RS62779B1 - Genska terapija neurodegenerativnih poremećaja - Google Patents

Genska terapija neurodegenerativnih poremećaja

Info

Publication number
RS62779B1
RS62779B1 RS20220002A RSP20220002A RS62779B1 RS 62779 B1 RS62779 B1 RS 62779B1 RS 20220002 A RS20220002 A RS 20220002A RS P20220002 A RSP20220002 A RS P20220002A RS 62779 B1 RS62779 B1 RS 62779B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
aav
sma
protein
vector
use according
Prior art date
Application number
RS20220002A
Other languages
English (en)
Inventor
Marco A Passini
Lamya Shihabuddin
Seng H Cheng
Original Assignee
Genzyme Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Genzyme Corp filed Critical Genzyme Corp
Publication of RS62779B1 publication Critical patent/RS62779B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C12N15/861—Adenoviral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0075—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the delivery route, e.g. oral, subcutaneous
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/02—Muscle relaxants, e.g. for tetanus or cramps
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C12N15/864—Parvoviral vectors, e.g. parvovirus, densovirus
    • C12N15/8645—Adeno-associated virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14121—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14133—Use of viral protein as therapeutic agent other than vaccine, e.g. apoptosis inducing or anti-inflammatory
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14171—Demonstrated in vivo effect

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

Opis
UNAKRSNA REFERENCA NA POVEZANE PATENTNE PRIJAVE
[0001] Ova aplikacija zahteva beneficije pod 35 USC §119(e)(1) Privremene prijave SAD br.
61/174/982, podnesene 2. maja, 2009 i 61/268,059, podnesene 8. juna, 2009,
OBLAST TEHNIKE
[0002] Predmetni pronalazak se uopšteno odnosi na postupke isporuke gena. Posebno su obelodanjeni sastavi i postupci za lečenje poremećaja koji utiču na motoričku funkciju, kao što je motorna funkcija zahvaćena bolešću ili povredom mozga i/ili kičmene moždine.
OPIS PRONALASKA
[0003] Genska terapija je novi modalitet lečenja poremećaja koji utiču na centralni nervni sistem (CNS). CNS genska terapija je olakšana razvojem virusnih vektora sposobnih da efikasno inficiraju postmitotične neurone. Centralni nervni sistem se sastoji od kičmene moždine i mozga. Kičmena moždina sprovodi senzorne informacije od perifernog nervnog sistema do mozga i prenosi motoričke informacije od mozga do različitih efektora. Za pregled virusnih vektora za isporuku gena u centralni nervni sistem, videti Davidson i dr., Nature Rev. (2003) 4:353-364.
[0004] Vektori povezani sa adeno-asociranim virusom (AAV) se smatraju korisnim za CNS gensku terapiju jer imaju povoljan profil toksičnosti i imunogenosti, sposobni su da transduciraju neuronske ćelije i sposobni su da posreduju u dugotrajnoj ekspresiji u CNS (Kaplitt i dr., Nat. Genet. (1994) 8:148-154; Bartlett i dr., Hum. Gene Ther. (1998) 9:1181-1186; i Passini i dr., J. Neurosci. (2002) 22:6437-6446).
[0005] Jedno korisno svojstvo AAV vektora leži u sposobnosti nekih AAV vektora da se podvrgnu retrogradnom i/ili anterogradnom transportu u neuronskim ćelijama. Neuroni u jednom regionu mozga su međusobno povezani aksonima sa distalnim regionima mozga, čime se obezbeđuje transportni sistem za isporuku vektora. Na primer, AAV vektor se može primeniti na ili blizu terminala aksona neurona. Neuroni internalizuju AAV vektor i transportuju ga na retrogradan način duž aksona do tela ćelije. Pokazalo se da slična svojstva adenovirusa, HSV i virusa pseudo-besnila isporučuju gene distalnim strukturama u mozgu (Soudas i dr., FASEB J. (2001) 15:2283-2285; Breakefield i dr., New Biol. (1991) 3:203-218; i deFalco i dr., Science (2001) 291:2608-2613).
[0006] Nekoliko eksperimentatora je izvestilo da je transdukcija mozga pomoću AAV serotipa 2 (AAV2) ograničena na mesto intrakranijalne injekcije (Kaplitt i dr., Nat. Genet. (1994) 8:148-154; Passini i dr., J. Neurosci. (2002) 22:6437-6446; i Chamberlin i dr., Brain Res. (1998) 793:169-175). Takođe postoje dokazi da se retrogradni aksonski transport neurotrofnih virusnih vektora, uključujući AAV i lentivirusne vektore, takođe može pojaviti u odabranim krugovima normalnog mozga pacova (Kaspar i dr., Mol. Ther. (2002) 5:50-56; Kasper i dr., Science (2003) 301:839-842 i Azzouz i dr., Nature (2004) 429:413-417. Roaul i dr., Nat. Med. (2005) 11(4):423-428 i Ralph i dr., Nat. Med. (2005) 11(4):429-433 izveštavaju da intramuskularna injekcija lentivirusa koji eksprimira utišavanje humane Cu/Zn superoksid dismutaze (SOD1) ometajući RNK retardiranu pojavu bolesti amiotrofične lateralne skleroze (ALS) u terapeutski relevantnom modelu ALS kod glodara.
[0007] Ćelije transdukovane AAV vektorima mogu da eksprimiraju terapeutski transgenski proizvod, kao što je enzim ili neurotrofni faktor, da bi posredovali korisnim efektima intracelularno. Ove ćelije takođe mogu da luče terapeutski transgenski proizvod, koji kasnije može da se preuzme u distalne ćelije gde može da posreduje u svojim korisnim efektima. Ovaj proces je opisan kao unakrsna korekcija (Neufeld i dr., Science (1970) 169:141-146).
[0008] Svojstvo rekombinantnih AAV vektora opisanih iznad je zahtev da se jednolančana DNK (ssDNK) AAV genom mora konvertovati u dvolančanu DNK (dsDNK) pre ekspresije kodiranog transgena. Ovaj korak se može zaobići upotrebom samo-komplementarnih vektora koji pakuju invertovani ponovljeni genom koji se savija u dsDNK bez potrebe za sintezom DNK ili uparivanje baza između više vektorskih genoma, čime se povećava efikasnost prenosa gena posredovanog AAV. Za pregled samo-komplementarnih AAV vektora, videti npr., McCarty, D.M. Molec. Ther. (2008) 16:1648-1656.
[0009] Spinalna mišićna atrofija (SMA) je autozomno recesivni neuromuskularni poremećaj uzrokovan mutacijama gena za preživljavanje motornog neurona 1 (SMN1) i gubitkom kodiranog SMN proteina (Lefebvre i dr., Cell (1995) 80:155-165). Nedostatak SMN dovodi do degeneracije motornih neurona u ventralnom (prednjem) rogu kičmene moždine, što dovodi do slabosti proksimalnih mišića odgovornih za puzanje, hodanje, kontrolu vrata i gutanja, i nevoljnih mišića koji kontrolišu disanje i kašalj (Sumner C.J., NeuroRx (2006) 3:235-245). Shodno tome, pacijenti sa SMA imaju povećanu sklonost ka pneumoniji i drugim plućnim problemima kao što je restriktivna bolest pluća. Početak bolesti i stepen ozbiljnosti su delimično određeni fenotipskim modifikatorskim genom SMN2, koji je sposoban da napravi malu količinu SMN (Monani i dr., Hum. Mol. Genet. (1999) 8:1177-1183; Lorson i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1999) 96:6307-6311). Dakle, pacijenti sa velikim brojem kopija SMN2 (3-4 kopije) pokazuju manje teški oblik bolesti (koji se nazivaju Tipovi II ili III), dok 1-2 kopije SMN2 tipično dovode do teže bolesti tipa I (Campbell i dr., Am. J. Hum. Genet. (1997) 61:40-50; Lefebvre i dr., Nat. Genet. (1997) 16:265-269). Trenutno ne postoje efikasne terapije za SMA.
[0010] Osnovna strategija za lečenje ovog monogenog poremećaja je povećanje nivoa SMN kod pacijenata sa SMA. Jedan pristup da se ovo postigne je modulacija endogenog SMN2 gena sa malim molekulima koji aktiviraju promotor SMN2 ili ispravljaju SMN2 pre-mRNK obrazac spajanja. Promena SMN2 spajanja se takođe može realizovati sa antisens oligonukleotidima i trans-splajsing RNK. Međutim, dok je modulacija SMN2 in
vitro povećala nivoe SMN i rekonstituisala nuklearne dragulje u SMA ćelijskim linijama, studije efikasnosti sa malim molekularnim lekovima nisu dovele do merljivih poboljšanja u klinici (Oskoui i dr., Nerotherapeutics (2008) 5:499-506).
[0011] Foust i dr. (2009) Nature Biotechnology 27(1):59-65 odnosi se na AAV9-GFP injekciju kroz venu lica.
SUŠTINA PRONALASKA
[0012] Predmetni pronalazak je zasnovan na obelodanjivanju da su i konvencionalni rekombinantni AAV (rAAV) virioni, kao i rekombinantni samo-komplementarni AAV vektori (scAAV), u stanju da isporuče gene u CNS sa uspešnom ekspresijom u CNS i lečenjem neurodegenerativnih bolesti. Ovaj terapijski pristup za isporuku gena koji kodiraju terapeutske molekule koji rezultiraju bar delimičnom korekcijom neuropatologija predstavlja veoma poželjan postupak za lečenje različitih neurodegenerativnih poremećaja, uključujući SMA.
[0013] Prema tome, u jednom slučaju, ovde je obelodanjen samo-komplementaran adenoasociran virus (scAAV) vektor koji sadrži polinukleotid koji kodira protein koji modulira motoričku funkciju kod ispitanika sa poremećajem motornog neurona. U određenim slučajevima koji su ovde obelodanjeni, poremećaj motornog neurona se bira između spinalne mišićne atrofije (SMA), amiotrofične lateralne skleroze (ALS), spinalne bulbarne mišićne atrofije, spinalne cerebelarne ataksije, primarne lateralne skleroze (PLS) ili traumatske povrede kičmene moždine.
[0014] U predmetnom pronalasku, poremećaj motornog neurona je spinalna mišićna atrofija (SMA). Shodno tome, pronalazak obezbeđuje rekombinantni AAV virion koji sadrži samokomplementarni vektor adeno-povezanog virusa (scAAV), za upotrebu u lečenju spinalne mišićne atrofije (SMA), pri čemu scAAV vektor sadrži polinukleotid koji kodira protein koji modulira motornu funkciju, pri čemu ekspresija pomenutog proteina u CNS rezultira bar delimičnom korekcijom neuropatologije i/ili stabilizacijom progresije SMA, pri čemu vektor scAAV sadrži kapsid proteine iz serotipa AAV9, i gde virion AAV:
(i) treba da se daje u najmanje jedan region dubokih jezgara malog mozga;
(ii) treba da se daje neposrednom injekcijom u kičmenu moždinu; ili
(iii) treba da se daje putem intracerebroventrikularne injekcije.
[0015] Pronalazak takođe obezbeđuje upotrebu rekombinantnog AAV viriona u proizvodnji leka za lečenje spinalne mišićne atrofije (SMA), pri čemu rekombinantni AAV virion sadrži samo-komplementarni vektor adeno-povezanog virusa (scAAV) koji sadrži polinukleotid koji kodira protein koji modulira motoričku funkciju, pri čemu ekspresija pomenutog proteina u CNS-u rezultira barem delimičnom korekcijom neuropatologije i/ili stabilizacijom progresije SMA, pri čemu scAAV vektor sadrži kapsid proteine iz serotipa AAV9, i gde virion AAV:
(i) treba da se daje u najmanje jedan region dubokih jezgara malog mozga;
(ii) treba da se daje neposrednom injekcijom u kičmenu moždinu; ili
(iii) treba da se daje putem intracerebroventrikularne injekcije.
[0016] U dodatnim otelotvorenjima, polinukleotid prisutan u scAAV vektoru kodira protein motornog neurona preživljavanja (SMN). U određenim otelotvorenjima, SMN protein je humani SMN-1. U daljim otelotvorenjima, SMN-1 sadrži aminokiselinsku sekvencu sa najmanje 90% identičnosti sekvence sa sekvencom prikazanom na Slici 9B. U dodatnim otelotvorenjima, SMN-1 sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je prikazano na Slici 9B.
[0017] Pronalazak se odnosi na rekombinantni AAV virion, koji sadrži scAAV vektor kao što je iznad opisano.
[0018] Ovde je takođe obelodanjen sastav koji sadrži rekombinantni AAV virion kao iznad i farmaceutski prihvatljiv ekscipijens.
[0019] Ovde je takođe obelodanjen postupak modulacije motoričke funkcije kod ispitanika sa poremećajem motoričkih neurona koji se sastoji od davanja terapeutski efikasne količine gornjeg sastava ćelijama ispitanika. U određenim slučajevima, sastav se daje ćelijama in vitro da bi se ćelije transdukovale, a transdukovane ćelije se daju ispitaniku. U alternativnim slučajevima, sastav se daje u ćelije in vivo.
[0020] Ovde je takođe obelodanjen postupak obezbeđivanja SMN proteina ispitaniku sa spinalnom mišićnom atrofijom (SMA) koji obuhvata primenu rekombinantnog AAV viriona koji sadrži AAV vektor kao što je gore opisano na ćelije ispitanika kojima je to potrebno. U određenim slučajevima, sastav se daje ćelijama in vitro da bi se ćelije transdukovale, a transdukovane ćelije se daju ispitaniku. U alternativnim slučajevima, sastav se daje u ćelije in vivo.
[0021] U svakom od gornjih postupaka i u otelotvorenjima pronalaska, sastav se može primeniti direktnom injekcijom u kičmenu moždinu. U drugim otelotvorenjima, sastav se primenjuje putem intracerebroventrikularne injekcije. U dodatnim otelotvorenjima, sastav se primenjuje u cerebralnu bočnu komoru. U određenim otelotvorenjima, sastav se primenjuje u obe cerebralne lateralne komore. U drugim otelotvorenjima, sastav se primenjuje i putem intracerebroventrikularne injekcije i direktnom injekcijom u kičmenu moždinu. U dodatnim otelotvorenjima, sastav se primenjuje intratekalnom injekcijom.
[0022] Ovo i druga otelotvorenja će lako pasti na pamet onima koji su verzirani u ovu oblast tehnike s obzirom na predmetno obelodanjivanje.
KRATAK OPIS SLIKA
[0023]
Slika 1 prikazuje preživljavanje miševa tretiranih sa AAVhSMN1 u odnosu na netretirane SMA miševe. Tretman sa AAVhSMN1 povećao je preživljavanje kod SMA miševa. Netretirani SMA miševi (n = 34, otvoreni krugovi) imali su srednji životni vek od 15 dana. SMA miševi tretirani na P0 sa AAVhSMN1 (n = 24, zatvoreni krugovi) imali su srednji životni vek od 50 dana (p < 0,0001), što je povećanje dugovečnosti od 233%.
Slike 2A-2C pokazuju efekat tretmana genskom terapijom na nivoe SMN u kičmenoj moždini. Prikazani su nivoi proteina hSMN u ubrizganim lumbalnim (Slika 2A), torakalnim (Slika 2B) i cervikalnim (Slika 2C) segmentima u poređenju sa netretiranim SMA i miševima divljeg tipa. Vestern blotovi su urađeni na lumbalnom, torakalnom i cervikalnom segmentu kičmene moždine 16, 58-66 i 120-220 dana nakon injekcije. Vestern blotovi iz tri segmenta su kvantifikovani i, da bi se kontrolisao nivo proteina, SMN je normalizovan na β-tubulin i ucrtan kao procenat divljeg tipa koji odgovara starosti. Ključ (i n-vrednosti): SMA, nelečeni nokaut (n = 5 na 16 dana); AAV, AAV8-hSMN tretirani SMA miševi (n = 7 na 16 dana, n = 5 na 58-66 dana); SMA miševi tretirani scAAV, scAAV8-hSMN (n = 5 u svakoj vremenskoj tački). Vrednosti predstavljaju srednju vrednost ± SEM.
Slike 3A-3J pokazuju podćelijsku distribuciju hSMN proteina i ekspresiju u motornim neuronima kičmene moždine kod lečenih i netretiranih SMA miševa. hSMN protein je obilno detektovan u citoplazmi transdukovanih ćelija (Slike 3A i 3B). Štaviše, hSMN protein je otkriven u jezgru, kao što je ilustrovano parom struktura nalik na dragulj (glava strelice) uvećanih na umetku (Slika 3A). hSMN protein je takođe otkriven u dendritima (Slike 3B i 3C) i aksonima (Slika 3D) neurona. hSMN protein nije bio detektovan na delovima tkiva netretiranih SMA miševa (Slika 3E). Ko-lokalizacija hSMN proteina (Slika 3F) sa mišjim ChAT (Slika 3G) pokazala je da su podskup transduciranih ćelija motorni neuroni (Slike 3H i 3I). Procenat ChAT ćelija koje su bile imuno-pozitivne na hSMN protein određen je 16 (bele kolone) i 58-66 (crne kolone) dana (Slika 3J). Vrednosti predstavljaju srednju vrednost ± SEM.
Slika 4 prikazuje broj ćelija motornih neurona u kičmenoj moždini kod tretiranih i netretiranih SMA miševa. Prikazani su prosečni brojevi ChAT imunopozitivnih neurona izbrojani na presecima tkiva od 10 µm za svaku grupu. Brojevi predstavljaju brojanje svakog desetog preseka sa različitih nivoa cervikalnog, torakalnog, lumbalnog i sakralnog segmenata. Vrednosti predstavljaju srednju vrednost ± SEM. Ključ:<∗>, p < 0,05;<∗∗>, p < 0,01;<∗∗∗>, p < 0,001.
Slike 5A-5C prikazuju površinu poprečnog preseka mišićnog vlakna iz mišićnih grupa kod tretiranih i netretiranih SMA miševa. Površina poprečnog preseka mišićnog vlakna iz više mišićnih grupa je povećana tretmanom AAVhSMN1. Naslagani grafici kvadricepsa, gastroknemija i interkostalnih mišića od 16 (Slika 5A) i 58-66 (Slika 5B) dana pokazali su da je raspodela veličina mišićnog vlakna bila slična između tretiranih SMA i miševa divljeg tipa. Ukupan prosek za 16 dana pokazao je da je površina poprečnog preseka mišićnog vlakna bila značajno veća sa tretmanom (Slika 5C). Štaviše, nakon 58-66 dana, prosečna površina je bila statistički slična između tretiranih SMA miševa i divljeg tipa odgovarajućeg uzrasta u gastroknemijusu i interkostalnim mišićima (Slika 5C). Vrednosti predstavljaju srednju vrednost ± SEM. Ključ: WT, neobrađeni divlji tip; HET, netretirani heterozigot; SMA, nelečeni nokaut; SMA miševi tretirani AAV, AAVhSMN1;<∗>, p < 0,05;<∗∗>, p < 0,01;<∗∗∗>, p < 0,001. Slike 6A-6F prikazuju strukturu NMJ u mišićima tretiranih i netretiranih SMA miševa. Struktura kvadricepsa, gastroknemija i interkostalnog mišića je poboljšana genskom terapijom. Prikazani su neuromuskularni spoj (NMJ) od kvadricepsa netretiranog SMA (Slika 6A), tretiranog SMA (Slika 6B) i netretiranog divljeg tipa (Slika 6C) miševa nakon 16 dana i od tretiranog SMA (Slika 6D) i netretiranih miševa divljeg tipa (Slika 6E) na 58-66 dana. Pre- i post-sinaptički NMJ je obeležen antitelom neurofilamenta (zeleno) i α-bungarotoksinom bojenjem (crveno), respektivno. Strelica na glavnom panelu pokazuje na NMJ koji je istaknut na umecima ispod. Najmanje 100 NMJ je nasumično ocenjeno u svakom mišiću po životinji. Normalni NMJ je definisan kao da ima predsinaptički kraj koji nije pokazao abnormalnu akumulaciju proteina neurofilamenta prikazanu na Slici 6A. Vrednosti na Slici 6F predstavljaju srednju vrednost ± SEM. Ključ: WT, neobrađeni divlji tip; HET, netretirani heterozigot; SMA, nelečeni nokaut; SMA miševi tretirani AAV, AAVhSMN1;<∗>, p < 0,05;<∗∗>, p < 0,01;<∗∗∗>, p < 0,001. Skala: 20 µm.
Slike 7A-7F prikazuju rezultate testova ponašanja kod tretiranih i netretiranih SMA miševa. Tretirani SMA miševi su pokazali značajna poboljšanja na testovima ponašanja. Tretirani SMA (zvezdica) i netretirani miševi divljeg tipa (WT) bili su znatno bolji od netretiranih SMA miševa (označenih sa 'x') nakon 16 dana (Slika 7A). Tretirani SMA miševi su takođe bili značajno teži od netretiranih SMA kontrola od 11. dana pa nadalje (Slika 7B). Tretirani SMA miševi pokazali su se značajno bolje od netretiranih SMA miševa na testovima refleksa uspravljanja (Slika 7C), negativne geotakse (Slika 7D), snage hvata (Slika 7E) i pomeranja zadnjih udova (Slika 7F). Tretirani SMA miševi su bili statistički identični miševima divljeg tipa i heterozigotnim miševima na testovima refleksa uspravljanja i negativnih geotaksijskih testova na 12-16 dana (Slike 7C i 7D). Vrednosti predstavljaju srednju vrednost ± SEM. Ključ: netretirani WT (otvoreni krug), netretirani heterozigot (otvoreni trougao); nelečeni SMA (otvoreni kvadrat); SMA miševi tretirani AAVhSMN1 (zatvoreni kvadrat);<∗>, p < 0,05;<∗∗>, p < 0,01;<∗∗∗>, p < 0,001.
Slika 8 pokazuje preživljavanje miševa tretiranih i netretiranih scAAVhSMN1.
Tretman sa scAAVhSMN1 povećao je preživljavanje kod SMA miševa. SMA miševi tretirani na P0 sa scAAVhSMN1 (n = 17, zatvoreni trouglovi) imali su srednji životni vek od 157 dana (p < 0,0001), u poređenju sa 16 dana kod netretiranih SMA miševa (n = 47, otvoreni krugovi).
Slike 9A-9B (SEQ ID NOS: 1 i 2) prikazuju kodirajuću sekvencu DNK (Slika 9A) i odgovarajuću aminokiselinsku sekvencu (Slika 9B) reprezentativnog gena motornog neurona za preživljavanje čoveka (SMN1).
Slike 10A-10F pokazuju da ekspresija scAAV8-hSMN povećava broj motornih neurona i poboljšava NMJ kod SMA miševa. Slika 10A prikazuje procenat mChAT imunopozitivnih ćelija koje su ko-lokalizovane sa ekspresijom hSMN u torakalnolumbalnom regionu 16 dana nakon injekcije. Slike 10B-10F prikazuju prosečan broj mChAT imunopozitivnih ćelija u lumbalnom (Slika 10B), torakalnom (Slika 10C) i cervikalnom (Slika 10D) segmentima i prosečne procente kolabiranih NMJ u kvadricepsima (Slika 10E) i interkostalnim (Slika 10F) mišićima na 16, 58-66 i 214-269 dana. Kao referenca za Slike 10E i 10F, 75-90% NMJ u kvadricepsima i interkostalnim mišićima netretiranih SMA miševa je sadržalo aberantnu urušenu strukturu nakon 16 dana (videti Sliku 6F). Ključ i n-vrednosti: SMA, nelečeni nokaut (otvorene kolone, n = 8 na 16 dana), AAV, AAV8-hSMN (šrafirane kolone, n = 8 na 16 dana, n = 5 na 58-66 dana); scAAV, scAAV8-hSMN (zatvorene kolone, n = 5 u svakoj vremenskoj tački); WT, netretirana WT (kockaste trake, n = 8 na 16 dana, n = 5 svaki na 58-66 i 216-269 dana). Vrednosti predstavljaju srednju vrednost ± SEM. Statistička poređenja su obavljena sa jednosmernim ANOVA i Bonferonijevim višestrukim post hoc testovima na 16 dana (Slike 10B-10F). Neupareni dvostrani studentski t-test upoređivao je 1) dva vektora jedan sa drugim nakon 16 dana (Slika 10A) i 58-66 dana (Slike 10B-10D); 2) relativni broj ChAT ćelija u grupama 58-66d i 214-269d sa tretmanom scAAV8-hSMN (Slike 10B-10D); 3) relativni broj abnormalnih NMJ između netretiranih WT miševa odgovarajućeg uzrasta i SMA miševa tretiranih scAAV8-hSMN na 214-269 dana (E, F);<∗>p <0,05,<∗∗>p <0,01,<∗∗∗>p <0,001.
DETALJNI OPIS PRONALASKA
[0024] Praksa ovog pronalaska će koristiti, osim ako nije drugačije naznačeno, konvencionalne postupke hemije, biohemije, tehnike rekombinantne DNK i imunologije, u okviru veštine tehnike. Takve tehnike su u potpunosti objašnjene u literaturi. Videti npr., Fundamental Virology, 2nd Edition, vol. I & II (B.N. Fields and D.M. Knipe, eds.); Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D.M. Weir i C.C. Blackwell eds., Blackwell Scientific Publications); T.E. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W.H. Freeman and Company, 1993); A.L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., current addition); Sambrook, i dr., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989); Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.).
1. DEFIINICIJE
[0025] U opisu predmetnog pronalaska, biće korišćeni sledeći termini, koji će biti definisani kao što je ispod navedeno.
[0026] Mora se primetiti da, kao što se koristi u ovoj specifikaciji i priloženim patentnim zahtevima, oblici jednine „a“, „an“ i „the“ uključuju množinske reference, osim ako kontekst jasno ne nalaže drugačije. Tako, na primer, referenca na "interleukin receptor" uključuje mešavinu dva ili više takvih receptora, i slično.
[0027] Termini "polipeptid" i "protein", koji se ovde koriste naizmenično, ili nukleotidna sekvenca koja kodira istu, odnose se na proteinsku ili nukleotidnu sekvencu, respektivno, koja predstavlja ili izvornu sekvencu, njenu varijantu ili njen fragment. Proteini pune dužine, sa ili bez signalne sekvence, i njihovi fragmenti, kao i proteini sa modifikacijama, kao što su delecije, dodaci i supstitucije (bilo konzervativne ili nekonzervativne prirode), u izvornu sekvencu, namenjeni su za koristiti ovde, sve dok protein održava željenu aktivnost. Ove modifikacije mogu biti namerne, kao kroz mutagenezu usmerenu na mesto, ili mogu biti slučajne, kao što su mutacije domaćina koji proizvode proteine ili greške usled PCR amplifikacije. Shodno tome, aktivni proteini u suštini homologni roditeljskoj sekvenci, npr., proteini sa 70...80...85...90...95...98...99% itd. identiteta, koji zadržavaju željenu aktivnost izvorni molekul, su predviđeni za upotrebu ovde.
[0028] "Izvorni" polipeptid, kao što je polipeptid motornog neurona preživljavanja (SMN), odnosi se na polipeptid koji ima istu aminokiselinsku sekvencu kao i odgovarajući molekul koji potiče iz prirode. Takve prirodne sekvence mogu biti izolovane iz prirode ili se mogu
1
proizvesti rekombinantnim ili sintetičkim sredstvima. Termin "izvorna" sekvenca posebno obuhvata prirodno prisutne skraćene ili izlučene forme specifičnog molekula (npr., sekvencu ekstracelularnog domena), varijante oblika koje se javljaju u prirodi (npr., alternativno spojene forme) i alelne varijante polipeptida koje se javljaju u prirodi. U različitim otelotvorenjima pronalaska, izvorni molekuli koji su ovde obelodanjeni su zrele ili prirodne sekvence pune dužine koje sadrže sekvence aminokiselina pune dužine prikazane na pratećim slikama. Međutim, dok neki od molekula obelodanjenih na pratećim slikama počinju ostacima metionina označenim kao aminokiselinska pozicija 1 na slikama, drugi ostaci metionina koji se nalaze uzvodno ili nizvodno od aminokiselinske pozicije 1 na slikama mogu se koristiti kao početna aminokiselina. ostatak za određeni molekul. Alternativno, u zavisnosti od korišćenog sistema ekspresije, ovde opisanim molekulima može nedostajati N-terminalni metionin.
[0029] Pod "varijantom" se podrazumeva aktivni polipeptid kao što je ovde definisano sa najmanje oko 80% identičnosti aminokiselinske sekvence sa odgovarajućom prirodnom sekvencom pune dužine, polipeptid bez signalnog peptida, ekstracelularni domen polipeptida, sa ili bez signala peptid, ili bilo koji drugi fragment polipeptidne sekvence pune dužine kako je ovde obelodanjeno. Takve polipeptidne varijante uključuju, na primer, polipeptide u kojima je jedan ili više aminokiselinskih ostataka dodat, ili izbrisan, na N- i/ili C-završetku izvorne aminokiselinske sekvence pune dužine. Obično, varijanta će imati najmanje oko 80 % identiteta aminokiselinske sekvence, alternativno najmanje oko 81% identičnosti aminokiselinske sekvence, alternativno najmanje oko 82 % identičnosti aminokiselinske sekvence, alternativno najmanje oko 83% identičnosti aminokiselinske sekvence, alternativno najmanje oko 84% identičnosti aminokiselinske sekvence, alternativno najmanje oko 85 % identičnosti aminokiselinske sekvence, alternativno najmanje oko 86 % identičnosti aminokiselinske sekvence, alternativno najmanje oko 87% identičnosti aminokiselinske sekvence, alternativno najmanje oko 88% identičnosti aminokiselinske sekvence, alternativno najmanje oko 89 % identičnosti aminokiselinske sekvence, alternativno najmanje oko 90 % identičnosti aminokiselinske sekvence, alternativno najmanje oko 91 % identičnosti aminokiselinske sekvence, najmanje oko 92 % identičnosti aminokiselinske sekvence, najmanje oko 93 % identičnosti aminokiselinske sekvence, najmanje oko 94 % identičnosti aminokiselinske sekvence, najmanje oko 95 % identičnosti aminokiselinske sekvence, najmanje oko 96 % identičnosti aminokiselinske sekvence, najmanje oko 97 % identičnosti aminokiselinske sekvence, najmanje oko 98 % identičnosti aminokiselinske sekvence i alternativno najmanje oko 99% identičnosti aminokiselinske sekvence sa odgovarajućom prirodnom sekvencom pune dužine. Obično, varijantni polipeptidi imaju najmanje oko 10 aminokiselina u dužini, kao što je najmanje oko 20 aminokiselina u dužinu, npr., najmanje oko 30 aminokiselina u dužinu, alternativno najmanje oko 40 aminokiselina u dužinu, alternativno najmanje oko 50 aminokiselina u dužinu, alternativno najmanje oko 60 aminokiselina u dužinu, alternativno najmanje oko 70 aminokiselina u dužinu, alternativno najmanje oko 80 amin kiselina u dužinu, alternativno najmanje oko 90 aminokiselina u dužinu, alternativno najmanje oko 100 aminokiselina u dužinu, alternativno najmanje oko 150 aminokiselina u dužinu, alternativno najmanje oko 200 aminokiselina u dužinu, alternativno najmanje oko 300 aminokiselina u dužinu, ili više.
[0030] Posebno poželjne varijante uključuju supstitucije koje su po prirodi konzervativne, tj., one supstitucije koje se odvijaju unutar porodice aminokiselina koje su povezane u svojim bočnim lancima. Konkretno, aminokiseline su generalno podeljene u četiri porodice: (1) kisele -- aspartat i glutamat; (2) bazne -- lizin, arginin, histidin; (3) nepolarne -- alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenilalanin, metionin, triptofan; i (4) nenaelektrisane polarne --glicin, asparagin, glutamin, cistein, serin treonin, tirozin. Fenilalanin, triptofan i tirozin se ponekad klasifikuju kao aromatične aminokiseline. Na primer, razumno je predvidljivo da izolovana zamena leucina sa izoleucinom ili valinom, aspartata sa glutamatom, treonina sa serinom, ili slična konzervativna zamena aminokiseline sa strukturno srodnom aminokiselinom, neće imati veliki uticaj na biološku aktivnost. Na primer, polipeptid od interesa može uključivati do oko 5-10 konzervativnih ili nekonzervativnih supstitucija aminokiselina, ili čak do oko 15-25 ili 50 konzervativnih ili nekonzervativnih supstitucija aminokiselina, ili bilo koji broj između 5-50 , sve dok željena funkcija molekula ostane netaknuta.
[0031] "Homologija" se odnosi na procenat identičnosti između dva polinukleotidna ili dva polipeptidna dela. Dve DNK, ili dve polipeptidne sekvence su "suštinski homologne" jedna drugoj kada sekvence pokazuju najmanje oko 50%, poželjno najmanje oko 75%, poželjnije najmanje oko 80%-85%, poželjno najmanje oko 90%, a najpoželjnije najmanje oko 95%-98% identičnosti sekvence na definisanoj dužini molekula. Kako se ovde koristi, suštinski homologno se takođe odnosi na sekvence koje pokazuju potpuni identitet sa navedenom DNK ili polipeptidnom sekvencom.
[0032] Generalno, "identitet" se odnosi na tačnu korespondenciju nukleotida prema nukleotidu ili aminokiseline prema aminokiselini dva polinukleotida ili polipeptidne sekvence, respektivno. Procenat identiteta se može odrediti direktnim poređenjem informacija o sekvenci između dva molekula poravnavanjem sekvenci, brojanjem tačnog broja podudaranja između dve poravnate sekvence, deljenjem sa dužinom kraće sekvence i množenjem rezultata sa 100. Lako dostupni kompjuterski programi mogu se koristiti kao pomoć u analizi, kao što je ALIGN, Dayhoff, M.O. u Atlas of Protein Sequence and Structure M.O. Dayhoff ed., 5 Suppl.3:353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, DC, koji prilagođava lokalni algoritam homologije od Smith and Waterman Advances in Appl. Math.2:482-489, 1981 za peptidnu analizu. Programi za određivanje identiteta nukleotidne sekvence dostupni su u paketu za analizu sekvenci Wiskonsin, verzija 8 (dostupan od Genetics Computer Group, Madison, WI), na primer, programi BESTFIT, FASTA i GAP, koji se takođe oslanjaju na Smith i Waterman algoritam. Ovi programi se lako koriste sa podrazumevanim parametrima koje preporučuje proizvođač i opisanim u iznad pomenutom paketu za analizu sekvenci u Wiskonsinu. Na primer, procenat identiteta određene nukleotidne sekvence sa referentnom sekvencom može se odrediti korišćenjem algoritma za homologiju Smitha i Waterman sa podrazumevanom tabelom bodovanja i kaznom za praznine od šest pozicija nukleotida.
[0033] Drugi postupak utvrđivanja procenta identiteta u kontekstu predmetnog pronalaska je korišćenje MPSRCH paketa programa zaštićenih autorskim pravima Univerziteta u Edinburgu, koji su razvili Džon F. Kolins i Šejn S. Sturrok, a distribuira IntelliGenetics, Inc. (Mountain View, CA). Iz ovog skupa paketa, Smith-Waterman algoritam se može koristiti gde se podrazumevani parametri koriste za tabelu bodovanja (na primer, kazna za otvaranje praznine od 12, kazna za proširenje jaza od jedan i praznina od šest). Iz generisanih podataka vrednost „Match“ odražava „identitet sekvence“. Drugi pogodni programi za izračunavanje procenta identičnosti ili sličnosti između sekvenci su generalno poznati u tehnici, na primer, drugi program za poravnanje je BLAST, koji se koristi sa podrazumevanim parametrima. Na primer, BLASTN i BLASTP se mogu koristiti pomoću sledećih podrazumevanih parametara: genetski kod = standard; filter = nijedan; pramen = oba; prekid = 60; očekivati = 10; Matrix = BLOSUM62; Opisi = 50 sekvenci; sortiraj po = VISOKI REZULTATI; Baze podataka = ne redundantne, GenBank EMBL DDBJ PDB GenBank CDS prevodi švajcarski protein Spupdate PIR. Detalji ovih programa su dobro poznati u tehnici.
1
[0034] Alternativno, homologija se može odrediti hibridizacijom polinukleotida pod uslovima koji formiraju stabilne duplekse između homolognih regiona, nakon čega sledi digestija sa jednolančanom specifičnom nukleazom(ama) i određivanje veličine digestiranih fragmenata. DNK sekvence koje su suštinski homologne mogu se identifikovati u eksperimentu sa Saudern hibridizacijom pod, na primer, strogim uslovima, kao što je definisano za taj određeni sistem. Definisanje odgovarajućih uslova hibridizacije je u okviru veštine tehnike. Videti, npr., Sambrook i dr., supra; DNK kloniranje, supra; Hibridizacija nukleinske kiseline, supra.
[0035] Pod pojmom "degenerisana varijanta" podrazumeva se polinukleotid koji sadrži promene u svojoj sekvenci nukleinske kiseline, koji kodira polipeptid koji ima istu aminokiselinsku sekvencu kao polipeptid kodiran polinukleotidom iz kojeg je izvedena degenerisana varijanta.
[0036] „Kodirajuća sekvenca“ ili sekvenca koja „kodira“ odabrani polipeptid je molekul nukleinske kiseline koji se transkribuje (u slučaju DNK) i prevodi (u slučaju mRNK) u polipeptid in vivo kada se stavi pod kontrolu odgovarajućih regulatornih sekvenci. Granice kodirajuće sekvence određene su start kodonom na 5' (amino) završetku i translacionim stop kodonom na 3' (karboksi) završetku. Sekvenca terminacije transkripcije može biti locirana 3' od kodirajuće sekvence.
[0037] Pod "vektorom" se podrazumeva bilo koji genetski element, kao što je plazmid, fag, transpozon, kosmid, hromozom, virus, virion, itd., koji je sposoban za replikaciju kada je povezan sa odgovarajućim kontrolnim elementima i koji može preneti sekvence gena u ćelije. Dakle, pojam uključuje kloniranje i ekspresione nosače, kao i virusne vektore.
[0038] Pod „rekombinantnim vektorom“ se podrazumeva vektor koji uključuje heterolognu sekvencu nukleinske kiseline koja je sposobna za ekspresiju in vivo.
[0039] Pod "rekombinantnim virusom" se podrazumeva virus koji je genetski izmenjen, npr., dodatkom ili umetanjem heterolognog konstrukta nukleinske kiseline u česticu.
[0040] Termin "transgen" se odnosi na polinukleotid koji je uveden u ćeliju i koji je sposoban da se transkribuje u RNK i opciono, translatira i/ili ekspresuje pod odgovarajućim uslovima.
U jednom aspektu, on daje željeno svojstvo ćeliji u koju je uveden, ili na drugi način dovodi do željenog terapijskog ili dijagnostičkog ishoda.
[0041] Termini "čestice genoma (gp)" ili "ekvivalenata genoma", kako se koriste u vezi sa virusnim titrom, odnose se na broj viriona koji sadrže rekombinantni AAV DNK genom, bez obzira na infektivnost ili funkcionalnost. Broj genomskih čestica u određenom vektorskom preparatu može se meriti postupcima kao što su opisani u Primerima ovde, ili na primer, u Clark i dr., Hum. Gene Ther. (1999) 10:1031-1039; i Veldwijk i dr., Mol. Ther. (2002) 6:272-278.
[0042] Termini „jedinica infekcije (iu)“, „infektivna čestica“ ili „jedinica replikacije“, kako se koriste u vezi sa virusnim titrom, odnose se na broj infektivnih rekombinantnih AAV vektorskih čestica izmerenih testom infektivnog centra, takođe poznatim kao test centra replikacije, kao što je opisano, na primer, u McLaughlin i dr., J. Virol. (1988) 62:1963-1973.
[0043] Termin "transdukciona jedinica (tu)" kako se koristi u vezi sa virusnim titrom, odnosi se na broj infektivnih rekombinantnih AAV vektorskih čestica koje rezultiraju proizvodnjom funkcionalnog transgenskog proizvoda kao što je mereno u funkcionalnim testovima kao što je opisano u Primerima ovde, ili na primer, u Xiao i dr., Exp. Neurobiol. (1997) 144:113-124; ili u Fisher i dr., J. Virol. (1996) 70:520-532 (LFU test).
[0044] Termin "transfekcija" se koristi za označavanje preuzimanja strane DNK od strane ćelije, a ćelija je "transfekcija" kada je egzogena DNK uvedena unutar ćelijske membrane. Brojne tehnike transfekcije su opšte poznate u tehnici. Videti npr., Graham i dr. (1973) Virology, 52 :456, Sambrook i dr. (1989) Molecular Cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, Davis i dr. (1986) Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier, i Chu i dr. (1981) Gene 13:197. Takve tehnike se mogu koristiti za uvođenje jednog ili više egzogenih delova DNK u odgovarajuće ćelije domaćine.
[0045] Termin "heterologan" jer se odnosi na sekvence nukleinskih kiselina kao što su kodirajuće sekvence i kontrolne sekvence, označava sekvence koje nisu normalno spojene zajedno, i/ili nisu normalno povezane sa određenom ćelijom. Dakle, "heterologni" region konstrukta nukleinske kiseline ili vektora je segment nukleinske kiseline unutar ili vezan za drugi molekul nukleinske kiseline koji se ne nalazi u vezi sa drugim molekulom u prirodi. Na
1
primer, heterologni region konstrukta nukleinske kiseline može uključiti kodirajuću sekvencu praćenu sekvencama koje nisu pronađene u vezi sa kodirajućom sekvencom u prirodi. Drugi primer heterologne kodirajuće sekvence je konstrukt gde se sama kodirajuća sekvenca ne nalazi u prirodi (npr., sintetičke sekvence koje imaju kodone različite od prirodnog gena). Slično, ćelija transformisana konstruktom koji inače nije prisutan u ćeliji bi se smatrala heterolognom za svrhe predmetnog pronalaska. Alelne varijacije ili događaji mutacije koji se javljaju u prirodi ne dovode do heterologne DNK, kako se ovde koristi.
[0046] Sekvenca "nukleinske kiseline" se odnosi na sekvencu DNK ili RNK. Termin obuhvata sekvence koje uključuju bilo koji od poznatih baznih analoga DNK i RNK, kao što su, ali ne ograničavajući se na 4-acetilcitosine, 8-hidroksi-N6-metiladenozin, aziridinilcitozin, pseudoizocitozin, 5-(karboksihidroksil-metil) uracil, 5-fluorouracil, 5-bromouracil, 5-karboksimetilaminometil-2-tiouracil, 5-karboksimetil-aminometiluracil, dihidrouracil, inozin, N6-izopenteniladenin, 1-metiladenin, 1-metilpseudo-uracil, 1-metilguanin, 1-metilinozin, 2,2-dimetil-guanin, 2-metiladenin, 2-metilguanin, 3-metil-citozin, 5-metilcitozin, N6-metiladenin, 7-metilguanin, 5-metilaminometiluracil, 5-metoksi-amino-metil-2-tiouracil, beta-D- manosilkjuozin, 5'-methoksicarbonilmethiluracil, 5-methoksiuracil, 2-methilthio-N6-isopenteniladenine, uracil-5- oksisirćetna kiselina metilester, uracil-5-oksisirćetna kiselina, oksibutoksozin, pseudouracil, kjuozin, 2-tiocitozin, 5-metil-2-tiouracil, 2-tiouracil, 4-tiouracil, 5-metiluracil, -uracil-5-oksisirćetna kiselina metilester, uracil-5-oksisirćetna kiselina, pseudouracil, kjuozin, 2-tiocitozin, i 2,6-diaminopurin.
[0047] Termin "kontrolne sekvence" DNK se zajedno odnosi na promoterske sekvence, signale poliadenilacije, sekvence za završetak transkripcije, uzvodne regulatorne domene, poreklo replikacije, interna mesta ulaska ribozoma ("IRES"), pojačivače i slično, koji zajedno obezbeđuju replikaciju, transkripcija i translacija kodirajuće sekvence u ćeliji primaocu. Sve ove kontrolne sekvence ne moraju uvek da budu prisutne sve dok se odabrana kodirajuća sekvenca može replicirati, transkribovati i prevesti u odgovarajuću ćeliju domaćina.
[0048] Termin "promoter" se ovde koristi u svom uobičajenom smislu da se odnosi na nukleotidni region koji sadrži regulatornu sekvencu DNK, pri čemu je regulatorna sekvenca izvedena iz gena koji je sposoban da vezuje RNK polimerazu i započne transkripciju nizvodne (3'-pravac) sekvenca kodiranja. Promoteri transkripcije mogu uključivati "inducibilne promotere" (gde je ekspresija polinukleotidne sekvence koja je operativno
1
povezana sa promoterom indukovana analitom, kofaktorom, regulatornim proteinom, itd.), "represivnim promoterima" (gde je ekspresija polinukleotidne sekvence operativno povezana sa promoter indukuje analit, kofaktor, regulatorni protein, itd.), i "konstitutivni promoteri".
[0049] "Operabilno povezan" se odnosi na raspored elemenata u kome su tako opisane komponente konfigurisane tako da obavljaju svoju uobičajenu funkciju. Prema tome, kontrolne sekvence koje su operativno povezane sa kodirajućom sekvencom su sposobne da utiču na ekspresiju kodirajuće sekvence. Kontrolne sekvence ne moraju biti uzastopne sa sekvencom kodiranja, sve dok funkcionišu da usmeravaju njenu ekspresiju. Tako, na primer, intervenišuće neprevedene, ali transkribovane sekvence mogu biti prisutne između promoterske sekvence i kodirajuće sekvence, a sekvenca promotera se i dalje može smatrati "operativno vezanom" za kodirajuću sekvencu.
[0050] Termin "nervni sistem" uključuje i centralni nervni sistem i periferni nervni sistem. Termin "centralni nervni sistem" ili "CNS" obuhvata sve ćelije i tkivo mozga i kičmene moždine kičmenjaka. Termin "periferni nervni sistem" odnosi se na sve ćelije i tkivo dela nervnog sistema izvan mozga i kičmene moždine. Dakle, termin "nervni sistem" uključuje, ali nije ograničen na, neuronske ćelije, glijalne ćelije, astrocite, ćelije u cerebrospinalnoj tečnosti (CSF), ćelije u intersticijalnim prostorima, ćelije u zaštitnim omotačima kičmene moždine, epiduralne ćelije (tj., ćelije izvan dura mater), ćelije u ne-nervnim tkivima u blizini ili u kontaktu sa nervnim tkivom ili inervisane njime, ćelije u epineurijumu, perineurijumu, endoneurijumu, funikulima, fascikulima i slično.
[0051] "Aktivan" ili "aktivnost" za svrhe ovog pronalaska se odnosi na oblike terapeutskog proteina koji zadržavaju biološku aktivnost odgovarajućeg prirodnog ili prirodnog polipeptida. Aktivnost može biti veća, jednaka ili manja od one koja je primećena kod odgovarajućeg izvornog ili prirodnog polipeptida.
[0052] Pod "izolovano" kada se odnosi na nukleotidnu sekvencu, podrazumeva se da je naznačeni molekul prisutan u značajnom odsustvu drugih bioloških makromolekula istog tipa. Dakle, "izolovani molekul nukleinske kiseline koji kodira određeni polipeptid" se odnosi na molekul nukleinske kiseline koji je suštinski slobodan od drugih molekula nukleinske kiseline koji ne kodiraju predmetni polipeptid; međutim, molekul može da sadrži neke dodatne baze ili delove koji ne utiču štetno na osnovne karakteristike sastava.
1
[0053] U svrhu opisa relativne pozicije nukleotidnih sekvenci u određenom molekulu nukleinske kiseline tokom trenutne primene, kao što je kada je određena nukleotidna sekvenca opisana kao „uzvodno“, „nizvodno“, „3-prime (3')" ili "5-prime (5')" u odnosu na drugu sekvencu, treba razumeti da je položaj sekvenci u "smislenom" ili "kodirajućem" lancu molekula DNK koji se naziva konvencionalno u umetnosti.
[0054] Termin "oko", posebno u odnosu na datu količinu, podrazumeva odstupanja od plus ili minus pet procenata.
[0055] Termini "ispitanik", "pojedinac" ili "pacijent" se ovde koriste naizmenično i odnose se na kičmenjaka, poželjno sisara. Sisari uključuju, ali nisu ograničeni na, miševe, glodare, majmune, ljude, domaće životinje, sportske životinje i kućne ljubimce.
[0056] Termin "modulirati" kako se ovde koristi znači variranje količine ili intenziteta efekta ili ishoda, npr., pojačavanje, povećanje, smanjenje, smanjenje ili eliminisanje.
[0057] Kako se ovde koristi, termin "poboljšati" je sinonim za "ublažiti" i znači smanjiti ili olakšati. Na primer, neko može ublažiti simptome bolesti ili poremećaja tako što će bolest ili simptome bolesti učiniti manje ozbiljnim.
[0058] Termini "terapeutska", "efikasna količina" ili "terapeutski efikasna količina" sastava ili sredstva, kako je ovde dato, odnose se na dovoljnu količinu sastava ili sredstva da obezbedi željeni odgovor, kao što je prevencija, odlaganje početka ili poboljšanje simptoma kod subjekta ili postizanje željenog biološkog ishoda, kao što je korekcija neuropatologije, npr. ćelijske patologije povezane sa bolešću motornih neurona kao što je spinalna mišićna atrofija (SMA). Termin "terapeutska korekcija" se odnosi na onaj stepen korekcije koji rezultira prevencijom ili odlaganjem početka ili ublažavanjem simptoma kod ispitanika. Tačna potrebna količina će varirati od ispitanika do ispitanika, u zavisnosti od vrste, starosti i opšteg stanja ispitanika, ozbiljnosti stanja koje se leči, i posebnog makromolekula od interesa, načina davanja i slično. Odgovarajuću "efikasnu" količinu u svakom pojedinačnom slučaju može odrediti neko od uobičajenih veština u tehnici koristeći rutinsko eksperimentisanje.
1
[0059] "Lečenje" ili "lečiti" određene bolesti uključuje: (1) sprečavanje bolesti, odnosno sprečavanje razvoja bolesti ili izazivanje bolesti manjeg intenziteta kod subjekta koji može biti izložen ili predisponiran za bolest, ali još ne doživljava niti pokazuje simptome bolesti, (2) inhibiranje bolesti, odnosno zaustavljanje razvoja ili preokretanje bolesnog stanja, ili (3) ublažavanje simptoma bolesti, odnosno smanjenje broja simptoma koje subjekt doživljava, kao i promena ćelijske patologije povezane sa bolešću.
2. NAČINI IZVOĐENJA PRONALASKA
[0060] Iako se može koristiti niz postupaka i materijala sličnih ili ekvivalentnih onima koji su ovde opisani, ovde su opisani poželjni materijali i postupci.
[0061] Centralno za predmetni pronalazak je obelodanjivanje da je isporuka viriona rAAV koji sadrže cDNK motornog neurona 1 (hSMN1) ljudskog preživljavanja u CNS agresivnog mišjeg modela spinalne mišićne atrofije (SMA), proizvela ekspresiju SMN1 kroz kičmenu moždinu. Tretirani SMA miševi su sadržali veći broj motornih neurona u poređenju sa netretiranim mutantima koji odgovaraju godinama. Pored toga, procena veličine mišićnih vlakana je pokazala da je veličina pojedinačnih mišićnih vlakana iz različitih mišićnih grupa kod tretiranih SMA miševa približna onoj uočenoj kod miševa divljeg tipa. Štaviše, struktura neuromuskularnog spoja (NMJ) kod lečenih SMA miševa bila je slična miševima divljeg tipa, što je bilo u suprotnosti sa netretiranim SMA koji je pokazao abnormalnu akumulaciju proteina neurofilamenta na presinaptičkim krajevima. Tretirani SMA miševi su takođe pokazali značajna poboljšanja na bateriji testova ponašanja koji sugerišu da je NMJ funkcionalan. Važno je da su miševi tretirani rekombinantnim AAV imali značajno produžen životni vek u poređenju sa njihovim netretiranim kolegama. SMA miševi tretirani samokomplementarnim vektorom rAAV takođe su pokazali značajno poboljšanje srednjeg preživljavanja, čak i u poređenju sa tretmanom sa konvencionalnim, ne-samokomplementarnim vektorima rAAV.
[0062] Ovi rezultati pokazuju da je povećanje SMN1 gena posredovano CNS i posredovano AAV veoma efikasno u rešavanju neuronskih i mišićnih patologija SMA i dokazuju korisnost virusne genske terapije kao terapijske strategije za lečenje i prevenciju neuronskih i mišićnih patologija, kao što su SMA, kao i druge bolesti koje utiču na motoričku funkciju. Tehnike genske terapije opisane ovde mogu se koristiti samostalno ili u kombinaciji sa tradicionalnim lekovima.
1
[0063] U cilju daljeg razumevanja pronalaska, u nastavku je data detaljnija diskusija u vezi sa patologijama motornih neurona i terapeutskim molekulima, kao i različitim postupcima isporuke gena za upotrebu sa predmetnim pronalaskom.
Patologije motornih neurona i terapeutski molekuli
[0064] Obelodanjivanje obezbeđuje sastave i postupke za modulaciju, korekciju ili povećanje motoričke funkcije kod subjekta koji ima poremećaj motornog neurona ili oštećenje motornog neurona. Samo u svrhu ilustracije, ispitanik može da pati od jedne ili više od spinalne mišićne atrofije (SMA), amiotrofične lateralne skleroze (ALS), spinalne bulbarne mišićne atrofije, spinalne cerebelarne ataksije, primarne lateralne skleroze (PLS) ili traumatske kičmene moždine povreda. Bez vezanja za određenu teoriju, patologija povezana sa oštećenjem motornih neurona može uključivati degeneraciju motornih neurona, gliozu, abnormalnosti neurofilamenta, gubitak mijelinizovanih vlakana u kortikospinalnim traktovima i ventralnim korenima. Na primer, prepoznata su dva tipa početka - bulbarni početak, koji utiče na gornje motorne neurone (motorne neurone korteksa i moždanog stabla), utiče na mišiće lica, govor i gutanje; i početak udova, koji utiče na donje motorne neurone (motorne neurone kičmene moždine), odražava se spastičnošću, generalizovanom slabošću, mišićnom atrofijom, paralizom i respiratornom insuficijencijom. Kod ALS-a, ispitanici imaju i bulbarni početak i početak ekstremiteta. Kod PLS-a, ispitanici imaju samo bulbarni početak. Predmetni pronalazak se odnosi na lečenje SMA.
[0065] Stoga, u određenim slučajevima, subjektu se obezbeđuju rAAV konstrukti koji kodiraju biološki aktivan molekul, čija ekspresija u CNS-u rezultira barem delimičnom korekcijom neuropatologije i/ili stabilizacijom progresije bolesti, kao što je prevencija, odlaganje početak ili poboljšanje simptoma kod subjekta ili postizanje željenog biološkog ishoda, uključujući, na primer, promenu u ćelijskoj patologiji povezanu sa bolešću motornih neurona opisanom iznad.
[0066] Kao primer, transgen prisutan u rAAV konstruktu može biti, ali nije ograničen na, protein motornog neurona preživljavanja (preko SMN1 gena ili SMN2 gena), insulin faktor rasta-1 (IGF-1), kalbindin D28, parvalbumin , HIFl-alfa, SIRT-2, VEGF kao što je VEGF165, CNTF (cilijarni neurotrofni faktor), sonic hedgehog (shh), eritropoetin (EPO), lizil oksidaza (LOX), progranulin, prolaktin, grelin, neuroserpin, angiogenin i placenta laktogen.
2
[0067] Molekularna osnova SMA, autozomno recesivnog neuromuskularnog poremećaja, je homozigotni gubitak gena 1 motornog neurona preživljavanja (SMN1), koji može biti poznat i kao SMN telomerni. Skoro identična kopija SMN1 gena, nazvana SMN2, koja može biti poznata i kao SMN Centromerna, nalazi se kod ljudi i modulira težinu bolesti. Ekspresija normalnog SMN1 gena rezultira isključivo ekspresijom proteina motornog neurona preživljavanja (SMN). Ekspresija SMN2 gena dovodi do približno 10-20% SMN proteina i 80-90% nestabilnog/nefunkcionalnog proteina SMNdelta7. Samo 10% SMN2 transkripata kodira funkcionalni protein pune dužine identičan SMN1. Ova funkcionalna razlika između oba gena je rezultat translatorno tihe mutacije koja, međutim, ometa egzonski pojačivač spajanja uzrokujući preskakanje eksona 7 u većini SMN2 transkripata. SMN protein igra dobro utvrđenu ulogu u sklapanju splajsozoma i takođe može posredovati u prometu mRNK u aksonu i nervnom kraju neurona.
[0068] Poznate su sekvence nukleotida i aminokiselina različitih molekula SMN1 i SMN proteina. Videti, na primer, Slike 9A-9B; NCBI pristupni brojevi NM_000344 (humani), NP_000335 (humani), NM_11420 (mišji), EU 791616 (svinja), NM_001131470 (orangutan), NM_131191 (zebrica), BC062404 (pacov), NM_001009328 (mačka), NM_001003226 (pas), NM_175701 (krava). Slično, poznate su različite sekvence SMN2. Pogledajte, npr., NCBI pristupne brojeve NM_022876, NM_022877, NM_017411, NG_008728, BC_000908, BC070242, DQ185039 (svi humani).
[0069] Inzulinu sličan faktor rasta 1 (IGF-I) je terapeutski protein za lečenje neurodegenerativnih poremećaja, uključujući poremećaje motornih neurona, zbog mnogih akcija na različitim nivoima neuraksisa (videti Dore i dr., Trends Neurosci (1997) 20:326-331). Na primer, smatra se da u mozgu smanjuje i neuronsku i glijalnu apoptozu, štiti neurone od toksičnosti izazvane gvožđem, kolhicinom, destabilizatorima kalcijuma, peroksidima i citokinima. Takođe se čini da modulira oslobađanje neurotransmitera acetilholina i glutamata i indukuje ekspresiju neurofilamenta, tublina i bazičnog proteina mijelina. Veruje se da u kičmenoj moždini IGF-I moduliše aktivnost ChAT i ublažava gubitak holinergičnog fenotipa, pojačava klijanje motornih neurona, povećava mijelinizaciju, inhibira demijelinizaciju, stimuliše proliferaciju motornih neurona i diferencijaciju od ćelija prekursora, i promoviše deobu, sazrevanje Svanovih ćelija, i rast. Čini se da u mišićima IGF-I indukuje formiranje klastera acetilholinskih receptora na neuromuskularnom spoju i povećava neuromuskularnu funkciju i snagu mišića.
[0070] IGF-1 gen ima složenu strukturu, koja je dobro poznata u tehnici. Ima najmanje dva alternativno spojena mRNK proizvoda koja proizilaze iz transkripta gena. Postoji peptid od 153 aminokiseline, poznat pod nekoliko imena uključujući IGF-IA ili IGF-IEa, i peptid od 195 aminokiselina, poznat pod nekoliko imena uključujući IGF-IB ili IGF-IEb. Oblik Eb je takođe poznat kao Ec kod ljudi. Zreli oblik IGF-I je polipeptid od 70 aminokiselina. I IGF-IEa i IGF-IEb sadrže zreli peptid od 70 aminokiselina, ali se razlikuju po sekvenci i dužini njihovih karboksil-terminalnih produžetaka. IGF-1 proteini, kao i peptidne sekvence IGF-IEa i IGF-IEb su poznati i opisani u, npr., Međunarodnoj patentnoj objavi br.. WO 2007/146046.
[0071] Genomske i funkcionalne cDNK humanog IGF-I, kao i dodatne informacije u vezi sa IGF-I genom i njegovim proizvodima, dostupni su na Unigene pristupnom broju NM_000618.
[0072] Kalbindin D28K (koji se takođe naziva kalbindin D28) i parvalbumin su proteini koji vezuju kalcijum za koje se veruje da su uključeni u puferovanje kalcijuma. Bez vezanja za određenu teoriju, izgleda da je homeostaza kalcijuma promenjena kod subjekata sa poremećajima motornih neurona (npr., ALS) i niskim nivoom kalbindina-D28K i/ili parvalbumina može povećati ranjivost motornih neurona smanjenjem njihove sposobnosti da se nose sa povećano opterećenje kalcijumom. Ovo smanjenje može dovesti do povrede ćelije i eventualne smrti motornih neurona. Dalji dokazi sugerišu da su neuroni bogati proteinima koji vezuju kalcijum, kao što su kalbindin D28K i parvalbumin, otporni na degeneraciju.
[0073] HIF-I je heterodimerni protein sastavljen od dve podjedinice: (i) konstitutivno eksprimirana b podjedinica poznata i kao aril ugljovodonični nuklearni translokator (ARNT) (koju dele i drugi srodni transkripcioni faktori (npr., dioksin/aril ugljovodonični receptor (DR/AhR)); i (ii) α podjedinicu (videti, npr., Međunarodnu objavu br. WO 96/39426, koja opisuje nedavno afinitetno prečišćavanje i molekularno kloniranje HIF-Iα. Obe podjedinice su članovi osnovne porodice transkripcionih faktora heliks-petlja-heliks (bHLH)-PAS. Ovi domeni regulišu vezivanje i dimerizaciju DNK. Transaktivacioni domen se nalazi na C-završetku proteina. Osnovni region se sastoji od približno 15 pretežno baznih aminokiselina odgovornih za direktno vezivanje DNK. Ovaj region je u blizini dva amfipatska a spirala, odvojena petljom promenljive dužine, koja formira primarni interfejs dimerizacije između članova porodice (Moore, i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000) 97:10436-10441). PAS domen obuhvata 200-300 aminokiselina koje sadrže dva slabo očuvana, uglavnom hidrofobna regiona sa približno 50 aminokiselina, označenih kao PAS A i PAS B. HIF-Iα podjedinica je nestabilna tokom normoksičnih uslova, prekomerna ekspresija ove podjedinice u kultivisanim ćelijama pod normalnim kiseonikom nivoi su sposobni da indukuju ekspresiju gena koja je normalno indukovana hipoksijom. Zamena C terminalnog (ili transaktivacionog) regiona proteina faktora izazvanog hipoksijom sa jakim domenom transaktivacije iz proteina aktivatora transkripcije kao što je, na primer, Herpes Simpleks Virus (HSV) VP16, NFκB ili faktori transkripcije kvasca GAL4 i GCN4, je dizajniran da stabilizuje protein u normoksičnim uslovima i obezbedi snažnu, konstitutivnu, transkripcionu aktivaciju. Videti npr., Međunarodnu objavu br. WO 2008/042420 za opis i sekvencu reprezentativnog stabilizovanog proteina faktora izazvanog hipoksijom koji je hibridni/himerični fuzioni protein koji se sastoji od domena za vezivanje DNK i domena dimerizacije iz HIF-lα i transaktivacije domen od HSV VP16 proteina.
[0074] Videti takođe, patente SAD br.6,432,927 i 7,053,062 za opis konstitutivno stabilnog hibrida HIF-Iα .
[0075] Članovi porodice vaskularnog endotelnog faktora rasta (VEGF) su među najmoćnijim modulatorima vaskularne biologije. Oni regulišu vaskulogenezu, angiogenezu i održavanje krvnih sudova. Opisane su četiri različite molekularne varijante VEGF. Varijanta od 165 aminokiselina je dominantni molekularni oblik koji se nalazi u normalnim ćelijama i tkivima. Manje obilan, kraći oblik sa brisanjem 44 aminokiseline između pozicija 116 i 159 (VEGF121), duži oblik sa umetanjem 24 bazna ostatka na poziciji 116 (VEGF189) i drugi duži oblik sa umetanjem 41 aminokiseline (VEGF206), koji uključuje inserciju od 24 aminokiseline koja se nalazi u VEGF189, takođe su poznati. VEGF121i VEGF165su rastvorljivi proteini. Čini se da su VEGF189i VEGF206uglavnom povezani sa ćelijama. Sve verzije VEGF su biološki aktivne. Videti, npr., Tischer i dr., J. Biol. Chem. (1991) 266:11947-11954, opisivanje sekvence VEGF165(videti, takođe, GenBank pristupni broj AB021221), VEGF121(vidi, takođe, GenBank pristupni broj AF214570) i VEGF189; i Houck i dr., Mol. Endocrinol.
(1991) 5:1806-1814, opisivanje sekvence VEGF206.
[0076] CNTF (Ciliari neurotrophic factor) je neurocitokin koji se eksprimuje u glijalnim ćelijama u perifernim nervima i centralnom nervnom sistemu. CNTF je generalno poznat po svojoj funkciji u podršci i preživljavanju ne-neuronskih i neuronskih tipova ćelija. Videti
2
npr., Vergara, C and Ramirez, B; Brain Res, Brain Res. Rev. (2004) 47: 161-73.
[0077] Sonic hedgehog (Shh) kontroliše važne razvojne procese, uključujući preživljavanje neurona i glijalnih ćelija.
[0078] Eritropoetin (EPO) je glavni regulator eritroidnih progenitor ćelija. Međutim, on je funkcionalno izražen u nervnom sistemu i prijavljeni su neuroprotektivni efekti. Videti npr., Bartesaghi, S., 2005. Neurotoxicologi, 26:923-8. Geni koji kodiraju EPO kod ljudi i drugih sisara su klonirani, sekvencionirani i eksprimirani, i pokazuju visok stepen homologije sekvence u kodirajućem regionu među vrstama. Wen i dr., Blood (1993) 82:1507-1516. Sekvenca gena koji kodira nativni humani EPO, kao i postupci dobijanja istih, opisani su u npr., patentima SAD br.4,954,437 i 4,703,008,
kao i Jacobs i dr. (1985) Nature 313:806-810; Lin i dr. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:7580; Međunarodnoj patentnoj objavi br. WO 85/02610; i Evropskoj patentnoj objavi br.
232,034 B1. Pored toga, poznate su i lako dostupne sekvence gena koji kodiraju izvorni EPO mačaka, pasa i svinja (GenBank pristupni brojevi: L10606; L13027; i L10607, respektivno), a sekvenca gena koji kodira majmun (Macaca mulatta) je takođe poznata i dostupna (GenBank pristupni broj: L10609).
[0079] Lizil oksidaza (LOX) oksidiše bočni lanac peptidil lizina i na taj način konvertuje određene ostatke lizina u alfa-aminoadipik-delta-semialdehid. Ovo je post-translaciona promena koja, na primer, omogućava kovalentno umrežavanje komponentnih lanaca kolagena i elastina. On stabilizuje fibrozne naslage ovih proteina u ekstracelularnom matriksu. LOX takođe može da oksidira lizin unutar raznih katjonskih proteina, što sugeriše da su njegove funkcije šire od stabilizacije ili ekstracelularnog matriksa. LOX se sintetiše kao preprotein; izlazi iz ćelije kao proLOX i proteolitički se obrađuje u aktivni enzim. Videti npr., Lucero, HA and Kagan, HM, Cell Mol. Life Sci. (2006) 63:2304-2316.
[0080] Progranulin (PGRN) je pleitropni protein. Mutacije u genu uzrokuju frontotemporalnu lobarnu degeneraciju. PGRN u CNS-u se izražava mikrogijom i neuronima i igra ulogu u razvoju mozga. PGRN je takođe uključen u višestruke procese „modeliranja tkiva“, uključujući razvoj, popravku rana i tumorogenezu. PGRN se pretvara u granulin (GRN) pomoću enzima elastaze. Dok progranulin ima trofička svojstva, GRN su sličniji medijatorima upale. Ispoljavanja ekspresije gena na životinjskim modelima CNS bolesti pokazuju diferencijalno povećanje PRGN u kombinaciji sa mikroglijalnom aktivacijom i upalom. Povećanje ekspresije PGRN može biti usko povezano sa mikroglijalnom aktivacijom i neuroinflamacijom. Štaviše, ekspresija PGRN je povećana u aktiviranoj mikrogliji kod mnogih neurodegenerativnih bolesti uključujući bolest motornih neurona i Alchajmerovu bolest. Ispitivanja su identifikovala mutacije u PGRN kao uzrok neurodegenerativne bolesti i ukazuju na važnost funkcije PGRN za preživljavanje neurona.
[0081] Oligodendrociti, mijelinizirajuće ćelije CNS, nastavljaju da se generišu od ćelija prekursora oligodendrocita (OPC) tokom odraslog doba i potrebni su za intrinzičnu popravku oštećenja mijelina u CNS-u odraslih. Fiziološki događaji koji moduliraju proliferaciju OPC i stvaranje novih mijelinizirajućih oligodendrocita u odraslom CNS-u su uglavnom poznati. Nedavno je objavljeno da pacijenti sa multiplom sklerozom (MS), demileinizirajućom bolešću, imaju smanjenu stopu relapsa tokom trećeg trimestra trudnoće što sugeriše da hormoni utiču na stvaranje oligodendrocita. Remisija kod pacijenata sa MS je u korelaciji sa smanjenjem broja i veličine aktivnih lezija bele materije. Trudnoća kod miševa dovodi do povećanja proizvodnje novih oligodendrocita i broja mijelinizovanih aksona u CNS-u majke (Gregg i dr., J. Neurosci. (2007) 27:1812-1823). Pokazalo se da prolaktin, hormon koji raste tokom završne faze trudnoće, reguliše proliferaciju OPC tokom trudnoće i promoviše popravku bele materije kod netaknutih ženki miševa (Gregg i dr., J. Neurosci. (2007) 27:1812-1823).
[0082] Laktogen ljudske placente (hPL), hormon koji takođe dostiže vrhunac tokom trećeg trimestra trudnoće, može imati sličan uticaj na stvaranje oligodendrocita. hPL ima brojne biološke aktivnosti koje su kvalitativno slične humanom hormonu rasta (hGH) i prolaktinu i čini se da je glavni regulator proizvodnje IGF-I. Pokazalo se da su i hGH i IGF-I stimulatori mijelinizacije u CNS-u odraslih (Carson i dr., Neuron (1993) 10:729-740; Peltwon i dr., Neurologi (1977) 27:282-288). Prema tome, lečenje bolesti CNS koje uključuju demijelinizaciju kao što je MS, ALS, moždani udar i povreda kičmene moždine može imati koristi od terapija zasnovanih na PRL ili hPL, kao što je intraventrikularna injekcija virusnog vektora koji eksprimuje rhPRL ili hPL.
[0083] Grelin je hormon želuca koji je posrednik u oslobađanju hormona rasta. Videti npr. Wu, i dr., Ann. Surg. (2004) 239:464.
2
[0084] Neuroserpin je član porodice inhibitora serpin proteaze. U određenim stanjima CNS-a, neuroserpin može da igra neuroprotektivnu ulogu potencijalno kroz blokadu efekata tPA. Videti npr., Galliciotti, G and Sonderegger, P, Front Biosci (2006) 11:33; Simonin, i dr., (2006) 26:10614; Miranda, E and Lomas, DA, Cell Mol Life Sci (2006) 63:709.
[0085] Angiogenin je član superfamilije RNKse. To je normalan sastojak cirkulacije, ali je takođe uključen kao faktor rizika kod poremećaja motornih neurona.
[0086] U određenim sastavima i postupcima koji su ovde obelodanjeni, može se isporučiti više od jednog transgena koji kodira više od jednog od gore opisanih terapeutskih molekula, pri čemu je svaki transgen operativno vezan za promoter da bi se omogućila ekspresija transgena iz jednog AAV vektora. U dodatnim postupcima, transgeni mogu biti operativno vezani za isti promoter. Svaki transgen kodira biološki aktivan molekul, čija ekspresija u CNS-u rezultira barem delimičnom korekcijom neuropatologije. Dodatno, u slučajevima kada se isporučuje više od jednog transgena, transgeni se mogu isporučiti preko više od jednog AAV vektora, pri čemu svaki AAV vektor sadrži transgen koji je operativno vezan za promoter.
[0087] Izvorni molekuli, kao i njihovi aktivni fragmenti i analozi, koji zadržavaju željenu biološku aktivnost, merenu u bilo kom od različitih testova i životinjskih modela, uključujući one koji su dalje opisani, namenjeni su za upotrebu sa predmetnim pronalaskom.
[0088] Polinukleotidi koji kodiraju željeni protein za upotrebu sa ovim pronalaskom mogu se napraviti korišćenjem standardnih tehnika molekularne biologije. Na primer, polinukleotidne sekvence koje kodiraju za iznad opisane molekule mogu se dobiti korišćenjem rekombinantnih metoda, kao što je skrining cDNK i genomskih biblioteka iz ćelija koje eksprimiraju gen, ili izvođenjem gena iz vektora za koji je poznato da sadrži isti. Gen od interesa se takođe može proizvesti sintetički, umesto da se klonira, na osnovu poznatih sekvenci. Molekuli se mogu dizajnirati sa odgovarajućim kodonima za određenu sekvencu. Kompletna sekvenca se zatim sklapa od preklapajućih oligonukleotida pripremljenih standardnim metodama i sklapa u kompletnu kodirajuću sekvencu. Videti npr., Edge, Nature (1981) 292:756; Nambair i dr., Science (1984) 223:1299; i Jai i dr., J. Biol. Chem. (1984) 259:6311.
2
[0089] Prema tome, određene nukleotidne sekvence se mogu dobiti iz vektora koji sadrže željene sekvence ili sintetizovani u potpunosti ili delimično korišćenjem različitih tehnika sinteze oligonukleotida poznatih u tehnici, kao što su mutageneza usmerena na mesto i tehnike lančane reakcije polimeraze (PCR) gde je to prikladno. Videti, npr.,
Sambrook, supra. Jedan postupak za dobijanje nukleotidnih sekvenci koje kodiraju željene sekvence je žarenje komplementarnih skupova preklapajućih sintetičkih oligonukleotida proizvedenih u konvencionalnom, automatizovanom polinukleotidnom sintetizatoru, nakon čega sledi ligacija sa odgovarajućom DNK ligazom i amplifikacija vezane sekvence preko PCR nukleotida. Videti npr., Jaiaraman i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991) 88:4084-4088. Dodatno, sinteza usmerena na oligonukleotide (Jones i dr., Nature (1986) 54:75-82), oligonukleotidno usmerena mutageneza već postojećih nukleotidnih regiona (Riechmann i dr., Nature (1988) 332:323-327 i Verhoeien i dr., Science (1988) 239:1534-1536),i enzimsko popunjavanje praznih oligonukleotida pomoću T4DNK polimeraze (Queen i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1989) 86:10029-10033) može se koristiti za obezbeđivanje molekula za upotrebu u predmetnim postupcima.
[0090] Jednom proizvedeni, konstrukti se isporučuju korišćenjem rekombinantnih virusnih vektora kao što je opisano dalje u nastavku.
AAV tehnike isporuke gena
[0091] Konstrukti kao što je iznad opisano mogu biti isporučeni subjektu u pitanju korišćenjem bilo koje od nekoliko tehnika isporuke gena rAAV. Nekoliko AAV-posredovanih postupaka za isporuku gena je poznato u tehnici. Kao što je dalje opisano u nastavku, geni mogu biti isporučeni ili direktno ispitaniku ili, alternativno, isporučeni ex vivo, odgovarajućim ćelijama, kao što su ćelije izvedene iz ispitanika, i ćelije ponovo implantirane u ispitanika.
[0092] Različiti AAV vektorski sistemi su razvijeni za isporuku gena. AAV vektori se mogu lako konstruisati korišćenjem tehnika dobro poznatih u tehnici. Videti npr., patent SAD br. 5,173,414 i 5,139,941; Međunarodnoj patentnoj objavi br. WO 92/01070 (objavljeno 23. januara 1992) i WO 93/03769 (objavljeno 4. marta 1993); Lebkowski i dr., Molec. Cell. Biol. (1988) 8:3988-3996; Vincent i dr., Vaccines 90 (1990) (Cold Spring Harbor Laboratori Press); Carter, B.J. Current Opinion in Biotechnologi (1992) 3:533-539; Muzyczka, N.
Current Topics in Microbiol. and Immunol. (1992) 158:97-129; Kotin, R.M. Human Gene Therapy (1994) 5:793-801; Shelling and Smith, Gene Therapy (1994) 1:165-169; i Zhou i dr.,
2
J. Exp. Med. (1994) 179:1867-1875. AAV vektorski sistemi su takođe detaljnije opisani u nastavku.
[0093] AAV genom je linearni, jednolančani DNK molekul koji sadrži oko 4681 nukleotida. AAV genom se generalno sastoji od unutrašnjeg genoma koji se ne ponavlja na svakom kraju sa obrnutim terminalnim ponavljanjima (ITR). ITR su dužine približno 145 baznih parova (bp). ITR imaju više funkcija, uključujući obezbeđivanje porekla replikacije DNK i pakovanje signala za virusni genom. Unutrašnji neponovljeni deo genoma uključuje dva velika otvorena okvira čitanja, poznata kao geni za AAV replikaciju (rep) i kapsid (cap). Geni rep i cap kodiraju virusne proteine koji omogućavaju virusu da se replicira i pakuje u virion. Konkretno, porodica od najmanje četiri virusna proteina je eksprimirana iz
AAV rep regiona, Rep 78, Rep 68, Rep 52 i Rep 40, imenovanih prema njihovoj očiglednoj molekularnoj težini. AAV cap region kodira najmanje tri proteina, VPI, VP2 i VP3.
[0094] AAV je konstruisan da isporuči gene od interesa brisanjem unutrašnjeg ne ponavljajućeg dela AAV genoma (tj., gena rep i cap ) i umetanjem heterolognog gena između ITR. Heterologni gen je tipično funkcionalno vezan za heterologni promoter (konstitutivni, ćelijski-specifičan ili inducibilan) koji je sposoban da pokrene ekspresiju gena u ciljnim ćelijama pacijenta pod odgovarajućim uslovima. Primeri svakog tipa promotera su dobro poznati u tehnici. Terminacijski signali, kao što su mesta poliadenilacije, takođe mogu biti uključeni.
[0095] AAV je virus zavisan od pomagača; to jest, zahteva koinfekciju sa pomoćnim virusom (npr., adenovirusom, herpesvirusom ili vakcinijom), da bi se formirali AAV virioni. U odsustvu koinfekcije sa pomoćnim virusom, AAV uspostavlja latentno stanje u kome se virusni genom ubacuje u hromozom ćelije domaćina, ali se infektivni virioni ne proizvode. Naknadna infekcija pomoćnim virusom „spašava“ integrisani genom, omogućavajući mu da replicira i pakuje svoj genom u infektivni AAV virion. Dok AAV može inficirati ćelije različitih vrsta, pomoćni virus mora biti iste vrste kao i ćelija domaćina. Tako će se, na primer, humani AAV replicirati u psećim ćelijama koinficiranim psećim adenovirusom.
[0096] Rekombinantni AAV virioni koji sadrže gen od interesa mogu se proizvesti korišćenjem različitih tehnika priznatih u struci, detaljnije opisanih u nastavku. Divlji tip AAV i pomoćni virusi mogu se koristiti za obezbeđivanje neophodnih replikativnih funkcija
2
za proizvodnju rAAV viriona (videti, npr., patent SAD br.5,139,941).
[0097] Alternativno, plazmid, koji sadrži gene pomoćne funkcije, u kombinaciji sa infekcijom jednim od dobro poznatih pomoćnih virusa može se koristiti kao izvor replikativnih funkcija (videti npr., Patent SAD br..5,622,856 i Patent SAD br..5,139,941). Slično, plazmid, koji sadrži gene dodatne funkcije, može se koristiti u kombinaciji sa infekcijom divljim tipom AAV, da bi se obezbedile neophodne replikativne funkcije. Ova tri pristupa, kada se koriste u kombinaciji sa rAAV vektorom, dovoljna su za proizvodnju rAAV viriona. Drugi pristupi, dobro poznati u tehnici, takođe mogu biti korišćeni od strane kvalifikovanog stručnjaka za proizvodnju rAAV viriona.
[0098] U jednom slučaju predmetnog obelodanjivanja, postupak trostruke transfekcije (detaljno opisana u patentu SAD br.6,001,650) se koristi za proizvodnju rAAV viriona jer ovaj postupak ne zahteva upotrebu infektivnog pomoćnog virusa, što omogućava da se rAAV virioni proizvode bez bilo koji prisutan pomoćni virus koji se može otkriti. Ovo se postiže upotrebom tri vektora za proizvodnju rAAV viriona: vektor AAV pomoćne funkcije, vektor dodatne funkcije i vektor ekspresije rAAV. Stručnjak u ovoj oblasti će, međutim, ceniti da sekvence nukleinske kiseline kodirane ovim vektorima mogu biti obezbeđene na dva ili više vektora u različitim kombinacijama.
[0099] Kao što je ovde objašnjeno, vektor AAV pomoćne funkcije kodira sekvence „AAV pomoćne funkcije“ (tj., rep i cap), koje funkcionišu u trans za produktivnu AAV replikaciju i enkapsidaciju. Poželjno je da vektor funkcije pomoćnika AAV podržava efikasnu proizvodnju AAV vektora bez generisanja bilo kakvih detektabilnih vt AAV viriona (tj., AAV viriona koji sadrže funkcionalne rep i cap gene). Primer takvog vektora, pHLP19, opisan je u patentu SAD br.6,001,650.
[0100] Geni rep i cap vektora funkcije pomoćnika AAV mogu biti izvedeni iz bilo kog od poznatih AAV serotipova, kao što je objašnjeno iznad. Na primer, vektor pomoćne funkcije AAV može imati rep gen izveden iz AAV-2 i cap gen izveden iz AAV-6; neko vešt u ovoj oblasti tehnike prepoznaće da su moguće druge kombinacije rep i cap gena, a definišuća karakteristika je mogućnost podrške proizvodnji viriona rAAV.
[0101] Vektor dodatne funkcije kodira nukleotidne sekvence za virusne i/ili ćelijske funkcije
2
koje nisu izvedene iz AAV od kojih AAV zavisi za replikaciju (tj., "dodatne funkcije").
Dodatne funkcije obuhvataju one funkcije potrebne za AAV replikaciju, uključujući, bez ograničenja, one delove koji su uključeni u aktivaciju transkripcije AAV gena, stadijum specifičnog spajanja AAV mRNK, replikaciju AAV DNK, sintezu proizvoda ekspresije kapa i sklapanje AAV kapsida. Dodatne funkcije zasnovane na virusima mogu biti izvedene iz bilo kog od dobro poznatih pomoćnih virusa kao što su adenovirus, herpesvirus i virus vakcinije. U jednom slučaju, koristi se plazmid dodatne funkcije pLadeno5 (detalji u vezi sa pLadeno5 su opisani u patentu SAD br.6,004,797). Ovaj plazmid obezbeđuje kompletan skup adenovirusnih dodatnih funkcija za proizvodnju AAV vektora, ali mu nedostaju komponente neophodne za formiranje adenovirusa kompetentnog za replikaciju.
[0102] U cilju daljeg razumevanja AAV, u nastavku je data detaljnija diskusija u vezi sa rekombinantnim AAV ekspresionim vektorima i AAV pomoćnim i pomoćnim funkcijama.
Rekombinantni AAV vektori ekspresije
[0103] Rekombinantni AAV (rAAV) ekspresioni vektori su konstruisani korišćenjem poznatih tehnika da obezbede barem kao operativno povezane komponente u pravcu transkripcije, kontrolne elemente uključujući region inicijacije transkripcije, polinukleotid od interesa i region za završetak transkripcije. Kontrolni elementi su odabrani da budu funkcionalni u ćeliji od interesa, kao što je u ćeliji sisara. Dobijeni konstrukt koji sadrži operativno povezane komponente je omeđen (5' i 3') funkcionalnim AAV ITR sekvencama.
[0104] Poznate su nukleotidne sekvence AAV ITR regiona. Videti npr., Kotin, R.M. (1994) Human Gene Therapy 5:793-801; Berns, K.I. "Parvoviridae and their Replication" in Fundamental Virology, 2nd Edition, (B.N. Fields and D.M. Knipe, eds.) za AAV-2 sekvencu. AAV ITR koji se koriste u vektorima pronalaska ne moraju da imaju nukleotidnu sekvencu divljeg tipa i mogu biti izmenjeni, na primer, umetanjem, brisanjem ili supstitucijom nukleotida. Pored toga, AAV ITR mogu biti izvedeni iz bilo kog od nekoliko AAV serotipova, uključujući, bez ograničenja, AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, itd. Štaviše, 5' i 3' ITR koji okružuju odabranu nukleotidnu sekvencu u vektoru ekspresije AAV ne moraju nužno biti identični ili izvedeni iz istog AAV serotipa ili izolata, sve dok funkcionišu kako je predviđeno, tj. da se omogući ekscizija i spasavanje sekvence od interesa iz genoma ili vektora ćelije domaćina, i da se omogući integracija molekula DNK u genom ćelije primaoca kada su proizvodi gena AAV Rep prisutni u ćeliji.
[0105] Pogodni polinukleotidni molekuli za upotrebu u tradicionalnim AAV vektorima biće manji od ili oko 5 kilobaza (kb). Izabrana polinukleotidna sekvenca je operativno povezana sa kontrolnim elementima koji usmeravaju transkripciju ili ekspresiju iste kod subjekta in vivo. Takvi kontrolni elementi mogu sadržati kontrolne sekvence koje su normalno povezane sa izabranim genom. Alternativno, mogu se koristiti heterologne kontrolne sekvence. Korisne heterologne kontrolne sekvence generalno uključuju one izvedene iz sekvenci koje kodiraju gene sisara ili virusa. Neograničavajući primeri promotera uključuju, ali nisu ograničeni na, promoter citomegalovirusa (CMV) (Kaplitt i dr., Nat. Genet. (1994) 8:148-154), CMV/humani β3-globin promoter (Mandel i dr., J. Neurosci. (1998) 18:4271-4284), GFAP promoter (Xu i dr., Gene Ther. (2001) 8:1323-1332), promotor enolaze (NSE) specifične za neurone od 1,8 kb (Klein i dr., Exp. Neurol. (1998) 150:183-194), promotor pilećeg beta aktina (CBA) (Miiazaki, Gene (1989) 79:269-277), promoter β-glukuronidaze (GUSB) (Shipley i dr., Genetics (1991) 10:1009-1018), i promoteri ubikvitina kao što su oni izolovani iz humanog ubikvitina A, humanog ubikvitina B i humanog ubikvitina C, kao što je opisano u patentu SAD br.6,667,174. Da bi se produžila ekspresija, drugi regulatorni elementi mogu dodatno biti operativno povezani sa transgenom, kao što je, na primer, postregulatorni element virusa Woodchuck hepatitisa (WPRE) (Donello i dr., J. Virol. (1998) 72:5085-5092) ili mesto poliadenilacije goveđeg hormona rasta (BGH). Pored toga, sekvence izvedene iz ne virusnih gena, kao što je mišji gen za metalotionein, takođe će naći primenu ovde. Takve promoterske sekvence su komercijalno dostupne od, na primer, Stratagene (San Diego, CA).
[0106] Za neke primene CNS genske terapije, možda će biti potrebno kontrolisati transkripcionu aktivnost. U tom cilju, farmakološka regulacija ekspresije gena pomoću virusnih vektora može se postići uključivanjem različitih regulatornih elemenata i promotera koji reaguju na lekove, kao što je opisano, na primer, u Habermay dr., Gene Ther. (1998) 5.1604-16011; i Ye i dr., Science (1995) 283:88-91..
[0107] AAV ekspresioni vektor koji sadrži polinukleotidni molekul od interesa omeđen AAV ITR, može se konstruisati direktnim umetanjem odabrane sekvence(i) u AAV genom iz kojeg su izrezani glavni AAV otvoreni okviri čitanja („ORFs“). Drugi delovi AAV genoma se takođe mogu obrisati, sve dok ostane dovoljan deo ITR-a da omogući funkcije replikacije i pakovanja. Takvi konstrukti mogu biti dizajnirani korišćenjem tehnika dobro poznatih u tehnici. Videti npr., patent SAD br.5,173,414 i 5,139,941; Međunarodnoj patentnoj objavi br.
1
WO 92/01070 (objavljeno 23. januara 1992) i WO 93/03769 (objavljeno 4. marta 1993); Lebkowsky i dr. (1988) Molec. Cell. Biol.8:3988-3996; Vincent i dr. (1990) Vaccines 90 (Cold Spring Harbor Laboratory Press); Carter (1992) Current Opinion in Biotechnology 3:533-539; Muzyczka (1992) Current Topics in Microbiol. and Immunol. 158:97-129; Kotin (1994) Human Gene Therapy 5:793-801; Shelling and Smith (1994) Gene Therapy 1:165-169; i Zhou i dr. (1994) J. Exp. Med.179:1867-1875.
[0108] Alternativno, AAV ITR se mogu izrezati iz virusnog genoma ili iz AAV vektora koji sadrži iste i fuzionisane 5' i 3' odabranog konstrukta nukleinske kiseline koji je prisutan u drugom vektoru koristeći standardne tehnike ligacije, kao što su one opisane u Sambrook i dr., supra. Na primer, ligacije se mogu obaviti u 20 mM Tris-Cl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 33 µg/ml BSA, 10 mM-50 mM NaCl, ili 40 µM 1 Weiss jedinica ATP,0,01-0,02 T4 DNK ligaza na 0°C (za vezivanje "lepljivog kraja") ili 1 mM ATP, 0,3-0,6 (Weiss) jedinica T4 DNK ligaza na 14°C (za vezivanje "tupim krajem"). Intermolekularne ligacije "lepljivog kraja" se obično izvode pri 30-100 µg/ml ukupnim koncentracijama DNK (5-100 nM ukupna koncentracija na kraju). AAV vektori koji sadrže ITR su opisani u, npr., patentu SAD br.5,139,941. Konkretno, u njemu je opisano nekoliko AAV vektora koji su dostupni u American Tipe Culture Collection ("ATCC") pod pristupnim brojevima 53222, 53223, 53224, 53225 i 53226.
[0109] Prema pronalasku, vektori ekspresije rAAV su obezbeđeni kao samokomplementarni rAAV konstrukti. Tipično, rAAV DNK je upakovana u virusni kapsid kao jednolančani DNK (ssDNK) molekul dužine oko 4600 nukleotida. Nakon infekcije ćelije virusom, jednostruki lanac DNK se pretvara u oblik dvolančane DNK (dsDNK). Samo dsDNK je korisna za proteine ćelije koji transkribuju sadržani gen ili gene u RNK. Dakle, konvencionalna šema replikacije AAV zahteva de novo sintezu komplementarnog DNK lanca. Ovaj korak pretvaranja ssDNK AAV genoma u dsDNK pre ekspresije može se zaobići upotrebom samokomplementarnih (sc) vektora.
[0110] Samo-komplementarni vektori se proizvode uparivanjem baza komplementarnih lanaca iz dva inficirajuća virusa, što ne zahteva sintezu DNK (videti, npr., Nakay i dr., J. Virol. (2000) 74:9451-9463). Ovo međulančano uparivanje baza, ili žarenje lanaca (SA), moguće je zato što AAV pakuje ili plus ili minus DNK lanac sa jednakom efikasnošću (Berns, K.I., Microbiol. Rev. (1990) 54:316-329).
2
[0111] Stoga i bez ograničenja u teoriji, potreba za konverzijom dsDNK, bilo sintezom SA ili DNK, može se u potpunosti zaobići pakovanjem oba lanca kao jednog molekula. Ovo se može postići korišćenjem prednosti AAV da proizvodi dimerne invertovane ponovljene genome tokom ciklusa AAV replikacije. Ako su ovi dimeri dovoljno mali, mogu se upakovati na isti način kao i konvencionalni AAV genomi, a dve polovine molekula ssDNK mogu se saviti i upariti bazni par da formiraju dsDNK molekul polovine dužine. dsDNK konverzija je nezavisna od sinteze DNK ćelije domaćina i koncentracije vektor (McCarty i dr., Gene Ther. (2001) 8:1248-1254).
[0112] Virusni konstrukti scAAV obuhvataju približno 4,6 kb i mogu da se upakuju u normalan AAV kapsid. Svaki od poznatih AAV serotipova je sposoban da pakuje scAAV genome sa sličnom efikasnošću (videti, npr., Sipo i dr., Gene Ther. (2007) 14:1319-1329). Dakle, u određenim slučajevima koji su ovde otkriveni, scAAV vektor sadrži kapsid proteine iz serotipova odabranih od AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 ili AAV9 serotipova. Međutim, scAAV vektor može da sadrži kapsid proteine iz bilo kog od poznatih serotipova ili modifikovanih kapsidnih proteina poznatih u tehnici. Ovi scAAV vektori mogu takođe biti pseudotipovani vektori koji sadrže genom jednog AAV serotipa u kapsidu drugog AAV serotipa. Takvi vektori mogu da sadrže, na primer, AAV vektor koji sadrži AAV2 kapsid i AAV1 genom ili AAV vektor koji sadrži AAV5 kapsid i AAV 2 genom (Auricchio i dr., (2001) Hum. Mol. Genet., 10(26):3075-81). Prema pronalasku, scAAV vektor sadrži kapsid proteine iz serotipa AAV9.
[0113] U početku se verovalo da transgenska sekvenca u scAAV vektoru može da sadrži samo približno 2,2 kb. Međutim, čini se da postoji veća širina u kapacitetu pakovanja nego što se ranije verovalo. Na primer, Wu i dr., Human Gene Ther. (2007) 18:171-182 uspešno upakovane scAAV-2 konstrukte veće od 3.300 bp i demonstrirani dimerni invertovani ponovljeni genomi koji su bili potpuno otporni na Dnazu. Ovi vektori su dali očekivano povećanje efikasnosti transdukcije u odnosu na ssAAV kada su testirani na kultivisanim ćelijama.
[0114] scAAV vektori se mogu proizvesti bilo generisanjem vektorskih plazmida koji su približno polovine konvencionalne veličine genoma u kombinaciji sa selektivnim prečišćavanjem infektivnog dvolančanog oblika, ili upotrebom vektorskih plazmida veličine približno polovine genoma sa mutacijom u jednom od terminalnih rezolucione sekvence AAV virusa koje obezbeđuju sintezu dvolančanog virusa. Obe strategije generišu i - lanac virusnih genoma koji su kovalentno povezani u jednom terminalnom ponavljanju.
[0115] Konkretno, stvaranje normalnih monomernih AAV genoma se oslanja na efikasnu rezoluciju dva ITR-a zauzvrat, sa svakim krugom sinteze DNK. Ova reakcija je posredovana ssDNK endonukleaznom aktivnošću dve veće izoforme AAV Rep. Izvlačenje ITR-a na mestu krajnje rezolucije je praćeno elongacijom DNK od zareza pomoću DNK polimeraze domaćina. Dimerni genomi se formiraju kada Rep ne uspe da odvoji mesto za krajnju rezoluciju pre nego što ga dosegne kompleks replikacije pokrenut na drugom kraju.
[0116] Prinos dimernih genoma u scAAV preparatu može se dramatično povećati inhibicijom rezolucije na jednom terminalnom ponavljanju. Ovo se lako postiže brisanjem sekvence terminalne rezolucije iz jednog ITR, tako da Rep protein ne može da generiše esencijalni nadimak ssDNK (videti, npr., McCarty i dr., Gene Ther. (2003) 10:2112-2118 i Wang i dr., Gene Ther. (2003) 10:2105-2111). Kompleks replikacije pokrenut na drugom ITR-u se zatim kopira kroz ukosnicu i nazad ka inicijalnom kraju. Replikacija se nastavlja do kraja molekula šablona, ostavljajući dsDNK obrnuti ponavljanje sa ITR divljeg tipa na svakom kraju i mutiranim ITR u sredini. Ovo dimerno obrnuto ponavljanje tada može proći normalne krugove replikacije sa dva divljeg tipa ITR kraja. Svaki izmešteni ćerki lanac sadrži obrnuti ponavljanje ssDNK sa kompletnim ITR na svakom kraju i mutiranim ITR u sredini.
Pakovanje u AAV kapsid počinje na 3' kraju izmeštenog lanca. Proizvodnja scAAV iz konstrukta sa jednim mutiranim ITR obično daje više od 90% dimernih genoma.
[0117] Proizvodnja i prečišćavanje scAAV vektora iz mutiranih ITR konstrukata je isto kao i konvencionalni ssAAV, kao što je opisano dalje u nastavku. Međutim, ako se koristi dot blot ili Saudern blot, vektorska DNK se poželjno primenjuje na hibridizacione membrane pod alkalnim uslovima da bi se sprečilo ponovno kaljenje komplementarnih lanaca. Pored toga, moguće je da se lažno mesto Rep-zarezivanja proizvede dovoljno blizu mutiranog ITR-a da omogući terminalnu rezoluciju i stvaranje monomernih genoma. Ovo se obično može izbeći okretanjem transgenske kasete u odnosu na mutantne i terminalne ponavljanja divljeg tipa.
[0118] Videti npr., McCarty, D.M., Molec. Ther. (2008) 16:1648-1656; McCarty i dr., Gene Ther. (2001) 8:1248-1254; McCarty i dr., Gene Ther. (2003) 10:2112-2118; Wang i dr., Gene
4
Ther. (2003) 10:2105-2111); Wu i dr., Human Gene Ther. (2007) 18:171-182; patentu objavu SAD br.2007/0243168 i 2007/0253936, kao i primeri ovde, za postupke proizvodnje scAAV konstrukata.
[0119] Za svrhe pronalaska, pogodne ćelije domaćini za proizvodnju rAAV viriona iz vektora ekspresije AAV (bilo konvencionalnih ili sc vektora) uključuju mikroorganizme, ćelije kvasca, ćelije insekata i ćelije sisara, koje se mogu koristiti ili su bile korišćene kao primaoci heterolognog molekula DNK i koji su sposobni za rast u, na primer, suspenzijskoj kulturi, bioreaktoru, ili slično. Termin uključuje potomstvo originalne ćelije koja je transfektovana. Prema tome, "ćelija domaćin" kako se ovde koristi generalno se odnosi na ćeliju koja je transfektovana sa egzogenom DNK sekvencom. Ćelije iz stabilne humane ćelijske linije, 293 (lako dostupne preko, na primer, američke kolekcije tipskih kultura pod pristupnim brojem ATCC CRL1573) su poželjnije u praksi ovog pronalaska. Konkretno, humana ćelijska linija 293 je ćelijska linija bubrega ljudskog embriona koja je transformisana fragmentima DNK adenovirusa tipa 5 (Graham i dr. (1977) J. Gen. Virol.36:59), i eksprimira adenovirusne Ela i E1b gene (Aiello i dr. (1979) Virology 94:460). Ćelijska linija 293 se lako transfektuje i pruža posebno pogodnu platformu za proizvodnju rAAV viriona.
AAV pomoćne funkcije
[0120] Ćelije domaćini koje sadrže iznad opisane vektore ekspresije AAV moraju biti u stanju da obezbede AAV pomoćne funkcije kako bi se replicirale i inkapsulirale sekvence nukleotida koje su flankirane sa AAV ITR da bi proizvele rAAV virione. AAV pomoćne funkcije su generalno AAV izvedene kodirajuće sekvence koje se mogu izraziti da obezbede AAV genske proizvode koji zauzvrat funkcionišu u trans za produktivnu AAV replikaciju. AAV pomoćne funkcije se ovde koriste da dopune neophodne AAV funkcije koje nedostaju u vektorima ekspresije AAV. Prema tome, pomoćne funkcije AAV-a uključuju jedan ili oba glavna AAV ORF-a, odnosno regione za kodiranje rep i cap, ili njihove funkcionalne homologe.
[0121] Pod „AAV rep kodirajući region“ se podrazumeva umetnički prepoznat region AAV genoma koji kodira proteine replikacije Rep 78, Rep 68, Rep 52 i Rep 40. Pokazalo se da ovi proizvodi ekspresije Rep poseduju mnoge funkcije, uključujući prepoznavanje, vezivanje i odsecanje AAV porekla replikacije DNK, aktivnost DNK helikaze i modulaciju transkripcije sa AAV (ili drugih heterolognih) promotera. Proizvodi ekspresije Rep su zajedno potrebni za replikaciju AAV genoma. Za opis regiona rep kodiranja AAV pogledajte, npr., Muzyczka, N.
(1992) Current Topics in Microbiol, and Immunol.158:97-129; i Kotin, R.M. (1994) Human Gene Therapy 5:793-801. Odgovarajući homolozi regiona koji kodira rep AAV uključuju rep gen humanog herpesvirusa 6 (HHV-6) za koji je takođe poznato da posreduje u replikacije DNK AAV-2 (Thomson i dr. (1994) Virology 204:304-311).
[0122] Pod „AAV cap kodirajući region“ se podrazumeva umetnički priznati region AAV genoma koji kodira kapsid proteine VP1, VP2 i VP3, ili njihove funkcionalne homologe. Ovi Cap ekspresioni proizvodi obezbeđuju funkcije pakovanja koje su zajedno potrebne za pakovanje virusnog genoma. Za opis regiona AAV cap kodiranja pogledajte,
npr., Muzyczka, N. i Kotin, R.M. (supra).
[0123] AAV pomoćne funkcije se uvode u ćeliju domaćina transfekcijom ćelije domaćina pomoću AAV pomoćne konstrukcije ili pre, ili istovremeno sa transfekcijom vektora ekspresije AAV. AAV pomoćne konstrukcije se stoga koriste da obezbede barem prolaznu ekspresiju AAV rep i/ili cap gena da dopune nedostajuće AAV funkcije koje su neophodne za produktivnu AAV infekciju. AAV pomoćnim konstrukcijama nedostaju AAV ITR i ne mogu se ni replicirati ni pakovati.
[0124] Ovi konstrukti mogu biti u obliku plazmida, faga, transpozona, kosmida, virusa ili viriona. Opisani su brojni AAV pomoćni konstrukti, kao što su obično korišćeni plazmidi papav/Ad i pIM29+45 koji kodiraju i Rep i Cap ekspresione proizvode. Videti npr., Samulsky i dr. (1989) J. Virol.63:3822-3828; i McCarty i dr. (1991) J. Virol.65:2936-2945. Opisani su i brojni drugi vektori koji kodiraju proizvode ekspresije Rep i/ili Cap. Videti, npr., patent SAD br.5,139,941.
AAV dodatne funkcije
[0125] Ćelija domaćin (ili ćelija za pakovanje) takođe mora biti osposobljena za pružanje funkcija koje nisu izvedene iz AAV-a, ili „dodatnih funkcija“, da bi proizvele rAAV virione. Dodatne funkcije su virusne i/ili ćelijske funkcije koje nisu izvedene iz AAV-a od kojih AAV zavisi za svoju replikaciju. Prema tome, dodatne funkcije uključuju najmanje one neAAV proteine i RNK koji su potrebni u replikaciji AAV, uključujući one uključene u aktivaciju transkripcije AAV gena, stadijum specifičnog spajanja AAV mRNK, replikaciju AAV DNK, sintezu proizvoda ekspresije Cap i sklapanje AAV kapsida. Dodatne funkcije zasnovane na virusima mogu biti izvedene iz bilo kog od poznatih pomoćnih virusa.
[0126] Posebno, dodatne funkcije se mogu uvesti u ćelije domaćina i zatim eksprimirati u njima korišćenjem postupaka poznatih stručnjacima u ovoj oblasti. Tipično, dodatne funkcije se obezbeđuju infekcijom ćelija domaćina nesrodnim pomoćnim virusom. Poznato je nekoliko pogodnih pomoćnih virusa, uključujući adenoviruse; herpesvirusi kao što je virus herpes simpleksa tipa 1 i 2; i virusi vakcinije. Ne virusne dodatne funkcije će takođe naći primenu ovde, kao što su one koje obezbeđuje sinhronizacija ćelija korišćenjem bilo kog od različitih poznatih sredstava. Videti npr., Buller i dr. (1981) J. Virol.40:241-247; McPherson i dr. (1985) Virology 147:217-222; Schlehofer i dr. (1986) Virology 152:110-117.
[0127] Alternativno, dodatne funkcije se mogu obezbediti korišćenjem vektora dodatne funkcije kao što je iznad definisano. Videti npr., Patent SAD br..6,004,797 i Međunarodnoj patentnoj objavi br.. WO 01/83797.
[0128] Sekvence nukleinske kiseline koje obezbeđuju pomoćne funkcije mogu se dobiti iz prirodnih izvora, kao što je iz genoma čestice adenovirusa, ili konstruisane korišćenjem rekombinantnih ili sintetičkih metoda poznatih u tehnici. Kao što je iznad objašnjeno, pokazano je da potpuni komplement gena adenovirusa nije potreban za pomoćne funkcije pomoćnika. Posebno se pokazalo da su mutanti adenovirusa nesposobni za replikaciju DNK i kasnu sintezu gena dozvoljeni za AAV replikaciju. Ito i dr., (1970) J. Gen. Virol.
9:243; Ishibashi i dr, (1971) Virology 45:317. Slično, pokazalo se da mutanti unutar E2B i E3 regiona podržavaju AAV replikaciju, što ukazuje da regioni E2B i E3 verovatno nisu uključeni u obezbeđivanje pomoćnih funkcija. Carter i dr., (1983) Virology 126:505.
Međutim, adenovirusi koji su defektni u E1 regionu ili imaju izbrisani E4 region, nisu u stanju da podrže AAV replikaciju. Dakle, regioni E1A i E4 su verovatno potrebni za AAV replikaciju, bilo direktno ili indirektno. Laughlin i dr., (1982) J. Virol.41:868; Janik i dr., (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1925; Carter i dr., (1983) Virology 126:505. Ostali okarakterisani Ad mutanti uključuju: E1B (Laughlin i dr. (1982), supra; Janik i dr.
(1981), supra; Ostrove i dr., (1980) Virology 104:502); E2A (Handa i dr., (1975) J. Gen. Virol. 29:239; Strauss i dr., (1976) J. Virol.17:140; Miers i dr., (1980) J. Virol.35:665; Jai i dr., (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2927; Miers i dr., (1981) J. Biol. Chem.256:567); E2B (Carter, Adeno-Associated Virus Helper Functions, in I CRC Handbook of Parvoviruses (P. Tijssen ed., 1990)); E3 (Carter i dr. (1983), supra); i E4 (Carter i dr.(1983), supra; Carter (1995)). Iako su ispitivanja pomoćnih funkcija koje obezbeđuju adenovirusi koji imaju mutacije u regionu kodiranja E1B dale oprečne rezultate, Samulski i dr., (1988) J. Virol.
62:206-210, izvestio je da je E1B55k potreban za proizvodnju AAV viriona, dok E1B19k nije. Dodatno, međunarodna objava WO 97/17458 i Matshushita i dr., (1998) Gene Therapy 5:938-945, opisuju vektore dodatne funkcije koji kodiraju različite Ad gene. Naročito poželjni vektori dodatne funkcije obuhvataju region kodiranja VA RNK adenovirusa, region kodiranja adenovirusa E4 ORF6, region kodiranja adenovirusa E2A 72 kD, region kodiranja adenovirusa E1A i region adenovirusa E1B kome nedostaje netaknuti region kodiranja E1B55k. Takvi vektori su opisani u Međunarodnoj patentnoj objavi br.. WO 01/83797.
[0129] Kao posledica infekcije ćelije domaćina pomoćnim virusom, ili transfekcije ćelije domaćina vektorom dodatne funkcije, eksprimiraju se dodatne funkcije koje transaktiviraju pomoćnu konstrukciju AAV da bi proizvele AAV Rep i/ili Cap proteine. Ekspresioni proizvodi Rep izdvajaju rekombinantnu DNK (uključujući DNK od interesa) iz vektora ekspresije AAV. Rep proteini takođe služe za umnožavanje AAV genoma. Ekspresirani Cap proteini se sastavljaju u kapside, a rekombinantni AAV genom se pakuje u kapside. Tako dolazi do produktivne AAV replikacije, a DNK se pakuje u rAAV virione. "Rekombinantni AAV virion" ili "rAAV virion" je ovde definisan kao infektivni virus sa defektom replikacije uključujući AAV proteinski omotač, koji obuhvata heterolognu nukleotidnu sekvencu od interesa koja je sa obe strane okružena AAV ITR-ovima.
[0130] Nakon rekombinantne AAV replikacije, virioni rAAV mogu se prečistiti iz ćelije domaćina korišćenjem različitih konvencionalnih metoda prečišćavanja, kao što su hromatografija na koloni, gradijenti CsCl i slično. Na primer, može se koristiti više koraka prečišćavanja u koloni, kao što je prečišćavanje preko anjonoizmenjivačke kolone, afinitetne kolone i/ili kolone za izmenu katjona. Pogledajte, na primer, Međunarodnoj patentnoj objavi br.. WO 02/12455. Dalje, ako se infekcija koristi za izražavanje pomoćnih funkcija, rezidualni pomoćni virus se može inaktivirati, korišćenjem poznatih postupaka. Na primer, adenovirus se može inaktivirati zagrevanjem do temperature od približno 60°C, na primer, 20 minuta ili više. Ovaj tretman efikasno inaktivira samo pomoćni virus pošto je AAV izuzetno stabilan na toplotu dok je pomoćni adenovirus toplotno labilan.
[0131] Dobijeni virioni rAAV koji sadrže nukleotidnu sekvencu od interesa mogu se zatim koristiti za isporuku gena korišćenjem tehnika opisanih u nastavku.
Sastavi i isporuka
A. Sastavi
[0132] Jednom proizvedeni, virioni rAAV koji kodiraju gen od interesa, biće formulisani u sastave pogodne za isporuku. Sastavi će sadržati dovoljan genetski materijal da proizvede terapeutski efikasnu količinu gena od interesa, odnosno, količinu dovoljnu da (1) spreči razvoj bolesti ili izazove da se bolest javi manjim intenzitetom kod ispitanika koji može biti izložen ili predisponirani na bolest, ali još ne doživljavaju ili ne ispoljavaju simptome bolesti, (2) inhibiraju bolest, odnosno zaustavljaju razvoj ili preokrenu bolest, ili (3) ublažavaju simptome bolesti, odnosno smanjuju broj simptomi koje je ispitanik iskusio, kao i promena ćelijske patologije povezane sa bolešću.
[0133] Odgovarajuće doze će takođe zavisiti od sisara koji se leči (npr., humani ili ne-humani primat ili drugi sisar), starosti i opšteg stanja ispitanika koji se leči, težine stanja koje se leči, načina davanja, između ostalih faktora. Odgovarajuću efektivnu količinu može lako odrediti stručnjak u ovoj oblasti, a reprezentativne količine su date u nastavku.
[0134] Sastavi će takođe sadržati farmaceutski prihvatljiv ekscipijens. Takvi ekscipijensi uključuju bilo koje farmaceutske sredstvo koji sam po sebi ne indukuje proizvodnju antitela štetnih za pojedinca koji prima sastav, i koji se može primeniti bez nepotrebne toksičnosti. Farmaceutski prihvatljivi ekscipijenti uključuju, ali nisu ograničeni na, sorbitol, bilo koje od različitih TWEEN jedinjenja i tečnosti kao što su voda, fiziološki rastvor, glicerol i etanol. Farmaceutski prihvatljive soli mogu biti uključene u to, na primer, soli mineralnih kiselina kao što su hidrohloridi, hidrobromidi, fosfati, sulfati i slično; i soli organskih kiselina kao što su acetati, propionati, malonati, benzoati i slično. Dodatno, pomoćne supstance, kao što su sredstva za vlaženje ili emulgatori, pH puferske supstance i slično, mogu biti prisutne u takvim nosačima. Detaljna diskusija o farmaceutski prihvatljivim ekscipijensima je dostupna u REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Mack Pub. Co., N.J.1991).
[0135] Formulacije mogu biti tečne ili čvrste, na primer, liofilizovane. Formulacije se takođe mogu davati kao aerosoli.
[0136] Jedna posebno korisna formulacija sadrži virion rAAV od interesa u kombinaciji sa jednim ili više dihidričnih ili polihidričnih alkohola i, opciono, deterdžent, kao što je sorbitan estar. Videti na primer, Patent SAD br..6,764,845.
B. Isporuka
[0137] Generalno, rekombinantni virioni se uvode u ispitanika pomoću tehnika transdukcije in vivo ili in vitro. Ako se transdukuje in vitro, željena ćelija primaoca će biti uklonjena iz ispitanika, transdukovana rekombinantnim vektorom i ponovo uvedena u ispitanika. Alternativno, singene ili ksenogene ćelije se mogu koristiti tamo gde te ćelije neće generisati neodgovarajući imuni odgovor kod ispitanika. Pogodne ćelije za isporuku životinjama domaćinima sisara uključuju tipove ćelija sisara iz organa, tumora ili ćelijskih linija. Na primer, mogu se koristiti ćelije čoveka, miša, koza, ovaca, goveda, pasa, mačaka i svinja. Pogodni tipovi ćelija za upotrebu uključuju, bez ograničenja, fibroblaste, hepatocite, endotelne ćelije, keratinocite, hematopoetske ćelije, epitelne ćelije, miocite, neuronske ćelije i matične ćelije. Pored toga, nervne progenitorne ćelije mogu da se transduciraju in vitro i zatim isporuče u CNS.
[0138] Ćelije se mogu transducirati in vitro kombinovanjem rekombinantnih viriona sa željenom ćelijom u odgovarajućem medijumu, a ćelije se mogu pregledati na ćelije koje sadrže DNK od interesa korišćenjem konvencionalnih tehnika kao što su Saudern blotovi i/ili PCR, ili korišćenjem selektivnih markera. Transdukovane ćelije se zatim mogu formulisati u farmaceutske sastave, kao što je iznad opisano, i sastav uveden u ispitanika različitim tehnikama kao što je opisano u nastavku, u jednoj ili više doza.
[0139] Za in vivo isporuku, rekombinantni virioni će biti formulisani u farmaceutske kompozicije i jedna ili više doza se mogu davati direktno na naznačen način. Za identifikaciju struktura u ljudskom mozgu, pogledajte, npr., The Human Brain: Surface, Three-Dimensional Sectional Anatomi With MRI, and Blood Suppli, 2nd ed., eds. Deuteron i dr., Springer Vela, 1999; Atlas of the Human Brain, eds. Mai i dr., Academic Press; 1997; i Co-Planar Sterotaxic Atlas of the Human Brain: 3-Dimensional Proportional Sistem: An Approach to Cerebral Imaging, eds. Tamarack i dr., Thime Medical Pub., 1988. Za identifikaciju struktura u mozgu miša, videti, npr., The Mouse Brain in Sterotaxic Coordinates, 2nd ed., Academic Press, 2000. Po želji, struktura ljudskog mozga može se povezati sa sličnim strukturama u mozgu drugog sisara. Na primer, većina sisara, uključujući ljude i glodare, pokazuje sličnu topografsku organizaciju projekcija entorina-hipokampusa, sa neuronima u bočnom delu i lateralnog i medijalnog entorinalnog korteksa koji se projektuju na dorzalni deo ili septalni pol hipokampusa, dok projekcija na ventralni hipokampus potiče prvenstveno od neurona u medijalnim delovima entorhinalnog korteksa (Principles of Neural Science, 4th ed., eds Kandel i dr., McGraw-Hill, 1991; The Rat Nervous Sistem, 2nd ed., ed. Paxinos, Academic
4
Press, 1995). Štaviše, ćelije sloja II entorhinalnog korteksa projektuju se u zupčani girus i završavaju se u spoljnim dvema trećinama molekularnog sloja zupčastog vijuga. Aksoni iz ćelija sloja III štrče bilateralno u oblasti cornu ammonis CA1 i CA3 hipokampusa, završavajući se u molekularnom sloju stratum lakunoze.
[0140] Da bi se vektor isporučio specifično u određeni region centralnog nervnog sistema, posebno u određeni region mozga, može se primeniti sterotaksičnom mikroinjekcijom. Na primer, na dan operacije, pacijenti će imati sterotaksičnu osnovu okvira fiksiranu na mestu (uvrnutu u lobanju). Mozak sa sterotaksičnom bazom okvira (MRI-kompatibilan sa fiducijarnim oznakama) biće snimljen korišćenjem MRI visoke rezolucije. MRI slike će se zatim preneti na računar koji pokreće stereotaksički softver. Serija koronalnih, sagitalnih i aksijalnih slika će se koristiti za određivanje ciljnog mesta vektorske injekcije i putanje.
Softver direktno prevodi putanju u 3-dimenzionalne koordinate prikladne za stereotaksički okvir. Iznad mesta ulaska izbušene su rupe i stereotaksički aparat se lokalizuje sa iglom implantiranom na datu dubinu. Vektor u farmaceutski prihvatljivom nosaču će se zatim ubrizgati. Vektor se zatim primenjuje direktnom injekcijom na primarno ciljno mesto i retrogradno se transportuje do distalnih ciljnih mesta preko aksona. Mogu se koristiti dodatni načini davanja, na primer, površinska kortikalna primena pod direktnom vizualizacijom, ili druga nestereotaksična primena.
[0141] Rekombinantni AAV bilo kog serotipa se može koristiti u opisanim metodama, pri čemu rekombinantni AAV može biti ili samo-komplementaran AAV ili ne-samokomplementaran AAV. Serotip virusnog vektora koji se koristi u određenim slučajevima je izabran iz grupe koju čine AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 i AAV9 (videti, npr., Gao i dr. (2002) PNAS, 99:1185411859; i Viral Vectors for Gene Therapi: Methods and Protocols, ed. Machida, Humana Press, 2003). Mogu se koristiti i drugi serotipovi osim onih koji su ovde navedeni. Štaviše, pseudotipovani AAV vektori se takođe mogu koristiti u ovde opisanim postupcima. Pseudotipovani AAV vektori su oni koji sadrže genom jednog AAV serotipa u kapsidu drugog AAV serotipa; na primer, AAV vektor koji sadrži AAV2 kapsid i AAV1 genom ili AAV vektor koji sadrži AAV5 kapsid i AAV 2 genom (Auricchio i dr., (2001) Hum. Mol. Genet., 10(26):3075-81). Vektor scAAV korišćen u pronalasku sadrži kapsid proteine iz AAV9.
[0142] Rekombinantni virioni ili ćelije transdukovane in vitro mogu da se isporuče direktno u nervno tkivo kao što su periferni nervi, retina, ganglije dorzalnog korena, neuromuskularni spoj, kao i CNS, injekcijom u, npr., ventrikularni region, kao što je jedan ili oba bočnih komora, kao i na strijatum (npr., kaudatno jezgro ili putamen strijatum), mali mozak, kičmenu moždinu i neuromišićni spoj, iglom, kateterom ili srodnim uređajem, korišćenjem neurohirurških tehnika poznatih u tehnici, kao što je stereotaksično ubrizgavanje (videti, npr., Stein i dr., J Virol 73:3424-3429, 1999; Davidson i dr., PNAS 97:3428-3432,
2000 ; Davidson i dr., Nat. Genet. 3:219-223, 1993; i Aliski and Davidson, Hum. Gene Ther.
11:2315-2329, 2000). U ilustrativnoj varijanti, isporuka se postiže direktnim ubrizgavanjem vektorskog rastvora visokog titra u kičmenu moždinu ispitanika ili pacijenta.
[0143] U drugom ilustrativnom otelotvorenju, dostava transgena u kičmenu moždinu i/ili region moždanog stabla ispitanika primenom rekombinantnog AAV vektora koji sadrži transgen u najmanje jedan region regiona dubokog malog mozga (DCN) regiona malog mozga ispitanika. Duboko u malom mozgu nalazi se siva materija koja se naziva duboka jezgra malog mozga koja se nazivaju medijalno (fastigijalno) jezgro, interponirano (interpositus) jezgro i lateralno (zubasto) jezgro. Kako se ovde koristi, termin "duboka cerebelarna jezgra" zajedno se odnosi na ova tri regiona, pri čemu jedan ili više od ova tri regiona mogu biti ciljani. Dostava virusa je u uslovima koji favorizuju ekspresiju transgena u kičmenu moždinu i/ili region moždanog stabla. u najmanje jednom delu kičmene moždine ispitanika. Ove podele uključuju jednu ili više cervikalnih, torakalnih, lumbalnih ili sakralnih.
[0144] Bez ograničenja u teoriji, jedna realizacija pronalaska leži u sposobnosti da se obezbedi terapeutski molekul (na primer, protein ili peptid) svakom delu kičmene moždine. Ovo se može postići ubrizgavanjem AAV vektora, uključujući scAAV vektor u DCN.
Štaviše, može biti važno ciljati pojedinačnu laminu unutar svake divizije kičmene moždine. Lamina su specifične podregije unutar regiona mozga i kičmene moždine. U određenim otelotvorenjima može biti poželjno da se cilja specifična lamina unutar određene divizije kičmene moždine. Pošto se oštećenje motornih neurona može javiti iu gornjim motornim neuronima, takođe može biti poželjno obezbediti terapeutski molekul (na primer, protein ili peptid) u delovima moždanog stabla. U jednom otelotvorenju, može biti poželjno da se terapeutski molekul obezbedi i za kičmenu moždinu, uključujući neke ili sve podele, kao i za moždano stablo, uključujući neke ili sve podele. Predmetni pronalazak koristi uvođenje AAV vektora u DCN da bi se postigla gore opisana isporuka terapeutskog molekula u region(e) kičmene moždine i/ili moždano stablo.
[0145] Drugi postupak za ciljanje kičmene moždine (npr., glija) je intratekalna isporuka, a ne u samo tkivo kičmene moždine. Takva isporuka ima mnoge prednosti. Ciljani protein se oslobađa u okolni CSF i za razliku od virusa, oslobođeni proteini mogu prodreti u parenhim kičmene moždine, baš kao što to čine nakon akutnih intratekalnih injekcija. Zaista, intratekalna isporuka virusnih vektora može zadržati ekspresiju lokalno. Dodatna prednost intratekalne genske terapije je u tome što intratekalni put oponaša primenu lumbalne punkcije (tj., kičmenu punkciju) već u rutinskoj upotrebi kod ljudi.
[0146] Drugi postupak za primenu rekombinantnih vektora ili transdukovanih ćelija je isporuka neuronima dorzalnih ganglija (DRG), na primer, injekcijom u epiduralni prostor sa naknadnom difuzijom u DRG. Na primer, rekombinantni vektori ili transdukovane ćelije mogu da se isporuče putem intratekalne kanilacije pod uslovima u kojima je protein difundovan u DRG. Videti npr., Chiang i dr., Acta Anaesthesiol. Sin. (2000) 38:31-36; Jain, K.K., Expert Opin. Investig. Drugs (2000) 9:2403-2410.
[0147] Još jedan način davanja u CNS koristi sistem isporuke sa poboljšanom konvekcijom (CED), što je bilo koja ne ručna isporuka vektora. U jednom aspektu CED-a, gradijent pritiska se stvara korišćenjem sistema za isporuku koji nije ručno. Korišćenjem CED-a, rekombinantni vektori se mogu isporučiti u mnoge ćelije na velikim površinama CNS-a. Štaviše, isporučeni vektori efikasno eksprimiraju transgene u CNS ćelijama (npr., glijalne ćelije). Bilo koji uređaj za isporuku poboljšan konvekcijom može biti prikladan za isporuku rekombinantnih vektora. U poželjnom otelotvorenju, uređaj je osmotska pumpa ili infuziona pumpa. I osmotske i infuzione pumpe su komercijalno dostupne od raznih dobavljača, na primer Alzet Corporation, Hamilton Corporation, Alza, Inc., Palo Alto, Kalifornija). Tipično, rekombinantni vektor se isporučuje preko CED uređaja na sledeći način. Kateter, kanila ili drugi injekcioni uređaj se ubacuje u tkivo CNS izabranom subjektu. Stereotaktičke mape i uređaji za pozicioniranje su dostupni, na primer od ASI Instruments, Warren, MI.
Pozicioniranje se takođe može obaviti korišćenjem anatomskih mapa dobijenih CT i/ili MRI imidžingom da bi se pomoglo u vođenju uređaja za injekciju do izabrane mete. Štaviše, pošto se postupci opisani ovde mogu praktikovati tako da relativno velike površine ispit zauzimaju rekombinantne vektore, potrebno je manje infuzionih kanila. Pošto su hirurške komplikacije često povezane sa brojem penetracija, ovaj način isporuke služi za smanjenje nuspojava koje se vide kod konvencionalnih tehnika isporuke. Za detaljan opis u vezi sa isporukom CED-a, pogledajte Patent SAD br..6,309,634.
4
[0148] Intracerebroventrikularna ili intraventrikularna isporuka rekombinantnog AAV vektora može se izvršiti u bilo kojoj ili više moždanih komora, koje su ispunjene cerebrospinalnom tečnošću (CSF). CSF je bistra tečnost koja ispunjava komore, prisutna je u subarahnoidnom prostoru i okružuje mozak i kičmenu moždinu. CSF se proizvodi u horoidnim pleksusima i putem isplakavanja ili prenosa tkivne tečnosti od strane mozga u komore. Horoidni pleksus je struktura koja oblaže dno bočne komore i krov treće i četvrte komore. Određena ispitivanja su pokazale da su ove strukture sposobne da proizvedu 400-600 kubika tečnosti dnevno, što je u skladu sa količinom koja ispunjava prostore centralnog nervnog sistema četiri puta dnevno. Kod odraslih ljudi, zapremina ove tečnosti je izračunata od 125 do 150 ml (4-5 oz). CSF je u kontinuiranom formiranju, cirkulaciji i apsorpciji.
Određena ispitivanja su pokazale da se otprilike 430 do 450 ml (skoro 2 šolje) CSF može proizvesti svakog dana. Određeni proračuni procenjuju da je proizvodnja jednaka približno 0,35 ml u minuti kod odraslih i 0,15 ml u minuti kod novorođenčadi. Četvrta komora dodaje više CSF; Teče kroz Monrov otvor u treću komoru gde se dodaje produkcijom iz treće komore i nastavlja niz Silviusov akvadukt do četvrte komore. Četvrta komora dodaje više CSF; tečnost zatim putuje u subarahnoidalni prostor kroz otvore Magendie i Luschka. Zatim cirkuliše kroz bazu mozga, dole oko kičmene moždine i nagore preko moždanih hemisfera. CSF se prazni u krv preko arahnoidnih resica i intrakranijalnih vaskularnih sinusa.
[0149] U jednom slučaju, obelodanjeni postupci uključuju davanje u CNS obolelog subjekta viriona rAAV koji nosi transgen koji kodira terapeutski proizvod i omogućava da se transgen ekspresuje u CNS u blizini mesta primene na nivou koji je dovoljan da ispolji terapeutski efekat kao što je eksprimirani protein se transportuje preko CSF-a kroz CNS. U nekim slučajevima, postupci obuhvataju davanje sastava viriona visokog titra koja nosi terapeutski transgen tako da se transgenski proizvod eksprimira na terapeutskom nivou na prvom mestu unutar CNS distalno od krajnjeg mesta delovanja eksprimovanog proizvoda.
[0150] Kod eksperimentalnih miševa, ukupna zapremina ubrizganog AAV rastvora je, na primer, između 1 i 20 µl. Za druge sisare, uključujući ljude, zapremine i stope isporuke su na odgovarajući način skalirane. Tretman se može sastojati od jedne injekcije po ciljnom mestu, ili se može ponoviti na jednom ili više mesta. Može se koristiti više mesta za injekcije. Na primer, u nekim slučajevima, pored mesta prve primene, sastav koji sadrži virusni vektor koji nosi transgen se primenjuje na drugo mesto koje može biti kontralateralno ili ipsilateralno u odnosu na mesto prve primene. Injekcije mogu biti pojedinačne ili višestruke, jednostrane ili bilateralne.
[0151] Tretman doziranjem može biti raspored jedne doze, kontinuirano ili povremeno, ili raspored višestrukih doza. Štaviše, subjektu se može dati onoliko doza koliko je prikladno. Ako se daje više doza, prva primenjena formulacija može biti ista ili drugačija od sledećih formulacija. Tako, na primer, prva primena može biti u obliku AAV vektora, a druga primena u obliku vektora adenovirusa, plazmidne DNK, proteinskog sastava ili slično. Štaviše, naknadna isporuka takođe može biti ista ili drugačija od drugog načina isporuke.
[0152] Pored toga, ispitanik može da primi vektor rAAV prema predmetnom pronalasku kombinacijom postupaka isporuke koje su tamo obelodanjene. Dakle, ispitanik može dobiti injekcije AAV vektora na najmanje dva mesta za injekcije izabrana iz grupe koju čine intracerebroventrikularne injekcije, direktne injekcije kičmene moždine, intratekalne injekcije i intraparenhimske injekcije mozga (npr., strijatum, mali mozak, uključujući duboke jezgra malog mozga). U jednom otelotvorenju, ispitanik može da primi rAAV vektor putem 1) najmanje jedne intracerebroventrikularne injekcije i najmanje jedne direktne injekcije kičmene moždine ili 2) najmanje jedne intracerebroventrikularne injekcije i najmanje jedne intratekalne injekcije ili 3) najmanje jedne intracerebroventrikularne injekcije i najmanje jedna intraparenhimalna injekcija u mozak ili 4) najmanje jedna direktna injekcija kičmene moždine i najmanje jedna intratekalna injekcija ili 5) najmanje jedna direktna injekcija kičmene moždine i najmanje jedna intraparenhimalna injekcija u mozak ili 6) najmanje jedna intratekalna injekcija i najmanje jedna intraparenhimalna injekcija u mozak.
[0153] Trebalo bi razumeti da više od jednog transgena može biti eksprimirano isporučenim rekombinantnim virionom. Alternativno, odvojeni vektori, od kojih svaki eksprimira jedan ili više različitih transgena, takođe mogu biti dostavljeni ispitaniku kao što je ovde opisano. Dakle, više transgena može biti isporučeno istovremeno ili uzastopno. Dalje, takođe je predviđeno da se vektori koji se isporučuju ovim pronalaskom kombinuju sa drugim pogodnim sastavima i terapijama. Pored toga, mogu se koristiti kombinacije tretmana proteinima i nukleinskim kiselinama.
[0154] Postupcima za određivanje najefikasnijih načina davanja i terapeutski efikasnih doza
4
su dobro poznati stručnjacima u ovoj oblasti i variraće u zavisnosti od vektora, sastava terapije, ciljnih ćelija i ispitanika koji se leči. Terapeutski efikasne doze mogu se lako odrediti korišćenjem, na primer, jednog ili više životinjskih modela određene bolesti u pitanju.
„Terapeutski efikasna količina“ pada u relativno širok raspon koji se može odrediti kroz klinička ispitivanja. Na primer, za in vivo injekciju rAAV viriona, doza će biti reda veličine od oko 10<6>do 10<15>čestica genoma rekombinantnog virusa, poželjnije 10<8>do 10<14>čestica genoma rekombinantnog virusa, ili bilo koje doze unutar ovih opsega koja je dovoljna da obezbedi željeni efekat. U određenim otelotvorenjima, koncentracija ili titar vektora u sastavu je najmanje: (a) 56, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, ili 50 (× 10<12>gp/ml); (b) 56, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, ili 50 (×10<9>tu/ml); ili (c) 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, ili 50 (×10<10>iu/ml).
[0155] Za in vitro transdukciju, efikasna količina viriona rAAV koja se isporučuje u ćelije biće reda veličine 10<8>do 10<13>rekombinantnog virusa. Količina transdukovanih ćelija u farmaceutskim sastavima će zauzvrat biti od oko 10<4>do 10<10>ćelija, poželjnije 10<5>do 10<8>ćelija. Ostale efikasne doze može lako da utvrdi neko od uobičajenih veština u ovoj oblasti kroz rutinska ispitivanja koja uspostavljaju krive odgovora na dozu.
[0156] Generalno, od 1 µl do 1 ml sastava će biti isporučeno, kao što je od 0,01 do oko ,5 ml, na primer oko 0,05 do oko 0,3 ml, kao što je 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, itd. i bilo koji broj unutar ovih opsega, sastava će biti isporučeni.
Životinjski modeli
[0157] Terapeutska efikasnost i bezbednost korišćenjem AAV viriona uključujući transgene kao što je iznad opisano mogu se testirati na odgovarajućem životinjskom modelu. Na primer, životinjski modeli koji izgledaju najsličniji ljudskim bolestima uključuju životinjske vrste koje ili spontano razviju visoku incidencu određene bolesti ili one koje su indukovane na to.
[0158] Konkretno, poznato je i generisano nekoliko životinjskih modela za SMA. Videti npr., Sumner C.J., NeuroRx (2006) 3:235-245; Schmid i dr., J. Child Neurol. (2007) 22:1004-1012. Kao što je iznad objašnjeno, molekularna osnova SMA, autozomno recesivnog neuromuskularnog poremećaja, je homozigotni gubitak gena 1 motornog neurona preživljavanja (SMN1). Skoro identična kopija SMN1 gena, nazvana SMN2, nalazi se kod ljudi i modulira ozbiljnost bolesti. Za razliku od ljudi, miševi imaju jedan gen (SMN) koji je ekvivalentan SMN1. Homozigotni gubitak ovog gena je smrtonosan za embrione i rezultira
4
masivnom smrću ćelija, što ukazuje da je proizvod SMN gena neophodan za opstanak i funkciju ćelije. Uvođenje 2 kopije SMN2 u miševe kojima nedostaje SMN spašava embrionalnu smrtnost, što rezultira miševima sa SMA fenotipom (Monani i dr., Hum. Mol. Genet. (2000) 9:333-339. Veliki broj kopija SMN2 spašava miševe jer se dovoljno SMN proteina proizvodi u motornim neuronima. Videti takođe, Hsieh-Li, i dr., Nat. Genet. (2000) 24:66-70, izveštavajući o proizvodnji transgenih linija miša koje su eksprimirale humani SMN2. Konkretno, transgeni miševi koji nose SMN2 u pozadini SMN-/- pokazuju patološke promene u kičmenoj moždini i skeletnim mišićima slične onima kod pacijenata sa SMA. Ozbiljnost patoloških promena kod ovih miševa korelira sa količinom SMN proteina koji je sadržao region kodiran egzonom 7. Fenotipovi u ovom modelu miša uključuju gubitak ćelija motornih neurona, atrofiju skeletnih mišića, aberantne neuromuskularne spojeve (NMJ), poremećaje ponašanja, paralizu i skraćeni životni vek od oko dve nedelje. Le i dr., Hum. Mol. Genet. (2005) 14:845-857.
[0159] Slično, poznati su životinjski modeli za ALS. ALS je fatalna neurodegenerativna bolest koju karakteriše selektivni gubitak motornih neurona u korteksu, moždanom stablu i kičmenoj moždini. Napredovanje bolesti može dovesti do atrofije udova, aksijalnih i respiratornih mišića. Smrt ćelija motornih neurona je praćena reaktivnom gliozom, abnormalnostima neurofilamenta i značajnim gubitkom velikih mijelinizovanih vlakana u kortikospinalnim traktovima i ventralnim korenima. Iako je etiologija ALS slabo shvaćena, akumulirani dokazi ukazuju na to da sporadični (SALS) i porodični (FALS) ALS dele mnoge slične patološke karakteristike; tako, pružajući nadu da će proučavanje bilo kojeg oblika dovesti do zajedničkog tretmana. FALS čini oko 10% dijagnostikovanih slučajeva, od kojih je 20% povezano sa dominantno naslednim mutacijama Cu/Zn superoksid dismutaze (SODI). Transgenski miševi koji eksprimiraju mutantni humani SODI protein (npr. SODIG93A miševi) rekapituliraju mnoge patološke karakteristike ALS-a i dostupni su model anima za proučavanje ALS-a. Za SALS, bezbroj patoloških mehanizama je impliciran kao osnovni uzrok, uključujući ekscitotoksičnost izazvanu glutamatom, izloženost toksinima, disfunkciju proteazoma, oštećenje mitohondrija, dezorganizaciju neurofilamenta i gubitak neurotrofne podrške.
[0160] Eksperimentalni autoimuni encefalomijelitis (EAE), takođe nazvan eksperimentalni alergijski encefalomijelitis, pruža životinjski model za MS. EAE veoma liči na različite oblike i stadijume MS. EAE je akutna ili hronična relapsirajuća, stečena, inflamatorna i
4
demijelinizirajuća autoimuna bolest. Da bi se stvorila bolest, životinjama se ubrizgavaju proteini koji čine mijelin, izolacioni omotač koji okružuje neurone. Ovi proteini izazivaju autoimuni odgovor kod ubrizganih životinja koje razvijaju proces bolesti koji veoma liči na MS kod ljudi. EAE je indukovana kod brojnih različitih životinjskih vrsta uključujući miševe, pacove, zamorce, zečeve, makake, rezus majmune i marmozete.
[0161] Spinalna i bulbarna mišićna atrofija (SBMA) je bolest motornih neurona koja se javlja kod odraslih, uzrokovana ekspanzijom trinukleotidnog ponavljanja (TNR) u eksonu 1 gena za androgeni receptor (AR). Ovaj poremećaj karakteriše degeneracija motornih i senzornih neurona, proksimalna mišićna atrofija i endokrine abnormalnosti, kao što su ginekomastija i smanjena plodnost. Samo muškarci razvijaju simptome, dok su žene nosioci obično asimptomatske. Molekularna osnova SBMA je ekspanzija trinukleotidnog CAG ponavljanja, koji kodira poliglutaminski (poliQ) trakt, u prvom egzonu gena za androgeni receptor (AR). Patološki znak su nuklearne inkluzije (NI) koje sadrže mutantni i skraćeni AR sa proširenim poliQ u zaostalim motornim neuronima u moždanom stablu i kičmenoj moždini, kao i u nekim drugim visceralnim organima. Stvoreno je nekoliko modela transgenih miševa za proučavanje patogeneze SBMA. Videti npr., Katsuno i dr., Citogen. and Genome Res. (2003) 100:243-251. Na primer, model transgenog miša koji nosi čiste 239 CAG-ova pod humanim AR promoterom i drugi model koji nosi skraćeni AR sa proširenim CAG-ovima pokazuju oštećenje motora i nuklearne NI u motornim neuronima kičme. Transgeni miševi koji nose ljudski AR pune dužine sa proširenim poliQ pokazuju progresivno oštećenje motora i neurogenu patologiju, kao i seksualnu razliku fenotipova. Ovi modeli rekapituliraju fenotipsku ekspresiju uočenu u SBMA.
[0162] Machado-Josephova bolest (MJD), takođe nazvana spinocerebelarna ataksija tipa 3, uzrokovana je mutiranim ataksin-3 sa ekspanzijom poliglutamina. Generisani su mišji modeli MJD, kao i druge poliglutaminske spinocerebelarne ataksije. Za pregled ovih modela, pogledajte npr., Gould, V.F.C. NeuroRX(2005) 2:480-483.
[0163] Shodno tome, standardni životinjski modeli u tehnici su dostupni za skrining i/ili procenu aktivnosti i/ili efikasnosti postupaka i sastava iz obelodanjivanja za lečenje poremećaja motornih neurona.
Kompleti obelodanjivanja
[0164] Obelodanjivanje takođe pruža komplete. U određenim slučajevima, kompleti prema
4
obelodanjivanju sadrže jedan ili više kontejnera koji sadrže rekombinantne vektore koji kodiraju protein od interesa. Kompleti mogu dalje da sadrže odgovarajući skup uputstava, generalno pisana uputstva, koja se odnose na upotrebu vektora za bilo koji od ovde opisanih postupaka.
[0165] Kompleti mogu sadržati komponente u bilo kom prikladnom, odgovarajućem pakovanju. Na primer, ako su rekombinantni vektori obezbeđeni kao suva formulacija (npr., zamrzavanjem sušeni ili suvi prah), obično se koristi bočica sa elastičnim čepom, tako da se vektori mogu lako resuspendovati ubrizgavanjem tečnosti kroz elastični čep. Za tečne formulacije najpogodnije se koriste ampule sa neotpornim zatvaračima koji se mogu ukloniti (npr., zaptiveno staklo) ili elastičnim čepovima. Takođe se razmatraju pakovanja za upotrebu u kombinaciji sa određenim uređajem, kao što je špric ili uređaj za infuziju kao što je minipumpa.
[0166] Uputstva koja se odnose na upotrebu ili rekombinantne vektore generalno uključuju informacije o doziranju, rasporedu doziranja i načinu primene za nameravani postupak upotrebe. Ambalaže mogu biti jedinične doze, rasuti paketi (npr., paketi sa više doza) ili podjedinične doze. Uputstva koja se dostavljaju u kompletima obelodanjivanja su tipično pisana uputstva na etiketi ili u pakovanju (npr., list papira koji se nalazi u kompletu), ali i mašinski čitljive instrukcije (npr., uputstva na magnetnom ili optičkom disku za skladištenje) su takođe prihvatljivo.
2. EKSPERIMENTALNO
[0167] Uloženi su napori da se obezbedi tačnost u odnosu na korišćene brojeve (npr., količine, temperature, itd.), ali treba, naravno, dozvoliti neke eksperimentalne greške i odstupanja.
Materijali i postupci
[0168] AAV vektori. Otvoreni okvir za čitanje primera humanog SMN1 gena (sekvenca otvorenog okvira za čitanje je prikazana na Slici 9A; odgovarajuća aminokiselinska sekvenca je prikazana na Slici 9B; kompletna nukleotidna sekvenca je pronađena na GenBank pristupnom broju NM_000344)) je kloniran u šatl plazmid koji sadrži ili AAV2 invertovane terminalne ponavljanja (ITR) i 1,6 kb citomegalovirus pojačivač/pileći β-aktin (CBA) promoter ili scAAV2 ITR Promotor humane β-glukuronidaze (GUSB) od 0,4 kb. Ograničenje veličine rekombinantnog genoma u reakciji pakovanja scAAV zahtevalo je upotrebu malog promotera (McCarty, D.M. Molec. Ther. (2008) 16:1648-1656). Stoga je odabran GUSB
4
promotor od 0,4 kb jer je sveprisutno eksprimiran u CNS uključujući motorne neurone kičmene moždine (Passini i dr., J. Virol. (2001) 75:12382-12392). Svaki od rekombinantnih plazmida je upakovan u kapsid AAV serotipa-8 kotransfekcijom trostrukog plazmida humanih 293 ćelija (videti, npr., Patent SAD br..6,001,650)
i virioni su prečišćeni na koloni kao što je prethodno objavljeno (O'Riordan i dr., J. Gene Med. (2000) 2:444-454.). Dobijeni vektori AAV2/8-CBA-hSMN1 (AAV-hSMN1) i scAAV2/8-GUSB-hSMN1 (scAAV-hSMN1) posedovali su titre od 8,3 e12 i 2,8 e12 kopija genoma po ml, respektivno.
[0169] Životinje i postupci. Parovi za razmnožavanje heterozigota (SMN<+/->, hSMN2<+/+>, SMND7<+/+>) su pareni i, na dan rođenja (P0), novorođenčad je primila 3 ukupne injekcije od po 2 µl u cerebralne bočne komore obe hemisfere i gornji deo lumbalna kičmena moždina. Ukupne doze virusnih vektora bile su 5,0 e10 i 1,7 el0 kopija genoma za AAV-hSMN1 i scAAV-hSMN1, respektivno. Sve injekcije su izvedene sa fino izvučenom staklenom mikropipetnom iglom kako je opisano (Passini i dr, J. Virol. (2001) 75:12382-12392). Nakon injekcija, štenadima su ošišani prsti na nogama i genotipizovani (Le i dr., Hum. Mol. Genet. (2005) 14:845-857) za identifikovanje SMA (SMN<-/->, hSMN2<+/+>, SMNΔ7<+/+>), heterozigota, i divljeg tipa (SMN<+/+>, hSMN2<+/+>, SMNΔ7<+/+>) miševa. Sva legla su izbačena na 7 mladunaca da bi se kontrolisala veličina legla u pogledu preživljavanja. Neka od legla nisu ubrizgana da bi se stvorile neobrađene kontrolne grupe.
[0170] Vestern blotovi. Za biohemijsku analizu, tretirani i netretirani miševi su ubijeni na 16, a 58-66 dana su perfuzirani fiziološkim rastvorom puferovanim fosfatom (PBS), kičmena moždina je secirana i razdvojena na lumbalni, torakalni i cervikalni segment i brzo zamrznuta u tečnosti. azot. Tkiva su homogenizovana u koncentraciji od 50 mg/mL korišćenjem pufera za lizu T-Per i koktela inhibitora proteaze (Pierce, Rockford, IL). Homogenati su očišćeni centrifugiranjem na 10,000 RCF tokom 6 minuta i koncentracija proteina je izmerena BCA testom (Pierce, Rockford, IL).10-20 µg homogenatnog proteina je rastvoreno na 4-12% SDS-PAGE, prebačeno na nitroceluloznu membranu i ispitano mišjim monoklonalnim anti-SMN (1:5,000 BD Biosciences, San Jose, CA) i poliklonalnim anti-β-tubulin (1:750, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) antitelima zeca. Membrane su inkubirane sa infracrvenim sekundarnim antitelima (1:20,000, LI-COR Biosciences, Lincoln NB), a proteinske trake su vizuelizovane kvantitativnom fluorescencijom korišćenjem Odissey (LI-COR Biosciences). Markeri molekularne mase potvrdili su veličine traka.
[0171] Imunohistohemija. Za histološku analizu, tretirani i netretirani miševi su ubijeni na 16, a 58-66 dana su perfuzirani sa 4% paraformaldehida (pH 7,4), kičmena moždina je uklonjena i stavljena u 30% saharozu na 48-72 sata, ugrađena u OCT i isečena u zamrznute delove od 10 µm pomoću kriostata. Sekcije kičmene moždine su blokirane 1 sat na sobnoj temperaturi (RT), a zatim inkubirane ili sa mišjim monoklonskim anti-SMN antitelom (razblaženjem 1:200) da bi se identifikovala ekspresija hSMN izvedena iz AAV-a, ili sa poliklonalnom antiholin acetil transferazom koze (ChAT) antitelo (Millipore; Burlington, MA; 1:100 razblaživanje) za identifikaciju motornih neurona lamina 8 i 9 (ventralni rog) kičmene moždine ili antitela zečjeg poliklonalnog anti-glijalnog fibrilarnog kiselog proteina (GFAP) (Sigma-Aldrich, 1:2,500 razblaženja) za otkrivanje astrocita. Primarna antitela su inkubirana 1 h na sobnoj temperaturi, nakon čega je usledila inkubacija preko noći na 4°C u vlažnoj komori. Sekcije kičmene moždine su zatim inkubirane 1 h na sobnoj temperaturi ili sa FITC-konjugovanim anti-zečjim sekundarnim antitelom ili Ci3-konjugovanim anti-kozjim sekundarnim antitelom (Jackson ImmunoResearch; West Grove, PA; 1:250 razblaživanje). Za povećanje SMN i ChAT imuno-pozitivnog signala, komplet za pojačanje TSA signala (Perkin Elmer; Waltham, MA) ili protokol za pronalaženje antigena limunske kiseline (Vector Labs; Burlingame, CA) izvedeni su prema uputstvu proizvođača, respektivno.
Sekcije su prekrivene Vectashield medijumom za montiranje (Vector Labs; Burlingame, CA).
[0172] Brojanje motornih neurona. Broj ChAT imunopozitivnih ćelija je prebrojan u cervikalnom, torakalnom i lumbalnom segmentu. Bilateralna brojanja su obavljena pri uvećanju od 100x u ventralnim rogovima duž rostrokaudalne ose tri segmenta kičmene moždine. Susedni delovi su bili udaljeni najmanje 100 mikrona da bi se sprečilo dvostruko brojanje iste ćelije. Posebna pažnja je vođena da se uporede anatomski podudarni delovi između različitih životinja, a jedan posmatrač je slepo procenio sve ćelije. Ćelije locirane u laminama 8 i 9 kičmene moždine koje pokazuju fluorescentni ChAT signal značajno iznad pozadine smatrane su motornim neuronima.
[0173] Veličina mišićnog vlakna. Za histološku analizu periferije, fiksni kvadriceps, gastroknemius i interkostalni mišići sa desne strane svakog miša su obrađeni parafinom i obojeni na hematoksilin-eozin da bi se odredila veličina mišićnog vlakna kao što je objavljeno (Avila i dr., J. Clin. Invest. (2007) 117:659-671). Približno 500 ne-preklapajućih mišićnih vlakana iz svakog mišića po životinji je nasumično odabrano i fotografisano pri
1
uvećanju od 60X. Površine poprečnog preseka svakog mišićnog vlakna merene su korišćenjem softvera Metamorph (Molecular Devices, Sunnivale, CA).
[0174] Bojenje neuromišićnog spoja (NMJ). Fiksne mišićne grupe sa leve strane svakog miša su uskladištene u PBS za NMJ analizu. Ukupno bojenje na isprekidanim mišićnim vlaknima kvadricepsa, gastroknemija i interkostalnih mišića obavljeno je kako je prijavljeno Lesbordes i dr., Hum. Mol. Genet. (2003) 12:1233-1239). Predsinaptički nervni terminali su obeleženi inkubacijom preko noći na 4°C sa zečjim poliklonalnim antitelom protiv izoforme neurofilamenta od 150 kD (NF-M, Millipore, Billerica, MA, 1:200 razblaženjem), praćeno biotinilovanim sekundarnim anti-zečjim antitelo (Jackson ImmunoResearch, 1:200 razblaživanje). Acetilholinski receptori na mišićnim završnim pločama su obeleženi αbungarotoksinom konjugovanim Aleka 555 (Molecular Probes, Eugene, OR) u 1:5000 tokom 3 h na sobnoj temperaturi. Obojena mišićna vlakna su postavljena na stakalce, prekrivena Vectashield i posmatrana pod epifluorescencijom. Za kvantifikaciju NMJ, najmanje 100 NMJ iz svakog mišića po životinji je nasumično odabrano i procenjeno pod mikroskopom.
Konfokalne slike su snimljene pomoću Zeiss LSM 510-META mikroskopa.
[0175] Testovi ponašanja. U refleksu uspravljanja, svaki miš je postavljen u ležeći položaj i mereno je vreme potrebno da se miš ponovo postavi na sve četiri šape. Procedura je ponovljena tri puta za svaku životinju, a prosek od tri rezultata je označen kao ispravljajući rezultat. Ako miš nije odgovorio u roku od 60 sekundi, test je prekinut. U negativnoj geotaksiji, svaki miš je postavljen na platformu od 45° okrenutu nadole. Test se smatra uspešnim ako se miš okrene za 180° u položaj „glava gore“. Svaki miš je dobio tri pokušaja da izvrši zadatak za 180 sekundi ili manje. U snazi hvata, prednji i zadnji udovi su postavljeni zajedno na žičanu mrežu i nežno povlačeći horizontalno duž mreže. Otpor je zabeležen u gramima pomoću pretvarača sile. U testu pomeranja zadnjih udova, svaki miš je suspendovan za rep na 5 sekundi, a rezultujući razmak je ocenjen na osnovu proizvoljnog sistema. Zdrav raster oba zadnja ekstremiteta sličan onom uočenom kod miševa divljeg tipa dobio je ocenu 4. Oštar ugao nagiba ili „slabo istupanje“ oba zadnja uda je rezultat 3. Jednoj nozi je dodeljena ocena 2. Miš koji nije pokazivao razmak dobio je ocenu 1. Konačno, rezultat od 0 je postignut kada je štene povuklo oba zadnja uda zajedno, efektivno ih ukrštajući preko drugog.
[0176] Statistika. Testovi ponašanja, broj motornih neurona, područja mišićnog vlakna
2
poprečnog preseka i NMJ analizirani su jednosmernim ANOVA i Bonferoni višestrukim post hoc poređenjima i neuparenim dvostranim studentskim t-testovima. Kaplan-Meierova kriva preživljavanja analizirana je testom log ranga koji je ekvivalentan Mantel-Haenszel testu. Sve statističke analize izvršene su sa GraphPad Prism v4.0 (GraphPad Software, San Diego, CA). Vrednosti sa p < 0,05 smatrane su značajnim.
Primer 1
Značajno povećanje preživljavanja uz lečenje korišćenjem AAV-posredovanog SMN1 isporuke
[0177] SMA miševima postnatalnog dana 0 (P0) je ubrizgan intracerebroventrikularno sa AAV-hSMN1 u obe cerebralne lateralne komore i direktnom injekcijom kičmene moždine u gornji lumbalni deo kičmene moždine za ukupnu dozu od 5,0 e10 kopija genoma po mišu. Tretirani i netretirani SMA miševi su nasumično razdvojeni ili u kohortu preživljavanja u kojoj su svi miševi ostavljeni neometani i žrtvovani na humanoj krajnjoj tački, ili u kohortu prilagođenu uzrastu u kojoj su svi miševi žrtvovani nakon 16 dana za odgovarajuće uzraste. poređenja sa netretiranim SMA miševima u završnoj fazi.
[0178] U kohorti preživljavanja, SMA miševi tretirani AAV-hSMN1 pokazali su značajno povećanje srednjeg životnog veka na 50 dana (p < 0,0001), u poređenju sa 15 dana kod netretiranih SMA kontrola (Slika 1). Svi tretirani SMA miševi bili su živi 15 dana, a 87,5% tretiranih SMA miševa bilo je živo 19 dana u poređenju sa 0% kod netretiranog SMA.
Kaplan-Meierova kriva je pokazala bimodalnu distribuciju preživljavanja sa tretmanom, u kojoj je prva grupa umrla 17-27 dana, a druga grupa 58-66 dana (Slika 1). U prvoj grupi, većina lečenih SMA miševa pokazala je kretanje, ali su miševi bili usporeni u rastu i na kraju su pronađeni mrtvi u kavezu. Druga grupa lečenih SMA miševa na 58-66 dana pokazala je kretanje i povećanje telesne mase, ali je na kraju razvila tešku nekrozu zadnjih udova koja je rezultirala eutanazijom životinje. Kao takvi, miševi od 58-66 dana su analizirani paralelno sa kohortom od 16 dana.
Primer 2
AAV posredovana ekspresija SMN u kičmenoj moždini i broju motornih neurona [0179] Nivoi hSMN proteina su se povećali u kičmenoj moždini nakon primene AAV-hSMN1 u CNS. Kod SMA miševa tretiranih sa AAV nakon 16 dana, došlo je do približno 34,0- i 3,6 puta povećanja nivoa hSMN proteina u ubrizganom lumbalnom segmentu u poređenju sa netretiranim SMA i miševima divljeg tipa, respektivno (Slika 2A). Povećanje ekspresije proteina hSMN proširilo se na druge segmente, što je uključivalo >2,0 puta povećanje iznad nivoa divljeg tipa u grudnom košu i cervikalnoj kičmenoj moždini nakon 16 dana (Slike 2B i 2C). U drugoj grupi, ekspresija proteina hSMN održavana je kod SMA miševa tretiranih AAV 58-66 dana. Ubrizgani lumbalni i susedni torakalni i cervikalni regioni bili su približno 2,5-, 2,2- i 1,2 puta veći od VT kontrola odgovarajućeg uzrasta, respektivno.
[0180] Imunološko bojenje preseka tkiva pokazalo je hSMN protein u dorzalnim i ventralnim rogovima kičmene moždine kod lečenih SMA miševa na 16 i 58-66 dana (Slika 3). Nakon detaljnijeg pregleda transdukovanih ćelija, ekspresija hSMN izvedena iz vektora je otkrivena u tačkastom obrascu u celom citosolu i u strukturama sličnim dragulju u jezgru (Slika 3A). Štaviše, hSMN protein je bio lokalizovan na neuritima u različitim strukturama nalik granulama koje su se mogle videti po dužini dendrita i aksona (Slike 3B-3D). Veoma nizak nivo endogenog hSMN proteina kod SMA miševa bio je ispod praga imunodetekcije u ćelijama (Slika 3E).
[0181] Ko-lokalizacija sa ChAT i hSMN potvrdila je da su podskup transdukovanih ćelija zaista motorni neuroni (Slike 3F-3I). Nakon 16 dana, približno 18-42% ChAT-pozitivnih ćelija u lumbalnom, torakalnom i cervikalnom segmentu kičmene moždine je transdukovano pomoću AAV-hSMN1 (Slika 3J). Ovaj procenat je bio veći nakon 58-66 dana, kada je 60-70% motornih neurona eksprimiralo egzogeni hSMN u tri segmenta kičmene moždine (Slika 3J). Došlo je do ukupnog povećanja broja motornih neurona kod tretiranih SMA miševa u poređenju sa netretiranim mutantima (Slika 4). Međutim, bilo je značajno manje motornih neurona kod tretiranih SMA miševa u poređenju sa miševima divljeg tipa nakon 16 i 58-66 dana (Slika 4).
[0182] Izvršeno je hSMN imunobojenje delova tkiva grlića materice od netretiranih, intracerebroventrikularnih (ICV) samo injektiranih i heterozigotnih miševa ubrizganih samo u lumbalni deo. ICV injekcije same po sebi nisu doprinele značajnim obrascima AAV transdukcije u mozgu, ali su ipak izazvale značajno ciljanje cervikalne kičmene moždine što nije bilo moguće postići injekcijama samo u lumbalnom delu. Konkretno, injekcije samo za ICV dovele su do ekspresije hSMN cervikalne kičmene moždine. Ovo je bilo u suprotnosti sa intraparenhimskom injekcijom lumbalnog segmenta koja je pokazala vrlo malu transdukciju
4
cervikalne kičmene moždine, verovatno zbog distalne blizine od mesta injekcije. Povremeno, SMN imunopozitivni signal koji je imao izgled poput dragulja primećen je u jezgru netretiranih heterozigota i miševa divljeg tipa. Međutim, ovaj obrazac imunološkog bojenja nije primećen u jezgru netretiranih SMA miševa.
[0183] Dakle, kombinacija ICV i lumbalnih injekcija kod P0 miševa obezbedila je široku, rasprostranjenu transdukciju kičmene moždine. ICV injekcije AAV8-hSMN ciljale su vratnu kičmenu moždinu radi transdukcije.
Primer 3
Efekti AAV tretmana na veličinu mišićnog vlakna, NMJ i ponašanje
[0184] Za analizu su odabrani kvadriceps (proksimalni), gastroknemius (distalni) i interkostalni (respiratorni) mišići jer pokazuju izraženu degeneraciju. Kod netretiranih SMA miševa nakon 16 dana, mišićna vlakna su bila mala i većina pojedinačnih ćelija je sadržala površinu poprečnog preseka od <100 um<2>(Slika 5A). Manje od 10% mišićnog vlakna netretiranih SMA miševa imalo je površinu poprečnog preseka veću od 200 um<2>. Nasuprot tome, distribucija veličina mišićnog vlakna kod SMA miševa tretiranih AAV-hSMN1 bila je slična divljem tipu, a mnoge ćelije su imale površinu poprečnog preseka više od 200 i više od 400 µm<2>na 16 i 58-66 dana, respektivno (Slike 5A i 5B). Ukupan prosek za 16 dana pokazao je da su mišićna vlakna tretiranih SMA miševa bila više od 2 puta veća od onih kod netretiranih SMA miševa (Slika 5C). Štaviše, prosečna površina poprečnog preseka mišićnog vlakna kod tretiranih SMA miševa na 58-66 dana bila je 67%, 76% i 82% površine miševa divljeg tipa u kvadricepsu, gastroknemijusu i interkostalnom delu (Slika 5C).
[0185] Analiza neuromuskularnog spoja (NMJ) kod netretiranih SMA miševa nakon 16 dana pokazala je abnormalnu akumulaciju proteina neurofilamenta na presinaptičkim krajevima (Slika 6A). Približno 75-90% presinaptičkih završetaka iz kvadricepsa, gastroknemija i interkostalnog je pokazalo ovu karakterističnu patologiju kod nelečenih SMA miševa (Slika 6F). Nasuprot tome, većina presinaptičkih završetaka SMA miševa tretiranih AAV-hSMN1 nije sadržala ovu urušenu strukturu (Slika 6B, 6D). Samo 10-25% i 5% presinaptičkih završetaka tretiranih SMA miševa pokazalo je ovu karakterističnu patologiju na 16 i 58-66 dana, respektivno (slika 6F). Međutim, tretman je rezultirao većim grananjem na predsinaptičkim krajevima u poređenju sa divljim tipom (Slika 6B-6E). Na post-sinaptičkom NMJ od tretiranih SMA i divljeg tipa miševa, bojenje a-bungarotoksinom proizvelo je strukturu nalik perecu koja je indukovala funkcionalnu mrežu acetilholinskih receptora (Slika 6B-6E).
[0186] Tretirani i netretirani miševi su podvrgnuti periodičnim testovima ponašanja koji su validirani za ovaj životinjski model (Butchbach i dr., Neurobiol. Dis. (2007) 27:207-219; El-Khodar i dr., Exp. Neurol. (2008) 212:29-43). Tretirani SMA miševi su imali dobre telesne rezultate i pokretne veštine, dok su nelečeni SMA miševi bili emancipovani i paralizovani (Slika 7A). Tretirani SMA miševi su bili značajno teži od netretiranih SMA kontrola, iako nikada nisu dostigli veličinu divljeg tipa (Slika 7B). Tretirani SMA miševi su pokazali značajno poboljšanje latencije ispravljanja (Slika 7C). Takođe je došlo do značajnog poboljšanja kod tretiranih SMA miševa kako bi se završio negativan test geotaksije, koji meri ponašanje prostorne lokomotive (Slika 7D). Štaviše, tretirani SMA miševi su pokazali značajna poboljšanja u snazi držanja i u sposobnosti da rašire svoje zadnje udove (Slika 7E, 7F).
Primer 4
Efekti na dugovečnost korišćenjem samo-komplementarnog AAV
[0187] Bez ograničenja u teoriji, predviđa se da će samo-komplementarni AAV (scAAV) vektori imati bržu kinetiku ekspresije zbog dvolančanog rekombinantnog genoma (pregledano u McCarty, D.M. Molec. Ther. (2008) 16:1648-1656). Ovo brzo povećanje ekspresije može biti od koristi kod veoma agresivnih bolesti ili stanja gde je vremenski period intervencije mali. Stoga, da bi se utvrdilo da li ranija ekspresija može poboljšati efikasnost, scAAV vektor (scAAV-hSMN1) je konstruisan i testiran. Koristeći isto mesto injekcija kao što je izvedeno u Primeru 1, P0 SMA miševima je primenjena doza od 1,7 e10 kopija genoma scAAV-hSMN1.
[0188] Tretman scAAV-hSMN1 je rezultirao upadljivim i izuzetnim poboljšanjem srednjeg preživljavanja od 157 dana (p <0,0001), što je bilo povećanje od 214% i 881% u poređenju sa AAV-hSMN1 tretiranim i netretiranim SMA miševima, respektivno (Slika 8). Približno 42% miševa tretiranih scAAV imalo je više od 1000% povećanje (log puta povećanje) srednjeg preživljavanja. Štaviše, tretman scAAV2/8-GUSB-hSMN1 je doveo do toga da je 88% SMA miševa živelo duže od 66 dana, za razliku od 0% kod AAV2/8-CBA-hSMN1. SMA miševi tretirani scAAV imali su zdrave telesne rezultate, bili su dobro negovani, dobili na masi i održavali su kretanje tokom celog života. Zanimljivo je da su SMA miševi tretirani scAAV razvili samo blagu nekrozu zadnjih ekstremiteta koja nikada nije napredovala u teški fenotip. Većina SMA miševa tretiranih scAAV-om žrtvovana je zbog nepredviđene i iznenadne pojave respiratornog distresa, koji je uključivao čujne škljocanje pri disanju i smanjenu brzinu disanja.
[0189] Da bi se bolje razumela osnova za uočeno povećanje preživljavanja sa scAAV8-hSMN, dodatni SMA miševi su tretirani na P0 i žrtvovani 16 ili 64 (58-66d) dana nakon injekcije, i analizirani sa dugovečnim miševima tretiranim scAAV8 sa krive preživljavanja (Slika 8). Nakon 16 dana, nivoi ekspresije SMN iz grupe scAAV8-hSMN bili su približno 60-90% u odnosu na one uočene kod WT životinja. Ovi nivoi su bili znatno manji od onih postignutih tretmanom AAV8-hSMN u ovom trenutku. Kod SMA miševa tretiranih scAAV8-hSMN, nivoi SMN u lumbalnom i torakalnom segmentu bili su iznad ili na nivou WT na 58-66 i 120-220 dana, respektivno (Slike 2A i 2B). Nasuprot tome, nivoi SMN u vratnoj kičmenoj moždini ostali su relativno niski u svim vremenskim tačkama.
[0190] Poređenje tropizma AAV vektora u lumbalnoj kičmenoj moždini je ispitano korišćenjem hSMN imunološkog bojenja na zamrznutim delovima tkiva iz netretiranog SMA, SMA tretiranog AAV8-hSMN i SMA miševa tretiranih scAAV8-hSMN 16 dana i 157 dana nakon injekcije. Difuzni hSMN imunološki obrazac u skladu sa morfologijom glijalnih ćelija primećen je 16 dana sa AAV8-hSMN. Udvostručenje imuno-obeležavanja hSMN i mGFAP potvrdilo je da su podskup ćelija transdukovanih AAV8-hSMN astrociti. Nasuprot tome, tretman scAAV8 je rezultirao ekspresijom hSMN samo u različitim ćelijskim telima sa neuronskom morfologijom, koja se nisu ko-lokalizovala sa GFAP. Dvostruko imunoobeležavanje hSMN i markera motornog neurona mChAT potvrdilo je da su podskup ćelija transdukovanih scAAV8-hSMN i AAV8-hSMN motorni neuroni. Ekspresija hSMN je takođe primećena u slojevima interneuronskih ćelija kičmene moždine sa oba virusna vektora, kao što je prikazano na scAAV8-hSMN na 157 dana. Dakle, za razliku od AAV8-hSMN, histološka analiza SMA miševa tretiranih scAAV8-hSMN pokazala je da je ekspresija hSMN u velikoj meri ograničena na neurone.
[0191] Štaviše, dvostruko imunobojenje sa hSMN i mChAT pokazalo je značajno povećanje procenta motornih neurona transdukovanih sa scAAV8-hSMN u poređenju sa AAV8-hSMN (Slika 10A). Efikasnije ciljanje motornih neurona sa scAAV je u korelaciji sa značajnim povećanjem broja ChAT-pozitivnih ćelija (Slike 10B-10D). Analiza NMJ u kvadricepsima i interkostalnim mišićima nakon 16 dana takođe je pokazala značajno smanjenje broja kolabiranih struktura sa scAAV-hSMN u poređenju sa AAV8-hSMN (Slike 10E i 10F). Međutim, došlo je do povećanja broja aberantnih NMJ na 216-269 dana što je bilo istovremeno sa padom broja ćelija motornih neurona u grupi scAAV-hSMN (Slike 10B-10F).
[0192] Da rezimiramo, injekcija AAV8-hSMN pri rođenju u CNS mišjeg modela SMA rezultirala je široko rasprostranjenom ekspresijom SMN kroz kičmenu moždinu, što je dovelo do snažnog poboljšanja fiziologije skeletnih mišića. Tretirane SMA životinje su takođe pokazale značajna poboljšanja na testovima ponašanja koji pokazuju da je neuromuskularni spoj bio funkcionalan. Važno je da je tretman sa AAV8-hSMN povećao srednji životni vek SMA miševa na 50 dana u poređenju sa 15 dana za netretirane kontrole. Štaviše, SMA miševi kojima je ubrizgan samo-komplementarni AAV vektor rezultirali su poboljšanom efikasnošću uključujući značajno produženje srednjeg preživljavanja na 157 dana. Ovi podaci dokazuju da je povećanje SMN usmereno na CNS, posredovano AAV, veoma efikasno u rešavanju neuronskih i mišićnih patologija teškog mišjeg modela SMA.
[0193] Tako su obelodanjeni sastavi i postupci za lečenje poremećaja kičmene moždine.
�
�

Claims (8)

Patentni zahtevi
1. Rekombinantni AAV virion koji sadrži samo-komplementarni vektor adeno-povezanog virusa (scAAV), za upotrebu u lečenju spinalne mišićne atrofije (SMA), pri čemu scAAV vektor sadrži polinukleotid koji kodira protein koji modulira motornu funkciju, pri čemu ekspresija pomenutog proteina u CNS rezultira bar delimičnom korekcijom neuropatologije i/ili stabilizacijom progresije SMA, pri čemu vektor scAAV sadrži kapsid proteine iz serotipa AAV9, i gde virion AAV:
(i) treba da se daje u najmanje jedan region dubokih jezgara malog mozga;
(ii) treba da se daje neposrednom injekcijom u kičmenu moždinu; ili
(iii) treba da se daje putem intracerebroventrikularne injekcije.
2. Upotreba rekombinantnog AAV viriona u proizvodnji leka za lečenje spinalne mišićne atrofije (SMA), pri čemu rekombinantni AAV virion sadrži samo-komplementarni vektor adeno-povezanog virusa (scAAV) koji sadrži polinukleotid koji kodira protein koji modulira motoričku funkciju, pri čemu ekspresija pomenutog proteina u CNS-u rezultira barem delimičnom korekcijom neuropatologije i/ili stabilizacijom progresije SMA, pri čemu scAAV vektor sadrži kapsid proteine iz serotipa AAV9, i gde virion AAV:
(i) treba da se daje u najmanje jedan region dubokih jezgara malog mozga;
(ii) treba da se daje neposrednom injekcijom u kičmenu moždinu; ili
(iii) treba da se daje putem intracerebroventrikularne injekcije.
3. Rekombinantni AAV virion za upotrebu prema patentnom zahtevu 1 ili upotreba prema patentnom zahtevu 2, pri čemu polinukleotid kodira protein motornog neurona preživljavanja (SMN).
4. Rekombinantni AAV virion za upotrebu prema patentnom zahtevu 3 ili upotreba prema patentnom zahtevu 3, pri čemu je SMN protein kodiran humanim SMN-1.
5. Rekombinantni AAV virion za upotrebu prema patentnom zahtevu 4 ili za upotrebu prema patentnom zahtevu 4, gde SMN protein sadrži:
(i) aminokiselinska sekvenca sa najmanje 90% identičnosti sekvence sa sekvencom aminokiselina SEQ ID NO: 2; ili
(ii) aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 2.
6. Rekombinantni AAV virion za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 ili 3-5 ili upotreba prema bilo kom od patentnih zahteva 2-5, pri čemu se rekombinantni AAV virion primenjuje u najmanje jednu cerebralnu bočnu komoru.
7. Rekombinantni AAV virion za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 ili 3-5 ili upotreba prema bilo kom od patentnih zahteva 2-5, pri čemu se rekombinantni AAV virion primenjuje i putem intracerebroventrikularne injekcije i direktnom injekcijom kičmene moždine.
8. Rekombinantni AAV virion za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 ili 3-5 ili upotreba prema bilo kom od patentnih zahteva 2-5, pri čemu se rekombinantni AAV virion primenjuje putem intratekalne injekcije.
4
RS20220002A 2009-05-02 2010-04-27 Genska terapija neurodegenerativnih poremećaja RS62779B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US17498209P 2009-05-02 2009-05-02
US26805909P 2009-06-08 2009-06-08
EP18175397.1A EP3421603B1 (en) 2009-05-02 2010-04-27 Gene therapy for neurodegenerative disorders

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS62779B1 true RS62779B1 (sr) 2022-01-31

Family

ID=43050324

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20220002A RS62779B1 (sr) 2009-05-02 2010-04-27 Genska terapija neurodegenerativnih poremećaja
RS20250772A RS67077B1 (sr) 2009-05-02 2010-04-27 Genska terapija za neurodegenerativne poremećaje
RS20250773A RS67078B1 (sr) 2009-05-02 2010-04-27 Genska terapija za neurodegenerativne poremećaje

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20250772A RS67077B1 (sr) 2009-05-02 2010-04-27 Genska terapija za neurodegenerativne poremećaje
RS20250773A RS67078B1 (sr) 2009-05-02 2010-04-27 Genska terapija za neurodegenerativne poremećaje

Country Status (22)

Country Link
US (9) US20130287736A1 (sr)
EP (5) EP3421603B1 (sr)
JP (3) JP5879256B2 (sr)
KR (2) KR101835490B1 (sr)
CN (2) CN107083400A (sr)
CA (1) CA2759801C (sr)
CY (1) CY1120982T1 (sr)
DK (4) DK3988660T3 (sr)
ES (4) ES3038109T3 (sr)
FI (2) FI3988660T3 (sr)
HR (4) HRP20250897T1 (sr)
HU (4) HUE072713T2 (sr)
IL (2) IL216094A0 (sr)
LT (4) LT3421603T (sr)
MX (4) MX341073B (sr)
PL (4) PL3421603T3 (sr)
PT (4) PT2424991T (sr)
RS (3) RS62779B1 (sr)
RU (2) RU2743398C2 (sr)
SG (3) SG10202109219SA (sr)
SI (4) SI2424991T1 (sr)
WO (1) WO2010129021A1 (sr)

Families Citing this family (101)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9217155B2 (en) 2008-05-28 2015-12-22 University Of Massachusetts Isolation of novel AAV'S and uses thereof
US11219696B2 (en) 2008-12-19 2022-01-11 Nationwide Children's Hospital Delivery of polynucleotides using recombinant AAV9
HRP20250897T1 (hr) 2009-05-02 2025-09-26 Genzyme Corporation Genska terapija za neurodegenerativne poremećaje
US8734809B2 (en) 2009-05-28 2014-05-27 University Of Massachusetts AAV's and uses thereof
EP2561073B1 (en) 2010-04-23 2016-08-24 University of Massachusetts Cns targeting aav vectors and methods of use thereof
EP3444346B1 (en) 2010-04-23 2022-07-27 University of Massachusetts Aav-based treatment of cholesterol-related disorders
JP6312436B2 (ja) * 2010-11-16 2018-04-18 ニューロダイン ライフ サイエンシズ インコーポレイテッドＮｅｕｒｏｄｙｎ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ． ネプリライシンの発現および活性を増大させるための方法および医薬組成物
GB201103062D0 (en) * 2011-02-22 2011-04-06 Isis Innovation Method
CN103476399A (zh) * 2011-04-18 2013-12-25 独立行政法人国立精神·神经医疗研究中心 药剂递送粒子及其制造方法
EP3318635A1 (en) 2011-04-21 2018-05-09 University of Massachusetts Raav-based compositions and methods for treating alpha-1 anti-trypsin deficiencies
US20130039888A1 (en) 2011-06-08 2013-02-14 Nationwide Children's Hospital Inc. Products and methods for delivery of polynucleotides by adeno-associated virus for lysosomal storage disorders
US20150182637A1 (en) * 2012-06-21 2015-07-02 Association Institut De Myologie Widespread gene delivery of gene therapy vectors
AU2013296425B2 (en) 2012-08-01 2018-06-07 Nationwide Children's Hospital Intrathecal delivery of recombinant adeno-associated virus 9
CN103638604B (zh) * 2012-12-31 2016-05-04 深圳先进技术研究院 一种助行系统
US20160045617A1 (en) * 2013-04-10 2016-02-18 Justin C. Lee Treatment of proximal spinal muscular atrophy
MX380973B (es) * 2013-05-01 2025-03-12 Genzyme Corp Composiciones y metodos para tratar la atrofia muscular espinal.
HK1222673A1 (zh) 2013-07-12 2017-07-07 The Children's Hospital Of Philadelphia Aav载体和用於抗aav(腺相关病毒)中和抗体的检测
US10072251B2 (en) 2014-02-19 2018-09-11 University Of Massachusetts Recombinant AAVS having useful transcytosis properties
EP3119406B1 (en) 2014-03-18 2021-01-20 Carmel-Haifa University Economic Corporation Ltd Methods for improving cognitive function via modulation of quinone reductase 2
CA2942515C (en) 2014-03-18 2025-12-09 University Of Massachusetts Raav-based compositions and methods for treating amyotrophic lateral sclerosis
EP2933335A1 (en) * 2014-04-18 2015-10-21 Genethon A method of treating peripheral neuropathies and motor neuron diseases
WO2015164786A1 (en) 2014-04-25 2015-10-29 University Of Massachusetts Recombinant aav vectors useful for reducing immunity against transgene products
WO2015164723A1 (en) 2014-04-25 2015-10-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods and compositions for treating metastatic breast cancer and other cancers in the brain
WO2015187825A2 (en) 2014-06-03 2015-12-10 University Of Massachusetts Compositions and methods for modulating dysferlin expression
EP3200830B1 (en) 2014-10-03 2020-09-09 University of Massachusetts High efficiency library-identified aav vectors
US10370432B2 (en) 2014-10-03 2019-08-06 University Of Massachusetts Heterologous targeting peptide grafted AAVS
CN107073051B (zh) 2014-10-21 2021-08-24 马萨诸塞大学 重组aav变体及其用途
RU2716991C2 (ru) 2014-11-05 2020-03-17 Вояджер Терапьютикс, Инк. Полинуклеотиды aadc для лечения болезни паркинсона
WO2016100575A1 (en) 2014-12-16 2016-06-23 Board Of Regents Of The University Of Nebraska Gene therapy for juvenile batten disease
HRP20190992T1 (hr) * 2014-12-24 2019-09-20 Uniqure Ip B.V. Suprimiranje gena za huntingtin inducirano s rnai
EP3256170B1 (en) 2015-02-13 2020-09-23 University of Massachusetts Compositions and methods for transient delivery of nucleases
US11046955B2 (en) 2015-04-24 2021-06-29 University Of Massachusetts Modified AAV constructs and uses thereof
CA2995733A1 (en) * 2015-08-31 2017-03-09 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Aav-epo for treating companion animals
ES2865487T3 (es) 2015-09-28 2021-10-15 Univ North Carolina Chapel Hill Métodos y composiciones para vectores virales que evaden los anticuerpos
WO2017070516A1 (en) 2015-10-22 2017-04-27 University Of Massachusetts Prostate-targeting adeno-associated virus serotype vectors
EP3364997B1 (en) 2015-10-22 2024-01-17 University of Massachusetts Aspartoacylase gene therapy in the treatment of canavan disease
CA3011939A1 (en) 2016-02-02 2017-08-10 University Of Massachusetts Method to enhance the efficiency of systemic aav gene delivery to the central nervous system
CA3012344A1 (en) 2016-02-12 2017-08-17 University Of Massachusetts Anti-angiogenic mirna therapeutics for inhibiting corneal neovascularization
US20190328906A1 (en) * 2016-03-02 2019-10-31 The Children's Hospital Of Philadelphia Therapy for frontotemporal dementia
US11207426B2 (en) 2016-04-05 2021-12-28 University Of Massachusetts Compositions and methods for selective inhibition of grainyhead-like protein expression
US11413356B2 (en) 2016-04-15 2022-08-16 University Of Massachusetts Methods and compositions for treating metabolic imbalance
JP6671664B2 (ja) * 2016-05-24 2020-03-25 学校法人東京女子医科大学 Ｓｍｎタンパク質の核内構造体の発現解析方法
US11882815B2 (en) 2016-06-15 2024-01-30 University Of Massachusetts Recombinant adeno-associated viruses for delivering gene editing molecules to embryonic cells
US10457940B2 (en) 2016-09-22 2019-10-29 University Of Massachusetts AAV treatment of Huntington's disease
AU2017341849B2 (en) 2016-10-13 2024-03-21 University Of Massachusetts AAV capsid designs
EP3535403A4 (en) * 2016-11-07 2020-08-12 MacQuarie University MODULATION OF PROTEIN ACCUMULATION AND ASSOCIATED USES
JOP20190200A1 (ar) 2017-02-28 2019-08-27 Univ Pennsylvania تركيبات نافعة في معالجة ضمور العضل النخاعي
US11859179B2 (en) 2017-05-09 2024-01-02 University Of Massachusetts Methods of treating amyotrophic lateral sclerosis (ALS)
JOP20190269A1 (ar) 2017-06-15 2019-11-20 Voyager Therapeutics Inc بولي نوكليوتيدات aadc لعلاج مرض باركنسون
JP2020531047A (ja) * 2017-08-16 2020-11-05 エッレジヴ１・ソチエタ・ア・レスポンサビリタ・リミタータ 神経疾患及び神経損傷における使用のためのｂｐｉｆｂ４タンパク質のｖｔｆｔアイソフォーム
CN111448321A (zh) 2017-09-22 2020-07-24 马萨诸塞大学 Sod1双表达载体及其用途
BR112020006661A2 (pt) 2017-10-03 2020-10-13 Prevail Therapeutics, Inc. terapias de genes para distúrbios lipossomais
CN112501208A (zh) 2017-10-03 2021-03-16 普利维尔治疗公司 用于溶酶体障碍的基因疗法
WO2019094253A1 (en) 2017-11-08 2019-05-16 Avexis Inc. Means and method for preparing viral vectors and uses of same
CN108096243B (zh) * 2017-11-24 2020-05-29 江苏康缘药业股份有限公司 银杏内酯组合物的医药用途
CA3086046C (en) 2017-12-29 2023-02-21 Helixmith Co., Ltd. Adeno-associated virus (aav) vector having hybrid hgf gene introduced thereto
CN119679944A (zh) * 2018-01-25 2025-03-25 渤健马萨诸塞州股份有限公司 治疗脊髓性肌萎缩症的方法
US20190256867A1 (en) 2018-02-01 2019-08-22 Homology Medicines, Inc. Adeno-associated virus compositions for restoring pah gene function and methods of use thereof
US10610606B2 (en) 2018-02-01 2020-04-07 Homology Medicines, Inc. Adeno-associated virus compositions for PAH gene transfer and methods of use thereof
BR112020016170A2 (pt) 2018-02-09 2020-12-15 Genentech, Inc. Oligonucleotídeos terapêutico e antissenso, conjugado, sal farmaceuticamente aceitável, composição farmacêutica, método in vitro ou in vivo para modular a expressão de tmem106b, método para tratar ou prevenir uma doença, uso do oligonucleotídeo e uso ou método
AU2019247748A1 (en) 2018-04-03 2020-10-08 Ginkgo Bioworks, Inc. Antibody-evading virus vectors
MX2020010465A (es) 2018-04-03 2021-01-08 Vectores de virus para direccionamiento a tejidos oftalmicos.
EP3774852A1 (en) 2018-04-03 2021-02-17 Stridebio, Inc. Antibody-evading virus vectors
WO2019204369A1 (en) * 2018-04-17 2019-10-24 Applied Stemcell, Inc. Compositions and methods for treating spinal muscular atrophy
KR20210019996A (ko) 2018-05-15 2021-02-23 보이저 테라퓨틱스, 인크. 파킨슨병의 치료를 위한 조성물 및 방법
EP3801638A1 (en) * 2018-06-08 2021-04-14 Novartis AG Cell-based assay for measuring drug product potency
WO2019236995A1 (en) 2018-06-08 2019-12-12 University Of Massachusetts Antisense oligonucleotides to restore dysferlin protein expression in dysferlinopathy patient cells
CN114908099B (zh) * 2018-06-28 2024-07-02 北京锦篮基因科技有限公司 携带设计smn1基因表达框的重组腺相关病毒及应用
EP3856762A1 (en) 2018-09-28 2021-08-04 Voyager Therapeutics, Inc. Frataxin expression constructs having engineered promoters and methods of use thereof
CN109266682B (zh) * 2018-09-29 2022-04-01 中国科学院武汉物理与数学研究所 一种神经细胞快速逆行跨突触标记的方法及应用
US12429487B2 (en) 2018-12-06 2025-09-30 Biogen Ma Inc. Neurofilament protein for guiding therapeutic intervention in amyotrophic lateral sclerosis
RU2731514C2 (ru) * 2018-12-21 2020-09-03 Селл энд Джин Терапи Лтд Генотерапевтический ДНК-вектор на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущий целевой ген, выбранный из группы генов SHH, CTNNB1, NOG, WNT7A для повышения уровня экспрессии этих целевых генов, способ его получения и применения, штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-SHH, или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-CTNNB1, или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-NOG, или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-WNT7A, несущий генотерапевтический ДНК-вектор, способ его получения, способ производства в промышленных масштабах генотерапевтического ДНК-вектора
WO2020160458A1 (en) * 2019-02-01 2020-08-06 Avrobio, Inc. Compositions and methods for treating neurocognitive disorders
BR112021015817A2 (pt) 2019-02-22 2021-10-13 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Vírus adeno-associado recombinante para tratamento de neurodegeneração com início na idade adulta associado a grn
AR118465A1 (es) 2019-03-21 2021-10-06 Stridebio Inc Vectores de virus adenoasociados recombinantes
EP3947700A4 (en) 2019-04-01 2023-01-04 Tenaya Therapeutics, Inc. Adeno-associated virus with engineered capsid
CA3136004A1 (en) 2019-04-10 2020-10-15 Prevail Therapeutics, Inc. Gene therapies for lysosomal disorders
EP3952924A4 (en) * 2019-04-12 2023-05-24 Encoded Therapeutics, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS OF ADMINISTRATION OF THERAPEUTIC PRODUCTS
US12611436B2 (en) 2019-10-17 2026-04-28 Sarepta Therapeutics, Inc. AAV transfer cassette
JP2022551739A (ja) 2019-10-17 2022-12-13 ストライドバイオ，インコーポレイテッド ニーマン・ピック病ｃ型の治療のためのアデノ随伴ウイルスベクター
MX2022004812A (es) * 2019-10-22 2023-02-23 Applied Genetic Tech Corporation Sistemas de virus adeno-asociados (aav) para el tratamiento de enfermedades o trastornos neurodegenerativos asociados a la progranulina.
WO2021119622A1 (en) * 2019-12-12 2021-06-17 Northwestern University Modulation of ubiquitin carboxy-terminal hydrolase ligase 1 expression
TW202140791A (zh) 2020-01-13 2021-11-01 美商霍蒙拉奇醫藥公司 治療苯酮尿症之方法
CN115867650A (zh) 2020-04-20 2023-03-28 克里斯蒂安娜基因编辑研究公司 用于肺癌治疗的aav递送系统
TW202208632A (zh) 2020-05-27 2022-03-01 美商同源醫藥公司 用於恢復ｐａｈ基因功能的腺相關病毒組成物及其使用方法
AU2021328475A1 (en) 2020-08-19 2023-03-16 Sarepta Therapeutics, Inc. Adeno-associated virus vectors for treatment of Rett syndrome
CN112121179A (zh) * 2020-09-15 2020-12-25 山东兴瑞生物科技有限公司 一种组合物及其在治疗脊髓性肌萎缩症中的应用
BR112023006305A2 (pt) 2020-10-09 2023-05-09 Tenaya Therapeutics Inc Métodos e composições de terapia gênica com placofilina-2
CR20230363A (es) * 2021-01-29 2024-02-20 Biocad Joint Stock Co Efecto sinérgico de smn1 y mir-23a en el tratamiento de la atrofia muscular espinal
IL307633A (en) * 2021-04-12 2023-12-01 Univ Pennsylvania Useful preparations in the treatment of spinal muscular atrophy (SBMA)
CN116179605B (zh) * 2021-08-12 2025-11-11 蓝图生物医药(广州)有限公司 一种重组腺相关病毒载体及其应用
WO2023150544A1 (en) * 2022-02-01 2023-08-10 Seattle Children's Hospital D/B/A Seattle Children's Research Institute Simplified method of preparing cells for patient administration
EP4504951A2 (en) * 2022-04-05 2025-02-12 The Johns Hopkins University Methods and materials for treating syngap1-associated neurodevelopmental disorders
WO2023201207A1 (en) 2022-04-11 2023-10-19 Tenaya Therapeutics, Inc. Adeno-associated virus with engineered capsid
WO2023219394A1 (ko) * 2022-05-10 2023-11-16 서울대학교산학협력단 인간 smn1 단백질 변이체 및 이의 용도
CN114903010B (zh) * 2022-05-19 2024-06-07 暨南大学 神经退行性疾病模型的构建方法
WO2023240236A1 (en) 2022-06-10 2023-12-14 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of spinal muscular atrophy related disorders
CN116042719B (zh) * 2022-12-28 2025-11-11 蓝图生物医药(广州)有限公司 一种重组腺相关病毒载体及其应用
WO2024215655A1 (en) 2023-04-10 2024-10-17 Tenaya Therapeutics, Inc. Cardioprotective bag3 therapies
WO2024215653A1 (en) 2023-04-10 2024-10-17 Tenaya Therapeutics, Inc. Guide rnas, vectors, and virions for targeting mutations in the pln gene
CN118045206B (zh) * 2024-04-12 2024-07-05 四川至善唯新生物科技有限公司 一种治疗脊髓型肌肉萎缩的药物组合物及其用途

Family Cites Families (91)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4703008A (en) 1983-12-13 1987-10-27 Kiren-Amgen, Inc. DNA sequences encoding erythropoietin
NZ210501A (en) 1983-12-13 1991-08-27 Kirin Amgen Inc Erythropoietin produced by procaryotic or eucaryotic expression of an exogenous dna sequence
US5139941A (en) 1985-10-31 1992-08-18 University Of Florida Research Foundation, Inc. AAV transduction vectors
JPS62171696A (ja) 1986-01-23 1987-07-28 Sumitomo Chem Co Ltd ヒトエリスロポエチンの製造方法
US4954437A (en) 1986-09-15 1990-09-04 Integrated Genetics, Inc. Cell encoding recombinant human erythropoietin
US5328470A (en) 1989-03-31 1994-07-12 The Regents Of The University Of Michigan Treatment of diseases by site-specific instillation of cells or site-specific transformation of cells and kits therefor
US5399346A (en) 1989-06-14 1995-03-21 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Gene therapy
US5605690A (en) 1989-09-05 1997-02-25 Immunex Corporation Methods of lowering active TNF-α levels in mammals using tumor necrosis factor receptor
US5436146A (en) 1989-09-07 1995-07-25 The Trustees Of Princeton University Helper-free stocks of recombinant adeno-associated virus vectors
AU8200191A (en) 1990-07-09 1992-02-04 United States of America, as represented by the Secretary, U.S. Department of Commerce, The High efficiency packaging of mutant adeno-associated virus using amber suppressions
US5173414A (en) 1990-10-30 1992-12-22 Applied Immune Sciences, Inc. Production of recombinant adeno-associated virus vectors
US5747469A (en) * 1991-03-06 1998-05-05 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions comprising DNA damaging agents and p53
DE69233013T2 (de) 1991-08-20 2004-03-04 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of National Institute Of Health, Office Of Technology Transfer Adenovirus vermittelter gentransfer in den gastrointestinaltrakt
US5587308A (en) 1992-06-02 1996-12-24 The United States Of America As Represented By The Department Of Health & Human Services Modified adeno-associated virus vector capable of expression from a novel promoter
US5478745A (en) 1992-12-04 1995-12-26 University Of Pittsburgh Recombinant viral vector system
US5869305A (en) 1992-12-04 1999-02-09 The University Of Pittsburgh Recombinant viral vector system
US6686200B1 (en) 1993-08-31 2004-02-03 Uab Research Foundation Methods and compositions for the large scale production of recombinant adeno-associated virus
PT728214E (pt) 1993-11-09 2004-11-30 Ohio Med College Linhas celulares estaveis capazes de expressar o gene de replicacao do virus adeno-associado
WO1995013365A1 (en) 1993-11-09 1995-05-18 Targeted Genetics Corporation Generation of high titers of recombinant aav vectors
ATE386131T1 (de) 1994-04-13 2008-03-15 Univ Rockefeller Aav-vermittelte überbringung von dna in zellen des nervensystems
US5658785A (en) 1994-06-06 1997-08-19 Children's Hospital, Inc. Adeno-associated virus materials and methods
EP0708178A1 (en) * 1994-10-19 1996-04-24 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Survival motor neuron (SMN) gene: a gene for spinal muscular atrophy
CA2207927A1 (en) 1994-12-06 1996-06-13 Targeted Genetics Corporation Packaging cell lines for generation of high titers of recombinant aav vectors
US5756283A (en) 1995-06-05 1998-05-26 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Method for improved production of recombinant adeno-associated viruses for gene therapy
US6281010B1 (en) 1995-06-05 2001-08-28 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Adenovirus gene therapy vehicle and cell line
US5882914A (en) 1995-06-06 1999-03-16 The Johns Hopkins University School Of Medicine Nucleic acids encoding the hypoxia inducible factor-1
US5677158A (en) 1995-06-07 1997-10-14 Research Foundation Of State University Of New York In vitro packaging of adeno-associated virus DNA
US6001650A (en) 1995-08-03 1999-12-14 Avigen, Inc. High-efficiency wild-type-free AAV helper functions
US5622856A (en) 1995-08-03 1997-04-22 Avigen High efficiency helper system for AAV vector production
US6004797A (en) 1995-11-09 1999-12-21 Avigen, Inc. Adenovirus helper-free recombinant AAV Virion production
AU2064297A (en) 1996-02-29 1997-09-16 Immusol, Inc Hepatitis c virus ribozymes
JP2002514899A (ja) 1996-03-04 2002-05-21 ターゲティッド ジェネティックス コーポレイション 組換えａａｖベクターを用いて血管中の細胞を形質導入するための方法
US20040076613A1 (en) * 2000-11-03 2004-04-22 Nicholas Mazarakis Vector system
US6261823B1 (en) 1996-12-13 2001-07-17 Schering Corporation Methods for purifying viruses
JP2001506133A (ja) 1996-12-18 2001-05-15 ターゲティッド ジェネティクス コーポレイション 組換えａａｖベクターの産生における使用のための、ａａｖスプリット−パッケージング遺伝子およびこのような遺伝子を含む細胞株
JP2001506132A (ja) 1996-12-18 2001-05-15 ターゲティッド ジェネティクス コーポレイション Ａａｖベクターの産生における使用のためのリコンビナーゼ活性化可能ａａｖパッケージングカセット
US6605429B1 (en) 1997-01-23 2003-08-12 Immusol, Incorporated Gene functional analysis and discovery using randomized or target-specific ribozyme gene vector libraries
US6156303A (en) 1997-06-11 2000-12-05 University Of Washington Adeno-associated virus (AAV) isolates and AAV vectors derived therefrom
US6989264B2 (en) 1997-09-05 2006-01-24 Targeted Genetics Corporation Methods for generating high titer helper-free preparations of released recombinant AAV vectors
US6566118B1 (en) 1997-09-05 2003-05-20 Targeted Genetics Corporation Methods for generating high titer helper-free preparations of released recombinant AAV vectors
DK1009808T3 (da) 1997-09-05 2013-01-21 Genzyme Corp Fremgangsmåder til generering af hjælper-frie præparater af rekombinante aav-vektorer med høj titer
AU756827B2 (en) 1997-10-21 2003-01-23 Targeted Genetics Corporation Transcriptionally-activated AAV inverted terminal repeats (ITRs) for use with recombinant AAV vectors
WO1999020779A1 (en) 1997-10-21 1999-04-29 Targeted Genetics Corporation Amplifiable adeno-associated virus (aav) packaging cassettes for the production of recombinant aav vectors
NZ504847A (en) 1997-12-04 2003-02-28 Genzyme Corp Chimeric protein comprising a hypoxia inducible factor protein and a transcriptional activation domain and pharmaceutical use
IL137510A0 (en) 1998-02-17 2001-07-24 Schering Corp Compositions comprising viruses and methods for concentrating virus preparations
AUPP249298A0 (en) 1998-03-20 1998-04-23 Ag-Gene Australia Limited Synthetic genes and genetic constructs comprising same I
EP1064393B1 (en) 1998-03-20 2004-12-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for helper-free production of recombinant adeno-associated viruses
US6146874A (en) 1998-05-27 2000-11-14 University Of Florida Method of preparing recombinant adeno-associated virus compositions
WO1999061066A2 (en) 1998-05-27 1999-12-02 Avigen, Inc. Convection-enhanced delivery of aav vectors
CA2342849C (en) 1998-09-04 2013-01-29 Genzyme Corporation Methods for generating high titer helper-free preparations of released recombinant aav vectors
US6646113B1 (en) * 1998-09-17 2003-11-11 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Nucleic acid molecule encoding human survival of motor neuron-interacting protein 1 (SIP1) deletion mutants
US6759050B1 (en) 1998-12-03 2004-07-06 Avigen, Inc. Excipients for use in adeno-associated virus pharmaceutical formulations, and pharmaceutical formulations made therewith
US6893865B1 (en) 1999-04-28 2005-05-17 Targeted Genetics Corporation Methods, compositions, and cells for encapsidating recombinant vectors in AAV particles
DK1180159T3 (da) 1999-05-28 2008-11-17 Targeted Genetics Corp Fremgangsmåder og sammensætninger til at sænke niveauet af Tumor-Nekrose-Faktor (TNF) i TNF-associerede lidelser
CA2379166C (en) 1999-08-09 2013-03-26 Targeted Genetics Corporation Enhancement of expression of a single-stranded, heterologous nucleotide sequence from recombinant viral vectors by designing the sequence such that it forms instrastrand base pairs
US20020099025A1 (en) * 1999-12-30 2002-07-25 Heywood James A. Treatment of neurological disorders
JP5118798B2 (ja) 2000-03-07 2013-01-16 メルク・シャープ・エンド・ドーム・コーポレイション アデノウイルス製剤
AU2001257611A1 (en) 2000-04-28 2001-11-12 Avigen, Inc. Polynucleotides for use in recombinant adeno-associated virus virion production
ATE318923T1 (de) 2000-06-01 2006-03-15 Univ North Carolina Doppelsträngige parvovirus-vektoren
US6593123B1 (en) 2000-08-07 2003-07-15 Avigen, Inc. Large-scale recombinant adeno-associated virus (rAAV) production and purification
JP2004516016A (ja) 2000-09-18 2004-06-03 ジェンザイム・コーポレイション ハイブリッドユビキチンプロモーターを含む発現ベクター
EP1402043A1 (en) 2001-07-03 2004-03-31 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Methods of administering vectors to synaptically connected neurons
US20030050273A1 (en) * 2001-08-29 2003-03-13 Keiya Ozawa Compositions and methods for treating neurodegenerative diseases
AU2002348151A1 (en) 2001-11-05 2003-05-19 Genvec, Inc. Viral vector production methods and compositions
US20030134404A1 (en) 2001-11-26 2003-07-17 Lochrie Michael A. Methods for producing stocks of recombinant AAV virions
DK2573170T3 (en) 2001-12-17 2018-04-09 Univ Pennsylvania Sequences of adeno-associated virus (AAV) serotype 9, vectors containing them, and their use
AU2003221733A1 (en) * 2002-04-17 2003-11-03 University Of Florida Research Foundation, Inc. Improved raav vectors
EP1620133B1 (en) 2003-05-01 2015-12-09 Genzyme Corporation Gene therapy for neurometabolic disorders
US7765583B2 (en) 2005-02-28 2010-07-27 France Telecom System and method for managing virtual user domains
CA2606490C (en) * 2005-05-02 2018-02-06 Genzyme Corporation Gene therapy for spinal cord disorders
JP5829372B2 (ja) 2005-05-02 2015-12-09 ジェンザイム・コーポレーション 神経代謝性疾患のための遺伝子治療
AR059089A1 (es) 2006-01-20 2008-03-12 Genzyme Corp Administracion intraventricular de una enzima para enfermedades de almacenamiento lisosomal
WO2008016391A2 (en) 2006-01-31 2008-02-07 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Self-complementary parvoviral vectors, and methods for making and using the same
WO2007120533A2 (en) 2006-03-30 2007-10-25 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Minigene expression cassette
HUE031156T2 (en) 2006-06-07 2017-06-28 Genzyme Corp Gene therapy for amyotrophic lateral sclerosis and other spinal cord disorders
EP2066791B1 (en) 2006-10-03 2012-09-12 Genzyme Corporation Gene therapy for amyotrophic lateral sclerosis and other spinal cord disorders
ITMI20070127A1 (it) 2007-01-29 2008-07-30 Fond I R C C S Proteine e-o peptidi per la prevenzione e-o cura di malattie neurodegenerative
US20080187512A1 (en) * 2007-02-07 2008-08-07 Academia Sinica Treatment for spinal muscular atrophy
EP2176283B1 (en) 2007-07-14 2016-11-02 University of Iowa Research Foundation Methods and compositions for treating brain diseases
EP2019143A1 (en) * 2007-07-23 2009-01-28 Genethon CNS gene delivery using peripheral administration of AAV vectors
EP2058401A1 (en) * 2007-10-05 2009-05-13 Genethon Widespread gene delivery to motor neurons using peripheral injection of AAV vectors
WO2009151546A2 (en) 2008-05-27 2009-12-17 Ptc Therapeutics, Inc. Methods for treating spinal muscular atrophy
WO2010071832A1 (en) 2008-12-19 2010-06-24 Nationwide Children's Hospital Delivery of polynucleotides across the blood brain barrier using recombinant aav9
US11219696B2 (en) 2008-12-19 2022-01-11 Nationwide Children's Hospital Delivery of polynucleotides using recombinant AAV9
US9415121B2 (en) 2008-12-19 2016-08-16 Nationwide Children's Hospital Delivery of MECP2 polynucleotide using recombinant AAV9
HRP20250897T1 (hr) 2009-05-02 2025-09-26 Genzyme Corporation Genska terapija za neurodegenerativne poremećaje
AU2013296425B2 (en) 2012-08-01 2018-06-07 Nationwide Children's Hospital Intrathecal delivery of recombinant adeno-associated virus 9
FR3002237B1 (fr) 2013-02-15 2017-12-15 Genethon Methodes pour la production de particules virales aav double brin
MX380973B (es) 2013-05-01 2025-03-12 Genzyme Corp Composiciones y metodos para tratar la atrofia muscular espinal.
LT3137497T (lt) 2014-05-02 2021-07-26 Genzyme Corporation Aav vektoriai, skirti tinklainės ir cns genų terapijai
EP3411484B1 (en) 2016-02-05 2023-10-04 Emory University Injection of single-stranded or self-complementary adeno-associated virus 9 into the cerebrospinal fluid

Also Published As

Publication number Publication date
PL4342992T3 (pl) 2025-09-22
JP6397391B2 (ja) 2018-09-26
EP3421603A1 (en) 2019-01-02
US20230084580A1 (en) 2023-03-16
MX2023006169A (es) 2023-06-09
JP2012526046A (ja) 2012-10-25
RU2016140850A3 (sr) 2019-11-25
EP4585263A2 (en) 2025-07-16
ES2903127T3 (es) 2022-03-31
HUE057606T2 (hu) 2022-05-28
DK2424991T3 (en) 2018-09-17
CA2759801C (en) 2019-04-02
CN102459611A (zh) 2012-05-16
EP3988660B1 (en) 2025-05-14
MX2011011594A (es) 2011-11-18
US11911440B2 (en) 2024-02-27
US12350311B2 (en) 2025-07-08
SG10202109219SA (en) 2021-10-28
PT2424991T (pt) 2018-10-19
US20230135379A1 (en) 2023-05-04
US20160051699A1 (en) 2016-02-25
RU2016140850A (ru) 2018-12-14
PL3988660T3 (pl) 2025-09-22
US9415119B2 (en) 2016-08-16
PT4342992T (pt) 2025-07-31
LT4342992T (lt) 2025-08-25
MX2018006955A (es) 2020-11-12
HUE072713T2 (hu) 2025-12-28
HUE072183T2 (hu) 2025-10-28
RS67078B1 (sr) 2025-08-29
SG10201404528SA (en) 2014-10-30
IL259898A (en) 2018-07-31
HUE039345T2 (hu) 2018-12-28
PL3421603T3 (pl) 2022-02-14
RU2603740C2 (ru) 2016-11-27
ES3038109T3 (en) 2025-10-09
CA2759801A1 (en) 2010-11-11
SI4342992T1 (sl) 2025-09-30
SI3988660T1 (sl) 2025-09-30
KR20120006073A (ko) 2012-01-17
SI2424991T1 (sl) 2018-11-30
IL216094A0 (en) 2012-01-31
LT3421603T (lt) 2022-01-10
CN107083400A (zh) 2017-08-22
BRPI1010868A2 (en) 2018-06-12
US20200384076A1 (en) 2020-12-10
HRP20212024T1 (hr) 2022-04-01
SG175409A1 (en) 2011-12-29
EP3421603B1 (en) 2021-10-06
EP4342992A2 (en) 2024-03-27
EP4585263A3 (en) 2025-10-22
KR20180027619A (ko) 2018-03-14
FI3988660T3 (fi) 2025-08-14
US20240033323A1 (en) 2024-02-01
DK3988660T3 (da) 2025-08-18
JP2016052309A (ja) 2016-04-14
JP5879256B2 (ja) 2016-03-08
HRP20250892T1 (hr) 2025-09-26
US11975043B2 (en) 2024-05-07
WO2010129021A1 (en) 2010-11-11
ES3041882T3 (en) 2025-11-17
LT3988660T (lt) 2025-08-11
EP2424991A4 (en) 2012-11-14
PT3421603T (pt) 2022-01-10
EP2424991A1 (en) 2012-03-07
RS67077B1 (sr) 2025-08-29
HRP20181423T1 (hr) 2018-11-30
MX341073B (es) 2016-08-05
US20250288644A1 (en) 2025-09-18
SI3421603T1 (sl) 2022-02-28
HRP20250897T1 (hr) 2025-09-26
CN102459611B (zh) 2016-11-09
ES2686504T3 (es) 2018-10-18
EP4342992B1 (en) 2025-05-14
US10369193B2 (en) 2019-08-06
US20240350584A1 (en) 2024-10-24
CY1120982T1 (el) 2019-12-11
KR101835490B1 (ko) 2018-03-08
US20170087212A1 (en) 2017-03-30
MX356669B (es) 2018-06-08
JP2018148927A (ja) 2018-09-27
RU2011149094A (ru) 2013-06-10
PT3988660T (pt) 2025-07-31
EP2424991B1 (en) 2018-06-06
US20130287736A1 (en) 2013-10-31
FI4342992T3 (fi) 2025-08-12
PL2424991T3 (pl) 2018-11-30
DK4342992T3 (da) 2025-08-18
EP3988660A1 (en) 2022-04-27
DK3421603T3 (da) 2022-01-10
LT2424991T (lt) 2018-09-25
RU2743398C2 (ru) 2021-02-18
EP4342992A3 (en) 2024-04-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US12350311B2 (en) Gene therapy for neurodegenerative disorders
RU2836835C2 (ru) Генная терапия нейродегенеративных нарушений
HK40129483A (en) Gene therapy for neurodegenerative disorders
HK40106863A (en) Gene therapy for neurodegenerative disorders
HK40106863B (en) Gene therapy for neurodegenerative disorders
HK40073109A (en) Gene therapy for neurodegenerative disorders
HK40073109B (en) Gene therapy for neurodegenerative disorders
BRPI1010868B1 (pt) Composição compreendendo um virion de aav recombinante, e uso do referido vírion