RS62343B1 - Pirolobenzodiazepin-antitelo konjugati - Google Patents

Pirolobenzodiazepin-antitelo konjugati

Info

Publication number
RS62343B1
RS62343B1 RS20211152A RSP20211152A RS62343B1 RS 62343 B1 RS62343 B1 RS 62343B1 RS 20211152 A RS20211152 A RS 20211152A RS P20211152 A RSP20211152 A RS P20211152A RS 62343 B1 RS62343 B1 RS 62343B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
group
antibody
seq
cancer
sequence
Prior art date
Application number
RS20211152A
Other languages
English (en)
Inventor
Berkel Patricius Hendrikus Cornelis Van
Original Assignee
Adc Therapeutics Sa
Medimmune Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GBGB1702031.4A external-priority patent/GB201702031D0/en
Priority claimed from GBGB1719398.8A external-priority patent/GB201719398D0/en
Priority claimed from GBGB1719391.3A external-priority patent/GB201719391D0/en
Priority claimed from GBGB1719393.9A external-priority patent/GB201719393D0/en
Application filed by Adc Therapeutics Sa, Medimmune Ltd filed Critical Adc Therapeutics Sa
Publication of RS62343B1 publication Critical patent/RS62343B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6889—Conjugates wherein the antibody being the modifying agent and wherein the linker, binder or spacer confers particular properties to the conjugates, e.g. peptidic enzyme-labile linkers or acid-labile linkers, providing for an acid-labile immuno conjugate wherein the drug may be released from its antibody conjugated part in an acidic, e.g. tumoural or environment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/68035—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a pyrrolobenzodiazepine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6861—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from kidney or bladder cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D519/00—Heterocyclic compounds containing more than one system of two or more relevant hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system not provided for in groups C07D453/00 or C07D455/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Description

Opis
Upućivanje na odnosne prijave
[0001] Ova prijava zahteva koristi od GB1702031,4, podnete 8. februara 2017, GB1719391,3, podnete 22. novembra 2017, GB1719398,8, podnete 22. novembra 2017, i GB1719393,9, podnete 22. novembra 2017.
Oblast pronalaska
[0002] Ovde su obelodanjeni pirolobenzodiazepini (PBD) koji imaju labilnu zaštitnu grupu u obliku veznika za antitelo.
[0003] Pronalazak je definisan patentnim zahtevima. Svaka tema koja izlazi iz okvira patentnih zahteva se primenjuje samo u informativne svrhe.
Stanje tehnike
Pirolobenzodiazepini
[0004] Neki pirolobenzodiazepini (PBD) imaju sposobnost prepoznavanja i vezivanja za specifične sekvence DNK; poželjna sekvenca je PuGPu. Prvi PBD anti-tumorski antibiotik, antramicin, otkriven je 1965. godine (Leimgruber, i dr., J. Am. Chem. Soc., 87, 5793-5795 (1965); Leimgruber, i dr., J. Am. Chem. Soc., 87, 5791-5793 (1965)). Od tada je prijavljeno nekoliko prirodnih PBD, i razvijeno je preko 10 sintetičkih puteva do različitih analoga (Thurston, i dr., Chem. Rev. 1994, 433-465 (1994); Antonow, D. i Thurston, D.E., Chem. Rev. 2011 111 (4), 2815-2864). Članovi porodice uključuju abeimicin (Hochlowski, i dr., J. Antibiotics, 40, 145-148 (1987)), čicamicin (Konishi, i dr., J. Antibiotics, 37, 200-206 (1984)), DC-81 (Japanski patent 58-180487; Thurston, et at., Chem. Brit., 26, 767-772 (1990); Bose, i dr., Tetrahedron, 48, 751-758 (1992)), mazetramicin (Kuminoto, i dr., J. Antibiotics, 33, 665-667 (1980)), neothramicine A i B (Takeuchi, i dr., J. Antibiotics, 29, 93-96 (1976)), porotramicin (Tsunakawa, i dr., J. Antibiotics, 41, 1366-1373 (1988)), protrakarcin (Shimizu, i dr, J. Antibiotics, 29, 2492-2503 (1982); Langley i Thurston, J. Org. Chem., 52, 91-97 (1987)), sibanomicin (DC-102)(Hara, i dr., J. Antibiotics, 41, 702-704 (1988); Itoh, i dr., J. Antibiotics, 41, 1281-1284 (1988)), sibiromicin (Leber, i dr., J. Am. Chem. Soc., 110, 2992-2993 (1988)) i tomamicin (Arima, i dr., J. Antibiotics, 25, 437-444 (1972)). PBD imaju opštu strukturu:
[0005] Oni se razlikuju po broju, tipu i položaju supstituenata, kako u njihovim aromatičnim A prstenovima, tako i u pirolo C prstenovima, i u stepenu zasićenja C prstena. U B-prstenu postoje bilo imin (N=C), karbinolamin (NH-CH(OH)), ili karbinolamin metil etar (NH-CH(OMe)) na položaju N10-C11 koji je elektrofilni centar odgovoran za alkiliranje DNK. Svi poznati prirodni proizvodi imaju (S)-konfiguraciju na hiralnom položaju C11a koja im pruža okret u desno gledano od C prstena prema A prstenu. To im daje odgovarajući trodimenzionalni oblik za izoheličnost sa manjim žlebom DNK B-oblika, što dovodi do prianjanja na mestu vezivanja (Kohn, In Antibiotics III. Springer-Verlag, New York, pp.3-11 (1975); Hurley i Needham-VanDevanter, Acc. Chem. Res., 19, 230-237 (1986)). Njihova sposobnost da formiraju adukt u manjem žlebu omogućava im da ometaju obradu DNK, pa se stoga koriste kao anti-tumorski agensi.
[0006] Jedno jedinjenje pirolobenzodiazepina je opisano prema Gregson i dr. (Chem. Commun. 1999, 797-798) kao jedinjenje 1, i po Gregson i dr. (J. Med. Chem. 2001, 44, 1161-1174) kao jedinjenje 4a. Ovo jedinjenje, takođe poznato kao SG2000, prikazano je u nastavku:
[0007] WO 2007/085930 opisuje pripremu dimernih PBD jedinjenja koja imaju vezničke grupe za povezivanje sa agensom za vezivanje ćelija, kao što je antitelo. Veznik je prisutan u mostu koji povezuje monomerne PBD jedinice dimera.
[0008] Dimerna PBD jedinjenja koja imaju vezničke grupe za povezivanje sa agensom za vezivanje ćelija, kao što je antitelo, opisana su u WO 2011/130613 i WO 2011/130616. Veznik u ovim jedinjenjima je vezan za PBD jezgro preko C2 položaja i generalno se razdvaja dejstvom enzima na vezničku grupu. U WO 2011/130598, veznik u ovim jedinjenjima je vezan za jedan od dostupnih N10 položaja na PBD jezgru i generalno se razdvaja dejstvom enzima na vezničku grupu.
Antitelo-lek konjugati
[0009] Utvrđena je terapija antitelima za ciljan tretman pacijenata sa rakom, imunološkim i angiogenim poremećajima (Carter, P. (2006) Nature Reviews Immunology 6:343-357). Upotreba antitelo-lek konjugata (ADC), odnosno imunokonjugata, za lokalnu isporuku citotoksičnih ili citostatičkih agenasa, odnosno lekova za ubijanje ili inhibiranje tumorskih ćelija pri tretmanu raka, usmerava isporuku dela leka u tumore i unutarćelijsku akumulaciju u tom slučaju, dok sistemska primena ovih nekonjugovanih lekova može dovesti do neprihvatljivih nivoa toksičnosti za normalne ćelije (Xie i dr (2006) Expert. Opin. Biol. Ther. 6(3):281-291; Kovtun i dr (2006) Cancer Res. 66(6):3214-3121; Law i dr (2006) Cancer Res. 66(4):2328-2337; Wu i dr (2005) Nature Biotech. 23(9):1137-1145; Lambert J. (2005) Current Opin. in Pharmacol. 5:543-549; Hamann P. (2005) Expert Opin. Ther. Patents 15(9):1087-1103; Payne, G. (2003) Cancer Cell 3:207-212; Trail i dr (2003) Cancer Immunol. Immunother.52:328-337; Syrigos i Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614).
[0010] Time se traži maksimalna efikasnost uz minimalnu toksičnost. Napori na dizajniranju i usavršavanju ADC bili su fokusirani na selektivnost monoklonskih antitela (mAbs), kao i na mehanizam delovanja lekova, povezivanje lekova, lek/antitelo odnos (opterećenje) i svojstva oslobađanja lekova (Junutula, i dr., 2008b Nature Biotech., 26(8):925-932; Dornan i dr (2009) Blood 114(13):2721-2729; US 7521541; US 7723485; WO2009/052249; McDonagh (2006) Protein Eng. Design & Sel. 19(7): 299-307; Doronina i dr (2006) Bioconj. Chem.17:114-124; Erickson i dr (2006) Cancer Res.66(8):1-8; Sanderson i dr (2005) Clin. Cancer Res. 11:843-852; Jeffrey i dr (2005) J. Med. Chem. 48:1344-1358; Hamblett i dr (2004) Clin. Cancer Res.
10:7063-7070). Delovi leka mogu preneti svoje citotoksične i citostatičke efekte mehanizmima uključujući vezivanje tubulina, vezivanje DNK, inhibiciju proteazoma i/ili topoizomeraze. Neki citotoksični lekovi imaju tendenciju da budu neaktivni ili manje aktivni kada su konjugovani sa velikim antitelima ili ligandima receptora proteina.
[0011] Predstavljeni autori su razvili posebne PBD dimer antitelo konjugate.
Sažetak
[0012] Predmetni pronalazak je definisan u patentnim zahtevima. Ovaj i drugi aspekti obelodanjenja mogu se potpunije razumeti pozivanjem na naredni opis.
[0013] Prvi aspekt predmetnog obelodanjenja pruža konjugate formule (I):
Ab-(DL)p(I)
gde:
Ab je antitelo koje se vezuje za DLK1;
DL je
gde:
X je izabran iz grupe koju čine: jednostruka veza, -CH2- i -C2H4-;
n iznosi od 1 do 8;
m iznosi 0 ili 1;
R<7>je ili metil ili fenil;
kada postoji dvostruka veza između C2 i C3, R<2>je izabran iz grupe koju čine:
(ia) C5-10aril grupa, opciono supstituisana sa jednim ili više supstituenata izabranih iz grupe koju čine: halo, nitro, cijano, etar, karboksi, estar, C1-7alkil, C3-7heterociklil i bis-oksi-C1-3alkilen;
(ib) C1-5zasićen alifatski alkil;
(ic) C3-6zasićen cikloalkil;
(id)
gde je svaki R<21>, R<22>i R<23>nezavisno izabran iz grupe koju čine H, C1-3zasićen alkil, C2-3alkenil, C2-3alkinil i ciklopropil, gde ukupan broj atoma ugljenika u R<12>grupi nije veći od 5;
gde jedan od R<25a>i R<25b>jeste H, a drugi je izabran iz grupe koju čine: fenil, gde je fenil opciono supstituisan sa grupom izabranom od narednih članova: halo, metil, metoksi; piridil; i tiofenil; i
gde je R<24>izabran iz grupe koju čine: H; C1-3zasićen alkil; C2-3alkenil; C2-3alkinil; ciklopropil; fenil, gde je fenil opciono supstituisan sa grupom izabranom od narednih članova: halo, metil, metoksi; piridil; i tiofenil;
kada postoji jednostruka veza između
gde je R<26a>i R<26b>nezavisno izabran iz grupe koju čine H, F, C1-4zasićen alkil, C2-3alkenil, gde su alkil i alkenil grupe opciono supstituisane sa grupom izabranom od narednih članova: C1-4alkil amido i C1-4alkil estar; ili, kada jedan od R<26a>i R<26b>jeste H, drugi je izabran od narednih članova: nitril i C1-4alkil estar;
kada postoji dvostruka veza između C2' i C3', R<12>je izabran iz grupe koju čine:
(ia) C5-10aril grupa, opciono supstituisana sa jednim ili više supstituenata izabranih iz grupe koju čine: halo, nitro, cijano, etar, karboksi, estar, C1-7alkil, C3-7heterociklil i bis-oksi-C1-3alkilen;
(ib) C1-5zasićen alifatski alkil;
(ic) C3-6zasićen cikloalkil;
(id)
gde je svaki R<31>, R<32>i R<33>nezavisno izabran iz grupe koju čine H, C1-3zasićen alkil, C2-3alkenil, C2-3alkinil i ciklopropil, gde ukupan broj atoma ugljenika u R<12>grupi nije veći od 5; (ie)
gde jedan od R<35a>i R<35b>jeste H, a drugi je izabran iz grupe koju čine: fenil, gde je fenil opciono supstituisan sa grupom izabranom od narednih članova: halo, metil, metoksi; piridil; i tiofenil; i
(if)
gde je R<24>je izabran iz grupe koju čine: H; C1-3zasićen alkil; C2-3alkenil; C2-3alkinil; ciklopropil; fenil, gde je fenil opciono supstituisan sa grupom izabranom od narednih članova: halo, metil, metoksi; piridil; i tiofenil;
kada postoji jednostruka veza između C2' i C3', R<12>je
gde je R<36a>i R<36b>nezavisno izabran iz grupe koju čine H, F, C1-4zasićen alkil, C2-3alkenil, gde su alkil i alkenil grupe opciono supstituisane sa grupom izabranom od narednih članova: C1-4alkil amido i C1-4alkil estar; ili, kada jedan od R<36a>i R<36b>jeste H, drugi je izabran od narednih članova: nitril i C1-4alkil estar;
i p iznosi od 1 do 8.
[0014] Drugi aspekt predmetnog obelodanjenja pruža konjugate formule (I):
Ab - (DL)p (I)
gde:
Ab je antitelo koje se vezuje za KAAG1; i
DL je kako je definisano za prvi aspekt, iznad.
[0015] Treći aspekt predmetnog obelodanjenja pruža konjugate formule (I):
Ab - (DL)p (I)
gde:
Ab je antitelo koje se vezuje za Mezotelin; i
DL je kako je definisano za prvi aspekt, iznad.
[0016] Utvrđeno je da ovi konjugati pokazuju dobru aktivnost i iznenađujuću podnošljivost u poređenju sa analognim konjugatima koji ne sadrže deo sulfonamida.
Kratak opis slika
[0017]
Slika 1 prikazuje in vitro citotoksičnost konjugata prema prvom aspektu obelodanjenja
Slika 2 prikazuje in vivo efikasnost konjugata prema prvom aspektu obelodanjenja
Slika 3 prikazuje in vitro citotoksičnost u A204 i Hep3B ćelijama u 2D i 3D ćelijskoj kulturi konjugata prema prvom aspektu obelodanjenja
Slika 4 prikazuje in vitro citotoksičnost konjugata prema drugom aspektu obelodanjenja
Slika 5 prikazuje in vivo efikasnost konjugata prema drugom aspektu obelodanjenja
Slika 6 prikazuje in vivo anti-tumorsku aktivnost u modelu konjugata SN12C ksenografta prema drugom aspektu obelodanjenja
Detaljan opis
[0018] Predmetno obelodanjenje pruža PBD dimer sa veznikom povezanim kroz položaj N10 na jednom od PBD delova konjugovanih sa antitelom kako je definisano u nastavku.
[0019] Predmetno obelodanjenje je pogodno za upotrebu u pružanju PBD jedinjenja na poželjno mesto kod pacijenta. Konjugat dozvoljava oslobađanje aktivnog PBD jedinjenja koje ne zadržava nijedan deo veznika. Ne postoji završetak koja bi mogao uticati na reaktivnost PBD jedinjenja. Tako bi konjugat formule (I) oslobodio jedinjenje RelA:
[0020] Specifična veza između PBD dimera i antitela u predmetnom obelodanjenju je poželjno stabilna van ćelije. Pre transporta ili isporuke u ćeliju, antitelo-lek konjugat (ADC) je poželjno stabilan i ostaje netaknut, tj. antitelo ostaje povezano sa delom leka. Veznici su stabilni izvan ciljne ćelije i mogu se odvojiti nekom efikasnom brzinom unutar ćelije. Efikasan veznik će: (i) zadržati specifična svojstva vezivanja antitela; (ii) dozvoliti intracelularnu isporuku konjugata ili dela leka; (iii) ostati stabilan i netaknut, tj. nije razdvojen, sve dok konjugat nije isporučen ili transportovan na ciljano mesto; i (iv) održati citotoksični efekat ubijanja ćelija ili citostatički efekat dela PBD leka. Stabilnost ADC može se meriti standardnim analitičkim tehnikama kao što su masena spektroskopija, HPLC i tehnika razdvajanja/analize LC/MS.
[0021] Isporuka jedinjenja formula RelA se postiže na željenom mestu aktivacije konjugata formule (I) dejstvom enzima, kao što je katepsin, na vezničku grupu, i posebno na valin-alanin deo dipeptida.
Definicije
Supstituenti
[0022] Izraz „opciono supstituisan“, kako se ovde koristi, odnosi se na roditeljsku grupu koja može biti nesupstituisana ili koja može biti supstituisana.
[0023] Osim ako nije drugačije naznačeno, izraz „supstituisan“, kako se ovde koristi, odnosi se na roditeljsku grupu koja nosi jednog ili više supstituenata. Izraz „supstituent“ se ovde koristi u konvencionalnom smislu i odnosi se na hemijski deo koji je kovalentno vezan za, ili ako je prikladno, spojen sa roditeljskom grupom. Širok spektar supstituenata je dobro poznat, i postupci za njihovo formiranje i uvođenje u različite roditeljske grupe su takođe dobro poznati.
[0024] Primeri supstituenata su detaljnije opisani u nastavku.
[0025] C1-12alkil: Izraz „ C1-12alkil“, kako se ovde koristi, odnosi se na monovalentni deo dobijen uklanjanjem atoma vodonika od atoma ugljenika jedinjenja ugljovodonika koje ima od 1 do 12 atoma ugljenika, koji može biti alifatski ili alicikličan, i koji može biti zasićen ili nezasićen (npr. delimično nezasićen, potpuno nezasićen). Izraz „C1-4alkil“, kako se ovde koristi, odnosi se na monovalentni deo dobijen uklanjanjem atoma vodonika od atoma ugljenika jedinjenja ugljovodonika koje ima od 1 do 4 atoma ugljenika, koji može biti alifatski ili alicikličan, i koji može biti zasićen ili nezasićen (npr. delimično nezasićen, potpuno nezasićen). Tako, izraz „alkil“ uključuje potklase alkenil, alkinil, cikloalkil, itd.
[0026] Primeri zasićenih alkil grupa uključuju, ali nisu ograničeni na, metil (C1), etil (C2), propil (C3), butil (C4), pentil (C5), heksil (C6) i heptil (C7).
[0027] Primeri zasićenih linearnih alkil grupa uključuju, ali nisu ograničeni na, metil (C1), etil (C2), n-propil (C3), n-butil (C4), n-pentil (amil) (C5), n-heksil (C6) i n-heptil (C7).
[0028] Primeri zasićenih razgranatih alkil grupa uključuju izo-propil (C3), izo-butil (C4), sek-butil (C4), tercbutil (C4), izo-pentil (C5), i neo-pentil (C5).
[0029] C2-12alkenil: Izraz „C2-12alkenil“, kako se ovde koristi, odnosi se na alkil grupu koja ima jednu ili više dvostrukih ugljenik-ugljenik veza.
[0030] Primeri nezasićenih alkenil grupa uključuju, ali nisu ograničeni na, etenil (vinil, - CH=CH2), 1-propenil (-CH=CH-CH3), 2-propenil (allil, -CH-CH=CH2), izopropenil (1-metilvinil, -C(CH3)=CH2), butenil (C4), pentenil (C5), i heksenil (C6).
[0031] C2-12alkinil: Izraz „C2-12alkinil“, kako se ovde koristi, odnosi se na alkil grupu koja ima jednu ili više trostrukih ugljenik-ugljenik veza.
[0032] Primeri nezasićenih alkinil grupa uključuju, ali nisu ograničeni na, tinil (-C≡CH) i 2-propinil (propargil, -CH2-C≡CH).
[0033] C3-12cikloalkil: Izraz „C3-12cikloalkil“, kako se ovde koristi, odnosi se na alkil grupu koja je takođe ciklična grupa; to jest, monovalentni deo dobijen uklanjanjem atoma vodonika iz alicikličnog atoma prstena od cikličnog ugljovodoničnog (karbocikličnog) jedinjenja, koje ima od 3 do 7 atoma ugljenika, uključujući 3 do 7 atoma u prstenu.
[0034] Primeri cikloalkil grupa uključuju, ali nisu ograničeni na, one izvedene iz:
zasićenih monocikličnih jedinjenja ugljovodonika:
ciklopropan (C3), ciklobutan (C4), ciklopentan (C5), cikloheksan (C6), cikloheptan (C7), metilciklopropan (C4), dimetilciklopropan (C5), metilciklobutan (C5), dimetilciklobutan (C6), metilciklopentan (C6), dimetilciklopentan (C7) i metilcikloheksan (C7);
nezasićenih monocikličnih jedinjenja ugljovodonika:
ciklopropen (C3), ciklobuten (C4), ciklopenten (C5), cikloheksen (C6), metilciklopropen (C4), dimetilciklopropen (C5), metilciklobuten (C5), dimetilciklobuten (C6), metilciklopenten (C6), dimetilciklopenten (C7) i metilcikloheksen (C7); i
zasićenihih policikličnih jedinjenja ugljovodonika:
norkaran (C7), norpinan (C7), norbornan (C7).
[0035] C3-20heterociklil: Izraz „C3-20heterociklil“, kako se ovde koristi, odnosi se na monovalentni deo dobijen uklanjanjem atoma vodonika iz atoma prstena heterocikličnog jedinjenja, gde deo ima od 3 do 20 atoma u prstenu, od kojih je od 1 do 10 heteroatoma u prstenu. Poželjno, svaki prsten ima od 3 do 7 atoma u prstenu, od kojih su 1 do 4 heteroatomi u prstenu.
[0036] U ovom kontekstu, prefiksi (npr. C3-20, C3-7, C5-6, itd.) označavaju broj atoma u prstenu ili raspon broja atoma u prstenu, bilo da su atomi ugljenika ili heteroatomi. Na primer, izraz „C5-6heterociklil“, kako se ovde koristi, odnosi se na heterociklil grupu koja ima 5 ili 6 atoma u prstenu.
[0037] Primeri monocikličnih heterociklil grupa uključuju, ali nisu ograničeni na, one izvedene iz:
N1: aziridin (C3), azetidin (C4), pirolidin (tetrahidropirol) (C5), pirolin (e.g., 3-pirolin, 2,5-dihidropirol) (C5), 2H-pirol ili 3H-pirol (izopirol, izoazol) (C5), piperidin (C6), dihidropiridin (C6), tetrahidropiridin (C6), azepin (C7);
O1: oksiran (C3), oksetan (C4), oksolan (tetrahidrofuran) (C5), oksol (dihidrofuran) (C5), oksan (tetrahidropiran) (C6), dihidropiran (C6), piran (C6), oksepin (C7);
S1: tiiran (C3), tietan (C4), tiolan (tetrahidrotiofen) (C5), tian (tetrahidrotiopiran) (C6), tiepan (C7); O2: dioksolan (C5), dioksan (C6), i dioksepan (C7);
O3: trioksan (C6);
N2: imidazolidin (C5), pirazolidin (diazolidin) (C5), imidazolin (C5), pirazolin (dihidropirazol) (C5), piperazin (C6);
N1O1: tetrahidrooksazol (C5), dihidrooksazol (C5), tetrahidroizoksazol (C5), dihidroizoksazol (C5), morfolin (C6), tetrahidrooksazin (C6), dihidrooksazin (C6), oksazin (C6);
N1S1: tiazolin (C5), tiazolidin (C5), tiomorfolin (C6);
N2O1: oksadiazin (C6);
O1S1: oksatiol (C5) i oksatian (tioksan) (C6);i,
N1O1S1: oksatiazin (C6).
[0038] Primeri supstituisanih monocikličnih heterociklil grupa uključuju one izvedene iz saharida, u cikličnom obliku, na primer, furanoze (C5), kao što su arabinofuranoza, liksofuranoza, ribofuranoza i ksilofuranza i piranoze (C6), poput alopiranoze, altropiranoze, glukopiranoze, manopiranoze, gulopiranoze, idopiranoze, galaktopiranoze i talopiranoze.
[0039] C5-20aril: Izraz „C5-20aril“, kako se ovde koristi, odnosi se na monovalentni deo dobijen uklanjanjem atoma vodonika iz atoma aromatičnog prstena aromatičnog jedinjenja, gde deo ima od 3 do 20 atoma u prstenu. Izraz „C5-7aril“, kako se ovde koristi, odnosi se na monovalentni deo koji se dobija uklanjanjem atoma vodonika iz atoma aromatičnog prstena aromatičnog jedinjenja, gde deo ima od 5 do 7 atoma u prstenu, i izraz aril“, kako se ovde koristi, odnosi se na monovalentni deo dobijen uklanjanjem atoma vodonika iz atoma aromatičnog prstena aromatičnog jedinjenja, koje ima od 5 do 10 atoma u prstenu. Poželjno, svaki prsten ima od 5 do 7 atoma u prstenu.
[0040] U ovom kontekstu, prefiksi (npr. C3-20, C5-7, C5-6, C5-10, itd.) označavaju broj atoma u prstenu ili raspon broja atoma u prstenu, bilo da su atomi ugljenika ili heteroatomi. Na primer, izraz „C5-6aril“, kako se ovde koristi, odnosi se na aril grupu koja ima 5 ili 6 atoma u prstenu.
[0041] Atomi u prstenu mogu biti svi atomi ugljenika, kao u „karboaril grupama“. Primeri karboaril grupa uključuju, ali nisu ograničeni na one, izvedene iz benzena (tj. fenila) (C6), naftalena (C10), azulena (C10), antracena (C14), fenantrena (C14), naftacena (C18), i pirena (C16).
[0042] Primeri aril grupa koje sadrže spojene prstenove, od kojih je bar jedan aromatični prsten, uključuju, ali nisu ograničeni na, grupe izvedene iz indana (npr. 2,3-dihidro-1H-inden) (C9), indena (C9), izoindena (C9), tetralina (1,2,3,4-tetrahidronaftalen (C10), acenaftena (C12), fluorena (C13), fenalena (C13), acefenantrena (C15), i aceantrena (C16).
[0043] Alternativno, atomi u prstenu mogu uključivati jedan ili više heteroatoma, kao u „heteroaril grupama“. Primeri monocikličnih heteroaril grupa uključuju, ali nisu ograničeni na, one izvedene iz:
N1: pirol (azol) (C5), piridin (azin) (C6);
O1: furan (oksol) (C5);
S1: tiofen (tiol) (C5);
N1O1: oksazol (C5), izoksazol (C5), izoksazin (C6);
N2O1: oksadiazol (furazan) (C5);
N3O1: oksatriazol (C5);
N1S1: tiazol (C5), izotiazol (C5);
N2: imidazol (1,3-diazol) (C5), pirazol (1,2-diazol) (C5), piridazin (1,2-diazin) (C6), pirimidin (1,3-diazin) (C6) (npr., citosin, thymin, uracil), pirazin (1,4-diazin) (C6);
N3: triazol (C5), triazin (C6);i,
N4: tetrazol (C5).
[0044] Primeri heteroarila koji sadrže fuzionisane prstenove uključuju, ali nisu ograničeni na:
Cg (sa 2 fuzionisana prstena) izveden iz nekog od članova: benzofuran (O1), izobenzofuran (O1), indol (N1), izoindol (N1), indolizin (N1), indolin (N1), izoindolin (N1), purin (N4) (npr., adenin, guanin), benzimidazol (N2), indazol (N2), benzoksazol (N1O1), benzizoksazol (N1O1), benzodioksol (O2), benzofurazan (N2O1), benzotriazol (N3), benzotiofuran (S1), benzotiazol (N1S1), benzotiadiazol (N2S); C10(sa 2 fuzionisana prstena) izveden iz nekog od članova: hromen (O1), izohromen (O1), hroman (O1), izohroman (O1), benzodioksan (O2), hinolin (N1), izohinolin (N1), hinolizin (N1), benzoksazin (N1O1), benzodiazin (N2), piridopiridin (N2), hinoksalin (N2), hinaazolin (N2), cinolin (N2), ftalazin (N2), naftiridin (N2), pteridin (N4);
C11(sa 2 fuzionisana prstena) izveden iz benzodiazepina (N2);
C13(sa 3 fuzionisana prstena) izveden iz nekog od članova: karbazol (N1), dibenzofuran (O1), dibenzotiofen (S1), karbolin (N2), perimidin (N2), piridoindol (N2); i,
C14(sa 3 fuzionisana prstena) izveden iz nekog od članova: acridin (N1), ksanten (O1), tioksanten (S1), oksantren (O2), fenoksatiin (O1S1), fenazin (N2), fenoksazin (N1O1), fenotiazin (N1S1), tiantren (S2), fenantridin (N1), fenantrolin (N2), fenazin (N2).
[0045] Gore navedene grupe, bilo same ili deo drugog supstituenta, mogu same po izboru biti supstituisane sa jednom ili više grupa izabranih od njih samih, i dodatnim supstituentima navedenim u nastavku.
Halo: -F, -CI, -Br, i -I.
hidroksi: -OH.
etar: -OR, gde R je etar supstituent, na primer, C1-7alkil grupa (takođe se naziva C1-7alkoksi grupa, kako je razmotreno u nastavku), C3-20heterociklil grupa (takođe se naziva C3-20heterocikliloksi grupa), ili C5-20aril grupa (takođe se naziva C5-20ariloksi grupa), poželjno C1-7alkil grupa.
Alkoksi: -OR, gde je R alkil grupa, na primer, C1-7alkil grupa. Primeri C1-7alkoksi grupa uključuju, ali nisu ograničeni na, -OMe (metoksi), -OEt (etoksi), -O(nPr) (n-propoksi), -O(iPr) (izopropoksi), -O(nBu) (n-butoksi), -O(sBu) (sek-butoksi), -O(iBu) (izobutoksi), i -O(tBu) (terc-butoksi).
karboksi (karboksilna kiselina): -C(=O)OH.
estar (karboksilat, estar karboksilne kiseline, oksikarbonil): -C(=O)OR, gde je R supstituent estra, na primer, C1-7alkil grupa, C3-20heterociklil grupa, ili C5-20aril grupa, poželjno C1-7alkil grupa. Primeri estar grupa uključuju, ali nisu ograničeni na, -C(=O)OCH3, -C(=O)OCH2CH3, -C(=O)OC(CH3)3, i -C(=O)OPh.
Amino: -NR<1>R<2>, gde su R<1>i R<2>nezavisno amino supstituenti, na primer, hidrogen, C1-7alkil grupa (takođe se naziva C1-7alkilamino ili di-C1-7alkilamino), C3-20heterociklil grupa, ili C5-20aril grupa, poželjno H ili C1-7alkil grupa, ili, u slučaju „ciklične“ amino grupe, R<1>i R<2>, uzeti zajedno sa atomom azota za koji su vezani, formiraju heterociklični prsten koji ima od 4 do 8 atoma u prstenu. Amino grupe mogu biti primarne (-NH2), sekundarne (-NHR<1>), ili tercijarne (-NHR<1>R<2>), i u katjonskom obliku mogu biti kvaternarne (-<+>NR<1>R<2>R<3>). Primeri amino grupa uključuju, ali nisu ograničeni na, -NH2, -NHCH3, -NHC(CH3)2, -N(CH3)2, -N(CH2CH3)2, i -NHPh. Primeri cikličnih amino grupa uključuju, ali nisu ograničeni na, aziridino, azetidino, pirolidino, piperidino, piperazino, morfolino, i tiomorfolino.
Amido (karbamoil, karbamil, aminokarbonil, karboksamid): -C(=O)NR<1>R<2>, gde su R<1>i R<2>nezavisno amino supstituenti, kako je definisano za amino grupe. Primeri amido grupa uključuju, ali nisu ograničeni
na, -C(=O)NH2, -C(=O)NHCH3, -C(=O)N(CH3)2, -C(=O)NHCH2CH3, i -C(=O)N(CH2CH3)2, kao i amido grupe u kojima R<1>i R<2>, zajedno sa atomom azota za koji su vezani, formiraju heterocikličnu strukturu kao kod, na primer, piperidinokarbonila, morfolinokarbonila, tiomorfolinokarbonila, i piperazinokarbonila.
Nitro: -NO2.
Azido: -N3.
Cijano (nitril, karbonitril): -CN.
Antitelo
Anti-DLK1
[0046] U jednom aspektu, antitelo je antitelo koje se vezuje za DLK1.
[0047] Homolog protein 1 sličan delti (DLK-1) je membranski vezan protein sličan EGF koji se sastoji od šest ponavljanja sličnih EGF, jukstamembranskog regiona saTACE (ADAM17)-posredovanim mestom razdvajanja, transmembranskog domena i kratkog unutarćelijskog repa. DLK-1 je snažno eksprimiran tokom fetalnog razvoja, ali je njegovo eksprimiranje smanjeno i visoko ograničena kod odraslih. Nasuprot tome, DLK-1 se ponovo eksprimira kod nekoliko tumora, kao što su neuroblastom, hepatocelularni rak (HCC), rabdomiosarkom, rak malih ćelija pluća, mijelodisplastični sindrom i akutna mijeloidna leukemija. Zanimljivo je da se kod HCC, DLK-1 pokazao kao marker matičnih ćelija raka, subpopulacije ćelija odgovorne za pokretanje, rast, metastaze i recidiv tumora.
[0048] Sve u svemu, DLK-1 predstavlja atraktivnu metu za pristup antitelo-lek konjugata (ADC) zasnovanog na njegovom selektivnom eksprimiranju u širokom spektru malignih oboljenja i ograničenom eksprimiranju u zdravim organima, kao i eksprimiranju na HCC matičnim ćelijama raka.
HuBa-1-3d
[0049] U nekim otelotvorenjima, antitelo sadrži VH domen koji ima VH CDR3 sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO.7. U nekim otelotvorenjima VH domen dalje sadrži VH CDR2 sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO.6, i/ili VH CDR1 sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO.5. U nekim otelotvorenjima, antitelo sadrži VH domen koji ima VH CDR1 sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO.5, VH CDR2 sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO.6, i VH CDR3 sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO.7. U poželjnim otelotvorenjima, antitelo sadrži VH domen koji ima sekvencu u skladu sa SEQ ID NO.1.
[0050] Antitelo može dalje da obuhvata VL domen. U nekim otelotvorenjima, antitelo sadrži VL domen koji ima VL CDR3 sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO.10. U nekim otelotvorenjima VL domen dalje sadrži VL CDR2 sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO.9, i/ili VL CDR1 sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO.8. U nekim otelotvorenjima, antitelo sadrži VL domen koji ima VL CDR1 sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO.8, VL CDR2 sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO.9, i VL CDR3 sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO.10. U poželjnim otelotvorenjima, antitelo sadrži VL domen koji ima sekvencu u skladu sa SEQ ID NO.2.
[0051] U poželjnim otelotvorenjima, antitelo sadrži VH domen i VL domen. Poželjno VH sadrži sekvencu SEQ ID NO.1 i VL domen sadrži sekvencu SEQ ID NO.2.
[0052] VH i VL domeni mogu da se upare kako bi formirali antigen-vezujuće mesto antitela koje vezuje DLK1.
[0053] U nekim otelotvorenjima, antitelo je netaknuto antitelo koje obuhvata VH domen uparen sa VL domenom, gde VH i VL domeni imaju sekvencu SEQ ID NO.1 uparenu sa SEQ ID NO.2.
[0054] U nekim otelotvorenjima, antitelo sadrži teški lanac koji ima sekvencu SEQ ID NO. 3 uparen sa lakim lancem koji ima sekvencu SEQ ID NO.4. U nekim otelotvorenjima, antitelo je netaknuto antitelo koje obuhvata dva teška lanca koji imaju sekvencu SEQ ID NO.3, gde je svaki uparen sa lakim lancem koji ima sekvencu SEQ ID NO.4.
[0055] U nekim otelotvorenjima, antitelo sadrži teški lanac koji ima sekvencu SEQ ID NO. 11 uparen sa lakim lancem koji ima sekvencu SEQ ID NO.4. U nekim otelotvorenjima, antitelo je netaknuto antitelo koje obuhvata dva teška lanca koji imaju sekvencu SEQ ID NO.11, gde je svaki uparen sa lakim lancem koji ima sekvencu SEQ ID NO.4.
[0056] U jednom aspektu antitelo je antitelo kako je opisano ovde koje je modifikovano (ili modifikovano dalje) kako je opisano u nastavku. U nekim otelotvorenjima, antitelo je humanizovana, deimunizovana ili obnovljena verzija ovde obelodanjenog antitela.
Anti-KAAG1
[0057] U jednom aspektu antitelo je antitelo koje se vezuje za KAAG1.
Antitelo 3A4
[0058] U nekim otelotvorenjima, antitelo sadrži VH domen koji ima VH CDR3 sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO.107. U nekim otelotvorenjima VH domen dalje sadrži VH CDR2 sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO.106, i/ili VH CDR1 sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO.105. U nekim otelotvorenjima, antitelo sadrži VH domen koji ima VH CDR1 sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO.105, VH CDR2 sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO.106, i VH CDR3 sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO.107. U poželjnim otelotvorenjima, antitelo sadrži VH domen koji ima sekvencu u skladu sa SEQ ID NO.101.
[0059] Antitelo može dalje da obuhvata VL domen. U nekim otelotvorenjima, antitelo sadrži VL domen koji ima VL CDR3 sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO.110. U nekim otelotvorenjima VL domen dalje
1
sadrži VL CDR2 sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO.109, i/ili VL CDR1 sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO.108. U nekim otelotvorenjima, antitelo sadrži VL domen koji ima VL CDR1 sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO.108, VL CDR2 sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO.109, i VL CDR3 sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO.110. U poželjnim otelotvorenjima, antitelo sadrži VL domen koji ima sekvencu u skladu sa SEQ ID NO. 102, SEQ ID NO.113, ili SEQ ID NO.115.
[0060] U poželjnim otelotvorenjima, antitelo sadrži VH domen i VL domen. Poželjno VH sadrži sekvencu SEQ ID NO.101 i VL domen sadrži sekvencu SEQ ID NO.102, SEQ ID NO.113, ili SEQ ID NO.115.
[0061] VH i VL domeni mogu da se upare kako bi formirali antigen-vezujuće mesto antitela koje vezuje KAAG1.
[0062] U nekim otelotvorenjima, antitelo je netaknuto antitelo koje obuhvata VH domen uparen sa VL domenom, gde VH i VL domeni imaju sekvencu SEQ ID NO.101 uparenu sa SEQ ID NO.102, SEQ ID NO.113, ili SEQ ID NO.115.
[0063] U nekim otelotvorenjima, antitelo sadrži teški lanac koji ima sekvencu SEQ ID NO. 103 uparen sa lakim lancem koji ima sekvencu SEQ ID NO.104, SEQ ID NO.114, ili SEQ ID NO.116. U nekim otelotvorenjima, antitelo je netaknuto antitelo koje obuhvata dva teška lanca koji imaju sekvencu SEQ ID NO.103, gde je svaki uparen sa lakim lancem koji ima sekvencu SEQ ID NO.104, SEQ ID NO.114, ili SEQ ID NO.116.
[0064] U nekim otelotvorenjima, antitelo sadrži teški lanac koji ima sekvencu SEQ ID NO. 111 uparen sa lakim lancem koji ima sekvencu SEQ ID NO.104, SEQ ID NO.114, ili SEQ ID NO.116. U nekim otelotvorenjima, antitelo je netaknuto antitelo koje obuhvata dva teška lanca koji imaju sekvencu SEQ ID NO.111, gde je svaki uparen sa lakim lancem koji ima sekvencu SEQ ID NO.104, SEQ ID NO.114, ili SEQ ID NO.116.
[0065] U jednom aspektu antitelo je antitelo kako je opisano ovde koje je modifikovano (ili modifikovano dalje) kako je opisano u nastavku. U nekim otelotvorenjima, antitelo je humanizovana, deimunizovana ili obnovljena verzija ovde obelodanjenog antitela.
Anti-Mezotelin
[0066] U jednom aspektu antitelo je antitelo koje se vezuje za Mezotelin.
ADCT-XA4
[0067] U nekim otelotvorenjima, antitelo sadrži VH domen koji ima VH CDR3 sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO.207. U nekim otelotvorenjima VH domen dalje sadrži VH CDR2 sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO.206, i/ili VH CDR1 sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO.205. U nekim otelotvorenjima, antitelo sadrži VH domen koji ima VH CDR1 sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO.205, VH CDR2 sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO.206, i VH CDR3 sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO.207. U poželjnim otelotvorenjima, antitelo sadrži VH domen koji ima sekvencu u skladu sa SEQ ID NO.201.
[0068] Antitelo može dalje da obuhvata VL domen. U nekim otelotvorenjima, antitelo sadrži VL domen koji ima VL CDR3 sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO.210. U nekim otelotvorenjima VL domen dalje sadrži VL CDR2 sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO.209, i/ili VL CDR1 sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO.208. U nekim otelotvorenjima, antitelo sadrži VL domen koji ima VL CDR1 sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO.208, VL CDR2 sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO.209, i VL CDR3 sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO.210. U poželjnim otelotvorenjima, antitelo sadrži VL domen koji ima sekvencu u skladu sa SEQ ID NO.202.
[0069] U poželjnim otelotvorenjima, antitelo sadrži VH domen i VL domen. Poželjno VH sadrži sekvencu SEQ ID NO.201 i VL domen sadrži sekvencu SEQ ID NO.202.
[0070] VH i VL domeni mogu da se upare kako bi formirali antigen-vezujuće mesto antitela koje vezuje Mezotelin.
[0071] U nekim otelotvorenjima, antitelo je netaknuto antitelo koje obuhvata VH domen uparen sa VL domenom, gde VH i VL domeni imaju sekvencu SEQ ID NO.201 uparenu sa SEQ ID NO.202.
[0072] U nekim otelotvorenjima, antitelo sadrži teški lanac koji ima sekvencu SEQ ID NO. 203 uparen sa lakim lancem koji ima sekvencu SEQ ID NO.204. U nekim otelotvorenjima, antitelo je netaknuto antitelo koje obuhvata dva teška lanca koji imaju sekvencu SEQ ID NO.203, gde je svaki uparen sa lakim lancem koji ima sekvencu SEQ ID NO.204.
[0073] U nekim otelotvorenjima, antitelo sadrži teški lanac koji ima sekvencu SEQ ID NO. 211 uparen sa lakim lancem koji ima sekvencu SEQ ID NO.204. U nekim otelotvorenjima, antitelo je netaknuto antitelo koje obuhvata dva teška lanca koji imaju sekvencu SEQ ID NO.211, gde je svaki uparen sa lakim lancem koji ima sekvencu SEQ ID NO.204.
ADCT-XFT
[0074] U nekim otelotvorenjima, antitelo sadrži VH domen koji ima VH CDR3 sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO.218. U nekim otelotvorenjima VH domen dalje sadrži VH CDR2 sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO.217, i/ili VH CDR1 sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO.216. U nekim otelotvorenjima, antitelo sadrži VH domen koji ima VH CDR1 sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO.216, VH CDR2 sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO.217, i VH CDR3 sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO.218. U poželjnim otelotvorenjima, antitelo sadrži VH domen koji ima sekvencu u skladu sa SEQ ID NO.212.
[0075] Antitelo može dalje da obuhvata VL domen. U nekim otelotvorenjima, antitelo sadrži VL domen koji ima VL CDR3 sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO.221. U nekim otelotvorenjima VL domen dalje sadrži VL CDR2 sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO.220, i/ili VL CDR1 sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO.219. U nekim otelotvorenjima, antitelo sadrži VL domen koji ima VL CDR1 sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO.219, VL CDR2 sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO.220, i VL CDR3 sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO.221. U poželjnim otelotvorenjima, antitelo sadrži VL domen koji ima sekvencu u skladu sa SEQ ID NO.213.
[0076] U poželjnim otelotvorenjima, antitelo sadrži VH domen i VL domen. Poželjno VH sadrži sekvencu SEQ ID NO.212 i VL domen sadrži sekvencu SEQ ID NO.213.
[0077] VH i VL domeni mogu da se upare kako bi formirali antigen-vezujuće mesto antitela koje vezuje Mezotelin.
[0078] U nekim otelotvorenjima, antitelo je netaknuto antitelo koje obuhvata VH domen uparen sa VL domenom, gde VH i VL domeni imaju sekvencu SEQ ID NO.212 uparenu sa SEQ ID NO.213.
[0079] U nekim otelotvorenjima, antitelo sadrži teški lanac koji ima sekvencu SEQ ID NO. 214 uparen sa lakim lancem koji ima sekvencu SEQ ID NO.215. U nekim otelotvorenjima, antitelo je netaknuto antitelo koje obuhvata dva teška lanca koji imaju sekvencu SEQ ID NO.214, gde je svaki uparen sa lakim lancem koji ima sekvencu SEQ ID NO.215.
[0080] U nekim otelotvorenjima, antitelo sadrži teški lanac koji ima sekvencu SEQ ID NO. 222 uparen sa lakim lancem koji ima sekvencu SEQ ID NO.215. U nekim otelotvorenjima, antitelo je netaknuto antitelo koje obuhvata dva teška lanca koji imaju sekvencu SEQ ID NO.222, gde je svaki uparen sa lakim lancem koji ima sekvencu SEQ ID NO.215.
ADCT-X09
[0081] U nekim otelotvorenjima, antitelo sadrži VH domen koji ima VH CDR3 sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO.229. U nekim otelotvorenjima VH domen dalje sadrži VH CDR2 sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO.228, i/ili VH CDR1 sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO.227. U nekim otelotvorenjima, antitelo sadrži VH domen koji ima VH CDR1 sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO.227, VH CDR2 sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO.228, i VH CDR3 sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO.229. U poželjnim otelotvorenjima, antitelo sadrži VH domen koji ima sekvencu u skladu sa SEQ ID NO.223.
[0082] Antitelo može dalje da obuhvata VL domen. U nekim otelotvorenjima, antitelo sadrži VL domen koji ima VL CDR3 sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO.232. U nekim otelotvorenjima VL domen dalje sadrži VL CDR2 sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO.231, i/ili VL CDR1 sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO.230. U nekim otelotvorenjima, antitelo sadrži VL domen koji ima VL CDR1 sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO.230, VL CDR2 sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO.231, i VL CDR3 sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO.232. U poželjnim otelotvorenjima, antitelo sadrži VL domen koji ima sekvencu u skladu sa SEQ ID NO.224.
[0083] U poželjnim otelotvorenjima, antitelo sadrži VH domen i VL domen. Poželjno VH sadrži sekvencu SEQ ID NO.223 i VL domen sadrži sekvencu SEQ ID NO.224.
[0084] VH i VL domeni mogu da se upare kako bi formirali antigen-vezujuće mesto antitela koje vezuje mezitelin.
[0085] U nekim otelotvorenjima, antitelo je netaknuto antitelo koje obuhvata VH domen uparen sa VL domenom, gde VH i VL domeni imaju sekvencu SEQ ID NO.223 uparenu sa SEQ ID NO.224.
[0086] U nekim otelotvorenjima, antitelo sadrži teški lanac koji ima sekvencu SEQ ID NO. 225 uparen sa lakim lancem koji ima sekvencu SEQ ID NO.226. U nekim otelotvorenjima, antitelo je netaknuto antitelo koje obuhvata dva teška lanca koji imaju sekvencu SEQ ID NO.225, gde je svaki uparen sa lakim lancem koji ima sekvencu SEQ ID NO.226.
[0087] U nekim otelotvorenjima, antitelo sadrži teški lanac koji ima sekvencu SEQ ID NO. 233 uparen sa lakim lancem koji ima sekvencu SEQ ID NO.226. U nekim otelotvorenjima, antitelo je netaknuto antitelo koje obuhvata dva teška lanca koji imaju sekvencu SEQ ID NO.233, gde je svaki uparen sa lakim lancem koji ima sekvencu SEQ ID NO.226.
ADCT-X09,2
[0088] U nekim otelotvorenjima, antitelo sadrži VH domen koji ima VH CDR3 sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO.240. U nekim otelotvorenjima VH domen dalje sadrži VH CDR2 sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO.239, i/ili VH CDR1 sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO.238. U nekim otelotvorenjima, antitelo sadrži VH domen koji ima VH CDR1 sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO.238, VH CDR2 sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO.239, i VH CDR3 sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO.240. U poželjnim otelotvorenjima, antitelo sadrži VH domen koji ima sekvencu u skladu sa SEQ ID NO.234.
[0089] Antitelo može dalje da obuhvata VL domen. U nekim otelotvorenjima, antitelo sadrži VL domen koji ima VL CDR3 sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO.243. U nekim otelotvorenjima VL domen dalje sadrži VL CDR2 sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO.242, i/ili VL CDR1 sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO.241. U nekim otelotvorenjima, antitelo sadrži VL domen koji ima VL CDR1 sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO.241, VL CDR2 sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO.242, i VL CDR3 sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO.243. U poželjnim otelotvorenjima, antitelo sadrži VL domen koji ima sekvencu u skladu sa SEQ ID NO.235.
[0090] U poželjnim otelotvorenjima, antitelo sadrži VH domen i VL domen. Poželjno VH sadrži sekvencu SEQ ID NO.234 i VL domen sadrži sekvencu SEQ ID NO.235.
[0091] VH i VL domeni mogu da se upare kako bi formirali antigen-vezujuće mesto antitela koje vezuje Mezotelin.
[0092] U nekim otelotvorenjima, antitelo je netaknuto antitelo koje obuhvata VH domen uparen sa VL domenom, gde VH i VL domeni imaju sekvencu SEQ ID NO.234 uparenu sa SEQ ID NO.235.
[0093] U nekim otelotvorenjima, antitelo sadrži teški lanac koji ima sekvencu SEQ ID NO. 236 uparen sa lakim lancem koji ima sekvencu SEQ ID NO.237. U nekim otelotvorenjima, antitelo je netaknuto antitelo koje obuhvata dva teška lanca koji imaju sekvencu SEQ ID NO.236, gde je svaki uparen sa lakim lancem koji ima sekvencu SEQ ID NO.237.
[0094] U nekim otelotvorenjima, antitelo sadrži teški lanac koji ima sekvencu SEQ ID NO. 244 uparen sa lakim lancem koji ima sekvencu SEQ ID NO.237. U nekim otelotvorenjima, antitelo je netaknuto antitelo koje obuhvata dva teška lanca koji imaju sekvencu SEQ ID NO.244, gde je svaki uparen sa lakim lancem koji ima sekvencu SEQ ID NO.237.
Terminologija
[0095] Izraz „antitelo“ ovde se koristi u najširem smislu i posebno obuhvata monoklonska antitela, poliklonska antitela, dimere, multimere, multispecifična antitela (npr. bispecifična antitela), netaknuta antitela i fragmente antitela, sve dok pokazuju željenu biološku aktivnost, na primer, sposobnost vezivanja DLK1, KAAG1 ili Mezotelina. Antitela mogu biti mišja, ljudska, humanizovana, himerna ili izvedena iz drugih vrsta. Antitelo je protein koji generiše imunološki sistem i koji je sposoban da prepozna i veže se za određeni antigen. (Janeway, C., Travers, P., Walport, M., Shlomchik (2001) Immuno Biology, 5th Ed., Garland Publishing, New York). Ciljani antigen generalno ima brojna mesta vezivanja, koja se nazivaju i
1
epitopi, koje prepoznaju CDR na više antitela. Svako antitelo koje se specifično vezuje za drugi epitop ima drugačiju strukturu. Prema tome, jedan antigen može imati više od jednog odgovarajućeg antitela. Antitelo uključuje molekul imunoglobulina cele dužine ili imunološki aktivan deo molekula imunoglobulina cele dužine, tj. molekul koji sadrži mesto vezivanja antigena koje imunospecifično vezuje antigen cilja od interesa ili njegov deo, gde takvi ciljevi uključuju, ali bez ograničenja, ćelije raka ili ćelije koje proizvode autoimuna antitela povezana sa autoimunom bolešću. Imunoglobulin može biti bilo koje vrste (npr. IgG, IgE, IgM, IgD i IgA), klase (npr. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 i IgA2) ili potklase, ili alotipa (npr. ljudski G1 m1, G1m2, G1m3, ne-G1 m1 [koji je bilo koji alotip osim G1m1], G1m17, G2m23, G3m21, G3m28, G3m11, G3m5, G3m13, G3m14, G3m10, G3m15, G3m16, G3m6, G3m24, G3m26, G3m27, A2m1, A2m2, Km1, Km2 i Km3) molekula imunoglobulina. Imunoglobulini mogu biti izvedeni iz bilo koje vrste, uključujući ljudsko, mišje ili zečje poreklo.
[0096] Kako se ovde koristi, „vezuje DLK1“ se koristi da označi da antitelo vezuje DLK1 sa većim afinitetom od nespecifičnog partnera kao što je albumin goveđeg seruma (BSA, Genbank pristupni broj CAA76847, verzija br. CAA76847,1 GI: 3336842, datum ažuriranja zapisa: 7. januar 2011, 14:30). U nekim otelotvorenjima, antitelo se vezuje za DLK1 konstantom asocijacije (Ka) koja je najmanje 2, 3, 4, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000, 2000, 5000, 10<4>, 10<5>ili 10<6>-struko veća od konstante asocijacije antitela za BSA, mereno u fiziološkim uslovima. Antitela predmetnog obelodanjenja mogu da vezuju DLK1 sa visokim afinitetom. Na primer, u nekim otelotvorenjima antitelo može da se vezuje za DLK1 sa KDkoja je jednaka ili manje od oko 10<-6>M, kao što je 1 x 10<-6>, 10<-7>, 10<-8>, 10<-9>, 10<-10>, 10<-11>, 10<-12>, 10<-13>ili 10<-14>.
[0097] DLK1 je član porodice homeotskih proteina sličnih EGF. U nekim otelotvorenjima, DLK1 polipeptid odgovara Genbank pristupnom broju CAA78163, verzija br. CAA78163,1, datum ažuriranja zapisa: 2. februar 2011 10:34 (SEQ ID NO. 12). U jednom otelotvorenju, nukleinska kiselina koja kodira DLK1 polipeptid odgovara Genbank pristupnom broju Z12172, verzija br. Z12172,1, datum ažuriranja zapisa: 2. februar 2011.10:34. U nekim otelotvorenjima, DLK1 polipeptid ima sekvencu SEQ ID NO.13.
[0098] Kako se ovde koristi, „vezuje KAAG1“ se koristi za označavanje antitela koje vezuje KAAG1 sa većim afinitetom od nespecifičnog partnera, kao što je albumin goveđeg seruma (BSA, Genbank pristupni broj, CAA76847,1, verzija br. CAA76847,1 GI: 3336842, datum ažuriranja zapisa: 7. januar 2011, 14:30). U nekim otelotvorenjima, antitelo se vezuje za KAAG1 sa konstantom asocijacije (Ka) koja je najmanje 2, 3, 4, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000, 2000, 5000, 10<4>, 10<5>ili 10<6>-struko veća od konstante asocijacije antitela za BSA, mereno u fiziološkim uslovima. Antitela predmetnog obelodanjenja mogu vezati KAAG1 sa visokim afinitetom. Na primer, u nekim otelotvorenjima antitelo može da vezuje KAAG1 sa KDkoja je jednaka ili manja od oko 10<-6>M, kao što je 1 x 10<-6>, 10<-7>, 10<-8>, 10<-9>, 10<-10>, 10<-11>, 10<-12>, 10<-13>ili 10<-14>.
[0099] KAAG1 (antigen povezan sa bubrezima 1) se eksprimira u testisima i bubrezima, i u nižim nivoima u mokraćnoj bešici i jetri. Eksprimira se visokim udelom tumora različitog histološkog porekla, uključujući melanome, sarkome i kolorektalne rakove. U nekim otelotvorenjima, KAAG1 polipeptid odgovara Genbank pristupnom broju AAF23613, verzija br. AAF23613,1. U jednom aspektu, nukleinska kiselina koja kodira KAAG1 polipeptid odgovara Genbank pristupnom broju AF181722, verzija br. AF181722,1. U nekim otelotvorenjima, KAAG1 polipeptid ima sekvencu SEQ ID NO.112.
[0100] Kako se ovde koristi, „vezuje Mezotelin“ se koristi za označavanje antitela za vezanje Mezotelina sa većim afinitetom od nespecifičnog partnera, kao što je albumin goveđeg seruma (BSA, Genbank pristupni broj CAA76847,1, verzija br. CAA76847,1 GI: 3336842, datum ažuriranja zapisa: 7. januar 2011, 14:30). U nekim otelotvorenjima, antitelo vezuje Mezotelin sa konstantom asocijacije (Ka) koja je najmanje 2, 3, 4, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000, 2000, 5000, 10<4>, 10<5>ili 10<6>-struko veća od konstante asocijacije antitela za BSA, mereno u fiziološkim uslovima. Antitela predmetnog obelodanjenja mogu vezati Mezotelin sa visokim afinitetom. Na primer, u nekim otelotvorenjima antitelo može da vezuje Mezotelin sa KDkoja je jednaka ili manja od oko 10<-6>M, kao što je 1 x 10-<6>, 10<-7>, 10<-8>, 10<-9>, 10<-10>, 10<-11>, 10<-12>, 10<-13>ili 10<-14>.
[0101] Mezotelin je protein od 40 kDa prisutan u normalnim mezotelnim ćelijama. Gen mezotelina kodira protein prekursor koji se obrađuje kako bi se dobio mezotelin, koji je vezan za ćelijsku membranu pomoću glikofosfatidilinozitol veze, i fragment od 31 kDa koji se naziva faktor koji potencira megakariocite (MPF). Predloženo je da mezotelin može biti uključen u ćelijsku adheziju. U nekim otelotvorenjima, Mezotelin polipeptid odgovara Genbank pristupnom broju AAC50348, verzija br. AAC50348,1, datum ažuriranja zapisa: 23. jun 2010 09:12. U jednom aspektu, nukleinska kiselina koja kodira Mezotelin polipeptid odgovara Genbank pristupnom broju U40434, verzija br. U40434,1, datum ažuriranja zapisa: 23. jun 2010 09:12. U nekim otelotvorenjima, Mezotelin polipeptid ima sekvencu SEQ ID NO.245. U nekim otelotvorenjima, Mezotelin polipeptid ima sekvencu SEQ ID NO.246.
[0102] „Fragmenti antitela“ obuhvataju deo antitela pune dužine, generalno njegovo vezivanje za antigen ili njegov varijabilni region. Primeri fragmenata antitela uključuju Fab, Fab', F(ab')2, i scFv fragmente; dijatela; linearna antitela; fragmente koji proizvodi Fab ekspresiona biblioteka, anti-idiotipska (anti-Id) antitela, CDR (komplementarno određujući region) i fragmente koji vezuju epitope bilo čega od gore navedenog koji se imunospecifično vezuju za antigene ćelija raka, virusne antigene ili mikrobne antigene, molekule jedenolančanih antitela; i multispecifična antitela nastala od fragmenata antitela.
[0103] Izraz „monoklonsko antitelo“, kako se ovde koristi, odnosi se na antitela dobijena iz populacije znatno homogenih antitela, tj. pojedinačna antitela koja čine populaciju su identična, osim mogućih prirodnih mutacija koje mogu biti prisutne u manjim količinama. Monoklonska antitela su visoko specifična, usmerena su protiv jednog antigenskog mesta. Dalje, za razliku od preparata poliklonskih antitela koji uključuju različita antitela usmerena protiv različitih determinanti (epitopa), svako monoklonsko antitelo je usmereno protiv jedne determinante na antigenu. Pored svoje specifičnosti, monoklonska antitela su povoljna i po tome što se mogu sintetisati nezagađena drugim antitelima. Modifikator „monoklonski“ označava karakter antitela dobijenog iz bitno homogene populacije antitela i ne treba ga tumačiti kao da zahteva proizvodnju antitela bilo kojim posebnim postupkom. Na primer, monoklonska antitela koja će se koristiti u skladu sa predmetnim obelodanjenjem mogu se dobiti postupkom hibridoma koji je prvi put opisan kod Kohler i dr (1975) Nature 256:495, ili se mogu napraviti postupcima rekombinantne DNK (pogledati, US 4816567). Monoklonska antitela se takođe mogu izolovati iz biblioteka faga antitela koristeći tehnike opisane kod Clackson i dr. (1991) Nature, 352:624-628; Marks i dr. (1991) J. Mol. Biol., 222:581-597 ili od transgenih miševa koji nose potpuno ljudski imunoglobulinski sistem (Lonberg (2008) Curr. Opinion 20(4):450-459).
[0104] Monoklonska antitela ovde posebno uključuju „himerna“ antitela u kojima je deo teškog i/ili lakog lanca identičan ili homologan odgovarajućim sekvencama u antitelima izvedenim iz određene vrste ili koji pripadaju određenoj klasi ili potklasi antitela, dok je ostatak lanca identičan ili homologan odgovarajućim sekvencama u antitelima izvedenim iz druge vrste ili pripada drugoj klasi ili potklasi antitela, kao i fragmentima takvih antitela, sve dok pokazuju željenu biološku aktivnost (US 4816567; i Morrison i dr (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855). Himerna antitela uključuju „primatizovana“ antitela koja sadrže antigen-vezujuće sekvence varijabilnog domena izvedene od primata koji nije čovek (npr. majmun ili majmun iz starog sveta) i sekvence ljudskog konstantnog regiona.
[0105] „Netaknuto antitelo“ ovde obuhvata ono koje sadrži VL i VH domene, kao i konstantni domen lakog lanca (CL) i konstantne domene teškog lanca, CH1, CH2 i CH3. Konstantni domeni mogu biti stalni domeni nativne sekvence (npr. konstantni domeni ljudske nativne sekvence) ili njihove varijante aminokiselinske sekvence. Netaknuto antitelo može imati jednu ili više „efektorskih funkcija“ koje se odnose na one biološke aktivnosti koje se mogu pripisati Fc regionu (Fc region nativne sekvence ili varijanta Fc sekvence aminokiselinske sekvence) antitela. Primeri efektorskih funkcija antitela uključuju vezivanje C1q; citotoksičnost zavisna od komplementa; Vezivanje Fc receptora; ćelijski posredovana citotoksičnost zavisna od antitela (ADCC); fagocitoza; i smanjenje regulacije receptora ćelijske površine, poput receptora B ćelija i BCR.
[0106] U zavisnosti od aminokiselinske sekvence konstantnog domena njihovih teških lanaca, netaknuta antitela se mogu svrstati u različite „klase“. Postoji pet glavnih klasa netaknutih antitela: IgA, IgD, IgE, IgG i IgM, i neke od njih mogu se dalje podeliti u „potklase“ (izotipovi), npr., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA i IgA2. Konstantni domeni teškog lanca koji odgovaraju različitim klasama antitela nazivaju se α, δ, ε, γ i µ, respektivno. Strukture podjedinica i trodimenzionalne konfiguracije različitih klasa imunoglobulina su dobro poznate.
Modifikacija antitela
[0107] Ovde obelodanjena antitela mogu biti modifikovana. Na primer, kako bi se učinila manje imunogenima za čoveka. Ovo se može postići upotrebom bilo koje od brojnih tehnika poznatih stručnjaku. Neke od ovih tehnika su detaljnije opisane u nastavku.
Humanizacija
[0108] Tehnike za smanjenje in vivo imunogenost antitela koje nije ljudsko ili fragmenta antitela uključuju one koje se nazivaju „humanizacija“.
[0109] „Humanizovano antitelo“ se odnosi na polipeptid koji sadrži najmanje deo modifikovanog
1
varijabilnog regiona ljudskog antitela gde je deo varijabilnog regiona, poželjno deo znatno manji od netaknutog ljudskog varijabilnog domena, supstituisan odgovarajućom sekvencom iz vrste koja nije čovek i gde je modifikovani varijabilni region vezan za bar drugi deo drugog proteina, poželjno za konstantan region ljudskog antitela. Izraz „humanizovana antitela“ uključuje ljudska antitela u kojima su jedan ili više regona koji određuju komplementarnost („CDR“) aminokiselinski ostaci i/ili su jedan ili više okvirnih regiona („FW“ ili „FR“) aminokiselinski ostaci supstitiisani aminokiselinskim ostacima sa analognih mesta kod glodarima ili drugim antitelima koja nisu ljudska. Izraz „humanizovano antitelo“ takođe uključuje varijantu aminokiselinske sekvence imunoglobulina ili njen fragment koji sadrži FR koji suštinski ima aminokiselinsku sekvencu ljudskog imunoglobulina i CDR koji suštinski ima aminokiselinsku sekvencu imunoglobulina koji nije ljudski.
[0110] „Humanizovani“ oblici ne-ljudskih (na primer, mišjih) antitela su himerna antitela koja sadrže minimalnu sekvencu izvedenu iz ljudskog imunoglobulina. Ili, gledano na drugi način, humanizovano antitelo je ljudsko antitelo koje takođe sadrži izabrane sekvence iz ne-ljudskih (na primer mišjih) antitela umesto ljudskih sekvenci. Humanizovano antitelo može uključivati konzervativne supstitucije aminokiselina ili neprirodne ostatke iz iste ili različite vrste koje ne menjaju značajno njegovo vezivanje i/ili biološku aktivnost. Takva antitela su himerna antitela koja sadrže minimalnu sekvencu dobijenu od imunoglobulina koji nisu ljudski.
[0111] Postoji niz tehnika humanizacije, uključujući 'CDR graftovanje', 'vođeni odabir', 'deimunizaciju', 'obnavljanje' (poznato i kao 'furniranje'), 'kompozitna antitela', 'optimizacija sadržaja ljudskih nizova' i mešanje okvira.
CDR graftovanje
[0112] U ovoj tehnici, humanizovana antitela su ljudski imunoglobulini (antitelo primalac) u kojima su ostaci iz regiona za određivanje komplementarnosti (CDR) antitela primaoca zamenjeni ostacima od CDR vrste koja nije čovek (donorsko antitelo) kao što su miš, pacov, kamila, goveče, koza ili zec, koja imaju željena svojstva (u stvari, CDR koji nisu ljudski ljudi se 'graftuju' na ljudski okvir). U nekim slučajevima, ostaci okvirnog regiona (FR) ljudskog imunoglobulina zamenjeni su odgovarajućim ostacima koji nisu ljudski (to se može dogoditi kada, na primer, određeni FR ostatak ima značajan uticaj na vezivanje antigena).
[0113] Šta više, humanizovana antitela mogu sadržati ostatke koji se ne nalaze ni u antitelu primaocu ni u uvezenim CDR ili okvirnim sekvencama. Ove modifikacije su napravljene kako bi se dodatno poboljšale i povećale performanse antitela. Tako, generalno, humanizovano antitelo će sadržati sve od najmanje jednog, i u jednom aspektu dva, promenljiva domena, u kojima sve ili sve hipervarijabilne petlje odgovaraju onim od imunoglobulina koji nije ljudski, i svi ili suštinski svi FR regioni su oni od sekvence ljudskog imunoglobulina. Humanizovano antitelo će opciono takođe sadržati najmanje deo konstantnog regiona imunoglobulina (Fc), ili onaj od ljudskog imunoglobulina.
Vođeni izbor
[0114] Postupak se sastoji od kombinovanja VHili VLdomena datog antitela koje nije ljudsko specifičnog za određeni epitop sa ljudskom VHili VLbibliotekom, i specifični ljudski V domeni se biraju u odnosu na antigen od interesa. Ovaj odabrani ljudski VH se zatim kombinuje sa VL bibliotekom kako bi se dobila potpuno ljudska VHxVL kombinacija. Postupak je opisana u Nature Biotechnology (N.Y.) 12, (1994) 899-903.
Kompozitna antitela
[0115] U ovom postupku, dva ili više segmenata aminokiselinske sekvence iz ljudskog antitela se kombinuju unutar konačnog molekula antitela. Konstruisani su kombinovanjem više segmenata ljudske VH i VL sekvence u kombinacijama koje ograničavaju ili izbegavaju epitope ljudskih T ćelija u konačnim kompozitnim V regionima antitela. Ako je potrebno, epitopi T ćelija se ograničavaju ili izbegavaju razmenom segmenata V regiona koji doprinose ili kodiraju epitop T ćelija sa alternativnim segmentima koji izbegavaju epitope T ćelija. Ovaj postupak je opisan u US 2008/0206239 A1.
Deimunizacija
[0116] Ovaj postupak uključuje uklanjanje ljudskih (ili od drugih vrsta) epitopa T-ćelija iz V regiona terapijskog antitela (ili drugog molekula). Sekvenca terapijskog antitela V-regiona se analizira na prisustvo vezujućih motiva MHC klase II, na primer, poređenjem sa bazama podataka o MHC-vezujućim motivima (kao što je baza podataka „motifs“ koja se nalazi na www.wehi.edu.au). Alternativno, vezujućih motiva
1
MHC klase II mogu se identifikovati pomoću računarskih postupaka, poput onih koji su osmišljeni od strane Altuvia i dr. (J. Mol. Biol. 249 244-250 (1995)); u ovim postupcima, uzastopni preklapajući peptidi iz sekvenci V-regiona testiraju se na svoju energiju vezivanja za proteine MHC klase II. Ovi podaci se zatim mogu kombinovati sa informacijama o drugim karakteristikama sekvence koje se odnose na uspešno predstavljene peptide, kao što su amfipatičnost, Rotbardovi motivi i mesta razdvajanja za katepsin B i druge enzime za obradu.
[0117] Jednom kada se identifikuju potencijalni epitopi T-ćelija druge vrste (npr. ljudski), oni se eliminišu promenom jedne ili više aminokiselina. Modifikovane aminokiseline se obično nalaze unutar samog epitopa T-ćelije, ali takođe mogu biti u blizini epitopa u smislu primarne ili sekundarne strukture proteina (i stoga ne moraju biti susedne u primarnoj strukturi). Najčešće se promena vrši putem supstitucije, ali će u nekim okolnostima dodavanje ili brisanje aminokiselina biti prikladnije.
[0118] Sve promene se mogu izvršiti rekombinantnom DNK tehnologijom, tako da se konačni molekul može pripremiti eksprimiranjem iz rekombinantnog domaćina koristeći dobro utvrđene postupke kao što je mutageneza usmerena na mesto. Međutim, moguća je i upotreba proteinske hemije ili bilo koji drugi način molekularne promene.
Obnavljanje
[0119] Ovaj postupak uključuje:
(a) određivanje konformacione strukture varijabilnog regiona antitela koje nije ljudsko (npr. glodarsko) (ili njegovog fragmenta) konstruisanjem trodimenzionalnog modela varijabilnog regiona antitela koje nije ljudsko;
(b) generisanje poravnanja sekvenci koristeći relativnu distribuciju pristupačnosti iz rendgenskih kristalografskih struktura dovoljnog broja teških i lakih lanaca varijabilnog regiona ljudskog antitela i antitela koje nije ljudsko kako bi se dobio skup okvira teškog i lakog lanca gde su položaji poravnanja identični u 98% od dovoljnog broja teških i lakih lanaca antitela koje nije ljudsko;
(c) određivanje za antitelo koje nije ljudsko koje treba da se humanizuje skupa aminokiselinskih ostataka izloženih na površini teškog i lakog lanca, pomoću skupa okvirnih položaja generisanih u koraku (b);
(d) identifikovanje iz aminokiselinskih sekvenci antitela koje nije ljudsko skupa ostataka aminokiselina izloženih na površini teškog i lakog lanca koji je najbliže identičan skupu površinski izloženih aminokiselinskih ostataka definisanih u koraku (c), gde teški i laki lanac iz ljudskog antitela jesu ili nisu prirodno upareni;
(e) supstituisanje, u aminokiselinskoj sekvenci antitela koje nije ljudsko koje treba da se humanizuje, skupa aminokiselinskih ostataka izloženih na površini teškog i lakog lanca definisanih u koraku (c) sa skupom aminokiselinskih ostataka izloženih na površini teškog i lakog lanca identifikovanih u koraku (d);
(f) konstruisanje trodimenzionalnog modela varijabilnog regiona antitela koje nije ljudsko, koje je rezultat supstitucije navedene u koraku (e);
(g) identifikovanje, upoređivanjem trodimenzionalnih modela konstruisanih u koracima (a) i (f), svih aminokiselinskih ostataka iz skupova identifikovanih u koracima (c) ili (d), koji se nalaze unutar 5 Angstrema od bilo kog atoma bilo kog ostatka regiona za određivanje komplementarnosti antitela koje nije ljudsko koje treba da se humanizuje; i
(h) menjanje bilo kakvih ostataka identifikovanih u koraku (g) od ljudskog na originalni aminokiselinski ostatak koji nije ljudski kako bi se na taj način definisao skup površinski izloženih aminokiselinskih ostataka antitela koja nisu ljudska; s tim da korak (a) ne mora prvo da se izvodi, ali se mora sprovesti pre koraka (g).
Superhumanizacija
[0120] Postupak upoređuje sekvencu koja nije ljudska sa funkcionalnim repertoarom ljudskog germlinijskog gena. Odabrani su oni ljudski geni koji kodiraju kanonske strukture identične ili blisko povezane sa sekvencama koje nisu ljudske. Odabrani ljudski geni sa najvećom homologijom unutar CDR izabrani su za donatore FR. Konačno, ne-ljudski CDR se graftuju na ove ljudske FR. Ovaj postupak je opisan u patentu WO 2005/079479 A2.
1
Optimizacija sadržaja ljudskih nizova
[0121] Ovaj postupak upoređuje sekvencu koja nije ljudska (npr. mišja) sa repertoarom ljudskog germlinijskog gena, i razlike se boduju kao sadržaj ljudskih nizova (HSC) koji kvantifikuje sekvencu na nivou potencijalnih epitopa MHC/T-ćelija. Ciljna sekvenca se zatim humanizuje maksimizovanjem njenog HSC umesto da se koristi globalna mera identičnosti za generisanje više različitih humanizovanih varijanti (opisano u Molecular Immunology, 44, (2007) 1986-1998).
Mešanje okvira
[0122] CDR antitela koje nije ljudsko su spojeni u okviru sa cDNK grupama koji obuhvataju sve poznate okvire teškog i lakog lanca gena ljudske germlinije. Humanizovana antitela se zatim biraju npr. pomeranje biblioteke antitela sa prikazom faga. Ovo je opisano u Methods 36, 43-60 (2005).
Modifikacija antitela sa azidom
[0123] Antitelo se može pripremiti za konjugaciju sa veznikom za lek kroz proces u tri koraka:
(1) eksprimiranje antitela (Ab) koje nosi jezgro N-glikana u odgovarajućem sistemu eksprimiranja (npr. CHO ćelijska linija). Jezgro N-glikana je tipično konjugovano sa Asn-297 teškog lanca prema Kabat sistemu numerisanja;
(2) obrezivanje svih glikonskih izoformi (kompleksnih, hibridnih, sa visokom manozom) endoglikozidazom kako bi se napustilo jezgro GlcNAc; i
(3) enzimski transfer u jezgro GlcNAc ostatka N-acetilgalaktoze koji sadrži azidnu grupu za konjugaciju sa veznikom za lek.
[0124] Pregled gore navedenog procesa dat je kod van Geel, R., i dr., Bioconjugate Chemistry, 2015, 26, 2233-2242; DOI: 10,1021/acs.bioconjchem,5b00224. Alternativno, može se koristiti proces sa jednom posudom - pogledati primere.
Otelotvorenja
X
[0125] U nekim otelotvorenjima, X je jednostruka veza.
U drugim otelotvorenjima, X je -CH2-.
U daljim otelotvorenjima, X je -C2H4-.
[0126] U nekim otelotvorenjima, n iznosi 1 do 4.
[0127] U nekim od ovih otelotvorenja, n iznosi 1.
U drugim od ovih otelotvorenja, n iznosi 2.
U daljim od ovih otelotvorenja, n iznosi 4.
R<7>
[0128] U jednom otelotvorenju, R<7>je metil.
[0129] U drugom otelotvorenju, R<7>je fenil.
R<2>
[0130] Kada postoji dvostruka veza između C2 i C3, R<2>je izabran iz grupe koju čine:
(a) C5-10aril grupa, opciono supstituisana sa jednim ili više supstituenata izabranih iz grupe koju čine: halo, nitro, cijano, etar, C1-7alkil, C3-7heterociklil i bis-oksi-C1-3alkilen;
(b) C1-5zasićen alifatski alkil;
(c) C3-6zasićen cikloalkil;
(d)
1
gde je svaki R<21>, R<22>i R<23>nezavisno izabran iz grupe koju čine H, C1-3zasićen alkil, C2-3alkenil, C2-3alkinil i ciklopropil, gde ukupan broj atoma ugljenika u R<2>grupi nije veći od 5;
(e)
gde jedan od R<25a>i R<25b>jeste H, a drugi je izabran iz grupe koju čine: fenil, gde je fenil opciono supstituisan sa grupom izabranom od narednih članova: halo metil, metoksi; piridil; i tiofenil; i (f)
gde je R<24>je izabran iz grupe koju čine: H; C1-3zasićen alkil; C2-3alkenil; C2-3alkinil; ciklopropil; fenil, gde je fenil opciono supstituisan sa grupom izabranom od narednih članova: halo metil, metoksi; piridil; i tiofenil.
[0131] Kada R<2>jeste C5-10aril grupa, on može biti C5-7aril grupa. C5-7aril grupa može biti fenil grupa ili C5-7heteroaril grupa, na primer furanil, tiofenil i piridil. U nekim otelotvorenjima, R<2>je poželjno fenil. U drugim otelotvorenjima, R<12>je poželjno tiofenil, na primer, tiofen-2-il i tiofen-3-il.
[0132] Kada R<2>jeste C5-10aril grupa, on može biti C8-10aril, na primer hinolinil ili izohinolinil grupa. Hinolinil ili izohinolinil grupa može biti vezana za PBD jezgro kroz bilo koji raspoloživ položaj na prstenu. Na primer, hinolinil može biti hinolin-2-il, hinolin-3-il, hinolin-4il, hinolin-5-il, hinolin-6-il, hinolin-7-il i hinolin-8-il. Od njih, hinolin-3-il i hinolin-6-il mogu biti poželjni. Izohinolinil može biti izohinolin-1-il, izohinolin-3-il, izohinolin-4il, izohinolin-5-il, izohinolin-6-il, izohinolin-7-il i izohinolin-8-il. Od njih, izohinolin-3-il i izohinolin-6-il mogu biti poželjni.
[0133] Kada R<2>jeste C5-10aril grupa, on može nositi bilo koji broj supstituent grupa. On poželjno nosi od 1 do 3 supstituent grupe, gde su 1 i 2 poželjnije, a pojedinačno supstituisane grupe su najpoželjnije. Supstituenti mogu biti bilo koji položaj.
[0134] Gde R<2>jeste C5-7aril grupa, pojedinačni supstituent je poželjan na atomu u prstenu koji nije u blizini veze sa ostatkom jedinjenja, tj. poželjno je β ili γ za vezu sa ostatkom jedinjenja. Stoga, gde C5-7aril grupa jeste fenil, supstituent je poželjno u meta- ili para-položajima, a poželjnije je u para-položaju.
[0135] Gde R<2>jeste C8-10aril grupa, na primer hinolinil ili izohinolinil, može da sadrži bilo koji broj supstituenata na bilo kojom položaju hinolinskih ili izohinolinskih prstenova. U nekim otelotvorenjima, on sadrži jedan, dva ili tri supstituenta, i oni mogu biti ili na proksimalnom i distalnom prstenu ili na oba (ako ima više supstituenata).
R<2>supstituenti, kada je R<2>jeste C5-10arilna grupa
[0136] Ako je supstituent na R<2>kada R<2>jeste C5-10aril grupa halo, poželjnije F ili Cl, poželjnije Cl.
[0137] Ako je supstituent na R<2>kada R<2>jeste C5-10aril grupa etar, u nekim otelotvorenjima može biti alkoksi grupa, na primer, C1-7alkoksi grupa (npr. metoksi, etoksi) ili u nekim otelotvorenjima može biti C5-7ariloksi grupa (npr. fenoksi, piridiloksi, furaniloksi). Sama alkoksi grupa može dalje biti supstituisana, na primer amino grupom (npr. dimetilamino).
[0138] Ako je supstituent na R<2>kada R<2>jeste C5-10aril grupa C1-7alkil, poželjno može biti C1-4alkil grupa (npr. metil, etil, propir, butil).
[0139] Ako je supstituent na R<2>kada R<2>jeste C5-10aril grupa C3-7heterociklil, u nekim otelotvorenjima može biti C6azot koji sadrži heterociklil grupu, npr. morfolino, tiomorfolino, piperidinil, piperazinil. Ove grupe mogu biti vezane za ostatak PBD grupe preko atoma azota. Ove grupe mogu dalje biti supstituisane, na
1
primer, sa C1-4alkil grupama. Ako je C6azot koji sadrži heterociklil grupu je piperazinil, navedeni dalji supstituent može biti na drugom atomu azota u prstenu.
[0140] Ako je supstituent na R<2>kada R<2>jeste C5-10aril grupa bis-oksi-C1-3alkilen, on je poželjno bis-oksimetilen ili bis-oksi-etilen.
[0141] Ako je supstituent na R<2>kada R<2>jeste C5-10aril grupa estar, ovo je poželjno metil estar ili etil estar.
[0142] Posebno poželjni supstituenti kada je R<2>jeste C5-10arilna grupa uključuju metoksi, etoksi, fluoro, hloro, cijano, bis-oksi-metilen, metil-piperazinil, morfolino i metiltiofenil. Drugi naročito poželjni supstituenti za R<2>su dimetilaminopropiloksi i karboksi.
[0143] Posebno poželjno supstituisane R<2>grupe kada R<2>jeste C<5-10>aril grupa uključuju, ali nisu ograničene na, 4-metoksi-fenil, 3-metoksifenil, 4-etoksi-fenil, 3-etoksi-fenil, 4-fluorofenil, 4-hloro-fenil, 3,4-bizoksimetilen-fenil, 4-metiltiofenil, 4-cijanofenil, 4-fenoksifenil, hinolin-3-il i hinolin-6-il, izohinolin-3-il i izohinolin-6-il, 2-tienil, 2-furanil, metoksinaftil, i naftil. Druga moguća supstituisana R<2>grupa je 4-nitrofenil. R<2>grupe od posebnog interesa uključuju 4- (4-metilpiperazin-1-il)fenil i 3,4-bisoksimetilen-fenil.
[0144] Kada je R<2>jeste C1-5zasićeni alifatski alkil, on može biti metil, etil, propil, butil ili pentil. U nekim otelotvorenjima, to može biti metil, etil ili propil (n-pentil ili izopropil). U nekim od ovih otelotvorenja, to može biti metil. U drugim otelotvorenjima, to može biti butil ili pentil, koji može biti linearan ili razgranat.
[0145] Kada R<2>jeste C3-6zasićeni cikloalkil, on može biti ciklopropil, ciklobutil, ciklopentil ili cikloheksil. U nekim otelotvorenjima, on može biti ciklopropil.
[0146] Kada je R<2>jeste
svaki od R<21>, R<22>i R<23>su nezavisno izabrani iz grupe koju čine H, C1-3zasićen alkil, C2-3alkenil, C2-3alkinil i ciklopropil, gde ukupan broj atoma ugljenika u R<2>grupi nije veći od 5. U nekim otelotvorenjima, ukupan broj atoma ugljenika u R<2>grupi nije veći od 4 ili nije veći od 3.
[0147] U nekim otelotvorenjima, jedan od R<21>, R<22>i R<23>je H, dok su druge dve grupe izabrane od članova koje čine: H, C1-3zasićen alkil, C2-3alkenil, C2-3alkinil i ciklopropil.
[0148] U drugim otelotvorenjima, dva od R<21>, R<22>i R<23>su H, dok je druga grupa izabrana od članova koje čine: H, C1-3zasićen alkil, C2-3alkenil, C2-3alkinil i ciklopropil.
[0149] U nekim otelotvorenjima, grupe koje nisu H su izabrane od metila i etila. U nekim od ovih otelotvorenja, grupe koje nisu H su metil.
[0150] U nekim otelotvorenjima, R<21>je H.
[0151] U nekim otelotvorenjima, R<22>je H.
[0152] U nekim otelotvorenjima, R<23>je H.
[0153] U nekim otelotvorenjima, R<21>i R<22>su H.
[0154] U nekim otelotvorenjima, R<21>i R<23>su H.
[0155] U nekim otelotvorenjima, R<22>i R<23>su H.
[0156] A R<2>grupa od posebnog interesa je:
[0157] Kada R<2>jeste
jedan od R<25a>i R<25b>jeste H, a drugi je izabran iz grupe koju čine: fenil, gde je fenil opciono supstituisan sa
2
grupom izabranom od narednih članova: halo, metil, metoksi; piridil; i tiofenil. U nekim otelotvorenjima, grupa koja nije H je opciono supstituisan fenil. Ako je opcioni supstituent fenila halo, poželjno je fluoro. U nekim otelotvorenjima, fenil grupa je nesupstituisana.
[0158] Kada R<2>jeste
R<24>je izabran iz grupe koju čine: H; C1-3zasićen alkil; C2-3alkenil; C2-3alkinil; ciklopropil; fenil, gde je fenil opciono supstituisan sa grupom izabranom od narednih članova: halo metil, metoksi; piridil; i tiofenil. Ako je opcioni supstituent fenila halo, poželjno je fluoro. U nekim otelotvorenjima, fenil grupa je nesupstituisana. U nekim otelotvorenjima, R<24>je izabran od članova koje čine: H, metil, etil, etenil i etinil. U nekim od ovih otelotvorenja, R<24>je izabran od H i metila.
[0159] Kada je jednostruka veza prisutna između C2 i C3,
R<2>je
gde su R<26a>i R<26b>nezavisno izabrani iz grupe koju čine H, F, C1-4zasićen alkil, C2-3alkenil, gde su alkil i alkenil grupe opciono supstituisane sa grupom izabranom od narednih članova: C1-4alkil amido i C1-4alkil estar; ili, kada jedan od R<26a>i R<26b>jeste H, drugi je izabran od narednih članova: nitril i C1-4alkil estar.
[0160] U nekim otelotvorenjima, poželjno je da su R<26a>i R<26b>oba H.
[0161] U drugim otelotvorenjima, poželjno je da su R<26a>i R<26b>oba metil.
[0162] U daljim otelotvorenjima, poželjno je da jedan od R<26a>i R<26b>jeste H, a drugi je izabran od članova koje čine: C1-4zasićen alkil, C2-3alkenil, gde su alkil i alkenil grupe opciono supstituisane. U ovim daljim otelotvorenjima, može dalje biti poželjno da je grupa koja nije H izabrana od metila i etila.
R<12>
[0163] Gore navedene preference za R<2>jednako se primenjuju i na R<12>.
[0164] U jednom otelotvorenju obelodanjenja, DL je
Opterećenje lekom
[0165] Opterećenje lekom je prosečan broj PBD lekova po antitelu, npr. antitelo.
[0166] Prosečan broj lekova po antitelu u ADC preparatima iz reakcija konjugacije može se okarakterisati konvencionalnim sredstvima kao što su UV, HPLC reverzne faze, HIC, masena spektroskopija, ELISA test i elektroforeza. Takođe se može odrediti kvantitativna distribucija ADC u smislu p. Pomoću ELISA može se odrediti prosečna vrednost p u određenom ADC preparatu (Hamblett i dr (2004) Clin. Cancer Res. 10:7063-7070; Sanderson i dr (2005) Clin. Cancer Res. 11:843-852). Međutim, raspodela p (lek) vrednosti nije uočljiva antitelo-antigen vezivanjem i ograničenjem detektovanja ELISA. Takođe, ELISA test za detektovanje antitelo-lek konjugata ne određuje gde su ostaci leka vezani za antitelo, kao što su fragmenti teškog lanca ili lakog lanca, ili određeni aminokiselinski ostaci. U nekim slučajevima, odvajanje, prečišćavanje i karakterizacija homogenog ADC, gde je p određena vrednost od ADC sa drugim opterećenjima leka, može se postići sredstvima kao što je HPLC sa reverznom fazom ili elektroforeza. Takve tehnike su primenljive i na druge vrste konjugata.
[0167] Za predmetne antitelo-lek konjugate, p je ograničen brojem mesta vezivanja na antitelu, odnosno brojem azidnih grupa. Na primer, antitelo može imati samo jednu ili dve azidne grupe za koje veznik za lek može biti vezan.
[0168] Obično se tokom reakcije konjugacije sa antitelom konjuguje manje od teoretskog maksimuma delova leka. Opterećenje (lek/antitelo odnos) ADC može se kontrolisati na nekoliko različitih načina, uključujući: (i) ograničavanje molarnog viška lek-veznik međuproizvoda (DL) ili veznik reagensa u odnosu na antitelo, i (ii) ograničavanje vremena ili temperatura reakcije konjugacije.
[0169] Kada više od jedne nukleofilne ili elektrofilne grupe antitela reaguje sa lek-veznik međuproizvodom, ili veznik reagensom, nakon čega sledi reagens dela leka, onda je rezultujući proizvod mešavina ADC jedinjenja sa raspodelom delova leka vezanih za antitelo, npr. 1, 2, 3 itd. Postupci tečne hromatografije kao što su polimerna reverzna faza (PLRP) i hidrofobna interakcija (HIC) mogu odvojiti jedinjenja u smeši prema vrednosti opterećenja leka. ADC preparati sa jednom vrednosti opterećenja leka (p) mogu biti izolovani, međutim, ti ADC sa jednim opterećenjem mogu i dalje biti heterogene smeše jer se delovi leka mogu vezati, preko veznika, na različitim mestima na antitelu.
[0170] Tako sastavi antitelo-lek konjugata predmetnog obelodanjenja uključuju smeše jedinjenja antitelo-lek konjugata gde antitelo ima jedan ili više PBD delova leka i gde se delovi leka mogu vezati za antitelo na različitim aminokiselinskim ostacima.
[0171] U jednom aspektu, prosečan broj dimerskih pirolobenzodiazepinskih grupa po antitelu je u rasponu 1 do 8. U nekim otelotvorenjima raspon je izabran od 1 do 4, 1 do 4, 2 do 4 i 1 do 3.
[0172] U nekim otelotvorenjima, postoje jedna ili dve dimerne grupe pirolobenzodiazepina po antitelu.
Uključuje druge oblike
[0173] Osim ako nije drugačije naznačeno, u gore navedeno su uključeni dobro poznati jonski, slani, solvatni i zaštićeni oblici ovih supstituenata. Na primer, pozivanje na karboksilnu kiselinu (-COOH) takođe uključuje anjonski (karboksilatni) oblik (-COO-), njegovu so ili solvat, kao i uobičajene zaštićene oblike. Slično, pozivanje na amino grupu uključuje protonirani oblik (-N<+>HR<1>R<2>), so ili solvat amino grupe, na primer, hidrohloridnu so, kao i konvencionalne zaštićene oblike amino grupe. Slično, pozivanje na hidroksilnu grupu takođe uključuje anjonski oblik (-O-), njegovu so ili solvat, kao i uobičajene zaštićene oblike.
Soli
[0174] Može biti zgodno ili poželjno pripremiti, prečistiti i/ili rukovati odgovarajućom soli aktivnog jedinjenja, na primer, farmaceutski prihvatljivom soli. Primeri farmaceutski prihvatljivih soli razmatrani su kod Berge, etal., J. Pharm. Sci., 66, 1-19 (1977).
[0175] Na primer, ako je jedinjenje anjonsko ili ima funkcionalnu grupu koja može biti anjonska (npr. -COOH može biti -COO-), tada se može formirati so sa odgovarajućim katjonom. Primeri pogodnih neorganskih katjona uključuju, ali nisu ograničeni na, jone alkalnih metala kao što je Na<+>i K<+>, zemnoalkalni katjoni kao što su Ca<2+>i Mg<2+>, i drugi katjoni kao što je Al<+3>. Primeri pogodnih organskih katjona uključuju, ali nisu ograničeni na, amonijum jon (tj. NH4<+>) i supstituisani amonijum joni (npr. NHsR<+>, NH2R2<+>, NHR3<+>, NR4<+>). Primeri nekih pogodnih supstituisanih amonijum jona su oni izvedeni iz: etilamina, dietilamina, dicikloheksilamina, trietilamina, butilamina, etilendiamina, etanolamina, dietanolamina, piperazina, benzilamina, fenilbenzilamina, holina, meglumina i trometamina, kao i aminokiseline kao što su lizin i arginin. Primer uobičajenog kvaternarnog amonijum jona je N(CH3)4<+>.
[0176] Ako je jedinjenje katjonsko ili ima funkcionalnu grupu koja može biti katjonska (npr. -NH2može biti -NH3<+>), tada se može formirati so sa odgovarajućim anjonom. Primeri pogodnih neorganskih anjona uključuju, ali nisu ograničeni na one, izvedene iz narednih neorganskih kiselina: hlorovodonične, bromovodonične, jodovodonične, sumporne, sumporaste, azotne, azotaste, fosforne i fosforaste.
[0177] Primeri odgovarajućih organskih anjona uključuju, ali nisu ograničeni na one, izvedene iz narednih organskih kiselina: 2-acetioksibenzoeva, sirćetna, askorbinska, asparaginska, benzoeva, kamforsulfonska, cimetna, limunska, edetinska, etandisulfonska, etansulfonska, fumarna, gluheptonska, glukonska, glutaminska, glikolinska, hidroksimaleinska, hidroksinaftalen karboksilna, izetoninska, mlečna kiselina, laktobioninska, laurinska, maleinska, jabučna, metansulfonska, glaktarinska, oleinska, oksalna, palmitinska, pamoinska, pantotenska, fenilacetatna, fenilsulfonska, propionska, piruvinska, salicilna, stearinska, sukcinska, sulfanilinska, vinska, toluensulfonska, trifluorosirćetna kiselina i pentanska.
[0178] Primeri pogodnih polimernih organskih anjona uključuju, ali nisu ograničeni na one, izvedene iz narednih polimernih kiselina: taninska kiselina, karboksimetil celuloza.
Solvati
[0179] Može biti zgodno ili poželjno pripremiti, prečistiti i/ili rukovati odgovarajućim solvatom aktivnog jedinjenja. Izraz „solvat“ se ovde koristi u konvencionalnom smislu da se odnosi na kompleks rastvorene supstance (npr. aktivno jedinjenje, so aktivnog jedinjenja) i rastvarača. Ako je rastvarač voda, solvat se može prikladno nazvati hidrat, na primer, monohidrat, dihidrat, trihidrat itd.
[0180] Obelodanjenje uključuje jedinjenja gde se rastvarač dodaje preko iminske veze PBD dela, što je ilustrovano ispod gde je rastvarač voda ili alkohol (R<A>OH, gde je R<A>predstavlja C1-4alkil):
Ovi oblici se mogu nazvati karbinolamin i karbinolamin etarski oblici PBD (kao što je opisano u odeljku koji se odnosi na R<10>iznad). Balans ovih ravnoteža zavisi od uslova u kojima se jedinjenja nalaze, kao i od prirode samog dela.
[0181] Ova posebna jedinjenja se mogu izolovati u čvrstom obliku, na primer, liofilizacijom.
Izomeri
[0182] Određena jedinjenja predmetnog obelodanjenja mogu postojati u jednom ili više određenih geometrijskih, optičkih, enantiomernih, diasteriomernih, epimernih, atropskih, stereoizomernih, tautomernih, konformacionih ili anomernih oblika, uključujući, ali bez ograničenja, cis- i trans-oblike; E- i Z-oblike; c-, ti r- oblike; endo- i egzo-oblike; R-, S- i mezo-oblike; D- i L-oblike; d- i I-oblike; (+) i (-) oblike; keto-, enoli enolat- oblike; sin- i anti-oblike; sinklinalne i antiklinalne oblike; α- i β-oblike; aksijalne i ekvatorijalne oblike; oblike čamca, stolice, uvijanja, koverte i polustolica; i njihove kombinacije, u daljem tekstu zajednički označene kao „izomeri“ (ili „izomerni oblici“).
[0183] Izraz „hiralno“ odnosi se na molekule koji imaju svojstvo da se ne mogu superponirati na partnera koji je kao odraz u ogledalu, dok se izraz „ahiralno“ odnosi na molekule koji se mogu superponirati na partnera koji je kao odraz u ogledalu.
[0184] Izraz „stereoizomeri“ odnosi se na jedinjenja koja imaju identičan hemijski sastav, ali se razlikuju u pogledu rasporeda atoma ili grupa u prostoru.
[0185] „Dijastereomer“ se odnosi na stereoizomer sa dva ili više hiralnih centara, a čiji molekuli nisu preslikani jedni na druge. Dijastereomeri imaju različita fizička svojstva, npr. tačke topljenja, tačke ključanja, spektralna svojstva i reaktivnosti. Smeše dijastereomera mogu se razdvojiti pod analitičkim postupcima visoke rezolucije, kao što su elektroforeza i hromatografija.
[0186] „Enantiomeri“ se odnose na dva stereoizomera jedinjenja koji se međusobno ne mogu međusobno preslikati.
[0187] Stereohemijske definicije i konvencije koje se ovde koriste generalno slede S. P. Parker, Ed., McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (1984) McGraw-Hill Book Company, New York; and Eliel, E. and Wilen, S., „Stereochemistry of Organic Compounds“, John Wiley & Sons, Inc., New York, 1994. Jedinjenja predmetnog obelodanjenja mogu sadržati asimetrične ili hiralne centre, pa stoga postoje u različitim stereoizomernim oblicima. Namera je se da svi stereoizomerni oblici jedinjenja predmetnog obelodanjenja, uključujući, ali bez ograničenja, dijastereomere, enantiomere i atropisomere, kao i njihove smeše, poput racemičnih smeša, čine deo predmetnog obelodanjenja. Mnoga organska jedinjenja postoje u optički aktivnim oblicima, odnosno imaju sposobnost rotiranja ravni svetlosti polarizovane na ravni. U
2
opisivanju optički aktivnog jedinjenja, prefiksi D i L, ili R i S, koriste se za označavanje apsolutne konfiguracije molekula oko njegovog hiralnog centra. Prefiksi d i I ili (+) i (-) koriste se za označavanje znaka rotacije ravni polarizovane svetlosti jedinjenja, gde (-) ili I znači da je jedinjenje levorotatorno. Jedinjenje sa prefiksom (+) ili d je dekstrotatorno. Za datu hemijsku strukturu, ovi stereoizomeri su identični, osim što su međusobno preslikani. Specifični stereoizomer se takođe može nazvati enantiomerom, a mešavina takvih izomera često se naziva enantiomerna smeša. 50:50 smeša enantiomera naziva se racemska smeša ili racemat, što se može dogoditi tamo gde nije došlo do stereoselekcije ili stereospecifičnosti u hemijskoj reakciji ili procesu. Izrazi „racemska smeša“ i „racemat“ odnose se na ekvimolarnu mešavinu dve enantiomerne vrste, lišene optičke aktivnosti.
[0188] Treba imati na umu da su, osim onog što je dole objašnjeno za tautomerne oblike, posebno isključeni iz izraza „izomeri“, kako se ovde koristi, su strukturni (ili konstitucioni) izomeri (tj. izomeri koji se razlikuju po vezama između atoma, a ne samo po položaju atoma u prostoru). Na primer, pozivanje na metoksi grupu, -OCH3, ne treba tumačiti kao upućivanje na njegov strukturni izomer, hidroksimetil grupu, -CH2OH . Slično, pozivanje na orto-hlorofenil ne treba tumačiti kao upućivanje na njegov strukturni izomer, meta-hlorofenil. Međutim, pozivanje na klasu struktura može uključivati strukturno izomerne oblike koji spadaju u tu klasu (npr. C1-7alkil uključuje n-propil i izo-propil; butil uključuje n-, izo-, sek- i terc-butil; metoksifenil uključuje orto-, meta- i para-metoksifenil).
[0189] Gore navedeno isključenje ne odnosi se na tautomerne oblike, na primer, keto-, enol- i enolatne oblike, kao što su, na primer, u narednim tautomernim parovima: keto/enol (ilustrovano u nastavku), imin/enamin, amid/imino alkohol, amidin/amidin, nitrozo/oksim, tioketon/enetiol, N-nitrozo/hiroksiazo i nitro/aci-nitro.
[0190] Izraz „tautomer“ ili „tautomerni oblik“ odnosi se na strukturne izomere različitih energija koji se mogu pretvoriti jedan u drugi preko barijere niske energije. Na primer, protonski tautomeri (takođe poznati i kao prototropni tautomeri) uključuju međusobne konverzije migracijom protona, kao što su keto-enol i iminenamin izomerizacije. Valentni tautomeri uključuju interkonverzije reorganizacijom nekih od vezujućih elektrona.
[0191] Treba imati na umu da su u izraz „izomer“ posebno uključena jedinjenja sa jednom ili više izotopskih supstitucija. Na primer, H može biti u bilo kom izotopskom obliku, uključujući<1>H,<2>H (D), i<3>H (T); C može biti u bilo kom izotopskom obliku, uključujući<12>C,<13>C, i<14>C; O može biti u bilo kom izotopskom obliku, uključujući<16>O i<18>O; i slično.
[0192] Primeri izotopa koji se mogu ugraditi u jedinjenja predmetnog obelodanjenja uključuju izotope vodonika, ugljenika, azota, kiseonika, fosfora, fluora i hlora, kao što su, ali bez ograničavanja na<2>H (deuterijum, D),<3>H (tricijum),<11>C,<13>C,<14>C,<15>N,<18>F,<31>P,<32>P,<35>S,<36>Cl, i<125>I. Različita izotopski obeležena jedinjenja predmetnog obelodanjenja, na primer ona u koja su ugrađeni radioaktivni izotopi, kao što su 3H, 13C i 14C. Takva izotopski obeležena jedinjenja mogu biti korisna u metaboličkim studijama, studijama kinetičke reakcije, tehnikama detektovanja ili snimanja, kao što je pozitronska emisiona tomografija (PET) ili izračunata tomografija emisije sa jednim fotonom (SPECT), uključujući analize lekova ili raspodele tkiva, ili u radioaktivnom tretmanu pacijenata. Deuterijumom obeležena ili supstituisana terapeutska jedinjenja predmetnog obelodanjenja mogu imati poboljšana DMPK (metabolizam leka i farmakokinetika) svojstva, koja se odnose na distribuciju, metabolizam i izlučivanje (ADME). Supstitucija sa težim izotopima, kao što je deuterijum, može doneti određene terapeutske prednosti proizašle iz veće metaboličke stabilnosti, na primer povećanog in vivo polu-života ili smanjene potrebe za doziranjem. Jedinjenje označeno sa 18F može biti korisno za PET ili SPECT studije. Izotopski obeležena jedinjenja predmetnog obelodanjenja i njihovi prolekovi se generalno mogu pripremiti sprovođenjem postupaka obelodanjenih u šemama ili u primerima i preparatima opisanim u nastavku supstitucijom neizotopski obeleženog reagensa lako dostupnim izotopski obeleženim reagensom. Dalje, supstitucija sa težim izotopima, posebno deuterijumom (tj. 2H ili D) može dati određene terapeutske prednosti proizašle iz veće metaboličke stabilnosti, na primer povećano vreme polu-života in vivo ili smanjeni zahtevi za doziranje ili poboljšanje terapijskog indeksa. Podrazumeva se da se deuterijum u ovom kontekstu smatra supstituentom. Koncentracija takvog težeg izotopa, posebno deuterijuma, može se definisati faktorom obogaćivanja izotopa. U jedinjenjima predmetnog obelodanjenja svaki atom koji nije posebno označen kao određen izotop ima za cilj da predstavlja bilo koji stabilan izotop tog atoma.
[0193] Osim ako nije drugačije naznačeno, pozivanje na određeno jedinjenje uključuje sve takve izomerne oblike, uključujući (potpuno ili delimično) racemične i druge njihove smeše. Postupci za pripremu (npr. Asimetrična sinteza) i odvajanje (npr. frakciona kristalizacija i hromatografski načini) takvih izomernih oblika su ili poznati u struci ili se lako dobijaju prilagođavanjem ovde navedenih postupaka, ili poznatih postupaka, na poznati način.
Biološka aktivnost
In vitro testovi proliferacije ćelija
[0194] Generalno, citotoksična ili citostatička aktivnost antitelo-lek konjugata (ADC) meri se: izlaganjem ćelija sisara koje imaju receptorske proteine antitelu ADC u medijumu ćelijske kulture; kultivisanje ćelija u periodu od oko 6 sati do oko 5 dana; i merenje održivosti ćelija. In vitro testovi na bazi ćelija se koriste za merenje održivosti (proliferacije), citotoksičnosti i indukcije apoptoze (aktivacija kaspaze) ADC iz obelodanjenja.
[0195] In vitro potencija antitelo-lek konjugata može se meriti testom proliferacije ćelija. CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay je komercijalno dostupan (Promega Corp., Madison, WI), homogen postupak ispitivanja zasnovan na rekombinantnom eksprimiranju Coleoptera luciferaze (SAD patenti br.
5583024; 5674713 i 5700670). Ovaj test ćelijske proliferacije određuje broj održivih ćelija u kulturi na osnovu kvantifikacije prisutnog ATP, pokazatelja metabolički aktivnih ćelija (Crouch i dr (1993) J. Immunol. Meth. 160:81-88; US 6602677). CellTiter-Glo® test se sprovodi u formatu sa 96 komorica, što ga čini podložnim automatizovanom skriningu velike propusnosti (HTS) (Cree i dr (1995) AntiCancer Drugs 6:398-404). Postupak homogenog testa uključuje dodavanje jednog reagensa (CellTiter-Glo® reagens) direktno u ćelije kultivisane u medijumu dopunjenom serumom. Pranje ćelija, uklanjanje medijuma i više koraka pipetiranja nisu potrebni. Sistem detektuje samo 15 ćelija/komorica u formatu od 384 komorice tokom10 minuta nakon dodavanja reagensa i mešanja. Ćelije se mogu kontinuirano tretirati sa ADC, ili se mogu tretirati i odvojiti od ADC. Generalno, ćelije tretirane kratko, tj. 3 sata, pokazale su iste efekte potencije kao i ćelije koje se kontinuirano tretiraju.
[0196] Homogeni format „dodaj-pomešaj-meri“ rezultuje lizom ćelija i generisanjem luminiscentnog signala proporcionalnog količini prisutnog ATP. Količina ATP je direktno proporcionalna broju ćelija prisutnih u kulturi. CellTiter-Glo® test generiše luminiscentni signal „sjajnog tipa“, proizveden reakcijom luciferaze, koji ima polu-život uglavnom veći od pet sati, u zavisnosti od vrste ćelije i korišćenog medijuma. Održive ćelije se reflektuju u jedinicama relativne luminiscencije (RLU). Supstrat, Beetle Luciferin, oksidativno je dekarboksiliran rekombinantnom luciferazom svica uz istovremenu konverziju ATP u AMP i stvaranje fotona.
[0197] In vitro jačina antitelo-lek konjugata takođe se može meriti testom citotoksičnosti. Kultivisane adhezivne ćelije se ispiraju sa PBS, odvajaju od tripsina, razblažuju u potpunom medijumu, koji sadrži 10% FCS, centrifugiraju, ponovo suspenduju u svežem medijumu i prebroje sa hemocitometrom. Suspenzione kulture se direktno broje. Monodisperzne ćelijske suspenzije pogodne za prebrojavanje mogu zahtevati mešanje suspenzije ponovljenom aspiracijom radi razbijanja grudvi ćelija.
[0198] Ćelijska suspenzija se razblažuje do željene gustine sejanja i raspršuje (100 µl po komorici) u crne ploče sa 96 komorica. Ploče adhezivnih ćelijskih linija inkubiraju se preko noći kako bi se omogućilo pridržavanje. Suspenzione ćelijske kulture mogu se koristiti na dan sejanja.
[0199] Osnovni rastvor (1ml) ADC (20µglml) se pravi u odgovarajućem medijumu za ćelijsku kulturu. Serijska 10-ostruka razblaženja osnovnog ADC se prave u epruvetama za centrifugiranje od 15 ml serijskim prenosom 100 µl do 900 µl medijuma ćelijske kulture.
[0200] Četiri ponovljene komorice svakog razblaženja ADC (100 µl) se sipaju u crne ploče sa 96 komorica, prethodno prekrivene ćelijskom suspenzijom (100 µl), što rezultuje konačnom zapreminom od 200 µl. Kontrolne komorice primaju medijum ćelijske kulture (100 µl).
[0201] Ako je vreme udvostručavanja ćelijske linije veće od 30 sati, ADC inkubacija je 5 dana, u suprotnom se vrši četvorodnevna inkubacija.
2
[0202] Na kraju perioda inkubacije, vitalnost ćelija se procenjuje Alamar blue testom. AlamarBlue (Invitrogen) se raspršuje po celoj ploči (20 µl po komorica) i inkubira 4 sata. Alamar blue fluorescencija se meri pri ekscitaciji 570nm, emisiji 585nm na Varioskan čitaču fleš ploča. Procenat preživljavanja ćelija izračunat je iz srednje fluorescencije u komoricama tretiranim sa ADC u poređenju sa srednjom fluorescencijom u kontrolnim komoricama.
Upotreba
[0203] Konjugati predmetnog obelodanjenja mogu se koristiti za dobijanje PBD jedinjenja na ciljnoj lokaciji.
[0204] Ciljna lokacija je poželjno populacija proliferativnih ćelija. Antitelo je antitelo za antigen prisutan u populaciji proliferativnih ćelija.
[0205] U jednom otelotvorenju, antigen je odsutan ili prisutan na smanjenom nivou u populaciji neproliferativnih ćelija u poređenju sa količinom antigena prisutnom u populaciji proliferativnih ćelija, na primer populacijom tumorskih ćelija.
[0206] Na ciljnom mestu, veznik se može razdvojiti tako da se oslobodi jedinjenje RelA. Prema tome, konjugat se može koristiti za selektivno pružanje jedinjenja RelA na ciljanu lokaciju.
[0207] Veznik se može razdvojiti pomoću enzima prisutnog na ciljnoj lokaciji.
[0208] Ciljna lokacija može biti in vitro, in vivo ili ex vivo.
[0209] Antitelo-lek konjugat (ADC) jedinjenja predmetnog obelodanjenja obuhvataju ona koja su korisna za aktivnost protiv raka. Konkretno, jedinjenja uključuju antitelo konjugovano, tj. kovalentno vezano veznikom, na PBD deo leka, tj. toksin. Kada lek nije konjugovan sa antitelom, PBD lek ima citotoksični efekat. Biološka aktivnost PBD dela leka je tako modulirana konjugacijom sa antitelom. Antitelo-lek konjugati (ADC) predmetnog obelodanjenja selektivno isporučuju efikasnu dozu citotoksičnog agensa u tumorsko tkivo gde se može postići veća selektivnost, tj. niža efikasna doza.
[0210] Tako, u jednom aspektu, predmetno obelodanjenje pruža konjugovano jedinjenje kao što je ovde opisano za upotrebu u terapiji.
[0211] U daljem aspektu, takođe se pruža konjugovano jedinjenje kao što je ovde opisano za upotrebu u tretmanu proliferativne bolesti. Drugi aspekt predmetnog obelodanjenja pruža upotrebu konjugovanog jedinjenja u proizvodnji leka za tretman proliferativne bolesti.
[0212] Stručnjak je u stanju lako da utvrdi da li konjugat kandidat tretira proliferativno stanje za bilo koji određeni tip ćelije ili ne. Na primer, testovi koji se mogu pogodno koristiti za procenu aktivnosti koju nudi određeno jedinjenje opisani su u primerima u nastavku.
[0213] Izraz „proliferativna bolest“ odnosi se na neželjenu ili nekontrolisanu ćelijsku proliferaciju prekomernih ili abnormalnih ćelija koja je nepoželjna, kao što je neoplastični ili hiperplastični rast, bilo in vitro ili in vivo.
Anti-DLK-1 konjugati
[0214] Primeri proliferativnih stanja uključuju, ali nisu ograničeni na, benignu, pre-malignu i malignu ćelijsku proliferaciju, uključujući, ali bez ograničenja, neoplazme i tumore (npr. histocitom, gliom, astrociom, osteom), rak (npr. rak pluća, rak malih ćelija pluća, rak gastrointestinalnog trakta, rak creva, rak debelog creva, rak dojke, rak jajnika, rak prostate, rak testisa, rak jetre, rak bubrega, rak bešike, rak pankreasa, rak mozga, sarkom, osteosarkom, Kaposijev sarkom, melanom), limfomi, leukemije, psorijaza, bolesti kostiju, fibroproliferativni poremećaji (npr. vezivnog tkiva) i ateroskleroza. Rakovi od posebnog interesa uključuju, ali nisu ograničeni na, leukemije i rak jajnika.
[0215] Bilo koja vrsta ćelija se može tretirati, uključujući, ali bez ograničenja, pluća, gastrointestinalne (uključujući, npr. crevo, debelo crevo), dojke , jajnika, prostate, jetre, bubrega, bešike, pankreasa, mozga, i kože.
[0216] Poremećaji od posebnog interesa uključuju, ali nisu ograničeni na rak, uključujući metastatski rak i metastatske ćelije raka, kao što su tumorske ćelije u cirkulaciji, koje se mogu naći u cirkulaciji u telesnim tečnostima kao što su krv ili limfa. Rakovi od posebnog interesa uključuju: hepatocelularni rak, hepatoblastom, rak ne-malih ćelija pluća, rak malih ćelija pluća, rak debelog creva, rak dojke, rak želuca, rak pankreasa, neuroblastom, rak nadbubrežne žlezde, feohromocitom, paragangliom, medularni rak štitne žlezde, rak skeletnog mišića, liposarkom, gliom, Vilmsov tumor, neuroendokrine tumore, akutnu mijeloidnu
2
leukemiju i mijelodisplastični sindrom.
[0217] Drugi poremećaji od interesa uključuju bilo koje stanje u kom je DLK1 prekomerno eksprimiran ili u kom će antagonizam DLK1 pružiti kliničku korist. To uključuje imunološke poremećaje, kardiovaskularne poremećaje, trombozu, dijabetes, poremećaje imunoloških kontrolnih tačaka, fibrotične poremećaje (fibrozu) ili proliferativne bolesti kao što je rak, naročito metastatski rak.
Anti-KAAG1 konjugati
[0218] Primeri proliferativnih stanja uključuju, ali nisu ograničeni na, benignu, pre-malignu i malignu ćelijsku proliferaciju, uključujući, ali bez ograničenja, neoplazme i tumore (npr. histocitom, gliom, astrociom, osteom), rak (npr. rak pluća, rak malih ćelija pluća, rak gastrointestinalnog trakta, rak creva, rak debelog creva, rak dojke, rak jajnika, rak prostate, rak testisa, rak jetre, rak bubrega, rak bešike, rak pankreasa, rak mozga, sarkom, osteosarkom, Kaposijev sarkom, melanom), limfome, leukemije, psorijazu, bolesti kostiju, fibroproliferativne poremećaje (npr. vezivnog tkiva) i aterosklerozu.
[0219] Bilo koja vrsta ćelija se može tretirati, uključujući, ali bez ograničenja, pluća, gastrointestinalne (uključujući, npr. crevo, debelo crevo), dojke, jajnika, prostate, jetre, bubrega, bešike, pankreasa, mozga, i kože.
[0220] Poremećaji od posebnog interesa uključuju, ali nisu ograničeni na rak, uključujući metastatski rak i metastatske ćelije raka, kao što su tumorske ćelije u cirkulaciji, koje se mogu naći u cirkulaciji u telesnim tečnostima kao što su krv ili limfa. Rakovi od posebnog interesa uključuju rak jajnika, dojke, prostate i bubrega.
[0221] Drugi poremećaji od interesa uključuju bilo koje stanje u kom je KAAG1 prekomerno eksprimiran ili u kom će antagonizam KAAG1 pružiti kliničku korist. To uključuje imunološke poremećaje, kardiovaskularne poremećaje, trombozu, dijabetes, poremećaje imunoloških kontrolnih tačaka, fibrotične poremećaje (fibrozu) ili proliferativne bolesti kao što je rak, naročito metastatski rak.
Anti-mezotelin konjugati
[0222] Primeri proliferativnih stanja uključuju, ali nisu ograničeni na, benignu, pre-malignu i malignu ćelijsku proliferaciju, uključujući, ali bez ograničenja, neoplazme i tumore (npr. histocitom, gliom, astrociom, osteom), rak (npr. rak pluća, rak malih ćelija pluća, rak gastrointestinalnog trakta, rak creva, rak debelog creva, rak dojke, rak jajnika, rak prostate, rak testisa, rak jetre, rak bubrega, rak bešike, rak pankreasa, rak mozga, sarkom, osteosarkom, Kaposijev sarkom, melanom), limfome, leukemije, psorijazu, bolesti kostiju, fibroproliferativne poremećaje (npr. vezivnog tkiva) i aterosklerozu.
[0223] Bilo koja vrsta ćelija se može tretirati, uključujući, ali bez ograničenja, pluća, gastrointestinalne (uključujući, npr. crevo, debelo crevo), dojke, jajnika, prostate, jetre, bubrega, bešike, pankreasa, mozga, i kože.
[0224] Poremećaji od posebnog interesa uključuju, ali nisu ograničeni na rak, uključujući metastatski rak i metastatske ćelije raka, kao što su tumorske ćelije u cirkulaciji, koje se mogu naći u cirkulaciji u telesnim tečnostima kao što su krv ili limfa. Rakovi od posebnog interesa uključuju Mezoteliom, rak pluća, rak jajnika i rak pankreasa.
[0225] Drugi poremećaji od interesa uključuju bilo koje stanje u kom je Mezotelin prekomerno eksprimiran, ili u kom će Mezotelinski antagonizam pružiti kliničku korist. To uključuje imunološke poremećaje, kardiovaskularne poremećaje, trombozu, dijabetes, poremećaje imunoloških kontrolnih tačaka, fibrotične poremećaje (fibrozu) ili proliferativne bolesti kao što je rak, naročito metastatski rak.
[0226] Predviđeno je da se antitelo-lek konjugati (ADC) prema predmetnom obelodanjenju mogu koristiti za tretman različitih bolesti ili poremećaja, npr. koje karakteriše prekomerno eksprimiranje tumorskog antigena. Primer stanja ili hiperproliferativnog poremećaja uključuje benigne ili maligne tumore; leukemije, hematološke i limfoidne malignosti. Drugi uključuju neuronske, glijalne, astrocitalne, hipotalamusne, žlezdane, makrofagalne, epitelne, stromalne, blastokoelne, inflamatorne, angiogene i imunološke poremećaje, uključujući autoimune.
[0227] Generalno, bolest ili poremećaj koji se tretira je hiperproliferativna bolest kao što je rak. Primeri raka koji se ovde tretiraju uključuju, ali nisu ograničeni na, rak, limfom, blastom, sarkom i leukemiju ili limfoidne malignosti. Konkretniji primeri takvih rakova uključuju rak pločastih ćelija (npr. epitelni pločasti rak), rak pluća, uključujući rak malih ćelija pluća, rak ne-malih ćelija pluća, adenokarcinom pluća i skvamozni rak
2
pluća, rak peritoneuma, hepatocelularni rak, rak želuca ili stomaka uključujući rak gastrointestinalnog trakta, rak pankreasa, glioblastom, rak grlića materice, rak jajnika, rak jetre, rak bešike, hepatom, rak dojke, rak debelog creva, rak rektuma, rak debelog creva, rak endometrijuma ili materice, rak pljuvačne žlezde, rak bubrega ili bubrega, rak prostate, rak vulve, rak štitne žlezde, rak jetre, rak anusa, rak penisa, kao i rak glave i vrata.
[0228] Autoimune bolesti za koje se ADC jedinjenja mogu koristiti u tretmanu uključuju reumatološke poremećaje (kao što su, na primer, reumatoidni artritis, Sjogrenov sindrom, skleroderma, lupus kao što je SLE i lupusni nefritis, polimiozitis/dermatomiozitis, krioglobulinemija, sindrom antifosfolipidnih antitela, i psorijatični artritis), osteoartritis, autoimuni gastrointestinalni i jetreni poremećaji (kao što su, na primer, upalne bolesti creva (npr. ulcerozni kolitis i Kronova bolest), autoimuni gastritis i perniciozna anemija, autoimuni hepatitis, primarna bilijarna ciroza, primarni sklerozni holangitis i celijakija), vaskulitis (kao što je, na primer, vaskulitis povezan sa ANCA, uključujući Churg-Strauss vaskulitis, Vegenerovu granulomatoza i poliarteriitis), autoimuni neurološki poremećaji (kao što je, na primer, multipla skleroza, opsoklonusni mioklonusni sindrom, mijastenija gravis, neuromijelitis optica, Parkinsonova bolest, Alchajmerova bolest i autoimune polineuropatije), bubrežni poremećaji (kao što su, na primer, glomerulonefritis, Gudpastureov sindrom i Bergerova bolest), autoimuni dermatološki poremećaji (kao što su, na primer, psorijaza, urtikarija, košnica, pemfigus vulgaris, bulozni pemfigoid i kožni lupus eritematozus), hematološki poremećaji (kao što su, na primer, trombocitopenična purpura, trombotična trombocitopenična purpura, post-transfuzijska purpura i autoimuna hemolitička anemija), ateroskleroza, uveitis, autoimune bolesti sluha (kao što su, na primer, bolesti unutrašnjeg uha i gubitak sluha), Behčetova bolest bolest, Rejnoov sindrom, transplantacija organa i autoimuni endokrini poremećaji (kao što su, na primer, autoimune bolesti povezane sa dijabetesom, kao što je dijabetes melitus zavisan od insulina (IDDM), Adisonova bolest i autoimune bolesti štitne žlezde (npr. Gravesova bolest i tiroiditis). Poželjnije takve bolesti uključuju, na primer, reumatoidni artritis, ulcerozni kolitis, vaskulitis povezan sa ANCA, lupus, multiplu sklerozu, Sjogrenov sindrom, Gravesovu bolest, IDDM, pernicioznu anemiju, tiroiditis i glomerulonefritis.
Postupci tretmana
[0229] Konjugati prema predmetnom obelodanjenju mogu se koristiti u postupku terapije. Takođe je pružen postupak tretmana, koji obuhvata primenu pacijentu koji ima potrebu za tretmanom terapeutski efikasne količine konjugovanog jedinjenja predmetnog obelodanjenja. Izraz „terapeutski efikasna količina“ je količina dovoljna da pokaže korist za pacijenta. Takva korist može biti barem ublažavanje barem jednog simptoma. Stvarna primenjena količina, brzina i tok primene zavisiće od prirode i težine onoga što se tretira. Propisivanje tretmana, npr. odluke o doziranju su u nadležnosti lekara opšte prakse i drugih lekara.
[0230] Jedinjenje predmetnog obelodanjenja može se primenjivati samo ili u kombinaciji sa drugim tretmanima, bilo simultano ili sekvencijalno zavisno od stanja koje se tretira. Primeri tretmana i terapija uključuju, ali nisu ograničeni na, hemoterapiju (primenu aktivnih agenasa, uključujući, na primer, lekove, kao što su hemoterapeutici); operaciju; i zračenje.
[0231] „Hemoterapijski agens“ je hemijsko jedinjenje korisno u tretmanu raka, bez obzira na mehanizam delovanja. Klase hemoterapijskih agenasa uključuju, ali nisu ograničene na: agense za alkilovanje, antimetabolite, alkaloide biljaka otrovnih vretena, citotoksične/anti-tumorske antibiotike, inhibitore topoizomeraze, antitela, fotosenzibilizatore i inhibitore kinaze. Hemoterapijski agensi uključuju jedinjenja koja se koriste u „ciljanoj terapiji“ i konvencionalnoj hemoterapiji.
[0232] Primeri hemoterapijskih agenasa uključuju: erlotinib (TARCEVA®, Genentech/OSI Pharm.), docetaksel (TAXOTERE®, Sanofi-Aventis), 5-FU (fluorouracil, 5-fluorouracil, CAS br. 51-21-8), gemcitabin (GEMZAR®, Lilly), PD-0325901 (CAS br. 391210-10-9, Pfizer), cisplatin (cis-diamin, dihloroplatin (II), CAS br. 15663-27-1), karboplatin (CAS br. 41575-94-4), paklitaksel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), trastuzumab (HERCEPTIN®, Genentech), temozolomid (4-metil-5-okso-2,3,4,6,8-pentazabiciklo [4,3,0] nona-2,7,9-trien-9-karboksamid, CAS br.85622-93-1, TEMODAR®, TEMODAL®, Schering Plough), tamoksifen ((Z)-2-[4-(1,2-difenilbut-1-enil)fenoksi]-N,N-dimetiletanamin, NOLVADEX®, ISTUBAL®, VALODEX®) i doksorubicin (ADRIAMICIN®), Akti-1/2, HPPD i rapamicin.
Još primera hemoterapijskih agenasa uključuju: oksaliplatin (ELOXATIN®, Sanofi), bortezomib (VELCADE®, Millennium Pharm.), sutent (SUNITINIB®, SU11248, Pfizer), letrozol (FEMARA®, Novartis), imatinib mesilat, GLEEVEC®, Novartis), XL-518 (Mek inhibitor, Exelixis, WO 2007/044515), ARRI-886 (Mek inhibitor, AZD6244, Array BioPharma, Astra Zeneca), SF-1126 (PI3K inhibitor, Semafore
2
Pharmaceuticals), BEZ-235 (PI3K inhibitor, Novartis), XL-147 (PI3K inhibitor, Exelixis), PTK787/ZK 222584 (Novartis), fulvestrant (FASLODEX®, AstraZeneca), leukovorin (folna kiselina), rapamicin (sirolimus, RAPAMUNE®, Wyeth), lapatinib (TYKERB®, GSK572016, Glaxo Smith Kline), lonafarnib (SARA63), SARA63, Schering Plough), sorafenib (NEXAVAR®, BAI43-9006, Bayer Labs), gefitinib (IRESSA®, AstraZeneca), irinotekan (CAMPTOSAR®, CPT-11, Pfizer), tipifarnib (ZARNESTRA™, Johnson & Johnson), ABRAXANE™ (bez kremofora), formulacije nanočestica paklitaksela napravljene od albumina (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, II), vandetanib (rINN, ZD6474, ZACTIMA®, AstraZeneca), hloranmbucil, AG1478, AG1571 (SU 5271; Sugen), temsirolimus (T ®, Wyeth), pazopanib (GlaxoSmithKline), kanfosfamid (TELCYTA®, Telik), tiotepa i ciklosfosfamid (CITOXAN®, NEOSAR®); alkil sulfonate kao što su busulfan, improsulfan i piposulfan; aziridine kao što su benzodopa, karbokon, meturedopa i uredopa; etilenimine i metilamelamine uključujući altretamin, trietilenmelamin, trietilenfosforamid, trietilentiofosforamid i trimetilomelamin; acetogenine (naročito bulatacin i bulatacinon); kamptotecin (uključujući sintetički analogni topotekan); briostatin; calistatin; CC-1065 (uključujući sintetičke analoge adozelesina, karzelesina i bizelesina); kriptoficine (naročito kriptoficin 1 i kriptoficin 8); dolastatin; duokarmicin (uključujući sintetičke analoge, KW-2189 i CB1-TM1); eleuterobin; pankratistatin; sarcodictiin; spongistatin; azotne iperite kao što su hlorambucil, hlornafazin, hlorofosfamid, estramustin, ifosfamid, mehloretamin, mehloretamin oksid hidrohlorid, melfalan, novembihin, fenesterin, prednimustin, trofosfamid, uracil iperit; nitrozore, kao što su karmustin, hlorozotocin, fotemustin, lomustin, nimustin i ranimnustin; antibiotike kao što su enedinski antibiotici (npr. kaliheamicin, kaliheamicin gama 1l, kaliheamicin omegal1 (Angew Chem. Intl. Ed. Engl. (1994) 33:183-186); dinemicin, dinemicin A; bisfosfonati, kao što je klodronat; esperamicin; kao i neokarzinostatin hromofor i srodni hromoprotein enedinski antibiotski hromofori), aklacinomisini, aktinomicin, autramicin, azaserin, bleomicini, kaktinomicin, karabicin, karminomicin, karzinofilin, hromomicini, daktinomicin, daunorubicin, detorubicin, 6-dijazi-5-okso-L-norleucin, morfolino-doksorubicin, cijanomorfolino-doksorubicin, 2-pirolino-doksorubicin i deoksidoksorubicin), epirubicin, esorubicin, idarubicin, nemorubicin, marcelomicin, mitomicini kao što su mitomocin C, mikofenolna kiselina, nogalmicin, olivomicini, peplomicin, porfiromicin, puromicin, kelamicin, rodorubicin, streptonigrin, streptozocin, tubercidin, ubenimeks, zinostatin, zorubicin; antimetaboliti kao što su metotreksat i 5-fluorouracil (5-FU); analozi folne kiseline kao što su denopterin, metotreksat, pteropterin, trimetreksat; analozi purina kao što su fludarabin, 6-merkaptopurin, tiamiprin, tioguanin; analozi pirimidina kao što su ancitabin, azacitidin, 6-azauridin, karmofur, citarabin, dideoksiuridin, doksifluridin, enocitabin, floksuridin; androgeni kao što su kalusteron, dromostanolon propionat, epitiostanol, mepitiostan, testolakton; anti-adrenali kao što su aminoglutetimid, mitotan, trilostan; dopunjivač folne kiseline, kao što je frolinska kiselina; aceglaton; aldofosfamid glikozid; aminolevulinska kiselina; eniluracil; amsakrin; bestrabucil; bisantren; edatraksat; defofamin; demekolcin; diazikuon; elfornitin; eliptinijum acetat; epotilon; etoglucid; galijum nitrat; hidroksiurea; lentinan; lonidainin; majtanzinoidi kao što su majtansin i ansamitocini; mitoguazon; mitoksantron; mopidanmol; nitraerin; pentostatin; fenamet; pirarubicin; losoksantron; podofilinska kiselina; 2-etilhidrazid; prokarbazin; PSK® kompleks polisaharida (JHS Natural Products, Eugene, OR); razoksan; rizoksin; sizofiran; spirogermanijum; tenuazonska kiselina; triazikvon; 2,2',2"-trihlorotrietilamin; trihoteceni (posebno T-2 toksin, verracurin A, roridin A i anguidin); uretan; vindesin; dakarbazin; manomustin; mitobronitol; mitolaktol; pipobroman; gacitozin; arabinozid („Ara-C“); ciklofosfamid; tiotepa; 6-tioguanin; merkaptopurin; metotreksat; analozi platine kao što su cisplatin i karboplatin; vinblastin; etopozid (VP-16); ifosfamid; mitoksantron; vinkristin; vinorelbin (NAVELBINE®); novantron; tenipozid; edatrekast; danomicin; aminopterin; kapecitabin (XELODA®, Roche); ibandronat; CPT-11; inhibitor topoizomeraze RFS 2000; difluorometilornitin (DMFO); retinoidi kao što je retinoinska kiselina; i farmaceutski prihvatljive soli, kiseline i derivati bilo čega od gore navedenog.
[0233] U definiciju „hemoterapijskog agensa“ takođe su uključeni: (i) anti-hormonski agensi koji deluju na regulisanje ili inhibiranje delovanja hormona na tumore kao što su anti-estrogeni i selektivni modulatori receptora estrogena (SERM), uključujući, na primer, tamoksifen (uključujući NOLVADEX®; tamoksifen citrat), raloksifen, droloksifen, 4-hidroksitamoksifen, trioksifen, keoksifen, LY117018, onapriston i FARESTON® (toremifin citrat); (ii) inhibitori aromataze koji inhibiraju enzim aromatazu, koji regulišu proizvodnju estrogena u nadbubrežnim žlezdama, kao što su, na primer, 4(5)-imidazoli, aminoglutetimid, MEGASE® (megestrol acetat), AROMASIN® (egzemestan; Pfizer), formestani, fadrozol, RIVISOR® (vorozol), FEMARA® (letrozol; Novartis) i ARIMIDEX® (anastrozol; AstraZeneca); (iii) anti-androgeni kao što su flutamid, nilutamid, bikalutamid, leuprolid i goserelin; kao i troksacitabin (1,3-dioksolana analog nukleozidnog citozina); (iv) inhibitori protein kinaze, kao što su MEK inhibitori (WO 2007/044515); (v) inhibitori lipid kinaze; (vi) antisens oligonukleotidi, posebno oni koji inhibiraju eksprimiranje gena na
2
signalnim putevima uključenim u aberantnu ćelijsku proliferaciju, na primer, PKC-alfa, Raf i H-Ras, kao što je oblimersen (GENASENSE®, Genta Inc.); (vii) ribozimi kao što su inhibitori eksprimiranja VEGF (npr. ANGIOZYME®) i inhibitori eksprimiranja HER2; (viii) vakcine kao što su vakcine za gensku terapiju, na primer, ALLOVECTIN®, LEUVECTIN® i VAXID®; PROLEUKIN® rIL-2; inhibitori topoizomeraze 1 kao što su LURTOTECAN®; ABARELIX® rmRH; (ix) anti-angiogeni agensi kao što je bevacizumab (AVASTIN®, Genentech); i farmaceutski prihvatljive soli, kiseline i derivati bilo čega od gore navedenog. U definiciju „hemoterapijski agens“ takođe su uključena terapijska antitela kao što su alemtuzumab (Campath), bevacizumab (AVASTIN®, Genentech); cetuksimab (ERBITUX®, Imclone); panitumumab (VECTIBIX®, Amgen), rituksimab (RITUXAN®, Genentech/Biogen Idec), ofatumumab (ARZERRA®, GSK), pertuzumab (PERJETA™, OMNITARG™, 2C4, Genentech), trastuzumab (HERCEPT®, Genentech), tositumomab (Bexxar, Corixia), i antitelo lek konjugat, gemtuzumab ozogamicin (MYLOTARG®, Wyeth).
[0234] Humanizovana monoklonska antitela sa terapeutskim potencijalom u kombinaciji sa konjugatima predmetnog obelodanjenja uključuju: alemtuzumab, apolizumab, aselizumab, atlizumab, bapineuzumab, bevacizumab, bivatuzumab mertansin, kantuzumab mertansin, cedelizumab, certolizumab pegol, cidfusituzumab, cidtuzumab, daclizumab, eculizumab, efalizumab, epratuzumab, erlizumab, felvizumab, fontolizumab, gemtuzumab ozogamicin, inotuzumab ozogamicin, ipilimumab, labetuzumab, lintuzumab, matuzumab, mepolizumab, motavizumab, motovizumab, natalizumab, nimotuzumab, nolovizumab, numavizumab, ocrelizumab, omalizumab, palivizumab, paskolizumab, pekfusituzumab, pektuzumab, pertuzumab, pekselizumab, ralivizumab, ranibizumab, reslivizumab, reslizumab, resivizumab, rovelizumab, ruplizumab, sibrotuzumab, siplizumab, sontuzumab, takatuzumab tetraksetan, tadocizumab, talizumab, tefibazumab, tocilizumab, toralizumab, trastuzumab, tucotuzumab celmoleukin, tucusituzumab, umavizumab, urtoksazumab, i visilizumab.
[0235] Farmaceutski sastavi prema predmetnom obelodanjenju i za upotrebu u skladu sa predmetnim obelodanjenjem mogu da sadrže, pored aktivnog sastojka, odnosno konjugovanog jedinjenja, farmaceutski prihvatljiv ekscipijens, nosač, pufer, stabilizator ili druge materijale dobro poznate stručnjacima. Takvi materijali treba da budu netoksični i ne smeju ometati efikasnost aktivnog sastojka. Precizna priroda nosača ili drugog materijala zavisiće od načina primene, koji može biti oralni ili injekcijom, npr. kožnom, potkožnom ili intravenoznom.
[0236] Farmaceutski sastavi za oralnu primenu mogu biti u obliku tableta, kapsula, praha ili tečnosti. Tableta može sadržati čvrsti nosač ili adjuvans. Tečni farmaceutski sastavi generalno sadrže tečni nosač kao što su voda, nafta, životinjska ili biljna ulja, mineralna ulja ili sintetička ulja. Mogu se uključiti fiziološki rastvor soli, dekstroza ili drugi rastvor saharida ili glikoli kao što su etilen glikol, propilen glikol ili polietilen glikol. Kapsula može sadržati čvrsti nosač kao što je želatin.
[0237] Za intravenoznu, kožnu ili potkožnu injekciju ili injekciju na mestu oboljenja, aktivni sastojak će biti u obliku parenteralno prihvatljivog vodenog rastvora koji je bez pirogena i ima odgovarajući pH, izotoničnost i stabilnost. Stručnjaci su u stanju da pripreme odgovarajuće rastvore koristeći, na primer, izotonične agense kao što je injekcija natrijum hlorida, Ringerova injekcija, laktatirana Ringerova injekcija. Po potrebi se mogu uključiti konzervansi, stabilizatori, puferi, antioksidansi i/ili drugi aditivi.
Formulacije
[0238] Iako je moguće da se konjugovano jedinjenje koristi (npr. primenjuje) samo, često je poželjno da se ono predstavi kao sastav ili formulacija.
[0239] U jednom aspektu, sastav je farmaceutska sastav (npr. formulacija, preparat, lek) koji sadrži konjugovano jedinjenje, kao što je ovde opisano, i farmaceutski prihvatljiv nosač, razblaživač ili ekscipijens.
[0240] U jednom aspektu, sastav je farmaceutski sastav koji sadrži najmanje jedno jedinjenje konjugata, kako je ovde opisano, zajedno sa jednim ili više drugih farmaceutski prihvatljivih sastojaka dobro poznatih stručnjacima, uključujući, ali bez ograničenja na, farmaceutski prihvatljive nosače, razređivače, ekscipijense, adjuvanse, punila, pufere, konzervanse, antioksidanse, lubrikante, stabilizatore, rastvarače, surfaktante (npr. agensi za vlaženje), agense za maskiranje, agense za bojenje, arome i zaslađivače.
[0241] U jednom aspektu, sastav dalje sadrži druge aktivne agense, na primer, druge terapeutske ili profilaktičke agense.
[0242] Pogodni nosači, razblaživači, ekscipijense itd. mogu se naći u standardnim farmaceutskim tekstovima. Pogledati, na primer, Handbook of Pharmaceutical Additives, 2nd Edition (eds. M. Ash and I. Ash), 2001 (Synapse Information Resources, Inc., Endicott, New York, USA), Remington's Pharmaceutical Sciences, 20th edition, pub. Lippincott, Williams & Wilkins, 2000; i Handbook of Pharmaceutical Excipients, 2nd edition, 1994.
[0243] Drugi aspekt predmetnog obelodanjenja odnosi se na postupke za pravljenje farmaceutskog sastava koji obuhvata mešanje najmanje jednog [<11>C]-radioobeleženog konjugata ili jedinjenja sličnog konjugatu, kako je ovde definisano, zajedno sa jednim ili više drugih farmaceutski prihvatljivih sastojaka dobro poznatih stručnjacima, na primer, nosači, razblaživači, ekscipijensi itd. Ako su formulisane kao diskretne jedinice (npr., tablete itd.), svaka jedinica sadrži unapred određenu količinu (dozu) aktivnog jedinjenja.
[0244] Izraz „farmaceutski prihvatljiv“, kako se ovde koristi, odnosi se na jedinjenja, sastojke, materijale, sastave, oblike doziranja itd., koji su, u okviru zdrave medicinske procene, pogodni za upotrebu u dodiru sa tkivom pacijenta u pitanju (na primer, čovekom) bez prekomerne toksičnosti, iritacije, alergijskog odgovora ili drugog problema ili komplikacije, srazmerno razumnom odnosu koristi/rizika. Svaki nosač, razblaživač, ekscipijens itd. takođe moraju biti „prihvatljivi“ u smislu da su kompatibilni sa ostalim sastojcima formulacije.
[0245] Formulacije se mogu pripremiti bilo kojim postupcima dobro poznatim u farmaciji. Takvi postupci uključuju korak dovođenja u vezu aktivnog jedinjenja sa nosačem koji čini jedan ili više pomoćnih sastojaka. Uopšteno, formulacije se pripremaju uniformnim i bliskim povezivanjem aktivnog jedinjenja sa nosačima (npr. tečnim nosačima, fino usitnjenim čvrstim nosačem itd.), i zatim oblikovanjem proizvoda, ako je potrebno.
[0246] Formulacija se može pripremiti da pruži brzo ili sporo oslobađanje; trenutno, odloženo, vremenski ili produženo oslobađanje; ili njihovu kombinaciju.
[0247] Formulacije pogodne za parenteralnu primenu (npr. injekcijom) uključuju vodene ili nevodene, izotonične, sterilne tečnosti bez pirogena (npr. rastvori, suspenzije), u kojima je aktivni sastojak rastvoren, suspendovan ili na drugi način pružen (npr., u lipozomu ili drugoj mikročestici). Takve tečnosti mogu dodatno da sadrže druge farmaceutski prihvatljive sastojke, kao što su antioksidansi, puferi, konzervansi, stabilizatori, bakteriostati, agensi za suspendovanje, agensi za zgušnjavanje i rastvori koji čine formulaciju izotoničnom u odnosu na krv (ili drugu relevantnu telesnu tečnost) namerenog primaoca. Primeri ekscipijenasa uključuju, na primer, vodu, alkohole, poliole, glicerol, biljna ulja i slično. Primeri pogodnih izotoničnih nosača za upotrebu u takvim formulacijama uključuju injekciju natrijum hlorida, Ringerov rastvor ili laktatiranu Ringerovu injekciju. Obično je koncentracija aktivnog sastojka u tečnosti od oko 1 ng/ml do oko 10 µg/ml, na primer od oko 10 ng/ml do oko 1 µg/ml. Formulacije se mogu predstaviti u zapečaćenim kontejnerima za pojedinačne doze ili više doza, na primer, u ampulama i bočicama, i mogu se skladištiti u zamrzavanjem osušenom (liofilizovanom) stanju koje zahteva samo dodavanje sterilnog tečnog nosača, na primer vode za injekcije, neposredno pre upotrebe. Rastvori i suspenzije za istovremenu injekciju mogu se pripremiti od sterilnih prahova, granula i tableta.
Doziranje
[0248] Stručnjak će znati da odgovarajuće doze konjugovanog jedinjenja i sastavi koji sadrže konjugovano jedinjenje mogu varirati od pacijenta do pacijenta. Određivanje optimalne doze će generalno uključivati balansiranje nivoa terapijske koristi sa bilo kojim rizikom ili štetnim nuspojavama. Izabrani nivo doze zavisiće od različitih faktora uključujući, ali ne ograničavajući se na, aktivnost određenog jedinjenja, način primene, vreme primene, brzinu izlučivanja jedinjenja, trajanje tretmana, druge lekovi, jedinjenja i/ili materijale koji se koriste u kombinaciji, težinu stanja i vrstu, pol, uzrast, težinu, stanje, opšte zdravlje i prethodnu medicinsku istorija pacijenta. Količina jedinjenja i način primene će na kraju biti diskrecija lekara, veterinara ili kliničara, iako će se uglavnom doza odabrati za postizanje lokalnih koncentracija na mestu delovanja koje postižu željeni učinak bez nanošenja značajnih štetnih ili neželjenih posledica.
[0249] Primena se može vršiti u jednoj dozi, kontinuirano ili povremeno (npr. u podeljenim dozama u odgovarajućim intervalima) tokom čitavog tretmana. Postupci određivanja najefikasnijeg sredstva i doze primene dobro su poznate stručnjacima i variraće u zavisnosti od formulacije koja se koristi za terapiju, svrhe terapije, ciljanih ćelija koje se tretiraju i pacijenta koji se tretira. Pojedinačne ili višestruke primene mogu se sprovesti, i lekar, veterinar ili kliničar će izabrati nivo i obrazac doze.
[0250] Generalno, pogodna doza aktivnog jedinjenja je u rasponu od oko 100 ng do oko 25 mg (tipičnije oko 1 µg do oko 10 mg) po kilogramu telesne težine pacijenta dnevno. Tamo gde je aktivno jedinjenje so, estar,
1
amid, prolek ili slično, primenjena količina se izračunava na osnovu matičnog jedinjenja, pa se stvarna težina koja se koristi proporcionalno povećava.
[0251] U jednom otelotvorenju, aktivno jedinjenje se primenjuje ljudskom pacijentu prema narednom režimu doziranja: oko 100 mg, 3 puta dnevno.
[0252] U jednom otelotvorenju, aktivno jedinjenje se primenjuje ljudskom pacijentu prema narednom režimu doziranja: oko 150 mg, 2 puta dnevno.
[0253] U jednom otelotvorenju, aktivno jedinjenje se primenjuje ljudskom pacijentu prema narednom režimu doziranja: oko 200 mg, 2 puta dnevno.
[0254] Međutim, u jednom otelotvorenju, jedinjenje konjugata se primenjuje ljudskom pacijentu prema narednom režimu doziranja: oko 50 ili oko 75 mg, 3 ili 4 puta dnevno.
[0255] U jednom otelotvorenju, jedinjenje konjugata se primenjuje ljudskom pacijentu prema narednom režimu doziranja: oko 100 ili oko 125 mg, 2 puta dnevno.
[0256] Gore opisane količine doziranja mogu se primeniti na konjugat (uključujući PBD deo i veznik za antitelo) ili na efektivnu količinu PBD jedinjenja koje je pruženo, na primer količinu jedinjenja koja se može otpustiti nakon razdvajanja veznika.
[0257] Za prevenciju ili tretman bolesti, odgovarajuća doza ADC iz obelodanjenja zavisiće od vrste bolesti koja će se tretirati, kao što je gore definisano, težine i toka bolesti, da li se molekul primenjuje u preventivne ili terapeutske svrhe, prethodne terapije, kliničke istorije pacijenta i odgovora na antitelo, i diskrecija lekara. Molekul se na odgovarajući način primenjuje pacijentu odjednom ili tokom niza tretmana. U zavisnosti od vrste i težine bolesti, oko 1 µg/kg do 15 mg/kg (npr. 0,1-20 mg/kg) molekula je početna kandidat doza za primenu pacijentu, bilo da je u pitanju, na primer, jedna ili više odvojenih primena ili kontinuirana infuzija. Tipična dnevna doza može se kretati od oko 1 µg/kg do 100 mg/kg ili više, u zavisnosti od gore navedenih faktora. Primerna doza ADC koja se primenjuje pacijentu je u rasponu od oko 0,1 do oko 10 mg/kg težine pacijenta. Za ponovljene primene tokom nekoliko dana ili duže, u zavisnosti od stanja, tretman se nastavlja sve dok se ne pojavi željeno suzbijanje simptoma bolesti. Primer režima doziranja obuhvata kurs primene početne doze od oko 4 mg/kg, praćene dodatnim ADC dozama svake nedelje, dve nedelje ili tri nedelje. Drugi režimi doziranja mogu biti korisni. Napredak ove terapije lako se prati konvencionalnim tehnikama i testovima.
Tretman
[0258] Izraz „tretman“, kako se ovde koristi u kontekstu tretmana stanja, generalno se odnosi na tretman i terapiju, bilo da se radi o čoveku ili životinji (npr. U veterinarskoj primeni), u kojoj se postiže neki željeni terapeutski efekat, na primer, inhibicija napredovanja stanja, i uključuje smanjenje stope napredovanja, zaustavljanje brzine napredovanja, regresiju stanja, poboljšanje stanja i izlečenje stanja. Tretman kao profilaktička mera (tj. Profilaksa, prevencija) je takođe uključen.
[0259] Izraz „terapeutski efikasna količina“, kako se ovde koristi, odnosi se na tu količinu aktivnog jedinjenja ili materijala, sastavi ili doze koja sadrži aktivno jedinjenje, i koja je efikasna za postizanje nekog željenog terapijskog efekta, srazmerno razumnom odnosu koristi i rizika, kada se primenjuje u skladu sa željenim režimom tretmana.
[0260] Slično, izraz „profilaktički efikasna količina“, kako se ovde koristi, odnosi se na tu količinu aktivnog jedinjenja ili materijala, sastavi ili doze koja sadrži aktivno jedinjenje, i koji je efikasan za stvaranje nekog željenog profilaktičkog efekta, srazmerno razumnom odnosu koristi i rizika, kada se primenjuje u skladu sa željenim režimom tretmana.
Priprema konjugata leka
[0261] Antitelo lek konjugati prema predmetnom obelodanjenju mogu se pripremiti konjugovanjem narednog veznika za lek:
2
na antitelo koje sadrži azide postupcima opisanim kod, na primer, van Geel, R., i dr., Bioconjugate Chemistry, 2015, 26, 2233-2242; DOI: 10,1021/acs.bioconjchem,5b00224. Pogodni postupci uključuju, ali nisu ograničeni na, konjugaciju bez bakra, na primer, u vodenim uslovima sa opcionim ko-rastvaračem izabranim od DMF, DMSO i DMA.
[0262] Veznik leka može da se sintetiše u skladu sa primerima, uz odgovarajuće modifikacije, na primer, pozivajući se na WO 2016/053107 za sintezu veznika i narednih dokumenata za PBD dimer, na primer: WO 2011/130598, WO2013/055987, WO2014/057074.
Pacijent
[0263] Pacijent može biti životinja, sisar, placentalni sisar, torbar (na primer, kengur, vombat), monotrem (na primer, kljunar), glodar (npr. zamorče, hrčak, pacov, miš), miš, lagomorf (npr. zec), ptica, pas, mačka, konj, svinja, ovca, govedo (npr. krava), primat, majmun (npr. marmozet, pavijan), čovekoliki majmun (npr. gorila, šimpanza, orangutang, gibon) ili čovek.
[0264] Dalje, pacijent može biti bilo u bilo kom od svojih oblika razvoja, na primer, fetus. U jednom poželjnom otelotvorenju, pacijent je čovek.
Primeri
Pregled
[0265] Ovde obelodanjeni ADC se sintetišu u dvostepenom procesu. Prva faza - remodeliranje glikana -skraćuje nativni N-vezani glikan nazad u jezgru GlcNAc, i zatim dodaje azido modifikovan GalNAc kako bi se formirao antitelo-GalNAc-N3međuproizvod. Ovo se prečišćava hromatografijom proteina A i zatim konjuguje sa veznikom za lek u drugoj fazi.
[0266] Ove faze su opisane ispod narednog opisa načina kako se lek-veznik sintetiše.
Sinteza međuproizvoda 3
[0267]
[0268] Rastvor BCN alkohola (0,384 g, 2,55 mmola) u MeCN (25 ml) u atmosferi N2je ohlađen na 0°C i dodat je hlorosulfonil izocijanat (CSI) u kapima (0,255 mL, 415 mg, 2,93 mmola, 1,15 ekvivalenta). Nakon mešanja 15 minuta, Et3N je dodat u kapima (1,42 mL, 1,03 g, 10,2 mmola, 4 ekvivalenta) i mešanje je nastavljeno još 10 minuta. Zatim, rastvor 2-(2-(2-aminoetoksi)etoksi)sirćetne kiseline (1,0 g, 6,1 mmola, 2,4 ekvivalenta) u H2O (5 mL) je dodat i reakciona smeša se meša 2 sata na sobnoj temperaturi. Nakon ovog vremena, CHCl3(50 mL) i H2O (100 mL) su dodati i slojevi su razdvojeni. Vodenom sloju u levku za odvajanje dodat je CH2Cl2(100 mL) i pH je podešen na 4 sa 1 N HCl, pre odvajanja slojeva. Vodeni sloj je ekstrahovan dva puta sa CH2Cl2(2 × 100 mL), organski slojevi su spojeni i osušeni (Na2SO4), filtrirani i koncentrisani. Ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni sa silikonom, uz eluiranje sa CH2Cl2do 20% MeOH u CH2Cl2. Prinos 0,42 g (1,0 mmol, 39%) 3 kao bezbojni lepljivi vosak.
Sinteza povezivanja lekova
[0269]
4
[0270] Jedinjenje 1 se može sintetisati kao što je opisano u WO2014/057074 - pogledati jedinjenje 22.
(a) Paladijum tetrakistrifenilfosfin (Pd(PPh3)4, 4,8 mg, 4,15 µmol) se meri i stavlja pod inertnu atmosferu. Rastvor pirolidina (5,0 µL, 4,3 mg, 60 µmol) u DCM (1 mL) se degazira penušanjem N2kroz rastvor. Rastvor 1 (27 mg, 24 µmol) u DCM (6 mL) se degazira penušanjem N2kroz rastvor. Dok se N2još uvek penuša kroz rastvor, dodaje se degazirani rastvor pirolidina. Izmereni Pd(PPh3)4se rastvora u DCM (1 mL) i dodaje se 0,9 mL ovog rastvora. Posle 50 min penušanja N2, dodat je DCM (25 mL) i smeša je isprana zasićenim vodenim rastvorom NH4Cl (25 ml). Nakon odvajanja, vodeni sloj je ekstrahovan sa DCM (2 × 25 mL). Kombinovani organski slojevi se suše (Na2SO4) i koncentrišu. Ostatak je prečišćen sa RP-HPLC (30-90% MeCN (0,1% mravlja kiselina) u H2O (0,1% mravlja kiselina). Kombinovani fragmenti se propuštaju kroz SPE (HCO3-) kolone i koncentrišu. Posle dodavanja MeCN (50 mL) smeša je ponovo koncentrovana. Dobijeni ostatak 2 se koristi u narednom koraku.
Konverzija reakcije se može pratiti putem LCMS analize. Kolona: Kolona XBridge BEH C18 Intelligent Speed (IS), 130Å, 3,5 µm (4,6 mm x 20 mm). Mobilna faza A: voda (0,1% mravlja kiselina), Mobilna faza B (0,1% mravlja kiselina). Detektovanje pomoću PDA i ESI+. Uzorci se mogu pripremiti razblaživanjem reakcione smeše sa MeCN.
(b) U rastvor gornjeg ostatka 2 u CHCl3(5 mL) dodaje se rastvor 3 (15 mg, 36 µmol, mw 418 g/mol) u CHCl3(0,8 mL). Dobijena smeša se dodaje u čvrsti EDC.HCl (4,7 mg, 25 µmol), CHCl3(5 mL) je dodat i smeša je mešana 30 minuta. Dodat je DCM (30 mL) i dobijena smeša se ispira vodom (30 mL). Nakon razdvajanja, vodena faza je ekstrahovana sa DCM (30 mL). Kombinovani organski slojevi se suše (Na2SO4) i koncentrišu. Ostatak je prečišćen RP-HPLC (30-90% MeCN (bez kiseline) u H2O (0,01% mravlja kiselina). HPLC epruvete za sakupljanje su napunjene 5% vodenim (NH4)HCO3pre sakupljanja. Kombinovani HPLC fragmenti se ekstrahuju sa DCM (3 × 20 mL). Kombinovani organski slojevi se suše (Na2SO4) i koncentrišu. Proizvod 4 se dobija kao blago žuto/belo ulje (21 mg, 16 µmol, mw 1323 g/mol, 67% u dva koraka).
[0271] Konverzija reakcije se može pratiti putem LCMS analize. Kolona: Kolona XBridge BEH C18 Intelligent Speed (IS), 130Å, 3,5 µm (4,6 mm x 20 mm). Mobilna faza A: voda (0,1% mravlja kiselina), Mobilna faza B (0,1% mravlja kiselina). Detektovanje pomoću PDA i ESI+.
Preoblikovanje glikana (anti-DLK1 ADC, ConjA1)
Priprema antitela
[0272] Približno 60 mg anti-DLK1 antitela je razmenjeno puferom u 25 mM Tris/Cl, 150 mM NaCl, pH 8,0 preko G25 kolone za desalinizaciju; 4 x 2,5 ml pri 6 mg/mL napunjeno na 4 x PD10 kolone za desalinizaciju (GE 17085101). Antitelo razmenjeno puferom je zatim koncentrovano na najmanje 25 mg/mL pomoću Vivaspin 20 centrifugalnog koncentratora (Sigma Z614637). Koncentracija proteina je potvrđena kao 28,4 mg/mL ultrazvučnom analizom A280-320nm koristeći koeficijent ekstinkcije od 1,5.
Reakcija preoblikovanja
[0273] Preoblikovanje glikana je izvedeno u reakciji sa jednom posudom preko noći (16 sati) na sobnoj temperaturi. Naredna reakciona smeša je pripremljena sa rastvorima/reagensima dodatim redosledom navedenim u nastavku:
Postupak prečišćavanja proteina A.
[0274] Vezivanje i eluiranje proteina A izvedeno je na 5 ml HiTrap MabSelect Sure koloni (GE 11-0034-94). Svi koraci hromatografije su izvedeni pri protoku od 240 cm/h koristeći AKTA Prime plus sistem. Kolona je pripremljena i korišćena na naredni način:
[0275] Nakon afinitetnog prečišćavanja proteina A, mali uzorak proizvoda može se redukovati koristeći DTT i zatim podvrgnuti MS analizi. Tipičan maseni spektar uspešne reakcije prenosa pokazuje formiranje jednog velikog proizvoda (90% ukupnog teškog lanca), koji je rezultat modifikovanog prenosa galaktoze u jezgrom GlcNAc (Fuc) supstituisanog Ab, i sporednog proizvoda (± 10% ukupni teški lanac), koji je rezultat modifikovanog prenosa galaktoze u jezgro GlcNAc (bez fukoze) supstituisanog antitela.
Razmena puferom posle proteina A
[0276] Preoblikovano i prečišćeno anti-DLK1-GalNAc-N3 antitelo je zatim razmenjeno puferom u fiziološki rastvor puferisan fosfatom (PBS) i koncentrovano do približno 16,6 mg/mL pomoću Vivaspin 20 centrifugalnog koncentratora (Sigma Z614637). Protein A eluat je razblažen 1:1 sa PBS i zatim koncentrovan nazad do prvobitne zapremine i to je ponovljeno 6 puta. Količina je konačno smanjena na ciljanih 16-17 mg/mL i uzorak je izvučen iz uređaja. Koncentracija proteina je potvrđena kao 16,4 mg/mL ultrazvučnom analizom A280-320nm korišćenjem koeficijenta ekstinkcije od 1,5 i ukupno je izvučeno 2,7 ml.
Konjugacija od 4 za modifikovano antitelo kako bi se proizveo ConjA1
Uslovi reakcije
2,7mL 16,4 mg/mL azido-modifikovanog DLK1 antitela (u ovom primeru, HuBa-1-3d kao što je ovde opisano)
0,3mL 10mM 4 u dimetilacetamidu
[0278] Reakcija se temeljno pomeša i ostavi da konjuguje preko noći (16 sati) na sobnoj temperaturi. Smeša za konjugaciju je filtrirana kroz 0,2 µm PVDF filer (Millipore SLGV033RS) pre konačnog prečišćavanja i formulacije.
Prečišćavanje ConjA 1
[0279] Filtrirana smeša za konjugaciju je prečišćena upotrebom Vivaspin 20 centrifugalnog koncentratora (Sigma Z614637). Smeša za konjugaciju je razblažena 1:1 sa 30 mM Histidin HCl, 200 mM Sorbitola, pH 6,0 i koncentrovana nazad do prvobitne zapremine. Ovo se ponovilo 12 puta pre nego što je prečišćena ADC masa izvađena iz centrifugalnog uređaja.
[0280] Koncentracija proteina je određena kvantitativnom SEC analizom korišćenjem kalibracione krive antitela i konjugata razblaženog na približno 5 mg/mL sa dodatnih 30 mM Histidin HCl, 200 mM Sorbitola, pH 6,0. Tween 20 je dodat u 0,02% mas./zap. iz 1% materijala u 30mM Histidin HCl, 200mM Sorbitola, pH 6,0 i koncentracija je ponovo ispitana kvantitativnom SEC analizom. Uzorak je uzet za testiranje, i ostatak je podeljen na alikvote od 1 ml i zamrznut na -80°C.
[0281] Analiza proizvoda pokazala je naredna svojstva:
Bistra, bezbojna, bez čestica
5,17 [protein] prema SEC
Prosečan DAR od 1,87 (RP hromatografijom)
0,09EU/mg endotoksina
≤4,5% bez lek-veznika
pH 6,06
Preoblikovanje glikana (anti-KAAG1 ADC, ConjA2)
Priprema antitela
[0282] Približno 150 mg anti-KAAG1 (približno 25 ml pri 6,13 mg/mL u PBS pH 7,4) je razmenjeno puferom u 25 mM Tris/Cl, 150 mM NaCl, pH 8,0 i koncentrovano do > 25 mg/ml pomoću Vivaspin 20 centrifugalnih koncentratora (Sigma Z614637). U početku, antitelo je koncentrovano na 12 ml, i zatim razblaženo 1:1 sa 25 mM Tris/Cl, 150 mM NaCl, pH 8,0, i zatim koncentrovano natrag na 12 ml, i ovaj proces je ponovljen 6 puta. Konačno, materijala razmenjene puferom su dalje koncentrovane na 6 ml. Koncentracija proteina je određena pomoću A280-320nm UV analize korišćenjem koeficijenta ekstinkcije od 1,5, i zatim razblažena na 25 mg/mL sa 25 mM Tris/Cl, 150 mM NaCl, pH 8,0.
Reakcija preoblikovanja
[0283] Preoblikovanje glikana je izvedeno u reakciji sa jednom posudom preko noći (16 sati) na sobnoj temperaturi. Naredna reakciona smeša je pripremljena sa rastvorima/reagensima dodatim redosledom navedenim u nastavku:
Postupak prečišćavanja proteina A.
[0284] Vezivanje i eluiranje proteina A izvedeno je na 4,7 ml HiScreen MabSelect Sure koloni (GE 28-9269-77). Svi koraci hromatografije su izvedeni pri protoku od 240 cm/h koristeći AKTA Prime plus sistem. Kolona je pripremljena i korišćena na naredni način:
[0285] Nakon afinitetnog prečišćavanja proteina A, mali uzorak proizvoda može se redukovati koristeći DTT i zatim podvrgnuti MS analizi. Tipičan maseni spektar uspešne reakcije prenosa pokazuje formiranje jednog velikog proizvoda (90% ukupnog teškog lanca), koji je rezultat modifikovanog prenosa galaktoze u jezgro GlcNAc (Fuc) supstituisanog Ab, i sporednog proizvoda (± 10% ukupni teški lanac), koji je rezultat modifikovanog prenosa galaktoze u jezgro GlcNAc (bez fukoze) supstituisanog antitela.
Razmena puferom posle proteina A
[0286] Protein A eluat koji sadrži preoblikovano/prečišćeno Ab-GalNAc-N3 je pH podešen dodavanjem 1,5M Tris baze na 3,2% zap./zap., i zatim je razmenjen puferom u PBS i koncentrovan do ≈17 mg/mL pomoću Vivaspin 20 centrifugalnih koncentratora (Sigma Z614637). U početku je bazen sa prilagođenim pH razblažen 1:1 PBS, i zatim koncentrovan natrag do prvobitne zapremine i ovaj proces je ponovljen 6 puta. Konačno, materijak razmenjen puferom je dalje koncentrovan do ciljane vrednosti ≈17 mg/mL. Koncentracija proteina je potvrđena na 16,5 mg/mL ultrazvučnom analizom A280-320nm korišćenjem koeficijenta ekstinkcije od 1,5; ukupno je izdvojeno 7,9 ml za prinos od 88%.
Konjugacija od 4 za modifikovano antitelo kako bi se proizveo ConjA2
[0287] U 7,9 ml od 16,5 mg/mL Ab-GalNAc-N3 (Ab=3A4, kao što je ovde opisano) dodato je 0,788 ml od 10 mM PL1601 u DMF-u (10% konačan zap./zap. DMF). Reakcija je temeljno pomešana i ostavljena da konjuguje preko noći (16 sati) na sobnoj temperaturi. Smeša za konjugaciju je filtrirana kroz 0,22 µm PES filter (Millipore SLGV033RS) pre konačnog prečišćavanja i formulacije.
Prečišćavanje ConjA2
[0288] Filtrirana smeša konjugacije je prečišćena dijafiltracijom konstantne zapremine pomoću 30kDa Pellicon 3 membrane pri ≈50g/m<2>površine membrane, poprečni protok od 5,0 ± 0,25 L/min/m2, TMP od 1,0 ± 0,2 bara i ukupno 12 dijazapremina razmene pufera u PBS pH 7,4. Dijafiltriran bazen je izvađen iz UFDF i filtriran kroz 0,22 µm PES membranski filter (Millipore SLGV033RS) u sterilne ependorfe. Koncentracija proteina je određena A280-320nm UV analizom korišćenjem koeficijenta ekstinkcije od 1,5 i utvrđeno je da je 4,9 mg/mL. Uzorak je uzet za testiranje, i ostatak uskladišten na 4°C.
[0289] Analiza proizvoda pokazala je naredna svojstva:
Bistra, bezbojna, bez čestica
4,9 mg/ml [proteina] pomoću A280/330nm spektroskopije
Prosečan DAR od 1,9 (RP hromatografijom)
0,07 EU/mg endotoksina
3% bez lek-veznika
98,3% monomer pomoću sixe hromatografije isključivanja
Preoblikovanje glikana (ADC protiv Mezotelina, ConjA3)
Priprema antitela
[0290] Približno 60 mg antiMezotelinskog antitela je razmenjeno puferom u 25 mM Tris/Cl, 150 mM NaCl, pH 8,0 preko kolone za desalinizaciju G25; 4 x 2,5 ml pri 6 mg/mL napunjeno na 4 x kolone za desalinizaciju PD10 (GE 17085101). Antitelo razmenjeno puferom se zatim koncentriše na najmanje 25 mg/mL pomoću Vivaspin 20 centrifugalnog koncentratora (Sigma Z614637). Koncentracija proteina je potvrđena A280-320nm UV analizom koristeći koeficijent ekstinkcije od 1,5.
Reakcija preoblikovanja
[0291] Preoblikovanje glikana se vrši u reakciji u jednoj posudi preko noći (16 sati) na sobnoj temperaturi. Naredna reakciona smeša se priprema sa rastvorima/reagensima dodatim redosledom navedenim u nastavku:
Procedura prečišćavanja proteina A
[0292] Vezivanje i eluiranje proteina A se vrši na 5 ml HiTrap MabSelect Sure koloni (GE 11-0034-94). Svi koraci hromatografije se izvode pri protoku od 240 cm/h koristeći AKTA Prime plus sistem. Kolona se priprema i koristi na naredni način:
[0293] Nakon afinitetnog prečišćavanja proteina A, mali uzorak proizvoda može se redukovati koristeći DTT i zatim podvrgnuti MS analizi. Tipičan maseni spektar uspešne reakcije prenosa pokazuje formiranje jednog velikog proizvoda (90% ukupnog teškog lanca), koji je rezultat modifikovanog prenosa galaktoze u jezgro GlcNAc (Fuc) supstituisanog Ab, i sporednog proizvoda (± 10% ukupni teški lanac), koji je rezultat modifikovanog prenosa galaktoze u jezgro GlcNAc (bez fukoze) supstituisanog antitela.
Razmena puferom posle proteina A
[0294] Preoblikovano i prečišćeno anti-Mezotelin-GalNAc-N3 antitelo se zatim razmeni puferom u fiziološki rastvor puferisan fosfatom (PBS) i koncentriše do približno 16,6 mg/mL koristeći Vivaspin 20 centrifugalni koncentrator (Sigma Z614637). Protein A eluat se razblaži 1:1 sa PBS i zatim koncentriše nazad do prvobitne zapremine i to se ponavlja 6 puta. Količina se konačno smanjuje na ciljanih 16-17 mg/mL i uzorak se izvlači iz uređaja. Koncentracija proteina je potvrđena A280-320nm UV analizom koristeći koeficijent ekstinkcije od 1,5.
Konjugacija od 4 za modifikovano antitelo kako bi se proizveo ConjA3
Uslovi reakcije
[0295]
2,7mL od 15 mg/mL azido-modifikovanog anti-Mezotelin antitela
0,3mL od 10mM 4 u dimetilacetamidu
[0296] Reakcija se temeljno pomeša i ostavi da konjuguje preko noći (16 sati) na sobnoj temperaturi. Smeša za konjugaciju se filtrira kroz 0,2 µm PVDF filer (Millipore SLGV033RS) pre konačnog prečišćavanja i formulacije.
Prečišćavanje ConjA3
[0297] Filtrirana smeša za konjugaciju se prečisti pomoću centrifugalnog koncentratora Vivaspin 20 (Sigma Z614637). Smeša za konjugaciju je razblažena 1:1 sa 30 mM Histidin HCl, 200 mM Sorbitola, pH 6,0 i zatim koncentrovana nazad do prvobitne zapremine. Ovo se ponavlja 12 puta pre nego što se prečišćena ADC masa izvadi iz centrifugalnog uređaja.
[0298] Koncentracija proteina je određena kvantitativnom SEC analizom korišćenjem kalibracione krive antitela i konjugata razblaženog na približno 5 mg/mL sa dodatnih 30 mM Histidin HCl, 200 mM Sorbitola, pH 6,0. Tween 20 se dodaje u 0,02% mas./zap. iz 1% materijala u 30mM Histidin HCl, 200mM Sorbitola, pH 6,0 i koncentracija je ponovo testirana kvantitativnom SEC analizom. Uzorak se uzima za testiranje, i ostatak se deli na alikvote od 1 ml i zamrzne na -80°C.
In vitro citotoksičnost ConjA1
[0299] Bočice sa Lu135 ćelijama ili SK-N-FI ćelijama su tretirane tripsinom, i oslobođene ćelije su isprane i ponovo suspendovane u svežem medijumu. Gustina ćelija je određena mešanjem 1:1 sa tripan plavim (0,4% (mas./zap.) Sigma TB154) i prebrojavanjem bistrih/plavih (živih/mrtvih) ćelija sa Luna II automatizovanim brojačem ćelija (Logos Biosystems). Ćelijska suspenzija je razblažena do potrebne gustine sejanja (20 x 104/ml), raspršena u bele mikroploče sa ravnim dnom sa 96 komorica (50 µl/komorica) i inkubirana preko noći.
[0300] Osnovni rastvor (1 ml) ConjA1 (20 µg/ml) napravljen je razblaživanjem filtrirano sterilnog ConjA1 u isti medijum ćelijske kulture. Set od 8x 10-ostrukih razblaženja osnovnog ConjA1 napravljen je u sterilnoj ploči sa 24 komorice serijskim prenosom 100 µl u 900 µl medijuma ćelijske kulture. Svako razblaživanje ConjA1 je dozirano, 50 µl/komorica, u 4 ponovljene komorice ploče sa 96 komorica, koje sadrže suspenziju ćelija. Kontrolne komorice su dobile samo istu zapreminu medijuma za kulturu.
[0301] Nakon perioda izlaganja ConjA1, vitalnost ćelija je izmerena pomoću Promega CellTiter-Glo dodavanjem 100 µl/komorica, mešana 2 minuta i čitana na Envision pomoću protokola luminiscencije. Podaci su analizirani pomoću Graphpad Prism programa.
[0302] Utvrđeno je da EC50za ConjA1 protiv Lu-135 ćelija iznosi 0,01765 µg/mL. EC50za ADC kontrolu iznosio je 0,5326 µg/mL (pogledati Sliku 1A*).
[0303] Utvrđeno je da EC50za ConjA1 protiv SK-N-FI ćelija iznosi 0,1565 µg/mL. EC50za ADC kontrolu iznosio je 5x10<5>µg/mL (pogledati Sliku 1B*).
[0304] *Na obe Slike 1A * 1B, ▼ je ConjA1, a ● je inače identična ADC kontrola koja sadrži ne-DLK1 specifično antitelo B12).
In vivo studije efikasnosti sa ConjA1
In vivo anti-tumorska aktivnost u modelu ksenografta (PDX) LI1097 izvedenog od pacijenata sa rakom jetre
[0305] LI1097 semena tumora su oživljena potkožno kod NOD/SCID miševa i održavana potkožno kod BALB/c golih miševa pre implantacije. Kada su zapremine tumora dostigle 700-1500 mm<3>, tumori su prikupljeni i isečeni na komade prečnika oko 2-3 mm3. Tumori ili delovi tumora su isprani ledeno hladnom podlogom RPMI1640 (bez seruma) i zatim stavljeni u ledeno hladnu podlogu za upotrebu.
[0306] Koža ženki BALB/c golih miševa starih pet do šest nedelja dezinfikovana je jodoforom pre implantacije tumora u desni bok. Svaki miš je inokuliran bez anestezije, potkožno na desnom gornjem boku sa jednim primarnim LI1097 fragmentom ljudskog tumora jetre za razvoj tumora.
4
[0307] Nakon inokulacije tumora, životinje su svakodnevno proveravane na morbiditet i mortalitet. Veličina tumora je merena šestarom dva puta nedeljno u dve dimenzije. Zapremina tumora izražena je u mm<3>koristeći formulu: TV=0,5 a × b2, gde su a i b dugački i kratki prečnik tumora.
[0308] Na dan 12 istraživanja, miševi su randomizovani u 5 grupa od po 8 miševa; srednja zapremina tumora iznosila je -170 mm<3>preko kohorte. Miševi su dozirani sa ispitivanim agensima na dan 13 ispitivanja (dan 1, označen vertikalnom isprekidanom linijom na grafikonu). Ispitivani miševi u ovoj studiji primili su jednu dozu dodeljenog ispitivanog predmeta i nivo doze na dan 1, i rast tumora je praćen nakon toga, do dana 51.
[0309] Rezultati su prikazani na Slici 2A, gde:
○ = nosač, qdx1
◊ = ADC kontrola koja koristi ne-DLK1 specifično antitelo B12, 1mg/kg, qdx1
□ = ConjA1, 0,1 mg/kg, qdx1
Δ = ConjA1, 0,3 mg/kg, qdx1
▼ = ConjA1, 1,0 mg/kg, qdx1
[0310] Kao što je jasno sa Slike 2A, ConjA1 pri 1,0 mg/kg doveo je do najvećeg usporavanja rasta tumora, praćen sa ConjA1 pri 0,3 mg/kg. Štaviše, pri najvećoj testiranoj dozi, ConjA1 je rezultovao sa 3/8 PR i 2/8 CR, dok nijedan od miševa tretiranih sa nosačem ili ADC za kontrolu izotipa (1 mg/kg, pojedinačna doza) nije imao PR, CR ili TFS.
In vivo anti-tumorska aktivnost u SK-N-FI modelu ksenografta neuroblastoma
[0311] Ženke NOD-SCID miševa bile su stare šest nedelja na dan implantacije. SK-N-FI ćelije su sakupljene tokom rasta log faze i resuspendovane u fiziološkom rastvoru puferisanom fosfatom sa 50% matrigela. Koristeći špric od 26 G, 100 µL (3 × 10<6>ćelija) smeše ćelijske suspenzije potkožno je injektirano u desni bok svakog miša. Životinje su pregledane dva puta nedeljno za svoju telesnu težinu i veličinu tumora. Veličina tumora je merena pomoću digitalnih šestara i izračunata prema narednom izrazu:
Zapremina tumora (mm<3>) = (mala osa) 2 × (velika osa) × π/6
[0312] Osamnaest dana nakon transplantacije ćelija raka, 50 miševa čija je zapremina tumora iznosila između 99,0 mm<3>i 155,2 mm<3>(prosečno 116,2 mm<3>) podeljeni su u 5 grupa (N=10 u svakoj grupi). Na dan doziranja, ispitanicima je primenjena intravenozna injekcija iz repne vene. Krajnja tačka studije postavljena je kada svaki tumor dostigne zapreminu krajnje tačke od 1000 mm<3>ili na kraju studije (60 dana nakon doziranja), šta je pre nastupilo.
[0313] Rezultati su prikazani na Slici 2B, gde:
◊ = nosač, qdx1
○ = ADC kontrola koja koristi ne-DLK1 specifično antitelo B12, 0,5 mg/kg, qdx1
□ = ADC kontrola koja koristi ne-DLK1 specifično antitelo B12, 1 mg/kg, qdx1
Δ = ConjA1, 0,5 mg/kg, qdx1
▼ = ConjA1, 1,0 mg/kg, qdx1
[0314] Kao što je jasno sa Slike 2B, ConjA1 pri 1,0 mg/kg doveo je do najvećeg usporavanja rasta tumora, praćen sa ConjA1 pri 0,5 mg/kg.
[0315] U modelu SK-N-FI ksenografta dobijenog od ljudskog neuroblastoma, pojedinačna doza ConjA1 od 0,5 ili 1 mg/kg pokazala je anti-tumorsku aktivnost zavisnu od doze u poređenju sa miševima koji su tretirani nosačem i izotipskom kontrolom ADC.
[0316] U najvećoj testiranoj dozi, ConjA1 je rezultovao sa 1/9 delimičnih odgovora (PR) i 4/9 potpunih odgovora (CR), od kojih je jedan bio preživeli bez tumora (TFS) na kraju studije na dan 60 (jedna životinja od inicijalnih 10 u ovoj grupi isključena je iz konačnih brojki iz razloga koji nisu povezani sa tretmanom). Toksikološka studija na pacovima
[0317] Toksikološka studija na pacovima (procena toksičnosti van cilja, testirani ADC ne vezuje pacovski Dlk-1)
Postupak
[0318] ConjA1 je procenjivan u studiji tolerancije pacova sa jednom intravenoznom dozom. Mužjaci sprague-dawley pacova (n=3/grupa) dozirani su u dozi od 5 mg/kg na dab 1, sa obdukcijom na dan 21 nakon doziranja. Težina tela i potrošnja hrane često su praćeni uzimanjem uzoraka tokom života za kliničku patologiju (krv na dan 8 i 21) i ponovljenim uzorkovanjem za farmakokinetiku. Prilikom obdukcije izvršena su makroskopska zapažanja sa odabranim organima koji su izmereni i zadržani radi moguće histopatologije.
Rezultati
[0319] ConjA1 se klinički dobro podnosio u dozi od 5 mg/kg bez zabeleženih neželjenih kliničkih znakova. Povećanje telesne težine je smanjeno, gde su životinje bile oko 15 % lakše od kontrolne grupe na kraju studije. Broj belih krvnih zrnaca smanjen je na dan 8 (neutrofili su smanjeni za oko 95 % u poređenju sa istovremenom kontrolom), sa dokazima oporavka do dana 22.
Opšti zaključak
[0320] ConjA1 je bio dobro stabilan, dobro se podnosio i pokazao je povoljan farmakokinetički profil kod pacova sa polu-životom od 9 dana pri 5 mg/kg. Ovo sugeriše da je MTD kod pacova najmanje 5 mg/kg ili više.
In vitro citotoksičnost u A204 i Hep3B ćelijama u 2D i 3D ćelijskoj kulturi
Materijali & postupci
[0321] Ćelije su zasejane u onko-medijum (RPMI, 5% FBS, 2 mM L-alanil-L-glutamin, 1 mM natrijum piruvat i 1% penicilin/streptomicin) u Elplasia ploče sa 384 komorice prethodno premazane sa pHEMA.
[0322] ADC, ConjA1 i B12-1601 jedinjenja su dodata 24 sata nakon sejanja ćelija, sa početnom koncentracijom od 10 mg/mL, 10-strukim serijskim razblaženjem u 9 koncentracija iz četiri puta. Vremena inkubacije sa ADC jedinjenjima bila su 5 dana u 2D- i 7 dana u 3D-kulturama sa razmenom medijuma svaka 3 dana, ukupno 14.
[0323] Na kraju perioda inkubacije, ćelije su lizirane i analizirane kako bi se odredila vitalnost ćelija. Krajnja tačka proliferacije ćelija je analizirana kao procenat kontrole (POC) koristeći narednu formulu:
POC = relativni broj ćelija (komorica sa jedinenjem) / relativan broj ćelija (komorice sa kontrolom nosača) × 100%
[0324] Podaci su analizirani pomoću Graphpad Prism programa.
Rezultati
[0325] Na Slici 3 prikazani su podaci in vitro citotoksičnost u A204 i Hep3B ćelijama u 3D ćelijskoj kulturi:
• Slika 3A su podaci o A204 ćelijama [IC503D ADC = 0,001460 µg/ml, IC503D B12-PL1601 = 0,7662 µg/ml, IC502D ADC = 0,006399 µg/ml, IC503D B12-PL1601 = 0,4059µg/m];
• Slika 3B su podaci ćelije Hep3B [IC503D ADC = 0,2271 µg/ml, IC503D B12 -PL1601 = -432,6 µg/ml, IC502D ADC = -59,29 µg/ml, IC502D B12 -PL1601 = -3,957 µg/ml].
In vitro citotoksičnost ConjA2
[0326] Bočice sa bilo SN12C i MDA-MB-231FI ćelijama su tretirane tripsinom, i oslobođene ćelije su isprane i ponovo suspendovane u svežem medijumu. Gustina ćelija je određena mešanjem 1:1 sa tripan plavim (0,4% (mas./zap.) Sigma TB154) i prebrojavanjem bistrih/plavih (živih/mrtvih) ćelija sa Luna II automatizovanim brojačem ćelija (Logos Biosystems). Ćelijska suspenzija je razblažena do potrebne gustine sejanja (20 x 104/ml), raspršene u bele mikropločice sa 96 dna sa ravnim dnom (50 µl/komorica) i inkubirane preko noći.
[0327] Osnovni rastvor (1 ml) ConjA2 (20 µg/ml) napravljen je razblaživanjem filtrirano sterilnog ConjA2 u istom medijumu ćelijske kulture. Set od 8x 10-ostrukih razblaženja osnovnog ConjA2 napravljen je u sterilnoj ploči sa 24 komorice serijskim prenosom 100 µl u 900 µl medijuma ćelijske kulture. Svako razblaživanje ConjA2 je dozirano, 50 µl/komorica, u 4 ponavljanja komorica ploče sa 96 komorica, koje sadrže suspenziju ćelija. Kontrolne komorice su dobile samo istu zapreminu medijuma za kulturu.
[0328] Nakon perioda izlaganja ConjA2, vitalnost ćelija je izmerena pomoću Promega CellTiter-Glo dodavanjem 100 µl/komorica, mešano je 2 minuta i očitano na Envision pomoću protokola luminiscencije. Podaci su analizirani pomoću Graphpad Prism programa.
[0329] Utvrđeno je da EC50za koncentraciju ConjA2 u SN12C ćelijama iznosi 0,0663 µg/mL. EC50za ADC kontrolu nije bilo moguće detektovati (pogledati Sliku 4A*).
[0330] Utvrđeno je da EC50za ConjA2 protiv MDA-MB-231 ćelija iznosi 0,226 µg/mL. EC50za ADC kontrolu ponovo nije bilo moguće otkriti (pogledati Sliku 4B*).
[0331] *Na obe Slike 4A & 4B,◆ je ConjA2, a ● je inače identična ADC kontrola koja sadrži antitelo B12 koje nije specifično za KAAG1).
In vivo studija efikasnosti ConjA2
[0332] Ženke atimičnih golih miševa (Crl:NU(Ncr)-Fokx1nu, Charles River) bile su stare osam nedelja sa rasponom telesne težine (BV) od 20,7 - 31,2 g prvog dana studije.
[0333] Na dan implantacije, tumorske ćelije MDA-MB-231 korišćene za implantaciju sakupljene su tokom rasta log faze i resuspendovane u fiziološkom rastvoru puferisanom fosfatom (PBS) na 5 x 10<7>ćelija/mL. Svaki miš je injektiran potkožno (s.c.) u desni bok sa 5 x 10<6>ćelija (0,1 mL ćelijske suspenzije) i tumori su praćeni kako se njihova zapremina približavala ciljnom rasponu od 100 do 150 mm<3>. Tumori su mereni u dve dimenzije pomoću šestara, i zapremina je izračunata po formuli:
Zapremina tumora (mm<3>) = w<2>× l/2
gde je w=širina i l=dužina, u mm, tumora. Težina tumora može se proceniti uz pretpostavku da je 1 mg ekvivalentno 1 mm3 zapremine tumora.
[0334] Šesnaest dana nakon implantacije tumora, označeno kao Dan 1 studije, životinje su razvrstane u grupe od kojih se svaka sastoji od 8 miševa sa pojedinačnim zapreminama tumora od 108 do 144 mm<3>, uz grupne srednje zapremine tumora od 112,5 - 123,8 mm<3>. Prvog dana studije svi tretmani su primenjeni intravenozno (iv) u jednoj injekciji (qd x 1) putem injekcije u repnu venu u zapremini doziranja od 0,2 mL po 20 grama telesne težine (10 mL/kg), skalirano na telesnu težinu svake pojedinačne životinje. Tumori su mereni pomoću šestara dva puta nedeljno, i svaka životinja je eutanazirana kada je njen tumor dostigao zapreminu krajnje tačke od 1500 mm<3>ili na kraju studije, šta je pre nastupilo. Studija je završena na Dan 59.
[0335] Rezultati su prikazani na Slici 5, gde:
○ = nosač, qdx1 (gornji lin)
□ = ADC kontrola koristeći ne-KAAG1 specifično antitelo B12, 0,6 mg/kg, qdx1 ○ = ConjA2, 0,6 mg/kg, qdx1 ( gornji lin)
[0336] Kao što je jasno sa Slike 5, ConjA2 pri 0,6 mg/kg doveo je do značajnog usporavanja rasta tumora.
In vivo anti-tumorska aktivnost ConjA2 u SN12C modelu ksenografta
[0337] Ženke teških kombinovanih imunodeficijentnih miševa (Fox Chase SCID®, CB17/lcr-Prkdcscid/IcrlcoCrl, Charles River) bile su stare devet nedelja sa rasponom telesne težine (TB) od 15,4 do 22,2 g na Dan 1 studije.
[0338] Na dan implantacije tumora, svaki ispitivani miš je primio 5 x 10<6>SN12C ćelija (0,1 ml ćelijske suspenzije u 50% Matrigel® Matrix (Corning®) u fiziološkom rastvoru puferisanom fosfatom) implantirano potkožno u desni bok. Rast tumora je praćen kako se prosečna veličina približavala ciljnom rasponu od 100 do 150 mm<3>. Tumori su mereni u dve dimenzije pomoću šestara, i zapremina je izračunata po formuli:
Zapremina tumora (mm<3>) = w<2>× l/2
gde je w=širina i l=dužina, u mm, tumora. Težina tumora može se proceniti uz pretpostavku da je 1 mg ekvivalentno 1 mm3 zapremine tumora.
[0339] Dvadeset tri dana nakon implantacije tumora, označene kao Dan 1 studije, životinje su razvrstane u devet grupa (n=8) sa pojedinačnim zapreminama tumora od 108 do 172 mm<3>i grupnom srednjom zapreminom tumora od 129 mm<3>.
4
[0340] Prvog dana studije svi tretmani su primenjeni intravenozno (iv) u jednoj injekciji (qd x 1) putem injekcije u repnu venu pri zapremini doziranja od 0,2 mL po 20 grama telesne težine (10 mL/kg), skalirano na telesnu težinu svake pojedinačne životinje. Tumori su mereni šestarama dva puta nedeljno, i svaka životinja je eutanazirana kada je njen tumor dostigao zapreminu krajnje tačke od 1000 mm<3>ili na kraju studije, šta je pre nastupilo. Studija je završena 60.
[0341] Podaci su prikazani na Slici 6, gde se može videti da je primena ADC (ConjA2) smanjila rast tumora na način zavisan od doze.
In vitro citotoksičnost
[0342] Bočice sa bilo OVCAR3, CAPAN-2 ili HPAC ćelijama se tretiraju tripsinom, i oslobođene ćelije se isperu i ponovo suspenduju u svežem medijumu. Gustina ćelija se određuje mešanjem 1:1 sa tripan plavim (0,4% (mas./zap.) Sigma TB154) i prebrojavanjem bistrih/plavih (živih/mrtvih) ćelija pomoću Luna II automatizovanog brojača ćelija (Logos Biosystems). Suspenzija ćelija se razblažuje do potrebne gustine sejanja (20 x 104/ml), raspršuje u bele mikropločice sa ravnim dnom sa 96 komorica (50 µl/komorica) i inkubira preko noći.
[0343] Osnovni rastvor (1 ml) ConjA3 (20 µg/ml) dobija se razblaživanjem sterilno filtriranog ConjA3 u istom medijumu za ćelijsku kulturu. Set od 8x 10-ostrukih razblaženja osnovnog ConjA3 napravljen je u sterilnoj ploči sa 24 komorice serijskim prenosom 100 µl u 900 µl medijuma ćelijske kulture. Svako razblaživanje ConjA3 se raspršuje, 50 µl/komorica, u 4 ponavljanja komorica ploče sa 96 komorica, koje sadrže suspenziju ćelija. Kontrolne komorice primaju samo istu zapreminu medijuma za kulturu.
[0344] Nakon perioda izlaganja ConjA3, vitalnost ćelija se meri pomoću Promega CellTiter-Glo dodavanjem 100 µl/komorica, meša se 2 minuta i očitava na Envision pomoću protokola luminiscencije. Podaci se analiziraju pomoću Graphpad Prism softvera.
In vivo studija efikasnosti ConjA3
In vivo anti-tumorska aktivnost u modelu OVCAR3
[0345] Semena tumori oživljavaju se potkožno u NOD/SCID miševima i održavaju potkožno u golim BALB/c miševima pre implantacije. Kada su zapremine tumora dostigle 700-1500 mm<3>, tumori se sakupljaju i seku na komade prečnika oko 2-3 mm<3>. Tumori ili delovi tumora ispiraju se ledeno hladnom medijumu RPMI1640 (bez seruma) i zatim stavljaju u ledeno hladan medijum za upotrebu.
[0346] Koža ženki BALB/c golih miševa starih pet do šest nedelja dezinfikuje se jodoforom na desnoj strani pre implantacije tumora. Svaki miš je inokuliran bez anestezije, potkožno na desnom gornjem boku sa jednim fragmentom tumora za razvoj tumora.
[0347] Nakon inokulacije tumora, životinje se svakodnevno proveravaju na morbiditet i mortalitet. Veličina tumora se meri šestarom dva puta nedeljno u dve dimenzije. Zapremina tumora izražena je u mm<3>koristeći formulu: TV = 0,5 a × b2 gde su a i b dugački i kratki prečnik tumora.
[0348] Na dan 12 studije, miševi su randomizovani u 5 grupa od po 8 miševa; ciljana srednja početna zapremina tumora je -170 mm<3>za celu kohortu. Miševi se doziraju sa ispitivanim agensima na dan 13 studije. Ispitivani miševi u ovoj studiji primaju jednu dozu dodeljenog test proizvoda i nivo doze na dan 1, a rast tumora se prati do dana 51.
SEKVENCE
[0349]
4
4
4
4
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
�
2
4
1
11
12
1
��
1
1
�
1
1
11
11
11
11
11
11
11
12
12
��
��

Claims (26)

  1. Patentni zahtevi 1. Konjugat formule (I): Ab - (DL)p(I) gde: Ab je antitelo koje se vezuje za DLK1;
    gde: X je izabran iz grupe koju čine: jednostruka veza, -CH2- i -C2H4-; n iznosi od 1 do 8; m iznosi 0 ili 1; R<7>je ili metil ili fenil; kada postoji dvostruka veza između C2 i C3, R<2>je izabran iz grupe koju čine: (ia) C5-10aril grupa, opciono supstituisana sa jednim ili više supstituenata izabranih iz grupe koju čine: halo, nitro, cijano, alkoksi, karboksi, C1-7alkil, C3-7heterociklil, bis-oksi-C1-3alkilen, i -C(=O)OR, gde R je C1-7alkil grupa, C3-20heterociklil grupa ili C5-20aril grupa; (ib) C1-5zasićen alifatski alkil; (ic) C3-6zasićen cikloalkil; (id)
    gde je svaki R<21>, R<22>i R<23>nezavisno izabran iz grupe koju čine H, C1-3zasićen alkil, C2-3alkenil, C2-3alkinil i ciklopropil, gde ukupan broj atoma ugljenika u R<2>grupi nije veći od 5; (ie)
    gde jedan od R<25a>i R<25b>jeste H, a drugi je izabran iz grupe koju čine: fenil, gde je fenil opciono supstituisan sa grupom izabranom od narednih članova: halo, metil, metoksi; piridil; i tiofenil; i (if)
    gde je R<24>je izabran iz grupe koju čine: H; C1-3zasićen alkil; C2-3alkenil; C2-3alkinil; ciklopropil; fenil, gde je fenil opciono supstituisan sa grupom izabranom od narednih članova: halo, metil, metoksi; piridil; i tiofenil; kada postoji jednostruka veza između C2 i C3, R<2>je
    gde su R<26a>i R<26b>nezavisno izabrani iz grupe koju čine H, F, C1-4zasićen alkil, C2-3alkenil, gde su alkil i alkenil grupe opciono supstituisan sa grupom izabranom od narednih članova: C1-4alkil amido i C1-4alkil estar; ili, kada jedan od R<26a>i R<26b>jeste H, drugi je izabran od narednih članova: nitril i C1-4alkil estar; kada postoji dvostruka veza između C2' i C3', R<12>je izabran iz grupe koju čine: (iia) C5-10aril grupa, opciono supstituisana sa jednim ili više supstituenata izabranih iz grupe koju čine: halo, nitro, cijano, alkoksi, karboksi, C1-7alkil, C3-7heterociklil, bis-oksi-C1-3alkilen, i -C(=O)OR, gde R je C1-7alkil grupa, C3-20heterociklil grupa ili C5-20aril grupa; (iib) C1-5zasićen alifatski alkil; (iic) C3-6zasićen cikloalkil; (iid)
    gde je svaki R<31>, R<32>i R<33>nezavisno izabran iz grupe koju čine H, C1-3zasićen alkil, C2-3alkenil, C2-3alkinil i ciklopropil, gde ukupan broj atoma ugljenika u R<12>grupi nije veći od 5; (iie)
    gde jedan od R<35a>i R<35b>jeste H, a drugi je izabran iz grupe koju čine: fenil, gde je fenil opciono supstituisan sa grupom izabranom od narednih članova: halo, metil, metoksi; piridil; i tiofenil; i (iif)
    gde je R<34>je izabran iz grupe koju čine: H; C1-3zasićen alkil; C2-3alkenil; C2-3alkinil; ciklopropil; fenil, gde je fenil opciono supstituisan sa grupom izabranom od narednih članova: halo, metil, metoksi; piridil; i tiofenil; kada postoji jednostruka veza između C2' i C3', R<12>je
    gde su R<36a>i R<36b>nezavisno izabrani iz grupe koju čine H, F, C1-4zasićen alkil, C2-3alkenil, gde su alkil i alkenil grupe opciono supstituisan sa grupom izabranom od narednih članova: C1-4alkil amido i C1-4alkil estar; ili, kada jedan od R<36a>i R<36b>jeste H, drugi je izabran od narednih članova: nitril i C1-4alkil estar; i p iznosi od 1 do 8.
  2. 2. Konjugat prema patentnom zahtevu 1, gde X je -CH2-.
  3. 3. Konjugat prema patentnom zahtevu 1 ili 2, gde n iznosi od 1 do 4.
  4. 4. Konjugat prema patentnom zahtevu 3, gde n iznosi 2.
  5. 5. Jedinjenje prema bilo kom patentnom zahtevu od 1 do 4, gde gde postoji dvostruka veza između C2 i C3, a R<2>je C1-5zasićena alifatska alkil grupa.
  6. 6. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 5, gde R<2>jeste metil, etil ili propil.
  7. 7. Jedinjenje prema bilo kom patentnom zahtevu od 1 do 4, gde gde postoji dvostruka veza između C2 i C3, a R<2>je: (a) fenil, koji nosi jednu do tri supstituent grupe, gde supstituenti mogu biti izabrani od metoksi, etoksi, fluoro, hloro, cijano, bis-oksi-metilena, metil-piperazinila, morfolina i metil-tiofenila; ili (b) ciklopropil; ili (c) grupa formule:
    gde ukupan broj atoma ugljenika u R<2>grupi nije veći od 3; ili (d) grupa:
    ili (e) grupa formule:
    gde je R<24>izabran od H i metila.
  8. 8. Jedinjenje prema bilo kom patentnom zahtevu od 1 do 4, gde postoji jednostruka veza između C2 i C3, R<2>je
    i (a) R<26a>i R<26b>su oba H; ili (b) R<26a>i R<26b>su oba metil; ili (c) jedan od R<26a>i R<26b>je H, a drugi je izabran od članova koje čine: C1-4zasićen alkil, C2-3alkenil, gde su alkil i alkenil grupe opciono supstituisane.
  9. 9. Jedinjenje prema bilo kom patentnom zahtevu od 1 do 8, gde gde postoji dvostruka veza između C2' i C3', a R<12>je C1-5zasićena alifatska alkil grupa.
  10. 10. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 9, gde R<12>jeste metil, etil ili propil.
  11. 11. Jedinjenje prema bilo kom patentnom zahtevu od 1 do 8, gde gde postoji dvostruka veza između C2' 12 i C3', a R<12>je: (a) fenil, koji nosi jednu do tri supstituent grupe, gde su supstituenti izabrani od metoksi, etoksi, fluoro, hloro, cijano, bis-oksi-metilena, metil-piperazinila, morfolina i metil-tiofenila; ili (b) ciklopropil; ili (c) grupa formule:
    gde ukupan broj atoma ugljenika u R<12>grupi nije veći od 3; ili (d) grupa:
    ili (e) grupa formule:
    gde R<34>je izabran od H i metil.
  12. 12. Jedinjenje prema bilo kom patentnom zahtevu od 1 do 8, gde postoji jednostruka veza između C2' i C3', R<12>je
    i (a) R<36a>i R<36b>su oba H; ili (b) R<36a>i R<36b>su oba metil; ili (c) jedan od R<36a>i R<36b>je H, a drugi je izabran od članova koje čine: C1-4zasićen alkil, C2-3alkenil, gde su alkil i alkenil grupe opciono supstituisane.
  13. 13. Konjugat prema patentnom zahtevu 1, gde je DL:
  14. 14. Konjugat prema bilo kom patentnom zahtevu od 1 do 13, gde antitelo sadrži VH domen koji obuhvata VH CDR3 sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO.7., VH CDR2 sa 1 aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO.6, i VH CDR1 sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO.5.
  15. 15. Konjugat prema bilo kom patentnom zahtevu od 1 do 14, gde antitelo sadrži VH domen koji ima sekvencu SEQ ID NO.1.
  16. 16. Konjugat prema bilo kom patentnom zahtevu od 1 do 15, gde antitelo sadrži VL domen koji obuhvata VL CDR3 sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO.10., VL CDR2 sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO.9, i VL CDR1 sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO.8.
  17. 17. Konjugat prema bilo kom patentnom zahtevu od 1 do 16, gde antitelo sadrži VL domen koji ima sekvencu SEQ ID NO.2.
  18. 18. Konjugat prema bilo kom patentnom zahtevu od 1 do 17, gde antitelo sadrži teški lanac koji ima sekvencu SEQ ID NO.3, ili teški lanac koji ima sekvencu SEQ ID NO.11.
  19. 19. Konjugat prema bilo kom patentnom zahtevu od 1 do 18, gde antitelo sadrži laki lanac koji ima sekvencu SEQ ID NO.4.
  20. 20. Sastav koji sadrži smešu jedinjenja antitelo-lek konjugata kako je definisano u bilo kom patentnom zahtevu od 1 do 19, gde prosečno opterećenje leka po antitelu u smeši jedinjenja antitelo-lek konjugata iznosi od 1 do 4.
  21. 21. Konjugat prema bilo kom patentnom zahtevu od 1 do 19, za upotrebu u terapiji.
  22. 22. Konjugat prema bilo kom patentnom zahtevu od 1 do 19, za upotrebu u tretmanu proliferativne bolesti kod pacijenta.
  23. 23. Konjugat za upotrebu prema patentnom zahtevu 22, gde je bolest rak.
  24. 24. Konjugat za upotrebu prema patentnom zahtevu 23, gde je rak izabran iz grupe koju čine: hepatocelularni rak, hepatoblastom, rak ne malih ćelija pluća, rak malih ćelija pluća, rak debelog creva, rak dojke, rak želuca, rak pankreasa, neuroblastom, rak nadbubrežne žlezde, feohromocitom, paragangliom, medularni rak štitne žlezde, rak skeletnih mišića, liposarkom, gliom, Vilmsov tumor, neuroendokrini tumori, akutna mijeloidna leukemija i mijelodisplastični sindrom.
  25. 25. Farmaceutski sastav koji sadrži konjugat prema bilo kom patentnom zahtevu od 1 do 24, i farmaceutski prihvatljiv razblaživač, nosač ili ekscipijens.
  26. 26. Farmaceutski sastav prema patentnom zahtevu 25, koji dalje sadrži terapeutski efikasnu količinu hemoterapijskog agensa. 1 1
RS20211152A 2017-02-08 2018-02-08 Pirolobenzodiazepin-antitelo konjugati RS62343B1 (sr)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB1702031.4A GB201702031D0 (en) 2017-02-08 2017-02-08 Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
GBGB1719398.8A GB201719398D0 (en) 2017-11-22 2017-11-22 Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
GBGB1719391.3A GB201719391D0 (en) 2017-11-22 2017-11-22 Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
GBGB1719393.9A GB201719393D0 (en) 2017-11-22 2017-11-22 Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
PCT/EP2018/053188 WO2018146199A1 (en) 2017-02-08 2018-02-08 Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
EP18706437.3A EP3579883B1 (en) 2017-02-08 2018-02-08 Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS62343B1 true RS62343B1 (sr) 2021-10-29

Family

ID=61256913

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20211152A RS62343B1 (sr) 2017-02-08 2018-02-08 Pirolobenzodiazepin-antitelo konjugati

Country Status (24)

Country Link
US (2) US11384098B2 (sr)
EP (2) EP3579883B1 (sr)
JP (1) JP6704532B1 (sr)
KR (1) KR102153642B1 (sr)
CN (1) CN110300601B (sr)
AU (1) AU2018219654B2 (sr)
BR (1) BR112019016420A2 (sr)
CA (1) CA3047686C (sr)
CY (1) CY1124714T1 (sr)
DK (1) DK3579883T3 (sr)
ES (1) ES2890934T3 (sr)
HR (1) HRP20211640T1 (sr)
HU (1) HUE056289T2 (sr)
LT (1) LT3579883T (sr)
MX (1) MX375568B (sr)
NZ (1) NZ754811A (sr)
PL (1) PL3579883T3 (sr)
PT (1) PT3579883T (sr)
RS (1) RS62343B1 (sr)
SI (1) SI3579883T1 (sr)
SM (1) SMT202200068T1 (sr)
UA (1) UA123889C2 (sr)
WO (1) WO2018146199A1 (sr)
ZA (1) ZA201904269B (sr)

Families Citing this family (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2016359235B2 (en) 2015-11-25 2022-09-15 Ligachem Biosciences Inc. Antibody-drug conjugates comprising branched linkers and methods related thereto
GB201702031D0 (en) * 2017-02-08 2017-03-22 Medlmmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
CA3058360A1 (en) 2017-03-29 2018-10-04 Legochem Biosciences, Inc. Pyrrolobenzodiazepine dimer prodrug and ligand-linker conjugate compound of the same
EP3773727A4 (en) 2018-04-09 2022-05-04 Yale University BIFUNCTIONAL SMALL MOLECULES TO TARGETING THE SELECTIVE DEGRADATION OF CIRCULATING PROTEINS
US12485178B2 (en) 2018-04-09 2025-12-02 Yale University Bifunctional small molecules to target the selective degradation of circulating proteins
US20230097887A1 (en) 2018-04-09 2023-03-30 Yale University Bi-functional Molecules to Degrade Circulating Proteins
CN112601555A (zh) 2018-05-09 2021-04-02 乐高化学生物科学股份有限公司 与抗cd19抗体药物结合物相关的组合物和方法
WO2020127573A1 (en) 2018-12-19 2020-06-25 Adc Therapeutics Sa Pyrrolobenzodiazepine resistance
GB201820725D0 (en) 2018-12-19 2019-01-30 Adc Therapeutics Sarl Pyrrolobenzodiazepine resistance
KR102503143B1 (ko) * 2019-03-06 2023-02-24 주식회사 레고켐 바이오사이언스 인간 dlk1에 대한 항체를 포함하는 항체 약물 접합체 및 이의 용도
EP3936150A4 (en) * 2019-03-06 2023-03-29 LegoChem Biosciences, Inc. ANTIBODY-DRUG CONJUGATES COMPRISING ANTIBODY AGAINST HUMAN DLK1 AND USE THEREOF
CN113660954B (zh) * 2019-04-01 2025-01-14 凯奥目生物科学株式会社 癌症治疗用药物
GB201908128D0 (en) * 2019-06-07 2019-07-24 Adc Therapeutics Sa Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
KR20210028544A (ko) 2019-09-04 2021-03-12 주식회사 레고켐 바이오사이언스 인간 ror1에 대한 항체를 포함하는 항체 약물 접합체 및 이의 용도
KR20220099963A (ko) * 2019-10-10 2022-07-14 예일 유니버시티 세포 수용체를 통한 분자 분해제로서의 조작된 항체
KR20210086557A (ko) 2019-12-31 2021-07-08 주식회사 레고켐 바이오사이언스 피롤로벤조디아제핀 유도체 및 이의 리간드-링커 접합체
WO2021155317A1 (en) 2020-01-31 2021-08-05 Avilar Therapeutics, Inc. Asgpr-binding compounds for the degradation of extracellular proteins
TWI899083B (zh) * 2020-03-04 2025-10-01 韓商瑞嘉化學生物科學股份有限公司 包含針對人ｄｌｋ１的抗體的抗體藥物偶聯物及其用途
KR20230021018A (ko) * 2020-06-05 2023-02-13 재단법인 생물기술개발중심 항-메조텔린 항체를 함유하는 항체-약물 컨쥬게이트 및 이의 용도
GB202011993D0 (en) 2020-07-31 2020-09-16 Adc Therapeutics Sa ANTI-IL 13Ra2 antibodies
GB202012161D0 (en) * 2020-08-05 2020-09-16 Adc Therapeutics Sa Combination therapy
KR20240017423A (ko) 2021-05-03 2024-02-07 아빌라 테라퓨틱스, 인크. 이뮤노글로불린 및 다른 단백질의 분해를 위한 강력한 asgpr-결합 화합물
WO2022248268A1 (en) 2021-05-28 2022-12-01 Adc Therapeutics Sa Combination therapy
GB202107706D0 (en) 2021-05-28 2021-07-14 Adc Therapeutics S A Combination therapy
GB202107709D0 (en) 2021-05-28 2021-07-14 Adc Therapeutics S A Combination therapy
GB202107713D0 (en) 2021-05-28 2021-07-14 Medimmune Ltd Combination therapy
EP4279090A1 (en) * 2022-05-20 2023-11-22 ADC Therapeutics SA Composition comprising a pyrrolobenzodiazepine-based antibody drug conjugate
EP4548932A1 (en) 2022-06-30 2025-05-07 Toray Industries, Inc. Pharmaceutical composition for treating and/or preventing cancer
EP4389152A1 (en) * 2022-12-23 2024-06-26 Synaffix B.V. Conjugates of pbd prodrugs

Family Cites Families (52)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS58180487A (ja) 1982-04-16 1983-10-21 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 抗生物質ｄｃ−８１およびその製造法
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5583024A (en) 1985-12-02 1996-12-10 The Regents Of The University Of California Recombinant expression of Coleoptera luciferase
JPH08336393A (ja) 1995-04-13 1996-12-24 Mitsubishi Chem Corp 光学活性なγ−置換−β−ヒドロキシ酪酸エステルの製造法
US6602677B1 (en) 1997-09-19 2003-08-05 Promega Corporation Thermostable luciferases and methods of production
EP1720908A2 (en) 2004-02-17 2006-11-15 Absalus, Inc. Super-humanized antibodies against respiratory syncytial virus
DK1791565T3 (en) 2004-09-23 2016-08-01 Genentech Inc Cysteingensplejsede antibodies and conjugates
AU2006210724A1 (en) 2005-02-03 2006-08-10 Antitope Limited Human antibodies and proteins
SI1934174T1 (sl) 2005-10-07 2011-08-31 Exelixis Inc Inhibitorji MEK in postopki za njihovo uporabo
RS52060B (sr) 2006-01-25 2012-04-30 Sanofi Citotoksični agensi koji sadrže nove derivate tomaimicina
CL2008001334A1 (es) 2007-05-08 2008-09-22 Genentech Inc Anticuerpo anti-muc16 disenado con cisteina; conjugado que lo comprende; metodo de produccion; formulacion farmaceutica que lo comprende; y su uso para tratar el cancer.
ES2526355T3 (es) 2007-10-01 2015-01-09 Bristol-Myers Squibb Company Anticuerpos humanos que se adhieren a mesotelina, y usos de los mismos
NZ584514A (en) 2007-10-19 2012-07-27 Genentech Inc Cysteine engineered anti-tenb2 antibodies and antibody drug conjugates
EP2557986A4 (en) 2010-04-11 2014-01-22 Proteus Digital Health Inc APPARATUS, SYSTEM AND METHOD FOR DETECTION AND ADMINISTRATION OF MEDICINAL DOSE
SI2528625T1 (sl) * 2010-04-15 2013-11-29 Spirogen Sarl Pirolobenzodiazepini in njihovi konjugati
CA2795349C (en) 2010-04-15 2016-11-29 Seattle Genetics, Inc. Targeted pyrrolobenzodiazepine conjugates
JP5875083B2 (ja) 2010-04-15 2016-03-02 メディミューン リミテッド 増殖性疾患治療用ピロロベンゾジアゼピン
SI3173427T1 (sl) 2011-03-31 2019-08-30 ADC Therapeutics SA, Protitelesa proti antigenu 1, povezanemu z ledvicami, in antigen vezavni fragmenti le-tega
BR112014009050B1 (pt) 2011-10-14 2022-06-21 Medimmune Limited Conjugado anticorpo-fármaco de pirrolbenzodiazepinas, composição farmacêutica que compreende o mesmo, bem como compostos de pirrolbenzodiazepinas
KR102102239B1 (ko) 2012-01-09 2020-04-21 에이디씨 테라퓨틱스 에스에이 유방암을 치료하기 위한 방법
WO2014054820A1 (ja) 2012-10-03 2014-04-10 株式会社リブテック in vivoで抗腫瘍活性を有する抗ヒトDlk-1抗体
RS57694B1 (sr) 2012-10-12 2018-11-30 Adc Therapeutics Sa Pirolobenzodiazepin - anti-psma konjugati antitela
EP2906297B1 (en) 2012-10-12 2017-12-06 ADC Therapeutics SA Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
MX338711B (es) 2012-10-12 2016-04-28 Medimmune Ltd Pirrolobenzodiazepinas y conjugados de las mismas.
WO2014057118A1 (en) 2012-10-12 2014-04-17 Adc Therapeutics Sarl Pyrrolobenzodiazepine-anti-cd22 antibody conjugates
EP2906296B1 (en) 2012-10-12 2018-03-21 ADC Therapeutics SA Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
HRP20182129T1 (hr) 2012-10-12 2019-02-08 Adc Therapeutics Sa Konjugati protutijelo - pirolobenzodiazepin
JP6392765B2 (ja) 2012-10-12 2018-09-19 エイディーシー・セラピューティクス・エス・アーＡｄｃ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｓａ ピロロベンゾジアゼピン−抗体結合体
SI2906252T1 (sl) 2012-10-12 2017-10-30 Adc Therapeutics Sa Pirolobenzodiazepin-anti-HER2 protitelesni konjugati
ES2680153T3 (es) 2012-10-12 2018-09-04 Adc Therapeutics Sa Conjugados de anticuerpos anti-PSMA-pirrolobenzodiazepinas
US20160106861A1 (en) * 2013-04-26 2016-04-21 Spirogen Sarl Axl antibody-drug conjugate and its use for the treatment of cancer
EP3054983B1 (en) 2013-10-11 2019-03-20 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
US20160256561A1 (en) 2013-10-11 2016-09-08 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
WO2015052535A1 (en) 2013-10-11 2015-04-16 Spirogen Sàrl Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
WO2015052534A1 (en) 2013-10-11 2015-04-16 Spirogen Sàrl Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
GB201406767D0 (en) 2014-04-15 2014-05-28 Cancer Rec Tech Ltd Humanized anti-Tn-MUC1 antibodies anf their conjugates
RU2715905C2 (ru) 2014-10-01 2020-03-04 МЕДИММЬЮН, ЭлЭлСи Способ конъюгации полипептида
CN107106701B (zh) * 2014-10-03 2020-11-06 西纳福克斯股份有限公司 磺酰胺接头、其缀合物及制备方法
CN107148285B (zh) 2014-11-25 2022-01-04 Adc治疗股份有限公司 吡咯并苯并二氮杂䓬-抗体缀合物
GB201506393D0 (en) 2015-04-15 2015-05-27 Berkel Patricius H C Van And Howard Philip W Site-specific antibody-drug conjugates
GB201506405D0 (en) 2015-04-15 2015-05-27 Berkel Patricius H C Van And Howard Philip W Site-specific antibody-drug conjugates
GB201506402D0 (en) 2015-04-15 2015-05-27 Berkel Patricius H C Van And Howard Philip W Site-specific antibody-drug conjugates
GB201506394D0 (en) 2015-04-15 2015-05-27 Berkel Patricius H C Van And Howard Philip W Site-specific antibody-drug conjugates
GB201506407D0 (en) 2015-04-15 2015-05-27 Berkel Patricius H C Van And Howard Philip W Site-specific antibody-drug conjugates
GB201506388D0 (en) 2015-04-15 2015-05-27 Berkel Patricius H C Van And Cancer Res Technology Ltd And Howard Philip W Site-specific antibody-drug conjugates
GB201506409D0 (en) 2015-04-15 2015-05-27 Williams David G And Berkel Patricius H C Van And Howard Philip W Humanized anti-axl antibodies and their conjugates
GB201506389D0 (en) 2015-04-15 2015-05-27 Berkel Patricius H C Van And Howard Philip W Site-specific antibody-drug conjugates
GB201506399D0 (en) 2015-04-15 2015-05-27 Berkel Patricius H C Van And Howard Philip W Site-specific antibody-drug conjugates
GB201507827D0 (en) 2015-05-07 2015-06-17 Adc Therapeutics Sarl Diagnostic test
WO2017137458A1 (en) 2016-02-08 2017-08-17 Synaffix B.V. Antibody-conjugates with improved therapeutic index for targeting cd30 tumours and method for improving therapeutic index of antibody-conjugates
WO2017137457A1 (en) 2016-02-08 2017-08-17 Synaffix B.V. Antibody-conjugates with improved therapeutic index for targeting cd30 tumours and method for improving therapeutic index of antibody-conjugates
EP3413920A1 (en) 2016-02-08 2018-12-19 Synaffix B.V. Bioconjugates containing sulfamide linkers for use in treatment

Also Published As

Publication number Publication date
EP3939616A1 (en) 2022-01-19
DK3579883T3 (da) 2021-09-06
KR20190100413A (ko) 2019-08-28
JP2020518551A (ja) 2020-06-25
PL3579883T3 (pl) 2022-01-24
PT3579883T (pt) 2021-09-28
SI3579883T1 (sl) 2021-12-31
CN110300601B (zh) 2024-01-05
KR102153642B1 (ko) 2020-09-09
ZA201904269B (en) 2022-12-21
CY1124714T1 (el) 2022-07-22
EP3579883B1 (en) 2021-08-11
CA3047686C (en) 2020-07-07
CN110300601A (zh) 2019-10-01
BR112019016420A2 (pt) 2020-04-07
MX2019009427A (es) 2019-10-07
SMT202200068T1 (it) 2022-05-12
UA123889C2 (uk) 2021-06-16
EP3579883A1 (en) 2019-12-18
NZ754811A (en) 2023-06-30
LT3579883T (lt) 2021-10-25
JP6704532B1 (ja) 2020-06-03
AU2018219654B2 (en) 2019-10-10
US20210079020A1 (en) 2021-03-18
HRP20211640T1 (hr) 2022-02-04
US20230053603A1 (en) 2023-02-23
HUE056289T2 (hu) 2022-02-28
MX375568B (es) 2025-03-06
US11384098B2 (en) 2022-07-12
WO2018146199A1 (en) 2018-08-16
CA3047686A1 (en) 2018-08-16
ES2890934T3 (es) 2022-01-25
AU2018219654A1 (en) 2019-07-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20230053603A1 (en) Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
US11813335B2 (en) Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
ES2931051T3 (es) Conjugados de pirrolobenzodiacepina y anticuerpo
HK40056993A (en) Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
HK40012498B (en) Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
HK40012498A (en) Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
EA040749B1 (ru) Конъюгаты пирролобензодиазепин-антитело
HK40012528A (en) Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
HK40012528B (en) Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
EA039826B1 (ru) Конъюгаты пирролобензодиазепин-антитело