RS62083B1 - Identifikacija i izolacija humanog otičkog progenitora - Google Patents

Identifikacija i izolacija humanog otičkog progenitora

Info

Publication number
RS62083B1
RS62083B1 RS20210826A RSP20210826A RS62083B1 RS 62083 B1 RS62083 B1 RS 62083B1 RS 20210826 A RS20210826 A RS 20210826A RS P20210826 A RSP20210826 A RS P20210826A RS 62083 B1 RS62083 B1 RS 62083B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
cell
cells
binding
markers
bind
Prior art date
Application number
RS20210826A
Other languages
English (en)
Inventor
Carlos Marcelo Nicolas Rivolta
Sarah Louise Boddy
Original Assignee
Univ Sheffield
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univ Sheffield filed Critical Univ Sheffield
Publication of RS62083B1 publication Critical patent/RS62083B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3076—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells against structure-related tumour-associated moieties
    • C07K16/3084—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells against structure-related tumour-associated moieties against tumour-associated gangliosides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C12N5/0623—Stem cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56966—Animal cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere in G01N2333/705
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/71—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/745—Assays involving non-enzymic blood coagulation factors
    • G01N2333/7452—Thrombomodulin
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/916—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1), e.g. phosphatases (3.1.3), phospholipases C or phospholipases D (3.1.4)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)

Description

Opis
[0001] Predmetni pronalazak se generalno odnosi na identifikaciju i izolaciju humanih otičkih progenitorskih ćelija. Specifičnije, predmetni pronalazak se odnosi na postupak upotrebe ćelijskih markera za identifikaciju i izolaciju humanih otičkih progenitorskih ćelija iz mešovite populacije ćelija, postupke obogaćivanja i proizvodnje humanih otičkih progenitorskih ćelija, i povezane komplete za upotrebu u identifikaciji i/ili izolaciji.
[0002] Gluvoća je stanje sa visokom prevalencom širom sveta, nastalo prvenstveno gubitkom senzornih vlatastih ćelija i njihovih povezanih neurona spiralne ganglije (SGN). Od svih oblika gluvoće, auditorna neuropatija posebno zabrinjava. Ovo stanje, definisano prvenstveno oštećenjem SGN sa relativnim očuvanjem vlatastih ćelija, odgovorno je za značajan udeo pacijenata sa oštećenjem sluha. Iako se gubitak vlatastih ćelija može delimično zaobići kohlearnim implantom, nije dostupno rutinsko lečenje za gubitak senzornih neurona, pošto slaba inervacija ograničava prospektivne performanse implanta. Upotreba matičnih ćelija za oporavak oštećenog senzornog kola je potencijalna terapijska strategija.
[0003] Razvijeni su protokoli da indukuju diferencijaciju od humanih embrionalnih matičnih ćelija (hESC) upotrebom signala, kao što su FGF3 i FGF10, koji su uključeni u inicijalnu specifikaciju otičke plakode (Chen et al. 2012. Restoration of auditory evoked responses by human ES-cell-derived otic progenitors. Nature, 490(7419):278-82. doi: 10.1038/nature11415). Indukovani otički progenitori sposobni su da se diferenciraju in vitro u ćelije slične vlatastoj ćeliji i slušne neurone koji pokazuju očekivana elektrofiziološka svojstva. Osim toga, kada se transplantiraju u model slušne neuropatije, otički neuroprogenitori se graftuju, diferenciraju i značajno poboljšavaju slušno-evocirane pragove odgovora. Međutim, upotrebljeni postupak indukcije FGF3/10 je neefikasan, dajući samo približno 20% potrebnih tipova ćelija.
[0004] Ukoliko se otički progenitori poreklom od humanih embrionalnih matičnih ćelija (hESC) upotrebljavaju u kliničkoj postavci, od suštinske je važnosti da te ćelije mogu biti izolovane od drugih tipova ćelija nehotice proizvedenih tokom procesa diferencijacije. Određeni postupak izdvajanja komponenata ćelijskih populacija iz heterogenih kultura je fluorescencijom aktivirano sortiranje ćelija (FACS), ali kako bi se upotrebio ovaj postupak, moraju se identifikovati specifični markeri ćelijske površine koji se vezuju za ključni tip ćelije, npr. otičke progenitore. Iako su opisani različiti markeri za izolaciju generičkih neuralnih progenitora, nijedan nije identifikovan za izolaciju humanih otičkih progenitora (bilo neuralnih ili epitelnih).
[0005] Boddy et al. (Regenerative Med. (2012) vol 7, no 6, pp 757-767) i Boddy et al. (Human Gene Therapy (2013), vol 24, no.5) opisuju in vitro generisanje progenitorskih ćelija unutrašnjeg uha od mezenhimskih matičnih ćelija humane kostne srži i generisanje otičkih loza od humanih indukovanih pluripotentnih matičnih ćelija, respektivno.
[0006] Cilj predmetnog pronalaska je da obezbedi postupak identifikovanja, i potencijalno izolovanja humanih otičkih progenitora iz mešovite populacije ćelija.
Sažetak pronalaska
[0007] U skladu sa prvim aspektom predmetnog pronalaska, obezbeđen je in vitro postupak identifikovanja humanih otičkih progenitorskih ćelija u mešovitoj populaciji ćelija koji sadrži određivanje da li ćelija ima najmanje dva markera ćelijske površine odabrana od SSEA1 (takođe poznat kao CD15 ili Luis (Lewis) x), GD3, TRA-2-49 (alkalna fosfataza), SSEA4, GD2 i CD141.
[0008] U primeru izvođenja, ćelijski markeri SSEA1, GD3, TRA-2-49, SSEA4, i GD2 su pozitivni ćelijski markeri; i/ili ćelijski marker CD 141 je negativni ćelijski marker.
[0009] U primeru izvođenja, najmanje dva pozitivna ćelijska markera se upotrebljavaju u kombinaciji za identifikaciju humanih otičkih progenitora; ili se najmanje tri, četiri ili pet pozitivnih ćelijskih markera upotrebljava u kombinaciji za identifikaciju humanih otičkih progenitora; ili se pozitivni ćelijski marker, ili najmanje dva pozitivna ćelijska markera upotrebljavaju u kombinaciji sa negativnim ćelijskim markerom CD141.
[0010] U primeru izvođenja, mešovita populacija ćelija se obezbeđuje iz, ili tokom, in vitro protokola diferencijacije pluripotentnih matičnih ćelija, opciono pri čemu su pluripotentne matične ćelije indukovane pluripotentne matične ćelije (iPSC); ili pri čemu se mešovita populacija ćelija obezbeđuje iz, ili tokom, procedura dediferenciranja, transdiferenciranja ili direktnog reprogramiranja u humane otičke ćelijske loze; ili pri čemu se mešovita populacija ćelija obezbeđuje iz tkiva, opciono pri čemu su ćelije kohlearni ili vestibularni uzorci dobijeni hirurškim intervencijama iz unutrašnjeg uha odraslih.
[0011] U primeru izvođenja, mešovita populacija ćelija se dovodi u kontakt sa jednim ili više vezujućih članova aranžiranih tako da se vezuju za ćelijske markere, opciono pri čemu vezujući član sadrži antitelo, fragment antitela, ili njegov mimetik.
[0012] U primeru izvođenja, postupak sadrži korak detekcije, pri čemu se ćelijski markeri detektuju kao prisutni ili da nisu prisutni na ćeliji ili grupi ćelija, opciono pri čemu detekcija sadrži upotrebu FACS i/ili upotrebu MACS.
[0013] U primeru izvođenja, vezujući član je obeležen za identifikaciju, opciono pri čemu obeleživač sadrži fluoroforu. U skladu sa drugim aspektom predmetnog pronalaska, obezbeđen je in vitro postupak identifikovanja humanih otičkih progenitorskih ćelija u mešovitoj populaciji ćelija upotrebom najmanje dva markera ćelijske površine odabrana od SSEA1 (takođe poznat kao CD15), GD3, TRA-2-49 (alkalna fosfataza), SSEA4, GD2 i CD141, postupak sadrži:
- obezbeđivanje vezujućih članova specifičnih za najmanje dva različita ćelijska markera;
- dovođenje u kontakt mešovite populacije ćelija sa vezujućim članovima; i
- detektovanje vezivanja ili nevezivanja vezujućih članova za ćelije u mešovitoj populaciji ćelija.
[0014] U primeru izvođenja, postupak dodatno sadrži određivanje da je ćelija humana otička progenitorska ćelija ukoliko:
a) se vezujući članovi aranžirani tako da se vezuju za pozitivne ćelijske markere vezuju za najmanje dva različita pozitivna ćelijska markera na ćeliji; ili
b) se vezujući član aranžiran tako da vezuje jedan od pozitivnih ćelijskih markera vezuje za najmanje jedan od pozitivnih ćelijskih markera na ćeliji, i vezujući marker aranžiran tako da se vezuje za negativni ćelijski marker CD141 se ne vezuje za ćeliju,
opciono pri čemu postupak sadrži određivanje da je ćelija humana otička progenitorska ćelija ukoliko:
i) se vezujući članovi aranžirani tako da se vezuju za pozitivne ćelijske markere vezuju za najmanje tri različita pozitivna ćelijska markera na ćeliji; ili
ii) se vezujući članovi aranžirani tako da vezuju najmanje dva različita pozitivna ćelijska markera vezuju za najmanje dva različita pozitivna ćelijska markera na ćeliji, i vezujući marker aranžiran tako da se vezuje za negativni ćelijski marker CD141 se ne vezuje za ćeliju.
[0015] U primeru izvođenja, obezbeđen je postupak identifikovanja humanih otičkih progenitorskih ćelija u mešovitoj populaciji ćelija koji sadrži određivanje da li ćelija ima najmanje dva markera ćelijske površine odabrana od SSEA1, GD3, TRA-2-49, SSEA4, GD2 i CD141,
pri čemu su ćelije identifikovane da imaju:
a) najmanje dva od SSEA1, GD3, TRA-2-49, SSEA4, ili GD2; ili
b) najmanje jedan od SSEA1, GD3, TRA-2-49, SSEA4, GD2, i nemaju CD141,
identifikovane kao humane otičke progenitorske ćelije.
[0016] U skladu sa sledećim aspektom predmetnog pronalaska, obezbeđen je in vitro postupak obogaćivanja humanih otičkih progenitorskih ćelija iz mešovite populacije ćelija, postupak sadrži:
- identifikovanje humanih otičkih progenitorskih ćelija u skladu sa ovim pronalaskom; i - sortiranje ćelija tako da se humane otičke progenitorske ćelije izoluju iz ne-otičkih progenitorskih ćelija, tako da su humane otičke progenitorske ćelije obogaćene u populaciji.
[0017] U primeru izvođenja, sortiranje sadrži FACS i/ili sadrži MACS.
[0018] U skladu sa sledećim aspektom predmetnog pronalaska, obezbeđen je in vitro postupak proizvodnje populacije humanih otičkih progenitorskih ćelija, postupak sadrži:
- diferenciranje ne-otičkih progenitorskih ćelija u humane otičke progenitorske ćelije, pri čemu neke ne-otičke progenitorske ćelije mogu ostati u populaciji da bi formirale mešovitu populaciju ćelija; i
- obogaćivanje humanih otičkih progenitorskih ćelija iz mešovite populacije ćelija u skladu sa postupkom obogaćivanja humanih otičkih progenitorskih ćelija iz ovog pronalaska.
[0019] U skladu sa sledećim aspektom predmetnog pronalaska, obezbeđen je komplet koji sadrži najmanje dva različita vezujuća člana, pri čemu su vezujući članovi aranžirani tako da se vezuju za različite ćelijske markere odabrane od SSEA1, GD3, TRA-2-49, SSEA4, GD2 i CD141.
[0020] U primeru izvođenja, komplet sadrži najmanje tri različita vezujuća člana, pri čemu su vezujući članovi aranžirani tako da se vezuju za različite ćelijske markere odabrane od SSEA1, GD3, TRA-2-49, SSEA4, GD2 i CD141.
[0021] U primeru izvođenja, komplet sadrži panel vezujućih članova, pri čemu panel vezujućih članova sadrži vezujući član specifičan za svaki od ćelijskih markera SSEA1, GD3, TRA-2-49, SSEA4, GD2 i CD141.
[0022] U primeru izvođenja, vezujući članovi su antitela, opciono pri čemu su antitela obeležena.
U skladu sa sledećim aspektom predmetnog pronalaska, obezbeđena je upotreba CD141 kao negativnog ćelijskog markera za identifikaciju ne-otičkih progenitorskih ćelija u mešovitoj populaciji ćelija.
[0023] Povoljno, ćelijski markeri SSEA1, GD3, TRA-2-49, SSEA4, GD2 i CD141 su identifikovani kroz više krugova pregleda upotrebom panela antitela ćelijske površine na dve različite linije humanih embrionalnih matičnih ćelija, diferencirane u otičke progenitore upotrebom dva različita postupka. Upotrebom objektivnih, kvantitativnih pragova ekspresije i kvalitativne, morfološke analize morfologije otičkog progenitora, odabrani su sledeći markeri koji su obeležili tačan tip ćelije. Pored toga, CD141 je identifikovan kao negativni marker, tj. on obeležava ćelije koje nisu otički progenitori. Proteom ćelijske površine otičkih progenitora poreklom od humanih pluripotentnih matičnih ćelija okarakterisan je upotrebom antitela koja se mogu primeniti u protočnoj citometriji i fluorescentnom automatizovanom sortiranju ćelija (FACS) kako bi se prečistile iz hetereogenih populacija generisanih od diferencirajućih pluripotentnih matičnih ćelija. Izolacija i prečišćavanje mogu a) poboljšati direktnu primenu za ćelijsku terapiju, boljim definisanjem odgovarajućeg tipa ćelija i uklanjanjem potencijalno opasnih ćelija i b) poboljšati in vitro testove za pregled i toksičnost leka uklanjanjem ćelija koje bi mogle imati zbunjujući efekat. Osim toga, ovi markeri bi trebalo da su veoma korisni za prečišćavanje otičkih progenitora kako bi: 1) Učinili da se dodatno diferenciraju bilo u senzorne vlataste ćelije ili u neurone. Ovo bi trebalo da učini protokole diferencijacije efikasnijim, olakšavajući povećavanje razmere priprema za preglede leka velike propusne moći; i 2) Izabrali odgovarajući tip ćelije za terapiju transplantacije ćelija, minimalizujući kontaminaciju neželjenim tipovima ćelija i redukujući potencijalne rizike terapije od razvoja sporednih efekata.
Kratak opis crteža:
[0024]
Slika 1 - Indukcija hES ćelija prema sudbini otičkog progenitora postiže se indukcijom FGF signalizacije sa FGF3 i FGF10. Poboljšani prinos progenitora postignut je dodavanjem WNT-inaktivacije tokom prvih 9 dana, praćene WNT-aktivacijom tokom 3 dana uz istovremeno redukovanje koncentracije FGF3 i FGF10.
Slika 2 - Tačkasti grafikoni generisani iz intenziteta fluorescencije pojedinačnih ćelija (podaci panela 1), nivoi GFP iz endogenog reportera na x-osi i Alexa 568 iz sekundarnog ciljnog delovanja na antitela za markere ćelijske površine na y-osi.
Slika 3 - Spojene slike GD3 (crveno), PAX2 (zeleno) i Hoechst (plavo). Strelice označavaju: PAX2+/GD3- morfologiju kolonije otičkog neuronskog progenitora, PAX2+/GD3+ koloniju otičkih epitelnih progenitora i PAX2-/GD3+ ćelije za koje nije predviđeno da će biti otički progenitori na osnovu morfologije.
Slika 4a - Istaknuti bunarići se neće smatrati potencijalnim pogodcima, tj. ispod praga.
Slika 4b - Istaknuti bunarići se neće smatrati potencijalnim pogodcima, tj. iznad praga.
Slika 4c - Antitelo koje odgovara bunariću F-3 samo vezano za ćelije H14s9 linije koje su tretirane sa IWR-1 i BIO. Kako to nije zajedničko ni linijama ni protokolima, ne smatra se dalje kandidatom.
Slika 5 - Procenti odabranih markera detektovanih u BD Lyoplate pregledu. SSEA1 je predstavljen dva puta (kao HI98 antitelo - obeleženo kao CD15- i kao MC480 antitelo -obeleženo kao SSEA1). GD3 i TRA-2-49/6E nisu predstavljeni u BD Lyoplates i odabrani su samo sa našeg inicijalnog malog panela.
Slika 6 - Presek 13 nedelja starog humanog kohlearnog kanala, obojen za CD141. CD141 pozitivne ćelije (strelica) locirane su izvan epitela koji sadrži otičke progenitore (glava strelice).
Slika 7 - Presek 8 nedelja starog kohlearnog kanala, koji pokazuje bojenje za CD141 i neurofilament (NF200). CD141 obeležava ćelije koje okružuju kohlearni epitel, ali isključuje NF200 pozitivne neuroblaste (vrhovi strelica na preseku obojenom za NF200, strelice na preseku obojenom za CD141).
Slika 8a i 8b - hESC diferencirane u otičke progenitore i obojene za SSEA4, Tra-2-49 i CD141. (A) i (B) pokazuju dva nezavisna eksperimenta. SSEA4 i TRA-2-49 kolokalizuju na istu populaciju ćelija (leva kolona) ((A) P3-Q2 55,86%; (B) P3-Q2 65,15%), dok je većina SSEA4/TRA-2-49 pozitivnih ćelija CD141 negativno ((A) P4-Q3 48,97%, P5-Q1 52,87%; (B) P4-Q3 65,82%, P5-Q1 66,79%). (A) i (B) prikazuju ekstremnije primere, sa CD141 pozitivnim ćelijama u rasponu od ~0,3 do ~8% ((A) P4-Q2 8,17%, P5-Q28,25%; (B) P4-Q20,39%, P5-Q2 0,49%).
Slika 9 - hESC su diferencirane u otičke progenitore tokom 14 dana, i sortirane za SSEA4/TRA2-49. Dvostruko pozitivnim ćelijama je zatim omogućeno da se diferenciraju tokom 17, 20 i 26 dana u ćelije slične vlatastim ćelijama, upotrebom organoidnog (3D) sistema kulture razvijenog u našoj laboratoriji. Diferencijacija u ćelije slične vlatastim ćelijama takođe se može postići upotrebom objavljenog postupka (npr. Koehler et al, 2017). Nesortirane ćelije su takođe diferencirane zarad poređenja, i uzorci su analizirani pomoću qPCR. Markeri vlatastih ćelija Myo7a i Atoh1 imali su povećanu ekspresiju u sortiranoj populaciji, posle 26 dana 3D kulture. LGR5, marker matičnih ćelija i potpornih ćelija imao je povećanu ekspresiju u nezrelim progenitorima pre sortiranja, i tokom ranih faza diferencijacije uglavnom u nesortiranim uzorcima ćelija. JAG1, marker potpornih ćelija, nije imao povećanu ekspresiju.
Detaljan opis
[0025] U skladu sa prvim aspektom predmetnog pronalaska, obezbeđen je postupak identifikovanja humanih otičkih progenitorskih ćelija u mešovitoj populaciji ćelija upotrebom najmanje dva markera ćelijske površine odabrana od SSEA1 (takođe poznat kao CD15 ili Luis x), GD3, TRA-2-49 (alkalna fosfataza), SSEA4, GD2 i CD141.
[0026] U skladu sa sledećim aspektom predmetnog pronalaska, obezbeđen je postupak identifikovanja humanih otičkih progenitorskih ćelija u mešovitoj populaciji ćelija koji sadrži određivanje da li ćelija ima najmanje dva markera ćelijske površine odabrana od SSEA1, GD3, TRA-2-49, SSEA4, GD2 i CD141.
[0027] U skladu sa sledećim aspektom predmetnog pronalaska, obezbeđen je postupak identifikovanja humanih otičkih progenitorskih ćelija u mešovitoj populaciji ćelija koji sadrži određivanje da li ćelija ima najmanje dva markera ćelijske površine odabrana od SSEA1, GD3, TRA-2-49, SSEA4, GD2 i CD141,
pri čemu su ćelije identifikovane da imaju:
a) najmanje dva od SSEA1, GD3, TRA-2-49, SSEA4, ili GD2; ili
b) najmanje jedan od SSEA1, GD3, TRA-2-49, SSEA4, GD2, i nemaju CD141,
identifikovane kao humane otičke progenitorske ćelije.
[0028] U jednom primeru izvođenja, ćelijski markeri SSEA1, GD3, TRA-2-49, SSEA4, i GD2 su pozitivni ćelijski markeri i CD141 je negativni ćelijski marker. Pogodno, postupci uključuju merenje pozitivnih ćelijskih markera. Pogodno, postupci uključuju merenje negativnih ćelijskih markera. Postupci mogu takođe uključivati merenje pozitivnih i negativnih ćelijskih markera.
[0029] Upotreba markera ćelijske površine kao što je ovde opisano može sadržati njihovu upotrebu u koraku identifikacije/određivanja. Posebno određivanje da li je marker ćelijske površine prisutan ili nije prisutan na ćeliji, ili je prisutan ili nije prisutan na grupi ćelija. Pozitivni ćelijski markeri mogu se upotrebljavati u kombinaciji jedni sa drugima za identifikaciju humanih otičkih progenitora, na primer najmanje u parovima pozitivnih markera (tj. dva ili više pozitivnih markera). U sledećem primeru izvođenja, najmanje tri od pozitivnih ćelijskih markera se upotrebljavaju u kombinaciji. U sledećem primeru izvođenja, najmanje četiri od pozitivnih ćelijskih markera se upotrebljavaju u kombinaciji. U sledećem primeru izvođenja, svih pet (tj. pet od) pozitivnih ćelijskih markera SSEA1, GD3, TRA-2-49, SSEA4, i GD2 se upotrebljavaju za identifikaciju humanih otičkih progenitorskih ćelija u mešovitoj populaciji ćelija.
[0030] Pozitivni ćelijski markeri mogu se takođe upotrebljavati u kombinaciji sa negativnim ćelijskim markerom CD141. U jednom primeru izvođenja najmanje jedan (tj. jedan od) pozitivni ćelijski marker odabran od SSEA1, GD3, TRA-2-49, SSEA4, i GD2 se upotrebljava u kombinaciji sa CD141 negativnim ćelijskim markerom. U sledećem primeru izvođenja, najmanje dva (tj. dva od) pozitivna ćelijska markera odabrana od SSEA1, GD3, TRA-2-49, SSEA4, i GD2 se upotrebljavaju u kombinaciji sa CD141 negativnim ćelijskim markerom. U sledećem primeru izvođenja, najmanje tri (tj. tri od) pozitivna ćelijska markera odabrana od SSEA1, GD3, TRA-2-49, SSEA4, i GD2 se upotrebljavaju u kombinaciji sa CD141 negativnim ćelijskim markerom. U sledećem primeru izvođenja, najmanje četiri (tj. četiri od) pozitivna ćelijska markera odabrana od SSEA1, GD3, TRA-2-49, SSEA4, i GD2 se upotrebljavaju u kombinaciji sa CD141 negativnim ćelijskim markerom. U sledećem primeru izvođenja, svih pet (tj. pet od) pozitivnih ćelijskih markera SSEA1, GD3, TRA-2-49, SSEA4, i GD2 se upotrebljavaju u kombinaciji sa CD141 negativnim ćelijskim markerom.
[0031] Postupak može sadržati upotrebu najmanje dva ćelijska markera, najmanje dva ćelijska markera koja sadrže SSEA1 i GD3. Postupak može sadržati upotrebu najmanje dva pozitivna ćelijska markera, najmanje dva pozitivna ćelijska markera koja sadrže SSEA1 i GD3, i negativnog ćelijskog markera CD141. Postupak može sadržati upotrebu najmanje dva ćelijska markera, najmanje dva ćelijska markera koja sadrže SSEA1 i TRA-2-49. Postupak može sadržati upotrebu najmanje dva pozitivna ćelijska markera, najmanje dva pozitivna ćelijska markera koja sadrže SSEA1 i TRA-2-49, i negativnog ćelijskog markera CD141. Postupak može sadržati upotrebu najmanje dva ćelijska markera, najmanje dva ćelijska markera koja sadrže SSEA1 i SSEA4. Postupak može sadržati upotrebu najmanje dva pozitivna ćelijska markera, najmanje dva pozitivna ćelijska markera koja sadrže SSEA1 i SSEA4, i negativnog ćelijskog markera CD141. Postupak može sadržati upotrebu najmanje dva ćelijska markera, najmanje dva ćelijska markera koja sadrže SSEA1 i GD2. Postupak može sadržati upotrebu najmanje dva pozitivna ćelijska markera, najmanje dva pozitivna ćelijska markera koja sadrže SSEA1 i GD2, i negativnog ćelijskog markera CD141. Postupak može sadržati upotrebu najmanje dva ćelijska markera, najmanje dva ćelijska markera koja sadrže GD3 i TRA-2-49. Postupak može sadržati upotrebu najmanje dva pozitivna ćelijska markera, najmanje dva pozitivna ćelijska markera koja sadrže GD3 i TRA-2-49, i negativnog ćelijskog markera CD141. Postupak može sadržati upotrebu najmanje dva ćelijska markera, najmanje dva ćelijska markera koja sadrže GD3 i SSEA4. Postupak može sadržati upotrebu najmanje dva pozitivna ćelijska markera, najmanje dva pozitivna ćelijska markera koja sadrže GD3 i SSEA4, i negativnog ćelijskog markera CD141. Postupak može sadržati upotrebu najmanje dva ćelijska markera, najmanje dva ćelijska markera koja sadrže GD3 i GD2. Postupak može sadržati upotrebu najmanje dva pozitivna ćelijska markera, najmanje dva pozitivna ćelijska markera koja sadrže GD3 i GD2, i negativnog ćelijskog markera CD141.
[0032] Postupak može sadržati upotrebu najmanje dva ćelijska markera, najmanje dva ćelijska markera koja sadrže TRA-2-49 i SSEA4. Postupak može sadržati upotrebu najmanje dva pozitivna ćelijska markera, najmanje dva pozitivna ćelijska markera koja sadrže TRA-2-49 i
1
SSEA4, i negativnog ćelijskog markera CD141. Postupak može sadržati upotrebu najmanje dva ćelijska markera, najmanje dva ćelijska markera koja sadrže TRA-2-49 i GD2. Postupak može sadržati upotrebu najmanje dva pozitivna ćelijska markera, najmanje dva pozitivna ćelijska markera koja sadrže TRA-2-49 i GD2, i negativnog ćelijskog markera CD141. Postupak može sadržati upotrebu najmanje dva ćelijska markera, najmanje dva ćelijska markera koja sadrže SSEA4 i GD2. Postupak može sadržati upotrebu najmanje dva pozitivna ćelijska markera, najmanje dva pozitivna ćelijska markera koja sadrže SSEA4 i GD2, i negativnog ćelijskog markera CD141.
[0033] Upotreba ćelijskih markera u kombinaciji može biti istovremena (suštinski u isto vreme) ili uzastopna (u različito vreme/u koracima) u identifikaciji. U jednom primeru izvođenja, upotreba ćelijskih markera u kombinaciji je istovremena, na primer u FACS i/ili MACS.
[0034] Mešovita populacija ćelija se inače može označiti kao heterogena populacija ćelija. Mešovita populacija ćelija može biti in vitro. Postupci iz pronalaska se izvode in vitro. U jednom primeru izvođenja, mešovita populacija ćelija može se obezbediti iz, ili tokom, in vitro protokola diferencijacije matičnih ćelija (kao što su pluripotentne matične ćelije kao što su iPSC). U sledećem primeru izvođenja, mešovita populacija ćelija može se obezbediti iz, ili tokom, procedura dediferenciranja, transdiferenciranja ili direktnog reprogramiranja u humane otičke ćelijske loze.
[0035] U sledećem primeru izvođenja, mešovita populacija ćelija može se obezbediti iz tkiva, na primer iz biopsije. Izvori humanih otičkih progenitorskih ćelija mogu biti bilo koje tkivo poznato iskusnom u struci, uključujući ali ne ograničavajući se na razvijanje fetalnog tkiva unutrašnjeg uha, i kohlearni i vestibularni uzorci dobijeni hirurškim intervencijama iz unutrašnjeg uha odraslih.
[0036] Mešovita populacija ćelija može biti sisarska. U jednom primeru izvođenja, ćelije mešovite populacije ćelija su humane.
[0037] Postupak identifikacije može sadržati ciljno delovanje na ćelijske markere sa vezujućim članom koji je sposoban za detekciju, na primer vezivanje vezujućeg člana za ćelijski marker može biti detektabilno. Mešovita populacija ćelija može biti dovedena u kontakt sa jednim ili više vezujućih članova sposobnih za vezivanje (alternativno aranžiranih tako da se vezuju) za ćelijske markere.
[0038] Vezujući član može poželjno da vezuje ovde opisan ćelijski marker ili na drugi način biti specifičan za ovde opisan ćelijski marker. Vezujući član može sadržati antitelo, fragment antitela, ili njegov mimetik.
[0039] U jednom primeru izvođenja, vezujući član za identifikaciju/vezivanje za SSEA1 sadrži antitelo HI98 ili 480-1-1. U sledećem primeru izvođenja, vezujući član za identifikaciju/vezivanje za SSEA1 može sadržati vezujući član, kao što je antitelo, sposobno da bude u kompeticiji za vezivanje sa antitelom HI98 ili 480-1-1. U sledećem primeru izvođenja, vezujući član za identifikaciju/vezivanje za SSEA1 može sadržati vezujući član, kao što je antitelo, sposobno da vezuje isti epitop kao antitelo HI98 ili 480-1-1. U sledećem primeru izvođenja, vezujući član za identifikaciju/vezivanje za SSEA1 može sadržati antitelo koje ima isti VL i VH lanac kao antitelo HI98 ili 480-1-1. U sledećem primeru izvođenja, vezujući član za identifikaciju/vezivanje za SSEA1 može sadržati antitelo koje ima iste CDR kao antitelo HI98 ili 480-1-1.
[0040] U jednom primeru izvođenja, vezujući član za identifikaciju/vezivanje za SSEA4 sadrži antitelo MC-813-70. U sledećem primeru izvođenja, vezujući član za identifikaciju/vezivanje za SSEA4 može sadržati vezujući član, kao što je antitelo, sposobno da bude u kompeticiji za vezivanje sa antitelom MC-813-70. U sledećem primeru izvođenja, vezujući član za identifikaciju/vezivanje za SSEA4 može sadržati vezujući član, kao što je antitelo, sposobno da vezuje isti epitop kao antitelo MC-813-70. U sledećem primeru izvođenja, vezujući član za identifikaciju/vezivanje za SSEA4 može sadržati antitelo koje ima isti VL i VH lanac kao antitelo MC-813-70. U sledećem primeru izvođenja, vezujući član za identifikaciju/vezivanje za SSEA4 može sadržati antitelo koje ima iste CDR kao antitelo MC-813-70.
[0041] U jednom primeru izvođenja, vezujući član za identifikaciju/vezivanje za TRA-2-49 sadrži antitelo TRA-2-49/6E. U sledećem primeru izvođenja, vezujući član za identifikaciju/vezivanje za TRA-2-49 može sadržati vezujući član, kao što je antitelo, sposobno da bude u kompeticiji za vezivanje sa antitelom TRA-2-49/6E. U sledećem primeru izvođenja, vezujući član za identifikaciju/vezivanje za TRA-2-49 može sadržati vezujući član, kao što je antitelo, sposobno da vezuje isti epitop kao antitelo TRA-2-49/6E. U sledećem primeru izvođenja, vezujući član za identifikaciju/vezivanje za TRA-2-49 može sadržati antitelo koje ima isti VL i VH lanac kao antitelo TRA-2-49/6E. U sledećem primeru izvođenja, vezujući član za identifikaciju/vezivanje za TRA-2-49 može sadržati antitelo koje ima iste CDR kao antitelo TRA-2-49/6E.
[0042] U jednom primeru izvođenja, vezujući član za identifikaciju/vezivanje za GD2 sadrži bilo koje od antitela 14.18, DMab-20, 14G2a, VIN 2 ili PB22. U sledećem primeru izvođenja, vezujući član za identifikaciju/vezivanje za GD2 može sadržati vezujući član, kao što je antitelo, sposobno da bude u kompeticiji za vezivanje sa bilo kojim od antitela 14.18, DMab20, 14G2a, VIN 2 ili PB22. U sledećem primeru izvođenja, vezujući član za identifikaciju/vezivanje za GD2 može sadržati vezujući član, kao što je antitelo, sposobno da vezuje isti epitop kao bilo koje od antitela 14.18, DMab-20, 14G2a, VIN 2 ili PB22. U sledećem primeru izvođenja, vezujući član za identifikaciju/vezivanje za GD2 može sadržati antitelo koje ima isti VL i VH lanac kao bilo koje od antitela 14.18, DMab-20, 14G2a, VIN 2 ili PB22. U sledećem primeru izvođenja, vezujući član za identifikaciju/vezivanje za GD2 može sadržati antitelo koje ima iste CDR kao bilo koje od antitela 14.18, DMab-20, 14G2a, VIN 2 ili PB22.
[0043] U jednom primeru izvođenja, vezujući član za identifikaciju/vezivanje za GD3 sadrži antitelo DMab-7 ili VINIS56. U sledećem primeru izvođenja, vezujući član za identifikaciju/vezivanje za GD3 može sadržati vezujući član, kao što je antitelo, sposobno da bude u kompeticiji za vezivanje sa antitelom DMab-7 ili VINIS56. U sledećem primeru izvođenja, vezujući član za identifikaciju/vezivanje za GD3 može sadržati vezujući član, kao što je antitelo, sposobno da vezuje isti epitop kao antitelo DMab-7 ili VINIS56. U sledećem primeru izvođenja, vezujući član za identifikaciju/vezivanje za GD3 može sadržati antitelo koje ima isti VL i VH lanac kao antitelo DMab-7 ili VINIS56. U sledećem primeru izvođenja, vezujući član za identifikaciju/vezivanje za GD3 može sadržati antitelo koje ima iste CDR kao antitelo DMab-7 ili VINIS56.
[0044] U jednom primeru izvođenja, vezujući član za identifikaciju/vezivanje za CD141 sadrži antitelo 1A4. U sledećem primeru izvođenja, vezujući član za identifikaciju/vezivanje za CD141 može sadržati vezujući član, kao što je antitelo, sposobno da bude u kompeticiji za vezivanje sa antitelom 1A4. U sledećem primeru izvođenja, vezujući član za identifikaciju/vezivanje za CD141 može sadržati vezujući član, kao što je antitelo, sposobno da vezuje isti epitop kao antitelo 1A4. U sledećem primeru izvođenja, vezujući član za identifikaciju/vezivanje za CD141 može sadržati antitelo koje ima isti VL i VH lanac kao antitelo 1A4. U sledećem primeru izvođenja, vezujući član za identifikaciju/vezivanje za CD141 može sadržati antitelo koje ima iste CDR kao antitelo 1A4.
[0045] SSEA4 (Kannagi R, Cochran NA, Ishigami F, Hakomori S-i, Andrews PW, Knowles BB, Solter D. Stage-specific embryonic antigens (SSEA-3 and -4) are epitopes of a unique globo-series ganglioside isolated from human teratocarcinoma cells. EMBO J. 1983;2:2355-2361.)
[0046] GD2 (Andrews PW, Nudelman E, Hakomori S-i, Fenderson BA. Different patterns of glycolipid antigens are expressed following differentiation of TERA-2 human embryonal carcinoma cells induced by retinoic acid, hexamtehylene bisacetamide (HMBA) or
1
bromodeoxyuridine (BUdR) Differentiation. 1990;43:131-138) i (Durbas M, Horwacik I, Boratyn E, Kamycka E, Rokita H, GD2 ganglioside specific antibody treatment downregulates PI3K/Akt/mTOR signaling network in human neuroblastoma cell lines. Int J Oncol. 2015 Sep;47(3): 1143-59. doi: 10.3892/ijo.2015.3070.)
[0047] SSEA1 (Solter D, Knowles BB. Monoclonal antibody defining a stage specific mouse embryonic antigen (SSEA1) Proc. Natl. Acad. Sci. USA.1978;75:5565-5569.)
[0048] GD3 (Andrews PW, Nudelman E, Hakomori S-i, Fenderson BA. Different patterns of glycolipid antigens are expressed following differentiation of TERA-2 human embryonal carcinoma cells induced by retinoic acid, hexamtehylene bisacetamide (HMBA) or bromodeoxyuridine (BUdR) Differentiation. 1990;43:131-138) i (Stuhlmiller GM1, Roberson KM, Seigler HF., Serological response of non-human primates to human melanoma disialoganglioside GD3. Cancer Immunol Immunother.1989;29(3):205 -10)
[0049] TRA-2-49 (Andrews PW1, Casper J, Damjanov I, Duggan-Keen M, Giwercman A, Hata J, von Keitz A, Looijenga LH, Millán JL, Oosterhuis JW, Pera M, Sawada M, Schmoll HJ, Skakkebaek NE, van Putten W, Stern P, Comparative analysis of cell surface antigens expressed by cell lines derived from human germ cell tumours. Int J Cancer. 1996 Jun 11;66(6):806-16.)
[0050] CD141 (Mutin M, Dignat-George F, Sampol J. Immunologic phenotype of cultured endothelial cells: quantitative analysis of cell surface molecules. Tissue Antigens. 1997 Nov;50(5):449-58.)
[0051] Termin "antitelo" kao što se ovde upotrebljava označava molekule imunoglobulina i imunološki aktivne delove molekula imunoglobulina, tj. molekule koji sadrže antigen vezujuće mesto koje specifično vezuje antigen, bio on prirodan ili delimično ili u potpunosti sintetički proizveden. Termin takođe pokriva bilo koji polipeptid ili protein koji ima vezujući domen koji je, ili je homologan, vezujućem domenu antitela. Ovi mogu biti poreklom iz prirodnih izvora, ili mogu biti delimično ili u potpunosti sintetički proizvedeni. Primeri antitela su izotipovi imunoglobulina (npr. IgG, IgE, IgM, IgD i IgA) i njihove izotipske podklase; fragmenti koji sadrže antigen vezujući domen kao što su Fab, scFv, Fv, dAb, Fd; i diatela. Antitela mogu biti poliklonska ili monoklonska. Monoklonsko antitelo može biti označeno kao "mAb".
[0052] Kako se antitela mogu modifikovati na više načina, termin "antitelo" treba tumačiti tako da pokriva bilo koji specifični vezujući član ili supstancu koja ima vezujući domen sa potrebnom specifičnošću. Stoga, ovaj termin pokriva fragmente antitela, derivate, funkcionalne ekvivalente, mimetike i homologe antitela, humanizovana antitela, uključujući bilo koji polipeptid koji sadrži imunoglobulin vezujući domen, bio on prirodan ili potpuno ili delimično sintetički. Zato su uključeni himerni molekuli koji sadrže imunoglobulin vezujući domen, ili ekvivalent, fuzionisan za drugi polipeptid. Mimetik antitela može sadržati afitelo.
[0053] Pokazano je da fragmenti celog antitela mogu da obavljaju funkciju vezivanja antigena. Primeri vezujućih fragmenata su (i) Fab fragment koji se sastoji od VL, VH, CL i CH1 domena; (ii) Fd fragment koji se sastoji od VH i CH1 domena; (iii) Fv fragment koji se sastoji od VL i VH domena jednog antitela; (iv) dAb fragment koji se sastoji od VH domena; (v) izolovani CDR regioni; (vi) F(ab’)2 fragmenti, bivalentni fragment koji sadrži dva povezana Fab fragmenta; i (vii) jednolančani Fv molekuli (scFv), pri čemu su VH domen i VL domen povezani peptidnim linkerom koji omogućava da se dva domena udruže da formiraju antigen vezujuće mesto.
[0054] Postupak iz pronalaska može sadržati korak detekcije, pri čemu se ćelijski markeri detektuju kao prisutni ili da nisu prisutni na ćeliji ili grupi ćelija.
[0055] Stručnjak će razumeti da postoji niz postupaka za detekciju vezivanja vezujućih članova, kao što su antitela, za marker ćelijske površine. Takav postupak može sadržati obeležavanje vezujućeg člana detektabilnim obeleživačem/oznakom ili upotrebu sekundarnog vezujućeg člana, kao što je antitelo, koje je obeleženo ili označeno i koje je sposobno da se specifično vezuje za "primarni" vezujući član vezan za ćelijski marker.
[0056] U jednom primeru izvođenja, vezujući član je obeležen (ili na drugi način označen) za identifikaciju. Jednom kada je obeleženi vezujući član vezan za ćelijski marker, ćelija se može nazvati "obeležena ćelija". Za obeležavanje svake vrste vezujućeg člana aranžiranog za vezivanje ćelijskog markera može se upotrebiti drugačiji obeleživač. Obeleživač može sadržati bilo koji radioobeleživač, enzimski obeleživač, magnetni obeleživač, afinitetni obeleživač (kao što su biotin ili avidin), ili obeleživač koji se može detektovati emisijom svetlosti, kao što je fluorofora ili hromofora; ili njihove kombinacije. Obeleživač može biti konjugovan za vezujući član, na primer kovalentnom vezom.
[0057] Fluorofora može biti u obliku fluorescentnih proteina, kao što su GFP (zeleni), YFP (žuti) ili RFP (crveni). Alternativno, fluorofora može biti neproteinska organska fluorofora. Fluorofore koje se mogu obezbediti kao obeleživači mogu sadržati bilo koju grupu odabranu od derivata ksantena, kao što su fluorescein, rodamin, Oregon zelena, eozin, i Teksas crvena; derivata cijanina, kao što su cijanin, indokarbocijanin, oksakarbocijanin, tiakarbocijanin, i merocijanin; derivata skvaraina i prsten-supstituisanih skvaraina, uključujući Seta, SeTau, i Square boje; derivata naftalena (derivati dansila i prodana); derivata kumarina; derivata oksadiazola, kao što su piridiloksazol, nitrobenzoksadiazol i benzoksadiazol; derivata
1
antracena, kao što su antrakinoni, uključujući DRAQ5, DRAQ7 i CyTRAK narandžasta; derivata pirena, kao što je kaskadno plava; derivata oksazina, kao što su Nile crvena, Nile plava, krezil ljubičasta, i oksazin 170; derivata akridina, kao što su proflavin, akridin narandžasta, akridin žuta; derivata arilmetina, kao što su auramin, kristalno ljubičasta, malahit zelena; i derivata tetrapirola, kao što su porfin, ftalocijanin, i bilirubin.
[0058] Za obeležavanje svake vrste vezujućeg člana aranžiranog za vezivanje ćelijskog markera može se upotrebiti drugačija fluorofora. Svaka fluorofora ima karakterističnu talasnu dužinu pika ekscitacije i emisije koja se može detektovati. Kvantne tačke se mogu upotrebljavati umesto tradicionalnih fluorofora.
[0059] Alternativni vezujući član za antitela može biti obezbeđen pomoću aptamera, kratkih nukleotidnih sekvenci koje mogu prepoznati specifične proteinske domene. Budući da su aptameri mali i menjaju konformaciju nakon vezivanja svog cilja, oni mogu biti projektovani tako da specifično vezivanje oslobađa kvenčer ili generiše FRET par koji može biti detektovan.
[0060] Detekcija obeleženih ćelija može se izvesti bilo kojim pogodnim testom, koji može sadržati upotrebu bilo koje grupe koja sadrži imunotestove, spektrometriju, vestern blot, ELISA, imunoprecipitaciju, blot test proreza ili tačke, izoelektrično fokusiranje, SDS-PAGE i imunohistološko bojenje mikročip antitela, radio imuno test (RIA), fluoroimuno test, imuno test koji upotrebljava avidin-biotin ili streptavidin-biotin sistem, itd. ili njihove kombinacije. Ovi postupci su dobro poznati osobama iskusnim u struci. Neki postupci detekcije mogu zahtevati destrukciju ćelija. U nekim primerima izvođenja, postupak detekcije možda neće biti destruktivan za ćeliju. Na primer, detekcija može sadržati mikroskopiju, kao što je konfokalna i/ili fluorescentna mikroskopija, radi identifikacije obeleženih ćelija. Detekcija može sadržati upotrebu FACS (fluorescencijom aktivirano sortiranje ćelija) ili MACS (magnetski aktivirano sortiranje ćelija). U jednom primeru izvođenja, detekcija sadrži upotrebu FACS.
[0061] U skladu sa sledećim aspektom predmetnog pronalaska, obezbeđen je postupak identifikovanja humanih otičkih progenitorskih ćelija u mešovitoj populaciji ćelija upotrebom najmanje dva markera ćelijske površine odabrana od SSEA1 (takođe poznat kao CD15), GD3, TRA-2-49 (alkalna fosfataza), SSEA4, GD2 i CD141, postupak sadrži:
- obezbeđivanje vezujućih članova specifičnih za najmanje dva različita ćelijska markera (tj. pri čemu su ćelijski markeri odabrani od SSEA1 (takođe poznat kao CD15), GD3, TRA-2-49 (alkalna fosfataza), SSEA4, GD2 i CD141);
- dovođenje u kontakt mešovite populacije ćelija sa vezujućim članovima; i
1
- detektovanje vezivanja ili nevezivanja vezujućih članova za ćelije u mešovitoj populaciji ćelija.
[0062] Postupak može dodatno sadržati određivanje da je ćelija humani otički progenitor ukoliko:
a) se vezujući članovi aranžirani tako da se vezuju za pozitivne ćelijske markere vezuju za najmanje dva različita pozitivna ćelijska markera na ćeliji; ili
b) se vezujući član aranžiran tako da vezuje jedan od pozitivnih ćelijskih markera vezuje za najmanje jedan od pozitivnih ćelijskih markera na ćeliji, i vezujući marker aranžiran tako da se vezuje za negativni ćelijski marker CD141 se ne vezuje za ćeliju.
[0063] U sledećem primeru izvođenja, postupak može dodatno sadržati određivanje da je ćelija humana otička progenitorska ćelija ukoliko:
a) se vezujući članovi aranžirani tako da se vezuju za pozitivne ćelijske markere vezuju za najmanje tri različita pozitivna ćelijska markera na ćeliji; ili
b) se vezujući članovi aranžirani tako da vezuju najmanje dva različita pozitivna ćelijska markera vezuju za najmanje dva različita pozitivna ćelijska markera na ćeliji, i vezujući marker aranžiran tako da se vezuje za negativni ćelijski marker CD141 se ne vezuje za ćeliju.
[0064] U skladu sa sledećim aspektom predmetnog pronalaska, obezbeđen je postupak obogaćivanja humanih otičkih progenitorskih ćelija iz mešovite populacije ćelija, postupak sadrži:
- identifikaciju humanih otičkih progenitorskih ćelija u skladu sa ovim pronalaskom; i - sortiranje ćelija tako da se humane otičke progenitorske ćelije izoluju iz ne-otičkih progenitorskih ćelija, tako da su humane otičke progenitorske ćelije obogaćene u populaciji.
[0065] U jednom primeru izvođenja, izolacija humanih otičkih progenitorskih ćelija može biti potpuna (tj. 100% izolacija iz ne-otičkih progenitorskih ćelija). U sledećem primeru izvođenja, humane otičke progenitorske ćelije mogu biti obogaćene tako da u populaciji ima
1
manje od 20% ne-otičkih progenitorskih ćelija. U sledećem primeru izvođenja, humane otičke progenitorske ćelije mogu biti obogaćene tako da u populaciji ima manje od 15% ne-otičkih progenitorskih ćelija. U sledećem primeru izvođenja, humane otičke progenitorske ćelije mogu biti obogaćene tako da u populaciji ima manje od 10% ne-otičkih progenitorskih ćelija. U sledećem primeru izvođenja, humane otičke progenitorske ćelije mogu biti obogaćene tako da u populaciji ima manje od 8% ne-otičkih progenitorskih ćelija. U sledećem primeru izvođenja, humane otičke progenitorske ćelije mogu biti obogaćene tako da u populaciji ima manje od 5% ne-otičkih progenitorskih ćelija. U sledećem primeru izvođenja, humane otičke progenitorske ćelije mogu biti obogaćene tako da u populaciji ima manje od 3% ne-otičkih progenitorskih ćelija. U sledećem primeru izvođenja, humane otičke progenitorske ćelije mogu biti obogaćene tako da u populaciji ima manje od 2% ne-otičkih progenitorskih ćelija. U sledećem primeru izvođenja, humane otičke progenitorske ćelije mogu biti obogaćene tako da u populaciji ima manje od 1% ne-otičkih progenitorskih ćelija. U sledećem primeru izvođenja, humane otičke progenitorske ćelije mogu biti obogaćene tako da u populaciji ima manje od 0,1% ne-otičkih progenitorskih ćelija. U sledećem primeru izvođenja, humane otičke progenitorske ćelije mogu biti obogaćene tako da u populaciji ima manje od 0,01% neotičkih progenitorskih ćelija.
[0066] Obogaćivanje može biti posle jednog kruga sortiranja. Alternativno, može se obezbediti više krugova sortiranja, na primer za dodatno obogaćivanje ili osiguravanje većeg procenta humanih otičkih progenitora u populaciji.
[0067] Ne-otičke progenitorske ćelije se mogu odbaciti, uništiti, sekvestrirati, ili na neki drugi način držati odvojeno od humanih otičkih progenitorskih ćelija.
[0068] U jednom primeru izvođenja, proces obogaćivanja održava vijabilnost humanih otičkih progenitorskih ćelija.
[0069] U jednom primeru izvođenja, sortiranje je pomoću FACS. U sledećem primeru izvođenja, obogaćivanje i sortiranje humanih otičkih progenitorskih ćelija je pomoću upotrebe najmanje jedne afinitetne kolone. Alternativno, postupak može biti uz upotrebu magnetnih perli koje selektivno vezuju humane otičke progenitorske ćelije. U sledećem primeru izvođenja, obogaćivanje i sortiranje humanih otičkih progenitorskih ćelija je pomoću upotrebe MACS.
[0070] Povoljno je što upotreba FACS obezbeđuje obogaćivanje i sortiranje ćelija sa visokom tačnošću i redukuje potrebu za višestrukim prolascima za sortiranje, pošto FACS omogućava upotrebu više različitih fluorofornih obeleživača, i samim tim i višestruki izbor ćelijskih markera, u isto vreme.
1
[0071] U skladu sa sledećim aspektom predmetnog pronalaska, obezbeđen je postupak za proizvodnju populacije humanih otičkih progenitorskih ćelija, postupak sadrži:
- diferenciranje, dediferenciranje, transdiferenciranje ili usmereno reprogramiranje populacije ne-otičkih progenitorskih ćelija u humane otičke progenitorske ćelije, pri čemu neke ne-otičke progenitorske ćelije mogu ostati u populaciji da bi formirale mešovitu populaciju ćelija; i
- obogaćivanje humanih otičkih progenitorskih ćelija iz mešovite populacije ćelija u skladu sa postupkom iz ovog pronalaska.
[0072] Diferenciranje populacije ne-otičkih progenitorskih ćelija može sadržati diferenciranje populacije matičnih ćelija, kao što su iPSC. Na primer, ne-otičke progenitorske ćelije mogu sadržati matične ćelije, kao što su iPSC. Dediferenciranje populacije ne-otičkih progenitorskih ćelija može sadržati dediferenciranje populacije zrelijih ćelija. Na primer, ne-otičke progenitorske ćelije mogu sadržati zrele (potpuno diferencirane) ćelije. Transdiferencijacija ili usmereno reprogramiranje populacije ne-otičkih progenitorskih ćelija može sadržati transdiferencijaciju ili usmereno reprogramiranje populacije ćelija iz druge loze (tj. ne-otičke loze).
[0073] Mnogi agensi za diferencijaciju su poznati onima koji su iskusni u struci koji mogu diferencirati matične ćelije u specifične tipove ćelija, kao što su otičke progenitorske ćelije. Prema tome, predviđeno je da se matične ćelije mogu diferencirati u otičke progenitorske ćelije na bilo koji način poznat iskusnom u struci. Neki primeri agenasa za diferencijaciju, uključuju, ali nisu ograničeni na FGF ligande, inhibiciju i aktivaciju WNT, TGF1, inhibiciju i aktivaciju TGF, fetalni teleći serum, faktor rasta nerava, uklanjanje EGF, uklanjanje bFGF (ili oba), BDNF, tiroidni hormon, BMP, LIF, sonik hedžhog, GDNF, VEGF, interleukine, interferone, SCF, aktivine, inhibine, hemokine, retinoičnu kiselinu i CNTF.
[0074] Diferencijacija može biti u skladu sa, ali ne ograničena na, protokol koji su opisali Chen et al. (2012. Restoration of auditory evoked responses by human ES-cell-derived otic progenitors. Nature, 490(7419):278-82. doi: 10.1038/nature11415), ili Ronaghi et al. (2014. Stem Cells Dev, 23(11), 1275-1284). Posebno, diferencijacija može sadržati indukciju FGF (faktor rasta fibroblasta) sa FGF3 i FGF10, opciono pri čemu su koncentracije FGF3 i FGF10 svaka oko 50 ng/ml. Diferencijacija može sadržati korake opisane ovde na slici 1a ili u Chen et al. 2012. Alternativno, diferencijacija može sadržati indukciju FGF sa FGF3 i FGF10, i
1
manipulaciju WNT signalizacije pomoću WNT inhibicije praćeno WNT indukcijom (videti sliku 1b ovde). Diferencijacija može sadržati korake opisane ovde na slici 1b.
[0075] Predviđeno je da ne-otičke progenitorske ćelije mogu biti matične ćelije iz bilo kog poznatog izvora, kao što je postembrionalno tkivo. U jednom primeru izvođenja ne-otičke progenitorske ćelije za diferencijaciju sadrže ili se sastoje od pluripotentnih matičnih ćelija, kao što su indukovane pluripotentne matične ćelije (iPSC). Ne-otičke progenitorske ćelije mogu sadržati fetalne ćelije. U sledećem primeru izvođenja, ne-otičke progenitorske ćelije mogu sadržati matične ćelije iz drugih tkiva, kao što su mezenhimsko tkivo, masno tkivo, ili druga tkiva.
[0076] U skladu sa sledećim aspektom predmetnog pronalaska, obezbeđen je komplet koji sadrži najmanje dva različita vezujuća člana, pri čemu su vezujući članovi aranžirani tako da se vezuju za različite ćelijske markere odabrane od SSEA1, GD3, TRA-2-49, SSEA4, GD2 i CD141.
[0077] U jednom primeru izvođenja, komplet može sadržati najmanje tri različita vezujuća člana, pri čemu su vezujući članovi aranžirani tako da se vezuju za različite ćelijske markere odabrane od SSEA1, GD3, TRA-2-49, SSEA4, GD2 i CD141.
[0078] U sledećem primeru izvođenja, komplet može sadržati najmanje četiri različita vezujuća člana, pri čemu su vezujući članovi aranžirani tako da se vezuju za različite ćelijske markere odabrane od SSEA1, GD3, TRA-2-49, SSEA4, GD2 i CD141.
[0079] U sledećem primeru izvođenja, komplet može sadržati najmanje pet različitih vezujućih članova, pri čemu su vezujući članovi aranžirani tako da se vezuju za različite ćelijske markere odabrane od SSEA1, GD3, TRA-2-49, SSEA4, GD2 i CD141.
[0080] U sledećem primeru izvođenja, komplet može sadržati panel vezujućih članova, pri čemu panel vezujućih članova sadrži vezujući član specifičan za svaki od ćelijskih markera SSEA1, GD3, TRA-2-49, SSEA4, GD2 i CD141.
[0081] Vezujući članovi kompleta mogu sadržati antitela kao što je ovde opisano. Vezujući članovi kompleta mogu biti obeleženi kao što je ovde opisano.
[0082] U jednom primeru izvođenja, vezujući član kompleta za upotrebu za identifikaciju/vezivanje za SSEA1 sadrži antitelo HI98 ili 480-1-1. U sledećem primeru izvođenja, vezujući član kompleta za upotrebu za identifikaciju/vezivanje za SSEA1 može sadržati vezujući član, kao što je antitelo, sposobno da bude u kompeticiji za vezivanje sa antitelom HI98 ili 480-1-1. U sledećem primeru izvođenja, vezujući član kompleta za upotrebu za identifikaciju/vezivanje za SSEA1 može sadržati vezujući član, kao što je antitelo, sposobno da vezuje isti epitop kao antitelo HI98 ili 480-1-1. U sledećem primeru
2
izvođenja, vezujući član kompleta za upotrebu za identifikaciju/vezivanje za SSEA1 može sadržati antitelo koje ima isti VL i VH lanac kao antitelo HI98 ili 480-1-1. U sledećem primeru izvođenja, vezujući član kompleta za upotrebu za identifikaciju/vezivanje za SSEA1 može sadržati antitelo koje ima iste CDR kao antitelo HI98 ili 480-1-1.
[0083] U jednom primeru izvođenja, vezujući član kompleta za upotrebu za identifikaciju/vezivanje za SSEA4 sadrži antitelo MC-813-70. U sledećem primeru izvođenja, vezujući član kompleta za upotrebu za identifikaciju/vezivanje za SSEA4 može sadržati vezujući član, kao što je antitelo, sposobno da bude u kompeticiji za vezivanje sa antitelom MC-813-70. U sledećem primeru izvođenja, vezujući član kompleta za upotrebu za identifikaciju/vezivanje za SSEA4 može sadržati vezujući član, kao što je antitelo, sposobno da vezuje isti epitop kao antitelo MC-813-70. U sledećem primeru izvođenja, vezujući član kompleta za upotrebu za identifikaciju/vezivanje za SSEA4 može sadržati antitelo koje ima isti VL i VH lanac kao antitelo MC-813-70. U sledećem primeru izvođenja, vezujući član kompleta za upotrebu za identifikaciju/vezivanje za SSEA4 može sadržati antitelo koje ima iste CDR kao antitelo MC-813-70.
[0084] U jednom primeru izvođenja, vezujući član kompleta za upotrebu za identifikaciju/vezivanje za TRA-2-49 sadrži antitelo TRA-2-49/6E. U sledećem primeru izvođenja, vezujući član kompleta za upotrebu za identifikaciju/vezivanje za TRA-2-49 može sadržati vezujući član, kao što je antitelo, sposobno da bude u kompeticiji za vezivanje sa antitelom TRA-2-49/6E. U sledećem primeru izvođenja, vezujući član kompleta za upotrebu za identifikaciju/vezivanje za TRA-2-49 može sadržati vezujući član, kao što je antitelo, sposobno da vezuje isti epitop kao antitelo TRA-2-49/6E. U sledećem primeru izvođenja, vezujući član kompleta za upotrebu za identifikaciju/vezivanje za TRA-2-49 može sadržati antitelo koje ima isti VL i VH lanac kao antitelo TRA-2-49/6E. U sledećem primeru izvođenja, vezujući član kompleta za upotrebu za identifikaciju/vezivanje za TRA-2-49 može sadržati antitelo koje ima iste CDR kao antitelo TRA-2-49/6E.
[0085] U jednom primeru izvođenja, vezujući član kompleta za upotrebu za identifikaciju/vezivanje za GD2 sadrži bilo koje od antitela 14.18, DMab-20, 14G2a, VIN 2 ili PB22. U sledećem primeru izvođenja, vezujući član kompleta za upotrebu za identifikaciju/vezivanje za GD2 može sadržati vezujući član, kao što je antitelo, sposobno da bude u kompeticiji za vezivanje sa bilo kojim od antitela 14.18, DMab-20, 14G2a, VIN 2 ili PB22. U sledećem primeru izvođenja, vezujući član kompleta za upotrebu za identifikaciju/vezivanje za GD2 može sadržati vezujući član, kao što je antitelo, sposobno da vezuje isti epitop kao bilo koje od antitela 14.18, DMab-20, 14G2a, VIN 2 ili PB22. U sledećem primeru izvođenja, vezujući član kompleta za upotrebu za identifikaciju/vezivanje za GD2 može sadržati antitelo koje ima isti VL i VH lanac kao bilo koje od antitela 14.18, DMab-20, 14G2a, VIN 2 ili PB22. U sledećem primeru izvođenja, vezujući član kompleta za upotrebu za identifikaciju/vezivanje za GD2 može sadržati antitelo koje ima iste CDR kao bilo koje od antitela 14.18, DMab-20, 14G2a, VIN 2 ili PB22.
[0086] U jednom primeru izvođenja, vezujući član kompleta za upotrebu za identifikaciju/vezivanje za GD3 sadrži antitelo DMab-7 ili VINIS56. U sledećem primeru izvođenja, vezujući član kompleta za upotrebu za identifikaciju/vezivanje za GD3 može sadržati vezujući član, kao što je antitelo, sposobno da bude u kompeticiji za vezivanje sa antitelom DMab-7 ili VINIS56. U sledećem primeru izvođenja, vezujući član kompleta za upotrebu za identifikaciju/vezivanje za GD3 može sadržati vezujući član, kao što je antitelo, sposobno da vezuje isti epitop kao antitelo DMab-7 ili VINIS56. U sledećem primeru izvođenja, vezujući član kompleta za upotrebu za identifikaciju/vezivanje za GD3 može sadržati antitelo koje ima isti VL i VH lanac kao antitelo DMab-7 ili VINIS56. U sledećem primeru izvođenja, vezujući član kompleta za upotrebu za identifikaciju/vezivanje za GD3 može sadržati antitelo koje ima iste CDR kao antitelo DMab-7 ili VINIS56.
[0087] U jednom primeru izvođenja, vezujući član kompleta za upotrebu za identifikaciju/vezivanje za CD141 sadrži antitelo 1A4. U sledećem primeru izvođenja, vezujući član kompleta za upotrebu za identifikaciju/vezivanje za CD141 može sadržati vezujući član, kao što je antitelo, sposobno da bude u kompeticiji za vezivanje sa antitelom 1A4. U sledećem primeru izvođenja, vezujući član kompleta za upotrebu za identifikaciju/vezivanje za CD141 može sadržati vezujući član, kao što je antitelo, sposobno da vezuje isti epitop kao antitelo 1A4. U sledećem primeru izvođenja, vezujući član kompleta za upotrebu za identifikaciju/vezivanje za CD141 može sadržati antitelo koje ima isti VL i VH lanac kao antitelo 1A4. U sledećem primeru izvođenja, vezujući član kompleta za upotrebu za identifikaciju/vezivanje za CD141 može sadržati antitelo koje ima iste CDR kao antitelo 1A4.
[0088] Komplet može dodatno sadržati reagense ili vezujuće članove pogodne za detekciju obeleživača.
[0089] U skladu sa sledećim aspektom predmetnog pronalaska, obezbeđena je upotreba CD141 kao negativnog ćelijskog markera za identifikaciju ne-otičkih progenitorskih ćelija u mešovitoj populaciji ćelija.
[0090] Upotreba može sadržati utvrđivanje prisustva ili odsustva CD141 na ćeliji.
[0091] Dodatni primer izvođenja je upotreba markera ćelijske površine humanih otičkih progenitora, i pozitivnih i negativnih, za studiju ponašanja matičnih i humanih otičkih progenitorskih ćelija tokom razvića i u zrelosti.
[0092] Dodatni primer izvođenja pronalaska je upotreba ćelijskih markera specifičnih za humane otičke progenitorske ćelije kao ciljeva za farmakološku manipulaciju humanim otičkim progenitorskim ćelijama in vitro nakon izolacije ili diferencijacije.
[0093] "Otička progenitorska ćelija" kao što se ovde upotrebljava je ćelija koja je biološka ćelija koja, kao i matična ćelija, ima tendenciju da se diferencira u specifične tipove ćelija, ali je već specifičnija od matične ćelije i gurnuta je da se diferencira u slušno povezane ćelije, kao što su ćelije slične vlatastoj ćeliji ili slušni neuroni. Razlika između matičnih ćelija i progenitorskih ćelija je u tome što se matične ćelije mogu beskonačno replicirati, dok se progenitorske ćelije mogu deliti samo ograničen broj puta. Trenutni postupci identifikacije mogu da uključuju niz transkripcionih faktora koji se upotrebljavaju kao molekularni markeri, kao što su PAX2, PAX8, FOXG1, SOX2 da nabrojimo samo neke. Otičke progenitorske ćelije se nalaze in vivo, tokom fetalnog razvića, u otičkoj plakodi, otocisti i u prosenzornom regionu potencijalnog senzornog epitela. O njihovom prisustvu u odraslom, zrelom uhu i dalje se raspravlja. Neke potporne ćelije, međutim, mogu imati svojstva slična progenitoru. Kao što se ovde upotrebljava, prijava opisuje aspekte povezane sa humanim otičkim progenitorima. Međutim, svi ovde opisani aspekti u vezi sa humanim otičkim progenitorima takođe se mogu razumeti da generalnije označavaju sisare.
[0094] Termin "pozitivni marker ćelijske površine" koji se ovde upotrebljava podrazumeva da znači marker, kao što je molekul, koji je na površini otičkih progenitora i može se upotrebljavati, možda sa drugim markerima, za pozitivnu verifikaciju identiteta otičkih progenitora. Pozivanje na "pozitivni marker ćelijske površine" ili "pozitivni ćelijski marker" ovde je namenjeno da označi jedan od SSEA1, GD3, TRA-2-49, SSEA4, ili GD2.
[0095] Termin "negativni marker ćelijske površine" koji se ovde upotrebljava podrazumeva da znači marker, kao što je molekul, koji je na površini ćelije, i koji se ne može naći na otičkim progenitorima. Prema tome, ćelije koje imaju takav negativni marker mogu se verifikovati kao ne-otički progenitor. Pozivanje na "negativni marker ćelijske površine" ili "negativni ćelijski marker" ovde je namenjeno da označi CD 141.
[0096] Termin "obogatiti" ili "obogaćen" koji se ovde upotrebljava je namenjen da znači da je udeo otičkih progenitorskih ćelija povećan u populaciji ćelija u odnosu na ne-otičke progenitorske ćelije. Obogaćivanje se inače može smatrati sortiranjem otičkih progenitorskih
2
ćelija od ne-otičkih progenitorskih ćelija. U obogaćivanju, otičke progenitorske ćelije mogu biti izolovane od ne-otičkih progenitorskih ćelija ili vice versa.
[0097] Pronalazak ne isključuje upotrebu ovde opisanih ćelijskih markera u kombinaciji sa drugim poznatim ili u budućnosti identifikovanim ćelijskim markerima.
[0098] "Specifično" ili "specifično vezivanje" se generalno upotrebljava da označi situaciju u kojoj jedan član specifičnog vezujućeg para neće pokazivati značajnije vezivanje za molekule druge nego za svoj specifični vezujući partner(e), i npr, ima manje od oko 30% unakrsne reaktivnosti sa bilo kojim drugim molekulom. U sledećim primerima izvođenja ima manje od 20%, 10%, ili 1% unakrsne reaktivnosti sa bilo kojim drugim molekulom. U ovom kontekstu, vezujući član koji je "aranžiran tako da se vezuje" za određeni ćelijski marker je vezujući član koji je sposoban da se specifično vezuje za ćelijski marker, tj. konfigurisan je tako da se vezuje za navedeni marker bez značajnog vezivanja drugih molekula. Tamo gde kontekst dozvoljava, termini "aranžiran tako da se vezuje" i "specifično se vezuje" mogu se upotrebljavati naizmenično.
[0099] Stručna osoba će razumeti da opciona svojstva jednog primera izvođenja ili aspekta pronalaska mogu biti primenjena, gde je to prikladno, na druge primere izvođenja ili aspekte pronalaska.
[0100] Pošto smo sada generalno opisali pronalazak, sledeći primeri su ponuđeni da ilustruju, ali ne i da ograniče pronalazak koji se zahteva.
Primeri
[0101] Rad koji je doveo do ovog pronalaska finansiran je od strane sedmog okvirnog programa Evropske unije FP7/HEALTH-2013-INOVATION-1 po sporazumu o dodeljivanju granta broj 603029.
Prečišćavanje otičkih progenitora iz heterogene populacije ćelija
Uvod
Potreba za prospektivnim prečišćavanjem otičkih progenitora
[0102] Protokoli optimizovani za usmeravanje hPSC daju (u najboljem slučaju) populacije ćelija sa visokom zastupljenošću željenog tipa ćelija usled brojnih ključnih ograničenja u našoj sposobnosti da kontrolišemo matične ćelije. Problemi kao što su heterogene početne kulture, serija-do-serije varijacije u faktorima rasta, medijumu i ostalom potrošnom materijalu, varijabilnost ćelijskih linija i gustina zasejavanja ćelija mogu uticati na efikasnost diferencijacije. Brojni protokoli su razvijeni za generisanje otičkih progenitora od hPSC [1,2], ali svi daju mešovite kulture sa samo podgrupom samih progenitora. Trenutno, u eksperimentima sa otičkom diferencijacijom sprovodi se ručno čišćenje da bi se prečistili progenitori, što uključuje struganje neželjenih tipova ćelija na osnovu morfologije i/ili ekspresije reporterskih gena. Iako je ovaj pristup bio efikasan u olakšavanju nizvodnih diferencijacija neuronskih/vlatastih ćelija, istovremeno zahteva puno rada i sklon je prenošenju malog dela ne-progenitorskih tipova ćelija. Dakle, da bi terapije matičnim ćelijama napredovale ka kliničkim primenama, potreban je precizniji objektivan postupak kod kog je moguće povećati razmeru do velikog broja ćelija.
[0103] Fluorescencijom aktivirano sortiranje ćelija (FACS) je uobičajeno upotrebljavana tehnika za razdvajanje podgrupa ćelija unutar populacije na osnovu diferencijalne ekspresije markera ćelijske površine. Postupak zahteva identifikaciju jedinstvenih profila ekspresije proteina ćelijske površine u ćelijama koje treba sortirati iz heterogene populacije, u kombinaciji sa dostupnošću pogodnih antitela za te proteine. Pregledali smo antitela za koja se zna da se prikačinju za antigene ćelijske površine u kulturama hESC koje su podvrgnute otičkoj diferencijaciji kako bismo identifikovali kandidate za upotrebu u FACS za prečišćavanje optičkih progenitora.
[0104] Razvijeni su protokoli za pokretanje hPSC duž otičkih diferencijacionih loza ka fenotipovima senzornih neurona i vlatastih ćelija putem intermedijarnih stanja koja se označavaju kao "otički progenitori". Protokoli koji se upotrebljavaju za izvođenje otičkih progenitora uključuju indukciju FGF sa FGF3 i FGF10 (slika 1a i Chen et al 2012), i noviji postupak koji inkorporiše manipulaciju WNT signalizacije, dodajući fazu inhibicije WNT (upotrebom IWR-1-endo) praćeno indukcijom WNT (sa BIO) (slika 1b).
[0105] Pregled antitela je preduzet na heterogenim populacijama ćelija koje su rezultovale iz dva gore navedena protokola u pokušaju da se pronađu odgovarajući markeri ćelijske površine koji se mogu upotrebljavati za prečišćavanje populacija otičkih progenitora putem FACS.
Postupci i rezultati
2
[0106] hESC iz Shef3.2, H14-NOP-SOX2 reporterska i H14s9 kultura su diferencirane u pločama sa 96 bunarića upotrebom bilo "FGF protokola" (slika la) ili "WNT protokola" (slika 1b). Rezultujuće kulture su obojene u živom stanju sa panelima antitela ćelijske površine pre fiksacije i snimanja u IN Cell Analyser 2200. Postoje tri faze pregleda:
1. Pilot pregled upotrebom CSCB antitela. Upotrebljena je H14-NOP-SOX2 reporterska linija i WNT protokol.
2. Glavni pregled upotrebom BD lyoplate panela za pregled humanog markera ćelijske površine sa 242 antitela. Upotrebljena je H14s9 linija i WNT protokol. (3 replikat ploče) 3. Glavni pregled upotrebom BD lyoplate panela za pregled humanog markera ćelijske površine sa 242 antitela. Upotrebljena je Shef3.2 linija i FGF protokol. (2 replikat ploče)
Posle snimanja, podaci su obrađeni upotrebom Developer Toolbox softvera i dodatno analizirani sa Excel i SPSS.
[0107] Tri eksperimenta su sumirana u tabeli 1.
Tabela 1. "PILOT" je urađen upotrebom CSCB panela antitela, "BD PROLAZ" je urađen upotrebom BD Lyoplate panela za pregled humanog markera ćelijske površine.
1.1 Pilot pregled upotrebom CSCB-Šefild panela antitela
[0108] Inicijalna faza pregleda koristila je relativno mali panel antitela dostupan u Centru za biologiju matičnih ćelija u Šefildu (Tabela 2).
Tabela 2. Panel antitela Centra za biologiju matičnih ćelija upotrebljen za inicijalni pregled
2
[0109] hESC reporterska linija koja eksprimira EGFP pokrenuta nazalnim i otičkim SOX2 pojačivačem specifičnim za plakode diferencirana je upotrebom "WNT" protokola (Slika 1b). Bojenje u živom stanju izvedeno je upotrebom panela antitela na kraju otičke indukcije (~ 12 dana), i ćelije su zatim fiksirane pre nego što su sve ispitane sa Hoechst i snimljene upotrebom automatskog sistema za mikroskopiranje (IN Cell Analyser 2200, GE Healthcare).
[0110] Upotrebom Developer softvera identifikovane su pojedinačne ćelije na osnovu Hoechst ekspresije, zatim je zabeležen intenzitet fluorescencije i GFP (SOX2 reporter unutar ćelija) i Alexa 568 (fluorohroma prikačena za sekundarno antitelo koje se upotrebljava prema antitelima markera ćelijske površine) i upotrebljen je za definisanje pozitivne ekspresije u svakoj ćeliji. Pozitivnost je definisana kao intenzitet fluorescencije veći od onog viđenog u nereaktivnim IgG, bunarićima negativne kontrole (IgG proizvedeni pomoću linije roditeljskog mijeloma P3X63Ag8).
[0111] U ovom primarnom pregledu upotrebljene su dve ploče sa 96 bunarića koje su se neznatno razlikovale u postupku bojenja: ploča 1 je bojena u skladu sa BD Lyoplate bioimaging protokolom upotrebom 5% FBS u DMEM kao medijuma za rast sa dodavanjem antitela i ploča 2 kao ploča 1 ali sa 5% FBS u PBS (sa CaCl2i MgCl2) umesto medijuma za rast.
2
[0112] Brojni potencijalni pogodci su otkriveni na CSCB panelu antitela. Slika 2 pokazuje podatke iz ovog eksperimenta prikazane sa svakim antitelom u posebnom oknu, x-osa označava intenzitet fluorescencije SOX2 reportera (GFP) i y-osa označava intenzitet fluorescencije markera ćelijske površine. Okna su aranžirana od vrha do dna na osnovu udela ćelija pozitivnih na marker ćelijske površine, pri čemu je gornji levi najpozitivniji i donji desni najmanje pozitivan. TRA-1-85 je antitelo pozitivne kontrole, P3X je antitelo negativne kontrole. Najbolji pogodci su nađeni u prvoj koloni ka najslabijim kandidatima u poslednjoj.
[0113] Različit postupak analize zasnovan na procentu pozitivnih ćelija u svakom bunariću, i broju replikat bunarića po antitelu koja su postigla pozitivan rezultat na bilo >25% ili >10% pragovima potvrdila su prva tri pogotka kao SSEA1, GD3 i TRA-2-49, sa SSEA4 (813-70) neposredno ispod.
[0114] Postojala je mala razlika između inkubacija antitela urađenih u PBS ili u DMEM, pa je DMEM odabran za buduće eksperimente pošto formira komponentu medijuma za diferencijaciju u kom se ćelije uzgajaju tokom otičke indukcije. Nije utvrđeno da bojenje u živom stanju negativno utiče na ćelije na bilo koji očigledan način (tj. nije bilo dodatnog otkačinjanja ćelija tokom protokola), i preporučuje se u BD Lyoplate postupcima pošto prethodna fiksacija može dovesti do porasta pogrešnih rezultata. Bojenje u živom stanju bi takođe bilo primerenije za buduće primene kada su živi progenitori potrebni za dodatne manipulacije.
1.2. Inicijalna verifikacija pogodaka sa CSCB panela
[0115] SSEA-1 i GD3 antitela su odabrana za verifikaciju da li se efikasno vezuju za subpopulaciju otičkog progenitora. Da bismo oslobodili GFP kanal na mikroskopu, vratili smo se na roditeljsku hESC liniju iz koje je generisan reporter, H14s9. Ćelije su diferencirane na isti način kao u primarnom pregledu zatim su obojene u živom stanju sa SSEA-1 i GD3 antitelima (u više odvojenih bunarića, tj. ne gledajući koekspresiju površinskih proteina). Ćelije su zatim fiksirane i permeabilizovane kako bi mogle biti ispitane za nukleusne (transkripcione) otičke markere, PAX2, SOX2 i FOXG1. Hoechst je ponovo upotrebljen za identifikaciju nukleusa pojedinačnih ćelija. Upotrebljeni su isti postupci prikupljanja podataka i analize kao i u primarnom pregledu. Ovi podaci ukazuju da je populacija pozitivna za SSEA1 podskup ćelija pozitivnih za svaki od tri transkripciona faktora (Tabela 3i). Podaci za GD3 su slični, samo što udeo (3,4%) ćelija koje su pozitivne za GD3 nije pozitivan za PAX2 (Tabela 3ii). Ovo u kombinaciji sa morfološkim podacima koji pokazuju GD3 bojenje nekih
2
ćelija koje nisu povezane sa morfologijom otičkog progenitora sugeriše da GD3 manje diskriminiše željeni ćelijski podskup nego SSEA1. Videti Sliku 3.
2.1 Pregled BD Lyoplate panela antitela
[0116] Rad sa CSCB panelom antitela dokazao je i izvodljivost upotrebe postupka automatizovanog bioimidžinga za pregled markera ćelijske površine i omogućio temeljnu optimizaciju sistema pre preduzimanja sveobuhvatnijeg pregleda zasnovanog na BD Lyoplate panelu za pregled humanih markera ćelijske površine (BD Biosciences). Ovaj panel testira vezivanje 242 antitela i očekivalo se da proširi broj identifikovanih markera.
[0117] BD Lyoplate pregled omogućava pokretanje 5 replika u pločama sa 96 bunarića. Eksperiment smo podelili na dva dela. Tri replikata su urađena upotrebom H14s9 ćelijske linije diferencirane upotrebom WNT protokola, dok su preostala dva upotrebljavala Shef3.2 ćelijsku liniju sa FGF protokolom. Zato je ovaj eksperimentalni dizajn uključivao ukupno 5 replikata, pokrivajući 2 nezavisne ćelijske linije i 2 različita protokola diferencijacije. Verovali smo da će ovo maksimalizovati šanse za izvlačenje najboljih kandidata za površinske markere otičkog progenitora.
2
[0118] Posle obrade podataka, preduzeta je analiza kako bi se identifikovao ukupan broj ćelija u bunariću i onih za koje se smatra da su pozitivne. Pozitivni prag je izračunat pojedinačno za svaku ploču analizom bunarića A1 koji je definisan kao kontrola (bez primarnih antitela) na svakoj ploči. Procenat pozitivnih ćelija je zatim izračunat za svaki bunarić. Ovi podaci su zatim prikupljeni za svaku od 3 BD ploče antitela, tj.5 replikata za svaku ploču, 3 za H14s9 i 2 za SHef3.2.
[0119] Tada su primenjene dve različite vrste analiza, prva koja upotrebljava objektivne kriterijume zasnovane na intenzitetu i druga koja upotrebljava subjektivne kriterijume zasnovane na morfologiji.
Objektivna analiza pragova obeležavanja
[0120]
1. Svakom bunariću smo dali procentualno pozitivnu vrednost i naveli smo svih 5 replika uporedo za poređenje.
2. Ćelije koje su bile <10% pozitivne klasifikovane su kao negativne, ≥10% klasifikovane su kao pozitivne.
3. Ukoliko su 3 ili više replikata bunarića bila negativna, onda su bunarić i odgovarajuće antitelo klasifikovani kao ne-kandidati i uklonjeni su iz budućeg razmatranja.
4. Ukoliko su sva 4 ili 5 bunarića >80% pozitivna, smatra se da antitelo nije dovoljno diskriminatorno (tj. vezuje previše tipova ćelija) i stoga je klasifikovano kao nekandidat i uklonjeno je iz budućeg razmatranja.
5. Proverili smo da su preostali bunarići imali najmanje 3 pozitivna replikata koja se protežu na dve ćelijske linije, tj. ukoliko su replikati 1-3 pozitivni (replikati H14s9) ali su i 4 i 5 negativni (replikati Shef3.2), onda bunarić treba isključiti pošto ovo sugeriše da se antitelo vezuje specifično za jednu liniju (ili moguće samo za ćelije koje su podvrgnute diferencijaciji putem WNT protokola za razliku od FGF protokola).
[0121] Slika 4 pokazuje preseke dela podataka ploče 1 koji su upotrebljeni za ilustraciju kako su implementirani gore objašnjeni kriterijumi. Prikazani su podaci za bunariće F5 do G6 i podaci o procentima su formatirani tako da što je procenat veći, osenčenje je tamnije, kako bi se lakše videle razlike. Replikati 1-3 su H14s9/WNT protokol replikati. Replikati 4 i 5 su Shef3.2/FGF protokol replikati.
[0122] Na slici 4a, istaknuti bunarići spadaju u 3 ili više negativnih replikata (tačka 3 iznad) i stoga su uklonjeni kao ne-kandidati. Na slici 4b, istaknuti bunarići spadaju u nedovoljno diskriminatornu (tačka 4 iznad) kategoriju i stoga su uklonjeni kao ne-kandidati. Na slici 4c, istaknuti bunarići spadaju u kategoriju vezivanja koje je specifično za liniju/protokol (tačka 5 iznad), pa su takođe uklonjeni kao ne-kandidati.
Subjektivna anlaliza zasnovana na morfologiji
[0123] Jednom kada su svi ne-kandidat bunarići uklonjeni, vratili smo se na podatke sa snimaka i proverili preostale bunariće kako bismo videli da li je antitelo u stvari vezano za populaciju koju bismo samo morfološkim putem klasifikovali kao otičke progenitore. Ova analiza je urađena samo na Shef3.2 replikatima, pošto su H14s9 bili suviše konfluentni za procenu morfologije pomoću oka.
[0124] Sveukupno, ove analize potvrđuju tri od najboljih kandidata identifikovanih u početnom pilot pregledu (SSEA1, SSEA4 i GD2). GD3 i TRA2-49 (alkalna fosfataza) nisu predstavljeni u BD Lyoplate. Iako su identifikovani neki pozitivni markeri "drugog nivoa", oni nisu prošli stroge kriterijume postavljene u ovoj inicijalnoj studiji i samo se ovih pet (SSEA1, SSEA4, GD2, GD3 i TRA2-49) prati.
[0125] Pored toga, identifikovali smo CD141 kao marker za izuzeće pošto on obeležava većinu drugih tipova ćelija ali ne progenitore.
Postupci za Slike 6 i 7
[0126] Humani fetusi različite gestacijske starosti fiksirani su tokom dva sata u 4% PFA u PBS na 4 °C. Uzorci su zatim krio zaštićeni u rastućoj seriji od 5%-30% saharoze u PBS i ukalupljeni u Cryo-M-Bed (Bright), pre nego što su zamrznuti u tečnom izo-pentanu ohlađenom na tečnom azotu. Serijski preseci debljine deset μm isečeni su na kriostatu i sakupljeni na pločice presvučene želatinom. Preseci su kratko isprani sa PBS i inkubirani 15-30 minuta u blokirajućem puferu (0,1% triton 5% normalnog magarećeg seruma u PBS) na sobnoj temperaturi. Upotrebljena antitela su: anti-CD141 (Biolegend) i anti-neurofilament 200 (Sigma). Signali su vizualizovani upotrebom Alexa-konjugovanih sekundarnih antitela. Nukleusno kontra-bojenje je urađeno sa DAPI (Sigma).
1
Postupci za Slike 8 i 9
[0127] hESC iz Shef3.2 linije indukovane su da se diferenciraju u otičke progenitore tokom 14 dana upotrebom "FGF protokola", kao što je opisano u [1]. U ovoj fazi, nefiksirane ćelije su obeležene sa SSEA4, TRA-2-49 i CD141 antitelima, direktno konjugovanim za Alexa 647, Alexa 488 ili Brilliant Violet 421 fluorohrome respektivno (Biolegend). Ćelije su izdvojene i analizirane upotrebom BD FACSJazz.
[0128] Za sliku 9, sortiranim i nesortiranim ćelijama je omogućeno da se dalje diferenciraju tokom 17, 20 i 26 dana u ćelije sličnim vlatastim ćelijama, upotrebom sistema za kulturu organoida (3D) razvijenog u našoj laboratoriji. Diferencijacija u ćelije slične vlatastim ćelijama takođe se može postići upotrebom publikovanog postupka (npr. [2]). RNK je ekstrahovana i ekspresija gena analizirana pomoću qPCR upotrebom DD-Ct postupka.
[0129] Ovi rezultati sugerišu da SSEA4+/TRA2-49+ dvostruko pozitivna populacija sadrži progenitorske ćelije sposobne da se diferenciraju u lozu vlatastih ćelija, čak i kada su izolovane iz ne-SSEA4/TRA2-49 dvostruko pozitivne frakcije (pojedinačno pozitivne ili -/ćelije). Nesortirana populacija je i dalje sposobna da se diferencira, s obzirom na to da sadrži relativno veliki procenat SSEA4+/TRA2-49+ ćelija (54,8±5,6%, srednja vrednost ± s.e.m.).
Reference
[0130]
[1] Chen, W., Jongkamonwiwat, N., Abbas, L., Eshtan, S.J., Johnson, S.L., Kuhn, S., Milo, M., Thurlow, J.K., Andrews, P.W., Marcotti, W., Moore, H.D., Rivolta, M.N. "Restoration of auditory evoked responses by human ES-cell-derived otic progenitors." Nature, 490, 278-282, 2012.
[2] Ronaghi, M., Nasr, M., Ealy, M., Durruthy-Durruthy, R., Waldhaus, J., Diaz, G.H., Joubert, L.M., Oshima, K., Heller, S. "Inner ear hair cell-like cells from human embryonic stem cells. " Stem Cells Dev, 23(11), 1275-1284, 2014.
2

Claims (15)

Patentni zahtevi
1. In vitro postupak identifikovanja humanih otičkih progenitorskih ćelija u mešovitoj populaciji ćelija koji sadrži određivanje da li ćelija ima najmanje dva markera ćelijske površine odabrana od SSEA1, GD3, TRA-2-49, SSEA4, GD2 i CD141.
2. Postupak u skladu sa patentnim zahtevom 1, naznačen time što:
a) ćelijski markeri SSEA1, GD3, TRA-2-49, SSEA4, i GD2 su pozitivni ćelijski markeri; i/ili
b) ćelijski marker CD141 je negativni ćelijski marker.
3. Postupak u skladu sa patentnim zahtevom 1 ili 2, naznačen time što:
(a) najmanje dva pozitivna ćelijska markera se upotrebljavaju u kombinaciji za identifikaciju humanih otičkih progenitora; ili
(b) najmanje tri, četiri ili pet pozitivnih ćelijskih markera se upotrebljava u kombinaciji za identifikaciju humanih otičkih progenitora; ili
(c) pozitivan ćelijski marker, ili najmanje dva pozitivna ćelijska markera se upotrebljavaju u kombinaciji sa negativnim ćelijskim markerom CD141.
4. Postupak u skladu sa bilo kojim od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time što se mešovita populacija ćelija obezbeđuje iz, ili tokom, in vitro protokola diferencijacije pluripotentnih matičnih ćelija, opciono pri čemu su pluripotentne matične ćelije indukovane pluripotentne matične ćelije (iPSC); ili
pri čemu se mešovita populacija ćelija obezbeđuje iz, ili tokom, procedura dediferenciranja, transdiferenciranja ili direktnog reprogramiranja u humane otičke ćelijske loze; ili
pri čemu se mešovita populacija ćelija obezbeđuje iz tkiva, opciono pri čemu su ćelije kohlearni ili vestibularni uzorci dobijeni hirurškim intervencijama iz unutrašnjeg uha odraslih.
5. Postupak u skladu sa bilo kojim od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time što se mešovita populacija ćelija dovodi u kontakt sa jednim ili više vezujućih članova aranžiranih tako da se vezuju za ćelijske markere, opciono pri čemu vezujući član sadrži antitelo, fragment antitela, ili njegov mimetik.
6. Postupak u skladu sa bilo kojim od prethodnih patentnih zahteva, koji sadrži korak detekcije, naznačen time što se ćelijski markeri detektuju kao prisutni ili da nisu prisutni na ćeliji ili grupi ćelija, opciono pri čemu detekcija sadrži upotrebu FACS i/ili upotrebu MACS.
7. Postupak u skladu sa patentnim zahtevom 5 ili patentnim zahtevom 6, naznačen time što je vezujući član obeležen za identifikaciju, opciono pri čemu obeleživač sadrži fluoroforu.
8. In vitro postupak identifikovanja humanih otičkih progenitorskih ćelija u mešovitoj populaciji ćelija upotrebom najmanje dva markera ćelijske površine odabrana od SSEA1, GD3, TRA-2-49, SSEA4, GD2 i CD141, postupak sadrži:
- obezbeđivanje vezujućih članova specifičnih za najmanje dva različita ćelijska markera;
- dovođenje u kontakt mešovite populacije ćelija sa vezujućim članovima; i - detektovanje vezivanja ili nevezivanja vezujućih članova za ćelije u mešovitoj populaciji ćelija.
9. Postupak u skladu sa patentnim zahtevom 8, naznačen time što postupak dodatno sadrži određivanje da je ćelija humana otička progenitorska ćelija ukoliko:
a) se vezujući članovi aranžirani tako da se vezuju za pozitivne ćelijske markere vezuju za najmanje dva različita pozitivna ćelijska markera na ćeliji; ili b) se vezujući član aranžiran tako da vezuje jedan od pozitivnih ćelijskih markera vezuje za najmanje jedan od pozitivnih ćelijskih markera na ćeliji, i vezujući marker aranžiran tako da se vezuje za negativni ćelijski marker CD141 se ne vezuje za ćeliju,
opciono pri čemu postupak sadrži određivanje da je ćelija humana otička progenitorska ćelija ukoliko:
4
i) se vezujući članovi aranžirani tako da se vezuju za pozitivne ćelijske markere vezuju za najmanje tri različita pozitivna ćelijska markera na ćeliji; ili
ii) se vezujući članovi aranžirani tako da vezuju najmanje dva različita pozitivna ćelijska markera vezuju za najmanje dva različita pozitivna ćelijska markera na ćeliji, i vezujući marker aranžiran tako da se vezuje za negativni ćelijski marker CD141 se ne vezuje za ćeliju.
10. In vitro postupak obogaćivanja humanih otičkih progenitorskih ćelija iz mešovite populacije ćelija, postupak sadrži:
- identifikovanje humanih otičkih progenitorskih ćelija u skladu sa postupkom prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 9; i
- sortiranje ćelija tako da se humane otičke progenitorske ćelije izoluju iz neotičkih progenitorskih ćelija, tako da su humane otičke progenitorske ćelije obogaćene u populaciji, opciono pri čemu sortiranje sadrži FACS ili sadrži MACS.
11. In vitro postupak proizvodnje populacije humanih otičkih progenitorskih ćelija, postupak sadrži:
- diferenciranje ne-otičkih progenitorskih ćelija u humane otičke progenitorske ćelije, pri čemu neke ne-otičke progenitorske ćelije mogu ostati u populaciji da bi formirale mešovitu populaciju ćelija; i
- obogaćivanje humanih otičkih progenitorskih ćelija iz mešovite populacije ćelija u skladu sa postupkom prema patentnom zahtevu 10.
12. Komplet koji sadrži najmanje dva različita vezujuća člana, naznačeno time što su vezujući članovi aranžirani tako da se vezuju za različite ćelijske markere odabrane od SSEA1, GD3, TRA-2-49, SSEA4, GD2 i CD141, opciono pri čemu komplet sadrži najmanje tri različita vezujuća člana, pri čemu su vezujući članovi aranžirani tako da se vezuju za različite ćelijske markere odabrane od SSEA1, GD3, TRA-2-49, SSEA4, GD2 i CD141.
13. Komplet u skladu sa patentnim zahtevom 12, naznačeno time što komplet sadrži panel vezujućih članova, pri čemu panel vezujućih članova sadrži vezujući član specifičan za svaki od ćelijskih markera SSEA1, GD3, TRA-2-49, SSEA4, GD2 i CD141.
14. Komplet u skladu sa patentnim zahtevom 12 ili patentnim zahtevom 13, naznačeno time što su vezujući članovi antitela, opciono pri čemu su antitela obeležena.
15. Upotreba CD141 kao negativnog ćelijskog markera za identifikaciju humanih ne-otičkih progenitorskih ćelija u mešovitoj populaciji ćelija.
RS20210826A 2016-09-15 2017-09-14 Identifikacija i izolacija humanog otičkog progenitora RS62083B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB1615714.1A GB201615714D0 (en) 2016-09-15 2016-09-15 Otic progenitor identification and isolation
EP17771536.4A EP3513191B1 (en) 2016-09-15 2017-09-14 Human otic progenitor identification and isolation
PCT/GB2017/052707 WO2018051092A1 (en) 2016-09-15 2017-09-14 Human otic progenitor identification and isolation

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS62083B1 true RS62083B1 (sr) 2021-08-31

Family

ID=57288819

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20210826A RS62083B1 (sr) 2016-09-15 2017-09-14 Identifikacija i izolacija humanog otičkog progenitora

Country Status (28)

Country Link
US (2) US11634687B2 (sr)
EP (1) EP3513191B1 (sr)
JP (1) JP7134488B2 (sr)
KR (1) KR102409178B1 (sr)
CN (1) CN109716133B (sr)
AU (1) AU2017328903B2 (sr)
CA (1) CA3034529A1 (sr)
CL (1) CL2019000682A1 (sr)
CO (1) CO2019002095A2 (sr)
CY (1) CY1124285T1 (sr)
DK (1) DK3513191T3 (sr)
ES (1) ES2877795T3 (sr)
GB (1) GB201615714D0 (sr)
HR (1) HRP20211049T1 (sr)
HU (1) HUE055453T2 (sr)
IL (1) IL265288B2 (sr)
LT (1) LT3513191T (sr)
MA (1) MA46424B1 (sr)
MX (1) MX2019002995A (sr)
PL (1) PL3513191T3 (sr)
PT (1) PT3513191T (sr)
RS (1) RS62083B1 (sr)
RU (1) RU2768720C2 (sr)
SG (1) SG11201901410SA (sr)
SI (1) SI3513191T1 (sr)
SM (1) SMT202100378T1 (sr)
WO (1) WO2018051092A1 (sr)
ZA (1) ZA201902342B (sr)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201615714D0 (en) * 2016-09-15 2016-11-02 Univ Of Sheffield The Otic progenitor identification and isolation
GB202213060D0 (en) 2022-09-07 2022-10-19 Rinri Therapeutics Ltd Surgical method for treatment of auditory disease or condition
GB202214291D0 (en) 2022-09-29 2022-11-16 Rinri Therapeutics Ltd Laminin culture protocol
CN116162589B (zh) * 2022-12-30 2025-10-03 西北工业大学 干细胞及其制备方法和应用、及标记组合物及其应用

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003524407A (ja) 1999-07-20 2003-08-19 ユニバーシティ オブ サザン カリフォルニア 多能性前−間葉、前−造血先祖幹細胞の同定
US6436704B1 (en) 2000-04-10 2002-08-20 Raven Biotechnologies, Inc. Human pancreatic epithelial progenitor cells and methods of isolation and use thereof
US6534052B1 (en) 2000-09-05 2003-03-18 Yong-Fu Xiao Cardiac function comprising implantation of embryonic stem cell in which differentiation has been initiated
DE60230774D1 (de) 2001-04-20 2009-02-26 Children S Hospital Of Orange Isolierung von nervenstammzellen unter verwendung von gangliosiden und anderen oberflächenmarkern
US8673634B2 (en) 2003-11-13 2014-03-18 Massachusetts Eye & Ear Infirmary Method for the treatment of hearing loss
US20070250942A1 (en) 2006-04-07 2007-10-25 Cold Spring Harbor Laboratory Non-human transgenic mammals useful for identifying and assessing neural stem/progenitor cells
WO2008132722A1 (en) * 2007-04-26 2008-11-06 Ramot At Tel-Aviv University Ltd. Pluripotent autologous stem cells from oral mucosa and methods of use
GB2450747A (en) 2007-07-06 2009-01-07 Univ Sheffield Treatment of sensorineural hearing loss
RU2525223C2 (ru) * 2009-06-08 2014-08-10 Иалоджик Кореа Инк. Способ стимулирования области волосковых сенсорных клеток
WO2012103012A1 (en) 2011-01-24 2012-08-02 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for generating inner ear cells in vitro
BR112014019328A8 (pt) 2012-02-17 2017-07-11 The Schepens Eye Res Institute Perfil de fenótipo de células progenitoras retinais humanas
WO2013188679A1 (en) 2012-06-13 2013-12-19 Stemgent, Inc. Methods of preparing pluripotent stem cells
GB201615714D0 (en) * 2016-09-15 2016-11-02 Univ Of Sheffield The Otic progenitor identification and isolation

Also Published As

Publication number Publication date
RU2019110990A3 (sr) 2020-12-09
US20230313134A1 (en) 2023-10-05
RU2019110990A (ru) 2020-10-15
HUE055453T2 (hu) 2021-11-29
CL2019000682A1 (es) 2019-06-07
RU2768720C2 (ru) 2022-03-24
MA46424A (fr) 2019-07-24
PT3513191T (pt) 2021-07-05
SMT202100378T1 (it) 2021-09-14
JP2019533138A (ja) 2019-11-14
US11634687B2 (en) 2023-04-25
JP7134488B2 (ja) 2022-09-12
IL265288B2 (en) 2024-03-01
PL3513191T3 (pl) 2021-10-25
BR112019004749A2 (pt) 2019-05-28
AU2017328903A1 (en) 2019-03-07
MA46424B1 (fr) 2021-07-29
SG11201901410SA (en) 2019-03-28
SI3513191T1 (sl) 2021-09-30
MX2019002995A (es) 2019-09-18
AU2017328903B2 (en) 2023-07-06
US12209254B2 (en) 2025-01-28
ZA201902342B (en) 2021-09-29
CA3034529A1 (en) 2018-03-22
CN109716133A (zh) 2019-05-03
CN109716133B (zh) 2023-04-28
HRP20211049T1 (hr) 2021-10-01
LT3513191T (lt) 2021-08-10
IL265288A (en) 2019-05-30
DK3513191T3 (da) 2021-07-05
CY1124285T1 (el) 2022-07-22
EP3513191B1 (en) 2021-04-28
ES2877795T3 (es) 2021-11-17
WO2018051092A1 (en) 2018-03-22
EP3513191A1 (en) 2019-07-24
KR102409178B1 (ko) 2022-06-14
IL265288B1 (en) 2023-11-01
CO2019002095A2 (es) 2019-05-31
KR20190051971A (ko) 2019-05-15
US20190185813A1 (en) 2019-06-20
GB201615714D0 (en) 2016-11-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US12209254B2 (en) Human otic progenitor identification and isolation
Clarkson et al. Initial characterisation of adult human ovarian cell populations isolated by DDX4 expression and aldehyde dehydrogenase activity
Menon et al. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types
CN105102978B (zh) 分离循环肿瘤细胞的方法
Wu et al. Isolation and analysis of rare cells in the blood of cancer patients using a negative depletion methodology
US12173313B2 (en) Assembly of functionally integrated human forebrain spheroids and methods of use thereof
CN104471073B (zh) 用于从衍生自多能干细胞的细胞培养物中分离神经元的细胞表面特征物
US20070254319A1 (en) Identification of a constitutively resistant cancer stem cell
Siebzehnrubl et al. Isolation and characterization of adult neural stem cells
Samata et al. L1CAM is a marker for enriching corticospinal motor neurons in the developing brain
Fedr et al. Variability of fluorescence intensity distribution measured by flow cytometry is influenced by cell size and cell cycle progression
Pang et al. Neuron/oligodendrocyte myelination coculture
Horiguchi et al. Isolation and characterization of cluster of differentiation 9-positive ependymal cells as potential adult neural stem/progenitor cells in the third ventricle of adult rats
HK40010247A (en) Human otic progenitor identification and isolation
HK40010247B (en) Human otic progenitor identification and isolation
Khan et al. Fluorescence-activated nuclear sorting (FANS) of nuclei from in vitro-generated syncytiotrophoblast
BR112019004749B1 (pt) Método in vitro de identificação, de enriquecimento e de produção de células progenitoras óticas humanas em uma população mista de células, kit e uso de cd141
Wang et al. Association of glycolipids and growth factor receptors in lipid rafts
Das et al. Isolation and Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cells from Human Glioblastoma Multiforme (GBM) Tissues
Beckner et al. Tumor cells from ultrasonic aspirations of glioblastomas migrate and form spheres with radial outgrowth
Lőrincz et al. Advances of Squamata astroglia to other reptiles: numerous astrocytes and glial fibrillary acidic protein (GFAP)-free areas: a preliminary study
Pérez et al. by Immunohistochemistry and Flow Cytometry
Zilli et al. Immunohistochemical Staining Protocol of Enteric Glial Cells in Myenteric Plexi
KR101934619B1 (ko) Dazl 단백질 특이적 항체를 이용한 개 정원줄기세포의 확인 및 동정 방법
TWI639699B (zh) Method for screening fused cells