RS63817B1 - Čestice za isporuku slične virionu za molekule samoreplicirajuće rnk - Google Patents

Čestice za isporuku slične virionu za molekule samoreplicirajuće rnk

Info

Publication number
RS63817B1
RS63817B1 RS20221148A RSP20221148A RS63817B1 RS 63817 B1 RS63817 B1 RS 63817B1 RS 20221148 A RS20221148 A RS 20221148A RS P20221148 A RSP20221148 A RS P20221148A RS 63817 B1 RS63817 B1 RS 63817B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
rna
virus
liposomes
immunogen
liposome
Prior art date
Application number
RS20221148A
Other languages
English (en)
Inventor
Andrew Geall
Christian Mandl
Derek O'hagan
Manmohan Singh
Original Assignee
Glaxosmithkline Biologicals Sa
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=44629863&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS63817(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Glaxosmithkline Biologicals Sa filed Critical Glaxosmithkline Biologicals Sa
Publication of RS63817B1 publication Critical patent/RS63817B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/155—Paramyxoviridae, e.g. parainfluenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/245—Herpetoviridae, e.g. herpes simplex virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Synthetic bilayered vehicles, e.g. liposomes or liposomes with cholesterol as the only non-phosphatidyl surfactant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/88—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microencapsulation, e.g. using amphiphile liposome vesicle
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55555—Liposomes; Vesicles, e.g. nanoparticles; Spheres, e.g. nanospheres; Polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16111—Cytomegalovirus, e.g. human herpesvirus 5
    • C12N2710/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18511—Pneumovirus, e.g. human respiratory syncytial virus
    • C12N2760/18522—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18511—Pneumovirus, e.g. human respiratory syncytial virus
    • C12N2760/18534—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/36011—Togaviridae
    • C12N2770/36111—Alphavirus, e.g. Sindbis virus, VEE, EEE, WEE, Semliki
    • C12N2770/36141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2770/36143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Manufacturing Of Micro-Capsules (AREA)

Description

Opis
OBLAST TEHNIKE
[0001] Ovaj pronalazak je u oblasti nevirusne isporuke samoreplicirajućih RNK za imunizaciju.
TEHNIČKA OSNOVA
[0002] Isporuka nukleinskih kiselina za imunizaciju životinja je cilj već nekoliko godina. Testirani su različiti pristupi, uključujući upotrebu DNK ili RNK, virusnih ili nevirusnih nosača za isporuku (ili čak bez nosača za isporuku, u „goloj“ vakcini), vektora koji se repliciraju ili ne repliciraju, ili virusnih ili ne-virusnih vektora.
[0003] Ostaje potreba za daljim i poboljšanim vakcinama nukleinske kiseline i, posebno, za poboljšanim načinima isporuke vakcina nukleinske kiseline.
[0004] Wilson et al., 1979, Cell, 17:1, 77-84 opisuju uvođenje RNK poliovirusa u ćelije posredovano lipidima.
OPIS PRONALASKA
[0005] Prema pronalasku, imunizacija nukleinskom kiselinom se postiže isporukom samoreplicirajuće RNK inkapsulirane unutar male čestice koja je lipozom koji sadrži lipid sa katjonskom glavom. RNK kodira imunogen od interesa koji može izazvati imuni odgovor in vivo protiv virusa, bakterije, gljivice, parazita, alergena ili tumorskog antigena, a čestica može da isporuči ovu RNK oponašajući funkciju isporuke prirodnog virusa.
[0006] Dakle, pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži nevirionsku česticu koja ne sadrži proteinski kapsid, za in vivo isporuku RNK u ćeliju kičmenjaka; pri čemu je (a) čestica formirana od materijala za isporuku amfifilnih lipida koji može da formira lipozome, a čestica je lipozom koji sadrži lipid sa katjonskom grupom glave i inkapsulira samoreplicirajući RNK molekul koji kodira imunogen, pri čemu imunogen može izazvati imuni odgovor in vivo protiv virusa, bakterije, gljivice, parazita, alergena ili tumorskog antigena; i pri čemu (bi) RNK ne uključuje modifikovane nukleotide osim bilo koje strukture 5' kape, ili (bii) RNK uključuje 5' kapu koja sadrži 7-metilguanozin i prvih 1, 2 ili 3 5' ribonukleotida su metilovani na 2' poziciji riboze.
[0007] Ove farmaceutske kompozicije su za imunizaciju subjekata protiv različitih bolesti. Kombinacija korišćenja nevirionske čestice za isporuku RNK koja se samoreplicira pruža način da se izazove jak i specifičan imuni odgovor protiv imunogena dok se isporučuje samo mala doza RNK. Dodatno, ove čestice se mogu lako proizvesti u komercijalnom obimu.
Čestica
[0008] Čestice pronalaska su nevirionske čestice tj. nisu virion. Dakle, čestica ne sadrži proteinski kapsid. Izbegavajući potrebu za stvaranjem kapsidnih čestica, pronalazak ne zahteva ćelijsku liniju za pakovanje, što omogućava lakše povećanje veličine za komercijalnu proizvodnju i minimizira rizik da se opasni zarazni virusi nenamerno proizvedu.
[0009] Umesto inkapsulacije RNK u virion, čestice pronalaska se formiraju od materijala za isporuku amfifilnih lipida koji mogu da formiraju lipozome. Tamo gde se isporuka vrši putem lipozoma, RNK treba da bude inkapsulirana.
[0010] Stoga je čestica pronalaska lipozom koji inkapsulira molekul RNK koji se samoreplicira i koji kodira imunogen koji može izazvati imuni odgovor in vivo protiv virusa, bakterije, gljivice, parazita, alergena ili tumorskog antigena. Poželjno je da je čestica u suštini sferna.
[0011] RNK je inkapsulirana unutar lipozoma. To znači da je RNK unutar čestica (kao u prirodnom virusu) odvojena od bilo kog spoljašnjeg medijuma materijalom za isporuku, a otkriveno je da inkapsulacija štiti RNK od digestije RNKaze. Inkapsulacija može imati različite oblike. Na primer, u nekim primerima izvođenja (kao u unilamelarnom lipozomu) materijal za isporuku formira spoljašnji sloj oko vodenog jezgra koje sadrži RNK. Čestice mogu uključivati neku spoljašnju RNK (npr. na površini čestica), ali najmanje polovina RNK (i idealno cela) je inkapsulirana. Inkapsulacija unutar lipozoma se razlikuje od, na primer, kompleksa lipid/RNK otkrivenih u referenci 1.
Lipozomi
[0012] Različiti amfifilni lipidi mogu da formiraju dvoslojne slojeve u vodenom okruženju da inkapsuliraju vodeno jezgro koje sadrži RNK kao lipozom. Ovi lipidi imaju katjonsku glavenu grupu. Dalji lipidi mogu imati anjonsku ili cviterjonsku hidrofilnu glavenu grupu. Formiranje lipozoma iz anjonskih fosfolipida datira još od 1960-ih, a katjonski lipozomi koji formiraju lipozome proučavaju se od 1990-ih. Neki fosfolipidi su anjonski, dok su drugi cviterjonski, a drugi su katjoni. Pogodne klase fosfolipida uključuju, ali nisu ograničene na, fosfatidiletanolamine, fosfatidilholine, fosfatidilserine i fosfatidil-glicerole, a neki korisni fosfolipidi su navedeni u tabeli 1. Korisni kationski lipidi uključuju, ali nisu ograničeni na, dioleoil trimetilamonijum propan (DOTAP), 1.2-disteariloksi-N,N-dimetil-3-aminopropan (DSDMA), 1.2-dioleiloksi-N,Ndimetil-3 -aminopropan (DODMA), 1.2-dilinoleiloksi-N,N-dimetil-3-aminopropan (DLinDMA), 1.2-dilinoleniloksi-N,N-dimetil-3-aminopropan (DLenDMA). Cviterjonski lipidi uključuju, ali nisu ograničeni na, acil cviterjonske lipide i etarske cviterjonske lipide. Primeri korisnih cviterjonskih lipida su DPPC, DOPC i dodecilfosfoholin. Lipidi mogu biti zasićeni ili nezasićeni. Poželjna je upotreba najmanje jednog nezasićenog lipida za pripremu lipozoma. Ako nezasićeni lipid ima dva repa, oba repa mogu biti nezasićena, ili mogu imati jedan zasićeni rep i jedan nezasićeni rep.
[0013] Lipozomske čestice pronalaska mogu se formirati iz jednog lipida ili iz smeše lipida. Smeša može da sadrži (i) smešu katjonskih lipida (ii) mešavinu anjonskih lipida i katjonskih lipida (iii) mešavinu cviterjonskih lipida i katjonskih lipida ili (iv) mešavinu anjonskih lipida, katjonskih lipida i cviterjonskih lipida. Slično, smeša može da sadrži i zasićene i nezasićene lipide. Na primer, smeša može da sadrži DSPC (cviterjonski, zasićeni), DlinDMA (katjonski, nezasićeni) i/ili DMG (anjonski, zasićeni). Kada se koristi smeša lipida, ne moraju svi komponentni lipidi u smeši biti amfifilni, npr. jedan ili više amfifilnih lipida se mogu mešati sa holesterolom.
[0014] Hidrofilni deo lipida može biti PEGilovan (tj. modifikovan kovalentnim vezivanjem polietilen glikola). Ova modifikacija može povećati stabilnost i sprečiti nespecifičnu adsorpciju lipozoma. Na primer, lipidi se mogu konjugovati sa PEG korišćenjem tehnika kao što su one otkrivene u referencama 2 i 3. Mogu se koristiti različite dužine PEG, npr. između 0.5-8 kDa.
[0015] U primerima je korišćena mešavina DSPC, DlinDMA, PEG-DMG i holesterola.
[0016] Lipozomske čestice se obično dele u tri grupe: multilamelarne vezikule (MLV); male unilamelarne vezikule (SUV); i velike unilamelarne vezikule (LUV). MLV imaju više dvoslojnih slojeva u svakoj vezikuli, formirajući nekoliko odvojenih vodenih pregrada. SUV i LUV vehikulumi imaju jedan dvosloj koji obuhvata vodeno jezgro; SUV vehikulumi obično imaju prečnik ≤50nm, a LUV-ovi imaju prečnik >50nm. Lipozomalne čestice pronalaska su idealno LUV sa prečnikom u opsegu od 50-220 nm. Za kompoziciju koja sadrži populaciju LUV različitih prečnika: (i) najmanje 80% po broju treba da ima prečnike u opsegu od 20-220nm, (ii) prosečni prečnik (Zav, prema intenzitetu) populacije je idealno u opseg od 40-200 nm, i/ili (iii) prečnici treba da imaju indeks polidisperznosti <0.2. Očekuje se da kompleksi lipozom/RNK iz reference 1 imaju prečnik u opsegu od 600-800 nm i da imaju visoku polidisperznost.
[0017] Tehnike za pripremu pogodnih lipozoma su dobro poznate u tehnici npr. videti reference 4 do 6. Jedna korisna postupaka je opisana u referenci 7 i uključuje mešanje (i) etanolnog rastvora lipida (ii) vodenog rastvora nukleinske kiseline i (iii) pufera, nakon čega sledi mešanje, ekvilibrisanje, razblaživanje i prečišćavanje. Poželjni lipozomi pronalaska se mogu dobiti ovim postupkom mešanja.
RNK
[0018] Čestice pronalaska uključuju molekul RNK koji se samoreplicira i koji (za razliku od siRNK) kodira imunogen. RNK ne uključuje modifikovane nukleotide osim bilo koje strukture 5' kape, ili uključuje 5' kapu koja sadrži 7-metilguanozin i prvih 1, 2 ili 3 5' ribonukleotidi je metilovano na 2' poziciji riboze. Posle in vivo davanja čestica, RNK se oslobađa iz čestica i prevodi unutar ćelije da bi obezbedio imunogen in situ.
[0019] Za razliku od reference 13, RNK u česticama pronalaska se samoreplicira. Molekul RNK koji se samoreplicira (replikon) može, kada se isporuči u ćeliju kičmenjaka čak i bez ikakvih proteina, da dovede do proizvodnje više ćerki RNK sopstvenom transkripcijom (preko sopstveno generisane antisens kopije). Molekul RNK koji se samoreplicira je stoga tipično molekul -lanca koji se može direktno prevesti nakon isporuke u ćeliju, a ovaj prevod obezbeđuje RNK-zavisnu RNK polimerazu koja zatim proizvodi i antisense i sens transkripte iz isporučene RNK.
[0020] Tako isporučena RNK dovodi do proizvodnje više ćerki RNK. Ove ćerke RNK, kao i kolinearni subgenomski transkripti, mogu se sami prevesti da bi obezbedili in situ ekspresiju kodiranog imunogena, ili mogu biti transkribovani da bi se obezbedili dalji transkripti koji imaju isti sens kao isporučena RNK koja se prevodi da se obezbedi in situ ekspresija imunogena. Ukupni rezultati ove sekvence transkripcija su ogromno povećanje broja uvedenih replikonskih RNK i tako kodirani imunogen postaje glavni polipeptidni proizvod ćelija.
[0021] Jedan pogodan sistem za postizanje samoreplikacije na ovaj način je korišćenje replikona zasnovanog na alfavirusu. Ovi replikoni su -lančane RNK koje dovode do translacije replikaze (ili replikaze-transkriptaze) nakon isporuke u ćeliju. Replikaza se prevodi kao poliprotein koji se auto-cepa da bi obezbedio replikacioni kompleks koji stvara kopije genomskih –-lanaca isporučene RNK sa -lancem. Ovi –-lančani transkripti mogu sami biti transkribovani da daju dalje kopije -lančane roditeljske RNK i takođe da daju subgenomski transkript koji kodira imunogen. Prevođenje subgenomskog transkripta tako dovodi do in situ ekspresija imunogena od strane inficirane ćelije. Odgovarajući replikoni alfavirusa mogu koristiti repliku iz virusa Sindbis, šumskog Semliki virusa, virusa istočnog konjskog encefalitisa, virusa venecuelanskog encefalitisa konja, itd. Mogu se koristiti mutantne ili virusne sekvence divljeg tipa npr. atenuirani TC83 mutant VEEV je korišćen u replikonima [14].
[0022] Poželjni samoreplicirajući RNK molekul tako kodira (i) RNK-zavisnu RNK polimerazu koja može da transkribuje RNK iz molekula RNK koji se samoreplicira i (ii) imunogen. Polimeraza može biti replikaza alfavirusa, npr. koji sadrže jedan ili više alfavirusnih proteina nsP1, nsP2, nsP3 i nsP4.
[0023] Dok prirodni genomi alfavirusa kodiraju strukturne virionske proteine pored poliproteina nestrukturne replikaze, poželjno je da molekuli RNK koji se samorepliciraju prema pronalasku ne kodiraju strukturne proteine alfavirusa. Tako poželjna samoreplicirajuća RNK može dovesti do proizvodnje kopija sopstvene genomske RNK u ćeliji, ali ne i do proizvodnje viriona koji sadrže RNK. Nemogućnost proizvodnje ovih viriona znači da, za razliku od alfavirusa divljeg tipa, molekul RNK koji se samoreplicira ne može da se perpetuira u infektivnom obliku. Strukturni proteini alfavirusa koji su neophodni za perpetuaciju u virusima divljeg tipa su odsutni u samoreplicirajućim RNK prema pronalasku i njihovo mesto zauzima(ju) gen(i) koji kodiraju imunogen od interesa, tako da subgenomski transkript kodira imunogen, a ne strukturni alfavirus virion proteini.
[0024] Prema tome, samoreplicirajući RNK molekul koristan sa pronalaskom može imati dva otvorena okvira čitanja. Prvi (5') otvoreni okvir čitanja kodira repliku; drugi (3') otvoreni okvir za čitanje kodira imunogen. U nekim primerima izvođenja RNK može imati dodatne (npr. nizvodno) otvoreni okviri za čitanje npr. za kodiranje daljih imunogena (vidi dole) ili za kodiranje pomoćnih polipeptida.
[0025] Poželjni molekul RNK koji se samoreplicira ima kapu od 5' (npr. 7-metilguanozin). Ova kapa može poboljšati in vivo prevod RNK. U nekim primerima izvođenja 5' sekvenca molekula RNK koja se samoreplicira mora biti odabrana da bi se obezbedila kompatibilnost sa kodiranom replikom.
[0026] Molekul RNK koji se samoreplicira može imati 3' poli-A rep. Takođe može uključiti sekvencu prepoznavanja poli-A polimeraze (npr. AAUAAA) blizu njegovog kraja od 3'.
[0027] Molekuli RNK koji se samorepliciraju mogu imati različite dužine, ali su obično dugi 5000-25000 nukleotida npr. 8000-15000 nukleotida, ili 9000-12000 nukleotida. Stoga je RNK duža nego što se vidi u isporuci siRNK.
[0028] Molekuli RNK koji se samorepliciraju će obično biti jednolančani. Jednolančane RNK generalno mogu inicirati adjuvantni efekat vezivanjem za TLR7, TLR8, RNK helikaze i/ili PKR. RNK isporučena u dvolančanoj formi (dsRNK) može da se veže za TLR3, a ovaj receptor takođe može biti pokrenut dsRNK koja se formira ili tokom replikacije jednolančane RNK ili unutar sekundarne strukture jednolančane RNK.
[0029] RNK koja se samoreplicira može se lako pripremiti pomoću in vitro transkripcija (IVT). IVT može da koristi (cDNK) šablon kreiran i razmnožen u obliku plazmida u bakterijama, ili stvoren sintetički (na primer, sintezom gena i/ili inženjerskim postupakama lančane reakcije polimeraze (PCR). Na primer, RNK polimeraza zavisna od DNK (kao što je bakteriofag T7, T3 ili SP6 RNK polimeraza) može se koristiti za transkripciju RNK koja se samoreplicira sa DNK šablona. Odgovarajuće zatvaranje i reakcije dodavanja poli-A mogu se koristiti po potrebi (iako je poli-A replikona obično kodiran unutar DNK šablona). Ove RNK polimeraze mogu imati stroge zahteve za transkribovane 5' nukleotide i u nekim primerima izvođenja ovi zahtevi moraju biti usklađeni sa zahtevima kodirane replike, kako bi se osiguralo da IVT-transkribovana RNK može efikasno da funkcioniše kao supstrat za sebe -kodirana replika.
[0030] Kao što je diskutovano u referenci 15, RNK koja se samoreplicira može uključivati (pored bilo koje 5' kap strukture) jedan ili više nukleotida koji imaju modifikovanu nukleobazu. Tako RNK može da sadrži m5C (5-metilcitidin), m5U (5-metiluridin), m6A (N6-metiladenozin), s2U (2-tiouridin), Um (2’-O-metiluridin), m1A (1-metiladenozin); m2A (2-metiladenozin); Am O-metiladenozin); ms2m6A (2-metiltio-N6-metiladenozin); i6A (N6-izopenteniladenozin); ms2i6A (2-metiltio-N6izopenteniladenozin); io6A (N6-(cisnilizopentenil)adenozin); ms2io6A (2-metiltio-N6-(cis-nilizopentenil) adenozin); g6A (N6-glicinilkarbamoiladenozin); t6A (N6-treonil karbamoiladenozin); ms2t6A (2-metiltio-N6-treonil karbamoiladenozin); m6t6A (N6-metil-N6-treonilkarbamoiladenozin); hn6A(N6.-nilnorvalilkarbamoil adenozin); ms2hn6A (2-metiltio-N6-nilnorvalil karbamoiladenozin); Ar(p) (2’-O-riboziladenozin (fosfat)); I (inozin); m11 (1-metilinozin); m’Im (1.2’-O-dimetilinozin); m3C (3-metilcitidin); Cm (2T-O-metilcitidin); s2C (2-tiocitidin); ac4C (N4-acetilcitidin); f5C (5-fonnilcitidin); m5Cm (5.2-0-dimetilcitidin); ac4Cm (N4acetil2TOmetilcitidin); k2C (lizidin); m1G (1-metilguanozin); m2G (N2-metilguanozin); m7G (7-metilguanozin); Gm (2’-O-metilguanozin); m22G (N2,N2-dimetilguanozin); m2Gm (N2.2’-O-dimetilguanozin); m22Gm (N2,N2,2’-O-trimetilguanozin); Gr(p)
ribozilguanozin (fosfat)); yW (vibutozin); o2yW (peroksivibutozin); OHyW (nilvibutozin); OHyW∗ (podmodifikovani nilvibutozin); imG (viozin); mimG (metilguanozin); Q (kjuozin); oQ (epoksikjueozin); galQ (galtactozilkjuozin); manQ (manozil-kjuozin); preQo (7-cijano-7-deazaguanozin); preQi (7-aminometil-7-deazaguanozin); G (arheozin); D (dihidrouridin); m5Um (5.2’-O-dimetiluridin); s4U (4-tiouridin); m5s2U (5-metil-2-tiouridin); s2Um (2-tio-2’-O-metiluridin); acp3U (3-(3-amino-3-karboksipropil)uridin); ho5U (5-niluridin); mo5U (5-metoksiuridin); cmo5U (uridin 5-oksisirćetna kiselina); mcmo5U (uridin 5-oksisirćetna kiselina); chm5U (5-(karboksinilmetil)uridin)); mchm5U (5-(karboksinilmetil)uridin metil estar); mcm5U (5-metoksikarbonilmetiluridin); mcm5Um (S-metoksikarbonilmetil-2-O-metiluridin); mcm5s2U (5-metoksikarbonilmetil-2-tiouridin); nm5s2U (5-aminometil-2-tiouridin); mnm5U (5-metilaminometiluridin); mnm5s2U (5-metilaminometil-2-tiouridin); mnm5se2U (5-metilaminometil-2-selenouridin); ncm5U (5-karbamoilmetil uridin); ncm5Um (5-karbamoilmetil-2’-O-metiluridin); cmnm5U (5-carboksimetilaminometiluridin); cnmm5Um (5-karboksimetilaminometil-2-L-Ometiluridin); cmnm5s2U (5-carboksimetilaminometil-2-tiouridin); m62A (N6,N6-dimetiladenozin); Tm (2’-O-metilinozin); m4C (N4-metilcitidin); m4Cm (N4.2-O-dimetilcitidin); hm5C (5-nilmetilcitidin); m3U (3-metiluridin); cm5U (5-karboksimetiluridin); m6Am (N6,T-O-dimetiladenozin); rn62Am (N6,N6,O-2-trimetiladenozin); m2’7G (N2.7-dimetilguanozin); m2’2’7G (N2,N2,7-trimetilguanozin); m3Um (3.2T-O-dimetiluridin); m5D (5-metildihidrouridin); f5Cm (5-formil-2’-O-metilcitidin); m1Gm (1.2’-Odimetilguanozin); m’Am (1.2-O-dimetil adenozin) irinometiluridin); tm5s2U (S-taurinometil-2-tiouridin)); imG-14 (4-demetil guanozin); imG2 (izoguanozin); ili ac6A (N6-acetiladenozin), hipoksantin, inozin, 8-oksoadenin, njegovi 7-supstituisani derivati, dihidrouracil, pseudouracil, 2-tiouracil, 4-tiouracil, 5-aminouracil, 5-(C1-C6)-alkiluracil, 5-metiluracil, 5-(C2-C6)-alkeniluracil, 5-(C2-C6)-alkiniluracil, 5-(nilmetil)uracil, 5-hlorouracil, 5-fluorouracil, 5-bromouracil, 5-nilcitozin, 5-(C1-C6)-alkilcitozin, 5-metilcitozin, 5-(C2-C6)-alkenilcitozin, 5-(C2-C6)-alkinilcitozin, 5-hlorocitozin, 5-fluorocitozin, 5-bromocitozin, N2-dimetilguanin, 7-deazaguanin, 8-azaguanin, 7-deaza-7-supstituisani guanin, 7-deaza-7-(C2-C6)alkinilguanin, 7-deaza-8-supstituisani guanin, 8-nilguanin, 6-tioguanin, 8-oksoguanin, 2-aminopurin, 2-amino-6-hloropurin, 2.4-diaminopurin, 2.6-diaminopurin, 8-azapurin, supstituisani 7-deazapurin, 7-deaza-7-supstituisani purin, 7-deaza-8-supstituisani purin, ili abazni nukleotid. Na primer, RNK koja se samoreplicira može uključiti jednu ili više modifikovanih pirimidinskih nukleobaza, kao što su pseudouridin i/ili ostaci 5-metilcitozina. U nekim primerima izvođenja, međutim, RNK ne uključuje modifikovane nukleobaze i može da sadrži modifikovane nukleotide tj. svi nukleotidi u RNK su standardni A, C, G i U ribonukleotidi (osim bilo koje strukture 5' kape, koja može uključivati 7'-metilguanozin). U drugim primerima izvođenja, RNK uključuje 5' kapu koja sadrži 7'-metilguanozin, a prvih 1, 2 ili 35' ribonukleotida mogu biti metilovani na 2' poziciji riboze.
[0031] RNK koja se koristi u pronalasku idealno uključuje samo fosfodiestarske veze između nukleozida, ali u nekim primerima izvođenja može da sadrži fosfororamidne, fosforotioatne i/ili metilfosfonatne veze.
[0032] Količina RNK po čestici može varirati, a broj pojedinačnih samoreplicirajućih RNK molekula po čestici može zavisiti od karakteristika čestice koja se koristi. Generalno, čestica može uključivati od 1-500 RNK molekula. Za lipozom, broj RNK molekula je tipično ≤50 po lipozomu npr. <20, <10, <5 ili 1-4. U idealnom slučaju, čestica uključuje manje od 10 različitih vrsta RNK npr. 5, 4, 3, ili 2 različite vrste; najpoželjnije, čestica uključuje jednu vrstu RNK tj. svi molekuli RNK u čestici imaju istu sekvencu i istu dužinu.
Imunogen
[0033] Molekuli RNK koji se samorepliciraju upotrebljeni u pronalasku kodiraju polipeptidni imunogen koji izaziva imuni odgovor protiv bakterije, virusa, gljivice ili parazita (ili, u nekim primerima izvođenja, protiv alergena; a u drugim primerima izvođenja, protiv tumorskog antigena). Nakon davanja čestica, imunogen se prevodi in vivo i može izazvati imuni odgovor kod primaoca. Imuni odgovor može da obuhvata odgovor antitela (obično uključujući IgG) i/ili imuni odgovor posredovan ćelijama. Polipeptidni imunogen će tipično izazvati imuni odgovor koji prepoznaje odgovarajući bakterijski, virusni, gljivični ili parazitski (ili alergen ili tumor) polipeptid, ali u nekim primerima izvođenja polipeptid može delovati kao mimotop da izazove imuni odgovor koji prepoznaje bakterijski, virusni, gljivični ili parazitski saharid. Imunogen će tipično biti površinski polipeptid npr. adhezin, hemaglutinin, glikoprotein omotača, spajk glikoprotein, itd.
[0034] Molekuli RNK koji se samorepliciraju mogu kodirati jedan polipeptidni imunogen ili više polipeptida. Više imunogena može biti predstavljeno kao jedan polipeptidni imunogen (fuzioni polipeptid) ili kao zasebni polipeptidi. Ako se imunogeni eksprimiraju kao zasebni polipeptidi, onda jedan ili više njih mogu biti obezbeđeni uzvodnim IRES ili dodatnim elementom virusnog promotera. Alternativno, višestruki imunogeni mogu biti eksprimirani iz poliproteina koji kodira pojedinačna imunogena jedinjenja sa kratkom autokatalitičkom proteazom (npr. virus slinavke i šapa (protein 2A) ili kao inteini.
[0035] Za razliku od referenci 1 i 16, RNK kodira imunogen koji može izazvati imuni odgovor in vivo protiv virusa, bakterije, gljivice, parazita, alergena ili tumorskog antigena. Da bi se izbegla sumnja, pronalazak ne obuhvata RNK koja kodira luciferazu svitaca ili koja kodira fuzioni protein E.coli β-galaktozidazu ili koja kodira zeleni fluorescentni protein (GFP). Takođe, RNK nije totalna RNK timusa miša.
[0036] U nekim primerima izvođenja, imunogen izaziva imuni odgovor protiv jedne od ovih bakterija:
Neisseria meningitidis: korisni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, membranske proteine kao što su adhezini, autotransporteri, toksini, proteini za sticanje gvožđa i protein koji vezuje faktor H. Kombinacija tri korisna polipeptida je otkrivena u referenci 17.
Streptococcus pneumonie: korisni polipeptidni imunogeni su otkriveni u referenci 18. Ovo uključuje, ali nije ograničeno na, RrgB pilus podjedinicu, prekursor beta-N-acetilheksosaminidaze (spr0057), spr0096, protein opšteg stresa GSP-781 (spr2021), SP2216 , serin/treonin kinaza StkP (SP1732) i pneumokokni površinski adhezin PsaA.
Streptococcus piogenes: korisni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, polipeptide otkrivene u referencama 19 i 20.
Moraxella catarrhalis.
Bordetella pertussis: Korisni imunogeni protiv pertusisa uključuju, ali nisu ograničeni na, toksin ili toksoid pertusisa (PT), filamentni hemaglutinin (FHA), pertaktin i aglutinogene 2 i 3.
Staphilococcus aureus: Korisni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, polipeptide otkrivene u referenci 21, kao što su hemolizin, eskA, eskB, protein koji vezuje ferihrom (sta006) i/ili sta011 lipoprotein.
Clostridium tetani: tipični imunogen je toksoid tetanusa.
Corninebacterium diphtheriae: tipičan imunogen je toksoid difterije.
Haemophilus influenzae: Korisni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, polipeptide otkrivene u referencama 22 i 23.
Pseudomonas aeruginosa
Streptococcus agalactiae: korisni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, polipeptide otkrivene u referenci 19.
Chlamidia trachomatis: Korisni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, PepA, LcrE,
1
ArtJ, DnaK, CT398, OmpH-like, L7/L12, OmcA, AtoS, CT547, Eno, HtrA i MurG (npr. kao što je otkriveno u referenci 24. LcrE [25] i HtrA [26] su dva poželjna imunogena.
Chlamidia pneumoniae: Korisni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, polipeptide otkrivene u referenci 27.
Helicobacter pilori: Korisni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, CagA, VacA, NAP i/ili ureazu [28].
Escherichia coli: Korisni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, imunogene izvedene iz enterotoksigena E. coli (ETEC), enteroagregativan E. coli (EAggEC), difuzno prianjajući E. coli (DAEC), enteropatogen E. coli (EPEC), ekstraintestinalni patogen E. coli (EkPEC) i/ili enterohemoragični E. coli (EHEC). ExPEC sojevi uključuju uropatogene E.coli (UPEC) i E.coli povezan sa meningitisom/sepsom (MNEC). Korisni UPEC polipeptidni imunogeni su otkriveni u referencama 29 i 30. Korisni MNEC imunogeni su otkriveni u referenci 31. Korisni imunogen za nekoliko tipova E.coli je AcfD [32].
Bacillus anthracis
Yersinia pestis: Korisni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, one otkrivene u referencama 33 i 34.
Staphilococcus epidermis
Clostridium perfringens ili Clostridium botulinums
Legionella pneumophila
Coxiella burnetii
Brucella, kao što je B. abortus, B.canis, B.melitensis, B.neotomae, B.ovis, B.suis, B.pinnipediae.
Francisella, kao što je F.novicida, F.philomiragia, F.tularensis.
Neisseria gonorrhoeae
Treponema pallidum
Haemophilus ducreii
Enterococcus faecalis ili Enterococcus faecium
Staphilococcus saprophiticus
Yersinia enterocolitica
Micobacterium tuberculosis
Rickettsia
Listeria monocitogenes
Vibrio cholerae
Salmonella typhi
Borrelia burgdorferi
Porphiromonas gingivalis
Klebsiella
[0037] U nekim primerima izvođenja, imunogen izaziva imuni odgovor protiv jednog od ovih virusa:
Orthomixovirus: Korisni imunogeni mogu biti iz virusa gripa A, B ili C, kao što su hemaglutinin, neuraminidaza ili matriksni M2 proteini. Tamo gde je imunogen hemaglutinin virusa gripa A, on može biti iz bilo kog podtipa npr. H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 ili H16.
Paramixoviridae virusi: Virusni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, one koji potiču od pneumovirusa (npr. respiratorni sincicijalni virus, RSV), Rubulavirusi (npr. virus zauški), paramiksovirusi (npr. virus parainfluence), metapneumovirusi i morbilivirusi (npr. morbila). Poxviridae: Virusni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, one izvedene iz Orthopoxvirus kao takav Variola vera, uključujući, ali ne ograničavajući se na, Variola major i Variola minor.
Picornavirus: Virusni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, one koji potiču od pikornavirusa, kao što su enterovirusi, rinovirusi, heparnavirusi, kardiovirusi i aftovirusi. U jednom aspektu, enterovirus je poliovirus npr. poliovirus tipa 1, tipa 2 i/ili tipa 3. U drugom aspektu, enterovirus je EV71 enterovirus. U drugom aspektu, enterovirus je koksaki A ili B virus.
Bunyavirus: Virusni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, one izvedene iz Orthobunyavirus, kao što je virus kalifornijskog encefalitisa, flebovirus, kao što je virus groznice doline Rift, ili Nairovirus, kao što je virus Krim-Kongo hemoragične groznice virus. Heparnavirus: Virusni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, one koji potiču od Heparnavirusa, kao što je virus hepatitisa A (HAV).
Filovirus: Virusni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, one koji potiču od filovirusa, kao što je virus ebole (uključujući ebolavirus Zaira, Obale Slonovače, Reston ili Sudan) ili virus Marburg.
Togavirus: Virusni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, one koji potiču od Togavirusa, kao što su Rubivirus, Alfavirus ili Arterivirus. Ovo uključuje virus rubeole.
Flavivirus: Virusni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, one koji potiču od Flavivirusa, kao što je virus krpeljnog encefalitisa (TBE), virus Denga (tipovi 1, 2, 3 ili 4), virus žute groznice, virus japanskog encefalitisa, virus Kjasanur šume, virus encefalitisa Zapadnog Nila, virus encefalitisa Sent Luisa, virus ruskog prolećno-letnjeg encefalitisa, virus encefalitisa Powassan.
Pestivirus: Virusni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, one koji potiču od pestivirusa, kao što je goveđa virusna dijareja (BVDV), klasična svinjska kuga (CSFV) ili granična bolest (BDV).
Hepadnavirus: Virusni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, one koji potiču od Hepadnavirusa, kao što je virus hepatitisa B. Kompozicija može uključivati površinski antigen virusa hepatitisa B (HBsAg).
Drugi virusi hepatitisa: Kompozicija može uključivati imunogen iz virusa hepatitisa C, virusa delta hepatitisa, virusa hepatitisa E ili virusa hepatitisa G.
Rhabdovirus: Virusni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, one koji potiču od rabdovirusa, kao što je Lissavirus (npr. virus besnila) i Vesiculovirus (VSV).
Caliciviridae: Virusni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, one koji potiču od Calciviridae, kao što je virus Norwalk (Norovirus), i viruse nalik Norvalku, kao što su Havaii Virus i Snow Mountain Virus.
Virus korona: Virusni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, one koji potiču od SARS koronavirusa, infektivnog bronhitisa ptica (IBV), virusa mišjeg hepatitisa (MHV) i virusa prenosivog gastroenteritisa svinja (TGEV). Imunogen za koronavirus može biti spajk polipeptid.
Retrovirus: Virusni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, one koji potiču od onkovirusa, lentivirusa (npr. HIV-1 ili HIV-2) ili Spumavirus.
Reovirus: Virusni imunogeni obuhvataju, ali nisu ograničeni na, one koji potiču od Ortoreovirusa, Rotavirusa, Orbivirusa ili Koltivirusa.
Parvovirus: Virusni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, one izvedene iz Parvovirusa B19.
Herpesvirus: Virusni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, one koji potiču od humanog herpes virusa, kao što su, samo kao primer, Herpes simplex virusi (HSV) (npr. HSV tipovi 1 i 2), virus Varicella-zoster (VZV), Epstein-Barr virus (EBV), Citomegalovirus (CMV), Humani herpesvirus 6 (HHV6), Humani herpesvirus 7 (HHV7) i Humani Herpesvirus 8 (HHV8).
Papovavirusi: Virusni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, one koji potiču od papiloma virusa i polioma virusa. (Humani) papiloma virus može biti serotipa 1, 2, 4, 5, 6, 8, 11, 13, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 41, 42, 47, 51, 57, 58, 63 ili 65 npr. od jednog ili više serotipova 6, 11, 16 i/ili 18.
1
Adenovirus: Virusni imunogeni uključuju one izvedene iz adenovirusa serotipa 36 (Ad-36).
[0038] U nekim primerima izvođenja, imunogen izaziva imuni odgovor protiv virusa koji inficira ribu, kao što su: virus infektivne anemije lososa (ISAV), virus bolesti pankreasa lososa (SPDV), virus infektivne nekroze pankreasa (IPNV), virus kanalnog soma (CCV) , virus bolesti limfocistisa riba (FLDV), virus infektivne hematopoetske nekroze (IHNV), koi herpesvirus, virus sličan pikorni lososa (takođe poznat kao virus atlantskog lososa sličan pikorni), virus lososa koji nema izlaz na more (LSV), rotavirus atlantskog lososa (ASR ), virus bolesti jagode pastrmke (TSD), virus tumora koho lososa (CSTV) ili virus virusne hemoragične septikemije (VHSV).
[0039] Gljivični imunogeni mogu biti izvedeni iz Dermatophitresa, uključujući: Epidermophyton floccusum, Microsporum audouini, Microsporum canis, Microsporum distortum, Microsporum equinum, Microsporum gypsum, Microsporum nanum, Trichophyton concentricum, Trichophyton equinum, Trichophyton gallinae, Trichophyton gypseum, Trichophyton megnini, Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton quinckeanum, Trichophyton rubrum, Trichophyton schoenleini, Trichophyton tonsurans, Trichophyton verrucosum, T. verrucosum var. album, var. discoides, var. ochraceum, Trichophyton violaceum, and/or Trichophyton faviforme; or from Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus nidulans, Aspergillus terreus, Aspergillus sydowi, Aspergillus flavatus, Aspergillus glaucus, Blastoschizomyces capitatus, Candida albicans, Candida enolase, Candida tropicalis, Candida glabrata, Candida krusei, Candida parapsilosis, Candida stellatoidea, Candida kusei, Candida parakwsei, Candida lusitaniae, Candida pseudotropicalis, Candida guilliermondi, Cladosporium carrionii, Coccidioides immitis, Blastomyces dermatidis, Cryptococcus neoformans, Geotrichum clavatum, Histoplasma capsulatum, Klebsiella pneumoniae, Microsporidia, Encephalitozoon spp., Septata intestinalis and Enterocytozoon bieneusi; the less common are Brachiola spp, Microsporidium spp., Nosema spp., Pleistophora spp., Trachipleistophora spp., Vittaforma spp Paracoccidioides brasiliensis, Pneumocystis carinii, Pythiumn insidiosum, Pityrosporum ovale, Sacharomyces cerevisae, Saccharomyces boulardii, Saccharomyces pombe, Scedosporium apiosperum, Sporothrix schenckii, Trichosporon beigelii, Toxoplasma gondii, Penicillium marneffei, Malassezia spp., Fonsecaea spp., Wangiella spp., Sporothrix spp., Basidiobolus spp., Conidiobolus spp., Rhizopus spp, Mucor spp, Absidia spp, Mortierella spp, Cunninghamella spp, Saksenaea spp., Alternaria spp, Curvularia spp, Helminthosporium spp, Fusarium spp, Aspergillus spp, Penicillium spp, Monolinia spp, Rhizoctonia spp, Paecilomyces spp, Pithomyces spp, and Cladosporium spp.
[0040] U nekim primerima izvođenja, imunogen izaziva imuni odgovor protiv parazita iz Plasmodium roda, kao npr P.falciparum, P.vivax, P.malariae ili P.ovale. Stoga se pronalazak može koristiti za imunizaciju protiv malarije. U nekim primerima izvođenja, imunogen izaziva imuni odgovor protiv parazita iz Caligidae porodice, posebno onih iz Lepeoftheirus i Caligus rodova npr. morske vaši kao što je Lepeophtheirus salmonis ili Caligus rogercresseii.
[0041] U nekim primerima izvođenja, imunogen izaziva imuni odgovor protiv: polenskih alergena (alergeni polena drveća, biljaka, korova i trava); alergeni insekata ili pauka (alergeni za inhalaciju, pljuvačku i otrove, npr. alergeni grinja, alergeni bubašvaba i mušica, alergeni otrova himenoptera); alergeni životinjske dlake i peruti (npr. pas, mačka, konj, pacov, miš, itd.); i alergeni u hrani (npr. glijadin). Važni polenski alergeni drveća, trava i bilja su takvi koji potiču iz taksonomskih redova Fagales, Oleales, Pinales i platanaceae uključujući, ali ne ograničavajući se na, brezu (Betula), jovu (Alnus), lesku (Corilus), grab (Carpinus) i maslina (Olea), kedar (Criptomeria i Juniperus), platana (Platanus), red Poales uključujući trave iz rodova Lolium, Phleum, Poa, Cinodon, Dactilis, Holcus, Phalaris, Secale i Sorghum, redovi Asterales i Urticales uključujući biljke iz rodova Ambrosia, Artemisia i Parietaria. Drugi važni inhalacioni alergeni su oni iz grinja kućne prašine iz roda Dermatophagoides i Eurogliphus, grinja skladištenja npr. Lepidoglifi, glicifag i tirofag, oni od bubašvaba, mušica i buva, npr. Blatella, Periplaneta, Chironomus i Ctenocepphalides, i oni od sisara kao što su mačke, psi i konji, alergeni otrova, uključujući one koji potiču od insekata koji ubadaju ili grizu, kao što su oni iz taksonomskog reda Himenoptera uključujući pčele (Apidae), ose (Vespidea), i mravi (Formicoidae).
[0042] U nekim primerima izvođenja, imunogen je tumorski antigen izabran između: (a) antigena raka testisa kao što su NI-ESO-1, SSKS2, SCP1 kao i polipeptida porodice RAGE, BAGE, GAGE i MAGE, na primer, GAGE-1, GAGE-2, MAGE-1, MAGE-2, MAGE-3, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6 i MAGE-12 (koji se mogu koristiti, na primer, za lečenje melanoma, pluća, glave i vrata , NSCLC, tumori dojke, gastrointestinalnog trakta i mokraćne bešike; (b) mutirani antigeni, na primer, p53 (povezan sa različitim čvrstim tumorima, npr., karcinom debelog creva, pluća, glave i vrata), p21/Ras (povezan sa, npr., melanomom, rakom pankreasa i kolorektalnim kancerom), CDK4 (povezan sa, npr., melanomom), MUM1 (povezan sa, na primer., melanomom), kaspaza-8 (povezana sa, na primer., rakom glave i vrata), CIA 0205 (povezan sa, na primer., rakom mokraćne bešike), HLA-A2-R1701, beta katenin (povezan sa, npr., melanomom), TCR (povezan sa, npr., T-ćelijskim ne-Hodgkin
1
limfomom), BCR-abl (povezan sa, npr., hroničnom mijelogenom leukemijom), triosefosfat izomeraza, KIA 0205, CDC-27 i LDLR-FUT; (c) prekomerno eksprimirani antigeni, na primer, galektin 4 (povezan sa, npr., kolorektalni karcinom), Galektin 9 (povezan sa, npr., Hodgkin bolešću), proteinaza 3 (povezana sa, na primer., hroničnom mijelogenom leukemijom), VT 1 (povezan sa, npr., raznim leukemijama), karboanhidraza (povezana sa, na primer., rakom bubrega), aldolaza A (povezana sa, na primer., rakom pluća), PRAME (povezan sa, na primer., melanomom), HER-2/neu (povezan sa, na primer., rakom dojke, debelog creva, pluća i jajnika), mamaglobin, alfa-fetoprotein (povezan sa, npr., hepatomom), KSA (povezan sa, na primer., kolorektalnim karcinomom), gastrin (povezan sa, na primer., rakom pankreasa i želuca), katalitički protein telomeraze, MUC-1 (povezan sa, npr., rakon dojke i jajnika), G-250 (povezan sa, na primer., karcinomon bubrežnih ćelija), p53 (povezan sa, na primer., rakon dojke, debelog creva) i karcinoembrionalni antigen (povezan sa, npr., rakom dojke, rakom pluća i karcinomom gastrointestinalnog trakta kao što je kolorektalni kancer); (d) zajednički antigeni, na primer, antigeni za diferencijaciju melanoma i melanocita kao što su MART-1/Melan A, gp100, MC1R, receptor hormona koji stimuliše melanocite, tirozinaza, protein srodan tirozinazi-1/TRP1 i protein povezan sa tirozinazom-2/TRP2 (povezan sa, npr., melanom); (e) antigeni povezani sa prostatom kao što su PAP, PSA, PSMA, PSH-P1, PSM-P1, PSM-P2, povezani sa npr., karcinomom prostate; (f) idiotipi imunoglobulina (povezani sa mijelomom i B ćelijskim limfomima, na primer). U određenim primerima izvođenja, imunogeni tumora uključuju, ali nisu ograničeni na, p15, Hom/Mel-40, H-Ras, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MIL-RAR, antigene virusa Epstein Barr, EBNA, humane antigene papiloma virusa (HPV), uključujući E6 i E7, antigene virusa hepatitisa B i C, antigene humanog limfotropnog virusa T-ćelija, TSP-180, p185erbB2, p180erbB-3, c-met, mn-23H1, TAG-72-4, CA 19-9, CA 72-4, CAM 17.1, NuMa, K-ras, p16, TAGE, PSCA, CT7, 43-9F, 5T4, 791 Tgp72, beta-HCG, BCA225, BTAA, CA 125, CA 15- 3 (CA 27.29\BCAA), CA 195, CA 242, CA-50, CAM43, CD68\KP1, CO-029, FGF-5, Ga733 (EpCAM), HTgp-175, M344, MA-50, MG7-Ag , MOV18, NB/70K, NI-CO-1, RCAS1, SDCCAG16, TA-90 (Mac-2 vezujući protein/protein povezan sa ciklofilinom C), TAAL6, TAG72, TLP, TPS i slično.
Farmaceutske kompozicije
[0043] Farmaceutske kompozicije pronalaska su za imunizaciju subjekata protiv različitih bolesti. Ove kompozicije će tipično uključiti i farmaceutski prihvatljiv nosač pored čestica.
1
Detaljna rasprava o farmaceutski prihvatljivim nosačima dostupna je u referenci 35.
[0044] Farmaceutska kompozicija pronalaska može da sadrži jedan ili više imunopotencijatora malih molekula. Na primer, kompozicija može uključivati TLR2 agonist (npr. Pam3CSK4), TLR4 agonist (na primer, aminoalkil glukozaminid fosfat, kao što je E6020), agonist TLR7 (npr. imikvimod), agonist TLR8 (npr. resikvimod) i/ili agonist TLR9 (npr. IC31). Bilo koji takav agonist idealno ima molekulsku masu od <2000Da. RNK je inkapsulirana, a u nekim primerima izvođenja takvi agonisti su takođe inkapsulirani sa RNK, ali u drugim primerima izvođenja su neinkapsulirani
[0045] Farmaceutske kompozicije pronalaska mogu uključivati čestice u običnoj vodi (npr. v.f.i.) ili u puferu na primer, fosfatni pufer, Tris pufer, boratni pufer, sukcinatni pufer, histidinski pufer ili citratni pufer. Puferske soli će obično biti uključene u opsegu 5-20 mM.
[0046] Farmaceutske kompozicije pronalaska mogu imati pH između 5.0 i 9.5 npr. između 6.0 i 8.0.
[0047] Kompozicije pronalaska mogu uključivati natrijumove soli (npr. natrijum hlorid) da daju toničnost. Koncentracija od 10±2 mg/ml NaCl je tipična npr. oko 9 mg/ml.
[0048] Kompozicije pronalaska mogu uključivati helatore metalnih jona. Oni mogu produžiti stabilnost RNK uklanjanjem jona koji mogu ubrzati hidrolizu fosfodiestera. Stoga kompozicija može uključivati jednu ili više od EDTA, EGTA, BAPTA, pentetinske kiseline, itd.. Takvi helatori su tipično prisutni između 10-500 uM npr. 0.1mM. Citratna so, kao što je natrijum citrat, takođe može delovati kao helator, dok je povoljno takođe da obezbedi pufersku aktivnost.
[0049] Farmaceutske kompozicije pronalaska mogu imati osmolalnost između 200 mOsm/kg i 400 mOsm/kg, npr. između 240-360 mOsm/kg, ili između 290-310 mOsm/kg.
[0050] Farmaceutske kompozicije pronalaska mogu da sadrže jedan ili više konzervansa, kao što su tiomersal ili 2-fenoksietanol. Poželjne su kompozicije bez žive, a mogu se pripremiti vakcine bez konzervansa.
[0051] Farmaceutske kompozicije pronalaska su poželjno sterilne.
[0052] Farmaceutske kompozicije pronalaska su poželjno nepirogene npr. koje sadrže <1 EU (jedinica endotoksina, standardna mera) po dozi, a poželjno <0.1 EU po dozi.
[0053] Farmaceutske kompozicije pronalaska su poželjno bez glutena.
[0054] Farmaceutske kompozicije pronalaska se mogu pripremiti u obliku jedinične doze. U nekim primerima izvođenja, jedinična doza može imati zapreminu između 0.1-1.0 ml npr. oko 0.5 ml.
[0055] Kompozicije se mogu pripremiti kao injekcije, bilo kao rastvori ili suspenzije.
1
Kompozicija se može pripremiti za plućnu primenu npr. pomoću inhalatora, koristeći fini sprej. Kompozicija se može pripremiti za nazalnu, ušnu ili okularnu primenu npr. kao sprej ili kapi. Tipične su injekcije za intramuskularnu primenu.
[0056] Kompozicije sadrže imunološki efikasnu količinu čestica, kao i bilo koje druge komponente, po potrebi. Pod 'imunološki efikasnom količinom', podrazumeva se da je primena te količine pojedincu, bilo u jednoj dozi ili kao deo serije, efikasna za lečenje ili prevenciju. Ovaj iznos varira u zavisnosti od zdravlja i fizičkog stanja pojedinca koji se leči, starosti, taksonomske grupe pojedinca koji se leči (npr. ne-humani primat, primat, itd.), kapaciteta imunog sistema pojedinca da sintetiše antitela, željenog stepena zaštite, formulacije vakcine, procene medicinske situacije od strane lekara i drugih relevantnih faktora. Očekuje se da će količina biti u relativno širokom rasponu koji se može utvrditi kroz rutinska ispitivanja. Sadržaj čestica i RNK u kompozicijama pronalaska će generalno biti izražen u smislu količine RNK po dozi. Poželjna doza ima ≤100µg RNK (npr. od 10-100µg, kao što je oko 10µg, 25µg, 50µg, 75µg ili 100µg), ali ekspresija se može videti na mnogo nižim nivoima npr. ≤1µg/doza, ≤100ng/doza, ≤10ng/doza, ≤1ng/doza, itd. Pronalazak takođe obezbeđuje uređaj za isporuku (npr. špric, nebulizator, raspršivač, inhalator, kožni flaster, itd.) koji sadrže farmaceutsku kompoziciju pronalaska. Ovaj uređaj se može koristiti za davanje kompozicije kičmenjaku.
[0057] Čestice pronalaska ne uključuju ribozome.
Medicinske upotrebe
[0058] Za razliku od čestica otkrivenih u referenci 16, farmaceutske kompozicije pronalaska su za in vivo upotrebu za izazivanje imunog odgovora protiv imunogena od interesa.
[0059] Imuni odgovor je poželjno zaštitni i poželjno uključuje antitela i/ili ćelijski posredovan imunitet. Može doći do pojačanog odgovora.
[0060] Pronalazak takođe obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju pronalaska za upotrebu u postupku za podizanje imunog odgovora kod kičmenjaka.
[0061] Podizanjem imunog odgovora kod kičmenjaka ovim upotrebama, kičmenjak se može zaštititi od različitih bolesti i/ili infekcija npr. protiv bakterijskih i/ili virusnih bolesti kao što je prethodno diskutovano. Kompozicije su imunogene i poželjnije su kompozicije vakcine. Vakcine prema pronalasku mogu biti ili profilaktičke (tj. za sprečavanje infekcije) ili terapijske (tj. za lečenje infekcije), ali će obično biti profilaktičke.
[0062] Poželjno je da je kičmenjak sisar, kao što je čovek ili veliki veterinarski sisar (npr.
1
konji, goveda, jeleni, koze, svinje). Tamo gde je vakcina za profilaktičku upotrebu, čovek je poželjno dete (npr. malo dete ili novorođenče) ili tinejdžer; gde je vakcina za terapeutsku upotrebu, čovek je poželjno tinejdžer ili odrasla osoba. Vakcina namenjena deci može se davati i odraslima npr. da se proceni bezbednost, doza, imunogenost, itd.
[0063] Vakcine pripremljene prema pronalasku mogu se koristiti za lečenje i dece i odraslih. Dakle, humani pacijent može biti star manje od 1 godine, manje od 5 godina, 1-5 godina, 5-15 godina, 15-55 godina ili najmanje 55 godina. Poželjni pacijenti za primanje vakcina su starije osobe (npr. ≥50 godina, ≥60 godina, a poželjno ≥65 godina), mladi (npr. ≤5 godina), hospitalizovani pacijenti, zdravstveni radnici, pripadnici oružanih snaga i vojnog osoblja, trudnice, hronični bolesnici ili pacijenti sa imunodeficijencijom. Međutim, vakcine nisu pogodne samo za ove grupe i mogu se koristiti generalno u populaciji.
[0064] Kompozicije pronalaska će se generalno davati direktno pacijentu. Direktna isporuka se može postići parenteralnom injekcijom (npr. subkutano, intraperitonealno, intravenozno, intramuskularno, intradermalno ili u intersticijski prostor tkiva; za razliku od reference 1, intraglosalna injekcija se obično ne koristi sa ovim pronalaskom). Alternativni putevi isporuke uključuju rektalni, oralni (npr. tableta, sprej), bukalni, sublingvalni, vaginalni, lokalni, transdermalni ili transkutani, intranazalni, okularni, auralni, plućni ili drugi mukozni način primene. Intradermalna i intramuskularna primena su dva poželjna načina. Injekcija može biti putem igle (npr. hipodermička igla), ali se alternativno može koristiti injekcija bez igle. Tipična intramuskularna doza je 0.5 ml.
[0065] Pronalazak se može koristiti za izazivanje sistemskog i/ili mukoznog imuniteta, poželjno za izazivanje poboljšanog sistemskog i/ili mukoznog imuniteta.
[0066] Doziranje može biti prema rasporedu jedne doze ili rasporedu višestrukih doza. Višestruke doze se mogu koristiti u rasporedu primarne imunizacije i/ili u rasporedu dopunske imunizacije. U rasporedu višestrukih doza različite doze se mogu davati istim ili različitim putevima npr. parenteraln prajming i mukozni buster, mukozni prajming i parenteralni buster, itd. Više doza će se obično davati u razmaku od najmanje 1 nedelje (npr. oko 2 nedelje, oko 3 nedelje, oko 4 nedelje, oko 6 nedelja, oko 8 nedelja, oko 10 nedelja, oko 12 nedelja, oko 16 nedelja, itd.). U jednom aspektu, višestruke doze se mogu primeniti približno 6 nedelja, 10 nedelja i 14 nedelja nakon rođenja, npr. u dobi od 6 nedelja, 10 nedelja i 14 nedelja, kako se često koristi u Proširenom programu imunizacije Svetske zdravstvene organizacije („EPI“). U alternativnom izvođenju, dve primarne doze se daju u razmaku od oko dva meseca, npr. u razmaku od oko 7, 8 ili 9 nedelja, nakon čega sledi jedna ili više buster doza oko 6 meseci do 1 godine nakon druge primarne doze, npr. oko 6, 8, 10 ili
1
12 meseci nakon druge primarne doze. U daljem izvođenju, tri primarne doze se daju u razmaku od oko dva meseca, npr. u razmaku od oko 7, 8 ili 9 nedelja, nakon čega sledi jedna ili više buster doza oko 6 meseci do 1 godine nakon treće primarne doze, npr. oko 6, 8, 10 ili 12 meseci nakon treće primarne doze.
Opšti primeri izvođenja
[0067] U nekim primerima izvođenja pronalaska, RNK ne uključuje modifikovane nukleotide (videti gore). U drugim primerima izvođenja, RNK može opciono da uključi najmanje jedan modifikovani nukleotid, pod uslovom da je takođe potrebno jedno ili više od sledećih karakteristika (već otkrivenih gore):
A. Kada se RNK isporučuje sa lipozomom, lipozom sadrži DSDMA, DODMA, DLinDMA i/ili DLenDMA
B. Tamo gde je RNK inkapsulirana u lipozomu, hidrofilni deo lipida u lipozomu je PEGilovan.
C. Tamo gde je RNK inkapsulirana u lipozomu, najmanje 80% broja lipozoma ima prečnik u opsegu od 20 do 220 nm.
D. RNK ima 3' poli A rep, a imunogen može izazvati imuni odgovor in vivo protiv bakterije, virusa, gljivice ili parazita.
E. RNK se isporučuje u kombinaciji sa helatorom metalnih jona sa sistemom isporuke koji su lipozomi.
Opšte
[0068] Praksa ovog pronalaska će koristiti, osim ako nije drugačije naznačeno, konvencionalne postupaka hemije, biohemije, molekularne biologije, imunologije i farmakologije, u okviru tehnike. Takve tehnike su u potpunosti objašnjene u literaturi. Videti, na primer, reference 36-42, itd.
[0069] Termin "sastoji" obuhvata "uključujući" kao i "sastoji se od" npr. kompozicija "koja sadrži" X može se sastojati isključivo od X ili može uključivati nešto dodatno npr. X+ Y.
[0070] Termin „oko“ u odnosu na brojčanu vrednost X je opciono i znači, na primer, X ±10%.
[0071] Reč "u suštini" ne isključuje "potpuno" npr. kompozicija koja je "suštinski oslobođena" od Y može biti potpuno slobodna od Y. Gde je potrebno, reč "u suštini" može biti izostavljena iz definicije pronalaska.
2
[0072] Reference na naelektrisanje, katjone, anjone, cviterione, itd., uzimaju se na pH 7.
[0073] TLR3 je receptor 3 sličan Tollu. To je jedan receptor koji se proteže kroz jednu membranu i igra ključnu ulogu u urođenom imunološkom sistemu. Poznati agonisti TLR3 uključuju poli(I:C). „TLR3“ je odobreni naziv HGNC za gen koji kodira ovaj receptor, a njegov jedinstveni HGNC ID je HGNC: 11849. RefSeq sekvenca za ljudski TLR3 gen je GI:2459625.
[0074] TLR7 je receptor 7 sličan Tollu. To je jedan receptor koji se proteže kroz jednu membranu i igra ključnu ulogu u urođenom imunološkom sistemu. Poznati agonisti TLR7 uključuju npr. imikvimod. „TLR7“ je odobreni naziv HGNC za gen koji kodira ovaj receptor, a njegov jedinstveni HGNC ID je HGNC: 15631. RefSeq sekvenca za ljudski TLR7 gen je GI:67944638.
[0075] TLR8 je receptor 8 sličan Tollu. To je receptor koji se proteže kroz jednu membranu i igra ključnu ulogu u urođenom imunološkom sistemu. Poznati agonisti TLR8 uključuju npr. resikvimod. „TLR8“ je odobreni naziv HGNC za gen koji kodira ovaj receptor, a njegov jedinstveni HGNC ID je HGNC:15632. RefSeq sekvenca za humani TLR8 gen je GI:20302165.
[0076] Porodica receptora sličnih RIG-I („RLR“) uključuje različite RNK helikaze koje igraju ključnu ulogu u urođenom imunom sistemu[43]. RLR-1 (takođe poznat kao RIG-I ili gen I koji indukuje retinoičnu kiselinu) ima dva domena za regrutovanje kaspaze blizu svog N-kraja. Odobreni naziv HGNC za gen koji kodira RLR-1 helikazu je „DDKS58“ (za DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) boks polipeptid 58) i jedinstveni HGNC ID je HGNC:19102. RefSeq sekvenca za ljudski gen RLR-1 je GI:77732514. RLR-2 (takođe poznat kao MDA5 ili gen 5 povezan sa diferencijacijom melanoma) takođe ima dva domena za regrutovanje kaspaze blizu svog N-kraja. Odobreni naziv HGNC za gen koji kodira RLR-2 helikazu je „IFIH1“ (za interferon indukovan domenom helikaze C 1), a jedinstveni HGNC ID je HGNC:18873. RefSeq sekvenca za ljudski RLR-2 gen je GI: 27886567. RLR-3 (takođe poznat kao LGP2 ili laboratorija za genetiku i fiziologiju 2) nema domene za regrutovanje kaspaze. Odobreni naziv HGNC za gen koji kodira RLR-3 helikazu je „DHKS58“ (za DEKSH (Asp-Glu-Ks-His) kutija polipeptida 58) i jedinstveni HGNC ID je HGNC:29517. RefSeq sekvenca za ljudski gen RLR-3 je GI:149408121.
[0077] PKR je dvolančana RNK zavisna protein kinaza. Ona igra ključnu ulogu u urođenom imunom sistemu. „EIF2AK2“ (za eukariotski faktor inicijacije translacije 2-alfa kinazu 2) je odobreno HGNC ime za gen koji kodira ovaj enzim, a njegov jedinstveni HGNC ID je HGNC:9437. RefSeq sekvenca za ljudski PKR gen je GI:208431825.
KRATAK OPIS CRTEŽA
[0078]
Slika 1 prikazuje gel sa obojenom RNK. Trake pokazuju (1) markere (2) goli replikon (3) replikon nakon tretmana RNazom (4) replikon inkapsuliran u lipozomu (5) lipozom nakon tretmana RNazom(6) lipozom tretiran RNazom zatim podvrgnut ekstrakciji fenolom/hloroformom.
Slika 2 je elektronska mikrografija lipozoma.
Slika 3 prikazuje ekspresiju proteina (kao relativne svetlosne jedinice, RLU) u danima 1, 3 i 6 nakon isporuke RNK u vidu viriona upakovanog replikona (kvadrati), gole RNK (trouglovi) ili kao mikročestice (krugovi).
Slika 4 prikazuje gel sa obojenom RNK. Trake pokazuju (1) markere (2) goli replikon (3) replikon inkapsuliran u lipozomu (4) lipozom tretiran RNazom zatim podvrgnut ekstrakciji fenolom/hloroformom.
Slika 5 prikazuje ekspresiju proteina u danima 1, 3 i 6 nakon isporuke RNK u vidu replikona upakovanog virionima (kvadrati), kao gole RNK (rombine), ili u lipozomima (+ = 0.1 µg, k = 1 µg).
Slika 6 prikazuje ekspresiju proteina u danima 1, 3 i 6 nakon isporuke četiri različite doze RNK inkapsulirane u lipozomima.
Slika 7 prikazuje titre anti-F IgG kod životinja koje primaju replikon upakovan u virion (VRP ili VSRP), 1 µg gole RNK i 1 µg RNK inkapsulirane u lipozomima.
Slika 8 prikazuje titre anti-F IgG kod životinja koje primaju VRP, 1 µg gole RNK i 0.1 g ili 1 µg inkapsulirane RNK u lipozomima.
Slika 9 prikazuje titre neutralizujućih antitela kod životinja koje primaju VRP ili 0.1 g ili 1 µg RNK inkapsulirane lipozomima.
Slika 10 prikazuje nivoe ekspresije nakon isporuke replikona kao gola RNK (krugovi), RNK inkapsulirana u lipozomima (trougao i kvadrat) ili kao lipopleks (obrnuti trougao).
Slika 11 prikazuje F-specifične titre IgG (2 nedelje nakon druge doze) nakon isporuke replikona kao gole RNK (0.01-1 µg), RNK inkapsulirane u lipozomima (0.01-10 µg) ili pakovane kao virion (VRP, 10<6>infektivne jedinice ili IU).
Slika 12 prikazuje F-specifične IgG titre (krugovi) i PRNT titre (kvadrati) nakon isporuke replikona kao gole RNK (1µg), RNK inkapsulirane u lipozomima (0.1 ili 1µg) ili pakovane kao virion (VRP, 10<6>IU). Prikazani su i titri kod naivnih miševa. Pune linije pokazuju geometrijske sredine.
Slika 13 prikazuje intracelularnu proizvodnju citokina nakon restimulacije sa sintetičkim peptidima koji predstavljaju glavne epitope u F proteinu, 4 nedelje nakon druge doze. Y-osa prikazuje % citokina+ CD8+CD4-.
Slika 14 prikazuje F-specifične IgG titre (srednji log10titri ± std dev) tokom 63 dana (Slika 14A) i 210 dana (Slika 14B) nakon imunizacije teladi. Tri linije se lako razlikuju 63. dana i to su, odozdo prema gore: PBS negativna kontrola; RNK isporučena lipozomima; i proizvod „Triangle 4“.
Slika 15 prikazuje anti-HIV serum IgG titre kao odgovor na golu („RNK“) ili RNK inkapsuliranu u lipozomima („LNP“) ili na DNK isporučenu elektroporacijom u mišiće. Slika 16 prikazuje titre IgG u 13 grupa miševa. Svaki krug je pojedinačni miš, a pune linije pokazuju geometrijske sredine. Isprekidana horizontalna linija je granica detekcije testa. 13 grupa su, s leva na desno, od A do M kao što je opisano u nastavku.
Slika 17 prikazuje (A) IL-6 i (B) IFNα (pg/ml) koje oslobađa pDC. Postoje 4 para kolona, s leva na desno: kontrola; imunizovan sa RNK+DOTAP; imunizovan sa RNK+lipofektamin; i imunizovan sa RNK u lipozomima. U svakom paru crna traka su miševi divljeg tipa, a siva je rsk1 mutant.
NAČINI ZA IZVOĐENJE PRONALASKA
RNK replikoni
[0079] U nastavku se koriste različiti replikoni. Generalno, oni su zasnovani na hibridnom genomu alfavirusa sa nestrukturnim proteinima iz venecuelanskog virusa konjskog encefalitisa (VEEV), signalu pakovanja od sindbis virusa i 3' UTR iz Sindbis virusa ili VEEV mutanta. Replikon je dugačak oko 10 kb i ima poli-A rep.
[0080] Plazmidna DNK koja kodira replikone alfavirusa (nazvana: pT7-mVEEV-FL.RSVF ili A317; pT7-mVEEV-SEAP ili A306; pSP6-VCR-GFP ili A50) služila je kao šablon za sintezu RNK in vitro. Replikoni sadrže genetske elemente alfavirusa koji su potrebni za replikaciju RNK, ali nemaju one koji kodiraju genske proizvode neophodne za sklapanje čestica; strukturni proteini su umesto toga zamenjeni proteinom od interesa (bilo reporterom, kao što je SEAP ili GFP, ili imunogenom, kao što je RSV F protein pune dužine) i tako replikoni nisu u stanju da indukuju stvaranje infektivnih čestica. Promotor bakteriofaga (T7 ili SP6) uzvodno od cDNK alfavirusa olakšava sintezu replikonske RNK in vitro a ribozim
2
virusa hepatitisa delta (HDV) odmah nizvodno od poli(A)-repa generiše ispravan 3'-kraj svojom aktivnošću samocepanja.
[0081] Nakon linearizacije plazmidne DNK nizvodno od HDV ribozima sa odgovarajućom restrikcionom endonukleazom, run-off transkripti su sintetisani in vitro korišćenjem T7 ili SP6 bakteriofaga izvedene od DNK zavisne RNK polimeraze. Transkripcije su vršene 2 sata na 37°C u prisustvu 7.5 mM (T7 RNK polimeraza) ili 5 mM (SP6 RNK polimeraza) svakog od nukleozid trifosfata (ATP, CTP, GTP i UTP) prema uputstvima koja je dao proizvođač (Ambion). Nakon transkripcije, šablon DNK je digestiran sa TURBO DNase (Ambion). Replikon RNK je precipitiran sa LiCl i rekonstituisan u vodi bez nukleaza. Na RNK bez kape dodata je kapa posle transkripcije sa Vaccinia Capping Enzime (VCE) korišćenjem sistema za dodavanje kape ScriptCap m7G (Epicentre Biotechnologies) kao što je navedeno u korisničkom priručniku; ovako ograničenim replikonima se daje prefiks "v", npr. vA317 je replikon A317 koji je ograničen VCE. RNK kojoj je post-transkripciono dodata kapa je precipitirana sa LiCl i rekonstituisana u vodi bez nukleaza. Koncentracija uzoraka RNK određena je merenjem OD260nm. Integritet in vitro transkripata je potvrđen elektroforezom denaturišućeg agaroznog gela.
PLG adsorpcija (referentni primer)
[0082] Mikročestice su napravljene korišćenjem 500 mg PLG RG503 (50:50 laktid/glikolid molarni odnos, MV ~30 kDa) i 20 mg DOTAP-a korišćenjem Omni Macro Homogenizer. Suspenzija čestica je mućkana na 150 rpm preko noći, a zatim filtrirana kroz sterilni filter od 40 µm za čuvanje na 2-8 °C. RNK koja se samoreplicira je adsorbovana na čestice. Da bi se pripremio 1 mL suspenzije PLG/RNK, potrebna zapremina suspenzije PLG čestica je dodata u bočicu i dodata je voda bez nukleaza da bi se zapremina dovela do 900 µL. 100 µL RNK (10 µg/mL) je dodato u kapima u PLG suspenziju, uz stalno mućkanje. PLG/RNK je inkubirana na sobnoj temperaturi 30 min. Za 1 mL rekonstituisane suspenzije dodato je 45 mg manitola, 15 mg saharoze i 250-500 µg PVA. Bočice su zamrznute na -80°C i liofilizovane.
[0083] Da bi se procenila adsorpcija RNK, suspenzija čestica od 100 µL je centrifugirana na 10.000 rpm tokom 5 minuta i supernatant je sakupljen. PLG/RNK je rekonstituisan korišćenjem 1 mL vode bez nukleaze. U 100 µL suspenzije čestica (1 µg RNK), dodat je 1 mg heparin sulfata. Smeša je mešana na vorteksu i ostavljena da odstoji na sobnoj temperaturi 30 min za desorpciju RNK. Suspenzija čestica je centrifugirana i supernatant je sakupljen.
[0084] Za stabilnost RNKaze, suspenzija od 100 µL čestica je inkubirana sa 6.4 mAU RNKaze A na sobnoj temperaturi 30 min. RNKaza je inaktivirana sa 0.126 mAU proteinaze K na 55°C tokom 10 min. Dodato je 1 mg heparin sulfata da bi se desorbovala RNK, a zatim je usledilo centrifugiranje. Uzorci supernatanta koji sadrže RNK su pomešani sa formaldehidnom bojom za punjenje, zagrevani na 65°C tokom 10 minuta i analizirani korišćenjem 1% denaturacionog gela (460 ng RNK napunjenih po traci).
[0085] Da bi se procenila ekspresija, Balb/c miševi su imunizovani sa 1 µg RNK u 100 µL zapremine intramuskularne injekcije (50 µL/noga) dana 0. Serumi su sakupljeni 1, 3 i 6 dana. Ekspresija proteina je određena korišćenjem hemiluminescentnog testa. Kao što je prikazano na slici 3, ekspresija je bila veća kada je RNK isporučena pomoću PLG (trouglovi) nego bez ikakvih čestica za isporuku (krugovi).
Lipozomalna inkapsulacija
[0086] RNK je inkapsulirana u lipozome napravljene postupkom iz referenci 7 i 44. Lipozomi su napravljeni od 10% DSPC (cviterjonski), 40% DlinDMA (katjonski), 48% holesterola i 2% PEG-konjugovanog DMG (2kDa PEG). Ove proporcije se odnose na % mola u ukupnom lipozomu.
[0087] DlinDMA (1.2-dilinoleiloksi-N,N-dimetil-3-aminopropan) je sintetizovan korišćenjem procedure iz reference 2. DSPC (1.2-Diastearoil-sn-glicero-3-fosfoholin) je nabavljen od Genzime. Holesterol je dobijen od Sigma-Aldrich. PEG-konjugovani DMG (1.2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamin-N-[metoksi(polietilen glikol), amonijum so), DOTAP (1.2-dioleoil-3-trimetilamonijum-propan, hloridna so) i DC-hol (3β-[N-(N',N'-dimetilaminoetan)-karbamoil]holesterol hidrohlorid) su iz Avanti Polar Lipids.
[0088] Ukratko, lipidi su rastvoreni u etanolu (2ml), replikon RNK je rastvoren u puferu (2ml, 100mM natrijum citrat, pH 6) i oni su pomešani sa 2ml pufera nakon čega je usledio 1 sat ekvilibracije. Smeša je razblažena sa 6 ml pufera, a zatim filtrirana. Dobijeni proizvod je sadržao lipozome, sa ~95% efikasnosti inkapsulacije.
[0089] Na primer, u jednom posebnom postupku, sveži osnovni rastvori lipida su pripremljeni u etanolu. 37 mg DlinDMA, 11.8 mg DSPC, 27.8 mg holesterola i 8.07 mg PEG-DMG je izmereno i rastvoreno u 7.55 mL etanola. Sveže pripremljeni osnovni rastvor lipida je lagano mućkan na 37°C oko 15 min da bi se formirala homogena smeša. Zatim je 755 µL matičnog materijala dodato u 1.245 mL etanola da bi se napravio radni osnovni
2
rastvor lipida od 2 mL. Ova količina lipida je korišćena za formiranje lipozoma sa 250 µg RNK. Radni rastvor RNK od 2 mL je takođe pripremljen iz osnovnog rastvora od ~1 µg/µL u 100 mM citratnog pufera (pH 6). Tri staklene bočice od 20 mL (sa šipkama za mešanje) su isprane rastvorom RNase Away (Molecular BioProducts) i isprane sa puno MilliQ vode pre upotrebe da bi se dekontaminirale bočice od RNaze. Jedna od bočica je korišćena za radni rastvor RNK, a druge za sakupljanje mešavine lipida i RNK (kao što je kasnije opisano). Radni rastvori lipida i RNK su zagrevani na 37°C tokom 10 minuta pre nego što su stavljeni u 3cc luer-lok špriceve. 2 mL citratnog pufera (pH 6) je stavljeno u drugi špric od 3 cc. Špricevi koji sadrže RNK i lipide su povezani na T mikser (PEEK<™>500 µm ID spoj, Idex Health Science) korišćenjem FEP cevi (fluorovani etilen-propilen; sve korišćene FEP cevi imale su unutrašnji prečnik 2 mm i spoljašnji prečnik 3 mm; dobijeno od Idex Health Science). Izlaz iz T miksera je takođe bio FEP cev. Treći špric koji je sadržao citratni pufer povezan je sa zasebnim komadom cevi. Svi špricevi su zatim pokretani brzinom protoka od 7 mL/min pomoću pumpe za špriceve. Izvodi epruvete su postavljeni da sakupljaju smeše u staklenu bočicu od 20 mL (uz mešanje). Mešalica je izvađena i etanol/vodeni rastvor je ostavljen da se uravnoteži na sobnoj temperaturi 1 h.4 ml smeše je stavljeno u špric od 5 cc, koji je bio spojen na komad FEP cevi i u drugom špricu od 5 cc spojenom na FEP cev iste dužine, jednaka količina 100 mM citratnog pufera (pH 6) je bila natovarena. Dva šprica su pokretana brzinom protoka od 7 mL/min korišćenjem pumpe za špric, a konačna smeša je sakupljena u staklenu bočicu od 20 mL (uz mešanje). Zatim, smeša sakupljena iz drugog koraka mešanja (lipozomi) je propuštena kroz Mustang Q membranu (podloga za izmenu anjona koja vezuje i uklanja anjonske molekule, dobijena od Pall Corporation). Pre upotrebe ove membrane za lipozome, kroz nju je sukcesivno propušteno 4 mL 1 M NaOH, 4 mL 1 M NaCl i 10 mL 100 mM citratnog pufera (pH 6). Lipozomi su zagrevani 10 minuta na 37°C pre nego što su prošli kroz membranu. Zatim, lipozomi su koncentrovani do 2 mL i dijalizovani nasuprot 10-15 zapremina IX PBS korišćenjem filtracije tangencijalnog protoka pre dobijanja konačnog proizvoda. TFF sistem i filterske membrane sa šupljim vlaknima su kupljeni od Spectrum Labs (Rancho Dominguez) i korišćeni su u skladu sa uputstvima proizvođača. Korišćena je filtraciona membrana od polisulfonskih šupljih vlakana sa ograničenjem veličine pora od 100 kD i površinom od 8 cm<2>. Za in vitro i in vivo eksperimente formulacije su razblažene do potrebne koncentracije RNK sa X PBS. Dalji postupci proizvodnje lipozoma su otkriveni u nastavku.
[0090] Slika 2 prikazuje primer elektronske mikrografije lipozoma pripremljenih ovim postupcima. Ovi lipozomi sadrže inkapsuliranu RNK koja kodira RSV F antigen pune dužine.
2
Dinamičko rasipanje svetlosti jedne serije pokazalo je prosečan prečnik od 141 nm (po intenzitetu) ili 78 nm (po broju).
[0091] Procenat inkapsulirane RNK i koncentracije RNK određen je Quant-iT RiboGreen RNK kompletom reagensa (Invitrogen), prateći uputstva proizvođača. Standard ribosomske RNK koji se nalazi u kompletu je korišćen za generisanje standardne krive. Lipozomi su razblaženi 10x ili 100x u IX TE puferu (iz kompleta) pre dodavanja boje. Odvojeno, lipozomi su razblaženi 10x ili 100x u IX TE puferu koji sadrži 0.5% Triton X pre dodavanja boje (da bi se poremetili lipozomi i na taj način ispitala ukupna RNK). Nakon toga je jednaka količina boje dodata svakom rastvoru, a zatim je ~180 µL svakog rastvora nakon dodavanja boje stavljeno u duplikatu u ploču za kulturu tkiva sa 96 bunarčića. Fluorescencija (Ek 485 nm, Em 528 nm) je očitana na čitaču mikroploče. Sve formulacije lipozoma su dozirane in vivo na osnovu inkapsulirane količine RNK.
[0092] Pokazalo se da inkapsulacija u lipozomima štiti RNK od digestije sa RNKazom. Eksperimenti su koristili 3.8 mAU RNKaze A po mikrogramu RNK, inkubirane 30 minuta na sobnoj temperaturi. RNaza je inaktivirana proteinazom K na 55°C tokom 10 minuta. Zatim je dodata mešavina uzorka 1:1 zapr/zapr do 25:24:1 zapr/zapr/zapr, fenol:hloroform:izoamil alkohol da bi se RNK ekstrahovala iz lipida u vodenu fazu. Uzorci su mešani vrtložnim mešanjem nekoliko sekundi, a zatim stavljeni na centrifugu na 15 minuta na 12x RPM. Vodena faza (koja sadrži RNK) je uklonjena i korišćena za analizu RNK. Pre punjenja (400 ng RNK po bunarčiću) svi uzorci su inkubirani sa bojom za punjenje formaldehida, denaturisani 10 minuta na 65°C i ohlađeni na sobnu temperaturu. Ambion Millennium markeri su korišćeni za aproksimaciju molekulske težine RNK konstrukta.
[0093] Gel je radio na 90 V. Gel je obojen korišćenjem 0.1% SYBR gold prema uputstvima proizvođača u vodi ljuljanjem na sobnoj temperaturi 1 sat. Slika 1 pokazuje da RNaza potpuno digestira RNK u odsustvu inkapsulacije (traka 3). RNK se ne može detektovati nakon inkapsulacije (traka 4) i nikakva promena se ne vidi ako se ovi lipozomi tretiraju RNazom (traka 4). Nakon što su lipozomi tretirani RNazom podvrgnuti ekstrakciji fenola, vidi se nedigestovana RNK (traka 6). Čak i posle 1 nedelje na 4°C, RNK se mogla videti bez ikakve fragmentacije (Slika 4, strelica). Ekspresija proteina in vivo je nepromenjena nakon 6 nedelja na 4°C i jednog ciklusa zamrzavanja-odmrzavanja. Tako je RNK inkapsulirana u lipozomima stabilna.
[0094] Da bi se procenila in vivo ekspresija RNK, enzim reporter (SEAP; izlučena alkalna fosfataza) je kodiran u replikonu, a ne imunogen (referentni primer). Nivoi ekspresije su mereni u serumima razblaženim 1:4 u puferu za razblaživanje IX Phospha-Light korišćenjem
2
hemiluminescentnog alkalnog fosfatnog supstrata. BALB/c miševima starim od 8-10 nedelja (5/grupa) je ubrizgano intramuskularno dana 0, 50 µl po nozi sa dozom od 0.1 µg ili 1 µg RNK. Isti vektor je takođe primenjen bez lipozoma (u IX PBS bez RNaze) u dozi od 1 ug. Takođe su testirani replikoni upakovani u virion. Replikoni upakovani virionom koji se ovde koriste (koji se nazivaju „VRPs“) dobijeni su postupcima reference 45, gde je replikon alfavirusa izveden iz mutantnog VEEV ili himere izvedene iz genoma VEEV konstruisanog da sadrži 3' UTR od Sindbis virus i signal za pakovanje Sindbis virusa (PS), upakovani koelektroporacijom u BHK ćelije sa defektnim pomoćnim RNK koje kodiraju kapsid i glikoproteinske gene Sindbis virusa.
[0095] Kao što je prikazano na Slici 5, inkapsulacija je povećala nivoe SEAP-a za oko 1⁄2 log pri dozi od 1 µg, a 6. dana ekspresija od 0.1 µg inkapsulirane doze odgovara nivoima uočenim sa neinkapsuliranom dozom od 1 µg. Do 3. dana nivoi ekspresije su premašili one postignute sa VRP (kvadrati). Stoga se ekspresija povećala kada je RNK formulisana u lipozomima u odnosu na kontrolu gole RNK, čak i pri 10 puta nižoj dozi. Ekspresija je takođe bila veća u odnosu na VRP kontrolu, ali je kinetika ekspresije bila veoma različita (videti sliku 5). Isporuka RNK elektroporacijom je rezultovala povećanom ekspresijom u odnosu na kontrolu gole RNK, ali ovi nivoi su bili niži nego kod lipozoma.
[0096] Dalji SEAP eksperimenti su pokazali jasan odgovor na dozu in vivo, sa ekspresijom koja se vidi nakon isporuke od samo 1ng RNK (slika 6). Dalji eksperimenti sa upoređivanjem ekspresije iz inkapsuliranih i golih replikona pokazali su da je 0.01 µg inkapsulirane RNK ekvivalentno 1 µg gole RNK. U dozi od 0.5 µg RNK, inkapsulirani materijal je dao 12 puta veću ekspresiju 6. dana; pri dozi od 0.1 µg nivoi doze su bili 24 puta veći 6. dana.
[0097] Umesto da se posmatraju prosečni nivoi u grupi, proučavane su i pojedinačne životinje. Dok nekoliko životinja nije reagovalo na gole replikone, inkapsulacija je eliminisala one koji nisu reagovali.
[0098] Dalji eksperimenti zamenili su DlinDMA sa DOTAP. Iako su DOTAP lipozomi dali bolju ekspresiju od golog replikona, bili su inferiorni u odnosu na DlinDMA lipozome (razlika od 2 do 3 puta prvog dana).
[0099] Za procenu in vivo imunogenosti replikon je konstruisan da eksprimira F protein pune dužine iz respiratornog sincicijalnog virusa (RSV). Ovo je isporučeno golo (1 µg), inkapsulirano u lipozome (0.1 ili 1 µg) ili upakovano u virione (10<6>IU; "VRP") u danima 0 i 21. Slika 7 pokazuje titre anti-F IgG 2 nedelje nakon druge doze, a lipozomi jasno povećavaju imunogenost. Slika 8 prikazuje titre 2 nedelje kasnije, do kada nije bilo statističke razlike između inkapsulirane RNK od 0.1 µg, inkapsulirane RNK od 1 µg ili VRP grupe.
2
Titri neutralizacije (mereni kao smanjenje plaka od 60%, "PRNT60") nisu se značajno razlikovali u ove tri grupe 2 nedelje nakon druge doze (Slika 9). Slika 12 prikazuje titre IgG i PRNT 4 nedelje nakon druge doze.
[0100] Slika 13 potvrđuje da RNK izaziva snažan odgovor CD8 T ćelija.
[0101] Dalji eksperimenti su upoređivali titre F-specifičnih IgG kod miševa koji su primali VRP, 0.1 µg RNK inkapsulirane lipozomima ili 1 µg RNK inkapsulirane lipozomima. Odnosi titra (VRP: lipozom) u različitim vremenima nakon druge doze bili su sledeći:
[0102] Stoga RNK inkapsulirana u lipozomima indukuje u suštini istu veličinu imunog odgovora kao što se vidi kod isporuke viriona.
[0103] Dalji eksperimenti su pokazali superiorne F-specifične IgG odgovore sa dozom od 10 µg, ekvivalentne odgovore za doze od 1 µg i 0.1 µg i niži odgovor sa dozom od 0.01 µg. Slika 11 prikazuje titre IgG kod miševa koji primaju replikon u golom obliku u 3 različite doze, u lipozomima u 4 različite doze, ili kao VRP (10<6>IU). Odgovor uočen sa RNK inkapsuliranom lipozomima od 1 µg nije bio statistički značajan (ANOVA) u poređenju sa VRP, ali je veći odgovor primećen sa RNK inkapsuliranom u lipozomima od 10 µg bio statistički značajan (p<0.05) u poređenju sa obe ove grupe.
[0104] Dalja studija je potvrdila da je 0.1 µg inkapsulirane RNK u lipozomima dalo mnogo veće anti-F IgG odgovore (15 dana nakon druge doze) od 0.1 µg isporučene DNK, i čak je bilo imunogenije od 20 µg plazmidne DNK koji kodira F antigen, isporučuje se elektroporacijom (Elgen<™>Sistem za isporuku DNK, Inovio).
[0105] Miševi su pokazali nekoliko vizuelnih znakova uznemirenosti (gubitak težine, itd.) nakon primanja replikona RNK inkapsulirane u lipozomima, iako je primećen prolazni gubitak težine od 3-4% nakon druge doze od 10 µg RNK. Nasuprot tome, isporuka 10 µg DNK inkapsulirane u lipozomima dovela je do gubitka težine od 8-10%.
Mehanizam dejstva
[0106] Dendritske ćelije izvedene iz koštane srži (pDC) dobijene su od miševa divljeg tipa ili "Resk" (rsk1) mutantnog soja. Mutantni soj ima tačkastu mutaciju na amino terminusu svog
2
TLR7 receptora koja ukida TLR7 signalizaciju bez uticaja na vezivanje liganda [46]. Ćelije su stimulisane replikonskom RNK formulisanom sa DOTAP-om, lipofektaminom 2000 ili unutar lipozoma. Kao što je prikazano na slici 17, IL-6 i INFα su indukovani u VT ćelijama, ali je ovaj odgovor skoro potpuno poništen kod mutantnih miševa. Ovi rezultati pokazuju da je TLR7 neophodan za prepoznavanje RNK u imunim ćelijama, i da replikoni inkapsulirani u lipozomima mogu uzrokovati da imune ćelije luče visoke nivoe interferona i proinflamatornih citokina.
[0107] Uopšteno govoreći, pokazalo se da replikoni RNK isporučeni lipozomima indukuju nekoliko serumskih citokina u roku od 24 sata od intramuskularne injekcije (IFN-α, IP-10 (CKSCL-10), IL-6, KC, IL-5, IL-13, MCP -1 i MIP-a), dok je samo MIP-1 indukovan golom RNK, a sam lipozom je indukovao samo IL-6.
[0108] Pokazalo se da IFN-α doprinosi imunološkom odgovoru na replikon koji kodira RSV-F u lipozomima jer je antitelo protiv IFNa receptora (IFNAR1) smanjilo F-specifični serumski IgG 10 puta nakon 2 vakcinacije.
[0109] Generalno se uočava da replikoni RNK dostavljeni lipozomima izazivaju uravnotežen profil podtipa IgG1:IgG2a kod miševa, ponekad sa većim odnosom IgG2a/IgG1 nego što se vidi kod elektroporisane DNK ili imunizacije proteinom/MF59 (i.e. imuni odgovor Th1 tipa).
Postupci proizvodnje lipozoma
[0110] Generalno, osam različitih postupaka je korišćeno za pripremu lipozoma prema pronalasku. Oni se u tekstu pominju kao postupci (A) do (H) i razlikuju se uglavnom u odnosu na korake filtracije i TFF. Detalji su sledeći:
(A) Pripremljeni su sveži osnovni rastvori lipida u etanolu.37 mg DlinDMA, 11.8 mg DSPC, 27.8 mg holesterola i 8.07 mg PEG DMG 2000 je izmereno i rastvoreno u 7.55 mL etanola. Sveže pripremljeni osnovni rastvor lipida je lagano mućkan na 37°C oko 15 min da bi se formirala homogena smeša. Zatim je 755 µL matičnog materijala dodato u 1.245 mL etanola da bi se napravio radni osnovni rastvor lipida od 2 mL. Ova količina lipida je korišćena za formiranje lipozoma sa 250 µg RNK. Radni rastvor RNK od 2 mL je takođe pripremljen iz osnovnog rastvora od ~1 µg/µL u 100 mM citratnog pufera (pH 6). Tri staklene bočice od 20 mL (sa šipkama za mešanje) su isprane rastvorom RNase Away (Molecular BioProducts, San Diego, California) i isprane sa dosta MilliQ vode pre upotrebe da bi se dekontaminirale bočice od RNaza. Jedna od bočica je korišćena za radni rastvor RNK, a druge za sakupljanje mešavine lipida i RNK (kao što je kasnije opisano). Radni rastvori lipida i RNK su zagrevani na 37 ° C tokom 10 minuta pre nego što su stavljeni u 3cc luer-lok špriceve. 2 mL citratnog pufera (pH 6) je stavljeno u drugi špric od 3 cc. Špricevi koji sadrže RNK i lipide su povezani na T mikser (PEEK<™>500 µm ID spoj, Idex Health Science, Oak Harbor, VA) korišćenjem FEP cevi (fluorovani etilen-propilen; al FEP cev ima unutrašnji prečnik 2 mm × spoljašnji prečnik 3 mm, isporučuje Idex Health Science). Izlaz iz T miksera je takođe bio FEP cev. Treći špric koji je sadržao citratni pufer povezan je sa zasebnim komadom FEP cevi. Svi špricevi su zatim pokretani brzinom protoka od 7 mL/min pomoću pumpe za špriceve. Izvodi epruvete su postavljeni da sakupljaju smeše u staklenu bočicu od 20 mL (uz mešanje). Mešalica je izvađena i etanol/vodeni rastvor je ostavljen da se uravnoteži do sobne temperature 1 sat. 4 ml smeše je stavljeno u špric od 5 cc, koji je bio spojen na komad FEP cevi i u drugom špricu od 5 cc spojenom na FEP cev iste dužine, jednaka količina 100 mM citratnog pufera (pH 6) je bila napunjen. Dva šprica su pokretana brzinom protoka od 7 mL/min korišćenjem pumpe za špric, a konačna smeša je sakupljena u staklenu bočicu od 20 mL (uz mešanje). Zatim, smeša sakupljena iz drugog koraka mešanja (lipozomi) je propuštena kroz Mustang Q membranu (podloga za izmenu anjona koja vezuje i uklanja anjonske molekule, dobijena od Pall Corporation, AnnArbor, MI, SAD). Pre propuštanja lipozoma, 4 mL 1 M NaOH, 4 mL 1 M NaCl i 10 mL 100 mM citratnog pufera (pH 6) su sukcesivno propušteni kroz Mustang membranu. Lipozomi su zagrevani 10 minuta na 37 ° C pre nego što su prošli kroz membranu. Zatim, lipozomi su koncentrovani do 2 mL i dijalizovani nasuprot 10-15 zapremina IKS PBS korišćenjem TFF-a pre nego što se dobije konačni proizvod. TFF sistem i filterske membrane sa šupljim vlaknima su kupljeni od Spectrum Labs i korišćeni su u skladu sa uputstvima proizvođača. Korišćene su polisulfonske filterske membrane od šupljih vlakana (broj dela P/N: X1AB-100-20P) sa graničnom veličinom pora od 100 kD i površinom od 8 cm<2>. Za in vitro i in vivo eksperimente, formulacije su razblažene do potrebne koncentracije RNK sa IKS PBS.
(B) Kao postupak (A) osim što je, nakon mešanja na rokeru, 226.7 µL stok materijala dodato u 1.773 mL etanola da bi se napravio radni osnovni rastvor lipida od 2 mL, modifikujući tako odnos lipid:RNK.
(C) Kao postupak (B) osim što je Mustang filtracija izostavljena, tako da su lipozomi prešli iz staklene bočice od 20 mL u TFF dijalizu.
1
(D) Kao postupak (C) osim što je TFF koristio polietersulfonske (PES) membrane od šupljih vlakana (broj dela P-C1-100E-100-01N) sa graničnom veličinom pora od 100 kD i površinom od 20 cm<2>.
(E) Kao postupak (D) osim što je korišćena Mustang membrana, kao u postupku (A).
(F) Kao postupak (A) osim što je Mustang filtracija izostavljena, tako da su lipozomi prešli iz staklene bočice od 20 mL u TFF dijalizu.
(G) Kao postupak (D) osim što je radni rastvor RNK od 4 mL pripremljen iz osnovnog rastvora od ~ 1 µg/µL u 100 mM citratnog pufera (pH 6). Zatim su četiri staklene bočice od 20 mL pripremljene na isti način. Dva od njih su korišćena za radni rastvor RNK (2 mL u svakoj bočici), a drugi za sakupljanje mešavine lipida i RNK, kao u (C). Umesto da koriste T mikser, špricevi koji sadrže RNK i lipide su povezani na Mitos Droplet junction Chip (stakleni mikrofluidni uređaj dobijen od Sirris, deo br. 3000158) korišćenjem PTFE cevi (0.03 inča unutrašnjeg prečnika × 1/16 inča spoljašnjeg prečnika) koristeći 4-smerni ivični konektor (Sirris). Dve struje RNK i jedna struja lipida pokretane su špric pumpama, a mešanje etanola i vodene faze je obavljeno na X spoju (100 µm × 105 µm) čipa. Brzina protoka sve tri struje je održavana na 1.5 mL/min, pa je odnos ukupnog vodenog i etanolnog protoka bio 2:1. Izlaz epruvete je pozicioniran da sakuplja smeše u staklenu bočicu od 20 mL (uz mešanje). Mešalica je izvađena i etanol/vodeni rastvor je ostavljen da se uravnoteži na sobnoj temperaturi 1 h. Zatim je smeša napunjena u špric od 5 cc, koji je postavljen na drugi komad PTFE cevi; u još jedan špric od 5 cc sa jednakom dužinom PTFE cevi, stavljena je jednaka zapremina 100 mM citratnog pufera (pH 6). Dva šprica su pokretana brzinom protoka od 3 mL/min korišćenjem pumpe šprica i konačna smeša je sakupljena u staklenu bočicu od 20 mL (uz mešanje). Zatim, lipozomi su koncentrovani do 2 mL i dijalizovani nasuprot 10-15 zapremina 1X PBS koristeći TFF, kao u (D).
(H) Kao postupak (A) osim što je radni rastvor lipida od 2 mL napravljen mešanjem 120.9 µL lipidnog osnovnog rastvora sa 1.879 mL etanola. Takođe, nakon mešanja u T mikseru, lipozomi iz bočice od 20 mL su stavljeni u Pierce Slide-A-Lyzer kasetu za dijalizu (Thermo Scientific, ekstra jačine, 0.5-3 mL kapaciteta) i dijalizirani nasuprot 400-500 mL IX PBS preko noći na 4°C u autoklaviranoj plastičnoj posudi pre nego što se dobije konačni proizvod.
2
BHK ekspresija
[0111] Lipozomi sa različitim lipidima su inkubirani sa BHK ćelijama preko noći i procenjeni na ekspresiju proteina. Od početne vrednosti sa RV05 ekspresija lipida može se povećati 18x dodavanjem 10% 1.2-difitanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DPiPE) u lipozom, 10x dodavanjem 10% 18:2 (cis) fosfatidil900k i tako što ćete umesto toga koristiti RV01.
[0112] Generalno, in vivo studije su pokazale da nezasićeni lipidni repovi imaju tendenciju da povećaju titar IgG podignut protiv kodiranih antigena.
RSV imunogenost
[0113] Replikon vA317 koji se samoreplicira i kodira RSV F protein je davan BALB/c miševima, 4 ili 8 životinja po grupi, bilateralnim intramuskularnim vakcinacijama (50 µL po nozi) 0. i 21. dana sa replikonom (1 µg) samim ili formulisanim kao lipozomi sa DlinDMA ("RV01") ili DOTAP ("RV13"). RV01 lipozomi su imali 40% DlinDMA, 10% DSPC, 48% holesterola i 2% PEG-DMG, ali sa različitim količinama RNK. RV13 lipozomi su imali 40% DOTAP, 10% DPE, 48% holesterola i 2% PEG-DMG. Za poređenje, gola plazmidna DNK (20 µg) koja eksprimira isti RSV-F antigen je isporučena ili korišćenjem elektroporacije ili sa RV01(10) lipozomima (0.1 µg DNK). Četiri miša su korišćena kao naivna kontrolna grupa.
[0114] Lipozomi su pripremljeni postupkom (D) ili postupkom (B). Za neke lipozome napravljene postupkom (D) korišćena je dupla ili polovina količine RNK. Z prosečni prečnik čestica, indeks polidisperznosti i efikasnost inkapsulacije lipozoma su bili sledeći:
[0115] Serum je sakupljen za analizu antitela 14., 36. i 49. dana. Slezine su sakupljene od miševa 49. dana za analizu T ćelija.
[0116] F-specifični titri IgG u serumu (GMT) bili su sledeći:
[0117] Udeo T ćelija koje su pozitivne na citokine i specifične za RSV F51-66 peptid je sledeći, pokazujući samo brojke koje su statistički značajno iznad nule:
[0118] Stoga su formulacije lipozoma značajno poboljšale imunogenost u odnosu na gole RNK kontrole, što je određeno povećanim F-specifičnim titarima IgG i frekvencijama T ćelija. Plazmidna DNK formulisana sa lipozomima, ili isporučena gola pomoću elektroporacije, bila je značajno manje imunogena od samoreplicirajuće RNK formulisane lipozomima.
[0119] RV01 RNK vakcine su bile imunogenije od RV13 vakcine. RV01 ima tercijarni amin u glavnoj grupi sa pKa od oko 5.8, a takođe uključuje nezasićene alkilne repove. RV13 ima nezasićene alkilne repove, ali njegova glava ima kvaternarni amin i veoma je jako katjonska.
4
Lipozomi - zahtev za inkapsulaciju
[0120] Da bi se procenilo da li je efekat primećen u grupama lipozoma bio posledica samo komponenti lipozoma, ili je bio povezan sa inkapsulacijom, replikon je davan u inkapsuliranom obliku (sa dva različita protokola prečišćavanja, 0.1 µg RNK), ili pomešan sa lipozomima nakon njihovog formiranje (neinkapsulirani "lipopleks", 0.1 µg RNK), ili kao gola RNK (1 µg). Slika 10 pokazuje da je lipopleks dao najniže nivoe ekspresije, pokazujući da je inkapsulacija neophodna za moćnu ekspresiju.
[0121] Dalji eksperimenti su koristili tri različite RNK: (i) 'vA317' replikon koji eksprimira RSV-F tj. površinski fuzioni glikoprotein RSV; (ii) 'vA17' replikon koji eksprimira GFP; i (iii) 'vA336' koji je defektan u replikaciji i kodira GFP.
[0122] RNK su isporučene ili gole ili sa lipozomima napravljenim postupkom (D). Prazni lipozomi su napravljeni postupkom (D) ali bez ikakve RNK. Četiri formulacije lipozoma imale su sledeće karakteristike:
[0123] BALB/c miševima, 5 životinja po grupi, date su bilateralne intramuskularne vakcinacije (50 µL po nozi) 0. i 21. dana sa:
Grupa 1 gola samoreplicirajuća RSV-F RNK (vA317, 0.1 µg)
Grupa 2 samoreplicirajuća RSV-F RNK (vA317, 0.1 µg) inkapsulirana u lipozomima Grupa 3 samoreplicirajuća RSV-F RNK (vA317, 0.1 µg) dodata praznim lipozomima Grupa 4 Protein F podjedinice (5 µg)
[0124] Serum je sakupljen za analizu antitela 14., 35. i 51. dana. Mereni su F-specifični titri IgG u serumu (GMT); ako je pojedinačna životinja imala titar <25 (granica detekcije), dodeljen joj je titar 5. Pored toga, slezine su sakupljene od miševa 51. dana za analizu T ćelija, da bi se odredile ćelije koje su bile pozitivne i specifične na citokine. za RSV F51-66 peptid (CD4+) ili za RSV F peptide F85-93 i F249-258 (CD8+).
[0125] IgG titri su bili sledeći u 10 grupa i kod neimunizovanih kontrolnih miševa:
[0126] Titri neutralizacije RSV seruma 51. dana bili su sledeći:
[0127] Životinje koje pokazuju RSV F-specifične CD4+ T ćelije slezine 51. dana bile su sledeće, gde je broj (% pozitivnih ćelija) dat samo ako je stimulisani odgovor bio statistički značajno iznad nule:
[0128] Životinje koje su 51. dana pokazale RSV F-specifične CD8+ T ćelije slezine bile su sledeće, gde je broj dat samo ako je stimulisani odgovor bio statistički značajno iznad nule:
[0129] Stoga je inkapsulacija RNK unutar lipozoma neophodna za visoku imunogenost, pošto jednostavna mešavina RNK i lipozoma (grupa 3) nije bila imunogena (u stvari, manje imunogena od gole RNK).
[0130] U drugim studijama miševi su primili različite kombinacije (i) samoreplicirajućeg RNK replikona koji kodira RSV F protein pune dužine (ii) samoreplicirajućeg RNK replikona koji kodira GFP (iii) GFP-kodirajućeg RNK replikona sa nokautom u nsP4 koji eliminiše samo-replikaciju (iv) RSV F-protein pune dužine. Ukupno je dobijeno 13 grupa:
[0131] Rezultati na slici 16 pokazuju da su F-specifični IgG odgovori zahtevali inkapsulaciju u lipozomu, a ne puku ko-isporuku (uporediti grupe C i D). Poređenje grupa K, L i M pokazuje da je RNK pružala pomoćni efekat protiv ko-isporučenog proteina, a ovaj efekat je primećen i kod replicirajuće i kod nereplicirajuće RNK.
Imunogenost RSV kod različitih sojeva miševa
[0132] Replikon "vA142" kodira površinski fuzioni (F) glikoprotein pune dužine RSV-a, ali sa izbrisanim fuzionim peptidom, a 3' kraj se formira cepanjem posredovanim ribozimom. Testirano je na tri različita soja miševa.
[0133] BALB/c miševima su date bilateralne intramuskularne vakcinacije (50 µL po nozi) 0 i 22 dana. Životinje su podeljene u 8 test grupa (5 životinja po grupi) i naivnu kontrolu (2 životinje):
Grupa 1 dali su goli replikon (1 µg).
Grupa 2 dobili su 1 µg replikona isporučenog u lipozomima "RV01(37)" sa 40% DlinDMA, 10% DSPC, 48% hol, 2% PEG-konjugovanog DMG.
Grupa 3 date su isto kao i grupa 2, ali sa 0.1 µg RNK.
Grupa 4 dobili su 1 µg replikona u "RV17(10)" lipozomima (40% RV17 (vidi gore), 10% DSPC, 49.5% holesterola, 0.5% PEG-DMG).
Grupa 5 bili su 1 µg replikona u "RV05(11)" lipozomima (40% RV07 lipida, 30% 18:2 PE (DLoPE, 28% holesterola, 2% PEG-DMG).
Grupa 6 dobili su 0.1 ug replikona u "RV17(10)" lipozomima.
Grupa 7 dato je 5 ug RSV-F proteina podjedinice sa adjuvansom sa aluminijum hidroksidom. Grupa 8 bili su naivna kontrola (2 životinje)
[0134] Serumi su sakupljeni za analizu antitela 14., 35. i 49. dana. F-specifični serumski IgG GMT su bili:
[0135] 35. dana F-specifični titri IgG1 i IgG2a (GMT) bili su sledeći:
[0136] Titri antitela za neutralizaciju RSV seruma 35. i 49. dana bili su sledeći (podaci su titri neutralizacije 60% smanjenja plaka u grupama od 2-5 miševa, 1 grupa po grupi):
[0137] Slezine su sakupljene 49. dana za analizu T ćelija. Prosečne neto F-specifične citokinpozitivne T ćelije (CD4+ ili CD8+) bile su sledeće, pokazujući samo brojke koje su bile statistički značajno iznad nule (specifične za RSV peptide F51-66, F164-178, F309-323 za CD4+, ili za peptidi F85-93 i F249-258 za CD8+):
[0138] C57BL/6 miševi su imunizovani na isti način, ali je 9. grupa dobila VRPs (1×10<6>IU) koji eksprimira površinski fuzioni glikoprotein divljeg tipa pune dužine RSV (brisanje fuzionog peptida).
[0139] Serumi su sakupljeni za analizu antitela 14., 35. i 49. dana. F-specifični titri IgG (GMT) su bili:
[0140] 35. dana F-specifični titri IgG1 i IgG2a (GMT) bili su sledeći:
[0141] Titri antitela za neutralizaciju RSV seruma 35. i 49. dana bili su sledeći (podaci su titri neutralizacije 60% smanjenja plaka u grupama od 2-5 miševa, 1 grupa po grupi):
[0142] Slezine su sakupljene 49. dana za analizu T ćelija. Prosečne neto F-specifične citokinpozitivne T ćelije (CD8+) bile su sledeće, pokazujući samo brojke koje su bile statistički značajno iznad nule (specifične za RSV peptide F85-93 i F249-258):
[0143] Devet grupa C3H/HeN miševa je imunizovano na isti način. F-specifični IgG titri (GMT) su bili:
[0144] 35. dana F-specifični titri IgG1 i IgG2a (GMT) bili su sledeći:
[0145] Titri antitela koji neutrališu serum RSV 35. i 49. dana bili su sledeći:
[0146] Tako su tri različita lipida (RV01, RV05, RV17; pKa 5.8, 5.85, 6.1) testirana u tri različita inbred soja miševa. Za sva 3 soja RV01 je bio efikasniji od RV17; za sojeve BALB/c i C3H RV05 je bio manje efikasan od RV01 ili RV17, ali je bio efikasniji u soju B6. U svim slučajevima, međutim, lipozomi su bili efikasniji od dve katjonske nanoemulzije koje su testirane paralelno.
CMV imunogenost
[0147] RV01 lipozomi sa DLinDMA kao katjonskim lipidom korišćeni su za isporuku RNK replikona koji kodiraju glikoproteine citomegalovirusa (CMV). Replikon "vA160" kodira
4
glikoproteine pune dužine H i L (gH/gL), dok replikon "vA322" kodira rastvorljivi oblik (gHsol/gL). Dva proteina su pod kontrolom odvojenih subgenomskih promotera u jednom replikonu; istovremena primena dva odvojena vektora, jednog koji kodira gH i jednog koji kodira gL, nije dala dobre rezultate.
[0148] BALB/c miševima, 10 po grupi, date su bilateralne intramuskularne vakcinacije (50 µL po nozi) 0, 21. i 42. dana sa VRP-ovima koji eksprimiraju gH/gL (1×10<6>IU), VRP-ovi koji eksprimiraju gHsol/gL (1×10<6>IU) i PBS kao kontrole. Dve test grupe su primile 1 µg replikona vA160 ili vA322 formulisanog u lipozomima (40% DlinDMA, 10% DSPC, 48% hol, 2% PEG-DMG; napravljen korišćenjem postupaka (D) ali sa veličinom serije RNK od 150 µg).
[0149] Lipozomi vA160 su imali Zav prečnik od 168 nm, pdI od 0.144 i 87.4% inkapsulacije. Lipozomi vA322 su imali Zav prečnik od 162 nm, pdI od 0.131 i 90% inkapsulacije.
[0150] Replikoni su bili u stanju da eksprimiraju dva proteina iz jednog vektora.
[0151] Serumi su sakupljeni za imunološku analizu 63. dana (3wp3). Titri neutralizacije CMV-a (recipročna vrednost razblaženja seruma koja dovodi do 50% smanjenja broja pozitivnih žarišta virusa po bunarčiću, u odnosu na kontrole) bili su sledeći:
[0152] RNK koja je eksprimirala ili punu dužinu ili rastvorljivu formu CMV gH/gL kompleksa je tako izazvala visoke titre neutralizujućih antitela, kao što je ispitano na epitelnim ćelijama. Prosečni titri izazvani RNK inkapsuliranim u lipozomima bili su najmanje visoki kao za odgovarajuće VRP.
[0153] Ponovljeni eksperimenti su potvrdili da je replikon bio u stanju da eksprimira dva proteina iz jednog vektora. Replikon RNK je dao titar 3wp3 od 11457, u poređenju sa 5516 sa VRP.
[0154] Dalji eksperimenti su koristili različite replikone pored vA160. Replikon vA526 eksprimira CMV pentamerni kompleks (gH-gL-UL128-UL130-UL-131) pod kontrolom tri subgenomska promotora: prvi pokreće ekspresiju gH; drugi pokreće ekspresiju gL; treći pokreće ekspresiju UL128-2A-UL130-2A-UL131 poliproteina, koji sadrži dva 2A mesta cepanja između tri UL gena. Replikon vA527 eksprimira CMV pentamerni kompleks preko tri subgenomska promotera i dva IRESs: prvi subgenomski promoter pokreće ekspresiju gH; drugi subgenomski promotor pokreće ekspresiju gL; treći subgenomski promotor pokreće ekspresiju UL128; UL130 je pod kontrolom EMCV IRES; UL131 je pod kontrolom EV71 IRES. Ova tri replikona su isporučena lipozomom (postupak (H), sa veličinom serije od 150 µg) ili VRP-om.
[0155] BALB/c miševima, 10 grupa od 10 životinja, date su bilateralne intramuskularne vakcinacije (50 µL po nozi) 0, 21. i 42. dana sa:
Grupa 1 VRP-ovi koji eksprimiraju gH FL/gL (1×10<6>IU)
Grupa 2 pentamerni, 2A VRP (1×10<5>IU)
Grupa 3 pentamerni, 2A VRP (1×10<6>IU)
Grupa 4 pentamerni, IRES VRP (1×10<5>IU)
Grupa 5 samoreplicirajuća RNK vA160 (1 µg) formulisana u lipozomima
Grupa 6 samoreplicirajuća RNK vA526 (1 µg) formulisana u lipozomima
Grupa 7 samoreplicirajuća RNK vA527 (1 µg) formulisana u lipozomima
Grupa 8 samoreplicirajuća RNK vA160 (1µg) formulisana u katjonskoj nanoemulziji Grupa 9 samoreplicirajuća RNK vA526 (1µg) formulisana u kationskoj nanoemulziji Grupa 10 samoreplicirajuća RNK vA527 (1 µg) formulisana u katjonskoj nanoemulziji.
[0156] Serumi su sakupljeni za imunološku analizu 21. dana (3wp1), 42. (3wp2) i 63. (3wp3).
[0157] Titri neutralizacije CMV seruma 21., 42. i 63. dana bili su:
[0158] Tako se samoreplicirajuća RNK može koristiti za ekspresiju više antigena iz jednog vektora i za podizanje snažnog i specifičnog imunološkog odgovora. Replikon može da eksprimira pet antigena (CMV pentamerni kompleks (gH-gL-UL128-UL130-UL-131) i da podigne moćan imuni odgovor. Samoreplicirajuća RNK isporučena u lipozomima je bila u stanju da izazove visoke titre neutralizujućih antitela, kao što je ispitano na epitelnim ćelijama, u svim vremenskim tačkama koje su analizirane (3wp1, 3wp2 i 3wp3).Ovi odgovori su bili superiorniji u odnosu na odgovarajuće VRP i katjonske nanoemulzije.
Zapremina isporuke
[0159] Hidrodinamička isporuka koristi silu koja se stvara brzim ubrizgavanjem velike zapremine rastvora da bi se prevazišle fizičke barijere ćelijskih membrana koje sprečavaju ulazak velikih jedinjenja koja su nepropusna za membranu u ćelije. Ranije se pokazalo da je ovaj fenomen koristan za intracelularnu isporuku DNK vakcina.
[0160] Tipična zapremina davanja miša za intramuskularnu injekciju je 50 µl u zadnju nogu, što je relativno velika zapremina za mišiće noge miša. Nasuprot tome, humana intramuskularna doza od ~0.5 ml je relativno mala. Ako bi imunogenost kod miševa zavisila od zapremine, onda bi efikasnost replikonskih vakcina mogla biti posledica, barem delimično, hidrodinamičkih sila, što ne bi bilo ohrabrujuće za upotrebu istih vakcina kod ljudi i većih životinja.
[0161] Replikon vA317 je isporučen BALB/c miševima, 10 po grupi, bilateralnim intramuskularnim vakcinacijama (5 ili 50 po nozi) 0. i 21. dana:
Grupa 1 primio goli replikon, 0.2 µg u 50 µL po nozi
Grupa 2 primio goli replikon, 0.2 µg u 5 µL po nozi
Grupa 3 primio replikon formulisan lipozomima (0.2 µg, 50 µL po nozi)
Grupa 4 primio replikon formulisan lipozomima (0.2 µg, 5 µL po nozi)
[0162] Serum je sakupljen za analizu antitela 14. i 35. dana. F-specifični serumski IgG GMT su bili:
[0163] Dakle, imunogenost formulisanog replikona nije varirala u zavisnosti od isporučenog volumena, što ukazuje da se ove RNK vakcine ne oslanjaju na hidrodinamičku isporuku za
4
svoju efikasnost.
Kinetika ekspresije (referentni primer)
[0164] Za proučavanje kinetike ekspresije proteina nakon injekcije korišćen je samoreplicirajući RNK replikon ("vA311") koji eksprimira reporterski gen luciferaze (luc). BALB/c miševi, 5 životinja po grupi, primili su bilateralne intramuskularne vakcinacije (50 µL po nozi) dana 0 sa:
Grupa 1 DNK koja eksprimira luciferazu, isporučena elektroporacijom (10 µg)
Grupa 2 samoreplicirajuća RNK (1 µg) formulisana u lipozomima
Grupa 3 samoreplicirajuća RNK (1 µg) formulisana sa katjonskom nanoemulzijom Grupa 4 samoreplicirajuća RNK (1 µg) formulisana sa katjonskom nanoemulzijom Grupa 5 VRP (1×10<6>IU) koji eksprimira luciferazu
[0165] Pre vakcinacije, miševi su depilirani. Miševi su anestezirani (2% izoflurana u kiseoniku), dlake su prvo uklonjene električnim brijačem, a zatim hemijskim Nair. Podaci o bioluminescenciji su zatim dobijeni korišćenjem sistema za snimanje Xenogen IVIS 200 (Caliper Life Sciences) dana 3, 7, 14, 21, 28, 35, 42, 49, 63 i 70. Pet minuta pre snimanja miševima je intraperitonealno ubrizgano 8 mg/kg rastvora luciferina. Životinje su zatim anestezirane i prebačene u sistem za snimanje. Vremena akvizicije slike su održavana konstantnim jer je bioluminescencijski signal meren hlađenom CCD kamerom.
[0166] U vizuelnom smislu, primećeno je da ćelije koje eksprimiraju luciferazu ostaju prvenstveno na mestu injekcije RNK, a životinje snimljene nakon uklanjanja četvorostrukih ćelija nisu pokazale nikakav signal.
[0167] U kvantitativnom smislu, ekspresija luciferaze je merena kao prosečna radijansa tokom perioda od 70 dana (p/s/cm<2>/sr), a rezultati su bili sledeći za 5 grupa:
[0168] Samoreplicirajuća RNK formulisana katjonskim nanoemulzijama pokazala je merljivu bioluminescenciju 3. dana, koja je dostigla vrhunac 7. dana, a zatim se smanjila na referentne nivoe od 28. do 35. dana. Kada je formulisana u lipozomima, RNK je pokazala merljivu bioluminescenciju 3. dana, koja je dostigla vrhunac na dan 7 i smanjena na referentne nivoe do 63. dana. RNK isporučena korišćenjem VRPs pokazala je povećanu bioluminescenciju 21. dana u poređenju sa formulisanom RNK, ali je ekspresija smanjena na referentne nivoe do 28. dana. Elektroporisana DNK je pokazala najviši nivo bioluminescencije u svim vremenskim tačkama izmereni i nivoi bioluminescencije se nisu smanjili na referentne nivoe tokom 70 dana eksperimenta.
Put isporuke
[0169] Lipozom-inkapsulirana RNK koja kodira HIV gp140 isporučena je miševima intramuskularno, intradermalno ili subkutano. Sva tri puta su dovela do visokih serumskih IgG nivoa HIV-specifičnih antitela (Slika 15), premašujući titre uočene kao odgovor na elektroporisanu intramuskularnu DNK.
Pamučni pacovi
[0170] Studija je sprovedena na pamučnim pacovima (Sigmodon hispidis) umesto miševa. Inkapsulacija lipozoma u dozi od 1 µg povećala je F-specifične IgG titre za 8.3 puta u poređenju sa golom RNK i povećala titre PRNT za 9.5 puta. Veličina odgovora antitela bila je ekvivalentna onom indukovanom sa 5×10<6>IU VRP. I gola i RNK inkapsulirana u lipozomima su bile u stanju da zaštite pamučne pacove od izazivanja RSV (1×10<5>jedinice koje formiraju plak), smanjujući virusno opterećenje pluća za najmanje 3.5 log. Inkapsulacija je povećala smanjenje za oko 2 puta.
[0171] Dalji rad na pamučnim pacovima koristio je četiri različita replikona: vA317 eksprimira RSV-F pune dužine; vA318 eksprimira skraćeni (transmembranski i citoplazmatski rep uklonjen) RSV-F; vA142 eksprimira RSV-F sa izbrisanim fuzionim
4
peptidom; vA140 eksprimira skraćeni RSV-F takođe bez njegovog peptida. Pamučnim pacovima, 4 do 8 životinja po grupi, date su intramuskularne vakcinacije (100 µL u jednoj nozi) 0. i 21. dana sa četiri različita replikona u dve doze (1.0 i 0.1 µg) formulisanim u lipozomima napravljenim postupkom (D), ali sa veličinom serije od 150 µg RNK. Kontrolne grupe su primile RSV-F podjediničnu proteinsku vakcinu (5 µg) sa adjuvansom sa stipsom (8 životinja/grupi), VRPs koji eksprimiraju RSV-F pune dužine (1×10<6>IU, 8 životinja/grupi), ili naivna kontrola (4 životinje/grupa). Serum je sakupljen za analizu antitela 0, 21. i 34. dana.
[0172] F-specifični titri IgG u serumu i titri antitela koji neutrališu serum RSV 21. i 34. dana bili su:
[0173] Sva četiri replikona procenjena u ovoj studiji (vA317, vA318, vA142, vA140) bila su imunogena kod pamučnih pacova kada su isporučeni lipozomom, iako su titri neutralizacije seruma bili najmanje deset puta niži od onih indukovanih proteinskim vakcinama sa adjuvansom ili VRP. Lipozomske/RNK vakcine su izazvale serumska F-specifična IgG i RSV neutrališuća antitela nakon prve vakcinacije, a druga vakcinacija je efikasno pojačala odgovor. F-specifični titri IgG posle druge vakcinacije sa 1 µg replikona bili su 2 do 3 puta veći nego posle druge vakcinacije sa 0.1 µg replikona. Četiri replikona su izazvala uporedive titre antitela, što sugeriše da su RSV-F pune dužine i skraćeni, svaki sa ili bez fuzionog peptida, slično imunogeni kod pamučnih pacova.
[0174] Dalji rad na pamučnim pacovima ponovo je koristio replikone vA317, vA318 i vA142. Pamučnim pacovima, 2-8 životinja po grupi, date su intramuskularne vakcinacije
4
(100 µL u jednoj nozi) 0. i 21. dana sa replikonima (0.1 ili 1 µg) inkapsuliranim u RV01 lipozome napravljene postupkom (D), ali sa šaržom RNK veličina 150 µg. Kontrolne grupe su primile RSV-F podjediničnu proteinsku vakcinu (5 µg) sa adjuvansom sa stipsom ili VRPs koji eksprimiraju RSV-F pune dužine (1×10<6>IU, 8 životinja/grupa). Sve ove životinje su primile treću vakcinaciju (56. dan) sa RSV-F podjediničnom proteinskom vakcinom (5 µg) sa adjuvansom sa stipsom. Pored toga, postojala je i naivna kontrola (4 životinje/grupi). Nadalje, dodatnoj grupi su date bilateralne intramuskularne vakcinacije (50 µL po nozi) 0. i 56. dana sa 1 µg vA317 RNK u lipozomima, ali nije primila treću vakcinu sa podjediničnom proteinskom vakcinom.
[0175] Serum je sakupljen za analizu antitela 0, 21, 35, 56, 70, plus dana 14, 28 i 42 za dodatnu grupu. F-specifični titri IgG u serumu (GMT) bili su sledeći:
[0176] Titri neutralizacije seruma su bili sledeći (60% titri neutralizacije RSV za 2 grupe od 3-4 životinje po grupi, GMT od ove 2 grupe po grupi):
4
[0177] Titri seruma i titri neutralizacije za dodatnu grupu bili su sledeći:
[0178] Tako su replikoni potvrđeni kao imunogeni kod pamučnih pacova, izazivajući serumska F-specifična IgG i RSV neutrališuća antitela nakon prve vakcinacije. Druga vakcinacija je efikasno pojačala odgovore. F-specifični titri IgG posle druge vakcinacije sa 1.0 µg replikona bili su 1.5 do 4 puta veći nego posle druge vakcinacije sa 0.1 µg replikona.
[0179] Treća vakcinacija (protein 56. dana) nije povećala titre kod pamučnih pacova koji su prethodno vakcinisani sa F trimer podjedinicom stipsa, ali je pružila veliko povećanje titra kod pamučnih pacova prethodno vakcinisanih replikonom. U većini slučajeva, titri neutralizacije RSV seruma nakon dve vakcinacije replikona praćene povećanjem proteina bili su jednaki ili veći od titara izazvanih sa dve ili tri uzastopne proteinske vakcinacije.
[0180] Ova studija je takođe procenila kinetiku odgovora antitela na 1.0 µg vA317. F-specifični serumski IgG i RSV neutralizacioni titri indukovani jednom vakcinacijom dostigli su svoj vrhunac oko 21. dana i održavani su tokom najmanje 56. dana (50-70% pad titra F-specifičnog IgG, mala promena u titru neutralizacije RSV). Homologa druga vakcinacija je data ovim životinjama 56. dana i povećani titri antitela do nivoa koji je najmanje jednak onom postignutom kada je druga vakcinacija primenjena 21. dana.
[0181] Dalji eksperimenti su uključivali virusni izazov. Replikon vA368 kodira površinski fuzioni glikoprotein RSV pune dužine sa izbrisanim fuzionim peptidom, sa ekspresijom koju pokreće EV71 IRES. Pamučnim pacovima, 7 po grupi, date su intramuskularne vakcinacije (100 µL po nozi) 0. i 21. dana sa vA368 u lipozomima pripremljenim postupkom (H), veličine serije RNK od 175 µg ili sa VRP-ovima koji imaju isti replikon. Kontrolna grupa je primila 5 µg proteina sa adjuvansom stipsom, a uključena je i naivna kontrolna grupa.
[0182] Sve grupe su primile intranazalni izazov (i.n.) sa 1×10<6>PFU RSV četiri nedelje nakon konačne imunizacije. Serum je sakupljen za analizu antitela 0, 21, 35 dana. Titri virusa pluća su mereni 5 dana nakon izazivanja. Rezultati su bili sledeći:
4
[0183] Tako je RNK vakcina smanjila virusno opterećenje pluća za više od tri log, sa približno 10<6>PFU/g kod nevakcinisanih kontrolnih pamučnih pacova na manje od 10<3>PFU/g kod vakcinisanih pamučnih pacova.
Studija sa velikim sisarima
[0184] Studija na velikim životinjama je sprovedena na govedima. Telad (4-6 nedelja stara, ~60-80 kg, 5 po grupi) je imunizovana sa 66 µg replikona vA317 koji kodira RSV F protein pune dužine u danima 0, 21, 86 i 146. Replikoni su formulisani unutar lipozoma. Kao negativna kontrola korišćen je samo PBS, a kao pozitivna kontrola korišćena je licencirana vakcina („Triangle 4“ iz Fort Dodge, koji sadrži ubijeni virus). Sva telad su primila 15 µg F proteina sa adjuvansom MF59 emulzijom 146. dana. Jedna krava je greškom vakcinisana pogrešnom vakcinom 86. dana umesto Triangle 4 i tako su njeni podaci isključeni od 100. dana nadalje.
[0185] RNK vakcine su kodirale humani RSV F, dok vakcina "Triangle 4" sadrži goveđi RSV F, ali RSV F protein je visoko očuvan između BRSV i HRSV.
[0186] Lipozomi su napravljeni postupkom (E), osim što je korišćena serija od 1.5 mg RNK.
[0187] Telad su primila 2ml svake eksperimentalne vakcine, primenjene intramuskularno po 2×1ml na svakoj strani vrata. Nasuprot tome, vakcina "Triangle 4" je data kao pojedinačna doza od 2 ml u vrat.
[0188] Serum je sakupljen za analizu antitela 0, 14, 21, 35, 42, 56, 63, 86, 100, 107, 114, 121, 128, 135, 146, 160, 167, 174, 18, 181 i 202 dana. Ako je pojedinačna životinja imala titar ispod granice detekcije, dodeljen joj je titar 5.
[0189] Slika 14A prikazuje F-specifične IgG titre tokom prva 63 dana. Replikon RNK je bio imunogen kod krava preko lipozoma, iako je davao niže titre od licencirane vakcine. Sve vakcinisane krave pokazale su F-specifična antitela posle druge doze, a titri su bili veoma stabilni u periodu od 2 do 6 nedelja nakon druge doze (i bili su posebno stabilni za RNK vakcine).
4
[0190] Slika 14B prikazuje F-specifične titre IgG u serumu (GMT) tokom 210 dana, a izmerene vrednosti do 202. dana su bile sledeće:
[0191] Titri antitela koji neutrališu serum RSV bili su sledeći:
[0192] Materijal korišćen za drugu dozu lipozoma nije bio sveže pripremljen, a ista serija RNK je pokazala smanjenje potencije u studiji imunogenosti kod miša. Stoga je moguće da bi vakcina bila imunogenija da je za sve vakcinacije korišćen svež materijal.
[0193] Kada su testirani sa komplementom, neutralizujuća antitela su otkrivena kod svih vakcinisanih krava. U ovom testu, sva vakcinisana telad imala su dobre titre neutralizujućih antitela posle druge RNK vakcinacije. Dodatno, RNK vakcina je izazvala F-specifične serumske IgG titre koji su otkriveni kod nekoliko teladi posle druge vakcinacije i kod svih teladi posle treće.
[0194] RSV-F sa adjuvansom MF59 je bio u stanju da pojača IgG odgovor kod svih prethodno vakcinisanih teladi i da poveća titre neutralizacije nezavisne od komplementa teladi koja su prethodno vakcinisana sa RNK.
[0195] Dokaz koncepta za RNK vakcine kod velikih životinja je posebno važan u svetlu gubitka potencije koji je ranije primećen kod vakcina zasnovanih na DNK kada se prelazi sa modela malih životinja na veće životinje i ljude. Tipična doza vakcine sa DNK krava bi bila 0.5-1 mg [47.48] i stoga je veoma ohrabrujuće da su imuni odgovori indukovani sa samo 66 µg RNK.
Tabela 1: korisni fosfolipidi
DDPC 1.2-didekanoil-sn-glicero-3-fosfatidilholin
DEPA 1.2-dierukoil-sn-glicero-3-fosfat
DEPC 1.2-erukoil-sn-glicero-3-fosfatidilholin
DEPE 1.2-dierukoil-sn-glicero-3-fosfatidiletanolamin DEPG 1.2-dierukoil-sn-glicero-3 [fosfatidil-rac-(1-glicerol...) DLOPC 1.2- Linoleoil-sn-Glicero-3-fosfatidilholin
DLPA 1.2- Dilauroil-sn-Glicero-3-Fosfat
DLPC 1.2-dilauroil-sn-glicero-3-fosfatidilholin
DLPE 1.2-dilauroil-sn-glicero-3-fosfatidiletanolamin DLPG 1.2-dilauroil-sn-glicero-3 [fosfatidil-rac-(1-glicerol...) DLPS 1.2-dilauroil-sn-glicero-3-fosfatidilserin
DMG 1.2- Dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamin DMPA 1.2- Dimiristoil-sn-Glicero-3-Fosfat
DMPC 1.2-dimirstoil-sn-glicero-3-fosfatidilholin
DMPE 1.2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfatidiletanolamin DMPG 1.2-Miristoil-sn-Glicero-3 [fosfatidil-rac-(1-glicerol...) DMPS 1.2-dimirstoil-sn-glicero-3-fosfatidilserin
DOPA 1.2- Dioleoil-sn-Glicero-3-Fosfat
DOPC 1.2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfatidilholin
DOPE 1.2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfatidiletanolamin DOPG 1.2-dioleoil-sn-glicero-3 [fosfatidil-rac-(1-glicerol...) DOPS 1.2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfatidilserin
DPPA 1.2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfat
DPPC 1.2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfatidilholin
DPPE 1.2- Dipalmitoil-sn-Glicero-3-fosfatidiletanolamin DPPG 1.2-dipalmitoil-sn-glicero-3 [fosfatidil-rac-(1-glicerol...) DPPS 1.2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfatidilserin
DPiPE 1 .2-difitanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamin
DSPA 1.2- Distearoil-sn-Glicero-3-Fosfat
DSPC 1.2-distearoil-sn-glicero-3-fosfatidilholin
DSPE 1.2-Diostearpil-sn-Glicero-3-fosfatidiletanolamin DSPG 1.2-distearoil-sn-glicero-3 [fosfatidil-rac-(1-glicerol...)
1
DSPS 1.2-distearoil-sn-glicero-3-fosfatidilserin
EPC PC iz jaja
HEPC PC iz hidrogrnizovanih jaja
HSPC PC iz hidrogrnizovanih jaja visoke čistoće
HSPC PC iz hidrogrnizovane soje
LISOPC MIRISTIC 1-Miristoil-sn-Glicero-3-fosfatidilholin
LISOPC PALMITIĆ 1-Palmitoil-sn-Glicero-3-fosfatidilholin
LISOPC STEARIĆ 1-stearoil-sn-glicero-3-fosfatidilholin
Mlečni sfingomijelin MPPC 1-miristoil.2-palmitoil-sn-glicero 3-fosfatidilholin MSPC 1-miristoil.2-stearoil-sn-glicero-3-fosfatidilholin
PMPC 1-palmitoil.2-miristoil-sn-glicero-3-fosfatidilholin POPC 1-palmitoil.2-oleoil-sn-glicero-3-fosfatidilholin
PAPA 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfatidiletanolamin POPG 1.2-dioleoil-sn-glicero-3 [fosfatidil-rac-(1-glicerol)...] PSPC 1-palmitoil.2-stearoil-sn-glicero-3-fosfatidilholin SMPC 1-stearoil.2-miristoil-sn-glicero-3-fosfatidilholin
SOPC 1-stearoil.2-oleoil-sn-glicero-3-fosfatidilholin
SPPC 1-stearoil.2-palmitoil-sn-glicero-3-fosfatidilholin
REFERENCE
[0196]
[1] Johanning et al. (1995) Nucleic Acids Res 23:1495-1501.
[2] Heyes et al. (2005) J Controlled Release 107:276-87.
[3] WO2005/121348.
[4] Lipozomes: Methods and Protocols, Volume 1: Pharmaceutical Nanocarriers: Methods and Protocols. (ed. Weissig). Humana Press, 2009. ISBN 160327359X.
[5] Lipozome Technology, volumes I, II & III. (ed. Gregoriadis). Informa Healthcare, 2006.
[6] Functional Polymer Colloids and Microparticles volume 4 (Microspheres, microcapsules & lipozomes). (eds. Arshady & Guyot). Citus Books, 2002.
[7] Jeffs et al. (2005) Pharmaceutical Research 22 (3):362-372.
[13] Martinon et al. (1993) Eur J Immunol 23:1719-22.
[14] WO2005/113782.
2
[15] WO2011/005799.
[16] El Ouahabi et al. (1996) FEBS Letts 380:108-12.
[17] Giuliani et al. (2006) Proc Natl Acad Sci U S A 103(29):10834-9.
[18] WO2009/016515.
[19] WO02/34771.
[20] WO2005/032582.
[21] WO2010/119343.
[22] WO2006/110413.
[23] WO2005/111066.
[24] WO2005/002619.
[25] WO2006/138004.
[26] WO2009/109860.
[27] WO02/02606.
[28] WO03/018054.
[29] WO2006/091517.
[30] WO2008/020330.
[31] WO2006/089264.
[32] WO2009/104092.
[33] WO2009/031043.
[34] WO2007/049155.
[35] Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy. 20th edition, ISBN: 0683306472.
[36] Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan, eds., Academic Press, Inc.)
[37] Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds, 1986, Blackwell Scientific Publications)
[38] Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press).
[39] Handbook of Surface and Colloidal Chemistry (Birdi, K.S. ed., CRC Press, 1997)
[40] Ausubel et al. (eds) (2002) Short protocols in molecular biology, 5th edition (Current Protocols).
[41] Molecular Biology Techniques: An Intensive Laboratory Course, (Ream et al., eds., 1998, Academic Press)
[42] PCR (Introduction to Biotechniques Series), 2nd ed. (Newton & Graham eds., 1997, Springer Verlag)
[43] Yoneyama & Fujita (2007) Cytokine & Growth Factor Reviews 18:545-51.
[44] Maurer et al. (2001) Biophysical Journal, 80: 2310-2326.
[45] Perri et al. (2003) J Virol 77:10394-10403.
[46] Iavarone et al. (2011) J Immunol 186;4213-22.
[47] Boxus et al. (2007) J Virol 81:6879-89.
[48] Taylor et al. (2005) Vaccine 23:1242-50.
4

Claims (14)

Patentni zahtevi
1. Farmaceutska kompozicija koja sadrži nevirionsku česticu koja ne sadrži proteinski kapsid, za in vivo isporuku RNK u ćeliju kičmenjaka; naznačena time da
(a) čestica je formirana od materijala za isporuku amfifilnih lipida koji mogu da formiraju lipozome, a čestica je lipozom koji sadrži lipid sa katjonskom grupom glave i inkapsulira samoreplicirajući RNK molekul koji kodira imunogen, pri čemu imunogen može izazvati imuni odgovor in vivo protiv virusa, bakterije, gljivice, parazita, alergena ili tumorskog antigena; i pri čemu
(bi) RNK ne uključuje modifikovane nukleotide osim bilo koje strukture 5' kape, ili (bii) RNK uključuje 5' kapu koja sadrži 7-metilguanozin i prvih 1, 2 ili 3 5' ribonukleotida su metilovani na 2' položaju riboze.
2. Kompozicija prema patentnom zahtevu 1, naznačena time da lipozom ima prečnik u opsegu od 50-220 nm.
3. Kompozicija prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačena time da lipozom sadrži lipid sa cviterjonskom grupom glave.
4. Kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 1 ili 3, naznačena time da lipozom sadrži PEGilovani lipid, pri čemu je PEG izborno između 0.5-8 kDa.
5. Kompozicija prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačena time da su jedan ili više lipida pomešani sa holesterolom.
6. Kompozicija prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačena time što molekul RNK koji se samoreplicira kodira (i) RNK-zavisnu RNK polimerazu koja može da transkribuje RNK iz molekula RNK koji se samoreplicira i (ii) imunogen.
7. Kompozicija prema patentnom zahtevu 6, gde molekul RNK ima dva otvorena okvira čitanja, od kojih prvi kodira repliku alfavirusa, a drugi kodira imunogen.
8. Kompozicija prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačena time da je molekul RNK dugačak 5000-25000 nukleotida.
9. Kompozicija prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačena time što imunogen može izazvati imuni odgovor in vivo protiv:
(a) koronavirusa, kao što je SARS koronavirus, infektivni bronhitis ptica (IBV), virus mišjeg hepatitisa (MHV) i virus prenosivog gastroenteritisa svinja (TGEV); (b) ortomiksovirusa, kao što je virus gripa A, B i C; (c) respiratornog sincicijalnog virusa (RSV), kao što je RSV glikoprotein F; (d) herpes virusa, kao što su herpes simplex virusi (HSV), varičela-zoster virus (VZV), Epstein-Barr virus (EBV), citomegalovirus (CMV), humani herpesvirus 6 (HHV6), humani herpesvirus 7 (HHV7) i humani herpesvirus 8 (HHV8); ili (e) bakterija.
10. Kompozicija prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačena time da je imunogen površinski polipeptid, opciono izabran od spajk glikoproteina, hemaglutinina, glikoproteina omotača ili adhezina.
11. Kompozicija prema patentnom zahtevu 10, naznačena time da je imunogen spajk glikoprotein
12. Kompozicija prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, za upotrebu u imunizaciji subjekta ili za upotrebu u postupku podizanja zaštitnog imunog odgovora kod kičmenjaka.
13.Kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 12, za upotrebu kao profilaktička vakcina za sprečavanje infekcije.
14. Postupak za pripremu farmaceutske kompozicije prema bilo kom od zahteva 1 do 11, koji obuhvata pripremu lipozoma mešanjem (i) etanolnog rastvora lipida koji formiraju lipozome, (ii) vodenog rastvora RNK i (iii) pufera, nakon čega sledi ekvilibracija, razblaživanje i prečišćavanje; i formulaciju u farmaceutsku kompoziciju sa farmaceutski prihvatljivim nosačem.
RS20221148A 2010-07-06 2011-07-06 Čestice za isporuku slične virionu za molekule samoreplicirajuće rnk RS63817B1 (sr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US36182810P 2010-07-06 2010-07-06
EP21204155.2A EP4005592B2 (en) 2010-07-06 2011-07-06 Virion-like delivery particles for self-replicating rna molecules

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS63817B1 true RS63817B1 (sr) 2023-01-31

Family

ID=44629863

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20221148A RS63817B1 (sr) 2010-07-06 2011-07-06 Čestice za isporuku slične virionu za molekule samoreplicirajuće rnk
RS20160879A RS55260B1 (sr) 2010-07-06 2011-07-06 Čestice slične virionu za dopremanje samoreplicirajućih rnk molekula

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20160879A RS55260B1 (sr) 2010-07-06 2011-07-06 Čestice slične virionu za dopremanje samoreplicirajućih rnk molekula

Country Status (22)

Country Link
US (2) US11291635B2 (sr)
EP (4) EP4005592B2 (sr)
JP (1) JP6061849B2 (sr)
CN (2) CN103052400B (sr)
AU (1) AU2011276232B2 (sr)
BR (1) BR112013000392B8 (sr)
CA (1) CA2804494A1 (sr)
CY (1) CY1118080T1 (sr)
DK (1) DK2590676T3 (sr)
ES (2) ES2934240T3 (sr)
FI (1) FI4005592T3 (sr)
HR (2) HRP20161352T1 (sr)
HU (2) HUE060788T2 (sr)
LT (2) LT4005592T (sr)
MX (1) MX342608B (sr)
PL (2) PL4005592T3 (sr)
PT (2) PT4005592T (sr)
RS (2) RS63817B1 (sr)
RU (1) RU2013104890A (sr)
SI (2) SI4005592T1 (sr)
SM (2) SMT202200500T1 (sr)
WO (1) WO2012006376A2 (sr)

Families Citing this family (215)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PT3243526T (pt) 2010-07-06 2020-03-04 Glaxosmithkline Biologicals Sa Distribuição de arn para despoletar múltiplas vias imunitárias
US10487332B2 (en) 2010-07-06 2019-11-26 Glaxosmithkline Biologicals Sa Immunisation of large mammals with low doses of RNA
CN103153284B (zh) 2010-07-06 2015-11-25 诺华股份有限公司 含有其pKa值有利于RNA递送的脂质的脂质体
FI4005592T3 (fi) 2010-07-06 2023-01-13 Virionin kaltaisia kuljetuspartikkeleita itsereplikoituville rna-molekyyleille
CA2804591C (en) 2010-07-06 2019-01-22 Novartis Ag Cationic oil-in-water emulsions
CA2807552A1 (en) 2010-08-06 2012-02-09 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
RS63890B1 (sr) * 2010-08-31 2023-02-28 Glaxosmithkline Biologicals Sa Mali lipozomi za isporuku rnk koja kodira imunogen
JP5911870B2 (ja) 2010-08-31 2016-04-27 ノバルティス アーゲー 免疫原をコードするｒｎａの送達のためのｐｅｇ化リポソーム
EP2857499A1 (en) 2010-10-01 2015-04-08 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
KR102266691B1 (ko) * 2010-10-11 2021-06-23 노파르티스 아게 항원 전달 플랫폼
CA2831613A1 (en) 2011-03-31 2012-10-04 Moderna Therapeutics, Inc. Delivery and formulation of engineered nucleic acids
EP4074693A1 (en) 2011-06-08 2022-10-19 Translate Bio, Inc. Cleavable lipids
KR20220025112A (ko) 2011-06-08 2022-03-03 샤이어 휴먼 지네틱 테라피즈 인크. Mrna 전달을 위한 지질 나노입자 조성물 및 방법
JP2014522842A (ja) 2011-07-06 2014-09-08 ノバルティス アーゲー 免疫原性組み合わせ組成物およびその使用
US9655845B2 (en) 2011-07-06 2017-05-23 Glaxosmithkline Biologicals, S.A. Oil-in-water emulsions that contain nucleic acids
RU2014104090A (ru) * 2011-07-06 2015-08-20 Новартис Аг Липосомы с эффективным соотношением n:p для доставки молекул phk
US9636410B2 (en) 2011-07-06 2017-05-02 Glaxosmithkline Biologicals Sa Cationic oil-in-water emulsions
PT2750707T (pt) 2011-08-31 2019-01-23 Glaxosmithkline Biologicals Sa Lipossomas peguilados para distribuição de arn que codifica imunogénio
US9464124B2 (en) 2011-09-12 2016-10-11 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
PT3682905T (pt) 2011-10-03 2022-04-07 Modernatx Inc Nucleósidos, nucleótidos e ácidos nucleicos modificados e respetivas utilizações
BR112014008694A2 (pt) * 2011-10-11 2017-06-20 Novartis Ag moléculas de ácido nucleico policistrônico recombinante
ES2923757T3 (es) 2011-12-16 2022-09-30 Modernatx Inc Composiciones de ARNm modificado
WO2013151664A1 (en) 2012-04-02 2013-10-10 modeRNA Therapeutics Modified polynucleotides for the production of proteins
CN104411338A (zh) 2012-04-02 2015-03-11 现代治疗公司 用于产生与人类疾病相关的生物制剂和蛋白质的修饰多核苷酸
US9572897B2 (en) 2012-04-02 2017-02-21 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
US10501512B2 (en) 2012-04-02 2019-12-10 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides
US9283287B2 (en) 2012-04-02 2016-03-15 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins
EA201492055A1 (ru) 2012-06-08 2015-11-30 Шир Хьюман Дженетик Терапис, Инк. ИНГАЛЯЦИОННАЯ ДОСТАВКА мРНК В НЕЛЕГОЧНЫЕ КЛЕТКИ-МИШЕНИ
US9512456B2 (en) 2012-08-14 2016-12-06 Modernatx, Inc. Enzymes and polymerases for the synthesis of RNA
PT2922554T (pt) 2012-11-26 2022-06-28 Modernatx Inc Arn modificado nas porções terminais
AU2014204826A1 (en) 2013-01-10 2015-07-09 Seqirus UK Limited Influenza virus immunogenic compositions and uses thereof
EP3434774A1 (en) 2013-01-17 2019-01-30 ModernaTX, Inc. Signal-sensor polynucleotides for the alteration of cellular phenotypes
US20160024181A1 (en) 2013-03-13 2016-01-28 Moderna Therapeutics, Inc. Long-lived polynucleotide molecules
US10258698B2 (en) 2013-03-14 2019-04-16 Modernatx, Inc. Formulation and delivery of modified nucleoside, nucleotide, and nucleic acid compositions
PL2970948T3 (pl) 2013-03-15 2019-06-28 Glaxosmithkline Biologicals Sa Sposoby oczyszczania rna
US8980864B2 (en) 2013-03-15 2015-03-17 Moderna Therapeutics, Inc. Compositions and methods of altering cholesterol levels
PL3019619T3 (pl) 2013-07-11 2022-01-10 Modernatx, Inc. Kompozycje zawierające syntetyczne polinkleotydy kodujące białka powiązane z crispr i syntetyczne sgrna oraz sposoby ich stosowania
CA2923029A1 (en) 2013-09-03 2015-03-12 Moderna Therapeutics, Inc. Chimeric polynucleotides
WO2015034925A1 (en) 2013-09-03 2015-03-12 Moderna Therapeutics, Inc. Circular polynucleotides
US10023626B2 (en) 2013-09-30 2018-07-17 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding immune modulating polypeptides
KR20160067219A (ko) 2013-10-03 2016-06-13 모더나 세라퓨틱스, 인코포레이티드 저밀도 지단백질 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드
WO2015126477A1 (en) * 2013-11-08 2015-08-27 Tyrx, Inc. Polymeric drug delivery system for treating surgical complications
US10842859B2 (en) * 2014-03-25 2020-11-24 Yale University Uses of parasite macrophage migration inhibitory factors
HRP20220070T1 (hr) 2014-04-23 2022-04-01 Modernatx, Inc. Cjepiva nukleinske kiseline
EP2974739A1 (en) 2014-07-15 2016-01-20 Novartis AG RSVF trimerization domains
EP3154576A1 (en) 2014-06-13 2017-04-19 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Immunogenic combinations
WO2016011226A1 (en) 2014-07-16 2016-01-21 Moderna Therapeutics, Inc. Chimeric polynucleotides
EP3171895A1 (en) 2014-07-23 2017-05-31 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of intrabodies
EP3061826A1 (en) 2015-02-27 2016-08-31 Novartis AG Flavivirus replicons
AU2016251687C1 (en) 2015-04-22 2023-07-27 CureVac SE RNA containing composition for treatment of tumor diseases
MA42502A (fr) 2015-07-21 2018-05-30 Modernatx Inc Vaccins contre une maladie infectieuse
US11364292B2 (en) 2015-07-21 2022-06-21 Modernatx, Inc. CHIKV RNA vaccines
HRP20220156T1 (hr) 2015-09-17 2022-04-15 Modernatx, Inc. Spojevi i pripravci za unutarstaničnu isporuku terapeutskih sredstava
EP3359670B2 (en) 2015-10-05 2024-02-14 ModernaTX, Inc. Methods for therapeutic administration of messenger ribonucleic acid drugs
US20180271970A1 (en) * 2015-10-22 2018-09-27 Modernatx, Inc. Respiratory syncytial virus vaccine
WO2017070624A1 (en) 2015-10-22 2017-04-27 Modernatx, Inc. Tropical disease vaccines
EP3364981A4 (en) * 2015-10-22 2019-08-07 ModernaTX, Inc. VACCINE AGAINST THE HUMAN CYTOMEGALOVIRUS
MA45209A (fr) 2015-10-22 2019-04-17 Modernatx Inc Vaccins contre les maladies sexuellement transmissibles
PE20181531A1 (es) * 2015-10-22 2018-09-26 Modernatx Inc Vacuna del virus herpes simple
SG11201803360UA (en) * 2015-10-22 2018-05-30 Modernatx Inc Nucleic acid vaccines for varicella zoster virus (vzv)
MA46023A (fr) * 2015-10-22 2019-07-03 Modernatx Inc Vaccin contre le virus de la grippe à large spectre
CN108368028B (zh) 2015-10-28 2021-09-03 爱康泰生治疗公司 用于递送核酸的新型脂质和脂质纳米颗粒制剂
DK3386484T3 (da) 2015-12-10 2022-07-04 Modernatx Inc Sammensætninger og fremgangsmåder til afgivelse af terapeutiske midler
RS63051B1 (sr) 2015-12-22 2022-04-29 Modernatx Inc Jedinjenja i kompozicije za intracelularnu isporuku agenasa
SMT202200310T1 (it) 2015-12-23 2022-09-14 Modernatx Inc Metodi di utilizzo dei polinucleotidi codificanti il ligando di ox40
US12678515B2 (en) 2015-12-30 2026-07-14 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipids and lipid nanoparticle formulations for delivery of nucleic acids
US20190241658A1 (en) 2016-01-10 2019-08-08 Modernatx, Inc. Therapeutic mRNAs encoding anti CTLA-4 antibodies
US10022436B2 (en) 2016-01-11 2018-07-17 Verndari, Inc. Microneedle compositions and methods of using same
WO2017162265A1 (en) 2016-03-21 2017-09-28 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh Trans-replicating rna
US12128113B2 (en) 2016-05-18 2024-10-29 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding JAGGED1 for the treatment of Alagille syndrome
WO2017208191A1 (en) 2016-06-02 2017-12-07 Glaxosmithkline Biologicals Sa Zika viral antigen constructs
WO2018060288A1 (en) 2016-09-29 2018-04-05 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Compositions and methods of treatment of persistent hpv infection
GB201616904D0 (en) 2016-10-05 2016-11-16 Glaxosmithkline Biologicals Sa Vaccine
EP3528821A4 (en) 2016-10-21 2020-07-01 ModernaTX, Inc. HUMAN CYTOMEGALOVIRUS VACCINE
US12491261B2 (en) 2016-10-26 2025-12-09 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle formulations
EP3538067A1 (en) 2016-11-08 2019-09-18 Modernatx, Inc. Stabilized formulations of lipid nanoparticles
MA46766A (fr) 2016-11-11 2019-09-18 Modernatx Inc Vaccin antigrippal
EP3541416A1 (en) 2016-11-17 2019-09-25 GlaxoSmithKline Biologicals SA Zika viral antigen constructs
EP3551193A4 (en) 2016-12-08 2020-08-19 Modernatx, Inc. NUCLEIC ACID VACCINES AGAINST RESPIRATORY VIRUSES
KR20240144261A (ko) 2017-02-28 2024-10-02 사노피 치료적 rna
WO2018170322A1 (en) 2017-03-15 2018-09-20 Modernatx, Inc. Crystal forms of amino lipids
JP7332478B2 (ja) 2017-03-15 2023-08-23 モデルナティエックス インコーポレイテッド 脂質ナノ粒子製剤
WO2018170260A1 (en) 2017-03-15 2018-09-20 Modernatx, Inc. Respiratory syncytial virus vaccine
WO2018170256A1 (en) 2017-03-15 2018-09-20 Modernatx, Inc. Herpes simplex virus vaccine
WO2018170270A1 (en) 2017-03-15 2018-09-20 Modernatx, Inc. Varicella zoster virus (vzv) vaccine
RS63953B1 (sr) 2017-03-15 2023-02-28 Modernatx Inc Jedinjenje i kompozicije za intracelularnu isporuku terapeutskih sredstava
US11576961B2 (en) 2017-03-15 2023-02-14 Modernatx, Inc. Broad spectrum influenza virus vaccine
KR102945203B1 (ko) 2017-05-08 2026-03-31 시애틀 프로젝트 코포레이션 알파바이러스 신생항원 벡터
EP4253544A3 (en) 2017-05-18 2023-12-20 ModernaTX, Inc. Modified messenger rna comprising functional rna elements
AU2018270111B2 (en) 2017-05-18 2022-07-14 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding tethered interleukin-12 (IL12) polypeptides and uses thereof
PL3638776T3 (pl) 2017-06-14 2026-02-23 Technische Universität Dresden Sposoby i środki do zmiany genetycznej genomów z wykorzystaniem projektowanych enzymów rekombinujących dna
EP3638678B1 (en) 2017-06-14 2025-12-03 ModernaTX, Inc. Compounds and compositions for intracellular delivery of agents
EP3638292A1 (en) 2017-06-14 2020-04-22 ModernaTX, Inc. Polynucleotides encoding coagulation factor viii
MA49421A (fr) 2017-06-15 2020-04-22 Modernatx Inc Formulations d'arn
WO2019023566A1 (en) * 2017-07-28 2019-01-31 Janssen Vaccines & Prevention B.V. METHODS AND COMPOSITIONS FOR PROVIDING IMMUNIZATION AGAINST Heterologous ARNREP
JP7355731B2 (ja) 2017-08-16 2023-10-03 アクイタス セラピューティクス インコーポレイテッド 脂質ナノ粒子製剤における使用のための脂質
MX2020002348A (es) 2017-08-31 2020-10-08 Modernatx Inc Métodos de elaboración de nanopartículas lipídicas.
EP3681514A4 (en) 2017-09-14 2021-07-14 ModernaTX, Inc. RNA VACZINE AGAINST ZIKA VIRUS
EP3461497A1 (en) 2017-09-27 2019-04-03 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Viral antigens
US11939601B2 (en) 2017-11-22 2024-03-26 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding phenylalanine hydroxylase for the treatment of phenylketonuria
JP7424976B2 (ja) 2017-11-22 2024-01-30 モダーナティエックス・インコーポレイテッド プロピオン酸血症の治療用のプロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼアルファ及びベータサブユニットをコードするポリヌクレオチド
EP3714048B1 (en) 2017-11-22 2025-04-09 ModernaTX, Inc. Polynucleotides encoding ornithine transcarbamylase for the treatment of urea cycle disorders
EA202091517A1 (ru) 2017-12-19 2020-11-03 Янссен Сайенсиз Айрлэнд Анлимитед Компани Способы и устройство для доставки вакцин против вируса гепатита b (hbv)
EA202091513A1 (ru) 2017-12-19 2020-09-09 Янссен Сайенсиз Айрлэнд Анлимитед Компани Вакцины против вируса гепатита b (hbv) и их применение
EA202091516A1 (ru) 2017-12-19 2020-11-03 Янссен Сайенсиз Айрлэнд Анлимитед Компани Способы и композиции для индукции иммунного ответа против вируса гепатита b (hbv)
KR20200101394A (ko) 2017-12-20 2020-08-27 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이. 엡스타인-바 바이러스 항원 구축물
KR20240134250A (ko) 2018-01-04 2024-09-06 아이코닉 테라퓨틱스, 인코포레이티드 항-조직 인자 항체, 항체-약물 결합체, 및 관련 방법
US11802146B2 (en) 2018-01-05 2023-10-31 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding anti-chikungunya virus antibodies
US11911453B2 (en) 2018-01-29 2024-02-27 Modernatx, Inc. RSV RNA vaccines
CA3100050A1 (en) 2018-05-11 2019-11-14 Lupagen, Inc. Systems and methods for closed loop, real-time modifications of patient cells
MA52709A (fr) 2018-05-23 2021-03-31 Modernatx Inc Administration d'adn
EP3581201A1 (en) 2018-06-15 2019-12-18 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Escherichia coli o157:h7 proteins and uses thereof
WO2020023390A1 (en) 2018-07-25 2020-01-30 Modernatx, Inc. Mrna based enzyme replacement therapy combined with a pharmacological chaperone for the treatment of lysosomal storage disorders
AU2019321186B2 (en) 2018-08-17 2024-05-23 Glaxosmithkline Biologicals Sa Immunogenic compositions and uses thereof
MA53545A (fr) 2018-09-02 2021-07-14 Modernatx Inc Polynucléotides codant pour l'acyl-coa déshydrogénase à très longue chaîne pour le traitement de l'insuffisance en acyl-coa déshydrogénase à très longue chaîne
JP2022500436A (ja) 2018-09-13 2022-01-04 モダーナティエックス・インコーポレイテッドModernaTX, Inc. 糖原病を処置するためのグルコース−６−ホスファターゼをコードするポリヌクレオチド
US12644102B2 (en) 2018-09-13 2026-06-02 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding branched-chain alpha-ketoacid dehydrogenase complex E1-α, E1-β, and E2 subunits for the treatment of maple syrup urine disease
MA53615A (fr) 2018-09-14 2021-07-21 Modernatx Inc Polynucléotides codant pour le polypeptide a1, de la famille de l'uridine diphosphate glycosyltransférase 1, pour le traitement du syndrome de crigler-najjar
CN112996854B (zh) 2018-09-19 2024-08-30 摩登纳特斯有限公司 高纯度peg脂质和其用途
US12151029B2 (en) 2018-09-19 2024-11-26 Modernatx, Inc. PEG lipids and uses thereof
EP3853202A1 (en) 2018-09-19 2021-07-28 ModernaTX, Inc. Compounds and compositions for intracellular delivery of therapeutic agents
US12090235B2 (en) 2018-09-20 2024-09-17 Modernatx, Inc. Preparation of lipid nanoparticles and methods of administration thereof
WO2020069169A1 (en) 2018-09-27 2020-04-02 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding arginase 1 for the treatment of arginase deficiency
KR20210090650A (ko) 2018-11-07 2021-07-20 그릿스톤 바이오, 인코포레이티드 알파바이러스 신생항원 벡터 및 인터페론 억제제
TWI852977B (zh) 2019-01-10 2024-08-21 美商健生生物科技公司 前列腺新抗原及其用途
CN113939282A (zh) 2019-01-31 2022-01-14 摩登纳特斯有限公司 制备脂质纳米颗粒的方法
US11351242B1 (en) 2019-02-12 2022-06-07 Modernatx, Inc. HMPV/hPIV3 mRNA vaccine composition
DK3934673T3 (da) * 2019-03-08 2026-04-07 Massachusetts Inst Technology Syntetisk onkolytisk lnp-replikon-rna og anvendelser til cancerimmunterapi
MA55321A (fr) 2019-03-15 2022-01-19 Modernatx Inc Vaccins à base d'arn contre le vih
WO2020227642A1 (en) 2019-05-08 2020-11-12 Modernatx, Inc. Compositions for skin and wounds and methods of use thereof
SG11202113187WA (en) 2019-05-30 2021-12-30 Gritstone Bio Inc Modified adenoviruses
WO2020255010A1 (en) 2019-06-18 2020-12-24 Janssen Sciences Ireland Unlimited Company Combination of recombinant interleukin 12 construct and hepatitis b virus (hbv) vaccines
CN114630675A (zh) 2019-06-18 2022-06-14 爱尔兰詹森科学公司 乙型肝炎病毒(hbv)疫苗和抗pd-1或抗pd-l1抗体的组合
EP3986915A1 (en) 2019-06-18 2022-04-27 Janssen Sciences Ireland Unlimited Company Recombinant interleukin 12 construct and uses thereof
CA3143634A1 (en) 2019-06-18 2020-12-24 Janssen Sciences Ireland Unlimited Company Combination of hepatitis b virus (hbv) vaccines and anti-pd-1 antibody
JP2022536945A (ja) 2019-06-18 2022-08-22 ヤンセン・サイエンシズ・アイルランド・アンリミテッド・カンパニー Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ワクチンおよびＨＢＶを標的化するＲＮＡｉの組合せ
EP3986563A1 (en) 2019-06-20 2022-04-27 Janssen Sciences Ireland Unlimited Company Lipid nanoparticle or liposome delivery of hepatitis b virus (hbv) vaccines
MX2022000879A (es) 2019-07-21 2022-05-02 Glaxosmithkline Biologicals Sa Vacuna viral terapeutica.
AU2020351220A1 (en) 2019-09-19 2022-04-07 Modernatx, Inc. Carbonate containing lipid compounds and compositions for intracellular delivery of therapeutic agents
EP4031524A1 (en) 2019-09-19 2022-07-27 ModernaTX, Inc. Branched tail lipid compounds and compositions for intracellular delivery of therapeutic agents
EP4061405A1 (en) 2019-11-18 2022-09-28 Janssen Biotech, Inc. Vaccines based on mutant calr and jak2 and their uses
JP2023517644A (ja) 2020-03-09 2023-04-26 アークトゥラス・セラピューティクス・インコーポレイテッド コロナウイルスワクチン組成物及び方法
US12569553B2 (en) 2020-03-09 2026-03-10 Dynavax Technologies Corporation Shingles vaccines comprising a TLR9 agonist
US20230364219A1 (en) 2020-04-16 2023-11-16 Glaxosmithkline Biologicals Sa Sars cov-2 spike protein construct
IL298363A (en) * 2020-05-20 2023-01-01 Flagship Pioneering Innovations Vi Llc Immunogenic compositions and uses thereof
AU2021285812A1 (en) 2020-06-01 2023-01-05 Modernatx, Inc. Phenylalanine hydroxylase variants and uses thereof
WO2021245611A1 (en) 2020-06-05 2021-12-09 Glaxosmithkline Biologicals Sa Modified betacoronavirus spike proteins
EP4171629A1 (en) 2020-06-29 2023-05-03 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Adjuvants
EP4175664A2 (en) 2020-07-06 2023-05-10 Janssen Biotech, Inc. Prostate neoantigens and their uses
WO2022009049A1 (en) 2020-07-06 2022-01-13 Janssen Biotech, Inc. Prostate neoantigens and their uses
IL299571A (en) 2020-07-08 2023-02-01 Janssen Sciences Ireland Unlimited Co Rna replicon vaccines against hbv
KR20230051172A (ko) 2020-07-16 2023-04-17 아퀴타스 테라퓨틱스 인크. 지질 나노 입자에 사용하기 위한 양이온성 지질
IL300026A (en) 2020-08-06 2023-03-01 Gritstone Bio Inc Multiepitope vaccine cassettes
US12178921B2 (en) 2020-08-14 2024-12-31 Arcturus Therapeutics, Inc. Method of lyophilizing lipid nanoparticles
US11406703B2 (en) 2020-08-25 2022-08-09 Modernatx, Inc. Human cytomegalovirus vaccine
CA3199784A1 (en) 2020-11-13 2022-05-19 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding cystic fibrosis transmembrane conductance regulator for the treatment of cystic fibrosis
TW202245809A (zh) 2020-12-18 2022-12-01 美商詹森藥物公司 用於治療b型肝炎病毒感染之組合療法
US20240299309A1 (en) * 2020-12-22 2024-09-12 CureVac SE Pharmaceutical composition comprising lipid-based carriers encapsulating rna for multidose administration
US20240301006A1 (en) 2020-12-23 2024-09-12 Glaxosmithkline Biologicals Sa Self-amplifying messenger rna
AU2021412833A1 (en) 2020-12-28 2023-07-06 Arcturus Therapeutics, Inc. Transcription activator-like effector nucleases (talens) targeting hbv
EP4032546A1 (en) 2021-01-20 2022-07-27 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Therapeutic viral vaccine
US11524023B2 (en) 2021-02-19 2022-12-13 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticle compositions and methods of formulating the same
WO2022204380A1 (en) 2021-03-24 2022-09-29 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticles containing polynucleotides encoding propionyl-coa carboxylase alpha and beta subunits and uses thereof
WO2022204369A1 (en) 2021-03-24 2022-09-29 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding methylmalonyl-coa mutase for the treatment of methylmalonic acidemia
WO2022204390A1 (en) 2021-03-24 2022-09-29 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticles containing polynucleotides encoding phenylalanine hydroxylase and uses thereof
US20240207374A1 (en) 2021-03-24 2024-06-27 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticles containing polynucleotides encoding glucose-6-phosphatase and uses thereof
US20240189449A1 (en) 2021-03-24 2024-06-13 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticles and polynucleotides encoding ornithine transcarbamylase for the treatment of ornithine transcarbamylase deficiency
EP4313152A1 (en) 2021-03-26 2024-02-07 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Immunogenic compositions
US20240285755A1 (en) 2021-05-24 2024-08-29 Glaxosmithkline Biologicals Sa Adjuvants
WO2022259191A1 (en) 2021-06-09 2022-12-15 Glaxosmithkline Biologicals Sa Release assay for determining potency of self-amplifying rna drug product and methods for using
US20240384277A1 (en) 2021-06-15 2024-11-21 Modernatx, Inc. Engineered polynucleotides for cell-type or microenvironment-specific expression
US20240376445A1 (en) 2021-06-22 2024-11-14 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding uridine diphosphate glycosyltransferase 1 family, polypeptide a1 for the treatment of crigler-najjar syndrome
WO2023020993A1 (en) 2021-08-16 2023-02-23 Glaxosmithkline Biologicals Sa Novel methods
US20240350410A1 (en) 2021-08-16 2024-10-24 Glaxosmithkline Biologicals Sa Freeze-drying of lipid nanoparticles (lnps) encapsulating rna and formulations thereof
WO2023020992A1 (en) 2021-08-16 2023-02-23 Glaxosmithkline Biologicals Sa Novel methods
US20250134824A1 (en) 2021-08-16 2025-05-01 Glaxosmithkline Biologicals Sa Low-dose lyophilized rna vaccines and methods for preparing and using the same
WO2023020994A1 (en) 2021-08-16 2023-02-23 Glaxosmithkline Biologicals Sa Novel methods
WO2023031855A1 (en) 2021-09-03 2023-03-09 Glaxosmithkline Biologicals Sa Substitution of nucleotide bases in self-amplifying messenger ribonucleic acids
US20250017867A1 (en) 2021-10-01 2025-01-16 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding relaxin for the treatment of fibrosis and/or cardiovascular disease
CN115960922A (zh) * 2021-10-09 2023-04-14 吴可行 自复制rna分子设计及其应用
CA3232485A1 (en) 2021-11-15 2023-05-19 Technische Universitat Dresden Site-specific recombinases for efficient and specific genome editing
WO2023114943A2 (en) 2021-12-16 2023-06-22 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipids for use in lipid nanoparticle formulations
WO2023183909A2 (en) 2022-03-25 2023-09-28 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding fanconi anemia, complementation group proteins for the treatment of fanconi anemia
WO2023198815A1 (en) 2022-04-14 2023-10-19 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Sequential administration of adenoviruses
WO2023218420A1 (en) 2022-05-13 2023-11-16 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Mrna compositions for inducing latent hiv-1 reversal
WO2023221938A1 (zh) * 2022-05-16 2023-11-23 上海行深生物科技有限公司 蛋白包裹自复制rna及其制备方法
WO2023233290A1 (en) 2022-05-31 2023-12-07 Janssen Sciences Ireland Unlimited Company Rnai agents targeting pd-l1
WO2023242817A2 (en) 2022-06-18 2023-12-21 Glaxosmithkline Biologicals Sa Recombinant rna molecules comprising untranslated regions or segments encoding spike protein from the omicron strain of severe acute respiratory coronavirus-2
EP4562163A1 (en) 2022-07-26 2025-06-04 ModernaTX, Inc. Engineered polynucleotides for temporal control of expression
CA3267272A1 (en) 2022-09-26 2024-04-04 Glaxosmithkline Biologicals Sa FLU VIRUS VACCINES
US12115217B2 (en) 2022-11-18 2024-10-15 Trustees Of Boston University Self-replicating RNA and uses thereof
WO2024133160A1 (en) 2022-12-19 2024-06-27 Glaxosmithkline Biologicals Sa Hepatitis b compositions
WO2024160936A1 (en) 2023-02-03 2024-08-08 Glaxosmithkline Biologicals Sa Rna formulation
GB202302092D0 (en) 2023-02-14 2023-03-29 Glaxosmithkline Biologicals Sa Analytical method
WO2024197033A1 (en) 2023-03-21 2024-09-26 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding relaxin for the treatment of heart failure
JP2026514719A (ja) 2023-04-17 2026-05-13 テクニスチェ ユニベルシタト ドレスデン ケルパーシャフト デス エーフェントリッヒェン レヒツ 部位特異的ｄｎａ組換えのための新規のリコンビナーゼ酵素
EP4701657A1 (en) 2023-04-27 2026-03-04 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Influenza virus vaccines
JP2026518411A (ja) 2023-04-27 2026-06-08 グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム インフルエンザウイルスワクチン
EP4704816A1 (en) 2023-05-03 2026-03-11 ModernaTX, Inc. Polynucleotides encoding cystic fibrosis transmembrane conductance regulator for the treatment of cystic fibrosis
EP4480490A1 (en) 2023-06-23 2024-12-25 Medizinische Hochschule Hannover Brick1 for use in treating myocardial diseases
CN121532514A (zh) 2023-07-07 2026-02-13 上海环码生物医药有限公司 用于季节性流感的环状rna疫苗及使用方法
CN116726036B (zh) * 2023-07-27 2025-12-26 中国水产科学研究院黑龙江水产研究所 Nm107在抗传染性胰脏坏死病毒中的应用
EP4771042A1 (en) 2023-08-29 2026-07-08 Shanghai Circode Biomed Co., Ltd Circular rna encoding vegf polypeptides, formulations, and methods of uses
WO2025043547A1 (zh) 2023-08-30 2025-03-06 杭州高田生物医药有限公司 T细胞导向免疫脂质体及其用途
IL326816A (en) 2023-09-01 2026-04-01 Seamless Therapeutics Gmbh Method for the production of a target-specific large serine recombinase
WO2025072482A1 (en) 2023-09-27 2025-04-03 Modernatx, Inc. Immunoglobulin a protease polypeptides, polynucleotides, and uses thereof
AU2024363742A1 (en) 2023-10-16 2026-04-30 Technische Universität Dresden Körperschaft Des Öffentlichen Rechts Conditioned dna modifying enzyme comprising heterologous dna binding domain
WO2025132839A1 (en) 2023-12-21 2025-06-26 Glaxosmithkline Biologicals Sa Influenza virus vaccines
GB202404607D0 (en) 2024-03-29 2024-05-15 Glaxosmithkline Biologicals Sa RNA formulation
WO2025229572A1 (en) 2024-05-01 2025-11-06 Glaxosmithkline Biologicals Sa Epstein-barr virus antigen-encoding messenger ribonucleic acid and antigen protein vaccines
WO2025255199A1 (en) 2024-06-05 2025-12-11 Modernatx, Inc. Argininosuccinate synthase 1 and argininosuccinate lyase polypeptides and polynucleotides and uses thereof
WO2025252950A1 (en) 2024-06-07 2025-12-11 Technische Universität Dresden Körperschaft Des Öffentlichen Rechts Method for producing spacer-specific dna recombining enzymes
US20260049306A1 (en) 2024-07-25 2026-02-19 Technische Universität Dresden Körperschaft Des Öffentlichen Rechts Modifying nucleic acid sequences having asymmetric target sites
CN120310792B (zh) * 2025-02-27 2026-01-30 复旦大学附属肿瘤医院 一种帽非依赖的线性mRNA表达系统及其应用
WO2026139456A2 (en) 2024-12-23 2026-07-02 Glaxosmithkline Biologicals Sa Self-amplifying messenger rna molecules

Family Cites Families (115)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6090406A (en) * 1984-04-12 2000-07-18 The Liposome Company, Inc. Potentiation of immune responses with liposomal adjuvants
US5140086A (en) 1988-11-25 1992-08-18 Weyerhaeuser Company Isocyanate modified cellulose products and method for their manufacture
US6867195B1 (en) 1989-03-21 2005-03-15 Vical Incorporated Lipid-mediated polynucleotide administration to reduce likelihood of subject's becoming infected
US5013556A (en) 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5279833A (en) 1990-04-04 1994-01-18 Yale University Liposomal transfection of nucleic acids into animal cells
US5750390A (en) 1992-08-26 1998-05-12 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Method and reagent for treatment of diseases caused by expression of the bcl-2 gene
US5693535A (en) 1992-05-14 1997-12-02 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. HIV targeted ribozymes
EP0646178A1 (en) 1992-06-04 1995-04-05 The Regents Of The University Of California expression cassette with regularoty regions functional in the mammmlian host
JPH07509133A (ja) 1992-07-17 1995-10-12 リボザイム・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 動物疾患の処置のための方法および剤
JPH09500013A (ja) 1993-06-01 1997-01-07 ライフ・テクノロジーズ・インコーポレイテッド カチオン性脂質による遺伝子免疫
US6015686A (en) 1993-09-15 2000-01-18 Chiron Viagene, Inc. Eukaryotic layered vector initiation systems
US6264957B1 (en) * 1995-09-27 2001-07-24 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Product of infectious respiratory syncytial virus from cloned nucleotide sequences
JP2001503735A (ja) 1996-07-03 2001-03-21 ユニバーシティ オブ ピッツバーグ 親水性活性試薬のためのエマルジョン処方物
EP0938298B1 (en) 1996-09-13 2002-12-04 Lipoxen Technologies Limited Liposome-based composition
US7384923B2 (en) 1999-05-14 2008-06-10 Lipoxen Technologies Limited Liposomes
US6395302B1 (en) 1996-11-19 2002-05-28 Octoplus B.V. Method for the preparation of microspheres which contain colloidal systems
CA2289702C (en) 1997-05-14 2008-02-19 Inex Pharmaceuticals Corp. High efficiency encapsulation of charged therapeutic agents in lipid vesicles
US6060308A (en) 1997-09-04 2000-05-09 Connaught Laboratories Limited RNA respiratory syncytial virus vaccines
US6009406A (en) 1997-12-05 1999-12-28 Square D Company Methodology and computer-based tools for re-engineering a custom-engineered product line
US6432925B1 (en) 1998-04-16 2002-08-13 John Wayne Cancer Institute RNA cancer vaccine and methods for its use
US6517842B1 (en) 1998-06-29 2003-02-11 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Marburg virus vaccines
ATE492644T1 (de) 1999-09-09 2011-01-15 Curevac Gmbh Transfer von mrna unter verwendung von polykationischen verbindungen
DE60038622D1 (de) 1999-10-20 2008-05-29 Univ Johns Hopkins Med Chimäre immunogene zusammensetzungen und dafür kodierende nukleinsäure
US8541008B2 (en) * 1999-11-19 2013-09-24 Los Angeles Biomedical Research Institute At Harbor-Ucla Medical Center Pharmaceutical compositions and methods to vaccinate against candidiasis
US20030212022A1 (en) * 2001-03-23 2003-11-13 Jean-Marie Vogel Compositions and methods for gene therapy
US7149665B2 (en) 2000-04-03 2006-12-12 Browzwear International Ltd System and method for simulation of virtual wear articles on virtual models
WO2001079253A1 (en) 2000-04-18 2001-10-25 Human Genome Sciences, Inc. Extracellular matrix polynucleotides, polypeptides, and antibodies
ATE440861T1 (de) 2000-07-03 2009-09-15 Novartis Vaccines & Diagnostic Immunisierung gegen chlamydia pneumoniae
WO2002009645A2 (en) 2000-08-01 2002-02-07 The Johns Hopkins University Intercellular transport protein linked to an antigen as a molecular vaccine
US20030138453A1 (en) 2000-09-28 2003-07-24 O'hagan Derek Microparticles for delivery of heterologous nucleic acids
US7939087B2 (en) 2000-10-27 2011-05-10 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Nucleic acids and proteins from Streptococcus groups A & B
WO2002079239A2 (en) 2001-01-31 2002-10-10 U.S. Army Medical Research Institute Of Infectious Diseases Chimeric filovirus glycoprotein
WO2002061113A2 (en) 2001-02-01 2002-08-08 The Johns Hopkins University Nucleic acid derived vaccine that encodes an antigen linked to a polypeptide that promotes antigen presentation
US20030040498A1 (en) 2001-03-14 2003-02-27 Ansardi David Calvert Oncolytic RNA replicons
US20030077251A1 (en) 2001-05-23 2003-04-24 Nicolas Escriou Replicons derived from positive strand RNA virus genomes useful for the production of heterologous proteins
ATE291925T1 (de) 2001-06-05 2005-04-15 Curevac Gmbh Stabilisierte mrna mit erhöhtem g/c-gehalt und optimierter codon usage für die gentherapie
WO2003018054A1 (en) 2001-08-31 2003-03-06 Chiron Srl. Helicobacter pylori vaccination
WO2003023026A1 (en) * 2001-09-06 2003-03-20 Alphavax, Inc. Alphavirus replicon vector systems
AU2003211103A1 (en) 2002-02-13 2003-09-04 Northeastern University Intracellular delivery of therapeutic agents
DE10207177A1 (de) 2002-02-19 2003-09-04 Novosom Ag Fakultativ kationische Lipide
EP1519714B1 (en) 2002-06-28 2010-10-20 Protiva Biotherapeutics Inc. Method and apparatus for producing liposomes
EA008940B1 (ru) 2002-09-13 2007-10-26 Репликор, Инк. Антивирусные олигонуклеотиды, не связанные с комплементарностью последовательностей
WO2004058166A2 (en) 2002-12-23 2004-07-15 Vical Incorporated Codon-optimized polynucleotide-based vaccines against human cytomegalovirus infection
WO2004069148A2 (en) 2003-02-04 2004-08-19 Bar-Ilan University Snornai-small nucleolar rna degradation by rna interference in trypanosomatids
US7731967B2 (en) * 2003-04-30 2010-06-08 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Compositions for inducing immune responses
US20070042979A1 (en) 2003-05-30 2007-02-22 Junichi Yano Oligonucleic acid-bearing composite and pharmaceutical composition containing the composite
WO2005002619A2 (en) 2003-06-26 2005-01-13 Chiron Corporation Immunogenic compositions for chlamydia trachomatis
US7368537B2 (en) * 2003-07-15 2008-05-06 Id Biomedical Corporation Of Quebec Subunit vaccine against respiratory syncytial virus infection
AU2004257373B2 (en) 2003-07-16 2011-03-24 Arbutus Biopharma Corporation Lipid encapsulated interfering RNA
US7709009B2 (en) 2003-07-31 2010-05-04 Novartis Vaccines And Diagnostics, Srl Immunogenic compositions for streptococcus pyogenes
US7303881B2 (en) 2004-04-30 2007-12-04 Pds Biotechnology Corporation Antigen delivery compositions and methods of use
GB0410866D0 (en) 2004-05-14 2004-06-16 Chiron Srl Haemophilius influenzae
JP5331340B2 (ja) 2004-05-18 2013-10-30 バイカル インコーポレイテッド インフルエンザウィルスワクチン組成物、及びその使用方法
PT1751289E (pt) 2004-05-18 2009-03-31 Alphavax Inc Vectores de alfavirais derivados da tc-83, partículas e métodos
US20090104226A1 (en) 2004-05-21 2009-04-23 Novartis Vaccines And Diagnostics Inc. Alphavirus Vectors for Respiratory Pathogen Vaccines
CA2569664C (en) 2004-06-07 2013-07-16 Protiva Biotherapeutics, Inc. Lipid encapsulated interfering rna
US7745651B2 (en) 2004-06-07 2010-06-29 Protiva Biotherapeutics, Inc. Cationic lipids and methods of use
WO2006007712A1 (en) * 2004-07-19 2006-01-26 Protiva Biotherapeutics, Inc. Methods comprising polyethylene glycol-lipid conjugates for delivery of therapeutic agents
WO2006038129A2 (en) 2004-10-01 2006-04-13 Novartis Vaccines And Diagnostics Srl Hepatitis c virus replication system
AU2005334819B2 (en) * 2004-11-15 2011-11-24 Novartis Vaccines And Diagnostics Inc. Immunogenic compositions containing anthrax antigen, biodegradable polymer microparticles, and polynucleotide-containing immunological adjuvant
AU2006214064B2 (en) 2005-02-18 2012-04-26 J. Craig Venter Institute, Inc. Proteins and nucleic acids from meningitis/sepsis-associated escherichia coli
JP2008530245A (ja) 2005-02-18 2008-08-07 ノバルティス ヴァクシンズ アンド ダイアグノスティクス， インコーポレイテッド 尿路病原性菌株由来の抗原
DE602006008278D1 (de) 2005-03-02 2009-09-17 Pharmazeutische zusammensetzung
AU2006235045A1 (en) 2005-03-30 2006-10-19 J. Craig Venter Institute, Inc. Haemophilus influenzae type b
US7618393B2 (en) 2005-05-03 2009-11-17 Pharmajet, Inc. Needle-less injector and method of fluid delivery
AU2006259858A1 (en) 2005-05-12 2006-12-28 Novartis Vaccines And Diagnostics S.R.L. Immunogenic compositions for Chlamydia trachomatis
US8703095B2 (en) 2005-07-07 2014-04-22 Sanofi Pasteur S.A. Immuno-adjuvant emulsion
PL2578685T3 (pl) 2005-08-23 2020-01-31 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Rna zawierający zmodyfikowane nukleozydy i sposoby jego zastosowania
EP1945247A1 (en) 2005-10-18 2008-07-23 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Mucosal and systemic immunizations with alphavirus replicon particles
JP2007112768A (ja) 2005-10-24 2007-05-10 Kyoto Univ 肝指向性リポソーム組成物
EP1954306A2 (en) 2005-10-25 2008-08-13 Novartis Vaccines and Diagnostics S.r.l. Compositions comprising yersinia pestis antigens
US7915399B2 (en) 2006-06-09 2011-03-29 Protiva Biotherapeutics, Inc. Modified siRNA molecules and uses thereof
EP2586790A3 (en) 2006-08-16 2013-08-14 Novartis AG Immunogens from uropathogenic Escherichia coli
WO2008103276A2 (en) 2007-02-16 2008-08-28 Merck & Co., Inc. Compositions and methods for potentiated activity of biologicaly active molecules
US8877206B2 (en) 2007-03-22 2014-11-04 Pds Biotechnology Corporation Stimulation of an immune response by cationic lipids
EP3434259A1 (en) 2007-05-04 2019-01-30 Marina Biotech, Inc. Amino acid lipids and uses thereof
DE102007029471A1 (de) 2007-06-20 2008-12-24 Novosom Ag Neue fakultativ kationische Sterole
GB0714963D0 (en) 2007-08-01 2007-09-12 Novartis Ag Compositions comprising antigens
GB0717187D0 (en) 2007-09-04 2007-10-17 Novartis Ag Compositions comprising yersinia pestis antigens
WO2009042794A2 (en) 2007-09-26 2009-04-02 Vanderbilt University Venezuelan equine encephalitis replicons expressing paramyxovirus glycoproteins as vaccine
WO2009079185A2 (en) 2007-11-26 2009-06-25 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Methods of generating alphavirus particles
EP3100718B1 (en) 2008-01-02 2019-11-27 Arbutus Biopharma Corporation Improved compositions and methods for the delivery of nucleic acids
WO2009111088A2 (en) 2008-01-02 2009-09-11 The Johns Hopkins University Antitumor immunization by liposomal delivery of vaccine to the spleen
ITMI20081249A1 (it) 2008-07-09 2010-01-09 Novartis Vaccines & Diagnostic Immunogeni di escherichia coli con solubilità migliorata.
WO2009109860A2 (en) 2008-03-06 2009-09-11 Novartis Ag Mutant forms of chlamydia htra
EP2279254B1 (en) 2008-04-15 2017-07-05 Protiva Biotherapeutics Inc. Novel lipid formulations for nucleic acid delivery
WO2009127230A1 (en) 2008-04-16 2009-10-22 Curevac Gmbh MODIFIED (m)RNA FOR SUPPRESSING OR AVOIDING AN IMMUNOSTIMULATORY RESPONSE AND IMMUNOSUPPRESSIVE COMPOSITION
WO2009132206A1 (en) 2008-04-25 2009-10-29 Liquidia Technologies, Inc. Compositions and methods for intracellular delivery and release of cargo
US20100040650A1 (en) * 2008-05-30 2010-02-18 Crowe Jr James E Virus-Like paramyxovirus particles and vaccines
EP2130912A1 (en) 2008-06-04 2009-12-09 Institut für Viruskrankeiten und Immunprophylaxe Pestivirus replicons providing an RNA-based viral vector system
CL2008002322A1 (es) * 2008-08-07 2009-06-05 Univ Concepcion Formulacion farmaceutica veterinaria que comprende un sistema vectorial viral constituido por una particula recombinante de arn que codifica una cu/zn superoxido dismutasa de la bacteria patogena de bovinos brucella abortus, y al menos un alfavirus arn perteneciente a la familia del virus semliki forest (sfv), util como vacuna.
AU2009303345B2 (en) 2008-10-09 2015-08-20 Arbutus Biopharma Corporation Improved amino lipids and methods for the delivery of nucleic acids
AU2009316680B2 (en) 2008-11-18 2016-03-24 Takeda Vaccines, Inc. RSV F VLPs and methods of manufacture and use thereof
EP2419129A2 (en) 2009-04-14 2012-02-22 Novartis AG Compositions for immunising against staphylococcus aerus
ES2613498T3 (es) 2009-07-01 2017-05-24 Protiva Biotherapeutics Inc. Nuevas formulaciones de lípidos para el suministro de agentes terapéuticos a tumores sólidos
US20120100207A1 (en) 2009-07-02 2012-04-26 Konica Minolta Holdings, Inc. Process for producing liposomes by two-step emulsification method utilizing outer aqueous phase containing specific dispersing agent, process for producing liposome dispersion or dry powder thereof using the process for producing liposomes, and liposome dispersion or dry powder thereof produced thereby
EP2451475A2 (en) 2009-07-06 2012-05-16 Novartis AG Self replicating rna molecules and uses thereof
EP4183412B1 (en) 2009-07-15 2024-08-14 GlaxoSmithKline Biologicals SA Rsv f protein compositions and methods for making same
US8277919B2 (en) 2009-07-23 2012-10-02 VMO Systems, Inc. Reflective coating for an optical disc
EA022786B1 (ru) 2009-07-31 2016-03-31 Этрис Гмбх Рнк с комбинацией из немодифицированных и модифицированных нуклеотидов для экспрессии белков
RU2573409C2 (ru) * 2009-11-04 2016-01-20 Дзе Юниверсити Оф Бритиш Коламбиа Содержащие нуклеиновые кислоты липидные частицы и относящиеся к ним способы
US20110112353A1 (en) 2009-11-09 2011-05-12 Circulite, Inc. Bifurcated outflow cannulae
SI2506857T1 (en) 2009-12-01 2018-08-31 Translate Bio, Inc. Delivery of mRNA for the enrichment of proteins and enzymes in human genetic diseases
WO2011076807A2 (en) 2009-12-23 2011-06-30 Novartis Ag Lipids, lipid compositions, and methods of using them
CA2804591C (en) 2010-07-06 2019-01-22 Novartis Ag Cationic oil-in-water emulsions
CN103153284B (zh) 2010-07-06 2015-11-25 诺华股份有限公司 含有其pKa值有利于RNA递送的脂质的脂质体
PT3243526T (pt) 2010-07-06 2020-03-04 Glaxosmithkline Biologicals Sa Distribuição de arn para despoletar múltiplas vias imunitárias
US10487332B2 (en) 2010-07-06 2019-11-26 Glaxosmithkline Biologicals Sa Immunisation of large mammals with low doses of RNA
FI4005592T3 (fi) 2010-07-06 2023-01-13 Virionin kaltaisia kuljetuspartikkeleita itsereplikoituville rna-molekyyleille
US9770463B2 (en) 2010-07-06 2017-09-26 Glaxosmithkline Biologicals Sa Delivery of RNA to different cell types
EP3542789A3 (en) 2010-08-31 2020-01-01 GlaxoSmithKline Biologicals SA Lipids suitable for liposomal delivery of protein-coding rna
RS63890B1 (sr) 2010-08-31 2023-02-28 Glaxosmithkline Biologicals Sa Mali lipozomi za isporuku rnk koja kodira imunogen
JP5911870B2 (ja) 2010-08-31 2016-04-27 ノバルティス アーゲー 免疫原をコードするｒｎａの送達のためのｐｅｇ化リポソーム
RU2014104090A (ru) 2011-07-06 2015-08-20 Новартис Аг Липосомы с эффективным соотношением n:p для доставки молекул phk
PT2750707T (pt) 2011-08-31 2019-01-23 Glaxosmithkline Biologicals Sa Lipossomas peguilados para distribuição de arn que codifica imunogénio

Also Published As

Publication number Publication date
SI2590676T1 (sl) 2016-11-30
RU2013104890A (ru) 2014-08-20
AU2011276232B2 (en) 2016-01-14
CN103052400A (zh) 2013-04-17
CN103052400B (zh) 2016-11-16
EP4005592A1 (en) 2022-06-01
CY1118080T1 (el) 2017-06-28
SI4005592T1 (sl) 2023-03-31
AU2011276232A1 (en) 2013-02-21
EP4180057A1 (en) 2023-05-17
RS55260B1 (sr) 2017-02-28
ES2600892T3 (es) 2017-02-13
BR112013000392B8 (pt) 2022-10-04
ES2934240T3 (es) 2023-02-20
SMT202200500T1 (it) 2023-01-13
EP4005592B1 (en) 2022-10-12
EP2590676B1 (en) 2016-08-17
SMT201600386B (it) 2017-01-10
JP6061849B2 (ja) 2017-01-18
PL4005592T3 (pl) 2023-02-06
HRP20161352T1 (hr) 2016-12-02
CA2804494A1 (en) 2012-01-12
EP4005592B2 (en) 2026-05-27
JP2013533747A (ja) 2013-08-29
WO2012006376A2 (en) 2012-01-12
HUE031485T2 (en) 2017-07-28
US11291635B2 (en) 2022-04-05
MX2013000089A (es) 2013-02-27
MX342608B (es) 2016-10-06
US20220192997A1 (en) 2022-06-23
WO2012006376A3 (en) 2012-04-19
PL2590676T3 (pl) 2017-02-28
EP3115061A1 (en) 2017-01-11
FI4005592T3 (fi) 2023-01-13
DK2590676T3 (en) 2016-10-24
LT2590676T (lt) 2016-10-25
PT2590676T (pt) 2016-11-04
CN106421773A (zh) 2017-02-22
LT4005592T (lt) 2023-01-10
BR112013000392A2 (pt) 2021-05-25
HUE060788T2 (hu) 2023-04-28
PT4005592T (pt) 2022-12-30
EP2590676A2 (en) 2013-05-15
BR112013000392B1 (pt) 2022-07-12
HRP20221522T1 (hr) 2023-02-17
US20130195968A1 (en) 2013-08-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11883534B2 (en) Immunisation with lipid formulations with RNA encoding immunogens
AU2022205179B2 (en) Small liposomes for delivery of immunogen-encoding RNA
US20220192997A1 (en) Virion-like delivery particles for self-replicating rna molecules
HK40071976B (en) Virion-like delivery particles for self-replicating rna molecules
HK40088259A (en) Virion-like delivery particles for self-replicating rna molecules
HK40071976A (en) Virion-like delivery particles for self-replicating rna molecules
HK40087666A (en) Small liposomes for delivery of immunogen-encoding rna
HK40082652A (en) Small liposomes for delivery of immunogen-encoding rna
HK40079415A (en) Small liposomes for delivery of immunogen-encoding rna
HK40092401A (en) Small liposomes for delivery of immunogen-encoding rna
HK40076055A (en) Small liposomes for delivery of immunogen-encoding rna