RS62189B1 - Nukleinske kiseline koje kodiraju humana antitela na sijalil-luis a - Google Patents

Nukleinske kiseline koje kodiraju humana antitela na sijalil-luis a

Info

Publication number
RS62189B1
RS62189B1 RS20210929A RSP20210929A RS62189B1 RS 62189 B1 RS62189 B1 RS 62189B1 RS 20210929 A RS20210929 A RS 20210929A RS P20210929 A RSP20210929 A RS P20210929A RS 62189 B1 RS62189 B1 RS 62189B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
antibody
seq
cancer
cells
antibodies
Prior art date
Application number
RS20210929A
Other languages
English (en)
Inventor
Ritsuko Sawada
Shu-Man Sun
Wolfgang Scholz
Original Assignee
Biontech Research And Development Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biontech Research And Development Inc filed Critical Biontech Research And Development Inc
Publication of RS62189B1 publication Critical patent/RS62189B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/337—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having four-membered rings, e.g. taxol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
    • A61K51/1027—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody against receptors, cell-surface antigens or cell-surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
    • A61K51/1045—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody against animal or human tumor cells or tumor cell determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
    • A61K51/1045—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody against animal or human tumor cells or tumor cell determinants
    • A61K51/1057—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody against animal or human tumor cells or tumor cell determinants the tumor cell being from liver or pancreas
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
    • A61K51/1093—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody conjugates with carriers being antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3076—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells against structure-related tumour-associated moieties
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57525—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer of the liver or pancreas
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6081—Albumin; Keyhole limpet haemocyanin [KLH]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/626—Diabody or triabody
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

Opis
OSNOV PRONALASKA
[0001] Predmetno uputstvo odnosi se uopšteno na antitela usmerena protiv sijalil -Luis<a>(sLe<a>), a konkretnije na polinukleotide koji kodiraju anti-sLe<a>antitela i odgovarajuća kodirana antitela ili njihove fragmente.
[0002] Karcinom pankreasa je jedan od najagresivnijih adenokarcinoma i često je povezan za lošom prognozom. Karcinom pankreasa kotira se kao četvrti vodeći uzrok smrtnosti usled kancera. Uprkos napretku u skriningu za različite karcinome, pouzdanost detekcije malignih lezija koje potiču od pankreasa i dalje je slaba. U cilju detekcije i kategorizacije kancera pankreasa ukazano je na pozitronsku emisionu tomografiju u kojoj se koristi fluorodeoksiglukaza (FDG-PET). Međutim, FDG-PET nije senzitivna u smislu razlikovanja pankreatitisa od maligniteta i ostaje problematična kada je u pitanju kategorizacija malih primarnih lezija (< 7mm) i metastaza u jetri (<1 cm). Jedan dijagnostički metod skrininga koji se koristi za praćenje stanja pacijenata sa duktalnim adenokarcinomom pankreasa (PDAC) uključuje detekciju povišenih nivoa cirkulišućeg sLe<a>antigena u serumima. Patients with > 37 U/ml of circulating sLe<a>antigen indicates cancer recurrence. Međutim, razvoj alternativnih dijagnostičkih alata koji koriste ove tumor-specifične ugljene hidrate odvija se sporo.
[0003] Pasivna primena antitela usmerenih protiv tumor-specifičnih antigena može da eliminiše tumorske ćelije i rane metastaze tokom razvoja kancera. Ovaj tretman može takođe da ima značajan uticaj na ponovljeno javljanje kancera. Antitela usmerena protiv tumor-specifičnih ugljenih hidrata mogu da budu korisni kandidati u ovom tretmanu za kancer. Na primer, pokazano je da su brojna monoklonska antitela ograničena na tumor, koja nastaju imunizacijom miševa humanim ćelijama kancera, usmerena protiv ugljenohidratnih antigena eksprimiranih na površini ćelije u vidu glikolipida ili glikoproteina. Pokazano je da je ugljeni hidrat sLe<a>eksprimiran na tumorima gastrointestinalnog trakta. Takođe je pokazano da ekspresija sLe<a>utiče na metastatski potencijal i da je u korelaciji sa povećanim metastatskim potencijalom kod humanog kancera debelog creva i adenokarcinoma pankreasa. Međutim, hemijske osobine ugljenih hidrata uglavnom su problematične i klinički razvoj antitela koja prepoznaju ove tumorspecifične ugljene hidrate je spor. Postojeći dokumenti iz stanja tehnike Shitara et al. 1991 (Anticancer Res. 11: 2003-2014), Girgis et al.2011 (Int. J. Mol. Imaging 2011: 1-9), Girgis et al.
2011 (J. Surg. Res.170: 169-178), i van Heel & Suresh 1989 (Can. Letters 48: 85-100) pominju da se raznovrsni konjugati antitela ili obeležena antitela vezuju za sLe<a>. Nijedan od ovih dokumenata, međutim, ne obezbeđuje antitelo i ne pokazuje da je to antitelo terapeutski aktivno u ubijanju ćelija putem ADCC ili CDC.
[0004] Dakle postoji potreba za identifikacijom i generisanjem antitela koja specifično prepoznaju tumor-specifične ugljene hidrate, kao što je sLe<a>, za lečenje rekurentnih kancera. Ovo uputstvo zadovoljva ovu potrebu i obezbeđuje povezane prednosti.
KRATAK PREGLED PRONALASKA
[0005] Predmetni pronalazak se zasniva na opštem uputstvu koje je ovde opisano u tekstu koji sledi i definisan je priloženim patentnim zahtevima.
KRATAK PREGLED UPUTSTVA
[0006] U skladu sa predmetnim uputstvima, ovde su obezbeđene kompozicije za proizvodnju antitela ili njihovih funkcionalnih fragmenata koji se vezuju za sLe<a>. Kompozicije uključuju izolovani polinukleotid koji kodira antitelo ili njegov funkcionalni fragment, pri čemu antitelo uključuje varijabilni domen teškog lanca (VH) koji ima ovde obezbeđenu amino kiselinsku sekvencu. Izolovani polinukleotid prema uputstvima može da uključuje i ovde obezbeđenu sekvencu nukleinske kiseline, pri čemu sekvenca nukleinske kiseline kodira VH domen antitela ili njegovog funkcionalnog fragmenta.
[0007] U drugom primeru izvođenja prema uputstvima, izolovani polinukleotid može da kodira antitelo ili njegov funkcionalni fragment, pri čemu antitelo uključuje varijabilni domen lakog lanca (VL) koji ima ovde obezbeđenu amino kiselinsku sekvencu. Izolovani polinukleotid prema uputstvima može da uključuje i ovde obezbeđenu sekvencu nukleinske kiseline, pri čemu sekvenca nukleinske kiseline kodira VL domen antitela ili njegovog funkcionalnog fragmenta.
[0008] Kompozicije prema uputstvima uključuju takođe izolovano antitelo ili njegov funkcionalni fragment, pri čemu se antitelo vezuje za sLe<a>. U nekim primerima izvođenja, uputstvo obezbeđuje izolovano antitelo ili njegov funkcionalni fragment koji se vezuje za sLe<a>, pri čemu antitelo ili njegov funkcionalni fragment uključuje VH domen koji ima ovde obezbeđenu amino kiselinsku sekvencu.
[0009] U nekim primerima izvođenja, uputstvo obezbeđuje izolovano antitelo ili njegov funkcionalni fragment koji se vezuje za sLe<a>, pri čemu antitelo ili njegov funkcionalni fragment uključuje VL domen koji ima ovde obezbeđenu amino kiselinsku sekvencu.
[0010] U nekim primerima izvođenja, uputstvo obezbeđuje izolovano antitelo ili njegov funkcionalni fragment koji se vezuje za sLe<a>, pri čemu antitelo ili njegov funkcionalni fragment uključuje i VH domen i VL domen, gde VH domen i VL domen redom uključuju amino kiselinsku sekvencu za respektivne VH i VL domene ovde obezbeđenih klonalnih izolata.
[0011] U nekim primerima izvođenja, uputstvo obezbeđuje konjugat koji ovde sadrži antitelo ili funkcionalni fragment koji je konjugovan ili rekombinantno spojen sa dijagnostičkim agensom, detektibilnim agensom ili terapeutskim agensom. U nekim aspektima uputstva, konjugat uputstva koji uključuje detektabilno sredstvo može se koristiti u metodi za otkrivanje i / ili dijagnostikovanje stvaranja tumora. Takvi postupci mogu uključivati davanje efikasne količine konjugata subjektu kome je to potrebno.
[0012] U nekim primerima izvođenja, uputstvo pruža farmaceutske kompozicije koje imaju jedan ili više antitelo ili funkcionalnih fragmenata uputstva i farmaceutski prihvatljiv nosač. U nekim aspektima, uputstvo takođe pruža postupak za lečenje ili prevenciju bolesti kod subjekta kome je to potrebno, primenom terapeutski efikasne količine farmaceutskog sastava uputstva. U još jednom aspektu, uputstvo omogućava davanje drugog terapijskog sredstva istovremeno ili uzastopno sa antitelom ili funkcionalnim fragmentom uputstva.
KRATAK OPIS CRTEŽA
[0013]
SL. 1 prikazuje nukleotidnu sekvencu i kodiranu amino kiselinsku sekvencu varijabilnog domena teškog (VH) lanca klona 5B1 i lidersku sekvencu koja može da se koristi za rekombinanatnu ekspresiju. Gornji deo slike predstavlja naporedni prikaz nukleotidne sekvence SEQ ID NO: 1 i amino kiselinske sekvence SEQ ID NO: 2. Takođe su identifikovana tri regiona koja determinišu komplementarnost (regioni CDR1, CDR2 i CDR3).
SL. 2 prikazuje nukleotidnu sekvencu i kodiranu amino kiselinsku sekvencu varijabilnog domena lakog (VL) lanca klona 5B1 i lidersku sekvencu koja može da se koristi za rekombinanatnu ekspresiju. Gornji deo slike predstavlja naporedni prikaz nukleotidne sekvence SEQ ID NO: 3 i amino kiselinske sekvence SEQ ID NO:4. Takođe su identifikovana tri regiona koja determinišu komplementarnost (regioni CDR1, CDR2 i CDR3).
SL. 3 prikazuje nukleotidnu sekvencu i kodiranu amino kiselinsku sekvencu varijabilnog domena teškog (VH) lanca klona 9H3 i lidersku sekvencu koja može da se koristi za rekombinanatnu ekspresiju. Gornji deo slike predstavlja naporedni prikaz nukleotidne sekvence SEQ ID NO: 5 i amino kiselinske sekvence SEQ ID NO: 6. Takođe su identifikovana tri regiona koja determinišu komplementarnost (regioni CDR1, CDR2 i CDR3).
SL. 4 prikazuje nukleotidnu sekvencu i kodiranu amino kiselinsku sekvencu varijabilnog domena lakog (VL) lanca klona 9H3 i lidersku sekvencu koja može da se koristi za rekombinanatnu ekspresiju. Gornji deo slike predstavlja naporedni prikaz nukleotidne sekvence SEQ ID NO: 7 i amino kiselinske sekvence SEQ ID NO: 8. Takođe su identifikovana tri regiona koja determinišu komplementarnost (regioni CDR1, CDR2 i CDR3).
SL. 5 prikazuje nukleotidnu sekvencu i kodiranu amino kiselinsku sekvencu varijabilnog domena teškog (VH) lanca klona 5H11 i lidersku sekvencu koja može da se koristi za rekombinanatnu ekspresiju. Gornji deo slike predstavlja naporedni prikaz nukleotidne sekvence SEQ ID NO: 9 i amino kiselinske sekvence SEQ ID NO: 10. Takođe su identifikovana tri regiona koja determinišu komplementarnost (regioni CDR1, CDR2 i CDR3).
SL. 6 prikazuje nukleotidnu sekvencu i kodiranu amino kiselinsku sekvencu varijabilnog domena lakog (VL) lanca klona 5H11 i lidersku sekvencu koja može da se koristi za rekombinanatnu ekspresiju. Gornji deo slike predstavlja naporedni prikaz nukleotidne sekvence SEQ ID NO: 11 i amino kiselinske sekvence SEQ ID NO: 12. Takođe su identifikovana tri regiona koja determinišu komplementarnost (regioni CDR1, CDR2 i CDR3)
SL. 7 prikazuje nukleotidnu sekvencu i kodiranu amino kiselinsku sekvencu varijabilnog domena teškog (VH) lanca klona 7E3 i lidersku sekvencu koja može da se koristi za rekombinanatnu ekspresiju. Gornji deo slike predstavlja naporedni prikaz nukleotidne sekvence SEQ ID NO: 13 i amino kiselinske sekvence SEQ ID NO: 14. Takođe su identifikovana tri regiona koja determinišu komplementarnost (regioni CDR1, CDR2 i CDR3).
SL. 8 prikazuje nukleotidnu sekvencu i kodiranu amino kiselinsku sekvencu varijabilnog domena lakog (VL) lanca klona 7E3 i lidersku sekvencu koja može da se koristi za rekombinanatnu ekspresiju. Gornji deo slike predstavlja naporedni prikaz nukleotidne sekvence SEQ ID NO: 15 i amino kiselinske sekvence SEQ ID NO: 16. Takođe su identifikovana tri regiona koja determinišu komplementarnost (regioni CDR1, CDR2 i CDR3).
SL. 9 prikazuje nukleotidnu sekvencu i kodiranu amino kiselinsku sekvencu dijatela označenog kao 5B1CysDb, koje ima CDR1, CDR2 i CDR2 i varijabilnog domena teškog (VH) i varijabilnog domena lakog (VL) lanca klona 5B1. Gornji deo slike predstavlja naporedni prikaz nukleotidne sekvence SEQ ID NO: 17 i amino kiselinske sekvence SEQ ID NO: 18. Tri regiona za određivanje komplementarnosti (regioni CDR1, CDR2 i CDR3) i za VH i za VL domen, naznačeni su podebljanim i podvučenim tekstom. Linkerska sekvenca i polihistdinski marker (Poly His-Tag) sa dodatim amino kiselinama takođe su naznačeni kurzivom i podvučenim tekstom.
SL. 10 prikazuje nukleotidnu sekvencu i kodiranu amino kiselinsku sekvencu dijatela označenog kao 7E3CysDb, koje ima CDR1, CDR2 i CDR2 i varijabilnog domena teškog (VH) i varijabilnog domena lakog (VL) lanca klona 7E3. Gornji deo slike predstavlja naporedni prikaz nukleotidne sekvence SEQ ID NO: 19 i amino kiselinske sekvence SEQ ID NO: 20. Tri regiona za određivanje komplementarnosti (regioni CDR1, CDR2 i CDR3) i za VH i za VL domen, naznačeni su podebljanim i podvučenim tekstom. Linkerska sekvenca i polihistdinski marker (Poly His-Tag) sa dodatim amino kiselinama takođe su naznačeni kurzivom i podvučenim tekstom.
SL. 11, paneli A-E, prikazuju vezivanje humanog anti-sLe<a>antitela za tumorske ćelije, analizirano protočnom citometrijom. Panel A prikazuje DMS-79 ćelije obojene rekombinanatnim (r) 5B1, 9H3, 5H11 i 7E3 antitelima. Paneli B-F redom prikazuju HT29, BxPC3, SW626, SK-MEL28, i Colo205-luc ćelije obojene sa 1-2 µg/mL r5B1 ili r7E3 plus IgG ili IgM-specifično sekundarno antitelo, kao što je opisano u Primeru I.
SL. 12, paneli A i B, prikazuju CDC aktivnost r5B1 i r7E3 antitela u poređenju sa mišjim 121SLE (IgM) u prisustvu humanog komplementa (Hu C’), mereno delovanjem na DMS-79 ćelije. Humana antitela za kontrolu izotipa, Hu IgG (◊) i Hu IgM (♦) pokazala su <4% citotoksičnosti. Dozni odgovor za r5Bl IgG (■), r7E3 IgM (•) i 121SLE mIgM (▲) antitela prikazan je u panelu A. Izračunate vrednosti EC50 (µg/ml) za r5B1 (IgG), r7E3 (IgM) i 121SLE (mIgM) antitela prikazane su u panelu B.
SL. 13, paneli A-C, prikazuju antitelo-zavisnu ćelijski posredovanu citotoksičnost (ADCC) zavisnu od antitela r5B1. Panel A prikazuje r5B1-posredovanu ADCC sa humanim PBMC ćelijama protiv DMS-79 ćelija. PBMC ćelije su testirane pri E:T odnosima od 100:1 do 12.5:1 sa DMS-79 tumorskim ćelijama u prisustvu i odsustvu 2 µg/mL r5B1. Panel B prikazuje r5B1-posredovanu ADCC sa primarnim humanim NK ćelijama protiv DMS-79 ćelija. NK ćelije su testirane pri nižim E:T odnosima od 5:1 do 0.6:1, sa DMS-79 tumorskim ćelijama u prisustvu i odsustvu 2 µg/mL r5B1. Panel C prikazuje ADCC antitela r5B1 pri različitim koncentracijama sa PBMC ćelijama od 2 donora, pri E:T odnosu od 1:100, sa DMS-79 tumorskim ćelijama u prisustvu naznačenih koncentracija r5B 1.
SL. 14 prikazuje internalizaciju sLe<a>u BxPC3 ćelije. BxPC3 tumorske ćelije pankreasa su gajene u prisustvu antitela r5B1 (anti-sLe<a>) ili r1B7 (anti-GD2) kompleksovanih sa Hum-ZAP, saporin-konjugovanim anti-humanim IgG. Nakon 3 dana, vijabilnost ćelija je merena upotrebom testa sa 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolijum bromidom (MTT), a vrednosti za uzorke su normalizovane pomoću vrednosti za netretirane kulture.
SL. 15 prikazuje aktivnost r5B1 antitela u modelu ksenografta upotrebom Colo205-luc ćelija. Miševi sa teškom kombinovanom imunodeficijencijom (SCID) (5 po grupi) primili su 0.5 miliona Colo205-luc ćelija injekcijom u repnu venu na dan 0. Miševi su primili po 100 µg r5B1 putem intraperitonealne injekcije 1., 7., 14. i 21. dana (eksperiment 1, Exp 1) ili 1., 4., 7., 10., 14. i 21.dana (eksperiment 2, Exp 2) do ukupne doze od 600 µg. Kontrolne (kontr.) životinje su primile placebo injekcije PBS rastvora.
SL. 16 prikazuje efekat antitela r5B1 na Colo205-luc tumore u SCID miševima. Miševi su primili 100 µg (▼), 300 µg (■) or 1 mg (♦) r5B1 antitela po injekciji, kao što je opisano u Primeru I. Kontrolne (■) životinje su primile placebo injekcije PBS rastvora.
SL. 17 prikazuje fluorescentne slike pet miševa po grupi za miševe koji su tretirani sa r5B1 a koji imaju Colo205-luc tumore, snimljene 0. dana i 5. nedelje. Miševi su primili tretman po režimu koji je prikazan na SL.16 i opisan u Primeru I.
SL. 18, paneli A i B, prikazuje anti-tumorsku aktivnost u terapeutskom potkožnom modelu ksenografta upotrebom DMS-79 ćelija. Panel A prikazuje supresiju ili regresiju kod miševa koji su tretirani sa 5B 1 (samo 5B1 (▲) ili 5B1 cRGD (▼)) u poređenju sa humanim IgG (samo IgG (♦) ili IgG cRGD (●)) i kontrolom (■) kojoj je injeciran PBS. Strelice označavaju dane kada su antitelo ili PBS injecirani. Panel B prikazuje reprezentativne slike tretiranih miševa. Strelice označavaju osustvi bilo kakvog vizuelnog tumora.
SL. 19, paneli A-F, prikazuje vezivanje 5B1 za različite tipove tumora. Panel A je duktalni adenokarcinom pankreasa, tumor stadijuma III. Panel B je sigmoidni kolon, karcinom tumor stadijuma IIIB. Panel C je adenokarcinom pluća, tumor stadijuma IB. Panel D je mucinozni adenokarcinom mokraćne bešike, tumor stadijuma IV. Panel E je jajnik, metastatski karcinom debelog creva. Panel F je metastatski karcinom limfnog čvora, tumor stadijuma IIIA.
SL. 20 prikazuje serijske PET projekcije maksimalnog intenziteta (MIP) slike dobijene od 2-120 h sa 89Zr radioaktivno obeleženo-5B1 antitelo (<89>Zr-5B1) intravenskom primenom kod ženki SCID miševa subkutano implantiranim sa BxPC3 tumorima pankreasa. Snimanje PET-MIP pokazuje visoko preuzimanje u tumoru uz uklanjanje nespecifično vezanog trejsera već 24 sata nakon injekcije (h p.i.)
SL. 21 prikazuje rezultate biološke distribucije koji se slažu sa PET podacima SL. 20, sa primećenim unosom tumora od 84,73612,28% ID/g. Zbog malih težina tumora, grafikon umetanja prikazuje grafikon unosa tumora izražen kao % ID u odnosu na vreme. ID% tumora pokazuje značajno preuzimanje tumor od<89>Zr-5B1 u svim vremenskim tačkama, i najmanje je sedmostruko veći od nespecifičnog<89>Zr-IgG. Konkurentska inhibicija hladnim 5B1 (200 mg) pokazuje smanjenje akumulacije tumora.
SL. 22, paneli A-C, prikazuju PET-MIP slike miševva koji nose DMS79 (Panel A) i Colo205-luc ksenografte (Panel B). Označeni su delineacija tumora (T), srca (H) I jetre (L) PET-MIP snimanjem pomoću<89>Zr-5B1 Model kolorektalnog ksenografta Colo205-luc pokazuje da akumulacija<89>Zr-5B1 postiže najvišu vrednost posle 24 h, koja na kraju opada dok se uočava porast nespeciifčnog vezivanja za jetru (Panel C).
SL. 23 prikazuje dozno zavisnu inhibiciju i regresiju rasta tumora u DMS-79 modelu ksenografta sitnoćelijskog carcinoma pluća koji je tertian uzastopnom koadministracijom antitela 5B1 i taksola (Paklitaksel). Velike strelice na X osi označavaju 5B1 tretman. Koadministracija 5B 1 antitela i taksola značajno je ograničila rast tumora i dovela do regresije tumora u poređenju sa IgG (HuIgG) ili 5B 1 antitelom i taksolom kada se daju pojedinačno. Značajne razlike u odnosu na kontrolu putem ANOVA pri p<0.01 (**) and p<0.001 (***) are indicated. N=5.
SL. 24 prikazuje inhibiciju rasta tumora u BxPc3 modelu ksenografta, karcinomu pankreasa, koji je tertian sukcesivnom zajedničkom primenom atitela 5B1 antitela I taksola (Paklitaksel). Velike strelice na X osi označavaju taksol plus 5B1 tretman, dok male strelice označavaju samo 5B1 tretman. Zajednička primena 5B1 antitela i taksola značajno je ograničila rast tumora u poređenju sa kontrolama (PBS – kontr.; humani IgG - HuIgG) ili 5B 1 antitelom i taksolom, kad su primenjeni pojedinačno.
SL. 25, paneli A and B, prikazuju reprezentativne slike miševa kojima su ortotopno transplantirani ksenografti BxPC3-luc tumora pankreasa. Panel A: Istovremeno snimanje FDG-PET i kompjuterizovane tomografije (CT) (levo) i planarni preseci samo FDG-PET (desno) prikazali su minimalnu detekciju trejsera u tumoru sa intenzivnim preuzimanjem u tkivima sa intenzivnom metaboličkom aktivnošću (tj. srce, H i bešika, B). Panel B: Snimljena PET slika sa<89>Zr radioaktivno obeleženim-5B1 antitelom (<89>Zr-5B1) istog miša, koja je istovremeno snimljena i putem CT,3 prikazala je izuzetnu detekciju tumora kod BxPC3-luc tumorskog ksenografta.
DETALJAN OPIS
[0014] Ugljeni hidrati eksprimirani na površini tumorske ćelije mogu da budu ciljni molekuli za pasivnu imunoterapiju. Ovde obezbeđene kompozicije baziraju se, najmanje delimično, na identifikaciji i karakterizaciji humanih antitela koja smo generisali od limfocita iz krvi osoba imunizovanih sa sijalil-Luis<a>-hemocijanin prilepka (sLe<a>-KLH) konjugovanom vakcinom. identifikovana su najmanje četiri antitela sa visokim afinitetom za sLe<a>(5B1, 9H3, 5H11 i 7E3). Dva od ovih antitela su eksprimirana kao rekombinantna antitela (r5B1 i r7E3) i dalje okarakterisana u in vitro i in vivo modelima. Ova antitela su bila potentna u testovima komplement-zavisne citotoksičnosti (CDC), a 5B1 antitelo je takođe bilo vrlo aktivno u testovima antitelo-zavisne citotoksičnosti. In vivo efikasnost antitela je testirana u dva modela ksenografta, upotrebom Colo205 tumorskih ćelija ili DMS-79 tumorskih ćelija implantiranih u miševe sa teškom kombinovanom imunodeficijencijom (SCID). Translacioni značaj ovde obezbeđenih uputstava je dvostruk: Prvo, ovde obezbeđeni pristup pokazuje da je odgovor pokrenut sLe<a>-KLH vakcinom koristan kao i sama vakcina. Drugo, najpotentnija antitela koja su generisana tokom kliničkog ispitivanja mogu da se očuvaju i da se na kraju koriste kao terapeutska sredstva, ili za generisanje terapeutskih sredstava za populaciju sa ciljnim kancerom. Visok afinitet ovde obezbeđenih antitela i njihove intenzivne efektorske funkcije govore u prilog ovom translacionom potencijalu.
[0015] Kako se ovde koristi, predviđeno je da izraz "antitelo" označava polipeptidni proizvod B ćelija u okviru imunoglobulinske klase polipeptida koji može da se veže za specifični molekulski antigen i sastavljen je od dva identična para polipetidnih lanaca, gde svaki par ima jedan teški lanac (oko 50-70 kDa) i jedan laki lanac (oko 25 kDa) i svaki amino-terminalni deo svakog lanca uključuje varijabilni region od oko 100 do oko 130 ili više amino kiselina i svaki karboksiterminalni deo svakog lanca uključuje konstantni region (videti Borrebaeck (ed.) (1995) Antibody Engineering, Second Edition, Oxford University Press.; Kuby (1997) Immunology, Third Edition, W.H. Freeman and Company, New York). U kontekstu predmetnog uputstva, specifični molekulski antigen koga može da veže antitelo prema uputstvu, uključuje ciljni ugljeni hidrat sLe<a>.
[0016] Izraz "humano" kada se koristi u odnosu na antitelo ili njegov funkcionalni fragment odnosi se na antitelo ili njegov funkcionalni fragment koji ima promenljivi region čoveka i/ili konstantni region čoveka ili njegov deo koji odgovara sekvencama imunoglobulina humane klicine linije. Takve sekvence imunoglobulina humanih klica opisali su Kabat et al. (1991) Sekvence proteina od imunološkog interesa, peto izdanje, Ministarstvo zdravlja i socijalne zaštite SAD, Publikacija NIH br. 91-3242. Ljudsko antitelo, u kontekstu ovog učenja, može da sadrži antitelo koje se vezuje za sLea i kodirano je sekvencom nukleinske kiseline koja je prirodna somatska varijanta sekvence nukleinske kiseline imunoglobulina humanog klica. Primerni postupci za proizvodnju humanih antitela su dati u Primeru I, ali može se koristiti bilo koji postupak dobro poznat stručnjacima.
[0017] Izraz "monoklonsko antitelo" odnosi se na antitelo koje je proizvod jednog ćelijskog klona ili hibridoma ili populacije ćelija izvedenih iz jedne ćelije. Monoklonsko antitelo takođe treba da se odnosi na antitelo proizvedeno rekombinantnim metodama iz teškog i lakog lanca koji kodiraju imunoglobulinske gene da bi proizvelo jednu molekularnu vrstu imunoglobulina. Sekvence aminokiselina za antitela u preparatu za monoklonska antitela su u osnovi homogene i aktivnost vezivanja antitela u takvom preparatu pokazuje u osnovi istu aktivnost vezivanja za antigen. Nasuprot tome, poliklonska antitela se dobijaju iz različitih B ćelija unutar populacije, koje su kombinacija molekula imunoglobulina koji vezuju specifični antigen. Svaki imunoglobulin poliklonskih antitela može da veže različiti epitop istog antigena. Postupci za proizvodnju monoklonskih antitela i poliklonalnih antitela su dobro poznati u struci (Harlow i Lane., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) i Borrebaeck (ed.), Antibodies Engineering: A Practical Guide, W.H. Freeman and Co., Publishers, New York, pp.103-120 (1991)).
[0018] Kako se ovde koristi, izraz "funkcionalni fragment" kada se koristi u odnosu na antitelo podrazumeva deo antitela koji uključuje polipeptide teškog ili lakog lanca koji zadržava deo ili celokupnu vezujuću aktivnost kao antitelo iz kojeg je fragment izveden. Takvi funkcionalni fragmenti mogu da uključuju, na primer, Fd, Fv, Fab, F (ab’), F (ab) 2, F (ab’)2, jednolančani Fv (scFv), dijatelo, triatelo, tetratelo i mini telo. Drugi funkcionalni fragmenti mogu da uključuju, na primer, polipeptide teškog ili lakog lanca, polipeptide promenljivog regiona ili CDR polipeptide ili njihove delove sve dok takvi funkcionalni fragmenti zadržavaju vezujuću aktivnost. Takvi fragmenti koji se vezuju za antitela mogu se naći opisani u, na primer, u Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989); Myers (ed.), Molec. Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference, New York:
1
VCH Publisher, Inc.; Huston et al., Cell Biophysics, 22:189-224 (1993); Plückthun and Skerra, Meth. Enzymol., 178:497-515 (1989) kao i u Day, E.D., Advanced Immunochemistry, Second Ed., Wiley-Liss, Inc., New York, NY (1990).
[0019] Izraz "teški lanac" kada se koristi u odnosu na antitelo odnosi se na polipeptidni lanac od oko 50-70 kDa, pri čemu amino-terminalni deo uključuje promenljivi region od oko 120 do 130 ili više aminokiselina i karboksi-terminalni deo to uključuje konstantni region. Konstantni region može da bude jedan od pet različitih tipova, koji se nazivaju alfa (α), delta (δ), epsilon (ε), gama (γ) i mu (µ), na osnovu aminokiselinske sekvence konstante teškog lanca region. Različiti teški lanci se razlikuju po veličini: α, δ i γ sadrže približno 450 aminokiselina, dok µ i ε sadrže približno 550 aminokiselina. U kombinaciji sa lakim lancem, ovi različiti tipovi teških lanaca daju pet dobro poznatih klasa antitela, IgA, IgD, IgE, IgG i IgM, respektivno, uključujući četiri podklase IgG, tačnije IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4. Teški lanac može da bude humani teški lanac.
[0020] Izraz "laki lanac" kada se koristi u odnosu na antitelo odnosi se na polipeptidni lanac od oko 25 kDa, pri čemu amino-terminalni deo uključuje promenljivi region od oko 100 do oko 110 ili više aminokiselina i karboksi-terminalni deo koji uključuje konstantni region. Približna dužina lakog lanca je 211 do 217 aminokiselina. Postoje dva različita tipa, koja se nazivaju kapa (κ) ili lambda (λ) na osnovu aminokiselinske sekvence konstantnih domena. Sekvence aminokiselina lakog lanca su dobro poznate u tehnici. Laki lanac može da bude humani laki lanac.
[0021] Izraz "promenljivi domen" ili "promenljivi region" odnosi se na deo lakih ili teških lanaca antitela koji se generalno nalazi na amino-kraju lakog ili teškog lanca i ima dužinu od oko 120 do 130 aminokiselina u teškom lancu i oko 100 do 110 aminokiselina u lakom lancu i koriste se u vezivanju i specifičnosti svakog određenog antitela za njegov određeni antigen. Varijabilni domeni se uveliko razlikuju u nizu između različitih antitela. Varijabilnost u nizu koncentrisana je u CDR-ima, dok se manje promenljivi delovi u promenljivom domenu nazivaju okvirnim regionima (FR). CDR-ovi lakog i teškog lanca prvenstveno su odgovorni za interakciju antitela sa antigenom. Brojanje položaja aminokiselina koji se ovde koriste je prema EU indeksu, kao u Kabat et al. (1991) Sequences of proteins of immunological interest. (U.S. Department of Health and Human Services, Washington, D.C.) 5th ed. Varijabilni region može da bude humani varijabilni region.
[0022] CDR se odnosi na jedan od tri hipervarijabilna regiona (H1, H2 ili H3) unutar neokvirnog regiona imunoglobulinske VH (Ig ili antitelo) β-ploče ili jedan od tri hipervarijabilna regiona (L1, L2 ili L3) unutar neokvirni region okvira VL β-ploče antitela. Shodno tome, CDR su sekvence promenljivog regiona prošarane unutar sekvenci okvirnog regiona. CDR regioni su dobro poznati stručnjacima i, na primer, Kabat ih je definisao kao regione sa najviše hipervarijabilnosti u domenima varijabilnih antitela (V) (Kabat et al., J. Biol. Chem. 252: 66096616 (1977); Kabat, Adv. Prot. Chem. 32: 1-75 (1978)). Chothia je takođe strukturno definisao sekvence CDR regiona kao one ostatke koji nisu deo očuvanog okvira β-ploče, i stoga su sposobni da prilagode različite konformacije (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)). Obe terminologije su dobro prepoznate u tehnici. Položaji CDR regiona unutar kanonskog promenljivog domena antitela određeni su upoređivanjem brojnih struktura (Al-Lazikani et al., J. Mol. Biol. 273: 927-948 (1997); Morea et al., Metode 20: 267 -279 (2000)). Budući da se broj ostataka unutar hipervarijabilnog regiona razlikuje kod različitih antitela, dodatni ostaci u odnosu na kanonske položaje konvencionalno se numerišu sa a, b, c i tako dalje pored broja ostataka u šemi kanonskog promenljivog numerisanja domena (Al-Lazikani et al., supra (1997). Takva nomenklatura je na sličan način dobro poznata stručnjacima.
[0023] Na primer, CDR regioni definisani prema označavanju, bilo po autoru Kabat (hiperavarijalbilni), bilo po autoru Chothia (strukturni), izloženi su u Tabeli 1 koja sledi.
Tabela 1: Definicije CDR
Kabat<1>Chothia<2>Lokacija petlje
VHCDR1 31-35 26-32 Povezuje B i C lance
VHCDR2 50-65 53-55 Povezuje C’ i C’’ lance
VHCDR3 95-102 96-101 Povezuje F i G lance
VLCDR1 24-34 26-32 Povezuje B i C lance
VLCDR2 50-56 50-52 Povezuje C’ i C’’ lance
VLCDR3 89-87 91-96 Povezuje F i G lance Numeracija ostataka prati nomenklaturu po Kabat et al., supra
Numeracija ostataka prati nomenklaturu po Chothia et al., supra
[0024] Jedan ili više CDR regiona takođe se mogu ugraditi u molekul ili kovalentno ili nekovalentno, da bi postao imunoadhezin. Imunoadhezin može da uključi CDR regione kao deo većeg polipeptidnog lanca, može kovalentno da poveže CDR regione sa drugim polipeptidnim lancem ili može da uključi CDR (e) nekovalentno. CDR regioni omogućavaju imunoadhezinu da se veže za određeni antigen od interesa.
[0025] Kako se ovde koristi, izraz "izolovan" kada se koristi u odnosu na antitelo, funkcionalni fragment antitela ili polinukleotid podrazumeva da molekul na koji se odnosi sadrži najmanje jednu komponentu koja se nalazi u prirodi. Izraz uključuje antitelo, funkcionalni fragment antitela ili polinukleotid koji se uklanja iz nekih ili svih drugih komponenti, jer se nalazi u svom prirodnom okruženju. Komponente prirodnog okruženja antitela uključuju, na primer, eritrocite, leukocite, trombocite, plazmu, proteine, nukleinske kiseline, soli i hranljive materije. Komponente prirodnog okruženja funkcionalnog fragmenta antitela ili polinukleotida uključuju, na primer, lipidne membrane, ćelijske organele, proteine, nukleinske kiseline, soli i hranljive materije. Antitelo, fragment funkcionalnog antitela ili polinukleotid iz uputstva, takođe mogu da budu slobodni ili u potpunosti oslobođeni svih ovih komponenti ili bilo koje druge komponente ćelija iz kojih su izolovani ili rekombinantno proizvedeni.
[0026] Kako se ovde koristi, "izotip" se odnosi na klasu antitela koja je kodirana genima konstantnog regiona teškog lanca. Teški lanci datog antitela ili funkcionalnog fragmenta određuju klasu tog antitela ili funkcionalnog fragmenta: IgM, IgG, IgA, IgD ili IgE. Svaka klasa može da imati ili κ lanac ili λ lanac. Izraz "potklasa" odnosi se na manje razlike u aminokiselinskim sekvencama teških lanaca koje razlikuju potklase. Kod ljudi postoje dve potklase IgA (potklase IgA1 i IgA2) i postoje četiri podklase IgG (potklase IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4). Takve klase i potklase dobro su poznate stručnjacima u oblasti.
[0027] Termini "vezuje" ili "vezujući", kako se ovde koriste, odnose se na interakciju između molekula da bi se stvorio kompleks. Interakcije mogu biti, na primer, nekovalentne interakcije, uključujući vodonične veze, jonske veze, hidrofobne interakcije i/ili van der Valsove interakcije. Kompleks takođe može da uključuje vezivanje dva ili više molekula koji su zajedno povezani kovalentnim ili nekovalentnim vezama, interakcijama ili silama. Vezivanje antitela ili njegovog funkcionalnog fragmenta može se otkriti korišćenjem, na primer, enzimski vezanog imunosorbant testa, postupka iz Primera I ili bilo kog od brojnih postupaka koji su dobro poznati stručnjacima u ovoj oblasti.
[0028] Jačina ukupnih nekovalentnih interakcija između jednog mesta za vezivanje antigena na antitelu ili funkcionalnom fragmentu i jednog epitopa ciljnog molekula, kao što je sLe<a>, je afinitet antitela ili funkcionalnog fragmenta za taj epitop. Odnos asocijacije (k1) i disocijacije (k-
1) antitela ili njegovog funkcionalnog fragmenta prema monovalentnom antigenu (k1/k-1) je konstanta asocijacije K, koja je mera afiniteta. Vrednost K varira za različite komplekse antitela ili funkcionalnog fragmenta i antigena i zavisi i od k1i od k-1. Konstanta asocijacije K za antitelo ili funkcionalni fragment prema uputstvu može se odrediti korišćenjem bilo kog ovde datog postupka ili bilo kog drugog postupka dobro poznatog stručnjacima u ovoj oblasti.
[0029] Afinitet na jednom mestu vezivanja ne odražava uvek stvarnu snagu interakcije između antitela ili funkcionalnog fragmenta i antigena. Kada složeni antigeni koji sadrže višestruke, ponavljajuće antigenske odrednice, poput polivalentne sLe<a>, dođu u kontakt sa antitelima koja sadrže više mesta vezivanja, interakcija antitela ili funkcionalnog fragmenta sa antigenom na jednom mestu povećaće verovatnoću reakcije na drugom mestu. Snaga takvih višestrukih interakcija između multivalentnog antitela i antigena naziva se aviditetom. Aviditet antitela ili funkcionalnog fragmenta može da bude bolja mera njegovog vezivnog kapaciteta nego afinitet njegovih pojedinačnih mesta vezivanja.
1
[0030] Na primer, velika aviditet može nadoknaditi nizak afinitet kao što se to ponekad može naći za pentamerna IgM antitela, koja mogu imati niži afinitet od IgG, ali velika aviditet IgM, koja je rezultat njegove multivalentnosti, omogućava mu efikasno vezivanje antigena.
[0031] Specifičnost nekog antitela ili njegovog funkcionalnog fragmenta odnosi se na sposobnost antitela ili njegovog funkcionalnog fragmenta da reaguje samo sa jednim antigenom. Može da se smatra da je neko antitelo ili njegov funkcionalni fragment specifičan kada mogu da prepoznaju različitosti u primarnoj, sekundarnoj ili tercijarnoj strukturi antigena ili izomernih oblika antigena.
[0032] Izraz "polinukleotid" odnosi se na polimerni oblik nukleotida bilo koje dužine, bilo deoksiribonukleotide ili ribonukleotide ili njihove analoge. Sekvenca polinukleotida sastoji se od četiri nukleotidne baze: adenin (A); citozin (C); guanin (G); timin (T); i uracil (U) za timin kada je polinukleotid RNK. Prema tome, izrazi "nukleotidna sekvenca" ili "sekvenca nukleinske kiseline" predstavljaju abecedni prikaz polinukleotida. Polinukleotid može da sadrži gen ili fragment gena (na primer, proba, prajmer, EST ili SAGE oznaka), egzone, introne, informacionu RNK (mRNK), transportnu RNK, ribozomalnu RNK, ribozime, cDNK, rekombinantne polinukleotide, razgranate polinukleotide, plazmidi, vektori, izolovana DNK bilo koje sekvence, izolovana RNK bilo koje sekvence, sonde nukleinske kiseline i prajmeri. Polinukleotid se takođe odnosi na dvolančane i jednolančane molekule. Ako nije drugačije naznačeno ili zahtevano, bilo koje ostvarenje ovog učenja koje je polinukleotid obuhvata i dvolančani oblik i svaki od dva komplementarna jednolančana oblika za koja je poznato ili se predviđa da čine dvolančani oblik. Podrazumeva se da su ovde opisani izolovani polinukleotidi i nukleinske kiseline usmereni na polinukleotide i nukleinske kiseline koji se ne pojavljuju u prirodi. Polinukleotidi i nukleinske kiseline koji se ne pojavljuju u prirodi mogu da uključuju, ali nisu ograničeni na, cDNK i hemijski sintetisane molekule.
[0033] Izraz "kodiranje" ili njegovi gramatički ekvivalenti, kako se koristi u odnosu na polinukleotide, odnosi se na polinukleotid u svom izvornom stanju ili kada se njime manipuliše metodama dobro poznatim stručnjacima koji mogu da se transkribuju u mRNK, koji se zatim prevode u polipeptid i/ili njegov fragment. Antisens lanac je komplement takvog polinukleotida i iz njega se može izvesti kodirajuća sekvenca.
[0034] Fraza "terapeutsko sredstvo" odnosi se na bilo koje sredstvo koje može da se koristi za lečenje, regulisanje ili poboljšanje bolesti u vezi sa sLe<a>i/ili simptoma u vezi sa njom. U nekim primerima izvođenja, terapeutsko sredstvo se odnosi na antitelo ili funkcionalni fragment prema uputstvima. U nekim primerima izvođenja, terapeutsko sredstvo se odnosi na sredstvo koje nije antitelo ili funkcionalni fragment prema uputstvima. Terapeutsko sredstvo može da bude sredstvo za koje se dobro zna da je korisno za, ili koje se koristilo ili se trenutno koristi za lečenje, regulisanje ili poboljšanje bolesti u vezi sa ekspresijom sLe<a>i/ili jednog ili više simptoma u vezi sa njom.
[0035] Fraza „dijagnostički agens“ odnosi se na supstancu koja se daje subjektu koji pomaže u dijagnozi bolesti. Takve supstance se mogu koristiti za otkrivanje, određivanje i/ili definisanje lokalizacije procesa koji uzrokuje bolest. U određenim realizacijama, dijagnostički agens uključuje supstancu koja je konjugovana sa antitelom ili funkcionalnim fragmentom uputstva, koja kada se daje subjektu ili kontaktira uzorak sa subjektom, pomaže u dijagnozi raka ili stvaranja tumora.
[0036] Fraza „sredstvo za detekciju“ odnosi se na supstancu koja se može koristiti za utvrđivanje postojanja ili prisustva željenog molekula, kao što je antitelo ili funkcionalni fragment prema uputstvu, u uzorku ili predmetu. Sredstvo za detekciju može da bude supstanca koja se može vizualizovati ili supstanca koju je na drugi način moguće odrediti i/ili izmeriti (npr. kvantifikacijom).
[0037] „Efektivna količina“ je količina dovoljna za postizanje korisnih ili željenih rezultata. Efikasna količina se može primeniti u jednoj ili više primena, aplikacija ili doza. Takva isporuka zavisi od velikog broja promenljivih, uključujući vremenski period za koji pojedinačna jedinica doze treba da se koristi, bioraspoloživost agensa, način primene itd.
[0038] Fraza "terapeutski efikasna količina", kako se ovde koristi, odnosi se na količinu terapeutskog agensa (npr. antitela ili funkcionalnog fragmenta ovde obezbeđenog ili bilo kog drugog terapeutskog agensa koji je ovde dat) koja je dovoljna da smanji i/ili ublaži težinu i/ili trajanje date bolesti i/ili s tim povezani simptom. Terapeutski efikasna količina terapijskog sredstva može da bude količina neophodna za smanjenje ili poboljšanje napredovanja ili napredovanja date bolesti, smanjenje ili poboljšanje recidiva, razvoja ili početka date bolesti, i/ili za poboljšanje ili poboljšanje profilaktički ili terapeutski efekat druge terapije (npr. terapije koja nije primena ovde datog antitela ili funkcionalnog fragmenta).
[0039] Jedinjenje "sijalil-Luis<a>" (sLe<a>), poznato i kao Le<a>, sijalil-Luis A, sijalizovani Luis a i CA 19.9, je tetrasaharid sa molekulskom formulom C31H52N2O23i molarnom masom od 820.74 g/mol. Struktura sLe<a>može da uključuje Neu5Acα2-3Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAcβ i Neu5Gcα2-3Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAcβ. sLe<a>je intenzivno eksprimiran na tumorima gastrointestinalnog trakta i koristi se kao tumor-marker kod kancera pankreasa i debelog creva. sLe<a>je takođe poznati ligand za E-selekciju, označen i kao endotelijalni leukocitni adhzioni molekul (ELAM).
[0040] u nekim primerima izvođenja, ovo uputstvo obezbeđuje izolovani polinukleotid koji kodira teški ili laki lanac antitela ili njegov funkcionalni fragment, pri čemu se antitelo ili njegov funkcionalni fragment generisano korišćenjem teškog ili lakog lanca antitela vezuje za sLea. Shodno tome, u nekim realizacijama, uputstvo pruža izolovani polinukleotid koji kodira antitelo
1
ili njegov funkcionalni fragment, gde antitelo uključuje VH domen koji ima aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od ostataka 20-142 SEQ ID NO: 2 , ostaci 20-142 iz SEQ ID NO: 6, ostaci 20-142 iz SEQ ID NO: 10 i ostaci 20-145 iz SEQ ID NO: 14. Izolovani polinukleotid prema uputstvu takođe može da sadrži sekvence ostataka nukleinske kiseline 58 -426 iz SEQ ID NO: 1, ostatke 58-426 iz SEQ ID NO: 5, ostatke 58-426 iz SEQ ID NO: 9 ili ostatke 58-435 iz SEQ ID NO: 13, pri čemu sekvenca nukleinske kiseline kodira VH domen antitela ili njegovog funkcionalnog fragmenta.
[0041] U još jednom primeru izvođenju prema uputstvu, izolovani polinukleotid može da kodira antitelo ili njegov funkcionalni fragment, pri čemu antitelo uključuje VL domen koji ima aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od ostataka 20-130 iz SEQ ID NO : 4, ostataka 20-129 iz SEQ ID NO: 8, ostataka 20-130 iz SEQ ID NO: 12 i ostataka 23-130 iz SEQ ID NO: 16. Izolovani polinukleotid prema uputstvu takođe može da sadrži sekvencu nukleinske kiseline ostataka 58-390 iz SEQ ID NO: 3, ostataka 58-387 iz SEQ ID NO: 7, ostataka 58 390 iz SEQ ID NO: 11 ili ostataka 67-390 iz SEQ ID NO: 15, pri čemu sekvenca nukleinske kiseline kodira VL domen antitela ili njegovog funkcionalnog fragmenta.
[0042] U još jednom izvođenju, uputstvo obezbeđuje izolovani polinukleotid koji kodira teški ili laki lanac antitela ili njegov funkcionalni fragment, pri čemu teški ili laki lanac antitela ili njegov funkcionalni fragment kodiran polinukleotidom prema uputstvu ima jedan ili više regiona koji određuju komplementarnost (CDR) prikazani na SL. 1-8 ili navedeni u tabeli 2. Antitelo ili njegov funkcionalni fragment koji uključuje jedan ili više CDR-ova može se specifično vezati za sLea kako je ovde opisano. Specifično vezivanje za sLe<a>može da uključuje specifičnost, afinitet i/ili aviditet kako je dato u Primeru I za bilo koje ovde dato antitelo. U drugom aspektu, antitelo ili njegov funkcionalni fragment kodiran polinukleotidima prema uputstvu može da uključuje aktivnost citotoksičnosti zavisne od komplementa (CDC) i/ili aktivnost ćelijske citotoksičnosti (ADCC) zavisnu od antitela bilo kog od klonskih izolata 5B1, 9H3 , 5H11 ili 7E3 ovde opisani. Postupci za procenu specifičnosti, afiniteta i/ili aviditeti antitela ili njegovog funkcionalnog fragmenta dobro su poznati u tehnici i ovde su dati primeri primera.
Tabela 2: CDR regioni klonskih izolata
1
[0043] U nekim primerima izvođenja, antitelo ili njegov funkcionalni fragment prema uputstvu uključuje manje od šest CDR-a. u nekim primerima izvođenja, antitelo ili njegov funkcionalni fragment uključuje jedan, dva, tri, četiri ili pet CDR-a izabranih iz grupe koju čine VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 i/ili VL CDR3. U specifičnim realizacijama, antitelo ili njegov funkcionalni fragment uključuje jedan, dva, tri, četiri ili pet CDR-a izabranih iz grupe koju čine VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 i/ili VL CDR3 klona ovde opisani izolati 5B1, 9H3, 5H11 ili 7E3.
[0044] U nekim primerima izvođenja, uputstvo daje izolovani polinukleotid koji kodira antitelo ili njegov funkcionalni fragment, pri čemu antitelo ili funkcionalni fragment uključuje promenljivi domen teškog (VH) lanca koji ima CDR1, CDR2 i CDR3 aminokiselinsku sekvencu klonskog izolata 5B1, 9H3, 5H11 ili 7E3. Takvi VH domeni mogu da uključuju aminokiselinske ostatke 55-62, 70-77 i 116-131 iz SEQ ID NO: 2, ili alternativno aminokiselinske ostatke 45-52, 70 77 i 116-131 iz SEQ ID NO: 6, ili alternativno aminokiselinski ostaci 45-52, 70-77 i 116131 iz SEQ ID NO: 10, ili alternativno aminokiselinski ostaci 45-52, 70-77 i 116-134 iz SEQ ID NO: 14. U drugom aspektu , nukleotidna sekvenca koja kodira CDR1, CDR2 i CDR3 VH domena može respektivno da uključuje nukleotidnu sekvencu ostataka 133-156, 208-231 i 346-393 iz SEQ ID NO: 1, ili alternativno nukleotidnu sekvencu ostataka 133 156 , 208-231 i 346-393 iz SEQ ID NO: 5, ili alternativno nukleotidna sekvenca ostataka 133-156, 208-231 i 346-393 iz SEQ ID NO: 9, ili alternativno nukleotidna sekvenca ostataka 133-156 , 208-231, 346-402 od SEQ ID NO: 13.
[0045] U još jednom izvođenju, uputstvo daje izolovani polinukleotid koji kodira antitelo ili njegov funkcionalni fragment, pri čemu antitelo uključuje domen promenljivog lakog (VL) lanca koji ima CDR1, CDR2 i CDR3 aminokiselinsku sekvencu klonskog izolata 5B1, 9H3, 5H11 ili 7E3. Takav VL domen može uključivati aminokiselinske ostatke 45-52, 70-72 i 109-120 iz SEQ ID NO: 4, ili alternativno aminokiselinske ostatke 45-52, 70-72 i 109-119 iz SEQ ID NO: 8 , ili alternativno aminokiselinski ostaci 45-52, 70-72 i 109-120 iz SEQ ID NO: 2, ili alternativno aminokiselinski ostaci 49-53, 72-74 i 111-120 iz SEQ ID NO: 16. U drugi aspekt, nukleotidna
1
sekvenca koja kodira CDR1, CDR2 i CDR3 VH domena može respektivno da uključuje nukleotidnu sekvencu ostataka 133-156, 208-216 i 325 360 iz SEQ ID NO: 3, ili alternativno nukleotidnu sekvencu ostataka 133 -156, 208-216 i 325-357 od SEQ ID NO: 7, ili alternativno nukleotidna sekvenca ostataka 134-156, 208-216 i 325-360 od SEQ ID NO: 11, ili alternativno nukleotidna sekvenca ostataka 145 -162, 214-222 i 331-360 od SEQ ID NO: 15
[0046] U još jednom izvođenju, uputstvo pruža varijantu polinukleotida ovde obezbeđenih. Varijanta kada se koristi u odnosu na polinukleotid uključuje polinukleotid koji ima jedan ili više modifikovanih nukleotida, kao što je, ali nije ograničen na, metilirani nukleotid ili nukleotidni analog. Pored toga, varijanta polinukleotida može sadržati polinukleotid koji je prekinut nenukleotidnim komponentama. Modifikacije polinukleotida mogu se dati pre ili posle sastavljanja polinukleotida korišćenjem postupaka dobro poznatih stručnjacima. Na primer, polinukleotid se može modifikovati nakon polimerizacije konjugacijom sa komponentom za obeležavanje korišćenjem bilo enzimskih ili hemijskih tehnika (npr., kako je opisano u Gottfried i Veinhold, 2011, Biochem. Soc. Trans., 39 (2): 523-628; Paredes et al., 2011, Methods, 54 (2): 251-259).
[0047] Polinukleotidi se mogu dobiti i odrediti nukleotidna sekvenca polinukleotida bilo kojim postupkom dobro poznatim u tehnici. Budući da su poznate aminokiselinske sekvence promenljivih domena teškog i lakog lanca 5B1, 9H3, 5H11 i 7E3 (videti, npr., SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 i 16), nukleotid sekvence koje kodiraju antitela i modifikovane verzije ovih antitela mogu se odrediti korišćenjem postupaka dobro poznatih u struci, tj. nukleotidni kodoni za koje je poznato da kodiraju određene aminokiseline sastavljeni su na takav način da generišu nukleinsku kiselinu koja kodira antitelo. Takav polinukleotid koji kodira antitelo može se sastaviti od hemijski sintetisanih oligonukleotida (npr. Kako je opisano u Kutmeier et al., 1994, BioTechnikues 17: 242), koji ukratko uključuje sintezu preklapajućih se oligonukleotida koji sadrže delove sekvence koja kodira antitelo , fragmenti ili njihove varijante, žarenje i ligovanje tih oligonukleotida, a zatim amplifikacija ligovanih oligonukleotida pomoću PCR.
[0048] Polinukleotid koji kodira antitelo ili njegov funkcionalni fragment prema uputstvu može se generisati korišćenjem sekvence nukleinske kiseline promenljivih domena teškog i/ili lakog lanca izolata 5B1, 9H3, 5H11 ili 7E3 (npr. SEQ ID NOS: 1, 3 , 5, 7, 9, 11, 13 i 15). Nukleinska kiselina koja kodira antitelo ili njegov funkcionalni fragment može se hemijski sintetizovati ili dobiti iz pogodnog izvora (npr. CDNK izolovana iz ćelija koje eksprimiraju antitelo ili njegov funkcionalni fragment, kao što su ćelije hibridoma odabrane za ekspresiju antitela ili njegovog funkcionalnog fragmenta) pomoću PCR-a amplifikacija upotrebom sintetičkih prajmera koji se hibridizuju na 3'i 5' krajeve sekvence ili kloniranjem upotrebom oligonukleotidne sonde specifične za određenu sekvencu nukleinske kiseline. Amplifikovane nukleinske kiseline
1
generisane pomoću PCR mogu se zatim klonirati u replicirajuće vektore kloniranja koristeći bilo koji postupak dobro poznat u struci.
[0049] U nekim primerima izvođenja, ovo uputstvo daje izolovano antitelo ili njegov funkcionalni fragment, gde se antitelo vezuje za sLea. Shodno tome, u nekim aspektima, uputstvo daje izolovano antitelo ili njegov funkcionalni fragment koji se vezuje za sLea, pri čemu antitelo ili njegov funkcionalni fragment uključuje VH domen koji ima aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od ostataka 20-142 od SEQ ID NO: 2, ostaci 20-142 od SEQ ID NO: 6, ostaci 20-142 od SEQ ID NO: 10 i ostaci 20-145 od SEQ ID NO: 14.
[0050] u nekim primerima izvođenja, uputstvo daje izolovano antitelo ili njegov funkcionalni fragment koji se vezuje za sLea, pri čemu antitelo ili njegov funkcionalni fragment uključuje VL domen koji ima aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od ostataka 20-130 SEQ ID NO: 4, ostaci 20-129 od SEQ ID NO: 8, ostaci 20-130 od SEQ ID NO: 12 i ostaci 23-130 od SEQ ID NO: 16.
[0051] U nekim primerima izvođenja, uputstvo daje izolovano antitelo ili njegov funkcionalni fragment koji se vezuje za sLea, pri čemu antitelo ili njegov funkcionalni fragment uključuje i VH domen i VL domen, gde VH domen i VL domen uključuju aminokiselinsku sekvencu izabrani iz grupe koja se sastoji od ostataka 20-142 od SEQ ID NO: 2 i ostataka 20-130 od SEQ ID NO: 4; ostaci 20-142 od SEQ ID NO: 6 i ostaci 20-129 od SEQ ID NO: 8; ostaci 20-142 od SEQ ID NO: 10 i ostaci 20-130 od SEQ ID NO: 12; i ostaci 20-145 od SEQ ID NO: 14 i ostaci 23-130 od SEQ ID NO: 16.
[0052] U nekim primerima izvođenja, da bi se vezalo za sLe<a>, antitelo ili njegov funkcionalni fragment prema uputstvu ima jedan ili više CDR-a prikazanih na sl. 1-8 ili navedeni u tabeli 2. Antitelo ili njegov funkcionalni fragment koji uključuje jedan ili više CDR-a, posebno CDR3, mogu se specifično vezati za sLe<a>kako je ovde opisano. Specifično vezivanje za sLea može da uključuje specifičnost i afinitet kako je dato u Primeru I za bilo koje ovde dato antitelo. U nekim aspektima, antitelo ili njegov funkcionalni fragment može sadržati CDC aktivnost i/ili ADCC aktivnost bilo kog od ovde opisanih klonskih izolata 5B1, 9H3, 5H11 ili 7E3.
[0053] U nekim primerima izvođenja, uputstvo daje izolovano antitelo ili njegov funkcionalni fragment, gde antitelo uključuje domen VH lanca koji ima CDR1, CDR2 i CDR3 aminokiselinsku sekvencu klonskog izolata 5B1, 9H3, 5H11 ili 7E3. Takvi VH domeni mogu da uključuju aminokiselinske ostatke 55-62, 70-77 i 116-131 iz SEQ ID NO: 2, ili alternativno aminokiselinske ostatke 45-52, 70-77 i 116-131 iz SEQ ID NO: 6 , ili alternativno aminokiselinski ostaci 45-52, 70-77 i 116-131 iz SEQ ID NO: 10, ili alternativno aminokiselinski ostaci 45-52, 70-77 i 116-134 iz SEQ ID NO: 14.
1
[0054] U nekim primerima izvođenja, u nekim primerima izvođenja, uputstvo daje izolovano antitelo ili njegov funkcionalni fragment, gde antitelo uključuje domen VL lanca koji ima CDR1, CDR2 i CDR3 aminokiselinsku sekvencu klonskog izolata 5B1, 9H3, 5H11 ili 7E3. Takav VL domen može uključivati aminokiselinske ostatke 45-52, 70-72 i 109-120 iz SEQ ID NO: 4, ili alternativno aminokiselinske ostatke 45-52, 70-72 i 109-119 iz SEQ ID NO: 8 , ili alternativno aminokiselinski ostaci 45-52, 70-72 i 109-120 iz SEQ ID NO: 12, ili alternativno aminokiselinski ostaci 49-53, 72-74 i 111-120 iz SEQ ID NO: 16.
[0055] U nekim aspektima uputstva, izolovano antitelo ili njegov funkcionalni fragment je monoklonsko antitelo. U nekim aspektima uputstva, ovde dato izolovano antitelo ili njegov funkcionalni fragment je IgG ili IgM izotip. U daljem aspektu uputstva, antitelo ili njegov funkcionalni fragment je antitelo iz podklase IgG1.
[0056] U nekim primerima izvođenja, u nekim primerima izvođenja, funkcionalni fragment nastalog antitela može da bude, ali nije ograničen na, Fab, Fab', F(ab')2, Fabc, scFV, dijatelo, trijatelo, minitelo ili antitelo sa jednim domenom (sdAB). U nekim aspektima, uputstvo nudi dijatelo koje uključuje aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 18 ili 20. Takva antitela uputstva mogu, u nekim aspektima, biti kodirana polinukleotidom koji ima sekvencu nukleinskih kiselina SEQ ID NO: 17 ili 19. Što se tiče antitela i njihovih funkcionalnih fragmenata, različiti oblici, promene i modifikacije su dobro poznati u tehnici. Fragmenti antitela specifični za sLe<a>mogu da uključuju bilo koji od takvih različitih oblika, promena i modifikacija antitela. Primeri takvih različitih oblika i pojmova koji su poznati u tehnici su navedeni u nastavku.
[0057] U nekim primerima izvođenja, uputstvo obezbeđuje postupak za proizvodnju antitela ili njegovog funkcionalnog fragmenta prema uputstvu. Postupak prema uputstvu može da uključuje uvođenje polinukleotida prema uputstvu u ćeliju domaćina, gajenje ćelije domaćina pod takvim uslovima i tokom dovoljno dugog vremenskog perioda da proizvede kodirani teški i/ili laki lanac antitela ili funkcionalnog fragmenta prema uputstvu, i prečišćavanje teškog i/ili lakog lanca antitela ili funkcionalnog fragmenta.
[0058] Rekombinantna ekspresija antitela ili njegovog funkcionalnog fragmenta učenja koja se vezuje za sLe<a>antigen može da uključuje izgradnju ekspresijskog vektora koji sadrži polinukleotid koji kodira teški i/ili laki lanac antitela ili funkcionalni fragment uputstva. Jednom kada se dobije polinukleotid koji kodira antitelo ili njegov funkcionalni fragment (poželjno, ali ne nužno, koji sadrži promenljivi domen teškog i/ili lakog lanca) uputstva, vektor za proizvodnju antitela ili funkcionalnog fragmenta može se proizvesti tehnologija rekombinantne DNK koristeći tehnike dobro poznate u tehnici. Ovde su opisani postupci za pripremu proteina ekspresijom polinukleotida koji sadrži antitelo ili njegov funkcionalni fragment koji kodira nukleotidnu sekvencu.
2
[0059] Postupci koji su dobro poznati stručnjacima u ovoj oblasti mogu se koristiti za konstrukciju ekspresionih vektora koji sadrže antitelo ili njegove funkcionalne fragmente koji kodiraju sekvence i odgovarajuće transkripcione i translacione kontrolne signale. Ove metode uključuju, na primer, in vitro tehnike rekombinantne DNK, sintetičke tehnike i in vivo genetsku rekombinaciju. Uputstvo, prema tome, pruža replicirane vektore, uključujući nukleotidnu sekvencu koja kodira antitelo ili njegov funkcionalni fragment prema uputstvu koji je operativno povezan sa promotorom. Takvi vektori mogu da uključuju nukleotidnu sekvencu koja kodira konstantni region molekula antitela (videti, npr. Međunarodnu publikaciju br. VO 86/05807 i VO 89/01036; i američki patent br.5,122,464), a varijabilni domen antitela može da bude kloniran u takav vektor za izražavanje čitavog teškog, čitavog lakog lanca ili i celog teškog i lakog lanca.
[0060] Ekspresijski vektor se može preneti u ćeliju domaćina konvencionalnim tehnikama, a transformisane ćelije se zatim uzgajaju konvencionalnim tehnikama da bi se proizvelo antitelo ili njegov funkcionalni fragment iz uputstva. Dakle, uputstvo uključuje ćelije domaćina koje sadrže polinukleotid koji kodira antitelo ili njegov funkcionalni fragment prema uputstvu koji je operativno povezan sa heterolognim promotorom. u nekim primerima izvođenja za ekspresiju dvolančanih antitela, vektori koji kodiraju teški i laki lanac mogu se ko-ekspresovati u ćeliji domaćina za ekspresiju celokupnog molekula imunoglobulina, kao što je detaljno objašnjeno u nastavku.
[0061] Raznovrsni vektorski sistemi ekspresije domaćina mogu se koristiti za ekspresiju antitela ili njegovih funkcionalnih fragmenata u uputstvu (videti, na primer, američki patent br.
5,807,715). Takvi ekspresijski sistemi domaćina predstavljaju nosače pomoću kojih se kodirajuće sekvence od interesa mogu proizvesti i naknadno prečistiti, ali takođe predstavljaju ćelije koje mogu, kada se transformišu ili transformišu odgovarajućim nukleotidnim kodirajućim sekvencama, da izraze molekul antitela prema uputstvu in situ. Oni uključuju, ali nisu ograničeni na mikroorganizme kao što su bakterije (npr. E. coli i B. subtilis) transformisane sa rekombinantnom bakteriofagnom DNK, plazmidnom DNK ili kosmidnom DNK ekspresijom vektora koji sadrže sekvence kodiranja antitela; kvasac (npr. Saccharomices Pichia) transformisan rekombinantnim vektorima ekspresije kvasca koji sadrže sekvence kodiranja antitela; sistemi ćelija insekata zaraženi vektorima ekspresije rekombinantnih virusa (npr. bakulovirus) koji sadrže sekvence koje kodiraju antitela; sistemi biljnih ćelija zaraženi vektorima ekspresije rekombinantnih virusa (npr. mozaični virus karfiola, CaMV; mozaični virus karfiola duvana, TMV) ili transformisani rekombinantnim vektorima ekspresije plazmida (npr. Ti plazmid) koji sadrže sekvence kodiranja antitela; ili ćelijski sistem sisara (npr. COS, CHO, BHK, 293, NS0 i 3T3 ćelije) u kojima se nalaze rekombinantni ekspresijski konstrukti koji sadrže promotore koji potiču iz genoma ćelija sisara (npr. promotor metalotioneina) ili virusa sisara (npr. kasni promotor adenovirusa; vakcinija) promotor virusa 7.5K). U nekim aspektima, bakterijske ćelije kao što su Escherichia coli ili eukariotske ćelije, posebno za ekspresiju celog rekombinantnog antitela, koriste se za ekspresiju rekombinantnog antitela ili funkcionalnog fragmenta. Na primer, ćelije sisara poput ćelija jajnika kineskog hrčka (CHO), u sprezi sa vektorom, kao što je glavni intermedijarni element ranog gena promotora iz humanog citomegalovirusa, efikasan je sistem ekspresije antitela (Foecking et al., 1986, Gene 45: 101; i Cockett et al., 1990, Bio / Technologi 8: 2). u nekim primerima izvođenja, antitela ili njihovi fragmenti nastaju u CHO ćelijama. U jednom primeru izvođenja, ekspresija nukleotidnih sekvenci koje kodiraju antitela ili njihove funkcionalne fragmente u uputstvu koja se vezuje za sLe<a>regulisana je konstitutivnim promotorom, inducibilnim promotorom ili promotorom specifičnim za tkivo.
[0062] U bakterijskim sistemima, broj vektora ekspresije može se povoljno odabrati u zavisnosti od upotrebe namenjene molekulu antitela koji se eksprimira. Na primer, kada treba da se proizvede velika količina takvog antitela, za generisanje farmaceutskih kompozicija molekula antitela mogu biti poželjni vektori koji usmeravaju ekspresiju visokih nivoa fuzionih proteinskih proizvoda koji se lako prečišćavaju. Takvi vektori uključuju, ali nisu ograničeni na njih, vektor ekspresije E. coli pUR278 (Ruther et al., 1983, EMBO 12: 1791), u kome sekvenca koja kodira antitela može da se pojedinačno veže u vektor u okviru sa lac Z kodno područje tako da se stvara fuzijski protein; pIN vektori (Inouie & Inouie, 1985, Nucleic Acids Res. 13: 3101-3109; Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 24: 5503-5509); i slično. pGEKS vektori se takođe mogu koristiti za ekspresiju stranih polipeptida kao fuzionih proteina sa glutation 5-transferazom (GST). Generalno, takvi fuzioni proteini su rastvorljivi i lako se mogu prečistiti iz liziranih ćelija adsorpcijom i vezivanjem za matrične glutation agarozne kuglice praćene eluiranjem u prisustvu slobodnog glutationa. PGEKS vektori su dizajnirani da uključuju mesta cepanja trombina ili faktora Ksa proteaze, tako da se klonirani ciljni genski proizvod može osloboditi iz GST dela.
[0063] U sistemu insekata, virus nuklearne poliedroze Autographa californica (AcNPV) koristi se kao vektor za ekspresiju stranih gena. Virus raste u ćelijama Spodoptera frugiperda. Sekvenca za kodiranje antitela ili funkcionalnog fragmenta može se pojedinačno klonirati u nebitne regione (na primer gen poliedra) virusa i staviti pod kontrolu promotora AcNPV (na primer promotora polihedrina).
[0064] U ćelijama domaćina sisara može se koristiti niz ekspresijskih sistema zasnovanih na virusima. U slučajevima kada se adenovirus koristi kao ekspresijski vektor, sekvenca koja kodira antitela od interesa može se povezati sa kompleksom za kontrolu transkripcije / translacije adenovirusa, na primer, kasni promotor i tripartitna vodeća sekvenca. Ovaj himerni gen se zatim može ubaciti u genom adenovirusa rekombinacijom in vitro ili in vivo. Umetanje u nebitni region virusnog genoma (npr. region El ili E3) rezultiraće rekombinantnim virusom koji je održiv i sposoban da izrazi molekul antitela kod zaraženih domaćina (npr. videti Logan & Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad Sci Sci USA 8 1: 355-359). Specifični inicijacijski signali se takođe mogu koristiti za efikasno prevođenje ubačenih sekvenci koje kodiraju antitela. Ovi signali uključuju ATG inicijacioni kodon i susedne sekvence. Dalje, inicijacioni kodon mora biti u fazi sa okvirom za čitanje željene sekvence kodiranja da bi se obezbedio prevod celog umetka. Ovi egzogeni translacioni kontrolni signali i inicijacijski kodoni mogu biti različitog porekla, i prirodni i sintetički. Efikasnost izražavanja može se poboljšati uključivanjem odgovarajućih elemenata za poboljšanje transkripcije, terminatora transkripcije itd. (videti, npr., Bittner et al., 1987, Methods in Enzymol. 153:51-544).
[0065] Pored toga, može se odabrati soj ćelije domaćina koji modulira ekspresiju umetnutih sekvenci ili modifikuje i obrađuje genski proizvod na specifičan željeni način. Takve modifikacije (npr. glikozilacija) i obrada (npr. cepanje) proteinskih proizvoda mogu biti važne za funkciju antitela ili funkcionalnog fragmenta. Različite ćelije domaćini imaju karakteristične i specifične mehanizme za post-translacionu obradu i modifikaciju proteina i genskih proizvoda. Odgovarajuće ćelijske linije ili domaćinski sistemi mogu se odabrati kako bi se osigurala ispravna modifikacija i obrada eksprimiranog stranog proteina. U tu svrhu mogu se koristiti eukariotske ćelije domaćina koje poseduju ćelijsku mašineriju za pravilnu obradu primarnog transkripta, glikozilaciju i fosforilaciju genskog proizvoda. Takve ćelije domaćina sisara uključuju, ali nisu ograničene na CHO, VERI, BHK, Hela, COS, MDCK, 293, 3T3, V138, BT483, Hs578T, HTB2, BT2O i T47D, NS0 (ćelijska linija mišjeg mijeloma koja ne proizvodi endogeno bilo koji lanci imunoglobulina), ćelije CRL7O3O i HsS78Bst.
[0066] Za dugoročnu proizvodnju rekombinantnih proteina visokog prinosa, poželjna je stabilna ekspresija. Na primer, mogu se projektovati ćelijske linije koje stabilno izražavaju antitelo ili funkcionalni fragment uputstva. Umesto da koriste ekspresijske vektore koji sadrže virusno poreklo replikacije, ćelije domaćina mogu se transformisati sa DNK kontrolisanom odgovarajućim elementima za kontrolu ekspresije (npr. Promotor, pojačivač, sekvence, terminatori transkripcije, mesta poliadenilacije, itd.) I selektivnim markerom. Nakon uvođenja stranog DNK, inženjerskim ćelijama se može dozvoliti da raste 1-2 dana u obogaćenom medijumu, a zatim se prebace na selektivni medijum. Selektivni marker u rekombinantnom plazmidu daje otpor selekciji i omogućava ćelijama da stabilno integrišu plazmid u svoje hromozome i rastu da bi formirali žarišta koja zauzvrat mogu da se kloniraju i prošire u ćelijske linije. Ovaj metod se može korisno koristiti za projektovanje ćelijskih linija koje izražavaju molekul antitela.
2
[0067] Mogu se koristiti brojni selekcioni sistemi, uključujući ali ne ograničavajući se na timidin kinazu virusa herpes simpleksa (Vigler et al., 1977, ćelija 11: 223), hipoksantinegvanin fosforiboziltransferaza (Szibalska & Szibalski, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48: 202), i geni adenin fosforiboziltransferaze (Lovi et al., 1980, Cell 22: 8-17) mogu se koristiti u tk-, hgprt- ili aprt-ćelijama. Takođe, rezistencija na antimetabolite može se koristiti kao osnova selekcije za sledeće gene: dhfr, koji daje rezistenciju na metotreksat (Vigler et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA.77 (6): 3567-70 ; O'Hare et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1527); glutamin sintetaza (GS), koja je enzim odgovoran za biosintezu glutamina pomoću glutamata i amonijaka (Bebbington et al., 1992, Biuotechnologi 10: 169); gpt, koji daje rezistenciju na mikofenolnu kiselinu (Mulligan & Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2072); neo, koji daje rezistenciju na aminoglikozid G-418 (Vu i Vu, 1991, Bioterapija 3: 87-95; Tolstošev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Tokicol. 32: 573-596; Mulligan, 1993, Science 260: 926-932; i Morgan i Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62: 191-217; maj, 1993, TIB TECH 11 (5): 155-215); i higro, koji daje rezistenciju na higromicin (Santerre et al., 1984, Gene 30: 147). Metode dobro poznate u tehnici tehnologije rekombinantne DNK mogu se rutinski primeniti za odabir željenog rekombinantnog klona, a takve metode su opisane, na primer, u Ausubel et al. (ur.), Trenutni protokoli u molekularnoj biologiji, John Vilei & Sons, NI (1993); Kriegler, Prenos i ekspresija gena, Laboratorijski priručnik, Stockton Press, NI (1990); i u poglavljima 12 i 13, Dracopoli et al. (ur.), Trenutni protokoli u humanoj genetici, John Vilei & Sons, NI (1994); Colberre-Garapin et al., 1981, J. Mol. Biol 150: 1.
[0068] Nivoi ekspresije molekula antitela mogu se povećati vektorskom amplifikacijom (za pregled videti Bebbington i Hentschel, Upotreba vektora zasnovanih na amplifikaciji gena za ekspresiju kloniranih gena u ćelijama sisara u kloniranju DNK, tom 3 (Academic Press) , Nev Iork, 1987)). Kada se marker u vektorskom sistemu koji izražava antitelo ili njegov funkcionalni fragment može pojačati, povećanje nivoa inhibitora prisutnog u kulturi ćelije domaćina povećaće broj kopija gena markera. Pošto je pojačani region povezan sa genom antitela, proizvodnja antitela će se takođe povećati (Crouse et al., 1983, Mol. Cell. Biol.3: 257).
[0069] Ćelija domaćin može se ko-transfektirati sa dva ekspresijska vektora iz uputstva, prvim vektorom koji kodira polipeptid izveden iz teškog lanca i drugim vektorom koji kodira polipeptid izveden iz lakog lanca. Dva vektora mogu sadržati identične markere koji se mogu odabrati, što omogućava jednaku ekspresiju polipeptida teškog i lakog lanca. Alternativno, može se koristiti jedan vektor koji kodira i sposoban je da ekspresuje polipeptide teškog i lakog lanca. U takvim se situacijama laki lanac može postaviti ispred teškog lanca kako bi se izbegao višak toksičnog slobodnog teškog lanca (Proudfoot, 1986, Nature 322: 52; i Kohler, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 77: 2197 -2199). Kodirajuće sekvence teškog i lakog lanca mogu da uključuju cDNK ili genomsku DNK.
[0070] Pored toga, polinukleotidi koji kodiraju teški i/ili laki lanac antitela ili funkcionalnog fragmenta uputstva mogu biti podvrgnuti optimizaciji kodona upotrebom tehnika dobro poznatih u struci da bi se postigla optimizovana ekspresija antitela ili funkcionalnog fragmenta uputstva u željenom domaćinu ćelija. Na primer, u jednom metodu optimizacije kodona, nativni kodon je zamenjen najčešćim kodonom iz referentnog skupa gena, pri čemu je brzina translacije kodona za svaku aminokiselinu dizajnirana da bude visoka. Dodatni primerni postupci za generisanje kodon-optimizovanih polinukleotida za ekspresiju željenog proteina, koji se mogu primeniti na teški i/ili laki lanac antitela ili funkcionalni fragment uputstva, opisani su u Kanaia et al., Gene, 238: 143 -155 (1999), Vang et al., Mol. Biol. Evol., 18 (5): 792-800 (2001), američki patent 5,795,737, američka publikacija 2008/0076161 i VO 2008/000632.
[0071] Jednom kada se molekul antitela iz nastajanja dobije rekombinantnom ekspresijom, on se može prečistiti bilo kojim postupkom poznatim u struci za prečišćavanje molekula imunoglobulina, na primer hromatografijom (npr. Jonska razmena, afinitet, posebno afinitet za specifični antigen posle proteina A i hromatografije na koloni za određivanje veličine), centrifugiranje, diferencijalna rastvorljivost ili bilo kojom drugom standardnom tehnikom za prečišćavanje proteina. Dalje, antitela ili funkcionalni fragmenti iz ovog učenja mogu se spojiti sa heterolognim polipeptidnim sekvencama ovde obezbeđenim ili na drugi način poznatim u tehnici da bi se olakšalo prečišćavanje. Na primer, antitelo ili funkcionalni fragment uputstva može se prečistiti rekombinantnim dodavanjem poli-histidinske oznake (His-tag), FLAG-tag-a, hemaglutininske oznake (HAtag) ili mic-tag-a, između ostalih koji su komercijalno dostupni i koriste prečišćavanje postupci dobro poznati stručnjacima.
[0072] Fab fragment se odnosi na monovalentni fragment koji se sastoji od VL, VH, CL i CH1 domena; fragment F (ab’)2je bivalentni fragment koji uključuje dva Fab fragmenta povezana disulfidnim mostom u zglobnom regionu; Fd fragment se sastoji od VH i CH1 domena; Fv fragment se sastoji od VL i VH domena jednog kraka antitela; i fragment dAb (Ward et al., Nature 341: 544-546, (1989)) sastoji se od VH domena.
[0073] Antitelo može da ima jedno ili više mesta vezivanja. Ako postoji više od jednog mesta vezivanja, mesta za vezivanje mogu da budu međusobno identična ili mogu da budu različita. Na primer, imunoglobulin koji se javlja u prirodi ima dva identična mesta vezivanja, jednolančana antitela ili Fab fragment imaju jedno mesto vezivanja, dok „bispecifično“ ili „bifunkcionalno“ antitelo ima dva različita mesta vezivanja.
[0074] Jednolančano antitelo (scFv) odnosi se na antitelo u kojem su VL i VH region spojeni preko veznika (npr. Sintetička sekvenca aminokiselinskih ostataka) da bi se formirao
2
kontinuirani polipeptidni lanac u kome je linker dovoljno dug proteinski lanac da se preklopi na sebi i formira monovalentno mesto vezivanja antigena (vidi, na primer, Bird et al., Science 242: 423-26 (1988) i Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 : 5879-83 (1988). Dijela se odnose na bivalentna antitela, uključujući dva polipeptidna lanca, pri čemu svaki polipeptidni lanac uključuje VH i VL domene spojene veznikom koji je prekratak da bi omogućio uparivanje između dva domena u istom lancu, omogućavajući tako svakom domenu da se upari sa komplementarnim domenom na drugom polipeptidnog lanca (videti, na primer, Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-48 (1993), i Poljak et al., Struktura 2: 1121-23 (1994)). Ako su dva polipeptidna lanca dijatela identična, tada će dijatelo koje je rezultat njihovog uparivanja imati dva identična mesta za vezivanje antigena. Polipeptidni lanci koji imaju različite sekvence mogu se koristiti za stvaranje dijatela sa dva različita mesta vezivanja antigena. Slično tome, tri tela i tetra tela su antitela koja uključuju tri, odnosno četiri polipeptidna lanca, i formiraju tri, odnosno četiri mesta za vezivanje antigena, koja mogu biti ista ili različita.
[0075] Ovo predavanje takođe pruža antitelo ili njegov funkcionalni fragment derivat 5B1, 9H3, 5H11 i/ili 7E3, pri čemu se antitelo ili funkcionalni fragment vezuje za sLea. Standardne tehnike dobro poznate stručnjacima u ovoj oblasti tehnike mogu se koristiti za uvođenje mutacija u nukleotidnu sekvencu koja kodira antitelo ili njegov funkcionalni fragment, uključujući, na primer, mutagenezu usmerenu na lokaciju i mutagenezu posredovanu PCR-om, što rezultira amino supstitucije kiseline. U nekim aspektima, derivat uključuje manje od 25 zamena aminokiselina, manje od 20 zamena aminokiselina, manje od 15 zamena aminokiselina, manje od 10 zamena aminokiselina, manje od 5 zamena aminokiselina, manje od 4 zamene aminokiselina, manje od 3 zamene aminokiselina ili manje od 2 zamene aminokiselina u odnosu na originalni molekul.
[0076] u nekim primerima izvođenja, uputstvo pruža antitelo ili njegov funkcionalni fragment koji ima modifikovane oblike aminokiselina koje se javljaju u prirodi, konzervativne supstitucije, aminokiseline koje se ne pojavljuju u prirodi, analoge aminokiselina i mimetike dokle god takvo antitelo ili funkcionalni fragment zadržavaju funkcionalnu aktivnost kako je definisano ovde. U jednom izvođenju, derivat ima konzervativne supstitucije aminokiselina koje se prave na jednom ili više predviđenih neesencijalnih aminokiselinskih ostataka. Konzervativna supstitucija aminokiselina je ona u kojoj je aminokiselinski ostatak zamenjen aminokiselinskim ostatkom koji ima bočni lanac sa sličnim punjenjem. Porodice aminokiselinskih ostataka koji imaju bočne lance sa sličnim punjenjem su definisane u tehnici. U ove porodice spadaju aminokiseline sa osnovnim bočnim lancima (npr. Lizin, arginin, histidin), kiseli bočni lanci (npr. Asparaginska kiselina, glutaminska kiselina), nenaelektrisani polarni bočni lanci (npr. Glicin, asparagin, glutamin, serin, treonin, tirozin , cistein), nepolarni bočni lanci (npr. alanin, valin, leucin,
2
izolevcin, prolin, fenilalanin, metionin, triptofan), beta-razgranati bočni lanci (npr. treonin, valin, izoleucin) i aromatični bočni lanci (npr. tirozin, fenilalanin, triptofan, histidin). Alternativno, mutacije se mogu uvesti nasumično duž cele ili dela kodirajuće sekvence, na primer zasićenom mutagenezom, a rezultujući mutanti mogu biti pregledani na biološku aktivnost kako bi se identifikovali mutanti koji zadržavaju aktivnost. Nakon mutageneze, kodirano antitelo ili njegov funkcionalni fragment se može izraziti i može se utvrditi aktivnost antitela ili funkcionalnog fragmenta.
[0077] U nekim primerima izvođenja, u nekim primerima izvođenja, uputstvo nudi antitelo ili njegov funkcionalni fragment koji ima modifikovanu fukozilaciju, galaktosilaciju i/ili sialilaciju Fc fragmenta koji se nalazi u antitelu ili funkcionalnom fragmentu uputstva. Takve modifikacije Fc fragmenta mogu uticati na aktivnost posredovanu Fc receptorima, kao što je diskutovano u Peipp et al., Blood, 112 (6): 2390-2399 (2008). Na primer, glikoinženjerski razvijena terapijska antitela kojima nedostaju jezgroviti ostaci fukoze iz Fc N-glikana pokazuju jaku ADCC pri nižim koncentracijama sa mnogo većom efikasnošću u poređenju sa fukoziliranim kolegama. Shields et al., J. Biol. Chem., 277 (30): 26733-40 (2002); Okazaki et al., J Mol Biol., 336: 1239-1249 (2004); Natsume et al., J. Immunol. Methods., 306: 93-103 (2005). Postupci za modifikovanje fukozilacije, galaktosilacije i/ili sialilacije antitela za njegov funkcionalni fragment su dobro poznati u tehnici. Na primer, pristupi defukozilacije mogu se grupisati u tri metodologije (1) pretvaranje N-puta glikozilacije ne-sisavih ćelija u ’humanizovani’ ne-fukozilacioni put; (2) inaktivacija puta fukozilacije N-glikan ćelija sisara i (3) in vitro hemijska sinteza nefukoziliranog N-glikoproteina ili enzimska modifikacija N-glikana u ne-fukozilovane oblike, kao što je opisano u Iamane-Ohnuki et al. , MAbs., 1 (3): 230-236 (2009). Podrazumeva se da se bilo koja od ovih metoda ili bilo koja druga metoda koja je dobro poznata u tehnici može koristiti za proizvodnju antitela ili njegovog funkcionalnog fragmenta koji ima modifikovanu fukozilaciju, galaktosilaciju i/ili sialilaciju.
[0078] Antitela ili njihovi funkcionalni fragmenti koji se vezuju za sLea mogu se proizvesti bilo kojim postupkom poznatim u struci za sintezu antitela, naročito hemijskom sintezom ili tehnikama rekombinantne ekspresije. Praktikovanje uputstva koristi, ukoliko nije drugačije naznačeno, konvencionalne tehnike u molekularnoj biologiji, mikrobiologiji, genetskoj analizi, rekombinantnoj DNK, organskoj hemiji, biohemiji, PCR-u, sintezi i modifikaciji oligonukleotida, hibridizaciji nukleinskih kiselina i srodnim poljima u okviru stanja tehnike. Ove tehnike su opisane u ovde navedenim referencama i u potpunosti su objašnjene u literaturi. Videti, npr.,, Maniatis et al. (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Sambrook et al. (2001) Molecular
2
Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987 i godišnja ažuriranja); Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (1987 i godišnja ažuriranja) Gait (ed.) (1984) Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; Eckstein (ed.) (1991) Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, IRL Press; Birren et al. (eds.) (1999) Genome Analysis: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Borrebaeck (ed.) (1995) Antibody Engineering, Second Edition, Oxford University Press; Lo (ed.) (2006) Antibody Engineering: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology); Vol. 248, Humana Press, Inc.
[0079] Monoklonska antitela se mogu pripremiti primenom širokog spektra tehnika poznatih u tehnici, uključujući upotrebu hibridoma i rekombinantnih tehnologija, ili njihovu kombinaciju. Na primer, monoklonska antitela mogu da se proizvedu hibridomskim tehnikama, uključujući one poznate u struci i kojima se podučava, na primer, u Harlov et al., Antitela: Laboratorijski priručnik, (Cold Spring Harbor Laboratori Press, 2. izdanje 1988); Hammerling et al., U: Monoklonska antitela i hibridomi T-ćelija 563 681 (Elsevier, N.I., 1981). Monoklonsko antitelo nije ograničeno na antitela proizvedena tehnologijom hibridoma. Drugi primerni postupci za proizvodnju monoklonskih antitela su poznati u tehnici. Dodatni primerni postupci za proizvodnju monoklonskih antitela su dati u Primeru I ovde.
[0080] Funkcionalni fragmenti antitela koji vezuju sLea mogu se generisati bilo kojom tehnikom koja je dobro poznata stručnjacima. Na primer, fragmenti Fab i F (ab’)2uputstva mogu se proizvesti proteolitičkim cepanjem molekula imunoglobulina, koristeći enzime kao što su papain (za proizvodnju fragmenata Fab) ili pepsin (za proizvodnju fragmenata F (ab’) 2). F (ab ’) 2 fragmenti sadrže promenljivi region, konstantni region lakog lanca i domen CH1 teškog lanca.
[0081] Funkcionalni fragmenti antitela u uputstvu takođe se mogu generisati upotrebom različitih metoda prikazivanja faga poznatih u tehnici. Na primer, u metodama prikaza faga, funkcionalni domeni antitela, kao što su varijabilni regioni teškog i/ili lakog lanca koji imaju jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest CDR-ova ovde obezbeđeni, prikazani su na površini čestica faga koje nose polinukleotidne sekvence koje ih kodiraju. DNK koja kodira VH i VL domene rekombinuje se zajedno sa scFv vezom pomoću PCR-a i klonira u fagemidni vektor. Vektor se elektroporuje u E. coli, a E. coli je zaražen pomoćnim fagom. Fag koji se koristi u ovim metodama je tipično filamentozni fag. Uključujući fd i M13, a VH i VL domeni su obično rekombinantno fuzionisani ili sa fagom gen III ili gen VIII. Fag koji eksprimira domen za vezivanje antigena koji se vezuje za određeni antigen, kao što je sLea, može se odabrati ili identifikovati sa antigenom, na primer, korišćenjem obeleženog antigena ili antigena vezanog ili zarobljenog za čvrstu površinu ili zrno. Primeri metoda prikazivanja faga koji se mogu koristiti
2
za stvaranje funkcionalnih fragmenata antitela u ovom učenju uključuju oneprikazane u Brinkman et al., 1995, J. Immunol. Methods 182:41-50; Ames et al., 1995, J. Immunol. Methods 184:177-186; Kettleborough et al., 1994, Eur. J. Immunol.24:952-958; Persic et al., 1997, Gene 187:9-18; Burton et al., 1994, Advances in Immunology 57:191-280; PCT prijave br. PCT/GB91/01134; međunarodne objave br. WO 90/02809, WO 91/10737, WO 92/01047, WO 92/18619, WO 93/1 1236, WO 95/15982, WO 95/20401, i WO97/13844; i SAD patenti br.
5,698,426, 5,223,409, 5,403,484, 5,580,717, 5,427,908, 5,750,753, 5,821,047, 5,571,698, 5,427,908, 5,516,637, 5,780,225, 5,658,727, 5,733,743 i 5,969,108.
[0082] Kao što je opisano u gornjim referencama, nakon selekcije faga, regioni koji kodiraju antitela iz faga mogu se izolovati i koristiti za stvaranje celokupnih antitela, uključujući humana antitela, ili bilo koji drugi željeni fragment koji vezuje antigen, i eksprimirati u bilo kom željenom domaćinu, uključujući ćelije sisara, ćelije insekata, biljne ćelije, kvasac i bakterije, npr., kako je ovde opisano.
[0083] Tehnike za rekombinantno stvaranje fragmenata Fab, Fab ’i F (ab’) 2 takođe se mogu primeniti primenom metoda poznatih u tehnici, kao što su one prikazane u PCT objavi br. WO 92/22324; Mullinax et al., 1992, BioTechniques 12(6):864-869; Sawai et al., 1995, AJRI 34:26-34; i Better et al., 1988, Science 240:1041-1043.
[0084] Da bi se generisala cela antitela, PCR prajmeri koji uključuju VH ili VL nukleotidne sekvence, restrikciono mesto i bočni niz koji štite restrikciono mesto mogu se koristiti za pojačavanje VH ili VL sekvenci u scFv klonovima. Koristeći tehnike kloniranja dobro poznate stručnjacima u ovoj oblasti, PCR amplifikovani VH domeni mogu se klonirati u vektore koji izražavaju VH konstantni region, npr. humani gama 1 konstantni region, a PCR pojačani VL domeni mogu se klonirati u vektore koji eksprimiraju VL konstantni region, npr. humani kapa ili lambda konstantni regioni. VH i VL domeni se takođe mogu klonirati u jedan vektor izražavajući neophodne konstantne regione. Vektori konverzije teškog lanca i vektori konverzije lakog lanca se zatim ko-transfektiraju u ćelijske linije da bi se generisale stabilne ili prolazne ćelijske linije koje izražavaju antitela pune dužine, npr. IgG, koristeći tehnike dobro poznate stručnjacima u ovoj oblasti.
[0085] U nekim primerima izvođenja, antitelo ili funkcionalni fragment prema uputstvu, konjugovan (kovelentne ili nekovalentne konjugacije) ili rekombinantno fuzionisan sa jednim ili više dijagnostičkih sredstava, detektabilnih sredstava ili terapijskih sredstava ili bilo kojim drugim željenim molekulom. Konjugovana ili rekombinantno fuzionisana antitela ili funkcionalni fragmenti mogu biti korisni za praćenje ili dijagnozu početka, razvoja, napredovanja i/ili težine bolesti povezane sa ekspresijom sLea, kao što je rak ili stvaranje
2
tumora, kao deo postupka kliničkog ispitivanja, kao što je utvrđivanje efikasnosti određene terapije.
[0086] Detekcija i dijagnoza mogu da se postignu, na primer, kuplovanjem antitela ili funkcionalnog fragmenta prema uputstvu sa supstancama za detekciju, uključujući, ali ne i ograničeno na, radioaktivne materijale, kao što su, ali ne ograničeno na, cirkonijum (<89>Zr), jod (<131>I,<125>I,<124>I,<123>I i<121>I,), ugljenik (<14>C,<11>C), sumpor (<35>S), tricijum (<3>H), indijum (<113>In,<112>In i<111>In,), tehnecijum (<99>Tc), talijum (<201>Ti), galijum (<68>Ga,<67>Ga), paladijum (<103>Pd), molbden (<99>Mo), ksenon (<133>Xe), fluor (<18>F),<15>O,<13>N,<64>Cu,<94>mTc,<153>Sm,<177>Lu,<159>Gd,<149>Pm,<140>La,<175y>b,<166>Ho,<86>Y,<90>Y,<47>Sc,<186>Re,<188>Re,<142>Pr,<105>Rh ,<97>Ru,<68>Ge,<57>Co,<65>Zn,<85>Sr,<32>P,<153>Gd,<169>Yb,<51>Cr,<54>Mn,<75>Se,<113>Sn i<117>Sn; i metali koji emituju pozitrone, koristeći različite pozitronske emisione tomografije, različite enzima kao što je, ali ne i ograničeno na, peroksidaza rena, alkalna fosfataza, beta-galaktozidaza ili acetilholinesteraza, prostetičke grupe, kao što su, ali ne i ograničeno na, streptavidin/biotin i avidin/biotin; fluorescentne materijale, kao što su, ali ne i ograničeno na, umbeliferon, fluorescein, fluorescein izotiocijanat, rodamin, dihlorotriazinilamin fluorescein, dansil hlorid ili fikoeritrin; luminescentni materijali, kao što su, ali ne i ograničeno na, luminol; bioluminescentni materijali, ka što su, ali ne i ograničeno na, luciferaza, luciferin, i akvorin, i neradioaktivni paramagnetni metalni joni.
[0087] Ovo uputstvo dalje obuhvata terapijsku upotrebu antitela ili funkcionalnog fragmenta uputstva konjugovane (kovalentne ili nekovalentne konjugacije) ili rekombinantno fuzionisane sa jednim ili više terapijskih sredstava. U ovom kontekstu, na primer, antitelo može da bude konjugovano ili rekombinantno fuzionisano sa terapijskim agensom, kao što je citotoksin, npr. Citostatik ili citocidni agens, ili radioaktivni metalni jon, npr. alfa-emiteri. Citotoksin ili citotoksično sredstvo uključuje bilo koje sredstvo koje šteti ćelijama. Terapijsko sredstvo može da bude hemoterapeutsko sredstvo, kao što je, ali nije ograničeno na, antraciklin (npr. doksorubicin i daunorubicin (ranije daunomicin)); taksan (npr. paklitaksel (Taksol) i docetaksel (Taksoter); antimetabolit (npr. metotreksat, 6-merkaptopurin, 6-tioguanin, citarabin, 5-fluorouracil i dekarbazin); ili sredstvo za alkilovanje (npr. mehloretamin, tioepapa, melfalan, karmustin (BCNU), lomustin (CCNU), ciklofosfamid, busulfan, dibromomanitol, streptozotocin, mitomicin C, cisdihlorodiamin platina (II) (DDP) i cisplatin); (AMC)); molekul auristatina (npr. auristatin PHE, briostatin 1, solastatin 10, monometil auristatin E (MMAE) i monometilauristatin F (MMAF)); hormon (npr. glukokortikoidi, progestini, androgeni i estrogeni); nukleozidni analog (npr. Gemcitabin), inhibitor enzima za obnavljanje DNK (npr. etopozid i topotekan), inhibitor kinaze (npr. jedinjenje ST1571, takođe poznato kao Gleevec ili imatinib mezilat); citotoksično sredstvo (npr. maitanzin, paklitaksel, citohalazin B, gramicidin D, etidiu m bromid, emetin, mitomicin, etopozid, tenopozid, vinkristin, vinblastin, kolhicin, doksorubicin, daunorubicin, dihidroksi antracin-dion, mitoksantron, mitramicin, 1 dehidrotestosteron, glukortikoidi, prokain, prokain, tetrapozin, prokain, prokain, tetrapozin, prokain, prokain, tetrapozit ona jedinjenja otkrivena u SAD patentima br. 6,245,759, 6,399,633, 6,383,790, 6,335,156, 6,271,242, 6,242,196, 6,218,410, 6,218,372, 6,057,300, 6,034,053, 5,985,877, 5,958,769, 5,925,376, 5,922,844, 5,911,995, 5,872,223, 5,863,904, 5,840,745, 5,728,868, 5,648,239, 5,587,459); inhibitor farnezil transferaze (npr., R115777, BMS-214662, i jedinjenja prikazana, na primer, u SAD patentima br: 6,458,935, 6,451,812, 6,440,974, 6,436,960, 6,432,959, 6,420,387, 6,414,145, 6,410,541, 6,410,539, 6,403,581, 6,399,615, 6,387,905, 6,372,747, 6,369,034, 6,362,188, 6,342,765, 6,342,487, 6,300,501, 6,268,363, 6,265,422, 6,248,756, 6,239,140, 6,232,338, 6,228,865, 6,228,856, 6,225,322, 6,218,406, 6,211,193, 6,187,786, 6,169,096, 6,159,984, 6,143,766, 6,133,303, 6,127,366, 6,124,465, 6,124,295, 6,103,723, 6,093,737, 6,090,948, 6,080,870, 6,077,853, 6,071,935, 6,066,738, 6,063,930, 6,054,466, 6,051,582, 6,051,574 i 6,040,305); inhibitor topoizomeraze (npr., kamptotecin, irinotekan, SN-38, topotekan, 9-aminokamptotecin, GG-211 (GI 147211), DX-8951f, IST-622, rubitekan, pirazoloacridin, XR-5000, saintopin, UCE6, UCE1022, TAN-1518A, TAN 1518B, KT6006, KT6528, ED-110, NB-506, ED-110, NB-506, fagaronin, koralin, beta-lapahon i rebekamicin); molekul koji se vezuje za manji žljeb DNK (npr. Hoescht boja 33342 i Hoechst boja 33258); inhibitori adenozin deaminaze (npr. fludarabin fosfat i 2-hlorodeoksiadenozin); ili njihove farmaceutski prihvatljive soli, solvati, klatrati ili prolekovi. Terapijsko sredstvo može da bude imunoterapeutsko sredstvo, kao što je, ali nije ograničeno na, cetuksimab, bevacizumab, heceptin, rituksimab).
[0088] Pored toga, antitelo ili funkcionalni fragment uputstva može se konjugovati sa terapijskim sredstvom kao što je radioaktivni metalni jon, kao što su alfa-emiteri kao što je 213Bi ili makrociklični helatori korisni za konjugaciju radiometalnih jona, uključujući, ali bez ograničenja,<131>In,<131>LU,<131>I,<131>Ho,<131>Sm; ili makrociklični helator, kao što je 1,4,7,10 tetraazaciklododekan-N, N’,N’’, N’’’ - tetrasirćetna kiselina (DOTA) koji se može vezati za antitelo ili funkcionalni fragment preko vezujućeg molekula. Takvi vezujući molekuli su poznati u struci i opisani su u Denardo et al., 1998, Clin Cancer Res. 4(10):2483-90; Peterson et al., 1999, Bioconjug. Chem.10(4):553-7; and Zimmerman et al., 1999, Nucl. Med. Biol.26(8):943-50.
[0089] Dalje, antitelo ili funkcionalni fragment uputstva mogu biti konjugovani (kovalentne ili nekovalentne konjugacije) ili rekombinantno fuzionisani sa terapeutskim agensom koji modifikuje dati biološki odgovor. Prema tome, terapijska sredstva ne treba tumačiti kao ograničena na klasična hemijska terapijska sredstva. Na primer, terapeutsko sredstvo može biti protein, peptid ili polipeptid koji poseduje željenu biološku aktivnost. Takvi proteini mogu da
1
uključuju, na primer, toksin (npr. abrin, ricin A, pseudomonas egzotoksin, toksin kolere i toksin difterije); protein kao što je faktor nekroze tumora, γ-interferon, faktor rasta nerva, faktor rasta izveden iz trombocita, tkivni aktivator plazminogena, apoptotski agens (npr. TNF-γ, AIM I, AIM II, Fas ligand i VEGF), anti-angiogeno sredstvo (npr. angiostatin, endostatin i komponenta koagulacionog puta kao što je tkivni faktor); modifikator biološkog odgovora (npr. citokin kao što je interferon gama, interleukin-1, interleukin-2, interleukin-5, interleukin-6, interleukin-7, interleukin-9, interleukin-10, interleukin-12, interleukin-15, interleukin-23, faktor stimulacije kolonije granulocitnih makrofaga i faktor stimulacije kolonije granulocita); faktor rasta (npr. hormon rasta) ili sredstvo za zgrušavanje (npr. kalcijum, vitamin K, faktori tkiva, kao što su, ali bez ograničenja na njih, Hagemanov faktor (faktor XII), kininogen velike molekulske težine (HMVK), prekalikrein (PK), koagulacioni proteini-faktori II (protrombin), faktor V, XIIa, VIII, XIIIa, XI, XIa, IX, IXa, X, fosfolipid i fibrin monomer).
[0090] Ovo predavanje obuhvata antitela ili funkcionalne fragmente uputstva koji su rekombinantno fuzionisani ili hemijski konjugovani (kovalentne ili nekovalentne konjugacije) u heterologni protein ili polipeptid da bi se stvorili fuzioni proteini. U nekim aspektima, takav polipeptid može da bude oko 10, oko 20, oko 30, oko 40, oko 50, oko 60, oko 70, oko 80, oko 90 ili oko 100 aminokiselina. U nekim aspektima, uputstvo nudi fuzijske proteine koji imaju funkcionalni fragment antitela prema uputstvu (npr. Fab fragment, Fd fragment, Fv fragment, F(ab)2fragment, VH domen, VH CDR, VL domen ili VL CDR) i heterologni protein ili polipeptid. U jednom primeru izvođenja, heterologni protein ili polipeptid sa kojim su fuzionisana antitela ili funkcionalni fragmenti je koristan za ciljanje antitela ili funkcionalnog fragmenta na određeni tip ćelije, kao što je ćelija koja eksprimira sLe<a>.
[0091] Konjugovani ili fuzioni protein uputstva uključuje bilo koje antitelo ili funkcionalni fragment ovde datog učenja konjugovano (kovalentne ili nekovalentne konjugacije) ili rekombinantno fuzionisano sa dijagnostičkim agensom, detektibilnim agensom ili terapeutskim agensom. U jednom primeru izvođenja, konjugovani ili fuzioni protein prema uputstvu uključuje antitelo 5B1, 9H3, 5H11 ili 7E3 i dijagnostičko sredstvo, detektabilno sredstvo ili terapeutsko sredstvo. U nijednom njenom ostvarenju, konjugovani ili fuzioni protein ovog učenja uključuje funkcionalni fragment antitela 5B1, 9H3, 5H11 ili 7E3 i dijagnostički agens, detektovan agens ili terapijski agens. U još jednom izvođenju, konjugovani ili fuzioni protein prema uputstvu uključuje VH domen koji ima aminokiselinsku sekvencu bilo kog od VH domena prikazanih u ostacima 20-142 SEQ ID NO: 2, ostacima 20-142 SEQ ID NO: 6, ostaci 20-142 od SEQ ID NO: 10, ili ostaci 20-145 od SEQ ID NO: 14, i/ili VL domen koji ima aminokiselinsku sekvencu bilo kog od VL domena prikazanih u ostacima 20-130 od SEQ ID NO: 4, ostaci 20-129 od SEQ ID NO: 8, ostaci 20-130 od SEQ ID NO: 12, ili ostaci 23-130 od SEQ ID NO: 16, i dijagnostičko
2
sredstvo, detektabilno sredstvo ili terapijsko sredstvo . U još jednom izvođenju, konjugovani ili fuzioni protein ovog predavanja uključuje jedan ili više VH CDR-ova koji imaju aminokiselinsku sekvencu bilo kog od VH CDR-a prikazanih u SEQ ID NOS: 2, 6, 10 ili 14, i dijagnostički agens, sredstvo za otkrivanje ili terapijsko sredstvo. U još jednom izvođenju, konjugovani ili fuzijski protein uključuje jedan ili više VL CDR-ova koji imaju aminokiselinsku sekvencu bilo kog od VL CDR-a prikazanih u SEQ ID NOS: 4, 8, 12 ili 16, i dijagnostički agens, detektovan agens ili terapeutski agent. U još jednom izvođenju, konjugovani ili fuzioni protein prema uputstvu uključuje najmanje jedan VH domen i najmanje jedan VL domen prikazan u ostacima 20-142 SEQ ID NO: 2 i ostacima 20-130 SEQ ID NO: 4; ostaci 20-142 od SEQ ID NO: 6 i ostaci 20-129 od SEQ ID NO: 8; ostaci 20-142 od SEQ ID NO: 10 i ostaci 20-130 od SEQ ID NO: 12; ili ostaci 20-145 od SEQ ID NO: 14, odnosno ostaci 23-130 od SEQ ID NO: 16, i dijagnostički agens, detektovan agens ili terapeutski agens.
[0092] Postupci za fuzionisanje ili konjugovanje dijagnostičkih sredstava, sredstava za detekciju ili terapeutskih sredstava (uključujući polipeptide) sa antitelima su dobro poznati, videti, npr., Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", u Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", u Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", u Monoclonal Antibodies 84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", u Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62:119-58; SAD pat. br..5,336,603, 5,622,929, 5,359,046, 5,349,053, 5,447,851, 5,723,125, 5,783,181, 5,908,626, 5,844,095, 5,112,946, 7,981,695, 8,039,273, 8,142,784; SAD objave 2009/0202536, 2010/0034837, 2011/0137017, 2011/0280891, 2012/0003247; EP 307,434; EP 367,166; EP 394,827; PCT objave WO 91/06570, WO 96/04388, WO 96/22024, WO 97/34631, i WO 99/04813; Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 10535-10539, 1991; Traunecker et al., Nature, 331:84-86, 1988; Zheng et al., J. Immunol., 154:5590-5600, 1995; Vil et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:11337-11341, 1992; and Senter, Current Opinion in Chemical Biology, 13:235-244 (2009).
[0093] U drugom aspektu, dijagnostičko sredstvo, sredstvo za detekciju ili terapeutsko sredstvo, može da bude vezano za zglobni region komponente redukovanog antitela, putem obrazovanja disulfidne veze. Alternativno, ova sredstva mogu da budu vezana za komponentu antitela upotrebom heterobifunkcionalnog sredstva za unakrsno povezivanje, kao što je N-sukcinil 3-(2-piridilditio)proprionat (SPDP). Yu et al., Int. J. Cancer 56: 244 (1994). Opšte tehnike za ovakvu konjugaciju su dobro poznate u stanju tehnike. Videti, na primer, Wong, CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION AND CROSS-LINKING (CRC Press 1991); Upeslacis et al., "Modification of Antibodies by Chemical Methods," u MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND APPLICATIONS, Birch et al. (eds.), strane 187-230 (Wiley-Liss, Inc.
1995); Price, "Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies," u MONOCLONAL ANTIBODIES: PRODUCTION, ENGINEERING AND CLINICAL APPLICATION, Ritter et al. (eds.), strane 60-84 (Cambridge University Press 1995).
[0094] Alternativno, dijagnostičko sredstvo, detektabilno sredstvo ili terapeutsko sredstvo mogu biti konjugovani preko ugljenohidratnog dela u Fc regionu antitela. Postupci za konjugovanje peptida sa komponentama antitela preko antitelo-ugljenih hidratnih delova dobro su poznati stručnjacima u ovoj oblasti. Videti, na primer, Shih et al., Int. J. Cancer.41:832-839 (1988); Shih et al., Int. J. Cancer. 46:1101-1106 (1990); i Shih et al., SAD patent br.5,057,313. Opšta metoda uključuje reakciju komponente antitela koja ima deo oksidovanih ugljenih hidrata sa polimernim nosačem koji ima najmanje jednu funkciju slobodnog amina i koji nosi više peptida. Ova reakcija rezultira početnom vezom Šifove baze (imin), koja se može stabilizovati redukcijom do sekundarnog amina da bi se dobio konačni konjugat.
[0095] Međutim, ako je Fc region odsutan, na primer, ukoliko je funkcionalni fragment antitela, kako je ovde obezbeđen, poželjan, i dalje je moguće da se veže dijagnostičko sredstvo, sredstvo za detekciju ili terapeutsko sredstvo. Ugljenohidratna komponenta može da se uvede u varijabilni region lakog lanca antitela pune dužin, ili u fragment antitela. Videti, na primer, Leung et al., J. Immunol., 154: 5919 (1995); SAD patenti br. 5,443,953 i 6,254,868. Inženjeringom obrađena kaboksilna grupa se koristi da se veže dijagnostičko sredstvo, sredstvo za detekciju ili terapeutsko sredstvo
[0096] Terapeutsko sredstvo konjugovano ili rekombinantno fuzionisano sa funkcionalnim fragmentom antitela uputstva koje se vezuje za sLe<a>može se odabrati da bi se postigao željeni profilaktički ili terapeutski efekat (i). Podrazumeva se da je u okviru nivoa veštine kliničara ili drugog medicinskog osoblja da prilikom odlučivanja koje terapeutsko sredstvo konjugira ili rekombinantno stapa sa antitelom ili funkcionalnim fragmentom uputstva uzima u obzir sledeće: prirodu bolesti, težinu bolest i stanje subjekta.
[0097] Konjugovano ili fuzijsko antitelo ili funkcionalni fragment učenja koji je detektujuće obeležen kako je ovde dato i vezuje se za sLe<a>može se koristiti u dijagnostičke svrhe za otkrivanje, dijagnozu ili nadgledanje bolesti, pri čemu ćelije koje uzrokuju ili su povezane sa bolešću izražavaju sLe<a>. Na primer, kako je ovde dato, pokazano je da ćelije raka i tumori izražavaju sLe<a>, kao što su, ali nisu ograničeni na, tumori gastrointestinalnog trakta, rak dojke, rak jajnika, rak debelog creva, kolorektalni adenokarcinom, rak pankreasa, adenokarcinom
4
pankreasa, maloćelijski karcinom pluća, adenokarcinom bešike, metastatski karcinom debelog creva, kolorektalni karcinom, karcinom jajnika u obliku prstenastog metastatskog karcinoma. Shodno tome, uputstvo pruža metode za otkrivanje raka ili tumorske formacije kod subjekta davanjem efektivne količine konjugovanog ili fuzionog antitela ili funkcionalnog fragmenta uputstva subjektu kome je to potrebno. U nekim aspektima, metoda detekcije može dalje uključivati ispitivanje ekspresije sLe<a>na ćelijama ili uzorku tkiva subjekta koristeći jedan ili više konjugata ili fuzionih antitela ili funkcionalnih fragmenata učenja koji se vezuju za sLe<a>; i upoređivanje nivoa sLe<a>sa kontrolnim nivoom, npr. nivoa u uzorcima normalnih tkiva (npr. od subjekta koji nema bolest ili od istog subjekta pre početka bolesti), pri čemu je porast ispitivanog nivoa sLe<a>u poređenju sa do nivoa kontrole sLe<a>je indikativna za bolest. Takve dijagnostičke metode mogu omogućiti zdravstvenim radnicima da preduzmu preventivne mere ili agresivno lečenje ranije nego što je to moguće, sprečavajući tako razvoj ili dalje napredovanje bolesti.
[0098] Antitelo ili funkcionalni fragment uputstva takođe se mogu koristiti za ispitivanje nivoa antigena sLe<a>u biološkom uzorku primenom klasičnih imunohistoloških metoda kako su ovde date ili dobro poznate stručnjacima u ovoj oblasti (npr. videti Jalkanen et al., 1985, J. Cell. Biol.
101: 976985; i Jalkanen et al., 1987, J. Cell. Biol.105: 3087-3096). Ostale metode zasnovane na antitelima korisne za otkrivanje sLe<a>uključuju imunološke testove, kao što je enzimski imunološki test (ELISA) i radioimunološki test (RIA). Pogodne oznake za ispitivanje antitela su poznate u struci i uključuju enzimske oznake, kao što je glukoza oksidaza; radioizotopi, kao što su jod (125I, 121I), ugljenik (14C), sumpor (35S), tritijum (3H), indijum (121In) i tehnecijum (99Tc); luminiscentne etikete, kao što je luminol; i fluorescentne oznake, kao što su fluorescein i rodamin, i biotin.
[0099] U jednom aspektu, uputstvo omogućava detekciju i dijagnostifikovanje bolesti kod čoveka. U jednom primeru izvođenja, dijagnostifikovanje uključuje: a) primenu (na primer, parenteralno, potkožno ili intraperitonealno) kod subjekta efikasne količine konjugata ili fuzionog proteina prema uputstvu, koji se vezuje za sLe<a>; b) čekanje tokom vremenskog intervala posle primene, da se konjugatu ili fuzionom proteinu dozvoli da se preferencijalno koncentruje na mestima u subjektu gde se sLe<a>eksprimira (i, u nekim aspektima, da se nevezani konjugovani ili fuzioni protein očisti do pozadinskog nivoa); c) određivanje nivoa pozadine; i d) otkrivanje konjugata ili fuzionog proteina kod subjekta, tako da otkrivanje konjugata ili fuzionog proteina iznad nivoa pozadine ukazuje na to da subjekat ima bolest. Pozadina se može odrediti različitim metodama, uključujući poređenje otkrivene količine konjugata ili fuzionog proteina sa standardnom vrednošću koja je prethodno određena za određeni sistem.
[0100] Podrazumeva se da će veličina subjekta i sistem za obradu slike koji se koriste odrediti količinu dela snimka potrebnog za izradu dijagnostičkih slika, a stručnjak može lako da ga odredi. Na primer, u slučaju radioizotopa konjugovanog sa antitelom ili funkcionalnim fragmentom uputstva, za ljudskog subjekta, količina ubrizgane radioaktivnosti će se normalno kretati u rasponu od oko 5 do 20 miljuka od 99Tc. Konjugat će se tada preferencijalno akumulirati na mestu ćelija koje eksprimiraju sLe<a>. Snimanje tumora in vivo opisano je u S.W. Burchiel et al., "Immunopharmacokinetics of Radiolabeled Antibodies and Their Fragments." (Poglavlje 13 u Tumor Imaging: The Radiochemical Detection of Cancer, S.W. Burchiel i B.A. Rhodes, eds., Masson Publishing Inc. (1982).
[0101] U zavisnosti od nekoliko promenljivih, uključujući vrstu detektujućeg agensa koji se koristi i način davanja, vremenski interval nakon davanja dozvole da se konjugat preferencijalno koncentriše na mestima u subjektu i da se nevezani konjugat ukloni na nivo pozadine je 6 do 48 sati ili 6 do 24 sata ili 6 do 12 sati. U još jednom izvođenju, vremenski interval nakon primene je 5 do 20 dana ili 5 do 10 dana. U jednom primeru izvođenja, nadgledanje bolesti se izvodi ponavljanjem postupka dijagnoze kako je ovde predviđeno, na primer, mesec dana nakon početne dijagnoze, šest meseci nakon početne dijagnoze, godinu dana nakon početne dijagnoze ili duže.
[0102] Prisustvo konjugovanog ili fuzionog proteina može se otkriti kod subjekta korišćenjem metoda poznatih u struci za in vivo skeniranje. Ove metode zavise od vrste agensa koji se može detektovati. Kvalifikovani zanatlija će moći da odredi odgovarajući metod za otkrivanje određenog agensa koji se može detektovati. Metode i uređaji koji se mogu koristiti u dijagnostičkim metodama uputstva uključuju, ali nisu ograničeni na, računarsku tomografiju (CT), skeniranje celog tela poput emisione tomografije položaja (PET), snimanje magnetne rezonance (MRI) i sonografiju. U jednom primeru izvođenja, antitelo ili fragment funkcije učenja je konjugovano sa radioizotopom i otkriveno je kod ispitanika pomoću hirurškog instrumenta koji reaguje na zračenje. U još jednom izvođenju, antitelo ili fragment funkcije podučavanja je konjugovano sa fluorescentnim jedinjenjem i otkriveno je u subjektu pomoću instrumenta za skeniranje koji reaguje na fluorescenciju. U još jednom izvođenju, antitelo ili fragment funkcije podučava se sa metalom koji emituje pozitron, kao što je cirkonijum (89Zr) ili bilo kojim drugim metalom koji emituje pozitron, koji je ovde dat ili koji je u struci dobro poznat da se može otkriti pozitronskom emisionom tomografijom, a otkriva se kod subjekta pomoću pozitronske emisione tomografije. U još jednom izvođenju, antitelo ili fragment funkcije učenja je konjugovano sa paramagnetnom oznakom i detektuje se kod subjekta pomoću magnetne rezonance (MRI).
[0103] U jednom izvođenju, uputstvo obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja ima antitelo ili funkcionalni fragment uputstva i farmaceutski prihvatljiv nosač. Farmaceutski prihvatljiv nosač koji se može koristiti u farmaceutskim kompozicijama uputstva uključuje bilo koji od standardnih farmaceutskih nosača poznatih u struci, kao što je fiziološki rastvor puferisan u fosfatu, voda i emulzije kao što su emulzija ulja i vode i razne vrste vlaženja agenti. Ove farmaceutske smeše mogu se pripremiti u tečnim jediničnim doznim oblicima ili u bilo kom drugom obliku doziranja koji je dovoljan za isporuku antitela ili funkcionalnog fragmenta uputstva u ciljno područje osobe kojoj je potrebno lečenje. Na primer, farmaceutske smeše se mogu pripremiti na bilo koji način koji odgovara odabranom načinu primene, npr. Intravaskularno, intramuskularno, potkožno, intraperitonealno, itd. Ostale neobavezne komponente, npr. Stabilizatori farmaceutske građe, puferi, konzervansi, pomoćne supstance i slično može biti odabrano od strane stručnjaka u ovoj oblasti. Priprema farmaceutske kompozicije, uzimajući u obzir pH, izotoničnost, stabilnost i slično, u okviru je nivoa stručnosti u tehnici.
[0104] Farmaceutske formulacije koje sadrže jedno ili više antitela ili funkcionalnih fragmenata ovde datog učenja mogu se pripremiti za skladištenje mešanjem antitela željenog stepena čistoće sa opcionalnim fiziološki prihvatljivim nosačima, ekscipijentima ili stabilizatorima (Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co. , Easton, PA), u obliku liofilizovanih formulacija ili vodenih rastvora. Prihvatljivi nosači, pomoćne supstance ili stabilizatori nisu toksični za primaoce u dozama i koncentracijama koje se koriste i uključuju pufere kao što su fosfat, citrat i druge organske kiseline; antioksidanti, uključujući askorbinsku kiselinu i metionin; konzervansi (kao što su oktadecildimetilbenzil amonijum hlorid; heksametonijum hlorid; benzalkonijum hlorid, benzetonijum hlorid; fenol, butil ili benzil alkohol; alkil parabeni kao što je metil ili propil paraben; katehol; resorcinol; cikloheksanol; 3-pentarezol; polipeptidi niske molekulske težine (manje od oko 10 ostataka); proteini, kao što su serumski albumin, želatin ili imunoglobulini; hidrofilni polimeri kao što je polivinilpirolidon; aminokiseline kao što su glicin, glutamin, asparagin, histidin, arginin ili lizin; monosaharidi, disaharidi i drugi ugljeni hidrati, uključujući glukozu, manozu ili dekstrine; helatni agensi kao što je EDTA; šećeri kao što su saharoza, manitol, trehaloza ili sorbitol; soli protiv formiranja kao što je natrijum; metalni kompleksi (npr. Zn-proteinski kompleksi); i / ili nejonske površinski aktivne supstance kao što su TVEEN ™, PLURONICS ™ ili polietilen glikol (PEG).
[0105] Tako, u nekim realizacijama, uputstvo pruža metod za lečenje ili prevenciju bolesti kod subjekta kome je to potrebno. Metode uputstva mogu obuhvatati davanje subjektu terapeutski efikasne količine ovde date farmaceutske smeše. Na primer, farmaceutska kompozicija može da sadrži jedno ili više antitela ili funkcionalnih fragmenata ovde datih. Bolesti koje mogu da se leče ili spreče postupcima prema uputstvima uključuju rak, stvaranje tumora i / ili metastaze. Metode uputstva su naročito korisne za lečenje karcinoma ili tumorskih formacija, pri čemu ćelije karcinoma ili tumor eksprimiraju ugljeni hidrat sLea. Neograničavajući primeri karcinoma ili tumora koji se mogu lečiti ili sprečiti korišćenjem metoda uputstva uključuju tumore gastrointestinalnog trakta, na primer, rak debelog creva, kolorektalni adenokarcinom, metastatski rak debelog creva, rak debelog creva, pankreas ili adenokarcinom pankreasa; maloćelijski karcinom pluća; adenokarcinom bešike; karcinom jajnika sa pečatnim prstenom; rak jajnika, metastatski karcinom; i adenokarcinom želuca, jednjaka, grla, urogenitalnog trakta ili dojke.
[0106] Shodno tome, u nekim aspektima, uputstvo nudi metodu za lečenje raka ili sprečavanje metastaziranja tumora kod subjekta kome je to potrebno davanjem terapeutski efikasne količine farmaceutske smeše koja ima antitelo ili njegov funkcionalni fragment, pri čemu se antitelo ili funkcionalni fragment vezuje za sLea i uključuje VH domen koji ima aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine ostaci 20-142 od SEQ ID NO: 2, ostaci 20-142 od SEQ ID NO: 6, ostaci 20-142 od SEQ ID NO: 10, i ostaci 20 145 iz SEQ ID NO: 14. U drugom aspektu, uputstvo pruža metodu za lečenje raka ili sprečavanje metastaziranja tumora kod subjekta kome je to potrebno davanjem terapeutski efikasne količine farmaceutske smeše koja ima antitelo ili njegov funkcionalni fragment. , pri čemu se antitelo ili funkcionalni fragment veže za sLea i uključuje VL domen koji ima aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od ostataka 20-130 od SEQ ID NO: 4, ostaci 20-129 od SEQ ID NO: 8, ostaci 20-130 od SEQ ID NO: 12 i ostaci 23 130 od SEQ ID NO: 16. U još jednom aspektu, uputstvo nudi metod za lečenje karcinoma ili sprečavanje tumorskih metastaza kod subjekta kome je to potrebno davanjem terapeutski efikasne količine farmaceutske smeše koja ima antitelo ili njegov funkcionalni fragment, pri čemu se antitelo ili funkcionalni fragment vezuje za sLea i uključuje i VH domen i VL domen, gde VH domen i VL domen uključuju aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od ostataka 20-142 od SEQ ID NO: 2 i ostataka 20-130 od SEQ ID NO: 4; ostaci 20-142 od SEQ ID NO: 6 i ostaci 20-129 od SEQ ID NO: 8; ostaci 20-142 od SEQ ID NO: 10 i ostaci 20-130 od SEQ ID NO: 12; i ostaci 20-145 od SEQ ID NO: 14 i ostaci 23-130 od SEQ ID NO: 16.
[0107] Formulacije, kao što su ovde opisane, takođe mogu sadržati više od jednog aktivnog jedinjenja po potrebi za određenu bolest koja se leči. U određenim realizacijama, formulacije uključuju antitelo ili funkcionalni fragment uputstva i jedno ili više aktivnih jedinjenja sa komplementarnim aktivnostima koje ne utiču negativno jedna na drugu. Takvi molekuli su pogodno prisutni u kombinaciji u količinama koje su efikasne za namenu. Na primer, antitelo ili funkcionalni fragment uputstva mogu se kombinovati sa jednim ili više drugih terapeutskih sredstava. Takva kombinovana terapija može se primeniti na subjektu istovremeno ili uzastopno.
[0108] Prema tome, u nekim aspektima, uputstvo pruža postupak za lečenje ili prevenciju bolesti davanjem ovde terapeutski efikasne količine farmaceutske kompozicije subjektu kome je to potrebno, pri čemu farmaceutska kompozicija uključuje antitelo ili funkcionalni fragment uputstva i drugo terapijsko sredstvo. Odgovarajući drugi terapeutski agens može lako odrediti stručnjak u struci, kao što je ovde diskutovano. Kao što je ovde dato u Primeru IV, u nekim aspektima uputstva, drugo terapeutsko sredstvo može biti taksol.
[0109] Ovde obezbeđeni farmaceutski sastavi sadrže terapeutski efikasne količine jednog ili više antitela iz ovde datog učenja, i opciono jedno ili više dodatnih terapijskih sredstava, u farmaceutski prihvatljivom nosaču. Takve farmaceutske smeše su korisne u prevenciji, lečenju, upravljanju ili ublažavanju bolesti, takvog raka ili formiranja tumora, ili jednog ili više njihovih simptoma.
[0110] Farmaceutske smeše mogu sadržati jedno ili više antitela ili funkcionalnih fragmenata uputstva. U jednom izvođenju, antitela ili funkcionalni fragmenti su formulisani u odgovarajuće farmaceutske preparate, kao što su sterilni rastvori ili suspenzije za parenteralnu primenu. U jednom izvođenju, ovde data antitela ili funkcionalni fragmenti formulisani su u farmaceutske kompozicije primenom tehnika i postupaka dobro poznatih u struci (videti, na primer, Ansel (1985) Uvod u farmaceutske dozne oblike, 4. izdanje, str.126).
[0111] Antitelo ili funkcionalni fragment uputstva može se uključiti u farmaceutsku kompoziciju u terapeutski efikasnoj količini dovoljnoj za vršenje terapeutski korisnog dejstva u odsustvu neželjenih neželjenih efekata na subjekta koji se leči. Terapeutski efikasna koncentracija može se empirijski odrediti ispitivanjem jedinjenja u sistemima in vitro i in vivo upotrebom rutinskih metoda, a zatim ekstrapolovanjem iz njih za doziranje za ljude. Koncentracija antitela ili funkcionalnog fragmenta u farmaceutskoj kompoziciji zavisiće, na primer, od fizičko-hemijskih karakteristika antitela ili funkcionalnog fragmenta, rasporeda doziranja i primenjene količine, kao i od drugih faktora dobro poznatih stručnjacima u ovoj oblasti.
[0112] U jednom primeru izvođenja, terapeutski efikasna doza daje serumsku koncentraciju antitela ili funkcionalnog fragmenta od oko 0,1 ng / ml do oko 50-100 mg / ml. Farmaceutske smeše, u još jednom izvođenju, obezbeđuju dozu od oko 0,001 mg do oko 500 mg antitela po kilogramu telesne težine dnevno. Oblici jediničnih farmaceutskih doza mogu se pripremiti da obezbede od oko 0,01 mg, 0,1 mg ili 1 mg do oko 30 mg, 100 mg ili 500 mg, a u jednom izvođenju od oko 10 mg do oko 500 mg antitela ili funkcionalnog fragmenta i/ili kombinacija drugih neobaveznih esencijalnih sastojaka po jedinici dozne jedinice.
[0113] Antitelo ili funkcionalni fragment uputstva mogu se primeniti odjednom ili se mogu podeliti u veći broj manjih doza koje se daju u intervalima. Podrazumeva se da su tačna doza i trajanje lečenja u funkciji bolesti koja se leči i mogu se empirijski odrediti koristeći poznate protokole ispitivanja ili ekstrapolacijom iz podataka in vivo ili in vitro testova. Treba napomenuti da koncentracije i vrednosti doziranja mogu takođe da variraju u zavisnosti od težine stanja koje treba ublažiti. Dalje treba razumeti da se za bilo koji određeni subjekt, određeni režimi doziranja mogu vremenom prilagoditi prema individualnoj potrebi i profesionalnoj proceni osobe koja administrira ili nadzire administraciju kompozicija, i da su ovde navedeni rasponi koncentracija samo primerni i nisu namenjeni ograničavanju obima ili prakse zahtevanih kompozicija.
[0114] Nakon mešanja ili dodavanja antitela ili funkcionalnog fragmenta uputstva, rezultujuća smeša može da bude rastvor, suspenzija ili slično. Oblik rezultujuće smeše zavisi od brojnih faktora, uključujući predviđeni način primene i rastvorljivost jedinjenja u odabranom nosaču ili nosaču. Efektivna koncentracija je dovoljna za ublažavanje simptoma bolesti, poremećaja ili stanja i može se empirijski odrediti.
[0115] Farmaceutske smeše su predviđene za primenu kod ljudi i životinja u jediničnim oblicima doziranja, kao što su sterilni parenteralni rastvori ili suspenzije koji sadrže odgovarajuće količine jedinjenja ili njihovih farmaceutski prihvatljivih derivata. Antitelo ili funkcionalni fragment mogu se, u jednom izvođenju, formulisati i primeniti u oblicima jedinične doze ili oblicima više doza. Oblici jediničnih doza odnose se na fizički odvojene jedinice pogodne za ljude i životinje i pakovane pojedinačno, kao što je poznato u tehnici. Svaka jedinična doza sadrži unapred određenu količinu antitela ili funkcionalnog fragmenta uputstva dovoljnu da proizvede željeni terapeutski efekat, zajedno sa potrebnim farmaceutskim nosačem, nosačem ili razblaživačem. Primeri oblika jedinične doze uključuju ampule i špriceve. Oblici jediničnih doza mogu se davati u frakcijama ili u više njih. Oblik sa više doza je mnoštvo identičnih oblika jediničnih doza, upakovanih u jedan kontejner, koji se daju u odvojenom obliku jediničnih doza. Primeri oblika više doza uključuju bočice ili boce sa pintama ili galonima. Stoga je oblik višestruke doze višestruki jedinični doza koji nije odvojen u pakovanju.
[0116] U jednom primeru izvođenja, jedno ili više antitela ili funkcionalni fragment uputstva nalazi se u tečnoj farmaceutskoj formulaciji. Tečni farmaceutski primenljivi sastavi mogu se, na primer, pripremiti rastvaranjem, dispergovanjem ili na drugi način mešanjem antitela ili funkcionalnog fragmenta kao što je ovde dato i opcionalnih farmaceutskih dodataka u nosaču, kao što su, na primer, voda, fiziološki rastvor, vodena dekstroza, glicerol, glikoli, etanol i slično, čime se formira rastvor. Po želji, farmaceutski sastav koji se daje može takođe sadržati manje količine netoksičnih pomoćnih supstanci kao što su sredstva za vlaženje, emulgatori, sredstva za solubilizaciju, pH puferi i slično, na primer, acetat, natrijum citrat, derivati ciklodekstrina, sorbitan monolaurat, trietanolamin natrijum acetat, trietanolamin oleat i druga takva sredstva. Stvarne metode pripreme takvih oblika doziranja poznate su ili će biti očigledne stručnjacima u ovoj oblasti; na primer, vidi Remington’s Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, PA.
4
[0117] Postupci za primenu farmaceutskog sastava uputstva dobro su poznati u tehnici. Podrazumeva se da kvalifikovani kliničar može lako odrediti odgovarajući način primene farmaceutske smeše. Primeri primene primene uključuju intravensku injekciju, intramuskularnu injekciju, intradermalnu injekciju ili potkožnu injekciju. Štaviše, podrazumijeva se da se formulacija farmaceutske kompozicije može lako prilagoditi da se prilagodi načinu davanja. Uputstvo takođe predviđa da se nakon primene farmaceutskog sastava uputstva, odloženo, uzastopno i/ili ponovljeno doziranje jednog ili više farmaceutskih preparata kako je ovde dato može dati subjektu.
[0118] Metode uputstva za lečenje bolesti treba da obuhvate (1) sprečavanje bolesti, tj. Sprečavanje da se klinički simptomi bolesti razvijaju kod subjekta koji može da bude predisponiran bolesti, ali još uvek nema simptoma ili ne pokazuje simptome bolesti; (2) inhibiranje bolesti, tj. Zaustavljanje ili smanjenje razvoja bolesti ili njenih kliničkih simptoma; ili (3) ublažavanje bolesti, tj. izazivanje regresije bolesti ili njenih kliničkih simptoma. Metode uputstva za sprečavanje bolesti imaju za cilj da uključuju sprečavanje kliničkog simptoma koji ukazuje na rak ili stvaranje tumora. Takvo unapredjenje uključuje, na primer, održavanje normalnih fizioloških pokazatelja kod subjekta. Prema tome, prevencija može da uključuje i profilaktički tretman subjekta koji ga štiti od pojave metastaza tumora.
[0119] Terapeutski efikasna količina farmaceutskog preparata koji se koristi u metodama prema uputstvu variraće u zavisnosti od korišćenog farmaceutskog sastava, bolesti i težine i starosti, težine itd. Subjekta koji se leči, a sve je u okviru veština lekara koji dolazi. Predmeti koji se mogu lečiti metodama uputstva uključuju kičmenjake, poželjno sisare, poželjnije čoveka.
[0120] Podrazumeva se da su modifikacije koje ne utiču suštinski na aktivnost različitih ostvarenja prema uputstvu takođe predviđene u okviru definicije uputstva koja je ovde data. Shodno tome, sledeći primeri imaju za cilj da ilustruju, ali ne i ograniče sadašnje uputstvo.
PRIMER I
Humana monoklonska antitela na sLe<a>imaju potentnu antitumorsku aktivnost
[0121] Ugljikohidratni antigen sLe<a>je široko eksprimiran na epitelnim tumorima gastrointestinalnog trakta, dojke i pankreasa i na malim ćelijskim karcinomima pluća. Pošto se čini da je prekomerna ekspresija sLea ključni događaj u invaziji i metastaziranju mnogih tumora i rezultira osetljivošću na lizu posredovanu antitelima, sLea je atraktivna molekularna meta za terapiju tumora. Shodno tome, kako je ovde opisano, generisana su i okarakterisana potpuno humana monoklonska antitela (mAb) iz limfocita u krvi od pojedinaca imunizovanih sLea-KLH vakcinom. Nekoliko mAb je odabrano na osnovu ELISA i FACS, uključujući dva mAb sa visokim afinitetom za sLea (5B1 i 7E3, afiniteti vezivanja 0,14 i 0,04 nmol/L, i dalje okarakterisani). Oba antitela bila su specifična za Neu5Acα2-3Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAcβ i Neu5Gcα2-3Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAcβ utvrđena analizom glikanskog niza. Citotoksičnost koja zavisi od komplementa protiv ćelija DMS-79 bila je veća (EC500.1 mg / ml naspram 1,7 mg / ml) za r7E3 (IgM) nego za r5B1 (IgG1). Pored toga, antitela na r5B1 pokazala su visok nivo aktivnosti ćelije posredovane citotoksičnošću zavisne od antitela na DMS-79 ćelijama sa humanim NK ćelijama ili mononuklearnim ćelijama periferne krvi. Da bi se procenila in vivo efikasnost, antitela su testirana u modelu ksenografta sa tumorskim ćelijama Colo205 ili tumorskim ćelijama DMS-79 ugrađenim u miševe sa teškim kombinovanim imunodeficijentom (SCID). U modelu Colo205 ksenografta, tretman tokom prva 21 dana sa četiri doze r5B1 (100 mg po dozi) udvostručio je srednje vreme preživljavanja na 207 dana, a tri od pet životinja preživele su sa šest doza. U DSM-79 ksenograftskom modelu, rast uspostavljenih DMS-79 tumora je suzbijen ili regresiran kod životinja lečenih r5B 1 antitelom. Na osnovu potencijala sLe<a>kao mete za imunološki napad i njihovog afiniteta, specifičnosti i efektorskih funkcija, 5B1 i 7E3 imaju kliničku korist u lečenju karcinoma.
Materijali, ćelije i antitela
[0122] DMS-79 (Pettengill et al., Cancer, 45: 906-18 (1980)), SV626, EL4, HT29, BxPC3, SK MEL28 i P3 3 63Ag8.653 ćelijske linije su kupljene od American Tipe Culture Collection (ATCC). Colo205-luc ćelije (Bioware ultra) su dobijene od kompanije Caliper Life Sciences. Mišji kontrolni mAb 121SLE (IgM) kupljen je od GeneTek. sLe<a>tetrasaharid (Cat # S2279) kupljen je od Sigma-Aldrich. konjugat sLea-HSA (humani serumski albumin) (Cat # 07-011), monovalentni biotinilirani sLea (sLea-sp-biotin; Cat # 02-044), polivalentni biotinilirani sLea-PAA (Cat # 01-044), označen biotinom Lea-PAA (Cat # 01-035) i sLek-PAA-biotin (Cat # 01-045) su kupljeni od GlicoTech-a. U polivalentnoj prezentaciji, tetrasaharid se ugrađuje u poliakrilamidnu matricu (PAA), stvarajući tako multivalentni polimer od 30 kDa sa približno svakom petom amidnom grupom polimernog lanca N-supstituisanom sa biotinom u omjeru 4: 1 i približno 20% sadržaj ugljenih hidrata. Ostale HSA ili BSA glikokonjugati korišćeni u ovoj studiji smo sami pripremili koristeći sLe<a>pentenil glikozid kako je opisano. Ragupathi et al., Cancer Immunol Immunother, 58: 1397-405 (2009). GD3, fukozil GM1, GM2 i GM3 su kupljeni od firme Matreya, a GD2 od Advanced ImmunoChemical.
Generisanje hibridoma koji proizvode anti-sLe<a>mAb
[0123] Uzorci krvi su dobijeni od 3 pacijenta u tekućem ispitivanju sa konjugovanom vakcinom sLea-KLH kod pacijenata sa rakom dojke pokrenutog na MSKCC prema MSKCC i FDA odobrenom IRB protokolu i IND. Uzorci krvi odabrani su od 2 pacijenta nakon 3 ili 4 vakcinacije, koje su pokazale titre antitela 1/160, odnosno 1/320, protiv sLe<a>. Ovi serumi (i mišji mAb 19.9) dobro reaguju sa sLe<a>-pozitivnim ćelijskim linijama u FACS testovima i posreduju u snažnom CDC. Ragupathi et al., Cancer Immunol Immunother, 58: 1397-405 (2009). Mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) izolovane su od približno 80 do 90 ml krvi gradijentnim centrifugiranjem na Histopaque-1077 (Sigma-Aldrich).
[0124] PBMC su kultivisani u RPMI-1640 medijumu dopunjenom L-glutaminom, neesencijalnim aminokiselinama, natrijum piruvatom, vitaminom, penicilinom/streptomicinom, 10% FBS (Omega Scientific), 10 ng/ml IL-21 (Biosource) i 1 µg/ml anti-CD40 mAb (supernatant hibridoma G28-5; ATCC). Ćelije su fuzionisane elektrofuzijom sa ćelijama mijeloma P3 x 63Ag8.653.
sLe<a>ELISA
[0125] Za sLe<a>ELISA, ploče su obložene ili sa 1 µg/ml konjugata sLe<a>-HSA, monovalentnog biotinilovanog sLe<a>, ili sa polivalentnim biotiniliranim sLe<a>-PAA uhvaćenim na pločama obloženim Neutr Avidin. Bunarci bez premaza (PBS) i HSA obloženi bunari korišćeni su kao kontrole. Vezana antitela su u početku otkrivena kozjim anti-humanim IgA G M obeleženim peroksidazom hrena (HRP), a pozitivni bunarčići su naknadno sondirani sekundarnim antitelima specifičnim za IgG Fcor IgM da bi se utvrdili izotipovi.
Analiza specifičnosti ugljenih hidrata
[0126] Unakrsna reaktivnost prema usko povezanim antigenima, Le<a>i sLe<x>, procenjena je površinskom plazmonskom rezonancom (SPR) i potvrđena ELISA testom korišćenjem biooznačenih Le<a>-PAA i biotin-sLe<x>-PAA. Vezivanje za gangliozide GD2, GD3, fukozil-GM1, GM2 i GM3 testirano je ELISA. Kompetitivni ELISA test je korišćen za procenu specifičnosti mAb u odnosu na nekoliko drugih srodnih ugljenohidratnih delova. Ukratko, 2 µg/ml sLea-HSA konjugata je obložen na ploče, a zatim je blokirano sa 3% BSA u PBS. Sledeće, 30 µl različitih ugljenohidratnih delova (40 µg/ml u PBS pripremljenom od matičnih rastvora od 1 mg/ml), bilo nekonjugovanih ili konjugovanih sa HSA ili BSA, pomešano je odvojeno sa 30 µl test antitela i inkubirano na sobnoj temperaturi u ploči za uzorke . Posle 30 minuta 50 µl smeše je prebačeno na presvučenu test pločicu i inkubirano 1 sat, nakon čega je usledila inkubacija sa HRP obeleženim kozjim anti-humanim IgA G M, pranjem i kolorimetrijskom detekcijom vezanih antitela pomoću Versamak spektrofluorometra (svi koraci su izvedeni na sobnoj temperaturi). Testirani ugljenohidratni delovi su sadržali globo H, Luis Y, Luis X, sialil-Thomson-nouveaux (sTn), klaster sTn, Thomson Friedenreich (TF), Tighe Le<b>/Le<Y>mucin, svinjski submaksilarni
4
mucin (PSM) i sLe<a>tetrasaharid i sLe<a>-HSA konjugat. Da bi se utvrdila fina specifičnost antitela, analizu niza glikana uradila je grupa Consortium for Functional Glycomics Core H. Antitela na 5B1 i 7E3 ispitana su na 10 µg/ml upotrebom verzije 4.1 štampanog niza koji se sastojao od 465 glikana u 6 replikata.
Kloniranje imunoglobulinske cDNK i ekspresija rekombinanatnog antitela
[0127] Varijabilni region humane mAb teške i lakog lanca cDNA je obnovljen RT-PCR iz pojedinačne ćelijske linije hibridoma i subkloniran u IgG1 ili IgM teški lanac ili IgK ili IgL vektor ekspresije lakog lanca, kao što je prethodno opisano. Savada-Hirai et al., J. Immune Based Ther. Vakcine, 2: 5 (2004). Ekspresijski vektor teškog lanca ili lakog lanca je dvostruko svaren sa Not I i Sal I, a zatim su oba fragmenta podvezana da bi se formirao dvogeni ekspresijski vektor. CHO ćelije u pločama sa 6 jažica su transfektovane dvostrukim genskim ekspresijskim vektorom korišćenjem Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Posle 24 sata, transfektovane ćelije su prenete u posudu od 10 cm sa medijumom za selekciju [DMEM dopunjen sa 10% dijalizovanim FBS (Invitrogen), 50 mmol / L L-metionin sulfoksiminom (MSKS), GS suplementom (Sigma-Aldrich) i penicilin / streptomicin (Omega Scientific)]. Dve nedelje kasnije transfektanti otporni na MSKS su izolovani i prošireni. Klonovi visokih antitela na proizvodnju antitela izabrani su merenjem nivoa antitela u supernatantima u ELISA testu specifičnom za sLea i prošireni za proizvodnju mAb velikih razmera.
Prečišćavanje humanog mAb
[0128] Antitela su pročišćena pomoću sistema Akta Ekplorer (GE Healthcare) koji pokreće softver Unicorn 5.0. Ukratko, stabilni klonovi 5B1 ili 7E3 uzgajani su u medijumu za kulturu bez seruma u Vave bioreaktoru, a sakupljeni supernatant se bistri centrifugiranjem i filtriranjem i čuva u frižideru dok se ne upotrebi. Ljudska IgG antitela su prečišćena na protein A kolonama odgovarajuće veličine upotrebom 10 mmol/L PBS i 150 mmol/L NaCl tekućeg pufera. Ljudska IgM antitela su prečišćena na koloni hidroksiapatita, a IgM je eluiran gradijentom od 500 mmol/L fosfata. Koncentracije antitela su određene pomoću OD280 koristeći E1% 1,4 i 1,18 za IgG, odnosno IgM, za izračunavanje koncentracije. Čistoća svakog preparata je procenjena SDS-PAGE analizom (1-5 mg po traci) pod redukcionim uslovima, a čistoća je bila veća od 90% na osnovu zbira teških i lakih lanaca.
Protočna citometrija
[0129] sLe<a>-pozitivne ili negativne ćelijske linije (0,5 x 10<6>ćelija po stanju) isprane su u PBS/2% FBS (PBSF). Zatim je dodat test ili kontrola humanog mAb (1-2 mg/ml u potpunom medijumu) i inkubiran na ledu 30 minuta. Gilewski et al., Clin Cancer Res, 6: 1693-701 (2000); Gilewski et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 98: 3270-5 (2001). Posle pranja u PBSF, ćelije su inkubirane sa Alexa-488 anti-humanim IgG-Fci ili anti-humanim IgM-m (Invitrogen) tokom 30 minuta na ledu. Ćelije su isprane dva puta u PBSF-u i analizirane protočnom citometrijom primenom sistema Guava Personal Cell Analysis-96 (PCA-96) (Millipore). Ćelije Colo205-luc su inkubirane sa 2 µg/mL primarnog antitela, praćeno bojanjem sekundarnim antitelima iz SouthernBiotech-a i analizirane na Becton Dickinson FACS Advantage IV instrumentu pomoću softvera FlovJo 7.2.4.
Određivanje afiniteta
[0130] Konstante afiniteta su određene pomoću principa SPR sa Biacore 3000 (GE Healthcare). Biovalentno obeleženi jednovalentni sLe<a>(Cat # 02-044) ili polivalentni sLea-PAA-biotin (Cat # 01-044) su spojeni za odvajanje protočnih ćelija SPA biosenzorskog čipa prema uputstvima proizvođača. Kao referentna ćelija korišćena je protočna ćelija blokirana HSA i podloga za kulturu koja sadrži slobodni biotin. Kinetički parametri vezivanja određeni su iz nekoliko poznatih koncentracija antitela razblaženih u puferu HBS-EP (10 mmol / L HEPES, pH 7,4, 150 mmol / L NaCl, 3,4 mmol / L EDTA, 0,005% surfaktanta P20) koristeći sLea-PAA -protočna ćelija obložena biotinom. Softver za prilagođavanje krivine koji pruža instrument Biacore korišćen je za generisanje procena stopa pridruživanja i disocijacije na osnovu kojih se izračunavaju afiniteti.
CDC test
[0131] sLea antigen pozitivne i -negativne ćelijske linije su korišćene za 90-minutni test citotoksičnosti (Guava PCA-96 komplet za ćelijsku toksičnost; Millipore; Cat # 4500-0200) korišćenjem humanog komplementa (Kuidel; Cat # A113) i prečišćenih humanih mAb u raznim razblaženjima (0,1-25 mg / ml) ili sa pozitivnim kontrolnim mAb kako je prethodno opisano (Ragupathi et al. Clin Cancer Res 2003, 9: 5214; Ragupathi et al. Int J Cancer 2000, 85: 659; Dickler et al. Cancer Res 1999, 5: 2773). Ukratko, 2,5 x 10<6>ciljne ćelije su obojene karboksifluorescein diacetat sukcinimil esterom (CSFE) da bi se dobile zelene / žute fluorescentne ciljne ćelije. Obojene ćelije (13 105/50 ml uzorka) inkubirane su 40 minuta sa 100 ml antitela na ledu. Sledeće, 50 mL humanog komplementa razblaženog 1: 2 u kompletnom medijumu (RPMI-1640, 10% FCS) ili samom medijumu dodato je u trostruke uzorke i inkubirano 90 minuta na 37 ° C. Tako je konačno razblaženje komplementa u testu bilo 1: 8. Ćelije koje su ubijene tokom ovog vremena inkubacije obeležene su dodavanjem membranski nepropusne boje 7-aminoaktinomicin D (7-AAD), a uzorci su analizirani imunofluorescencijom
4
u dve boje koristeći softverski modul Guava CellTokiciti. Kontrolni uzorci koji su primili NP40 korišćeni su za određivanje maksimalnog ubijanja, a uzorci koji su primili komplement sami su poslužili kao početna linija. Procenat ubijenih ćelija određen je odgovarajućim zatvaranjem i izračunat prema sledećoj formuli:% ubijenih = [(% uzoraka -% komplementa samo) / (% NP40 -% samo komplementa)] x 100.
Antitelo-zavisan ćelijski posredovan test citotoksičnosti
[0132] PBMC efektorske ćelije izolovane su Ficoll-Hypaque centrifugiranjem gustine iz uzoraka krvi dobijenih prema protokolu odobrenom od MSKCC IRB. Ciljne ćelije su inkubirane sa 5 x 10<6>ćelija/ml u kompletnom medijumu za rast sa 15 µl 0,1% rastvora kalcein-AM (Sigma Aldrich) tokom 30 minuta na 37 °C, u prisustvu 5% CO2. Ćelije su isprane dva puta sa 15 µl PBS-0,02% EDTA i resuspendovane u 1 ml celokupnog medijuma za rast. Pedeset mikrolitara (10.000 ćelija) obeleženih ciljnih ćelija stavljeno je u ploču sa 96 jažica u prisustvu ili odsustvu antitela u koncentracijama opisanim na sl. 13, i inkubirani sa 50 µL sveže izolovanih mononuklearnih ćelija periferne krvi (efektorske ćelije, u omjeru 100: 1 E / T). Posle 2 sata inkubacije, ploča je centrifugirana na 300 3 g tokom 10 minuta, a 75 µl supernatanta je prebačeno u novu ploču sa 96 dna sa ravnim dnom. Fluorescencija u supernatantu je izmerena pri pobudi od 485 nm i emisiji 535 nm u usponu Fluoroskan (T ermo Scientific). Spontano otpuštanje je određeno iz ciljnih ćelija u medijumu RPMI-1640 sa 30% FBS bez efektorskih ćelija, a maksimalno oslobađanje je određeno iz ciljnih ćelija u medijumu RPMI-1640 sa 30% FBS i 6% Triton X-100 bez efektorskih ćelija. Procenat citotoksičnosti izračunat je kao [(brojevi u uzorku - spontano oslobađanje) / (maksimalno brojanje - spontano oslobađanje)] x 100.
Test internalizacije mAb
[0133] Internalizacija 5B 1 antitela je procenjena merenjem citotoksične aktivnosti r5B 1 i kompleksa sekundarnog konjugata Hum-ZAP (Napredni ciljni sistemi) protiv sLea koji eksprimiraju ćelije BxPC3, koje su postavljene u ploču sa 96 bunarčića (2.000 ćelija/90 µl/bunarčiću) i inkubirani preko noći u duplikatima. Razne koncentracije antitela 5B1 su inkubirane sa Hum-ZAP sekundarnim konjugatima na RT u skladu sa uputstvom proizvođača. Dalje, ćelijama je dodato 10 µl/jamici r5B1 i Hum-ZAP kompleksa i inkubirano 3 dana. Dvadeset pet mikrolitara rastvora tiazolil plavog tetrazolijum bromida (Sigma-Aldrich) (5 mg/mL u PBS) dodato je u svaku jažicu i inkubirano na 37 °C. Posle 2 sata inkubacije, u svaku jažicu je dodato 100 mL/jamici rastvora za rastvaranje (20% SDS50% N, N-dimetilformamid) i inkubirano još 16 sati na 37 °C. OD je izmeren na 570/690 nm, a vrednosti dobijene samo sa
4
medijumom su korišćene za oduzimanje pozadine ploče. Osam paralelnih kultura bez antitela je korišćeno za normalizaciju vrednosti uzorka (uzorak / srednja vrednost neobrađena x 100).
Model transplantacije ksenografta
[0134] Ženke CB17 SCID miševa (stare 5-8 nedelja) kupljene su od firme Taconic. Za Colo205 model ksenografta, Colo205-luc ćelije (0.5 × 10<6>) u 0.1 mL kompletnog medijuma za gajenje, injecirane su kroz repnu venu na dan 0 pomoću BD insulinskog šprica sa 28G iglom (Becton Dickinson & Co). Za prvu studiju je jedna stotina mikrograma mAb 5B1 injecirana intraperitonealno 1., 7., 14. i 21. dana (eksperiment 1) ili 1., 4., 7., 10., 14. i 21.dana (eksperiment 2). Za drugu studiju, 100 µg, 300 µg ili 1 mg mAb 5B1 injecirano je intraperitonealno 4. dana nakon injeciranja ćelija tumora, dvaput nedeljno prve dve nedelje i jednom nedeljno sledećih 7 nedelja. Praćen je razvoj tumora kod miševa. Za DMS-79 model ksenografta, DMS-79 ćelije (1 × 10<6>) su injecirane potkožno u ženke CB17 SCID miševa, i tretman miševa je otpočeo 19. dana, nakon što je dužina tumora dostigla 5 mm (∼20 mm<2>). Životinje su zatim tretirane humanim IgG ili 5B1 antitelima koja su davana putem intraperitonealne injekcije, sa 200 µg po dozi, plus cRGD putem intravenske injekcije, kako bi se povećala vaskularna permeabilnost, inicijalno sa 80 µg, zatim 5 dana po nedelji, 40 µg po dozi, do 37. dana.
[0135] Sve procedure su rađene prema protokolu koji je odobrio Institucionalni odbor za negu i upotrebu životinja Memorial Sloan Kettering bolnice. Kaplan-Majerove krive preživljavanja su generisane pomoću GraphPad Prism 5.1 (GraphPad softver) i analizirane pomoću Mantel-Henselovog log-rank testa.
Rezultati
Identifikacija humanih monoklonskih antitela ELISA testom i generisanje rekombinanatnih antitela
[0136] Uzorci krvi od 3 vakcinisana pacijenta korišćeni su za napore na generisanju hibridoma i u pozitivnim jamama otkriveno je u antigen specifičnim ELISA testovima (tabela 3). Opsežni skrining je korišćen za uklanjanje antitela koja su pokazala inferiorno ili nespecifično vezivanje. Osam ćelija hibridoma koji eksprimiraju antitela (1 IgM i 7 IgG) sa jakom reaktivnošću na sLea je u početku odabrano, prošireno i subklonirano za dalju karakterizaciju. Dva antitela (9H1 i 9H3) pokazala su snažno vezivanje za sLe<a>-HSA konjugate, ali ne i za ploče obložene sLe<a>-PAA. Tri antitela (5B1, 5H11 i 7E3) pokazala su snažno vezivanje za monovalentne i polivalentne konjugate sLe<a>i sLe<a>-HSA kada se mere ELISA testovima (Tabela 4).
4
Tabela 3: Vezivanje supernatanata dobijenih od hibridoma-kandidata koji sadrže IgG candidate ili IgM monoklonska antitela na konjugate sLe<a>-acetilfenilendiamina(APD) i humanog serumskog albumin (HSA) (sLea-HuSA).
OD (490 nm)*
4
[0137] Varijabilni regioni teškog i lakog lanca iz 4 odabrana antitela oporavljeni su pomoću RT-PCR i klonirani u naše ekspresijske vektore pune dužine IgG1 ili IgM. Analiza molekularne sekvence primenom IMGT / V-Kuest (Brochet et al., Nucleic Acids Res., 36: V503-8 (2008)) otkrila je da su 3 odabrana IgG antitela 5B1 (IgG / ), 9H3 (IgG / ), i 5H11 (IgG / ) su izvedeni iz iste porodice VH i svi su koristili lambda lagane lance. Ova IgG1 antitela su pokazala različite CDR sekvence sa 16, 5 ili 3 mutacije koje odstupaju od klicine linije (SLIKE 1-6; Tabela 5). IgM antitelo (7E3) koristi laki lanac kappa i ima 6 mutacija teškog lanca (SLIKE 7-8; Tabela 5). Povećane mutacije u 5B1 ukazuju na sazrevanje afiniteta. Rekombinantna antitela su proizvedena u ćelijskim linijama CHO u talasnom bioreaktor sistemu i prečišćena korišćenjem proteina A ili hidroksiapatitne hromatografije za IgG, odnosno IgM. Prečišćena rekombinantna antitela zadržala su svojstva originalnih antitela izvedenih iz hibridoma s obzirom na ELISA vezivanje i specifičnost.
Tabela 5: Klasifikacija cDNK odabranih humanih anti-sLe<a>antitela dobijenih od vakcinisanih donora krvi.
4
Analiza vezivanja za ćelije tumora
[0138] Vezivanje za površinu ćelija je od suštinskog značaja za citotoksičnu aktivnost, pa je ono sledeće testirano. Protočna citometrija je pokazala snažno vezivanje 5B1, 9H3, 5H11 i 7E3 rekombinanatnih antitela za DMS-79 ćelije, koje predstavljaju ćelijsku liniju sitnoćelijskog kancera pluća u suspenziji (SL. 11A). Vezivanje r5B1 i r7E3 potvrđeno je i na HT29 ćelijama kancera debelog creva (SL. 11B), BxPC3 ćelijama kancera pankreasa (SL. 11C), SW626 ćelijama kancera jajnika (SL. 11D), i Colo205-luc ćelijama kancera debelog creva (SL. 11F). Ova antitela nisu se vezivala za sLe<a>-negativne (SLE121-negativne) SK-MEL28 ćelije melanoma (SL. 11E) ili EL4 ćelije mišjeg limfoma (podaci nisu prikazani).
Merenja afiniteta
[0139] Relativni afinitet/aviditet vezivanja za sLe<a>testiran je putem SPR koristeći streptavidinom obloženi biosenzorski čip za hvatanje biotiniliranog sLe<a>-PPA. Kao što je prikazano u tabeli 6, r5B1 i r7E3 se brzo vezuju za sLe<a>-PPA i pokazuju znatno sporiji off-rate u poređenju sa 121SLE, komercijalno dostupnim mišjim IgM anti-sLe<a>antitelom koje je korišćeno za poređenje. Afinitet 5B1 izmeren je pri 0,14 nmol/L, a prividni afinitet/aviditet 7E3 bio je približno 4 puta veći (Tabela 6). Određivanje afiniteta za 9H3 je bilo otežano pošto se antitela za 9H3 (nativna i rekombinantna) nisu uspela vezati za biosenzorski čip obložen sLe<a>-PAA.
Tabela 6: Određivanje kinetičkih parametara za anti-sLe<a>antitrla putem SPR
Anliza specifičnosti
[0140] Preliminarni testovi za ispitivanje specifičnosti ugljenih hidrata pokazali su da se 5B1, 9H3 i 7E3 nisu vezali za usko povezane sLeKs, Lea ili LeI antigene ili gangliozide GD2, GD3, fukozil-GM1, GM2 i GM3, mereno ELISA ili SPR. Dodatna analiza vezivanja 7E3, 5B1 i 121SLE za sLe<a>-PAA-biotin ili sLe<a>-sp-biotin uhvaćene na Biacore 2.8 x 10<9>2.7 x 10<6>9.4 x 10-4 m-IgM avidin čipu pokazala su da su sva tri antitela vezana za polivalentnost. oblik sLe<a>, dok je utvrđeno da 7E3 i 5B1 vezuju monovalentni oblik. Vezivanje 5B1 za sLe<a>-PAA takođe je inhibirano sLe<a>tetrasaharidom na način koji zavisi od doze u seriji analize koncentracije Biacore (podaci nisu prikazani). Ovi rezultati su u skladu sa prethodnim zapažanjima da je utvrđeno da su serumi sa visokim titrima antitela na sLe<a>specifični za sLe<a>, odnosno da nisu reaktivni sa gangliozidima GM2, GD2, GD3, fukozil GM1 ili neutralnim glikolipidima globo H i Lei pomoću ELISA. Ragupathi et al., Cancer Immunol Immunother 58: 1397-405 (2009). U kompetitivnom testu sa 9 različitih srodnih ugljenohidratnih delova u različitim prezentacijama (npr. Kao ceramid ili konjugovani sa BSA ili HSA), samo sLe<a>tetrasaharidi i sLe<a>-HAS konjugati uspeli su da inhibiraju vezivanje za sLe<a>-HSA konjugat (Tabela 7).
Tabela 7: Vezivanje za sLeA-PAA-HAS u prisustvu različitih srodnih glikokonjugata
r5B1 r9H3 r7E3
1
[0141] Da bi se detaljnije ispitala specifičnost ugljenih hidrata, antitela na 5B 1 i 7E3 su takođe testirana analizom niza glikana koju je uradila grupa Consortium for Functional Glicomics Core H. Oba antitela su testirana na 10 µg/ml na štampanim nizovima koji se sastoje od 465 glikana u 6 ponavljanja. Rezultati su potvrdili visoku specifičnost oba antitela sa selektivnim prepoznavanjem sLe<a>tetrasaharida, Neu5Acα2-3Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAcβ i Neu5Gcα2-3Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAcβ i virtuelno odsustvo vezivanja za usko povezane antigene koji su bili prisutni u nizu, uključujući sLek, Lea, Lek i Lei. Rezultati su sumirani u Tabeli 8, koja pokazuje prvih 5 od 465 glikanskih struktura koje su prepoznata od strane odgovarajućih antitela.
Tabela 8: Analiza ugljenih hidrata skriningom glikanskih nizova
2
CDC aktivnost
[0142] Kako bi ocenili funkcionalnu aktivnost 5B1 i 7E3, testirali smo citotoksičnu aktivnost sa DMS-79 ćelijama u prisustvu humanog seruma kao izvora komplementa. Oba antitela su u nekim testovima pokazala aktivnost ubijanja od skoro 100% pri 10 µg/mL, dok kontrolno antitelo sa različitom specifičnošću (1B7, anti-GD2 IgG1 mAb) nije imalo efekta pri istim koncentracijama (podaci nisu prikazani). CDC aktivnost zavisi od koncentracije, i 7E3 je u ovom testu bilo značajno aktivnije od 5B1 (SL.12), što je i očekivano pošto se zna da su IgM antitela efikasnija u testovima komplementom posredovane citotoksičnosti. EC50(50% citotoksičnost) je iznosila 1.7 µg/mL za 5B1 i 0.1 µg/mL za 7E3, što se grubo prevodi u 85 puta veću potenciju za 7E3 na molarnoj bazi (SL.12).
ADCC aktivnost
[0143] Dok je u CDC testu 7E3 značajno potentniji, poznato je da IgG antitela imaju antitelozavisnu ćelijski posredovanu citotoksičnu (ADCC) aktivnost, za koju se smatra da je važnija za ubijanje tumora in vivo. Visoki nivoi citotoksičnosti su izmereni kada se koristilo 5B1 antitelo sa humanim PBMC i DMS-79 ciljnim ćelijama pri različitim E:T odnosima (SL.13A). Slični nivoi citotoksičnosti su uočeni pri nižim E:T odnosima sa primarnim NK ćelijama (SL. 13B). Eksperiment u vezi sa odnosom doze i odgovora na PBMC ćelijama od 2 donora, mereno pri E/T odnosu od 100:1, pokazao je sličnu efikasnost, i citotoksičnost od više od 85% je dostignuta pri koncentracijama 5B1 od 0.5 mg/mL ili više (SL. 13C). Za citotoksičnost koja je posredovana putem 5B neophodni su FcγRIII receptori pošto može da se blokira 3G8 anti-CD16 antitelima. Visoki nivoi citotoksičnosti su takođe izmereni koristeći 5B1 antitelo sa humanim PBMC ćelijama against Colo205-luc ćelijama pri E:T odnosu od 100:1. ADCC aktivnost postignuta sa 1 mg/mL 5B1 antitela bila je veća od aktivnosti uočene sa antitelima na GM2, fukozil-GM1, globo H, ili polisijalinsku kiselinu. Kao što je i očekivano, 7E3 i mišije 121SLE (oba su IgM), bili su neaktivni u ovom testu.
Test internalizacije 5B1
[0144] Ranije se pokazalo da se konjugati antitela usmereni na antigen "usko povezan sa" Luis Y brzo internalizuju i vrlo su efikasni na životinjskim modelima. Hellstrom et al., Cancer Res 50: 2183-90 (1990); Trail et al., Science 261: 212-5 (1993). Da bismo ispitali da li je sLe<a>internalizovan, inkubirali smo ćelijsku liniju pankreasa, BkPC3 sa 5B1, a zatim smo dodali Hum-ZAP, anti-humani IgG konjugovani sa saporinom proteina za inaktivaciju ribosoma. Kohls
4
i sar., Biotechniques 28: 162-5 (2000). Ćelije koje internalizuju kompleks koji sadrži saporin umiru, dok neinternalizovani saporin ostavlja ćelije neozleđenim. Kao što je prikazano na sl.14, ćelije BxPC3 se efikasno ubijaju u prisustvu rastućih doza 5B1, dok prisustvo izotipa odgovarajućeg IgG1 antitela usmerenog protiv GD2, koje nije izraženo na ovim ćelijama, ne ubija ćelije.
Aktivnost u životinjskim modelima ksenografta za metastazu
[0145] Kako bi se ocenila aktivnost 5B1 in vivo, antitela su testirana u dva modela ksenografta, koristeći ili Colo205-luc tumorske ćelije ili DMS-79 tumorske ćelije u SCID miševima. Za model ksenografta u kome se koriste Colo205-luc tumorske ćelije, u pet miševa po grupi, u repnu venu je injecirano 0.5 x 10<6>ćelija, na dan 0, uspešno injeciranje ćelija je potvrđeno snimanjem životinja pomoću sistema za snimanje in vivo, IVIS 200 (Caliper Life Sciences). Jedan dan kasnije, životinje su tretirane 5B1 antitelima koja su im davana intraperitonealno, ili PBS placeboKONTROLNOM injekcijom. U eksperimentu 1, 100 mg 5B1 je dato 1., 7., 14., i 21. (ukupna doza 400 mg) dana, a u eksperimentu 2 životinje su primile 100 mg 5B11., 4., 7., 10., 14. i 21. (ukupna doza 600 mg) dana. Prosečno srednje preživljavanje nelečenih životinja bilo je 102 dana u 2 eksperimenta, i sve nelečene životinje uginule su u roku od 155 dana (SL.
15). Da bi se procenila aktivnost 5B1 in vivo, antitela su testirana na dva modela ksenografta koristeći bilo Colo205-luc tumorske ćelije ili DMS-79 tumorske ćelije na SCID miševima. Za model ksenografta koji koristi Colo205-luc tumorske ćelije, pet miševa u grupi ubrizgano je 0,5 × 10<6>ćelija u repnu venu na dan 0, a uspešno ubrizgavanje ćelija je verifikovano slikanjem životinja pomoću IVIS 200 in vivo sistema za snimanje (Caliper Life Sciences). Jedan dan kasnije, životinje su lečene 5B1 antitelima kojima je davana intraperitonealna ili PBS lažna injekcija. U eksperimentu 1, 100 mg 5B1 je dato 1., 7., 14. i 21. dana (ukupna doza od 400 mg), a u eksperimentu 2 životinje su dobile 100 mg 5B11., 4., 7., 10., 14. i 21 (ukupna doza 600 mg). Prosečno srednje preživljavanje nelečenih životinja bilo je 102 dana u dva eksperimenta, a sve nelečene životinje su umrle u roku od 155 dana (slika 15). Tretman sa životinjama značajno je poboljšao preživljavanje: medijan preživljavanja udvostručen je na 207 dana u grupi koja je primila 4 doze 5B1, a 2 od 5 životinja preživele su do prekida eksperimenta nakon 301 dana (log-rank test, P = 0,0499; HR = 3.46). Procenat preživelih se dalje povećao na 3 od 5 miševa kada se primenilo 6 doza (log-rank test, P = 0,0064; HR = 6,375). Drugi eksperiment je završen nakon 308 dana, a preživele životinje nisu uspele da otkriju Colo205-luc tumore pri najvećoj osetljivosti sistema za snimanje (podaci nisu prikazani).
[0146] U drugoj studiji, miševi koji su slično injektirani sa Colo205-luc tumorskim ćelijama, kao što je gore opisano, tretirani su sa sve većim dozama 5B1 ili 7E3 antitela (100 mg, 300 mg ili 1 mg). Sve životinje su inicijalno primile interperitonealnu ili PBS lažnu injekciju (kontrolu) antitela 5B1 ili 7E34. dana nakon injekcije tumorskih ćelija, zatim dva puta nedeljno tokom prve dve nedelje i jednom nedeljno tokom narednih 7 nedelja. Odloženo lečenje različitim dozama 5B1 pokazalo je zavisnost doze do potpunog izlečenja kod SCID miševa kojima su ugrađene ćelije tumora Colo205-luc (SLIKE 16 i 17). Tretman sa 7E3 antitelima nije pokazao veću zaštitu uprkos povećanom prividnom afinitetu (podaci nisu prikazani).
[0147] U modelu ksenografta koji koristi DMS-79 ćelije, pet miševa u grupi je subkutano ubrizgano sa 1 3 10<6>ćelija 0. dana i započelo je lečenje 19. dana nakon što je dužina tumora dostigla 5 mm (-20 mm2). Životinje su zatim tretirane humanim IgG ili 5B 1 antitelima datim intraperitonealnom injekcijom od 200 mg po dozi, plus cRGD intravenskom injekcijom u početku 80 mg, zatim 5 dana nedeljno, 40 mg po dozi do 37. dana. DMS-79 tumori su suzbijeni ili regresirani kod životinja lečenih 5B1 ili kombinacijom 5B1 plus cRGD (slike 18A i 18B). Tretman životinja sa 5B1 na dan ugradivanja sa DMS-79 ćelijama u potkožnom modelu u potpunosti je sprečio rast tumora (podaci nisu prikazani).
[0148] Prethodno izloženi podaci prikazuju značajnu sposobnost da se ustanovljeni tumori suprimiraju ili povuku i obezbeđuju prednost za preživljavanje, kada se koristi lečenje 5B1 antitelom.
PRIMER II
Imuno-PET detekcija i dijagnostifikovanje kancera pankreasa i drugih sLe<a>pozitivnih adenokarcinoma upotrebom radioaktivno obeleženog monoklonskog antitela 5B1
[0149] Adenokarcinomi su vodeći uzrok smrti od raka. Otkrivanje karcinoma pankreasa ostaje posebno teško sa dijagnozom koja se često postavlja u kasnoj fazi. Pristupi za ranije otkrivanje primarnih i metastatskih karcinoma pankreasa mogli bi imati značajan klinički uticaj. U kliničkoj praksi se nadgledaju povišeni nivoi antigena sLe<a>kako bi se identifikovali sumnjivi okultni maligniteti kod pacijenata sa rakom pankreasa. Kao što je ovde opisano, istražen je potencijal nove imunoPET sonde za obradu slike koja cilja sLe<a>u pretkliničkim modelima karcinoma pankreasa i drugih sLe<a>pozitivnih adenokarcinoma. Ljudsko monoklonsko antitelo 5B1 protiv sLe<a>pokazalo je pozitivno bojenje na humanim adenokarcinomima za koje je poznato da su sLe<a>pozitivni, ali ne i na sLe<a>negativne maligne tumore ili većinu normalnih tkiva.<89>Zr radioaktivno obeleženo sa 5B1 (<89>Zr-5B1) pokazao je veliko obeležavanje (> 80%) i prinos prečišćavanja (> 95%). Snimanje sa<89>Zr-5B1 istraživano je u potkožnim, ortotopskim i metastatskim ksenograftovima karcinoma pankreasa na ženskim SCID miševima. Dobijene PET slike i studije biološke distribucije pokazale su izuzetnu specifičnost i lokalizaciju<89>Zr-5B1 za sLe<a>prekomerno eksprimirane BxPC3 ksenografte sa minimalnim nespecifičnim vezivanjem za zdrava tkiva. Dalja analiza na modelima potkožnog ksenografta transplantata karcinoma pluća i debelog creva rezultirala je odličnom razmeđivanjem tumora i sa<89>Zr-5B1. Shodno tome, ovi rezultati pokazuju da se<89>Zr-5B1 može koristiti kao molekularna sonda za rano otkrivanje malignih tumora koji eksprimiraju sLe<a>u klinici.
Ćelijske linije i kultura tkiva
[0150] Sve manipulacije kulturom tkiva vršene su sterilnim tehnikama. Sitnoćelijski rak pluća DMS79 i BxPC3 ćelije karcinoma pankreasa dobijeni su iz American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Ćelije kolorektalnog karcinoma Colo205-luc (Bioware Ultra) kupljene su od kompanije Caliper Life Sciences (CLS, Hopkinton, MA). Sve ćelije su uzgajane prema preporukama ATCC i CLS pod 37 ° C u 5% CO2 vlažnoj atmosferi.
In vitro procena nivoa ekspresije sLe<a>putem FACS
[0151] Protočna citometrija sa naznačenim kultivanim ćelijskim linijama karcinoma izvedena je kako je ovde opisano u Primeru 1. Ukratko, suspenzije pojedinačnih ćelija tumorskih ćelija kulture 1x10<6>po epruveti isprane su u PBS sa 3% fetalnog goveđeg seruma (FBS). Zatim su dodata humana monoklonska antitela r5B 1 (IgG protiv sLe<a>) sa 20 ug / ml po epruveti i inkubirana na ledu 30 minuta. Posle ispiranja u PBS sa 3% FBS, dodato je 20 ml razređenog kozjeg anti-humanog IgG u količini od 1:25 označenog fluoresceinizotiocijanatom (FITC, Southern Biotechnologi, Birmingham, AL) i smeša je inkubirana još 30 minuta na ledu. Posle završnog pranja, pozitivna populacija i srednji intenzitet fluorescencije obojenih ćelija su diferencirani pomoću FACS skeniranja (Becton & Dickinson, San Jose, CA). Ćelije obojene samo kozjim antihumanskim IgG obeleženim fluorescein izotiocijanatom su korišćene za postavljanje rezultata FACScan-a na 1% kao pozadinu za poređenje sa procentom pozitivnih ćelija obojenih primarnim mAb.
Priprema antitela obeleženih sa<89>Zr
[0152] Rekombinantna 5B 1 antitela su pripremljena i prečišćena kako je ovde opisano. Antitela na 5B 1 i nespecifični humani IgG su funkcionalizovani sa p-izotiocijanatobenzil desferrioksaminom (DFO-Bz-NCS, Macrociclics, Inc., Dallas, TX) sa odnosom 1: 4 mAb: DFO-Bz-NCS. Na primer, u 300 ml 5B1 (1,23 mg u PBS, pH 9), dodata je zapremina od 7,2 ml DFO-Bz NCS (4,25 mM u DMSO). Reakcija je inkubirana na 37°C tokom 1-1,5 h. Funkcionalizovana antitela su prečišćena ili preko PD10 kolone za desaltizaciju (GE Healthcare) ili centrifugalnog filtera od 10 kDa (Amicon).
[0153] Zr-89 je proizveden bombardovanjem protonske zrake itrijumskom folijom i izolovan u visokoj čistoći kao Zr-89 oksalat na MSKCC prema prethodno utvrđenom postupku. Holland et al., Nuklearna medicina i biologija 36: 729-39 (2009). Obeležavanje antitela odvijalo se metodama kako su opisali Holland et aladnici, zvanična publikacija Journal of Nuclear Medicine, Society of Nuclear Medicine 51: 1293-300 (2010). Generalno, Zr-89 oksalat je neutralisan do pH 7,07,2 sa 1 M Na2C03. Zatim su dodata DFO-antitela. Reakcija je inkubirana na sobnoj temperaturi 1-2 sata. Naknadno prečišćavanje je izvedeno koristeći PD10 kolonu za desalinizaciju sa 0.9% fiziološkim rastvorom.
In vitro eksperimenti
[0154] Stabilnost<89>Zr-5B1 je ispitivana in vitro u 0.9% fiziološkom rastvoru i u 1% goveđem serumskom albuminu tokom 5 dana na 37°C. Promene radiohemijske čistoće su praćene tokom t=0-5 dana, putem iTLC sa 50 mM DTPA kao mobilnom fazom. Testovi in vitro imunoreaktivnosti su izvedeni u skladu sa protokolom koji su opisali Lindmo et al., Journal of Immunological Methods 72:77-89 (1984), kako bi bio prikazan integritet Zr-89 radioaktivno obeleženih antitela.
Životinjski modeli
[0155] Sve studije na životinjama sprovedene su u skladu sa smernicama koje je utvrdio Institucionalni odbor za negu i upotrebu životinja. Ženke CB17SC-F SCID miševa (Jackson Laboratories, 6-8 nedelja, 20-22 g) ili goli atimični (nu/nu) miševi indukovani su tumorima na zadnjim nogama. Sve ćelijske linije inokulirane su subkutano u 200 µl 1:1 medijum:rastvor Matrigel (BD Biosciences) i uzgajane do maksimalne zapremine tumora od 250 mm<3>pre upotrebe.
Studije biološke distribucije
[0156] Studije biološke distribucije su izvedene na nekoliko kohorti miševa koji nose odvojeni kolorektalni Colo205-luc, BxPC3 pankreas i DMS79 sitnoćelijske ksenografte pluća (n = 3-5). Zr-89 mAb (10-20 µCi, 1-2 µg) u 100 µl 0.9% fiziološkog rastvora primenjeno je intravenozno u bočnu venu. Dodatni neobeleženi mAb (10-50 µg) je ubrizgan zajedno sa traserom. Izvedena je studija blokiranja sa 250 µg viška neobeleženog mAb da bi se adresirala specifičnost antitela na sLe<a>u kohorti miševa. Posle svake vremenske tačke (t = 24, 48, 120 h p.i.), miševi su eutanazirani asfiksijom sa CO2. Krv je odmah sakupljena srčanom punkcijom dok je uzet tumor zajedno sa odabranim organima. Izmerena je mokra težina svakog tkiva, a brojana je radioaktivnost vezana za svaki organ pomoću gama brojača Wizard<2>2480 (Perkin Elmer).
Procenat usvajanja trejsera izražen kao% ubrizgane doze po gramu (% ID/g) izračunat je kao aktivnost vezana za tkivo po težini organa po stvarnoj ubrizganoj dozi, propadanje korigovano u vreme brojanja.
Imuno-PET na malim životinjama
[0157] Eksperimenti za snimanje su izvedeni pomoću microPET Focus 120 ili R4 skenera (Concorde Microsystems). Miševima (n = 3-5) su davana antitela obeležena Zr-89 (200-300 µCi, 15-25 µg) u 100-200 µL 0.9% fiziološkog rastvora putem injekcija bočnih repnih vena. Prikupljanje PET celog tela zabeleženo je na miševima 24-96 h p.i. dok je anesteziran sa 1,5-2,0% izofluorana (Baxter Healthcare) u kiseoniku. Slike su analizirane pomoću softvera ASIPro VM™ (Concorde Microsistems). Izvučeni su i ocrtani regioni od interesa (ROI) u odnosu na vreme.
Imunohistohemija
[0158] Biotinilisano 5B1 antitelo je pripremljeno inkubacijom u Sulfo-NHS-LC-biotinu (Thermo Scientific/Pierce kat. br. 21327), u molarnom višku od 20x, tokom 30 minuta na sobnoj temperaturi. Slobodan biotin je uklonjen pomoću Zebra™ kolone za odsoljavanje centrifugiranjem (Thermo Scientific/Pierce, kat. br. 89889), prema uputstvima proizvođača. Antitela su puferski zamenjena sa PBS sa sadržajem od 0.01% natrijum azida pri koncentraciji od 1.1 mg/ml. Vezivanje na DMS79 ćelijama je potvrđeno putem FACS i bilo je uporedivo sa roditeljskim 5B1 antitelom.
[0159] Preliminarni uslovi imunohistohemijskog bojenja određeni su korišćenjem ćelija Colo205 kao pozitivne kontrole i ćelija SK-MEL28 kao negativne kontrole. Pripremljeni su ćelijski peleti, fiksirani formalinom i ukalupljeni u parafin. Pločice su inkubirani sa biotiniliranim 5B1 razblaženim u 10% (zap./zap.) normalnom humanom serumu u PBS (Jackson ImmunoResearch Labs; kat. br.009-000-121). Bojenje je izvedeno automatizacijom Ventana (platforma Discovery XT-Ventana Medical Systems, Inc, Tucson, AZ) standardnom metodom imunoperoksidaze streptavidin-biotin i sistemom detekcije DAB kao metodom bojenja. Oporavak antigena je izveden pomoću toplote i Ventana CC1 rastvora za kondicioniranje. CA 19.9 mišji monoklon (klon 116-NS-19-9) kompanije Signet (Covance) dao je uporedne rezultate u pilot studiji. Ćelije Colo205 su snažno pozitivne sa biotiniliranim 5B1 koji se koristi u dozi od 10 mg/µl, dok su ćelije SKMEL28 bile potpuno negativne. Mikrorezovi tkiva Histo Array ™ kupljeni su od firme Imgenex (San Diego, CA). Korišćene su sledeće pločice koje su sadržale jezgre tumorske biopsije, kao i neka normalna jezgra tkiva: IMH-327 (česti karcinomi, 59 uzoraka), IMH-359 (kolorektalni: karcinom metastaza - normalan; 59 uzoraka) i IMH-324 (metastatski rak do jajnik). Jezgra tumora pankreasa bila su prisutna na IMH 327.
Serumska koncentracija sLe<a>in vivo
[0160] Miševi koji nose ksenotransplantate Colo205, BxPC3 i DMS79 su eksangvinirani za testove sLe<a>antigena. Grupa miševa bez tumora poslužila je kao kontrola. Nivoi sLe<a>u serumu miševa izmereni su pomoću ST AIA-PACK CA19.9 kompleta (Kat. br. 025271, TOSOH Bioscience Inc, South San Francisco, CA). Princip ispitivanja zasnovan je na imunoenzimskometričkom testu sa dva mesta. Analiza je izvedena kako je opisano u uputstvu za upotrebu proizvođača. Optička gustina ploča za imunoanalizu izmerena je pomoću automatizovanog analizatora imunoanalize TOSOH AIA2000 (TOSOH Bioscience, Inc, San Francisco, CA).
Statistička analiza
[0161] Vrednosti za podatke su eksprimirane kao ± SD izuzev ako je drugačije rečeno. Statistička analiza je izvedena pomoću softvera GraphPad Prism verzija 5.03, upotrebome jednostrane ANOVA analize praćene Dunnett-ovim testom. P vrednost od <0.05 se smatra statistički značajnom.
Rezultati
[0162] Specifičnost vezivanja 5B1 ispitivana je bojenjem odabranih malignih i normalnih mikromreza tkiva. Reaktivnost 5B1 bila je ograničena na maligne bolesti i povremena normalna tkiva za koja je ranije bilo poznato da prekomerno izražavaju sLe<a>(slika 19; tabela 9). Većina normalnih tkiva bila je potpuno negativna (Tabela 9). Suprotno tome, snažno pozitivno bojenje pronađeno je kod 21/34 adenokarcinoma u debelom crevu (62%), 33/57 metastaza adenokarcinoma u jajniku (58%) i 7/9 karcinoma duktalnog creva (66%) u različitim fazama (Tabela 10) . Kao što je prikazano na sl.19, tipična reaktivnost je difuzno citoplazmatsko bojenje sa nekim ćelijama tumora koje jasno pokazuje jasno bojenje ćelijske membrane. Pored toga, utvrđeno je da su neki karcinomi jajnika u obliku prstenastog prstena i neki karcinomi pluća i dojke snažno pozitivni. Nasuprot tome, samo 4/43 uzorka raka prostate i 0/51 slučajeva GIST-a bili su pozitivni (podaci nisu prikazani).
Tabela 9: Praćenje vezivanja 5B1 za različita tkiva
1
[0163] Visoka specifičnost imunobojenja 5B1 za tkiva karcinoma koja eksprimiraju sLe<a>bila je osnova za upotrebu ovog mAb kao PET sonde. Modifikacija 5B1 sa benzil-izotiocijanatnim analogom desferrioksamina (DFO-Bz-NCS) izvršena je u omjeru 4: 1 (helat: mAb) sa naknadnim prečišćavanjem centrifugalnom filtracijom koristeći fiziološki rastvor kao pufer za pranje. Lagano radio-obeležavanje sa Zr-89 nastavljeno je na sobnoj temperaturi nakon podešavanja pH na 7,0-7,2. Neophodan je uži opseg pH bliži neutralnom da bi se postigao optimalan prinos od radioaktivnog obeležavanja> 80%. Slobodni, nevezani Zr-89 je uklonjen preko PD10 kolone za desaltizaciju. Koncentracija proizvoda je napravljena pomoću centrifugalnog filtera (MVCO: 10 kDa). Utvrđena je relativno visoka specifična aktivnost od 12.161,1 µCi/mg. Pre upotrebe osigurane su radiohemijske čistoće veće od 95%. Analize imunoreaktivnosti su pokazale zadržavanje aktivnosti za sLe<a>(72.461.1%, n = 3). Stabilnost u goveđem serumskom albuminu na 37 ° C održavana je na> 95% tokom 5 dana (podaci nisu prikazani). U fiziološkom rastvoru, de-metalacija je primećena već za 24 sata (> 85% u kompleksu) sa oko> 75% vezanog za radiometal nakon 120 h na 37 °C.
[0164] Studije PET-a za biodistribuciju malih životinja izvedene su na ženskim SCID miševima supkutano implantiranim BxPC3 ksenograftom kancera pankreasa na levoj zadnjoj nozi. Dobijene PET slike potvrdile su značajnu granicu sLe<a>povezanih sa tumorom za<89>Zr-5B1. Iz projekcija maksimalnog intenziteta (MIP) na sl. 20, BxPC3 ksenotransplantati (n = 3) pokazali su izuzetno nagomilavanje radiotracera davanog intravenozno. Regije od interesa (ROI) izvučene na tumoru sa PET slika pokazale su unos od 5.060,4% ID/g (2 h), 16.262,5% ID/g (24 h), 23.864,7% ID/g (48 h), 36,866,1% ID/g (96 h) i 49,567,7% ID/g (120 h). Izgleda da se krvni bazen i aktivnost vezanja normalnog tkiva očistila nakon 24 sata p.i. Rezultati eksperimenata sa biorazdelom su u skladu sa PET podacima. Primećena je visoka lokalizacija tumora<89>Zr-5B1 za 24 sata (84,7612,3% ID/g, n = 4); povećano usvajanje je pokazano dalje na 120 h p.i. (114,1623,1% ID/g, n = 4) (SLIKA 21). Unos tumora premašuje 100% zbog male težine (62.460,03 mg). % ID na 24 sata p.i. utvrđeno je da je deset puta veći od nespecifičnog IgG u sličnim vremenskim tačkama (slika 21 uložak). Konkurentska inhibicija sa 250 mg neradioaktivno obeleženog 5B1 u 24 sata p.i. blokirao nakupljanje trejsera definišući specifičnost usvajanja. Primećeno je minimalno vezivanje<89>Zr-5B1 za normalni pankreas i ostatak sakupljenih normalnih tkiva, pružajući visok kontrast tumora za tkivo u svim vremenskim tačkama.u svim vremenskim trenucima.
[0165] Nakon prethodno izloženih rezultata,<89>Zr-5B1 je testiran u ortotopnom modelu tumora pankreasa, BxPC3. Ortotopni modeli su klinički relevantni i obezbeđuju klinički prihvaćene testove za efikasnost PET probe. Nakon inokulacije u pankreas, rast tumora je svake nedelje praćen optičkim snimanjem bioluminescencije Eksperimenti PET snimanja su izvedeni kada su
2
tumori mogli da se napipaju. Poređenje sposobnosti probe da razgraniči tumor izvršeno je za FDG-PET i<89>Zr-5B1 (SL. 25). Kompjuterizovana tomografija (CT) u tandemu sa PET omogućila je poboljšanu vizuelizaciju anatomskog regiona od interesa.
[0166] Kako bi se procenilo<89>Zr-5B1 antitelo kao PET proba u drugim adenokarcinomima koji eksprimiraju sLe<a>,<89>Zr-5B1 antitelo je testirano u modelima za kancer pluća i kancer debelog creva. Izvedeni su eksperimenti na malim životinjama koristeći DMS79 ćelije raka malih pluća i Colo205-luc ćelije raka debelog creva injektirane supkutano na desnu zadnju nogu ženskih SCID miševa. PET MIP slike su dobijene nakon 24-120 h p.i. od 200-300 µCi (16-25 mg) ubrizgava se intravenozno. Heterogeni prijem DMS79 tumora je demonstriran sa 38,1562,12% ID/g već 24 sata p.i. sa odličnim signalom u pozadini (slika 22A). Povećanje akumulacije traga tumora rezultiralo je nakon 48 h p.i. (44,6066,47% ID/g) sa zadržavanjem 120 h p.i. (41,97612,23% ID/g). Nespecifični vezani 89Zr 5B1 brzo se uklanja iz normalnih tkiva sa minimalnim i nikakvim usvajanjem u pozadini tokom 48 h p.i. Pored toga, primećena je razgraničenja tumora u ksenograftovima Colo205-luc, kao što je prikazano na SL.22B u 24-120 h p.i. ROI su pokazali akumulaciju tumora sa 10.560,76, 23.562.7, 24.864.0, 18.464.7, 16.562.3% ID/g za 2, 24, 48, 96 i 120 sati, respektivno. Primetno povećanje akumulacije jetre rezultiralo je vremenom, sa posledičnim smanjenjem unosa tumora, kao što je prikazano u oblastima od interesa izvučenih iz PET slika (slika 22C). Podaci dobijeni iz studija biorazdeljenja dobro koreliraju sa posmatranim rezultatima PET (podaci nisu prikazani).
[0167] Kvantifikovan je nivo sLe<a>u serumu miša kako su tumori napredovali. Izvršena je eksanguinacija SCID miševa koji nose ksenografte Colo205, DMS79 i BxPC3 pri čemu je grupa bez tumora služila kao kontrola. Vrednosti sLe<a>pokazale su visoke nivoe sLe<a>kod miševa izazvanih Colo205 u poređenju sa miševima kod kojih su implantirane pankreasne BxPC3 i DSM79 (Tabela 11).
Tabela 11: serumske vrednosti sLe<a>iz miševa koji nose ksenografte tumora debelog creva (Colo205), pankreasa (BxPC3) i sitnih ćelija pluća (DMS79), u poređenju sa kontrolom
[0168] Ovi rezultati pokazuju da je radioaktivno obeleženo antitelo protiv sLe<a>(<89>Zr-5B1) specifično za otkrivanje i dijagnozu adenokarcinoma pankreasa i drugih sLe<a>pozitivnih adenokarcinoma.<89>Zr-5B1 je proizveden sa odličnim prinosima i čistoćom, zajedno sa visokom specifičnom aktivnošću i zadržanom imunoreaktivnošću. Evaluacija<89>Zr-5B1 u subkutanim, ortotopskim i metastatskim modelima tumora pankreasa dala je izvrsnu granicu i dijagnozu tumora. Predklinička evaluacija ovog radiotrasera kod malih životinja koje nose tumor pluća debelog creva i malih ćelija pokazala je univerzalnu korisnost ovog trejsera za maligne tumore koji izražavaju sLe<a>.
PRIMER III
Anti-sLe<a>dijatela se vezuju za različite ćelijske linije kancera
[0169] Dva dijtela su generisana upotrebom VH i VL domena klonskih izolata 5B1 i 7E3 koji su ovde opisani i označeni kao 5B1CysDb, odnosno 7E3CysDb (SLIKE 9 i 10). Oba dijatela su sadržala linkerski region od 5 amino kiselina, između VL i VH domena. Polihistidinski marker na C-kraju, koji se koristi za prečišćavanje i detekciju, takođe je bio uključen u oba dijatela.
[0170] Vezivanje 5B1CysDb i 7E3CysDb za tri ćelijske linije karcinoma: (1) DMS-79 ćelije, ćelijska linija sitnoćelijskog kancera pluća u suspenziji; (2) Capan-2 ćelije, ćelije adenokarcinoma pankreasa; i (3) BxPC3 ćelije, ćelije karcinoma pankreasa, testirane su inkubacijom 0.25 miliona ćelija u 0.2 ml sa 10 µg/ml 5B1CysDb, odnosno 7E3CysDb. Kombinacije ćelija i dijatela inkubirane su 40 minuta na ledu u PBS/2%FBS.
[0171] Nakon ispiranja, ćelije su inkubirane 40 minuta sa 0.2 ml ALEXA-488-obeleženim anti-His antitelom, razblaženim 1:1000 (Life Technology, Kat. br. A21215). Nakon drugog ispiranja ćelije su analizirane na instrumentu Guava Flow Cytometer. I 5B1CysDb i 7E3CysDb su pokazali značajno vezivanje za DMS-79, Capan-2 i BxPC3 ćelije (Tabela 12).
4
PRIMER IV
Primena 5B1 i taksola inhibira rast tumora
[0172] Anti-tumorska aktivnost istovremene primene anti-sLe<a>antitela (5B1) i hemioterapijskog sredstva taksola (Paklitaksel) ocenjena je u modelima ksenografta kancera pankreasa i sitnoćelijskog kancera pluća. Kao što je prethodno opisano u ovom dokumentu, 1 milion BxPc3 ćelija (ćelije tumora pankreasa) ili 5 miliona DMS-79 ćelija (ćelije sitnoćelijskog kancera pluća) injecirane su u zadnji bok ženke CB17 SCID miša stare 6 nedelja (dan 0; N=5). DMS79 tumorima je omogućano da rastu 21 dan dok prosečna veličina tumora nije bila 193x64 mm<3>. Humani IgG ili 5B 1 (0.5 ili 1 mg) davani su ip dvaput nedeljno (počev od 21. dana), a taksol (0.2 mg/dozi) je primenjivan iv 23., 30., 37. i 44. dana. U DMS-79 modelu ksenografta, istovremena primena antitela 5B 1 i taksola značajno je ograničila rast tumora i dovela do regresije tumora u poređenju sa kontrolnim humanim IgG ili antitelom 5B 1 i taksolom kada se primenjuju pojedinačno (SL. 23).
[0173] U BxPc3 modelu ksenografta, tumori su rasli 14 dana, u kom trenutku su dostigli prosečnu veličinu od 126x30 mm<3>. Taksol je primenjivan iv 14., 21., 28. i 34. dana (na nedelju dana), a 5B1 je davan dva puta nedeljno počev od 14. dana. Istovremena primena 5B1 antitela i taksola značajno je ograničila rast tumora u poređenju sa kontrolama ili antitelom 5B1 i taksolom kada se primenjuju pojedinačno (SL. 24). Ovi rezultati prikazuju sinergistički efekat anti-sLe<a>antitela i hemioterapijskog sredstva u sprečavanju rasta tumora i/ili smanjivanju veličine tumora kod kancera pankreasa i sitnoćelijskog kancera pluća.
1
2
4
1
�

Claims (10)

Patentni zahtevi
1. Izolovano antitelo koje se vezuje za sijalil-Luis<a>i indukuje ADCC ili CDC aktivnost, pri čemu navedeno antitelo sadrži varijabilan domen teškog lanca (VH) i varijabilan domen lakog lanca (VL), gde navedeni VH domen i navedeni VL domen, redom, sadrže amino kiselinsku sekvencu ostataka 20-142 iz SEQ ID NO: 2 i ostataka 20-130 iz SEQ ID NO: 4.
2. Izolovani polinukleotid koji kodira teški lanac antitela, pri čemu navedeni teški lanac antitela sadrži varijabilni domen teškog lanca (VH) koji ima amino kiselinsku sekvencu ostataka 20-142 iz SEQ ID NO: 2; i izolovani polinukleotid koji kodira laki lanac antitela, pri čemu navedeni laki lanac antitela sadrži varijabilni domen lakog lanca (VL) koji ima amino kiselinsku sekvencu ostataka 20-130 iz SEQ ID NO: 4, naznačen time što se antitelo koje sadrži navedeni teški lanac antitela i navedeni laki lanac antitela vezuje za sijalil-Luis<a>i indukuje ADCC ili CDC aktivnost.
3. Izolovani polinukleotid prema patentnom zahtevu 2, naznačen time što je navedena amino kiselinska sekvenca VH domena kodirana sekvencom nukleinske kiseline ostataka 58-426 iz SEQ ID NO: 1.
4. Izolovani polinukleotid prema patentnom zahtevu 2, naznačen time što je navedena amino kiselinska sekvenca VL domena kodirana sekvencom nukleinske kiseline ostataka 58-390 iz SEQ ID NO: 3.
5. Izolovano antitelo prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time što je navedeno antitelo humano antitelo, poželjno IgG ili IgM izotipa, pri čemu navedeno IgG antitelo poželjno pripada IgG 1 potklasi.
6. Farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo prema patentnom zahtevu 1 ili 5 i farmaceutski prihvatljiv nosač.
7. Farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo prema patentnom zahtevu 1 ili 5 i farmaceutski prihvatljiv nosač, za upotrebu u lečenju ili prevenciji bolesti, koja upotreba obuhvata primenu terapeutski efikasne količine navedene farmaceutske kompozicije kod subjekta kome je to potrebno.
8. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 7, naznačena time što navedena bolest predstavlja obrazovanje kancera ili tumora, pri čemu ćelije navedenog kancera ili navedenog tumora eksprimiraju sLe<a>; ili gde su navedeni kancer ili tumor odabrani iz grupe koja se sastoji od tumora gastrointestinalnog trakta, kancera debelog creva, kolorektalnog adenokarcinoma, metastatskog kancera debelog creva, kolorektalnog kancera, kancera pankreasa, adenokarcinoma pankreasa, sitnoćelijskog karcinoma pluća, adenokarcinoma bešike, kancera jajnika pečatnog prstena, kancera jajnika, metastatskog karcinoma, adenokarcinoma želuca, adenokarcinoma jednjaka, adenokarcinoma grla, adenokarcinoma urogenitalnog trakta, i adenokarcinoma dojke.
9. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 7, naznačena time što je navedena farmaceutska kompozicija prilagođena za istovremenu ili sukcesivnu primenu drugog terapeutskog sredstva, poželjno, navedeno drugo terapeutsko sredstvo je hemioterapijsko sredstvo ili imunoterapijsko sredstvo.
10. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 9, naznačena time što je drugo terapeutsko sredstvo taksol.
4
RS20210929A 2013-08-26 2014-08-26 Nukleinske kiseline koje kodiraju humana antitela na sijalil-luis a RS62189B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361870137P 2013-08-26 2013-08-26
EP14852746.8A EP3041507B1 (en) 2013-08-26 2014-08-26 Nucleic acids encoding human antibodies to sialyl-lewis a
PCT/US2014/052631 WO2015053871A2 (en) 2013-08-26 2014-08-26 NUCLEIC ACIDS ENCODING HUMAN ANTIBODIES TO SIALYL-LEWISa

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS62189B1 true RS62189B1 (sr) 2021-08-31

Family

ID=52480556

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20210929A RS62189B1 (sr) 2013-08-26 2014-08-26 Nukleinske kiseline koje kodiraju humana antitela na sijalil-luis a

Country Status (22)

Country Link
US (4) US9475874B2 (sr)
EP (2) EP3906945A3 (sr)
JP (7) JP6626445B2 (sr)
KR (4) KR102313341B1 (sr)
CN (2) CN105764526B (sr)
AU (4) AU2014332442B2 (sr)
CA (2) CA3090644C (sr)
CY (1) CY1124435T1 (sr)
DK (1) DK3041507T3 (sr)
ES (1) ES2880709T3 (sr)
HR (1) HRP20211129T1 (sr)
HU (1) HUE056325T2 (sr)
IL (2) IL244297B (sr)
LT (1) LT3041507T (sr)
PL (1) PL3041507T3 (sr)
PT (1) PT3041507T (sr)
RS (1) RS62189B1 (sr)
RU (1) RU2699289C2 (sr)
SI (1) SI3041507T1 (sr)
SM (1) SMT202100427T1 (sr)
WO (1) WO2015053871A2 (sr)
ZA (1) ZA201601354B (sr)

Families Citing this family (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102313341B1 (ko) * 2013-08-26 2021-10-18 바이오엔테크 리서치 앤드 디벨롭먼트 인코포레이티드 시알릴-루이스 ａ에 대한 사람 항체 코드화 핵산
GB201515094D0 (en) 2015-08-25 2015-10-07 Univ Nottingham Sialyl-di-lewis a as expressed on glycoproteins but not glycolipids as a functional cancer target and antibodies thereto
JP6920293B2 (ja) * 2015-10-30 2021-08-18 メドイミューン・リミテッドＭｅｄＩｍｍｕｎｅ Ｌｉｍｉｔｅｄ ＩｇＧ軽鎖におけるＮ末端切断の防止
RU2019102746A (ru) * 2016-07-14 2020-08-14 Биоарктик Аб Белок для транспорта в мозг
TWI780082B (zh) 2016-11-18 2022-10-11 日商安斯泰來製藥股份有限公司 新穎抗人類ＭＵＣ１抗體Ｆａｂ片段
EP3548515B1 (en) 2016-12-01 2026-01-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Radiolabeled anti-pd-l1 antibodies for immuno-pet imaging
CA3053348A1 (en) 2017-02-10 2018-08-16 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Radiolabeled anti-lag3 antibodies for immuno-pet imaging
JP7264831B2 (ja) * 2017-06-15 2023-04-25 ディベロップメント センター フォー バイオテクノロジー 抗ｇｌｏｂｏ ｈ抗体を含有する抗体－薬物コンジュゲートおよびその使用
TWI795415B (zh) 2017-07-07 2023-03-11 日商安斯泰來製藥股份有限公司 新穎的抗人類ＣＥＡＣＡＭ５抗體Ｆａｂ片段
KR102880156B1 (ko) 2017-07-24 2025-11-05 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 항cd8 항체 및 이의 용도
JP7774283B2 (ja) * 2017-12-19 2025-11-21 ザ ロックフェラー ユニバーシティー エフェクター機能を改良したヒトＩｇＧのＦｃ領域改変体
PT110526B (pt) 2018-01-26 2021-02-04 Univ Nova De Lisboa Anticorpo, fragmento funcional ou sonda do mesmo contra antigénios tumorais
KR102115236B1 (ko) * 2018-01-29 2020-05-27 (주)에스엠티바이오 췌장 또는 담관계암 치료를 위한 키메라 항원 수용체
MX2020012351A (es) 2018-05-17 2021-01-29 Astellas Pharma Inc Complejo que tiene fragmento fab de anticuerpo anti-muc1 de humano, enlazador peptido y/o ligando.
SG11202102416SA (en) 2018-09-10 2021-04-29 Cold Spring Harbor Laboratory Methods for treating pancreatitis
CA3115747A1 (en) 2018-10-10 2020-04-16 Astellas Pharma Inc. Pharmaceutical composition containing tagged site-antihuman antibody fab fragment complex
WO2020081988A1 (en) * 2018-10-19 2020-04-23 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Chimeric antigen receptor targeting sialyl lewis a and uses thereof
US11896682B2 (en) 2019-09-16 2024-02-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Radiolabeled MET binding proteins for immuno-PET imaging and methods of use thereof
EP4065605A4 (en) * 2019-11-26 2023-07-12 Ramot at Tel-Aviv University Ltd. Antibodies to carbohydrate antigens
CN114605550B (zh) * 2020-12-08 2023-09-22 东莞市朋志生物科技有限公司 抗ca19-9的抗体、其应用和检测ca19-9的试剂盒
US20250297027A1 (en) * 2021-01-12 2025-09-25 Yeda Research And Development Co. Ltd. Antibodies to cancer glycosylation and uses thereof
JP2024511189A (ja) 2021-03-26 2024-03-12 ビオンテック・ソシエタス・エウロパエア がんの処置における抗ｃａ１９－９抗体およびｆｏｌｆｉｒｉｎｏｘを用いた組合せ療法。
WO2025038668A1 (en) 2023-08-14 2025-02-20 Voro Therapeutics, Inc. Therapeutic binding agents that conditionally promote myeloid cell activity against target cells and uses thereof
WO2025261951A1 (en) 2024-06-18 2025-12-26 BioNTech SE Combination therapy with an anti-ca19-9 antibody and folfirinox in the treatment of cancer

Family Cites Families (126)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA128362A (en) 1910-07-25 1910-09-27 Victor Herbert Gregory Furnace for drawing glass
US5807715A (en) 1984-08-27 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin
AU584417B2 (en) 1985-04-01 1989-05-25 Lonza Group Ag Transformed myeloma cell-line and a process for the expression of a gene coding for a eukaryotic polypeptide employing same
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US5057313A (en) 1986-02-25 1991-10-15 The Center For Molecular Medicine And Immunology Diagnostic and therapeutic antibody conjugates
WO1988007089A1 (en) 1987-03-18 1988-09-22 Medical Research Council Altered antibodies
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
US5336603A (en) 1987-10-02 1994-08-09 Genentech, Inc. CD4 adheson variants
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
EP0436597B1 (en) 1988-09-02 1997-04-02 Protein Engineering Corporation Generation and selection of recombinant varied binding proteins
KR900005995A (ko) 1988-10-31 1990-05-07 우메모또 요시마사 변형 인터류킨-2 및 그의 제조방법
EP0394827A1 (en) 1989-04-26 1990-10-31 F. Hoffmann-La Roche Ag Chimaeric CD4-immunoglobulin polypeptides
US5112946A (en) 1989-07-06 1992-05-12 Repligen Corporation Modified pf4 compositions and methods of use
WO1991006570A1 (en) 1989-10-25 1991-05-16 The University Of Melbourne HYBRID Fc RECEPTOR MOLECULES
WO1991010737A1 (en) 1990-01-11 1991-07-25 Molecular Affinities Corporation Production of antibodies using gene libraries
US5780225A (en) 1990-01-12 1998-07-14 Stratagene Method for generating libaries of antibody genes comprising amplification of diverse antibody DNAs and methods for using these libraries for the production of diverse antigen combining molecules
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
US5349053A (en) 1990-06-01 1994-09-20 Protein Design Labs, Inc. Chimeric ligand/immunoglobulin molecules and their uses
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5698426A (en) 1990-09-28 1997-12-16 Ixsys, Incorporated Surface expression libraries of heteromeric receptors
CA2405246A1 (en) 1990-12-03 1992-06-11 Genentech, Inc. Enrichment method for variant proteins with alterred binding properties
DE69123241T2 (de) 1990-12-14 1997-04-17 Cell Genesys Inc Chimärische ketten zur transduktion von rezeptorverbundenen signalwegen
DK0580737T3 (da) 1991-04-10 2004-11-01 Scripps Research Inst Heterodimere receptorbiblioteker ved anvendelse af phagemider
CA2110799A1 (en) 1991-06-14 1992-12-23 Arnold H. Horwitz Microbially-produced antibody fragments and their conjugates
US5844095A (en) 1991-06-27 1998-12-01 Bristol-Myers Squibb Company CTLA4 Ig fusion proteins
ES2341666T3 (es) 1991-12-02 2010-06-24 Medimmune Limited Produccion de autoanticuerpos de repertorios de segmentos de anticue rpos expresados en la superficie de fagos.
US5622929A (en) 1992-01-23 1997-04-22 Bristol-Myers Squibb Company Thioether conjugates
US6271242B1 (en) 1992-02-10 2001-08-07 Bristol-Myers Squibb Co. Method for treating cancer using a tyrosine protein kinase inhibitor
US5733743A (en) 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
US5447851B1 (en) 1992-04-02 1999-07-06 Univ Texas System Board Of Dna encoding a chimeric polypeptide comprising the extracellular domain of tnf receptor fused to igg vectors and host cells
JPH0630786A (ja) * 1992-07-14 1994-02-08 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd バイスペシフィック抗体
AU691820B2 (en) 1993-07-15 1998-05-28 Cancer Research Campaign Technology Limited Prodrugs of protein tyrosine kinase inhibitors
US5443953A (en) 1993-12-08 1995-08-22 Immunomedics, Inc. Preparation and use of immunoconjugates
EP0733070A1 (en) 1993-12-08 1996-09-25 Genzyme Corporation Process for generating specific antibodies
US5925376C1 (en) 1994-01-10 2001-03-20 Madalene C Y Heng Method for treating psoriasis using selected phosphorylase kinase inhibitor and additional compounds
PT1231268E (pt) 1994-01-31 2005-11-30 Univ Boston Bancos de anticorpos policlonais
US5516637A (en) 1994-06-10 1996-05-14 Dade International Inc. Method involving display of protein binding pairs on the surface of bacterial pili and bacteriophage
JPH10503371A (ja) 1994-07-29 1998-03-31 スミスクライン・ビーチャム・パブリック・リミテッド・カンパニー 新規化合物
GB9415379D0 (en) 1994-07-29 1994-09-21 Smithkline Beecham Plc Novel compounds
US5587459A (en) 1994-08-19 1996-12-24 Regents Of The University Of Minnesota Immunoconjugates comprising tyrosine kinase inhibitors
US5911995A (en) 1994-08-19 1999-06-15 Regents Of The University Of Minnesota EGF-genistein conjugates for the treatment of cancer
US5795737A (en) 1994-09-19 1998-08-18 The General Hospital Corporation High level expression of proteins
EP1323346B1 (en) 1995-01-17 2006-06-28 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of immunogens
US6030613A (en) 1995-01-17 2000-02-29 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of therapeutics
GB9501567D0 (en) 1995-01-26 1995-03-15 Pharmacia Spa Hydrosoluble 3-arylidene-2-oxindole derivatives as tyrosine kinase inhibitors
GB9515975D0 (en) 1995-08-04 1995-10-04 Zeneca Ltd Chemical compounds
US5863904A (en) 1995-09-26 1999-01-26 The University Of Michigan Methods for treating cancers and restenosis with P21
GB9601081D0 (en) 1995-10-06 1996-03-20 Cambridge Antibody Tech Specific binding members for human transforming growth factor beta;materials and methods
US6127366A (en) 1995-11-22 2000-10-03 Merck & Co., Inc. Inhibitors of farnesyl-protein transferase
DE69620445T2 (de) 1995-12-08 2002-12-12 Janssen Pharmaceutica N.V., Beerse (imidazol-5-yl)methyl-2-chinolinoderivate als farnesyl protein transferase inhibitoren
US5723125A (en) 1995-12-28 1998-03-03 Tanox Biosystems, Inc. Hybrid with interferon-alpha and an immunoglobulin Fc linked through a non-immunogenic peptide
US5958769A (en) 1996-01-18 1999-09-28 Fred Hutchinson Cancer Research Center Compositions and methods for mediating cell cycle progression
JP2978435B2 (ja) 1996-01-24 1999-11-15 チッソ株式会社 アクリロキシプロピルシランの製造方法
JP2000504014A (ja) 1996-01-30 2000-04-04 メルク エンド カンパニー インコーポレーテッド ファルネシル―タンパク質転移酵素の阻害剤
EP1011669A4 (en) 1996-01-30 2001-09-12 Merck & Co Inc FARNESYL PROTEIN TRANSFERASE INHIBITORS
JP4046354B2 (ja) 1996-03-18 2008-02-13 ボード オブ リージェンツ，ザ ユニバーシティ オブ テキサス システム 増大した半減期を有する免疫グロブリン様ドメイン
EP0888125B1 (en) 1996-03-20 2004-05-26 Immunomedics, Inc. GLYCOSYLATED IgG ANTIBODIES
US6063930A (en) 1996-04-03 2000-05-16 Merck & Co., Inc. Substituted imidazole compounds useful as farnesyl-protein transferase inhibitors
US5891889A (en) 1996-04-03 1999-04-06 Merck & Co., Inc. Inhibitors of farnesyl-protein transferase
US5883105A (en) 1996-04-03 1999-03-16 Merck & Co., Inc. Inhibitors of farnesyl-protein transferase
US6080870A (en) 1996-04-03 2000-06-27 Merck & Co., Inc. Biaryl substituted imidazole compounds useful as farnesyl-protein transferase inhibitors
US6300501B1 (en) 1996-05-22 2001-10-09 Warner-Lambert Company Histidine-(N-benzyl glycinamide) inhibitors of protein farnesyl transferase
US5648239A (en) 1996-06-21 1997-07-15 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Human camp-dependent protein kinase inhibitor homolog
US6071935A (en) 1996-06-27 2000-06-06 Pfizer Inc. Derivatives of 2-(2-oxo-ethylidene)-imidazolidin-4-one and their use as farnesyl protein transferase inhibitors
NZ513800A (en) 1996-08-12 2001-09-28 Welfide Corp Treatment of diseases using Rho kinase inhibitors
US6030982A (en) 1996-09-13 2000-02-29 Schering Corporationm Compounds useful for inhibition of farnesyl protein transferase
US5945429A (en) 1996-09-13 1999-08-31 Schering Corporation Compounds useful for inhibition of farnesyl protein transferase
US6040305A (en) 1996-09-13 2000-03-21 Schering Corporation Compounds useful for inhibition of farnesyl protein transferase
US6013662A (en) 1996-12-30 2000-01-11 Rhone-Poulenc Rorer S.A. Farnesyl transferase inhibitors, their preparation, the pharmaceutical compositions which contain them and their use in the preparation of medicaments
US6093737A (en) 1996-12-30 2000-07-25 Merck & Co., Inc. Inhibitors of farnesyl-protein transferase
US5939439A (en) 1996-12-30 1999-08-17 Merck & Co., Inc. Inhibitors of farnesyl-protein transferase
WO1998032741A1 (en) 1997-01-29 1998-07-30 Zeneca Limited Inhibitors of farnesyl protein transferase
ZA981080B (en) 1997-02-11 1998-08-12 Warner Lambert Co Bicyclic inhibitors of protein farnesyl transferase
US6180415B1 (en) 1997-02-20 2001-01-30 The Regents Of The University Of California Plasmon resonant particles, methods and apparatus
WO1998039027A2 (en) 1997-03-05 1998-09-11 John Wayne Cancer Institute Sialyl lewis antigens as targets for immunotherapy
TW591030B (en) 1997-03-10 2004-06-11 Janssen Pharmaceutica Nv Farnesyl transferase inhibiting 1,8-annelated quinolinone derivatives substituted with N- or C-linked imidazoles
US6051582A (en) 1997-06-17 2000-04-18 Schering Corporation Compounds useful for inhibition of farnesyl protein transferase
US6239140B1 (en) 1997-06-17 2001-05-29 Schering Corporation Compounds useful for inhibition of farnesyl protein transferase
US6159984A (en) 1997-06-17 2000-12-12 Schering Corporation Farnesyl protein transferase inhibitors
US6211193B1 (en) 1997-06-17 2001-04-03 Schering Corporation Compounds useful for inhibition of farnesyl protein transferase
US6225322B1 (en) 1997-06-17 2001-05-01 Schering Corporation Compounds useful for inhibition of farnesyl protein transferase
US6228865B1 (en) 1997-06-17 2001-05-08 Schering Corporation Compounds useful for inhibition of farnesyl protein transferase
TR200000415T2 (tr) 1997-08-15 2000-08-21 Cephalon Inc. Prostat kanserinin tedavi edilmesi için birleşimler.
US6103723A (en) 1997-10-17 2000-08-15 Merck & Co., Inc. Inhibitors of farnesyl-protein transferase
DK1025088T3 (da) 1997-10-22 2001-11-12 Astrazeneca Ab Imidazolderivater og deres anvendelse som farnesylproteintransferaseinhibitorer
WO1999020612A1 (en) 1997-10-22 1999-04-29 Astrazeneca Uk Limited Imidazole derivatives and their use as farnesyl protein transferase inhibitors
US6124465A (en) 1997-11-25 2000-09-26 Rhone-Poulenc S.A. Farnesyl transferase inhibitors, their preparation, the pharmaceutical compositions which contain them and their use in the preparation of medicaments
EP1045846B1 (en) 1997-11-28 2003-05-02 Lg Chemical Limited Imidazole derivatives having an inhibitory activity for farnesyl transferase and process for preparation thereof
US6054466A (en) 1997-12-04 2000-04-25 Merck & Co., Inc. Inhibitors of farnesyl-protein transferase
US6242196B1 (en) 1997-12-11 2001-06-05 Dana-Farber Cancer Institute Methods and pharmaceutical compositions for inhibiting tumor cell growth
US6335156B1 (en) 1997-12-18 2002-01-01 The Johns Hopkins University School Of Medicine 14-3-3σ arrests the cell cycle
CN1158277C (zh) 1998-02-02 2004-07-21 Lg化学株式会社 具有哌啶结构的法尼转移酶抑制剂及其制备方法
EP1076663B1 (en) 1998-04-27 2004-02-18 Warner-Lambert Company LLC Functionalized alkyl and alkenyl side chain derivatives of glycinamides as farnesyl transferase inhibitors
HRP20000904A2 (en) 1998-07-06 2001-12-31 Janssen Pharmaceutica Nv Farnesyl protein transferase inhibitors for treating arthropathies
US6034053A (en) 1998-07-13 2000-03-07 Wayne Hughes Institute EGF-isoflavone conjugates for the prevention of restenosis
US6787638B1 (en) * 1998-12-02 2004-09-07 Applied Molecular Evolution, Inc. Tumor specific human monoclonal antibodies and methods of use
US6372747B1 (en) 1998-12-18 2002-04-16 Schering Corporation Farnesyl protein transferase inhibitors
US6362188B1 (en) 1998-12-18 2002-03-26 Schering Corporation Farnesyl protein transferase inhibitors
FR2787327B1 (fr) 1998-12-21 2003-01-17 Aventis Pharma Sa Compositions contenant des inhibiteurs de farnesyle transferase
US6432959B1 (en) 1998-12-23 2002-08-13 Schering Corporation Inhibitors of farnesyl-protein transferase
DK1140938T3 (da) 1999-01-11 2003-12-22 Univ Princeton Højaffinitetsinhibitorer for målvalidering og anvendelser heraf
US6399633B1 (en) 1999-02-01 2002-06-04 Aventis Pharmaceuticals Inc. Use of 4-H-1-benzopryan-4-one derivatives as inhibitors of smooth muscle cell proliferation
US6245759B1 (en) 1999-03-11 2001-06-12 Merck & Co., Inc. Tyrosine kinase inhibitors
US6143766A (en) 1999-04-16 2000-11-07 Warner-Lambert Company Benzopyranone and quinolone inhibitors of ras farnesyl transferase
US6458935B1 (en) 1999-06-23 2002-10-01 Merck & Co., Inc. Radiolabeled farnesyl-protein transferase inhibitors
US6403581B1 (en) 2000-01-19 2002-06-11 American Cyanamid Company Method of inhibition of farnesyl-protein transferase using substituted benz (cd) indol-2-imine and-amine derivatives
US20040005600A1 (en) 2002-04-01 2004-01-08 Evelina Angov Method of designing synthetic nucleic acid sequences for optimal protein expression in a host cell
US7498298B2 (en) 2003-11-06 2009-03-03 Seattle Genetics, Inc. Monomethylvaline compounds capable of conjugation to ligands
KR20120064120A (ko) 2004-06-01 2012-06-18 제넨테크, 인크. 항체 약물 접합체 및 방법
KR101270829B1 (ko) 2004-09-23 2013-06-07 제넨테크, 인크. 시스테인 유전자조작 항체 및 접합체
HUE035853T2 (en) 2005-07-18 2018-05-28 Seattle Genetics Inc Beta-glucuronide-linker-drug conjugates
DK2423315T3 (en) 2006-06-29 2015-04-13 Dsm Ip Assets Bv A method for obtaining enhanced polypeptide expression
EP2975057A1 (en) * 2006-07-10 2016-01-20 Fujita Health University Novel anti-cd73 antibody
EP2185188B1 (en) 2007-08-22 2014-08-06 Medarex, L.L.C. Site-specific attachment of drugs or other agents to engineered antibodies with c-terminal extensions
JP5766947B2 (ja) * 2007-09-07 2015-08-19 チルドレンズ ホスピタル メディカル センター 臨床サンプルにおける分泌性のルイス抗原およびシアル化抗原のレベルの疾患リスクの予測指標としての使用
CN102159248B (zh) 2008-07-15 2013-09-11 健泰科生物技术公司 蒽环类衍生物缀合物、它们的制备方法以及它们作为抗肿瘤化合物的用途
RU2581962C2 (ru) * 2008-09-19 2016-04-20 Медиммун Ллк Нацеленные средства связывания, направленные на dll4, и их применение
WO2010091637A1 (en) * 2009-02-10 2010-08-19 Shenogen Pharma Group Ltd. Antibodies and methods for treating estrogen receptor-associated diseases
MX349662B (es) * 2010-07-22 2017-08-08 Univ California Anticuerpos de antigenos antitumorales y metodos de uso.
AU2013235479A1 (en) * 2012-03-23 2014-10-02 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Potentiating antibody-induced complement-mediated cytotoxicity via PI3K inhibition
EP3594231A1 (en) * 2013-02-13 2020-01-15 Laboratoire Français du Fractionnement et des Biotechnologies Highly galactosylated anti-tnf-alpha antibodies and uses thereof
KR102313341B1 (ko) * 2013-08-26 2021-10-18 바이오엔테크 리서치 앤드 디벨롭먼트 인코포레이티드 시알릴-루이스 ａ에 대한 사람 항체 코드화 핵산
GB201515094D0 (en) * 2015-08-25 2015-10-07 Univ Nottingham Sialyl-di-lewis a as expressed on glycoproteins but not glycolipids as a functional cancer target and antibodies thereto
US11707522B2 (en) * 2017-10-13 2023-07-25 Boehringer Ingelheim International Gmbh Human antibodies to Tn antigen
WO2020081988A1 (en) * 2018-10-19 2020-04-23 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Chimeric antigen receptor targeting sialyl lewis a and uses thereof
JP2024511189A (ja) * 2021-03-26 2024-03-12 ビオンテック・ソシエタス・エウロパエア がんの処置における抗ｃａ１９－９抗体およびｆｏｌｆｉｒｉｎｏｘを用いた組合せ療法。

Also Published As

Publication number Publication date
US20200247900A1 (en) 2020-08-06
JP7635329B2 (ja) 2025-02-25
US20230365707A1 (en) 2023-11-16
US9475874B2 (en) 2016-10-25
LT3041507T (lt) 2021-08-25
JP7161397B2 (ja) 2022-10-26
JP2023165831A (ja) 2023-11-17
WO2015053871A3 (en) 2015-06-11
KR20200085940A (ko) 2020-07-15
WO2015053871A4 (en) 2015-07-30
EP3906945A2 (en) 2021-11-10
IL276819A (en) 2020-10-29
JP2021151263A (ja) 2021-09-30
EP3041507A4 (en) 2017-07-12
HRP20211129T1 (hr) 2021-10-15
US20170015756A1 (en) 2017-01-19
CA2922478C (en) 2020-09-29
AU2025223771A1 (en) 2025-09-18
KR102553717B1 (ko) 2023-07-11
HUE056325T2 (hu) 2022-02-28
HK1226295A1 (zh) 2017-09-29
IL244297B (en) 2020-09-30
CN105764526B (zh) 2020-12-15
AU2022209226A1 (en) 2022-08-18
US20150056134A1 (en) 2015-02-26
NZ756328A (en) 2020-09-25
IL244297A0 (en) 2016-04-21
JP2023026538A (ja) 2023-02-24
CA3090644C (en) 2023-02-07
JP2025116141A (ja) 2025-08-07
CN112695039A (zh) 2021-04-23
SI3041507T1 (sl) 2021-11-30
CA3090644A1 (en) 2015-04-16
CN112695039B (zh) 2025-07-29
JP2016534735A (ja) 2016-11-10
SMT202100427T1 (it) 2021-09-14
EP3041507B1 (en) 2021-06-30
BR112016004133A2 (pt) 2017-10-24
ZA201601354B (en) 2020-08-26
CY1124435T1 (el) 2022-07-22
WO2015053871A8 (en) 2016-03-31
AU2020201225B2 (en) 2022-05-05
CA2922478A1 (en) 2015-04-16
EP3906945A3 (en) 2022-03-16
KR20160054501A (ko) 2016-05-16
NZ717428A (en) 2020-09-25
RU2016111015A3 (sr) 2018-03-30
ES2880709T3 (es) 2021-11-25
EP3041507A2 (en) 2016-07-13
KR20210079426A (ko) 2021-06-29
PT3041507T (pt) 2021-07-26
CN105764526A (zh) 2016-07-13
KR102313341B1 (ko) 2021-10-18
WO2015053871A2 (en) 2015-04-16
JP2019047821A (ja) 2019-03-28
AU2014332442B2 (en) 2019-12-19
AU2020201225A1 (en) 2020-03-12
AU2022209226B2 (en) 2025-08-21
JP7846285B2 (ja) 2026-04-14
JP7299405B2 (ja) 2023-06-27
KR20220025183A (ko) 2022-03-03
RU2699289C2 (ru) 2019-09-04
PL3041507T3 (pl) 2021-11-15
KR102362630B1 (ko) 2022-02-15
RU2016111015A (ru) 2017-10-03
RU2019125161A (ru) 2019-09-03
JP6626445B2 (ja) 2019-12-25
DK3041507T3 (da) 2021-07-26
JP2024050966A (ja) 2024-04-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7635329B2 (ja) シアリル－Ｌｅｗｉｓ ａに対するヒト抗体をコードする核酸
AU2014332442A1 (en) Nucleic acids encoding human antibodies to Sialyl-Lewis
US9856324B2 (en) Human monoclonal antibodies to ganglioside GD2
HK40064012A (en) Nucleic acids encoding human antibodies to sialyl-lewis a
HK40050582A (en) Nucleic acids encoding human antibodies to sialyl-lewis a
HK1226295B (en) Nucleic acids encoding human antibodies to sialyl-lewis a
NZ717428B2 (en) NUCLEIC ACIDS ENCODING HUMAN ANTIBODIES TO SIALYL-LEWISa
BR122020012421B1 (pt) Polinucleotídeos isolados, anticorpo isolado ou fragmento funcional do mesmo que se liga a sialil-lewisa, usos dos mesmos, conjugado e composições
BR112016004133B1 (pt) Polinucleotídeos isolados, anticorpo isolado ou fragmento funcional do mesmo que se liga a sialillewisa, usos dos mesmos, conjugado e composição farmacêutica