RS62429B1 - Cetilirane masne kiseline, sistem za njihovu pripremu i njihova upotreba - Google Patents

Description

Opis

[0001] Ovaj pronalazak odnosi se na postupak za pripremu mešavine cetiliranih masnih kiselina i sistem za izvođenje pomenutog postupka. Osim toga, ovaj pronalazak odnosi se na kompoziciju koja obuhvata ili, alternativno, koju čini pomenuta mešavina cetiliranih masnih kiselina. Konačno, ovaj pronalazak odnosi se na pomenutu kompoziciju za upotrebu u lečenju i/ili prevenciji: (i) reumatoidnog artritisa zapaljenskog i nezapaljenskog porekla, posebno osteoartritisa; (ii) drugih upalnih stanja zglobova; (iii) psorijaze, lupusa, parodontalnih bolesti ili kardiovaskularnih ili srčanih bolesti; (iv) svih posttraumatskih osteoartikularnih patologija, uključujući sportske povrede; (v) svih degenerativnih patologija zglobova (artroza, gonartroza, koksartroza, itd.) i (vi) zapaljenskih-traumatičnih tetiva i mišićnih stanja. Dalje, predviđeno je da se kompozicija ovog pronalaska koristi u lečenju i/ili prevenciji gorepomenutih patologija i poremećaja (i)-(vi) u vezi sa rehabilitacionom terapijom. Kompozicija koja obuhvata pomenutu mešavinu formuliše se u farmaceutski oblik za oralnu upotrebu (novi prehrambeni proizvod, dodatak ishrani ili medicinsko sredstvo), tj. u obliku pilula, pastila, kapsula, tableta, granula, disperzibilnog praška, sirupa, rastvora, rastvora za prskanje; za topikalnu upotrebu (kompozicija za neko medicinsko sredstvo), tj. u obliku krema, sredstva za mazanje, masti, gela ili spreja koji se koriste kao takvi za nanošenje na kožu, ili inače za transdermalnu upotrebu u obliku lekovitog flastera.

[0002] Dobro je poznato da se reakcija esterifikacije između masne kiseline i alkohola dugog lanca (dužeg od C12) ili alkohola velike molekulske mase (MW veće od 200) može izvesti u prisustvu hemijskog rastvarača, kao što je toluen, koji se ponaša kao azeotropni rastvarač za uklanjanje vode iz esterifikacije. Kiseli katalizator kao što je sumporna kiselina takođe se koristi u reakciji, a postupak se izvodi u reaktoru opremljenom sa aparaturom po Markusonu. Kada se koristi takav postupak, krajnji estarski proizvod, koji ima voštanu konzistenciju, je crne boje zbog prisustva sumporne kiseline, koja izaziva delimičnu karbonizaciju krajnjeg estarskog proizvoda. Crna boja može da se ukloni ispiranjem razblaženim alkalijama, koje neutrališu katalizator, i natrijumhloridom koji favorizuje razdvajanje faza. Korišćenjem ove vrste postupka, potrebno je, štaviše, da se potpuno ukloni korišćen rastvarač od krajnjeg estarskog proizvoda. Potpuno uklanjanje rastvarača ne može uvek jednostavno da se postigne, u bilo kom slučaju predstavlja trošak i veliku tehnološku komplikaciju. Kao rezultat pomenutih obaveznih faza na kraju reakcije esterifikacije, ovaj poznati postupak je skup i zahteva složene tehnologije. Osim toga, upotreba rastvarača tokom reakcije esterifikacije ne garantuje uvek njihovo potpuno i celokupno uklanjanje iz krajnjeg proizvoda, a uvek postoji rizik od zaostalog sadržaja rastvarača u krajnjem proizvodu koji može da bude iznad graničnih vrednosti koje nameću regulatorna tela za medicinske ili kozmetičke primene.

Ovo je razlog zašto upotreba krajnjeg proizvoda dobijenog korišćenjem rastvarača, čak i ako dođe do velikog smanjenja količine istih, može naići na regulatorne prepreke ako se koristi za oralnu ili topikalnu primenu.

[0003] G. Bartoli et al. (Adv. Synth. Catal.2005, 1, 33-38) opisuje postupak za esterifikaciju karboksilnih kiselina sa alkoholima u prisustvu cink-perhlorat heksahidrata kao katalizatora i magnezijumsulfata kao sredstva za dehidrataciju.

[0004] Prisustvo čvrstog sredstva za dehidrataciju zahteva dodatnu filtraciju i faze prečišćavanja, koje su naročito nepoželjne za reakcije velikih razmera.

[0005] Štaviše, važno je istaći da je jon perhlorata snažno oksidujuće sredstvo koje, čak i na relativno niskim temperaturama, izaziva razgradnju alkil jedinjenja kao što su reagensi i proizvod reakcije na koji se ovaj pronalazak odnosi. Ovo je tačno u konkretnom slučaju struktura koje sadrže nezasićene sisteme. Osim toga, prisustvo perhlorata može takođe da predstavlja opasnost, budući da perhlorna kiselina i njene soli mogu takođe da izazovu eksplozije u reakcionoj sredini.

[0006] Drugi značajan faktor je da perhlorna kiselina, kao sumporna kiselina i p-toluensulfonska kiselina, katalizuje parazitsku reakciju koja dovodi do obrazovanja estolida nezasićenih masnih kiselina, tj. estara kiselina dugih lanaca obrazovanih od hidroksi kiselina esterifikacijom dve kiseline koje imaju istu strukturu ili različite formule, koji su nepoželjni nusproizvodi, na primer preko obrazovanja epoksida na dvostrukoj vezi neke nezasićene masne kiseline. Prema tome, ostaje potreba za postojanjem postupka (i povezanog sistema) koji je jednostavan za izvođenje, ekonomičan i moguć za pripremu, sa visokim prinosom, gde će se estar kao sirovi materijal koristiti u kompoziciji gotovog proizvoda za oralnu i topikalnu upotrebu. Poželjno je da postoji postupak (i povezani sistem) kod kojeg nije potrebno uklanjanje rastvarača na kraju reakcije esterifikacije, ali je ipak moguće uklanjanje vode proizvedene tokom reakcije esterifikacije radi favorizovanja napredovanja reakcije, kao i neizreagovalih jedinjenja na kraju same reakcije. Osim toga, poželjno je postojanje postupka (i povezanog sistema) koji ne dovodi do sekundarnih reakcija ili nusproizvoda reakcije, kao što su, na primer, estolidi.

[0007] Međutim, jednostavna primena vakuuma tokom reakcije esterifikacije ima dejstvo ne samo da uklanja proizvedenu vodu iz reakcionog suda, već i da ukloni polazne reagense (tj. masna kiselina i cetil alkohol) koji nisu još izreagovali. Kao rezultat, ne samo da je prinos reakcije smanjen, već može da dođe do okluzije u kondenzatoru iznad vakuumske pumpe, a iza reaktora ili reakcionog suda, čak u početnim fazama reakcije. Prema tome, takođe sa stanovišta inženjeringa postrojenja, postoji potreba za uvođenjem izmena/poboljšanja u postojeće sisteme da bi se prevazišla ograničenja i nedostaci prisutni u njima.

[0008] Dokument US 4,113,881 opisuje postupak proizvodnje cetil miristoleata ekstrakcijom iz tkiva miševa ili sintetički, i upotrebu cetil miristoleata u lečenju simptoma zapaljenskog reumatoidnog artritisa. Sinteza cetil miristoleata izvodi se reagovanjem cetil alkohola i miristoleinske kiseline u benzenu u prisustvu p-toluensulfonske kiseline (Primer II). Reakcija esterifikacije opisana u US 4,113,881 je katalizovana kiselinom i izvedena u prisustvu rastvarača.

[0009] Prijavilac, nakon dugotrajne i intenzivne istraživačke aktivnosti, iznenađujuće je otkrio da gorepomenuti nedostaci mogu da se prevaziđu zahvaljujući postupku (i povezanom sistemu) kao što je opisano u nastavku. Zahvaljujući postupku i povezanom sistemu koji su ovde opisani i za koje se traži zaštita patentom, prijavilac može da pripremi mešavinu cetiliranih masnih kiselina jednostavno i ekonomično, sa veoma velikom brzinom reakcije i veoma visokim prinosima, bez rastvarača, i na način pogodan za pripremu farmaceutske kompozicije ili kompozicije za neko medicinsko sredstvo ili dodatka ishrani za oralnu upotrebu u obliku pilula, pastila, kapsula, tableta, granula, disperzibilnog praška, sirupa, rastvora, rastvora za prskanje; ili za topikalnu upotrebu u obliku krema, sredstva za mazanje, masti, gela ili spreja koji se koriste kao takvi za nanošenje na kožu, ili inače za transdermalnu upotrebu u obliku lekovitog flastera.

[0010] Ovaj pronalazak odnosi se na postupak za pripremu mešavine cetiliranih masnih kiselina, kao što je definisano u priloženim patentnim zahtevima.

[0011] Ovaj pronalazak odnosi se na sistem za pripremu pomenute mešavine cetiliranih masnih kiselina, u skladu sa postupkom ovog pronalaska, kao što je definisano u priloženim patentnim zahtevima.

[0012] Ovaj pronalazak odnosi se na kompoziciju koja obuhvata pomenutu mešavinu cetiliranih masnih kiselina, kao što je definisano u priloženim patentnim zahtevima.

[0013] Ovaj pronalazak odnosi se na kompoziciju koja obuhvata pomenutu mešavinu cetiliranih masnih kiselina za upotrebu u lečenju i/ili prevenciji: (i) reumatoidnog artritisa zapaljenskog i nezapaljenskog porekla, posebno osteoartritisa; (ii) drugih upalnih stanja zglobova; (iii) psorijaze, lupusa, parodontalnih bolesti ili kardiovaskularnih ili srčanih bolesti; (iv) svih posttraumatskih osteoartikularnih patologija, uključujući sportske povrede; (v) svih degenerativnih patologija zglobova (artroza, gonartroza, koksartroza, itd.) i (vi) zapaljenskih-traumatičnih tetiva i mišićnih stanja, kao što je definisano u priloženim patentnim zahtevima.

[0014] Ovaj pronalazak odnosi se na kompoziciju za upotrebu u lečenju i/ili prevenciji gorepomenutih patologija i poremećaja (i)-(vi) u vezi sa rehabilitacionom terapijom.

[0015] Pomenuta mešavina cetiliranih masnih kiselina i pomenuta kompozicija koja sadrži istu mogu da modulišu i smanjuju zapaljenske mehanizme brzo i efikasno, čime se obezbeđuje veoma snažno antizapaljensko dejstvo.

[0016] Poželjni načini ostvarivanja ovog pronalaska detaljno su opisani u nastavku bez bilo kakve namere da se ograniči obim ovog pronalaska.

[0017] Postupak ovog pronalaska obuhvata fazu u kojoj se najmanje jedna masna kiselina biljnog ili životinjskog porekla (reagens reakcije) dovodi u kontakt sa cetil alkoholom (reagens reakcije) [1-heksadekanol, CAS 36653-82-4, EINECS 253-149-0] i katalizatorom, u odsustvu rastvarača (kao što je, na primer, u odsustvu vode ili u odsustvu bilo kog organskog rastvarača ili neorganskog rastvarača). Dva reagensa reakcije dovode se u kontakt na početnom pritisku od 1 atmosfera (1 atm = 1.01 bar). Tokom celog toka reakcije esterifikacije, pritisak može da ostane konstantan na 1 atmosfera, ili, inače, može da se smanji, kao što je bolje opisano u nastavku, podešavanjem vakuumskog programa tokom celog toka reakcije. Masne kiseline su biljnog ili životinjskog porekla i odabrane su iz grupe koja obuhvata ili, alternativno, koju čine miristinska kiselina, na primer miristinska kiselina tipa [tetradekanoinska kiselina, CAS 544-63-8, EINECS 208-875-2], oleinska kiselina, na primer oleinska kiselina tipa [CAS 112-80-1, EINECS 204-007-1] i njihove mešavine. Miristinska kiselina može da bude miristinska kiselina sa čistoćom obuhvaćenom od 90% do 99%, poželjno od 94% do 98%. Oleinska kiselina može da bude oleinska kiselina sa čistoćom obuhvaćenom od 70% do 95%, poželjno od 75% do 90%, čak poželjnije od 80% do 85%.

[0018] U nekom poželjnom načinu ostvarivanja, polazna mešavina masnih kiselina može da obuhvata od 50mas.% do 99mas.% miristinske kiseline, na primer miristinske kiseline tipa [tetradekanoinska kiselina, CAS 544-63-8, EINECS 208-875-2] i od 1mas.% do 50mas.% oleinske kiseline, na primer oleinska kiselina tipa [CAS 112-80-1, EINECS 204-007-1].

[0019] U nekom drugom poželjnom načinu ostvarivanja, polazna mešavina masnih kiselina može da obuhvata od 60mas.% do 90mas.% miristinske kiseline, na primer miristinske kiseline tipa [tetradekanoinska kiselina, CAS 544-63-8, EINECS 208-875-2] i od 40mas.% do 10mas.% oleinske kiseline, na primer oleinske kiseline tipa [CAS 112-80-1, EINECS 204-007-1].

[0020] Na primer, polazna mešavina masnih kiselina obuhvata 65mas.% miristinske kiseline, na primer miristinske kiseline tipa [tetradekanoinska kiselina, CAS 544-63-8, EINECS 208-875-2] i 35mas.% oleinske kiseline, na primer oleinske kiseline tipa [CAS 112-80-1, EINECS 204-007-1].

[0021] Katalizator je metalni katalizator i može poželjno da bude cink prah. U jednom načinu ostvarivanja, korišćeni katalizator je metalni prah cinka. Količina dodatog katalizatora obuhvaćena je od 0.05mas.% do 0.3mas.% u odnosu na ukupnu masu reagenasa reakcije (tj. masna kiselina ili mešavina masnih kiselina cetil alkohol). Poželjno, količina dodatog katalizatora obuhvaćena je od 0.1mas.% do 0.25mas.%; čak poželjnije, obuhvaćena je od 0.15mas.% do 0.20mas.%.

[0022] Otkriveno je da je upotreba metalnog praškastog katalizatora kao što je, na primer, metalni prah cinka, naročito povoljna jer, osim toga što obezbeđuje odlične prinose i visoku čistoću proizvoda reakcije, može jednostavno da se ukloni iz krajnje mešavine filtracijom. Na primer, sadržaj cinka u krajnjem proizvodu koji je dobijen u postupku ovog pronalaska jednaka je ili manja od 20 ppm. Ovaj sadržaj je savršeno kompatibilan sa upotrebom proizvoda reakcije u farmaceutske ili kozmetičke svrhe, a takođe uzimajući u obzir da cink ima tolerantnost koja je značajno veća od one drugih metala, kao što su, na primer, kalaj i titanijum, koji mogu da se koriste kao katalizatori u reakcijama esterifikacije u obliku soli, npr. hloridi ili oksidi.

[0023] Reakcija se izvodi na temperaturi obuhvaćenoj od 150C° do 200°C, poželjno na temperaturi obuhvaćenoj od 160°C do 190°C, čak poželjnije na 180°C. Reakciono vreme je obuhvaćeno od 1 sata do 10 sati, poželjno od 1 sata do 8 sati, poželjno od 4 sata do 7 sati. Stručnjak u tehnici upoznat je sa činjenicom da reakciono vreme zavisi od korišćenih uslova reakcije (temperatura, pritisak, vrsta katalizatora i koncentracije reagenasa).

[0024] Uklanjanje vode iz reakcije koja se obrazuje tokom reakcije esterifikacije je neophodna faza kako bi se dobila optimalna konverzija/prinos reakcije. Uklanjanje vode iz reakcione sredine može da se postigne vakuumskom destilacijom koja se izvodi tokom cele reakcije esterifikacije u reaktoru, korišćenjem vakuumskog programa koji primenjuje smanjenje reakcionog pritiska na nelinearan način (vidi postupak II i aparaturu II opisane u nastavku). U ovom slučaju se vakuumski program primenjuje na ceo sistem i ceo postupak. Alternativno, uklanjanje vode iz reakcione sredine može se postići na konstantnom pritisku od 1 atm pomoću toka inertnog gasa koji se uvodi u reakcionu sredinu tokom reakcije esterifikacije. Tok inertnog gasa služi za prenos/izvlačenje vode iz reakcije obrazovane od reakcione sredine (vidi postupak I i aparaturu I opisane u nastavku).

[0025] Otkriveno je da upotreba nekog inertnog gasa, kao što je, na primer azot, argon ili njihove mešavine, takođe ima zaštitni efekat protiv oksidacije materijala, naročito u odnosu na nezasićene sisteme, kao što je onaj miristoleinske kiseline ili drugih nezasićenih masnih kiselina koje mogu da budu prisutne (npr. palmitoleinska, oleinska, linolna i linoleinska kiselina).

[0026] Povoljno je otkriveno da krajnji proizvod postupka prema ovom pronalasku (naznačen kao MI na Fig.1-4) ima visoku čistoću, na primer veću od 95%. U stvari, korišćenjem pogodnih analitičkih postupaka kao što je gasna hromatografija sa detektorom jonizacije plamenom (GC-FID), nisu detektovane nečistoće kao što su nusproizvodi oksidacije ili estolidi, koji se uopšteno dobijaju u značajnim količinama u uslovima esterifikacije prema stanju tehnike.

[0027] Obično, prinos reakcije je veći od 95%, a mešavina na kraju reakcije sadrži ne više od 3% cetil alkohola i ne više od 1.4% polazne mešavine masnih kiselina (masa/ukupna masa mešavine MI). Nakon filtriranja katalizatora i, opciono, obrade dezodorantom da bi se dobila MF (Fig.1-4), na primer na 180°C i na rezidualnom pritisku od 10 mbar, sadržaj cetil alkohola je manji od 1.5%, a sadržaj mešavine masnih kiselina je manji od 0.9%. Dobija se čistoća veća od 97.5%. Prijavilac je iznenađujuće otkrio da je primenom vakuumskog programa, pažljivo odabranog prema stepenu razvoja reakcije, moguće da se favorizuje napredovanje reakcije uklanjanjem samo vode bez izazivanja destilacije reagenasa, iznad svega u ranim fazama reakcije, na primer u okviru prva dva/tri sata (vidi postupak II, aparatura II).

[0028] U jednom načinu ostvarivanja, reakcija se izvodi primenom vakuumskog programa (smanjenje pritiska unutar reaktora i celog sistema na nelinearan način - vidi postupak II, aparatura II) u kojem je primenjeni pritisak, na primer, jednak 60000 Pa (600 mbar) i smanjuje se na nelinearan način do 500 Pa (5 mbar), na primer, nakon 7 sata. Poželjno, početni reakcioni pritisak je 1 atm, a zatim se primenjuje smanjenje pritiska koje je, na primer, jednako 600 mbar tokom prvog sata a zatim opada, na primer, do 500 mbar 2 sata nakon početka, 300 mbar 3 sata nakon početka, 200 mbar 5 sati nakon početka i 5 mbar 7 sati nakon početka (ukupno reakciono vreme od 7 sati). Takođe mogu da se koriste drugi vakuumski programi.

[0029] Prijavilac je otkrio korisnim i povoljnim da se reaktor sistema ovog pronalaska opremi vertikalnim kondenzatorom i horizontalnim kondenzatorom, koji su postavljeni u nizu i sa kontrolisanom temperaturom (vidi postupak II, aparatura II) ili, alternativno, samo horizontalnim kondenzatorom (vidi postupak I, aparatura I). Vertikalni kondenzator se održava na temperaturi obuhvaćenoj od 70°C do 90°C, poželjno na temperaturi od 80°C, dok se horizontalni kondenzator, u oba slučaja, održava na temperaturi obuhvaćenoj od 10°C do 40°C, poželjno na temperaturi od 25°C. Vertikalni kondenzator favorizuje isparavanje vode i istovremeno kondenzovanje reagenasa, koji se na taj način recikliraju u reakcionom sudu. Štaviše je dokazano da je posebna prednost, u oba slučaja, da tok inertnog gasa prolazi kroz reaktor tokom reakcije. Poželjno, pomenuti inertni gas je gas azota.

[0030] U pomenutom prvom načinu ostvarivanja (postupak I, aparatura I), inertni gas se uvodi u reakcionu sredinu, poželjno kao kontinuirani tok, ne u reakcionu masu, već u zapreminu iznad (na vrhu reaktora) pomenute reakcione mase sadržane u reaktoru.

[0031] U pomenutom drugom načinu ostvarivanja (postupak II, aparatura II), inertni gas se uvodi u reakcionu sredinu, poželjno kao kontinuirani tok, u reakcionu masu prisutnu u reaktoru (dodaje masi) pomoću cevi umetnute u reakcionoj masi.

[0032] Ovaj pronalazak odnosi se na sistem za izvođenje postupka za pripremu mešavine cetiliranih masnih kiselina koja obuhvata ili, alternativno, koju čine cetil miristat i/ili cetil oleat.

[0033] U prvom načinu ostvarivanja šematski prikazanom na Fig.1 (postupak I), sistem 1 obuhvata reaktor 2 predstavljen sudom 3 koji je obezbeđen sredstvom 4 za mešanje, kao što je, na primer, mehanička mešalica, sredstvima 5 za zagrevanje, kao što je, na primer omotač izveden na spoljašnjoj strani suda 3, unutar kojeg se zagrejani fluid propušta, sredstvima 6 za kontrolu temperature unutar suda, sredstvima 7 za uduvavanje inertnog gasa unutar suda, ulaznim otvorom 8 koji je izveden u gornjem delu suda 3a da bi se omogućilo uvođenje čvrstih materija ili reagenasa, izlaznim otvorom 9 koji je izveden u donjem bočnom delu suda 3 da bi se omogućilo prikupljanje uzoraka iz reakcije, i ventilom 10 koji omogućava ispuštanje mešavine na kraju postupka.

[0034] Reaktor 2, preko suda 3, je povezan sa horizontalnim kondenzatorom 11, koji ima prvi ulazni kraj 11a i drugi izlazni kraj 11b, pomoću cevovoda 12. Glavna osa horizontalnog kondenzatora 11 prostire se na način suštinski paralelno sa ostatkom površine reaktora 2. Cevovod 12 je postavljen između gornjeg dela suda 3a i pomenutog prvog ulaznog kraja horizontalnog kondenzatora 11a. Horizontalni kondenzator 11 povezan je sa sudom 13 za prikupljanje vode iz reakcije preko cevovoda 14. Cevovod 14 postavljen je između pomenutog drugog izlaznog kraja 11b i gornjeg dela suda 13a.

[0035] U prvom načinu ostvarivanja, postupak (I), za pripremu mešavine cetiliranih masnih kiselina koja obuhvata ili, alternativno, koju čine cetil miristat i/ili cetil oleat izvodi se pomoću sistema na Fig.1.

[0036] Postupak obuhvata fazu u kojoj se oleinska i/ili miristinska kiselina dovode u kontakt da bi reagovale sa cetil alkoholom u prisustvu katalizatora kao što je metal cink, da bi se dobila reakciona mešavina 15. Za svrhu izvođenja ove faze, pomenute masne kiseline, cetil alkohol i, kasnije kada je masa reaktivnih supstanci u istopljenom stanju, katalizator (u odsustvu rastvarača) uvode se u reaktor 2 tako što se uvode kroz otvor 8.

[0037] Reakciona mešavina se dovodi na reakcionu temperaturu jednaku ili manju od 100°C i pritisak od 1 atm. Radi zagrevanja, zagrejani fluid, kao što je, na primer, zagrejano ulje ili vodena para, uvodi se pod pritiskom, na temperaturi kao što je da bi se dobila željena reakciona temperatura u omotaču 5 suda 3. Tokom faze zagrevanja, reakciona mešavina 15, koja je unutar reaktora 2, sredstvo 4 za mešanje i sredstva 6 za kontrolu temperature aktiviraju se i inertni gas, na primer azot, se uduvava/uvodi u sud 3 preko sredstava 7 za uduvavanje. Inertni gas, azot, ne uduvava se/ne uvodi se u reakcionu mešavinu 15, već se uvodi u sud 3, u zapreminu koja je iznad reakcione mešavine 15. Pomenute masne kiseline, cetil alkohol i katalizator (povoljno u odsustvu rastvarača, pritisak jednak 101325 Pa (1 atm) i temperatura obuhvaćena od 150°C do 200°C) dovode do reakcije esterifikacije unutar reakcione mešavine 15, pri čemu se proizvode cetilirani estri i voda iz esterifikacije. Reakcija esterifikacije izvodi se bez upotrebe vakuuma, već na pritisku od 101325 Pa (1 atm). Voda iz esterifikacije prisutna u reakcionoj mešavini 15, u uslovima reakcione temperature i pritiska, transformiše se u vodenu paru, koja se uklanja iz suda 3. Vodena para se uklanja iz suda 3 zahvaljujući toku azota koji se uvodi/uduvava u deo zapremine iznad reakcione mešavine 15 (zapremina iznad reakcione mešavine). Vodena para i azot dolaze u horizontalni kondenzator 11 preko cevovoda 12. Izlaz inertnog gasa iz suda 3 prolazi kroz cevovode 12 i 14, obnavlja se i ponovo uvodi u sud 3 (pomoću sistema cevi i ventila koji nisu prikazani na Fig.1) preko sredstava 7 za uduvavanje.

[0038] Horizontalni kondenzator 11 ima ulogu u kondenzovanju vode iz esterifikacije, njenom uklanjanju iz reakcione mešavine 15 tako da se vodi reakcija esterifikacije ka najvećem mogućem prinosu. Voda iz esterifikacije kondenzovana u tečno stanje prikuplja se u sudu 13 preko cevovoda 14. Da bi se postigla kondenzacija vode iz esterifikacije, kondenzator 11 se održava na temperaturi manjoj od 100°C, na primer na temperaturi obuhvaćenoj od 10°C do 40°C, poželjno od 20°C do 30°C, i pritisku od 1 atm. Na kraju reakcije esterifikacije (izvedene bez upotrebe rastvarača, na pritisku od 1 atm i bez vakuuma) mešavina cetiliranih masnih kiselina se hladi i ispušta kroz ventil 10.

[0039] U drugom načinu ostvarivanja šematski prikazanom na Fig.2 (postupak II), sistem 1 obuhvata reaktor 2 predstavljen sudom 3 koji je obezbeđen sredstvom 4 za mešanje, na primer mehanička mešalica, sredstvima 5 za zagrevanje, na primer omotač izveden na spoljašnjoj strani suda 3, unutar kojeg se propušta zagrejan fluid, sredstvima 6 za kontrolu temperature unutar suda, sredstvima 7 za uduvavanje inertnog gasa u reakcionu mešavinu 15 sadržanu u sudu 3, ulaznim otvorom 8 koji je izveden u gornjem delu suda 3a da bi se omogućilo uvođenje čvrstih materija ili reagenasa, izlaznim otvorom 9 koji je izveden u donjem bočnom delu suda 3 da bi se omogućilo prikupljanje uzoraka iz reakcije, i ventilom 10 da bi se omogućilo ispuštanje mešavine na kraju postupka.

[0040] Reaktor 2, preko suda 3, povezan je sa vertikalnim kondenzatorom 16 koji ima prvi ulazni kraj 16a i drugi izlazni kraj 16b, pomoću cevovoda 12. Glavna osa vertikalnog kondenzatora 16 prostire se suštinski upravno na ostatak površine reaktora 2. Cevovod 12 je smešten između gornjeg dela suda 3a i pomenutog prvog ulaznog kraja vertikalnog kondenzatora 16a. Vertikalni kondenzator 16 povezan je sa horizontalnim kondenzatorom 11, koji ima prvi ulazni kraj 11a i drugi izlazni kraj 11b, preko cevovoda 17. Glavna osa horizontalnog kondenzatora 11 prostire se suštinski paralelno ostatku površine reaktora 2. Cevovod 17 smešten je između kraja vertikalnog kondenzatora 16b i pomenutog prvog ulaznog kraja horizontalnog kondenzatora 11a. Horizontalni kondenzator 11 povezan je sa sudom 13 za prikupljanje vode iz reakcije preko cevovoda 14. Cevovod 14 postavljen je između pomenutog drugog izlaznog kraja 11b i gornjeg dela suda 13a. Cevovod 14 obuhvata izlaz 18 u pumpu ili uređaj (nije prikazan na Fig.2) koji može da stvara vakuum (pritisak manji od 1 atm) ili, bolje, vakuumski program sa nelinearnim smanjenjem pritiska. U drugom načinu ostvarivanja, postupak (II), za pripremu mešavine cetiliranih masnih kiselina koja obuhvata ili, alternativno, koju čine cetil miristat i/ili cetil oleat izvodi se pomoću sistema na Fig.2. Postupak obuhvata fazu u kojoj oleinska i/ili miristinska kiselina dolaze u kontakt da bi reagovale sa cetil alkoholom u prisustvu nekog katalizatora kao što je metal cink, da bi se dobila reakciona mešavina 15. Da bi se izvela ova faza, pomenute masne kiseline, cetil alkohol i katalizator (u odsustvu rastvarača) uvode se u reaktor 2 tako što se uvode kroz otvor 8.

[0041] Reakciona mešavina dovodi se do reakcione temperature jednake ili manje od 100°C i pritiska od 1 atm ili, drugačije, reakcione temperature veće od 100°C, na primer temperatura obuhvaćena od 150°C do 200°C. U svrhe zagrevanja, zagrejani fluid, kao što je, na primer, zagrejano ulje ili vodena para uvodi se pod pritiskom, na temperaturi kao što je da bi se dobila željena reakciona temperatura u omotaču 5 suda 3. Tokom faze zagrevanja, reakciona mešavina 15, koja je unutar reaktora 2, sredstvo 4 za mešanje i sredstva 6 za kontrolu temperature aktiviraju se i inertni gas, na primer azot, se uduvava/uvodi u sud 3 pomoću sredstava 7 za uduvavanje. Inertni gas, azot, se uduvava/uvodi u reakcionu mešavinu 15.

Pomenute masne kiseline, cetil alkohol i katalizator (povoljno u odsustvu rastvarača i na temperaturi obuhvaćenoj od 150°C do 200°C) dovode do reakcije esterifikacije unutar reakcione mešavine 15, pri čemu se proizvode cetilirani estri i voda iz esterifikacije. Voda iz esterifikacije prisutna u reakcionoj mešavini 15, pod reakcionim uslovima temperature i pritiska, transformiše se u vodenu paru, koja mora da se ukloni iz suda 3 da bi se povećao prinos reakcije. Vodena para se uklanja iz suda 3 pomoću vakuumskog programa sa smanjenjem nelinearnog pritiska koje se odvija iza kondenzatora 11. Vodena para i azot dolaze u horizontalni kondenzator 11 preko cevovoda 12. Izlaz inertnog gasa iz suda 3 prolazi kroz cevovode 12, 17 i 14, obnavlja se i ponovo uvodi u sud 3 (pomoću sistema cevi i ventila koji nisu prikazani na Fig.2) pomoću sredstava 7 za uduvavanje. Vertikalni kondenzator 16 (topao) ima ulogu da favorizuje isparavanje vode iz reakcije i, istovremeno, kondenzovanje reagenasa, koji se, na taj način, recikliraju u sudu 3 preko cevovoda 12. Voda koja isparava dolazi u kondenzator 11 preko cevovoda 17, dok kondenzovanje reagenasa i njihovo ponovno uvođenje u sud 3 sprečava okluziju cevovoda i isključenje reaktora 2.

[0042] Horizontalni kondenzator 11 (hladni) ima svrhu kondenzovanja vode iz esterifikacije, pri čemu se ona uklanja iz reakcione mešavine 15 na takav način da se odvija reakcija esterifikacije ka najvećem mogućem prinosu. Voda iz esterifikacije koja kondenzuje u tečno stanje prikuplja se u sudu 13 preko cevovoda 14, koji obuhvata cevovod 18 koji vodi u pumpu ili uređaj (nije prikazan na Fig.2) da bi se izvodio vakuumski program sa nelinearnim smanjenjem pritiska kako bi se olakšalo uklanjanje vode iz esterifikacije. Da bi došlo do kondenzovanja vode iz esterifikacije, kondenzator 11 održava se na temperaturi manjoj od 100°C, na primer na temperaturi obuhvaćenoj od 10°C do 40°C, poželjno od 20°C do 25°C, i pritisku od 1 atm.

[0043] Na kraju reakcije esterifikacije (izvedene bez upotrebe rastvarača), mešavina cetiliranih masnih kiselina se hladi i ispušta iz ventila 10.

[0044] Korišćena miristinska kiselina (tetradekanoinska kiselina) može, na primer, da se odabere od onih koncentracije od 99% CAS 544-63-8 (EINECS 208-875-2) koje imaju % sastav (GLC): laurinska kiselina C12:0 jednako ili manje od 1; miristinska kiselina C14:0 jednako ili više od 99%; palmitinska kiselina C16:0 jednako ili manje od 1. Korišćena oleinska kiselina može da bude, na primer, odabrana od onih koje imaju najmanje 78% oleinske kiseline CAS 112-80-1 (EINECS 204-007-1) sa % sastavom (GLC) na primer: [laurinska kiselina miristinska kiselina] C12:0+C14:0 jednako ili manje od 0.5; oleinska kiselina C18:1 jednako ili više od 78%; linoleinska kiselina C18:2 jednako ili manje od 15 i ostale C18:3 jednako ili manje od 1.

[0045] Korišćen cetil alkohol (1-heksadekanol) može da bude, na primer, odabran od onih identifikovanih kao CAS 36653-82-4 (EINECS 253-149-0).

[0046] Izlaz mešavine MI (Fig.3) cetiliranih masnih kiselina iz ventila 10 reaktora 2 (Fig.1 i 2), dobijene u prethodno opisanom postupku (postupak I, aparatura I, ili postupak II, aparatura II) obuhvata ili, alternativno, se sastoji od cetil miristata i/ili cetil oleata i nekog katalizatora.

[0047] Ova "početna" mešavina MI može da se podvrgne naknadnoj obradi prečišćavanja da bi se (i) smanjila količina katalizatora sadržanog u njoj, (ii) uklonili neprijatni mirisi mešavine i (iii) uklonile reaktivne supstance prisutne u njoj koje nisu izreagovale. U ovu svrhu, mešavina MI podvrgava se filtraciji kroz dijatomejsku zemlju u filter presi da bi se dobila filtrirana mešavina Mf u kojoj je katalizator uklonjen ili je znatno smanjena njegova količina. Izlazna filtrirana mešavina Mf uvodi se u aparaturu za uklanjanje mirisa da bi se obradila na temperaturi obuhvaćenoj od 150°C do 200°C, na primer 180°C, na rezidualnom pritisku obuhvaćenom od 500 Pa do 1500 Pa (od 5 mbar do 15 mbar), na primer 10 mbar, u prisustvu direktne vodene pare tokom vremenskog perioda obuhvaćenog od 1 sata do 5 sati, poželjno od 2 sata do 4 sata, na primer 3 sata, da bi se dobila "krajnja" mešavina MF. Što se tiče uklanjanja katalizatora, ICP-IES analizom izvedenoj na "krajnjoj" mešavini MF otkrivena je koncentracija rezidualnog

1

cinka od 19.6 mg/Kg u reakcionoj mešavini, sa smanjenjem od 98% početnog sadržaja uvedenog metalnog praha cinka, koji je bio jednak 1000 mg/Kg reakcione mešavine.

[0048] Fig.3 prikazuje obradu prečišćavanja u kojoj se izlaz mešavine MI iz ventila 10 reaktora 2 uvodi, pomoću cevi 19, u mešač 20 u koji se dodaje dijatomejska zemlja. Cevovodima 21 i 21a, mešavina MI uvodi se u sud 22 pomoću pumpe 26 postavljene na cevovodu 21, kako bi se podvrgnula nizu faza unutar filter prese 23 pomoću cevi 24 i pumpe 25, da bi se dobila filtrirana mešavina Mf, u kojoj je katalizator uklonjen ili je znatno smanjena njegova količina. Izlaz filtrirane mešavine Mf iz filter prese 23 uvodi se u sud 27 pomoću elementa 27a ventila. Sud 27 obezbeđen je sredstvima 28 za zagrevanje, sredstvom 29 za mešanje i sredstvima 30 za uduvavanje vodene pare. Uklanjanje mirisa i uklanjanje reagenasa iz mešavine Mf izvodi se, na primer, na 180°C i na pritisku od 10 mbar. Kondenzator 32 je postavljen na strani izlaza iz suda 27; pri čemu je povezan, preko cevi 31, sa uređajem za stvaranje vakuuma (nije prikazan na slici). Na kraju prečišćavanja, dobija se krajnja prečišćena mešavina MF koja obuhvata ili, alternativno, koju čine cetil miristat i/ili cetil oleat i katalizator u minimalnim tragovima.

[0049] Krajnja prečišćena mešavina MF, dobijena kao što je prethodno opisano, ima biljno ulje dodato u nju, kao što je prečišćeno maslinovo ulje, u masenom odnosu 3:1 da bi se dobila kompozicija ovog pronalaska; opciono, pomenuta kompozicija može dalje da obuhvata farmaceutske aditive i ekscipijense ili aditive i ekscipijense kvaliteta za prehrambene proizvode. Prečišćeno maslinovo ulje dodaje se krajnjoj prečišćenoj mešavini MF, ohlađenoj do 100°C pre očvršćavanja.

[0050] U poželjnom načinu ostvarivanja, pomenuta kompozicija ovog pronalaska obuhvata mešavinu cetiliranih masnih kiselina i mešavinu masnih kiselina biljnog porekla sa visokim sadržajem oleinske kiseline, iz maslinovog ulja, palminog ulja i suncokretovog ulja (HOSO) itd.; pri čemu se pomenuta mešavina cetiliranih masnih kiselina (dobijena kao što je prethodno opisano) i pomenuta mešavina masnih kiselina biljnog porekla poželjno dodaju u masenom odnosu 5:1, 4:1, 3:1 ili 2:1, povoljno u masenom odnosu od 3:1.

[0051] Kompozicija ovog pronalaska može dalje da obuhvata mešavinu tokoferola i lecitina. Mešavina tokoferola može da bude prisutna u količini po masi obuhvaćenoj od 1% do 5%, poželjno od 2% do 3%, u odnosu na ukupnu masu kompozicije. Lecitin može da bude prisutan u količini po masi obuhvaćenoj od 1 do 10%, poželjno u količini od 1% do 5%, u odnosu na ukupnu masu kompozicije.

[0052] U naročito poželjnom načinu ostvarivanja, kompozicija ovog pronalaska obuhvata 5mas.% lecitina, 20mas.% prečišćenog maslinovog ulja, 74mas.% cetiliranih masnih kiselina i 1mas.% mešavine tokofenola u odnosu na ukupnu masu kompozicije.

[0053] Prijavilac je iznenađujuće otkrio da je kompozicija ovog pronalaska posebno korisna u lečenju i prevenciji (i) reumatoidnog artritisa zapaljenskog i nezapaljenskog porekla, posebno osteoartritisa; (ii) drugih upalnih stanja zglobova; (iii) psorijaze, lupusa, parodontalnih bolesti ili kardiovaskularnih ili srčanih bolesti; (iv) svih posttraumatskih osteoartikularnih patologija, uključujući sportske povrede; (v) svih degenerativnih patologija zglobova (artroza, gonartroza, koksartroza, itd.) i (vi) zapaljenskihtraumatičnih tetiva i mišićnih stanja. Osim toga, predviđeno je da se kompozicija ovog pronalaska takođe koristi u lečenju i/ili prevenciji gorepomenutih patologija i poremećaja (i)-(vi) u vezi sa rehabilitacionom terapijom.

[0054] Kompozicija ovog pronalaska nema bilo kakva neželjena dejstva, kao što su disfunkcije bubrega ili srca, za razliku od poznatih tretmana.

[0055] Artritis, ili druga upalna stanja zglobova uključuju, ali nisu ograničena na, osteoartritis, ankilozni spondilitis, cervikalni artritis, fibromialgiju, osteonekrozu, Padžetovu bolest, bursitis, psorijazu, giht, sindrom karpalnog tunela, juvenilni reumatoidni artritis, lumbosakralni artritis, psorijazni artritis i reumatoidni artritis.

[0056] Kompozicija koja obuhvata pomenutu mešavinu formuliše se u farmaceutski oblik za oralnu upotrebu (novi prehrambeni proizvod, dodatak ishrani ili medicinsko sredstvo), tj. u obliku pilula, pastila, kapsula, tableta, granula, disperzibilnog praška, sirupa, rastvora, rastvora za prskanje; za topikalnu upotrebu (kompozicija za neko medicinsko sredstvo), tj. u obliku krema, sredstva za mazanje, masti, gela ili spreja koji se koriste kao takvi za nanošenje na kožu, ili inače za transdermalnu upotrebu u obliku lekovitog flastera.

[0057] Pojam "lekoviti flaster" predstavlja tkaninu ili sintetički medijum koji može da oslobađa krem na područje kože na koje je nanet. Kada se nanosi topikalno, količina nanete kompozicije obuhvaćena je od 1 do 15 mg/Kg telesne mase dnevno. Poželjnije, količina nanete kompozicije obuhvaćena je od 3 do 10 mg/Kg telesne mase dnevno. Poželjnije, količina nanete kompozicije obuhvaćena je od 5 do 8 mg/Kg telesne mase dnevno.

[0058] Kompozicija ovog pronalaska može dalje da sadrži druge aktivne sastojke i/ili farmaceutski prihvatljive aditive, kao što su arome, stabilizatori i antioksidansi.

Postupak analize

[0059] Reakcija za sintezu cetiliranih masnih kiselina, koja se izvodi pomoću postupka II, aparatura II (Fig. 2), kontrolisana je pomoću GC-FID sistema (gasna hromatografija sa detektorom jonizacije plamenom) kojeg čine:

- Hladni injektor na koloni;

- Kapilarna kolona tipa SE-54 (DB-5, HP-5, itd.), dužine 15 metara, unutrašnji prečnik 0.32 mm, debljina filma 0.1 mikrona;

- Detektor jonizacije plamenom (FID), podešen na temperaturu od 370°C;

- Noseći gas: helijum 1 ml/min (konstantni režim protoka);

- Program temperature pećnice: polazna 50°C (1 min) →- 180°C (15°C/min) →- 230°C (7°C/min) → 360°C (10°C/min) sa krajnjom izotermijom tokom 15 minuta.

[0060] Reprezentativni uzorak uzet u količini od 5 mg je prethodno tretiran diazometanom u etarskom rastvoru radi dobijanja slobodnih -COOH grupa, zatim je razblažen heptanom (8 ml) i injektiran.

[0061] Fig.4 (Primer GC-FID analize za sintezu cetil miristata) prikazuje uobičajen GC grafikon dobijen u slučaju sinteze cetil miristata kao u Primeru 1. Kada se koristi oleinska kiselina kao polazni materijal zajedno sa miristinskom kiselinom (Primeri 2 i 4), dobijeni hromatogram je kao onaj na Fig.5 (Primer GC-FID analize za sintezu cetil miristata/oleata).

[0062] Vremena zadržavanja (RT) u minutama su:

- 8.025 za miristinsku kiselinu;

- 9.044 za cetil alkohol;

- 10.550 za oleinsku kiselinu ostale C18;

- 21.167 za cetil miristat;

- 22.416 za cetil palmitat;

- 23.608 za cetil oleat cetil ostale C18.

[0063] Prisustvo cetil palmitata je opravdano sastavom korišćene mešavine oleinske kiseline. Primeri načina ostvarivanja izvedeni su bez rastvarača u reaktoru opremljenom vertikalnim kondenzatorom zagrejanim do 80°C i horizontalnim kondenzatorom do 20°C (postupak II i aparatura II):

Primer 1

[0064] Miristinska kiselina (molekulska masa 228), 50.0 g (0.219 molova). Cetil alkohol (molekulska masa 242), 53.0 g (0.219 molova). Katalizator: Metalni prah cinka (Zn), 0.1% (0.1 g). Temperatura 180°C. Na kraju reakcije, uzorak je filtriran. Tabela 1.

1

Primer 2

[0065] Miristinska kiselina (molekulska masa 228), 65.0 g (0.285 molova). Oleinska kiselina 80% (molekulska masa 274), 35.0 g (0.128 molova) [kiselost 204.7 NS 200.5 mg KOH/g]. Ukupno molova kiseline: 0.413. Cetil alkohol (molekulska masa 242), 100.0 g (0.413 molova). Katalizator: Zn prah, 0.1% (0.2 g). Temperatura 180°C. Na kraju reakcije, uzorak je filtriran. Nije došlo do okluzije kondenzatora u početnim fazama reakcije. Tabela 2.

Primer 3

[0066] Cetil alkohol (molekulska masa 242), 100.0 g (0.413 molova). Oleinska kiselina 80% (molekulska masa 274), 112.0 g (0.409 molova). Katalizator: Zn prah, 0.1% (0.2 g). Temperatura 180°C. Na kraju reakcije, uzorak je filtriran. Nije došlo do okluzije kondenzatora u početnim fazama reakcije. Tabela 3.

Primer 4

[0067] Miristinska kiselina (molekulska masa 228), 160.0 g (0.701 molova). Oleinska kiselina 80% (molekulska masa 274), 88.0 g (0.321 molova) [kiselost 204.7 NS 200.5 mg KOH/g]. Ukupno molova kiseline: 1.022. Cetil alkohol (molekulska masa 242), 250.0 g (1.033 molova). Katalizator: Zn prah, 0.1% (0.2 g). Temperatura 180°C. Lagani protok azota u reaktoru. Na kraju reakcije, uzorak je filtriran. Nije došlo do okluzije kondenzatora u početnim fazama reakcije. Tabela 4.

Određivanje tačke topljenja kompozicija dobijenih prema NGD C27-1976

[0068] S obzirom na same karakteristike masnih supstanci, tačka topljenja je dobro definisana merenjem tačaka klizanja i prozračnosti. Ove temperature odgovaraju onima na kojima frakcija supstance u kontaktu sa zidovima kapilarne cevi počinje da se topi (tačka klizanja) i zatim kliza i kreće se unutar same kapilarne cevi (tačka prozračnosti). Da bi se izmerile, predmetna supstanca smešta se u specijalnu cev U-oblika dobro ustanovljenih dimenzija (za toplotnu aspiraciju istopljenog uzorka na temperaturi od 10°C iznad tačke topljenja) i omogućava se očvršćavanje za neko vreme od najmanje 16 sati, a zatim se vodeno kupatilo u koje je uronjena, zagreva veoma polako. Mešavina koju čine cetil miristat (75mas.%) iz Primera 1 i prečišćeno maslinovo ulje (25mas.%) ima: tačku klizanja od 44.9°C i tačku prozračnosti od 47.1°C. Mešavina koju čine cetil miristat i cetil oleat (75mas.%) iz Primera 2 i prečišćeno maslinovo ulje (25mas.%) ima tačku klizanja od 44.4°C i tačku prozračnosti od 45.1°C. Mešavina koju čine cetil miristat i cetil oleat (75mas.%) iz Primera 4 i prečišćeno maslinovo ulje (25mas.%) ima tačku klizanja od 44.2°C i tačku prozračnosti od 45.2°C.

Eksperimentalni dizajn

[0069] In vitro ispitivanje efektivnosti - in vitro procena antizapaljenske aktivnosti uzorka mešavine cetiliranih masnih kiselina dobijene u postupku I ovog pronalaska na ćelijskoj kulturi. Cilj ovog ispitivanja bio je da se oceni, u in vitro sistemu, kapacitet pomenutog uzorka za moduliranje zapaljenskih mehanizama indukovanih u kulturama humanih sinovijalnih ćelija (sinoviociti poput fibroblasta) (ATCC-HTB-93). Ispitivanje antizapaljenske aktivnosti izvedeno je pomoću testa, pomoću ELISA postupka, nekoliko markera zapaljenja, posebno, tri prozapaljenskih citokina: TNFalfa, IL1alfa i IL6.

Priprema uzoraka i postupak izlaganja

1

[0070] Pre ispitivanja efektivnosti, uzorak je zagrejan do 50°C u kupatilu sa kontrolisanom temperaturom uz mešanje da bi se dobio homogeni rastvor. Zatim je uzorak emulgovan sa kukuruznim uljem (37°C) i dodata mu je podloga za kulturu kao što sledi: 0.1 g emulgovan sa 100 µl kukuruznog ulja, doveden do zapremine od 1 ml sa podlogom za kulturu (37°C). Zatim su napravljena uzastopna razblaženja u podlozi za kulturu. Uzorak je podvrgnut prethodnom testu citotoksičnosti u svrhu odabira najpovoljnijih koncentracija za konačni test. U tom cilju, ispitivane su koncentracije u opsegu od 10.00% do 0.08% (1:2 serijska razblaženja). Na osnovu procene rezultata ispitivanja, odabran je 1.00% uzoraka za izvođenje ispitivanja antizapaljenskog dejstva. Radi izvođenja ispitivanja, kulture humanih sinovijalnih ćelija (sinoviociti poput fibroblasta) (ATCC-HTB-93) tretirane su tokom 24 sata sa LPS (lipopolisaharid iz Escherichia coli, 1 µg/ml), poznato nadražujuće sredstvo bakterijske prirode, da bi se izazvali akutni zapaljenski stresovi i, istovremeno, tretirane su uzorcima koji se ispituju u koncentraciji od 1% odabranoj na osnovu prethodnog testa citotoksičnosti. Na kraju praćenog eksperimentalnog perioda, nivoi citokina od interesa izmereni su u podlogama za kulturu pomoću ELISA testa. Rezultati su upoređeni sa kulturama negativne kontrole (netretirane, CTR-) i kulturama pozitivne kontrole (tretirane samo sa LPS, CTR+). Rezime, eksperimentalni protokol obezbeđen za ispitivanje tri prozapaljenska markera (TNFalfa, IL1alfa i IL6) u:

- netretiranim ćelijskim kulturama (negativna kontrola, CTR-);

- ćelijskim kulturama u kojima je akutno zapaljenje eksperimentalno indukovano (pozitivna kontrola, CTR+);

- ćelijskim kulturama u kojima je akutno zapaljenje eksperimentalno indukovano i koje su istovremeno tretirane ispitivanim uzorcima od 1.00%.

Ispitivanje markera zapaljenja (TNFalfa, IL1alfa i IL6)

[0071] Podloge za kulture kontrola i ćelija tretiranih ispitivanim uzorcima korišćene su za ispitivanje prozapaljenskih citokina TNFalfa, IL1alfa i IL6 pomoću ELISA postupka. U ovu svrhu, korišćeni su komercijalno dostupni kompleti koji koriste kompetitivno vezivanje nekog antigena (u ovom slučaju citokin od interesa) sa njegovim primarnim antitelom. Imunološki kompleks (antigen-antitelo) zauzvrat je prepoznat od strane sekundarnog antitela konjugovanog sa peroksidazom. Dodavanje supstrata peroksidaze proizvodi kolorimetrijsku reakciju sa intenzitetom koji je proporcionalan količini prisutnih imunoloških kompleksa i, prema tome, količini vezanih citokina. Kvantitativno određivanje zasniva se na kalibracionoj krivoj izrađenoj na osnovu standardnih koncentracija citokina u rastućoj skali.

Rezultati i grafikoni

1

[0072] Tabele koje slede prikazuju dobijene rezultate u ovom ispitivanju. Rezultati su dati kao količina citokina oslobođenog u podlogama za kulturu tokom eksperimentalnog perioda (srednja vrednost ± SD) i srednja % varijacija u poređenju sa kontrolama.

Antizapaljensko dejstvo - Ispitivanje TNFalfa

[0073]

Tabela 5: Ispitivanje TNFalfa u ćelijskim kulturama CTR-, CTR+ i tretiranje uzorkom mešavine cetiliranih masnih kiselina dobijene u postupku I (uzorak R8P). Rezultati su izraženi kao srednji sadržaj ± SD (izraženi u ng/l) i kao srednja % varijacija u poređenju sa kontrolama. Tabela 5.

Antizapaljensko dejstvo - Ispitivanje IL1alfa

[0074]

Tabela 6: Ispitivanje IL1alfa u ćelijskim kulturama CTR-, CTR+ i tretiranje uzorkom R8P. Rezultati su izraženi kao srednji sadržaj ± SD (izraženi u ng/l) i kao srednja % varijacija u poređenju sa kontrolama.

Tabela 6.

Antizapaljensko dejstvo - Ispitivanje IL6

[0075]

Tabela 7: Ispitivanje IL6 u ćelijskim kulturama CTR-, CTR+ i tretiranje uzorkom R8P. Rezultati su izraženi kao srednji sadržaj ± SD (izraženi u ng/l) i kao srednja % varijacija u poređenju sa kontrolama. Tabela 7.

1

Claims (10)

1. Patentni zahtevi 1. Postupak za pripremu mešavine cetiliranih masnih kiselina (MI), koji obuhvata faze: - dovođenja u kontakt, u sudu (3) reaktora (2), najmanje jedne masne kiseline odabrane iz grupe koja obuhvata ili, alternativno, koju čine miristinska kiselina, oleinska kiselina ili njihove mešavine, sa cetil alkoholom i metalnim katalizatorom, u odsustvu rastvarača, da bi se dobila reakciona mešavina (15); - zagrevanja pomenute reakcione mešavine (15) do reakcione temperature obuhvaćene od 150°C do 200°C i reakcionog pritiska od 101325 Pa (1 atmosfera), da bi došlo do reakcije esterifikacije sa početnim obrazovanjem estara cetiliranih masnih kiselina i vode iz esterifikacije; - omogućavanja da pomenuta reakciona mešavina (15) reaguje tokom reakcionog vremena obuhvaćenog od 1 sata do 8 sati do završetka pomenute reakcije esterifikacije da bi došlo do potpunog obrazovanja mešavine cetiliranih masnih kiselina (MI) i potpunog uklanjanja pomenute vode iz esterifikacije, pri čemu se potonje postiže uvođenjem toka inertnog gasa u sud (3) pomenutog reaktora (2) tokom sveukupnog reakcionog vremena.
2. 2. Postupak prema zahtevu 1, u kojem metalni katalizator predstavlja metalni praškasti katalizator, poželjno praškasti katalizator metala cinka.
3. 3. Postupak prema zahtevu 1 ili 2, u kojem se pomenuto potpuno uklanjanje vode iz esterifikacije postiže održavanjem reakcionog pritiska konstantnim na 101325 Pa (1 atm) i uvođenjem pomenutog toka inertnog gasa, sredstvima (7) za uduvavanje, u deo zapremine iznad reakcione mešavine (15), čime je omogućeno da se voda iz esterifikacije izvuče iz suda (3).
4. 4. Postupak prema zahtevu 3, u kojem se voda iz esterifikacije, koja se izvlači iz suda (3) tokom reakcije esterifikacije na konstantnom reakcionom pritisku, kondenzuje u horizontalom kondenzatoru (11) i prikuplja u sudu (13); pri čemu, poželjno, pomenuti kondenzator (11) se održava na temperaturi obuhvaćenoj od 10°C do 40°C i povezan je sa pomenutim sudom (3), u njegovom gornjem delu (3a), cevovodom (12).
5. 5. Postupak prema zahtevu 1 ili 2, u kojem se pomenuto potpuno uklanjanje vode iz esterifikacije postiže korišćenjem vakuumskog programa koji primenjuje smanjenje reakcionog pritiska na nelinearan način i uvođenjem pomenutog toka inertnog gasa, sredstvima (7) za uduvavanje, u reakcionu mešavinu (15), čime je omogućeno da se voda iz esterifikacije izvuče iz suda (3).
6. 6. Postupak prema zahtevu 5, u kojem vakuumski program poželjno primenjuje smanjenje reakcionog pritiska do 60000 Pa (600 mbar) nakon prvog sata reakcije na nelinearan način, a poželjno se dostiže 500 Pa (5 mbar) nakon reakcionog vremena od sedam sati.
7. 7. Postupak prema zahtevu 6, u kojem se voda iz esterifikacije, koja se izvlači iz suda (3) tokom reakcije esterifikacije vakuumskim programom, kondenzuje u horizontalnom kondenzatoru (11) i prikuplja u sudu (13) nakon prolaska kroz vertikalni kondenzator (16).
8. 8. Postupak prema zahtevu 7, u kojem se pomenuti kondenzator (11) održava na temperaturi poželjno obuhvaćenoj od 10°C do 40°C i povezan je sa pomenutim sudom (3) preko vertikalnog kondenzatora (16), koji se održava na temperaturi poželjno obuhvaćenoj od 70°C do 90°C.
9. 9. Postupak prema bilo kom od zahteva 1-8, u kojem se pomenuta mešavina cetiliranih masnih kiselina (MI) podvrgava naknadnoj obradi prečišćavanja, koja obuhvata filtraciju kroz dijatomejsku zemlju u filter presi (23), da bi se dobila filtrirana mešavina Mf u kojoj je metalni katalizator, prisutan u njoj, uklonjen ili je znatno smanjena njegova količina.
10. 10. Postupak prema zahtevu 9, u kojem se filtrirana mešavina Mf obrađuje u reaktoru (27), na temperaturi obuhvaćenoj od 150°C do 200°C i pritisku obuhvaćenom od 500 Pa do 1500 Pa (5 mbar do 15 mbar) u prisustvu vodene pare tokom vremenskog perioda obuhvaćenog od 1 sata do 5 sati, da bi se dobila krajnja prečišćena mešavina (MF) na bazi cetiliranih masnih kiselina. 1