RS62543B1 - Trans-replicirajuća rnk - Google Patents

Trans-replicirajuća rnk

Info

Publication number
RS62543B1
RS62543B1 RS20211377A RSP20211377A RS62543B1 RS 62543 B1 RS62543 B1 RS 62543B1 RS 20211377 A RS20211377 A RS 20211377A RS P20211377 A RSP20211377 A RS P20211377A RS 62543 B1 RS62543 B1 RS 62543B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
rna
replicase
alphavirus
protein
replicon
Prior art date
Application number
RS20211377A
Other languages
English (en)
Inventor
Tim Beissert
Ugur Sahin
Mario Perkovic
Original Assignee
BioNTech SE
Tron Translationale Onkologie An Der Univ Der Johannes Gutenberg Univ Mainz Gemeinnuetzige Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by BioNTech SE, Tron Translationale Onkologie An Der Univ Der Johannes Gutenberg Univ Mainz Gemeinnuetzige Gmbh filed Critical BioNTech SE
Publication of RS62543B1 publication Critical patent/RS62543B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1131—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/64—General methods for preparing the vector, for introducing it into the cell or for selecting the vector-containing host
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12N9/127—RNA-directed RNA polymerase (2.7.7.48), i.e. RNA replicase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/07—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12Y207/07048—RNA-directed RNA polymerase (2.7.7.48), i.e. RNA replicase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/36011—Togaviridae
    • C12N2770/36111—Alphavirus, e.g. Sindbis virus, VEE, EEE, WEE, Semliki
    • C12N2770/36122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/36011—Togaviridae
    • C12N2770/36111—Alphavirus, e.g. Sindbis virus, VEE, EEE, WEE, Semliki
    • C12N2770/36141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/36011—Togaviridae
    • C12N2770/36111—Alphavirus, e.g. Sindbis virus, VEE, EEE, WEE, Semliki
    • C12N2770/36141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2770/36143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Description

Opis
Tehnička oblast
[0001] Predmetno učenje se generalno odnosi na sisteme i postupke pogodne za proizvodnju proteina na visokom nivou. Predmetno učenje donosi sistem koji sadrži dva odvojena molekula RNK koji su funkcionalno povezani: jedan molekul RNK, replikazni konstrukt, sadrži RNK konstrukt za ekspresiju alfavirusne replikaze, i drugi molekul RNK, transreplikon, sadrži sekvencu RNK koja se može replicirati pomoću replikaze in trans. Transreplikon može sadržati gen od interesa, npr. gen koji kodira vakcinu, za ekspresiju. RNK konstrukt za ekspresiju alfavirusne replikaze sadrži 5'-kapu. Pronađeno je da je 5'-kapa ključna za visok nivo ekspresije gena od interesa in trans. Predmetno učenje ne zahteva propagaciju čestica virusa i pogodno je za efikasnu i bezbednu proizvodnju proteina od interesa, npr. terapijskog proteina ili antigenskog proteina, kao što je vakcina, u ciljnom organizmu, npr. životinji.
Pozadina
[0002] Introdukovanje stranih genetičkih informacija koje kodiraju jedan ili više polipeptida u profilaktičke i terapijske svrhe bio je cilj biomedicinskih istraživanja tokom dugog niza godina. Pristupi iz stanja tehnike dele isporuku molekula nukleinske kiseline ciljnoj ćeliji ili organizmu, ali se razlikuju po tipu molekula nukleinske kiseline i/ili sistemu isporuke: pod uticajem zabrinutosti za bezbednost povezane sa upotrebom molekula dezoksiribonukleinske kiseline (DNK), molekuli ribonukleinske kiseline (RNK) dobijaju sve veću pažnju poslednjih godina. Predloženi su različiti pristupi, uključujući primenu jednolančane ili dvolančane RNK, u obliku gole RNK, ili u kompleksovanoj ili upakovanoj formi, npr. u nevirusnim ili virusnim vehikulumima za isporuku. U virusima i u virusnim vehikulumima za isporuku, genetičke informacije su tipično inkapsulirane pomoću proteina i/ili lipida (čestica virusa). Na primer, projektovane čestice RNK virusa poreklom iz RNK virusa predložene su kao vehikulum za isporuku za tretiranje biljaka (WO 2000/053780 A2) ili za vakcinaciju sisara (Tubulekas et al., 1997, Gene, vol.190, pp.191-195).
[0003] Generalno, RNK virusi su raznovrsna grupa infektivnih čestica sa RNK genomom. RNK virusi mogu biti podgrupisani u jednolančane RNK (ssRNA) i dvolančane RNK (dsRNA) viruse, i ssRNA virusi se dodatno mogu generalno podeliti na pozitivno-lančane [(+) lančane] i/ili negativno-lančane [(-) lančane] viruse. Pozitivno-lančani RNK virusi su prima facie atraktivni kao sistem za isporuku u biomedicini pošto njihova RNK može poslužiti direktno kao templat za translaciju u ćeliji domaćinu.
[0004] Alfavirusi su tipični predstavnici pozitivno-lančanih RNK virusa. Alfavirusi se repliciraju u citoplazmi inficiranih ćelija (za pregledni prikaz životnog ciklusa alfavirusa videti Jose et al., Future Microbiol., 2009, vol 4, pp. 837-856). Ukupna dužina genoma mnogih alfavirusa tipično je u opsegu između 11.000 i 12.000 nukleotida, i genom tipično ima 5'-kapu i 3' poli(A) rep. Genom alfavirusa kodira nestrukturne proteine (uključene u transkripciju, modifikaciju i replikaciju virusne RNK i u modifikaciju proteina) i strukturne proteine (koji formiraju česticu virusa). U genomu tipično postoje dva otvorena okvira čitanja (ORF). Četiri nestrukturna proteina (nsP1-nsP4) obično su zajedno kodirani prvim ORF koji počinje blizu 5' terminusa genoma, dok su alfavirusni strukturni proteini kodirani zajedno u drugom ORF koji se nalazi nizvodno od prvog ORF i proteže se blizu 3' terminusa genoma. Tipično, prvi ORF je veći od drugog ORF, odnos je ugrubo 2:1.
[0005] U ćelijama inficiranim alfavirusom, samo se nestrukturni proteini translatiraju iz genomske RNK, dok se strukturni proteini translatiraju iz subgenomskog transkripta, koji je molekul RNK koji liči na eukariotsku informacionu RNK (iRNK; Gould et al., 2010, Antiviral Res., vol. 87, pp. 111-124). Nakon infekcije, tj. u ranim fazama životnog ciklusa virusa, (+) lančana genomska RNK direktno deluje kao informaciona RNK za translaciju nestrukturnog poli-proteina (nsP1234). U nekim alfavirusima, postoji opal stop kodon između kodirajućih sekvenci nsP3 i nsP4: poliprotein P123, koji sadrži nsP1, nsP2, i nsP3, se proizvodi kada se translacija završi na opal stop kodonu, i poliprotein P1234, koji pored toga sadrži i nsP4, se proizvodi nakon čitanja ovog opal kodona (Strauss & Strauss, Microbiol. Rev., 1994, vol.58, pp.491-562; Rupp et al., 2015, J. Gen. Virology, vol.96, pp.2483-2500). nsP1234 se autoproteolitički iseca na fragmente nsP123 i nsP4. Polipeptidi nsP123 i nsP4 se povezuju da formiraju (-) lanačani replikazni kompleks koji transkribuje (-) lančanu RNK, upotrebom (+) lančane genomske RNK kao templata. Tipično se u kasnijim fazama nsP123 fragment potpuno iseca na pojedinačne proteine nsP1, nsP2, nsP3 i nsP4 (Shirako & Strauss, 1994, J. Virol. vol 68, pp. 1874-1885); ovi proteini se asembliraju da formiraju (+) lančani replikazni kompleks koji sintetiše nove (+) lančane genome, upotrebom (-) lančanog komplementa genomske RNK kao templata (Kim et al., 2004, Virology, vol. 323, pp. 153-163, Vasiljeva et al., 2003, J. Biol. Chem. vol.278, pp.41636-41645).
[0006] Strukturni proteini alfavirusa (nukleokapsidni protein C, protein omotača P62 i protein omotača E1, svi konstituenti čestice virusa) tipično su kodirani jednim jedinim otvorenim okvirom čitanja pod kontrolom subgenomskog promotora (Strauss & Strauss, Microbiol. Rev., 1994, vol. 58, pp.491-562). Subgenomski promotor prepoznaju alfavirusni nestrukturni proteini koji deluju u cis. Posebno, alfavirusna replikaza sintetiše (+) lančani subgenomski transkript upotrebom (-) lančanog komplementa genomske RNK kao templata. (+) lančani subgenomski transkript kodira strukturne proteine alfavirusa (Kim et al., 2004, Virology, vol.
323, pp. 153-163, Vasiljeva et al., 2003, J. Biol. Chem. vol. 278, pp 41636-41645). Subgenomski RNK transkript služi kao templat za translaciju otvorenog okvira čitanja koji kodira strukturne proteine kao jedan poli-protein, i poli-protein se iseca kako bi se dobili strukturni proteini. U kasnoj fazi infekcije alfavirusom u ćeliji domaćinu, signal za pakovanje koji je lociran unutar kodirajuće sekvence nsP2 obezbeđuje selektivno pakovanje genomske RNK u pupeće virione, upakovane od strane strukturnih proteina (White et al., 1998, J. Virol., vol. 72, pp.4320-4326).
[0007] U inficiranim ćelijama, subgenomska RNK, kao i nova genomska RNK je obezbeđena sa 5'-kapom od strane nsP1 (Pettersson et al. 1980, Eur. J. Biochem. 105, 435-443; Rozanov et al., 1992, J. Gen. Virology, vol. 73, pp. 2129-2134), i obezbeđena je sa poli adenilat [poli (A)] repom od strane nsP4 (Rubach et al., Virology, 2009, vol. 384, pp. 201-208). Stoga, i subgenomska RNK i genomska RNK liče na informacionu RNK (iRNK).
[0008] Genom alfavirusa sadrži četiri konzervirana elementa sekvence (CSE) za koje se razume da su važni za replikaciju virusne RNK u ćeliji domaćinu (Strauss & Strauss, Microbiol. Rev., 1994, vol. 58, pp. 491-562). Veruje se da CSE 1, pronađen na ili blizu 5' kraja genoma virusa, funkcioniše kao promotor za sintezu (+) lanca iz templata (-) lanca. Smatra se da CSE 2, lociran nizvodno od CSE1, ali još uvek blizu 5' kraja genoma unutar kodirajuće sekvence za nsP1 deluje kao promotor za inicijaciju sinteze (-) lanaca iz templata genomske RNK (imajte na umu da subgenomski RNK transkript, koji ne sadrži CSE 2, ne funkcioniše kao templat za sintezu (-) lanaca). CSE 3 je lociran u regionu spoja između kodirajuće sekvence za nestrukturne i strukturne proteine i deluje kao jezgro promotora za efikasnu transkripciju subgenomskog transkripta. Na kraju, smatra se da CSE 4, koji je lociran neposredno uzvodno od poli(A) sekvence u 3' netranslatiranom regionu genoma alfavirusa, funkcioniše kao jezgro promotora za inicijaciju sinteze (-) lanca (Jose et al., Future Microbiol., 2009, vol. 4, pp. 837-856). Smatra se da CSE 4 i poli(A) rep alfavirusa funkcionišu zajedno radi efikasne sinteze (-) lanca (Hardy & Rice, J. Virol., 2005, vol.79, pp.
4630-4639). Pored proteina alfavirusa, i faktori ćelije domaćina, verovatno proteini, mogu se vezati za konzervirane elemente sekvence (Strauss & Strauss, Microbiol. Rev., 1994, vol. 58, pp. 491-562).
[0009] Neka svojstva genoma tipičnog alfavirusa, virusa Semliki šume (SFV), ilustrovana su na Sl.1A.
[0010] Domaćini alfavirusa uključuju širok spektar životinja, uključujući insekte, ribe i sisare, kao što su domaće životinje i ljudi; vektori poreklom iz alfavirusa su stoga smatrani potencijalnim vektorom za isporuku stranih genetičkih informacija u široki spektar ciljnih organizama. Neke od pristupa iz stanja tehnike koji se odnose na upotrebu alfavirusa kao vektora za isporuku genetičkih informacija pregledno su prikazali Strauss & Strauss, Microbiol. Rev., 1994, vol. 58, pp. 491-562 i nedavno Ljungberg i Liljeström, 2015, Expert Rev. Vaccines, vol.14, pp.177-94. Već su Strauss & Strauss smatrali da su vektori zasnovani na alfavirusima posebno povoljni za isporuku genetičkih informacija; ovi autori opisuju vektore koji kodiraju protein od interesa nizvodno od subgenomskog promotora. Odgovarajući molekul nukleinske kiseline (replikon) je šematski prikazan na Sl. 1B. Predviđeno je da se, kada se replikon kao što je šematski prikazan na Sl. 1B introdukuje u ćeliju domaćina, sintetiše kodirana replikaza, formirajući replikacione komplekse povezane sa membranskim invaginacijama, što može favorizovati cis-replikaciju. Demonstrirana je cispreferencijalna replikacija za virus rubeole (Liang i Gillam, 2001, Virology 282, 307-319), koji je član porodice Togaviridae sa sličnom organizacijom genoma kao i alfavirusi.
[0011] Međutim, replikacija nije cis-ekskluzivna, opisana je trans-replikacija koja se oslanja na alfavirusne elemente na dva odvojena molekula nukleinske kiseline. Trans-replikacioni sistemi poreklom iz alfavirusa sadrže dva molekula nukleinske kiseline, pri čemu jedan molekul nukleinske kiseline kodira virusnu replikazu, i drugi molekul nukleinske kiseline se može replicirati pomoću navedene replikaze in trans (trans-replikacioni sistem). Takvi trans replikacioni sistemi zahtevaju, za trans-replikaciju, prisustvo oba molekula nukleinske kiseline u jednoj ćeliji domaćinu.
[0012] Virusni RNK vektori često su smatrani nepovoljnim zbog svog potencijala da se propagiraju kod pojedinca koji se leči formiranjem kompetentnih čestica virusa za propagiranje. Ovo može biti povezano sa zdravstvenim rizicima, ne samo za pojedinca koji se leči, već i za opštu populaciju: na primer, neki alfavirusi su patogeni za ljude (npr. čikungunja (Chikungunya) virus, virus venecuelanskog konjskog encefalitisa (VEEV); ulogu alfavirusa kod bolesti ljudi i životinja pregledno su prikazali Strauss & Strauss, Microbiol. Rev., 1994, vol. 58, pp.491-562).
[0013] U alternativnim pristupima, predloženo je introdukovanje nevirusnog transreplikacionog sistema u ćelije domaćina (Sanz et al., Cellular Microbiol., 2015, vol. 17, pp.
520-541; Spuul et al., J. Virol., 2011, vol. 85, pp. 4739-4751). Trans-replikacioni sistemi u skladu sa ovim referencama zasnovani su na introdukciji DNK vektora u ćelije domaćine, pri čemu vektori sadrže T7 promotor bakteriofaga i pri čemu su ćelije domaćina specijalizovane projektovane ćelije koje eksprimiraju T7 polimerazu (Buchholz et al., J. Virol., 1999, vol.73, pp. 251-259). DNK konstrukti koje su upotrebljavali Spuul et al. kodiraju element unutrašnjeg ulaznog mesta ribozoma (IRES) nizvodno od T7 promotora; u skladu sa tim člankom, IRES element je impliciran u pojačavanje ekspresije RNK transkripata koji su verovatno bez kape sintetisanih pomoću T7 polimeraze u ćelijama. Sanz et al. dodatno opisuju direktnu upotrebu RNK replikaznog konstrukta (koji kodira nsP1-4) nizvodno od IRES; RNK konstrukt je pripremljen in vitro u odsustvu strukture kape m<7>G(5ꞌ)ppp(5ꞌ)G. Ukratko, ove dve studije pokazuju da su trans-replikacioni sistemi funkcionalni bilo kao indirektni DNK vektori sa promotorom bakteriofaga za sintezu RNK u projektovanim ćelijama domaćina koje eksprimiraju RNK polimerazu bakteriofaga, ili u obliku direktnih RNK sistema koji sadrže IRES za vođenje translacije replikaze.
[0014] Diciommo et al. 1998 (JBC 273: 18060-18066), WO2012/006376 i WO2012/006359 opisuju alfavirusne ekspresione sisteme sa cis-replikon RNK sa dodatom kapom. Utt et al.
2016. (PLOS ONE 11: e0151616) objavljuje trans-replikacioni sistem za čikungunja virus pri čemu se i konstrukt koji kodira replikazu, kao i replikon koji kodira reporterske gene luciferaze i uključuje subgenomski promotor, eksprimiraju pod kontrolom CMV promotora. WO2008/119827 objavljuje trans-replikazne konstrukte zasnovane na SFV, pri čemu se kodirajuće sekvence SFV replikaze transkribuju pod kontrolom ćelijskog pol II promotora i kodirajuće sekvence SFV replikona se transkribuju iz CMV promotora.
[0015] U pogledu kontinuirane zabrinutosti za bezbednost, medicinska i veterinarska zajednica nerado primenjuje DNK vektore ili samo-replicirajuće virusne nukleinske kiseline ljudima ili životinjama. Pored toga, mnogi pristupi iz stanja tehnike za isporuku nukleinskih kiselina, posebno RNK, povezani su sa nezadovoljavajućim nivoima ekspresije transgena.
[0016] Stoga, i dalje postoji potreba za bezbednim i efikasnim postupcima isporuke nukleinske kiseline koja kodira protein sa terapijskom vrednošću, kao što je vakcina. Kao što je ovde opisano, aspekti i primeri izvođenja predmetnih učenja adresiraju ovu potrebu.
Pronalazak
[0017] Predmetni pronalazak je definisan i ograničen patentnim zahtevima. Sledeća objašnjenja obezbeđuju opšte učenje i njegove različite aspekte i primere izvođenja na kojima je pronalazak zasnovan.
Sažetak
[0018] Imunoterapijske strategije su obećavajuće opcije za prevenciju i terapiju npr. infektivnih bolesti i bolesti kancera. Identifikacija sve većeg broja antigena povezanih sa patogenom i tumorom dovela je do široke kolekcije pogodnih ciljeva za imunoterapiju. Predmetno učenje generalno obuhvata agense i postupke pogodne za efikasan imunoterapijski tretman za prevenciju i terapiju bolesti.
[0019] U prvom aspektu, predmetno učenje obezbeđuje sistem koji sadrži:
RNK konstrukt za ekspresiju alfavirusne replikaze,
RNK replikon koji se može replicirati pomoću replikaze in trans,
pri čemu RNK konstrukt za ekspresiju alfavirusne replikaze sadrži 5'-kapu za pokretanje translacije replikaze.
[0020] U jednom primeru izvođenja, 5'-kapa je prirodna 5'-kapa ili analog 5'-kape.
[0021] U jednom primeru izvođenja, RNK konstrukt za ekspresiju alfavirusne replikaze ne sadrži element unutrašnjeg ulaznog mesta ribozoma (IRES). Stoga, translacija replikaze nije vođena IRES elementom.
[0022] U jednom primeru izvođenja, RNK konstrukt za ekspresiju alfavirusne replikaze sadrži otvoreni okvir čitanja (ORF) koji kodira replikazu. Dodatno, mogu biti prisutni 5ꞌ-UTR i/ili 3ꞌ -UTR. U poželjnom primeru izvođenja, RNK konstrukt za ekspresiju alfavirusne replikaze sadrži
(1) 5ꞌ UTR,
(2) otvoreni okvir čitanja koji kodira replikazu, i
(3) 3ꞌ UTR.
[0023] Poželjno, 5' UTR i/ili 3' UTR je heterologan ili nenativan za alfavirus iz kog je replikaza poreklom.
[0024] Poželjno, otvoreni okvir čitanja koji kodira alfavirusnu replikazu sadrži kodirajući region(e) za nestrukturne proteine potrebne za replikaciju RNK.
[0025] U jednom primeru izvođenja, RNK konstrukt za ekspresiju alfavirusne replikaze sadrži 3ꞌ poli(A) sekvencu.
[0026] U jednom primeru izvođenja, RNK konstrukt za ekspresiju alfavirusne replikaze ne može biti repliciran pomoću replikaze.
[0027] U jednom primeru izvođenja, RNK replikon sadrži:
(1) 5ꞌ sekvencu prepoznavanja replikacije alfavirusa, i
(2) 3ꞌ sekvencu prepoznavanja replikacije alfavirusa.
[0028] U jednom primeru izvođenja, 5ꞌ sekvenca prepoznavanja replikacije alfavirusa i 3ꞌ sekvenca prepoznavanja replikacije alfavirusa sposobne su da usmere replikaciju RNK replikona u prisustvu replikaze. Stoga, kada su RNK konstrukt za ekspresiju alfavirusne replikaze i RNK replikon prisutni zajedno, ove sekvence prepoznavanja replikacije usmeravaju replikaciju RNK.
[0029] U jednom primeru izvođenja, 5ꞌ sekvenca prepoznavanja replikacije alfavirusa i 3ꞌ sekvenca prepoznavanja replikacije alfavirusa su nativne za alfavirus iz kog je replikaza poreklom.
[0030] U jednom primeru izvođenja, RNK replikon sadrži heterolognu nukleinsku kiselinu.
[0031] U jednom primeru izvođenja, RNK replikon sadrži otvoreni okvir čitanja koji kodira protein od interesa.
[0032] Poželjno, otvoreni okvir čitanja koji kodira protein od interesa je nenativan za alfavirus iz kog je replikaza poreklom. Poželjno, otvoreni okvir čitanja koji kodira protein od interesa ne kodira strukturne proteine alfavirusa.
[0033] U jednom primeru izvođenja, RNK replikon sadrži subgenomski promotor.
[0034] Poželjno, gen koji kodira protein od interesa (tj. gen od interesa) je pod kontrolom subgenomskog promotora. Ovo omogućava da ekspresija otvorenog okvira čitanja koji kodira protein od interesa bude pod kontrolom subgenomskog promotora.
[0035] Poželjno, subgenomski promotor je nativan za alfavirus iz kog je replikaza poreklom.
[0036] Poželjno, subgenomski promotor je promotor za strukturni protein alfavirusa. To znači da je subgenomski promotor onaj koji je nativan za alfavirus i koji kontroliše transkripciju gena jednog ili više strukturnih proteina u navedenom alfavirusu.
[0037] U jednom primeru izvođenja, RNK replikon sadrži 3' poli(A) sekvencu.
[0038] U jednoj alternativnom ili dodatnom primeru izvođenja, RNK replikon sadrži 5'-kapu.
[0039] U jednom primeru izvođenja, RNK konstrukt za ekspresiju alfavirusne replikaze i/ili RNK replikon ne sadrži otvoreni okvir čitanja koji kodira intaktni strukturni protein alfavirusa.
[0040] U jednom primeru izvođenja, alfavirus je virus Semliki šume.
[0041] U drugom aspektu, učenje obezbeđuje RNK konstrukt za ekspresiju alfavirusne replikaze koji sadrži 5'-kapu za pokretanje translacije replikaze.
[0042] U trećem aspektu, učenje obezbeđuje DNK koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira RNK konstrukt za ekspresiju alfavirusne replikaze u skladu sa prvim aspektom učenja, RNK replikon u skladu sa prvim aspektom učenja, ili oba. Poželjno, DNK kodira sistem u skladu sa prvim aspektom učenja.
[0043] U četvrtom aspektu, učenje obezbeđuje postupak za proizvodnju proteina u ćeliji koji sadrži korake:
(a) dobijanje RNK konstrukta za ekspresiju alfavirusne replikaze,
(b) dobijanje RNK replikona koji se može replicirati pomoću replikaze in trans i sadrži otvoreni okvir čitanja koji kodira protein, i
(c) ko-inokulisanje RNK konstrukta za ekspresiju alfavirusne replikaze i RNK replikona u ćeliju,
pri čemu RNK konstrukt za ekspresiju alfavirusne replikaze sadrži 5'-kapu za pokretanje translacije replikaze.
[0044] U različitim primerima izvođenja postupka, RNK konstrukt za ekspresiju alfavirusne replikaze i/ili RNK replikon su kao što je prethodno definisano za sistem iz učenja. U petom aspektu, učenje obezbeđuje ćeliju koja sadrži sistem iz prvog aspekta. U jednom primeru izvođenja, ćelija je inokulisana u skladu sa postupkom u skladu sa četvrtim aspektom. U jednom primeru izvođenja, ćelija se može dobiti postupkom iz četvrtog aspekta učenja. U jednom primeru izvođenja, ćelija je deo organizma.
[0045] U šestom aspektu, učenje obezbeđuje postupak za proizvodnju proteina kod subjekta koji sadrži korake:
(a) dobijanje RNK konstrukta za ekspresiju alfavirusne replikaze,
(b) dobijanje RNK replikona koji se može replicirati pomoću replikaze in trans i sadrži otvoreni okvir čitanja koji kodira protein, i
(c) primenu RNK konstrukta za ekspresiju alfavirusne replikaze i RNK replikona subjektu,
pri čemu RNK konstrukt za ekspresiju alfavirusne replikaze sadrži 5'-kapu za pokretanje translacije replikaze.
[0046] U različitim primerima izvođenja postupka, RNK konstrukt za ekspresiju alfavirusne replikaze i/ili RNK replikon su kao što je prethodno definisano za sistem iz učenja.
Kratak opis crteža
[0047]
Sl. 1: Organizacija genoma alfavirusa i projektovani konstrukti nukleinske kiseline koji sadrže elemente poreklom iz genoma alfavirusa:
Simboli i skraćenice: An: poli(A) rep; C: Kapa; SGP: subgenomski promotor (uključujući CSE3); SFV: virus Semliki šume; CSE: konzervirani element sekvence.
Sl. 1A: Genom alfavirusa je jednolančana RNK pozitivnog sensa (ssRNA(+)) koja kodira dva otvorena okvira čitanja (ORF) za velike poliproteine. ORF na 5'-kraju genoma kodira nestrukturne proteine nsP1 do nsP4 (nsP1-4), koji se translatiraju i obrađuju u RNK-zavisnu RNK-polimerazu (replikazu); ORF na 3'-kraju kodira strukturne proteine - kapsid i glikoproteine. ORF na 3'-kraju je pod transkripcionom kontrolom subgenomskog promotora (SGP). Genom alfavirusa se može označiti kao cis-replikacioni sistem.
Sl. 1B: cis-replikon: Genetičkim inženjeringom, strukturni proteini nizvodno od subgenomskog promotora (SGP) mogu biti zamenjeni genom od interesa. Odgovarajući konstrukt koji ima sposobnost da se replicira pomoću alfavirusne replikaze naziva se cis-replikon. Cis-replikon se razlikuje od trans-replikona iz predmetnog učenja (videti detaljan opis).
1
Sl. 1C: Šematski prikaz aspekata trans-replikacionog sistema iz predmetnog učenja. U trans-replikacionom sistemu RNK koja kodira alfavirusnu replikazu (replikazni konstrukt) i RNK replikon ("transreplikon") su dva odvojena molekula RNK. RNK replikon poželjno kodira gen od interesa. Poželjno, replikazni konstrukt liči na ćelijsku iRNK sa jednom ili više, poželjno svim od: 5'-kapa, 5'-UTR, 3'-UTR i poli(A) rep (iRNK koja kodira replikazu). Replikaznom konstruktu tipično nedostaju elementi sekvence potrebni za replikaciju pomoću alfavirusne replikaze. Elementi sekvence potrebni za replikaciju pomoću alfavirusne replikaze su međutim locirani na RNK replikonu. U nekim primerima izvođenja RNK replikon sadrži CSE 1, 2 i 4; i SGP.
Sl. 2. Strukture kapa dinukleotida.
Gore: prirodni kapa dinukleotid, m<7>GpppG.
Dole: Fosforotioatni analog kape beta-S-ARCA dinukleotid: Postoje dva dijastereomera beta-S-ARCA usled stereogenog P centra, koji su označeni kao D1 i D2 u skladu sa karakteristikama elucije u HPLC na reverznim fazama.
Sl. 3: Efikasnost ekspresije transgena kodiranog replikonom zavisi od molekulskog okruženja ORF koji kodira replikazu. Intenzitet fluorescencije eGFP izmeren pomoću FACS nakon zajedničke isporuke cis-replikon RNK i trans-replikon RNK (levo), ili zajedničke isporuke iRNK koja kodira replikazu i trans-replikon RNK (desno) u BHK21 ćelije (Primer 1). Pokazan je procenat eGFP pozitivnih ćelija (barovi) i srednja vrednost intenziteta fluorescencije (MFI) eGFP-pozitivnih ćelija (rombovi). iRNK = replikazni konstrukt u skladu sa predmetnim učenjem.
Sl. 4: Genska ekspresija u primarnim ćelijama potvrđuje efikasnost transreplikacionog sistema. Intenzitet fluorescencije eGFP izmeren nakon isporuke cisreplikacionog sistema (eGFP RNK replikon), ili zajedničke isporuke transreplikacionog sistema (koji sadrži replikaznu RNK i trans-replikon RNK) u fibroblaste ljudskog prepucijuma. RNK koja kodira E3 inhibitor protein kinaze R Vaccinia virusa (PKR) ko-isporučena je kako bi se suprimirala aktivacija PKR i time povećala translacija RNK (Primer 2). Pokazan je procenat eGFP pozitivnih ćelija (barovi) i srednja vrednost intenziteta fluorescencije (MFI) eGFP-pozitivnih ćelija (rombovi).
Sl. 5: Uticaj količine replikazne RNK i upotrebe replikaznog kodona.
Sl. 5A: Relativne svetlosne jedinice [RLU] (sekretovana NanoLuc), izmerene posle lipofekcije primarnih fibroblasta ljudskog prepucijuma sa različitim količinama iRNK koja kodira replikazu (Primer 3).
Sl. 5B: Intenzitet fluorescencije eGFP izmeren pomoću FACS nakon zajedničke isporuke replikazne RNK i trans-replikon RNK u BHK21 ćelije (Primer 4). Prikazan je procenat eGFP pozitivnih ćelija (barovi) i srednja vrednost intenziteta fluorescencije (MFI) eGFP-pozitivnih ćelija (rombovi). Kao što je opisano u Primeru 4, modifikovanje upotrebe kodona je nepovoljno za ekspresiju transgena i za produktivnu replikaciju trans-replikona (za detalje videti Primer 4). upotreba hs kodona: upotreba kodona prilagođenog Homo sapiens-u; upotreba wt kodona: upotreba kodona alfavirusa divljeg tipa.
Donji deo: Western blot koji ukazuje na nivoe myc-nsP3 i aktina.
Sl. 6: Efikasna in vivo ekspresija transgena kodiranog trans-replikonom. Snimanje bioluminescencije (BLI) miševa posle intramuskularne (i.m.) i intradermalne (i.d.) zajedničke injekcije trans-replikacionog sistema u skladu sa učenjem, koji sadrži transreplikon RNK koja kodira luciferazu i replikazni konstrukt u obliku iRNK (Primer 5). Luminescencija je izražena kao fotoni u sekundi [p/s].
Sl. 7: Trans-replikoni koji kodiraju influenca HA kao protein od interesa obezbeđuju zaštitu od smrtonosnih virusnih infekcija. Kao što je opisano u Primeru 6, Balb/C miševi su vakcinisani intradermalno dva puta (prime-boost) unutar 3 nedelje bilo sa 5 μg cis-replikona koji kodira influenca HA (R-HA) ili sa 1 μg trans-replikona (TR-HA). Tamo gde je naznačeno, 4 μg do 14 μg iRNK koja kodira replikazu je primenjeno zajedno sa trans-replikonom. Tamo gde je naznačeno, različite količine iRNK koja kodira E3 Vaccinia virusa su zajedno primenjene kako bi se poboljšala translacija.
Pozitivna kontrola: inaktivirani virus (IAV). Negativna kontrola: rastvarač (PBS pufer).
Sl. 7A: Određivanje titra za neutralizaciju virusa (VNT) dan pre izazivanja infekcija smrtonosnim dozama influenca virusa.
Sl. 7B: Test inhibicije hemaglutinacije (HAI) seruma miša.
Slika 7C: Kaplan-Majer (Kaplan-Meier) krive koje pokazuju preživljavanje miševa nakon izazvane infekcije. Miševi tretirani PBS puferom su umrli unutar 5 dana.
Sl. 8: Uticaj kape. BHK21 ćelije su elektroporisane sa transreplikon RNK koja kodira eGFP i secNLuc (sekretabilna luciferaza) razdvojene samoisecajućim peptidom P2A (svinjski teschovirus-1 2A) zajedno sa bilo replikaznom iRNK sa beta-S-ARCA (D2) kapom ili iRNK bez kape sa IRES(EMCV) (unutrašnje ulazno mesto ribozoma iz encefalomiokarditis virusa) uzvodno od replikaznog ORF.24 sata posle elektroporacije ćelije su analizirane pomoću FACS na ekspresiju eGFP (A), supernatanti su analizirani na nivoe sekrecije secNLuc pomoću Nano-Glo® Luciferase Assay System (Promega) (B) i ekspresija replikaze je analizirana Western blotom (C).
Detaljan opis
[0048] Iako je predmetno učenje detaljno opisano u nastavku, treba razumeti da ovo učenje nije ograničeno na određene metodologije, protokole i reagense koji su ovde opisani pošto oni mogu varirati. Takođe treba razumeti da se ovde upotrebljena terminologija koristi samo za opisivanje posebnih primera izvođenja, i nije namenjena da ograniči obim predmetnog učenja koje će biti ograničeno samo priloženim patentnim zahtevima. Osim ukoliko nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni termini koji se ovde upotrebljavaju imaju ista značenja kao što ih uobičajeno razume onaj sa prosečnim iskustvom u struci.
[0049] Poželjno, termini koji se ovde upotrebljavaju su definisani kao što je opisano u "A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", H.G.W. Leuenberger, B. Nagel, i H. Kölbl, Eds., Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Bazel, Švajcarska, (1995).
[0050] Praksa predmetnog učenja koristiće, osim ukoliko nije drugačije naznačeno, konvencionalne postupke hemije, biohemije, ćelijske biologije, imunologije, i tehnike rekombinantne DNK koje su objašnjene u literaturi u oblasti (up. npr. Molecular Cloning: A
1
Laboratory Manual, 2nd Edition, J. Sambrook et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989).
[0051] U nastavku će biti opisani elementi predmetnog učenja. Ovi elementi su nabrojani sa specifičnim primerima izvođenja, međutim, treba razumeti da se mogu kombinovati na bilo koji način i u bilo kom broju kako bi se kreirali dodatni primeri izvođenja. Različito opisane primere i poželjne primere izvođenja ne treba tumačiti kao ograničavanje predmetnog učenja samo na izričito opisane primere izvođenja. Ovaj opis treba shvatiti tako da objavljuje i obuhvata primere izvođenja koji kombinuju izričito opisane primere izvođenja sa bilo kojim brojem objavljenih i/ili poželjnih elemenata. Nadalje, bilo koje permutacije i kombinacije svih opisanih elemenata u ovoj prijavi treba smatrati objavljenim ovim opisom osim ukoliko kontekst ne ukazuje drugačije.
[0052] Termin "oko" znači približno ili blizu, i u kontekstu numeričke vrednosti ili opsega koji je ovde iznet poželjno znači /- 10% numeričke vrednosti ili opsega koji je citiran ili zahtevan patentom.
[0053] Neodređene i određene članove i slična pozivanja koja se upotrebljavaju u kontekstu opisa učenja (posebno u kontekstu patentnih zahteva) treba tumačiti tako da pokrivaju i jedninu i množinu, osim ukoliko je ovde drugačije naznačeno ili je jasno kontradiktorno kontekstu. Navođenje opsega vrednosti ovde je samo namenjeno da služi kao stenografski postupak za pojedinačno pozivanje na svaku zasebnu vrednost koja spada unutar opsega. Ukoliko ovde nije drugačije naznačeno, svaka pojedinačna vrednost je uključena u specifikaciju kao da je ovde pojedinačno navedena. Svi ovde opisani postupci mogu se izvesti bilo kojim pogodnim redosledom, osim ukoliko je ovde drugačije naznačeno ili je na drugi način jasno kontradiktorno kontekstu. Upotreba bilo kog i svih primera, ili jezika koji ukazuje na primer (npr. "kao što je"), koja je ovde obezbeđena ima za cilj samo da bolje ilustruje učenje i ne predstavlja ograničavanje obima učenja koji se inače zahteva patentom. Nijedan jezik u specifikaciji ne bi trebalo tumačiti kao da ukazuje na bilo koji nezahtevani element od suštinske važnosti za praksu učenja.
[0054] Osim ukoliko nije izričito drugačije naznačeno, termin "koji sadrži" upotrebljava se u kontekstu predmetnog dokumenta da označi da dodatni članovi mogu biti opciono prisutni pored članova liste uvedene pomoću "koji sadrži". Smatra se, međutim, kao specifičan primer izvođenja predmetnog učenja da termin "koji sadrži" obuhvata mogućnost da ne budu prisutni drugi članovi, tj. za potrebe ovog primera izvođenja, "koji sadrži" treba shvatiti kao da ima značenje "koji se sastoji od".
[0055] Oznake relativnih količina komponente okarakterisane generičkim terminom treba da označavaju ukupnu količinu svih specifičnih varijanti ili članova pokrivenih navedenim generičkim terminom. Ukoliko je za određenu komponentu definisanu generičkim terminom specificirano da je prisutna u određenoj relativnoj količini, i ukoliko je ova komponenta dodatno okarakterisana da je specifična varijanta ili član pokriven generičkim terminom, to znači da nisu dodatno prisutne druge varijante ili članovi koji su pokriveni generičkim terminom tako da ukupna relativna količina komponenti pokrivenih generičkim terminom premašuje specificiranu relativnu količinu; poželjnije uopšte nisu prisutne druge varijante ili članovi koji su pokriveni generičkim terminom.
[0056] Termini kao što su "redukovati" ili "inhibirati" kao što se ovde upotrebljavaju znače sposobnost da izazovu ukupno smanjenje nivoa, poželjno za 5% ili više, 10% ili više, 20% ili više, poželjnije za 50% ili više, i najpoželjnije 75% ili više. Termin "inhibirati" ili slične fraze uključuju potpunu ili suštinski potpunu inhibiciju, tj. redukciju na nulu ili suštinski na nulu.
[0057] Termini kao što su "povećanje" ili "poboljšanje" poželjno se odnose na povećanje ili poboljšanje za najmanje 10%, poželjno najmanje 20%, poželjno najmanje 30%, poželjnije najmanje 40%, poželjnije najmanje 50%, još poželjnije najmanje 80%, i najpoželjnije najmanje 100%.
[0058] Termin "neto naelektrisanje" označava naelektrisanje celog objekta, kao što je jedinjenje ili čestica.
[0059] Jon koji ima ukupno neto pozitivno naelektrisanje je katjon, dok je jon koji ima ukupno neto negativno naelektrisanje anjon. Stoga, u skladu sa učenjem, anjon je jon sa više elektrona nego protona, koji mu daju neto negativno naelektrisanje; i katjon je jon sa manje elektrona nego protona, koji mu daju neto pozitivno naelektrisanje.
[0060] Termini kao što su "naelektrisano", "neto naelektrisanje", "negativno naelektrisano" ili "pozitivno naelektrisano", sa pozivanjem na dato jedinjenje ili česticu, označavaju električno neto naelektrisanje datog jedinjenja ili čestice kada se rastvori ili suspenduje u vodi na pH 7,0.
[0061] Termin "nukleinska kiselina" u skladu sa učenjem takođe sadrži hemijsku derivatizaciju nukleinske kiseline na bazi nukleotida, na šećeru ili na fosfatu, i nukleinske kiseline koje sadrže neprirodne nukleotide i analoge nukleotida. U nekim primerima izvođenja, nukleinska kiselina je dezoksiribonukleinska kiselina (DNK) ili ribonukleinska kiselina (RNK).
[0062] U skladu sa predmetnim učenjem, termin "RNK" ili "molekul RNK" se odnosi na molekul koji sadrži ostatke ribonukleotida i koji je poželjno u potpunosti ili suštinski sačinjen od ostataka ribonukleotida. Termin "ribonukleotid" se odnosi na nukleotid sa hidroksilnom
1
grupom na 2'-poziciji β-D-ribofuranozil grupe. Termin "RNK" sadrži dvolančanu RNK, jednolančanu RNK, izolovanu RNK kao što je delimično ili potpuno prečišćena RNK, suštinski čistu RNK, sintetičku RNK, i rekombinantno generisanu RNK kao što je modifikovana RNK koja se razlikuje od RNK koja se javlja u prirodi po adiciji, deleciji, supstituciji i/ili izmeni jednog ili više nukleotida. Takve izmene mogu uključivati adiciju nenukleotidnog materijala, kao na primer na kraj(eve) RNK ili internalno, na primer na jedan ili više nukleotida RNK. Nukleotidi u molekulima RNK takođe mogu sadržati nestandardne nukleotide, kao što su nukleotidi koji se ne javljuju u prirodi ili hemijski sintetisane nukleotide ili dezoksi nukleotide. Ove izmenjene RNK se mogu označiti kao analozi, posebno analozi RNK koje se javljaju u prirodi.
[0063] U skladu sa učenjem, RNK može biti jednolančana ili dvolančana. U nekim primerima izvođenja predmetnog učenja, poželjna je jednolančana RNK. Termin "jednolančana RNK" generalno označava primere izvođenja u kojima nijedan komplementarni lanac nukleinske kiseline (tipično nijedan komplementarni lanac RNK; tj. nijedan komplementarni molekul RNK) nije povezan sa molekulom RNK. Jednolančana RNK može postojati kao minus lanac [(-) lanac] ili kao plus lanac [(+) lanac]. (+) lanac je lanac koji sadrži ili kodira genetičke informacije. Genetičke informacije mogu biti na primer polinukleotidna sekvenca koja kodira protein. Kada (+) lanac RNK kodira protein, (+) lanac može poslužiti direktno kao templat za translaciju (sinteza proteina). (-) lanac je komplement (+) lanca. U slučaju dvolančane RNK, (+) lanac i (-) lanac su dva odvojena molekula RNK, i oba ova molekula RNK se međusobno povezuju da formiraju dvolančanu RNK ("dupleks RNK").
[0064] Termin "stabilnost" RNK se odnosi na "poluživot" RNK. "Poluživot" se odnosi na vremenski period koji je potreban da se eliminiše polovina aktivnosti, količine, ili broja molekula. U kontekstu predmetnog učenja, poluživot RNK je indikativan za stabilnost navedene RNK. Poluživot RNK može uticati na "trajanje ekspresije" RNK. Može se očekivati da će RNK koja ima dugi poluživot biti eksprimirana tokom dužeg vremenskog perioda.
[0065] "Fragment" ili "fragment sekvence nukleinske kiseline" se odnosi na deo sekvence nukleinske kiseline, tj. sekvencu koja predstavlja sekvencu nukleinske kiseline skraćenu na 5'-i/ili 3'-kraju(evima). Poželjno, fragment sekvence nukleinske kiseline sadrži najmanje 80%, poželjno najmanje 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% ostataka nukleotida iz navedene sekvence nukleinske kiseline. U predmetnom učenju poželjni su oni fragmenti molekula RNK koji zadržavaju stabilnost i/ili translacionu efikasnost RNK.
[0066] Termin "varijanta" u odnosu na, na primer, sekvence nukleinske kiseline i aminokiselinske sekvence, u skladu sa učenjem uključuje sve varijante, posebno mutante, virusne
1
sojeve, splajs varijante, konformacije, izoforme, alelne varijante, varijante vrsta i homologe vrsta, posebno one koje su prisutne u prirodi. Alelna varijanta se odnosi na izmenu normalne sekvence gena, čiji je značaj često nejasan. Kompletno gensko sekvenciranje često identifikuje brojne alelne varijante za dati gen. U odnosu na molekule nukleinske kiseline, termin "varijanta" uključuje degenerisane sekvence nukleinske kiseline, pri čemu je degenerisana nukleinska kiselina u skladu sa učenjem nukleinska kiselina koja se razlikuje od referentne nukleinske kiseline u sekvenci kodona usled degeneracije genetičkog koda. Homolog vrste je sekvenca nukleinske kiseline ili amino-kiselinske sekvence poreklom iz različite vrste od one date sekvence nukleinske kiseline ili amino-kiselinske sekvence. Homolog virusa je sekvenca nukleinske kiseline ili amino-kiselinska sekvenca poreklom iz različitog virusa od onog date sekvence nukleinske kiseline ili amino-kiselinske sekvence.
[0067] U skladu sa učenjem, varijante nukleinske kiseline uključuju pojedinačne ili više nukleotidnih delecija, adicija, mutacija i/ili insercija u poređenju sa referentnom nukleinskom kiselinom. Delecije uključuju uklanjanje jednog ili više nukleotida iz referentne nukleinske kiseline. Varijante adicije sadrže 5'- i/ili 3'-terminusne fuzije jednog ili više nukleotida, kao što su 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50, ili više nukleotida. Mutacije mogu uključivati, ali nisu ograničene na supstitucije, pri čemu se uklanja najmanje jedan nukleotid u sekvenci i drugi nukleotid se insertuje na njegovo mesto (kao što su transverzije i tranzicije), abazična mesta, umrežena mesta, i hemijski izmenjene ili modifikovane baze. Insercije uključuju adiciju najmanje jednog nukleotida u referentnu nukleinsku kiselinu.
[0068] Varijante specifičnih sekvenci nukleinske kiseline poželjno imaju najmanje jedno funkcionalno svojstvo navedenih specifičnih sekvenci i poželjno su funkcionalno ekvivalentne sa tim navedenim specifičnim sekvencama, npr. sekvence nukleinske kiseline pokazuju svojstva identična ili slična onima specifičnih sekvenci nukleinske kiseline.
[0069] Poželjno, stepen identičnosti između date sekvence nukleinske kiseline i sekvence nukleinske kiseline koja je varijanta navedene date sekvence nukleinske kiseline biće najmanje 70%, poželjno najmanje 75%, poželjno najmanje 80%, poželjnije najmanje 85%, još poželjnije najmanje 90%, ili najpoželjnije najmanje 95%, 96%, 97%, 98% ili 99%. Stepen identičnosti je poželjno dat za region od najmanje oko 30, najmanje oko 50, najmanje oko 70, najmanje oko 90, najmanje oko 100, najmanje oko 150, najmanje oko 200, najmanje oko 250, najmanje oko 300, ili najmanje oko 400 nukleotida. U poželjnim primerima izvođenja, stepen identičnosti je dat za celu dužinu referentne sekvence nukleinske kiseline.
[0070] "Sličnost sekvence" ukazuje na procenat amino-kiselina koje su bilo identične ili koje predstavljaju konzervativne amino-kiselinske supstitucije. "Identičnost sekvence" između dve
1
sekvence polipeptida ili nukleinskih kiselina ukazuje na procenat amino-kiselina ili nukleotida koji su identični između sekvenci.
[0071] Termin "% identična" je namenjen da označi, posebno, procenat nukleotida koji su identični u optimalnom poravnanju između dve sekvence koje treba uporediti, pri čemu je navedeni procenat čisto statistički, i razlike između dve sekvence mogu biti nasumično raspoređene po celoj dužini sekvence i sekvenca koja se upoređuje može sadržati adicije ili delecije u poređenju sa referentnom sekvencom, kako bi se postiglo optimalno poravnanje između dve sekvence. Poređenja dve sekvence se uobičajeno izvode poređenjem navedenih sekvenci, posle optimalnog poravnanja, u odnosu na segment ili "prozor za poređenje", kako bi se identifikovali lokalni regioni odgovarajućih sekvenci. Optimalno poravnanje za poređenje može se izvršiti ručno ili uz pomoć algoritma lokalne homologije Smita (Smith) i Vatermana (Waterman), 1981, Ads App. Math. 2, 482, uz pomoć algoritma lokalne homologije Nidelmana (Needleman) i Vunša (Wunsch), 1970, J. Mol. Biol. 48, 443, i uz pomoć algoritma za pretraživanje sličnosti Pirsona (Pearson) i Lipmana, 1988, Proc. Natl Acad. Sci. USA 85, 2444 ili uz pomoć računarskih programa koji upotrebljavaju navedene algoritme (GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N i TFASTA u Wisconsin Genetics softverskom paketu, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.).
[0072] Procenat identičnosti se dobija određivanjem broja identičnih pozicija u kojima korespondiraju sekvence koje se upoređuju, deljenjem ovog broja sa brojem upoređenih pozicija i množenjem ovog rezultata sa 100.
[0073] Na primer, može se upotrebljavati BLAST program "BLAST 2 sequence" koji je dostupan na veb stranici http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/wblast2.cgi.
[0074] Nukleinska kiselina je "sposobna za hibridizaciju" ili "hibridizuje" sa drugom nukleinskom kiselinom ukoliko su dve sekvence međusobno komplementarne. Nukleinska kiselina je "komplementarna" sa drugom nukleinskom kiselinom ukoliko su dve sekvence sposobne da formiraju stabilan dupleks jedna sa drugom. U skladu sa učenjem, hibridizacija se poželjno izvodi pod uslovima koji dozvoljavaju specifičnu hibridizaciju između polinukleotida (strogi uslovi). Strogi uslovi su opisani, na primer, u Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook et al., Editors, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbour, New York, 1989 ili Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., Editors, John Wiley & Sons, Inc., New York i pozivaju se, na primer, na hibridizaciju na 65 °C u puferu za hibridizaciju (3,5 x SSC, 0,02% Ficoll, 0,02% polivinilpirolidon, 0,02% goveđi serumski albumin, 2,5 mM NaH2PO4(pH 7), 0,5% SDS, 2 mM EDTA). SSC je 0,15 M natrijum hlorid/0,15 M natrijum citrat, pH 7. Posle hibridizacije,
1
membrana na koju je preneta DNK se ispira, na primer, u 2 x SSC na sobnoj temperaturi i zatim u 0,1-0,5 x SSC/0,1 x SDS na temperaturama do 68 °C.
[0075] Procenat komplementarnosti ukazuje na procenat susednih ostataka u molekulu nukleinske kiseline koji mogu da formiraju vodonične veze (npr. Votson-Krik (Watson-Crick) sparivanje baza) sa drugom sekvencom nukleinske kiseline (npr. 5, 6, 7, 8, 9, 10 od 10 su 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, i 100% komplementarne). "Savršeno komplementarna" ili "potpuno komplementarna" znači da će se svi susedni ostaci sekvence nukleinske kiseline vezati vodoničnom vezom sa istim brojem susednih ostataka u drugoj sekvenci nukleinske kiseline. Poželjno, stepen komplementarnosti u skladu sa učenjem je najmanje 70%, poželjno najmanje 75%, poželjno najmanje 80%, poželjnije najmanje 85%, još poželjnije najmanje 90% ili najpoželjnije najmanje 95%, 96%, 97%, 98% ili 99%. Najpoželjnije, stepen komplementarnosti u skladu sa učenjem je 100%.
[0076] Termin "derivat" sadrži bilo koju hemijsku derivatizaciju nukleinske kiseline na bazi nukleotida, na šećeru ili na fosfatu. Termin "derivat" takođe sadrži nukleinske kiseline koje sadrže nukleotide i analoge nukleotida koji se ne javljaju u prirodi. Poželjno, derivatizacija nukleinske kiseline povećava njenu stabilnost.
[0077] U skladu sa učenjem, "sekvenca nukleinske kiseline koja je poreklom iz sekvence nukleinske kiseline" označava nukleinsku kiselinu koja je varijanta nukleinske kiseline iz koje je poreklom. Poželjno, sekvenca koja je varijanta u odnosu na specifičnu sekvencu, kada zamenjuje specifičnu sekvencu u molekulu RNK, zadržava stabilnost i/ili efikasnost translacije RNK.
[0078] Termini "transkripcija" i "transkribovanje" odnose se na proces tokom kog se molekul nukleinske kiseline sa određenom sekvencom nukleinske kiseline ("templat nukleinske kiseline") čita od strane RNK polimeraze tako da RNK polimeraza proizvodi jednolančani molekul RNK. Tokom transkripcije, genetičke informacije u templatu nukleinske kiseline se transkribuju. Templat nukleinske kiseline može biti DNK; međutim, npr. u slučaju transkripcije iz templata alfavirusne nukleinske kiseline, templat je tipično RNK. Nakon toga, transkribovana RNK može biti translatirana u protein. U skladu sa predmetnim učenjem, termin "transkripcija" sadrži "in vitro transkripciju", pri čemu se termin "in vitro transkripcija" odnosi na proces u kome se RNK, posebno iRNK, in vitro sintetiše u sistemu bez ćelija. Poželjnom za generisanje transkripata primenjuju se klonirajući vektori. Ovi klonirajući vektori su generalno označeni kao transkripcioni vektori i u skadu sa predmetnim učenjem obuhvaćeni su terminom "vektor". U skadu sa predmetnim učenjem, RNK je poželjno in vitro transkribovana RNK (IVT-RNK) i može se dobiti in vitro transkripcijom
1
odgovarajućeg DNK templata. Promotor za kontrolu transkripcije može biti bilo koji promotor za bilo koju RNK polimerazu. DNK templat za in vitro transkripciju može se dobiti kloniranjem nukleinske kiseline, posebno cDNA, i njenim introdukovanjem u odgovarajući vektor za in vitro transkripciju. cDNA se može dobiti reverznom transkripcijom RNK.
[0079] Molekul jednolančane nukleinske kiseline proizveden tokom transkripcije tipično ima sekvencu nukleinske kiseline koja je komplementarna sekvenca templata.
[0080] U skladu sa učenjem, termini "templat" ili "templat nukleinske kiseline" ili "templat nukleinska kiselina" generalno označavaju sekvencu nukleinske kiseline koja se može replicirati ili transkribovati.
[0081] Termin "sekvenca nukleinske kiseline transkribovana iz sekvence nukleinske kiseline" označava sekvencu nukleinske kiseline, gde je to prikladno kao dela kompletnog molekula RNK, koji je proizvod transkripcije templata sekvence nukleinske kiseline. Tipično, transkribovana sekvenca nukleinske kiseline je jednolančani molekul RNK.
[0082] "3' kraj nukleinske kiseline" u skladu sa učenjem označava onaj kraj koji ima slobodnu hidroksilnu grupu. U dijagramskom prikazu dvolančanih nukleinskih kiselina, posebno DNK, 3' kraj je uvek na desnoj strani. "5' kraj nukleinske kiseline" u skladu sa učenjem označava onaj kraj koji ima slobodnu fosfatnu grupu. U dijagramskom prikazu dvolančanih nukleinskih kiselina, posebno DNK, 5' kraj je uvek sa leve strane.
"uzvodno" opisuje relativno pozicioniranje prvog elementa molekula nukleinske kiseline u odnosu na drugi element tog molekula nukleinske kiseline, pri čemu su oba elementa sadržana u istom molekulu nukleinske kiseline, i pri čemu je prvi element lociran bliže 5' kraju molekula nukleinske kiseline nego drugi element tog molekula nukleinske kiseline. Zatim se kaže da je drugi element "nizvodno" od prvog elementa tog molekula nukleinske kiseline. Element koji je lociran "uzvodno" od drugog elementa može se sinonimno označiti kao lociran "5'" od tog drugog elementa. Za dvolančani molekul nukleinske kiseline, indikacije kao što su "uzvodno" i "nizvodno" date su u odnosu na (+) lanac.
[0083] U skladu sa učenjem, "funkcionalna veza" ili "funkcionalno povezano" se odnosi na vezu unutar funkcionalnog odnosa. Nukleinska kiselina je "funkcionalno povezana" ukoliko je funkcionalno povezana sa drugom sekvencom nukleinske kiseline. Na primer, promotor je funkcionalno povezan sa kodirajućom sekvencom ukoliko utiče na transkripciju navedene
2
kodirajuće sekvence. Funkcionalno povezane nukleinske kiseline su tipično susedne jedna drugoj, gde je to prikladno odvojene dodatnim sekvencama nukleinske kiseline, i, u posebnim primerima izvođenja, transkribuju se pomoću RNK polimeraze dajući jedan molekul RNK (zajednički transkript).
[0084] U posebnim primerima izvođenja, nukleinska kiselina je funkcionalno povezana u skladu sa učenjem za sekvence za kontrolu ekspresije koje mogu biti homologne ili heterologne u odnosu na nukleinsku kiselinu.
[0085] Termin "sekvenca za kontrolu ekspresije" sadrži u skladu sa učenjem promotore, sekvence za koje se vezuju ribozomi i druge kontrolne elemente koji kontrolišu transkripciju gena ili translaciju izvedene RNK. U posebnim primerima izvođenja učenja, sekvence za kontrolu ekspresije mogu se regulisati. Precizna struktura sekvenci za kontrolu ekspresije može varirati u zavisnosti od vrste ili tipa ćelije, ali obično uključuje 5'-netranskribovane i 5'-i 3'-netranslatirane sekvence uključene u iniciranje transkripcije i translacije, respektivno. Specifičnije, 5'-netranskribovane sekvence za kontrolu ekspresije uključuju region promotora koji obuhvata sekvencu promotora za kontrolu transkripcije funkcionalno povezanog gena. Sekvence za kontrolu ekspresije takođe mogu uključivati sekvence pojačivača ili uzvodne aktivatorske sekvence. Sekvenca za kontrolu ekspresije molekula DNK uobičajeno uključuje 5'-netranskribovane i 5'- i 3'-netranslatirane sekvence, kao što je TATA boks, sekvence za dodavanje kape, CAAT sekvence i slično. Sekvenca za kontrolu ekspresije alfavirusne RNK može uključivati subgenomski promotor i/ili jedan ili više konzerviranih elemenata sekvence. Specifična sekvenca za kontrolu ekspresije u skladu sa predmetnim učenjem je subgenomski promotor alfavirusa, kao što je ovde opisano.
[0086] Ovde specificirane sekvence nukleinske kiseline, posebno sekvence nukleinske kiseline koje se mogu transkribovati i koje su kodirajuće, mogu se kombinovati sa bilo kojim sekvencama za kontrolu ekspresije, posebno sa promotorima, koji mogu biti homologni ili heterologni navedenim sekvencama nukleinske kiseline, pri čemu termin "homologna" označava činjenicu da je sekvenca nukleinske kiseline takođe funkcionalno prirodno povezana sa sekvencom za kontrolu ekspresije, i termin "heterologna" označava činjenicu da sekvenca nukleinske kiseline nije prirodno funkcionalno povezana sa sekvencom za kontrolu ekspresije.
[0087] Sekvenca nukleinske kiseline koja se može transkribovati, posebno sekvenca nukleinske kiseline koja kodira peptid ili protein, i sekvenca za kontrolu ekspresije su "funkcionalno" povezane jedna sa drugom, ukoliko su kovalentno povezane jedna sa drugom na takav način da je transkripcija ili ekspresija sekvence nukleinske kiseline koja se može transkribovati i posebno kodirajuće sekvence nukleinske kiseline pod kontrolom ili pod uticajem sekvence za kontrolu ekspresije. Ukoliko sekvenca nukleinske kiseline treba da se translatira u funkcionalni peptid ili protein, indukcija sekvence za kontrolu ekspresije koja je funkcionalno povezana sa kodirajućom sekvencom rezultuje transkripcijom navedene kodirajuće sekvence, bez uzrokovanja pomeranja okvira u kodirajućoj sekvenci ili kodirajućoj sekvenci koja se ne može translatirati u željeni peptid ili protein.
[0088] Termin "promotor" ili "region promotora" označava sekvencu nukleinske kiseline koja kontroliše sintezu transkripta, npr. transkripta koji sadrži kodirajuću sekvencu, obezbeđujući mesto za prepoznavanje i vezivanje RNK polimeraze. Region promotora može uključivati dodatno mesto za prepoznavanje ili vezivanje za dodatne faktore uključene u regulisanje transkripcije navedenog gena. Promotor može kontrolisati transkripciju prokariotskog ili eukariotskog gena. Promotor može biti "inducibilan" i inicirati transkripciju kao odgovor na inducer, ili može biti "konstitutivan" ukoliko transkripciju ne kontroliše inducer. Inducibilni promotor se eksprimira samo u vrlo maloj meri ili se uopšte ne eksprimira, ukoliko je inducer odsutan. U prisustvu inducera, gen se "uključuje" ili se povećava nivo transkripcije. Ovo je uobičajeno posredovano vezivanjem specifičnog transkripcionog faktora. Specifični promotor u skladu sa predmetnim učenjem je subgenomski promotor alfavirusa, kao što je ovde opisano. Drugi specifični promotori su genomski promotori sa plus-lancem ili negativnimlancem alfavirusa.
[0089] Termin "jezgro promotora" označava sekvencu nukleinske kiseline koju sadrži promotor. Jezgro promotora je tipično minimalni deo promotora potreban da pravilno inicira transkripciju. Jezgro promotora tipično uključuje start mesto transkripcije i vezujuće mesto za RNK polimerazu.
[0090] "Polimeraza" generalno označava molekulski entitet sposoban da katalizuje sintezu polimernog molekula iz monomernih gradivnih blokova. "RNK polimeraza" je molekulski entitet sposoban da katalizuje sintezu molekula RNK iz gradivnih blokova ribonukleotida. "DNK polimeraza" je molekulski entitet sposoban da katalizuje sintezu molekula DNK iz gradivnih blokova dezoksiribonukleotida. U slučaju DNK polimeraza i RNK polimeraza, molekulski entitet je tipično protein ili skup ili kompleks više proteina. Tipično, DNK polimeraza sintetiše molekul DNK na osnovu templata nukleinske kiseline, koja je tipično molekul DNK. Tipično, RNK polimeraza sintetiše molekul RNK na osnovu templata nukleinske kiseline, koja je bilo molekul DNK (u tom slučaju RNK polimeraza je DNK-zavisna RNK polimeraza, DdRP), ili je molekul RNK (u tom slučaju RNK polimeraza je RNK-zavisna RNK polimeraza, RdRP).
[0091] "RNK zavisna RNK polimeraza" ili "RdRP" je enzim koji katalizuje transkripciju RNK iz RNK templata. U slučaju alfavirusne RNK-zavisne RNK polimeraze, sekvencijalna sinteza (-) lančanog komplementa genomske RNK i (+) lančane genomske RNK dovodi do replikacije RNK. Alfavirusna RNK-zavisna RNK polimeraza se stoga sinonimno označava kao "RNK replikaza". U prirodi, RNK-zavisne RNK polimeraze tipično kodiraju svi RNK virusi osim retrovirusa. Tipični predstavnici virusa koji kodiraju RNK-zavisnu RNK polimerazu su alfavirusi.
[0092] U skladu sa predmetnim učenjem, "replikacija RNK" generalno označava molekul RNK sintetisan na osnovu nukleotidne sekvence datog molekula RNK (templat molekul RNK). Molekul RNK koji se sintetiše može biti npr. identičan ili komplementaran sa templat molekulom RNK. Uopšteno, do replikacije RNK može doći putem sinteze DNK intermedijera, ili može doći direktno RNK-zavisnom replikacijom RNK posredovanom RNK-zavisnom RNK polimerazom (RdRP). U slučaju alfavirusa, replikacija RNK se ne odvija putem DNK intermedijera, već je posredovana RNK-zavisnom RNK polimerazom (RdRP): templat lanac RNK (prvi lanac RNK) služi kao templat za sintezu drugog lanca RNK koji je komplementaran prvom lancu RNK ili njegovom delu. Drugi lanac RNK može zauzvrat opciono poslužiti kao templat za sintezu trećeg lanca RNK koji je komplementaran drugom lancu RNK ili njegovom delu. Prema tome, treći lanac RNK je identičan prvom lancu RNK ili njegovom delu. Stoga, RNK-zavisna RNK polimeraza je sposobna da direktno sintetiše lanac RNK komplementaran templatu, i da indirektno sintetiše identičan lanac RNK (preko komplementarnog intermedijarnog lanca).
[0093] U skladu sa učenjem, termin "gen" označava posebnu sekvencu nukleinske kiseline koja je odgovorna za proizvodnju jednog ili više ćelijskih proizvoda i/ili za postizanje jedne ili više međućelijskih ili unutarćelijskih funkcija. Specifičnije, navedeni termin se odnosi na deo nukleinske kiseline (tipično DNK; ali RNK u slučaju RNK virusa) koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira specifični protein ili funkcionalni ili strukturni molekul RNK.
[0094] "Izolovani molekul", kao što se ovde upotrebljava, je namenjen da označava molekul koji je suštinski bez drugih molekula kao što je drugi ćelijski materijal. Termin "izolovana nukleinska kiselina" znači u skladu sa učenjem da je nukleinska kiselina (i) amplifikovana in vitro, na primer lančanom reakcijom polimeraze (PCR), (ii) rekombinantno proizvedena kloniranjem, (iii) prečišćena, na primer isecanjem i gel-elektroforetskim frakcionisanjem, ili (iv) sintetisana, na primer hemijskom sintezom. Izolovana nukleinska kiselina je nukleinska kiselina dostupna za manipulaciju rekombinantnim tehnikama.
2
[0095] Termin "vektor" se ovde upotrebljava u svom najopštijem značenju i sadrži bilo koje intermedijarne vehikulume za nukleinsku kiselinu koji, na primer, omogućavaju da se navedena nukleinska kiselina introdukuje u prokariotske i/ili eukariotske ćelije domaćine i, gde je prikladno, da se integriše u genom. Takvi vektori se poželjno repliciraju i/ili eksprimiraju u ćeliji. Vektori sadrže plazmide, fagemide, genome virusa, i njihove frakcije.
[0096] Termin "rekombinantni" u kontekstu predmetnog učenja znači "napravljen genetičkim inženjeringom". Poželjno, "rekombinantni objekat" kao što je rekombinantna ćelija u kontekstu predmetnog učenja ne javlja se u prirodi.
[0097] Termin "javlja se u prirodi" kao što se ovde upotrebljava označava činjenicu da se neki objekat može naći u prirodi. Na primer, peptid ili nukleinska kiselina koja je prisutna u organizmu (uključujući viruse) i može biti izolovana iz izvora u prirodi i koju čovek nije namerno modifikovao u laboratoriji je ona koja se javlja u prirodi.
[0098] U skladu sa učenjem, termin "ekspresija" se upotrebljava u svom najopštijem značenju i sadrži proizvodnju RNK, ili RNK i proteina. Takođe sadrži i delimičnu ekspresiju nukleinskih kiselina. Štaviše, ekspresija može biti prolazna ili stabilna. Što se tiče RNK, termin "ekspresija" ili "translacija" se odnosi na proces u ribozomima ćelije pomoću koga lanac informacione RNK usmerava sklapanje sekvence amino-kiselina kako bi se napravio peptid ili protein.
[0099] U skladu sa učenjem, termin "iRNK" znači "informaciona RNK" i odnosi se na transkript koji se tipično generiše upotrebom DNK templata i kodira peptid ili protein. Tipično, iRNK sadrži 5'-UTR, region koji kodira protein, 3'-UTR, i poli(A) sekvencu. iRNK se može generisati in vitro transkripcijom iz DNK templata. Metodologija in vitro transkripcije poznata je stručnjaku. Na primer, postoji niz komercijalno dostupnih kompleta za in vitro transkripciju. U skladu sa učenjem, iRNK se može modifikovati stabilizacionim modifikacijama i dodavanjem kape.
[0100] U skladu sa učenjem, termini "poli(A) sekvenca" ili "poli(A) rep" označavaju neprekinutu ili prekinutu sekvencu adenilatnih ostataka koja je tipično locirana na 3' kraju molekula RNK. Neprekinutu sekvencu karakterišu uzastopni adenilatni ostaci. U prirodi je neprekinuta poli(A) sekvenca tipična. Dok poli(A) sekvenca normalno nije kodirana u eukariotskoj DNK, već je prikačena tokom eukariotske transkripcije u nukleusu ćelije za slobodni 3' kraj RNK pomoću templat-nezavisne RNK polimeraze posle transkripcije, predmetno učenje obuhvata poli(A) sekvence kodirane od strane DNK.
[0101] U skladu sa učenjem, nukleinska kiselina kao što je RNK, npr. iRNK, može kodirati peptid ili protein. U skladu sa tim, sekvenca nukleinske kiseline koja se može transkribovati ili njen transkript može sadržati otvoreni okvir čitanja (ORF) koji kodira peptid ili protein.
[0102] U skladu sa učenjem, termini "nukleinska kiselina koja kodira peptid ili protein" znači da nukleinska kiselina, ukoliko je prisutna u odgovarajućem okruženju, poželjno unutar ćelije, može da usmeri sklapanje amino-kiselina kako bi se proizveo peptid ili protein tokom procesa translacije. Poželjno, RNK u skladu sa učenjem može da stupi u interakciju sa mašinerijom za translaciju u ćeliji omogućavajući translaciju peptida ili proteina.
[0103] U skladu sa učenjem, termin "peptid" sadrži oligo- i polipeptide i označava supstance koje sadrže dva ili više, poželjno 3 ili više, poželjno 4 ili više, poželjno 6 ili više, poželjno 8 ili više, poželjno 10 ili više, poželjno 13 ili više, poželjno 16 ili više, poželjno 20 ili više, i do poželjno 50, poželjno 100 ili poželjno 150, uzastopnih amino-kiselina povezanih jedna sa drugom putem peptidnih veza. Termin "protein" označava velike peptide, poželjno peptide koji imaju najmanje 151 amino-kiselinu, ali se termini "peptid" i "protein" ovde uobičajeno upotrebljavaju kao sinonimi.
[0104] Termini "peptid" i "protein" sadrže, u skladu sa učenjem, supstance koje sadrže ne samo amino-kiselinske komponente, već i komponente koje nisu amino-kiseline, kao što su šećeri i fosfatne strukture, i takođe sadrže supstance koje sadrže veze kao što su estarske, tioetarske ili disulfidne veze.
[0105] U skladu sa učenjem, termin "alfavirus" treba shvatiti široko i uključuje bilo koje čestice virusa koje imaju karakteristike alfavirusa. Karakteristike alfavirusa uključuju prisustvo (+) lančane RNK koja kodira genetičke informacije pogodne za replikaciju u ćeliji domaćinu, uključujući aktivnost RNK polimeraze. Dodatne karakteristike mnogih alfavirusa opisane su npr. u Strauss & Strauss, Microbiol. Rev., 1994, vol.58, pp.491-562; Gould et al., 2010, Antiviral Res., vol. 87, pp. 111-124; Rupp et al., 2015, J. Gen. Virology, vol. 96, pp.
2483-2500. Termin "alfavirus" uključuje alfavirus koji se nalazi u prirodi, kao i bilo koju njegovu varijantu ili derivat. U nekim primerima izvođenja, varijanta ili derivat se ne nalaze u prirodi.
[0106] U jednom primeru izvođenja, alfavirus je alfavirus koji se nalazi u prirodi. Tipično, alfavirus koji se nalazi u prirodi je infektivan za jedan ili više eukariotskih organizama, kao što je životinja (uključujući vertebrata kao što je čovek, i artropodu kao što je insekt). U tipičnim primerima izvođenja, alfavirus koji se nalazi u prirodi je infektivan za životinju.
[0107] Mnogi alfavirusi koji se nalaze u prirodi su infektivni za vertebrate i/ili artropode (Strauss & Strauss, Microbiol. Rev., 1994, vol.58, pp.491-562).
2
[0108] Alfavirus koji se nalazi u prirodi poželjno je odabran iz grupe koja se sastoji od sledećih: kompleks virusa Barmah šume (koji sadrži virus Barmah šume); kompleks istočnog konjskog encefalitisa (koji sadrži sedam antigenih tipova virusa istočnog konjskog encefalitisa); kompleks Midelburg virusa (koji sadrži Midelburg virus); kompleks Ndumu virusa (koji sadrži Ndumu virus); kompleks virusa Semliki šume (koji sadrži Bebaru virus, čikungunja virus, Mayaro virus i njegov podtip Una virus, O'Nyong Nyong virus i njegov podtip Igbo-Ora virus, Ross River virus i njegove podtipove Bebaru virus, Getah virus, Sagiyama virus, virus Semliki šume i njegov podtip Me Tri virus); kompleks venecuelanskog konjskog encefalitisa (koji sadrži Cabassou virus, Everglades virus, Mosso das Pedras virus, Mucambo virus, Paramana virus, Pixuna virus, Rio Negro virus, Trocara virus i njegov podtip Bijou Bridge virus, virus venecuelanskog konjskog encefalitisa); kompleks zapadnog konjskog encefalitisa (koji sadrži Aura virus, Babanki virus, Kyzylagach virus, Sindbis virus, Ockelbo virus, Whataroa virus, Buggy Creek virus, Fort Morgan virus, Highlands J virus, virus zapadnog konjskog encefalitisa); i neke neklasifikovane viruse uključujući virus bolesti pankreasa lososa; virus bolesti spavanja; virus južnog morskog slona; Tonate virus. Poželjnije, alfavirus je odabran iz grupe koja se sastoji od kompleksa virusa Semliki šume (koji sadrži prethodno navedene tipove virusa, uključujući virus Semliki šume), kompleksa zapadnog konjskog encefalitisa (koji sadrži prethodno navedene tipove virusa, uključujući Sindbis virus), virusa istočnog konjskog encefalitisa (koji sadrži prethodno navedene tipove virusa), kompleksa venecuelanskog konjskog encefalitisa (koji sadrži prethodno navedene tipove virusa, uključujući i virus venecuelanskog konjskog encefalitisa).
[0109] U dodatnom poželjnom primeru izvođenja, alfavirus je virus Semliki šume. U alternativnom dodatnom poželjnom primeru izvođenja, alfavirus je Sindbis virus. U alternativnom dodatnom poželjnom primeru izvođenja, alfavirus je virus venecuelanskog konjskog encefalitisa.
[0110] U nekim primerima izvođenja predmetnog učenja, alfavirus nije alfavirus koji se nalazi u prirodi. Tipično, alfavirus koji se ne nalazi u prirodi je varijanta ili derivat alfavirusa koji se nalazi u prirodi, koji se razlikuje od alfavirusa koji se nalazi u prirodi po najmanje jednoj mutaciji u nukleotidnoj sekvenci, tj. genomskoj RNK. Mutacija u nukleotidnoj sekvenci može biti odabrana od insercije, supstitucije ili delecije jednog ili više nukleotida, u poređenju sa alfavirusom koji se nalazi u prirodi. Mutacija u nukleotidnoj sekvenci može ili ne mora biti povezana sa mutacijom u polipeptidu ili proteinu kodiranom nukleotidnom sekvencom. Na primer, alfavirus koji se ne nalazi u prirodi može biti oslabljen alfavirus. Oslabljeni alfavirus koji se ne nalazi u prirodi je alfavirus koji tipično ima najmanje jednu
2
mutaciju u svojoj nukleotidnoj sekvenci po kojoj se razlikuje od alfavirusa koji se nalazi u prirodi, i koji ili uopšte nije infektivan, ili je infektivan, ali ima niži nivo sposobnosti da proizvede bolest ili uopšte nema sposobnost da proizvede bolest. Kao ilustrativan primer, TC83 je oslabljeni alfavirus koji se razlikuje od virusa venecuelanskog konjskog encefalitisa (VEEV) koji se nalazi u prirodi (MyKinney et al., 1963, Am. J. Trop. Med. Hyg., 1963, vol.
12; pp.597-603).
[0111] Termin "nalazi se u prirodi" znači "prisutan u prirodi" i uključuje poznate objekte kao i objekte koji još nisu otkriveni i/ili izolovani iz prirode, ali koji se u budućnosti mogu otkriti i/ili izolovati iz prirodnog izvora.
[0112] Pripadnici roda alfavirusa takođe se mogu klasifikovati na osnovu svojih relativnih kliničkih svojstava kod ljudi: alfavirusi povezani prvenstveno sa encefalitisom, i alfavirusi povezani prvenstveno sa groznicom, osipom, i poliartritisom.
[0113] Termin "alfavirusni" znači da se nalazi u alfavirusu, ili je poreklom iz alfavirusa, ili je izveden od alfavirusa, npr. genetičkim inženjeringom.
[0114] U skladu sa učenjem, "SFV" znači virus Semliki šume. U skladu sa učenjem, "SIN" ili "SINV" označava Sindbis virus. U skladu sa učenjem, "VEE" ili "VEEV" označava virus venecuelanskog konjskog encefalitisa.
[0115] Termin "konzervirani element sekvence" ili "CSE" označava nukleotidnu sekvencu koja se nalazi u alfavirusnoj RNK. Ovi elementi sekvence nazivaju se "konzervirani" pošto su ortolozi prisutni u genomu različitih alfavirusa, i ortologni CSE različitih alfavirusa poželjno dele visok procenat identičnosti sekvence i/ili sličnu sekundarnu ili tercijarnu strukturu. Termin CSE uključuje CSE 1, CSE 2, CSE 3 i CSE 4 (za detalje videti Jose et al., Future Microbiol., 2009, vol.4, pp.837-856).
[0116] U skladu sa učenjem, termin "subgenomski promotor" ili "SGP" označava sekvencu nukleinske kiseline uzvodno (5') od sekvence nukleinske kiseline (npr. kodirajuće sekvence), koja kontroliše transkripciju navedene sekvence nukleinske kiseline obezbeđujući mesto za prepoznavanje i vezivanje RNK polimeraze, tipično RNK-zavisne RNK polimeraze. SGP može uključivati dodatna mesta za prepoznavanje i vezivanje dodatnih faktora. Subgenomski promotor je tipično genetički element pozitivnog lanca RNK virusa, kao što je alfavirus. Subgenomski promotor alfavirusa je sekvenca nukleinske kiseline koja je sadržana u virusnoj genomskoj RNK. Subgenomski promotor se generalno karakteriše po tome što omogućava inicijaciju transkripcije (sinteze RNK) u prisustvu RNK-zavisne RNK polimeraze, npr. alfavirusne replikaze. RNK (-) lanac, tj. komplement alfavirusne genomske RNK, služi kao templat za sintezu (+) lanca subgenomskog molekula RNK, i sinteza subgenomskog (+) lanca
2
se tipično inicira na ili blizu subgenomskog promotora. U ilustrativne i neograničavajuće svrhe, tipična lokalizacija SGP kao što je sadržana u primeru genoma alfavirusa ilustrovana je na Sl. 1A. Međutim, termin "subgenomski promotor", kao što se ovde upotrebljava, nije ograničen na bilo koju određenu lokalizaciju u nukleinskoj kiselini koja sadrži takav subgenomski promotor. U nekim primerima izvođenja, SGP je identičan sa CSE 3 ili se preklapa sa CSE 3 ili sadrži CSE 3.
[0117] Termin "autologno" se upotrebljava za opisivanje svega što je poreklom iz istog subjekta. Na primer, "autologna ćelija" označava ćeliju poreklom iz istog subjekta. Introdukcija autolognih ćelija u subjekta je povoljna pošto te ćelije prevazilaze imunsku barijeru koja inače rezultuje odbacivanjem.
[0118] Termin "alogeno" se upotrebljava za opisivanje svega što je poreklom iz različitih jedinki iste vrste. Za dve ili više jedinki se kaže da su međusobno alogene kada geni na jednom ili više lokusa nisu identični.
[0119] Termin "singeno" se upotrebljava za opisivanje svega što je poreklom iz pojedinaca ili tkiva koja imaju identične genotipove, tj. identičnih blizanaca ili životinja istog inbred soja, ili njihovih tkiva ili ćelija.
[0120] Termin "heterologno" se upotrebljava za opisivanje nečega što se sastoji od više različitih elemenata. Kao primer, introdukcija ćelije od jednog pojedinca u drugog pojedinca predstavlja heterolognu transplantaciju. Heterologni gen je gen poreklom iz izvora drugog nego što je subjekt.
[0121] U nastavku su obezbeđene specifične i/ili poželjne varijante pojedinačnih svojstava iz učenja. Predmetno učenje takođe razmatra kao posebno poželjne primere izvođenja one primere izvođenja, koji su generisani kombinovanjem dve ili više specifičnih i/ili poželjnih varijanti opisanih za dva ili više svojstava iz predmetnog pronalaska.
Sistem iz predmetnog učenja
[0122] U prvom aspektu, predmetno učenje obezbeđuje sistem koji sadrži:
RNK konstrukt za ekspresiju alfavirusne replikaze,
RNK replikon koji se može replicirati pomoću replikaze in trans,
pri čemu RNK konstrukt za ekspresiju alfavirusne replikaze sadrži 5'-kapu.
[0123] 5'-kapa služi u svrhu pokretanja translacije replikaze.
2
[0124] Stoga, predmetno učenje obezbeđuje sistem koji sadrži dva molekula nukleinske kiseline: prvi molekul RNK za ekspresiju replikaze (tj. koji kodira replikazu); i drugi molekul RNK (replikon). RNK konstrukt za ekspresiju replikaze se ovde sinonimno označava kao "replikazni konstrukt".
[0125] U sistemu iz predmetnog učenja, uloga replikaze je da amplifikuje replikon in trans. Replikon se prema tome može označiti kao trans-replikon. Ukoliko replikon kodira gen od interesa za ekspresiju, nivoi ekspresije gena od interesa i/ili trajanje ekspresije mogu se regulisati in trans modifikovanjem nivoa replikaze.
[0126] Generalno, RNK predstavlja atraktivnu alternativu DNK kako bi se zaobišli potencijalni bezbednosni rizici povezani sa upotrebom DNK u terapiji ljudi i životinja. Prednosti terapijske upotrebe RNK uključuju prolaznu ekspresiju i netransformišući karakter, i RNK ne mora da uđe u nukleus kako bi se eksprimirala, čime se minimalizuje rizik od onkogeneze.
[0127] Uprkos ovim prednostima, upotreba RNK za kliničke primene je ograničena, naročito zbog nestabilnosti RNK, i povezanog kratkog poluživota RNK. U predmetnom učenju, kratak poluživot RNK može se nadoknaditi sistemom koji pokreće replikaciju RNK u ćeliji domaćinu ili organizmu. Pored toga, predmetno učenje obezbeđuje specifične modifikacije, formulacije, vehikulume i načine isporuke RNK koji su povoljni za stabilnost RNK. Oni će biti opisani u nastavku. Zaista, kada se RNK iz sistema iz predmetnog učenja introdukuje u ćeliju ili životinju, postiže se efikasna ekspresija genetičkih informacija.
[0128] Prednost je predmetnog učenja u poređenju sa pristupima iz stanja tehnike što je transkripcija DNK templata i transport transkripta iz nukleusa u citosol neobavezan. Ovo eliminiše zavisnost od pravilnog funkcionisanja DNK-zavisne RNK polimeraze i od transporta iRNK. Umesto toga, replikazni konstrukt iz predmetnog učenja je odmah dostupan za translaciju.
[0129] Kao što je ovde opisano, sistem iz predmetnog učenja je pogodan za efikasnu proizvodnju željenog polipeptida (npr. transgena) u ćeliji domaćinu ili organizmu domaćinu. Jedna prednost predmetnog učenja je da se može postići veća ekspresija transgena nego u slučaju replikona pune dužine pogodnih za replikaciju in cis. Dodatna prednost sistema iz predmetnog učenja je da se ekspresija gena od interesa na visokom nivou može postići u primarnim ćelijama divljeg tipa (videti Primer 2) i u živim životinjama, tj. in vivo (Primeri 5 i 6). Ovo je značajna prednost u odnosu na sisteme iz stanja tehnike koji zavise od projektovanih ćelijskih linija koje eksprimiraju DNK-zavisnu RNK polimerazu bakteriofagnog porekla, T7 RNK polimerazu (Spuul et al., J. Virol., 2011, vol. 85, pp. 4739-
2
4751; Sanz et al., Cellular Microbiol., 2015, vol. 17, pp. 520-541). Ćelije sisara tipično ne eksprimiraju T7 RNK polimerazu, osim ukoliko nisu specifično projektovane (Buchholz et al., J. Virol., 1999, vol.73, pp. 251-259). Ukratko, sistem iz predmetnog učenja zasnovan na RNK ima prednost nad konvencionalnim pristupima isporuke gena ili genske terapije.
[0130] Sistem iz predmetnog učenja može se lako pripremiti. Na primer, molekuli RNK mogu se in vitro transkribovati iz DNK templata. U jednom primeru izvođenja, RNK iz predmetnog učenja je in vitro transkribovana RNK (IVT-RNK). Stoga u jednom primeru izvođenja, sistem iz predmetnog učenja sadrži IVT-RNK. Poželjno, svi molekuli RNK u sistemu iz predmetnog učenja su IVT-RNK. In vitro transkribovana RNK (IVT-RNK) je od posebnog interesa za terapijske pristupe.
[0131] Sistem iz predmetnog učenja sadrži najmanje dva molekula nukleinske kiseline. Stoga, može sadržati dva ili više, tri ili više, četiri ili više, pet ili više, šest ili više, sedam ili više, osam ili više, devet ili više, ili deset ili više molekula nukleinske kiseline. U poželjnom primeru izvođenja, on sadrži tačno dva molekula nukleinske kiseline, poželjno molekule RNK, replikon i replikazni konstrukt. U alternativnim poželjnim primerima izvođenja, sistem sadrži, pored replikaznog konstrukta, više od jednog replikona, od kojih svaki poželjno kodira najmanje jedan protein od interesa. U ovim primerima izvođenja, replikaza kodirana replikaznim konstruktom može delovati na svaki replikon da pokrene replikaciju i proizvodnju subgenomskih transkripata, respektivno. Na primer, svaki replikon može kodirati farmaceutski aktivan peptid ili protein. Ovo je povoljno npr. ukoliko se želi vakcinacija subjekta protiv nekoliko različitih antigena.
[0132] Poželjno, sistem iz učenja nije sposoban da formira čestice virusa, posebno čestice virusa sledeće generacije. Poželjno, replikazni konstrukt iz predmetnog učenja nije sposoban za samoreplikaciju u ciljnoj ćeliji ili ciljnom organizmu.
[0133] Dok su aspekti i prednosti RNK ovde opisani, u nekim primerima izvođenja je alternativno moguće da sistem iz predmetnog učenja sadrži jedan ili više molekula DNK. Bilo koji jedan ili više molekula nukleinske kiseline u sistemu iz predmetnog učenja mogu, u nekim primerima izvođenja, biti molekul DNK. Moguće je da su replikazni konstrukt i/ili replikon molekuli DNK. U slučaju molekula DNK, poželjno je prisutan promotor za DNK-zavisnu RNK polimerazu, čime se omogućava transkripcija u inficiranoj ili vakcinisanoj ćeliji domaćinu ili organizmu domaćinu.
[0134] Dodatni primeri izvođenja i prednosti sistema iz predmetnog učenja opisani su u nastavku.
Karakterizacija replikaznog konstrukta
[0135] Poželjno, RNK konstrukt za ekspresiju alfavirusne replikaze (replikazni konstrukt) sadrži otvoreni okvir čitanja (ORF) koji kodira alfavirusnu replikazu.
[0136] U skladu sa predmetnim učenjem, "replikaza" označava RNK-zavisnu RNK polimerazu (RdRP). RdRP je enzimska funkcija. Replikaza generalno označava polipeptid ili kompleks ili asocijaciju više od jednog identičnog i/ili neidentičnog proteina koji je sposoban da katalizuje sintezu (-) lanca RNK na osnovu templata (+) lanca RNK, i/ili koji je sposoban da katalizuje sintezu (+) lanca RNK na osnovu templata (-) lanca RNK. Replikaza može dopunski imati jednu ili više dopunskih funkcija, kao što je npr. proteaza (za auto-isecanje), helikaza, terminalna adenililtransferaza (za dodavanje poli(A) repa), metiltransferaza i guanililtransferaza (za obezbeđivanje nukleinske kiseline sa 5'-kapom), mesta za lokalizaciju u nukleus, trifosfataza (Gould et al., 2010, Antiviral Res., vol. 87, pp. 111-124; Rupp et al., 2015, J. Gen. Virol., vol.96, pp.2483-500).
[0137] U skladu sa učenjem, "alfavirusna replikaza" označava RNK replikazu iz alfavirusa, uključujući RNK replikazu iz alfavirusa koji se javlja u prirodi i RNK replikazu iz varijante ili derivata alfavirusa, kao što je iz oslabljenog alfavirusa. U kontekstu predmetnog učenja, termini "replikaza" i "alfavirusna replikaza" se upotrebljavaju naizmenično, osim ukoliko kontekst nalaže da bilo koja određena replikaza nije alfavirusna replikaza. Termin "replikaza" sadrži sve varijante, posebno posttranslaciono modifikovane varijante, konformacije, izoforme i homologe alfavirusne replikaze, koje eksprimiraju ćelije inficirane alfavirusom ili koje eksprimiraju ćelije koje su transfekovane nukleinskom kiselinom koja kodira za replikazu. Štaviše, termin "replikaza" sadrži sve oblike replikaze koji su proizvedeni i mogu se proizvesti rekombinantnim postupcima. Na primer, replikaza koja sadrži oznaku koja olakšava detekciju i/ili prečišćavanje replikaze u laboratoriji, npr. myc-tag, HA-tag ili oligohistidinsku oznaku (His-tag) može se proizvesti rekombinantnim postupcima.
[0138] Opciono, replikaza je dopunski funkcionalno definisana sposobnošću vezivanja za bilo koji jedan ili više od konzerviranog elementa sekvence 1 (CSE1) alfavirusa ili njegovu komplementarnu sekvencu, konzerviranog elementa sekvence 2 (CSE2) ili njegovu komplementarnu sekvencu, konzerviranog elementa sekvence 3 (CSE3) ili njegovu komplementarnu sekvencu, konzerviranog elementa sekvence 4 (CSE 4) ili njegovu komplementarnu sekvencu. Poželjno, replikaza je sposobna da se veže za CSE 2 [tj. za (+) lanac] i/ili za CSE 4 [tj. za (+) lanac], ili da se veže za komplement CSE 1 [tj. za (-) lanac] i/ili za komplement CSE 3 [tj. za (-) lanac].
1
[0139] Poreklo replikaze nije ograničeno na bilo koji određeni alfavirus. U poželjnom primeru izvođenja, alfavirusna replikaza poreklom je od virusa Semliki šume, uključujući virus Semliki šume koji se javlja u prirodi i varijantu ili derivat virusa Semliki šume, kao što je oslabljen virus Semliki šume. U alternativnom poželjnom primeru izvođenja, replikaza je iz Sindbis virusa, uključujući Sindbis virus koji se javlja u prirodi i varijantu ili derivat Sindbis virusa, kao što je oslabljeni Sindbis virus. U alternativnom poželjnom primeru izvođenja, replikaza je iz virusa venecuelanskog konjskog encefalitisa (VEEV), uključujući VEEV koji se javlja u prirodi i varijantu ili derivat VEEV, kao što je oslabljeni VEEV.
[0140] Alfavirusna replikaza tipično sadrži ili se sastoji od nestrukturnih proteina (nsP) alfavirusa. U ovom kontekstu, "nestrukturni proteini" označavaju bilo koji jedan ili više pojedinačnih nestrukturnih proteina poreklom iz alfavirusa (nsP1, nsP2, nsP3, nsP4), ili poliprotein koji sadrži polipeptidnu sekvencu više od jednog nestrukturnog proteina poreklom iz alfavirusa, npr. nsP1234. U nekim primerima izvođenja, "nestrukturni protein" označava nsP123. U drugim primerima izvođenja, "nestrukturni protein" označava nsP1234. U drugim primerima izvođenja, "nestrukturni protein" označava kompleks ili asocijaciju nsP123 (sinonimno P123) i nsP4. U nekim primerima izvođenja, "nestrukturni protein" označava kompleks ili asocijaciju nsP1, nsP2, i nsP3. U nekim primerima izvođenja, "nestrukturni protein" označava kompleks ili asocijaciju nsP1, nsP2, nsP3 i nsP4. U nekim primerima izvođenja, "nestrukturni protein" označava kompleks ili asocijaciju bilo kog jednog ili više odabranih iz grupe koja se sastoji od nsP1, nsP2, nsP3 i nsP4.
[0141] Poželjno, "kompleks ili asocijacija" je funkcionalna celina mnoštva elemenata. U kontekstu alfavirusne replikaze, termin "kompleks ili asocijacija" opisuje mnoštvo od najmanje dva molekula proteina, od kojih je najmanje jedan nestrukturni protein alfavirusa, pri čemu kompleks ili asocijacija ima aktivnost RNK-zavisne RNK polimeraze (RdRP). Kompleks ili asocijacija se mogu sastojati od više različitih proteina (heteromultimer) i/ili od više kopija jednog određenog proteina (homomultimer). U kontekstu multimera ili mnoštva, "multi" znači više od jednog, kao što su dva, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet, deset, ili više od deset.
[0142] Kompleks ili asocijacija može takođe sadržati proteine iz više od jednog različitog alfavirusa. Na primer, u kompleksu ili asocijaciji u skladu sa učenjem koji sadrži različite nestrukturne proteine alfavirusa, nije neophodno da svi nestrukturni proteini budu poreklom iz istog alfavirusa. Heterologni kompleksi ili asocijacije podjednako su sadržani u predmetnom učenju. Samo u ilustrativne svrhe, heterologni kompleks ili asocijacija može sadržati jedan ili
2
više nestrukturnih proteina (npr. nsP1, nsP2) iz prvog alfavirusa (npr. Sindbis virus), i jedan ili više nestrukturnih proteina (nsP3, nsP4) iz drugog alfavirusa (npr. virus Semliki šume).
[0143] Termini "kompleks" ili "asocijacija" označavaju dva ili više istih ili različitih molekula proteina koji su prostorno u blizini. Proteini kompleksa su poželjno u direktnom ili indirektnom fizičkom ili fizičko-hemijskom kontaktu jedan sa drugim. Kompleks ili asocijacija se mogu sastojati od više različitih proteina (heteromultimer) i/ili više kopija jednog određenog proteina (homomultimer).
[0144] Termin "replikaza" uključuje svaki ko- ili posttranslaciono modifikovan oblik, uključujući ugljenohidratno modifikovane (kao što su glikozilovani) i lipidno modifikovane oblike nestrukturnih proteina alfavirusa.
[0145] Termin "replikaza" uključuje svaki funkcionalni fragment alfavirusne replikaze. Fragment je funkcionalan kada funkcioniše kao RNK-zavisna RNK polimeraza (RdRP).
[0146] U nekim primerima izvođenja, replikaza je sposobna da formira membranske komplekse replikacije i/ili vakuole u ćelijama u kojima se replikaza eksprimira.
[0147] Poželjno replikazni konstrukt sadrži kodirajući(e) region(e) za replikazu kao što je prethodno definisano. Kodirajući region(i) se mogu sastojati od jednog ili više otvorenih okvira čitanja.
[0148] U jednom primeru izvođenja, replikazni konstrukt kodira sve nsP1, nsP2, nsP3 i nsP4 alfavirusa. U jednom primeru izvođenja, replikazni konstrukt kodira nsP1, nsP2, nsP3 i nsP4 alfavirusa kao jedan jedini poliprotein koji se opciono može isecati: nsP1234, kodiran jednim jedinim otvorenim okvirom čitanja. U jednom primeru izvođenja, replikazni konstrukt kodira nsP1, nsP2 i nsP3 alfavirusa kao jedan jedini, koji se opciono može isecati: nsP123, kodiran jednim jedinim otvorenim okvirom čitanja. U tom primeru izvođenja, nsP4 može biti kodiran odvojeno.
[0149] Poželjno, replikazni konstrukt iz predmetnog učenja ne sadrži subgenomski promotor alfavirusa.
[0150] Poželjno, replikazni konstrukt je molekul iRNK. Molekul iRNK poželjno ne sadrži ni CSE 1 ni CSE 4. Bez želje da bude vezano teorijom, predviđeno je da takva iRNK neće biti u kompeticiji sa replikonom za vezivanje replikaze, tako da se replikon može replicirati vrlo efikasno pomoću replikaze.
[0151] RNK replikaznog konstrukta poželjno nije dvolančana, poželjno je jednolančana, poželjnije (+) lanac RNK. Replikaza je kodirana otvorenim okvirom čitanja na replikaznom konstruktu.
[0152] U jednom primeru izvođenja, replikazni konstrukt iz predmetnog učenja je RNK bez introna, poželjno iRNK bez introna. Poželjno, replikazni konstrukt je prirodna RNK (iRNK) bez introna. Na primer, RNK (iRNK) bez introna se može dobiti sintezom in vitro, npr. in vitro transkripcijom. U jednom primeru izvođenja, replikazni konstrukt sadrži otvoreni okvir čitanja koji kodira nsP1234 koji ne sadrži intron. U jednom primeru izvođenja, replikazni konstrukt sadrži otvoreni okvir čitanja koji kodira nsP123 koji ne sadrži intron. Poželjno, replikazni konstrukt ne sadrži intron dobijen iz beta-globin gena zeca (kao što je opisano u WO 2008/119827 A1).
[0153] "Intron", kao što se ovde upotrebljava, definisan je kao nekodirajući deo prekursorske iRNK (pre-iRNK), koji se uklanja, tj. splajsuje iz RNK, pre translacije kodirajuće sekvence RNK u polipeptid. Nakon što su introni splasovani iz pre-iRNK, rezultujuća sekvenca iRNK je spremna da bude translatirana u polipeptid. Drugim rečima, nukleotidna sekvenca introna se tipično ne translatira u protein. iRNK bez introna je iRNK koja sadrži uzastopni red kodona (bazni tripleti) za translaciju u polipeptid. iRNK bez introna može biti prirodno bez introna (tj. inicijalno se sintetisati kao iRNK bez introna, npr. u ćeliji ili in vitro transkripcijom), ili može sazreti u iRNK bez introna splajsovanjem pre-iRNK koja sadrži intron. In vitro transkribovana RNK prirodno bez introna je poželjna u predmetnom učenju.
[0154] Replikazni konstrukt iz predmetnog učenja se razlikuje od alfavirusne genomske RNK barem po tome što nije sposoban za samoreplikaciju i/ili po tome što ne sadrži otvoreni okvir čitanja pod kontrolom subgenomskog promotora. Kada nije sposoban da se samoreplicira, replikazni konstrukt se takođe može nazvati "konstruktom samoubicom".
[0155] Poželjno, replikazni konstrukt iz predmetnog učenja nije povezan sa strukturnim proteinima alfavirusa. Poželjno replikazni konstrukt nije upakovan od strane strukturnih proteina alfavirusa. Poželjnije, replikazni konstrukt nije upakovan u česticu virusa. Poželjno, replikazni konstrukt nije povezan sa virusnim proteinima (sistem bez proteina virusa). Sistem bez proteina virusa obezbeđuje prednost u poređenju sa sistemom zasnovanim na virusima pomoćnicima iz stanja tehnike, npr. Bredenbeek et al., supra.
[0156] Poželjno, replikaznom konstruktu nedostaje najmanje jedan konzervirani element sekvence (CSE) koji je neophodan za sintezu (-) lanca na osnovu templata (+) lanca, i/ili za sintezu (+) lanca na osnovu templata (-) lanca. Poželjnije, replikazni konstrukt ne sadrži nikakve konzervirane elemente sekvence (CSE) poreklom iz alfavirusa. Posebno, između četiri CSE alfavirusa (Strauss & Strauss, Microbiol. Rev., 1994, vol. 58, pp.491-562; Jose et al., Future Microbiol., 2009, vol. 4, pp. 837-856), bilo koji jedan ili više od sledećih CSE poželjno nisu prisutni na replikaznom konstruktu.
4
- CSE 1, za koji se veruje da funkcioniše kao promotor za sintezu (+) lanca na osnovu templata (-) lanca u alfavirusu koji se nalazi u prirodi;
- CSE 2, za koji se veruje da funkcioniše kao promotor za sintezu (-) lanca na osnovu (+) lanca genomske RNK alfavirusa koji se nalazi u prirodi;
- CSE 3, za koji se veruje da doprinosi efikasnoj transkripciji subgenomskog (+) lanca RNK u alfavirusu koji se nalazi u prirodi;
- CSE 4, za koji se veruje da funkcioniše kao jezgro promotora za inicijaciju sinteze (-) lanca na osnovu (+) lanca genomske RNK u alfavirusu koji se nalazi u prirodi.
[0157] U jednom primeru izvođenja, CSE 1, CSE 3 i CSE 4 nisu prisutni, i CSE 2 može ili ne mora biti prisutan.
[0158] Posebno u odsustvu bilo kog jednog ili više alfavirusnih CSE, replikazni konstrukt iz predmetnog učenja mnogo više liči na tipičnu eukariotsku iRNK nego što liči na alfavirusnu genomsku RNK.
[0159] U jednom primeru izvođenja, replikazni konstrukt iz predmetnog učenja je izolovani molekul nukleinske kiseline.
Kapa
[0160] RNK konstrukt za ekspresiju alfavirusne replikaze (replikazni konstrukt) sadrži 5'-kapu. Termini "5'-kapa", "kapa", "struktura 5'-kape", "struktura kape" upotrebljavaju se kao sinonimi za označavanje dinukleotida koji se nalazi na 5' kraju nekih eukariotskih primarnih transkripata kao što je prekursor informacione RNK. 5'-kapa je struktura u kojoj je (opciono modifikovan) guanozin vezan za prvi nukleotid molekula iRNK putem 5' do 5' trifosfatne veze (ili modifikovane trifosfatne veze u slučaju određenih analoga kape). Termini mogu označavati konvencionalnu kapu ili analog kape. Ilustracije radi, neki posebni kapa dinukleotidi sa (uključujući kape analoge dinukleotida) pokazani su na Sl.2.
[0161] "RNK koja sadrži 5'-kapu" ili "RNK koja je obezbeđena sa 5'-kapom" ili "RNK koja je modifikovana sa 5'-kapom" ili "RNK sa dodatom kapom" označavaju RNK koja sadrži 5'-kapu. Na primer, obezbeđivanje RNK sa 5'-kapom može se postići in vitro transkripcijom DNK templata u prisustvu navedene 5'-kape, pri čemu je navedena 5'-kapa kotranskripciono inkorporisana u generisani lanac RNK, ili se RNK može generisati, na primer, in vitro transkripcijom, i 5'-kapa se može prikačiti za RNK posttranskripciono upotrebom enzima za dodavanje kape, na primer, enzima za dodavanje kape Vaccinia virusa. U RNK sa dodatom kapom, 3' pozicija prve baze molekula RNK (sa dodatom kapom) je povezana sa 5' pozicijom sledeće baze molekula RNK ("druga baza") putem fosfodiestarske veze. Ilustracije radi, na Sl.
1, poziciju kape u molekulima nukleinske kiseline u skladu sa predmetnim učenjem simbolizuje slovo C.
[0162] Termin "konvencionalna 5'-kapa" označava 5'-kapu koja se javlja u prirodi, poželjno 7-metilguanozin kapu. U 7-metilguanozin kapi, guanozin kape je modifikovani guanozin pri čemu se modifikacija sastoji od metilacije na 7-poziciji (Sl.2 gore).
[0163] U kontekstu predmetnog učenja, termin "analog 5'-kape" označava molekulsku strukturu koja liči na konvencionalnu 5'-kapu, ali je modifikovana tako da poseduje sposobnost da stabilizuje RNK ukoliko je prikačena za nju, poželjno in vivo i/ili u ćeliji. Analog kape nije konvencionalna 5'-kapa.
[0164] Predmetno učenje se razlikuje od trans-replikacionog sistema iz stanja tehnike u tome što se translacija replikaze pokreće 5'-kapom na replikaznom konstruktu. Predmetni pronalazači su pronašli da specifično 5'-kapa na replikaznom konstruktu ima veoma pozitivan uticaj, ne samo na ekspresiju replikaze, već i na performanse sistema u celini: može se postići veoma efikasna proizvodnja gena od interesa kodiranog in trans (videti primere). U jednom primeru izvođenja, replikazni konstrukt iz predmetnog učenja ne sadrži element unutrašnjeg ulaznog mesta ribozoma (IRES).
[0165] Generalno, unutrašnje ulazno mesto ribozoma, skraćeno IRES, je nukleotidna sekvenca koja omogućava inicijaciju translacije iz informacione RNK (iRNK) sa pozicije različite od 5ꞌ kraja sekvence iRNK, kao što je npr. sa pozicije u sredini sekvence iRNK. Termini IRES i IRES element se ovde upotrebljavaju naizmenično. IRES elementi se nalaze kod eukariota, kao i u virusima koji mogu inficirati eukariote. Međutim, mehanizam funkcije virusnog IRES do sada je bolje okarakterisan nego mehanizam funkcije eukariotskog IRES (López-Lastra et al., 2005, Biol. Res., vol. 38, pp. 121-146). Predložena je upotreba IRES za pokretanje ekspresije alfavirusne replikaze u eukariotskim ćelijama (npr. Sanz et al., Cellular Microbiol., 2015, vol. 17, pp. 520-541). Predmetni pronalazači pokazuju da se u različitim primerima izvođenja efikasna genska ekspresija gena kodiranog na trans-replikonu može postići kada replikazni konstrukt ne sadrži IRES (videti Primere 1 do 6). Stoga, u jednom primeru izvođenja, RNK konstrukt za ekspresiju alfavirusne replikaze (replikazni konstrukt) ne sadrži element unutrašnjeg ulaznog mesta ribozoma (IRES). Poželjno, translacija replikaze se ne pokreće IRES elementom. Poznato je da se nivoi translatiranog proteina kodiranog u otvorenom okviru čitanja nizvodno od IRES uveliko razlikuju i zavise od tipa i sekvence određenog IRES i od detalja eksperimentalne postavke (pregledno prikazano u Balvay et al., 2009, Biochim Biophys. Acta, vol. 1789, pp. 542-557). U slučaju genske ekspresije iz RNK koja sadrži IRES u stanju tehnike, uočeno je da je genska ekspresija manje efikasna iz većih trans-replikona, u poređenju sa kratkim trans-replikonom (Spuul et al., J. Virol., 2011, vol.
85, pp. 4739-4751) i da veličina membranskih kompleksa replikacije tipičnih za alfavirusnu replikazu zavisi od dužine trans-replikona (Kallio et al., 2013, J. Virol., vol. 87, pp 9125-9134). RNK koje sadrže IRES takođe su transkribovane in vitro i transfektovane u ćelije zajedno sa trans-replikonima (Sanz et al., Cellular Microbiol., 2015, vol. 17, pp. 520-541). Ova studija sugeriše da je upotreba in vitro transkribovane iRNK koja sadrži IRES funkcionalna za ekspresiju replikaze u ćeliji, i u posredovanju replikacije replikona in trans.
[0166] Pristup predmetnog učenja se značajno razlikuje od stanja tehnike: Spuul et al., supra, pretpostavljaju da je njihova RNK (proizvedena in situ u transfektovanim ćelijama) bez kape. Spuul et al. nisu predvideli inkorporaciju kape u RNK bez kape: izabrali su alternativni pristup i inkorporisali element unutrašnjeg ulaznog mesta ribozoma (IRES) nizvodno od T7 promotora; u skladu sa tom referencom, IRES element je umešan u pojačavanje ekspresije RNK koja je verovatno bez kape. Replikazni konstrukt iz predmetnog učenja takođe se razlikuje od in vitro transkribovanu RNK bez kape koja sadrži IRES koja kodira nsP1-4, koju su opisali Sanz et al., supra.
[0167] Supstitucija IRES (kao što je upotrebljavaju Sanz et al., supra i Spuul et al., supra) sa 5'-kapom u predmetnom učenju je posebna modifikacija molekula RNK koja ne utiče na sekvencu polipeptida koji je kodiran molekulom RNK (modifikacija koja modifikuje nepolipeptidnu sekvencu).
[0168] U principu, bilo koja kodirajuća RNK je podložna modifikacijama koje modifikuju nepolipeptidnu sekvencu. U savremenoj molekularnoj biologiji, mogući efekti modifikacija koje modifikuju nepolipeptidnu sekvencu, npr. na efikasnost genske ekspresije, proučavani su u nekoliko sistema. Međutim, nisu ustanovljena opšte primenljiva pravila o tome koji tip modifikacije koja modifikuje nepolipeptidnu sekvencu treba odabrati kako bi se postigla efikasna genska ekspresija, npr. poboljšana genska ekspresija u poređenju sa nemodifikovanom sekvencom. Prema tome, odabir odgovarajuće modifikacije koja modifikuje nepolipeptidnu sekvencu za bilo koju kodirajuću nukleinsku kiselinu i/ili bilo koji određeni ekspresioni sistem je izazov. U struci je opisano mnoštvo različitih modifikacija koje modifikuju nepolipeptidnu sekvencu. Na primer, za eukariotske informacione RNK, modifikacije koje modifikuju nepolipeptidnu sekvencu koje su proučavane uključuju odabir određenih netranslatiranih regiona (UTR, kao što je opisano npr. u WO 2013/143699 A1, WO 2013/143698 A1; Holtkamp et al., Blood, 2006, vol. 108, pp. 4009-4017), introdukovanje introna, npr. zečje beta-globin intron II sekvence (npr. Li et al., J. Exp. Med., 1998, vol.188, pp. 681-688), ili tihu modifikaciju kodirajuće sekvence, npr. prilagođavanjem poželjnoj upotrebi kodona ćelije domaćina ili organizma domaćina bez izmene kodirane polipeptidne sekvence (tiha modifikacija, generalno opisana npr. u WO 2003/085114 Al). Prema saznanjima predmetnih pronalazača, trenutno nema dostupnih sistematičnih uporednih studija o uticaju različitih modifikacija koje modifikuju nepolipeptidnu sekvencu u ekspresionim sistemima zasnovanim na alfavirusima.
[0169] U istraživanju koje je sprovedeno da bi se došlo do predmetnog učenja, različiti pristupi koji uključuju npr. modifikacije koje modifikuju nepolipeptidnu sekvencu su marljivo ispitivani, i kao rezultat toga je iznenađujuće pronađeno da specifično supstitucija IRES sa 5'-kapom na replikaznom konstruktu ima povoljan efekat in trans, tj. povoljan efekat na nivou replikona in trans: proizvodnja proteina od interesa koji je kodiran replikonom u skladu sa predmetnim učenjem je efikasna kada je na replikaznom konstruktu prisutna kapa. Ovo je izvanredno, posebno zato što alternativna modifikacija koja modifikuje nepolipeptidnu sekvencu, tj. prilagođavanje modifikacije kodirajuće sekvence, nije uspelo da poboljša performanse sistema iz predmetnog učenja: nasuprot tome, efikasnost proizvodnje proteina od interesa koji je kodiran replikonom čak je bila redukovana. Ovo je ilustrovano u Primeru 4. Stoga, u slučaju trans-replikacionog sistema koji se zasniva na alfavirusnim RNK elementima, uključivanje 5'-kape na replikazni konstrukt je posebno povoljna modifikacija koja modifikuje nepolipeptidnu sekvencu. Nalazi predmetnog učenja su takođe iznenađujući s obzirom na WO 2008/119827 A1, koji opisuje da je replikaza Semliki šume prilagođena kodonu eksprimirana u transfektovanim BHK-21 ćelijama domaćina, i koji zaključuje da je SFV replikaza optimizovana za kodon visoko aktivna i sposobna da pojača ekspresiju reporterskog gena in trans. Stoga, WO 2008/119827 A1 ukazuje u smeru različitom od predmetnog učenja, sugerišući da je alternativna modifikacija koja modifikuje nepolipeptidnu sekvencu, tj. introdukovanje introna u kodirajuću sekvencu replikaze, od pomoći za efikasnu ekspresiju replikaze.
[0170] U eukariotskoj iRNK, smatra se da prisustvo 5'-kape ima ulogu između ostalog u regulaciji eksporta iRNK iz nukleusa i u obradi, posebno promovisanju ekscizije 5' proksimalnog introna (Konarskaet al., 2014, Cell, vol.38, pp. 731-736). Replikazni konstrukt iz predmetnog učenja tipično niti mora da se eksportuje iz nukleusa niti da se obrađuje. Ipak, iznenađujuće je pronađeno da je prisustvo 5'-kape na replikaznom konstruktu povoljno.
[0171] U slučaju eukariotske iRNK, generalno je opisano da je 5'-kapa uključena u efikasnu translaciju iRNK: generalno, kod eukariota, translacija se inicira samo na 5' kraju molekula informacione RNK (iRNK), osim ukoliko nije prisutan IRES. Eukariotske ćelije su sposobne da obezbede RNK sa 5'-kapom tokom transkripcije u nukleusu: novosintetisane iRNK se uobičajeno modifikuju sa strukturom 5'-kape, npr. kada transkript dostigne dužinu od 20 do 30 nukleotida. Prvo, 5' terminusni nukleotid pppN (ppp predstavlja trifosfat; N predstavlja bilo koji nukleozid) se u ćeliji konvertuje u 5' GpppN pomoću enzima za dodavanje kape koji ima aktivnosti RNK 5'-trifosfataze i guanilil-transferaze. GpppN se može naknadno metilovati u ćeliji pomoću drugog enzima sa aktivnošću (guanin-7)-metiltransferaze kako bi se formirala mono-metilovana m<7>GpppN kapa. U jednom primeru izvođenja, 5'-kapa koja se upotrebljava u predmetnom učenju je prirodna 5-kapa.
[0172] U predmetnom učenju, prirodni 5'-kapa dinukleotid je tipično odabran iz grupe koja se sastoji od nemetilovanog kapa dinukleotida (G(5')ppp(5')N; takođe nazvanog GpppN) i metilovanog kapa dinukleotida ((m<7>G(5')ppp(5')N; takođe nazvanog m<7>GpppN). m<7>GpppN (pri čemu je N G) predstavljen je sledećom formulom:
[0173] Replikazni konstrukt iz predmetnog učenja ne zavisi od mašinerije za dodavanje kape u ćeliji domaćina. Predviđeno je da se, kada se transfektuje u ćeliju domaćina, replikazni konstrukt iz predmetnog učenja tipično ne lokalizuje u nukleus ćelije, tj. mesto gde bi inače došlo do dodavanja kape u tipičnim eukariotskim ćelijama.
[0174] Bez želje da bude vezano teorijom, i po analogiji sa IRES u konstruktima iz stanja tehnike, može se predvideti da je 5'-kapa na replikaznom konstruktu korisna za pokretanje inicijacije translacije replikaze. Može se predvideti da je faktor inicijacije eukariotske translacije eIF4E uključen u povezivanje iRNK sa kapom u skladu sa predmetnim učenjem sa ribozomom. Pronalazači predmetnog učenja iznenađujuće su pronašli da prisustvo 5'-kape značajno povećava performanse. Replikazni konstrukt iz predmetnog učenja stoga sadrži 5'-kapu.
[0175] Prisustvo 5'-kape takođe obezbeđuje neočekivane sinergističke efekte u transreplikacionom sistemu iz predmetnog učenja: kao što je pokazano u primerima, replikazni konstrukti sa kapom pokreću proizvodnju proteina od interesa efikasnije kada je replikazni konstrukt sa kapom obezbeđen in trans u odnosu na RNK replikon (videti npr. Primer 1). Stoga, ovde je demonstriran sinergistički efekat 5'-kape i replikacije in trans, tj. superiornija je od replikacije in cis.
[0176] RNK sa kapom iz predmetnog učenja može se pripremiti in vitro, i prema tome, ne zavisi od mašinerije za dodavanje kape u ćeliji domaćina. Najčešće upotrebljavani postupak za pravljenje RNK sa kapom in vitro je transkripcija DNK templata bilo sa bakterijskom ili bakteriofagnom RNK polimerazom u prisustvu sva četiri ribonukleozid trifosfata i kapa dinukleotida, kao što je m<7>G(5')ppp(5')G (takođe nazvan m<7>GpppG). RNK polimeraza inicira transkripciju nukleofilnim napadom pomoću 3'-OH guanozinskog ostatka m<7>GpppG na αfosfat sledećeg nukleozid trifosfata templata (pppN), što rezultuje intermedijarom m<7>GpppGpN (pri čemu je N druga baza molekula RNK). Formiranje kompetirajućeg GTP-iniciranog proizvoda pppGpN suprimirano je postavljanjem molskog odnosa kape prema GTP između 5 i 10 tokom in vitro transkripcije.
[0177] U poželjnim primerima izvođenja predmetnog učenja, 5'-kapa je analog 5'-kape. Ovi primeri izvođenja su posebno pogodni ukoliko se RNK dobija in vitro transkripcijom, npr. ukoliko je in vitro transkribovana RNK (IVT-RNK). Prvobitno je opisano da analozi kape olakšavaju sintezu transkripata RNK u velikim razmerama pomoću in vitro transkripcije.
[0178] Za razliku od prethodno opisanih projektovanih sistema replikacije alfavirusa (npr. WO 2008/119827 A1, WO2012/006376 A2), replikazni konstrukt iz predmetnog učenja poželjno sadrži analog kape. Stoga, translacija replikaze iz sistema iz predmetnog učenja poželjno se pokreće pomoću analoga kape. U idealnom slučaju, odabran je analog kape koji je povezan sa većom efikasnošću translacije i/ili većom otpornošću na in vivo degradaciju i/ili većom otpornošću na in vitro degradaciju. Predmetno učenje stoga obezbeđuje pristup koji se značajno razlikuje od stanja tehnike (WO 2012/006376 A2), koji opisuje alfavirusne ekspresione konstrukte koji poželjno ne sadrže bilo koje modifikovane nukleotide, i koji sadrže prirodnu kapu, (m<7>G(5')ppp(5')G; koja se takođe naziva m<7>GpppG, koja se opciono dodaje komercijalno dostupnim sistemom za dodavanje kape ScriptCap m7G (Epicenter Biotechnologies).
4
[0179] Za informacionu RNK, neki analozi kape (sintetičke kape) su do sada generalno opisani, i svi se mogu upotrebljavati u kontekstu predmetnog učenja. Poželjno, upotrebljava se analog kape koji se može inkorporisati u RNK lanac samo u jednoj orijentaciji. Pasquinelli et al. (1995, RNA J., vol., 1, pp. 957-967) demonstrirali su da tokom in vitro transkripcije, bakteriofagne RNK polimeraze upotrebljavaju 7-metilguanozinsku jedinicu za inicijaciju transkripcije, pri čemu oko 40-50% transkripata sa kapom poseduje kapa dinukleotid u reverznoj orijentaciji (tj. početni proizvod reakcije je Gpppm<7>GpN). U poređenju sa RNK sa ispravnom kapom, RNK sa reverznom kapom nisu funkcionalne u odnosu na translaciju kodiranih proteina. Stoga, poželjno je inkorporisati kapu u ispravnoj orijentaciji, tj. rezultujući sa RNK koja ima strukturu koja u suštini odgovara m<7>GpppGpN itd. Pokazano je da je reverzna integracija kapa dinukleotida inhibirana supstitucijom bilo 2'- ili 3'-OH grupe metilovane guanozinske jedinice (Stepinski et al., 2001; RNA J., vol.7, pp. 1486-1495; Peng et al., 2002; Org. Lett., vol. 24, pp. 161-164). RNK koje se sintetišu u prisustvu takvih "anti reverznih analoga kape" translatiraju se efikasnije nego RNK koje su in vitro transkribovane u prisustvu konvencionalne 5'-kape m<7>GpppG. U tu svrhu, opisan je jedan analog kape u kome je 3'-OH grupa metilovane guanozinske jedinice zamenjena sa OCH3, npr. od strane Holtkamp et al., 2006, Blood, vol. 108, pp. 4009-4017 (7-metil(3'-O-metil)GpppG; anti reverzni analog kape (ARCA)). ARCA je pogodni kapa dinukleotid u skladu sa predmetnim učenjem.
[0180] U poželjnom primeru izvođenja iz predmetnog učenja, RNK iz predmetnog učenja suštinski nije podložna uklanjanju kape. Ovo je važno pošto je, generalno, količina proteina proizvedena iz sintetičkih iRNK introdukovanih u kultivisane ćelije sisara ograničena prirodnom degradacijom iRNK. Jedan in vivo put za degradaciju iRNK počinje sa uklanjanjem iRNK kape. Ovo uklanjanje katalizuje heterodimerna pirofosfataza, koja sadrži regulatornu podjedinicu (Dcp1) i katalitičku podjedinicu (Dcp2). Katalitička podjedinica iseca između α i β fosfatnih grupa trifosfatnog mosta. U predmetnom učenju, analog kape može biti odabran ili prisutan koji nije podložan, ili je manje podložan toj vrsti isecanja. Pogodni analog kape za ovu svrhu može se odabrati od kapa dinukleotida u skladu sa formulom (I):
pri čemu je R<1>odabran iz grupe koja se sastoji od opciono supstituisanog alkila, opciono supstituisanog alkenila, opciono supstituisanog alkinila, opciono supstituisanog cikloalkila, opciono supstituisanog heterociklila, opciono supstituisanog arila, i opciono supstituisanog heteroarila,
R<2>i R<3>su nezavisno odabrani iz grupe koja se sastoji od H, halo, OH, i opciono supstituisanog alkoksi, ili R<2>i R<3>zajedno formiraju O-X-O, pri čemu je X odabran iz grupe koja se sastoji od opciono supstituisanog CH2, CH2CH2, CH2CH2CH2, CH2CH(CH3), i C(CH3)2, ili je R<2>kombinovan sa atomom vodonika na poziciji 4' prstena za koji je R<2>prikačen da formira -O-CH2- ili -CH2-O-,
R<5>je odabran iz grupe koja se sastoji od S, Se, i BH3,
R<4>i R<6>su nezavisno odabrani iz grupe koja se sastoji od O, S, Se, i BH3,
i
n je 1, 2, ili 3.
[0181] Poželjni primeri izvođenja za R<1>, R<2>, R<3>, R<4>, R<5>, R<6>su objavljeni u WO 2011/015347 A1 i mogu biti odabrani u skladu sa tim u predmetnom učenju. U jednom primeru izvođenja predmetnog učenja, R<1>je metil, i R<2>i R<3>su nezavisno hidroksi ili metoksi.
[0182] Na primer, u poželjnom primeru izvođenja predmetnog učenja, RNK iz predmetnog učenja sadrži fosforotioatni analog kape. Fosforotioatni analozi kape su specifični analozi kape u kojima je jedan od tri nepremošćujuća atoma O u trifosfatnom lancu zamenjen sa atomom S, tj. jedan od R<4>, R<5>ili R<6>u Formuli (I) je S. Fosforotioatne analoge kape su opisali J. Kowalska et al., 2008, RNA, vol. 14, pp. 1119-1131, kao rešenje za neželjeni proces uklanjanja kape, i stoga za povećanje stabilnosti RNK in vivo. Posebno, supstitucija atoma kiseonika za atom sumpora u beta-fosfatnoj grupi 5'-kape rezultuje stabilizacijom prema dejstvu Dcp2. U tom primeru izvođenja, koji je poželjan u predmetnom učenju, R<5>u Formuli (I) je S; i R<4>i R<6>su O.
[0183] U sledećem poželjnom primeru izvođenja predmetnog učenja, RNK iz predmetnog učenja sadrži fosforotioatni analog kape pri čemu se fosforotioatna modifikacija RNK 5'-kape kombinuje sa modifikacijom "anti reverzni analog kape" (ARCA). Odgovarajući ARCA fosforotioatni analozi kape opisani su u WO 2008/157688 A2, i svi se mogu upotrebljavati u RNK iz predmetnog učenja. U tom primeru izvođenja, najmanje jedan od R<2>ili R<3>u Formuli (I) nije OH, poželjno jedan od R<2>i R<3>je metoksi (OCH3), a drugi od R<2>i R<3>je poželjno OH. U poželjnom primeru izvođenja, atom kiseonika je supstituisan za atom sumpora u betafosfatnoj grupi (tako da je R<5>u Formuli (I) S; i R<4>i R<6>su O). Veruje se da fosforotioatna modifikacija ARCA osigurava da su α, β, iYfosfatne i fosforotioatne grupe precizno pozicionirane unutar aktivnih mesta proteina za koje se vezuje kapa i u mašinerijama za translaciju i za uklanjanje kape. Barem su neki od ovih analoga suštinski otporni na pirofosfatazu Dcp1/Dcp2. Opisano je da fosforotioatno modifikovane ARCA imaju mnogo veći afinitet za eIF4E nego odgovarajuće ARCA kojima nedostaje fosforotioatna grupa.
[0184] Respektivni analog kape koji je posebno poželjan u predmetnom učenju, tj. m2'<7,2'->GppspG, se naziva beta-S-ARCA (WO 2008/157688 A2; Kuhn et al., Gene Ther., 2010, vol.
17, pp.961-971). Stoga, u jednom primeru izvođenja predmetnog učenja, replikazni konstrukt iz predmetnog učenja je modifikovan sa beta-S-ARCA. beta-S-ARCA je predstavljen sledećom strukturom:
4
[0185] Generalno, zamena atoma kiseonika za atom sumpora na premošćujućem fosfatu rezultuje fosforotioatnim dijastereomerima koji su označeni kao D1 i D2, na osnovu njihovog obrasca eluiranja u HPLC. Ukratko, D1 dijastereomer beta-S-ARCA ili "beta-S-ARCA(D1)" je dijastereomer beta-S-ARCA koji se prvo eluira na HPLC koloni u poređenju sa D2 dijastereomerom beta-S-ARCA (beta-S-ARCA(D2)) i stoga pokazuje kraće vreme zadržavanja. Određivanje stereohemijske konfiguracije pomoću HPLC opisano je u WO 2011/015347 A1.
[0186] U prvom posebno poželjnom primeru izvođenja predmetnog učenja, replikazni konstrukt iz predmetnog učenja je modifikovan sa beta-S-ARCA(D2) dijastereomerom. Dva dijastereomera beta-S-ARCA se razlikuju u osetljivosti na dejstvo nukleaza. Pokazano je da je RNK koja nosi D2 dijastereomer beta-S-ARCA skoro potpuno otporna prema Dcp2 isecanju (samo 6% isecanja u poređenju sa RNK koja je sintetisana u prisustvu nemodifikovane ARCA 5'-kape), dok RNK sa beta-S-ARCA(D1) 5'-kapom pokazuje intermedijarnu osetljivost na Dcp2 isecanje (71% isecanja). Dodatno je pokazano da povećana stabilnost prema Dcp2 isecanju korelira sa povećanom ekspresijom proteina u ćelijama sisara. Posebno, pokazano je da se RNK koje nose beta-S-ARCA(D2) kapu efikasnije translatiraju u ćelijama nego RNK koje nose beta-S-ARCA(D1) kapu. Prema tome, u jednom primeru izvođenja predmetnog učenja, replikazni konstrukt iz predmetnog učenja je modifikovan sa analogom kape u skladu sa Formulom (I), koji karakteriše stereohemijska konfiguracija na P atomu koji sadrži supstituent R<5>u Formuli (I) koji odgovara onom na Pβatomu D2 dijastereomera beta-S-ARCA. U tom primeru izvođenja, R<5>u Formuli (I) je S; i R<4>i R<6>su O. Pored toga, najmanje jedan od R<2>ili R<3>u Formuli (I) poželjno nije OH, poželjno jedan od R<2>i R<3>je metoksi (OCH3), i drugi od R<2>i R<3>je poželjno OH.
[0187] U drugom posebno poželjnom primeru izvođenja, replikazni konstrukt iz predmetnog učenja je modifikovan sa beta-S-ARCA(D1) dijastereomerom. Ovaj primer izvođenja je posebno pogodan za transfer RNK sa kapom u nezrele antigen prezentujuće ćelije, na primer u svrhe vakcinacije. Demonstrirano je da je beta-S-ARCA(D1) dijastereomer, nakon transfera odgovarajuće RNK sa kapom u nezrele antigen prezentujuće ćelije, posebno pogodan za povećanje stabilnosti RNK, povećanje efikasnosti translacije RNK, produžavanje translacije RNK, povećanje ukupne ekspresije proteina RNK, i/ili povećanje imunskog odgovora prema antigenu ili antigenskom peptidu koji je kodiran navedenom RNK (Kuhn et al., 2010, Gene Ther., vol. 17, pp. 961-971). Prema tome, u alternativnom primeru izvođenja predmetnog učenja, replikazni konstrukt iz predmetnog učenja je modifikovan sa analogom kape u skladu sa Formulom (I), koji karakteriše stereohemijska konfiguracija na P atomu koji sadrži supstituent R<5>u Formuli (I) koji odgovara onom na Pβatomu D1 dijastereomera beta-S-ARCA. Respektivni analozi kape i njihovi primeri izvođenja opisani su u WO 2011/015347 A1 i Kuhn et al., 2010, Gene Ther., vol.17, pp. 961-971. Bilo koji analog kape opisan u WO 2011/015347 A1, pri čemu stereohemijska konfiguracija na P atomu koji sadrži supstituent R<5>odgovara onoj na Pβatomu D1 dijastereomera beta-S-ARCA, može se upotrebiti u predmetnom učenju. Poželjno, R<5>u Formuli (I) je S; i R<4>i R<6>su O. Dopunski, najmanje jedan od R<2>ili R<3>u Formuli (I) poželjno nije OH, poželjno jedan od R<2>i R<3>je metoksi (OCH3), i drugi od R<2>i R<3>je poželjno OH.
[0188] U jednom primeru izvođenja, replikazni konstrukt iz predmetnog učenja je modifikovan sa strukturom 5'-kape u skladu sa Formulom (I) pri čemu je bilo koja fosfatna grupa zamenjena boranofosfatnom grupom ili fosforoselenoatnom grupom. Takve kape imaju povećanu stabilnost i in vitro i in vivo. Opciono, respektivno jedinjenje ima 2'-O- ili 3'-O-alkil grupu (pri čemu je alkil poželjno metil); respektivni analozi kape se nazivaju BH3-ARCA ili Se-ARCA. Jedinjenja koja su posebno pogodna da budu kapa na iRNK uključuju β-BH3-ARCA i β-Se-ARCA, kao što je opisano u WO 2009/149253 A2. Za ova jedinjenja, poželjna je stereohemijska konfiguracija na P atomu koji sadrži supstituent R<5>u Formuli (I) koji odgovara onom na Pβatomu D1 dijastereomera beta-S-ARCA.
UTR
[0189] Termin "netranslatirani region" ili "UTR" odnosi se na region koji je transkribovan ali nije translatiran u amino-kiselinsku sekvencu, ili na odgovarajući region u molekulu RNK, kao što je molekul iRNK. 3'-UTR, ukoliko je prisutan, lociran je na 3' kraju gena, nizvodno od terminacionog kodona regiona koji kodira protein, ali termin "3'-UTR" poželjno ne uključuje poli(A) rep. Stoga, 3'-UTR je uzvodno od poli(A) repa (ukoliko je prisutan), npr. direktno pored poli(A) repa.
4
[0190] 5'-UTR, ukoliko je prisutan, lociran je na 5' kraju gena, uzvodno od start kodona regiona koji kodira protein.5'-UTR je nizvodno od 5'-kape (ukoliko je prisutna), npr. direktno pored 5'-kape.
[0191] 5'- i/ili 3'-netranslatirani regioni mogu, u skladu sa učenjem, biti funkcionalno povezani sa otvorenim okvirom čitanja, tako da se ti regioni mogu povezati sa otvorenim okvirom čitanja na takav način da se povećava stabilnost i/ili efikasnost translacije RNK koja sadrži navedeni otvoreni okvir čitanja.
[0192] Netranslatirani region (UTR) može biti prisutan 5' (uzvodno) od otvorenog okvira čitanja koji kodira replikazu (5'-UTR) i/ili 3' (nizvodno) od otvorenog okvira čitanja koji kodira replikazu (3'-UTR). U poželjnom primeru izvođenja, RNK konstrukt za ekspresiju alfavirusne replikaze (replikazni konstrukt) sadrži
(1) 5' UTR,
(2) otvoreni okvir čitanja koji kodira replikazu, i
(3) 3' UTR.
[0193] Specifično u primeru izvođenja replikaznog konstrukta iz predmetnog učenja, termin "3'-UTR" se odnosi na region koji je lociran 3' od kodirajućeg regiona za replikazu, i termin "5'-UTR" se odnosi na region koji je lociran 5' od kodirajućeg regiona za replikazu.
[0194] UTR su uključeni u stabilnost i efikasnost translacije RNK, što je preduslov za efikasan imunski odgovor upotrebom vakcina zasnovanih na RNK. Oboje se može poboljšati, pored strukturnih modifikacija koje se odnose na 5'-kapu i/ili 3' poli(A)-rep kao što je ovde opisano, odabirom specifičnih 5' i/ili 3' netranslatiranih regiona (UTR). Generalno se smatra da elementi sekvence unutar UTR utiču na efikasnost translacije (uglavnom 5'-UTR) i stabilnost RNK (uglavnom 3'-UTR). Poželjno je da je prisutan 5'-UTR koji je aktivan kako bi se povećala efikasnost translacije i/ili stabilnost sekvence nukleinske kiseline. Nezavisno ili dopunski, poželjno je da je prisutan 3'-UTR koji je aktivan kako bi se povećala efikasnost translacije i/ili stabilnost sekvence nukleinske kiseline.
[0195] Termin "sekvenca nukleinske kiseline koja je aktivna kako bi se povećala efikasnost translacije i/ili stabilnost sekvence nukleinske kiseline", u odnosu na prvu sekvencu nukleinske kiseline (npr. UTR), znači da je prva sekvenca nukleinske kiseline sposobna da modifikuje, u zajedničkom transkriptu sa drugom sekvencom nukleinske kiseline, efikasnost translacije i/ili stabilnost navedene druge sekvence nukleinske kiseline na takav način da se navedena efikasnost translacije i/ili stabilnost povećaju u poređenju sa efikasnošću translacije
4
i/ili stabilnošću navedene druge sekvence nukleinske kiseline u odsustvu navedene prve sekvence nukleinske kiseline. U ovom kontekstu, termin "efikasnost translacije" odnosi se na količinu proizvoda translacije koji obezbeđuje molekul RNK u određenom vremenskom periodu, i termin "stabilnost" se odnosi na poluživot molekula RNK.
[0196] Poželjno, replikazni konstrukt sadrži 5'-UTR i/ili 3'-UTR koji je heterologan ili nenativan u odnosu na alfavirus iz kog je replikaza poreklom. Ovo omogućava da se netranslatirani regioni dizajniraju u skladu sa željenom efikasnošću translacije i stabilnošću RNK. Stoga, heterologni ili nenativni UTR omogućavaju visok stepen fleksibilnosti, i ta fleksibilnost je povoljnija u poređenju sa nativnim alfavirusnim UTR. Posebno, iako je poznato da alfavirusna (nativna) RNK takođe sadrži 5' UTR i/ili 3' UTR, alfavirusni UTR ispunjavaju dvostruku funkciju, tj. (i) da pokreću replikaciju RNK, kao i (ii) da pokreću translaciju. Iako je saopšteno da su alfavirusni UTR neefikasni za translaciju (Berben-Bloemheuvel et al., 1992, Eur. J. Biochem., vol. 208, pp. 581-587), oni se ne mogu lako zameniti efikasnijim UTR zbog njihove dvostruke funkcije. U predmetnom učenju, međutim, 5'-UTR i/ili 3'-UTR replikaznog konstrukta mogu se odabrati nezavisno od njihovog potencijalnog uticaja na replikaciju RNK.
[0197] Poželjno, replikazni konstrukt sadrži 5'-UTR i/ili 3'-UTR koji nisu virusnog porekla; posebno ne alfavirusnog porekla. U jednom primeru izvođenja, RNK sadrži 5'-UTR poreklom iz eukariotskog 5'-UTR i/ili 3'-UTR poreklom iz eukariotskog 3'-UTR.
[0198] 5’-UTR u skladu sa predmetnim učenjem može sadržati bilo koju kombinaciju više od jedne sekvence nukleinske kiseline, opciono razdvojene pomoću linkera. 3'-UTR u skladu sa predmetnim učenjem može sadržati bilo koju kombinaciju više od jedne sekvence nukleinske kiseline, opciono razdvojene pomoću linkera.
[0199] Termin "linker" u skladu sa učenjem se odnosi na sekvencu nukleinske kiseline koja je dodata između dve sekvence nukleinske kiseline radi povezivanja navedene dve sekvence nukleinske kiseline. Ne postoji posebno ograničenje u pogledu linker sekvence.
[0200] 3'-UTR tipično ima dužinu od 200 do 2000 nukleotida, npr. 500 do 1500 nukleotida.
3'-netranslatirani regioni iRNK imunoglobulina su relativno kratki (manje od oko 300 nukleotida), dok su 3'-netranslatirani regioni drugih gena relativno dugački. Na primer, 3'-netranslatirani regioni tPA je dužine oko 800 nukleotida, onaj faktora VIII je dužine oko 1800 nukleotida, i onaj eritropoetina je dužine oko 560 nukleotida.
[0201] 3'-netranslatirani regioni iRNK sisara tipično imaju region homologije poznat kao AAUAAA heksanukleotidna sekvenca. Ova sekvenca je verovatno signal za prikačinjanje poli(A) i često je locirana od 10 do 30 baza uzvodno od mesta prikačinjanja poli(A).
4
[0202] 3'-netranslatirani regioni mogu sadržati jedan ili više invertovanih ponovaka koji se mogu savijati dajući strukture ukosnice koje deluju kao barijere za egzoribonukleaze ili interaguju sa proteinima za koje je poznato da povećavaju stabilnost RNK (npr. RNK-vezujući proteini).
[0203] Humani beta-globin 3'-UTR, posebno dve uzastopne identične kopije humanog betaglobin 3'-UTR, doprinosi visokoj stabilnosti transkripta i efikasnosti translacije (Holtkamp et al., 2006, Blood, vol. 108, pp. 4009-4017). Stoga, primer izvođenja, replikazni konstrukt iz predmetnog učenja sadrži dve uzastopne identične kopije humanog beta-globin 3'-UTR. Stoga, u pravcu 5' → 3' on sadrži: (a) opciono 5'-UTR; (b) otvoreni okvir čitanja koji kodira replikazu; (c) 3'-UTR; navedeni 3'-UTR sadrži dve uzastopne identične kopije humanog betaglobin 3'-UTR, njegov fragment, ili varijantu humanog beta-globin 3'-UTR ili njegov fragment.
[0204] U jednom primeru izvođenja, replikazni konstrukt iz predmetnog učenja sadrži 3'-UTR koji je aktivan kako bi povećao efikasnost translacije i/ili stabilnost replikaznog konstrukta, ali koji nije humani beta-globin 3'-UTR, njegov fragment, ili varijanta humanog beta-globin 3'-UTR ili njegovog fragmenta.
[0205] U jednom primeru izvođenja, replikazni konstrukt iz predmetnog učenja sadrži 5'-UTR koji je aktivan kako bi povećao efikasnost translacije i/ili stabilnost replikaznog konstrukta.
[0206] RNK koja sadrži UTR u skladu sa učenjem može se pripremiti npr. in vitro transkripcijom. Ovo se može postići genetičkim modifikovanjem ekspresije molekula nukleinske kiseline iz učenja (npr. DNK) na takav način da oni dozvoljavaju transkripciju RNK sa 5'-UTR i/ili 3'-UTR.
Poli(A) sekvenca
[0207] U jednom primeru izvođenja, RNK konstrukt za ekspresiju alfavirusne replikaze (replikazni konstrukt) sadrži 3' poli(A) sekvencu.
[0208] Kod alfavirusa se smatra da je 3' poli(A) sekvenca od najmanje 11 uzastopnih adenilatnih ostataka, ili najmanje 25 uzastopnih adenilatnih ostataka, važna za efikasnu sintezu minus lanca. Posebno, kod alfavirusa se podrazumeva da 3' poli(A) sekvenca od najmanje 25 uzastopnih adenilatnih ostataka funkcioniše zajedno sa konzerviranim elementom sekvence 4 (CSE 4) kako bi promovisala sintezu (-) lanca (Hardy & Rice, J Virol., 2005, vol. 79, pp.4630-4639). U predmetnom učenju, međutim, sinteza (-) lanca replikaznog konstrukta tipično nije poželjna, i poli(A) sekvenca služi prvenstveno funkcijama uticaja na
4
stabilnost RNK i translaciju proteina u transfektovanim eukariotskim ćelijama. Zaista, demonstrirano je da 3' poli(A) sekvenca od oko 120 A nukleotida ima koristan uticaj na nivoe RNK u transfektovanim eukariotskim ćelijama, kao i na nivoe proteina koji se translatira iz otvorenog okvira čitanja koji je prisutan uzvodno (5') od 3' poli(A) sekvence (Holtkamp et al., 2006, Blood, vol. 108, pp. 4009-4017). U skladu sa učenjem, u jednom primeru izvođenja, poli(A) sekvenca sadrži ili se suštinski sastoji od ili se sastoji od najmanje 20, poželjno najmanje 26, poželjno najmanje 40, poželjno najmanje 80, poželjno najmanje 100 i poželjno do 500, poželjno do 400, poželjno do 300, poželjno do 200, i posebno do 150, A nukleotida, i posebno oko 120 A nukleotida. U ovom kontekstu "suštinski se sastoji od" znači da su većina nukleotida u poli(A) sekvenci, tipično najmanje 50%, i poželjno najmanje 75% po broju nukleotida u "poli(A) sekvenci", A nukleotidi, ali dozvoljava da su preostali nukleotidi nukleotidi različiti od A nukleotida, kao što su U nukleotidi (uridilat), G nukleotidi (guanilat), C nukleotidi (cititilat). U ovom kontekstu "sastoji se od" znači da su svi nukleotidi u poli(A) sekvenci, tj. 100% po broju nukleotida u poli(A) sekvenci, A nukleotidi. Termin "A nukleotid" ili "A" označava adenilat.
[0209] Predmetno učenje obezbeđuje da se 3' poli(A) sekvenca prikači tokom transkripcije RNK, tj. tokom pripreme in vitro transkribovane RNK, na osnovu DNK templata koji sadrži ponovljene dT nukleotide (dezoksitimidilat) u lancu komplementarnom kodirajućem lancu. Sekvenca DNK koja kodira poli(A) sekvencu (kodirajući lanac) označava se kao poli(A) kaseta.
[0210] U poželjnom primeru izvođenja predmetnog učenja, 3' poli(A) kaseta prisutna u kodirajućem lancu DNK suštinski se sastoji od dA nukleotida, ali je prekinuta nasumičnom sekvencom koja ima jednaku raspodelu četiri nukleotida (dA, dC, dG, dT). Takva nasumična sekvenca može biti dužine 5 do 50, poželjno 10 do 30, poželjnije 10 do 20 nukleotida. Takva kaseta je objavljena u WO 2016/005004 A1. Bilo koja poli(A) kaseta objavljena u WO 2016/005004 A1 može se upotrebljavati u predmetnom učenju. Poli(A) kaseta koja se suštinski sastoji od dA nukleotida, ali je prekinuta nasumičnom sekvencom koja ima jednaku raspodelu četiri nukleotida (dA, dC, dG, dT) i ima dužinu od npr. 5 do 50 nukleotida pokazuje, na nivou DNK, konstantnu propagaciju plazmidne DNK u E. coli i još uvek je povezana, na nivou RNK, sa korisnim svojstvima u pogledu podrške stabilnosti RNK i efikasnosti translacije.
[0211] Kao posledica toga, u poželjnom primeru izvođenja predmetnog učenja, 3' poli(A) sekvenca sadržana u ovde opisanom molekulu RNK suštinski se sastoji od A nukleotida, ali je prekinuta nasumičnom sekvencom koja ima jednaku raspodelu četiri nukleotida (A, C, G, U).
4
Takva nasumična sekvenca može biti dužine 5 do 50, poželjno 10 do 30, poželjnije 10 do 20 nukleotida.
Upotreba kodona
[0212] Generalno, degeneracija genetičkog koda će omogućiti supstituciju određenih kodona (baznih tripleta) koji su prisutni u sekvenci RNK drugim kodonima (baznim tripletima), uz održavanje istog kapaciteta kodiranja. U nekim primerima izvođenja predmetnog učenja, najmanje jedan kodon otvorenog okvira čitanja koji je sadržan u molekulu RNK razlikuje se od odgovarajućeg kodona u odgovarajućem otvorenom okviru čitanja u vrsti iz koje je otvoreni okvir čitanja poreklom. U tom primeru izvođenja, za kodirajuću sekvencu otvorenog okvira čitanja se kaže da je "prilagođena".
[0213] Na primer, kada je kodirajuća sekvenca otvorenog okvira čitanja prilagođena, mogu se odabrati često upotrebljavani kodoni: WO 2009/024567 A1 opisuje prilagođavanje kodirajuće sekvence molekula nukleinske kiseline, uključujući supstituciju retkih kodona kodonima koji se češće upotrebljavaju. Pošto učestalost upotrebljavanja kodona zavisi od ćelije domaćina ili organizma domaćina, ta vrsta prilagođavanja je pogodna za prilagođavanje sekvence nukleinske kiseline za ekspresiju u određenoj ćeliji domaćinu ili organizmu domaćinu. Generalno govoreći, češće upotrebljavani kodoni se tipično efikasnije translatiraju u ćeliji domaćini ili organizmu domaćinu, iako prilagođavanje svih kodona otvorenog okvira čitanja nije uvek neophodno.
[0214] Na primer, kada se prilagođava kodirajuća sekvenca otvorenog okvira čitanja, sadržaj G (guanilat) ostataka i C (citidilat) ostataka može se izmeniti odabirom kodona sa najvećim sadržajem bogatim sa GC za svaku amino-kiselinu. Saopšteno je da molekuli RNK sa otvorenim okvirima čitanja bogatim sa GC imaju potencijal da smanje imunsku aktivaciju i da poboljšaju translaciju i poluživot RNK (Thess et al., 2015, Mol. Ther.23, 1457-1465).
[0215] Otvoreni okvir čitanja koji kodira replikazu u skladu sa predmetnim učenjem može biti prilagođen respektivno.
Karakterizacija replikona
[0216] Sistem iz predmetnog učenja sadrži replikon. Konstrukt nukleinske kiseline koji je sposoban da se replicira pomoću replikaze, poželjno alfavirusne replikaze, naziva se replikon. Tipično, replikon u skladu sa predmetnim učenjem je molekul RNK.
[0217] U skladu sa učenjem, termin "replikon" definiše molekul RNK koji se može replicirati pomoću RNK-zavisne RNK polimeraze, dajući - bez DNK intermedijera - jednu ili više identičnih ili suštinski identičnih kopija RNK replikona. "Bez DNK intermedijera" znači da se nijedna kopija ili komplement replikona dezoksiribonukleinske kiseline (DNK) ne formira u procesu formiranja kopija RNK replikona, i/ili da se nijedan molekul dezoksiribonukleinske kiseline (DNK) ne upotrebljava kao templat u procesu formiranja kopija RNK replikona, ili njegovog komplementa.
[0218] U skladu sa učenjem, termin "može se replicirati" generalno opisuje da se može pripremiti jedna ili više identičnih ili suštinski identičnih kopija nukleinske kiseline. Kada se upotrebljava zajedno sa terminom "replikaza", na primer u "može se replicirati pomoću replikaze", termin "može se replicirati" opisuje funkcionalne karakteristike replikona u odnosu na replikazu. Ove funkcionalne karakteristike sadrže najmanje jedno od (i) replikaza je sposobna da prepozna replikon i (ii) replikaza je sposobna da deluje kao RNK-zavisna RNK polimeraza (RdRP). Poželjno, replikaza je sposobna i da (i) prepozna replikon i (ii) da deluje kao RNK-zavisna RNK polimeraza. RNK-zavisna RNK polimeraza može upotrebljavati replikon, njegov komplement ili deo bilo kog od njih kao templat.
[0219] Izraz "sposoban da prepozna" opisuje da je replikaza sposobna da se fizički poveže sa replikonom, i poželjno, da je replikaza sposobna da se veže za replikon, tipično nekovalentno. Termin "vezivanje" može značiti da replikaza ima sposobnost vezivanja za bilo koji jedan ili više od konzerviranog elementa sekvence 1 (CSE 1) ili njegovu komplementarnu sekvencu (ukoliko je replikon sadrži), konzerviranog elementa sekvence 2 (CSE 2) ili njegovu komplementarnu sekvencu (ukoliko je replikon sadrži), konzerviranog elementa sekvence 3 (CSE 3) ili njegovu komplementarnu sekvencu (ukoliko je replikon sadrži), konzerviranog elementa sekvence 4 (CSE 4) ili njegovu komplementarnu sekvencu (ukoliko je replikon sadrži). Poželjno, replikaza je sposobna da se veže za CSE 2 [tj. za (+) lanac] i/ili za CSE 4 [tj. za (+) lanac], ili da se veže za komplement CSE 1 [tj. za (-) lanac] i/ili za komplement CSE 3 [tj. za (-) lanac].
[0220] Izraz "sposobna da deluje kao RdRP" uključuje značenje da je replikaza sposobna da katalizuje sintezu (-) lanca komplementa alfavirusnog genomskog (+) lanca RNK, pri čemu (+) lanac RNK ima funkciju templata, i/ili da je replikaza sposobna da katalizuje sintezu (+) lanca alfavirusne genomske RNK, pri čemu (-) lanac RNK ima funkciju templata. Generalno, izraz "sposobna da deluje kao RdRP" takođe može uključivati da je replikaza sposobna da katalizuje sintezu (+) lanca subgenomskog transkripta pri čemu (-) lanac RNK ima funkciju
1
templata, i pri čemu se sinteza (+) lanca subgenomskog transkripta tipično inicira na subgenomskom promotoru alfavirusa.
[0221] Izrazi "sposoban za vezivanje" i "sposoban da deluje kao RdRP" odnose se na sposobnost u normalnim fiziološkim uslovima. Posebno, izrazi se odnose na uslove unutar ćelije, koja eksprimira alfavirusnu replikazu ili koja je transfektovana sa nukleinskom kiselinom koja kodira alfavirusnu replikazu. Ćelija je poželjno eukariotska ćelija. Sposobnost vezivanja i/ili sposobnost delovanja kao RdRP mogu se eksperimentalno testirati, npr. u in vitro sistemu bez ćelija ili u eukariotskoj ćeliji. Opciono, navedena eukariotska ćelija je ćelija iz vrste u kojoj je određeni alfavirus koji predstavlja poreklo replikaze infektivan. Na primer, kada se upotrebljava alfavirusna replikaza iz određenog alfavirusa koji je infektivan za ljude, normalni fiziološki uslovi su uslovi u humanoj ćeliji. Poželjnije, eukariotska ćelija (u jednom primeru humana ćelija) je iz istog tkiva ili organa za koji je određeni alfavirus koji predstavlja poreklo replikaze infektivan.
[0222] U pogledu ovih funkcionalnih karakteristika, replikon iz predmetnog učenja i replikazni konstrukt iz predmetnog učenja formiraju funkcionalan par. Alfavirusna replikaza može biti bilo koja alfavirusna replikaza u skladu sa učenjem, i nukleotidna sekvenca RNK replikona nije posebno ograničena, sve dok se replikon može replicirati pomoću alfavirusne replikaze in trans.
[0223] Kada se sistem iz predmetnog učenja introdukuje u ćeliju, poželjno eukariotsku ćeliju, replikaza kodirana na replikaznom konstruktu može se translatirati, generišući tako enzim replikazu. Posle translacije, replikaza je sposobna da replicira RNK replikon in trans. Stoga, predmetno učenje obezbeđuje sistem za replikaciju RNK in trans. Kao posledica toga, sistem iz predmetnog učenja je trans-replikacioni sistem. Replikon u skladu sa predmetnim učenjem je stoga trans-replikon.
[0224] Ovde trans (npr. u kontekstu trans-delujućeg, trans-regulatornog), generalno, znači "delovanje iz drugog molekula" (tj. intermolekulski). To je suprotno od cis (npr. u kontekstu cis-delujućeg, cis-regulatornog), što, generalno, znači "delovanje iz istog molekula" (tj. intermolekulski). U kontekstu sinteze RNK (uključujući transkripciju i replikaciju RNK), trans-delujući element uključuje sekvencu nukleinske kiseline koja sadrži gen koji kodira enzim sposoban za sintezu RNK (replikaza). Replikaza funkcioniše u sintezi drugog molekula nukleinske kiseline, tj. različitog molekula. I za trans-delujuću RNK i za protein koji ona kodira se kaže da "deluju in trans" na ciljni gen. U kontekstu predmetnog učenja, transdelujuća RNK kodira alfavirusnu RNK polimerazu. Alfavirusna RNK polimeraza je sposobna da replicira RNK i zato se naziva replikaza. Replikaza deluje in trans na drugi molekul RNK
2
(replikon). Replikon koji se može replicirati pomoću replikaze in trans u skladu sa predmetnim učenjem ovde se sinonimno označava kao "trans-replikon" ili kao "replikon u skladu sa predmetnim učenjem".
[0225] Činjenica da je alfavirusna replikaza generalno u stanju da prepozna i replicira RNK templat in trans prvobitno je otkrivena 1980-ih, ali potencijal trans-replikacije za biomedicinske primene nije prepoznat, između ostalog pošto se smatralo da trans-replicirana RNK inhibira efikasnu replikaciju: otkriveno je u slučaju defektno interferirajuće (DI) RNK koja se koreplicira sa alfavirusnim genomima u inficiranim ćelijama (Barrett et al., 1984, J. Gen. Virol., vol. 65 (Pt 8), pp. 1273-1283; Lehtovaara et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., vol. 78, pp. 5353-5357; Pettersson, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., vol. 78, pp.
115-119). DI RNK su trans-replikoni koji se mogu pojaviti kvazi-prirodno tokom infekcija ćelijskih linija sa visokim opterećenjem virusom. DI elementi se korepliciraju toliko efikasno da redukuju virulencu roditeljskog virusa i na taj način deluju kao inhibitorna parazitska RNK (Barrett et al., 1984, J. Gen. Virol., Vol. 65 (Pt 11), pp. 1909-1920). Iako potencijal za biomedicinske primene nije prepoznat, fenomen trans-replikacije je upotrebljen u nekoliko osnovnih studija sa ciljem da se razjasne mehanizmi replikacije, bez potrebe da se eksprimira replikaza iz istog molekula in cis; dodatno, razdvajanje replikaze i replikona takođe omogućava funkcionalne studije koje uključuju mutante virusnih proteina, čak i ukoliko su odgovarajući mutanti bili mutanti sa gubitkom funkcije (Lemm et al., 1994, EMBO J., vol.
13, pp. 2925-2934). Ove studije gubitka funkcije i DI RNK nisu sugerisale da transaktivacioni sistemi zasnovani na alfavirusnim elementima mogu na kraju postati dostupni za terapijske svrhe. Noviji pristup za in vivo isporuku RNK vertebratima sugeriše cisreplikacioni sistem koji sadrži samoreplicirajući molekul RNK (WO 2012/006376 A2).
[0226] Suprotno sugestijama iz stanja tehnike, trans-replikacioni sistem iz predmetnog učenja veoma je pogodan za gensku ekspresiju: povezan je sa visokim nivoima ekspresije, visokim titrom antigena, i zadovoljavajući stepen preživljavanja vakcinisanih životinja može se postići čak i kada je nivo RNK koja kodira antigen relativno nizak. Posebno, primena 1 μg transreplikon-RNK iz sistema iz predmetnog učenja može uzrokovati titar za neutralizaciju virusa i titar HA uporediv sa primenom 5 μg cis-replikona (videti Primer 6 i Sl. 7). Ovo predstavlja značajan doprinos struci, posebno napretku u oblasti vakcinacije životinja, pošto se ukupna količina nukleinske kiseline koja kodira vakcinu može redukovati. Ovo štedi troškove i vreme za proizvodnju i važno je barem iz sledećih razloga:
Prvo i najvažnije, raznovrsnost sistema iz predmetnog učenja - koji se sastoji od dva odvojena molekula RNK - omogućava da se replikon i replikazni konstrukt mogu dizajnirati i/ili pripremiti u različito vreme i/ili na različitim mestima. U jednom primeru izvođenja, replikazni konstrukt je pripremljen u prvoj vremenskoj tački, i replikon je pripremljen u kasnijoj vremenskoj tački. Na primer, nakon pripreme, replikazni konstrukt može biti uskladišten za upotrebu u kasnijoj vremenskoj tački. Predmetno učenje obezbeđuje povećanu fleksibilnost u poređenju sa cis-replikonima: kada se pojavi novi patogen, sistem iz predmetnog učenja može biti dizajniran za vakcinaciju, kloniranjem u replikon nukleinske kiseline koja kodira polipeptid koji izaziva imunski odgovor prema novom patogenu. Prethodno pripremljen replikazni konstrukt može se uzeti iz skladišta. Stoga, nije neophodno da, u vreme kada se replikazni konstrukt dizajnira i priprema, bude poznata priroda određenog patogena, ili jednog ili više antigena određenog patogena. Kao posledica toga, nije potrebno da, u vreme kada se replikazni konstrukt dizajnira i priprema, bude dostupan replikon koji kodira polipeptid koji izaziva imunski odgovor prema određenom novom patogenu. Drugim rečima, replikazni konstrukt se može dizajnirati i pripremiti nezavisno od bilo kog određenog replikona. Ovo omogućava da se brzo reaguje na pojavu novih patogena, ili na patogene koje karakteriše ekspresija barem jednog novog antigena, zato što priprema replikona lišenog replikaze zahteva manje truda i resursa nego priprema cis-replikona. Istorija govori da je potreban sistem koji omogućava brzu reakciju na patogene: ovo je ilustrovano npr. pojavom patogena koji uzrokuju teški akutni respiratorni sindrom (SARS), ebole i raznih podtipova virusa gripa poslednjih godina.
Drugo, u slučaju vakcinacije životinja, cena vakcine je ključna za njen uspeh u veterinarskoj i poljoprivrednoj zajednici. Pošto se replikon iz predmetnog učenja može replicirati u prisustvu funkcionalnog nestrukturnog proteina alfavirusa, npr. u ćeliji vakcinisane životinje, mogu se postići visoki nivoi ekspresije gena od interesa čak i ukoliko se primene relativno male količine RNK replikona. Male količine RNK replikona pozitivno utiču na troškove vakcine po subjektu.
Treće, trans-replikon u skladu sa predmetnim učenjem je tipično kraći molekul nukleinske kiseline nego tipični cis-replikon. Ovo omogućava brže kloniranje replikona koji kodira protein od interesa, npr. imunogeni polipeptid, i obezbeđuje veće prinose proteina od interesa (videti npr. Primer 1).
4
[0227] U poželjnom primeru izvođenja, replikon se može replicirati pomoću alfavirusne replikaze iz virusa Semliki šume, uključujući virus Semliki šume koji se javlja u prirodi i varijantu ili derivat virusa Semliki šume, kao što je oslabljeni virus Semliki šume. U alternativnom poželjnom primeru izvođenja, replikon se može replicirati pomoću alfavirusne replikaze iz Sindbis virusa, uključujući Sindbis virus koji se javlja u prirodi i varijantu ili derivat Sindbis virusa, kao što je oslabljeni Sindbis virus. U alternativnom poželjnom primeru izvođenja, replikon se može replicirati pomoću alfavirusne replikaze iz virusa venecuelanskog konjskog encefalitisa (VEEV), uključujući VEEV koji se javlja u prirodi i varijantu ili derivat VEEV, kao što je oslabljeni VEEV.
[0228] RNK replikon u skladu sa predmetnim učenjem je poželjno jednolančani molekul RNK. Generalno, jednolančani kodirajući molekuli nukleinske kiseline sadrže dvostruko više genetičkih informacija po jedinici težine (npr. μg) materijala nukleinske kiseline. Stoga, jednolančana priroda predstavlja dodatnu prednost u poređenju sa dvolančanim DNK vektorima iz stanja tehnike koji se upotrebljavaju npr. od strane Spuul et al., supra. Replikon u skladu sa predmetnim učenjem je tipično (+) lančani molekul RNK.
[0229] U jednom primeru izvođenja, RNK replikon je izolovani molekul nukleinske kiseline.
[0230] Trans-replikacioni sistem iz predmetnog učenja je pogodan za inokulaciju ćelije domaćina, i za ekspresiju gena od interesa u ćeliji domaćinu (videti npr. Primere 1-3). U nekim eksperimentalnim primerima predmetnog učenja, trans-replikon RNK sadrži kao gen od interesa gen koji kodira reporterski protein (npr. fluorescentni protein, kao što je GFP ili eGFP), koji omogućava da se lako odredi efikasnost ekspresije respektivnog gena od interesa. Kao što je pokazano u Primeru 2, trans-replikacioni sistem - koji sadrži dve RNK - povezan je sa znatno boljom efikasnošću ekspresije gena od interesa, u poređenju sa cis-replikacijom (eGFP RNK replikon).
[0231] Trans-replikacioni sistem iz predmetnog učenja je pogodan za efikasnu ekspresiju gena od interesa u čoveku ili životinji, npr. za ekspresiju na visokim nivoima. Posebno, Primer 5 demonstrira da se reporterski protein može efikasno proizvesti, i Primer 6 demonstrira da se terapijski efekat, zaštita od patogene infekcije, može postići kod životinja tretiranih sistemom iz predmetnog učenja.
[0232] Bez želje da bude vezano za bilo koju posebnu teoriju, moguće je zamisliti da npr. oko 7400 nukleotida koji kodiraju replikazu u tipičnim alfavirusima koji se nalaze u prirodi opterećuju ćeliju, pošto bi bila potrebna amplifikacija replikona pune dužine. Moguće je zamisliti da se veliki deo ovog tereta eliminiše kada se nereplikativni replikazni konstrukt, npr. u obliku iRNK, upotrebljava za ekspresiju replikaze. Ovo omogućava upotrebu transreplikona za amplifikaciju RNK i ekspresiju transgena. Ukoliko se replikazni konstrukt ne replicira u ćeliji (tj. jedini strani konstrukt koji se replicira je trans-replikon iz predmetnog učenja), izbegava se rasipanje ćelijske energije i resursa (nukleotidi itd.), što bi moglo objasniti superiorne nivoe ekspresije. Pored toga, kraći RNK replikon verovatno zahteva manje vremena za sintezu RNK. Prema tome je moguće zamisliti da ušteda vremena, ćelijske energije i/ili resursa doprinosi replikaciji na višim nivoima.
Konzervirani elementi sekvence
[0233] U jednom primeru izvođenju, replikon je ili sadrži alfavirusnu genomsku RNK ili je poreklom iz alfavirusne genomske RNK. U jednom primeru izvođenju, replikon u skladu sa predmetnim učenjem sadrži jedan ili više konzerviranih elemenata sekvence (CSE) (Strauss & Strauss, Microbiol. Rev., 1994, vol. 58, pp.491-562). Posebno, replikon može sadržati jedan ili više konzerviranih elemenata sekvence (CSE) alfavirusa koji se nalazi u prirodi ili njihovu varijantu ili derivat:
- CSE 1, za koji se veruje da funkcioniše kao promotor za sintezu (+) lanaca iz templata (-) lanca. Ukoliko je prisutan, CSE 1 je tipično lociran na ili blizu 5ꞌ kraja RNK replikona.
- CSE 2, za koji se veruje da deluje kao promotor ili pojačivač za sintezu (-) lanca iz templata genomskog RNK (+) lanca. Ukoliko je prisutan, CSE 2 je tipično lociran nizvodno od CSE 1, ali uzvodno od CSE 3.
- CSE 3, za koji se veruje da doprinosi efikasnoj transkripciji subgenomske RNK; Ukoliko je prisutan, CSE 3 je tipično lociran uzvodno od kodirajuće sekvence za gen od interesa (ukoliko postoji), ali nizvodno od CSE 2.
- CSE 4, za koji se veruje da funkcioniše kao jezgro promotora za inicijaciju sinteze (-) lanca. Ukoliko je prisutan, CSE 4 je tipično lociran nizvodno od kodirajuće sekvence za gen od interesa (ako postoji). U svakom slučaju, CSE 4 je tipično prisutan nizvodno od CSE 3. Detalje o sekvenci CSE 4 (koja se takođe naziva 3ꞌ CSE) u različitim alfavirusima opisali su Hardy & Rice, J. Virol., 2005, vol. 79, pp. 4630-4639, i u predmetnom učenju, sekvenca CSE 4 se može na primer odabrati u skladu sa učenjem tog dokumenta.
[0234] U jednom primeru izvođenju, RNK replikon u skladu sa predmetnim učenjem sadrži:
(1) 5ꞌ sekvencu prepoznavanja replikacije alfavirusa, i
(2) 3ꞌ sekvencu prepoznavanja replikacije alfavirusa.
[0235] U jednom primeru izvođenja, 5ꞌ sekvenca prepoznavanja replikacije alfavirusa sadrži CSE 1 i/ili CSE 2 alfavirusa. U alfavirusu koji se javlja u prirodi, CSE 1 i/ili CSE 2 su tipično sadržani u 5ꞌ sekvenci prepoznavanja replikacije.
[0236] U jednom primeru izvođenja, 3ꞌ sekvenca prepoznavanja replikacije alfavirusa sadrži CSE 4 alfavirusa. U alfavirusu koji se javlja u prirodi, CSE 4 je tipično sadržan u 3ꞌ sekvenci prepoznavanja replikacije.
[0237] U jednom primeru izvođenju, 5ꞌ sekvenca prepoznavanja replikacije alfavirusa i 3ꞌ sekvenca prepoznavanja replikacije alfavirusa sposobne su da usmere replikaciju RNK replikona u skladu sa predmetnim učenjem u prisustvu replikaze. Stoga, kada su prisutne same ili poželjno zajedno, ove sekvence prepoznavanja usmeravaju replikaciju RNK replikona u prisustvu replikaze. Bez želje da bude vezano za bilo koju posebnu teoriju, podrazumeva se da su konzervirani elementi sekvence (CSE) alfavirusa 1, 2 i 4 (sadržani u) sekvencama prepoznavanja koje usmeravaju replikaciju RNK replikona u prisustvu replikaze. Stoga, u ovom primeru izvođenja, replikon će tipično sadržati CSE 1, 2 i 4.
[0238] Poželjno je da je replikaza koju kodira replikazni konstrukt alfavirusna replikaza koja je sposobna da prepozna i 5ꞌ sekvencu prepoznavanja replikacije alfavirusa i 3ꞌ sekvencu prepoznavanja replikacije alfavirusa replikona.
[0239] U jednom primeru izvođenja, ovo se postiže kada su 5ꞌ sekvenca prepoznavanja replikacije alfavirusa i 3ꞌ sekvenca prepoznavanja replikacije alfavirusa nativne za alfavirus iz koga je replikaza poreklom. Nativna znači da je prirodno poreklo ovih sekvenci isti alfavirus. U jednom primeru izvođenja, CSE 1, CSE 2 i CSE 4 su nativne za alfavirus iz kog je replikaza poreklom.
[0240] U alternativnom primeru izvođenja, 5' sekvenca prepoznavanja replikacije (i/ili CSE 1 i/ili CSE 2) i/ili 3' sekvenca prepoznavanja replikacije alfavirusa (i/ili CSE 4) nisu nativne za alfavirus iz kog je replikaza poreklom, pod uslovom da je alfavirusna replikaza sposobna da prepozna i 5' sekvencu prepoznavanja replikacije (i/ili CSE 1 i/ili CSE 2) i 3' sekvencu prepoznavanja replikacije (i/ili CSE 4) replikona. Drugim rečima, replikacija je kompatibilna sa 5' sekvencom prepoznavanja replikacije (i/ili CSE 1 i/ili CSE 2) i 3' sekvencom prepoznavanja replikacije (i/ili CSE 4). Kada je nenativna alfavirusna replikaza sposobna da prepozna odgovarajuću sekvencu ili element sekvence, za replikazu se kaže da je kompatibilna (kompatibilnost među virusima). Primeri kompatibilnosti među virusima koji se odnose na (3'/5') sekvence prepoznavanja replikacije i CSE, respektivno, sa nenativnim replikazama iz različitih alfavirusa su poznati u struci (pregledno prikazano npr. od strane Strauss & Strauss, Microbiol. Rev., 1994, vol.58, pp. 491-562). Bilo koja kombinacija (3'/5') sekvenci prepoznavanja replikacije i CSE, respektivno, sa alfavirusnom replikazom je moguća sve dok postoji kompatibilnost među virusima. Kompatibilnost među virusima može lako proveriti stručna osoba koja radi na predmetnom učenju inkubiranjem replikaze koja se testira zajedno sa RNK, pri čemu RNK ima 3'- i 5' sekvence prepoznavanja replikacije koje treba testirati, u uslovima pogodnim za replikaciju RNK, npr. u pogodnoj ćeliji domaćinu. Ukoliko dođe do replikacije, utvrđeno je da su (3'/5') sekvence prepoznavanja replikacije i replikaza kompatibilne.
Subgenomski promotor
[0241] U posebnim primerima izvođenja, RNK replikon u skladu sa predmetnim učenjem sadrži sekvencu za kontrolu ekspresije. Tipična sekvenca za kontrolu ekspresije je ili sadrži promotor. U jednom primeru izvođenja, RNK replikon u skladu sa predmetnim učenjem sadrži subgenomski promotor. Poželjno, subgenomski promotor je subgenomski promotor alfavirusa. Nukleotidna sekvenca subgenomskog promotora je visoko konzervirana među alfavirusima (Strauss & Strauss, Microbiol. Rev., 1994, vol.58, pp.491-562).
[0242] Poželjno, subgenomski promotor je promotor za strukturni protein alfavirusa. To znači da je subgenomski promotor onaj koji je nativan za alfavirus i koji kontroliše transkripciju gena jednog ili više strukturnih proteina u navedenom alfavirusu.
[0243] Poželjno je da je subgenomski promotor kompatibilan sa replikazom replikaznog konstrukta. Kompatibilan u ovom kontekstu znači da je alfavirusna replikaza sposobna da prepozna subgenomski promotor. Stoga, poželjno je da je replikaza koju kodira replikazni konstrukt alfavirusna replikaza koja je sposobna da prepozna subgenomski promotor replikona.
[0244] U jednom primeru izvođenja, ovo se postiže kada je subgenomski promotor nativan za alfavirus iz kog je replikaza poreklom. Nativan znači da je prirodno poreklo subgenomskog promotora i replikaze isti alfavirus.
[0245] U alternativnom primeru izvođenja, subgenomski promotor nije nativan za alfavirus iz kog je replikaza poreklom, pod uslovom da je alfavirusna replikaza sposobna da prepozna subgenomski promotor replikona. Drugim rečima, replikaza je kompatibilna sa subgenomskim promotorom (kompatibilnost među virusima). Bilo koja kombinacija subgenomskog promotora i replikaze je moguća sve dok postoji kompatibilnost među virusima. Kompatibilnost među virusima može lako proveriti stručna radi osoba koja radi napredmetnom učenju inkubiranjem replikaze koja se testira zajedno sa RNK, pri čemu RNK ima subgenomski promotor koji treba testirati, u uslovima pogodnim za sintezu RNK iz subgenomskog promotora. Ukoliko je pripremljen subgenomski transkript, utvrđeno je da su subgenomski promotor i replikaza kompatibilni. Poznati su različiti primeri kompatibilnosti među virusima: u nekim slučajevima, nenativni subgenomski promotor čak dovodi do efikasnije transkripcije nego nativni subgenomski promotor (pregledno prikazano od strane Strauss & Strauss, Microbiol. Rev., 1994, vol.58, pp.491-562).
[0246] Poželjno, replikon u skladu sa predmetnim učenjem sadrži konzervirani element sekvence 3 (CSE 3) iz alfavirusa. Veruje se da CSE 3 doprinosi efikasnoj transkripciji subgenomske RNK. Poznato je da se transkripcija subgenomske RNK odvija veoma efikasno kada je CSE 3 prisutan. Tipično, CSE 3 je polinukleotidni niz od oko 24 nukleotida. U genomima alfavirusa, CSE 3 je lociran u regionu spoja između kodirajuće sekvence za nestrukturne i strukturne proteine. U trans-replikonu iz predmetnog učenja, CSE 3 je tipično prisutan uzvodno (5ꞌ) od otvorenog okvira čitanja (ORF) pod kontrolom subgenomskog promotora. U slučaju da replikon u skladu sa predmetnim učenjem sadrži jedan ORF pod kontrolom subgenomskog promotora, CSE 3 je lociran 5ꞌ od tog ORF. U slučaju da replikon u skladu sa predmetnim učenjem sadrži više od jednog ORF pod kontrolom subgenomskog promotora, CSE 3 može biti lociran 5ꞌ od svakog takvog ORF. U jednom primeru izvođenja, CSE 3 je nativan za alfavirus iz kog je replikaza poreklom. U alternativnom primeru izvođenja, CSE 3 nije nativan za alfavirus iz kog je replikaza poreklom, pod uslovom da je alfavirusna replikaza sposobna da prepozna CSE 3 replikona.
Opciona dodatna svojstva replikona
[0247] U jednom primeru izvođenja, RNK replikon u skladu sa predmetnim učenjem sadrži 3' poli(A) sekvencu. Opisano je da poli(A) sekvenca alfavirusne RNK igra ulogu u efikasnosti translacije virusnih nestrukturnih proteina i stabilnosti RNK, analogno njenoj ulozi u ćelijskoj iRNK (Hardy & Rice, J. Virol., 2005, vol. 79, pp. 4630-4639). U predmetnom učenju, predviđeno je da poli(A) sekvenca igra ulogu u efikasnosti translacije gena od interesa i u stabilnosti replikona. Primeri izvođenja i poželjni primeri izvođenja 3ꞌ poli(A) sekvence replikona u skladu sa predmetnim učenjem mogu se odabrati među onima koji su ovde objavljeni za 3ꞌ poli(A) sekvencu replikaznog konstrukta. Pored toga, u jednom primeru izvođenja, poli(A) sekvenci (ukoliko je prisutna na replikonu u skladu sa predmetnim učenjem) prethodi konzervirani element sekvence 4 (CSE 4) alfavirusa. Poželjno, on je neposredno pored CSE 4, tako da je nukleotid na najdaljoj 3' poziciji u CSE 4 neposredno pored A nukleotida na najdaljoj 5' poziciji poli(A) repa.
[0248] U jednom primeru izvođenja, RNK replikon u skladu sa predmetnim učenjem sadrži 5'-kapu (uključujući analog kape). Ilustracije radi, na Sl. 1, kapa (ili analog kape) je simbolizovana slovom C. Aspekti kape (ili analoga) replikona u skladu sa predmetnim učenjem su identični sa aspektima koji su ovde opisani za kapu (ili analog) replikaznog konstrukta, osim što prisustvo kape nije obavezno u slučaju RNK replikona. Stoga, u alternativnom primeru izvođenja, RNK replikon u skladu sa predmetnim učenjem ne sadrži kapu. U tom primeru izvođenja, može sadržati slobodan 5' OH terminus, ili bilo koju pogodnu 5' modifikaciju. Taj primer izvođenja je podjednako sadržan u predmetnom učenju, bez obzira na činjenicu da Sl. 1 šematski prikazuje alternativni primer izvođenja u kom RNK replikon sadrži kapu, ilustrovanu slovom C.
[0249] U jednom primeru izvođenja, kodirajuća sekvenca otvorenog(ih) okvira čitanja prisutnih na replikonu u skladu sa predmetnim učenjem (ukoliko postoji) je prilagođena. Primeri izvođenja i poželjni primeri izvođenja prilagođavanja kodona replikona u skladu sa predmetnim učenjem mogu se odabrati među onima koji su ovde objavljeni za slučaj prilagođavanja kodona replikaznog konstrukta. Kodoni otvorenog(ih) okvira čitanja mogu se prilagoditi za ekspresiju u ćeliji domaćinu ili organizmu domaćinu.
Heterologna sekvenca nukleinske kiseline
[0250] U jednom primeru izvođenja replikon dodatno sadrži najmanje jednu sekvencu nukleinske kiseline koja nije poreklom iz virusa, posebno ne iz alfavirusa. U poželjnim primerima izvođenja, RNK replikon u skladu sa predmetnim učenjem sadrži heterolognu sekvencu nukleinske kiseline. U skladu sa predmetnim učenjem, termin "heterologna" označava situaciju da sekvenca nukleinske kiseline nije prirodno funkcionalno povezana sa sekvencom nukleinske kiseline alfavirusa, kao što je sekvenca za kontrolu ekspresije alfavirusa, posebno subgenomski promotor alfavirusa. Heterolognu sekvencu nukleinske kiseline čini sekvenca nukleinske kiseline replikona.
[0251] Poželjno, heterologna sekvenca nukleinske kiseline je pod kontrolom subgenomskog promotora, poželjno subgenomskog promotora alfavirusa. Još poželjnije, heterologna sekvenca nukleinske kiseline je lokalizovana nizvodno od subgenomskog promotora. Subgenomski promotor alfavirusa je veoma efikasan, i prema tome je pogodan za ekspresiju heterolognog gena na visokim nivoima (Jose et al., Future Microbiol., 2009, vol. 4, pp. 837-856). Poželjno, subgenomski promotor kontroliše proizvodnju subgenomske RNK koja sadrži transkript heterologne sekvence nukleinske kiseline ili njenog dela.
[0252] Poželjno, subgenomski promotor je promotor za strukturni protein alfavirusa. To znači da je subgenomski promotor onaj koji je nativan za alfavirus i koji kontroliše transkripciju kodirajuće sekvence jednog ili više strukturnih proteina u navedenom alfavirusu. U skladu sa predmetnim učenjem, heterologna sekvenca nukleinske kiseline može delimično ili potpuno zameniti virusnu sekvencu nukleinske kiseline, kao što je sekvenca nukleinske kiseline koja kodira strukturne proteine alfavirusa. Poželjno, heterologna sekvenca nukleinske kiseline nije poreklom iz alfavirusa; posebno, poželjno je da heterologna sekvenca nukleinske kiseline nije poreklom iz istog alfavirusa kao što je alfavirus iz kog je poreklom subgenomski promotor. U jednom primeru izvođenja, replikon sadrži CSE 3, i heterologna sekvenca nukleinske kiseline je heterologna u odnosu na CSE 3.
Protein od interesa
[0253] U jednom primeru izvođenja, RNK replikon u skladu sa predmetnim učenjem sadrži otvoreni okvir čitanja koji kodira peptid od interesa ili protein od interesa. Poželjno, protein od interesa je kodiran heterolognom nukleinskom kiselinom. Poželjno, gen koji kodira protein od interesa (tj. gen od interesa) je prisutan zajedno sa sekvencom za kontrolu ekspresije. Poželjno, gen od interesa je pod kontrolom promotora, poželjno pod kontrolom subgenomskog promotora kao što je ovde opisano. Poželjnije gen od interesa je lociran nizvodno od subgenomskog promotora.
[0254] Gen koji kodira protein od interesa sinonimno se naziva "gen od interesa" ili "transgen". Transgen je prisutan na replikonu u skladu sa predmetnim učenjem poželjno pod
1
kontrolom subgenomskog promotora, i njegova lokalizacija stoga liči na lokalizaciju strukturnih gena u alfavirusu. Poželjno, lokacija nizvodno od subgenomskog promotora je takva da će subgenomski transkript sadržati transkript gena od interesa. Poželjno, gen od interesa sadrži otvoreni okvir čitanja koji sadrži start kodon (bazni triplet), tipično AUG (u molekulu RNK) ili ATG (u respektivnom molekulu DNK).
[0255] Poželjno, u slučaju da RNK replikon u skladu sa predmetnim učenjem sadrži najmanje jedan otvoreni okvir čitanja (region koji kodira protein), replikon je molekul iRNK.
[0256] Replikon u skladu sa predmetnim učenjem može kodirati jedan polipeptid ili više polipeptida. Više polipeptida može biti kodirano kao jedan polipeptid (fuzioni polipeptid) ili kao zasebni polipeptidi. Ukoliko su polipeptidi kodirani kao zasebni polipeptidi, onda jedan ili više njih mogu biti obezbeđeni sa uzvodnim IRES ili dodatnim elementom virusnog promotora. Alternativno, replikon u skladu sa predmetnim učenjem može sadržati više od jednog otvorenog okvira čitanja, od kojih je svaki pod kontrolom subgenomskog promotora. Kada se takav replikon sa više ORF postavi u eukariotske ćelije, biće pripremljeno više subgenomskih transkripata, od kojih je svaki iniciran sopstvenim subgenomskim promotorom (Strauss & Strauss, Microbiol. Rev., 1994, vol. 58, pp.491-562). Alternativno, poli-protein ili fuzioni polipeptid sadrži pojedinačne polipeptide odvojene autokatalitičkom proteazom (npr.
2A protein virusa slinavke i šapa), ili inteinom.
[0257] Poželjno, otvoreni okvir čitanja koji kodira protein od interesa je nenativan za alfavirus iz kog je replikaza poreklom. Poželjno, otvoreni okvir čitanja pod kontrolom subgenomskog promotora ne kodira nijedan alfavirusni protein. U poželjnim primerima izvođenja, otvoreni okvir čitanja pod kontrolom subgenomskog promotora ne kodira nijedan nestrukturni protein alfavirusa pune dužine (nsP) ili njegov fragment, i/ili ne kodira nijedan strukturni protein alfavirusa pune dužine (sP) ili njegov fragment. Poželjno, otvoreni okvir čitanja koji kodira protein od interesa pod kontrolom subgenomskog promotora ne kodira nijedan strukturni protein alfavirusa. U jednom primeru izvođenja, sistem iz predmetnog učenja ne sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira jedan ili više strukturnih proteina alfavirusa. U jednom primeru izvođenja, sistem ne sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira bilo koji nukleokapsidni protein C, protein omotača P62 i/ili protein omotača E1.
[0258] Prednost sistema iz predmetnog učenja je što ne zahteva prisustvo ili primenu pomoćnog virusa koji kodira strukturne proteine alfavirusa. Ovo je prednost u odnosu na stanje tehnike (npr. Bredenbeek et al., J. Virol, 1993, vol. 67, pp. 6439-6446), koje opisuje trans-replikacioni sistem sposoban da pakuje replikon vektore kojima nedostaje ORF strukturnog proteina u virusne čestice, pri čemu strukturni proteini moraju biti eksprimirani in
2
trans iz pomoćne RNK. Replikacija ovih pomoćnih RNK, koje kodiraju strukturne proteine alfavirusa, tipično zavisi od replikaze eksprimirane iz replikon RNK koja kodira antigen. Samoj pomoćnoj RNK nedostaje funkcionalna replikaza i sadrži samo konzervirane elemente sekvence RNK potrebne za replikaciju (Smerdou & Liljeström, 1999, J. Virol., vol. 73, pp.
1092-1098; Ehrengruber & Lundstrom, 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., vol. 96, pp.
7041-7046). Međutim, nijedna takva pomoćna RNK koja kodira strukturne proteine alfavirusa nije potrebna za postizanje uspeha predmetnog učenja. Stoga, poželjno, nijedan molekul nukleinske kiseline iz predmetnog učenja ne kodira strukturne proteine alfavirusa.
[0259] U jednom primeru izvođenja, otvoreni okvir čitanja kodira reporterski protein. U tom primeru izvođenja, otvoreni okvir čitanja sadrži reporterski gen. Određeni geni mogu biti odabrani kao reporteri zato što se karakteristike koje daju ćelijama ili organizmima koji ih eksprimiraju mogu lako identifikovati i izmeriti, ili zato što su selektabilni markeri. Reporterski geni se često upotrebljavaju kao pokazatelj da li je određeni gen unet ili eksprimiran u populaciji ćelija ili organizama. Poželjno, ekspresioni proizvod reporterskog gena je vizuelno detektabilan. Uobičajeni vizuelno detektibilni reporterski proteini tipično poseduju fluorescentne ili luminescentne proteine. Primeri specifičnih reporterskih gena uključuju gen koji kodira zeleni fluorescentni protein meduze (GFP), koji uzrokuje da ćelije koje ga eksprimiraju sijaju zeleno pod plavim svetlom, enzim luciferazu, koja katalizuje reakciju sa luciferinom da proizvede svetlost, i crveni fluorescentni protein (RFP). Varijante bilo kog od ovih specifičnih reporterskih gena su moguće, sve dok varijante poseduju vizuelno detektabilna svojstva. Na primer, eGFP je tačkasto mutirana varijanta GFP. Primer izvođenja reporterskog proteina je posebno pogodan za testiranje ekspresije posredovane trans-replikacionim sistemom iz predmetnog učenja in vitro i in vivo, videti npr. Primere 2 i 4. Na primer, u oba slučaja (cis-replikacioni sistem i trans-replikacioni sistem, respektivno), prisustvo reporterskog proteina pretpostavlja da je pripremljen subgenomski transkript koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira reporterski protein. Zauzvrat, proizvodnja subgenomskog transkripta u ćeliji pretpostavlja da je replikazni konstrukt prisutan u toj ćeliji, i da je replikazni gen eksprimiran.
[0260] U alternativnom primeru izvođenja, otvoreni okvir čitanja ne kodira reporterski protein. Na primer, kada je sistem iz predmetnog učenja dizajniran za introdukciju farmaceutski aktivnog peptida ili proteina u čoveka ili životinju, kao što je pokazano npr. u Primeru 6, moguće je da nije kodiran fluorescentni reporterski protein. Na primer, farmaceutski aktivan protein može biti jedini protein kodiran otvorenim okvirom čitanja pod kontrolom subgenomskog promotora.
[0261] U skladu sa učenjem, u jednom primeru izvođenja, RNK replikona sadrži ili se sastoji od farmaceutski aktivne RNK. "Farmaceutski aktivna RNK" može biti RNK koja kodira farmaceutski aktivan peptid ili protein. Poželjno, RNK replikon u skladu sa predmetnim učenjem kodira farmaceutski aktivan peptid ili protein. Poželjno, otvoreni okvir čitanja kodira farmaceutski aktivan peptid ili protein. Poželjno, RNK replikon sadrži otvoreni okvir čitanja koji kodira farmaceutski aktivan peptid ili protein, poželjno pod kontrolom subgenomskog promotora.
[0262] "Farmaceutski aktivan peptid ili protein" ima pozitivan ili povoljan efekat na stanje ili bolesno stanje subjekta kada se primenjuje subjektu u terapijski efikasnoj količini. Poželjno, farmaceutski aktivan peptid ili protein ima lekovita ili palijativna svojstva i može se primenjivati na poboljšanje, olakšavanje, ublažavanje, preokretanje, odlaganje početka ili smanjenje težine jednog ili više simptoma bolesti ili poremećaja. Farmaceutski aktivan peptid ili protein mogu imati profilaktička svojstva i mogu se upotrebljavati za odlaganje početka bolesti ili za smanjenje težine takve bolesti ili patološkog stanja. Termin "farmaceutski aktivan peptid ili protein" uključuje cele proteine ili polipeptide, i može takođe označavati njihove farmaceutski aktivne fragmente. Takođe može uključivati farmaceutski aktivne analoge peptida ili proteina. Termin "farmaceutski aktivan peptid ili protein" uključuje peptide i proteine koji su antigeni, tj. peptid ili protein izaziva imunski odgovor kod subjekta koji može biti terapijski ili delimično ili potpuno zaštitan. Farmaceutski aktivan peptid ili protein se takođe može označiti kao terapijski peptid ili protein.
[0263] U jednom primeru izvođenja, farmaceutski aktivan peptid ili protein je ili sadrži imunski aktivno jedinjenje ili antigen ili epitop.
[0264] U skladu sa učenjem, termin "imunski aktivno jedinjenje" se odnosi na bilo koje jedinjenje koje menja imunski odgovor, poželjno indukovanjem i/ili suprimiranjem sazrevanja imunskih ćelija, indukovanjem i/ili suprimiranjem biosinteze citokina, i/ili promenom humoralnog imuniteta stimulacijom proizvodnje antitela od strane B ćelija. U jednom primeru izvođenja, imunski odgovor uključuje stimulaciju odgovora antitela (što obično uključuje imunoglobulin G (IgG)). Imunski aktivna jedinjenja poseduju potentnu imunostimulacijsku aktivnost uključujući, ali bez ograničavanja na, antivirusnu i antitumorsku aktivnost, i takođe mogu smanjiti druge aspekate imunskog odgovora, na primer pomičući imunski odgovor od TH2imunskog odgovora, što je korisno za lečenje širokog spektra TH2posredovanih bolesti.
[0265] U skladu sa učenjem, termin "antigen" ili "imunogen" pokriva bilo koju supstancu koja će izazvati imunski odgovor. Posebno, "antigen" se odnosi na bilo koju supstancu koja specifično reaguje sa antitelima ili T-limfocitima (T-ćelije). U skladu sa predmetnim učenjem,
4
termin "antigen" sadrži bilo koji molekul koji sadrži najmanje jedan epitop. Poželjno, antigen u kontekstu predmetnog učenja je molekul koji, opciono posle obrade, indukuje imunsku reakciju, koja je poželjno specifična za antigen. U skladu sa predmetnim učenjem, može se upotrebljavati bilo koji pogodan antigen, koji je kandidat za imunsku reakciju, pri čemu imunska reakcija može biti i humoralna kao i ćelijska imunska reakcija. U kontekstu primera izvođenja predmetnog učenja, antigen je poželjno prezentovan od strane ćelije, poželjno antigen prezentujuće ćelije, u kontekstu molekula MHC, što rezultuje imunskom reakcijom prema antigenu. Antigen je poželjno proizvod koji odgovara ili je poreklom iz antigena koji se javlje u prirodi. Takvi antigeni koji se javljaju u prirodi mogu uključivati ili mogu biti poreklom iz alergena, virusa, bakterija, gljivica, parazita i drugih infektivnih agenasa i patogena ili antigen može takođe biti tumorski antigen. U skladu sa predmetnim učenjem, antigen može odgovarati proizvodu koji se javlja u prirodi, na primer, virusnom proteinu, ili njegovom delu. U poželjnim primerima izvođenja, antigen je površinski polipeptid, tj. polipeptid koji je prirodno izložen na površini ćelije, patogena, bakterije, virusa, gljivice, parazita, alergena, ili tumora. Antigen može izazvati imunski odgovor prema ćeliji, patogenu, bakteriji, virusu, gljivici, parazitu, alergenu, ili tumoru.
[0266] Termin "patogen" označava patogeni biološki materijal sposoban da uzrokuje bolest u organizmu, poželjno u organizmu vertebrata. Patogeni uključuju mikroorganizme kao što su bakterije, jednoćelijski eukariotski organizmi (protozoe), gljivice, kao i virusi.
[0267] Termini "epitop", "antigenski peptid", "antigenski epitop", "imunogeni peptid" i "MHC vezujući peptid" se ovde upotrebljavaju naizmenično i označavaju antigenu determinantu u molekulu kao što je antigen, tj. deo u ili fragment imunski aktivnog jedinjenja koje prepoznaje imunski sistem, na primer, koje prepoznaje T ćelija, posebno kada je prezentovan u kontekstu molekula MHC. Epitop proteina poželjno sadrži kontinuirani ili diskontinuirani deo navedenog proteina i poželjno je dužine između 5 i 100, poželjno između 5 i 50, poželjnije između 8 i 30, najpoželjnije između 10 i 25 amino-kiselina, na primer, epitop može poželjno biti dužine 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ili 25 amino-kiselina. U skladu sa učenjem, epitop se može vezati za molekule MHC kao što su molekuli MHC na površini ćelije, i stoga može biti "MHC vezujući peptid" ili "antigenski peptid". Termin "glavni kompleks histokompatibilnosti" i skraćenica "MHC" uključuju molekule MHC klase I i MHC klase II i odnose se na kompleks gena koji je prisutan kod svih vertebrata. MHC proteini ili molekuli važni su za signalizaciju između limfocita i antigen prezentujućih ćelija ili obolelih ćelija u imunskim reakcijama, pri čemu MHC proteini ili molekuli vezuju peptide i prezentuju ih za prepoznavanje receptorima T ćelija. Proteini koje kodira MHC eksprimiraju se na površini ćelija, i izlažu i samo-antigene (fragmente peptida iz same ćelije) i ne-samo-antigene (npr. fragmente invazivnih mikroorganizama) T ćeliji. Poželjni takvi imunogeni delovi se vezuju za molekul MHC klase I ili klase II. Kao što se ovde upotrebljava, za imunogeni deo se kaže da se "vezuje" za molekul MHC klase I ili klase II ukoliko se takvo vezivanje može detektovati upotrebom bilo kog testa poznatog u struci. Termin "MHC vezujući peptid" odnosi se na peptid koji se vezuje za molekul MHC klase I i/ili MHC klase II. U slučaju MHC klase I/peptidnih kompleksa, vezujući peptidi su tipično dugački 8-10 amino-kiselina, iako duži ili kraći peptidi mogu biti efikasni. U slučaju MHC klase II/peptidnih kompleksa, vezujući peptidi su tipično dugački 10-25 amino-kiselina, i posebno su dugački 13-18 amino-kiselina, dok duži i kraći peptidi mogu biti efikasni.
[0268] U jednom primeru izvođenja, protein od interesa u skladu sa predmetnim učenjem sadrži epitop pogodan za vakcinaciju ciljnog organizma. Osoba sa iskustvom u ovoj struci znaće da je jedan od principa imunobiologije i vakcinacije zasnovan na činjenici da se imunoprotektivna reakcija na bolest proizvodi imunizacijom organizma antigenom, koji je imunski relevantan u odnosu na bolest koja se leči. U skladu sa predmetnim učenjem, antigen je odabran iz grupe koja sadrži samo-antigen i ne-samo-antigen. Ne-samo-antigen je poželjno bakterijski antigen, antigen virusa, antigen gljivica, antigen alergena ili parazita. Poželjno je da antigen sadrži epitop koji je sposoban da izazove imunski odgovor u ciljnom organizmu. Na primer, epitop može izazvati imunski odgovor prema bakteriji, virusu, gljivici, parazitu, alergenu, ili tumoru.
[0269] U nekim primerima izvođenja ne-samo-antigen je bakterijski antigen. U nekim primerima izvođenja antigen izaziva imunski odgovor prema bakteriji koja inficira životinje, uključujući ptice, ribe i sisare, uključujući i pripitomljene životinje. Poželjno, bakterija prema kojoj se izaziva imunski odgovor je patogena bakterija.
[0270] U nekim primerima izvođenja ne-samo-antigen je antigen virusa. Antigen virusa može, na primer, biti peptid iz površinskog proteina virusa, npr. polipeptid kapsida ili spajk polipeptid. U nekim primerima izvođenja, antigen izaziva imunski odgovor prema virusu koji inficira životinje, uključujući ptice, ribe i sisare, uključujući pripitomljene životinje. Poželjno, virus prema kome se izaziva imunski odgovor je patogeni virus.
[0271] U nekim primerima izvođenja ne-samo-antigen je polipeptid ili protein iz gljivice. U nekim primerima izvođenja, antigen izaziva imunski odgovor prema gljivicama koje inficiraju životinje, uključujući ptice, ribe i sisare, uključujući pripitomljene životinje. Poželjno, gljivica prema kojoj se izaziva imunski odgovor je patogena gljivica.
[0272] U nekim primerima izvođenja ne-samo-antigen je polipeptid ili protein iz jednoćelijskog eukariotskog parazita. U nekim primerima izvođenja, antigen izaziva imunski odgovor prema jednoćelijskom eukariotskom parazitu, poželjno patogenom jednoćelijskom eukariotskom parazitu. Patogeni jednoćelijski eukariotski paraziti mogu biti npr. iz roda Plasmodium, npr. P. falciparum, P. vivax, P. malariae ili P. ovale, iz roda Leishmania, ili iz roda Trypanosoma, npr. T. cruzi ili T. brucei.
[0273] U nekim primerima izvođenja ne-samo-antigen je alergeni polipeptid ili alergeni protein. Alergeni protein ili alergeni polipeptid je pogodan za imunoterapiju alergenom, poznatu i kao hiposenzibilizacija.
[0274] U nekim primerima izvođenja antigen je samo-antigen, posebno tumorski antigen. Tumorski antigeni i njihovo određivanje su poznati stručnjaku.
[0275] U kontekstu predmetnog učenja, termin "tumorski antigen" ili "antigen povezan sa tumorom" se odnosi na proteine koji su u normalnim uslovima specifično eksprimirani u ograničenom broju tkiva i/ili organa ili u specifičnim fazama razvića, na primer, tumorski antigen može biti u normalnim uslovima specifično eksprimiran u tkivu želuca, poželjno u mukozi želuca, u reproduktivnim organima, npr. u testisima, u trofoblastnom tkivu, npr. u placenti, ili u ćelijama germinativne linije, i eksprimiran je ili aberantno eksprimiran u jednom ili više tumorskih ili kancerskih tkiva. U ovom kontekstu, "ograničen broj" poželjno znači ne više od 3, poželjnije ne više od 2. Tumorski antigeni u kontekstu predmetnog učenja uključuju, na primer, antigene za diferencijaciju, poželjno antigene za diferencijaciju specifične za ćelijski tip, tj. proteine koji su u normalnim uslovima specifično eksprimirani u određenom tipu ćelija u određenoj fazi diferencijacije, antigene kancera/testisa, tj. proteine koji su u normalnim uslovima specifično eksprimirani u testisima i ponekad u placenti, i specifične antigene germinativnih linija. U kontekstu predmetnog učenja, tumorski antigen je poželjno povezan sa ćelijskom površinom ćelije kancera i poželjno se ne eksprimira ili se samo retko eksprimira u normalnim tkivima. Poželjno, tumorski antigen ili aberantna ekspresija tumorskog antigena identifikuju ćelije kancera. U kontekstu predmetnog učenja, tumorski antigen koji se eksprimira u ćeliji kancera kod subjekta, npr. pacijenta koji boluje od bolesti kancera, je poželjno samo-protein kod navedenog subjekta. U poželjnim primerima izvođenja, tumorski antigen u kontekstu predmetnog učenja se eksprimira u normalnim uslovima specifično u tkivu ili organu koji je neesencijalan, tj. u tkivima ili organima koji, kada su oštećeni imunskim sistemom, ne dovode do smrti subjekta, ili u organima ili strukturama tela koje nisu dostupne ili su teško dostupne imunskom sistemu. Poželjno, aminokiselinska sekvenca tumorskog antigena je identična između tumorskog antigena koji se eksprimira u normalnim tkivima i tumorskog antigena koji se eksprimiran u kancerskim tkivima.
[0276] Primeri za tumorske antigene koji mogu biti korisni u predmetnom učenju su p53, ART-4, BAGE, beta-katenin/m, Bcr-abL CAMEL, CAP-1, CASP-8, CDC27/m, CDK4/m, CEA, proteini ćelijske površine iz porodice klaudina, kao što su CLAUDIN-6, CLAUDIN-18.2 i CLAUDIN-12, c-MYC, CT, Cyp-B, DAM, ELF2M, ETV6-AML1, G250, GAGE, GnT-V, Gap100, HAGE, HER-2/neu, HPV-E7, HPV-E6, HAST-2, hTERT (ili hTRT), LAGE, LDLR/FUT, MAGE-A, poželjno MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A11, ili MAGE-A12, MAGE-B, MAGE-C, MART-1/Melan-A, MC1R, Myosin/m, MUC1, MUM-1, -2, -3, NA88-A, NF1, NY-ESO-1, NY-BR-1, p190 minor BCR-abL, Pm1/RARa, PRAME, proteinaza 3, PSA, PSM, RAGE, RU1 ili RU2, SAGE, SART-1 ili SART-3, SCGB3A2, SCP1, SCP2, SCP3, SSX, SURVIVIN, TEL/AML1, TPI/m, TRP-1, TRP-2, TRP-2/INT2, TPTE i WT. Posebno poželjni tumorski antigeni uključuju CLAUDIN-18.2 (CLDN18.2) i CLAUDIN-6 (CLDN6).
[0277] U nekim primerima izvođenja, nije potrebno da je farmaceutski aktivan peptid ili protein antigen koji izaziva imunski odgovor. Pogodni farmaceutski aktivni peptidi ili proteini mogu se odabrati iz grupe koja se sastoji od citokina i proteina imunskog sistema, kao što su imunski aktivna jedinjenja (npr. interleukini, faktor stimacije kolonija (CSF), faktor stimulacije kolonija granulocita (G-CSF), faktor stimulacije kolonija granulocita-makrofaga (GM-CSF), eritropoetin, faktor nekroze tumora (TNF), interferoni, integrini, adresini, seletini, receptori za navođenje, T ćelijski receptori, imunoglobulini), hormoni (insulin, tiroidni hormon, kateholamini, gonadotropini, trofični hormoni, prolaktin, oksitocin, dopamin, goveđi somatotropin, leptini i slično), hormoni rasta (npr. humani hormon rasta), faktori rasta (npr. epidermalni faktor rasta, faktor rasta nerva, insulinu sličan faktor rasta i slično), receptori faktora rasta, enzimi (tkivni aktivator plazminogena, streptokinaza, biosintetički ili degradabilni za holesterol, steriodogeni enzimi, kinaze, fosfodiesteraze, metilaze, de-metilaze, dehidrogenaze, celulaze, proteaze, lipaze, fosfolipaze, aromataze, citohromi, adenilat ili guanilat ciklaze, neuramidaze i slično), receptori (receptori steroidnih hormona, receptori peptida), vezujući proteini (vezujući proteini hormona rasta ili faktora rasta i slično), transkripcioni i translacioni faktori, proteini koji suprimiraju rast tumora (npr. proteini koji inhibiraju angiogenezu), strukturni proteini (kao što su kolagen, fibroin, fibrinogen, elastin, tubulin, aktin i miozin), proteini krvi (trombin, serumski albumin, faktor VII, faktor VIII, insulin, faktor IX, faktor X, tkivni aktivator plazminogena, protein C, von Vilebrandov (von Wilebrand) faktor, antitrombin III, glukocerebrozidaza, eritropoetin, faktor stimulacije kolonija granulocita (GCSF) ili modifikovani faktor VIII, antikoagulanti i slično. U jednom primeru izvođenja, farmaceutski aktivan protein u skladu sa učenjem je citokin koji je uključen u regulaciju limfoidne homeostaze, poželjno citokin koji je uključen i poželjno indukuje ili pospešuje razvoj, prajmiranje, ekspanziju, diferencijaciju i/ili opstanak T ćelija. U jednom primeru izvođenja, citokin je interleukin, npr. IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, ili IL-21.
Raznovrsnost sistema iz predmetnog učenja
[0278] Prednosti sistema iz predmetnog učenja uključuju nezavisnost od transkripcije u nukleusu i prisustvo ključnih genetičkih informacija na dva odvojena molekula RNK, što obezbeđuje slobodu dizajna bez presedana. S obzirom na raznovrsne elemente, koji se mogu međusobno kombinovati, predmetno učenje omogućava da se optimizuje ekspresija replikaze za željeni nivo amplifikacije RNK, za željeni ciljni organizam, za željeni nivo proizvodnje proteina od interesa, itd. Replikon koji se može replicirati pomoću replikaze in trans može se dizajnirati nezavisno.
[0279] Na primer, sledeći elementi mogu biti pojedinačno izabrani, dizajnirani i/ili prilagođeni, na osnovu ovde objavljenog: dodavanje kape na replikazni konstrukt (posebno izbor specifične kape); 5ꞌ-UTR replikaznog konstrukta; kodirajuća sekvenca ORF koji kodira replikazu (optimizacija kodona); 3ꞌ-UTR replikaznog konstrukta; poli(A) rep replikaznog konstrukta; 5ꞌ-UTR replikona (sve dok replikon sadrži 5ꞌ sekvencu prepoznavanja replikacije za alfavirusnu replikazu); subgenomska promotorska sekvenca; 5ꞌ-UTR subgenomskog transkripta generisanog iz replikona; kodirajuća sekvenca ORF koji kodira gen od interesa (optimizacija kodona); 3ꞌ-UTR replikona i/ili subgenomskog transkripta generisanog iz replikona (sve dok replikon sadrži 3ꞌ sekvencu prepoznavanja replikacije za alfavirusnu replikazu); poli(A) rep replikona i/ili subgenomskog transkripta generisanog iz replikona.
[0280] Pored toga, predmetno učenje omogućava ko-transfekciju optimalnih količina replikona i replikaznog konstrukta za bilo koji dati tip ćelije – u mirovanju ili ciklirajuću, in vitro ili in vivo.
Bezbednosna svojstva primera izvođenja predmetnog učenja
[0281] Sledeća svojstva su poželjna u predmetnom učenju, sama ili u bilo kojoj pogodnoj kombinaciji:
Poželjno, sistem iz predmetnog učenja ne sadrži nijedan strukturni protein alfavirusa, kao što je nukleokapsidni protein C, protein omotača P62, i/ili protein omotača E1.
[0282] Poželjno, sistem iz predmetnog učenja nije sistem koji formira čestice. To znači da, nakon inokulacije ćelije domaćina pomoću sistema iz predmetnog učenja, ćelija domaćin ne proizvodi čestice virusa, kao što su čestice virusa sledeće generacije. U jednom primeru izvođenja, sistem je potpuno bez genetičkih informacija koje kodiraju bilo koji strukturni protein alfavirusa, kao što je nukleokapsidni protein C, protein omotača P62, i/ili protein omotača E1. Ovaj aspekt predmetnog učenja obezbeđuje dodatnu vrednost u smislu bezbednosti u odnosu na sisteme iz stanja tehnike u kojima su strukturni proteini kodirani na trans-replicirajućoj pomoćnoj RNK (npr. Bredenbeek et al., J. Virol, 1993, vol.67, pp. 6439-6446).
[0283] Poželjno, ni replikon ni replikazni konstrukt nisu sposobni da pokrenu svoju sopstvenu replikaciju, tj. cis-replikaciju. U jednom primeru izvođenja, replikon ne kodira funkcionalnu alfavirusnu replikazu. U jednom primeru izvođenja, replikaznom konstruktu nedostaje najmanje jedan element sekvence (poželjno najmanje jedan CSE) koji je potreban za sintezu (-) lanca na osnovu templata (+) lanca, i/ili za sintezu (+) lanca na osnovu templatu (-) lanca. U jednom primeru izvođenja, replikazni konstrukt ne sadrži CSE 1 i/ili CSE 4.
[0284] Poželjno, ni replikon u skladu sa predmetnim učenjem, ni replikazni konstruki u skladu sa predmetnim učenjem ne sadrže signal za pakovanje alfavirusa. Na primer, signal za pakovanje alfavirusa koji je sadržan u kodirajućem regionu nsP2 SFV (White et al. 1998, J. Virol., vol.72, pp.4320-4326) može se ukloniti, npr. delecijom ili mutacijom. Pogodan način uklanjanja signala za pakovanje alfavirusa uključuje prilagođavanje upotrebe kodona u kodirajućem regionu nsP2. Degeneracija genetičkog koda može omogućiti deleciju funkcije signala pakovanja bez uticaja na amino-kiselinsku sekvencu kodiranog nsP2.
[0285] U jednom primeru izvođenja, sistem iz predmetnog učenja je izolovan sistem. U tom primeru izvođenja, sistem nije prisutan unutar ćelije, kao što je unutar ćelije sisara, ili nije prisutan unutar kapsida virusa, kao što je unutar omotača koji sadrži strukturne proteine alfavirusa. U jednom primeru izvođenja, sistem iz predmetnog učenja je prisutan in vitro.
Inhibicija signaliziranja interferona (IFN)
[0286] Saopšteno je da se redukuje vijabilnost ćelija u koje je RNK introdukovana radi ekspresije, posebno, ukoliko su ćelije više puta transfektovane sa RNK. Kao rešenje, pronađeno je da ko-transfekcija sa agensima koji inhibiraju IFN povećava vijabilnost ćelija u kojima RNK treba da bude eksprimirana (WO 2014/071963 A1). Bilo koji inhibitor unutarćelijskog IFN signaliziranja ili vanćelijskog IFN signaliziranja, kao što je opisano u WO 2014/071963 A1, pogodan je u predmetnom učenju. Poželjno, inhibitor je inhibitor signaliziranja IFN tipa I.
[0287] U jednom primeru izvođenja predmetnog učenja, sistem iz predmetnog učenja može biti dizajniran tako da poboljša translaciju, posebno da inhibira negativne uticaje na translaciju. Ovo može uključivati da inhibira unutarćelijsko signaliranje interferona (IFN) u ćelijama i da se spreči angažovanje IFN receptora vanćelijskim IFN. Sprečavanje angažovanja IFN receptora vanćelijskim IFN i inhibiranje unutarćelijskog IFN signaliziranja u ćelijama omogućava stabilnu ekspresiju RNK u ćelijama. Alternativno ili dodatno, sprečavanje angažovanja IFN receptora vanćelijskim IFN i inhibiranje unutarćelijskog IFN signaliziranja povećava preživljavanje ćelija, posebno, ukoliko se ćelije ponavljajući transfektuju sa RNK. Bez želje da bude vezano teorijom, predviđeno je da unutarćelijsko IFN signaliziranje može rezultovati inhibicijom translacije i/ili degradacijom RNK. Ovo se može rešiti inhibicijom jednog ili više IFN-induktabilnih antivirusno aktivnih efektorskih proteina. IFN-induktabilan antivirusno aktivan efektorski protein može se odabrati iz grupe koja se sastoji od RNK-zavisne protein kinaze (PKR), 2ꞌ,5ꞌ-oligoadenilat sintetaze (OAS) i RNazeL. Inhibicija unutarćelijskog IFN signaliziranja može sadržati inhibiciju PKR-zavisnog puta i/ili OAS-zavisnog puta. Inhibicija PKR-zavisnog puta može sadržati inhibiciju eIF2-alfa fosforilacije. Inhibicija PKR može sadržati tretiranje ćelije sa najmanje jednim inhibitorom PKR. Inhibitor PKR može biti virusni inhibitor PKR. Poželjni virusni inhibitor PKR je E3 Vaccinia virusa. Ukoliko peptid ili protein (npr. E3, K3) treba da inhibira unutarćelijsko IFN signaliziranje, poželjna je unutarćelijska ekspresija peptida ili proteina.
[0288] E3 Vaccinia virusa je dsRNA-vezujući protein od 25 kDa (kodiran genom E3L) koji vezuje i sekvestrira dsRNA kako bi sprečio aktivaciju PKR i OAS. E3 se može vezati direktno za PKR i inhibirati njenu aktivnost, što rezultuje redukovanom fosforilacijom eIF2-alfa. Drugi pogodni inhibitori IFN signaliziranja su Herpes simplex virus ICP34.5, Toscana virus NS, Bombyx mori nukleopolihedrovirus PK2, i HCV NS34A.
[0289] Inhibitor unutarćelijskog IFN signaliziranja može biti obezbeđen ćeliji u obliku sekvence nukleinske kiseline (npr. RNK) koja kodira inhibitora unutarćelijskog IFN signaliziranja.
[0290] U jednom primeru izvođenja, inhibitor unutarćelijskog ili vanćelijskog IFN signaliziranja kodiran je od strane molekula iRNK. Taj molekul iRNK može sadržati
1
modifikaciju koja modifikuje nepolipeptidnu sekvencu kao što je ovde opisano, npr. kapu, 5ꞌ-UTR, 3ꞌ-UTR, poli(A) sekvencu, prilagođavanje upotrebe kodona.
[0291] U alternativnom primeru izvođenja, inhibitor unutarćelijskog ili vanćelijskog IFN signaliziranja kodiran je od strane replikona, poželjno trans-replikona. Replikon sadrži elemente sekvence nukleinske kiseline koji omogućavaju replikaciju pomoću alfavirusne replikaze, tipično CSE 1, CSE 2 i CSE 4; i poželjno takođe elemente sekvence nukleinske kiseline koji omogućavaju proizvodnju subgenomskog transkripta, tj. subgenomskog promotora, koji tipično sadrži CSE 3. Replikon može dopunski sadržati jednu ili više modifikacija koje modifikuju nepolipeptidnu sekvencu, kao što je ovde opisano, npr. kapu, poli(A) sekvencu, prilagođavanje upotrebe kodona.
RNK konstrukt za ekspresiju alfavirusne replikaze
[0292] U drugom aspektu, učenje obezbeđuje RNK konstrukt za ekspresiju alfavirusne replikaze (replikazni konstrukt) koji sadrži 5'-kapu za pokretanje translacije replikaze. U drugom aspektu, moguće je da nema alfavirusnog replikona u skladu sa predmetnim učenjem. Drugim rečima, u drugom aspektu predmetnog učenja, replikazni konstrukt iz predmetnog učenja, kao što je ovde opisano, može se obezbediti nezavisno od replikona iz predmetnog učenja. U drugom aspektu, replikazni konstrukt se može nezavisno okarakterisati pomoću bilo kog jednog ili više svojstava replikaznog konstrukta iz prvog aspekta predmetnog učenja. U jednom primeru izvođenja, RNK konstrukt za ekspresiju alfavirusne replikaze je izolovani molekul nukleinske kiseline. Ovo uključuje primer izvođenja da on je izolovan, tj. suštinski bez, drugih molekula nukleinske kiseline.
[0293] RNK konstrukt u skladu sa drugim aspektom je pogodan, na primer, za kombinaciju sa pogodnim replikonom u obliku sistema ili kompleta.
DNK u skladu sa učenjem
[0294] U trećem aspektu, učenje obezbeđuje DNK koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira RNK konstrukt za ekspresiju alfavirusne replikaze (replikazni konstrukt) u skladu sa prvim aspektom učenja, RNK replikon u skladu sa prvim aspektom učenja, ili oba.
[0295] U jednom primeru izvođenja, molekul DNK u skladu sa predmetnim učenjem kodira replikon i replikazni konstrukt iz sistema u skladu sa prvim aspektom učenja. U alternativnom primeru izvođenja, prvi molekul DNK kodira jedan element RNK (replikon ili replikazni
2
konstrukt) iz sistema u skladu sa prvim aspektom učenja, i drugi molekul DNK kodira odgovarajući drugi element RNK iz sistema u skladu sa predmetnim učenjem.
[0296] Poželjno, DNK je dvolančana.
[0297] U poželjnom primeru izvođenja, DNK u skladu sa trećim aspektom učenja je plazmid. Termin "plazmid", kao što se ovde upotrebljava, generalno se odnosi na konstrukt ekstrahromozomskog genetičkog materijala, uobičajeno cirkularnog DNK dupleksa, koji se može replicirati nezavisno od hromozomske DNK.
[0298] DNK iz predmetnog učenja može sadržati promotor koji može biti prepoznat od strane DNK-zavisne RNK polimeraze. Ovo omogućava transkripciju kodirane RNK in vivo ili in vitro, npr. RNK iz predmetnog učenja. IVT vektori se mogu upotrebljavati na standardizovan način kao templat za in vitro transkripciju. Primeri promotora koji su poželjni u skladu sa učenjem su promotori za SP6, T3 ili T7 polimerazu.
[0299] U jednom primeru izvođenja, DNK iz predmetnog učenja je izolovani molekul nukleinske kiseline.
Postupci pripremanja RNK
[0300] Bilo koji molekul RNK u skladu sa predmetnim učenjem, bio on deo sistema iz predmetnog učenja ili ne, može se dobiti in vitro transkripcijom. In vitro transkribovana RNK (IVT-RNK) je od posebnog interesa u predmetnom učenju. IVT-RNK se može dobiti transkripcijom iz molekula nukleinske kiseline (posebno molekula DNK). Molekul(i) DNK iz trećeg aspekta predmetnog učenja pogodni su za takve svrhe, posebno ukoliko sadrže promotor koji može biti prepoznat od strane DNK-zavisne RNK polimeraze.
[0301] RNK u skladu sa predmetnim učenjem može se sintetisati in vitro. Ovo omogućava dodavanje analoga kape u in vitro reakciji transkripcije. Tipično, poli(A) rep je kodiran poli-(dT) sekvencom na DNK templatu. Alternativno, dodavanje kape i poli(A) repa može se postići enzimski posle transkripcije.
[0302] Metodologija in vitro transkripcije poznata je stručnjaku. Na primer, kao što je pomenuto u WO 2011/015347A1, različiti kompleti za in vitro transkripciju su komercijalno dostupni.
Komplet
[0303] Predmetno učenje takođe obezbeđuje komplet koji sadrži sistem u skladu sa prvim aspektom učenja ili RNK konstrukt za ekspresiju alfavirusne replikaze u skladu sa drugim aspektom učenja.
[0304] U jednom primeru izvođenja, sastavni delovi kompleta su prisutni kao zasebni entiteti. Na primer, jedan molekul nukleinske kiseline iz kompleta može biti prisutan u jednom entitetu, i druga nukleinska kiselina iz kompleta može biti prisutna u zasebnom entitetu. Na primer, otvoreni ili zatvoreni kontejner je pogodan entitet. Poželjan je zatvoreni kontejner. Poželjno je da upotrebljeni kontejner bude bez RNAze ili suštinski bez RNAze.
[0305] U jednom primeru izvođenja, komplet iz predmetnog učenja sadrži RNK za inokulaciju sa ćelijom i/ili za primenu humanom ili životinjskom subjektu.
[0306] Komplet u skladu sa predmetnim učenjem opciono sadrži etiketu ili neki drugi oblik informacionog elementa, npr. elektronski nosač podataka. Etiketa ili informacioni element poželjno sadrži uputstva, npr. štampana pisana uputstva ili uputstva u elektronskom obliku koja se opciono mogu štampati. Uputstva se mogu odnositi na najmanje jednu pogodnu moguću upotrebu kompleta.
Farmaceutska kompozicija
[0307] Konstrukt za ekspresiju alfavirusne replikaze i/ili replikona koji je ovde opisan može biti prisutan u obliku farmaceutske kompozicije. Farmaceutska kompozicija u skladu sa učenjem može sadržati najmanje jedan molekul nukleinske kiseline, poželjno RNK, u skladu sa predmetnim učenjem. Farmaceutska kompozicija u skladu sa učenjem sadrži farmaceutski prihvatljiv razblaživač i/ili farmaceutski prihvatljiv ekscipijens i/ili farmaceutski prihvatljiv nosač i/ili farmaceutski prihvatljiv vehikulum. Izbor farmaceutski prihvatljivog nosača, vehikuluma, ekscipijensa ili razblaživača nije posebno ograničen. Može se upotrebljavati bilo koji pogodan farmaceutski prihvatljiv nosač, vehikulum, ekscipijens ili razblaživač poznat u struci.
[0308] U jednom primeru izvođenja predmetnog učenja, farmaceutska kompozicija može dodatno sadržati rastvarač kao što je vodeni rastvarač ili bilo koji rastvarač koji omogućava očuvanje integriteta RNK. U poželjnom primeru izvođenja, farmaceutska kompozicija je vodeni rastvor koji sadrži RNK. Vodeni rastvor može opciono da sadrži rastvorke, npr. soli.
[0309] U jednom primeru izvođenja predmetnog učenja, farmaceutska kompozicija je u obliku kompozicije osušene zamrzavanjem. Kompozicija osušena zamrzavanjem se može dobiti pomoću sušenja zamrzavanjem odgovarajuće vodene kompozicije.
4
[0310] U jednom primeru izvođenja, farmaceutska kompozicija sadrži najmanje jedan katjonski entitet. Generalno, katjonski lipidi, katjonski polimeri i druge supstance sa pozitivnim naelektrisanjem mogu formirati komplekse sa negativno naelektrisanim nukleinskim kiselinama. Moguće je stabilizovati RNK u skladu sa učenjem kompleksovanjem sa katjonskim jedinjenjima, poželjno polikatjonskim jedinjenjima kao što je na primer katjonski ili polikatjonski peptid ili protein. U jednom primeru izvođenja, farmaceutska kompozicija u skladu sa predmetnim učenjem sadrži najmanje jedan katjonski molekul odabran iz grupe koja se sastoji od protamina, polietilen imina, poli-L-lizina, poli-L-arginina, histona ili katjonskog lipida.
[0311] U skladu sa predmetnim učenjem, katjonski lipid je katjonski amfifilni molekul, npr. molekul koji sadrži najmanje jedan hidrofilni i lipofilni deo. Katjonski lipid može biti monokatjonski ili polikatjonski. Katjonski lipidi tipično imaju lipofilni deo, kao što je sterol, acilni ili diacilni lanac, i imaju ukupno neto pozitivno naelektrisanje. Glavena grupa lipida tipično nosi pozitivno naelektrisanje. Katjonski lipid poželjno ima pozitivno naelektrisanje od 1 do 10 valenci, poželjnije pozitivno naelektrisanje od 1 do 3 valence, i poželjnije pozitivno naelektrisanje od 1 valence. Primeri katjonskih lipida uključuju, ali nisu ograničeni na 1,2-di-O-oktadecenil-3-trimetilamonijum propan (DOTMA); dimetildioktadecilamonijum (DDAB); 1,2-dioleoil-3-trimetilamonijum-propan (DOTAP); 1,2-dioleoil-3-dimetilamonijum-propan (DODAP); 1,2-diaciloksi-3-dimetilamonijum propane; 1,2-dialkiloksi-3-dimetilamonijum propane; dioktadecildimetil amonijum hlorid (DODAC), 1,2-dimiristoiloksipropil-1,3-dimetilhidroksietil amonijum (DMRIE), i 2,3-dioleoiloksi-N-[2(spermin karboksamid)etil]-N,N-dimetil-1-propanamijum trifluoroacetat (DOSPA). Katjonski lipidi takođe uključuju lipide sa tercijarnom amino grupom, uključujući 1,2-dilinoleiloksi-N,N-dimetil-3-aminopropan (DLinDMA). Katjonski lipidi su pogodni za formulisanje RNK u lipidnim formulacijama kao što je ovde opisano, kao što su lipozomi, emulzije i lipopleksi. Tipično pozitivnim naelektrisanjima doprinosi najmanje jedan katjonski lipid, i negativnim naelektrisanjima doprinosi RNK. U jednom primeru izvođenja, farmaceutska kompozicija sadrži najmanje jedan pomoćni lipid, pored katjonskog lipida. Pomoćni lipid može biti neutralan ili anjonski lipid. Pomoćni lipid može biti prirodni lipid, kao što je fosfolipid, ili analog prirodnog lipida, ili potpuno sintetički lipid, ili molekul sličan lipidu, bez sličnosti sa prirodnim lipidima. U slučaju gde farmaceutska kompozicija uključuje i katjonski lipid i pomoćni lipid, molski odnos katjonskog lipida prema neutralnom lipidu može se odgovarajuće odrediti s obzirom na stabilnost formulacije i slično.
[0312] U jednom primeru izvođenja, farmaceutska kompozicija u skladu sa predmetnim učenjem sadrži protamin. U skladu sa učenjem, protamin je koristan kao katjonski agens nosač. Termin "protamin" označava bilo koji od različitih jako baznih proteina relativno male molekulske mase koji su bogati argininom i za koje je pronađeno da su povezani naročito sa DNK na mestu somatskih histona u ćelijama sperme životinja kao što su ribe. Posebno, termin "protamin" označava proteine koji se nalaze u spermi riba koji su jako bazni, solubilni u vodi, ne koagulišu se toplotom, i sadrže više monomera arginina. U skladu sa učenjem, termin "protamin", kao što se ovde upotrebljava, znači da sadrži bilo koju protamin amino-kiselinsku sekvencu dobijenu ili poreklom iz nativnih ili bioloških izvora, uključujući njene fragmente i multimerne oblike navedene amino-kiselinske sekvence ili njen fragment. Nadalje, termin obuhvata (sintetisane) polipeptide koji su veštački i specifično dizajnirani za specifične svrhe i ne mogu se izolovati iz nativnih ili bioloških izvora.
[0313] U nekim primerima izvođenja, kompozicije iz učenja mogu sadržati jedan ili više adjuvanasa. Adjuvansi se mogu dodati vakcinama kako bi se stimulisao odgovor imunskog sistema; adjuvansi sami tipično ne obezbeđuju imunitet. Primeri adjuvanasa uključuju bez ograničavanja sledeće: neorganska jedinjenja (npr. alum, aluminijum hidroksid, aluminijum fosfat, kalcijum fosfat hidroksid); mineralno ulje (npr. parafinsko ulje), citokine (npr. IL-1, IL-2, IL-12); imunostimulatorni polinukleotid (kao što je RNK ili DNK; npr. oligonukleotidi koji sadrže CpG); saponine (npr. biljne saponine iz Quillaja, soje, Polygala senega); uljne emulzije ili lipozome; formulacije polioksi etilen etra i polioksi etilen estra; polifosfazen (PCPP); muramil peptide; jedinjenja imidazokvinolona; jedinjenja tiosemikarbazona; Flt3 ligand (WO 2010/066418 A1); ili bilo koji drugi adjuvans koji je poznat osobi sa iskustvom u ovoj struci. Poželjni adjuvans za primenu RNK u skladu sa predmetnim učenjem je Flt3 ligand (WO 2010/066418 Al). Kada se Flt3 ligand primenjuje zajedno sa RNK koja kodira antigen, može se uočiti jako povećanje antigen specifičnih CD8<+>T ćelija.
[0314] Farmaceutska kompozicija u skladu sa učenjem može biti puferisana (npr. sa acetatnim puferom, citratnim puferom, sukcinatnim puferom, Tris puferom, fosfatnim puferom).
Čestice koje sadrže RNK
[0315] U nekim primerima izvođenja, zbog nestabilnosti nezaštićene RNK, povoljno je obezbediti molekule RNK iz predmetnog učenja u kompleksovanom ili inkapsuliranom obliku. Respektivne farmaceutske kompozicije obezbeđene su u predmetnom učenju.
Posebno, u nekim primerima izvođenja, farmaceutska kompozicija iz predmetnog učenja sadrži čestice koje sadrže nukleinsku kiselinu, poželjno čestice koje sadrže RNK. Respektivne farmaceutske kompozicije se označavaju kao formulacije čestica. U formulacijama čestica u skladu sa predmetnim učenjem, čestica sadrži nukleinsku kiselinu u skladu sa učenjem i farmaceutski prihvatljiv nosač ili farmaceutski prihvatljiv vehikulum koji je pogodan za isporuku nukleinske kiseline. Čestice koje sadrže nukleinsku kiselinu mogu biti, na primer, u obliku proteinskih čestica ili u obliku čestica koje sadrže lipide. Pogodni proteini ili lipidi se označavaju kao agensi za formiranje čestica. Proteinske čestice i čestice koje sadrže lipide ranije su opisane kao pogodne za isporuku alfavirusne RNK u obliku čestica (npr. Strauss & Strauss, Microbiol. Rev., 1994, vol. 58, pp. 491-562). Posebno, strukturni proteini alfavirusa (obezbeđeni, npr. od strane pomoćnog virusa) su pogodni nosač za isporuku RNK u obliku proteinskih čestica.
[0316] Kada je sistem u skladu sa predmetnim učenjem formulisan kao formulacija čestica, moguće je da se svaka RNK vrsta (npr. replikon, replikazni konstrukt, i opcione dopunske RNK vrste, kao što je RNK koja kodira protein pogodan za inhibiranje IFN) zasebno formuliše kao individualna formulacija čestica. U tom slučaju, svaka pojedinačna formulacija čestica sadržaće jednu RNK vrstu. Pojedinačne formulacije čestica mogu biti prisutne kao zasebni entiteti, npr. u zasebnim kontejnerima. Takve formulacije se mogu dobiti obezbeđivanjem svake RNK vrste zasebno (tipično svaka u obliku rastvora koji sadrži RNK) zajedno sa agensom za formiranje čestica, čime se omogućava formiranje čestica. Respektivne čestice sadržaće isključivo specifične RNK vrste koje se obezbeđuju kada se formiraju čestice (pojedinačne formulacije čestica).
[0317] U jednom primeru izvođenja, farmaceutska kompozicija u skladu sa učenjem sadrži više od jedne pojedinačne formulacije čestica. Respektivne farmaceutske kompozicije se označavaju kao mešovite formulacije čestica. Mešovite formulacije čestica u skladu sa učenjem mogu se dobiti formiranjem, zasebno, pojedinačnih formulacija čestica, kao što je prethodno opisano, praćeno korakom mešanja pojedinačnih formulacija čestica. Korakom mešanja, može se dobiti jedna formulacija koja sadrži mešovitu populaciju čestica koje sadrže RNK (za ilustraciju: npr. prva populacija čestica može sadržati replikon u skladu sa učenjem, i druga formulacija čestica može sadržati replikazni konstrukt u skladu sa učenjem). Pojedinačne populacije čestica mogu biti zajedno u jednom kontejneru, čineći mešovitu populaciju pojedinačnih formulacija čestica.
[0318] Alternativno, moguće je da se sve RNK vrste iz farmaceutske kompozicije (npr. replikon, replikazni konstrukt, i opcione dopunske vrste, kao što je RNK koja kodira protein pogodan za inhibiranje IFN) formulišu zajedno kao kombinovana formulacija čestica. Takve formulacije se mogu dobiti obezbeđivanjem kombinovane formulacije (tipično kombinovani rastvor) svih RNK vrsta zajedno sa agensom za formiranje čestica, čime se omogućava formiranje čestica. Za razliku od mešovite formulacije čestica, kombinovana formulacija čestica tipično će sadržati čestice koje sadrže više od jedne RNK vrste. U kompoziciji kombinovanih čestica različite RNK vrste su tipično prisutne zajedno u jednoj čestici.
[0319] U jednom primeru izvođenja, formulacija čestica iz predmetnog učenja je formulacija nanočestica. U tom primeru izvođenja, kompozicija u skladu sa predmetnim učenjem sadrži nukleinsku kiselinu u skladu sa učenjem u obliku nanočestica. Formulacije nanočestica mogu se dobiti pomoću različitih protokola i sa različitim jedinjenjima za kompleksovanje. Lipidi, polimeri, oligomeri, ili amfipili su tipični sastojci formulacija nanočestica.
[0320] Kao što se ovde upotrebljava, termin "nanočestica" označava bilo koju česticu koja ima prečnik koji čini česticu pogodnom za sistemsku, posebno parenteralnu, primenu, posebno, nukleinskih kiselina, tipično prečnika 1000 nanometara (nm) ili manje. U jednom primeru izvođenja, nanočestice imaju prosečan prečnik u opsegu od oko 50 nm do oko 1000 nm, poželjno od oko 50 nm do oko 400 nm, poželjno oko 100 nm do oko 300 nm, kao što je oko 150 nm do oko 200 nm. U jednom primeru izvođenja, nanočestice imaju prečnik u opsegu od oko 200 do oko 700 nm, oko 200 do oko 600 nm, poželjno oko 250 do oko 550 nm, posebno oko 300 do oko 500 nm ili oko 200 do oko 400 nm.
[0321] U jednom primeru izvođenja, indeks polidisperznosti (PI) ovde opisanih nanočestica, meren dinamičkim rasipanjem svetlosti, je 0,5 ili manje, poželjno 0,4 ili manje ili još poželjnije 0,3 ili manje. "Indeks polidisperznosti" (PI) je mera homogene ili heterogene raspodele veličine pojedinačnih čestica (kao što su lipozomi) u smeši čestica i označava širinu raspodele čestica u smeši. PI se može odrediti, na primer, kao što je opisano u WO 2013/143555 A1.
[0322] Kao što se ovde upotrebljava, termin "formulacija nanočestica" ili slični termini označavaju bilo koju formulaciju čestica koja sadrži najmanje jednu nanočesticu. U nekim primerima izvođenja, kompozicija nanočestica je uniformna kolekcija nanočestica. U nekim primerima izvođenja, kompozicija nanočestica je farmaceutska formulacija koja sadrži lipide, kao što je formulacija lipozoma ili emulzija.
Farmaceutske kompozicije koje sadrže lipide
[0323] U jednom primeru izvođenja, farmaceutska kompozicija iz predmetnog učenja sadrži najmanje jedan lipid. Poželjno, najmanje jedan lipid je katjonski lipid. Navedena farmaceutska kompozicija koja sadrži lipide sadrži nukleinsku kiselinu u skladu sa predmetnim učenjem. U jednom primeru izvođenja, farmaceutska kompozicija u skladu sa učenjem sadrži RNK inkapsuliranu u vezikulu, npr. u lipozom. U jednom primeru izvođenja, farmaceutska kompozicija u skladu sa učenjem sadrži RNK u obliku emulzije. U jednom primeru izvođenja, farmaceutska kompozicija u skladu sa učenjem sadrži RNK u kompleksu sa katjonskim jedinjenjem, formirajući tako npr. takozvane lipoplekse ili poliplekse. Inkapsulacija RNK unutar vezikula kao što su lipozomi razlikuje se od, na primer, kompleksa lipida/RNK. Kompleksi lipid/RNK se mogu dobiti npr. kada se RNK npr. pomeša sa prethodno formiranim lipozomima.
[0324] U jednom primeru izvođenja, farmaceutska kompozicija u skladu sa učenjem sadrži RNK inkapsuliranu u vezikulu. Takva formulacija je posebna formulacija čestica u skladu sa učenjem. Vezikula je lipidni dvosloj smotan u sferičnu ljusku, koja zatvara mali prostor i odvaja taj prostor od prostora izvan vezikule. Tipično, prostor unutar vezikule je vodeni prostor, tj. sadrži vodu. Tipično, prostor izvan vezikule je vodeni prostor, tj. sadrži vodu. Lipidni dvosloj je formiran od strane jednog ili više lipida (lipidi koji formiraju vezikule). Membrana koja zatvara vezikulu je lamelarna faza, slična onoj plazma membrane. Vezikula u skladu sa predmetnim učenjem može biti multilamelarna vezikula, unilamelarna vezikula, ili njihova smeša. Kada je inkapsulirana u vezikulu, RNK je tipično odvojena od bilo kog spoljašnjeg medijuma. Stoga je prisutna u zaštićenom obliku, funkcionalno ekvivalentnom zaštićenom obliku u prirodnom alfavirusu. Pogodne vezikule su čestice, posebno nanočestice, kao što je ovde opisano.
[0325] Na primer, RNK može biti inkapsulirana u lipozomu. U tom primeru izvođenja, farmaceutska kompozicija je ili sadrži formulaciju lipozoma. Inkapsulacija unutar lipozoma će tipično zaštititi RNK od digestije RNazom. Moguće je da lipozomi uključuju neku spoljašnju RNK (npr. na svojoj površini), ali je najmanje polovina RNK (i idealno sva) inkapsulirana unutar jezgra lipozoma.
[0326] Lipozomi su mikroskopske lipidne vezikule koje često imaju jedan ili više dvoslojeva lipida koji formiraju vezikule, kao što je fosfolipid, i sposobne su da inkapsuliraju lek, npr. RNK. U kontekstu predmetnog učenja mogu se koristiti različiti tipovi lipozoma, uključujući, bez ograničavanja na, multilamelarne vezikule (MLV), male unilamelarne vezikule (SUV), velike unilamelarne vezikule (LUV), sterički stabilizovane lipozome (SSL), multivezikularne vezikule (MV), i velike multivezikularne vezikule (LMV), kao i druge dvoslojne oblike poznate u struci. Veličina i lamelarnost lipozoma zavisiće od načina pripreme. Postoji nekoliko drugih oblika supramolekulske organizacije u kojima lipidi mogu biti prisutni u vodenom medijumu, koji sadrže lamelarne faze, heksagonalne i inverzne heksagonalne faze, kubične faze, micele, reverzne micele sačinjene od monoslojeva. Ove faze se takođe mogu dobiti u kombinaciji sa DNK ili RNK, i interakcija sa RNK i DNK može značajno uticati na fazno stanje. Takve faze mogu biti prisutne u formulacijama nanočestica RNK iz predmetnog učenja.
[0327] Lipozomi se mogu formirati upotrebom standardnih postupaka poznatih stručnjaku. Respektivni postupci uključuju postupak reverzne evaporacije, postupak ubrizgavanja etanola, postupak dehidratacije-rehidratacije, ultrazvučne obrade ili druge pogodne postupke. Nakon formiranja lipozoma, lipozomi se mogu odabrati po veličini kako bi se dobila populacija lipozoma koji imaju značajno homogen opseg veličina.
[0328] U poželjnom primeru izvođenja predmetnog učenja, RNK je prisutna u lipozomu koji uključuje najmanje jedan katjonski lipid. Respektivni lipozomi se mogu formirati od jednog lipida ili od smeše lipida, pod uslovom da se upotrebljava najmanje jedan katjonski lipid. Poželjni katjonski lipidi imaju atom azota koji je sposoban da bude protonovan; poželjno, takvi katjonski lipidi su lipidi sa tercijarnom amino grupom. Posebno pogodan lipid sa tercijarnom amino grupom je 1,2-dilinoleiloksi-N,N-dimetil-3-aminopropan (DLinDMA). U jednom primeru izvođenja, RNK u skladu sa predmetnim učenjem prisutna je u formulaciji lipozoma kao što je opisano u WO 2012/006378 A1: lipozom ima lipidni dvosloj koji inkapsulira vodeno jezgro uključujući RNK, pri čemu lipidni dvosloj sadrži lipid sa pKa u opsegu od 5,0 do 7,6, koji poželjno ima tercijarnu amino grupu. Poželjni katjonski lipidi sa tercijarnom amino grupom uključuju DLinDMA (pKa 5,8) i generalno su opisani u WO 2012/031046 A2. U skladu sa WO 2012/031046 A2, lipozomi koji sadrže respektivno jedinjenje su posebno pogodni za inkapsulaciju RNK i stoga lipozomsku isporuku RNK. U jednom primeru izvođenja, RNK u skladu sa predmetnim učenjem prisutna je u formulaciji lipozoma, pri čemu lipozom uključuje najmanje jedan katjonski lipid čija glavena grupa uključuje najmanje jedan atom azota (N) koji je sposoban da bude protonovan, pri čemu lipozom i RNK imaju N:P odnos između 1:1 i 20:1. U skladu sa predmetnim učenjem, "N:P odnos" označava molski odnos atoma azota (N) u katjonskom lipidu prema atomima fosfata (P) u RNK koja je sadržana u česticama koje sadrže lipide (npr. lipozom), kao što je opisano u WO 2013/006825 A1. N:P odnos između 1:1 i 20:1 je uključen u neto naelektrisanje lipozoma i u efikasnost isporuke RNK u ćeliju vertebrata.
[0329] U jednom primeru izvođenja, RNK u skladu sa predmetnim učenjem prisutna je u formulaciji lipozoma koja sadrži najmanje jedan lipid koji uključuje polietilen glikol (PEG) deo, pri čemu je RNK inkapsulirana unutar PEGilovanog lipozoma tako da je PEG deo prisutan na spoljašnjosti lipozoma, kao što je opisano u WO 2012/031043 A1 i WO 2013/033563 A1.
[0330] U jednom primeru izvođenja, RNK u skladu sa predmetnim učenjem prisutna je u formulaciji lipozoma, pri čemu lipozom ima prečnik u opsegu od 60-180 nm, kao što je opisano u WO 2012/030901 Al.
[0331] U jednom primeru izvođenja, RNK u skladu sa predmetnim učenjem prisutna je u formulaciji lipozoma, pri čemu lipozomi koji sadrže RNK imaju neto naelektrisanje blizu nule ili negativno, kao što je objavljeno u WO 2013/143555 Al.
[0332] U drugim primerima izvođenja, RNK u skladu sa predmetnim učenjem prisutna je u obliku emulzije. Prethodno je opisano da se emulzije upotrebljavaju za isporuku molekula nukleinskih kiselina, kao što su molekuli RNK, ćelijama. Ovde su poželjne ulje u vodi emulzije. Respektivne čestice emulzije sadrže uljano jezgro i katjonski lipid. Poželjnije su katjonske ulje u vodi emulzije u kojima je RNK u skladu sa predmetnim učenjem kompleksovana sa česticama emulzije. Čestice emulzije sadrže uljano jezgro i katjonski lipid. Katjonski lipid može da interaguje sa negativno naelektrisanom RNK, time privezujući RNK za čestice emulzije. U ulje u vodi emulziji, čestice emulzije su dispergovane u vodenoj kontinuiranoj fazi. Na primer, prosečan prečnik čestica emulzije može tipično biti od oko 80 nm do 180 nm. U jednom primeru izvođenja, farmaceutska kompozicija iz predmetnog učenja je katjonska ulje u vodi emulzija, pri čemu čestice emulzije sadrže uljano jezgro i katjonski lipid, kao što je opisano u WO 2012/006380 A2. RNK u skladu sa predmetnim učenjem može biti prisutna u obliku emulzije koja sadrži katjonski lipid, pri čemu je N:P odnos emulzije najmanje 4:1, kao što je opisano u WO 2013/006834 A1. RNK u skladu sa predmetnim učenjem može biti prisutna u obliku emulzije katjonskih lipida, kao što je opisano u WO 2013/006837 A1. Posebno, kompozicija može sadržati RNK kompleksovanu sa česticom katjonske ulje u vodi emulzije, pri čemu je odnos ulje/lipid najmanje oko 8:1 (mol:mol).
[0333] U drugim primerima izvođenja, farmaceutska kompozicija u skladu sa učenjem sadrži RNK u formatu lipopleksa. Termin "lipopleks" ili "RNK lipopleks" označava kompleks lipida i nukleinskih kiselina kao što je RNK. Lipopleksi se mogu formirati od katjonskih (pozitivno naelektrisanih) lipozoma i anjonske (negativno naelektrisane) nukleinske kiseline. Katjonski lipozomi mogu takođe uključivati neutralni "pomoćni" lipid. U najjednostavnijem slučaju, lipopleksi se formiraju spontano mešanjem nukleinske kiseline sa lipozomima sa određenim
1
protokolom mešanja, međutim mogu se primeniti različiti drugi protokoli. Podrazumeva se da su elektrostatičke interakcije između pozitivno naelektrisanih lipozoma i negativno naelektrisane nukleinske kiseline pokretačka snaga za formiranje lipopleksa (WO 2013/143555 A1). U jednom primeru izvođenja predmetnog učenja, neto naelektrisanje čestica RNK lipopleksa je blizu nule ili je negativno. Poznato je da elektro-neutralni ili negativno naelektrisani lipopleksi RNK i lipozomi dovode do značajne ekspresije RNK u dendritskim ćelijama (DC) slezine posle sistemske primene i nisu povezani sa povišenom toksičnošću koja je saopštena za pozitivno naelektrisane lipozome i lipoplekse (up. WO 2013/143555 A1). Prema tome, u jednom primeru izvođenja predmetnog učenja, farmaceutska kompozicija u skladu sa učenjem sadrži RNK u formatu nanočestica, poželjno nanočestica lipopleksa, u kojima (i) broj pozitivnih naelektrisanja u nanočesticama ne prelazi broj negativnih naelektrisanja u nanočesticama i/ili (ii) nanočestice imaju neutralno ili neto negativno naelektrisanje i/ili (iii) odnos naelektrisanja pozitivnih naelektrisanja prema negativnim naelektrisanjima u nanočesticama je 1,4:1 ili manji i/ili (iv) zeta potencijal nanočestica je 0 ili manji. Kao što je opisano u WO 2013/143555 A1, zeta potencijal je naučni termin za elektrokinetički potencijal u koloidnim sistemima. U predmetnom učenju, (a) zeta potencijal i (b) odnos naelektrisanja katjonskog lipida prema RNK u nanočesticama mogu se izračunati kao što je objavljeno u WO 2013/143555 A1. Ukratko, farmaceutske kompozicije koje su formulacije nanočestica lipopleksa sa definisanom veličinom čestica, pri čemu je neto naelektrisanje čestica blizu nule ili je negativno, kao što je objavljeno u WO 2013/143555 A1, su poželjne farmaceutske kompozicije u kontekstu predmetnog učenja.
Postupci za proizvodnju proteina
[0334] U četvrtom aspektu, učenje obezbeđuje postipak za proizvodnju proteina u ćeliji koji sadrži korake:
(a) dobijanje RNK konstrukta za ekspresiju alfavirusne replikaze,
(b) dobijanje RNK replikona koji se može replicirati pomoću replikaze in trans i sadrži otvoreni okvir čitanja koji kodira protein, i
(c) ko-inokulisanje RNK konstrukta za ekspresiju alfavirusne replikaze i RNK replikona u ćeliju,
2
pri čemu RNK konstrukt za ekspresiju alfavirusne replikaze sadrži 5'-kapu za pokretanje translacije replikaze.
[0335] RNK konstrukt za ekspresiju alfavirusne replikaze u skladu sa (a) može se okarakterisati pomoću bilo kog jednog ili više svojstava replikaznog konstrukta sadržanog u sistemu u skladu sa prvim aspektom predmetnog učenja.
[0336] RNK replikon u skladu sa (b) može se okarakterisati pomoću bilo kog jednog ili više svojstava replikona sadržanog u sistemu u skladu sa prvim aspektom predmetnog učenja.
[0337] U jednom primeru izvođenja, RNK konstrukt za ekspresiju alfavirusne replikaze u skladu sa (a) i RNK replikon u skladu sa (b) koji se upotrebljavaju u postupku za proizvodnju proteina u ćeliji su sastavni delovi sistema u skladu sa predmetnim učenjem.
[0338] Ćelija u koju se može inokulisati jedan ili više nukleinskih molekula može se označiti kao "ćelija domaćin". U skladu sa učenjem, termin "ćelija domaćin" označava bilo koju ćeliju koja se može transformisati ili transfektovati sa egzogenim molekulom nukleinske kiseline. Termin "ćelija" je poželjno intaktna ćelija, tj. ćelija sa intaktnom membranom koja nije oslobodila svoje normalne unutarćelijske komponente kao što su enzimi, organele, ili genetički materijal. Intaktna ćelija je poželjno vijabilna ćelija, tj. živa ćelija sposobna da obavlja svoje normalne metaboličke funkcije. Termin "ćelija domaćin" sadrži, u skladu sa učenjem, prokariotske (npr. E. coli) ili eukariotske ćelije (npr. humane i životinjske ćelije, i ćelije insekata). Posebna prednost se daje ćelijama sisara, kao što su ćelije ljudi, miševa, hrčaka, svinja, pripitomljenih životinja uključujući konje, krave, ovce i koze, kao i primata. Ćelije mogu biti poreklom iz više tipova tkiva i sadrže primarne ćelije i ćelijske linije. Specifični primeri uključuju keratinocite, leukocite periferne krvi, matične ćelije kostne srži i embrionalne matične ćelije. U drugim primerima izvođenja, ćelija domaćin je antigen prezentujuća ćelija, posebno dendritska ćelija, monocit ili makrofag. Nukleinska kiselina može biti prisutna u ćeliji domaćinu u jednoj ili u više kopija i, u jednom primeru izvođenja eksprimira se u ćeliji domaćinu.
[0339] Ćelija može biti prokariotska ćelija ili eukariotska ćelija. Prokariotske ćelije su pogodne ovde, npr. za propagaciju DNK u skladu sa učenjem, i eukariotske ćelije su pogodne ovde, npr. za ekspresiju otvorenog okvira čitanja replikona.
[0340] U postupku iz predmetnog učenja može se upotrebljavati bilo koji sistem u skladu sa učenjem, ili komplet u skladu sa učenjem, ili farmaceutska kompozicija u skladu sa učenjem. RNK se može upotrebljavati u obliku farmaceutske kompozicije, ili kao gola RNK, npr. za elektroporaciju. Inokulacija kompozicija koje sadrže RNK u ćelije, kao i elektroporacija gole RNK u ćelije su prethodno opisane (videti reference koje su citirane ovde u odeljku koji opisuje farmaceutske kompozicije u skladu sa predmetnim učenjem).
[0341] U skladu sa postupkom iz predmetnog učenja, može se postići efikasna ekspresija gena od interesa u ćeliji domaćinu (videti npr. Primere 1 i 2).
[0342] U postupku za proizvodnju proteina u ćeliji u skladu sa predmetnim učenjem, različiti molekuli RNK u skladu sa prvim aspektom (replikon i replikazni konstrukt) mogu se inokulisati bilo u istoj vremenskoj tački, ili se alternativno mogu inokulisati u različitim vremenskim tačkama. U drugom slučaju, replikazni konstrukt se tipično inokuliše u prvoj vremenskoj tački, i replikon se tipično inokuliše u drugoj, kasnijoj vremenskoj tački. U tom slučaju, predviđeno je da se replikon odmah replicira pošto je replikaza već translatirana u ćeliji. Druga vremenska tačka je tipično kratko posle prve vremenske tačke, npr. 1 minut do 24 sata posle prve vremenske tačke.
[0343] U jednom primeru izvođenja, dopunski molekul RNK, poželjno molekul iRNK, može se inokulisati u ćeliju. Opciono, dopunski molekul RNK kodira protein pogodan za inhibiranje IFN, kao što je E3, kao što je ovde opisano. Opciono, dopunski molekul RNK može biti inokulisan pre inokulacije replikona ili replikaznog konstrukta ili sistema u skladu sa učenjem.
[0344] U postupku za proizvodnju proteina u ćeliji u skladu sa predmetnim učenjem, ćelija može biti antigen prezentujuća ćelija, i postupak se može upotrebljavati za ekspresiju RNK koja kodira antigen. U tu svrhu, učenje može uključivati introdukciju RNK koja kodira antigen u antigen prezentujuće ćelije, kao što su dendritske ćelije. Za transfekciju antigen prezentujućih ćelija, kao što su dendritske ćelije, može se upotrebljavati farmaceutska kompozicija koja sadrži RNK koja kodira antigen.
[0345] U jednom primeru izvođenja, postupak za proizvodnju proteina u ćeliji je in vitro postupak. U jednom primeru izvođenja, postupak za proizvodnju proteina u ćeliji ne sadrži uklanjanje ćelije iz humanog ili životinjskog subjekta operacijom ili terapijom.
[0346] U ovom primeru izvođenja, ćelija inokulisana u skladu sa četvrtim aspektom učenja može se primeniti subjektu tako da proizvede protein u subjektu i da obezbedi subjektu protein. Ćelija može biti autologna, singena, alogena ili heterologna u odnosu na subjekt.
[0347] U sledećem primeru izvođenja, ćelija u postupku za proizvodnju proteina u ćeliji može biti prisutna u subjektu, kao što je pacijent. U ovom primeru izvođenja, postupak za proizvodnju proteina u ćeliji je in vivo postupak koji sadrži primenu molekula RNK subjektu.
[0348] S tim u vezi, učenje takođe obezbeđuje postupak za proizvodnju proteina u subjektu koji sadrži korake:
4
(a) dobijanje RNK konstrukta za ekspresiju alfavirusne replikaze,
(b) dobijanje RNK replikona koji se može replicirati pomoću replikaze in trans i sadrži otvoreni okvir čitanja koji kodira protein, i
(c) primenu RNK konstrukta za ekspresiju alfavirusne replikaze i RNK replikona subjektu,
pri čemu RNK konstrukt za ekspresiju alfavirusne replikaze sadrži 5'-kapu za pokretanje translacije replikaze.
[0349] RNK konstrukt za ekspresiju alfavirusne replikaze u skladu sa (a) može se okarakterisati pomoću bilo kog jednog ili više svojstava replikaznog konstrukta sadržanog u sistemu u skladu sa prvim aspektom predmetnog učenja. RNK konstrukt u skladu sa (a) može se dobiti npr. kao što je ovde opisano.
[0350] RNK replikon u skladu sa (b) može se okarakterisati pomoću bilo kog jednog ili više svojstava replikona sadržanog u sistemu u skladu sa prvim aspektom predmetnog učenja. Poželjno, replikon u skladu sa (b) kodira farmaceutski aktivan peptid ili protein kao protein od interesa. U jednom primeru izvođenja, farmaceutski aktivan peptid ili protein je imunski aktivno jedinjenje ili antigen. RNK replikon u skladu sa (b) može se dobiti npr. kao što je ovde opisano. Postupak za proizvodnju proteina u subjektu u skladu sa premetnim učenjem je posebno pogodan za profilaktičke, kao i za terapijske primene. Poželjno, u postupku za proizvodnju proteina u subjektu, RNK replikon kodira, kao gen od interesa, farmaceutski aktivan protein ili polipeptid.
[0351] U postupku za proizvodnju proteina u subjektu, RNK replikaznog konstrukta u skladu sa (a) i replikon u skladu sa (b) mogu se primeniti bilo u istoj vremenskoj tački, ili se alternativno mogu primeniti u različitim vremenskim tačkama. U drugom slučaju, replikazni konstrukt u skladu sa (a) se tipično primenjuje u prvoj vremenskoj tački, i replikon u skladu sa (b) se tipično primenjuje u drugoj, kasnijoj vremenskoj tački. U tom slučaju, predviđeno je da se replikon odmah replicira pošto je replikaza već translatirana u ćeliji. Druga vremenska tačka je tipično kratko posle prve vremenske tačke, npr. 1 minut do 24 sata posle prve vremenske tačke. Poželjno je da se primena replikona vrši na istom mestu i istim putem primene kao i primena replikaznog konstrukta, kako bi se povećali izgledi da replikon i replikazni konstrukt dopru do istog ciljnog tkiva ili ćelije. "Mesto" označava poziciju na telu subjekta. Pogodna mesta su, na primer, leva ruka, desna ruka, itd.
[0352] U jednom primeru izvođenja, dopunski molekul RNK, poželjno molekul iRNK, može se primeniti subjektu. Opciono, dopunski molekul RNK kodira protein pogodan za inhibiranje IFN, kao što je E3, kao što je ovde opisano. Opciono, dopunski molekul RNK može se primeniti pre primene replikona ili replikaznog konstrukta ili sistema u skladu sa učenjem.
[0353] Bilo koji sistem u skladu sa učenjem, ili komplet u skladu sa učenjem, ili farmaceutska kompozicija u skladu sa učenjem mogu se upotrebljavati u postupku za proizvodnju proteina u subjektu u skladu sa učenjem. Na primer, u postupku iz učenja, RNK se može upotrebljavati u formatu farmaceutske kompozicije, npr. kao što je ovde opisano, ili kao gola RNK. Primena farmaceutskih kompozicija koje sadrže RNK je prethodno opisana, videti npr. reference koje su ovde citirane u odeljku koji opisuje farmaceutske kompozicije u skladu sa predmetnim učenjem.
[0354] S obzirom na oblik koji će se primenizi subjektu, svaki sistem u skladu sa učenjem, ili komplet u skladu sa učenjem, ili farmaceutska kompozicija u skladu sa učenjem, mogu se označiti kao "medikament", ili slično. Predmetno učenje predviđa da se sistem, komplet, i/ili farmaceutska kompozicija, iz predmetnog učenja obezbede za upotrebu kao medikament. Medikament se može upotrebljavati za lečenje subjekta. Pod "lečenje" se podrazumeva primena subjektu jedinjenja ili kompozicije ili drugog entiteta, kao što je ovde opisano. Termin uključuje postupke za lečenje tela čoveka ili životinje pomoću terapije.
[0355] Prethodno opisani medikament tipično ne sadrži DNK, i stoga je povezan sa dopunskim bezbednosnim svojstvima u poređenju sa DNK vakcinama opisanim u stanju tehnike (npr. WO 2008/119827 A1).
[0356] Alternativna medicinska upotreba u skladu sa predmetnim učenjem sadrži postupak za proizvodnju proteina u ćeliji u skladu sa četvrtim aspektom predmetnog učenja, pri čemu ćelija može biti antigen prezentujuća ćelija, kao što je dendritska ćelija, nakon čega sledi introdukcija navedene ćelije subjektu. Na primer, sistem koji sadrži replikon koji kodira farmaceutski aktivan protein, kao što je antigen, može se introdukovati (transfektovati) u antigen prezentujuće ćelije ex vivo, npr. antigen prezentujuće ćelije uzete iz subjekta, i antigen prezentujuće ćelije, opciono klonalno propagirane ex vivo, mogu se reintrodukovati u istog ili drugog subjekta. Transfektovane ćelije se mogu reintrodukovati u subjekta upotrebom bilo kog načina poznatog u struci.
[0357] Medikament u skladu sa predmetnim učenjem može se primeniti subjektu kome je to potrebno. Medikament iz predmetnog učenja može se upotrebljavati u profilaktičkim, kao i u terapijskim postupcima lečenja subjekta.
[0358] Medikament u skladu sa učenjem primenjuje se u efikasnoj količini. "Efikasna količina" se tiče količine koja je dovoljna, sama ili zajedno sa drugim dozama, da uzrokuje reakciju ili željeni efekat. U slučaju lečenja određene bolesti ili određenog stanja kod subjekta, željeni efekat je inhibicija progresije bolesti. Ovo uključuje usporavanje progresije bolesti, posebno prekid progresije bolesti. Željeni efekat u lečenju bolesti ili stanja može takođe biti odlaganje izbijanja bolesti ili inhibicija izbijanja bolesti.
[0359] Efikasna količina zavisiće od stanja koje se leči, težine bolesti, individualnih parametara pacijenta, uključujući starost, fiziološko stanje, veličinu i težinu, trajanja lečenja, vrste prateće terapije (ukoliko postoji), specifičnog načina primene i drugih faktora.
Vakcinacija
[0360] Termin "imunizacija" ili "vakcinacija" se generalno odnosi na postupak lečenja subjekta iz terapijskih ili profilaktičkih razloga. Lečenje, posebno profilaktičko lečenje, je ili poželjno sadrži lečenje koje ima za cilj da indukuje ili pojača imunski odgovor subjekta, npr. prema jednom ili više antigena. Ukoliko je, u skladu sa predmetnim učenjem, poželjno da se indukuje ili pojača imunski odgovor upotrebom RNK kao što je ovde opisano, imunski odgovor može biti aktiviran ili pojačan pomoću RNK. U jednom primeru izvođenja, učenje obezbeđuje profilaktičko lečenje koje je ili poželjno sadrži vakcinaciju subjekta. Primer izvođenja predmetnog učenja pri čemu replikon kodira, kao protein od interesa, farmaceutski aktivan peptid ili protein koji je imunski aktivno jedinjenje ili antigen je posebno koristan za vakcinaciju.
[0361] RNK je ranije opisana za vakcinaciju prema stranim agensima, uključujući patogene ili kancer (nedavno su pregledno prikazali Ulmer et al., 2012, Vaccine, vol. 30, pp. 4414-4418). Za razliku od uobičajenih pristupa u stanju tehnike, replikon u skladu sa predmetnim učenjem je posebno pogodan element za efikasnu vakcinaciju zbog sposobnosti da se replicira in trans pomoću replikaze kodirane replikaznim konstruktom iz predmetnog učenja. Vakcinacija u skladu sa predmetnim učenjem može se upotrebljavati, na primer, za indukovanje imunskog odgovora na slabo imunogene proteine. U slučaju RNK vakcina u skladu sa učenjem, proteinski antigen nikada nije izložen serumskim antitelima, već ga proizvode same transfektovane ćelije posle translacije RNK. Prema tome anafilaksa ne bi trebalo da bude problem. Učenje prema tome dozvoljava ponovljenu imunizaciju pacijenta bez rizika od alergijskih reakcija.
[0362] Primer 5 iz predmetnog učenja čini izvodljivim da replikon koji sadrži transgen dostiže veliki broj kopija kod vakcinisanih životinja, što je evidentno iz vrlo snažne ekspresije rekombinantnog proteina. Primer 6 svedoči da je vakcinacija u skladu sa predmetnim učenjem, pri čemu replikon kodira terapijski protein, veoma efikasna. Stoga, predmetno učenje omogućava efikasnu vakcinaciju trans-replikacionim RNK sistemom zasnovanim na alfavirusu.
[0363] U postupcima koji uključuju vakcinaciju u skladu sa predmetnim učenjem, medikament iz predmetnog učenja primenjuje se subjektu, posebno je poželjan ukoliko se leči subjekt koji ima bolest koja uključuje antigen ili je u riziku da se razboli od bolesti koja uključuje antigen.
[0364] U postupcima koji uključuju vakcinaciju u skladu sa predmetnim učenjem, protein od interesa kodiran replikonom u skladu sa predmetnim učenjem kodira na primer za bakterijski antigen, prema kome treba usmeriti imunski odgovor, ili za virusni antigen, prema kome treba usmeriti imunski odgovor, ili za antigen kancera, prema kome treba usmeriti imunski odgovor, ili za antigen jednoćelijskog organizma, prema kome treba usmeriti imunski odgovor. Efikasnost vakcinacije se može proceniti poznatim standardnim postupcima, kao što je merenje antigen-specifičnih IgG antitela iz organizma. U postupcima koji uključuju imunoterapiju specifičnu za alergen u skladu sa predmetnim učenjem, protein od interesa kodiran replikonom u skladu sa predmetnim učenjem kodira za antigen relevantan za alergiju. Imunoterapija specifična za alergen (poznata i kao hiposenzibilizacija) definiše se kao primena poželjno rastućih doza vakcine protiv alergena organizmu sa jednom ili više alergija, kako bi se postiglo stanje u kojem se simptomi koji su povezani sa naknadnim izlaganjem uzročnom alergenu ublažavaju. Efikasnost imunoterapije specifične za alergen može se proceniti poznatim standardnim postupcima, kao što je merenje alergen-specifičnih IgG i IgE antitela iz organizma.
[0365] Medikament iz predmetnog učenja može se primeniti subjektu, npr. za lečenje subjekta, uključujući vakcinaciju subjekta.
[0366] Termin "subjekt" odnosi se na vertebrate, posebno sisare. Na primer, sisari u kontekstu predmetnog učenja su ljudi, ne-humani primati, pripitomljeni sisari kao što su psi, mačke, ovce, goveda, koze, svinje, konji itd., laboratorijske životinje kao što su miševi, pacovi, zečevi, zamorci itd. kao i životinje u zatočeništvu kao što su životinje iz zooloških vrtova. Termin "subjekt" takođe se odnosi na ne-sisarske vertebrate, kao što su ptice (posebno pripitomljene ptice kao što su kokoške, patke, guske, ćurke) i na ribu (posebno uzgajanu ribu, npr. losos ili som). Termin "životinja" kao što se ovde upotrebljava takođe uključuje ljude.
[0367] Primena pripitomljenim životinjama kao što su psi, mačke, zečevi, zamorci, hrčci, ovce, goveda, koze, svinje, konji, kamile, kokoške, patke, guske, ćurke, ili divlje životinje, npr. lisice, jeleni, srne, divlje svinje, poželjna je u nekim primerima izvođenja. Na primer, profilaktička vakcinacija u skladu sa predmetnim učenjem može biti pogodna za vakcinaciju populacije životinja, npr. u poljoprivrednoj industriji, ili populacije divljih životinja. Druge populacije životinja u zatočeništvu, kao što su kućni ljubimci, ili životinje iz zooloških vrtova, mogu biti vakcinisane.
[0368] Kada se primenjuje subjektu, replikon i/ili replikazni konstrukt koji se upotrebljavaju kao medikament poželjno ne sadrže sekvence iz tipa alfavirusa koji je infektivan za vrstu ili rod kome lečeni subjekt pripada. Poželjno, u tom slučaju replikon i/ili replikazni konstrukt ne sadrže bilo koju nukleotidnu sekvencu iz alfavirusa koja može inficirati respektivnu vrstu ili rod. Ovaj primer izvođenja ima prednost zato što nije moguća rekombinacija sa infektivnim (npr. potpuno funkcionalnim ili divljeg tipa) alfavirusom, čak i ukoliko je subjekt kome se primenjuje RNK (npr. slučajno) pogođen infektivnim alfavirusom. Kao ilustrativan primer, za lečenje svinja, replikon i/ili replikazni konstrukt koji se upotrebljavaju ne sadrže bilo koju nukleotidnu sekvencu iz alfavirusa koja može inficirati svinje.
Način primene
[0369] Medikament u skladu sa predmetnim učenjem može se primeniti subjektu bilo kojim odgovarajućim putem.
[0370] Na primer, medikament se može primeniti sistemski, na primer intravenski (i.v.), subkutano (s.c.), intradermalno (i.d.) ili pomoću inhalacije.
[0371] U jednom primeru izvođenja, medikament u skladu sa predmetnim učenjem se primenjuje u mišićno tkivo, kao što su skeletni mišići, ili kožu, npr. subkutano. Generalno se razume da transfer RNK u kožu ili mišiće dovodi do visoke i održive lokalne ekspresije, paralelno sa snažnom indukcijom humoralnih i ćelijskih imunskih odgovora (Johansson et al.
2012, PLoS. One., 7, e29732; Geall et. al., 2012, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., vol.109, pp.
14604-14609).
[0372] Alternative za primenu u mišićno tkivo ili kožu uključuju, ali nisu ograničene na: intradermalnu, intranazalnu, intraokularnu, intraperitonealnu, intravensku, intersticijsku, bukalnu, transdermalnu, ili sublingvalnu primenu. Intradermalna i intramuskularna primena su dva poželjna puta.
[0373] Primena se može postići na različite načine. U jednom primeru izvođenja, medikament u skladu sa predmetnim učenjem primenjuje se injekcijom. U poželjnom primeru izvođenja, injekcija se vrši putem igle. Alternativno se može upotrebljavati injekcija bez igle.
[0374] Predmetno učenje je detaljno opisano i ilustrovano pomoću sledećih slika i primera.
Primeri
Materijal i postupci
[0375] Sledeći materijali i postupci su upotrebljavani u primerima koji su opisani u nastavku.
DNK koja kodira replikon, replikazni konstrukt i E3L; i in vitro transkripcija
[0376]
(1) DNK koja kodira cis-replikon upotrebljen u primerima pripremljena je na sledeći način: pripremljen je DNK plazmid pogodan za in vitro transkripciju RNK replikona koji je sposoban da se replicira pomoću replikaze virusa Semliki šume (SFV): Referentni replikon plazmid virusa Semliki šume (pSFV-gen-GFP) ljubazno je obezbedio K. Lundstrom (Lundstrom et al., 2001, Histochem. Cell Biol., vol. 115, pp.
83-91; Ehrengruber & Lundstrom, 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., vol. 96, pp.
7041-7046). Poli(A) kaseta kodirana od strane pSFV-gen-GFP je produžena sa 62 adenilatnih ostataka u originalnom vektoru na 120 adenilatnih ostataka, i SapI restrikciono mesto postavljeno je neposredno nizvodno od poli(A) kasete. Ovaj poli(A) dizajn je opisan da pojačava ekspresiju sintetičke iRNK (Holtkamp et al., 2006, Blood, vol. 108, pp. 4009-4017). Na kraju je promotor fag-polimeraze promenjen sa SP6 na T7.
(2) DNK koje kodiraju trans-replikone su projektovane iz prethodno opisanog cisreplikona delecijom glavnih delova otvorenog okvira čitanja koji kodira alfavirusnu replikazu (nukleotidi 222-6321 ORF replikaze) uz zadržavanje vektorske okosnice. (1a, 2a) Mi smo nezavisno klonirali reporterske gene luciferaze svica, sekretabilne NanoLuc (oba komercijalizovana od strane Promega, Madison, WI, SAD), influenca virus A/Portoriko/08/1934 hemaglutinin (HA) i pojačani zeleni fluorescentni protein (eGFP, na slikama bilo "GFP" ili "eGFP") 3' na subgenomski promotor cis- i transreplikona.
(3) Kako bi se kreirao replikazni konstrukt, otvoreni okvir čitanja koji kodira SFV replikazu kloniran je u pST1 plazmid koji karakteriše tandem kopija humanog betaglobin 3'UTR, poli(A120) rep i SapI restrikciono mesto neposredno nizvodno od poli(A) repa (Holtkamp et al., 2006, Blood, vol.108, pp.4009-4017).
(4) Otvoreni okvir čitanja koji kodira E3L Vaccinia virus kloniran je u pST1 plazmid koji karakteriše tandem kopija humanog beta-globin 3'UTR, poli(A120) rep i SapI restrikciono mesto neposredno nizvodno od poli(A) repa (Holtkamp et al., 2006, Blood, vol. 108, pp.4009-4017).
[0377] In vitro transkripcija iz plazmida poreklom iz pST1 i pSFV-gen-GFP [(1a), (2a), (3) i (4)] i prečišćavanje RNK izvedeno je kao što je prethodno opisano, sa izuzetkom da je beta-S-ARCA(D2) analog kape upotrebljen umesto ARCA (Holtkamp et al., supra; Kuhn et al., 2010, Gene Ther., vol. 17, pp. 961-971). Kvalitet prečišćene RNK procenjen je pomoću spektrofotometrije, i analize na 2100 BioAnalyzer (Agilent, Santa Clara, SAD). RNK koja je upotrebljena u primerima je prečišćena IVT-RNK.
Transfer RNK u ćelije:
[0378] Za elektroporaciju, RNK je elektroporisana u ćelije na sobnoj temperaturi upotrebom uređaja za elektroporaciju kvadratnog talasa (BTX ECM 830, Harvard Apparatus, Holliston, MA, SAD) upotrebom sledećih postavki: 750 V/cm, 1 impuls od 16 milisekundi (ms). Za elektroporaciju, RNK je resuspendovana u krajnjoj zapremini od 62,5 μl/mm veličine praznine kivete.
[0379] Lipofekcije RNK su izvedene upotrebom Lipofektamin RNAiMAX prateći uputstva proizvođača (Life Technologies, Darmstadt, Nemačka). Ćelije su postavljene na približno 20.000 ćelija/cm<2>površine za rast i transfektovane sa ukupnom količinom od 260 ng/cm<2>RNK i 1 μl/cm<2>RNAiMAX. RNK vrste su pomešane u Ependorf (Eppendorf) tubama bez RNAze i držane na ledu sve dok nisu upotrebljene za transfekciju.
[0380] Ćelijska kultura: Sve medijume za rast, fetalni teleći serum (FCS), antibiotike i druge suplemente isporučila je kompanija Life Technologies/Gibco, osim ukoliko nije drugačije
1
navedeno. Fibroblasti ljudskog prepucijuma dobijeni iz System Bioscience (HFF, neonatalni) ili ATCC (CCD-1079Sk) su uzgajani u minimalnim esencijalnim medijumima (MEM) koji sadrže 15% FCS, 1 jedinicu/ml penicilina, 1 μg/ml streptomicina, 1% neesencijalnih aminokiselina, 1 mM natrijum piruvata na 37 °C. Ćelije su uzgajane na 37 °C u vlažnoj atmosferi uravnoteženoj sa 5% CO2. BHK21 ćelije (ATCC; CCL10) su uzgajane u Iglovom (Eagle) minimalnom esencijalnom medijumu suplementovanom sa 10% FCS.
[0381] Protočna citometrija: Osim ukoliko nije drugačije naznačeno, transfektovane ćelije su sakupljene 16 h posle transfekcije radi merenja efikasnosti produktivnih transfekcija i transgene (eGFP) ekspresije pomoću protočne citometrije (FACS). Merenje je izvedeno pomoću protočne citometrije upotrebom FACS Canto II protočnog citometra (BD Bioscience, Heidelberg, Nemačka), i prikupljeni podaci su analizirani odgovarajućim Diva softverom ili FlowJo softverom (Tree Star Inc., Ashland, OR, SAD).
[0382] Testovi luciferaze: Kako bi se procenila ekspresija luciferaze u transfektovanim ćelijama, transfektovane ćelije su zasejane u bele mikroploče sa 96 bunarića (Nunc, Langenselbold, Nemačka). Detekcija luciferaze svica je izvedena sa Bright-Glo Luciferase Assay System; NanoLuc je detektovana upotrebom NanoGlo kompleta (oba Promega, Madison, WI, SAD) u skladu sa uputstvima proizvođača. Bioluminiscencija je izmerena upotrebom čitača luminescencije mikroploča Infinite M200 (Tecan Group, Männedorf, Švajcarska). Podaci su predstavljeni u relativnim jedinicama luciferaze [RLU]. Luciferazanegativne ćelije su upotrebljene za oduzimanje pozadinskog signala.
[0383] Životinje: Balb/c miševi, starosti 6-8 nedelja, kupljeni su od Janvier LABS (Saint Berthevin Cedex, Francuska) i smešteni u normalnim laboratorijskim uslovima sa cirkadijalnim ciklusima svetlo/mrak i slobodnim pristupom standardnoj hrani za miševe i česmenskoj vodi. Sve eksperimente je odobrio Etički komitet Regionalnog saveta za eksperimente na životinjama (Koblenz/Rhineland-Palatinate, Nemačka, G 13-8-063).
[0384] Proizvodnja influenca virusa i određivanje titra. Za infekciju, Madin-Darby ćelije psećeg bubrega II (MDCK-II) kultivisane su u MEM koji sadrži 0,2% goveđeg serumskog albumina (30% BSA naročito bez IgG; Sigma) umesto FCS (medijum za infekciju). Mišu prilagođen influenca virus A/Portoriko/08/1934 propagiran je u MDCK-II ćelijama u medijumu za infekciju koji sadrži 1 μg/ml tozilsulfonil fenilalanil hlormetil keton (TPCK)-tripsina (Sigma). Ćelijski supernatanti su očišćeni centrifugiranjem pri niskim brzinama i uskladišteni na -80 °C. Titri virusa (jedinice za formiranje plaka (PFU) po ml) određeni su testom plaka upotrebom monoslojeva MDCK-II ćelija od 70-80% konfluence (ploča sa 12 bunarića). Ćelije su inokulisane sa 200 μl serijskog 10-strukog razblaženja virusnih preparata
2
(10<-2>do 10<-8>). Virusu je omogućeno da adsorbuje tokom 1 h na 37 °C, pre nego što su ćelije prekrivene Avicel medijumom niske viskoznosti kako bi se redukovala difuzija virusa i omogućilo stvaranje plaka. 2,4% rastvor Avicela je razblažen sa 2xMEM/1 μg/ml TPCK-tripsina kako bi se postigla krajnja koncentracija Avicela od 1,2%. Tri dana kasnije uklonjeni su prekrivni slojevi i ćelije su obojene upotrebom 1% vodenog rastvora kristal ljubičaste koji sadrži 10% formaldehid (10 min na RT). Obojene ćelije su isprane vodom, prebrojani su plakovi po bunariću i izračunat je PFU/ml.
[0385] Titar hemaglutinacije (HA titar): Jedinice hemaglutinacije (HAU) su određene upotrebom pilećih crvenih krvnih zrnaca (RBC; Fitzgerald, SAD) u skladu sa preporukama koje je SZO publikovala 2011. godine u "Priručniku za laboratorijsku dijagnostiku i virološki nadzor influence" ("Manual for the laboratory diagnosis and virological surveillance of influenza"). Ukratko, izvedeno je serijsko razblaživanje virusnih preparata (2-struko) u pločama sa 96 bunarića u obliku slova V, i zatim su inkubirani sa 50 μl 0,5% pilećih RBC ("standardizovana RBC") tokom 30 minuta na 25 °C. Smatralo se da je hemaglutinacija potpuna, kada su RBC još uvek bila u suspenziji posle inkubacije sa virusnim preparatom, dok su se neaglutinirana RBC slegla na dno bunarića. HA titar je zabeležen kao inverzija najnižeg razblaženja koje je pokazalo potpunu aglutinaciju i definisan je kao jedna jedinica hemaglutinacije (HAU) na 50 μl, količina virusa koja je neophodna za aglutinaciju jednake zapremine standardizovanih RBC.
[0386] Test inhibicije hemaglutinacije (HAI). Kako bi se odredio nivo u serumu anti-HA antitela koja inhibiraju hemaglutinaciju kod imunizovanih miševa, serumi su sakupljeni i tretirani preko noći sa enzimom koji uništava receptore II "Seiken" u odnosu 1:5 (RDE (II), Denka Seiken Co. Ltd., Japan), praćeno inaktivacijom toplotom tokom 30 min. na 56 °C. Serumi su upotrebljeni u duplikatima i izvedena su serijska razblaženja (1:2) pre dodavanja 25 μl razblaženja virusa PR8 (4 HAU/50 μl). Posle 15 min inkubacije na sobnoj temperaturi, dodato je 50 μl 0,5% RBC i smeša je inkubirana tokom 30 minuta pre procene aglutinacije. HAI titar je zabeležen kao inverzija najnižeg razblaženja koje je inhibiralo aglutinaciju (HAI/50 μl).
[0387] Određivanje titra za neutralizaciju virusa (VNT): Za određivanje titra antitela za neutralizovanje virusa u serumu vakcinisanih miševa testirali smo sposobnost serumskih antitela da spreče infekciju i stoga oslobađanje de novo virusa iz Madin-Darby ćelija psećeg bubrega (MDCK). U tu svrhu serijska 1:2 razblaženja toplotom inaktiviranih seruma (56 °C tokom 30 min) iz vakcinisanih i kontrolnih miševa inkubirana su sa fiksnom koncentracijom infektivnog influenca virusa (2 TCID50/μl) (infektivna doza za kulturu tkiva (50)). Kontrole su uključivale kontrolu bez seruma i kontrolu bez virusa na svakoj mikrotitarskoj ploči, kao i indirektnu titraciju preparata virusa u odsustvu seruma radi potvrđivanja titra preparata virusa. Svi preparati (smeše seruma i virusa i kontrolni uzorci) inkubirani su 2 h na 37 °C u prisustvu 1 μg/ml tozilsulfonil fenilalanil hlormetil keton (TPCK)-tripsina pre izlaganja MDCK ćelija preparatu tokom 3 dana na 37 °C. Posle 3 dana, supernatanti ćelijske kulture su sakupljeni iz MDCK ćelija i podvrgnuti određivanju HA titra kao što je prethodno opisano.
[0388] Intradermalne imunizacije, izazivanje virusne infekcije i procena životinja: Ženke BALB/c miševa starosti 8-10 nedelja upotrebljene su za eksperimente imunizacije. Miševi su anestezirani inhalacijom izoflurana, dorzalno područje je obrijano, i HA-replikon RNK u kombinaciji sa replikazom i E3 iRNK, rastvoreno u 20 μl PBS bez RNAze, injektirani su intradermalno na dan 0 i 21. Krv je uzeta pod anestezijom izoflurana ispuštanjem krvi iz orbitalnog venskog pleksusa na dane 20, 35 i 55 posle prve imunizacije. Ćelijski ostaci su peletirani iz krvi centrifugiranjem, i uzorci seruma su direktno upotrebljeni za test hemaglutinacije (HAI). Kako bi se procenila zaštita od infekcije influenca virusom, imunizovani miševi su intranazalno izazvani sa 10-strukim LD50mišu prilagođenog influenca virusa A/Portoriko/08/1934 (PR8) dok su anestezirani ketaminom/ksilazinom. Miševima je svakodnevno merena težina i eutanazirani su 14 dana posle izazivanja ili kada je ispunjen kriterijum terminacije (gubitak 25% težine).
Primer 1: Efikasnost ekspresije transgena zavisna je od tipa molekula RNK koji kodira replikazu.
[0389] Cis-replikon RNK koja kodira replikazu i kodira luciferazu nizvodno od SGP ("cisreplikon RNK") ili sintetička iRNK koja kodira replikazu ("iRNK"), svaka zajedno sa transreplikon RNK koja kodira eGFP nizvodno od SGP introdukovane su elektroporacijom u BHK21 ćelije (Sl. 3). Ekspresija trans-replikona je određena merenjem fluorescencije eGFP pomoću FACS, ekspresija luciferaze iz cis-replikona nije bila od interesa. Posebno, uspeh eksperimenta je kvantifikovan određivanjem stope transfekcije, što se odražava procentom eGFP pozitivnih ćelija (barovi na Sl. 3); i određivanjem nivoa ekspresije eGFP, koji se odražava srednjom vrednošću intenziteta fluorescencije (MFI) eGFP pozitivnih ćelija (rombovi na Sl. 3). Kao što je pokazano na Sl. 3, trans-replikacioni sistem (pri čemu je replikaza obezbeđena in trans u obliku iRNK) dao je i veći procenat eGFP pozitivnih ćelija kao i višu srednju vrednost intenziteta fluorescencije eGFP-pozitivnih ćelija u poređenju sa replikazom eksprimiranom iz replikona sposobnog za cis-replikaciju ("cis-replikon RNK").
4
Stoga, replikaza eksprimirana iz replikona sposobnog za cis-replikaciju je manje potentna da amplifikuje subgenomski transkript trans-replikona, što rezultuje nižim nivoom ekspresije transgena. Dodatno, sistem koji sadrži replikaznu iRNK i trans-replikon RNK, ko-isporučene u BHK21 ćelije, verovatnije će produktivno replicirati trans-replikon, što se zaključuje iz procenta eGFP pozitivnih ćelija (barovi na Sl.3).
[0390] Sumirano, zaključeno je da je ekspresija gena od interesa u trans-replikacionom sistemu efikasnija kada se upotrebljava iRNK za isporuku replikaze.
Primer 2: Trans-replikacioni sistem koji se sastoji od replikaze kodirane od strane iRNK i trans-replikona koji kodira transgen obezbeđuje visok nivo ekspresije transgena takođe u primarnim ćelijama, i rezultuje višom ekspresijom u poređenju sa cisreplikonom koji kodira transgen.
[0391] RNK replikon sposoban za cis-replikaciju ("eGFP-replikon RNK"); ili iRNK koja kodira replikazu ("replikazna iRNK") zajedno sa trans-replikon RNK ("eGFP transreplikon RNK") su transfektovane u primarne fibroblaste ljudskog prepucijuma (Sl. 4). Kako bi se redukovala aktivnost protein kinaze R, svakom uzorku RNK dodata je iRNK koja kodira protein E3 Vaccinia virusa. Transfekcija je izvedena kombinovanjem RNK ili smeša RNK sa reagensom za transfekciju RNAiMAX i dodavanjem ove formulacije medijumu ćelija (stoga verovatno ko-isporuka RNK u istim lipozomima).
[0392] Ekspresija gena od interesa određena je merenjem fluorescencije eGFP, tj. određivanjem procenta eGFP pozitivnih ćelija (barovi na Sl. 4); i određivanjem srednje vrednosti intenziteta fluorescencije (MFI) eGFP pozitivnih ćelija (rombovi na Sl. 4). Transreplikacioni sistem ("eGFP transreplikon RNK" zajedno sa "replikaznom iRNK") dao je i veći procenat eGFP pozitivnih ćelija, kao i višu srednju vrednost intenziteta fluorescencije eGFP pozitivnih ćelija nego cis-replikacioni sistem ("eGFP-replikon RNK"). Stoga, u slučaju transreplikacionog sistema, veća je verovatnoća da će doći do produktivne replikacije RNK koja kodira transgen. U oba sistema verovatnoća uspostavljanja produktivne replikacije je dozno zavisna, ali 50 ng trans-replikon RNK je približno toliko potentno kao i 625 ng referentnog replikona (cis-replikon); i 10 ng trans-replikona je potentno kao 500 ng referentnog replikona. Pored toga, trans-replikacioni sistem daje više nivoe ekspresije transgena po ćeliji (reflektuje ih MFI) nego referentni replikon (rombovi na Sl.4).
Primer 3: Proizvodnja proteina od interesa zavisna je od doze replikaze.
[0393] RNK koja kodira replikazu ("replikazna iRNK") zajedno sa trans-replikon RNK ("transreplikon") i E3 iRNK lipofektovane su u primarne fibroblaste ljudskog prepucijuma, kao što je pokazano na Sl. 5A. Trans-replikon RNK kodira sekretorni reporterski protein NanoLuc luciferazu kao gen od interesa. Efikasnost proizvodnje proteina može se modulisati količinom replikazne RNK na dozno zavisan način, kao što je demonstrirano merenjem sekretovane NanoLuc (Sl.5A).
Primer 4: Modifikovanje upotrebe kodona replikaznog konstrukta je nepovoljna modifikacija koja modifikuje nepolipeptidnu sekvencu.
[0394] U ovom primeru, upotrebljen je trans-replikacioni sistem pri čemu replikazni konstrukt kodira myc-označen nsP3. Myc-tag je insertovan u varijabilni region nsP3 kako bi se omogućila detekcija nivoa nsP3 (odražavajući ukupne količine replikaze) pomoću Western blota sa anti-myc antitelima. Insercije u varijabilni region nsP3 ne utiču na aktivnost replikaznog poliproteina (Spuul et al., 2010, J. Virol, vol. 85, pp. 7543-7557). Upotreba kodona myc-označene replikaze ("upotreba wt kodona replikaze") je opciono prilagođena upotrebi Homo sapiens kodona (kako bi se dobila "upotreba hs kodona replikaze"). Transreplikon koji kodira eGFP kao gen od interesa ko-lipofektovan je u BHK21 ćelije zajedno sa različitim količinama replikazne RNK, kako je naznačeno (Sl.5B).
[0395] Ekspresija gena od interesa je određena merenjem fluorescencije eGFP, tj. određivanjem procenta eGFP pozitivnih ćelija (barovi na Sl. 5B); i određivanjem srednje vrednosti intenziteta fluorescencije (MFI) eGFP pozitivnih ćelija (rombovi na Sl.5B).
[0396] Modifikacija upotrebe kodona dovodi do povećanih nivoa replikaze (nivoi mycoznačenih nsP3), ali to nije povoljno za ekspresiju gena od interesa iz trans-replikona koji kodira eGFP: mnogo viša ekspresija replikaze iz kodon-optimizovane RNK u poređenju sa nekodon optimizovanom replikaznom RNK se ne odražava višom ekspresijom eGFP (rombovi na Sl.5B), i smanjuje se verovatnoća da se uspostavi produktivna replikacija transreplikona, kao što je pokazano procentom eGFP pozitivnih ćelija (barovi na Sl.5B).
Primer 5: Efikasna ekspresija transgena kodiranog replikonom u skladu sa predmetnim pronalaskom može se postići in vivo.
[0397] IVT RNK koja kodira replikazu zajedno sa trans-replikon RNK i sa iRNK koja kodira protein E3 Vaccinia virusa resuspendovane su u fosfatom puferisanom fiziološkom rastvoru (PBS) i ko-injektirane u miševe, intradermalno ili u tibialis anterior (intramuskularno). Otvoreni okvir čitanja trans-replikona kodira reporterski protein luciferazu kao protein od interesa.
[0398] Upotrebljene su dve grupe sa 3 životinje po grupi. Svaka životinja je injektirana na dve pozicije. In vivo ekspresija luciferaze merena je kao što je opisano (Kuhn et al., 2010, Gene Ther., vol. 17, pp. 961-971). Ekspresija traje najmanje tokom 9 dana, kao što je pokazano bioluminescentnim snimanjem (BLI) miševa posle intramuskularne (i.m.) i intradermalne (i.d.), respektivno, ko-injekcije RNK. Rezultati su pokazani na Sl.6.
Primer 6: Vakcinacija sa trans-replikacionim sistemom koji sadrži replikon u skladu sa predmetnim pronalaskom koji kodira influenca HA kao protein od interesa obezbeđuje zaštitu od smrtonosnih virusnih infekcija.
[0399] Balb/C miševi su vakcinisani intradermalno dva puta (prime-boost) unutar 3 nedelje sa RNK replikonom koji kodira hemaglutinin (HA) kao gen od interesa (na Sl.7: "R-HA"); ili sa RNK koja kodira replikazu (na Sl. 7: "replikaza") i sa trans-replikon RNK koja kodira hemaglutinin (HA) kao gen od interesa (na Sl. 7: "TR-HA"), kao što je pokazano na Sl. 7. Kako bi se poboljšala translacija, iRNK koja kodira E3 Vaccinia virusa je ko-transfektovana, gde je naznačeno. Kontrolne životinje su bilo vakcinisane sa inaktiviranim virusom (IAV) ili su primile rastvarač (PBS).
[0400] Dan pre izazivanja infekcija sa smrtonosnim dozama influenca virusa, prikupljeni su serumi svih životinja i upotrebljeni za određivanje titra za neutralizaciju virusa (VNT). U referentnoj replikon grupi sve životinje pokazuju VNT koji se približava titrima životinja tretiranih sa IAV. U trans-replikon grupi, VNT se povećavao što je više replikazne iRNK kotransfektovano. Sa 14-strukim viškom replikazne iRNK u odnosu na trans-replikon, postignut je VNT toliko visok kao i u replikon kontrolama, što znači da samo 20% RNK koja kodira antigen (1 μg TR-HA naspram 5 μg R-HA) rezultuje uporedivim VNT titrima (Sl.7A).
[0401] Mišji serumi su takođe podvrgnuti testu inhibicije hemaglutinacije (HAI). Sve životinje vakcinisane sa RNK pokazale su uporedive HAI titre (Sl.7B).
[0402] Pratilo se preživljavanje miševa nakon izazivanja infekcija. Miševi tretirani puferom umrli su unutar 5 dana. Svi vakcinisani miševi su preživeli, sa jednim izuzetkom u grupi vakcinisanoj sa TR-HA i 15 μg E3 (Sl.7C).
[0403] Sumirano, zaključeno je da vakcinacija sa trans-replikonom koji kodira HA obezbeđuje zaštitu od smrtonosne virusne infekcije i omogućava redukciju količine RNK koja kodira antigen.
Primer 7: Uticaj kape.
[0404] BHK21 ćelije su elektroporisane sa transreplikon RNK koja kodira eGFP i secNLuc (sekretabilna luciferaza) razdvojene samoisecajućim peptidom P2A (svinjski teschovirus-1 2A) zajedno sa bilo replikaznom iRNK sa beta-S-ARCA(D2) kapom ili iRNK sa IRES(EMCV) (unutrašnje ulazno mesto ribozoma iz encefalomiokarditis virusa) bez kape uzvodno od ORF replikaze.24 h posle elektroporacije ćelije su analizirane pomoću FACS na ekspresiju eGFP (Sl. 8A), supernatanti su analizirani na nivoe sekrecije secNLuc pomoću Nano-Glo® Luciferase Assay System (Promega) (Sl.8B), i ekspresija replikaze je analizirana Western blotom (Sl.8C).
[0405] Kao što je demonstrirano na Sl. 8A, replikazna iRNK sa kapom dovodi do veće verovatnoće da se uspostavi replikacija transreplikona kao što je mereno procentom eGFP pozitivnih (barovi) i do većih nivoa ekspresije eGFP u pozitivnim ćelijama (rombovi).
[0406] Kako bi se kvantifikovala razlika, merena je aktivnost sekretovane luciferaze i otkriveno je da su obe replikazne iRNK funkcionalne (pozadina testa je ~ 10 RLU), ali je opisani transreplikacioni sistem 37-struko potentniji kada se upotrebljava iRNK sa kapom, kao što je demonstrirano na Sl.8B.
[0407] Kao što je demonstrirano na Sl. 8C, razlog za prethodno zapažanje je veća koncentracija proteina replikaze kada ekspresiju pokreće kapa (leva traka) u poređenju sa IRES (desna traka) kao što je pokazano sondiranjem uzoraka sa anti myc antitelom (gornji blot). Sondiranje uzoraka sa anti eGFP antitelom (srednji blot) potvrdilo je veću ekspresiju eGFP kao što je već pokazano na Sl. 8A. Jednako opterećenje gela je potvrđeno detekcijom ćelijskog proteina α-Tubulina sa odgovarajućim antitelom (donji blot).

Claims (13)

Patentni zahtevi
1. Farmaceutska kompozicija koja sadrži:
(a) iRNK konstrukt za ekspresiju alfavirusne replikaze koji nije sposoban za samoreplikaciju, i
(b) RNK replikon koji se može replicirati pomoću replikaze in trans,
pri čemu iRNK konstrukt iz (a) za ekspresiju alfavirusne replikaze sadrži 5'-kapu za pokretanje translacije replikaze; i
pri čemu RNK replikon iz (b) sadrži (1) 5' sekvencu prepoznavanja replikacije alfavirusa, (2) otvoreni okvir čitanja koji kodira farmaceutski aktivan protein ili peptid i (3) 3' sekvencu prepoznavanja replikacije alfavirusa i pri čemu 5' sekvenca prepoznavanja replikacije alfavirusa i 3' sekvenca prepoznavanja replikacije alfavirusa usmeravaju replikaciju RNK replikona u prisustvu replikaze.
2. Farmaceutska kompozicija u skladu sa patentnim zahtevom 1, naznačena time što je 5'-kapa prirodna 5'-kapa ili analog 5'-kape.
3. Farmaceutska kompozicija u skladu sa patentnim zahtevom 1 ili 2, naznačena time što iRNK konstrukt za ekspresiju alfavirusne replikaze sadrži:
(1) 5ꞌ UTR,
(2) otvoreni okvir čitanja koji kodira replikazu, i
(3) 3ꞌ UTR.
4. Farmaceutska kompozicija u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 3, naznačena time što iRNK konstrukt za ekspresiju alfavirusne replikaze sadrži 3' poli(A) sekvencu.
5. Farmaceutska kompozicija u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 4, naznačena time što RNK replikon sadrži heterolognu nukleinsku kiselinu.
6. Farmaceutska kompozicija u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 5, naznačena time što protein ili peptid sadrži epitop pogodan za vakcinaciju, poželjno epitop koji izaziva imunski odgovor prema bakteriji, virusu, gljivici, parazitu, alergenu, ili tumoru.
7. Farmaceutska kompozicija u skladu sa patentnim zahtevom 6, naznačena time što je ekspresija otvorenog okvira čitanja koji kodira protein od interesa pod kontrolom subgenomskog promotora koji je poželjno nativan za alfavirus iz koga je replikaza poreklom.
8. Farmaceutska kompozicija u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 7, naznačena time što RNK replikon sadrži 3' poli(A) sekvencu i/ili 5'-kapu.
9. Farmaceutska kompozicija u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 8, naznačena time što je alfavirus virus Semliki šume, virus venecuelanskog konjskog encefalitisa, Sindbis virus, ili čikungunja virus.
10. Komplet koji sadrži iRNK konstrukt i RNK replikon u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 9, naznačen time što je RNK za inokulaciju sa ćelijom i/ili za primenu humanom ili životinjskom subjektu.
11. Izolovani iRNK konstrukt koji eksprimira alfavirusnu replikazu koji sadrži 5'-kapu za pokretanje translacije replikaze, za upotrebu u terapiji, naznačeno time što terapija sadrži primenu subjektu (a) iRNK konstrukta i (b) RNK replikona koji se može replicirati pomoću replikaze in trans i sadrži otvoreni okvir čitanja koji kodira protein od interesa,
pri čemu iRNK konstrukt koji eksprimira alfavirusnu replikazu nije sposoban za samoreplikaciju, i
pri čemu RNK replikon sadrži (1) 5' sekvencu prepoznavanja replikacije alfavirusa, i (2) 3' sekvencu prepoznavanja replikacije alfavirusa i pri čemu 5' sekvenca prepoznavanja replikacije alfavirusa i 3' sekvenca prepoznavanja replikacije alfavirusa usmeravaju replikaciju RNK replikona u prisustvu replikaze, pri čemu je protein od interesa poželjno farmaceutski aktivan peptid ili protein ili antigen koristan za vakcinaciju.
1
12. RNK replikon za upotrebu u terapiji, naznačeno time što terapija sadrži primenu subjektu (a) iRNK konstrukta koji eksprimira alfavirusnu replikazu koja sadrži 5'-kapu za pokretanje translacije replikaze i (b) RNK replikona koji se može replicirati pomoću replikaze in trans i sadrži otvoreni okvir čitanja koji kodira protein od interesa,
pri čemu iRNK konstrukt koji eksprimira alfavirusnu replikazu nije sposoban za samoreplikaciju, i
pri čemu RNK replikon sadrži (1) 5' sekvencu prepoznavanja replikacije alfavirusa, i (2) 3' sekvencu prepoznavanja replikacije alfavirusa i pri čemu 5' sekvenca prepoznavanja replikacije alfavirusa i 3' sekvenca prepoznavanja replikacije alfavirusa usmeravaju replikaciju RNK replikona u prisustvu replikaze, pri čemu je protein od interesa poželjno farmaceutski aktivan peptid ili protein ili antigen koristan za vakcinaciju.
13. In vitro postupak za proizvodnju farmaceutski aktivnog proteina ili peptida u ćeliji koji sadrži korake:
(a) dobijanje iRNK konstrukta za ekspresiju alfavirusne replikaze,
(b) dobijanje RNK replikona koji se može replicirati pomoću replikaze in trans i sadrži otvoreni okvir čitanja koji kodira protein ili peptid, i
(c) ko-inokulisanje iRNK konstrukta za ekspresiju alfavirusne replikaze i RNK replikona u ćeliju,
pri čemu iRNK konstrukt iz (a) sadrži 5'-kapu za pokretanje translacije replikaze, i pri čemu navedena iRNK nije sposobna za samoreplikaciju; i
pri čemu RNK replikon iz (b) sadrži (1) 5' sekvencu prepoznavanja replikacije alfavirusa i (2) 3' sekvencu prepoznavanja replikacije alfavirusa i pri čemu 5' sekvenca prepoznavanja replikacije alfavirusa i 3' sekvenca prepoznavanja replikacije alfavirusa usmeravaju replikaciju RNK replikona u prisustvu replikaze.
1 1
RS20211377A 2016-03-21 2017-03-13 Trans-replicirajuća rnk RS62543B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/EP2016/056160 WO2017162265A1 (en) 2016-03-21 2016-03-21 Trans-replicating rna
PCT/EP2017/055813 WO2017162461A1 (en) 2016-03-21 2017-03-13 Trans-replicating rna
EP17710268.8A EP3433368B1 (en) 2016-03-21 2017-03-13 Trans-replicating rna

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS62543B1 true RS62543B1 (sr) 2021-12-31

Family

ID=55586324

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20211377A RS62543B1 (sr) 2016-03-21 2017-03-13 Trans-replicirajuća rnk

Country Status (26)

Country Link
US (2) US12338448B2 (sr)
EP (2) EP3964584A1 (sr)
JP (2) JP7105193B2 (sr)
KR (1) KR102441725B1 (sr)
CN (2) CN115386596A (sr)
AU (1) AU2017236240B2 (sr)
BR (1) BR112018068391A2 (sr)
CY (1) CY1124689T1 (sr)
DK (1) DK3433368T3 (sr)
ES (1) ES2896927T3 (sr)
HR (1) HRP20211715T1 (sr)
HU (1) HUE058889T2 (sr)
IL (1) IL261327B2 (sr)
LT (1) LT3433368T (sr)
MA (1) MA44479B1 (sr)
MD (1) MD3433368T2 (sr)
MX (1) MX2018011384A (sr)
PL (1) PL3433368T3 (sr)
PT (1) PT3433368T (sr)
RS (1) RS62543B1 (sr)
RU (1) RU2752580C2 (sr)
SG (1) SG11201807378SA (sr)
SI (1) SI3433368T1 (sr)
SM (1) SMT202100634T1 (sr)
WO (2) WO2017162265A1 (sr)
ZA (2) ZA201805520B (sr)

Families Citing this family (87)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3324979B1 (en) 2015-07-21 2022-10-12 ModernaTX, Inc. Infectious disease vaccines
US11364292B2 (en) 2015-07-21 2022-06-21 Modernatx, Inc. CHIKV RNA vaccines
EP3364950A4 (en) 2015-10-22 2019-10-23 ModernaTX, Inc. VACCINES AGAINST TROPICAL DISEASES
JP7389741B2 (ja) * 2017-09-13 2023-11-30 バイオエヌテック セル アンド ジーン セラピーズ ゲーエムベーハー Ｔ細胞受容体または人工ｔ細胞受容体を発現するためのｒｎａレプリコン
WO2019053012A1 (en) * 2017-09-13 2019-03-21 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh RNA REPLICON FOR THE REPROGRAMMING OF SOMATIC CELLS
EP3681514A4 (en) 2017-09-14 2021-07-14 ModernaTX, Inc. RNA VACZINE AGAINST ZIKA VIRUS
US10736957B2 (en) * 2017-12-19 2020-08-11 President And Fellows Of Harvard College Enhanced immunogenicity of mRNA with co-encoded adjuvant sequences
EP3938379A4 (en) 2019-03-15 2023-02-22 ModernaTX, Inc. Hiv rna vaccines
CN114072513A (zh) * 2019-06-27 2022-02-18 Emd密理博公司 用表达永生化蛋白的自我复制型rna载体的细胞扩增
WO2021138447A1 (en) 2019-12-31 2021-07-08 Elixirgen Therapeutics, Inc. Temperature-based transient delivery of nucleic acids and proteins to cells and tissues
WO2021160346A1 (en) 2020-02-13 2021-08-19 Institut Pasteur Nucleic acid vaccine against the sars-cov-2 coronavirus
KR102462990B1 (ko) * 2020-03-17 2022-11-07 에이비온 주식회사 인비트로 트랜스크립트 mRNA 및 이를 함유하는 약학조성물
EP4171629A1 (en) 2020-06-29 2023-05-03 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Adjuvants
WO2022099003A1 (en) 2020-11-06 2022-05-12 Sanofi Lipid nanoparticles for delivering mrna vaccines
GB202020061D0 (en) 2020-12-17 2021-02-03 Imp College Innovations Ltd RNA construct
GB202020063D0 (en) 2020-12-17 2021-02-03 Imperial College Innovations Ltd RNA construct
GB202020064D0 (en) 2020-12-17 2021-02-03 Imperial College Innovations Ltd RNA construct
CN112852841A (zh) 2021-02-03 2021-05-28 郑州大学 一种高效表达目的蛋白的顺式复制子rna构建体
US20240181037A1 (en) 2021-03-26 2024-06-06 Glaxosmithkline Biologicals Sa Immunogenic compositions
US20240336672A1 (en) 2021-04-26 2024-10-10 Institut Pasteur Human neutralizing monoclonal antibodies against sars-cov-2 and uses thereof
JP2024517848A (ja) * 2021-05-04 2024-04-23 モグリファイ リミテッド 細胞変換
EP4346894A1 (en) 2021-05-24 2024-04-10 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Adjuvants
US12570977B2 (en) * 2021-06-12 2026-03-10 Mello Biotech Taiwan Co., Ltd. mRNA composition and production method for use in anti-viral and anti-cancer vaccines
KR20240022610A (ko) 2021-06-18 2024-02-20 사노피 다가 인플루엔자 백신
WO2023021427A1 (en) 2021-08-16 2023-02-23 Glaxosmithkline Biologicals Sa Freeze-drying of lipid nanoparticles (lnps) encapsulating rna and formulations thereof
WO2023020993A1 (en) 2021-08-16 2023-02-23 Glaxosmithkline Biologicals Sa Novel methods
WO2023020994A1 (en) 2021-08-16 2023-02-23 Glaxosmithkline Biologicals Sa Novel methods
WO2023021421A1 (en) 2021-08-16 2023-02-23 Glaxosmithkline Biologicals Sa Low-dose lyophilized rna vaccines and methods for preparing and using the same
WO2023020992A1 (en) 2021-08-16 2023-02-23 Glaxosmithkline Biologicals Sa Novel methods
JP2024534120A (ja) 2021-08-24 2024-09-18 ビオンテック・ソシエタス・エウロパエア インビトロ転写技術
CN115960922A (zh) * 2021-10-09 2023-04-14 吴可行 自复制rna分子设计及其应用
WO2023066874A1 (en) 2021-10-18 2023-04-27 BioNTech SE Methods for determining mutations for increasing modified replicable rna function and related compositions and their use
EP4186528A1 (en) 2021-11-30 2023-05-31 BioNTech SE Oligosaccharide complexes and uses
EP4169534A1 (en) 2021-10-22 2023-04-26 BioNTech SE Oligosaccharide complexes and uses
EP4169578A1 (en) 2021-10-22 2023-04-26 BioNTech SE Oligosaccharide compounds and complexes
EP4286003A1 (en) 2022-05-30 2023-12-06 BioNTech SE Oligosaccharide compounds and complexes
EP4169579A1 (en) 2021-10-22 2023-04-26 BioNTech SE Disulfide oligosaccharide compounds and complexes
WO2023067125A1 (en) 2021-10-22 2023-04-27 BioNTech SE Oligosaccharide complexes and uses
EP4286394A1 (en) 2022-05-30 2023-12-06 BioNTech SE Oligosaccharide compounds and complexes
EP4402149A1 (en) 2021-10-22 2024-07-24 BioNTech SE Disulfide oligosaccharide compounds and complexes
JP2024540979A (ja) 2021-10-22 2024-11-06 ビオンテック・ソシエタス・エウロパエア オリゴ糖複合体及び用途
EP4286004A1 (en) 2022-05-30 2023-12-06 BioNTech SE Disulfide oligosaccharide compounds and complexes
EP4285933A1 (en) 2022-05-30 2023-12-06 BioNTech SE Oligosaccharide complexes and uses
WO2023067126A1 (en) 2021-10-22 2023-04-27 BioNTech SE Oligosaccharide compounds and complexes
EP4285932A1 (en) 2022-05-30 2023-12-06 BioNTech SE Oligosaccharide complexes and uses
JP2024543247A (ja) 2021-10-22 2024-11-20 ビオンテック・ソシエタス・エウロパエア オリゴ糖化合物及び複合体
EP4169580A1 (en) 2021-10-22 2023-04-26 BioNTech SE Oligosaccharide compounds and complexes
MX2024005462A (es) 2021-11-05 2024-05-22 Sanofi Sa Vacuna de arn del virus respiratorio sincitial.
WO2023083434A1 (en) 2021-11-09 2023-05-19 BioNTech SE Rna encoding peptidoglycan hydrolase and use thereof for treating bacterial infection
WO2023111262A1 (en) 2021-12-17 2023-06-22 Sanofi Lyme disease rna vaccine
WO2023214082A2 (en) 2022-05-06 2023-11-09 Sanofi Signal sequences for nucleic acid vaccines
US20250375534A1 (en) 2022-05-30 2025-12-11 BioNTech SE Complexes for delivery of nucleic acids
EP4577236A1 (en) 2022-08-22 2025-07-02 The Henry M. Jackson Foundation for the Advancement of Military Medicine, Inc. Vaccines against coronaviruses
JP2025532191A (ja) 2022-09-26 2025-09-29 ビオンテック・ソシエタス・エウロパエア 核酸複合体及びその使用
WO2024086549A1 (en) * 2022-10-17 2024-04-25 The University Of North Carolina At Chapel Hill Chimeric alphaviruses for directed evolution
EP4605010A1 (en) 2022-10-21 2025-08-27 BioNTech SE Nucleic acid complexes and uses thereof
WO2024083345A1 (en) 2022-10-21 2024-04-25 BioNTech SE Methods and uses associated with liquid compositions
WO2024094881A1 (en) 2022-11-04 2024-05-10 Sanofi Respiratory syncytial virus rna vaccination
US12115217B2 (en) 2022-11-18 2024-10-15 Trustees Of Boston University Self-replicating RNA and uses thereof
CN120659802A (zh) 2022-12-15 2025-09-16 赛诺菲巴斯德有限公司 mRNA重组加帽酶
WO2024133160A1 (en) 2022-12-19 2024-06-27 Glaxosmithkline Biologicals Sa Hepatitis b compositions
WO2024133550A1 (en) 2022-12-22 2024-06-27 Vector Biopharma Ag Eukaryotic self-amplifying system
EP4669348A1 (en) 2023-02-24 2025-12-31 BioNTech SE IMMUNOGENEOUS COMPOSITIONS
AR132053A1 (es) 2023-03-02 2025-05-21 Sanofi Pasteur Composiciones para su uso en el tratamiento de clamidia
EP4442276A1 (en) 2023-04-07 2024-10-09 Institut Pasteur Combined antibodies against sarbecoviruses and uses thereof
US12502424B2 (en) 2023-05-05 2025-12-23 Sanofi Pasteur Inc. Compositions for use in treatment of acne
US20250009865A1 (en) 2023-05-10 2025-01-09 Sanofi Combination respiratory mrna vaccines
WO2024236192A1 (en) 2023-05-17 2024-11-21 Institut Pasteur Heterodimer of poxvirus a16 and g9 proteins as an immunogen
EP4474015A1 (en) 2023-06-05 2024-12-11 Veterna Srl Noda-like rna-vaccine pharmacon and production and uses thereof
IL325951A (en) 2023-07-19 2026-03-01 Sanofi Sa Antigenic structures of PORPHYROMONAS GINGIVALIS
IL326176A (en) 2023-08-01 2026-03-01 BioNTech SE Ionizable Thiolipids and Their Uses
WO2025026545A1 (en) 2023-08-01 2025-02-06 BioNTech SE Ionizable thioplipids and uses thereof
EP4520334A1 (en) 2023-09-07 2025-03-12 Mnemo Therapeutics Methods and compositions for improving immune response
WO2025052001A1 (en) 2023-09-07 2025-03-13 Mnemo Therapeutics Methods and compositions for improving immune response
WO2025084729A1 (ko) * 2023-10-16 2025-04-24 한국생명공학연구원 단백질 번역 효율 향상용 RNA 구조체, 이를 포함하는 mRNA 구조체 및 이의 용도
WO2025096982A1 (en) * 2023-11-02 2025-05-08 Amplitude Therapeutics, Inc. Trans amplifying rnas comprising chemically modified nucleobases
WO2025124711A1 (en) 2023-12-13 2025-06-19 BioNTech SE Glycolipid compositions
TW202525287A (zh) 2023-12-21 2025-07-01 德商拜恩技術運輸科技有限責任公司 可離子化脂質
WO2025134066A1 (en) 2023-12-21 2025-06-26 Biontech Delivery Technologies Gmbh Ionizable lipids
WO2025153707A1 (en) 2024-01-19 2025-07-24 Spikimm Broadly sars-cov-2 neutralizing monoclonal antibodies and uses thereof
WO2025157249A1 (zh) * 2024-01-24 2025-07-31 南京金斯瑞生物科技有限公司 一种自复制rna及其用途
WO2025217136A2 (en) * 2024-04-08 2025-10-16 Amplitude Therapeutics, Inc. Trans-amplifying rnas encoding immunomodulators
EP4656648A1 (en) 2024-05-31 2025-12-03 Consejo Superior De Investigaciones Científicas Immunomodulatory thiourea and urea carbohydrate compounds and uses thereof
WO2025262460A1 (en) 2024-06-21 2025-12-26 BioNTech SE Lipid compositions for nucleic acid delivery
WO2026008743A1 (en) 2024-07-02 2026-01-08 Sanofi Pasteur Inc. Water-soluble polyanionic polymer as adjuvant for carrier-formulated nucleic acid
WO2026033380A1 (en) 2024-08-05 2026-02-12 BioNTech SE Process for preparing oligosaccharide complexes
EP4696782A1 (en) 2024-08-14 2026-02-18 Starvax One B.V. Improved split rna replicons

Family Cites Families (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999049029A1 (en) * 1998-03-20 1999-09-30 Benitec Australia Ltd Control of gene expression
CA2372306A1 (en) 1999-03-09 2000-09-14 Large Scale Biology Corp. Multiple component rna vector system for expression of foreign sequences
MXPA03001680A (es) 2000-08-29 2004-11-01 Wyeth Corp Empaque de particulas de un replicon del virus de acido ribonucleico (arn) de hebra positiva.
US20030232324A1 (en) * 2001-05-31 2003-12-18 Chiron Corporation Chimeric alphavirus replicon particles
AU2002303330B2 (en) * 2001-05-31 2008-07-24 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Chimeric alphavirus replicon particles
WO2003023026A1 (en) * 2001-09-06 2003-03-20 Alphavax, Inc. Alphavirus replicon vector systems
US20040005600A1 (en) 2002-04-01 2004-01-08 Evelina Angov Method of designing synthetic nucleic acid sequences for optimal protein expression in a host cell
CN1791678A (zh) 2003-03-20 2006-06-21 阿尔法瓦克斯公司 改进的甲病毒复制子和辅助构建体
US20090104226A1 (en) * 2004-05-21 2009-04-23 Novartis Vaccines And Diagnostics Inc. Alphavirus Vectors for Respiratory Pathogen Vaccines
WO2008119827A1 (en) * 2007-04-02 2008-10-09 Fit Biotech Oy Transreplicase constructs
WO2008157688A2 (en) 2007-06-19 2008-12-24 Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College Synthesis and use of anti-reverse phosphorothioate analogs of the messenger rna cap
DK2947149T3 (en) * 2007-06-21 2018-06-06 Alphavax Inc ALPHAVIRUS REPLICATION PARTICLES FOR USE IN VACCINATION
ES2473623T3 (es) 2007-08-20 2014-07-07 Glaxo Group Limited Procedimiento de producción
PL215513B1 (pl) 2008-06-06 2013-12-31 Univ Warszawski Nowe boranofosforanowe analogi dinukleotydów, ich zastosowanie, czasteczka RNA, sposób otrzymywania RNA oraz sposób otrzymywania peptydów lub bialka
DE102008061522A1 (de) 2008-12-10 2010-06-17 Biontech Ag Verwendung von Flt3-Ligand zur Verstärkung von Immunreaktionen bei RNA-Immunisierung
EP2281579A1 (en) 2009-08-05 2011-02-09 BioNTech AG Vaccine composition comprising 5'-Cap modified RNA
RS63817B1 (sr) * 2010-07-06 2023-01-31 Glaxosmithkline Biologicals Sa Čestice za isporuku slične virionu za molekule samoreplicirajuće rnk
EP2590625B1 (en) 2010-07-06 2017-09-20 GlaxoSmithKline Biologicals SA Cationic oil-in-water emulsions
US9192661B2 (en) * 2010-07-06 2015-11-24 Novartis Ag Delivery of self-replicating RNA using biodegradable polymer particles
HUE026646T2 (en) 2010-07-06 2016-07-28 Glaxosmithkline Biologicals Sa Preferred liposomes containing lipids of PKA value for delivery of RNA
ES2727583T3 (es) 2010-08-31 2019-10-17 Glaxosmithkline Biologicals Sa Lípidos adecuados para la administración liposómica de ARN que codifica proteínas
PT3970742T (pt) 2010-08-31 2022-06-27 Glaxosmithkline Biologicals Sa Lipossomas peguilados para entrega de arn codificador de imunogénio
RS63890B1 (sr) 2010-08-31 2023-02-28 Glaxosmithkline Biologicals Sa Mali lipozomi za isporuku rnk koja kodira imunogen
JP2013544504A (ja) 2010-10-11 2013-12-19 ノバルティス アーゲー 抗原送達プラットフォーム
SG10201605512WA (en) 2011-07-06 2016-09-29 Novartis Ag Oil-in-water emulsions that contain nucleic acids
CA2840965C (en) 2011-07-06 2021-03-02 Novartis Ag Cationic oil-in-water emulsions
WO2013006838A1 (en) 2011-07-06 2013-01-10 Novartis Ag Immunogenic combination compositions and uses thereof
US20140141070A1 (en) 2011-07-06 2014-05-22 Andrew Geall Liposomes having useful n:p ratio for delivery of rna molecules
EP3508220A1 (en) 2011-08-31 2019-07-10 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Pegylated liposomes for delivery of immunogen-encoding rna
BR112014008694A2 (pt) * 2011-10-11 2017-06-20 Novartis Ag moléculas de ácido nucleico policistrônico recombinante
ES2874233T3 (es) 2011-11-11 2021-11-04 Variation Biotechnologies Inc Composiciones y métodos para el tratamiento de citomegalovirus
WO2013143555A1 (en) 2012-03-26 2013-10-03 Biontech Ag Rna formulation for immunotherapy
RU2658490C2 (ru) 2012-03-27 2018-06-21 Кьюрвак Аг Искусственные молекулы нуклеиновых кислот для улучшенной экспрессии белков или пептидов
SG10201607962RA (en) 2012-03-27 2016-11-29 Curevac Ag Artificial nucleic acid molecules
WO2014071963A1 (en) 2012-11-09 2014-05-15 Biontech Ag Method for cellular rna expression
WO2014170493A2 (en) * 2013-04-19 2014-10-23 Novartis Ag Alphavirus vector
WO2016005004A1 (en) 2014-07-11 2016-01-14 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh Stabilization of poly(a) sequence encoding dna sequences
EP4368702A3 (en) 2017-09-13 2024-08-14 BioNTech SE Method of enhancing rna expression in a cell

Also Published As

Publication number Publication date
IL261327B2 (en) 2024-08-01
IL261327A (en) 2018-10-31
CN115386596A (zh) 2022-11-25
MX2018011384A (es) 2019-02-13
HUE058889T2 (hu) 2022-09-28
IL261327B1 (en) 2024-04-01
EP3433368B1 (en) 2021-10-06
AU2017236240B2 (en) 2022-11-17
RU2752580C2 (ru) 2021-07-29
PL3433368T3 (pl) 2021-12-27
BR112018068391A2 (pt) 2019-01-15
CN109328233A (zh) 2019-02-12
JP2019509048A (ja) 2019-04-04
HRP20211715T1 (hr) 2022-02-18
JP7421256B2 (ja) 2024-01-24
RU2018131783A (ru) 2020-04-22
WO2017162265A1 (en) 2017-09-28
CA3017285A1 (en) 2017-09-28
CN109328233B (zh) 2022-10-11
KR20180127360A (ko) 2018-11-28
US20250290095A1 (en) 2025-09-18
PT3433368T (pt) 2021-11-15
JP7105193B2 (ja) 2022-07-22
SMT202100634T1 (it) 2022-01-10
ES2896927T3 (es) 2022-02-28
ZA201805520B (en) 2019-11-27
MA44479A (fr) 2021-04-21
SG11201807378SA (en) 2018-10-30
LT3433368T (lt) 2021-11-25
ZA201905396B (en) 2021-03-31
CY1124689T1 (el) 2022-07-22
MA44479B1 (fr) 2021-11-30
WO2017162461A1 (en) 2017-09-28
AU2017236240A1 (en) 2018-09-20
DK3433368T3 (da) 2021-11-15
KR102441725B1 (ko) 2022-09-08
EP3964584A1 (en) 2022-03-09
SI3433368T1 (sl) 2022-01-31
EP3433368A1 (en) 2019-01-30
RU2018131783A3 (sr) 2020-07-14
US12338448B2 (en) 2025-06-24
JP2022020634A (ja) 2022-02-01
MD3433368T2 (ro) 2021-12-31
US20200299724A1 (en) 2020-09-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20250290095A1 (en) Trans-Replicating RNA
JP7465310B2 (ja) 多用途性且つ効率的な遺伝子発現のためのｒｎａレプリコン
JP7769644B2 (ja) 多用途かつ効率的な遺伝子発現のためのｒｎａレプリコン
CA3017285C (en) Trans-replicating rna
HK40059264A (en) Trans-replicating rna
HK40003013B (en) Trans-replicating rna
NZ785741A (en) Trans-replicating RNA
HK40004174B (en) Trans-replicating rna
HK40004174A (en) Trans-replicating rna
HK40000763B (en) Rna replicon for versatile and efficient gene expression
HK40000763A (en) Rna replicon for versatile and efficient gene expression