RS61991B1 - Derivati pirazolilaminobenzimidazola kao jak inhibitori - Google Patents

Description

Opis

[0001] Prikazani pronalazak se odnosi na jedinjenja benzimidazola i njihove farmaceutski prihvatljive soli, koji inhibiraju Janus kinase 1 (JAK1), farmaceutske formulacije koje sadrže pomenuta jedinjenja i na jedinjenja za upotrebu u lečenju izvesnih tipova autoimunih bolesti.

[0002] Familija Janus kinaza (JAK1, JAK2, JAK3 i TYK2) su intracelularne proteinske tirozin kinaze sa suštinskim ulogama u imunim funkcijama, zapaljenju i hematopoiezi preko signalnih transduktora i aktivatora puta transkripcije (JAK-STAT) Janus kinaza. Kao odgovor na ekstracelularne polipeptide kao što su citokinaze tipa I i tipa II, Janus kinaze regulišu fosforilaciju tirozina različitih efektora i iniciraju aktivaciju nishodnog puta signalizacije uključujući različite fiziološke odgovore. Specifično, JAK1 izoblik igra ključnu ulogu u signalizaciji interferona I i II i izaziva signale interleukina-2 (IL-2), interleukina-4 (IL-4), glikoproteina 130 (gp130) i familija receptora klase II. Kao takva, inhibicija JAK1 malim molekulima može posredovati u signalnim putevima uključenim u onkologiju, inflamaciju i autoimune bolesti. Ghoreschi K et al. Immunological Review 2009, 228, 273-287 and Zak M. et al. Med Chem.2013, 56, 4764-4785.

[0003] Uprkos uspehu sredstava koja inhibiraju JAK, još uvek postoji potreba za otkrivanjem i razvijanjem inhibitora, koji selektivno ciljaju pojedinačne izooblike JAK. Ovo može umanjiti rizik od uticaja pored ciljanih.

[0004] Jedinjenja inhibitori Janus kinaze su poznata u literaturi. Na primer, US 2015/0203455 opisuje izvesna jedinjenja benzimidazola koja su inhibitori JAK i koja se reklamiraju da su korisna u lečenju autoimunih bolesti, inflamatornih bolesti i proliferativnih bolesti inter alia.

[0005] Postoji potreba da se obezbede alternativni inhibitori JAK1 za lečenjenje autoimunih bolesti naročito za imunološke bolesti kao što su artritis, reumatoidni artritis i dijabetičarska nefropatija. Pored toga, preostaje potreba da se obezbede selektivni inhibitori JAK1. Prikazani pronalazak obezbeđuje izvesne inhibitore JAK1, koji mogu da ispunjavaju jedan ili više ovih zahteva.

[0006] Prikazani pronalazak obezbeđuje jedinjenje formule 1, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so:

gde R je izabran između: H, -C1-3alkil, -CH2CH(OH)CH3, -C2-3alkil-O-CH3,

i

R1 je izabran između: H, -CH3i -OCH3; R2 je -CHF2ili -CF3; i R3 je H ili -CH3; uz uslov da kada R2 je -CF3i

R3 je H, ili R ili R1 može biti -CH3, ali ne oba. Veza prikazana kao označava tačku vezivanja prstena tetrahidropirana ili prstena piridina za ostatak molekula.

[0007] Prikazani pronalazak obezbeđuje jedinjenje formule 2, ili farmaceutski prihvatljivu so tamo, koja je,

gde R je izabran između: H, -C1-3alkil, -CH2CH(OH)CH3, -C2-3alkil-O-CH3,

i

R1 je izabran između: H, -CH3i -OCH3; R2 je -CHF2ili -CF3; i R3 je H ili -CH3; uz uslov da kada R2 je -CF3i R3 je H, ili R ili R1 mogu biti -CH3ali ne oba.

[0008] U jednom obliku, prikazani pronalazak obezbeđuje jedinjenje prema formuli 1 ili 2 gde R je izabran između: -CH3, -CH2CH3, i

ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so. U izvesnim izvođenjima, R je -CH3, ili -CH2CH3. U drugim izvođenjima, R je

[0009] U drugom obliku prikazani pronalazak obezbeđuje jedinjenje prema formuli 1 ili 2 gde R je

gde veza prikazana kao označava tačku vezivanja za ostatak molekula. U drugom obliku, prikazani pronalazak obezbeđuje jedinjenje prema formuli 1 ili 2 gde R je

[0010] U drugom obliku, prikazani pronalazak obezbeđuje jedinjenje prema formuli 1 ili 2 gde R1 je izabran između: H, -CH3, i -OCH3. U izvesnim izvođenjima R1 je H ili -CH3. U drugim izvođenjima, R1 je -OCH3.

[0011] U drugom obliku, prikazani pronalazak obezbeđuje jedinjenje prema formuli 1 ili 2 gde R2 je -CF3U izvesnim izvođenjima ovog oblika, R je -CH3, ili -CH2CH3i R1 je -CH3, ili -OCH3. U drugim izvođenjima ovog oblika, R je

i R1 je H.

[0012] U drugom obliku, prikazani pronalazak obezbeđuje jedinjenje prema formuli 1 ili 2 gde R3 je -CH3.

[0013] U jednom izvođenju, prikazani pronalazak obezbeđuje jedinjenje formule 3 koje je

ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so.

[0014] U drugom izvođenju, prikazani pronalazak obezbeđuje jedinjenje formule 4 koje je

ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so.

[0015] U još jednom izvođenju, prikazani pronalazak obezbeđuje jedinjenje formule 5, koje je

ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so.

[0016] U drugom izvođenju, prikazani pronalazak obezbeđuje jedinjenje formule 5A, koje je:

ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so.

[0017] U drugom izvođenju, prikazani pronalazak obezbeđuje jedinjenje formule 5B, koje je:

ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so.

[0018] U još jednom izvođenju, prikazani pronalazak obezbeđuje jedinjenje formule 6 koje je

ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so. U jednom izvođenju farmaceutska kompozicija sadrži jedinjenje formule 6 kao neutralno jedinjenje kao slobodnu bazu ili cviterjon. U jednom izvođenju, prikazani pronalazak obezbeđuje jedinjenje formule 6 kao citratnu so. U još jednom izvođenju, prikazani pronalazak obezbeđuje jedinjenje formule 6 kao slobodnu bazu u kristalnom obliku karakterisanu spektrom difrakcije X-zraka na prahu dobijenim pomoću CuKa izvora (λ=1.54060 Å), koji ima signal na 20.5 u kombinaciji sa jednim ili više signala izabranih iz grupe koju čine 15.5, 18.1, 18.3, 18.5, 22.9 i 23.6; sa odsupanjem difrakcionih uglova od 0.2 stepeni.

[0019] U još jednom izvođenju, prikazani pronalazak obezbeđuje jedinjenje formule 6 kao (2R)-1,1,1-trifluoro-3-({cis-4-[(1-metil-4-{[1-(piridin-2-il)-1H-pirazol-3-il]amino}-1H-benzimidazol-6-il)oksi]cikloheksil}amino)propan-2-ol 2-hidroksipropan-1,2,3-trikarboksilat hidrat (1:1:1) u kristalnom obliku karakterisanom sa spektrom difrakcije X-zraka na prahu dobijenom od CuKa izvora (λ=1.54060 Å), koji ima signal na 17.9 u kombinaciji sa jednim ili više signala izabranih iz grupe koju čine 26.1, 26.6 i 22.7; sa odstupanjem difrakcionih uglova od 0.2 stepena.

[0020] U drugom obliku, prikazani pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja obuhvata jedinjenje prema bilo kojoj od formula 1 do 6, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, i bar jedan farmaceutski prihvatljiv nosač, razblaživač ili ekscipijent

[0021] U drugom obliku, prikazani pronalazak obezbeđuje kompoziciju koja sadrži suštinski čist (2R)-1,1,1-trifluoro-3-({cis-4-[(1-metil-4-{[1-(piridin-2-il)-1H-pirazol-3-il]amino}-1H-benzimidazol-6-il)oksi]cikloheksil}amino)propan-2-ol 2-hidroksipropan-1,2,3-trikarboksilat hidrat (1:1:1) u kristalnom obliku. Poželjno kompozicija sadrži više od 80 % (masenih /masenih) (2R)-1,1,1-trifluoro-3-({cis-4-[(1-metil-4-{[1-(piridin-2-il)-1H-pirazol-3-il]amino}-1H-benzimidazol-6-il)oksi]cikloheksil}amino)propan-2-ol 2-hidroksipropan-1,2,3-trikarboksilat hidrata (1:1:1) u kristalnom obliku. Poželjnije više od 90 % (masenih/masenih) (2R)-1,1,1-trifluoro-3-({cis-4-[(1-metil-4-{[1-(piridin-2-il)1H-pirazol-3-il]amino}-1H-benzimidazol-6-il)oksi]cikloheksil}amino)propan-2-ol 2-hidroksipropan-1,2,3-trikarboksilat hidrata (1:1:1) u kristalnom obliku. Još poželjnije više od 95 % (masenih /masenih) (2R)-1,1,1-trifluoro-3-({cis-4-[(1-metil-4-{[1-(piridin-2-il)-1H-pirazol-3-il]amino}-1H-benzimidazol-6-il)oksi]cikloheksil}amino)propan-2-ol 2-hidroksipropan-1,2,3-trikarboksilat hidrata (1:1:1) u kristalnom obliku.

[0022] U drugom obliku, prikazani pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja uključuje jedinjenje prema bilo kojoj od formula 1 do 6, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so i bar jedan farmaceutski prihvatljiv nosač, razblaživač ili ekscipijent.

[0023] U jednom izvođenju farmaceutska kompozicija sadrži jedinjenje formule 1 do 6 kao neutralno jedinjenje ili cviterjon. U drugom izvođenju farmaceutska kompozcija sadrži jedinjenje formule 1 do 6 kao farmaceutski prihvatljivu so. U još jednom izvođenju, farmaceutska kompozicija sadrži jedinjenje formule 1 do 6 kao citratnu so.

[0024] U drugom obliku, prikazani pronalazak obezbeđuje jedinjenje prema bilo kojoj formula 1 do 6 za upotrebu u terapiji.

[0025] U jednom izvođenju, terapija, u kojoj može biti korišćeno jedinjenje prema bilo kojoj formuli 1 do 6, je izabrana između: artritisa, poželjnije reumatoidnog artritisa; dijabetičarske nefropatije; Lupusa, poželjnije sistemskog eritemskog lupusa; Sjögren-ovog sindroma; i inflamatorne bolesti creva, poželjnije Kronove bolesti i ulceroznog kolitisa.

[0026] U drugom obliku, prikazani pronalazak obezbeđuje upotrebu jedinjenja prema bilo kojoj od formula 1 do 6 u proizvodnji leka.

[0027] U jednom izvođenju, lek je koristan u lečenju artritisa. U drugom izvođenju, lek je koristan u lečenju reumatoidnog artritisa. U još jednom izvođenju, lek je koristan u lečenju stanja izabranih između; dijabetičarske retinopatije; Lupusa, poželjnije sistemskog eritemskog lupusa; Sjögren-ovog sindroma; i inflamatrone bolesti creva, poželjnije, Kronove bolesti i ulceroznog kolitisa. U još jednom izvođenju, lek je koristan u lečenju dijabetičarske nefropatije. U još jednom izvođenju, lek je koristan u lečenju lupusa. U još jednom izvođenju, lek je koristan u lečenju Sjögren-ovog sindroma. U još jednom izvođenju, lek je koristan u lečenju inflamatorne bolesti creva.

[0028] Izraz "farmaceutski prihvatljiva so" kako je ovde korišćen odnosi se na so jedinjenja prema pronalasku koja se smatra da je primenjiva za kliničku i/ili veterinarsku upotrebu. Primeri farmaceutski prihvatljivih soli i uobičajenih metodologija za njihovo dobijanje može se nači kod P. Stahl, et al., Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection and Use, 2nd Revised Edition, Wiley-VCH, 2011, and S.M. Berge, et al., "Pharmaceutical Salts," Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol.66, No.

1, January 1977.

[0029] Farmaceutske kompozicije prema prikazanom pronalasku mogu biti dobijene poznatim postupcima u stanju tehnike korišćenjem prihvatljivih farmaceutskih aditiva. Izraz "farmaceutski prihvatljiv(i) aditiv(i)" kako ovde je korišćeno za farmaceutske kompozicije, odnosi se na jedan ili više nosača, razblaživača i ekscipijenata koji su kompatibilni sa drugim aditivima formulacije i nisu štetni za pacijenta. Farmaceutke kompozicije i postupci za njihovo dobijanje su poznati i primeri se mogu naći u Loyd, V., et al. eds. Remington: The Science and Practice of Pharmacy 22nd Ed., Mack Publishing Co., 2012. Primeri farmaceutski prihvatljivih nosača, razblaživača i ekscipijenata obuhvataju sledeće: rastvor soli, vodu, skrob, šećere, manitol, i derivate silicijum dioksida; sredstva za vezivanje kao što su karboksimetil celuloza i ostali celulozni derivati, alginati, želatin, i polivinil-pirolidon; kaolin i bentonit; polietil glikoli.

[0030] Poželjne farmaceutske kompozicije mogu biti formulisane kao tableta, kapsula, rastvor za oralno davanje, ili rastvor za injekcije. Tableta, kapsula ili rastvor mogu obuhvatati jedinjenje prema prikazanom pronalasku u količini efikasnoj za lečenje pacijenta kome je tretman potreban.

[0031] Kako je ovde korišćeno, izraz "efikasna količina" odnosi se na količinu koja je doza, koja je efikasna za lečenje poremećaja, kao što je artriris, autoimunog poremećaja ili kancera. Nadležni lekar ili veterinar, kao osoba iz struke, može lako odrediti efikasnu količinu upotrebom konvencionalnih tehnika i posmatranjem rezultata dobijenih pod analognim okolnostima. Brojni faktori mogu biti uzeti u obzir za određivanje efikasne količine ili doze; faktori, uključuju, ali bez ograničenja da li će jedinjenje ili njegova so, biti davani; zajedničko davanje drugih sredstava, ukoliko se koriste; pacijentove karakteristike; njegova veličina, godine i opšte zdravlje; stepen uključenosti ili ozbiljnosti poremećaja; odgovor pojedinačnog pacijenta; način davanja; karakterisike biodostupnosti davanog preparata; izabrani dozni režim; upotrebu drugih pratećih lekova; i drugih relevantih okolnosti.

[0032] Kako je ovde korišćeno, izraz "pacijent" odnosi se na sisara, živinu ili ribu. Poželjni sisari obuhvataju čoveka, ljubimca, kao što su pas ili mačka ili domaću životinju ili stoku, kao što je krava, svinja, konj, ovca i koza.

[0033] Izraz "sušinski čisto" odnosi se na kompoziciju koja je čistoće veće od 80% , poželjnije veće od 90% čistoće, i još poželjnije veće od 95% čistoće mase na osnovu težine.

[0034] Jedinjenja prema prikazanom pronalasku mogu biti korišćena sama ili u kombinaciji sa jednim ili više dodatnih terapeutskih sredstava. Na primer, jedinjenja prema prikazanom pronalasku mogu biti kombinovana sa sredstvima za lečenjenje zapaljenja i/ili autoimunih bolesti. Primeri uključuju NSAIDs ili COX-2 inhibitore, kao što je ibuprofen, aspirin, acetaminofen, celecoksib, naproksen, i ketoprofen; opijate, kao što je oksikodon i fentanil; metotreksat; i kortikosteroide, kao što je hidrokortizon, prednisolon, i prednison.

[0035] Jedinjenja mogu takođe biti kombinovana sa jednim ili više dodatnih terapeutskih sredstava efikasnih u lečenju kancera. Primeri uključuju cisplatin, karboplatin, etoposid, gemcitabin, paclitaksel, vinorelbin, topotekan, irinotekan, ciklofosfamid, doksorubicin, vinkristin, i metotreksat.

[0036] Primeri jedinjenja i dodatnih terapeutskih sredstava mogu biti davani ili zajedno davanjem istim putem i oblikom, kao što su tableta, kapsula ili tableta; ili odovjenim davanjem ili istovremeno u odvojenim oblicima ili uzastopno.

Hemijski deo

[0037] Jedinjenja prema prikazanom pronalasku, ili njegove soli, mogu biti pripremljene različitim postupcima, od kojih su neki prikazani u donjim dobijanjima i primerima. Proizvod(i) svakog koraka u donjim postupcima mogu biti regenerisani konvencionalnim postupcima, uključujući ekstrakciju, uparavanje, taloženje, hromatografiju, ceđenje, triruraciju i kristalizaciju. Reagensi i polazni materijali su lako dostupni osobama iz struke. U dole opisanim dobijanjima, aminski supstituent može biti zaštićen da se olakša sinteza ovde opisanih jedinjenja.

[0038] Kako je ovde korišćeno, sledeći izrazi imaju sledeća značenja: "AcOH" odnosi se na glacijalnu sirćetnu kiselinu, "EC50" odnosi se na koncentraciju sredstva koje proizvodi 50% odgovora ciljane aktivnosti u poređenju sa prethodno definisanim pozitivnim kontrolnim jedinjenjem (apsolutni EC50); "EtOAc" odnosi se na etil acetat; "ES/MS" odnosi se masenu spektroskopiju u elektrospreju; "DCM" odnosi se dihlorometan; DMF" odnosi se na N,N-dimetilformamid; "DMSO" odnosi se na dimetilsulfoksid; "GC-MS" odnosi se na gasnu hromatografiju sa masenom spektrometrijom; "GFP" odnosi se na zeleni fluorescentni protein; "HEPES" odnosi se na 4-(2-hidroksietil)-1-piperazinetansulfonsku kiselinu; "h", "hr" ili "hrs" odnosi se na sat(e); "IC50" odnosi se na koncentraciju sredstva koje proizvodi 50 % mogućeg maksimalnog inhibitornog efekta za to sredstvo (relatini IC50), ili koncentracija sredstva koja proizvodi 50 % inhibicije ciljane aktivnosti poređene sa kontrolnim placebom (apsolutni IC50) "LC-MS" odnosi se na tečnu hromatografiju sa masenom spektrometrijom-; "MeOH" odnosi se na metanol; "min" odnosi se na minute; "MS" odnosi se na masenu spektroskopiju; "MTBE" odnosi se na metil terc-butil etar, "OAc" odnosi se na acetat ili acetatni anjon; "QD" odnosi se na jednom dnevno; "ST ili st" odnosi se na sobnu temperaturu; "STAT1" odnosi se na transduktor signala i aktivator transkrpcije 1; "THF" odnosi se na tetrahidrofuran, i "TR-FRET" odnosi se na vremenski fluorescentno rezonantni energetski transfer.

[0039] Različite zaštitne grupe amina su poznate u stanju tehnike i obuhvataju: karbamat kao što su C1-5alkil karbamat, C3-6cikloalkil karbamat, poželjno t-bulil karbamat, (BOC) ili benzil karbamat (CBZ); amide kao što su C1-3alkilamid, C1-3haloalkilamid, formamid ili acetamid hloroacetamid, trifluoridoacetamid; i benzil amini. Dodatni primeri zaštitnih grupa amina, postupci dobijanja zaštićenih aminskih supstituenata i postupci za skidanje zaštite sa aminskih supstiutenata mogu se naći u "Greene’s Protective Groups in Organic Synthesis", 5th Ed., Wuts, P.G.M., Eds. John Wiley and Sons, 2014. Ljudi iz struke će znati da druge funkcionalne grupe, koje mogu biti lako konvertovane u amino grupu, mogu biti korišćene. Takve funkcionalne grupe, dobijanja i transformacije ovih grupa, mogu se naći u "Comprehensive Organic Transformations: A Guide to Functional Group Preparations" by Larock. R.C, Wiley VCH, 1999 and in "March’s Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms and Structure" Smith, M.B., Wiley-Interscience, 7th Ed., 2013.

Dobijanje 1

(2R)-2-(Trifluorometil)oksiran

[0040] Dodati sirćetnu kiselinu (0.89 mL, 0.052 ekv.) u rastvor (1S,2S)-(+)-1,2-cikloheksandiamino-N,N’-bis(3,5-di-t-butilsaliciliden)kobalta (II) (0.90 g, 0.0050 ekv.) u toluenu (16.65 mL). Mešati na st u toku 30 min. Ukloniti rastvarač in vacuo. Dodati toluen (20 mL) i koncentrovati in vacuo. Ohladiti na 0 °C i dodati 2-(trifluorometil)oksiran (37.00 g, 330 mmol; 80.0 % ee, (2R) je glavni enantiomer). Mešati u toku 5 minuta i dodati u kapima vodu (0.80 mL, 0.15 ekv.). Polako zagrejati na st i mešati u toku noći. Destilovati u vakumu na st, i sakupiti naslovno jedinjenje u balon koji se hladi kao svetlo žuto ulje (28.10 g, 76 %; 99.8 % ee).<1>H NMR (CDCl3) δ 2.92-2.94 (m, 1H), 2.98-3.01 (m, 1H), 3.41-3.46 (m, 1H).

[0041] Spojiti naslovno jedinjenje (0.13 g, 1.16 mmol) i MeOH (1.3 mL). Ohladiti na 0 °C i dodati trietilamin (0.17 mL, 1.10 ekv.) i tiofenol (0.12 mL, 1.05 ekv.). Mešati smešu u toku 30 min. Pratiti reakciju pomoću GC-MS za dobijanje 1,1,1-trifluoro-3-fenilsulfanil-propan-2-ola; m/z = 222. Analiza proizvoda pomoću hiralne LC-MS otkrila je da izomerna čistoća proizvoda 99.8 % ee, (2S)-1,1,1-trifluoro-3-fenilsulfanil-propan-2-ol je glavni enantiomer.

Dobijanje 2

1-Bromo-3,5-difluoro-2-nitrobenzen

1

[0042] Dodati u kapima azotnu kiselinu (pušljivu 20 mL) u rastvor 1-bromo-3,5-difluorobenzena (35.00 mL, 304 mmol) u sumpronoj kiselini (50 mL) na 0 °C. Polako zagrejati do st i mešati u toku noći. Sipati reakcionu smešu u smešu leda i vode (600 mL). Polako zagrejati do st. Dodati EtOAc (200 mL) i heksane (100 mL). Mešati dok se ne rastvori sva čvrsta supstanca. Odovojiti slojeve. Isprati organski sloj sa zasićenim vodenim natrijum hloridom, osušiti preko Na2SO4, procediti, i koncentrovati filtrat in vacuo da bi se dobilo naslovno jedinjenje kao žuto ulje (57.37 g, 79 %). GC-MS m/z = (<79>Br/<81>Br) 237, 239 (M+H).

Dobijanje 3

3-Bromo-5-fluoro-N-metil-2-nitroanilin

[0043] Dodati 2 M monometilamin u tetrahidrofuranu (92 mL, 2.00 ekv.) u rastvor 1-bromo-3,5-difluoro-2-nitrobenzena (21.90 g, 92 mmol) u 1,4-dioksanu (92 mL). Mešati na st u toku 45 min. Dodati vodu; zatim ekstrahovati sa EtOAc. Sakupiti organske ekstrakte i isprati sa zasićenim vodenim natrijum hloridom. Osušiti preko anhidrovanog Na2SO4, procediti, i koncentrovati filtrat in vacuo da bi se dobio ostatak. Ostatak podvrgnut hromatografiji sa normalnom fazom, eluiran sa 20-40% DCM gradijenta u heksanima, da bi se dobilo naslovno jedinjenje kao narandžasta čvrsta supstanca (16.95 g, 74 %). MS (ES) m/z = (<79>Br/<81>Br) 249/251 (M+H).

Dobijanje 4

terc-Butil {cis-4-[3-bromo-5-(metilamino)-4-nitrofenoksi]cikloheksil}karbamat

[0044]

[0045] Spojiti 3-bromo-5-fluoro-N-metil-2-nitroanilin (75.04 g, 301 mmol), terc-butil(cis-4-hidroksicikloheksil)karbamat (89.52 g, 1.38 ekv.), tetra(n-butil)amonijum bisulfat (15.58 g, 0.15 ekv.) u DCM (975 mL) i 5 M vodeni natrijum hidroksid (241 mL). Mešati brzo na 37 °C pod azotom u toku pet dana. Ohladiti na st. Razblažiti sa DCM (200 mL) i vodom (400 mL). Odvojiti slojeve. Ekstrahovati vodeni sa DCM (3 x 100 mL). Isprati spojene organske ekstrakte zasićenim vodenim natrijum hloridom, osušiti preko anhidrovanog Na2SO4, procediti, i koncentrovati filtrat in vacuo da bi se dobio ostatak. Ostatak podvrgnut hromatografiji sa normalnom fazom, eluiran sa 0-40% EtOAc u gradijentu heksana, da bi se dobilo naslovno jedinjenje kao narandžasta čvrsta supstanca (68.57 g, 51%). MS (ES) m/z = C<79>Br/<81>Br) 442/444 (M-H).

Dobijanje 5

terc-Butil {cis-4-1(4-bromo-1-metil-1H-benzimidazol-6-il)oksi]cikloheksil}karbamat

[0047] Spojiti terc-butil {cis-4-[3-bromo-5-(metilamino)-4-nitrophenoksi]cikloheksil}karbamat (76.92 g, 173 mmol) i platinu (5 % na sufidiranom ugljeniku, 3.85 g) u tetrahidrofuranu (923 mL) u Parr®-ovom reaktoru. Mešati na st pod H2(414 kPa) u toku tri dana. Procediti kroz diatomejsku zemlju. Isprati diatomejsku zemlju sa THF. Dodati trimetilortoformijat (165 mL, 8.70 ekv.) u spojene THF filtrate. Mešati u toku 22 sata na 63 °C. Koncentrovati većinu reakcione smeše in vacuo. Razblažiti sa vodom (400 mL) i EtOAc (400 mL). Zabaziti sa vodenim natrijum karbonatom da bi se podesio pH na 9. Odvojiti slojeve. Ekstrhovati vodeni sa EtOAc (2 x 200 mL). Osuštiti spojene organske ekstrakte preko anhidrovanog Na2SO4, procediti, i koncentrovati filtrat in vacuo. Razblažiti ostatak sa metil terc-butil etrom (400 mL) i podvrgnuti ultra zvuku u toku 30 minuta. Procediti, isprati sa metil terc-butil etrom, i osušiti pod vakuumom da bi se dobilo naslovno jedinjenje kao svetlo braon čvrsta supstanca (52.02 g, 71 %). MS (ES) m/z = (<79>Br/<81>Br) 424/426 (M+H).

Dobijanje 6

cis-4-[(-metil-1H-benzimidazol-6-il)oksi]cikloheksanamin

[0048]

[0049] Dodati trifluorosirćetnu kiselinu (666 mL) polako u rastvor terc-butil {cis-4-[(4-bromo-1-metil-1H-benzimidazol-6-il)oksi]cikloheksil}karbamata (222 g, 497 mmol) u DCM (1110 mL) na 0 °C. Polako zagrejati smešu na st i mešati u toku noći. Koncentrovati smešu in vacuo. Dodati vodu (250 mL) i zabaziti sa 50% vodenim natrijumhidroksidom da bi se podesio pH na 10. Dodati vodu (250 mL). Ekstrahovati sa 20% MeOH u DCM (1500 mL, zatim 500 mL, zatim 250 mL). Isprati spojene organske ekstrakte sa 2 M vodenim natrijum hidroksidom, osušiti preko anhidrovanog MgSO4, procediti, i koncentrovati filtrat da bi se dobilo naslovno jedinjenje kao braon čvrsta supstanca (155 g, 91%). MS (ES) m/z = (<79>Br/<81>Br) 324/326 (M+H).

Dobijanje 7

(2R)-3-({cis-4-[(4-Bromo-1-metil-1H-benzimidazol-6-il)oksi]cikloheksil}amino)-1,1,1-trifluoropropan-2-ol

[0051] Dodati (2R)-2-(trifluorometil)oksiran (73.29 g, 1.50 ekv.) u rastvor cis-4-[(4-bromo-1-metil-1H-benzimidazol-6-il)oksi]cikloheksanamina (150.4 g, 436 mmol) u MeOH (1053 mL). Mešati na st u toku noći. Koncentrovati reakcionu smešu in vacuo da bi se dobio ostatak. Ostatak podvrgnut hromatografiji sa normalnom fazom, eluiran sa 0-10% EtOH u DCM gradijentu, da bi se dobilo naslovno jedinjenje kao beličasta čvrsta supstanca (98.10 g, 52%). MS (ES) m/z = (<79>Br/<81>Br) 436/438 (M+H).

Dobijanje 8

1-(3-Metoksipropil)-5-metil-3-nitro-1H-pirazol

[0052] Dodati acetonitril (56 mL) u smešu 5-metil-3-nitro-1H-pirazola (3.0 g, 22 mmol), kalijum karbonata (6.2 g, 2.0 ekv.), i 1-bromo-3-metoksipropana(3.8 g, 1.1 ekv.). Mešati na 65 °C u toku noći. Ohladiti na st. Dodati EtOAc (∼50 mL) i procediti. Koncentrovati filtrat in vacuo. Ostatak podvrgnut hromatografiji sa normalnom fazom, eluiran sa 35% EtOAc u heksanima, da bi se dobilo naslovno jedinjenje (3.3 g, 70%). MS (ES) m/z = 200 (M+H).

Dobijanje 9

1-(3-Metoksipropil)-5-metil-1H-pirazol-3-amin

[0053] Dodati paladijum na ugljenu (5% mas/mas, 0.38 g) u Parr®-ov reaktor od 500 mL. Prečistiti reaktor sa N2i dodati EtOH (100 mL). Dodati rastvor 1-(3-metoksipropil)-5-metil-3-nitro-1H-pirazola (3.3 g, 17 mmol) u EtOH (100 mL). Mešati na st pod H2(60 psi) u toku dva sata. Procediti kroz dijatomejsku zemlju. Koncentrovati filtrat in vacuo da bi se dobilo naslovno jedinjenje kao narandžasto ulje (2.7 g, 96%). MS (ES) m/z = 170 (M+H).

Dobijanje 10

1-(2-Metoksietil)-5-metil-3-nitro-1H-pirazol

[0054] Dodati acetonitril (35 mL) u smešu 5-metil-3-nitro-1H-pirazola (0.95 g, 7.1 mmol), kalcijum karbonata (2.0 g, 2.0 ekv.), i 1-bromo-2-metoksietana (2.0 mL, 3.0 ekv.). Mešati na 75 °C u toku tri sata. Ohladiti na st. Dodati dietil etar (∼35 mL) i procediti. Isprati čvrste supstance sa EtOAc (2 x 25 mL). Koncentrovati filtrat in vacuo da bi se dobio ostatak. Ostatak podvrgnut hromatografiji sa normalnom fazom, eluiran sa 0-100% EtOAc u gradijentu heksana, da bi se dobilo naslovno jedinjenje kao žuto ulje (1.1 g, 64%). MS (ES) m/z = 186 (M+H).

Dobijanje 11

1

1-(2-Metoksietil)-5-metil-1H-pirazol-3-amin

[0055] Dodati paladijum na ugljeniku (10% mas/mas, 0.38 g) u balon. Prečistiti sa N2i dodati EtOH (10 mL). Dodati rastvor 1-(2-metoksietil)-5-metil-3-nitro-1H-pirazola (0.86 g, 4.6 mmol) u EtOH (40 mL). Mešati na st pod H2(baloon) preko noći. Procediti kroz diatomejsku zemlju. Koncentrovati filtrat in vacuo da bi se dobilo naslovno jedinjenje kao braon ulje (0.68 g, 84%). MS (ES) m/z = 156 (M+H).

Dobijanje 12

1-(5-Metil-3-nitro-1H-pirazol-1-il)propan-2-ol

[0056] Dodati acetonitril (75 mL) u smešu 5-metil-3-nitro-1H-pirazola (2.0 g, 15 mmol), kalijum karbonata (4.1 g, 2.0 ekv.), i 1-hloro-2-propanola (3.8 mL, 3.0 ekv.). Mešati na 85 °C preko noći. Ohladiti na st. Procediti isprati čvrstu supstancu sa EtOAc. Koncentrovati filtrat in vacuo da bi se dobio ostatak. Ostatak podvrgnut hromatografiji sa normalnom fazom, eluiran sa 50% EtOAc u heksanima, da bi se dobilo naslovno jedinjenje (2.0 g, 65%). MS (ES) m/z = 186 (M+H).

Dobijanje 13

1-(3-Amino-5-metil-1H-pirazol-1-il)propan-2-ol

[0057] Dodati paladijum na ugljeniku (10% mas/mas, 0.35 g) u balon. Prečistiti sa N2i dodati EtOH (50 mL). Dodati rastvor 1-(5-metil-3-nitro-1H-pirazol-1-il)propan-2-ola (2.0 g, 11 mmol) u EtOH (150 mL). Mešati na st pod H2(balon) preko noći. Procediti kroz diatomejsku zemlju. Koncentrovati filtrat in vacuo da bi se dobilo naslovno jedinjenje kao ružičasto ulje (1.2 g, 69%). MS (ES) m/z = 156 (M+H).

Dobijanje 14

(2S)-1-(5-Metil-3-nitro-1H-pirazol-1-il)propan-2-ol

[0058]

[0059] Dodati acetonitril (45 mL) u smešu 5-metil-3-nitro-1H-pirazola (1.2 g, 9.0 mmol), kalijum karbonata (2.5 g, 2.0 ekv.), i (S)-1-hloro-2-propanola (0.98 g, 1.2 ekv.). Mešati na 85 °C u toku četiri dana. Ohladiti na st. Procediti da se sakupi supstanca i opere čvrsta supstanca sa EtOAc, zatim odbaciti čvrstu supstancu. Sakupiti i koncentrovati filtrat in vacuo da bi se dobio ostatak. Ostatak podvrgnut hromatografiji sa normalnom fazom, eluiran sa 50% EtOAc u heksanima, da bi se dobilo naslovno jedinjenje kao bela čvrsta supstanca (1.1 g, 67%). MS (ES) m/z = 186 (M+H).

Dobijanje 15

(2S)-1-(3-Amino-5-metil-1H-pirazol-1-il)propan-2-ol

[0060]

[0061] Dodati paladijum na ugljeniku(10% mas/mas, 0.22 g) u balon. Dodati rastvor (2S)-1-(5-metil-3-nitro-1H-pirazol-1-il)propan-2-ola (1.1 g, 6.0 mmol) u EtOH (50 mL). Mešati na st pod H2(balon) preko noći. Procediti kroz diatomejsku zemlju. Isprati čvrstu supstancu sa MeOH. Koncentrovati filtrat in vacuo da bi se dobilo naslovno jedinjenje (0.89 g, 9.5%). MS (ES) m/z = 156 (M+H).

Dobijanje 16

(2R)-1-(5-Metil-3-nitro-1H-pirazol-1-il)propan-2-ol

[0062]

[0063] Dodati acetonitril (41 mL) u smešu 5-metil-3-nitro-1H-pirazola (1.1 g, 8.2 mmol), kalijum karbonata (2.3 g, 2.0 ekv.), i (R)-1-hloro-2-propanola (0.92 mL, 1.3 ekv.). Mešati na 85 °C preko noći. Ohladiti na st. Procediti i isprati čvrstu supstancu sa EtOAc. Koncentrovati filtrat in vacuo da bi se dobio ostatak. Ostatak podvrgnut hromatografiji sa normalnom fazom, eluiran sa 50% EtOAc u heksanima, da bi se dobilo naslovno jedinjenje kao bela čvrsta supstanca (0.74 g, 48%). MS (ES) m/z = 186 (M+H).

Dobijanje 17

(2R)-1-(3-Amino-5-metil-1H-pirazol-1-il)propan-2-ol

[0064]

[0065] Dodati paladijum na ugljeniku (10% mas/mas, 0.15 g) u balon. Dodati rastvor (2R)-1-(5-metil-3-nitro-1H-pirazol-1-il)propan-2-ola (0.74 g, 4.0 mmol) u EtOH (33 mL). Mešati na st pod H2(balon) preko noći. Procediti kroz diatomejsku zemlju. Isprati čvrstu supstancu sa MeOH. Koncentrovati filtrat in vacuo da bi se dobilo naslovno jedinjenje kao žuta čvrsta supstanca (0.58 g, 95%). MS (ES) m/z = 156 (M+H).

Dobijanje 18

Etil 8-metil-1,4-dioksaspiro[4.5]dekan-8-karboksilat

[0066]

1

[0067] Spojiti diizopropilamin (55 mL, 1.36 ekv.) i 2-metiltetrahidrofuran (500 mL). Ohladiti na -20 °C pod N2. Dodati 2.5 M n-butillitijum u heksanima (150 mL, 1.30 ekv.) u kapima u toku 10 min, zatim mešati rastvor na -20 °C u toku dodatnih 15 min. Preneti rastvor pomoću cevčice u toku 20 min u rastvor etil 1,4-dioksaspiro[4.5]dekan-8-karboksilata (50 mL, 287 mmol) u 2-metiltetrahidrofuranu (500 mL) na -40 °C. Mešati rastvor na -40 °C u toku deset min. Dodati rastvor jodometana (30 mL, 1.68 ekv.) u 2-metiltetrahidrofuranu (60 mL) u kapima u toku deset min. Mešati na -40 °C u toku jedan sat. Dozvoliti da se polako zagreje do st i mešati preko noći. Zaustaviti sa zasićenim vodenim amonijum hloridom (150 mL). Odvojiti slojeve. Ekstrahovati vodeni sloj sa metil terc-butil etrom (50 mL). Osušiti spojene organske slojeve preko anhidrovanog Na2SO4, procediti, i koncentrovati in vacuo da bi se dobilo naslovno jedinjenje kao žuto ulje (63.3 g, 97%).<1>H NMR (CDCl3) δ 1.16 (s, 3H), 1.20-1.25 (m, 3H), 1.42-1.66 (m, 6H), 2.07-2.14 (m, 2H), 3.91 (s, 4H), 4.08-4.15 (m, 2H).

Dobijanje 19

8-Metil-1,4-dioksaspiro[4.5]decane-8-karboksilna kiselina

[0068]

[0069] Spojiti etil 8-metil-1,4-dioksaspiro[4.5]dekan-8-karboksilat (20 g, 88 mmol), MeOH (100 mL), i 3 M natrijum hidroksid u vodi (140 mL). Zagrejati reakcionu smešu do refluksa preko noći. Koncentrovati in vacuo i razblažiti sa vodom (150 mL) i metil terc-butil etrom (50 mL). Odvojiti slojeve i odbaciti organski sloj. Zakiseliti vodeni sloj sa 3% mas/mas vodenom hlorovodoničnom kiselinom i podesiti pH na 2. Ekstrahovati sa metil terc-butil etrom (3 x 100 mL). Osušiti spojenu organsku supstancu preko anhidrovanog Na2SO4, procediti, i koncentrovati in vacuo da bi se dobilo naslovno jedinjenje kao žuta uljasta čvrsta supstanca (12.6 g, 72%).<1>H NMR (CDCl3) δ 1.25 (s, 3H), 1.47-1.60 (m, 2H), 1.65-1.70 (m, 4H), 2.08-2.17 (m, 2H), 3.93 (s, 4H).

Dobijanje 20

Prop-2-en-1-il (8-metil-1,4-dioksaspiro[4.5]dec-8-il)karbamat

[0070]

1

[0071] Spojiti 8-metil-1,4-dioksaspiro[4.5]dekan-8-karboksilnu kiselinu (12 g, 60 mmol) i acetonitril (200 mL). Dodati trietilamin (25.5 mL, 3.11 ekv.) i difenilfosforil azid (15 mL, 1.18 ekv.). Mešati na st pod N2u toku dva sata. Dodati alil alkohol (25 mL, 6.25 ekv.). Mešati reakcionu smešu na refluksu preko noći. Koncentrovati in vacuo i razblažiti sa vodom (150 mL) i metil terc-butil etrom (150 mL). Odvojiti slojeve. Ekstrahovati vodeni sloj sa metil terc-butil etrom (2 x 100 mL). Osušiti spojenu organsku supstancu preko anhidrovanog Na2SO4, procediti, i koncentrovati in vacuo da bi se dobilo naslovno jedinjenje kao braon ulje (10.8 g, 71%).<1>H NMR (CDCl3) δ 1.34 (s, 3H), 1.57-1.69 (m, 6H), 1.98-2.11 (m, 2H), 3.92-3.93 (m, 4H), 4.48-4.66 (m, 3H), 5.16-5.32 (m, 2H), 5.82-5.99 (m, 1H).

Dobijanje 21

Prop-2-en-1-il (1-metil-4-oksocikloheksil)karbamat

[0072]

[0073] Spojiti prop-2-en-1-il (8-metil-1,4-dioksaspiro[4.5]dec-8-il)karbamat (10.5 g, 41 mmol), aceton (30 mL), i vodu (3 mL). Dodati 35% hlorovodoničnu kiselinu (2.7 mL). Mešati na st preko noći. Koncentrovati reakcionu smešu in vacuo da se ukloni aceton. Razblažiti sa metil terc-butil etrom (100 mL). Zabaziti sa 6 M vodenog kalijum karbonata da se podesi pH na 8. Odvojiti slojeve. Ekstrahovati vodeni sloj sa metil terc-butil etrom (2 x 20 mL). Osušiti spojenu organsku supstancu preko anhidrovanog Na2SO4, procediti, i koncentrovati in vacuo da bi se dobio ostatak. Ostatak podvrgnut hromatografiji sa normalnom fazom, eluiran sa gradijentom 20-100% metil terc-butil etra u heksanima da bi se dobilo naslovno jedinjenje kao bezbojno ulje (6.0 g, 69%).<1>H NMR (CDCl3) δ 1.44 (s, 3H), 1.76-1.88 (m, 2H), 2.24-2.51 (m, 6H), 4.54 (d, 2H), 4.78 (s, 1H), 5.20-5.35 (m, 2H), 5.85-6.00 (m, 1H).

Dobijanje 22

Prop-2-en-1-il (cis-4-hidroksi-1-metilcikloheksil)karbamat

[0074]

1

[0075] Dodati 0.1 M monokalijum fosfatni pufer (pH 7, 500 mL), MgSO4(0.12 g),NADP (0.27 g), i ketoreduktaze-P1-B10 (0.32 g) u rastvor prop-2-en-1-il (1-metil-4-oksocikloheksil)karbamata (32.8 g, 155 mmol) u izopropanolu (110 mL). Mešati na 35 °C u toku 24 sata. Ekstrahovati sa EtOAc. Osušiti organsku supstancu preko anhidrovanog MgSO4, procediti, i koncentrovati filtrat in vacuo da bi se dobilo naslovno jedinjenje kao žuto ulje (32.41 g, 98%).<1>H NMR (CDCl3) δ 1.18-1.50 (m, 7H), 1.57-1.88 (m, 3H), 1.98-2.14 (m, 2H), 3.55-3.65 (m, 1H), 4.46-4.66 (m, 3H), 5.17-5.32 (m, 2H), 5.83-5.96 (m, 1H). Protonski multiplet na 3.55-3.65 ppm je poznato da je u cis konfiguraciji.

Dobijanje 23

Prop-2-en-1-il {cis-4-[(4-bromo-1-metil-1H-benzimidazol-6-il)oksi]-1-metilcikloheksil}karbamat

[0076]

[0077] Dodati 5 M vodeni natrijum hidroksid (270 mL) i tetra(n-butil)amonijum bisulfat (7.50 g, 0.18 ekv.) u rastvor 3-bromo-5-fluoro-N-metil-2-nitroanilina (30.00 g, 120 mmol) i prop-2-en-1-il (cis-4-hidroksi-1-metilcikloheksil)karbamata (33.00 g, 1.28 ekv.) u DCM (300 mL). Mešati smešu brzo na st u toku 24 sata. Dodati tetrabutilamonijum hidrogen sulfat (7.50 g, 0.18 ekv.). Mešati brzo na st preko noći. Razblažiti sa vodom (20 mL). Odvojiti slojeve. Ekstrahovati vodeni sloj sa DCM (2 x 150 mL). Isprati spojene organske ekstrakte sa 5% mas/mas vodenim natrijum hloridom (200 mL) i vodom (200 mL); zatim koncentrovati organske ekstrakte in vacuo. Spojiti koncentrovane organske ekstrakte i sirćetnu kiselinu (650 mL). Dodati trimetilortoformijat (45 mL). Mešati na 90 °C u toku 2.5 h pod azotom. Razblažiti sa EtOAc (500 mL). Procediti kroz sloj diatomejske zemlje. Isprati sloj sa EtOAc. Koncentrovati spojene filtrate in vacuo. Razblažiti sa 2 M vodenim dikalijum fosfatom (60 mL) i 2-metiltetrahidrofuranom (60 mL). Mešati u toku 20 min, zatim procediti kroz diatomejsku zemlju. Odvojiti slojeve. Ekstrahovati vodeni sloj sa 2-metilletrahidrofuranom (2 x 20 mL). Spojiti organske ekstrakte, isprati sa vodom, i koncentrovati in vacuo. Razblažiti sa 1-metil-2-pirolidinonom (100 mL) i mešati da bi se dobila homogena smeša. U kapima dodati smešu u vodu (1200 mL) u toku 30 min. Mešati u toku 30 min, procediti da bi se sakupila čvrsta supstanca, i isprati čvrstu supstancu sa vodom.

1

Rastvoriti čvrstu supstancu u 2-metiltetrahidrofuranu (250 mL) i koncentrovati in vacuo. Razblažiti rastvor sa izopropanolom (3 x 150 mL) i koncentrovati in vacuo. Razblažiti rastvor sa 2-metiltetrahidrofuranom (10 mL) i koncentrovati in vacuo da bi se dobilo naslovno jedinjenje kao uljasti, braon ostatak (31.5 g, 74%). MS (ES) m/z = (<79>Br/<81>Br) 422/424 (M+H).

Dobijanje 24

cis-4-[(4-Bromo-1-metil-1H-benzimidazol-6-il)oksi]-1-metilcikloheksamin

[0078]

[0079] Spojiti prop-2-en-1-il {cis-4-[(4-bromo-1-metil-1H-benzimidazol-6-il)oksi]-1-metilcikloheksil}karbamat (30 g, 71 mmol), bis(dibenzilidenaceton)paladijum (0.50 g, 0.017 ekv.), 1,4-bis(difenilfosfino)butan (0.50 g, 0.022 ekv.), i tiosalicilnu kiselinu (15 g, 1.90 ekv.) u 2-metiltetrahidrofuranu (700 mL). Zagrejati reakcionu smešu na 50 °C u toku jedan sat. Razblažiti sa vodom (300 mL) i metil terc-butil etrom (300 mL). Zakiseliti sa 35% hlorovodoničnom kiselinom da bi se podesio pH na 2. Odvojiti slojeve i odbaciti organski sloj. Razblažiti vodeni sloj sa EtOAc (20 mL) i mešati u toku deset min. Odvojiti slojeve i odbaciti organsku supstancu. Razblažiti vodeni sloj sa DCM (150 mL) i mešati u toku deset min. Odvojiti slojeve i odbaciti organski sloj. Zabaziti vodeni sloj sa natrijum hidroksidom. Procediti; sakupiti čvrstu supstancu; Zatim podvrgnuti dobijenu čvrstu supstancu hromatografiji sa normalnom fazom, eluirati sa 5% 2 M MeOH sa amonijakom u DCM, da bi se dobilo naslovno jedinjenje (12.0 g, 50%). MS (ES) m/z = (<79>Br/<81>Br) 338/340 (M+H).

Dobijanje 25

(2R)-3-({cis-4-[(4-Bromo-1-metil-1H-benzimidazol-6-il)oksi]-1-metilcikloheksil}amino)-1,1,1-trifluoropropan-2-ol

[0080]

[0081] Spojiti cis-4-[(4-bromo-1-metil-1H-benzimidazol-6-il)oksi]-1-metilcikloheksanamin (11.6 g, 34 mmol), (2R)-2-(trifluorometil)oksiran (4.00 g, 1.05 ekv.), EtOH (45 mL), i vodu (45 mL) u staklenom reaktoru pod pritiskom. Zatvoriti i zagrejati reakcionu smešu na 90 °C u toku jedan h. Dozvoliti da se ohladi na st. Dodati (2R)-2-(trifluorometil)oksiran (0.44 g, 0.12 ekv.). Zatvoriti i zagrejati reakcionu smešu na 90 °C u toku jedan h. Koncentrovati in vacuo. Razblažiti sa vodom (100 mL), metil terc-butil

1

etrom (20 mL) i EtOAc (20 mL). Zakiseliti da 35% vodenom hlorovodoničnom kiselinom da bi se podesio pH na 2 i mešati do dobijanja potpunog rastvora. Odvojiti slojeve i odbaciti organski sloj. Razblažiti vodeni sloj sa metil terc-butil etrom (40 mL). Odvojiti slojeve i odbaciti organski sloj. Zabaziti vodeni sloj sa 50% mas/mas vodenim natrijum hidroksidom da bi se podesio pH na 10. Ekstrahovati vodeni sloj sa EtOAc (2 x 50 mL). Spojiti organske ekstrakte i koncentrovati in vacuo. Kristalisati čvrstu supstancu iz EtOAc (50 mL). Procediti da bi se sakupila čvrsta supstanca, zatim isprati dobijenu čvrstu supstancu sa EtOAc da bi se dobilo naslovno jedinjenje kao bela čvrsta supstanca (6.3 g, 41%). MS (ES) m/z = (<79>Br/<81>Br) 450/452 (M+H).

[0082] Koncentrovati filtrat iz matične tečnosti za kristalizaciju da bi se dobio ostatak. Ostatak podvrgnut hromatografiji sa normalnom fazom, eluiran sa 5% 2 M MeOH sa amonijakom u EtOAc, da bi se dobilo dodatno naslovno jedinjenja kao beličasta čvrsta supstanca (3.3 g, 21%). MS (ES) m/z = (<79>Br/<81>Br) 450/452 (M+H).

Dobijanje 26

(2R)-2-(Difluorometil)-1,4-dioksaspiro[4.5]dekan

[0083]

[0084] Rastvoriti (3R)-1,4-dioksaspiro[4.5]dekan-3-karbaldehid (15.98 g, 89.19 mmol) u DCM (80 mL). Smestiti pod N2i ohladiti rastvor na 0 °C. Pažljivo dodati dietilaminosumpor trifluorid (15 mL, 1.2 ekv.) u kapima. Dozvoliti da se polako zagreje do st i mešati preko noći. Sporo sipati smešu u smešu koja se meša smrvljenog leda, zasićenog vodenog natrijum bikarbonata, i DCM. Dodati dikalijum fosfat (5 g) i dodati kalijum karbonat u pocijama, održavajući pH ∼7-8, do prestanka razvijanja mehurića. Mešati u toku 20 min. Odvojiti slojeve. Ekstrahovati vodeni sloj sa DCM (3 x). Isprati spojene organske ekstrakte sa 1M vodenim natrijum bisulfitom i zasićenim vodenim natrijum hlrodom. Osušiti organsku supstancu preko anhidrovanog Na2SO4, procediti, i koncentrovati filtrat in vacuo da bi se dobilo naslovno jedinjenje kao ćilibarno ulje (17.37 g, 93%). GC-MS m/z = 192.

Dobijanje 27

(2R)-3,3-Difluoro-2-hidroksipropil 4-metilbenzensulfonat

[0085]

[0086] Rastvoriti (2R)-2-(difluorometil)-1,4-dioksaspiro[4.5]dekan (9.08 g, 47.2 mmol) u MeOH (250 mL). Dodati monohidrat p-toluensulfonske kiseline (0.70 g, 0.1 ekv.). Mešati na st u toku jedne nedelje.

2

Dodati natrijum bikarbonat (0.60 g). Mešati u toku jedan h. Dodati silikagel i trimetilamin (3 mL). Mešati u toku deset min. Koncentrovati in vacuo i prečistiti hromatografijom sa normalnom fazom, eluirati sa 15-100% EtOAc u gradijentu heksana, da bi se dobio (2R)-3,3-difluoropropan-1,2-diol kao žuto ulje (2.95 g).

[0087] Rastvoriti (2R)-3,3-difluoropropan-1,2-diol (2.0 g, 15.2 mmol) u DCM (40 mL). Smestiti pod azot i ohladiti rastvor na 0 °C. Dodati 2,6-lutidin (8.0 mL, 4.5 ekv.). Dodati p-toluensulfonil hlorid (3.0 g, 1.0 ekv.) u porcijama. Dozvoliti da se polako zagreje do st i mešati u toku dva dana. Ohladiti na -78 °C i dodati trimetilsilil trifluorometansulfonat (1.5 mL, 0.5 ekv.) u kapima. Dozvoliti da se zagreje na 0 °C u toku 40 min. Dodati trimetilsilil trifluorometansulfonat (1.5 mL, 0.5 ekv.) u kapima. Mešati u toku 30 min i zaustaviti sa MeOH (5 mL). Razblažiti sa DCM i dodati rastvor natrijum fosfata (4.9 g) u vodi (75 mL). Podesiti pH na ∼3 sa 2M vodenim kalijum bisulfatom. Odvojiti slojeve. Ekstrahovati vodeni sloj sa dietil etrom. Osuštiti organske ekstrakte preko anhidrovanog Na2SO4, procediti, i koncentrovati filtrat in vacuo. Dodati etilen glikol (1 mL) i silikagel (∼20 g). Koncentrovati in vacuo da bi se dobio ostatak. Ostatak podvrgnut hromatografiji sa normalnom fazom, eluirati sa 20-100% B u A gradijentu (A: heksani, B: 6:3:1 heksani:DCM:THF), da bi se dobilo naslovno jedinjenje (1.37 g, 16%). GC-MS m/z = 266.

Dobijanje 28

6-[(cis-4-Aminocikloheksil)oksi]-N-(1,5-dimetil-1H-pirazol-3-il)-1-metil-1H-benzimidazol-4-amin

[0088]

[0089] Spojiti cis-4-[(4-bromo-1-metil-1H-benzimidazol-6-il)oksi]cikloheksanamin (25.70 g, 79.27 mmol), 1,5-dimetil-1H-pirazol-3-amin (9.08 g, 1.0 ekv.), kalijum karbonat (28.48 g, 2.6 ekv.), 2-(dicikloheksilfosfino)3,6-dimetoksi-2’,4’,6’-triizopropil-1,1’-bifenil (8.60 g, 0.20 ekv.), tris(dibenzilidenaceton)dipaladijum(0) (3.63 g, 0.050 ekv.), i sirćetnu kiselinu (0.14 mL) u terc-butil alkoholu (250 mL). Zagrejati na refluksu preko noći. Koncentrovati reakcionu smešu in vacuo. Dodati DCM i vodu; odvojiti slojeve. Osušiti organsku supstancu preko anhidrovanog magnezijum sulfata, procediti, i koncentrovati in vacuo. Triturisati iz EtOAc i heksana da bi se dobila smeđa čvrsta supstanca. Podvrgnuti smeđu čvrstu supstancu hromatografiji sa normalnom fazom, eluirati sa heksanima, zatim 5% MeOH u DCM, zatim 20% 2M MeOH sa amonijakom u DCM, da bi se dobilo naslovno jedinjenje kao smeđa čvrsta supstanca (21.71 g, 77%). MS (ES) m/z = 355 (M+H).

Dobijanje 29

2-(3-Nitro-1H-pirazol-1-il)piridin

[0090]

[0091] U svaku od dve odvojene bočice, spojiti 3-nitro-1H-pirazol (3.0 g, 27 mmol), 2-fluoropiridin (2.9 mL, 1.3 ekv.), i trietilamin (4.6 mL, 1.2 ekv.) u 1-metil-2-pirolidinonu (20 mL). Zatvoriti i mešati na 180 °C preko noći. Ohladiti na st. Spojiti reakcione smeše i razblažiti sa vodom. Procediti da bi se sakupila čvrsta supstanca, isprati čvrstu supstancu sa vodom, i osušiti pod vakuumom da bi se dobilo naslovno jedinjenje (5.9 g, 58%). MS (ES) m/z = 191 (M+H).

Dobijanje 30

1-Piridin-2-il-1H-pirazol-3-amin

[0092] Dodati paladijum na ugljeniku (10% mas/mas, 1.9 g) u balon. Prečistiti sa N2i dodati EtOH (200 mL). Dodati 2-(3-nitro-1H-pirazol-1-il)piridin (2.5 g, 13 mmol). Mešati na st pod H2(baloon) preko noći. Dodati malu količinu diatomejske zemlje i mešati u toku pet min. Procediti kroz sloj diatomejske zemlje i isprati sloj sa EtOH. Koncentrovati filtrat in vacuo da bi se dobilo naslovno jedinjenje kao braon čvrsta supstanca (1.8 g, 85%). MS (ES) m/z = 161 (M+H).

Dobijanje 31

1-(Metilsulfonil)-3-nitro-1H-pirazol

[0093] Spojiti 3-nitro-1H-pirazol (3.0 g, 27 mmol), metansulfonil hlorid (2.5 mL, 1.2 ekv.), i trietilamin (4.4 mL, 1.2 ekv.) u DCM (20 mL). Mešati na st u toku dva sata. Razblažiti sa DCM i zasićenim vodenim natrijum bikarbonatom. Odvojiti slojeve. Isprati organski sloj sa vodom i rastvorom soli. Osuštiti organski sloj preko anhidrovanog MgSO4, procediti, i koncentrovati filtrat in vacuo da bi se dobilo naslovno jedinjenje kao braon čvrsta supstanca (3.7 g, 73%).<1>H NMR (DMSO-d6) δ 3.74 (s, 3H), 7.30 (d, J = 2.9 Hz, 1H), 8.55 (d, J = 2.9 Hz, 1H).

Dobijanje 32

3-Nitro-1-tetrahidro-2H-piran-3-il-1H-pirazol

[0094]

[0095] Spojiti tetrahidropiran-3-ol (1.3 g, 13 mmol), 1-(metilsulfonil)-3-nitro-1H-pirazol (2.4 g, 1.0 ekv.), i cezijum karbonatom (4.8 g, 1.2 ekv.) u acetonitrilu (40 mL). Mešati na 90 °C preko noći. Koncentrovati smešu in vacuo. Razblažiti sa EtOAc i procediti kroz sloj diatomejske zemlje. Koncentrovati filtrat in vacuo da bi se dobio ostatak. Ostatak podvrgnut C-18 hromatografiji sa reverznom fazom eluiranjem sa gradijentom od 0% do 100% (0.1%) mravlje kiseline u acetonitrilu) u (0.1% mravlje kiseline u vodi), da bi se dobilo naslovno jedinjenje (0.35 g, 14%). MS (ES) m/z = 198 (M+H).

Dobijanje 33

1-(Tetrahidro-2H-piran-3-il)-1H-pirazol-3-amin

[0096]

[0097] Dodati paladijum na ugljeniku(10% mas/mas, 0.10 g) u balon. Pročistiti sa N2i dodati EtOH (20 mL). Dodati 3-nitro-1-tetrahidro-2H-piran-3-il-1H-pirazol (0.30 g, 1.5 mmol). Mešati na st pod H2(balon) u toku dva h. Procediti kroz diatomejsku zemlju i isprati sa EtOH. Koncentrovati filtrat in vacuo da bi se dobilo naslovno jedinjenje kao siva čvrsta supstanca (0.24 g, 94%). MS (ES) m/z = 168 (M+H).

Primer 1

(2R)-1,1,1-Trifluoro-3-({cis-4-[(4-{[1-(3-metoksipropil)-5-metil-1H-pirazol-3-il]amino}-1-metil-1H-benzimidazol-6-il)oksi]cikloheksil}amino)propan-2-ol

[0098]

[0099] Spojiti (2R)-3-({cis-4-[(4-bromo-1-metil-1H-benzimidazol-6-il)oksi]cikloheksil}amino)-1,1,1-trifluoropropan-2-ol (4.0 g, 9.2 mmol), 1-(3-metoksipropil)-5-metil-1H-pirazol-3-amin (2.2 g, 1.4 ekv.), kalijum karbonat (3.2 g, 2.5 ekv.), 2-(di-terc-butilfosfino)-2’,4’,6’-triizopropil-3,6-dimetoksi-1,1’-bifenil (0.92 g, 0.20 ekv.), tris(dibenzilidenaceton)dipaladijum (0) (0.87 g, 0.10 ekv.), i sirćetnu kiselinu (0.01 mL) u terc-butil alkoholu (46 mL). Zagrejati na 90 °C preko noći. Procediti kroz sloj diatomejske zemlje i isprati sloj sa EtOAc. Koncentrovati filtrat in vacuo da bi se dobio ostatak. Ostatak podvrgnut hromatografiji sa normalnom fazom, eluiran sa 5% MeOH u DCM, da bi se dobio sirovi proizvod. Dalje prečistiti sirov proizvod hromatografijom sa reverznom fazom, eluiran sa 15-60% B u A gradijentu (A: 10 mM amonijum bikarbonat u MeOH, B: acetonitril). Koncentrovati frakcije koje sadrže proizvod da bi se uklonila većina acetonitrila. Dodati EtOAc i odvojiti slojeve. Isprati organski sloj sa zasićenim natrijum hloridom, osušiti preko natrijum sulfata, procediti i koncentrovati filtrat in vacuo. Dalje prečistiti proizvod hromatografijom sa normalnom fazom, eluiran sa 5% MeOH in DCM, da bi se dobilo naslovno jedinjenje kao bela čvrsta supstanca (2.4 g, 49%). MS (ES) m/z = 525 (M+H).

Primer 2

2

(2R)-1,1,1-Trifluoro-3-({cis-4-[(4-{[1-(2-metoksietil)-5-metil-1H-pirazol-3-il]amino}-1-metil-1H-benzimidazol-6-il)oksi]cikloheksil}amino)propan-2-ol

[0100]

[0101] Spojiti (2R)-3-({cis-4-[(4-bromo-1-metil-1H-benzimidazol-6-il)oksi]cikloheksil}amino)-1,1,1-trifluoropropan-2-ol (1.4 g, 3.2 mmol), 1-(2-metoksietil)-5-metil-1H-pirazol-3-amin (0.69 g, 1.4 ekv.), kalijum karbonat (1.1 g, 2.6 ekv.), 2-(dicikloheksilfosfino)3,6-dinietboksi-2’,4’,6’-triizopropil-1,1’-bifenil (0.35 g, 0.20 ekv.), tris(dibenzilidenaceton)dipaladijum(0) (0.15 g, 0.050 ekv.), i sirćetnu kiselinu (0.01 mL) u terc-butil alkoholu (32 mL). Zagrejati do refluksa preko noći. Koncentrovati reakcionu smešu in vacuo. Dodati DCM i vodu; odvojiti slojeve. Procediti organski sloj kroz ISOLUTE® HM-N materijal, isprati sa DCM i EtOAc. Koncentrovati filtrat in vacuo da bi se dobio ostatak. Ostatak podvrgnut hromatografiji sa normalnom fazom, eluiran sa 30-100% B u A gradijentu (A: DCM, B: 15% 2M MeOH sa amonijakom u DCM), da bi se dobilo naslovno jedinjenje kao beličasta čvrsta supstanca (0.91 g, 56%). MS (ES) m/z = 511 (M+H).

Primer 3

(2R)-1,1,1-Trifluoro-3-[(cis-4-{[4-({1-(2-hidroksipropil)-5-metil-1H-pirazol-3-il}amino)-1-metil-1H-benzimidazol-6-il]oksi}cikloheksil)amino]propan-2-ol

[0102]

[0103] Spojiti (2R)-3-({cis-4-[(4-bromo-1-metil-1H-benzimidazol-6-il)oksi]cikloheksil}amino)-1,1,1-trifluoropropan-2-ol (0.35 g, 0.80 mmol), 1-(3-amino-5-metil-1H-pirazol-1-il)propan-2-ol (0.14 g, 1.1 ekv.), kalijum karbonat (0.28 g, 2.5 ekv.), 2-(di-terc-butilfosfino)-2’,4’,6’-triizopropil-3,6-dimetoksi-1,1’-bifenil (0.12 g, 0.30 ekv.), tris(dibenzilidenaceton)dipaladijum(0) (0.055 g, 0.075 ekv.), i sirćetnu kiselinu (0.01 mL) u terc-butil alkoholu (5.3 mL). Zagrejati na 100 °C preko noći. Koncentrovati reakcionu smešu in vacuo da bi se dobio ostatak. Ostatak podvrgnut C-18 hromatografiji sa reverznom fazom, eluiran sa gradijentom od 0%-80% acetonitrila u (10mM amonijum bikarbonat u metanolu). Koncentrovati frakcije koje sadrže proizvod (kao smeše izomera) in vacuo da bi se dobilo naslovno jedinjenje kao bela čvrsta supstanca (0.29 g, 71%). MS (ES) m/z = 511 (M+H).

[0104] Odvojiti izomere u smeši pomoću sledećih uslova hiralne hromatografije da bi se dobio:

Prvi eluirani enantomer 1 (0.12 g, 99% ee). MS (ES) m/z = 511 (M+H), 75%/25% CO2/izopropanol, 5 mL/min, 4.6 x 150 mm, Chiralpak AD-H

Drugi eluirani enantiomer 2 (0.11 g, 97% ee). MS (ES) m/z = 511 (M+H), 75%/25% CO2/izopropanol, 5 mL/min, 4.6 x 150 mm, Chiralpak AD-H

Primer 4

(2R)-1,1,1-Trifluoro-3-[(cis-4-{[4-({1-[(2S)-2-hidroksipropil]-5-metil-1H-pirazol-3-il}amino)-1-metil-1H-benzimidazol-6-il]oksi}cikloheksil)amino]propan-2-ol

[0105]

[0106] Spojiti (2R)-3-({cis-4-[(4-bromo-1-metil-1H-benzimidazol-6-il)oksi]cikloheksil}amino)-1,1,1-trifluoropropan-2-ol (0.40 g, 0.92 mmol), (2S)-1-(3-amino-5-metil-1H-pirazol-1-il)propan-2-ol (0.17 g, 1.2 ekv.), kalijum karbonat (0.33 g, 2.6 ekv.), 2-(dicikloheksilfosfino)3,6-dimetoksi-2’,4’,6’-triizopropil-1,1’-bifenil (0.099 g, 0.20 ekv.), tris(dibenzilidenaceton)dipaladijum(0) (0.042 g, 0.050 ekv.), i sirćetnu kiselinu (0.01 mL) u terc-butil alkoholu (10 mL). Zatvoriti sa steznim poklopcem. Zagrejati smešu u mikrotalasnom reaktoru na 140 °C u toku 60 min. Koncentrovati reakcionu smešu in vacuo. Dodati DCM i vodu; odvojiti slojeve. Procediti organski sloj kroz ISOLUTE® HM-N materijal, isprati materijal sa DCM i EtOAc. Koncentrovati filtrat in vacuo da bi se dobio ostatak. Triturisati ostatak sa EtOAc/heksanima da bi se dobilo naslovno jedinjenje (0.44 g, 95%). MS (ES) m/z = 511 (M+H).

Primer 5

(2R)-1,1,1-Trifluoro-3-[(cis-4-{[4-({1-[(2R)-2-hidroksipropil]-5-metil-1H-pirazol-3-il}amino)-1-metil-1H-benzimidazol-6-il]oksi}cikloheksil)amino]propan-2-ol

[0107]

2

[0108] Spojiti (2R)-3-({cis-4-[(4-bromo-1-metil-1H-benzimidazol-6-il)oksi]cikloheksil}amino)-1,1,1-trifluoropropan-2-ol (0.15 g, 0.34 mmol), (2R)-1-(3-amino-5-metil-1H-pirazol-1-il)propan-2-ol (0,064 g, 1.2 ekv.), kalijum karbonat (0.12 g, 2.6 ekv.), 2-(dicikloheksilfosfino)3,6-dimetoksi-2’,4’,6’-triizopropil-1,1’-bifenil (0.037 g, 0.20 ekv.), tris(dibenzilidenaceton)dipaladijum(0) (0.016 g, 0.050 ekv.), i sirćetnu kiselinu (0.01 mL) u terc-butil alkoholu (10 mL). Zatvoriti sa steznim poklopcem. Zagrejati smešu u mikrotalasnom reaktoru na 140 °C u toku 60 min. Koncentrovati smešu in vacuo da bi se dobio ostatak. Dodati DCM i vodu u ostatak i odvojiti slojeve. Procediti organski sloj kroz ISOLUTE® HM-N materijal; isprati materijal sa DCM i EtOAc. Koncentrovati filtrat in vacuo. Triturisati iz EtOAc/heksani da bi se dobilo naslovno jedinjenje kao smeđa čvrsta supstanca (0.11 g, 62%). MS (ES) m/z = 511 (M+H).

Primer 6

(2R)-1,1,1-Trifluoro-3-{[cis-4-({4-[(5-metoksi-1-metil-1H-pirazol-3-il)amino]-1-metil-1H-benzimidazol-6-il}oksi)cikloheksil]amino}propan-2-ol

[0109]

[0110] Dodati 2-metilbutan-2-ol (120 mL) u smešu (2R)-3-({cis-4-[(4-bromo-1-metil-1H-benzimidazol-6-il)oksi]cikloheksil}amino)-1,1,1-trifluoropropan-2-ola (10 g, 22.9 mmol), 5-metoksi-1-metil-pirazol-3-amina (3.6 g, 28.8 mmol), tris(dibenzilidenaceton) dipaladijum-(0) (1.8 g, 2 mmol), di-terc-butil(2’,4’,6’-triizopropil-3,6-dimetoksi-[1,1’-bifenil]-2-il)fosfin (1.3 g, 2.4 mmol) i kalijum karbonata (9 g, 65 mmol). Smeša je degasirana uvođenjem mehurića N2gasa kroz smešu i zatim dodata u sirćetnu kiselinu (118 uL, 2 mmol). Zagrejati i mešati smešu pod N2na 100 °C u toku 20 h. Ohladiti na st; upariti rastvarač; zatim dodati EtOAc (100 mL), vodu (50 mL), i ugljen (1 g). Mešati smešu u toku 15 min i procediti smešu kroz diatomejsku zemlju. Sakupiti filtrat i odgovojiti organski sloj. Dodati vodu (100 mL) i

2

koncentrovanu hlorovodoničnu kiselinu da bi se podesio pH na 2. Dodati ugalj (1.5g), mešati smešu 30 min i procediti smešu kroz diatomejsku zemlju. Premestiti filtrat u levak za odvajanje i odvojiti vodeni sloj. Dodati koncentrovani rastvor amonijum hidroksida preko vodenog sloja da bi se podesio pH na 10 da bi se dobila bledo krem čvrsta supstanca. Čvrsta supstanca je podvrgnuta hromatografiji na silikagelu eluiranjem sa smešom metilen hlorida i MeOH (95:5). Sakupiti željene frakcije i upariti rastvarač da bi se dobilo naslovno jedinjenje kao bledo krem materijal (6.5 g, 13 mmol) 64% prinos.

[0111] Kristalisati naslovo jedinjenje iz ciklopentil metil etra (45 mL) da bi se dobio (2R)-1,1,1-trifluoro-3-[[4-[7-[(5-metoksi-1-metil-pirazol-3-il)amino]-3-metil-benzimidazol-5-il]oksicikloheksil]amino]propan-2-ola (3.2 g, 6.5 mmol). Mešati smešu na 22 °C u toku 18 h. Upariti rastvarač i osušiti belu čvrstu supstancu do konstantne mase da bi se dobilo naslovno jedinjenje kao bela čvrsta supstanca (3.2 g, 6.4 mmol) u 99% prinosa. MS (m/z): 483.2 (M+H).1H NMR (300.16 MHz, DMSO): 8.13 (s, 1H), 7.90 (s, 1H), 7.46 (d, J= 1.9 Hz, 1H), 6.46 (d, J= 1.9 Hz, 1H), 5.49 (s, 1H), 4.45 (s, 1H), 3.83 (s, 3H), 3.73 (s, 3H), 3.47 (s, 3H), 2.75-2.67 (m, 2H), 1.99-1.91 (m, 2H), 1.67-1.54 (m, 7H).

Primer 7

(2R)-3-{[cis-4-({4-[(Etil-5-metil-1H-pirazol-3-il)amino]-1-metil-1H-benzimidazol-6-il}oksi)cikloheksil]amino}-1,1,1-trifluoropropan-2-ol

[0112]

[0113] Spojiti (2R)-3-({cis-4-[(4-bromo-1-metil-1H-benzimidazol-6-il)oksi]cikloheksil}amino)-1,1,1-trifluoropropan-2-ol (1.36 g, 3.12 mmol), 1-etil-5-metil-1H-pirazol-3-amin (0.78 g, 2.0 ekv.), kalijum karbonat (1.12 g, 2.6 ekv.), 2-(dicikloheksilfosfino)3,6-dimetoksi-2’,4’,6’-triisopropil-1,1’-bifenil (0.34 g, 0.20 ekv.), tris(dibenzilideneaceton)dipaladijum(0) (0.14 g, 0.050 ekv.), i sirćetnu kiselinu (0.01 mL) u terc-butil alkoholu (30 mL). Zagrejati do refluksa preko noći. Koncentrovati reakcionu smešu in vacuo. Dodati DCM i vodu; odvojiti slojeve. Procediti organski sloj kroz ISOLUTE® HM-N materijal, ispiranjem sa DCM. Koncentrovati filtrat in vacuo da bi se dobio ostatak. Triturisati ostatak u EtOAc i heksanima da bi se dobilo naslovno jedinjenje (1.40 g, 94%). MS (ES) m/z = 481 (M+H).

Primer 8

(2R)-1,1,1-Trifluoro-3-[(cis-1-metil-4-{[1-metil-4-(1H-pirazol-3-ilamino)-1H-benzimidazol-6-il]oksi}cikloheksil)amino]propan-2-ol

2

[0115] Spojiti (2R)-3-({cis-4-[(4-bromo-1-metil-1H-benzimidazol-6-il)oksi]-1-metilcikloheksil}amino)-1,1,1-trifluoropropan-2-ol (0.91 g, 2.02 mmol), 3-aminopirazol (0.29 g, 1.70 ekv.), kalijum karbonat (0.73 g, 2.6 ekv.), 2-(dicikloheksilfosfino)3,6-dimetoksi-2’,4’,6’-triisopropil-1,1’-bifenil (0.22 g, 0.20 ekv.), tris(dibenzilideneaceton)dipaladijum(0) (0.093 g, 0.050 ekv.), i sirćetnu kiselinu (0.01 mL) u tercbutil alkoholu (20 mL). Refluktovati smešu preko noći. Koncentrovati smešu in vacuo. Dodati DCM i vodu; odvojiti slojeve. Procediti organski sloj kroz ISOLUTE® HM-N materijal, isprati sa DCM. Koncentrovati filtrat in vacuo da bi se dobio ostatak. Ostatak podvrgnut hromatografiji sa normalnom fazom, eluirati sa 50-100% B u A gradijent (A: metil terc-butil etar, B: 15% 7M MeOH sa amonijakom u DCM), da bi se dobilo naslovno jedinjenje (0.67 g, 74%). MS (ES) m/z = 453 (M+H).

Primer 9

(2R)-3-{[cis-4-({4-[(1,5-Dimetil-1H-pirazol-3-il)amino]-1-metil-1H-benzimidazol-6-il}oksi)cikloheksil]amino}-1,1-difluoropropan-2-ol

[0116]

[0117] Spojiti (2R)-3,3-difluoro-2-hidroksipropil 4-metilbenzensulfonat (0.38 g, 1.31 mmol) i 6-[(cis-4-aminocikloheksil)oksi]-N-(1,5-dimetil-1H-pirazol-3-il)-1-metil-1H-benzimidazol-4-amin (0.61 g, 1.30 ekv.) u acetonitrilu (3 mL) i 2-propanol (3 mL). Dodati N,N-diizopropiletilamin (0.50 mL, 2.0 ekv.) i natrijum jodid (0.015 g, 0.1 ekv.). Zagrejati na 65 °C preko noći. Dodati (2R)-3,3-difluoro-2-hidroksipropil 4-metilbenzensulfonat (0.065 g, 0.22 mmol) i zagrejati na 65 °C preko noći. Procediti kroz diatomejsku zemlju. Isprati čvrstu supstancu sa EtOAc. Koncentrovati filtrat in vacuo. Prečistiti

2

hromatografijom sa reverznom fazom, eluirati sa 0-90% acetonitrilom u vodenom gradijentu. Koncentrovati frakcije koje sadrže proizvod in vacuo da bi se dobilo naslovno jedinjenje kao beličasta čvrsta supstanca (0.40 g, 67%). MS (ES) m/z = 449 (M+H).

Primer 10

(2R)-1,1,1-Trifluoro-3-({cis-4-[(1-metil-4-{[1-(piridin-2-il)-1H-pirazol-3-il]amino}-1H-benzimidazol-6-il)oksi]cikloheksil}amino)propan-2-ol

[0118]

[0119] Spojiti (2R)-3-({cis-4-[(4-bromo-1-metil-1H-benzimidazol-6-il)oksi]cikloheksil}amino)-1,1,1-trifluoropropan-2-ol (1.8 g, 4.1 mmol), 1-piridin-2-il-1H-pirazol-3-amin (0.86 g, 1.3 ekv.), kalijum karbonat (1.7 g, 2.9 ekv.), 2-(di-terc-butilfosfino)-2’,4’,6’-triizopropil-3,6-dimetoksi-1,1’-bifenil (0.83 g, 0.41 ekv.), tris(dibenzilidenaceton)dipaladijum(0) (0.38 g, 0.10 ekv.), i sirćetnu kiselinu (0.03 mL) u tercbutil alkoholu (22 mL). Zagrejati smešu na 90 °C u toku tri sata. Ohladiti smešu na st. Procediti kroz sloj diatomejske zemlje i isprati sloj sa EtOAc. Koncentrovati filtrat in vacuo da bi se dobio ostatak. Ostatak podvrgnut hromatografiji sa normalnom fazom, eluiran sa 0-10% MeOH u DCM gradijentu, da bi se dobilo naslovno jedinjenje (1.34 g, 63%). MS (ES) m/z = 516 (M+H).

[0120] Bazni materijal bez kristala može biti dobijen rastvaranjem čvrstog materijala, koji je pripremljen suštinski kao što je gore opisano, u 2 butanonu (100 mas%) zatim zagrevanjem dobijene smeše 65°C. Dozvoliti da se smeša ohladi na 20°C i dodati heptan (100 mas. %) da bi se izazvalo taloženje. Sakupiti dobijenu čvrstu supstancu i isprati sa heptanima, osušiti na vazduhu 15 minuta, zatim osuštiti u sušnici 40°C preko noći da bi se dobilo naslovno jedinjenje kao anhidrovana baza bez kristala u prinosu od 62%.

Difrakcija X-zraka na prahu Primera 10

[0121] XRD spektar kristalne čvrste supstance je dobijen na Bruker D4 Endeavor difraktomentu X-zraka na prahu, snabdevenom sa CuKa izvorom (λ = 1.54060 Å) i Vantec detektorom, koji radi na 35 kV i 50 mA. Uzorak je sniman između 4 i 40° 2θ, sa veličinom koraka od 0.0087° 2θ i brzinom snimanja od 0.5 sekunde/koraku, i sa divergencom od 0.6 mm , 5.28mm fiksnim uređajem protiv rasipanja, i 9.5 mm prorezima detektora. Suvi prah je spakovan u držač uzorka od kvarca i glatka površina je dobijena pomoću staklenog poklopca. U stanju tehnike kristalografije je dobro poznato da, za bilo koji dati oblik kristala, relativni intenziteti difrakcionih signala mogu varirati usled poželjne orijentacije koja je rezultat faktora kao što su morfologija kristala i stanje. Gde su prisutni efekti poželjne orijentacije, intenziteti signala se menjaju, ali karakteristični položaji signala polimorfa su nepromenjeni. Videti, npr.

2

The U. S. Pharmacopeia 38 -National Formulary 35 Chapter Characterization of crystalline and partially crystalline solids by X-ray powder diffraction (XRPD) Official May 1, 2015. Dalje, takođe je dobro poznato u stanju tehnike kristalografije da se za bilo koji dati kristalni oblik mogu malo razlikovati položaji ugla signala. Na primer, položaji signala se mogu pomeriti usled varijacije u temperaturi ili vlažnost pri kojoj je svaki uzorak analiziran, zamenjivan uzorak, ili prisutva ili odsustva unutrašnjeg stanndarda. U sadašnjem slučaju, varijabilnost položaja signala ±0.2 u 2θ će uzeti u obzir ove potencijalne varijacije bez zasenjivanja nedvosmislene identifikacije kristalnog oblika. Potvrda kristalnog oblika može biti zasnovana na jedinstvenoj kombinaciji karakterističnih signala (u jedinicama ° 2θ), tipično istaknutijih signala. Difrakcioni spektri kristalnog oblika, snimljeni na temperaturi i relativnoj vlažnosti okoline, su podešeni na osnovu standardnih signala NIST 675 na 8.85 i 26.77 stepena 2-teta.

[0122] Prema tome, pripremljeni uzorak slobodne baze jedinjenja iz Primera 10 je karakterisan XRD spektrom korišćenjem CuKa zračenja koje ima difrakcione signale (2-teta vrednosti) kako je opisano dole u Tabeli 1. Specifično spektar sadrži signal na 20.5 u kombinaciji sa jednim ili više signala izabranih iz grupe koju čine 15.5, 18.1, 18.3, 18.5, 22.9 i 23.6 sa odstupanjem difrakcionih uglova od 0.2 stepena.

Tabela 1

Primeri 11A i 11B

(2R)-1,1,1-Trifluoro-3-[(cis-4-{[1-metil-4-({1-[(3R)-tetrahidro-2H-piran-3-il]-1H-pirazol-3-il}amino)-1H-benzimidazol-6-il]oksi}cikloheksil)amino]propan-2-ol

[0123]

(2R)-1,1,1-Trifluoro-3-[(cis-4-{[1-metil-4-({1-[(3S)-tetrahidro-2H-piran-3-il]-1H-pirazol-3-il}amino)-1H-benzimidazol-6-il]oksi}cikloheksil)amino]propan-2-ol

[0124]

[0125] Prvo pripremiti jedinjenja kao racemsku smešu. Spojiti (2R)-3-({cis-4-[(4-bromo-1-metil-1H-benzimidazol-6-il)oksi]cikloheksil}amino)-1,1,1-trifluoropropan-2-ol (0.62 g, 1.2 ekv.), 1-(tetrahidro-2H-piran-3-il)-1H-pirazol-3amin (0.20 g, 1.2 mmol), kalijum karbonat (0.42 g, 2.5 ekv.), 2-(di-tercbutilfosfino)-2’,4’,6’-triizopropil-3,6-dimetoksi-1,1’-bifenil (0.18 g, 0.30 ekv.), tris(dibenzilidenaceton)dipaladijum(0) (0.085 g, 0.075 ekv.), i sirćetnu kiselinu (0.02 mL) u terc-butil alkoholu (6 mL). Zagrejati na 100 °C u toku sedam h. Dozvoliti da se reakciona smaša ohladiti na st. Koncentrovati reakcionu smešu in vacuo. Razblažiti sa EtOAc. Procediti kroz sloj diatomejske zemlje i isprati sloj sa EtOAc. Dodati zasićeni vodeni natrijum bikarbonat u filtrat. Odvojiti slojeve. Isprati vodeni sloj sa vodom i rastvorom soli. Osušiti organski sloj preko anhidrovanog MgSO4, procediti, i koncentrovati filtrat in vacuo da bi se dobio ostatak. Ostatak podvrgnut hromatografiji sa normalnom fazom, eluirati sa 0-30% MeOH u DCM gradijentu, da bi se dobilo naslovno jedinjenje (0.31 g, 49%). MS (ES) m/z = 523 (M+H).

[0126] Odvojiti izomere prvo dobijanjem derivata 5-(trifluorometil)oksazolidin-2-ona :

(5R)-3-(cis-4-{[1-Metil-4-({1-[(3R)-tetrahidro-2H-piran-3-il]-1H-pirazol-3-il}amino)-1H-benzimidazol-6-il]oksi}cikloheksil)-5-(trifluorometil)-1,3-oksazolidin-2-on,

1

i (5R)-3-(cis-4-{[1-Metil-4-({1-[(3S)-tetrahidro-2H-piran-3-il]-1H-pirazol-3-il}amino)-1H-benzimidazol-6-il]oksi}cikloheksil)-5-(trifluorometil)-1,3-oksazolidin-2-on

[0127] Spojiti (2R)-1,1,1-trifluoro-3-({cis-4-[(1-metil-4-{[1-(tetrahidro-2H-piran-3-il)-1H-pirazol-3-il]amino}-1H-benzimidazol-6-il)oksi]cikloheksil}amino)propan-2-ol (0.25 g, 0.42 mmol), 1,1’-karbonildiimidazol (0.14 g, 2.0 ekv.), i 4-dimetilaminopiridin (0.011 g, 0.21 ekv.) u DCM (2 mL). Mešati na st u toku tri dana. Koncentrovati in vacuo da bi se dobio ostatak. Ostatak podvrgnut hromatografiji sa normalnom fazom, eluirati sa 0-20% MeOH u DCM gradijentu, da bi se dobila racemska smeša (5R)-3-(cis-4-{[1-metil-4-({1-[tetrahidro-2H-piran-3-il]-1H-pirazol-3-il}amino)-1H-benzimidazol-6-il]oksi}cikloheksil)-5-(trifluorometil)-1,3-oksazolidin-2-ona. Odvojiti izomere hiralnom hromatografijom pomoću 60%/40% CO2/izopropanol, 5 mL/min, 4.6 x 150 mm, Lux Amylose-2.

Izomer 1 (0.10 g, 99% ee). Retenciono vreme 2.98 min. MS (ES) m/z = 549 (M+H)

Izomer 2 (0.10 g, 99% ee). Retenciono vreme 4.83 min. MS (ES) m/z = 549 (M+H)

Izomer 1

(2R)-1,1,1-Trifluoro-3-({cis-4-[(1-metil-4-{[1-(tetrahidro-2H-piran-3-il)-1H-pirazol-3-il]amino}-1H-benzimidazol-6-il)oksi]cikloheksil}amino)propan-2-ol

[0128] Spojiti (5R)-3-(cis-4-{[1-metil-4-({1-[tetrahidro-2H-piran-3-il]-1H-pirazol-3-il}amino)-1H-benzimidazol-6-il]oksi}cikloheksil)-5-(trifluorometil)-1,3-oksazondin-2-on (Izomer 1) (0.080 g, 0.15 mmol) i kalijum trimetil-silanolat (0.041 g, 2.0 ekv.) u THF (2 mL). Mešati na 65 °C u toku tri dana. Dodati kalijum trimetilsilanolat (0.018 g, 1.0 ekv.). Mešati na 65 °C preko noći. Dozvoliti da se ohladi na st. Razblažiti sa nekoliko kapi vode i koncentrovati in vacuo. Prečistiti C-18 hromatografijom sa reverznom fazom pomoću 0%-100% acetonitrila u (10mM amonijum bikarbonatu u metanolu) gradijentu, da bi se dobilo naslovno jedinjenje (0.055 g, 72%). MS (ES) m/z = 523 (M+H).

Izomer 2

2

(2R)-1,1,1-Trifluoro-3-({cis-4-[(1-metil-4-{[1-(tetrahidro-2H-piran-3-il)-1H-pirazol-3-il]amino}-1H-benzimidazol-6-il)oksi]cikloheksil}amino)propan-2-ol

[0129] Spojiti (5R)-3-(cis-4-{[1-metil-4-(11-[tetrahidro-2H-piran-3-il]-1H-pirazol-3-il}amino)-1H-benzimidazol-6-il]oksi}cikloheksil)-5-(trifluorometil)-1,3-oksazolidin-2-on (Izomer 2) (0.080 g, 0.15 mmol) i kalijum trimetil-silanolat (0.040 g, 2.0 ekv.) u THF (2 mL). Mešati na 65 °C u toku tri dana. Dodati kalijum trimetilsilanolat (0.018 g, 1.0 ekv.). Mešati na 65 °C preko noći. Dozvoliti da se ohladi na st. Razblažiti sa nekoliko kapi vode i koncentrovati in vacuo. Prečistiti C-18 hromatografijom sa reverznom fazom pomoću 0%-100% acetonitrila u (10mM amonijum bikarbonata u metanolu) gradijentu, da bi se dobilo naslovno jedinjenje (0.058 g, 76%). MS (ES) m/z = 523 (M+H).

Primer 12

(2R)-1,1,1-Trifluoro-3-({cis-4-[(1-metil-4-{[1-(piridin-2-il)-1H-pirazol-3-il]amino}-1H-benzimidazol-6-il)oksi]cikloheksil}amino)propan-2-ol 2-hidroksipropan-1,2,3-trikarboksilat hidrat (1:1:1)

[0130]

[0131] Dodati 1.23 g (2R)-1,1,1-trifluoro-3-({cis-4-[(1-metil-4-{[1-(piridin-2-il)-1H-pirazol-3-il]amino}-1H-benzimidazol-6-il)oksi]cikloheksil}amino)propan-2-ola u 10 mL 88% acetona uz mešanje na 1000 oum/70 °C da bi se dobila bela suspenzija. Dodati 510 mg limuske kiseline u kapima. Bela suspenzija se pretvorila u bistri žućkasti rastvor. Pekinuto je zagrevanje i mešanje. U toku sledećeg sata, polako je obrazovana čvrsta žuta supstanca. Izolovana je svetlo žuta čvrsta supstanca vakuum filtracijom. Suvi uzorak je proceđen pod strujom vazduha u toku 20 minuta da bi se dobilo naslovno jedinjenje. (1.62 g, 93.6%)

Spektar difrakcije X-zraka na prahu primera 12:

[0132] XRD spektar kristalne čvrste supstance je dobijen na Bruker D4 Endeavor difraktomentu X-zraka na prahu, snabdevenom sa CuKa izvorom (λ = 1.54060 Å) i Vantec detektorom, koji radi na 35 kV i 50 mA. Uzorak je sniman između 4 i 40° 2θ, sa veličinom koraka od 0.0087° 2θ i brzinom snimanja od 0.5 sekunde/koraku, i sa divergencom od 0.6 mm, 5.28mm fiksnim uređajem protiv rasipanja, i 9.5 mm prorezima detektora. Suvi prah je spakovan u držač uzorka od kvarca i glatka površina je dobijena pomoću staklenog poklopca. U stanju tehnike kristalografije je dobro poznato da, za bilo koji dati oblik kristala, relativni intenziteti difrakcionih signala mogu varirati usled poželjne orijentacije koja je rezultat faktora kao što su morfologija kristala i stanje. Gde su prisutni efekti poželjne orijentacije, intenziteti signala se menjaju, ali karakteristični položaji signala polimorfa su nepromenjeni . Videti, npr. The U. S. Pharmacopeia 38 -National Formulary 35 Chapter Characterization of crystalline and partially crystalline solids by X-ray powder diffraction (XRPD) Official May 1, 2015. Dalje, takođe je dobro pozanto u stanju tehnike kristalografije da se za bilo koji dati kristalni oblik položaji ugla signala mogu malo razlikovati. Na primer, položaji signala se mogu pomeriti usled varijacije u temperaturi ili vlažnost pri kojoj je svaki uzorak analiziran, zamenjivan uzorak, ili prisutva ili odsustva unutrašnjeg stanndarda. U sadašnjem slučaju, varjabilnost položaja signala ±0.22θ će uzeti u obzir ove potencijalne varijacije bez zasenjivanja nedvosmislene identifikacije kristalnog oblika. Potvrda kristalnog oblika može biti zasnovana na jedinstvenoj kombinaciji karakterističnih signala (u jedinicama ° 2θ), tipično istaknutijih signala. Difrakcioni spektri kristalnog oblika, snimljeni na temperaturi i relativnoj vlažnosti okoline, su podešeni na osnovu standardnih signala NIST 675 na 8.85 i 26.77 stepena 2-teta.

[0133] XRD spektar (2R)-1,1,1-trifluoro-3-({cis-4-[(1-mety1-4-{[1-(piridin-2-il)-1H-pirazol-3-il] amino}-1H-benzimidazol-6-il)oksi]cikloheksil}amino)propan-2-ol 2-hidroksipropan-1,2,3-trikarboksilat hidrata (1:1:1) pomoću CuKa zračenja daje difrakcione signale (2-teta vrednosti) kao što je opisano dole u tabeli 2, i posebno ima signale na 17.9 u kombinaciji sa jednim ili više signala izabranih iz grupe koja se sastoji od 26.1, 26.6, i 22.7; sa odstupanjem difrakcionih uglova od 0.2 stepena.

Tabela 2

Biološki deo

JAK1, JAK2 i JAK3 in vitro enzimski testovi

[0134] JAK LanthaScreen™ kinazni test (Invitrogen) je korišćen za određivanje sposobnosti testiranih jedinjenja da inhibiraju JAK1, JAK2, i JAK3 kinaznu aktivnost. Ovo su formati TR-FRET testa koji koriste antitela obeležena sa dugoživećim terbijumom kao donorske vrste i GFP-STAT1 kao akceptorske vrste. Upotrebiti odnos TR-FRET da bi se pratila JAK kinazna aktivnost gde porast u forsforilaciji GFP-STAT1 dovodi do porasta odnosa TR-FRET. Izvesti kinaznu reakciju pomoću reakcione zapremina od 12.5 μl na plitkim crnim Proxiplate® sa 384-bunarčića. Dodati reagense da bi se dobili krajnji uslovi reakcije 50 ml HEPES pH, 1.76 mM Triton X-100, ATP (20.0 μM za JAK1 i JAK3 ili 5 μM za JAK2) enzimski testovi, 10.0 mM MgCl2, 1 mM EGTA i 0.01% Brij-35, 0.05 mM GFP-STAT1, 14 nM JAK1 enzim za JAK1, 1.0 nM za JAK2 ili 2.5 nM za JAK3 enzimske testove, i 4% DMSO i serijska razblaženja testiranog jedinjenja (razblaženje 1:3 od 20,000 do 1 nM). Posle dodavanja ATP/GFP-STAT1, centrifugirati testirane ploče u toku 1 minuta na 1000 obrtaja u minuti (OUM). Dozvoliti da se ploče inkubiraju na ST u toku 60 minuta i zatim dodati 12.5 μl pufera za zaustavljanje koji sadrži 20 mM EDTA, 2 nM Terbium-anti-fosforilovanih transduktora signala i aktivatora transdukcije [fosforilacija Tirozin 701 aminokiseline] Antitelo (Tb-antipSTAT1[pTyr701], 0.67 mM tris(hidroksimetil)aminoetan hidrohlorid (Trizma®) pH 7.5, 0.02 % NaN3i 0.01 % nonilfenilpolietilen glikola (Nonidet ® P40). Inkubirati na ST u toku 90 min i čitati na EnVision®

4

čitaču ploča sa ekscitacionim filterom talasne dužine 340 nm i emisionim filterima na 520 nm i 495 nm talasne dužine. Izvesti odnos iz emisione talasne dužine za GFP-STAT1 koji je meren na 520 nm naspram emisije na 495 nm za (Tb-anti-pSTAT1[pTyr701]. Izvesti IC50vrednost za svako jedinjenje pomoću procentnog inhibicionog podatka koji je izračunat iz reakcionih podataka u odnosu na kontrole na ploči (aktivni enzimi naspram inhibiranih enzima na 2.0 mM sa tofacitinibom). Koristiti ACTIVITYBASE® 4.0 da se uklopi procentna inhibicijia i podaci koncentracije deset tačaka jedinjenja u logističku jednačinu sa četiri parametra.

[0135] Suštinskim praćenjem gore opisanog protokola, jedinjenja iz primera su testirana. Jedinjenja iz primera su pokazala IC50za JAK1 manji od 8 nM i selektivnu inhibicuju JAK1 u odnosu na JAK2, ili JAK3 in vitro. Jedinjenja iz primera 1 i 6 do 10 pokazala su aktivnost prikazanu u tabeli 3.

Tabela 3

[0136] Podaci pokazuju da jedinjenja iz primera su inhibitori JAK1 enzima i selektivni prema JAK1 u odnosu na JAK2 i JAK3 in vitro.

Protokol AlphaScreen SureFire testa zasnovanog na p-STAT3-(p-Tyr705)-IL6-TF-1-JAK1 ćelijama

[0137] Test zasnovan na JAK1 ćelijama koji je dole opisan je korišćen za određivanje JAK1 ćelijske jačine testiranih jedinjenja.

[0138] Dobijanje ćelija: Starve TF-1 ćelije u DMEM medijumu sa 0.5% 26400 (FBS) i IX Pen/Strep na 37 °C. Zasejati 100K ćelija po bunarčiću na BD crnim pločama sa 96 bunarčića sa providnim dnom. Držati ploče na ST u toku 30-60 minuta inkubacije preko noći na 37 °C i 5% CO2. Izbrojati ćelije pomoću Vibrojača ćelija, pomoću ćelijske suspenzije 100 ćelija/mL i zasejanih 100 μL/bunarčiću na Beckman Dickinson Biocoat pločama (Catalog # 354640).

[0139] Dobijanje i tretman testiranog jedinjenja: Pripremiti jedinjenja pri 1:3 serijskom razblaženju u DMSO i dalje razblažiti u medijumu. Testirana jedinjenja u opsegu 10 tačaka koncentracije od 20,000 do 1 nM. Dodati razblaženo jedinjenje da odgovara pločama sa ćelijama. Inkubirati ploče na 37 °C u toku 20 min. Dodati rastvor IL6 u krajnjoj koncentraciji od 30 ng/mL u odgovarajuće ploče sa ćelijama i nastaviti da se inkubiraju na 37°C u toku 30 min. Ukloniti medijum i dodati 50 μL 1x pufera za lizu u svaki balon.

[0140] pSTAT3 detekcija: Izvesti sledeće uzastopne korake: pripremiti akceptorsku smešu (aktivacioni pufer/ pufer za reakciju/akceptorska zrnca); premestiti 4 μL lizata iz ploča sa 96 bunarčića na Proxi ploče sa 384 bunarčića; dodati 5 μL akceptorskog miksa u proksi ploče sa 384 i poklopiti ploče sa aluminijumskim poklopcem; mućkati 1-2 minuta na mućkalici za ploče; inkubirati ploče na ST u toku 2 h uz blago mućkanje; napraviti smešu donora (donorska zrnca u puferu za razblaživanje); dodati 2 μL donorske smeže na ploče za testiranje; poklopiti ploče sa aluminijumskim poklopcem; mućkati 1-2 minuta na mućkalici za ploče; inkubirati na ST u toku 2 h uz blago mućkanje; očitati ploče sa Envision; protokol AlphaScreen Surefire 384.

[0141] Prateći u suštini gore opisani protokol, jedinjenja iz primera 1, 2, i 6 su testirana i pokazala su sledeću aktivnost kako je prikazano dole u tabeli 4.

Tabela 4

[0142] Podaci u tabeli 4 pokazuju da jedinjenja iz primera 1, 2, i 6 inhibiraju JAK1 enzime u testu zasnovanom na ćelijama pri čemu obezbeđuju osnovu da jedinjenja iz primera takođe inhibiraju JAK1 enzime u ćeliji.

Test celokupne humane krvi: Određivanje pSTAT3 (JAK1) i pSTAT5 (JAK2) u limfocitima i monocitima

[0143] Test celokupne humane krvi (HWB) je razvijen i validiran da se odredi sekretivnost na JAK1 i JAK2 testiranih jedinjenja.

[0144] Razblažiti testirana jedinjenja, 10 tačaka, (1:3) u DMSO 100% i korak dole u PBS 0.1 % BSA. Upotrebiti Tofacitinib kao referentno jedinjenje u svakoj ploči, kao i maksimalni signal (stimulisani bunarčići) i minimalni signal (bunarčići koji nisu stimulisani) u cilju normalizacije podataka. Dobijanje pula HWB iz 4 različita zdrava donora. Staviti krv na ploče sa 96 bunarčića pomoću Tecan Evo 96 w i inkubirati sa jedinjenjima za testiranje u toku 1h na ST. Posle ovog vremena inkubacije, stimulisati HWB sa oba IL6 (206-IL, R&D System) i GM-CSF (PHC2015, Life Technologies) u toku 15 minuta više. Dodati Viability Dye (65-0865, eBiosicience) (1:1000) pomoću Tecan Evo 96w (5xmešati).

[0145] Krajnje koncentracije u testu su bile sledeće: 100 μM za jedinjenja, 50 μM za Tofacitinib, 0.1 μg/mL IL6, 0.038 μg/mL GM-CSF i 1% DMSO. Lizirati i fiksirati HWB pomoću pufera za Lizu/fiksiranje (558049, Becton Dickinson) dodavanjem 900 μL pufera za lizu korišćenjem Tecan Evo 96w (mešati 10x visoka brzina). Inkubirati HWB u kupatilu na 37°C u toku 10 minuta. Centrifugirati HWB na 500G, 8 min i odbaciti supernatant. Dodati hladni MeOH korišćenjem Tecan Exo 96w u cilju permeabiliziranja ćelija. Inkubiranje ćelija krvi na ledu u toku 30 min. Posle ovoga, isprati ćelije 2x korišćenjem pufera za bojenje (554656, Becton Dickinson), okretati na 3000 oum, 2 min, odbaciti supernatant, i dodati sledeća antitela: Anti-Humani CD4 PE, 1:100 (12-0048, eBioscience), Anti-Humani CD33 eFluor® 450,1:50 (48-0337, eBioscience), Phospho-STAT5 (Tyr694) (C71E5) zečiji mAb, 1:100 (Alexa Fluor® 488 konjugat)(3939, ćelijsko bojenje) i Phospho-STAT3 (Tyr705) (D3A7) XP™ zečiji mAb 1:200, (Alexa Fluor® 647 konjugate)(4324, ćelijko bojenje). Inkubiranje antitela u toku 1h u mraku na ST, zatim isprati ćelije 2x i očitati na Cytometer Macsquant (Miltenyi Biotec). Usmeriti podatke na CD4+ (limfocite) i CD4Low CD33Hi (monocite), da bi se izmerio intenzitet fluorescencije iz ćelija koje eksprimuju pSTAT3 i pSTAT5, tim redom. Analiza podataka pomoću FlowJo v 10 i zatim normalizacija medijane fluorescencije naspram maksimuma signala da se odredi ICsos. Koristiti Graph Pad Prism 5™ da se prikažu krive doznog zavisnog odgovora.

[0146] Sušinskim praćenjem gore opisanog protokola, jedinjenja iz primera su testirana. Jedinjenja iz primera su pokazala veću selektivnost za JAK1 u odnosu na JAK 2, Aktivnost za jedinjenja iz primera 6 do 10 je data u tabeli 5.

Tabela 5

[0147] Podaci u tabeli 5 pokazuju da jedinjenja iz primera su jača za JAK1 u odnosu na JAK2 u testu celokupne krvi.

PK/PD test pacova

[0148] Muški Wistar pacovi, 265-285 grama (Charles River) su korišćeni za oralno gavažno doziranje. Dozirati životinjama (Oralnom gavažom) 1.82 mL/kg (0.5 mL na 275 grama). Formulisati jedinjenja u 1% HEC nosaču koji sadrži 0.25% Tween 80 i 0.05% sredstva protiv penjenja sa 1.1 molarna ekvivalenta metansulfonske kiseline da bi se obrazovala in situ so. Formulisati jedinjenja jednom nedeljno, i čuvati na 4 °C. U različitim vremenskim tačkama, obezbediti celokupnu krv pacova krvarenjem iz repne vene u epruvete za sakupljanje krvi Multivette 600 μl EDTA (cat# 151671100PK100, Sarstedt Inc) i koristiti za ex vivo JAK1 i JAK2 testove. Alikvot 100 ul krvi svakog pacova na ploču sa 96-bunarčića sa okruglim dnom. Stimulisati celokupnu krv sa rekombinantnim IL-6 (100ng/ml, i rekombinantnim mišijim GM-CSF (cat# 415-ML, lot#, R&D) u toku 12 min na st. Posle stimulacije citokina, dodati celukupnu krv u Lyse/fiks (cat# 558049, lot#, BD) miniepruvete na stalku; pomešati bunarčić 5X. Inkubirati 10 min na st. Centrifugirati stalak sa miniepruvetama na 600g u toku 4 min. Aspirirati sa 12-višestrukih kanala. Preneti sadržaj stalka miniepruveta na ploče sa 96 bunarčića sa okruglim dnom. Centrifugirati ćelije na 3000 oum u toku 1 min i odbaciti supernatant. Pomešati ćelije u bunarčiće sa 100 ul ledeno-hladne MeOH i inkubirati na ledu 30 min. Dodati 150 ul PBS 2% FCS u svaki bunarčić i centrifugirati na 3000 oum, 2 min. Isprati ćelije sa 2x 250 ul PBS 2% FCS. Za ćelijsku površinu i međućelijsko bojenje, pomešati sva antitela i dodati u svaki bunarčić i inkubirati 1 h na st u mraku. Korišćena antitela za bojenje su kao što sledi: pSTAT3, Alexa Fluor 647 (cat# 4324s, lot, Cell Signaling); pSTAT5, Alexa Fluor 488 (cat# 3939s, lot#, Cell Signaling), anti-pacovski CD4, V450 (cat# 561579, lot#, BD); anti-pacovski CD11b, Percp eFluor710 (cat# 12-0110-82, lot#, eBioscience) Posle bojenja ćelija sa Abs, isprati ploče dva puta sa PBS 2% FCS i na kraju resuspendovati u 150 ul istog rastvora. Proceniti postojanost ćelija sa Viability Dye 780 (cat# 65-0865-14, lot#, eBioscience). Izvesti test citometrije pomoću FORTESSA.

[0149] Suštinskim praćenjem gore opisanog protokola, jedinjenja iz primera 4, i 6 do 10 su testirana, i podaci su dati u tabeli 6.

Tabela 6

[0150] Ovi podaci podržavaju aktivnost jedinjenja iz primera i oni su jači za JAK1 u odnosu na JAK2 kod pacova in vivo.

Model artritisa izazvanog kolagenom (CIA) kod pacova

[0151] U ovom protokolu su korišćeni Lewis-ovi pacovi (mase 150-175 grama) iz Charles River. Dana 0, pacovi su anestezirani sa izofluranom. Dana 1, imunizirani su intradermalno sa emulzijom kolagena na dva mesta na donjem lumbalnom regionu, iznad baze repa. Zapremina doze je minimalno 0.4 mL po injekcionom mestu. Dana 8, pacovi su anestezirani sa izofuranom i imunizirani intradermalno sa emulzijom kolagena na dva mesta u nižem lumbalnom regionu , iznad baze repa. Pacovi su uključeni u grupe za tretiranje dana 12, na osnovu inflamacije (crvenila i/ili otoka) u njihovim zadnjim šapama. Nasumično su raspoređene životinje za fazu lečenja na osnovu vrednosti merenja skočnog zgloba i telesne mase pomoću alata za nasumičnu raspodelu u blokove. Zabeleženo je oticanje zgloba dana 1, 8, i 11 i zatim tri puta nedeljno posle raspodele i uklučujući dan nekroskopije. Dozirati jedinjenja oralno jednom dnevno polazeći od dana 12 (posle nasumične raspodele) do dana 25. Jedinjenja iz primera 6 i 7 su suštinski procenjena prema protokolu kako je gore opisano. Rezultati su prikazani dole u tabeli 7.

Tabela 7

[0152] Podaci u tabeli 7 pokazuju da jedinjenja iz primera 6 i 7 prikazuju dozno zavisnu inhibiciju naticanja šapa kod pacova, i pružaju osnov da su jedinjenja iz primera efikasna u lečenju artritisa.

Model artritisa izazvan adjuvantom (AIA) kod pacova

[0153] Efekti jedinjenja na poliartritičnu infamaciju i eroziju zgloba članka mogu biti procenjeni na modelu artritisa izazvanog adjuvantom (AIA) kod pacova. Upotrebljeni su muški Lewis-ovi pacovi sa srednjom vrednošću telesne mase od 185g za ispitivanje. Izazvati artritis intradermalnom injekcijom lociranom u bazi repa sa 100 μL adjuvanta suspendovanog u imunizacionu emulziju ulja. Nasumično rasporediti životinje na osnovu srednje vrednosti debiljine šape i telesne mase dana 10 u grupe za ispitivanje od 8 pacova u svakoj grupi. Pripremiti jedinjenja u 1% HEC / 0.25% P80 / 0.05% AF u prečišćenoj vodi i dozirati dnevno pomoću oralne gavaže polazeći od dana 11 posle imunizacije u toku 14 dana. Kvantitativno oticanje šape mereno je šestarom na oba članka. Proceniti razlike u grupama pomoću jednosmerne ANOVA praćene sa Dunnett-ovim post-testom za višestruka poređenja sa kontrolama nosača. Jedinjenje iz primera 10 je suštinski procenjeno u gore opisanom protokolu. Rezultati su prikazani dole u tabeli 8.

Tabela 8

[0154] Podaci iz tabele 8 pokazuju da jedinjenje iz primera 10 pokazuje dozno zavisnu inhibiciju oticanja šape kod pacova, i pružaju osnov da jedinjenja iz primera mogu biti efikasna u lečenju artritisa.

Claims (19)

1. PATENTNI ZAHTEVI 1. Jedinjenje formule, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so

   gde R je izabran između: H, -C1-3alkil, -CH2CH(OH)CH3, -C2-3alkil-O-CH3,

   R1 je izabran između: H, -CH3, i -OCH3; R2 je -CHF2ili -CF3; i R3 je H ili -CH3; uz uslov da kada R2 je -CF3i R3 je H, ili R ili R1 mogu biti -CH3, ali ne oba.
2. 2. Jedinjenje prema zahtevu 1 formule, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so,

   gde: R je izabran između: H, -C1-3alkil, -CH2CH(OH)CH3, -C2-3alkil-O-CH3, 4

   R1 je izabran između: H, -CH3, i -OCH3; R2 je -CHF2ili -CF3; i R3 je H ili -CH3; uz uslov da kad R2 je -CF3, i R3 je H, ili R ili R1 mogu biti -CH3, ali ne oba.
3. 3. Jedinjenje prema zahtevu 1 ili 2 gde R je izabran između: -CH3, -CH2CH3, i

   ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.
4. 4. Jedinjenje prema bilo kom od zahteva 1 do 3 gde R je -CH3, ili -CH2CH3, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.
5. 5. Jedinjenje prema bilo kom od zahteva 1 do 3 gde R je

   ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.
6. 6. Jedinjenje prema bilo kom od zahteva 1 do 5 gde R2 je -CF3, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.
7. 7. Jedinjenje prema bilo kom od zahteva 1 do 6 gde R3 je -CH3, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.
8. 8. Jedinjenje prema bilo kom od zahteva 1 do 4 koje je

   ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.
9. 9. Jedinjenje prema bilo kom od zahteva 1 do 4 koje je

   ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.
10. 10. Jedinjenje prema zahtevu 1 ili 2 koje je

    ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.
11. 11. Jedinjenje prema bilo kom od zahteva 1 do 3, ili 5 koje je

    ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.
12. 12. Jedinjenje prema bilo kom od zahteva 1 do 3, ili 5 koje je (2R)-1,1,1-trifluoro-3-({cis-4-[(1-metil-4-{[1-(piridin-2-il)-1H-pirazol-3-il]amino}-1H-benzimidazol-6-il)oksi]cikloheksil}amino)propan-2-ol2-hidroksipropan-1,2,3-trikarboksilat hidrat.
13. 13. Jedinjenje prema bilo kom od zahteva 1 do 3, ili 5 koje je (2R)-1,1,1-trifluoro-3-({cis-4-[(1-metil-4-{[1-(piridin-2-il)-1H-pirazol-3-il]amino}-1H-benzimidazol-6-il)oksi]cikloheksil}amino)propan-2-ol u kristalnom obliku karakterisanom sa spektrom difrakcije X-zraka na prahu dobijenom sa CuKa izvorom (λ=1.54060 Å), koji ima signal na 20.5 u kombinaciji sa jednim ili više signala izabranih iz grupe koju čine 15.5, 18.1, 18.3, 18.5, 22.9 i 23.6; sa odstupanjem difrakcionih uglova od 0.2 stepeni.
14. 14. Jedinjenje prema bilo kom od zahteva 1 do 3, ili 5 koje je (2R)-1,1,1-trifluoro-3-({cis-4-[(1-metil-4-{[1-(piridin2-il)-1H-pirazol-3-il]amino}-1H-benzimidazol-6-il)oksi]cikloheksil}amino)propan-2-ol 2-hidroksipropan-1,2,3-trikarboksilat hidrat u kristalnom obliku karakterisanom sa spektrom difrakcije X-zraka na prahu dobijenom pomoću CuKa izvora (λ=1.54060 Å), koji ima signal na 17.9 u kombinaciji sa jednim ili više signala izabranih iz grupe koju čine 26.1, 26.6 i 22.7; sa odstupanjem difrakcionih uglova od 0.2 stepeni.
15. 15. Farmaceutska kompozicija koja sadrži jedinjenje prema bilo kom od zahteva 1 do 14 i farmaceutski prihvatljiv nosač, razblaživač ili ekscipijent.
16. 16. Farmaceutska kompozicija prema zahtevu 15 koja sadrži više od 80% mas/mas jedinjenja koje je (2R)-1,1,1-trifluoro-3-({cis-4-[(1-metil-4-{[1-(piridin-2-il)-1H-pirazol-3-il]amino}-1H-benzimidazol-6-il)oksi]cikloheksil}amino)propan-2-ol2-hidroksipropan-1,2,3-trikarboksilat hidrat u kristalnom obliku.
17. 17. Farmaceutska kompozicija prema zahtevu 15 koja sadrži više od 90 % mas/mas jedinjenja koje je (2R)-1,1,1-trifluoro-3-({cis-4-[(1-metil-4-{[1-(piridin-2-il)-1H-pirazol-3-il]amino}-1H-benzimidazol-6-il)oksi]cikloheksil}amino)propan-2-ol2-hidroksipropan-1,2,3-trikarboksilat hidrat u kristalnom obliku.
18. 18. Jedinjenje prema bilo kom od zahteva 1 do 14 za upotrebu u lečenju.
19. 19. Jedinjenje prema bilo kom od zahteva 1 do 14 za upotrebu u lečenju artritisa. Izdaje i štampa: Zavod za intelektualnu svojinu, Beograd, Kneginje Ljubice 5