatih u struci, obično hirurškom resekcijom, biopsijom iglom ili drugim načinima dobijanja uzorka koji sadrži mešavinu tumorskih i TIL ćelija. Uopšteno, uzorak tumora može biti iz bilo kojeg solidnog tumora, uključujući primarne tumore, invazivne tumore ili metastatske tumore. Uzorak tumora može biti i tečni tumor, kao što je tumor dobijen iz hematološkog maligniteta. Solidni tumor može biti kancer bilo kojeg tipa, uključujući, ali ne ograničavajući se na kancer dojke, pankreasa, prostate, kolorektalni kancer, kancer pluća, mozga, bubrega, želuca i kože (uključujući, ali ne ograničavajući se na karcinom skvamoznih ćelija, karcinom bazalnih ćelija, i melanom). U nekim primerima izvođenja, korisni TIL se dobijaju iz malignih melanoma, jer je bilo saopšteno da oni imaju posebno visoke nivoe TIL.
[0162] Izraz "solidni tumor" označava abnormalnu masu tkiva koja obično ne sadrži ciste ili tečna područja. Solidni tumori mogu biti benigni ili maligni. Izraz "solidni tumorski kancer" označava maligne, neoplastične, ili kancerozne solidne tumore. Solidni tumorski kanceri uključuju, ali se ne ograničavaju na sarkome, karcinome i limfome, kao što su kancer pluća, dojke, trostruko negativni kancer dojke, kancer prostate, kolona, rektuma i mokraćne bešike. U nekim primerima izvođenja, kancer se bira između kancera cerviksa, kancera glave i vrata (uključujući, na primer, karcinom skvamoznih ćelija glave i vrata, HNSCC), glioblastoma, kancera ovarijuma, sarkoma, kancera pankreasa, kancera mokraćne bešike, kancera dojke, trostruko negativnog kancera dojke, i nesitnoćelijskog karcinoma pluća. Struktura tkiva solidnih tumora obuhvata međusobno zavisne tkivne kompartmente, uključujući parenhim (kancerske ćelije) i potporne ćelije strome među kojima su kancerske ćelije dispergovane i koje mogu obezbediti podržavajuće mikrookruženje.
[0163] Izraz "hematološki malignitet" označava kancere sisara i tumore hematopoetskih i limfoidnih tkiva, uključujući, ali ne ograničavajući se na krvno tkivo, tkivo kostne srži, limfnih čvorova i limfnog sistema. Hematološki maligniteti su označeni i kao "tečni tumori". Hematološki maligniteti uključuju, ali se ne ograničavaju na akutnu limfoblastnu leukemiju (ALL), hronični limfocitni limfom (CLL), limfom malih limfocita (SLL), akutnu mijelogenu leukemiju (AML), hroničnu mijelogenu leukemiju (CML), akutnu monocitnu leukemiju (AMoL), Hodgkinov limfom, i ne-Hodgkinove limfome. Izraz "hematološki malignitet B ćelija" označava hematološke malignitete koji zahvataju B ćelije.
[0164] Kada se dobiju, uzorci tumora se obično fragmentišu disekcijom oštrim instrumentom u male komade veličine od 1 do oko 8 mm<3>, pri čemu su oni od oko 2-3 mm<3>posebno korisni.
4
TIL se kultivišu iz ovih fragmenata korišćenjem enzimskih tumorskih digestata. Takvi tumorski digestati mogu se proizvesti inkubacijom u enzimskom medijumu (npr., Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 pufer, 2 mM glutamat, 10 mcg/mL gentamicin, 30 jedinica/mL DNaze i 1.0 mg/mL kolagenaze) što je praćeno mehaničkom disocijacijom (npr., korišćenjem tkivnog disacijatora). Tumorski digestati mogu da se proizvedu stavljanjem tumora u enzimski medijum i mehaničkim disociranjem tumora tokom približno 1 minuta, što je praćeno inkubacijom u trajanju od 30 minuta na 37 °C u 5% CO2, i zatim ponavljanim ciklusima mehaničke disocijacije i inkubacije pod napred navedenim uslovima dok ne budu prisutni samo mali komadi tkiva. Na kraju ovog procesa, ako ćelijska suspenzija sadrži veliki broj crvenih krvnih ćelija ili mrtvih ćelija, može se izvesti separacija na gustinskom gradijentu uz korićenje FICOLL granatog hidrofilnog polisaharida da bi se ove ćelije uklonile. Mogu se koristiti alternativni postupci poznati u struci, kao što su oni opisani u U.S. objavljenoj patentnoj prijavi br. 2012/0244133 A1. Svaki od navedenih postupaka može se upotrebiti u bilo kojem od primera izvođenja opisanih u ovom tekstu za postupke ekspandiranja TIL ili postupke lečenja kancera.
[0165] Uopšteno, sakupljena ćelijska suspenzija se naziva "primarna ćelijska populacija" ili "sveže sakupljena ćelijska populacija".
[0166] U nekim primerima izvođenja, fragmentacija obuhvata fizičku fragmentaciju, uključujući, na primer, disekciju, kao i digestiju. U nekim primerima izvođenja, fragmentacija je fizička fragmentacija. U nekim primerima izvođenja, fragmentacija je disekcija. U nekim primerima izvođenja, fragmentacija je fragmentacija digestijom. U nekim primerima izvođenja, TIL mogu da se inicijalno kultivišu iz enzimskih digestata tumora i fragmenata tumora dobijenih od pacijenata. U primeru izvođenja, TIL mogu inicijalno da se kultivišu iz enzimskih tumorskih digestata i tumorskih fragmenata dobijenih od pacijenata.
[0167] U nekim primerima izvođenja, kada je tumor solidni tumor, tumor se podvrgava fizičkoj fragmentaciji posle dobijanaja uzorka tumora u, na primer, Koraku A (kako je prikazano na Slici 27). U nekim primerima izvođenja, fragmentacija se dešava pre krioprezervacije. U nekim primerima izvođenja, fragmentacija se dešava posle krioprezervacije. U nekim primerima izvođenja, fragmentacija se dešava posle dobijanja tumora i u odsustvu ikakve krioprezervacije. U nekim primerima izvođenja, tumor se fragmentiše i 10, 20, 30, 40 ili više fragmenata ili komada stavi se u svaki kontejner za prvu ekspanziju. U nekim primerima izvođenja, tumor se fragmentiše i 30 ili 40 fragmenata ili komada stavi se u svaki kontejner za prvu ekspanziju. U nekim primerima izvođenja, tumor se fragmentiše i 40 fragmenata ili komada stavi se u svaki kontejner za prvu ekspanziju. U
4
nekim primerima izvođenja, više fragmenata obuhvata oko 4 do oko 50 fragmenata, pri čemu svaki fragment ima zapreminu od oko 27 mm3. U nekim primerima izvođenja, više fragmenata obuhvata oko 30 do oko 60 fragmenata sa ukupnom zapreminom od oko 1300 mm3 do oko 1500 mm3. U nekim primerima izvođenja, više fragmenata obuhvata oko 50 fragmenata sa ukupnom zapreminom od oko 1350 mm3. U nekim primerima izvođenja, više fragmenata obuhvata oko 50 fragmenata sa ukupnom masom od oko 1 grama do oko 1.5 grama. U nekim primerima izvođenja, više fragmenata obuhvata oko 4 fragmenta.
[0168] U nekim primerima izvođenja, TIL se dobijaju iz fragmenata tumora. U nekim primerima izvođenja, tumorski fragment se dobija disekcijom oštrim instrumentom. U nekim primerima izvođenja, tumorski fragment ima između oko 1 mm<3>i 10 mm<3>. U nekim primerima izvođenja, tumorski fragment ima između oko 1 mm<3>i 8 mm<3>. U nekim primerima izvođenja, tumorski fragment ima oko 1 mm<3>. U nekim primerima izvođenja, tumorski fragment ima oko 2 mm3. U nekim primerima izvođenja, tumorski fragment ima oko 3 mm<3>. U nekim primerima izvođenja, tumorski fragment ima oko 4 mm<3>. U nekim primerima izvođenja, tumorski fragment ima oko 5 mm<3>. U nekim primerima izvođenja, tumorski fragment ima oko 6 mm3. U nekim primerima izvođenja, the tumor fragment ima oko 7 mm<3>. U nekim primerima izvođenja, tumorski fragment ima oko 8 mm<3>. U nekim primerima izvođenja, tumorski fragment ima oko 9 mm<3>. U nekim primerima izvođenja, tumorski fragment ima oko 10 mm3.
[0169] U nekim primerima izvođenja, TIL se dobijaju iz tumorskih digestata. U nekim primerima izvođenja, tumorski digestati nastaju inkubacijom u enzimskom medijumu, na primer, ali ne ograničavajući se na RPMI 1640, 2 mM GlutaMAX, 10 mg/mL gentamicina, 30 U/mL DNaze, i 1.0 mg/mL kolagenaze, praćeno mehaničkom disocijacijom (GentleMACS, Miltenyi Biotec, Auburn, CA). Posle stavljanja tumora u enzimski medijum, tumor može mehanički da se disocira tokom približno 1 minuta. Rastvor zatim može da se inkubira 30 minuta na 37 °C u 5% CO2i zatim mehanički naruši ponovo u trajanju od približno 1 minuta. Pošto se ponovo inkubira 30 minuta na 37 °C u 5% CO2, tumor može da se mehanički narušava treći put tokom približno 1 minuta. U nekim primerima izvođenja, posle trećeg mehaničkog narušavanja, ako su prisutni veći komadi, na uzorak se primenjuju 1 ili 2 dodatne mehaničke disocijacije, sa ili bez dodatnih 30 minuta inkubacije na 37 °C u 5% CO2. U nekim primerima izvođenja, na kraju finalne inkubacije, ako ćelijska suspenzija sadrži veliki broj crvenih krvnih ćelija ili mrtvih ćelija, može se izvesti separacija na gustinskom gradijentu korišćenjem fikola da bi se ove ćelije uklonile.
4
[0170] U nekim primerima izvođenja, sakupljena ćelijska suspenzija pre prvog koraka ekspanzije naziva se "primarna ćelijska populacija" ili "sveže sakupljena" ćelijska populacija.
[0171] U nekim primerima izvođenja, ćelije se mogu opciono zamrznuti posle sakupljanja uzorka i uskladištiti zamrznute do uvođenja u ekspanziju opisanu u Koraku B, koja je opisana detaljnije u nastavku, i prikazano na Slici 27.
B. KORAK B: Prva ekspanzija
1. Mladi TILs
[0172] U nekim primerima izvođenja, predmetni postupci obezbeđuju dobijanje mladih TIL, koji su sposobni za povećane cikluse replikacije posle primene kod subjekta/pacijenta i kao takvi mogu obezbediti dodatne terapijske koristi u odnosu na starije TIL (tj., TIL koji su podvrgnuti većem broju ciklusa replikacije pre primene kod subjekta/pacijenta). Osobine mladih TIL opisane su u literaturi, na primer Donia, at al., Scandinavian Journal of Immunology, 75:157-167 (2012); Dudley et al., Clin Cancer Res, 16:6122-6131 (2010); Huang et al., J Immunother, 28(3):258-267 (2005); Besser et al., Clin Cancer Res, 19(17):OF1-OF9 (2013); Besser et al., J Immunother 32:415-423 (2009); Robbins, et al., J Immunol 2004; 173:7125-7130; Shen et al., J Immunother, 30:123-129 (2007); Zhou, et al., J Immunother, 28:53-62 (2005); i Tran, et al., J Immunother, 31:742-751 (2008).
[0173] Raznovrsni antigenski receptori T i B limfocita proizvode se somatskom rekombinacijom ograničenog, ali velikog broja genskih segmenata: V (varijabilni), D (diverzitet), J (spojni), i C (konstantni), određuju vezujuću specifičnost i nishodne primene imunoglobulina i T-ćelijskih receptora (TCR). Predmetni pronalazak obezbeđuje postupak stvaranja TIL koji pokazuju povećani diverzitet repertoara T-ćelija. U nekim primerima izvođenja, TIL dobijeni predmetnim postupkom pokazuju porast diverziteta repertoara T-ćelija. U nekim primerima izvođenja, TIL dobijeni predmetnim postupkom pokazuju porast diverziteta repertoara T-ćelija u poređenju sa sveže sakupljenim TIL i/ili TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih obezbeđenih u ovom tekstu uključujući, na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, TIL dobijeni predmetnim postupkom pokazuju porast diverziteta T-ćelijskog repertoara u poređenju sa sveže sakupljenim TIL i/ili TIL pripremljenim korišćenjem postupka označenog kao proces 1C, što je za primer pokazano na Slici 83. U nekim primerima izvođenja, TIL dobijeni u prvoj ekspanziji pokazuju porast diverziteta T-ćelijskog repertoara. U nekim primerima izvođenja, porast diverziteta je porast diverziteta imunoglobulina i/ili diverziteta T-
4
ćelijskog repertoara. U nekim primerima izvođenja, diverzitet je u imunoglobulinu u imunoglobulinskom teškom lancu. U nekim primerima izvođenja, diverzitet je u imunoglobulinu u imunoglobulinskom lakom lancu. U nekim primerima izvođenja, diverzitet je u T-ćelijskom receptoru. U nekim primerima izvođenja, diverzitet je u jednom od T-ćelijskih receptora odabranom iz grupe koju čine alfa, beta, gama, i delta receptor. U nekim primerima izvođenja, postoji porast ekspresije T-ćelijskog receptora (TCR) alfa i/ili beta. U nekim primerima izvođenja, postoji porast ekspresije T-ćelijskog receptora (TCR) alfa. U nekim primerima izvođenja, postoji porast ekspresije T-ćelijskog receptora (TCR) beta. U nekim primerima izvođenja, postoji porast ekspresije TCRab (tj., TCRα/β).
[0174] Posle disekcije ili digestije tumorskih fragmenata, na primer kako je opisano u Koraku A Slike 27, dobijene ćelije se kultivišu u serumu koji sadrži IL-2, pod uslovima koji favorizuju rast TIL u odnosu na tumorske i druge ćelije. U nekim primerima izvođenja, tumorski digestati se inkubiraju u bunarčićima od 2 mL u medijumu koji sadrži inaktivirani humani AB serum sa 6000 IU/mL IL-2. Ova primarna ćelijska populacija kultiviše se tokom perioda od nekoliko dana, obično od 3 do 14 dana, rezultujući "bulk" TIL populacijom, obično oko 1 × 10<8>"bulk" TIL ćelija. Alternativno, ova primarna ćelijska populacija se kultiviše tokom perioda od 7 do 14 dana, rezultujući "bulk" TIL populacijom, obično oko 1 × 108 "bulk" TIL ćelija. Alternativno, ova primarna ćelijska populacija se kultiviše tokom perioda od 10 do 14 dana, rezultujući "bulk" TIL populacijom, obično oko 1 × 10<8>"bulk" TIL ćelija. Alternativno, ova primarna ćelijska populacija se kultiviše tokom perioda od oko 11 dana, rezultujući "bulk" TIL populacijom, obično oko 1 × 10<8>"bulk" TIL ćelija.
[0175] U poželjnom primeru izvođenja, ekspanzija TIL može da se izvede korišćenjem inicijalnog "bulk" TIL koraka ekspanzije (na primer kao što su oni opisani u Koraku B Slike 27, koji mogu uključivati procese označene kao pre-REP) kako je opisano u nastavku i u ovom tekstu, praćeno drugom ekspanzijom (Korak D, uključujući procese označene kao koraci protokola brze ekspanzije (REP)) kako je opisano u nastavku pod Korak D i u ovom tekstu, praćeno opcionim krioprezerviranjem, i praćeno drugim Korakom D (uključujući procese označene kao koraci restimulacije REP) kako je opisano u nastavku i u ovom tekstu. TIL dobijeni iz ovog procesa mogu se opciono okarakterisati u pogledu fenotipskih karakteristika i metaboličkih parametara, kako je opisano u ovom tekstu.
[0176] U primerima izvođenja gde se TIL kulture iniciraju u pločama sa 24 bunarčića, na primer, uz korišćenje Costar klastera za ćelijsku kulturu sa 24 bunarčića sa ravnim dnom (Corning Incorporated, Corning, NY, svaki bunarčić može se zasejati sa 1 × 10<6>ćelija
4
tumorskog digestata ili jednog tumorskog fragmenta u 2 mL kompletnog medijuma (complete medium, CM) sa IL-2 (6000 IU/mL; Chiron Corp., Emeryville, CA). U nekim primerima izvođenja, tumorski fragment ima između oko 1 mm<3>i 10 mm<3>.
[0177] U nekim primerima izvođenja, kultivacioni medijum prve ekspanzije označen je kao "CM", što je skraćenica za kultivacioni medijum. U nekim primerima izvođenja, CM za Korak B sastoji se od RPMI 1640 sa GlutaMAX, dopunjenog 10% humanim AB serumom, 25 mM Hepes, i 10 mg/mL gentamicinom. U primerima izvođenja gde se kulture iniciraju u flakonima permeabilnim za gas sa kapacitetom 40 mL i silikonskim dnom površine 10 cm<2>permeabilnim za gas (na primer, G-Rex10; Wilson Wolf Manufacturing, New Brighton, MN) (Sl. 1), svaki flakon se puni sa 10-40 × 10<6>vijabilnih ćelija tumorskog digestata ili 5-30 tumorskih fragmenata u 10-40 mL CM sa IL-2. G-Rex10 i ploče sa 24 bunarčića inkubiraju se u humidifikovanom inkubatoru na 37°C u 5% CO2i 5 dana posle inicijacije kulture, polovina medijuma se ukloni i zameni svežim CM i IL-2 i posle dana 5, polovina medijuma se menja svaka 2-3 dana.
[0178] Posle pripremanja tumorskih fragmenata, rezultujuće ćelije (tj., fragmenti) kultivišu se u serumu koji sadrži IL-2, pod uslovima koji favorizuju rast TIL u odnosu na tumorske i druge ćelije. U nekim primerima izvođenja, tumorski digestati se inkubiraju u bunarčićima od 2 mL u medijumu koji sadrži inaktivirani humani AB serum (ili, u nekim slučajevima, kako je navedeno u ovom tekstu, u prisustvu APC ćelijske populacije) sa 6000 IU/mL IL-2. Ova primarna ćelijska populacija kultiviše se tokom više dana, obično od 10 do 14 dana, što rezultuje "bulk" TIL populacijom, obično oko 1 ×10<8>"bulk" TIL ćelija. U nekim primerima izvođenja, medijum za rast tokom prve ekspanzije sadrži IL-2 ili njegovu varijantu. U nekim primerima izvođenja, IL je rekombinantni humani IL-2 (rhIL-2). U nekim primerima izvođenja stok-rastvor IL-2 ima specifičnu aktivnost 20-30 ×10<6>IU/mg za 1 mg fiolu. U nekim primerima izvođenja stok-rastvor IL-2 ima specifičnu aktivnost 20 ×10<6>IU/mg za 1 mg fiolu. U nekim primerima izvođenja stok-rastvor IL-2 ima specifičnu aktivnost 25 ×10<6>IU/mg za 1 mg fiolu. U nekim primerima izvođenja stok-rastvor IL-2 ima specifičnu aktivnost 30 ×10<6>IU/mg za 1 mg fiolu. U nekim primerima izvođenja stok-rastvor IL-2 ima finalnu koncentraciju 4-8 ×10<6>IU/mg IL-2. U nekim primerima izvođenja, stok-rastvor IL-2 ima finalnu koncentraciju 5-7 ×10<6>IU/mg IL-2. U nekim primerima izvođenja, stok-rastvor IL-2 ima finalnu koncentraciju 6 ×10<6>IU/mg IL-2. U nekim primerima izvođenja, stok rastvor IL-2 priprema se kako je opisano u Primeru 4. U nekim primerima izvođenja, kultivacioni medijum za prvu ekspanziju sadrži oko 10,000 IU/mL IL-2, oko 9,000 IU/mL IL-2, oko 8,000 IU/mL IL-2, oko 7,000 IU/mL IL-2, oko 6000 IU/mL IL-2 ili oko 5,000 IU/mL IL-2. U nekim primerima izvođenja, kultivacioni medijum za prvu ekspanziju sadrži oko 9,000 IU/mL IL-2 do oko 5,000 IU/mL IL-2. U nekim primerima izvođenja, kultivacioni medijum za prvu ekspanziju sadrži oko 8,000 IU/mL IL-2 do oko 6,000 IU/mL IL-2. U nekim primerima izvođenja, kultivacioni medijum za prvu ekspanziju sadrži oko 7,000 IU/mL IL-2 do oko 6,000 IU/mL IL-2. U nekim primerima izvođenja, kultivacioni medijum za prvu ekspanziju sadrži oko 6,000 IU/mL IL-2. U primeru izvođenja, medijum za ćelijsku kulturu sadrži još i IL-2. U nekim primerima izvođenja, medijum za ćelijsku kulturu sadrži oko 3000 IU/mL IL-2. U primeru izvođenja, medijum za ćelijsku kulturu sadrži još i IL-2. U poželjnom primeru izvođenja, medijum za ćelijsku kulturu sadrži oko 3000 IU/mL IL-2. U primeru izvođenja, medijum za ćelijsku kulturu sadrži oko 1000 IU/mL, oko 1500 IU/mL, oko 2000 IU/mL, oko 2500 IU/mL, oko 3000 IU/mL, oko 3500 IU/mL, oko 4000 IU/mL, oko 4500 IU/mL, oko 5000 IU/mL, oko 5500 IU/mL, oko 6000 IU/mL, oko 6500 IU/mL, oko 7000 IU/mL, oko 7500 IU/mL, ili oko 8000 IU/mL IL-2. U primeru izvođenja, medijum za ćelijsku kulturu sadrži između 1000 i 2000 IU/mL, između 2000 i 3000 IU/mL, između 3000 i 4000 IU/mL, između 4000 i 5000 IU/mL, između 5000 i 6000 IU/mL, između 6000 i 7000 IU/mL, između 7000 i 8000 IU/mL, ili oko 8000 IU/mL IL-2.
[0179] U nekim primerima izvođenja, kultivacioni medijum za prvu ekspanziju sadrži oko 500 IU/mL IL-15, oko 400 IU/mL IL-15, oko 300 IU/mL IL-15, oko 200 IU/mL IL-15, oko 180 IU/mL IL-15, oko 160 IU/mL IL-15, oko 140 IU/mL IL-15, oko 120 IU/mL IL-15, ili oko 100 IU/mL IL-15. U nekim primerima izvođenja, kultivacioni medijum za prvu ekspanziju sadrži oko 500 IU/mL IL-15 do oko 100 IU/mL IL-15. U nekim primerima izvođenja, kultivacioni medijum za prvu ekspanziju sadrži oko 400 IU/mL IL-15 do oko 100 IU/mL IL-15. U nekim primerima izvođenja, kultivacioni medijum za prvu ekspanziju sadrži oko 300 IU/mL IL-15 do oko 100 IU/mL IL-15. U nekim primerima izvođenja, kultivacioni medijum za prvu ekspanziju sadrži oko 200 IU/mL IL-15. U nekim primerima izvođenja, medijum za kulturu ćelija sadrži oko 180 IU/mL IL-15. U primeru izvođenja, medijum za kulturu ćelija sadrži još i IL-15. U poželjnom primeru izvođenja, medijum za kulturu ćelija sadrži oko 180 IU/mL IL-15.
[0180] U nekim primerima izvođenja, kultivacioni medijum za prvu ekspanziju sadrži oko 20 IU/mL IL-21, oko 15 IU/mL IL-21, oko 12 IU/mL IL-21, oko 10 IU/mL IL-21, oko 5 IU/mL IL-21, oko 4 IU/mL IL-21, oko 3 IU/mL IL-21, oko 2 IU/mL IL-21, oko 1 IU/mL IL-21, ili oko 0.5 IU/mL IL-21. U nekim primerima izvođenja, kultivacioni medijum za prvu ekspanziju sadrži oko 20 IU/mL IL-21 do oko 0.5 IU/mL IL-21. U nekim primerima
1
izvođenja, kultivacioni medijum za prvu ekspanziju sadrži oko 15 IU/mL IL-21 do oko 0.5 IU/mL IL-21. U nekim primerima izvođenja, kultivacioni medijum za prvu ekspanziju sadrži oko 12 IU/mL IL-21 do oko 0.5 IU/mL IL-21. U nekim primerima izvođenja, kultivacioni medijum za prvu ekspanziju sadrži oko 10 IU/mL IL-21 do oko 0.5 IU/mL IL-21. U nekim primerima izvođenja, kultivacioni medijum za prvu ekspanziju sadrži oko 5 IU/mL IL-21 do oko 1 IU/mL IL-21. U nekim primerima izvođenja, kultivacioni medijum za prvu ekspanziju sadrži oko 2 IU/mL IL-21. U nekim primerima izvođenja, medijum za kulturu ćelija sadrži oko 1 IU/mL IL-21. U nekim primerima izvođenja, medijum za kulturu ćelija sadrži oko 0.5 IU/mL IL-21. U primeru izvođenja, medijum za kulturu ćelija sadrži još i IL-21. U poželjnom primeru izvođenja, medijum za kulturu ćelija sadrži oko 1 IU/mL IL-21.
[0181] U nekim primerima izvođenja, kultivacioni medijum za prvu ekspanziju označen je kao "CM", što je skraćenica za kultivacioni medijum. U nekim primerima izvođenja, označen je kao CM1 (kultivacioni medijum 1). U nekim primerima izvođenja, CM se sastoji od RPMI 1640 sa GlutaMAX, dopunjen 10% humanim AB serumom, 25 mM Hepes, i 10 mg/mL gentamicina. U primerima izvođenja gde se kulture iniciraju u flakonima permeabilnim za gas sa kapacitetom 40 mL i silikonskim dnom površine 10 cm<2>permeabilnim za gas (na primer, G-Rex10; Wilson Wolf Manufacturing, New Brighton, MN) (Sl. 1), svaki flakon se puni sa 10-40 × 10<6>vijabilnih ćelija tumorskog digestata ili 5-30 tumorskih fragmenata u 10-40 mL CM sa IL-2. G-Rex10 i ploče sa 24 bunarčića inkubiraju se u humidifikovanom inkubatoru na 37°C u 5% CO2i 5 dana posle inicijacije kulture, polovina medijuma se ukloni i zameni svežim CM i IL-2 i posle dana 5, polovina medijuma se menja svaka 2-3 dana. U nekim primerima izvođenja, CM je CM1 opisan u Primerima, vidi Primer 5. U nekim primerima izvođenja, prva ekspanzija dešava se u inicijalnom medijumu za kulturu ćelija ili prvom medijumu za kulturu ćelija. U nekim primerima izvođenja, inicijalni medijum za kulturu ćelija ili prvi medijum za kulturu ćelija sadrži IL-2.
[0182] Proces prve ekspanzije (uključujući procese kao što su na primer oni opisani u koraku B Slike 27, koji mogu uključivati one koji se ponekad označavaju kao pre-REP) mogu se skratiti na 3-14 dana, kako se razmatra u primerima i na slikama. Prva ekspanzija (uključujući procese kao što su na primer oni opisani u koraku B Slike 27, koji mogu uključivati one koji se ponekad označavaju kao pre-REP) mogu se skratiti na 7 do 14 dana, kako se razmatra u Primerima i kako je prikazano na Slikama 4 i 5, kao i uključujući na primer, ekspanziju opisanu u Koraku B Slike 27. Prva ekspanzija Koraka B može se skratiti na 10-14 dana, kako se razmatra u Primerima i kako je prikazano na Slikama 4 i 5. U nekim primerima izvođenja,
2
prva ekspanzija je skraćena na 11 dana, kako se diskutuje u Primerima i kako je prikazano na Slikama 4 i 5, kao i uključujući na primer, ekspanziju opisanu u Koraku B Slike 27.
[0183] Prva TIL ekspanzija može se nastaviti 1 dan, 2 dana, 3 dana, 4 dana, 5 dana, 6 dana, 7 dana, 8 dana, 9 dana, 10 dana, 11 dana, 12 dana, 13 dana, ili 14 dana. Prva TIL ekspanzija može se nastaviti 1 dan do 14 dana. Prva TIL ekspanzija može se nastaviti 2 dana do 14 dana. Prva TIL ekspanzija može se nastaviti 3 dana do 14 dana. Prva TIL ekspanzija može se nastaviti 4 dana do 14 dana. Prva TIL ekspanzija može se nastaviti 5 dana do 14 dana. Prva TIL ekspanzija može se nastaviti 6 dana do 14 dana. Prva TIL ekspanzija može se nastaviti 7 dana do 14 dana. Prva TIL ekspanzija može se nastaviti 8 dana do 14 dana. Prva TIL ekspanzija može se nastaviti 9 dana do 14 dana. Prva TIL ekspanzija može se nastaviti 10 dana do 14 dana. Prva TIL ekspanzija može se nastaviti 11 dana do 14 dana. Prva TIL ekspanzija može se nastaviti 12 dana do 14 dana. Prva TIL ekspanzija može se nastaviti 13 dana do 14 dana. Prva TIL ekspanzija može se nastaviti 14 dana. Prva TIL ekspanzija može se nastaviti 1 dan do 11 dana. Prva TIL ekspanzija može se nastaviti 2 dana do 11 dana. U nekim primerima izvođenja, prva TIL ekspanzija može se nastaviti 3 dana do 11 dana. U nekim primerima izvođenja, prva TIL ekspanzija može se nastaviti 4 dana do 11 dana. U nekim primerima izvođenja, prva TIL ekspanzija može se nastaviti 5 dana do 11 dana. U nekim primerima izvođenja, prva TIL ekspanzija može se nastaviti 6 dana do 11 dana. U nekim primerima izvođenja, prva TIL ekspanzija može se nastaviti 7 dana do 11 dana. U nekim primerima izvođenja, prva TIL ekspanzija može se nastaviti 8 dana do 11 dana. U nekim primerima izvođenja, prva TIL ekspanzija može se nastaviti 9 dana do 11 dana. U nekim primerima izvođenja, prva TIL ekspanzija može se nastaviti 10 dana do 11 dana. U nekim primerima izvođenja, prva TIL ekspanzija može se nastaviti 11 dana.
[0184] U nekim primerima izvođenja, kombinacija IL-2, IL-7, IL-15, i/ili IL-21 koristi se kao kombinacija tokom prve ekspanzije. U nekim primerima izvođenja, IL-2, IL-7, IL-15, i/ili IL-21 kao i sve njihove kombinacije mogu se uključiti tokom prve ekspanzije, uključujući na primer tokom procesa Koraka B prema Slici 27, i kako je opisano u ovom tekstu. U nekim primerima izvođenja, kombinacija IL-2, IL-15, i IL-21 upotrebljava se kao kombinacija tokom prve ekspanzije. U nekim primerima izvođenja, IL-2, IL-15, i IL-21 kao i sve njihove kombinacije mogu se uključiti tokom procesa Koraka B prema Slici 27 i kako je opisano u ovom tekstu.
[0185] Procesi prve ekspanzije (uključujući procese označene kao pre-REP; na primer, Korak B prema Slici 27) mogu se skratiti na 3 do 14 dana, kako se razmatra u primerima i na slikama. Prva ekspanzija Koraka B može se skratiti na 7 do 14 dana, kako se razmatra u Primerima i kako je prikazano na Slikama 4 i 5. Prva ekspanzija Koraka B može se skratiti na 10 do14 dana, kako se razmatra u Primerima i kako je prikazano na Slikama 4, 5, i 27. U nekim primerima izvođenja, prva ekspanzija je skraćena na 11 dana, kako se razmatra u Primerima i kako je prikazano na Slikama 4, 5, i 27.
[0186] U nekim primerima izvođenja, prva ekspanzija, na primer, Korak B prema Slici 27, izvodi se u zatvorenom bioreaktorskom sistemu. U nekim primerima izvođenja, zatvoreni sistem se koristi za ekspanziju TIL. U nekim primerima izvođenja, koristi se jedan bioreaktor. U nekim primerima izvođenja, jedan upotrebljeni bioreaktor je na primer G-REX -10 ili G-REX -100. U nekim primerima izvođenja, zatvoreni bioreaktorski sistem je jedan bioreaktor.
C. KORAK C: Prelaz prve ekspanzije u drugu ekspanziju
[0187] U nekim slučajevima, "bulk" TIL populacija dobijena u prvoj ekspanziji, uključujući na primer TIL populaciju dobijenu na primer u Koraku B, kako je navedeno na Slici 27, može se odmah krioprezervirati, korišćenjem protokola koji se razmatraju u nastavku ovog teksta. Alternativno, TIL populacija dobijena u prvoj ekspanziji, označena kao druga TIL populacija, može se izložiti drugoj ekspanziji (koja može uključivati ekspanzije ponekad označene kao REP) i zatim krioprezervirati kako će biti objašnjeno u nastavku ovog teksta. Slično tome, u slučaju kada će se u terapiji koristiti genetički modifikovani TIL, prva TIL populacija (ponekad označena kao "bulk" TIL populacija) ili druga TIL populacija (koja može u nekim primerima izvođenja uključivati populacije označene kao REP TIL populacije) može se izložiti genetičkim modifikacijama za odgovarajuće tretmane, pre ekspanzije ili posle prve ekspanzije i pre druge ekspanzije.
[0188] U nekim primerima izvođenja, TIL dobijeni iz prve ekspanzije (na primer, iz Koraka B naznačenog na Slici 27) skladište se do fenotipizacije za odabir. U nekim primerima izvođenja, TIL dobijeni iz prve ekspanzije (na primer, iz Koraka B naznačenog na Slici 27) ne skladište se i nastavljaju direktno u drugu ekspanziju. U nekim primerima izvođenja, TIL dobijeni iz prve ekspanzije ne krioprezerviraju se posle prve ekspanzije, a pre druge ekspanzije. U nekim primerima izvođenja, prelaz iz prve ekspanzije u drugu ekspanziju dešava se oko 3 dana, 4 dana, 5 dana, 6 dana, 7 dana, 8 dana, 9 dana, 10 dana, 11 dana, 12 dana, 13 dana, ili 14 dana posle fragmentacije. U nekim primerima izvođenja, prelaz iz prve ekspanzije u drugu ekspanziju dešava se oko 3 dana do 14 dana posle fragmentacije. U nekim primerima izvođenja, prelaz iz prve ekspanzije u drugu ekspanziju dešava se oko 4 dana do 14 dana posle fragmentacije. U nekim primerima izvođenja, prelaz iz prve ekspanzije u drugu ekspanziju dešava se oko 4 dana do 10 dana posle fragmentacije. U nekim primerima
4
izvođenja, prelaz iz prve ekspanzije u drugu ekspanziju dešava se oko 7 dana do 14 dana posle fragmentacije. U nekim primerima izvođenja, prelaz iz prve ekspanzije u drugu ekspanziju dešava se oko 14 dana posle fragmentacije.
[0189] U nekim primerima izvođenja, prelaz iz prve ekspanzije u drugu ekspanziju dešava se 1 dan, 2 dana, 3 dana, 4 dana, 5 dana, 6 dana, 7 dana, 8 dana, 9 dana, 10 dana, 11 dana, 12 dana, 13 dana, ili 14 dana posle fragmentacije. U nekim primerima izvođenja, prelaz iz prve ekspanzije u drugu ekspanziju dešava se 1 dan do 14 dana posle fragmentacije. U nekim primerima izvođenja, prva TIL ekspanzija može da se nastavi 2 dana do 14 dana. U nekim primerima izvođenja, prelaz iz prve ekspanzije u drugu ekspanziju dešava se 3 dana do 14 dana posle fragmentacije. U nekim primerima izvođenja, prelaz iz prve ekspanzije u drugu ekspanziju dešava se 4 dana do 14 dana posle fragmentacije. U nekim primerima izvođenja, prelaz iz prve ekspanzije u drugu ekspanziju dešava se 5 dana do 14 dana posle fragmentacije. U nekim primerima izvođenja, prelaz iz prve ekspanzije u drugu ekspanziju dešava se 6 dana do 14 dana posle fragmentacije. U nekim primerima izvođenja, prelaz iz prve ekspanzije u drugu ekspanziju dešava se 7 dana do 14 dana posle fragmentacije. U nekim primerima izvođenja, prelaz iz prve ekspanzije u drugu ekspanziju dešava se 8 dana do 14 dana posle fragmentacije. U nekim primerima izvođenja, prelaz iz prve ekspanzije u drugu ekspanziju dešava se 9 dana do 14 dana posle fragmentacije. U nekim primerima izvođenja, prelaz iz prve ekspanzije u drugu ekspanziju dešava se 10 dana do 14 dana posle fragmentacije. U nekim primerima izvođenja, prelaz iz prve ekspanzije u drugu ekspanziju dešava se 11 dana do 14 dana posle fragmentacije. U nekim primerima izvođenja, prelaz iz prve ekspanzije u drugu ekspanziju dešava se 12 dana do 14 dana posle fragmentacije. U nekim primerima izvođenja, prelaz iz prve ekspanzije u drugu ekspanziju dešava se 13 dana do 14 dana posle fragmentacije. U nekim primerima izvođenja, prelaz iz prve ekspanzije u drugu ekspanziju dešava se 14 dana posle fragmentacije. U nekim primerima izvođenja, prelaz iz prve ekspanzije u drugu ekspanziju dešava se 1 dan do 11 dana posle fragmentacije. U nekim primerima izvođenja, prelaz iz prve ekspanzije u drugu ekspanziju dešava se 2 dana do 11 dana posle fragmentacije. U nekim primerima izvođenja, prelaz iz prve ekspanzije u drugu ekspanziju dešava se 3 dana do 11 dana posle fragmentacije. U nekim primerima izvođenja, prelaz iz prve ekspanzije u drugu ekspanziju dešava se 4 dana do 11 dana posle fragmentacije. U nekim primerima izvođenja, prelaz iz prve ekspanzije u drugu ekspanziju dešava se 5 dana do 11 dana posle fragmentacije. U nekim primerima izvođenja, prelaz iz prve ekspanzije u drugu ekspanziju dešava se 6 dana do 11 dana posle fragmentacije. U nekim primerima izvođenja, prelaz iz prve ekspanzije u drugu ekspanziju dešava se 7 dana do 11 dana posle fragmentacije. U nekim primerima izvođenja, prelaz iz prve ekspanzije u drugu ekspanziju dešava se 8 dana do 11 dana posle fragmentacije. U nekim primerima izvođenja, prelaz iz prve ekspanzije u drugu ekspanziju dešava se 9 dana do 11 dana posle fragmentacije. U nekim primerima izvođenja, prelaz iz prve ekspanzije u drugu ekspanziju dešava se 10 dana do 11 dana posle fragmentacije. U nekim primerima izvođenja, prelaz iz prve ekspanzije u drugu ekspanziju dešava se 11 dana posle fragmentacije.
[0190] U nekim primerima izvođenja, TIL se ne skladište posle prve ekspanzije i pre druge ekspanzije, i TIL nastavljaju direktno u drugu ekspanziju (na primer, u nekim primerima izvođenja, skladištenje izostaje tokom prelaza iz Koraka B u Korak D kako je prikazano na Slici 27). U nekim primerima izvođenja, prelaz se odvija u zatvorenom sistemu, kako je opisano u ovom tekstu. U nekim primerima izvođenja, TIL iz prve ekspanzije, druga populacija TIL, nastavljaju direktno u drugu ekspanziju bez prelaznog perioda.
[0191] U nekim primerima izvođenja, prelaz iz prve ekspanzije u drugu ekspanziju, na primer, Korak C prema Slici 27, odvija se u zatvorenom bioreaktorskom sistemu. U nekim primerima izvođenja, zatvoreni sistem se koristi za TIL ekspanziju, kako je opisano u ovom tekstu. U nekim primerima izvođenja, koristi se jedan bioreaktor. U nekim primerima izvođenja, jedan bioreaktor koji se koristi je na primer G-REX-10 ili G-REX-100. U nekim primerima izvođenja, zatvoreni bioreaktorski sistem je jedan bioreaktor.
D. KORAK D: Druga ekspanzija
[0192] U nekim primerima izvođenja, TIL ćelijska populacija se brojčano ekspandira posle sakupljanja i inicijalne obrade u masi, na primer, posle Koraka A i Koraka B, i prelaz se označava kao Korak C, kako je naznačeno na Slici 27). Ova dodatna ekspanzija označava se u ovom tekstu kao druga ekspanzija, koja može uključivati procese ekspanzije obično označene u struci kao proces brze ekspanzije (REP; kao i procesi navedeni u Koraku D Slike 27). Druga ekspanzija se obično izvodi korišćenjem kultivacionog medijuma koji sadrži brojne komponente, uključujući ćelije-hraniteljice, izvor citokina, i anti-CD3 antitelo, u kontejneru propustljivom za gas.
[0193] U nekim primerima izvođenja, druga ekspanzija ili druga TIL ekspanzija (koja može uključivati ekspanzije ponekad označene kao REP; kao i procese naznačene u Koraku D Slike 27) može se izvesti korišćenjem bilo kojeg TIL flakona ili kontejnera poznatog stručnjaku u oblasti. U nekim primerima izvođenja, druga TIL ekspanzija može da se nastavi 7 dana, 8 dana, 9 dana, 10 dana, 11 dana. Druga TIL ekspanzija može da se nastavi 12 dana, 13 dana, ili 14 dana. Druga TIL ekspanzija može da se nastavi oko 7 dana do oko 14 dana. Druga TIL ekspanzija može da se nastavi oko 8 dana do oko 14 dana. Druga TIL ekspanzija može da se nastavi oko 9 dana do oko 14 dana. Druga TIL ekspanzija može da se nastavi oko 10 dana do oko 14 dana. Druga TIL ekspanzija može da se nastavi oko 11 dana do oko 14 dana. Druga TIL ekspanzija može da se nastavi oko 12 dana do oko 14 dana. Druga TIL ekspanzija može da se nastavi oko 13 dana do oko 14 dana. Druga TIL ekspanzija može da se nastavi oko 14 dana.
[0194] U primeru izvođenja, druga ekspanzija može da se izvede u kontejneru propustljivom za gas, korišćenjem postupaka predmetne objave (uključujući na primer, ekspanzije označene kao REP; kao i procese naznačene u Koraku D Slike 27). Na primer, TIL mogu da se brzo ekspandiraju korišćenjem nespecifične stimulacije T-ćelijskog receptora u prisustvu interleukina-2 (IL-2) ili interleukina-15 (IL-15). Nespecifični stimulus za T-ćelijski receptor može uključivati, na primer, anti-CD3 antitelo, na primer oko 30 ng/ml OKT3, mišjeg monoklonskog anti-CD3 antitela (komercijalno se može nabaviti od Ortho-McNeil, Raritan, NJ ili Miltenyi Biotech, Auburn, CA) ili UHCT-1 (komercijalno se može nabaviti od BioLegend, San Diego, CA, USA). TIL se mogu ekspandirati da bi indukovali dodatnu stimulaciju TIL in vitro, uključivanjem jednog ili više antigena tokom druge ekspanzije, uključujući njegove antigenske delove, kao što su epitop(-i) kancera koji se opciono mogu eksprimirati iz vektora, kao što je vezujući peptid humanog leukocitnog antigena A2 (HLA-A2), npr., 0.3 μM MART-1 :26-35 (27 L) ili gpl 00:209-217 (210M), opciono u prisustvu faktora rasta T-ćelija, na primer 300 IU/mL IL-2 ili IL-15. Drugi pogodni antigeni mogu uključivati, npr., NY-ESO-1, TRP-1, TRP-2, tirozinazni kancerski antigen, MAGE-A3, SSX-2, i VEGFR2, ili njihove antigene delove. TIL mogu brzo da se ekspandiraju i restimulacijom HLA-A2-eksprimirajućim antigen-prezentujućim ćelijama pobuđenim istim antigenom(-ima) kancera. Alternativno, TIL mogu dodatno da se restimulišu, npr., ozračenim, autolognim limfocitima ili ozračenim HLA-A2+ alogenim limfocitima i IL-2. U nekim primerima izvođenja, restimulacija se dešava kao deo druge ekspanzije. U nekim primerima izvođenja, druga ekspanzija se dešava u prisustvu ozračenih, autolognih limfocita ili ozračenih HLA-A2+ alogenih limfocita i IL-2.
[0195] U primeru izvođenja, medijum za kulturu ćelija sadrži još i IL-2. U nekim primerima izvođenja, medijum za kulturu ćelija sadrži oko 3000 IU/mL IL-2. U primeru izvođenja, medijum za kulturu ćelija sadrži oko 1000 IU/mL, oko 1500 IU/mL, oko 2000 IU/mL, oko 2500 IU/mL, oko 3000 IU/mL, oko 3500 IU/mL, oko 4000 IU/mL, oko 4500 IU/mL, oko 5000 IU/mL, oko 5500 IU/mL, oko 6000 IU/mL, oko 6500 IU/mL, oko 7000 IU/mL, oko 7500 IU/mL, ili oko 8000 IU/mL IL-2. U primeru izvođenja, medijum za kulturu ćelija sadrži između 1000 i 2000 IU/mL, između 2000 i 3000 IU/mL, između 3000 i 4000 IU/mL, između 4000 i 5000 IU/mL, između 5000 i 6000 IU/mL, između 6000 i 7000 IU/mL, između 7000 i 8000 IU/mL, ili između 8000 IU/mL IL-2.
[0196] U primeru izvođenja, medijum za kulturu ćelija sadrži OKT3 antitelo. U nekim primerima izvođenja, medijum za kulturu ćelija sadrži oko 30 ng/mL OKT3 antitela. U primeru izvođenja, medijum za kulturu ćelija sadrži oko 0.1 ng/mL, oko 0.5 ng/mL, oko 1 ng/mL, oko 2.5 ng/mL, oko 5 ng/mL, oko 7.5 ng/mL, oko 10 ng/mL, oko 15 ng/mL, oko 20 ng/mL, oko 25 ng/mL, oko 30 ng/mL, oko 35 ng/mL, oko 40 ng/mL, oko 50 ng/mL, oko 60 ng/mL, oko 70 ng/mL, oko 80 ng/mL, oko 90 ng/mL, oko 100 ng/mL, oko 200 ng/mL, oko 500 ng/mL, i oko 1 mg/mL OKT3 antitela. U primeru izvođenja, medijum za kulturu ćelija sadrži između 0.1 ng/mL i 1 ng/mL, između 1 ng/mL i 5 ng/mL, između 5 ng/mL i 10 ng/mL, između 10 ng/mL i 20 ng/mL, između 20 ng/mL i 30 ng/mL, između 30 ng/mL i 40 ng/mL, između 40 ng/mL i 50 ng/mL, i između 50 ng/mL i 100 ng/mL OKT3 antitela.
[0197] U nekim primerima izvođenja, kombinacija IL-2, IL-7, IL-15, i/ili IL-21 koristi se kao kombinacija tokom druge ekspanzije. U nekim primerima izvođenja, IL-2, IL-7, IL-15, i/ili IL-21 kao i bilo koja njihova kombinacija, može se uključiti tokom druge ekspanzije, uključujući na primer tokom Koraka Step D procesa prema Slici 27, kao i kako je opisano u ovom tekstu. U nekim primerima izvođenja, kombinacija IL-2, IL-15, i IL-21 koristi se kao kombinacija tokom druge ekspanzije. U nekim primerima izvođenja, IL-2, IL-15, i IL-21 kao i bilo koja njihova kombinacija, može se uključiti tokom procesa Koraka D prema Slici 27 i kako je opisano u ovom tekstu.
[0198] U nekim primerima izvođenja, druga ekspanzija se može izvoditi u suplementisanom medijumu za ćelijsku kulturu koji sadrži IL-2, OKT-3, i antigen-prezentujuće ćelijehraniteljice. U nekim primerima izvođenja, druga ekspanzija se dešava u suplementisanom medijumu za ćelijsku kulturu. U nekim primerima izvođenja, suplementisani medijum za ćelijsku kulturu sadrži IL-2, OKT-3, i antigen-prezentujuće ćelije-hraniteljice. U nekim primerima izvođenja, drugi medijum za kulturu ćelija sadrži IL-2, OKT-3, i antigenprezentujuće ćelije (APC; označene i kao antigen-prezentujuće ćelije-hraniteljice). U nekim primerima izvođenja, druga ekspanzija se dešava u dopunjenom medijumu za ćelijsku kulturu koji sadrži IL-2, OKT-3, i antigen-prezentujuće ćelije-hraniteljice (tj., antigen-prezentujuće ćelije).
[0199] U nekim primerima izvođenja, kultivacioni medijum za drugu ekspanziju sadrži oko 500 IU/mL IL-15, oko 400 IU/mL IL-15, oko 300 IU/mL IL-15, oko 200 IU/mL IL-15, oko 180 IU/mL IL-15, oko 160 IU/mL IL-15, oko 140 IU/mL IL-15, oko 120 IU/mL IL-15, ili oko 100 IU/mL IL-15. U nekim primerima izvođenja, kultivacioni medijum za drugu ekspanziju sadrži oko 500 IU/mL IL-15 do oko 100 IU/mL IL-15. U nekim primerima izvođenja, kultivacioni medijum za drugu ekspanziju sadrži oko 400 IU/mL IL-15 do oko 100 IU/mL IL-15. U nekim primerima izvođenja, kultivacioni medijum za drugu ekspanziju sadrži oko 300 IU/mL IL-15 do oko 100 IU/mL IL-15. U nekim primerima izvođenja, kultivacioni medijum za drugu ekspanziju sadrži oko 200 IU/mL IL-15. U nekim primerima izvođenja, medijum za kulturu ćelija sadrži oko 180 IU/mL IL-15. U primeru izvođenja, medijum za kulturu ćelija sadrži još i IL-15. U poželjnom primeru izvođenja, medijum za kulturu ćelija sadrži oko 180 IU/mL IL-15.
[0200] U nekim primerima izvođenja, kultivacioni medijum za drugu ekspanziju sadrži oko 20 IU/mL IL-21, oko 15 IU/mL IL-21, oko 12 IU/mL IL-21, oko 10 IU/mL IL-21, oko 5 IU/mL IL-21, oko 4 IU/mL IL-21, oko 3 IU/mL IL-21, oko 2 IU/mL IL-21, oko 1 IU/mL IL-21, ili oko 0.5 IU/mL IL-21. U nekim primerima izvođenja, kultivacioni medijum za drugu ekspanziju sadrži oko 20 IU/mL IL-21 do oko 0.5 IU/mL IL-21. U nekim primerima izvođenja, kultivacioni medijum za drugu ekspanziju sadrži oko 15 IU/mL IL-21 do oko 0.5 IU/mL IL-21. U nekim primerima izvođenja, kultivacioni medijum za drugu ekspanziju sadrži oko 12 IU/mL IL-21 do oko 0.5 IU/mL IL-21. U nekim primerima izvođenja, kultivacioni medijum za drugu ekspanziju sadrži oko 10 IU/mL IL-21 do oko 0.5 IU/mL IL-21. U nekim primerima izvođenja, kultivacioni medijum za drugu ekspanziju sadrži oko 5 IU/mL IL-21 do oko 1 IU/mL IL-21. U nekim primerima izvođenja, kultivacioni medijum za drugu ekspanziju sadrži oko 2 IU/mL IL-21. U nekim primerima izvođenja, medijum za kulturu ćelija sadrži oko 1 IU/mL IL-21. U nekim primerima izvođenja, medijum za kulturu ćelija sadrži oko 0.5 IU/mL IL-21. U primeru izvođenja, medijum za kulturu ćelija sadrži još i IL-21. U poželjnom primeru izvođenja, medijum za kulturu ćelija sadrži oko 1 IU/mL IL-21.
[0201] U nekim primerima izvođenja antigen-prezentujuće ćelije-hraniteljice (APC) su PBMC. U primeru izvođenja, odnos TIL prema PBMC i/ili antigen-prezentujućim ćelijama u brzoj ekspanziji i/ili drugoj ekspanziji je oko 1 do 25, oko 1 do 50, oko 1 do 100, oko 1 do 125, oko 1 do 150, oko 1 do 175, oko 1 do 200, oko 1 do 225, oko 1 do 250, oko 1 do 275, oko 1 do 300, oko 1 do 325, oko 1 do 350, oko 1 do 375, oko 1 do 400, ili oko 1 do 500. U primeru izvođenja, odnos TIL prema PBMC u brzoj ekspanziji i/ili drugoj ekspanziji je između 1 do 50 i 1 do 300. U primeru izvođenja, odnos TIL prema PBMC u brzoj ekspanziji i/ili drugoj ekspanziji je između 1 do 100 i 1 do 200.
[0202] U primeru izvođenja, REP i/ili druga ekspanzija izvodi se u flakonima kada se "bulk" TIL mešaju sa 100-strukim ili 200-strukim viškom inaktiviranih ćelija-hraniteljica, 30 mg/mL OKT3 anti-CD3 antitela i 3000 IU/mL IL-2 u 150 ml medijuma. Zamena medijuma se obavlja (uopšteno 2/3 zamene medijuma respiracijom svežim medijumom) dok se ćelije ne prenesu u alternativnu komoru za rast. Alternativna komora za rast uključuje G-REX flakone i kontejnere propustljive za gas, kako se detaljnijen objašnjava u nastavku.
[0203] Druga ekspanzija (koja može uključivati procese označene kao REP proces) može se skratiti na 7-14 dana, kako se razmatra u primerima i na slikama. U nekim primerima izvođenja,
druga ekspanzija je skraćena na 11 dana.
[0204] U primeru izvođenja, REP i/ili druga ekspanzija može se izvoditi korišćenjem T-175 flakona i kesa propustljivih za gas kako je ranije opisano (Tran, et al., J. Immunother. 2008, 31, 742-51; Dudley, et al., J. Immunother. 2003, 26, 332-42) ili posuda za kulturu propustljivih za gas (G-Rex flakoni). U nekim primerima izvođenja, druga ekspanzija (uključujući ekspanzije označene kao brze ekspanzije) izvodi se u T-175 flakonima, i u svaki T-175 flakon može se dodati oko 1 x 10<6>TIL suspendovanih u 150 mL medijuma. TIL mogu da se kultivišu u mešavini 1 prema 1 CM i AIM-V medijuma, dopunjenog sa 3000 IU po mL IL-2 i 30 ng po ml anti-CD3. T-175 flakoni mogu da se inkubiraju na 37° C u 5% CO2. Polovina medijuma može da se promeni na dan 5 korišćenjem 50/50 medijuma sa 3000 IU po mL IL-2. U nekim primerima izvođenja, na dan 7 ćelije iz dva T-175 flakona mogu da se kombinuju u 3 L kesi i 300 mL AIM V sa 5% humanog AB seruma i 3000 IU po mL IL-2 se doda u 300 ml TIL suspenzije. Broj ćelija u svakoj kesici utvrđuje se na dan ili dva i sveži medijum se dodaje da bi se broj ćelija održao između 0.5 i 2.0 x 10<6>ćelija/mL.
[0205] U primeru izvođenja, druga ekspanzija (koja može uključivati ekspanzije označene kao REP, kao i one označene u Koraku D Slike 27) može se izvoditi u flakonima propustljivim za gas, kapaciteta 500 mL sa silikonskim dnom od 100 cm2 , propustljivim za gas (G-Rex 100, komercijalno se mogu nabaviti od Wilson Wolf Manufacturing Corporation, New Brighton, MN, USA), 5 ×10<6>ili 10 × 10<6>TIL mogu da se kultivišu sa PBMC u 400 mL 50/50 medijuma, suplementisanog sa 5% humanog AB seruma, 3000 IU po mL IL-2 i 30 ng po ml anti-CD3 (OKT3). G-Rex 100 flakoni mogu da se inkubiraju na 37°C u 5% CO2. Na dan 5, 250 mL supernatanta može da se ukloni i stavi u boce za centrifugiranje i centrifugira na 1500 rpm (491 × g) 10 minuta. TIL peleti mogu da se resuspenduju sa 150 mL svežeg medijuma sa 5% humanog AB seruma, 3000 IU po mL IL-2, i stave nazad u originalne G-Rex 100 flakone. Kada se TIL ekspandiraju serijski u G-Rex 100 flakonima, na dan 7 TIL u svakom G-Rex 100 mogu da se suspenduju u 300 mL medijuma prisutnog u svakom flakonu i ćelijska suspenzija može da se podeli na 3 alikvota od 100 mL, koji mogu da se koriste za zasejavanje 3 G-Rex 100 flakona. Zatim 150 mL AIM-V sa 5% humanog AB seruma i 3000 IU po mL IL-2 može se dodati u svaki flakon. G-Rex 100 flakoni mogu da se inkubiraju na 37° C u 5% CO2i posle 4 dana 150 mL AIM-V sa 3000 IU po mL IL-2 može se dodati u svaki G-REX 100 flakon. Ćelije mogu da se sakupe na dan 14 kulture.
[0206] U primeru izvođenja, druga ekspanzija (uključujući ekspanzije označene kao REP) obavlja se u flakonima sa "bulk" TIL pomešanim sa 100-strukim ili 200-strukim viškom inaktiviranih ćelija-hraniteljica, 30 mg/mL OKT3 anti-CD3 antitela i 3000 IU/mL IL-2 u 150 ml medijuma. U nekim primerima izvođenja, zamena medijuma se obavlja dok se ćelije ne prenesu u alternativnu komoru za rast. U nekim primerima izvođenja, 2/3 medijuma se zameni respiracijom svežim medijumom. U nekim primerima izvođenja, alternativna komora za rast uključuje G-REX flakone i kontejnere propustljive za gas, kako se detaljnijen diskutuje u nastavku.
[0207] U primeru izvođenja, druga ekspanzija (uključujući ekspanzije označene kao REP) se izvodi i uključuje još i korak u kojem se TIL biraju u pogledu superiorne reaktivnosti na tumor. Može se koristiti bilo koji postupak selekcije. Na primer, postupci opisani u U.S. objavljenoj patentnoj prijavi br. 2016/0010058 A1, mogu se upotrebiti za selektovanje TIL u pogledu superiorne reaktivnosti na tumor.
[0208] Opciono, test ćelijske vijabilnosti može se izvesti posle druge ekspanzije (uključujući ekspanzije označene kao REP ekspanzija), korišćenjem standardnih testova poznatih u struci. Na primer, na uzorku "bulk" TIL može da se izvrši test isključivanja tripan plavog, kojim se selektivno obeležavaju mrtve ćelije i omogućava procena vijabilnosti. U nekim primerima izvođenja, TIL uzorci mogu da se prebroje i vijabilnost odredi korišćenjem Cellometer K2 automatizovanog brojača ćelija (Nexcelom Bioscience, Lawrence, MA). U nekim primerima izvođenja, vijabilnost se određuje prema protokolu za Cellometer K2 imidž citometarskom automatizovanom brojaču ćelija, opisanom, na primer, u Primeru 15.
[0209] U nekim primerima izvođenja, druga ekspanzija (uključujući ekspanzije označene kao REP) TIL može se izvesti korišćenjem T-175 flakona i kesa propustljivih za gas kako je ranije opisano (Tran KQ, Zhou J, Durflinger KH, et al., 2008, J Immunother., 31:742-751, i Dudley ME, Wunderlich JR, Shelton TE, et al. 2003, J Immunother., 26:332-342) ili G-Rex flakona propustljivih za gas. U nekim primerima izvođenja, druga ekspanzija izvodi se korišćenjem flakona. U nekim primerima izvođenja, druga ekspanzija izvodi se korišćenjem G-Rex flakona permeabilnih za gas. U nekim primerima izvođenja, druga ekspanzija izvodi se u T-175 flakonima, i oko 1 x 106 TIL se suspenduje u oko 150 mL medijuma i ovo se doda u svaki T-175 flakona. TIL se kultivišu sa ozračenim (50 Gy) alogenim PBMC kao ćelijama-
1
"hraniteljicama" u odnosu 1 prema 100 i ćelije se kultivišu u mešavini CM i AIM-V medijuma (50/50 medijum) u odnosu 1 prema 1, suplementisanoj sa 3000 IU/mL IL-2 i 30 ng/mL anti-CD3. T-175 flakoni se inkubiraju na 37°C u 5% CO2. U nekim primerima izvođenja, polovina medijuma se zameni na dan 5 korišćenjem 50/50 medijuma sa 3000 IU/mL IL-2. U nekim primerima izvođenja, na dan 7, ćelije iz 2 T-175 flakona kombinuju se u 3 L kesi i 300 mL AIM-V sa 5% humanog AB seruma i 3000 IU/mL IL-2 doda se u 300 mL TIL suspenzije. Broj ćelija u svakoj kesi može da se određuje svakog dana ili svaka dva dana i sveži medijum može da se dodaje da bi se broj ćelija održao na između oko 0.5 i oko 2.0 x 10<6>ćelija/mL.
[0210] U nekim primerima izvođenja, druga ekspanzija (uključujući ekspanzije označene kao REP) izvodi se u flakonima kapaciteta 500 mL sa silikonskim dnom od 100 cm2 propustljivim za gas (G-Rex 100, Wilson Wolf) (Sl.1), oko 5x106 ili 10x106 TIL se kultiviše sa ozračenim alogenim PBMC u odnosu 1 prema 100 u 400 mL 50/50 medijuma, dopunjenog sa 3000 IU/mL IL-2 i 30 ng/ mL anti-CD3. G-Rex 100 flakoni se inkubiraju na 37°C u 5% CO2. U nekim primerima izvođenja, na dan 5, 250 mL supernatanta se ukloni i stavi u boce za centrifugiranje i centrifugira na 1500 rpm (491g) 10 minuta. TIL peleti tada mogu da se resuspenduju sa 150 mL svežeg 50/50 medijuma sa 3000 IU/mL IL-2 i doda ponovo u originalne G-Rex 100 flakone. U primerima izvođenja gde se TIL ekspandiraju serijski u GRex 100 flakonima, na dan 7 TIL u svakom G-Rex 100 se suspenduju u 300 mL medijuma prisutnog u svakom flakonu i ćelijska suspenzija se podeli u tri alikvota od po 100 mL koji se koriste za zasejavanje 3 G-Rex 100 flakona. Zatim se 150 mL AIM-V sa 5% humanog AB seruma i 3000 IU/mL IL-2 doda u svaki flakon. The G-Rex 100 flakoni se inkubiraju na 37°C u 5% CO2i posle 4 dana 150 mL AIM-V sa 3000 IU/mL IL-2 doda se u svaki G-Rex 100 flakon. Ćelije se sakupljaju 14. dana kulture.
[0211] Raznoliki antigenski receptori T i B limfocita proizvode se somatskom rekombinacijom ograničenog, ali velikog broja genskih segmenata. Ovi genski segmenti: V (varijabilni), D (diverzitet), J (spojni), i C (konstantni), određuju vezujuću specifičnost i nishodne primene imunoglobulina i T-ćelijskih receptora (TCR). Predmetni pronalazak obezbeđuje postupak stvaranja TIL koji ispoljavaju i povećavaju diverzitet repertoara T-ćelija. U nekim primerima izvođenja, TIL dobijeni predmetnim postupkom ispoljavaju porast diverzitet repertoara T-ćelija. U nekim primerima izvođenja, TIL dobijeni u drugoj ekspanziji spoljavaju porast diverzitet repertoara T-ćelija. U nekim primerima izvođenja, porast diverziteta je porast diverziteta imunoglobulina i/ili diverziteta repertoara T-ćelija. U nekim primerima izvođenja, diverzitet je u imunoglobulinu u teškom lancu imunoglobulina. U
2
nekim primerima izvođenja, diverzitet u imunoglobulinu je u lakom lancu imunoglobulina. U nekim primerima izvođenja, diverzitet je u T-ćelijskom receptoru. U nekim primerima izvođenja, diverzitet je u jednom od T-ćelijskih receptora odabranih iz grupe koju čine alfa, beta, gama, i delta receptori. U nekim primerima izvođenja, postoji porast ekspresije T-ćelijskog receptora (TCR) alfa i/ili beta. U nekim primerima izvođenja, postoji porast ekspresije T-ćelijskog receptora (TCR) alfa. U nekim primerima izvođenja, postoji porast ekspresije T-ćelijskog receptora (TCR) beta. U nekim primerima izvođenja, postoji porast ekspresije TCRab (tj., TCRα/β).
[0212] U nekim primerima izvođenja, kultivacioni medijum za drugu ekspanziju (npr., ponekad označen kao CM2 ili drugi medijum za kulturu ćelija), sadrži IL-2, OKT-3, kao i antigen-pretentujuće ćelije-hraniteljice (APC), kako se detaljnije razmatra u nastavku.
[0213] U nekim primerima izvođenja, druga ekspanzija, na primer, Korak D prema Slici 27, obavlja se u zatvorenom bioreaktorskom sistemu. U nekim primerima izvođenja, zatvoreni sistem se koristi za TIL ekspanziju, kako je opisano u ovom tekstu. U nekim primerima izvođenja, koristi se jedan bioreaktor. U nekim primerima izvođenja, jedan biorekator koji se koristi je na primer G-REX-10 ili G-REX-100. U nekim primerima izvođenja, zatvoreni bioreaktorski sistem je jedan bioreaktor.
1. Ćelije-hraniteljice i antigen-prezentujuće ćelije
[0214] U primeru izvođenja, procedure druge ekspanzije opisane u ovom tekstu (na primer uključujući ekspanziju kao što je opisano u Koraku D na Slici 27, kao i one označene kao REP) zahtevaju ćelije-hraniteljice u višku tokom REP TIL ekspanzije i/ili tokom druge ekspanzije. U mnogim primerima izvođenja, ćelije-hraniteljice su mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) dobijene iz standardnih jedinica cele krvi zdravih davalaca krvi. PBMC dobijaju se korišćenjem standardnih postupaka kao što je separacija na Ficoll-Paque gradijentu.
[0215] Uopšteno, alogene PBMC se inaktiviraju, ozračivanjem ili tretmanom toplotom, i koriste u REP procedurama, kako je opisano u primerima, posebno u primeru 14, koji daje primer protokola za evaluiranje izostanka sposobnosti za replikaciju ozračenih alogenih PBMC.
[0216] U nekim primerima izvođenja, PBMC se smatraju nesposobnim za replikaciju i prihvataju za upotrebu u procedurama TIL ekspanzije opisanim u ovom tekstu ako je ukupan broj vijabilnih ćelija na dan 14 manji od inicijalnog broja vijabilnih ćelija stavljenih u kulturu na dan 0 REP i/ili dan 0 druge ekspanzije (tj., početni dan druge ekspanzije). Vidi, na primer, Primer 14.
[0217] U nekim primerima izvođenja, PBMC se smatraju nesposobnim za replikaciju i prihvataju za upotrebu u procedurama TIL ekspanzije opisanim u ovom tekstu ako ukupan broj vijabilnih ćelija, kultivisanih u prisustvu OKT3 i IL-2, na dan 7 i dan 14 nije povećan u odnosu na inicijalni broj vijabilnih ćelija stavljenih u kulturu na dan 0 REP i/ili dan 0 druge ekspanzije (tj., početni dan druge ekspanzije). U nekim primerima izvođenja, PBMC se kultivišu u prisustvu 30 ng/ml OKT3 antitela i 3000 IU/ml IL-2. Vidi, na primer, Primer 13.
[0218] U nekim primerima izvođenja, PBMC se smatraju nesposobnim za replikaciju i prihvataju za upotrebu u procedurama TIL ekspanzije opisanim u ovom tekstu ako ukupan broj vijabilnih ćelija, kultivisanih u prisustvu OKT3 i IL-2, na dan 7 i dan 14 nije povećan u odnosu na inicijalni broj vijabilnih ćelija stavljenih u kulturu na dan 0 REP i/ili dan 0 druge ekspanzije (tj., početni dan druge ekspanzije). U nekim primerima izvođenja, PBMC se kultivišu u prisustvu 5-60 ng/ml OKT3 antitela i 1000-6000 IU/ml IL-2. U nekim primerima izvođenja, PBMC se kultivišu u prisustvu 10-50 ng/ml OKT3 antitela i 2000-5000 IU/ml IL-2. U nekim primerima izvođenja, PBMC se kultivišu u prisustvu 20-40 ng/ml OKT3 antitela i 2000-4000 IU/ml IL-2. U nekim primerima izvođenja, PBMC se kultivišu u prisustvu 25-35 ng/ml OKT3 antitela i 2500-3500 IU/ml IL-2.
[0219] U nekim primerima izvođenja, antigen-prezentujuće ćelije-hraniteljice su PBMC. U nekim primerima izvođenja, antigen-prezentujuće ćelije-hraniteljice su veštačke antigenprezentujuće ćelije-hraniteljice. U primeru izvođenja, odnos TIL prema antigenprezentujućim ćelijama-hraniteljicama u drugoj ekspanziji je oko 1 prema 25, oko 1 prema 50, oko 1 prema 100, oko 1 prema 125, oko 1 prema 150, oko 1 prema 175, oko 1 prema 200, oko 1 prema 225, oko 1 prema 250, oko 1 prema 275, oko 1 prema 300, oko 1 prema 325, oko 1 prema 350, oko 1 prema 375, oko 1 prema 400, ili oko 1 prema 500. U primeru izvođenja, odnos TIL prema antigen-prezentujućim ćelijama-hraniteljicama u drugoj ekspanziji je između 1 prema 50 i 1 prema 300. U primeru izvođenja, odnos TIL prema antigenprezentujućim ćelijama-hraniteljicama u drugoj ekspanziji je između 1 prema 100 i 1 prema 200.
[0220] U primeru izvođenja, procedure druge ekspanzije opisane u ovom tekstu zahtevaju odnos od oko 2.5x109 ćelija-hraniteljica prema oko 100x10<6>TIL. U drugom primeru izvođenja, procedure druge ekspanzije opisane u ovom tekstu zahtevaju odnos od oko 2.5x10<9>ćelija-hraniteljica prema oko 50x10<6>TIL. U još jednom primeru izvođenja, procedure druge
4
ekspanzije opisane u ovom tekstu zahtevaju oko 2.5x109 ćelija-hraniteljica prema oko 25x10<6>TIL.
[0221] U primeru izvođenja, procedure druge ekspanzije opisane u ovom tekstu zahtevaju ćelije-hraniteljice u višku tokom druge ekspanzije. U mnogim primerima izvođenja, ćelijehraniteljice su mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) dobijene iz standardnih jedinica cele krvi zdravih davalaca krvi. PBMC se dobijaju korišćenjem standardnih postupaka kao što je separacija na Ficoll-Paque gradijentu. U primeru izvođenja, veštačke antigen-prezentujuće (artificial antigen-presenting cells, aAPC) ćelije koriste se umesto PBMC.
[0222] Uopšteno, alogene PBMC se inaktiviraju, ozračivanjem ili tretmanom toplotom i koriste u procedurama TIL ekspanzije opisanim u ovom tekstu, uključujući primere prosedura opisane na Slikama 4, 5, i 27.
[0223] U primeru izvođenja, veštačke antigen-prezentujuće ćelije koriste se u drugoj ekspanziji umesto ili u kombinaciji sa, PBMC.
2. Citokini
[0224] U postupcima ekspanzije opisanim u ovom tekstu obično se koristi kultivacioni medijum sa visokim dozama citokina, posebno IL-2, kao što je poznato u struci.
[0225] Alternativno, korišćenje kombinacija citokina za brzu ekspanziju i/ili drugu ekspanziju TIL dodatno je moguće, uz kombinacije dva ili više od IL-2, IL-15 i IL-21 kako se uopšteno navodi u Međunarodnoj publikaciji br. WO 2015/189356 i Međunarodnoj publikaciji br. WO 2015/189357. Prema tome, moguće kombinacije uključuju IL-2 i IL-15, IL-2 i IL-21, IL-15 i IL-21 i IL-2, IL-15 i IL-21, pri čemu se u mnogim primerima izvođenja posebno koristi poslednja. Upotreba kombinacija citokina specifično favorizuje stvaranje limfocita, i posebno T-ćelija kako je opisano u ovom tekstu.
3. Anti-CD3 antitela
[0226] U nekim primerima izvođenja, kultivacioni medijum upotrebljen u postupcima ekspanzije opisanim u ovom tekstu (uključujući one koji su označeni kao REP, vidi na primer, Sliku 27) uključuju i anti-CD3 antitelo. Anti-CD3 antitelo u kombinaciji sa IL-2 indukuje aktivaciju T ćelija i ćelijsku deobu u TIL populaciji. Ovaj efekat se može zapaziti sa antitelima pune dužine kao i sa Fab i F(ab’)2 fragmentima, pri čemu su ovi prvi obično poželjniji; vidi, npr., Tsoukas et al., J. Immunol. 1985, 135, 1719.
[0227] Kako će proceniti stručnjak u oblasti, postoje brojna pogodna antihumana CD3 antitela koja se mogu upotrebiti u pronalasku, uključujući antihumana CD3 poliklonska i monoklonska antitela iz različitih sisara, uključujući, ali ne ograničavajući se na antitela miševa, ljudi, primata, pacova, i psa. U određenim primerima izvođenja, koristi se OKT3 anti-CD3 antitelo (komercijalno se može nabaviti od Ortho-McNeil, Raritan, NJ ili Miltenyi Biotech, Auburn, CA).
E. KORAK E: Sakupljanje TIL
[0228] Posle koraka druge ekspanzije, ćelije mogu da se sakupe. U nekim primerima izvođenja TIL se sakupljaju posle jednog, dva, tri, četiri ili više koraka ekspanzije, na primer kako je pokazano na Slici 27. U nekim primerima izvođenja TIL se sakupljaju posle dva koraka ekspanzije, na primer kako je prikazano na Slici 27.
[0229] TIL mogu da se sakupe na bilo koji odgovarajući sterilan način, uključujući na primer centrifugiranje. Postupci sakupljanja TIL dobro su poznati u struci i svaki takav poznat postupak može se upotrebiti u predmetnom procesu. U nekim primerima izvođenja, TIL se sakupljaju korišćenjem automatizovanog sistema.
[0230] Sakupljači ćelija i/ili sistemi za obradu ćelija komercijalno se mogu nabaviti iz različitih izvora, uključujući, na primer, Fresenius Kabi, Tomtec Life Science, Perkin Elmer, i Inotech Biosystems International, Inc. Sa predmetnim metodima može se upotrebiti svaki sakupljač ćelija. U nekim primerima izvođenja, sakupljač ćelija i/ili sistem za obradu ćelija je sakupljač ćelija baziran na membrani. U nekim primerima izvođenja, sakupljanje ćelija odvija se preko sistema za obradu ćelija, kao što je LOVO sistem (proizvodi ga Fresenius Kabi). Izraz "LOVO sistem za obradu ćelija" označava i svaki instrument ili uređaj izrađen od strane bilo kojeg prodavca, koji može da pumpa rastvor koji sadrži ćelije kroz membranu ili filter kao što je obrtna membrana ili obrtni filter u sterilnom i/ili zatvorenom sistemskom okruženju, omogućavajući kontinuirani protok ćelija i obradu ćelija da se ukloni supernatant ili medijum za kulturu ćelija bez peletizacije. U nekim primerima izvođenja, sakupljač ćelija i/ili sistem za procesovanje ćelija može da izvede separaciju ćelija, ispiranje, razmenu tečnosti, koncentrovanje, i/ili druge korake procesovanja ćelija u zatvorenom, sterilnom sistemu.
[0231] U nekim primerima izvođenja, sakupljanje, na primer, Korak E prema Slici 27, izvodi se iz zatvorenog bioreaktorskog sistema. U nekim primerima izvođenja, zatvoreni sistem se koristi za ekspanziju TIL, kako je opisano u ovom tekstu. U nekim primerima izvođenja, koristi se jedan bioreaktor. U nekim primerima izvođenja, jedan bioreaktor koji se koristi je na primer G-REX -10 ili G-REX -100. U nekim primerima izvođenja, zatvoreni bioreaktorski sistem je jedan bioreaktor.
F. KORAK F: Finalna formulacija / Transfer u infuzionu kesu
[0232] Kada se završe Koraci A do E prikazani redosledom za primer na Slici 27 i kako je navedeno detaljno gore i u ovom tekstu, ćelije se prenesu u kontejner koji se koristi za primenu kod pacijenta. U nekim primerima izvođenja, kada se goreopisanim postupcima ekspanzije dobije broj TIL dovoljan za terapiju, oni se prenesu u kontejner koji se koristi za primenu kod pacijenta.
[0233] TIL ekspandirani korišćenjem APC predmetne objave mogu biti namenjeni za davanje pacijentu u vidu farmaceutske kompozicije. U primeru izvođenja, farmaceutska kompozicija je suspenzija TIL u sterilnom puferu. TIL ekspandirani korišćenjem PBMC predmetne objave mogu se primeniti bilo kojim pogodnim putem, kako je poznato u struci. U nekim primerima izvođenja, T-ćelije se primenjuju kao jedna intraarterijska ili intravenska infuzija, koja poželjno traje približno 30 do 60 minuta. Drugi pogodni putevi primene uključuju intraperitonealni, intratekalni, i intralimfni.
1. Farmaceutske kompozicije, doziranje i režimi doziranja
[0234] U primeru izvođenja, TIL ekspandirani korišćenjem metoda predmetne objave namenjeni su za davanje pacijentu u vidu farmaceutske kompozicije. U primeru izvođenja, farmaceutska kompozicija je suspenzija TIL u sterilnom puferu. TIL ekspandirani korišćenjem PBMC predmetne objave mogu se primeniti bilo kojim pogodnim putem poznatim u struci. U nekim primerima izvođenja, T-ćelije se primenjuju kao jedna intraarterijska ili intravenska infuzija, koja poželjno traje približno 30 do 60 minuta. Drugi pogodni putevi primene uključuju intraperitonealnu, intratekalnu, i intralimfnu primenu.
[0235] Može se primeniti svaka pogodna doza TIL. U nekim primerima izvođenja, primenjuje se od oko 2.3 ×10<10>do oko 13.7 ×10<10>TIL, sa prosekom od oko 7.8 ×10<10>TIL, posebno ako je kancer melanom. U primeru izvođenja, primenjuje se oko 1.2 ×10<10>do oko 4.3 ×10<10>TIL. U nekim primerima izvođenja, primenjuje se oko 3 ×10 do oko 12 ×10<10>TIL. U nekim primerima izvođenja, primenjuje se oko 4 ×10<10>do oko 10 ×10<10>TIL. U nekim primerima izvođenja, primenjuje se oko 5 ×10<10>do oko 8 ×10<10>TIL. U nekim primerima izvođenja, primenjuje se oko 6 ×10<10>do oko 8 ×10<10>TIL. U nekim primerima izvođenja, primenjuje se oko 7 ×10<10>do oko 8 ×10<10>TIL. U nekim primerima izvođenja, terapijski efikasna doza je oko 2.3 ×10<10>do oko 13.7 ×10<10>. U nekim primerima izvođenja, terapijski efikasna doza je oko 7.8 ×10<10>TIL, posebno ako je kancer melanom. U nekim primerima izvođenja, terapijski efikasna doza je oko 1.2 ×10<10>do oko 4.3 ×10<10>TIL. U nekim primerima izvođenja, terapijski efikasna doza je oko 3 ×10<10>do oko 12 ×10<10>TIL. U nekim primerima izvođenja, terapijski efikasna doza je oko 4 ×10<10>do oko 10 ×10<10>TIL. U nekim primerima izvođenja, terapijski efikasna doza je oko 5 ×10<10>do oko 8 ×10<10>TIL. U nekim primerima izvođenja, terapijski efikasna doza je oko 6 ×10<10>do oko 8 ×10<10>TIL. U nekim primerima izvođenja, terapijski efikasna doza je oko 7 ×10<10>do oko 8 ×10<10>TIL.
[0236] U nekim primerima izvođenja, broj TIL obezbeđen u farmaceutskim kompozicijama pronalaska je oko 1 ×10<6>, 2x10<6>, 3 ×10<6>, 4 ×10<6>, S ×10<6>, 6 ×10<6>, 7 ×10<6>, 8 ×10<6>, 9 ×10<6>, 1 ×10<7>2 ×10<7>3 ×10<7>4 ×10<7>5 ×10<7>6 ×10<7>7 × 0<7>, 8 ×10<7>, 9 ×10<7>, 1 ×10<8>, 2 ×10<8>, 3 ×10<8>, 4 ×10<8>, 5 ×10<8>, 6 ×10<8>, 7 ×10<8>, 8 ×10<8>, 9 ×10<8>, 1 ×10<9>, 2 ×10<9>, 3 ×10<9>, 4 ×10<9>, 5 ×10<9>, 6 ×10<9>, 7 ×10<9>, 8 ×10<9>, 9 ×10<9>, 1 ×10<10>, 2 ×10<10>, 3 ×10<10>, 4 ×10<10>, 5 ×10<10>, 6 ×10<10>7 ×10<10>8 ×10<10>9 ×10<10>, 1 ×10<11>, 2 ×10<11>, 3 ×10<11>, 4 ×10<11>, 5 ×10<11>, 6 ×10<11>, 7 ×10<11>, 8 ×10<11>, 9 ×10<11>, 1 ×10<12>, 2 ×10<12>, 3 ×10<12>, 4 ×10<12>, 5 ×10<12>, 6 ×10<12>, 7 ×10<12>, 8 ×10<12>, 9 ×10<12>, 1 ×10<13>, 2 ×10<13>, 3 ×10<13>, 4 ×10<13>, 5 ×10<13>, 6 ×10<13>, 7 ×10<13>, 8 ×10<13>, i 9 ×10<13>. U primeru izvođenja, broj TIL obezbeđen u farmaceutskim kompozicijama pronalaska je u rasponu od 1 ×10<6>do 5 ×10<6>, 5 ×10<6>do 1 ×10<7>, 1 ×10<7>do 5 ×10<7>5 ×10<7>do 1 ×10<8>, 1 ×10<8>do 5 ×10<8>, 5 ×10<8>do 1 ×10<9>, 1 ×10<9>do 5 ×10<9>, 5 ×10<9>do 1 ×10<10>, 1 ×10<10>do 5 ×10<10>, 5 ×10<10>do 1 ×10<11>, 5 ×10<11>do 1 ×10<12>, 1 ×10<12>do 5 ×10<12>, i 5 ×10<12>do 1 ×10<13>.
[0237] U nekim primerima izvođenja, koncentracija TIL obezbeđena u farmaceutskim kompozicijama pronalaska manja je od, na primer, 100%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1%, 0.09%, 0.08%, 0.07%, 0.06%, 0.05%, 0.04%, 0.03%, 0.02%, 0.01%, 0.009%, 0.008%, 0.007%, 0.006%, 0.005%, 0.004%, 0.003%, 0.002%, 0.001%, 0.0009%, 0.0008%, 0.0007%, 0.0006%, 0.0005%, 0.0004%, 0.0003%, 0.0002% ili 0.0001% w/w, w/v ili v/v farmaceutske kompozicije.
[0238] U nekim primerima izvođenja, koncentracija TIL obezbeđena u farmaceutskim kompozicijama pronalaska veća je od, na primer 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 19.75%, 19.50%, 19.25% 19%, 18.75%, 18.50%, 18.25% 18%, 17.75%, 17.50%, 17.25% 17%, 16.75%, 16.50%, 16.25% 16%, 15.75%, 15.50%, 15.25% 15%, 14.75%, 14.50%, 14.25% 14%, 13.75%, 13.50%, 13.25% 13%, 12.75%, 12.50%, 12.25% 12%, 11.75%, 11.50%, 11.25% 11%,
10.75%, 10.50%, 10.25% 10%, 9.75%, 9.50%, 9.25% 9%, 8.75%, 8.50%, 8.25% 8%, 7.75%, 7.50%, 7.25% 7%, 6.75%, 6.50%, 6.25% 6%, 5.75%, 5.50%, 5.25% 5%, 4.75%, 4.50%, 4.25%, 4%, 3.75%, 3.50%, 3.25%, 3%, 2.75%, 2.50%, 2.25%, 2%, 1.75%, 1.50%, 125%, 1%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1%, 0.09%, 0.08%, 0.07%, 0.06%, 0.05%, 0.04%, 0.03%, 0.02%, 0.01%, 0.009%, 0.008%, 0.007%, 0.006%, 0.005%, 0.004%, 0.003%, 0.002%, 0.001%, 0.0009%, 0.0008%, 0.0007%, 0.0006%, 0.0005%, 0.0004%, 0.0003%, 0.0002% ili 0.0001% w/w, w/v, ili v/v farmaceutske kompozicije.
[0239] U nekim primerima izvođenja, koncentracija TIL obezbeđena u farmaceutskim kompozicijama pronalaska je u opsegu od oko 0.0001% do oko 50%, oko 0.001% do oko 40%, oko 0.01% do oko 30%, oko 0.02% do oko 29%, oko 0.03% do oko 28%, oko 0.04% do oko 27%, oko 0.05% do oko 26%, oko 0.06% do oko 25%, oko 0.07% do oko 24%, oko 0.08% do oko 23%, oko 0.09% do oko 22%, oko 0.1% do oko 21%, oko 0.2% do oko 20%, oko 0.3% do oko 19%, oko 0.4% do oko 18%, oko 0.5% do oko 17%, oko 0.6% do oko 16%, oko 0.7% do oko 15%, oko 0.8% do oko 14%, oko 0.9% do oko 12% ili oko 1% do oko 10% w/w, w/v ili v/v farmaceutske kompozicije.
[0240] U nekim primerima izvođenja, koncentracija TIL obezbeđena u farmaceutskim kompozicijama pronalaska je u opsegu od oko 0.001% do oko 10%, oko 0.01% do oko 5%, oko 0.02% do oko 4.5%, oko 0.03% do oko 4%, oko 0.04% do oko 3.5%, oko 0.05% do oko 3%, oko 0.06% do oko 2.5%, oko 0.07% do oko 2%, oko 0.08% do oko 1.5%, oko 0.09% do oko 1%, oko 0.1% do oko 0.9% w/w, w/v ili v/v farmaceutske kompozicije.
[0241] U nekim primerima izvođenja, količina TIL obezbeđena u farmaceutskim kompozicijama pronalaska jednaka je ili manja od 10 g, 9.5 g, 9.0 g, 8.5 g, 8.0 g, 7.5 g, 7.0 g, 6.5 g, 6.0 g, 5.5 g, 5.0 g, 4.5 g, 4.0 g, 3.5 g, 3.0 g, 2.5 g, 2.0 g, 1.5 g, 1.0 g, 0.95 g, 0.9 g, 0.85 g, 0.8 g, 0.75 g, 0.7 g, 0.65 g, 0.6 g, 0.55 g, 0.5 g, 0.45 g, 0.4 g, 0.35 g, 0.3 g, 0.25 g, 0.2 g, 0.15 g, 0.1 g, 0.09 g, 0.08 g, 0.07 g, 0.06 g, 0.05 g, 0.04 g, 0.03 g, 0.02 g, 0.01 g, 0.009 g, 0.008 g, 0.007 g, 0.006 g, 0.005 g, 0.004 g, 0.003 g, 0.002 g, 0.001 g, 0.0009 g, 0.0008 g, 0.0007 g, 0.0006 g, 0.0005 g, 0.0004 g, 0.0003 g, 0.0002 g, ili 0.0001 g.
[0242] U nekim primerima izvođenja, količina TIL obezbeđena u farmaceutskim kompozicijama pronalaska veća je od 0.0001 g, 0.0002 g, 0.0003 g, 0.0004 g, 0.0005 g, 0.0006 g, 0.0007 g, 0.0008 g, 0.0009 g, 0.001 g, 0.0015 g, 0.002 g, 0.0025 g, 0.003 g, 0.0035 g, 0.004 g, 0.0045 g, 0.005 g, 0.0055 g, 0.006 g, 0.0065 g, 0.007 g, 0.0075 g, 0.008 g, 0.0085 g, 0.009 g, 0.0095 g, 0.01 g, 0.015 g, 0.02 g, 0.025 g, 0.03 g, 0.035 g, 0.04 g, 0.045 g, 0.05 g, 0.055 g, 0.06 g, 0.065 g, 0.07 g, 0.075 g, 0.08 g, 0.085 g, 0.09 g, 0.095 g, 0.1 g, 0.15 g, 0.2 g, 0.25 g, 0.3 g, 0.35 g, 0.4 g, 0.45 g, 0.5 g, 0.55 g, 0.6 g, 0.65 g, 0.7 g, 0.75 g, 0.8 g, 0.85 g, 0.9 g, 0.95 g, 1 g, 1.5 g, 2 g, 2.5, 3 g, 3.5, 4 g, 4.5 g, 5 g, 5.5 g, 6 g, 6.5 g, 7 g, 7.5 g, 8 g, 8.5 g, 9 g, 9.5 g, ili 10 g.
[0243] TIL obezbeđeni u farmaceutskim kompozicijama pronalaska efikasni su u širokom opsegu doza. Tačna doza zavisiće od puta primene, obliku u kojem se jedinjenje primenjuje, pola i starosti subjekta koji će se tretirati, i preferencije i iskustva nadležnog lekara. Klinički uspostavljene doze TIL takođe se mogu koristiti ako je to pogodno. Količine farmaceutskih kompozicija primenjenih korišćenjem postupaka iz ovog teksta, kao što su doze TIL, zavisiće od čoveka ili sisara koji se leči, ozbiljnosti poremećaja ili stanja, stope primene, osobina aktivnih farmaceutskih sastojaka i odluke nadležnog lekara.
[0244] U nekim primerima izvođenja, TIL mogu biti predviđeni za primenu u vidu jedne doze. Takva primena može biti putem injekcije, npr., intravenske injekcije. U nekim primerima izvođenja, TIL mogu biti predviđeni za primenu u vidu više doza. Doziranje se može vršiti jednom, dva puta, tri puta, četiri puta, pet puta, šest puta, ili više od šest puta godišnje. Doziranje se može vršiti jednom mesečno, jednom svake dve nedelje, jednom nedeljno, ili jednom svakog drugog dana. Primena TIL može trajati dugo koliko je potrebno.
[0245] U nekim primerima izvođenja, efikasna doza TIL iznosi oko 1 ×10<6>, 2 ×10<6>, 3 ×10<6>, 4 ×10<6>, S ×10<6>, 6 ×10<6>, 7 ×10<6>, 8 ×10<6>, 9 ×10<6>, 1 ×10<7>2 ×10<7>, 3 ×10<7>, 4 ×10<7>, 5 ×10<7>6 ×10<7>, 7 ×10<7>, 8 ×10<7>, 9 ×10<7>, 1 ×10<8>, 2 ×10<8>, 3 ×10<8>, 4 ×10<8>, 5 ×10<8>, 6 ×10<8>, 7 ×10<8>, 8 ×10<8>, 9 ×10<8>, 1 ×10<9>, 2 ×10<9>, 3 ×10<9>, 4 ×10<9>, 5 ×10<9>, 6 ×10<9>, 7 ×10<9>, 8 ×10<9>, 9 ×10<9>, 1 ×10<10>, 2 ×10<10>, 3 ×10<10>, 4 ×10<10>, 5 ×10<10>, 6 ×10<10>, 7 ×10<10>, 8 ×10<10>, 9 ×10<10>, 1 ×10<11>, 2 ×10<11>, 3 ×10<11>, 4 ×10<11>, 5 ×10<11>, 6 ×10<11>, 7 ×10<11>, 8 ×10<11>, 9 ×10<11>, 1 ×10<12>, 2 ×10<12>, 3 ×10<12>, 4 ×10<12>, 5 ×10<12>, 6 ×10<12>, 7 ×10<12>, 8 ×10<12>, 9 ×10<12>, 1 ×10<13>, 2 ×10<13>, 3 ×10<13>, 4 ×10<13>, 5 ×10<13>, 6 ×10<13>, 7 ×10<13>, 8 ×10<13>, i 9 ×10<13>. U nekim primerima izvođenja, efikasna doza TIL je u rasponu od 1 ×10<6>do 5 ×10<6>, 5 ×10<6>do 1 ×10<7>1 ×10<7>do 5 ×10<7>5 ×10<7>do 1 ×10<8>, 1 ×10<8>do 5 ×10<8>, 5 ×10<8>do 1 ×10<9>, 1 ×10<9>do 5 ×10<9>, 5 ×10<9>do 1 ×10<10>, 1 ×10<10>do 5 ×10<10>, 5 ×10<10>do 1 ×10<11>, 5 ×10<11>do 1 ×10<12>, 1 ×10<12>do 5 ×10<12>, i 5 ×10<12>do 1 ×10<13>.
[0246] U nekim primerima izvođenja, efikasna doza TIL je u rasponu od oko 0.01 mg/kg do oko 4.3 mg/kg, oko 0.15 mg/kg do oko 3.6 mg/kg, oko 0.3 mg/kg do oko 3.2 mg/kg, oko 0.35 mg/kg do oko 2.85 mg/kg, oko 0.15 mg/kg do oko 2.85 mg/kg, oko 0.3 mg do oko 2.15 mg/kg, oko 0.45 mg/kg do oko 1.7 mg/kg, oko 0.15 mg/kg do oko 1.3 mg/kg, oko 0.3 mg/kg do oko 1.15 mg/kg, oko 0.45 mg/kg do oko 1 mg/kg, oko 0.55 mg/kg do oko 0.85 mg/kg, oko 0.65 mg/kg do oko 0.8 mg/kg, oko 0.7 mg/kg do oko 0.75 mg/kg, oko 0.7 mg/kg do oko 2.15 mg/kg, oko 0.85 mg/kg do oko 2 mg/kg, oko 1 mg/kg do oko 1.85 mg/kg, oko 1.15 mg/kg do oko 1.7 mg/kg, oko 1.3 mg/kg mg do oko 1.6 mg/kg, oko 1.35 mg/kg do oko 1.5 mg/kg, oko 2.15 mg/kg do oko 3.6 mg/kg, oko 2.3 mg/kg do oko 3.4 mg/kg, oko 2.4 mg/kg do oko 3.3 mg/kg, oko 2.6 mg/kg do oko 3.15 mg/kg, oko 2.7 mg/kg do oko 3 mg/kg, oko 2.8 mg/kg do oko 3 mg/kg, ili oko 2.85 mg/kg do oko 2.95 mg/kg.
[0247] U nekim primerima izvođenja, efikasna doza TIL je u rasponu od oko 1 mg do oko 500 mg, oko 10 mg do oko 300 mg, oko 20 mg do oko 250 mg, oko 25 mg do oko 200 mg, oko 1 mg do oko 50 mg, oko 5 mg do oko 45 mg, oko 10 mg do oko 40 mg, oko 15 mg do oko 35 mg, oko 20 mg do oko 30 mg, oko 23 mg do oko 28 mg, oko 50 mg do oko 150 mg, oko 60 mg do oko 140 mg, oko 70 mg do oko 130 mg, oko 80 mg do oko 120 mg, oko 90 mg do oko 110 mg, ili oko 95 mg do oko 105 mg, oko 98 mg do oko 102 mg, oko 150 mg do oko 250 mg, oko 160 mg do oko 240 mg, oko 170 mg do oko 230 mg, oko 180 mg do oko 220 mg, oko 190 mg do oko 210 mg, oko 195 mg do oko 205 mg, ili oko 198 do oko 207 mg.
[0248] Efikasna količina TIL može se primeniti u jednoj ili više doza, bilo kojim prihvaćenim načinom primene sredstava koja imaju slične upotrebe, uključujući intranazalni i transdermalni put, intraarterijsku injekciju, intravenski, intraperitonealno, parenteralno, intramuskularno, subkutano, površinski, transplantacijom ili inhalacijom.
G. Opcione analize ćelijske vijabilnosti
[0249] Opciono, testovi ćelijske vijabilnosti mogu se izvoditi posle Koraka B prve ekspanzije, Korišćenjem standardnih testova poznatih u struci. Na primer, test isključivanja tripan plavog može se izvesti na uzorku "bulk" TIL, kojim se selektivno obeležavaju mrtve ćelije i omogućava procena vijabilnosti. Drugi testovi za upotrebu u ispitivanju vijabilnosti mogu uključivati, ali se ne ograničavaju na test alamar plavim; i MTT test.
1. Broj ćelija, vijabilnost, protočna citometrija
[0250] U nekim primerima izvođenja, mere se broj ćelija i/ili vijabilnost. Ekspresija markera kao što su, bez ograničavanja CD3, CD4, CD8, i CD56, kao i svakog drugog objavljenog ili opisanog u ovom tekstu, može se meriti protočnom citometrijom uz korišćenje antitela, na primer, bez ograničavanja, onih koja se komercijalno mogu nabaviti od BD Bio-sciences (BD Biosciences, San Jose, CA) i FACSCanto™ protočnog citometra (BD Biosciences). Ćelije se mogu brojati ručno korišćenjem c-čip hemocitometra za jednokratnu upotrebu (VWR, Batavia, IL) i vijabilnost se može procenjivati korišćenjem bilo kojeg metoda poznatog u struci, uključujući, ali ne ograničavajući se na bojenje tripan plavim.
1
[0251] U nekim slučajevima, "bulk" TIL populacija može da se odmah krioprezervira, korišćenjem protokola o kojima će biti reči kasnije. Alternativno, "bulk" TIL populacija može da se podvrgne REP i onda krioprezervira, kako će se razmatrati kasnije. Slično tome, u slučaju korišćenja genetički modifikovanih TIL u lečenju, "bulk" ili REP TIL populacije mogu se izložiti genetičkim modifikacijama za odgovarajuće tretmane.
2. Kulture ćelija
[0252] U primeru izvođenja, postupak ekspandiranja TIL može uključivati korišćenje oko 5,000 mL do oko 25,000 mL ćelijskog medijuma, oko 5,000 mL do oko 10,000 mL ćelijskog medijuma, ili oko 5,800 mL do oko 8,700 mL ćelijskog medijuma. U primeru izvođenja, za ekspandiranje broja TIL koristi se ne više od jednog tipa medijuma za kulturu ćelija. Može se upotrebiti svaki pogodni medijum za kulturu ćelija, npr., AIM-V medijum (L-glutamin, 50 μM streptomicin sulfat, i 10 μM gentamicin sulfat) za kulturu ćelija (Invitrogen, Carlsbad CA). U vezi sa tim, postupci pronalaska pogodno smanjuju količinu medijuma i broj tipova medijuma potrebnih za brojčanu ekspanziju TIL. U primeru izvođenja, ekspandiranje broja TIL može uključivati dodavanje ćelijama svežeg medijuma za kulturu ćelija (označeno i kao hranjenje ćelija) ne češće nego svakog trećeg ili četvrtog dana. Ekspandiranje broja ćelija u kontejneru propustljivom za gas pojednostavljuje procedure neophodne za ekspandiranje broja ćelija smanjivanjem učestalosti hranjenja potrebnog za ekspandiranje ćelija.
[0253] U primeru izvođenja, ćelijski medijum u prvom i/ili drugom kontejneru propustljivom za gas nije filtriran. Upotreba nefiltriranog ćelijskog medijuma može pojednostaviti procedure neophodne za ekspandiranje broja ćelija. U primeru izvođenja, ćelijski medijum u prvom i/ili drugom kontejneru propustljivom za gas ne sadrži beta-merkaptoetanol (betamercaptoethanol, BME).
[0254] U primeru izvođenja, trajanje postupka koji uključuje dobijanje uzorka tumorskog tkiva iz sisara; kultivisanje uzorka tumorskog tkiva u prvom kontejneru propustljivom za gas koji sadrži ćelijski medijum; dobijanje TIL iz uzorka tumorskog tkiva; ekspandiranje broja TIL u drugom kontejneru propustljivom za gas koji sadrži ćelijski medijum uz korišćenje APC iznosi oko 14 do oko 42 dana, npr., oko 28 dana.
[0255] U primeru izvođenja, TIL se ekspandiraju u kontejnerima propustljivim za gas. Kontejneri propustljivi za gas služili su za ekspandiranje TIL korišćenjem postupaka u kojima se koriste PBMC, kompozicija i uređaja poznatih u struci, uključujući one koji su opisani u U.S. objavljenoj patentnoj prijavi br. 2005/0106717 A1. U primeru izvođenja, TIL se ekspandiraju u kesama propustljivim za gas. U primeru izvođenja, TIL se ekspandiraju
2
korišćenjem sistema za ekspanziju ćelija koji ekspandira TIL u kesama propustljivim za gas, na primer Xuri sistem za ekspanziju ćelija W25 (GE Healthcare). U primeru izvođenja, TIL se ekspandiraju korišćenjem sistema za ekspanziju ćelija koji ekspandira TIL u kesama propustljivim za gas, na primer WAVE bioreaktorskog sistema, poznatog i kao Xuri sistem za ekspanziju ćelija W5 (GE Healthcare). U primeru izvođenja, sistem za ekspanziju ćelija uključuje kesu propustljivu za gas za ćelije, sa zapreminom odabranom iz grupe koja se sastoji od oko 100 mL, oko 200 mL, oko 300 mL, oko 400 mL, oko 500 mL, oko 600 mL, oko 700 mL, oko 800 mL, oko 900 mL, oko 1 L, oko 2 L, oko 3 L, oko 4 L, oko 5 L, oko 6 L, oko 7 L, oko 8 L, oko 9 L, i oko 10 L. U primeru izvođenja, TIL mogu da se ekspandiraju u G-Rex flakonima (komercijalno se mogu nabaviti od Wilson Wolf Manufacturing). Takvi primeri izvođenja omogućavaju da se ćelijske populacije ekspandiraju od oko 5x10<5>ćelija/cm<2>do između 10x10<6>i 30x10<6>ćelija/cm<2>. U primeru izvođenja ova ekspanzija se sprovodi bez dodavanja svežeg kultivacionog medijuma ćelijama (označeno i kao hranjenje ćelija). U primeru izvođenja, stanje bez hranjenja traje dokle god je medijum u G-Rex flakonu na visini od oko 10 cm. U primeru izvođenja stanje je bez hranjenja, ali uz dodavanje jednog ili više citokina. U primeru izvođenja, citokin se može dodati u vidu bolusa bez potrebe da se citokin meša sa medijumom. Takvi kontejneri, uređaji i postupci poznati su u struci i korišćeni su za ekspandiranje TIL, i uključuju one koji su opisani u U.S.objavljenoj patentnoj prijavi br. US 2014/0377739A1, Međunarodnoj publikaciji br. WO 2014/210036 A1, U.S. objavljenoj patentnoj prijavi br. US 2013/0115617 A1, Međunarodnoj publikaciji br. WO 2013/188427 A1, U.S. objavljenoj patentnoj prijavi br. US 2011/0136228 A1, U.S. patentu br. US 8,809,050 B2, Međunarodnoj publikaciji br. WO 2011/072088 A2, U.S. objavljenoj patentnoj prijavi br. US 2016/0208216 A1, U.S. objavljenoj patentnoj prijavi br. US 2012/0244133 A1, Međunarodnoj publikaciji br. WO 2012/129201 A1, U.S. objavljenoj patentnoj prijavi br. US 2013/0102075 A1, U.S. patentu br. US 8,956,860 B2, Međunarodnoj publikaciji br. WO 2013/173835 A1, U.S. objavljenoj patentnoj prijavi br. US 2015/0175966 A1. Takvi procesi opisani su i u Jin et al., J. Immunotherapy, 2012, 35:283-292. Optional Genetic Engineering TILs.
[0256] U nekim primerima izvođenja, TIL su opciono genetički inženjerisani da uključe dodatne funkcionalnosti, uključujući, ali ne ograničavajući se na visokoafinitetni T ćelijski receptor (TCR), npr., TCR usmeren ka tumor-pridruženom antigenu kao što je MAGE-1, HER2, ili NY-ESO-1, ili himerni antigeni receptor (chimeric antigen receptor, CAR) koji se vezuje za tumor-pridruženi ćelijski površinski molekul (npr., mezotelin) ili linijski ograničeni ćelijski površinski molekul (npr., CD19).
H. Opciona krioprezervacija TIL
[0257] Kako je bilo rečeno ranije u ovom tekstu, i za primer prikazano u Koracima A do E na Slici 27, krioprezervacija se može vršiti na brojnim mestima u procesu ekspandiranja TIL. U nekim primerima izvođenja, ekspandirana populacija TIL posle druge ekspanzije (obezbeđena, na primer, prema Koraku D Slike 27) može se krioprezervirati. Krioprezervacija se obično može obaviti stavljanjem TIL populacije u rastvor za zamrzavanje, npr., 85% komplementom inaktivirani AB serum i 15% dimetil sulfoksid (DMSO). Ćelije u rastvoru se stavljaju u kriogene fiole i skladište 24 sata na -80 °C, uz opciono prenošenje u zamrzivače sa gasovitim azotom, radi krioprezervacije. Vidi Sadeghi, et al., Acta Oncologica 2013, 52, 978-986. U nekim primerima izvođenja, TIL se krioprezerviraju u 5% DMSO. U nekim primerima izvođenja, TIL se krioprezerviraju u medijumu za kulturu ćelija uz dodatak 5% DMSO. U nekim primerima izvođenja, TIL se krioprezerviraju prema postupcima obezbeđenim u Primerima 8 i 9.
[0258] Kada je pogodno, ćelije se vade iz zamrzivača i odmrzavaju u vodenom kupatilu na 37 °C dok se približno 4/5 rastvora ne ohladi. Ćelije se obično resuspenduju u kompletnom medijumu i opciono ispiraju jednom ili više puta. U nekim primerima izvođenja, odmrznuti TIL mogu da se broje i procenjuju u pogledu vijabilnosti kako je poznato u struci.
I. Fenotipske karakteristike ekspandiranih TIL
[0259] U nekom primeru izvođenja, TIL se naliziraju u pogledu ekspresije brojnih fenotipskih markera posle ekspanzije, uključujući one opisane u ovom tekstu i u Primerima. U primeru izvođenja, ispituje se ekspresija jednog ili više fenotipskih markera. U nekim primerima izvođenja, fenotipske karakteristike TIL analiziraju se posle prve ekspanzije u Koraku B. U nekim primerima izvođenja, fenotipske karakteristike TIL analiziraju se tokom prelaza u Koraku C. U nekim primerima izvođenja, fenotipske karakteristike TIL analiziraju se tokom prelaza prema Koraku C i posle krioprezervacije. U nekim primerima izvođenja, fenotipske karakteristike TIL analiziraju se posle druge ekspanzije u skladu sa Korakom D. U nekim primerima izvođenja, fenotipske karakteristike TIL analiziraju se posle dve ili više ekspanzija u skladu sa Korakom D. U nekim primerima izvođenja, marker se bira iz grupe koja se sastoji od TCRab (tj., TCRα/β/), CD57, CD28, CD4, CD27, CD56, CD8a, CD45RA, CD8a, CCR7, CD4, CD3, CD38, i HLADR. U nekim primerima izvođenja, marker se bira iz grupe koja se sastoji od TCRab (tj., TCRα/β), CD57, CD28, CD4, CD27, CD56, i CD8a. U primeru izvođenja, marker se bira iz grupe koja se sastoji od CD45RA, CD8a, CCR7, CD4, CD3,
4
CD38, i HLA-DR. U nekim primerima izvođenja, ispituje se ekspresija jednog, dva, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet, deset, jedanaest, dvanaest, trinaest ili četrnaest markera. U nekim primerima izvođenja, ispituje se ekspresija jednog ili više markera iz svake grupe. U nekim primerima izvođenja, ekspresija jednog ili više od HLA-DR, CD38, i CD69 se održava (tj., ne pokazuje statistički značajnu razliku) u svežim TIL u poređenju sa odmrznutim TIL. U nekim primerima izvođenja, aktivacioni status TIL se održava u odmrznutim TIL.
[0260] U primeru izvođenja, meri se ekspresija jednog ili više regulatornih markera. U nekim primerima izvođenja, regulatorni marker se bira iz grupe koja se sastoji od CD137, CD8a, Lag3, CD4, CD3, PD-1, TIM-3, CD69, CD8a, TIGIT, CD4, CD3, KLRG1, i CD154. U nekim primerima izvođenja, se bira iz grupe koja se sastoji od CD137, CD8a, Lag3, CD4, CD3, PD-1, i TIM-3. U nekim primerima izvođenja, regulatorni marker se bira iz grupe koja se sastoji od CD69, CD8a, TIGIT, CD4, CD3, KLRG1, i CD154. U nekim primerima izvođenja, ekspresija regulatornog molekula je smanjena u odmrznutim TIL u poređenju sa svežim TIL. U nekim primerima izvođenja, ekspresija regulatornih molekula LAG-3 i TIM-3 smanjena je u odmrznutim TIL u poređenju sa svežim TIL. U nekim primerima izvođenja, nema značajne razlike u ekspresiji CD4, CD8, NK, TCRαβ. U nekim primerima izvođenja, nema značajne razlike u ekspresiji CD4, CD8, NK, TCRαβ, i/ili memorijskih markera u svežim TIL u poređenju sa odmrznutim TIL. U nekim primerima izvođenja, nema značajne razlike u ekspresiji CD4, CD8, NK, TCRαβ između TIL proizvedenih postupcima obezbeđenim u ovom tekstu, primerima prikazanim na, na primer, Slici 27, i/ili TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu, uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27.
[0261] U nekim primerima izvođenja, selekcija prve populacije TIL, druge populacije TIL, treće populacije TIL, sakupljene TIL populacije, i/ili terapijske TIL populacije bazirana na ekspresiji CD4, CD8, i/ili NK, TCRαβ ne izvodi se ni u jednom od koraka, uključujući one o kojima je bilo reči ranije u ovom tekstu ili koji su prikazani na primer na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, ne obavlja se selekcija prve populacije TIL bazirana na ekspresiji CD4, CD8, i/ili NK, TCRαβ. U nekim primerima izvođenja, ne obavlja se selekcija druge populacije TIL na bazi ekspresije CD4, CD8, i/ili NK, TCRαβ. U nekim primerima izvođenja, ne obavlja se selekcija treće populacije TIL na bazi ekspresije CD4, CD8, i/ili NK, TCRαβ. U nekim primerima izvođenja, ne obavlja se selekcija sakupljene populacije TIL bazirana na ekspresiji CD4, CD8, i/ili NK, TCRαβ. U nekim primerima izvođenja, ne obavlja se selekcija terapijske populacije TIL na bazi ekspresije CD4, CD8, i/ili NK, TCRαβ.
[0262] U određenim primerima, ne izvodi se selekcija prve populacije TIL, druge populacije TIL, treće populacije TIL, ili sakupljene TIL populacije bazirana na ekspresiji CD4, CD8, i/ili NK, TCRαβ, tokom bilo kojeg od koraka (a) do (f) postupka ekspandiranja tumorinfiltrirajućih limfocita (TIL) u terapijsku populaciju TIL koji uključuje:
(a) dobijanje prve populacije TIL iz tumora dobijenog od pacijenta resekcijom, obrađivanjem uzorka tumora dobijenog od pacijenta u više tumorskih fragmenata;
(b) dodavanje tumorskih fragmenata zatvorenom sistemu;
(c) izvođenje prve ekspanzije kultivisanjem prve populacije TIL u medijumu za ćelijsku kulturu, koji sadrži IL-2 da bi se proizvela druga populacija TIL, pri čemu se prva ekspanzija izvodi u zatvorenom kontejneru koji obezbeđuje prvu površinu permeabilnu za gas, pri čemu se prva ekspanzija izvodi tokom oko 3-14 dana da bi se dobila druga populacija TIL, pri čemu je druga populacija TIL najmanje 50 puta brojnija od prve populacije TIL, i pri čemu se prelaz iz koraka (b) u korak (c) dešava bez otvaranja sistema;
(d) izvođenje druge ekspanzije suplementacijom medijuma za kulturu ćelija druge populacije TIL dodatnim IL-2, OKT-3, i antigen-prezentujućim ćelijama (antigen presenting ćelije, APC), da bi se proizvela treća populacija TIL, pri čemu se druga ekspanzija izvodi tokom oko 7-14 dana da bi se dobila treća populacija TIL, pri čemu je treća populacija TIL terapijska populacija TIL, koja uključuje povećanu potpopulaciju efektorskih T ćelija i/ili centralnih memorijskih T-ćelija u odnosu na drugu populaciju TIL, pri čemu se druga ekspanzija izvodi u zatvorenom kontejneru koji obezbeđuje drugu površinu permeabilnu za gas, i pri čemu se prelaz iz koraka (c) u korak (d) dešava bez otvaranja sistema;
(e) sakupljanje terapijske populacije TIL dobijene iz koraka (d), pri čemu se prelaz iz koraka (d) u korak (e) dešava bez otvaranja sistema; i
(f) prenošenje sakupljene TIL populacije iz koraka (e) u infuzionu kesu, pri čemu se prelaz iz koraka (e) u (f) dešava bez otvaranja sistema.
[0263] U određenim primerima, ne izvodi se selekcija prve populacije TIL, druge populacije TIL, treće populacije TIL, ili sakupljene TIL populacije bazirana na ekspresiji CD4, CD8, i/ili NK, TCRαβ, tokom bilo kojeg od koraka (a) do (h) postupka za lečenje subjekta sa kancerom, postupak koji obuhvata primenu ekspandiranih tumor-infiltrirajućih limfocita (TIL) uključuje: (a) dobijanje prve populacije TIL iz tumora dobijenog od pacijenta resekcijom, obrađivanjem uzorka tumora dobijenog od pacijenta u više tumorskih fragmenata; (b) dodavanje tumorskih fragmenata zatvorenom sistemu;
(c) izvođenje prve ekspanzije kultivisanjem prve populacije TIL u medijumu za ćelijsku kulturu koji sadrži IL-2 da bi se proizvela druga populacija TIL, pri čemu se prva ekspanzija izvodi u zatvorenom kontejneru koji obezbeđuje prvu površinu permeabilnu za gas, pri čemu se prva ekspanzija izvodi tokom oko 3-14 dana da bi se dobila druga populacija TIL, pri čemu je druga populacija TIL najmanje 50 puta brojnija od prve populacije TIL, i pri čemu se prelaz iz koraka (b) u korak (c) dešava bez otvaranja sistema;
(d) izvođenje druge ekspanzije suplementacijom medijuma za kulturu ćelija druge populacije TIL dodatnim IL-2, OKT-3, i antigen-prezentujućim ćelijama (APC), da bi se proizvela treća populacija TIL, pri čemu se druga ekspanzija izvodi tokom oko 7-14 dana da bi se dobila treća populacija TIL, pri čemu je treća populacija TIL terapijska populacija TIL, koja uključuje povećanu potpopulaciju efektorskih T ćelija i/ili centralnih memorijskih T-ćelija u odnosu na drugu populaciju TIL, pri čemu se druga ekspanzija izvodi u zatvorenom kontejneru koji obezbeđuje drugu površinu permeabilnu za gas, i pri čemu se prelaz iz koraka (c) u korak (d) dešava bez otvaranja sistema;
(e) sakupljanje terapijske populacije TIL dobijene iz koraka (d), pri čemu se prelaz iz koraka (d) u korak (e) dešava bez otvaranja sistema; i
(f) prenošenje sakupljene TIL populacije iz koraka (e) u infuzionu kesu, pri čemu se prelaz iz koraka (e) u (f) dešava bez otvaranja sistema;
(g) opciono krioprezerviranje infuzione kese koja sadrži sakupljenu TIL populaciju iz koraka (f) korišćenjem procesa krioprezervacije; i
(h) primenu terapijski efikasne doze treće populacije TIL iz infuzione kese u koraku (g) kod pacijenta.
[0264] U nekim primerima izvođenja memorijski marker se bira iz grupe koja se sastoji od CCR7 i CD62L
[0265] U nekim primerima izvođenja, vijabilnost svežih TIL u poređenju sa odmrznutim TIL je najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, ili najmanje 98%. U nekim primerima izvođenja, vijabilnost svežih i odmrznutih TIL je veća od 70%, veća od 75%, veća od 80%, veća od 85%, veća od 90%, veća od 95%, ili veća od 98%. U nekim primerima izvođenja, vijabilnost svežeg i odmrznutog proizvoda je veća od 80%, veća od 81%, veća od 82%, veća od 83%, veća od 84%, veća od 85%, veća od 86%, veća od 87%, veća od 88%, veća od 89%, ili veća od 90%. U nekim primerima izvođenja, vijabilnost svežeg i odmrznutog proizvoda je veća od 86%.
[0266] U primeru izvođenja, restimulisani TIL mogu se evaluirati i u pogledu oslobađanja citokina, korišćenjem testova oslobađanja citokina. U nekim primerima izvođenja, TIL se mogu evaluirati u pogledu sekrecije interferona-7 (IFN-7) u odgovoru na stimulaciju sa OKT3 ili kokultivaciju sa autolognim tumorskim digestatom. Na primer, u primeru izvođenja u kojem se koristi stimulacija pomoću OKT3, TIL se dobro isperu i pripreme se bunarčići u duplikatima, sa 1 x 105 ćelija u 0.2 mL CM, na pločama sa 96 bunarčića sa ravnim dnom, koji su prethodno obloženi sa 0.1 ili 1.0 μg/mL OKT3 razblaženog u fosfatom puferisanom slanom rastvoru. Posle inkubiranja preko noći, supernatanti se sakupe i IFN-7 u supernatantu se meri pomoću ELISA (Pierce/Endogen, Woburn, MA). Za test kokultivacije, 1 x 10<5>TIL ćelija stavi se na ploče sa 96 bunarčića sa autolognim tumorskim ćelijama. (odnos 1:1). Posle inkubacije u trajanju od 24 sata, supernatanti se sakupe i oslobađenje IFN-7 može da se kvantifikuje, na primer pomoću ELISA.
[0267] Protočno-citometrijska analiza ćelijskih površinskih biomarkera: uzorci TIL se alikvotiraju za protočno-citometrijsku analizu ćelijskih površinskih markera, vidi, na primer Primere 7, 8, i 9.
[0268] U nekim primerima izvođenja, TIL se evaluiraju u pogledu različitih regulatornih markera. U nekim primerima izvođenja, regulatorni marker se bira iz grupe koja se sastoji od TCR α/β, CD56, CD27, CD28, CD57, CD45RA, CD45RO, CD25, CD127, CD95, IL-2R-, CCR7, CD62L, KLRG1, i CD122. U nekim primerima izvođenja, regulatorni marker je TCR α/β. U nekim primerima izvođenja, regulatorni marker je CD56. U nekim primerima izvođenja, regulatorni marker je CD27. U nekim primerima izvođenja, regulatorni marker je CD28. U nekim primerima izvođenja, regulatorni marker je CD57. U nekim primerima izvođenja, regulatorni marker je CD45RA. U nekim primerima izvođenja, regulatorni marker je CD45RO. U nekim primerima izvođenja, regulatorni marker je CD25. U nekim primerima izvođenja, regulatorni marker je CD127. U nekim primerima izvođenja, regulatorni marker je CD95. U nekim primerima izvođenja, regulatorni marker je IL-2R-. U nekim primerima izvođenja, regulatorni marker je CCR7. U nekim primerima izvođenja, regulatorni marker je CD62L. U nekim primerima izvođenja, regulatorni marker je KLRG1. U nekim primerima izvođenja, regulatorni marker je CD122.
[0269] U primeru izvođenja, ekspandirani TIL se analiziraju u pogledu ekspresije brojnih fenotipskih markera, uključujući one koji su opisani u ovom tekstu i u Primerima. U primeru izvođenja, ispituje se ekspresija jednog ili više fenotipskih markera. U nekim primerima izvođenja, marker se bira iz grupe koja se sastoji od TCRab (tj., TCRα/β), CD57, CD28, CD4, CD27, CD56, CD8a, CD45RA, CD8a, CCR7, CD4, CD3, CD38, i HLA-DR. U nekim primerima izvođenja, marker se bira iz grupe koja se sastoji od TCRab (tj., TCRα/β), CD57, CD28, CD4, CD27, CD56, i CD8a. U primeru izvođenja, marker se bira iz grupe koja se sastoji od CD45RA, CD8a, CCR7, CD4, CD3, CD38, i HLA-DR. U nekim primerima izvođenja, ispituje se ekspresija jednog, dva, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet, deset, jedanaest, dvanaest, trinaest ili četrnaest markera. U nekim primerima izvođenja, ispituje se ekspresija jednog ili više markera iz svake grupe. U nekim primerima izvođenja, ekspresija jednog ili više od HLA-DR, CD38, i CD69 se održava (tj., ne pokazuje statistički značajnu razliku) u svežim TIL u poređenju sa odmrznutim TIL. U nekim primerima izvođenja, aktivacioni status TIL se održava u odmrznutim TIL.
[0270] U primeru izvođenja, meri se ekspresija jednog ili više regulatornih markera. U nekim primerima izvođenja, regulatorni marker se bira iz grupe koja se sastoji od CD137, CD8a, Lag3, CD4, CD3, PD1, TIM-3, CD69, CD8a, TIGIT, CD4, CD3, KLRG1, i CD154. U nekim primerima izvođenja, regulatorni marker se bira iz grupe koja se sastoji od CD137, CD8a, Lag3, CD4, CD3, PD1, i TIM-3. U nekim primerima izvođenja, regulatorni marker se bira iz grupe koja se sastoji od CD69, CD8a, TIGIT, CD4, CD3, KLRG1, i CD154. U nekim primerima izvođenja, ekspresija regulatornog molekula je snižena kod odmrznutih TIL u poređenju sa svežim TIL. U nekim primerima izvođenja, ekspresija regulatornih molekula LAG-3 i TIM-3 je snižena kod odmrznutih TIL u poređenju sa svežim TIL. U nekim primerima izvođenja, nema značajne razlike u ekspresiji CD4, CD8, NK, TCRαβ. U nekim primerima izvođenja, nema značajne razlike u ekspresiji CD4, CD8, NK, TCRαβ, i/ili memorijskih markera u svežim TIL u poređenju sa odmrznutim TIL.
[0271] U nekim primerima izvođenja memorijski marker se bira iz grupe koja se sastoji od CCR7 i CD62L.
[0272] U nekim primerima izvođenja, vijabilnost svežih TIL u poređenju sa odmrznutim TIL iznosi najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, ili najmanje 98%. U nekim primerima izvođenja, vijabilnost svežih i odmrznutih TIL je veća od 70%, veća od 75%, veća od 80%, veća od 85%, veća od 90%, veća od 95%, ili veća od 98%. U nekim primerima izvođenja, vijabilnost svežeg i odmrznutog proizvoda je veća od 80%, veća od 81%, veća od 82%, veća od 83%, veća od 84%, veća od 85%, veća od 86%, veća od 87%, veća od 88%, veća od 89%, ili veća od 90%. U nekim primerima izvođenja, vijabilnost svežeg i odmrznutog proizvoda je veća od 86%.
[0273] U primeru izvođenja, restimulisani TIL se mogu evaluirati i u pogledu oslobađanja citokina, korišćenjem testova oslobađanja citokina. U nekim primerima izvođenja, TIL mogu se evaluirati u pogledu sekrecije interferona-7 (IFN-7) u odgovoru na stimulaciju sa OKT3 ili kokultivaciju sa autolognim tumorskim digestatom. Na primer, u primeru izvođenja u kojem se koristi stimulacija pomoću OKT3, TIL se dobro isperu i pripreme se bunarčići u duplikatima, sa 1 x 105 ćelija u 0.2 mL CM na pločama sa 96 bunarčića sa ravnim dnom, prethodno obloženim sa 0.1 ili 1.0 μg/mL OKT3 razblaženog u fosfatom puferisanom slanom rastvoru. Posle inkubiranja preko noći, supernatanti se sakupe i IFN-7 u supernatantu se meri pomoću ELISA (Pierce/Endogen, Woburn, MA). Za test kokultivacije, 1 x 10<5>TIL ćelija stavi se na ploče sa 96 bunarčića sa autolognim tumorskim ćelijama. (odnos 1:1). Posle inkubacije u trajanju od 24 sata, supernatanti se sakupe i oslobađenje IFN-7 može da se kvantifikuje, na primer pomoću ELISA.
[0274] U nekim primerima izvođenja, fenotipska karakterizacija se vrši posle krioprezervacije.
J. Metaboličko zdravlje ekspandiranih TIL
[0275] Restimulisani TIL karakterišu se značajnim povećanjem glikolize u poređenju sa sveže sakupljenim TIL i/ili post-odmrznutim TIL. U primeru izvođenja, ni u jednom koraku, uključujući one o kojima je bilo reči ranije u ovom tekstu ili kako je dato na primer na Slici 27, nije vršena selekcija prve populacije TIL, druge populacije TIL, treće populacije TIL, sakupljene populacije TIL, i/ili terapijske populacije TIL, na osnovu ekspresije CD8. U nekim primerima izvođenja, nije vršena selekcija prve populacije TIL na osnovu ekspresije CD8. U nekim primerima izvođenja, nije vršena selekcija druge populacije TIL na osnovu ekspresije CD8. U nekim primerima izvođenja, nije vršena selekcija treće populacije TIL na osnovu ekspresije CD8. U nekim primerima izvođenja, nije vršena selekcija sakupljene populacije TIL na osnovu ekspresije CD8. U nekim primerima izvođenja, nije vršena selekcija terapijske populacije TIL na osnovu ekspresije CD8.
[0276] U primeru, nije vršena selekcija prve populacije TIL, druge populacije TIL, treće populacije TIL ili sakupljene populacije TIL na osnovu ekspresije CD8, ni u jednom koraku (a) do (f) postupka ekspandiranja tumor-infiltrirajućih limfocita (TIL) u terapijsku populaciju TIL, koji uključuje:
(a) dobijanje prve populacije TIL iz tumora resektovanog iz pacijenta, obrađivanjem uzorka tumora dobijenog od pacijenta u više tumorskih fragmenata;
(b) dodavanje tumorskih fragmenata zatvorenom sistemu;
(c) izvođenje prve ekspanzije kultivisanjem prve populacije TIL u medijumu za ćelijsku kulturu koji sadrži IL-2 da bi se proizvela druga populacija TIL, pri čemu se prva ekspanzija izvodi u zatvorenom kontejneru koji obezbeđuje prvu površinu permeabilnu za gas, pri čemu se prva ekspanzija izvodi tokom oko 3-14 dana da bi se dobila druga populacija TIL, pri čemu je druga populacija TIL najmanje 50 puta brojnija od prve populacije TIL, i pri čemu se prelaz iz koraka (b) u korak (c) dešava bez otvaranja sistema;
(d) izvođenje druge ekspanzije suplementacijom medijuma za kulturu ćelija druge populacije TIL dodatnim IL-2, OKT-3, i antigen-prezentujućim ćelijama (APC), da bi se proizvela treća populacija TIL, pri čemu se druga ekspanzija izvodi tokom oko 7-14 dana da bi se dobila treća populacija TIL, pri čemu je treća populacija TIL terapijska populacija TIL, koja uključuje povećanu potpopulaciju efektorskih T ćelija i/ili centralnih memorijskih T-ćelija u odnosu na drugu populaciju TIL, pri čemu se druga ekspanzija izvodi u zatvorenom kontejneru koji obezbeđuje drugu površinu permeabilnu za gas, i pri čemu se prelaz iz koraka (c) u korak (d) dešava bez otvaranja sistema;
(e) sakupljanje terapijske populacije TIL dobijene iz koraka (d), pri čemu se prelaz iz koraka (d) u korak (e) dešava bez otvaranja sistema; i
(f) prenošenje sakupljene TIL populacije iz koraka (e) u infuzionu kesu, pri čemu se prelaz iz koraka (e) u (f) dešava bez otvaranja sistema.
[0277] U primeru, nije vršena selekcija prve populacije TIL, druge populacije TIL, treće populacije TIL ili sakupljene populacije TIL na osnovu ekspresije CD8, ni u jednom koraku (a) do (h) postupka lečenja subjekta sa kancerom, postupak koji obuhvata primenu ekspandiranih tumor-infiltrirajućih limfocita (TIL) uključuje:
(a) dobijanje prve populacije TIL iz tumora resektovanog iz pacijenta, obrađivanjem uzorka tumora dobijenog od pacijenta u više tumorskih fragmenata;
(b) dodavanje tumorskih fragmenata zatvorenom sistemu;
(c) izvođenje prve ekspanzije kultivisanjem prve populacije TIL u medijumu za ćelijsku kulturu koji sadrži IL-2 da bi se proizvela druga populacija TIL, pri čemu se prva ekspanzija izvodi u zatvorenom kontejneru koji obezbeđuje prvu površinu
1
permeabilnu za gas, pri čemu se prva ekspanzija izvodi tokom oko 3-14 dana da bi se dobila druga populacija TIL, pri čemu je druga populacija TIL najmanje 50 puta brojnija od prve populacije TIL, i pri čemu se prelaz iz koraka (b) u korak (c) dešava bez otvaranja sistema;
(d) izvođenje druge ekspanzije suplementacijom medijuma za kulturu ćelija druge populacije TIL dodatnim IL-2, OKT-3, i antigen-prezentujućim ćelijama (APC), da bi se proizvela treća populacija TIL, pri čemu se druga ekspanzija izvodi tokom oko 7-14 dana da bi se dobila treća populacija TIL, pri čemu je treća populacija TIL terapijska populacija TIL, koja uključuje povećanu potpopulaciju efektorskih T ćelija i/ili centralnih memorijskih T-ćelija u odnosu na drugu populaciju TIL, pri čemu se druga ekspanzija izvodi u zatvorenom kontejneru koji obezbeđuje drugu površinu permeabilnu za gas, i pri čemu se prelaz iz koraka (c) u korak (d) dešava bez otvaranja sistema;
(e) sakupljanje terapijske populacije TIL dobijene iz koraka (d), pri čemu se prelaz iz koraka (d) u korak (e) dešava bez otvaranja sistema; i
(f) prenošenje sakupljene TIL populacije iz koraka (e) u infuzionu kesu, pri čemu se prelaz iz koraka (e) u (f) dešava bez otvaranja sistema.
(g) opciono krioprezerviranje infuzione kese koja sadrži sakupljenu TIL populaciju iz koraka (f) korišćenjem procesa krioprezervacije; i
(h) primenu terapijski efikasne doze treće populacije TIL iz infuzione kese u koraku (g) kod pacijenta.
[0278] TIL pripremljeni postupcima opisanim u ovom tekstu karakterišu se značajnim povećanjem bazalne glikolize u poređenju sa, na primer, sveže sakupljenim TIL i/ili TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U primeru izvođenja, ni u jednom koraku, uključujući one o kojima je bilo reči ranije u ovom tekstu ili kako je dato na primer na Slici 27, nije vršena selekcija prve populacije TIL, druge populacije TIL, treće populacije TIL, sakupljene populacije TIL, i/ili terapijske populacije TIL, na osnovu ekspresije CD8. U nekim primerima izvođenja, nije vršena selekcija prve populacije TIL na osnovu ekspresije CD8. U nekim primerima izvođenja, nije vršena selekcija druge populacije TIL na osnovu ekspresije CD8. U nekim primerima izvođenja, nije vršena selekcija treće populacije TIL na osnovu ekspresije CD8. U nekim primerima izvođenja, nije vršena selekcija sakupljene populacije TIL na osnovu ekspresije CD8. U nekim primerima
2
izvođenja, nije vršena selekcija terapijske populacije TIL na osnovu ekspresije CD8. U primeru izvođenja, nije vršena selekcija prve populacije TIL, druge populacije TIL, treće populacije TIL, ili sakupljene populacije TIL na osnovu ekspresije CD8 ni u jednom od koraka (a) do (h).
[0279] Rezervni respiratorni kapacitet (spare respiratory capacity, SRC) i glikolitička rezerva mogu se evaluirati kod TIL ekspandiranih različitim postupcima predmetne objave. Seahorse XF Cell Mito Stress testom meri se funkcija mitohondrija direktnim merenjem stope potrošnje kiseonika (oxygen consumption rate, OCR) ćelija, korišćenjem modulatora respiracije koji ciljaju komponente elektron-transportnog lanca u mitohondrijama. Testna jedinjenja (oligomicin, FCCP, i mešavina rotenona i antimicina A, opisana dole) serijski se injektiraju da bi se merili proizvodnja ATP, maksimalna respiracija, odnosno nemitohondrijalna respiracija. Otpuštanje protona i rezervni respiratorni kapacitet se zatim izračunavaju korišćenjem ovih parametara i bazalne respiracije. Svaki modulator uperen je ka specifičnoj komponenti elektron-transportnog lanca. Oligomicin inhibira ATP sintazu (kompleks V) i smanjenje OCR posle injektiranja oligomicina u korelaciji je sa mitohondrijalnom respiracijom udruženom sa proizvodnjom ATP u ćeliji. Karbonil cijanid-4 (trifluorometoksi) fenilhidrazon (FCCP) je dekuplujuće sredstvo koje rasipa protonski gradijent i remeti mitohondrijalni membranski potencijal. Kao rezultat, protok elektrona duž elektron-transportnog lanca se ne zaustavlja i kompleks IV maksimalno konzumira kiseonik. FCCP-stimulisana OCR može zatim da se upotrebi za izračunavanje rezervnog respiratornog kapaciteta, definisanog kao razlika između maksimalne respiracije i bazalne respiracije. Rezervni respiratorni kapacitet (SRC) je mera sposobnosti ćelije da odgovori na povećani zahtev za energijom. Treća injekcija je mešavina rotenona, inhibitora kompleksa I, i antimicina A, inhibitora kompleksa III. Ova kombinacija prekida mitohondrijalnu respiraciju i omogućava izračunavanje nemitohondrijalne respiracije vođene procesima izvan mitohondrija. U nekim primerima izvođenja, upoređivanje se vrši sa, na primer, sveže sakupljenim TIL i/ili TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27.
[0280] U nekim primerima izvođenja, metabolički test je test bazalne respiracije. Uopšteno, TIL druge ekspanzije imaju stopu bazalne respiracije koja iznosi najmanje 50%, najmanje 55%, najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 97%, najmanje 98%, ili najmanje 99% od stope bazalne respiracije sveže sakupljenih TIL i/ili TIL pripremljenih korišćenjem postupaka različitih od onih koji su dati u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, stopa bazalne respiracije iznosi od oko 50% do oko 99% od stope bazalne respiracije sveže sakupljenih TIL i/ili TIL pripremljenih korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, stopa bazalne respiracije iznosi od oko 60% do oko 99% od stope bazalne respiracije sveže sakupljenih TIL i/ili TIL pripremljenih korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, stopa bazalne respiracije iznosi od oko 70% do oko 99% od stope bazalne respiracije sveže sakupljenih TIL i/ili TIL pripremljenih korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, stopa bazalne respiracije iznosi od oko 80% do oko 99% od stope bazalne respiracije sveže sakupljenih TIL i/ili TIL pripremljenih korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, stopa bazalne respiracije iznosi od oko 90% do oko 99% od stope bazalne respiracije sveže sakupljenih TIL i/ili TIL pripremljenih korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, stopa bazalne respiracije iznosi od oko 95% do oko 99% od stope bazalne respiracije sveže sakupljenih TIL i/ili TIL pripremljenih korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, TIL druge ekspanzije ili TIL druge dodatne ekspanzije (kao što su, na primer, oni opisani u Koraku D Slike 27, uključujući TIL označene kao reREP TIL) imaju stopu bazalne respiracije koja se statistički značajno ne razlikuje od stope bazalne respiracije sveže sakupljenih TIL i/ili TIL pripremljenih korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, upoređivanje se vrši sa, na primer, sveže sakupljenim TILs i/ili TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27.
[0281] U nekim primerima izvođenja, metabolički test je test rezervnog respiratornog kapaciteta. Uopšteno, TIL druge ekspanzije ili TIL druge dodatne ekspanzije (kao što su, na primer, oni opisani u Koraku D Slike 27, uključujući TIL označene kao reREP TIL) imaju rezervni respiratorni kapacitet koji iznosi najmanje 50%, najmanje 55%, najmanje 60%,
4
najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 97%, najmanje 98%, ili najmanje 99% od stope bazalne respiracije sveže sakupljenih TIL i/ili TIL pripremljenih korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, rezervni respiratorni kapacitet iznosi od oko 50% do oko 99% od stope bazalne respiracije sveže sakupljenih TIL. U nekim primerima izvođenja, rezervni respiratorni kapacitet iznosi od oko 50% do oko 99% od stope bazalne respiracije sveže sakupljenih TIL i/ili TIL pripremljenih korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, rezervni respiratorni kapacitet iznosi od oko 60% do oko 99% od stope bazalne respiracije sveže sakupljenih TIL i/ili TIL pripremljenih korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, rezervni respiratorni kapacitet iznosi od oko 70% do oko 99% od stope bazalne respiracije sveže sakupljenih TIL i/ili TIL pripremljenih korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, rezervni respiratorni kapacitet iznosi od oko 80% do oko 99% od stope bazalne respiracije sveže sakupljenih TIL. U nekim primerima izvođenja, rezervni respiratorni kapacitet iznosi od oko 90% do oko 99% od stope bazalne respiracije sveže sakupljenih TIL i/ili TIL pripremljenih korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, rezervni respiratorni kapacitet iznosi od oko 95% do oko 99% od stope bazalne respiracije sveže sakupljenih TIL i/ili TIL pripremljenih korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, TIL druge ekspanzije ili TIL druge dodatne ekspanzije (kao što su, na primer, oni opisani u Koraku D Slike 27, uključujući TIL označene kao reREP TIL) imaju rezervni respiratorni kapacitet koji nije statistički značajno različit od stope bazalne respiracije
sveže sakupljenih TIL i/ili TIL pripremljenih korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27.
[0282] Uopšteno, TIL druge ekspanzije ili TIL druge dodatne ekspanzije (kao što su, na primer, oni opisani u Koraku D Slike 27, uključujući TIL označene kao reREP TIL) imaju rezervni respiratorni kapacitet koji iznosi najmanje 50%, najmanje 55%, najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 97%, najmanje 98%, ili najmanje 99% od stope bazalne respiracije sveže sakupljenih TIL i/ili TIL pripremljenih korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, metabolički test meri glikolitičku rezervu. U nekim primerima izvođenja, metabolički test je test rezervnog respiratornog kapaciteta. Da bi se merio ćelijski (respiratorni) metabolizam, ćelije se tretiraju inhibitorima mitohondrijalne respiracije i glikolize kako bi se odredio metabolički profil TIL, koji se sastoji od sledećih mera: bazalna oksidativna fosforilacija (merena preko OCR), rezervni respiratorni kapacitet, bazalna glikolitička aktivnost (merena preko ECAR), i glikolitička rezerva. Metaboličko profilisanje se izvodi korišćenjem "Seahorse" kombinovanog testa za stres mitohondrija/glikolizu (uključujući kit koji se komercijalno može nabaviti od Agilent®), koji omogućava određivanje kapaciteta ćelija za obavljanje glikolize posle blokade proizvodnje ATP u mitohondrijama. U nekim primerima izvođenja, ćelije se lišavaju glukoze, zatim se glukoza injektira, posle čega sledi stresno sredstvo. U nekim primerima izvođenja, stresno sredstvo se bira iz grupe koja se sastoji od oligomicina, FCCP, rotenona, antimicina A i/ili 2-deoksiglukoze (2-deoxyglucose, 2-DG), kao i njihovih kombinacija. U nekim primerima izvođenja, oligomicin se dodaje u koncentraciji od 10 mM. U nekim primerima izvođenja, FCCP se dodaje u koncentraciji od 10 mM. U nekim primerima izvođenja, rotenone se dodaje u koncentraciji od 2.5 mM. U nekim primerima izvođenja, antimicin A se dodaje u koncentraciji od 2.5 mM. U nekim primerima izvođenja, 2-deoksiglukoza (2-DG) se dodaje u koncentraciji od 500 mM. U nekim primerima izvođenja, mere se glikolitički kapacitet, glikolitička rezerva, i/ili neglikolitička acidifikacija. Uopšteno, TIL imaju glikolitičku rezervu koja iznosi najmanje 50%, najmanje 55%, najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 97%, najmanje 98%, ili najmanje 99% od stope bazalne respiracije sveže sakupljenih TIL i/ili TIL pripremljenih korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, glikolitička rezerva iznosi od oko 50% do oko 99% od stope bazalne respiracije sveže sakupljenih TIL i/ili TIL pripremljenih korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, glikolitička rezerva iznosi od oko 60% do oko 99% od stope bazalne respiracije sveže sakupljenih TIL i/ili TIL pripremljenih korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, glikolitička rezerva iznosi od oko 70% do oko 99% od stope bazalne respiracije sveže sakupljenih TIL i/ili TIL pripremljenih korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, glikolitička rezerva iznosi od oko 80% do oko 99% od stope bazalne respiracije sveže sakupljenih TIL i/ili TIL pripremljenih korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, glikolitička rezerva iznosi od oko 90% do oko 99% od stope bazalne respiracije sveže sakupljenih TIL i/ili TIL pripremljenih korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, glikolitička rezerva iznosi od oko 95% do oko 99% od stope bazalne respiracije sveže sakupljenih TIL i/ili TIL pripremljenih korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27.
[0283] U nekim primerima izvođenja, metabolički test je test bazalne glikolize. U nekim primerima izvođenja, TIL druge ekspanzije ili TIL druge dodatne ekspanzije (kao što su, na primer, oni opisani u Koraku D Slike 27, uključujući TIL označene kao reREP TIL) imaju porast bazalne glikolize od najmanje dva puta, najmanje tri puta, najmanje četiri puta, najmanje pet puta, najmanje šest puta, najmanje 7 puta, najmanje osam puta, najmanje devet puta, ili najmanje deset puta u poređenju sa sveže sakupljenim TIL i/ili TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu, uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, TIL druge ekspanzije ili TIL druge dodatne ekspanzije (kao što su, na primer, oni opisani u Koraku D Slike 27, uključujući TIL označene kao reREP TIL) imaju porast bazalne glikolize od najmanje dva puta do oko deset puta u poređenju sa sveže sakupljenim TIL i/ili TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, TIL druge ekspanzije ili TIL druge dodatne ekspanzije (kao što su, na primer, oni opisani u Koraku D Slike 27, uključujući TIL označene kao reREP TIL) imaju porast bazalne glikolize od najmanje dva puta do oko osam puta u poređenju sa sveže sakupljenim TIL i/ili TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, TIL druge ekspanzije ili TIL druge dodatne ekspanzije (kao što su, na primer, oni opisani u Koraku D Slike 27, uključujući TIL označene kao reREP TIL) imaju porast bazalne glikolize od oko tri puta do oko sedam puta u poređenju sa sveže sakupljenim TIL i/ili TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, TIL druge ekspanzije ili TIL druge dodatne ekspanzije (kao što su, na primer, oni opisani u Koraku D Slike 27, uključujući TIL označene kao reREP TIL) imaju porast bazalne glikolize od oko dva puta do oko četiri puta u poređenju sa sveže sakupljenim TIL i/ili TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, TIL druge ekspanzije ili TIL druge dodatne ekspanzije (kao što su, na primer, oni opisani u Koraku D Slike 27, uključujući TIL označene kao reREP TIL) imaju porast bazalne glikolize od oko dva puta do oko tri puta u poređenju sa sveže sakupljenim TIL i/ili TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27.
[0284] Uopšteno, TIL druge ekspanzije ili TIL druge dodatne ekspanzije (kao što su, na primer, oni opisani u Koraku D Slike 27, uključujući TIL označene kao reREP TIL) imaju glikolitičku rezervu koja iznosi najmanje 50%, najmanje 55%, najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 97%, najmanje 98%, ili najmanje 99% od stope bazalne respiracije sveže sakupljenih TIL i/ili TIL pripremljenih korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, glikolitička rezerva iznosi od oko 50% do oko 99% od stope bazalne respiracije sveže sakupljenih TIL. U nekim primerima izvođenja, glikolitička rezerva iznosi od oko 60% do oko 99% od stope bazalne respiracije sveže sakupljenih TIL i/ili TIL pripremljenih korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, glikolitička rezerva iznosi od oko 70% do oko 99% od stope bazalne respiracije sveže sakupljenih TIL i/ili TIL pripremljenih korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, glikolitička rezerva iznosi od oko 80% do oko 99% od stope bazalne respiracije sveže sakupljenih TIL i/ili TIL pripremljenih korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, glikolitička rezerva iznosi od oko 90% do oko 99% od stope bazalne respiracije sveže sakupljenih TIL i/ili TIL pripremljenih korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, glikolitička rezerva iznosi od oko 95% do oko 99% od stope bazalne respiracije sveže sakupljenih TIL.
[0285] Proizvodnja granzima B: Granzim B je još jedna mera sposobnosti TIL da ubiju ciljne ćelije. Supernatanti medijuma, posle restimulacije opisane ranije u ovom tekstu uz korišćenje antitela na CD3, CD28, i CD137/4-1BB evaluirani su i u pogledu nivoa granzima B upotrebom Human Granzyme B DuoSet ELISA kita (R & D Systems, Minneapolis, MN) prema uptstvima proizvođača. U nekim primerima izvođenja, TIL druge ekspanzije ili TIL druge dodatne ekspanzije (kao što su, na primer, oni opisani u Koraku D Slike 27, uključujući TIL označene kao reREP TIL) imaju povećanu proizvodnju granzima B. U nekim primerima izvođenja, TIL druge ekspanzije ili TIL druge dodatne ekspanzije (kao što su, na primer, oni opisani u Koraku D Slike 27, uključujući TIL označene kao reREP TIL) imaju povećanu citotoksičnu aktivnost.
[0286] U nekim primerima izvođenja, dužina telomera može se upotrebiti kao mera ćelijske vijabilnosti i/ili ćelijske funkcije. U nekim primerima izvođenja, telomere su iznenađujuće iste dužine kod TIL proizvedenih predmetnim pronalaskom i TIL pripremljenih postupcima različitim od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. Merenje dužine telomera: Različiti metodi korišćeni su za merenje dužine telomera u genomskoj DNK i citološkim preparatima. Analiza telomernih restrikcionih fragmenata (telomere restriction fragment, TRF) je zlatni standard za merenje dužine telomera (de Lange et al., 1990). Međutim, glavno ograničenje TRF je potreba za velikom količinom DNK (1.5 ^g). Dve široko korišćene tehnike merenja dužine telomera, konkretno, fluorescentna in situ hibridizacija (fluorescence in situ hybridization, FISH; Agilent Technologies, Santa Clara, CA) i kvantitativna PCR mogu se koristiti sa predmetnim pronalaskom. U nekim primerima izvođenja, nema promene u dužini telomera između inicijalno sakupljenih TIL u Koraku A i ekspandiranih TIL iz, na primer, Koraka D kako je dato na Slici 27.
[0287] U nekim primerima izvođenja, zdravlje TIL meri se sekrecijom IFN-gama (IFN-γ). U nekim primerima izvođenja, sekrecija IFN-γ ukazuje na aktivne TIL. U nekim primerima izvođenja, koristi se test potencije za proizvodnju IFN-γ. Proizvodnja IFN-γ je još jedna mera citotoksičnog potencijala. Proizvodnja IFN-γ može da se meri određivanjem nivoa citokina IFN-γ u medijumu TIL stimulisanih antitelima na CD3, CD28, i CD137/4-1BB. Nivoi IFNγ u medijumu ovih stimulisanih TIL mogu se odrediti merenjem oslobađanja IFN-γ. U nekim primerima izvođenja, porast proizvodnje IFN-γ u na primer TIL Koraka D, kako je dato na Slici 27, u poređenju sa inicijalno sakupljenim TIL u na primer Koraku A kako je dato na Slici 27 ukazuje na porast citotoksičnog potencijala TIL Koraka D. U nekim primerima izvođenja, sekrecija IFN-γ je povećana jednom, dva puta, tri puta, četiri puta, ili pet puta ili više. U nekim primerima izvođenja, sekrecija IFN-γ je povećana jedan put. U nekim primerima izvođenja, sekrecija IFN-γ je povećana dva puta. U nekim primerima izvođenja, sekrecija IFN-γ je povećana tri puta. U nekim primerima izvođenja, sekrecija IFN-γ je povećana četiri puta. U nekim primerima izvođenja, sekrecija IFN-γ je povećana pet puta. U nekim primerima izvođenja, IFN-γ se meri korišćenjem Quantikine ELISA kita. U nekim primerima izvođenja, IFN-γ se meri u TIL ex vivo. U nekim primerima izvođenja, IFN-γ se meri u TIL ex vivo, uključujući TIL proizvedene postupcima predmetnog pronalaska, uključujući na primer postupke sa Slike 27, kao i sveže sakupljene TIL ili TIL proizvedene drugim postupcima, kao što su oni obezbeđeni na primer na Slici 83 (kao što su na primer TIL iz procesa 1C).
[0288] U nekim primerima izvođenja, citotoksični potencijal TIL da liziraju ciljne ćelije procenjuje se korišćenjem testa kokultivisanja TIL sa bioluminiscentnom ćelijskom linijom, P815 (klon G6), prema testu bioluminiscentne preusmerene lize (test potencije) za testiranje TIL, koji meri citotoksičnost TIL na visokosenzitivan i dozno-zavisan način.
[0289] U nekim primerima izvođenja, predmetni postupci obezbeđuju test za procenu vijabilnosti TIL, uz korišćenje postupaka opisanih ranije u ovom tekstu. U nekim primerima izvođenja, TIL se ekspandiraju kako je bilo reči ranije u ovom tekstu, uključujući na primer prikazano na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, pre procene vijabilnosti TIL se krioprezerviraju. U nekim primerima izvođenja, procena vijabilnosti uključuje odmrzavanje TIL pre obavljanja prve ekspanzije, druge ekspanzije, i dodatne druge ekspanzije. U nekim primerima izvođenja, predmetni postupci obezbeđuju test za procenu ćelijske proliferacije, ćelijske toksičnosti, ćelijske smrti, i/ili drugih termina povezanih sa vijabilnošću TIL populacije. Vijabilnost može da se meri bilo kojim od metaboličkih testova TIL opisanih gore, kao i bilo kojim od postupaka za procenjivanje ćelijske vijabilnosti poznatih u struci. U nekim primerima izvođenja, predmetni postupci obezbeđuju test za procenu ćelijske proliferacije, ćelijske toksičnosti, ćelijske smrti, i/ili drugih termina povezanih sa vijabilnošću TIL ekspandiranih korišćenjem postupaka opisanih u ovom tekstu, uključujući one koji su kao primer dati na Slici 27.
[0290] Isto tako, u ovom tekstu se objavljuju, ali ne i zahtevaju testni postupci za određivanje vijabilnosti TIL. U nekim primerima izvođenja, TIL imaju jednaku vijabilnost u poređenju sa sveže sakupljenim TIL i/ili TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, TIL imaju povećanu vijabilnost u poređenju sa sveže sakupljenim TIL i/ili TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. Predmetna objava obezbeđuje postupke za testiranje TIL u pogledu vijabilnosti ekspandiranjem tumor-infiltrirajućih limfocita (TIL) u veću populaciju TIL, koji uključuju:
(i) dobijanje prve populacije TIL koji su bili prethodno ekspandirani;
(ii) izvođenje prve ekspanzije kultivisanjem prve populacije TIL u medijumu za kulturu ćelija koji sadrži IL-2 da bi se proizvela druga populacija TIL; i
(iii) izvođenje druge ekspanzije suplementacijom medijuma za kulturu ćelija druge populacije TIL dodatnim IL-2, OKT-3, i antigen-prezentujućim ćelijama (APC), da bi se proizvela treća populacija TIL, pri čemu je treća populacija TIL najmanje 100 puta brojnija od druge populacije TIL, i pri čemu se druga ekspanzija izvodi tokom najmanje 14 dana u cilju dobijanja treće populacije TIL, pri čemu treća populacija TIL uključuje povećanu potpopulaciju efektorskih T ćelija i/ili centralnih memorijskih T ćelija u odnosu na drugu populaciju TIL, i pri čemu se treća populacija dodatno procenjuje u pogledu vijabilnosti.
[0291] Postupak može dodatno uključivati:
(iv) izvođenje dodatne druge ekspanzije suplementacijom medijuma za kulturu ćelija treće populacije TIL dodatniml IL-2, dodatnim OKT-3, i dodatnim APC, pri čemu se dodatna druga ekspanzija izvodi tokom najmanje najmanje 14 dana da bi se dobila veća populacija TIL od one koja je dobijeena u koraku (iii), pri čemu veća populacija TIL uključuje povećanu potpopulaciju efektorskih T ćelija i/ili centralnih memorijskih T ćelija u odnosu na treću populaciju TIL, i pri čemu se treća populacija dodatno testira u pogledu vijabilnosti.
[0292] Pre koraka (i), ćelije mogu da se krioprezerviraju.
[0293] Ćelije mogu da se odmrznu pre izvođenja koraka (i).
1
[0294] Korak (iv) može da se ponovi jedan do četiri puta u cilju dobijanja dovoljno TIL za analizu.
[0295] Koraci (i) do (iii) ili (iv) mogu da se izvode unutar perioda od oko 40 dana do oko 50 dana.
[0296] Koraci (i) do (iii) ili (iv) mogu da se izvode unutar perioda od oko 42 dana do oko 48 dana.
[0297] Koraci (i) do (iii) ili (iv) mogu da se izvode unutar perioda od oko 42 dana do oko 45 dana.
[0298] Koraci (i) do (iii) ili (iv) mogu da se izvode unutar perioda od oko 44 dana.
[0299] Ćelije iz koraka (iii) ili (iv) mogu da eksprimiraju CD4, CD8, i TCR α β na nivoima sličnim sveže sakupljenim ćelijama.
[0300] Antigen-prezentujuće ćelije mogu biti mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC).
[0301] PBMC mogu da se dodaju ćelijskoj kulturi bilo kojeg od dana 9 do 17 u koraku (iii).
[0302] Effektorske T ćelije i/ili centralne memorijske T ćelije u većoj populaciji TIL u koraku (iv) mogu ispoljavati jednu ili više karakteristika koje se biraju iz grupe koju čine ekspresija CD27, ekspresija CD28, duže telomere, povišena ekspresija CD57, i smanjena ekspresija CD56, u odnosu na efektorske T ćelije, i/ili centralne memorijske T ćelije u trećoj populaciji ćelija.
[0303] Efektorske T ćelije i/ili centralne memorijske T ćelije mogu ispoljiti povećanu ekspresiju CD57 i smanjenu ekspresiju CD56.
[0304] APC mogu biti veštačke APC (aAPC).
[0305] Postupak može dodatno uključivati korak transdukovanja prve populacije TIL ekspresionim vektorom koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira visokoafinitetni T ćelijski receptor.
[0306] Korak transdukovanja može da se dogodi pre koraka (i).
[0307] Postupak može dodatno uključivati korak transdukovanja prve populacije TIL ekspresionim vektorom koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira himerni antigenski receptor (CAR) koji sadrži jednolančani varijabilni fragment antitela fuzionisan sa najmanje jednim endodomenom T-ćelijskog signalnog molekula.
[0308] Korak transdukovanja može da se dešava pre koraka (i).
[0309] TIL mogu da se testiraju u pogledu vijabilnosti.
[0310] TIL mogu da se testiraju u pogledu vijabilnosti posle krioprezervacije i posle koraka (iv).
2
[0312] Različiti antigenski receptori T i B limfocita proizvode se somatskom rekombinacijom ograničenog, ali velikog broja genskih segmenata. Ovi genski segmenti: V (varijabilni), D (diverzitet), J (spojni), i C (konstantni), određuju vezujuću specifičnost i nishodne primene imunoglobulina i T-ćelijskih receptora (TCR). Predmetni pronalazak obezbeđuje postupak stvaranja TIL koji pokazuje porast diverziteta repertoara T-ćelija (ponekad označeno kao poliklonalnost). U nekim primerima izvođenja, porast diverziteta repertoara T-ćelija je u odnosu na sveže sakupljene TIL i/ili TIL pripremljene korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, TIL dobijeni predmetnim postupcima ispoljavaju porast diverziteta repertoara T-ćelija. U nekim primerima izvođenja, TIL dobijeni u prvoj ekspanziji ispoljavaju porast diverziteta repertoara T-ćelija. U nekim primerima izvođenja, porast diverziteta je porast diverziteta imunoglobulina i/ili diverziteta T-ćelijskog receptora. U nekim primerima izvođenja, diverzitet je u imunoglobulinu u imunoglobulinskom teškom lancu. U nekim primerima izvođenja, diverzitet je u imunoglobulinu u imunoglobulinskom lakom lancu. U nekim primerima izvođenja, diverzitet je u T-ćelijskom receptoru. U nekim primerima izvođenja, diverzitet je u jednom od T-ćelijskih receptora odabranih iz grupe koja se sastoji od alfa, beta, gama, i delta receptora. U nekim primerima izvođenja, postoji porast ekspresije T-ćelijskog receptora (TCR) alfa i/ili beta. U nekim primerima izvođenja, postoji porast ekspresije T-ćelijskog receptora (TCR) alfa. U nekim primerima izvođenja, postoji porast ekspresije T-ćelijskog receptora (TCR) beta. U nekim primerima izvođenja, postoji porast ekspresije TCRab (tj., TCRα/β).
[0313] U skladu sa predmetnom objavom, obezbeđuje se postupak za testiranje TIL u pogledu vijabilnosti i/ili dodatne upotrebe za apliciranje kod subjekta. Postupak za testiranje tumorinfiltrirajućih limfocita (TIL) može uključivati:
(i) dobijanje prve populacije TIL;
(ii) izvođenje prve ekspanzije kultivisanjm prve populacije TIL u medijumu za kulturu ćelija koji sadrži IL-2 da bi se proizvela druga populacija TIL; i
(iii) izvođenje druge ekspanzije suplementacijom medijuma za kulturu ćelija druge populacije TIL dodatnim IL-2, OKT-3, i antigen-prezentujućim ćelijama (APC), da se proizvede treća populacija TIL, pri čemu je treća populacija TIL najmanje 50 puta brojnija od druge populacije TIL;
(iv) sakupljanje, ispiranje i krioprezerviranje treće populacije TIL;
(v) skladištenje krioprezerviranih TIL na kriogenoj temperaturi;
(vi) odmrzavanje treće populacije TIL da bi se obezbedila treća populacija TIL; i
(vii) izvođenje dodatne druge ekspanzije dela odmrznute treće populacije TIL suplementacijom medijuma za kulturu ćelija treće populacije sa IL-2, OKT-3, i APC tokom dodatnog perioda ekspanzije (ponekad označenog kao reREP period) od najmanje 3 dana, pri čemu se treća ekspanzija izvodi da bi se dobila četvrta populacija TIL, pri čemu se broj TIL u četvrtoj populaciji TIL upoređuje sa brojem TIL u trećoj populaciji TIL da se dobije određeni odnos;
(viii) određivanje, na osnovu odnosa iz koraka (vii) da li je odmrznuta populacija TIL pogodna za primenu kod pacijenta;
(ix) primenu terapijski efikasne doze odmrznute treće populacije TIL kod pacijenta kada se odredi da je odnos broja TIL u četvrtoj populaciji TIL prema broju TIL u trećoj populaciji veći od 5:1 u koraku (viii).
[0314] Dodatni period ekspanzije (ponekad označen kao reREP period) može se izvoditi dok broj TIL u četvrtoj populaciji TIL prema broju TIL u trećoj populaciji TIL ne bude veći od 50:1.
[0315] Broj TIL dovoljan za terapijski efikasno doziranje može biti od oko 2.3 ×10<10>do oko 13.7 ×10<10>.
[0316] Koraci (i) do (vii) izvode se unutar perioda od oko 40 dana do oko 50 dana. Koraci (i) do (vii) mogu se izvesti unutar period aod oko 42 dana do oko 48 dana. Koraci (i) do (vii) mogu se izvesti unutar perioda od oko 42 dana do oko 45 dana. Koraci (i) do (vii) mogu se izvesti unutar oko 44 dana.
[0317] Ćelije iz koraka (iii) ili (vii) mogu eksprimirati CD4, CD8, i TCR α β na nivoima sličnim kao kod sveže sakupljenih ćelija. Ćelije mogu biti TIL.
[0318] Antigen-prezentujuće ćelije mogu biti mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC). PBMC mogu se dodati ćelijskoj kulturi bilo kojeg od dana 9 do 17, koraka (iii).
[0319] Efektorske T ćelije i/ili centralne memorijske T ćelije u većoj populaciji TIL u koracima (iii) ili (vii) mogu ispoljavati jednu ili više karakteristika odabranih iz grupe koja se sastoji od ekspresije CD27, ekspresije CD28, dužih telomera, povećane ekspresije CD57, i
4
smanjene ekspresije CD56, u odnosu na efektorske T ćelije, i/ili centralne memorijske T ćelije u trećoj populaciji ćelija.
[0320] Efektorske T ćelije, i/ili centralne memorijske T ćelije mogu ispoljiti povišenu ekspresiju CD57 i smanjenu ekspresiju CD56.
[0321] APC mogu biti veštačke APC (aAPC).
[0322] Korak transdukovanja prve populacije TIL ekspresionim vektorom može uključivati nukleinsku kiselinu koja kodira visokoafinitetni T ćelijski receptor.
[0323] Korak transdukovanja može se dešavati pre koraka (i).
[0324] Korak transdukovanja prve populacije TIL ekspresionim vektorom može uključivati nukleinsku kiselinu koja kodira himerni antigenski receptor (CAR) koji sadrži jednolančani varijabilni fragment antitela fuzionisan sa najmanje jednim endodomenom T-ćelijskog signalnog molekula.
[0325] Korak transdukovanja može da se desi pre koraka (i).
[0326] TIL mogu da se testiraju u pogledu vijabilnosti posle koraka (vii).
[0327] Predmetna objava obezbeđuje dodatne postupke testiranja TIL. Objava može obezbeđivati postupak za testiranje TIL koji uključuje:
(i) dobijanje dela prve populacije krioprezerviranih TIL;
(ii) odmrzavanje dela prve populacije krioprezerviranih TIL;
(iii) izvođenje prve ekspanzije kultivisanjem dela prve populacije TIL u medijumu za kulturu ćelija koji sadrži IL-2, OKT-3, i antigen.prezentujuće ćelije (APC) tokom dodatnog perioda ekspanzije (ponekad označen kao reREP period) od najmanje 3 dana, da bi se proizvela druga populacija TIL, pri čemu se deo prve populacije TIL upoređuje sa drugom populacijom TIL da bi se dobio odnos broja TIL, pri čemu je odnos broja TIL u drugoj populaciji TIL prema broju TIL u delu prve populacije TIL veći od 5:1;
(iv) određivanje na osnovu odnosa iz koraka (iii) da li je prva populacija TIL pogodna za upotrebu u terapijskoj primeni kod pacijenta;
(v) određivanje da li je prva populacija TIL pogodna za upotrebu u terapijskoj primeni kada je određeno da je odnos broja TIL u drugoj populaciji TIL prema broju TIL u prvoj populaciji TIL veći od 5:1 u koraku (iv).
[0328] Odnos broja TIL u drugoj populaciji TIL prema broju TIL u delu prve populacije TIL može biti veći od 50:1.
[0329] Postupak može uključivati još i izvođenje ekspanzije cele prve populacije krioprezerviranihTIL iz koraka (i) prema postupcima opisanim u bilo kojem od primera izvođenja datih u ovom tekstu.
[0330] Postupak može uključivati još i primenu cele prve populacije krioprezerviranih TIL iz koraka (i) kod pacijenta.
K. Zatvoreni sistem za proizvodnju TIL
[0331] Predmetni pronalazak obezbeđuje upotrebu zatvorenih sistema tokom procesa kultivisanja TIL. Takvi zatvoreni sistemi omogućavaju prevenciju i/ili smanjenje kontaminacije mikrobima, omogućavaju korišćenje manjeg broja flakona, i omogućavaju smanjenje troškova. U nekim primerima izvođenja, u zatvorenom sistemu koriste se dva kontejnera.
[0332] Takvi zatvoreni sistemi dobro su poznati u struci i mogu se naći na primer, na http://www.fda.gov/cber/guidelines. htm i
https://www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/G uidances/B lood/ucm076779.htm..
[0333] Kako je dato na veb-stranici FDA, zatvoreni sistemi za postupke koji se izvode sterilno poznati su i dobro su opisani. Vidi,
https://www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/G uidances/ Blood/ucm076779.htm, kako je gore navedeno i obezbeđeno u odgovarajućem delu u nastavku. Uvod
[0334] Sterilni spojni uređaji (sterile connecting devices, STCD) proizvode sterilne spojeve između dva dela kompatibilnih vodova. Ova procedura dopušta sterilno spajanje različitih kontejnera i cevi različitih dijametara. Ovo uputstvo opisuje preporučeni način korišćenja i procedure za upotrebu ovih uređaja. Ovo uputstvo ne bavi se podacima ili informacijama koje proizvođač sterilnog spojnog uređaja mora podneti FDA da bi dobio dozvolu ili odobrenje za izlazak na tržište. Važno je takođe napomenuti da upotreba dozvoljenog ili odobrenog sterilnog spojnog uređaja u svrhe za koje prema oznaci nije namenjen, može dovesti do toga da se uređaj smatra falsifikovanim i pogrešno označenim, prema Saveznom zakonu o hrani, lekovima i kozmetičkim sredstvima.
1. Preporuke FDA
[0335] Proizvođači krvnih proizvoda koji predlažu rutinsku upotrebu STCD odobrenih od strane FDA, trebalo bi da informacije koje se tiču takve upotrebe pridruže uputstvima za standardnu radnu proceduru (standard operating procedure, SOP), za svaki krvni proizvod. Ovi unosi trebalo bi da uključuju vođenje evidencije, praćenje proizvoda, kontrolu kvaliteta mesta spajanja vodova, broj serije softvera i proizvoda za jednokratnu upotrebu (uključujući izvor(-e) elemenata koji će se dodati). Procedure kontrole kvaliteta trebalo bi da uključe test integriteta svakog spoja.
2. Primene STCD
[0336] Korisnik treba da ima na umu da upotreba uređaja može stvoriti novi proizvod ili regulisani proizvod značajno izmenjene konfiguracije, za koje nema dokaza o sigurnosti i efikasnosti. Za one "nove proizvode" koje su predmet licenciranja, prijave ili dodaci prijave moraju biti podneti FDA, pored podnošenja SOP. Uopšteno, spajanje ili mešanje koje uključuje ćelijske komponente predstavlja promenu u proizvodu, koja zahteva da se podnese i odobri prijava za licencu, ili dopuna prijave. Takvi prijave i dodaci prijava treba da sadrže podatke i opise postupaka proizvodnje koji pokazuju da je "novi proizvod", u okviru predviđenog roka trajanja, bezbedan i efikasan za upotrebu kojoj je namenjen.
[0337] Sledeći komentari dati su kao uputstvo u vezi sa jednom ili više uobičajenih upotreba STCD, odobrenih ili dozvoljenih od strane FDA:
L. Dodavanje nove ili manje igle setu za sakupljanje krvi
[0338] Korišćenje STCD da bi se dodala igla pre otpočinjanja procedure (sakupljanje cele krvi, tromboforeze ili sakupljanja izvora plazme) ne smatra se otvaranjem funkcionalno zatvorenog sistema. Ako se igla dodaje u toku procedure, treba da se koristi samo STCD odobren za spajanje vodova ispunjenih tečnošću. Ako je test integriteta spoja zadovoljavajući, upotreba STCD ne smatra se otvaranjem funkcionalno zatvorenog sistema.
[0339] Pločice, fereza, pripremljene u otvorenom sistemu, treba obeležiti sa rokom trajanja od 24 sata Pločice, fereza, proizvode pripremljene u funkcionalno zatvorenom sistemu treba obeležiti sa rokom trajanja od pet dana (vidi Revised Guideline for Collection of Platelets, Pheresis, 7. oktobar 1988).
[0340] Izvore i specifikacije dodatih vodova i igala treba navesti u SOP i evidenciji centra za krv. Korišćenje STCD za dodavanje igala nije velika promena u izradi, za koju je licenciranim ustanovama potrebno prethodno odobrenje.
M. Korišćenje STCD za pripremanje komponenti
[0341] Kada se STCD koristi za prikačinjanje dodatnih kesa za pripremu komponenti, treba pravilno voditi evidenciju o identifikovanju izvora paketa za prenos i odgovarajućoj verifikaciji broja jedinica krvi i ABO/Rh. Sva krv i krvne komponente moraju biti pravilno obeležene (21 CFR 606.121).
[0342] Primeri:
• Dodavanje četvrte kese trostrukom pakovanu cele krvi za proizvodnju krioprecipitiranog AHF iz sveže zamrznute plazme.
• Povezivanje rastvora aditiva sa jedinicom crvenih krvnih ćelija.
• Dodavanje filtera u nizu, odobrenog od strane FDA za upotrebu u proizvodnji komponenti.
• Dodavanje opremi za tromboforezu trećeg kontejnera za skladištenje.
• Za gorepomenute upotrebe, potrebno je razviti procedure i voditi evidenciju, ali korisnici licence ne moraju imati odobrenje FDA da bi pokrenuli procedure.
1. Korišćenje STCD za spajanje krvnih proizvoda
[0343] Pravilnom upotrebom STCD za spajanje pločica pripremljenih iz kolekcije cele krvi može se izbeći moguća kontaminacija na često korišćenim portnim ulazima i ulazima za ubrizgavanje. Spajanje obavljeno neposredno pre transfuzije primer je takve odgovarajuće upotrebe. Spojene pločice treba primeniti najdalje 4 sata posle spajanja (vidi 21 CFR 606.122(1)(2)).
[0344] Međutim, spajanje i zatim skladištenje mogu povećati rizik u poređenju sa primenom nasumičnih donorskih jedinica; ako se jedna kontaminirana jedinica spoji sa drugom i uskladišti pre primene, ukupan bakterijski inokulum može se povećati usled umnožavanja u povećanoj zapremini. Prema tome, predloženo korišćenje STCD za spajanje i skladištenje pločica tokom više od 4 sata treba da bude podržano podacima koji daju zadovoljavajući odgovor na pitanje da li je takvo spajanje udruženo sa povećanim rizikom.
[0345] Takvo spajanje pločica predstavlja izradu novog proizvoda.
[0346] Spajanje ili mešanje koje uključuje pločice smatra se izradom novog proizvoda i zahteva novo podnošenje i odobravanje zahteva za licencu ili dodatka zahteva, ako je period skladištenja duži od četiri sata.
2. Upotreba STCD za pripremanje alikvota za pedijatrijsku upotrebu i podeljene jedinice
[0347] Pedijatrijske jedinice i podeljene jedinice za celu krv, crvene krvne ćelije i sveže smrznutu plazmu pripremljene korišćenjem STCD neće se smatrati novim proizvodom za koji je potreban dodatak zahtevu za licencu za biološke proizvode (biologics license application, BLA) ukoliko su ispunjeni sledeći uslovi:
Proizvođač treba da poseduje odobrenu licencu ili dodatak licence za biološki proizvod, za originalni (tj., nepodeljeni) proizvod, uključujući odobrenje za svaki upotrebljeni antikoagulant.
Etikete treba da se podnesu na uvid i odobrenje pre distribucije. Potrebno je uvesti napomenu u odeljku za komentare FDA formulara 2567, Predaja etiketa i cirkulara.
Treba koristiti kontejnere za finalni proizvod odobrene za skladištenje pripremljenih komponenti.
[0348] Pločice proizvedene pod licencom moraju sadržati najmanje 5.5 X (10)<10>pločica (21 CFR 640.24 (c)). Pločice, foreza proizvedeni pod licencom treba da sadrže najmanje 3.0 X (10)11 pločica (vidi Revised Guideline for the Collection of Platelets, Pheresis, 7. oktobar, 1988).
[0349] Procedure koje treba pratiti u vezi sa upotrebom STCD za pripremanje podeljenih proizvoda od kolekcija cele krvi i od plazme i pločica pripremljenih procesima automatizovane hemaforeze treba da uključe opise:
• Na koji način će oprema za aferezu ili kontejner za sakupljanje biti modifikovani sa STCD dozvoljenim od strane FDA;
• minimalne zapremine razdeljene plazme ili proizvoda cele krvi;
• zapremine i koncentracije pločica razdeljenih proizvoda foreze pločica;
• vremena skladištenja proizvoda. Proizvod bi trebalo da bude u odobrenom kontejneru i da bude u skladu sa vremenom skladištenja na etiketi tog kontejnera;
• postupka(-aka) koje treba koristiti za obeležavanje i praćenje podeljenih proizvoda u evidencijama centra za krv.
[0350] NAPOMENA: Procedure obeležavanja alikvota treba jasno da budu navedene u proceduri vođenja evidencije da bi se omogućilo praćenje i povlačenje svih komponenti, ako je to potrebno.
3. Korišćenje STCD za spajanje dodatnih vodova za slani rastvor ili antikoagulant tokom procedure automatizovane plazmaforeze
[0351] Potrebno je razviti proceduru i voditi evidenciju u skladu sa uputstvima za upotrebu proizvođača instrumenta, ali vlasnici licence ne moraju imati odobrenje FDA da bi pokrenuli procedure.
4. Korišćenje STCD za spajanje rastvora za obradu
[0352] Kada se koristi STCD za prikačinjanje kontejnera sa rastvorima za obradu, za ispiranje ili zamrzavanje proizvoda crvenih krvnih ćelija, rok trajanaja dobijenih proizvoda je 24 sata, ukoliko nisu obezbeđeni podaci u vidu licencnih zahteva ili dodataka zahteva CBER koji podržavaju duži rok trajanja (21 CFR 610.53(c)). Izuzeća ili modifikacije moraju biti odobreni u pismenom obliku od strane Direktora CBER (21 CFR 610.53(d)).
5. Korišćenje STCD za dodavanje filtera za smanjenje leukocita, dozvoljenog od strane FDA
[0353] Neki filteri za smanjenje leukocita nisu integralni delovi sistema za sakupljanje cele krvi. Procedure za upotrebu STCD za filtraciju pre skladištenja treba da budu konzistentne sa uputstvima za upotrebu proizvođača filtera.
[0354] Smanjenje leukocita pre izdavanja predstavlja veliku promenu u proizvodnji. Prema tome, za nove proizvode sa redukovanim leukocitima, pripremljene korišćenjem STCD, proizvođači moraju podneti zahteve za licencu za biološke proizvode (21 CFR 601.2) ili dopune prethodno odobrenih zahteva FDA (21 CFR 601.12).
1
[0355] Korišćenje STCD za uzimanje uzoraka iz kontejnera za krvne proizvode, za testiranje (npr., korišćenje STCD za dobijanje uzorka pločica iz kontejnera Pločice ili Pločice, foreza, za unakrsnu reakciju).
[0356] Ako se zapremina i/ili broj ćelija proizvoda posle uzimanja uzorka razlikuju od onoga što je navedeno na originalnoj etiketi ili informacionom cirkularu, etiketa na proizvodu treba da se modifikuje da bi podaci odgovarali novoj zapremini i/ili broju ćelija. Na primer, ne smeju se uzimati uzorci koji smanjuju broj pločica na manje od 5.5 x (10)<10>pločica (21 CFR 640.24 (c)).
6. Dodatne informacije iz smernica FDA
[0357] Smernice FDA predstavljaju opšte smernice kao i specifične informacije i primere u vezi sa specifikacijama za podnošenje zahteva i dodataka zahteva FDA u vezi sa upotrebom STCD. Ako bi se pojavila dodatna pitanja u vezi sa odgovarajućom upotrebom STCD, pitanja treba uputiti Kancelariji za istraživanje i pregled krvi Centra za biološku evaluaciju i istraživanje (Office of Blood Research and Review, Center for Biologics Evaluation and Research).
[0358] U nekim primerima izvođenja, u zatvorenom sistemu koristi se samo jedan kontejner od vremena dobijanja tumorskih fragmenata, pa dok TIL ne budu spremni za davanje pacijentu ili krioprezerviranje. U nekim primerima izvođenja kada se koriste dva kontejnera, prvi kontejner je zatvoreni G-kontejner i populacija TIL se centrifugira i prenosi u infuzionu kesu bez otvaranja prvog zatvorenog G-kontejnera. U nekim primerima izvođenja, kada se koriste dva kontejnera, infuziona kesa je infuziona kesa koja sadrži HypoThermosol. Zatvoreni sistem ili zatvoreni sistem za kulturu TIL karakteriše se time što se, kada se tumorski uzorak i/ili tumorski fragmenti dodaju, sistem čvrsto zatopi i odvoji od spoljne sredine da bi se formirala zatvorena sredina zaštićena od invazije bakterija, gljivica, i/ili svake druge mikrobne kontaminacije.
[0359] U nekim primerima izvođenja, smanjenje kontaminacije mikrobima iznosi između oko 5% i oko 100%. U nekim primerima izvođenja, smanjenje kontaminacije mikrobima iznosi između oko 5% i oko 95%. U nekim primerima izvođenja, smanjenje kontaminacije mikrobima iznosi između oko 5% i oko 90%. U nekim primerima izvođenja, smanjenje kontaminacije mikrobima iznosi između oko 10% i oko 90%. U nekim primerima izvođenja, smanjenje kontaminacije mikrobima iznosi između oko 15% i oko 85%. U nekim primerima izvođenja, smanjenje kontaminacije mikrobima iznosi između oko 5%, oko 10%, oko 15%, oko 20%, oko 25%, oko 30%, oko 35%, oko 40%, oko 45%, oko 50%, oko 55%, oko 60%,
1 1
oko 65%, oko 70%, oko 75%, oko 80%, oko 85%, oko 90%, oko 95%, oko 97%, oko 98%, oko 99%, ili oko 100%.
[0360] Zatvoreni sistem omogućava rast TIL u odsustvu i/ili uz značajno smanjenje kontaminacije mikrobima.
[0361] Štaviše, pH, parcijalni pritisak ugljen-dioksida i parcijalni pritisak kiseonika u ćelijskoj kulturi TIL variraju sa kultivisanjem ćelija. Posledično, čak i kada medijum pogodan za ćelijsku kulturu cirkuliše, zatvorenoj sredini je potrebno konstantno održavanje optimalnih uslova za proliferaciju TIL. U tom cilju, poželjno je da se fizički faktori pH, parcijalni pritisak ugljen-dioksida i parcijalni pritisak kiseonika u tečnosti za kulturu zatvorene sredine prate senzorima čiji signali se koriste za kontrolu izmenjivača vazduha instaliranog na ulazu u sredinu kulture, i da se parcijalni pritisak gasova zatvorene sredine podešava u realnom vremenu u skladu sa promenama u tečnosti kulture tako da se optimizuje sredina za kulturu ćelija. U nekim primerima izvođenja, predmetni pronalazak obezbeđuje zatvoreni sistem za kulturu ćelija koji na ulazu u zatvorenu sredinu sadrži izmenjivač gasova opremljen uređajem za monitoring, koji meri parcijalni pritisak ugljen-dioksida i parcijalni pritisak kiseonika u zatvorenoj sredini i optimizuje sredinu ćelijske kulture automatskim podešavanjem koncentracija gasova na osnovu signala sa uređaja za monitoring.
[0362] U nekim primerima izvođenja, pritisak u zatvorenoj sredini kontroliše se kontinuirano ili sa prekidima. To znači, pritisak u zatvorenoj sredini može da se varira putem uređaja za održavanje pritiska na primer, osiguravajući tako da prostor bude pogodan za rast TIL u stanju pozitivnog pritiska, ili promovišući eksudaciju tečnosti u stanju negativnog pritiska i time promovišući ćelijsku proliferaciju. Primenjivanjem negativnog pritiska sa prekidima, štaviše, moguće je ujednačeno i efikasno zameniti cirkulišuću tečnost u zatvorenoj sredini putem privremenog smanjenja zapremine zatvorene sredine.
[0363] U nekim primerima izvođenja, komponente kulture optimalne za proliferaciju TIL mogu se zameniti ili dodati, uključujući tu i faktore kao što su IL-2 i/ili OKT3, kao i kombinacije, koji se mogu dodati.
C. Kulture ćelija
[0364] U primeru izvođenja, postupak za ekspandiranje TIL, uključujući one o kojima se dikutovalo ranije u ovom tekstu i koji su kao primer prikazani na Slici 27, može uključiti korišćenje oko 5,000 mL do oko 25,000 mL ćelijskog medijuma, oko 5,000 mL do oko 10,000 mL ćelijskog medijuma, ili oko 5,800 mL do oko 8,700 mL ćelijskog medijuma. U nekim primerima izvođenja, medijum je medijum koji ne sadrži serum, kako je opisano na
1 2
primer u Primeru 21. U nekim primerima izvođenja, medijum u prvoj ekspanziji ne sadrži serum. U nekim primerima izvođenja, medijum u drugoj ekspanziji ne sadrži serum. U nekim primerima izvođenja, medijumi u prvoj i drugoj ekspanziji ne sadrže serum. U primeru izvođenja, u ekspandiranju broja TIL koristi se ne više od jednog tipa medijuma za kulturu ćelija. Može se koristiti bilo koji pogodan medijum za kulturu ćelija, npr., AIM-V ćelijski medijum (L-glutamin, 50 μM streptomicin sulfat, i 10 μM gentamicin sulfat) za kulturu ćelija (Invitrogen, Carlsbad CA). U vezi sa tim, inventivni postupci pogodno smanjuju količinu medijuma i broj tipova medijuma potrebnih za ekspandiranje broja TIL. U primeru izvođenja, ekspandiranje broja TIL može uključivati hranjenje ćelija ne češće nego svakog trećeg ili četvrtog dana. Ekspandiranje broja ćelija u kontejneru permeabilnom za gas pojednostavljuje procedure potrebne za ekspandiranje broja ćelija smanjenjem učestalosti hranjenja potrebnog za ekspanziju ćelija.
[0365] U primeru izvođenja, ćelijski medijum u prvom i/ili drugom kontejneru permeabilnom za gas se ne filtrira. Upotreba nefiltriranog ćelijskog medijuma može olakšati procedure potrebne za ekspandiranje broja ćelija. U primeru izvođenja, ćelijski medijum u prvom i/ili drugom kontejneru permeabilnom za gas ne sadrži beta-merkaptoetanol (BME).
[0366] Trajanje postupka koji uključuje dobijanje uzorka tumorskog tkiva od sisara; kultivisanje uzorka tumorskog tkiva u prvom kontejneru permeabilnom za gas koji sadrži u sebi ćelijski medijum; dobijanje TIL iz uzorka tumorskog tkiva; ekspandiranje broja TIL u drugom kontejneru permeabilnom za gas koji sadrži ćelijski medijum, može trajati oko 7 do 14 dana, npr., oko 11 dana. U nekim primerima izvođenja pre-REP može trajati oko 7 do 14 dana, npr., oko 11 dana. U nekim primerima izvođenja, REP traje oko 7 do 14 dana, npr., oko 11 dana.
[0367] U primeru izvođenja, TIL se ekspandiraju u kontejnerima permeabilnim za gas. Kontejneri permeabilni za gas upotrebljavaju se za ekspandiranje TIL uz korišćenje PBMC i postupaka, kompozicija, i uređaja poznatih u struci, uključujući one opisane u U.S. objavljenoj patentnoj prijavi br.2005/0106717 A1. U primeru izvođenja, TIL se ekspandiraju u kesama permeabilnim za gas. U primeru izvođenja, TIL se ekspandiraju korišćenjem sistema za ekspanziju ćelija, koji ekspandira TIL u kesama permeabilnim za gas, kao što je Xuri sistem za ekspanziju ćelija W25 (GE Healthcare). U primeru izvođenja, TIL se ekspandiraju korišćenjem sistema za ekspanziju ćelija koji ekspandiraju TIL u kesama propustljivim za gas, kao što je WAVE bioreaktorski sistem, poznat i kao Xuri sistem za ekspanziju ćelija W5 (GE Healthcare). U primeru izvođenja, sistem za ekspanziju ćelija uključuje kesu za ćelije, permeabilnu za gas, zapremine odabrane iz grupe koja se sastoji od
1
oko 100 mL, oko 200 mL, oko 300 mL, oko 400 mL, oko 500 mL, oko 600 mL, oko 700 mL, oko 800 mL, oko 900 mL, oko 1 L, oko 2 L, oko 3 L, oko 4 L, oko 5 L, oko 6 L, oko 7 L, oko 8 L, oko 9 L, i oko 10 L.
[0368] U primeru izvođenja, TIL mogu da se ekspandiraju u G-Rex flakonima (komercijalno se mogu nabaviti od Wilson Wolf Manufacturing). Takvi primeri izvođenja omogućavaju ćelijskim populacijama da se ekspandiraju od oko 5x10<5>ćelija/cm<2>do između 10x10<6>i 30x106 ćelija/cm<2>. U primeru izvođenja ovo se dešava bez hranjenja. U primeru izvođenja, ovo se dešava bez hranjenja dokle god medijum u G-Rex flakonu ima visinu od oko 10 cm. U primeru izvođenja ovo se dešava bez hranjenja, ali uz dodavanje jednog ili više citokina. U primeru izvođenja, citokin može da se doda kao bolus bez potrebe za mešanje citokina sa medijumom. Takvi kontejneri, uređaji, i postupci poznati su u struci i korišćeni su za ekspandiranje TIL, i uključuju one koji su opisani u U.S. objavljenoj patentnoj prijavi br. US 2014/0377739A1, Međunarodnoj publikaciji br. WO 2014/210036 A1, U.S. objavljenoj patentnoj prijavi br. US 2013/0115617 A1, Međunarodnoj publikaciji br. WO 2013/188427 A1, U.S. objavljenoj patentnoj prijavi br. US 2011/0136228 A1, U.S. patentu br. US 8,809,050 B2, Međunarodnoj publikaciji br. WO 2011/072088 A2, U.S. objavljenoj patentnoj prijavi br. US 2016/0208216 A1, U.S. objavljenoj patentnoj prijavi br. US 2012/0244133 A1, Međunarodnoj publikaciji br. WO 2012/129201 A1, U.S. objavljenoj patentnoj prijavi br. US 2013/0102075 A1, U.S. patentu br. US 8,956,860 B2, Međunarodnoj publikaciji br. WO 2013/173835 A1, U.S. objavljenoj patentnoj prijavi br. US 2015/0175966 A1. Takvi procesi opisani su i u Jin et al., J. Immunotherapy, 2012, 35:283-292.
D. Opciono genetičko inženjerisanje TIL.
[0369] U nekim primerima izvođenja, TIL se opciono genetički inženjerišu da bi sadržali dodatne funkcionalnosti, uključujući, ali ne ograničavajući se na visokoafinitetni T ćelijski receptor (TCR), npr., TCR usmeren ka tumor-pridruženom antigenu, na primer MAGE-1, HER2, ili NY-ESO-1, ili himerni antigenski receptor (CAR) koji se vezuje za tumorpridruženi ćelijski površinski molekul (npr., mezotelin) ili ćelijski površinski molekul ograničen na linuju (npr., CD19).
E. Opciona krioprezervacija TIL
[0370] "Bulk" TIL populacija ili ekspandirana populacija TIL može se opciono krioprezervirati. U nekim primerima izvođenja, vrši se krioprezervacija terapijske populacije TIL. U nekim primerima izvođenja, vrši se krioprezervacija TIL sakupljenih posle druge
1 4
ekspanzije. U nekim primerima izvođenja, vrši se krioprezervacija TIL u Koraku F datom kao primer na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, TIL se krioprezerviraju u infuzionoj kesi. U nekim primerima izvođenja, TIL se krioprezerviraju pre stavljanja u infuzionu kesu. U nekim primerima izvođenja, TIL se krioprezerviraju i ne stavljaju se u infuzionu kesu. U nekim primerima izvođenja, krioprezerviranje se obavlja korišćenjem krioprezervacionog medijuma. U nekim primerima izvođenja, krioprezervacioni medijum sadrži dimetilsulfoksid (DMSO). Ovo se obično obavlja stavljanjem TIL populacije u rastvor za zamrzavanje, npr. 85% komplementom inaktivirani AB serum i 15% dimetil sulfoksid (DMSO). Ćelije u rastvoru stavljaju se u kriogene fiole i skladište 24 sata na -80 °C, sa opcionim transferom u zamrzivače sa gasovitim azotom. Vidi, Sadeghi, et al., Acta Oncologica 2013, 52, 978-986.
[0371] Kada je pogodno, ćelije se izvade iz zamrzivača i odmrzavaju u vodenom kupatilu na 37 °C dok se ne odmrzne približno 4/5 rastvora. Ćelije se obično resuspenduju u kompletnom medijumu i opciono isperu jednom ili više puta. U nekim primerima izvođenja, odmrznuti TIL mogu da se broje i procenjuju u pogledu vijabilnosti, kako je poznato u struci.
[0372] U poželjnom primeru izvođenja, populacija TIL se krioprezervira korišćenjem CS10 krioprezervacionog medijuma (CryoStor 10, BioLife Solutions). U poželjnom primeru izvođenja, populacija TIL se krioprezervira korišćenjem krioprezervacionog medijuma koji sadrži dimetilsulfoksid (DMSO). U poželjnom primeru izvođenja, populacija TIL se krioprezervira korišćenjem 1:1 (vol:vol) odnosa CS10 i medijuma za kulturu ćelija. U poželjnom primeru izvođenja, populacija TIL se krioprezervira korišćenjem oko 1:1 (vol:vol) odnosa CS10 i medijuma za kulturu ćelija, koji sadrži još i dodatni IL-2.
[0373] Kako je razmatrano ranije u ovom tekstu u Koracima A do E, krioprezervacija se može dešavati na većem broju tačaka tokom procesa ekspanzije TIL. U nekim primerima izvođenja, može se krioprezervirati "bulk" TIL populacija posle prve ekspanzije prema Koraku B ili ekspandirana populacija TIL posle jedne ili više drugih ekspanzija prema Koraku D. Krioprezervacija obično može da se obavi stavljanjem populacije TIL u rastvor za zamrzavanje, npr., 85% komplementom inaktivirani AB serum i 15% dimetilsulfoksid (DMSO). Ćelije u rastvoru se stavljaju u kriogene fiole i skladište 24 sata na -80 °C, uz opcioni transfer u zamrzivače sa gasovitim azotom za krioprezervaciju. Vidi Sadeghi, et al., Acta Oncologica 2013, 52, 978-986.
[0374] Kada je pogodno, ćelije se izvade iz zamrzivača i odmrzavaju u vodenom kupatilu na 37 °C dok se ne odmrzne približno 4/5 rastvora. Ćelije se obično resuspenduju u kompletnom medijumu i opciono isperu jednom ili više puta. U nekim primerima izvođenja, odmrznuti TIL mogu da se broje i procenjuju u pogledu vijabilnosti, kako je poznato u struci.
1
[0375] U nekim slučajevima, TIL populacija Koraka B može da se krioprezervira odmah, korišćenjem protokola o kojima se diskutuje u nastavku ovog teksta. Alternativno, "bulk" TIL populacija može da se izloži Koraku C i Koraku D i zatim krioprezervira posle koraka D. Slično tome, u slučaju kada se u terapiji koriste genetički modifikovani TIL, populacije TIL Koraka B ili Koraka D mogu da se izlože geničkim modifikacijama za odgovarajuće tretmane.
F. Opcione analize vijabilnosti ćelija
[0376] Opciono, test ćelijske vijabilnosti može da se izvede posle prve ekspanzije (nekada označene kao početna "bulk" ekspanzija), korišćenjem standardnih testova poznatih u struci. Na primer, na uzorku "bulk" TIL može se izvesti test isključivanja tripan plavog, koji selektivno obeležava mrtve ćelije i omogućava procenu vijabilnosti. Drugi testovi koji se koriste za procenu vijabilnosti mogu uključivati, ali se ne ograničavaju na test alamar-plavog; i MTT test.
1. Broj ćelija, vijabilnost, protočna citometrija
[0377] U nekim primerima izvođenja, mere se broj ćelija i/ili vijabilnost. Ekspresija markera kao što su, bez ograničavanja CD3, CD4, CD8, i CD56, kao i svaki drugi objavljen ili opisan u ovom tekstu, može se meriti protočnom citometrijom uz korišćenje antitela, na primer, bez ograničavanja, onih koja se mogu komercijalno nabaviti od BD Bio-sciences (BD Biosciences, San Jose, CA) uz upotrebu FACSCanto™ protočnog citometra (BD Biosciences). Ćelije mogu da se broje ručno, korišćenjem jednokratnog c-čip hemocitometra (VWR, Batavia, IL) i vijabilnost može da se procenjuje korišćenjem bilo kojeg metoda poznatog u struci, uključujući, ali ne ograničavajući se na bojenje tripan-plavim.
[0378] U nekim slučajevima, "bulk" TIL populacija može da se krioprezervira odmah, korišćenjem protokola koji se razmatraju u nastavku ovog teksta. Alternativno, "bulk" TIL populacija može da se izloži REP i zatim krioprezervira, kako se govori u nastavku ovog teksta. Slično tome, u slučaju kada se genetički modifikovani TIL koriste u terapiji, populacije "bulk" ili REP TIL mogu da se izlože geničkim modifikacijama za odgovarajuće tretmane.
2. Ćelijske kulture
[0379] U primeru izvođenja, postupak za ekspandiranje TIL može uključiti korišćenje oko 5,000 mL do oko 25,000 mL ćelijskog medijuma, oko 5,000 mL do oko 10,000 mL ćelijskog medijuma, ili oko 5,800 mL do oko 8,700 mL ćelijskog medijuma. U primeru izvođenja, u
1
ekspandiranju broja TIL koristi se ne više od jednog tipa medijuma za kulturu ćelija. Za kultivisanje ćelija može se koristiti bilo koji pogodan medijum za kulturu ćelija, npr., AIM-V ćelijski medijum (L-glutamin, 50 μM streptomicin sulfat, i 10 μM gentamicin sulfat) (Invitrogen, Carlsbad CA). U vezi sa tim, inventivni postupci pogodno smanjuju količinu medijuma i broj tipova medijuma potrebnih za ekspandiranje broja TIL. U primeru izvođenja, ekspandiranje broja TIL može uključivati hranjenje ćelija ne češće nego svakog trećeg ili četvrtog dana. Ekspandiranje broja ćelija u kontejneru permeabilnom za gas pojednostavljuje procedure potrebne za ekspandiranje broja ćelija smanjenjem učestalosti hranjenja neophodnog za ekspanziju ćelija.
[0380] U primeru izvođenja, ćelijski medijum u prvom i/ili drugom kontejneru permeabilnom za gas se ne filtrira. Upotreba nefiltriranog ćelijskog medijuma može pojednostaviti procedure potrebne za ekspandiranje broja ćelija. U primeru izvođenja, ćelijski medijum u prvom i/ili drugom kontejneru permeabilnom za gas ne sadrži beta-merkaptoetanol (BME).
[0381] Trajanje postupka koji uključuje dobijanje uzorka tumorskog tkiva od sisara; kultivisanje uzorka tumorskog tkiva u prvom kontejneru permeabilnom za gas koji sadrži u sebi ćelijski medijum; dobijanje TIL iz uzorka tumorskog tkiva; ekspandiranje broja TIL u drugom kontejneru permeabilnom za gas koji sadrži ćelijski medijum uz korišćenje aAPC traje oko 14 do oko 42 dana, npr., oko 28 dana.
[0382] U primeru izvođenja, TIL se ekspandiraju u kontejnerima permeabilnim za gas. Kontejneri permeabilni za gas koriste se za ekspandiranje TIL uz upotrebu PBMC, postupcima, kompozicijama i uređajima poznatim u struci, uključujući one objavljene u U.S. Objavljenoj patentnoj prijavi br.2005/0106717 A1. U primeru izvođenja, TIL se ekspandiraju u kesama permeabilnim za gas. U primeru izvođenja, TIL se ekspandiraju korišćenjem sistema za ekspandiranje ćelija kojim se ekspandiraju TIL u kesama permeabilnim za gas, na primer Xuri sistem za ekspandiranje ćelija W25 (GE Healthcare). U primeru izvođenja, TIL se ekspandiraju korišćenjem sistema za ekspandiranje ćelija kojim se ekspandiraju TIL u kesama permeabilnim za gas, na primer WAVE bioreaktorski sistem, poznat i kao Xuri sistem za ekspandiranje ćelija W5 (GE Healthcare). U primeru izvođenja, sistem za ekspandiranje ćelija uključuje kese za ćelije, permeabilne za gas, sa zapreminom odabranom iz grupe koja se sastoji od oko 100 mL, oko 200 mL, oko 300 mL, oko 400 mL, oko 500 mL, oko 600 mL, oko 700 mL, oko 800 mL, oko 900 mL, oko 1 L, oko 2 L, oko 3 L, oko 4 L, oko 5 L, oko 6 L, oko 7 L, oko 8 L, oko 9 L, i oko 10 L.
[0383] U primeru izvođenja, TIL mogu da se ekspandiraju u G-Rex flakonima (komercijalno se mogu nabaviti od Wilson Wolf Manufacturing). Takvi primeri izvođenja omogućavaju
1
ćelijskim populacijama da se ekspandiraju od oko 5x10<5>ćelija/cm<2>do između 10x10<6>i 30x106 ćelija/cm<2>. U primeru izvođenja ovo se dešava bez hranjenja. U primeru izvođenja, ovo se dešava bez hranjenja dokle god medijum u G-Rex flakonu ima visinu od oko 10 cm. U primeru izvođenja ovo se dešava bez hranjenja, ali uz dodavanje jednog ili više citokina. U primeru izvođenja, citokin može da se doda kao bolus bez potrebe za mešanje citokina sa medijumom. Takvi kontejneri, uređaji, i postupci poznati su u struci i korišćeni su za ekspandiranje TIL, i uključuju one koji su opisani u U.S. objavljenoj patentnoj prijavi br. US 2014/0377739A1, Međunarodnoj publikaciji br. WO 2014/210036 A1, U.S. objavljenoj patentnoj prijavi br. US 2013/0115617 A1, Međunarodnoj publikaciji br. WO 2013/188427 A1, U.S. objavljenoj patentnoj prijavi br. US 2011/0136228 A1, U.S. patentu br. US 8,809,050 B2, Međunarodnoj publikaciji br. WO 2011/072088 A2, U.S. objavljenoj patentnoj prijavi br. US 2016/0208216 A1, U.S. objavljenoj patentnoj prijavi br. US 2012/0244133 A1, Međunarodnoj publikaciji br. WO 2012/129201 A1, U.S. objavljenoj patentnoj prijavi br. US 2013/0102075 A1, U.S. patentu br. US 8,956,860 B2, Međunarodnoj publikaciji br. WO 2013/173835 A1, U.S. objavljenoj patentnoj prijavi br. US 2015/0175966 A1. Takvi procesi opisani su i u Jin et al., J. Immunotherapy, 2012, 35:283-292.
Opciono genetičko inženjerisanje TIL.
[0384] U nekim primerima izvođenja, TIL se opciono genetički inženjerišu da bi sadržali dodatne funkcionalnosti, uključujući, ali ne ograničavajući se na visokoafinitetni T ćelijski receptor (TCR), npr., TCR usmeren ka tumor-pridruženom antigenu, na primer MAGE-1, HER2, ili NY-ESO-1, ili himerni antigenski receptor (CAR) koji se vezuje za tumorpridruženi ćelijski površinski molekul (npr., mezotelin) ili ćelijski površinski molekul ograničen na linuju (npr., CD19).
IV. Postupci lečenja pacijenata
[0385] Postupci lečenja počinju inicijalnim sakupljanjem TIL i kultivisanjem TIL. Takvi postupci su opisani u struci, na primer, Jin et al., J. Immunotherapy, 2012, 35(3):283-292. Primeri postupaka lečenja opisani su u odeljcima u nastavku, uključujući Primere.
[0386] Ekspandirani TIL proizvedeni prema postupcima opisanim u ovom tekstu, uključujući na primer opisano u Koracima A do F gore, ili prema Koracima A do F gore (i kako je pokazano, na primer, na Slici 27) nalaze posebnu primenu u lečenju pacijenata sa kancerom (na primer, kako je opisano u Goff, et al., J. Clinical Oncology, 2016, 34(20):2389-239, kao i dodatnom sadržaju). U nekim primerima izvođenja, TIL rastu iz resektovanih depozita
1
metastatskog melanoma kako je ranije opisano (vidi, Dudley, et al., J Immunother., 2003, 26:332-342). Sveži tumor može da se disekuje pod sterilnim uslovima. Reprezentativni uzorak može da se uzme za formalnu patološku analizu. Mogu se koristiti pojedinačni fragmenti od 2 mm3 do 3 mm3. Može se dobiti 5, 10, 15, 20, 25 ili 30 uzoraka po pacijentu. Može se dobiti 20, 25, ili 30 uzoraka po pacijentu. Može se dobiti 20, 22, 24, 26, ili 28 s uzoraka po pacijentu. Mogu se dobiti 24 uzorka po pacijentu. Uzorci se mogu staviti u pojedinačne bunarčiće na ploči sa 24 bunarčića, održavati u medijumu za rast u prisustvu visoke doze IL-2 (6,000 IU/mL), i pratiti u pogledu destrukcije tumora i/ili proliferacije TIL. Vijabilne tumorske ćelije koje preostanu posle procesovanja mogu se enzimski digestirati u suspenziju pojedinačnih ćelija i krioprezervirati, kako je opisano u ovom tekstu.
[0387] U nekim primerima izvođenja, uspešno izrasli TIL mogu da se uzorkuju za fenotipsku analizu (CD3, CD4, CD8, i CD56) i testiraju protiv autolognog tumora kada je to moguće. TIL mogu da se smatraju reaktivnim ako kokultivisanje preko noći daje nivoe interferonagama (IFN-γ) > 200 pg/mL i dvostruke u odnosu na pozadinu. (Goff, et al., J Immunother., 2010, 33:840-847). U nekim primerima izvođenja, kulture sa dokazom autologne reaktivnosti ili dovoljnih obrazaca rasta mogu se selektovati za drugu ekspanziju (na primer, druga ekspanzija kako je obezbeđeno u skladu sa Korakom D Slike 27), uključujući drugu ekspanziju koja se ponekad označava kao brza ekspanzija (REP). U nekim primerima izvođenja, ekspandirani TIL sa visokom autolognom reaktivnošću (na primer, visoka proliferacija tokom druge ekspanzije), biraju se za dodatnu drugu ekspanziju. U nekim primerima izvođenja, TIL sa visokom autolognom reaktivnošću (na primer, visoka proliferacija tokom druge ekspanzije kako je dato u Koraku D Slike 27), biraju se za dodatnu drugu ekspanziju prema Koraku D Slike 27.
[0388] U nekim primerima izvođenja, pacijent se ne prebacuje direktno na ACT (adoptivni ćelijski transfer), na primer, u nekim primerima izvođenja, posle sakupljanja tumora i/ili prve ekspanzije, ćelije se ne koriste odmah. U takvim primerima izvođenja, TIL mogu da se krioprezerviraju i odmrznu 2 dana pre davanja pacijentu. U takvim primerima izvođenja, TIL mogu da se krioprezerviraju i odmrznu 1 dan pre davanja pacijentu. U nekim primerima izvođenja, TIL mogu da se krioprezerviraju i odmrznu neposredno pre davanja pacijentu.
[0389] Ćelijski fenotipovi krioprezerviranih uzoraka TIL iz infuzione kese mogu se analizirati protočnom citometrijom (npr., FlowJo) u pogledu površinskih markera CD3, CD4, CD8, CCR7, i CD45RA (BD BioSciences), kao i bilo kojim od postupaka opisanih u ovom tekstu. Serumski citokini mere se korišćenjem standardnih tehnika imunoenzimskih testova. Porast IFN-g u serumu definiše se kao >100 pg/mL i više od 4 × u odnosu na bazalni nivo.
1
[0390] U nekim primerima izvođenja, TIL proizvedeni postupcima obezbeđenim u ovom tekstu, na primer onima čiji je primer dat na Slici 27, pružaju iznenađujuće poboljšanje kliničke efikasnosti TIL. U nekim primerima izvođenja, TIL proizvedeni postupcima obezbeđenim u ovom tekstu, na primer onima koji su kao primer dati na Slici 27, pokazuju povećanu kliničku efikasnost u poređenju sa TIL proizvedenim postupcima različitim od onih koji su opisani u ovom tekstu, uključujući na primer, postupke različite od onih čiji je primer dat na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, postupci različiti od onih koji su opisani u ovom tekstu uključuju postupke označene kao proces 1C i/ili Generacija 1 (Gen 1). U nekim primerima izvođenja, povećana efikasnost meri se preko DCR, ORR, i/ili drugih kliničkih odgovora. U nekim primerima izvođenja, TIL proizvedeni postupcima obezbeđenim u ovom tekstu, na primer onima čiji je primer dat na Slici 27, pokazuju slično vreme do odgovora i sličan profil bezbednosti kao TIL proizvedeni postupcima različitim od onih koji su opisani u ovom tekstu, uključujući na primer, postupke različite od onih čiji je primer dat na Slici 27, na primer proces Gen 1.
[0391] U nekim primerima izvođenja, IFN-gama (IFN-γ) predstavlja indikaciju efikasnosti lečenja i/ili povećane kliničke efikasnosti. U nekim primerima izvođenja, IFN-γ u krvi subjekata lečenih primenom TIL ukazuje na aktivne TIL. U nekim primerima izvođenja, koristi se test potencije za proizvodnju IFN-γ. Proizvodnja IFN-γ je druga mera citotoksičnog potencijala. Proizvodnja IFN-γ može da se meri određivanjem nivoa citokina IFN-γ u krvi, serumu, ili TIL ex vivo subjekta lečenog primenom TIL pripremljenih postupcima predmetnog pronalaska, uključujući one koji su opisani na primer na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, porast IFN-γ ukazuje na efikasnost lečenja kod pacijenta lečenog primenom TIL proizvedenih postupcima predmetnog pronalaska. U nekim primerima izvođenja, IFN-γ je povećan jednom, dva puta, tri puta, četiri puta, ili pet ili više puta u poređenju sa nelečenim pacijentom i/ili u poređenju sa pacijentom koji je lečen primenom TIL pripremljenih korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, sekrecija IFN-γ je povećana jednom u poređenju sa nelečenim pacijentom i/ili u poređenju sa pacijentom koji je lečen TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, sekrecija IFN-γ je povećana dva puta u poređenju sa nelečenim pacijentom i/ili u poređenju sa pacijentom koji je lečen TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su
11
opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, sekrecija IFN-γ je povećana tri puta u poređenju sa nelečenim pacijentom i/ili u poređenju sa pacijentom koji je lečen TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, sekrecija IFN-γ je povećana četiri puta u poređenju sa nelečenim pacijentom i/ili u poređenju sa pacijentom koji je lečen TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, sekrecija IFN-γ je povećana pet puta u poređenju sa nelečenim pacijentom i/ili u poređenju sa pacijentom koji je lečen TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, IFN-γ se meri korišćenjem Quantikine ELISA kita. U nekim primerima izvođenja, IFN-γ se meri u TIL ex vivo subjekta lečenog primenom TIL pripremljenih jednim od postupaka predmetnog pronalaska, uključujući one koji su opisani na primer na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, IFN-γ se meri u krvi subjekta lečenog primenom TIL pripremljenih postupcima predmetnog pronalaska uključujući one koji su opisani na primer na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, IFN-γ se meri u TIL seruma subjekta lečenog TIL pripremljenim postupcima predmetnog pronalaska uključujući one koji su opisani na primer na Slici 27.
[0392] U nekim primerima izvođenja, viši prosečni IP-10 ukazuje na efikasnost lečenja i/ili povišenu kliničku efikasnost. U nekim primerima izvođenja, viši prosečni IP-10 u krvi subjekata lečenih TIL ukazuje na aktivne TIL. Proizvodnja IP-10 može da se meri određivanjem nivoa IP-10 u krvi subjekta lečenog TIL pripremljenim postupcima predmetnog pronalaska, uključujući one koji su opisani na primer na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, viši prosečni IP-10 ukazuje na efikasnost lečenja kod pacijenta lečenog TIL proizvedenim postupcima predmetnog pronalaska. U nekim primerima izvođenja, viši prosečni IP-10 koreliše sa porastom od jednom, dva puta, tri puta, četiri puta, pet puta ili više u poređenju sa nelečenim pacijentom i/ili u poređenju sa pacijentom koji je lečen TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, viši prosečni IP-10 koreliše sa porastom od jedan put u poređenju sa nelečenim pacijentom i/ili u poređenju sa pacijentom koji je lečen TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, viši prosečni IP-10 koreliše sa porastom od dva puta u poređenju sa nelečenim pacijentom i/ili u poređenju sa pacijentom koji je lečen TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, viši prosečni IP-10 koreliše sa porastom od tri puta u poređenju sa nelečenim pacijentom i/ili u poređenju sa pacijentom koji je lečen TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, viši prosečni IP-10 koreliše sa porastom od četiri puta u poređenju sa nelečenim pacijentom i/ili u poređenju sa pacijentom koji je lečen TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, viši prosečni IP-10 koreliše sa porastom od pet puta u poređenju sa nelečenim pacijentom i/ili u poređenju sa pacijentom koji je lečen TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, IP-10 se meri u krvi subjekta lečenog TIL pripremljenim postupcima predmetnog pronalaska, uključujući one koji su opisani na primer na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, IP-10 se meri u TIL serumu subjekta lečenog TIL pripremljenim postupcima predmetnog pronalaska, uključujući one koji su opisani na primer na Slici 27.
[0393] U nekim primerima izvođenja, viši prosečni MCP-1 ukazuje na efikasnost lečenja i/ili povišenu kliničku efikasnost. U nekim primerima izvođenja, viši prosečni MCP-1 u krvi subjekata lečenih TIL ukazuje na aktivne TIL. Proizvodnja MCP-1 može da se meri određivanjem nivoa MCP-1 u krvi subjekta lečenog TIL pripremljenim postupcima predmetnog pronalaska, uključujući one koji su opisani na primer na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, viši prosečni MCP-1 ukazuje na efikasnost lečenja kod pacijenta lečenog TIL proizvedenim postupcima predmetnog pronalaska. U nekim primerima izvođenja, viši prosečni MCP-1 koreliše sa porastom od jednom, dva puta, tri puta, četiri puta, pet puta ili više u poređenju sa nelečenim pacijentom i/ili u poređenju sa pacijentom koji je lečen korišćenjem TIL pripremljenih korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, viši prosečni MCP-1 koreliše sa porastom od jedan put u poređenju sa nelečenim pacijentom i/ili u poređenju sa pacijentom koji je lečen TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27.
U nekim primerima izvođenja, viši prosečni MCP-1 koreliše sa porastom od dva puta u poređenju sa nelečenim pacijentom i/ili u poređenju sa pacijentom koji je lečen TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, viši prosečni MCP-1 koreliše sa porastom od tri puta u poređenju sa nelečenim pacijentom i/ili u poređenju sa pacijentom koji je lečen TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, viši prosečni MCP-1 koreliše sa porastom od četiri puta u poređenju sa nelečenim pacijentom i/ili u poređenju sa pacijentom koji je lečen TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, viši prosečni MCP-1 koreliše sa porastom od pet puta u poređenju sa nelečenim pacijentom i/ili u poređenju sa pacijentom koji je lečen TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, MCP-1 se meri u krvi subjekta lečenog TIL pripremljenim postupcima predmetnog pronalaska uključujući one koji su opisani na primer na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, MCP-1 se meri u TIL serumu subjekta lečenog TIL pripremljenim postupcima predmetnog pronalaska uključujući one koji su opisani na primer na Slici 27.
[0394] U nekim primerima izvođenja, TIL pripremljeni postupcima predmetnog pronalaska, uključujući one koji su opisani na primer na Slici 27, pokazuju povišenu poliklonalnost u poređenju sa TIL proizvedenim drugim postupcima, uključujući one čiji primer nije prikazan na Slici 27, kao što su na primer, postupci označeni kao postupci procesa 1C. U nekim primerima izvođenja, značajno povećana poliklonalnost i/ili povećana poliklonalnost ukazuje na efikasnost lečenja i/ili povišenu kliničku efikasnost. U nekim primerima izvođenja, poliklonalnost se odnosi na diverzitet repertoara T-ćelija. U nekim primerima izvođenja, povišenje poliklonalnosti može ukazivati na efikasnost lečenja u vezi sa primenom TIL proizvedenih postupcima predmetnog pronalaska. U nekim primerima izvođenja, poliklonalnost je povećana jednom, dva puta, deset puta, 100 puta, 500 puta, ili 1000 puta u poređenju sa TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, poliklonalnost je povećana jedan put u poređenju sa nelečenim pacijentom i/ili u poređenju sa pacijentom koji je lečen TIL pripremljenim
11
korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, poliklonalnost je povećana dva puta u poređenju sa nelečenim pacijentom i/ili u poređenju sa pacijentom koji je lečen TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, poliklonalnost je povećana deset puta put u poređenju sa nelečenim pacijentom i/ili u poređenju sa pacijentom koji je lečen TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, poliklonalnost je povećana 100 puta u poređenju sa nelečenim pacijentom i/ili u poređenju sa pacijentom koji je lečen TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, poliklonalnost je povećana 500 puta u poređenju sa nelečenim pacijentom i/ili u poređenju sa pacijentom koji je lečen TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, poliklonalnost je povećana 1000 puta u poređenju sa nelečenim pacijentom i/ili u poređenju sa pacijentom koji je lečen TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27.
[0395] Mere efikasnosti mogu uključivati merenja stope kontrole bolesti (disease control rate, DCR) kao i ukupnu stopu odgovora (overall response rate, ORR), kako je poznato u struci i opisano u Primerima datim u ovom tekstu, uključujući Primer 28.
1. Postupci lečenja kancera i drugih bolesti
[0396] Kompozicije i postupci opisani u ovom tekstu mogu se koristiti u postupku lečenja bolesti. U primeru, služe za lečenje hiperproliferativnih poremećaja. Mogu se koristiti i za lečenje drugih poremećaja kako je opisano u ovom tekstu i u paragrafima koji slede.
[0397] Hiperproliferativni poremećaj može biti kancer. Hiperproliferativni poremećaj može biti kancer u vidu solidnog tumora. Kancer u vidu solidnog tumora može se odabrati iz grupe koju čine melanom, kancer ovarijuma, kancer cerviksa, nesitnoćelijski kancer pluća (NSCLC), kancer pluća, kancer mokraćne bešike, kancer dojke, kancer izazvan humanim papiloma virusom, kancer glave i vrata (uključujući karcinom skvamoznih ćelija glave i vrata (HNSCC)), kancer bubrega, i karcinom ćelija bubrega. Hiperproliferativni pormeećaj može biti hematološki malignitet. Kancer u vidu solidnog tumora može se odabrati iz grupe koju čine hronična limfocitna leukemija, akutna limfoblastna leukemija, difuzni limfom krupnih B ćelija, ne-Hodgkinov limfom, Hodgkinov limfom, folikularni limfom, i limfom plaštanih ćelija.
[0398] U ovom tekstu je takođe objavljen, ali ne i zahtevan postupak lečenja kancera populacijom TIL, pri čemu je pacijent prethodno lečen nemijeloablativnom hemioterapijom pre infuzije TIL prema predmetnoj objavi. Nemijeloablativnu hemioterapiju može činiti ciklofosfamid 60 mg/kg/d tokom 2 dana (dani 27 i 26 pre TIL infuzije) i fludarabin 25 mg/m2/d tokom 5 dana (dani 27 do 23 pre TIL infuzije). Posle nemijeloablativne hemioterapije i infuzije TIL (na dan 0) prema predmetnoj objavi, pacijent može primati intravensku infuziju IL-2 u dozi od 720,000 IU/kg svakih 8 sati do fiziološke tolerancije.
[0399] Efikasnost jedinjenja i kombinacija opisanih u ovom tekstu u lečenju, prevenciji i/ili upravljanju navedenim oboljenjima ili poremećajima može se testirati različitim modelima poznatim u struci, koji daju smernice za lečenje oboljenja kod ljudi. Na primer, modeli za određivanje efikasnosti lečenja kancera ovarijuma opisani su, npr., u Mullany, et al., Endocrinology 2012, 153, 1585-92; i Fong, et al., J. Ovarian Res. 2009, 2, 12. Modeli za određivanje efikasnosti lečenja kancera pankreasa opisani su u Herreros-Villanueva, et al., World J. Gastroenterol. 2012,18, 1286-1294. Modeli za određivanje efikasnosti lečenja kancera dojke opisani su, npr., u Fantozzi, Breast Cancer Res. 2006, 8, 212. Modeli za određivanje efikasnosti lečenja melanoma opisani su, npr., u Damsky, et al., Pigment Cell & Melanoma Res. 2010, 23, 853-859. Modeli za određivanje efikasnosti lečenja kancera pluća opisani su, npr., u Meuwissen, et al., Genes & Development, 2005, 19, 643-664. Modeli za određivanje efikasnosti lečenja kancera pluća opisani su, npr., u Kim, Clin. Exp. Otorhinolaryngol. 2009, 2, 55-60; i Sano, Head Neck Oncol.2009, 1, 32.
[0400] U nekim primerima izvođenja, IFN-gama (IFN-γ) ukazuje na efikasnost lečenja hiperproliferativnog poremećaja. U nekim primerima izvođenja, IFN-γ u krvi subjekata lečenih upotrebom TIL ukazuje na aktivne TIL. U nekim primerima izvođenja, koristi se test potencije proizvodnje IFN-γ. Proizvodnja IFN-γ je još jedna mera citotoksičnog potencijala. Proizvodnja IFN-γ može da se meri određivanjem nivoa citokina IFN-γ u krvi subjekta lečenog korišćenjem TIL pripremljenih postupcima predmetnog pronalaska, uključujući one koji su opisani na primer na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, TIL dobijeni predmetnim postupcima obezbeđuju povišenje IFN-γ u krvi subjekata lečenih korišćenjem TIL predmetnog postupka u poređenju sa subjektima lečenim korišćenjem TIL pripremljenih postupcima označenim kao proces 1C, kako je za primer pokazano na Slici 83. U nekim
11
primerima izvođenja, porast IFN-γ ukazuje na efikasnost lečenja kod pacijenta lečenog korišćenjem TIL proizvedenih postupcima predmetnog pronalaska. U nekim primerima izvođenja, IFN-γ je povećan jedan put, dva puta, tri puta, četiri puta, ili pet puta ili više u poređenju sa nelečenim pacijentom i/ili u poređenju sa pacijentom koji je lečen TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, sekrecija IFN-γ je povećana jedan put u poređenju sa nelečenim pacijentom i/ili u poređenju sa pacijentom koji je lečen TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, sekrecija IFN-γ je povećana dva puta u poređenju sa nelečenim pacijentom i/ili u poređenju sa pacijentom koji je lečen TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, sekrecija IFN-γ je povećana tri puta u poređenju sa nelečenim pacijentom i/ili u poređenju sa pacijentom koji je lečen TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, sekrecija IFN-γ je povećana četiri puta u poređenju sa nelečenim pacijentom i/ili u poređenju sa pacijentom koji je lečen TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, sekrecija IFN-γ je povećana pet puta u poređenju sa nelečenim pacijentom i/ili u poređenju sa pacijentom koji je lečen TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, IFN-γ se meri Quantikine ELISA kitom. U nekim primerima izvođenja, IFN-γ se meri Quantikine ELISA kitom. U nekim primerima izvođenja, IFN-γ se meri u TIL ex vivo kod pacijenta lečenog TIL proizvedenim postupcima predmetnog pronalaska. U nekim primerima izvođenja, IFN-γ se meri u krvi pacijenta lečenog TIL proizvedenim postupcima predmetnog pronalaska. U nekim primerima izvođenja, IFN-γ se meri u serumu pacijenta lečenog TIL proizvedenim postupcima predmetnog pronalaska.
[0401] U nekim primerima izvođenja, viši prosečni IP-10 ukazuje na efikasnost lečenja i/ili povećanu kliničku efikasnost u lečenju hiperproliferativnog poremećaja. U nekim primerima izvođenja, viši prosečni IP-10 u krvi subjekata lečenih TIL ukazuje na aktivne TIL. U nekim
11
primerima izvođenja, TIL dobijeni predmetnim postupcima obezbeđuju viši prosečni IP-10 u krvi subjekata lečenih korišćenjem TIL predmetnog postupka u poređenju sa subjektima lečenim TIL pripremljenih korišćenjem postupaka označenih kao proces 1C, što je kao primer prikazano na Slici 83. Proizvodnja IP-10 može se meriti određivanjem nivoa IP-10 u krvi subjekta lečenog korišćenjem TIL pripremljenih postupcima predmetnog pronalaska, uključujući one koji su opisani na primer na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, viši prosečni IP-10 ukazuje na efikasnost lečenja kod pacijenta lečenog korišćenjem TIL proizvedenih postupcima predmetnog pronalaska. U nekim primerima izvođenja, viši prosečni IP-10 koreliše sa porastom od jedan put, dva puta, tri puta, četiri puta, ili pet puta ili više u poređenju sa nelečenim pacijentom i/ili u poređenju sa pacijentom koji lečen TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, viši prosečni IP-10 koreliše sa porastom od jedan put u poređenju sa nelečenim pacijentom i/ili u poređenju sa pacijentom koji lečen TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, viši prosečni IP-10 koreliše sa porastom od dva puta u poređenju sa nelečenim pacijentom i/ili u poređenju sa pacijentom koji lečen TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, viši prosečni IP-10 koreliše sa porastom od tri puta u poređenju sa nelečenim pacijentom i/ili u poređenju sa pacijentom koji lečen TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, viši prosečni IP-10 koreliše sa porastom od četiri puta u poređenju sa nelečenim pacijentom i/ili u poređenju sa pacijentom koji lečen TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, viši prosečni IP-10 koreliše sa porastom od pet puta u poređenju sa nelečenim pacijentom i/ili u poređenju sa pacijentom koji lečen TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27.
[0402] U nekim primerima izvođenja, viši prosečni MCP-1 ukazuje na efikasnost lečenja i/ili povećanu kliničku efikasnost u lečenju hiperproliferativnog poremećaja. U nekim primerima izvođenja, viši prosečni MCP-1 u krvi subjekata lečenih korišćenjem TIL indikativan je za
11
aktivne TIL. U nekim primerima izvođenja, TIL dobijeni predmetnim postupcima obezbeđuju viši prosečni MCP-1 u krvi subjekata lečenih korišćenjem TIL predmetnog postupka u poređenju sa subjektima lečenim korišćenjem TIL pripremljenih postupcima označenim kao proces 1C, što je kao primer prikazano na Slici 83. Proizvodnja MCP-1 može se meriti određivanjem nivoa MCP-1 u krvi subjekta lečenog korišćenjem TIL pripremljenih postupcima predmetnog pronalaska, uključujući one koji su opisani na primer na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, viši prosečni MCP-1 ukazuje na efikasnost lečenja kod pacijenta lečenog korišćenjem TIL proizvedenih postupcima predmetnog pronalaska. U nekim primerima izvođenja, viši prosečni MCP-1 koreliše sa porastom od jedan put, dva puta, tri puta, četiri puta, ili pet puta ili više u poređenju sa nelečenim pacijentom i/ili u poređenju sa pacijentom koji je lečen TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, viši prosečni MCP-1 koreliše sa porastom od jedan put u poređenju sa nelečenim pacijentom i/ili u poređenju sa pacijentom koji lečen TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, viši prosečni MCP-1 koreliše sa porastom od dva puta u poređenju sa nelečenim pacijentom i/ili u poređenju sa pacijentom koji lečen TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, viši prosečni MCP-1 koreliše sa porastom od tri puta u poređenju sa nelečenim pacijentom i/ili u poređenju sa pacijentom koji lečen TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, viši prosečni MCP-1 koreliše sa porastom od četiri puta u poređenju sa nelečenim pacijentom i/ili u poređenju sa pacijentom koji lečen TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, viši prosečni MCP-1 koreliše sa porastom od pet puta u poređenju sa nelečenim pacijentom i/ili u poređenju sa pacijentom koji lečen TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27.
[0403] U nekim primerima izvođenja, TIL pripremljeni postupcima predmetnog pronalaska, uključujući opisane na primer na Slici 27, pokazuju povećanu poliklonalnost u poređenju sa
11
TIL proizvedenim drugim postupcima, uključujući one koji nisu kao primer prikazani na Slici 27, kao što su na primer, postupci označeni kao postupci procesa 1C. U nekim primerima izvođenja, značajno poboljšana poliklonalnost i/ili povećana poliklonalnost ukazuju na efikasnost lečenja i/ili povećanu kliničku efikasnost u lečenju kancera. U nekim primerima izvođenja, poliklonalnost se odnosi na diverzitet repertoara T-ćelija. U nekim primerima izvođenja, porast poliklonalnosti može ukazivati na efikasnost lečenja u vezi sa primenom TIL proizvedenih postupcima predmetnog pronalaska. U nekim primerima izvođenja, poliklonalnost je povećana jedan put, dva puta, deset puta, 100 puta, 500 puta, ili 1000 puta u poređenju sa TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, poliklonalnost je povećana jedan put u poređenju sa nelečenim pacijentom i/ili u poređenju sa pacijentom koji je lečen TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, poliklonalnost je povećana dva puta u poređenju sa nelečenim pacijentom i/ili u poređenju sa pacijentom koji je lečen TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, poliklonalnost je povećana deset puta u poređenju sa nelečenim pacijentom i/ili u poređenju sa pacijentom koji je lečen TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, poliklonalnost je povećana 100 puta u poređenju sa nelečenim pacijentom i/ili u poređenju sa pacijentom koji je lečen TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, poliklonalnost je povećana 500 puta u poređenju sa nelečenim pacijentom i/ili u poređenju sa pacijentom koji je lečen TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27. U nekim primerima izvođenja, poliklonalnost je povećana 1000 puta u poređenju sa nelečenim pacijentom i/ili u poređenju sa pacijentom koji je lečen TIL pripremljenim korišćenjem postupaka različitih od onih koji su obezbeđeni u ovom tekstu uključujući na primer, postupke različite od onih koji su opredmećeni na Slici 27.
2. Postupci uporede primene
11
[0404] U nekim primerima izvođenja, TIL proizvedeni kako je opisano u ovom tekstu, uključujući na primer TIL izvedne iz postupaka opisanih u Koracima A do F Slike 27, mogu biti namenjeni za primenu u kombinaciji sa jednim ili više regulatora imunskih kontrolnih tačaka, kako što su antitela opisana u nastavku ovog teksta. Na primer, antitela koja ciljaju PD-1 i koja mogu da se primenjuju uporedo sa TIL predmetnog pronalaska uključuju, npr., ali se ne ograničavaju na nivolumab (BMS-936558, Bristol-Myers Squibb; Opdivo®), pembrolizumab (lambrolizumab, MK03475 ili MK-3475, Merck; Keytruda®), humanizovano anti-PD-1 antitelo JS001 (ShangHai JunShi), monoklonsko anti-PD-1 antitelo TSR-042 (Tesaro, Inc.), Pidilizumab (anti-PD-1 mAb CT-011, Medivation), anti-PD-1 monoklonsko antitelo BGB-A317 (BeiGene), i/ili anti-PD-1 antitelo SHR-1210 (ShangHai HengRui), humano monoklonsko antitelo REGN2810 (Regeneron), humano monoklonsko antitelo MDX-1106 (Bristol-Myers Squibb), i/ili humanizovano anti-PD-1 IgG4 antitelo PDR001 (Novartis). U nekim primerima izvođenja, PD-1 antitelo je iz klona: RMP1-14 ( IgG pacova) -BioXcell kat. # BP0146. Druga antitela pogodna za upotrebu u postupcima paralelne primene sa TIL proizvedenim prema Koracima A do F kako je opisano u ovom tekstu su anti-PD-1 antitela objavljena u U.S. patentu br. 8,008,449. U nekim primerima izvođenja, antitelo ili njegov antigen-vezujući deo vezuje se specifično za PD-L1 i inhibira njegovu interakciju sa PD-1, povećavajući time imunsku aktivnost. Sva antitela poznata u struci koja se vezuju za PD-L1 i ometaju interakciju između PD-1 i PD-L1, i stimulišu antitumorski imunski odgovor, pogodna su za upotrebu u postupcima uporede primene sa TIL proizvedenim prema Koracima A do F kako je opisano u ovom tekstu. Na primer, antitela koja ciljaju PD-L1 i koja su u kliničkim ispitivanjima, uključuju BMS-936559 (Bristol-Myers Squibb) i MPDL3280A (Genentech). Druga pogodna antitela koja ciljaju PD-L1 objavljena su u U.S. patentu br.
7,943,743. Prosečno obučeni stručnjak u oblasti će razumeti da je svako antitelo koje se vezuje za PD-1 ili PD-L1, remeti interakciju PD-1/PD-L1, i stimuliše antitumorski imunski odgovor, pogodno za upotrebu u postupcima uporede primene sa TIL proizvedenim prema Koracima A do F kako je opisano u ovom tekstu. Kod subjekta kod kojeg se primenjuje kombinacija TIL proizvedenih prema Koracima A do F može se paralelno primeniti anti-PD-1 antitelo kada pacijent ima tip kancera koji je refraktoran na anti-PD-1 antitelo kada se ono primenjuje samo. Kod pacijenta se može primeniti TIL u kombinaciji sa anti-PD-1 kada pacijent ima refraktorni melanom. Kod pacijenta se može primeniti TIL u kombinaciji sa anti-PD-1 kada pacijent ima nesitnoćelijski karcinom pluća (NSCLC).
3. Opciono prekondicioniranje pacijenata limfodeplecijom
12
[0405] U ovom tekstu se objavljuje, ali ne i zahteva i postupak lečenja kancera populacijom TIL, pri čemu se pacijent tretira nemijeloablativnom hemioterapijom, pre infuzije TIL prema predmetnoj objavi. Isto tako, u ovom tekstu se objavljuje, ali ne i zahteva populacija TIL za upotrebu u lečenju kancera kod pacijenta koji je bio prethodno ltretiran nemijeloablativnom hemioterapijom. Populacija TIL može se primeniti infuzijom. Nemijeloablativna hemioterapija može biti predstavljena ciklofosfamidom 60 mg/kg/d tokom 2 dana (dani 27 i 26 pre TIL infuzije) i fludarabinom 25 mg/m2/d tokom 5 dana (dani 27 do 23 pre TIL infuzije). Posle nemijeloablativne hemioterapije i infuzije TIL (na dan 0) prema predmetnoj objavi, pacijent može primiti intravensku infuziju IL-2 (aldesleukin, komercijalno se može nabaviti kao PROLEUKIN) u dozi od 720,000 IU/kg svakih 8 sati do fiziološke tolerancije. Populacija TIL može biti namenjena lečenju kancera, u kombinaciji sa IL-2, pri čemu se IL-2 primenjuje posle populacije TIL.
[0406] Eksperimentalni podaci ukazuju da limfodeplecija pre adoptivnog transfera tumorspecifičnih T limfocita igra ključnu ulogu u poboljšavanju efikasnosti lečenja eliminisanjem regulatornih T ćelija i kompetirajućih elemenata imunskog sistema ('konzumacija citokina'). Prema tome, korak limfodeplecije (ponekad takođe označen kao "imunosupresivno kondicioniranje") može se koristiti kod pacijenta pre uvođenja TIL pronalaska.
[0407] Uopšteno, limfodeplecija se postiže primenom fludarabina ili ciklofosfamida (aktivna forma označena kao mafosfamid) i njihovih kombinacija. Takvi postupci su opisani u Gassner, et al., Cancer Immunol. Immunother. 2011, 60, 75-85, Muranski, et al., Nat. Clin. Pract. Oncol., 2006, 3, 668-681, Dudley, et al., J. Clin. Oncol.2008, 26, 5233-5239, i Dudley, et al., J. Clin. Oncol.2005, 23, 2346-2357.
[0408] Fludarabin može da se primeni u koncentraciji od 0.5 μg/mL do 10 μg/mL fludarabina. Fludarabin može da se primeni u koncnetraciji od 1 μg/mL fludarabina. Lečenje fludarabinom može da se primeni u toku 1 dana, 2 dana, 3 dana, 4 dana, 5 dana, 6 dana, ili 7 dana ili više. Fludarabin može da se primeni u dozi od 10 mg/kg/dan, 15 mg/kg/dan, 20 mg/kg/dan, 25 mg/kg/dan, 30 mg/kg/dan, 35 mg/kg/dan, 40 mg/kg/dan, ili 45 mg/kg/dan. Lečenje fludarabinom može da se primeni u toku 2-7 dana u dozi od 35 mg/kg/dan. Lečenje fludarabinom može da se primeni u toku 4-5 dana u dozi od 35 mg/kg/dan. Lečenje fludarabinom može da se primeni u toku 4-5 dana u dozi od 25 mg/kg/dan.
[0409] Mafosfamid, aktivna forma ciklofosfamida, može da se dobije u koncentraciji od 0.5 μg/mL-10 μg/mL primenom ciklofosfamida. Mafosfamid, aktivna forma ciklofosfamida, može da se dobije u koncentraciji od 1 μg/mL primenom ciklofosfamida. Lečenje ciklofosfamidom može da se primeni u toku 1 dana, 2 dana, 3 dana, 4 dana, 5 dana, 6 dana, ili 7 dana ili više. Ciklofosfamid može da se primeni u dozi od 100 mg/m<2>/dan, 150 mg/m<2>/dan, 175 mg/m2/dan, 200 mg/m2/dan, 225 mg/m2/dan, 250 mg/m2/dan, 275 mg/m2/dan, ili 300 mg/m2/dan. Ciklofosfamid može da se primeni intravenski (tj., i.v.). Lečenje ciklofosfamidom može da se primeni tokom 2-7 dana u dozi od 35 mg/kg/dan. Lečenje ciklofosfamidom može da se primeni tokom 4-5 dana u dozi od 250 mg/m2/dan i.v. Lečenje ciklofosfamidom može da se primeni tokom 4 dana u dozi od 250 mg/m2/dan i.v.
[0410] Limfodeplecija kod pacijenta može da se izvede zajedničkom primenom fludarabina i ciklofosfamida. Fludarabin može da se primeni u dozi od 25 mg/m<2>/dan i.v. i ciklofosfamid se primenjuje u dozi od 250 mg/m2/dan i.v. tokom 4 dana.
[0411] Limfodeplecija može da se izvede primenom ciklofosfamida u dozi od 60 mg/m<2>/dan tokom dva dana, praćeno primenom fludarabina u dozi od 25 mg/m<2>/dan tokom pet dana.
4. Režimi IL-2
[0412] Režim IL-2 može uključivati režim visoke doze IL-2, pri čemu režim visoke doze IL-2 uključuje aldesleukin, ili biosimilar ili varijantu istog, primenjen intravenski počevši od prvog dana posle primene terapijski efikasnog dela terapijske populacije TIL, pri čemu se aldesleukin ili biosimilar ili varijanta istog primenjuju u dozi od 0.037 mg/kg ili 0.044 mg/kg IU/kg (telesne mase pacijenta) korišćenjem 15-minutne bolusne intravenske infuzije svakih osam sati do tolerancije, maksimalno 14 doza. Posle 9 dana pauze, ovaj raspored može da se ponovi za još 14 doza, maksimalno ukupno 28 doza.
[0413] Režim IL-2 može uključivati režim opadajućih doza IL-2. Opadajući režimi IL-2 opisani su u O’Day, et al., J. Clin. Oncol. 1999, 17, 2752-61 i Eton, et al., Cancer 2000, 88, 1703-9. Opadajući režim IL-2 može uključivati 18 × 10<6>IU/m<2>intravenski tokom 6 sati, praćeno sa 18 × 10<6>IU/m<2>intravenski tokom 12 sati, praćeno sa 18 × 10<6>IU/m<2>intravenski tokom 24 h, praćeno sa 4.5 × 10<6>IU/m<2>intravenski tokom 72 sata. Ovaj ciklus tretmana može se ponavljati svakih 28 dana u najviše četiri ciklusa. U primeru izvođenja, opadajući režim IL-2 uključuje 18,000,000 IU/m<2>na dan 1, 9,000,000 IU/m<2>na dan 2, i 4,500,000 IU/m<2>na dane 3 i 4.
[0414] Režim IL-2 može uključivati primenu pegilisanog IL-2 svakih 1, 2, 4, 6, 7, 14 ili 21 dan u dozi od 0.10 mg/dan do 50 mg/dan.
5. Adoptivni ćelijski transfer
[0415] Adoptivni ćelijski transfer (ACT) je veoma efikasna forma imunoterapije i uključuje transfer imunskih ćelija sa antitumorskom aktivnošću u pacijente sa kancerom. ACT je pristup tretmana koji uključuje identifikaciju, in vitro, limfocita sa antitumorskom aktivnošću, in vitro ekspanziju ovih ćelija do velikog broja i njihovu infuziju u domaćina koji nosi tumor. Limfociti upotrebljeni za adoptivni transfer mogu biti poreklom iz strome resektovanih tumora (tumor-infiltrirajući limfociti ili TIL). TIL za ACT mogu se pripremiti kako je opisano u ovom tekstu. U nekim primerima izvođenja, TIL su pripremljeni, na primer, prema postupku opisanom na Slici 27. Oni takođe mogu biti poreklom ili iz krvi ako su genetički inženjerisani da eksprimiraju antitumorske T-ćelijske receptore (TCR) ili himerne antigenske receptore (CAR), obogaćeni mešovitim kulturama limfocita i tumorskih ćelija (mixed lymphocyte tumor cell cultures, MLTC), ili klonirani korišćenjem autolognih antigenprezentujućih ćelija i peptida poreklom iz tumora. ACT u kojem se limfociti poreklom iz domaćina koji nosi kancer unose infuzijom naziva se autologni ACT. U.S. publikacija br.
2011/0052530 odnosi se na postupak izvođenja adoptivne ćelijske terapije za promociju regresije kancera, primarno za lečenje pacijenata koji pate od metastatskog melanoma.TIL će se primeniti kako je opisano u ovom tekstu. TIL se mogu primeniti u jednoj dozi. Takva primena može biti putem injekcije, npr., intravenske injekcije. U nekim primerima izvođenja, TIL i/ili citotoksični limfociti mogu da se primene u više doza. Doziranje može biti jednom, dva puta, tri puta, četiri puta, pet puta, šest puta, ili više od šest puta godišnje. Doziranje može biti jednom mesečno, jednom svake dve nedelje, jednom nedeljno, ili jednom svaki drugi dan. Primena TIL i/ili citotoksičnih limfocita može trajati koliko je potrebno.
6. Reprezentativni primeri tretmana
[0416] Predmetna objava uključuje postupak lečenja kancera populacijom tumorinfiltrirajućih limfocita (TIL), koji uključuje korake (a) dobijanja prve populacije TIL iz tumora resektovanog iz pacijenta; (b) izvođenja inicijalne ekspanzije prve populacije TIL u prvom medijumu za kulturu ćelija da bi se dobila druga populacija TIL, pri čemu je druga populacija TIL najmanje 5 puta brojnija od prve populacije TIL, i pri čemu prvi medijum za kulturu ćelija sadrži IL-2; (c) izvođenja brze ekspanzije druge populacije TIL korišćenjem populacije mijeloidnih veštačkih antigen-prezentujućih ćelija (mijeloidne aAPC) u drugom medijumu za kulturu ćelija da bi se dobila treća populacija TIL, pri čemu je treća populacija TIL najmanje 50 puta brojnija od druge populacije TIL posle 7 dana od početka brze ekspanzije; i pri čemu drugi medijum za kulturu ćelija sadrži IL-2 i OKT-3; (d) primene terapijski efikasnog dela treće populacije TIL kod pacijenta sa kancerom. Predmetna objava uključuje i populaciju tumor-infiltrirajućih limfocita (TIL) za upotrebu u lečenju kancera, pri čemu se populacija TIL može dobiti postupcima koji uključuju korake (b) izvođenja inicijalne
12
ekspanzije prve populacije TIL dobijene iz tumora resektovanog iz pacijenta u prvom medijumu za kulturu ćelija da bi se dobila druga populacija TIL, pri čemu je druga populacija TIL najmanje 5 puta brojnija od prve populacije TIL, i pri čemu prvi medijum za kulturu ćelija sadrži IL-2; (c) izvođenja brze ekspanzije druge populacije TIL korišćenjem populacije mijeloidnih veštačkih antigen-prezentujućih ćelija (mijeloidne aAPC) u drugom medijumu za kulturu ćelija da bi se dobila treća populacija TIL, pri čemu je treća populacija TIL najmanje 50 puta brojnija od druge populacije TIL, posle 7 dana od početka brze ekspanzije; i pri čemu drugi medijum za kulturu ćelija sadrži IL-2 i OKT-3; (d) primene terapijski efikasnog dela treće populacije TIL kod pacijenta sa kancerom. Postupak može uključivati prvi korak (a) dobijanja prve populacije TIL iz tumora resektovanog iz pacijenta. IL-2 može biti prisutan u inicijalnoj koncentraciji od oko 3000 IU/mL i OKT-3 antitelo je prisutno u inicijanoj koncentraciji od oko 30 ng/mL u drugom medijumu za kulturu ćelija. Prva ekspanzija može se izvoditi tokom perioda ne dužeg od 14 dana. Prva ekspanzija može da se izvede korišćenjem kontejnera permeabilnog za gas. Druga ekspanzija može da se izvede korišćenjem kontejnera permeabilnog za gas. Odnos druge populacije TIL prema populaciji aAPC u brzoj ekspanziji može iznositi između 1 prema 80 i 1 prema 400. Odnos druge populacije TIL prema populaciji aAPC u brzoj ekspanziji može iznositi oko 1 prema 300. Kancer koji se leči može da se bira iz grupe koju čine melanom, kancer ovarijuma, kancer cerviksa, nesitnoćelijski kancer pluća (NSCLC), kancer pluća, kancer mokraćne bešike, kancer dojke, kancer izazvan humanim papiloma virusom, kancer glave i vrata (uključujući karcinom skvamoznih ćelija glave i vrata (HNSCC)), kancer bubrega, i karcinom ćelija bubrega. Kancer koji se leči može da se bira iz grupe koju čine melanom, kancer ovarijuma i kancer cerviksa. Kancer koji se leči može biti melanom. Kancer koji se leči može biti kancer ovarijuma. Kancer koji se leči može biti kancer cerviksa. Postupak lečenja kancera može uključivati još i korak lečenja pacijenta režimom nemijeloablativne limfodeplecije pre primene treće populacije TIL kod pacijenta. Režim nemijeloablativne limfodeplecije može uključivati korake primene ciklofosfamida u dozi od 60 mg/m<2>/dan tokom dva dana, što je praćeno primenom fludarabina u dozi od 25 mg/m<2>/dan tokom pet dana. Režim visoke doze IL-2 može uljučivati 600,000 ili 720,000 IU/kg aldesleukina, ili biosimilara ili varijante istog, primenjeno u vidu 15-minutne bolusne intravenske infuzije svakih osam sati do tolerancije.
V. Reprezentativni primeri
[0417] Predmetna objava uključuje, ali ne zahteva postupak lečenja subjekta koji ima kancer, postupak koji obuhvata primenu ekspandiranih tumor-infiltritajućih limfocita (TIL) uključuje: (a) dobijanje prve populacije TIL iz tumora resektovanog iz subjekta, obrađivanjem uzorka tumora dobijenog od pacijenta u više tumorskih fragmenata;
(b) dodavanje tumorskih fragmenata zatvorenom sistemu;
(c) izvođenje prve ekspanzije kultivisanjem prve populacije TIL u medijumu za ćelijsku kulturu koji sadrži IL-2 da bi se proizvela druga populacija TIL, pri čemu se prva ekspanzija izvodi u zatvorenom kontejneru koji obezbeđuje prvu površinu permeabilnu za gas, pri čemu se prva ekspanzija izvodi tokom oko 11 dana da bi se dobila druga populacija TIL, pri čemu je druga populacija TIL najmanje 50 puta brojnija od prve populacije TIL, i pri čemu se prelaz iz koraka (b) u korak (c) dešava bez otvaranja sistema;
(d) izvođenje druge ekspanzije suplementacijom medijuma za kulturu ćelija druge populacije TIL dodatnim IL-2, OKT-3, i antigen-prezentujućim ćelijama (APC), da bi se proizvela treća populacija TIL, pri čemu se druga ekspanzija izvodi tokom oko 11 dana da bi se dobila treća populacija TIL, pri čemu je treća populacija TIL terapijska populacija TIL, pri čemu se druga ekspanzija izvodi u zatvorenom kontejneru koji obezbeđuje drugu površinu permeabilnu za gas, i pri čemu se prelaz iz koraka (c) u korak (d) dešava bez otvaranja sistema;
(e) sakupljanje terapijske populacije TIL dobijene iz koraka (d), pri čemu se prelaz iz koraka (d) u korak (e) dešava bez otvaranja sistema; i
(f) prenošenje sakupljene TIL populacije iz koraka (e) u infuzionu kesu, pri čemu se prelaz iz koraka (e) u (f) dešava bez otvaranja sistema.
(g) opciono krioprezerviranje infuzione kese koja sadrži sakupljenu TIL populaciju iz koraka (f) korišćenjem procesa krioprezervacije; i
(h) primenu kod pacijenta terapijski efikasne doze treće populacije TIL iz infuzione kese u koraku (g).
[0418] Proces krioprezervacije može uključivati krioprezervaciju u medijumu koji sadrži DMSO. Medijum za krioprezervaciju može sadržati 7% do 10% DMSO. Medijum za krioprezervaciju može biti CS10.
[0419] Terapijska populacija TIL sakupljena u koraku (e) može uključivati dovoljno TIL za primenu terapijski efikasne doze TIL u koraku (h).
[0420] Broj TIL dovoljan za primenu terapijski efikasne doze u koraku (h) može iznositi oko 2.3 ×10<10>do oko 13.7 ×10<10>.
[0421] Antigen-prezentujuće ćelije (APC) mogu biti PBMC.
12
[0422] PBMC se mogu dodati ćelijskoj kulturi bilo kojeg od dana 9 do 11 u koraku (d).
[0423] Pre primene terapijski efikasne doze TIL ćelija u koraku (h), kod pacijenta se može primeniti režim nemijeloablativne limfodeplecije.
[0424] Režim nemijeloablativne limfodeplecije može uključivati korake primene ciklofosfamida u dozi od 60 mg/m2/dan tokom dva dana, praćeno primenom fludarabina u dozi od 25 mg/m2/dan tokom pet dana.
[0425] Postupak može ukljućivati još i korak tretiranja pacijenta režimom visoke doze IL-2 počevši prvog dana posle primene TIL ćelija kod pacijenta u koraku (h).
[0426] Režim visoke doze IL-2 može uključivati 600,000 ili 720,000 IU/kg primenjeno u vidu 15-minutne bolusne intravenske infuzije svakih osam sati, do tolerancije.
[0427] Treća populacija TIL u koraku (d), kada se primeni kod subjekta, može obezbediti povećanu efikasnost, povećanu proizvodnju interferona-gama (IFNγ), povećanu poliklonalnost, povećani prosečni IP-10, i/ili povećani prosečni MCP-1. Porast IFN-γ, porast prosečnog IP-10, i/ili porast prosečnog MCP-1 može se meriti u krvi subjekta tretiranog korišćenjem TIL.
[0428] Kancer može da se bira iz grupe koju čine melanom, kancer ovarijuma, kancer cerviksa, nesitnoćelijski kancer pluća (NSCLC), kancer pluća, kancer mokraćne bešike, kancer dojke, kancer izazvan humanim papiloma virusom, kancer glave i vrata (uključujući karcinom skvamoznih ćelija glave i vrata (HNSCC)), kancer bubrega, i karcinom ćelija bubrega. Kancer može da se bira iz grupe koju čine melanom, HNSCC, kanceri cerviksa, i NSCLC. U nekim primerima izvođenja, kancer je melanom. Kancer može biti HNSCC. Kancer može biti kancer cerviksa. Kancer može biti NSCLC.
[0429] U primeru izvođenja, pronalazak obezbeđuje postupak za ekspandiranje tumorinfiltrirajućih limfocita (TIL).
[0430] U ovom tekstu objavljen je postupak za ekspandiranje tumor-infiltrirajućih limfocita (TIL) koji uključuje: (a) dobijanje uzorka tumora od pacijenta, pri čemu pomenuti uzorak tumora sadrži prvu populaciju TIL; (b) procesovanje pomenutog uzorka tumora u veći broj tumorskih fragmenata; (c) dodavanje pomenutih tumorskih fragmenata u zatvoreni kontejner; (d) izvođenje inicijalnog ekspandiranja pomenute prve populacije TIL u prvom medijumu za kulturu ćelija da bi se dobila druga populacija TIL, pri čemu pomenuti prvi medijum za kulturu ćelija sadrži IL-2, pri čemu se pomenuta inicijalna ekspanzija izvodi u pomenutom zatvorenom kontejneru koji obezbeđuje najmanje 100 cm<2>površine permeabilne za gas, pri čemu se pomenuta inicijalna ekspanzija izvodi unutar prvog perioda od oko 7-14 dana da bi
12
se dobila druga populacija TIL, pri čemu je pomenuta druga populacija TIL najmanje 50 puta brojnija od
pomenute prve populacije TIL, i pri čemu se prelaz iz koraka (c) u korak (d) dešava bez otvaranja sistema; (e) ekspandiranje pomenute druge populacije TIL u drugom medijumu za kulturu ćelija, pri čemu pomenuti drugi medijum za kulturu ćelija sadrži IL-2, OKT-3, i mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC, poznate i kao mononuklearne ćelije (MNC)), pri čemu se pomenuto ekspandiranje izvodi unutar drugog perioda od oko 7-14 dana da bi se dobila treća populacija TIL, pri čemu pomenuta treća populacija TIL pokazuje povećanu potpopulaciju efektorskih T ćelija i/ili centralnih memorijskih T ćelija u odnosu na drugu populaciju TIL, pri čemu se pomenuto ekspandiranje izvodi u zatvorenom kontejneru koji obezbeđuje najmanje 500 cm<2>površine permeabilne za gas, i pri čemu se prelaz iz koraka (d) u korak (e) dešava bez otvaranja sistema; (f) sakupljanje pomenute treće populacije TIL dobijene iz koraka (e), pri čemu se prelaz iz koraka (e) u korak (f) dešava bez otvaranja sistema; i (g) prenos pomenute sakupljene TIL populacije iz koraka (f) u infuzionu kesu, pri čemu se pomenuti prelaz iz koraka (f) u (g) dešava bez otvaranja sistema. Postupak može biti postupak in vitro ili ex vivo.
[0431] Postupak može uključivati još i sakupljanje u koraku (f) putem sistema za procesovanje ćelija kao što je LOVO sistem proizveden od strane Fresenius Kabi. Izraz "LOVO sistem za procesovanje ćelija" označava i bilo koji instrument ili uređaj koji izrađuje bilo koji prodavac, koji može da pumpa rastvor koji sadrži ćelije kroz membranu ili filter kao što je obrtna membrana ili obrtni filter u sterilnoj i/ili zatvorenoj sredini sistema, omogućavajući kontinuirani protok i obradu ćelija da bi se uklonio supernatant ili medijum za kulturu ćelija bez peletiranja. U nekim slučajevima, sistem za obradu ćelija može izvesti separaciju ćelija, ispiranje, razmenu tečnosti, koncentrovanje, i/ili druge korake obrade ćelija u zatvorenom, sterilnom sistemu.
[0432] Zatvoreni kontejner može da se bira iz grupe koju čine G-kontejner i Xuri kesa za ćelije.
[0433] Infuziona kesa u koraku (g) može da bude infuziona kesa koja sadrži HypoThermosol.
[0434] Prvi period u koraku (d) i pomenuti drugi period u koraku (e) mogu, svaki pojedinačno, da se izvedu unutar perioda od 10 dana, 11 dana, ili 12 dana.
[0435] Prvi period u koraku (d) i pomenuti drugi period u koraku (e) mogu, svaki pojedinačno, da se izvedu unutar perioda od 11 dana.
[0436] Koraci (a) do (g) mogu da se izvedu unutar perioda od oko 25 dana do oko 30 dana.
[0437] Koraci (a) do (g) mogu da se izvedu unutar perioda od oko 20 dana do oko 25 dana.
12
[0438] Koraci (a) do (g) mogu da se izvedu unutar perioda od oko 20 dana do oko 22 dana.
[0439] Koraci (a) do (g) mogu da se izvedu u 22 dana ili manje.
[0440] Koraci (c) do (f) mogu da se izvedu u jednom kontejneru, pri čemu izvođenje koraka (c) do (f) u jednom kontejneru rezultuje porastom prinosa TIL po resektovanom tumoru u poređenju sa izvođenjem koraka (c) do (f) u više nego jednom kontejneru.
[0441] PBMC mogu da se dodaju TIL tokom drugog perioda u koraku (e) bez otvaranja sistema.
[0442] Efektorske T ćelije i/ili centralne memorijske T ćelije dobijene iz pomenute treće populacije TIL mogu ispoljiti jednu ili više karakteristika koje se biraju iz grupe koju čine eksprimiranje CD27+, eksprimiranje CD28+, duže telomere, povećana ekspresija CD57, i smanjena ekspresija CD56 u odnosu na efektorske T ćelije i/ili centralne memorijske T ćelije dobijene iz pomenute druge populacije ćelija.
[0443] Efektorske T ćelije i/ili centralne memorijske T ćelije dobijene iz pomenute treće popučacije TIL mogu ispoljiti povišenu ekspresiju CD57 i smanjenu ekspresiju CD56 u odnosu na efektorske T ćelije i/ili centralne memorijske T ćelije dobijene iz pomenute druge populacije ćelija.
[0444] Rizik za mikrobnu kontaminaciju može biti smanjen u poređenju sa otvorenim sistemom.
[0445] TIL iz koraka (g) mogu se uneti infuzijom u pacijenta.
[0446] U ovom tekstu je objavljen, ali ne i zahtevan postupak lečenja kancera kod pacijenta populacijom tumor-infiltrirajućih limfocita (TIL) koji uključuje korake: (a) dobijanja uzorka tumora od pacijenta, pri čemu pomenuti uzorak tumora sadrži prvu populaciju TIL; (b) obrade pomenutog uzorka tumora u veliki broj tumorskih fragmenata; (c) dodavanja pomenutih tumorskih fragmenata u zatvoreni kontejner; (d) izvođenja inicijalne ekspanzije pomenute prve populacije TIL u prvom medijumu za kulturu ćelija da bi se dobila druga populacija TIL, pri čemu pomenuti prvi medijum za kulturu ćelija sadrži IL-2, pri čemu se pomenuta inicijalna ekspanzija izvodi u pomenutom zatvorenom kontejneru koji obezbeđuje najmanje 100 cm2 površine permeabilne za gas, pri čemu se pomenuta inicijalna ekspanzija izvodi unutar prvog perioda od oko 7-14 dana da bi se dobila druga populacija TIL, pri čemu je pomenuta druga populacija TIL najmanje 50 puta brojnija od pomenute prve populacije TIL, i pri čemu se prelaz iz koraka (c) u korak (d) dešava bez otvaranja sistema; (e) ekspandiranja pomenute druge populacije TIL u drugom medijumu za kulturu ćelija, pri čemu pomenuti drugi medijum za kulturu ćelija sadrži IL-2, OKT-3, i mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC), pri čemu se pomenuta ekspanzija izvodi unutar drugog perioda od oko 7-14 dana da
12
bi se dobila treća populacija TIL, pri čemu pomenuta treća populacija TIL pokazuje povećanu potpopulaciju efektorskih T ćelija i/ili centralnih memorijskih T ćelija u odnosu na drugu populaciju TIL, pri čemu se pomenuta ekspanzija izvodi u zatvorenom kontejneru koji obezbeđuje najmanje 500 cm<2>površine permeabilne za gas, i pri čemu se prelaz iz koraka (d) u korak (e) dešava bez otvaranja sistema; (f) sakupljanja pomenute treće populacije TIL dobijene iz koraka (e), pri čemu se prelaz iz koraka (e) u korak (f) dešava bez otvaranja sistema; i (g) prenos pomenute sakupljene TIL populacije iz koraka (f) u infuzionu kesu, pri čemu se pomenuti prelaz iz koraka (f) u (g) dešava bez otvaranja sistema; i (h) davanja pomenutom pacijentu terapijski efikasne količine TIL ćelija iz infuzione kese pomenute u koraku (g).
[0447] U ovom tekstu objavljena je, ali ne i zahtevana populacija tumor-infiltrirajućih limfocita (TIL) za upotrebu u lečenju kancera pri čemu se populacija TIL može dobiti iz postupka koji uključuje korake: (b) procesovanja uzorka tumora dobijenog od pacijenta pri čemu pomenuti tumorski uzorak sadrži prvu populaciju TIL u više tumorskih fragmenata; (c) dodavanja pomenutih tumorskih fragmenata u zatvoreni kontejner; (d) izvođenja inicijalne ekspanzije pomenute prve populacije TIL u prvom medijumu za kulturu ćelija da bi se dobila druga populacija TIL, pri čemu pomenuti prvi medijum za kulturu ćelija sadrži IL-2, pri čemu se pomenuta inicijalna ekspanzija izvodi u pomenutom zatvorenom kontejneru koji obezbeđuje najmanje 100 cm<2>površine permeabilne za gas, pri čemu se pomenuta inicijalna ekspanzija izvodi unutar prvog perioda od oko 7-14 dana da bi se dobila druga populacija TIL, pri čemu je pomenuta druga populacija TIL najmanje 50 puta brojnija od pomenute prve populacije TIL, i pri čemu se prelaz iz koraka (c) u korak (d) dešava bez otvaranja sistema; (e) ekspandiranja pomenute druge populacije TIL u drugom medijumu za kulturu ćelija, pri čemu pomenuti drugi medijum za kulturu ćelija sadrži IL-2, OKT-3, i mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC), pri čemu se pomenuta ekspanzija izvodi unutar drugog perioda od oko 7-14 dana da bi se dobila treća populacija TIL, pri čemu pomenuta treća populacija TIL pokazuje povećanu potpopulaciju efektorskih T ćelija i/ili centralnih memorijskih T ćelija u odnosu na drugu populaciju TIL, pri čemu se pomenuta ekspanzija izvodi u zatvorenom kontejneru koji obezbeđuje najmanje 500 cm<2>površine permeabilne za gas, i pri čemu se prelaz iz koraka (d) u korak (e) dešava bez otvaranja sistema; (f) sakupljanja pomenute treće populacije TIL dobijene iz koraka (e), pri čemu se prelaz iz koraka (e) u korak (f) dešava bez otvaranja sistema; (g) prenos pomenute sakupljene TIL populacije iz koraka (f) u infuzionu kesu, pri čemu se pomenuti prelaz iz koraka (f) u (g) dešava bez otvaranja sistema. Postupak može uključivati prvi korak (a) dobijanja tumorskog uzorka iz pacijenta, pri čemu pomenuti
12
tumorski uzorak sadrži prvu populaciju TIL. Populacija TIL može služiti za primenu iz pomenute infuzione kese u koraku (g) u terapijski efikasnoj količini.
[0448] Pre primene terapijski efikasne količine TIL ćelija u koraku (h), kod pomenutog pacijenta se može primeniti režim nemijeloablativne limfodeplecije. Populacije TIL mogu služiti za primenu kod pacijenta koji je podvrgnut režim nemijeloablativne limfodeplecije.
[0449] Režim nemijeloablativne limfodeplecije može uključivati korake primene ciklofosfamida u dozi od 60 mg/m<2>/dan tokom dva dana, praćeno primenom fludarabina u dozi od 25 mg/m2/dan tokom pet dana.
[0450] Postupak može uključivati još i korak tretiranja pomenutog pacijenta režimom visokih doza IL-2 počevši prvog dana posle primene pomenutih TIL ćelija kod pomenutog pacijenta u koraku (h). Populacija TIL može biti namenjena primeni pre režima visokih doza IL-2. Populacija TIL može biti namenjena primeni jedan dan pre početka režima visokih doza IL-2.
[0451] Režim visoke doze IL-2 može uključivati primenu 600,000 ili 720,000 IU/kg u vidu 15-minutne bolusne intravenske infuzije, na svakih osam sati, do tolerancije.
[0452] Efektorske T ćelije i/ili centralne memorijske T ćelije dobijene iz pomenute treće populacije TIL mogu ispoljavati jednu ili više karakteristika odabranih iz grupe koju čine eksprimiranje CD27+, eksprimiranje CD28+, duže telomere, povećana ekspresija CD57, i smanjena ekspresija CD56 u odnosu na efektorske T ćelije, i/ili centralne memorijske T ćelije dobijene iz pomenute druge populacije ćelija.
[0453] Efektorske T ćelije i/ili centralne memorijske T ćelije dobijene iz pomenute treće populacije TIL mogu ispoljavati povećanu ekspresiju CD57 i smanjenu ekspresiju CD56 u odnosu na efektorske T ćelije, i/ili centralne memorijske T ćelije dobijene iz pomenute druge populacije ćelija.
[0454] U ovom tekstu objavljen je i postupak ekspandiranja tumor-infiltrirajućih limfocita (TIL) koji uključuje korake (a) dodavanja obrađenih tumorskih fragmenata zatvorenom sistemu; (b) izvođenja prve ekspanzije pomenute prve populacije TIL u prvom medijumu za kulturu ćelija da bi se dobila druga populacija TIL, pri čemu prvi medijum za kulturu ćelija sadrži IL-2, pri čemu se prva ekspanzija izvodi u zatvorenom kontejneru koji obezbeđuje prvu površinu permeabilnu za gas, pri čemu se prva ekspanzija izvodi unutar prvog perioda od oko 3-14 dana da bi se dobila druga populacija TIL, pri čemu je pomenuta druga populacija TIL najmanje 50 puta brojnija od pomenute prve populacije TIL, i pri čemu se prelaz iz koraka (a) u korak (b) dešava bez otvaranja sistema; (c) ekspandiranja pomenute druge populacije TIL u drugom medijumu za kulturu ćelija, pri čemu pomenuti drugi medijum za kulturu ćelija sadrži IL-2, OKT-3, i antigen-prezentujuće ćelije, pri čemu se pomenuta ekspanzija izvodi unutar
1
drugog perioda od oko 7-14 dana da bi se dobila treća populacija TIL, pri čemu pomenuta treća populacija TIL pokazuje povećanu potpopulaciju efektorskih T ćelija i/ili centralnih memorijskih T ćelija u odnosu na drugu populaciju TIL, pri čemu se pomenuta ekspanzija izvodi u zatvorenom kontejneru koji obezbeđuje drugu površinu permeabilnu za gas, i pri čemu se prelaz iz koraka (b) u korak (c) dešava bez otvaranja sistema; (d) sakupljanja pomenute treće populacije TIL dobijene iz koraka (c), pri čemu se prelaz iz koraka (c) u korak (d) dešava bez otvaranja sistema; i (e) prenos pomenute sakupljene TIL populacije iz koraka (d) u infuzionu kesu, pri čemu se pomenuti prenos iz koraka (d) u (e) dešava bez otvaranja sistema.
[0455] Postupak može uključivati još i korak krioprezervacije infuzione kese koja sadrži sakupljenu populaciju TIL korišćenjem procesa krioprezervacije. Proces krioprezervacije može da se izvede korišćenjem sakupljene TIL populacije i CS10 medijuma u odnosu 1:1.
[0456] Antigen-prezentujuće ćelije mogu biti mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC). Antigen-prezentujuće ćelije mogu biti veštačke antigen-prezentujuće ćelije.
[0457] Sakupljanje u koraku (d) može da se izvede korišćenjem LOVO sistema za obradu ćelija.
[0458] Veći broj fragmenata može uključivati oko 50 fragmenata, pri čemu svaki fragment ima zapreminu od oko 27 mm3. Veći broj fragmenata može uključivati oko 30 do oko 60 fragmenata sa ukupnom zapreminom od oko 1300 mm3 do oko 1500 mm3. Veći broj fragmenata može uključivati oko 50 fragmenata sa ukupnom zapreminom od oko 1350 mm<3>. Veći broj fragmenata može uključivati oko 50 fragmenata sa ukupnom masom od oko 1 grama do oko 1.5 grama.
[0459] Drugi medijum za kulturu ćelija može biti obezbeđen u kontejneru odabranom iz grupe koja se sastoji od G-kontejnera i Xuri kese za ćelije.
[0460] Infuziona kesa u koraku (e) može biti infuziona kesa koja sadrži HypoThermosol.
[0461] Prvi period u koraku (b) i drugi period u koraku (c) mogu se, svaki pojedinačno, izvoditi unutar perioda od 10 dana, 11 dana, ili 12 dana. Prvi period u koraku (b) i pomenuti drugi period u koraku (c) mogu se svaki pojedinačno izvoditi unutar perioda od 11 dana.
[0462] Koraci (a) do (e) mogu se izvoditi unutar perioda od oko 25 dana do oko 30 dana. Koraci (a) do (e) mogu se izvoditi unutar perioda od oko 20 dana do oko 25 dana. Koraci (a) do (e) mogu se izvoditi unutar perioda od oko 20 dana do oko 22 dana. Koraci (a) do (e) mogu se izvoditi 22 dana ili manje. Koraci (a) do (e) i krioprezervacija mogu se izvoditi 22 dana ili manje.
1 1
[0463] Koraci (b) do (e) mogu se izvoditi u jednom zatvorenom sistemu, pri čemu izvođenje koraka (b) do (e) u jednom kontejneru rezultuje porastom prinosa TIL po resektovanom tumoru u poređenju sa izvođenjem koraka (b) do (e) u više od jednog kontejnera.
[0464] Antigen-prezentujuće ćelije mogu se dodati TIL tokom drugog perioda u koraku (c) bez otvaranja sistema.
[0465] Efektorske T ćelije i/ili centralne memorijske T ćelije dobijene iz pomenute treće populacije TIL mogu ispoljavati jednu ili više karakteristika odabranih iz grupe koju čine eksprimiranje CD27+, eksprimiranje CD28+, duže telomere, povećana ekspresija CD57, i smanjena ekspresija CD56 u odnosu na efektorske T ćelije, i/ili centralne memorijske T ćelije dobijene iz pomenute druge populacije ćelija
[0466] Efektorske T ćelije i/ili centralne memorijske T ćelije dobijene iz pomenute treće populacije TIL mogu ispoljavati povećanu ekspresiju CD57 i smanjenu ekspresiju CD56 u odnosu na efektorske T ćelije, i/ili centralne memorijske T ćelije dobijene iz pomenute druge populacije ćelija.
[0467] Rizik za kontaminaciju mikrobima može biti smanjen u poređenju sa otvorenim sistemom.
[0468] TIL i z koraka (e) mogu se uneti u pacijenta infuzijom.
[0469] Zatvoreni kontejner može podrazumevati jedan bioreaktor. Zatvoreni kontejner može podrazumevati G-REX-10. Zatvoreni kontejner može podrazumevati G-REX-100. Zatvoreni kontejner može podrazumevati G-Rex 500. Zatvoreni kontejner može podrazumevati Xuri ili Wave bioreaktorsku kesu permeabilnu za gas.
[0470] Predmetna objava obezbeđuje postupak za ekspandiranje tumor-infiltrirajućih limfocita (TIL) u terapijsku populaciju TIL, koji uključuje:
(b) dodavanje tumorskih fragmenata zatvorenom sistemu pri čemu tumorski fragmenti sadrže prvu populaciju TIL;
(c) izvođenje prve ekspanzije kultivisanjem prve populacije TIL u medijumu za ćelijsku kulturu, koji sadrži IL-2 da bu se proizvela druga populacija TIL, pri čemu se prva ekspanzija izvodi u zatvorenom kontejneru koji obezbeđuje prvu površinu permeabilnu za gas, pri čemu se prva ekspanzija izvodi tokom oko 3-14 dana da bi se dobila druga populacija TIL, pri čemu je druga populacija TIL najmanje 50 puta brojnija od prve populacije TIL, i pri čemu se prelaz iz koraka (b) u korak (c) dešava bez otvaranja sistema;
1 2
(d) izvođenje druge ekspanzije suplementacijom medijuma za kulturu ćelija druge populacije TIL dodatnim IL-2, OKT-3, i antigen-prezentujućim ćelijama (APC), da bi se proizvela treća populacija TIL, pri čemu se druga ekspanzija izvodi tokom oko 7-14 dana da bi se dobila treća populacija TIL, pri čemu je treća populacija TIL terapijska populacija TIL koja sadrži povećanu potpopulaciju efektorskih T ćelija i/ili centralnih memorijskih ćelija u odnosu na drugu populaciju TIL, pri čemu se druga ekspanzija izvodi u zatvorenom kontejneru koji obezbeđuje drugu površinu permeabilnu za gas, i pri čemu se prelaz iz koraka (c) u korak (d) dešava bez otvaranja sistema;
(e) sakupljanje terapijske populacije TIL dobijene iz koraka (d), pri čemu se prelaz iz koraka (d) u korak (e) dešava bez otvaranja sistema; i
(f) prenošenje sakupljene TIL populacije iz koraka (e) u infuzionu kesu, pri čemu se prelaz iz koraka (e) u (f) dešava bez otvaranja sistema.
[0471] Postupak može uključivati i, kao prvi korak:
(a) dobijanje prve populacije TIL iz tumora resektovanog iz pacijenta obradom uzorka tumora dobijenog od pacijenta u veći broj fragmenata tumora.
[0472] Postupak može biti postupak in vitro ili ex vivo.
[0473] Predmetna objava može obezbediti postupak za ekspandiranje tumor-infiltrirajućih limfocita (TIL) u terapijsku populaciju TIL koji uključuje:
(a) dobijanje prve populacije TIL iz tumora resektovanog iz pacijenta, obradom uzorka tumora dobijenog od pacijenta u više tumorskih fragmenata;
(b) dodavanje tumorskih fragmenata zatvorenom sistemu;
(c) izvođenje prve ekspanzije kultivisanjem prve populacije TIL u medijumu za ćelijsku kulturu koji sadrži IL-2 da bi se proizvela druga populacija TIL, pri čemu se prva ekspanzija izvodi u zatvorenom kontejneru koji obezbeđuje prvu površinu permeabilnu za gas, pri čemu se prva ekspanzija izvodi tokom oko 3-14 dana da bi se dobila druga populacija TIL, pri čemu je druga populacija TIL najmanje 50 puta brojnija od prve populacije TIL, i pri čemu se prelaz iz koraka (b) u korak (c) dešava bez otvaranja sistema;
(d) izvođenje druge ekspanzije suplementacijom medijuma za kulturu ćelija druge populacije TIL dodatnim IL-2, OKT-3, i antigen-prezentujućim ćelijama (APC), da bi se proizvela treća populacija TIL, pri čemu se druga ekspanzija izvodi tokom oko 7-14 dana da bi se dobila treća populacija TIL, pri čemu je treća populacija TIL terapijska
1
populacija TIL koja uključuje povećanu potpopulaciju efektorskih T ćelija i/ili centralnih memorijskih T ćelija u poređenju sa drugom populacijom TIL, pri čemu se druga ekspanzija izvodi u zatvorenom kontejneru koji obezbeđuje drugu površinu permeabilnu za gas, i pri čemu se prelaz iz koraka (c) u korak (d) dešava bez otvaranja sistema;
(e) sakupljanje terapijske populacije TIL dobijene iz koraka (d), pri čemu se prelaz iz koraka (d) u korak (e) dešava bez otvaranja sistema; i
(f) prenošenje sakupljene TIL populacije iz koraka (e) u infuzionu kesu, pri čemu se prelaz iz koraka (e) u (f) dešava bez otvaranja sistema.
[0474] Postupak može biti postupak in vitro ili ex vivo.
[0475] Postupak može uključivati još i korak krioprezerviranja infuzione kese koja sadrži populaciju TIL sakupljenu u koraku (f) uz korišćenje procesa krioprezervacije.
[0476] Proces krioprezervacije može da se izvede korišćenjem odnosa 1:1 sakupljene TIL populacije prema medijumu za krioprezervaciju. Medijum za krioprezervaciju može sadržati dimetilsulfoksid. Medijum za krioprezervaciju može da se bira iz grupe koju čine Cryostor CS10, HypoThermasol, ili njihova kombinacija.
[0477] Antigen-prezentujuće ćelije mogu biti mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC).
[0478] PBMC mogu biti ozračene ili alogene.
[0479] PBMC mogu da se dodaju u ćelijsku kulturu bilo kojeg od dana 9 do 14 u koraku (d).
[0480] Antigen-prezentujuće ćelije mogu biti veštačke antigen-prezentujuće ćelije.
[0481] Sakupljanje u koraku (e) može se izvesti korišćenjem LOVO sistema za obradu ćelija.
[0482] Tumorski fragmenti mogu biti brojni fragmenti i uključivati oko 4 do oko 50 fragmenata, pri čemu svaki fragment ima zapreminu od oko 27 mm<3>. Veći broj fragmenata može uključivati oko 30 do oko 60 fragmenata sa ukupnom zapreminom od oko 1300 mm<3>do oko 1500 mm3. Veći broj fragmenata može uključivati oko 50 fragmenata sa ukupnom zapreminom od oko 1350 mm3. Veći broj fragmenata može uključivati oko 50 fragmenata sa ukupnom masom od oko 1 grama do oko 1.5 grama.
[0483] Medijum za kulturu ćelija može biti obezbeđen u kontejneru odabranom iz grupe koja se sastoji od G-kontejnera i Xuri kese za ćelije.
[0484] Infuziona kesa iz koraka (f) može biti infuziona kesa koja sadrži HypoThermosol.
[0485] Prvi period u koraku (c) i drugi period u koraku (e) mogu se, svaki pojedinačno, izvoditi unutar perioda od 10 dana, 11 dana, ili 12 dana. Prvi period u koraku (c) i pomenuti drugi period u koraku (e) mogu se svaki pojedinačno izvoditi unutar perioda od 11 dana.
1 4
Koraci (a) do (f) mogu se izvoditi unutar perioda od oko 25 dana do oko 30 dana. Koraci (a) do (f) mogu se izvoditi unutar perioda od oko 20 dana do oko 25 dana. Koraci (a) do (f) mogu se izvoditi unutar perioda od oko 20 dana do oko 22 dana. Koraci (a) do (f) mogu se izvoditi 22 dana ili manje. Koraci (a) do (f) i krioprezervacija mogu se izvoditi 22 dana ili manje.
[0486] Terpijska populacija TIL sakupljena u koraku (e) može sadržati dovoljno TIL za terapijski efikasno doziranje TIL. Broj TIL dovoljan za terapijski efikasno doziranje može biti od oko 2.3 ×10<10>do oko 13.7 ×10<10>.
[0487] Koraci (b) do (e) mogu da se izvedu u jednom kontejneru, pri čemu izvođenje koraka (b) do (e) u jednom kontejneru rezultuje porastom prinosa TIL po resektovanom tumoru u poređenju sa izvođenjem koraka (b) do (e) u više od jednog kontejnera.
[0488] Antigen-prezentujuće ćelije mogu da se dodaju TIL tokom drugog perioda u koraku (d) bez otvaranja sistema.
[0489] Efektorske T ćelije i/ili centralne memorijske T ćelije u terapijskoj populaciji TIL mogu ispoljavati jednu ili više karakteristika odabranih iz grupe koju čine eksprimiranje CD27+, eksprimiranje CD28+, duže telomere, povećana ekspresija CD57, i smanjena ekspresija CD56 u odnosu na efektorske T ćelije, i/ili centralne memorijske T ćelije dobijene iz druge populacije ćelija
[0490] Efektorske T ćelije i/ili centralne memorijske T ćelije dobijene iz treće populacije TIL mogu ispoljavati povećanu ekspresiju CD57 i smanjenu ekspresiju CD56 u odnosu na efektorske T ćelije, i/ili centralne memorijske T ćelije dobijene iz pomenute druge populacije ćelija.
[0491] Rizik za kontaminaciju mikrobima može biti smanjen u poređenju sa otvorenim sistemom.
[0492] TIL i z koraka (f) mogu se unetii u pacijenta infuzijom.
[0493] Veći broj fragmenata može uključivati oko 4 fragmenta. Četiri fragmenta mogu se staviti u G-REX -100. Četiri fragmenta mogu imati dijametar od oko 0.5 cm. Četiri fragmenta mogu da se stave u G-REX -100. Četiri fragmenta mogu imati dijametar od oko 0.1 cm, 0.2 cm, 0.3 cm, 0.4 cm, 0.5 cm, 0.6 cm, 0.7 cm, 0.8 cm, 0.9 cm, ili 1 cm. Četiri fragmenta mogu imati dijametar od oko 0.1 cm, 0.2 cm, 0.3 cm, 0.4 cm, 0.5 cm, 0.6 cm, 0.7 cm, 0.8 cm, 0.9 cm, ili 1 cm i stavljaju se u G-REX -100. Četiri fragmenta mogu imati dijametar od oko 0.1 cm, 0.2 cm, 0.3 cm, 0.4 cm, 0.5 cm, 0.6 cm, 0.7 cm, 0.8 cm, 0.9 cm, ili 1 cm i mogu se staviti u kontejner sa ekvivalentnom zapreminom G-REX -100. Četiri fragmenta mogu imati dijametar od oko 0.5 cm i mogu se staviti u G-REX -100. Četiri fragmenta mogu imati
1
dijametar od oko 0.5 cm i mogu se staviti u kontejner sa ekvivalentnom zapreminom G-REX -100.
[0494] Dodatni detalji koraka (a), (b), (c), (d), (e) i (f) dati su u nastavku ovog teksta, uključujući na primer, ali ne ograničavajući se na primere izvođenja opisane pod pod naslovima "KORAK A: Dobijanje uzorka tumora od pacijenta", "KORAK B: Prva ekspanzija", "KORAK C: Prelaz iz prve ekspanzije u drugu ekspanziju", "KORAK D: Druga ekspanzija", "KORAK E: Sakupljanje TIL" i "KORAK F: Konačno formulisanje/Prenos u infuzionu kesu".
[0495] Predmetna objava obezbeđuje postupke za lečenje subjekta koji ima kancer, postupak koji obuhvata primenu ekspandiranih tumor-infiltrirajućih limfocita (TIL) uključuje:
(a) dobijanje prve populacije TIL iz tumora resektovanog iz pacijenta, obrađivanjem uzorka tumora dobijenog od pacijenta u više tumorskih fragmenata;
(b) dodavanje tumorskih fragmenata zatvorenom sistemu;
(c) izvođenje prve ekspanzije kultivisanjem prve populacije TIL u medijumu za ćelijsku kulturu koji sadrži IL-2 da bi se proizvela druga populacija TIL, pri čemu se prva ekspanzija izvodi u zatvorenom kontejneru koji obezbeđuje prvu površinu permeabilnu za gas, pri čemu se prva ekspanzija izvodi tokom oko 3-14 dana da bi se dobila druga populacija TIL, pri čemu je druga populacija TIL najmanje 50 puta brojnija od prve populacije TIL, i pri čemu se prelaz iz koraka (b) u korak (c) dešava bez otvaranja sistema;
(d) izvođenje druge ekspanzije suplementacijom medijuma za kulturu ćelija druge populacije TIL dodatnim IL-2, OKT-3, i antigen-prezentujućim ćelijama (APC), da bi se proizvela treća populacija TIL, pri čemu se druga ekspanzija izvodi tokom oko 7-14 dana da bi se dobila treća populacija TIL, pri čemu je treća populacija TIL terapijska populacija TIL, koja uključuje povećanu potpopulaciju efektorskih T ćelija i/ili centralnih memorijskih T-ćelija u odnosu na drugu populaciju TIL, pri čemu se druga ekspanzija izvodi u zatvorenom kontejneru koji obezbeđuje drugu površinu permeabilnu za gas, i pri čemu se prelaz iz koraka (c) u korak (d) dešava bez otvaranja sistema;
(e) sakupljanje terapijske populacije TIL dobijene iz koraka (d), pri čemu se prelaz iz koraka (d) u korak (e) dešava bez otvaranja sistema; i
(f) prenošenje sakupljene TIL populacije iz koraka (e) u infuzionu kesu, pri čemu se prelaz iz koraka (e) u (f) dešava bez otvaranja sistema;
1
(g) opciono krioprezerviranje infuzione kese koja sadrži sakupljenu TIL populaciju iz koraka (f) korišćenjem procesa krioprezervacije; i
(h) davanje pacijentu terapijski efikasne doze treće populacije TIL iz infuzione kese u koraku (g).
[0496] U ovom tekstu objavljena je i terapijska populacija tumor-infiltrirajućih limfocita (TIL) za upotrebu u lečenju kancera, pri čemu se populacija može dobiti postupkom koji uključuje korake:
(b) dodavanje tumorskih fragmenata zatvorenom sistemu pri čemu tumorski fragmenti sadrže prvu populaciju TIL;
(c) izvođenje prve ekspanzije kultivisanjem prve populacije TIL u medijumu za ćelijsku kulturu koji sadrži IL-2 da bi se proizvela druga populacija TIL, pri čemu se prva ekspanzija izvodi u zatvorenom kontejneru koji obezbeđuje prvu površinu permeabilnu za gas, pri čemu se prva ekspanzija izvodi tokom oko 3-14 dana da se dobije druga populacija TIL, pri čemu je druga populacija TIL najmanje 50 puta brojnija od prve populacije TIL, i pri čemu se prelaz iz koraka (b) u korak (c) dešava bez otvaranja sistema;
(d) izvođenje druge ekspanzije suplementacijom medijuma za kulturu ćelija druge populacije TIL dodatnim IL-2, OKT-3, i antigen-prezentujućim ćelijama (APC), da bi se proizvela treća populacija TIL, pri čemu se druga ekspanzija izvodi tokom oko 7-14 dana da bi se dobila treća populacija TIL, pri čemu je treća populacija TIL terapijska populacija TIL koja sadrži povećanu potpopulaciju efektorskih T ćelija i/ili centralnih memorijskih ćelija u odnosu na drugu populaciju TIL, pri čemu se druga ekspanzija izvodi u zatvorenom kontejneru koji obezbeđuje drugu površinu permeabilnu za gas, i pri čemu se prelaz iz koraka (c) u korak (d) dešava bez otvaranja sistema;
(e) sakupljanje terapijske populacije TIL dobijene iz koraka (d), pri čemu se prelaz iz koraka (d) u korak (e) dešava bez otvaranja sistema; i
(f) prenošenje sakupljene TIL populacije iz koraka (e) u infuzionu kesu, pri čemu se prelaz iz koraka (e) u (f) dešava bez otvaranja sistema; i
(g) opciono krioprezerviranje infuzione kese koja sadrži sakupljenu TIL populaciju iz koraka (f) korišćenjem procesa krioprezervacije.
[0497] Populacija se može dobiti postupkom koji kao prvi korak uključuje i:
1
(a) dobijanje prve populacije TIL iz tumora resektovanog iz pacijenta obradom uzorka tumora dobijenog od pacijenta u veći broj fragmenata tumora.
[0498] Postupak može biti postupak in vitro ili ex vivo.
[0499] Svaki od koraka (a) do (f) može uključivati jednu ili više osobina objavljenih u ovom tekstu, npr. jednu ili više osobina objavljenih pod podnaslovima "KORAK A: Dobijanje uzorka tumora od pacijenta", "KORAK B: Prva ekspanzija", "KORAK C: Prelaz iz prve ekspanzije u drugu ekspanziju", "KORAK D: Druga ekspanzija", "KORAK E: Sakupljanje TIL" i "KORAK F: Konačno formulisanje/Prenos u infuzionu kesu".
[0500] Korak (g) može uključivati jednu ili više osobina objavljenih u ovom tekstu, npr. jednu ili više osobina objavljenih pod podnaslovom "KORAK H: Opciona krioprezervacija TIL". Korak (h) uključuje jednu ili više osobina objavljenih u ovom tekstu, npr. jednu ili više osobina objavljenih pod podnaslovom "KORAK F: 1 Farmaceutske kompozicije, doziranje i režimi doziranja".
[0501] Terapijska populacija TIL sakupljena u koraku (e) može sadržati dovoljno TIL za primenu terapijski efikasne doze TIL u koraku (h).
[0502] Broj TIL dovoljan za primenu terapijski efikasne doze u koraku (h) može iznositi od oko 2.3 ×10<10>do oko 13.7 ×10<10>.
[0503] Antigen-prezentujuće ćelije (APC) mogu biti PBMC.
[0504] PBMC se mogu dodati u ćelijsku kulturu bilo kojeg od dana 9 do 14 u koraku (d).
[0505] Pre primene terapijski efikasne doze TIL ćelija u koraku (h), kod pacijenta se može primeniti režim nemijeloablativne limfodeplecije.
[0506] U ovom tekstu objavljena je i terapijska populacija tumor-infiltrirajućih limfocita (TIL) za upotrebu u lečenju kancera i u kombinaciji sa režimom nemijeloablativne limfodeplecije. Režim nemijeloablativne limfodeplecije može se primeniti pre primene terapijske populacije tumor-infiltrirajućih limfocita (TIL).
[0507] Režim nemijeloablativne limfodeplecije može uključivati korake primene ciklofosfamida u dozi od 60 mg/m<2>/dan tokom dva dana, praćeno primenom fludarabina u dozi od 25 mg/m2/dan tokom pet dana.
[0508] Može postojati korak tretiranja pacijenta režimom visoke doze IL-2 počevši prvog dana posle primene TIL ćelija kod pacijenta u koraku (h).
1
[0509] U ovom tekstu objavljena je i terapijska populacija tumor-infiltrirajućih limfocita (TIL) za upotrebu u lečenju kancera i u kombinaciji sa režimom visoke doze IL-2. Režim visoke doze IL-2 može početi prvog dana posle primene terapijske populacije TIL ćelija.
[0510] Režim visoke doze IL-2 može uključivati primenu 600,000 ili 720,000 IU/kg u vidu 15-minutne bolusne intravenske infuzije, svakih osam sati do tolerancije.
[0511] Efektorske T ćelije i/ili centralne memorijske T ćelije u terapijskoj populaciji TIL mogu ispoljavati jednu ili više karakteristika odabranih iz grupe koju čine eksprimiranje CD27+, eksprimiranje CD28+, duže telomere, povećana ekspresija CD57, i smanjena ekspresija CD56 u odnosu na efektorske T ćelije, i/ili centralne memorijske T ćelije dobijene iz druge populacije ćelija
[0512] Efektorske T ćelije i/ili centralne memorijske T ćelije u trećoj populaciji TIL mogu ispoljavati povećanu ekspresiju CD57 i smanjenu ekspresiju CD56 u odnosu na efektorske T ćelije, i/ili centralne memorijske T ćelije dobijene iz pomenute druge populacije ćelija.
[0513] Predmetna objava obezbeđuje i postupke za ekspandiranje tumor-infiltrirajućih limfocita (TIL) u terapijsku populaciju TIL koji uključuju:
(a) dodavanje obrađenih fragmenata tumora dobijenih resekcijom tumora kod pacijenta, u zatvoreni sistem da se dobije prva populacija TIL;
(b) izvođenje prve ekspanzije kultivisanjem prve populacije TIL u medijumu za kulturu ćelija, koji sadrži IL-2 da bi se proizvela druga populacija TIL, pri čemu se prva ekspanzija izvodi u zatvorenom kontejneru koji obezbeđuje prvu površinu permeabilnu za gas, pri čemu se prva ekspanzija izvodi tokom oko 3-14 dana da bi se dobila druga populacija TIL, pri čemu je druga populacija TIL najmanje 50 puta veća po brojnosti od prve populacije TIL, i pri čemu se prelaz iz koraka (a) u korak (b) dešava bez otvaranja sistema;
(c) izvođenje druge ekspanzije suplementacijom medijuma za kulturu ćelija druge populacije TIL dodatnim IL-2, OKT-3, i antigen-prezentujućim ćelijama (APC), da se proizvede treća populacija TIL, pri čemu se druga ekspanzija izvodi tokom oko 7-14 dana da bi se dobila treća populacija TIL, pri čemu je treća populacija TIL terapijska populacija TIL koja uključuje povećanu potpopulaciju efektorskih T ćelija i/ili centralnih memorijskih T ćelija u odnosu na drugu populaciju TIL, pri čemu se druga ekspanzija izvodi u zatvorenom kontejneru koji obezbeđuje drugu površinu permeabilnu za gas, i pri čemu se prelaz iz koraka (b) u korak (c) dešava bez otvaranja sistema;
(d) sakupljanje terapijske populacije TIL dobijene iz koraka (c), pri čemu se prelaz iz koraka (c) u korak (d) dešava bez otvaranja sistema; i
1
(e) prenošenje sakupljene populacije TIL dobijene iz koraka (d) u infuzionu kesu, pri čemu se prelaz iz koraka (d) u korak (e) dešava bez otvaranja sistema.
[0514] Terapijska populacija TIL sakupljenih u koraku (d) može sadržati dovoljno TIL za terapijski efikasno doziranje TIL.
[0515] Broj TIL dovoljan za terapijski efikasno doziranje može iznositi od oko 2.3 ×10<11>do oko 13.7 ×10<10>.
[0516] Postupak uključuje još i korak krioprezerviranja infuzione kese koja sadrži sakupljenu TIL populaciju, korišćenjem procesa krioprezervacije.
[0517] Proces krioprezervacije može da se izvede korišćenjem odnosa 1:1 sakupljene TIL populacije prema CS10 medijumu
[0518] ] Predmetna objava obezbeđuje postupke za lečenje subjekta koji ima kancer, postupak koji obuhvata primenu ekspandiranih tumor-infiltrirajućih limfocita (TIL) uključuje:
(a) dobijanje prve populacije TIL iz tumora resektovanog iz pacijenta, obradom uzorka tumora dobijenog od pacijenta u više tumorskih fragmenata;
(b) dodavanje tumorskih fragmenata zatvorenom sistemu;
(c) izvođenje prve ekspanzije kultivisanjem prve populacije TIL u medijumu za ćelijsku kulturu koji sadrži IL-2 da se proizvede druga populacija TIL, pri čemu se prva ekspanzija izvodi u zatvorenom kontejneru koji obezbeđuje prvu površinu permeabilnu za gas, pri čemu se prva ekspanzija izvodi tokom oko 3-14 dana da se dobije druga populacija TIL, pri čemu je druga populacija TIL najmanje 50 puta brojnija od prve populacije TIL, i pri čemu se prelaz iz koraka (b) u korak (c) dešava bez otvaranja sistema;
(d) izvođenje druge ekspanzije suplementacijom medijuma za kulturu ćelija druge populacije TIL dodatnim IL-2, OKT-3, i antigen-prezentujućim ćelijama (APC), da se proizvede treća populacija TIL, pri čemu se druga ekspanzija izvodi tokom oko 7-14 dana da se dobije treća populacija TIL, pri čemu je treća populacija TIL terapijska populacija TIL, koja uključuje povećanu potpopulaciju efektorskih T ćelija i/ili centralnih memorijskih T-ćelija u odnosu na drugu populaciju TIL, pri čemu se druga ekspanzija izvodi u zatvorenom kontejneru koji obezbeđuje drugu površinu permeabilnu za gas, i pri čemu se prelaz iz koraka (c) u korak (d) dešava bez otvaranja sistema;
(e) sakupljanje terapijske populacije TIL dobijene iz koraka (d), pri čemu se prelaz iz koraka (d) u korak (e) dešava bez otvaranja sistema; i
14
(f) prenošenje sakupljene TIL populacije iz koraka (e) u infuzionu kesu, pri čemu se prelaz iz koraka (e) u (f) dešava bez otvaranja sistema;
(g) opciono krioprezerviranje infuzione kese koja sadrži sakupljenu TIL populaciju iz koraka (f) korišćenjem procesa krioprezervacije; i
(h) primenu terapijski efikasne doze treće populacije TIL iz infuzione kese u koraku (g) kod pacijenta
pri čemu se ne vrši selekcija prve populacije TIL tokom nekog od koraka (a) do (h). U primeru, ne vrši se selekcija druge populacije TIL (pre-REP populacija) na osnovu fenotipa pre izvođenja druge ekspanzije koraka (d). U primeru, ne vrši se selekcija prve populacije TIL, druge populacije TILs, treće populacije TIL, ili sakupljene TIL populacije na osnovu ekspresije CD8 tokom bilo kojeg od koraka (a) do (h).
[0519] Predmetna objava obezbeđuje postupke za lečenje subjekta koji ima kancer, postupak koji obuhvata primenu ekspandiranih tumor-infiltrirajućih limfocita (TIL) uključuje:
(a) dobijanje prve populacije TIL iz tumora resektovanog iz pacijenta, obrađivanjem uzorka tumora dobijenog od pacijenta u više tumorskih fragmenata;
(b) dodavanje tumorskih fragmenata zatvorenom sistemu;
(c) izvođenje prve ekspanzije kultivisanjem prve populacije TIL u medijumu za ćelijsku kulturu koji sadrži IL-2 da bi se proizvela druga populacija TIL, pri čemu se prva ekspanzija izvodi u zatvorenom kontejneru koji obezbeđuje prvu površinu permeabilnu za gas, pri čemu se prva ekspanzija izvodi tokom oko 3-14 dana da bi se dobila druga populacija TIL, pri čemu je druga populacija TIL najmanje 50 puta brojnija od prve populacije TIL, i pri čemu se prelaz iz koraka (b) u korak (c) dešava bez otvaranja sistema;
(d) izvođenje druge ekspanzije suplementacijom medijuma za kulturu ćelija druge populacije TIL dodatnim IL-2, OKT-3, i antigen-prezentujućim ćelijama (APC), da bi se proizvela treća populacija TIL, pri čemu se druga ekspanzija izvodi tokom oko 7-14 dana da bi se dobila treća populacija TIL, pri čemu je treća populacija TIL terapijska populacija TIL, koja uključuje povećanu potpopulaciju efektorskih T ćelija i/ili centralnih memorijskih T-ćelija u odnosu na drugu populaciju TIL, pri čemu se druga ekspanzija izvodi u zatvorenom kontejneru koji obezbeđuje drugu površinu permeabilnu za gas, i pri čemu se prelaz iz koraka (c) u korak (d) dešava bez otvaranja sistema;
(e) sakupljanje terapijske populacije TIL dobijene iz koraka (d), pri čemu se prelaz iz koraka (d) u korak (e) dešava bez otvaranja sistema; i
(f) prenošenje sakupljene TIL populacije iz koraka (e) u infuzionu kesu, pri čemu se prelaz iz koraka (e) u (f) dešava bez otvaranja sistema;
(g) krioprezerviranje infuzione kese koja sadrži sakupljenu TIL populaciju iz koraka (f) korišćenjem procesa krioprezervacije, pri čemu proces krioprezervacije uključuje mešanje krioprezervacionog medijuma sa sakupljenom TIL populacijom;
(h) primenu terapijski efikasne doze treće populacije TIL iz infuzione kese u koraku (g) kod pacijenta pri čemu se ne vrši selekcija TIL populacije tokom nekog od koraka (a) do (h). U primeru, ne vrši se selekcija druge populacije TIL (na primer, pre-REP populacija) na osnovu fenotipa pre izvođenja druge ekspanzije koraka (d). U primeru, ne vrši se selekcija prve populacije TIL, druge populacije TIL, treće populacije TIL, ili sakupljene TIL populacije na osnovu ekspresije CD8 tokom nekog od koraka (a) do (h). U nekim primerima, režim nemijeloablativne limfodeplecije primenjuje se pre primene sakupljene TIL populacije. U nekim primerima, režim nemijeloablativne limfodeplecije uključuje korake primene ciklofosfamida u dozi od 60 mg/m2/dan tokom dva dana, što je praćeno primenom fludarabina u dozi od 25 mg/m2/dan tokom pet dana.
[0520] U nekim primerima, antigen-prezentujuće ćelije su mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC). U nekim primerima, PBMC su ozračene i alogene. U nekim primerima, PBMC se dodaju ćelijskoj kulturi bilo kojeg od dana 9 do 14 u koraku (c).
[0521] Antigen-prezentujuće ćelije mogu biti veštačke antigen-prezentujuće ćelije.
[0522] Sakupljanje u koraku (d) može da se izvede korišćenjem LOVO sistema za obradu ćelija.
[0523] Postupak može uključivati još i sakupljanje u koraku (d) putem sistema za procesovanje ćelija kao što je LOVO sistem proizveden od strane Fresenius Kabi. Izraz "LOVO sistem za obrađivanje ćelija" označava i bilo koji instrument ili uređaj koji može da pumpa rastvor koji sadrži ćelije kroz membranu ili filter kao što je obrtna membrana ili obrtni filter u sterilnom i/ili zatvorenom okruženju sistema, omogućavajući kontinuirani protok i obradu ćelija da bi se uklonio supernatant ili medijum za kulturu ćelija bez peletiranja. U nekim slučajevima, sistem za obradu ćelija može izvesti separaciju ćelija, ispiranje, razmenu tečnosti, koncentrovanje, i/ili druge korake obrade ćelija u zatvorenom, sterilnom sistemu.
[0524] Tumorski fragmenti mogu biti brojni fragmenti i uključuju oko 4 do oko 50 fragmenata, pri čemu svaki fragment ima zapreminu od oko 27 mm<3>. Veći broj fragmenata može uključivati oko 30 do oko 60 fragmenata sa ukupnom zapreminom od oko 1300 mm<3>do oko 1500 mm<3>. Veći broj fragmenata može uključivati oko 50 fragmenata sa ukupnom zapreminom od oko 1350 mm<3>. Veći broj fragmenata može uključivati oko 50 fragmenata sa ukupnom masom od oko 1 grama do oko 1.5 grama.
[0525] Veći broj fragmenata može uključivati oko 4 fragmenta. Četiri fragmenta mogu se staviti u G-REX -100. Četiri fragmenta mogu imati dijametar od oko 0.1 cm, 0.2 cm, 0.3 cm, 0.4 cm, 0.5 cm, 0.6 cm, 0.7 cm, 0.8 cm, 0.9 cm, ili 1 cm. Četiri fragmenta mogu imati dijametar od oko 0.1 cm, 0.2 cm, 0.3 cm, 0.4 cm, 0.5 cm, 0.6 cm, 0.7 cm, 0.8 cm, 0.9 cm, ili 1 cm i stavljaju se u G-REX-100. Četiri fragmenta mogu imati dijametar od oko 0.1 cm, 0.2 cm, 0.3 cm, 0.4 cm, 0.5 cm, 0.6 cm, 0.7 cm, 0.8 cm, 0.9 cm, ili 1 cm i stavljaju se u kontejner sa ekvivalentnom zapreminom G-REX-100. Četiri fragmenta mogu imati dijametar od oko 0.5 cm i mogu se staviti u G-REX-100. Četiri fragmenta mogu imati dijametar od oko 0.5 cm i mogu se staviti u kontejner sa ekvivalentnom zapreminom G-REX -100.
[0526] Medijum za kulturu ćelija može se obezbediti u kontejneru odabranom iz grupe koju čine G-kontejner i Xuri kesa za ćelije.
[0527] Infuziona kesa u koraku (e) može biti infuziona kesa koja sadrži HypoThermosol.
[0528] Prvi period u koraku (b) i drugi period u koraku (c) mogu se, svaki pojedinačno, izvoditi unutar perioda od 10 dana, 11 dana, ili 12 dana. Prvi period u koraku (b) i drugi period u koraku (c) mogu se, svaki pojedinačno, izvoditi unutar perioda od 11 dana. Koraci (a) do (e) mogu se izvoditi unutar perioda od oko 25 dana do oko 30 dana. Koraci (a) do (e) mogu se izvoditi unutar perioda od oko 20 dana do oko 25 dana. Koraci (a) do (e) mogu se izvoditi unutar perioda od oko 20 dana do oko 22 dana. Koraci (a) do (e) mogu se izvoditi 22 dana ili manje. Koraci (a) do (e) i krioprezervacija mogu se izvoditi 22 dana ili manje.
[0529] Koraci (b) do (e) mogu se izvesti u jednom kontejneru, pri čemu izvođenje koraka (b) do (e) u jednom kontejneru rezultuje porastom prinosa TIL po resektovanom tumoru u poređenju sa izvođenjem koraka (b) do (e) u više od jednog kontejnera.
[0530] Antigen-prezentujuće ćelije mogu se dodati TIL tokom drugog perioda u koraku (c) bez otvaranja sistema.
[0531] Efektorske T ćelije i/ili centralne memorijske T ćelije dobijene u terapijskoj populaciji TIL mogu ispoljavati jednu ili više karakteristika odabranih iz grupe koju čine eksprimiranje CD27+, eksprimiranje CD28+, duže telomere, povećana ekspresija CD57, i smanjena ekspresija CD56 u odnosu na efektorske T ćelije, i/ili centralne memorijske T ćelije dobijene iz druge populacije ćelija
[0532] Efektorske T ćelije i/ili centralne memorijske T ćelije dobijene u terapijskoj populaciji TIL mogu ispoljavati povećanu ekspresiju CD57 i smanjenu ekspresiju CD56 u odnosu na efektorske T ćelije, i/ili centralne memorijske T ćelije dobijene iz druge populacije ćelija.
14
[0533] Rizik za mikrobnu kontaminaciju može se smanjiti u poređenju sa otvorenim sistemom.
[0534] TIL iz koraka (e) mogu se uneti u pacijenta infuzijom.
[0535] Zatvoreni kontejner može uključivati jedan bioreaktor. U nekim primerima izvođenja, zatvoreni kontejner uključuje G-REX-10. U nekim primerima izvođenja, zatvoreni kontejner uključuje G-REX-100.
PRIMERI
[0536] Primeri izvođenja obuhvaćeni ovim tekstom opisani su uz pozivanje na primere koji slede. Ovi primeri dati su samo radi ilustrovanja i objavu obuhvaćenu ovim tekstom ne treba shvatiti kao ograničenu na ove primere, nego je treba shvatiti tako da obuhvata svaku i sve varijacije koje postaju jasne na osnovu uputstava datih u ovom tekstu.
PRIMER 1: TESTOVI ZATVORENOG SISTEMA
[0537] Kako se razmatra u ovom tekstu, razvijeni su protokoli i testovi za generisanje TIL poreklom iz pacijentovih tumora, u zatvorenom sistemu.
[0538] Ovaj Primer opisuje novu skraćenu proceduru za generisanje klinički relevantnog broja TIL iz pacijentovog resektovanog tumorskog tkiva u G-REX uređaju i krioprezervaciju finalnog ćelijskog proizvoda. Dodatni aspekti ove procedure opisani su u Primerima 2 do 8.
Definicije/Skraćenice
[0539]
BSC - Kabinet za biološku bezbednost (Biological safety cabinet)
°C - stepeni Celzijusovi
CO2- Ugljen-dioksid
CD3 - Klaster diferencijacije 3
CM1 - Kompletni medijum 1
CM2 - Kompletni medijum 2
TIWB - Pufer za ispiranje pri izolaciji tumora (Tumor isolation wash buffer) CM4 - Kompletni medijum 4
CRF - Zamrzivač sa kontrolisanom stopom hlađenja (Control rate freezer)
EtOH - etanol
GMP - Dobra proizvođačka praksa (Good manufacturing practice)
IL-2, rIL-2 -interleukin-2, rekombinantni humani interleukin-2,
IU - Internacionalna jedinica
L - Litar
LN2 - tečni azot
mL - mililitar
μl - mikrolitar
mM - milimolarno
μm - mikrometar
NA - Nije primenljivo
PBMC - Mononuklearne ćelije periferne krvi
PPE - Lična zaštitna oprema (Personal protective equipment)
Pre-REP - Inicijalne TIL kulture poreklom od tumorskih fragmenata
REP - Protokol brze ekspanzije (Rapid expansion protocol)
TIL - Tumor-infiltrirajući limfociti (Tumor infiltrating lymphocytes)
TIWB - Pufer za ispiranje pri izolaciji TIL (TIL isolation wash buffer)
SOP - Standardna radna procedura (Standard operating procedure)
Procedura
[0540]
1. Prethodna priprema: Dan 0 (Izvodi se do 36 sati unapred)
1.1 Pripremiti pufer za ispiranje pri izolaciji TIL (TIWB) suplementacijom sa 500 mL Hanksovog balansiranog slanog rastvora sa 50 μg/mL gentamicina. Za 10 mg/mL stok rastvor gentamicina preneti 2.5 mL u HBSS. Za 50 mg/mL stok rastvora preneti 0.5 mL u HBSS.
1.2. Priprema CM1 medijuma sa GlutaMax™ po LAB-005 "Uputstva za pripremu medijuma za PreREP i REP" za CM2 ". Skladištiti na 4 °C do 24 sata. Ostaviti da se zagreje na 37°C najmanje 1 sat pre upotrebe.
1.3. Uzeti alikvot(-e) IL-2 iz zamrzivača na -20°C i staviti alkivot(-e) u frižider na 2-8°C.
2. Prijem tumorskog tkiva
14
2.1. Čuvati svu dokumentaciju prispelu sa tumorskim tkivom i napraviti fotografije transportnog kontejnera i tumorskog tkiva.
2.2. Ako je obezbeđen TempTale odštampati i sačuvati pridruženi dokument; sačuvati PDF.
2.3. Uzeti uzorak tumora i sekundarni kontejner (kesa koja se zatvara na vrhu) iz posude za transport i uskladištiti na 4 °C dok ne bude spremno za obradu.
2.4. Isporučiti neiskorišćeni tumor u HypoThermasol ili kao zamrznute fragmente u CryoStor CS10 (oba se komercijalno mogu nabaviti od BioLife Solutions, Inc.).
brađivanje tumora za TIL
3.1. Aseptično preneti sledeće materijale u BSC, po potrebi, i obeležiti prema Tabeli 3 dole.
TABELA 3. Materijali za izolaciju tumora.
Obeležiti krugove posuda za fragmente tumora slovima A-J.
Obeležiti donju stranu bunarčića posuda sa pogodnim tkivom slovima A - J.
Preneti 5 mL gentamicina u HBSS bocu. Obeležiti kao TIWB.
Promešati kružnim okretanjem posude.
Pipetirati 50 mL TIWB u svaku od sledećih:
14
1. Posuda Ispiranje 1
2. Posuda Ispiranje 2
3. Posuda Ispiranje 3
4. Posuda Ispiranje 4
3.7. Pipetirati 2 mL TIWB u bunarčiće A-J posude sa pogodnim tkivom.
3.8. Prekriti posude sa pogodnim tkivom (dno ploče sa 6 bunarčića) odgovarajućom posudom za tumorske fragmente (poklopac ploče sa 6 bunarčića).
3.9. Korišćenjem duge hvataljke, izvaditi tumor(-e) iz boce sa uzorkom i preneti u posudu za Ispiranje 1.
3.10. Inkubirati tumor na ambijentalnoj temperaturi u posudi za Ispiranje 1, 3 minuta.
3.11. Dok traje inkubacija, promeniti oznaku boce za uzorak u "Bioopterećenje" i držati na 2-8 °C dok se ne dostavi Kontroli kvaliteta na testiranje.
3.12. Odložiti dugu hvataljku i za dalje manipulacije koristiti kratku hvataljku.
3.13. Hvataljkom preneti tumor u posudu za Ispiranje 2.
3.14. Inkubirati tumor na ambijentalnoj temperaturi u posudi za Ispiranje 2, 3 minuta.
3.15. Korišćenjem hvataljke preneti tumor u posudu za Ispiranje 3.
3.16. Inkubirati tumor na ambijentalnoj temperaturi u posudi za Ispiranje 3, 3 minuta.
3.17. Skloniti posude za tumorske fragmente (poklopci ploče sa 6 bunarčića) sa posuda za pogodno tkivo (dna ploče sa 6 bunarčića) i postaviti posude za tumorske fragmente naopako na radnu površinu BSC.
3.18. Koristeći pipetu za prenos, dodati približno 4 jednako razdvojene pojedinačne kapi TIWB svakom krugu posuda sa tumorskim fragmentom.
3.19. Staviti lenjir ispod posude za disekciju.
3.20. Koristeći hvataljku preneti tumor u posudu za disekciju.
3.21. Koristeći lenjir ispod posude za disekciju, meriti i beležiti dužinu tumora.
3.22. Za tumore veće od 1 cm prave se dodatne posude za pogodno tkivo.
3.23. Izvršiti inicijalno disekovanje komada tumora u 10 intermedijarnih komada i postarati se da se očuva tumorska struktura svakog intermedijarnog komada.
14
3.24. Preneti intermedijarne tumorske komade koji se trenutno ne disekuju u fragmente, u posudu za Ispiranje 4 da bi se obezbedilo da tkivo ostane hidratisano tokom čitave procedure disekovanja.
3.25. Raditi sa jednim intermedijarnim komadom tumora u jednom trenutku, u posudi za disekciju pažljivo iseći tumor do fragmenata 3x3x3 mm, uz korišćenje lenjira ispod posude, za orijentaciju. Kada se skalpel istupi zameniti ga novim.
3.26. Nastaviti sa disekovanjem fragmenata intermedijanog komada tumora dok se ne evaluira čitavo tkivo intermedijarnog komada.
3.27. Odabrati pogodne fragmente i koristeći pipetu za transfer preneti do 4 pogodna fragmenta u kapi TIWB u jednom krugu posude za tumorske fragmente.
3.28. Koristeći pipetu za transfer preneti preostale pogodne fragmente iz komada tumora, kada su raspoloživi, u odgovarajući bunarčić posude za pogodno tkivo.
3.29. Koristeći pipetu za transfer preneti što je moguće više nepogodnog tkiva i otpadnih proizvoda u posudu za nepogodno tkivo da bi se ispraznila posuda za disekovanje. Nepogodno tkivo se prepoznaje po belom masnom tkivu ili nekrotičnom tkivu.
3.30. Nastaviti obradu ponavljanjem koraka 7.3.25-7.3.30 za preostale intermediajrne tumorske komade, radeći uvek sa po jednim intermedijarnim komadom dok se ceo tumor ne obradi.
3.31. Ako su raspoloživa manje od 4 tumorska fragmenta u odgovarajućem krugu posude za tumorske fragmente, prihvatljivo je koristiti fragmente iz nekorespondirajućih bunarčića posude za pogodno tkivo, ako su raspoloživi, da bi se dostigao cilj od 40 fragmenata. Kada ima manje od 40 fragmenata, 10-40 fragmenata se stavi u izdvojeni G-Rex 100M flakon.
4. Zasejavanje G-Rex 100M flakona
4.1. Aseptično preneti sledeći materijal u BSC, po potrebi, i obeležiti prema Tabeli 4 dole.
TABELA 4. Dodatni materijali za zasejavanje flakona
4.2. Suplementisati svaki litar CM1 sa 1 mL stok rastvora IL-2 (6 × 10<6>IU/mL).
14
4.3. Staviti 1000 mL prethodno zagrejanog CM1 koji sadrži 6,000 IU/mL IL-2 u svaki potreban G-REX 100M bioreaktor kako je određeno Tabelom 5 dole.
4.4.Koristeći pipetu za transfer, preneti odgovarajući broj tumorskih fragmenata u svaki G-Rex 100M flakon, raspoređujući fragmente prema Tabeli 5.
4.5. Kada se jedan ili više tumorskih fragmenata prenese u G-Rex 100M flakon, nabaviti još jedan fragment tumora, ako je raspoloživ iz posude za pogodno tkivo i preneti ga u G-Rex 100M flakon.
4.6. Zabeležiti ukupan broj tumorskih fragmenata dodatih u svaki flakon.
4.7. Isprazniti posudu za nepovoljno tkivo.
4.8. Staviti svaki G-REX 100M bioreaktor u inkubator na 37 °C, 5 % CO2.
4.9. Kada je raspoloživo više od 40 fragmenata:
4.9.1. Kada je dobijeno >41 fragmenata, staviti 1000 mL prethodno zagrejanog kompletnog CM1 u drugi G-REX 100M bioreaktor.
TABELA 5. Broj potrebnih G-REX bioreaktora.
5. Pripremanje unapred: Dan 11 (Pripremiti do 24 sata unapred)
5.1. Pripremiti 6 L CM2 sa GlutaMax. Koristiti referentne laboratorijske procedure za "Uputstva za pripremanje medijuma za PreREP i REP" za CM2. Zagrejati na 37 °C 1 sat pre upotrebe.
5.2. Odmrznuti alikvote IL-2: Izvaditi alikvote IL-2 iz zamrzivača i staviti ih na 4 °C.
6. Sakupljanje TIL (Dan 11)
6.1. Pažljivo uzeti G-REX -100M flakone iz inkubatora i staviti ih u BSC2. Paziti da se ne poremete ćelije na dnu flakona.
6.2. Koristeći GatherRex ili peristaltičku pumpu aspirirati ∼900 mL supernatanta ćelijske kulture iz flakona.
14
6.3. Resuspendovati TIL blagim kružnim okretanjem flakona. Zapaziti da se sve ćelije sklone sa membrane.
6.4. Koristeći peristaltičku pumpu ili GatherRex preneti rezidualnu ćelijsku suspenziju u pakovanja za prenos krvi odgovarajuće veličine (300-1000 mL). Paziti da fragmenti ne pređu u pakovanje za prenos krvi.
6.5. Ubosti pakovanje za transfer korišćenjem 4" plazma-transfer seta (obezbediti da steznica bude zatvorena).
6.6. Pritiskati pakovanje da bi se osiguralo da je ćelijska suspenzija dobro promešana i koristeći špric od 3 mL, uzeti 1 mL TIL suspenzije za brojanje ćelija. Stegnuti cevi i poklopiti ženski luer-konektor novim sterilnim poklopcem za luer.
6.7. Staviti pakovanje za transfer u plastičnu kesu koja se na vrhu zatvara zipom i staviti u inkubator dok ne bude spremna za upotrebu.
emanje medijuma
7.1. Pustiti da se medijum zagreje na 37 °C > 1 h.
7.2. Dodati 3 mL 6x106 IU/mL stok rhIL-2 u 6 L CM2 da se dobije finalna koncentracija od 3,000 IU/mL rhIL-2. Obeležiti kao "kompletni CM2".
7.3. Sterilno spojiti 4" plazma-transfer set sa ženskim luerom za 1 L pakovanje za transfer.
7.4. Preneti 500 mL kompletnog CM2 u 1 L pakovanje za transfer. Otkačiti set za transfer tečnosti ili špric i prikačiti sterilni čep za luer na ženski luer-priključak.
7.5. Probosti pakovanje spojnicom za uzorkovanje.
7.6. Koristeći špric od 1.0 mL sa iglom, izvući 150 μL 1 mg/mL anti-CD3 (klon OKT3) i preneti u 500 mL "kompletnog CM2" preko spojnice za uzorkovanje. Ponovo povući špric da se osigura da je sav reagens spran iz voda. Držati na 37 °C do upotrebe.
emanje flakona
8.1. Preneti 4.5 L "kompletnog CM2" u G-REX -500M flakon korišćenjem gradacije na flakonu kao reference.
1
8.2. Staviti flakon u inkubator na 37 °C dok ne bude spreman.
rzavanje ozračenih hraniteljica
9.1. Upotrebiti 5.0 × 10<9>alogenih ozračenih hraniteljica od dva ili više donora.
9.2. Izvadii hraniteljice iz zamrzivača sa LN2 i staviti u biohazardnu transportnu kesu.
9.3. Dok su kese hraniteljica u biohazardnoj transportnoj kesi, odmrznuti hraniteljice u inkubatoru na 37 °C ili u kupatilu sa perlicama. Držati kese nepomične i potopljene. Skloniti hraniteljice iz kupatila kada se skoro potpuno otope, ali su još uvek hladne.
9.4. Poprskati ili prebrisati kese hraniteljica sa 70% EtOH i staviti u BSC2. Dodati svaku kesu hraniteljica direktno u otvoreni G-Rex 500M da se osigura dovoljan broj ozračenih ćelija (5x10<9>ćelija, /- 20%).
9.5. Zatvoriti obe steznice na fenval Y tipu konektora sa muškom luer-bravicom.
9.6. Probosti svaku kesu hraniteljica krakom Y konektora.
9.7. Uzeti pakovanje od 1 L za prenos sa 500 mL "kompletnim CM2" OKT3 i preneti u BSC.
9.8. Aseptično prikačiti špric od 60 mL za 3-kraki ventil, i aseptično prikačiti pakovanje za transfer za muški kraj ventila.
9.9. Aseptično prikačiti Y konektor za 3-kraki ventil.
9.10. Izvući sav sadržaj kese hraniteljica u špric, zabeležiti zapreminu, i dispendovati 5.0 × 10<9>alogenih ozračenih hraniteljica u pakovanje za transfer.
9.11. Zatvoriti steznicu i otkačiti pakovanje za transfer od aparata, i zatvoriti žensku luer-bravicu novim sterilnim zatvaračem za luer.
9.12. Koristeći iglu i špric od 3 mL izvući 1 mL za brojanje ćelija iz spojnice za uzorkovanje.
9.13. Kada se dostigne /- 10% ciljnog broja ćelija (5.0 × 10<9>) sa >70% vijabilnosti, nastaviti.
1 1
9.14. Kada se dostigne manje od 90% ciljnog broja ćelija (5.0 × 10<9>) sa >70% vijabilnosti, odmrznuti sledeću kesu i ponoviti 7.9.4-7.9.12. Kada se dostigne više od 110% ciljnog broja ćelija, izračunati odgovarajuću zapreminu potrebnu za željenu dozu ćelija i nastaviti.
10. Kokultivisanje TIL i hraniteljica u G-REX 500M flakonu
10.1. Uzeti G-REX 500M flakon sa pripremljenim medijumom iz inkubatora i staviti u BSC2.
10.2. Prikačiti pakovanje hraniteljica za transfer za G-REX -500M i pustiti da se sadržaj kese prelije u 500M.
10.3. Izvaditi TIL suspenziju iz inkubatora i staviti je u BSC.
10.4. Izračunati zapreminu suspenzije TIL koju treba dodati da se dostigne 200 × 10<6>ukupnih vijabilnih ćelija.
(TVC/mL) /200 x 106 = mL
10.5. Kada su TIL između 5-200 × 10<6>ukupnih vijabilnih ćelija, dodati sve TIL (ukupnu zapreminu) u G-REX -500M. Kada broj TIL bude veći od 200 × 10<6>ukupnih vijabilnih ćelija, dodati izračunatu zapreminu potrebnu da se 200 × 10<6>TIL distribuira u pojedinačni G-REX -500M. Preostali TIL se obore i zamrznu u najmanje dve kriofiole pri ne više od 10<8>/mL u CS10, obeleže TIL-identifikacijom i datumom zamrzavanja.
10.6. Staviti G-REX -500M u inkubator na 37°C, 5% CO2, 5 dana.
11. Pripremanje unapred: Dan 16-18
11.1. "Zagrejano 1" - 10 L kesa AIM V za kulture inicirane sa manje od 50 × 10° TIL "zagrejano 2" - za one inicirane sa više od 50 × 10° TIL na 37 °C najmanje 1 h ili dok ne budu spremni za upotrebu.
12. Brojanje TIL ćelija: Dan 16-18
12.1. Izvaditi G-REX-500M flakon iz inkubatora i staviti ga u BSC2. Paziti da se ne poremeti ćelijska kultura na dnu flakona.
1 2
12.2. Aseptično ukloniti 4 L medijuma za kulturu ćelija iz G-REX-500M flakona i staviti u sterilni kontejner.
12.3. Kružnim pokretima mešati G-REX -500M dok se svi TIL ne resuspenduju sa membrane.
12.4. Koristeći GatherRex ili peristaltičku pumpu preneti ćelijsku suspenziju u 2 L pakovanje za transfer. Zadržati 500M flakon za kasniju upotrebu. Zatvoriti priključak spojnicom za uzorkovanje da bi se izbegao gubitak TIL.
12.5. Probosti pakovanje za transfer spojnicom za uzorkovanje i koristeći špric od 3 mL i iglu uzeti 2 ×1 mL nezavisnih uzoraka za brojanje ćelija.
12.6. Izračunati ukupan broj flakona potrebnih za potkulturu prema sledećoj formuli. Zaokružiti decimalne brojeve.
Ukupno vijabilnih ćelija /1.0 x10<9>= # flakona
remanje CM4
13.1. Pripremiti 10 L kesu AIM-V za svaka dva potrebna 500M flakona. Zagrejati dodatni medijum po potrebi.
13.2. Za svakih potrebnih 10 L AIM-V, dodati 100 mL GlutaMAX da se napravi CM4.
13.3. Suplementisati CM4 medijum sa rhIL-2 do finalne koncentracije od 3,000 IU/mL rhIL-2.
deljivanje ćelijske kulture
14.1. Koristeći graduisanost flakona, napuniti svaki G-REX-500M do 5 L.
14.2. Jednako rasporediti zapreminu TIL u izračunati broj G-REX-500M.
14.3. Staviti flakone u inkubator na 37 °C, 5% CO2do sakupljanja na Dan 22 REP.
remanje unapred: Dan 22-24
15.1. Pripremiti 2 L 1% HSA pufera za ispiranje dodavanjem 40 mL 25% HSA u svaku od dve 1 L kese PlasmaLyte A
1
7.4. Spojiti u LOVO pomoćnoj kesi.
15.2. Suplementisati 200 mL CS10 sa IL-2 pri 600 IU/mL.
15.3. Četiri aluminijumska kanistera za zamrzavanje od 750 mL pripremiti hlađenjem na 4 °C.
upljanje TIL: Dan 22-24
16.1. Izvaditi G-REX-500M flakone iz inkubatora na 37 °C i staviti ih u BSC2. Paziti da se ne poremeti ćelijska kultura na dnu flakona.
16.2. Aspirirati i odbaciti 4.5 L supernatanta ćelijske kulture iz svakog flakona.
16.3. Kružnim pokretima mešati G-REX -500M flakon da se potpuno resuspenduju TIL.
16.4. Izmeriti bioprocesnu kesu od 3-5 L pre upotrebe.
16.5. Koristeći GatherRex ili peristaltičku pumpu, sakupiti TIL u bioprocesnu kesu.
16.6. Dobro promešati kesu i koristeći špric od 3 mL uzeti uzorke 2 ×2 mL iz priključka za uzorkovanje špricem, za brojanje ćelija.
16.7. Izmeriti kesu i naći razliku između početne i finalne težine. Upotrebiti sledeću računicu za određivanje zapremine ćelijske suspenzije.
Neto težina ćelijske suspenzije (mL) /1.03 = zapremina (mL)
rirati TIL i pripremiti LOVO izvornu kesu (LOVO Source bag)
17.1. Staviti kesu sa ćelijskom kulturom u BSC2.
17.2. Staviti 170 μm-ski krvni filter u BSC2 i zatvoriti sve steznice.
17.3. Sterilno spojiti izvorni krak filtera sa ćelijskom suspenzijom.
17.4. Izmeriti novu bioprocesnu kesu odgovarajuće veličine (ovo se označava kao LOVO izvorna kesa).
17.5. Sterilno spojiti terminalni deo filtera sa the LOVO izvornom kesom.
1 4
17.6. Podići ćelijsku suspenziju vešanjem ćelija na IV stalak da se uspostavi transfer ćelija protokom u skladu sa gravitacijom.
Napomena: (Nije dozvoljeno da kesa izvora visi sa filtracionog aparata.)
17.7. Otvoriti sve potrebne steznice i pustiti da se TIL izlivaju iz kese sa ćelijskom suspenzijom kroz filter u LOVO kesu izvora.
17.8. Kada sve ćelije pređu u LOVO izvornu kesu, zatvoriti sve steznice i zatvoriti cevi LOVO izvorne kese da bi se uklonio filter.
17.9. Izmeriti LOVO izvornu kesu i izračunati zapreminu.
17.10. LOVO izvorna kesa spremna je za LOVO.
17.11. Uzeti LOVO kesu za finalni proizvod iz kita za jednokratnu upotrebu zaptivanjem voda u blizini kese.
18. Formulisanje, u odnosu 1:1, TIL u hladnom CS10 suplementisanom sa 600 IU/mL rhIL-2
18.1. Izračunati traženi broj potrebnih kriokesa.
(zapremina ćelijskog proizvoda x 2)/100 = broj potrebnih kesa (zaokružen)
18.2. Izračunati zapreminu za dispendovanje u svakoj kesi.
(zapremina ćelijskog proizvoda x 2) / broj potrebnih kesa = zapremina koju treba dodati u svaku kesu
18.3. Aseptično preneti sledeće materijale iz Tabele 6 u BSC.
TABELA 6. Materijali za TIL krioprezervaciju
1
19. TIL formulacija
19.1. Zatvoriti sve steznice na Cell Connect CC1.
19.2. Na "cell connect" uređaj aseptično prikačiti LOVO finalni proizvod, luer-bravicu CS10 kese i odgovarajući broj kriokesa. Špric od 60 mL zameniti špricem od 100 mL.
19.3. Potrebna zapremina CS10 ekvivalentna je zapremini LOVO kese za finalni proizvod.
19.4. Otvoriti ventil i otpustiti steznicu na vodu između LOVO kese za finalni proizvod i šprica da se CS10 izvuče u špric, ponovo stegnuti CS10 vod. Otpustiti steznicu ka ćelijskoj kesi da bi se CS10 potisnuo u LOVO kesu za finalni proizvod. Upotrebiti špric za merenje zapremine dodate u LOVO kesu za finalni proizvod. Ponoviti po potrebi uz korišćenje novog šprica dok se ne prenese željena količina CS10.
19.5. Obrtanjem mešati LOVO kesu sa finalnim prizvodom.
19.6. Skloniti špric od 100 mL
19.7. Otvoriti steznice na kriokesama od 750 mL, jednu u jednom trenutku
19.8. Otvoriti samo steznice koje su direktno povezane sa formulisanim proizvodom i kriokesama u upotrebi.
19.9. Upotrebiti špric od 100 mL za merenje zapremine formulisanog proizvoda koja vodi do kriokese.
19.10. Preneti 100 mL formulisanog proizvoda u svaku kriokesu.
19.11. Posle dodavanja u svaku kesu povući špric da se uklone mehurići vazduha iz kriokesa i ponovo zatvoriti steznice na pridruženom vodu.
19.12. Na finalnoj kesi izvući 10 mL i zadržati za testiranje QC.
1
19.13. Zatopiti svaku kriokesu, ostaviti što je manje moguće cevi.
19.14. Uzeti špric koji sadrži zadržani uzorkom i preneti u 50 mL konusnu epruvetu; preneti 1.5ml u pojedinačne kriofiole i zamrznuti u zamrzivaču sa kontrolisanom stopom hlađenja.
19.15. Preneti zatopljene kese na 4 °C dok se pripremaju oznake.
19.16. Obeležiti svaku kriokesu opisom proizvoda, imenom i datumom, zapreminom, brojem ćelija, i vijabilnošću.
19.17. Staviti svaku kriokesu u prethodno ohlađeni aluminijumski kanister za zamrzavanje.
20. Krioprezervacija TIL korišćenjem zamrzivača sa kontrolisanom stopom hlađenja (CRF)
20.1. Pratiti standardnu proceduru za upotrebu zamrzivača sa kontrolisanom stopom hlađenja.
20.2. Posle korišećnja CRF, uskladištiti kriokese u tečnom azotu (LN2).
21. Odrediti očekivane rezultate i meriti kriterijume prihvatljivosti.
PRIMER 2: IZVOĐENJE PROCESA NA TUMORIMA 8 PACIJENATA
[0541] Proces iz Primera 1 izveden je korišćenjem tumora 8 pacijenata da bi se proizvelo 8 serija TIL. Dobar oporavak iz kulture, vijabilnost, broj ćelija, CD3<+>(ukazuje na % sadržaj T ćelija) i oslobađanje IFN-gama (IFN-g ili IFN-γ) dobijeni su kako je pokazano u Tabeli 7 u nastavku i na Slikama 7 do 10.
TABELA 7. Rezultati testiranja identičnosti, potencije, i vijabilnosti/oporavka za proces iz Primera 1.
1
PRIMER 3: PRILAGODLJIVOST MODIFIKOVANOG TIL PROCESA
[0542] Ovde predstavljene studije izvedene su u laboratoriji za razvoj procesa (process development, PD), a zatim je izvedena studija kvalifikacije procesa (process qualification, PQ) u kojoij su korišćeni inženjerisani ciklusi, u GMP odeljenju sa čistom sobom pri proizvodnom objektu. Tri PQ/inženjerijska ciklusa obavljena su u čistoj sobi GMP objekta, prema protokolu za kvalifikaciju, i ovde su prikazani podaci za serije bazirani na PD studijama. Kriterijumi prihvatljivosti za inženjerijske cikluse postavljeni su prospektivno. PQ studija je dodatno sumirana u nastavku, i rezultati testova dobijeni za inženjerijske serije dati su u odeljcima koji slede.
[0543] Broj ćelija nastalih iz kultura protokola pre-brze ekspanzije (pre-REP) često prevazilaze 100 × 10<6>vijabilnih ćelija. Pored toga, uključivanje ciklusa zamrzavanjaodmrzavanja između Pre-REP i REP koraka kulture smanjuje prinos vijabilnih ćelija. Eliminisanjem koraka krioprezervacije u toku procesa, REP bi se mogao pouzdano i regularno inicirati povećanim brojem TIL. Ova promena dopušta da se srazmernim skraćenjem vremena udvostručavanja ćelija, trajanje REP smanji na otprilike 11 dana, a da to ne utiče na dozu ćelija. Pored toga, skraćeno vreme kulture od aktivacije do sakupljanja rezultuje proizvodom koji je manje diferenciran i potencijalno sposobniji da opsatene in-vivo (Tran 2008).
[0544] PD studija validira inicijaciju REP kulture sa do 200 × 10<6>ćelija uz fiksiran broj ćelija-hraniteljica. Optimalno vreme do sakupljanja REP kulture je tada evaluirano tokom 9 do 14 dana. Kulture su zasejane pri odnosu hraniteljica prema TIL u opsegu od 100:1 do 25:1. Optimizacija vremena sakupljanja određena je merenjem ukupnog broja ćelija, vijabilnosti, imunofenotipa, konzumiranja medijuma, analizom metabolita, analizom interleukina-2 (IL-2) i funkcionalnim analizama, kako je opisano u nastavku ovog teksta.
[0545] Imunofenotipizacija ćelija na kraju REP kulture evaluirana je na osnovu markera navedenih u Tabeli 8 u nastavku. Evaluiraju se fenotipska aktivacija i stanje diferencijacije ćelija. Nisu zapažene statistički značajne razlike u fenotipu između eksperimentalnih uslova.
1
TABELA 8. Markeri aktivacije i diferencijacije testirani na kulturama optimizacije procesa
1
[0546] Konzumiranje medijuma i proizvodnja metabolita ostaju unutar granica toleranicje za sve testirane uslove; i nivoi IL-2 ostali su viši od 150 IU/mL supernatanta kulture (podaci nisu prikazani).
[0547] Pozanto je da je ubijanje tumorskih ćelija T-ćelijama posredovano aktivacijom T-ćelijskog receptora na efektorskoj T ćeliji u odgovoru na peptide prezentovane na površini tumorskih ćelija. Ex vivo ekspandirane T-ćelije moraju zadržati sposobnost da budu aktivirane u odgovoru na aktivaciju TCR ako perzistiraju in vivo posle infuzije i posreduju u regresiji tumora.
[0548] Da bi se procenio aktivacioni potencijal kultivisanih ćelija, TIL sakupljeni u različitim vremenskim tačkama reaktiviraju se ozračenim alogenim PBMC koje nose OKT3. TIL kulture se sakupljaju posle 7 dana i testira se koliko puta su se ekspandirale. Rezultati ove studije sumirani su u TABELI 9.
TABELA 9. Zbirni rezultati: Proliferacija post-REP TIL posle rekultivisanja sa alogenim PBMC koje nose OKT3.
1
[0549] Ova studija pokazala je da se potencijal TIL da budu aktivirani u ovom testu povećava sa svakim danom kulture do Dana 11 (dani sakupljanja 9-11). Ćelije sakupljene na Dan 11 modifikovanog procesa ponašaju se slično kontrolnim TIL održavanim u kulturi 14 dana, slično sadašnjem procesu.
[0550] Ove studije pokazale su prilagodljivost modifikovanog TIL procesa i utvrdile prihvatljivi opseg odnosa pri zasejavanju TIL i ćelija-hraniteljicama. Pored toga, nađeno je da karakteristike rasta perzistiraju do Dana 14 kulture, dok uslovi kulture ostaju optimalni do Dana 11. Testirani uslovi nisu pokazali merljivi efekat na fenotip TIL. Ćelije sakupljene na Dan 11 REP kulture pokazale su najbolju sposobnost da odgovore na reaktivaciju dok uslovi ćelijske kulture ostaju unutar tolerancije. Ove promene su usvojene i validirane u punoj razmeri, pri čemu je razdeljivanje kulture vršeno na Dan 5 i sakupljanje na Dan 11.
[0551] Inženjerijski ciklusi implementirani su u objektu za razvoj procesa da bi se steklo iskustvo u proizvodnji i testiranju TIL proizvoda pre GMP proizvodnje autolognog TIL proizvoda za primenu kod pacijenata. Proizvodne procedure korišćene za inženjerijske cikluse bile su u istim razmerama kao one koje će se koristiti u proizvodnji GMP TIL proizvoda. Iskustvo u gajenju TIL iz različitih tipova tumora uključujući metastaze melanoma, dojke, karcinoma skvamoznih ćelija glave i vrata (HNSCC), karcinoma cerviksa, i kancera pluća odredilo je da su disekovanje i rast TIL iz uzoraka metastatskih tumora slični za ove kancere (Sethuraman 2016, JITC P42). Zbog toga što su inicijalna izolacija tumorskih fragmenata i rast limfocita izgleda slični za različite histološke tipove tumora, ovi inženjerijski ciklusi su dovoljni za kvalifikovanje procesa proizvodnje TIL iz HNSCC, cervikalnog tumora i melanoma.
[0552] Tabela 10 prikazuje izvor i karakteristike tumorskih uzoraka upotrebljenih za inženjerijske cikluse.
TABELA 10. Tumorski uzorci testirani u inženjerijskim ciklusima
1 1
[0553] Testiranje oslobađanja tri inženjerijska cikulsa TIL u objektu za razvoj procesa obavljeno je (Tabela 11) kako je opisano u nastavku. Proizvod je testiran na Dan 16 i Dan 22. Sekrecija IFN-γ je takođe određena za tri inženjerijska ciklusa (Tabela 12) kako je detaljno opisano na drugom mestu.
TABELA 11. Rezultati testiranja oslobađanja proizvoda za inženjerijske cikluse pri objektu za razvoj procesa.
1 2
TABELA 12. Dodatna funkcionalna karakterizacija: Merenje sekrecije IFN-γ
[0554] U zaključku, podaci za inženjerijske cikluse pokazuju da TIL lekoviti proizvod može da se proizvede u svrhu autologne primene kod pacijenta.
PRIMER 4: LIMFODEPLECIJA
[0555] Ćelije mogu da se broje na dan 7 i pre limfodeplecije. Finalni ćelijski proizvod uključuje do približno150 × 10<9>vijabilnih ćelija formulisanih u najmanje 50% HypoThermosol™ u Plasma-Lyte A™ (zapremina/zapremina) i do 0.5% HSA (kompatibilno sa infuzijom za ljude) sa 300 IU/mL IL2. Finalni proizvod je na raspolaganju za primenu u jednoj od dve zapremine za infuziju:
1) 250 mL (u infuzionoj kesi kapaciteta 300 mL) kada je ukupan broj sakupljenih TIL ≤ 75 × 10<9>
ILI
1
2) 500 mL (u infuzionoj kesi kapaciteta 600 mL) kada je ukupan broj sakupljenih TIL < 150 × 10<9>
[0556] Ukupan broj ćelija koje se mogu generisati za TIL infuzioni proizvod za svakog pacijenta ne može se predvideti zbog varijacija među pacijentima u stopi ekspanzije T-ćelija tokom REP koraka. Donja granica ćelija na dan 3, 4, 5, 6, 7 3- do 14-dnevnog REP postavljena je na osnovu minimalnog broja potrebnih ćelija sa ciljem donošenja odluke o limfodepleciji kod pacijenta korišćenjem terapijskog režima hemioterapije ciklofosfamidom i fludarabinom. Kada smo otpočeli sa limfodeplecijom na osnovu tog minimalnog postignutog broja ćelija, opredelili smo se da lečimo pacijenta raspoloživim brojem TIL koji smo generisali u REP do bilo kojeg od dana 3 do 14, i u mnogim slučajevima dana 7. Gornja granica opsega za infuziju (150 × 10<9>vijabilnih ćelija) bazirana je na poznatim objavljenim podacima o gornjoj granici za bezbednu infuziju uz postizanje kliničkog odgovora. Radvanyi, et al., Clin Cancer Res 2012, 18, 6758-6770.
PRIMER 5: PROCES 2A - DAN 0
[0557] Ovaj primer detaljno opisuje dan 0 protokola za proces 2A opisan u Primerima 1 do 4.
[0558] Priprema.
1. Potvrditi da su medijum za ispiranje tumora, CM1, i IL-2 unutar roka trajanja.
2. Staviti CM1 (ćelijski medijum 1) u inkubator.
[0559] Postupak.
1. Očistiti kabinet za biološku bezbednost (BSC).
2. Postaviti ploče za nadzor procesa i ostaviti ih u kabinetu za biobezbednost 1-2 sata tokom procedure.
3. Staviti TIL medijum CMl u kabinet za biološku bezbednost.
4. Pripremiti TIL medijum CM1 koji sadrži 6000 IU/mL IL-2:
4.1. 1 L CM1
4.2. 1 ml IL-2 (6,000,000 IU/mL)
4.3. Staviti 25 ml CM1+IL2 u 50 ml konusne epruvete koje će se koristiti za fragmente kada se dodaju u G-REX .
4.4. Staviti u inkubator na 37 °C na prethodno zagrevanje
1 4
5. Obrisati G-REX 100MCS pakovanje 70% alkoholom i staviti ga u kabinet za biobezbednost. Zatvoriti sve steznice osim filterskog voda.
6. Kalibrisati Acacia pumpu.
7. Prikačiti crveni vod G-REX 100MCS flakona za izlaznu liniju uvodnice Acacia pumpe.
8. Prikačiti "pumpmatic" pipetu za ulazni vod uvodnice pumpe i staviti u bocu sa medijumom. Osloboditi steznice ka uvodnici pumpe.
9. Pumpati preostalih 975 ml prethodno zagrejanog CM1 koji sadrži 6,000 IU/ml IL-2 u svaki G-REX 100MCS bioreaktor.
10. Toplotom zatopiti crveni vod, odvojiti od uvodnice pumpe.
11. Staviti oznaku na G-REX .
12. Staviti G-REX 100MCS u inkubator do korišćenja.
Disekcija tkiva
[0560]
1. Zabeležiti vreme početka obrade tumora.
2. Preneti medijum za ispiranje tumora u BSC.
3. Staviti 5100 mm Petrijevih posuda u kabinet za biobezbednost, 3 za ispiranje, 1 za držanje i 1 za nepogodno tkivo. U skladu sa tim označiti posude. Nepogodno tkivo se prepoznaje po žutom masnom tkivu ili nekrotičnom tkivu.
4. Staviti tri ploče sa 6 bunarčića u biobezbednosni kabinet.
5. Pipetirati 3-5 mL medijuma za ispiranje tumora u svaki bunarčić jedne ploče sa šest bunarčića za višak tumorskih komada.
6. Pipetirati 50 mL medijuma za ispiranje tumora u posude za ispiranje 1-3 i posudu za držanje.
7. Staviti dve 150 mm posude za disekciju u biobezbednosni kabinet.
8. Staviti 3 sterilne 50 mL konusne epruvete u BSC.
9. Obeležiti jednu kao medijum za ispiranje tumora za hvataljku, drugu kao medijum za ispiranje tumora za skalpel i treću kao medijum za ispiranje tumora koji se koristi za kapi na poklopcu.
10. Dodati 5-20 mL medijuma za ispiranje tumora u svaku konusnu epruvetu. Hvataljke i skalpele uranjati u medijum za ispiranje tumora po potrebi tokom ispiranja tumora i procesa disekovanja.
1
11. Staviti skapel i hvataljku u odgovarajuće epruvete.
12. Koristeći duge hvataljke uzeti tumor(-e) iz boce za uzorke i preneti u posudu za Ispiranje 1.
13. Inkubirati tumor na ambijentalnoj temperaturi u posudi za Ispiranje 1 ≥3 minuta.
14. Tokom inkubacije, ponovo obeležiti bocu za uzorak sa "Biološko opterećenje" i držati na 2-8 °C do finalnog sakupljanja ili dodatnog testiranja sterilnosti ako je potrebno.
15. Koristeći hvataljku preneti tumor u posudu za Ispiranje 2.
16. Inkubirati tumor na ambijentalnoj temperaturi u posudi za Ispiranje 2 ≥3 minuta.
17. Tokom inkuibacije, koristeći pipetu za transfer, staviti približno 4 jednako razmaknute kapi medijuma za ispiranje tumora na svaki krug poklopaca ploče sa 6 bunarčića označene kao posude za tumorske fragmente.
18. Koristeći hvataljku preneti tumor u posudu za Ispiranje 3.
19. Inkubirati tumor na ambijentalnoj temperaturi u posudi za Ispiranje 3 ≥3 minuta.
20. Poklopac 150 mm posude koristiti za disekciju. Ispod staviti lenjir.
21. Koristeći hvataljku preneti tumor u posudu za disekciju, izmeriti i zabeležiti dužinu tumora.
22. Fotografisati tumor.
23. Izvesti početnu disekciju tumorskih komada u posudi za disekciju u intermedijarne komade vodeći računa o očuvanju tumorske strukture svakog intermedijarnog komada.
24. Preneti intermedijarne komade tumora koji se trenutno ne disekuju u fragmente, u posudu za držanje tkiva da bi se obezbedilo da tkivo ostane hidratisano tokom čitave procedure disekovanja.
25. Raditi sa jednim po jednim komadom tumora, pažljivo seći tumor u fragmente dimenzija približno 33 ×33 mm u posudi za disekciju, koristeći lenjir ispod posude za orijentaciju
26. Nastaviti sa disekovanjem fragmenata iz intermedijarnog komada tumora dok se ne avalira svo tkivo intermedijarnog komada.
27. Odabrati pogodne fragmente i koristeći pipetu za transfer preneti do 4 pogodna fragmenta u kapi medijuma za ispiranje u jednom krugu posude za fragmente tumora. koristeći pipetu za transfer, skalpel ili hvataljku, preneti što je moguće više nepogodnog tkiva i otpadnog materijala u posudu za nepogodno tkivo da bi se očistila posuda za disekciju. Svo preostalo tkivo staviti u jedan od bunarčića ploče sa šest
1
bunarčića. (Nepogodno tkivo se prepoznaje po žutom masnom tkivu ili nekrotičnom tkivu.)
28. Nastaviti obrade ponavljanjem koraka 23-26 za preostale intermedijarne komade tumora, radeći sa jednim po jednim intermedijarnim komadom dok se ne obradi ceo tumor. (Uzimati novi skalpel ili hvataljku po potrebi, po odluci tehničara za obradu.) 29. Pomeriti ploče sa fragmentima ka zadnjem delu digestora.
30. Koristeći pipetu za transfer, skalpel ili hvataljku, preneti do 50 najboljih tumorskih fragmenata u 50 mL konusnu epruvetu obeleženu kao tumorski fragmenti, sa CM1. 31. Ukloniti plutajuće fragmente iz 50 mL konusne epruvete pipetom za transfer. Zabeležiti broj fragmenata i onih koji plutaju.
32. Skloniti svu nepotrebnu opremu iz digestora, zadržati ploče sa pogodnim tkivom ako sadrže dodatne fragmente. Obrisati digestor alkoholom.
33. Izvaditi G-REX 100MCS iz inkubatora, obrisati 70% alkoholom i staviti u biobezbednostni kabinet.
34. Promešati kružnim pokretima konusnu epruvetu sa tumorskim fragmentima i preliti sadržaj 50 mL konusne epruvete u G-Rex 100MCS flakon
35. Ako jedan ili više tumorskih fragmenata prenetih u G-Rex 100M flakon pluta, uzeti jedan dodatni tumorski fragment kada je raspoloživ iz posude sa pogodnim tkivom i preneti u G-Rex 100M flakon.
36. Zabeležiti # inkubatora i ukupan broj fragmenata dodatih u svaki flakon.
37. Staviti G-REX 100M bioreaktor u inkubator na in 37 °C, 5% CO2
38. Neiskorišćeni tumor staviti u 100 mL HypoThermosol i dostaviti laboratoriji. 39. Zabeležiti vreme zaustavljanja obrade tumora.
40. Odbaciti neupotrebljeni TIL kompletni medijum sa IL-2 i neupotrebljene alikvote IL-2.
41. Očistiti kabinet za biološku bezbednost.
42. Staviti uzorak "Biološko opterećenje" u odgovarajuće uslove skladištenja.
43. Zabeležiti podatke.
44. Sačuvati sliku kao dokument ID # uzorka datum obrade tumora u pripremljenom pacijentovom dokumentu (fajlu).
45. Naručiti i obezbediti dostavljanje taložnih ploča u mikrobiološku laboratoriju.
PRIMER 6: PROCES 2A - DAN 11
1
[0561] Ovaj primer detaljno opisuje protokol dana 11 za proces 2A opisan u Primerima 1 do 4.
[0562] Pripremanje unapred.
1. Dan pre obrade:
1.1. CM2 može da se pripremi dan pre obrade. Staviti na 4°C.
2. Dan obrade.
2.1. Pripremiti opremu za ćelije-hraniteljice.
2.1.1. Zatvoriti sve steznice na CC2 i 4S-4M60 setovima konektora.
2.1.2. Sterilno spojiti 4 šiljaka 4S-4M60 opreme sa vodom za šiljak na CC2 uklanjajući šiljak.
2.1.3. Ostaviti na stranu za spajanje ćelija-hraniteljica.
2.2. Pripremiti 5 mL medijuma za krioprezervaciju po CTF-FORM-318 i staviti na 4°C do upotrebe.
Monitoring čiste sobe - prethodi obradi
[0563]
1. Zabeležiti informacije o čistoj sobi.
2. Biobezbednosni kabineti (BSC) se čiste velikim, alkoholom natopljenim ubrusima ili alkoholnim sprejom.
3. Verifikovati brojač čestica 10 minuta pre početka obrade.
4. Postaviti ploče za nadgledanje procesa i ostaviti ih u biobezbednosnom kabinetu 1-2 sata tokom procedure.
[0564] Pripremanje G-Rex 500MCS flakona:
1. Koristeći špric od 10 mL aseptično preneti 0.5 mL IL-2 (stok je 6 × 10<6>IU/mL) za svaki litar CM2 (ćelijski medijum 2) u bioprocesnu kesu kroz nekorišćeni sterilni ženski luer-konektor.
2. Upotrebiti višak vazduha u špricu za čišćenje voda, izvući malo medijuma iz kese i ušpricati nazad. Ovo osigurava da se sav IL-2 dobro pomeša sa medijumom. Dobro izmešati.
3. Otvoriti spoljašnje pakovanje i staviti G-Rex 500MCS u BSC. Zatvoriti sve steznice na uređaju osim velikog voda za filter.
1
4. Sterino spojiti crveni sakupljajući vod iz G-Rex 500MCS sa izlaznim vodom cevi pumpe.
5. Spojiti ženski luer bioprocesne kese sa muškim luerom uvodnice pumpe.
6. Okačiti bioprocesnu kesu na IV stalak, otvoriti steznice i pumpati 4.5 litara CM2 medijuma u GRex 500MCS. Isprazniti vod, zatvoriti steznicu i zaptiti toplotom.
7. Zadržati vod od pumpe do medijuma. Koristiće se u pripremanju ćelija-hraniteljica.
8. Staviti G-Rex 500MCS u inkubator.
Pripremanje ozračenih ćelija-hraniteljica
[0565]
1. Zatopiti i ukloniti šiljak(-ke) sa IL TP. Zatvoriti steznice na oba voda.
2. Zabeležiti suvu težinu jednolitarskog paketa za transfer (transfer pack, TP).
3. Sterilno spojiti jednolitarski paket za transfer sa uvodnicom "Acacia" pumpe -12" od kese.
4. Drugi kraj cevi pumpe i dalje je povezan sa desetolitarskim labtejnerom.
5. Pumpati 500 mL CM2 po težini u TP.
6. Zatvoriti steznicu i zatopiti blizu spojnog zgloba.
7. Staviti u inkubator.
8. Verifikovati i odjaviti kese sa ćelijama-hraniteljicama.
9. Zabeležiti upotrebljenu partiju hraniteljica.
10. Obrisati kese alkoholom.
11. Staviti u kese koje se zatvaraju zipom.
12. Odmrznuti ćelije-hraniteljice u vodenom kupatilu na 37° C (+/- 1° C). Zabeležiti temperaturu vodenog kupatila.
13. Izvaditi i osušiti gazom.
14. Propustiti ćelije-hraniteljice kroz "pass thru" u pripremnu sobu.
15. Preneti u BSC u čistoj sobi.
16. Koristeći prethodno pripremljenu opremu za hraniteljice, spojiti 1 L TP sa medijumom za jedan od slobodnih vodova na strani priključka za uzorak 3-krakog ventila što je bliže moguće zaptivenom spoju gubeći što manje od cevi.
17. Staviti opremu za hraniteljice u BSC.
18. Ubosti svaku od 3 kese sa hraniteljicama šiljkom opreme za hraniteljice u jedan priključak kese hraniteljica.
1
19. Okrenuti zaporni ventil tako da je 1 L TP u položaju "OFF".
20. Raditi sa jednom po jednom kesom, otvoriti steznice na vodu ka kesi sa hraniteljicama, izbaciti vazduh iz šprica i izvući sadržaj kese sa hraniteljicama u špric. Izbacivanje vazduha iz šprica pomaže u oporavku ćelija. Zatvoriti steznicu ka kesi sa hraniteljicama.
21. Zabeležiti oporavljenu zapreminu odmrznutih ćelija-hraniteljica u svakoj kesi. 22. Okrenuti zaporni ventil tako da je kesa sa hraniteljicama u položaju "OFF" 23. Otvoriti steznicu na TP i dispendovati sadržaj šprica u TP.
24. Uveriti se da je vod čist i zatvoriti steznicu TP. Možda ste morali da izvučete malo vazduha u špric iz TP za čišćenje voda.
25. Izmešati dobro ćelije.
26. Zatvoriti steznicu ka kesi sa hraniteljicama.
27. Okrenuti ventil tako da priključak šprica bude u položaju "OFF’. Isključiti 60 mL špric sa ventila.
28. Staviti novi špric na svaku kesu sa hraniteljicama.
29. Ostaviti špric priključen posle poslednje kese.
30. Dobro promešati finalnu formulaciju hraniteljica.
31. Okrenuti ventil tako da suspenzija ćelija-hraniteljica bude na položaju "OFF". 32. Izmešati ćelije i koristeći 5 mL špric i priključak za iglu, isprati priključak sa nešto ćelijskog rastvora da se osigura precizno uzorkovanje i uzeti 1ml ćelija, staviti u obeleženu epruvetu, za brojanje.
33. Ponoviti sa drugim špricem. Ova dva nezavisna uzorka služila su za po jedno brojanje ćelija.
34. Okrenuti ventil tako da je suspenzija hraniteljica na položaju "OPEN" i koristeći 60 ml špric prikačen na opremu izbaciti vazduh u TP da se očisti vod.
35. Skloniti špric i pokriti luerski priključak novim sterilnim poklopcem.
36. Izvršiti zaptivanje toplotom TP blizu spojnog zgloba, skloniti opremu.
37. Zabeležiti masu pakovanja za transfer sa ćelijskom suspenzijom i izračunati zapreminu ćelijske suspenzije.
38. Staviti u inkubator.
39. Izvršiti jedno brojanje ćelija na uzorku ćelija-hraniteljica i zabeležiti podatke i pridružiti sirove podatke brojanja podacima za seriju.
40. Dokumentovati program za brojanje ćelija Cellometer.
41. Potvrditi da je odgovarajuće razblaženje uneto u Cellometer.
1
42. Izračunati ukupnu gustinu vijabilnih ćelija u pakovanju za transfer hraniteljica. 43. Ako je broj ćelija < 5 x10<9>, odmrznuti još ćelija, izbrojati i dodati ćelijamahraniteljicama.
44. Ponovo izmeriti kesu sa hraniteljicama i izračunati zapreminu.
45. Izračunati zapreminu ćelija za uklanjanje.
Dodavanje hraniteljica u G-REX
[0566]
1. Sterilno spojiti 4" set za transfer sa TP sa hraniteljicama.
2. U BSC prikačiti špric odgovarajuće veličine za ženski luer spojen sa pakovanjem za prenos hraniteljica.
3. Dobro izmešati ćelije i uzeti zapreminu izračunatu u koraku 40 ili 41 da se dobije 5.0 x 109 ćelija. Odbaciti nepotrebne ćelije.
4. Koristeći 1 mL špric i iglu 18G izvući 0.150 mL OKT3, ukloniti iglu i preneti u TP sa hraniteljicama preko ženskog luera.
5. Isprati cevi i špric ćelijama-hraniteljicama i dobro promešati kesu. Očistiti vod vazduhom iz šprica.
6. Izvaditi G-Rex 500MCS iz inkubatora, obrisati alkoholom i staviti iza SCD.
7. Sterilno spojiti kesu sa hraniteljicama za crveni vod na G-Rex 500MCS. Osloboditi steznicu voda i pustiti da ćelije-hraniteljice teku u flakon pod dejstvom gravitacije. 8. Obezbediti da vod bude potpuno očišćen zatim zaptiti toplotom vod u blizini originalnog spoja i skloniti kesu sa hraniteljicama.
9. Vratiti G-Rex 500MCS u inkubator i zabeležiti vreme.
Pripremanje TIL: zabeležiti vreme početka sakupljanja TIL
[0567]
1. Pažljivo izvaditi G-Rex 100MCS iz inkubatora i zatvoriti sve steznice osim velikog filterskog voda.
2. Spojiti jednolitarsko pakovanje za transfer sa crvenim vodom na G-REX 100MCS.
3. Zatvoriti steznicu na 300 ml TP. Izvršiti toplotno zaptivanje -12 inča od kese uklanjajući šiljak. Zabeležiti suvu težinu/masu.
4. Sterilno spojiti 300 mL pakovanje za transfer sa vodom za sakupljanje ćelija na 100MCS blizu mesta zaptivenog toplotom. Zatvoriti steznicom vod.
1 1
5. Osloboditi sve steznice koje vode do 1 L TP.
6. Koristeći GatheRex preneti ∼900mL supernatanta kulture u jednolitarsko pakovanje za transfer. Gatherex zaustaviti kada vazduh uđe u vod. Steznicom zatvoriti vod i zatopiti toplotom.
7. Promešati kružnim pokretima flakon dok se sve ćelije ne odvoje od membrane. Uveriti se da su se sve ćelije odvojile sa membrane.
8. Nagnuti flakon dalje od cevi za sakupljanje i ostaviti da se tumorski fragmenti slegnu duž ivice.
9. Flakon polako nagnuti prema sabirnoj cevi tako da fragmenti ostanu na suprotnoj strani flakona.
10. Koristeći GatheRex preneti rezidualnu ćelijsku suspenziju u 300 mL pakovanje za transfer izbegavajući fragmente tumora.
11. Ponovo proveriti da li su sve ćelije uklonjene sa membrane.
12. Po potrebi, oprati oslobađanjem steznica na GatheRex i puštanjem da se nešto medijuma ulije u G-Rex 100MCS flakon pod dejstvom gravitacije.
13. Snažno lupnuti bocu da se oslobode ćelije i upumpati u 300 ml TP.
14. Kada se završi sakupljanje, zatvoriti crveni vod i zatopiti toplotom.
15. Zatopiti toplotom sabirni vod ostavljajući otprilike istu dužinu cevi kao kada je registrovana suva težina.
16. Zabeležiti masu (uključujući suvu masu) 300 ml TP koje sadrži ćelijsku suspenziju i izračunati zapreminu ćelijske suspenzije.
17. U BSC, setom za transfer plazme od 4"ubosti 300 mL TP. Izmešati dobro ćelije. Aseptično prikačiti špric od 5 mL izvući 1 mL, staviti u kriofiolu. Ponoviti sa drugim špricem. Ovo služi za brojanje ćelija, vijabilnost.
18. Ponovo stegnuti i zameniti poklopac luera novim sterilnim poklopcem luera.
19. Staviti u inkubator i zabeležiti vreme stavljanja u inkubator.
20. Obaviti brojanje pojedinačnih ćelija na svakom uzorku i zabeležiti podatke i pridružiti sirove podatke zapisu za seriju.
21. Dokumentovati program za brojanje Cellometer.
22. Proveriti da li je odgovarajuće razblaženje uneto u Cellometer.
23. Po potrebi podesiti ukupnu gustinu vijabilnih TIL na ≤ 2x10<8>vijabilnih ćelija. 24. Izračunati zapreminu koju treba ukloniti ili napomenuti da podešavanje nije potrebno.
25. U BSC aseptično prikačiti špric odgovarajuće veličine za 300 mL TP.
1 2
26. Po potrebi, ukloniti izračunatu zapreminu ćelija iz tabele "Izračunata zapremina za uklanjanje".
27. Zatvoriti steznicom i zatopiti toplotom 300 ml TP.
28. Preneti višak ćelija u konusnu epruvetu odgovarajuće veličine i staviti u inkubator sa olabavljenim poklopcem za kasniju kriprezervaciju.
29. Izvaditi G-Rex 500MCS iz inkubatora i staviti pored SCD.
30. Sterilno spojiti 300 ml TP sa ulaznim vodom Acacia pumpe.
31. Sterilno spojiti crveni vod G-Rex 500MCS sa izlaznim vodom Acacia pumpe. 32. Pumpati ćelije u flakon.
33. Osigurati da je vod potpuno očišćen zatim zatopiti toplotom crveni vod blizu originalnog spoja.
34. Proveriti da su sve steznice na G-Rex 500MCS zatvorene osim velikog filterskog voda.
35. Vratiti e G-Rex 500MCS u inkubator i zabeležiti vreme stavljanja G-Rex u inkubator.
36. Naručiti i obezbediti dostavu taložnih ploča u mikrobiološku laboratoriju.
Krioprezervacija viška
[0568] Izračunati količinu medijuma za zamrzavanje koji će se dodati ćelijama:
TABELA 13: Ciljna koncentracija ćelija bila je 1 x 10<8>/ml
37. Oboriti TIL na 400 x g 5 min na 20°C sa punom kočnicom i punim ubrzanjem. 38. Aseptično aspirirati supernatant.
39. Blago lupnuti dno epruvete da se ćelije resuspenduju u preostaloj tečnosti.
40. Uz blago lupkanje epruvete polako dodavati pripremljeni medijum za zamrzavanje.
41. Alikvotirati u krioepruvete odgovarajuće veličine i zabeležiti vreme stavljanja ćelija na -80°C.
PRIMER 7: PROCES 2A - DAN 16
1
[0569] Ovaj primer detaljno opisuje dan 16 protokola procesa 2A opisanog u Primerima 1 do 4.
[0570] Monitoring čiste sobe - prethodi obradi
1. Biobezbednosni kabineti se čiste velikim, alkoholom natopljenim ubrusima ili alkoholnim sprejom.
2. Verifikovati brojač čestica 10 minuta pre početka obrade.
3. Postaviti procesne ploče za nadgledanje i ostaviti u biobezbednosnom kabinetu 1-2 sata tokom procedure.
[0571] Sakupljnaje i brojanje TIL.
1. Zagrejati jednu 10 L kesu CM4 za kulturu iniciranu sa manje od 50x106 TIL u inkubatoru na 37°C najmanje 30 minuta ili dok ne bude spremna za upotrebu.
2. U BSC aseptično prikačiti Baksterov set sa produžetkom za 10 L labtejnersku kesu.
3. Izvaditi G-Rex 500MCS flakon iz inkubatora i staviti na radnu površinu pored GatheRex. Proveriti da su sve steznice zatvorene osim velikog filterskog voda. Pomeriti steznicu na brzi povezujući vod blizu "T" spoja.
4. Sterilno spojiti 10L Labtejner za crveni vod za sakupljanje na G-Rex 500MCS preko cevi na spajajućem Baksterovom produžetku.
5. Toplotom zatopiti 2 L pakovanje za transfer 2" ispod "Y uklanjajući šiljak i zabeležiti suvu težinu. Sterilno spojiti 2 L TP sa čistim vodom za sakupljanje na G-Rex 500MCS.
6. Staviti G-Rex 500MCS na ravnu površinu.
7. Otpustiti sve steznice koje vode ka 10 L Labtejneru i koristeći GatheRex preneti -4 L supernatanta kulture u 10 L Labtejner.
8. Izvršiti sakupljanje prema odgovarajućim uputstvima za sakupljanje za GatheRex.
9. Zatvoriti steznicu na crvenom vodu i zabeležiti vreme početka sakupljanja TIL.
10. GatheRex zaustaviti kada vazduh uđe u vod. Zatvoriti steznicu na crvenoj liniji.
11. Posle uklanjanja supernatanta, promešati kružnim pokretima flakon dok se sve ćelije ne odvoje od membrane. Nagnuti flakon da bi se osiguralo da je crevo na ivici flakona.
12. Osloboditi sve steznice ka 2 L TP i koristeći GatheRex preneti rezidualnu ćelijsku suspenziju u 2 L TP održavajući ivicu nagnutu dok se ne prikupe sve ćelije.
13. Pregledati da li na membrani još ima priljubljenih ćelija.
14. Po potrebi ponovo isprati oslobađajući steznice na crvenom vodu i omogućiti da se nešto medijuma ulije u flakon pod dejstvom gravitacije.
15. Zatvoriti crveni vod i trostruku toplotnu zaptivku.
1 4
16. Snažno lupiti flakon da bi se oslobodile ćelije
17. Dodati ćelije u 2 L TP.
18. Zatvoriti toplotom 2 L pakovanje za transfer ostavljajući približno istu dužinu cevi kao prilikom beleženja suve težine.
19. Zadržati G-Rex 500MCS, može ponovo da se koristi u razdeljivanju.
20. Zabeležiti masu pakovanja za transfer sa ćelijskom suspenzijom i izračunati zapreminu ćelijske suspenzije.
21. Odrediti zapreminu ćelijske suspenzije, uključujući suvu masu.
22. Sterilno spojiti 4" set za transfer sa kesom za ćelijsku suspenziju.
23. U BSC izmešati ćelije blago i špricem od 20 cc izvući 11 ml i alikvotirati kako je pokazano u Tabeli 14:
TABELA 14. Parametri testiranja
24. Zatopiti toplotom. Zatvoriti luerski spoj zadržavajući steznicu
25. Obeležiti i staviti ćelijsku suspenziju u inkubator i zabeležiti vreme stavljanja u inkubator.
26. Izračunati novu zapreminu.
27. Zabeležiti zapreminu u 2 L pakovanju za transfer na osnovu zapremine ćelijske suspenzije i zapremine uzete za QC (11 mL).
28. Inokulisati i naručiti testiranje sterilnosti.
29. Uskladištiti uzorke za mikoplazmu na 4°C na polici za testiranje na mikoplazmu.
30. Ostaviti na stranu do zasejavanja TIL.
Brojanje ćelija:
1
[0572] Izvesti brojanje pojedinačnih ćelija i zabeležiti podatke i pridružiti sirove podatke brojanja zapisu za seriju. Dokumentovati razblaženje. Dokumentovati Cellometer program za brojanje. Verifikovati da je odgovarajuće razblaženje uneto u Cellometer.
Nastavak postupka:
[0573] 31. Izračunati ukupan broj flakona potrebnih za potkulturu **Ponovo upotrebiti originalni sud i broj dodatnih sudova zaokružiti na višu vrednost.
Dodavanje IL-2 u CM
[0574]
1. Staviti 10 L kesu Aim V sa Glutamax u BSC.
2. Ubosti kesu za medijum 4" setom za transfer plazme.
3. Prikačiti 18G iglu za 10 mL špric i izvući 5 mL IL-2 u špric (finalna koncentracija je 3000 IU/ml).
4. Skloniti iglu i aseptično prikačiti špric za set za transfer plazme i dispendovati IL-2 u kesu.
5. Sprati vod vazduhom, izvući nešto medijuma i dispendovati u kesu. Ovo osigurava da je sav IL-2 dospeo u medijum.
6. Ponovit za ostale kese sa Aim V.
Pripremiti G-REX500MCS flakone
[0575]
1. Odrediti količinu CM4 koja će se dodati u flakone. Zabeležiti zapreminu ćelija dodatih po flakonu i zapreminu CM45000 mL-A.
2. Zatvoriti sve steznice osim velikog filterskog voda.
3. Sterilno spojiti ulazni vod Acacia pumpe sa 4" setom za transfer plazme u kesu sa medijumom koja sadrži CM4.
4. Sterilno spojiti izlazni vod pumpe sa G-Rex 500MCS preko crvenog voda za prikupljanje.
5. Upumpati određenu količinu CM4 u G-Rex 500MCS koristeći vodove na flakonu kao vodiče.
6. Izvršiti zaptivanje toplotom G-Rex 500MCS crvene linije.
1
7. Ponoviti korake 4-6 za svaki flakon. Više flakona može da se napuni istovremeno korišćenjem gravitacije ili većeg broja pumpi. "Y" konektor može da se spoji sa izlaznim vodom pumpe i dva kraka spojena sa G-Rex 500MCS flakonima pune oba istovremeno.
8. Staviti flakone na 37°C, 5% CO2.
Zasejavanje flakona sa TIL
[0576]
1. Zatvoriti sve steznice na G-Rex 500MCS osim velikog filterskog voda
2. Sterilno spojiti kesu za ćelijski proizvod za ulazni vod Acacia pumpe.
3. Sterilno spojiti spoljašnji kraj pumpe sa crvenim vodom na G-Rex 500MCS.
4. Staviti uvodnicu pumpe u pumpu.
5. Staviti kesu za ćelijski proizvod na analitičku vagu i zabeležiti vreme dodavanja TIL u G-REX flakon.
6. Postaviti nulti balans.
7. Osloboditi steznice vodova i pumpati potrebnu zapreminu ćelija u G-Rex 500MCS po težinu uz pretpostavku 1 g=1 mL.
8. Okrenuti naopako kesu i pumpati vazduh da se pročisti vod. Toplotom zatopiti crveni vod G-Rex 500MCS. Stavit flakon u inkubator.
9. Sterilno spojiti izlazni vod pumpe sa sledećim G-Rex 500MCS preko crvenog voda za prikupljanje
10. Izmešati dobro ćelije.
11. Ponoviti transfer ćelija za sve flakone.
12. Staviti flakone na 37°C, 5% CO2i zabeležiti vreme dodavanja TIL u G_REX flakon.
13. Naručiti testiranje u mikrobiološkoj laboratoriji za taložne ploče.
14. Zabeležiti pristupne brojeve.
15. Naručiti testiranje aerobne i anaerobne sterilnosti.
16. Osigurati dostavu ploča i boca u mikrobiološku laboratoriju.
[0577] Krioprezervacija protoka ili viška ćelija:
1. Izračunati potrebnu količinu medijuma za zamrzavanje:
1
a. Ciljna koncentracija ćelija bila je 1 x 10<8>/ml; zabeležiti ukupne uzete ćelije. Ciljna koncentracija ćelija bila je 1 x 10<8>ćelija/ml. Izračunati ukupnu zapreminu medijuma za zamrzavanje koja će se dodati.
2. Pripremiti medijum za krioprezervaciju i staviti na 40°C do upotrebe.
3. Oboriti TIL na 400 x g 5 min na 20°C uz punu kočnicu i puno ubrzanje.
4. Aseptično aspirirati supernatant.
5. Blago lupnuti dno epruvete da se ćelije resuspenduju u preostaloj tečnosti.
6. Uz blago lupkanje epruvete polako dodavati pripremljeni medijum za zamrzavanje.
7. Alikvotirati u krioepruvete odgovarajuće veličine.
8. Staviti fiole u Mr. Frosty ili ekvivalent i staviti u zamrzivač na -80°C.
9. U roku od 72 sata preneti na lokaciju za trajno skladištenje i dokumentovati i zabeležiti datum i mesto stavljanja u zamrzivač na -80°C.
PRIMER 8: PROCES 2A - DAN 22
[0578] Ovaj primer detaljno opisuje dan 22 protokola procesa 2A opisanog u Primerima 1 do 4.
Dokumentovanje negativnih rezultata za sterilnost procesa
[0579] Pre početka sakupljanja, potrebno je iz mikrobiološke laboratorije dobiti preliminarne rezultate testiranja sterilnosti od Dana 16. Ukoliko su rezultati pozitivni, kontaktirati sa rukovodiocem laboratorije ili zaduženom osobom za dodatna uputstva.
Monitoring čiste sobe - Prethodi obradi
[0580]
1. Verifikovati brojač čestica 10 minuta pre početka obrade.
2. Biobezbednosni kabineti se čiste velikim, alkoholom natopljenim ubrusima ili alkoholnim sprejom.
3. Postaviti procesne ploče za nadgledanje i ostaviti ih u biobezbednosnom kabinetu 1-2 sata tokom procedure
Priprema unapred
[0581]
1
1. U BSC aseptično prikačiti Baksterov ekstenzioni set za 10 L labtejnersku kesu ili ekvivalent. Obeležiti LOVO kese za filtrat.
2. Staviti tri 1 L kese PlasmaLyte A u BSC
3. Pripremiti pul i obeležiti PlasmaLyte A kese sa 1% HSA:
3.1. Zatvoriti sve steznice na 4S-4M60 konektorskom setu i probosti svaku od PlasmaLyte kesa.
3.2. Spojiti jedan od muških krajeva 4S-4M60 za ulazni vod uvodnice Acacia pumpe.
3.3. Spojiti izlazni vod uvodnice pumpe sa trolitarskom kesom za prikupljanje. Zatvoriti sve steznice na 3 L kesi osim voda pumpe.
3.4. Pumpati 3 litra Plasmalyte u trolitarsku kesu. Po potrebi ukoniti vazduh iz 3 L kese reverzijom pumpe.
3.5. Zatvoriti sve steznice osim voda sa ženskim luerom.
3.6. Koristeći dva 100 mL šprica i 16-18G igle, uneti 120 mL 25% HSA. Staviti crvene kapice na špriceve.
3.7. Prikačiti jedan špric za ženski luer na trolitarskoj kesi i preneti HSA u 3 L PlasmaLyte kesu. Dobro izmešati.
3.8. Ponoviti sa drugim špricem.
3.9. Dobro izmešati.
3.10. Zatvoriti sve steznice.
3.11. Koristeći 10 mL špric, uzeti 5 mL PlasmaLyte sa 1%HSA iz priključka bez igle na trolitarskoj kesi.
3.12. Staviti kapicu na špric i držati u BSC, za razblaživanje IL-2.
3.13. Zatvoriti sve steznice.
3.14. Zatopiti toplotom uklanjajući ženski luerski vod sa uvodnice pumpe. 3.15. Obeležiti LOVO pufer za ispiranje i datum. Rok trajanja je 24 h na ambijentalnoj temperaturi.
Pripremanje IL-2
[0582]
1. Dispendovati Plasmalyte/1%HSA iz 5 mL šprica u obeleženu 50 ml sterilnu konusnu epruvetu.
1
2. Dodati 0.05 mL stok-rastvora IL-2 u epruvetu sa PlasmaLyte.
3. Obeležiti IL-26X10<4>
4. Poklopiti etiketu i uskladištiti na 2-8°C. Zabeležiti zapremine.
Pripremanje ćelija
[0583]
1. Zatvoriti sve steznice na 10 L Labtejnerskoj kesi. Prikačiti Baksterov ekstenzioni set za 10 L kesu preko luerske veze.
2. Izvaditi G-REX 500M flakone sa 37°C
3. Sterilno spojiti crveni vod za uzimanje medijuma sa G-Rex 500MCS sa ekstenzionim setom na 10 L bioprocesorskoj kesi.
4. Sterilno spojiti čisti vod za uklanjanje ćelija sa G-Rex 500MCS sa 3 L kesom za sakupljanje i označiti kao "spojena ćelijska suspenzija".
5. Osloboditi steznice na crvenom vodu i 10 L kesi.
6. Upotrebiti GatheRex pumpu, smanjiti zapreminu u prvom flakonu.
Napomena: Ako se detektuju mehurići vazduha, pumpu treba zaustaviti pre vremena. Ako redukcija pune zapremine nije potpuna reaktivirati GatheRex pumpu.
7. Zatvoriti steznice na kesi za supernatant i crvenom vodu.
8. Kružnim pokretima mešati G-REX 500M flakon dok se TIL potpuno ne resuspenduju uz izbegavanje prskanja i pravljenja pene. Uveriti se da su sve ćelije sklonjene sa membrane. 9. Otvoriti steznice na čistom vodu i 3 L kesi za ćelije.
10. Nagnuti G-Rex flakon tako da se ćelijska suspenzija nakupi na strani flakona na kojoj se nalazi sakupljajuća cevčica.
11. Pokrenuti GatherRex da sakuplja suspenziju ćelija. Napomena: Ako cevčica za sakupljanje ćelija nije na spoju zida i dna membrane, za njeno pravilno postavljanje obično je dovoljno lupkanje flakona dok je pod nagibom od 45.
12. Osigurati da sve ćelije izađu iz flakona.
13. Ako ćelije ostanu u flakonu, dodati 100 mL supernatanta nazad u flakon, promešati kružnim pokretima i sakupiti u kesu za ćelijsku suspenziju.
14. Zatvoriti steznicu na vodu za kesu za sakupljanje ćelija. Osloboditi steznice na GatheRex.
15. Toplotom zatopiti čisti vod G-Rex 500MCS.
16. Toplotom zatopiti crveni vod G-Rex 500MCS.
17. Ponoviti korake 3-16 za dodatne flakone.
1
18. Po potrebi zameniti 10 L kesu za supernatant posle svakog drugog flakona.
19. Može se koristiti više GatherRex.
20. Dokumentovati broj obrađenih G-Rex 500MCS.
21. Toplotom zatopiti kesu za sakupljanje ćelija. Zabeležiti broj sakupljenih G-REX.
22. Markerom staviti oznaku ∼2" od jednog od ženskih luerskih konektora na novoj 3-litarskoj kesi za sakupljanje.
23. Toplotom zatopiti i ukloniti ženski luer neposredno ispod oznake.
24. Označiti kao LOVO kesa za izvor
25. Zabeležiti suvu težinu.
26. Zatvoriti sve steznice 170 μm filtera za krv.
27. Sterilno spojiti završni kraj filtera za LOVO kesu za izvor neposredno ispod oznake.
28. Sterilno spojiti izvorni vod filtera za kesu koja sadrži ćelijsku suspenziju.
29. Podići ćelijsku suspenziju vešanjem ćelija na IV stalak da se inicira transfer ćelija proticanjem usled gravitacije. (Napomena: ne dopustiti da kesa izvora visi sa filtracionog aparata.)
30. Otvoriti sve potrebne steznice i dopustiti da TIL teku iz kese za ćelijsku suspenziju kroz filter i u LOVO kesu izvora.
31. Kada se sve ćelije prebace u LOVO kesu izvora, zatvoriti sve steznice, toplotom zatopiti neposredno iznad oznake i odvojiti da se ukloni filter.
32. Izmešati dobro kesu i koristeći dva 3 mL šprica uzeti dva nezavisna uzorka od po 2 mL iz priključka za uzorkovanje špricem za određivanje broja i vijabilnosti ćelija.
33. Izmeriti kesu i odrediti razliku između početne i finalne težine.
34. Zabeležiti datum i mesto u inkubatoru uključujući suvu masu.
Broj ćelija
[0584] Izvršiti brojanje ćelija na svakom uzorku i zabeležiti podatke i pridružiti sirove podatke brojanja zapisu za seriju. Dokumentovati Cellometer program za brojanje. Verifikovati da je odgovarjuće razblaženja uneto u Cellometer. Odrediti ukupan broj nukleisanih ćelija. Odrediti broj TNC koje treba ukloniti da bi ostalo = 1.5 X 10<11>ćelija za LOVO obrađivanje.
Staviti uklonjene ćelije u kontejner odgovarajuće veličine, za odlaganje.
LOVO sakupljanje
1 1
[0585] 10 L Labtejner sa Baksterovim ekstenzionim setom u prethodnoj pripremi bila je zamenska filtratna kesa spojena za LOVO kit posle toga. Uključiti LOVO i pratiti prikaze na ekranu.
Provera vage i senzora pritiska
[0586] Da bi se pristupilo operativnom profilu instrumenta (Instrument Operation Profile):
1. Dotaći dugme za informacije.
2. Dotaći tabulator za podešavanje instrumenta.
3. Dotaći dugme Operativni profil instrumenta.
4. Pokaže se Operativni profil instrumenta.
Provera vage
[0587]
1. Proveriti da ništa ne visi ni na jednoj vagi i pregledati očitavanja za svaku vagu. 2. Ako neka od vaga očitava izvan opsega od 0 /- 2 g, izvršiti kalibraciju kako je opisano u Uputstvu za kalibraciju vage, dobijenom od proizvođača.
3. Ako su sve vage u granicama tolerancije bez opterećenja, nastaviti sa kačenjem tereta od 1 kg na svaku vagu (#1-4) i pregledati očitavanja.
4. Ako neka od vaga očitava izvan opsega od 1000 /- 10 g kada je obešen teret od 1 kg, izvršiti kalibraciju vage kako je opisano u LOVO priručniku za operatera dobijenom od proizvođača.
Provera senzora pritiska
[0588]
1. Pregledati očitavanja senzora pritiska na ekranu Operativni profil instrumenta. 2. N/A: Ako je očitavanje senzora pritiska izvan 0 /- 10 mmHg, sačuvati novo podešavanje za atmosferski pritisak u servis-modu kako je opisano u LOVO priručniku za operatera dobijenom od proizvođača.
a. Dotaćidugne za proveru na ekranu Operativni profil instrumenta.
b. Dotaći dugme za proveru na tabulatoru Podešavanje instrumenta.
1 2
3. Ako je izvršena kalibracija vage ili je sačuvano novo podešavanje atmosferskog pritiska, ponoviti relevantne odeljke.
[0589] Za otpočinjanje procedure, odabrati "TIL G-Rex Harvest" protokol iz opadajućeg menija na ekranu Izbor protokola i pritisnuti Start.
1. Prikazaće se ekran za podešavanje procedure.
2. Dotaći dugme Solutions Information (Informacije o rastvoru).
3. Pokazaće se ekran Solution 1 (Rastvor 1. Pregledati tip pufera za ispiranje potrebnog za Solution 1. (Treba da bude PlasmaLyte.)
4. Dotaći dugme Next (Sledeće) da se ode na ekran Solution 2. Pregledati tip pufera za ispiranje potrebnog za Solution 2. (Treba da piše "NONE" ("Nijedan"), što ukazuje da je protokol konfigurisan samo za upotrebu jednog tipa pufera za ispiranje koji je PlasmaLyte) 5. Dotaći dugme za proveru na Solution 2 informacionom ekranu da bi se vratilo na ekran za podešavanje procedure.
6. Dotaći dugme Procedure Information (Informacije o proceduri).
7. Pokazaće se ekran Procedure Information.
8. Dotaći polje za unos User ID (Identifikacija korisnika). Pokazaće se tastatura. Uneti inicijale izvođača i verifikatora. Dotaći dugme za prihvatanje unosa.
9. Dotaći polje za unos Source ID (Identifikacija izvora). Pokazaće se tastatura. Uneti # partije proizvoda. Dotaći dugme za prihvatanje unosa.
10. Dotaći polje za unos Procedure ID (Identifikacija procedure). Pokazaće se tastatura. Uneti "TIL Harvest" ("Sakupljanje TIL"). Dotaći dugme za prihvatanje unosa.
11. Ako postoje druge napomene za beleženje, dotaći polje za unos Procedure Note (Beleške o proceduri). Pokazaće se tastatura. Uneti beleške. Dotaći dugme za prihvatanje unosa.
NAPOMENA: Procedure Note polje za unos je opciono i može se ostaviti prazno.
12. Dotaći dugme za proveru na ekranu Procedure Information Screen za povratak na ekran Procedure Setup (Podešavanje procedure).
13. Verifikovati da se "check" prikazuje na dugmetu Procedure Information. Ako nema "check" prikaza, dotaći dugme Procedure Information ponovo i uveriti se da postoji unos u poljima User ID, Source ID, i Procedure ID.
14. Dotaći dugme Parameter Configuration (Konfiguracija parametara).
15. Pokazaće se ekran General Procedure Information (Opšte informacije o proceduri).
16. Dotaći polje za unos Source Volume (Zapremina izvora) (mL). Pokazaće se numerička tastatura. Uneti izračunatu zapreminu ćelijske suspenzije iz Tabele 1
1
17. Dotaći dugme za prihvatanje unosa.
18. Dotaći polje za unos Source PCV (%). pokazaće se ekran TIL (viable+dead) (vijabilne+mrtve).
19. Dotaći polje za unos Cell Concentration (Koncentracija ćelija). Pokazaće se numerička tastatura. Uneti ukupnu koncentraciju ćelija/mL iz Tabele 14 u Izvornom proizvodu u jedinicama "x 10<6>/mL". Unos može biti u opsegu od 00.0 do 99.9. Dotaći dugme za prihvatanje unosa i vratiti se na ekran General Procedure Information Screen. NAPOMENA: Posle prihvatanja Cell Concentration, polje za unos Source PCV (%) na ekranu General Procedure Information pokazuje PCV % koji je izračunao LOVO, na osnovu unosa Cell Concentration koji je napravio operater.
20. Na ekranu General Procedure, dotaći dugme Next da bi se prešlo na ekran 4 od 8, Ekran Final Product Volume (Retentate Volume) (Zapremina finalnog proizvoda (zapremina retentata)). Napomena: Ekrani 2 i 3 nemaju polja za unos za operatera koji ih popunjava. 21. Pokazaće se ekran Final Product Volume (Retentate Volume).
22. Korišćenjem vrednosti Total nucleated cells (Ukupne nukleisane ćelije, TNC) iz Tabele 15, odrediti ciljnu zapreminu finalnog proizvoda u tabeli u nastavku (Tabela 16). Uneti Final Product Volume (mL) udružen sa Cell Range (Opseg ćelija) tokom LOVO Procedure podešavanja.
TABELA 15. Određivanje ciljne zapremine finalnog proizvoda
TABELA 16. Ciljana zapremina proizvoda
23. Za ciljanje specifikovane zapremine iz Tabele 16, dotaći polje za unos Final Product Volume (mL). Pokazaće se numerička tastatura. Uneti željenu vrednost Final Product Volume u jedinicama mL. Dotaći dugme za prihvatanje unosa.
1 4
24. Dotaći ekran Final Product Volume (Retentate Volume) za vraćanje na ekran Procedure Setup Screen. Napomena: Ekrani 5-8 nisu imali polja za unos koja popunjava operater.
25. Verifikovati da se "check" prikazuje na dugmetu Parameter Configuration. Ako nema "check" prikaza, dotaći dugme Procedure Information ponovo i uveriti se da postoji unos u poljima Source Volume i Source PCV na strani 1. Uveriti se da je čekirano polje Target Minimum Final Product Volume ILI da polje Final Product Volume (mL) ima unos na strani 4.
26. Dotaći dugme Estimate (Procena) u gornjem desnom uglu ekrana.
27. Pokazaće se ekran Estimation Summary. Potvrditi dovoljne i ispravne vrednosti za Source i PlasmaLyte pufer za ispiranje.
28. Napuiti komplet za jednokratnu upotrebu: Pratiti uputstva na ekranu za punjenje kita biranjem dugmeta za pomoć "(?)".
29. Zabeležiti zapreminu koja se prikaže za Filtrate i Solution 1 (PlasmaLyte)
30. Zabeležiti zapreminu koja se prikaže za Filtrate i Solution 1 (PlasmaLyte).
31. Za uputstva o punjenju jednokratnog kita dotaći dugme za pomoć ili pratiti uputstva u priručniku za operatera za detaljno uputstvo.
32. Kada se standardni LOVO jednokratni kit napuni, dotaći dugme Next. Pokazuju se Container Information (Informacije o kontejneru) i Location Screen (Ekran lokacije). Skloniti filtratnu kesu sa vage #3.
33. Za ovaj protokol, kontejner za filtrat je "New" i "Off Scale"
34. Ako se kontejner za filtrat već prikazao kao "New" i "Off-Scale", ne prave se izmene. 35. Ako se tip kontejnera za filtrat pokazao kao Original, dotaći dugme Original da se isključi na New.
36. Ako je lokacija filtrata prikazana kao On-Scale, dotaći dugme On-Scale da se isključi na Off-Scale.
37. Ako je zapremina filtrata koja će se generisati ≤ 2500 mL, Filtrate Container Location se pokazuje kao On-Scale za konzistenciju između ciklusa, Filtrate Container Location se promeni u Off-Scale i tip kontejnera je "new".
38. Dotaći dugme On-Scale da se isključi u Off-Scale. Prikačiti set za transfer. Koristiti tehniku sterilnog spajanja da se zameni kontejner za filtrat LOVO jednokratnog kita 10-litarskom kesom. Otvoriti spojnicu.
39. Staviti kontejner za filtrat na radnu površinu. NE vešati kesu za filtrat na vagu #3. Vaga #3 je prazna tokom procedure.
1
40. Otvoriti plastične steznice na cevima koje vode do kontejnera za filtrat. NAPOMENA: Ako je cev uklonjena sa F steznice tokom spajanja, zameniti steznicu.
41. Dotaći polje za unos Filtrate Container Capacity. Pokazaće se numerička tastatura. Uneti ukupan kapacitet za novi filtrat (10,000 mL). Dotaći dugme "check" za prihvatanje unosa. 42. Koristeći tehniku sterilnog spajanja za zamenu kontejnera za filtrat LOVO jednokratnog kita 10 L kesom. Otvoriti spojnicu. Napomena: Ako je cev uklonjena sa F steznice tokom spajanja, zameniti steznicu.
43. Staviti novi kontejner za filtrat na radnu površinu. NE vešati kesu za filtrat na vagu #3. Vaga #3 je prazna tokom procedure.
44. Otvoriti plastične steznice na cevima koje vode do kontejnera za filtrat
45. Za kontejner za retentat, ekran pokazuje Original i On-Scale.
46. Ne vrše se promene za retencioni kontejner.
47. Kada se naprave sve promene za kontejner za filtrat i unesu odgovarajuće informacije, dotaći dugme Next.
48. Pokazuje se pokrovni sloj Disposable Kit Dry Checks (Suva provera jednokratnog kita). Proveriti da je kit napunjen pravilno, zatim pritisnuti dugme Yes.
49. Sve LOVO mehaničke steznice se automatski zatvaraju i pokazuje se ekran Checking Disposable Kit Installation (Instalacija provere jednokratnog kita). LOVO prolazi kroz niz koraka pod pritiskom za proveru kita.
50. Kada se uspešno završi provera jednokratnog kita, pokazuje se ekran Connect Solutions (Spojiti rastvore).
51. 3 L je zapremina za ispiranje. Uneti ovu vrednost na ekran.
52. Koristiti tehniku sterilnog spajanja za prikačinjanje trolitarske kese PlasmaLyte za cev koja prolazi kroz Steznicu 1. Otvoriti spoj.
53. Obesiti PlasmaLyte kesu na IV stalak,
54. Otvoriti plastične steznice na cevima koje vode do PlasmaLyte kese.
55. Verifikovati da je unos Solution Volume 3000 mL. Ovo je ranije uneto.
56. Dotaći dugme Next. Pokazaće se pokrovni lejer Disposable Kit Prime (Pokretanje jednokratnog kita). Verifikovati da je PlasmaLyte zakačen i da su otvoreni spojevi i plastične steznice na cevima koje vode do PlasmaLyte, i zatim dotaći dugme Yes. NAPOMENA: Pošto se samo jedan tip pufera za ispiranje (PlasmaLyte) koristi tokom LOVO procedure, nema rastvora prikačenih za cev koja prolazi kroz Steznicu 2. Robertsova steznica na toj cevi ostaje zatvorena tokom procedure.
1
57. Pokretanje jednokratnog kita počinje i pokazuje se ekran Priming Disposable Kit (Pokreće se jednokratni kit). Vizuelno se zapaža da se PlasmaLyte kreće kroz cev povezanu sa kesom PlasmaL Lyte. Ako se tečnost ne kreće, pritisnuti dugme Pause (Pauza) na ekranu i videti da li je steznica ili spojnica još uvek otvorena. Kada se problem reši, pritisnuti dugme Resume (Rezime) na ekranu da se nastavi Disposable Kit Prime.
58. Kada se pokretanje jednokratnog kita uspešno završi, prikazuje se ekran Connect Source.
59. Za ovaj protokol, kontejner Izvor je New i Off-Scale
60. Ako se kontejner Izvor već prikazuje kao New i Off-Scale, ne vrše se promene.
61. Ako se lokacija Izvor pokaže kao On-Scale, dotaći dugme On-Scale da se isključi u Off-Scale.
62. Dotaći polje za unos Source Capacity (mL). Pojaviće se numerička tastatura. Uneti kapacitet kontejnera u kojem je Izvor proizvod. Dotaći dugme za proveru da se prihvati unos. Napomena: unos Source Capacity koristi se da bi se osiguralo da kesa Izvor može da sadrži još dodatnog rastvora koji se dodaje u kesu tokom faze Source Prime.
63. Upotrebiti tehniku sterilnog spajanja za prikačinjanje kontejnera Izvor za cev koja prolazi kroz Steznicu S. Otvoriti spojnicu. Ukloniti cev sa steznice po potrebi.
64. Osigurati zamenu cevi izvora u S steznicu.
65. Dotaći dugme Next. Prikazaće se pokrovni sloj Source Prime overlay. Verifikovati da je Izvor prikačen za jednokratni kit i da su spojnice i plastične steznice na cevi koja vodi ka Izvoru otvorene, zatim dotaći dugme Yes.
66. Pokretanje Izvora počinje i prikazuje se ekran Priming Source. Vizuelno se zapaža da se PlasmaLyte kreće kroz cev povezanu sa kesom Izvor. Ako se tečnost ne kreće, pritisnuti dugme Pause na ekranu i videti da li su steznica ili spojnica još uvek zatvorene. Kada se problem reši, pritisnuti dugme Resume na ekranu da se nastavi Source Prime.
67. Kada se pokretanje Izvora uspešno završi, prikazuje se ekran Start Procedure.
68. Pritisnuti dugme Start. prikazuje se ekran pauze "Pre-Wash Cycle 1" ("Predispiranje ciklus1"), sa uputstvima "Coat IP, Mix Source" ("Obložiti IP, mešati izvor").
69. Prethodno obložiti IP kesu.
70. Pre nego što se pritisne dugme Start, skloniti IP kesu sa vage #2 (može se ukloniti i cev sa vodičem gornjeg porta IP) i ručno je okrenuti da se omogući da pufer za ispiranje dodat tokom koraka pokretanja jednokratnog kita obloži čitavu unutrašnju površinu kese.
71. Ponovo okačiti IP kesu na vagu #2 (oznaka na kesi okrenuta je levo). Zameniti cev gornjeg priključka u vodiču cevi, ako je uklonjena.
72. Izmešati kesu Izvor.
1
73. Pre pritiskanja dugmeta Start, skloniti kesu Izvor sa vage #1 i okrenuti je naopako nekoliko puta da se napravi homogena suspenzija.
74. Ponovo okačiti kesu Izvor na vagu #1 ili IV stalak. Uveriti se da se kesa ne ljulja.
75. Pritisnuti dugme Start.
76. LOVO počinje da obrađuje tečnost iz kese Izvor i prikazuje se ekran Wash Cycle 1.
[0590] Tokom LOVO procedure, sistem automatski pravi pauze da bi omogućio operateru da interaguje sa različitim kesama. Različiti ekrani prikazuju se tokom različitih pauza. Pratiti odgovarajuća uputstva za svaki ekran.
Pauza u ispiranju izvora
[0591] Posle dreniranje kese Izvor, LOVO dodaje pufer za ispiranje u kesu Izvor da bi se kesa isprala. Posle dodavanja konfigurisane zapremine pufera za ispiranje u kesu Izvor, LOVO pauzira automatski i prikazuje se ekran Source Rinse Paused.
[0592] Kada se prikaže ekran Source Rinse Paused, operater:
1. Uklanja kesu Izvor sa vage #1.
1. Okreće kesu naopako nekoliko puta da bi pufer za ispiranje došao u kontakt sa čitavom unutrašnjošću kese.
2. Ponovo obesi kesu Izvor na vagu #1. Uveri se da se kesa Izvor ne ljulja na vagi #1.
3. Pritisne dugme Resume.
[0593] LOVO obrađuje tečnost za ispiranje iz kese Izvor, zatim nastavlja sa automatskom procedurom.
Pauza u mešanju IP kese
[0594] Da bi se ćelije pripremile za sledeći prolazak kroz spiner, IP kesa se razblaži puferom za ispiranje. Posle dodavanja pufera za ispiranje u IP kesu, LOVO automatski pravi pauzu i prikazuje se ekran pauze "Mix IP bag".
[0595] Kada se prikaže ekran pauze "Mix IP bag" operater:
1. Sklanja IP kesu sa vage #2. Može se ukloniti i cev sa vodičem cevi gornjeg priključka IP.
2. Nekoliko puta okrene naopako IP kesu da se ćelijska suspenzija dobro promeša. 3. Ponovo okači IP kesu na vagu #2. Postavi i cev gornjeg priključka IP u vodiču cevi, ako je uklonjena. Uveri se da se IP kesa ne ljulja na vagi #2.
1
4. Pritisne dugme Resume. LOVO počinje da obrađuje tečnost iz IP kese.
Pauza za masiranje uglova IP
[0596] Tokom finalnog ciklusa ispiranja LOVO procedure, ćelije se pumpaju iz IP kese kroz spiner, i u kesu Retentat (Finalni proizvod). Kada se kesa IP isprazni, 10 mL pufera za isširanje doda se kroz donji priključak IP kese da se kesa ispere. Posle dodavanja tečnosti za ispiranje, LOVO automatski pauzira i prikazuje se ekran pauze "Massage IP corners" ("Masirati uglove IP").
[0597] Kada se prikaže ekran pauze "Massage IP corners", operater:
1. NE sklanja IP kesu sa vage #2.
2. Dok IP kesa visi na vagi #2, masira uglove kese da se rezidualne ćelije, ako ih ima, unesu u suspenziju.
3. Uveri se da se IP kesa ne ljulja na vagi #2.
4. Pritisne dugme Resume.
5. LOVO počinje da ispumpava tečnost za ispiranje iz IP kese.
[0598] Na kraju LOVO procedure, prikazuje se ekran Remove Products (Skloniti proizvod). Kada se ovaj ekran prikaže, može se rukovati svim kesama na LOVO kitu.
Napomena: Ne dirati kese dok se ne prikaže eksran Remove Products.
[0599] Staviti hemostat na cev veoma blizu priključka na kesi Retentae da se spreči taloženje suspenzije u cevi i trostruko zatopiti toplotom ispod hemostata.
[0600] Uzeti kesu za retentat lomljenjem srednjeg zatopljenja i preneti u BSC.
[0601] Pratiti uputstva na ekranu Remove Products
[0602] Dotaći dugme Next. Sve LOVO mehaničke steznice se otvaraju i prikazuje se ekran Remove Kit.
[0603] Pratiti uputstva na ekranu Remove Kit. Kada se izvrše, nastaviti.
[0604] Dotaći dugme Next. Sve LOVO mehaničke steznice se zatvaraju i prikazuje se ekran Results Summary (Zbirni prikaz rezultata). Zabeležiti podatke sa ekrana za sumiranje rezultata u Tabeli 17. Zatvoriti sve pumpe i filter-podlogu.
1
[0605] Dotaći dugme Next. Prikazaće se ekran Protocol Selection (Izbor protokola).
Postupak gašenja LOVO
[0606]
1. Osigurati da su sve steznice zatvorene i filter-podloga u uspravnom položaju.
2. Dotaći dugme na prednjoj strani LOVO.
3. Prikazuje se pokrovni sloj STOP Button Decision (Odluka o zaustavljanju).
4. Prikazuje se pokrovni sloj Shutdown Confirmation (Potvrda gašenja).
5. Dotaći dugme Yes. Prikazuje se ekran Shutting Down (Gašenje).
6. Posle nekoliko sekundi, prikazuje se ekran Power Off (Isključivanje). Kada se ovaj ekran prikaže, isključiti LOVO korišćenjem prekidača na zadnjem levom delu instrumenta.
[0607] U tabelu upisati zapreminu finalno formulisanog proizvoda.
Izračunavanje količine potrebnog IL-2 iz tabele finalnog proizvoda
[0608]
1
Određivanje broja kriokesa i zadržane zapremine
[0609] Na tabeli u nastavku Ciljna zapremina i zadržano označiti, broj krioprezervacionih kesa i zapreminu retencionog uzorka za proizvod.
[0610] Izračunavanje ciljne zapremine/kesi: (Finalna formulisana zapremina - podešena zapremina jer se ne dobija 100% oporavak=10 mL)/# kesa.
[0611] Pripremiti ćelije sa 1:1 (vol:vol) CS10 (CryoStor 10, BioLife Solutions) i IL-2.
1. Sklopiti povezujuću aparaturu
1.1. Sterilno spojiti CS750 kriokese sa CC2 Cell Connect aparatom, povezujući po jedan kraj distalnog muškog luera sa svakom kesom.
1.2. Ostaviti steznice u zatvorenom položaju.
1.3. Obeležiti kese 1-4.
2. Pripremiti ćelije sa IL-2 i spojiti aparat.
2.1. U BSC probosti kesu sa ćelijskim proizvodom 4" setom za transfer plazme sa ženskim luer konektorom. Uveriti se da je steznica zatvorena na setu za transfer.
2.2. Špricem odgovarajuće veličine izvući zapreminu IL-2 radnog razblaženja određenu u tabeli Finalni proizvod.
2.3. Dispendovati u LOVO proizvod.
2.4. Sterilno spojiti kesu LOVO proizvod sa CC2 vodom sa jednim šiljkom uklanjajući šiljak.
2.5. Staviti ćelije i aparat u transportnu kesu i staviti na 2-8 °C ≤ 15 min.
1 1
3. Dodavanje CS10
3.1. U BSC povezati trokraki ventil sa muškim luerom na kesi hladnog CS10.
3.2. Prikačiti špric odgovarajuće veličine za ženski luer ventila.
3.3. Otvoriti steznicu kese i uliti količinu CS 10 određenu u tabeli "Zapremina finalno formulisanog proizvoda".
3.4. Skloniti špric i poklopiti crvenom kapicom.
3.5. Ponoviti ako je potrebno više špriceva.
3.6. Izvaditi ćelije/CC2 aparat iz frižidera sa 2-8 °C i staviti u BSC.
3.7. Prikačiti prvi špric sa CS10 za srednji luer ventila. Okrenuti ventil tako da vod ka CS750 kesama bude u položaju "OFF".
3.8. Polako i uz blago mešanje dodati CS10 (1:1, vol:vol) ćelijama.
3.9. Ponoviti za dodatne špriceve sa CS10.
Dodavanje formulisanog ćelijskog proizvoda u kriokese
[0612]
1. Zameniti postojeći špric špricem odgovarajuće veličine za zapreminu ćelija koja će se staviti u svaku kriokesu.
2. Izmešati ćelijski proizvod.
3. Otvoriti steznicu koja vodi ka kesi sa ćelijskim proizvodom i ispustiti odgovarajuću zapreminu
4. Okrenuti ventil tako da kesa za ćelijski proizvod bude u položaju "OFF" i dispendovati sadržaj šprica u kriokesu #1. Očistiti vod vazduhom iz šprica.
Beleženje zapremine finalnog proizvoda
[0613]
1. Koristeći priključak bez igle i špric odgovarajuće veličine, odliti ranije određenu zapreminu retentata.
2. Staviti zadržano u konusnu epruvetu od 50 mL obeleženu kao "Zadržano"
3. Koristeći špric prikačen za opremu izvući sav vazduh povlačeći ćelije do oko 1" u cev. Zatvoriti steznicu i zatopiti toplotom. Staviti na 2-8 °C.
4. Okrenuti ventil tako da kriokese budu u položaju "OFF"
1 2
5. Izmešati ćelije u kesi za ćelijski proizvod i ponoviti korake 3-8 za preostale CS750 kese koristeći novi špric na ventilu i novi špric za dobijanje zadržanih ćelija.
6. Zadržane ćelije se ostave na stranu za obradu kada proizvod bude u CRF.
[0614] Procedura u zamrzivaču sa kontrolisanom stopom hlađenja (CRF) (vidi i Primer 9)
1. Uključiti CRF (CryoMed Controlled Rate Freezer, Model 7454) i pridruženi laptop kompjuter.
2. Ulogovati se na kompjuter koristeći račun i lozinku
3. Otvoriti ikonu Controlled Rate Freezer koja se nalazi na desktopu.
4. Kliknuti na dugme Run (Pokretanje) na glavnom ekranu.
5. Kliknuti Open Profile (Otvoriti profil), kliknuti Open.
6. Uneti Run File Name i datum u formatu: runMMDDYYYY.
7. Uneti datum u formatu MMDDYYY.
8. Zatvoriti vrata CRF.
9. Kliknuti Start Run.
10. Odabrati COM 6 na opadajućem meniju.
11. Kliknuti Ok. Sačekati oko 30 sekundi.
12. Kada se pojavi "Profile Download" ("Preuzimanje profila"), kliknuti OK. kliknuti Save. (Vidi Primer 9 za detalje o profilu zamrzavanja uz kontrolisanu stopu.)
13. Sačekati sa pritiskivanjem zelenog dugmeta dok se uzorci ne stave u CRF. Zamrzivač se drži na 4 °C do stavljanja uzoraka.
14. Staviti uzorke u CRF.
15. Sačekati dok se CRF ne vrati na 4 °C. Kada se dostigne ta temperatura, kliknuti na zeleno dugme za nastavljanje. Ovo pokreće prelaz u sledeći korak programa.
16. Izvršiti vizuelnu inspekciju kriokesa u pogledu sledećeg (Napomena: ne pregledaju se nedovoljna ispunjenost ili prepunjenost): integritet kontejnera, integritet priključka, integritet plombi, prisustvo grudvica ćelija, i prisustvo čestica.
17. Na svaku kesu staviti odobrenu viseću oznaku.
18. Verifikovati oznaku finalnog proizvoda koja uključuje: broj partije, naziv proizvoda, datum proizvodnje, zapreminu porizvoda, druge aditive, temperaturu skladištenja, i rok.
19. Staviti svaku kriokesu (sa visećom oznakom) u drugu kesu.
20. Zatopiti toplotom.
21. Staviti u hladnu kasetu.
1
22. Ponoviti za svaku kesu.
23. Staviti obeležene kriokese u prekondicionirane kasete i preneti u CRF.
24. Ujednačeno rasporediti kasete na postolje u CRF.
25. Staviti trakasti termokupler na centralnu kasetu ili staviti lažnu kesu na centralnu poziciju.
26. Zatvoriti vrata CRF.
27. Kada komora dostigne temperaturu 4 °C /- 1.5 °C, pritisnuti Run na PC Interface softveru.
28. Zabeležiti vreme i temperaturu komore kada je proizvod prenet u CRF.
Obrađivanje uzorka za kontrolu kvaliteta
[0615]
1. Aseptično preneti sledeće materijale u BSC, po potrebi, i obeležiti prema tabeli u nastavku:
2. Upotrebiti novu pipetu za pipetiranje sledećeg:
Tabela: QC i Retencija
3. Dostaviti na QC: 1 Epruvetu za brojanje ćelija, 1 Epruvetu za endotoksin, 1 Epruvetu za Mycoplasma, 1 epruvetu za bojenje po Gramu, 1 restimulacionu epruvetu, i 1 epruvetu za protok za QC, za neposredno testiranje. Preostali duplikati epruveta stavljaju se u zamrzivač sa kontrolisanom stopom hlađenja.
4. Kontaktirati sa supervizorom za QC i obavestiti ga o potrebnom testiranju.
5. Vidi Tabelu 18 za uputstva o testiranju i skladištenju.
TABELA 18. Uputstva o testiranju i skladištenju
1 4
Broj ćelija
[0616] Izvršiti brojanje pojedinačnih ćelija svakog uzorka i zabeležiti podatke i sirove podatke brojanja pridružiti zapisu za seriju. Dokumentovati program za brojanje Cellometer. Verifikovati da je ispravno razblaženje uneto u Cellometer.
[0617] Krioprezerviranje postformulacionih retencionih ćelija:
1. Staviti fiolu u CRF.
2. Posle okončanja hlađenja preneti na mesto za skladištenje i zabeležiti datum i vreme stavljanja u CFR. Zabeležiti datum i vreme premeštanja u LN2.
Mikrobiološko testiranje
[0618]
1. Naručiti testiranje taložnih ploča u mikrobiološkoj laboratoriji.
2. Zabeležiti pristupne brojeve.
3. Naručiti testiranje aerobne i anaerobne sterilnosti.
4. Osigurati dostavu ploča i boca do mikrobiološke laboratorije.
Postkrioprezervacija kesa sa ćelijskim proizvodom
[0619]
1. Zaustaviti zamrzivač posle završetka ciklusa. Ciklus može da se zaustavi klikom na dugme Stop ili pritiskom na Back na tastaturi zamrzivača.
2. Izvaditi kriokese iz kasete
3. Preneti kasete u LN2u fazi isparavanja.
1
4. Zabeležiti mesto skladištenja.
5. Uneti dodatne komentare ako ih ima kada se ponovo otvori prozor za unos teksta. Ovaj prozor se pojavljuje bez obzira na postupak zaustavljanja ciklusa.
6. Odštampati izveštaj profila i pridružiti zapisu za seriju označen brojem partije za ciklus.
7. Završiti Warm Mode (Mod toplo) i napustiti ekran Run dugmetom Exit.
PRIMER 9: PROCES KRIOPREZERVACIJE
[0620] Ovaj primer opisuje postupak procesa krioprezervacije TIL pripremljenih skraćenom, zatvorenom procedurom opisanom gore u Primeru 8 korišćenjem CryoMed zamrzivača sa kontrolisanom stopom hlađenja, Model 7454 (Thermo Scientific).
[0621] Upotrebljena oprema, uz onu opisanu u Primeru 9, je sledeća:
aluminijumsko postolje za držanje kaseta (kompatibilno sa CS750 kesama za zamrzivač), kasete za krioskladištenje za kese od 750 mL, tank za tečni azot pod niskim pritiskom (22 psi), frižider, termokuplujući senzor (tipa trake, za kese), i CryoStore CS750 kese za zamrzavanje (OriGen Scientific).
[0622] Proces zamrzavanja obezbeđuje stopu hlađenja od 0.5 °C od nukleacije do -20 °C i stopu hlađenja od 1 °C do krajnje temperature od -80 °C. Programski parametri su sledeći: Korak 1 - čekati na 4 °C; Korak 2: 1.0 °C/min (temperatura uzorka) do -4 °C; Korak 3: 20.0 °C/min (temperatura komore) do -45 °C; Korak 4: 10.0 °C/min (temperatura komore) do -10.0 °C; Korak 5: 0.5 °C/min (temperatura komore) do -20 °C; i Korak 6: 1.0 °C/min (temperatura uzorka) do -80 °C.
[0623] Opis procedure ovog primera zajedno sa procesom Primera 1 do 8 prikazan je na Slici 11.
PRIMER 10: KARAKTERIZACIJA TIL IZ PROCESA 2A
[0624] Ovaj primer opisuje karakterizaciju TIL pripremljenih skraćenom, zatvorenom procedurom opisanom gore. Ukratko, skraćena, zatvorena procedura (proces 2A, opisan u Primerima 1 do 9) ima prednost u odnosu na prethodne procese proizvodnje TIL date u Tabeli 19. Prednosti Pre-REP mogu uključiti: porast broja tumorskih fragmenata po flakonu, skraćeno vreme kultivacije, smanjen broj koraka, i/ili mogućnost odvijanja u zatvorenom sistemu. Prednosti prelaza Pre-REP u REP mogu uključiti: skraćenje procesa pre-REP-u-REP, smanjenje broja koraka, eliminisanje fenotipske selekcije, i/ili mogućnost odvijanja u
1
zatvorenom sistemu. Prednosti REP mogu uključiti: smanjenje broja koraka, kraće trajanje REP, zatvoren sistema transfera TIL između flakona, i/ili zatvoren sistem promene medijuma. Prednosti Sakupljanja mogu uključiti: smanjenje broja koraka, automatizovano ispiranje ćelija, zatvoreni sistem, i smanjenje gubitka proizvoda tokom ispiranja. Prednosti finalne formulacije i/ili proizvoda mogu uključivati fleksibilnost transporta.
TABELA 19. Poređenje primera procesa 1C i primera izvođenja procesa 2A.
1
[0625] Izvedeno je ukupno 9 eksperimenata korišćenjem TIL poreklom iz 9 tumora opisanih u Tabeli 20. Svi prikazani podaci su mereni na odmrznutom zamrzavanom TIL proizvodu iz procesa 1C i primera izvođenja procesa 2A.
TABELA 20. Opis donora tumora, datumi i mesta obrade
[0626] Procedure opisane u ovom tekstu za proces 2A korišćene su da se proizvedu TIL za karakterizaciju u ovom primeru. Ukratko, za REP, na Dan 11, pripremi se jedan G-REX -500M flakon sa 5 L CM2 suplementisanog sa 3000 IU/ml rhil-2, 30 ng/mL anti-CD3 (Klon OKT3) i 5 × 10<9>ozračenih alogenih hraniteljskih PBMC ćelija. TIL sakupljni iz pre-REP G-REX -100M flakona posle smanjenja zapremine, broje se i zasejavaju u G-REX -500M flakon pri gustini u opsegu između 5 × 10<6>i 200 × 10<6>ćelija. Flakon se zatim stavi u humidifikovani inkubator za kulturu tkiva na 37 °C, 5% CO2, pet dana. Na Dan 16, zapremina G-REX -500M flakona se redukuje, TIL se broje i određuje im se vijabilnost. U tom trenutku, TIL se ekspandiraju u više G-REX -500M flakona (do najviše šest flakona), svaki sa gustinom zasejavanja od 1 × 10<9>TIL/flakonu. Svi flakoni se tada stave u humidifikovani inkubator za kulturu tkiva na 37 °C, 5% CO2, na još šest dana. Na Dan 22, dan sakupljanja, svaki flakon je sa zapreminom smanjenom za 90%, ćelije se spajaju i filtriraju kroz 170 μm filter za krv, i zatim sakupe u 3 L Origin EV3000 kesu ili ekvivalent, u pripremi za automatizovano
1
ispiranje korišćenjem LOVO. TIL se ispiraju korišćenjem LOVO automatizovanog sistema za ispiranje ćelija koji vrši zamenu 99.99% medijuma za kulturu ćelija puferom za ispiranje koji se sastoji od PlasmaLyte-A suplementisanog sa 1% HSA. LOVO radi koristeći tehnologiju rotirajuće filtracione membrane koja oporavlja preko 92% TIL, praktično eliminišući rezidualne tkivne komponente kulture, uključujući serum, faktore rasta i citokine kao i detritus i čestice. Posle završetka ispiranja, vrši se brojanje ćelija da se utvrdi ekspanzija TIL i njihova vijabilnost posle sakupljanja. Ispranim TIL dodaje se CS10 u odnosu zapremina 1:1 da se dobije finalna formulacija Procesa 2A. Finalno formulisani proizvod se alikvotira u kese za krioskladištenje, koje se zatope i stavljaju u prethodno ohlađene aluminijumske kasete. Kese za krioskladištenje koje sadrže TIL se zatim zamrznu korišćenjem CryoMed zamrzivača sa kontrolisanom stopom hlađenja (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) prema proceduri opisanoj u ovom tekstu, uključujući Primer 9.
[0627] Broj ćelija i procenat vijabilnosti za devet ciklusa upoređuje se na Slikama 12 i 13.
[0628] Ćelijski površinski markeri prikazani u rezultatima koji slede, analiziraju se protočnom citometrijom (Canto II protočni citometar, Becton, Dickinson, and Co., Franklin Lakes, NJ, USA) uz korišćenje komercijalno dostupnih reagenasa. Rezultati za markere od inetresa prikazani su na Slikama 14 do 23.
[0629] Različiti postupci koriste se za merenje dužine telomera u genomskoj DNK i citološkim preparatima. Analiza telomernih restrikcionih fragmenata (TRF) predstavlja zlatni standard za merenje dužine telomera (de Lange et al., 1990). Međutim, glavno ograničenja TRF je potreba za velikom količinom DNK (1.5 μg). Ovde se koriste dve tehnike za merenje dužine telomera koje su u širokoj primeni, i to su fluorescentna hibridizacija in situ (FISH) i kvantitativna PCR.
[0630] Flow-FISH izvodi se korišćenjem Dako kita (K532711-8 RUO šifra K5327 Telomere PNA Kit/FITC za protočnu citometriju, PNA FISH Kit/FITC. Flow, 20 testova) i prate se uputstva proizvođača za merenje prosečne dužine telomernih ponovaka. Ukratko, površina ćelija se oboji sa CD3 APC 20 minuta na 4°C, praćeno GAM Alexa 546, 20 minuta. Kompleks antigen-antitelo se zatim unakrsno poveže sa 2 mM BS3 (Fisher Scientific) hemijskim unakrsnim povezivačem. Vezivanje PNA-telomerne probe u standardnoj populaciji T-ćelija sa dugim telomerama, Jurkat 1301 liniji leukemijskih T ćelija (1301 ćelije) koristi se kao unutrašnji referentni standard u svakom testu. Pojedinačni TIL se broje posle inkubacije sa antitelom i mešaju sa 1301 ćelijama (ATCC) u odnosu ćelija 1:1. 5 × 10<5>TIL pomeša se sa 5 × 10<5>1301 ćelija. In situ hibridizacija izvede se u hibridizacionom rastvoru (70% formamid, 1% BSA, 20 mM Tris pH 7.0) u duplikatu i u prisustvu i odsustvu FITC-
1
konjugovane Telomere PNA probe (Panagene), FITC-00-CCC-TAA-CCC-TAA-CCC-TAA, komplementarne sa sekvencom telomernih ponovaka, u finalnoj koncentraciji od 60 nM. Posle dodavanja Telomere PNA probe, ćelije se inkubiraju 10 minuta na 81 °C u vodenom kupatilu na šejkeru. Ćelije se ostave u mraku na sobnoj temperaturi preko noći. Sledećeg jutra višak telomerne probe se ukloni ispiranjem u 2 promene PBS prethodno zagrejanog na 40°C. Posle ispiranja doda se DAPI (Invitrogen, Carlsbad, CA) u finalnoj koncentraciji od 75 ng/mL. Bojenje DNK pomoću DAPI koristi se za ograđivanje ćelija u G0/G1 populaciju. Analiza uzorka vrši se našim protočnim citometrom (BD Canto II, Mountain View, CA). Fluorescencija telomera testnog uzorka izražava se kao procenat fluorescencije (fl) 1301 ćelija po sledećoj formuli: Relativna dužina telomera = [(sr. vr. FITC fl testnih ćelija sa probom - sr. vr. FITC fl testnih ćelija bez probe) × DNK indeks 1301 ćelija × 100] / [(sr. vr. FITC fl 1301 ćelija sa probom - sr. vr. FITC fl 1301 ćelija bez probe) × DNK indeks testnih ćelija.
[0631] qPCR u realnom vremenu takođe se koristi za merenje relativne dužine telomera (Nucleic Acids Res.15. maj 2002; 30(10): e47., 20, Leukemia, 2013, 27, 897-906). Ukratko, određuje se odnos broja kopija telomernih ponovaka prema broju kopija pojedinačnog gena (T/S) korišćenjem BioRad PCR termalnog ciklizera (Hercules, CA) u formatu sa 96 bunarčića. Deset ng genomske DNK koristi se za PCR reakciju za telomere ili hemoglobin (hgb) i koriste se sledeći prajmeri: Tel-1b prajmer (CGG TTT GTT TGG GTT TGG GTT TGG GTT TGG GTT TGG GTT), Tel-2b prajmer (GGC TTG CCT TAC CCT TAC CCT TAC CCT TAC CCT TAC CCT), hgb1 prajmer (GCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGC), i hgb2 prajmer (CACCAACTTCATCCACGTTCACC). Svi uzorci se naliziraju reakcijama za telomere i hemoglobin, i analiza se izvodi u triplikatu na istoj ploči. Pored testnih uzoraka, svaka ploča sa 96 bunarčića sadrži bunarčiće za konstruisanje standardne krive od pet tačaka, od 0.08 ng do 250 ng uz korišćenje genomske DNK izolovane iz 1301 ćelijske linije. Odnos T/S (-dCt) za svaki uzorak izračunava se oduzimanjem medijane hemoglobinskog pražnog ciklusa (Ct) od medijane Ct telomera. Relativni odnos T/S (-ddCt) određuje se oduzimanjem odnosa T/S za tačku na standardnoj krivoj za 10.0 ng od T/S odnosa svakog nepozantog uzorka.
[0632] Rezultati Flow-FISH prikazani su na Slikama 24 i 25, i nije zapažena značajna razlika između procesa 1C i procesa 2A, što sugeriše da se iznenađujuća svojstva TIL proizvedenih procesom 2A ne mogu predvideti samo na osnovu starosti TIL.
[0633] U zaključku, proces 2A proizveo je potentni TIL proizvod sa "mladim" fenotipom što je definisano visokim nivoima kostimulatornih molekula, niskim nivoom markera iscrpljivanja, i povećanom sposobnošću sekrecije citokina posle reaktivacije. Skraćena 22-
2
dnevna ekspanziona platforma omogućava brzo generisanje doza TIL u kliničkim razmerama za pacijente kojima je potrebno brzo lečenje. Krioprezervirani lekoviti proizvod uvodi kritičnu logističku efikasnost omogućavajući brzu proizvodnju i fleksibilnost distribucije. Ovaj postupak ekspanzije prevazilazi tradicionalne prepreke za širu primenu TIL terapije.
PRIMER 11: UPOTREBA KOKTELA CITOKINA IL-2, IL-15, I IL-21
[0634] Ovaj primer opisuje upotrebu citokina IL-2, IL-15, i IL-21, kao dodatnih faktora rasta T ćelija, u kombinaciji sa TIL procesom Primera 1 do 10.
[0635] Koristeći proces Primera 1 do 10, gajeni su TIL iz kolorektalnog tumora, melanoma, tumora cerviksa, trostruko negativnog tumora dojke, tumora pluća i tumora bubrega, u prisustvu IL-2 u okviru jedne linije eksperimenta i, umesto IL-2, u prisustvu kombinacije IL-2, IL-15, i IL-21 u okviru druge linije eksperimenta, pri inicijaciji kulture. Na završetku pre-REP, kulture se procenjuju u pogledu ekspanzije, fenotipa, funkcije (CD107a+ i IFN-γ) i repertoara TCR Vβ. IL-15 i IL-21 opisani su na drugim mestima u ovom tekstu i u Gruijl, et al., IL-21 promotes the expansion of CD27+CD28+ tumor infiltrating lymphocytes with high cytotoxic potential and low collateral expansion of regulatory T cells, Santegoets, S. J., J Transl Med., 2013, 11:37 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3626797/).
[0636] Rezultati pokazuju da je poboljšana ekspanzija TIL (>20%), i to i CD4<+>i CD8<+>ćelija u uslovima tretmana IL-2, IL-15, i IL-21, zapažena u različitim tkivima, u odnosu na uslove prisustva samo IL-2. Postoji nagib ka pretežno CD8<+>populaciji uz nagib repertoara TCR Vβ u TIL dobijenim iz kultura tretiranih IL-2, IL-15, i IL-21 u odnosu na kulture tretirane samo IL-2. IFN-γ i CD107a bili su povišeni u TIL tretiranim IL-2, IL-15, i IL 21 u poređenju sa TIL tretiranim samo IL-2.
PRIMER 12: MULTICENTRIČNA TROKOHORTNA STUDIJA MELANOMA, FAZE 2
[0637] Ova multicentrična trokohortna studija Faze 2 dizajnirana je da bi se procenila bezbednost i efikasnost TIL terapije proizvedene prema procesu 1C (kako je opisano u ovom tekstu) kod pacijenata sa metastatskim melanomom. Kohorti jedan i dva obuhvatiće do 30 pacijenata svaki, a kohort tri je kohort ponovljenog tretmana za drugu TIL infuziju kod najviše deset pacijenata. Prva dva kohorta evaluiraju dva različita procesa proizvodnje: proces 1C i primer izvođenja procesa 2A (opisan u Primerima 1 do 10) respektivno. Pacijenti u kohortu jedan primaju sveže, nekrioprezervirane TIL, a pacijenti u kohortu dva primaju proizvod izrađen u procesu opisanom u Primerima 1 do 10, koji daje krioprezervirani
2 1
proizvod. Dizajn studije prikazan je na SL. 26. Studija je multicentrična trokohortna studija Faze 2 za procenu bezbednosti i efikasnosti autolognih TIL za lečenje potpopulacija pacijenata sa metastatskim melanomom. Ključni inkluzioni kriterijumi uključuju: merljivi metastatski melanom i ≥ 1 resektabilnih lezija za generisanje TIL; najmanje jedna ranija linija sistemske terapije; starost ≥ 18; i status ECOG performansi 0-1. Kohorti tretmana uključuju nekrioprezervirani TIL proizvod (pripremljen procesom 1C), krioprezervirani TIL proizvod (pripremljen primerom izvođenja procesa 2A), i ponovljeni tretman TIL proizvodom za pacijente bez odgovora ili kod kojih je bolest progredirala posle početnog odgovora. Primarni cilj je bezbednost, a sekundarni cilj je efikasnost, definisana kao objektivna stopa odgovora (objective response rate, ORR), stopa potpune remisije (complete remission rate, CRR), preživljavanje bez progresije (progression free survival, PFS), dužina odgovora (duration of response, DOR), i ukupno preživljavanje (overall survival, OS).
PRIMER 13: KVALIFIKOVANJE POJEDINAČNIH PARTIJA GAMA-OZRAČENIH PERIFERNIH MONONUKLEARNIH ĆELIJA
[0638] Ovaj primer opisuje novu skraćenu proceduru kvalifikovanja pojedinačnih partija gama-ozračenih perifernih mononuklearnih ćelija (PBMC, poznate i kao MNC) koje se koriste kao alogene ćelije-hraniteljice u primerima postupaka opisanih u ovom tekstu.
[0639] Svaka partija ozračenih MNC hraniteljica pripremljena je od individualnog donora. Svaka partija ili donor pregleda se pojedinačno u pogledu sposobnosti ekspandiranja TIL u REP u prisustvu prečišćenog anti-CD3 (klon OKT3) antitela i interleukina-2 (IL-2). Pored toga, svaka partija hraniteljica testirana je bez dodavanja TIL da bi se verifikovalo da je primljena doza gama zračenja dovoljna da ih učini replikaciono nekompetentnim.
Definicije/Skraćenice
[0640]
BSC - Kabinet za biološku bezbednost
CD3 - Klaster diferencijacije 3; površinski markerski protein T-limfocita
CF - Centrifuga
CM2 - Kompletni medijum za TIL #
CMO - Organizacija za ugovornu proizvodnju (Contract Manufacturing Organization) CO2 - Ugljen-dioksid
EtOH - Etil alkohol
2 2
GMP - Dobra proizvođačka praksa
IL-2 - Interleukin 2
IU - Internacionalne jedinice
LN2 - Tečni azot
mini-REP - Mini-brzi protokol ekspanzije (Mini-Rapid Expansion Protocol
ml - Mililitar
MNC - Mononuklearne ćelije (Mononuclear Cells)
NA - Nije primenljivo
OKT3 - MACS GMP CD3 čisto (klon OKT3) antitelo
PPE - Lična zaštitna oprema (Personal Protective Equipment)
Pre-REP - Pre protokola brze ekspanzije (Before Rapid Expansion Protocol)
QS - Quantum satis; dopuniti do ove količine
REP - Protokol brze ekspanzije (Rapid Expansion Protocol)
TIL - Tumor-iInfiltrirajući limfociti
T25 - flakon za kulturu tkiva sa površinom 25 cm<2>
μg - Mikrogrami
μL - Mikrolitar
PROCEDURA
Osnov
[0641]
7.1.1 Gama-ozračene MNC ćelije-hraniteljice zaustavljene u rastu potrebne su za REP TIL. Membranski receptori na MNC hraniteljicama vezuju se za anti-CD3 (klon OKT3) antitelo i unakrsno povezuju sa TIL u REP flakonu, stimulišući TIL na ekspanziju. Partije hraniteljica pripremaju se leukoferezom cele krvi dobijene od individualnih donora. Proizvod leukofereze se centrifugira na Ficoll-Hypaque, ispere, ozrači i krioprezrvira u uslovima GMP.
7.1.2 Važno je da se pacijentu koji je primio TIL terapiju infuzijom ne daju vijabilne ćelije-hraniteljice jer to može rezultovati bolešću kalema protiv domaćina (graftversus-host disease, GVHD). Rast ćelija-hraniteljica se zato zaustavlja doziranjem ćelija gama zračenjem, što rezultuje dvolančanim prekidima u DNK i gubitkom vijabilnosti MNC ćelija posle rekultivisanja.
2
Kriterijumi evaluacije i postavka eksperimenta
[0642] Partije hraniteljica procenjuju se na osnovu dva kriterijuma: 1) sposobnost da ekspandiraju TIL u kokulturi >100 puta i 2) replikativna nekompetentnost.
7.2.2 Partije hraniteljica testiraju se u mini-REP formatu uz korišćenje dve primarne pre-REP TIL linije koje su rasle u uspravnim T25 flakonima za kulturu tkiva.
7.2.3 Partije hraniteljica se testiraju u odnosu na dve različite linije TIL, jer je svaka TIL linija jedinstvena po svojoj sposobnosti za proliferaciju u odgovoru na aktivaciju u REP.
7.2.4 Kao kontrola, partija ozračenih MNC ćelija-hraniteljica za koje je odranije poznato da zadovoljavaju kriterijume iz 7.2.1, puštaju se uz testne partije.
7.2.5 Da bi se osiguralo da se sve partije testirane u jednom eksperimentu testiraju ekvivalentno, na raspolaganju ima dovoljno stokova istih pre-REP TIL linija za tetsiranje svih uslova i svih partija hraniteljica.
7.2.6 Za svaku partiju testiranih ćelija-hraniteljica, bilo je ukupno šest T25 flakona:
7.2.6.1 Pre-REP TIL linija #1 (2 flakona)
7.2.6.2 Pre-REP TIL linija #2 (2 flakona)
7.2.6.3 Kontrola hraniteljica (2 flakona)
NOTE: Flakoni koji sadrže TIL linije #1 i #2 služili su za evaluiranje sposobnosti partije hraniteljica da ekspandiraju TIL. Kontrolni flakoni sa hraniteljicama služili su za evaluiranje replikacione nekompetencije partije hraniteljica.
Protokol eksperimenta
[0643]
7.3.1 Dan -2/3, odmrzavanje TIL linije
7.3.1.1 Pripremiti CM2 medijum.
7.3.1.2 Zagrejati CM2 u vodenom kupatilu na 37°C.
2 4
7.3.1.3 Pripremiti 40 ml CM2 suplementisanog sa 3000 IU/ml IL-2. Držati na toplom do upotrebe.
7.3.1.4 Staviti 20 ml ranije zagrejang CM2 bez IL-2 u svaku od dve 50 ml konusne epruvete obeležene imenima upotrebljenih TIL linija.
7.3.1.5 Uzeti dve označene pre-REP TIL linije iz LN2-skladišta i fiole preneti u sobu za kulturu tkiva.
7.3.1.6 Zabeležiti oznake TIL linije.
7.3.1.7 Odmrznuti fiole stavljajući ih u kesu za skladištenje koja se zatvara zipom i zatim u vodeno kupatilo na 37°C dok ne ostane samo mala količina leda.
7.3.1.8 Poprskati ili prebrisati odmrznute fiole 70% etanolom i preneti fiole u BSC.
7.3.1.9 Koristeći sterilnu pipetu za transfer, odmah preneti sadržaj fiole u 20 ml CM2 u pripremljenoj obeleženoj 50 ml konusnoj epruveti.
7.3.1.10 QS do 40 ml korišćenjem CM2 bez IL-2 da se isperu ćelije.
7.3.1.11 Centrifugirati na 400 x CF 5 minuta.
7.3.1.12 Aspirirati supernatant i resuspendovati u 5 ml toplog CM2 suplementisanog sa 3000 IU/ml IL-2.
7.3.1.13 Uzeti mali alikvot (20 μl) u duplikatu za brojanje ćelija automatskim brojačem ćelija. Zabeležiti brojeve.
7.3.1.14 Dok se broji, staviti 50 ml konusnu epruvetu sa TIL ćelijama u humidifikovani inkubator na 37°C, 5% CO2, sa labavom kapicom da se omogući razmena gasova.
7.3.1.15 Odrediti koncentraciju ćelija i razblažiti TIL do 1 x 10<6>ćelija/ml u CM2 suplementisanom sa IL-2 pri 3000 IU/ml.
2
7.3.1.16 Kultivisati u 2 ml/bunarčiću ploče za kulturu tkiva sa 24 bunarčića u onoliko bunarčića koliko je potrebno, u humidifikovanom inkubatoru na 37°C do Dana 0 mini-REP.
7.3.1.17 Kultivisati različite TIL linije u zasebnim pločama za kulturu tkiva sa 24 bunarčića da se izbegne zabuna i moguća ukrštena kontaminacija.
an 0, iniciranje Mini-REP
7.3.2.1 Pripremiti dovoljno CM2 medijuma za onaj broj partija hraniteljica koje će se testirati, (npr., za testiranje 4 partije hraniteljica u isto vreme, pripremiti 800 ml CM2 medijuma).
7.3.2.2 Alikvotirati deo CM2 pripremljenog u 7.3.2.1 i suplementisati sa 3000 IU/ml IL-2 za kultivaciju ćelija. (npr., za testiranje 4 partije hraniteljica u isto vreme, pripremiti 500 ml CM2 medijuma sa 3000 IU/ml IL-2).
7.3.2.3 Preostali CM2 bez IL-2 upotrebiće se za ispiranje ćelija kako je opisano u nastavku.
7.3.2.4 Raditi sa svakom TIL linijom odvojeno da bi se sprečila ukrštena kontaminacija, izvaditi ploču sa 24 bunarčića sa TIL kulturom iz inkubatora i preneti u BSC.
7.3.2.5 Koristeći sterilnu pipetu za transfer ili 100-1000 μl automatsku pipetu sa nastavkom, uzeti oko 1 ml medijuma iz svakog bunarčića TIL koji će se koristiti i staviti u neupotrebljeni bunarčić ploče za kulturu tkiva sa 24 bunarčića. Ovo se koristi za ispiranje bunarčića.
7.3.2.6 Koristeći novu sterilnu pipetu za transfer ili 100-1000 μl automatsku pipetu sa nastavkom, izmešati preostali medijum sa TIL u bunarčićima da se ćelije resuspenduju i zatim preneti ćelijsku suspenziju u 50 ml konusnu epruvetu označenu imenom TIL i zabeležiti zapreminu.
7.3.2.7 Isprati bunarčiće rezervnim medijumom i preneti tu zapreminu u istu 50 ml konusnu epruvetu.
7.3.2.8 Centrifugirati ćelije na 400 x CF da se sakupi ćelijski pelet.
2
7.3.2.9 Aspirirati supernatant i ćelijski pelet resuspendovati u 2-5 ml CM2 medijuma koji sadrži 3000 IU/ml IL-2, zapremina koja će se koristiti bazira se na broju sakupljenih bunarčića i veličini peleta - zapremina treba da bude dovoljna da se osigura koncentracija od >1.3 x 106 ćelija/ml.
7.3.2.10 Koristeći serološku pipetu, dobro izmešati ćelijsku suspenziju i zabeležiti zapreminu.
7.3.2.11 Uzeti 200 μl za brojanje ćelija automatskim brojačem ćelija.
7.3.2.12 Dok se broji, staviti 50 ml konusnu epruvetu sa TIL ćelijama u humidifikovani inkubator na 37°C, 5% CO2, sa labavom kapicom da se omogući razmena gasova
7.3.2.13 Zabeležiti brojeve ćelija.
7.3.2.14 Uzeti 50 ml konusnu epruvetu koja sadrži TIL ćelije iz inkubatora i resuspendovati ćelije u koncentraciji od 1.3 x10<6>ćelija/ml u toplom CM2 suplementisanom sa 3000 IU/ml IL-2. Vratiti 50 ml konusnu epruvetu u inkubator, sa labavo postavljenom kapicom.
7.3.2.15 Po želji, zadržati originalnu ploču sa 24 bunarčića za rekultivisanje rezidualnih TIL ako ih ima.
7.3.2.16 Ponoviti korake 7.3.2.4 - 7.3.2.15 za drugu TIL liniju.
7.3.2.17 Neposredno pre zasejavanja TIL u T25 flakone za eksperiment, TIL se razblaže 1:10 za finalnu koncentraciju od 1.3 x 10<5>ćelija/ml kao za korak 7.3.2.35 u nastavku.
Pripremanje radnog rastvora MACS GMP CD3 čisto (OKT3)
[0644]
7.3.2.18 Izvaditi stok rastvor OKT3 (1 mg/ml) iz frižidera na 4°C i staviti u BSC.
7.3.2.19 Finalna koncentracija od 30 ng/ml OKT3 koristi se u medijumu mini-REP.
2
7.3.2.20 600 ng OKT3 potrebno je za 20 ml u svakom od T25 flakona eksperimenta; ovo je ekvivalentno sa 60 μl rastvora koncentracije 10 μg/ml za svakih 20 ml, ili 360 μl za svih 6 flakona testiranih za svaku partiju hraniteljica.
7.3.2.21 Za svaku testiranu partiju hraniteljica, napraviti 400 μl razblaženja 1:100 1 mg/ml OKT3 za radnu koncentraciju od 10 μg/ml (npr., za testiranje 4 partije hraniteljica, napraviti 1600 μl 1:100 razblaženja 1 mg/ml OKT3: 16 μl 1mg/ml OKT3 1.584 ml CM2 medijuma sa 3000 IU/ml IL-2.)
Pripremanje T25 flakona
[0645]
7.3.2.22 Obeležiti svaki flakon imenom testirane linije TIL, brojem replike flakona, brojem partije hraniteljica, datumom i inicijalima analitičara.
7.3.2.23 Napuniti flakon CM2 medijumom pre pripremanja ćelija-hraniteljica.
7.3.2.24 Staviti flakone u humidifikovani inkubator na 37°C, 5% CO2da se medijum održi toplim dok se čeka da mu se dodaju ostale komponente.
7.3.2.25 Kada se ćelije-hraniteljice pripreme, komponente će se dodavati u CM2 u svakom flakonu.
[0646] Pripremanje radnog rastvora MACS GMP CD3 čisto (OKT3).
TABELA 21: Rastvori
2
Pripremanje ćelija-hraniteljica
[0647]
7.3.2.26 Za ovaj protokol potrebno je najmanje 78 x 106 ćelija-hraniteljica po testiranom lotu. Svaka 1 ml fiola zamrznuta od strane SDBB imala je 100 x 106 vijabilnih ćelija po zamrzavanju. Pošto se oporavak posle odmrzavanja posle skladištenja u LN2 procenjuje na 50%, preporučuje se da se odmrznu najmanje dve 1 ml fiole ćelija-hraniteljica po partiji dajući procenjenih 100 x 10<6>vijabilnih ćelija za svaki REP. Alternativno, ako su u fiolama od 1.8 ml, jedna fiola obezbeđuje dovoljno ćelija-hraniteljica.
7.3.2.27 Pre odmrzavanja ćelija-hraniteljica, ranije zagrejati približno 50 ml CM2 bez IL-2 za svaku partiju hraniteljica koje će se testirati.
7.3.2.28 Izvaditi označene fiole sa partijom hraniteljica iz LN2 skladišta, staviti u kesu koja se zatvara zipom i staviti na led. Preneti fiole u sobu za kulturu tkiva.
7.3.2.29 Odmrznuti fiole u kesi za skladištenje zatvorenoj zipom, potapanjem kese u vodeno kupatilo na 37°C.
7.3.2.30 Izvaditi fiole iz kese koja se zatvara zipom, poprskati ili prebrisati 70% EtOH i preneti fiole u BSC.
7.3.2.31 Koristeći pipetu za transfer odmah preneti sadržaje fiola sa hraniteljicama u 30 ml toplog CM2 u 50 ml konusnoj epruveti. Isprati fiolu malom zapreminom CM2 da se uklone rezidualne ćelije u fioli, ako ih ima.
7.3.2.32 Centrifugirati na 400 x CF 5 minuta.
7.3.2.33 Aspirirati supernatant i resuspendovati u 4 ml toplog CM2 plus 3000 IU/ml IL-2.
7.3.2.34 Uzeti 200 μl za brojanje ćelija automatskim brojačem ćelija. Zabeležiti dobijene podatke.
2
7.3.2.34 Resuspendovati ćelije pri 1.3 x 10<7>ćelija/ml u toplom CM2 plus 3000 IU/ml IL-2.
7.3.2.34 Razblažiti TIL ćelije sa 1.3 x 10<6>ćelija/ml do 1.3 x 10<5>ćelija/ml. Raditi sa svakom linijom TIL nezavisno da bi se sprečila ukrštena kontaminacija.
Postavljanje kokulture
[0648]
7.3.2.36 Razblažiti TIL ćelije od 1.3 x 10<6>ćelija/ml do 1.3 x 10<5>ćelija/ml. Raditi sa svakom linijom TIL nezavisno da bi se sprečila ukrštena kontaminacija.
7.3.2.36.1 Dodati 4.5 ml CM2 medijuma u 15 ml konusnu epruvetu.
7.3.2.36.2 Izvaditi TIL ćelije iz inkubatora i resuspendovati ih dobro korišćenjem 10 ml serološkel pipete.
7.3.2.36.3 Uzeti 0.5 ml ćelija iz 1.3 x 10<6>ćelija/ml TIL suspenzije i dodati u 4.5 ml medijuma u 15 ml konusnoj epruveti. Vratiti fiole sa stokom TIL u inkubator.
7.3.2.36.4 Dobro izmešati.
7.3.2.36.5 Ponoviti korake 7.3.2.36.1 - 7.3.2.36.4 za drugu liniju TIL.
7.3.2.36.6 Ako se testira više od jedne partije hraniteljica istovremeno, razblažiti TIL do niže koncentracije za svaku partiju hranitlejica neposredno pre zasejavanja TIL.
7.3.2.37 Preneti flakone sa ranije zagrejanim medijumom za jedanu partiju hraniteljica iz inkubatora u BSC.
7.3.2.38 Izmešati ćelije-hraniteljice pipetiranjem gore-dole nekoliko puta 1 ml vrhom pipete i preneti 1 ml (1.3 x 107 ćelija) u svaki flakon za tu partiju hraniteljica.
7.3.2.39 Dodati 60 μl OKT3 radnog stoka (10 μg/ml) u svaki flakon.
7.3.2.40 Vratiti dva kontrolna flakona u inkubator.
21
7.3.2.41 Preneti 1 ml (1.3 x 10<5>) svake partije TIL u odgovarajuće obeleženi T25 flakon.
7.3.2.42 Vratiti flakone u inkubator i inkubirati uspravno. Ne dirati do Dana 5.
7.3.2.43 Ponoviti 7.3.2.36 - 7.3.2.42 za sve partije hraniteljica koje se testiraju.
Dan 5, Promena medijuma
[0649]
7.3.3.1 Pripremiti CM2 sa 3000 IU/ml IL-2. 10 ml je potrebno za svaki flakon
7.3.3.2 Da bi se sprečila unakrsna kontaminacija, raditi sa jednim po jednim flakonom za partije hraniteljica. Uzeti flakone iz inkubatora i preneti ih u BSC, paziti da se ne poremeti sloj ćelija na dnu flakona.
7.3.3.3 Ponoviti za sve flakone uključujući kontrolni.
7.3.3.4 Pipetom od 10 ml preneti 10 ml toplog CM2 sa 3000 IU/ml IL-2 u svaki flakon.
7.3.3.5 Vratiti flakone u inkubator i inkuborati uspravno do Dana 7. Ponoviti 7.3.3.1 -7.3.3.6 za sve testirane partije hraniteljica.
Dan 7, Sakupljanje
[0650]
7.3.4.1 Da bi se sprečila unakrsna kontaminacija, raditi sa jednim po jednim flakonom za partije hraniteljica.
7.3.4.2 Uzeti flakone iz inkubatora i preneti ih u BSC, paziti da se ne poremeti sloj ćelija na dnu flakona.
7.3.4.3 Bez remećenja ćelija na dnu flakona, uzeti 10 ml medijuma iz svakog testnog flakona i 15 ml medijuma iz svakog kontrolnog flakona.
7.3.4.4 Koristeći serološku pipetu od 10 ml, resuspendovati ćelije u preostalom medijumu i dobro izmešati da se razbiju grudvice ćelija ako ih ima.
7.3.4.5 Zabeležiti zapreminu svakog flakona.
7.3.4.6 Pošto se ćelijska suspenzija dobro izmeša pipetiranjem, uzeti 200 μl za brojanje ćelija.
7.3.4.7 Brojati TIL koristeći odgovarajuću standardnu radnu proceduru i opremu za automatsko brojanje ćelija.
7.3.4.8 Zabeležiti rezultate brojanja na Dan 7.
7.3.4.9 Ponoviti 7.3.4.1 - 7.3.4.8 za sve testirane partije hraniteljica.
7.3.4.10 Kontrolni flakoni za hraniteljice evaluiraju se u pogledu nekompetencije za replikaciju i flakoni koji sadrže TIL evaluiraju se u pogledu broja puta ekspanzije od Dana 0 prema kriterijumima navedenim u Tabeli 21 (dole).
Dan 7, nastavak sa kontrolnim flakonima za hraniteljice do Dana 14
[0651]
7.3.5.1 Posle završetka brojanja kontrolnih flakona za hraniteljice na Dan 7, dodati 15 ml svežeg CM2 medijuma sa 3000 IU/ml IL-2 u svaki od kontrolnih flakona.
7.3.5.2 Vratiti kontrolne flakone u inkubator i inkubirati u uspravnom položaju do Dana 14.
Dan 14, Produženi izostanak proliferacije kontrolnih flakona za hraniteljice
[0652]
7.3.6.1 Da bi se sprečila unakrsna kontaminacija, raditi sa jednim po jednim flakonom za partije hraniteljica.
7.3.6.2 Uzeti flakone iz inkubatora i preneti ih u BSC, paziti da se ne poremeti sloj ćelija na dnu flakona.
7.3.6.3 Bez remećenja ćelija koje rastu na dnu flakona, uzeti približno 17 ml medijuma iz svakog kontrolnog flakona.
7.3.6.4 Koristeći serološku pipetu od 5 ml, resuspendovati ćelije u preostalom medijumu i dobro izmešati da se razbiju grudvice ćelija ako ih ima.
7.3.6.5 Zabeležiti zapreminu svakog flakona.
7.3.6.6 Pošto se ćelijska suspenzija dobro izmeša pipetiranjem, uzeti 200 μl za brojanje ćelija
7.3.6.7 Brojati TIL koristeći odgovarajuću standardnu radnu proceduru i opremu za automatsko brojanje ćelija
7.3.6.8 Zabeležiti rezultate brojanja.
7.3.6.9 Ponoviti 7.3.4.1 - 7.3.4.8 za sve testirane partije hraniteljica.
REZULTATI I KRITERIJUMI PRIHVATLJIVOSTI
Rezultati
[0653]
10.1.1 Doza gama-zračenja bila je dovoljna da učini ćelije-hraniteljice replikaciono nekompetentnim. Očekuje se da sve partije ispune evaluacione kriterijume i pokažu smanjenje ukupnog broja ćelija-hraniteljica preostalih na Dan 7 REP kulture u poređenju sa Danom 0.
10.1.2 Očekuje se da sve partije hraniteljica ispune evaluacione kriterijume stostruke ekspanzije rasta TIL do Dana 7 REP kulture.
10.1.3 Očekuje se da brojanje kontrolnih flakona za hraniteljice na Dan 14 pokaže nastavak trenda izostanka proliferacije viđenog na Dan 7.
Kriterijumi prihvatljivosti
[0654]
10.2.1 Sledeći kriterijumi prihvatljivosti bili su zadovoljeni za svaki testirani ponovak TIL linije za svaku partiju ćelija-hraniteljica
10.2.2 Prihvatljivost je bila dupla, kako sledi (navedeno u Tabeli dole).
21
TABELA 22: Kriterijumi prihvatljivosti
10.2.2.1 Evaluirati da li su doze zračenja dovoljne da MNC ćelije-hraniteljice učine replikaciono nekompetentnim kada se kultivišu u prisustvu 30 ng/ml OKT3 antitela i 3000 IU/ml IL-2.
10.2.2.1.1 Replikaciona nekompetentnost se evaluira ukupnim brojem vijabilnih ćelija (total viable cell count, TVC) koji se određuje automatizovanim brojanjem ćelija na Dan 7 i Dan 14 REP.
10.2.2.1.2 Kriterijum prihvatljivosti bio je "Nema rasta" što znači da ukupan broj vijabilnih ćelija nije povećan na Dan 7 i Dan 14 u odnosu na početan broj vijabilnih ćelija stavljenih u kulturu na Dan 0 REP.
10.2.2.2 Evaluirati sposobnost ćelija-hraniteljica da podrže TIL ekspanziju.
10.2.2.2.1 Rast TIL se meri u okvirima broja puta ekspanzije vijabilnih ćelija od uspostavljanja kulture na Dan 0 REP do Dana 7 REP.
10.2.2.2.1 Na Dan 7, TIL kulture dostižu najmanje stostruku ekspanziju, (tj., više od 100 puta od broja vijabilnih TIL ćelija stavljenih u kulturu na REP Dan 0), evaluirano automatizovanim brojanjem ćelija.
10.2.2.3 Ako partija ne ispuni dva gorenavedena kriterijuma, partija se ponovo testira u skladu sa planom za nepredviđene okolnosti navedenim u Odeljku 10.3 dole.
10.2.2.4 Posle ponovljenog testiranja neuspešne partije, isključuje se svaka partija MNC hraniteljica koja nije zadovoljila dva kriterijuma prihvatljivosti u originalnoj evaluaciji i testiranju za nepredviđene okolnosti.
10.2.2.5 Partije MNC hraniteljica koje su zadovoljile kriterijume prihvatljivosti, ali za koje je procenjeno da imaju loše performanse u pogledu sposobnosti da ekspandiraju TIL u odnosu na ranije partije hraniteljica testiranih paralelno istim pre-REP TIL linijama, isključuju se.
Testiranje za nepredviđene okolnosti partija MNC hraniteljica koje nisu zadovoljile kriterijume prihvatljivosti
[0655]
10.3.1 U slučaju da MNC hraniteljice nisu zadovoljile nijedan od kriterijuma prihvatljivosti navedenih u Odeljku 10.2 gore, preduzeće se sledeći koraci za ponovno testiranje partije da bi se odbacila greška eksperimentatora kao njihov uzrok.
10.3.2 Ako postoje dve ili više satelitskih testnih fiola za partiju, onda se partija ponovo testira. Ukoliko ne postoji ili postoji jedna preostala satelitska testna fiola partije, onda je lot neuspešan prema kriterijumima prihvatljivosti navedenim u Odeljku 10.2 gore.
10.3.3 Dve obučene osobe uključujući originalnu osobu koja je evaluirala partiju o kojoj je reč, istovremeno testiraju partiju.
10.3.4 Ponavljaju se odeljci 7.2 - 7.3 da bi se ponovo evaluirale partije o kojima je reč.
10.3.5 Svaka osoba testira partiju o kojoj je reč i kontrolnu partiju (definisanu u Odeljku 7.2.4 gore).
10.3.6 Da bi se kvalifikovala, partiju o kojoj je reč i kontrolna partija treba da dostignu kriterijume prihvatljivosti iz Odeljka 10.2 kod obe osobe koje vrše testiranje za slučaj nepredviđenih okolnosti.
10.3.7 Posle zadovoljavanja kriterijuma, partija se oslobađa za CMO upotrebu kako je navedeno u Odeljku 10.2 gore.
PRIMER 14: KVALIFIKOVANJE POJEDINAČNIH PARTIJA GAMA-OZRAČENIH MONONUKLEARNIH ĆELIJA PERIFERNE KRVI
[0656] Ovaj primer opisuje novu skraćenu proceduru za kvalifikovanje pojedinačnih partija gama-ozračenih mononukearnih ćelija periferne krvi (PBMC) koje će se koristiti kao alogene ćelije-hraniteljice u primerima postupaka opisanimu ovom tekstu. Ovaj primer obezbeđuje
21
protokol za evaluaciju ozračenih PBMC partija ćelija za upotrebu u proizvodnji kliničkih partija TIL. Svaka partija ozračenih PBMC pripremljena je od individualnog donora. Tokom više od 100 protokola kvalifikacije, pokazalo se, u svim slučajevima, da ozračene partije PBMC iz SDBB (San Diego Blood Bank) ekspandiraju TIL >100 puta na Dan 7 REP. Ovaj modifikovani protokol kvalifikovanja namenjen je primeni na ozračene donorske partije PBMC iz SDBB koje su zatim dodatno testirane da bi se verifikovalo da je primljena doza gama zračenja dovoljna da ih učini replikaciono nekompetentnim. Kada se pokaže da su zadržale replikacionu nekompetenciju tokom 14 dana, partije donorskih PBMC smatarju se "kvalifikovanim" za upotrebu u proizvodnji kliničkih partija TIL.
Ključni izrazi i definicije
[0657]
μg - Mikrogram
μl - Mikrolitar
AIM-V - komercijalno dostupni medijum za kulturu ćelija Kabinet za biološku bezbednost
BSC - Klaster diferencijacije
CD - Kompletni medijum za TIL #2
CM2 - CM2 suplementisan sa 3000 IU/ml IL-2
CM2IL2 - Organizacija koja obavlja ugovornu proizvodnju
CO2- Ugljen-dioksid
EtOH - Etanol
GMP - Dobra proizvođačka praksa
Gy - Gray
IL - Interleukin
IU - Internacionalne jedinice
LN2 - Tečni azot
Ml - Mililitar
NA - Nije primenljivo
OKT3 - oznaka za anti-CD3 monoklonsko antitelo
P20 - 2-20 μl automatska pipeta
P200 - 20-200 μl automatska pipeta
PBMC - mononuklearne ćelije periferne krvi
21
P1000 - 100-1000 μl automatska pipeta
PPE - Lična zaštitna oprema
REP - Protokol brze ekspanzije
SDBB - Banka krvi iz San Dijega
TIL - Tumor-infiltrirajući limfociti
T25 - Flakon za kulturu tkiva sa površinom 25 cm<2>
x g - "puta gravitacija" - mera relativne centrifugalne sile
[0658] Uzorci uključuju ozračene donorske PBMC (SDBB).
Procedura
Osnov
[0659] 7.1.1 Gama-ozračene PBMC zaustavljene u rastu potrebne su za sadašnje standardne REP TIL. Membranski receptori na PBMC vezuju se za anti-CD3 (klon OKT3) antitelo i povezuju sa TIL u kulturi, stimulišući TIL na ekspanziju. Partije PBMC pripremaju se leukoferezom cele krvi uzete od individualnih donora. Proizvod leukofereze se centrifugira na Ficoll-Hypaque, ispere, ozrači i krioprezervira pod uslovima GMP. Važno je da se pacijentima koji su primili TIL terapiju infuzijom ne daju vijabilne PBMC jer to može rezultovati bolešću kalema protiv domaćina (GVHD). Rast donorskih PBMC se zato zaustavlja doziranjem ćelija gama-zračenjem, što rezultuje dvolančanim prekidima u DNK i gubitkom vijabilnosti PBMC posle rekultivisanja.
Evaluacioni kriterijumi
[0660] 7.2.1 Evaluacioni kriterijum za ozračene partije PBMC bila je njihova replikaciona nekompetencija.
Postavka eksperimenta
[0661]
7.3.1 Partije hraniteljica testiraju se u mini-REP formatu da li će biti kokultivisane sa TIL, korišćenjem uspravnih T25 flakona za kulturu tkiva.
21
7.3.1.1 Kontrolna partija: Jedna partija ozračenih PBMC, za koje je odranije poznato da zadovoljavaju kriterijume iz 7.2.1 pušta se zajedno sa eksperimentalnim partijama, kao kontrola.
7.3.2 Za svaku partiju testiranih ozračenih donorskih PBMC, puštaju se flakoni u duplikatu.
Eksperimentalni protokol
[0662] Sav rad u ovom protokolu odvija se korišćenjem sterilne tehnike u BSC.
Dan 0
[0663]
7.4.1 Pripremiti ∼90 ml CM2 medijuma za svaku partiju donorskih PBMC koje će se testirati. Držati CM2 zagrejan u vodenom kupatilu na 37°C.
7.4.2 Odmrznuti alikvot 6 x 106 IU/ml IL-2.
7.4.3 Vratiti CM2 medijum u BSC, obrisati 70% EtOH pre stavljanja u digestor. Za svaku testiranu partiju PBMC, uzeti oko 60 ml CM2 u zasebnu sterilnu bocu. Dodati IL-2 iz odmrznutog 6 x 106 IU/ml stok-rastvora u ovaj medijum za postizanje finalne koncentracije od 3000 IU/ml. Označiti ovu bocu kao "CM2/IL2" (ili slično) da bi se razlikovala od nesuplementisanog CM2.
7.4.4 Označiti dva T25 flakona za svaku partiju PBMC koja će se testirati. Minimalna oznaka uključuje:
7.4.4.1 Broj partije
7.4.4.2 Broj flakona (1 ili 2)
7.4.4.3 Datum inicijacije kulture (Dan 0)
Pripremiti OKT3
[0664]
7.4.5 Izvaditi stok rastvor anti-CD3 (OKT3) iz frižidera na 4°C i staviti u BSC.
21
7.4.6 Finalna koncentracija od 30 ng/ml OKT3 koristi se u medijumu mini-REP.
7.4.7 Pripremiti 10 μg/ml radni rastvor anti-CD3 (OKT3) od 1 mg/ml stok-rastvora. Staviti u frižider do upotrebe.
7.4.7.1 Za svaku testiranu partiju PBMC, pripremiti 150 μl 1:100 razblaženja anti-CD3 (OKT3) stoka Npr., za testiranje 4 partije PBMC u jednom trenutku, pripremiti 600 μl 10 μg/ml anti-CD3 (OKT3) dodavanjem 6 μl 1mg/ml stokrastvora u 594 μl CM2 suplementisanog sa 3000 IU/ml IL-2.
Pripremanje flakona
[0665] 7.4.8 Dodati 19 ml po flakonu CM2/IL-2 u obeležene T25 flakone i staviti flakone u humidifikovani inkubator na 37°C, 5% CO2dok se pripremaju ćelije.
Pripremanje ozračenih PBMC
[0666]
7.4.9 Raditi sa jednom po jednom partijom donorskih PBMC da bi se izbegla moguća unakrsna kontaminacija partija.
7.4.10 Uzeti partije PBMC koje će se testirati iz skladišta u LN2. Bile su na -80°C ili držane na suvom ledu pre odmrzavanja.
7.4.11 Staviti 30 ml CM2 (bez IL-2) u konusne epruvete od 50 ml za svaku partiju koja će se odmrznuti. Obeležiti svaku epruvetu različitim brojem partije PBMC koja će se odmrznuti. Staviti čvrsto kapice na epruvete i staviti u vodeno kupatilo na 37°C pre upotrebe. Po potrebi, vratiti konusne epruvete od 50 ml u BSC, obrisati korišćenjem 70% EtOH pre stavljanja u digestor.
7.4.12 Uzeti fiole sa PBMC iz hladnog skladišta i staviti ih na plutajući stalak za epruvete u vodeno kupatilo na 37°C da se odmrznu. Pustiti da se odmrzavanje odvija dok u fioli ne ostane samo mala količina leda.
7.4.13 Poprskati ili prebrisati fiolu korišćenjem 70% EtOH i preneti u BSC.
7.4.14 Koristeći sterilnu pipetu za transfer, odmah prebaciti sadržaj fiole u 30 ml CM2 u konusnoj epruveti od 50 ml. Uzeti oko 1 ml medijuma iz epruvete da se ispere fiola;
21
vratiti ispirak u 50 ml konusnu epruvetu. Staviti kapicu čvrsto i blago provrteti da se ćelije isperu.
7.4.15 Centrifugirati na 400 x g 5 min na sobnoj temperaturi.
7.4.16 Aspirirati supernatant i resuspendovati ćelijski pelet u 1ml toplog CM2/IL-2 korišćenjem 1000 μl vrha pipete. Alternativno, pre dodavanja medijuma, resuspendovati ćelijski pelet povlačenjem epruvete duž praznog stalka za epruvete. Posle resuspendovanja ćelijskog peleta, dovesti zapreminu do 4 ml korišćenjem CM2/IL-2 medijuma. Zabeležiti zapreminu.
7.4.17 Uzeti mali alikvot (npr., 100 μl) za brojanje ćelija automatskim brojačem ćelija.
7.4.17.1 Izvršiti brojanje u duplikatu prema SOP za određeni automatizovani brojač ćelija. Najverovatnije će biti potrebno da se PBMC razblaže pre brojanja ćelija. Preporučeno početno razblaženje je 1:10, ali ovo varira u zavisnosti od tipa upotrebljenog brojača ćelija.
7.4.17.2 Zabeležiti rezultate brojanja.
7.4.18 Podesiti koncentraciju PBMC na 1.3 x 107 ćelija/ml kao za radni list u koraku 7.4.15.2 korišćenjem CM2/IL-2 medijuma. Izmešati dobro blagim kružnim pokretima ili blagim aspiriranjem i vraćanjem, pomoću serološke pipete.
Postavljanje flakona za kulturu
[0667]
7.4.19 Iz inkubatora za kulturu tkiva vratiti dva obeležena T25 flakona u BSC.
7.4.20 Vratiti fiolu sa 10 mg/ml anti-CD3/OKT3 u BSC.
7.4.21 Dodati 1 ml 1.3 x 107 PBMC ćelijske suspenzije u svaki flakon.
7.4.22 Dodati 60 μl 10 μg/ml anti-CD3/OKT3 u svaki flakon.
7.4.23 Vratiti poklopljene flakone u inkubator za kulturu tkiva na 14 dana rasta bez uznemiravanja.
7.4.24 Staviti anti-CD3/OKT3 fiolu nazad u frižider do korišćenja za sledeću partiju.
22
7.4.25 Ponoviti korake 7.4.9 - 7.4.24 za svaku partiju PBMC koju treba evaluirati.
[0668] Dan 14, Merenje izostanka proliferacije PBMC
7.4.26 Raditi sa svakom partijom nezavisno, pažljivo vratiti duplikate T25 flakona u BSC.
7.4.27 Iz svakog flakona, koristeći novu 10 ml serološku pipetu, uzeti ∼17 ml, zatim pažljivo povući preostali medijum da se izmeri preostala zapremina u flakonima. Zabeležiti zapreminu.
7.4.28 Izmešati dobro uzorak pipetiranjem gore-dole koristeći istu serološku pipetu.
7.4.29 Uzeti 200 μl uzorka iz svakog flakona za brojanje ćelija.
7.4.30 Izbrojati ćelije korišćenjem automatskog brojača ćelija.
7.4.31 Ponoviti korake 7.4.26 - 7.4.31 za svaku evaluiranu partiju PBMC.
REZULTATI I KRITERIJUM PRIHVATLJIVOSTI
Rezultati
[0669] 10.1.1 Očekuje se da je doza gama-zračenja dovoljna da ćelije-hraniteljice učini replikaciono nekompetentnim. Očekuje se da sve partije zadovolje evaluacioni kriterijum, pokazujući smanjenje ukupnog broja vijabilnih ćelija-hraniteljica preostalih na Dan 14 REP kulture u poređenju sa Danom 0.
Kriterijum prihvatljivosti
[0670]
10.2.1 Svaka testirana ozračena partija donorskih PBMC zadovoljila je sledeći kriterijum prihvatljivosti:
10.2.2 "Bez rasta" - znači da je ukupan broj vijabilnih ćelija na Dan 14 bio manji od početnog broja vijabilnih ćelija stavljenih u kulturu na Dan 0 REP.
10.2.3 U slučaju da partija ne zadovolji gornji kriterijum, partija se ponovo testira prema proceduri testiranja za nepredviđene okolnosti navedenoj u odeljku 10.4.
10.2.4 Posle ponovnog testiranja neuspešne partije, svaka partija MNC hraniteljica koja nije zadovoljila kriterijum prihvatljivosti u originalnoj evaluaciji i u testiranja za nepredviđene okolnosti, isključuje se.
[0671] Testiranje za slučaj nepredviđenih okolnosti partija PBMC koje ne zadovoljavaju kriterijum prihvatljivosti.
10.4.1 U slučaju da ozračena partija donorskih PBMC nije zadovoljila gornji kriterijum prihvatljivosti, sledeći koraci preduzimaju se za ponovno testiranje partije da bi se isključila greška eksperimentatora kao uzrok njene neuspešnosti.
10.4.2 Ako postoje dve ili više preostalih satelitskih fiola partije, onda se partija ponovo testira. Ukoliko ne postoje ili postoji samo jedna preostala satelitska testna fiola partije, onda je partija neuspešna prema kriterijumima prihvatljivosti iz Odeljka 10.2 gore.
10.4.3 Kada god je moguće, dve obučene osobe (poželjno uključujući osobu koja je originalno evaluirala partiju o kojoj je reč) testiraju dve zasebne fiole nezavisno. Ovo je poželjan postupak testiranja za slučaj nepredviđenih okolnosti. Osim zasebnih fiola sa PBMC, iste reagense mogu da koriste obe osobe.
10.4.3.1. Ako dve osobe nisu na raspolaganju, jedna osoba može da testira dve fiole sa PBMC neuspešne partije, radeći sa svakom fiolom nezavisno.
10.4.4 Ponavljanje odeljka 7.4 "Eksperimentalni protokol" vrši se za ponovnu evaluaciju partije o kojoj je reč.
10.4.5 Pored partije o kojoj je reč, svaka osoba koja izvodi testiranje za slučaj nepredviđenih okolnosti testira kontrolnu partiju.
10.4.5.1 Ako dve osobe izvode testiranje za slučaj nepredviđenih okolnosti, obe osobe nezavisno testiraju kontrolnu partiju.
10.4.5.2 Ako je samo jedna osoba na raspolaganju da izvede testiranje za slučaj nepredviđenih okolnosti, nije neophodno da kontrolna partija bude puštena u duplikatu.
10.4.5.3 Da bi se kvallifikovala, PBMC partija koja prolazi testiranje za slučaj nepredviđenih okolnosti, obe kontrolne partije u oba ponovka za partiju o kojoj je reč treba da prođu kriterijum prihvatljivosti iz Odeljka 10.2.
10.4.5.4 Posle zadovoljavanja ovog kriterijuma, partija se oslobađa na CMO upotrebu kako je navedeno u odeljku 10.2.
PRIMER 15: AUTOMATSKI BROJAČ ĆELIJA CELLOMETER IC2 IMAGE CYTOMETER
[0672] Ovaj primer opisuje proceduru rada sa automatskim brojačem ćelija Cellometer K2 Image Cytometer.
1. Definicije
[0673]
μl Mikrolitar
AOPI Akridin oranž - propidijum jodid
BSC Kabinet za biološku bezbednost
DPBS Dulbeccov fosfatom puferisani slani rastvor
ml Mililitar
MNC Mononuklearne ćelije krvi
NA Nije primenljivo
PBMC Mononuklearne ćelije periferne krvi
PPE Lična zaštitna oprema
Pre-REP Inicijalna TIL kultura pre Protokola brze ekspanzije kulture
REP Protokol brze ekspanzije
TIL Tumor-infiltrirajući limfociti
7. Procedura
[0674]
7.1 Pripremanje ćelijske suspenzije
7.1.1 Pripremanje tripan-plavog
22
Finalna koncentracija tripan-plavog je 0.1%. Proizvođač preporučuje pripremanje stok-rastvora od 0.2%.
7.1.1.1 Kada se koristi tripan plavo na Cellometer K2, razblažiti stok (0.4 %) pomoću PBS do 0.2%.
7.1.1.2 Filtrirati tripan plavo kroz filter od 0.2-0.4 mikrona i alikvotirati male zapremine u obeležene epruvete sa kapicom.
7.1.1.3 Pomešati ćelijsku suspenziju u odnosu 1:1 sa 0.2% tripan plavim.
7.1.2 AOPI pripremanje
7.1.2.1 Kada se koristi AOPI na Cellometer K2, napraviti AOPI rastvor.
7.1.2.2 Obojiti uzorak ćelija u odnosu 1:1 rastvorom AOPI.
NAPOMENA: Kada se broje kulture visoke koncentracije, razblažiti uzorke ćelija u medijumu za kulturu ćelija pre finalnog razblaženja 1:1 sa tripan plavim ili AOPI. Koristiti opseg brojanja koji sugeriše proizvođač da bi se odredilo najbolje razblaženje za upotrebu.
tavka Cellometer K2
7.2.1 Uključiti Cellometer K2 opremu.
7.2.2 Selektovati ikonu Cellometer Image Cytometer na pridruženom kompjuterskom monitoru.
7.2.3 Na glavnom ekranu softvera, selektovati Assays (Testovi) navedeno u opadajućem meniju.
7.2.3.1 Kada se odabere odgovarajući test, sami se popunajvaju Cell Type (Tip ćelija) i Image Mode (Mod slike).
7.2.3.2 Pod odeljkom "Sample" ("Uzorak"), kliknuti na Set User/Sample ID (Podesiti identifikaciju korisnika/uzorka) da se otvori sledeći ekran na kojem će operater uneti informacije za uzorak.
7.2.3.2.1 Uneti "User ID" Ovo će se sastojati od tri slova inicijala korisnika.
7.2.3.2.2 Uneti "Sample ID". ID uzorka se izvodi iz podataka o uzorku koji su sa njim došli.
7.2.3.3 Postaviti parametre razblaženja.
7.2.3.3.1 Ako nema drugog razblaženja osim 1:1 mešavine, faktor razblaženja je 2.
7.2.3.3.2 Ako je razblaženje napravljeno pre finalne mešavine od 1:1, faktor razblaženja iznosi 2 puta od prethodnog razblaženja.
7.2.3.3.3 Ažurirati faktor razblaženja prema mešavini upotrebljenoj u odeljku za razblaženje na ekranu. Kliknuti na ikonu olovke da bi se pojavili ekrani za dijalog.
7.2.3.3.4 Verifikovati da su odeljci F1 Image i F2 Image međusobno identični.
7.2.3.3.5 Kliknuti dugme "Save" kada se završi unos.
janje ćelija
7.3.1 Skloniti plastične podloge sa obe strane pločice komore za brojanje Cellometer (SD100) i staviti je na čisti ubrus bez dlačica.
7.3.2 Posle pripremanja ćelijske suspenzije, uzeti male alikvote uzorka i preneti ih u bunarčić ploče za kulturu ćelija sa više bunarčića ili epruvetu.
7.3.3 Ako se razblažuje uzorak, razblaživanje obaviti korišćenjem medijuma za kulturu ćelija.
7.3.4 Dodati 20 I11 ćelijske suspenzije u bunarčić ploče za kulturu ćelija sa više bunarčića ili epruvetu.
22
7.3.5 Dodati 20 111 0.2% tripan plavog ili AOPI rastvora u 20111 ćelijske suspenzije i dobro promešati uzorak.
7.3.6 Odmeriti 20 IA 1:1 rastvora i preneti ga na jednu stranu komore za brojanje. NAPOMENA: Izbeći dodirivanje čistog dela pločice.
7.3.7 Ako je potrebno, ponoviti uzorak na drugij strani pločice.7.3.8. Umetnuti komoru u prorez na prednoj strani Cellometer.
7.3.8 Za AOPI brojanje ćelija, kliknuti na "Preview F1" (prethodna slika F1) na glavnom ekranu da se pojavi "privju" zelene fluorescentne slike (živa ćelija). Za brojanje tripan plavim, kliknuti na "Preview Brightfield" ("Prethodna slika na svetlom polju").
7.3.9 Koristeći točak za fokusiranje, dovesti sliku do optimalnog fokusa. Ćelije imaju svetli centar i jasno definisanu ivicu.
7.3.10 Kliknuti "Count" ("Izbroj") da bi otpočeo proces brojanja.
7.3.11 Rezultati se prikazuju u iskačućem prozoru na kompjuterskom ekranu, koji pokazuje rezultate brojanja.
PRIMER 16: PRIPREMANJE STOK-RASTVORA IL-2 (CELLGENIX)
[0675] Ovaj primer opisuje proces rastvaranja prečišćenog, liofilizovanog rekombinantnog humanog interleukina-2 u stok-uzorcima pogodnim za korišćenje u daljim protokolima kulture tkiva, uključujući sve opisane u ovoj prijavi i Primerima, u kojima se koristi rhIL-2.
3. Definicije/skraćenice
[0676]
μL: mikrolitar
BSC: Kabinet za biološku bezbednost
BSL2: Nivo 2 biobezbednosti
D-PBS: Dulbeccov fosfatom puferisani slani rastvor
22
G: Mera za veličinu igle
GMP: Dobra proizvođačka praksa
HAc: Sirćetna kiselina
HSA: Humani serum albumin
mL: Mililitar
NA: Nije primenljivo
PPE: Lična zaštitna oprema
rhIL-2; IL-2: Rekombinantni humani interleukin-2
COA: Sertifikat analize
6. Procedura
[0677]
6.1 Pripremiti 0.2% rastvor sirćetne kiseline (HAc).
6.1.1 Preneti 29 mL sterilne vode u 50 mL konusnu epruvetu.
6.1.2 Dodati 1mL 1N sirćetne kiseline u 50 mL konusnu epruvetu.
6.1.3 Promešati dobro okretanjem epruvete 2-3 puta.
6.1.4 Sterilisati HAc rastvor filtrirajući ga uz korišćenje Steriflip filtera.
6.1.5 Poklopiti, napisati datum i obeležiti rastvor kao "Sterilni 0.2% rastvor sirćetne kiseline".
6.1.6 Rok trajanja rastvora ističe posle 2 meseca. Držati na sobnoj temperaturi.
6.2 Pripremiti 1% HSA u PBS.
6.2.1 Dodati 4 mL 25% HSA stok rastvora u 96 mL PBS u 150 mL sterilnu filterski jedinicu.
22
6.2.2 Filtrirati rastvor.
6.2.3 Poklopiti, napisati datum i obeležiti rastvor kao "1% HSA u PBS."
6.2.4 Rok trajanja rastvora ističe posle 2 meseca. Držati na 4°C.
vaku pripremljenu fiolu rhIL-2, popuniti formular.
remiti rhIL-2 stok-rastvor (6 x 106 IU/mL finalna koncentracija)
6.4.1 Svaka partija rhIL-2 se razlikuje i potrebne informacije se nalaze u proizvođačevom Sertifikatu analize (COA), na primer:
6.4.1.1 Masa rhIL-2 po fioli (mg)
6.4.1.2 Specifična aktivnost rhIL-2 (IU/mg)
6.4.1.3 Preporučena zapremina 0.2% HAc za rekonstituisanje (mL)
6.4.2 Izračunati zapreminu 1% HSA potrebnu za partiju rhIL-2 korišćenjem jednačine u nastavku:
6.4.2.1 Na primer, prema COA CellGenix rhIL-2 partija 10200121, specifična aktivnost za l mg fiolu je 25x106 lU/mg. Preporučuje se rekonstituisanje rhIL-2 u 2 mL 0.2% HAc.
6.4.3 Alkoholnim ubrusom obrisati gumeni poklopac fiole sa IL-2.
6.4.4 Koristeći iglu 16G prikačenu za špric od 3 mL, injektirati preporučenu zapreminu 0.2% HAc u fiolu.
Paziti da se ne pomeri čep dok se izvlači igla.
22
6.4.5 Okretati fiolu 3 puta i promešati kružnim pokretima dok se sav prah ne rastvori.
6.4.6 Pažljivo skloniti čep i spustiti ga na alkoholni ubrus.
6.4.7 Dodati izračunatu zapreminu 1% HSA u fiolu.
6.4.8 Zatvoriti fiolu gumenim čepom.
6.5 Uskladištiti rastvor rhIL-2
6.5.1 Za kratkotrajno skladištenje (<72 h), držati fiolu na 4°C.
6.5.2 Za dugotrajno skladištenje (>72 h), alikvotirati fiolu u manje zapremine i držati u kriofiolama na -20°C do korišćenja. Izbeći cikluse zamrzavanja/odmrzavanja. Rok ističe 6 meseci posle dana pripreme.
6.5.3 Rh-IL-2 oznake uključuju prodavca i kataloški broj, broj partije, rok trajanja, inicijale operatera, koncentraciju i zapreminu alikvota.
PRIMER 17: PRIPREMANJE MEDIJUMA ZA PROCESE PRE-REP I REP
[0678] Ovaj Primer opisuje proceduru za pripremanje medijuma za kulturu tkiva za upotrebu u protokolima koji uključuju kultivisanje tumor-infiltrirajućih limfocita (TIL) poreklom iz različitih tipova tumora uključujući, ali ne ograničavajući se na metastatski melanom, karcinom skvamoznih ćelija glave i vrata (HNSCC), karcinom ovarijuma, trostruko negativni karcinom dojke, i adenokarcinom pluća. Ovaj medijum može da se koristi za pripremanje bilo kojih TIL opisanih u predmetnoj prijavi i Primerima.
3. Definicija
[0679]
μg mikrogram
μm mikrometar
μM mikromolarno
AIM-V® medijum za kulturu tkiva koji ne sadrži serum (Thermo Fisher Scientific)
BSC Kabinet za biološku bezbednost
CM1 Kompletni medijum #1
22
CM2 Kompletni medijum #2
CM3 Kompletni medijum #3
CM4 Kompletni medijum #4
IU ili U Internacionalne jedinice
ml mililitar
mM milimolarno
NA nije primenljivo
PPE lična zaštitna oprema
Pre-REP pre Procesa brze ekspanzije
REP Proces brze ekspanzije
rhIL-2, IL-2 rekombinantni humani interleukin-2
RPMI1640 Roswell Park Memorial Institute medijum, formulacija 1640
SOP Standardna radna procedura
TIL tumor-infiltrirajući limfociti
7. Procedura
[0680]
7.1 Sve procedure se obavljaju korićenjem sterilne tehnike u BSC (Klasa II, Tip A2).
7.1.1 Poprskati površinu digestora 70% etanolom pre upotrebe.
7.1.2 Poprskati sve artikle i reagense 70% etanolom pre stavljanja u digestor za kulturu tkiva.
7.2 Alikvotirati 200 mM L-glutamina
7.2.1 L-glutamin se isporučuje u većim zapreminama od potrebnih za pripremanje seruma (npr., zapremine 100 ml ili 500 ml).
7.2.2 Odmrznuti bocu L-glutamina u vodenom kupatilu na 37°C.
7.2.3 Dobro izmešati L-glutamin posle odmrzavanja, jer posle odmrzavanja stvara precipitat. Osigurati da se sav precipitat vrati u rastvor pre alikvotiranja.
7.2.4 Staviti alikvote od 5-10 ml L-glutamina u sterilne konusne epruvete od 15 ml.
2
7.2.5 Na epruvetama naznačiti koncentraciju, prodavca, broj partije, datum alikvotiranja, i rok trajanja.
7.2.6 Epruvete zatim uskladištiti na -20°C i uzimati po potrebi za pripremanje medijuma.
7.3 Pripremanje CM1
7.3.1 Izvaditi reagense iz hladnog skladišta i zagrejati ih na37°C u vodenom kupatilu:
7.3.1.1 RPMI1640
7.3.1.2 Humani AB serum
7.3.1.3 200 mM L-glutamina
7.3.2 Izvaditi BME iz skladišta na 4°C i staviti ih u digestor za kulturu tkiva.
7.3.3 Stok-rastvor gentamicina iz skladišta na sobnoj temperaturi staviti u digestor za kulturu tkiva.
7.3.4 Pripremiti CM1 medijum prema Tabeli 23, dole, dodavanjem svakog od sastojaka u gornji deo 0.2 um filterske jedinice odgovarajuće zapremini koja će se filtrirati.
TABELA 23. Pripremanje CM1
7.3.5 Obeležiti bocu sa CM1 medijumom njegovim imenom, inicijalima preparatora, datumom filtriranja/pripremanja, rokom trajanja od dve nedelje i držati na 4°C dok ne bude potreban za kulturu tkiva. Medijum se može alikvotirati u boce manje zapremine po potrebi.
2 1
7.3.6 Preostali RPMI1640, Humani AB serum, ili L-glutamin, ako ih ima, držati na 4°C do sledeće pripreme medijuma.
7.3.7 Boca sa stok-rastvorom BME vraća se na 4°C za skladištenje.
7.3.8 Boca sa stok-rastvorom gentamicina vraća se na za nju odgovarajuću RT na mesto skladištenja.
7.3.9 Zbog ograničenog puferišućeg kapaciteta medijuma, CM1 se baca najkasnije dve nedelje posle pripreme ili kada pH indikator fenol-crveno pokaže ekstremni pomak pH (svetlocrvena do ružičasta obojenost).
7.3.10 Na dan upotrebe, prethodno zagrejati potrebnu količinu CM1 u vodenom kupatilu na 37°C i dodati 6000 IU/ml IL-2.
7.3.11 Dodatna suplementacija - po potrebi
7.3.11.1 CM1 suplementisati sa GlutaMAX®
7.3.11.1.1 CM1 može da se pripremi korišćenjem 2 mM GlutaMAXTM umesto 2 mM glutamina (finalna koncentracija, vidi Tabelu 2.) Ako se ovo radi, obeležiti bocu sa medijumom kao u Koraku 7.3.5 gore dodajući "2mM GlutaMAX" da se ne bi pomešalo sa standardnom formulacijom CM1.
7.3.11.2 CM1 suplementisati dodatnim antibiotikom/antimikotikom
7.3.11.2.1 Neke formulacije CM1 zahtevaju dodatni antibiotik ili antimikotik da bi se sprečila kontaminacija pre-REP TIL gajenih iz određenih tipova tumora.
7.3.11.2.2 Dodati antibiotik/antimikotik u finalnim koncentracijama prikazanim u Tabeli 24 u nastavku.
7.3.11.2.3 Ako se ovo uradi, obeležiti bocu sa medijumom kao u Koraku 7.3.1 gore dodajući ime/imena dodatnih antibiotika/antimikotika da se ne bi pomešalo sa standardnom formulacijom CM1.
TABELA 24. Dodatna suplementacija CM1, po potrebi
2 2
remanje CM2
7.4.1 Uzeti pripremljeni CM1 iz frižidera ili pripremiti svež CM1 kao u Odeljku 7.3 gore.
7.4.2 Izvaditi AIM-V® iz frižidera.
7.4.3 Pripremiti potrebnu količinu CM2 mešanjem pripremljenog CM1 sa jednakom zapreminom AIM-V® u sterilnoj boci za medijum.
7.4.4 Na dan korišćenja dodati 3000 IU/ml IL-2 u CM2 medijum.
7.4.5 Napraviti dovoljnu količinu CM2 sa 3000 IU/ml IL-2 na dan korišćenja.
7.4.6 Na boci sa CM2 medijumom naznačiti naziv medijuma, inicijale preparatora, datum filtriranja/pripremanja, rok trajanja od dve nedelje i držati na 4°C dok ne bude potreban za kulturu tkiva. Medijum se alikvotira u boce manje zapremine po potrebi.
7.4.7 Vratiti CM2 bez IL-2, ako ga ima, u frižider gde se može čuvati najviše dve nedelje, ili dok indikator pH fenol crveno ne pokaže ekstremno pomeranje pH (svetlocrvena do ružičasta obojenost).
remanje CM3
7.5.1 Pripremiti CM3 na dan kada je potreban za upotrebu.
7.5.2 CM3 je isti kao AIM-V® medijum, suplementisan sa 3000 IU/ml IL-2 na dan upotrebe.
7.5.3 Pripremiti količinu CM3 dovoljnu za potrebe eksperimenta dodavanjem IL-2 stok-rastvora direktno u bocu ili kesu AIM-V. Dobro izmešati blagim mrdanjem. Označiti bocu sa "3000 IU/ml IL-2" odmah posle dodavanja u AIM-V. Ako ima viška CM3, uskladištiti u bocama na 4°C obeleženim nazivom medijuma, inicijalima preparatora, datumom pripremanja medijuma, i rokom trajanja (7 dana posle pripremanja).
7.5.4 Baciti medijum suplementisan IL-2 posle 7 dana skladištenja na 4°C.
rema CM4
2
7.6.1 CM4 je isti kao CM3, uz dodatnu suplementaciju 2 mM GlutaMAXTM (finalna koncentracija).
7.6.1.1 Za svaki 1 L CM3, dodati 10 ml 200 mM GlutaMAXTM.
7.6.2 Pripremiti količinu CM4 dovoljnu za potrebe eksperimenta dodavanjem stokrastvora IL-2 i GlutaMAXTM stok-rastvora direktno u bocu ili kesu AIM-V. Izmešati dobro blagim protresanjem.
7.6.3 Obeležiti boce kao "3000 IL/nil IL-2 i GlutaMAX" odmah posle dodavanja u AIM-V.
7.6.4 Ako ima viška CM4, čuvati ga u bocama na 4°C obeleženim nazivom medijuma, "GlutaMAX", inicijalima preparatora, datumom pripremanja medijuma, i rokom trajanja (7 dana posle pripremanja).
7.6.5 Bacit medijum suplementisan sa IL-2 posle 7 dana skladištenja na 4°C.
PRIMER 18: BOJENJE POVRŠINSKIH ANTIGENA POST REP TIL
1. SVRHA
[0681] Primer opisuje proceduru bojenja ćelijske površine post-REP TIL protočnom citometrijom. Ova procedura može da se primeni na bilo koje od TIL opisanih u prijavi i primerima.
KLJUČNI IZRAZI I DEFINICIJE
[0682]
α: Alfa
β: Beta
μl: Mikrolitar
APC: Alofikocijanin
Ax647: Alex Fluor 647
BD: Becton Dickinson Company
BSA: Albumin goveđeg seruma
BSC: Kabinet za biološku bezbednost
BV421: Brilliant Violet 421
2 4
CD: Klaster diferencijacije
CST: Postavljanje i praćenje citometra
Cy: Cijanin
DPBS: Dulbeccov fosfatom puferisani slani rastvor
FACS: Sortiranje ćelija aktivirano fluorescencijom
FBS: Fetalni goveđi serum
FITC: Fluorescein izotiocijanat
FMO: Fluorescencija minus jedan
G: Gram
H7: Analog Cy7
Ml: Mililitar
PE: Fikoeritrin
PerCP-Cy5.5: Peridinin-hlorofil proteini
PPE: Lična zaštitna oprema
REP: Protokol brze ekspanzije
SIT: Tuba za injektiranje uzorka
TCR: T-ćelijski receptor
w/v: Težina prema zapremini
Antitela i boje za protočnu citometriju
[0683]
TABELA 25: Live/Dead Aqua bojenje ThermoFisher kataloški # L34966.
2
7. PROCEDURA
[0684]
7.1 Priprema reagensa
7.1.1 FACS pufer za ispiranje
7.1.1.1 Dodati 2% (w/v) toplotom inaktivirani FBS u DPBS (dodati 10 ml FBS u 490 mL 1X dPBS).
7.1.1.2 Dodati 0.1% (w/v) NaN3(76.9 ul u bocu od 500 mL) 7.1.1.3 Rastvor se drži na 40°C. Baciti posle 30 dana.
7.1.2 Aqua boja
7.1.2.1 Dodati 50 μl DMSO u fiolu reaktivne boje.
7.1.2.2 Dobro izmešati i vizuelno se uveriti da se sva boja rastvorila. 7.1.2.3 Boja koja nije upotrebljena za proceduru alikvotira se i zamrzne na -20°C do sledećeg korišćenja. Ne zamrzavati/odmrzavati drugi put.
2
.1.3 Priprema koktela antitela.
7.1.3.1 Kokteli se prave u polipropilenskim epruvetama kao što cu Eppendorf tube
7.1.3.2 Kokteli se čuvaju do 6 meseci.
Tabela 26: Diferencijacioni panel 1 (DF1)
2
Tabela 27: Diferencijacioni panel 2 (DF2)
Tabela 28: Panel aktivacije T ćelija 1 (Tact1)
2
Tabela 29: Panel aktivacije T ćelija 2 (Tact2)
7.2 Protočna citometrija - uslovi testa
7.2.1 Kalibrisanje protočnog citometra
7.2.1.1 Protočni citometar se kalibriše na dan testa korišćenjem CST perlica, prema uputstvima proizvođača.
7.2.1.2 Operater obezbeđuje da protočni citometar prođe kalibrisanje, pri čemu su provere performansi i osnovnog stanja validne.
7.2.2 Kompenzacija/FMO kontrole
7.2.2.1 Jednokolorni kompenzacioni uzorci pripremaju se korišćenjem BD kompenzacionih perlica i ArCTM kita sa amin-reaktivnim kompenzacionim perlicama.
7.2.2.2 FMO kontrola, uzorci koji sadrže ćelije boje se koktelom antitela minus sledeći konjugat jednog antitela, CD27, CD28, i CD57.
7.2.3 MFI Standardizacija
7.2.3.1 Napon citometra određuju se dnevno, prelicama za kontrolu i vrednostima ciljne voltaže.
2
enje uzorka
7.3.1 Obeležiti FACS epruvete sa Uzorkom ID-DF1, Uzorkom ID-DF2, Uzorkom ID-T1, Uzorkom ID-T2.
7.3.2 Obeležiti jedan set FMO kontrola sa CD27-APC-H7, CD28-PE, CD57-PerCPCy5.5, CD45RA-PECy7, CCR7-PE, CD38-APC, CD137-PE7, Lag3-PE, PD1 APC, Tim3-BV421, CD69-PE7, TIGIT-PE, KLRG1-Ax647, i CD154-BV421.
7.3.3 Dodati 0.5 do 2 miliona ćelija u svaku epruvetu.
7.3.4 QS do 3 mL 1xPBS u svaku epruvetu.
7.3.5 Centrifugirati epruvete na 400 x g, visoko ubrzanje i kočenje, 5 minuta.
7.3.6 Dok se uzorci centrifugiraju, pripremiti Aqua boju za obeležavanje mrtvih ćelija.
7.3.7 Izvaditi Aqua alikvot iz zamrzivača i razblažiti 1/200 u PBS. Držati u mraku. Dodati 2 uL boje u 198 uL DPBS.
7.3.8 Dekantovati ili aspirirati supernatant iz koraka 7.3.5.
7.3.9 Dodati 25 uL Aqua rastvora iz gornjih uzoraka i FMO kontrola.
7.3.10 Inkubirati 15 minuta na sobnoj temperaturi (room temperature, RT) u mraku.
7.3.11 Napomena: Ako su ćelije inicijalno držane u medijumu koji ne sadrži proteine, onda treba da se doda korak blokiranja, na primer 5 uL TruStain u trajanju od 10 minuta na sobnoj temperaturi.
7.3.12 Dodati 50 uL koktela antitela u odgovarajuće epruvete.
7.3.13 Prodrmati stalak za epruvete da se promeša.
7.3.14 Inkubirati 15 minuta na RT u mraku.
24
7.3.15 Zabeležiti početno i krajnje vreme. Dodati 3 mL FACS pufera za ispiranje.
7.3.16 Centrifugirati epruvete na 400 x g, visoko ubrzanje i kočenje, 5 minuta.
7.3.17 Kada se završi okretanje centrifuge, odliti ili aspirirati supernatant. 7.3.18 Resuspendovati ćelije povlačenjem epruveta duž praznog stalka.
7.3.19 Dodati 100 uL 1% paraformaldehida u svaku epruvetu.
7.3.20 Držati na 40C u mraku dok ne bude spremno za kolektovanje na protočnom citometru. Napomena: Uzorci mogu da se čuvaju do 72 sata.
Aqua kompenzaciona kontrola.
7.4.1 Označiti FACS epruvete kao L/D Aqua kompenzaciona kontrola.
7.4.2 Dodati jednu kap Arc perlica u epruvetu.
7.4.3 Dodati 3 μl L/D Aqua direktno perlicama.
7.4.4 Inkubirati epruvete na sobnoj temperaturi u mraku 10 do 30 min.
7.4.5 Zabeležiti vreme početka i završetka inkubacije na radnom listu 7.4.6 Posle inkubacije, dodati 3 ml FACS pufera za ispiranje u svaku epruvetu.
7.4.7 Centrifugirati epruvete na 400 x g, visoko ubrzanje i kočenje, 5 minuta.
7.4.8 Odliti ili aspirirati supernatant.
7.4.9 Resuspendovati epruvete sa 500 μl 1% PFA rastvora. Dodati 1 kap negativnih perlica. Staviti na 40°C u mraku do sakupljanja.
enje kompenzacione kontrole.
7.5.1 Obeležiti FACS epruvete kako je pokazano u Fenotip post-REP TIL radnom listu.
7.5.2 Dodati antitela kako je pokazano u Fenotip post-REP TIL radnom listu.
7.5.3 Posle inkubacije dodati 3 mL FACS pufera u svaku epruvetu.
7.5.4 Centrifugirati epruvete na 500 g, visoko ubrzanje i kočnica, 2 minuta.
7.5.5 Odliti ili aspirirati supernatant.
7.5.6 Resuspendovati epruvete sa 500 μl 1% PFA u PBS i držati na 2-80°C u mraku.
7.6 Prikupljanje podataka
7.6.1 Otvoriti FACSDiva softver i logovati se.
7.6.2 U dijalogu nepoklapanja citometra, kliknuti "Use CST Settings" ("Upotrebi CST postavku").
7.6.3 Kreirati novi eksperiment klikom na tabulator "Experiment" i biranjem templata "Extended Phenotype" ("Prošireni fenotip").
7.6.4 Dva puta kliknuti na Target Values (Ciljne vrednosti) eksperimenta i podesiti voltaže da se dostignu ciljne vrednosti određene od strane operatera odeljenja za protočnu citometriju.
7.6.5 Kopirati podešavanje instrumenta i umetnuti ga na mesto za novi eksperiment.
7.6.6 Kreirati Specimen (Uzorak) za svaku osobu i imenovati ga na odgovarajući način.
7.6.7 Kreirati imena uzoraka prema oznakama na epruvetama.
7.6.8 Blago vorteksovati ili lako udariti prstom pre stavljanja epruvete u SIT.
7.6.9 Sakupiti podatke pod RECORD na tabli Acquisition (Prikupljanje).
7.6.10 Pustiti uzorke pri brzini manjoj od 7,500 događaja u sekundi.
7.6.11 Sakupiti između 50,000 i 100,000 živih događaja isključujući detritus.
PRIMER 19: VERIFIKACIJA RAZVOJA PROCESA 2A
[0685] Eksperimenti u ovom Primeru izvršeni su da bi se analizirao Proces 2A za proizvodnju TIL iz melanoma i iz jednog kancera dojke, uključujući rast TIL iz tumora u pre-REP proceduri, što je praćeno modifikovanim REP. Poseban akcenat stavljen je na uspostavljanje zamrznutog TIL proizvoda i upoređivanje performansi zamrznutog TIL proizvoda i svežeg TIL proizvoda trenutnog procesa (Proces 1C). Ovaj izveštaj pokazuje da su slični profili dobijeni prilikom procene kritičnih atributa kvaliteta svežih i odmrznutih proizvoda (broj ćelija, % vijabilnosti, % CD3+ T-ćelija, i perlicama stimulisana proizvodnja gama interferona (IFN-y)) kao i u proceduri restimulacije proširenog fenotipa (reREP) bilo da je isti TIL proizvod svež ili zamrznut. Podaci prikazani da bi podržali ovaj zaključak uključuju proliferaciju, vijabilnost, fenotip, oslobađanje IFN-γ, potenciju, dužinu telomera, i metaboličku aktivnost. Rezultati karakterišu Proces 2A, skraćeni pre-REP/REP proces praćen krioprezervacijom TIL i upoređuju proces 2A sa dužim 1C procesom, kako je opisano u ovom tekstu.
[0686] Opisi donora tumora, datum obrade i mesta obrade mogu se naći u Tabeli 1 dole (*označava da REP započet korišćenjem zamrznute linije pre-REP TIL):
Tabela 30: Opis davalaca tumora, datuma obrade i mesta obrade.
3. OSNOVNE INFORMACIJE
[0687]
24
3.1 LN-144 je imunoterapijski proizvod za lečenje pacijenata sa metastatskim melanomom. Proizvod je sačinjen od autolognih tumor-infiltrirajućih T limfocita (TIL) dobijenih od pojedinačnih pacijenata posle hirurške resekcije tumora i ekspandiranja ex vivo u ćelijskoj kulturi morcelisanih tumorskih fragmenata (pre-REP) što je praćeno brzom ekspanzijom TIL u prisustvu visoke doze IL-2, anti-CD3, i kostimulatornih APC. Posle prekondicioniranja nemijeloablativnom limfodeplecijom, pacijent prima jednu infuziju svojih TIL i zatim intravenske infuzije aldesleukina (IL-2) svakih 8 sati, do najviše 6 doza. Studije koje uključuju alternativne postupke ekspanzije TIL u postavci molekula molekulskih obrazaca udruženih sa oštećenjem (Damage Associated Molecular Pattern Molecules, DAMP) u tumorskom mikrookruženju (tumor microenvironment, TNE) takođe su pokazale efikasnu ekspanziju T-ćelija korisnih u terapiji (Donia 2014; Sommerville, 2012). Proces 1C koji je bio korišćen za komercijlalnu proizvodnju TIL uključuje plan proizvodnje koji može da traje -45-55 dana da bi se proizveo infuzibilni TIL proizvod koji se dostavlja imunodepletovanom pacijentu u roku od 24 sata. Imunodeplecija primaoca mora se precizno vremenski uskladiti sa sakupljanjem trenutnog TIL proizvoda. Odlaganje u sakupljanju ili dostavi svežeg proizvoda može negativno uticati na imunodepletovanog pacijenta koji čeka infuziju. Proces 2A poboljšan je u odnosu na Proces 1C zbog smanjenja vremena realizacije i materijala, zbog smanjenja dužine pre-REP i REP procedura. Pored toga, Proces 2A povećava fleksibilnost vremena transporta proizvoda. Razlika između Procesa 1C i Procesa 2A u pre-REP, REP sakupljanju procesa (vidi Tabelu 2) uključuje:
3.1.1 Veće flakone sa povećanim kapacitetom za tumorske fragmente upotrebljene u pre-REP proceduri.
3.1.2 Korake koji podrazumevaju upotrebu zatvorenog sistema ili koji su podložni budućem prilagođavanju na zatvoreni sistem.
3.1.3 Smanjenje broja dana trajanja pre-REP i REP procedura.
3.1.4 Pristup "direktno u REP", kojim se eliminiše potreba za fenotipizacijom pre-REP populacija pre biranja specifičnih populacija pre-REP TIL koje će nastaviti u REP.
3.1.5 Kokulturu sa prethodno određenim brojem ozračenih, alogenih PBMC APC zajedno sa anti-CD3 (klon OKT3) izračunatim za dovoljnu ekspanziju TIL.
3.1.6 Automatizovani sistem za ispiranje ćelija, za sakupljanje.
3.1.7 Finalnu formulaciju na bazi CS10 koja se kriogeno prezervira pre transporta.
Tabela 31: Uticaj procesa 2A na Proces 1C.
Korak procesa Proces 1C Proces 2A Uticaj Korak A - Posle operacije - Posle operacije može - Isto Dobijanje uzorka može se zamrznuti se zamrznuti
tumora od posle sakupljanja i posle sakupljanja i pre
pacijenta pre koraka B koraka B
-Fizička - Fizička - Povećan broj fragmentacija fragmentacija fragmenata tumora - 4 fragmenta po 10 - 40 fragmenta po 1G- po flakonu
G-REX -10 flakona REX - Skraćeno vreme -100M flakon kulture
- 11-21 dan trajanja 11 dana - Smanjen broj trajanja(raspon 3 do koraka
14 dana)
- Medijum za rast - Medijum/medijumi - Podleže sadrži IL-2 za rast sadrže IL-2 zatvorenom sistemu - TIL Koraka B se - TIL Koraka B - Skraćen proces prezamrznu do direktno prelaze u REP u REP fenotipizacije za Korak D na dan 11
selekciju zatim Koraka B
odmrznu da bi
nastavili u Korak D
(⁓dana 30)
- Korak D zahteva 25- - Smanjen broj 200x106 TIL koraka
Korak C Prelaz - Eliminacija prve ekspanzije u fenotipske selekcije drugu ekspanziju
Korak D zahteva - Podleže >40x106 TIL zatvorenom sistemu 6 G-Rex -100M 1 G-Rex -500M - Smanjen broj flakona flakona na dan 11 koraka
Koraka B
na dan 0 Koraka D - Kraće trajanje REP
24
5x106 TIL i 5x108 - 25-200x106 TIL i - Zatvoren sistem antigen- 5x109 antigen- transfera TIL između prezentujućih ćelija- prezentujućih ćelija- flakona hraniteljica po hraniteljica na dan 11
flakonu na dan 0 Koraka B
KorakaD
- Razdeljivanje na - Razdeljivanje na ≤6
18-36 flakona na dan G-Rex -500M flakona - Medijum za 7 Koraka D na dan 16 zatvoreni sistem Korak D Druga - Trajanje Koraka D razmene ekspanzija 11 dana
- Trajanje Koraka D - Medijum za rast
14 dana sadrži IL-2,OKT-3, i
- Medijum za rast antigen-prezentujuće
sadrži IL-2,OKT-3, i ćelije
antigen-prezentujuće
ćelije
- Smanjen broj koraka
Korak E - Sakupljane TIL - Sakupljanje TIL - Automatizovano Sakupljanje TIL centrifugiranjem pomoću LOVO ispiranje ćelija automatizovanog - Zatvoren sistem sistema za ispiranje - Smanjen gubitak ćelija proizvoda tokom ispiranja
- Krioprezervirani - Fleksibilnost proizvod u otpremanja PlasmaLyteA 1%
HSA i CS10 - Fleksibilno - Sveži proizvod u skladištenje u LN2 zakazivanje Hypothermosol pacijenata
- Jedna infuziona - Više alikvota - Više oslobađanja kesa
24
Step F Finalna - Ograničena - Duža stabilnost pri pravovremeno formulacija stabilnost pri otpremanju testiranje otpremanju
Transfer u - 43-55 dana od - 22 dana od Koraka
infuzionu kesu Koraka A A - Brže
kroz Korak E kroz Korak E vraćanje do pacijenta - Skraćen prolazak kroz čistu sobu - Smanjena cena robe
4. SKRAĆENICE
[0688]
μg mikrogram
μl mikrolitar
μm mikrometar
APC Antigen-prezentujuće ćelije
CD Klaster diferencijacije
CM Centralna memorija
CM1, CM2 Medijum za kulturu 1, 2
CO2Ugljen-dioksid
CS10 CryoStor® CS10 krioprezervacioni medijum (BioLife Solutions)
Ct granični ciklus PCR
DAMP Molekuli molekulskih obrazaca udruženih sa oštećenjem
dCt Razlika između referentne Ct vrednosti i testne Ct vrednosti
ddCt Razlika između dCt i lOng standardne Ct vrednosti
ECAR Stopa vanćelijske acidifikacije (mera glikolize)
EM Efektorska memorija
ER+/PR+ Estrogenski receptor+/Progesteronski receptor+
GMP Dobra proizvođačka praksa
HBSS Hanksov balansirani slani ratsvor
HSA Humani serum albumin
24
IFN-γ Interferon gama
IL Interleukin
IU Internacionalne jedinice
LN2Tečni azot
Ml mililitar
Mm milimetar
ND Nije određeno
Ng Nanogram
°C Celzijusov stepen
OCR Stopa potrošnej kiseonika (mera oksidativne fosforilacije)
OKT3 Klonska oznaka anti-CD3 monoklonskog antitela
PBMC Mononuklearne ćelije periferne krvi
PD Razvoj procesa
REP Protokol brze ekspanzije
Rh Rekombinantni humani
SOP Standardna radna procedura
T/S Odnos broja kopija telomernih ponovaka prema broju kopija jednog gena TIL Tumor-infiltrirajući limfociti
VDJ Segmenti varijabilnosti diverziteta i spajanja T-ćelijskog receptora
Vα, Vβ Segmenti varijabilnog regiona zrelog T-ćelijskog receptorau preovlađujućem tumor-infiltrirajućem limfocitu
μg mikrogram
μl mikrolitar
μm mikrometar
APC Antigen-prezentujuće ćelije
CD Klaster diferencijacije
CM Centralna memorija
CM1, CM2 medijum za kulturu 1, 2
CO2Ugljen-dioksid
CS10 CryoStor® CS10 krioprezervacioni medijum (BioLife Solutions)
Ct granični ciklus PCR
DAMP Molekuli molekulskih obrazaca udruženih sa oštećenjem
dCt Razlika između referentne Ct vrednosti i testne Ct vrednosti
ddCt Razlika između dCt i lOng standardne Ct vrednosti
24
ECAR Stopa vanćelijske acidifikacije (mera glikolize)
EM Efektorska memorija
ER+/PR+ Estrogen Receptor+/Progesterone Receptor+
GMP Dobra proizvođačka praksa
HBSS Hanksov balansirani slani ratsvor
HSA Humani serum albumin
IFN-γ Interferon gama
IL Interleukin
IU Internacionalne jedinice
LN2Tečni azot
Ml mililitar
Mm milimetar
ND Nije određeno
Ng Nanogram
°C Celzijusov stepen
OCR Stopa potrošnje kiseonika (mera oksidativne fosforilacije)
OKT3 Klonska oznaka anti-CD3 monoklonskog antitela
PBMC Mononuklearne ćelije periferne krvi
PD Razvoj procesa
REP Protokol brze ekspanzije
Rh Rekombinantni humani
SOP Standardna radna procedura
T/S Odnos broja kopija telomernih ponovaka prema broju kopija jednog gena TIL Tumor-infiltrirajući limfocit
VDJ Segmenti varijabilnosti diverziteta i spajanja T-ćelijskog receptora
Vα, Vβ Segmenti varijabilnog regiona zrelog T-ćelijskog receptora u preovlađujućem tumor-infiltrirajućem limfocitu
5. DIZAJN EKSPERIMENTA
[0689]
5.1 Proces 2A
24
5.1.1 Pre-REP: Po prispeću, tumor se prenoci u Kabinet za biološku bezbednost (klasa II, Tip A2). Korišćenjem tehnike sterilnog rada, tumor se izvadi iz kontejnera za otpremanje i ispere u HBSS koji sadrži 50 μg/mL gentamicina. Tehničar morcelizuje tumor u fragmente veličine 40 x 3X3X3 mm koji se prenesu u G-REX-100M flakone koji sadrže prethodno zagrejani CM1 medijum dopunjem sa 6000 IU/mL rhIL-2. Flakon se stavi u humidifikovani inkubator za kulturu tkiva na 37°C, 5% CO2, 11 dana. Ako je od tumora dobijeno više od 40 fragmenata, onda se može postaviti više od jednog G-REX -100M. Ćelije se zatim sakupljaju za REP.
5.1.2 REP: Na Dan 11, pripremi se jedan G-REX -500M flakon koji sadrži 5 L CM2 dopunjenog sa 3000 IU/mL rhIL-2, 30ng/mL anti-CD3 (klon OKT3) i 5 x 109 ozračenih alogenih hraniteljskih PBMC ćelija. Posle smanjenja zapremine, TIL sakupljeni iz pre-REP G-REX -100M flakona broje se i zasejavaju u G-REX -500M flakonu u gustini u opsegu od 5 x 106 do 200 x 106 ćelija. Flakon se zatim stavi u humidifikovani inkubator za kulturu tkiva na 37°C, 5% CO2, pet dana. Na Dan 16, zapremina G-REX -500M flakona se smanji, TIL se broje i određuje se njihova vijabilnost. Tada se TIL ekspandiraju u više G-REX -500M flakona (najviše do šest flakona), svaki sa gustinom zasejavanja od 1 x 109 TIL/flakonu. Svi flakoni se zatim stave u humidifikovani inkubator za kulturu tkiva na 37°C, 5% CO2, na još šest dana. Na Dan 22, dan sakupljanja, smanji se zapremina svakog flakona za 90%, ćelije se spajaju i filtriraju kroz 170 μm filter za krv, i zatim sakupe u 3 L Origin EV3000 kesu ili ekvivalent, u pripremi za automatizovano ispiranje korišćenjem LOVO.
5.1.3 Sakupljanje i finalno formulisanje: TIL se isperu korišćenjem LOVO automatizovanog sistema za obradu ćelija koji vrši zamenu 99.99% medijuma za kulturu ćelija puferom za ispiranje koji se sastoji od PlasmaLyte-A dopunjenog sa 1% HSA. LOVO radi koristeći tehnologiju obrtne filtracione membrane kojom se oporavlja preko 92% TIL dok se praktično eliminišu rezidualne komponente kulture tkiva, uključujući serum, faktore rasta i citokine i druge detritusne i čestične materijale. Posle završetka ispiranja, broje se ćelije da bi se odredila ekspanzija TIL i njihova vijabilnost posle sakupljanja. CS10 se dodaje u isprane TIL u odnosu zapremina 1:1 da se dobije finalna formulacija Procesa 2A. Finalno formulisani proizvod se alikvotira u kriokese
2
koje se zatope i stave u prethodno ohlađene aluminijumske kasete. Kese za krioskladištenje koje sadrže TIL se zatim zamrzavaju korišćenjem CryoMed zamrzivača sa kontrolisanom stopom hlađenja (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) prema uputstvu SOP LAB-018 Rev 000 Rad zamrzivača sa kontrolisanom stopom hlađenja.
Uzorci: TIL iz četiri uslova sakupljaju se za upoređivanje karakteristika.
5.2.1 Sveže sakupljeni TIL (direktno iz PlasmaLyte-A sa 1% HSA puferom za ispiranje) Odmrznuti TIL (direktno iz kese sa odmrznutim finalnim proizvodom)
5.2.2 Sveži reREP TIL proširenog fenotipa (sveže sakupljeni TIL gajeni u kulturi 7-14 dana sa IL-2, PBMC hraniteljicama, i anti-CD3, klon OKT3)
5.2.3 Odmrznuti reREP TIL proširenog fenotipa (odmrznuti TIL gajeni u kulturi 7-14 dana sa IL-2, PBMC hraniteljicama, i anti-CD3, klon OKT3)
gled testiranja (vidi Sliku 2)
5.3.1 Pre-REP testiranje uključuje evaluaciju količine IL-2 i analiziranje metabolita ćelijske kulture kao što su glukoza, mlečna kiselina, L-glutamin i amonijak, u toku pre-REP.
5.3.1.1 Kvantifikacija IL-2: medijum se periodično uzima iz pre-REP kulture i testira korišćenjem ELISA da bi se izvršila kvantifikacija IL-2. Kao referenca služi uputstvo proizvođača R&D Systems Human IL-2 Quantikine ELISA kita.
5.3.1.2 Analiza metabolita ćelijske kulture: medijum se periodično uzima iz pre-REP kulture i testira na prisustvo sledećih metabolita: glukoza, mlečna kiselina, L-glutamin i amonijak. Referenca za uputstva je Roche Cedex Bioanalyzer, uputstvo za korisnika.
5.3.2 REP testiranje uključuje proširene testove kao što su broj ćelija, % vijabilnosti, analiza ćelijskih površinskih molekula protočnom citometrijom,
2 1
potencija (proizvodnja IFN-γ), bioluminiscentni test preusmerene lize, proizvodnja granzima B, ćelijski metabolizam i merenje dužine telomera.
5.3.2.1 Broj i vijabilnost ćelija: Broje se uzorci TIL i utvrđuje vijabilnost korišćenjem Cellometer K2 automatizovanog brojača ćelija (Nexcelom Bioscience, Lawrence, MA) prema uputstvu za SOP LAB-003 Rev 000 Cellometer K2 Image citometarski automatski brojač ćelija.
5.3.2.2 Protočno-citometrijska analiza ćelijskih površinskih biomarkera: TIL uzorci se alikvotiraju za protočno-citometrijsku analizu ćelijskih površinskih biomarkera navedenih u WRK LAB-041 Rev 000 bojenje površinskih antigena post REP TIL
5.3.2.3 Test potencije (proizvodnja IFN-γ): Druga mera citotoksičnog potencijala meri se određivanjem nivoa citokina IFN-γ u medijumu TIL stimulisanih antitelima na CD3, CD28, i CD137/4-1BB. Nivoi IFN-γ u medijumu iz ovih stimulisanih TIL određuju se korišćenjem WRK LAB-016 Rev 000 Stimulacija TIL za merenje oslobađanja IFN-γ
5.3.2.4 Bioluminiscentni test preusmerene lize: Citotoksični potencijal TIL za lizu ciljnih ćelija procenjuje se testom kokulture TIL korišćenjem bioluminiscentne ćelijske linije, P815 (klon G6), prema SOP navedenoj u WRK LAB-040 za Bioluminiscentni test preusmerene lize (test potencije) za TIL
5.3.2.5 Proizvodnja granzima B: Granzim B je još jedna mera sposobnosti TIL da ubijaju ciljne ćelije. Supernatanti medijuma restimulisani kako je opisano u 5.2.5.3 evaluiraju se i u pogledu nivoa granzima B, korišćenjem Human Granzyme B DuoSet ELISA kita (R & D Systems, Minneapolis, MN) prema uputstvima proizvođača.
5.3.2.6 Ćelijski (respiratorni) metabolizam: Ćelije se tretiraju inhibitorima mitohondrijalne respiracije i glikolize da bi se odredio metabolički profil TIL, koji se sastoji od sledećih merenja: bazalna oksidativna fosforilacija (mereno kao OCR), rezervni respiratobni
2 2
kapacitet, bazalna glikolitička aktivnost (mereno preko ECAR), i glikolitička rezerva. Metaboličko profilisanje se izvodi korišćenjem procedure navedene u testu WRK LAB-029 Seahorse kombinovani test stresa mitohondrija/gikolize.
5.3.2.7 Merenje dužine telomera: Različiti postupci korišćeni su za merenje dužine telomera u genomskoj DNK i citološkim preparatima. Analiza telomernih restrikcionih fragmenata (TRF) je zlatni standard za merenje dužine telomera (de Lange et al., 1990). Međutim, glavno ograničenje TRF je potreba za velikom količinom DNK (1.5 ^g). Dve široko korišćenje tehnike za merenje dužine telomera su fluorescencijain situ hibridizacija (FISH; Agilent Technologies, Santa Clara, CA) i kvantitativna PCR.
5.3.3 Dodatni uzorci uzimaju se za sledeće testove, i mogu se analizirati ubuduće, po potrebi:
5.3.3.1 Detaljna analiza citokina
5.3.3.2 TCR sekvenciranje
6. POSTIGNUTI REZULTATI
[0690] Ukupno 9 eksperimenata izvršeno je korišćenjem TIL izvedenih iz tumora opisanih u odeljku 2.3, uz eksperimentalni dizajn i uslove sakupljanja iz odeljka 5.1. TIL sakupljeni korišćenjem Procesa 2A podvrgnuti su testiranju navedenom u odeljku 5.3.2 u svrhu razumevanja njihove sposobnosti za ekspanziju, njihove vijabilnosti, fenotipa, citotoksičnog potencijala i metaboličkog profila. Sva merenja su urađena na sveže sakupljenom TIL proizvodu i odmrznutom zamrzavanom TIL proizvodu (Proces 2A).
6.1 Broj ćelija i vijabilnost
[0691]
6.1.1 Brojanje ćelija vršeno je na kraju pre-REP, na Dan 5 ili 6 REP (dan ekspanzije), i na kraju
REP, i pre LOVO ispiranja i posle LOVO ispiranja. Brojanje ćelija služilo je za određivanje ekspanzije TIL u toku REP i oporavka TIL posle ispiranja na LOVO. Posle odmrzavanja,
2
ćelije su ponovo brojane da bi se odredio oporavak posle odmrzavanja (na bazi koncentracije pri kojoj su TIL bili zamrznuti) i vijabilnosti posle odmrzavanja, pre nastavka sa drugim analitičkim testom. Tabela 3 sumira sve ove rezultate za devet ciklusa Procesa 2A.
2 4
� 6.1.2 SOP Procesa 2A definiše početni broj TIL za REP kao raspon od 5 do 200 x 10<6>TIL. Opseg devet TIL uzoraka upotrebljenih za otpočinjanje REP Procesa 2A bio je 4.1 x 10<6>(M1065T) - 1.8 x 108 (M1064T), sa prosečnim početnim brojem TIL od 6.58 x 10<7>. Interesantno, REP postavljeni sa najnižim brojem TIL ekspandiraju se do najvećeg stepena pri sakupljanju REP (opseg ekspanzije za svih 9 REP: 130-1900 puta; Prosečna ekspanzija, 840 puta). Prosečan broj sakupljenih TIL na kraju ovih devet REP Procesa 2A bio je 4.49 x 10<10>(opseg 7.8 x 109 - 6.7 x 1010).
6.1.3 Za uporednu statistiku Procesa 1C, vidi Chemistry, Manufacturing, and Controls (CMC), odeljak Investigational New Drug (IND) Prijava za LN144/LN-145.
6.1.4 Proces 1C koristi manuelni rad i centrifugiranje za ispiranje TIL proizvoda. Za ovo je potrebno dosta vremena, ali što je još važnije može rezultovati gubitkom do 25% proizvoda između sakupljanja i finalne formulacije. LOVO sistem za automatsko ispiranje ćelija obezbeđuje način da se na najmanju moguću meru svede gubitak ćelija i da se uvede ispiranje u zatvorenom sistemu što smanjuje rizik za kontaminaciju proizvoda tokom koraka ispiranja. Oporavak proizvoda prati korak ispiranja korišćenjem LOVO protokola i pokazuje se prosečan oporavak od 93.8 ± 10.4% TIL proizvoda koji prelaze u korak ispiranja. Ova statistika uključuje TIL proizvod za M1062T, koji je imao LOVO oporavak od 68%, tokom čega je greška operatera u radu sa LOVO rezultovala potrebom za centrifugiranjem uzorka i zatim ponovnim pokretanjem LOVO procedure (vidi Odeljak 7, Odstupanja i neslaganja). Ovo predstavlja veoma povoljno poboljšanje koraka ispiranja Procesa 1C na dan sakupljanja REP.
6.1.5 Oporavak TIL posle odmrzavanja takođe je predmet brige u vezi sa zamrznutim TIL proizvodom. Oporavak proizvoda određuje se merenjem broja ćelija oporavljenih iz kese posle odmrzavanja u odnosu na broj ćelija stavljenih u svaku od kesa za zamrzavanje pre krioprezervacije. Raspon oporavka posle odmrzavanja bio je 78-103%, sa prosečnim oporavkom od 88.2 ± 8.6%.
6.1.6 Iako postoji značajna razlika u vijabilnosti uzoraka pre ili posle odmrzavanja, u proseku, posle odmrzavanja postoji samo 2% gubitka vijabilnosti. Vijabilnost TIL koji odlaze u krioprezervaciju bila je 84.3 ± 4.7%, i isti TIL posle odmrzavanja imali su vijabilnost od 82.1 ± 4.4% (p = 0.0742, parni Studentov t-test, neparametarski). Kriterijumi oslobađanja za sveži klinički TIL proizvod Procesa 1C zahtevaju minimum od 70% vijabilnosti. Bez obzira na mali gubitak vijabilnosti posle odmrzavanja, svih 9 ciklusa Procesa 2A zadovoljava ovaj kriterijum
2
oslobađanja posle odmrzavanja kriogenog proizvoda. Tabela 4 i Slika 3 pokazuju vijabilnost TIL koji ulazi u krioprezervaciju (Sveži CS10) i vijabilnost TIL posle odmrzavanja.
6.2 Re-REP ekspanzija TIL. Pored ispitivanja sposobnosti svežeg proizvoda da se ekspandira u REP, evaluirana je sposobnost svežeg i odmrznutog TIL proizvoda da se ekspandira posle restimulacije sa sveže ozračenim alogenim PBMC hraniteljskim APC i svežim anti-CD3. Posle 7 dana, ovi restimulisani TIL proizvodi analizirani su u pogledu sposobnosti da se ekspandiraju iz inicijalnih uslova kulture. Slika 4 i Tabela 5 pokazuju prosečnu ekspanziju re-REP TIL ćelija posle 7 dana rasta u kulturi. Analiza podataka korišćenjem parnog Studentovog t-testa pokazuje da sposobnost TIL da se ekspandiraju u re-REP nije značajno različita bilo da REP započinje sa svežim TIL ili odmrznutim TIL proizvodom (p = 0.81).
6.3 Metaboliti ćelijske kulture. Jedna od glavnih premisa Lion 2A je da kraće tehnološko vreme i procesni transferi dovode do ušteda i ograničavaju varijabilnost. Moguće neželjene posledice ovoga su porast neželjenih metabolita i smanjenje izvora nutrijenata. Kako je pokazano na Slici 5, normalne vrednosti elektrolita u krvi (natrijum i kalijum), nutrijenata (glutamin i glukoza), i metabolita (mlečna kiselina i amonijak) imaju opseg koji treba uzeti u obzir kada se evaluiraju rezultati iz 11-dnevnog pre-REP. Kako je pokazano na Slici 6, tri TIL (M1061T, M1062T, i M1064T) evaluiraju se sekvencijalno. U ovoj postavci, kalijum i natrijum se održavaju na normlanim nivoima, glukoza je na >1.0 g/L a glutamin > 0.3 mmol/L, dosta iznad donje granice normalne vrednosti u krvi. Kako je očekivano, laktat raste čak na 0.8 g/L, što je oko 5X od nivoa koji se normalno nalazi u krvi i amonijak čak na 3 mmol/L, kao što se i očekuje od ćelija koje se brzo ekspandiraju i značajno iznad normalnih vrednosti u krvi.
2
6.4 Kvantifikacija IL-2.
[0692] 6.4.1 Glavni pokretač proliferacije TIL u pre-REP pored dodatne glukoze, glutamina i dovoljne oksigenacije je obezbeđivanje visokih nivoa rhIL-2. Posle njegovog dodavanja u medijum koji sadrži serum, izmereni nivoi IL-2 su na 2-3.5x10<3>IU/ml, i padaju samo na oko 1.0x103 IU/ml tokom 11 dana kulture. Ovo je dosta iznad 30-100 IU/ml potrebnih za održivu proliferaciju T-ćelija. Procena koncentracija IL-2 korišćenjem različitih izvora IL-2 (Prometheus, Akron, Cellgenix) trenutno se testira u zasebnim eksperimentima (QP-17-010 : Qualification of IL-2 from Cellgenix, Akron and Prometheus) pri Lion Biotechnologies, Tampa.
6.5 Proizvodnja IFN-γ
[0693] 6.5.1 Posle 24 h stimulacije TIL magnetnim anti-CD3, CD28 i 4-1BB Dynabeads kako je opisano u odeljcima 5.3.5.3, supernatant iz kultura se sakupi i analizira u pogledu prisustva IFN-γ korišćenjem ELISA kitova. Svi restimulisani TIL proizvode više IFN-γ nego njihovi nestimulisani parnjaci, što pokazuje da stimulacija TIL rezultuje njihovom aktivacijom. Slika 8 prikazuje sposobnost četiri različite testirane TIL kompozicije (sveži, odmrznuti, sveži re-REP i odmrznuti re-REP TIL) da oslobađaju IFN-γ u okolni medijum posle restimulacije.
[0694] Tabele 6 i 7 prikazuju prosečne vrednosti sekrecije IFN-γ u 9 ciklusa Procesa 2A. Sekrecija IFN-γ u okolni medijum posle restimulacije ne razlikuje se između svežeg TIL proizvoda i odmrznutih, krioprezerviranih TIL. Tabela 6 prikazuje da sveži proizvod proizvodi prosečno 4143 ± 2285 pg IPN-γ/10<6>TIL dok odmrznuti proizvod proizvodi 3910 ± 1487 pg IPN-γ/10<6>TIL (p = 0.55 uz korišćenje parnog Studentovog t-testa). Ako se izvrši normalizacija prema ukupnom TIL proizvodu (Tabela 7), u proseku, stimulisani sveži TIL proizvode 86 ± 61 gram IFN-γ, dok odmrznuti stimulisani TIL proizvedu 68 ± 40 grama IFN-γ (p = 0.13). Ovi podaci ukazuju na to da i sveži i odmrznuti TIL proizvodi proizvode IFN-γ i da nema razlike u sposobnosti svežih i odmrznutih podudarnih TIL da proizvode IFN-γ posle stimulacije pomoću anti-CD3/anti-CD28/anti-4-1BB.
2
6.6 Proizvodnja granzima B
[0695] 6.6.1 TIL se stimulišu magnetnim anti-CD3, CD28 i 4-1BB Dynabeads 24 h kako je opisano u 5.2.5.3, i supernatanti kultura se sakupe posle 24 h i analiziraju se nivoi granzima B korišćenjem ELISA. Svi restimulisani TIL proizveli su više granzima B nego njihovi nestimulisani parnjaci, što pokazuje da stimulacija TIL rezultuje njihovom aktivacijom. Slika 9 prikazuje sposobnost svežih TIL, svežih re-REP i odmrznutih re-REP TIL da oslobađaju granzim B u okolni medijum posle restimulacije koktelom citokina.
[0696] Svi proizvodi pokazali su proizvodnju granzima B u rasponu od 9190 pg/106 vijabilnih ćelija do 262000pg/10<6>vijabilnih ćelija (Tabela 8). Tabela 6 prikazuje da sveži proizvod proizvodi prosečno 60644 42959, dok sveži i odmrznuti re-REP proizvode 93600 67558, odnosno 103878 84515 respektivno. Poređenje između svežih re-REP i odmrznutih re-REP pokazuje da nema razlike u sposobnosti TIL dobijenih iz ovih uslova (p = 0.7). Zbog izostanka merenja granzima B u odmrznutom proizvodu, nije vršena statistička analiza svežeg TIL proizvoda.
2
� 6.7 Protočno-citometrijska analiza ćelijskih površinskih biomarkera
[0697] Fenotipsko profilisanje TIL: Četiri panela antitela bila su standardizovana pri LION da bi se široko okarakterisao funkcionalni profil T-ćelija. Ovi paneli se koriste za imunofenotipizaciju svežih TIL, odmrznutih TIL, svežih re-REP TIL, i odmrznutih re-REP TIL. Svi podaci upotrebljeni za grafičko prikazivanje u ovom odeljku dati su i u vidu tabele (Tabele 14-24) u priloženom odeljku 10.
6.8 Bioluminiscentni test preusmerene lize
[0698]
6.8.1 Da bi se odredila potencijalna sposobnost TIL Procesa 2A da ubiju svoje ciljne tumorske ćelije, razvili smo test potencije, koji uključuje kokultivisanje TIL sa bioluminiscentnom surogatskom ciljnom ćelijskom linijom P815, kako je opisano u odeljku 5.3.2.4. Četiri sata kokultivisanja različitih TIL kompozicija sa P815, u prisustvu stimulacije pomoću anti-CD3 daje meru citotoksičnog potencijala TIL ćelija izraženu u LU50, litičkim jedinicama koje se mogu definisati kao broj TIL potrebnih da se ubije 50% ciljnih ćelija. Ova mera se zatim izražava kao LU50/10<6>TIL. Slika 32, kasnije, pokazuje citotoksični potencijal svežeg TIL proizvoda, i TIL iz dva re-REP uslova, svežih re-REP i odmrznutih re-REP.
6.8.2 Poređenje svežih re-REP sa odmrznutim re-REP pokazuje da nema značajne razlike u sposobnosti TIL iz ovih uslova da ubiju ciljne ćelije (p = 0.3126). Ovaj podatak podržava zaključak da nema razlike između svežeg i odmrznutog proizvoda u pogledu citotoksičnog potencijala TIL proizvoda. Poređenje između svežih nije vršeno jer citotoksični potencijal nije meren neposredno posle odmrzavanja TIL. Tabela 9 prikazuje litičke jedinice TIL potrebne da se ubije 50% ćelija ciljne ćelijske linije P815.
Tabela 38: Litičke jedinice koje daje TIL protiv ciljne P815 ćelijske linije
2 1
6.9 Ćelijski metabolički profil TIL
[0699]
6.9.1 Da bi se procenilo metaboličko zdravlje post-REP TIL, koristili smo instrumente za analizu metabolizma saharoze (XFp i XFe96), Agilent Technologies (Santa Clara, CA) prema protokolu navedenom u odeljku 5.3.2.6. Ukratko, tretiranjem ćelija inhibitorima koji ciljaju određene aspekte oksidativne fosforilacije ili glikolize, ćelije su izložene stresu na način koji omogućava određivanje njihovog SRC i glikolitičke rezerve. Pored toga, moguće je odrediti bazalni nivoi oksidativne fosforilacije (bazalna OCR) i glikolize (bazalni ECAR). Na kraju, zbog toga što su inhibitori oksidativne fosforilacije i glikolize kombinovani u istom testu, može se odrediti potencijalna skrivena rezerva SRC što je vidljivo samo kada se ćelije tretiraju kompetitivnim inhibitorom glikolize, 2-deoksiglukozom (2-DG), (obeleženo SRC2DG), što za rezultat ima porast SRC koji bi inače ostao prikriven. Ovaj respiratorni kapacitet u višku obeležen je kao "Covert" (prikriveno) SRC. Tabela 9 prikazuje metaboličke profile svežih sakupljenih TIL, svežih re-REP TIL, i odmrznutih re-REP TIL, izvedene iz testa metaboličkog stresa izvršenog na ćelijama.
6.9.2 Slike 55A - F prikazuju podatke iz Tabele 38 u obliku grafikona. Sveži sakupljeni REP proizvod pokazuje izvesne statističke razlike u odnosu na sveži re-REP i odmrznuti re-REP proizvod. Ovo ne iznenađuje jer je re-REP proizvod bio restimulisan svežim ozračenim PBMC APC i svežim anti-CD3 antitelom neposredno posle REP ili posle odmrzavanja. Međutim, u svim slučajevima, nema značajne razlike između svežih i odmrznutih proizvoda kada su oba restimulisana u re-REP proceduri (vidi p vrednosti iz Tabele 9). Ovo ukazuje da proces krioprezervacije ne utiče štetno na TIL proizvod. Pre svega, za oksidativnu fosforilaciju, re-REP proizvodi imaju viši SRC nego njihovi odgovarajući sveži sakupljeni REP proizvodi. Za glikolizu, re-REP TIL imaju statistički značajno više bazalne nivoe glikolize i, nasuprot tome, statistički niže nivoe glikolitičke rezerve nego sveži REP proizvod. Treba napomenuti da ovo može ukazati da su re-REP TIL više aktivirani nego sveže
2 2
sakupljeni TIL, jer je saopšteno da aktivirani, zdravi TIL poseduju visoke nivoe glikolitičke aktivnosti (Buck et al., JEM 212:1345-1360; 2015).
2
6.9.3 Direktno upoređivanje svežeg i smrznutog proizvoda korišćenjem re-REP procedure omogućilo nam je da odredimo da i sveži i zamrznuti TIL proizvodi, posle istih uslova stimulacije, rezultuju metaboličkim profilima koji se statistički ne razlikuju. I sveži re-REP i odmrznuti re-REP TIL imaju slične nivoe bazalne respiracije (Slika 60A, 36.7 ± 10.6, odnosno 44.8 ± 12.9 pmol/min; p = 0.11) kao i sličan (očigledni) SRC (Slika 60B, 41.6 ± 27.2 i 62.7 ± 30.8; p = 0.12). Posle tretmana ovih re-REP ćelija korišćenjem 2-DG, kompetitivnog inhibitora glukoze, što rezultuje inhibicijom glikolize, vidimo da i sveži i odmrznuti re-REP TIL pokazuju ekstra, "prikriveni" rezervni respiratorni kapacitet (SRC2DG; Prikriveni SRC) koji je uglavnom nizak ili odsutan kod sveže sakupljenog TIL uzorka (Slika 60C); samo jedan uzorak imao je visoke nivoe SRC2DG (Slika 60C) kod sveže sakupljenih TIL, dok je, nasuprot tome, samo jedan od sedam testiranih uzoraka pokazao odsustvo Prikrivenog SRC posle re-REP. Prikriveni SRC (Slika 60D) za sveže re-REP iznosio je prosečno 20.7 ± 20.1, dok je prikriveni SRC (Slika 60D) za odmrznuti re-REP iznosio 27.8 ± 16.1; p = 0.52).
6.9.4 Najupečatljivije metaboličko očitavanje za TIL proširenog fenotipa (re-REP) su konzistentno visoki nivoi bazalne glikolize uzoraka proširenog fenotipa (re-REP). Bazalna glikoliza (Slika 60E) je konzistentno visoka kod re-REP uzoraka, u proseku iznosi 118.7 ± 44.2 mpH/min za sveže re-REP i 132.0 ± 43.2 mpH/min za odmrznute re-REP. Ovi uzorci se međusobno ne razlikuju statistički (p = 0.38). Međutim, kako je rečeno gore, sveži sakupljeni uzorak ne poseduje tako visoke bazalne nivoe glikolize. U poređenju sa svežim re-REP TIL, ova razlika je suštinska, ali nije značajna (p = 0.10); međutim, u poređenju sa odmrznutim re-REP uzorcima, razlika je značajna (p 0.01). Ove re-REP ćelije se očigledno snažno oslanjaju na glikolizu u pogledu svojih energetskih potreba, jer imaju malu glikolitičku rezervu koja ostaje posle stresa u Seahorse metaboličkim testovima (Slika 60F): sveži re-REP TIL prosečno 12.9 ± 14.9 mpH/min; odmrznuti re-REP TIL, 3.35 ± 23.8 mpH/min). Ovi re-REPs se ne razlikuju međusobno (p = 0.47) ali su i jedan i drugi statistički različiti od glikolitičke rezerve nađene kod sveže sakupljenih TIL uzoraka, čija srednja vrednost iznosi 40.8 ± 17.6 mpH/min (p = 0.003 i 0.01 u poređenju sa svežim re-REP, odnosno odmrznutim re-REP TIL). Potrebne su dodatne studije da bi se odredio uzrok koji stoji iza razlike zapažene u glikolizi između ovih sveže sakupljenih i re-REP TIL uzoraka.
6.10 Merenje dužine telomera
[0700]
6.10.1 Merenje dužine telomera post-REP TIL metodima Flow Fish i qPCR.
2 4
6.10.1.1 Flow-FISH se izvodi korišćenjem kita Dako/Agilent Pathology Solutions (Telomere PNA Kit/FITC za protočnu citometriju) i prate se uputstva proizvođača da bi se merila prosečna dužina telomernih ponovaka. Ćelijska linija 1301 leukemijskih T-ćelija (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) koristi se kao unutrašnji referentni standard u svakom testu. Pojedinačni TIL se broje i mešaju sa 1301 ćelijama u odnosu ćelija 1:1. 2 X 10<6>TIL meša se sa 2 X 10<6>1301 ćelija. In situ hibridizacija se izvodi u hibridizacionom rastvoru (70% formamid, 1% BSA, 20 mM Tris, pH 7.0) u duplikatu i u prisustvu i odsustvu FITC-konjugovane telomerne PNA probe (FITC-00-CCCTAA-CCC-TAA-CCC-TAA) komplementarne sa sekvencom telomernog ponovka u finalnoj koncentraciji od 60 nM. Posle dodavanjae telomerne PNA probe, ćelije se inkubiraju 10 minuta na 82 °C u toplotnom bloku. Ćelije se zatim ostavljaju u mraku na sobnoj temperaturi preko noći. Sledećeg jutra, višak telomerne probe ukloni se ispiranjem u 2 promene od po 10 minuta na toplotnom bloku, na 40°C, uz korišćenje rastvora za ispiranje. Posle ispiranja, dodaje se DAPI (Invitrogen, Carlsbad, CA) u finalnoj koncentraciji od 75 ng/ml. DNK bojenje pomoću DAPI koristi se za ograđivanje ćelija u G0/G1 populaciju. Analiza uzorka vrši se korišćenjem Yeti protočnog citometra (Propel-Labs, Fort Collins, CO). Fluorescencija telomera testnog uzorka izražava se kao procenat fluorescencije (fl) 1301 ćelija prema sledećoj formuli: Relativna dužina telomera = [(srednja vrednost FITC fl test-ćelija sa probom - srednja vrednost FITC fl test-ćelija bez probe) X DNK indeks 1301 ćelija X 100] / [(srednja vrednost FITC fl 1301 ćelija sa probom - srednja vrednost FITC fl 1301 ćelija bez probe) X DNK indeks testnih ćelija.
6.10.1.2 qPCR: qPCR u realnom vremenu koristi se za merenje relativne dužine telomera. Ukratko, odnos broja kopija telomernog ponovka prema broju kopija jednog gena (T/S) određuje se korišćenjem Bio-Rad PCR termalnog ciklizera (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) u formatu 96 bunarčića. Deset nanograma genomske DNK koristi se za PCR reakciju za telomere (Tel) ili hemoglobin (hgb) uz upotrebu sledećih prajmera: Tel-1b prajmer (CGG TTT GTT TGG GTT TGG GTT TGG GTT TGG GTT TGG GTT), Tel-2b primer (GGC TTG CCT TAC CCT TAC CCT TAC CCT TAC CCT TAC CCT), hgb1 prajmer (GCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGC), i hgb2 prajmer
2
(CACCAACTTCATCCACGTTCACC). Svi uzorci se analiziraju i telomernom i hemoglobinskom reakcijom, i analiza se izvodi u triplikatu na istoj ploči. Pored testnih uzoraka, svaka ploča sa 96 bunarčića sadržala je bunarčiće za standardnu krivu sa pet tačaka, od 0.08 ng do 250 ng uz korišćenje genomske DNK izolovane iz 1301 ćelija. Odnos T/S (-dCt) za svaki uzorak izračunava se oduzimanjem medijane hemoglobinskog graničnog ciklusa (Ct) od medijane Ct vrednosti za telomere. Relativni odnos T/S (-ddCt) određuje se oduzimanjem T/S odnosa tačke standardne krive za 10 ng od T/S odnosa svakog nepoznatog uzorka.
6.10.1.3 Dužina telomera - Rezultati i diskusija: Telomere su kapice (ponavljajuće nukleotidne sekvence) na kraju linearnih hromozoma, koje igraju kritičnu ulogu u olakšavanju potpune replikacije hromozoma. Merenje telomera je novo sredstvo u izučavanju stanja kao što su degenerativne bolesti, kancer, i starenje. Ranije studije iz NIH (J Immunol. 2005, Nov 15;175(10):7046-52; Clin Cancer Res. 2011, Jul 1; 17(13): 4550- 4557) pokazale su da je veća dužina telomera TIL udružena sa kliničkim odgovorom. Obrnuto, Radvanyijeva grupa nije našla značajnu razliku u dužini telomera TIL između onih koji su odgovarali i onih koji nisu odgovarali (Clin Cancer Res; 18(24); 6758-70). Za sada nema dokaza koji bi pokazali da je dužina telomera udružena sa dužinom in vitro T ćelijske kulture. Moguće je da će post-REP TIL kultivisani Procesom 2A (22 dana kulture) imati duže telomere u poređenjuu sa TIL kultivisanim Procesom 1C (25-36 dana kulture).
7. NESLAGANJA I ODSTUPANJA
7.1 Odstupanja procesa
[0701]
7.1.1 M1061T: REP ćelije se razdeljuju na Dan 6 u 4 G-Rex500M flakona.
7.1.2 M1062T: REP ćelije se razdeljuju na Dan 6 u 4 G-Rex500M flakona. Zbog greške operatera na LOVO filtracionom sistemu, moralo je doći do hitnog zaustavljanja tokom procedure što je zahtevalo ručno sakupljanje TIL iz kita za jednokratnu upotrebu. TIL su uspešno filtrirani tokom drugog LOVO ciklusa.
2
7.1.3 M1063T: Nema devijacija M1064T: Nema devijacija
7.1.4 M1065T: Pre-REP ćelije bile su ispod specifikacije za broj ćelija na Dan 11 (<5 x 106 ćelija) ali su nastavile u REP. Na REP Dan 6, ćelije se broje i stavljaju nazad u G-Rex500M i hrane sa 4.5 L svežeg medijuma. TIL nisu ekspandirani na taj dan zbog nedovoljnog broja ćelija (<1 x 10<9>ćelija na REP Dan 6).
7.1.5 EP11001T: Bez devijacije
7.1.6 M1056T: Pre-REP ćelije su kultivisane pri LION u G-Rex 100 flakonima tokom do 21 dana. Tumorski fragmenti su filtrirani na pre-REP Dan 11 i TIL su zamrznuti na dan sakupljanja u 100% CS10 pri 30 x 106 ćelija po fioli od 1.5 ml. Zamrznuti TIL se odmrzavaju pri Moffitt PD u CM1 dopunjenom sa 6000 IU/mL rhIL-2 i miruju 3 dana pre počinjanja Dana 0 REP. Na Dan 6 REP, TIL se ekspandiraju u 4 flakona koji se sprovode do sakupljanja na REP Dan 11.
7.1.7 M1058T: Pre-REP ćelije se gaje pri LION u G-Rex 100 flakonima tokom do 21 dana. Tumorski fragmenti su filtrirani na pre-REP Dan 11 i TIL su zamrznuti na dan sakupljanja u 100% CS10 pri 30 x 106 ćelija po 1.5 ml fioli. Zamrznuti TIL se odmrzavaju pri Moffitt PD u CM1 dopunjenom sa 6000 IU/mL rhIL-2 i miruju 3 dana pre počinjanja Dana 0 REP. Na Dan 6 REP, TIL se razdeljuju u 4 flakona koji se sprovode do sakupljanja na REP Dan 11.
7.1.8 M1023T: Pre-REP ćelije se gaje pri LION u G-RexlO flakonima tokom do 21 dana. Tumorski fragmenti su filtrirani na pre-REP Dan 11 i TIL su zamrznuti na dan sakupljanja u 100% CS10 pri 30 x 106 ćelija po 1.5 ml fioli. Zamrznuti TIL se odmrzavaju pri Moffitt PD u CM1 dopunjenom sa 6000 IU/mL rhIL-2 i miruju 3 dana pre počinjanja Dana 0 REP. Na Dan 6 REP, TIL se ekspandiraju u 4 flakona koji se sprovode do sakupljanja na REP Dan 11.
7.2 Odstupanja u testu
[0702] 7.2.1 Široka analiza citokina i TCR sekvenciranje nisu izvedeni
8. ZAKLJUČCI I PREPORUKE
[0703]
2
8.1 Razvijanje robusnijeg procesa. Izazov za Lion bio je konvertovanje ranijeg Lion Procesa 1C, koji je imao dugo procesno vreme, u Proces 2A koji bi potencijalno mogao bolje da se komercijalizuje, u kojem se koriste poboljšanja koja rezultuju kraćim vremenom obrade i krioprezerviranom finalnom formulacijom TIL proizvoda. Sa ovim ciljem, devet ciklusa Razvoja procesa izvedeno je da bi se potvrdilo da stari i novi proces pokazuju uporedive prinose ćelija i uporedivu potenciju i fenotip TIL. Posebno treba napomenuti upadljivo smanjenje kompleksnosti procesa, što rezultuje 50% smanjenjem dužine pre-REP i REP procesa, i dalje dajući uporedive prinose TIL (7.8 x 109 - 67 x 109 ćelija) u poređenju sa istorijskim Lion Procesom 1C koji se trenutno praktikuje kod našeg ugovornog proizvođača. Ovo je nedavno ažurirano za ASCO prezentaciju juna 2017 (Sr. vr.: 41.04 x 109 ćelija sa rasponom od 1.2-96 x 10<9>ćelija). Pored toga, Lion je uspešno razvio krioprezervirani TIL proizvod koji pokazuje oporavak posle odmrzavanja od 78-103% sa > 70% vijabilnosti TIL, konzistentno sa kriterijumima oslobađanja trenutnog Procesa 1C (vidi Tabelu 2).
8.2 Uloga proširene fenotipske analize (Re-REP). Sposobnost proliferacije u odgovoru na mitogenu stimulaciju (kao u eksperimetalnim re-REP prikazanim u ovom izveštaju) kritičan je atribut kvaliteta TIL. Eksperimenti prikazani u ovom tekstu pokazuju da 8/9 odmrznutih TIL proizvoda pokazuje sposobnost da se ekspandira >100 puta u toku jedne nedelje u poređenju sa 7/9 odgovarajućih svežih TIL proizvoda, što podržava uporedivost odmrznutog TIL proizvoda sa svežim TIL proizvodom (Tabela 2). Dva dodatna kritična atributa kvaliteta TIL su njihova sposobnost da oslobađaju IFN-γ i/ili granzim B posle stimulacije citokinima (CD3/CD28/4-1BB). Stimulacija citokinima svežih i odmrznutih proizvoda rezultuje oslobađanjem IFN-γ koje prevazilazi 2 ng/10<6>ćelija/24 sata u 7/9 svežih proizvoda i svim odmrznutim proizvodima (Slika 35) (vidi odeljak 6.2 ovog izveštaja). Oslobađanje granzima B (Slika 36) zapaženo je za svih 9 ciklusa procesa. Nivoi CD4 i CD8 (Slika 39 i Slika 40) pokazuju upadljivu unutrašnju konzistenciju između svežih i odmrznutih TIL proizvoda. Pored toga, analiza sposobnosti TIL da ubijaju surogatsku tumorsku ciljnu ćelijsku liniju (P815, Slika 59) pokazuje da sveži i odmrznuti TIL poseduju sličan citotoksični potencijal.
8.3 Test metaboličkog stresa TIL otkriva robusnu bioenergetiku. Analiza metaboličkih profila svežih i odmrznutih TIL proizvoda stimulisanih u re-REP pokazuje da sveži i odmrznuti TIL odgovaraju slično na testiranje metaboličkim
2
stresom i ne pokazuju bitnu razliku u panelu metaboličkih karakteristika (Tabela 39). Prema tome, krioprezervirani TIL proizvod Procesa 2A može se smatrati uporedivim sa svežim proizvodom Procesa 1C na osnovu četiri atributa kvaliteta - identičnosti, potencije, broja ćelija i vijabilnosti, prikazanih u ovom izveštaju. Rezultati testova u kojima se porede odgovarajuće sveže i odmrznute ćelije prilično su uporedivi. za svaki test naveden u ovom izveštaju.
8.4 Kriterijumi prihvatljivosti: Unutrašnja heterogenost TIL proizvoda uz personalizovanu terapiju za svakog pacijenta, odražava: (1) njihove jedinstvene restriktivne molekule glavnog kompleksa histokompatibilnosti (najpolimorfniji genski proizvodi u humanoj biologiji); (2) jedinstvenu evolucionu putanju pojedinačnih tumora nastalih u tumorskom mikrookruženju sa genomskom nestabilnošću i jedinstvenim pojedinačnim pokretačkim i naknadnim mutacijama; i (3) heterogenost datu alelskim varijacijama, diverzitetom N-regiona, i VDJ rearanžmanima u Vα i Vβ segmentima koji definišu T-ćelijske receptore koji se koriste za prepoznavanje neoepitopa zajedničkih za tumor-testisne antigene, i virusima kodiranim proizvodima. Procena dodatne varijacije do koje dolazi u rezultatu promena procesa je, tako, zastrašujući zadatak i zahteva procenu što je više moguće parametara da bi se pružilo uveravanje da je ’komparabilnost’ intrinzično heterogenog materijala moguća. Ovo se može postići preciznim ispitivanjem nekoliko kriterijuma prihvatljivosti za izvodljivost i uporedivost, kako je detaljno prikazano u Tabeli 40 u nastavku.
Tabela 40: Kriterijumi prihvatljivosti za izvodljivost i uporedivost
2
[0704] Na osnovu kriterijuma izvodljivosti navedenih u Tabeli 11, TIL će se evaluirati u vezi sa tim da li zadovoljavaju ili ne zadovoljavaju kriterijume. Svi pojedinačni kriterijumi zadovoljeni su u svakom eksparimentu i svakoj liniji TIL (n=9). Studentov t-test upotrebljen je za statističku analizu. Neparametarski Studentov T-test upotrebljen je za izračunavanje pvrednosti za % vijabilnosti jer mere vijabilnosti nisu po Gaussovoj raspodeli. Vidi Tabelu 41 u nastavku.
Tabela 41: Zadovoljavanje kriterijuma prihvatljivosti za izvodljivost.
2
[0705] Na osnovu kriterijuma prihvatljivosti navedenih u Tabeli 40, sveži i zamrznuti re-REP TIL evaluirani su u vezi sa tim da li zadovoljavaju kriterijume. (Vijabilnost nije saopštena jer je trajanje re-REP bilo 7 dana i rezidualne ozračene PBMC nisu mogle da se razlikuju od TIL.) Brojevi u zagradama označavaju kriterijume koji nisu zadovoljeni. Na osnovu kriterijuma čistoće, merenog korišćenjem ekspresije CD3+, 6/9 svežih Re-REP TIL proizvoda zadovoljilo je stroge kriterijume od >90% (M1061, M1065 i EP11001 nisu) i 8/9 odmrznutih proizvoda prošlo je kriterijum prihvatljivosti čak i posle Re-REP. Mali broj CD3+ TIL u EP11001T svežim re-REP mogao bi se pripisati ekstremnoj nishodnoj regulaciji T ćelijskog receptora. Merenje CD3+ TIL kao mera čistoće nije vršeno za M1023T odmrznute re-REP TIL. Za ovu TIL kompoziciju, čistoća je procenjivana korišćenjem TCRap bojenja i to je naznačeno asteriskom (*). Studentov t-test upotrebljen je za statističku analizu. Vidi Tabelu 42 u nastavku.
Tabela 42: Zadovoljavanje kriterijuma prihvatljivosti za uporedivost.
2 1
Bibliografija
[0706] Goff SL, Dudley ME, Citrin DE, Somerville RP, Wunderlich JR, Danforth DN, Zlott DA, Yang JC, Sherry RM, Kammula US, Klebanoff CA, Hughes MS, Restifo NP, Langhan MM, Shelton TE, Lu L, Kwong ML, Ilyas S, Klemen ND, Payabyab EC, Morton KE, Toomey MA, Steinberg SM, White DE, Rosenberg SA. Randomized, Prospective Evaluation Comparing Intensity of Lymphodepletion Before Adoptive Transfer of Tumor-Infiltrating Lymphocytes for Patients With Metastatic Melanoma. J Clin Oncol. 2016 Jul 10;34(20):2389-97. doi: 10.1200/JCO.2016.66.7220. Epub 2016 May 23. PubMed PMID: 27217459; PubMed Central PMCID: PMC4981979.
[0707] Hinrichs CS, Rosenberg SA. Exploiting the curative potential of adoptive T-cell therapy for cancer. Immunol Rev. 2014 Jan;257(1):56-71. doi:10.1111/imr.12132. Review. PubMed PMID: 24329789; PubMed Central PMCID: PMC3920180.
[0708] Jin J, Sabatino M, Somerville R, Wilson JR, Dudley ME, Stroncek DF, Rosenberg SA. Simplified method of the growth of human tumor infiltrating lymphocytes in gas-permeable flasks to numbers needed for patient treatment. J Immunother. 2012 Apr;35(3):283-92.
2 2
d10.1097/CJI.0b013e31824e801f. PubMed PMID: 22421946; PubMed Central PMCID: PMC3315105.
[0709] Somerville RP, Devillier L, Parkhurst MR, Rosenberg SA, Dudley ME. Clinical scale rapid expansion of lymphocytes for adoptive cell transfer therapy in the WAVE® bioreactor. J Transl Med.2012 Apr 4;10:69.
[0710] Donia M, Larsen SM, Met O, Svane IM. Simplified protocol for clinical-grade tumorinfiltrating lymphocyte manufacturing with use of the Wave bioreactor. Cytotherapy. 2014 Aug;16(8):1117-20. doi: 10.1016/j.jcyt.2014.02.004; PubMed PMID: 24831841.
[0711] Henning AL, Levitt DE, Vingren JL, McFarlin BK. Measurement of T-Cell Telomere Length Using Amplified-Signal FISH Staining and Flow Cytometry. Curr Protoc Cytom.
2017 Jan 5;79:7.47.1-7.47.10. doi: 10.1002/cpcy.11. PubMed PMID 28055115
[0712] Kelesidis T, Schmid I. Assessment of Telomere Length, Phenotype, and DNA Content. Curr Protoc Cytom. 2017 Jan 5;79:7.26.1-7.26.23. doi: 10.1002/cpcy.12. PubMed PMID: 28055113.
[0713] Gardner M, Bann D, Wiley L, Cooper R, Hardy R, Nitsch D, Martin-Ruiz C, Shiels P, Sayer AA, Barbieri M, Bekaert S, Bischoff C, Brooks-Wilson A, Chen W, Cooper C, Christensen K, De Meyer T, Deary I, Der G, Diez Roux A, Fitzpatrick A, Hajat A, Halaschek-Wiener J, Harris S, Hunt SC, Jagger C, Jeon HS, Kaplan R, Kimura M, Lansdorp P, Li C, Maeda T, Mangino M, Nawrot TS, Nilsson P, Nordfjall K, Paolisso G, Ren F, Riabowol K, Robertson T, Roos G, Staessen JA, Spector T, Tang N, Unryn B, van der Harst P, Woo J, Xing C, Yadegarfar ME, Park JY, Young N, Kuh D, von Zglinicki T, Ben-Shlomo Y; Halcyon study team.. Gender and telomere length: systematic review and meta-analysis. Exp Gerontol. 2014 Mar;51:15-27. doi:10.1016/j.exger.2013.12.004. Epub 2013 Dec 21. Review. PubMed PMID:
24365661;PubMed Central PMCID: PMC4523138.
[0714] Carbonari M, Tedesco T, Fiorilli M. Correlation between terminal restriction fragments and flow-FISH measures in samples over wide range telomere lengths. Cell Prolif.
2014 Feb;47(1):20-7. doi: 10.1111/cpr.12086. PubMed PMID: 24450811.
[0715] Rufer N, Dragowska W, Thornbury G, Roosnek E, Lansdorp PM. Telomere length dynamics in human lymphocyte subpopulations measured by flow cytometry. Nat Biotechnol.
1998 Aug;16(8):743-7. PubMed PMID: 9702772.
[0716] Li Y, Liu S, Hernandez J, Vence L, Hwu P, Radvanyi L. MART-1-specific melanoma tumor-infiltrating lymphocytes maintaining CD28 expression have improved survival and expansion capability following antigenic restimulation in vitro. J Immunol. 2010 Jan
2
1;184(1):452-65. doi: 10.4049/jimmunol.0901101. Epub 2009 Nov 30. PubMed PMID: 19949105.
[0717] Rosenberg SA, Dudley ME. Adoptive cell therapy for the treatment of patients with metastatic melanoma. Curr Opin Immunol. 2009 Apr;21(2):233-40. doi:10.1016/j.coi.2009.03.002. Epub 2009 Mar 21. Review. PubMed PMID: 19304471; PubMed Central PMCID: PMC3459355.
[0718] Shen X, Zhou J, Hathcock KS, Robbins P, Powell DJ Jr, Rosenberg SA, Hodes RJ. Persistence of tumor infiltrating lymphocytes in adoptive immunotherapy correlates with telomere length. J Immunother. 2007 Jan;30(1):123-9. PubMed PMID:17198091; PubMed Central PMCID: PMC2151201.
[0719] Zhou J, Shen X, Huang J, Hodes RJ, Rosenberg SA, Robbins PF. Telomere length of transferred lymphocytes correlates with in vivo persistence and tumor regression in melanoma patients receiving cell transfer therapy. J Immunol. 2005 Nov 15;175(10):7046-52. PubMed PMID: 16272366; PubMed Central PMCID: PMC1351312.
[0720] Maciejowski J, de Lange T. Telomeres in cancer: tumour suppression and genome instability. Nat Rev Mol Cell Biol. 2017 Mar;18(3): 175-186. doi:10.1038/nrm.2016.171. Epub 2017 Jan 18. Review. PubMed PMID: 28096526.
[0721] Erdel F, Kratz K, Willcox S, Griffith JD, Greene EC, de Lange T. Telomere Recognition and Assembly Mechanism of Mammalian Shelterin. Cell Rep. 2017 Jan 3;18(1):41-53. doi: 10.1016/j.celrep.2016.12.005. PubMed PMID: 28052260; PubMed Central PMCID: PMC5225662.
[0722] Cardenas ME, Bianchi A, de Lange T. A Xenopus egg factor with DNA-binding properties characteristic of terminus-specific telomeric proteins. Genes Dev.1993 May;7(5):883-94. PubMed PMID: 7684008.
[0723] de Lange T. Activation of telomerase in a human tumor. Proc Natl Acad Sci U S A.
1994 Apr 12;91(8):2882-5. Review. PubMed PMID: 8159672; PubMed Central PMCID: PMC43476.
[0724] de Lange T, Shiue L, Myers RM, Cox DR, Naylor SL, Killery AM, Varmus HE. Structure and variability of human chromosome ends. Mol Cell Biol.1990 Feb;10(2):518-27. PubMed PMID: 2300052; PubMed Central PMCID: PMC360828.
9. Dodatne tabele
[0725]
2 4
Tabela 43 - Slika 39: CD4+ ćelije
Tabela 44 - Slika 40: CD8+ ćelije
2
�
�
�
�
�
21
22
�
��
� PRIMER 20: NOVI KRIOPREZERVIRANI TUMOR-INFILTRIRAJUĆI LIMFOCITI (LN-144) PRIMENJENI KOD PACIJENATA SA METASTATSKIM MELANOMOM
[0726] Novi krioprezervirani tumor-infiltrirajući limfociti (LN-144) primenjeni kod pacijenata sa metastatskim melanomom pokazuju efikasnost i tolerabilnost u multicentričnoj kliničkoj studiji Faze 2
UVOD:
[0727] Bezbednost i efikasnost adoptivne ćelijske terapije (ACT) sa nekrioprezerviranim tumor-infiltrirajućim limfocitima (TIL) bile su izučavane na stotinama pacijenata sa metastatskim melanomom. Ovo multicentrično kliničko ispitivanje otpočelo je sa centralno proizvedenim TIL (LN-144) korišćenim u vidu nekrioprezerviranih i krioprezerviranih infuzionih proizvoda. Naš novi proizvodni proces za nekrioprezervirane LN-144 upotrebljen je u Kohortu 1, a skraćeni tronedeljni, krioprezervirani proces za proizvodnju LN-144 upotrebljen je za Kohort 2. Izrada za Kohort 2 ponudila je značajno kraći proces, zajedno sa krioprezerviranim TIL proizvodom koji je omogućio fleksibilnost pri zakazivanju i doziranju pacijenata. Kraći proces proizvodnje skraćuje vreme koje pacijenti provedu čekajući na svoj TIL proizvod, a krioprezervacija doprinosi pogodnostima prilikom logistike i dostave do klinike.
POSTUPCI:
[0728] C-144-01 je prospektivna, multicentrična studija u kojoj se evaluiraju pacijenti sa metastatskim melanomom koji primaju LN-144. Posle pripremnog režima nemijeloablativne limfodeplecije uz korišćenje Cy/Flu, pacijenti primaju jednu infuziju LN-144 praćenu primenom IL-2 (600,000 IU/kg) do 6 doza. Pacijenti se evaluiraju u pogledu objektivnog odgovora kao primarnog ishoda, u trajanju od najviše 24 meseca.
REZULTATI:
[0729] Karakterisali smo krioprezervirane LN-144 primenjene kod drugog kohorta pacijenata, Kohort 2 (N=10) prema istom režimu tretmana pre i posle TIL infuzije kao što je korišćen za Kohort 1.
[0730] Pacijenti iz Kohorta 2 snažno su pretretirani povećanim brojem prethodnih linija pri čemu su svi pacijenti primali anti-CTLA-4 i anti-PD-1 terapije, i veće opterećenje tumorom (sr. vr. SOD: 15.3, 10.9 cm za Kohorte 2, 1). Medijana broja ranijih sistemskih terapija je 4, 3
2
za Kohorte 2, 1, respektivno. Početna analiza podataka o bezbednosti pokazuje uporedivu tolerabilnost krioprezerviranih LN-144. Profil bezbednosti za pacijente Kohorta 1 koji su primili nekrioprezervirane LN-144 i dalje je prihvatljiv za ovu populaciju pacijenata u kasnom stadijumu bolesti. Najčešći TEAE zapaženi u oba kohorta po frekvenciji bili su muka, anemija, febrilna neutropenija, smanjen broj neutrofila, smanjen broj krvnih pločica. Rani pregled podataka o efikasnosti ukazuje na antitumorsku aktivnost, uključujući PR, za TIL terapiju kod tretiranih pacijenata Kohorta 2.
ZAKLJUČCI:
[0731] Ovo predstavlja prvo kliničko ispitivanje u multicentričnoj postavci sa centralno proizvedenim TIL, koje procenjuje novi proces za krioprezervirani autologni proizvod iz procesa značajno kraćeg trajanja (približno 3 nedelje). Preliminarni rezultati ukazuju na to da su krioprezervirani LN-144 bezbedna i tolerabilna terapijska opcija za pacijente sa metastatskim melanomom kod kojih je više ranijih terapija bilo neuspešno, uključujući inhibitore kontrolnih tačaka. Krioprezervirani LN-144 obezbeđuju veću fleksibilnost za pacijente i negovatelje i omogućavaju bržu primenu lečenja kod pacijenata sa tako visokim nezadovoljenim medicinskim potrebama. NCT02360579.
PRIMER 21: EVALUACIJA MEDIJUMA KOJI NE SADRŽI SERUM ZA UPOTREBU U PROCESU 2A
[0732] Ovaj primer prikazuje podatke o evaluaciji efikasnosti medijuma koji ne sadrži serum kao zamene za standardne CM1, CM2, i CM4 medijume koji se trenutno koriste u procesu 2A. U ovoj studiji testira se, u tri faze, efikasnost raspoloživih medijuma koji ne sadrže serum (serum-free media, SFM) i alternativa koje ne sadrže serum, kao zamena.
[0733] Faza -1: Uporediti efikasnosti ekspanzije TIL (n = 3) uz korišćenje standardnih, u odnosu na CTS Optimizer ili Prime T CDM ili Xvivo-20 medijume koji ne sadrže serum sa ili bez zamene za serum ili lizata pločica.
[0734] Faza-2: Testirati uslove kandidatskog medijuma koji ne sadrži serum u procesu 2A u mini-razmeri, korišćenjem G-Rex 5M (n=3).
OSNOVNE INFORMACIJE
[0735] Iako se sadašnja kombinacija medijuma koji se koriste u Pre i Post REP kulturi pokazala efikasnom, prilikom korišćenja AIM-V može doći do neuspeha REP. Ako se identifikuje efikasna alternativa koja ne sadrži serum, to bi proces učinilo jednostavnijim i
2
lakšim za izvođenje u CMO, uz smanjenje tipova medijuma koji se koriste sa 3 na 1. Pored toga, SFM smanjuje mogućnost nastanka adventicijske bolesti time što eliminiše upotrebu humanog seruma. Ovaj primer pruža podatke koji podržavaju upotrebu medijuma bez seruma u procesima 2A.
SKRAĆENICE
[0736]
μl mikrolitar
CM1,2,4 Kompletni medijum 1,2,4
CTS OpTimizer SFM Medijum koji ne sadrži serum CTS OpTimizer
g Grami
h Sat
IFU Uputstva za upotrebu (Instructions for use)
IL-2 Citokin interleukin-2
Min Minut
mL Mililitar
°C Celzijusov stepen
PreREP Pre protokola brze ekspanzije
REP Protokol brze ekspanzije
RT Sobna temperatura (room temperature)
SR Zamena za serum (serum replacement)
TIL Tumor-infiltrirajući limfociti
DIZAJN EKSPERIMENTA
[0737] Pre-REP i REP se iniciraju kako je pomenuto u LAB-008. Pregled ove tri faze eksperimenta prikazan je na crtežu dole:
2
[0738] Kao što se vidi na gornjem crtežu, izložen je projekat za testiranje medijuma i suplemenata bez seruma, u dva koraka.
[0739] Korak 1. Izbor dobavljača medijuma koji ne sadrži serum. preREP i postREP postavljeni su tako da imitiraju proces 2A, u GRex ploči sa 24 bunarčića. PreREP se inicira kultivisanjem svakog fragmenta/bunarčiću G-Rex ploče sa 24 bunarčića u triplikatima ili kvadriplikatima, po uslovima. REP se iniciraju na Dan 11 kultivisanjem 4 x 10e5 TIL/bunarčiću G-Rex sa 24 bunarčića, razdeljivanje se vrši na Dan 16, sakupljanje na Dan 22. CTS OpTimizer, X-Vivo 20, i Prime T-CDM koriste se kao potencijalne alternative za medijum koji ne sadrži serum, za upotrebu u PreREP i REP. CTS Immune SR zamena za serum (Life Technologies) ili lizat krvnih pločica (SDBB) dodaju se u količini od 3% u SFM. Planirano je da se svaki uslov testira sa najmanje 3 tumora u preREP i postREP da bi se imitirao proces 2A.
[0740] Korak 2. Identifikovani kandidati se dodatno testiraju u Procesu 2A u minirazmerama, prema protokolu (TP-17-007). Ukratko, preREP se iniciraju kultivisanjem 2 fragmenta/G-Rex 5M flakonu u triplikatima po dvskom od uslova. REP se inicira na Dan 11 korišćenjem 2 x 10e6/G-Rex 5M flakonu, razdeljivanje se vrši na Dan 16, sakupljanje na Dan 22.
[0741] Napomena: Neki tumori su obrađeni i postavljeni za merenje većeg broja parametara u jednom eksperimentu.
ZAPAŽANJA
[0742] Prilikom upoređivanja medijuma koji ne sadrži serum sa standardom korišćenim u Procesu 2A zapaženi su ekvivalentni ili statistički značajno bolji rezultati rasta ćelija.
[0743] Zapažaju se sličan fenotip, proizvodnja IFN-γ, podaci metaboličke analize za TIL koji su rasli u medijumu bez seruma, u poređenju sa TIL koji su rasli u medijumu standardno korišćenom u procesu 2A.
2
REZULTATI
Testiranje efikasnosti medijuma koji ne sadrži serum za ekspanziju pre i post REP TIL.
[0744] CTS Optimizer SR (zamena za serum) pokazuju povećanu ekspanziju preREP TIL i uporedivu REP TIL ekspanziju. CTS OpTimizer, X-Vivo 20, i Prime T-CDM se dodaju sa ili bez 3% CTS Immune CTS SR, i testiraju u odnosu na standardne uslove. U M1079 i L4026, CTS OpTimizer CSR uslovima pokazana je značajno bolja ekspanzija preREP TIL (p <0.05) u poređenju sa standardnim uslovima (CM1, CM2, CM4) (Slika 62A). Nasuprot tome, CTS Optimizer bez CSR ne pomaže pri ekspanziji preREP TIL (Dodatak -1,2,3). CTS Optimizer CSR pokazuje uporedivu TIL ekspanziju u PostREP za dva od tri testirana tumora (Slika-2B). Velika količina varijacija dešava se u pre i post REP sa X-Vivo 20 i Prime T-CDM uslovima, dok je CTS Optimizer bio relativno konzistentan među kvadriplikatima. Pored toga, SFM sa lizatom pločica nije pojačao preREP i postREP TIL ekspanziju u poređenju sa standardima (Slika 62A). Ovi rezultati sugerišu da je zamena za serum sigurno potrebna za obezbeđivanje rasta uporedivog sa našim standardom, CTS optimizer CSR može biti kandidat.
[0745] Testiranje kandidatskog uslova u G-Rex 5M u mini-razmeri (vidi Sliku 64).
[0746] Fenotipska analiza Post REP TIL. Vidi Sliku 66 i Tabelu 56 u nastavku.
Tabela 56: CD8 nagib sa CTS OpTimizer
Uporedivost interferona-gama
2
[0747] Interferon-gama ELISA (Quantikine). Proizvodnja IFN-γ merena je upotrebom Quantikine ELISA kita, R&D systems. CTS+SR proizvodi količine IFN-γ uporedive sa našim standardnim uslovom. Vidi Sliku 67.
PRIMER 22: KOKTEL FAKTORA RASTA T-ĆELIJA IL-2/IL-15/IL-21 POJAČAVA EKSPANZIJU I EFEKTORSKU FUNKCIJU TUMOR -INFILTRIRAJUĆIH T ĆELIJA
[0748] Adoptivna T-ćelijska terapija autolognim tumor-infiltrirajućim limfocitima (TIL) pokazala je kliničku efikasnost kod pacijenata sa metastatskim melanomom i cervikalnim karcinomom. U nekim studijama, bolji klinički ishodi bili su pozitivno korelisani sa ukupnim brojem ćelija unetih infuzijom i/ili procentom CD8+ T ćelija. Većina sadašnjih režima proizvodnje za promociju rasta TIL koristi samo IL-2. Pojačana ekspanzija limfocita saopštena je uz korišćenje režima koji uključuju IL-15 i IL-21. U ovoj studji opisuju se pozitivni efekti dodavanja IL-15 i IL-21 drugoj generaciji IL-2-TIL protokola, koji je nedavno sproveden na klinici.
Materijali i metodi
[0749] Proces generisanja TIL uključuje pre-protokol brze ekspanzije (pre-REP), u kojem se fragmenti tumora veličine 1-3 mm<3>stavljaju u medijum koji sadrži IL-2. Tokom pre-REP, TIL izlaze iz tumorskih fragmenata i ekspandiraju se u odgovoru na stimulaciju IL-2.
[0750] Da bi se dalje stimulisao rast TIL, TIL se ekspandiraju kroz drugi period kultivisanja označen kao Protokol brze ekspanzije (REP) koji uključuje ozračene PBMC hraniteljice, IL-2 i anti-CD3. U ovoj studiji, razvijen je skraćeni pre-REP i REP protokol ekspanzije da bi se ekspandirali TIL uz zadržavanje fenotipskih i funkcionalnih atributa finalnog TIL proizvoda.
[0751] Skraćeni protokol proizvodnje TIL koristi se za procenu uticaja IL-2 samog, u poređenju sa kombinacijom IL2/IL-15/IL-21. Ova dva režima kultivacije upoređuju se u vezi sa proizvodnjom TIL poreklom iz kolorektalnog tumora, melanoma, cervikalnog tumora, trostruko negativnog tumora dojke, tumora pluća i tumora bibrega. Po završetku pre-REP, kultivisani TIL procenjivani su u pogledu ekspanzije, fenotipa, funkcije (CD107a+ i IFNγ) i repertoara TCR Vβ.
[0752] pre-REP kulture se iniciraju korišćenjem standardnog protokola sa IL-2 (600 IU/ml), ili sa IL-15 (180 IU/ml) i IL-21 (IU/ml) zajedno sa IL-2. Procenjuje se ekspanzija ćelija na završetku pre-REP. Kultura se klasifikuje da ima povećanu ekspanziju u odnosu na IL-2 ako
2 1
je ukupan rast povećan za najmanje 20%. Fenotipske i funkcionalne studije iz melanoma i pluća prikazane su u ovom tekstu. Vidi Tabelu 57 dole.
Tabela 57: Pojačavanje ekspanzije tokom pre-REP sa IL-2/IL-15/IL-21 u više indikacija
[0753] Ovi podaci prikazuju povećani prinos TIL proizvoda kada se TIL kultivišu sa IL-2/IL15/IL-21 u poređenju samo sa IL-2, pored fenotipskih i funkcionalnih razlika, u plućima.
[0754] Efekat trostrukog koktela na ekspanziju TIL bio je specifičan za indikaciju i najviše je koristi doneo kod tumora sa malim prinosom.
[0755] Odnos CD8+/CD4+ T ćelija bio je povećan tretmanom u NSCLC TIL proizvodu.
[0756] Aktivnost T ćelija izgleda da je povećana dodavanjem IL-15 i IL-21 uz IL-2, što je procenjeno nivoima ekspresije CD107a u melanomu i NSCLC.
[0757] Priloženi podaci pokazuju da TIL ekspanzija u kojoj se koristi kraći robusniji proces, kao što je proces 2A opisan u ovom tekstu u prijavi i drugim primerima, može da se prilagodi tako da uključi koktel citokina IL-2/IL-15/IL-21, čime se obezbeđuje dodatna promocija ekspanzije TIL, naročito u određenim indikacijama.
[0758] Eksperimenti koji su u toku, dodatno evaluiraju efekte IL-2/IL-15/IL-21 na funkciju TIL.
[0759] Dodatni eksperimenti evaluiraće efekat trostrukog koktela tokom REP (prva ekspanzija).
[0760] Ova zapažanja su posebno relevantna za optimizaciju i standardizaciju režima kulture TIL potrebnog za proizvodnju TIL u velikim razmerama sa širokom primenljivošću i dostupnošću, kako to zahteva glavni pravac lečenja kancera.
2 2
PRIMER 23: KRIOPREZERVIRANI TIL NAPRAVLJENI SKRAĆENIM POSTUPKOM
Osnov
[0761] Ovaj primer pruža podatke u vezi sa krioprezerviranim tumor-infiltrirajućim limfocitnim (TIL) proizvodom za LN-144, napravljenim skraćenim postupkom pogodnim za visokopropusnu komercijalnu proizvodnju, koji pokazuje pogodne atribute kvaliteta za adoptivni ćelijski transfer (ACT).
[0762] Postojeći postupci za stvaranje TIL proizvoda za kliničku upotrebu uključuju otvorene intervencije operatera praćene produženim periodima inkubacije da bi se napravio terapijski proizvod. Proces Generacije 1 traje približno 6 nedelja i daje sveži proizvod. Da bi se TIL terapija približila svim pacijentima koji mogu imati koristi od njenog potencijala, razvijen je skraćeni postupak kultivisanja od 22 dana, Generacija 2, pogodan za centralizovanu proizvodnju sa krioprezerviranim lekovitim proizvodom koji može da se transportuje do udaljenih kliničkih mesta. Generacija 2 predstavlja fleksibilni, robusni, zatvoreni i poluautomatizovani proces proizvodnje ćelija, koji podleže visokopropusnoj proizvodnji u komercijalnim razmerama. Lekoviti proizvod nastao ovim postupkom ima uporedive atribute kvaliteta kao onaj nastao procesom Generacija 1.
Ciljevi studije:
[0763] Lekoviti proizvodi nastali procesima Generacije 1 (primer izvođenja procesa 1C) i Generacije 2 (primer izvođenja procesa 2A) testirani su da bi se odredila uporedivost u pogledu sledećih atributa kvaliteta:
Doza i višestrukost ekspanzije.
Čistoća T ćelija i proprcija podgrupa T ćelija.
Fenotipska ekspresija kostimulatornih molekula na podgrupama T ćelija.
Procečna relativna dužina telomernih ponovaka.
Sposobnost za sekreciju citokina u odgovoru na reaktivaciju TCR.
Diverzitet T-ćelijskih receptora.
Pregled procesa lečenja korišćenjem TIL:
2
EKSTRAKCIJA: Pacijentovi TIL se uklanjaju iz supresivnog tumorskog mikrookruženja (hirurškom resekcijom lezije)
EKSPANZIJA: TIL se ekspandiraju eksponencijalno u kulturi sa IL-2 da se dobije 109 - 1011 TIL, pre nego što se infuzijom unesu u pacijenta
PRIPREMA: Pacijent prima NMA-LD (nemijeloablativna limfodeplecija, ciklofosfamid: 60 mg/kg, IV x 2 doze i fludarabin: 25 mg/m2 x 5 doza) da bi se eliminisalo potencijalno supresivno tumorsko mikrookruženje i maksimiziralo prihvatanje i snaga terapije pomoću TIL
INFUZIJA: Pacijentu se daje infuzija njegovih ekspandiranih TIL (LN-144) i kratkotrajno visoka doza IL-2 (600,000 IU/kg do 6 doza) da bi se promovisale aktivacija, proliferacija i antitumorska citolitička aktivnost TIL
Tabela 58: Zbirni prikaz procesnih poboljšanja u proizvodnji Generacije 2
2 4
Analitički postupci i instrumentacija:
[0765] Doza i vijabilnost: Finalno formulisani proizvodi uzorkuju se i testiraju u pogledu ukupnog broja nukleisanih ćelija, ukupnog broja vijabilnih ćelija, i vijabilnosti koje se određuju akridin-oranž / DAPI kontrabojenjem i NC-200 automatizovanim brojačem ćelija.
[0766] Protočna citometrija: Formulisani lekoviti proizvodi se uzorkuju i testiraju u pogledu identičnosti pomoću FACS. Procenat T-ćelija određuje se kao CD45, CD3 dvostruko pozitivna populacija vijabilnih ćelija. Zamrznute satelitske ili kontrolne fiole za svaki proces odmrzavaju se i testiraju za markere proširenog fenotipa koji uključuju CD3, CD4, CD8, CD27, i CD28.
[0767] Prosečna relativna dužina telomernih ponovaka: Flow-FISH tehnologija koristi se za merenje prosečne dužine telomernih ponovaka. Ovaj test se obavlja kao što je opisano u protokolu DAKO® Telomere PNA kit/FITC za protočnu citometriju. Ukratko, 2x10<6>TIL ćelija kombinuje se sa 2 ×10<6>1301 leukemijskih ćelija. DNK se denaturiše na 82°C 10 minuta i PNA-FITC proba se hibridizuje u mraku, preko noći na sobnoj temperaturi. Propidijumjodid se koristi za identifikovanje ćelija u G0/G1 fazi.
2
[0768] Imunotestovi: Sposobnost lekovitog proizvoda da sekretuje citokin posle reaktivacije meri se posle kokulture, perlicama obloženim sa mAb (Life Technologies, anti-CD3, anti-CD28 i anti-CD137). Posle 24 h supernatanti kulture se sakupe, zamrznu, odmrzavaju i testiraju pomoću ELISA uz korišćenje Quantikine IFNγ ELISA kita (R&D systems) prema uputstvima proizvođača.
[0769] Diverzitet T-ćelijskih receptora: RNK iz finalno formulisanih proizvoda izoluje se i izloži višestrukoj PCR sa prajmerima specifičnim za VDJ. CDR3 sekvence eksprimirane u TIL proizvodu bile su semikvantitativno amplifikovano da bi se odredile frekvencija i prevalencija jedinstvenih klonova TIL. Sekvenciranje se obavlja na Illumina MiSeq benčtopsekvenceru. Vrednosti su indeksirane da bi se dobio skor reprezentativan za relativan diverzitet T-ćelijskih receptora u proizvodu.
Rezultati i zaključci:
[0770] Rezultati su prikazani na Slikama 75 do 81.
[0771] Proces Generacije 2 proizvodi TIL proizvod čiji su atributi kvaliteta uporedivi sa Generacijom 1.
[0772] Generacija 2 proizvodi sličnu količinu TIL proizvoda visoke čistoće, koji su sastavljeni od podgrupa T-ćelija u sličnim proporcijama. koje eksprimiraju uporedive nivoe kostimulatornih molekula u odnosu na Gen 1.
[0773] TIL Generacije 2 pokazuju povećani diverzitet TCR receptora koji, kada se angažuju, iniciraju robusnu sekreciju citokina.
[0774] Krioprezervirani lekoviti proizvod uvodi kritičnu logističku efikasnost omogućavajući fleksibilnost distribucije.
[0775] Za razliku od ranijih procesa, na 22 dana skraćena ekspanziona platforma Generacije 2 predstavlja prilagodljivu i logistički izvodljivu TIL proizvodnu platformu koja omogućava brzo generisanje doza u kliničkim razmerama za pacijente kojima je hitno potrebno lečenje.
[0776] Protokol proizvodnje TIL Generacije 2 bavi se mnogim preprekama koje su do sada ometale širu primenu lečenja korišćenjem TIL.
PRIMER 24: EVALUACIJA RASPONA ODNOSA ALOGENIH ĆELIJA-HRANITELJICA:TIL OD 100:1 DO 25:1
[0777] U ovoj studiji testira se proliferacija TIL pri odnosu alogenih ćelija-hraniteljica prema TIL od 25:1 i 50:1, u poređenju sa kontrolnim odnosom alogenih ćelija-hraniteljica prema TIL od 100:1, koji se trenutno koristi u Procesu 1C.
2
[0778] Studije koje je objavio Hirurški ogranaka pri Nacionalnom institutu za rak pokazale su da je prag optimalne aktivacije TIL u G-Rex 100 flakonu na 5 ×10<6>alogenih ćelija-hraniteljica po cm2 pri inicijaciji REP<(1)>. Ovo je verifikovano matematičkim modelovanjem, i, istim modelom, pretpostavljeno je da sa hraniteljskim slojem optimizovanim za kontakt ćelije sa ćelijom po jedinici površine, proporcija alogenih ćelija-hraniteljica prema TIL može da se smanji na 25:1, uz minimalni efekat na aktivaciju i ekspanziju TIL.
[0779] Ovom studijom utvrđena je optimalna gustina ćelija-hraniteljica po jedinici površine u REP postavci, i validiran efikasan raspon odnosa alogenih hraniteljica pri inicijaciji REP potreban za smanjenje i normalizovanje količine ćelija hraniteljica za kliničku partiju. Studija takođe validira inicijaciju REP sa manje od 200 ×10<6>TIL kokultivisanih sa fiksim brojem ćelija-hraniteljica.
A. Zapremina T-ćelija (dijametar 10 μm): V = (4/3) πr<3>=523.6 μm<3>
B. Kolone G-Rex 100 (M) 40 μm (4 ćelije) visine: V = (4/3) πr<3>= 4 ×10<12>μm<3>
C. Broj ćelija potrebnih za popunjavanje kolone B: 4 ×10<12>μm<3>/ 523.6 μm<3>= 7.6x10<8>μm<3>∗ 0.64 = 4.86x10<8>
D. Broj ćelija koje se mogu optimalno aktivirati u 4D prostoru: 4.86 ×10<8>/ 24 = 20.25 ×10<6>
E. Broj hraniteljica i TIL ekstrapoliran prema G-Rex 500: TIL: 100 ×10<6>i hraniteljica: 2.5 ×10<9>
[0780] Jednačina 1. Aproksimacija broja mononuklearnih ćelija potrebnih za obezbeđivanje ikozaedrične geometrije za aktivaciju TIL u cilindru sa bazom od 100 cm<2>. Izračunavanje daje eksperimentalni rezultat od ∼5 ×10<8>za prag aktivacije T-ćelija što blisko odražava eksperimetalne podatke NCI.(1) (C) Množilac (0.64) je nasumična gustina pakovanja za ekvivalentne sfere, kako su izračunali Jaeger and Nagel 1992<(2)>. (D) Delilac 24 je broj ekvivalentnih sfera koje mogu da kontaktiraju sa sličnim objektom u četvorodimenzionalnom prostoru "Newtonov broj."(3)
Reference
[0781]
2
(1) Jin, Jianjian, et.al., Simplified Method of the Growth of Human Tumor Infiltrating Lymphocytes (TIL) in Gas-Permeable Flasks to Numbers Needed for Patient Treatment. J Immunother. 2012 Apr; 35(3): 283-292.
(2) Jaeger HM, Nagel SR. Physics of the granular state. Science. 1992 Mar 20;255(5051):1523-31.
(3) O. R. Musin (2003). "The problem of the twenty-five spheres". Russ. Math. Surv.
58 (4): 794-795.
PRIMER 25: STUDIJE KLJUČNIH ATRIBUTA KVALITETA ZA TIL PROIZVOD
Osnov
[0782] Adoptivna T-ćelijska terapija autolognim tumor-infiltrirajućim limfocitima (TIL) pokazala je kliničku efikasnost kod pacijenata sa metastatskim melanomom i drugim tumorima1-3.
[0783] Većina saopštenja iz kliničkih studija uključuje eksplorativne analize TIL proizvoda namenjenih infuziji sa ciljem identifikovanja atributa kvaliteta kao što su sterilnost, identičnost, čistoća, i potencija, koji bi mogli da se povežu sa efikasnošću i/ili bezbednošću proizvoda.4,5
[0784] Ovde predstavljamo evaluaciju tri ključna parametra TIL proizvoda, koji mogu doprineti budućoj platformi kontrole kvaliteta za upotrebu u komercijalnoj proizvodnji TIL.
[0785] Pregled procesa lečenja korišćenjem TIL
1. Tumor se izoluje iz pacijenta i transportuje u GMP proizvodni objekat.
2. Po prispeću, tumor se fragmentiše i stavlja u flakone sa IL-2 za pre-protokol brze ekspanzije (REP).
3. pre-REP TIL se dalje propagiraju po REP protokolu u prisustvu ozračenih PBMC, anti-CD3 antitela (30 ng/mL), i IL-2 (3000 IU/mL).
4. TIL proizvodi se procenjuju u pogledu kritičnih atributa kvaliteta, uključujući: (1) Identičnost (2) Čistoću, i (3) Potenciju.
5. Pre infuzije ekspandiranih TIL (LN-144), pacijent prima režim nemijeloablativne limfodeplecije koji se sastoji od ciklofosfamida i fludarabina. Posle infuzije TIL,
2
pacijenti primaju kratkotrajno (do 6 doza) IL-2 u visokoj dozi (600,000 IU/kg) kako bi se podržao rast i ukalemljenje prenetih TIL.
Predmet studije
[0786] Cilj: Potpuno okarakterisati TIL proizvode u pogledu identičnosti, čistoće i potencije, i time (a) izvesti definiciju kritičnih atributa kvaliteta i (b) podržati uspostavljanje formalnih kriterijuma oslobađanja koji će se implementirati u komercijalnu proizvodnju TIL proizvoda.
[0787] Strategija: Razviti sledeće analitičke metodologije za podršku karakterizacije TIL proizvoda. Posebno, izvode se sledeći postupci: fenotipska analiza protočnom citometrijom za procenu identičnosti i čistoće, test detekcije rezidualnih tumorskih ćelija za merenje čistoće, i test oslobađanja interferona-gama za procenu potencije.
Materijali i metodi
Identičnost i čistoća
[0788] Fenotipska karakterizacija: TIL proizvodi se boje anti-CD45, anti-CD3, anti-CD8, anti-CD4, anti-CD45RA, anti CCR7, anti CD62L, anti-CD19, anti-CD16, i anti-CD56 antitelima i analiziraju protočnom citometrijom da bi se kvantifikovale podgrupe T i ne-T ćelija.
Čistoća
[0789] Test detekcije rezidualnog tumora: TIL proizvod se boji anti-MCSP (melanomu pridruženi hondroitin sulfatni proteoglikan) i anti-CD45 antitelima, kao i Live/Dead fiksabilnom Aqua bojom, zatim analizira protočnom citometrijom da bi se detektovale ćelije melanoma. Pozitivne kontrole koriste se za procenu preciznosti detekcije tumora i uspostavljanje kriterijuma ograđivanja za analizu podataka.
Potencija
[0790] Test oslobađanja IFNγ: TIL proizvodi se restimulišu perlicama obloženim anti-CD3/CD28/CD137 tokom 18 do 24 sata, posle čega se sakupljaju supernatanti da bi se procenila sekrecija IFNγ korišćenjem ELISA testa.
Rezultati
2
[0791] Identičnost: Većina (>99%) TIL proizvoda iz melanoma sačinjena je od CD45<+>CD3<+>ćelija
[0792] Slike 86A-86C prikazuju fenotipsku karakterizaciju TIL proizvoda korišćenjem 10-bojnog protočno-citometarskog testa. (A) Procenat podgrupa T- i ne-T-ćelija definiše se prema CD45+CD3+ i CD45-(nelimfociti)/CD45+CD3- (ne-T-ćelijski limfociti), respektivno. Ukupno, >99% testiranih TIL proizvoda sastoji se od T-ćelija (CD45<+>CD3<+>). Pokazan je prosek za TIL proizvode (n=10). (B) Procenat dve podgrupe T-ćelija koje uključuju CD45+CD3+CD8+ (plavi prazan kružić) i CD45<+>CD3<+>CD4<+>(ružičasti prazan kružić). Nije zapažena statistički značajna razlika u procentu podgrupa korišćenjem Studentovog neparnog T testa (P=0.68). (C) Populacija ne-T-ćelija karakteriše se po četiri različite podgrupe: 1) Nelimfociti (CD45-), 2) NK ćelije (CD45<+>CD3-CD16<+>/56<+>), 3) B-ćelije (CD45<+>CD19<+>), i 4) Ne-NK/B-ćelije (CD45<+>CD3-CD16-CD56-CD19-).
[0793] Identičnost: Većina TIL proizvoda iz melanoma ispoljava fenotip efektorskih ili memorijskih T-ćelija udružen sa citotoksičnom funkcijom T-ćelija.
[0794] Slike 87A i 87B prikazuju karakterizaciju podgrupa T-ćelija u populacije CD45+CD3+CD4+ i CD45+CD3+CD8+ ćelija. Naivne, centralne memorijske (TCM), efektorske meorijske (TEF), i efektorske memorijske RA+(EMRA) podgrupe T-ćelija definisane su korišćenjem CD45RA i CCR7. Slike 87A i 87B prikazuju reprezentativne podgrupe T-ćelija iz 10 finalnih TIL proizvoda u ćelijskim populacijama CD4<+>(A), i CD8<+>(B). Podgrupa efektorskih memorijskih T-ćelija (plavi prazan kružić) bila je glavna populacija (>93%) i u CD4+ i u CD8+ podgrupi finalnog TIL proizvoda. Manje od 7% ćelija TIL proizvoda bile su podgrupa centralnih memorijskih (ružičasti prazan kružič). Podgrupe EMRA (sivi prazan kružić) i naivnih (crni prazan kružić) jedva da su detektovane u TIL proizvodu (<0.02%). p vrednosti predstavljaju razliku između EM i CM korišćenjem Studentovog neparnog T testa.
[0795] Čistoća: MCSP predstavlja pogodan tumorski marker melanoma za test čistoće.
[0796] Slike 88A i 88B prikazuju detekciju ekspresiju MCSP i EpCAM u tumorskim ćelijama melanoma. Tumorske ćelijske linije melanoma (WM35, 526, i 888), ćelijske linijje melanoma poreklom iz pacijenta, napravljene prema postupcima opisanim u ovom tekstu (1028, 1032, i 1041), i ćelijske linije kolorektalnog adenokarcinoma (HT29 kao negativna kontrola) okarakterisane su bojenjem na markere MCSP (sa melanomom udruženi hondroitin sulfatni proteoglikan) i EpCAM (adhezivni molekul epitelnih ćelija). (A) Prosečno 90% tumorskih ćelija melanoma eksprimira MCSP. (B) Ekspresija EpCAM nije detektovana u tumorskim ćelijskim linijama melanoma u poređenju sa pozitivnom kontrolom HT29, EpCAM+ tumorskom ćelijskom linijom.
[0797] Čistoća: Razvijanje testa zasnovanog na protočnoj citometriji za detekciju rezidualnih tumorskih ćelija u TIL proizvodima.
[0798] Slike 89A i 89B ilustruju detekciju pozitivnih kontrola za utvrđivanje preciznosti detekcije tumora. Test je izveden ubacivanjem poznatih količina tumorskih ćelija u suspenzije PBMC (n=10). MCSP+526 tumorske ćelije melanoma razblažene su u odnosima 1:10, 1:100, i 1:1,000, zatim pomešane sa PBMC i bojene anti-MCSP i anti-CD45 antitelima i live/dead bojom i analizirane protočnom citometrijom. (A) Približno 3000, 300, i 30 ćeliija detektovano je u rastvoru 1:10, 1:100, odnosno1:1000. (B) Srednja vrednost (AV) i standardna devijacija (SD) ćelija dobijenih u svakom uslovu upotrebljene su za definisanje gornje i donje referentne granične vrednosti.
[0799] Čistoća: Kvalifikovanje testa detekcije rezidualnog tumora korišćenjem pozitivnih kontrola
[0800] Slike 90A i 90B pokazuju ponovljivost studije gornje i donje granične vrednosti u pozitivnim kontrolama. Izvedena su tri nezavisna eksperimenta u triplikatu da bi se odredila ponovljivist testa pozitivnih kontrola. (A) Broj MCSP+ detektovanih tumorskih ćelija bio je konzistentno unutar raspona gornje i donje referentne granične vrednosti. (B) Dijagram linearne regresije prikazuje korelaciju između MCSP<+>ćelija i poznatih pozitivnih kontrolnih razblaženja (R<2>=0.99) pri čemu crna debela linija prikazuje najbolje poklapanje. Zelena i siva isprekidana linija predstavljaju 95% predviđene granične vrednosti standardne krive i uzoraka, respektivno (Eksp. # 1 do 3).
[0801] Čistoća: Kontaminirajuće tumorske ćelije melanoma bile su ispod granice detekcije testa za finalni TIL proizvod.
[0802] Slike 91A i 91B prikazuju detekciju rezidualnog melanoma u TIL proizvodima. TIL proizvodi se procenjuju u pogledu kontaminacije rezidualnim tumorom uz korišćenje razvijenog testa (n=15). Medijane broja i procenta detektabilnih MCSP+ događaja bile su 2, odnosno 0.0002%.
[0803] Potencija: sekrecija IFNγ iz TIL (konzistentno > 1000 pg/ml) pokazuje efektorsku funkciju TIL proizvoda.
[0804] Slika 92 prikazuje procenu potencije TIL proizvoda posle aktivacije T-ćelija. Sekrecija IFNγ posle restimulacije sa anti-CD3/CD28/CD137 u TIL proizvodima procenjena je pomoću ELISA, u duplikatu (n=5). Sekrecija IFNγ iz TIL proizvoda bila je značajno veća nego iz nestimulisanih kontrola, uz korišćenje Wilcoxonovog testa (P=0.02), i konzistentno >1000
1
pg/ml. Sekrecija IFNγ >200 pg/ml smatrana je za potentnu. p vrednost <0.05 smatrana je za statistički značajnu.
Zaključak
[0805] Evaluirani su ključni parametri proizvoda - identičnost, čistoća i potencija TIL proizvoda. TIL proizvodi proizvedeni prema postupcima opisanim u ovom tekstu sastojali su se od preko 99% CD45+CD3+ T ćelija. Većina CD4+ i CD8+ podgrupa TIL pokazuje efektorsko-memorijski fenotip, udružen sa citotoksičnom funkcijom T-ćelija. Test baziran na protočnoj citometriji za detekciju kontaminirajućih ćelija melanoma u finalnom TIL proizvodu uspešno je razvijen i okvalifikovan. Primenom ovog testa, pokazano je da je kontaminirajućih tumorskih ćelija melanoma u finalnom TIL proizvodu bilo ispod granica detekcije testa. Sekrecija IFNγ od strane finalnog TIL proizvoda posle anti-CD3/CD28/CD137 restimulacije može da služi kao test potencije za komercijalno proizvedene TIL. Ovi podaci obezbeđuju osnov platforme za kontrolu kvaliteta, koja će podržati dalji razvoj kritičnih atributa kvaliteta za komercijalnu proizvodnju TIL proizvoda.
PRIMER 26: KRIOPREZERVIRANI TIL PROIZVOD GENERISAN SKRAĆENIM POSTUPKOM POGODNIM ZA VISOKOPROPUSNU KOMERCIJALNU PROIZVODNJU ISPOLJAVA POVOLJNE ATRIBUTE KVALITETA ZA ADOPTIVNI ĆELIJSKI TRANSFER
Osnov
[0806] Klasični postupci stvaranja tumor-infiltrirajućih limfocita (TIL) za adoptivni ćelijski transfer (ACT) uključuju više koraka ex vivo inkubacije da bi se dobio sveži (nekrioprezervirani) infuzioni proizvod.
[0807] Proces prve generacije (Gen 1) porizvodi dozu svežih TIL za približno 6 nedelja. Razvijen je proces proizvodnje TIL druge generacije (Gen 2) koji skraćuje trajanje ex vivo kulture na 22 dana (Slika 93).
[0808] Proces Gen 2 pogodan je za centralizovanu proizvodnju i daje krioprezervirani TIL infuzioni proizvod sa pogodnostima u vezi sa zakazivanjem, logistikom i dostavom na klinička mesta. Krioprezervirani TIL infuzioni proizvod za LN-144 proizvedene procesom Gen 2 ima atribute kvaliteta uporedive sa nekrioprezerviranim TIL infuzionim proizvodom za TIL nastale postupkom Gen 1. Postupak proizvodnje TIL Gen 2 predstavlja fleksibilan,
2
robustan, zatvoren, i poluautomatizovan proces proizvodnje ćelija koji je podložan visokopropusnoj proizvodnji TIL u komercijalnim razmerama.
Predmet studije
[0809] TIL infuzioni proizvod generisan proizvodnim procesima Gen 1 i Gen 2 procenjuje se da bi se odredila njegova uporedivost u pogledu sledećih atributa kvaliteta: (1) Broj ćelija (doza), vijabilnost ćelija, stopa rasta u REP fazi, (2) čistoća T-ćelija i fenotipska ekspresija kostimulatornih molekula na podgrupama T-ćelija, (3) Prosečna relativna dužina telomernih ponovaka, (4) Sposobnost sekrecije IFNγ u odgovoru na angažman CD3, CD28, CD137, i (5) Diverzitet T-ćelijskih receptora prisutnih u finalnom infuzionom proizvodu (Slika 94).
Analitički postupci i instrumentacija
[0810] Broj i vijabilnost ćelija: Finalno formulisani infuzioni proizvodi uzorkuju se i testiraju u pogledu ukupnog broja nukleisanih ćelija, ukupnog broja vijabilnih ćelija, i vijabilnosti, određeno akridin oranž/DAPI kontrabojenjem uz korišćenje NC-200 automatizovanog brojača ćelija. Partije razvoja procesa testirane su na Nexcellom Cellometer K2 brojaču ćelijske vijabilnosti uz korišćenje akridin oranž/propidijum jodid dvostrukog fluorescentnog bojenja.
[0811] Fenotipski markeri: Formulisani infuzioni proizvodi uzorkuju se i testiraju u pogledu identičnosti, imunofluorescentnim bojenjem. Procenat T-ćelija određuje se kao CD45+,CD3+ (dvostruko pozitivni) populacija vijabilnih ćelija. Zamrznute satelitske ili kontrolne fiole za svaki proces odmrznu se i testiraju za markere proširenog fenotipa uključujući CD3, CD4, CD8, CD27, i CD28. Sveži infuzioni proizvodi analiziraju se na BD FACS Canto II, i markeri proširenog fenotipa na zamrznutim infuzionim proizvodima analiziraju se na Bio-Rad ZE5 analizatoru ćelija.
[0812] Prosečna relativna dužina telomernih ponovaka: Flow-FISH tehnologija koristi se za merenje prosečne dužine telomernih ponovaka. Ovaj test se obavlja kako je opisano u protokolu DAKO® Telomere PNA Kit/FITC za protočnu citometriju. Ukratko, 2.0 ×10<6>TIL ćelija se kombinuju sa 2.0 ×10<6>T ćelija ćelijske linije humane leukemije (1301). DNK se denaturiše na 82°C 10 minuta i PNA-FITC proba se hibridizuje u mraku, preko noći na sobnoj temperaturi.
Propidijum jodid se koristi za identifikovanje ćelija u G0/G1 fazi.
[0813] Imunska funkcija: Sposobnost infuzionog proizvoda da sekretuje IFNγ posle reaktivacije meri se posle kokultivisanja perlica obloženih antitelima (Life Technologies, antiCD3, anti-CD28 i anti-CD137). Posle 24 sata kultivisanja supernatanti se sakupe, zamrznu, odmrznu i testiraju pomoću ELISA uz korišćenje Quantikine IFNγ ELISA kita (R&D systems) prema uputstvima proizvođača.
[0814] Diverzitet T-ćelijskog receptora: RNK iz infuzionih proizvoda izoluje se i izloži višestrukoj PCR sa VDJ-specifičnim prajmerima. CDR3 sekvence eksprimirane u TIL proizvodu se semikvantitativno amplifikuju i opsežno sekvenciraju da se odrede frekvencija i prevalencija jedinstvenih TIL klonova. Sekvenciranje se izvodi na Illumina MiSeq benčtopsekvenceru. Vrednosti su indeksirane da bi se dobio skor reprezentativan za relativni diverzitet T-ćelijskih receptora u proizvodu.
Rezultati
[0815] Na Dan 22 ćelijski proizvod redukovane zapremine se spoji i uzorkuje da se odredi osobina kulture pre ispiranja i formulisanja. Slike 95A-95C pokazuje ukupne vijabilne ćelije, stopu rasta, i vijabilnost. (A) Uzorci se analiziraju na NC-200 automatizovanom brojaču ćelija, kako je opisano ranije. Ukupna gustina vijabilnih ćelija određuje se kao ukupna srednja vrednost duplikata brojanja za 4 nezavisna uzorka. Proces Gen 2 daje TIL proizvod slične doze kao Gen 1 (Gen 1 srednja vrednost = 4.10 ×10<10>± 2.8 ×10<10>, Gen 2 srednja vrednost = 4.12 ×10<10>± 2.5 ×10<10>). (B) Stopa rasta se izračunava zaREP fazu kao. (C) Ćelijska vijabilnost se procenjuje iz 9 partija razvoja procesa uz korišćenje Cellometer K2 kako je ranije opisano. Nije zapaženo značajno sniženje ćelijske vijabilnosti posle jednog ciklusa zamrzavanjaodmrzavanja formulisnaog proizvoda. Prosečna redukcija vijabilnosti posle odmrzavanja i uzorkovanja bila je 2.19%.
[0816] Slike 96A-96C pokazuju da su proizvodi Gen 2 kulture T-ćelija visoke čistoće, koje eksprimiraju kostimulatorne molekule na nivoima uporedivim sa Gen 1. (Slika 96A) Sveži lekoviti proizvod testira se u pogledu identičnosti protočnom citometrijom za oslobađanje. Gen 1 i Gen 2 procesi proizvode T-ćelijske kulture visoke čistoće, definisano prema CD45+,CD3+ (dvostruko pozitivni) fenotipu. (Slike 96B i 96C). Krioprezervirane satelitske fiole formulisanog lekovitog proizvoda odmrznu se i testiraju u pogledu proširenog fenotipa protočnom citometrijom, kako je prethodno opisano. Proizvodi Gen 1 i Gen 2 eksprimiraju slične nivoe kostimulatornih molekula CD27 i CD28 na podgrupama T-ćelija. Kostimulatorni molekuli kao što su CD27 i CD28 mogu biti potrebni za snabdevanje sekundarnim i tercijarnim signalima potrebnim za proliferaciju efektorskih ćelija posle angažovanja T ćelijskog receptora. P-vrednost se izračunava korišćenjem Mann-Whitney ’t’ testa.
4
[0817] Slika 97 pokazuje da proizvodi Gen 2 naginju ka relativno dužim telomerama. Dužine. Flow-FISH tehnologija korišćena je za merenje prosečne dužine telomernog ponovka, kako je ranije opisano. RTL vrednost ukazuje da je prosečna fluorescencija telomera po hromozomu/genomu u Gen 1 bila 7.5 % ± 2.1%, a u Gen 2 bila je 8.4% ± 1.8% telomerne fluorescencije po hromozomu/genomu u kontrolnoj liniji ćelija (1301 linija leukemijskih ćelija). Podaci ukazuju da proizvodi Gen 2 u proseku imaju dužine telomera uporedive sa proizvodima Gen 1. Dužina telomera je surogatska mera dužine ex vivo ćelijske kulture.
[0818] Slika 98 prikazuje da Gen 2 lekoviti proizvod sekretuje IFNγ u odgovoru na angažovanje CD3, CD28, i CD137. Krioprezervirani lekoviti proizvodi se odmrznu i inkubiraju sa perlicama obloženim antitelima kako je ranije opisano. Podaci se izražavaju kao količina IFNγ proizvedenog u 5 ×10<5>vijabilnih ćelija u toku 24 h. Lekoviti proizvodi Gen 2 pokazuju povećanu sposobnost proizvodnje IFNγ posle reaktivacije u odnosu na lekovite proizvode Gen 1. Sposobnost lekovitog proizvoda da se reaktivira i sekretuje citokin je surogatska mera in-vivo funkcije posle vezivanja TCR za poznati antigen u kontekstu HLA.
[0819] Slike 99A i 99B pokazuju da lekoviti proizvodi Gen 2 imaju povećani diverzitet jedinstvenih T-ćelijskih receptora. Diverzitet T-ćelijskog receptora procenjuje se na sledeći način. RNK iz 10x10<6>TIL iz Gen 1 i Gen 2 infuzionih proizvoda testira se da bi se odredili ukupan broj i frekvencija jedinstvenih CDR3 sekvenci prisutnih u svakom proizvodu. (Slika 99A). Jedinstvene CDR3 sekvence indeksirane su u odnosu na frekvenciju u svakom proizvodu da bi se dobio skor reprezentativan za ukupan diverzitet T-ćelijskih receptora u proizvodu. (Slika 99B). Prosečan ukupan broj jedinstvenih CDR3 sekvenci prisutnih u svakom infuzionom proizvodu. TIL proizvodi iz oba procesa sačinjeni su od poliklonskih populacija T-ćelija sa različitim antigenskim specifičnostima i aviditetima. Širina ukupnog repertoara T-ćelija može biti indikacija broja delotvornih epitopa prisutnih na tumorskim ćelijama.
Zaključci
[0820] Proizvodni proces Gen 2 proizveo je TIL infuzioni proizvod (LN-144) sa atributima kvaliteta uporedivim sa Gen 1. Gen 2 proizveo je slične doze TIL visoke čistoće. Podgrupe T ćelija bile su u sličnim proporcijama i eksprimirale su kostimulatorne molekule u uporedivim nivoima u odnosu na Gen 1. Gen 2 TIL naginjali su relativno dužim telomerama srazmerno sa smanjenjem preioda kultivacije ex vivo. Gen 2 TIL pokazali su povećani diverzitet TCR receptora koji, kada se angažuju, iniciraju robusnu sekreciju IFN-γ, meru citolitičke efektorske funkcije. Prema tome, skraćeni 22-dnevni zatvoreni ekspanzioni proces Gen 2 sa krioprezerviranim infuzionim proizvodom predstavlja prilagodljivu i logistički izvodljivu TIL proizvodnu platformu koja omogućava brzo stvaranje doza u kliničkim razmerama za pacijente obolele od kancera kojima je hitno potrebna nova terapijska opcija.
Reference
[0821]
1 Dudley, M. E. et al. Adoptive cell transfer therapy following non-myeloablative but lymphodepleting chemotherapy for the treatment of patients with refractory metastatic melanoma. J Clin Oncol 23, 2346-2357, doi:10.1200/JC0.2005.00.240 (2005).
2 Chandran, S. S. et al. Treatment of metastatic uveal melanoma with adoptive transfer of tumour-infiltrating lymphocytes: a single-centre, two-stage, single-arm, phase 2 study. Lancet Oncol, doi:10.1016/S1470-2045(17)30251-6 (2017).
3 Stevanovic, S. et al. Complete regression of metastatic cervical cancer after treatment with human papillomavirustargeted tumor-infiltrating T cells. J Clin Oncol 33, doi:10.1200/jco.2014.58.9093 (2015).
4 FDA Recenzenti i sponzori: Content and Review of Chemistry, Manufacturing, and Control (CMC) Information for Human Gene Therapy Investigational New Drug Applications (INDs), 21 CFR 610.3(r), 2008.
5 Richards JO, Treisman J, Garlie N, Hanson JP, Oaks MK. Flow cytometry assessment of residual melanoma cells in tumor-infiltrating lymphocyte cultures. Cytometry A 2012; 81:374-81.
PRIMER 27: KOKTEL FAKTORA RASTA T-ĆELIJA IL-2/IL-15/IL-21 POJAČAVA EKSPANZIJU I EFEKTORSKU FUNKCIJU TUMOR-INFILTRIRAJUĆIH T ĆELIJA U NOVOM PROCESU OPISANOM U OVOM TEKSTU
Osnov
[0822] Adoptivna T-ćelijska terapija autolognim TIL pokazala je kliničku efikasnost kod pacijenata sa metastatskim melanomom i cervikalnim karcinomom. U nekim studijama, bolji klinički ishod bio je pozitivno korelisan sa ukupnim brojem ćelija datih u infuziji i/ili procentom CD8+ T ćelija. Većina sadašnjih režima proizvodnje koristi samo IL-2 za pokretanje rasta TIL. Povećana ekspanzija limfocita saopštena je uz korišćenje režima koji su uključivali IL-15 i IL-21. Ova studija opisuje pozitivne efekte i sinergije kada se IL-15 i IL-21 dodaju primerima izvođenja procesa 2A i procesima izrade TIL Generacije 2.
Generisanje TIL korišćenjem novog procesa opisanog u ovom tekstu
[0823] Tumor se izoluje iz pacijenta i transportuje do GMP proizvodnog objekta ili laboratorije u svrhu istraživanja. Po pristizanju, tumor se fragmentiše i stavlja u flakone sa IL-2 za pre-protokol brze ekspanzije (pre-REP) u trajanju od 11 dana. Za studije sa trostrukim koktelom, pri inicijaciji pre-REP dodaju se IL-2, IL-15, i IL-21 (IL-2/IL-15/IL-21). Za Protokol brze ekspanzije (REP), TIL se kultivišu sa hraniteljicama i anti-CD3 antitelom tokom još 11 dana (Slika 100).
Materijali i metodi
[0824] Proces stvaranja TIL uključuje pre-protokol brze ekspanzije (pre-REP), u kojem se tumorski fragmenti veličine 1-3 mm<3>stavljaju u medijum koji sadrži IL-2. Tokom pre-REP, TIL izlaze iz tumorskih fragmenata i ekspandiraju se u odgovoru na stimulaciju IL-2.
[0825] Da bi se dodatno stimulisao rast TIL, TIL se ekspandiraju kroz drugi kultivacioni period označen kao Protokol brze ekspanzije (REP) koji uključuje ozračene PBMC hraniteljice, IL-2 i anti-CD3 antitelo. Skraćeni pre-REP i REP ekspanzioni protokol razvijen je za ekspanzju TIL uz zadržavanje fenotipskih i funkcionalnih atributa finalnog TIL proizvoda. Ovaj skraćeni protokol stvaranja TIL koristi se za procenu uticaja IL-2 samog, u poređenju sa kombinacijom IL2/IL-15/IL-21 dodatom u koraku pre-REP. Ova dva režima kulture upoređuju se u pogledu generisanja TIL izvedenih iz kolorektalnog tumora, melanoma, cervikalnog tumora, trostruko negativnog tumora dojke tumora pluća i bubrega. Po završetku pre-REP, kultivisani TIL se procenjuju u pogledu ekspanzije, fenotipa, funkcije (CD107a+ i IFNγ) i repertoara TCR Vβ.
[0826] Studija pokazuje pojačanje ekspanzije tokom pre-REP sa IL-2/IL-15/IL-21 u više različitih histoloških tipova tumora. Pre-REP kulture iniciraju se korišćenjem standardnog protokola sa IL-2 (6000 IU/mL), ili IL-15 (180 IU/mL) i IL-21 (1 IU/mL) koji se dodaju uz IL-2 (Slika 101). Ekspanzija ćelija procenjuje se na kraju pre-REP. Kultura se klasifikuje da ima povišenu ekspanziju u odnosu na IL-2 ako je ukupan rast povećan za najmanje 20%. O fenotipskim i funkcionalnim studijama melanoma i pluća biće reči dalje u paragrafima koji slede (tekst napisan zadebljanim fontom na Slici 101).
[0827] IL-2/IL-15/IL-21 poboljšavaju procenat CD8+ ćelija u karcinomu pluća, ali ne i u melanomu. Na Slikama 102A i 102B, TIL poreklom iz (A) melanoma (n=4), i (B) pluća (n=7) procenjuju se fenotipski u pogledu CD4+ i CD8+ ćelija korišćenjem protočne citometrije posle pre-REP. p vrednost predstavlja razliku između uslova sa IL-2 i IL-12/IL-15/IL-21 uz korišćenje Studentovog neparnog t-testa.
[0828] Ekspresija CD27 bila je blago pojačana u CD8+ ćelijama u kulturama tretiranim sa IL-2/IL-15/IL-21. Na Slikama 103A i 103B, TIL poreklom iz (A) melanoma (n=4), i (B) pluća (n=7) procenjuju se fenotipski u pogledu CD27+ i CD28+ u CD4+ i CD8+ ćelijama korišćenjem protočne citometrije posle pre-REP. Ekspresija CD27, ćelijskog markera udruženog sa mlađim fenotipom koji korelira sa ishodima adoptivne T-ćelijske terapije, blago je povećana u CD8+ TIL poreklom iz kulture sa IL-2/IL-15/IL-21 u poređenju sa samo IL-2.
[0829] Podgrupe T ćelija nisu promenjene dodavanjem IL-15/IL-21. Na Slikama 104A i104B, TIL se procenjuju fenotipski u pogledu efektorskih/memorijskih podgrupa (CD45RA i CCR7) u CD8+ i CD4+ (podaci nisu prikazani) ćelijama iz (A) melanoma (n=4), i (B) pluća (n=8) pomoću protočne citometrije post pre-REP. TEM=efektorske memorijske (CD45RA-, CCR7-), TCM=centralne memorijske (CD45RA-, CCR7+), TSCM= matične memorijske (CD45RA+, CCR7+), TEMRA=efektorske T ćelije (CD45RA+CCR7-).
[0830] Funkcionalni kapacitet TIL bio je diferencijalno pojačan sa IL-2/IL-15/IL-21. Na Slikama 105A i 105B, TIL poreklom iz (A) melanoma (n=4) i (B) pluća (n=5) procenjivani su protočnom citometrijom u pogledu ekspresije CD107a+, u odgovoru na PMA stimulaciju tokom 4 sata, u CD4+ i CD8+ ćelijama. (C) pre-REP TIL poreklom iz melanoma i pluća stimulisani su tokom 24 sata solubilnim anti-CD3 antitelom i supernatanti su procenjivani u pogledu IFNγ pomoću ELISA.
[0831] Relativna frekvencija repertoara TCRvβ izmenjena je u odgovoru na IL-2/IL-15/IL-21 u plućima, ali ne i u melanomu. Na Slikama 106A i 106B, repertoar TCRvβ (24 specifičnosti) procenjuje se u TIL poreklom iz (A) melanoma i (B) tumora pluća korišćenjem Beckman Coulter kita za protočnu citometriju.
Sažetak
[0832] Ovaj rad pokazuje sposobnost koktela IL-2/IL-15/IL-21 da poveća broj TIL u poređenju sa IL-2 samim (>20%) u procesu Generacije 2, kao i da utiče na fenotipske i funkcionalne karakteristike.
[0833] Efekat trostrukog koktela na TIL ekspanziju bio je histološki zavisan. Odnos CD8+/CD4+ T ćelija povećava se dodavanjem IL-2/IL-15/IL-21 u tumorima pluća.
Dodavanje IL-15 i IL-21 pojačava ekspresiju CD107a i proizvodnju IFNγ u TIL poreklom iz tumora pluća. Dodavanje IL-2/IL-15/IL-21 menja repertoar TCRvβ u plućima. Proces ekspanzije TIL Generacije 2 upotrebljen je za uključivanje IL-2/IL-15/IL-21 koktela citokina, čime je obezbeđena dodatna promocije ekspanzije TIL u specifičnim histološkim tipovima tumora, kao što su tumori pluća i kolorektalni tumori. Ova zapažanja su posebno relevantna za optimizaciju i standardizaciju režima kultivacije TIL, potrebnog za proizvodnju TIL u velikim razmerama, sa širokom primenljivošću i raspoloživošću koje su potrebne za glavni pravac u lečenju kancera.
PRIMER 28: NOVI KRIOPREZERVIRANI TUMOR-INFILTRIRAJUĆI LIMFOCITI (LN-144) PRIMENJENI KOD PACIJENATA SA METASTATSKIM MELANOMOM POKAZUJU EFIKASNOST I TOLERABILNOST U MULTICENTRIČNOM KLINIČKOM ISPITIVANJU FAZE 2
Osnov
[0834] Bezbednost i efikasnost adoptivne ćelijske terapije (ACT) u kojoj se koriste tumorinfiltrirajući limfociti (TIL) izučavane su na stotinama pacijenata sa metastatskim melanomom, i pokazale su značajne i trajne stope objektivnog odgovora (objective response rates, ORR).1 U trenutnom ispitivanju Faze 2, C-144-01 u kojem se koristi centralizovana GMP proizvodnja TIL, procenjuju se procesi proizvodnje nekrioprezerviranih TIL Generacije 1 (Gen 1) i krioprezerviranih TIL Generacije 2 (Gen 2).
[0835] Trajanje proizvodnje Gen 1 je približno 5-6 nedelja (primena kod Kohorta 1 C-144-01 studije), dok trajanje procesa proizvodnje u Gen 2 iznosi 22 dana (proces 2A, primena kod Kohorta 2 C-144-01 studije). Preliminarni podaci dobijeni od pacijenata iz Kohorta 1 kojima je infuzijom unet LN-144 proizvod Gen 1, ohrabruje u lečenju post-PD-1 pacijenata sa metastatskim melanomom jer TIL terapija proizvodi odgovor.2 Koristi od Gen 2 uključuju: (A) smanjenje vremena tokom kojeg pacijent i lekar čekaju na infuziju TIL pacijentu; (B) krioprezervacija omogućava fleksibilnost u zakazivanju, distribuciji i dostavi; i (C) smanjenje proizvodnih troškova. Preliminarni podaci iz Kohorta 2 predstavljeni su u ovom tekstu. Slika 107 pokazuje primer izvođenja procesa proizvodnje krioprezerviranih LN-144 Gen 2 (proces 2A).
Dizajn studije: C-144-01 klinička studija Faze 2 u metastatskom melanomu
[0836] Multicentrična, trokohortna studija Faze 2 za procenu efikasnosti i bezbednosti autologih tumor-infiltrirajućih limfocita (LN-144) za lečenje pacijenata sa metastatskim melanomom.
[0837] Ključni kriterijumi uključivanja u studiju: (1) Merljivi metastatski melanom i ≥ 1 lezije resektabilne za generisanje TIL; (2) Progresija posle najmanje jedne ranije sistemske terapije; (3) Starost ≥ 18; i (4) ECOG PS 0-1.
[0838] Kohorti tretmana: (1) Nekrioprezervirani LN-144 proizvod; (2) Krioprezervirani LN-144 proizvod; i (3) Ponovljeni tretman pomoću LN-144 za pacijente kod kojih nije bilo odgovora ili kod kojih je došlo do progresije posle inicijalnog odgovora. Slika 108 prikazuje dizajn studije.
[0839] Ishodi: (1) Primarni: Efikasnost definisana kao ORR i (2) Sekundarni: Bezbednost i efikasnost.
Postupci
[0840] Kohort 2 postavka za ispitivanje bezbednosti: 13 pacijenata koji su podvrgnuti resekciji u cilju generisanja TIL i primili neku od komponenti tretmana studije.
[0841] Kohort 2 postavka za ispitivanje efikasnosti: 9 pacijenata koji su primali prekondicioniranje NMA-LD, infuziju LN-144 i najmanje jednu dozu IL-2, i imali najmanje jednu procenu efikasnosti. Za 4 pacijenta nije izvršena procena efikasnosti u vreme pravljenja preseka podataka.
[0842] Podaci za biomarkere prikazani su za sva raspoloživa očitavanja prema datumu preseka podataka.
Rezultati
[0843] Slika 109 prikazuje tabelu koja ilustruje poređenje karakteristika pacijenata iz Kohorta 1 (ASCO 2017) prema Kohortu 2. Kohort 2 ima: medijanu ranijih terapija 4; svi pacijenti su primali prethodno anti-PD-1 i anti-CTLA-4; imali su povećano opterećenje tumorom što se reflektovalo većim zbirom dijametara (SOD) ciljnih lezija i većom srednjom LDH u bazalnom stanju. Slika 110 prikazuje tabelu sa neželjenim efektima tretmana (≥ 30%).
[0844] Za Kohort 2 (krioprezervirani LN-144), karakteristike infuzionog proizvoda i TIL terapije su (1) prosečan broj TIL ćelija unetih infuzijom: 37 × 10<9>, i (2) medijana broja primenjenih doza IL-2 je 4.5. Slika 111 prikazuje efikasnost infuzionog proizvoda i TIL terapije za pacijente #1 do #8.
1
[0845] Slika 112 prikazuje klinički status pacijenata kod kojih je evaluirani odgovor bio stabilna bolest (stable disease, SD) ili bolji. Delimični odgovor (partial response, PR) za Pacijenta 6 nije bio potvrđen jer pacijent još nije došao do druge procene efikasnosti. Jedan pacijent (Pacijent 9) preminuo je pre prve procene (i dalje se razmatra u postavci efikasnosti).
[0846] Od 9 pacijenata u postavci efikasnosti, jedan pacijent (Pacijent 9) nije mogao biti evaluiran (not evaluable, NE) zbog smrti povezane sa melanomom pre prve procene i nije prikazan na Slici 112. Odgovori su zapaženi kod pacijenata tretiranih korišćenjem Gen 2. Stopa kontrole bolesti (disease control rate, DCR) bila je 78%. Vreme do odgovora bilo je slično kao za Kohort 1. Jedan pacijent (Pacijent 3) sa progresivnom bolešću (progressive disease, PD) kao najboljim odgovorom nije uključen u dijagram "plivačkih staza".
[0847] Slika 113 prikazuje procenat promena zbira dijametara. Za Pacijenta 9 nije rađena post-LN-144 procena bolesti jer je preminuo usled melanoma pre Dana 42. Dan -14: % promene zbira dijametara iz bazalnog skrininga (Dan -14). Dan -14 do Dan 126: % promene SOD u odnosu na bazalni nivo. Dan -14 = bazalni nivo. Dan 0 = infuzija LN-144.
[0848] Posle TIL tretmana, zapažen je porast HMGB1 (Slika 114). Nivoi HMGB1 u plazmi mereni su korišćenjem HMGB1 ELISA kita (Tecan US, Inc). Prikazani podaci predstavljaju broj puta promene nivoa HMGB1 pre (Dan -7) i posle (Dan 4 i Dan 14) infuzije LN-144 kod pacijenata Kohorta 1 i Kohorta 2 (p vrednosti su izračunate korišćenjem dvosmernog parnog t-testa baziranog na log-transformisanim podacima). Veličina uzorka (zadebljani i kurzivni font) i srednja vrednost (kurziv) prikazani su u zagradi za svaku vremensku tačku. HMGB1 se sekretuje iz aktiviranih imunskih ćelija i oslobađa iz oštećenih tumorskih ćelija. Povećani nivoi HMGB1 zapaženi posle tretmana korišćenjem LN-144 zato sugerišu imunski posredovani mehanizam antitumorske aktivnosti.
[0849] Nivoi IP-10 u plazmi mereni su korišćenjem Luminex testa. Prikazani podaci na Slici 115 predstavljaju broj puta promene nivoa IP-10 pre (Dan -7) i posle (Dan 4 i Dan 14) LN-144 infuzije pacijentima Kohorta 1 i Kohorta 2 (p vrednosti se izračunavaju korišćenjem dvosmernog parnog t-testa baziranog na log-transformisanim podacima). Veličina uzorka (zadebljani i kurzivni font) i srednja vrednost (kurziv) prikazani su u zagradi za svaku vremensku tačku. Porast IP-10 posle infuzije LN-144 praćen je da bi se razumela moguća korelacija sa perzistencijom TIL.
[0850] Ažurirani podaci za Kohort 2 (n = 17 pacijenata) saopšteni su na Slikama 116 do 121. U poređenju sa kohortom 1 i primerom izvođenja procesa Gen 1, koji pokazuju DCR od 64% i stopu ukupnog odgovora (ORR) od 29% (N = 14), Kohort 2 i primer izvođenja procesa Gen 2 pokazuje DCR od 80% i ORR od 40% (N = 10).
11
Zaključci
[0851] Preliminarni rezultati na osnovu postojećih podataka pokazuju uporedivu bezbednost između LN-144 TIL proizvoda Gen 1 i Gen 2. Primena TIL proizvedenih procesom Gen 2 (proces 2A, opisanom u ovom tekstu) dovodi do iznenađujućeg porasta kliničkih odgovora kod pacijenata sa odmaklim metastatskim melanomom, kod kojih je postojala progresija pri prethodnim terapijama pomoću anti-PD-1 i anti-CTLA-4. DCR za kohort 2 bio je 78%.
[0852] Preliminarni podaci za biomarkere podržali su citolitički mehanizam dejstva predložen za TIL terapiju.
[0853] Primer izvođenja proizvodnog procesa Gen 2 opisan u ovom tekstu traje 22 dana. Ovaj proces značajno skraćuje vreme koje pacijent mora da čeka da bi dobio TIL, nudi fleksibilnost vremena doziranja pacijenata, i smanjuje troškove proizvodnje, uz obezbeđivanje drugih prednosti u odnosu na ranije pristupke, koje bi omogućile komercijalizaciju i registraciju kod zdravstvenih regulatornih agencija. Preliminarni klinički podaci za metastatski melanom uz korišćenje primera izvođenja proizvodnog procesa Gen 2 takođe ukazuju na iznenađujuće poboljšanje kliničke efikasnosti TIL, mereno prema DCR, ORR, i drugim kliničkim odgovorima, uz slično vreme do odgovora i profil bezbednosti u poređenju sa TIL proizvedenim korišćenjem procesa Gen 1. Neočekivano poboljšanje efikasnosti TIL proizvoda Gen 2 pokazano je i više od pet puta povećanom proizvodnjom IFN-γ (Slika 98), što je u korelaciji sa opštim povećanjem efikasnosti (Slika 122), značajno poboljšanom poliklonalnošću (Slika 99A i Slika 99B), i većom prosečnom proizvodnjom IP-10 i MCP-1 (Slike 123 do 126). Iznenađujuće, uprkos mnogo kraćem procesu Gen 2, mnoge druge kritične karakteristike TIL proizvoda su slične onima koje su zapažene korišćenjem tradicionalnijih proizvodnih procesa, uključujući relativnu dužinu telomera (Slika 97) i ekspresiju CD27 i CD28 (Slika 96B i Slika 96C).
Reference
[0854]
1Goff, et al. Randomized, Prospective Evaluation Comparing Intensity of Lymphodepletion Before Adoptive Transfer of Tumor-Infiltrating Lymphocytes for Patients With Metastatic Melanoma. J Clin Oncol.2016 Jul 10;34(20):2389-97.
12
2Sarnaik A, Kluger H, Chesney J, et al. Efficacy of single administration of tumorinfiltrating lymphocytes (TIL) in heavily pretreated patients with metastatic melanoma following checkpoint therapy. J Clin Oncol.2017; 35 [suppl; abstr 3045].
PRIMER 29: STUDIJE FAZE 2 HNSCC I CERVIKALNOG KARCINOMA
[0855] Uključivanje u studiju faze 2 HNSCC (karcinom skvamoznih ćelija glave i vrata; C-145-03). 13 pacijenata koji su pristali da učestvuju u studiji, TIL su sakupljeni od 10 pacijenata i na kraju je 7 pacijenata primilo infuziju, dok je jedan još uvek u procesu.
[0856] Uključivanje u studiju faze 2 za karcinom cerviksa (C-145-04). 8 pacijenata koji su pristali da učestvuju u studiji, TIL su sakupljeni od 4 pacijenta i na kraju su 2 pacijenta primila infuziju, dok su 2 još uvek u procesu.
[0857] Početni podaci iz studije koja je u toku prikazani su na Slici 127. Stabilna bolest (SD) i/ili progresivni odgovor zapaženi su kod pacijenata sa HCNSCC i cervikalnim kancerom tretiranih TIL terapijom u periodu do 84 dana.
[0858] Primeri navedeni ranije u ovom tekstu dati su da bi prosečno obučenom stručnjaku u oblasti objavili i opisali kako da naprave i koriste primere izvođenja kompozicija, sistema i postupaka pronalaska i nisu namenjeni ograničavanju obima onoga što izumitelji smatraju svojim pronalaskom. Podrazumeva se da su modifikacije goreopisanih načina izvođenja pronalaska, koje su očigledne stručnjacima u oblasti, u okvirima obima patentnih zahteva koji slede. Svi patenti i publikacije pomenuti u specifikaciji indikativni su za nivo obučenosti stručnjaka u oblasti na koju se pronalazak odnosi.
[0859] Sve oznake poglavlja i odeljaka upotrebljene su samo radi jasnoće i kao referenca i ne treba ih ni na koji način smatrati ograničavajućim. Na primer, stručnjak u oblasti će razumeti korisnost kombinovanja različitih aspekata različitih poglavlja i odeljaka, po potrebi [0860] Specifični primeri izvođenja i primeri opisani u ovom tekstu ponuđeni su samo kao primeri, a prijava je ograničena jedino okvirima priloženih patentnih zahteva, zajedno sa punim obimom ekvivalenata na koje se patentni zahtevi odnose.
Sekvence:
[0861]
SEQ ID NO:1 je aminokiselinska sekvenca teškog lanca muromonaba.
SEQ ID NO:2 je aminokiselinska sekvenca lakog lanca muromonaba.
SEQ ID NO:3 je aminokiselinska sekvenca rekombinantnog humanog IL-2 proteina.
SEQ ID NO:4 je aminokiselinska sekvenca aldesleukina.
1
SEQ ID NO:5 je aminokiselinska sekvenca rekombinantnog humanog IL-4 proteina. SEQ ID NO:6 je aminokiselinska sekvenca rekombinantnog humanog IL-7 proteina. SEQ ID NO:7 je aminokiselinska sekvenca rekombinantnog humanog IL-15 proteina. SEQ ID NO:8 je aminokiselinska sekvenca rekombinantnog humanog IL-21 proteina.
Aminokiselinske sekvence muromonaba.
[0862] Aminokiselinske sekvence interleukina.
14
1
1
�
1
1
2
21
22
2
24
2
�

Claims (12)

PATENTNI ZAHTEVI
1. Postupak ekspandiranja tumor-infiltrirajućih limfocita (TIL) u terapijsku populaciju TIL, naznačen time, što uključuje:
(a) dodavanje procesovanih tumorskih fragmenata tumora resektovanog iz pacijenta u zatvoreni sistem da bi se dobila prva populacija TIL;
(b) izvođenje prve ekspanzije kultivisanjem prve populacije TIL u medijumu za kulturu ćelija koji sadrži IL-2 da bi se proizvela druga populacija TIL, pri čemu se prva ekspanzija izvodi u zatvorenom kontejneru koji obezbeđuje prvu površinu propustljivu za gas, pri čemu se prva ekspanzija izvodi oko 3-11 dana da bi se dobila druga populacija TIL, pri čemu je druga populacija TIL najmanje 50 puta brojnija od prve populacije TIL, i pri čemu se prelaz iz koraka (a) u korak (b) dešava bez otvaranja sistema;
(c) izvođenje druge ekspanzije suplementacijom medijuma za kulturu ćelija druge populacije TIL dodatnim IL-2, OKT-3, i antigen-prezentujućim ćelijama (APC), da bi se proizvela treća populacija TIL, pri čemu se treća ekspanzija izvodi oko 7-11 dana da bi se dobila treća populacija TIL, pri čemu je treća populacija TIL terapijska populacija TIL, pri čemu se druga ekspanzija vrši u zatvorenom kontejneru koji obezbeđuje drugu površinu propustljivu za gas, i pri čemu se prelaz iz koraka (b) u korak (c) odvija bez otvaranja sistema;
(d) sakupljanje terapijske populacije TIL dobijenih iz koraka (c), pri čemu se prelaz iz koraka (c) u korak (d) dešava bez otvaranja sistema, i pri čemu sakupljena terapijska populacija TIL sadrži dovoljno TIL za terapijski efikasno doziranje TIL;
(e) prenošenje sakupljene TIL populacije iz koraka (d) u infuzionu kesu, pri čemu se prenošenje iz koraka (d) u (e) dešava bez otvaranja sistema, i
(f) krioprezerviranje infuzione kese koja sadrži sakupljenu TIL populaciju, korišćenjem procesa krioprezervacije.
2. Postupak prema patentnom zahtevu 1, naznačen time, što broj TIL dovoljan za terapijski efikasno doziranje iznosi od oko 1 ×10<9>do 5 ×10<9>TIL.
3. Postupak prema patentnom zahtevu 1, naznačen time, što broj TIL dovoljan za terapijski efikasno doziranje iznosi od oko 5 ×10<9>do 1 ×10<10>TIL.
2
4. Postupak prema bilo kojem od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time, što se proces krioprezervacije izvodi korišćenjem sakupljene TIL populacije i medijuma za krioprezervaciju u odnosu 1:1.
5. Postupak prema bilo kojem od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time, što su antigen-prezentujuće ćelije mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC).
6. Postupak prema patentnom zahtevu 1, naznačen time, što se koraci (a) do (e) izvode u okviru perioda od oko 10 dana do oko 22 dana.
7. Postupak prema patentnom zahtevu 1, naznačen time, što se koraci (a) do (e) izvode u okviru perioda od oko 15 dana do oko 22 dana.
8. Postupak prema patentnom zahtevu 1, naznačen time, što se koraci (a) do (e) izvode u okviru perioda od oko 10 dana do oko 20 dana.
9. Postupak prema patentnom zahtevu 1, naznačen time, što se koraci (a) do (e) izvode u okviru perioda od oko 20 dana do oko 22 dana.
10. Postupak prema bilo kojem od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time, što se u koraku (c) antigen-prezentujuće ćelije (APC) dodaju ćelijskoj kulturi druge populacije TIL u odnosu APC:TIL od 25:1.
11. Postupak prema patentnom zahtevu 4, naznačen time, što medijum za krioprezervaciju sadrži dimetilsulfoksid (DMSO).
12. Postupak prema patentnom zahtevu 11, naznačen time, što medijum za krioprezervaciju sadrži 7% do 10% DMSO.
RS20210622A 2017-03-29 2018-01-05 Postupci proizvodnje tumor-infiltrirajućih limfocita i upotrebe istih u imunoterapiji RS61863B1 (sr)

Applications Claiming Priority (11)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762478506P 2017-03-29 2017-03-29
US201762539410P 2017-07-31 2017-07-31
US201762548306P 2017-08-21 2017-08-21
US201762554538P 2017-09-05 2017-09-05
US201762559374P 2017-09-15 2017-09-15
US201762567121P 2017-10-02 2017-10-02
US201762577655P 2017-10-26 2017-10-26
US201762582874P 2017-11-07 2017-11-07
US201762596374P 2017-12-08 2017-12-08
PCT/US2018/012633 WO2018182817A1 (en) 2017-03-29 2018-01-05 Processes for production of tumor infiltrating lymphocytes and uses of same in immunotherapy
EP18709132.7A EP3601533B1 (en) 2017-03-29 2018-01-05 Processes for production of tumor infiltrating lymphocytes and uses of same in immunotherapy

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS61863B1 true RS61863B1 (sr) 2021-06-30

Family

ID=61569356

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20250109A RS66452B1 (sr) 2017-03-29 2018-01-05 Postupci proizvodnje tumor-infiltrirajućih limfocita i upotrebe istih u imunoterapiji
RS20210622A RS61863B1 (sr) 2017-03-29 2018-01-05 Postupci proizvodnje tumor-infiltrirajućih limfocita i upotrebe istih u imunoterapiji
RS20250044A RS66400B1 (sr) 2017-03-29 2018-01-05 Postupci proizvodnje tumor-infiltrirajućih limfocita i upotrebe istih u imunoterapiji

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20250109A RS66452B1 (sr) 2017-03-29 2018-01-05 Postupci proizvodnje tumor-infiltrirajućih limfocita i upotrebe istih u imunoterapiji

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20250044A RS66400B1 (sr) 2017-03-29 2018-01-05 Postupci proizvodnje tumor-infiltrirajućih limfocita i upotrebe istih u imunoterapiji

Country Status (36)

Country Link
US (60) US10894063B2 (sr)
EP (6) EP3722415B1 (sr)
JP (6) JP7169291B2 (sr)
KR (2) KR102686794B1 (sr)
CN (1) CN110785486A (sr)
AU (2) AU2018243355B2 (sr)
BR (1) BR112019020326A2 (sr)
CA (1) CA3057975A1 (sr)
CL (2) CL2019002769A1 (sr)
CO (1) CO2019011995A2 (sr)
CR (1) CR20190487A (sr)
CY (1) CY1124136T1 (sr)
DK (3) DK3730608T3 (sr)
EC (1) ECSP19077884A (sr)
ES (3) ES3009885T3 (sr)
FI (2) FI3730608T3 (sr)
HR (3) HRP20250068T1 (sr)
HU (3) HUE070176T2 (sr)
IL (2) IL305198A (sr)
JO (1) JOP20190224A1 (sr)
LT (3) LT3730608T (sr)
MA (2) MA68856B1 (sr)
MD (3) MD3730608T2 (sr)
MX (2) MX2019011768A (sr)
NZ (1) NZ796142A (sr)
PE (1) PE20191841A1 (sr)
PH (1) PH12019502247A1 (sr)
PL (3) PL3722415T3 (sr)
PT (3) PT3730608T (sr)
RS (3) RS66452B1 (sr)
SG (1) SG11201908994RA (sr)
SI (3) SI3730608T1 (sr)
SM (3) SMT202100298T1 (sr)
TN (1) TN2019000273A1 (sr)
TW (1) TWI799402B (sr)
WO (1) WO2018182817A1 (sr)

Families Citing this family (121)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014133568A1 (en) 2013-03-01 2014-09-04 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Methods of producing enriched populations of tumor reactive t cells from peripheral blood
GB201522097D0 (en) 2015-12-15 2016-01-27 Cellular Therapeutics Ltd Cells
SMT202400133T1 (it) 2016-10-26 2024-05-14 Iovance Biotherapeutics Inc Restimolazione di linfociti infiltranti il tumore crioconservati
US11332713B2 (en) 2016-11-16 2022-05-17 KSQ Therapeutics, Inc. Gene-regulating compositions and methods for improved immunotherapy
ES3055314T3 (en) 2017-01-06 2026-02-11 Iovance Biotherapeutics Inc Expansion of tumor infiltrating lymphocytes with potassium channel agonists and therapeutic uses thereof
GB201700621D0 (en) 2017-01-13 2017-03-01 Guest Ryan Dominic Method,device and kit for the aseptic isolation,enrichment and stabilsation of cells from mammalian solid tissue
EP3596108A4 (en) 2017-03-15 2020-12-23 Pandion Operations, Inc. TARGETED IMMUNOTOLERANCE
US11254913B1 (en) 2017-03-29 2022-02-22 Iovance Biotherapeutics, Inc. Processes for production of tumor infiltrating lymphocytes and uses of same in immunotherapy
JOP20190224A1 (ar) 2017-03-29 2019-09-26 Iovance Biotherapeutics Inc عمليات من أجل إنتاج الخلايا اللمفاوية المرتشحة للأورام واستخداماتها في العلاج المناعي
AU2018273914A1 (en) 2017-05-24 2019-11-14 Pandion Operations, Inc. Targeted immunotolerance
AR112072A1 (es) * 2017-06-05 2019-09-18 Iovance Biotherapeutics Inc Métodos de uso de linfocitos infiltrantes de tumor en melanoma doble refractario
CN111601883B (zh) * 2017-11-17 2024-06-21 艾欧凡斯生物治疗公司 由细针抽吸物和小活检物扩增til
US20200299349A1 (en) 2017-11-21 2020-09-24 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Partial agonists of interleukin-2
JP2021503885A (ja) 2017-11-22 2021-02-15 アイオバンス バイオセラピューティクス，インコーポレイテッド 末梢血からの末梢血リンパ球（ｐｂｌ）の拡大培養
US10174091B1 (en) 2017-12-06 2019-01-08 Pandion Therapeutics, Inc. IL-2 muteins
US10946068B2 (en) 2017-12-06 2021-03-16 Pandion Operations, Inc. IL-2 muteins and uses thereof
USRE50550E1 (en) 2017-12-06 2025-08-26 Pandion Operations, Inc. IL-2 muteins and uses thereof
US12104172B2 (en) 2018-01-08 2024-10-01 Iovance Biotherapeutics, Inc. Processes for generating TIL products enriched for tumor antigen-specific t-cells
US11713446B2 (en) 2018-01-08 2023-08-01 Iovance Biotherapeutics, Inc. Processes for generating TIL products enriched for tumor antigen-specific T-cells
JP2021518160A (ja) 2018-03-15 2021-08-02 ケーエスキュー セラピューティクス， インコーポレイテッド 免疫療法の改善のための遺伝子調節組成物及び遺伝子調節方法
AU2019236204B2 (en) 2018-03-15 2026-02-26 KSQ Therapeutics, Inc. Gene-regulating compositions and methods for improved immunotherapy
MA52667B1 (fr) * 2018-03-29 2024-07-31 Iovance Biotherapeutics, Inc. Procédés de production de lymphocytes infiltrant les tumeurs et leurs utilisations en immunothérapie
MA52533A (fr) * 2018-04-27 2021-03-03 Iovance Biotherapeutics Inc Procédé en circuit fermé pour l'amplification et l'edition de gènes de lymphocytes d'infiltration des tumeurs et leurs utilisations en immunothérapie
WO2019217753A1 (en) * 2018-05-10 2019-11-14 Iovance Biotherapeutics, Inc. Processes for production of tumor infiltrating lymphocytes and uses of same in immunotherapy
BR112021007115A2 (pt) 2018-10-15 2021-07-20 Nurix Therapeutics, Inc. compostos bifuncionais para dedradação de btk por meio da via de proteossoma de ubiquitina
CA3118493A1 (en) 2018-11-05 2020-05-14 Iovance Biotherapeutics, Inc. Expansion of tils utilizing akt pathway inhibitors
JP7688575B2 (ja) * 2018-11-05 2025-06-04 アイオバンス バイオセラピューティクス，インコーポレイテッド 抗ｐｄ－１抗体に対して不応性のｎｓｃｌｃ患者の治療
US20230039976A1 (en) * 2018-11-05 2023-02-09 Iovance Biotherapeutics, Inc. Selection of improved tumor reactive t-cells
KR20210091213A (ko) * 2018-11-05 2021-07-21 이오반스 바이오테라퓨틱스, 인크. 종양 침윤 림프구의 생성 방법 및 면역치료법에서 이의 용도
CN113423820A (zh) * 2018-11-08 2021-09-21 伽马三角洲疗法有限公司 分离和扩增细胞的方法
US20220193131A1 (en) * 2018-12-19 2022-06-23 Iovance Biotherapeutics, Inc. Methods of Expanding Tumor Infiltrating Lymphocytes Using Engineered Cytokine Receptor Pairs and Uses Thereof
EP3908678A1 (en) 2019-01-10 2021-11-17 Iovance Biotherapeutics, Inc. System and methods for monitoring adoptive cell therapy clonality and persistence
WO2020232029A1 (en) 2019-05-13 2020-11-19 Iovance Biotherapeutics, Inc. Methods and compositions for selecting tumor infiltrating lymphocytes and uses of the same in immunotherapy
TW202110885A (zh) 2019-05-20 2021-03-16 美商潘迪恩治療公司 靶向ＭＡｄＣＡＭ之免疫耐受性
US20220257656A1 (en) * 2019-07-10 2022-08-18 National Cancer Center Specific marker for identifying t cells specifically attacking cancer cells
GB201911066D0 (en) 2019-08-02 2019-09-18 Achilles Therapeutics Ltd T cell therapy
US20220273717A1 (en) * 2019-08-12 2022-09-01 Bellicum Pharmaceuticals, Inc. Improved formulations for immune cells
JP7764035B2 (ja) 2019-08-19 2025-11-05 ウニベルシテート バーゼル 細胞治療の方法
KR20220068227A (ko) * 2019-09-24 2022-05-25 누릭스 테라퓨틱스 인코포레이티드 입양 세포 요법에 사용하기 위한 cbl 억제제 및 조성물
EP4048295A1 (en) * 2019-10-25 2022-08-31 Iovance Biotherapeutics, Inc. Gene editing of tumor infiltrating lymphocytes and uses of same in immunotherapy
CA3160713A1 (en) 2019-12-04 2021-06-10 Nurix Therapeutics, Inc. Bifunctional compounds for degrading btk via ubiquitin proteosome pathway
JP7749561B2 (ja) * 2019-12-11 2025-10-06 アイオバンス バイオセラピューティクス，インコーポレイテッド 腫瘍浸潤リンパ球（ｔｉｌ）の産生のためのプロセス及びそれを使用する方法
CN115244173A (zh) 2019-12-20 2022-10-25 英研生物(英国)有限公司 用于分离肿瘤浸润淋巴细胞的装置及方法及其用途
CA3166509A1 (en) 2020-01-14 2021-07-22 Synthekine, Inc. Biased il2 muteins methods and compositions
WO2021168079A1 (en) 2020-02-21 2021-08-26 Pandion Operations, Inc. Tissue targeted immunotolerance with a cd39 effector
JP2023524639A (ja) * 2020-04-22 2023-06-13 アイオバンス バイオセラピューティクス，インコーポレイテッド 患者特異的免疫療法用細胞の製造調整システム及び調整方法
EP4143300A1 (en) 2020-04-28 2023-03-08 Lyell Immunopharma, Inc. Methods for culturing cells
CA3176654A1 (en) 2020-04-28 2021-11-04 Karl PEGGS T cell therapy
JP2023524032A (ja) * 2020-04-30 2023-06-08 ザ・トランスレーショナル・ジェノミクス・リサーチ・インスティチュート ネオアンチゲン情報に基づいた腫瘍浸潤性リンパ球によるがん免疫療法
TW202208616A (zh) * 2020-05-04 2022-03-01 美商艾歐凡斯生物治療公司 改良之腫瘤反應性ｔ細胞的選擇
CA3176826A1 (en) 2020-05-04 2021-11-11 Iovance Biotherapeutics, Inc. Processes for production of tumor infiltrating lymphocytes and uses of the same in immunotherapy
GB202006989D0 (en) * 2020-05-12 2020-06-24 Gammadelta Therapeutics Ltd Methods for isolating gamma delta t cells
EP4159843A4 (en) * 2020-05-29 2024-07-31 Shanghai Juncell Therapeutics Co., Ltd. MEDIUM FOR SEEDING CELLS OF TUMOR INFILTRATING LYMPHOCYTES AND ITS APPLICATION
CN111876381A (zh) * 2020-07-22 2020-11-03 中美冠科生物技术（太仓）有限公司 一种t细胞模型及其在体外人源pd-1抗体药效评价中的应用
WO2022076606A1 (en) 2020-10-06 2022-04-14 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of nsclc patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies
US20230372397A1 (en) * 2020-10-06 2023-11-23 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of nsclc patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies
JP2023550490A (ja) 2020-11-23 2023-12-01 ライエル・イミュノファーマ・インコーポレイテッド 免疫細胞を培養するための方法
EP4252754A4 (en) 2020-11-25 2024-11-13 Shanghai Juncell Therapeutics Co., Ltd. PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR IMPROVING CELL KILLING AND USE THEREOF
EP4253530A4 (en) 2020-11-25 2024-10-30 Shanghai Juncell Therapeutics Co., Ltd. TUMOR INFILTRATION LYMPHOCYTE CULTURE MEDIUM AND ITS APPLICATION
WO2022125941A1 (en) 2020-12-11 2022-06-16 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of cancer patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies in combination with braf inhibitors and/or mek inhibitors
WO2022133149A1 (en) 2020-12-17 2022-06-23 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of cancers with tumor infiltrating lymphocytes
WO2022133140A1 (en) * 2020-12-17 2022-06-23 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment with tumor infiltrating lymphocyte therapies in combination with ctla-4 and pd-1 inhibitors
WO2022130017A2 (en) * 2020-12-18 2022-06-23 Instil Bio (Uk) Limited Processing of tumor infiltrating lymphocytes
EP4262828A1 (en) 2020-12-18 2023-10-25 Instil Bio (Uk) Limited Tumor infiltrating lymphocytes and anti-cd47 therapeutics
EP4263807A2 (en) * 2020-12-18 2023-10-25 Instil Bio (Uk) Limited Processing of tumor infiltrating lymphocytes
CN114686430A (zh) * 2020-12-31 2022-07-01 上海赛比曼生物科技有限公司 一种制备til的方法
TW202242085A (zh) 2020-12-31 2022-11-01 美商艾歐凡斯生物治療公司 供自動生產腫瘤浸潤淋巴球的裝置和方法
JPWO2022145490A1 (sr) * 2021-01-04 2022-07-07
TW202241508A (zh) * 2021-01-29 2022-11-01 美商艾歐凡斯生物治療公司 細胞介素相關之腫瘤浸潤性淋巴球組合物及方法
CA3207359A1 (en) 2021-02-05 2022-08-11 Cecile Chartier-Courtaud Adjuvant therapy for cancer
EP4298208A1 (en) 2021-02-25 2024-01-03 Lyell Immunopharma, Inc. Methods for culturing cells
WO2022187741A2 (en) 2021-03-05 2022-09-09 Iovance Biotherapeutics, Inc. Tumor storage and cell culture compositions
US20240191191A1 (en) * 2021-03-19 2024-06-13 Iovance Biotherapeutics, Inc. Methods for infiltrating lymphocyte (til) expansion related to cd39/cd69 selection and gene knockout in tils
KR20240032711A (ko) 2021-03-25 2024-03-12 이오반스 바이오테라퓨틱스, 인크. T-세포 공배양 효능 검정 및 세포 치료제와 함께 사용하기 위한 방법 및 조성물
KR102666931B1 (ko) * 2021-03-30 2024-05-20 주식회사 네오젠티씨 면역세포 조성물을 생산하는 방법
GB202109886D0 (en) 2021-07-08 2021-08-25 Achilles Therapeutics Uk Ltd Assay
EP4320435A1 (en) 2021-04-09 2024-02-14 Achilles Therapeutics UK Limited Batch release assay for pharmaceutical products relating to t cell therapies
JP2024515189A (ja) 2021-04-19 2024-04-05 アイオバンス バイオセラピューティクス，インコーポレイテッド 細胞免疫療法におけるキメラ共刺激受容体、ケモカイン受容体、及びそれらの使用
TW202309269A (zh) 2021-04-27 2023-03-01 日商武田藥品工業股份有限公司 重組抗原呈現細胞
WO2022245754A1 (en) 2021-05-17 2022-11-24 Iovance Biotherapeutics, Inc. Pd-1 gene-edited tumor infiltrating lymphocytes and uses of same in immunotherapy
DE102021002748A1 (de) 2021-05-27 2022-12-01 Zellwerk Gmbh Verfahren zur Herstellung von Tumor-infiltrierten T-Lymphozyten (TIL) und deren Verwendung als Zell-Therapeutika für die Behandlung humaner Tumoren
WO2022263673A1 (en) * 2021-06-17 2022-12-22 CBio A/S Multistep process for culturing tumor-infiltrating lymphocytes for therapeutic use
JP2024524185A (ja) 2021-06-22 2024-07-05 アキレス セラピューティクス ユーケー リミテッド 抗原特異的ｔ細胞を生成するための方法
CA3226111A1 (en) 2021-07-22 2023-01-26 Iovance Biotherapeutics, Inc. Method for cryopreservation of solid tumor fragments
EP4377446A1 (en) 2021-07-28 2024-06-05 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of cancer patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies in combination with kras inhibitors
US20240424097A1 (en) 2021-09-09 2024-12-26 Iovance Biotherapeutics, Inc. Processes for generating til products using pd-1 talen knockdown
JP2024534581A (ja) 2021-09-24 2024-09-20 アイオバンス バイオセラピューティクス，インコーポレイテッド 腫瘍浸潤リンパ球のための拡張プロセス及び薬剤
KR20240090898A (ko) 2021-10-26 2024-06-21 누릭스 테라퓨틱스 인코포레이티드 암을 치료 및 예방하고 btk를 분해하기 위한 피페리디닐피라진-카복스아미드 화합물
AR127482A1 (es) 2021-10-27 2024-01-31 Iovance Biotherapeutics Inc Sistemas y métodos para coordinar la fabricación de células para inmunoterapia específica de paciente
IL312027A (en) 2021-10-28 2024-06-01 Lyell Immunopharma Inc Methods for culturing immune cells
CA3237410A1 (en) 2021-11-10 2023-05-19 Friedrich Graf Finck VON FINCKENSTEIN Methods of expansion treatment utilizing cd8 tumor infiltrating lymphocytes
WO2023137471A1 (en) 2022-01-14 2023-07-20 Tune Therapeutics, Inc. Compositions, systems, and methods for programming t cell phenotypes through targeted gene activation
CA3247927A1 (en) 2022-01-14 2023-07-20 Tune Therapeutics, Inc. Compositions, systems and methods for programming T-lymphocyte phenotypes by targeted gene repression
CA3243416A1 (en) * 2022-01-28 2023-08-03 Iovance Biotherapeutics, Inc. TUMOR INFILTRATION LYMPHOCYTES MODIFIED TO EXPRESS PAYLOADS
US20250099588A1 (en) 2022-01-28 2025-03-27 Iovance Biotherapeutics, Inc. Cytokine associated tumor infiltrating lymphocytes compositions and methods
CA3247638A1 (en) 2022-04-06 2023-10-12 Maria Fardis TREATMENT OF PATIENTS WITH NON-SMALL CELL LUNG CARCINOMA (NSCLC) WITH TUMOR-INFILTRATING LYMPHOCYTE THERAPIES
CA3248034A1 (en) * 2022-04-15 2023-10-19 Iovance Biotherapeutics, Inc. METHODS FOR EXPANSION OF TIL CELLS BY MEANS OF SPECIFIC CYTOKINE COMBINATIONS AND/OR AKT INHIBITOR TREATMENT
CA3251533A1 (en) 2022-05-10 2023-11-16 Iovance Biotherapeutics, Inc. TREATMENT OF CANCER PATIENTS WITH TUMOR-INFILTRATING LYMPHOCYTE THERAPIES IN COMBINATION WITH AN IL-15R AGONIST
WO2024011114A1 (en) 2022-07-06 2024-01-11 Iovance Biotherapeutics, Inc. Devices and processes for automated production of tumor infiltrating lymphocytes
GB202210006D0 (en) 2022-07-07 2022-08-24 Achilles Therapeutics Uk Ltd Analysis of T cell samples
EP4565683A1 (en) 2022-08-01 2025-06-11 Iovance Biotherapeutics, Inc. Chimeric costimulatory receptors, chemokine receptors, and the use of same in cellular immunotherapies
EP4583890A1 (en) 2022-09-09 2025-07-16 Iovance Biotherapeutics, Inc. Processes for generating til products using pd-1/tigit talen double knockdown
JP2025531877A (ja) 2022-09-09 2025-09-25 アイオバンス バイオセラピューティクス，インコーポレイテッド Ｐｄ－１／ｔｉｇｉｔ ｔａｌｅｎダブルノックダウンを使用したｔｉｌ製品を生成するためのプロセス
US12181192B2 (en) * 2022-09-16 2024-12-31 Black & Decker, Inc. Methods and devices for controlling the temperature of a surface
CN120239746A (zh) 2022-09-19 2025-07-01 图恩疗法股份有限公司 用于调节t细胞功能的组合物、系统和方法
JP2025537155A (ja) 2022-11-04 2025-11-14 アイオバンス バイオセラピューティクス，インコーポレイテッド Ｃｄ３９／ｃｄ１０３選択に関連した腫瘍浸潤リンパ球（ｔｉｌ）拡張のための方法
KR20250122544A (ko) 2022-11-21 2025-08-13 이오반스 바이오테라퓨틱스, 인크. 종양 침윤 림프구의 확장을 위한 2차원 공정 및 이를 통한 요법
CN120225666A (zh) 2022-11-21 2025-06-27 艾欧凡斯生物治疗公司 用于评估基因编辑的t细胞的增殖效力的方法
WO2024118836A1 (en) 2022-11-30 2024-06-06 Iovance Biotherapeutics, Inc. Processes for production of tumor infiltrating lymphocytes with shortened rep step
WO2024178397A2 (en) 2023-02-24 2024-08-29 Elevatebio Technologies, Inc. Modified immune effector cells and methods of use
DE102023002417B3 (de) 2023-06-15 2024-12-05 Zellwerk Gmbh Verfahren zur Expansion von Zellen
WO2025006811A1 (en) 2023-06-27 2025-01-02 Lyell Immunopharma, Inc. Methods for culturing immune cells
WO2025015318A2 (en) 2023-07-13 2025-01-16 Iovance Biotherapeutics, Inc. Cytokine encoding lentiviral vectors and uses thereof for making tumor infiltrating lymphocytes
WO2025029840A1 (en) 2023-07-31 2025-02-06 Tune Therapeutics, Inc. Compositions and methods for multiplexed activation and repression of t cell gene expression
WO2025029835A1 (en) 2023-07-31 2025-02-06 Tune Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating il-2 gene expression
WO2025038289A1 (en) * 2023-08-17 2025-02-20 H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute Inc. Using 12 chemokine signature to select sting agonist and til treatments for solid tumors
WO2025047660A1 (ja) * 2023-08-31 2025-03-06 国立大学法人筑波大学 腫瘍性濾胞制御性ｔ細胞及び腫瘍性濾胞殺細胞性ｔ細胞を定量する方法、腫瘍性濾胞制御性ｔ細胞及び腫瘍性濾胞殺細胞性ｔ細胞をスクリーニングする方法、治療用組成物、及びキット
WO2025054540A1 (en) 2023-09-08 2025-03-13 Iovance Biotherapeutics, Inc. Methods of gene-editing using programmable nucleases
WO2025101484A1 (en) 2023-11-06 2025-05-15 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of endometrial cancers with tumor infiltrating lymphocyte therapies
WO2026006604A1 (en) 2024-06-26 2026-01-02 Lyell Immunopharma, Inc. Feeder cell replacement
CN118710478B (zh) * 2024-08-27 2025-01-03 福州大学 基于改进麻雀搜索算法的地铁突发运营中断客流疏运方法

Family Cites Families (79)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4766106A (en) 1985-06-26 1988-08-23 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US5206344A (en) 1985-06-26 1993-04-27 Cetus Oncology Corporation Interleukin-2 muteins and polymer conjugation thereof
AU7873187A (en) 1986-08-08 1988-02-24 University Of Minnesota Method of culturing leukocytes
US7479269B2 (en) 1988-11-23 2009-01-20 Genetics Institute, Llc Methods for selectively enriching TH1 and TH2 cells
US6905680B2 (en) 1988-11-23 2005-06-14 Genetics Institute, Inc. Methods of treating HIV infected subjects
US6534055B1 (en) 1988-11-23 2003-03-18 Genetics Institute, Inc. Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US6352694B1 (en) 1994-06-03 2002-03-05 Genetics Institute, Inc. Methods for inducing a population of T cells to proliferate using agents which recognize TCR/CD3 and ligands which stimulate an accessory molecule on the surface of the T cells
US5089261A (en) 1989-01-23 1992-02-18 Cetus Corporation Preparation of a polymer/interleukin-2 conjugate
US4902502A (en) 1989-01-23 1990-02-20 Cetus Corporation Preparation of a polymer/interleukin-2 conjugate
US5126132A (en) 1989-08-21 1992-06-30 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Tumor infiltrating lymphocytes as a treatment modality for human cancer
US7175843B2 (en) 1994-06-03 2007-02-13 Genetics Institute, Llc Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US7572631B2 (en) 2000-02-24 2009-08-11 Invitrogen Corporation Activation and expansion of T cells
US6867041B2 (en) 2000-02-24 2005-03-15 Xcyte Therapies, Inc. Simultaneous stimulation and concentration of cells
AU2000202A (en) 2000-10-31 2002-05-15 Pr Pharmaceuticals Inc Methods and compositions for enhanced delivery of bioactive molecules
US20050084967A1 (en) 2002-06-28 2005-04-21 Xcyte Therapies, Inc. Compositions and methods for eliminating undesired subpopulations of T cells in patients with immunological defects related to autoimmunity and organ or hematopoietic stem cell transplantation
EP1539929B1 (en) 2002-06-28 2013-04-10 Life Technologies Corporation Methods for restoring immune repertoire in patients with immunological defects related to autoimmunity and organ or hematopoietic stem cell transplantation
EP1545204B1 (en) 2002-09-06 2016-08-10 THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES Immunotherapy with in vitro-selected antigen-specific lymphocytes after nonmyeloablative lymphodepleting chemotherapy
ITMI20022118A1 (it) 2002-10-04 2004-04-05 Abiogen Pharma Spa Procedimento per la coltura su larga scala di t-linfociti in un sistema omogeneo.
EP2336293B1 (en) 2003-10-08 2016-02-10 Wilson Wolf Manufacturing Corporation Cell culture methods and devices utilizing gas permeable materials
ES2720160T3 (es) 2005-05-09 2019-07-18 Ono Pharmaceutical Co Anticuerpos monoclonales humanos contra muerte programada 1(PD-1) y métodos para tratar el cáncer usando anticuerpos dirigidos contra PD-1 solos o junto con otras sustancias inmunoterapéuticas
EA019344B1 (ru) 2005-07-01 2014-03-31 МЕДАРЕКС, Эл.Эл.Си. Человеческие моноклональные антитела против лиганда-1 запрограммированной гибели клеток (pd-l1) и их применения
WO2007071388A1 (en) 2005-12-21 2007-06-28 Sentoclone Ab Improved method for expansion of tumour-reactive t-lymphocytes for immunotherapy of patients with cancer
WO2007071390A1 (en) 2005-12-21 2007-06-28 Sentoclone Ab Method for treating malignant melanoma
WO2007071409A1 (en) 2005-12-21 2007-06-28 Sentoclone Ab Method for treating colon cancer
JP5205275B2 (ja) 2005-12-21 2013-06-05 セントクローネ インターナショナル エービー 散在性ガンの治療法
FR2911346B1 (fr) * 2007-01-12 2012-12-07 Ct Hospitalier Universitaire De Nantes Procede de culture in vitro de lymphocytes t,en particulier de lymphocytes t infiltrant les tumeurs dits til
US7951365B2 (en) 2007-06-27 2011-05-31 Deifiera Falun Ab Method for expansion of tumour-reactive T-lymphocytes for immunotherapy of patients with specific cancer types
EP2203746B1 (en) * 2007-09-24 2013-03-06 Technion Research & Development Foundation Ltd. T cell subpopulations capable of treating cancer
US20150320798A1 (en) 2012-11-27 2015-11-12 The Johns Hopkins University Use of Post-Transplant Cyclophosphamide Treated Allogeneic Marrow Infiltrating Lymphocytes to Augment Anti-Tumor Immunity
US8383099B2 (en) 2009-08-28 2013-02-26 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Adoptive cell therapy with young T cells
US8956860B2 (en) 2009-12-08 2015-02-17 Juan F. Vera Methods of cell culture for adoptive cell therapy
US20130115617A1 (en) 2009-12-08 2013-05-09 John R. Wilson Methods of cell culture for adoptive cell therapy
US8809050B2 (en) 2009-12-08 2014-08-19 Wilson Wolf Manufacturing Methods of cell culture for adoptive cell therapy
HRP20210642T1 (hr) 2010-11-12 2021-05-28 Nektar Therapeutics Konjugati il-2 ostatka i polimera
WO2012129201A1 (en) 2011-03-22 2012-09-27 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Methods of growing tumor infiltrating lymphocytes in gas-permeable containers
JP2014514927A (ja) 2011-04-13 2014-06-26 イミュニカム・エイビイ 抗原特異的ｔ細胞の増殖のための方法
ES2598055T3 (es) * 2011-10-21 2017-01-25 Cell Medica Limited Dispositivo para la expansión aséptica de células
GB201121308D0 (en) * 2011-12-12 2012-01-25 Cell Medica Ltd Process
CN102816734A (zh) 2012-05-09 2012-12-12 阮润生 一种肿瘤抗原特异性t细胞的获取方法
AU2013262485B2 (en) 2012-05-18 2017-12-14 Wilson Wolf Manufacturing, LLC Improved methods of cell culture for adoptive cell therapy
IL288241B2 (en) 2012-06-11 2023-10-01 Wilson Wolf Mfg Corporation Improved cell culture methods for stress cell therapy
EP2925329B1 (en) 2012-11-27 2021-01-06 Borrello, Ivan Marques Use of post-transplant cyclophosphamide treated allogeneic marrow infiltrating lymphocytes to augment anti-tumor immunity
AU2013379772B2 (en) 2013-03-01 2018-09-20 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Methods of producing enriched populations of tumor-reactive T cells from tumor
WO2014133568A1 (en) 2013-03-01 2014-09-04 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Methods of producing enriched populations of tumor reactive t cells from peripheral blood
JP6560667B2 (ja) 2013-06-24 2019-08-14 ウィルソン ウォルフ マニュファクチャリング コーポレイションＷｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ 気体透過性細胞培養作業のための閉鎖系装置および方法
EP3022294B1 (en) * 2013-07-15 2019-11-20 The U.S.A. as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Methods of preparing anti-human papillomavirus antigen t cells
US10233425B2 (en) 2013-09-16 2019-03-19 The Trustees Of The University Of Pennsylvania CD137 enrichment for efficient tumor infiltrating lymphocyte selection
KR20230085225A (ko) 2014-03-20 2023-06-13 에이치 리 모피트 캔서 센터 앤드 리서어치 인스티튜트 아이엔씨 입양 세포 요법을 위한 종양-침윤 림프구
WO2015157636A1 (en) 2014-04-10 2015-10-15 H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute, Inc. Enhanced expansion of tumor-infiltrating lymphocytes for adoptive cell therapy
ES2995052T3 (en) 2014-04-23 2025-02-05 Juno Therapeutics Inc Methods for isolating, culturing, and genetically engineering immune cell populations for adoptive therapy
EP3838288A1 (en) 2014-06-11 2021-06-23 polybiocept GmbH Expansion of lymphocytes with a cytokine composition for active cellular immunotherapy
WO2015188839A2 (en) 2014-06-13 2015-12-17 Immudex Aps General detection and isolation of specific cells by binding of labeled molecules
WO2016037054A1 (en) 2014-09-04 2016-03-10 The Johns Hopkins University Activation of marrow infiltrating lymphocytes in hypoxic alternating with normoxic conditions
JP6686008B2 (ja) * 2014-10-02 2020-04-22 アメリカ合衆国 がん特異的突然変異に対し抗原特異性を有するｔ細胞受容体を単離する方法
EP3034092A1 (en) 2014-12-17 2016-06-22 Université de Lausanne Adoptive immunotherapy for treating cancer
AU2016258845B2 (en) 2015-05-01 2022-03-10 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Methods of isolating T cells and T cell receptors having antigenic specificity for a cancer-specific mutation from peripheral blood
FR3038324B1 (fr) 2015-06-30 2020-10-30 Lab Francais Du Fractionnement Procede de cryoconservation de cellules a visee therapeutique
FR3040396A1 (fr) 2015-06-30 2017-03-03 Chu Nantes Procede de cryoconservation de lymphocytes infiltrant la tumeur
WO2017048614A1 (en) 2015-09-15 2017-03-23 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Methods of isolating tumor-reactive t cell receptors from tumor or peripheral blood
IL258844B2 (en) 2015-10-22 2024-03-01 Juno Therapeutics Gmbh Methods for culturing cells and kits and apparatus for same
US20190062706A1 (en) 2015-10-28 2019-02-28 Life Technologies As Selective expansion of different subpopulations of t cells by the alteration of cell surfacing signals and signal ratio
EP3487990A4 (en) 2016-06-28 2020-07-29 Geneius Biotechnology, Inc. T-LYMPHOCYTE COMPOSITIONS FOR IMMUNOTHERAPY
CN106244538A (zh) 2016-08-04 2016-12-21 英普乐孚生物技术(上海)有限公司 一种恶性腹水来源的til细胞的分离培养方法
LT3512547T (lt) 2016-09-14 2021-01-11 Abbvie Biotherapeutics Inc. Antikūnai prieš pd-1
SMT202400133T1 (it) 2016-10-26 2024-05-14 Iovance Biotherapeutics Inc Restimolazione di linfociti infiltranti il tumore crioconservati
TWI788307B (zh) 2016-10-31 2023-01-01 美商艾歐凡斯生物治療公司 用於擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞之工程化人造抗原呈現細胞
MA46916A (fr) 2016-11-17 2019-09-25 Iovance Biotherapeutics Inc Resttumorinfiltrierende lymphozyten und verfahren zur herstellung und verwendung davon
US20200095547A1 (en) 2016-12-02 2020-03-26 Darya ALIZADEH Methods for manufacturing t cells expressing of chimeric antigen receptors and other receptors
CN106591232A (zh) 2017-01-04 2017-04-26 安徽安龙基因医学检验所有限公司 一种高效的pd‑1‑cd8+t细胞的培养方法
ES3055314T3 (en) 2017-01-06 2026-02-11 Iovance Biotherapeutics Inc Expansion of tumor infiltrating lymphocytes with potassium channel agonists and therapeutic uses thereof
JP7780248B2 (ja) 2017-01-06 2025-12-04 アイオバンス バイオセラピューティクス，インコーポレイテッド 腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ｔｎｆｒｓｆ）アゴニストによる腫瘍浸潤リンパ球（ｔｉｌ）の拡大培養及びｔｉｌとｔｎｆｒｓｆアゴニストとの治療的併用
JP7359751B2 (ja) 2017-03-14 2023-10-11 ジュノー セラピューティクス インコーポレイテッド 極低温保管のための方法
US11254913B1 (en) 2017-03-29 2022-02-22 Iovance Biotherapeutics, Inc. Processes for production of tumor infiltrating lymphocytes and uses of same in immunotherapy
JOP20190224A1 (ar) 2017-03-29 2019-09-26 Iovance Biotherapeutics Inc عمليات من أجل إنتاج الخلايا اللمفاوية المرتشحة للأورام واستخداماتها في العلاج المناعي
JP7349365B2 (ja) 2017-05-10 2023-09-22 アイオバンス バイオセラピューティクス，インコーポレイテッド 液性腫瘍からの腫瘍浸潤リンパ球の拡大培養及びその治療的使用
AR112072A1 (es) 2017-06-05 2019-09-18 Iovance Biotherapeutics Inc Métodos de uso de linfocitos infiltrantes de tumor en melanoma doble refractario
CN107384867B (zh) 2017-08-04 2020-09-11 北京世纪劲得生物技术有限公司 一种肿瘤组织til细胞制备方法及专用培养基
US11713446B2 (en) 2018-01-08 2023-08-01 Iovance Biotherapeutics, Inc. Processes for generating TIL products enriched for tumor antigen-specific T-cells
JP2023524639A (ja) 2020-04-22 2023-06-13 アイオバンス バイオセラピューティクス，インコーポレイテッド 患者特異的免疫療法用細胞の製造調整システム及び調整方法

Also Published As

Publication number Publication date
US20220000924A1 (en) 2022-01-06
MX2019011768A (es) 2019-12-09
US11083752B2 (en) 2021-08-10
US20210128624A1 (en) 2021-05-06
US11241456B2 (en) 2022-02-08
US20200289569A1 (en) 2020-09-17
JP7169291B2 (ja) 2022-11-10
US20210128620A1 (en) 2021-05-06
US20200281978A1 (en) 2020-09-10
KR20240114787A (ko) 2024-07-24
US11168304B2 (en) 2021-11-09
CR20190487A (es) 2020-03-17
US20250082683A1 (en) 2025-03-13
NZ796142A (en) 2026-01-30
LT3730608T (lt) 2024-12-27
US11007225B1 (en) 2021-05-18
US11998568B2 (en) 2024-06-04
JP2020515257A (ja) 2020-05-28
JP2021519582A (ja) 2021-08-12
US10933094B2 (en) 2021-03-02
HRP20241688T1 (hr) 2025-02-14
US11007226B2 (en) 2021-05-18
PE20191841A1 (es) 2019-12-31
US20190000883A1 (en) 2019-01-03
US10653723B1 (en) 2020-05-19
US20200306307A1 (en) 2020-10-01
US12121541B2 (en) 2024-10-22
US20250121009A1 (en) 2025-04-17
IL305198A (en) 2023-10-01
US10946045B2 (en) 2021-03-16
US20210106625A1 (en) 2021-04-15
SG11201908994RA (en) 2019-10-30
DK3730608T3 (da) 2024-12-16
US20210128623A1 (en) 2021-05-06
US10130659B2 (en) 2018-11-20
CL2020002737A1 (es) 2021-03-05
PL3601533T3 (pl) 2021-08-16
US20210361713A1 (en) 2021-11-25
US20220008469A1 (en) 2022-01-13
US20190083538A1 (en) 2019-03-21
JP2023012510A (ja) 2023-01-25
US20190070222A1 (en) 2019-03-07
US12194061B2 (en) 2025-01-14
US20210214685A1 (en) 2021-07-15
LT3722415T (lt) 2025-01-10
US10953047B2 (en) 2021-03-23
HUE070176T2 (hu) 2025-05-28
JP7817138B2 (ja) 2026-02-18
MD3730608T2 (ro) 2025-03-31
US10894063B2 (en) 2021-01-19
US20220387497A1 (en) 2022-12-08
RS66452B1 (sr) 2025-02-28
US20230012086A1 (en) 2023-01-12
PT3601533T (pt) 2021-05-24
US10953046B2 (en) 2021-03-23
US10905718B2 (en) 2021-02-02
SMT202500040T1 (it) 2025-03-12
TWI799402B (zh) 2023-04-21
US20200276242A1 (en) 2020-09-03
US11541077B2 (en) 2023-01-03
ES3009885T3 (en) 2025-03-31
MX2024002827A (es) 2024-03-19
CL2019002769A1 (es) 2020-05-08
US10646517B2 (en) 2020-05-12
FI3722415T3 (fi) 2025-01-10
EP3910055A1 (en) 2021-11-17
US11040070B2 (en) 2021-06-22
US11202803B1 (en) 2021-12-21
FI3730608T3 (fi) 2024-12-30
JP7522037B2 (ja) 2024-07-24
US10695372B2 (en) 2020-06-30
US10925900B2 (en) 2021-02-23
MA68856B1 (fr) 2025-01-31
US12558375B2 (en) 2026-02-24
EP3766964A1 (en) 2021-01-20
PL3730608T3 (pl) 2025-03-31
LT3601533T (lt) 2021-06-10
AU2018243355B2 (en) 2024-10-24
US20180207201A1 (en) 2018-07-26
US20200155601A1 (en) 2020-05-21
CA3057975A1 (en) 2018-10-04
ECSP19077884A (es) 2020-01-31
PT3722415T (pt) 2025-01-08
US20190358260A1 (en) 2019-11-28
EP3722415B1 (en) 2024-11-06
ES2874335T3 (es) 2021-11-04
SI3601533T1 (sl) 2021-09-30
US10537595B2 (en) 2020-01-21
SI3730608T1 (sl) 2025-03-31
SI3722415T1 (sl) 2025-03-31
US11337998B2 (en) 2022-05-24
EP4279574A2 (en) 2023-11-22
JP2023011778A (ja) 2023-01-24
CY1124136T1 (el) 2022-05-27
JP7814287B2 (ja) 2026-02-16
BR112019020326A2 (pt) 2020-04-28
US10166257B2 (en) 2019-01-01
US10420799B2 (en) 2019-09-24
US20180325954A1 (en) 2018-11-15
MD3601533T2 (ro) 2021-07-31
US10363273B2 (en) 2019-07-30
US11052115B2 (en) 2021-07-06
US20220378838A1 (en) 2022-12-01
US20210128622A1 (en) 2021-05-06
US20210207092A1 (en) 2021-07-08
US11344579B2 (en) 2022-05-31
MD3722415T2 (ro) 2025-05-31
US11202804B2 (en) 2021-12-21
US20200246384A1 (en) 2020-08-06
US11304979B2 (en) 2022-04-19
US12226434B2 (en) 2025-02-18
US20180280436A1 (en) 2018-10-04
US20220000923A1 (en) 2022-01-06
HRP20250068T1 (hr) 2025-03-14
US20220387495A1 (en) 2022-12-08
US11517592B1 (en) 2022-12-06
US20220387499A1 (en) 2022-12-08
US20180282694A1 (en) 2018-10-04
US20210100842A1 (en) 2021-04-08
US20190358261A1 (en) 2019-11-28
US20220395533A1 (en) 2022-12-15
US20190000882A1 (en) 2019-01-03
PT3730608T (pt) 2025-01-07
JP7772680B2 (ja) 2025-11-18
JP2025023951A (ja) 2025-02-19
TN2019000273A1 (en) 2021-01-07
US20210361712A1 (en) 2021-11-25
EP3730608A1 (en) 2020-10-28
CN110785486A (zh) 2020-02-11
EP4279574A3 (en) 2024-04-10
WO2018182817A1 (en) 2018-10-04
HRP20210677T1 (hr) 2021-06-25
RS66400B1 (sr) 2025-02-28
US20230045899A1 (en) 2023-02-16
JOP20190224A1 (ar) 2019-09-26
DK3601533T3 (da) 2021-05-03
EP3601533A1 (en) 2020-02-05
US20210100843A1 (en) 2021-04-08
US20230015649A1 (en) 2023-01-19
DK3722415T3 (da) 2025-01-13
IL269543A (en) 2019-11-28
US20220000925A1 (en) 2022-01-06
US20210128625A1 (en) 2021-05-06
HUE070256T2 (hu) 2025-05-28
US20210137984A1 (en) 2021-05-13
MA68598B1 (fr) 2025-01-31
EP3722415A1 (en) 2020-10-14
US10463697B2 (en) 2019-11-05
NZ758201A (en) 2024-01-26
US20220387496A1 (en) 2022-12-08
US20220387498A1 (en) 2022-12-08
KR20190142342A (ko) 2019-12-26
US20200306306A1 (en) 2020-10-01
TW201839129A (zh) 2018-11-01
AU2025200434A1 (en) 2025-02-20
US10639330B2 (en) 2020-05-05
SMT202100298T1 (it) 2021-07-12
US11052116B2 (en) 2021-07-06
US20210207091A1 (en) 2021-07-08
US11013770B1 (en) 2021-05-25
PH12019502247A1 (en) 2020-06-29
US20210079348A1 (en) 2021-03-18
US20210128621A1 (en) 2021-05-06
US20210353677A1 (en) 2021-11-18
US20210379111A1 (en) 2021-12-09
ES3008832T3 (en) 2025-03-25
HUE054829T2 (hu) 2021-10-28
US20190083536A1 (en) 2019-03-21
US20200276241A1 (en) 2020-09-03
US11273180B2 (en) 2022-03-15
US10272113B2 (en) 2019-04-30
US20220387494A1 (en) 2022-12-08
SMT202500027T1 (it) 2025-03-12
US20220362301A1 (en) 2022-11-17
JP2023012511A (ja) 2023-01-25
US20230133298A1 (en) 2023-05-04
KR102686794B1 (ko) 2024-07-24
US12485145B2 (en) 2025-12-02
US11291687B2 (en) 2022-04-05
US11273181B2 (en) 2022-03-15
PL3722415T3 (pl) 2025-03-31
US11168303B2 (en) 2021-11-09
US10918666B2 (en) 2021-02-16
US20250121008A1 (en) 2025-04-17
EP3601533B1 (en) 2021-02-24
AU2018243355A1 (en) 2019-10-31
US10946044B2 (en) 2021-03-16
US20190083539A1 (en) 2019-03-21
US10398734B2 (en) 2019-09-03
US20190358259A1 (en) 2019-11-28
US11529372B1 (en) 2022-12-20
EP3730608B1 (en) 2024-10-23
CO2019011995A2 (es) 2020-02-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7772680B2 (ja) 腫瘍浸潤リンパ球の製造方法及び免疫療法におけるその使用方法
RS65674B1 (sr) Postupci proizvodnje tumor-infiltrirajućih limfocita i upotrebe istih u imunoterapiji