ES3009885T3 - Processes for production of tumor infiltrating lymphocytes and uses of same in immunotherapy - Google Patents

Processes for production of tumor infiltrating lymphocytes and uses of same in immunotherapy Download PDF

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Seth Wardell
James Bender
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Iovance Biotherapeutics Inc
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Abstract

La presente invención proporciona métodos mejorados y/o abreviados para expandir TIL y producir poblaciones terapéuticas de TIL, incluyendo nuevos métodos para expandir poblaciones de TIL en un sistema cerrado que conducen a una mayor eficacia, un fenotipo mejorado y una mayor salud metabólica de los TIL en un período de tiempo más corto, a la vez que permiten reducir la contaminación microbiana y los costos. Dichos TIL se utilizan en regímenes de tratamiento terapéutico. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Procedimientos para la preparación de linfocitos infiltrantes de tumor y usos de los mismos en inmunoterapia
Listado de secuencias
La presente solicitud contiene un listado de secuencias que se ha enviado electrónicamente en formato ASCII. Dicha copia ASCII, creada el 4 de enero de 2018, se denomina 116983-5017_ST25.txt y tiene un tamaño de 14 kilobytes.
Antecedentes de la invención
El tratamiento de cánceres voluminosos y refractarios usando la transferencia adoptiva de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) representa una estrategia terapéutica poderosa para pacientes con mal pronóstico. Gattinoni, et al., Nat. Rev. Immunol. 2006, 6, 383-393. Se requiere una gran cantidad de TIL para una inmunoterapia exitosa, y se necesita un procedimiento robusto y confiable para su comercialización. Esto ha sido un desafío a lograr debido a problemas técnicos, logísticos y regulatorios con la expansión celular. La expansión de TIL basada en IL-2 seguida de un "procedimiento de expansión rápida" (REP) se ha convertido en un procedimiento preferido para la expansión de TIL debido a su velocidad y eficiencia. Dudley, et al., Science 2002, 298, 850 54; Dudley, et al., J. Clin. Oncol. 2005, 23, 2346-57; Dudley, et al., J. Clin. Oncol. 2008, 26, 5233-39; Riddell, et al., Science 1992, 257, 238-41; Dudley, et al., J. Immunother. 2003, 26, 332-42. El REP puede resultar en una expansión de 1000 veces de TIL durante un período de 14 días, aunque requiere un gran exceso (por ejemplo, 200 veces) de células mononucleares de sangre periférica alogénicas irradiadas (PBMC, también conocidas como células mononucleares (MNC)), a menudo de múltiples donantes, como células alimentadoras, así como anticuerpos anti-CD3 (OKT3) y altas dosis de IL-2. Dudley, et al., J. Immunother. 2003, 26, 332-42. Los TIL que se han sometido a un procedimiento REP han producido una terapia celular adoptiva exitosa después de la inmunosupresión del huésped en pacientes con melanoma. Los parámetros de aceptación de la infusión actuales se basan en lecturas de la composición de TIL (por ejemplo, positividad para CD28, CD8 o CD4) y en la expansión múltiple y viabilidad del producto REP. La publicación de patente estadounidense No.
2012/244 133 describe un procedimiento de expansión de TIL que incluye una etapa procedimental de expansión rápida de aproximadamente 14 días y una duración total desde la obtención de una muestra de tumor hasta la población de TIL expandida de entre 28 y 42 días. El documento WO2016/053338 describe un procedimiento de entre 2 y 3 semanas y una segunda expansión de aproximadamente dos semanas.
Los procedimientos actuales de fabricación de TIL están limitados por la duración, el coste, las preocupaciones de esterilidad y otros factores descritos en el presente documento, de modo que el potencial para comercializar dichos procedimientos está severamente limitado y, por estas y otras razones, en la actualidad no se dispone de ningún procedimiento comercial. Existe una necesidad urgente de proporcionar procedimientos de fabricación y terapias de TIL basados en dichos procedimientos que sean apropiados para la fabricación a escala comercial y la aprobación regulatoria para su uso en pacientes humanos en múltiples centros clínicos.
Breve resumen de la invención
La presente invención proporciona procedimientos mejorados y/o abreviados para expandir TIL y producir poblaciones terapéuticas de TIL.
En un primer aspecto de la presente invención, se proporciona un procedimiento para expandir linfocitos infiltrantes de tumores (TILS) en una población terapéutica de TIL que comprende:
(a) añadir fragmentos tumorales procesados que comprenden una primera población de TIL de un tumor resecado de un sujeto en un sistema cerrado;
(b) realizar una primera expansión cultivando la primera población de TIL en un medio de cultivo celular que comprende IL-2 para producir una segunda población de TIL, en donde la primera expansión se realiza en un recipiente cerrado que proporciona una primera área superficial permeable a los gases, en donde la primera expansión se realiza durante 3-11 días para obtener la segunda población de TIL, en donde la segunda población de TIL es al menos 50 veces mayor en número que la primera población de TIL, y en donde la transición del paso (a) al paso (b) ocurre sin abrir el sistema;
(c) realizar una segunda expansión suplementando el medio de cultivo celular de la segunda población de TIL con IL-2, OKT-3 y células presentadoras de antígeno (APC) adicionales, para producir una tercera población de TIL, en donde la segunda expansión se realiza durante 7-11 días para obtener la tercera población de TIL, en donde la tercera población de TIL es una población terapéutica de TIL, en donde la segunda expansión se realiza en un recipiente cerrado que proporciona una segunda área superficial permeable a los gases, y en donde la transición del paso (b) al paso (c) se produce sin abrir el sistema;
(d) recolectar la tercera población de TIL obtenida del paso (c), en donde la transición del paso (c) al paso (d) se produce sin abrir el sistema;
(e) transferir la tercera población de TIL recolectada del paso (d) a una bolsa de infusión, en donde la transferencia del paso (d) al (e) se produce sin abrir el sistema; y
(f) criopreservar la bolsa de infusión que comprende la población de TIL recolectada en el paso (e) utilizando un proceso de criopreservación, en donde la población terapéutica de TIL recolectada en el paso (d) comprende suficientes TIL para una dosificación terapéuticamente efectiva de los TIL, en donde el procedimiento comprende analizar la viabilidad de los TIL y en donde la viabilidad de la población terapéutica de TIL una vez descongelada es mayor o igual al 70%.
En algunas realizaciones, el procedimiento comprende además analizar la viabilidad de los TIL criopreservados descongelados.
En algunas realizaciones, no se realiza ninguna selección de la primera población de TIL, la segunda población de TIL, la tercera población de TIL, la población de TIL recolectada y/o la población de TIL terapéutica durante ninguno de los pasos (a) a (f).
En algunas realizaciones, las APC son células mononucleares de sangre periférica (PBMC).
En algunas realizaciones, las PBMC se complementan en una relación de 1:25 TIL:PBMC.
En algunas realizaciones, los pasos (a) hasta (e) se realizan en un período de 15 días a 22 días.
En algunas realizaciones, los pasos (a) a (e) se realizan en un período de 22 días.
En algunas realizaciones, el cáncer se selecciona del grupo que consiste en melanoma, cáncer de ovario, cáncer de cuello uterino, cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), cáncer de pulmón, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer causado por el virus del papiloma humano, cáncer de cabeza y cuello (incluido el carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (HNSCC)), cáncer renal y carcinoma de células renales. En algunas realizaciones, el cáncer se selecciona del grupo que consiste en melanoma, HNSCC, cáncer de cuello uterino y NSCLC.
En algunas realizaciones, el cáncer es melanoma.
En algunas realizaciones, el cáncer es HNSCC.
En algunas realizaciones, el cáncer es cáncer cervical.
En algunas realizaciones, el cáncer es NSCLC.
En algunas realizaciones, antes del paso (a), el procedimiento comprende obtener la primera población de TIL de un tumor resecado de un sujeto mediante el procesamiento de una muestra de tumor obtenida del sujeto en múltiples fragmentos de tumor.
En algunas realizaciones, el riesgo de contaminación microbiana se reduce en comparación con un sistema abierto.
En algunas realizaciones, la tercera población de TIL es una población terapéutica de TIL que comprende una subpoblación aumentada de células T efectoras y/o células T de memoria central en relación con la segunda población de TIL, en donde las células T efectoras y/o las células T de memoria central obtenidas en la población terapéutica de TIL exhiben una o más características seleccionadas del grupo que consiste en expresar CD27+, expresar CD28+, telómeros más largos, expresión aumentada de CD57 y expresión disminuida de CD56 en relación con las células T efectoras y/o las células T de memoria central obtenidas de la segunda población de células.
En algunas realizaciones, la viabilidad de la población terapéutica de TIL una vez descongelados es mayor del 70 %.
En algunas realizaciones, la viabilidad de la población terapéutica de TIL una vez descongelados es mayor del 86 %.
Otro asunto objeto
También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, un procedimiento para expandir linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) en una población terapéutica de TIL que comprende:
(a) obtener una primera población de TIL de un tumor extirpado de un paciente convirtiendo una muestra de tumor obtenida del paciente en múltiples fragmentos de tumor;
(b) agregar los fragmentos de tumor a un sistema cerrado;
(c) realizar una primera expansión cultivando la primera población de TIL en un medio de cultivo celular que comprende IL-2 para producir una segunda población de TIL, en donde la primera expansión se realiza en un recipiente cerrado lo cual proporciona una primera área de superficie permeable a los gases, donde la primera expansión se realiza durante aproximadamente 3-14 días para obtener la segunda población de TIL, donde la segunda población de TIL es al menos 50 veces mayor en número que la primera población de TIL, y donde la transición desde la etapa (b) a la etapa (c) ocurre sin abrir el sistema;
(d) realizar una segunda expansión suplementando el medio de cultivo celular de la segunda población de TIL con IL-2, OKT-3 y células presentadoras de antígeno (APC) adicionales, para producir una tercera población de TIL, en la que la segunda expansión es realizada durante aproximadamente 7-14 días para obtener la tercera población de TIL, en la que la tercera población de TIL es una población terapéutica de TIL, en la que la segunda expansión se realiza en un recipiente cerrado, lo que proporciona una segunda área superficie permeable a los gases, y en la que la la transición de la etapa (c) a la etapa (d) se produce sin abrir el sistema;
(e) recolectar la población terapéutica de TIL obtenida de la etapa (d), en donde la transición de la etapa (d) a la etapa (e) ocurre sin abrir el sistema; y
(f) transferir la población de TIL recolectada de la etapa (e) a una bolsa de infusión, en donde la transferencia de la etapa (e) a la (f) ocurre sin abrir el sistema.
El procedimiento puede comprender además la etapa de crioconservar la bolsa de infusión que comprende la población de TIL recolectada en la etapa (f) usando un procedimiento de crioconservación.
El procedimiento de crioconservación se puede realizar usando una relación 1:1 de población de TIL recolectada con respecto a los medios de crioconservación.
Las células presentadoras de antígenos pueden ser células mononucleares de sangre periférica (PBMC). Las PBMC pueden irradiarse y ser alogénicas. Las PBMC se pueden agregar al cultivo celular en cualquiera de los días 9 a 14 en la etapa (d). Las células presentadoras de antígenos pueden ser células presentadoras de antígenos artificiales.
La recolección en la etapa (e) se puede realizar usando un sistema de tratamiento celular basado en membranas.
La recolección en la etapa (e) se puede realizar usando un sistema de tratamiento de células LOVO.
Los múltiples fragmentos pueden comprender de aproximadamente 4 a aproximadamente 50 fragmentos, en los que cada fragmento tiene un volumen de aproximadamente 27 mm3.
Los múltiples fragmentos pueden comprender de aproximadamente 30 a aproximadamente 60 fragmentos con un volumen total de aproximadamente 1300 mm3 a aproximadamente 1500 mm3.
Los múltiples fragmentos pueden comprender aproximadamente 50 fragmentos con un volumen total de aproximadamente 1350 mm3.
Los múltiples fragmentos pueden comprender aproximadamente 50 fragmentos con una masa total de aproximadamente 1 gramo a aproximadamente 1.5 gramos.
El medio de cultivo celular se puede proporcionar en un recipiente seleccionado del grupo que consiste en un recipiente G y una bolsa de células Xuri.
El medio de cultivo celular en la etapa (d) puede comprender además IL-15 y/o IL-21.
La concentración de IL-2 puede ser de aproximadamente 10,000 UI/ml a aproximadamente 5,000 UI/ml. La concentración de IL-15 puede ser de aproximadamente 500 UI/ml a aproximadamente 100 UI/ml.
La concentración de IL-21 puede ser de aproximadamente 20 UI/ml a aproximadamente 0.5 UI/ml.
La bolsa de infusión de la etapa (f) puede ser una bolsa de infusión que contenga HypoThermosol.
Los medios de crioconservación pueden comprender dimetilsulfóxido (DMSO). Los medios de crioconservación pueden comprender del 7% al 10% de dimetilsulfóxido (DMSO).
El primer período en la etapa (c) y el segundo período en la etapa (e) pueden realizarse cada uno individualmente dentro de un período de 10 días, 11 días o 12 días.
El primer período en la etapa (c) y el segundo período en la etapa (e) pueden realizarse cada uno individualmente dentro de un período de 11 días.
Las etapas (a) a (f) se pueden realizar dentro de un período de aproximadamente 10 días a aproximadamente 22 días.
Las etapas (a) a (f) se pueden realizar dentro de un período de aproximadamente 20 días a aproximadamente 22 días.
Las etapas (a) a (f) pueden realizarse dentro de un período de aproximadamente 15 días a aproximadamente 20 días.
Las etapas (a) a (f) pueden realizarse dentro de un período de aproximadamente 10 días a aproximadamente 20 días.
Las etapas (a) a (f) pueden realizarse dentro de un período de aproximadamente 10 días a aproximadamente 15 días.
Las etapas (a) a (f) pueden realizarse en 22 días o menos.
Las etapas (a) a (f) pueden realizarse en 20 días o menos.
Las etapas (a) a (f) pueden realizarse en 15 días o menos.
Las etapas (a) a (f) pueden realizarse en 10 días o menos.
Las etapas (a) a (f) y la crioconservación pueden realizarse en 22 días o menos.
La población terapéutica de TIL recolectada en la etapa (e) puede comprender suficientes TIL para una dosificación terapéuticamente eficaz de los TIL.
El número de TIL suficientes para una dosis terapéuticamente eficaz puede ser de aproximadamente 2.3x1010 a aproximadamente 13.7x1010.
Las etapas (b) a (e) se pueden realizar en un solo recipiente, en donde realizar las etapas (b) a (e) en un solo recipiente puede dar como resultado un aumento en el rendimiento de TIL por tumor extirpado en comparación con la realización de las etapas (b) a (e) en más de un recipiente.
Las células presentadoras de antígeno se pueden agregar a los TIL durante el segundo período en la etapa (d) sin abrir el sistema.
La tercera población de TIL en la etapa (d) puede proporcionar una mayor eficacia, una mayor producción de interferón-gamma, una mayor policlonalidad, un promedio incrementado de IP-10 y/o un promedio incrementado de MCP-1 cuando se administra a un sujeto.
La tercera población de TIL en la etapa (d) puede proporcionar al menos una producción de interferón gamma cinco veces o más cuando se administra a un sujeto.
La tercera población de TIL en la etapa (d) puede ser una población terapéutica de TIL que comprende una subpoblación aumentada de células T efectoras y/o células T de memoria central en relación con la segunda población de TIL, en la que las células T efectoras y/o las células T de memoria central en la población terapéutica de TIL pueden exhibir una o más características seleccionadas del grupo que consiste en la expresión de CD27+, la expresión de CD28+, telómeros más largos, expresión aumentada de CD57 y expresión disminuida de CD56 en relación con las células T efectoras y/o células T de memoria obtenidas de la segunda población de células.
Las células T efectoras y/o las células T de memoria central obtenidas de la tercera población de TIL pueden exhibir una expresión de CD57 aumentada y una expresión de CD56 disminuida en relación con las células T efectoras y/o las células T de memoria central obtenidas de la segunda población de células.
El riesgo de contaminación microbiana se puede reducir en comparación con un sistema abierto.
Los TIL de la etapa (g) se pueden infundir en un paciente.
Los múltiples fragmentos pueden comprender aproximadamente 4 fragmentos.
También se divulga, aunque no se reivindica, un procedimiento para tratar a un sujeto con cáncer; el procedimiento comprende la administración de linfocitos infiltrantes de tumores expandidos (TIL) que comprende:
(a) obtener una primera población de TIL de un tumor extirpado de un sujeto convirtiendo una muestra de tumor obtenida del paciente en múltiples fragmentos de tumor;
(b) agregar los fragmentos de tumor a un sistema cerrado;
(c) realizar una primera expansión cultivando la primera población de TIL en un medio de cultivo celular que comprende IL-2 para producir una segunda población de TIL, en donde la primera expansión se realiza en un recipiente cerrado, lo que proporciona una primera área de superficie permeable a los gases, donde la primera expansión se realiza durante aproximadamente 3-14 días para obtener la segunda población de TIL, donde la segunda población de TIL es al menos 50 veces mayor en número que la primera población de TIL, y donde la transición desde la etapa (b) a la etapa (c) ocurre sin abrir el sistema;
(d) realizar una segunda expansión suplementando el medio de cultivo celular de la segunda población de TIL con IL-2, OKT-3 y células presentadoras de antígeno (APC) adicionales, para producir una tercera población de TIL, en la que la segunda expansión es realizada durante aproximadamente 7-14 días para obtener la tercera población de TIL, en la que la tercera población de TIL es una población terapéutica de TIL, en la que la segunda expansión se realiza en un recipiente cerrado, lo que proporciona una segunda área de superficie permeable a los gases, y en la que la la transición de la etapa (c) a la etapa (d) ocurre sin abrir el sistema;
(e) recolectar la población terapéutica de TIL obtenida de la etapa (d), en donde la transición de la etapa (d) a la etapa (e) ocurre sin abrir el sistema; y
(f) transferir la población de TIL recolectada de la etapa (e) a una bolsa de infusión, en donde la transferencia de la etapa (e) al (f) ocurre sin abrir el sistema;
(g) opcionalmente crioconservar la bolsa de infusión que comprende la población de TIL recolectada de la etapa (f) usando un procedimiento de crioconservación; y
(h) administrar una dosis terapéuticamente eficaz de la tercera población de TIL de la bolsa de infusión en la etapa (g) al paciente.
La población terapéutica de TIL recolectada en la etapa (e) puede comprender suficientes TIL para administrar una dosis terapéuticamente eficaz de los TIL en la etapa (h).
El número de TIL suficientes para administrar una dosis terapéuticamente eficaz en la etapa (h) puede ser de aproximadamente 2.3x1010 a aproximadamente 13.7x1010.
Las células presentadoras de antígeno (APC) pueden ser PBMC.
Las PBMC se pueden agregar al cultivo celular en cualquiera de los días 9 a 14 en la etapa (d).
Antes de administrar una dosis terapéuticamente eficaz de células TIL en la etapa (h), se puede haber administrado al paciente un régimen de agotamiento de linfocitos (linfodepleción) no mieloablativo.
El régimen de linfodepleción no mieloablativa puede comprender las etapas de administración de ciclofosfamida a una dosis de 60 mg/m2/día durante dos días seguido de la administración de fludarabina a una dosis de 25 mg/m2/día durante cinco días.
El procedimiento puede comprender además la etapa de tratar al paciente con un régimen de IL-2 de dosis alta comenzando el día después de la administración de las células TIL al paciente en la etapa (h).
El régimen de IL-2 de dosis alta puede comprender 600,000 o 720,000 UI/kg administrados como infusión intravenosa en bolo de 15 minutos cada ocho horas hasta la tolerancia.
La tercera población de TIL en la etapa (d) puede ser una población terapéutica de TIL que comprende una subpoblación aumentada de células T efectoras y/o células T de memoria central en relación con la segunda población de TIL, en la que las células T efectoras y/o las células T de memoria central en la población terapéutica de TIL exhiben una o más características seleccionadas del grupo que consiste en la expresión de CD27+, la expresión de CD28+, telómeros más largos, expresión aumentada de CD57 y expresión disminuida de CD56 en relación con las células T efectoras y/o células T de memoria central obtenidas de la segunda población de células.
Las células T efectoras y/o las células T de memoria central en la población terapéutica de TIL pueden exhibir una expresión de CD57 aumentada y una expresión de CD56 disminuida en relación con las células T efectoras y/o las células T de memoria central obtenidas de la segunda población de células.
El cáncer puede seleccionarse del grupo que consiste en melanoma, cáncer de ovario, cáncer de cuello uterino, cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), cáncer de pulmón, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer causado por el virus del papiloma humano, cáncer de cabeza y cuello (incluido el carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (HNSCC)), cáncer de riñón y carcinoma de células renales.
El cáncer se puede seleccionar del grupo que consiste en melanoma, HNSCC, cánceres de cuello uterino y NSCLC.
El cáncer puede ser melanoma
El cáncer puede ser HNSCC.
El cáncer puede ser un cáncer de cuello uterino.
El cáncer puede ser NSCLC.
También se divulgan en el presente documento pero no se reivindican procedimientos para expandir linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) en una población terapéutica de TIL que comprende:
(a) agregar fragmentos de tumor tratados de un tumor extirpado de un paciente a un sistema cerrado para obtener una primera población de TIL;
(b) realizar una primera expansión cultivando la primera población de TIL en un medio de cultivo celular que comprende IL-2 para producir una segunda población de TIL, en donde la primera expansión se realiza en un recipiente cerrado, lo que proporciona una primera área de superficie permeable a los gases, donde la primera expansión se realiza durante aproximadamente 3-14 días para obtener la segunda población de TIL, donde la segunda población de TIL es al menos 50 veces mayor en número que la primera población de TIL, y donde la transición desde la etapa (a) a la etapa (b) ocurre sin abrir el sistema;
(c) realizar una segunda expansión suplementando el medio de cultivo celular de la segunda población de TIL con IL-2, OKT-3 y células presentadoras de antígeno (APC) adicionales, para producir una tercera población de TIL, en la que la segunda expansión es realizada durante aproximadamente 7-14 días para obtener la tercera población de TIL, en la que la tercera población de TIL es una población terapéutica de TIL, en la que la segunda expansión se realiza en un recipiente cerrado, lo que proporciona una segunda área superficial permeable a los gases, y en la que la la transición de la etapa (b) a la etapa (c) ocurre sin abrir el sistema;
(d) recolectar la población terapéutica de TIL obtenida de la etapa (c), en donde la transición de la etapa (c) a la etapa (d) ocurre sin abrir el sistema; y
(e) transferir la población de TIL recolectada de la etapa (d) a una bolsa de infusión, en donde la transferencia de la etapa (d) a (e) ocurre sin abrir el sistema.
La población terapéutica de TIL recolectada en la etapa (d) puede comprender suficientes TIL para una dosificación terapéuticamente eficaz de los TIL.
El número de TIL suficientes para una dosis terapéuticamente eficaz puede ser de aproximadamente 2.3x1010 a aproximadamente 13.7x1010.
El procedimiento puede comprender además la etapa de criopreservar la bolsa de infusión que comprende la población de TIL recolectada utilizando un proceso de criopreservación.
El procedimiento de crioconservación se puede realizar usando una relación 1: 1 de población de TIL recolectada con respecto al medio de crioconservación.
Las células presentadoras de antígeno pueden ser células mononucleares de sangre periférica (PBMC). Las PBMC pueden ser irradiadas y alogénicas.
Las PBMC se pueden añadir al cultivo celular en cualquiera de los días 9 a 14 en la etapa (c).
Las células presentadoras de antígenos pueden ser células presentadoras de antígenos artificiales.
La recolección en la etapa (d) se puede realizar usando un sistema de tratamiento de células LOVO.
Los múltiples fragmentos pueden comprender aproximadamente 4 a aproximadamente 50 fragmentos, en los que cada fragmento tiene un volumen de aproximadamente 27 mm3.
Los fragmentos múltiples pueden comprender aproximadamente 30 a aproximadamente 60 fragmentos con un volumen total de aproximadamente 1300 mm3 a aproximadamente 1500 mm3.
Los fragmentos múltiples pueden comprender aproximadamente 50 fragmentos con un volumen total de aproximadamente 1350 mm3.
Los fragmentos múltiples pueden comprender aproximadamente 50 fragmentos con una masa total de aproximadamente 1 gramo a aproximadamente 1.5 gramos.
Los múltiples fragmentos pueden comprender aproximadamente 4 fragmentos.
El segundo medio de cultivo celular se puede proporcionaren un recipiente seleccionado del grupo que consiste en un recipiente G y una bolsa de células Xuri.
La bolsa de infusión en la etapa (e) puede ser una bolsa de infusión que contiene HypoThermosol.
El primer período en la etapa (b) y el segundo período en la etapa (c) se pueden realizar cada uno individualmente dentro de un período de 10 días, 11 días, o 12 días.
El primer período en la etapa (b) y el segundo período en la etapa (c) se pueden realizar cada uno individualmente dentro de un período de 11 días.
Las etapas (a) a (e) se pueden realizar dentro de un período de aproximadamente 10 días a aproximadamente 22 días.
Las etapas (a) a (e) se pueden realizar dentro de un período de aproximadamente 10 días a aproximadamente 20 días.
En algunas formas de realización, las etapas (a) a (e) se realizan dentro de un período de aproximadamente 10 días a aproximadamente 15 días.
Las etapas (a) a (e) se pueden realizar en 22 días o menos.
Las etapas (a) a (e) y la crioconservación se pueden realizar en 22 días o menos.
Las etapas (b) a (e) se pueden realizar en un solo recipiente, en donde realizar las etapas (b) a (e) en un solo recipiente da como resultado un aumento en el rendimiento de TIL por tumor extirpado en comparación con realizar etapas (b) a (e) en más de un recipiente.
Las células presentadoras de antígeno se pueden agregar a los TIL durante el segundo período en la etapa (c) sin abrir el sistema.
La tercera población de TIL en la etapa (d) puede ser una población terapéutica de TIL que comprende una subpoblación aumentada de células T efectoras y/o células T de memoria central en relación con la segunda población de TIL, en la que las células T efectoras y/o las células T de memoria central obtenidas en la población terapéutica de TIL exhiben una o más características seleccionadas del grupo que consiste en expresar CD27+, expresar CD28+, telómeros más largos, una expresión de CD57 aumentada y una expresión de CD56 disminuida en relación con las células T efectoras y/o células T de memoria central obtenidas de la segunda población de células.
Las células T efectoras y/o las células T de memoria central obtenidas en la población terapéutica de TIL pueden exhibir una mayor expresión de CD57 y una menor expresión de CD56 en relación con las células T efectoras y/o las células T de memoria central obtenidas de la segunda población de células.
El riesgo de contaminación microbiana se puede reducir en comparación con un sistema abierto.
Los TIL de la etapa (e) se pueden infundir en un paciente.
El recipiente cerrado puede comprender un solo biorreactor.
El recipiente cerrado puede comprender un G-REX-10.
El recipiente cerrado puede comprender un G-REX -100.
En la etapa (d) las células presentadoras de antígeno (APC) se pueden agregar al cultivo celular de la segunda población de<T i l>en una relación APC: TII, de 25:1 a 100:1.
El cultivo celular puede tener una relación de 2.5x109 APC a 100x106 TIL.
En la etapa (c) las células presentadoras de antígeno (APC) se pueden agregar al cultivo celular de la segunda población de TlL en una relación APC:TII, de 25:1 a 100:1.
El cultivo celular puede tener una relación de 2.5x109 APC a 100x106 TIL.
También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, una población de TIL expandidos para su uso en el tratamiento de un sujeto con cáncer, en donde la población de TIL expandidos es una tercera población de TIL que se puede obtener mediante un procedimiento que comprende:
(a) obtener una primera población de TIL de un tumor extirpado de un sujeto convirtiendo una muestra de tumor obtenida del paciente en múltiples fragmentos de tumor;
(b) agregar los fragmentos de tumor a un sistema cerrado;
(c) realizar una primera expansión cultivando la primera población de TIL en un medio de cultivo celular que comprende IL-2 para producir una segunda población de TIL, en la que la primera expansión se realiza en un recipiente cerrado, lo que proporciona una primera área de superficie permeable a los gases, donde la primera expansión se realiza durante aproximadamente 3-14 días para obtener la segunda población de TIL, donde la segunda población de TIL es al menos 50 veces mayor en número que la primera población de TIL, y donde la transición desde la etapa (b) a la etapa (c) ocurre sin abrir el sistema;
(d) realizar una segunda expansión suplementando el medio de cultivo celular de la segunda población de TIL con IL-2, OKT-3 y células presentadoras de antígeno (APC) adicionales, para producir una tercera población de TIL, en la que la segunda expansión es realizada durante aproximadamente 7-14 días para obtener la tercera población de TIL, en la que la tercera población de TIL es una población terapéutica de TIL, en la que la segunda expansión se realiza en un recipiente cerrado, lo que proporciona una segunda área de superficie permeable a los gases, y en la que la la transición de la etapa (c) a la etapa (d) se produce sin abrir el sistema;
(e) recolectar la población terapéutica de TIL obtenida de la etapa (d), en donde la transición de la etapa (d) a la etapa (e) ocurre sin abrir el sistema; y
(f) transferir la población de TIL recolectada de la etapa (e) a una bolsa de infusión, en donde la transferencia de la etapa (e) a la (f) ocurre sin abrir el sistema; y
(g) opcionalmente crioconservar la bolsa de infusión que comprende la población de TIL recolectada de la etapa (f) usando un procedimiento de crioconservación.
La población de TIL se puede utilizar para tratar a un sujeto con cáncer de acuerdo con los procedimientos descritos anteriormente y en el presente documento, en el que el procedimiento comprende además una o más de las características enumeradas anteriormente y en el presente documento.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1: muestra un diagrama de una forma de realización del procedimiento 2A, un procedimiento de 22 días para la fabricación de TIL.
Figura 2: muestra una comparación entre el procedimiento 1C y una forma de realización del procedimiento 2A para la fabricación de TIL.
Figura 3: muestra la línea de tiempo del procedimiento 1C.
Figura 4: muestra el procedimiento de una forma de realización de la terapia TIL que utiliza el procedimiento 2A para la fabricación de TIL, que incluye las etapas de administración y co-terapia, para recuentos de células más altos.
Figura 5: muestra el procedimiento de una forma de realización de la terapia TIL que utiliza el procedimiento 2A para la fabricación de TIL, que incluye las etapas de administración y co-terapia, para recuentos de células más bajos.
Figura 6: muestra un esquema detallado para una forma de realización del procedimiento 2A.
Figura 7: muestra la caracterización de TIL preparados usando una forma de realización del procedimiento 2A comparando la expresión de interferón-gamma (IFN-y) entre TIL frescos y TIL descongelados.
Figura 8: muestra la caracterización de TIL preparados usando una forma de realización del procedimiento 2A examinando la expresión de CD3 en TIL frescos frente a TIL descongelados.
Figura 9: muestra la caracterización de TIL preparados usando una forma de realización del procedimiento 2A examinando la recuperación en TIL frescos frente a TIL descongelados.
Figura 10: muestra la caracterización de TIL preparados usando una forma de realización del procedimiento 2A examinando la viabilidad de TIL frescos frente a TIL descongelados.
Figura 11: Representa las etapas principales de una forma de realización del procedimiento 2A que incluye las etapas de crioconservación.
Figura 12: Representa los recuentos de células obtenidos del procedimiento 1C y una forma de realización del procedimiento 2A.
Figura 13: Representa el porcentaje de viabilidad celular obtenido del procedimiento 1C y una forma de realización del procedimiento 2A.
Figura 14: Representa los porcentajes de células CD45 y CD3 (es decir, células T) medidos por citometría de flujo para TIL obtenidos para el procedimiento 1C y una forma de realización del procedimiento 2A.
Figura 15: Representa la liberación de IFN-<y>obtenida para el procedimiento 1C y formas de realización del procedimiento 2A, medida mediante un ensayo diferente al utilizado para generar los datos en las Figuras 80 y 98.
Figura 16: Representa la liberación de IFN-y obtenida para el procedimiento 1C y las formas de realización del procedimiento 2A, medida mediante un ensayo diferente al utilizado para generar los datos en las Figuras 80 y 98.
Figura 17: Representa los porcentajes de células TCR a/b y NK obtenidas del procedimiento 1C y una forma de realización del procedimiento 2A.
Figura 18: Representa los porcentajes de células CD8+ y CD4+ medidos por citometría de flujo para TIL obtenidos mediante el procedimiento 1C y una forma de realización del procedimiento 2A, así como la relación entre cada subconjunto.
Figura 19: Representa porcentajes de subconjuntos de memoria medidos por citometría de flujo para TIL obtenidos del procedimiento 1C y una forma de realización del procedimiento 2A.
Figura 20: Representa los porcentajes de expresión de PD-1, LAG-3 y TIM-3 mediante citometría de flujo para TIL obtenidos del procedimiento 1C y una forma de realización del procedimiento 2A.
Figura 21: Representa los porcentajes de expresión de 4-1BB, CD69 y KLRG1 por citometría de flujo para TIL obtenidos del procedimiento 1C y una forma de realización del procedimiento 2A.
Figura 22: Representa los porcentajes de expresión de TIGIT por citometría de flujo para TIL obtenidos del procedimiento 1C y una forma de realización del procedimiento 2A.
Figura 23: Representa los porcentajes de expresión de CD27 y CD28 por citometría de flujo para TIL obtenidos del procedimiento 1C y una forma de realización del procedimiento 2A.
Figura 24: Representa los resultados del análisis de la longitud de los telómeros de flujo-FISH.
Figura 25: Representa los resultados del análisis de la longitud de los telómeros de flujo-FISH (después de eliminar un punto de datos atípico).
Figura 26: Representa el diseño del ensayo clínico, incluidas las cohortes tratadas con el procedimiento 1C y una forma de realización del procedimiento 2A.
Figura 27: Diagrama de procedimiento ejemplar 2A que ofrece una descripción general de las etapas A a F. Figura 28: Diagrama de flujo del procedimiento del procedimiento 2A.
Figura 29: Diagrama de flujo del procedimiento en el plan de recopilación de datos del procedimiento 2A Figura 30: Viabilidad de TIL fresco frente a descongelado
Figura 31: Expansión de TIL fresco y descongelado en cultivo re-REP
Figura 32: Valores normales de laboratorio de metabolitos sanguíneos.
Figura 33: Análisis de metabolitos del TIL pre-REP de procedimiento 2A.
Figura 34: Cuantificación de IL-2 en cultivo de células TIL pre-REP del procedimiento 2A.
Figura 35: Liberación de citocinas citotóxicas IFN-<y>tras la estimulación anti-CD3, anti-CD28 y anti-4-1BB de TIL.
Figura 36: Liberación de Granzima B después de la estimulación anti-CD3, anti-CD28 y anti-4-1BB de TIL. Figura 37: TCR ap TIL. La mayoría de las células T CD3+ humanas expresan los receptores formados por cadenas a y p que reconocen antígenos de una manera restringida por MHC. A) Excepto en M1061, el producto TIL fresco y descongelado tenía 80% o más de TCR ap+ que expresan TIL. Tanto el TIL fresco como el descongelado tenían una expresión comparable de TCR ap (valor p - 0.9582). A pesar de que se observó una disminución en el TCR ap+ que expresa TIL después del Re-REP, esta disminución no fue significativa dentro del Re-REP TIL (p = 0.24). B) Hubo una disminución del 9.2% y del 15.7% en el RE-REP TIL fresco y descongelado que expresa TCR ap en comparación con el TIL fresco y descongelado, respectivamente.
Figura 38: TCRap-CD56+. Las células Natural Killer (NK) y NKT que se infiltran en el tumor también tienen la capacidad de lisar las células que carecen de expresión de MHC, así como el antígeno lipídico presentado por CD1 y de proporcionar citocinas inmunorreguladoras. Sin embargo, una infiltración intensa de células NK se asocia con una enfermedad avanzada y podría facilitar el desarrollo del cáncer. La Figura A muestra que, en todos los casos, excepto en M1063, hubo una disminución modesta, aunque no significativa, en la población de NK en TIL descongelado en comparación con TIL fresco, (p = 0.27). No se observaron diferencias significativas entre la población re-REP TIL (p = 0.88). TIL fresco, re-REP TIL fresco y re-REP TIL descongelado demuestran una expresión similar de CD56 como se muestra en la Figura B. El producto TIL descongelado tenía menos (1.9 ± 1.3) células que expresan NK que TIL fresco (3.0 ± 2.2) posiblemente como como resultado del procedimiento de congelación criogénica.
Figura 39: Células CD4+. No se observaron diferencias sustanciales en la población de CD4 en condiciones individuales. La Figura A representa la población CD4 promedio en cada condición. La tabla de la Figura B muestra los valores SD y SEM. Hay una ligera disminución en la población de CD4 en la población de re-REP fresco que se debe principalmente a una disminución de CD4 en la población de re-REP fresco en EP11001T.
Figura 40: Células CD8+. A) En todos, excepto EP11001T, tanto el TIL fresco como el descongelado mostraron poblaciones CD8+ comparables (p = 0.10, sin diferencia significativa). En la mayoría de los experimentos, hubo una ligera disminución en el CD8+ que expresa TIL en el producto fresco re-REP TIL (las excepciones fueron M1061T y M1065T). Hubo aproximadamente una disminución del 10-30% en la población de CD8+ en el re-REP TIL descongelado. La comparación del re-REP TIL de TIL fresco y descongelado mostró una diferencia significativa (p = 0.03, prueba t de Student). La Figura B muestra los valores medios de CD8+ que expresa TIL en todas las condiciones. Tanto el TIL fresco como el descongelado muestran resultados similares. Sin embargo, hubo una disminución del 10.8% en la población CD8+ en el producto descongelado re-REP TIL en comparación con el re-REP TIL fresco.
Figura 41: Células CD4+CD154+. CD154, también conocido como CD40L, es un marcador de células T activadas. Figura A: No se observó una diferencia sustancial en la población CD4+CD154+ en las diferentes condiciones; sin embargo, se observó una disminución del 34,1% en los re-REP CD4+ TIL frescos de EP11001T. La expresión de CD154 no se midió en M1061T y M1062T ya que estos experimentos se llevaron a cabo antes de tener lugar el panel de fenotipo extendido. Figura B: Una ligera disminución en la condición de TIL descongelado podría atribuirse a CD154 no medido en M1061T y M1062T. Todas las condiciones muestran una expresión de CD154 muy comparable en la población de CD4, lo que sugiere células T CD4+ activadas.
Figura 42A-42B: células CD8+CD154+. También se analizó el marcador de activación CD154 expresado en CD8+ TIL. A) En general, la expresión de CD154 fue menor en la población CD8+ en el producto TIL fresco y descongelado. Esto no es sorprendente ya que CD154 se expresa principalmente en las células T CD4+ activadas. En los casos en los que se midió la expresión de CD154 tanto en el producto TIL fresco como en el descongelado, no se observó diferencia o un aumento en la expresión de CD154 en los productos TIL descongelados. La prueba t de Student mostró que no había diferencias significativas entre las dos condiciones. En todos los experimentos se mostró un aumento en la expresión de CD154 en el re-REP descongelado en comparación con el re-REP fresco (p = 0.02). B) Se observó un aumento en la expresión de CD154 en los productos TIL descongelados y re-REP TIL descongelados en comparación con sus contrapartes. El re-REP TIL descongelado mostró un aumento del 29.1% en la expresión de CD154 en comparación con el re-REP TIL fresco.
Figura 43A-43B: células CD4+CD69 . CD69 es el marcador de activación temprana en las células T después de la estimulación o activación. A) En todos los TIL excepto en EP1 1001T, tanto el re-REP fresco como el descongelado mostraron un aumento modesto en la expresión de CD69, posiblemente debido a la duración del re-REP (7 días en lugar de 11 días). No se observaron diferencias entre TIL fresco y descongelado (p = 0.89). Tampoco se observó una diferencia entre re-REP fresco y descongelado (p = 0.82). B) Se observa un aumento menor en la expresión de CD69 en los productos re-REP TIL. (Nota: No se realizó tinción con CD69 para el producto TIL descongelado M1061T y M1062T. La expresión de CD69 del producto TIL fresco M1061T fue del 33.9%).
Figura 44A-44B: células CD8+CD69+. Como se observa para la población de CD4+, la Figura A muestra un aumento en la expresión de CD69 en el CD8+ re-REP TIL. La expresión de CD69 no mostró diferencias significativas entre el TIL fresco y descongelado (p = 0.68) o el re-REP TIL fresco y descongelado (p = 0.76). La Figura B apoya la observación de que hay un aumento modesto en la expresión de CD69 en el producto re-REP TIL.
Figura 45A-45B: células CD4+CD137+. CD137 (4-11313) es un receptor coestimulador de células T inducido tras la activación de TCR. Se activa en las células T CD4+ y CD8+. A) La expresión de CD137 mostró un profundo aumento en la población re-REP TIL después de 7 días de estimulación. Sin embargo, no se observaron diferencias entre el TIL fresco y descongelado o el re-REP TIL fresco y descongelado (p < 0.05 en ambos casos, la Figura B apoya esta observación). Además, el TIL descongelado mostró una modesta disminución en la expresión de CD137. El aumento en la expresión de CD137 en re-REP TIL podría atribuirse a la segunda ronda de estimulación del re-REP de 7 días.
Figura 46A-46B: células CD8+CD137+. A) La población de CD8+ mostró un aumento general en el producto re-REP. B) El producto re-REP fresco tuvo un aumento del 33.4% en la expresión de CD8+ CD137+ en comparación con el producto TIL fresco. El producto re-REP descongelado también mostró un aumento del 33.15% en la expresión de CD137 en la población CD8 en comparación con TIL descongelado. No se observaron diferencias significativas entre re-REP TIL fresco y descongelado. Se puede ver una observación similar comparando el TIL fresco con el producto TIL descongelado. Este aumento en la expresión de CD137 podría deberse a la segunda ronda de activación del re-REP. (Nótese que solo se usaron 6 TIL para el análisis ya que la expresión de CD137 no se midió para 3 de los experimentos).
Figura 47A-47B: células CD4+CM. La población de memoria central (CM) se define por la expresión de CD45RA- (negativo) y CCR7+ (positivo). A) Se observó un aumento en la población de CM en las condiciones de re-REP. M1063T y M1064T mostraron una disminución en la expresión de CM en la población de CD4+ obtenida de TIL descongelado en comparación con el producto de TIL fresco. Ni el producto TIL fresco y descongelado (p = 0.1658) ni el re-REP fresco y re-REP TIL descongelado (p = 0.5535) mostraron una diferencia significativa en la población de CM. B) Se observó un aumento del 14.4% y del 15.4% en la población de CM en el Re-REP TIL fresco y descongelado en comparación con el TIL fresco y descongelado, respectivamente.
Figura 48A-48B: células CD8+CM. A) En la población CD8+, se observó un aumento drástico en la expresión de CM en el producto TIL fresco, una observación que no estaba presente en el producto TIL. Este aumento no afectó la significación (p = 0.3086), lo que sugiere que no hay diferencia entre el TIL fresco y descongelado. También se observó una tendencia similar en los productos re-REP TIL. Figura 48B). Se observó un aumento general de la población de CM en el TIL fresco en comparación con el TIL descongelado. Los números muestran que TIL y re-REP TIL frescos tenían solo una diferencia de ~2%; el TIL fresco mostró una desviación estándar muy alta que podría atribuirse a M1064T; excluir la expresión de CM en M1064T dio como resultado una expresión de CM muy similar entre el producto TIL fresco y descongelado (no mostrado).
Figura 49A-49B: células CD4+EM. La población de memoria efectora (EM) se define por la falta de expresión de CCR7 y CD45RA. A) Como se esperaba, la población CD4+ de TIL fresco y descongelada tenía un alto nivel de fenotipo de memoria efectora. Se encontró una disminución drástica en la expresión de la memoria efectora en la población M1056T re-REP TIL. Además, otros 5 experimentos mostraron una disminución en el fenotipo de memoria efectora en re-REP TIL tanto fresco como descongelado. B) Tanto el TIL fresco como el descongelado mostraron una expresión similar del fenotipo de memoria efectora. La comparación de Re-REP TIL fresco y fresco mostró una disminución del 16% en este último. Se observó una disminución similar en el Re-REP TIL descongelado (9%) en comparación con el TIL descongelado.
Figura 50A-50B: células CD8+EM. A) También se observó un patrón similar de aumento de la memoria efectora en el TIL fresco en la población CD8+. Se observó una excepción en el M1064T en el que el TIL fresco solo tenía un perfil de memoria efectora del 20%; esto se debe a que el 73% de estos TIL tienen un fenotipo CM como se describe en A y B. Todas las muestras que muestran una disminución en la población de memoria efectora en su CD4+ TIL del producto re-REP siguieron la misma tendencia en su CD8+ TIL. B) A diferencia de la población de CD4+ TIL, CD8+ TIL mostró un fenotipo de memoria efectora similar en productos frescos, descongelados y re-REP. (Nótese la alta desviación estándar en el TIL fresco y descongelado, que se debe a la población de memoria efectora baja en M1064T fresco y a la ausencia de expresión en las muestras de TIL descongelados de M1061T).
Figura 51A-51B: células CD4+CD28+. La expresión de CD28 se correlaciona con la disminución de TIL joven con la edad. A) Aunque se observó un aumento en la población de CM en el re-REP TIL, una disminución en la expresión de CD28 se vio como una tendencia que sugiere que el estado de CM por sí solo no podría determinar el destino de TII,. Se observó una disminución en la expresión de CD28 en el producto -re-REP, excepto para M1061T CD4+TII,. B) Se observó una disminución del 8.89% en el TIL fresco y del 5.71% en el TIL descongelado en comparación con el producto TIL fresco y descongelado, respectivamente.
Figura 52A-52B: células CD8+ CD28+. A) La expresión de CD28 en la población de TIL CD8+ fue mayor en el producto TIL fresco y descongelado que en el producto re-REP. En la mayoría de los casos, el re-REP TIL descongelado mostró una disminución drástica en comparación con el TIL descongelado y el re-REP TIL fresco. Sin embargo, la prueba t de Student no mostró diferencias significativas entre TIL fresco y descongelado (p = 0.3668) y también entre los productos re-REP frescos y descongelados (p - = 0.7940). B) Como se ve en la población TIL CD4+, hubo una disminución en las poblaciones de CD8+ CD28+ en el re-REP fresco (21.5%) y el re-REP descongelado (18.2%) en comparación con sus contrapartes no reestimuladas.
Figura 53A-53B: células CD4+PD-1+. La expresión de PD-1 en TIL se correlaciona con células T agotadas y reactivas al antígeno. Por tanto, no es de extrañar que se observe un fenotipo agotado en TIL que se han sometido a un REP durante 11 días. A) Este fenotipo agotado se mantuvo o aumentó (específicamente, EP11001T y M1056T) en el producto TIL descongelado. No se observaron diferencias significativas entre el producto TIL fresco y descongelado (p = 0.9809). Se mostró una tendencia similar en el re-REP TIL fresco en comparación con el descongelado (p = 0.0912). B) El re-REP fresco mostró una modesta disminución en la expresión de PD-1 en la población de TIL CD4+. Todas las demás condiciones mantuvieron un patrón de expresión de PD-1 comparable. Se observó una disminución o ningún cambio en la expresión de PD-1 en el producto re-REP fresco en comparación con todas las demás condiciones. Se observó un aumento en la expresión de PD-1 en M1062T, M1063T (CD4+) y EP11001T (CD8+) en el producto re-REP descongelado. Todos los demás productos descongelados re-REP mostraron resultados comparables a los del producto descongelado.
Figura 54A-54B: células CD8+ PD-1+. A) La población de CD8+ del producto TIL fresco mostró un fenotipo más agotado asociado con un aumento de la expresión de PD-1. Se observó una excepción en EP11001T donde el producto TIL descongelado CD8+ tuvo un aumento modesto en la expresión de PD-1 en comparación con el producto TIL fresco. Hubo una diferencia pequeña, aunque no significativa, en la expresión de PD-1 en el TIL fresco en comparación con el TIL descongelado (p = 0.3144). B) El producto TIL fresco mostró un ligero aumento, pero una expresión de PD-1 no significativa en comparación con TIL descongelado (6.74%, o 1,2 veces más alto que TIL descongelado), lo que sugiere que el producto TIL descongelado era comparable en base al patrón de fenotipo.
Figura 55A-55B: células CD4+LAG3+. Las células T agotadas expresan altos niveles de receptor inhibidor LAG3 junto con PD-1. A) El TIL descongelado CD4+ mostró niveles ligeramente más altos, pero no significativos, de expresión de LAG3 en comparación con el TIL fresco (p = 0.52). Se observó una excepción en M1063T. En experimentos en los que se midió la expresión de LAG3 en CD4+ fresco y re-REP TIL fresco, se observó una disminución en la expresión de LAG3+ en las muestras de re-REP fresco en comparación con TIL fresco. B) En general, hay una modesta disminución en la expresión de LAG3 en el producto fresco re-REP TIL. Nótese que para que la Figura B se mantenga consistente, se excluyeron M1061T, M1062T y M1064T ya que la expresión de LAG3 no se midió en el producto fresco.
Figura 56A-56B: células CD8+LAG3+. A) CD8+LAG3+ que expresa TIL mostró una modesta disminución en los experimentos, con la excepción de M1063T en el que se observó una marcada disminución en la expresión de LAG3 en el re-REP TIL fresco. En general, el re-REP TIL descongelado mostró un aumento significativo de 1.5 veces en comparación con el re-REP TIL fresco para la expresión de LAG3 (p = 0.0154). Sin embargo, no se observaron diferencias significativas entre los productos TIL frescos y descongelados (p = 0.0884). B) Se observó una disminución de aproximadamente el 30% en la expresión de LAG3 en el<c>D8+ TIL de re-REP fresco en comparación con el producto TIL descongelado. Tanto el TIL fresco como el descongelado fueron comparables al TIL descongelado que mostró un modesto aumento. (En esta figura, se omitieron M1061T, M1062T y M1064T ya que la expresión de LAG3 no se midió en las muestras frescas o de re-REP TIL fresco).
Figura 57A-57B: células CD4+TIM-3+. A) Como se observó previamente en el caso de PD-1 y LAG3, se observó una disminución en la expresión de TIM-3 en el reREP TIL fresco en comparación con el re-REP TIL descongelado. Independientemente, no existieron diferencias significativas entre reREP TIL fresco y descongelado (p = 0.2007). B) No se observaron cambios importantes en la expresión de TIM-3 entre los productos reREP TIL frescos, descongelados y descongelados. Se observó una modesta disminución del 9.2% en la expresión de TIM-3 en el reREP TIL fresco en comparación con el producto reREP descongelado.
Figura 58A-58B: células CD8+TIM-3+. A) Una tendencia similar en la expresión de TIM-3 que se observó en la población CD4+ también se observó en el CD8+ TIL. Re-REP TIL fresco tuvo el fenotipo menos agotado con baja expresión de TIM-3, que mostró una diferencia significativa en comparación con re-REP TIL descongelado (p = 0.0147). La comparación de PD-1, LAG3 y TIM-3 sugiere que el REP TIL fresco tenía un fenotipo menos exhaustivo con un fenotipo de CM aumentado. B) En comparación con el producto re-REP TIL descongelado, el re-REP TIL fresco mostró una disminución significativa del 22% en la expresión de TIM-3. Tanto el TIL fresco como el descongelado muestran patrones de expresión TIM-3 similares.
Figura 59: Potencial citotóxico de TIL contra la línea celular diana P815.
Figura 60A-60F: Perfil de respiración metabólica de TIL fresco, Re-REP TIL fresco y Re-REP TIL descongelado. OCR basal (A), SRC abierta (B), SRC2DG (C), SRC encubierta (D), ECAR basal (E) y reserva glicolítica (F).
Figura 61A-61B: Se usó la tecnología Flow-FISH para medir la longitud promedio de la repetición del telómero en 9 productos TIL descongelados de procediiento post-REP 2A. A) Los datos representan la longitud de los telómeros medida por qPCR comparando TIL con 1301 células. B) Los datos muestran la longitud de los telómeros medida por el ensayo Flow Fish de TIL en comparación con 1301 células. Los datos utilizados para los gráficos se proporcionan en formato de tabla (Tablas 25) en la sección 10 del apéndice. En general, hubo una similitud aproximada en los patrones de los resultados de los dos ensayos de longitud de telómeros, pero los experimentos continuarán determinando qué procedimiento refleja con mayor precisión la longitud real de los telómeros del TIL. Esta técnica podría aplicarse a futuras muestras clínicas para determinar una relación entre la longitud de los telómeros y la respuesta del paciente a la terapia TIL.
Figura 62A-62B: Selección del proveedor de medios sin suero (reemplazo de suero). Cada fragmento se cultivó en un solo pocillo de una placa de 24 pocillos G-Rex en cuadruplicados. En el día 11, se iniciaron REP usando 45 TIL con 106 alimentadores para imitar el procedimiento 2A. A) Gráfico de barras que muestra el recuento medio de células viables registrado el día 11 (preREP) para cada condición. B) Gráfico de barras que muestra el recuento medio de células viables registrado el día 22 (postREP). El valor de p se calculó mediante la prueba t de Student. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 respectivamente.
Figura 63A-63B: Selección del proveedor de medios libres de suero (suero de lisado de plaquetas). Cada fragmento se cultivó en un solo pocillo de una placa de 24 pocillos G-Rex por triplicado. El día 11 se iniciaron REP usando 4e5 TIL con 10e6 alimentadoras para imitar el procedimiento 2A. A) Gráfico de barras que muestra el recuento medio de células viables registrado el día 11 (preREP) para cada condición. B) Gráfico de barras que muestra el recuento medio de células viables registrado el día 22 (postREP). El valor de p se calculó mediante la prueba t de Student. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 respectivamente. '#' No hay suficientes fragmentos tumorales.
Figura 64A-64B: Comparar la eficacia del CTS Optimizer con la condición estándar usando el procedimiento 2A a mini escala (G-Rex 5M). Se cultivaron dos fragmentos/G-Rex 5M por triplicado, se iniciaron REP usando 26 TIL con 506 alimentadoras para imitar el procedimiento 2A. Las barras presentadas anteriormente fueron el recuento promedio de células viables obtenido el día 11 (A) o el día 22 (B).
Figura 65A-65C: Resumen de la expansión previa y posterior a TIL extrapolada comparando la condición estándar y el Optimizador de CTS. A) PreREP. B) PostREP. C) Resumen de la expansión de TIL extrapolada a la ejecución a escala completa (Estándar vs CTS Optimizer SR).
Figura 66: CD8+ se activó en células vivas. 7 de los 9 tumores muestran un aumento en las poblaciones absolutas de CD8+ con la condición CTS+SR.
Figura 67: Comparabilidad de interferón-gamma. ELISA de interferón-gamma (Quantikine). La producción de IFN-<y>se midió utilizando el kit Quantikine ELISA mediante sistemas de R&D. CTS+SR produjo cantidades comparables de IFN-<y>en comparación con nuestra condición estándar.
Figura 68: Esquema de una forma de realización ejemplar del Protocolo de expansión rápida (REP). A su llegada, el tumor se fragmenta, se coloca en matraces de G-Rex con IL-2 para la expansión de TIL (expansión pre-REP), durante 11 días. Para los estudios de triple cóctel, se agrega IL-2/IL-15/IL-21 al inicio del pre-REP. Para el Protocolo de expansión rápida (REP), se cultivan TIL con alimentadores y OKT3 para la expansión de REP durante 11 días adicionales.
Figura 69: TIL derivado de melanoma (n=4) y pulmón (n=7) se evaluaron fenotípicamente para células CD4+ y CD8+ usando citometría de flujo post pre-REP. Los valores *p representan la diferencia entre IL-2 e IL-12/IL-15/IL-21 en las células CD8+ utilizando la prueba t para datos no apareados de Student.
Figura 70: TIL derivado de melanoma (n=4) y pulmón (n=7) se evaluaron fenotípicamente para CD27+ y CD28+ en las células CD4+ y CD8+ usando citometría de flujo post pre-REP.
Figura 71A-71B: TIL se evaluó fenotípicamente para subconjuntos efector/memoria (CD45RA y CCR7) en las células CD8+ y CD4+ (datos no mostrados) en melanoma (n=4) (A) y pulmón (n=8) (B). Se evaluó la expresión de CXCR3 en melanoma y pulmón. Toda la expresión fenotípica se evaluó mediante citometría de flujo post REP. TCM=memoria central, TSCM=memoria de células madre, TEMRA (células T efectoras), TEM=memoria efectora.
Figura 72A-72C: Se evaluó la expresión de CD107a+ de TIL derivada de (A) melanoma (n=4) y (B) pulmón (n=5) en respuesta a la estimulación de PMA durante 4 horas en las células CD4+ y CD8+, mediante citometría de flujo. (C) pre-REP TIL (n=5) se estimularon durante 24 horas con OKT3 soluble (30 ng/ml) y los sobrenadantes se evaluaron para IFN<y>mediante ELISA.
Figura 73A-73B: Se evaluó el repertorio de TCRvp (24 especificidades) en el TIL derivado de melanoma (A) y pulmón (B) usando el kit Beckman Coulter para citometría de flujo.
Figura 74: Procedimiento de fabricación ejemplar de TIL crioconservado (~22 días).
Figura 75A-75B: el día 22, el producto celular de volumen reducido se agrupa y se toman muestras para determinar el rendimiento del cultivo antes del lavado y la formulación. Las muestras se analizan en el contador celular automático NC-200 como se describió anteriormente. La densidad de células viables total se determina mediante la gran media de recuentos duplicados de 4 muestras independientes. El procedimiento de Generación 2 (Gen 2) produce un producto TIL de dosis similar a la Generación 1 (Gen 1; la media de Gen 1 = 4.10*101° ± 2.92*1010, media de Gen 2 = 3.12*1010± 2.19*1010). B) La expansión múltiple se calcula para la fase REP como el dividendo de la densidad de células viables final sobre la densidad de siembra de TIL viable inicial. Los productos TIL Gen 2 tienen una expansión menor en relación con Gen 1 (media de Gen 1 =1.40*103 ± 9.86*102, media de Gen 2 = 5.11*102± 2.95*102).
Figura 76: Se ensayó la identidad de productos farmacéuticos recién formulados mediante citometría de flujo para su liberación. Los procedimientos Gen 1 y Gen 2 producen cultivos de células T de alta pureza según lo definido por el fenotipo CD45, CD3 doble positivo (Gen1 # ± SD, Gen 2 # ± SD). El valor de p se calculó utilizando la prueba 't' de Mann-Whitney.
Figura 77: Los viales satélites crioconservados del producto farmacéutico formulado se descongelaron y se analizaron para determinar el fenotipo extendido mediante citometría de flujo como se describió anteriormente. Los productos Gen 1 y Gen 2 expresan relaciones similares de subtipos de células T CD8 a CD4. El valor de p se calculó utilizando la prueba 't' de Mann-Whitney.
Figura 78: Los viales satélites crioconservados del producto farmacéutico formulado se descongelaron y se analizaron para determinar el fenotipo extendido mediante citometría de flujo como se describió anteriormente. Los productos Gen 1 y Gen 2 expresan niveles similares de moléculas coestimuladoras CD27 y CD28 en subconjuntos de células T. El valor de p se calculó mediante la prueba t de Mann-Whitney. Se requieren moléculas coestimuladoras tales como CD27 y CD28 para suministrar la señalización secundaria y terciaria necesaria para la proliferación de células efectoras en el acoplamiento del receptor de células T.
Figura 79: Se utilizó la tecnología Flow-FISH para medir la longitud promedio de la repetición del telómero como se describió anteriormente. El valor de RTL anterior indica que la fluorescencia de telómero promedio por cromosoma/genoma en Gen 1 (una forma de realización del procedimiento 1C) es # % ± SD%, y Gen 2 es #% ± SD% de la fluorescencia de telómero por cromosoma/genoma en la línea de células de control (línea de células de leucemia 1301). Los datos indican que los productos Gen 2 en promedio tienen al menos longitudes de telómero comparables a las de los productos Gen 1. La longitud de los telómeros es una medida sustituta de la longitud del cultivo celular ex vivo.
Figura 80: Los productos farmacéuticos Gen 2 (una forma de realización del procedimiento 2A) exhiben una mayor capacidad de producir IFN-y en relación con los productos farmacéuticos Gen 1. La capacidad del fármaco para reactivarse y secretar citocinas es una medida sustituta de la función in vivo tras la unión del TCR al antígeno afín en el contexto de HLA.
Figura 81: Diversidad del receptor de células T: se analizaron ARN de 10x106 TIL de Gen 1 (una forma de realización del procedimiento 1C) y Gen 2 (una forma de realización del procedimiento 2A) para determinar el número total y la frecuencia de secuencias de CDR3 únicas presentes en cada producto. A) El número total de secuencias CDR3 únicas presentes en cada producto (Gen 1 n=#, media ± SD, Gen 2 n =#, media ± SD). B) Se indexaron secuencias únicas de CDR3 en relación con la frecuencia en cada producto para producir una clasificación representativa de la diversidad relativa de receptores de células T en el producto. Los productos TIL de ambos procedimientos están compuestos por poblaciones policlonales de células T con diferentes especificidades de antígenos y avideces. La amplitud del repertorio total de células T puede ser indicativa del número de epítopos accionables sobre las células tumorales.
Figura 82: muestra un diagrama de una forma de realización del procedimiento 2A, un procedimiento de 22 días para la fabricación de TIL.
Figura 83: Tabla comparativa de las etapas A a F de las formas de realización ejemplares del procedimiento 1C y el procedimiento 2A.
Figura 84: Comparación detallada de una forma de realización del procedimiento 1C y una forma de realización del procedimiento 2A.
Figura 85: Esquema detallado de una forma de realización de un procedimiento de terapia TIL.
Figuras 86A-86C: Caracterización fenotípica de productos TIL usando un ensayo de citometría de flujo de 10 colores. (A) El porcentaje de subconjuntos de células T y no células T se define por CD45+CD3+ y c D45- (no linfocitos) /CD45+CD3' (linfocitos de células no T), respectivamente. En general, > 99% de los productos TIL probados consistieron en células T (CD45+CD3+). Se muestra un promedio de productos TIL (n=10). (B) Porcentaje de dos subconjuntos de células T que incluyen CD45+CD3+CD8+ (círculo abierto azul) y CD45+CD3+CD4+ (círculo abierto rosa). No se observa ninguna diferencia estadística en el porcentaje de ambos subconjuntos utilizando la prueba T para datos no apareados de Student (P=0.68). (C) La población que no es de células T se caracterizó para cuatro subconjuntos diferentes que incluyen: 1) No linfocitos (CD45-), 2) Células NK (CD45+CD3CD16756+), 3) Células B (CD45+CD19+) y 4) células no NK/B (CD45+CD3-CD16'CD56-CD19-).
Figuras 87A-87B: Caracterización de subconjuntos de células T en poblaciones de células CD45+CD3+CD4+ y CD45+CD3+CD8+. Los subconjuntos de células T naive, de memoria central (TCM), de memoria efectora (TEF) y de memoria efectora RA+(EMRA) se definieron utilizando CD45RA y CCR7. Las figuras muestran subconjuntos de células T representativos de 10 productos TIL finales en poblaciones de células CD4+ (A) y de células CD8+ (B). El subconjunto de células T de memoria efectora (círculo azul abierto) es una población importante (>93%) en los subconjuntos CD4+ y CD8+ del producto final TIL. Menos del 7% de las células de productos TIL es un subconjunto de memoria central (círculo rosado abierto). Los subconjuntos EMRA (círculo gris abierto) y naive (círculo negro abierto) apenas se detectan en el producto TIL (<0.02%). Los valores p representan la diferencia entre EM y CM utilizando la prueba T para datos no apareados de Student
Figuras 88A-88B: detección de la expresión de MCSP y EpCAM en células tumorales de melanoma. Las líneas celulares de tumor de melanoma (WM35, 526 y 888), las líneas celulares de melanoma derivadas del paciente (1028, 1032 y 1041) y una línea celular de carcinoma de adenoma colorrectal (HT29 como control negativo) se caracterizaron mediante tinción para MCSP (proteoglicano de sulfato de condroitina asociado a melanoma) y marcadores EpCAM (molécula de adhesión de células epiteliales). (A) El promedio del 90% de las células tumorales de melanoma expresan MCSP. (B) La expresión de EpCAM no se detectó en líneas de células tumorales de melanoma en comparación con el control positivo HT29, una línea de células tumorales EpCAM+.
Figuras 89A-89B: Detección de controles enriquecidos para la determinación de la precisión de detección de tumores. El ensayo se realizó agregando cantidades conocidas de células tumorales a suspensiones de PBMC (n=10). Se diluyeron células tumorales de melanoma MCSP+526 en relaciones de 1:10, 1:100 y 1:1000, luego se mezclaron con PBMC y se tiñeron con anticuerpos anti-MCSP y anti-CD45 y colorante vivo/muerto y se analizaron por citometría de flujo. (A) Se detectaron aproximadamente 3000, 300 y 30 células en la dilución de 1:10, 1: 100 y 1: 1000, respectivamente. (B) Se utilizó un promedio (AV) y una desviación estándar (DE) de las células adquiridas en cada condición para definir los límites de referencia superior e inferior.
Figuras 90A-90B: Estudio de repetibilidad de los límites superior e inferior en controles enriquecidos. Se realizaron tres experimentos independientes por triplicado para determinar la repetibilidad del ensayo de adición. (A) El número de células tumorales detectadas por MCSP+ estaba de modo consistente dentro del rango de los límites de referencia superior e inferior. (B) El gráfico de regresión lineal demuestra la correlación entre las células MCSP+ y las diluciones de adición (R2=0.99) con la línea sólida negra que muestra el mejor ajuste. Las líneas discontinuas verdes y grises representan los límites de predicción del 95% en la curva estándar y las muestras (Exp#1 a 3), respectivamente.
Figuras 91A-91B: Detección de tumor de melanoma residual en productos TIL. Los productos TIL se evaluaron para determinar la contaminación residual del tumor usando el ensayo desarrollado (n=15). (A y B) La mediana del número y el porcentaje de eventos MCSP+ detectables fue 2 y 0.0002%, respectivamente.
Figura 92: Evaluación de la potencia de los productos TIL después de la activación de las células T. Secreción de IFNy después de la reestimulación con anti-CD3/CD28/CD137 en productos TIL evaluados por ELISA por duplicado (n=5). La secreción de IFN<y>por parte de los productos TIL fue significativamente mayor que los controles no estimulados usando la prueba de grado con signo de Wilcoxon (P = 0.02), y consistentemente > 1000 pg/ml. La secreción de IFN<y>> 200 pg/ml se considera potente, el valor de p <0.05 se considera estadísticamente significativo.
Figura 93: Representación de una forma de realización de un procedimiento de fabricación de TIL crioconservado (22 días).
Figura 94: Tabla de mejoras de procedimientos de Gen 1 a Gen 2.
Figuras 95A-95C: células viables totales, tasa de crecimiento y viabilidad. El día 22, el producto celular de volumen reducido se agrupa y se toman muestras para determinar el rendimiento del cultivo antes de lavado y formulación. (A) Las muestras se analizan en el contador de células automatizado NC-200 como se describió anteriormente. La densidad de células viables total se determina mediante la gran media de recuentos duplicados de 4 muestras independientes. El procedimiento de Gen 2 produce un producto TIL de dosis similar a Gen 1 (media de Gen 1 = 4.10x1010 ± 2.8x1010, media de Gen 2 = 4.12x1010 ± 2.5x1010). (B) La tasa de crecimiento se calcula para la fase REP como gr = ln(N(t)/N(0))/t. (C) La viabilidad celular se evaluó a partir de 9 lotes de desarrollo de procedimientos utilizando el Cellometer K2 como se describió anteriormente. No se observó una disminución significativa en la viabilidad celular después de un único ciclo de congelacióndescongelación del producto formulado. Elpromedio de reducción de la viabilidad tras el deshielo y el muestreo es del 2.19%.
Figuras 96A-96C: Los productos Gen 2 son cultivos de células T altamente puros que expresan moléculas coestimuladoras a niveles comparables a los de Gen 1. (A) Se ensayó la identidad de productos farmacéuticos recién formulados mediante citometría de flujo para su liberación. Los procedimientos de Gen 1 y Gen 2 producen cultivos de células T de alta pureza según lo definido por el fenotipo CD45+, CD3+ (doble positivo). (B & C) Se descongelaron viales satélites crioconservados de producto farmacéutico formulado y se ensayó el fenotipo extendido mediante citometría de flujo como se describió previamente. Los productos Gen 1 y Gen 2 expresan niveles similares de moléculas coestimuladoras CD27 y CD28 en subconjuntos de células T. Se requieren moléculas coestimuladoras tales como CD27 y CD28 para suministrar la señalización secundaria y terciaria necesaria para la proliferación de células efectoras en el acoplamiento del receptor de células T. El valor de p se calculó utilizando la prueba 't' de Mann-Whitney.
Figura 97: Los productos Gen 2 exhiben longitudes de telómero similares. Sin embargo, algunas poblaciones de TIL pueden tender hacia un telómero relativo más largo.
Figura 98: Los productos farmacológicos Gen 2 secretan IFN<y>en respuesta al acoplamiento de CD3, CD28 y CD137.
Figuras 99A-99B: diversidad de receptores de células T. (A) Se indexaron secuencias de CDR3 únicas en relación con la frecuencia en cada producto para producir una clasificación representativa de la diversidad general de receptores de células T en el producto. (B) El número total promedio de secuencias de CDR3 únicas presentes en cada producto de infusión.
Figura 100: una forma de realización de un procedimiento de fabricación de TIL de la presente invención.
Figura 101: Mejora de la expansión durante el pre-REP con IL-2/IL-15/IL-21 en múltiples histologías tumorales.
Figuras 102A-102B: IL-2/IL-15/IL-21 aumentó el porcentaje de células CD8+ en el carcinoma de pulmón, pero no en el melanoma. TIL derivado de (A) melanoma (n=4), y (B) pulmón (n=7) fueron evaluados fenotípicamente para células CD4+ y CD8+ usando citometría de flujo post pre-REP.
Figuras 103A-103B: la expresión de CD27 se incrementó ligeramente en células CD8+ en cultivos tratados con IL-2/IL-15/IL-21. TIL derivado de (A) melanoma (n=4) y (B) pulmón (n=7) se evaluaron fenotípicamente para CD27+ y CD28+ en las células c D4+ y CD8+ usando citometría de flujo post pre-REP.
Figuras 104A-104B: los subconjuntos de células T no se modificaron con la adición de IL-15/IL-21. Los TIL se evaluaron fenotípicamente para los subconjuntos efector/de memoria (CD45RA y CCR7) en las células CD8+ y CD4+ (datos no mostrados) de (A) melanoma (n=4) y (B) pulmón (n=8) mediante citometría de flujo pos-pre-REP.
Figuras 105A-105C: La capacidad funcional de TIL se mejoró diferencialmente con IL-2/IL-15/IL-21. Se evaluó la expresión de CD107a+ de TIL derivada de (A) melanoma (n=4) y (B) pulmón (n=5) en respuesta a la estimulación de PMA durante 4 horas en las células CD4+ y CD8+, mediante citometría de flujo. (C) Pre-REP TIL derivado de melanoma y pulmón se estimularon durante 24 horas con anticuerpo anti-CD3 soluble y los sobrenadantes se evaluaron para IFNy mediante ELISA.
Figuras 106A-106B: Se evaluó el repertorio de TCRvp (24 especificidades) en el TIL derivado de un (A) melanoma y (B) tumor de pulmón usando el kit Beckman Coulter para citometría de flujo.
Figura 107: Esquema del procedimiento de fabricación de LN-144 crioconservado Gen 2.
Figura 108: Esquema del diseño del estudio de un ensayo clínico multicéntrico de fase 2 de nuevos TIL crioconservados administrados a pacientes con melanoma metastásico.
Figura 109: Tabla que ilustra la comparación de las características de los pacientes de la cohorte 1 (ASCO 2017) frente a la cohorte 2.
Figura 110: Tabla que ilustra los eventos adversos emergentes del tratamiento (> 30%).
Figura 111: Eficacia del producto de infusión y la terapia TIL.
Figura 112: Estado clínico de respuesta evaluable de los pacientes con SD o mejor respuesta.
Figura 113: Cambio porcentual en la suma de diámetros.
Figura 114: Se observó un aumento del nivel de HMGB1 con el tratamiento con TIL.
Figura 115: Se observó un aumento en el biomarcador IL-10 después de la infusión de LN-144.
Figura 116: Características actualizadas de los pacientes para la Cohorte 2 del ensayo clínico de fase 2 en melanoma metastásico del segundo corte de datos (N=17 pacientes).
Figura 117: Eventos adversos emergentes del tratamiento para la cohorte 2 (> 30%) del segundo corte de datos (N=17 pacientes).
Figura 118: Tiempo de respuesta para pacientes evaluables (enfermedad estable o mejor) en la Cohorte 2 desde el segundo corte de datos (N=17 pacientes). De los 10 pacientes en el conjunto de eficacia, un paciente (Paciente 10) no fue evaluable debido a una muerte relacionada con el melanoma antes de la primera evaluación del tumor no representada en la figura.
Figura 119: Datos de eficacia actualizados para la cohorte 2 del segundo corte de datos (N=17 pacientes). El número medio de TIL infundidos es 34 * 1o9. La mediana del número de terapias previas fue de 4:5. Los pacientes con una mutación BRAF respondieron tan bien como los pacientes con BRA<f>de tipo silvestre (* se refiere a pacientes con una mutación BRAF). Un paciente (Paciente 10) no fue evaluable debido a una muerte relacionada con el melanoma antes de la primera evaluación del tumor, pero aún se consideró en el conjunto de eficacia. Abreviaturas: RP, respuesta parcial; SD: enfermedad estable; EP, enfermedad progresiva.
Figura 120: Datos de eficacia actualizados para pacientes evaluables de la Cohorte 2 del segundo corte de datos (N=17 pacientes). El * indica un paciente no evaluable que no alcanzó la primera evaluación. Todos los pacientes evaluables en cuanto a eficacia habían recibido terapias previas con inhibidores de puntos de control anti-PD-1 y anti-CTLA-4.
Figura 121: Tomografía computarizada representativa de un paciente (003-015) con un RP de la cohorte 2, segundo corte de datos.
Figura 122: Correlación de la inducción de IFN-<y>por el producto TIL antes de la infusión con la reducción clínica del tamaño del tumor el día 42 después de la infusión de TIL.
Figura 123: Niveles de IP-10 (CXCL10) (pg/mL, log-^) antes y después de la infusión de una forma de realización del producto Gen 2 TIL. IP-10 es un marcador de adhesión celular y dirigido.
Figura 124: Niveles de IP-10 (CXCL10) (pg/mL, log-^) antes y después de la infusión de una forma de realización del producto Gen 1 TIL.
Figura 125: Niveles de MCP-1 (pg/mL, logio) antes y después de la infusión de una forma de realización del producto Gen 2 TIL. MCP-1 es un marcador de adhesión celular y dirigido.
Figura 126: Niveles de MCP-1 (pg/mL, logio) antes y después de la infusión de una forma de realización del producto Gen 1 TIL.
Figura 127: Datos de estudios de fase 2 en carcinoma de cuello uterino y carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (HNSCC). SD=enfermedad estable. PR=enfermedad progresiva. PR=respuesta parcial. Breve descripción del listado de secuencias
La SEQ ID NO:1 es la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de muromonab.
La SEQ ID NO:2 es la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de muromonab.
La SEQ ID NO:3 es la secuencia de aminoácidos de una proteína IL-2 humana recombinante.
La SEQ ID NO:4 es la secuencia de aminoácidos de la aldesleucina.
La SEQ ID NO:5 es la secuencia de aminoácidos de una proteína IL-4 humana recombinante.
La SEQ ID NO:6 es la secuencia de aminoácidos de una proteína IL-7 humana recombinante.
La SEQ ID NO:7 es la secuencia de aminoácidos de una proteína IL-15 humana recombinante.
La SEQ ID NO:8 es la secuencia de aminoácidos de una proteína IL-21 humana recombinante.
Descripción detallada de la invención
I. Introducción
La terapia celular adoptiva que utiliza TIL cultivados ex vivo mediante el Protocolo de expansión rápida (REP) ha producido una terapia celular adoptiva exitosa después de la inmunosupresión del huésped en pacientes con melanoma. Los parámetros actuales de aceptación de la infusión se basan en lecturas de la composición de los TIL (por ejemplo, positividad para CD28, CD8 o CD4) y en los múltiples numéricos de expansión y viabilidad del producto REP.
Los protocolos actuales de REP dan poca información sobre la salud del TIL que se infundirá al paciente. Las células T experimentan un cambio metabólico profundo durante el curso de su maduración de células T naive a efectoras (véase Chang, et al., Nat. Immunol. 2016,17, 364, y en particular para la discusión y marcadores de metabolismo anaeróbico y aeróbico). Por ejemplo, las células T naive dependen de la respiración mitocondrial para producir ATP, mientras que las células T efectoras maduras y sanas como TIL son altamente glucolíticas y dependen de la glucólisis aeróbica para proporcionar los sustratos bioenergéticos que necesitan para la proliferación, migración, activación y eficacia antitumoral.
Los trabajos anteriores informan que es deseable limitar la glucólisis y promover el metabolismo mitocondrial en los TIL antes de la transferencia, ya que las células que dependen en gran medida de la glucólisis sufrirán privación de nutrientes tras la transferencia adoptiva, lo que da como resultado la muerte de la mayoría de las células transferidas. Por tanto, la técnica enseña que la promoción del metabolismo mitocondrial podría promover la longevidad in vivo y, de hecho, sugiere el uso de inhibidores de la glucólisis antes de la inducción de la respuesta inmune. Véase Chang et al. (Chang et al., Nat. Immunol. 2016, 17(364).
Se divulgan en el presente documento, aunque no se reivindican, procedimientos para evaluar y cuantificar este aumento en la salud metabólica. Por lo tanto, la presente divulgación proporciona procedimientos para analizar la salud relativa de una población de TIL utilizando una o más evaluaciones generales del metabolismo, que incluyen, entre otras, tasas y cantidades de glucólisis, fosforilación oxidativa, capacidad respiratoria de reserva (SRC), y reserva glucolítica.
Además, también se divulgan en el presente documento, aunque no se reivindican, procedimientos para evaluar y cuantificar este aumento en la salud metabólica. Por lo tanto, se divulgan en el presente documento, pero no se reivindican, procedimientos para analizar la salud relativa de una población de TIL utilizando una o más evaluaciones generales del metabolismo, que incluyen, entre otras, tasas y cantidades de glucólisis, fosforilación oxidativa, capacidad respiratoria de reserva (SRC), y reserva glucolítica.
Además, las evaluaciones adicionales opcionales incluyen, pero no se limitan a, producción de ATP, masa mitocondrial y absorción de glucosa.
II. Definiciones
A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en este documento tienen el mismo significado que el que entiende comúnmente un experto en la técnica a la que pertenece esta invención.
El término "in vivo" se refiere a un evento que tiene lugar en el cuerpo de un sujeto.
El término "in vitro" se refiere a un evento que tiene lugar fuera del cuerpo de un sujeto. Los ensayos in vitro abarcan ensayos basados en células en los que se emplean células vivas o muertas y también pueden abarcar un ensayo sin células en el que no se emplean células intactas.
El término "ex vivo" se refiere a un evento que implica tratar o realizar un procedimiento en una célula, tejido y/u órgano que se ha eliminado del cuerpo de un sujeto. Acertadamente, la célula, tejido y/u órgano pueden devolverse al cuerpo del sujeto en un procedimiento de cirugía o tratamiento.
El término "expansión rápida" significa un aumento en el número de TIL específicos de antígeno de al menos aproximadamente 3 veces (o 4, 5, 6, 7, 8 o 9 veces) por un período de una semana, más preferiblemente al menos aproximadamente 10 veces (o 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 o 90 veces) por un período de una semana, o lo más preferiblemente al menos aproximadamente 100 veces por un período de una semana. A continuación se describen varios protocolos de expansión rápida.
Por "linfocitos que se infiltran en el tumor" o "TIL" en el presente documento se entiende una población de células obtenidas originalmente como glóbulos blancos que han abandonado el torrente sanguíneo de un sujeto y han migrado a un tumor. Los TIL incluyen, pero no se limitan a, células T citotóxicas CD8+ (linfocitos), células T Th1 y Th17 CD4+, células asesinas naturales, células dendríticas y macrófagos M1. Los TIL incluyen tanto los TIL primarios como los secundarios. Los "TIL primarios" son aquellos que se obtienen de muestras de tejido del paciente como se describe en este documento (a veces denominado "recién recolectado"), y los "TIL secundarios" son cualquier población de células TIL que se han expandido o proliferado como se discute en este documento, incluyendo, pero no limitado a TIL a granel y TIL expandidos ("REP TIL" o "post-REP TIL"). Las poblaciones de células TIL pueden incluir TIL modificadas genéticamente.
Por "población de células" (incluidas las TIL) en el presente documento se entiende un número de células que comparten rasgos comunes. En general, las poblaciones varían generalmente de 1 X 106a 1 X 1010en número, con diferentes poblaciones de TIL que comprenden diferentes números. Por ejemplo, el crecimiento inicial de TIL primarios en presencia de IL-2 da como resultado una población de TIL a granel de aproximadamente 1 x 108 células. La expansión de REP se realiza generalmente para proporcionar poblaciones de 1.5 x 109 a 1.5 x 1010 células para infusión.
Por "TIL crioconservados" en el presente documento se entiende que los TIL, primarios, a granel o expandidos (REP TIL), se tratan y almacenan en el intervalo de aproximadamente -150°C a -60°C. Los procedimientos generales para la crioconservación también se describen en otra parte de este documento, incluidos los Ejemplos. Para mayor claridad, los "TIL crioconservados" se distinguen de las muestras de tejido congeladas que pueden usarse como fuente de TIL primarios.
Por "TIL descongelados crioconservados" en el presente documento se entiende una población de TIL que se crioconservó previamente y luego se trató para volver a temperatura ambiente o superior, incluidas, entre otras, temperaturas de cultivo celular o temperaturas en las que se pueden administrar TIL a un paciente.
Los TIL generalmente se pueden definir bioquímicamente, usando marcadores de superficie celular, o funcionalmente, por su capacidad para infiltrar tumores y efectuar el tratamiento. Los TIL generalmente se pueden clasificar expresando uno o más de los siguientes biomarcadores: CD4, CD8, TCR ap, CD27, CD28, CD56, CCR7, CD45Ra, CD95, PD-1 y CD25. Además, y alternativamente, los TIL pueden definirse funcionalmente por su capacidad para infiltrar tumores sólidos tras la reintroducción en un paciente.
El término "medios de crioconservación" o "medio de crioconservación" se refiere a cualquier medio que pueda usarse para la crioconservación de células. Dichos medios pueden incluir medios que comprenden del 7% al 10% de DMSO. Los medios ejemplares incluyen CryoStor CS10, Hyperthermasol, así como combinaciones de los mismos. El término "CS10" se refiere a un medio de crioconservación que se obtiene de Stemcell Technologies o de Biolife Solutions. El medio CS10 puede denominarse con el nombre comercial "CryoStor® CS10". El medio CS10 es un medio libre de componentes animales y sin suero que comprende DMSO.
El término "célula T de memoria central" se refiere a un subconjunto de células T que en el ser humano son CD45R0+ y expresan constitutivamente CCR7 (CCR7hi) y CD62L (CD62hi). El fenotipo de superficie de las células T de memoria central también incluye TCR, CD3, CD127 (IL-7R) e IL-15R. Los factores de transcripción para las células T de memoria central incluyen BCL-6, BCL-6B, MBD2 e BMI1. Las células T de memoria central secretan principalmente IL-2 y CD40L como moléculas efectoras después de la activación del TCR. Los linfocitos T de memoria central predominan en el compartimento CD4 de la sangre, y en el ser humano están proporcionalmente enriquecidos en los ganglios linfáticos y las amígdalas.
El término "célula T de memoria efectora" se refiere a un subconjunto de células T humanas o de mamífero que, como las células T de memoria central, son CD45R0+, pero han perdido la expresión constitutiva de CCR7 (CCR710) y son heterogéneas o bajas para la expresión de CD62L (CD62L10). El fenotipo de superficie de las células T de memoria central también incluye TCR, CD3, CD127 (IL-7R) e IL-15R. Los factores de transcripción para las células T de memoria central incluyen BLIW1. Las células T de memoria efectora secretan rápidamente altos niveles de citocinas inflamatorias después de la estimulación antigénica, que incluyen interferón-y, IL-4 e IL-5. Las células T de memoria efectora predominan en el compartimento CD8 de la sangre y, en el ser humano, se enriquecen proporcionalmente en los pulmones, el hígado y el intestino. Las células T de memoria efectora CD8+ transportan grandes cantidades de perforina.
El término "sistema cerrado" se refiere a un sistema que está cerrado al entorno exterior. Se puede emplear cualquier sistema cerrado apropiado para procedimientos de cultivo celular con los procedimientos de la presente invención. Los sistemas cerrados incluyen, por ejemplo, pero no se limitan a contenedores G cerrados. Una vez que se agrega un segmento tumoral al sistema cerrado, el sistema no se abre al ambiente exterior hasta que los TIL estén listos para ser administrados al paciente.
Los términos "fragmentación", "fragmento" y "fragmentado", como se usan en el presente documento para describir procedimientos para afectar un tumor, incluyen procedimientos de fragmentación mecánica tales como triturar, cortar, dividir y morcelar tejido tumoral, así como cualquier otro procedimiento para alterar la estructura física del tejido tumoral.
Los términos "células mononucleares de sangre periférica" y "PBMC" se refieren a una célula de sangre periférica que tiene un núcleo redondo, que incluye linfocitos (células T, células B, células NK) y monocitos. Preferiblemente, las células mononucleares de sangre periférica son células mononucleares de sangre periférica alogénicas irradiadas. Las PBMC son un tipo de célula presentadora de antígenos.
El término "anticuerpo anti-CD3" se refiere a un anticuerpo o una variante del mismo, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal y que incluye anticuerpos humanos, humanizados, quiméricos o murinos que se dirigen contra el receptor CD3 en el receptor del antígeno de células T de células T maduras. Los anticuerpos anti-CD3 incluyen OKT-3, también conocido como muromonab. Los anticuerpos anti-CD3 también incluyen el clon UHCT1, también conocido como T3 y CD3<e>. Otros anticuerpos anti-CD3 incluyen, por ejemplo, otelixizumab, teplizumab y visilizumab.
El término "OKT-3" (también denominado en el presente documento "OKT3") se refiere a un anticuerpo monoclonal o biosimilar o variante del mismo, incluidos anticuerpos humanos, humanizados, quiméricos o murinos, dirigidos contra el receptor CD3 en el receptor de antígeno de célula T de células T maduras, e incluye formas disponibles comercialmente como OKT-3 (30 ng/mL, MACS GMP CD3 pure, Miltenyi Biotech, Inc., San Diego, CA, USA) y muromonab o variantes, sustituciones conservadoras de aminoácidos, glicoformas o biosimilares de las mismas. Las secuencias de aminoácidos de las cadenas pesada y ligera de muromonab se dan en la Tabla 1 (SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO:2). Un hibridoma capaz de producir OKT-3 se deposita en la Colección Americana de Cultivos Tipo y se le asigna el número de acceso ATCC CRL 8001. Un hibridoma capaz de producir OKT-3 también se deposita en la Colección Europea de Cultivos Celulares Autenticados (ECACC) y se le asigna el número de catálogo 86022706.
TABLA 1. Secuencias de aminoácidos de muromonab.
El término "IL-2" (también denominado en el presente documento como "Il,2") se refiere al factor de crecimiento de células T conocido como interleucina-2, e incluye todas las formas de IL-2, incluidas las formas humanas y de mamíferos, sustituciones conservadoras de aminoácidos, glicoformas, biosimilares y variantes de los mismos. La IL-2 se describe, por ejemplo, en Nelson, J. Immunol. 2004, 172, 3983-88 and Malek, Annu. Rev. Immunol. 2008, 26, 453-79. La secuencia de aminoácidos de IL-2 humana recombinante adecuada para su uso en la invención se proporciona en la Tabla 2 (SEQ ID NO:3). Por ejemplo, el término IL-2 abarca formas humanas recombinantes de IL-2 como la aldesleucina (PROLEUKIN, disponible comercialmente en múltiples proveedores en 22 millones de UI por viales de un solo uso), así como la forma de IL-2 recombinante suministrada comercialmente por CellGenix, Inc., Portsmouth, NH, USA (CELLGRO GMP) o ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA (Cat. No. CYT-209-b) y otros equivalentes comerciales de otros proveedores. La aldesleucina (desalanil-1, serina-125 IL-2 humana) es una forma recombinante humana no glicosilada de IL-2 con un peso molecular de aproximadamente 15 kDa. La secuencia de aminoácidos de la aldesleucina adecuada para su uso en la invención se proporciona en la Tabla 2 (SEQ ID NO:4). El término IL-2 también abarca formas pegiladas de IL-2, como se describe en el presente documento, incluido el profármaco de IL2 pegilado NKTR-214, disponible en Nektar Therapeutics, South San Francisco, CA, USA. La NKTR-214 y la IL-2 pegilada adecuadas para su uso en la invención se describen en la publicación de solicitud de patente estadounidense No. US 2014/0328791 A1 y la publicación de solicitud de patente internacional No. WO 2012/065086 A1. Las formas alternativas de IL-2 conjugada adecuadas para su uso en la invención se describen en las Patentes de Estados Unidos Nos. 4,766,106, 5,206,344, 5,089,261 y 4902,502. Las formulaciones de IL-2 adecuadas para su uso en la invención se describen en la patente de EE.UU. No.
6,706,289.
TABLA 2. Secuencias de aminoácidos de interleucinas.
El término "IL-4" (también denominado en el presente documento "11,4") se refiere a la citocina conocida como interleucina 4, que es producida por células T Th2 y por eosinófilos, basófilos y mastocitos. IL-4 regula la diferenciación de células T colaboradoras naive (células Th0) a células T Th2. Steinke y Borish, Respir. Res.
2001, 2, 66-70. Tras la activación por IL-4, las células T Th2 producen posteriormente IL-4 adicional en un
circuito de retroalimentación positiva. IL-4 también estimula la proliferación de células B y la expresión del MHC
de clase II e induce el cambio de clase a la expresión de IgE e IgG<1>de las células B. La IL-4 humana recombinante adecuada para su uso en la invención está disponible comercialmente por múltiples proveedores,
incluidos ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, EUA (Cat. No. CYT-211) y ThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, EUA (proteína recombinante IL-15 humana, cat. No. Gibco CTP0043). La
secuencia de aminoácidos de IL-4 humana recombinante adecuada para su uso en la invención se proporciona
en la Tabla 2 (SEQ ID NO:5).
El término "IL-7" (también denominado en el presente documento "IL7") se refiere a una citocina derivada de
tejido glicosilada conocida como interleucina 7, que puede obtenerse de células estromales y epiteliales, así
como de células dendríticas. Fry y Mackall, Blood 2002, 99, 3892-904. IL-7 puede estimular el desarrollo de
células T. La IL-7 se une al receptor de IL-7, un heterodímero formado por el receptor alfa de IL-7 y el receptor
de cadena gamma común, que en una serie de señales importantes para el desarrollo de las células T dentro
del timo y la supervivencia dentro de la periferia. La IL-7 humana recombinante adecuada para su uso en la
invención está disponible comercialmente por múltiples proveedores, incluidos ProSpec-Tany TechnoGene
Ltd., East Brunswick, NJ, EUA (Cat. No.<C y T - 2 5 4 )>y ThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, EUA (proteína recombinante IL-15 humana, No. de cat. Gibco PHC0071). La secuencia de aminoácidos de IL-7 humana recombinante adecuada para su uso en la invención se proporciona en la Tabla 2 (SEQ ID NO:6).
El término "IL-15" (también denominado en el presente documento como "IL15") se refiere al factor de crecimiento de células T conocido como interleucina-15, e incluye todas las formas de IL-2, incluidas las formas
humanas y de mamíferos, sustituciones conservadoras de aminoácidos, glicoformas, biosimilares y variantes
de los mismos. La IL-15 se describe, por ejemplo, en Fehniger y Caligiuri, Blood 2001,97, 14-32. IL-15 comparte subunidades de receptores de señalización p y<y>con IL-2. La IL-15 humana recombinante es una cadena polipeptídica única no glicosilada que contiene 114 aminoácidos (y una metionina N-terminal) con una masa molecular de 12.8 kDa. La IL-15 humana recombinante está disponible comercialmente por múltiples proveedores, incluidos ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, EUA (Cat. No. CYT-230-b) and ThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, EUA (proteína recombinante IL-15 humana, No. de catálogo 34
8159-82). La secuencia de aminoácidos de IL-15 humana recombinante adecuada para su uso en la invención
se proporciona en la Tabla 2 (SEQ ID NO:7).
El término "IL-21" (también denominado en el presente documento "IL21") se refiere a la proteína citocina pleiotrópica conocida como interleucina-21, e incluye todas las formas de IL-21, incluidas las formas humanas
y de mamíferos, sustituciones conservadoras de aminoácidos, glicoformas, biosimilares y variantes de los
mismos. IL-21 se describe, por ejemplo, en Spolski y Leonard, Nat. Rev. Drug. Disc. 2014,13, 379-95. La IL-21
es producida principalmente por células T asesinas naturales y células T CD4+ humanas activadas. La IL-21
humana recombinante es una cadena polipeptídica única no glicosilada que contiene 132 aminoácidos con una
masa molecular de 15.4 kDa. La IL-21 humana recombinante está disponible comercialmente por múltiples proveedores, incluidos ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, EUA (Cat. No. CYT-408-b) and ThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, EUA (proteína recombinante IL-21 humana, No. de cat. 14-8219
80). La secuencia de aminoácidos de IL-21 humana recombinante adecuada para su uso en la invención se proporciona en la Tabla 2 (SEQ ID NO:8).
Cuando se indica "una cantidad eficaz antitumoral", "una cantidad eficaz inhibidora de tumores" o "cantidad terapéutica", un médico puede determinar la cantidad precisa de las composiciones de la presente invención a administrar teniendo en cuenta las diferencias individuales de edad, peso, tamaño del tumor, extensión de la
infección o metástasis y estado del paciente (sujeto). En general, se puede afirmar que una composición farmacéutica que comprende los linfocitos que infiltran el tumor (por ejemplo, TIL secundarios o linfocitos citotóxicos modificados genéticamente) descrita en el presente documento puede administrarse en una dosis
de 104 a 1011 células/kg de peso corporal (por ejemplo, 105 a 106, 105 a 1010, 105 a 1011, 106 a 1010, 106 a 1011,
107 a 1011, 107 a 1010, 108 a 1011, 108 a 1010, 109 a 1011, o 109 a 1010 células/kg de peso todos los valores enteros dentro de esos intervalos. Las composiciones de linfocitos infiltrantes de tumores
(incluidos en algunos casos, linfocitos citotóxicos modificados genéticamente) también se pueden administrar
múltiples veces a estas dosis. Los linfocitos que infiltran el tumor (incluidos en algunos casos, genéticamente) pueden administrarse usando técnicas de infusión que se conocen comúnmente en inmunoterapia (véase, por ejemplo, Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319: 1676, 1988). Un experto en la técnica de la medicina puede determinar fácilmente la dosificación y el régimen de tratamiento óptimos para un paciente en particular controlando al paciente para detectar signos de enfermedad y ajustando el tratamiento en consecuencia.
El término "malignidad hematológica" se refiere a cánceres de mamíferos y tumores de los tejidos hematopoyéticos y linfoides, que incluyen, pero no se limitan a tejidos de la sangre, médula ósea, ganglios linfáticos y sistema linfático. Las neoplasias malignas hematológicas también se denominan "tumores líquidos". Las neoplasias malignas hematológicas incluyen, entre otras, leucemia linfoblástica aguda (LLA), linfoma linfocítico crónico (LLC), linfoma linfocítico pequeño (SLL), leucemia mielógena aguda (LMA), leucemia mielógena crónica (LMC), leucemia monocítica aguda (LMA), linfoma de Hodgkin y linfomas no Hodgkin. El término "neoplasia hematológica de células B" se refiere a neoplasias hematológicas que afectan a las células B.
El término "tumor sólido" se refiere a una masa anormal de tejido que normalmente no contiene quistes o áreas líquidas. Los tumores sólidos pueden ser benignos o malignos. El término cáncer de tumor sólido se refiere a tumores sólidos malignos, neoplásicos o cancerosos. Los cánceres de tumor sólido incluyen, pero no se limitan a, sarcomas, carcinomas y linfomas, tales como cánceres de pulmón, mama, próstata, colon, recto, y vejiga. La estructura tisular de los tumores sólidos incluye compartimentos de tejido interdependientes que incluyen el parénquima (células cancerosas) y las células estromales de soporte en las que se dispersan las células cancerosas y que pueden proporcionar un microambiente de soporte.
El término "tumor líquido" se refiere a una masa anormal de células que es de naturaleza fluida. Los cánceres de tumores líquidos incluyen, pero no se limitan a, leucemias, mielomas y linfomas, así como otras neoplasias malignas hematológicas. Los TIL obtenidos de tumores líquidos también pueden denominarse en el presente documento linfocitos infiltrantes de médula (MIL).
El término "microambiente", como se usa en este documento, puede referirse al microambiente tumoral sólido o hematológico como un todo o a un subconjunto individual de células dentro del microambiente. El microambiente tumoral, como se usa en este documento, se refiere a una mezcla compleja de "células, factores solubles, moléculas de señalización, matrices extracelulares y señales mecánicas que promueven la transformación neoplásica, apoyan el crecimiento e invasión tumoral, protegen el tumor de la inmunidad del huésped, fomentan la resistencia terapéutica y proporcionan nichos para que prosperen las metástasis dominantes", como se describe en Swartz, et al., Cancer Res., 2012, 72, 2473. Aunque los tumores expresan antígenos que deberían ser reconocidos por las células T, la eliminación del tumor por parte del sistema inmunológico es poco común debido a la inmunosupresión del microambiente.
También se divulga aunque no se reivindica un procedimiento para tratar un cáncer con una población de TIL, en el que un paciente se trata previamente con quimioterapia no mieloablativa antes de una infusión de TIL según la invención. Se puede proporcionar la población de TIL en la que un paciente se trata previamente con quimioterapia no mieloablativa antes de una infusión de TIL de acuerdo con la presente invención. La quimioterapia no mieloablativa puede ser ciclofosfamida 60 mg/kg/d durante 2 días (días 27 y 26 antes de la infusión de TIL) y fludarabina 25 mg/m2/d durante 5 días (días 27 a 23 antes de la infusión de TIL). Después de la quimioterapia no mieloablativo y la infusión de TIL (en el día 0), el paciente puede recibir una infusión intravenosa de<i L - 2>por vía intravenosa a 720,000 UI/kg cada 8 horas hasta tolerancia fisiológica.
Los hallazgos experimentales indican que el agotamiento de linfocitos (linfodepleción) antes de la transferencia adoptiva de linfocitos T específicos de tumor desempeña un papel clave en la mejora de la eficacia del tratamiento al eliminar las células T reguladoras y los elementos competidores del sistema inmunológico ("sumideros de citocinas"). Por consiguiente, una etapa de linfodepleción (a veces también denominada "acondicionamiento inmunosupresor") en el paciente puede ser utilizada antes de la introducción de las rTIL de la invención.
Los términos "coadministración", "coadministrar", "administrado en combinación con", "administrar en combinación con", "simultáneo" y "concurrente", como se usan en este documento, abarcan la administración de dos o más ingredientes farmacéuticos activos (en una forma de realización preferida de la presente invención, por ejemplo, al menos un agonista del canal de potasio en combinación con una pluralidad de TIL) a un sujeto de modo que ambos ingredientes farmacéuticos activos y/o sus metabolitos estén presentes en el sujeto al mismo tiempo. La coadministración incluye la administración simultánea en composiciones separadas, la administración en diferentes momentos en composiciones separadas o la administración en una composición en la que están presentes dos o más ingredientes farmacéuticos activos. Se prefiere la administración simultánea en composiciones separadas y la administración en una composición en la que están presentes ambos agentes.
El término "cantidad eficaz" o "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a la cantidad de un compuesto o combinación de compuestos como se describe en el presente documento que es suficiente para efectuar la aplicación pretendida que incluye, pero no se limita a, el tratamiento de enfermedades. Una cantidad terapéuticamente eficaz puede variar según la aplicación prevista (in vitro o in vivo), o el sujeto y la condición patológica que se está tratando (por ejemplo, el peso, la edad y el sexo del sujeto), la gravedad de la condición patológica, o la forma de administración. El término también se aplica a una dosis que inducirá una respuesta particular en las células diana (por ejemplo, la reducción de la adhesión plaquetaria y/o la migración celular). La dosis específica variará dependiendo de los compuestos particulares elegidos, el régimen de dosificación a seguir, si el compuesto se administra en combinación con otros compuestos, el momento de administración, el tejido al que se administra y el sistema de administración física en el que se transporta el compuesto.
Los términos "tratamiento", "tratar", "trato" y similares, se refieren a la obtención de un efecto farmacológico y/o fisiológico deseado. El efecto puede ser profiláctico en términos de prevención completa o parcial de una enfermedad o síntoma de la misma y/o puede ser terapéutico en términos de curación parcial o completa de una enfermedad y/o efecto adverso atribuible a la enfermedad. "Tratamiento", como se usa en este documento, cubre cualquier tratamiento de una enfermedad en un mamífero, particularmente en un ser humano, e incluye: (a) prevenir que la enfermedad ocurra en un sujeto que puede estar predispuesto a la enfermedad pero que aún no ha sido diagnosticado con tenerla; (b) inhibir la enfermedad, es decir, detener su desarrollo o progresión; y (c) aliviar la enfermedad, es decir, provocar la regresión de la enfermedad y/o aliviar uno o más síntomas de la enfermedad. "Tratamiento" también pretende abarcar la administración de un agente para proporcionar un efecto farmacológico, incluso en ausencia de una enfermedad o afección. Por ejemplo, "tratamiento" abarca la administración de una composición que puede provocar una respuesta inmune o conferir inmunidad en ausencia de una enfermedad, por ejemplo, en el caso de una vacuna.
El término "heterólogo" cuando se usa con referencia a porciones de un ácido nucleico o proteína indica que el ácido nucleico o proteína comprende dos o más subsecuencias que no se encuentran en la misma relación entre sí en la naturaleza. Por ejemplo, el ácido nucleico se produce típicamente de forma recombinante, teniendo dos o más secuencias de genes no relacionados dispuestos para producir un nuevo ácido nucleico funcional, por ejemplo, un promotor de una fuente y una región codificante de otra fuente, o regiones codificantes de diferentes fuentes. De manera similar, una proteína heteróloga indica que la proteína comprende dos o más subsecuencias que no se encuentran en la misma relación entre sí en la naturaleza (por ejemplo, una proteína de fusión).
Los términos "identidad de secuencia", "porcentaje de identidad" y "porcentaje de identidad de secuencia" (o sinónimos de los mismos, por ejemplo, "99% idéntico") en el contexto de dos o más ácidos nucleicos o polipéptidos, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o tienen un porcentaje específico de nucleótidos o residuos de aminoácidos que son iguales, cuando se comparan y alinean (introduciendo espacios, si es necesario) para una correspondencia máxima, sin considerar ninguna sustitución conservadora de aminoácidos como parte de la identidad de secuencia. El porcentaje de identidad se puede medir utilizando software o algoritmos de comparación de secuencias o mediante inspección visual. Se conocen en la técnica diversos algoritmos y software que pueden usarse para obtener alineamientos de secuencias de aminoácidos o nucleótidos. Los programas adecuados para determinar el porcentaje de identidad de secuencia incluyen, por ejemplo, el conjunto de programas BLAST disponibles en el sitio web BLAST del Centro Nacional de Información Biotecnológica del Gobierno de EE. UU. Las comparaciones entre dos secuencias se pueden realizar utilizando el algoritmo BLASTN o BLASTP. BLASTN se usa para comparar secuencias de ácidos nucleicos, mientras que BLASTP se usa para comparar secuencias de aminoácidos. ALIGN, ALIGN-2 (Genentech, South San Francisco, California) o MegAlign, disponibles en DNASTAR, son programas de software adicionales disponibles públicamente que pueden usarse para alinear secuencias. Un experto en la técnica puede determinar los parámetros apropiados para la alineación máxima mediante un software de alineación particular. En determinadas formas de realización, se utilizan los parámetros predeterminados del software de alineación.
Como se usa en este documento, el término "variante" abarca, pero no se limita a anticuerpos o proteínas de fusión que comprenden una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo de referencia por medio de una o más sustituciones, deleciones y/o adiciones en ciertas posiciones dentro o adyacentes a la secuencia de aminoácidos del anticuerpo de referencia. La variante puede comprender una o más sustituciones conservadoras en su secuencia de aminoácidos en comparación con la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo de referencia. Las sustituciones conservadoras pueden implicar, por ejemplo, la sustitución de aminoácidos cargados de manera similar o no cargados. La variante conserva la capacidad de unirse específicamente al antígeno del anticuerpo de referencia. El término variante también incluye anticuerpos o proteínas pegilados.
Por "linfocitos infiltrantes de tumores" o "TIL" se entiende en la presente una población de células obtenidas originalmente como glóbulos blancos que han abandonado el torrente sanguíneo de un sujeto y migrado a un tumor. Los TIL incluyen, pero no se limitan a, células T citotóxicas CD8+ (linfocitos), células T Th1 y Th17 CD4+, células asesinas naturales, células dendríticas y macrófagos M1. Los TIL incluyen tanto los TIL primarios como los secundarios. Los "TIL primarios" son aquellos que se obtienen de muestras de tejido de pacientes como se describe en este documento (a veces denominadas "recién recolectadas"), y los "TIL secundarios" son cualquier población de células TIL que se hayan expandido o proliferado como se discute en la presente, que incluyen, pero no se limitan a TIL a granel, TIL expandidos ("REP TIL") así como "reREP TIL" como se discuten en el presente documento. Los reREP TIL pueden incluir, por ejemplo, TIL de segunda expansión o TIL de segunda expansión adicional (como, por ejemplo, los descritos en la etapa D de la Figura 27, incluidos los TIL denominados reREP TIL).
Los TIL generalmente se pueden definir bioquímicamente, usando marcadores de superficie celular, o funcionalmente, por su capacidad para infiltrar tumores y efectuar el tratamiento. Los TIL generalmente se pueden clasificar expresando uno o más de los siguientes biomarcadores: CD4, CD8, TCR ap, CD27, CD28, CD56, CCR7, CD45Ra, CD95, PD-1 y CD25. Además, y de forma alternativa, los TIL pueden definirse funcionalmente por su capacidad para infiltrar tumores sólidos tras la reintroducción en un paciente. Los TIL pueden caracterizarse además por su potencia; por ejemplo, los TIL pueden considerarse potentes si, por ejemplo, la liberación de interferón (IFN) es mayor que aproximadamente 50 pg/ml, mayor que aproximadamente 100 pg/ml, mayor que aproximadamente 150 pg/ml o superior a aproximadamente 20o pg/ml.
Los términos "vehículo farmacéuticamente aceptable" o "excipiente farmacéuticamente aceptable" pretenden incluir todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, revestimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardadores de la absorción e ingredientes inertes. El uso de tales vehículos farmacéuticamente aceptables o excipientes farmacéuticamente aceptables para ingredientes farmacéuticos activos es bien conocido en la técnica. Excepto en la medida en que cualquier vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable convencional sea incompatible con el ingrediente farmacéutico activo, se contempla su uso en las composiciones terapéuticas de la invención. Ingredientes farmacéuticos activos adicionales, como otros medicamentos, también se pueden incorporar a las composiciones y procedimientos descritos.
Los términos "alrededor de" y "aproximadamente" significan que están dentro de un rango estadísticamente significativo de un valor. Tal intervalo puede estar dentro de un orden de magnitud, preferiblemente dentro del 50%, más preferiblemente dentro del 20%, más preferiblemente todavía dentro del 10%, e incluso más preferiblemente dentro del 5% de un valor o intervalo dado. La variación permisible abarcada por los términos "alrededor de" o "aproximadamente" depende del sistema particular en estudio y puede ser fácilmente apreciada por un experto en la técnica. Además, como se usa en este documento, los términos "alrededor de" y "aproximadamente" significan que las dimensiones, tamaños, formulaciones, parámetros, formas y otras cantidades y características no son y no necesitan ser exactos, pero pueden ser aproximados y/o mayores o menores. según se desee, reflejando tolerancias, factores de conversión, redondeo, error de medición y similares, y otros factores conocidos por los expertos en la técnica. En general, una dimensión, tamaño, formulación, parámetro, forma u otra cantidad o característica es "aproximada" si se indica expresamente o no que sea así. Se observa que las formas de realización de tamaños, formas y dimensiones muy diferentes pueden emplear las disposiciones descritas.
Los términos transitorios "que comprende", "que consiste esencialmente en" y "que consiste en", cuando se usan en las reivindicaciones adjuntas, en forma original y enmendada, definen el alcance de la reivindicación con respecto a los elementos o etapas adicionales de la reivindicación no citados, si los hubiera, están excluidos del alcance de la (s) reivindicación (es). El término "que comprende" pretende ser inclusivo o ilimitado y no excluye ningún elemento, procedimiento, etapa o material adicional no mencionado. El término "que consiste en" excluye cualquier elemento, etapa o material que no sean los especificados en la reivindicación y, en este último caso, las impurezas ordinarias asociadas con el o los materiales especificados. El término "que consiste esencialmente en" limita el alcance de una reivindicación a elementos, etapas o material(es) especificados y aquellos que no afecten materialmente a las características básicas y nuevas de la invención reivindicada. En formas de realización alternativas, todas las composiciones, procedimientos y kits descritos en el presente documento pueden definirse más específicamente mediante cualquiera de los términos de transición "que comprende", "que consiste esencialmente en" y "que consiste en".
III. Procedimientos de fabricación de TIL
Un ejemplo de procedimiento de TIL conocido como procedimiento 2A que contiene algunas de estas características se representa en la Figura 1, y algunas de las ventajas de esta forma de realización de la presente invención sobre el procedimiento 1C se describen en la Figura 2, al igual que la Figura 84. El procedimiento 1C se muestra a modo de comparación en la Figura 3. En la Figura 4 (recuentos de células más altos) y en la Figura 5 (recuentos de células más bajos) se muestran dos líneas de tiempo alternativas para la terapia TIL basadas en el procedimiento 2A. En la Figura 6 y en la Figura 27 se muestra una forma de realización del procedimiento 2A. Las figuras 83 y 84 proporcionan además un procedimiento 2A ejemplar en comparación con un procedimiento 1C ejemplar.
Tal como se discute en el presente documento, la presente invención puede incluir una etapa relacionada con la reestimulación de TIL crioconservados para aumentar su actividad metabólica y, por tanto, su salud relativa antes del trasplante en un paciente, y procedimientos para probar dicha salud metabólica. Como se describe en general en el presente documento, los TIL generalmente se toman de una muestra de paciente y se manipulan para expandir su número antes del trasplante a un paciente. En algunas formas de realización, los TIL pueden manipularse genéticamente opcionalmente como se discute a continuación.
En algunas formas de realización, los TIL se pueden crioconservar. Una vez descongelados, también pueden reestimularse para aumentar su metabolismo antes de la infusión a un paciente.
La primera expansión (incluidos los procedimientos denominados preREP, así como los procedimientos que se muestran en la Figura 27 como Etapa A) se puede acortar a 3 a 14 días y la segunda expansión (incluidos los procedimientos denominados REP, así como los procedimientos que se muestran en la Figura 27 como Etapa B) se puede acortar a 7 a 14 días, como se discute en detalle a continuación, así como en los ejemplos y figuras. En algunas formas de realización, la primera expansión (por ejemplo, una expansión descrita como Etapa B en la Figura 27) se acorta a 11 días y la segunda expansión (por ejemplo, una expansión como se describe en la etapa D en la Figura 27) se acorta a 11 días, como se discute en los Ejemplos y se muestra en las Figuras 4, 5 y 27. En algunas formas de realización, la combinación de la primera expansión y la segunda expansión (por ejemplo, las expansiones descritas como Etapa B y Etapa D en la Figura 27) se acorta a 22 días, como se explica en detalle a continuación y en los ejemplos y figuras.
Las denominaciones de "etapa" A, B, C, etc., más adelante, se refieren a la figura 27 y a determinadas formas de realización descritas en el presente documento. El orden de las etapas a continuación y en la Figura 27 es ejemplar y cualquier combinación u orden de etapas, así como etapas adicionales, repetición de etapas y/u omisión de etapas está contemplada por la presente solicitud y los procedimientos descritos en este documento.
A. ETAPA A: Obtener una muestra de tumor del paciente
En general, los TIL se obtienen inicialmente de una muestra de tumor del paciente ("TIL primarios") y luego se expanden a una población más grande para su manipulación adicional como se describe en este documento, opcionalmente crioconservados, reestimulados como se describe en este documento y opcionalmente evaluados para fenotipo y parámetros metabólicos como una indicación de la salud de TIL.
Puede obtenerse una muestra de tumor de un paciente usando procedimientos conocidos en la técnica, generalmente mediante extirpación quirúrgica, biopsia con aguja u otros medios para obtener una muestra que contiene una mezcla de células tumorales y TIL. En general, la muestra de tumor puede ser de cualquier tumor sólido, incluidos tumores primarios, tumores invasores o tumores metastásicos. La muestra de tumor también puede ser un tumor líquido, como un tumor obtenido de una neoplasia maligna hematológica. El tumor sólido puede ser de cualquier tipo de cáncer, incluidos, entre otros, mama, páncreas, próstata, colorrectal, pulmón, cerebro, riñón, estómago y piel (incluidos, entre otros, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basales y melanoma). En algunas formas de realización, se obtienen TIL útiles a partir de tumores de melanoma malignos, ya que se ha informado que estos tienen niveles particularmente altos de TIL.
El término "tumor sólido" se refiere a una masa anormal de tejido que generalmente no contiene quistes o áreas líquidas. Los tumores sólidos pueden ser benignos o malignos. El término "cáncer de tumor sólido" se refiere a tumores sólidos malignos, neoplásicos o cancerosos. Los cánceres de tumores sólidos incluyen, pero no se limitan a, sarcomas, carcinomas y linfomas, tales como cánceres de pulmón, mama, cáncer de mama triple negativo, próstata, colon, recto y vejiga. En algunas formas de realización, el cáncer se selecciona entre cáncer de cuello uterino, cáncer de cabeza y cuello (que incluye, por ejemplo, carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (HNSCC)) glioblastoma, cáncer de ovario, sarcoma, cáncer de páncreas, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer de mama triple negativo y carcinoma de pulmón de células no pequeñas. La estructura tisular de los tumores sólidos incluye compartimentos de tejido interdependientes que incluyen el parénquima (células cancerosas) y las células estromales de soporte en las que se dispersan las células cancerosas y que pueden proporcionar un microambiente de soporte.
El término "neoplasia maligna hematológica" se refiere a cánceres de mamíferos y tumores de los tejidos hematopoyéticos y linfoides, que incluyen, pero no se limitan a, tejidos de la sangre, médula ósea, ganglios linfáticos y sistema linfático. Las neoplasias malignas hematológicas también se denominan "tumores líquidos". Las neoplasias malignas hematológicas incluyen, entre otras, leucemia linfoblástica aguda (LLA), linfoma linfocítico crónico (LLC), linfoma linfocítico pequeño (SLL), leucemia mielógena aguda (LMA), leucemia mielógena crónica (LMC), leucemia monocítica aguda (LMA), linfoma de Hodgkin y linfomas no Hodgkin. El término "neoplasia hematológica de células B" se refiere a neoplasias hematológicas que afectan a las células B.
Una vez obtenida, la muestra de tumor se fragmenta generalmente usando disección aguda en pequeños trozos de entre 1 y aproximadamente 8 mm3, siendo particularmente útil de aproximadamente 2-3 mm3. Los TIL se cultivan a partir de estos fragmentos utilizando digestiones tumorales enzimáticas. Tales digestiones tumorales pueden producirse mediante incubación en medio enzimático (por ejemplo, regulador de pH 1640 del Roswell Park Memorial Institute (RPMI), glutamato de 2 mM, gentamicina de 10 mcg/ml, 30 unidades/ml de DNasa y 1.0 mg/ml de colagenasa) seguido de disociación mecánica (por ejemplo, utilizando un disociador de tejidos). Se pueden producir digestiones tumorales colocando el tumor en medios enzimáticos y disociando mecánicamente el tumor durante aproximadamente 1 minuto, seguido de incubación durante 30 minutos a 37 °C en CO<2>al 5%, seguido de ciclos repetidos de disociación mecánica e incubación en las condiciones anteriores hasta que solo queden pequeños trozos de tejido. Al final de este procedimiento, si la suspensión celular contiene una gran cantidad de glóbulos rojos o células muertas, se puede realizar una separación en gradiente de densidad utilizando polisacárido hidrófilo ramificado FICOLL para eliminar estas células. Pueden usarse procedimientos alternativos conocidos en la técnica, tales como los descritos en la Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos No. 2012/0244133 A1. Cualquiera de los procedimientos anteriores puede usarse en cualquiera de las formas de realización descritas en el presente documento para procedimientos de expansión de TIL.
En general, la suspensión de células recolectadas se denomina "población de células primarias" o población de células "recién recolectadas".
En algunas formas de realización, la fragmentación incluye la fragmentación física que incluye, por ejemplo, disección y digestión. En algunas formas de realización, la fragmentación es una fragmentación física. En algunas formas de realización, la fragmentación es disección. En algunas formas de realización, la fragmentación se realiza por digestión. En algunas formas de realización, los TIL pueden cultivarse inicialmente a partir de digestiones enzimáticas de tumores y de fragmentos tumorales obtenidos de pacientes. En una forma de realización, los TIL se pueden cultivar inicialmente a partir de digestiones tumorales enzimáticas y fragmentos tumorales obtenidos de pacientes.
En algunas formas de realización, donde el tumor es un tumor sólido, el tumor se somete a fragmentación física después de que se obtiene la muestra de tumor, por ejemplo, en la etapa A (como se proporciona en la Figura 27). En algunas formas de realización, la fragmentación se produce antes de la crioconservación. En algunas formas de realización, la fragmentación se produce después de la crioconservación. En algunas formas de realización, la fragmentación se produce después de obtener el tumor y en ausencia de cualquier crioconservación. En algunas formas de realización, el tumor se fragmenta y se colocan 10, 20, 30, 40 o más fragmentos o piezas en cada recipiente para la primera expansión. En algunas formas de realización, el tumor se fragmenta y se colocan 30 o 40 fragmentos o piezas en cada recipiente para la primera expansión. En algunas formas de realización, el tumor se fragmenta y se colocan 40 fragmentos o piezas en cada recipiente para la primera expansión. En algunas formas de realización, los múltiples fragmentos comprenden aproximadamente 4 a aproximadamente 50 fragmentos, en los que cada fragmento tiene un volumen de aproximadamente 27 mm<3>. En algunas formas de realización, los fragmentos múltiples comprenden aproximadamente 30 a aproximadamente 60 fragmentos con un volumen total de aproximadamente 1300 mm<3>a aproximadamente 1500 mm<3>. En algunas formas de realización, los múltiples fragmentos comprenden aproximadamente 50 fragmentos con un volumen total de aproximadamente 1350 mm<3>. En algunas formas de realización, los fragmentos múltiples comprenden aproximadamente 50 fragmentos con una masa total de aproximadamente 1 gramo a aproximadamente 1.5 gramos. En algunas formas de realización, los múltiples fragmentos comprenden aproximadamente 4 fragmentos.
En algunas formas de realización, los TIL se obtienen a partir de fragmentos tumorales. En algunas formas de realización, el fragmento de tumor se obtiene mediante disección aguda. En algunas formas de realización, el fragmento de tumor tiene entre aproximadamente 1 mm<3>y 10 mm<3>. En algunas formas de realización, el fragmento de tumor tiene entre aproximadamente 1 mm<3>y 8 mm<3>. En algunas formas de realización, el fragmento de tumor es de aproximadamente 1 mm<3>. En algunas formas de realización, el fragmento de tumor mide aproximadamente 2 mm<3>. En algunas formas de realización, el fragmento de tumor mide aproximadamente 3 mm<3>. En algunas formas de realización, el fragmento de tumor mide aproximadamente 4 mm<3>. En algunas formas de realización, el fragmento de tumor mide aproximadamente 5 mm<3>. En algunas formas de realización, el fragmento de tumor mide aproximadamente 6 mm<3>. En algunas formas de realización, el fragmento de tumor mide aproximadamente 7 mm<3>. En algunas formas de realización, el fragmento de tumor mide aproximadamente 8 mm<3>. En algunas formas de realización, el fragmento de tumor mide aproximadamente 9 mm<3>. En algunas formas de realización, el fragmento de tumor tiene aproximadamente 10 mm<3>.
En algunas formas de realización, los TIL se obtienen a partir de digestiones de tumor. En algunas formas de realización, los digeridos tumorales se generaron mediante incubación en medio enzimático, por ejemplo, pero sin limitarse a RPMI 1640, GlutaMAX de 2 mM, gentamicina de 10 mg/ml, DNasa de 30 U/ml y colagenasa de 1.0 mg/ml, seguido de disociación mecánica (GentleMACS, Miltenyi Biotec, Auburn, CA). Después de colocar el tumor en medio enzimático, el tumor se puede disociar mecánicamente durante aproximadamente 1 minuto. Luego, la solución se puede incubar durante 30 minutos a 37 °C en CO<2>al 5% y luego se puede romper mecánicamente nuevamente durante aproximadamente 1 minuto. Después de incubarse nuevamente durante 30 minutos a 37 °C en CO<2>al 5%, el tumor puede romperse mecánicamente por tercera vez durante aproximadamente 1 minuto. En algunas formas de realización, después de la tercera rotura mecánica, si estaban presentes grandes trozos de tejido, se aplicaron 1 o 2 disociaciones mecánicas adicionales a la muestra, con o sin 30 minutos adicionales de incubación a 37 °C en CO<2>al 5%. En algunas formas de realización, al terminare la incubación final, si la suspensión celular contenía un gran número de glóbulos rojos o células muertas, se puede realizar una separación en gradiente de densidad usando Ficoll para eliminar estas células.
En algunas formas de realización, la suspensión de células recolectadas antes de la primera etapa de expansión se denomina "población de células primarias" o población de células "recién recolectadas".
En algunas formas de realización, las células pueden congelarse opcionalmente después de la recolección de la muestra y almacenarse congeladas antes de pasar a la expansión descrita en la etapa B, que se describe con más detalle más adelante, así como se ejemplifica en la Figura 27.
B. ETAPA B: Primera expansión
1. TIL jóvenes
En algunas formas de realización, los presentes procedimientos proporcionan la obtención de TIL jóvenes, que son capaces de aumentar los ciclos de replicación tras la administración a un sujeto/paciente y, como tales, pueden proporcionar beneficios terapéuticos adicionales sobre los TIL más antiguos (es decir, TIL que se han sometido además a más rondas de replicación antes de la administración a un sujeto/paciente). Las características de los TIL jóvenes se han descrito en la literatura, por ejemplo, Donia, at al., Scandinavian Journal of Immunology, 75:157-167 (2012); Dudley et al., Clin Cancer Res, 16:6122-6131 (2010); Huang et al., J Immunother, 28(3):258-267 (2005); Besser et al., Clin Cancer Res, 19(17):OF1-OF9 (2013); Besser et al., J Immunother 32:415-423 (2009); Robbins, et al., J Immunol 2004; 173:7125-7130; Shen et al., J Immunother, 30:123-129 (2007); Zhou, et al., J Immunother, 28:53-62 (2005); and Tran, et al., J Immunother, 31:742-751 (2008).
Los diversos receptores de antígenos de los linfocitos T y B se producen por recombinación somática de un número limitado, pero grande, de segmentos de genes. Estos segmentos de genes: V (variable), D (diversidad), J (unión) y C (constante), determinan la especificidad de enlace y las aplicaciones posteriores de inmunoglobulinas y receptores de células T (TCR). La presente invención proporciona un procedimiento para generar TIL que exhiben y aumentan la diversidad del repertorio de células T. En algunas formas de realización, los TIL obtenidos por el presente procedimiento exhiben un aumento en la diversidad del repertorio de células T. En algunas formas de realización, los TIL obtenidos mediante el presente procedimiento exhiben un aumento en la diversidad del repertorio de células T en comparación con los TIL recién recolectados y/o TIL preparados utilizando otros procedimientos distintos a los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura. 27. En algunas formas de realización, los TIL obtenidos mediante el presente procedimiento exhiben un aumento en la diversidad del repertorio de células T en comparación con los TIL recién recolectados y/o los TIL preparados usando procedimientos denominados procedimiento 1C, como se ejemplifica en la Figura 83. En algunas formas de realización, los TIL obtenidos en la primera expansión exhiben un aumento en la diversidad del repertorio de células T. En algunas formas de realización, el aumento de la diversidad es un aumento de la diversidad de inmunoglobulinas y/o la diversidad del receptor de células T. En algunas formas de realización, la diversidad está en la inmunoglobulina; está en la cadena pesada de inmunoglobulina. En algunas formas de realización, la diversidad está en la inmunoglobulina; está en la cadena ligera de inmunoglobulina. En algunas formas de realización, la diversidad está en el receptor de células T. En algunas formas de realización, la diversidad está en uno de los receptores de células T seleccionados del grupo que consiste en receptores alfa, beta, gamma y delta. En algunas formas de realización, hay un aumento en la expresión del receptor de células T (TCR) alfa y/o beta. En algunas formas de realización, hay un aumento en la expresión del receptor alfa de células T (TCR). En algunas formas de realización, hay un aumento en la expresión del receptor de células T (TCR) beta. En algunas formas de realización, hay un aumento en la expresión de TCRab (es decir, TCRa/p).
Después de la disección o digestión de los fragmentos tumorales, por ejemplo, como se describe en la etapa A de la Figura 27, las células resultantes se cultivan en suero que contiene IL-2 en condiciones que favorecen el crecimiento de TIL sobre el tumor y otras células. En algunas formas de realización, los digeridos tumorales se incuban en pocillos de 2 ml en un medio que comprende suero AB humano inactivado con 6000 UI/ml de IL-2. Esta población de células primarias se cultiva durante un período de días, generalmente de 3 a 14 días, dando como resultado una población de TIL a granel, generalmente alrededor de 1 x 108 células TIL a granel. Esta población de células primarias se puede cultivar durante un período de 7 a 14 días, dando como resultado una población de TIL a granel, generalmente alrededor de 1 x 108 células de TIL a granel. Alternativamente, esta población de células primarias se cultiva durante un período de 10 a 14 días, lo que da como resultado una población de TIL a granel, generalmente aproximadamente 1 x 108 células de TIL a granel. En algunas formas de realización, esta población de células primarias se cultiva durante un período de aproximadamente 11 días, lo que da como resultado una población de TIL a granel, generalmente alrededor de 1 x 108 células de TIL a granel.
En una forma de realización preferida, la expansión de TIL se puede realizar utilizando una etapa de expansión de TIL a granel inicial (por ejemplo, como los descritos en la etapa B de la Figura 27, que puede incluir procedimientos denominados pre-REP) como se describe más adelante y en el presente documento, seguido por una segunda expansión (Etapa D, incluidos los procedimientos denominados etapas del protocolo de expansión rápida (REP)) como se describe más adelante en la etapa D y en este documento, seguido de una crioconservación opcional, y seguida de una segunda Etapa D (incluidos los procedimientos denominados etapas de reestimulación REP) como se describe más adelante y en este documento. Los TIL obtenidos de este procedimiento se pueden caracterizar opcionalmente por características fenotípicas y parámetros metabólicos como se describe en el presente documento.
En formas de realización en las que los cultivos de TIL se inician en placas de 24 pocillos, por ejemplo, usando un grupo de cultivo celular Costar de 24 pocillos, fondo plano (Corning Incorporated, Corning, NY, cada pocillo se puede sembrar con 1 x 106 células de digestión tumoral o un fragmento de tumor en 2 mL de medio completo (CM) con IL-2 (6000 UI/ml; Chiron Corp., Emeryville, CA). En algunas formas de realización, el fragmento de tumor está entre aproximadamente 1 mm3y 10 mm3
En algunas formas de realización, el primer medio de cultivo de expansión se denomina "CM", una abreviatura de medios de cultivo. En algunas formas de realización, CM para la etapa B consiste en RPMI 1640 con GlutaMAX, suplementado con suero AB humano al 10%, Hepes de 25 mM y gentamicina de 10 mg/ml. En formas de realización en las que los cultivos se inician en matraces permeables al gas con una capacidad de 40 ml y un fondo de silicio permeable al gas de 10 cm2 (por ejemplo, G-Rex10; Wilson Wolf Manufacturing, New Brighton, MN) (figura 1), cada matraz se cargó con 10-40 x 106 células de digestión tumoral viables o 5 30 fragmentos tumorales en 10-40 ml de CM con IL-2. Tanto las placas de G-Rex10 como las de 24 pocillos se incubaron en una incubadora humidificada a 37°C en CO<2>al 5% y 5 días después del inicio del cultivo se retiró la mitad del medio y se reemplazó con CM e IL-2 frescos y después del día 5 la mitad de los medios se cambió cada 2-3 días.
Después de la preparación de los fragmentos tumorales, las células resultantes (es decir, los fragmentos) se cultivan en suero que contiene IL-2 en condiciones que favorecen el crecimiento de TIL sobre el tumor y otras células. En algunas formas de realización, los digeridos tumorales se incuban en pocillos de 2 ml en medios que comprenden suero AB humano inactivado (o, en algunos casos, como se describe en este documento, en presencia de una población de células APC) con 6000 UI/ml de IL-2. Esta población de células primarias se cultiva durante un período de días, generalmente de 10 a 14 días, dando como resultado una población de TIL a granel, generalmente alrededor de 1 x 108 células de TIL a granel. En algunas formas de realización, los medios de crecimiento durante la primera expansión comprenden IL-2 o una variante de la misma. En algunas formas de realización, la IL es IL-2 humana recombinante (rhIL-2). En algunas formas de realización, la solución madre de IL-2 tiene una actividad específica de 20-30 x 106 UI/mg para un vial de 1 mg. En algunas formas de realización, la solución madre de IL-2 tiene una actividad específica de 20 x 106 UI/mg para un vial de 1 mg. En algunas formas de realización, la solución madre de IL-2 tiene una actividad específica de 25 x 106 UI/mg para un vial de 1 mg. En algunas formas de realización, la solución madre de IL-2 tiene una actividad específica de 30 x 106 UI/mg para un vial de 1 mg. En algunas formas de realización, la solución madre de IL-2 tiene una concentración final de 4-8 x 106 UI/mg de IL-2. En algunas formas de realización, la solución madre de IL-2 tiene una concentración final de 5-7 x 106 UI/mg de IL-2. En algunas formas de realización, la solución madre de IL-2 tiene una concentración final de 6 x 106 UI/mg de IL-2. En algunas formas de realización, la solución madre de IL-2 se prepara como se describe en el Ejemplo 4. En algunas formas de realización, el primer medio de cultivo de expansión comprende alrededor de 10,000 UI/ml de IL-2, alrededor de 9,000 UI/ml de IL-2, alrededor de 8,000 UI/ml de IL-2, alrededor de 7,000 UI/ml de IL-2, alrededor de 6000 UI/ml de IL-2 o alrededor de 5,000 UI/ml de IL-2. En algunas formas de realización, el primer medio de cultivo de expansión comprende alrededor de 9,000 UI/ml de IL-2 a alrededor de 5,000 UI/ml de IL-2. En algunas formas de realización, el primer medio de cultivo de expansión comprende alrededor de 8,000 UI/ml de IL-2 a alrededor de 6,000 UI/ml de IL-2. En algunas formas de realización, el primer medio de cultivo de expansión comprende alrededor de 7,000 UI/ml de IL-2 a alrededor de 6,000 UI/ml de IL-2. En algunas formas de realización, el primer medio de cultivo de expansión comprende alrededor de 6,000 UI/ml de IL-2. En una forma de realización, el medio de cultivo celular comprende además IL-2. En algunas formas de realización, el medio de cultivo celular comprende alrededor de 3000 UI/ml de IL-2. En una forma de realización, el medio de cultivo celular comprende además IL-2. En una forma de realización preferida, el medio de cultivo celular comprende alrededor de 3000 UI/ml de IL-2. En una forma de realización, el medio de cultivo celular comprende alrededor de 1000 UI/ml, alrededor de 1500 UI/ml, alrededor de 2000 UI/ml, alrededor de 2500 UI/ml, alrededor de 3000 UI/ml, alrededor de 3500 UI/ml, alrededor de 4000 UI/ml, alrededor de 4500 UI/ml, alrededor de 5000 UI/ml, alrededor de 5500 UI/ml, alrededor de 6000 UI/ml, alrededor de 6500 UI/ml, alrededor de 7000 UI/ml, alrededor de 7500 UI/ml o alrededor de 8000 UI/ml de IL-2. En una forma de realización, el medio de cultivo celular comprende entre 1000 y 2000 UI/ml, entre 2000 y 3000 UI/ml, entre 3000 y 4000 UI/ml, entre 4000 y 5000 UI/ml, entre 5000 y 6000 UI/ml, entre 6000 y 7000 UI/ml, entre 7000 y 8000 UI/ml, o alrededor de 8000 UI/ml de IL-2.
En algunas formas de realización, el primer medio de cultivo de expansión comprende alrededor de 500 UI/ml de IL-15, alrededor de 400 UI/ml de IL-15, alrededor de 300 UI/ml de IL-15, alrededor de 200 UI/ml de IL-15, alrededor de 180 UI/ml de IL-15, alrededor de 160 UI/ml de IL-15, alrededor de 140 UI/ml de IL-15, alrededor de 120 UI/ml de IL-15 o alrededor de 100 UI/ml de IL-15. En algunas formas de realización, el primer medio de cultivo de expansión comprende alrededor de 500 UI/ml de IL-15 a alrededor de 100 UI/ml de iL-15. En algunas formas de realización, el primer medio de cultivo de expansión comprende de alrededor de 400 UI/ml de IL-15 a alrededor de 100 Ul/ml de IL-15. En algunas formas de realización, el primer medio de cultivo de expansión comprende alrededor de 300 UI/ml de IL-15 a alrededor de 100 UI/ml de IL-15. En algunas formas de realización, el primer medio de cultivo de expansión comprende alrededor de 200 UI/ml de IL-15. En algunas formas de realización, el medio de cultivo celular comprende alrededor de 180 UI/ml de IL-15. En una forma de realización, el medio de cultivo celular comprende además IL-15. En una forma de realización preferida, el medio de cultivo celular comprende alrededor de 180 UI/ml de IL-15.
En algunas formas de realización, el primer medio de cultivo de expansión comprende alrededor de 20 UI/ml de IL-21, alrededor de 15 UI/ml de IL-21, alrededor de 12 UI/ml de IL-21, alrededor de 10 UI/ml de IL-21, alrededor de 5 UI/ml de IL-21, alrededor de 4 UI/ml de IL-21, alrededor de 3 UI/ml de IL-21, alrededor de 2 UI/ml de IL-21, alrededor de 1 UI/ml de IL-21, o alrededor de 0.5 UI/ml de IL-21. En algunas formas de realización, el primer medio de cultivo de expansión comprende alrededor de 20 UI/ml de IL-21 a alrededor de 0.5 UI/ml de IL-21. En algunas formas de realización, el primer medio de cultivo de expansión comprende alrededor de 15 UI/ml de IL-21 a alrededor de 0.5 UI/ml de IL-21. En algunas formas de realización, el primer medio de cultivo de expansión comprende alrededor de 12 UI/ml de IL-21 a alrededor de 0.5 UI/ml de IL-21. En algunas formas de realización, el primer medio de cultivo de expansión comprende alrededor de 10 UI/ml de IL-21 a alrededor de 0.5 UI/ml de IL-21. En algunas formas de realización, el primer medio de cultivo de expansión comprende alrededor de 5 UI/ml de IL-21 a alrededor de 1 UI/ml de iL-21. En algunas formas de realización, el primer medio de cultivo de expansión comprende alrededor de 2 Ul/ml de IL-21. En algunas formas de realización, el medio de cultivo celular comprende alrededor de 1 Ul/ml de IL-21. En algunas formas de realización, el medio de cultivo celular comprende alrededor de 0.5 Ul/ml de IL-21. En una forma de realización, el medio de cultivo celular comprende además IL-21. En una forma de realización preferida, el medio de cultivo celular comprende alrededor de 1 Ul/ml de IL-21.
En algunas formas de realización, el primer medio de cultivo de expansión se denomina "CM", una abreviatura de medios de cultivo. En algunas formas de realización, se denomina CM1 (medio de cultivo 1). En algunas formas de realización, CM consta de RPMI 1640 con GlutaMAX, suplementado con suero AB humano al 10%, Hepes de 25 mM y gentamicina de 10 mg/ml. En formas de realización en las que los cultivos se inician en matraces permeables al gas con una capacidad de 40 ml y un fondo de silicio permeable al gas de 10 cm2 (por ejemplo, G-Rex10; Wilson Wolf Manufacturing, New Brighton, MN) (figura 1), cada matraz se cargó con 10-40 x 106 células de digestión tumoral viables o 5-30 fragmentos tumorales en 10-40 ml de CM con IL-2. Tanto las placas de G-Rex10 como las de 24 pocillos se incubaron en una incubadora humidificada a 37°C en CO<2>al 5% y 5 días después del inicio del cultivo se retiró la mitad del medio y se reemplazó con CM e IL-2 frescos y después del día 5 la mitad de los medios se cambió cada 2-3 días. En algunas formas de realización, el CM es el CM1 descrito en los Ejemplos, ver Ejemplo 5. En algunas formas de realización, la primera expansión ocurre en un medio de cultivo celular inicial o en un primer medio de cultivo celular. En algunas formas de realización, el medio de cultivo celular inicial o el primer medio de cultivo celular comprende IL-2.
El primer procedimiento de expansión (que incluye procedimientos como, por ejemplo, los descritos en la etapa B de la Figura 27, que puede incluir los que a veces se denominan pre-REP) puede acortarse a 3-14 días, como se explica en los ejemplos y figuras. La primera expansión (incluidos los procedimientos como, por ejemplo, los descritos en la etapa B de la Figura 27, que pueden incluir los que a veces se denominan pre-REP) se puede acortar a 7 a 14 días, como se explica en los Ejemplos y se muestra en las Figuras. 4 y 5, además de incluir, por ejemplo, una expansión como se describe en la etapa B de la Figura 27. La primera expansión de la etapa B se puede acortar a 10-14 días, como se explica en los Ejemplos y se muestra en las Figuras 4 y 5. En algunas formas de realización, la primera expansión se acorta a 11 días, como se describe en los Ejemplos y se muestra en las Figuras 4 y 5, además de incluir, por ejemplo, una expansión como se describe en la etapa B de la Figura 27.
La primera expansión de TIL puede continuar durante 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días, 9 días, 10 días, 11 días, 12 días, 13 días o 14 días. La primera expansión de TIL puede continuar durante 1 día a 14 días. La primera expansión de TIL puede continuar durante 2 días a 14 días. La primera expansión de TIL puede continuar durante 3 a 14 días. La primera expansión de TIL puede continuar durante 4 a 14 días. La primera expansión de TIL puede continuar durante 5 a 14 días. La primera expansión de TIL puede continuar durante 6 a 14 días. La primera expansión de TIL puede continuar durante 7 días a 14 días. La primera expansión de TIL puede continuar durante 8 días a 14 días. La primera expansión de TIL puede continuar durante 9 días a 14 días. La primera expansión de TIL puede continuar durante 10 a 14 días. La primera expansión de TIL puede continuar durante 11 a 14 días. La primera expansión de TIL puede continuar durante 12 a 14 días. La primera expansión de TIL puede continuar durante 13 a 14 días. La primera expansión de TIL puede continuar durante 14 días. La primera expansión de TIL puede continuar durante 1 día a 11 días. La primera expansión de TIL puede continuar durante 2 días a 11 días. En algunas formas de realización, la primera expansión de TIL puede continuar durante 3 días a 11 días. En algunas formas de realización, la primera expansión de TIL puede continuar durante 4 días a 11 días. En algunas formas de realización, la primera expansión de TIL puede continuar durante 5 días a 11 días. En algunas formas de realización, la primera expansión de TIL puede continuar durante 6 días a 11 días. En algunas formas de realización, la primera expansión de TIL puede continuar durante 7 días a 11 días. En algunas formas de realización, la primera expansión de TIL puede continuar durante 8 días a 11 días. En algunas formas de realización, la primera expansión de TIL puede continuar durante 9 días a 11 días. En algunas formas de realización, la primera expansión de TIL puede continuar durante 10 días a 11 días. En algunas formas de realización, la primera expansión de TIL puede continuar durante 11 días.
En algunas formas de realización, se emplea una combinación de IL-2, IL-7, IL-15 y/o IL-21 como combinación durante la primera expansión. En algunas formas de realización, IL-2, IL-7, IL-15 y/o IL-21, así como cualquier combinación de los mismos, pueden incluirse durante la primera expansión, incluyendo, por ejemplo, durante los procedimientos de la etapa B según la Figura 27, así como se describe en este documento. En algunas formas de realización, se emplea una combinación de IL-2, IL-15 e IL-21 como combinación durante la primera expansión. En algunas formas de realización, IL-2, IL-15 e IL-21, así como cualquier combinación de las mismas, pueden incluirse durante los procedimientos de la Etapa B según la Figura 27 y como se describe en el presente documento.
El primer procedimiento de expansión (incluidos los procedimientos denominados pre-REP; por ejemplo, Etapa B según la Figura 27) puede acortarse de 3 a 14 días, como se explica en los ejemplos y figuras. La primera expansión de la etapa B puede acortarse de 7 a 14 días, como se explica en los Ejemplos y se muestra en las Figuras 4 y 5. La primera expansión de la etapa B puede acortarse de 10 a 14 días, como se explica en los Ejemplos y se muestra en las Figuras 4, 5 y 27. En algunas formas de realización, la primera expansión se acorta a 11 días, como se explica en los Ejemplos y se muestra en las Figuras 4, 5 y 27.
En algunas formas de realización, la primera expansión, por ejemplo, la etapa B según la Figura 27, se realiza en un biorreactor de sistema cerrado. En algunas formas de realización, se emplea un sistema cerrado para la expansión de TIL, como se describe en el presente documento. En algunas formas de realización, se emplea un solo biorreactor. En algunas formas de realización, el único biorreactor empleado es, por ejemplo, un G-REX -10 o un G-REX -100. En algunas formas de realización, el biorreactor de sistema cerrado es un solo biorreactor.
C. ETAPA C: Transición de la primera expansión a la segunda expansión
En algunos casos, la población de TIL a granel obtenida de la primera expansión, incluida, por ejemplo, la población de TIL obtenida de, por ejemplo, la etapa B como se indica en la Figura 27, se puede crioconservar inmediatamente, utilizando los protocolos que se describen más adelante en el presente documento. Alternativamente, la población de TIL obtenida de la primera expansión, denominada segunda población de TIL, puede someterse a una segunda expansión (que puede incluir expansiones a veces denominadas REP) y luego crioconservarse como se describe más adelante. De manera similar, en el caso de que en terapia se utilicen TIL modificados genéticamente, la primera población de TIL (a veces denominada población de TIL a granel) o la segunda población de TIL (que en algunas formas de realización puede incluir poblaciones denominadas poblaciones de TIL de REP) puede someterse a modificaciones genéticas para tratamientos adecuados antes de la expansión o después de la primera expansión y antes de la segunda expansión.
En algunas formas de realización, los TIL obtenidos de la primera expansión (por ejemplo, de la etapa B como se indica en la Figura 27) se almacenan hasta que se fenotipifican para la selección. En algunas formas de realización, los TIL obtenidos de la primera expansión (por ejemplo, de la etapa B como se indica en la Figura 27) no se almacenan y proceden directamente a la segunda expansión. En algunas formas de realización, los TIL obtenidos de la primera expansión no se crioconservan después de la primera expansión y antes de la segunda expansión. En algunas formas de realización, la transición de la primera expansión a la segunda expansión ocurre a alrededor de los 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días, 9 días, 10 días, 11 días, 12 días, 13 días, o 14 días desde que ocurre la fragmentación. En algunas formas de realización, la transición de la primera expansión a la segunda expansión ocurre a alrededor de 3 a 14 días desde que ocurre la fragmentación. En algunas formas de realización, la transición de la primera expansión a la segunda expansión ocurre a alrededor de 4 días y 14 días desde que ocurre la fragmentación. En algunas formas de realización, la transición de la primera expansión a la segunda expansión ocurre a alrededor de 4 días y 10 días desde que ocurre la fragmentación. En algunas formas de realización, la transición de la primera expansión a la segunda expansión ocurre a alrededor de 7 días y 14 días desde que ocurre la fragmentación. En algunas formas de realización, la transición de la primera expansión a la segunda expansión se produce a alrededor de los 14 días desde que se produce la fragmentación.
En algunas formas de realización, la transición de la primera expansión a la segunda expansión ocurre en 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días, 9 días, 10 días, 11 días, 12 días, 13 días o 14 días desde que ocurre la fragmentación. En algunas formas de realización, la transición de la primera expansión a la segunda expansión ocurre de 1 día a 14 días desde que ocurre la fragmentación. En algunas formas de realización, la primera expansión de TIL puede continuar durante 2 días a 14 días. En algunas formas de realización, la transición de la primera expansión a la segunda expansión ocurre de 3 a 14 días desde que ocurre la fragmentación. En algunas formas de realización, la transición de la primera expansión a la segunda expansión ocurre de 4 a 14 días desde que ocurre la fragmentación. En algunas formas de realización, la transición de la primera expansión a la segunda expansión ocurre de 5 a 14 días desde que ocurre la fragmentación. En algunas formas de realización, la transición de la primera expansión a la segunda expansión ocurre de 6 a 14 días desde que ocurre la fragmentación. En algunas formas de realización, la transición de la primera expansión a la segunda expansión ocurre de 7 a 14 días desde que ocurre la fragmentación. En algunas formas de realización, la transición de la primera expansión a la segunda expansión ocurre de 8 a 14 días desde que ocurre la fragmentación. En algunas formas de realización, la transición de la primera expansión a la segunda expansión ocurre de 9 a 14 días desde que ocurre la fragmentación. En algunas formas de realización, la transición de la primera expansión a la segunda expansión ocurre de 10 a 14 días desde que ocurre la fragmentación. En algunas formas de realización, la transición de la primera expansión a la segunda expansión ocurre de 11 a 14 días desde que ocurre la fragmentación. En algunas formas de realización, la transición de la primera expansión a la segunda expansión ocurre de 12 a 14 días desde que ocurre la fragmentación. En algunas formas de realización, la transición de la primera expansión a la segunda expansión ocurre de 13 a 14 días desde que ocurre la fragmentación. En algunas formas de realización, la transición de la primera expansión a la segunda expansión ocurre a los 14 días desde que ocurre la fragmentación. En algunas formas de realización, la transición de la primera expansión a la segunda expansión ocurre de 1 día a 11 días desde que ocurre la fragmentación. En algunas formas de realización, la transición de la primera expansión a la segunda expansión ocurre de 2 a 11 días desde que ocurre la fragmentación. En algunas formas de realización, la transición de la primera expansión a la segunda expansión ocurre de 3 a 11 días desde que ocurre la fragmentación. En algunas formas de realización, la transición de la primera expansión a la segunda expansión ocurre de 4 a 11 días desde que ocurre la fragmentación. En algunas formas de realización, la transición de la primera expansión a la segunda expansión ocurre de 5 a 11 días desde que ocurre la fragmentación. En algunas formas de realización, la transición de la primera expansión a la segunda expansión ocurre de 6 a 11 días desde que ocurre la fragmentación. En algunas formas de realización, la transición de la primera expansión a la segunda expansión ocurre de 7 a 11 días desde que ocurre la fragmentación. En algunas formas de realización, la transición de la primera expansión a la segunda expansión ocurre de 8 a 11 días desde que ocurre la fragmentación. En algunas formas de realización, la transición de la primera expansión a la segunda expansión ocurre de 9 a 11 días desde que ocurre la fragmentación. En algunas formas de realización, la transición de la primera expansión a la segunda expansión ocurre de 10 a 11 días desde que ocurre la fragmentación. En algunas formas de realización, la transición de la primera expansión a la segunda expansión ocurre a los 11 días desde que ocurre la fragmentación.
En algunas formas de realización, los TIL no se almacenan después de la primera expansión y antes de la segunda expansión, y los TIL proceden directamente a la segunda expansión (por ejemplo, en algunas formas de realización, no hay almacenamiento durante la transición de la etapa B a la etapa D). como se muestra en la Figura 27). En algunas formas de realización, la transición se produce en un sistema cerrado, como se describe en el presente documento. En algunas formas de realización, los TIL de la primera expansión, la segunda población de TIL, procede directamente a la segunda expansión sin período de transición.
En algunas formas de realización, la transición de la primera expansión a la segunda expansión, por ejemplo, la etapa C según la Figura 27, se realiza en un biorreactor de sistema cerrado. En algunas formas de realización, se emplea un sistema cerrado para la expansión de TIL, como se describe en el presente documento. En algunas formas de realización, se emplea un solo biorreactor. En algunas formas de realización, el único biorreactor empleado es, por ejemplo, un G-REX -10 o un G-REX -100. En algunas formas de realización, el biorreactor de sistema cerrado es un solo biorreactor.
D. ETAPA D: Segunda expansión
En algunas formas de realización, la población de células TIL se expande en número después de la recolección y el tratamiento a granel inicial, por ejemplo, después de la etapa A y la etapa B, y la transición se denomina Etapa C, como se indica en la Figura 27). Esta expansión adicional se denomina en el presente documento segunda expansión que puede incluir procedimientos de expansión generalmente referidos en la técnica como un procedimiento de expansión rápida (REP; así como procedimientos como se indica en la etapa D de la Figura 27). La segunda expansión se logra generalmente usando un medio de cultivo que comprende varios componentes que incluyen células alimentadoras, una fuente de citocina y un anticuerpo anti-CD3, en un recipiente permeable a los gases.
En algunas formas de realización, la segunda expansión o la segunda expansión de TIL (que puede incluir expansiones a veces denominadas REP; así como los procedimientos indicados en la etapa D de la Figura 27) de TIL se puede realizar utilizando cualquier matraz o recipiente TIL conocido por los expertos en la técnica. En algunas formas de realización, la segunda expansión de TIL puede continuar durante 7 días, 8 días, 9 días, 10 días, 11 días. La segunda expansión de TIL puede continuar durante 12 días, 13 días o 14 días. La segunda expansión de TIL puede continuar durante alrededor de 7 días a alrededor de 14 días. La segunda expansión de TIL puede continuar durante alrededor de 8 días a alrededor de 14 días. La segunda expansión de TIL puede continuar durante alrededor de 9 días a alrededor de 14 días. La segunda expansión de TIL puede continuar durante alrededor de 10 días a alrededor de 14 días. La segunda expansión de TIL puede continuar durante alrededor de 11 días a alrededor de 14 días. La segunda expansión de TIL puede continuar durante alrededor de 12 días a alrededor de 14 días. La segunda expansión de TIL puede continuar durante alrededor de 13 días a alrededor de 14 días. La segunda expansión de TIL puede continuar durante unos 14 días.
En una forma de realización, la segunda expansión se puede realizar en un recipiente permeable al gas usando los procedimientos de la presente divulgación (que incluyen, por ejemplo, expansiones denominadas REP; así como procedimientos como se indican en la etapa D de la Figura 27). Por ejemplo, los TIL se pueden expandir rápidamente usando la estimulación del receptor de células T inespecíficas en presencia de interleucina-2 (IL-2) o interleucina-15 (IL-15). El estímulo inespecífico del receptor de células T puede incluir, por ejemplo, un anticuerpo anti-CD3, tal como alrededor de 30 ng/mL de OKT3, un anticuerpo anti-CD3 monoclonal de ratón (disponible comercialmente en Ortho-McNeil, Raritan, NJ o Miltenyi Biotech, Auburn, CA) o UHCT-1 (disponible comercialmente en BioLegend, San Diego, CA, EE. UU.). Los TIL se pueden expandir para inducir una estimulación adicional de los TIL in vitro al incluir uno o más antígenos durante la segunda expansión, incluidas porciones antigénicas de los mismos, como epítopo(s), del cáncer, que pueden expresarse opcionalmente a partir de un vector, como como péptido de unión al antígeno leucocitario humano A2 (HLA-A2), por ejemplo, 0.3 |jM MART-1: 26-35 (27 L) o gpl 00: 209-217 (210 M), opcionalmente en presencia de un crecimiento de células T factor, como 300 UI/ml de IL-2 o IL-15. Otros antígenos adecuados pueden incluir, por ejemplo, NY-ESO-1, TRP-1, TRP-2, antígeno de cáncer de tirosinasa, MAGE-A3, SSX-2 y VEGFR2, o porciones antigénicas de los mismos. TIL también se puede expandir rápidamente mediante reestimulación con el mismo o los mismos antígenos del cáncer pulsados sobre células presentadoras de antígeno que expresan HLA-A2. Alternativamente, los TIL se pueden volver a estimular con, por ejemplo, linfocitos autólogos irradiados o con linfocitos alogénicos HLA-A2+ irradiados e IL-2. En algunas formas de realización, la reestimulación se produce como parte de la segunda expansión. En algunas formas de realización, la segunda expansión se produce en presencia de linfocitos autólogos irradiados o con linfocitos alogénicos HLA-A2+ irradiados e IL-2.
En una forma de realización, el medio de cultivo celular comprende además IL-2. En algunas formas de realización, el medio de cultivo celular comprende alrededor de 3000 UI/ml de IL-2. En una forma de realización, el medio de cultivo celular comprende alrededor de 1000 UI/ml, alrededor de 1500 UI/ml, alrededor de 2000 UI/ml, alrededor de 2500 UI/ml, alrededor de 3000 UI/ml, alrededor de 3500 UI/ml, alrededor de 4000 UI/ml, alrededor de 4500 UI/ml, alrededor de 5000 UI/ml, alrededor de 5500 UI/ml, alrededor de 6000 UI/ml, alrededor de 6500 UI/ml, alrededor de 7000 UI/ml, alrededor de 7500 UI/ml o alrededor de 8000 UI/ml de IL-2. En una forma de realización, el medio de cultivo celular comprende entre 1000 y 2000 UI/ml, entre 2000 y 3000 UI/ml, entre 3000 y 4000 UI/ml, entre 4000 y 5000 UI/ml, entre 5000 y 6000 UI/ml, entre 6000 y 7000 UI/ml, entre 7000 y 8000 UI/ml, o entre 8000 UI/ml de IL-2.
En una forma de realización, el medio de cultivo celular comprende anticuerpo OKT3. En algunas formas de realización, el medio de cultivo celular comprende alrededor de 30 ng/mL de anticuerpo OKT3. En una forma de realización, el medio de cultivo celular comprende alrededor de 0.1 ng/mL, alrededor de 0.5 ng/mL, alrededor de 1 ng/mL, alrededor de 2.5 ng/mL, alrededor de 5 ng/mL, alrededor de 7.5 ng/mL, alrededor de 10 ng/mL , alrededor de 15 ng/mL, alrededor de 20 ng/mL, alrededor de 25 ng/mL, alrededor de 30 ng/mL, alrededor de 35 ng/mL, alrededor de 40 ng/mL, alrededor de 50 ng/mL, alrededor de 60 ng/mL, alrededor de 70 ng/mL, alrededor de 80 ng/mL, alrededor de 90 ng/mL, alrededor de 100 ng/mL, alrededor de 200 ng/mL, alrededor de 500 ng/mL y alrededor de 1 jg/m l de anticuerpo OKT3. En una forma de realización, el medio de cultivo celular comprende entre 0.1 ng/mL y 1 ng/mL, entre 1 ng/mL y 5 ng/mL, entre 5 ng/mL y 10 ng/mL, entre 10 ng/mL y 20 ng/mL, entre 20 ng/mL y 30 ng/mL, entre 30 ng/mL y 40 ng/mL, entre 40 ng/mL y 50 ng/mL, y entre 50 ng/mL y 100 ng/mL de anticuerpo OKT3.
En algunas formas de realización, se emplea una combinación de IL-2, IL-7, IL-15 y/o IL-21 como combinación durante la segunda expansión. En algunas formas de realización, IL-2, IL-7, IL-15 y/o IL-21, así como cualquier combinación de los mismos, pueden incluirse durante la segunda expansión, incluyendo, por ejemplo, durante un procedimiento de la etapa D según la Figura 27, así como se describe en este documento. En algunas formas de realización, se emplea una combinación de IL-2, IL-15 e IL-21 como combinación durante la segunda expansión. En algunas formas de realización, IL-2, IL-15 e IL-21, así como cualquier combinación de las mismas, pueden incluirse durante los procedimientos de la Etapa D según la Figura 27 y como se describe en el presente documento.
En algunas formas de realización, la segunda expansión se puede realizar en un medio de cultivo celular suplementado que comprende IL-2, OKT-3 y células alimentadoras presentadoras de antígeno. En algunas formas de realización, la segunda expansión se produce en un medio de cultivo celular suplementado. En algunas formas de realización, el medio de cultivo celular suplementado comprende IL-2, OKT-3 y células alimentadoras presentadoras de antígeno. En algunas formas de realización, el segundo medio de cultivo celular comprende IL-2, OKT-3 y células presentadoras de antígeno (APC; también denominadas células alimentadoras presentadoras de antígeno). En algunas formas de realización, la segunda expansión se produce en un medio de cultivo celular que comprende IL-2, OKT-3 y células alimentadoras presentadoras de antígeno (es decir, células presentadoras de antígeno).
En algunas formas de realización, el segundo medio de cultivo de expansión comprende alrededor de 500 UI/ml de IL-15, alrededor de 400 UI/ml de IL-15, alrededor de 300 UI/ml de IL-15, alrededor de 200 UI/ml de IL-15, alrededor de 180 UI/ml de IL-15, alrededor de 160 UI/ml de IL-15, alrededor de 140 UI/ml de IL-15, alrededor de 120 UI/ml de IL-15 o alrededor de 100 UI/ml de IL-15. En algunas formas de realización, el segundo medio de cultivo de expansión comprende de alrededor de 500 UI/ml de IL-15 a alrededor de 100 UI/ml de IL-15. En algunas formas de realización, el segundo medio de cultivo de expansión comprende alrededor de 400 Ul/ml de IL-15 a alrededor de 100 UI/ml de IL-15. En algunas formas de realización, el segundo medio de cultivo de expansión comprende alrededor de 300 UI/ml de IL-15 a alrededor de 100 UI/ml de IL-15. En algunas formas de realización, el segundo medio de cultivo de expansión comprende alrededor de 200 UI/ml de IL-15. En algunas formas de realización, el medio de cultivo celular comprende alrededor de 180 UI/ml de IL-15. En una forma de realización, el medio de cultivo celular comprende además IL-15. En una forma de realización preferida, el medio de cultivo celular comprende alrededor de 180 UI/ml de IL-15.
En algunas formas de realización, el segundo medio de cultivo de expansión comprende alrededor de 20 UI/ml de IL-21, alrededor de 15 UI/ml de IL-21, alrededor de 12 UI/ml de IL-21, alrededor de 10 UI/ml de IL-21, alrededor de 5 UI/ml de IL-21, alrededor de 4 UI/ml de IL-21, alrededor de 3 UI/ml de IL-21, alrededor de 2 UI/ml de IL-21, alrededor de 1 UI/ml de IL-21, o alrededor de 0.5 UI/ml de IL-21. En algunas formas de realización, el segundo medio de cultivo de expansión comprende alrededor de 20 UI/ml de IL-21 a alrededor de 0.5 UI/ml de IL-21. En algunas formas de realización, el segundo medio de cultivo de expansión comprende alrededor de 15 UI/ml de IL-21 a alrededor de 0.5 UI/ml de IL-21. En algunas formas de realización, el segundo medio de cultivo de expansión comprende alrededor de 12 UI/ml de IL-21 a alrededor de 0.5 UI/ml de IL-21. En algunas formas de realización, el segundo medio de cultivo de expansión comprende alrededor de 10 UI/ml de IL-21 a alrededor de 0.5 UI/ml de IL-21. En algunas formas de realización, el segundo medio de cultivo de expansión comprende alrededor de 5 UI/ml de IL-21 a alrededor de 1 UI/ml de IL-21. En algunas formas de realización, el segundo medio de cultivo de expansión comprende alrededor de 2 UI/ml de IL-21. En algunas formas de realización, el medio de cultivo celular comprende alrededor de 1 UI/ml de IL-21. En algunas formas de realización, el medio de cultivo celular comprende alrededor de 0.5 UI/ml de IL-21. En una forma de realización, el medio de cultivo celular comprende además IL-21. En una forma de realización preferida, el medio de cultivo celular comprende alrededor de 1 UI/ml de IL-21.
En algunas formas de realización, las células alimentadoras presentadoras de antígenos (APC) son PBMC. En una forma de realización, la relación de TIL a PBMC y/o células presentadoras de antígeno en la expansión rápida y/o la segunda expansión es de alrededor de 1 a 25, alrededor de 1 a 50, alrededor de 1 a 100, alrededor de 1 a 125, alrededor de 1 a 150, alrededor de 1 a 175, alrededor de 1 a 200, alrededor de 1 a 225, alrededor de 1 a 250, alrededor de 1 a 275, alrededor de 1 a 300, alrededor de 1 a 325, alrededor de 1 a 350, alrededor de 1 a 375, alrededor de 1 a 400, o alrededor de 1 a 500. En una forma de realización, la relación de TIL a PBMC en la expansión rápida y/o la segunda expansión está entre 1 a 50 y 1 a 300. En una forma de realización, la relación de TIL a PBMC en la expansión rápida y/o la segunda expansión está entre<1>a<1 0 0>y<1>a<2 0 0>.
En una forma de realización, REP y/o la segunda expansión se realiza en matraces con los TIL a granel que se mezclan con un exceso de 100 o 200 veces de células alimentadoras inactivadas, 30 mg/ml de anticuerpo anti-CD3 OKT3 y 3000 UI/ml de IL-2 en 150 ml de medio. Se realiza el reemplazo de los medios (generalmente 2/3 de los medios mediante la respiración con medios frescos) hasta que las células se transfieren a una cámara de crecimiento alternativa. Las cámaras de crecimiento alternativas incluyen matraces G-REX y recipientes permeables al gas, como se expllica con más detalle más adelante.
La segunda expansión (que puede incluir procedimientos denominados procedimiento REP) se puede acortar a 7-14 días, como se explica en los ejemplos y figuras. En algunas formas de realización, la segunda expansión se acorta a<1 1>días.
En una forma de realización, REP y/o la segunda expansión se pueden realizar usando matraces T-175 y bolsas permeables al gas como se describió previamente (Tran, et al., J. Immunother. 2008, 31, 742-51; Dudley, et al., J. Immunother. 2003, 26, 332-42) o material de cultivo permeable a los gases (matraces G-Rex). En algunas formas de realización, la segunda expansión (incluidas las expansiones denominadas expansiones rápidas) se realiza en matraces T-175, y se pueden agregar alrededor de 1 x 10<6>TIL suspendidos en 150 ml de medio a cada matraz T-175. Los TIL se pueden cultivar en una mezcla 1 a 1 de medio CM y AIM-V, suplementado con 3000 UI por ml de IL-2 y 30 ng por ml de anti-CD3. Los matraces T-175 se pueden incubar a 37° C en CO<2>al 5%. La mitad del medio puede intercambiarse el día 5 usando medio 50/50 con 3000 UI por ml de IL-2. En algunas formas de realización, el día 7, las células de dos matraces T-175 pueden combinarse en una bolsa de 3 l y 300 ml de AIM V con suero AB humano al 5% y se agregaron 3000 UI por ml de IL-2 a los 300 ml de suspensión de TIL. Se contó el número de células en cada bolsa cada uno o dos días y se añadió medio fresco para mantener el recuento de células entre 0.5 y 2.0 x 10<6>células/ml.
En una forma de realización, la segunda expansión (que puede incluir expansiones denominadas REP, así como las referidas en la etapa D de la Figura 27) se puede realizar en matraces permeables al gas de 500 ml de capacidad con fondos de silicio permeables al gas de 100 cm (G -Rex 100, disponible comercialmente en Wilson Wolf Manufacturing Corporation, New Brighton, MN, EUA), 5 x 10<6>o 10 x 10<6>TIL se puede cultivar con PBMC en 400 ml de medio 50/50, suplementado con suero AB humano al 5%, 3000 UI por ml de IL-2 y 30 ng por ml de anti-CD3 (OKT3). Los matraces G-Rex 100 se pueden incubar a 37°C en CO<2>al 5%. El día 5 se pueden retirar 250 ml de sobrenadante y colocar en botellas de centrífuga y centrifugar a 1500 rpm (491 x g) durante 10 minutos. Los sedimentos de TIL se pueden resuspender con 150 ml de medio fresco con suero AB humano al 5%, 3000 UI por ml de IL-2 y se pueden volver a agregar a los matraces G-Rex 100 originales.
Cuando los TIL se expanden en serie en matraces G-Rex 100, el día 7 el TIL de cada G-Rex 100 se puede suspender en los 300 ml de medio presentes en cada matraz y la suspensión celular se puede dividir en 3 alícuotas de<1 0 0>ml que pueden utilizarse para sembrar 3 matraces G-Rex<1 0 0>. Luego, a cada matraz se pueden agregar 150 ml de AIM-V con suero AB humano al 5% y 3000 UI por ml de IL-2. Los matraces G-Rex 100 se pueden incubar a 37°C en CO<2>al 5% y después de 4 días a cada matraz G-REX 100 se pueden agregar 150 mL de AIM-V con 3000 UI por mL de IL-2. Las células se pueden recolectar el día 14 de cultivo.
En una forma de realización, la segunda expansión (incluidas las expansiones denominadas REP) se realiza en matraces con los TIL a granel mezclados con un exceso de 100 o 200 veces de células alimentadoras inactivadas, 30 mg/ml de anticuerpo anti-CD3 OKT3 y 3000 IL-2 UI/ml en 150 ml de medio. En algunas formas de realización, el reemplazo del medio se realiza hasta que las células se transfieren a una cámara de crecimiento alternativa. En algunas formas de realización, 2/3 del medio se reemplaza por respiración con medio fresco. En algunas formas de realización, las cámaras de crecimiento alternativas incluyen matraces G-REX y recipientes permeables a los gases, como se describe más detalladamente más adelante.
En una forma de realización, se realiza la segunda expansión (incluidas las expansiones denominadas REP) y comprende además una etapa en la que los TIL se seleccionan para una reactividad tumoral superior. Puede usarse cualquier procedimiento de selección conocido en la técnica. Por ejemplo, los procedimientos descritos en la Publicación de Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. 2016/0010058 A1, pueden usarse para la selección de TIL para una reactividad tumoral superior.
Opcionalmente, se puede realizar un ensayo de viabilidad celular después de la segunda expansión (incluidas las expansiones denominadas expansión REP), usando ensayos estándar conocidos en la técnica. Por ejemplo, se puede realizar un ensayo de exclusión con azul tripán en una muestra de TIL a granel, que marca selectivamente las células muertas y permite una evaluación de viabilidad. En algunas formas de realización, las muestras de TIL se pueden contar y la viabilidad se puede determinar usando un contador celular automatizado Cellometer K2 (Nexcelom Bioscience, Lawrence, MA). En algunas formas de realización, la viabilidad se determina de acuerdo con el protocolo del Contador de Células Automático del Citómetro de Imagen Cellometer K2 descrito, por ejemplo, en el Ejemplo 15.
En algunas formas de realización, la segunda expansión (incluidas las expansiones denominadas REP) de TIL se puede realizar utilizando matraces T-175 y bolsas permeables al gas como se describió anteriormente (Tran KQ, Zhou J, Durflinger KH, et al., 2008, J Immunother., 31:742-751, and Dudley ME, Wunderlich JR, Shelton TE, et al. 2003, J Immunother., 26:332-342) o matraces G-Rex permeables al gas. En algunas formas de realización, la segunda expansión se realiza utilizando matraces. En algunas formas de realización, la segunda expansión se realiza utilizando matraces G-Rex permeables al gas. En algunas formas de realización, la segunda expansión se realiza en matraces T-175, y se suspenden alrededor de 1 x 10<6>TIL en alrededor de 150 ml de medio y esto se agrega a cada matraz T-175. Los TIL se cultivan con PBMC alogénicas irradiadas (50 Gy) como células "alimentadoras" en una relación de 1 a 100 y las células se cultivan en una mezcla 1 a 1 de medio CM y AIM-V (medio 50/50), suplementado con 3000 UI/ml de IL-2 y 30 ng/mL de anti-CD3. Los matraces T-175 se incuban a 37°C en CO<2>al 5%. En algunas formas de realización, la mitad del medio se cambia el día 5 usando medio 50/50 con 3000 UI/ml de IL-2. En algunas formas de realización, el día 7, las células de 2 matraces T-175 se combinan en una bolsa de 3 l y 300 ml de AIM-V con suero AB humano al 5% y se agregan 3000 UI/ml de IL-2 a los 300 ml de suspensión de TIL. El número de células en cada bolsa se puede contar cada día o dos y se pueden agregar medios frescos para mantener el recuento de células entre alrededor de 0.5 y alrededor de 2.0 x 10<6>células/ml.
En algunas formas de realización, la segunda expansión (incluidas las expansiones denominadas REP) se realiza en matraces de 500 ml de capacidad con fondos de silicona de 100 cm<2>permeables al gas (G-Rex 100, Wilson Wolf) (figura 1), se cultivan alrededor de 5x10<6>o 10x10<6>TIL con PBMC alogénicas irradiadas en una relación de 1 a 100 en 400 ml de medio 50/50, suplementado con 3000 UI/ml de IL-2 y 30 ng/mL de anti-CD3. Los matraces G-Rex 100 se incuban a 37°C en CO<2>al 5%. En algunas formas de realización, el día 5 se retiran 250 ml de sobrenadante y se colocan en botellas de centrífuga y se centrifugan a 1500 rpm (491 g) durante 10 minutos. Los gránulos de TIL se pueden resuspender luego con 150 ml de medio fresco 50/50 con 3000 UI/ml de IL-2 y se pueden volver a agregar a los matraces G-Rex 100 originales. En las formas de realización en las que los TIL se expanden en serie en matraces de G-Rex 100, el día 7 los TIL de cada G-Rex 100 se suspenden en los 300 ml de medio presente en cada matraz y la suspensión celular se divide en tres alícuotas de 100 ml que son utilizados para sembrar 3 matraces G-Rex 100. Más adelante, a cada matraz se agregan 150 ml de A iM-V con suero AB humano al 5% y 3000 UI/ml de IL-2. Los matraces G-Rex 100 se incuban a 37°C en CO<2>al 5% y después de 4 días a cada matraz G-Rex 100 se agregan 150 mL de AIM-V con 3000 UI/ml de IL-2. Las células se recogen el día 14 de cultivo.
Los diversos receptores de antígenos de los linfocitos T y B se producen por recombinación somática de un número limitado, pero grande, de segmentos de genes. Estos segmentos de genes: V (variable), D (diversidad), J (unión) y C (constante), determinan la especificidad de enlace y las aplicaciones posteriores de inmunoglobulinas y receptores de células T (TCR). La presente invención proporciona un procedimiento para generar TIL que exhiben y aumentan la diversidad del repertorio de células T. En algunas formas de realización, los TIL obtenidos por el presente procedimiento exhiben un aumento en la diversidad del repertorio de células T. En algunas formas de realización, los TIL obtenidos en la segunda expansión exhiben un aumento en la diversidad del repertorio de células T. En algunas formas de realización, el aumento de la diversidad es un aumento de la diversidad de inmunoglobulinas y/o la diversidad del receptor de células T. En algunas formas de realización, la diversidad está en la inmunoglobulina, está en la cadena pesada de inmunoglobulina. En algunas formas de realización, la diversidad está en la inmunoglobulina, está en la cadena ligera de inmunoglobulina. En algunas formas de realización, la diversidad está en el receptor de células T. En algunas formas de realización, la diversidad está en uno de los receptores de células T seleccionados del grupo que consiste en receptores alfa, beta, gamma y delta. En algunas formas de realización, hay un aumento en la expresión del receptor de células T (TCR) alfa y/o beta. En algunas formas de realización, hay un aumento en la expresión del receptor de células T (TCR) alfa. En algunas formas de realización, hay un aumento en la expresión del receptor de células T (TCR) beta. En algunas formas de realización, hay un aumento en la expresión de TCRab (es decir, TCRa/p).
En algunas formas de realización, el segundo medio de cultivo de expansión (por ejemplo, a veces denominado CM2 o el segundo medio de cultivo celular), comprende IL-2, o KT-3, así como las células alimentadoras presentadoras de antígeno (APC), como se analiza en más detalles más adelante.
En algunas formas de realización, la segunda expansión, por ejemplo, la etapa D según la Figura 27, se realiza en un biorreactor de sistema cerrado. En algunas formas de realización, se emplea un sistema cerrado para la expansión de TIL, como se describe en el presente documento. En algunas formas de realización, se emplea un solo biorreactor. En algunas formas de realización, el único biorreactor empleado es, por ejemplo, un G-REX -10 o un G-REX -100. En algunas formas de realización, el biorreactor de sistema cerrado es un solo biorreactor.
1. Células alimentadoras y células presentadoras de antígeno
En una forma de realización, los segundos procedimientos de expansión descritos en este documento (por ejemplo, incluida una expansión como las descritas en la etapa D de la Figura 27, así como las denominadas REP) requieren un exceso de células alimentadoras durante la expansión REP TIL y/o durante la segunda expansión. En muchas formas de realización, las células alimentadoras son células mononucleares de sangre periférica (PBMC) obtenidas de unidades de sangre entera estándar de donantes de sangre sanos. Las PBMC se obtienen utilizando procedimientos estándar como la separación por gradiente Ficoll-Paque.
En general, las PBMC alogénicas se inactivan, ya sea mediante irradiación o tratamiento térmico, y se utilizan en los procedimientos de REP, como se describe en los ejemplos, en particular el ejemplo 14, que proporciona un protocolo ejemplar para evaluar la incompetencia de replicación de las PBMC alogénicas irradiadas.
En algunas formas de realización, las PBMC se consideran incompetentes para la replicación y se aceptan para su uso en los procedimientos de expansión de TIL descritos en este documento si el número total de células viables el día 14 es menor que el número de células viables inicial puestas en cultivo el día 0 del REP y/o día 0 de la segunda expansión (es decir, el día de inicio de la segunda expansión). Véase, por ejemplo, el Ejemplo 14.
En algunas formas de realización, las PBMC se consideran incompetentes para la replicación y se aceptan para su uso en los procedimientos de expansión de TIL descritos en este documento si el número total de células viables, cultivadas en presencia de OKT3 e IL-2, el día 7 y el día 14 no ha aumentado desde el número de células viables inicial puestas en cultivo el día 0 del REP y/o el día 0 de la segunda expansión (es decir, el día de inicio de la segunda expansión). En algunas formas de realización, las PBMC se cultivan en presencia de 30 ng/ml de anticuerpo OKT3 y 3000 UI/ml de IL-2. Véase, por ejemplo, el Ejemplo 13.
En algunas formas de realización, las PBMC se consideran incompetentes para la replicación y se aceptan para su uso en los procedimientos de expansión de TIL descritos en este documento si el número total de células viables, cultivadas en presencia de OKT3 e IL-2, el día 7 y el día 14 no ha aumentado desde el número de células viables inicial puestas en cultivo el día 0 del REP y/o el día 0 de la segunda expansión (es decir, el día de inicio de la segunda expansión). En algunas formas de realización, las PBMC se cultivan en presencia de 5-60 ng/mL de anticuerpo OKT3 y 1000-6000 UI/ml de IL-2. En algunas formas de realización, las PBMC se cultivan en presencia de 10-50 ng/mL de anticuerpo OKT3 y 2000-5000 UI/ml de IL-2. En algunas formas de realización, las PBMC se cultivan en presencia de 20-40 ng/mL de anticuerpo OKT3 y 2000-4000 UI/ml de IL-2. En algunas formas de realización, las PBMC se cultivan en presencia de 25-35 ng/mL de anticuerpo OKT3 y 2500-3500 UI/ml de IL-2.
En algunas formas de realización, las células alimentadoras presentadoras de antígeno son PBMC. En algunas formas de realización, las células alimentadoras presentadoras de antígeno son células alimentadoras presentadoras de antígeno artificiales. En una forma de realización, la relación de TIL a las células alimentadoras presentadoras de antígeno en la segunda expansión es alrededor de 1 a 25, alrededor de 1 a 50, alrededor de 1 a 100, alrededor de 1 a 125, alrededor de 1 a 150, alrededor de 1 a 175, alrededor de 1 a 200, alrededor de 1 a 225, alrededor de 1 a 250, alrededor de 1 a 275, alrededor de 1 a 300, alrededor de 1 a 325, alrededor de 1 a 350, alrededor de 1 a 375, alrededor de 1 a 400, o alrededor de 1 a 500. En una forma de realización, la relación de TIL a células alimentadoras presentadoras de antígeno en la segunda expansión es de 1 a 50 y de 1 a 300. En una forma de realización, la relación de TIL a células alimentadoras presentadoras de antígeno en la segunda expansión es de<1>a<1 0 0>y<1>a<2 0 0>.
En una forma de realización, los segundos procedimientos de expansión descritos en el presente documento requieren una relación de alrededor de 2.5 x 10<9>células alimentadoras a alrededor de 100 x 10<6>TIL. En otra realización, los segundos procedimientos de expansión descritos en el presente documento requieren una relación de alrededor de 2.5 x 10<9>células alimentadoras a alrededor de 50 x 10<6>TIL. En otra realización más, los segundos procedimientos de expansión descritos en el presente documento requieren de alrededor de 2.5 x 10<9>células alimentadoras a alrededor de 25 x 10<6>TIL.
En una forma de realización, los segundos procedimientos de expansión descritos en este documento requieren un exceso de células alimentadoras durante la segunda expansión. En muchas formas de realización, las células alimentadoras son células mononucleares de sangre periférica (PBMC) obtenidas de unidades de sangre entera estándar de donantes de sangre sanos. Las PBMC se obtienen utilizando procedimientos estándar como la separación por gradiente Ficoll-Paque. En una forma de realización, se utilizan células presentadoras de antígenos artificiales (aAPC) en lugar de PBMC.
En general, las PBMC alogénicas se inactivan, ya sea mediante irradiación o tratamiento térmico, y se usan en los procedimientos de expansión de TIL descritos en este documento, incluidos los procedimientos ejemplares descritos en las Figuras 4, 5 y 27.
En una forma de realización, las células presentadoras de antígenos artificiales se utilizan en la segunda expansión como reemplazo de, o en combinación con, PBMC.
2. Citocinas
Los procedimientos de expansión descritos en este documento generalmente usan medios de cultivo con altas dosis de una citocina, en particular IL-2, como se conoce en la técnica.
Alternativamente, también es posible usar combinaciones de citocinas para la expansión rápida y/o la segunda expansión de TIL, con combinaciones de dos o más de IL-2, IL-15 e IL-21 como se describe generalmente en la Publicación Internacional No. WO 2015/189356 y Publicación Internacional W No. WO 2015/189357. Por lo tanto, las posibles combinaciones incluyen IL-2 e<i>L-15, IL-2 e IL-21, IL-15 e IL-21 e IL-2, IL-15 e IL-21, y esta última encuentra un uso particular en muchas formas de realización. El uso de combinaciones de citocinas favorece específicamente la generación de linfocitos y, en particular, de células T como se describe allí.
3. Anticuerpos anti-CD3
En algunas formas de realización, los medios de cultivo usados en los procedimientos de expansión descritos en el presente documento (incluidos los denominados REP, véase, por ejemplo, la Figura 27) también incluyen un anticuerpo anti-CD3. Un anticuerpo anti-CD3 en combinación con IL-2 induce la activación de las células T y división celular en la población TIL. Este efecto puede observarse con anticuerpos de longitud completa, así como con fragmentos Fab y F (ab')<2>, y generalmente se prefiere el primero; véase, por ejemplo, Tsoukas et al., J. Immunol. 1985, 135, 1719.
Como apreciarán los expertos en la técnica, hay varios anticuerpos CD3 anti-humanos adecuados que encuentran uso en la invención, incluidos anticuerpos policlonales y monoclonales CD3 anti-humanos de varios mamíferos, incluidos, entre otros, anticuerpos de murinos, humanos, primates, ratas y caninos. En formas de realización particulares, se usa el anticuerpo anti-CD3 OKT3 (disponible comercialmente en Ortho-McNeil, Raritan, NJ o Miltenyi Biotech, Auburn, CA).
E. ETAPA E: Recolectar TIL
Después de la segunda etapa de expansión, se pueden recolectar las células. En algunas formas de realización, los TIL se recolectan después de uno, dos, tres, cuatro o más etapas de expansión, por ejemplo, como se proporciona en la Figura 27. En algunas formas de realización, los TIL se recolectan después de dos etapas de expansión, por ejemplo, como se muestra en la Figura 27.
Los TIL se pueden recolectar de cualquier manera apropiada y estéril, incluyendo, por ejemplo, por centrifugación. Los procedimientos para la recolección de TIL son bien conocidos en la técnica y cualquier procedimiento conocido puede emplearse con el presente procedimiento. En algunas formas de realización, los TIL se recolectan usando un sistema automatizado.
Los recolectores de células y/o los sistemas de tratamiento de células están disponibles comercialmente en una variedad de fuentes, que incluyen, por ejemplo, Fresenius Kabi, Tomtec Life Science, Perkin Elmer e Inotech Biosystems International, Inc. Cualquier recolector de células puede emplearse con los procedimientos presentes. En algunas formas de realización, el recolector de células y/o los sistemas de tratamiento de células es un recolector de células basado en membrana. En algunas formas de realización, la recolección de células se realiza mediante un sistema de tratamiento de células, como el sistema LOVO (fabricado por Fresenius Kabi). El término "sistema de tratamiento de células LOVO" también se refiere a cualquier instrumento o dispositivo fabricado por cualquier proveedor que pueda bombear una solución que comprende células a través de una membrana o filtro, como una membrana giratoria o un filtro giratorio, en un entorno de sistema cerrado y/o estéril, lo que permite flujo continuo y tratamiento celular para eliminar el sobrenadante o los medios de cultivo celular sin formación de pellas. En algunas formas de realización, el recolector de células y/o el sistema de tratamiento de células puede realizar la separación de células, lavado, intercambio de fluidos, concentración y/u otras etapas de tratamiento de células en un sistema estéril cerrado.
En algunas formas de realización, la recolección, por ejemplo, la etapa E según la Figura 27, se realiza desde un biorreactor de sistema cerrado. En algunas formas de realización, se emplea un sistema cerrado para la expansión de TIL, como se describe en el presente documento. En algunas formas de realización, se emplea un solo biorreactor. En algunas formas de realización, el único biorreactor empleado es, por ejemplo, un G-REX -10 o un G-REX -100. En algunas formas de realización, el biorreactor de sistema cerrado es un solo biorreactor.
F. ETAPA F: Formulación final/ Transferencia a la bolsa de infusión
Después de que las etapas A a E como se proporcionan en un orden ejemplar en la Figura 27 y como se describe en detalle anteriormente y en el presente documento estén completos, las células se transfieren a un recipiente para su uso en la administración a un paciente. En algunas formas de realización, una vez que se obtiene un número terapéuticamente suficiente de TIL usando los procedimientos de expansión descritos anteriormente, se transfieren a un recipiente para su uso en la administración a un paciente.
Los TIL expandidos usando APC de la presente divulgación pueden ser para la administración a un paciente como una composición farmacéutica. En una forma de realización, la composición farmacéutica es una suspensión de TIL en un regulador de pH estéril. Los TIL expandidos usando PBMC de la presente divulgación pueden administrarse mediante cualquier ruta adecuada como se conoce en la técnica. Las células T se pueden administrar como una única infusión intraarterial o intravenosa, que preferiblemente dura alrededor de de 30 a 60 minutos. Otras vías de administración adecuadas incluyen intraperitoneal, intratecal e intralinfática.
1. Composiciones farmacéuticas, dosis y regímenes de dosificación
En una forma de realización, los TIL expandidos usando los procedimientos de la presente divulgación son para la administración a un paciente como una composición farmacéutica. En una forma de realización, la composición farmacéutica es una suspensión de TIL en un regulador de pH estéril. Los TIL expandidos usando PBMC de la presente divulgación pueden ser para administración mediante cualquier ruta adecuada como se conoce en la técnica. Las células T se pueden administrar como una única infusión intraarterial o intravenosa, que preferiblemente dura alrededor de de 30 a 60 minutos. Otras vías de administración adecuadas incluyen la administración intraperitoneal, intratecal e intralinfática.
Puede administrarse cualquier dosis adecuada de TIL. Se pueden administrar de alrededor de 2.3 x 10<10>a alrededor de 13.7 x 10<10>TII, con un promedio de alrededor de 7.8 x 10<10>TIL, particularmente si el cáncer es melanoma. Se pueden administrar alrededor de 1.2 x 10<10>a alrededor de 4.3 x 10<10>TIL. Se pueden administrar alrededor de 3 x 10<10>a alrededor de 12 x 10<10>TII. Se pueden administar alrededor de 4 x 10<10>a alrededor de 10 x 10<10>TIL. Se pueden administar alrededor de 5 x 10<10>a alrededor de<8>x 10<10>TIL. Se pueden administar alrededor de<6>x 10<10>a alrededor de<8>x 10<10>TII. Se pueden administar alrededor de 7 x 10<10>a alrededor de<8>x 10<10>TIL. En algunas formas de realización, la dosis terapéuticamente eficaz es de alrededor de 2.3 x 10<10>a alrededor de 13.7 x 1010. En algunas formas de realización, la dosis terapéuticamente eficaz es de alrededor de 7.8 x 10<10>TIL, particularmente del cáncer es melanoma. En algunas formas de realización, la dosis terapéuticamente eficaz es de alrededor de 1.2 x 10<10>a alrededor de 4.3 x 10<10>de TIL. En algunas formas de realización, la dosis terapéuticamente eficaz es de alrededor de 3 x 10<10>a alrededor de 12 x 10<10>TIL. En algunas formas de realización, la dosis terapéuticamente eficaz es de alrededor de 4 x 10<10>a alrededor de 10 x 10<10>TIL. En algunas formas de realización, la dosis terapéuticamente eficaz es de alrededor de 5 x 10<10>a alrededor de<8>x 10<10>TIL. En algunas formas de realización, la dosis terapéuticamente eficaz es de alrededor de<6>x 10<10>a alrededor de<8>x 10<10>TIL. En algunas formas de realización, la dosis terapéuticamente eficaz es de alrededor de 7 x 10<10>a alrededor de<8>x 10<10>TIL.
En algunas formas de realización, el número de TIL proporcionados en las composiciones farmacéuticas de la invención es alrededor de 1 x 106, 2 x 106, 3 x 106, 4 x 106, 5 x 106,<6>* 106, 7 * 106,<8>* 106, 9 * 106, 1 * 107, 2 * 107, 3 * 107, 4 * 107, 5 * 107,<6>* 107, 7 * 107,<8>* 107, 9 * 107, 1 * 108, 2 * 108, 3 * 108, 4 * 108, 5 * 108,<6>* 108, 7 * 108,<8>* 108, 9 * 108, 1 * 109, 2 *109, 3 * 109, 4 * 109, 5 * 109,<6>* 109, 7 * 109,<8>* 109, 9 * 109, 1 * 1010, 2 * 1010, 3 * 1010, 4 * 1010, 5 * 1010,<6>* 1010, 7 * 1010,<8>* 1010, 9 * 1010, 1 * 1011, 2 * 1011, 3 * 1011, 4 * 10<11>, 5 * 1011,<6>* 1011, 7 * 1011,<8>* 1011, 9 * 1011, 1 * 1012, 2 * 1012, 3 * 1012, 4 * 1012, 5 * 1012,<6>* 1012, 7 x 1012,<8>x 1012, 9 x 1012, 1 x 1013, 2 x 1013, 3 x 1013, 4 x 1013, 5 x 1013,<6>x 1013, 7 x 1013,<8>x 10<13>y 9 x 10<13>En una forma de realización, el número de TIL proporcionados en las composiciones farmacéuticas de la invención está en el rango de 1 x 10<6>a 5 x 106, 5 x 10<6>a 1 x 107, 1 x 10<7>a 5 x 107, 5 x 10<7>a 1 x 108, 1 x 10<8>a 5 x<1 0>8, 5 x<1 0 8>a 1 x 109, 1 x 10<9>a 5 x 109, 5 x 10<9>a 1 x 1010, 1 x 10<10>a 5 x 1010, 5 x 10<10>a 1 x<1 0>11, 5 x 10<11>a 1 x<1 0>12, 1 x<1 0 12>a 5 x 1012y 5 x 1012a 1 x 1013.
En algunas formas de realización, la concentración de los TIL proporcionados en las composiciones farmacéuticas de la invención es menor que, por ejemplo, 100%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%,<8>%, 7%,<6>%, 5%, 4%, 3 %, 2%, 1%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1%, 0.09%, 0.08%, 0.07%, 0.06%, 0.05%, 0.04%, 0.03%, 0.02%, 0.01%, 0.009%, 0.008%, 0.007%, 0.006%, 0.005%, 0.004%, 0.003%, 0.002%, 0.001%, 0.0009%, 0.0008%, 0.0007%, 0.0006%, 0.0005%, 0.0004%, 0.0003%, 0.0002% o 0.0001% p/p, p/v o v/v de la composición farmacéutica.
En algunas formas de realización, la concentración de los TIL proporcionados en las composiciones farmacéuticas de la invención es superior al 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 19,75%, 19,50%, 19,25% 19%, 18,75%, 18,50%, 18,25% 18%, 17,75%, 17,50%, 17,25% 17%, 16,75%, 16,50%, 16,25% 16%, 15,75%, 15,50%, 15,25% 15%, 14,75 %, 14,50%, 14,25% 14%, 13.75%, 13.50%, 13.25% 13%, 12.75%, 12.50%, 12.25% 12%, 11,75%, 11,50%, 11,25% 11%, 10.75%, 10.50%, 10.25 % 10%, 9,75%, 9,50%, 9,25% 9%, 8,75%, 8,50%, 8,25%<8>%, 7,75%, 7,50%, 7,25% 7%, 6,75%, 6,50%, 6,25%<6>%, 5,75% , 5.50%, 5.25% 5%, 4.75%, 4.50%, 4.25%, 4%, 3.75%, 3.50%, 3.25%, 3%, 2.75%, 2.50%, 2.25%, 2%, 1.75%, 1.50% , 125%, 1%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1%, 0.09%, 0.08%, 0.07%, 0.06%, 0.05%, 0.04%, 0.03%, 0.02%, 0.01%, 0.009 %, 0.008%, 0.007%, 0.006%, 0.005%, 0.004%, 0.003%, 0.002%, 0.001%, 0.0009%, 0.0008%, 0.0007%, 0.0006%, 0.0005%, 0.0004%, 0.0003%, 0.0002% o 0.0001% p/p, p/v o v/v de la composición farmacéutica.
En algunas formas de realización, la concentración de los TIL proporcionados en las composiciones farmacéuticas de la invención está en el intervalo de alrededor de 0.0001% a alrededor de 50%, alrededor de 0.001% a alrededor de 40%, alrededor de 0.01% a alrededor de 30%, alrededor de 0.02% a alrededor de 29%, alrededor de 0.03% a alrededor de 28%, alrededor de 0.04% a alrededor de 27%, alrededor de 0.05% a alrededor de 26%, alrededor de 0.06% a alrededor de 25%, alrededor de 0.07% a alrededor de 24%, alrededor de 0.08% a alrededor de 23%, alrededor de 0.09% a alrededor de 22%, alrededor de 0.1% a alrededor de 21%, alrededor de 0.2% a alrededor de 20%, alrededor de 0.3% a alrededor de 19%, alrededor de 0.4% a alrededor de 18%, alrededor de 0.5% a alrededor de 17%, alrededor de 0.6% a alrededor de 16%, alrededor de 0.7% a alrededor de 15%, alrededor de 0.8% a alrededor de 14%, alrededor de 0.9% a alrededor de 12% o alrededor de<1>% a alrededor de<1 0>% p/p, p/v o v/v de la composición farmacéutica.
En algunas formas de realización, la concentración de los TIL proporcionados en las composiciones farmacéuticas de la invención está en el intervalo de alrededor de<0>.<0 0 1>% a alrededor de<1 0>%, alrededor de 0.01% a alrededor de 5%, alrededor de 0.02% a alrededor de 4.5%, alrededor de 0.03% a alrededor de 4%, alrededor de 0.04% a alrededor de 3.5%, alrededor de 0.05% a alrededor de 3%, alrededor de 0.06% a alrededor de 2.5%, alrededor de 0.07% a alrededor de 2%, alrededor de 0.08% a alrededor de 1.5%, alrededor de 0.09% a alrededor de 1 %, alrededor de 0.1% a alrededor de 0.9% p/p, p/v o v/v de la composición farmacéutica.
En algunas formas de realización, la cantidad de los TIL proporcionados en las composiciones farmacéuticas de la invención es igual o menor que 10 g, 9.5 g, 9.0 g, 8.5 g, 8.0 g, 7.5 g, 7.0 g, 6.5 g, 6.0 g, 5.5 g, 5.0 g, 4.5 g, 4.0 g, 3.5 g, 3.0 g, 2.5 g, 2.0 g, 1.5 g, 1.0 g, 0.95 g, 0.9 g, 0.85 g, 0.8 g, 0.75 g, 0.7 g, 0.65 g , 0.6 g, 0.55 g, 0.5 g, 0.45 g, 0.4 g, 0.35 g, 0.3 g, 0.25 g, 0.2 g, 0.15 g, 0.1 g, 0.09 g, 0.08 g, 0.07 g, 0.06 g, 0.05 g, 0.04 g, 0.03 g, 0.02 g, 0.01 g, 0.009 g, 0.008 g, 0.007 g, 0.006 g, 0.005 g, 0.004 g, 0.003 g, 0.002 g, 0.001 g, 0.0009 g, 0.0008 g, 0.0007 g, 0.0006 g, 0.0005 g, 0.0004 g, 0.0003 g, 0.0002 g o 0.0001 g.
En algunas formas de realización, la cantidad de TIL proporcionada en las composiciones farmacéuticas de la invención es más de 0.0001 g, 0.0002 g, 0.0003 g, 0.0004 g, 0.0005 g, 0.0006 g, 0.0007 g, 0.0008 g, 0.0009 g, 0.001 g, 0.0015 g, 0.002 g, 0.0025 g, 0.003 g, 0.0035 g, 0.004 g, 0.0045 g, 0.005 g, 0.0055 g, 0.006 g, 0.0065 g, 0.007 g, 0.0075 g, 0.008 g, 0.0085 g, 0.009 g, 0.0095 g , 0.01 g, 0.015 g, 0.02 g, 0.025 g, 0.03 g, 0.035 g, 0.04 g, 0.045 g, 0.05 g, 0.055 g, 0.06 g, 0.065 g, 0.07 g, 0.075 g, 0.08 g, 0.085 g, 0.09 g, 0.095 g, 0.1 g, 0.15 g, 0.2 g, 0.25 g, 0.3 g, 0.35 g, 0.4 g, 0.45 g, 0.5 g, 0.55 g, 0.6 g, 0.65 g, 0.7 g, 0.75 g, 0.8 g, 0.85 g, 0.9 g, 0.95 g, 1 g, 1.5 g, 2 g, 2.5, 3 g, 3.5, 4 g, 4.5 g, 5 g, 5.5 g,<6>g, 6.5 g, 7 g, 7.5 g,<8>g, 8.5 g, 9 g, 9.5 g o 10 g.
Los TIL proporcionados en las composiciones farmacéuticas de la invención son eficaces en un amplio intervalo de dosis. La dosis exacta dependerá de la vía de administración, la forma en la que se administra el compuesto, el sexo y la edad del sujeto a tratar, el peso corporal del sujeto a tratar y la preferencia y experiencia del médico tratante. Las dosis clínicamente establecidas de los TIL también pueden usarse si es apropiado. Las cantidades de las composiciones farmacéuticas administradas utilizando los procedimientos del presente documento, como las dosis de TIL, dependerán del ser humano o mamífero que se esté tratando, la gravedad del trastorno o afección, la velocidad de administración y la disposición de los ingredientes farmacéuticos activos. y la discreción del médico que prescribe.
En algunas formas de realización, los TIL pueden administrarse en una sola dosis. Tal administración puede
ser mediante inyección, por ejemplo, inyección intravenosa. En algunas formas de realización, los TIL pueden administrarse en múltiples dosis. La dosificación puede ser una, dos, tres, cuatro, cinco, seis o más de seis
veces al año. La dosificación puede ser una vez al mes, una vez cada dos semanas, una vez a la semana o
una vez cada dos días. La administración de TIL puede continuar tanto tiempo como sea necesario.
En algunas formas de realización, una dosis eficaz de TIL es alrededor de 1 x 106, 2 x 106, 3 x 106, 4 x 106, 5 x
106,<6>x 106, 7 x 106,<8>x 106, 9 x 106, 1 * 107, 2 x 107, 3 x 107, 4 x 107, 5 x 107,<6>x 107, 7 x 107,<8>x 107, 9 x
107, 1 x<1 0>8, 2 x 108, 3 x 108, 4 x 108, 5 x 108,<6>x 108, 7 x 108,<8>x 108, 9 x 108, 1 x 109, 2 x 109, 3 x 109, 4 x
109, 5 x 109,<6>x 109, 7 x 109,<8>x 109, 9 x 109, 1 x 1010, 2 x 1010, 3 x 1010, 4<8>x<1 0>10,<9>x<1 0>10,<1>x<1 0 1 1>,<2>x<1 0 1 1>,<3>x<1 0 1 1>,<4>x<1 0>11,<5>x<1 0>11,<6>x<1 0>11, 7 x<1 0>11,<8>x<1 0>11, 9 x<1 0>11, 1 x<1 0>12,
2 x 1012, 3 x 1012, 4 x 1012, 5 x 1012,<6>x 1012, 7 x 1012,<8>x 1012, 9 x 1012, 1 x 1013, 2 x 1013, 3 x 1013, 4 x 1013,
5 x<1 0>13,<6>x<1 0>13, 7 x<1 0>13,<8>x 10<13>y 9 x<1 0>13. En algunas formas de realización, una dosificación eficaz de
TIL está en el intervalo de 2 x 10<10>a 5 x 106, 5 x 10<6>a 1 x 107, 1 x 10<7>a 5 x 107, 5 x 10<7>a 1 x<1 0>8, 1 x<1 0 8>a 5
x 108, 5 x<1 0 8>a 1 x<1 0>9, 1 x<1 0 9>a 5 x<1 0>9, 5 x<1 0 9>a 1 x<1 0>10, 1 x<1 0 10>a 5 x<1 0>10, 5 x 10<10>a 1 x<1 0>11, 5 x<1 0 11>
a 1 x<1 0>12, 1 x<1 0 12>a 5 x 10<12>y 5 x 1012a 1 x<1 0>13.
En algunas formas de realización, una dosis eficaz de TIL está en el intervalo de alrededor de 0.01 mg/kg a
alrededor de 4.3 mg/kg, alrededor de 0.15 mg/kg a alrededor de 3.6 mg/kg, alrededor de 0.3 mg/kg a alrededor
de 3.2 mg/kg, alrededor de 0.35 mg/kg a alrededor de 2.85 mg/kg, alrededor de 0.15 mg/kg a alrededor de 2.85
mg/kg, alrededor de 0.3 mg a alrededor de 2.15 mg/kg, alrededor de 0.45 mg/kg a alrededor de 1.7 mg/kg,
alrededor de 0.15 mg/kg a alrededor de 1.3 mg/kg, alrededor de 0.3 mg/kg a alrededor de 1.15 mg/kg, alrededor
de 0.45 mg/kg a alrededor de 1 mg/kg, alrededor de 0.55 mg/kg a alrededor de 0.85 mg/kg, alrededor de 0.65
mg/kg a alrededor de 0.8 mg/kg, alrededor de 0.7 mg/kg a alrededor de 0.75 mg/kg, alrededor de 0.7 mg/kg a
alrededor de 2.15 mg/kg, alrededor de 0.85 mg/kg a alrededor de 2 mg/kg, alrededor de 1 mg/kg a alrededor
de 1.85 mg/kg, alrededor de 1.15 mg/kg a alrededor de 1.7 mg/kg, alrededor de 1.3 mg/kg mg a alrededor de
1.6 mg/kg, alrededor de 1.35 mg/kg a alrededor de 1.5 mg/kg, alrededor de 2.15 mg/kg a alrededor de 3.6
mg/kg, alrededor de 2.3 mg/kg a alrededor de 3.4 mg/kg, alrededor de 2.4 mg/kg a alrededor de 3.3 mg/kg,
alrededor de 2.6 mg/kg a alrededor de 3.15 mg/kg, alrededor de 2.7 mg/kg a alrededor de 3 mg/kg , alrededor
de 2.8 mg/kg a alrededor de 3 mg/kg, o alrededor de 2.85 mg/kg hasta alrededor de 2.95 mg/kg.
En algunas formas de realización, una dosis eficaz de TIL está en el intervalo de alrededor de 1 mg a alrededor
de 500 mg, alrededor de 10 mg a alrededor de 300 mg, alrededor de 20 mg a alrededor de 250 mg, alrededor
de 25 mg a alrededor de 200 mg, alrededor de 1 mg a alrededor de alrededor de 50 mg, alrededor de 5 mg a
alrededor de 45 mg, alrededor de 10 mg a alrededor de 40 mg, alrededor de 15 mg a alrededor de 35 mg,
alrededor de 20 mg a alrededor de 30 mg, alrededor de 23 mg a alrededor de 28 mg, alrededor de 50 mg a
alrededor de 150 mg, alrededor de 60 mg a alrededor de 140 mg, alrededor de 70 mg a alrededor de 130 mg, alrededor de 80 mg a alrededor de 120 mg, alrededor de 90 mg a alrededor de 110 mg, o alrededor de 95 mg
a alrededor de 105 mg, alrededor de 98 mg a alrededor de 102 mg , alrededor de 150 mg a alrededor de 250
mg, alrededor de 160 mg a alrededor de 240 mg, alrededor de 170 mg a alrededor de 230 mg, alrededor de
180 mg a alrededor de 220 mg, alrededor de 190 mg a alrededor de 210 mg, alrededor de 195 mg a alrededor
de 205 mg, o alrededor de 198 a alrededor de 207 mg.
Se puede administrar una cantidad eficaz de TIL en dosis únicas o múltiples mediante cualquiera de los modos
aceptados de administración de agentes que tienen utilidades similares, incluidas las vías intranasal y transdérmica, mediante inyección intraarterial, intravenosa, intraperitoneal, parenteral, intramuscular, subcutánea, por vía tópica, por trasplante o por inhalación.
G. Análisis de viabilidad celular opcional
Opcionalmente, se puede realizar un ensayo de viabilidad celular después de la primera expansión de la etapa
B, usando ensayos estándar conocidos en la técnica. Por ejemplo, se puede realizar un ensayo de exclusión
con azul tripán en una muestra de TIL a granel, que marca selectivamente las células muertas y permite una evaluación de viabilidad. Otros ensayos para usar en las pruebas de viabilidad pueden incluir, entre otros, el
ensayo de azul de Alamar; y el ensayo MTT.
1. Recuento celular, viabilidad, citometría de flujo
En algunas formas de realización, se miden los recuentos de células y/o la viabilidad. La expresión de marcadores como, entre otros, CD3, CD4, CD<8>y CD56, así como cualquier otro divulgado o descrito en el
presente documento, se puede medir mediante citometría de flujo con anticuerpos, por ejemplo, pero sin
limitarse a los disponibles comercialmente en BD Bio- ciencias (BD Biosciences, San José, CA) utilizando un
citómetro de flujo FACSCanto™ (BD Biosciences). Las células se pueden contar manualmente usando un hemocitómetro de chip c desechable (VWR, Batavia, IL) y la viabilidad se puede evaluar usando cualquier procedimiento conocido en la técnica, que incluye, entre otros, la tinción con azul tripán.
En algunos casos, la población de TIL a granel se puede crioconservar inmediatamente, utilizando los protocolos que se describen más adelante. Alternativamente, la población de TIL a granel puede someterse a REP y luego crioconservarse como se describe más adelante. De manera similar, en el caso de que en terapia se utilicen TIL modificados genéticamente, las poblaciones de REP TIL a granel pueden someterse a modificaciones genéticas para tratamientos adecuados.
2. Cultivos celulares
En una forma de realización, un procedimiento para expandir TIL puede incluir el uso de alrededor de 5,000 ml a alrededor de 25,000 ml de medio celular, de alrededor de 5,000 ml a alrededor de 10,000 ml de medio celular o de alrededor de 5,800 ml a alrededor de 8,700 ml de medio celular. En una forma de realización, expandir el número de TIL no usa más de un tipo de medio de cultivo celular. Puede usarse cualquier medio de cultivo celular adecuado, por ejemplo, medio celular AIM-V (L-glutamina, sulfato de estreptomicina de 50 pM y sulfato de gentamicina de l0 pM) medio de cultivo celular (Invitrogen, Carlsbad CA). A este respecto, los procedimientos de la invención reducen ventajosamente la cantidad de medio y el número de tipos de medio requeridos para expandir el número de TIL. En una forma de realización, expandir el número de TIL puede comprender agregar medio de cultivo celular fresco a las células (también denominado alimentación de las células) no más frecuentemente que cada tercer o cuarto día. La expansión del número de células en un recipiente permeable al gas simplifica los procedimientos necesarios para expandir el número de células al reducir la frecuencia de alimentación necesaria para expandir las células.
En una forma de realización, el medio celular en el primer y/o segundo recipiente permeable a los gases no está filtrado. El uso de medio celular sin filtrar puede simplificar los procedimientos necesarios para expandir el número de células. En una forma de realización, el medio celular en el primer y/o segundo recipiente permeable a los gases carece de beta-mercaptoetanol (BME).
En una forma de realización, la duración del procedimiento comprende obtener una muestra de tejido tumoral del mamífero; cultivar la muestra de tejido tumoral en un primer recipiente permeable al gas que contiene medio celular; obtener TIL de la muestra de tejido tumoral; expandir el número de TIL en un segundo recipiente permeable al gas que contiene medio celular usando aAPC durante una duración de alrededor de 14 a alrededor de 42 días, por ejemplo, alrededor de 28 días.
En una forma de realización, los TII se expanden en contenedores permeables a los gases. Se han utilizado recipientes permeables a los gases para expandir TIL utilizando PBMC utilizando procedimientos, composiciones y dispositivos conocidos en la técnica, incluidos los descritos en la publicación de solicitud de patente de EE.UU. No. 2005/0106717 A1. En una forma de realización, los TII se expanden en bolsas permeables a los gases. En una forma de realización, los TII se expanden utilizando un sistema de expansión celular que expande los TII en bolsas permeables al gas, como el Xuri Cell Expansion System W25 (GE Healthcare). En una forma de realización, los TII se expanden usando un sistema de expansión celular que expande los TII en bolsas permeables al gas, como el WAVE Bioreactor System, también conocido como Xuri Cell Expansion System W5 (GE Healthcare). En una forma de realización, el sistema de expansión celular incluye una bolsa celular permeable a los gases con un volumen seleccionado del grupo que consta de alrededor de 100 ml, alrededor de 200 ml, alrededor de 300 ml, alrededor de 400 ml, alrededor de 500 ml, alrededor de 600 ml, alrededor de 700 ml , alrededor de 800 ml, alrededor de 900 ml, alrededor de 1 L, alrededor de 2 L, alrededor de 3 L, alrededor de 4 L, alrededor de 5 L, alrededor de<6>L, alrededor de 7 L, alrededor de<8>L, alrededor de 9 L y alrededor de 10 L. En una forma de realización, los TIL se pueden expandir en matraces G-Rex (disponibles comercialmente en Wilson Wolf Manufacturing). Tales formas de realización permiten que las poblaciones de células se expandan desde alrededor de 5x10<5>células/cm<2>a entre 10x10<6>y 30x106 células/cm2. En una forma de realización, esta expansión se lleva a cabo sin agregar medio de cultivo celular fresco a las células (también denominado alimentación de las células). En una forma de realización, esto es sin alimentación siempre que el medio resida a una altura de alrededor de 10 cm en el matraz G-Rex. En una forma de realización, esto es sin alimentación, pero con la adición de una o más citocinas. En una forma de realización, la citocina se puede agregar como un bolo sin necesidad de mezclar la citocina con el medio. Dichos contenedores, dispositivos y procedimientos son conocidos en la técnica y se han utilizado para expandir los TIL, e incluyen los descritos en la publicación de solicitud de patente de EE. UU. No. US 2014/0377739A1, publicación internacional No. WO 2014/210036 A1, publicación de solicitud de patente de EE. UU. No. US 2013/0115617 A1, publicación internacional No. WO 2013/188427 A1, solicitud de patente de EE. UU. No. US 2011/0136228 A1, patente de EE. UU. No. US 8.809,050 B2, publicación internacional No. WO 2011/072088 A2, publicación de solicitud de patente de EE. UU. No. US 2016/0208216 A1, publicación de solicitud de patente de EE. UU. No. US 2012/0244133 A1, publicación internacional No. WO 2012/129201 A1, publicación de solicitud de patente de EE. UU. No. US 2013/0102075 A1, patente de EE. UU. No. US 8,956,860 B2, publicación internacional No. WO 2013/173835 A1, publicación de solicitud de patente estadounidense No. US 2015/0175966 A1. Dichos procedimientos también se describen en Jin et al., J. Immunotherapy, 2012, 35:283-292. Optional Genetic Engineering of TILs.
En algunas formas de realización, los TIL se diseñan opcionalmente genéticamente para incluir funcionalidades adicionales que incluyen, entre otras, un receptor de células T de alta afinidad (TCR), por ejemplo, un TCR dirigido a un antígeno asociado a un tumor como MAGE-1, HER2 o NY-ESO-1, o un receptor de antígeno quimérico (CAR) que se une a una molécula de la superficie celular asociada a un tumor (por ejemplo, mesotelina) o una molécula de la superficie celular de linaje restringido (por ejemplo, CD19).
H. Crioconservación opcional de TIL
Como se discutió anteriormente, y se ejemplificó en las etapas A a E como se proporciona en la Figura 27, la crioconservación puede ocurrir en numerosos puntos a lo largo del procedimiento de expansión de TIL. En algunas formas de realización, la población expandida de TIL después de la segunda expansión (como se proporciona, por ejemplo, según la etapa D de la Figura 27) se puede crioconservar. La crioconservación generalmente se puede lograr colocando la población de TIL en una solución de congelación, por ejemplo, suero AB inactivado con suplemento al 85% y dimetilsulfóxido (DMSO) al 15%. Las células en solución se colocan en viales criogénicos y se almacenan durante 24 horas a -80°C, con transferencia opcional a congeladores de nitrógeno gaseoso para crioconservación. Véase Sadeghi, et al., Acta Oncologica 2013, 52, 978-986. En algunas formas de realización, los TIL se crioconservan en DMSO al 5%. En algunas formas de realización, los TIL se crioconservan en medio de cultivo celular más DMSO al 5%. En algunas formas de realización, los TIL se crioconservan de acuerdo con los procedimientos proporcionados en los Ejemplos<8>y 9.
Cuando sea apropiado, las células se sacan del congelador y se descongelan en un baño de agua a 37°C hasta que alrededor de 4/5 de la solución se descongelan. Las células generalmente se resuspenden en medio completo y opcionalmente se lavan una o más veces. En algunas formas de realización, los TIL descongelados pueden contarse y evaluarse para determinar su viabilidad como se conoce en la técnica.
I. Características fenotípicas de los TIL expandidos
En alguna forma de realización, los TIL se analizan para determinar la expresión de numerosos marcadores fenotípicos después de la expansión, incluidos los descritos en el presente documento y en los Ejemplos. En una forma de realización, se examina la expresión de uno o más marcadores fenotípicos. En algunas formas de realización, las características fenotípicas de los TIL se analizan después de la primera expansión en la etapa B. En algunas formas de realización, las características fenotípicas de los TIL se analizan durante la transición en la etapa C. En algunas formas de realización, las características fenotípicas de los TIL son analizados durante la transición según la etapa C y después de la crioconservación. En algunas formas de realización, las características fenotípicas de los TIL se analizan después de la segunda expansión según la etapa D. En algunas formas de realización, las características fenotípicas de los TIL se analizan después de dos o más expansiones según la etapa D. En algunas formas de realización, el marcador es seleccionado del grupo que consiste en TCRab (es decir, TCRa/p/), CD57, CD28, CD4, CD27, CD56, CD<8>a, CD45RA, CD<8>a, CCR7, CD4, CD3, CD38 y HLA-DR. En algunas formas de realización, el marcador se selecciona del grupo que consiste en TCRab (es decir, TCRa/p), CD57, CD28, CD4, CD27, CD56 y CD<8>a. En una forma de realización, el marcador se selecciona del grupo que consiste en CD45RA, CD<8>a, CCR7, CD4, CD3, CD38 y HLA-DR. En algunas formas de realización, se examina la expresión de uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece o catorce marcadores. En algunas formas de realización, se examina la expresión de uno o más marcadores de cada grupo. En algunas formas de realización, se mantiene la expresión de uno o más de HLA-DR, CD38 y CD69 (es decir, no muestra una diferencia estadísticamente significativa) en TIL frescos en comparación con TIL descongelados. En algunas formas de realización, el estado de activación de los TIL se mantiene en los TIL descongelados.
En una forma de realización, se mide la expresión de uno o más marcadores reguladores. En algunas formas de realización, el marcador regulador se selecciona del grupo que consiste en CD137, CD<8>a, Lag3, CD4, CD3, PD-1, TIM-3, CD69, CD<8>a, TIGIT, CD4, CD3, KLRG1 y CD154. En algunas formas de realización, el marcador regulador se selecciona del grupo que consiste en CD137, CD<8>a, Lag3, CD4, CD3, PD-1 y TIM-3. En algunas formas de realización, el marcador regulador se selecciona del grupo que consiste en CD69, CD<8>a, TIGIT, CD4, CD3, KLRG1 y CD154. En algunas formas de realización, la expresión de la molécula reguladora disminuye en los TIL descongelados en comparación con los TIL frescos. En algunas formas de realización, la expresión de las moléculas reguladoras LAG-3 y TIM-3 disminuye en los TIL descongelados en comparación con los TIL frescos. En algunas formas de realización, no hay una diferencia significativa en la expresión de CD4, CD<8>, NK, TCRap. En algunas formas de realización, no hay una diferencia significativa en la expresión de CD4, CD<8>, NK, TCRap y/o marcadores de memoria en TIL frescos en comparación con TIL descongelados. En algunas formas de realización, no hay una diferencia significativa en la expresión de CD4, CD<8>, NK, TCRap entre los TIL producidos por los procedimientos proporcionados en este documento, como se ejemplifica, por ejemplo, en la Figura 27, y/o los TIL preparados utilizando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento que incluyen, por ejemplo, procedimientos distintos a los incorporados en la Figura 27.
En algunas formas de realización, no se realiza ninguna selección de la primera población de TIL, la segunda población de TIL, la tercera población de TIL, la población de TIL recolectada y/o la población de TIL terapéutica basada en la expresión de CD4, CD<8>y/o NK, TCRap durante ninguna de las etapas, incluidos los descritos anteriormente o los que se proporcionan, por ejemplo, en la Figura 27. En algunas formas de realización, no se realiza ninguna selección de la primera población de TIL basada en CD4, CD<8>y/o NK, TCRap. En algunas formas de realización, no se realiza ninguna selección de la segunda población de TIL basada en la expresión de CD4, CD<8>y/o NK, TCRap. En algunas formas de realización, no se realiza ninguna selección de la tercera población de TlL basada en la expresión de CD4, CD<8>y/o NK, TCRap. En algunas formas de realización, no se realiza ninguna selección de la población recolectada de TIL basada en la expresión de CD4, CD<8>y/o NK, TCRap. En algunas formas de realización, no se realiza ninguna selección de la población terapéutica de TIL basada en la expresión de CD4, CD<8>y/o NK, TCRap.
En ciertos ejemplos, no se realiza ninguna selección de la primera población de TIL, la segunda población de TIL, la tercera población de TIL o la población de TIL recolectada basada en la expresión de CD4, CD<8>y/o NK, TCRap durante ninguna de las etapas (a) para (f) del procedimiento para expandir linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) en una población terapéutica de TIL que comprende:
(a) obtener una primera población de TIL de un tumor extirpado de un paciente convirtiendo una muestra de tumor obtenida del paciente en múltiples fragmentos de tumor
(b) agregar los fragmentos de tumor a un sistema cerrado;
(c) realizar una primera expansión cultivando la primera población de TIL en un medio de cultivo celular que comprende IL-2 para producir una segunda población de TIL, en donde la primera expansión se realiza en un recipiente cerrado, lo que proporciona una primera área de superficie permeable a los gases, donde la primera expansión se realiza durante alrededor de 3-14 días para obtener la segunda población de TIL, donde la segunda población de TIL es al menos 50 veces mayor en número que la primera población de TIL, y donde la transición desde la etapa (b) a la etapa (c) ocurre sin abrir el sistema;
(d) realizar una segunda expansión suplementando el medio de cultivo celular de la segunda población de TIL con IL-2, OKT-3 y células presentadoras de antígeno (APC) adicionales, para producir una tercera población de TIL, en donde la segunda expansión se realiza durante alrededor de 7-14 días para obtener la tercera población de TIL, en donde la tercera población de TIL es una población terapéutica de TIL que comprende una subpoblación aumentada de células T efectoras y/o células T de memoria central en relación con la segunda población de TIL, en donde la segunda expansión se realiza en un recipiente cerrado, lo que proporciona una segunda área superficial permeable al gas, y en donde la transición de la etapa (c) a la etapa (d) se produce sin abrir el sistema;
(e) recolectar la población terapéutica de TIL obtenida de la etapa (d), en donde la transición de la etapa (d) a la etapa (e) ocurre sin abrir el sistema; y
(f) transferir la población de TIL recolectada de la etapa (e) a una bolsa de infusión, en donde la transferencia de la etapa (e) al (f) ocurre sin abrir el sistema.
En un ejemplo, no se realiza ninguna selección de la primera población de TIL, la segunda población de TIL, la tercera población de TIL o la población de TIL recolectada basada en la expresión de CD4, CD<8>y/o NK, TCRap durante ninguna de las etapas (a) a (h) del procedimiento para tratar a un sujeto con cáncer, y el procedimiento comprende la administración de linfocitos infiltrantes de tumores expandidos (TIL) que comprende:
(a) obtener una primera población de TIL de un tumor extirpado de un sujeto convirtiendo una muestra de tumor obtenida del paciente en múltiples fragmentos de tumor;
(b) agregar los fragmentos de tumor a un sistema cerrado;
(c) realizar una primera expansión cultivando la primera población de TIL en un medio de cultivo celular que comprende IL-2 para producir una segunda población de TIL, en donde la primera expansión se realiza en un recipiente cerrado, lo que proporciona una primera área de superficie permeable a los gases, donde la primera expansión se realiza durante alrededor de 3-14 días para obtener la segunda población de TIL, donde la segunda población de TIL es al menos 50 veces mayor en número que la primera población de TIL, y donde la transición desde la etapa (b) a la etapa (c) ocurre sin abrir el sistema;
(d) realizar una segunda expansión suplementando el medio de cultivo celular de la segunda población de TIL con IL-2, OKT-3 y células presentadoras de antígeno (APC) adicionales, para producir una tercera población de TIL, en donde la segunda expansión se realiza durante alrededor de 7-14 días para obtener la tercera población de TIL, en donde la tercera población de TIL es una población terapéutica de TIL que comprende una subpoblación aumentada de células T efectoras y/o células T de memoria central en relación con la segunda población de TIL, en donde la segunda expansión se realiza en un recipiente cerrado, lo que proporciona una segunda área superficial permeable al gas, y en donde la transición de la etapa (c) a la etapa (d) se produce sin abrir el sistema;
(e) recolectar la población terapéutica de TIL obtenida de la etapa (d), en donde la transición de la etapa (d) a la etapa (e) ocurre sin abrir el sistema; y
(f) transferir la población de TIL recolectada de la etapa (e) a una bolsa de infusión, en donde la transferencia de la etapa (e) al (f) ocurre sin abrir el sistema;
(g) opcionalmente crioconservar la bolsa de infusión que comprende la población de TIL recolectada de la etapa (f) usando un procedimiento de crioconservación; y
(h) administrar una dosis terapéuticamente eficaz de la tercera población de TIL de la bolsa de infusión en la etapa (g) al paciente.
En algunas formas de realización, el marcador de memoria se selecciona del grupo que consiste en CCR7 y CD62L
En algunas formas de realización, la viabilidad de los TIL frescos en comparación con los TIL descongelados es al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, o al menos el 98%. En algunas formas de realización, la viabilidad de los TIL tanto frescos como descongelados es mayor al 70%, mayor al 75%, mayor al 80%, mayor al 85%, mayor al 90%, mayor al 95% o mayor al 98%. En algunas formas de realización, la viabilidad tanto del producto fresco como descongelado es mayor al 80%, mayor al 81%, mayor al 82%, mayor al 83%, mayor al 84%, mayor al 85%, mayor al<8 6>%, mayor más del 87%, mayor al<8 8>%, mayor al 89% o mayor al 90%. En algunas formas de realización, la viabilidad del producto tanto fresco como descongelado es mayor al<8 6>%.
En una forma de realización, los TIL reestimulados también pueden evaluarse para la liberación de citocinas, usando ensayos de liberación de citocinas. En algunas formas de realización, los TII pueden evaluarse para la secreción de interferón-7 (IFN-7) en respuesta a la estimulación con OKT3 o cocultivo con digestión de tumor autólogo. Por ejemplo, en las formas de realización que emplean estimulación con OKT3, los TII se lavan extensamente y se preparan pocillos duplicados con 1 x 10<5>células en 0.2 ml de CM en placas de fondo plano de 96 pocillos recubiertas previamente con 0.1 o 1.0 pg/ml de OKT3 diluido en solución salina con pH regulado con fosfato. Después de la incubación durante la noche, se recogen los sobrenadantes y se mide el IFN-7 en el sobrenadante mediante ELISA (Pierce/Endogen, Woburn, MA). Para el ensayo de cocultivo, se colocan 1 x 10<5>células de TIL en una placa de 96 pocillos con células tumorales autólogas. (Relación 1:1). Después de una incubación de 24 horas, se recogen los sobrenadantes y se puede cuantificar la liberación de IFN-7, por ejemplo, mediante ELISA.
Análisis de citometría de flujo de biomarcadores de superficie celular: Se tomaron alícuotas de muestras de TIL para análisis de citometría de flujo de marcadores de superficie celular; véase, por ejemplo, Ejemplos 7,<8>y 9.
En algunas formas de realización, los TIL se están evaluando para varios marcadores reguladores. En algunas formas de realización, el marcador regulador se selecciona del grupo que consiste en TCR a/p, CD56, CD27, CD28, CD57, CD45RA, CD45RO, CD25, CD127, CD95, IL-2R-, CCR7, CD62L, KLRG1 y CD122. En algunas formas de realización, el marcador regulador es TCR a/p. En algunas formas de realización, el marcador regulador es CD56. En algunas formas de realización, el marcador regulador es CD27. En algunas formas de realización, el marcador regulador es CD28. En algunas formas de realización, el marcador regulador es CD57. En algunas formas de realización, el marcador regulador es CD45RA. En algunas formas de realización, el marcador regulador es CD45RO. En algunas formas de realización, el marcador regulador es CD25. En algunas formas de realización, el marcador regulador es CD127. En algunas formas de realización, el marcador regulador es CD95. En algunas formas de realización, el marcador regulador es IL-2R-. En algunas formas de realización, el marcador regulador es CCR7. En algunas formas de realización, el marcador regulador es CD62L. En algunas formas de realización, el marcador regulador es KLRG1. En algunas formas de realización, el marcador regulador es CD122.
En una forma de realización, los TIL expandidos se analizan para la expresión de numerosos marcadores fenotípicos, incluidos los descritos en el presente documento y en los Ejemplos. En una forma de realización, se examina la expresión de uno o más marcadores fenotípicos. En algunas formas de realización, el marcador se selecciona del grupo que consiste en TCRab (es decir, TCRa/p), CD57, CD28, CD4, CD27, CD56, CD<8>a, CD45RA, CD<8>a, CCR7, CD4, CD3, CD38 y h La -DR. En algunas formas de realización, el marcador se selecciona del grupo que consiste en TCRab (es decir, TCRa/p), CD57, CD28, CD4, CD27, CD56 y CD<8>a. En una forma de realización, el marcador se selecciona del grupo que consiste en CD45RA, CD<8>a, CCR7, CD4, CD3, CD38 y HLA-DR. En algunas formas de realización, se examina la expresión de uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece o catorce marcadores. En algunas formas de realización, se examina la expresión de uno o más marcadores de cada grupo. En algunas formas de realización, se mantiene la expresión de uno o más de HLA-DR, CD38 y CD69 (es decir, no muestra una diferencia estadísticamente significativa) en TIL frescos en comparación con TIL descongelados. En algunas formas de realización, el estado de activación de los TIL se mantiene en los TIL descongelados.
En una forma de realización, se mide la expresión de uno o más marcadores reguladores. En algunas formas de realización, el marcador regulador se selecciona del grupo que consiste en CD137, CD<8>a, Lag3, CD4, CD3, PD1, TIM-3, CD69, CD<8>a, TIGIT, CD4, CD3, KLRG1 y CD154. En algunas formas de realización, el marcador regulador se selecciona del grupo que consiste en CD137, CD<8>a, Lag3, CD4, CD3, PD1 y TIM-3. En algunas formas de realización, el marcador regulador se selecciona del grupo que consiste en CD69, CD<8>a, TIGIT, CD4, CD3, KLRG1 y CD154. En algunas formas de realización, la expresión de la molécula reguladora disminuye en los TIL descongelados en comparación con los TIL frescos. En algunas formas de realización, la expresión de las moléculas reguladoras LAG-3 y TIM-3 disminuye en los TIL descongelados en comparación con los TIL frescos. En algunas formas de realización, no hay una diferencia significativa en la expresión de CD4, CD<8>, NK, TCRap. En algunas formas de realización, no hay una diferencia significativa en la expresión de CD4, CD<8>, NK, TCRap y/o marcadores de memoria en TIL frescos en comparación con TIL descongelados.
En algunas formas de realización, el marcador de memoria se selecciona del grupo que consiste en CCR7 y CD62L.
En algunas formas de realización, la viabilidad de los TIL frescos en comparación con los TIL descongelados es al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, o al menos el 98%. En algunas formas de realización, la viabilidad de los TIL tanto frescos como descongelados es mayor al 70%, mayor al 75%, mayor al 80%, mayor al 85%, mayor al 90%, mayor al 95% o mayor al 98%. En algunas formas de realización, la viabilidad tanto del producto fresco como descongelado es mayor al 80%, mayor al 81%, mayor al 82%, mayor al 83%, mayor al<8 4>%, mayor al 85%, mayor al<8 6>%, mayor al 87%, mayor al<8 8>%, mayor al 89% o mayor al 90%. En algunas formas de realización, la viabilidad del producto tanto fresco como descongelado es mayor al<8 6>%.
En una forma de realización, los TIL reestimulados también pueden evaluarse para la liberación de citocinas, usando ensayos de liberación de citocinas. En algunas formas de realización, los TII pueden evaluarse para la secreción de interferón-7 (IFN-7) en respuesta a la estimulación con OKT3 o cocultivo con digestión de tumor autólogo. Por ejemplo, en las formas de realización que emplean estimulación con OKT3, los TII se lavan extensamente y se preparan pocillos duplicados con 1 x 10<5>células en 0.2 ml de CM en placas de fondo plano de 96 pocillos recubiertas previamente con 0.1 o 1.0 pg/ml de OKT3 diluido en solución salina con pH regulado con fosfato. Después de la incubación durante la noche, se recogen los sobrenadantes y se mide el IFN-7 en el sobrenadante mediante ELISA (Pierce/Endogen, Woburn, MA). Para el ensayo de cocultivo, se colocan 1 x 10<5>células TIL en una placa de 96 pocillos con células tumorales autólogas. (Relación 1:1). Después de una incubación de 24 horas, se recogen los sobrenadantes y se puede cuantificar la liberación de IFN-7, por ejemplo, mediante ELISA.
En algunas formas de realización, la caracterización fenotípica se examina después de la crioconservación.
J. Salud metabólica de los TIL expandidos
Los TIL reestimulados se caracterizan por una mejora significativa de la glucólisis basal en comparación con los TIL recién recolectados y/o los TIL post-descongelados. En una forma de realización, no se realiza ninguna selección de la primera población de TIL, la segunda población de TIL, la tercera población de TIL, la población de TIL recolectada y/o la población de TIL terapéutica basada en la expresión de CD<8>durante ninguna de las etapas, incluidas las discutidas anteriormente o como se proporciona, por ejemplo, en la Figura 27. En algunas formas de realización, no se realiza ninguna selección de la primera población de TIL basada en la expresión de CD<8>. En algunas formas de realización, no se realiza ninguna selección de la segunda población de TIL basada en la expresión de CD<8>. En algunas formas de realización, no se realiza ninguna selección de la tercera población de TIL basada en la expresión de CD<8>. En algunas formas de realización, no se realiza ninguna selección de la población recolectada de TIL basada en la expresión de CD<8>. En algunas formas de realización, no se realiza ninguna selección de la población terapéutica de TIL basada en la expresión de CD<8>.
En un ejemplo, no se realiza ninguna selección de la primera población de TIL, la segunda población de TIL, la tercera población de TIL o la población de TIL recolectada basada en la expresión de CD<8>durante ninguna de las etapas (a) a (f) del procedimiento para expandir los linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) en una población terapéutica de TIL que comprende:
(a) obtener una primera población de TIL de un tumor extirpado de un paciente convirtiendo una muestra de tumor obtenida del paciente en múltiples fragmentos de tumor;
(b) agregar los fragmentos de tumor a un sistema cerrado;
(c) realizar una primera expansión cultivando la primera población de TIL en un medio de cultivo celular que comprende IL-2 para producir una segunda población de TIL, en donde la primera expansión se realiza en un recipiente cerrado, lo que proporciona una primera área de superficie permeable a los gases, donde la primera expansión se realiza durante alrededor de 3-14 días para obtener la segunda población de TIL, donde la segunda población de TIL es al menos 50 veces mayor en número que la primera población de TIL, y donde la transición desde la etapa (b) a la etapa (c) ocurre sin abrir el sistema;
(d) realizar una segunda expansión suplementando el medio de cultivo celular de la segunda población de TIL con IL-2, OKT-3 y células presentadoras de antígeno (APC) adicionales, para producir una tercera población de TIL, en donde la segunda expansión se realiza durante alrededor de 7-14 días para obtener la tercera población de TIL, en donde la tercera población de TIL es una población terapéutica de TIL que comprende una subpoblación aumentada de células T efectoras y/o células T de memoria central en relación con la segunda población de TIL, en donde la segunda expansión se realiza en un recipiente cerrado, lo que proporciona una segunda área superficial permeable al gas, y en donde la transición de la etapa (c) a la etapa (d) se produce sin abrir el sistema;
(e) recolectar la población terapéutica de TIL obtenida de la etapa (d), en donde la transición de la etapa (d) a la etapa (e) ocurre sin abrir el sistema; y
(f) transferir la población de TIL recolectada de la etapa (e) a una bolsa de infusión, en donde la transferencia de la etapa (e) a la (f) ocurre sin abrir el sistema.
En un ejemplo, no se realiza ninguna selección de la primera población de TIL, la segunda población de TIL, la tercera población de TIL o la población de TIL recolectada basada en la expresión de CD<8>durante ninguna de las etapas (a) a (h) del procedimiento. para el tratamiento de un sujeto con cáncer; el procedimiento comprende administrar linfocitos infiltrantes de tumores expandidos (TIL) y comprende:
(a) obtener una primera población de TIL de un tumor extirpado de un sujeto convirtiendo una muestra de tumor obtenida del paciente en múltiples fragmentos de tumor;
(b) agregar los fragmentos de tumor a un sistema cerrado;
(c) realizar una primera expansión cultivando la primera población de TIL en un medio de cultivo celular que comprende IL-2 para producir una segunda población de TIL, en donde la primera expansión se realiza en un recipiente cerrado, lo que proporciona una primera área de superficie permeable a los gases, donde la primera expansión se realiza durante alrededor de 3-14 días para obtener la segunda población de TIL, donde la segunda población de TIL es al menos 50 veces mayor en número que la primera población de TIL, y donde la transición desde la etapa (b) a la etapa (c) ocurre sin abrir el sistema;
(d) realizar una segunda expansión suplementando el medio de cultivo celular de la segunda población de TIL con IL-2, OKT-3 y células presentadoras de antígeno (APC) adicionales, para producir una tercera población de TIL, en donde la segunda expansión se realiza durante alrededor de 7-14 días para obtener la tercera población de TIL, en donde la tercera población de TIL es una población terapéutica de TIL que comprende una subpoblación aumentada de células T efectoras y/o células T de memoria central en relación con la segunda población de TIL, en donde la segunda expansión se realiza en un recipiente cerrado, lo que proporciona una segunda área superficial permeable al gas, y en donde la transición de la etapa (c) a la etapa (d) se produce sin abrir el sistema;
(e) recolectar la población terapéutica de TIL obtenida de la etapa (d), en donde la transición de la etapa (d) a la etapa (e) ocurre sin abrir el sistema; y
(f) transferir la población de TIL recolectada de la etapa (e) a una bolsa de infusión, en donde la transferencia de la etapa (e) a la (f) ocurre sin abrir el sistema;
(g) opcionalmente crioconservar la bolsa de infusión que comprende la población de TIL recolectada de la etapa (f) usando un procedimiento de crioconservación; y
(h) administrar una dosis terapéuticamente eficaz de la tercera población de TIL de la bolsa de infusión en la etapa (g) al paciente.
Los TIL preparados mediante los procedimientos descritos en este documento se caracterizan por una mejora significativa de la glucólisis basal en comparación con, por ejemplo, los TIL recién recolectados y/o los TIL preparados usando otros procedimientos distintos a los que se proporcionan en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En una forma de realización, no se realiza ninguna selección de la primera población de TIL, la segunda población de TIL, la tercera población de TIL, la población de TIL recolectada y/o la población de TIL terapéutica basada en la expresión de CD<8>durante ninguna de las etapas, incluidas las discutidas anteriormente o como se proporcionan, por ejemplo, en la Figura 27. En algunas formas de realización, no se realiza ninguna selección de la primera población de TIL basada en la expresión de CD<8>. En algunas formas de realización, no se realiza ninguna selección de la segunda población de TIL basada en la expresión de CD<8>. En algunas formas de realización, no se realiza ninguna selección de la tercera población de TIL basada en la expresión de CD<8>. En algunas formas de realización, no se realiza ninguna selección de la población recolectada de TIL basada en la expresión de CD<8>. En algunas formas de realización, no se realiza ninguna selección de la población terapéutica de TIL basada en la expresión de CD<8>. En una forma de realización, no se realiza ninguna selección de la primera población de TIL, la segunda población de TIL, la tercera población de TIL o la población de TIL recolectada basada en la expresión de CD<8>durante ninguna de las etapas (a) a (h).
La capacidad respiratoria de reserva (SRC) y la reserva glucolítica pueden evaluarse para los TIL expandidos con diferentes procedimientos de la presente divulgación. La prueba de estrés Seahorse XF Cell Mito mide la función mitocondrial midiendo directamente la tasa de consumo de oxígeno (OCR) de las células, utilizando moduladores de la respiración que se dirigen a los componentes de la cadena de transporte de electrones en las mitocondrias. Los compuestos de prueba (oligomicina, FCCP y una mezcla de rotenona y antimicina A, descritos más adelante) se inyectan en serie para medir la producción de ATP, la respiración máxima y la respiración no mitocondrial, respectivamente. Más adelante, se calculan la fuga de protones y la capacidad respiratoria de reserva utilizando estos parámetros y la respiración basal. Cada modulador se dirige a un componente específico de la cadena de transporte de electrones. La oligomicina inhibe la ATP sintasa (complejo V) y la disminución de OCR después de la inyección de oligomicina se correlaciona con la respiración mitocondrial asociada con la producción de ATP celular. El carbonilcianuro-4 (trifluorometoxi) fenilhidrazona (FCCP) es un agente desacoplador que colapsa el gradiente de protones y altera el potencial de la membrana mitocondrial. Como resultado, el flujo de electrones a través de la cadena de transporte de electrones se desinhibe y el complejo IV consume al máximo el oxígeno. El OCR estimulado por FCCP se puede utilizar para calcular la capacidad respiratoria de reserva, definida como la diferencia entre la respiración máxima y la respiración basal. La capacidad respiratoria de reserva (SRC) es una medida de la capacidad de la célula para responder al aumento de la demanda de energía. La tercera inyección es una mezcla de rotenona, un inhibidor del complejo I, y antimicina A, un inhibidor del complejo III. Esta combinación detiene la respiración mitocondrial y permite el cálculo de la respiración no mitocondrial impulsada por procesos fuera de las mitocondrias. En algunas formas de realización, la comparación es, por ejemplo, con TIL recién recolectados y/o TIL preparados usando otros procedimientos distintos a los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados a la Figura 27.
En algunas formas de realización, el ensayo metabólico es la respiración basal. En general, los TIL de segunda expansión tienen una tasa de respiración basal de al menos 50%, al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99% de la tasa de respiración basal de TIL recién recolectados y/o TIL recién preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento incluyendo, por ejemplo, procedimientos distintos a los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, la tasa de respiración basal es de alrededor de el 50% a alrededor de el 99% de la tasa de respiración basal de los TIL recién recolectados y/o los TIL preparados utilizando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, la tasa de respiración basal es de alrededor del 60% a alrededor del 99% de la tasa de respiración basal de los TIL recién recolectados y/o los TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, la tasa de respiración basal es de alrededor de el 70% a alrededor del 99% de la tasa de respiración basal de los TIL recién recolectados y/o los TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, la tasa de respiración basal es de alrededor del 80% a alrededor del 99% de la tasa de respiración basal de los TIL recién recolectados y/o los TIL preparados utilizando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, la tasa de respiración basal es de alrededor del 90% a alrededor del 99% de la tasa de respiración basal de los TIL recién recolectados y/o los TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, la tasa de respiración basal es de alrededor del 95% a alrededor del 99% de la tasa de respiración basal de los TIL recién recolectados y/o los TIL preparados usando otros procedimientos que los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, los TIL de segunda expansión o los TIL de segunda expansión adicional (como, por ejemplo, los descritos en la etapa D de la Figura 27, incluidos los TIL denominados reREP TIL) tienen una tasa de respiración basal que no es estadísticamente significativa distinto de la tasa de respiración basal de TIL recién recolectados y/o TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en el presente documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, la comparación es, por ejemplo, con TIL recién recolectados y/o TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados a la Figura 27.
En algunas formas de realización, el ensayo metabólico es capacidad respiratoria de reserva. En general, los TIL de segunda expansión o los TIL de segunda expansión adicional (como, por ejemplo, los descritos en la etapa D de la Figura 27, incluidos los TIL denominados reREP TIL) tienen una capacidad respiratoria de reserva que es al menos del 50%, al menos el 55%, al menos el 60%, al menos el 65%, al menos el 70%, al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 97%, al menos el 98%, o al menos el 99% de la tasa de respiración basal de los TIL recién recolectados y/o TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, la capacidad respiratoria de reserva es de alrededor del 50% a alrededor del 99% de la tasa de respiración basal de los TIL recién recolectados. En algunas formas de realización, la capacidad respiratoria de reserva es de alrededor del 50% a alrededor del 99% de la tasa de respiración basal de los TIL recién recolectados y/o TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, la capacidad respiratoria de reserva es de alrededor del 60% a alrededor del 99% de la tasa de respiración basal de los TIL recién recolectados y/o TIL preparados utilizando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, la capacidad respiratoria de reserva es de alrededor del 70% a alrededor del 99% de la tasa de respiración basal de los TIL recién recolectados y/o los TIL preparados utilizando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, la capacidad respiratoria de reserva es de alrededor de un 80% a alrededor de un 99% de la tasa de respiración basal de los TIL recién recolectados. En algunas formas de realización, la capacidad respiratoria de reserva es de alrededor de 90% a alrededor de 99% de la tasa de respiración basal de TIL recién recolectados y/o TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, la capacidad respiratoria de reserva es de alrededor del 95% a alrededor del 99% de la tasa de respiración basal de los TIL recién recolectados y/o los TIL preparados utilizando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, los TIL de segunda expansión o los TIL de segunda expansión adicional (como, por ejemplo, los descritos en la etapa D de la Figura 27, incluidos los TIL denominados reREP TIL) tienen una capacidad respiratoria de reserva que no es diferente de manera estadísticamente significativa de la tasa de respiración basal de TIL recién recolectados y/o TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en el presente documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27.
En general, los TIL de segunda expansión o los TIL de segunda expansión adicional (como, por ejemplo, los descritos en la etapa D de la figura 27, incluidos los TIL denominados reREP TIL) tienen una capacidad respiratoria de reserva que es al menos de al menos 50%, al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 97%, al menos 98%, o al menos 99% de la tasa de respiración basal de TIL recién recolectados y/o TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento incluyendo, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, el ensayo metabólico medido es la reserva glucolítica. En algunas formas de realización, el ensayo metabólico es capacidad respiratoria de reserva. Para medir el metabolismo celular (respiratorio), las células se trataron con inhibidores de la respiración mitocondrial y la glucólisis para determinar un perfil metabólico para el TIL que consta de las siguientes medidas: fosforilación oxidativa basal (medida por OCR), capacidad respiratoria de reserva, actividad glucolítica de línea base (como se mide por ECAR) y reserva glucolítica. Los perfiles metabólicos se realizaron utilizando el Ensayo de Prueba de Estrés de Glicólisis/Mitocondrial Combinado Seahorse (incluido el kit disponible comercialmente en Agilent®), que permite determinar la capacidad de las células para realizar glucólisis tras el bloqueo de la producción de<a>T<p>mitocondrial. En algunas formas de realización, las células carecen de glucosa, luego se inyecta glucosa, seguida de un agente de estrés. En algunas formas de realización, el agente de estrés se selecciona del grupo que consiste en oligomicina, FCCP, rotenona, antimicina A y/o 2-desoxiglucosa (2-DG), así como combinaciones de las mismas. En algunas formas de realización, se agrega oligomicina a 10 mM. En algunas formas de realización, se agrega FCCP a 10 mM. En algunas formas de realización, se agrega rotenona a 2.5 mM. En algunas formas de realización, se agrega antimicina A a 2.5 mM. En algunas formas de realización, se agrega 2-desoxiglucosa (2-DG) a 500 mM. En algunas formas de realización, se miden la capacidad glucolítica, la reserva glucolítica y/o la acidificación no glucolítica. En general, los TII tienen una reserva glucolítica de al menos 50%, al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 97%, al menos el 98% o al menos el 99% de la tasa de respiración basal de los TIL recién recolectados y/o los TIL preparados utilizando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, la reserva glucolítica es de alrededor del 50% a alrededor del 99% de la tasa de respiración basal de los TIL recién recolectados y/o los TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, la reserva glucolítica es de alrededor del 60% a alrededor del 99% de la tasa de respiración basal de los TIL recién recolectados y/o los TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, la reserva glucolítica es de alrededor de un 70% a alrededor de un 99% de la tasa de respiración basal de los TIL recién recolectados y/o los TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, la reserva glucolítica es de alrededor de un 80% a alrededor de un 99% de la tasa de respiración basal de los TIL recién recolectados y/o los TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, la reserva glucolítica es de alrededor del 90% a alrededor del 99% de la tasa de respiración basal de los TIL recién recolectados y/o TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, la reserva glucolítica es de alrededor del 95% a alrededor del 99% de la tasa de respiración basal de los TIL recién recolectados y/o los TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27.
En algunas formas de realización, el ensayo metabólico es la glucólisis basal. En algunas formas de realización, los TIL de segunda expansión o los TIL de segunda expansión adicional (como, por ejemplo, los descritos en la etapa D de la Figura 27, incluidos los TIL denominados reREP TIL) tienen un aumento en la glucólisis basal de al menos dos veces, de al menos tres veces, al menos cuatro veces, al menos cinco veces, al menos seis veces, al menos 7 veces, al menos ocho veces, al menos nueve veces o al menos diez veces en comparación con TIL recién recolectados y/o TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en el presente documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, los TIL de segunda expansión o los TIL de segunda expansión adicional (tales como, por ejemplo, las descritas en la etapa D de la Figura 27, incluidos los TIL denominados reREP TIL) tienen un aumento en la glucólisis basal de alrededor de dos veces a alrededor de diez veces en comparación con los TIL recién recolectados y/o los TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en el presente documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, los TIL de segunda expansión o los TIL de segunda expansión adicional (tales como, por ejemplo, los descritos en la etapa D de la Figura 27, incluidos los TIL denominados reREP TIL) tienen un aumento en la glucólisis basal de alrededor de dos veces a alrededor de ocho veces en comparación con los TIL recién recolectados y/o los TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en el presente documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, los TIL de la segunda expansión o los TIL de la segunda expansión adicional (como, por ejemplo, los descritos en la etapa D de la Figura 27, incluidos los TIL denominados reREP TIL) tienen un aumento en la glucólisis basal de alrededor de tres veces a alrededor de siete veces en comparación con los TIL recién recolectados y/o los TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en el presente documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, los TIL de segunda expansión o los TIL de segunda expansión adicional (tales como, por ejemplo, los descritos en la etapa D de la Figura 27, incluidos los TIL denominados reREP TIL) tienen un aumento en la glucólisis basal de alrededor de dos veces a alrededor de cuatro veces en comparación con los TIL recién recolectadas y/o los TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, los TIL de segunda expansión o los TIL de segunda expansión adicional (tales como, por ejemplo, los descritos en la etapa D de la Figura 27, incluidos los TIL denominados reREP TIL) tienen un aumento en la glucólisis basal de alrededor de dos veces a alrededor de tres veces en comparación con los TIL recién recolectadas y/o los TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en el presente documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27.
En general, los TIL de segunda expansión o los TIL de segunda expansión adicional (como, por ejemplo, los descritos en la etapa D de la figura 27, incluidos los TIL denominados reREP TIL) tienen una reserva glucolítica de al menos el 50%, al menos el 55%, al menos el 60%, al menos el 65%, al menos el 70%, al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 97%, al menos el 98%, o al menos el 99% de la tasa de respiración basal de los TIL recién recolectados y/o los TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, la reserva glucolítica es de alrededor del 50% a alrededor del 99% de la tasa de respiración basal de los TIL recién recolectados. En algunas formas de realización, la reserva glucolítica es de alrededor del 60% a alrededor del 99% de la tasa de respiración basal de los TIL recién recolectados y/o los TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, la reserva glucolítica es de alrededor de un 70% a alrededor de un 99% de la tasa de respiración basal de los TIL recién recolectados y/o los TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, la reserva glucolítica es de alrededor de un 80% a alrededor de un 99% de la tasa de respiración basal de los TIL recién recolectados y/o los TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, la reserva glucolítica es de alrededor del 90% a alrededor del 99% de la tasa de respiración basal de los TIL recién recolectados y/o TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, la reserva glucolítica es de alrededor de un 95% a alrededor de un 99% de la tasa de respiración basal de los TIL recién recolectados.
Producción de granzima B: la granzima B es otra medida de la capacidad de TIL para destruir células diana. Los sobrenadantes de los medios reestimulados como se describió anteriormente usando anticuerpos para CD3, CD28 y CD137/4-1BB también se evaluaron para sus niveles de Granzima B usando el Kit ELISA Human Granzyme B DuoSet (R & D Systems, Minneapolis, MN) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En algunas formas de realización, los TIL de segunda expansión o los TIL de segunda expansión adicional (tales como, por ejemplo, los descritos en la etapa D de la Figura 27, incluidos los TIL denominados reREP TIL) han aumentado la producción de Granzima B. En algunas formas de realización, los TIL de segunda expansión o los TIL de segunda expansión adicional (tales como, por ejemplo, los descritos en la etapa D de la Figura 27, incluidos los TIL denominados reREP TIL) tienen una actividad citotóxica aumentada.
En algunas formas de realización, la longitud de los telómeros se puede usar como una medida de la viabilidad celular y/o función celular. En algunas formas de realización, los telómeros tienen sorprendentemente la misma longitud en los TIL producidos por la presente invención en comparación con los TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. Medición de la longitud de los telómeros: se han utilizado diversos procedimientos para medir la longitud de los telómeros en preparaciones citológicas y de ADN genómico. El análisis de fragmentos de restricción de telómeros (TRF) es el estándar de oro para medir la longitud de los telómeros (de Lange et al., 1990). Sin embargo, la principal limitación de TRF es el requisito de una gran cantidad de ADN (1,5 A g). Con la presente invención se pueden emplear dos técnicas ampliamente utilizadas para la medición de la longitud de los telómeros, a saber, la hibridación de fluorescencia in situ (FISH; Agilent Technologies, Santa Clara, CA) y la PCR cuantitativa. En algunas formas de realización, no hay cambio en la longitud de los telómeros entre los TIL inicialmente recolectados en la etapa A y los TIL expandidos de, por ejemplo, la etapa D como se proporciona en la Figura 27.
En algunas formas de realización, la salud de TIL se mide mediante la secreción de IFN-gamma (IFN-<y>). En algunas formas de realización, la secreción de IFN-y es indicativa de TIL activos. En algunas formas de realización, se emplea un ensayo de potencia para la producción de IFN-y. La producción de IFN-y es otra medida del potencial citotóxico. La producción de IFN-y puede medirse determinando los niveles de la citocina IFN-y en el medio de TIL estimulado con anticuerpos a CD3, CD28 y CD137/4-1BB. Los niveles de IFNy en los medios de estos TIL estimulados pueden determinarse midiendo la liberación de IFN-y. En algunas formas de realización, un aumento en la producción de IFN-<y>en, por ejemplo, TIL de la etapa D como se proporciona en la Figura 27 en comparación con los TIL recolectados inicialmente en, por ejemplo, la etapa A como se proporciona en la Figura 27, es indicativo de un aumento en el potencial citotóxico de TIL de la etapa D. En algunas formas de realización, la secreción de IFN-<y>aumenta una, dos, tres, cuatro o cinco veces o más. En algunas formas de realización, la secreción de IFN-<y>aumenta una vez. En algunas formas de realización, la secreción de IFN-<y>aumenta al doble. En algunas formas de realización, la secreción de IFN-<y>se triplica. En algunas formas de realización, la secreción de IFN-y aumenta cuatro veces. En algunas formas de realización, la secreción de IFN-<y>aumenta cinco veces. En algunas formas de realización, el IFN-<y>se mide usando un kit de ELISA Quantikine. En algunas formas de realización, el IFN-y se mide en TIL ex vivo. En algunas formas de realización, el IFN-<y>se mide en TIL ex vivo, incluidos los TIL producidos por los procedimientos de la presente invención, incluidos, por ejemplo, los procedimientos de la Figura 27, así como los TIL recién recolectados o los TIL producidos por otros procedimientos, como los proporcionados, por ejemplo, en la Figura 83 (como, por ejemplo, el procedimiento iC TIL).
En algunas formas de realización, el potencial citotóxico de TIL para lisar células diana se evaluó usando un ensayo de cocultivo de TIL con la línea celular bioluminiscente, P815 (Clon G<6>), de acuerdo con un ensayo de lisis redirigida bioluminiscente (ensayo de potencia) para ensayo de TIL que mide la citotoxicidad de TIL de una manera dependiente de la dosis altamente sensible.
En algunas formas de realización, los presentes procedimientos proporcionan un ensayo para evaluar la viabilidad de TIL, utilizando los procedimientos descritos anteriormente. En algunas formas de realización, los TIL se expanden como se discutió anteriormente, incluyendo, por ejemplo, lo que se proporciona en la Figura 27. En algunas formas de realización, los TIL se crioconservan antes de evaluar su viabilidad. En algunas formas de realización, la evaluación de viabilidad incluye descongelar los TIL antes de realizar una primera expansión, una segunda expansión y una segunda expansión adicional. En algunas formas de realización, los presentes procedimientos proporcionan un ensayo para evaluar la proliferación celular, la toxicidad celular, la muerte celular y/u otros términos relacionados con la viabilidad de la población de TIL. La viabilidad se puede medir mediante cualquiera de los ensayos metabólicos de TIL descritos anteriormente, así como con cualquier procedimiento conocido para evaluar la viabilidad celular que se conoce en la técnica. En algunas formas de realización, los presentes procedimientos proporcionan un ensayo para la evaluación de la proliferación celular, toxicidad celular, muerte celular y/u otros términos relacionados con la viabilidad de los TIL expandidos usando los procedimientos descritos en este documento, incluidos los ejemplificados en la Figura 27.
La presente invención también proporciona procedimientos de ensayo para determinar la viabilidad de TIL. En algunas formas de realización, los TIL tienen la misma viabilidad en comparación con los TIL recién recolectados y/o los TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, los TIL tienen una viabilidad incrementada en comparación con los TIL recién recolectados y/o los TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en el presente documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. La presente divulgación proporciona procedimientos para analizar la viabilidad de TIL mediante la expansión de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) a una población más grande de TIL, que comprende:
(i) obtención de una primera población de TIL previamente expandida;
(ii) realizar una primera expansión cultivando la primera población de TIL en un medio de cultivo celular que comprende IL-2 para producir una segunda población de TIL; y
(iii) realizar una segunda expansión suplementando el medio de cultivo celular de la segunda población de TIL con IL-2, OKT-3 y células presentadoras de antígeno (APC) adicionales, para producir una tercera población de TIL, en donde la tercera población de TIL es al menos 100 veces mayor que la segunda población de TIL, y en donde la segunda expansión se realiza durante al menos 14 días para obtener la tercera población de TIL, en donde la tercera población de TIL comprende una subpoblación aumentada de células T efectoras y/o células T de memoria central en relación con la segunda población de TIL, y en las que la tercera población se analiza adicionalmente para determinar su viabilidad.
El procedimiento puede comprender, además:
(iv) realizar una segunda expansión adicional suplementando el medio de cultivo celular de la tercera población de TIL con IL-2 adicional, OKT-3 adicional y APC adicionales, en donde la segunda expansión adicional se realiza durante al menos 14 días para obtener una mayor población de TIL que la obtenida en la etapa (iii), en donde la población más grande de TIL comprende una subpoblación aumentada de células T efectoras y/o células T de memoria central en relación con la tercera población de TIL, y en donde la tercera población se analiza adicionalmente para viabilidad.
Antes de la etapa (i), las células se pueden crioconservar.
Las células T se pueden descongelar antes de realizar la etapa (i).
La etapa (iv) se puede repetir de una a cuatro veces con el fin de obtener suficientes TIL para el análisis.
Las etapas (i) a (iii) o (iv) se pueden realizar dentro de un período de alrededor de 40 días a alrededor de 50 días.
Las etapas (i) a (iii) o (iv) se pueden realizar dentro de un período de alrededor de 42 días a alrededor de 48 días.
Las etapas (i) a (iii) o (iv) se pueden realizar dentro de un período de alrededor de 42 días a alrededor de 45 días.
Las etapas (i) a (iii) o (iv) se pueden realizar en alrededor de 44 días.
Las células de las etapas (iii) o (iv) pueden expresar CD4, CD<8>y TCR a p a niveles similares a las células recién recolectadas.
Las células presentadoras de antígeno pueden ser células mononucleares de sangre periférica (PBMC).
Las PBMC se pueden agregar al cultivo celular en cualquiera de los días 9 a 17 en la etapa (iii).
Las células T efectoras y/o las células T de memoria central en la población más grande de TIL en la etapa (iv) pueden exhibir una o más características seleccionadas del grupo que consiste en expresión de CD27, expresión de CD28, telómeros más largos, expresión aumentada de CD57 y expresión disminuida de CD56, en relación con las células T efectoras y/o las células T de memoria central en la tercera población de células.
Las células T efectoras y/o las células T de memoria central pueden exhibir una expresión de CD57 aumentada y una expresión de CD56 disminuida.
Las APC pueden ser APC artificiales (aAPC).
El procedimiento puede comprender además la etapa de transducción de la primera población de TIL con un vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica un receptor de células T de alta afinidad.
La etapa de transducción puede ocurrir antes de la etapa (i).
El procedimiento puede comprender además la etapa de transducción de la primera población de TIL con un vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica un receptor de antígeno quimérico (CAR) que comprende un anticuerpo de fragmento variable de cadena única fusionado con al menos un endodominio de una molécula de señalización de célula T.
La etapa de transducción puede ocurrir antes de la etapa (i).
Se puede ensayar la viabilidad de los TIL.
Se puede analizar la viabilidad de los TIL después de la crioconservación.
Se puede analizar la viabilidad de los TIL después de la crioconservación y después de la etapa (iv).
Los diversos receptores de antígenos de los linfocitos T y B se producen por recombinación somática de un número limitado, pero grande, de segmentos de gen. Estos segmentos de genes: V (variable), D (diversidad), J (unión) y C (constante), determinan la especificidad de enlace y las aplicaciones posteriores de inmunoglobulinas y receptores de células T (TCR). La presente invención proporciona un procedimiento para generar TIL que exhiben y aumentan la diversidad del repertorio de células T (a veces denominado policlonalidad). En algunas formas de realización, el aumento en la diversidad del repertorio de células T se compara con los TIL recién recolectados y/o los TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, los TIL obtenidos por el presente procedimiento exhiben un aumento en la diversidad del repertorio de células T. En algunas formas de realización, los TIL obtenidos en la primera expansión exhiben un aumento en la diversidad del repertorio de células T. En algunas formas de realización, el aumento de la diversidad es un aumento de la diversidad de inmunoglobulinas y/o la diversidad del receptor de células T. En algunas formas de realización, la diversidad está en la inmunoglobulina; está en la cadena pesada de inmunoglobulina. En algunas formas de realización, la diversidad está en la inmunoglobulina; está en la cadena ligera de inmunoglobulina. En algunas formas de realización, la diversidad está en el receptor de células T. En algunas formas de realización, la diversidad está en uno de los receptores de células T seleccionados del grupo que consiste en receptores alfa, beta, gamma y delta. En algunas formas de realización, hay un aumento en la expresión del receptor de células T (TCR) alfa y/o beta. En algunas formas de realización, hay un aumento en la expresión del receptor de células T (TCR) alfa. En algunas formas de realización, hay un aumento en la expresión del receptor de células T (TCR) beta. En algunas formas de realización, hay un aumento en la expresión de TCRab (es decir, TCRa/p).
De acuerdo con la presente divulgación, se proporciona un procedimiento para analizar la viabilidad de los TIL y/o su uso adicional en la administración a un sujeto. El procedimiento para analizar los linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) puede comprender:
(i) obtener una primera población de TIL;
(ii) realizar una primera expansión cultivando la primera población de TIL en un medio de cultivo celular que comprende IL-2 para producir una segunda población de TIL; y
(iii) realizar una segunda expansión suplementando el medio de cultivo celular de la segunda población de TIL con IL-2, OKT-3 y células presentadoras de antígeno (APC) adicionales, para producir una tercera población de TIL, en donde la tercera población de TIL es al menos 50 veces mayor en número que la segunda población de TIL;
(iv) recolección, lavado y crioconservación de la tercera población de TIL;
(v) almacenar los TIL crioconservados a una temperatura criogénica;
(vi) descongelar la tercera población de TIL para proporcionar una tercera población descongelada de TIL; y
(vii) realizar una segunda expansión adicional de una porción de la tercera población descongelada de TIL suplementando el medio de cultivo celular de la tercera población con IL-2, OKT-3 y APC durante un período de expansión adicional (a veces denominado período reREP) de al menos 3 días, en donde la tercera expansión se realiza para obtener una cuarta población de TIL, en donde el número de TIL en la cuarta población de TIL se compara con el número de TIL en la tercera población de TIL para obtener un relación;
(viii) determinar basándose en la relación en la etapa (vii) si la población descongelada de TIL es adecuada para la administración a un paciente;
(ix) administrar una dosis terapéuticamente eficaz de la tercera población descongelada de TIL al paciente cuando se determina que la relación entre el número de TIL en la cuarta población de TIL y el número de TIL en la tercera población de TIL es superior a 5:1 en la etapa (viii).
El período de expansión adicional (a veces denominado período reREP) se puede realizar hasta que la relación entre el número de TIL en la cuarta población de TIL y el número de TIL en la tercera población de TIL sea mayor que 50:1.
El número de TIL suficientes para una dosificación terapéuticamente eficaz puede ser de alrededor de 2.3 x 10<10>a alrededor de 13.7 x 10<10>
Las etapas (i) a (vii) se pueden realizar dentro de un período de alrededor de 40 días a alrededor de 50 días. Las etapas (i) a (vii) se pueden realizar dentro de un período de alrededor de 42 días a alrededor de 48 días. Las etapas (i) a (vii) se pueden realizar dentro de un período de alrededor de 42 días a alrededor de 45 días. Las etapas (i) a (vii) se pueden realizar en alrededor de 44 días.
Las células de las etapas (iii) o (vii) pueden expresar CD4, CD<8>y TCR a p a niveles similares a las células recién recolectadas. Las células pueden ser TIL.
Las células presentadoras de antígeno pueden ser células mononucleares de sangre periférica (PBMC). Las PBMC se pueden agregar al cultivo celular en cualquiera de los días 9 a 17 en la etapa (iii).
Las células T efectoras y/o las células T de memoria central en la población más grande de TIL en las etapas (iii) o (vii) pueden exhibir una o más características seleccionadas del grupo que consiste en expresión de CD27, expresión de CD28, telómeros más largos, aumento de la expresión de CD57 y disminución de la expresión de CD56, en relación con las células T efectoras y/o las células T de memoria central en la tercera población de células.
Las células T efectoras y/o las células T de memoria central pueden exhibir una expresión de CD57 aumentada y una expresión de CD56 disminuida.
Las APC pueden ser APC artificiales (aAPC).
La etapa de transducción de la primera población de TIL con un vector de expresión puede comprender un ácido nucleico que codifica un receptor de células T de alta afinidad.
La etapa de transducción puede ocurrir antes de la etapa (i).
La etapa de transducción de la primera población de TIL con un vector de expresión puede comprender un ácido nucleico que codifica un receptor de antígeno quimérico (CAR) que comprende un anticuerpo de fragmento variable de cadena única fusionado con al menos un endodominio de una molécula de señalización de células T.
La etapa de transducción puede ocurrir antes de la etapa (i).
Se puede analizar la viabilidad de los TIL después de la etapa (vii).
La presente divulgación también proporciona procedimientos adicionales para analizar TIL. La divulgación proporciona un procedimiento para analizar TIL que comprende:
(i) obtener una porción de una primera población de TIL crioconservados;
(ii) descongelar la porción de la primera población de TIL crioconservados;
(iii) realizar una primera expansión cultivando la porción de la primera población de TIL en un medio de cultivo celular que comprende IL-2, OKT-3 y células presentadoras de antígeno (APC) durante un período de expansión adicional (a veces denominado período de reREP) de al menos 3 días, para producir una segunda población de TIL, en donde la porción de la primera población de TIL se compara con la segunda población de TIL para obtener una relación del número de TIL, donde la relación del número de TIL en la segunda población de TIL al número de TIL en la porción de la primera población de TIL es mayor que 5:1;
(iv) determinar basándose en la relación en la etapa (iii) si la primera población de TIL es adecuada para su uso en la administración terapéutica a un paciente;
(v) la determinación de la primera población de TIL es adecuada para su uso en la administración terapéutica cuando se determina que la relación entre el número de TIL en la segunda población de TIL y el número de TIL en la primera población de TIL es superior a 5:1 en la etapa (iv).
La relación entre el número de TIL en la segunda población de TIL y el número de TIL en la porción de la primera población de TIL puede ser superior a 50:1.
El procedimiento puede comprender además realizar la expansión de la primera población completa de TIL crioconservados de la etapa (i) según los procedimientos descritos en cualquiera de las formas de realización proporcionadas en el presente documento.
El procedimiento puede comprender además administrar la primera población completa de TIL crioconservados desde la etapa (i) al paciente.
K. Sistemas cerrados para la fabricación de TIL
La presente invención proporciona el uso de sistemas cerrados durante el procedimiento de cultivo de TIL. Dichos sistemas cerrados permiten prevenir y/o reducir la contaminación microbiana, permiten el uso de menos matraces y permiten reducir los costes. En algunas formas de realización, el sistema cerrado usa dos contenedores.
Estos sistemas cerrados son bien conocidos en la técnica y se pueden encontrar, por ejemplo, en http://www.fda.gov/cber/guidelines.htm y https://www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/Blood/uc m076779.htm.
Como se proporciona en el sitio web de la FDA, los sistemas cerrados con procedimientos estériles son conocidos y están bien descritos. Véase https://www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/Blood/uc m076779.htm, como se menciona anteriormente y se proporciona en la parte pertinente más adelante. Introducción
Los dispositivos de conexión estériles (STCD) producen soldaduras estériles entre dos piezas de tubería compatible. Este procedimiento permite la conexión estéril de una variedad de recipientes y diámetros de tubo. Esta guía describe las prácticas y los procedimientos recomendados para el uso de estos dispositivos. Esta guía no aborda los datos o la información que un fabricante de un dispositivo de conexión estéril debe enviar a la FDA para obtener la aprobación o autorización para su comercialización. También es importante tener en cuenta que el uso de un dispositivo de conexión estéril aprobado o autorizado para fines no autorizados en el etiquetado puede hacer que el dispositivo se considere adulterado y etiquetado incorrectamente según la Ley Federal de Alimentos, Medicamentos y Cosméticos.
1. Recomendaciones de la FDA
Los fabricantes de productos sanguíneos que proponen usar rutinariamente un STCD autorizado por la FDA deberían incorporar información sobre dicho uso en los manuales de procedimientos operativos estándar (POE) para cada producto sanguíneo. Estas entradas deben incluir mantenimiento de registros, seguimiento de productos, control de calidad de soldadura de tubos, números de lote de software y desechables (incluidas las fuentes de los elementos que se agregarán). Los procedimientos de control de calidad deben incluir una prueba de la integridad de cada soldadura.
2. Aplicaciones del STCD
El usuario debe ser consciente de que el uso del dispositivo puede crear un nuevo producto o modificar significativamente la configuración de un producto regulado para el que no se ha demostrado seguridad y eficacia. Para aquellos "nuevos productos" sujetos a licencia, las solicitudes o suplementos de solicitud deben enviarse a la FDA además de la presentación de un POE. En general, la combinación o mezcla que involucra componentes celulares representa un cambio en el producto que requiere la presentación y aprobación de una solicitud de licencia o un suplemento de solicitud. Dichas aplicaciones y suplementos de aplicación deben contener datos y descripciones de los procedimientos de fabricación que demuestren que el "nuevo producto" es seguro y eficaz para el uso previsto durante el período de datación propuesto.
Los siguientes comentarios se proporcionan como orientación sobre los usos más comunes de una STCD autorizada o aprobada por la FDA:
L. Agregar una aguja nueva o más pequeña a un equipo de extracción de sangre
No se considera que el uso del STCD para agregar una aguja antes del inicio de un procedimiento (extracción de sangre entera, plaquetaféresis o recolección de plasma fuente) abra un sistema funcionalmente cerrado. Si se agrega una aguja durante un procedimiento, solo se debe usar un STCD aprobado para soldar tubos llenos de líquido. Si la prueba de integridad de la soldadura es satisfactoria, no se considera que el uso de un STCD abra un sistema funcionalmente cerrado.
Las plaquetas, la feresis preparada en un sistema abierto deben etiquetarse con una fecha de vencimiento de 24 horas y las plaquetas, los productos de feresis preparados en un sistema funcionalmente cerrado deben etiquetarse con una fecha de vencimiento de cinco días (véase Revised Guideline for Collection of Platelets, Pheresis, October 7, 1988).
La fuente y las especificaciones de los tubos y agujas añadidos deben abordarse en los POE y los registros del centro de sangre. El uso del STCD para agregar agujas no representa un cambio importante en la fabricación para el cual los establecimientos autorizados necesitan aprobación previa.
M. Uso del STCD para preparar componentes
Cuando se usa el STCD para unir bolsas de preparación de componentes adicionales, se deben mantener registros de modo apropiado identificando la fuente de los paquetes de transferencia y la verificación apropiada del número de unidad de sangre y ABO/Rh. Toda la sangre y los componentes sanguíneos deben estar debidamente etiquetados (21 CFR 606.121).
Ejemplos:
Adición de una cuarta bolsa a un paquete triple de recolección de sangre entera para la producción de AHF crioprecipitado a partir de plasma fresco congelado.
Conexión de una solución aditiva a una unidad de glóbulos rojos.
Adición de un filtro en línea que ha sido aprobado por la FDA para su uso en la fabricación de componentes.
Adición de un tercer contenedor de almacenamiento a un arnés de plaquetaféresis.
Para los usos indicados anteriormente, se deben desarrollar procedimientos y mantener registros, pero los titulares de licencias no necesitan la aprobación de la FDA para establecer los procedimientos.
1. Uso del STCD para agrupar productos hemoderivados
El uso apropiado de un STCD para agrupar las plaquetas preparadas a partir de la extracción de sangre entera puede evitar la contaminación potencial de las entradas de intensificación y puertos que se usan comúnmente. La combinación realizada inmediatamente antes de la transfusión es un ejemplo de este uso apropiado. Las plaquetas combinadas deben administrarse no más de 4 horas después de la combinación (véase 21 CFR 606.122 (<1>) (<2>)).
Sin embargo, la combinación y el almacenamiento posterior pueden aumentar el riesgo en comparación con la administración de unidades de donantes al azar; si una unidad contaminada se combina con otras y se almacena antes de la administración, el inóculo bacteriano total administrado puede aumentar como resultado de la replicación en el volumen adicional. Por consiguiente, el uso propuesto de un STCD para agrupar y almacenar plaquetas durante más de 4 horas debería estar respaldado por datos que aborden satisfactoriamente si tal agrupación está asociada con un mayor riesgo.
Tal agrupación de plaquetas constituye la fabricación de un nuevo producto.
El agrupamiento o mezcla que involucra plaquetas se considera la fabricación de un nuevo producto que requiere la presentación y aprobación de una solicitud de licencia o suplemento de solicitud si el período de almacenamiento debe exceder las cuatro horas.
2. Uso del STCD para preparar una alícuota para uso pediátrico y unidades divididas
Las unidades pediátricas y las unidades divididas de sangre entera, glóbulos rojos y plasma fresco congelado preparadas con un STCD no se considerarán un producto nuevo para el que se requiere un suplemento de solicitud de licencia biológica (BLA) siempre que se cumplan las siguientes condiciones:
El fabricante debe tener una licencia biológica aprobada o un suplemento de licencia para el producto original (es decir, no dividido), incluida la aprobación de cada anticoagulante utilizado.
Las etiquetas deben enviarse para su revisión y aprobación antes de su distribución. Se debe hacer una anotación en la sección de comentarios del Formulario 2567 de la FDA, Transmisión de etiquetas y circulares.
Deben utilizarse envases de producto final aprobados para el almacenamiento del componente que se está preparando.
Las plaquetas fabricadas bajo licencia deben contener al menos 5,5 X (10<) 10>plaquetas (21 CFR 640.24 (c)). Plaquetas, féresis fabricada bajo licencia debe contener al menos 3.0 X (10<) 11>plaquetas (véase Revised Guideline for the Collection of Platelets, Pheresis, October 7, 1988).
Los procedimientos a seguir con respecto al uso de un STCD para preparar productos divididos de recolecciones de sangre entera y de plasma y plaquetas preparados mediante procedimientos de hemaféresis automatizados deben incluir descripciones de:
• cómo se modificará el arnés de aféresis o el recipiente de recolección con un STCD aprobado por la FDA;
• el volumen mínimo del plasma fraccionado o de los productos hemoderivados;
• el volumen y la concentración de plaquetas de los productos de plaquetaféresis dividida;
• tiempo de almacenamiento del producto. El producto debe estar en un recipiente aprobado y debe ser consistente con el tiempo de almacenamiento que figura en la etiqueta de dicho recipiente;
• procedimiento (s) que se utilizarán para etiquetar y rastrear productos divididos en los registros del centro de sangre.
NOTA: Los procedimientos para etiquetar las alícuotas deben establecerse claramente en el procedimiento, el mantenimiento de registros debe ser adecuado para permitir el seguimiento y la retirada de todos los componentes, si es necesario.
3. Uso de un STCD para conectar líneas adicionales de solución salina o anticoagulante durante un procedimiento de plasmaféresis automatizado
Se deben desarrollar procedimientos y mantener registros consistentes con las instrucciones de uso del fabricante del instrumento, pero los titulares de licencia no necesitan tener la aprobación de la FDA para establecer los procedimientos.
4. Uso del STCD para adjuntar soluciones de tratamiento
Cuando se usa un STCD para unir contenedores con soluciones de tratamiento a productos de glóbulos rojos lavados o congelados, el período de datación para los productos resultantes es de 24 horas, a menos que los datos se proporcionen en forma de solicitudes de licencia o suplementos de solicitud al CBER para respaldar un período de datación más largo (21 CFR 610.53 (c)). Las exenciones o modificaciones deben ser aprobadas por escrito por el Director, CBER (21 CFR 610.53 (d)).
5. Uso de un STCD para agregar un filtro de reducción de leucocitos aprobado por la FDA
Algunos filtros de leuco-reducción no están unidos integralmente a los sistemas de recolección de sangre entera. Los procedimientos de uso de un STCD para la filtración previa al almacenamiento deben ser consistentes con las instrucciones de uso de los fabricantes de filtros.
La reducción de leucocitos antes de la emisión constituye un cambio de fabricación importante. Por lo tanto, para los nuevos productos con contenido reducido de leucocitos preparados con un STCD, los fabricantes deben presentar solicitudes de licencia de productos biológicos (21 CFR 601.2) o suplementos de solicitud de aprobación previa a la FDA (21 CFR 601.12).
Usar un STCD para extraer muestras de recipientes de productos sanguíneos para su análisis (por ejemplo, usar un STCD para obtener una muestra de plaquetas de un recipiente de plaquetas o plaquetas, féresis para comparación cruzada).
Si el volumen y/o recuento de células del producto después de la extracción de la muestra difieren de lo que se indica en la etiqueta original o en la circular de información, la etiqueta del producto debe modificarse para reflejar el nuevo volumen y/o recuento celular. Por ejemplo, es posible que no se extraigan muestras que reduzcan el recuento de plaquetas de una unidad de plaquetas a menos de 5.5 x (10<) 10>plaquetas (21 CFR 640.24 (c)).
<6>. Información adicional de la guía de la FDA
La guía de la FDA presenta una guía general, así como información específica y ejemplos relacionados con las especificaciones para la presentación de solicitudes y suplementos de solicitud a la FDA que abordan el uso de un STCD. Si surgen más preguntas sobre el uso apropiado de un STCD, las inquietudes deben dirigirse a la Oficina de Investigación y Revisión de Sangre, Centro de Evaluación e Investigación Biológica.
En algunas formas de realización, el sistema cerrado usa un recipiente desde el momento en que se obtienen los fragmentos tumorales hasta que los TIL están listos para la administración al paciente o la crioconservación. En algunas formas de realización, cuando se utilizan dos recipientes, el primer recipiente es un recipiente G cerrado y la población de TIL se centrifuga y se transfiere a una bolsa de infusión sin abrir el primer recipiente G cerrado. En algunas formas de realización, cuando se utilizan dos recipientes, la bolsa de infusión es una bolsa de infusión que contiene HypoThermosol. Un sistema cerrado o un sistema de cultivo de células TIL cerrado se caracteriza porque una vez que se han agregado la muestra del tumor y/o los fragmentos del tumor, el sistema se sella herméticamente desde el exterior para formar un ambiente cerrado libre de la invasión de bacterias, hongos y/o o cualquier otra contaminación microbiana.
En algunas formas de realización, la reducción de la contaminación microbiana está entre alrededor de un 5% y alrededor de un 100%. En algunas formas de realización, la reducción de la contaminación microbiana está entre alrededor de un 5% y alrededor de un 95%. En algunas formas de realización, la reducción de la contaminación microbiana está entre alrededor de un 5% y alrededor de un 90%. En algunas formas de realización, la reducción de la contaminación microbiana está entre alrededor de un<1 0>% y alrededor de un 90%. En algunas formas de realización, la reducción de la contaminación microbiana está entre alrededor del 15% y alrededor del 85%. En algunas formas de realización, la reducción de la contaminación microbiana es alrededor del 5%, alrededor del 10%, alrededor del 15%, alrededor del 20%, alrededor del 25%, alrededor del 30%, alrededor del 35%, alrededor del 40%, alrededor del 45%, alrededor del 50%, alrededor del 55%, alrededor del 60%, alrededor del 65%, alrededor del 70%, alrededor del 75%, alrededor del 80%, alrededor del 85%, alrededor del 90%, alrededor del 95%, alrededor del 97%, alrededor del 98%, alrededor del 99% o alrededor de<1 0 0>%.
El sistema cerrado permite el crecimiento de TIL en ausencia y/o con una reducción significativa de la contaminación microbiana.
Además, el pH, la presión parcial de dióxido de carbono y la presión parcial de oxígeno del entorno de cultivo de células TIL varían cada uno a medida que se cultivan las células. En consecuencia, aunque se haga circular un medio apropiado para el cultivo celular, el entorno cerrado todavía necesita mantenerse constantemente como un entorno óptimo para la proliferación de TIL. Para ello, es deseable que los factores físicos de pH, presión parcial de dióxido de carbono y presión parcial de oxígeno dentro del líquido de cultivo del ambiente cerrado sean monitoreados por medio de un sensor, cuya señal se utiliza para controlar un intercambiador de gas instalado en la entrada del entorno de cultivo y la presión parcial de ese gas del entorno cerrado se ajustan en tiempo real de acuerdo con los cambios en el líquido de cultivo para optimizar el entorno de cultivo celular. En algunas formas de realización, la presente invención proporciona un sistema de cultivo de células cerradas que incorpora en la entrada al ambiente cerrado un intercambiador de gas equipado con un dispositivo de monitoreo que mide el pH, la presión parcial de dióxido de carbono y la presión parcial de oxígeno del ambiente cerrado, y optimiza el entorno de cultivo celular ajustando automáticamente las concentraciones de gas en función de las señales del dispositivo de monitorización.
En algunas formas de realización, la presión dentro del entorno cerrado se controla de forma continua o intermitente. Es decir, la presión en el ambiente cerrado se puede variar por medio de un dispositivo de mantenimiento de presión, por ejemplo, asegurando así que el espacio sea adecuado para el crecimiento de TIL en un estado de presión positiva, o promoviendo la exudación de fluido en un estado de presión negativa y promoviendo así la proliferación celular. Aplicando presión negativa de manera intermitente, además, es posible reemplazar uniforme y eficientemente el líquido circulante en el ambiente cerrado por medio de una contracción temporal en el volumen del ambiente cerrado.
En algunas formas de realización, pueden sustituirse o agregarse componentes de cultivo óptimos para la proliferación de los TIL, y que incluyen factores tales como IL-2 y/o OKT3, así como puede agregarse una combinación.
C. Cultivos celulares
En una forma de realización, un procedimiento para expandir los TIL, incluidos los discutidos anteriormente y los ejemplificados en la Figura 27, puede incluir el uso de alrededor de 5,000 ml a alrededor de 25,000 ml de medio celular, alrededor de 5,000 ml a alrededor de 10,000 ml de medio celular, o alrededor de 5,800 ml a alrededor de 8,700 ml de medio celular. En algunas formas de realización, el medio es un medio sin suero, como se describe, por ejemplo, en el Ejemplo 21. En algunas formas de realización, el medio en la primera expansión está libre de suero. En algunas formas de realización, el medio en la segunda expansión está libre de suero. En algunas formas de realización, los medios de la primera expansión y la segunda están libres de suero. En una forma de realización, expandir el número de TIL no usa más de un tipo de medio de cultivo celular. Puede usarse cualquier medio de cultivo celular adecuado, por ejemplo, medio celular AIM-V (L-glutamina, sulfato de estreptomicina de 50<j>M y sulfato de gentamicina de 10<j>M) medio de cultivo celular (Invitrogen, Carlsbad CA). A este respecto, los procedimientos de la invención reducen ventajosamente la cantidad de medio y el número de tipos de medio requeridos para expandir el número de TIL. En una forma de realización, expandir el número de TIL puede comprender alimentar a las células con una frecuencia no mayor a cada tercer o cuarto día. La expansión del número de células en un recipiente permeable al gas simplifica los procedimientos necesarios para expandir el número de células al reducir la frecuencia de alimentación necesaria para expandir las células.
En una forma de realización, el medio celular en el primer y/o segundo recipiente permeable a los gases no está filtrado. El uso de medio celular sin filtrar puede simplificar los procedimientos necesarios para expandir el número de células. En una forma de realización, el medio celular en el primer y/o segundo recipiente permeable a los gases carece de beta-mercaptoetanol (BME).
La duración del procedimiento que comprende obtener una muestra de tejido tumoral del mamífero; cultivar la muestra de tejido tumoral en un primer recipiente permeable al gas que contiene medio celular; obtener TIL de la muestra de tejido tumoral; expandir el número de TIL en un segundo recipiente permeable al gas que contiene medio celular puede ser de alrededor de 7 a 14 días, por ejemplo, alrededor de 11 días. El pre-REP puede ser de alrededor de 7 a 14 días. En algunas formas de realización, el pre-REP es de alrededor de 11 días. El pre-REP puede ser de alrededor de 7 a 14 días. En algunas formas de realización, REP es de alrededor de 11 días.
En una forma de realización, los TIL se expanden en contenedores permeables a los gases. Se han utilizado recipientes permeables a los gases para expandir TIL utilizando PBMC, utilizando procedimientos, composiciones y dispositivos conocidos en la técnica, incluidos los descritos en la publicación de solicitud de patente de EE.UU. No. 2005/0106717 A1. En una forma de realización, los TIL se expanden en bolsas permeables a los gases. En una forma de realización, los TIL se expanden utilizando un sistema de expansión celular que expande los TIL en bolsas permeables al gas, como el Xuri Cell Expansion System W25 (GE Healthcare). En una forma de realización, los TIL se expanden usando un sistema de expansión celular que expande los TIL en bolsas permeables al gas, como el WAVE Bioreactor System, también conocido como Xuri Cell Expansion System W5 (GE Healthcare). En una forma de realización, el sistema de expansión celular incluye una bolsa celular permeable a los gases con un volumen seleccionado del grupo que consta de alrededor de 100 ml, alrededor de 200 ml, alrededor de 300 ml, alrededor de 400 ml, alrededor de 500 ml, alrededor de 600 ml, alrededor de 700 ml, alrededor de 800 ml, alrededor de 900 ml, alrededor de 1 L, alrededor de 2 L, alrededor de 3 L, alrededor de 4 L, alrededor de 5 L, alrededor de<6>L, alrededor de 7 L, alrededor de<8>L, alrededor de 9 L y alrededor de 10 L.
En una forma de realización, los TIL se pueden expandir en matraces G-Rex (disponibles comercialmente en Wilson Wolf Manufacturing). Tales formas de realización permiten que las poblaciones de células se expandan desde alrededor de 5x10<5>células/cm<2>a entre 10x10<6>y 30x106 células/cm<2>En una forma de realización, esto es sin alimentación. En una forma de realización, esto es sin alimentación siempre que el medio resida a una altura de alrededor de 10 cm en el matraz G-Rex. En una forma de realización, esto es sin alimentación, pero con la adición de una o más citocinas. En una forma de realización, la citocina se puede agregar como un bolo sin necesidad de mezclar la citocina con el medio. Dichos contenedores, dispositivos y procedimientos son conocidos en la técnica y se han utilizado para expandir los TIL, e incluyen los descritos en la publicación de solicitud de patente de Ee . UU. No. US 2014/0377739A1, la publicación internacional No. WO 2014/210036 A1, la publicación de solicitud de patente de EE. UU. No. US 2013/0115617 A1, la publicación internacional No. WO 2013/188427 A1, la publicación de solicitud de patente de EE. UU. No. US 2011/0136228 A1, la patente de EE. UU. No. US 8,809,050 B2, la publicación internacional No. WO 2011/072088 A2, la publicación de solicitud de patente de EE. UU. No. US 2016/0208216 A1, la publicación de solicitud de patente de EE. UU. No. US 2012/0244133 A1, la publicación internacional No. WO 2012/129201 A1, la publicación de solicitud de patente de EE. UU. No. US 2013/0102075 A1, la patente de EE. UU. No. US 8,956,860 B2, la publicación internacional No. WO 2013/173835 A1, la publicación de solicitud de patente estadounidense No. US 2015/0175966 A1. Dichos procedimientos también se describen en Jin et al., J. Immunotherapy, 2012, 35: 283 292.
D. Ingeniería genética opcional de TIL
En algunas formas de realización, opcionalmente los TIL se diseñan genéticamente para incluir funcionalidades adicionales que incluyen, entre otras, un receptor de células T de alta afinidad (TCR), por ejemplo, un TCR dirigido a un antígeno asociado a un tumor como MAGE-1, HER2 o NY-ESO-1, o un receptor de antígeno quimérico (CAR) que se une a una molécula de superficie celular asociada a un tumor (por ejemplo, mesotelina) o una molécula de superficie celular de linaje restringido (por ejemplo, CD19).
E. Crioconservación opcional de TIL
Opcionalmente, se puede crioconservar o bien la población de TIL a granel o la población expandida de TIL. La crioconservación se produce en la población terapéutica de TIL. En algunas formas de realización, la crioconservación se produce en los TIL recolectados después de la segunda expansión. En algunas formas de realización, la crioconservación se produce en los TIL en la etapa F ejemplar de la Figura 27. En algunas formas de realización, los TIL se crioconservan en la bolsa de infusión. En algunas formas de realización, los TIL se crioconservan antes de colocarlos en una bolsa de infusión. En algunas formas de realización, los TIL se crioconservan y no se colocan en una bolsa de infusión. En algunas formas de realización, la crioconservación se realiza utilizando un medio de crioconservación. En algunas formas de realización, el medio de crioconservación contiene dimetilsulfóxido (DMSO). Esto generalmente se logra poniendo la población de TIL en una solución de congelación, por ejemplo, 85% de suero AB inactivado con suplemento y 15% de dimetilsulfóxido (DMSO). Las células en solución se colocan en viales criogénicos y se almacenan durante 24 horas a -80°C, con transferencia opcional a congeladores de nitrógeno gaseoso para crioconservación. Véase, Sadeghi, et al., Acta Oncologica 2013, 52, 978-986.
Cuando sea apropiado, las células se retiran del congelador y se descongelan en un baño de agua a 37°C hasta que se descongelan alrededor de 4/5 de la solución. Las células generalmente se resuspenden en medio completo y opcionalmente se lavan una o más veces. En algunas formas de realización, los TIL descongelados pueden contarse y evaluarse para determinar su viabilidad como se conoce en la técnica.
En una forma de realización preferida, una población de TIL se crioconserva usando medio de crioconservación CS10 (CryoStor 10, BioLife Solutions). En una forma de realización preferida, una población de TIL se crioconserva usando un medio de crioconservación que contiene dimetilsulfóxido (DMSO). En una forma de realización preferida, una población de TIL se crioconserva usando una relación 1:1 (vol: vol) de CS10 y medio de cultivo celular. En una forma de realización preferida, una población de TIL se crioconserva usando una relación de alrededor de 1:1 (vol: vol) de CS10 y medio de cultivo celular que comprende además IL-2 adicional.
Como se discutió anteriormente en las etapas A a E, la crioconservación puede ocurrir en numerosos puntos a lo largo del procedimiento de expansión de TIL. En algunas formas de realización, se pueden crioconservar la población de TIL a granel después de la primera expansión de acuerdo con la etapa B o la población expandida de TIL después de una o más segundas expansiones de acuerdo con la etapa D. La crioconservación generalmente se puede lograr colocando la población de TIL en una solución de congelación, por ejemplo, suero AB inactivado con suplemento al 85% y dimetilsulfóxido (DMSO) al 15%. Las células en solución se colocan en viales criogénicos y se almacenan durante 24 horas a -80°C, con transferencia opcional a congeladores de nitrógeno gaseoso para crioconservación. Véase Sadeghi, et al., Acta Oncologica 2013, 52, 978-986.
Cuando sea apropiado, las células se retiran del congelador y se descongelan en un baño de agua a 37°C hasta que se descongelan alrededor de 4/5 de la solución. Las células generalmente se resuspenden en medio completo y opcionalmente se lavan una o más veces. En algunas formas de realización, los TIL descongelados pueden contarse y evaluarse para determinar su viabilidad, tal como se conoce en la técnica.
En algunos casos, la población de TIL de la Etapa B se puede crioconservar inmediatamente, utilizando los protocolos que se explican más adelante. Alternativamente, la población de TIL a granel puede someterse a la etapa C y a la etapa D y luego crioconservarse después de la etapa D. De manera similar, en el caso de que se utilicen TIL modificados genéticamente en terapia, las poblaciones de TIL de la etapa B o de la etapa D pueden someterse a modificaciones para tratamientos adecuados.
F. Análisis de viabilidad celular opcionales
Opcionalmente, se puede realizar un ensayo de viabilidad celular después de la primera expansión (a veces denominada expansión inicial a granel), usando ensayos estándar conocidos en la técnica. Por ejemplo, se puede realizar un ensayo de exclusión con azul tripán en una muestra de TIL a granel, que marca selectivamente las células muertas y permite una evaluación de viabilidad. Otros ensayos para usar en las pruebas de viabilidad pueden incluir, entre otros, el ensayo de azul de Alamar; y el ensayo MTT.
1. Recuento celular, viabilidad, citometría de flujo
En algunas formas de realización, se miden los recuentos y/o la viabilidad de células. La expresión de marcadores tales como, pero no limitados a, CD3, CD4, CD<8>y CD56, así como cualquier otro divulgado o descrito en el presente documento, se puede medir mediante citometría de flujo con anticuerpos, por ejemplo, pero sin limitarse a los disponibles comercialmente en BD Bio-sciences (BD Biosciences, San José, CA) utilizando un citómetro de flujo FACSCanto™ (BD Biosciences). Las células se pueden contar manualmente usando un hemocitómetro de chip c desechable (VWR, Batavia, IL) y la viabilidad se puede evaluar usando cualquier procedimiento conocido en la técnica, que incluye, entre otros, la tinción con azul tripán.
En algunos casos, la población de TIL a granel se puede crioconservar inmediatamente, usando los protocolos que se explican más adelante. Alternativamente, la población de TIL a granel puede someterse a r Ep y luego crioconservarse como se explica más adelante. De manera similar, en el caso de que en terapia se utilicen TIL modificados genéticamente, las poblaciones de TIL a granel o REP pueden someterse a modificaciones genéticas para tratamientos adecuados.
2. Cultivos celulares
En una forma de realización, un procedimiento para expandir TIL puede incluir el uso de alrededor de 5,000 ml a alrededor de 25,000 ml de medio celular, de alrededor de 5,000 ml a alrededor de 10,000 ml de medio celular o de alrededor de 5,800 ml a alrededor de 8,700 ml de medio celular. En una forma de realización, expandir el número de TIL no usa más de un tipo de medio de cultivo celular. Puede usarse cualquier medio de cultivo celular adecuado, por ejemplo, medio celular AIM-V (L-glutamina, sulfato de estreptomicina de 50 pM y sulfato de gentamicina de 10 pM) medio de cultivo celular (Invitrogen, Carlsbad CA). A este respecto, los procedimientos de la invención reducen ventajosamente la cantidad de medio y el número de tipos de medio requeridos para expandir el número de TIL. En una forma de realización, expandir el número de TIL puede comprender alimentar a las células con una frecuencia no mayor a cada tercer o cuarto día. La expansión del número de células en un recipiente permeable al gas simplifica los procedimientos necesarios para expandir el número de células al reducir la frecuencia de alimentación necesaria para expandir las células.
En una forma de realización, el medio celular en el primer y/o segundo recipiente permeable a los gases no está filtrado. El uso de medio celular sin filtrar puede simplificar los procedimientos necesarios para expandir el número de células. En una forma de realización, el medio celular en el primer y/o segundo recipiente permeable a los gases carece de beta-mercaptoetanol (BME).
La duración del procedimiento comprende obtener una muestra de tejido tumoral del mamífero; cultivar la muestra de tejido tumoral en un primer recipiente permeable al gas que contiene medio celular; obtener TIL de la muestra de tejido tumoral; expandir el número de TIL en un segundo recipiente permeable al gas que contiene medio celular usando aAPCpuede ser de una duración de alrededor de 14 a alrededor de 42 días, por ejemplo, alrededor de 28 días.
En una forma de realización, los TIL se expanden en recipientes permeables a los gases. Se han utilizado recipientes permeables a los gases para expandir<t>I<l>utilizando PBMC, utilizando procedimientos, composiciones y dispositivos conocidos en la técnica, incluidos los descritos en la publicación de solicitud de patente de EE.UU. No. 2005/0106717 A1. En una forma de realización, los TIL se expanden en bolsas permeables a los gases. En una forma de realización, los TIL se expanden utilizando un sistema de expansión celular que expande los TIL en bolsas permeables al gas, como el Xuri Cell Expansion System W25 (GE Healthcare). En una forma de realización, los TIL se expanden usando un sistema de expansión celular que expande los TIL en bolsas permeables al gas, como el WAVE Bioreactor System, también conocido como Xuri Cell Expansion System W5 (GE Healthcare). En una forma de realización, el sistema de expansión celular incluye una bolsa celular permeable a los gases con un volumen seleccionado del grupo que consta de alrededor de 100 ml, alrededor de 200 ml, alrededor de 300 ml, alrededor de 400 ml, alrededor de 500 ml, alrededor de 600 ml, alrededor de 700 ml, alrededor de 800 ml, alrededor de 900 ml, alrededor de 1 L, alrededor de 2 L, alrededor de 3 L, alrededor de 4 L, alrededor de 5 L, alrededor de<6>L, alrededor de 7 L, alrededor de<8>L, alrededor de 9 L y alrededor de 10 L.
En una forma de realización, los TIL se pueden expandir en matraces G-Rex (disponibles comercialmente en Wilson Wolf Manufacturing). Tales formas de realización permiten que las poblaciones de células se expandan desde alrededor de 5x10<5>células/cm<2>a entre 10x10<6>y 30x106 células/cm<2>En una forma de realización, esto es sin alimentación. En una forma de realización, esto es sin alimentación siempre que el medio resida a una altura de alrededor de 10 cm en el matraz G-Rex. En una forma de realización, esto es sin alimentación, pero con la adición de una o más citocinas. En una forma de realización, la citocina se puede agregar como un bolo sin necesidad de mezclar la citocina con el medio. Dichos contenedores, dispositivos y procedimientos son conocidos en la técnica y se han utilizado para expandir los TIL, e incluyen los descritos en la publicación de solicitud de patente de E<e>. UU. No. US 2014/0377739A1, la publicación internacional No. WO 2014/210036 A1, la publicación de solicitud de patente de EE. UU. No. US 2013/0115617 A1, la publicación internacional No. WO 2013/188427 A1, la publicación de solicitud de patente de EE. UU. No. US 2011/0136228 A1, la patente de EE. UU. No. US 8.809,050 B2, la publicación internacional No. WO 2011/072088 A2, la publicación de solicitud de patente de EE. UU. No. US 2016/0208216 A1, la publicación de solicitud de patente de EE. UU. No. US 2012/0244133 A1, la publicación internacional No. WO 2012/129201 A1, la publicación de solicitud de patente de EE. UU. No. US 2013/0102075 A1, la patente de EE. UU. No. US 8,956,860 B2, la publicación internacional No. WO 2013/173835 A1, la publicación de solicitud de patente estadounidense No. US 2015/0175966 A1. Dichos procedimientos también se describen en Jin et al., J. Immunotherapy, 2012, 35: 283 292. Ingeniería genética opcional de TIL
En algunas formas de realización, opcionalmente los TIL se diseñan genéticamente para incluir funcionalidades adicionales, que incluyen, entre otras, un receptor de células T de alta afinidad (TCR), por ejemplo, un TCR dirigido a un antígeno asociado a tumores como MAGE-1, HER2 o NY-ESO-1, o un receptor de antígeno quimérico (CAR) que se une a una molécula de superficie celular asociada a un tumor (por ejemplo, mesotelina) o una molécula de superficie celular de linaje restringido (por ejemplo, CD19).
IV. Procedimientos de tratamiento de pacientes
Los procedimientos de tratamiento comienzan con la recolección inicial de TIL y el cultivo de TIL. Ambos procedimientos han sido descritos en la técnica, por ejemplo, por Jin et al., J. Immunotherapy, 2012, 35 (3): 283-292. Se describen ejemplos de procedimientos de tratamiento a lo largo de las secciones siguientes, incluidos los Ejemplos.
Los TIL expandidos producidos de acuerdo con los procedimientos descritos en este documento, incluidos, por ejemplo, los descritos en las etapas A a F anteriores o de acuerdo con las etapas A a F anteriores (también como se muestra, por ejemplo, en la Figura 27) encuentran un uso particular en el tratamiento de pacientes con cáncer (por ejemplo, como se describe en Goff, et al., J. Clinical Oncology, 2016, 34 (20): 2389-239, así como el contenido suplementario. En algunas formas de realización, se cultivaron TIL a partir de depósitos extirpados del melanoma metastásico como se describió anteriormente (véase, Dudley, et al., J Immunother., 2003, 26: 332-342). El tumor fresco se puede diseccionar en condiciones estériles. Se puede recolectar una muestra representativa para un análisis patológico formal. Fragmentos individuales de 2 mm<3>a 3 mm3. Pueden obtenerse 5, 10, 15, 20, 25 o 30 muestras por paciente. Pueden obtenerse 20, 25 o 30 muestras por paciente. Se pueden obtener 20, 22, 24, 26 o 28 muestras por paciente. Se pueden obtener 24 muestras por paciente. Las muestras se pueden colocar en pocillos de una placa de 24 pocillos, mantenerse en medio de crecimiento con IL-2 en dosis altas (6,000 UI/ml) y controlarse para detectar la destrucción del tumor y/o la proliferación de TIL. Cualquier tumor con células viables que queden después del tratamiento se puede digerir enzimáticamente en una suspensión de células individuales y crioconservarse, como se describe en el presente documento.
En algunas formas de realización, se puede tomar una muestra de TIL cultivada con éxito para el análisis de fenotipo (CD3, CD4, CD<8>y CD56) y ensayar contra un tumor autólogo cuando esté disponible. El TIL puede considerarse reactivo si el cocultivo durante la noche produjo niveles de interferón-gamma (IFN-y) ><2 0 0>pg/ml y el doble de fondo. (Goff et al., J Immunother., 2010, 33: 840-847). En algunas formas de realización, se pueden seleccionar cultivos con evidencia de reactividad autóloga o patrones de crecimiento suficientes para una segunda expansión (por ejemplo, una segunda expansión como se proporciona de acuerdo con la etapa D de la Figura 27), incluidas las segundas expansiones que a veces se denominan expansión rápida (REP). En algunas formas de realización, los TIL expandidos con alta reactividad autóloga (por ejemplo, alta proliferación durante una segunda expansión), se seleccionan para una segunda expansión adicional. En algunas formas de realización, los TIL con alta reactividad autóloga (por ejemplo, alta proliferación durante la segunda expansión como se proporciona en la etapa D de la Figura 27), se seleccionan para una segunda expansión adicional según la etapa D de la Figura 27.
En algunas formas de realización, el paciente no se traslada directamente a ACT (transferencia celular adoptiva); por ejemplo, en algunas formas de realización, después de la recolección del tumor y/o una primera expansión, las células no se utilizan inmediatamente. En tales formas de realización, los TIL se pueden crioconservar y descongelar 2 días antes de la administración a un paciente. En tales formas de realización, los TIL se pueden crioconservar y descongelar 1 día antes de la administración a un paciente. En algunas formas de realización, los TIL se pueden crioconservar y descongelar inmediatamente antes de la administración a un paciente.
Los fenotipos celulares de muestras crioconservadas de bolsa de infusión TIL se pueden analizar mediante citometría de flujo (por ejemplo, FlowJo) para los marcadores de superficie CD3, CD4, CD<8>, CCR7 y CD45RA (BD BioSciences), así como mediante cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento. Las citocinas séricas se midieron usando técnicas estándar de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas. Un aumento de IFN-g sérico se definió como > 100 pg/ml y superior a 43 niveles basales.
En algunas formas de realización, los TIL producidos por los procedimientos proporcionados en este documento, por ejemplo, los ejemplificados en la Figura 27, proporcionan una mejora sorprendente en la eficacia clínica de los TIL. En algunas formas de realización, los TIL producidos por los procedimientos proporcionados en este documento, por ejemplo, los ejemplificados en la Figura 27, exhiben una mayor eficacia clínica en comparación con los TIL producidos por procedimientos distintos de los descritos en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los ejemplificados en la Figura 27. En algunas formas de realización, los procedimientos distintos de los descritos en este documento incluyen procedimientos denominados procedimiento 1C y/o Generación 1 (Gen 1). En algunas formas de realización, la eficacia aumentada se mide mediante DCR, ORR y/u otras respuestas clínicas. En algunas formas de realización, los TIL producidos por los procedimientos proporcionados en este documento, por ejemplo, los ejemplificados en la Figura 27, exhiben un tiempo de respuesta similar y un perfil de seguridad en comparación con los TIL producidos por procedimientos distintos de los descritos en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los ejemplificado en la Figura 27, por ejemplo, el procedimiento Gen 1.
En algunas formas de realización, IFN-gamma (IFN-<y>) es indicativo de la eficacia del tratamiento y/o eficacia clínica aumentada. En algunas formas de realización, el IFN-y en la sangre de sujetos tratados con TIL es indicativo de TIL activos. En algunas formas de realización, se emplea un ensayo de potencia para la producción de IFN-y. La producción de IFN-y es otra medida del potencial citotóxico. La producción de IFN-y se puede medir determinando los niveles de la citocina IFN-y en la sangre, suero o TIL ex vivo de un sujeto tratado con TIL preparado por los procedimientos de la presente invención, incluidos los descritos, por ejemplo, en la Figura 27. En algunas formas de realización, un aumento de IFN-y es indicativo de la eficacia del tratamiento en un paciente tratado con los TIL producidos por los procedimientos de la presente invención. En algunas formas de realización, el IFN-y aumenta una, dos, tres, cuatro o cinco veces o más en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los que se proporcionan en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, la secreción de IFN-y aumenta una vez en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, la secreción de IFN-y aumenta dos veces en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, la secreción de IFN-y aumenta tres veces en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, la secreción de IFN-<y>aumenta cuatro veces en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, la secreción de IFN-<y>aumenta cinco veces en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparados utilizando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, el |FN-y se mide usando un kit de ELISA Quantikine. En algunas formas de realización, el IFN-y se mide en TIL ex vivo de un sujeto tratado con TIL preparado mediante los procedimientos de la presente invención, incluidos los descritos, por ejemplo, en la Figura 27. En algunas formas de realización, el<i>FN-<y>se mide en la sangre de un sujeto tratado con TIL preparados mediante los procedimientos de la presente invención, incluidos los descritos, por ejemplo, en la Figura 27. En algunas formas de realización, el IFN-<y>se mide en el suero de TIL de un sujeto tratado con TIL preparado mediante los procedimientos de la presente invención, incluidos los descritos, por ejemplo, en la Figura 27.
En algunas formas de realización, el promedio más alto de IP-10 es indicativo de la eficacia del tratamiento y/o la eficacia clínica aumentada. En algunas formas de realización, el promedio más alto de IP-10 en la sangre de los sujetos tratados con TIL es indicativo de TIL activos. La producción de IP-10 puede medirse determinando los niveles de IP-10 en la sangre de un sujeto tratado con TIL preparados por los procedimientos de la presente invención, incluidos los descritos, por ejemplo, en la Figura 27. En algunas formas de realización, el promedio más alto de IP-10 es indicativo de la eficacia del tratamiento en un paciente tratado con los TIL producidos por los procedimientos de la presente invención. En algunas formas de realización, el promedio más alto de IP-10 se correlaciona con un aumento de una, dos, tres, cuatro o cinco veces o más en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en el presente documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, el promedio más alto de IP-10 se correlaciona con un aumento de una vez en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los encarnados en la Figura 27. En algunas formas de realización, el promedio más alto de IP-10 se correlaciona con un aumento de dos veces en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los encarnados en la Figura 27. En algunas formas de realización, el promedio más alto de IP-10 se correlaciona con un aumento de tres veces en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los encarnados en la Figura 27. En algunas formas de realización, el promedio más alto de IP-10 se correlaciona con un aumento de cuatro veces en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los encarnados en la Figura 27. En algunas formas de realización, el promedio más alto de IP-10 se correlaciona con un aumento de cinco veces en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los encarnados en la Figura 27. En algunas formas de realización, IP-10 se mide en la sangre de un sujeto tratado con TIL preparados mediante los procedimientos de la presente invención, incluidos los descritos, por ejemplo, en la Figura 27. En algunas formas de realización, IP-10 se mide en suero de TIL de un sujeto tratado con TIL preparado mediante los procedimientos de la presente invención, incluidos los descritos, por ejemplo, en la Figura 27.
En algunas formas de realización, un promedio más alto de MCP-1 es indicativo de la eficacia del tratamiento y/o eficacia clínica incrementada. En algunas formas de realización, el promedio más alto de MCP-1 en la sangre de sujetos tratados con TIL es indicativo de TIL activos. La producción de MCP-1 se puede medir determinando los niveles de MCP-1 en la sangre de un sujeto tratado con TIL preparados por los procedimientos de la presente invención, incluidos los descritos, por ejemplo, en la Figura 27. En algunas formas de realización, el promedio más alto de MCP-1 es indicativo de la eficacia del tratamiento en un paciente tratado con los TIL producidos por los procedimientos de la presente invención. En algunas formas de realización, el promedio más alto de MCP-1 se correlaciona con un aumento de una, dos, tres, cuatro o cinco veces o más en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, un promedio más alto de MCP-1 se correlaciona con un aumento de una vez en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los encarnados en la Figura 27. En algunas formas de realización, un promedio más alto de MCP-1 se correlaciona con un aumento de dos veces en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los encarnados en la Figura 27. En algunas formas de realización, un promedio más alto de MCP-1 se correlaciona con un aumento de tres veces en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los encarnados en la Figura 27. En algunas formas de realización, un promedio más alto de MCP-1 se correlaciona con un aumento de cuatro veces en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los encarnados en la Figura 27. En algunas formas de realización, un promedio más alto de MCP-1 se correlaciona con un aumento de cinco veces en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los encarnados en la Figura 27. En algunas formas de realización, la<m>CP<- 1>se mide en la sangre de un sujeto tratado con TIL preparados mediante los procedimientos de la presente invención, incluidos los descritos, por ejemplo, en la Figura 27. En algunas formas de realización, la MCP-1 se mide en el suero de TIL de un sujeto tratado con TIL preparado mediante los procedimientos de la presente invención, incluidos los descritos, por ejemplo, en la Figura 27.
En algunas formas de realización, los TIL preparados por los procedimientos de la presente invención, incluidos los descritos, por ejemplo, en la Figura 27, exhiben una mayor policlonalidad en comparación con los TIL producidos por otros procedimientos, incluidos los no ejemplificados en la Figura 27, tales como, por ejemplo, procedimientos denominados procedimientos de proceso 1C. En algunas formas de realización, una policlonalidad significativamente mejorada y/o una policlonalidad aumentada es indicativa de la eficacia del tratamiento y/o la eficacia clínica aumentada. En algunas formas de realización, la policlonalidad se refiere a la diversidad del repertorio de células T. En algunas formas de realización, un aumento en la policlonalidad puede ser indicativo de la eficacia del tratamiento con respecto a la administración de los TIL producidos por los procedimientos de la presente invención. En algunas formas de realización, la policlonalidad aumenta una vez, dos veces, diez veces, 100 veces, 500 veces o 1000 veces en comparación con los TIL preparados utilizando procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, la policlonalidad aumenta una vez en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, la policlonalidad aumenta dos veces en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, la policlonalidad aumenta diez veces en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, la policlonalidad aumenta<1 0 0>veces en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, la policlonalidad aumenta 500 veces en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, la policlonalidad se incrementa 1000 veces en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27.
Las medidas de eficacia pueden incluir las mediciones de la tasa de control de la enfermedad (DCR) así como la tasa de respuesta global (ORR), como se conoce en la técnica, así como se describe en los Ejemplos proporcionados en este documento, incluido el Ejemplo 28.
1. Procedimientos de tratamiento de cánceres y otras enfermedades
Los procedimientos descritos en este documento se pueden utilizar en un procedimiento para tratar enfermedades. En una realización, son para el uso en el tratamiento de trastornos hiperproliferativos. También se pueden usar para tratar otros trastornos como se describen en el presente documento y en los siguientes párrafos.
En algunas formas de realización, el trastorno hiperproliferativo es cáncer. En algunas formas de realización, el trastorno hiperproliferativo es un cáncer de tumor sólido. En algunas formas de realización, el cáncer de tumor sólido se selecciona del grupo que consiste en melanoma, cáncer de ovario, cáncer de cuello uterino, cáncer de pulmón de células no pequeñas (CPCNP), cáncer de pulmón, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer causado por el virus del papiloma humano, cáncer de cabeza y cuello (incluido el carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (HNSCC)), cáncer renal y carcinoma de células renales. En algunas formas de realización, el trastorno hiperproliferativo es una neoplasia maligna hematológica. En algunas formas de realización, el cáncer de tumor sólido se selecciona del grupo que consiste en leucemia linfocítica crónica, leucemia linfoblástica aguda, linfoma difuso de células B grandes, linfoma no Hodgkin, linfoma de Hodgkin, linfoma folicular y linfoma de células del manto.
También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, un procedimiento para tratar un cáncer con una población de TIL, en donde un paciente se trata previamente con quimioterapia no mieloablativa antes de una infusión de TIL de acuerdo con la presente divulgación. La quimioterapia no mieloablativa puede ser ciclofosfamida de 60 mg/kg/d durante 2 días (días 27 y 26 antes de la infusión de TIL) y fludarabina de 25 mg/m2/d durante 5 días (días 27 a 23 antes de la infusión de TIL). Después de la quimioterapia no mieloablativa y la infusión de TIL (en el día 0) según la presente divulgación, el paciente puede recibir una infusión intravenosa de IL-2 por vía intravenosa a 720,000 UI/kg cada 8 horas hasta tolerancia fisiológica.
La eficacia de los compuestos y combinaciones de compuestos descritos en el presente documento para tratar, prevenir y/o manejar las enfermedades o trastornos indicados se puede probar usando diversos modelos conocidos en la técnica, que proporcionan una guía para el tratamiento de enfermedades humanas. Por ejemplo, se describen modelos para determinar la eficacia de los tratamientos para el cáncer de ovario, por ejemplo, en Mullany, et al., Endocrinology 2012, 153, 1585-92; y Fong, et al., J. Ovarian Res. 2009, 2, 12. Models for determining efficacy of treatments for pancreatic cancer are described en Herreros-Villanueva, et al., World J. Gastroenterol. 2012, 18, 1286-1294. Los modelos para determinar la eficacia de los tratamientos para el cáncer de mama se describen, por ejemplo, en Fantozzi, Breast Cancer Res. 2006, 8, 212. Los modelos para determinar la eficacia de los tratamientos para el melanoma se describen, por ejemplo, en Damsky, et al., Pigment Cell & Melanoma Res. 2010, 23, 853-859. Los modelos para determinar la eficacia de los tratamientos para el cáncer de pulmón se describen, por ejemplo, en Meuwissen, et al., Genes & Development, 2005, 19, 643-664. Los modelos para determinar la eficacia de los tratamientos para el cáncer de pulmón se describen, por ejemplo, en Kim, Clin. Exp. Otorrinolaringol. 2009, 2, 55-60; y Sano, Head Neck Oncol. 2009, 1, 32.
En algunas formas de realización, IFN-gamma (IFN-<y>) es indicativo de la eficacia del tratamiento para el tratamiento del trastorno hiperproliferativo. En algunas formas de realización, el IFN-<y>en la sangre de sujetos tratados con TIL es indicativo de TIL activos. En algunas formas de realización, se emplea un ensayo de potencia para la producción de IFN-<y>. La producción de IFN-<y>es otra medida del potencial citotóxico. La producción de IFN-<y>puede medirse determinando los niveles de la citocina IFN-<y>en la sangre de un sujeto tratado con TIL preparados mediante los procedimientos de la presente invención, incluidos los descritos, por ejemplo, en la Figura 27. En algunas formas de realización, los TIL obtenidos mediante el presente procedimiento proporcionan un aumento de IFN-<y>en la sangre de sujetos tratados con los TIL del presente procedimiento en comparación con sujetos tratados con TIL preparados utilizando procedimientos denominados proceso 1C, como se ejemplifica en la Figura 83. En algunas formas de realización, un aumento de IFN-y es indicativo de la eficacia del tratamiento en un paciente tratado con los TIL producidos por los procedimientos de la presente invención. En algunas formas de realización, el IFN-<y>aumenta una, dos, tres, cuatro o cinco veces o más en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los que se proporcionan en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, la secreción de IFN-<y>aumenta una vez en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, la secreción de IFN-y aumenta dos veces en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, la secreción de IFN-y aumenta tres veces en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, la secreción de IFN-<y>aumenta cuatro veces en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, la secreción de IFN-<y>aumenta cinco veces en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparados utilizando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, el<i>FN-<y>se mide usando un kit de ELIISA Quantikine. En algunas formas de realización, el IFN-y se mide usando un kit de ELISA Quantikine. En algunas formas de realización, el IFN-y se mide en TIL ex vivo de un paciente tratado con los TIL producidos por los procedimientos de la presente invención. En algunas formas de realización, el IFN-<y>se mide en sangre en un paciente tratado con los TIL producidos por los procedimientos de la presente invención. En algunas formas de realización, el IFN-Y se mide en suero en un paciente tratado con los TIL producidos por los procedimientos de la presente invención.
En algunas formas de realización, el promedio más alto de IP-10 es indicativo de la eficacia del tratamiento y/o la eficacia clínica aumentada para el tratamiento del trastorno hiperproliferativo. En algunas formas de realización, el promedio más alto de IP-10 en la sangre de los sujetos tratados con TIL es indicativo de TIL activos. En algunas formas de realización, los TIL obtenidos por el presente procedimiento proporcionan un promedio más alto de IP-10 en la sangre de los sujetos tratados con los TIL del presente procedimiento en comparación con los sujetos tratados con los TIL preparados usando procedimientos denominados proceso 1C, como se ejemplifica en la Figura. 83. La producción de IP-10 puede medirse determinando los niveles de IP-10 en la sangre de un sujeto tratado con TIL preparados por los procedimientos de la presente invención, incluidos los descritos, por ejemplo, en la Figura 27. En algunas formas de realización, el promedio más alto de IP-10 es indicativo de la eficacia del tratamiento en un paciente tratado con los TIL producidos por los procedimientos de la presente invención. En algunas formas de realización, el promedio más alto de IP<- 1 0>se correlaciona con un aumento de una, dos, tres, cuatro o cinco veces o más en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en el presente documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, el promedio más alto de IP-10 se correlaciona con un aumento de una vez en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, el promedio más alto de IP-10 se correlaciona con un aumento de dos veces en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, el promedio más alto de IP-10 se correlaciona con un aumento de tres veces en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, el promedio más alto de IP-10 se correlaciona con un aumento de cuatro veces en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, el promedio más alto de IP-10 se correlaciona con un aumento de cinco veces en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27.
En algunas formas de realización, el promedio más alto de MCP-1 es indicativo de la eficacia del tratamiento y/o la eficacia clínica aumentada para el tratamiento del trastorno hiperproliferativo. En algunas formas de realización, el promedio más alto de MCP-1 en la sangre de sujetos tratados con TIL es indicativo de TIL activos. En algunas formas de realización, los TIL obtenidos por el presente procedimiento proporcionan un promedio más alto de MCP-1 en la sangre de sujetos tratados con los TIL del presente procedimiento en comparación con sujetos tratados con TIL preparados usando procedimientos denominados proceso 1C, como se ejemplifica en la Figura 83. La producción de MCP-1 se puede medir determinando los niveles de MCP-1 en la sangre de un sujeto tratado con TIL preparados por los procedimientos de la presente invención, incluidos los descritos, por ejemplo, en la Figura 27. En algunas formas de realización, el promedio más alto de MCP-1 es indicativo de la eficacia del tratamiento en un paciente tratado con los TIL producidos por los procedimientos de la presente invención. En algunas formas de realización, el promedio más alto de MCP<- 1>se correlaciona con un aumento de una, dos, tres, cuatro o cinco veces o más en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, un promedio más alto de MCP-1 se correlaciona con un aumento de una vez en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, un promedio más alto de MCP-1 se correlaciona con un aumento de dos veces en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, un promedio más alto de MCP-1 se correlaciona con un aumento de tres veces en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, un promedio más alto de MCP-1 se correlaciona con un aumento de cuatro veces en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, un promedio más alto de MCP-1 se correlaciona con un aumento de cinco veces en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27.
En algunas formas de realización, los TIL preparados mediante los procedimientos de la presente invención, incluidos los descritos, por ejemplo, en la Figura 27, exhiben una mayor policlonalidad en comparación con los TIL producidos por otros procedimientos, incluidos los no ejemplificados en la Figura 27, tales como, por ejemplo, procedimientos denominados procedimientos de proceso 1C. En algunas formas de realización, una policlonalidad significativamente mejorada y/o una policlonalidad aumentada es indicativa de la eficacia del tratamiento y/o la eficacia clínica aumentada para el tratamiento del cáncer. En algunas formas de realización, la policlonalidad se refiere a la diversidad del repertorio de células T. En algunas formas de realización, un aumento en la policlonalidad puede ser indicativo de la eficacia del tratamiento con respecto a la administración de los TIL producidos por los procedimientos de la presente invención. En algunas formas de realización, la policlonalidad aumenta una vez, dos veces, diez veces, 100 veces, 500 veces o 1000 veces en comparación con los TIL preparados utilizando procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, la policlonalidad aumenta una vez en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, la policlonalidad aumenta dos veces en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, la policlonalidad aumenta diez veces en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, la policlonalidad aumenta 100 veces en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, la policlonalidad aumenta 500 veces en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, la policlonalidad se incrementa<1 0 0 0>veces en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27.
2. Procedimientos de coadministración
En algunas formas de realización, los TIL producidos como se describe en este documento, incluidos, por ejemplo, los TIL derivados de un procedimiento descrito en las etapas A a F de la Figura 27, pueden ser para administración en combinación con uno o más reguladores de puntos de control inmunitarios, tales como los anticuerpos descritos más adelante. Por ejemplo, los anticuerpos que se dirigen a PD-1 y que pueden coadministrarse con los TIL de la presente invención incluyen, por ejemplo, pero no se limitan a nivolumab (BMS-936558, Bristol-Myers Squibb; Opdivo®), pembrolizumab (lambrolizumab, MK03475 o MK-3475, Merck; Keytruda®), anticuerpo anti-PD-1 humanizado JS001 (ShangHai JunShi), anticuerpo monoclonal anti-PD-1 TSR-042 (Tesaro, Inc.), pidilizumab (anti-PD-1 mAb CT-011, Medivation), anticuerpo monoclonal anti-PD-1 BGB-A317 (BeiGene) y/o anticuerpo anti-PD-1 SHR-1210 (ShangHai HengRui), anticuerpo monoclonal humano REGN2810 (Regeneron), anticuerpo monoclonal humano MDX-1106 (Bristol-Myers Squibb) y/o anticuerpo IgG4 anti-PD-1 humanizado PDR001 (Novartis). En algunas formas de realización, el anticuerpo PD-1 es del clon: RMP1-14 (IgG de rata) - BioXcell cat#BP0146. Otros anticuerpos adecuados, que son adecuados para usar en procedimientos de coadministración con TIL producidos de acuerdo con las Etapas A a F como se describen en el presente documento, son los anticuerpos anti-PD-1 descritos en la Patente de Estados Unidos No. 8,008,449. En algunas formas de realización, el anticuerpo o la porción de unión a antígeno del mismo se une específicamente a PD-L1 e inhibe su interacción con PD-1, aumentando así la actividad inmunitaria. Cualquier anticuerpo conocido en la técnica que se una a PD-L1 y afecte la interacción entre PD-1 y PD-L1, y estimule una respuesta inmune antitumoral, es adecuado para usar en procedimientos de coadministración con TIL producidos de acuerdo con las etapas A a F, tal como se describe en este documento. Por ejemplo, los anticuerpos que se dirigen a PD-L1 y que se encuentran en ensayos clínicos incluyen BMS-936559 (Bristol-Myers Squibb) y MPDL3280A (Genentech). Otros anticuerpos adecuados que se dirigen a PD-L1 se divulgan en la patente de EE.UU. No. 7,943,743. Un experto en la materia entenderá que cualquier anticuerpo que se una a PD-1 o PD-L1, afecte la interacción PD-1/PD-L1 y estimule una respuesta inmunitaria antitumoral, es adecuado para su uso en procedimientos de co-administración con TIL producidos de acuerdo con las etapas A a F como se describe en el presente documento. El sujeto al que se le administra la combinación de TIL producida de acuerdo con las etapas A a F puede coadministrarse con un anticuerpo anti-PD-1 cuando el paciente tiene un tipo de cáncer que es refractario a la administración del anticuerpo anti-PD-1 solo. Al paciente se le pueden administrar TIL en combinación con y anti-PD-1 cuando el paciente tiene melanoma refractario. Al paciente se le pueden administrar TIL en combinación con y anti-PD-1 cuando el paciente tiene carcinoma de pulmón de células no pequeñas (NSCLC).
3. Acondicionamiento previo opcional de los pacientes por linfodepleción
También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, un procedimiento para tratar un cáncer con una población de TIL, en donde un paciente se trata previamente con quimioterapia no mieloablativa antes de una infusión de TIL de acuerdo con la presente divulgación. También se divulga en el presente documento una población de TIL para su uso en el tratamiento del cáncer en un paciente que ha sido tratado previamente con quimioterapia no mieloablativa. La población de TIL puede ser para administración por infusión. La quimioterapia no mieloablativa puede ser ciclofosfamida de 60 mg/kg/d durante<2>días (días 27 y 26 antes de la infusión de TIL) y fludarabina de 25 mg/m2/d durante 5 días (días 27 a 23 antes de la infusión de TIL). Después de la quimioterapia no mieloablativa y la infusión de TIL (en el día 0) de acuerdo con la presente divulgación, el paciente puede recibir una infusión intravenosa de IL-2 (aldesleucina, disponible comercialmente como PROLEUKIN) por vía intravenosa a 720,000 UI/kg cada<8>horas hasta tolerancia fisiológica. La población de TIL puede usarse en el tratamiento del cáncer en combinación con IL-2, en donde la IL-2 se administra después de la población de TIL.
Los hallazgos experimentales indican que la linfodepleción antes de la transferencia adoptiva de linfocitos T específicos de tumor desempeña un papel clave en la mejora de la eficacia del tratamiento al eliminar las células T reguladoras y los elementos competidores del sistema inmunológico ("sumideros de citocinas"). Por consiguiente, se puede utilizar una etapa de linfodepleción (a veces también denominada "acondicionamiento inmunosupresor") en el paciente antes de la introducción de los TIL de la invención.
En general, la linfodepleción se logra usando la administración de fludarabina o ciclofosfamida (la forma activa se denomina mafosfamida) y combinaciones de las mismas. Dichos procedimientos se describen en Gassner, et al., Cancer Immunol. Immunother. 2011, 60, 75-85, Muranski, et al., Nat. Clin. Pract. Oncol., 2006, 3,<6 6 8> 681, Dudley, et al., J. Clin. Oncol. 2008, 26, 5233-5239, y Dudley, et al., J. Clin. Oncol. 2005, 23, 2346-2357.
La fludarabina se puede administrar a una concentración de 0.5 pg/ml -10 pg/ml de fludarabina. La fludarabina se puede administrar a una concentración de 1 pg/ml de fludarabina. El tratamiento con fludarabina se puede administrar durante 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días,<6>días o 7 días o más. La fludarabina se puede administrar en dosis de 10 mg/kg/día, 15 mg/kg/día, 20 mg/kg/día, 25 mg/kg/día, 30 mg/kg/día, 35 mg/kg/día, 40 mg/kg/día o 45 mg/kg/día. El tratamiento con fludarabina se puede administrar durante 2-7 días a 35 mg/kg/día. El tratamiento con fludarabina se puede administrar durante 4-5 días a 35 mg/kg/día. El tratamiento con fludarabina se puede administrar durante 4-5 días a 25 mg/kg/día.
La mafosfamida, la forma activa de ciclofosfamida, se puede obtener a una concentración de 0.5 pg/ml -10 pg/ml mediante la administración de ciclofosfamida. La mafosfamida, la forma activa de ciclofosfamida, se puede obtener a una concentración de 1 pg/ml mediante la administración de ciclofosfamida. El tratamiento con ciclofosfamida se puede administrar durante 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días,<6>días o 7 días o más. La ciclofosfamida se puede administrar a una dosis de 100 mg/m<2>/día, 150 mg/m<2>/día, 175 mg/m<2>/día, 200 mg/m<2>/día, 225 mg/m<2>/día, 250 mg/m<2>/día, 275 mg/m2/día o 300 mg/m<2>/día. La ciclofosfamida se puede administrar por vía intravenosa (es decir, i.v.) El tratamiento se puede administrar durante 2-7 días a 35 mg/kg/día. El tratamiento con ciclofosfamida se puede administrar durante 4-5 días a 250 mg/m2/día i.v. El tratamiento con ciclofosfamida se puede administrar durante 4 días a 250 mg/m2/día i.v.
La linfodepleción se puede realizar administrando la fludarabina y la ciclofosfamida juntas a un paciente. La fludarabina se puede administrar a 25 mg/m2/día i.v. y la ciclofosfamida se administra a 250 mg/m2/día i.v. por 4 días.
La linfodepleción puede realizarse mediante la administración de ciclofosfamida a una dosis de 60 mg/m2/día durante dos días, seguida de la administración de fludarabina a una dosis de 25 mg/m2/día durante cinco días.
4. Regímenes de IL-2
El régimen de IL-2 puede comprender un régimen de IL-2 de dosis alta, en donde el régimen de IL-2 de dosis alta comprende aldesleucina, o un biosimilar o una variante de la misma, administrada por vía intravenosa comenzando el día después de administrar una porción terapéuticamente eficaz de la población terapéutica de TIL, en donde la aldesleucina o un biosimilar o una variante de la misma se administra a una dosis de 0.037 mg/kg o 0.044 mg/kg UI/kg (masa corporal del paciente) mediante infusiones intravenosas en bolo de 15 minutos cada ocho horas hasta la tolerancia, para un máximo de 14 dosis. Después de 9 días de reposo, este programa puede repetirse para otras 14 dosis, hasta un máximo de 28 dosis en total.
El régimen de IL-2 puede comprender un régimen de IL-2 decreciente. Se han descrito regímenes de IL-2 decreciente en O'Day, et al., J. Clin. Oncol. 1999, 17, 2752-61 y Eton, et al., Cancer 2000,<8 8>, 1703-9. Un régimen decreciente de IL-2 puede comprender 18 x 10<6>UI/m<2>administrados por vía intravenosa durante<6>horas, seguidos de 18 x<1 0 6>UI/m<2>administrados por vía intravenosa durante 12 horas, seguidos de 18 x<1 0 6>UI/m<2>administrados por vía intravenosa durante 12 horas, seguidos de 18 x 10<6>UI/m<2>administradas por vía intravenosa durante 24 horas, seguidas de 4.5 x 10<6>UI/m<2>administradas por vía intravenosa durante 72 horas. Este ciclo de tratamiento puede repetirse cada 28 días durante un máximo de cuatro ciclos. Un régimen decreciente de IL-2 puede comprender 18,000,000 UI/m<2>el día 1, 9,000,000 UI/m<2>el día 2 y 4,500.000 UI/m<2>los días 3 y 4.
El régimen de IL-2 puede comprender la administración de IL-2 pegilada cada 1,2, 4,<6>, 7, 14 o 21 días a una dosis de 0.10 mg/día a 50 mg/día.
5. Transferencia de células adoptivas
La transferencia de células adoptivas (ACT) es una forma muy eficaz de inmunoterapia e implica la transferencia de células inmunes con actividad antitumoral a pacientes con cáncer. ACT es un enfoque de tratamiento que implica la identificación, in vitro, de linfocitos con actividad antitumoral, la expansión in vitro de estas células a grandes cantidades y su infusión en el huésped portador del cáncer. Los linfocitos utilizados para la transferencia adoptiva se pueden derivar del estroma de tumores extirpados (linfocitos infiltrantes de tumores o TIL). Los TIL para ACT se pueden preparar como se describe en el presente documento. En algunas formas de realización, los TIL se preparan, por ejemplo, de acuerdo con un procedimiento como se describe en la Figura 27. También se pueden derivar o de la sangre si están diseñados genéticamente para expresar receptores de células T antitumorales (TCR), o de receptores de antígenos quiméricos (CAR), enriquecidos con cultivos mixtos de células tumorales de linfocitos (MLTC) o clonados utilizando células presentadoras de antígenos autólogas y péptidos derivados de tumores. La ACT en la que los linfocitos se originan en el huésped portador del cáncer que se va a infundir se denomina ACT autóloga. La publicación de Estados Unidos No.
2011/0052530 se refiere a un procedimiento para realizar terapia celular adoptiva para promover la regresión del cáncer, principalmente para el tratamiento de pacientes que padecen melanoma metastásico. En algunas formas de realización, los TIL pueden administrarse como se describe en el presente documento. En algunas formas de realización, los TIL se pueden administrar en una sola dosis. Tal administración puede ser mediante inyección, por ejemplo, inyección intravenosa. En algunas formas de realización, se pueden administrar TIL y/o linfocitos citotóxicos en múltiples dosis. La dosificación puede ser una, dos, tres, cuatro, cinco, seis o más de seis veces al año. La dosificación puede ser una vez al mes, una vez cada dos semanas, una vez a la semana o una vez cada dos días. La administración de TIL y/o linfocitos citotóxicos puede continuar tanto tiempo como sea necesario.
6. Ejemplos de tratamiento ejemplar
La presente divulgación incluye un procedimiento para tratar un cáncer con una población de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) que comprende las etapas de (a) obtener una primera población de TIL de un tumor extirpado de un paciente; (b) realizar una expansión inicial de la primera población de TIL en un primer medio de cultivo celular para obtener una segunda población de TIL, donde la segunda población de TIL es al menos 5 veces mayor en número que la primera población de TIL, y en donde el primer medio de cultivo celular comprende IL-2; (c) realizar una expansión rápida de la segunda población de TIL utilizando una población de células presentadoras de antígenos artificiales mieloides (aAPC mieloides) en un segundo medio de cultivo celular para obtener una tercera población de TIL, en donde la tercera población de TIL es de al menos 50 veces mayor en número que la segunda población de TIL después de 7 días desde el inicio de la rápida expansión; y en donde el segundo medio de cultivo celular comprende IL-2 y OKT-3; (d) administrar una porción terapéuticamente eficaz de la tercera población de TIL a un paciente con cáncer. La presente divulgación también incluye una población de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) para su uso en el tratamiento del cáncer, en donde la población de TIL se puede obtener mediante un procedimiento que comprende las etapas de (b) realizar una expansión inicial de una primera población de TIL obtenida de un tumor extirpado de un paciente en un primer medio de cultivo celular para obtener una segunda población de TIL, en donde la segunda población de TIL es al menos 5 veces mayor en número que la primera población de TIL, y en donde el primer medio de cultivo celular comprende IL-2; (c) realizar una expansión rápida de la segunda población de TIL utilizando una población de células presentadoras de antígenos artificiales mieloides (aAPC mieloides) en un segundo medio de cultivo celular para obtener una tercera población de TIL, en donde la tercera población de TIL es de al menos 50 -se multiplicó en número que la segunda población de TIL después de 7 días desde el inicio de la rápida expansión; y en donde el segundo medio de cultivo celular comprende IL-2 y OKT-3; (d) administrar una porción terapéuticamente eficaz de la tercera población de TIL a un paciente con cáncer. La presente divulgación también incluye una población de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) para su uso en el tratamiento del cáncer, en donde la población de TIL se puede obtener mediante un procedimiento que comprende las etapas de (b) realizar una expansión inicial de una primera población de TIL obtenidos a partir de un tumor extirpado de un paciente en un primer medio de cultivo celular para obtener una segunda población de TIL, en donde la segunda población de TIL es al menos 5 veces mayor en número que la primera población de TIL, y en donde el primer medio de cultivo celular comprende IL-2; (c) realizar una expansión rápida de la segunda población de TIL utilizando una población de células presentadoras de antígenos artificiales mieloides (aAPC mieloides) en un segundo medio de cultivo celular para obtener una tercera población de TIL, en donde la tercera población de TIL es de al menos 50 veces mayor en número que la segunda población de TIL después de 7 días desde el inicio de la rápida expansión; y en donde el segundo medio de cultivo celular comprende IL-2 y OKT-3; (d) administrar una porción terapéuticamente eficaz de la tercera población de TIL a un paciente con cáncer. El procedimiento puede comprender una primera etapa (a) de obtener la primera población de TIL de un tumor extirpado de un paciente. La IL-2 puede estar presente a una concentración inicial de alrededor de 3000 UI/ml y el anticuerpo OKT-3 está presente a una concentración inicial de alrededor de 30 ng/mL en el segundo medio de cultivo celular. La primera expansión se puede realizar durante un período no mayor de 14 días. La primera expansión se puede realizar utilizando un recipiente permeable a los gases. La segunda expansión se puede realizar utilizando un recipiente permeable a los gases. La relación de la segunda población de TIL a la población de aAPC en la rápida expansión puede estar entre 1 a 80 y 1 a 400. La relación de la segunda población de TIL a la población de aAPC en la rápida expansión puede ser de alrededor de 1 a 300. El cáncer para el tratamiento puede seleccionarse del grupo que consiste en melanoma, cáncer de ovario, cáncer de cuello uterino, cáncer de pulmón de células no pequeñas (CPCNP), cáncer de pulmón, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer causado por el virus del papiloma humano, cáncer de cabeza y cáncer de cuello (incluido el carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (HNSCC)), cáncer renal y carcinoma de células renales. El cáncer para el tratamiento puede seleccionarse del grupo que consiste en melanoma, cáncer de ovario y cáncer de cuello uterino. El cáncer para el tratamiento puede ser el melanoma. El cáncer para el tratamiento puede ser cáncer de ovario. El cáncer para el tratamiento puede ser cáncer de cuello uterino. El procedimiento de tratamiento del cáncer puede comprender además la etapa de tratar al paciente con un régimen de linfodepleción no mieloablativa antes de administrar la tercera población de TIL al paciente. El régimen de linfodepleción no mieloablativa puede comprender las etapas de administración de ciclofosfamida a una dosis de 60 mg/m2/día durante dos días, seguida de la administración de fludarabina a una dosis de 25 mg/m2/día durante cinco días. El régimen de dosis alta de IL-2 puede comprender 600,000 o 720,000 UI/kg de aldesleucina, o un biosimilar o una variante de la misma, administrado como una infusión intravenosa en bolo de 15 minutos cada ocho horas hasta la tolerancia.
V. Ejemplos ilustrativos
La presente divulgación incluye, pero no reivindica, un procedimiento para tratar a un sujeto con cáncer, y el procedimiento comprende la administración de linfocitos infiltrantes de tumores expandidos (TIL), que comprende:
(a) obtener una primera población de TIL de un tumor extirpado de un sujeto convirtiendo una muestra de tumor obtenida del paciente en múltiples fragmentos de tumor;
(b) agregar los fragmentos de tumor a un sistema cerrado;
(c) realizar una primera expansión cultivando la primera población de TIL en un medio de cultivo celular que comprende IL-2 para producir una segunda población de TIL, en donde la primera expansión se realiza en un recipiente cerrado, lo que proporciona una primera área de superficie permeable a los gases, donde la primera expansión se realiza durante alrededor de 11 días para obtener la segunda población de TIL, donde la segunda población de TIL es al menos 50 veces mayor en número que la primera población de TIL, y donde la transición de la etapa (b) a la etapa (c) ocurre sin abrir el sistema;
(d) realizar una segunda expansión suplementando el medio de cultivo celular de la segunda población de TIL con IL-2, OKT-3 y células presentadoras de antígeno (APC) adicionales, para producir una tercera población de TIL, en donde la segunda expansión es realizada durante alrededor de 11 días para obtener la tercera población de TIL, en donde la tercera población de TIL es una población terapéutica de TIL, en donde la segunda expansión se realiza en un recipiente cerrado, lo que proporciona una segunda área de superficie permeable a los gases, y en donde la transición de la etapa (c) a la etapa (d) ocurre sin abrir el sistema;
(e) recolectar la población terapéutica de TIL obtenida de la etapa (d), en donde la transición de la etapa (d) a la etapa (e) ocurre sin abrir el sistema; y
(f) transferir la población de TIL recolectada de la etapa (e) a una bolsa de infusión, en donde la transferencia de la etapa (e) a la (f) ocurre sin abrir el sistema;
(g) crioconservar la bolsa de infusión que comprende la población de TIL recolectada de la etapa (f) usando un procedimiento de crioconservación; y
(h) administrar una dosis terapéuticamente eficaz de la tercera población de TIL de la bolsa de infusión en la etapa (g) al paciente.
El procedimiento de crioconservación puede comprender la crioconservación en un medio que comprende DMSO. Los medios de crioconservación pueden comprender de un 7% a un 10% de DMSO. El medio de crioconservación puede ser CS10.
La población terapéutica de TIL recolectados en la etapa (e) puede comprender suficientes TIL para administrar una dosis terapéuticamente eficaz de los TIL en la etapa (h).
El número de TIL suficientes para administrar una dosis terapéuticamente eficaz en la etapa (h) puede ser de alrededor de 2.3 x 10<10>a alrededor de 13.7 x 1010.
Las células presentadoras de antígeno (APC) pueden ser PBMC.
Las PBMC se pueden agregar al cultivo celular en cualquiera de los días 9 a 11 en la etapa (d).
Antes de administrar una dosis terapéuticamente eficaz de células TIL en la etapa (h), se puede haber administrado al paciente un régimen de linfodepleción no mieloablativa.
El régimen de linfodepleción no mieloablativa puede comprender las etapas de administración de ciclofosfamida a una dosis de 60 mg/m2/día durante dos días seguido de la administración de fludarabina a una dosis de 25 mg/m2/día durante cinco días.
El procedimiento puede comprender además la etapa de tratar al paciente con un régimen de IL-2 de dosis alta comenzando el día después de la administración de las células TIL al paciente en la etapa (h).
El régimen de IL-2 de dosis alta puede comprender 600,000 o 720,000 UI/kg administrados como una infusión intravenosa en bolo de 15 minutos cada ocho horas hasta la tolerancia.
La tercera población de TIL en la etapa (d) puede proporcionar mayor eficacia, producción aumentada de interferón-gamma (IFN-y), policlonalidad aumentada, promedio aumentado de IP-10 y/o promedio aumentado de MCP-1 cuando se administra a un sujeto. El aumento de IFN-<y>, IP-10 de promedio aumentado y/o MCP-1 de promedio aumentado pueden medirse en la sangre del sujeto tratado con los TIL.
El cáncer puede seleccionarse del grupo que consiste en melanoma, cáncer de ovario, cáncer de cuello uterino, cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), cáncer de pulmón, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer causado por el virus del papiloma humano, cáncer de cabeza y cuello (incluido el carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (HNSCC)), cáncer de riñón y carcinoma de células renales. El cáncer se puede seleccionar del grupo que consiste en melanoma, HNSCC, cánceres de cuello uterino y NSCLC. El cáncer puede ser melanoma. El cáncer puede ser HNSCC. El cáncer puede ser un cáncer de cuello uterino. El cáncer puede ser NSCLC.
En una forma de realización, la invención proporciona un procedimiento para expandir linfocitos infiltrantes de tumores (TIL).
En el presente documento se divulga un procedimiento para expandir linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) que comprende: (a) obtener una muestra de tumor de un paciente, en donde dicha muestra de tumor comprende una primera población de TIL; (b) convertir dicha muestra de tumor en múltiples fragmentos de tumor; (c) agregar dichos fragmentos de tumor a un recipiente cerrado; (d) realizar una expansión inicial de dicha primera población de TIL en un primer medio de cultivo celular para obtener una segunda población de TIL, en donde dicho primer medio de cultivo celular comprende IL-2, en donde dicha expansión inicial se realiza en dicho recipiente cerrado que proporciona al menos<1 0 0>cm<2>de área superficial permeable al gas, en donde dicha expansión inicial se realiza dentro de un primer período de alrededor de 7-14 días para obtener una segunda población de TIL, en donde dicha segunda población de TIL es al menos 50 veces mayor en número que dicha primera población de TIL, y en donde la transición de la etapa (c) a la etapa (d) se produce sin abrir el sistema; (e) expandir dicha segunda población de TIL en un segundo medio de cultivo celular, en donde dicho segundo medio de cultivo celular comprende IL-2, OKT-3 y células mononucleares de sangre periférica (PBMC, también conocidas como células mononucleares (MNC)), donde dicha expansión se realiza dentro de un segundo período de alrededor de 7-14 días para obtener una tercera población de TIL, en donde dicha tercera población de TIL exhibe una subpoblación aumentada de células T efectoras y/o células T de memoria central en relación con la segunda población de TIL, en donde dicha expansión se realiza en un recipiente cerrado, lo que proporciona al menos 500 cm<2>de área de superficie permeable a los gases, y en donde la transición de la etapa (d) a la etapa (e) se produce sin abrir el sistema; (f) recolectar dicha tercera población de TIL obtenida de la etapa (e), en donde la transición de la etapa (e) a la etapa (f) ocurre sin abrir el sistema; y (g) transferir dicha población de TIL recolectada de la etapa (f) a una bolsa de infusión, en donde dicha transferencia de la etapa (f) a (g) ocurre sin abrir el sistema. En algunas formas de realización, el procedimiento es in vitro o ex vivo.
El procedimiento puede comprender además la recolección en la etapa (f) a través de un sistema de tratamiento celular, tal como el sistema LOVO fabricado por Fresenius Kabi. El término "sistema de tratamiento de células LOVO" también se refiere a cualquier instrumento o dispositivo fabricado por cualquier proveedor, que pueda bombear una solución que comprende células a través de una membrana o filtro, como una membrana giratoria o un filtro giratorio, en un entorno de sistema cerrado y/o estéril, lo que permite flujo continuo y tratamiento celular para eliminar el sobrenadante o los medios de cultivo celular sin formación de pellas. En algunos casos, el sistema de tratamiento celular puede realizar la separación celular, lavado, intercambio de fluidos, concentración y/u otras etapas de tratamiento celular en un sistema cerrado y estéril.
El recipiente cerrado se puede seleccionar del grupo que consta de un recipiente G y una bolsa de células Xuri.
La bolsa de infusión en la etapa (g) puede ser una bolsa de infusión que contenga HypoThermosol.
El primer período en la etapa (d) y dicho segundo período en la etapa (e) pueden realizarse cada uno individualmente dentro de un período de<1 0>días,<1 1>días o<1 2>días.
El primer período en la etapa (d) y dicho segundo período en la etapa (e) pueden realizarse individualmente cada uno dentro de un período de<1 1>días.
Las etapas (a) a (g) se pueden realizar dentro de un período de alrededor de 25 días a alrededor de 30 días.
Las etapas (a) a (g) se pueden realizar dentro de un período de alrededor de 20 días a alrededor de 25 días.
Las etapas (a) a (g) se pueden realizar dentro de un período de alrededor de 20 días a alrededor de 22 días.
Las etapas (a) a (g) se pueden realizar en 22 días o menos.
Las etapas (c) a (f) se pueden realizar en un solo recipiente, en donde realizar las etapas (c) a (f) en un solo recipiente puede dar como resultado un aumento en el rendimiento de TIL por tumor extirpado en comparación con la realización de las etapas (c) a (f) en más de un recipiente.
Las PBMC se pueden agregar a los TIL durante el segundo período en la etapa (e) sin abrir el sistema.
Las células T efectoras y/o las células T de memoria central obtenidas de dicha tercera población de TIL pueden exhibir una o más características seleccionadas del grupo que consiste en la expresión de CD27+, la expresión de CD28+, telómeros más largos, expresión aumentada de CD57 y expresión disminuida de CD56. en relación con las células T efectoras y/o las células T de memoria central obtenidas de dicha segunda población de células.
Las células T efectoras y/o las células T de memoria central obtenidas de dicha tercera población de TIL pueden exhibir una expresión de CD57 aumentada y una expresión de CD56 disminuida con respecto a las células T efectoras y/o células T de memoria central obtenidas de dicha segunda población de células.
El riesgo de contaminación microbiana se puede reducir en comparación con un sistema abierto.
Los TIL de la etapa (g) se pueden infundir a un paciente.
Se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, un procedimiento para tratar el cáncer en un paciente con una población de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) que comprende las etapas de: (a) obtener una muestra de tumor de un paciente, en donde dicha muestra de tumor comprende un primera población de TIL; (b) convertir dicha muestra de tumor en múltiples fragmentos de tumor; (c) agregar dichos fragmentos de tumor a un recipiente cerrado; (d) realizar una expansión inicial de dicha primera población de TIL en un primer medio de cultivo celular para obtener una segunda población de TIL, en donde dicho primer medio de cultivo celular comprende IL-2, en donde dicha expansión inicial se realiza en dicho recipiente cerrado que proporciona al menos<1 0 0>cm<2>de área superficial permeable al gas, en donde dicha expansión inicial se realiza dentro de un primer período de alrededor de 7-14 días para obtener una segunda población de TIL, en donde dicha segunda población de TIL es al menos 50 veces mayor en número que dicha primera población de TIL, y en donde la transición de la etapa (c) a la etapa (d) se produce sin abrir el sistema; (e) expandir dicha segunda población de TIL en un segundo medio de cultivo celular, en donde dicho segundo medio de cultivo celular comprende IL-2, OKT-3 y células mononucleares de sangre periférica (PBMC), en donde dicha expansión se realiza dentro de un segundo período de alrededor de 7-14 días para obtener una tercera población de TIL, en donde dicha tercera población de TIL exhibe una subpoblación aumentada de células T efectoras y/o células T de memoria central en relación con la segunda población de TIL, en donde dicha expansión se realiza en un recipiente cerrado, lo que proporciona al menos 500 cm<2>de área superficial permeable a los gases, y en donde la transición de la etapa (d) a la etapa (e) se produce sin abrir el sistema; (f) recolectar dicha tercera población de TIL obtenida de la etapa (e), en donde la transición de la etapa (e) a la etapa (f) ocurre sin abrir el sistema; (g) transferir dicha población de TIL recolectada de la etapa (f) a una bolsa de infusión, en donde dicha transferencia de la etapa (f) a (g) ocurre sin abrir el sistema; y (h) administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de células TIL de dicha bolsa de infusión en la etapa (g) a dicho paciente.
También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, una población de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) para su uso en el tratamiento del cáncer, en donde la población de TIL se puede obtener a partir de un procedimiento que comprende las etapas de: (b) tratar una muestra de tumor obtenida de un paciente en donde dicha muestra de tumor comprende una primera población de TIL en múltiples fragmentos de tumor; (c) agregar dichos fragmentos de tumor a un recipiente cerrado; (d) realizar una expansión inicial de dicha primera población de TIL en un primer medio de cultivo celular para obtener una segunda población de TIL, en donde dicho primer medio de cultivo celular comprende IL-2, en donde dicha expansión inicial se realiza en dicho recipiente cerrado que proporciona al menos<1 0 0>cm<2>de área superficial permeable al gas, en donde dicha expansión inicial se realiza dentro de un primer período de alrededor de 7-14 días para obtener una segunda población de TIL, en donde dicha segunda población de TIL es al menos 50 veces mayor en número que dicha primera población de TIL, y en donde la transición de la etapa (c) a la etapa (d) se produce sin abrir el sistema; (e) expandir dicha segunda población de TIL en un segundo medio de cultivo celular, en donde dicho segundo medio de cultivo celular comprende IL-2, OKT-3 y células mononucleares de sangre periférica (PBMC), en donde dicha expansión se realiza dentro de un segundo período de alrededor de 7-14 días para obtener una tercera población de TIL, en donde dicha tercera población de TIL exhibe una subpoblación aumentada de células T efectoras y/o células T de memoria central en relación con la segunda población de TIL, en donde dicha expansión se realiza en un recipiente cerrado, lo que proporciona al menos 500 cm<2>de área superficial permeable a los gases, y en donde la transición de la etapa (d) a la etapa (e) se produce sin abrir el sistema; (f) recolectar dicha tercera población de TIL obtenida de la etapa (e), en donde la transición de la etapa (e) a la etapa (f) ocurre sin abrir el sistema; (g) transferir dicha población de TIL recolectada de la etapa (f) a una bolsa de infusión, en donde dicha transferencia de la etapa (f) a (g) ocurre sin abrir el sistema. El procedimiento puede comprender una primera etapa de (a) obtener la muestra de tumor de un paciente, en donde dicha muestra de tumor comprende la primera población de TIL. La población de TIL puede ser para administración desde dicha bolsa de infusión en la etapa (g) en una cantidad terapéuticamente eficaz.
Antes de administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de células TIL en la etapa (h), se puede haber administrado a dicho paciente un régimen de linfodepleción no mieloablativa. Las poblaciones de TIL pueden ser para administración a un paciente que se ha sometido a un régimen de linfodepleción no mieloablativa.
El régimen de linfodepleción no mieloablativa puede comprender los pasos de administración de ciclofosfamida a una dosis de 60 mg/m2/día durante dos días, seguida de la administración de fludarabina a una dosis de 25 mg/m2/día durante cinco días.
El procedimiento puede comprender además la etapa de tratar a dicho paciente con un régimen de IL-2 de dosis alta comenzando el día después de la administración de dichas células TIL a dicho paciente en la etapa (h). En algunas formas de realización, las poblaciones de TIL son para administración antes de un régimen de IL-2 de dosis alta. En algunas formas de realización, la población de TIL es para la administración un día antes del inicio del régimen de dosis alta de IL-2.
El régimen de IL-2 de dosis alta puede comprender 600,000 o 720,000 UI/kg administrados como una infusión intravenosa en bolo de 15 minutos cada ocho horas hasta la tolerancia.
Las células T efectoras y/o las células T de memoria central pueden ser obtenidas de dicha tercera población de TIL, exhibir una o más características seleccionadas del grupo que consiste en la expresión de CD27+, la expresión de CD28+, telómeros más largos, expresión de CD57 aumentada y expresión de CD56 disminuida. en relación con las células T efectoras y/o las células T de memoria central obtenidas de dicha segunda población de células.
Las células T efectoras y/o las células T de memoria central pueden ser obtenidas de dicha tercera población de TIL, exhibir una expresión de CD57 aumentada y una expresión de CD56 disminuida con respecto a las células T efectoras y/o células T de memoria central obtenidas de dicha segunda población de células.
También se divulga en el presente documento un procedimiento para expandir linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) que comprende las etapas de (a) agregar fragmentos de tumor tratados aun sistema cerrado; (b) realizar una primera expansión de dicha primera población de TIL en un primer medio de cultivo celular para obtener una segunda población de TIL, en donde dicho primer medio de cultivo celular comprende IL-2, en donde dicha primera expansión se realiza en un recipiente cerrado, lo que proporciona una primera área superficial permeable a los gases, en donde dicha primera expansión se realiza dentro de un primer período de alrededor de 3-14 días para obtener una segunda población de TIL, en donde dicha segunda población de TIL es al menos 50 veces mayor en número que dicha primera población de TIL, y en donde la transición de la etapa (a) a la etapa (b) se produce sin abrir el sistema; (c) expandir dicha segunda población de TIL en un segundo medio de cultivo celular, en donde dicho segundo medio de cultivo celular comprende IL-2, OKT-3 y células presentadoras de antígeno, en donde dicha expansión se realiza dentro de un segundo período de alrededor de 7-14 días para obtener una tercera población de TIL, en donde dicha tercera población de TIL exhibe una subpoblación aumentada de células T efectoras y/o células T de memoria central con respecto a la segunda población de TIL, en donde dicha expansión se realiza en un recipiente cerrado, lo que proporciona un segunda área superficial permeable a los gases, y en donde la transición de la etapa (b) a la etapa (c) se produce sin abrir el sistema; (d) recolectar dicha tercera población de TIL obtenida de la etapa (c), en donde la transición de la etapa (c) a la etapa (d) ocurre sin abrir el sistema; y (e) transferir dicha población de TIL recolectada de la etapa (d) a una bolsa de infusión, en donde dicha transferencia de la etapa (d) a (e) ocurre sin abrir el sistema.
El procedimiento puede comprender además la etapa de crioconservar la bolsa de infusión que comprende la población de TIL recolectada usando un procedimiento de crioconservación. El procedimiento de crioconservación se puede realizar usando una relación 1:1 de población de TIL recolectada a medio CS10.
Las células presentadoras de antígenos pueden ser células mononucleares de sangre periférica (PBMC). Las células presentadoras de antígenos pueden ser células presentadoras de antígenos artificiales.
La recolección en la etapa (d) se puede realizar usando un sistema de tratamiento de células LOVO.
Los fragmentos múltiples pueden comprender alrededor de 50 fragmentos, en los que cada fragmento tiene un volumen de alrededor de 27 mm3. Los múltiples fragmentos pueden comprender desde alrededor de 30 a alrededor de 60 fragmentos con un volumen total de alrededor de 1300 mm<3>a alrededor de 1500 mm3. Los múltiples fragmentos pueden comprender alrededor de 50 fragmentos con un volumen total de alrededor de 1350 mm3. Los múltiples fragmentos pueden comprender alrededor de 50 fragmentos con una masa total de alrededor de 1 gramo a alrededor de 1.5 gramos.
El segundo medio de cultivo celular se puede proporcionar en un recipiente seleccionado del grupo que consiste en un recipiente G y una bolsa de células Xuri.
La bolsa de infusión en la etapa (e) puede ser una bolsa de infusión que contenga HypoThermosol.
El primer período en la etapa (b) y dicho segundo período en la etapa (c) pueden realizarse cada uno individualmente dentro de un período de 10 días, 11 días o 12 días. El primer período en la etapa (b) y dicho segundo período en la etapa (c) pueden realizarse cada uno individualmente dentro de un período de<1 1>días.
Las etapas (a) a (e) se pueden realizar dentro de un período de alrededor de 25 días a alrededor de 30 días. Las etapas (a) a (e) se pueden realizar dentro de un período de alrededor de 20 días a alrededor de 25 días. Las etapas (a) a (e) se pueden realizar dentro de un período de alrededor de 20 días a alrededor de 22 días. Las etapas (a) a (e) se pueden realizar en 22 días o menos. Las etapas (a) a (e) y la crioconservación se pueden realizar en<2 2>días o menos.
Las etapas (b) a (e) se pueden realizar en un único sistema cerrado, en donde la realización de las etapas (b) a (e) en un solo recipiente puede dar como resultado un aumento en el rendimiento de TIL por tumor extirpado en comparación con la realización de las etapas (b) a (e) en más de un recipiente.
Las células presentadoras de antígeno se pueden agregar a los TIL durante el segundo período en la etapa (c) sin abrir el sistema.
Las células T efectoras y/o las células T de memoria central obtenidas de dicha tercera población de TIL pueden exhibir una o más características seleccionadas del grupo que consiste en la expresión de CD27+, la expresión de CD28+, telómeros más largos, la expresión de CD57 aumentada y la expresión de CD56 disminuida. en relación con las células T efectoras y/o las células T de memoria central obtenidas de dicha segunda población de células.
Las células T efectoras y/o las células T de memoria central obtenidas de dicha tercera población de TIL pueden exhibir expresión de CD57 aumentada y expresión de CD56 disminuida en relación con las células T efectoras y/o células T de memoria central obtenidas de dicha segunda población de células.
El riesgo de contaminación microbiana se puede reducir en comparación con un sistema abierto.
Los TIL de la etapa (e) se pueden infundir a un paciente.
El recipiente cerrado puede comprender un solo biorreactor. En algunas formas de realización, el recipiente cerrado comprende un G-REX-10. El recipiente cerrado puede comprender un G-REX-100. El recipiente cerrado puede comprender un G-Rex 500. El recipiente cerrado puede comprender una bolsa permeable al gas del biorreactor Xuri o Wave.
La presente divulgación también proporciona un procedimiento para expandir linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) a una población terapéutica de TIL que comprende:
(b) agregar fragmentos tumorales a un sistema cerrado en donde los fragmentos tumorales comprenden una primera población de TIL;
(c) realizar una primera expansión cultivando la primera población de TIL en un medio de cultivo celular que comprende IL-2 para producir una segunda población de TIL, en donde la primera expansión se realiza en un recipiente cerrado, lo que proporciona una primera área de superficie permeable a los gases, donde la primera expansión se realiza durante alrededor de 3-14 días para obtener la segunda población de TIL, donde la segunda población de TIL es al menos 50 veces mayor en número que la primera población de TIL, y donde la transición desde la etapa (b) a la etapa (c) ocurre sin abrir el sistema;
(d) realizar una segunda expansión suplementando el medio de cultivo celular de la segunda población de TIL con IL-2, OKT-3 y células presentadoras de antígeno (APC) adicionales, para producir una tercera población de TIL, en donde la segunda expansión se realiza durante alrededor de 7-14 días para obtener la tercera población de TIL, en donde la tercera población de TIL es una población terapéutica de TIL que comprende una subpoblación aumentada de células T efectoras y/o células T de memoria central en relación con la segunda población de TIL, en donde la segunda expansión se realiza en un recipiente cerrado, lo que proporciona una segunda área superficial permeable al gas, y en donde la transición de la etapa (c) a la etapa (d) se produce sin abrir el sistema;
(e) recolectar la población terapéutica de TIL obtenida de la etapa (d), en donde la transición de la etapa (d) a la etapa (e) ocurre sin abrir el sistema; y
(f) transferir la población de TIL recolectada de la etapa (e) a una bolsa de infusión, en donde la transferencia de la etapa (e) a la (f) ocurre sin abrir el sistema.
El procedimiento también puede comprender como primera etapa:
(a) obtener una primera población de TIL de un tumor extirpado de un paciente convirtiendo una muestra de tumor obtenida del paciente en múltiples fragmentos de tumor.
El procedimiento puede ser in vitro o ex vivo.
La presente divulgación también proporciona un procedimiento para expandir linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) a una población terapéutica de TIL, que comprende:
(a) obtener una primera población de TIL de un tumor extirpado de un paciente convirtiendo una muestra de tumor obtenida del paciente en múltiples fragmentos de tumor;
(b) agregar los fragmentos de tumor a un sistema cerrado;
(c) realizar una primera expansión cultivando la primera población de TIL en un medio de cultivo celular que comprende IL-2 para producir una segunda población de TIL, en donde la primera expansión se realiza en un recipiente cerrado, lo que proporciona una primera área de superficie permeable a los gases, donde la primera expansión se realiza durante alrededor de 3-14 días para obtener la segunda población de TIL, donde la segunda población de TIL es al menos 50 veces mayor en número que la primera población de TIL, y donde la transición desde la etapa (b) a la etapa (c) ocurre sin abrir el sistema;
(d) realizar una segunda expansión suplementando el medio de cultivo celular de la segunda población de TIL con IL-2, OKT-3 y células presentadoras de antígeno (APC) adicionales, para producir una tercera población de TIL, en donde la segunda expansión se realiza durante alrededor de 7-14 días para obtener la tercera población de TIL, en donde la tercera población de TIL es una población terapéutica de TIL que comprende una subpoblación aumentada de células T efectoras y/o células T de memoria central en relación con la segunda población de TIL, en donde la segunda expansión se realiza en un recipiente cerrado, lo que proporciona una segunda área superficial permeable al gas, y en donde la transición de la etapa (c) a la etapa (d) se produce sin abrir el sistema;
(e) recolectar la población terapéutica de TIL obtenida de la etapa (d), en donde la transición de la etapa (d) a la etapa (e) ocurre sin abrir el sistema; y
(f) transferir la población de TIL recolectada de la etapa (e) a una bolsa de infusión, en donde la transferencia de la etapa (e) a la (f) ocurre sin abrir el sistema.
El procedimiento puede ser in vitro o ex vivo.
El procedimiento puede comprender además la etapa de crioconservar la bolsa de infusión que comprende la población de TIL recolectada en la etapa (f) usando un procedimiento de crioconservación.
El procedimiento de crioconservación se puede realizar usando una relación 1:1 de población de TIL recolectada al medio de crioconservación. Los medios de crioconservación pueden comprender dimetilsulfóxido. Los medios de crioconservación se pueden seleccionar del grupo que consiste en Cryostor CS10, HypoThermasol o una combinación de los mismos.
Las células presentadoras de antígenos pueden ser células mononucleares de sangre periférica (PBMC). Las PBMC pueden irradiarse y ser alogénicas.
Las PBMC se pueden agregar al cultivo celular en cualquiera de los días 9 a 14 en la etapa (d).
Las células presentadoras de antígenos pueden ser células presentadoras de antígenos artificiales.
La recolección en la etapa (e) puede ser realizada usando un sistema de tratamiento de células LOVO.
Los fragmentos tumorales pueden ser múltiples fragmentos y comprender de alrededor de 4 a alrededor de 50 fragmentos, en los que cada fragmento tiene un volumen de alrededor de 27 mm3. Los múltiples fragmentos pueden comprender de alrededor de 30 a alrededor de 60 fragmentos con un volumen total de alrededor de 1300 mm<3>a alrededor de 1500 mm3. Los múltiples fragmentos pueden comprender alrededor de 50 fragmentos con un volumen total de alrededor de 1350 mm3. Los múltiples fragmentos pueden comprender alrededor de 50 fragmentos con una masa total de alrededor de 1 gramo a alrededor de 1.5 gramos.
El medio de cultivo celular puede proporcionarse en un recipiente seleccionado del grupo que consiste en un recipiente G y una bolsa de células Xuri.
La bolsa de infusión en la etapa (f) puede ser una bolsa de infusión que contenga HypoThermosol.
El primer período en la etapa (c) y el segundo período en la etapa (e) pueden realizarse cada uno individualmente dentro de un período de<1 0>días, 11 días o<1 2>días. El primer período en la etapa (c) y el segundo período en la etapa (e) pueden realizarse cada uno individualmente dentro de un período de<1 1>días. Las etapas (a) a (f) se pueden realizar dentro de un período de alrededor de 25 días a alrededor de 30 días. Las etapas (a) a (f) se pueden realizar dentro de un período de alrededor de 20 días a alrededor de 25 días. Las etapas (a) a (f) se pueden realizar dentro de un período de alrededor de 20 días a alrededor de 22 días. Las etapas (a) a (f) se pueden realizar en 22 días o menos. Las etapas (a) a (f) y la crioconservación se pueden realizar en<2 2>días o menos.
La población terapéutica de TIL recolectada en la etapa (e) puede comprender suficientes TIL para una dosificación terapéuticamente eficaz de los TIL. El número de TIL suficiente para una dosificación terapéuticamente eficaz puede ser de alrededor de 2.3 x 10<10>a alrededor de 13.7 x 1010.
Las etapas (b) a (e) se pueden realizar en un solo recipiente, en donde realizar las etapas (b) a (e) en un solo recipiente puede dar como resultado un aumento en el rendimiento de TIL por tumor extirpado en comparación con la realización de las etapas (b) a (e) en más de un recipiente.
Las células presentadoras de antígeno se pueden agregar a los TIL durante el segundo período en la etapa (d) sin abrir el sistema.
Las células T efectoras y/o las células T de memoria central en la población terapéutica de TIL pueden exhibir una o más características seleccionadas del grupo que consiste en la expresión de CD27+, la expresión de CD28+, telómeros más largos, la expresión de<c>D57 aumentada y la expresión de CD56 disminuida relativa a células T efectoras y/o células T de memoria central obtenidas de la segunda población de células.
Las células T efectoras y/o las células T de memoria central obtenidas de la tercera población de TIL pueden exhibir una expresión de CD57 aumentada y una expresión de CD56 disminuida en relación con las células T efectoras y/o las células T de memoria central obtenidas de la segunda población de células.
El riesgo de contaminación microbiana se puede reducir en comparación con un sistema abierto.
Los TIL de la etapa (f) se pueden infundir a un paciente.
Los múltiples fragmentos pueden comprender alrededor de 4 fragmentos. Los 4 fragmentos se pueden colocar en un G-REX -100. Los 4 fragmentos pueden tener alrededor de 0.5 cm de diámetro. Los 4 fragmentos se pueden colocar en un G-REX -100. Los 4 fragmentos pueden tener alrededor de 0.1 cm, 0.2 cm, 0.3 cm, 0.4 cm, 0.5 cm, 0.6 cm, 0.7 cm, 0.8 cm, 0.9 cm o 1 cm de diámetro. Los 4 fragmentos pueden tener alrededor de 0.1 cm, 0.2 cm, 0.3 cm, 0.4 cm, 0.5 cm, 0.6 cm, 0.7 cm, 0.8 cm, 0.9 cm o 1 cm de diámetro y se colocan en un G-REX -100. Los 4 fragmentos pueden tener alrededor de 0.1 cm, 0.2 cm, 0.3 cm, 0.4 cm, 0.5 cm, 0.6 cm, 0.7 cm, 0.8 cm, 0.9 cm o 1 cm de diámetro y pueden colocarse en un recipiente con un volumen equivalente a un G-REX -100. Los 4 fragmentos pueden ser de alrededor de 0.5 cm de diámetro y son colocados en un G-REX -100. Los 4 fragmentos pueden tener alrededor de 0.5 cm de diámetro y son colocados en un recipiente con un volumen equivalente a un G-REX-100.
Más detalles de las etapas (a), (b), (c), (d), (e) y (f) se proporcionan más adelante en el presente documento, que incluyen, por ejemplo, pero no se limitan a, las formas de realización descritas bajo los títulos "ETAPA A: Obtener la muestra de tumor del paciente", "ETAPA B: Primera expansión", "ETAPA C: Primera expansión a la segunda transición de expansión", "ETAPA D: Segunda expansión", "ETAPA E: Recolección de TIL y "ETAPA F: Formulación final/Transferir a bolsa de infusión".
La presente divulgación proporciona procedimientos para tratar a un sujeto con cáncer, y el procedimiento comprende la administración de linfocitos infiltrantes de tumores expandidos (TIL), que comprenden:
(a) obtener una primera población de TIL de un tumor extirpado de un sujeto convirtiendo una muestra de tumor obtenida del paciente en múltiples fragmentos de tumor;
(b) agregar los fragmentos de tumor a un sistema cerrado;
(c) realizar una primera expansión cultivando la primera población de TIL en un medio de cultivo celular que comprende IL-2 para producir una segunda población de TIL, en donde la primera expansión se realiza en un recipiente cerrado, lo que proporciona una primera área de superficie permeable a los gases, donde la primera expansión se realiza durante alrededor de 3-14 días para obtener la segunda población de TIL, donde la segunda población de TIL es al menos 50 veces mayor en número que la primera población de TIL, y donde la transición desde la etapa (b) a la etapa (c) ocurre sin abrir el sistema;
(d) realizar una segunda expansión suplementando el medio de cultivo celular de la segunda población de TIL con IL-2, OKT-3 y células presentadoras de antígeno (APC) adicionales, para producir una tercera población de TIL, en donde la segunda expansión se realiza durante alrededor de 7-14 días para obtener la tercera población de TIL, en donde la tercera población de TIL es una población terapéutica de TIL que comprende una subpoblación aumentada de células T efectoras y/o células T de memoria central en relación con la segunda población de TIL, en donde la segunda expansión se realiza en un recipiente cerrado, lo que proporciona una segunda área superficial permeable al gas, y en donde la transición de la etapa (c) a la etapa (d) se produce sin abrir el sistema;
(e) recolectar la población terapéutica de TIL obtenida de la etapa (d), en donde la transición de la etapa (d) a la etapa (e) ocurre sin abrir el sistema; y
(f) transferir la población de TIL recolectada de la etapa (e) a una bolsa de infusión, en donde la transferencia de la etapa (e) a la (f) ocurre sin abrir el sistema;
(g) opcionalmente crioconservar la bolsa de infusión que comprende la población de TIL recolectada de la etapa (f) usando un procedimiento de crioconservación; y
(h) administrar una dosis terapéuticamente eficaz de la tercera población de TIL de la bolsa de infusión en la etapa (g) al paciente.
También se divulga en el presente documento pero no se reivindica una población terapéutica de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) para su uso en el tratamiento del cáncer, en donde la población se puede obtener a partir de un procedimiento que comprende las etapas de:
(b) agregar fragmentos tumorales a un sistema cerrado en donde los fragmentos tumorales comprenden una primera población de TIL;
(c) realizar una primera expansión cultivando la primera población de TIL en un medio de cultivo celular que comprende IL-2 para producir una segunda población de TIL, en donde la primera expansión se realiza en un recipiente cerrado, lo que proporciona una primera área de superficie permeable a los gases, donde la primera expansión se realiza durante alrededor de 3-14 días para obtener la segunda población de TIL, donde la segunda población de TIL es al menos 50 veces mayor en número que la primera población de TIL, y donde la transición desde la etapa (b) a la etapa (c) ocurre sin abrir el sistema;
(d) realizar una segunda expansión suplementando el medio de cultivo celular de la segunda población de TIL con IL-2, OKT-3 y células presentadoras de antígeno (APC) adicionales, para producir una tercera población de TIL, en donde la segunda expansión se realiza durante alrededor de 7-14 días para obtener la tercera población de TIL, en donde la tercera población de TIL es una población terapéutica de TIL que comprende una subpoblación aumentada de células T efectoras y/o células T de memoria central en relación con la segunda población de TIL, en donde la segunda expansión se realiza en un recipiente cerrado, lo que proporciona una segunda área superficial permeable al gas, y en donde la transición de la etapa (c) a la etapa (d) se produce sin abrir el sistema;
(e) recolectar la población terapéutica de TIL obtenida de la etapa (d), en donde la transición de la etapa (d) a la etapa (e) ocurre sin abrir el sistema; y
(f) transferir la población de TIL recolectada de la etapa (e) a una bolsa de infusión, en donde la transferencia de la etapa (e) a la (f) ocurre sin abrir el sistema; y
(g) opcionalmente crioconservar la bolsa de infusión que comprende la población de TIL recolectada de la etapa (f) usando un procedimiento de crioconservación.
La población puede obtenerse mediante un procedimiento que también comprende como primera etapa:
(a) obtener una primera población de TIL de un tumor extirpado de un paciente convirtiendo una muestra de tumor obtenida del paciente en múltiples fragmentos de tumor.
El procedimiento puede ser in vitro o ex vivo.
Cualquiera de las etapas (a) a (f) puede comprender una o más características descritas en el presente documento, por ejemplo, una o más características divulgadas bajo los títulos "ETAPA A: Obtener una muestra de tumor del paciente", "ETAPA B: Primera expansión", "ETAPA C: Primera expansión a la segunda transición de expansión", "ETAPA D: Segunda expansión", "ETAPA E: Recolectar TIL y "ETAPA F: Formulación final/Transferencia a la bolsa de infusión".
La etapa (g) puede comprender una o más características descritas en el presente documento, por ejemplo, una o más características descritas bajo el título "ETAPA H: Crioconservación opcional de TIL". La etapa (h) puede comprender una o más características divulgadas en el presente documento, por ejemplo, una o más características divulgadas bajo el título "ETAPA F: 1 Composiciones farmacéuticas, dosis y regímenes de dosificación".
La población terapéutica de TIL recolectada en la etapa (e) puede comprender suficientes TIL para administrar una dosis terapéuticamente eficaz de los TIL en la etapa (h).
El número de TIL suficientes para administrar una dosis terapéuticamente eficaz en la etapa (h) puede ser de alrededor de 2.3 x 10<10>a alrededor de 13.7 x 10<10>
Las células presentadoras de antígeno (APC) pueden ser PBMC.
Las PBMC se pueden agregar al cultivo celular en cualquiera de los días 9 a 14 en la etapa (d).
Antes de administrar una dosis terapéuticamente eficaz de células TIL en la etapa (h), se puede haber administrado al paciente un régimen de linfodepleción no mieloablativa.
También se divulga en el presente documento pero no se reivindica una población terapéutica de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) para su uso en el tratamiento del cáncer y en combinación con un régimen de linfodepleción no mieloablativa. El régimen de linfodepleción no mieloablativa se puede administrar antes de administrar la población terapéutica de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL).
El régimen de linfodepleción no mieloablativa puede comprender las etapas de administración de ciclofosfamida a una dosis de 60 mg/m2/día durante dos días seguido de la administración de fludarabina a una dosis de 25 mg/m<2>/día durante cinco días.
La etapa de tratar al paciente con un régimen de IL-2 de dosis alta comenzando el día después de la administración de las células TIL al paciente en la etapa (h).
También se divulga en el presente documento una población terapéutica de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) para su uso en el tratamiento del cáncer y en combinación con un régimen de IL-2 de dosis alta. El régimen de dosis alta de IL-2 puede comenzar el día después de la administración de la población terapéutica de células TIL.
El régimen de IL-2 de dosis alta puede comprender 600,000 o 720,000 UI/kg que se administra como una infusión intravenosa de bolo de 15 minutos cada ocho horas hasta la tolerancia.
Las células T efectoras y/o las células T de memoria central en la población terapéutica de TIL pueden exhibir una o más características seleccionadas del grupo que consiste en la expresión de CD27+, la expresión de CD28+, telómeros más largos, expresión aumentada de CD57 y expresión disminuida de CD56 en relación con células T efectoras y/o células T de memoria central obtenidas de la segunda población de células.
Las células T efectoras y/o las células T de memoria central en la población terapéutica de TIL pueden exhibir una expresión de CD57 aumentada y una expresión de CD56 disminuida en relación con las células T efectoras y/o las células T de memoria central obtenidas de la segunda población de células.
La presente divulgación también proporciona procedimientos para expandir linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) a una población terapéutica de TIL que comprende:
(a) agregar fragmentos de tumor tratados de un tumor extirpado de un paciente a un sistema cerrado para obtener una primera población de TIL;
(b) realizar una primera expansión cultivando la primera población de TIL en un medio de cultivo celular que comprende IL-2 para producir una segunda población de TIL, en donde la primera expansión se realiza en un recipiente cerrado, lo que proporciona una primera área de superficie permeable a los gases, donde la primera expansión se realiza durante alrededor de 3-14 días para obtener la segunda población de TIL, donde la segunda población de TIL es al menos 50 veces mayor en número que la primera población de TIL, y donde la transición de la etapa (a) a la etapa (b) ocurre sin abrir el sistema;
(c) realizar una segunda expansión suplementando el medio de cultivo celular de la segunda población de TIL con IL-2, OKT-3 y células presentadoras de antígeno (APC) adicionales, para producir una tercera población de TIL, en donde la segunda expansión se realiza durante alrededor de 7-14 días para obtener la tercera población de TIL, en donde la tercera población de TIL es una población terapéutica de TIL que comprende una subpoblación aumentada de células T efectoras y/o células T de memoria central en relación con la segunda población de TIL, en donde la segunda expansión se realiza en un recipiente cerrado, lo que proporciona una segunda área superficial permeable al gas, y en donde la transición de la etapa (b) a la etapa (c) se produce sin abrir el sistema;
(d) recolectar la población terapéutica de TIL obtenida de la etapa (c), en donde la transición de la etapa (c) a la etapa (d) ocurre sin abrir el sistema; y
(e) transferir la población de TIL recolectada de la etapa (d) a una bolsa de infusión, en donde la transferencia de la etapa (d) al (e) ocurre sin abrir el sistema.
La población terapéutica de TIL recolectada en la etapa (d) puede comprender suficientes TIL para una dosificación terapéuticamente eficaz de los TIL.
El número de TIL suficiente para una dosificación terapéuticamente eficaz puede ser de alrededor de 2.3 x 10<11>a alrededor de 13.7 x 10<10>
El procedimiento puede comprender además la etapa de crioconservar la bolsa de infusión que comprende la población de TIL recolectada usando un procedimiento de crioconservación.
El procedimiento de crioconservación se puede realizar usando una relación 1:1 de población de TIL recolectada a medio CS10.
La presente divulgación incluye procedimientos para tratar a un sujeto con cáncer y los procedimientos comprenden la administración de linfocitos infiltrantes de tumores expandidos (TIL), que comprenden:
(a) obtener una primera población de TIL de un tumor extirpado de un sujeto convirtiendo una muestra de tumor obtenida del paciente en múltiples fragmentos de tumor;
(b) agregar los fragmentos de tumor a un sistema cerrado;
(c) realizar una primera expansión cultivando la primera población de TIL en un medio de cultivo celular que comprende IL-2 para producir una segunda población de TIL, en donde la primera expansión se realiza en un recipiente cerrado, lo que proporciona una primera área de superficie permeable a los gases, donde la primera expansión se realiza durante alrededor de 3-14 días para obtener la segunda población de TIL, donde la segunda población de TIL es al menos 50 veces mayor en número que la primera población de TIL, y donde la transición desde la etapa (b) a la etapa (c) ocurre sin abrir el sistema;
(d) realizar una segunda expansión suplementando el medio de cultivo celular de la segunda población de TIL con IL-2, OKT-3 y células presentadoras de antígeno (APC) adicionales, para producir una tercera población de TIL, en donde la segunda expansión se realiza durante alrededor de 7-14 días para obtener la tercera población de TIL, en donde la tercera población de TIL es una población terapéutica de TIL que comprende una subpoblación aumentada de células T efectoras y/o células T de memoria central en relación con la segunda población de TIL, en donde la segunda expansión se realiza en un recipiente cerrado, lo que proporciona una segunda área superficial permeable al gas, y en donde la transición de la etapa (c) a la etapa (d) se produce sin abrir el sistema;
(e) recolectar la población terapéutica de TIL obtenida de la etapa (d), en donde la transición de la etapa (d) a la etapa (e) ocurre sin abrir el sistema; y
(f) transferir la población de TIL recolectada de la etapa (e) a una bolsa de infusión, en donde la transferencia de la etapa (e) a la (f) ocurre sin abrir el sistema;
(g) opcionalmente crioconservar la bolsa de infusión que comprende la población de TIL recolectada de la etapa (f) usando un procedimiento de crioconservación; y
(h) administrar al paciente una dosis terapéuticamente eficaz de la tercera población de TIL desde la bolsa de infusión en la etapa (g),
en donde no se realiza ninguna selección de la población de TIL durante ninguna de las etapas (a) a (h). No se puede realizar ninguna selección de la segunda población de TIL (la población pre-REP) basada en el fenotipo antes de realizar la segunda expansión de la etapa (d). No se puede realizar ninguna selección de la primera población de TIL, la segunda población de TIL, la tercera población de TIL o la población de TIL recolectada basada en la expresión de CD<8>durante ninguna de las etapas (a) a (h).
La presente divulgación también proporciona procedimientos para tratar a un sujeto con cáncer, y el procedimiento comprende la administración de linfocitos infiltrantes de tumores expandidos (TIL), que comprende:
(a) obtener una primera población de TIL de un tumor extirpado de un sujeto convirtiendo una muestra de tumor obtenida del paciente en múltiples fragmentos de tumor;
(b) agregar los fragmentos de tumor a un sistema cerrado;
(c) realizar una primera expansión cultivando la primera población de TIL en un medio de cultivo celular que comprende IL-2 para producir una segunda población de TIL, en donde la primera expansión se realiza en un recipiente cerrado, lo que proporciona una primera área de superficie permeable a los gases, donde la primera expansión se realiza durante alrededor de 3-14 días para obtener la segunda población de TIL, donde la segunda población de TIL es al menos 50 veces mayor en número que la primera población de TIL, y donde la transición desde la etapa (b) a la etapa (c) ocurre sin abrir el sistema;
(d) realizar una segunda expansión suplementando el medio de cultivo celular de la segunda población de TIL con IL-2, OKT-3 y células presentadoras de antígeno (APC) adicionales, para producir una tercera población de TIL, en donde la segunda expansión se realiza durante alrededor de 7-14 días para obtener la tercera población de TIL, en donde la tercera población de TIL es una población terapéutica de TIL que comprende una subpoblación aumentada de células T efectoras y/o células T de memoria central en relación con la segunda población de TIL, en donde la segunda expansión se realiza en un recipiente cerrado, lo que proporciona una segunda área superficial permeable al gas, y en donde la transición de la etapa (c) a la etapa (d) se produce sin abrir el sistema;
(e) recolectar la población terapéutica de TIL obtenida de la etapa (d), en donde la transición de la etapa (d) a la etapa (e) ocurre sin abrir el sistema; y
(f) transferir la población de TIL recolectada de la etapa (e) a una bolsa de infusión, en donde la transferencia de la etapa (e) a la (f) ocurre sin abrir el sistema;
(g) crioconservar la bolsa de infusión que comprende la población de TIL recolectada de la etapa (f) usando un procedimiento de crioconservación, en donde el procedimiento de crioconservación comprende mezclar un medio de crioconservación con la población de TIL recolectada;
(h) administrar al paciente una dosis terapéuticamente eficaz de la tercera población de TIL desde la bolsa de infusión en la etapa (g),
en donde no se realiza ninguna selección de la población de TIL durante ninguna de las etapas (a) a (h). No se puede realizar ninguna selección de la segunda población de TIL (por ejemplo, la población pre-REP) basada en el fenotipo antes de realizar la segunda expansión de la etapa (d). No se puede realizar ninguna selección de la primera población de TIL, la segunda población de TIL, la tercera población de TIL o la población de TIL recolectada basada en la expresión de CD<8>durante ninguna de las etapas (a) a (h). El régimen de linfodepleción no mieloablativa se puede administrar antes de administrar la población de TIL recolectada. El régimen de linfodepleción no mieloablativa puede comprender las etapas de administración de ciclofosfamida a una dosis de 60 mg/m2/día durante dos días seguida de la administración de fludarabina a una dosis de 25 mg/m2/día durante cinco días.
Las células presentadoras de antígenos pueden ser células mononucleares de sangre periférica (PBMC). Las PBMC se pueden irradiar y son alogénicas. Las PBMC se pueden agregar al cultivo celular en cualquiera de los días 9 a 14 en la etapa (c).
Las células presentadoras de antígenos pueden ser células presentadoras de antígenos artificiales.
La recolección en la etapa (d) se puede realizar usando un sistema de tratamiento de células LOVO.
El procedimiento puede comprender la recolección en la etapa (d) mediante un sistema de tratamiento de células LOVO, tal como el sistema LOVO fabricado por Fresenius Kabi. El término "sistema de tratamiento de células LOVO" también se refiere a cualquier instrumento o dispositivo que pueda bombear una solución que comprende células a través de una membrana o filtro, como una membrana giratoria o un filtro giratorio, en un entorno de sistema estéril y/o cerrado, lo que permite un flujo continuo y tratamiento celular para eliminar el sobrenadante o el medio de cultivo celular sin formación de pellas. En algunos casos, el sistema de tratamiento celular puede realizar la separación celular, lavado, intercambio de fluidos, concentración y/u otras etapas de tratamiento celular en un sistema cerrado y estéril.
Los fragmentos tumorales pueden ser múltiples fragmentos y comprender de alrededor de 4 a alrededor de 50 fragmentos, en los que cada fragmento tiene un volumen de alrededor de 27 mm3. Los múltiples fragmentos pueden comprender de alrededor de 30 a alrededor de 60 fragmentos con un volumen total de alrededor de 1300 mm<3>a alrededor de 1500 mm3. En algunas formas de realización, los múltiples fragmentos comprenden alrededor de 50 fragmentos con un volumen total de alrededor de 1350 mm3. Los múltiples fragmentos pueden comprender alrededor de 50 fragmentos con una masa total de alrededor de 1 gramo a alrededor de 1.5 gramos.
Los fragmentos múltiples pueden comprender alrededor de 4 fragmentos. Los 4 fragmentos se pueden colocar en un G-REX-100. Los 4 fragmentos pueden tener alrededor de 0.1 cm, 0.2 cm, 0.3 cm, 0.4 cm, 0.5 cm, 0.6 cm, 0.7 cm, 0.8 cm, 0.9 cm o 1 cm de diámetro. Los 4 fragmentos pueden tener alrededor de 0.1 cm, 0.2 cm, 0.3 cm, 0.4 cm, 0.5 cm, 0.6 cm, 0.7 cm, 0.8 cm, 0.9 cm o 1 cm de diámetro y se colocan en un G-REX-100. Los 4 fragmentos pueden tener alrededor de 0.1 cm, 0.2 cm, 0.3 cm, 0.4 cm, 0.5 cm, 0.6 cm, 0.7 cm, 0.8 cm, 0.9 cm o 1 cm de diámetro y se colocan en un recipiente con un volumen equivalente a un G-REX-100. Los 4 fragmentos pueden tener alrededor de 0.5 cm de diámetro y se colocan en un G-REX-100. Los 4 fragmentos pueden tener alrededor de 0.5 cm de diámetro y se colocan en un recipiente con un volumen equivalente a un
G-REX-100.
El medio de cultivo celular puede proporcionarse en un recipiente seleccionado del grupo que consiste en un
recipiente G y una bolsa de células Xuri.
La bolsa de infusión en la etapa (e) puede ser una bolsa de infusión que contiene HypoThermosol.
El primer período en la etapa (b) y el segundo período en la etapa (c) pueden realizarse cada uno individualmente dentro de un período de 10 días, 11 días o 12 días. El primer período en la etapa (b) y el
segundo período en la etapa (c) pueden realizarse cada uno individualmente dentro de un período de<11>días.
Las etapas (a) a (e) se pueden realizar dentro de un período de alrededor de 25 días a alrededor d Las etapas (a) a (e) se pueden realizar dentro de un período de alrededor de 20 días a alrededor d Las etapas (a) a (e) se pueden realizar dentro de un período de alrededor de 20 días a alrededor d Las etapas (a) a (e) se pueden realizar en 22 días o menos. Las etapas (a) a (e) y la crioconservación se
pueden realizar en<2 2>días o menos.
Las etapas (b) a (e) se pueden realizar en un solo recipiente, en donde realizar las etapas (b) a (e) en un solo
recipiente da como resultado un aumento en el rendimiento de TIL por tumor extirpado en comparación con la
realización de las etapas (b) a (e) en más de un recipiente.
Las células presentadoras de antígeno se pueden agregar a los TIL durante el segundo período en la etapa (c)
sin abrir el sistema.
Las células T efectoras y/o las células T de memoria central obtenidas en la población terapéutica de TIL
pueden exhibir una o más características seleccionadas del grupo que consiste en la expresión de CD27+, la
expresión de CD28+, telómeros más largos, expresión aumentada de CD57, una expresión disminuida de CD56
en relación con las células T efectoras y/o células T de memoria central obtenidas de la segunda población de
células.
Las células T efectoras y/o las células T de memoria central obtenidas en la población terapéutica de TIL
pueden exhibir una mayor expresión de CD57 y una menor expresión de CD56 en relación con las células T
efectoras y/o las células T de memoria central obtenidas de la segunda población de células.
El riesgo de contaminación microbiana puede reducirse en comparación con un sistema abierto.
Los TIL de la etapa (e) se pueden infundir a un paciente.
El recipiente cerrado puede comprender un solo biorreactor. El recipiente cerrado puede comprender un G-REX-10. El recipiente cerrado puede comprender un G-REX-100.
EJEMPLOS
Las formas de realización abarcadas en el presente documento se describen ahora con referencia a los
siguientes ejemplos. Estos ejemplos se proporcionan solo con el propósito de ilustrar y la divulgación abarcada
en este documento no debe interpretarse de ninguna manera como limitada a estos ejemplos, sino que debe interpretarse para que abarque todas y cada una de las variaciones que se hacen evidentes como resultado
de las enseñanzas proporcionadas en este documento.
EJEMPLO 1:ENSAYOS DEL SISTEMA CERRADO
Como se analiza en el presente documento, se desarrollaron protocolos y ensayos para generar TIL a partir de
tumores de pacientes en un sistema cerrado.
Este ejemplo describe un nuevo procedimiento abreviado para generar números clínicamente relevantes de
TIL a partir de tejido tumoral extirpado de pacientes en dispositivos G-REX y crioconservación del producto
celular final. En los Ejemplos 2 a<8>se describen aspectos adicionales de este procedimiento.
Definiciones/Abreviaturas
BSC - Cabina de seguridad biológica
°C - grados Celsius
CO<2>- Dióxido de carbono
CD3 - Clúster de diferenciación 3
CM1 - Medio completo 1
CM2 - Medio completo 2
TIWB - Regulador de pH de lavado para aislamiento de tumores
CM4 - Medio completo 4
CRF - Congelador con velocidad de control
EtOH - etanol
GMP - Buenas prácticas de fabricación
IL-2, rIL-2 -Interleucina-2, Interleucina-2 humana recombinante,
IU - Unidad Internacional
L - Litro
LN2 - nitrógeno líquido
mL - mililitro
|jl - microlitro
mM - milimolar
jm - micrómetro
NA - No aplica
PBMC - Célula mononuclear de sangre periférica
PPE - Equipo de protección personal
Pre-REP: cultivos de TIL iniciales que se originan a partir de fragmentos de tumor
REP - Protocolo de expansión rápida
TIL - Linfocitos infiltrantes de tumores
TIWB - Regulador de pH de lavado de aislamiento TIL
POE - Procedimiento operativo estándar
Procedimiento
1. Preparación avanzada: Día 0 (Realizado hasta 36 horas antes)
1.1 Se preparó el regulador de pH de lavado de aislamiento de TIL (TIWB) suplementando 500 ml de solución salina equilibrada de Hanks con 50 jg/m l de gentamicina. Para obtener una solución madre de gentamicina de<1 0>mg/ml, se transfirieron 2.5 ml a HBSS. Para obtener 50 mg/ml de solución madre, se transfirieron 0.5 ml a HBSS.
1.2. Medios CM1 preparados con GlutaMax™ según LAB-005 "Preparación de medios para PreREP y REP" para instrucciones de CM2". Almacenar a 4°C hasta 24 horas. Dejar calentar a 37°C durante al menos 1 hora antes de usar.
1.3. Se retiraron las alícuotas de IL-2 del congelador a -20°C y se colocaron las alícuotas en el refrigerador a 2-8°C.
2. Recepción de tejido tumoral
2.1. Se conservó toda la documentación recibida con el tejido tumoral y se obtuvieron fotos del contenedor de transporte y del tejido tumoral.
2.2. Si TempTale se proporcionó impreso y se guardó el documento asociado; se guardo el PDF.
2.3. Se retiró la muestra de tumor y el recipiente secundario (bolsa con cierre de cremallera) del expedidor y se almacenó a 4°C hasta estar listo para su tratamiento.
2.4 Tumor no utilizado se envió en HypoThermasol o como fragmentos congelados en CryoStor CS10 (ambos disponibles comercialmente en BioLife Solutions, Inc.).
3. Tratamiento de tumores para TIL
3.1. Se transfirieron asépticamente los siguientes materiales al BSC, según fuera necesario, y se etiquetaron de acuerdo con la Tabla 3 más adelante.
TABLA 3. Materiales para el aislamiento de tumores.
3.2. Se etiquetaron los círculos de las placas de Fragmentos de Tumores con las letras A-J.
3.3. Se etiquetó la parte inferior de los pocillos de las placas de tejidos favorables con las letras A - J.
3.4. Se transfirieron 5 ml de gentamicina al matraz de HBSS. Se etiquetó como TIWB.
3.5. Se arremolinó para mezclar.
3.6. Se pipetearon 50 mL TIWB a cada uno de los siguientes:
1. Placa de lavado 1
2. Placa de lavado 2
3. Placa de lavado 3
4. Placa de lavado 4
3.7. Se pipetearon 2 ml de TIWB a los pocillos A-J de la placa de tejido favorable.
3.8. Se cubrieron las placas de tejidos favorables (parte inferior de la placa de<6>pocillos) con la placa de fragmentos tumorales correspondiente (tapa de la placa de<6>pocillos).
3.9. Con unas pinzas largas, se extrajo el tumor o los tumores del matraz de muestras y se transfirieron a la placa de lavado<1>.
3.10. Se incubó el tumor a temperatura ambiente en la placa de lavado 1 durante 3 minutos.
3.11. Durante la incubación, se volvió a etiquetar el matraz de muestras como "Carga biológica" y se almacéno a 2-8°C hasta que se envío al control de calidad para su análisis.
3.12. Se desecharon las pinzas largas y se utilizaron pinzas cortas para manipulaciones posteriores.
3.13. Con unas pinzas se transfirió el tumor a la placa de lavado 2.
3.14. Se incubó el tumor a temperatura ambiente en la placa de lavado 2 durante 3 minutos.
3.15. Con unas pinzas se transfirió el tumor a la placa de lavado 3.
3.16. Se incubó el tumor a temperatura ambiente en la placa de lavado 3 durante 3 minutos.
3.17. Se retiraron las placas de fragmentos tumorales (tapas de placa de<6>pocillos) de las placas de tejidos favorables (fondos de placa de<6>pocillos) y se colocaron las placas de fragmentos tumorales boca abajo sobre la superficie de la BSC.
3.18. Con una pipeta de transferencia, se agregaron alrededor de 4 gotas individuales espaciadas uniformemente de TIWB a cada círculo de las placas de fragmentos tumorales.
3.19. Se colocó una regla debajo de la placa de disección.
3.20. Con unas pinzas se transfirió el tumor a la placa de disección.
3.21. Usando la regla debajo de la placa de disección, se midió y se registró la longitud del tumor.
3.22. Para los tumores de más de 1 cm se hicieron placas de tejido favorable adicionales.
3.23. Se realizó una disección inicial de las piezas tumorales en la placa de disección en 10 piezas intermedias y se tuvo cuidado de conservar la estructura tumoral de cada pieza intermedia.
3.24. Se transfirieron las piezas de tumor intermedias que no se diseccionaron activamente en fragmentos a la placa de lavado 4 para garantizar que el tejido permaneciera hidratado durante todo el procedimiento de disección.
3.25. Trabajando con una pieza de tumor intermedia a la vez, se cortó cuidadosamente el tumor en fragmentos de hasta 3x3x3 mm en la placa de disección, usando la regla debajo de la placa como referencia. Cuando el bisturí se desafiló, se reemplazó por un bisturí nuevo.
3.26. Se continuó diseccionando fragmentos de la pieza de tumor intermedia hasta que se evaluó todo el tejido de la pieza intermedia.
3.27. Se seleccionaron los fragmentos favorables y usando una pipeta de transferencia se transfirieron hasta 4 fragmentos favorables a las gotas de TIWB en un círculo en la placa de Fragmentos de Tumores.
3.28. Con una pipeta de transferencia, se transfirieron los fragmentos favorables restantes de la pieza tumoral, cuando estuvieron disponibles, al pocillo correspondiente en la placa de tejido favorable.
3.29. Con una pipeta de transferencia, se transfirieron la mayor cantidad posible del tejido desfavorable y el producto de desecho a la placa de tejido desfavorable para limpiar la placa de disección. El tejido desfavorable se indicó mediante tejido adiposo amarillo o tejido necrótico.
3.30. Se continuó el tratamiento repitiendo la etapa 7.3.25-7.3.30 para las piezas tumorales intermedias restantes, trabajando una pieza intermedia a la vez hasta que se hubo tratado todo el tumor.
3.31. Si estaban disponibles menos de 4 fragmentos tumorales en el círculo correspondiente de la placa de fragmentos tumorales, era aceptable usar fragmentos de un pocillo no correspondiente de la placa de tejido favorable como disponibles para lograr el objetivo de 40 fragmentos. Cuando fueron menos de 40 fragmentos, se colocaron 10-40 en un matraz G-Rex 100M individual.
4. Matraz de siembra G-Rex 100M
4.1. Se transfirieron asépticamente los siguientes materiales al BSC, según fuera necesario, y se etiquetaron de acuerdo con la Tabla 4 más adelante.
TABLA 4. Materiales adicionales para matraces de siembra.
4.2. Se suplementó cada litro de CM1 con 1 ml de solución madre de IL-2<( 6>x 10<6>Ul/ml).
4.3. Se colocaron 1000 ml de CM1 precalentado que contenía 6000 UI/ml de IL-2 en cada biorreactor G-REX 100M necesario según lo determinado en la Tabla 5 más adelante.
4.4. Con una pipeta de transferencia, se transfirió el número apropiado de fragmentos de tumor a cada matraz G-Rex 100M, distribuyendo los fragmentos según la Tabla 5.
4.5. Cuando uno o más fragmentos de tumor se transfirieron al flote en el matraz G-Rex 100M, se obtuvo un fragmento de tumor adicional, si estaba disponible, en la placa de tejido favorable y se transfirió al matraz G-Rex 100M.
4.6. Se registró el número total de fragmentos agregados a cada matraz.
4.7. Se desechó la placa de tejido desfavorable.
4.8. Se colocó cada biorreactor G-REX 100M en una incubadora de CO<2>al 5% a 37°C.
4.9. Cuando hubo más de 40 fragmentos disponibles:
4.9.1. Cuando se obtuvieron > 41 fragmentos, se colocaron 1000 ml de CM1 completo precalentado en un segundo biorreactor G-REX 100M.
TABLA 5. Número de biorreactores G-REX necesarios.
5. Preparación avanzada: día 11 (preparada con hasta 24 horas de anticipación)
5.1. Se prepararon<6>L de CM2 con GlutaMax. Se utilizaron procedimientos de laboratorio de referencia para "Preparación de medios para PreREP y REP" para instrucciones de CM2". Se calentó a 37°C 1 hora antes de su uso.
5.2. Alícuotas de IL-2 descongeladas: se retiraron las alícuotas de IL-2 del congelador y se colocaron a 4°C.
<6>. Recolección de TIL (día 11)
6.1. Se retiraron con cuidado los matraces G-REX -100M de la incubadora y se colocaron en BSC2. Se tuvo cuidado de no perturbar las células del fondo del matraz.
6.2. Utilizando GatherRex o una bomba peristáltica, se aspiró ~900 ml de sobrenadante de cultivo celular del (los) matraz(ces).
6.3. Los TIL se resuspendieron agitando suavemente el matraz. Se observó que todas las células se habían liberado de la membrana.
6.4. Usando una bomba peristáltica o GatherRex se transfirió la suspensión de células residuales a un paquete de transferencia de sangre del tamaño adecuado (300-1000 ml). Se tuvo cuidado de no permitir que los fragmentos se transfirieran al paquete de transferencia de sangre.
6.5. Se agarró el paquete de transferencia con un conjunto de transferencia de plasma de 4" (se aseguró de que la abrazadera estuviera cerrada).
<6>.<6>. Se masajeó el paquete para asegurarse de que la suspensión de células se hubiera mezclado bien y, con una jeringa de 3 ml, se eliminó 1 ml de suspensión de TIL para el recuento de células. Se sujetó el tubo y se volvió a tapar el conector luer hembra con una nueva tapa luer estéril.
6.7. Se colocó el paquete de transferencia en una bolsa de plástico con cierre de cremallera y se volvió a colocarlo en la incubadora hasta estar listo para usar.
7. Preparación de los medios
7.1. Se dejó que el medio se calentara a 37°C durante > 1 hora.
7.2. Se agregaron 3 ml de solución madre de rhIL-26x10<6>UI/ml a<6>L de CM2 para alcanzar una concentración final de 3000 UI/ml de rhIL-2. Se etiqutó como "CM2 completo".
7.3. Se unió estéril un equipo de transferencia de plasma de 4" con luer hembra a un paquete de transferencia de 1L.
7.4. Se transfirieron 500 ml de CM2 completo a un paquete de transferencia de 1 L. Se separó el equipo de transferencia de fluido o la jeringa y se conectó un tapón luer estéril al puerto luer hembra.
7.5. Se agarró el paquete con un acoplador de sitio de muestra.
7.6. Usando una jeringa de 1.0 ml con aguja, se extrajo 150 pL de 1 mg/ml de anti-CD3 (clon OKT3) y se transfirió a 500 ml de "CM2 completa" a través del acoplador del sitio de la muestra. Se retiró la jeringa para asegurarse de que todo el reactivo se hubiera eliminado de la línea. Se almacenó a 37°C hasta su uso.
<8>. Preparación del matraz
8.1. Se transfirieron 4.5L de "CM2 completo" a un matraz G-REX -500M usando las graduaciones en el matraz como referencia.
8.2. Se colocó el matraz en una incubadora a 37°C hasta estar listo.
9. Descongelar alimentadores irradiados
9.1. Se utilizaron 5,0 x 10<9>alimentadores irradiados alogénicos de dos o más donantes para su uso.
9.2. Se retiraron los alimentadores del congelador LN2 y se colocaron en una bolsa de transporte de riesgo biológico.
9.3. Con las bolsas de alimentación en la bolsa de transporte de riesgo biológico, los alimentadores se descongelaron en una incubadora a 37°C o en un baño de cuentas. Las bolsas se mantuvieron estáticas y sumergidas. Se retiraron los alimentadores del baño cuando estaban casi completamente descongelados, pero aún estaban fríos.
9.4. Se rociaron o se limpiaron las bolsas de alimentación con EtOH al 70% y se colocaron en BSC2. Se agregó cada bolsa de alimentación directamente al G-Rex 500M abierto para asegurar un número suficiente de células irradiadas (5x10<9>células, /- 20%).
9.5. Ambas abrazaderas se cerraron en un conector tipo Y fenwal con cierre luer macho.
9.6. Cada bolsa de alimentación se agarró con una pata del conector en Y.
9.7. Se retiró el paquete de transferencia de 1 l con 500 ml de "CM2 completo" OKT3 y se transfirió a BSC.
9.8. Se conectó asépticamente una jeringa de 60 ml a una llave de paso de 3 vías y se conectó asépticamente el paquete de transferencia al extremo macho de la llave de paso.
9.9. Se acopló asépticamente el conector en Y a la llave de paso de 3 vías.
9.10. Se extrajo todo el contenido de las bolsas de alimentación a la jeringa, se registró el volumen y se despacharon 5.0 x 10<9>alimentadores irradiados alogénicos al paquete de transferencia.
9.11. Se sujetó y se separó el paquete de transferencia del aparato y se conectó el cierre luer hembra con un nuevo tapón luer estéril.
9.12. Usando una jeringa de aguja y 3 mL se extrajo 1 mL para el recuento de células del acoplador del sitio de la muestra.
9.13. Se procedió cuando se alcanzó /-10% del número de células diana (5.0 x 109) con > 70% de viabilidad.
9.14. Cuando se alcanzó menos del 90% del número de células diana (5.0 * 109) con > 70% de viabilidad, se descongeló otra bolsa y se repitió 7.9.4-7.9.12. Cuando se alcanzó más de 110% del número de células diana, se calculó el volumen adecuado requerido para la dosis de células deseada y se procedió.
10. Cocultivar TIL y alimentadores en matraz G-REX 500M
10.1. Se retiró el matraz G-REX 500M que contenía el medio preparado de la incubadora y se colocó en la BSC2.
10.2. Se adjuntó el paquete de transferencia del alimentador al G-REX -500M y se permitió que el contenido de la bolsa drenara en el 500M.
10.3. Se retiró la suspensión de TIL de la incubadora y se colocó en la BSC.
10.4. Se calculó el volumen de suspensión de TIL a agregar para conseguir 200 x 10<6>células viables totales.(TVC/mL) /200 x 106=mL
10.5. Cuando los TIL estuvieron entre 5-200 x 10<6>células viables totales, se añadieron todos los TIL (volumen total) al G-REX -500M. Cuando el recuento de TIL fue superior a 200 x 10<6>células viables totales, se añadió el volumen calculado necesario para que 200 x 10<6>TIL se distribuyeran a un G-REX -500M individual. Los TIL restantes se centrifugaron y congelaron en al menos dos crioviales hasta 108/ml en CS10, se etiquetaron con la identificación de los TIL y la fecha de congelación.
10.6. Se colocó el G-REX -500M en una incubadora de CO<2>al 5% a 37°C durante 5 días.
11. Preparación avanzada: día 16-18
11.1. Se calentó 1 bolsa de 10 L de AIM V para cultivos iniciados con menos de 50 * 10<6>TIL calentado 2 para aquellos iniciados con más de 50 * 10<6>TIL a 37°C al menos 1 hora o hasta que estén listos para usar.
12. Realizar el recuento de células TIL: días 16-18
12.1. Se retiró el matraz G-REX -500M de la incubadora y se colocó en BSC2. Se tuvo cuidado de no alterar el cultivo celular en el fondo del matraz.
12.2. Se retiraron asépticamente 4 L de medio de cultivo celular del matraz G-REX -500M y se colocaron en un recipiente estéril.
12.3. Se hizo girar el G-REX -500M hasta que todo el TIL se hubiera resuspendido de la membrana.
12.4. Ussando GatherRex o una bomba peristáltica se transfirió la suspensión de células a un paquete de transferencia de 2 litros. Se conservó el matraz de 500M para su uso posterior. Se selló el puerto con el acoplador del sitio de muestreo para evitar la pérdida de TIL.
12.5. Se agarró el paquete de transferencia con un acoplador para el lugar de la muestra y, utilizando una jeringa de 3 ml y una aguja, se extrajeron 2 muestras independientes de 1 ml para realizar un recuento de células.
12.6. Se calculó el número total de matraces necesarios para el subcultivo de acuerdo con la siguiente fórmula. Fracciones redondeadas hacia arriba.
Células viables totales/1.0 x10<9>= matraz #
13. Preparar CM4
13.1. Se preparó una bolsa de 10L de AIM-V por cada dos matraces de 500M necesarios. Medios adicionales calentados según sea necesario.
13.2. Por cada 10 L de AIM-V necesarios, se agregaron 100 mL de GlutaMAX para hacer CM4.
13.3. Medio CM4 suplementado con rhIL-2 para una concentración final de 3.000 UI/ml de rhIL-2.
14. Dividir el cultivo celular
14.1. Usando las graduaciones en el matraz, se llenó a gravedad cada G-REX -500M a 5 L.
14.2. Se distribuyó uniformemente el volumen TIL entre el número calculado de G-REX -500Ms.
14.3. Se colocaron los matraces en una incubadora de CO<2>al 5% a 37°C hasta la recolección el día 22 de REP.
15. Preparación avanzada: día 22-24
15.1. Se prepararon 2 l de regulador de pH de lavado de HSA al 1% agregando 40 ml de HSA al 25% a cada una de las dos bolsas de 1 l de PlasmaLyte A 7.4. Se agruparon en una bolsa auxiliar LOVO.
15.2. Se suplementaron 200 ml CS10 con IL-2 a 600 Ul/ml.
15.3. Se nfriaron previamente cuatro botes de aluminio para congelador de 750 ml a 4°C.
16. Recolectar TIL: Día 22-24
16.1. Se retiraron los matraces G-REX -500M de la incubadora a 37°C y se colocaron en la BSC2. Se tuvo cuidado de no alterar el cultivo celular en el fondo del matraz.
16.2. Se aspiraron y descartaron 4.5 L de sobrenadante de cultivo celular de cada matraz.
16.3. Se giró el matraz G-REX -500M para resuspender completamente los TIL.
16.4. Se pesó la bolsa de bioprocedimientos de 3-5 L antes de su uso.
16.5. Usando GatherRex o una bomba peristáltica, se recolectó TIL en la bolsa de bioprocedimientos.
16.6. Se mezcó bien la bolsa y con una jeringa de 3 ml se tomaron 2 muestras de 2 ml del puerto de muestra de la jeringa para el recuento de células.
16.7. Se pesó la bolsa y se encontró la diferencia entre el peso inicial y final. Se usó el siguiente cálculo para determinar el volumen de suspensión celular.
Peso neto de la suspensión celular (mL) /1.03 = volumen (mL)
17. Filtrar TIL y preparar la bolsa de fuente LOVO
17.1. Se colocó la bolsa que contiene el cultivo celular en la BSC2.
17.2. Se colocó un filtro de sangre de 170 pm en la BSC2 y se cerraron todas las abrazaderas.
17.3. Se unió estéril una extremidad fuente del filtro a la suspensión celular.
17.4. Se pesó una nueva bolsa de bioprocedimientos de tamaño apropiado (a esto se le denominó bolsa fuente LOVO).
17.5. Se unió estéril el extremo terminal del filtro a la bolsa de fuente LOVO.
17.6. Se elevó la suspensión celular colgando las células en un portasueros IV para establecer una transferencia de células por flujo de gravedad.
Nota: (No se permitió que la bolsa de la fuente cuelgue del aparato de filtración).
17.7. Se abrieron todas las abrazaderas necesarias y se permitió que los TIL drenaran de la bolsa de suspensión celular a través del filtro y a la bolsa fuente LOVO.
17.8. Una vez que todas las células se transfirieron a la bolsa de la fuente de LOVO, se cerraron todas las abrazaderas y se selló el tubo de la bolsa de la fuente de LOVO para quitar el filtro.
17.9. Se pesó la bolsa de origen LOVO y se calculó el volumen.
17.10. La bolsa de origen LOVO estaba lista para LOVO.
17.11. Se retiró la bolsa de producto final LOVO del kit desechable sellando el tubo cerca de la bolsa.
18. Formular TIL 1:1 en CS10 frío suplementado con 600 UI/ml de rhIL-2
18.1. Se calculó el número requerido de bolsas criogénicas necesarias.
(volumen de producto celular x<2 ) / 1 0 0>= número de bolsas requeridas (redondeo hacia abajo)
18.2. Se calculó el volumen a despachar en cada bolsa.
(volumen de producto celular x<2>)/número de bolsas requeridas=volumen para agregar a cada bolsa 18.3. Se transfirieron asépticamente los siguientes materiales de la Tabla<6>al BSC.
TABLA<6>. Materiales para la crioconservación de TIL.
Item Cantidad mínima Etiqueta en desarrollo
19. Formulación de TIL
19.1. Se cerraron todas las abrazaderas en conexión celular CC1.
19.2. Al dispositivo de conexión celular se adjunta asépticamente el producto final LOVO, el cierre luer de la bolsa CS10 y el número apropiado de bolsas criogénicas. Se reemplazó la jeringa de 60 ml con una jeringa de<1 0 0>ml.
19.3. La cantidad de volumen de CS10 necesaria era equivalente al volumen de la bolsa de producto final LOVO.
19.4. Se abrió la ruta de la llave de paso y se desenganchó la línea entre la bolsa de producto final LOVO y la jeringa para tirar de CS10 a la jeringa, volvió a sujetar la vía de CS10. Se abrió la vía hacia la bolsa de la célula para empujar CS10 dentro de la bolsa de producto final LOVO. Se usó la jeringa para medir el volumen agregado a la bolsa de producto final LOVO. Se repitió según fue necesario con una jeringa nueva hasta que se transfirió la cantidad deseada de CS10.
19.5. Se mezcló bolsa de producto final LOVO por inversión.
19.6. Se reemplazó la jeringa de 100 ml
19.7. Una a la vez se abrieron las abrazaderas en bolsas criogénicas de 750 ml
19.8. Solo se abrieron las abrazaderas que están directamente asociadas con el producto formulado y la bolsa criogénica en uso.
19.9. Se usó la jeringa de 100 ml para medir el volumen de producto formulado que conduce a la bolsa criogénica.
19.10. Se transfirieron 100 ml de producto formulado a cada bolsa criogénica.
19.11. Después de la adición a cada bolsa, se retiró la jeringa para eliminar todas las burbujas de aire de las bolsas criogénicas y se volvió a sujetar la línea asociada.
19.12. En la última bolsa, se retiró un retenedor de 10 ml para la prueba de CC.
19.13. Se selló cada bolsa criogénica, dejando la menor cantidad de tubos posible.
19.14. Se retiró la jeringa que contenía la muestra retenida y se transfirió a un tubo cónico de 50 ml; se transfirieron 1,5 ml a crioviales individuales y se congeló en un congelador de velocidad controlada.
19.15. Se transfirieron las bolsas selladas a 4°C mientras se preparaban las etiquetas.
19.16. Se etiquetó cada bolsa criogénica con la descripción del producto, el nombre y la fecha, el volumen, el recuento de células y la viabilidad.
19.17. Se colocó cada bolsa criogénica en botes preenfriados de aluminio para congelador.
20. Crioconservación de TIL usando congelador de velocidad controlada (CRF)
20.1. Se siguió el procedimiento estándar para el congelador de velocidad controlada.
20.2. Después de usar el CRF, se almacenaron las bolsas criogénicas en nitrógeno líquido (LN<2>).
21. Resultados esperados determinados y criterios de aceptación de la medida.
EJEMPLO 2:PROCEDIMIENTO EJECUTADO EN<8>TUMORES DE PACIENTE
El procedimiento del Ejemplo 1 se ejecutó usando<8>tumores de pacientes para producir<8>lotes de TIL. Se obtuvo una buena recuperación del cultivo, viabilidad, recuentos celulares, liberación de CD3+ (que indica el % de contenido de células T) e IFN-gamma (IFN-g o IFN-y), como se muestra en la Tabla 7 más adelante y en la Figura 7 a la Figura 10.
TABLA 7. Resultados de las pruebas de identidad, potencia y viabilidad/recuperación del procedimiento del ejemplo<1>.
EJEMPLO 3:ESCALABILIDAD DEL PROCEDIMIENTO TIL MODIFICADO
Los estudios presentados aquí se realizaron en un laboratorio de desarrollo de procedimientos (PD) y, posteriormente, se realizó un estudio de calificación de procedimientos (PQ) utilizando ejecuciones de ingeniería en la suite de sala limpia de GMP en una instalación de fabricación. Se completaron tres ejecuciones de PQ/ingeniería en la sala limpia de la instalación de GMP de acuerdo con un protocolo de calificación y un registro de lote basado en los estudios de DP presentados aquí. Los criterios de aceptación para las ejecuciones de ingeniería se establecieron de manera prospectiva. El estudio PQ se resume con más detalle más adelante, y los resultados de las pruebas obtenidos para los lotes de ingeniería se proporcionan en las siguientes secciones.
El número de células generadas a partir de cultivos del protocolo de expansión rápida previa (pre-REP) a menudo excedía de 100 x 10<6>células viables. Además, la inclusión de un ciclo de congelación-descongelación entre las etapas de cultivo Pre-REP y REP redujo el rendimiento de células viables. Al eliminar la etapa de crioconservación en desarrollo, el REP podría iniciarse de manera confiable y regular con un mayor número de TIL. Este cambio permitió que la duración del REP se redujera en una cantidad proporcional de tiempos de duplicación celular a alrededor de 11 días sin afectar la dosis celular. Además, el tiempo de cultivo reducido desde la activación hasta la recolección da como resultado un producto menos diferenciado y potencialmente más capaz de persistir in vivo (Tran 2008).
El estudio de PD validó el inicio del cultivo de REP con hasta 200 x 10<6>células con un número fijo de células alimentadoras. Más adelante, se evaluó el momento óptimo para recolectar el cultivo REP durante 9 a 14 días. Los cultivos se sembraron en relaciones de alimentador a TIL en el intervalo de 100:1 a 25:1. La optimización del tiempo de recolección se determinó midiendo el recuento celular total, la viabilidad, el inmunofenotipo, el consumo de medios, el análisis de metabolitos, el análisis de interleucina-2 (IL-2) y los análisis funcionales que se describen más adelante.
Se evaluó la inmunofenotipificación de células al final del cultivo de REP sobre la base de los marcadores enumerados en la Tabla<8>más adelante. Se evaluó el estado de activación y diferenciación fenotípica de las células. No se observaron diferencias estadísticas en el fenotipo entre ninguna de las condiciones experimentales.
TABLA<8>. Marcadores de activación y diferenciación ensayados en cultivos de optimización de procedimientos.
Diana Etiqueta para detección Clon
Panel 1
TCRab(i.e .,TCRa/p) PE/Cy7 IP26
CD57 PerCP-Cy5.5 HNK-1
CD28 PE CD28.2
CD4 FITC OKT4
CD27 APC-H7 M-T271
CD56 APC N901
CD<8>a PB RPA-T<8>Panel 2
CD45RA PE/Cy7 HI100
CD3 PerCP/Cy5.5 SP34-2 CCR7 PE 150503
CD<8>FITC HIT<8>
CD4 APC/Cy7 OKT4
CD38 APC HB-7
HLA-DR PB L243
Panel 3
CD137 PE/Cy7 4B4-1
CD3 PerCP/Cy5.5 SP34-2
Lag3 PE 3DS223H
CD<8>FITC HIT<8>
CD4 APCCy7 OKT4
PD1 APC EH12.2H7
Tim-3 BV421 F38-2E2 Abreviaturas: PE/Cy7= ficoeritrina: Cy-7 conjugado en tándem; PerCP-Cy5.5= peridinina-clorofila-proteína Complejo: CY5.5 Conjugado; PE= ficoeritrina;
FITC= conjugado fluoresceína isotiocianato; APC-H7= aloficocianina: H7 conjugado en tándem; APC= aloficocianina; PB=Pacific Blue™
El consumo de medios y la producción de metabolitos se mantuvieron dentro de los límites tolerables para todas las condiciones analizadas; y los niveles de IL-2 permanecieron por encima de 150 Ul/ml de sobrenadante de cultivo (datos no mostrados).
Se entiende que la destrucción de las células tumorales por las células T está mediada por la activación del receptor de las células T en la célula T efectora en respuesta a los péptidos presentados en la superficie de las células tumorales. Las células T expandidas ex vivo deben conservar la capacidad de activarse y proliferar en respuesta a la activación de TCR si han de persistir in vivo tras la infusión y mediar la regresión del tumor.
Para evaluar el potencial de activación de las células cultivadas, los TIL recolectados en diferentes puntos de tiempo se reactivaron con PBMC alogénicas irradiadas cargadas con OKT3. Los cultivos de TIL se recogieron después de 7 días y se ensayaron para determinar la expansión múltiple. Los resultados de este estudio se resumen en la TABLA 9.
TABLA 9. Resumen de resultados: Proliferación de post-REP TIL tras re-cultivo con PBMC alogénicas cargadas con OKT3.
Día de recolección Expansión múltiple SD Valor p (prueba 't' de Student)
Experimento 1
Día 9 43 6.088 NA
Día 10 48 3.105 NA
Día 11 71 11.137 0.135
Día 14 60 6.995
Experimento 2
Día 9 44 6.276 NA
Día 10 27 4.762 NA
Día 11 72 18.795 0.045
Día 14 41 7.050
Experimento 3
Día 9 54 5.810 NA
Día 10 54 9.468 NA
Día 11 65 1.674 0.071
Día 14 50 8.541
Este estudio demostró que el potencial de activación de TIL en este ensayo aumentó con cada día de cultivo hasta el día 11 (días de recolección 9-11). Las células recolectadas el día 11 del procedimiento modificado se realizaron de manera similar al control TIL mantenido en cultivo durante 14 días similar al procedimiento actual.
Estos estudios demostraron la escalabilidad del procedimiento de TIL modificado y establecieron un intervalo aceptable de relaciones de siembra de TIL a células alimentadoras. Además, se encontró que las características de crecimiento persistían hasta el día 14 de cultivo, mientras que las condiciones de cultivo permanecieron óptimas hasta el día 11. Las condiciones ensayadas no mostraron ningún efecto medible sobre el fenotipo TIL. Las células recolectadas en el día 11 del cultivo REP demostraron la mejor capacidad para responder a la reactivación mientras las condiciones del cultivo celular permanecieron dentro de las tolerancias. Estos cambios se adoptaron y validaron a escala completa con la división del cultivo que se produjo el día 5 y la recolección el día<1 1>.
Se pusieron en práctica ejecuciones de ingeniería en la instalación de desarrollo de procedimientos con el fin de ganar experiencia en la fabricación y prueba del producto TIL antes de la fabricación con GMP del producto TIL autólogo para su administración a pacientes. El procedimiento de fabricación utilizado para las ejecuciones de ingeniería fue a la misma escala que el que se utilizará en la fabricación del producto TIL con GMP. La experiencia en el cultivo de TIL de diversos tipos de tumores, incluidas metástasis de melanoma, carcinoma de células escamosas de mama, cabeza y cuello (HNSCC), carcinoma de cuello uterino y cáncer de pulmón ha determinado que la disección y el crecimiento de TIL de muestras de tumores metastásicos es similar para estos cánceres. (Sethuraman 2016, JITC P42). Debido a que el aislamiento inicial de fragmentos tumorales y el crecimiento de linfocitos parece ser similar entre las histologías tumorales, estas ejecuciones de ingeniería son suficientes para calificar el procedimiento para la producción de TIL a partir de HNSCC, tumores cervicales y melanoma.
La Tabla 10 muestra la fuente y las características de las muestras tumorales utilizadas para las ejecuciones de ingeniería.
TABLA 10. Muestras de tumores analizadas para ejecuciones de ingeniería.
Se completaron las pruebas de liberación de las tres ejecuciones de ingeniería de TIL en la instalación de desarrollo de procedimientos (Tabla 11) como se describe más adelante. El producto se probó el día 16 y el día 22. También se determinó la secreción de IFN-<y>para las tres ejecuciones de ingeniería (Tabla 12) como se detalla en otra parte.
TABLA 11. Resultados de las pruebas de liberación de productos para ejecuciones de ingeniería en la instalación de desarrollo de procedimientos.
TABLA 12. Caracterización funcional adicional: medición de la secreción de IFN-y.
En conclusión, los datos de las ejecuciones de ingeniería demuestran que el producto farmacéutico de TIL puede fabricarse con el propósito de la administración autóloga a pacientes.
EJEMPLO 4:LINFODEPLECIÓN
Los recuentos de células se pueden tomar el día 7 y antes de la linfodepleción. El producto celular final incluía hasta alrededor de 150 * 10<9>células viables formuladas en un mínimo de 50% de HypoThermosol™ en Plasma-Lyte A™ (volumen/volumen) y hasta un 0.5% de HSA (compatible para infusión humana) que contenía 300 Ul/ml de IL2. El producto final estaba disponible para la administración en uno de dos volúmenes para infusión: 1) 250 ml (en una bolsa de infusión de 300 ml de capacidad) cuando el total de TIL recolectado es < 75 * 10<9>O
2) 500 ml (en una bolsa de infusión de 600 ml de capacidad) cuando el total de TIL recolectado es <150 * 10<9>No se puede predecir el número total de células que podrían generarse para el producto de infusión de TIL final para cada paciente debido a la variación de paciente a paciente en las tasas de expansión de células T durante la etapa de REP. Se establece un límite inferior de células en los días 3, 4, 5,<6>, 7 del REP de 3 a 14 días en función del número mínimo de células necesarias para tomar la decisión de practicar una linfodepleción en el paciente usando el régimen de quimioterapia con ciclofosfamida más fludarabina. Una vez que hemos comenzado la linfodepleción en función de este número mínimo de células alcanzado, nos comprometemos a tratar al paciente con el número disponible de TIL que generamos en el REP en cualquiera de los días 3 a 14, y en muchos casos el día 7. El límite superior del intervalo para la infusión (150 * 10<9>células viables) se basa en el límite superior conocido, publicado, infundido de forma segura cuando se ha alcanzado una respuesta clínica. Radvanyi, et al., Clin Cancer Res 2012, 18, 6758-6770.
EJEMPLO 5:PROCEDIMIENTO 2A - DÍA 0
Este ejemplo describe el protocolo detallado del día 0 para el procedimiento 2A descrito en los Ejemplos 1 a 4. Preparación.
1. El medio de lavado de tumores confirmado, CM1 e IL-2 están dentro de la fecha de vencimiento.
2. Se colocó CM1 (medio celular 1) en la incubadora.
Procedimiento.
1. Se limpió la cabina de seguridad biológica (BSC).
2. Se colocaron placas de vigilancia en desarrollo y se dejaton en la cabina de bioseguridad durante 1-2 horas durante el procedimiento.
3. Se colocó el medio TIL CM en la cabina de seguridad biológica.
4. Se preparó el medio de TIL CM1 que contiene 6000 UI/ml de IL-2:
4.1. 1L CM1
4.2. 1 ml de IL-2 (6,000,000 UI/ml)
4.3. Se colocaron 25 ml de CM1 IL2 en cono de 50 ml para usarlos en los fragmentos al agregarlos a G-REX.
4.4. Se colocaron en una incubadora a 37°C para precalentar
5. Se limpió el paquete G-REX 100MCS con alcohol al 70% y se colocó en una cabina de bioseguridad. Se cerraron todas las abrazaderas excepto la línea de filtro.
<6>. Se realizó la calibración de la bomba Acacia.
7. Se conectó la línea roja del matraz G-REX 100MCS a la línea de salida de la campana de la bomba de acacia.
<8>. Se colocó el pumpmatic en la línea de entrada de la campana de la bomba y lo colocó en la botella con el medio. Se liberaon las abrazaderas para la campana de la bomba.
9. Se bombearon los 975 ml restantes de CM1 precalentado que contenían 6,000 UI/ml de IL-2 en cada biorreactor G-REX 100MCS.
10. Se calentó la línea roja del sello, se desconectó de la campana de la bomba.
11. Se colocó la etiqueta en G-REX.
12. Se colocó G-REX 100MCS en la incubadora hasta que sea necesario.
Disección de tejido
1. Se registró la hora de inicio del tratamiento del tumor.
2. Se transfirió medio de lavado tumoral a BSC.
3. Se colocaron 5 placas de Petri de 100 mm en la cabina de bioseguridad, 3 para lavados, 1 para retención y 1 para tejido desfavorable. Las placas se etiquetearon de manera correspondiente. El tejido desfavorable se indicó por tejido adiposo amarillo o tejido necrótico.
4. Se colocaron las tres placas de<6>pocillos en una cabina de bioseguridad.
5. Se pipetearon 3-5 ml de medio de lavado tumoral en cada pocillo de una placa de seis pocillos para detectar el exceso de piezas tumorales.
<6>. Se pipetearon 50 ml de medio de lavado tumoral para lavar las placas 1-3 y la placa de retención.
7. Se colocaron dos placas de disección de 150 mm en una cabina de bioseguridad.
<8>. Se colocaron 3 tubos cónicos estériles de 50 ml en la BSC.
9. Se etiquetó uno como medio de lavado de tumores con pinzas, el segundo como medio de lavado de tumores de bisturí y el tercero como medio de lavado de tumores usado para gotas de tapa.
10. Se agregaron de 5 a 20 ml de medio de lavado de tumores a cada cono. Las pinzas y los bisturís se sumergieron en el medio de lavado del tumor según fue necesario durante el lavado y procedimiento de disección del tumor.
11. Se colocaron el bisturí y las pinzas en tubos apropiados.
12. Con unas pinzas largas, se extrajeron los tumores del matraz de muestras y se transfirieron a la placa de Lavado 1.
13. Se incubó el tumor a temperatura ambiente en la placa de Lavado 1 durante > 3 minutos.
14. Durante la incubación, se volvió a etiquetar el matraz de muestras como "Carga biológica" y se le almacenó a 2-8°C hasta la recolección final o se requieran más pruebas de esterilidad.
15. Utilizando unas pinzas, se transfirió el tumor a la placa de lavado 2.
16. Se incubó el tumor al ambiente en la placa de lavado 2 durante >3 minutos.
17. Durante la incubación, usando una pipeta de transferencia, se agregaron alrededor de 4 gotas individuales espaciadas uniformemente de medio de lavado tumoral a cada círculo de las tapas de las placas de<6>pocillos designadas como placas de fragmentos tumorales.
18. Utilizando unas pinzas, se transfirió el tumor a la placa de lavado 3.
19. Se incubó el tumor al ambiente en la placa de lavado 3 durante >3 minutos.
20. La tapa de la placa de 150 mm se utilizó para la disección. Se colocó una regla debajo.
21. Con unas pinzas se transfirió el tumor a la placa de disección, se midió y se registró la longitud del tumor.
22. Se tomó una fotografía del tumor.
23. Se realizó una disección inicial de las piezas tumorales en la placa de Disección en piezas intermedias cuidando de conservar la estructura tumoral de cada pieza intermedia.
24. Se transfirieron las piezas de tumor intermedias que no se diseccionaban activamente en fragmentos a la placa de retención de tejido para garantizar que el tejido permaneciera hidratado durante todo el procedimiento de disección.
25. Se trabajó con una pieza de tumor intermedia a la vez, se cortó cuidadosamente el tumor en fragmentos de alrededor de 3*3*3 mm en la placa de disección, usando la regla debajo de la placa como referencia 26. Se continuó diseccionando fragmentos de la pieza de tumor intermedia hasta que se evaluó todo el tejido de la pieza intermedia.
27. Se seleccionaron fragmentos favorables y usando una pipeta de transferencia se transfirieron hasta 4 fragmentos favorables en las gotas del medio de lavado en un círculo en la placa de Fragmentos tumorales. Con una pipeta de transferencia, bisturí o pinzas, se transfirió la mayor cantidad posible del tejido desfavorable y el producto de desecho a la placa de tejido desfavorable para limpiar la placa de disección. Todo el tejido restante se colocó en uno de los pocillos de la placa de seis pocillos. (El tejido desfavorable se indicó por tejido adiposo amarillo o tejido necrótico).
28. Se continuó el tratamiento repitiendo las etapas 23-26 para las piezas intermedias restantes del tumor, trabajando una pieza intermedia a la vez hasta que se hubo tratado todo el tumor. (Se obtuvieron un bisturí nuevo o unas pinzas según era necesario, por decisión del técnico de tratamiento).
29. Las placas de fragmentos se movieron hacia la parte trasera del extractor.
30. Con una pipeta de transferencia, el bisturí o las pinzas, se transfirieron hasta 50 de los mejores fragmentos tumorales a los fragmentos tumorales etiquetados con tubo cónico de 50 ml que contenían el CM1.
31. Se retiraron los flotadores del cono de 50 ml con una pipeta de transferencia. Se registró el número de fragmentos y flotadores.
32. Se retiraron todos los elementos innecesarios del extractor, conservando las placas de tejido favorables si contenían fragmentos adicionales. El extractor se limpió con una toallita con alcohol.
33. Se sacó el G-REX 100MCS de la incubadora, se limpió con alcohol al 70% y se colocó en una cabina de bioseguridad.
34. La forma cónica se agitó con fragmentos de tumor y se vertió el contenido del cono de 50 ml en el matraz G-Rex 100MCS
35. Si uno o más fragmentos tumorales se transfirieron al matraz G-Rex 100M flotador, se obtuvo un fragmento tumoral adicional cuando estuvo disponible en la placa de tejido favorable y se transfirió al matraz G-Rex 100M.
36. Se registraron # (s) de incubadora y número total de fragmentos añadidos a cada matraz.
37. Se colocó el biorreactor G-REX 100M en una incubadora de CO<2>al 5% a 37°C
38. Cualquier tumor no utilizado se colocó en 100 mL de HypoThermosol y se envió al laboratorio.
39. Se registró el tiempo de parada del tratamiento del tumor.
40. Se desechó cualquier medio completo TIL no utilizado que contenía IL-2 y cualquier alícuota no utilizada de IL-2.
41. La cabina de seguridad biológica se limpio.
42. Se colocó la muestra de Bioburden (biocarga) en las condiciones adecuadas de almacenamiento.
43. Se registraron los datos.
44. Se guardó la imagen como número de identificación de la muestra de archivo, fecha del procedimiento del tumor en el archivo preparado del paciente.
45. Se ordenó y se aseguró la entrega de placas de sedimentación al laboratorio de microbiología.
EJEMPLO 6:PROCEDIMIENTO 2A - DÍA 11
Este ejemplo describe el protocolo detallado del día 11 para el procedimiento 2A descrito en los Ejemplos 1 a 4.
Preparación previa.
1. Día antes del tratamiento:
1.1. CM2 podría prepararse el día antes de que ocurriera el tratamiento. Colocar a 4°C.
2. Día de tramitación.
2.1. Se preparó el arnés de la célula de alimentación.
2.1.1. Se cerraron todas las abrazaderas en un juego de conectores CC2 y 4S-4M60.
2.1.2. Se soldaron 4 espigas estériles del arnés 4S-4M60 a la línea de espigas en el CC2 quitando la espiga.
2.1.3. Se reservo para la agrupación de células de alimentación.
2.2. Se prepararon 5 mL de medio de crioconservación según CTF-FORM-318 y se colocaron a 4°C hasta necesitarse.
Monitoreo ambiental de sala limpia - Pretratamiento
1. Se registro la Información de la sala limpia.
2. Las cabinas de bioseguridad (BSC) se limpiaron con toallitas grandes con alcohol saturado o aerosol con alcohol.
3. Recuentos de partículas verificados durante 10 minutos antes de comenzar el tratamiento.
4. Se coloqaron las placas de vigilancia en desarrollo y se dejaron en la cabina de bioseguridad durante 1-2 horas durante el procedimiento.
Preparar el matraz G-Rex 500MCS:
1. Con una jeringa de 10 ml, se transfirió asépticamente 0.5 ml de IL-2 (solución madre es 6 * 106 UI/ml) por cada litro de CM2 (medio celular 2) a la bolsa de bioprocedimiento a través de un conector luer hembra estéril sin usar.
2. Se usó el exceso de aire en la jeringa para despejar la línea, se extrajo un poco de medio de la bolsa y se expulsó hacia atrás. Esto aseguró que toda la IL-2 se hubiera mezclado con el medio. Se mezcló bien.
3. Se abrió el embalaje exterior y se colocó el G-Rex 500MCS en la BSC. Se cerraron todas las abrazaderas sobre el dispositivo, excepto la línea de filtro grande.
4. Se unió de modo estéril la línea de recolección roja del G-Rex 500MCS a la línea de salida de la tubería de la bomba.
5. Se conectó el luer hembra de la bolsa de bioprocedimientos al luer macho de la campana de la bomba.
<6>. Se colgó la bolsa de bioprocedimientos en el portasueros IV, se abrieron las abrazaderas y se bombearon 4.5 litros del medio CM2 en el G-Rex 500MCS. Se despejaron la línea, la abrazadera y el sello térmico. 7. Se retuvo la línea de la bomba al medio. Se utilizó para preparar células alimentadoras.
<8>. Se colocó G-Rex 500MCS en la incubadora.
Preparar las células de alimentación irradiadas
1. Se selló (sellaron) las espiga (s) de TP de IL. Se sujetaron ambas líneas.
2. Se registró el peso seco de un paquete de transferencia (TP) de 1L.
3. Se unió estérilmente el paquete de transferencia de 1L a la campana de la bomba de acacia ~12" desde la bolsa.
4. El otro extremo del tubo de la bomba todavía estaba conectado al recipiente para laboratorio de 10 litros.
5. Se bombearon 500 ml de CM2 por peso al TP.
<6>. Se cerró la abrazadera y se selló cerca de la junta unida.
7. Se colocó en la incubadora.
<8>. Se verificaron y se desconectaron las bolsas de células de alimentación.
9. Se registró el lote de alimentador usado.
10. Las bolsas se limpiaron con alcohol.
11. Se colocaron en bolsas con cierre hermético.
12. Células de alimentación se descongelaron en el baño de agua a 37°C (+/-1°C). Se registró la temperatura del baño de agua.
13. Se retiraron y se secaron con gasa.
14. Las células de alimentación se pasaron a través de la sala de preparación.
15. Se transfirieron a BSC en sala limpia.
16. Usando el arnés del alimentador preparado previamente, se unió el 1L TP con medio a una de las líneas no utilizadas en el lado del puerto de muestra de la llave de paso de 3 vías lo más cerca posible de la unión del sello, perdiendo la menor cantidad de tubería posible.
17. Se colocó el arnés del alimentador en la BSC.
18. Se agarró cada una de las 3 bolsas de alimentación con la espiga del arnés del alimentador en el puerto único de la bolsa de alimentación.
19. Se giró la válvula de la llave de paso para que el 1L TP estuviera en la posición "APAGADO" ("OFF"). 20. Trabajando con una bolsa a la vez, se abrieron las pinzas en la línea a la bolsa de alimentación, se expulsó el aire en la jeringa y se extrajo el contenido de la bolsa de alimentación a la jeringa. El aire expulsado de la jeringa ayudó a recuperar las células. Abrazadera cerrada a la bolsa de alimentación.
21. Se registró el volumen recuperado de células de alimentación descongeladas en cada bolsa.
22. Se giró la válvula de la llave de paso para que la bolsa de alimentación esté en la posición "APAGADO".
23. Se abrió la pinza del TP y se despachó el contenido de la jeringa al TP.
24. Se aseguró de que la línea se haya despejado y se volvió a sujetar el TP. Es posible que se haya tenido que sacar un poco de aire a la jeringa desde el TP para despejar la línea.
25. Se mezclaron bien las células.
26. Se cerró la abrazadera a la bolsa de alimentación.
27. Se giró la llave de paso para que el puerto de la jeringa esté en la posición “APAGADO”. Se desconectó la jeringa de 60 ml de la llave de paso.
28. Se reemplazó con una nueva jeringa para cada bolsa de alimentación.
29. La jeringa se dejó puesta después de la última bolsa.
30. Se mezcló bien la formulación final del alimentador.
31. Se giró la llave de paso para que la suspensión de la célula de alimentación estuviera en la posición "APAGADO".
32. Se mezclaron las células y utilizando una jeringa de 5 ml y un puerto sin agujas, se enjuagó el puerto con un poco de solución de células para garantizar un muestreo preciso y se extrajó<1>ml de células, se colocó en un tubo etiquetado para el recuento.
33. Se repitió con la segunda jeringa. Cada una de estas dos muestras independientes tuvo un recuento de células individuales.
34. Se giró la llave de paso para que la suspensión del alimentador estuviera en la posición "ABIERTA" y se usó la jeringa de 60 ml unida al aire expulsado del arnés hacia el TP para despejar la línea.
35. Se quitó la jeringa y se cubrió el puerto luer con una nueva tapa estéril.
36. Se selló con calor el TP cerca de la junta soldada, se retiró el arnés.
37. Se registró la masa del paquete de transferencia con la suspensión celular y se calculó el volumen de la suspensión celular.
38. Se colocó en incubadora.
39. Se realizó un recuento de una sola célula en la muestra de la célula de alimentación y se registraron los datos y se adjuntaron los datos primarios de recuento al registro de lote.
40. Se documentó el programa de recuento de Cellometer.
41. Se verificó que hubiera ingresado la dilución correcta en el Cellometer.
42. Se calculó la densidad celular viable total en el paquete de transferencia del alimentador.
43. Si el recuento de células era < 5 x1089, se descongelaron más células, se contaron y se agregaron a las células de alimentación.
44. Se pesó nuevamente la bolsa de alimentación y se calculó el volumen.
45. Se calculó el volumen de células para eliminar.
Adición de alimentador a G-REX
1. Se unió estérilmente un juego de transferencia de 4" al TP del alimentador.
2. En la BSC se adjuntó una jeringa de tamaño apropiado al luer hembra unido al paquete de transferencia del alimentador.
3. Se mezclaron bien las células y se eliminó el volumen calculado en la etapa 40 o 41 para conseguir 5.0x10<9>células. Se desecharon las células innecesarias.
4. Con una jeringa de 1 ml y una aguja de 18 G, se extrajeron 0.150 ml de OKT3, se retiró la aguja y se transfirió al TP del alimentador a través del luer hembra.
5. Se enjuagaron bien el tubo y la jeringa con la célula de alimentación y la bolsa mixta. Se limpió la línea con aire de la jeringa.
<6>. Se retiró el G-Rex 500MCS de la incubadora, se limpió con toallitas con alcohol y se colocó al lado del SCD.
7. Se unió estérilmente la bolsa de alimentación a la línea roja del G-Rex 500MCS. Se soltó la línea y se permitió que las células de alimentación fluyeran al matraz por gravedad.
<8>. Se aseguró de que la línea se hubiera limpiado por completo, luego se selló con calor la línea cerca de la soldadura original y se retiró la bolsa de alimentación.
9. Se devolvió el G-Rex 500MCS a la incubadora y se registró el tiempo.
Preparar TIL: registro del tiempo de inicio de la recolección de TIL
1. Se retiró con cuidado el G-Rex 100MCS de la incubadora y se cerraron todas las abrazaderas excepto la línea de filtro grande.
2. Se unió un paquete de transferencia de 1L a la línea roja en el G-REX 100MCS.
3. Se cerró la abrazadera en un TP de 300ml. Se selló con calor a ~12 pulgadas de la bolsa quitando la espiga. Se registró peso/masa seca.
4. Se unió estérilmente el paquete de transferencia de 300 ml a la línea de recolección de células en el 100MCS cerca del sello térmico. La línea se sujetó con abrazadera.
5. Se soltaron todas las abrazaderas que conducen al TP de 1L.
<6>. Con GatheRex se transfirieron ~900 ml del sobrenadante del cultivo al paquete de transferencia de 1 L. Gatherex se detuvo cuando el aire entró en la línea. Se sujetó la línea y el sello térmico.
7. Se agitó el matraz hasta que todas las células se hubieron desprendido de la membrana. Se verificó la membrana para asegurarse de que todas las células estaban desprendidas.
<8>. Se iInclinó el matraz alejándolo del tubo de recogida y se dejó que los fragmentos tumorales se depositaran en el borde.
9. Se inclinó lentamente el matraz hacia el tubo de recolección de modo que los fragmentos qquedaron en el lado opuesto del matraz.
10. Usando GatheRex se transfirió la suspensión de células residuales al paquete transferido de 300 ml evitando fragmentos tumorales.
11. Se volvió a comprobar que se habían eliminado todas las células de la membrana.
12. Si era necesario, se lavar de nuevo soltando las abrazaderas de GatheRex y se dejó que un poco de medio fluyera al matraz G-Rex 100MCS por gravedad.
13. Se golpeó vigorosamente el matraz para liberar las células y se bombeó a 300 ml de TP.
14. Una vez completada la recolección, se cerró la línea roja y se selló con calor.
15. Se selló con calor la línea de recolección dejando aproximadamente la misma longitud de tubería que cuando se registró el peso seco.
16. Se registró la masa (incluida la masa seca) del TP de 300 ml que contenía la suspensión celular y se calculó el volumen de la suspensión celular.
17. En la BSC se sujetó el TP de 300 ml con un conjunto de transferencia de plasma de 4". Las células se mezclaron bien. Se adjuntó asépticamente una jeringa de 5 ml, se extrajó 1 ml, se colocó en un vial criogénico. Se repitió con una segunda jeringa. Se utilizaron para el recuento, la viabilidad de las células.
18. Se volvió a sujetar y se reemplazó la tapa luer con una nueva tapa luer estéril.
19. Se colocó en la incubadora y se registró el tiempo y lugar en la incubadora.
20. Se realizó un solo recuento de células en cada muestra y se registraron los datos y se adjuntaron los datos brutos de recuento al registro del lote.
21. Se documentó el programa de recuento de Cellometer.
22. se verificó que se hubiera ingresado la dilución correcta en el Cellometer.
23. Cuando fue necesario, se ajustó la densidad de TIL viables totales a < 2x10*8 células viables.
24. Se calculó el volumen para eliminar o anotar que ajuste innecesario.
25. En la BSC, se conectó asépticamente una jeringa del tamaño adecuado al TP de 300 ml.
26. Si se requirió, se eliminó el volumen calculado de células calculadas en la tabla "Calcular volumen para eliminar".
27. Se sujetó y se selló con calor el TP de 300 ml.
28. Se transfirió el exceso de células a un tubo cónico de tamaño adecuado y se colocó en la incubadora con la tapa aflojada para su posterior crioconservación.
29. Se sacó el G-Rex 500MCS de la incubadora y se colocó al lado del SCD.
30. Se unió estérilmente el TP de 300 ml a la línea de entrada de la bomba Acacia.
31. Se unió estérilmente la línea roja del G-Rex 500MCS a la línea de salida de la bomba Acacia.
32. Se bombearon las células a un matraz.
33. Se asegúró de que la línea se haya despejado por completo y luego se selló con calor la línea roja cerca de la soldadura original.
34. Se verificó que todas las abrazaderas del G-Rex 500MCS estuvieran cerradas, excepto la línea de filtro grande.
35. Se devolvió el G-Rex 500MCS a la incubadora y se registró el tiempo colocado en la incubadora G-Rex.
36. Se ordenó y se aseguró la entrega de placas de sedimentación al laboratorio de microbiología.
Crioconservación del exceso
Cantidad calculada de medio de congelación para agregar a las células:
TABLA 13: La concentración de células diana fue de 1 x 108/ml
37. Se centrifugaron los TIL a 400 x g durante 5 min a 20°C con freno total y aceleración total.
38. Se aspiró asépticamente el sobrenadante.
39. Se golpeó suavemente el fondo del tubo para resuspender las células en el líquido restante.
40. Mientras se golpeaba suavemente el tubo, se agregó lentamente el medio de congelación preparado. 41. Se tomaron alícuotas en tubos criogénicos de tamaño apropiado y se registró el tiempo de colocación de las células a -80°C.
EJEMPLO 7:PROCEDIMIENTO 2A - DÍA 16
Este ejemplo describe el protocolo detallado del día 16 para el procedimiento 2A descrito en los Ejemplos 1 a 4.
Monitoreo ambiental de sala limpia - Pretratamiento.
1. Las cabinas de bioseguridad se limpiaron con toallitas grandes con alcohol saturado o spray de alcohol. 2. Se verificaron recuentos de partículas durante 10 minutos antes de comenzar el tratamiento.
3. Se colocaron las placas de vigilancia en desarrollo y se dejaron en la cabina de bioseguridad durante 1-2 horas durante el procedimiento.
Recolección y recuento de TIL.
1. Se calentó una bolsa de 10 L de CM4 para cultivos iniciados con menos de 50x106 TIL en una incubadora a 37°C durante al menos 30 minutos o hasta estar listos para usar.
2. En la BSC, se conectó asépticamente un juego de extensión Baxter a una bolsa Labtainer de 10 litros. 3. Se retiró el matraz G-Rex 500MCS de la incubadora y se colocó en la mesa junto al GatheRex. Se verificó que todas las abrazaderas estuvieran cerradas excepto la línea de filtro grande. Se movió la abrazadera de la línea de conexión rápida cerca de la unión en "T".
4. Se unió estérilmente un Labtainer de 10L a la línea de recolección roja en el G-Rex 500MCS a través del tubo soldable en la extensión Baxter.
5. Se selló con calor un paquete de transferencia de 2L 2" por debajo de la "Y, retirando la espiga y se registró el peso seco. Se unió estérilmente el TP de 2L a la línea de recolección despejada en el G-Rex 500MCS.
<6>. Se colocó el G-Rex 500MCS en una superficie a nivel.
7. Se soltaron todas las abrazaderas que conducen al Labtainer de 10L y utilizando GatheRex se transfirió ~4L de sobrenadante de cultivo al Labtainer de 10L.
<8>. Se recolectó de acuerdo con las instrucciones de recolección apropiadas de GatheRex.
9. Se fijó la línea roja y se registró la hora en que se inició la recolección de TIL.
10. GatheRex se detuvo cuando entró aire en la línea. Se sujetó la línea roja.
11. Después de eliminar el sobrenadante, se agitó el matraz hasta que todas las células se hubieron desprendido de la membrana. Se inclinó el matraz para asegurarse de que la manguera estuviera en el borde del matraz.
12. Se soltaron todas las abrazaderas que conducen al TP de 2L y usando GatheRex se transfirió la suspensión de células residuales al TP de 2L manteniendo el borde inclinado hasta que se hubieron recolectado todas las células.
13. Se inspeccionó la membrana en busca de células adherentes.
14. Si es necesario, se volvió a lavar soltando las abrazaderas en la línea roja y se dejó que algo de medio fluyera al matraz por gravedad.
15. Se cerró la línea roja y se termoselló de modo triple.
16. Se golpeó el matraz vigorosamente para liberar células.
17. Se agregaron células a TP de 2L.
18. Se selló con calor el paquete de transferencia de 2 L dejando aproximadamente la misma longitud de tubo que cuando se registró el peso seco.
19. Se retuvó G-Rex 500MCS, se reutilizó en la división.
20. Se registró la masa del paquete de transferencia con la suspensión celular y se calculó el volumen de la suspensión celular.
21. Se determinó el volumen de suspensión celular, incluida la masa seca.
22. Se unió estérilmente un juego de transferencia de 4" a la bolsa de suspensión celular.
23. En la BSC se mezclaron las células suavemente y con una jeringa de 20 cc se extrajeron 11 ml y se tomaron alícuotas como se muestra en la Tabla 14:
TABLA 14. Parámetros de prueba.
24. Se selló al calor. Se cerró la conexión luer reteniendo la abrazadera
25. Se etiquetó y se colocó la suspensión celular en la incubadora y se registró el tiempo que se colocó en la incubadora.
26. Se calculó nuevo volumen.
27. Se registró el volumen en el paquete de transferencia de 2 L basado en el volumen de suspensión celular y el volumen extraído para CC (11 ml).
28. Se inocularon y se ordenaron pruebas de esterilidad.
29. Se guardó la muestra de micoplasma a 4°C en el estante pendiente para la prueba de micoplasma. 30. Se dejó a un lado hasta que se sembró TIL.
Recuento de células:
Se realizaron recuentos de células individuales y se registraron datos y se adjuntaron los datos brutos de recuento al registro por lotes. Se documentó la dilución. Se documentó el programa de recuento de Cellometer. Se verificó que la dilución correcta se hubiera ingresado al Cellometer.
Continuación del procedimiento:
31. Se calculó el número total de matraces necesarios para el subcultivo **Se reutilizó el recipiente original y se redondearon hacia arriba las fracciones de los recipientes adicionales.
Adición de IL-2 a CM
1. Se colocó una bolsa de 10 litros de Aim V con Glutamax en la BSC.
2. Se agarró la bolsa de medios con un equipo de transferencia de plasma de 4".
3. Se conectó una aguja de 18G a una jeringa de 10 ml y se sacaron 5 ml de IL-2 a la jeringa (la concentración final es de 3000 UI/ml).
4. Se quitó la aguja y se conectó asépticamente la jeringa al equipo de transferencia de plasma y se dispachó IL-2 a la bolsa.
5. Se purgó la línea con aire, se saco un poco de medio y se despachó a la bolsa. Esto aseguró que toda la IL-<2>esté en los medios.
<6>. Se repitió para las bolsas restantes de Aim V.
Preparar matraces G-REX500MCS
1. Se determinó la cantidad de CM4 para agregar a los matraces. Se registró el volumen de células agregadas por matraz y volumen de CM45000mL-A.
2. Se cerraron todas las abrazaderas excepto la línea de filtro grande.
3. Se unió estérilmente la línea de entrada de la bomba Acacia al equipo de transferencia de plasma de 4" en la bolsa de medios que contiene CM4.
4. Se unió estérilmente la línea de salida de la bomba al G-Rex 500MCS a través de la línea de recolección roja.
5. Se bombeó determinada cantidad de CM4 al G-Rex 500MCS usando las líneas del matraz como guía.
<6>. Se selló con calor la línea roja del G-Rex 500MCS.
7. Se repitieron las etapas 4-6 para cada matraz. Se pudieron llenar múltiples matraces al mismo tiempo usando llenado por gravedad o bombas múltiples. Se podría soldar un conector en "Y" a la línea de salida de la bomba y soldar los dos brazos a dos matraces G-Rex 500MCS llenando ambos al mismo tiempo.
<8>. Se colocaron los matraces a 37°C, CO<2>al 5%.
Sembrar matraces con TIL
1. Se cerraron todas las abrazaderas en G-Rex 500MCS excepto la línea de filtro grande
2. Se unió estérilmente la bolsa de producto de célula a la línea de entrada de la bomba Acacia.
3. Se unió estérilmente el otro extremo de la bomba a la línea roja del G-Rex 500MCS.
4. Se colocó la campana de la bomba en la bomba.
5. Se colocó la bolsa de producto celular en la balanza analítica y se registró el tiempo TIL agregado al matraz G-REX.
<6>. Se puso a cero la balanza.
7. Se soltaron las abrazaderas de las líneas y se bombeó el volumen requerido de células en G-Rex 500MCS por peso, suponiendo que<1>g<= 1>ml.
<8>. Se colocó la bolsa de célula boca abajo y se bombeó aire para despejar la línea. Se selló en caliente la línea roja de G-Rex 500MCS. Se colocó el matraz en incubadora.
9. Se unió estérilmente la línea de salida de la bomba al siguiente G-Rex 500MCS a través de la línea de recolección roja.
10. Se mezclaron bien las células.
11. Se repitió la transferencia celular para todos los matraces.
12. Se colocaron los matraces a 37°C, 5% de CO<2>y se registró el tiempo de TIL añadido a matraz G_REX.
13. Se solicitarón pruebas para placas de sedimentación al laboratorio de microbiología.
14. Se registraron números de acceso.
15. Se ordenaron pruebas de esterilidad aeróbica y anaeróbica.
16. Se aseguró la entrega de placas y matraces al laboratorio de microbiología.
Crioconservación de flujo o exceso de células:
1. Se calculó la cantidad de medio de congelación necesaria:
a. La concentración de células diana fue de 1 x 10<8>/ml; se registró el total de células eliminadas. La concentración de células diana fue de 1 x 10<8>células/ml. Se calculó el volumen total de medios de congelación para agregar.
2. Se preparó el medio de crioconservación y se colocó a 40°C hasta necesitarse.
3. Se centrifugó TIL a 400 x g durante 5 min a 20°C con freno y aceleración total.
4. Sobrenadante aspirado asépticamente.
5. Se golpeó suavemente el fondo del tubo para resuspender las células en el líquido restante.
<6>. Mientras golpea suavemente el tubo, se agregó lentamente el medio de congelación preparado.
7. Se reparten alícuotas en tubos criogénicos etiquetados de tamaño apropiado.
<8>. Se colocó el vial en un Mr. Frosty o equivalente y se colocó en un congelador a -80°C.
9. Dentro de las 72 horas se transfirió a un lugar de almacenamiento permanente y se documentaron y registraron la fecha y la hora en que fueron colocadas en un congelador a -80°C.
EJEMPLO 8:PROCEDIMIENTO 2A - DÍA 22
Este ejemplo describe el protocolo detallado del día 22 para el procedimiento 2A descrito en los Ejemplos 1 a 4.
Documentar los resultados negativos de esterilidad en desarrollo
Antes de comenzar la recolección, se obtuvieron los resultados preliminares de esterilidad del día 16 del laboratorio de microbiología. Se comunicó con el director del laboratorio o su designado para obtener más instrucciones si los resultados fueron positivos.
Monitoreo ambiental de sala limpia - Pretratamiento
1. Se verificaron recuentos de partículas durante 10 minutos antes de comenzar el tratamiento.
2. Las cabinas de bioseguridad se limpiaron con toallitas grandes con alcohol saturado o en aerosol con alcohol.
3. Se colocaron las placas de vigilancia en desarrollo y se dejaron en la cabina de bioseguridad durante 1-2 horas durante el procedimiento.
Preparación avanzada
1. En BSC, se conectó asépticamente un juego de extensión Baxter a una bolsa de contenedor de laboratorio de 10 Lo equivalente. Se etiqueteó la bolsa de filtrado LOVO.
2. Se colocaron tres bolsas de 1 litro de PlasmaLyte A en la BSC
3. Se preparó la agrupación y se etiquetearon las bolsas PlasmaLyte A con 1% de HSA:
3.1. Se cerraron todas las abrazaderas en un juego conector 4S-4M60 y se agarró cada una de las bolsas PlasmaLyte.
3.2. Se unió uno de los extremos macho del 4S-4M60 a la línea de entrada de la campana de la bomba Acacia.
3.3. Se unió la línea de salida de la campana de la bomba a una bolsa de recogida de 3 litros. Se cerraron todas las abrazaderas en la bolsa de 3L excepto la línea para bombear.
3.4. Se bombearon 3 litros de Plasmalyte a la bolsa de 3 litros. Si es necesario, se elimina el aire de la bolsa de 3 litros invirtiendo la bomba.
3.5. Se cerraron todas las abrazaderas excepto la línea con luer hembra.
3.6. Usando dos jeringas de 100 ml y agujas de 16-18G, se cargaron 120 ml de HSA al 25%. Jeringas con tapón rojo.
3.7. Se conectó una jeringa al luer hembra en la bolsa de 3 litros y se transfirió HSA a la bolsa PlasmaLyte de 3 litros. Mezclar bien.
3.8. Se repitió con una segunda jeringa.
3.9. Se mezcló bien.
3.10. Se cerraron todas las abrazaderas.
3.11. Usando una jeringa de 10 ml, se quitaron 5 ml de PlasmaLyte con HSA al 1% del puerto sin agujas de la bolsa de 3 litros.
3.12. La jeringa se tapó y se guardó en BSC para dilución de IL-2.
3.13. Se cerraron todas las abrazaderas.
3.14. Se selló con calor quitando la línea luer hembra de la campana de la bomba.
3.15. Se etiquetó el regulador de pH de lavado LOVO y se fechó. Caducó en 24 horas a temperatura ambiente. Preparación de IL-2
1. Se despachó Plasmalyte/1% de HSA desde una jeringa de 5 ml en un tubo cónico estéril de 50 ml etiquetado.
2. Se agregaron 0.05 ml de solución madre de IL-2 al tubo que contenía PlasmaLyte.
3. Se etiquetó IL-26X10<4>
4. Se tapó con la etiqueta y se almacenó a 2-8°C. Se registraron los volúmenes.
Preparación de células
1. Se cerraron todas las abrazaderas en una bolsa Labtainerbag de 10 litros. Se conectó el juego de extensión Baxter a la bolsa de 10 litros mediante una conexión luer.
2. Se retiraron los matraces G-REX 500M de la temperatura de 37°C.
3. Se unió en condiciones estériles la línea roja de eliminación de medios del G-Rex 500MCS al juego de extensión en la bolsa de bioprocedimiento de<1 0 l>.
4. Se unió en condiciones estériles la línea de eliminación de células despejada del G-Rex 500MCS a una bolsa de recolección de 3 litros y se etiquetó como "suspensión de células agrupadas".
5. Se quitó la abrazadera de la línea roja y bolsa de 10L.
<6>. Se utilizó la bomba GatheRex, se redujó el volumen de primer matraz.
Nota: Si se detecta una burbuja de aire, la bomba podría detenerse prematuramente. Si la reducción de volumen total no fue completa, se reactivó la bomba GatheRex.
7. Se cerró la abrazadera de la bolsa de sobrenadante y la línea roja.
<8>. Se agitó el matraz G-REX 500M hasta que los TIL se resuspendieran por completo evitando salpicaduras o espuma. Se aseguró de que todas las células se hayan desprendido de la membrana.
9. Se abrieron las abrazaderas en la línea despejada y bolsa de célula de 3L.
10. Se inclinó el matraz G-Rex de manera que la suspensión celular se agrupara en el costado del matraz donde estaba ubicada la extracción de recolección.
11. Se inició GatherRex para recolectar la suspensión celular. Nota: Si la extracción de recolección de células no estaba en la unión de la pared y la membrana del fondo, golpear el matraz mientras estaba inclinado en un ángulo de 45 ° generalmente era suficiente para posicionar correctamente la extracción.
12. Se aseguró de que se hubieran sacado todas las células del matraz.
13. Si quedaron células en el matraz, se agregaron 100 ml de sobrenadante nuevamente al matraz, se agitó y se recogió en la bolsa de suspensión celular.
14. Se cerró la abrazadera en la línea a la bolsa de recolección de células. Se liberaron Alas abrazaderas en GatheRex.
15. Se selló en caliente la línea despejada de G-Rex 500MCS.
16. Se selló en caliente la línea roja de G-Rex 500MCS.
17. Se repitieron las etapas 3-16 para matraces adicionales.
18. Fue necesario reemplazar la bolsa de sobrenadante de 10 l según fuera necesario después de cada 2° matraz.
19. Se pueden utilizar múltiples GatherRex.
20. Se documentó el número de G-Rex 500MCS tratados.
21. Se selló a calor la bolsa recolectora de célula. Se registró el número de G-REX recolectados.
22. Con un marcador, se hizo una marca de ~2" desde uno de los conectores luer hembra de una nueva bolsa de recolección de 3 litros.
23. Se selló con calor y se quitó el luer hembra justo debajo de la marca.
24. Se etiquetó como bolsa de fuente LOVO
25. Se registró el peso seco.
26. Se cerraron todas las abrazaderas del filtro de sangre de 170 pm.
27. Se unió estérilmente el extremo terminal del filtro a la bolsa de la fuente LOVO justo debajo de la marca.
28. Se unió estérilmente una línea fuente del filtro a la bolsa que contiene la suspensión celular.
29. Se elevó la suspensión celular colgando las células en un portasueros IV para iniciar la transferencia de células por flujo de gravedad. (Nota: No se permitió que la bolsa de la fuente colgara del aparato de filtración).
30. Se abrieron todas las abrazaderas necesarias y se permitió que TIL drenaran de la bolsa de suspensión celular a través del filtro y dentro de la bolsa de fuente LOVO.
31. Una vez que se transfirieron todas las células a la bolsa de la fuente LOVO, se cerraron todas las abrazaderas, se selló con calor justo por encima de la marca y se desconectó para quitar el filtro.
32. Se mezcló bien la bolsa y usando dos jeringas de 3 ml se tomaron 2 muestras independientes de 2 ml del puerto de muestra de la jeringa para el recuento y la viabilidad de las células.
33. Se pesó la bolsa y se determinó la diferencia entre el peso inicial y final.
34. Se registraron los datos y lugar en incubadora, incluida la masa seca.
Recuento de células.
Se realizó un recuento individual de células en cada muestra y se registraron los datos y se adjuntaron los datos brutos de recuento al registro del lote. Se documentó el programa de recuento de Cellometer. Se verificó que la dilución correcta hubiera ingresado en el Cellometer. Se determinó el número total de células nucleadas. Se determinó el número de TNC a eliminar para retener = 1.5 X 10<11>células para el tratamiento de LOVO. Se colocó la célula extraída en un recipiente de tamaño adecuado para su eliminación.
Recolección de LOVO
El Labtainer de 10L con juego de extensión Baxter en Preparación previa fue la bolsa de filtrado de repuesto soldada al kit LOVO más adelante. Se encendió LOVO y se siguieron las pantallas.
Verificar básculas y el sensor de presión.
Para acceder al perfil de operación del instrumento:
1. Se tocó el botón de información.
2. Se tocó la pestaña de configuración del instrumento.
3. Se tocó el botón Perfil de funcionamiento del instrumento.
4. Se muestra el perfil de funcionamiento del instrumento.
Revisar las básculas
1. Se aseguró de que no hubiera nada colgado en ninguna de las básculas y se revisó la lectura de cada báscula.
2. Si alguna de las escalas se leyó fuera de un intervalo de 0 /- 2 g, se realizó la calibración de la báscula como se describe en el Manual de calibración de la báscula del fabricante.
3. Si todas las básculas estaban en tolerancia sin peso colgando, se procedió a colgar un peso de 1 kg en cada báscula (# 1-4) y se revisó la lectura.
4. Si alguna de las básculas se leyó fuera de un intervalo de 1000 /- 10 g cuando colgaba un peso de 1 kg, se realizó la calibración de la báscula como se describe en el Manual del operador de LOVO del fabricante. Verificar el sensor de presión
1. Se revisó la lectura del sensor de presión en la pantalla Perfil de operación del instrumento.
2. N/A: Si la lectura del sensor de presión estaba fuera de 0 /- 10 mmHg, se almacenó un nuevo ajuste de presión atmosférica en el modo de servicio como se describe en el Manual del operador de LOVO del fabricante. a. Se tocó el botón de verificación en la pantalla Perfil de operación del instrumento.
B. Se tocó el botón de verificación en la pestaña Configuración del instrumento.
3. Si se realizó la calibración de la báscula o se ha almacenado un nuevo ajuste de presión atmosférica, se repitieron las secciones pertinentes.
Para iniciar el procedimiento, se seleccionó el protocolo "Resolección de TIL G-Rex" del menú desplegable en la pantalla de selección de protocolo y se presionó Iniciar.
1. Apareció la pantalla de configuración del procedimiento.
2. Se tocó el botón Información de soluciones.
3. Apareció la pantalla Solución 1. Se revisó el tipo de regulador de pH de lavado requerido para la Solución 1. (Debía leerse PlasmaLyte).
4. Se tocó el botón Siguiente para avanzar a la pantalla Solución 2. Se revisó el tipo de regulador de pH de lavado requerido para la Solución 2. (Debía leerse "NINGUNO", lo que indicaba que el protocolo se había configurado para usar solo un tipo de regulador de pH de lavado, que era PlasmaLyte)
5. Se tocó el botón de verificación en la pantalla de información de la solución 2 para volver a la pantalla de configuración del procedimiento.
<6>. Se tocó el botón de información del procedimiento.
7. Se mostró la pantalla de información del procedimiento.
<8>. Se tocó el campo de entrada de ID de usuario. Debía aparecer un teclado. Se ingresaron las iniciales del ejecutante y el verificador. Se tocó el botón para aceptar la entrada.
9. Se tocó el campo de entrada ID de fuente. Debió aparecer un teclado. Se ingresó el número de lote del producto. Se tocó el botón para aceptar la entrada.
10. Se tocó el campo de entrada ID del procedimiento. Debía aparecer un teclado. Se ingresó a "Recolección de TIL". Se tocó el botón para aceptar la entrada.
11. Si hubo notas adicionales para registrar, se tocó el campo de entrada Nota de procedimiento. Apareció un teclado. Se ingresó cualquier nota. Se tocó el botón para aceptar la entrada.
NOTA: El campo de entrada Nota de procedimiento es opcional y puede dejarse en blanco.
12. Se tocó el botón de verificación en la pantalla de información del procedimiento para volver a la pantalla de configuración del procedimiento.
13. Se verificó que apareció una "verificación" en el botón Información del procedimiento. Si no apareció ninguna "marca de verificación", se tocó nuevamente el botón Información del procedimiento y se aseguró de que los campos ID de usuario, ID de fuente e ID de procedimiento tuvieran entradas.
14. Se tocó el botón de configuración de parámetros.
15. Apareció la pantalla de información del procedimiento general.
16. Se tocó el campo de entrada Volumen de la fuente (mL). Apareció un teclado numérico. Se ingresó el volumen calculado de suspensión celular (mL) de la Tabla 1
17. Se tocó el botón para aceptar la entrada.
18. Se tocó el campo de entrada Origen PCV (%). Apareció la pantalla TIL (viable muerto).
19. Se tocó el campo de entrada Cell Concentration. Apareció un teclado numérico. Se ingresó la concentración celular total/ml de la Tabla 14 en el producto fuente en unidades de "x 10<6>/ml". La entrada puede oscilar entre 00.0 y 99.9. Se tocó el botón para aceptar la entrada y regresar a la pantalla de información del procedimiento general. NOTA: Después de que se aceptó la concentración de células, el campo de entrada de PCV de origen (%) en la pantalla de información del procedimiento general mostró el % de PCV calculado por el LOVO, basado en la entrada de concentración de células realizada por el operador.
20. En la pantalla Procedimiento general, se tocó el botón Siguiente para avanzar a la pantalla 4 de<8>, la pantalla Volumen del producto final (Volumen retenido). Nota: Las pantallas 2 y 3 no tenían ningún campo de entrada para que el operador los completara.
21. Apareció la pantalla Volumen de producto final (volumen de retención).
22. Utilizando el valor de células nucleadas totales (TNC) de la Tabla 15, se determinó el volumen objetivo del producto final en la siguiente tabla (Tabla 16). Se ingresó el volumen de producto final (ml) asociado con ese intervalo de células durante la configuración del procedimiento LOVO.
TABLA 15. Determinación del volumen objetivo del producto final.
TABLA 16. Volumen objetivo del producto.
23. Para dirigirse al volumen especificado de la Tabla 16, se tocó el campo de entrada Volumen de producto final (mL). Apareció un teclado numérico. Se ingresó el Volumen de producto final deseado en unidades de mL. Se tocó el botón para aceptar la entrada.
24. Se tocó la pantalla Volumen del producto final (Volumen retenido) para volver a la pantalla Configuración del procedimiento. Nota: Las pantallas 5-8 no tenían ningún campo de entrada para que el operador los completara.
25. Se verificó que apareciera una "Verificación" en el botón Configuración de parámetros. Si no apareció ninguna "verificación", se tocó el botón Información del procedimiento nuevamente y se aseguró de que el Volumen de la fuente y el PCV de la fuente en la página 1 tuvieran entradas. También se aseguró de que la casilla de verificación Volumen de producto final mínimo objetivo estuviera marcada O que el campo Volumen de producto final (ml) tuviera una entrada en la página 4.
26. Se tocó el botón de estimación en la esquina superior derecha de la pantalla.
27. Se mostró la pantalla Resumen de estimación. Se confirmaron valores suficientes y precisos para regulador de pH de lavado Fuente y PlasmaLyte.
28. Se cargó el kit desechable: se siguieron las instrucciones de la pantalla para cargar el kit seleccionando el botón de ayuda "(?)".
29. Se tomó nota de los volúmenes mostrados para el filtrado y la solución 1 (léase PlasmaLyte)
30. Se tomó nota de los volúmenes mostrados para el filtrado y la solución 1 (léase PlasmaLyte).
31. Para obtener instrucciones sobre cómo cargar el kit desechable, se tocó el botón de ayuda o se siguieron las instrucciones del manual del operador para obtener instrucciones detalladas.
32. Cuando se hubo cargado el kit desechable estándar de LOVO, se tocó el botón Siguiente. Apareció la pantalla de información y ubicación del contenedor. Se quitó la bolsa de filtrado de la escala # 3.
33. Para este protocolo, el contenedor de filtrado era nuevo y fuera de báscula
34. Si el contenedor de filtrado ya se mostraba como Nuevo y Fuera de báscula, no se realizaron cambios. 35. Si el tipo de contenedor de filtrado se mostró como Original, se tocó el botón Original para cambiar a Nuevo.
36. Si la ubicación del filtrado se mostró como Sobre báscula, se tocó el botón Sobre báscula para cambiar a Fuera de báscula.
37. Si el volumen de filtrado a generar era < 2500 ml, la ubicación del recipiente de filtrado se mostró como Sobre báscula Para lograr coherencia entre las ejecuciones, la ubicación del recipiente de filtrado se cambió a Fuera de báscula y el tipo de recipiente era "nuevo".
38. Se tocó el botón En-escala para cambiar a fuera de báscula. Se conectó el equipo de transferencia adjunto. Se usó una técnica de soldadura estéril para reemplazar el recipiente de filtrado del equipo desechable LOVO por una bolsa de 10 litros. Se abrió la soldadura.
39. Se colocó el recipiente de filtrado en la mesa. NO se colgó la bolsa de filtrado en la báscula # 3. La báscula No. 3 estuvo vacía durante el procedimiento.
40. Se abrieron las abrazaderas de plástico de la tubería que conduce al recipiente de filtrado. NOTA: Si se quitó el tubo de la abrazadera F durante la soldadura, se volvió a colocarlo en la abrazadera.
41. Se tocó el campo de entrada Capacidad del contenedor de filtrado. Apareció un teclado numérico. Se ingresó la nueva capacidad total de filtrado (10,000 mL). Se tocó el botón "verificar" para aceptar la entrada.
42. Se utilizó una técnica de soldadura estéril para reemplazar el recipiente de filtrado del kit desechable LOVO por una bolsa de 10 litros. Se abrió la soldadura. Nota: Si se quitó el tubo de la abrazadera F durante la soldadura, volvió a ponerse en la abrazadera.
43. Se colocó el nuevo recipiente de filtrado en la mesa. NO se colgó la bolsa de filtrado en la báscula # 3. La báscula # 3 estuvo vacía durante el procedimiento.
44. Se abrieron las abrazaderas de plástico de la tubería que conduce al recipiente de filtrado.
45. Para el contenedor de retenido, la pantalla mostraba Original y Sobre báscula.
46. No se realizaron cambios en el contenedor de retenido.
47. Cuando se realizaron todos los cambios en el contenedor de filtrado y se ingresó la información adecuada, se tocó el botón Siguiente.
48. Apareció la superposición de verificaciones en seco del kit desechable. Se verificó que el kit se habubiera cargado correctamente y luego se tocó el botón Sí.
49. Todas las abrazaderas mecánicas LOVO se cerraron automáticamente y se mostró la pantalla Comprobación de la instalación del kit desechable. El LOVO pasó por una serie de etapas de presurización para revisar el kit.
50. Después de que la verificación del kit desechable se hubiera aprobado correctamente, se mostró la pantalla Soluciones de conexión.
51. 3 l fue el volumen de lavado. Se ingresó este valor en la pantalla.
52. Se utilizó una técnica de soldadura estéril para unir la bolsa de 3 L de PlasmaLyte al tubo que pasa por la abrazadera 1. Se abrió la soldadura.
53. Se colgó la bolsa PlasmaLyte en un portasueros,
54. Se abrieron las abrazaderas de plástico del tubo que conduce a la bolsa PlasmaLyte.
55. Se verificó que la entrada de Volumen de solución fuera 3000 ml. Esto fue ingresado previamente.
56. Se tocó el botón Siguiente. Se mostró la superposición del cebado de kit desechable de. Se verificó que PlasmaLyte estuviera conectado y todas las soldaduras y abrazaderas de plástico en la tubería que conduce al PlasmaLyte estuvieran abiertas, luego se tocó el botón Sí. NOTA: Debido a que solo se usó un tipo de regulador de pH de lavado (PlasmaLyte) durante el procedimiento LOVO, no se adjuntó ninguna solución al tubo que pasaba a través de la abrazadera 2. La abrazadera de Roberts en este tubo permaneció cerrada durante el procedimiento.
57. Se inició el cebado del kit desechable y se mostró la pantalla Cebado del kit desechable. Se observó visualmente que PlasmaLyte se movía a través del tubo conectado a la bolsa de PlasmaL Lyte. Si no se movía fluido, se tocó el botón de pausa en la pantalla y determinó si una abrazadera o soldadura todavía estaba cerrada. Una vez que se resolvió el problema, se tocó el botón Reanudar en la pantalla para reanudar el cebado de kit desechable.
58. Cuando el cebado del kit desechable finalizó correctamente, se mostró la pantalla Conectar fuente.
59. Para este protocolo, el contenedor de fuente era nuevo y fuera de báscula
60. Si el contenedor de fuente ya se mostraba como nuevo y fuera de báscula, no se realizaron cambios. 61. Si la ubicación de la Fuente se mostró como Sobre báscula, se tocó el botón Sobre báscula para cambiar a Fuera de báscula.
62. Se tocó el campo de entrada Capacidad de la fuente (ml). Apareció un teclado numérico. Se ingresó la capacidad del contenedor que contenía el producto de fuente. Se tocó el botón de verificación para aceptar la entrada. Nota: La entrada Capacidad de la fuente se utilizó para asegurarse de que la bolsa de la fuente pudiera contener la solución adicional que se agregó a la bolsa durante la fase de cebado de la fuente.
63. Se utilizó una técnica de soldadura estéril para unir el contenedor de la fuente a la tubería que pasa por la abrazadera S. Se abrió la soldadura. Se retiró el tubo de la abrazadera según fuera necesario.
64. Se aseguró de volver a colocar el tubo de la fuente en la abrazadera en S.
65. Se tocó el botón Siguiente. Se mostró la superposición de cebado de fuente. Se verificó que la Fuente estuviera conectada al kit desechable y que las soldaduras y abrazaderas de plástico en el tubo que conduce a la Fuente estuvieran abiertas, luego se tocó el botón Sí.
<6 6>. Se inició el cebado de la fuente y se mostró la pantalla de cebado de la fuente. Se observó visualmente que PlasmaLyte se movía a través del tubo conectado a la bolsa de la fuente. Si no se movía fluido, se tocó el botón de pausa en la pantalla y se determinó si una abrazadera o soldadura todavía estaba cerrada. Una vez que se resolvió el problema, se tocó el botón Reanudar en la pantalla para reanudar el Cebado de la fuente.
67. Cuando el cebado de fuente finalizó correctamente, se mostró la pantalla de procedimiento de inicio.
<6 8>. Se pulsó el botón Iniciar. Apareció la pantalla de pausa "Ciclo 1 de pre-lavado", con las instrucciones para "Recubrir IP, mezclar fuente".
69. Recubrimiento previo de la bolsa IP.
70. Antes de presionar el botón de inicio, se retiró la bolsa de IP de la báscula de pesaje #2 (también se podría quitar el tubo de la guía de tubo del puerto superior de IP) y se invirtió manualmente para permitir que el regulador de pH de lavado agregado durante la etapa de cebado del kit desechable cubriera todas las superficies interiores de la bolsa.
71. Se volvió a colgar la bolsa de IP en la báscula # 2 (etiqueta en la bolsa hacia la izquierda). Se reemplazó el tubo del puerto superior en la guía del tubo, si se había retirado.
72. Se mezcló la bolsa de fuente.
73. Antes de presionar el botón Inicio, se retiró la bolsa de la fuente de la báscula #1 y se invirtió varias veces para crear una suspensión celular homogénea.
74. Se volvió a colgar la bolsa de la fuente en la báscula #1 o en el portasueros. Se aseguró de que la bolsa no oscilara.
75. Se pulsó el botón Iniciar.
76. El LOVO comenzó a procesar el fluido de la bolsa de la fuente y se mostró la pantalla del ciclo de lavado 1. Durante el procedimiento LOVO, el sistema se detuvo automáticamente para permitir al operador interactuar con diferentes bolsas. Se mostraron diferentes pantallas durante diferentes pausas. Se siguieron las instrucciones correspondientes para cada pantalla.
Pausa de enjuague de fuente
Después de drenar la bolsa Fuente, LOVO agregó regulador de pH de lavado a la bolsa Fuente para enjuagar la bolsa. Después de que se hubi agregado el volumen configurado de regulador de pH de lavado a la bolsa de la fuente, el LOVO se pausó automáticamente y se mostró la pantalla Pausa de enjuague de la fuente. Cuando se mostró la pantalla Pausa de enjuague de fuente, el operador:
1. Quitó la bolsa de la fuente de la báscula # 1.
1. Invirtió la bolsa Fuente varias veces para permitir que el regulador de pH de lavado tocara todo el interior de la bolsa.
2. Volvió a colgar la bolsa de la fuente en la báscula # 1. Se aseguró de que la bolsa de la fuente no oscilara en la báscula n. °<1>.
3. Tocó el botón Reanudar.
El LOVO procesó el fluido de enjuague de la bolsa Fuente, luego continuó con el procedimiento automatizado. Pausa de bolsa de mezcla IP
Para preparar las células para otro paso a través del centrifugador, la bolsa de IP se diluyó con regulador de pH de lavado. Después de agregar el regulador de pH de lavado a la bolsa de IP, el LOVO se detuvo automáticamente y mostró la pantalla de pausa "Mezclar bolsa de IP".
Cuando se mostró la pantalla de pausa "Mezclar bolsa IP", el operador:
1. Quitó la bolsa de IP de la báscula # 2. También podría quitar el tubo de la guía de tubo del puerto superior IP.
2. Invirtió la bolsa de IP varias veces para mezclar bien la suspensión celular.
3. Volvió a colgar la bolsa de IP en la báscula # 2. También reemplazó el tubo del puerto superior IP en la guía del tubo, si se había retirado. Se aseguró de que la bolsa de IP no oscilara en la báscula # 2.
4. Se tocó el botón Reanudar. El LOVO comenzó a procesar el fluido de la bolsa IP.
Pausa de esquinas de IP de masaje
Durante el ciclo de lavado final del procedimiento LOVO, las células se bombearon desde la bolsa IP, a través del centrifugador, y hacia la bolsa de Retenido (Producto final). Cuando la bolsa de IP estuvo vacía, se agregaron 10 ml de reguladores de pH de lavado al puerto inferior de la bolsa de IP para enjuagar la bolsa. Después de agregar el líquido de enjuague, el LOVO se detuvo automáticamente y mostró la pantalla de pausar "Esquinas de IP de masaje".
Cuando se mostró la pantalla de pausar "Esquinas de IP de masaje", el operador:
1. NO retiró la bolsa de IP de la báscula # 2.
2. Con la bolsa de IP todavía colgando en la báscula # 2, masajeó las esquinas de la bolsa para poner en suspensión las células residuales.
3. Se aseguró de que la bolsa de IP no oscilara en la báscula # 2.
4. Presionó el botón Reanudar.
5. El LOVO comenzó a bombear el líquido de enjuague de la bolsa IP.
Al final del procedimiento LOVO, se mostró la pantalla Eliminar productos. Cuando se mostró esta pantalla, se pudieron manipular todas las bolsas del kit LOVO.
Nota: No se tocó ninguna bolsa hasta que apareciera la pantalla Retirar productos.
Se colocó una pinza hemostática en el tubo muy cerca del puerto de la bolsa de Retenido para evitar que la suspensión celular se asentara en el tubo y se selló con triple calor debajo de la pinza hemostática.
Se retiró la bolsa de retenido rompiendo el sello del medio y se transfirió a la BSC.
Se siguieron las instrucciones de la pantalla Retirar productos.
Se tocó el botón Siguiente. Se abrieron todas las abrazaderas mecánicas LOVO y se mostró la pantalla Retirar kit.
Se siguieron las instrucciones de la pantalla Retirar kit. Cuando terminó, se procedió.
Tocó el botón Siguiente. Se cerraron todas las pinzas mecánicas LOVO y se mostró la pantalla de resumen de resultados. Se registraron los datos de la pantalla de resumen de resultados en la Tabla 17. Se cerraron todas las bombas y se filtró el soporte.
TABLA 17. Tabla resumen de resultados de LOVO.
Se tocó el botón Siguiente. Se mostró la pantalla de selección de protocolo.
Procedimiento de apagado de LOVO
1. Se aseguró de que todas las abrazaderas estuvieran cerradas y que el soporte del filtro estuviera en posición vertical.
2. Se tocó el botón DETENER en la parte delantera del LOVO.
3. Se mostró la superposición de decisiones del botón DETENER.
4. Se mostró la superposición de confirmación de apagado.
5. Se tocó el botón Sí. Apareció la pantalla de apagado.
<6>. Después de unos segundos, se mostró la pantalla de apagado. Cuando se mostró esta pantalla, se apagó el LOVO usando el interruptor en la parte posterior izquierda del instrumento.
Se registró en una tabla el volumen de producto formulado final.
Se calculó la cantidad de IL-2 requerida de la tabla de producto final
Se determinó la cantidad de bolsas criogénicas y el volumen de retención
Se marcó en el volumen objetivo y la tabla de retención más adelante el número de bolsas de crioconservación y el volumen de la muestra de retención para el producto.
Cálculo de volumen objetivo /bolsa: (Volumen formulado final - ajuste de volumen debido a que no se obtuvo una recuperación del<1 0 0>% =<1 0>ml)/# bolsas.
Células preparadas con 1:1 (vol:vol) CS10 (CryoStor 10, BioLife Solutions) e IL-2.
1. Montar y conectar el aparato
1.1. Se soldaron en condiciones estériles las bolsas criogénicas CS750 al aparato CC2 Cell Connect reemplazando uno de los extremos luer macho distales de cada bolsa.
1.2. Las abrazaderas se mantuvieron en la posición cerrada.
1.3. Se etiquetaron las bolsas 1-4.
2. Células preparadas con IL-2 y aparato conectado.
2.1. En la espiga de BSC se colocó la bolsa de producto celular con un equipo de transferencia de plasma de 4" con conector luer hembra. Se aseguró de que la abrazadera estuviera cerrada en el equipo de transferencia.
2.2. Con una jeringa de tamaño apropiado, se extrajo el volumen de dilución de trabajo de IL-2 determinado a partir de la Tabla de Producto Final.
2.3. Se despachó a producto LOVO.
2.4. Bolsa de producto LOVO soldada estéril a la línea de espiga simple CC2 quitando la espiga.
2.5. Se colocaron las células y el aparato en una bolsa de transporte y se colocaron a 2-8°C durante < 15 min.
3. Adición de CS10
3.1. En BSC se adjunta una llave de paso de 3 vías al luer macho en una bolsa de CS10 fría.
3.2. Se adjunta una jeringa del tamaño adecuado a la llave hembra de la llave de paso.
3.3. Se desprendió la bolsa y se extrajo la cantidad de CS10 determinada en la tabla "Volumen de producto formulado final".
3.4. Se retiró la jeringa y se tapó en rojo.
3.5. Cuando se requirieron varias jeringas, se repitió.
3.6. Se retiró el aparato de célula/CC2 del refrigerador a 2-8°C y se colocó en BSC.
3.7. Se adjuntó la primera jeringa que contenía CS10 al luer medio de la llave de paso. Se giró la llave de paso para que la línea a las bolsas CS750 estuviera en la posición "APAGADO".
3.8. Lentamente y mezclando suavemente, se añadió CS10 (1:1, vol:vol) a las células.
3.9. Se repitió para jeringas adicionales de CS10.
Adición de producto celular formulado en bolsas criogénicas
1. Se reemplazó la jeringa con jeringa de tamaño apropiado para el volumen de células que se colocarán en cada bolsa criogénica.
2. Se mezcló producto de células.
3. Se abrió la abrazadera que conduce a la bolsa del producto celular y se extrajo el volumen apropiado. 4. Se giró la llave de paso para que la bolsa de producto celular estuviera en la posición "APAGADO" y se despachó el contenido de la jeringa en la bolsa criogénica # 1. Se despejó la línea con aire de la jeringa. Se registró el volumen del producto final
1. Utilizando un puerto sin agujas y una jeringa de tamaño apropiado, se extrajo la cantidad de retención determinada previamente.
2. Se colocó lo retenido en un tubo cónico de 50 ml con la etiqueta "Retener"
3. El uso de la jeringa unida al arnés se eliminó todo el aire de la bolsa que extrajo las células hasta alrededor de 1 "más allá de la bolsa en el tubo. Se sujetó con abrazaderas y se selló con calor. Se colocó a 2-8°C. 4. Se giró la llave de paso para que las bolsas criogénicas estuvieran en la posición "APAGADO"
5. Se mezclaron las células en la bolsa de producto celular y se repitieron las etapas 3-8 para las bolsas CS750 restantes usando una nueva jeringa en la llave de paso y una nueva jeringa para obtener la retención de células.
<6>. El producto retenido debe reservarse para su tratamiento una vez que el producto estuviera en CRF. Procedimiento de congelador de velocidad controlada (CRF) (véase también el Ejemplo 9)
1. Se encendió el CRF (congelador de velocidad controlada CryoMed, modelo 7454) y el ordenador portátil asociado.
2. Se conectó a el ordenador con una cuenta y una contraseña.
3. Se abrió ícono de congelador de velocidad controlada ubicado en el escritorio.
4. Se hizo clic en el botón Ejecutar en la pantalla principal.
5. Se hizo clic en Abrir perfil, se hizo clic en Abrir.
<6>. Se ingresó el nombre del archivo de ejecución seguido de la fecha en este formato: runMMDDYYYY. 7. Se ingresó la etiqueta de datos como fecha sin guiones como MMDDYYY.
<8>. Puerta cerrada al CRF.
9. Se hizo clic en Iniciar ejecución.
10. Seleccionado COM<6>en el menú desplegable.
11. Hizo clic en Aceptar. Esperó unos 30 segundos.
12. Cuando apareció "Descarga de perfil", se hizo clic en Aceptar. Se hizo clic en Guardar. (Véase el Ejemplo 9 para obtener detalles del perfil de congelación de velocidad controlada).
13. Se esperó para presionar el botón verde hasta que las muestras estuvieron en el CRF. El congelador se mantuvo a 4°C hasta que estuvo listo para agregarlos.
14. Se agregaron muestras a CRF.
15. Se esperó hasta que CRF se volvió a 4°C. Una vez que se alcanzó la temperatura, se hizo clic en el botón verde de continuar. Este programa inició para ir a la siguiente etapa del programa.
16. Se realizó una inspección visual de las bolsas criogénicas para lo siguiente (Nota: no inspeccionó el llenado excesivo o insuficiente): integridad del contenedor, integridad del puerto, integridad del sello, presencia de grumos de células y presencia de partículas.
17. Se colocó etiquetas colgantes aprobadas en cada bolsa.
18. Se verificó etiqueta del producto final que incluía: número de lote, nombre del producto, fecha del fabricante, volumen del producto, otros aditivos, temperatura de almacenamiento y vencimiento.
19. Se colocó cada bolsa criogénica (con etiqueta colgante) en una bolsa superior.
20. Se selló al calor.
21. Se colocó en un casete frío.
22. Se repitió para cada bolsa.
23. Se colocaron las bolsas criogénicas etiquetadas en casetes preacondicionados y se transfirieron al CRF.
24. Se distribuyó uniformemente los casetes en el bastidor del CRF.
25. Se aplicó un termopar de cinta al casete central o se colocó la bolsa falsa en la posición central.
26. Se cerró la puerta del CRF.
27. Una vez que la temperatura de la cámara alcanzó los 4°C /- 1.5°C, se tocó Ejecutar en el software de interfaz de PC.
28. Se registró el tiempo y la temperatura de la cámara en que el producto se transfiere al CRF.
Tratamiento de muestra de control de calidad
1. Transferir asépticamente los siguientes materiales a la BSC, según fuera necesario, y etiquetarlos de acuerdo con la siguiente tabla:
2. Se utilizó una pipeta nueva para pipetear lo siguiente:
Tabla de retención y control de calidad
3. Se entregó al control de calidad: 1 tubo de recuento de células, 1 tubo de endotoxina, 1 tubo de micoplasma,<1>tubo de tinción de gramo,<1>tubo de tubo de reestimulación y<1>tubo de flujo al control de calidad para una prueba inmediata. Los tubos duplicados restantes se colocaron en el congelador de velocidad controlada. 4. Se comunicó con el supervisor de control de calidad para notificarle las pruebas requeridas.
5. Véase la Tabla 18 para obtener instrucciones de prueba y almacenamiento.
TABLA 18. Instrucciones de prueba y almacenamiento.
Recuento de células
Se realizó un solo recuento de células en cada muestra y se registraron datos y se adjuntaron los datos brutos de recuento al registro por lotes. Se documentó el programa de recuento del Cellometer. Se verificó que se hubiera ingresado la dilución correcta al Cellometer.
Crioconservación de células de retención posteriores a la formulación:
1. Se colocó vial en CRF.
2. Se trasladó a la ubicación de almacenamiento después de completar la congelación y se registraron la fecha y la hora de colocación en CFR. La fecha y la hora registradas se trasladaron a LN<2>.
Pruebas de microbiología
1. Solicitud de pruebas para placas de sedimentación al laboratorio de microbiología.
2. Números de acceso registrados.
3. Pruebas ordenadas de esterilidad aeróbica y anaeróbica.
4. Entrega garantizada de placas y matraces al laboratorio de microbiología.
Crioconservación posterior de bolsas de productos celulares
1. Se detuvo el congelador después de completar la ejecución. La ejecución se pudo detener haciendo clic en el botón Detener o presionando la tecla Atrás en el teclado del congelador.
2. Se retiraron las bolsas criogénicas del casete
3. Se transfirieron casetes a la fase de vapor LN<2>.
4. Ubicación de almacenamiento registrada.
5. Se ingresaron comentarios adicionales cuando la ventana de ingreso de texto se abrió nuevamente. Esta ventana apareció independientemente del procedimiento de detener ejecución.
<6>. Se imprimió el informe de perfil y se adjuntó al registro de lote etiquetado con el número de lote para la ejecución.
7. Finalizó el modo de calentamiento y se cerró la pantalla Ejecutar con el botón Salir.
EJEMPLO 9:PROCEDIMIENTO DE CRIOCONSERVACIÓN
Este ejemplo describe el procedimiento del proceso de crioconservación para TIL preparados con el procedimiento cerrado abreviado descrito anteriormente en el Ejemplo<8>usando el congelador de velocidad controlada CryoMed, modelo 7454 (Thermo Scientific).
El equipo utilizado, además del descrito en el Ejemplo 9, es el siguiente:
Estante de soporte de casetes de aluminio (compatible con las bolsas para congelador CS750), casetes de almacenamiento criogénico para bolsas de 750 ml, tanque de nitrógeno líquido de baja presión (22 psi), refrigerador, sensor de termopar (tipo cinta para bolsas) y bolsas de congelación CryoStore CS750 (OriGen Scientific).
El procedimiento de congelación proporciona una velocidad de 0.5°C desde la nucleación hasta -20°C y una velocidad de enfriamiento de 1°C por minuto hasta la temperatura final de -80°C. Los parámetros del programa son los siguientes:
Etapa 1: espere a 4°C; Etapa 2: 1.0°C/min (temperatura de la muestra) a -4°C; Etapa 3: 20.0°C/min (temperatura de la cámara) a -45°C; Etapa 4: 10.0°C/min (temperatura de la cámara) a -10.0°C; Etapa 5: 0.5°C/min (temperatura de la cámara) a -20°C; y Etapa<6>: 1,0°C/min (temperatura de la muestra) a -80°C.
En la Figura 11 se mostró una descripción del procedimiento de este ejemplo junto con el procedimiento de los Ejemplos 1 a<8>.
EJEMPLO 10:CARACTERIZACIÓN DEL PROCEDIMIENTO 2A TILS
Este ejemplo describe la caracterización de los TIL preparados con el procedimiento cerrado abreviado descrito anteriormente. En resumen, el procedimiento cerrado abreviado (procedimiento 2A, descrito en los Ejemplos 1 a 9) tenía las ventajas sobre los procedimientos de fabricación de TIL anteriores que se indican en la Tabla 19. Las ventajas para el Pre-REP pueden incluir: mayor cantidad de fragmentos tumorales por matraz, menor tiempo de cultivo, número reducido de etapas y/o ser susceptible a un sistema cerrado. Las ventajas para la transición de Pre-REP a REP pueden incluir: procedimiento pre-REP-a-REP abreviado, número reducido de etapas, selección de fenotipado eliminada y/o susceptible a sistema cerrado. Las ventajas para el REP pueden incluir: número reducido de etapas, duración del REP más corta, transferencia del sistema cerrado de TIL entre matraces y/o intercambios de medios del sistema cerrado. Las ventajas para la recolección pueden incluir: número reducido de etapas, lavado de célula automatizado, sistema cerrado y menor pérdida de producto durante el lavado. Las ventajas para la formulación y/o producto final pueden incluir flexibilidad de envío.
TABLA 19. Comparación del procedimiento ejemplar 1C y una forma de realización del procedimiento 2A.
Se realizaron un total de 9 experimentos usando TIL derivados de 9 tumores descritos en la Tabla 20. Todos los datos mostrados aquí se midieron a partir del producto TIL congelado descongelado del proceso 1C y una forma de realización del procedimiento 2A.
TABLA 20. Descripción de donantes de tumores, fechas de tratamiento y ubicaciones de tratamiento.
Los procedimientos descritos en el presente documento para el procedimiento 2A se utilizaron para producir los TIL para la caracterización en este ejemplo. Brevemente, para el REP, el día 11, un matraz de G-REX -500M que contiene 5 L de CM2 suplementado con 3000 UI/ml de rhil-2, 30ng/mL de anti-CD3 (clon OKT3) y 5 x 10<9>irradiado se prepararon células PBMC alimentadoras alogénicas. Los TIL recogidos del matraz pre-REP G-REX -100M después de la reducción de volumen se contaron y se sembraron en el matraz G-REX -500M a una densidad que varió entre 5 x 106y 200 x 10<6>células. Más adelante, el matraz se colocó en una incubadora humidificada de cultivo de tejidos con CO<2>al 5% a 37°C durante cinco días. El día 16, se redujo el volumen del matraz G-REX -500M, se contaron los TIL y se determinó su viabilidad. En este punto, los TlL se expandieron en múltiples matraces G-REX -500M (hasta un máximo de seis matraces), cada uno con una densidad de siembra de 1 x 10<9>TIL/matraz. Más adelante, todos los matraces se colocaron en incubadoras de cultivo de tejidos con CO<2>al 5% y 37°C humidificadas durante seis días más. El día 22, el día de la recolección, se redujo el volumen de cada matraz en un 90%, se juntaron las células y se filtraron a través de un filtro de sangre de 170 |jm, y luego se recogieron en una bolsa Origin EV3000 de 3 L o equivalente en preparación para el lavado automático el LOVO. Los TIL se lavaron usando el sistema de tratamiento celular automatizado LOVO que reemplazó el 99.99% de los medios de cultivo celular con un regulador de pH de lavado que consistía en PlasmaLyte-A suplementado con HSA al 1%. El LOVO opera utilizando tecnología de membrana de filtración giratoria que recupera más del 92% del TIL al tiempo que elimina virtualmente los componentes residuales del cultivo de tejidos, incluidos el suero, los factores de crecimiento y las citocinas, así como otros desechos y partículas. Una vez completado el lavado, se realizó un recuento de células para determinar la expansión de los TIL y su viabilidad tras la recolección. Se añadió CS10 al TIL lavado en una relación volumen: volumen de 1:1 para lograr la formulación final del Procedimiento 2A. El producto final formulado se dividió en alícuotas en bolsas de almacenamiento criogénico, se selló y se colocó en casetes de aluminio preenfriados. Las bolsas de almacenamiento criogénico que contenían TIL se congelaron luego usando un congelador de velocidad controlada CryoMed (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) de acuerdo con los procedimientos descritos en este documento, incluido el Ejemplo 9.
En las Figuras 12 y 13 se compararon los recuentos de células y el porcentaje de viabilidad de las nueve ejecuciones.
Los marcadores de superficie celular que se mostraron en los siguientes resultados se analizaron usando citometría de flujo (citómetro de flujo Canto II, Becton, Dickinson, and Co., Franklin Lakes, NJ, EE.UU.) usando reactivos adecuados disponibles comercialmente. Los resultados de los marcadores de interés se mostraron en la Figura 14 a la Figura 23.
Se han utilizado diversos procedimientos para medir la longitud de los telómeros en preparaciones citológicas y de ADN genómico. El análisis de fragmentos de restricción de telómeros (TRF) es el estándar de oro para medir la longitud de los telómeros (de Lange et al., 1990). Sin embargo, la principal limitación de TRF es el requisito de una gran cantidad de ADN (1.5 jg). Aquí, se aplicaron dos técnicas ampliamente utilizadas para la medición de la longitud de los telómeros, a saber, hibridación in situ de fluorescencia (FISH) y PCR cuantitativa.
Flow-FISH se realizó utilizando el kit Dako kit (K532711-8 RUO Code K5327 Telomere PNA/FITC para citometría de flujo, kit PNA FISH/FITC. Flujo, 20 pruebas) y se siguieron las instrucciones del fabricante para medir la longitud media de repetición del telómero. Brevemente, la superficie de las células se tiñó con CD3 APC durante 20 minutos a 4°C, seguido de GAM Alexa 546 durante 20 minutos. Más adelante, el complejo antígeno-anticuerpo se reticuló con reticulante químico BS3 (Fisher Scientific) de 2 mM. La unión de la sonda de PNA-telómero en una población estándar de células T con telómeros largos, línea celular de leucemia Jurkat 1301 T (células 1301), se usó como patrón de referencia interno en cada ensayo. Los TIL individuales se contaron después de la incubación del anticuerpo y se mezclaron con 1301 células (ATCC) en una relación de células 1:1. Se mezclaron 5 x 10<5>TIL con 5 x 10<5>células 1301. La hibridación in situ se realizó en solución de hibridación (formamida al 70%, BSA al 1%, Tris 20 mM pH 7.0) por duplicado y en presencia y ausencia de una sonda de PNA de telómero conjugado con FITC (Panagene), FITC-00-CCC-TAA-CCC-TAA-CCC-TAA, suplementaria a la secuencia de repetición del telómero a una concentración final de 60 nM. Después de la adición de la sonda Telomere PNA, las células se incubaron durante 10 minutos a 81°C en un baño de agua con agitación. Más adelante, las células se colocaron en la oscuridad a temperatura ambiente durante la noche. A la mañana siguiente, se eliminó el exceso de sonda de telómero lavando 2 veces con PBS precalentado a 40°C. Después de los lavados, se añadió DAPI (Invitrogen, Carlsbad, CA) a una concentración final de 75 ng/mL. La tinción de ADN con DAPI se usó para bloquear células en la población G0/G1. El análisis de la muestra se realizó utilizando nuestro citómetro de flujo (BD Canto II, Mountain View, CA). La fluorescencia del telómero de la muestra de prueba se expresó como un porcentaje de la fluorescencia (fl) de las células 1301 según la siguiente fórmula: Longitud relativa del telómero = [(células de prueba FITC fl media con sonda -células de prueba FITC fl medias sin sonda) * índice de a Dn células 1301 * 100]/[(células FITC fl 1301 promedio con sonda - células FITC fl 1301 promedio sin sonda) * célula de prueba de índice de ADN.
También se usó qPCR en tiempo real para medir la longitud relativa de los telómeros (Nucleic Acids Res. 2002 May 15; 30(10): e47., 20, Leukemia, 2013, 27, 897-906). Brevemente, se determinó la relación entre el número de copias repetidas de telómeros y el número de copias de un solo gen (T/S) usando un termociclador BioRad PCR (Hercules, CA) en un formato de 96 pocillos. Se utilizaron diez ng de ADN genómico para la reacción de PCR de telómero o hemoglobina (hgb) y los cebadores utilizados fueron los siguientes: cebador Tel-1b (CGG TTT GTT TGG GTT TGG GTT TGG GTT TGG GTT TGG GTT), cebador Tel-2b (GGC TTG CCT TAC CCT TAC CCT TAC CCT TAC CCT TAC CCT), cebador hgb1 (GCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGC), y cebador hgb2 (CACCAACTTCATCCACGTTCACC). Todas las muestras se analizaron mediante las reacciones de los telómeros y la hemoglobina, y el análisis se realizó por triplicado en la misma placa. Además de las muestras de prueba, cada placa de 96 pocillos contenía una curva estándar de cinco puntos de 0.08 ng a 250 ng utilizando ADN genómico aislado de la línea celular 1301. La relación T/S (-dCt) para cada muestra se calculó restando el valor mediano del ciclo umbral de hemoglobina (Ct) del valor mediano de Ct del telómero. La relación T/S relativa (-ddCt) se determinó restando la relación T/S del punto de curva estándar de 10.0 ng de la relación T/S de cada muestra desconocida.
Los resultados de Flow-FISH se mostraron en las Figuras 24 y 25, y no se observaron diferencias significativas entre el proceso 1C y el procedimiento 2A, lo que sugiere que las propiedades sorprendentes de los TIL producidos por el procedimiento 2A no eran predecibles a partir de la edad de los TIL solos.
En conclusión, el procedimiento 2A produjo un potente producto TIL con un fenotipo "joven" definido por altos niveles de moléculas coestimuladoras, bajos niveles de marcadores de agotamiento y una mayor capacidad para secretar citocinas tras la reactivación. La plataforma de expansión abreviada del día 22 permite la generación rápida de dosis a escala clínica de TIL para pacientes con necesidad urgente de terapia. El producto farmacéutico crioconservado introduce eficiencias logísticas críticas que permiten una fabricación rápida y flexibilidad en la distribución. Este procedimiento de expansión supera las barreras tradicionales para la aplicación más amplia de la terapia TIL.
EJEMPLO 11:USO DE CÓCTEL DE CITOCINA DE IL-2, IL-15 E IL-21
Este ejemplo describe el uso de citocinas IL-2, IL-15 e IL-21, que sirven como factores de crecimiento de células T adicionales, en combinación con el procedimiento TIL de los Ejemplos 1 a 10.
Usando el procedimiento de los Ejemplos 1 a 10, se cultivaron TIL a partir de tumores colorrectales, de melanoma, cervicales, de mama triple negativo, pulmón y renales en presencia de IL-2 en un brazo del experimento y, en lugar de IL-2, una combinación de IL-2, IL-15 e IL-21 en otro brazo al inicio del cultivo. Al finalizar el pre-REP, se evaluaron los cultivos para determinar la expansión, el fenotipo, la función (CD107a+ e IFN-<y>) y el repertorio de TCR Vp. IL-15 e IL-21 se describen en otra parte de este documento y en Gruijl, et al., IL-21 promueve la expansión de linfocitos infiltrantes de tumores CD27+ CD28+ con alto potencial citotóxico y baja expansión colateral de células T reguladoras, Santegoets, S. J., J Transl Med., 2013, 11:37 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3626797/).
Los resultados mostraron que la expansión de TIL mejorada (>20%), tanto en células CD4+ como CD<8>+ en las condiciones tratadas con IL-2, IL-15 e IL-21 se observó en múltiples histologías relativas en las condiciones de solo IL-2. Hubo un sesgo hacia una población predominantemente de CD<8>+* con un repertorio TCR Vp sesgado en los TIL obtenidos de los cultivos tratados con IL-2, IL-15 e IL-21 en relación con los cultivos de solo IL-2. IFN-y y CD107a estaban elevados en los TIL tratados con IL-2, IL-15 e IL-21, en comparación con los TIL tratados solo con IL-2.
EJEMPLO 12:FASE 2, MULTICENTRO, ESTUDIO DE TRES COHORTES EN MELANOMA
Este estudio de fase 2, multicéntrico, de tres cohortes está diseñado para evaluar la seguridad y eficacia de una terapia TIL fabricada de acuerdo con el proceso 1C (como se describe en el presente documento) en pacientes con melanoma metastásico. Las cohortes uno y dos inscribirán hasta 30 pacientes cada una y la cohorte tres es una cohorte de retratamiento para una segunda infusión de TIL en hasta diez pacientes. Las dos primeras cohortes están evaluando dos procedimientos de fabricación diferentes: los procedimientos 1C y una forma de realización del procedimiento 2A (descrito en los Ejemplos 1 a 10, respectivamente. Los pacientes de la cohorte uno (1) reciben TIL frescos no crioconservados y los pacientes de la cohorte dos (2) reciben el producto fabricado a través del procedimiento descrito en los Ejemplos 1 a 10, produciendo un producto crioconservado. El diseño del estudio se mostró en la Figura 26. El estudio es un estudio de fase 2, multicéntrico, de tres cohortes para evaluar la seguridad y eficacia de los TIL autólogos para el tratamiento de subpoblaciones de pacientes con melanoma metastásico. Los criterios de inclusión clave incluyen: melanoma metastásico medible y > 1 lesión resecable para la generación de TIL; al menos una línea previa de terapia sistémica; edad > 18; y estado funcional ECOg de 0-1. Las cohortes de tratamiento incluyen productos TIL no crioconservados (preparados usando el procedimiento 1C), producto TIL crioconservado (preparado usando una forma de realización del procedimiento 2A) y re-tratamiento con producto TIL para pacientes sin respuesta o que progresan después de la respuesta inicial. El criterio de valoración principal es la seguridad y el criterio de valoración secundario es la eficacia, definida como tasa de respuesta objetiva (TRG), tasa de remisión completa (CRR), supervivencia libre de progresión (SLP), duración de la respuesta (DOR) y supervivencia global (SG).
EJEMPLO 13:LOTES INDIVIDUALES DE CALIFICACIÓN DE CÉLULAS MONONUCLEARES PERIFÉRICAS IRRADIADAS CON GAMMA
Este ejemplo describe un procedimiento abreviado nuevo para calificar lotes individuales de células mononucleares periféricas irradiadas con rayos gamma (PBMC, también conocidas como MNC) para su uso como células alimentadoras alogénicas en los procedimientos ejemplares descritos en este documento. Cada lote de alimentador de MNC irradiado se preparó a partir de un donante individual. Cada lote o donante se seleccionó individualmente para determinar su capacidad para expandir TIL en el REP en presencia de anticuerpo anti-CD3 (clon OKT3) purificado e interleucina-2 (IL-2). Además, cada lote de células alimentadoras se probó sin la adición de TIL para verificar que la dosis recibida de radiación gamma era suficiente para hacer que su replicación fuera incompetente.
Definiciones/Abreviaturas
BSC - Cabina de seguridad biológica
CD3 - Clúster de diferenciación 3; linfocitos T de proteína marcadora de superficie
CF - Centrífuga
CM2 - Medio completo para TIL #
CMO - Organización de fabricación por contrato
CO<2>- Dióxido de carbono
EtOH - alcohol etílico
GMP - Buenas prácticas de fabricación
IL-2: interleucina 2
IU - Unidades internacionales
LN2 - Nitrógeno líquido
mini-REP - Protocolo de expansión mini-rápida
ml - mililitro
MNC - Células mononucleares
NA - No aplica
OKT3 - Anticuerpo MACS GMP CD3 puro (clon OKT3)
EPI - Equipo de protección personal
Pre-REP: antes del protocolo de expansión rápida
QS - Quantum Satis; llenar a esta cantidad
REP - Protocolo de expansión rápida
TIL - Linfocitos infiltrantes de tumores
T25 - Matraz de cultivo de tejidos de 25 cm<2>A {2}
|jg - Microgramo
|jL - Microlitro
PROCEDIMIENTO
Antecedentes
7.1.1 Se requirieron células alimentadoras de MNC irradiadas con rayos gamma y detenidas en su crecimiento para REP de TIL. Los receptores de membrana en las MNC del alimentador se unen al anticuerpo anti-CD3 (clon OKT3) y se reticulan con TIL en el matraz de REP, que estimulan la expansión de TIL. Los lotes de alimentación se prepararon a partir de la leucaféresis de sangre entera extraída de donantes individuales. El producto de leucaféresis se sometió a centrifugación sobre Ficoll-Hypaque, se lavó, se irradió y se crioconservó en condiciones de GMP.
7.1.2 Es importante que los pacientes que recibieron terapia con TIL no reciban una infusión de células alimentadoras viables, ya que esto puede provocar la enfermedad de injerto contra huésped (EICH). Por tanto, el crecimiento de las células alimentadoras se detiene mediante la dosificación de las células con irradiación gamma, lo que da como resultado roturas del ADN bicatenario y la pérdida de la viabilidad celular de las células MNC tras el recultivo.
Criterios de evaluación y configuración experimental
Los lotes de alimentación se evaluaron según dos criterios: 1) su capacidad para expandir TIL en cocultivo ><1 0 0>veces y<2>) su incompetencia de replicación.
7.2.2 Los lotes de alimentación se probaron en formato mini-REP utilizando dos líneas pre-REP TIL primarias cultivadas en matraces de cultivo de tejidos T25 verticales.
7.2.3 Los lotes de alimentación se probaron frente a dos líneas TIL distintas, ya que cada línea TIL es única en su capacidad de proliferar en respuesta a la activación en un REP.
7.2.4 Como control, junto con los lotes de prueba se ejecutó un lote de células alimentadoras MNC irradiadas que históricamente se ha demostrado que cumplen con los criterios de 7.2.1.
7.2.5 Para asegurar que todos los lotes probados en un solo experimento reciban pruebas equivalentes, se dispuso de suficientes existencias de las mismas líneas pre-REP TIL para probar todas las condiciones y todos los lotes de alimentadoras.
7.2.6 Para cada lote de células de alimentación analizadas, hubo un total de seis matraces T25:
7.2.6.1 Línea # 1 de Pre-REP TIL (2 matraces)
7.2.6.2 Línea # 2 de Pre-REP TIL (2 matraces)
7.2.6.3 Control de alimentadoras (2 matraces)
NOTA: Los matraces que contienen las líneas TIL # 1 y # 2 evaluaron la capacidad del lote alimentador para expandir TIL. Los matraces de control de alimentadoras evaluaron la incompetencia de replicación del lote de las alimentadoras.
Protocolo experimental
7.3.1 Día -2/3, Descongelamiento de líneas TIL
7.3.1.1 Medio CM2 preparado.
7.3.1.2 CM2 calentado en baño de agua a 37°C.
7.3.1.3 Se prepararon 40 ml de CM2 suplementado con 3000 UI/ml de IL-2. Mantener caliente hasta su uso.
7.3.1.4 Se colocaron 20 ml de CM2 precalentado sin IL-2 en cada uno de los dos tubos cónicos de 50 ml etiquetados con los nombres de las líneas TIL utilizadas.
7.3.1.5 Se retiraron las dos líneas pre-REP TIL designadas del almacenamiento de LN2 y se transfirieron los viales a la sala de cultivo de tejidos.
7.3.1.6 Identificación de la línea TIL registrada.
7.3.1.7 Matraces descongelados colocándolos dentro de una bolsa de almacenamiento con cremallera sellada en un baño de agua a 37°C hasta que quede una pequeña cantidad de hielo.
7.3.1.8 Viales descongelados rociados o limpios con etanol al 70% y se transfirieron los viales a BSC.
7.3.1.9 Con una pipeta de transferencia estéril, se transfirieron inmediatamente el contenido del vial a los 20 ml de CM2 en el tubo cónico de 50 ml preparado y etiquetado.
7.3.1.10 QS a 40 ml usando CM2 sin IL-2 para lavar las células.
7.3.1.11 Centrifugado a 400 x CF durante 5 minutos.
7.3.1.12 Se aspiró el sobrenadante y se resuspendió en 5 ml de CM2 tibio suplementado con 3000 UI/ml de IL-2 .
7.3.1.13 Se eliminó una pequeña alícuota (20 j l ) por duplicado para el recuento celular utilizando un contador celular automático. Se registró los recuentos.
7.3.1.14 Mientras se realiza el recuento, Se colocó el tubo cónico de 50 ml con células TIL en una incubadora humidificada de 37°C con CO<2>al 5%, con la tapa aflojada para permitir el intercambio de gases.
7.3.1.15 Concentración celular determinada y TIL diluido a 1 x 10<6>células/ml en CM2 suplementado con IL-2 a 3000 UI/ml.
7.3.1.16 Se cultivó en 2 ml/pocillo de una placa de cultivo tisular de 24 pocillos en tantos pocillos como fuera necesario en una incubadora humidificada a 37°C hasta el día 0 del mini-REP.
7.3.1.17 Se cultivaron las diferentes líneas TIL en placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos independientes para evitar confusiones y una posible contaminación cruzada.
7.3.2 Día 0, iniciar Mini-REP
7.3.2.1 Se preparó suficiente medio CM2 para la cantidad de lotes de alimentadores que se analizarán (por ejemplo, para analizar 4 lotes de alimentadores a la vez, se prepararon 800 ml de medio CM2).
7.3.2.2 Se dividió en alícuotas una porción del CM2 preparado en 7.3.2.1 y se suplementó con 3000 UI/ml de IL-2 para el cultivo de las células. (por ejemplo, para analizar 4 lotes de alimentadores a la vez, preparar 500 ml de medio CM2 con 3000 UI/ml de IL-2).
7.3.2.3 El resto del CM2 sin IL-2 se utilizará para el lavado de células como se explica más adelante.
7.3.2.4 Trabajando con cada línea TIL por separado para evitar la contaminación cruzada, se retiró la placa de 24 pocillos con cultivo TIL de la incubadora y se transfirió al BSC.
7.3.2.5 Con una pipeta de transferencia estéril o una pipeta de 100-1000 j l y una punta, se extrajo alrededor de 1 ml de medio de cada pocillo de TIL que se utilizará y colóquelo en un pocillo no utilizado de la placa de cultivo tisular de 24 pocillos. Esto se usó para lavar pozos.
7.3.2.6 Utilizando una pipeta de transferencia estéril nueva o una pipeta de 100-1000 j l y una punta, se mezcló el medio restante con TIL en los pocillos para resuspender las células y luego se transfirieron la suspensión celular a un tubo cónico de 50 ml etiquetado con el nombre TIL y se registró el volumen.
7.3.2.7 Se lavaron los pocillos con el medio reservado y se transfirió ese volumen al mismo tubo cónico de 50 ml.
7.3.2.8 Se centrifugaron las células a 400 x CF para recoger el sedimento celular.
7.3.2.9 Se aspiró el sobrenadante del medio y se resuspendió el sedimento celular en 2-5 ml de medio CM2 que contiene 3000 UI/ml de IL-2, volumen que se utilizará según el número de pocillos recolectados y el tamaño del sedimento; el volumen debe ser suficiente para asegurar una concentración de > 1.3 x 10<6>células/ml. 7.3.2.10 Con una pipeta serológica, se mezcló bien la suspensión celular y se registró el volumen.
7.3.2.11 Se retiraron 200 j l para un recuento celular utilizando un contador celular automático.
7.3.2.12 Mientras se cuenta, se colocó el tubo cónico de 50 ml con células TIL en una incubadora humidificada con CO<2>al 5% a 37°C, con la tapa aflojada para permitir el intercambio de gases.
7.3.2.13 Registro de los recuentos.
7.3.2.14 Se retiró el tubo cónico de 50 ml que contenía las células TIL de la incubadora y se resuspendieron las células a una concentración de 1.3 x 10<6>células/ml en CM2 caliente suplementado con 3000 UI/ml de IL-2. Se devolvió el tubo cónico de 50 ml a la incubadora con la tapa aflojada.
7.3.2.15 Si se desea, se conserva la placa original de 24 pocillos para volver a cultivar cualquier TIL residual.
7.3.2.16 Se repitieron etapas 7.3.2.4 - 7.3.2.15 para la segunda línea TIL.
7.3.2.17 Justo antes de plaquear el TIL en los matraces T25 para el experimento, TIL se diluyó 1:10 para una concentración final de 1.3 x 10<5>células/ml según la etapa 7.3.2.35 más adelante.
Preparar la solución de trabajo MACS GMP CD3 puro (OKT3)
7.3.2.18 Se sacó la solución madre de OKT3 (1 mg/ml) del refrigerador a 4°C y se colocó en BSC.
7.3.2.19 Se utilizó una concentración final de 30 ng/mL de OKT3 en el medio del mini-REP.
7.3.2.20 Se necesitaron 600 ng de OKT3 para 20 ml en cada matraz T25 del experimento; esto fue el equivalente a 60 pl de una solución de 10 pg/ml por cada 20 ml, o 360 pl para todos los<6>matraces analizados para cada lote de alimentadoras.
7.3.2.21 Para cada lote de alimentadoras analizado, se prepararon 400 pl de una dilución 1:100 de 1 mg/ml de OKT3 para una concentración de trabajo de 10 pg/ml (por ejemplo, para probar 4 lotes de alimentadoras a la vez, se prepararon 1600 pl de una dilución de<1>mg/ml de OKT3:<1 6>pl de una dilución<1 : 1 0 0>de<1>mg/ml de OKT3 1.584 ml de medio CM2 con 3000 UI/ml de IL-2.)
Preparar matraces T25
7.3.2.22 Se etiquetó cada matraz con el nombre de la línea TIL probada, el número de réplica del matraz, el número de lote de las alimentadoras, la fecha y las iniciales del analista.
7.3.2.23 Se llenó el matraz con el medio CM2 antes de preparar las células alimentadoras.
7.3.2.24 Se colocaron los matraces en una incubadora de CO<2>al 5% humidificada a 37°C para mantener el medio caliente mientras se esperaba agregar los componentes restantes.
7.3.2.25 Una vez preparadas las células de alimentación, los componentes se agregarían al CM2 en cada matraz.
Preparar solución de trabajo MACS GMP CD3 pura (OKT3).
TABLA 21: Soluciones
Preparar las células de alimentación
7.3.2.26 Se necesitaba un mínimo de 78 x 10<6>células de alimentación por lote probado para este protocolo. Cada vial de 1 ml congelado por SDBB tenía 100 x 10<6>células viables tras la congelación. Suponiendo una recuperación del 50% tras la descongelación del almacenamiento de LN2, se recomendó descongelar al menos dos viales de<1>ml de células alimentadoras por lote dando un estimado de<1 0 0>x<1 0 6>células viables para cada REP. Alternativamente, si se suministra en viales de 1.8 ml, solo un vial proporcionó suficientes células alimentadoras.
7.3.2.27 Antes de descongelar las células alimentadoras, precalentar alrededor de 50 ml de CM2 sin IL-2 para cada lote de alimentadoras a analizar.
7.3.2.28 Se retiraron los viales del lote de alimentadoras designados del almacenamiento de LN2, se colocaron en una bolsa de almacenamiento con cierre y se colocaron en hielo. Viales transferidos a la sala de cultivo de tejidos.
7.3.2.29 Viales descongelados dentro de una bolsa de almacenamiento con cremallera cerrada sumergiéndolos en un baño de agua a 37°C.
7.3.2.30 Se retiraron los viales de la bolsa con cierre, se roció o se limpió con EtOH al 70% y se transfirieron los viales al BSC.
7.3.2.31 Utilizando una pipeta de transferencia, se transfirió inmediatamente el contenido de los viales de alimentadoras a 30 ml de CM2 caliente en un tubo cónico de 50 ml. Vial lavado con un pequeño volumen de CM2 para retirar las células residuales en el vial.
7.3.2.32 Centrifugado a 400 x CF durante 5 minutos.
7.3.2.33 Se aspiró el sobrenadante y se resuspendió en 4 ml de CM2 caliente más 3000 UI/ml de IL-2.
7.3.2.34 Se retiraron 200 pl para el recuento celular mediante el contador celular automatizado. Registrados los recuentos.
7.3.2.34 Células resuspendidas a 1.3 x 10<7>células/ml en CM2 caliente más 3000 UI/ml de IL-2.
7.3.2.34 Células TIL diluidas de 1.3 x 10<6>células/ml a 1.3 x 10<5>células/ml. Se trabajó con cada línea TIL de forma independiente para evitar la contaminación cruzada.
Configurar co-cultivo
7.3.2.36 Células TIL diluidas de 1.3 x 10<6>células/ml a 1.3 x 10<5>células/ml. Se trabajó con cada línea TIL de forma independiente para evitar la contaminación cruzada.
7.3.2.36.1 Se agregaron 4.5 ml de medio CM2 a un tubo cónico de 15 ml.
7.3.2.36.2 Se retiraron las células TIL de la incubadora y se resuspendieron bien con una pipeta serológica de<1 0>ml.
7.3.2.36.3 Se retiraron 0.5 ml de células de la suspensión de TIL 1.3 x 10<6>células/ml y se añadieron a los 4.5 ml de medio en el tubo cónico de 15 ml. Se devolvió el vial de solución madre de TIL a la incubadora.
7.3.2.36.4 Se mezcló bien.
7.3.2.36.5 Se repitieron etapas 7.3.2.36.1 - 7.3.2.36.4 para la segunda línea TIL.
7.3.2.36.6 Si se prueba más de un lote de alimentadoras a la vez, se diluye el TIL a la concentración más baja para cada lote de alimentadoras justo antes de sembrar el TIL.
7.3.2.37 Matraces transferidos con medios precalentados para un solo lote de alimentadoras desde la incubadora a la BSC.
7.3.2.38 Se mezclaron las células alimentadoras pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces con una punta de pipeta de 1 ml y transfiriendo 1 ml (1.3 x 10<7>células) a cada matraz para ese lote de alimentadoras.
7.3.2.39 Se agregaron 60 pl de solución madre de trabajo de OKT3 (10 pg/ml) a cada matraz.
7.3.2.40 Se devolvieron los dos matraces de control a la incubadora.
7.3.2.41 Se transfirió 1 ml (1.3 x 105) de cada lote de TIL al matraz T25 correspondientemente etiquetado. 7.3.2.42 Los matraces se devolvieron a la incubadora y se incubaron en posición vertical. No se molestó hasta el día 5.
7.3.2.43 Se repitieron 7.3.2.36 - 7.3.2.42 para todos los lotes de alimentadoras probados.
Día 5, cambio de medios
7.3.3.1 CM2 preparado con 3000 Ul/ml de IL-2. Se necesitan 10 ml para cada matraz
7.3.3.2 Para evitar la contaminación cruzada, se manipularon los matraces para un solo lote de alimentadoras a la vez. Se retiraron los matraces de la incubadora y se transfirieron a la BSC, se tuvo cuidado de no alterar la capa celular en el fondo del matraz.
7.3.3.3 Se repitió para todos los matraces, incluido el matraz de control.
7.3.3.4 Con una pipeta de 10 ml, se transfirieron 10 ml de CM2 caliente con 3000 UI/ml de IL-2 a cada matraz.
7.3.3.5 Se devolvieron los matraces a la incubadora y se incubaron en posición vertical hasta el día 7. Se repitieron 7.3.3.1 - 7.3.3.6 para todos los lotes de alimentadores analizados.
Día 7, Recolección
7.3.4.1 Para evitar la contaminación cruzada, manipular los matraces para un solo lote de alimentadoras a la vez.
7.3.4.2 Se retiraron los matraces de la incubadora y se transfirieron a la BSC, teniendo cuidado de no alterar la capa de células en el fondo del matraz.
7.3.4.3 Sin alterar las células que crecen en el fondo de los matraces, se extrajeron 10 ml de medio de cada matraz de prueba y 15 ml de medio de cada uno de los matraces de control.
7.3.4.4 Con una pipeta serológica de 10 ml, se resuspendieron las células en el medio restante y se mezclaron bien para disolver los grumos de células.
7.3.4.5 Se registraron los volúmenes de cada matraz.
7.3.4.6 Después de mezclar bien la suspensión celular mediante pipeteo, se extraen 200 pl para el recuento celular.
7.3.4.7 Contar el TIL usando el procedimiento operativo estándar apropiado junto con el equipo contador celular automático.
7.3.4.8 Recuentos registrados en el día 7.
7.3.4.9 Se repitieron 7.3.4.1 - 7.3.4.8 para todos los lotes de alimentadores probados.
7.3.4.10 Se evaluó la incompetencia de replicación de los matraces de control de alimentadoras y se evaluó la expansión múltiple de los matraces que contenían TIL desde el Día 0 de acuerdo con los criterios enumerados en la Tabla 21 (más adelante).
Día 7, continuación de los matraces de control de alimentadoras hasta el día 14
7.3.5.1 Después de completar los recuentos del día 7 de los matraces de control de alimentadoras, se agregaron 15 ml de medio CM2 fresco que contenía 3000 UI/ml de IL-2 a cada uno de los matraces de control.
7.3.5.2 Se devolvieron los matraces de control a la incubadora y se incubaron en posición vertical hasta el día 14.
Día 14, no proliferación extendida de matraces de control de alimentadoras
7.3.6.1 Para evitar la contaminación cruzada, los matraces se manipularon para un solo lote de alimentadoras a la vez.
7.3.6.2 Se retiraron los matraces de la incubadora y se transfirieron a la BSC; se tuvo cuidado de no alterar la capa de células en el fondo del matraz.
7.3.6.3 Sin alterar las células que crecen en el fondo de los matraces, se extrajo alrededor de 17 ml de medio de cada matraz de control.
7.3.6.4 Con una pipeta serológica de 5 ml, se resuspendieron las células en el medio restante y se mezclaron bien para disolver los grumos de células.
7.3.6.5 Se registraron los volúmenes de cada matraz.
7.3.6.6 Después de mezclar a fondo la suspensión celular mediante pipeteo, se extrajeron 200 pl para el recuento celular.
7.3.6.7 Se contaron los TIL usando el procedimiento operativo estándar apropiado junto con el equipo contador celular automático.
7.3.6.8 Recuentos registrados.
7.3.6.9 Se repitieron 7.3.4.1 - 7.3.4.8 para todos los lotes de alimentadoras probados.
RESULTADOS Y CRITERIOS DE ACEPTACIÓN
Resultados
10.1.1 La dosis de irradiación gamma fue suficiente para que la replicación de las células alimentadoras fuera incompetente. Se esperaba que todos los lotes cumplieran los criterios de evaluación y también demostraron una reducción en el número total viable de células alimentadoras restantes en el día 7 del cultivo de REP en comparación con el día<0>.
10.1.2 Se esperaba que todos los lotes de alimentadoras cumplieran con los criterios de evaluación de expansión de 100 veces el crecimiento de TIL para el día 7 del cultivo REP.
10.1.3 Se esperaba que los recuentos del día 14 de matraces de control de alimentadoras continuaran la tendencia no proliferativa observada en el día 7.
Criterios de aceptación
10.2.1 Se cumplieron los siguientes criterios de aceptación para cada línea TIL replicada probada para cada lote de células alimentadoras
10.2.2 La aceptación fue doble, como se indica más adelante (que se describe en la tabla siguiente).
TABLA 22: Criterios de aceptación
10.2.2.1 Se evaluó si la dosis de radiación era suficiente para hacer que la replicación de las células alimentadoras MNC fuera incompetente cuando se cultivaba en presencia de 30 ng/mL de anticuerpo OKT3 y 3000 UI/ml de IL-2.
10.2.2.1.1 La incompetencia de replicación se evaluó mediante el recuento total de células viables (TVC) según se determinó mediante el recuento celular automatizado el día 7 y el día 14 del REP.
10.2.2.1.2 El criterio de aceptación fue "Sin crecimiento", lo que significa que el número total de células viables no ha aumentado el día 7 y el día 14 desde el número de células viables inicial puesto en cultivo el día 0 del REP.
10.2.2.2 Se evaluó la capacidad de las células alimentadoras para soportar la expansión de TIL.
10.2.2.2.1 El crecimiento de TIL se midió en términos de expansión múltiple de células viables desde el inicio del cultivo en el día 0 del REP hasta el día 7 del REP.
10.2.2.2.1 El día 7, los cultivos de TIL lograron una expansión mínima de 100 veces, (es decir, más de 100 veces el número de células TIL viables totales puestas en cultivo el día 0 de REP), según se evaluó mediante el recuento celular automatizado.
10.2.2.3 Si un lote no cumpliera con los dos criterios anteriores, el lote se volvió a analizar de acuerdo con el plan de contingencia descrito en la Sección 10.3 más adelante.
10.2.2.4 Después de repetir la prueba de un lote fallido, se excluyó cualquier lote de alimentadoras de MNC que no cumpliera con los dos criterios de aceptación tanto en la evaluación original como en la prueba de contingencia.
10.2.2.5 Se excluyó cualquier lote de alimentadoras de MNC que cumpliera con los criterios de aceptación pero que se considerara que tenía un rendimiento deficiente en cuanto a la capacidad de expandir TIL en relación con otros lotes de alimentadoras anteriores probados en paralelo con las mismas líneas de TIL pre-REP. Pruebas de contingencia de lotes de alimentadoras MNC que no cumplen con los criterios de aceptación 10.3.1 En el caso de que un lote de alimentadoras de MNC no cumpliera con ninguno de los criterios de aceptación descritos en la Sección 10.2 anterior, se tomarán las siguientes etapas para volver a probar el lote y descartar un error simple del experimentador como su causa.
10.3.2 Si quedan dos o más viales de prueba satélite del lote, el lote se volvió a analizar. Si había uno o ningún matraz de prueba satélite restante del lote, entonces el lote falló de acuerdo con los criterios de aceptación enumerados en la Sección 10.2 anterior.
10.3.3 Dos personas capacitadas, incluida la persona original que evaluó el lote en cuestión, probaron ambas el lote al mismo tiempo.
10.3.4 Se repitió la Sección 7.2 - 7.3 para reevaluar el lote en cuestión.
10.3.5 Cada persona analizó el lote en cuestión, así como un lote de control (como se define en la Sección 7.2.4 anterior).
10.3.6 Para ser calificado, el lote en cuestión y el lote de control tenían que cumplir con los criterios de aceptación de la Sección 10.2 para el personal que realizaba las pruebas de contingencia.
10.3.7 Una vez cumplidos estos criterios, el lote se entregó para uso de CMO como se describe en la Sección<1 0 . 2>anterior.
EJEMPLO 14:LOTES INDIVIDUALES DE CALIFICACIÓN DE CÉLULAS MONONUCLEARES DE SANGRE PERIFÉRICA IRRADIADA CON GAMMA
Este ejemplo describe un procedimiento abreviado nuevo para calificar lotes individuales de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) irradiadas con rayos gamma para su uso como células alimentadoras alogénicas en los procedimientos ejemplares descritos en el presente documento. Este ejemplo proporciona un protocolo para la evaluación de lotes de células PBMC irradiadas para su uso en la producción de lotes clínicos de TIL. Cada lote de PBMC irradiado se preparó a partir de un donante individual. En el transcurso de más de 100 protocolos de calificación, se demostró que, en todos los casos, los lotes de PBMC irradiados de SDBB (Banco de sangre de San Diego) se expanden TIL > 100 veces el día 7 de un REP. Este protocolo de calificación modificado estaba destinado a aplicarse a lotes de PBMC de donantes irradiados de SDBB que luego se sometieron a pruebas adicionales para verificar que la dosis recibida de radiación gamma era suficiente para hacerlos incompetentes para la replicación. Una vez que se demostró que mantuvieron la incompetencia de replicación durante el transcurso de 14 días, los lotes de PBMC de donantes se consideraron "calificados" para su uso en la producción de lotes clínicos de TIL.
Términos y definiciones clave
|jg - Microgramo
|jl - Microlitro
AIM-V - cabina de seguridad biológica de medio de cultivo celular disponible comercialmente
BSC - Clúster de diferenciación
CD - Medio completo para TIL # 2
CM2 - CM2 suplementado con 3000 UI/ml de IL-2
CM2IL2 - Organización de fabricación por contrato
CO<2>- Dióxido de carbono
EtOH - Etanol
GMP - Buenas prácticas de fabricación
Gy - Gris
IL - Interleucina
IU - Unidades internacionales
LN2 - Nitrógeno líquido
MI - mililitro
NA - No aplica
OKT3: designación de anticuerpo monoclonal anti-CD3
P20 - pipeta 2-20|jl
P200 - pipeta de 20-200 j l
PBMC - células mononucleares de sangre periférica
P1000 - pipeta de 100-1000jl
EPI - Equipo de protección personal
REP - Protocolo de expansión rápida
SDBB - Banco de sangre de San Diego
TIL - Linfocitos infiltrantes de tumores
T25 - Matraz de cultivo de tejidos de 25cm2
x g - "multiplicado por la gravedad" - medida de la fuerza centrífuga relativa
Las muestras incluyen PBMC de donantes irradiados (SDBB).
Procedimiento
Antecedentes
7.1.1 Se requirieron PBMC irradiadas con rayos gamma, con crecimiento detenido para el REP estándar actual de TIL. Los receptores de membrana en las PBMC se unen al anticuerpo anti-CD3 (clon OKT3) y se reticulan con TIL en cultivo, lo que estimula la expansión de TIL. Se prepararon lotes de PBMC a partir de la leucaféresis de sangre entera extraída de donantes individuales. El producto de leucaféresis se sometió a centrifugación sobre Ficoll-Hypaque, se lavó, se irradió y se crioconservó en condiciones de GMP.
Es importante que los pacientes que recibieron terapia con TIL no reciban una infusión de PBMC viables, ya que esto podría provocar la enfermedad de injerto contra huésped (EICH). Por lo tanto, el crecimiento de las PBMC de donantes se detiene mediante la dosificación de las células con irradiación gamma, lo que da como resultado roturas del ADN bicatenario y la pérdida de la viabilidad celular de las PBMC tras el recultivo.
Criterios de evaluación
7.2.1 El criterio de evaluación para lotes de PBMC irradiados fue su incompetencia de replicación.
Configuración experimental
7.3.1 Los lotes de alimentadoras se probaron en formato mini-REP como si fueran a co-cultivarse con TIL, utilizando matraces de cultivo de tejidos T25 verticales.
7.3.1.1 Lote de control: Un lote de PBMC irradiadas, que se había demostrado históricamente que cumplían con el criterio de 7.2.1, se ejecutó junto con los lotes experimentales como control.
7.3.2 Para cada lote de PBMC de donantes irradiados analizados, se ejecutaron matraces por duplicado. Protocolo experimental
Todo el trabajo de cultivo de tejidos en este protocolo se realizó utilizando una técnica estéril en una BSC. Día 0
7.4.1 Se prepararon ~90 ml de medio CM2 para cada lote de PBMC del donante que debe analizarse. Mantener CM2 caliente en un baño de agua a 37°C.
7.4.2 Se descongeló una alícuota de<6>x 10<6>UI/ml de IL-2.
7.4.3 Se devolvió el medio CM2 a la BSC, limpiando con EtOH al 70% antes de colocarlo en la campana. Para cada lote de PBMC analizado, se extrajo alrededor de 60 ml de CM2 a una botella estéril separada. Se agregó IL-2 de la solución madre descongelada de 6 x 106 UI/ml a este medio para una concentración final de 3000 UI/ml. Se etiquetó esta botella como "CM2/IL2" (o similar) para distinguirla del CM2 sin suplementar.
7.4.4 Etiquetados dos matraces T25 por cada lote de PBMC que se va a analizar. Etiqueta mínima incluida: 7.4.4.1 Número de lote
7.4.4.2 Número de matraz (1 o 2)
7.4.4.3 Fecha de inicio del cultivo (día 0)
Preparar OKT3
7.4.5 Se extrajo la solución madre de anti-CD3 (OKT3) del refrigerador a 4°C y se colocó en la BSC.
7.4.6 Se utilizó una concentración final de 30 ng/mL de OKT3 en el medio del mini-REP.
7.4.7 Se preparó una solución de trabajo de 10 pg/ml de anti-CD3 (OKT3) a partir de la solución madre de 1 mg/ml. Colocar en el refrigerador hasta necesitarse.
7.4.7.1 Para cada lote de PBMC analizado, preparar 150 pl de una dilución 1:100 de la solución madre anti-CD3 (OKT3)
Por ejemplo, para analizar 4 lotes de PBMC a la vez, preparar 600 pl de 10 pg/ml de anti-CD3 (OKT3) agregando 6 pl de la solución madre de 1 mg/ml a 594 pl de CM2 suplementado con 3000 UI/ml de IL-2. Preparar matraces
7.4.8 Se añadieron 19 ml por matraz de CM2/IL-2 a los matraces T25 etiquetados y se colocaron los matraces en una incubadora de CO<2>al 5% humidificada a 37°C mientras se preparaban las células.
Preparar PBMC irradiadas
7.4.9 Se trabajó con cada lote de PBMC de donante individualmente para evitar la posible contaminación cruzada de los lotes.
7.4.10 Viales recuperados de lotes de PBMC que se analizarán a partir del almacenamiento de LN2. Estos se colocaron a -80°C o se mantuvieron en hielo seco antes de descongelarlos.
7.4.11 Se colocan 30 ml de CM2 (sin suplemento de IL-2) en tubos cónicos de 50 ml para cada lote a descongelar. Se etiquetó cada tubo con los diferentes números de lote de PBMC a descongelar. Se taparon de manera ajustada los tubos y se colocaron en un baño de agua a 37°C antes de usarlos. Según era necesario, se devolvieron los tubos cónicos de 50 ml a la BSC, limpiando con EtOH al 70% antes de colocarlos en la campana.
7.4.12 Se extrajo un vial de PBMC del almacenamiento en frío y se colocó en un estante de tubos flotantes en un baño de agua a 37°C para descongelarlo. Se dejó que continúe la descongelación hasta que quede una pequeña cantidad de hielo en el vial.
7.4.13 Vial descongelado rociado o limpiado con EtOH al 70% y transferido a BSC.
7.4.14 Con una pipeta de transferencia estéril, se transfirieron inmediatamente el contenido del vial a los 30 ml de CM2 en el tubo cónico de 50 ml. Se retiró alrededor de 1 ml de medio del tubo para enjuagar el vial; volvió a enjuagar al tubo cónico de 50 ml. Se tapó herméticamente y se agitó suavemente para lavar las células. 7.4.15 Se centrifuga a 400 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
7.4.16 Se aspiró el sobrenadante y se resuspendió el sedimento celular en 1 ml de CM2/IL-2 caliente usando una punta de pipeta de 1000 pl. Alternativamente, antes de agregar el medio, se resuspendió el sedimento celular arrastrando el tubo tapado a lo largo de una gradilla de tubos vacía. Después de resuspender el sedimento celular, se llevó el volumen a 4 ml usando medio CM2/IL-2. Volumen grabado.
7.4.17 Se eliminó una pequeña alícuota (por ejemplo, 100 pl) para el recuento celular usando un contador celular automatizado.
7.4.17.1 Recuentos realizados por duplicado de acuerdo con el POE del contador celular automatizado particular. Lo más probable es que fuera necesario realizar una dilución de las PBMC antes de realizar los recuentos de células. Una dilución inicial recomendada era 1:10, pero variaba según el tipo de contador de células utilizado.
7.4.17.2 Registrados los recuentos.
7.4.18 Concentración ajustada de PBMC a 1.3 x 107 células/ml según la hoja de trabajo en la etapa 7.4.15.2 usando medio CM2/IL-2. Mezclar bien agitando suavemente o aspirando suavemente hacia arriba y hacia abajo con una pipeta serológica.
Configurar matraces de cultivo
7.4.19 Se devolvieron dos matraces T25 etiquetados a la BSC desde la incubadora de cultivo de tejidos. 7.4.20 Se devolvió el vial de 10 pg/ml de anti-CD3/OKT3 a la BSC.
7.4.21 Se agregó 1 ml de la suspensión de células de PBMC 1.3 x 107 a cada matraz.
7.4.22 Se agregaron 60 pl de anti-CD3/OKT3 de 10 pg/ml a cada matraz.
7.4.23 Se devolvieron los matraces tapados a las incubadoras de cultivo de tejidos durante 14 días de crecimiento sin alteraciones.
7.4.24 Se volvió a colocar el vial de anti-CD3/OKT3 en el refrigerador hasta necesitarse para el siguiente lote.
7.4.25 Se repitieron las etapas 7.4.9 - 7.4.24 para cada lote de PBMC a evaluar.
Día 14, Medición de la no proliferación de PBMC
7.4.26 Trabajando con cada lote de forma independiente, se devolvieron cuidadosamente los matraces T25 duplicados a la BSC.
7.4.27 Para cada matraz, utilizando una pipeta serológica nueva de 10 ml, se extrajo ~17 ml de cada uno de los matraces y, más adelante, se extrajo con cuidado el medio restante para medir el volumen restante en los matraces. Volumen registrado.
7.4.28 Muestra bien mezclada pipeteando hacia arriba y hacia abajo usando la misma pipeta serológica. 7.4.29 Se extrajo una muestra de 200 pl de cada matraz para el recuento.
7.4.30 Células contadas usando un contador de células automatizado.
7.4.31 Se repitieron las etapas 7.4.26 - 7.4.31 para cada lote de PBMC que se evalúa.
RESULTADOS Y CRITERIO DE ACEPTACIÓN
Resultados
10.1.1 Se esperaba que la dosis de irradiación gamma fuera suficiente para hacer que la replicación de las células alimentadoras fuera incompetente. Se esperaba que todos los lotes cumplieran con el criterio de evaluación, que demostró una reducción en el número total viable de células alimentadoras restantes en el día 14 del cultivo de REP en comparación con el día 0.
Criterio de aceptación
10.2.1 Se cumplieron los siguientes criterios de aceptación para cada lote de PBMC donante irradiado analizado:
10.2.2 "Sin crecimiento" - significaba que el número total de células viables el día 14 era menor que el número de células viables inicial puesto en cultivo el día 0 del REP.
10.2.3 Si un lote no cumple con el criterio anterior, el lote se volvió a analizar según el Procedimiento de prueba de contingencia descrito en la sección 10.4.
10.2.4 Después de repetir la prueba de un lote fallido, se excluyó cualquier lote de alimentadoras de MNC que no cumpliera con el criterio de aceptación tanto en la evaluación original como en la prueba de contingencia. Pruebas de contingencia de lotes de PBMC que no cumplen con el criterio de aceptación.
10.4.1 En el caso de que un lote de PBMC de un donante irradiado no cumpliera con el criterio de aceptación anterior, se tomaron las siguientes etapas para volver a analizar el lote y descartar un error simple del experimentador como la causa de su falla.
10.4.2 Si quedaban dos o más viales satélite del lote, el lote se volvió a analizar. Si hay uno o ningún vial satélite restante del lote, entonces el lote falló de acuerdo con el criterio de aceptación de la sección 10.2 anterior. 10.4.3 Siempre que fuera posible, dos personas capacitadas (preferiblemente incluida la persona original que evaluó el lote en cuestión) realizaron las pruebas de los dos viales separados de forma independiente. Este fue el procedimiento preferido de prueba de contingencia. Aparte de los viales separados de PBMC, ambos miembros del personal podrían utilizar los mismos reactivos.
10.4.3.1. Si no había dos miembros del personal disponibles, una persona realizaba la prueba de los dos viales de PBMC para el lote fallido, trabajando con cada vial de forma independiente.
10.4.4 Se repitió la sección 7.4 "Protocolo experimental" para reevaluar el lote en cuestión.
10.4.5 Además del lote en cuestión, cada persona que realizaba las pruebas de contingencia probó un lote de control.
10.4.5.1 Si dos miembros del personal realizan pruebas de contingencia, ambos miembros del personal probaron el lote de control de forma independiente.
10.4.5.2 Si solo hay una persona disponible para realizar las pruebas de contingencia, no es necesario que el lote de control se ejecute por duplicado.
10.4.5.3 Para ser calificado, un lote de PBMC que pasa por pruebas de contingencia tenía el lote de control y ambas réplicas del lote en cuestión lograron que pasara el criterio de aceptación de la Sección 10.2.
10.4.5.4 Una vez cumplido este criterio, el lote se entregó para uso de CMO como se describe en la sección 10.2.
EJEMPLO 15:CITÓMETRO DE IMAGEN CONTADOR CELULAR AUTOMÁTICO CELLOMETER IC2 Este ejemplo describe el procedimiento para el funcionamiento del contador celular automático del citómetro de imagen Cellometer K2.
1. Definiciones
pl: microlitro
AOPI: yoduro de propidio de naranja acridina
BSC: Cabina de seguridad biológica
DPBS: solución salina con pH regulado con fosfato de Dulbecco
ml: mililitro
MNC: células sanguíneas mononucleares
NA: No aplica
PBMC: células mononucleares de sangre periférica
EPI: equipo de protección personal
Pre-REP: cultivo TIL inicial antes del Protocolo de expansión rápida del cultivo
REP: Protocolo de expansión rápida
TIL: linfocitos infiltrantes de tumores
7. Procedimiento
7.1 Preparación de la suspensión celular
7.1.1 Preparación de azul de tripán
La concentración final de azul de tripán fue del 0.1%. El fabricante recomendó preparar una solución madre al 0.2%.
7.1.1.1 Cuando utilice azul tripán en el Cellometer K2, diluir la solución madre (0.4%) con PBS al 0.2%.
7.1.1.2 Se filtró el azul tripán con un filtro de 0.2 a 0.4 micrones y se colocaron alícuotas en pequeños volúmenes en tubos con tapa y etiquetados.
7.1.1.3 Se mezcló la suspensión celular a 1:1 con azul tripán al 0.2%.
7.1.2 Preparación de AOPI
7.1.2.1 Al usar AOPI en el Cellometer K2, se obtuvo la solución de AOPI.
7.1.2.2 Muestra de células teñidas a 1: 1 con solución de AOPI.
NOTA: Al contar cultivos de alta concentración, diluir las muestras de células en medio de cultivo celular antes de la dilución final 1:1 con azul de tripán o AOPI. Se utilizó el intervalo de recuento sugerido por el fabricante para determinar la mejor dilución a utilizar.
7.2 Configuración del Cellometer K2
7.2.1 Encendido del equipo Cellometer K2.
7.2.2 Se seleccionó el icono Citómetro de imagen de Cellometer en el monitor de ordenador asociado.
7.2.3 En la pantalla principal del software, seleccionar uno de los ensayos enumerados en el cuadro desplegable.
7.2.3.1 Al seleccionar el ensayo apropiado, el tipo de célula y el modo de imagen se autocompletan.
7.2.3.2 En la sección "Muestra", se hizo clic en Establecer ID de usuario/muestra para abrir otra pantalla para ingresar la información del operador para la muestra.
7.2.3.2.1 Ingresó de "ID de usuario". Consistirá en las iniciales de tres letras del usuario.
7.2.3.2.2 Ingresó de "ID de muestra". La identificación de la muestra se deriva de la información de la muestra entrante.
7.2.3.3 Configurar los parámetros de dilución.
7.2.3.3.1 Si no se hizo ninguna otra dilución además de la mezcla 1: 1, el factor de dilución fue 2.
7.2.3.3.2 Si se hizo una dilución antes de la mezcla final 1: 1, el factor de dilución fue 2 veces mayor que la dilución anterior.
7.2.3.3.3 Factor de dilución actualizado según la mezcla utilizada en la sección de dilución de la pantalla. Se hizo clic en el icono del lápiz para que aparecieran las pantallas de diálogo.
7.2.3.3.4 Se verificó que las secciones Imagen F1 e Imagen F2 son idénticas entre sí.
7.2.3.3.5 Se hizo clic en el botón "Guardar" después de que se hubiera completado la configuración.
7.3 Recuento de células
7.3.1 Se quito el respaldo de plástico de ambos lados de un portaobjetos de la cámara de recuento del Cellometer (SD100) y se colocó sobre una toallita limpia que no suelte pelusa.
7.3.2 Después de preparar la suspensión celular, se extrajo una pequeña alícuota de la muestra y se transfirió a un pocillo de una placa o tubo de cultivo celular multipocillo.
7.3.3 Si se diluye la muestra, se realizó la dilución con medio de cultivo celular.
7.3.4 Se agregaron 20 III de suspensión celular en un pocillo de la placa o tubo de cultivo celular multipocillo.
7.3.5 Se agregaron 20 111 de azul de tripán al 0.2% o la solución de AOPI a la suspensión celular 20111 y se mezcló la muestra a fondo.
7.3.6 Se midieron 20 IA de la solución 1:1 y se transfirieron a un lado de la cámara de recuento.
NOTA: Evitar tocar el área despejada de la diapositiva.
7.3.7 Si es necesario, repetir la muestra en el otro lado del portaobjetos. 7.3.8. Se insertó la cámara en la ranura en la parte frontal del Cellometer.
7.3.8 Para el recuento de células AOPI, se hizo clic en "Vista previa F1" en la pantalla principal para obtener una vista previa de la imagen verde fluorescente (célula viva). Para el recuento de azul tripán, se hizo clic en "Vista previa Brightfield".
7.3.9 Usando la rueda de enfoque, se llevó la imagen a un enfoque óptimo. Las células tenían un centro brillante y un borde claramente definido.
7.3.10 Se hizo clic en "Contar" para comenzar el procedimiento de recuento.
7.3.11 Los resultados se mostraron en un cuadro emergente de resultados de recuento en la pantalla de el ordenador que mostraba los resultados del procedimiento de recuento.
EJEMPLO 16:PREPARACIÓN DE LA SOLUCIÓN MADRE DE IL-2 (CELLGENIX)
Este ejemplo describe el procedimiento de disolución de interleucina-2 humana recombinante liofilizada purificada en muestras de solución madre adecuadas para su uso en protocolos de cultivo de tejidos adicionales, incluidos todos los descritos en la presente solicitud y los ejemplos, incluidos los que implican el uso de rhIL-2.
3. Definiciones/Abreviaturas
|jL: microlitro
BSC: Cabina de seguridad biológica
BSL2: Nivel de bioseguridad 2
D-PBS: solución salina con pH regulado con fosfato de Dulbecco
G: calibre
GMP: Buenas prácticas de manufactura
HAc: ácido acético
HSA: Albúmina de suero humano
mL: mililitro
NA: No aplica
EPI: equipo de protección personal
rhIL-2; IL-2: Interleucina-2 humana recombinante
COA: Certificado de análisis
6. Procedimiento
6.1 Preparar una solución de ácido acético al 0.2% (HAc).
6.1.1 Se transfirieron 29 ml de agua estéril a un tubo cónico de 50 ml.
6.1.2 Se agregó 1 ml de ácido acético de IN al tubo cónico de 50 ml.
6.1.3 Se mezcló bien invirtiendo el tubo 2-3 veces.
6.1.4 Se esterilizó la solución de HAc mediante filtración con un filtro Steriflip.
6.1.5 Tapar, fechar y etiquetar la solución "Solución estéril de ácido acético al 0.2%".
6.1.6 La solución caducó a los 2 meses. Almacenada a temperatura ambiente.
6.2 Preparar HSA al 1% en PBS.
6.2.1 Se agregaron 4 ml de solución madre de HSA al 25% a 96 ml de PBS en una unidad de filtro estéril de 150 ml.
6.2.2 Solución filtrada.
6.2.3 Tapar, fechar y etiquetar la solución "HSA al 1% en PBS".
6.2.4 La solución caducó a los 2 meses. Conservar a 4°C.
6.3 Por cada vial de rhIL-2 preparado, completar los formularios.
6.4 Solución madre de rhIL-2 preparada (concentración final de 6 x 106 UI/ml)
6.4.1 Cada lote de rh1L-2 era diferente y la información requerida se encontraba en el Certificado de análisis (COA) del fabricante, como:
6.4.1.1 Masa de rhIL-2 por vial (mg)
6.4.1.2 Actividad específica de rhIL-2 (UI/mg)
6.4.1.3 Volumen de reconstitución recomendado de HAc al 0.2% (ml)
6.4.2 Se calculó el volumen de HSA al 1% requerido para el lote de rhIL-2 utilizando la siguiente ecuación:
6.4.2.1 Por ejemplo, según el COA rhIL-2 lote 10200121 de CellGenix, la actividad específica para el vial de 1 mg es de 25 x 106 lU/mg. Se recomienda reconstituir el rhIL-2 en 2 ml de HAc al 0.2%.
6.4.3 Tapón de goma limpiado del vial de IL-2 con una toallita con alcohol.
6.4.4 Con una aguja de 16G conectada a una jeringa de 3 ml, inyectar el volumen recomendado de 0.2% de HAc en el vial. Tener cuidado de no sacar el tapón al retirar la aguja.
6.4.5 Vial invertido 3 veces y agitado hasta que todo el polvo se disuelva.
6.4.6 Se retiró con cuidado el tapón y se dejó a un lado sobre una toallita con alcohol.
6.4.7 Se agregó el volumen calculado de HSA al 1% al vial.
6.4.8 Tapar el vial con el tapón de goma.
6.5 Almacenamiento de solución de rhIL-2
6.5.1 Para almacenamiento a corto plazo (<72 horas), vial almacenado a 4°C.
6.5.2 Para almacenamiento a largo plazo (> 72 horas), el vial se dividió en alícuotas en volúmenes más pequeños y se almacenó en crioviales a -20°C hasta que estar listo para usar. Ciclos de congelación/descongelación evitados. Caducó 6 meses después de la fecha de preparación.
6.5.3 Las etiquetas de Rh-IL-2 incluyeron el número de proveedor y de catálogo, el número de lote, la fecha de vencimiento, las iniciales del operador, la concentración y el volumen de la alícuota.
EJEMPLO 17:PREPARACIÓN DE MEDIOS PARA PROCEDIMIENTOS PRE-REP Y REP
Este ejemplo describe el procedimiento para la preparación de medios de cultivo de tejidos para su uso en protocolos que implican el cultivo de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) derivados de varios tipos de tumores que incluyen, entre otros, melanoma metastásico, carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello. (HNSCC), carcinoma de ovario, carcinoma de mama triple negativo y adenocarcinoma de pulmón. Este medio puede usarse para la preparación de cualquiera de los TIL descritos en la presente solicitud y en los Ejemplos.
3. Definición
|jg: microgramo
|jm: micrómetro
jM: micromolar
AIM-V®: medio de cultivo de tejidos sin suero (Thermo Fisher Scientific)
BSC: Cabina de seguridad biológica
CM1: Medio completo No.1
CM2: Medio completo No.2
CM3: Medio completo No.3
CM4: Medio completo No.4
IU o U: Unidades internacionales
ml: mililitro
mM: milimolar
NA: no aplica
EPI: equipo de protección personal
Pre-REP: procedimiento de expansión rápida previa
REP: Procedimiento de expansión rápida
rhIL-2, IL-2: interleucina-2 humana recombinante
RPMI1640: Medio del Roswell Park Memorial Institute, formulación 1640
POE: procedimiento operativo estándar
TIL: linfocitos infiltrantes de tumores
7. Procedimiento
7. Procedure
7.1 Todos los procedimientos se realizan utilizando una técnica estéril en una BSC (Clase II, Tipo A2).
7.1.1 Rociar la superficie de la campana con etanol al 70% antes de su uso.
7.1.2 Rociar todos los elementos y reactivos con etanol al 70% antes de colocarlos en la campana de cultivo de tejidos.
7.2 Alícuota de L-glutamina 200 mM
7.2.1 Se suministró L-glutamina en volúmenes mayores que los necesarios para la preparación de suero (por ejemplo, volúmenes de 100 ml o 500 ml).
7.2.2 Botella descongelada de L-glutamina en baño de agua a 37°C.
7.2.3 Mezclar bien L-glutamina después de descongelar, ya que precipita después de descongelar. Se aseguró de que todos los precipitados hubieran vuelto a la solución antes de la alícuota.
7.2.4 Colocar alícuotas de 5-10 ml de L-glutamina en tubos cónicos estériles de 15 ml.
7.2.5 Tubos etiquetados con concentración, proveedor, número de lote, fecha de alícuota y fecha de vencimiento.
7.2.6 Más adelante, los tubos se almacenaron a -20°C y se extrajeron según fuera necesario para la preparación del medio.
7.3 Preparación de CM1
7.3.1 Se sacaron los siguientes reactivos del almacenamiento en frío y se calentaron en un baño de agua a 37°C:
7.3.1.1 RPMI1640
7.3.1.2 Suero AB humano
7.3.1.3 L-glutamina 200 mM
7.3.2 Se retiró el BME del almacenamiento a 4°C y se colocó en una campana de cultivo de tejidos.
7.3.3 Se colocó la solución madre de gentamicina almacenada a temperatura ambiente en una campana de cultivo de tejidos.
7.3.4 Se preparó el medio CM1 de acuerdo con la Tabla 23 más adelante, agregando cada uno de los ingredientes en la sección superior de una unidad de filtro de 0.2 um apropiado para el volumen a filtrar.
TABLA 23. Preparación de CM1
7.3.5 Se etiquetó el matraz del medio CM1 con su nombre, las iniciales del preparador, la fecha en que se filtró/preparó, la fecha de vencimiento de dos semanas y se almacenó a 4°C hasta que fuera necesario para el cultivo de tejidos. Los medios se pueden dividir en alícuotas en botellas de menor volumen según fuera necesario.
7.3.6 Cualquier RPMI1640 restante, suero AB humano o L-glutamina se almacenó a 4°C hasta la siguiente preparación del medio.
7.3.7 La botella de reserva de BME se volvió a almacenar a 4°C.
7.3.8 La botella de reserva de gentamicina se devolvió a su ubicación adecuada de almacenamiento a temperatura ambiente.
7.3.9 Debido a la limitada capacidad amortiguadora del medio, el CM1 se descartó no más de dos semanas después de la preparación, o cuando el indicador de pH con rojo fenol mostró un cambio extremo en el pH (coloración de rojo brillante a rosa).
7.3.10 El día de uso, precalentar la cantidad requerida de CM1 en un baño de agua a 37°C y agregar 6000 UI/ml de IL-2.
7.3.11 Suplementación adicional, según fuera necesario
7.3.11.1 CM1 suplementado con GlutaMAX®
7.3.11.1.1 CM1 podría prepararse sustituyendo 2 mM GlutaMAXTM por 2 mM de glutamina (concentración final, véase la Tabla 2.) Si se hizo esto, se etiquetaron la botella de medio como en la etapa 7.3.5 anterior agregando "2 mM GlutaMAX" para evitar confusiones con la formulación estándar de CM1.
7.3.11.2 CM1 suplementado con antibiótico/antimicótico adicional
7.3.11.2.1 Algunas formulaciones de CM1 requieren antibióticos o antimicóticos adicionales para evitar la contaminación de TIL pre-REP que crecen a partir de ciertos tipos de tumores.
7.3.11.2.2 Se agregó antibiótico/antimicótico a las concentraciones finales que se mostraron en la Tabla 24 más adelante.
7.3.11.2.3 Si se hizo esto, se etiquetó el matraz del medio como en la etapa 7.3.1 anterior agregando el nombre o los nombres del antibiótico/antimicótico adicional para evitar confusión con la formulación estándar de CM1.
TABLA 24. Suplementación adicional de CM1, según fuera necesario.
7.4 Preparación de CM2
7.4.1 Retirar el CM1 preparado del refrigerador o preparar CM1 fresco como se indica en la Sección 7.3 anterior.
7.4.2 Retirado AIM-V® del refrigerador.
7.4.3 Se preparó la cantidad de CM2 necesaria mezclando el CM1 preparado con un volumen igual de AIM-V® en una botella de medio estéril.
7.4.4 Se agregaron 3000 UI/ml de IL-2 al medio CM2 el día de su uso.
7.4.5 Se preparó una cantidad suficiente de CM2 con 3000 UI/ml de IL-2 el día de su uso.
7.4.6 Se etiquetó la botella de medio CM2 con su nombre, las iniciales del preparador, la fecha en que se filtró/preparó, la fecha de vencimiento de dos semanas y almacénela a 4°C hasta que se necesite para el cultivo de tejidos. Los medios se dividieron en alícuotas en botellas de volumen más pequeño según se requirió. 7.4.7 Se devolvió cualquier CM2 sin IL-2 al refrigerador donde se puede almacenar hasta por dos semanas, o hasta que el indicador de pH rojo fenol muestre un cambio extremo en el pH (coloración de rojo brillante a rosa).
7.5 Preparación de CM3
7.5.1 Se preparó CM3 el día en que se requirió su uso.
7.5.2 CM3 era el mismo que el medio AIM-V®, suplementado con 3000 UI/ml de IL-2 el día de su uso.
7.5.3 Se preparó una cantidad de CM3 suficiente para las necesidades experimentales agregando la solución madre de IL-2 directamente a la botella o bolsa de AIM-V. Se mezcló bien con una suave agitación. Se etiquetaron el matraz con "3000 UI/ml de IL-2" inmediatamente después de agregarlo al AIM-V. Si hubo exceso de CM3, guárdelo en matraces a 4°C etiquetados con el nombre del medio, las iniciales del preparador, la fecha en que se preparó el medio y su fecha de caducidad (7 días después de la preparación).
7.5.4 Medios desechados suplementados con IL-2 después de 7 días de almacenamiento a 4°C.
7.6 Preparación de CM4
7.6.1 CM4 era igual que CM3, con el suplemento adicional de GlutaMAXTM 2 mM (concentración final). 7.6.1.1 Por cada 1 litro de CM3, se agregaron 10 ml de GlutaMAXTM 200 mM.
7.6.2 Se preparó una cantidad de CM4 suficiente para las necesidades experimentales agregando solución madre de IL-2 y solución madre de GlutaMAXTM directamente a la botella o bolsa de AIM-V. Se mezcló bien con una suave agitación.
7.6.3 Matraz etiquetado con "3000 IL/nil de IL-2 y GlutaMAX" inmediatamente después de agregarlo al AIM-V.
7.6.4 Si hubo exceso de CM4, guardar en botellas a 4°C etiquetadas con el nombre del medio, "GlutaMAX", las iniciales del preparador, la fecha en que se preparó el medio y su fecha de caducidad (7 días después de la preparación).
7.6.5 Medios desechados suplementados con IL-2 después de 7 días de almacenamiento a 4°C.
EJEMPLO 18:TINCIÓN SUPERFICIAL CON ANTÍGENO DE POST REP TIL
1. PROPÓSITO
El ejemplo describe el procedimiento para la tinción de la superficie celular de post-REP TIL mediante citometría de flujo. Este procedimiento se puede aplicar a cualquier TIL descrito en la aplicación y los Ejemplos.
TÉRMINOS Y DEFINICIONES CLAVE
a: Alfa
p: Beta
|jl: Microlitro
APC: Aloficocianina
Ax647: Alex Fluor 647
BD: Becton Dickinson Company
BSA: Albúmina de suero bovino
BSC: Cabina de seguridad biológica
BV421: Violeta brillante 421
CD: Clúster de diferenciación
CST: configuración y seguimiento del citómetro
Cy: cianina
DPBS: Solución salina con pH regulado con fosfato de Dulbecco
FACS: Clasificador de células activado por fluorescencia
FBS: Suero fetal bovino
FITC: Isotiocianato de fluoresceína
FMO: Fluorescencia menos uno
G: gramo
H7: Análogo de Cy7
ml: mililitro
PE: Ficoeritrina
PerCP-Cy5.5: Proteínas peridinina-clorofila
EPI: Equipo de protección personal
REP: Protocolo de expansión rápida
SIT: Tubo de inyección de muestra
TCR: Receptor de células T
p/v: peso a volumen
Anticuerpos y tinciones de citometría de flujo
TABLA 25: ThermoFisher de tinción de agua viva/muerta, catálogo n.o L34966.
7. PROCEDIMIENTO
7.1 Preparación de reactivos
7.1.1 Regulador de pH de lavado FACS
7.1.1.1 Se agregó FBS inactivado por calor al 2% (p/v) a DPBS (se agregaron 10 ml de FBS a 490 ml de IX dPBS).
7.1.1.2 Se agregó N aN al 0.1% (p/v) (botella de 76,9 ul a 500 ml).
7.1.1.3 La solución se almacenó a 40°C. Desechar después de 30 días.
7.1.2 Tinte de agua
7.1.2.1 Se agregaron 50 pl de DMSO al vial de colorante reactivo.
7.1.2.2 Mezclar bien y confirmar visualmente que todo el tinte se hubiera disuelto.
7.1.2.3 El tinte que no se utilizó para el procedimiento se dividió en alícuotas y se congeló a 20°C hasta el siguiente uso. No se congeló/descongeló por segunda vez.
7.1.3 Preparación del cóctel de anticuerpos.
7.1.3.1 Los cócteles se prepararon en tubos de polipropileno como un tubo Eppendorf
7.1.3.2 Los cócteles se almacenaron hasta por 6 meses.
Tabla 26: Panel de diferenciación 1 (DF1):
Tabla 27: Panel de diferenciación 2 (DF2):
Tabla 28: Panel de activación de células T (Tact 1)
Tabla 29: Panel de activación de células T (Tact 2)
7.2 Requisitos del ensayo de citometría de flujo
7.2.1 Calibración del citómetro de flujo
7.2.1.1 El citómetro de flujo se calibró el día del ensayo utilizando perlas de CST siguiendo las instrucciones del fabricante.
7.2.1.2 El operador se aseguró de que el citómetro de flujo hubiera pasado la calibración, donde las comprobaciones de rendimiento y de referencia son válidas.
7.2.2 Controles de compensación/FMO
7.2.2.1 Se prepararon muestras de compensación de un solo color utilizando las perlas de compensación BD y el kit de perlas de compensación reactiva de amina ArCTM.
7.2.2.2 Control de FMO, las muestras que contienen células se tiñeron con un cóctel de anticuerpos menos el siguiente conjugado de anticuerpo único, CD27, CD28 y CD57.
7.2.3 Estandarización de IMF
7.2.3.1 Los voltajes del citómetro se determinaron diariamente con un control de perlas y valores de voltaje objetivo.
7.3 Tinción de la muestra
7.3.1 Tubo FACS etiquetado con la muestra ID-DF1, muestra ID-DF2, muestra ID-T1, muestra ID-T2.
7.3.2 Etiquetado un conjunto de controles FMO con CD27-APC-H7, CD28-PE, CD57-PerCPCy5.5, CD45RA-PECy7, CCR7-PE, CD38-APC, CD137-PE7, Lag3-PE, PD1 APC, Tim3-BV421, CD69-PE7, TIGIT-PE, KLRG1-Ax647, y CD154-BV421.
7.3.3 Se agregaron de 0.5 a 2 millones de células a cada tubo.
7.3.4 QS a 3 ml de 1xPBS en cada tubo.
7.3.5 Hacer girar los tubos a 400 x g, alta aceleración y frenado, durante 5 minutos.
7.3.6 Mientras se centrifugaban las muestras, se preparó el tinte Aqua de etiquetado de células muertas. 7.3.7 Se retiró una alícuota de Aqua del congelador y se diluyó 1/200 en PBS. Mantener oscuro. Se agregaron 2 ul de tinte a 198 ul de DPBS.
7.3.8 Se decantó o aspiró el sobrenadante de la etapa 7.3.5.
7.3.9 Se agregaron 25 ul de la solución Aqua de arriba a las muestras y controles de FMO.
7.3.10 Se incubó durante 15 minutos a temperatura ambiente (RT) en la oscuridad.
7.3.11 Nota: Si las células se almacenaron inicialmente en un medio libre de proteínas, se debe agregar una etapa de bloqueo, como 5 ul de TruStain durante 10 minutos a temperatura ambiente.
7.3.12 Se agregaron 50 ul de cócteles de anticuerpos a los tubos correspondientes.
7.3.13 Se agitó la rejilla de tubos para mezclar.
7.3.14 Se incubó durante 15 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.
7.3.15 Registro de horas de inicio y finalización. Se agregaron 3 ml de regulador de pH de lavado FACS. 7.3.16 Tubos centrifugados a 400 x g, alta aceleración y frenado, durante 5 minutos.
7.3.17 Cuando se completó el centrifugado, se decantó o aspiró el sobrenadante.
7.3.18 Células resuspendidas deslizando los tubos a lo largo de una gradilla vacía.
7.3.19 Se agregaron 100 uL de paraformaldehído al 1% a cada tubo.
7.3.20 Almacenado a 40°C en la oscuridad hasta que estuviera listo para recolectarse en el citómetro de flujo. Nota: Las muestras se pueden almacenar hasta 72 horas.
7.4 Control de compensación LID Aqua.
7.4.1 Tubos FACS etiquetados como control de compensación LID Aqua.
7.4.2 Se agregó una gota de cuentas Arc al tubo.
7.4.3 Se agregaron 3 pl de LID Aqua directamente a las perlas.
7.4.4 Se incubaron los tubos a temperatura ambiente en la oscuridad durante 10 a 30 minutos.
7.4.5 Tiempo de incubación inicial y final registrado en la hoja de trabajo
7.4.6 Después de la incubación, se agregaron 3 ml de FACS Wash a cada tubo.
7.4.7 Tubos centrifugados a 400 x g, alta aceleración y frenado, durante 5 minutos.
7.4.8 Decantado o aspirado el sobrenadante.
7.4.9 Se resuspendieron los tubos con 500 pl de solución de PFA al 1%. Se agregó 1 gota de cuenta negativa. Colocar a 40°C en oscuridad hasta su recogida.
7.5 Tinción de control de compensación.
7.5.1 Tubos FACS etiquetados como se mostró en la hoja de trabajo Post-REP TIL Fenotipo.
7.5.2 Se agregaron los anticuerpos como se mostró en la hoja de trabajo Post-REP TIL Fenotipo.
7.5.3 Después de la incubación, se agregaron 3 ml de regulador de pH FACS a cada tubo.
7.5.4 Tubos centrifugados a 500 g, alta aceleración y frenado, durante 2 minutos.
7.5.5 Decantado o aspirado el sobrenadante.
7.5.6 Se resuspendieron los tubos con 500 |jl de PFA al 1% en PBS y se almacenaron a 2-80°C en la oscuridad.
7.6 Adquisición de datos
7.6.1 Software FACSDiva abierto e inicio de sesión.
7.6.2 En el cuadro de diálogo de discrepancia del citómetro, se hizo clic en "Usar configuración de CST". 7.6.3 Se creó un nuevo experimento haciendo clic en la pestaña "Experimento" y seleccionando la plantilla "Fenotipo extendido".
7.6.4 Se hizo doble clic en el experimento de valores objetivo y se ajustaron los voltajes para alcanzar los valores objetivo determinados por el operador del núcleo de flujo.
7.6.5
7.6.6 Se creó un espécimen para cada individuo y se nombró apropiadamente.
7.6.7 Se crearon nombres para las muestras de acuerdo con las etiquetas de sus tubos.
7.6.8 Se agitó suavemente con vórtex o se movió el dedo antes de colocar el tubo en el SIT.
7.6.9 Adquirir los datos bajo REGISTRO en el tablero de Adquisición.
7.6.10 Analizar las muestras a una velocidad de menos de 7,500 eventos por segundo.
7.6.11 Recopilar entre 50,000 y 100,000 eventos en vivo, excluidos los escombros.
EJEMPLO 19:PROCEDIMIENTO 2A DESARROLLO DEL PROCEDIMIENTO DE VERIFICACIÓN
Los experimentos de este ejemplo se completaron para analizar el procedimiento 2A para la fabricación de TIL a partir de tumores de melanoma derivados del paciente y un solo cáncer de mama que incluye el brote de TIL a partir de tumores en un procedimiento pre-REP, seguido de un REP modificado. Se hizo especial hincapié en el establecimiento de un producto TIL congelado y una comparación del rendimiento del producto TIL congelado con el procedimiento actual del producto TIL fresco (Procedimiento 1C). Este informe demostrará que se observan perfiles similares en la evaluación de atributos de calidad críticos frescos y descongelados (número de células, % de viabilidad, % de células T CD3+ y producción de interferón gamma estimulado por perlas (IFN-y)), así como un procedimiento fenotípico de reestimulación extendida (reREP) si el mismo producto TIL es fresco o congelado. Los datos presentados para apoyar esta conclusión incluyen proliferación, viabilidad, fenotipo, liberación de IFN-y, potencia, longitud de los telómeros y actividad metabólica. Los resultados caracterizan el Procedimiento 2A, un procedimiento pre-REP/REP abreviado seguido de la crioconservación de TIL y comparan el procedimiento 2A con el procedimiento 1C más largo, como se describe en el presente documento.
Las descripciones de los donantes de tumores, las fechas de tratamiento y las ubicaciones de tratamiento se pueden encontrar en la Tabla 1 más adelante (* indica que el REP se inició usando una línea de pre-REP TIL congelada):
Tabla 30: Descripción de donantes de tumores, fechas de tratamiento y ubicaciones de tratamiento.
3. INFORMACION DE ANTECEDENTES
3.1 LN-144 es un producto inmunoterapéutico para el tratamiento de pacientes con melanoma metastásico. El producto estaba compuesto por linfocitos T autólogos infiltrantes de tumores (TIL) obtenidos de un paciente individual después de la resección quirúrgica de un tumor y expandidos ex vivo mediante cultivo celular de fragmentos tumorales morcelados (pre-REP) seguido de expansión rápida de TIL en presencia de dosis altas de IL-2, anti-CD3 y APC coestimuladora. Después de un preacondicionamiento por depleción linfática no mieloablativa, el paciente recibió una única infusión de su TIL y posteriores infusiones intravenosas de aldesleucina (IL-2) cada 8 horas hasta un máximo de 6 dosis. El estudio que involucra procedimientos alternativos de expansión de TIL en la configuración de moléculas de patrón molecular asociado al daño (DAMP) dentro del microambiente tumoral (TNE) también ha demostrado una expansión eficaz de las células T útiles para la terapia (Donia 2014; Sommerville, 2012).
El Procedimiento 1C que se ha utilizado para la producción comercial de TIL implica un programa de producción que puede tardar entre -45 y 55 días en producir un producto de TIL infundible que se administra a un paciente inmunodeprimido en 24 horas. La inmunodepleción del paciente receptor debe sincronizarse con precisión con la recolección del producto TIL actual. Los retrasos en la recolección o la entrega del producto fresco pueden afectar negativamente a un paciente inmunodeprimido que espera la infusión. El procedimiento 2A mejoró tras el procedimiento 1C al reducir el plazo y los materiales de fabricación, debido a la reducción de la duración de los procedimientos de pre-REP y REP. Además, el Procedimiento 2A aumentó la flexibilidad para el tiempo de envío del producto. Las diferencias entre el Procedimiento 1C y el Procedimiento 2A en el pre-REP, REP y recolección del procedimiento (véase Tabla 2) incluyen:
3.1.1 Matraces más grandes con mayor capacidad de fragmentos tumorales utilizados en el procedimiento pre-REP.
3.1.2 Etapas que hicieron uso de un sistema cerrado o que son susceptibles de adaptación futura a un sistema cerrado.
3.1.3 Disminución del número de días en los procedimientos pre-REP y REP.
3.1.4 Un enfoque directo a REP, que eliminó la necesidad de fenotipar poblaciones pre-REP antes de seleccionar poblaciones específicas de pre-REP TIL para proceder a REP.
3.1.5 Un cocultivo con un número preestablecido de APC PBMC alogénicas irradiadas junto con anti-CD3 (clon OKT3) calculado para una expansión suficiente de TIL.
3.1.6 Un sistema de lavado celular automatizado para la recolección.
3.1.7 Una formulación final basada en CS10 que se conservó criogénicamente antes del envío.
Tabla 31: Impacto del procedimiento 2A en el procedimiento 1C.
4. ABREVIATURAS
|jg: microgramo
jl: microlitro
jm : micrómetro
APC: células presentadoras de antígeno
CD: Clúster de diferenciación
CM: memoria central
CM1, CM2: Medios de cultivo 1, 2
CO2: dióxido de carbono
CS10: medio de crioconservación CryoStor® CS10 (BioLife Solutions) Ct: ciclo umbral de PCR
DAMP: moléculas de patrón molecular asociado al daño
dCt: diferencia entre el valor Ct de referencia y el valor Ct de prueba ddCt: Diferencia entre el valor Ct estándar dCt y 10ng
ECAR: tasa de acidificación extracelular (medida de glucólisis)
EM: memoria efectora
ER+/PR+: Receptor de estrógeno+/Receptor de progesterona+
GMP: Buenas prácticas de fabricación
HBSS: solución salina equilibrada de Hanks
HSA: Albúmina de suero humano
IFN-y: interferón gamma
IL: interleucina
UI: unidades internacionales
LN2: nitrógeno líquido
Ml: mililitro
Mm: milímetro
ND: No determinado
Ng: Nanograma
°C: grados Celsius
OCR: tasa de consumo de oxígeno (medida de fosforilación oxidativa)
OKT3: designación de clon de anticuerpo monoclonal anti-CD3
PBMC: células mononucleares de sangre periférica
PD: Desarrollo de procedimientos
REP: Protocolo de expansión rápida
Rh: humano recombinante
POE: procedimiento operativo estándar
T/S: relación de número de copias repetidas de telómeros a número de copias de un solo gen
TIL: linfocito infiltrante de tumor
VDJ: segmentos variables, de diversidad y de unión del receptor de células T
Va, Vp: los segmentos de la región variable del receptor de células T maduras en el linfocito infiltrante de tumor predominante
|jg: microgramo
|jl: microlitro
jm : micrómetro
APC: células presentadoras de antígeno
CD: Clúster de diferenciación
CM: memoria central
CM1, CM2: Medios de cultivo 1, 2
CO2: dióxido de carbono
CS10: medio de crioconservación CryoStor® CS10 (BioLife Solutions)
Ct: ciclo umbral de PCR
DAMP: moléculas de patrón molecular asociado al daño
dCt: diferencia entre el valor Ct de referencia y el valor Ct de prueba
ddCt: Diferencia entre el valor Ct estándar dCt y 10ng
ECAR: tasa de acidificación extracelular (medida de glucólisis)
EM: memoria efectora
ER+/PR+: Receptor de estrógeno+/Receptor de progesterona+
GMP: Buenas prácticas de fabricación
HBSS: solución salina equilibrada de Hanks
HSA: Albúmina de suero humano
IFN-y: interferón gamma
IL: interleucina
UI: unidades internacionales
LN2: nitrógeno líquido
Ml: mililitro
Mm: milímetro
ND: No determinado
Ng: Nanograma
°C: grados Celsius
OCR: tasa de consumo de oxígeno (medida de fosforilación oxidativa)
OKT3: designación de clon de anticuerpo monoclonal anti-CD3
PBMC: células mononucleares de sangre periférica
PD: Desarrollo de procedimientos
REP: Protocolo de expansión rápida
Rh: humano recombinante
POE: procedimiento operativo estándar
T/S: relación de número de copias repetidas de telómeros a número de copias de un solo gen
TIL: linfocito infiltrante de tumor
VDJ: segmentos variables, de diversidad y de unión del receptor de células T
Va, Vp: los segmentos de la región variable del receptor de células T maduras en el linfocito infiltrante de tumor predominante
5. DISEÑO EXPERIMENTAL
5.1 Procedimiento 2A
5.1.1 Pre-REP: Una vez recibido, el tumor se transfirió a una cabina de seguridad biológica (Clase II, Tipo A2).
Utilizando una técnica estéril, el tumor se extrae del contenedor de envío y se lava en HBSS que contiene 50 |jg/ml de gentamicina. El técnico morcela el tumor en 40 fragmentos de 3X3X3 mm que se transfieren a un matraz G-REX - 100M que contiene medio CM1 precalentado suplementado con 6000 UI/ml de rhIL-2. El matraz se coloca en una incubadora de cultivo de tejidos humidificada con CO<2>al 5% a 37°C durante 11 días.
Si el tumor genera más de 40 fragmentos, entonces se puede configurar más de un G-REX -100M. Más adelante, las células se recogen y se preparan para el REP.
5.1.2 REP: El día 11, se prepara un matraz G-REX -500M que contiene 5L de CM2 suplementado con 3000 UI/ml de rhIL-2, 30ng/mL anti-CD3 (Clon OKT3) y 5 x 109 células alimentadoras PBMC alogénicas irradiadas.
Los TIL recolectados del matraz pre-REP G-REX -100M después de la reducción de volumen se cuentan y se siembran en el matraz G-REX -500M a una densidad que puede oscilar entre 5 x 106 y 200 x 106 células. Más adelante, el matraz se coloca en una incubadora humidificada de cultivo de tejidos con CO<2>al 5% a 37°C durante cinco días. El día 16, se reduce el volumen del matraz G-REX -500M, se cuentan los TIL y se determina su viabilidad. En este punto, los TIL se expanden en múltiples matraces G-REX -500M (hasta un máximo de seis matraces), cada uno con una densidad de siembra de 1 x 109 TII,/matraz. Más adelante, todos los matraces se colocan en incubadoras humidificadas de cultivo de tejidos con CO2 al 5% a 37°C durante seis días más. El día 22, el día de la recolección, el volumen de cada matraz se reduce en un 90%, las células se agrupan y se filtran a través de un filtro de sangre de 170 jm , y luego se recogen en una bolsa Origin EV3000 de 3 l o equivalente en preparación para el lavado automático usando el LOVO.
5.1.3 Recolección y formulación final: se lavan los TIL utilizando el sistema de tratamiento celular automatizado LOVO que reemplaza el 99.99% de los medios de cultivo celular con un regulador de pH de lavado que consiste en PlasmaLyte-A suplementado con 1% de HSA. El LOVO opera utilizando tecnología de membrana de filtración giratoria que recupera más de 92% de los TIL al tiempo que elimina virtualmente los componentes residuales del cultivo de tejidos, incluidos el suero, los factores de crecimiento y las citocinas, así como otros desechos y partículas. Una vez completado el lavado, se realiza un recuento de células para determinar la expansión del TIL y su viabilidad tras la recolección. Se agrega CS10 al TIL lavado en una relación volumen: volumen de 1:1 para lograr la formulación final del Procedimiento 2A. El producto formulado final se divide en alícuotas en bolsas de almacenamiento criogénico, se sella y se coloca en casetes de aluminio preenfriados. Las bolsas de almacenamiento criogénico que contienen TIL se congelan luego usando un congelador de velocidad controlada CryoMed (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) de acuerdo con POE LAB-018 Rev 000 Operación del congelador de velocidad controlada.
5.2 Muestras de TIL: Se recolectaron cuatro condiciones de TIL para la comparación de caracterización.
5.2.1 TIL recién recolectados (directo de PlasmaLyte-A con regulador de pH de lavado HSA al 1%) TIL descongelados (directo de la bolsa de producto final descongelado)
5.2.2 ReREP TIL de fenotipo extendido fresco (TIL recién recolectado cultivado durante 7-14 días con IL-2, alimentadoras de PBMC y clon anti-CD3 OKT3)
5.2.3 TIL de fenotipo extendido descongelado (TIL descongelado cultivado durante 7-14 días con IL-2, alimentadoras de p Bm C y clon anti-CD3 OKT3)
5.3 Descripción general de la prueba (véase la figura 2)
5.3.1 Las pruebas previas al REP incluyen la evaluación de la cantidad de IL-2 y el análisis de los metabolitos del cultivo celular como glucosa, ácido láctico, L-glutamina y amoníaco durante todo el período previo al REP.
5.3.1.1 Cuantificación de IL-2: el medio se extrajo periódicamente del cultivo pre-REP y se analizó mediante ELISA para la cuantificación de IL-2. Véanse las instrucciones del fabricante del kit de ELISA de IL-2 Quantikine humana de R&D Systems.
5.3.1.2 Análisis de metabolitos del cultivo celular: el medio se extrajo periódicamente del cultivo pre-REP y se analizó para los siguientes metabolitos: glucosa, ácido láctico, L-glutamina y amoníaco. Véase el manual del usuario de Roche Cedex Bioanalyzer para obtener instrucciones.
5.3.2 Las pruebas de REP incluyeron ensayos extendidos como recuentos de células, % de viabilidad, análisis de citometría de flujo de moléculas de superficie celular, potencia (producción de IFN-<y>), ensayo de lisis redirigida bioluminiscente, producción de granzima B, metabolismo celular y medición de la longitud de los telómeros.
5.3.2.1 Recuentos celulares y viabilidad: Se contaron las muestras de TIL y se determinó la viabilidad usando un contador celular automatizado Cellometer K2 (Nexcelom Bioscience, Lawrence, MA) de acuerdo con POE LAB-003 Rev 000 contador de células con citómetro automático de imagen Cellometer K2.
5.3.2.2 Análisis de citometría de flujo de biomarcadores de superficie celular: las muestras de TIL se dividieron en alícuotas para el análisis de citometría de flujo de marcadores de superficie celular utilizando el procedimiento descrito en WRK LAB-041 Rev 000 Tinción de antígeno de superficie de Post REP TIL
5.3.2.3 Ensayo de potencia (producción de IFN-y): se midió otra medida del potencial citotóxico determinando los niveles de la citocina IFN-<y>en el medio de TIL estimulado con anticuerpos contra CD3, CD28 y CD137/4-1BB. Los niveles de IFN-<y>en los medios de estos TIL estimulados se determinaron utilizando WRK LAB-016 Rev 000 estimulación de TIL para medir la liberación de IFN-y
5.3.2.4 Ensayo de lisis redirigida bioluminiscente: El potencial citotóxico de TIL para lisar las células diana se evaluó mediante un ensayo de cocultivo de TIL con la línea celular bioluminiscente, P815 (clon G6), de acuerdo con el POE descrito en WRK LAB-040 Ensayo de lisis redirigido bioluminiscente (ensayo de potencia) para TIL
5.3.2.5 Producción de granzima B: La granzima B es otra medida de la capacidad de TIL para matar las células diana. Los sobrenadantes del medio reestimulados como se describe en 5.2.5.3 también se evaluaron para sus niveles de Granzima B usando el Kit ELISA Human Granzyme B DuoSet ELISA (R & D Systems, Minneapolis, MN) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
5.3.2.6 Metabolismo celular (respiratorio): las células se trataron con inhibidores de la respiración mitocondrial y la glucólisis para determinar un perfil metabólico del TIL que consta de las siguientes medidas: fosforilación oxidativa basal (medida por OCR), capacidad respiratoria de reserva, actividad glucolítica basal (medido por ECAR) y reserva glucolítica. Los perfiles metabólicos se realizaron usando el procedimiento descrito en WRK LAB-029 Ensayo de Prueba de Estrés Mitocondrial/Glucólisis de Combinación de Seahorse.
5.3.2.7 Medición de la longitud de los telómeros: Se han utilizado diversos procedimientos para medir la longitud de los telómeros en preparaciones citológicas y de ADN genómico. El análisis de fragmentos de restricción de telómeros (TRF) es el estándar de oro para medir la longitud de los telómeros (de Lange et al., 1990). Sin embargo, la principal limitación de TRF es el requisito de una gran cantidad de ADN (1.5 Ag). Dos técnicas ampliamente utilizadas para la medición de la longitud de los telómeros, a saber, la hibridación fluorescente in situ (FISH; Agilent Technologies, Santa Clara, CA) y la PCR cuantitativa.
5.3.3 Se tomaron muestras adicionales para las siguientes pruebas y podrían analizarse en el futuro según fuera necesario:
5.3.3.1 Análisis de citocinas en profundidad
5.3.3.2 Secuenciación de TCR
6. RESULTADOS ALCANZADOS
Se realizaron un total de 9 experimentos utilizando los TIL derivados de los tumores descritos en la sección 2.3, el diseño experimental y las condiciones de recolección en la sección 5.1. Los TIL recolectados mediante el Procedimiento 2A se sometieron a las pruebas divulgadas en la sección 5.3.2 con el fin de comprender su capacidad para expandirse, su viabilidad, fenotipo, potencial citotóxico y perfil metabólico. Se tomaron todas las medidas para el producto TIL recién recolectado y el producto TIL congelado descongelado (Procedimiento 2A).
6.1 Recuento celular y viabilidad
6.1.1 Los recuentos de células se tomaron al final del pre-REP, el día 5 o 6 del REP (día de expansión) y al final del REP, tanto antes del lavado LOVO como después del lavado LOVO. Más adelante, se utilizaron los recuentos de células para determinar la expansión de TIL durante el REP y la recuperación de TIL después de lavar con LOVO. Después de la descongelación, las células se contaron nuevamente para determinar la recuperación posterior a la descongelación (basada en la concentración a la que se congelaron los TIL) y la viabilidad posterior a la descongelación antes de proceder con otro ensayo analítico. La Tabla 3 resume todos estos resultados para las nueve ejecuciones del Procedimiento 2A.
6.1.2 Procedimiento 2A POE define el número inicial de TIL para un REP como un intervalo de 5200 x 106 TIL. El intervalo de nueve muestras TIL utilizadas para iniciar los REP del Procedimiento 2A fue de 4.1 x 106 (M1065T) - 1.8 x 108 (M1064T), con un número TIL inicial promedio de 6.58 x 107. Curiosamente, el REP sembrado en placa con el número más bajo de TIL se expandió al mayor grado en la recolección de REP (intervalo de expansión para los 9 REP: 130-1900 veces; expansión promedio, 840 veces). El número medio de TIL recolectados al final de estos nueve REP del Procedimiento 2A fue 4.49 x 1010 (intervalo 7.8 x 109 - 6.7 x 1010).
6.1.3 Para obtener estadísticas comparativas del Procedimiento 1C, véase la Sección de Química, Fabricación y Controles (CMC) de la Solicitud de nuevo fármaco en investigación (IND) para LN144/LN-145.
6.1.4 El procedimiento 1C utiliza manipulación manual y centrifugación para lavar el producto TIL. Esto lleva mucho tiempo, pero lo que es más importante, puede resultar en la pérdida de hasta un 25% del producto entre la recolección y la formulación final. El sistema LOVO de lavado automático de células proporciona una manera de minimizar la pérdida de células y también introduce un sistema de lavado cerrado que disminuye el riesgo de contaminación del producto durante las etapas de lavado. La recuperación del producto que siguió a la etapa de lavado LOVO del protocolo y mostró una recuperación promedio de 93.8 ± 10.4% del producto TIL entrando en la etapa de lavado. Esta estadística incluye el producto TIL para M1062T, que tuvo una recuperación de LOVO del 68%, durante el cual un error del operador en la operación del LOVO resultó en la necesidad de centrifugar la muestra y luego reiniciar el procedimiento LOVO (véase la Sección 7, Desviaciones y discrepancias). Esto representa una mejora muy favorable con respecto a la etapa de lavado del Procedimiento 1C el día de la recolección de REP.
6.1.5 La recuperación de TIL después de la descongelación también es una preocupación importante para un producto TIL congelado. La recuperación del producto se determinó midiendo el número de células recuperadas de la bolsa después de la descongelación en comparación con el número de células colocadas en cada bolsa de congelación antes de la crioconservación. El intervalo de recuperación del deshielo fue de 78 a 103%, con una recuperación promedio de 88.2 ± 8.6%.
6.1.6 Aunque existe una diferencia significativa en la viabilidad de las muestras antes o después de la descongelación, en promedio, solo hay una pérdida de viabilidad del 2% después de la descongelación. La viabilidad del TIL que entró en crioconservación fue de 84.3 ± 4.7%, y la misma TIL después de la descongelación tuvo una viabilidad de 82.1 ± 4.4% (p=0.0742, prueba t de Student pareada, no paramétrica).
Los criterios de liberación para el producto clínico TIL Procedimiento 1C fresco requieren un mínimo del 70% de viabilidad. Independientemente de una pequeña pérdida de viabilidad tras la descongelación, las 9 ejecuciones del Procedimiento 2A cumplieron este criterio de liberación después de la descongelación del producto criogénico. La Tabla 4 y la Figura 3 muestran la viabilidad del TIL que entra en crioconservación (Fresh CS10) y la viabilidad del TIL tras la descongelación.
Tabla 33: Comparación de viabilidad de producto fresco y descongelado.
M1061T M1062 M1063 M1064 M1065 EP11001 M1056 M1058T M1023 T T T T T T T
Fresco 88.05 84.45 82.05 86.75 76.35 77.9 84.8 87.5 90.5 CS10
Descongel
ado 84.75 84.36 77.15 83.48 79.98 74.85 80.28 85.03 89.21
6.2 Expansión Re-REP de TIL. Además de examinar la capacidad del producto fresco para expandirse en un REP, se evaluó la capacidad del producto TIL fresco y descongelado para expandirse tras la reestimulación con APC alimentadoras de PBMC alogénicas irradiadas frescas y anti-CD3 fresco. Después de 7 días, estos productos TIL reestimulados se analizaron para determinar su capacidad para expandirse desde las condiciones de cultivo iniciales. La Figura 4 y la Tabla 5 muestran la expansión media de las células re-REP TIL después de 7 días de crecimiento en cultivo. El análisis de los datos utilizando una prueba emparejada t de Student muestra que la capacidad del TIL para expandirse en un re-REP no es significativamente diferente si se inicia el REP con TIL frescos o un producto TIL descongelado (p=0.81).
Tabla 34: Comparación de expansión de TIL frescos y descongelados en cultivo re-REP
Fresco 139.67 264 227 60.12 24.67 268.83 176 316.33
202.33
Descongelado 177.33 110.33 220.67 177.6 220.2 302.5 114.77 190.67
73.82
6.3 Metabolitos del cultivo celular. Una de las principales premisas de Lion 2A era que menos tiempo de tecnología y transferencias de procedimientos generarían ahorros de costes y limitarían la variabilidad. Las posibles consecuencias adversas de esto fueron el aumento de metabolitos indeseables y la disminución de las fuentes de nutrientes. Como se mostró en la Figura 5, los valores sanguíneos normales de electrolitos (sodio y potasio), nutrientes (glutamina y glucosa) y metabolitos (ácido láctico y amoníaco) proporcionan un intervalo a considerar al evaluar los resultados que salen de pre-REP del día 11. Como se mostró en la Figura 6, se evaluaron secuencialmente tres TIL (M1061T, M1062T y M1064T). En esta configuración, el potasio y el sodio se mantuvieron en niveles normales, la glucosa estaba en > 1.0 g/L y la glutamina > 0.3 mmol/L, muy por encima de los valores sanguíneos normales más bajos. Como se esperaba, el lactato se elevó hasta 0.8 g/L, alrededor de 5 veces el nivel que se encuentra en la sangre normalmente y el amoníaco hasta 3 mmol/L, como se esperaba de las células expandidas rápidamente y también sustancialmente más alto que lo que se encuentra normalmente en la sangre.
6.4 Cuantificación de IL-2.
6.4.1 El principal impulsor de la proliferación de TIL en el pre-REP, además de glucosa suplementaria, glutamina y oxigenación suficiente, es la provisión de altos niveles de rhIL-2. Después de su adición al medio que contenía suero, los niveles de IL-2 se midieron a 2-3.5 x 103 UI/ml, cayendo sólo hasta alrededor de 1.0 x 103 UI/ml durante los 11 días de cultivo. Esto está muy por encima de las 30-100 UI/ml necesarias para mantener la proliferación de células T. La evaluación de las concentraciones de IL-2 utilizando diferentes fuentes de IL-2 (Prometheus, Akron, Cellgenix) se está probando actualmente en experimentos separados (QP-17-010: Calificación de IL-2 a partir de Cellgenix, Akron y Prometheus) de Lion Biotechnologies, Tampa.
6.5 Producción de IFN-y
6.5.1 Después de 24 horas de estimulación de TIL con Dynabeads magnéticos anti-CD3, CD28 y 4-1BB como se describe en las secciones 5.3.5.3, se recogió el sobrenadante de los cultivos y se analizó el IFN-y usando kits de ELISA. Todos los TIL reestimulados produjeron más IFN-y que sus contrapartes no estimuladas, lo que demuestra que la estimulación del TIL dio como resultado su activación. La Figura 8 muestra la capacidad de las cuatro composiciones de TIL diferentes (fresca, descongelada, de re-REP frescos y re-REP TIL descongelados) probadas para liberar IFN-<y>en el medio circundante tras la reestimulación.
Las Tablas 6 y 7 muestran los valores medios de la secreción de IFN-y en las 9 ejecuciones del Procedimiento 2A. La secreción de IFN-y en el medio circundante tras la reestimulación no es diferente entre el producto TIL fresco y el TIL descongelado y crioconservado. La Tabla 6 muestra que el producto fresco produjo un promedio de 4143 ± 2285 pg IPN-y/1o6 TIL mientras que el producto descongelado produjo 3910 ± 1487 pg IPN-y/106 TIL (p=0.55 usando la prueba t de Student pareada). Si se normaliza al producto TIL total (Tabla 7), en promedio, el TIL fresco estimulado produjo 86 ± 61 gramos de IFN-y, mientras que el TIL estimulado descongelado produjo 68 ± 40 gramos de IFN-y (p=0.13). Estos hallazgos indican que tanto los productos TIL frescos como los descongelados producen IFN-<y>y que no hay diferencia en la capacidad del TIL coincidente fresco o descongelado para producir IFN-<y>tras la estimulación con anti-CD3/anti-CD28/anti-4- 1BB.
Tabla 35: Secreción de IFN-y en TIL fresco y descongelado (expresado como pg/106 células/24 horas)
Fresco 4570 3921 5589 619 1363 4263 6065 2983 7918
Descongelado 3158 3543 5478 1563 2127 5059 4216 4033 6010
Re- REP fresco 3638 1732 971 2676 2753 1461 2374 770 3512
Re- REP 2970 2060 1273 1074 1744 2522 5042 4038 923 descongelado
Tabla 36: Secreción de IFN-y en TIL fresco y descongelado. Todos los valores están en 1012 (expresados en gramos/106 células/24 horas)
Fresco 67.1 78.4 99.6 8.4 4.8 66.1 157.0 109.0 187.0
Descongelado 47.7 59.7 87.9 18.7 7.5 64.4 88.9 127.0 111.0
6.6 Producción de granzima B
6.6.1 Se estimularon TIL con anti-CD3, CD28 y Dynabeads 4-1BB magnéticos durante 24 horas como se describe en 5.2.5.3, y se recogió el sobrenadante de los cultivos después de 24 horas y se analizaron los niveles de Granzima B mediante ELISA. Todos los TIL reestimulados produjeron más Granzima B que sus contrapartes no estimuladas, lo que demuestra que la estimulación de TIL dio como resultado su activación. La Figura 9 muestra la capacidad del TIL fresco, la re-REP TIL fresco y la re-REP TIL descongelado para liberar Granzima B en el medio circundante tras la reestimulación con el cóctel de citocinas.
Todos los productos mostraron una producción de granzima B en el intervalo de 9190 pg/106 células viables a 262000 pg/106 células viables (Tabla 8). La Tabla 6 muestra que el producto fresco produjo un promedio de 60644 42959, mientras que el re-REP fresco y descongelado produjo 93600 67558 y 103878 84515 respectivamente. La comparación entre el re-REP fresco y el re-REP descongelado mostró que no hay diferencia en la capacidad del TIL obtenido de ninguna de las condiciones (p=0.7). Debido a la falta de medición de Granzima B en el producto descongelado, no se realizó ningún análisis estadístico utilizando el producto TIL fresco.
Tabla 37: Secreción de granzima B en TIL fresco, reREP TIL fresco y reREP TIL descongelado (expresado como pg/106 células/24 horas)
Fresco 10600 108000 49100 28400 24300 17900 120000 12900 79100
ReREP Fresco 216000 37700 42400 91800 192000 22200 97300 73800 69200
ReREP 262000 113000 35100 65600 48700 9190 147000 201000 53300 descongelado
6.7 Análisis de citometría de flujo de biomarcadores de superficie celular
Perfiles fenotípicos de TIL: se han estandarizado cuatro paneles de anticuerpos en LION para caracterizar ampliamente el perfil funcional de las células T. Estos paneles se utilizaron para evaluar la inmunofenotipificación de TIL fresco, TIL descongelado, Re-REP TIL fresco y Re-REP TIL descongelado. Todos los datos utilizados para la representación gráfica en esta sección también se proporcionan en formato de tabla (Tablas 14-24) en la sección 10 del apéndice.
6.8 Ensayo de lisis bioluminiscente redirigida
6.8.1 Para determinar la capacidad potencial de TIL del procedimiento 2A para matar sus células tumorales diana, desarrollamos un ensayo de potencia que implica el cocultivo de TIL con una línea celular diana sustituta bioluminiscente P815, como se describe en la sección 5.3.2.4. Un co-cultivo de 4 horas de las diferentes composiciones de TIL con P815 en presencia de estimulación anti-CD3 da una medida del potencial citotóxico de las células TIL expresadas como LU50, unidades líticas que pueden definirse como el número de TIL necesarios para matar 50% de las células diana. Esta medida se expresa luego como LU50/106 TIL. La Figura 32 más adelante muestra el potencial citotóxico del TIL del producto fresco y de las dos condiciones de re-REP TIL, re-REP fresco y re-REP descongelado.
6.8.2 La comparación del re-REP fresco con el re-REP descongelado muestra que no hay una diferencia significativa en la capacidad de cualquiera de los TIL para matar una célula diana (p=0.3126). Estos datos apoyan la conclusión de que no hay diferencia entre el producto fresco y descongelado en términos del potencial citotóxico del producto TIL. No se realizó ninguna comparación entre fresco ya que no se midió el potencial citotóxico inmediatamente después de descongelar TIL. La Tabla 9 muestra las unidades líticas de TIL necesarias para matar el 50% de la línea celular diana P815.
Tabla 38: Unidades líticas producidas por TIL contra la línea celular diana P815
6.9 Perfil de metabolismo celular de TIL
6.9.1 Para evaluar la salud metabólica de TIL post-REP, utilizamos los instrumentos analizadores de metabolismo de Seahorse (XFp y XFe96) de Agilent Technologies (Santa Clara, CA) siguiendo el protocolo descrito en la sección 5.3.2.6. Brevemente, al tratar las células con inhibidores que se dirigen a ciertos aspectos de la fosforilación oxidativa o la glucólisis, las células se estresan de tal manera que permiten la determinación de su SRC y reserva glucolítica. Además, se pueden determinar los niveles basales de fosforilación oxidativa (OCR basal) y glucólisis (ECAR basal). Finalmente, debido a que los inhibidores de la fosforilación oxidativa y la glucólisis se combinan en la misma prueba, se puede discernir una reserva oculta potencial de SRC que solo es aparente cuando las células se tratan con el inhibidor competitivo de la glucólisis, 2-desoxiglucosa (2-DG), (etiquetado como SRC2DG), lo que da como resultado un aumento de SRC que de otro modo permanecería oculto. Esta capacidad respiratoria adicional ha sido etiquetada como SRC "cubierta". La Tabla 9 muestra los perfiles metabólicos de TIL recién recolectado, Re-REP TIL fresco y Re-REP TIL descongelado derivados de la prueba de estrés metabólico realizada en las células.
6.9.2 Las Figuras 55A - F muestran los datos de la Tabla 38 en forma gráfica. El producto REP recién recolectado muestra algunas diferencias estadísticas con los productos re-REP fresco y descongelado. Esto no es sorprendente, ya que el producto re-REP se ha reestimulado con PBMC APC recién irradiado y anticuerpo anti-CD3 fresco, ya fuera inmediatamente después del REP o después de descongelarlo. Sin embargo, en todos los casos, no hay una diferencia significativa entre los productos frescos y descongelados cuando ambos se reestimulan en un procedimiento de re-REP (véanse valores de p de la Tabla 9). Esto indica que el procedimiento de crioconservación no afecta negativamente al producto TIL. En particular, para la fosforilación oxidativa, los productos re-REP tienen un SRC más alto que sus productos REP de recolección fresca correspondientes. Para la glucólisis, el re-REP TIL tiene niveles basales de glucólisis estadísticamente significativamente más altos y, a la inversa, niveles estadísticamente más bajos de reserva glucolítica que el producto REP fresco. Vale la pena señalar que esto podría indicar que los Re-REP TIL están más altamente activados que los TIL recién recolectados, ya que se informa que los TIL sanos y activados poseen altos niveles de actividad glucolítica (Buck et al., JEM 212:1345-1360; 2015).
ı54 6.9.3 Una comparación directa de productos frescos con congelados utilizando el procedimiento re-REP nos ha permitido determinar que tanto los productos TIL frescos como congelados, en condiciones de estimulación idénticas, dan como resultado perfiles metabólicos que son estadísticamente indistintos. Tanto el re-REP fresco como el re-REP TIL descongelado tienen niveles similares de respiración basal (Figura 60A, 36.7 ± 10.6 y 44.8 ± 12.9 pmol/min, respectivamente; p=0.11) así como SRC similar (encubierto) (Figura 60B, 41.6 ± 27,2 y 62.7 ± 30.8; p=0.12). Tras el tratamiento de estas células re-REP con 2-DG, el inhibidor competitivo de la glucosa, que da como resultado una inhibición de la glucólisis, vemos que tanto el re-REP TIL fresco como el descongelado muestran una capacidad respiratoria de reserva extra, "oculta" (SRC2DG; SRC encubierto) que es mayormente bajo o ausente en la muestra de TIL recién recolectado (Figura 60C); sólo una muestra tenía altos niveles de SRC2DG (Figura 60C) en el TIL recién recolectado, mientras que, a la inversa, sólo una de las siete muestras analizadas mostró una falta de SRC encubierta al re-REP. El s Rc encubierto (Figura 60D) para re-REP fresco promedió 20.7 ± 20.1 mientras que el SRC encubierto (Figura 60D) para re-REP descongelado varió de 27.8 ± 16.1; p=0.52).
6.9.4 La lectura metabólica más sorprendente del fenotipo extendido (re-REP) TIL son los niveles consistentemente altos de glucólisis basal de las muestras de fenotipo extendido (re-REP). La glucólisis basal (Figura 60E) es consistemente alta en las muestras de re-REP, con un promedio de 118.7 ± 44.2 mpH/min en el re-REP fresco y 132.0 ± 43.2 mpH/min en el re-REP descongelado. Estas muestras no son estadísticamente diferentes entre sí (p=0.38). Sin embargo, como se mencionó anteriormente, la muestra recién recolectada no posee niveles basales tan altos de glucólisis. En comparación con el REP TIL fresco, esta diferencia es sustancial, pero no significativa (p=0.10); sin embargo, en comparación con las muestras descongeladas re-REP, la diferencia es significativa (p 0.01). Estas células re-REP aparentemente dependen en gran medida de la glucólisis para sus necesidades energéticas, ya que tienen poca reserva glucolítica restante cuando se estresan en las pruebas metabólicas de Seahorse (Figura 60F): promedio de Re-REP TIL fresco 12.9 ± 14.9 mpH/min; Re-REP descongelado TIL, 3.35 ± 23.8 mpH/min). Estos re-REP no son diferentes entre sí (p=0.47) pero ambos son estadísticamente diferentes de la reserva glucolítica encontrada en muestras de TIL recolectados frescos, que promedia 40.8 ± 17.6 mpH/min (p=0.003 y 0.01 en comparación con las muestras frescas de TIL) REP y re-REP TIL descongelado, respectivamente). Se deben realizar más estudios para determinar la causa detrás de las diferencias observadas en la glucólisis entre estas muestras de recolección fresca y re-REP TIL.
6.10 Medición de la longitud de los telómeros
6.10.1 Medición de la longitud de los telómeros de pos-REP TIL mediante Flow Fish y qPCR.
6.10.1.1 Flow-FISH se realizó utilizando el kit Dako/Agilent Pathology Solutions (Telomere PNA Kit/FITC para citometría de flujo) y se siguieron las instrucciones del fabricante para medir la longitud promedio de la repetición del telómero. Se utilizó la línea celular de leucemia de células T 1301 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)) como patrón de referencia interno en cada ensayo. Se contaron los TIL individuales y se mezclaron con 1301 células en una relación de células 1:1. Se mezclaron 2 X 106 TIL con 2 X 1061301 células. La hibridación in situ se realizó en solución de hibridación (formamida al 70%, BSA al 1%, Tris 20 mM, pH 7.0) por duplicado y en presencia y ausencia de una sonda PNA de telómero conjugada con FITC (FITC-00-CCCTAA-CCC-TAA-CCC-TAA) suplementaria a la secuencia de repetición del telómero a una concentración final de 60 nM. Después de la adición de la sonda PNA de telómero, las células se incubaron durante 10 minutos a 82°C en un bloque de calor. Más adelante, las células se colocaron en la oscuridad a temperatura ambiente durante la noche. A la mañana siguiente, se eliminó el exceso de sonda de telómero lavando 2 veces durante 10 minutos cada una en un bloque de calor a 40°C con solución de lavado. Después de los lavados, se agregó DAPI (Invitrogen, Carlsbad, CA) a una concentración final de 75 ng/mL. La tinción de ADN con DAPI se utilizó para bloquear células en la población GO/G1. El análisis de la muestra se realizó utilizando un citómetro de flujo Yeti (Propel-Labs, Fort Collins, CO). La fluorescencia del telómero de la muestra de prueba se expresó como un porcentaje de la fluorescencia (fl) de las células 1301 según la siguiente fórmula: Longitud relativa del telómero = [(células de prueba FITC fl media con sonda - células de prueba FITC fl media sin sonda) X índice de ADN de 1301 células X 100]/[(media de 1301 células FITC fl con sonda - media de células FITC fl 1301 sin sonda) X índice de ADN de las células de prueba.
6.10.1.2 qPCR: Se utilizó qPCR en tiempo real para medir la longitud relativa de los telómeros. Brevemente, se determinó la relación de número de copias repetidas de telómeros a número de copias de un solo gen (T/S) usando un termociclador de PCR Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) en un formato de 96 pocillos. Se utilizaron diez nanogramos de ADN genómico para la reacción de PCR de telómero (Tel) o hemoglobina (hgb) y los cebadores utilizados fueron los siguientes: cebador Tel-1b (CGG TTT GTT TGG GTT TGG GTT TGG GTT TGG GTT TGG GTT), cebador Tel- 2b (GGC TTG CCT TAC CCT TAC CCT TAC CCT TAC CCT TAC CCT), cebador hgb1 (GCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGC), y cebador hgb2 (CACCAACTTCATCCACGTTCACC). Todas las muestras se analizaron mediante las reacciones de los telómeros y la hemoglobina, y el análisis se realizó por triplicado en la misma placa. Además de las muestras de prueba, cada placa de 96 pocillos contenía una curva estándar de cinco puntos de 0.08 ng a 250 ng utilizando ADN genómico aislado de 1301 células. La relación T/S (-dCt) para cada muestra se calculó restando el valor mediano del ciclo umbral de hemoglobina (Ct) del valor mediano de Ct del telómero. La relación T/S relativa (ddCt) se determinó restando la relación T/S del punto de curva estándar de 10 ng de la relación T/S de cada muestra desconocida.
6.10.1.3 Resultados y discusión de la longitud de los telómeros: Los telómeros son tapas (secuencias repetitivas de nucleótidos) al final de los cromosomas lineales que desempeñan un papel fundamental para facilitar la replicación completa de los cromosomas. La medición de los telómeros es una herramienta emergente en el estudio de afecciones tales como enfermedades degenerativas, cáncer y envejecimiento. Estudios previos de los NIH (J Immunol. 2005, Nov 15;175(10):7046-52; Clin Cancer Res. 2011, Jul 1; 17(13): 4550- 4557) han demostrado que una mayor longitud de los telómeros de TIL está asociada con respuesta clínica. Por el contrario, el grupo de Radvanyi no encontró diferencias significativas en la longitud de los telómeros de TIL entre respondedores y no respondedores (Clin Cancer Res; 18 (24); 6758-70). Hasta el momento, no hay evidencia que demuestre que la longitud de los telómeros estuviera asociada con la longitud del cultivo de células T in vitro. Es posible que el post-REP TIL cultivado por el procedimiento 2A (cultivo de 22 días) tenga una longitud de telómero más larga en comparación con el TIL cultivada por el procedimiento del procedimiento 1C (cultivo de 25-36 días).
7. DISCREPANCIAS Y DESVIACIONES
7.1 Desviaciones del procedimiento
7.1.1 M1061T: Las células REP se dividieron el día 6 en 4 matraces G-Rex500M.
7.1.2 M1062T: Las células REP se dividieron el día 6 en 4 matraces G-Rex500M. Debido a un error del operador en el sistema de filtración LOVO, se produjo una parada de emergencia durante el procedimiento que requirió una recolección manual de los TIL desde el kit desechable. Los TIL se filtraron con éxito durante una segunda ejecución de LOVO.
7.1.3 M1063T: Sin desviaciones M1064T: Sin desviaciones
7.1.4 M1065T: Las células pre-REP estaban por debajo de la especificación para el recuento de células el día 11 (<5 x 106 células) pero continuaron en el REP. En el día 6 de REP, las células se contaron y se volvieron a colocar en el G-Rex500M y se alimentaron con 4.5 l de medio fresco. Los TIL no se expandieron en este día debido a un recuento celular insuficiente (<1 x 109 células en el día 6 de REP).
7.1.5 EP11001T: Sin desviaciones
7.1.6 M1056T: Se cultivaron células pre-REP en LION en un matraz G-Rex 100 durante hasta 21 días. Los fragmentos de tumor se filtraron el día 11 de pre-REP y los TIL se congelaron el día de la recolección en CS10 al 100% a 30 x 106 células por vial de 1.5 ml. Los TIL congelados se descongelaron en Moffitt PD en CM1 suplementado con 6000 UI/ml de rhIL-2 y se dejaron reposar durante 3 días antes de iniciar el Día 0 del REP. El día 6 de REP, se expandieron TIL en 4 matraces que procedieron a recolectarse el día 11 de REP.
7.1.7 M1058T: Se cultivaron células pre-REP en LION en un matraz G-Rex 100 durante hasta 21 días. Los fragmentos de tumor se filtraron el día 11 de pre-REP y los TIL se congelaron el día de la recolección en CS10 al 100% a 30 x 106 células por vial de 1.5 ml. Los TIL congelados se descongelaron en Moffitt PD en CM1 suplementado con 6000 UI/ml de rhIL-2 y se dejaron reposar durante 3 días antes de iniciar el Día 0 del REP. El día 6 de REP, las células se dividieron en 4 matraces que procedieron a recolectarse el día 11 de REP.
7.1.8 M1023T: Se cultivaron células pre-REP en LION en matraces G-Rex10 durante hasta 21 días. Los fragmentos tumorales se filtraron el día 11 de pre-REP y los TIL se congelaron el día de la recolección en CS10 al 100% a 30 x 106 células por vial de 1.5 ml. Los TIL congelados se descongelaron en Moffitt PD en CM1 suplementado con 6000 UI/ml de rhIL-2 y se dejaron reposar durante 3 días antes de iniciar el Día 0 del REP. El día 6 de REP, las células se expandieron en 4 matraces que procedieron a recolectarse el día 11 de REP.
7.2 Prueba de desviaciones
7.2.1 No se realizaron análisis en profundidad de citocinas ni secuenciación de TCR
8. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
8.1 Desarrollo de un procedimiento más robusto. El desafío para Lion era convertir el procedimiento 1C Lion anterior, que tenía un largo tiempo de tratamiento, en un procedimiento 2A Lion potencialmente más comercializable que utiliza refinamientos que resultan en un tiempo de tratamiento más corto y una formulación final crioconservada del producto TIL. Con este fin, se llevaron a cabo nueve ejecuciones de desarrollo de procedimientos para confirmar que los procedimientos antiguos y nuevos demostraron rendimientos celulares comparables y potencia y fenotipo de TIL comparables. De particular interés fue la complejidad marcadamente disminuida del procedimiento general, lo que resultó en una reducción del 50% en la duración total de los procedimientos pre-REP y REP, pero aún así resultó en rendimientos de TIL comparables (7.8 x 109 - 67 x 109 células) en comparación al histórico procedimiento 1C Lion que se practica actualmente por nuestro fabricante contratado. Esto se actualizó recientemente para la presentación ASCO de junio de 2017 (Media: 41.04 x 109 células con un intervalo de 1.2-96 x 109 células). Además, Lion ha desarrollado con éxito un producto TIL crioconservado que demostró una recuperación posterior a la descongelación del 78-103% con una viabilidad de TIL > 70%, de acuerdo con los criterios de liberación actuales del Procedimiento 1C (véase la Tabla 2).
8.2 El papel del análisis fenotípico extendido (Re-REP). La capacidad de proliferar en respuesta a la estimulación mitogénica (como en los re-REP experimentales presentados en este informe) es un atributo de calidad crítico de TIL. Los experimentos presentados aquí muestran que 8/9 productos TIL descongelados pudieron expandirse > 100 veces en una semana en comparación con 7/9 productos TIL frescos emparejados, lo que respalda la comparabilidad del producto TIL descongelado con el producto TIL fresco (Tabla 2). Dos atributos de calidad críticos adicionales de TIL son su capacidad para liberar IFN-y y/o Granzima B después de la estimulación con citocinas (CD3/CD28/4-1BB). La estimulación de citocinas de los productos frescos y descongelados resultó en una liberación de IFN-y superior a 2 ng/106 células/24 horas en 7/9 productos frescos y todos los productos descongelados (Figura 35) (véase la sección 6.2 de este informe). Se observó liberación de granzima B (Figura 36) en las 9 ejecuciones del procedimiento. Los niveles de CD4 y CD8 (Figura 39 y Figura 40) demostraron una consistencia interna notable entre los productos TIL frescos y descongelados. Además, el análisis de la capacidad del TIL para destruir una línea celular diana tumoral sustituta (P815, Figura 59) mostró que el TIL fresco y descongelado poseía un potencial citotóxico similar.
8.3 Una prueba de estrés metabólico de TIL revela una bioenergética robusta. Un análisis de los perfiles metabólicos de productos TIL frescos y descongelados estimulados en un re-REP demostró que tanto TIL fresco como descongelado respondieron de manera similar a las pruebas de estrés metabólico y no mostró diferencias sustanciales en un panel de características metabólicas (Tabla 39). Por lo tanto, el producto TIL del Procedimiento 2A crioconservado puede considerarse comparable al producto del Procedimiento 1C fresco en función de los cuatro atributos de calidad de identidad, potencia, número de células y viabilidad presentados en este informe. Los ensayos que comparan células frescas y descongeladas emparejadas fueron bastante comparables en todos los ensayos descritos en este informe.
8.4 Criterios de aceptación: La heterogeneidad intrínseca de los productos TIL con terapia personalizada para cada paciente refleja: (1) sus moléculas restrictivas del complejo de histocompatibilidad principal único (la mayoría de los productos génicos polimórficos en biología humana); (2) la trayectoria evolutiva única de los tumores individuales que surgen en el microambiente tumoral con inestabilidad genómica y mutaciones únicas de impulsadores y pasajeros individuales; y (3) la heterogeneidad conferida por la variación alélica, la diversidad de la región N y los reordenamientos de VDJ en los segmentos Va y Vp que definen los receptores de células T usados para el reconocimiento de neoepítopos, antígenos de tumor-testicular compartidos y productos codificados viralmente. Evaluar la variación adicional que se produce como resultado de cambios en el procedimiento es, por lo tanto, una tarea abrumadora y requiere la evaluación de tantos parámetros como sea posible para asegurarse de que la "comparabilidad" de un material intrínsecamente heterogéneo sea posible. Esto se ha logrado examinando fielmente varios criterios de aceptación de viabilidad y comparabilidad, como se detalla en la Tabla 40 más adelante.
Tabla 40: Criterios de aceptación para viabilidad y comparabilidad
En base a los criterios de viabilidad enumerados en la Tabla 11, se evaluará TIL sobre si se cumplieron o no los requisitos. Se cumplieron todos los criterios individuales para cada experimento y cada línea TIL (n=9). Se utilizó la prueba t de Student para el análisis estadístico. Se utilizó la prueba T de Student no paramétrica para calcular el valor p para el % de viabilidad, ya que las medidas de viabilidad no serán una distribución gaussiana. Véase la Tabla 41 más adelante.
Tabla 41: Criterios de aceptación de factibilidad de cumplimiento.
En base a los criterios de aceptación enumerados en la Tabla 40, se evaluaron re-REP TIL frescos y congelados para determinar si se cumplían o no los requisitos. (No se informó la viabilidad ya que la duración del re-REP fue de 7 días y las PBMC residuales irradiadas no pudieron distinguirse de TIL). Los números entre paréntesis indican los criterios que no se cumplieron. Según los criterios de pureza medidos con la expresión de CD3+, 6/9 productos frescos de Re-REP TIL cumplieron con los estrictos criterios > 90% (M1061, M1065 y EP11001 no lo hicieron) y 8/9 productos descongelados pasaron los criterios de aceptación incluso después de Re-REP. El bajo número de CD3+ TIL en EP11001T re-REP fresco podría atribuirse a una regulación negativa extrema del receptor de células T. La medición de CD3+ TIL como medida de pureza no se determinó para M1023T re-REP TIL descongelado. Para esta composición de TIL, la pureza se estimó usando tinción con TCRap y se indica con un asterisco (*). Se utilizó la prueba t de Student para el análisis estadístico. Véase la Tabla 42 más adelante.
Tabla 42: Cumplimiento de los criterios de aceptación de comparabilidad.
Bibliografía
Goff SL, Dudley ME, Citrin DE, Somerville RP, Wunderlich JR, Danforth DN, Zlott DA, Yang JC, Sherry RM, Kammula US, Klebanoff CA, Hughes MS, Restifo NP, Langhan MM, Shelton TE, Lu L, Kwong ML, Ilyas S, Klemen ND, Payabyab EC, Morton KE, Toomey MA, Steinberg SM, White DE, Rosenberg SA. Randomized, Prospective Evaluation Comparing Intensity of Lymphodepletion Before Adoptive Transfer of Tumor-Infiltrating Lymphocytes for Patients With Metastatic Melanoma. J Clin Oncol. 2016 Jul 10;34(20):2389-97. doi: 10.1200/JCO.2016.66.7220. Epub 2016 May 23. PubMed PMID: 27217459; PubMed Central PMCID: PMC4981979.
Hinrichs CS, Rosenberg SA. Exploiting the curative potential of adoptive T-cell therapy for cancer. Immunol Rev. 2014 Jan;257(1):56-71. doi:10.1111/imr.12132. Review. PubMed PMID: 24329789; PubMed Central PMCID: PMC3920180.
Jin J, Sabatino M, Somerville R, Wilson JR, Dudley ME, Stroncek DF, Rosenberg SA. Simplified procedimiento of the growth of human tumor infiltrating lymphocytes in gas-permeable flasks to numbers needed for patient treatment. J Immunother. 2012 Apr;35(3):283-92. d10.1097/CJI.0b013e31824e801f. PubMed PMID: 22421946; PubMed Central PMCID: PMC3315105.
Somerville RP, Devillier L, Parkhurst MR, Rosenberg SA, Dudley ME. Clinical scale rapid expansion of lymphocytes for adoptive cell transfer therapy in the WAVE® bioreactor. J Transl Med. 2012 Abr 4;10:69.
Donia M, Larsen SM, Met O, Svane IM. Simplified protocol for clinical-grade tumor-infiltrating lymphocyte manufacturing with use of the Wave bioreactor. Cytotherapy. 2014 Agos;16(8):1117-20. doi: 10.1016/j.jcyt.2014.02.004; PubMed PMID: 24831841.
Henning AL, Levitt DE, Vingren JL, McFarlin BK. Measurement of T-Cell Telomere Length Using Amplified-Signal FISH Staining and Flow Cytometry. Curr Protoc Cytom. 2017 Ener. 5;79:7.47.1-7.47.10. doi: 10.1002/cpcy.11. PubMed PMID 28055115
Kelesidis T, Schmid I. Assessment of Telomere Length, Phenotype, and DNA Content. Curr Protoc Cytom. 2017 Ener. 5;79:7.26.1-7.26.23. doi: 10.1002/cpcy.12. PubMed PMID: 28055113.
Gardner M, Bann D, Wiley L, Cooper R, Hardy R, Nitsch D, Martin-Ruiz C, Shiels P, Sayer AA, Barbieri M, Bekaert S, Bischoff C, Brooks-Wilson A, Chen W, Cooper C, Christensen K, De Meyer T, Deary I, Der G, Diez Roux A, Fitzpatrick A, Hajat A, Halaschek-Wiener J, Harris S, Hunt SC, Jagger C, Jeon HS, Kaplan R, Kimura M, Lansdorp P, Li C, Maeda T, Mangino M, Nawrot TS, Nilsson P, Nordfjall K, Paolisso G, Ren F, Riabowol K, Robertson T, Roos G, Staessen JA, Spector T, Tang N, Unryn B, van der Harst P, Woo J, Xing C, Yadegarfar ME, Park JY, Young N, Kuh D, von Zglinicki T, Ben-Shlomo Y; Halcyon study team.. Gender and telomere length: systematic review and meta-analysis. Exp Gerontol. 2014 Mar;51:15-27. doi:10.1016/j.exger.2013.12.004. Epub 2013 Dic 21. Review. PubMed PMID: 24365661; PubMed Central PMCID: PMC4523138.
Carbonari M, Tedesco T, Fiorilli M. Correlation between terminal restriction fragments and flow-FISH measures in samples over wide range telomere lengths. Cell Prolif.2014 Feb;47(1):20-7. doi: 10.1111/cpr.12086. PubMed PMID: 24450811.
Rufer N, Dragowska W, Thornbury G, Roosnek E, Lansdorp PM. Telomere length dynamics in human lymphocyte subpopulations measured by flow cytometry. Nat Biotechnol. 1998 Agos.;16(8):743-7. PubMed PMID: 9702772.
Li Y, Liu S, Hernandez J, Vence L, Hwu P, Radvanyi L. MART-1-specific melanoma tumor-infiltrating lymphocytes maintaining CD28 expression have improved survival and expansion capability following antigenic restimulation in vitro. J Immunol. 2010 Jan 1;184(1):452-65. doi: 10.4049/jimmunol.0901101. Epub 2009 Nov 30. PubMed PMID: 19949105.
Rosenberg SA, Dudley ME. Adoptive cell therapy for the treatment of patients with metastatic melanoma. Curr Opin Immunol. 2009 Apr;21(2):233-40. doi:10.1016/j.coi.2009.03.002. Epub 2009 Mar 21. Review. PubMed PMID: 19304471; PubMed Central PMCID: PMC3459355.
Shen X, Zhou J, Hathcock KS, Robbins P, Powell DJ Jr, Rosenberg SA, Hodes RJ. Persistence of tumor infiltrating lymphocytes in adoptive immunotherapy correlates with telomere length. J Immunother. 2007 Ener.;30(1):123-9. PubMed PMID:17198091; PubMed Central PMCID: PMC2151201.
Zhou J, Shen X, Huang J, Hodes RJ, Rosenberg SA, Robbins PF. Telomere length of transferred lymphocytes correlates with in vivo persistence and tumor regression in melanoma patients receiving cell transfer therapy. J Immunol. 2005 Nov 15;175(10):7046-52. PubMed PMID: 16272366; PubMed Central PMCID: PMC1351312.
Maciejowski J, de Lange T. Telomeres in cancer: tumour suppression and genome instability. Nat Rev Mol Cell Biol. 2017 Mar;18(3): 175-186. doi:10.1038/nrm.2016.171. Epub 2017 Ener. 18. Review. PubMed PMID: 28096526.
Erdel F, Kratz K, Willcox S, Griffith JD, Greene EC, de Lange T. Telomere Recognition and Assembly Mechanism of Mammalian Shelterin. Cell Rep. 2017 Ener. 3;18(1):41-53. doi: 10.1016/j.celrep.2016.12.005. PubMed PMID: 28052260; PubMed Central PMCID: PMC5225662.
Cardenas ME, Bianchi A, de Lange T. A Xenopus egg factor with DNA-binding properties characteristic of terminus-specific telomeric proteins. Genes Dev.1993 May;7(5):883-94. PubMed<p>M<i>D: 7684008.
de Lange T. Activation of telomerase in a human tumor. Proc Natl Acad Sci U S A. 1994 Abr 12;91(8):2882-5. Review. PubMed PMID: 8159672; PubMed Central PMCID: PMC43476.
de Lange T, Shiue L, Myers RM, Cox DR, Naylor SL, Killery AM, Varmus HE. Structure and variability of human chromosome ends. Mol Cell Biol. 1990 Feb;10(2):518-27. PubMed PMID: 2300052; PubMed Central PMCID: PMC360828.
9. Tablas adicionales
Tabla 43 - Figura 39: Células CD4+
Tabla 44 - Figura 40: Células CD8+
Tabla 45 - Figura 41: Células CD4+CD154+ y Figura 105: Células CD8+CD154+
Tabla 46 - Figura 43: Células CD4+CD69+ y Figura 17: Células CD8+CD69+
Tabla 47 - Figura 45: Células CD4+CD137+ y Figura 19 células CD8+CD137+
Tabla 48 - Figura 47: Células CD4+CM y Figura 21 células CD8+CM
Tabla 49 - Figura 49: Células CD4+EM y Figura 23 células CD8+EM Célula T Marcadores M1061 M1062 M1063 M1064
Tabla 50 - Figura 51: Células CD4+CD28+ y Figura 25 células CD8+CD28+
Tabla 51 - Figura 53: Células CD4+PD-1+ y Figura 27 células CD8+PD-1
Tabla 52 - Figura 55: Células CD4+LAG3+ y Figura 29 células CD8+LAG3+
Tabla 53 - Figura 57: Células CD4+TIM-3+ y Figura 31 células CD8+TIM-3+
Tabla 54 - Figura 61: Determinación de la longitud de repetición del telómero mediante qPCR y Flow-FISH
EJEMPLO 20:NUEVOS LINFOCITOS INFILTRANTES DE TUMOR CRIOCONSERVADOS (LN-144) ADMINISTRADOS A PACIENTES CON MELANOMA METASTÁSICO
Los nuevos linfocitos infiltrantes de tumores crioconservados (LN-144) administrados a pacientes con melanoma metastásico demuestran eficacia y tolerabilidad en un ensayo clínico multicéntrico de fase 2
INTRODUCCIÓN:
Se ha estudiado la seguridad y eficacia de la terapia celular adoptiva (ACT) con linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) no crioconservados en cientos de pacientes con melanoma metastásico. Este ensayo clínico multicéntrico se inició con TIL de fabricación centralizada (LN-144) como productos de infusión no crioconservados y crioconservados. Nuestro nuevo procedimiento de fabricación para el LN-144 no crioconservado se utiliza en la Cohorte 1, y un LN-144 crioconservado acortado de 3 semanas se utiliza en la Cohorte 2. La fabricación de la Cohorte 2 ofrece un procedimiento significativamente más corto, junto con un producto TIL crioconservado lo que permite la flexibilidad de la programación y la dosificación del paciente. El procedimiento de fabricación más corto reduce el tiempo de espera para que el paciente reciba su producto TIL y la crioconservación agrega comodidad a la logística y la entrega a los sitios clínicos.
PROCEDIMIENTOS:
El C-144-01 es un estudio multicéntrico prospectivo que evalúa a pacientes con melanoma metastásico que reciben LN-144. Después de una linfodepleción no mieloablativa con el régimen de preacondicionamiento de Cy/Flu, los pacientes reciben una única infusión de LN-144 seguida de la administración de IL-2 (600,000 UI/kg) hasta 6 dosis. Se evalúa la respuesta objetiva de los pacientes como criterio de valoración principal durante un período de hasta 24 meses.
RESULTADOS:
Caracterizamos el LN-144 crioconservado administrado a una segunda cohorte de pacientes, Cohorte 2 (N=10) siguiendo el mismo régimen de tratamiento de infusión antes y después de TIL que se usó para la Cohorte 1.
Los pacientes de la cohorte 2 fueron tratados previamente en gran medida con un mayor número de líneas previas con todos los pacientes con terapias anti-CTLA-4 y anti-PD-1, y una mayor carga tumoral (media SOD: 15.3, 10.9 cm para las cohortes 2, 1). La mediana del número de terapias sistémicas previas es 4, 3 para las cohortes 2, 1, respectivamente. Un análisis inicial de los datos de seguridad demuestra una tolerabilidad comparable de LN-144 crioconservado. El perfil de seguridad para los pacientes de la Cohorte 1 que reciben LN-144 no crioconservado sigue siendo aceptable para esta población de pacientes en etapa avanzada. Los TEAE más comunes observados en ambas cohortes por frecuencia son náuseas, anemia, neutropenia febril, disminución del recuento de neutrófilos y disminución del recuento de plaquetas. La revisión temprana de los datos de eficacia indica actividad antitumoral, incluida la RP, para la terapia TIL observada en pacientes tratados en la Cohorte 2.
CONCLUSIONES:
Esto representa el primer ensayo clínico en un entorno multicéntrico con TIL fabricado centralmente que evalúa un procedimiento nuevo para un producto autólogo crioconservado con un procedimiento significativamente más corto (alrededor de 3 semanas). Los resultados preliminares indican que el LN-144 crioconservado es una opción terapéutica segura y tolerable para los pacientes con melanoma metastásico que han fallado en múltiples terapias anteriores, incluidos los inhibidores de puntos de control. El LN-144 crioconservado proporciona una mayor flexibilidad para los pacientes y los cuidadores y permite un tratamiento más inmediato para los pacientes con una necesidad médica insatisfecha tan alta. NCT02360579.
EJEMPLO 21:EVALUACIÓN DE MEDIOS SIN SUERO PARA USO EN EL PROCEDIMIENTO 2A
Este ejemplo proporciona datos que muestran la evaluación de la eficacia de los medios sin suero como reemplazo de los medios estándar CM1, CM2 y CM4 que se utilizan actualmente en el procedimiento 2A. Este estudio evaluó la eficacia de los medios sin suero (SFM) disponibles y las alternativas sin suero como reemplazo en tres fases;
Fase -1: se comparó la eficacia de la expansión de TIL (n=3) usando medios sin suero estándar frente a CTS Optimizer o Prime T CDM o Xvivo-20 con o sin reemplazo de suero o lisado de plaquetas.
Fase-2: se probó la condición de medio libre de suero candidato en un procedimiento 2A a pequeña escala usando G-Rex 5M (n=3).
INFORMACIÓN DE ANTECEDENTES
Aunque la combinación de medios actual utilizada en el cultivo Pre y Post REP ha demostrado ser eficaz, pueden producirse fallos de REP con el AIM-V. Si se identificara una alternativa efectiva sin suero, el procedimiento sería más directo y simple de realizar en los CMO al reducir el número de tipos de medios utilizados de 3 a 1. Además, SFM reduce la posibilidad de enfermedad inesperada al eliminando el uso de suero humano. Este ejemplo proporciona datos que demostraron que respaldan el uso de medios sin suero en los procedimientos 2A.
ABREVIATURAS
pl: microlitro
CM1,2,4: Medios completos 1,2,4
CTS OpTimizer SFM: Sistema de terapia celular, medios sin suero OpTimizer
g: gramos
Hr: Hora
IFU: Instrucciones de uso
IL-2: citocina interleucina-2
Min: Minuto
mL: mililitro
°C: grados Celsius
PreREP: Protocolo de expansión rápida previa
REP: Protocolo de expansión rápida
RT: temperatura ambiente
SR: Reemplazo de suero
TIL: linfocitos infiltrantes de tumores
DISEÑO DE EXPERIMENTO
Los Pre-REP y REP se iniciaron como se menciona en LAB-008. La descripción general de estas 3 fases del experimento se mostró en el siguiente cuadro:
Como se indica en el cuadro anterior, el proyecto se sugirió para probar los medios y suplementos sin suero en dos etapas.
Etapa 1. Selección del proveedor de medios sin suero. preREP y postREP se configuraron para imitar el procedimiento 2A en una placa de 24 pocillos G-Rex. PreREP se inició cultivando cada fragmento/pocillo de placa G-Rex de 24 pocillos por triplicado o cuatriplicado según las condiciones. REP se inició el día 11 cultivando 4 x 10e5 TII,/pocillo de G-Rex 24 pocillo; dividido el día 16, recolección el día 22. Se utilizaron CTS OpTimizer, X-Vivo 20 y Prime T-CDM como alternativas de medios sin suero potenciales para usar en PreREP y REP. Reemplazo de suero SR Inmune CTS (Life Technologies) o suero de lisado de plaquetas (SDBB) se añadieron al 3% a SFM. Se planificó que cada condición se probara con al menos 3 tumores tanto en preREP como en postREP para imitar el procedimiento 2A.
• Se comparó la eficacia de 3 SFM con tumores:
"CTS OpTimizer (Life TEch) ± SR o PL
•X-vivo 20 (Lonza) ± SR o PL
tCebo T-CDM (Irvine) ± SR o PL
•Se ensayó el candidato en G-REX 5Ms (escala 1:100
■n = 3
Etapa 2. Los candidatos identificados se probaron adicionalmente en procedimientos 2A a pequeña escala por protocolo (TP-17-007). Brevemente, los preREP se iniciaron cultivando 2 fragmentos/matraz G-Rex 5M por triplicado por condición. Los REP se iniciaron el día 11 usando 2 x 10e6/matraz G-Rex 5M; divididos el día 16, recolección el día 22.
Nota: Algunos tumores se procesaron y configuraron para medir múltiples parámetros en un experimento.
OBSERVACIONES
Resultados equivalentes o estadísticamente mejores fueron observados en el crecimiento celular cuando se comparó un medio sin suero con el estándar utilizado en el procedimiento 2A
Se observó un fenotipo, una producción de IFN-y y un análisis de metabolitos similares de los TIL cultivados en medio libre de suero en comparación con los TIL cultivados en el medio estándar usado en el procedimiento 2A.
RESULTADOS
Prueba de la eficacia de los medios sin suero en la expansión pre y pos REP TIL.
CTS Optimizer SR (reemplazo de suero) mostró una expansión preREP TIL mejorada y una expansión REP TIL comparable. Se agregaron CTS OpTimizer, X-Vivo 20 y Prime T-CDM con o sin 3% de CTS Immune CTS SR, se probaron contra condiciones estándar. En M1079 y L4026, la condición CTS OpTimizer CSR mostró una expansión TIL preREP significativamente mejorada (p <0.05) en comparación con las condiciones estándar (CM1, CM2, CM4) (Figura 62A). Por el contrario, CTS Optimizer sin c Sr no ayudó a la expansión previa a REP TIL (Apéndice -1,2,3). CTS Optimizer CSR mostró una expansión de TIL comparable en PostREP en los dos tumores de 3 probados (Figura-2B). Se produjo una gran variación en el REP antes y después de las condiciones de X-Vivo 20 y Prime T-CDM, mientras que CTS Optimizer fue relativamente consistente entre los cuatriplicados. Además, el lisado de plaquetas agregado SFM no mejoró la expansión de TIL preREP y postREP en comparación con los estándares (Figura 62A). Estos hallazgos sugieren que el reemplazo de suero ciertamente es necesario para proporcionar un crecimiento comparable a nuestro estándar; optimizador de CTS CSR puede ser un candidato.
Probar la condición de candidato en la mini báscula G-Rex 5M (véase Figura 64).
Análisis fenotípico de Post REP TIL. Véase la Figura 66 y la Tabla 56 más adelante.
Tabla 56: Inclinación de CD8 con CTS OpTimizer
Comparabilidad de interferón-gamma
ELISA de interferón-gamma (Quantikine). La producción de IFN-y se midió utilizando el kit Quantikine ELISA mediante sistemas de R&D. CTS SR produjo cantidades comparables de IFN-y en comparación con nuestra condición estándar. Véase la Figura 67.
EJEMPLO 22:CÓCTEL FACTOR DE CRECIMIENTO DE CÉLULAS T IL-2/IL-15/IL-21 MEJORA LA FUNCIÓN DE EXPANSIÓN Y EFECTORA DE LAS CÉLULAS T INFILTRANTES DE TUMOR
La terapia de células T adoptivas con linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) autólogos ha demostrado eficacia clínica en pacientes con melanoma metastásico y carcinoma cervical. En algunos estudios, los mejores resultados clínicos se han correlacionado positivamente con la cantidad total de células infundidas y/o el porcentaje de células T CD8+. La mayoría de los regímenes de producción actuales utilizan únicamente IL-2 para promover el crecimiento de TIL. Se ha informado una mayor expansión de linfocitos utilizando regímenes que contienen IL-15 e IL-21. Este estudio describe los efectos positivos de agregar IL-15 e IL-21 al protocolo IL-2-TIL de segunda generación implementado recientemente en la clínica.
Materiales y procedimientos
El procedimiento de generación de TIL incluye un protocolo de expansión rápida previa (pre-REP), en donde se colocan fragmentos tumorales de 1-3 mm3 de tamaño en medios que contienen IL-2. Durante el pre-REP, TIL emigra fuera de los fragmentos tumorales y se expande en respuesta a la estimulación de IL-2.
Para estimular aún más el crecimiento de TIL, TIL se expande a través de un período de cultivo secundario denominado Protocolo de Expansión Rápida (REP) que incluye alimentadoras de PBMC irradiadas, IL-2 y anti-CD3. En este estudio, se desarrolló un protocolo de expansión pre-REP y REP abreviado para expandir TIL mientras se mantienen los atributos fenotípicos y funcionales del producto TIL final.
Este protocolo de producción de TIL abreviado se utilizó para evaluar el impacto de IL-2 sola frente a una combinación de IL2/IL-15/IL-21. Estos dos regímenes de cultivo se compararon para la producción de TIL cultivada a partir de tumores colorrectales, melanomas, cervicales, de mama triple negativo, pulmón y renales. Una vez completado el pre-REP, se evaluó la expansión, el fenotipo, la función (CD107a+ e IEN<y>) y el repertorio de TCR Vp de los TIL cultivados.
Los cultivos pre-REP se iniciaron usando el protocolo estándar de IL-2 (600 Ul/ml), o con IL-15 (180 Ul/ml) e IL-21 (UI/ml) además de IL-2. Se evaluó la expansión de las células al completar el pre-REP. Un cultivo se clasificó como con un aumento de la expansión sobre la IL-2 si el crecimiento general se mejoraba en al menos un 20%. En este documento se presentan los estudios fenotípicos y funcionales de melanoma y pulmón. Véase la Tabla 57 más adelante.
Tabla 57: Mejora de la expansión durante el pre-REP con IL-2/IL-15/IL-21 en múltiples indicaciones
Estos datos demuestran un aumento del rendimiento del producto TIL cuando se cultivaron TIL con IL-2/IL15/IL-21 en comparación con IL-2 sola, además de diferencias fenotípicas y funcionales en el pulmón.
El efecto del cóctel triple sobre la expansión de TIL fue específico de la indicación y benefició a la mayoría de los tumores de bajo rendimiento.
La relación de células T CD8+/CD4+ aumentó mediante el tratamiento en el producto TIL de NSCLC.
La actividad de las células T pareció potenciada por la adición de IL-15 e IL-21 a IL-2, según lo evaluado por los niveles de expresión de CD107a tanto en melanoma como en NSCLC.
Los datos proporcionados aquí muestran que la expansión de TIL usando un procedimiento más corto y robusto, como el procedimiento 2A descrito aquí en la solicitud y otros ejemplos, se puede adaptar para abarcar el cóctel de citocinas IL-2/IL-15/IL-21, lo que proporciona un medio para promover aún más la expansión de TIL en particular en indicaciones específicas.
Los experimentos en curso están evaluando adicionalmente los efectos de IL-2/IL-15/IL-21 sobre la función de TIL.
Experimentos adicionales evaluarán el efecto del cóctel triple durante el REP (primera expansión).
Estas observaciones son especialmente relevantes para la optimización y estandarización de los regímenes de cultivo de TIL necesarios para la fabricación a gran escala de TIL con la amplia aplicabilidad y disponibilidad requeridas de una terapia anticáncer de corriente principal.
EJEMPLO 23:UN TIL CRIORESERVADO GENERADO CON UN PROCEDIMIENTO ABREVIADO
Antecedentes
Este ejemplo proporciona datos relacionados con un producto de linfocitos infiltrantes de tumores crioconservados (TIL) para LN-144, generado con un procedimiento abreviado adecuado para la fabricación comercial de alto rendimiento que presenta atributos de calidad favorables para la transferencia de células adoptivas (ACT).
Los procedimientos existentes para generar productos de TIL clínicos implican intervenciones abiertas del operador seguidas de períodos de incubación prolongados para generar un producto terapéutico. El procedimiento de Generación 1 toma alrededor de 6 semanas y produce un producto fresco. Para llevar la terapia TIL a todos los pacientes que puedan beneficiarse de su potencial, se desarrolló un procedimiento de cultivo abreviado de 22 días, Generación 2, adecuado para la fabricación centralizada con un producto farmacológico crioconservado capaz de enviarse a sitios clínicos distantes. La Generación 2 representa un procedimiento de producción de células flexible, robusto, cerrado y semiautomatizado que se adapta a la fabricación de alto rendimiento a escala comercial. Los productos farmacéuticos generados por este procedimiento tienen atributos de calidad comparables a los generados por el procedimiento de Generación 1. Objetivos del estudio:
Los productos farmacéuticos generados por los procedimientos de Generación 1 (una forma de realización del procedimiento 1C) y Generación 2 (una forma de realización del procedimiento 2A) se ensayaron para determinar la comparabilidad en términos de los siguientes atributos de calidad:
Dosis y expansión múltiple.
Pureza de células T y proporciones de subconjuntos de células T.
Expresión fenotípica de moléculas coestimuladoras en subconjuntos de células T.
Longitud relativa media de las repeticiones de los telómeros.
Capacidad para secretar citocinas en respuesta a la reactivación de TCR.
Diversidad de receptores de células T.
Descripción general del procedimiento de terapia TIL:
EXTRACCIÓN: Los TIL del paciente se eliminan del microambiente tumoral supresor (mediante extirpación quirúrgica de una lesión)
EXPANSIÓN: TIL se expandió exponencialmente en cultivo con IL-2 para producir 109 - 1011 TIL, antes de infundirlos en el paciente.
PREPARACIÓN: El paciente recibe NMA-LD (linfodepleción no mieloablativa, ciclofosfamida: 60 mg/kg, IV x 2 dosis y fludarabina: 25 mg/m2 x 5 dosis) para retirar el microambiente tumoral potencialmente supresor y maximizar el injerto y la potencia de Terapia TIL
INFUSIÓN: Se infunde al paciente con su TIL expandido (LN-144) y una dosis alta de IL-2 de corta duración (600,000 UI/kg para hasta 6 dosis) para promover la activación, proliferación y actividad citolítica antitumoral de TIL
Tabla 58: Resumen de las mejoras del procedimiento en la fabricación de segunda generación
Procedimientos analíticos e instrumentación:
Dosis y viabilidad: Se tomaron muestras de los productos formulados finales y se analizaron las células nucleadas totales, las células viables totales y la viabilidad determinada por contratinción de naranja de acridina/DAPI usando el contador celular automático NC-200.
Citometría de flujo: Se tomaron muestras de los productos farmacéuticos formulados y se ensayó su identidad mediante FACS. El porcentaje de células T se determinó como la población CD45, CD3 doble positiva de células viables. Los viales satélite o centinela congelados para cada procedimiento se descongelaron y se analizaron en busca de marcadores fenotípicos extendidos, incluidos<c>D3, CD4, CD8, CD27 y CD28.
Longitud relativa media de las repeticiones de los telómeros: se utilizó la tecnología Flow-FISH para medir la longitud media de las repeticiones de los telómeros. Este ensayo se completó como se describe en el protocolo DAKO® Telomere PNA Kit/FITC para citometría de flujo. Brevemente, se combinaron 2 x 106 células TIL con 2 x 106 células de leucemia 1301. El ADN se desnaturalizó a 82°C durante 10 minutos y la sonda PNA-FITC se hibridó en la oscuridad durante la noche a temperatura ambiente. Se utilizó yoduro de propidio para identificar las células en la fase G0/1.
Inmunoensayos: se midió la capacidad del producto farmacológico para secretar citocinas tras la reactivación después de un cocultivo con perlas recubiertas de mAb (Life Technologies, anti-CD3, anti-CD28 & anti-CD137). Después de 24 horas, los sobrenadantes del cultivo se recogieron, se congelaron, se descongelaron y se ensayaron mediante ELISA usando el kit Quantikine IFN<y>ELISA (sistemas de R&D) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Diversidad del receptor de células T: se aisló el ARN de los productos formulados finales y se sometió a una PCR multiplex con cebadores específicos de VDJ. Las secuencias de CDR3 expresadas dentro del producto de TIL se amplificaron semicuantitativamente para determinar la frecuencia y prevalencia de clones de TIL únicos. La secuenciación se realizó en el secuenciador de sobremesa Illumina MiSeq. Los valores se indexaron para producir una clasificación representativa de la diversidad relativa de receptores de células T en el producto.
Resultados y Conclusiones:
Los resultados se proporcionan en las Figuras 75 a 81.
El procedimiento de Generación 2 produce un producto TIL con atributos de calidad comparables a los de Generación 1.
La Generación 2 produce cantidades similares de productos TIL altamente puros que se componen de porciones similares de subconjuntos de células T que expresan niveles comparables de moléculas coestimuladoras en relación con Gen 1.
Los TIL de generación 2 muestran una mayor diversidad de receptores de TCR que, cuando se activan, inician una secreción robusta de citocinas.
El producto farmacéutico crioconservado introduce eficiencias logísticas críticas que permiten flexibilidad en la distribución.
A diferencia de los procedimientos anteriores, la plataforma de expansión de 22 días abreviada de Generación 2 presenta una plataforma de fabricación de TIL escalable y logísticamente factible que permite la generación rápida de dosis a escala clínica para pacientes que necesitan terapia urgente.
El protocolo de fabricación de TIL de Generación 2 aborda muchas de las barreras que hasta ahora han obstaculizado la aplicación más amplia de la terapia TIL.
EJEMPLO 24:EVALUACIÓN DE UNA GAMA DE CÉLULAS ALIMENTADORAS ALOGÉNICAS: RELACIONES de TIL DE 100:1 A 25:1
Este estudio probó la proliferación de TIL a 25:1 y 50:1 frente al control de células alimentadoras alogénicas a TIL de 100: 1 actualmente utilizadas en el Procedimiento 1C.
Los estudios publicados por la División de Cirugía del Instituto Nacional del Cáncer han demostrado el umbral para la activación óptima de TIL en el matraz G-Rex 100 a 5 * 106 células alimentadoras alogénicas por cm2 al inicio del REP(1). Esto se ha verificado mediante modelos matemáticos y, con el mismo modelo, se predijo que con una capa de alimentadoras optimizada para el contacto célula: célula por unidad de área, la relación de células alimentadoras alogénicas en relación con TIL puede reducirse a 25:1 con un efecto mínimo en la activación y la expansión de TIL.
Este estudio estableció una densidad óptima de células alimentadoras por unidad de área al inicio de REP y validó el intervalo efectivo de relaciones de alimentadoras alogénicas al inicio de REP necesarias para disminuir y normalizar la cantidad de células alimentadoras utilizadas por lote clínico. El estudio también validó el inicio del REP con menos de 200 * 106 TIL cocultivados con un número fijo de células alimentadoras.
A. Volumen de una célula T (10 pm de diámetro): V = (4/3) n r3 =523.6 pm3
B. Columna de G-Rex 100 (M) con una altura de 40 pm (4 células): V = (4/3) n r3=4 * 1012 pm3
C. Número de célula requerida para llenar la columna B: 4 * 1012 pm3/523.6 pm3= 7.6x108 pm3 * 0.64 = 4.86x108 D. Número de células que se pueden activar de manera óptima en el espacio 4D: 4.86 * 108/24 = 20.25 * 106 E. Número de alimentadoras y TIL extrapolados a G-Rex 500: TI I,: 100 * 106 y alimentador: 2.5 * 109 Ecuación 1. Aproximación del número de células mononucleares necesarias para proporcionar una geometría icosaédrica para la activación de TIL en un cilindro con una base de 100 cm2. El cálculo deriva el resultado experimental de ~5 * 108 para la activación del umbral de células T que refleja de cerca los datos experimentales del NCI. (1) (C) El multiplicador (0.64) es la densidad de empaquetamiento aleatoria para esferas equivalentes como fue calculado por Jaeger y Nagel en 1992 (2). (D) El divisor 24 es el número de esferas equivalentes que podrían entrar en contacto con un objeto similar en un espacio de 4 dimensiones "el número de Newton."(3)
Referencias
(1) Jin, Jianjian, et.al., Simplified Procedimiento of the Growth of Human Tumor Infiltrating Lymphocytes (TIL) in Gas- Permeable Flasks to Numbers Needed for Patient Treatment. J Immunother. 2012 Apr; 35(3): 283-292. (2) Jaeger HM, Nagel SR. Physics of the granular state. Science. 1992 Mar 20;255(5051):1523-31.
(3) O. R. Musin (2003). "The problem of the twenty-five spheres". Russ. Math. Surv. 58 (4): 794-795.
EJEMPLO 25:ESTUDIOS DE ATRIBUTOS CLAVE DE CALIDAD PARA EL PRODUCTO TIL Antecedentes
La terapia adoptiva de células T con linfocitos infiltrantes de tumores autólogos (TIL) ha demostrado eficacia clínica en pacientes con melanoma metastásico y otros tumores1'3.
La mayoría de los informes de estudios clínicos han incluido análisis exploratorios de los productos TIL infundidos con la intención de identificar atributos de calidad como esterilidad, identidad, pureza y potencia que podrían relacionarse con la eficacia y/o seguridad del producto.45
Aquí presentamos la evaluación de tres parámetros clave de producto, del producto TIL, que pueden contribuir a una futura plataforma de control de calidad para su uso en la fabricación comercial de TIL.
Descripción general del procedimiento de terapia TIL
1. El tumor fue extirpado del paciente y transportado a las instalaciones de fabricación con GMP.
2. A su llegada, el tumor se fragmenta y se coloca en matraces con IL-2 para un Protocolo de Expansión Rápida (REP).
3. Se propagaron adicionalmente pre-REP TIL en un protocolo REP en presencia de PBMC irradiadas, anticuerpo anti-CD3 (30 ng/mL) e IL-2 (3000 UI/ml).
4. Los productos TIL se evaluaron para determinar los atributos de calidad críticos que incluyen: (1) Identidad (2) Pureza y (3) Potencia.
5. Antes de la infusión de TIL expandido (LN-144), el paciente recibió un régimen de linfodepleción no mieloablativa que consistía en ciclofosfamida y fludarabina. Después de la infusión de TIL, los pacientes recibieron una duración corta (hasta 6 dosis) de IL-2 en dosis altas (600,000 UI/kg) para apoyar el crecimiento y el injerto de TIL transferido.
Objetivos del studio
Objetivo: caracterizar completamente los productos TIL en cuanto a identidad, pureza y potencia, y por lo tanto (a) orientar la definición de atributos de calidad críticos y (b) apoyar el establecimiento de criterios formales de liberación que se implementarán en la producción comercial de productos TIL.
Estrategia: Desarrollar las siguientes metodologías analíticas para apoyar la caracterización del producto TIL. En particular, se realizaron los siguientes procedimientos: análisis fenotípico por citometría de flujo para una evaluación de identidad y pureza, ensayo de detección de células tumorales residuales para una medida de pureza y ensayo de liberación de interferón gamma para evaluar la potencia.
Materiales y procedimientos
Identidad y Pureza
Caracterización fenotípica: los productos TIL se tiñeron con anticuerpos anti-CD45, anti-CD3, anti-CD8, anti-CD4, anti-CD45RA, anti CCR7, anti CD62L, anti-CD19, anti-CD16 y anti-CD56 y se analizaron por citometría de flujo para la cuantificación de subconjuntos de células T y no T.
Pureza
Ensayo de detección de tumores residuales: los productos TIL se tiñeron con anticuerpos anti-MCSP (sulfato de condroitina proteoglicano asociado a melanoma) y anti-CD45, así como un colorante Aqua fijable Viva/Muerta, luego fueron analizados por citometría de flujo para la detección de células de melanoma. Se utilizaron controles enriquecidos para evaluar la precisión de la detección de tumores y para establecer criterios de activación para el análisis de datos.
Potencia
Ensayo de liberación de IFNy: los productos TIL se reestimularon con perlas recubiertas con anti-CD3/CD28/CD137 durante 18 a 24 horas, después de lo cual se recogieron los sobrenadantes para evaluar la secreción de IFN<y>usando un ensayo ELISA.
Resultados
Identidad: La mayoría (> 99%) del producto TIL de melanoma estaba compuesto por células CD45+CD3+
Las Figuras 86A-86C proporcionan una caracterización fenotípica de productos TIL usando un ensayo de citometría de flujo de 10 colores. (A) El porcentaje de subconjuntos de células T y no células T se definió mediante CD45+CD3+ y CD45-(no linfocitos) /CD45+CD3'(linfocitos no T), respectivamente. En general, > 99% de los productos TIL probados consistieron en células T (CD45+CD3+). Se mostró un promedio de productos TIL (n=10). (B) Porcentaje de dos subconjuntos de células T que incluyen CD45+ CD3+CD8+ (círculo abierto azul) y CD45+CD3+CD4+ (círculo abierto rosa). No se observó ninguna diferencia estadística en el porcentaje de ambos subconjuntos utilizando la prueba T para datos no apareados de Student (P=0.68). (C) La población que no es de células T se caracterizó por cuatro subconjuntos diferentes que incluyen: 1) No linfocitos (CD45‘ ), 2) Células NK (CD45+CD3-CD16+/56+), 3) Célula B (CD45+CD19+), y 4) Célula no NKB (CD45+CD3'CD16‘ CD56-CD19-).
Identidad: la mayoría del producto TIL de melanoma exhibió un fenotipo de células T efectoras o de memoria, asociado con la función citotóxica de las células T.
Las Figuras 87A y 87B muestran la caracterización de subconjuntos de células T en poblaciones de células CD45+CD3+CD4+ y CD45+CD3+CD8+. Los subconjuntos de células T naives, de memoria central (TCM), memoria efectora (TEF) y memoria efectora RA+(EMRA) se definieron utilizando CD45RA y CCR7. Las Figuras 87A y 87B muestran subconjuntos de células T representativos de 10 productos TIL finales en poblaciones de células CD4+ (A) y CD8+ (B). El subconjunto de células T de memoria efectora (círculo azul abierto) fue una población importante (> 93%) en ambos subconjuntos CD4+ y CD8+ del producto final TIL. Menos del 7% de las células de productos TIL eran un subconjunto de memoria central (círculo abierto rosa). Los subconjuntos EMRA (círculo gris abierto) y naive (círculo negro abierto) apenas se detectaron en el producto TIL (<0.02%). Los valores p representan la diferencia entre EM y CM utilizando la prueba T para datos no apareados de Student.
Pureza: MCSP representa un marcador de tumor de melanoma apropiado para el ensayo de pureza.
Las Figuras 88A y 88B muestran la detección de la expresión de MCSP y EpCAM en células tumorales de melanoma. Se generaron líneas de células tumorales de melanoma (WM35, 526 y 888), líneas celulares de melanoma derivadas de pacientes de acuerdo con los procedimientos descritos en este documento (1028, 1032 y 1041) y una línea celular de carcinoma de adenoma colorrectal (HT29 como control negativo) se caracterizaron por tinción para marcadores MCSP (proteoglicano de sulfato de condroitina asociado a melanoma) y EpCAM (molécula de adhesión de células epiteliales). (A) El promedio del 90% de las células tumorales de melanoma expresaron MCSP. (B) La expresión de EpCAM no se detectó en líneas de células tumorales de melanoma en comparación con el control positivo HT29, una línea de células tumorales EpCAM+.
Pureza: Desarrollo de un ensayo basado en citometría de flujo para la detección de células tumorales residuales en productos TIL.
Las Figuras 89A y 89B ilustran la detección de controles enriquecidos para la determinación de la precisión de detección de tumores. El ensayo se realizó agregando cantidades conocidas de células tumorales en suspensiones de PBMC (n=10). Se diluyeron células tumorales de melanoma MCSP+526 en relaciones de 1:10, 1:100 y 1:1.000, luego se mezclaron con PBMC y se tiñeron con anticuerpos anti-MCSP y anti-CD45 y colorante vivo/muerto y se analizaron por citometría de flujo. (A) Se detectaron alrededor de 3000, 300 y 30 células en la dilución de 1:10, 1:100 y 1:1000, respectivamente. (B) Se utilizó un promedio (AV) y una desviación estándar (DE) de las células adquiridas en cada condición para definir los límites de referencia superior e inferior.
Pureza: Calificación del ensayo de detección de tumores residuales utilizando controles enriquecidos
Las Figuras 90A y 90B muestran el estudio de repetibilidad de los límites superior e inferior en controles enriquecidos. Se realizaron tres experimentos independientes por triplicado para determinar la repetibilidad del ensayo de adición. (A) El número de células tumorales detectadas por MCSP+ estaba constantemente dentro del intervalo de los límites de referencia superior e inferior. (B) El gráfico de regresión lineal demuestra la correlación entre las células MCSP+ y las diluciones de adición (R2=0.99) con la línea sólida negra que muestra el mejor ajuste. Las líneas discontinuas verdes y grises representan los límites de predicción del 95% en la curva estándar y las muestras (Exp. No. 1 a 3), respectivamente.
Pureza: los contaminantes de células tumorales de melanoma estaban por debajo de los límites de detección del ensayo en el producto TIL final.
Las Figuras 91A y 91B muestran la detección de tumor de melanoma residual en productos TIL. Los productos TIL se evaluaron para determinar la contaminación residual del tumor usando el ensayo desarrollado (n=15). La mediana del número y el porcentaje de eventos detectables de MCSP+ fue 2 y 0.0002%, respectivamente.
Potencia: la secreción de IFNy por TIL (consistentemente> 1000 pg/ml) demostró la función efectora del producto TIL.
La Figura 92 muestra la evaluación de la potencia de los productos TIL después de la activación de las células T. Secreción de IFNy después de la reestimulación con anti-CD3/CD28/CD137 en productos TIL evaluados por ELISA por duplicado (n=5). La secreción de IFNy por los productos TIL fue significativamente mayor que los controles no estimulados usando la prueba de intervalo con signo de Wilcoxon (P=0.02), y consistentemente > 1000 pg/ml. La secreción de IFN<y>>200 pg/ml se consideró potente. Un valor de p <0.05 se considera estadísticamente significativo.
Conclusión
Se evaluaron los parámetros clave del producto de identidad, pureza y potencia de los productos TIL. Los productos TIL fabricados de acuerdo con los procedimientos descritos en el presente documento consistían en más del 99% de células T CD45+CD3+. La mayoría de los subconjuntos de TIL CD4+ y CD8+ exhibieron un fenotipo de memoria efectora, asociado con la función citotóxica de las células T. Se desarrolló y calificó con éxito un ensayo basado en citometría de flujo para detectar células tumorales de melanoma contaminantes en el producto final de TIL. Aplicando este ensayo, se demostró que las células tumorales de melanoma contaminantes en el producto TIL final estaban por debajo de los límites de detección del ensayo. La secreción de IFNy por el producto TIL final después de la reestimulación anti-CD3/CD28/CD137 puede servir como ensayo de potencia para TIL fabricado comercialmente. Estos datos proporcionan la base de una plataforma de control de calidad que respaldará un mayor desarrollo de los atributos de calidad críticos para la producción comercial de productos TIL.
EJEMPLO 26:UN PRODUCTO DE TIL CRIOCONSERVADO GENERADO CON UN PROCEDIMIENTO ABREVIADO ADECUADO PARA LA FABRICACIÓN COMERCIAL DE ALTO RENDIMIENTO EXHIBE ATRIBUTOS DE CALIDAD FAVORABLES PARA LA TRANSFERENCIA DE CÉLULAS ADOPTIVAS
Antecedentes
Los procedimientos clásicos de generación de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) para transferencia de células adoptivas (ACT) implican múltiples etapas de incubación ex vivo para producir un producto de infusión fresco (no crioconservado).
El procedimiento de primera generación (Gen 1) produjo una dosis de TIL fresco en alrededor de 6 semanas. Se desarrolló un procedimiento de fabricación de TIL de segunda generación (Gen 2) que abrevia la duración del cultivo ex vivo a 22 días (Figura 93).
El procedimiento Gen 2 es adecuado para la fabricación centralizada y produce un producto de infusión de TIL crioconservado que brinda comodidad en la programación, logística y entrega a los sitios clínicos. El producto de infusión de TIL crioconservado para LN-144 producido por el procedimiento Gen 2 tiene atributos de calidad comparables al producto de infusión de TIL no crioconservado para TIL generado por el procedimiento Gen 1. El procedimiento de fabricación de TIL Gen 2 representa un procedimiento de producción de célula flexible, robusto, cerrado y semiautomático que se adapta a la fabricación de TIL de alto rendimiento a escala comercial.
Objetivo del studio
Se evaluaron los productos de infusión de TIL generados por los procedimientos de fabricación de Gen 1 y Gen 2 para determinar la comparabilidad en términos de los siguientes atributos de calidad: (1) Recuento de células (dosis), viabilidad, tasa de crecimiento de la fase REP, (2) pureza de células T y expresión fenotípica de moléculas coestimuladoras en subconjuntos de células T, (3) Longitud relativa promedio de las repeticiones de telómeros, (4) Capacidad para secretar IFNy en respuesta al acoplamiento de CD3, CD28, CD137 y (5) Diversidad de receptores de células T presentes en el producto de infusión final (Figura 94).
Procedimientos analíticos e instrumentación
Recuento de células y viabilidad: se tomaron muestras de los productos de infusión formulados finales y se analizaron las células nucleadas totales, las células viables totales y la viabilidad fue determinada mediante contratinción de naranja de acridina/DAPI usando el contador celular automático NC-200. Los lotes de desarrollo del procedimiento se ensayaron en el contador de viabilidad celular Nexcellom Cellometer K2 usando tinción fluorescente dual con naranja de acridina/yodo de propidio.
Marcadores fenotípicos: se tomaron muestras de los productos de infusión formulados y se ensayó su identidad mediante tinción inmunofluorescente. El porcentaje de células T se determinó como la población de células viables CD45+, CD3+ (doble positiva). Los viales satélite o centinela congelados para cada procedimiento se descongelaron y se analizaron en busca de marcadores fenotípicos extendidos, incluidos CD3, CD4, CD8, CD27 y CD28. Los productos de infusión frescos se adquirieron en el BD FACS Canto II, y los marcadores fenotípicos extendidos en los productos de infusión descongelados se adquirieron en el analizador de células Bio-Rad ZE5.
Longitud relativa promedio de las repeticiones de los telómeros: se utilizó la tecnología Flow-FISH para medir la longitud promedio de las repeticiones de los telómeros. Este ensayo se completó como se describe en el protocolo DAKO® Telomere PNA Kit/FITC para citometría de flujo. Brevemente, 2.0 x 106 células TIL se combinaron con 2.0 x 106 células T de leucemia de la línea celular humana (1301). El ADN se desnaturalizó a 82°C durante 10 minutos y la sonda PNA-FITC se hibridó en la oscuridad durante la noche a temperatura ambiente. Se utilizó yoduro de propidio para identificar las células en la fase G0/1.
Función inmunológica: se midió la capacidad del producto de infusión para secretar IFN<y>tras la reactivación después de un cocultivo con perlas recubiertas de anticuerpo (Life Technologies, anti-CD3, anti-CD28 & anti-CD137). Después de 24 horas, los sobrenadantes del cultivo se recolectaron, congelaron, descongelaron y ensayaron mediante ELISA usando el kit Quantikine IFNy ELISA (sistemas de R&D) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Diversidad del receptor de células T: se aisló el ARN de los productos de infusión y se sometió a una PCR multiplex con cebadores específicos de VDJ. Las secuencias de CDR3 expresadas en el producto de TIL se amplificaron semicuantitativamente y se secuenciaron en profundidad para determinar la frecuencia y prevalencia de clones de TIL únicos. La secuenciación se realizó en el secuenciador de sobremesa Illumina MiSeq. Los valores se indexaron para producir una clasificación representativa de la diversidad relativa de receptores de células T en el producto.
Resultados
El día 22, el producto celular de volumen reducido se combinó y se tomaron muestras para determinar el rendimiento del cultivo antes del lavado y la formulación. Las Figuras 95A-95C muestran células viables totales, tasa de crecimiento y viabilidad. (A) Las muestras se analizaron en el contador de células automatizado NC-200 como se describió anteriormente. La densidad de células viables total se determina mediante la gran media de recuentos duplicados de 4 muestras independientes. El procedimiento de Gen 2 produjo un producto TIL de dosis similar a Gen 1 (media de Gen 1=4.10 * 1010 ± 2.8 * 1010, media de Gen 2=4.12 * 1010 ± 2.5 * 1010). (B) La tasa de crecimiento se calculó para la fase REP como. (C) La viabilidad celular se evaluó a partir de 9 lotes de desarrollo de procedimientos utilizando el Cellometer K2 como se describió anteriormente. No se observó una disminución significativa en la viabilidad celular después de un único ciclo de congelación-descongelación del producto formulado. La reducción media de la viabilidad tras el deshielo y el muestreo fue del 2.19%.
Las Figuras 96A-96C muestran que los productos Gen 2 son cultivos de células T altamente puros que expresan moléculas coestimuladoras a niveles comparables a los de Gen 1. (Figura 96A) Se ensayó la identidad de productos farmacéuticos recién formulados mediante citometría de flujo para su liberación. Los procedimientos de Gen 1 y Gen 2 producen cultivos de células T de alta pureza según lo definido por el fenotipo CD45+, CD3+ (doble positivo). (Figuras 96B y 96C) Se descongelaron viales satélite crioconservados de producto farmacológico formulado y se ensayó el fenotipo extendido mediante citometría de flujo como se describió previamente. Los productos Gen 1 y Gen 2 expresaron niveles similares de moléculas coestimuladoras CD27 y CD28 en subconjuntos de células T. Es posible que se requieran moléculas coestimuladoras como CD27 y CD28 para suministrar la señalización secundaria y terciaria necesaria para la proliferación de células efectoras tras el acoplamiento del receptor de células T. El valor de p se calculó utilizando la prueba 't' de Mann-Whitney.
La Figura 97 muestra que los productos Gen 2 tienden hacia un telómero relativo más largo. Longitudes. La tecnología Flow-FISH se utilizó para medir la longitud promedio de la repetición de los telómeros como se describió anteriormente. El valor RTL indicó que la fluorescencia media de los telómeros por cromosoma/genoma en Gen 1 fue del 7.5% ± 2.1%, y Gen 2 fue del 8.4% ± 1.8% de la fluorescencia del telómero por cromosoma/genoma en la línea de células de control (línea celular de leucemia 1301). Los datos indican que los productos Gen 2 tienen, en promedio, longitudes de telómero comparables a las de los productos Gen 1. La longitud de los telómeros es una medida sustituta de la longitud del cultivo celular ex vivo.
La Figura 98 muestra que los productos farmacológicos Gen 2 secretan IFN<y>en respuesta al acoplamiento de CD3, CD28 y CD137. Los productos farmacológicos crioconservados se descongelaron y se incubaron con perlas recubiertas de anticuerpo como se describió anteriormente. Los datos se expresan como la cantidad de IFNy producida por 5 x 105 células viables en 24 horas. Los productos farmacéuticos Gen 2 mostraron una mayor capacidad para producir IFNy tras la reactivación en relación con los productos farmacéuticos Gen 1. La capacidad del fármaco para reactivarse y secretar citocinas es una medida sustituta de la función in vivo tras la unión del TCR al antígeno similar en el contexto de HLA.
Las Figuras 99A y 99B muestran que los productos farmacológicos Gen 2 tienen una mayor diversidad de receptores únicos de células T. La diversidad del receptor de células T se evaluó como sigue. Se ensayó el ARN de 10x106 TIL de los productos de infusión de Gen 1 y Gen 2 para determinar el número total y la frecuencia de secuencias de CDR3 únicas presentes en cada producto. (Figura 99A) Se indexaron secuencias únicas de CDR3 en relación con la frecuencia en cada producto para producir una clasificación representativa de la diversidad global de receptores de células T en el producto. (Figura 99B) El número total promedio de secuencias de CDR3 únicas presentes en cada producto de infusión. Los productos TIL de ambos procedimientos se componían de poblaciones policlonales de células T con diferentes especificidades y avidez de antígenos. La amplitud del repertorio total de células T puede ser indicativa del número de epítopos procesables presentados en las células tumorales.
Conclusiones
El procedimiento de fabricación de Gen 2 produjo un producto de infusión de TIL (LN-144) con atributos de calidad comparables a los de Gen 1. Gen 2 produjo dosis similares de TIL de alta pureza. Los subconjuntos de células T estaban en proporciones similares y expresaron moléculas coestimuladoras en niveles comparables de Gen 1. Gen 2 TIL tendió hacia una longitud relativa más larga de los telómeros proporcional al período de cultivo ex vivo reducido. TIL Gen 2 mostró una mayor diversidad de receptores de TCR que, cuando se activaron, iniciaron una secreción robusta de IFN-y, una medida de la función efectora citolítica. Por lo tanto, el procedimiento de expansión cerrado de 22 días abreviado de Gen 2, con producto de infusión crioconservado, presenta una plataforma de fabricación de TIL escalable y logísticamente factible que permite la generación rápida de dosis a escala clínica para pacientes con cáncer que necesitan de inmediato una nueva opción de terapia.
Referencias
1 Dudley, M. E. et al. Adoptive cell transfer therapy following non-myeloablative but lymphodepleting chemotherapy for the treatment of patients with refractory metastatic melanoma. J Clin Oncol 23, 2346-2357, doi:10.1200/JC0.2005.00.240 (2005).
2 Chandran, S. S. et al. Treatment of metastatic uveal melanoma with adoptive transfer of tumour-infiltrating lymphocytes: a single-centre, two-stage, single-arm, phase 2 study. Lancet Oncol, doi:10.1016/S1470-2045(17)30251-6 (2017).
3 Stevanovic, S. et al. Complete regression of metastatic cervical cancer after treatment with human papillomavirustargeted tumor-infiltrating T cells. J Clin Oncol 33, doi:10.1200/jco.2014.58.9093 (2015).
4 FDA Reviewers and Sponsors: Content and Review of Chemistry, Manufacturing, and Control (CMC) Information for Human Gene Therapy Investigational New Drug Applications (INDs), 21 CFR 610.3(r), 2008.
5 Richards JO, Treisman J, Garlie N, Hanson JP, Oaks MK. Flow cytometry assessment of residual melanoma cells in tumor-infiltrating lymphocyte cultures. Cytometry A 2012; 81:374-81.
EJEMPLO 27:EL CÓCTEL DE FACTOR DE CRECIMIENTO DE CÉLULAS T IL-2/IL-15/IL-21 MEJORÓ LA FUNCIÓN DE EXPANSIÓN Y EFECTORA DE LAS CÉLULAS T INFILTRANTES DE TUMORES EN UN NUEVO PROCEDIMIENTO DESCRITO AQUÍ
Antecedentes
La terapia de células T adoptivas con TIL autólogos ha demostrado eficacia clínica en pacientes con melanoma metastásico y carcinoma cervical. En algunos estudios, los mejores resultados clínicos se han correlacionado positivamente con la cantidad total de células infundidas y/o el porcentaje de células T CD8+. La mayoría de los regímenes de producción actuales utilizan únicamente IL-2 para promover el crecimiento de TIL. Se ha informado una mayor expansión de linfocitos utilizando regímenes que contienen IL-15 e IL-21. Este estudio describe los efectos positivos y las sinergias de la adición de IL-15 e IL-21 a las formas de realización del procedimiento 2A y los procedimientos de fabricación de TIL de generación 2.
Generación de TIL usando un procedimiento nuevo descrito en este documento
El tumor se extirpa del paciente y se transporta a la instalación de fabricación con GMP o un laboratorio con fines de investigación. A su llegada, el tumor se fragmenta y se coloca en matraces con IL-2 para el protocolo de expansión previa (pre-REP) durante 11 días. Para los estudios de triple cóctel, se agregan IL-2,<i>L-15 e IL-21 (IL-2/IL-15/IL-21) al inicio del pre-REP. Para el Protocolo de expansión rápida (REP), se cultivan TIL con alimentadoras y anticuerpo anti-CD3 durante 11 días adicionales (Figura 100).
Materiales y procedimientos
El procedimiento de generación de TIL incluyó un protocolo de expansión previa rápida (pre-REP), en donde se colocaron fragmentos tumorales de 1-3 mm3 de tamaño en medio que contenía IL-2. Durante el pre-REP, TIL emigró de los fragmentos tumorales y se expandió en respuesta a la estimulación de IL-2.
Para estimular aún más el crecimiento de TIL, los TIL se expandieron durante un período de cultivo secundario denominado Protocolo de Expansión Rápida (REP) que incluía alimentadoras de PBMC irradiadas, IL-2 y anticuerpo anti-CD3. Se desarrolló un protocolo de expansión pre-REP y REP abreviado para expandir TIL mientras se mantenían los atributos fenotípicos y funcionales del producto TIL final. Este protocolo de generación de TIL abreviado se utilizó para evaluar el impacto de IL-2 sola frente a una combinación de IL2/IL-15/IL-21 añadida a la etapa pre-REP. Estos dos regímenes de cultivo se compararon para la generación de TIL cultivada a partir de tumores colorrectales, melanomas, cervicales, de mama triple negativo, pulmón y renales. Al finalizar el pre-REP, se evaluó la expansión, el fenotipo, la función (CD107a+ e IFNy) y el repertorio de TCR Vp de TIL cultivados.
El estudio muestra una mejora en la expansión durante el pre-REP con IL-2/IL-15/IL-21 en múltiples histologías tumorales. Los cultivos pre-REP se iniciaron utilizando el protocolo estándar de IL-2 (6000 Ul/ml) o con IL-15 (180 Ul/ml) e IL-21 (1 Ul/ml) además de IL-2 (Figura 101). Se evaluó la expansión de las células al completar el pre-REP. Un cultivo se clasificó como con mayor expansión sobre la IL-2 si el crecimiento general se incrementó en al menos un 20%. Los estudios fenotípicos y funcionales del melanoma y del pulmón se analizan con más detalle en los siguientes párrafos (texto en negrita en la Figura 101).
La IL-2/IL-15/IL-21 aumentó el porcentaje de células CD8+ en el carcinoma de pulmón, pero no en el melanoma. En las Figuras 102A y 102B, TIL derivado de (A) melanoma (n=4) y (B) pulmón (n=7) se evaluaron fenotípicamente para células CD4+ y CD8+ usando citometría de flujo post pre-REP. El valor p representa la diferencia entre las condiciones de IL-2 e IL- 12/IL- 15/IL-21 utilizando la prueba t para datos no apareados de Student.
La expresión de CD27 mejoró ligeramente en células CD8+ en cultivos tratados con IL-2/IL-15/IL-21. En las Figuras 103A y 103B, los TIL derivados de (A) melanoma (n=4) y (B) pulmón (n=7) se evaluaron fenotípicamente para CD27+ y CD28+ en las células CD4+ y CD8+ usando citometría de flujo post pre-REP. La expresión de CD27, un marcador celular asociado con un fenotipo más joven que se ha correlacionado con los resultados de la terapia de células T adoptivas, mejoró ligeramente en CD8+ TIL derivados de cultivo con IL-2/IL-15/IL-21 frente a IL-2 sola.
Los subconjuntos de células T no se alteraron con la adición de IL-15/IL-21. En las Figuras 104A y 104B, los TIL se evaluaron fenotípicamente para los subconjuntos efector/memoria (CD45RA y CCR7) en las células CD8+ y CD4+ (datos no mostrados) de (A) melanoma (n=4) y (B) pulmón (n=8) mediante citometría de flujo post-REP. TEM=memoria efectora (CD45RA-, CCR7-), TCM=memoria central (CD45RA-, CCR7+), TSCM=memoria de células madre (CD45RA+, CCR7+), TEMRA=células T efectoras (CD45RA+ CCR7-).
La capacidad funcional de los TIL se mejoró diferencialmente con IL-2/IL-15/IL-21. En las Figuras 105A y 105B, se evaluó la expresión de CD107a+ de los TIL derivados de (A) melanoma (n=4) y (B) pulmón (n=5) en respuesta a la estimulación de PMA durante 4 horas en las células CD4+ y CD8+, por citometría de flujo. (C) Se estimularon los TIL pre-REP derivados de melanoma y pulmón durante 24 horas con anticuerpo anti-CD3 soluble y se evaluó el iFNy en los sobrenadantes mediante ELISA.
La frecuencia relativa del repertorio de TCRvp se alteró en respuesta a IL-2/IL-15/IL-21 en el pulmón, pero no en el melanoma. En las Figuras 106A y 106B, se evaluó el repertorio de TCRvp (24 especificidades) en los TIL derivados de un (A) melanoma y (B) tumor de pulmón usando el kit Beckman Coulter para citometría de flujo.
Resumen
Este trabajo demuestra la capacidad del cóctel IL-2/IL-15/IL-21 para mejorar los números de TIL en comparación con IL-2 sola (> 20%) en el procedimiento de Generación 2, además de impactar las caracteristicas fenotípicas y funcionales.
El efecto del cóctel triple sobre la expansión de TIL dependía de la histología. La relación de células T CD8+/CD4+ aumentó con la adición de IL-2/IL-15/IL-21 en tumores de pulmón. La adición de IL-15 e IL-21 aumentó la expresión de CD107a y la producción de IFNy en TIL derivados de tumores pulmonares. La adición de IL-2/IL-15/IL-21 alteró el repertorio de TCRvp en el pulmón. El procedimiento de expansión de TIL de Generación 2 se utilizó para abarcar el cóctel de citocinas IL-2/IL-15/IL-21, proporcionando así un medio para promover aún más la expansión de TIL en histologías tumorales específicas, como tumores pulmonares y colorrectales. Estas observaciones son especialmente relevantes para la optimización y estandarización de los regímenes de cultivo de TIL necesarios para la fabricación a gran escala de TIL con la amplia aplicabilidad y disponibilidad requeridas de una terapia contra el cáncer de corriente principal.
EJEMPLO 28:NUEVOS LINFOCITOS INFILTRANTES DE TUMOR CRIOCONSERVADOS (LN-144) ADMINISTRADOS A PACIENTES CON MELANOMA METASTÁSICO. EFICACIA Y TOLERABILIDAD DEMOSTRADAS EN UN ENSAYO CLÍNICO MULTICENTRO FASE 2
Antecedentes
La seguridad y eficacia de la terapia celular adoptiva (ACT) que utiliza linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) se ha estudiado en cientos de pacientes con melanoma metastásico y ha demostrado tasas de respuesta objetiva (TRO)1 significativas y duraderas. En un ensayo de fase 2 en curso, C-144-01 que utiliza la fabricación centralizada con GMP de TIL, se evaluaron tanto los procedimientos de fabricación de TIL de Generación 1 (Gen 1) no crioconservados como los de Generación 2 (Gen 2) crioconservados.
Gen 1 tiene alrededor de 5-6 semanas de duración de fabricación (administrado en la Cohorte 1 del estudio C-144-01), mientras que Gen 2 tiene 22 días de duración de fabricación (procedimiento 2A, administrado en Cohorte 2 de estudio C-144-01). Los datos preliminares de los pacientes de la Cohorte 1 infundidos con el producto fabricado Gen 1 LN-144 fueron alentadores en el tratamiento de pacientes con melanoma metastásico post-PD-1 ya que la terapia TIL produjo respuestas.2 Los beneficios de Gen 2 incluyeron: (A) reducción en el tiempo que los pacientes y los médicos esperan para infundir TIL al paciente; (B) la crioconservación permite flexibilidad en la programación, distribución y entrega; y (C) reducción de los costes de fabricación. Los datos preliminares de la Cohorte 2 se presentan en este documento. La Figura 107 muestra una forma de realización del procedimiento de fabricación de LN-144 crioconservado Gen 2 (procedimiento 2A).
Diseño de estudio: Ensayo de fase 2 C-144-01 en melanoma metastásico
Estudio de fase 2, multicéntrico, de 3 cohortes para evaluar la eficacia y seguridad de linfocitos infiltrantes de tumores autólogos (LN-144) para el tratamiento de pacientes con melanoma metastásico.
Criterios de inclusión clave: (1) Melanoma metastásico medible y > 1 lesión extirpable para la generación de TIL; (2) Progresión en al menos una línea previa de terapia sistémica; (3) Edad > 18; y (4) ECOG PS 0-1.
Cohortes de tratamiento: (1) producto LN-144 no crioconservado; (2) producto LN-144 crioconservado; y (3) Re-tratamiento con LN-144 para pacientes sin respuesta o que progresan después de la respuesta inicial. La Figura 108 muestra el diseño del estudio.
Criterios de valoración: (1) Primario: Eficacia definida como ORR y (2) Secundario: Seguridad y eficacia.
Procedimientos
Conjunto de seguridad de la cohorte 2: 13 pacientes que se sometieron a extirpación con el propósito de generar TIL y recibieron cualquier componente del tratamiento del estudio.
Conjunto de eficacia de la cohorte 2: 9 pacientes que recibieron el preacondicionamiento de NMA-LD, la infusión de LN-144 y al menos una dosis de IL-2, y tuvieron al menos una evaluación de eficacia. 4 pacientes no tenían una evaluación de la eficacia en el momento del corte de datos.
Se han mostrado datos de biomarcadores para todos los datos disponibles leídos en la fecha del corte de datos.
Resultados
La figura 109 proporciona una tabla que ilustra las características de los pacientes de comparación de la cohorte 1 (ASCO 2017) frente a la cohorte 2. La cohorte 2 tiene: 4 terapias previas medianas; todos los pacientes han recibido previamente anti-PD-1 y anti-CTLA-4; y tenía una mayor carga tumoral reflejada por una mayor suma de diámetros (SOD) para las lesiones diana y una LDH media más alta al inicio del estudio. La Figura 110 proporciona una tabla que muestra los eventos adversos emergentes del tratamiento (> 30%).
Para la Cohorte 2 (LN-144 crioconservado), el producto de infusión y las características de la terapia TIL fueron (1) número medio de células TIL infundidas: 37 * 109, y (2) número mediano de administraciones de dosis de IL-2 fue 4.5. La Figura 111 muestra la eficacia del producto de infusión y la terapia TIL para los pacientes # 1 a # 8.
La Figura 112 muestra el estado clínico de la respuesta de los pacientes evaluables con enfermedad estable (SD) o una mejor respuesta. No se confirmó una respuesta parcial (RP) para el Paciente 6 ya que el paciente aún no alcanzó la segunda evaluación de eficacia. Un paciente (Paciente 9) falleció antes de la primera evaluación (todavía se considera en el conjunto de eficacia).
De los 9 pacientes en el conjunto de eficacia, un paciente (Paciente 9) no fue evaluable (NE) debido a la muerte relacionada con el melanoma antes de la primera evaluación del tumor no representada en la Figura 112. Se observaron respuestas en pacientes tratados con Gen 2. La tasa de control de la enfermedad (DCR) fue del 78%. El tiempo de respuesta fue similar al de la Cohorte 1. Un paciente (Paciente 3) con enfermedad progresiva (EP) en calidad de mejor respuesta no se incluyó en el gráfico de carriles de natación.
La Figura 113 muestra el cambio porcentual en la suma de diámetros. El paciente 9 no tuvo una evaluación de la enfermedad posterior a LN-144 debido a la muerte relacionada con el melanoma antes del día 42. Día -14: % de cambio de la suma de diámetros desde el cribado hasta la línea de base (día -14). Día -14 al día 126: % de cambio de SOD desde el inicio. Día -14=Línea de base. Día 0=infusión de LN-144.
Tras el tratamiento con TIL, se observó un aumento de HMGB1 (Figura 114). Los niveles plasmáticos de HMGB1 se midieron usando el kit ELISA HMGB1 (Tecan US, Inc). Los datos mostrados representan el cambio de veces en los niveles de HMGB1 antes (día -7) y después (día 4 y día 14) de la infusión de LN-144 en pacientes de la Cohorte 1 y Cohorte 2 (los valores de p se calcularon usando la prueba t de dos colas emparejada basada en datos log transformados). El tamaño de la muestra (en negrita y en cursiva) y los valores medios (en cursiva) se muestran entre paréntesis para cada punto en el tiempo. La HMGB1 es secretada por células inmunitarias activadas y liberada por células tumorales dañadas. Los niveles aumentados de HMGB1 observados después del tratamiento con LN-144 sugieren, por lo tanto, un mecanismo de actividad antitumoral mediado por el sistema inmunitario.
Se midieron los niveles de IP-10 en plasma usando el ensayo Luminex. Los datos que se mostraron en la Figura 115 representan el cambio de veces en los niveles de IP-10 antes (día -7) y después (día 4 y día 14) de la infusión de LN-144 en pacientes de la Cohorte 1 y Cohorte 2 (los valores de p se calcularon usando prueba t emparejada de dos colas, basada en datos transformados logarítmicamente). El tamaño de la muestra (en negrita y en cursiva) y los valores medios (en cursiva) se mostraron entre paréntesis para cada punto en el tiempo. El aumento posterior a la infusión de LN-144 en IP-10 se está monitoreando para comprender la posible correlación con la persistencia de TIL.
Los datos actualizados de la cohorte 2 (n=17 pacientes) se informan en la Figura 116 a la Figura 121. En comparación con la Cohorte 1 y una forma de realización del procedimiento Gen 1, que mostró un DCR del 64% y una tasa de respuesta general (ORR) del 29% (N=14), la Cohorte 2 y una forma de realización del procedimiento Gen 2 mostraron una DCR del 80% y O<r>R del 40% (N=10).
Conclusiones
Los resultados preliminares de los datos existentes demuestran una seguridad comparable entre los productos de TIL LN-144 de Gen 1 y Gen 2. La administración de TIL fabricados con el procedimiento Gen 2 (procedimiento 2A, como se describe en este documento) conduce a respuestas clínicas sorprendentemente aumentadas, observadas en pacientes con melanoma metastásico de enfermedad avanzada; todas habían progresado con terapias anteriores anti-PD-1 y anti-CTLA-4. La DCR para la cohorte 2 fue del 78%.
Los datos preliminares de biomarcadores apoyan el mecanismo de acción citolítico propuesto para la terapia con TIL.
La forma de realización del procedimiento de fabricación Gen 2 descrito en este documento dura 22 días. Este procedimiento acorta significativamente el tiempo que un paciente tiene que esperar para recibir su TIL, ofrece flexibilidad en el momento de la dosificación de los pacientes y conduce a una reducción del coste de fabricación, al tiempo que proporciona otras ventajas sobre los enfoques anteriores que permiten la comercialización y registro en las agencias reguladoras de la salud. Los datos clínicos preliminares en el melanoma metastásico utilizando una forma de realización del procedimiento de fabricación Gen 2 también indican una mejora sorprendente en la eficacia clínica de los TIL, medida por DCR, ORR y otras respuestas clínicas, con un tiempo de respuesta similar y un perfil de seguridad en comparación con TIL fabricados mediante el procedimiento Gen 1. La eficacia inesperadamente mejorada del producto TIL de Gen 2 también se demuestra por un aumento de más de cinco veces en la producción de IFN-y (Figura 98), que se correlaciona con una eficacia mejorada en general (Figura 122), una policlonalidad significativamente mejorada (Figura 99A y Figura 99B), y una producción promedio más alta de IP-10 y MCP-1 (Figura 123 a Figura 126). Sorprendentemente, a pesar del procedimiento mucho más corto de Gen 2, muchas otras características críticas del producto TIL son similares a las observadas usando procedimientos de fabricación más tradicionales, incluida la longitud relativa de los telómeros (Figura 97) y la expresión de CD27 y CD28 (Figura 96B y Figura 96C).
Referencias
1Goff, et al. Randomized, Prospective Evaluation Comparing Intensity of Lymphodepletion Before Adoptive Transfer of Tumor-Infiltrating Lymphocytes for Patients With Metastatic Melanoma. J Clin Oncol. 2016 Jul 10;34(20):2389-97.
2Sarnaik A, Kluger H, Chesney J, et al. Efficacy of single administration of tumor-infiltrating lymphocytes (TIL) in heavily pretreated patients with metastatic melanoma following checkpoint therapy. J Clin Oncol. 2017; 35 [suppl; abstr 3045].
EJEMPLO 29:ESTUDIOS DE FASE 2 DE HNSCC Y CARCINOMA CERVICAL
Inscripción para el estudio de fase 2 del HNSCC (carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello; C-145-03). 13 pacientes dieron su consentimiento para el estudio, se recolectaron TIL de 10 pacientes y, finalmente, se infundió a 7 pacientes con 1 más en curso.
Inscripción en el estudio de fase 2 del carcinoma de cuello uterino (C-145-04). Ocho pacientes dieron su consentimiento para el estudio, se recolectaron TIL de 4 pacientes y finalmente se infundieron 2 pacientes y 2 más en desarrollo.
Los datos iniciales del estudio en curso se proporcionan en la Figura 127. Se observó enfermedad estable (SD) y/o respuesta progresiva tanto en pacientes con HCNSCC como en pacientes con cáncer de cuello uterino tratados con la terapia TIL hasta por 84 días.
Los ejemplos expuestos anteriormente se proporcionan para dar a los expertos en la técnica una divulgación y descripción completas de cómo hacer y usar las formas de realización de las composiciones, sistemas y procedimientos de la invención, y no pretenden limitar el alcance de lo que los inventores consideran su invención.
Secuencias:
SEQ ID NO:1 es la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de muromonab.
SEQ ID NO:2 es la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de muromonab.
SEQ ID NO:3 es la secuencia de aminoácidos de una proteína IL-2 humana recombinante.
SEQ ID NO:4 es la secuencia de aminoácidos de la aldesleucina.
SEQ ID NO:5 es la secuencia de aminoácidos de una proteína IL-4 humana recombinante.
SEQ ID NO:6 es la secuencia de aminoácidos de una proteína IL-7 humana recombinante.
SEQ ID NO:7 es la secuencia de aminoácidos de una proteína IL-15 humana recombinante.
SEQ ID NO:8 es la secuencia de aminoácidos de una proteína IL-21 humana recombinante. Secuencias de aminoácidos de muromonab.
Secuencias de aminoácidos de interleucinas.

Claims (18)

REIVINDICACIONES
1. Un procedimiento para expandir linfocitos infiltrantes de tumores (TILS) en una población terapéutica de TIL que comprende:
(a) agregar fragmentos de tumor tratados que comprenden una primera población de TIL de un tumor extirpado de un sujeto a un sistema cerrado;
(b) realizar una primera expansión cultivando la primera población de TIL en un medio de cultivo celular que comprende IL-2 para producir una segunda población de TILs, en donde la primera expansión se realiza en un recipiente cerrado, lo que proporciona una primera área de superficie permeable a los gases, donde la primera expansión se realiza durante 3-11 días para obtener la segunda población de TILs, donde la segunda población de TILs es al menos 50 veces mayor en número que la primera población de TILs, y donde la transición desde la etapa (a) a la etapa (b) ocurre sin abrir el sistema;
(c) realizar una segunda expansión suplementando el medio de cultivo celular de la segunda población de TILs con IL-2, OKT-3 y células presentadoras de antígeno (APC) adicionales, para producir una tercera población de TILs, en donde la segunda expansión es realizada durante 7-11 días para obtener la tercera población de TILs, en donde la tercera población de TILs es una población terapéutica de TILs, en donde la segunda expansión se realiza en un recipiente cerrado que proporciona una segunda área superficial permeable a los gases, y en donde la transición de la etapa (b) a la etapa (c) se produce sin abrir el sistema;
(d) recolectar la tercera población de TIL obtenida de la etapa (c), en donde la transición de la etapa (c) a la etapa (d) ocurre sin abrir el sistema;
(e) transferir la tercera población de TIL recolectada de la etapa (d) a una bolsa de infusión, en donde la transferencia de la etapa (d) al (e) ocurre sin abrir el sistema; y
(f) crioconservar la bolsa de infusión que comprende la población de TIL recolectada de la etapa (e) usando un procedimiento de crioconservación, en donde la población terapéutica de TIL recolectada en la etapa (d) comprende suficientes TILs para una dosificación terapéuticamente efectiva de los TILs, en donde el procedimiento comprende analizar los TILs para determinar su viabilidad y en donde la viabilidad de la población terapéutica de TIL una vez descongelada es mayor o igual al 70%.
2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende además el análisis de la viabilidad de los TIL criopreservados descongelados.
3. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en donde no se realiza ninguna selección de la primera población de TIL, la segunda población de TIL, la tercera población de TIL, la población de TIL recolectada y/o la población de TIL terapéutica durante ninguno de los pasos (a) a (f).
4. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde las APCs son antígenos son células mononucleares de sangre periférica (PBMC).
5. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 4, en donde las PBMCs se complementan en una relación de 1:25 TII,:PBMCs.
6. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde las etapas (a) a (e) se realizan dentro de un período de 20 días a 22 días.
7. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde las etapas (a) a (e) se realizan dentro de un período de 22 días.
8. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el cáncer se selecciona del grupo que consiste en melanoma, cáncer de ovario, cáncer de cuello uterino, cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), cáncer de pulmón, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer causado por el virus del papiloma humano, cáncer de cabeza y cuello (incluido el carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (HNSCC)), cáncer renal y carcinoma de células renales.
9. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8, en donde el cáncer se selecciona del grupo que consiste en melanoma, HNSCC, cáncer cervical y NSCLC.
10. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9, en donde el cáncer es melanoma.
11. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9, en donde el cáncer es HNSCC.
12. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9, en donde el cáncer es cáncer cervical.
13. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9, en donde el cáncer es NSCLC.
14. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde, antes de la etapa (a), el procedimiento comprende obtener la primera población de TIL de un tumor resecado de un sujeto mediante el procesamiento de una muestra de tumor obtenida del sujeto en múltiples fragmentos de tumor.
15. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el riesgo de contaminación microbiana se reduce en comparación con un sistema abierto.
16. EL procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la tercera población de TILs es una población terapéutica de TILs que comprende una subpoblación aumentada de células T efectoras y/o células T de memoria central en relación con la segunda población de TILs, en donde las células T efectoras y/o las células T de memoria central obtenidas en la población terapéutica de TILs presentan una o más características seleccionadas del grupo que consiste en expresar CD27+, expresar CD28+, telómeros más largos, expresión aumentada de CD57 y expresión disminuida de CD56 en relación con las células T efectoras y/o las células T de memoria central obtenidas de la segunda población de células.
17. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la viabilidad de la población terapéutica de TILs una vez descongelada es superior al 70%.
18. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la viabilidad de la población terapéutica de TILs una vez descongelados es superior al 86%.
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Families Citing this family (123)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3628322A1 (en) 2013-03-01 2020-04-01 The United States of America, as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Cd8+ t cells that also express pd-1 and/or tim-3 for the treatment of cancer
GB201522097D0 (en) 2015-12-15 2016-01-27 Cellular Therapeutics Ltd Cells
HUE066460T2 (hu) * 2016-10-26 2024-08-28 Iovance Biotherapeutics Inc A kriokonzervált tumor infiltráló limfociták restimulációja
US11332713B2 (en) 2016-11-16 2022-05-17 KSQ Therapeutics, Inc. Gene-regulating compositions and methods for improved immunotherapy
CA3049165A1 (en) 2017-01-06 2018-07-12 Iovance Biotherapeutics, Inc. Expansion of tumor infiltrating lymphocytes with potassium channel agonists and therapeutic uses thereof
GB201700621D0 (en) 2017-01-13 2017-03-01 Guest Ryan Dominic Method,device and kit for the aseptic isolation,enrichment and stabilsation of cells from mammalian solid tissue
EP3596108A4 (en) 2017-03-15 2020-12-23 Pandion Operations, Inc. TARGETED IMMUNOTOLERANCE
JOP20190224A1 (ar) 2017-03-29 2019-09-26 Iovance Biotherapeutics Inc عمليات من أجل إنتاج الخلايا اللمفاوية المرتشحة للأورام واستخداماتها في العلاج المناعي
US11254913B1 (en) 2017-03-29 2022-02-22 Iovance Biotherapeutics, Inc. Processes for production of tumor infiltrating lymphocytes and uses of same in immunotherapy
US10676516B2 (en) 2017-05-24 2020-06-09 Pandion Therapeutics, Inc. Targeted immunotolerance
AR112072A1 (es) 2017-06-05 2019-09-18 Iovance Biotherapeutics Inc Métodos de uso de linfocitos infiltrantes de tumor en melanoma doble refractario
CR20200251A (es) * 2017-11-17 2020-07-17 Iovance Biotherapeutics Inc Expansión de til de aspirados con aguja fina y biopsias por punción
KR102777151B1 (ko) 2017-11-21 2025-03-05 더 보드 어브 트러스티스 어브 더 리랜드 스탠포드 주니어 유니버시티 인터루킨-2의 부분 효능제
EP3714041A1 (en) 2017-11-22 2020-09-30 Iovance Biotherapeutics, Inc. Expansion of peripheral blood lymphocytes (pbls) from peripheral blood
USRE50550E1 (en) 2017-12-06 2025-08-26 Pandion Operations, Inc. IL-2 muteins and uses thereof
US10946068B2 (en) 2017-12-06 2021-03-16 Pandion Operations, Inc. IL-2 muteins and uses thereof
US10174092B1 (en) 2017-12-06 2019-01-08 Pandion Therapeutics, Inc. IL-2 muteins
EP3737743A1 (en) 2018-01-08 2020-11-18 Iovance Biotherapeutics, Inc. Processes for generating til products enriched for tumor antigen-specific t-cells
US11713446B2 (en) 2018-01-08 2023-08-01 Iovance Biotherapeutics, Inc. Processes for generating TIL products enriched for tumor antigen-specific T-cells
CN112040986A (zh) 2018-03-15 2020-12-04 Ksq治疗公司 用于改进的免疫疗法的基因调控组合物和方法
US20190284553A1 (en) 2018-03-15 2019-09-19 KSQ Therapeutics, Inc. Gene-regulating compositions and methods for improved immunotherapy
CA3094957A1 (en) * 2018-03-29 2019-10-03 Iovance Biotherapeutics, Inc. Processes for production of tumor infiltrating lymphocytes and uses of same in immunotherapy
WO2019210131A1 (en) 2018-04-27 2019-10-31 Iovance Biotherapeutics, Inc. Closed process for expansion and gene editing of tumor infiltrating lymphocytes and uses of same in immunotherapy
WO2019217753A1 (en) * 2018-05-10 2019-11-14 Iovance Biotherapeutics, Inc. Processes for production of tumor infiltrating lymphocytes and uses of same in immunotherapy
MX2021004191A (es) 2018-10-15 2021-05-27 Nurix Therapeutics Inc Compuestos bifuncionales para degradar la tirosina cinasa de bruton (btk) mediante la trayectoria de ubiquitina proteosoma.
MY210603A (en) * 2018-11-05 2025-10-01 Iovance Biotherapeutics Inc Processes for production of tumor infiltrating lymphocytes and uses of the same in immunotherapy
WO2020096927A1 (en) 2018-11-05 2020-05-14 Iovance Biotherapeutics, Inc. Expansion of tils utilizing akt pathway inhibitors
US12611427B2 (en) 2018-11-05 2026-04-28 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of NSCLC patients refractory for anti-PD-1 antibody
JP7854297B2 (ja) * 2018-11-05 2026-05-01 アイオバンス バイオセラピューティクス，インコーポレイテッド 改良された腫瘍反応性ｔ細胞の選択
CN113423820A (zh) * 2018-11-08 2021-09-21 伽马三角洲疗法有限公司 分离和扩增细胞的方法
CA3123392A1 (en) * 2018-12-19 2020-06-25 Iovance Biotherapeutics, Inc. Methods of expanding tumor infiltrating lymphocytes using engineered cytokine receptor pairs and uses thereof
WO2020146740A1 (en) 2019-01-10 2020-07-16 Iovance Biotherapeutics, Inc. System and methods for monitoring adoptive cell therapy clonality and persistence
US12582722B2 (en) 2019-02-13 2026-03-24 Nurix Therapeutics, Inc. Bifunctional compounds for degrading BTK via ubiquitin proteosome pathway
WO2020232029A1 (en) 2019-05-13 2020-11-19 Iovance Biotherapeutics, Inc. Methods and compositions for selecting tumor infiltrating lymphocytes and uses of the same in immunotherapy
BR112021023345A2 (pt) 2019-05-20 2022-02-01 Pandion Operations Inc Imunotolerância com alvo em madcam
US20220257656A1 (en) * 2019-07-10 2022-08-18 National Cancer Center Specific marker for identifying t cells specifically attacking cancer cells
GB201911066D0 (en) 2019-08-02 2019-09-18 Achilles Therapeutics Ltd T cell therapy
WO2021030482A1 (en) * 2019-08-12 2021-02-18 Bellicum Pharmaceuticals, Inc. Improved formulations for immune cells
AU2020334237B2 (en) 2019-08-19 2025-11-13 Universität Basel Cell therapy methods
EP4034140A1 (en) 2019-09-24 2022-08-03 Nurix Therapeutics, Inc. Cbl inhibitors and compositions for use in adoptive cell therapy
EP4048295A1 (en) * 2019-10-25 2022-08-31 Iovance Biotherapeutics, Inc. Gene editing of tumor infiltrating lymphocytes and uses of same in immunotherapy
WO2021113557A1 (en) 2019-12-04 2021-06-10 Nurix Therapeutics, Inc. Bifunctional compounds for degrading btk via ubiquitin proteosome pathway
US12516291B2 (en) 2019-12-11 2026-01-06 Iovance Biotherapeutics, Inc. Processes for the production of tumor infiltrating lymphocytes (TILs) and methods of using the same
BR112022011795A2 (pt) * 2019-12-20 2022-08-30 Instil Bio Uk Ltd Métodos para preparar e isolar uma população terapêutica de linfócitos e para tratar câncer em um indivíduo, população terapêutica de linfócitos, bolsa criopreservada, recipiente flexível, e, sistema para extração de linfócitos
WO2021146436A2 (en) 2020-01-14 2021-07-22 Synthekine, Inc. Biased il2 muteins methods and compositions
EP4107187A4 (en) 2020-02-21 2024-07-03 Pandion Operations, Inc. TISSUE-TARGETED IMMUNOTOLERANCE WITH A CD39 EFFECTOR
CN115997008A (zh) * 2020-04-22 2023-04-21 艾欧凡斯生物治疗公司 协调用于患者特异性免疫疗法的细胞的制造的系统和方法
CN115461062A (zh) 2020-04-28 2022-12-09 阿基里斯治疗英国有限公司 T细胞疗法
CA3158133A1 (en) 2020-04-28 2021-11-04 Lyell Immunopharma, Inc. Methods for culturing cells
CN116018158A (zh) * 2020-04-30 2023-04-25 转化基因组学研究所 新抗原知情的肿瘤浸润性淋巴细胞癌免疫疗法
CA3177413A1 (en) * 2020-05-04 2021-11-11 Michelle SIMPSON-ABELSON Selection of improved tumor reactive t-cells
CA3176826A1 (en) 2020-05-04 2021-11-11 Iovance Biotherapeutics, Inc. Processes for production of tumor infiltrating lymphocytes and uses of the same in immunotherapy
GB202006989D0 (en) * 2020-05-12 2020-06-24 Gammadelta Therapeutics Ltd Methods for isolating gamma delta t cells
EP4159843A4 (en) * 2020-05-29 2024-07-31 Shanghai Juncell Therapeutics Co., Ltd. MEDIUM FOR SEEDING CELLS OF TUMOR INFILTRATING LYMPHOCYTES AND ITS APPLICATION
CN111876381A (zh) * 2020-07-22 2020-11-03 中美冠科生物技术（太仓）有限公司 一种t细胞模型及其在体外人源pd-1抗体药效评价中的应用
JP2023546359A (ja) 2020-10-06 2023-11-02 アイオバンス バイオセラピューティクス，インコーポレイテッド 腫瘍浸潤リンパ球療法によるｎｓｃｌｃ患者の治療
WO2022076606A1 (en) 2020-10-06 2022-04-14 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of nsclc patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies
TW202237824A (zh) 2020-11-23 2022-10-01 美商萊爾免疫藥物股份有限公司 培養免疫細胞之方法
JP2024501127A (ja) 2020-11-25 2024-01-11 上海君賽生物科技有限公司 腫瘍浸潤リンパ球培地及びその使用
CN116761606A (zh) 2020-11-25 2023-09-15 上海君赛生物科技有限公司 增强细胞杀伤的药物组合物及其用途
EP4259164A1 (en) * 2020-12-11 2023-10-18 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of cancer patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies in combination with braf inhibitors and/or mek inhibitors
AU2021401302A1 (en) * 2020-12-17 2023-07-06 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment with tumor infiltrating lymphocyte therapies in combination with ctla-4 and pd-1 inhibitors
EP4262827A1 (en) 2020-12-17 2023-10-25 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of cancers with tumor infiltrating lymphocytes
JP2023554425A (ja) * 2020-12-18 2023-12-27 インスティル バイオ （ユーケイ） リミテッド 腫瘍浸潤リンパ球の処理
EP4263807A2 (en) * 2020-12-18 2023-10-25 Instil Bio (Uk) Limited Processing of tumor infiltrating lymphocytes
EP4262828A1 (en) 2020-12-18 2023-10-25 Instil Bio (Uk) Limited Tumor infiltrating lymphocytes and anti-cd47 therapeutics
JP2024501845A (ja) 2020-12-31 2024-01-16 アイオバンス バイオセラピューティクス，インコーポレイテッド 腫瘍浸潤リンパ球の自動化された産生のためのデバイス及びプロセス
CN114686430A (zh) * 2020-12-31 2022-07-01 上海赛比曼生物科技有限公司 一种制备til的方法
US20240052309A1 (en) * 2021-01-04 2024-02-15 Thyas Co. Ltd. Method for producing regenerated t cell via ips cell
WO2022165260A1 (en) 2021-01-29 2022-08-04 Iovance Biotherapeutics, Inc. Methods of making modified tumor infiltrating lymphocytes and their use in adoptive cell therapy
CA3207359A1 (en) 2021-02-05 2022-08-11 Cecile Chartier-Courtaud Adjuvant therapy for cancer
EP4298208A1 (en) 2021-02-25 2024-01-03 Lyell Immunopharma, Inc. Methods for culturing cells
EP4301138A2 (en) 2021-03-05 2024-01-10 Iovance Biotherapeutics, Inc. Tumor storage and cell culture compositions
US20240191191A1 (en) * 2021-03-19 2024-06-13 Iovance Biotherapeutics, Inc. Methods for infiltrating lymphocyte (til) expansion related to cd39/cd69 selection and gene knockout in tils
JP2024512029A (ja) 2021-03-25 2024-03-18 アイオバンス バイオセラピューティクス，インコーポレイテッド Ｔ細胞共培養効力アッセイのための方法及び組成物、ならびに細胞療法製品との使用
KR102666931B1 (ko) * 2021-03-30 2024-05-20 주식회사 네오젠티씨 면역세포 조성물을 생산하는 방법
EP4320435A1 (en) 2021-04-09 2024-02-14 Achilles Therapeutics UK Limited Batch release assay for pharmaceutical products relating to t cell therapies
GB202109886D0 (en) 2021-07-08 2021-08-25 Achilles Therapeutics Uk Ltd Assay
CA3215830A1 (en) 2021-04-19 2022-10-27 Rafael CUBAS Chimeric costimulatory receptors, chemokine receptors, and the use of same in cellular immunotherapies
CN117203328A (zh) 2021-04-27 2023-12-08 武田药品工业株式会社 重组抗原呈递细胞
JP2024519029A (ja) 2021-05-17 2024-05-08 アイオバンス バイオセラピューティクス，インコーポレイテッド Ｐｄ－１遺伝子編集された腫瘍浸潤リンパ球及び免疫療法におけるその使用
DE102021002748A1 (de) 2021-05-27 2022-12-01 Zellwerk Gmbh Verfahren zur Herstellung von Tumor-infiltrierten T-Lymphozyten (TIL) und deren Verwendung als Zell-Therapeutika für die Behandlung humaner Tumoren
US20250090581A1 (en) * 2021-06-17 2025-03-20 CBio A/S Multistep process for culturing tumor-infiltrating lymphocytes for therapeutic use
US20240287456A1 (en) 2021-06-22 2024-08-29 Achilles Therapeutics Uk Limited A method for producing antigen-specific t cells
EP4373270A2 (en) 2021-07-22 2024-05-29 Iovance Biotherapeutics, Inc. Method for cryopreservation of solid tumor fragments
JP2024527961A (ja) 2021-07-28 2024-07-26 アイオバンス バイオセラピューティクス，インコーポレイテッド Ｋｒａｓ阻害剤と併用した腫瘍浸潤リンパ球療法によるがん患者の治療
WO2023039488A1 (en) 2021-09-09 2023-03-16 Iovance Biotherapeutics, Inc. Processes for generating til products using pd-1 talen knockdown
US20250000903A1 (en) 2021-09-24 2025-01-02 Iovance Biotherapeutics, Inc. Expansion processes and agents for tumor infiltrating lymphocytes
CA3236073A1 (en) 2021-10-26 2023-05-04 Robert J. Brown Piperidinylpyrazine-carboxamide compounds for treating and preventing cancer and for degrading btk
WO2023077015A2 (en) 2021-10-27 2023-05-04 Iovance Biotherapeutics, Inc. Systems and methods for coordinating manufacturing of cells for patient-specific immunotherapy
KR20240099331A (ko) 2021-10-28 2024-06-28 라이엘 이뮤노파마, 인크. 면역 세포를 배양하기 위한 방법
CA3237410A1 (en) 2021-11-10 2023-05-19 Friedrich Graf Finck VON FINCKENSTEIN Methods of expansion treatment utilizing cd8 tumor infiltrating lymphocytes
US20250154503A1 (en) 2022-01-14 2025-05-15 Tune Therapeutics, Inc. Compositions, systems, and methods for programming t cell phenotypes through targeted gene repression
US20250134999A1 (en) 2022-01-14 2025-05-01 Tune Therapeutics, Inc. Compositions, systems, and methods for programming t cell phenotypes through targeted gene activation
EP4469065A1 (en) 2022-01-28 2024-12-04 Iovance Biotherapeutics, Inc. Cytokine associated tumor infiltrating lymphocytes compositions and methods
CA3243416A1 (en) 2022-01-28 2023-08-03 Iovance Biotherapeutics, Inc. TUMOR INFILTRATION LYMPHOCYTES MODIFIED TO EXPRESS PAYLOADS
WO2023196877A1 (en) 2022-04-06 2023-10-12 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of nsclc patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies
JP2025512401A (ja) 2022-04-15 2025-04-17 アイオバンス バイオセラピューティクス，インコーポレイテッド 特定のサイトカインの組み合わせ及び／またはＡＫＴｉ処理を使用したＴＩＬ拡張プロセス
CA3251533A1 (en) 2022-05-10 2023-11-16 Iovance Biotherapeutics, Inc. TREATMENT OF CANCER PATIENTS WITH TUMOR-INFILTRATING LYMPHOCYTE THERAPIES IN COMBINATION WITH AN IL-15R AGONIST
WO2024011114A1 (en) 2022-07-06 2024-01-11 Iovance Biotherapeutics, Inc. Devices and processes for automated production of tumor infiltrating lymphocytes
GB202210006D0 (en) 2022-07-07 2022-08-24 Achilles Therapeutics Uk Ltd Analysis of T cell samples
US20260021181A1 (en) 2022-08-01 2026-01-22 Iovance Biotherapeutics, Inc. Chimeric costimulatory receptors, chemokine receptors, and the use of same in cellular immunotherapies
EP4583890A1 (en) 2022-09-09 2025-07-16 Iovance Biotherapeutics, Inc. Processes for generating til products using pd-1/tigit talen double knockdown
EP4583889A1 (en) 2022-09-09 2025-07-16 Iovance Biotherapeutics, Inc. Processes for generating til products using pd-1/tigit talen double knockdown
US12181192B2 (en) * 2022-09-16 2024-12-31 Black & Decker, Inc. Methods and devices for controlling the temperature of a surface
WO2024064642A2 (en) 2022-09-19 2024-03-28 Tune Therapeutics, Inc. Compositions, systems, and methods for modulating t cell function
EP4612277A1 (en) 2022-11-04 2025-09-10 Iovance Biotherapeutics, Inc. Methods for tumor infiltrating lymphocyte (til) expansion related to cd39/cd103 selection
JP2025539712A (ja) 2022-11-21 2025-12-09 アイオバンス バイオセラピューティクス，インコーポレイテッド 遺伝子編集されたｔ細胞の増殖能を評価するための方法
JP2025539816A (ja) 2022-11-21 2025-12-09 アイオバンス バイオセラピューティクス，インコーポレイテッド 腫瘍浸潤リンパ球の増幅のための２次元プロセス及びそれからの治療法
WO2024118836A1 (en) 2022-11-30 2024-06-06 Iovance Biotherapeutics, Inc. Processes for production of tumor infiltrating lymphocytes with shortened rep step
WO2024178397A2 (en) 2023-02-24 2024-08-29 Elevatebio Technologies, Inc. Modified immune effector cells and methods of use
DE102023002417B3 (de) 2023-06-15 2024-12-05 Zellwerk Gmbh Verfahren zur Expansion von Zellen
WO2025006811A1 (en) 2023-06-27 2025-01-02 Lyell Immunopharma, Inc. Methods for culturing immune cells
WO2025015318A2 (en) 2023-07-13 2025-01-16 Iovance Biotherapeutics, Inc. Cytokine encoding lentiviral vectors and uses thereof for making tumor infiltrating lymphocytes
WO2025029840A1 (en) 2023-07-31 2025-02-06 Tune Therapeutics, Inc. Compositions and methods for multiplexed activation and repression of t cell gene expression
CN121909284A (zh) 2023-07-31 2026-04-21 图恩疗法股份有限公司 用于调节il-2基因表达的组合物和方法
WO2025038289A1 (en) * 2023-08-17 2025-02-20 H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute Inc. Using 12 chemokine signature to select sting agonist and til treatments for solid tumors
CN121773331A (zh) * 2023-08-31 2026-03-31 国立大学法人筑波大学 对肿瘤性滤泡调节性t细胞及肿瘤性滤泡杀伤性t细胞进行定量的方法、对肿瘤性滤泡调节性t细胞及肿瘤性滤泡杀伤性t细胞进行筛选的方法、治疗用组合物及试剂盒
WO2025054540A1 (en) 2023-09-08 2025-03-13 Iovance Biotherapeutics, Inc. Methods of gene-editing using programmable nucleases
WO2025101484A1 (en) 2023-11-06 2025-05-15 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of endometrial cancers with tumor infiltrating lymphocyte therapies
WO2025256538A1 (zh) * 2024-06-12 2025-12-18 北京沙砾生物医药股份有限公司 一种细胞产品中检测肿瘤残留的方法
WO2026006604A1 (en) 2024-06-26 2026-01-02 Lyell Immunopharma, Inc. Feeder cell replacement
CN118710478B (zh) * 2024-08-27 2025-01-03 福州大学 基于改进麻雀搜索算法的地铁突发运营中断客流疏运方法

Family Cites Families (79)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4766106A (en) 1985-06-26 1988-08-23 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US5206344A (en) 1985-06-26 1993-04-27 Cetus Oncology Corporation Interleukin-2 muteins and polymer conjugation thereof
WO1988000970A2 (en) 1986-08-08 1988-02-11 Regents Of The University Of Minnesota Method of culturing leukocytes
US6352694B1 (en) 1994-06-03 2002-03-05 Genetics Institute, Inc. Methods for inducing a population of T cells to proliferate using agents which recognize TCR/CD3 and ligands which stimulate an accessory molecule on the surface of the T cells
US6534055B1 (en) 1988-11-23 2003-03-18 Genetics Institute, Inc. Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US7479269B2 (en) 1988-11-23 2009-01-20 Genetics Institute, Llc Methods for selectively enriching TH1 and TH2 cells
US6905680B2 (en) 1988-11-23 2005-06-14 Genetics Institute, Inc. Methods of treating HIV infected subjects
US5089261A (en) 1989-01-23 1992-02-18 Cetus Corporation Preparation of a polymer/interleukin-2 conjugate
US4902502A (en) 1989-01-23 1990-02-20 Cetus Corporation Preparation of a polymer/interleukin-2 conjugate
US5126132A (en) 1989-08-21 1992-06-30 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Tumor infiltrating lymphocytes as a treatment modality for human cancer
US7175843B2 (en) 1994-06-03 2007-02-13 Genetics Institute, Llc Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US6867041B2 (en) 2000-02-24 2005-03-15 Xcyte Therapies, Inc. Simultaneous stimulation and concentration of cells
US7572631B2 (en) 2000-02-24 2009-08-11 Invitrogen Corporation Activation and expansion of T cells
CN1507357A (zh) 2000-10-31 2004-06-23 PRҩƷ���޹�˾ 提高生物活性分子传递的方法和组合物
US20050084967A1 (en) 2002-06-28 2005-04-21 Xcyte Therapies, Inc. Compositions and methods for eliminating undesired subpopulations of T cells in patients with immunological defects related to autoimmunity and organ or hematopoietic stem cell transplantation
ES2422193T3 (es) 2002-06-28 2013-09-09 Life Technologies Corp Métodos para restaurar el repertorio inmune en pacientes con defectos inmunológicos relacionados con la autoinmunidad y trasplante de órganos o de células madre hematopoyéticas
US8034334B2 (en) 2002-09-06 2011-10-11 The United States Of America As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Immunotherapy with in vitro-selected antigen-specific lymphocytes after non-myeloablative lymphodepleting chemotherapy
ITMI20022118A1 (it) 2002-10-04 2004-04-05 Abiogen Pharma Spa Procedimento per la coltura su larga scala di t-linfociti in un sistema omogeneo.
CN101120083B (zh) 2003-10-08 2013-03-27 威尔森沃尔夫制造公司 利用透气性材料进行细胞培养的方法及装置
DK2439273T3 (da) 2005-05-09 2019-06-03 Ono Pharmaceutical Co Humane monoklonale antistoffer til programmeret død-1(pd-1) og fremgangsmåder til behandling af cancer ved anvendelse af anti-pd-1- antistoffer alene eller i kombination med andre immunterapeutika
PT1907424E (pt) 2005-07-01 2015-10-09 Squibb & Sons Llc Anticorpos monoclonais humanos para o ligando 1 de morte programada (pd-l1)
AU2006328945B2 (en) 2005-12-21 2011-06-30 Sentoclone International Ab Method for treating malignant melanoma
US8211425B2 (en) 2005-12-21 2012-07-03 Sentoclone International Ab Method for treating disseminated cancer
US8007785B2 (en) 2005-12-21 2011-08-30 Sentoclone International Ab Method for treating colon cancer with tumour-reactive T-lymphocytes
CA2634167C (en) 2005-12-21 2015-06-16 Sentoclone Ab Improved method for expansion of tumour-reactive t-lymphocytes for immunotherapy of patients with cancer
FR2911346B1 (fr) * 2007-01-12 2012-12-07 Ct Hospitalier Universitaire De Nantes Procede de culture in vitro de lymphocytes t,en particulier de lymphocytes t infiltrant les tumeurs dits til
US7951365B2 (en) 2007-06-27 2011-05-31 Deifiera Falun Ab Method for expansion of tumour-reactive T-lymphocytes for immunotherapy of patients with specific cancer types
EP2203746B1 (en) * 2007-09-24 2013-03-06 Technion Research & Development Foundation Ltd. T cell subpopulations capable of treating cancer
WO2014085437A2 (en) 2012-11-27 2014-06-05 The Johns Hopkins University Use of post-transplant cyclophosphamide treated allogeneic marrow infiltrating lymphocytes to augment anti-tumor immunity
US20150320798A1 (en) 2012-11-27 2015-11-12 The Johns Hopkins University Use of Post-Transplant Cyclophosphamide Treated Allogeneic Marrow Infiltrating Lymphocytes to Augment Anti-Tumor Immunity
US8383099B2 (en) 2009-08-28 2013-02-26 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Adoptive cell therapy with young T cells
US20130115617A1 (en) 2009-12-08 2013-05-09 John R. Wilson Methods of cell culture for adoptive cell therapy
EP2510086A4 (en) 2009-12-08 2013-05-22 Wolf Wilson Mfg Corp IMPROVED METHODS FOR CELL CULTURES FOR ADOPTIVE CELL THERAPIES
US8956860B2 (en) 2009-12-08 2015-02-17 Juan F. Vera Methods of cell culture for adoptive cell therapy
WO2012065086A1 (en) 2010-11-12 2012-05-18 Nektar Therapeutics Conjugates of an il-2 moiety and a polymer
US20120244133A1 (en) 2011-03-22 2012-09-27 The United States of America, as represented by the Secretary, Department of Health and Methods of growing tumor infiltrating lymphocytes in gas-permeable containers
CN103502439B (zh) 2011-04-13 2016-10-12 因缪尼卡姆股份公司 用于抗原特异性t细胞增殖的方法
PL2768939T3 (pl) * 2011-10-21 2017-02-28 Cell Medica Limited Urządzenie do aseptycznego rozwoju komórek
GB201121308D0 (en) 2011-12-12 2012-01-25 Cell Medica Ltd Process
CN102816734A (zh) 2012-05-09 2012-12-12 阮润生 一种肿瘤抗原特异性t细胞的获取方法
EP2850175B1 (en) 2012-05-18 2020-12-16 Wilson Wolf Manufacturing Corporation Improved methods of cell culture for adoptive cell therapy
EP2859093A4 (en) 2012-06-11 2016-08-17 Wolf Wilson Mfg Corp IMPROVED METHODS FOR CELL CULTURES FOR ADOPTIVE CELL THERAPIES
EP2961415B1 (en) 2013-03-01 2021-01-06 The United States of America, as represented by The Secretary, Department of Health and Human Services Methods of producing enriched populations of tumor-reactive t cells from tumor
EP3628322A1 (en) 2013-03-01 2020-04-01 The United States of America, as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Cd8+ t cells that also express pd-1 and/or tim-3 for the treatment of cancer
CN118562610A (zh) 2013-06-24 2024-08-30 威尔逊沃夫制造公司 用于透气性细胞培养过程的封闭系统装置和方法
ES2932429T3 (es) * 2013-07-15 2023-01-19 Us Health Métodos de preparación de células T anti-antígeno de virus del papiloma humano
US10233425B2 (en) 2013-09-16 2019-03-19 The Trustees Of The University Of Pennsylvania CD137 enrichment for efficient tumor infiltrating lymphocyte selection
AU2015231041B2 (en) 2014-03-20 2020-07-16 H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute, Inc. Tumor-infiltrating lymphocytes for adoptive cell therapy
WO2015157636A1 (en) 2014-04-10 2015-10-15 H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute, Inc. Enhanced expansion of tumor-infiltrating lymphocytes for adoptive cell therapy
CA2946312A1 (en) * 2014-04-23 2015-10-29 Juno Therapeutics, Inc. Methods for isolating, culturing, and genetically engineering immune cell populations for adoptive therapy
RU2739770C2 (ru) 2014-06-11 2020-12-28 полибайосепт ГмбХ Экспансия лимфоцитов с использованием композиции цитокинов для активной клеточной иммунотерапии
WO2015188839A2 (en) 2014-06-13 2015-12-17 Immudex Aps General detection and isolation of specific cells by binding of labeled molecules
WO2016037054A1 (en) 2014-09-04 2016-03-10 The Johns Hopkins University Activation of marrow infiltrating lymphocytes in hypoxic alternating with normoxic conditions
AU2014407539B2 (en) * 2014-10-02 2020-10-22 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Methods of isolating T cell receptors having antigenic specificity for a cancer-specific mutation
EP3034092A1 (en) 2014-12-17 2016-06-22 Université de Lausanne Adoptive immunotherapy for treating cancer
WO2016179006A1 (en) 2015-05-01 2016-11-10 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Methods of isolating t cells and t cell receptors having antigenic specificity for a cancer-specific mutation from peripheral blood
FR3040396A1 (fr) 2015-06-30 2017-03-03 Chu Nantes Procede de cryoconservation de lymphocytes infiltrant la tumeur
FR3038324B1 (fr) 2015-06-30 2020-10-30 Lab Francais Du Fractionnement Procede de cryoconservation de cellules a visee therapeutique
WO2017048614A1 (en) 2015-09-15 2017-03-23 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Methods of isolating tumor-reactive t cell receptors from tumor or peripheral blood
AU2016341529B2 (en) 2015-10-22 2023-03-30 Juno Therapeutics Gmbh Methods for culturing cells and kits and apparatus for same
IL258935B2 (en) 2015-10-28 2024-08-01 Life Tech As Selective expansion of different subpopulations of t cells by the alteration of cell surfacing signals and signal ratio
MX2019000180A (es) 2016-06-28 2019-11-05 Geneius Biotechnology Inc Composiciones de células t para la inmunoterapia.
CN106244538A (zh) 2016-08-04 2016-12-21 英普乐孚生物技术(上海)有限公司 一种恶性腹水来源的til细胞的分离培养方法
MY192158A (en) 2016-09-14 2022-08-03 Abbvie Biotherapeutics Inc Anti-pd-1 antibodies and their uses
HUE066460T2 (hu) 2016-10-26 2024-08-28 Iovance Biotherapeutics Inc A kriokonzervált tumor infiltráló limfociták restimulációja
TWI788307B (zh) 2016-10-31 2023-01-01 美商艾歐凡斯生物治療公司 用於擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞之工程化人造抗原呈現細胞
KR102618948B1 (ko) 2016-11-17 2023-12-27 이오반스 바이오테라퓨틱스, 인크. 잔유 종양 침윤 림프구 및 그의 제조 및 사용 방법
US20200095547A1 (en) 2016-12-02 2020-03-26 Darya ALIZADEH Methods for manufacturing t cells expressing of chimeric antigen receptors and other receptors
CN106591232A (zh) 2017-01-04 2017-04-26 安徽安龙基因医学检验所有限公司 一种高效的pd‑1‑cd8+t细胞的培养方法
MX2019007963A (es) 2017-01-06 2019-10-21 Iovance Biotherapeutics Inc Expansion de linfocitos infiltrantes de tumor (til) con agonistas de la superfamilia de recptor de factor de necrosis tumoral (tnfrsf) y combinaciones terapeuticas de til- y agonistas de tnfrsf.
CA3049165A1 (en) 2017-01-06 2018-07-12 Iovance Biotherapeutics, Inc. Expansion of tumor infiltrating lymphocytes with potassium channel agonists and therapeutic uses thereof
MX2019010906A (es) 2017-03-14 2020-02-12 Juno Therapeutics Inc Metodos para almacenamiento criogenico.
US11254913B1 (en) 2017-03-29 2022-02-22 Iovance Biotherapeutics, Inc. Processes for production of tumor infiltrating lymphocytes and uses of same in immunotherapy
JOP20190224A1 (ar) 2017-03-29 2019-09-26 Iovance Biotherapeutics Inc عمليات من أجل إنتاج الخلايا اللمفاوية المرتشحة للأورام واستخداماتها في العلاج المناعي
KR20200003913A (ko) 2017-05-10 2020-01-10 이오반스 바이오테라퓨틱스, 인크. 액상 종양으로부터의 종양 침윤 림프구의 확장 및 그의 치료 용도
AR112072A1 (es) 2017-06-05 2019-09-18 Iovance Biotherapeutics Inc Métodos de uso de linfocitos infiltrantes de tumor en melanoma doble refractario
CN107384867B (zh) 2017-08-04 2020-09-11 北京世纪劲得生物技术有限公司 一种肿瘤组织til细胞制备方法及专用培养基
US11713446B2 (en) 2018-01-08 2023-08-01 Iovance Biotherapeutics, Inc. Processes for generating TIL products enriched for tumor antigen-specific T-cells
CN115997008A (zh) 2020-04-22 2023-04-21 艾欧凡斯生物治疗公司 协调用于患者特异性免疫疗法的细胞的制造的系统和方法

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