RS67077B1 - Genska terapija za neurodegenerativne poremećaje - Google Patents

Genska terapija za neurodegenerativne poremećaje

Info

Publication number
RS67077B1
RS67077B1 RS20250772A RSP20250772A RS67077B1 RS 67077 B1 RS67077 B1 RS 67077B1 RS 20250772 A RS20250772 A RS 20250772A RS P20250772 A RSP20250772 A RS P20250772A RS 67077 B1 RS67077 B1 RS 67077B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
aav
sma
administered
protein
vector
Prior art date
Application number
RS20250772A
Other languages
English (en)
Inventor
Marco A Passini
Lamya Shihabuddin
Seng H Cheng
Original Assignee
Genzyme Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Genzyme Corp filed Critical Genzyme Corp
Publication of RS67077B1 publication Critical patent/RS67077B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C12N15/861—Adenoviral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0075—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the delivery route, e.g. oral, subcutaneous
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/02—Muscle relaxants, e.g. for tetanus or cramps
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C12N15/864—Parvoviral vectors, e.g. parvovirus, densovirus
    • C12N15/8645—Adeno-associated virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14121—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14133—Use of viral protein as therapeutic agent other than vaccine, e.g. apoptosis inducing or anti-inflammatory
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14171—Demonstrated in vivo effect

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

Opis
POZIVANJE NA SRODNE PRIJAVE
[0001] Ova prijava polaže pravo na beneficije iz 35 USC §119(e)(1) po osnovu privremenih američkih prijava br.61/174/982, podnete 2. maja 2009. godine, i 61/268,059, podnete 8. juna 2009. godine.
TEHNIČKO POLJE
[0002] Ovo obelodanjivanje se generalno odnosi na metode isporuke gena. Posebno se obelodanjivanje odnosi na kompozicije i metode za tretman poremećaja koji utiču na motoričku funkciju, kao što je motorička funkcija pogođena bolešću ili povredom mozga i/ili kičmene moždine.
POZADINA
[0003] Genska terapija je nova modalnost tretmana poremećaja koji pogađaju centralni nervni sistem (CNS). CNS genska terapija je omogućena razvojem virusnih vektora sposobnih da efikasno inficiraju post-mitotičke neurone. Centralni nervni sistem se sastoji od kičmene moždine i mozga. Kičmena moždina provodi senzorne informacije iz perifernog nervnog sistema do mozga i provodi motoričke informacije iz mozga do različitih efektora. Za pregled virusnih vektora za isporuku gena u centralni nervni sistem, videti Davidson et al., Nature Rev. (2003) 4:353-364.
[0004] Vektori adeno-asociranog virusa (AAV) smatraju se korisnim za CNS gensku terapiju jer imaju povoljan profil toksičnosti i imunogenosti, sposobni su da transdukuju neuronske ćelije i sposobni su da posreduju dugotrajnu ekspresiju u CNS (Kaplitt et al., Nat. Genet. (1994) 8:148-154; Bartlett et al., Hum. Gene Ther. (1998) 9:1181-1186; i Passini et al., J. Neurosci. (2002) 22:6437-6446).
[0005] Jedna korisna osobina AAV vektora leži u sposobnosti nekih AAV vektora da se podvrgnu retrogradnom i/ili anterogradnom transportu u neuronskim ćelijama. Neuroni u jednoj regiji mozga su aksonima povezani sa udaljenim regijama mozga, čime se obezbeđuje transportni sistem za isporuku vektora. Na primer, AAV vektor se može primeniti na ili blizu aksonalnih završetaka neurona. Neuroni internalizuju AAV vektor i transportuju ga retrogradno duž aksona do tela ćelije. Slične osobine adenovirusa, HSV i pseudo-besnila virusa pokazano je da isporučuju gene u distalne strukture unutar mozga (Soudas et al., FASEB J. (2001) 15:2283-2285; Breakefield et al., New Biol. (1991) 3:203-218; i deFalco et al., Science (2001) 291:2608-2613).
[0006] Nekoliko eksperimentatora je izvestilo da je transdukcija mozga AAV serotipom 2 (AAV2) ograničena na intrakranijalno mesto injekcije (Kaplitt et al., Nat. Genet. (1994) 8:148-154; Passini et al., J. Neurosci. (2002) 22:6437-6446; i Chamberlin et al., Brain Res. (1998) 793:169-175). Takođe postoje dokazi da retrogradni aksonalni transport neurotrofnih virusnih vektora, uključujući AAV i lentivirusne vektore, takođe može doći u u određenim moždanim putevima normalnog pacova (Kaspar et al., Mol. Ther. (2002) 5:50-56; Kasper et al., Science (2003) 301:839-842 i Azzouz et al., Nature (2004) 429:413-417. Roaul et al., Nat. Med. (2005) 11(4):423-428 i Ralph et al., Nat. Med. (2005) 11(4):429-433 izveštavaju da intramuskularna injekcija lentivirusa koji eksprimira interferirajuću RNK humanu Cu/Zn superoksid dismutazu (SOD1) koja utišava bolest, usporava početak amiotrofične lateralne skleroze (ALS) u terapijski relevantnom modelu ALS na glodarima.
[0007] Ćelije transdukovane AAV vektorima mogu da eksprimiraju terapeutski produkt transgena, kao što je enzim ili neurotrofni faktor, kako bi posredovale korisne efekte intracelularno. Ove ćelije takođe mogu da izlučuju terapeutski produkt transgena, koji se zatim može preuzeti od strane distalnih ćelija gde može posredovati svoje korisne efekte. Ovaj proces je opisan kao unakrsna korekcija (Neufeld et al., Science (1970) 169:141-146).
[0008] Osobina gore opisanih rekombinantnih AAV vektora je zahtev da se jednolančani DNK (ssDNK) AAV genom mora prevesti u dvolančani DNK (dsDNK) pre ekspresije kodiranog transgena. Ovaj korak se može zaobići upotrebom samokomplementarnih vektora koji pakuju invertovani ponavljajući genom koji se savija u dsDNK bez zahteva za sintezom DNK ili sparivanjem baza između više vektorskih genoma, čime se povećava efikasnost AAV-posredovanog transfera gena. Za pregled samokomplementarnih AAV vektora, videti npr. McCarty, D.M. Molec. Ther. (2008) 16:1648-1656.
[0009] Spinalna mišićna atrofija (SMA) je autosomno recesivni neuromuskularni poremećaj uzrokovan mutacijama u genu za preživljavanje motornog neurona 1 (SMN1) i gubitkom kodiranog SMN proteina (Lefebvre et al., Cell (1995) 80:155-165). Nedostatak SMN rezultira degeneracijom motornih neurona u ventralnom (prednjem) rogu kičmene moždine, što dovodi do slabosti proksimalnih mišića odgovornih za puzanje, hodanje, kontrolu vrata i gutanje, kao i nevoljnih mišića koji kontrolišu disanje i kašljanje (Sumner C.J., NeuroRx (2006) 3:235-245). Posledično, pacijenti sa SMA pokazuju povećanu sklonost ka upali pluća i drugim plućnim problemima kao što je restriktivna bolest pluća. Početak bolesti i stepen ozbiljnosti delimično su određeni genotipom modifikatora SMN2, koji je sposoban da proizvede malu količinu SMN (Monani et al., Hum. Mol. Genet. (1999) 8:1177-1183; Lorson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1999) 96:6307-6311). Dakle, pacijenti sa velikim brojem kopija SMN2 (3-4 kopije) pokazuju blaži oblik bolesti (nazvan tip II ili III), dok 1-2 kopije SMN2 obično rezultiraju težim oblikom bolesti tipa I (Campbell et al., Am. J. Hum. Genet. (1997) 61:40-50; Lefebvre et al., Nat. Genet. (1997) 16:265-269). Trenutno ne postoje efikasne terapije za SMA.
[0010] Fundamentalna strategija za tretman ovog monogenog poremećaja je povećanje nivoa SMN kod pacijenata sa SMA. Jedan pristup za postizanje toga je modulacija endogenog SMN2 gena malim molekulima koji aktiviraju SMN2 promoter ili koriguju obrazac splajsovanja SMN2 pre-mRNK. Izmena splajsovanja SMN2 takođe se može ostvariti pomoću antisens oligonukleotida i trans-splajsujućih RNK. Međutim, iako je modulacija SMN2 in vitro povećala nivoe SMN i rekonstituisala nuklearne dragulje u SMA ćelijskim linijama, studije efikasnosti sa malim molekularnim lekovima nisu dovele do merljivih poboljšanja u klinici (Oskoui et al., Nerotherapeutics (2008) 5:499-506).
[0011] US 2009/0069261 A1 opisuje metode i kompozicije za tretman poremećaja ili povreda koje utiču na motoričku funkciju i kontrolu kod subjekta, kao što je isporuka transgena u kičmenu moždinu subjekta primenom rekombinantnog neurotropnog virusnog vektora koji sadrži transgen. Azzouz et al (J. Clinical Investigation (2004) 114: 1726-1731)odnosi se na SMN zamenu posredovanu lentivektorima u mišjem modelu spinalne mišićne atrofije. Foust et al (Nature Biotechnology (2009) 27: 59-65) izveštavaju da intravaskularni AAV9 preferencijalno cilja neonatalne neurone i odrasle astrocite.
REZIME PRONALASKA
[0012] Predmetni pronalazak obezbeđuje komplet za upotrebu u metodi tretmana spinalne mišićne atrofije (SMA) kod subjekta, pri čemu komplet obuhvata jednu ili više posuda koje obuhvataju rekombinantni AAV virion koji obuhvata samokomplementarni adeno-asocirani virusni (scAAV) vektor, pri čemu navedeni scAAV vektor obuhvata polinukleotid, pri čemu polinukleotid kodira protein preživljavanja motornog neurona (SMN) koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu sa najmanje 90% identiteta sekvence sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 2, pri čemu ekspresija navedenog proteina u CNS rezultira barem delimičnom korekcijom neuropatologije i/ili stabilizacijom progresije SMA, i pri čemu scAAV vektor obuhvata kapsidne proteine iz serotipa AAV8.
[0013] Takođe je obezbeđen komplet za upotrebu u metodi tretmana spinalne mišićne atrofije (SMA) kod subjekta, pri čemu komplet obuhvata jednu ili više posuda koje obuhvataju rekombinantni AAV virion koji obuhvata samokomplementarni adeno-asocirani virusni (scAAV) vektor, pri čemu navedeni scAAV vektor obuhvata polinukleotid, pri čemu polinukleotid kodira protein preživljavanja motornog neurona (SMN) koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu sa najmanje 90% identiteta sekvence sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 2, pri čemu ekspresija navedenog proteina u CNS rezultira barem delimičnom korekcijom neuropatologije i/ili stabilizacijom progresije SMA, i pri čemu scAAV vektor obuhvata kapsidne proteine iz serotipa AAV9, i pri čemu se AAV virion:
(i) primenjuje putem primene u barem jednu regiju dubokih cerebelarnih jezgara malog mozga;
(ii) primenjuje putem direktne injekcije u kičmenu moždinu;
(iii) primenjuje putem intracerebroventrikularne injekcije; ili
(iv) primenjuje putem intratekalne injekcije.
[0014] Ova i druga otelotvorenja predmetnog pronalaska izložena su u priloženim patentnim zahtevima.
DETALJAN OPIS
[0015] Tehničke informacije izložene u nastavku mogu u nekim aspektima prevazići opseg pronalaska, koji je definisan priloženim patentnim zahtevima. Dodatne tehničke informacije pružaju se kako bi se stvarni pronalazak stavio u širi tehnički kontekst i ilustrovao mogući srodni tehnički razvoj.
[0016] Bilo kakvo usputno pozivanje na metode tretmana ljudi ili životinja hirurškom ili terapijskom intervencijom i dijagnostičke metode koje se primenjuju na ljude ili životinje ne treba tumačiti kao traženje zaštite za takve metode kao takve, već se umesto toga treba tumačiti kao pozivanje na proizvode, posebno supstance ili kompozicije, za upotrebu u bilo kojoj od ovih metoda.
[0017] Predmetni pronalazak zasniva se na otkriću da su i konvencionalni rekombinantni AAV (rAAV) virioni, kao i rekombinantni samokomplementarni AAV vektori (scAAV), sposobni da isporučuju gene u CNS sa uspešnom ekspresijom u CNS i tretmanom neurodegenerativnih bolesti. Ovaj terapijski pristup za isporuku gena koji kodiraju terapeutske molekule, a koji rezultiraju barem delimičnom korekcijom neuropatologija, pruža veoma poželjnu metodu za tretman različitih neurodegenerativnih poremećaja, uključujući SMA.
[0018] Dakle, ovde je obelodanjen samokomplementarni adeno-asocirani virusni (scAAV) vektor koji sadrži polinukleotid koji kodira protein koji modulira motoričku funkciju kod subjekta sa poremećajem motornih neurona. U određenim slučajevima, poremećaj motornih neurona je odabran iz grupe: spinalna mišićna atrofija (SMA), amiotrofična lateralna skleroza (ALS), spinalna bulbarna mišićna atrofija, spinalna cerebelarna ataksija, primarna lateralna skleroza (PLS) ili traumatska povreda kičmene moždine. Pronalazak se odnosi na komplete za upotrebu u tretmanu SMA, pri čemu komplet sadrži jednu ili više posuda koje obuhvataju rekombinantni AAV virion koji obuhvata scAAV vektor, kao što je izloženo u patentnim zahtevima.
[0019] U dodatnim slučajevima, polinukleotid prisutan u scAAV vektoru kodira protein preživljavanja motornog neurona (SMN). U određenim slučajevima, SMN protein je humani SMN-1. U daljim otelotvorenjima, SMN-1 obuhvata aminokiselinsku sekvencu sa najmanje 90% identiteta sekvence sa sekvencom prikazanom na slici 9B. U dodatnim slučajevima, SMN-1 obuhvata aminokiselinsku sekvencu kao što je prikazano na slici 9B. U kompletima pronalaska, scAAV vektor obuhvata polinukleotid, pri čemu polinukleotid kodira protein preživljavanja motornog neurona (SMN) koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu sa najmanje 90% identiteta sekvence sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 2
[0020] Takođe je ovde obelodanjen rekombinantni AAV virion, koji obuhvata scAAV vektor kao što je gore opisano.
[0021] Takođe je ovde obelodanjena kompozicija koja obuhvata rekombinantni AAV virion kao što je gore i farmaceutski prihvatljiv ekscipijent.
[0022] Takođe je ovde obelodanjena modulacija motoričke funkcije kod subjekta sa poremećajem motornih neurona koja obuhvata primenu terapijski efikasne količine gore navedene kompozicije na ćelijama subjekta. U određenim slučajevima, kompozicija se primenjuje na ćelijama in vitro radi transdukcije ćelija, a transdukovane ćelije se primenjuju na subjektu. U alternativnim slučajevima, kompozicija se aprimenjuje na ćelijama in vivo.
[0023] Takođe je ovde obelodanjeno obezbeđivanje SMN proteina subjektu sa spinalnom mišićnom atrofijom (SMA) koje obuhvata primenu rekombinantnog AAV viriona koji obuhvata AAV vektor kao što je gore opisano na ćelijama subjekta kome je to potrebno. U određenim slučajevima, kompozicija se primenjuje na ćelijama in vitro radi transdukcije ćelija, a transdukovane ćelije se primenjuju na subjektu. U alternativnim slučajevima, kompozicija se aprimenjuje na ćelijama in vivo.
[0024] U svakoj od gore navedenih metoda, kompozicija se može primeniti putem direktne injekcije u kičmenu moždinu. U drugim slučajevima, kompozicija se primenjuje putem intracerebroventrikularne injekcije. U dodatnim slučajevima, kompozicija se primenjuje u cerebralnu lateralnu komoru. U određenim slučajevima, kompozicija se primenjuje u obe cerebralne lateralne komore. U drugim slučajevima, kompozicija se primenjuje putem i intracerebroventrikularne injekcije i direktne injekcije u kičmenu moždinu. U dodatnim slučajevima, kompozicija se primenjuje intratekalnom injekcijom.
[0025] Ova i druga otelotvorenja i slučajevi biće lako shvatljivi stručnjacima iz ove oblasti u svetlu ovde obelodanjenog.
KRATAK OPIS SLIKA
Slika 1 prikazuje preživljavanje miševa tretiranih sa AAVhSMN1 u poređenju sa netretiranim SMA miševima. Tretman sa AAVhSMN1 je povećao preživljavanje kod SMA miševa.
Netretirani SMA miševi (n = 34, otvoreni krugovi) imali su srednji životni vek od 15 dana. SMA miševi tretirani pri P0 sa AAVhSMN1 (n = 24, zatvoreni krugovi) imali su srednji životni vek od 50 dana (p < 0,0001), što je predstavljalo povećanje dugovečnosti za 233%.
Slike 2A-2C prikazuju efekat tretmana genskom terapijom na nivoe SMN u kičmenoj moždini. Prikazani su nivoi hSMN proteina u injektiranim lumbalnim (slika 2A), torakalnim (slika 2B) i cervikalnim (slika 2C) segmentima u poređenju sa netretiranim SMA i miševima divljeg tipa. Western blot testovi su izvedeni na lumbalnim, torakalnim i cervikalnim segmentima kičmene moždine 16, 58-66 i 120-220 dana nakon injekcije. Western blot testovi iz tri segmenta su kvantifikovani i, radi kontrole nivoa proteina, SMN je normalizovan na βtubulin i prikazan kao procenat divljeg tipa iste starosti. Legenda (i n-vrednosti): SMA, netretirani nokaut (n = 5 na 16 dana); AAV, AAV8-hSMN-tretirani SMA miševi (n = 7 na 16 dana, n = 5 na 58-66 dana); scAAV, scAAV8-hSMN-tretirani SMA miševi (n = 5 u svakom vremenskom trenutku). Vrednosti predstavljaju srednju vrednost ± SEM.
Slike 3A-3J prikazuju subćelijsku distribuciju hSMN proteina i ekspresiju u motornim neuronima kičmene moždine kod tretiranih i netretiranih SMA miševa. hSMN protein je obilno detektovan u citoplazmi transdukovanih ćelija (slike 3A i 3B). Nadalje, hSMN protein je detektovan u jezgru, što ilustruje par struktura nalik draguljima (vrh strelice) uvećanih u umetku (slika 3A). hSMN protein je takođe detektovan u dendritima (slike 3B i 3C) i aksonima (slika 3D) neurona. hSMN protein nije bio detektovan na tkivnim presecima netretiranih SMA miševa (slika 3E). Ko-lokalizacija hSMN proteina (slika 3F) sa mišem ChAT (slika 3G) pokazala je da je podskup transdukovanih ćelija bio motorni neuroni (slike 3H i 3I). Procenat ChAT ćelija koje su bile imunopozitivne na hSMN protein određen je na 16 (bele trake) i 58-66 (crne trake) dana (slika 3J). Vrednosti predstavljaju srednju vrednost ± SEM.
Slika 4 prikazuje brojanje motornih neurona u kičmenoj moždini kod tretiranih i netretiranih SMA miševa. Prikazani su prosečni brojevi ChAT imunopozitivnih neurona prebrojanih na 10 µm tkivnim presecima za svaku grupu. Brojevi predstavljaju brojanje svakog desetog preseka iz različitih nivoa cervikalnih, torakalnih, lumbalnih i sakralnih segmenata. Vrednosti predstavljaju srednju vrednost ± SEM. Legenda: *, p < 0,05; **, p < 0,01; ***, p < 0,001.
Slike 5A-5C prikazuju površinu poprečnog preseka miofibera iz mišićnih grupa kod tretiranih i netretiranih SMA miševa. Površina poprečnog preseka miofibera iz više mišićnih grupa je povećana tretmanom sa AAVhSMN1. Složeni grafikoni kvadricepsa, gastroknemijusa i interkostalnih mišića od 16 (slika 5A) i 58-66 (slika 5B) dana pokazali su da je distribucija veličina miofibera bila slična između tretiranih SMA i miševa divljeg tipa. Ukupan prosek na 16 dana pokazao je da je površina poprečnog preseka miofibera bila značajno veća sa tretmanom (slika 5C). Nadalje, na 58-66 dana, prosečna površina je bila statistički slična između tretiranih SMA miševa i miševa divljeg tipa iste starosti u gastroknemijusu i interkostalnim mišićima (slika 5C). Vrednosti predstavljaju srednju vrednost ± SEM.
Legenda: WT, netretirani divlji tip; HET, netretirani heterozigot; SMA, netretirani nokaut; AAV, AAVhSMN1-tretirani SMA miševi; *, p < 0,05; **, p < 0,01; ***, p < 0,001.
Slike 6A-6F prikazuju strukturu NMJ u mišićima kod tretiranih i netretiranih SMA miševa. Struktura u kvadricepsu, gastroknemijusu i interkostalnim mišićima je poboljšana genskom terapijom. Prikazani su neuromuskularni spojevi (NMJ) iz kvadricepsa netretiranih SMA (sl.
6A), tretiranih SMA (sl.6B) i miševa divljeg tipa (sl.6C) na 16 dana, kao i iz tretiranih SMA (sl. 6D) i miševa divljeg tipa (sl.6E) na 58-66 dana. Pre- i post-sinaptički NMJ su obeleženi antitelom na neurofilament (zeleno) i bojenjem α-bungarotoksinom (crveno), respektivno. Strelica na glavnom panelu pokazuje na NMJ koji je istaknut u umecima ispod. Najmanje 100 NMJ je nasumično ocenjeno u svakom mišiću po životinji. Normalan NMJ je definisan kao onaj koji ima presinaptički terminal koji nije pokazivao abnormalnu akumulaciju proteina neurofilamenta prikazanu na slici 6A. Vrednosti na slici 6F predstavljaju srednju vrednost ± SEM. Legenda: WT, netretirani divlji tip; HET, netretirani heterozigot; SMA, netretirani nokaut; AAV, AAVhSMN1-tretirani SMA miševi; *, p < 0,05; **, p < 0,01; ***, p < 0,001. Skalirane trake: 20 µm.
Slike 7A-7F prikazuju rezultate bihevioralnih testova kod tretiranih i netretiranih SMA miševa. Tretirani SMA miševi su pokazali značajna poboljšanja na bihevioralnim testovima. Tretirani SMA (zvezdica) i netretirani miševi divljeg tipa (WT) bili su znatno sposobniji od netretiranih SMA miševa (označeni 'x') na 16 dana (slika 7A). Tretirani SMA miševi su takođe bili značajno teži od netretiranih SMA kontrola od 11. dana pa nadalje (slika 7B). Tretirani SMA miševi su se značajno bolje pokazali od netretiranih SMA miševa na testovima refleksa ispravljanja (slika 7C), negativne geotakse (slika 7D), snage stiska (slika 7E) i širenja zadnjih udova (slika 7F). Tretirani SMA miševi su bili statistički identični miševima divljeg tipa i heterozigotima na testovima refleksa ispravljanja i negativne geotakse na 12-16 dana (slike 7C i 7D). Vrednosti predstavljaju srednju vrednost ± SEM. Legenda: netretirani WT (otvoreni krug), netretirani heterozigot (otvoreni trougao); netretirani SMA (otvoreni kvadrat); AAVhSMN1-tretirani SMA miševi (zatvoreni kvadrat); *, p < 0,05; **, p < 0,01; ***, p < 0,001.
Slika 8 prikazuje preživljavanje miševa tretiranih sa scAAVhSMN1 i netretiranih miševa. Tretman sa scAAVhSMN1 je povećao preživljavanje kod SMA miševa. SMA miševi tretirani pri P0 sa scAAVhSMN1 (n = 17, zatvoreni trouglovi) imali su srednji životni vek od 157 dana (p < 0,0001), u poređenju sa 16 dana kod netretiranih SMA miševa (n = 47, otvoreni krugovi).
Slike 9A-9B (SEQ ID NOS:1 i 2) prikazuju kodirajuću DNK sekvencu (slika 9A) i odgovarajuću aminokiselinsku sekvencu (slika 9B) reprezentativnog gena humanog preživljavanja motornog neurona (SMN1).
Slike 10A-10F pokazuju da ekspresija scAAV8-hSMN povećava broj motornih neurona i poboljšava NMJ kod SMA miševa. Slika 10A prikazuje procenat mChAT imunopozitivnih ćelija koje su se ko-lokalizovale sa ekspresijom hSMN u torako-lumbalnom regionu 16 dana nakon injekcije. Slike 10B-10F prikazuju prosečne brojeve mChAT imunopozitivnih ćelija u lumbalnim (slika 10B), torakalnim (slika 10C) i cervikalnim (slika 10D) segmentima, i prosečne procente kolabiranih NMJ u kvadricepsu (slika 10E) i interkostalnim (slika 10F) mišićima na 16, 58-66 i 214-269 dana. Kao referenca za slike 10E i 10F, 75-90% NMJ u kvadricepsu i interkostalnim mišićima netretiranih SMA miševa sadržalo je aberantnu kolabiranu strukturu na 16 dana (videti sliku 6F). Legenda i n-vrednosti: SMA, netretirani nokaut (otvorene trake, n = 8 na 16 dana), AAV, AAV8-hSMN (šrafirane trake, n = 8 na 16 dana, n = 5 na 58-66 dana); scAAV, scAAV8-hSMN (zatvorene trake, n = 5 u svakom vremenskom trenutku); WT, netretirani WT (karirane trake, n = 8 na 16 dana, n = 5 na 58-66 i 216-269 dana). Vrednosti predstavljaju srednju vrednost ± SEM. Statistička poređenja su izvršena jednosmernom ANOVA analizom i Bonferronijevim višestrukim post hoc testovima na 16 dana (slike 10B-10F). Neupareni dvostrani studentov t-test je uporedio 1) dva vektora međusobno na 16 dana (slika 10A) i 58-66 dana (slike 10B-10D); 2) relativni broj ChAT ćelija u grupama od 58-66d i 214-269d sa tretmanom scAAV8-hSMN (slike 10B-10D); 3) relativni broj abnormalnih NMJ između netretiranih WT i scAAV8-hSMN-tretiranih SMA miševa na 214-269 dana (E, F); *p <0,05, **p <0,01, ***p <0,001.
DALJI DETALJAN OPIS
[0027] Praksa predmetnog pronalaska će se, ukoliko nije drugačije naznačeno, oslanjati na konvencionalne metode hemije, biohemije, tehnika rekombinantne DNK i imunologije, u okviru veština struke. Takve tehnike su u potpunosti objašnjene u literaturi. Videti npr.
Fundamental Virology, 2nd Edition, vol. I & II (B.N. Fields and D.M. Knipe, eds.);
Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D.M. Weir and C.C. Blackwell eds., Blackwell Scientific Publications); T.E. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W.H. Freeman and Company, 1993); A.L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., current addition); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989); Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.).
1. DEFINICIJE
[0028] Prilikom opisivanja predmetnog pronalaska, koristiće se sledeći termini, sa namerom da budu definisani kao što je dole naznačeno.
[0029] Mora se napomenuti da, kako se koristi u ovoj specifikaciji i priloženim patentnim zahtevima, oblici u jednini „jedan“, „jedna“ i „jedno“ uključuju reference u množini, osim ako sadržaj jasno ne nalaže drugačije. Tako, na primer, pozivanje na „interleukin receptor“ uključuje mešavinu dva ili više takvih receptora, i slično.
[0030] Termini „polipeptid“ i „protein“, koji se ovde koriste naizmenično, ili nukleotidna sekvenca koja ih kodira, odnose se na protein ili nukleotidnu sekvencu, respektivno, koja predstavlja ili nativnu sekvencu, varijantu iste ili fragment iste. Proteini pune dužine, sa ili bez signalne sekvence, i fragmenti istih, kao i proteini sa modifikacijama, kao što su brisanja, dodavanja i supstitucije (bilo konzervativne ili nekonzervativne prirode), na nativnoj sekvenci, namenjeni su za upotrebu ovde, sve dok protein održava željenu aktivnost. Ove modifikacije mogu biti namerne, kao kroz mutagenezu usmerenu na mesto, ili mogu biti slučajne, kao kroz mutacije domaćina koji proizvode proteine ili greške usled PCR amplifikacije. U skladu s tim, aktivni proteini koji su suštinski homologni roditeljskoj sekvenci, npr. proteini sa 70...80...85...90...95...98...99% itd. identiteta koji zadržavaju željenu aktivnost nativnog molekula, predviđeni su za upotrebu ovde.
[0031] „Nativni“ polipeptid, kao što je polipeptid preživljavanja motornog neurona (SMN), odnosi se na polipeptid koji ima istu aminokiselinsku sekvencu kao odgovarajući molekul dobijen iz prirode. Takve nativne sekvence mogu se izolovati iz prirode ili se mogu proizvesti rekombinantnim ili sintetičkim sredstvima. Termin „nativna“ sekvenca specifično obuhvata prirodno nastale skraćene ili izlučene oblike specifičnog molekula (npr. sekvencu ekstracelularnog domena), prirodno nastale varijantne oblike (npr. alternativno splajsovane oblike) i prirodno nastale alelne varijante polipeptida. Nativni molekuli obelodanjeni ovde mogu biti zrele ili nativne sekvence pune dužine koje obuhvataju aminokiselinske sekvence pune dužine prikazane na priloženim slikama. Međutim, dok neki od molekula obelodanjenih na priloženim slikama počinju sa metioninskim ostacima označenim kao aminokiselinska pozicija 1 na slikama, drugi metioninski ostaci koji se nalaze ili uzvodno ili nizvodno od aminokiselinske pozicije 1 na slikama mogu se koristiti kao početni aminokiselinski ostatak za određeni molekul. Alternativno, u zavisnosti od korišćenog ekspresionog sistema, molekuli opisani ovde mogu da nemaju N-terminalni metionin.
[0032] Pod „varijantom“ se podrazumeva aktivni polipeptid kako je ovde definisano, koji ima najmanje oko 80% identiteta aminokiselinske sekvence sa odgovarajućom nativnom sekvencom pune dužine, polipeptid kome nedostaje signalni peptid, ekstracelularni domen polipeptida, sa ili bez signalnog peptida, ili bilo koji drugi fragment sekvence polipeptida pune dužine kao što je ovde obelodanjeno. Takve polipeptidne varijante uključuju, na primer, polipeptide kod kojih se jedan ili više aminokiselinskih ostataka dodaju, ili brišu, na N- i/ili C-terminusu nativne aminokiselinske sekvence pune dužine. Uobičajeno, varijanta će imati najmanje oko 80% identiteta aminokiselinske sekvence, alternativno najmanje oko 81% identiteta aminokiselinske sekvence, alternativno najmanje oko 82% identiteta aminokiselinske sekvence, alternativno najmanje oko 83% identiteta aminokiselinske sekvence, alternativno najmanje oko 84% identiteta aminokiselinske sekvence, alternativno najmanje oko 85% identiteta aminokiselinske sekvence, alternativno najmanje oko 86% identiteta aminokiselinske sekvence, alternativno najmanje oko 87% identiteta aminokiselinske sekvence, alternativno najmanje oko 88% identiteta aminokiselinske sekvence, alternativno najmanje oko 89% identiteta aminokiselinske sekvence, alternativno najmanje oko 90% identiteta aminokiselinske sekvence, alternativno najmanje oko 91% identiteta aminokiselinske sekvence, alternativno najmanje oko 92% identiteta aminokiselinske sekvence, alternativno najmanje oko 93% identiteta aminokiselinske sekvence, alternativno najmanje oko 94% identiteta aminokiselinske sekvence, alternativno najmanje oko 95% identiteta aminokiselinske sekvence, alternativno najmanje oko 96% identiteta aminokiselinske sekvence, alternativno najmanje oko 97% identiteta aminokiselinske sekvence, alternativno najmanje oko 98% identiteta aminokiselinske sekvence i alternativno najmanje oko 99% identiteta aminokiselinske sekvence sa odgovarajućom nativnom sekvencom pune dužine. Uobičajeno, varijantni polipeptidi su dužine najmanje oko 10 aminokiselina, kao što je najmanje oko 20 aminokiselina, npr. najmanje oko 30 aminokiselina, alternativno najmanje oko 40 aminokiselina, alternativno najmanje oko 50 aminokiselina, alternativno najmanje oko 60 aminokiselina, alternativno najmanje oko 70 aminokiselina, alternativno najmanje oko 80 aminokiselina, alternativno najmanje oko 90 aminokiselina, alternativno najmanje oko 100 aminokiselina, alternativno najmanje oko 150 aminokiselina, alternativno najmanje oko 200 aminokiselina, alternativno najmanje oko 300 aminokiselina, ili više.
[0033] Posebno preferirane varijante uključuju supstitucije koje su konzervativne prirode, tj. one supstitucije koje se dešavaju unutar porodice aminokiselina koje su srodne po svojim bočnim lancima. Specifično, aminokiseline su generalno podeljene u četiri porodice: (1) kisele -- aspartat i glutamat; (2) bazne -- lizin, arginin, histidin; (3) nepolarne -- alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenilalanin, metionin, triptofan; i (4) nejonizovane polarne -- glicin, asparagin, glutamin, cistein, serin, treonin, tirozin. Fenilalanin, triptofan i tirozin se ponekad klasifikuju kao aromatične aminokiseline. Na primer, razumno je predvideti da izolovana zamena leucina sa izoleucinom ili valinom, aspartata sa glutamatom, treonina sa serinom, ili slična konzervativna zamena aminokiseline sa strukturno srodnom aminokiselinom, neće imati veliki uticaj na biološku aktivnost. Na primer, polipeptid od interesa može uključiti do oko 5-10 konzervativnih ili nekonzervativnih aminokiselinskih supstitucija, ili čak do oko 15-25 ili 50 konzervativnih ili nekonzervativnih aminokiselinskih supstitucija, ili bilo koji broj između 5-50, sve dok željena funkcija molekula ostaje netaknuta.
[0034] „Homologija“ se odnosi na procenat identiteta između dve polinukleotidne ili dve polipeptidne celine. Dve DNK ili dve polipeptidne sekvence su „suštinski homologne“ jedna drugoj kada sekvence pokazuju najmanje oko 50%, poželjno najmanje oko 75%, još poželjnije najmanje oko 80%-85%, poželjno najmanje oko 90%, i najpoželjnije najmanje oko 95%-98% identiteta sekvence na definisanoj dužini molekula. Kao što je ovde definisano, suštinski homologno se takođe odnosi na sekvence koje pokazuju potpun identitet sa navedenom DNK ili polipeptidnom sekvencom.
[0035] Generalno, „identitet“ se odnosi na tačnu korespondenciju nukleotida sa nukleotidom ili aminokiseline sa aminokiselinom dve polinukleotidne odnosno polipeptidne sekvence. Procenat identiteta može se odrediti direktnim poređenjem informacija o sekvenci između dva molekula poravnavanjem sekvenci, prebrojavanjem tačnog broja podudarnosti između dve poravnate sekvence, deljenjem sa dužinom kraće sekvence i množenjem rezultata sa 100. Lako dostupni računarski programi mogu se koristiti za pomoć u analizi, kao što su ALIGN, Dayhoff, M.O. u Atlas of Protein Sequence and Structure M.O. Dayhoff ed., 5 Suppl.3:353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, DC, koji prilagođava Smit-Vatermanov algoritam lokalne homologije u Advances in Appl. Math.2:482-489, 1981 za analizu peptida. Programi za određivanje identiteta nukleotidne sekvence dostupni su u paketu za analizu sekvenci Wisconsin Sequence Analysis Package, verzija 8 (dostupno od Genetics Computer Group, Madison, WI), na primer, programi BESTFIT, FASTA i GAP, koji se takođe oslanjaju na Smit-Vatermanov algoritam. Ovi programi se lako koriste sa podrazumevanim parametrima koje preporučuje proizvođač i koji su opisani u gore pomenutom paketu za analizu sekvenci Wisconsin Sequence Analysis Package. Na primer, procenat identiteta određene nukleotidne sekvence u odnosu na referentnu sekvencu može se odrediti korišćenjem Smit-Vatermanovog algoritma homologije sa podrazumevanom tablicom bodovanja i kaznom za prazninu od šest nukleotidnih pozicija.
[0036] Druga metoda uspostavljanja procenta identiteta u kontekstu ovog izuma je korišćenje MPSRCH paketa programa, autorskih prava Univerziteta u Edinburgu, koji su razvili John F. Collins i Shane S. Sturrok, a distribuirala ih je kompanija IntelliGenetics, Inc. (Mountain View, CA). Iz ovog paketa programa može se koristiti Smit-Vatermanov algoritam gde se podrazumevani parametri koriste za tablicu bodovanja (na primer, kazna za otvaranje praznine od 12, kazna za proširenje praznine od jedan i prekid od šest). Iz generisanih podataka, vrednost „Match“ odražava „identitet sekvence“. Drugi odgovarajući programi za izračunavanje procenta identiteta ili sličnosti između sekvenci su opšte poznati u struci, na primer, drugi program za poravnavanje je BLAST, koji se koristi sa podrazumevanim parametrima. Na primer, BLASTN i BLASTP se mogu koristiti sa sledećim podrazumevanim parametrima: genetski kod = standardni; filter = nijedan; lanac = oba; granična vrednost = 60; očekivanje = 10; Matrica = BLOSUM62; Opisi = 50 sekvenci; sortiranje po = NAJVIŠI REZULTAT; Baze podataka = neredundantne, GenBank EMBL DDBJ PDB GenBank CDS translacije Swiss protein Spupdate PIR. Detalji ovih programa su dobro poznati u struci.
[0037] Alternativno, homologija se može odrediti hibridizacijom polinukleotida pod uslovima koji formiraju stabilne duplekse između homolognih regiona, nakon čega sledi digestija nukleazom specifičnom za jednostruki lanac, i određivanje veličine digestiranih fragmenata. DNK sekvence koje su suštinski homologne mogu se identifikovati u eksperimentu Southern hibridizacije pod, na primer, strogim uslovima, kako je definisano za taj određeni sistem. Definisanje odgovarajućih uslova hibridizacije je u okviru veština struke. Videti npr.
Sambrook et al., supra; DNA Cloning, supra; Nucleic Acid Hybridization, supra.
[0038] Pod terminom „degenerisana varijanta“ podrazumeva se polinukleotid koji sadrži promene u svojoj nukleinskoj kiselinskoj sekvenci, a koji kodira polipeptid koji ima istu aminokiselinsku sekvencu kao polipeptid kodiran polinukleotidom iz kojeg je degenerisana varijanta izvedena.
[0039] „Kodirajuća sekvenca“ ili sekvenca koja „kodira“ odabrani polipeptid, je molekul nukleinske kiseline koji se transkribuje (u slučaju DNK) i prevodi (u slučaju mRNK) u polipeptid in vivo kada se stavi pod kontrolu odgovarajućih regulatornih sekvenci. Granice kodirajuće sekvence određene su start kodonom na 5' (amino) kraju i stop kodonom za translaciju na 3' (karboksi) kraju. Sekvenca za terminaciju transkripcije može se nalaziti 3' u odnosu na kodirajuću sekvencu.
[0040] Pod „vektorom“ se podrazumeva bilo koji genetski element, kao što je plazmid, fag, transpozon, kosmid, hromozom, virus, virion, itd. koji je sposoban za replikaciju kada je povezan sa propernim kontrolnim elementima i koji može da prenosi genske sekvence u ćelije. Dakle, termin uključuje klonirajuće i ekspresione nosače, kao i viralne vektore.
[0041] Pod „rekombinantnim vektorom“ se podrazumeva vektor koji uključuje heterolognu nukleinsku kiselinsku sekvencu koja je sposobna za ekspresiju in vivo.
[0042] Pod „rekombinantnim virusom“ se podrazumeva virus koji je genetski izmenjen, npr. dodavanjem ili umetanjem heterolognog nukleinsko-kiselinskog konstrukta u česticu.
[0043] Termin „transgen“ odnosi se na polinukleotid koji se unosi u ćeliju i sposoban je da bude transkribovan u RNK i opcionalno, preveden i/ili eksprimiran pod odgovarajućim uslovima. U jednom aspektu, on daje željenu osobinu ćeliji u koju je unet, ili na drugi način dovodi do željenog terapeutskog ili dijagnostičkog ishoda.
[0044] Termini „genomske čestice (gp)“, ili „genomski ekvivalenti“, kako se koriste u vezi sa viralnim titrom, odnose se na broj viriona koji sadrže rekombinantni AAV DNK genom, bez obzira na infektivnost ili funkcionalnost. Broj genomskih čestica u određenoj vektorskoj pripremi može se meriti postupcima kao što je opisano u primerima ovde, ili na primer, u Clark et al., Hum. Gene Ther. (1999) 10:1031-1039; i Veldwijk et al., Mol. Ther. (2002) 6:272-278.
[0045] Termini „infekciona jedinica (iu)“, „infektivna čestica“ ili „replikaciona jedinica“, kako se koriste u vezi sa viralnim titrom, odnose se na broj infektivnih rekombinantnih AAV vektorskih čestica kako je izmereno testom infektivnog centra, poznatim i kao test replikacionog centra, kao što je opisano, na primer, u McLaughlin et al., J. Virol. (1988) 62:1963-1973.
[0046] Termin „transdukciona jedinica (tu)“ kako se koristi u vezi sa viralnim titrom, odnosi se na broj infektivnih rekombinantnih AAV vektorskih čestica koje rezultiraju proizvodnjom funkcionalnog transgena, kako je izmereno funkcionalnim testovima kao što je opisano u primerima ovde, ili na primer, u Xiao et al., Exp. Neurobiol. (1997) 144:113-124; ili u Fisher et al., J. Virol. (1996) 70:520-532 (LFU test).
[0047] Termin „transfekcija“ se koristi za označavanje preuzimanja strane DNK od strane ćelije, a ćelija je „transfekovana“ kada je egzogena DNK uneta unutar ćelijske membrane. Brojne tehnike transfekcije su opštepoznate u struci. Videti npr. Graham et al. (1973) Virology, 52 :456, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, Davis et al. (1986) Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier i Chu et al. (1981) Gene 13:197. Takve tehnike se mogu koristiti za unošenje jedne ili više egzogenih DNK delova u odgovarajuće ćelije domaćina.
[0048] Termin „heterologan“ kako se odnosi na sekvence nukleinskih kiselina kao što su kodirajuće sekvence i kontrolne sekvence, označava sekvence koje normalno nisu spojene zajedno, i/ili normalno nisu povezane sa određenom ćelijom. Dakle, „heterologni“ region konstrukta nukleinske kiseline ili vektora je segment nukleinske kiseline unutar ili priključen na drugi molekul nukleinske kiseline koji se ne nalazi u vezi sa drugim molekulom u prirodi. Na primer, heterologni region konstrukta nukleinske kiseline može uključivati kodirajuću sekvencu flankiranu sekvencama koje se ne nalaze u vezi sa kodirajućom sekvencom u prirodi. Drugi primer heterologne kodirajuće sekvence je konstrukt gde sama kodirajuća sekvenca nije pronađena u prirodi (npr. sintetičke sekvence sa kodonima različitim od nativnog gena). Slično, ćelija transformisana konstruktom koji normalno nije prisutan u ćeliji smatrala bi se heterogenom za potrebe ovog pronalaska. Alelna varijacija ili prirodno nastali mutacioni događaji ne dovode do heterogene DNK, kako se ovde koristi.
[0049] „Nukleinska kiselina“ sekvenca se odnosi na DNK ili RNK sekvencu. Termin obuhvata sekvence koje uključuju bilo koji od poznatih baznih analoga DNK i RNK kao što su, ali nisu ograničeni na 4-acetilcitozin, 8-hidroksi-N6-metiladenozin, aziridinilcitozin, pseudoisocitozin, 5-(karboksihidroksil-metil) uracil, 5-fluorouracil, 5-bromouracil, 5-karboksimetilaminometil-2-tiouracil, 5-karboksimetil-aminometiluracil, dihidrouracil, inozin, N6-izopenteniladenin, 1-metiladenin, 1-metilpseudo-uracil, 1-metilguanin, 1-metilinozin, 2,2-dimetil-guanin, 2-metiladenin, 2-metilguanin, 3-metil-citozin, 5-metilcitozin, N6-metiladenin, 7-metilguanin, 5-metilaminometiluracil, 5-metoksi-amino-metil-2-tiouracil, beta-D-manozilkveozin, 5'-metoksikarbonilmetiluracil, 5-metoksiuracil, 2-metiltio-N6-izopenteniladenin, uracil-5-oksioctena kiselina metilester, uracil-5-oksioctena kiselina, oksibutoksin, pseudouracil, kveozin, 2-tiocitozin, 5-metil-2-tiouracil, 2-thiouracil, 4-tiouracil, 5-metiluracil, -uracil-5-oksioctena kiselina metilester, uracil-5-oksioctena kiselina, pseudouracil, kveozin, 2-tiocitozin, i 2,6-diaminopurin.
[0050] Termin DNK „kontrolne sekvence“ se kolektivno odnosi na promoterske sekvence, poliadenilacione signale, transkripcione terminacione sekvence, uzvodne regulatorne domene, porekla replikacije, unutrašnje mesto ulaska ribozoma („IRES“), pojačivače, i slično, koji kolektivno obezbeđuju replikaciju, transkripciju i translaciju kodirajuće sekvence u ćeliji primaocu. Nisu sve ove kontrolne sekvence uvek prisutne sve dok odabrana kodirajuća sekvenca može da se replicira, transkribuje i prevede u odgovarajućoj ćeliji domaćinu.
[0051] Termin „promoter“ se ovde koristi u svom uobičajenom smislu za označavanje nukleotidnog regiona koji obuhvata DNK regulatornu sekvencu, pri čemu je regulatorna sekvenca izvedena iz gena koji je sposoban da veže RNK polimerazu i inicira transkripciju nizvodne (3'-smer) kodirajuće sekvence. Promoteri transkripcije mogu uključivati „inducibilne promotere“ (gde je ekspresija polinukleotidne sekvence operativno povezane sa promoterom indukovana analitom, kofaktorom, regulatornim proteinom, itd.), „represibilne promotere“ (gde je ekspresija polinukleotidne sekvence operativno povezane sa promoterom indukovana analitom, kofaktorom, regulatornim proteinom, itd.), i „konstitutivne promotere“.
[0052] „Operativno povezan“ odnosi se na raspored elemenata gde su komponente tako opisane konfigurisane tako da obavljaju svoju uobičajenu funkciju. Dakle, kontrolne sekvence operativno povezane sa kodirajućom sekvencom su sposobne da utiču na ekspresiju kodirajuće sekvence. Kontrolne sekvence ne moraju biti susedne kodirajućoj sekvenci, sve dok funkcionišu da usmeravaju njenu ekspresiju. Tako, na primer, intervenišuće netranslatovane, ali transkribovane sekvence mogu biti prisutne između promoterske sekvence i kodirajuće sekvence i promoterska sekvenca se i dalje može smatrati „operativno povezanom“ sa kodirajućom sekvencom.
[0053] Termin „nervni sistem“ uključuje i centralni nervni sistem i periferni nervni sistem. Termin „centralni nervni sistem“ ili „CNS“ uključuje sve ćelije i tkivo mozga i kičmene moždine kičmenjaka. Termin „periferni nervni sistem“ odnosi se na sve ćelije i tkivo dela nervnog sistema izvan mozga i kičmene moždine. Dakle, termin „nervni sistem“ uključuje, ali nije ograničen na, neuronske ćelije, glijalne ćelije, astrocite, ćelije u cerebrospinalnoj tečnosti (CSF), ćelije u intersticijumskim prostorima, ćelije u zaštitnim omotačima kičmene moždine, epiduralne ćelije (tj. ćelije izvan dure mater), ćelije u ne-neuralnim tkivima susednim ili u kontaktu sa nervnim tkivom ili inervisane nervnim tkivom, ćelije u epineurijumu, perineurijumu, endoneurijumu, funikulusima, fascikulima i slično.
[0054] „Aktivni“ ili „aktivnost“ za potrebe predmetnog pronalaska odnosi se na oblike terapeutskog proteina koji zadržavaju biološku aktivnost odgovarajućeg nativnog ili prirodno prisutnog polipeptida. Aktivnost može biti veća od, jednaka ili manja od one koja se primećuje kod odgovarajućeg nativnog ili prirodno prisutnog polipeptida.
[0055] Pod „izolovanim“ kada se odnosi na nukleotidnu sekvencu, podrazumeva se da je naznačeni molekul prisutan u suštinskom odsustvu drugih bioloških makromolekula istog tipa. Dakle, „izolovani molekul nukleinske kiseline koji kodira određeni polipeptid“ odnosi se na molekul nukleinske kiseline koji je suštinski oslobođen drugih molekula nukleinske kiseline koji ne kodiraju predmetni polipeptid; međutim, molekul može uključivati neke dodatne baze ili delove koji ne utiču štetno na osnovne karakteristike kompozicije.
[0056] Za svrhu opisivanja relativnog položaja nukleotidnih sekvenci u određenom molekulu nukleinske kiseline kroz celu ovu prijavu, kao što je kada se određena nukleotidna sekvenca opisuje kao locirana „uzvodno“, „nizvodno“, „3-prim (3')“ ili „5-prim (5')“ u odnosu na drugu sekvencu, podrazumeva se da se odnosi na položaj sekvenci u „smislenom“ ili „kodirajućem“ lancu DNK molekula, kao što je konvencionalno u struci.
[0057] Termin „oko“, posebno u vezi sa datom količinom, znači da obuhvata odstupanja od plus ili minus pet procenata.
[0058] Termini „subjekat“, „pojedinac“ ili „pacijent“ se ovde koriste međusobno zamenljivo i odnose se na kičmenjaka, poželjno sisara. Sisari uključuju, ali nisu ograničeni na, miševe, glodare, simijane, ljude, domaće životinje, životinje za sport i kućne ljubimce.
[0059] Termin „modulisati“ kako se ovde koristi znači varirati količinu ili intenzitet efekta ili ishoda, npr. poboljšati, pojačati, smanjiti, redukovati ili eliminisati.
[0060] Kako se ovde koristi, termin „ameliorirati“ je sinonim sa „ublažiti“ i znači redukovati ili olakšati. Na primer, može se ublažiti simptom bolesti tako što se bolest ili simptomi čine manje ozbiljnim.
[0061] Termini „terapijski“, „efikasna količina“ ili „terapijski efikasna količina“ kompozicije ili sredstva, kako je ovde obezbeđeno, odnose se na dovoljnu količinu kompozicije ili sredstva da obezbedi željeni odgovor, kao što je prevencija, odlaganje početka ili amelioracija simptoma kod subjekta ili postizanje željenog biološkog ishoda, kao što je korekcija neuropatologije, npr. ćelijske patologije povezane sa motornom neuronskom bolešću kao što je spinalna mišićna atrofija (SMA). Termin „terapijska korekcija“ odnosi se na onaj stepen korekcije koji rezultira prevencijom ili odlaganjem početka ili amelioracijom simptoma kod subjekta. Tačna potrebna količina će varirati od subjekta do subjekta, u zavisnosti od vrste, starosti i opšteg stanja subjekta, ozbiljnosti stanja koje se tretira, i određenog makromolekula od interesa, načina primene, i slično. Odgovarajuća „efikasna“ količina u bilo kom pojedinačnom slučaju može se odrediti od strane stručnjaka u ovoj oblasti korišćenjem rutinskog eksperimentisanja.
[0062] „Tretman“ ili „tretirati“ određene bolesti uključuje: (1) sprečavanje bolesti, tj. sprečavanje razvoja bolesti ili uzrokovanje da se bolest javi sa manjim intenzitetom kod subjekta koji može biti izložen ili predisponiran bolesti ali još uvek ne doživljava ili ne ispoljava simptome bolesti, (2) inhibiranje bolesti, tj. zaustavljanje razvoja ili preokretanje stanja bolesti, ili (3) ublažavanje simptoma bolesti, tj. smanjenje broja simptoma koje doživljava subjekat, kao i promenu ćelijske patologije povezane sa bolešću.
2. NAČINI SPROVOĐENJA PRONALASKA I OBELODANJIVANJE
[0063] Pre detaljnog opisivanja predmetnog pronalaska, treba razumeti da ovaj pronalazak nije ograničen na određene formulacije ili procesne parametre jer se oni, naravno, mogu razlikovati. Takođe treba razumeti da je terminologija korišćena ovde samo u svrhu opisivanja određenih otelotvorenja pronalaska, i nema nameru da bude ograničavajuća.
Pronalazak je izložen u priloženim patentnim zahtevima.
[0064] Iako se brojne metode i materijali slični ili ekvivalentni onima opisanim ovde mogu koristiti u praksi predmetnog pronalaska, preferirani materijali i metode su opisani ovde.
[0065] Centralno za predmetni pronalazak je otkriće da je isporuka rAAV viriona koji sadrže humani kDNK gena za preživljavanje motornog neurona 1 (hSMN1) u CNS agresivnog mišjeg modela spinalne mišićne atrofije (SMA), proizvela ekspresiju SMN1 širom kičmene moždine. Tretrirani SMA miševi sadržali su veći broj motornih neurona u poređenju sa netretiranim mutantima iste starosti. Pored toga, procena veličine miofibera pokazala je da se veličina pojedinačnih miofibera iz različitih mišićnih grupa kod tretiranih SMA miševa približila onoj koja je primećena kod miševa divljeg tipa. Nadalje, struktura neuromuskularnog spoja (NMJ) kod tretiranih SMA miševa bila je slična onoj kod miševa divljeg tipa, što je bilo u suprotnosti sa netretiranim SMA miševima koji su pokazivali abnormalnu akumulaciju neurofilament proteina na presinaptičkim terminalima. Tretirani SMA miševi su takođe pokazali značajna poboljšanja na nizu bihevioralnih testova, sugerišući da je NMJ bio funkcionalan. Važno je da su miševi tretirani rekombinantnim AAV imali značajno povećan životni vek u poređenju sa njihovim netretiranim pandanima. SMA miševi tretirani samokomplementarnim rAAV vektorom takođe su pokazali izvanredno poboljšanje u medijani preživljavanja, čak i u poređenju sa tretmanom konvencionalnim, nesamokomplementarnim rAAV vektorima.
[0066] Ovi rezultati pokazuju da je AAV-posredovano gensko augmentiranje SMN1 usmereno na CNS visoko efikasno u rešavanju i neuronskih i mišićnih patologija SMA i dokazuju korisnost viralne genske terapije kao terapeutske strategije za tretman i prevenciju neuronskih i mišićnih patologija, kao što su SMA, kao i druge bolesti koje utiču na motoričku funkciju. Genske terapijske tehnike opisane ovde mogu se primeniti same, ili u kombinaciji sa tradicionalnim lekovima.
[0067] Da bi se dodatno razumelo pronalazak, detaljnija diskusija je data u nastavku u vezi sa patologijama motornih neurona i terapeutskim molekulima, kao i različitim metodama isporuke gena za upotrebu sa predmetnim pronalaskom.
Patologije motornih neurona i terapeutski molekuli
[0068] Ovde su obelodanjene kompozicije i metode za modulaciju, korekciju ili augmentaciju motoričke funkcije kod subjekta pogođenog poremećajem motornih neurona ili oštećenjem motornih neurona. Isključivo radi ilustracije, subjekat može patiti od jednog ili više sledećih stanja: spinalna mišićna atrofija (SMA), amiotrofična lateralna skleroza (ALS), spinalna bulbarna mišićna atrofija, spinalna cerebelarna ataksija, primarna lateralna skleroza (PLS) ili traumatska povreda kičmene moždine. Pronalazak se odnosi na komplet za upotrebu u tretmanu SMA kod subjekta, kao što je definisano u patentnim zahtevima. Ne obavezujući se na određenu teoriju, patologija povezana sa oštećenjem motornih neurona može uključivati degeneraciju motornih neurona, gliozu, abnormalnosti neurofilamenata, gubitak mijelinizovanih vlakana u kortikospinalnim putevima i ventralnim korenima. Na primer, prepoznata su dva tipa početka -- bulbarni početak, koji pogađa gornje motorne neurone (motorni neuroni kore i moždanog stabla), utiče na mišiće lica, govor i gutanje; i početak u udovima, koji pogađa donje motorne neurone (motorni neuroni kičmene moždine), ogleda se u spastičnosti, generalizovanoj slabosti, mišićnoj atrofiji, paralizi i respiratornoj insuficijenciji. Kod ALS, subjekti imaju i bulbarni početak i početak u udovima. Kod PLS, subjekti imaju samo bulbarni početak.
[0069] Dakle, na subjektu se mogu primeniti rAAV konstrukti koji kodiraju biološki aktivan molekul, čija ekspresija u CNS rezultira barem delimičnom korekcijom neuropatologije i/ili stabilizacijom progresije bolesti, kao što je prevencija, odlaganje početka ili amelioracija simptoma kod subjekta ili postizanje željenog biološkog ishoda, uključujući, na primer, promenu u ćelijskoj patologiji povezanoj sa gore opisanom bolešću motornih neurona.
[0070] Na primer, transgen prisutan u rAAV konstruktu obelodanjenom ovde može biti, ali nije ograničen na, protein preživljavanja motornog neurona (putem SMN1 gena ili SMN2 gena), insulinu sličan faktor rasta 1 (IGF-1), kalbindin D28, parvalbumin, HIF1-alfa, SIRT-2, VEGF kao što je VEGF165, CNTF (cilijarni neurotrofni faktor), sonični jež (shh), eritropoietin (EPO), lizil oksidaza (LOX), progranulin, prolaktin, grelin, neuroserpin, angiogenin i placentni laktogen.
[0071] Molekulska osnova SMA, autosomno recesivnog neuromuskularnog poremećaja, je homozigotni gubitak gena za preživljavanje motornog neurona 1 (SMN1), koji može biti poznat i kao SMN telomerni gen. Gotovo identična kopija SMN1 gena, nazvana SMN2, koja može biti poznata i kao SMN centromerni gen, nalazi se kod ljudi i modulira težinu bolesti. Ekspresija normalnog SMN1 gena rezultira isključivo ekspresijom proteina preživljavanja motornog neurona (SMN). Ekspresija SMN2 gena rezultira sa približno 10-20% SMN proteina i 80-90% nestabilnog/nefunkcionalnog SMNdelta7 proteina. Samo 10% SMN2 transkripta kodira funkcionalan protein pune dužine identičan SMN1. Ova funkcionalna razlika između oba gena proizlazi iz translaciono tihe mutacije koja, međutim, ometa egzonski splicing pojačivač, uzrokujući preskakanje egzona 7 u većini SMN2 transkripta. SMN protein igra dobro utvrđenu ulogu u sklapanju splajsozoma i može takođe posredovati transport mRNK u aksonu i nervnom završetku neurona.
[0072] Nukleotidne i aminokiselinske sekvence različitih SMN1 molekula i SMN proteina su poznate. Videti, na primer, slike 9A-9B; NCBI pristupni brojevi NM_000344 (čovek), NP_000335 (čovek), NM_011420 (miš), EU 791616 (svinja), NM_001131470 (orangutan), NM_131191 (zebra), BC062404 (pacov), NM_001009328 (mačka), NM_001003226 (pas), NM_175701 (krava). Slično, poznate su različite SMN2 sekvence. Videti npr. NCBI pristupni brojevi NM_022876, NM_022877, NM_017411, NG_008728, BC_000908, BC070242, DQ185039 (svi humani). U pronalasku, polinukleotid kodira SMN protein koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu sa najmanje 90% identiteta sekvence sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 2
[0073] Insulinu sličan faktor rasta 1 (IGF-I) je terapeutski protein za tretman neurodegenerativnih poremećaja, uključujući poremećaje motornih neurona, zbog svojih brojnih dejstava na različitim nivoima neuraksisa (videti Dore et al., Trends Neurosci (1997) 20:326-331). Na primer, u mozgu se smatra da redukuje i neuronsku i glijalnu apoptozu, štiti neurone od toksičnosti izazvane gvožđem, kolhicinom, destabilizatorima kalcijuma, peroksidima i citokinima. Takođe se čini da modulira oslobađanje neurotransmitera acetilholina i glutamata i indukuje ekspresiju neurofilamenata, tubulina i mijelin baznog proteina. U kičmenoj moždini, veruje se da IGF-I modulira ChAT aktivnost i ublažava gubitak holinergičkog fenotipa, pojačava izrastanje motornih neurona, povećava mijelinizaciju, inhibira demijelinizaciju, stimuliše proliferaciju i diferencijaciju motornih neurona iz prekursorskih ćelija, i promoviše deobu, sazrevanje i rast Švanovih ćelija. U mišićima, IGF-I se čini da indukuje formiranje klastera acetilholinskih receptora na neuromuskularnom spoju i povećava neuromuskularnu funkciju i mišićnu snagu.
[0074] Gen IGF-1 ima složenu strukturu, koja je dobro poznata u struci. Ima najmanje dva alternativno splajsovana mRNK produkta koji nastaju iz genskog transkripta. Postoji peptid od 153 aminokiseline, poznat pod nekoliko imena uključujući IGF-IA ili IGF-IEa, i peptid od 195 aminokiselina, poznat pod nekoliko imena uključujući IGF-IB ili IGF-IEb. Eb oblik je takođe poznat kao Ec kod ljudi. Zreli oblik IGF-I je polipeptid od 70 aminokiselina. I IGF-IEa i IGF-IEb sadrže zreli peptid od 70 aminokiselina, ali se razlikuju po sekvenci i dužini svojih karboksil-terminalnih ekstenzija. Proteini IGF-1, kao i peptidne sekvence IGF-IEa i IGF-IEb su poznati i opisani u npr. Međunarodnoj publikaciji br. WO 2007/146046.
[0075] Genomska i funkcionalna kDNK humanog IGF-I, kao i dodatne informacije u vezi sa genom IGF-I i njegovim produktima, dostupne su pod Unigene pristupnim br. NM_000618.
[0076] Kalbindin D28K (takođe se naziva kalbindin D28) i parvalbumin su proteini koji vezuju kalcijum za koje se veruje da su uključeni u puferovanje kalcijuma. Ne obavezujući se na određenu teoriju, homeostaza kalcijuma se čini izmenjenom kod subjekata sa poremećajima motornih neurona (npr. ALS) i niski nivoi kalbindina-D28K i/ili parvalbumina mogu povećati ranjivost motornih neurona redukujući njihovu sposobnost da se nose sa povećanim opterećenjem kalcijuma. Ova redukcija može dovesti do oštećenja ćelija i eventualne smrti motornih neurona. Dalji dokazi sugerišu da su neuroni bogati proteinima koji vezuju kalcijum, kao što su kalbindin D28K i parvalbumin, otporni na degeneraciju.
[0077] HIF-I je heterodimerni protein sastavljen od dve podjedinice: (i) konstitutivno eksprimirane β podjedinice, poznate i kao aril ugljovodonični nuklearni translokator (ARNT) (koja je zajednička sa drugim srodnim faktorima transkripcije (npr. dioksin/aril ugljovodonični receptor (DR/AhR))); i (ii) α podjedinice (videti npr. Međunarodnu publikaciju br. WO 96/39426, koja opisuje nedavno prečišćavanje afinitetom i molekularno kloniranje HIF-Iα). Obe podjedinice su članovi osnovne heliks-petlja-heliks (bHLH)-PAS porodice faktora transkripcije. Ovi domeni regulišu vezivanje za DNK i dimerizaciju.
Transaktivacioni domen se nalazi u C-terminusu proteina. Osnovni region se sastoji od približno 15 pretežno baznih aminokiselina odgovornih za direktno vezivanje za DNK. Ovaj region je susedan dvema amfipatičnim α-heliksima, razdvojenim petljom promenljive dužine, koja formira primarni interfejs dimerizacije između članova porodice (Moore, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000) 97:10436-10441). PAS domen obuhvata 200-300 aminokiselina koje sadrže dva labavo konzervirana, uglavnom hidrofobna regiona od približno 50 aminokiselina, označena PAS A i PAS B. Podjedinica HIF-Iα je nestabilna tokom normoksičnih uslova, prekomerna ekspresija ove podjedinice u kultivisanim ćelijama pod normalnim nivoima kiseonika sposobna je da indukuje ekspresiju gena koji se normalno indukuju hipoksijom. Zamena C-terminalnog (ili transaktivacionog) regiona proteina hipoksijom indukovanog faktora jakim transaktivacionim domenom iz transkripcionog aktivacionog proteina kao što je, na primer, Herpes Simplex Virus (HSV) VP16, NFκB ili kvasni transkripcioni faktori GAL4 i GCN4, dizajnirana je da stabilizuje protein pod normoksičnim uslovima i obezbedi snažnu, konstitutivnu, transkripcionu aktivaciju. Videti npr. Međunarodnu publikaciju br. WO 2008/042420 za opis i sekvencu reprezentativnog stabilizovanog proteina hipoksijom indukovanog faktora koji je hibridni/himerični fuzioni protein koji se sastoji od domena za vezivanje za DNK i dimerizaciju iz HIF-1α i transaktivacionog domena iz HSV VP16 proteina.
[0078] Videti takođe američke patente br.6,432,927 i 7,053,062 za opis konstitutivno stabilnog hibridnog HIF-Iα.
[0079] Članovi porodice vaskularnog endotelnog faktora rasta (VEGF) su među najmoćnijim modulatorima vaskularne biologije. Oni regulišu vaskulogenezu, angiogenezu i vaskularno održavanje. Opisane su četiri različite molekulske varijante VEGF. Varijanta od 165 aminokiselina je dominantni molekulski oblik pronađen u normalnim ćelijama i tkivima. Manje zastupljen, kraći oblik sa brisanjem 44 aminokiseline između pozicija 116 i 159 (VEGF121), duži oblik sa umetanjem 24 bazna ostatka na poziciji 116 (VEGF189), i drugi duži oblik sa umetanjem 41 aminokiseline (VEGF206), koji uključuje umetanje 24 aminokiseline pronađenu u VEGF189, takođe su poznati. VEGF121i VEGF165su rastvorljivi proteini.
VEGF189i VEGF206se uglavnom čine ćelijski vezanim. Sve verzije VEGF su biološki aktivne. Videti npr. Tischer et al., J. Biol. Chem. (1991) 266:11947-11954, koji opisuje sekvencu VEGF165(videti takođe GenBank pristupni br. AB021221), VEGF121(videti takođe GenBank pristupni br. AF214570) i VEGF189; i Houck et al., Mol. Endocrinol. (1991) 5:1806-1814, koji opisuje sekvencu VEGF206.
[0080] CNTF (cilijarni neurotrofni faktor) je neurocitokin eksprimiran od strane glijalnih ćelija u perifernim nervima i centralnom nervnom sistemu. CNTF je generalno prepoznat po svojoj funkciji u podršci i preživljavanju neurona i ne-neuronskih ćelijskih tipova. Videti npr. Vergara, C and Ramirez, B; Brain Res, Brain Res. Rev. (2004) 47: 161-73.
[0081] Sonični jež (Shh) kontroliše važne razvojne procese, uključujući preživljavanje neuronskih i glijalnih ćelija.
[0082] Eritropoietin (EPO) je glavni regulator eritroidnih progenitor ćelija. Međutim, funkcionalno je eksprimiran u nervnom sistemu i prijavljeno je da ima neuroprotektivne efekte. Videti npr. Bartesaghi, S., 2005. Neurotoxicology, 26:923-8. Geni koji kodiraju humani i druge sisarske EPO su klonirani, sekvencionirani i eksprimirani, i pokazuju visok stepen homologije sekvence u kodirajućem regionu između vrsta. Wen et al., Blood (1993) 82:1507-1516. Sekvenca gena koji kodira nativni humani EPO, kao i metode za njegovo dobijanje, opisani su u npr. američkim patentima br.4,954,437 i 4,703,008, kao i u Jacobs et al. (1985) Nature 313:806-810; Lin et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:7580;
Međunarodnoj publikaciji br. WO 85/02610; i Evropskoj patentnoj publikaciji br.232,034 B1. Pored toga, sekvence gena koji kodiraju nativni mačji, pseći i svinjski EPO su poznate i lako dostupne (GenBank pristupni br.: L10606; L13027; i L10607, respektivno), a sekvenca gena koji kodira majmunski (Macaca mulatta) je takođe poznata i dostupna (GenBank pristupni br.: L10609).
[0083] Lizil oksidaza (LOX) oksiduje bočni lanac peptidil lizina, čime pretvara određene lizinske ostatke u alfa-aminoadipinsko-delta-semialdehid. Ovo je post-translaciona promena koja, na primer, omogućava kovalentno umrežavanje komponentnih lanaca kolagena i elastina. Ona stabilizuje vlaknaste depozite ovih proteina u ekstracelularnom matriksu. LOX takođe može oksidovati lizin unutar različitih katjonskih proteina, što sugeriše da su njegove funkcije šire od stabilizacije ili ekstracelularnog matriksa. LOX se sintetiše kao preprotein; izlazi iz ćelije kao proLOX i proteolitički se obrađuje u aktivni enzim. Videti npr. Lucero, HA and Kagan, HM, Cell MoI. Life Sci. (2006) 63:2304-2316.
[0084] Progranulin (PGRN) je pleitropni protein. Mutacije u genu uzrokuju frontotemporalnu lobarnu degeneraciju. PGRN u CNS je eksprimiran od strane mikroglije i neurona i igra ulogu u razvoju mozga. PGRN je takođe uključen u više procesa „modelovanja tkiva“, uključujući razvoj, zaceljivanje rana i tumorogenezu. PGRN se pretvara u granulin (GRN) pomoću enzima elastaze. Dok progranulin ima trofička svojstva, GRN su više slični inflamatornim medijatorima. Studije ekspresije gena iz životinjskih modela CNS bolesti pokazuju diferencijalno povećanje PRGN u kombinaciji sa aktivacijom mikroglije i upalom. Povećanje ekspresije PGRN može biti usko povezano sa aktivacijom mikroglije i neuroinflamacijom. Štaviše, ekspresija PGRN je povećana u aktiviranoj mikrogliji kod mnogih neurodegenerativnih bolesti, uključujući bolest motornih neurona i Alchajmerovu bolest. Studije su identifikovale mutacije u PGRN kao uzrok neurodegenerativnih bolesti i ukazuju na važnost funkcije PGRN za preživljavanje neurona.
[0085] Oligodendrociti, mijelinizujuće ćelije CNS, nastavljaju da se generišu od strane oligodendrocitnih prekursorskih ćelija (OPC) tokom celog odraslog doba i potrebni su za intrinzičnu popravku oštećenja mijelina u odraslom CNS. Fiziološki događaji koji moduliraju proliferaciju OPC i generisanje novih mijelinizujućih oligodendrocita u odraslom CNS uglavnom su poznati. Nedavno je objavljeno da pacijenti sa multiplom sklerozom (MS), demijelinizujućom bolešću, imaju smanjenu stopu relapsa tokom trećeg trimestra trudnoće, što sugeriše da hormoni utiču na generisanje oligodendrocita. Remisija kod pacijenata obolelih od MS je u korelaciji sa smanjenjem broja i veličine aktivnih lezija bele mase.
Trudnoća kod miševa rezultira povećanjem generisanja novih oligodendrocita i broja mijelinizovanih aksona unutar majčinog CNS (Gregg et al., J. Neurosci. (2007) 27:1812-1823). Prolaktin, hormon koji dostiže plato tokom završne faze trudnoće, pokazano je da reguliše proliferaciju OPC tokom trudnoće i promoviše popravku bele mase kod neplodnih ženki miševa (Gregg et al., J. Neurosci. (2007) 27:1812-1823).
[0086] Humani placentni laktogen (hPL), hormon koji takođe dostiže vrhunac tokom trećeg trimestra trudnoće, može imati sličan uticaj na generisanje oligodendrocita. hPL ima niz bioloških aktivnosti koje su kvalitativno slične humanom hormonu rasta (hGH) i prolaktinu i čini se da je glavni regulator proizvodnje IGF-I. I hGH i IGF-I su pokazano da su stimulatori mijelinizacije u odraslom CNS (Carson et al., Neuron (1993) 10:729-740; Peltwon et al., Neurology (1977) 27:282-288). Stoga, tretman CNS bolesti koje uključuju demijelinizaciju, kao što su MS, ALS, moždani udar i povreda kičmene moždine, može imati koristi od terapija zasnovanih na PRL ili hPL, kao što je intraventrikularna injekcija rhPRL ili virusnog vektora koji eksprimira hPL.
[0087] Grelin je želudačni hormon koji je medijator oslobađanja hormona rasta. Videti npr. Wu, et al., Ann. Surg. (2004) 239:464.
[0088] Neuroserpin je član porodice serpin proteaznih inhibitora. U određenim stanjima CNS, neuroserpin može igrati neuroprotektivnu ulogu potencijalno putem blokiranja efekata tPA. Videti npr. Galliciotti, G and Sonderegger, P, Front Biosci (2006) 11:33; Simonin, et al., (2006) 26:10614; Miranda, E and Lomas, DA, Cell MoI Life Sci (2006) 63:709.
[0089] Angiogenin je član RNKaze superfamilije. On je normalni konstituent cirkulacije, ali je takođe impliciran kao faktor rizika kod poremećaja motornih neurona.
[0090] U određenim kompozicijama i metodama obelodanjenim ovde, više od jednog transgena koji kodira više od jednog gore opisanog terapeutskog molekula može se isporučiti, pri čemu je svaki transgen operativno povezan sa promoterom kako bi se omogućila ekspresija transgena iz jednog AAV vektora. U dodatnim metodama, transgeni mogu biti operativno povezani sa istim promoterom. Svaki transgen kodira biološki aktivan molekul, čija ekspresija u CNS rezultira barem delimičnom korekcijom neuropatologije. Dodatno, u slučajevima kada se isporučuje više od jednog transgena, transgeni se mogu isporučiti putem više od jednog AAV vektora, pri čemu svaki AAV vektor obuhvata transgen operativno povezan sa promoterom.
[0091] Nativni molekuli, kao i aktivni fragmenti i analozi istih, koji zadržavaju željenu biološku aktivnost, kako je izmereno u bilo kojem od različitih testova i životinjskih modela uključujući one opisane dalje ovde, namenjeni su za upotrebu kako je ovde obelodanjeno.
[0092] Polinukleotidi koji kodiraju željeni protein za upotrebu sa predmetnim pronalaskom mogu se napraviti korišćenjem standardnih tehnika molekularne biologije. Na primer, polinukleotidne sekvence koje kodiraju gore opisane molekule mogu se dobiti korišćenjem rekombinantnih metoda, kao što je skrining kDNK i genomskih biblioteka iz ćelija koje eksprimiraju gen, ili izvođenjem gena iz vektora za koji se zna da ga sadrži. Gen od interesa se takođe može proizvesti sintetički, umesto kloniran, na osnovu poznatih sekvenci. Molekuli se mogu dizajnirati sa odgovarajućim kodonima za određenu sekvencu. Kompletna sekvenca se zatim sastavlja iz preklapajućih oligonukleotida pripremljenih standardnim metodama i sastavlja u kompletnu kodirajuću sekvencu. Videti npr. Edge, Nature (1981) 292:756;
Nambair et al., Science (1984) 223:1299; i Jay et al., J. Biol. Chem. (1984) 259:6311.
[0093] Dakle, određene nukleotidne sekvence se mogu dobiti iz vektora koji sadrže željene sekvence ili sintetizovati potpuno ili delimično korišćenjem različitih tehnika sinteze oligonukleotida poznatih u struci, kao što su mutageneza usmerena na mesto i tehnike lančane reakcije polimeraze (PCR) gde je to prikladno. Videti npr. Sambrook, supra. Jedna metoda dobijanja nukleotidnih sekvenci koje kodiraju željene sekvence je hibridizacijom komplementarnih skupova preklapajućih sintetičkih oligonukleotida proizvedenih u konvencionalnom, automatizovanom polinukleotidnom sintetizatoru, nakon čega sledi ligacija odgovarajućim DNK ligazom i amplifikacija ligovane nukleotidne sekvence putem PCR. Videti npr. Jayaraman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991) 88:4084-4088.
Dodatno, oligonukleotidno-usmerena sinteza (Jones et al., Nature (1986) 54:75-82), oligonukleotidno-usmerena mutageneza postojećih nukleotidnih regiona (Riechmann et al., Nature (1988) 332:323-327 i Verhoeyen et al., Science (1988) 239:1534-1536), i enzimsko popunjavanje praznih oligonukleotida korišćenjem T4 DNK polimeraze (Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1989) 86:10029-10033) mogu se koristiti za obezbeđivanje molekula za upotrebu u predmetnim metodama.
[0094] Kada se proizvedu, konstrukti se isporučuju korišćenjem rekombinantnih virusnih vektora kao što je detaljnije opisano u nastavku.
AAV Tehnike isporuke gena
[0095] Konstrukti opisani gore mogu se primeniti na subjektu korišćenjem bilo koje od nekoliko rAAV tehnika isporuke gena. Nekoliko AAV-posredovanih metoda za isporuku gena poznato je u struci. Kao što je detaljnije opisano u nastavku, geni se mogu isporučiti direktno subjektu ili, alternativno, primeniti ex vivo, na odgovarajuće ćelije, kao što su ćelije dobijene od subjekta, a ćelije se ponovo implantiraju u subjekt.
[0096] Razvijeni su različiti AAV vektorski sistemi za isporuku gena. AAV vektori se mogu lako konstruisati korišćenjem tehnika dobro poznatih u struci. Videti npr. američke patente br.
5,173,414 i 5,139,941; Međunarodne publikacije br. WO 92/01070 (objavljene 23. januara 1992.) i WO 93/03769 (objavljene 4. marta 1993.); Lebkowski et al., Molec. Cell. Biol.
(1988) 8:3988-3996; Vincent et al., Vaccines 90 (1990) (Cold Spring Harbor Laboratory Press); Carter, B.J. Current Opinion in Biotechnology (1992) 3:533-539; Muzyczka, N.
Current Topics in Microbiol. and Immunol. (1992) 158:97-129; Kotin, R.M. Human Gene Therapy (1994) 5:793-801; Shelling and Smith, Gene Therapy (1994) 1:165-169; i Zhou et al., J. Exp. Med. (1994) 179:1867-1875. AAV vektorski sistemi su takođe detaljnije opisani u nastavku.
[0097] AAV genom je linearni, jednolančani DNK molekul koji sadrži oko 4681 nukleotid. AAV genom generalno obuhvata unutrašnji, neponavljajući genom flankiran na svakom kraju invertovanim terminalnim ponavljanjima (ITR). ITR su dužine približno 145 baznih parova (bp). ITR imaju više funkcija, uključujući obezbeđivanje porekla replikacije DNK i signala pakovanja za viralni genom. Unutrašnji neponavljajući deo genoma uključuje dva velika otvorena okvira čitanja, poznata kao AAV replikacioni (rep) i kapsidni (cap) geni Rep i cap geni kodiraju viralne proteine koji omogućavaju virusu da se replicira i pakuje u virion.
Posebno, porodica od najmanje četiri viralna proteina je eksprimirana iz AAV rep regiona: Rep 78, Rep 68, Rep 52 i Rep 40, nazvani prema njihovoj prividnoj molekulskoj težini. AAV cap region kodira najmanje tri proteina: VP1, VP2 i VP3.
[0098] AAV je genetski modifikovan za isporuku gena od interesa brisanjem unutrašnjeg neponavljajućeg dela AAV genoma (tj. rep i cap gena) i umetanjem heterolognog gena između ITR. Heterologni gen je tipično funkcionalno povezan sa heterolognim promoterom (konstitutivnim, ćelijski-specifičnim ili inducibilnim) sposobnim da pokrene ekspresiju gena u ciljnim ćelijama pacijenta pod odgovarajućim uslovima. Primeri svakog tipa promotera su dobro poznati u struci. Signalni termini, kao što su poliadenilaciona mesta, takođe se mogu uključiti.
[0099] AAV je virus zavisnik od pomoćnog virusa; to jest, zahteva koinfekciju sa pomoćnim virusom (npr. adenovirusom, herpesvirusom ili vakcinia virusom), kako bi formirao AAV virione. U odsustvu koinfekcije sa pomoćnim virusom, AAV uspostavlja latentno stanje u kojem se viralni genom ubacuje u hromozom ćelije domaćina, ali infektivni virioni se ne proizvode. Naknadna infekcija pomoćnim virusom „spašava“ integrisani genom, omogućavajući mu da se replicira i pakuje svoj genom u infektivni AAV virion. Dok AAV može inficirati ćelije različitih vrsta, pomoćni virus mora biti iste vrste kao i ćelija domaćin. Tako, na primer, humani AAV će se replicirati u ćelijama pasa koinficiranih adenovirusom pasa.
[0100] Rekombinantni AAV virioni koji obuhvataju gen od interesa mogu se proizvesti korišćenjem različitih tehnika priznatih u struci, detaljnije opisanih u nastavku. Divlji tip AAV i pomoćni virusi mogu se koristiti za obezbeđivanje neophodnih replikativnih funkcija za proizvodnju rAAV viriona (videti npr. američki patent br.5,139,941 ).
[0101] Alternativno, plazmid koji sadrži gene pomoćne funkcije, u kombinaciji sa infekcijom jednim od dobro poznatih pomoćnih virusa, može se koristiti kao izvor replikativnih funkcija (videti npr. američki patent br.5,622,856 i američki patent br.5,139,941 ). Slično, plazmid koji sadrži gene akcesornih funkcija može se koristiti u kombinaciji sa infekcijom divljim tipom AAV, kako bi se obezbedile neophodne replikativne funkcije. Ova tri pristupa, kada se koriste u kombinaciji sa rAAV vektorom, svaki su dovoljni za proizvodnju rAAV viriona.
Drugi pristupi, dobro poznati u struci, takođe se mogu primeniti od strane veštog stručnjaka za proizvodnju rAAV viriona.
[0102] Metoda trostruke transfekcije (detaljno opisana u američkom patentu br.6,001,650) može se koristiti za proizvodnju rAAV viriona jer ova metoda ne zahteva upotrebu infektivnog pomoćnog virusa, omogućavajući proizvodnju rAAV viriona bez prisustva bilo kakvog detektabilnog pomoćnog virusa. Ovo se postiže upotrebom tri vektora za proizvodnju rAAV viriona: AAV vektora pomoćne funkcije, vektora akcesorne funkcije i rAAV ekspresionog vektora. Stručnjak u ovoj oblasti će ceniti, međutim, da nukleotidne sekvence kodirane ovim vektorima mogu biti obezbeđene na dva ili više vektora u različitim kombinacijama.
[0103] Kao što je ovde objašnjeno, AAV vektor pomoćne funkcije kodira sekvence „AAV pomoćne funkcije“ (tj. rep i cap), koje funkcionišu in trans za produktivnu AAV replikaciju i enkapsidaciju. Poželjno, AAV vektor pomoćne funkcije podržava efikasnu proizvodnju AAV vektora bez generisanja bilo kakvih detektabilnih wt AAV viriona (tj. AAV viriona koji sadrže funkcionalne rep i cap gene). Primer takvog vektora, pHLP19, opisan je u američkom patentu br. 6,001,650.
[0104] Rep i cap geni AAV vektora pomoćne funkcije mogu biti izvedeni iz bilo kojeg od poznatih AAV serotipova, kao što je gore objašnjeno. Na primer, AAV vektor pomoćne funkcije može imati rep gen izveden iz AAV-2 i cap gen izveden iz AAV-6; stručnjak u ovoj oblasti će prepoznati da su moguće i druge kombinacije rep i cap gena, a definišuća karakteristika je sposobnost da podrže proizvodnju rAAV viriona.
[0105] Vektor akcesorne funkcije kodira nukleotidne sekvence za viralne i/ili ćelijske funkcije koje nisu izvedene iz AAV, od kojih AAV zavisi za replikaciju (tj. „akcesorne funkcije“). Akcesorne funkcije uključuju one funkcije potrebne za AAV replikaciju, uključujući, bez ograničenja, one delove koji su uključeni u aktivaciju transkripcije AAV gena, specifično splajsovanje AAV mRNK u fazi, replikaciju AAV DNK, sintezu cap ekspresionih produkata i sklapanje AAV kapsida. Akcesorne funkcije zasnovane na virusima mogu biti izvedene iz bilo kojeg od dobro poznatih pomoćnih virusa kao što su adenovirus, herpesvirus i vakcinia virus. U jednom otelotvorenju, koristi se plazmid akcesorne funkcije pLadeno5 (detalji u vezi sa pLadeno5 opisani su u američkom patentu br.6,004,797). Ovaj plazmid pruža kompletan set akcesornih funkcija adenovirusa za proizvodnju AAV vektora, ali mu nedostaju komponente neophodne za formiranje replikaciono-kompetentnog adenovirusa.
[0106] Da bi se dodatno razumelo AAV, detaljnija diskusija je data u nastavku u vezi sa rekombinantnim AAV ekspresionim vektorima i AAV pomoćnim i akcesornim funkcijama.
Rekombinantni AAV ekspresioni vektori
[0107] Rekombinantni AAV (rAAV) ekspresioni vektori se konstruišu korišćenjem poznatih tehnika kako bi se barem obezbedili kao operativno povezani komponenti u smeru transkripcije, kontrolni elementi uključujući transkripcioni inicijacioni region, polinukleotid od interesa i transkripcioni terminacioni region. Kontrolni elementi su odabrani da budu funkcionalni u ćeliji od interesa, kao što je u ćeliji sisara. Dobijeni konstrukt koji sadrži operativno povezane komponente je ograničen (5' i 3') funkcionalnim AAV ITR sekvencama.
[0108] Nukleotidne sekvence AAV ITR regiona su poznate. Videti npr. Kotin, R.M. (1994) Human Gene Therapy 5:793-801; Berns, K.I. "Parvoviridae and their Replication" in Fundamental Virology, 2nd Edition, (B.N. Fields and D.M. Knipe, eds.) za AAV-2 sekvencu. AAV ITR korišćeni u vektorima pronalaska ne moraju imati nukleotidnu sekvencu divljeg tipa, i mogu biti izmenjeni, npr. umetanjem, brisanjem ili supstitucijom nukleotida. Dodatno, AAV ITR mogu biti izvedeni iz bilo kojeg od nekoliko AAV serotipova, uključujući bez ograničenja, AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, itd. Nadalje, 5' i 3' ITR koji flankiraju odabranu nukleotidnu sekvencu u AAV ekspresionom vektoru ne moraju nužno biti identični ili izvedeni iz istog AAV serotipa ili izolata, sve dok funkcionišu kako je predviđeno, tj. da omoguće eksciziju i spasavanje sekvence od interesa iz genoma ćelije domaćina ili vektora, i da omoguće integraciju DNK molekula u genom ćelije primaoca kada su AAV Rep genski produkti prisutni u ćeliji.
[0109] Pogodni polinukleotidni molekuli za upotrebu u tradicionalnim AAV vektorima biće manji od ili oko 5 kilobaza (kb) u veličini. Odabrana polinukleotidna sekvenca je operativno povezana sa kontrolnim elementima koji usmeravaju njenu transkripciju ili ekspresiju u subjektu in vivo. Takvi kontrolni elementi mogu obuhvatati kontrolne sekvence normalno povezane sa odabranim genom. Alternativno, mogu se primeniti heterologne kontrolne sekvence. Korisne heterologne kontrolne sekvence generalno uključuju one izvedene iz sekvenci koje kodiraju sisarske ili virusne gene. Neograničavajući primeri promotera uključuju, ali nisu ograničeni na, citomegalovirus (CMV) promoter (Kaplitt et al., Nat. Genet. (1994) 8:148-154), CMV/humani β3-globin promoter (Mandel et al., J. Neurosci. (1998) 18:4271-4284), GFAP promoter (Xu et al., Gene Ther. (2001) 8:1323-1332), 1,8-kb neuronspecifični enolazni (NSE) promoter (Klein et al., Exp. Neurol. (1998) 150:183-194), pileći beta aktinski (CBA) promoter (Miyazaki, Gene (1989) 79:269-277), β-glukuronidazni (GUSB) promoter (Shipley et al., Genetics (1991) 10:1009-1018), i ubikvitinske promotere kao što su oni izolovani iz humanog ubikvitina A, humanog ubikvitina B, i humanog ubikvitina C, kao što je opisano u američkom patentu br.6,667,174 . Da bi se produžila ekspresija, drugi regulatorni elementi mogu dodatno biti operativno povezani sa transgenom, kao što je, npr. post-regulacioni element virusa hepatitisa marmota (WPRE) (Donello et al., J. Virol. (1998) 72:5085-5092) ili poliadenilaciono mesto goveđeg hormona rasta (BGH). Pored toga, sekvence izvedene iz nevirusnih gena, kao što je mišji metalotioneinski gen, takođe će ovde naći primenu. Takve promoterske sekvence su komercijalno dostupne od npr. Stratagene (San Diego, CA).
[0110] Za neke primene genske terapije CNS, može biti neophodno kontrolisati transkripcionu aktivnost. U tu svrhu, farmakološka regulacija ekspresije gena sa viralnim vektorima može se postići uključivanjem različitih regulatornih elemenata i promotera koji reaguju na lekove, kao što je opisano, na primer, u Habermaet al., Gene Ther. (1998) 5.1604-16011; i Ye et al., Science (1995) 283:88-91.
[0111] AAV ekspresioni vektor koji sadrži polinukleotidni molekul od interesa flankiran AAV ITR, može se konstruisati direktnim umetanjem odabrane sekvence u AAV genom iz kojeg su uklonjeni glavni AAV otvoreni okviri čitanja („ORF“). Drugi delovi AAV genoma takođe mogu biti obrisani, sve dok dovoljan deo ITR ostane da omogući funkcije replikacije i pakovanja. Takvi konstrukti se mogu dizajnirati korišćenjem tehnika dobro poznatih u struci. Videti npr. američke patente br.5,173,414 i 5,139,941; Međunarodne publikacije br. WO 92/01070 (objavljeno 23. januara 1992.) i WO 93/03769 (objavljeno 4. marta 1993.);
Lebkowski et al. (1988) Molec. Cell. Biol.8:3988-3996; Vincent et al. (1990) Vaccines 90 (Cold Spring Harbor Laboratory Press); Carter (1992) Current Opinion in Biotechnology 3:533-539; Muzyczka (1992) Current Topics in Microbiol. and Immunol.158:97-129; Kotin (1994) Human Gene Therapy 5:793-801; Shelling and Smith (1994) Gene Therapy 1:165-169; i Zhou et al. (1994) J. Exp. Med.179:1867-1875.
[0112] Alternativno, AAV ITR se mogu izrezati iz viralnog genoma ili iz AAV vektora koji ga sadrži i spojiti 5' i 3' od odabranog nukleinsko-kiselinskog konstrukta koji je prisutan u drugom vektoru korišćenjem standardnih tehnika ligacije, kao što su one opisane u Sambrook et al., supra. Na primer, ligacije se mogu izvesti u 20 mM Tris-Cl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 33 µg/ml BSA, 10 mM-50 mM NaCl, i ili 40 µM ATP, 0,01-0,02 (Weiss) jedinice T4 DNK ligaze na 0°C (za ligaciju „lepljivih krajeva“) ili 1 mM ATP, 0,3-0,6 (Weiss) jedinice T4 DNK ligaze na 14°C (za ligaciju „tupih krajeva“). Intermolekularne ligacije „lepljivih krajeva“ obično se izvode pri ukupnoj koncentraciji DNK od 30-100 µg/ml (ukupna koncentracija krajeva 5-100 nM). AAV vektori koji sadrže ITR opisani su u npr. američkom patentu br.5,139,941. Posebno, nekoliko AAV vektora je tamo opisano koji su dostupni iz Američke kolekcije tipskih kultura pod pristupnim brojevima 53222, 53223, 53224, 53225 and 53226.
[0113] U određenim slučajevima, rAAV ekspresioni vektori su obezbeđeni kao samokomplementarni rAAV konstrukti. Tipično, rAAV DNK se pakuje u viralni kapsid kao jednolančani DNK (ssDNK) molekul dužine oko 4600 nukleotida. Nakon infekcije ćelije virusom, jednolančana DNK se pretvara u dvolančani DNK (dsDNK) oblik. Samo dsDNK je korisna za proteine ćelije koji transkribuju sadržani gen ili gene u RNK. Dakle, konvencionalna replikaciona šema AAV zahteva de novo sintezu komplementarnog DNK lanca. Ovaj korak pretvaranja ssDNK AAV genoma u dsDNK pre ekspresije može se zaobići upotrebom samokomplementarnih (sc) vektora. Kompleti za upotrebu u pronalasku obuhvataju jednu ili više posuda koje obuhvataju rekombinantni AAV virion koji obuhvata scAAV vektor.
[0114] Samokomplementarni vektori se proizvode sparivanjem baza komplementarnih lanaca iz dva inficirajuća virusa, što ne zahteva sintezu DNK (videti, npr. Nakai et al., J. Virol. (2000) 74:9451-9463). Ovo interlančano sparivanje baza, ili žarenje lanaca (SA), moguće je jer AAV pakuje ili plus ili minus DNK lanac sa jednakom efikasnošću (Berns, K.I., Microbiol. Rev. (1990) 54:316-329).
[0115] Dakle i bez ograničenja u pogledu teorije, potreba za konverzijom u dsDNK, bilo putem SA ili sinteze DNK, može se potpuno zaobići pakovanjem oba lanca kao jednog molekula. Ovo se može postići iskorišćavanjem tendencije AAV da proizvodi dimerne invertovane ponavljajuće genome tokom AAV replikacionog ciklusa. Ako su ovi dimeri dovoljno mali, mogu se pakovati na isti način kao konvencionalni AAV genomii, a dve polovine ssDNK molekula mogu se saviti i spariti baze da formiraju dsDNK molekul polovine dužine. Konverzija u dsDNK je nezavisna od DNK sinteze ćelije domaćina i koncentracije vektora (McCarty et al., Gene Ther. (2001) 8:1248-1254).
[0116] scAAV viralni konstrukti obuhvataju približno 4,6 kb i mogu se pakovati u normalan AAV kapsid. Svaki od poznatih AAV serotipova je sposoban da pakuje scAAV genome sa sličnom efikasnošću (videti npr. Sipo et al., Gene Ther. (2007) 14:1319-1329). Dakle, u određenim slučajevima obelodanjenim ovde, scAAV vektor obuhvata kapsidne proteine iz serotipova odabranih iz AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, ili AAV9 serotipova. Međutim, scAAV vektor može obuhvatati kapsidne proteine iz bilo kojeg od poznatih serotipova ili modifikovane kapsidne proteine poznate u struci. Ovi scAAV vektori takođe mogu biti pseudotipovani vektori koji sadrže genom jednog AAV serotipa u kapsidu drugog AAV serotipa. Takvi vektori mogu obuhvatati, na primer, AAV vektor koji sadrži AAV2 kapsid i AAV1 genom ili AAV vektor koji sadrži AAV5 kapsid i AAV2 genom (Auricchio et al., (2001) Hum. Mol. Genet., 10(26):3075-81). U određenim otelotvorenjima kompleta za upotrebu u pronalasku, scAAV vektor obuhvata kapsidne proteine iz serotipa AAV8 ili AAV9.
[0117] U početku se verovalo da sekvenca transgena u scAAV vektoru može obuhvatati samo približno 2,2 kb. Međutim, čini se da postoji veća sloboda u kapacitetu pakovanja nego što se ranije verovalo. Na primer Wu et al., Human Gene Ther. (2007) 18:171-182 uspešno su upakovali scAAV-2 konstrukte koji su prelazili 3,300 bp i pokazali dimerne invertovane ponavljajuće genome koji su bili potpuno DNase otporni. Ovi vektori su dali očekivana povećanja efikasnosti transdukcije u odnosu na ssAAV kada su testirani na kultivisanim ćelijama.
[0118] scAAV vektori se mogu proizvesti ili generisanjem vektorskih plazmida koji su približno polovine veličine konvencionalnog genoma u kombinaciji sa selektivnim prečišćavanjem infektivnog dvolančanog oblika, ili upotrebom vektorskih plazmida približno polovine veličine genoma sa mutacijom u jednoj od terminalnih rezolucionih sekvenci AAV virusa koja omogućava sintezu dvolančanog virusa. Obe strategije generišu i - lančane viralne genome koji su kovalentno povezani na jednom terminalnom ponavljanju.
[0119] Posebno, generisanje normalnih monomernih AAV genoma oslanja se na efikasnu rezoluciju dva ITR zauzvrat, sa svakim krugom sinteze DNK. Ovu reakciju posreduje ssDNK endonukleazna aktivnost dve veće izoforme AAV Rep. Zarezivanje ITR na mestu terminalne rezolucije prati elongacija DNK od zareza pomoću DNK polimeraze domaćina. Dimerne genome formiraju se kada Rep ne uspe da zareže mesto terminalne rezolucije pre nego što ga dostigne replikacioni kompleks iniciran na drugom kraju.
[0120] Prinos dimernih genoma u scAAV pripremi može se dramatično povećati inhibicijom rezolucije na jednom terminalnom ponavljanju. Ovo se lako postiže brisanjem sekvence mesta terminalne rezolucije iz jednog ITR, tako da Rep protein ne može generisati esencijalni ssDNK zarez (videti npr. McCarty et al., Gene Ther. (2003) 10:2112-2118 i Wang et al., Gene Ther. (2003) 10:2105-2111). Replikacioni kompleks iniciran na drugom ITR zatim kopira kroz ukosnicu i nazad prema inicijalnom kraju. Replikacija se nastavlja do kraja molekula templata, ostavljajući dsDNK invertovani ponovljeni segment sa divljim tipom ITR na svakom kraju i mutiranim ITR u sredini. Ovaj dimerni invertovani ponovljeni segment zatim može proći kroz normalne krugove replikacije sa dva ITR kraja divljeg tipa. Svaki pomereni ćerka lanac obuhvata ssDNK invertovani ponovljeni segment sa kompletnim ITR na svakom kraju i mutiranim ITR u sredini. Pakovanje u AAV kapsid počinje na 3' kraju pomerenog lanca. Proizvodnja scAAV iz konstrukata sa jednim mutiranim ITR obično daje više od 90% dimernih genoma.
[0121] Proizvodnja i prečišćavanje scAAV vektora iz mutiranih ITR konstrukata je ista kao konvencionalni ssAAV, kao što je detaljnije opisano u nastavku. Međutim, ako se koristi dot blot ili Southern blot, vektorska DNK se poželjno primenjuje na hibridizacione membrane pod alkalnim uslovima kako bi se sprečilo ponovno žarenje komplementarnih lanaca.
Dodatno, moguće je da se lažno Rep-zarezujuće mesto proizvede dovoljno blizu mutiranog ITR da omogući terminalnu rezoluciju i generisanje monomernih genoma. Ovo se tipično može izbeći okretanjem kasetne transgena u odnosu na mutantne i divlji tip terminalnih ponavljanja.
[0122] Videti npr. McCarty, D.M., Molec. Ther. (2008) 16:1648-1656; McCarty et al., Gene Ther. (2001) 8:1248-1254; McCarty et al., Gene Ther. (2003) 10:2112-2118; Wang et al., Gene Ther. (2003) 10:2105-2111); Wu et al., Human Gene Ther. (2007) 18:171-182; američke patentne publikacije br.2007/0243168 i 2007/0253936;
kao i primere ovde, za metode proizvodnje scAAV konstrukata.
[0123] Za potrebe pronalaska, pogodne ćelije domaćina za proizvodnju rAAV viriona iz AAV ekspresionih vektora (bilo konvencionalnih ili sc vektora) uključuju mikroorganizme, ćelije kvasca, ćelije insekata i ćelije sisara, koje mogu biti, ili su bile, korišćene kao primaoci heterolognog DNK molekula i koje su sposobne za rast u, na primer, suspenzionoj kulturi, bioreaktoru, ili slično. Termin uključuje potomstvo originalne ćelije koja je bila transfekovana. Dakle, „ćelija domaćin“ kako se ovde koristi generalno se odnosi na ćeliju koja je transfekovana egzogenom DNK sekvencom. Ćelije stabilne humane ćelijske linije, 293 (lako dostupne putem, npr., Američke kolekcije tipskih kultura pod pristupnim brojem ATCC CRL1573) su preferirane u praksi predmetnog pronalaska. Posebno, humana ćelijska linija 293 je humana embrionalna bubrežna ćelijska linija koja je transformisana fragmentima adenovirusne DNK tipa-5 (Graham et al. (1977) J. Gen. Virol.36:59), i eksprimira adenoviralne E1a i E1b gene (Aiello et al. (1979) Virology 94:460). Ćelijska linija 293 je lako transfekovana, i pruža posebno pogodnu platformu za proizvodnju rAAV viriona.
AAV Pomoćne funkcije
[0124] Ćelije domaćina koje sadrže gore opisane AAV ekspresione vektore moraju biti osposobljene da obezbede AAV pomoćne funkcije kako bi replicirale i enkapsidirale nukleotidne sekvence flankirane AAV ITR za proizvodnju rAAV viriona. AAV pomoćne funkcije su generalno kodirajuće sekvence izvedene iz AAV koje se mogu eksprimirati kako bi obezbedile AAV genske produkte koji, zauzvrat, funkcionišu in trans za produktivnu AAV replikaciju. AAV pomoćne funkcije se ovde koriste za komplementiranje neophodnih AAV funkcija koje nedostaju u AAV ekspresionim vektorima. Dakle, AAV pomoćne funkcije uključuju jedan, ili oba glavna AAV ORF, naime rep i cap kodirajuće regione, ili funkcionalne homologe istih.
[0125] Pod „AAV rep kodirajućim regionom“ podrazumeva se u struci prepoznat region AAV genoma koji kodira replikacione proteine Rep 78, Rep 68, Rep 52 i Rep 40. Pokazano je da ovi Rep ekspresioni produkti poseduju mnoge funkcije, uključujući prepoznavanje, vezivanje i zarezivanje porekla replikacije AAV DNK, DNK helikaznu aktivnost i modulaciju transkripcije iz AAV (ili drugih heterolognih) promotera. Rep ekspresioni produkti su kolektivno potrebni za replikaciju AAV genoma. Za opis AAV rep kodirajućeg regiona, videti npr. Muzyczka, N. (1992) Current Topics in Microbiol. and Immunol.158:97-129; and Kotin, R.M. (1994) Human Gene Therapy 5:793-801. Pogodni homolozi AAV rep kodirajućeg regiona uključuju HHV-6 (humani herpesvirus 6) rep gen koji je takođe poznat po posredovanju replikacije AAV-2 DNK (Thomson et al. (1994) Virology 204:304-311).
[0126] Pod „AAV cap kodirajućim regionom“ podrazumeva se u struci prepoznat region AAV genoma koji kodira kapsidne proteine VP1, VP2 i VP3, ili funkcionalne homologe istih. Ovi Cap ekspresioni produkti obezbeđuju funkcije pakovanja koje su kolektivno potrebne za pakovanje viralnog genoma. Za opis AAV cap kodirajućeg regiona, videti npr. Muzyczka, N. and Kotin, R.M. (supra).
[0127] AAV pomoćne funkcije se unose u ćeliju domaćina transfekcijom ćelije domaćina AAV pomoćnim konstruktom bilo pre, ili istovremeno sa, transfekcijom AAV ekspresionog vektora. AAV pomoćni konstrukti se stoga koriste za obezbeđivanje barem prolazne ekspresije AAV rep i/ili cap gena radi komplementiranja nedostajućih AAV funkcija koje su neophodne za produktivnu AAV infekciju. AAV pomoćni konstrukti nemaju AAV ITR i ne mogu se ni replicirati ni pakovati sami.
[0128] Ovi konstrukti mogu biti u obliku plazmida, faga, transpozona, kosmida, virusa ili viriona. Opisano je nekoliko AAV pomoćnih konstrukata, kao što su uobičajeno korišćeni plazmidi pAAV/Ad i pIM29+45 koji kodiraju i Rep i Cap ekspresione produkte. Videti npr. Samulski et al. (1989) J. Virol.63:3822-3828; i McCarty et al. (1991) J. Virol.65:2936-2945. Opisano je i nekoliko drugih vektora koji kodiraju Rep i/ili Cap ekspresione produkte. Videti npr. američki patent br.5,139,941.
AAV Akcesorne funkcije
[0129] Ćelija domaćin (ili ćelija za pakovanje) takođe mora biti osposobljena da obezbedi funkcije koje nisu izvedene iz AAV, ili „akcesorne funkcije“, kako bi se proizveli rAAV virioni. Akcesorne funkcije su viralne i/ili ćelijske funkcije koje nisu izvedene iz AAV, od kojih AAV zavisi za svoju replikaciju. Dakle, akcesorne funkcije uključuju barem one ne-AAV proteine i RNK koje su potrebne u AAV replikaciji, uključujući one uključene u aktivaciju transkripcije AAV gena, fazno specifično splajsovanje AAV mRNK, replikaciju AAV DNK, sintezu Cap ekspresionih produkata i sklapanje AAV kapsida. Viralne akcesorne funkcije mogu se izvesti iz bilo kojeg od poznatih pomoćnih virusa.
[0130] Posebno, akcesorne funkcije se mogu uneti u ćelije domaćina i zatim eksprimirati korišćenjem metoda poznatih stručnjacima u toj oblasti. Tipično, akcesorne funkcije se obezbeđuju infekcijom ćelija domaćina nepovezanim pomoćnim virusom. Poznat je niz pogodnih pomoćnih virusa, uključujući adenoviruse; herpesviruse kao što su herpes simpleks virusi tipova 1 i 2; i vakcinia viruse. Nevirusne akcesorne funkcije takođe će ovde naći primenu, kao što su one obezbeđene sinhornizacijom ćelija korišćenjem bilo kog od različitih poznatih agenasa. Videti npr. Buller et al. (1981) J. Virol.40:241-247; McPherson et al.
(1985) Virology 147:217-222; Schlehofer et al. (1986) Virology 152:110-117.
[0131] Alternativno, akcesorne funkcije se mogu obezbediti korišćenjem vektora akcesorne funkcije kao što je gore definisano. Videti npr. američki patent br.6,004,797 i Međunarodnu publikaciju br. WO 01/83797.
Nukleinsko-kiselinske sekvence koje obezbeđuju akcesorne funkcije mogu se dobiti iz prirodnih izvora, kao što su iz genoma čestice adenovirusa, ili konstruisati korišćenjem rekombinantnih ili sintetičkih metoda poznatih u struci. Kao što je gore objašnjeno, demonstrirano je da pun komplement adenovirusnih gena nije potreban za akcesorne pomoćne funkcije. Posebno, adenovirusni mutanti nesposobni za replikaciju DNK i sintezu kasnih gena pokazalo se da su permisivni za AAV replikaciju. Ito et al., (1970) J. Gen. Virol.
9:243; Ishibashi et al, (1971) Virology 45:317. Slično, mutanti unutar E2B i E3 regiona pokazalo se da podržavaju AAV replikaciju, što ukazuje da E2B i E3 regioni verovatno nisu uključeni u obezbeđivanje akcesornih funkcija. Carter et al., (1983) Virology 126:505.
Međutim, adenovirusi defektni u E1 regionu, ili sa obrisanim E4 regionom, ne mogu podržati AAV replikaciju. Dakle, E1A i E4 regioni su verovatno potrebni za AAV replikaciju, bilo direktno ili indirektno. Laughlin et al., (1982) J. Virol.41:868; Janik et al., (1981) Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 78:1925; Carter et al., (1983) Virology 126:505. Ostali karakterisani Ad mutanti uključuju: E1B (Laughlin et al. (1982), supra; Janik et al. (1981), supra; Ostrove et al., (1980) Virology 104:502); E2A (Handa et al., (1975) J. Gen. Virol.29:239; Strauss et al., (1976) J. Virol.17:140; Myers et al., (1980) J. Virol.35:665; Jay et al., (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2927; Myers et al., (1981) J. Biol. Chem.256:567); E2B (Carter, Adeno-Associated Virus Helper Functions, in I CRC Handbook of Parvoviruses (P. Tijssen ed., 1990)); E3 (Carter et al. (1983), supra); i E4 (Carter et al.(1983), supra; Carter (1995)). Iako su studije akcesornih funkcija obezbeđenih adenovirusima sa mutacijama u E1B kodirajućem regionu dale kontradiktorne rezultate, Samulski et al., (1988) J. Virol.62:206-210, izvestio je da je E1B55k potreban za proizvodnju AAV viriona, dok E1B19k nije. Pored toga, Međunarodna publikacija WO 97/17458 i Matshushita et al., (1998) Gene Therapy 5:938-945, opisuju vektore akcesorne funkcije koji kodiraju različite Ad gene. Posebno preferirani vektori akcesorne funkcije obuhvataju kodirajući region adenovirusne VA RNK, kodirajući region adenovirusne E4 ORF6, kodirajući region adenovirusne E2A 72 kD, kodirajući region adenovirusne E1A, i E1B region adenovirusa kome nedostaje intaktan E1B55k kodirajući region. Takvi vektori su opisani u Međunarodnoj publikaciji br. WO 01/83797.
[0132] Kao posledica infekcije ćelije domaćina pomoćnim virusom, ili transfekcije ćelije domaćina vektorom akcesorne funkcije, eksprimiraju se akcesorne funkcije koje transaktiviraju AAV pomoćni konstrukt za proizvodnju AAV Rep i/ili Cap proteina. Rep ekspresioni produkti izrezuju rekombinantnu DNK (uključujući DNK od interesa) iz AAV ekspresionog vektora. Rep proteini takođe služe za dupliranje AAV genoma. Eksprimirani Cap proteini se sklapaju u kapside, a rekombinantni AAV genom se pakuje u kapside. Tako se odvija produktivna AAV replikacija, a DNK se pakuje u rAAV virione. „Rekombinantni AAV virion“, ili „rAAV virion“ je ovde definisan kao infektivan, replikaciono-defektan virus koji uključuje AAV proteinski omotač, koji enkapsidira heterolognu nukleotidnu sekvencu od interesa koja je flankirana sa obe strane AAV ITR.
[0133] Nakon rekombinantne AAV replikacije, rAAV virioni se mogu prečistiti iz ćelije domaćina korišćenjem različitih konvencionalnih metoda prečišćavanja, kao što su kolonska hromatografija, CsCl gradijenti, i slično. Na primer, može se koristiti više koraka prečišćavanja kolone, kao što je prečišćavanje preko kolone sa anjonskom izmenom, afinitetne kolone i/ili kolone sa katjonskom izmenom. Videti, na primer, Međunarodnu publikaciju br. WO 02/12455. Nadalje, ako se koristi infekcija za ekspresiju akcesornih funkcija, rezidualni pomoćni virus se može inaktivirati, korišćenjem poznatih metoda. Na primer, adenovirus se može inaktivirati zagrevanjem na temperaturama od približno 60°C na npr. 20 minuta ili više. Ovaj tretman efikasno inaktivira samo pomoćni virus, budući da je AAV izuzetno toplotno stabilan, dok je pomoćni adenovirus toplotno labilan.
[0134] Dobijeni rAAV virioni koji sadrže nukleotidnu sekvencu od interesa zatim se mogu koristiti za isporuku gena korišćenjem tehnika opisanih u nastavku.
Kompozicije i isporuka
A. Kompozicije
[0135] Nakon proizvodnje, rAAV virioni koji kodiraju željeni gen biće formulisani u kompozicije pogodne za isporuku. Kompozicije će sadržati dovoljnu količinu genetskog materijala za proizvodnju terapijski efikasne količine željenog gena, tj. količinu dovoljnu da (1) spreči razvoj bolesti ili prouzrokuje da se bolest javi sa manjim intenzitetom kod subjekta koji može biti izložen ili predisponiran bolesti, ali još uvek ne ispoljava simptome bolesti, (2) inhibira bolest, tj. zaustavi razvoj ili preokrene stanje bolesti, ili (3) ublaži simptome bolesti, tj. smanji broj simptoma koje doživljava subjekt, kao i promeni ćelijsku patologiju povezanu sa bolešću.
[0136] Odgovarajuće doze će takođe zavisiti od tretirane sisara (npr. čovek, neljudski primat ili drugi sisar), starosti i opšteg stanja subjekta koji se tretira, ozbiljnosti stanja koje se tretira, načina primene, između ostalih faktora. Odgovarajuća efikasna količina može se lako odrediti od strane stručnjaka u datoj oblasti, a reprezentativne količine su navedene u nastavku.
[0137] Kompozicije će takođe sadržati farmaceutski prihvatljiv ekscipijens. Takvi ekscipijensi uključuju bilo koje farmaceutsko sredstvo koje samo po sebi ne indukuje proizvodnju antitela štetnih za pojedinca koji prima kompoziciju, i koje se može primeniti bez prekomerne toksičnosti. Farmaceutski prihvatljivi ekscipijensi uključuju, ali nisu ograničeni na, sorbitol, bilo koje od različitih TWEEN jedinjenja, i tečnosti kao što su voda, fiziološki rastvor, glicerol i etanol. Mogu se uključiti i farmaceutski prihvatljive soli, na primer, soli mineralnih kiselina kao što su hidrohloridi, hidrobromidi, fosfati, sulfati i slično; i soli organskih kiselina kao što su acetati, propionati, malonati, benzoati i slično. Pored toga, pomoćne supstance, kao što su sredstva za vlaženje ili emulgovanje, supstance za puferisanje pH vrednosti i slično, mogu biti prisutne u takvim nosačima. Detaljna diskusija o farmaceutski prihvatljivim ekscipijensima dostupna je u REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Mack Pub. Co., N.J.1991).
[0138] Formulacije mogu biti tečne ili čvrste, na primer, liofilizovane. Formulacije se takođe mogu primeniti kao aerosoli.
[0139] Jedna posebno korisna formulacija uključuje rAAV virion od interesa u kombinaciji sa jednim ili više dihidričnih ili polihidričnih alkohola, i, opciono, deterdžentom, kao što je sorbitan ester. Videti, na primer, američki patent br.6,764,845.
B. Isporuka
[0140] Uopšteno, rekombinantni virioni se uvode u subjekt koristeći in vivo ili in vitro tehnike transdukcije. Ako se transdukuju in vitro, željena ćelija primaoca će biti uklonjena iz subjekta, transdukovana rekombinantnim vektorom i ponovo uvedena u subjekt. Alternativno, mogu se koristiti singene ili ksenogene ćelije tamo gde te ćelije neće generisati neodgovarajući imuni odgovor kod subjekta. Pogodne ćelije za isporuku kod sisarskih domaćina uključuju tipove sisarskih ćelija iz organa, tumora ili ćelijskih linija. Na primer, mogu se koristiti ljudske, mišje, kozje, ovčije, goveđe, pseće, mačje i svinjske ćelije. Pogodni tipovi ćelija za upotrebu uključuju, bez ograničenja, fibroblaste, hepatocite, endotelne ćelije, keratinocite, hematopoetske ćelije, epitelne ćelije, miocite, neuronske ćelije i matične ćelije. Pored toga, neuralne progenitorske ćelije se mogu transdukovati in vitro i zatim isporučiti u CNS.
[0141] Ćelije se mogu transdukovati in vitro kombinovanjem rekombinantnih viriona sa željenom ćelijom u odgovarajućem medijumu, a zatim se mogu analizirati radi identifikacije onih ćelija koje sadrže željeni DNK koristeći konvencionalne tehnike kao što su Southern blot i/ili PCR, ili korišćenjem selektivnih markera. Transdukovane ćelije se zatim mogu formulisati u farmaceutske kompozicije, kao što je gore opisano, a kompozicija se uvodi u subjekt različitim tehnikama kao što je opisano u nastavku, u jednoj ili više doza.
[0142] Za in vivo isporuku, rekombinantni virioni će biti formulisani u farmaceutske kompozicije i jedna ili više doza mogu se primeniti direktno na naznačeni način. Za identifikaciju struktura u ljudskom mozgu, videti npr. The Human Brain: Surface, Three-Dimensional Sectional Anatomy With MRI, and Blood Supply, 2nd ed., eds. Deuteron et al., Springer Vela, 1999; Atlas of the Human Brain, eds. Mai et al., Academic Press; 1997; i Co-Planar Sterotaxic Atlas of the Human Brain: 3-Dimensional Proportional System: An Approach to Cerebral Imaging, eds. Tamarack et al., Thyme Medical Pub., 1988. Za identifikaciju struktura u mišjem mozgu, videti npr. The Mouse Brain in Sterotaxic Coordinates“, 2. izd., Academic Press, 2000. Ako se želi, struktura ljudskog mozga može se korelisati sa sličnim strukturama u mozgu drugog sisara. Na primer, većina sisara, uključujući ljude i glodare, pokazuje sličnu topografsku organizaciju entorhinalno-hipokampalnih projekcija, sa neuronima u lateralnom delu i lateralnog i medijalnog entorhinalnog korteksa koji se projektuju u dorzalni deo ili septalni pol hipokampusa, dok projekcija na ventralni hipokampus primarno potiče od neurona u medijalnim delovima entorhinalnog korteksa (Principles of Neural Science, 4th ed., eds Kandel et al., McGraw-Hill, 1991; The Rat Nervous System, 2nd ed., ed. Paxinos, Academic Press, 1995). Nadalje, ćelije sloja II entorhinalnog korteksa se projektuju na girus dentatus, i završavaju u spoljne dve trećine molekularnog sloja girusa dentatusa. Aksoni iz ćelija sloja III projektuju se bilateralno na područja Amonovih rogova CA1 i CA3 hipokampusa, završavajući u lakunoznomolekularnom sloju.
[0143] Da bi se vektor isporučio specifično na određeni region centralnog nervnog sistema, posebno na određeni region mozga, može se primeniti stereotaksičnom mikroinjekcijom. Na primer, na dan operacije, pacijentima će se fiksirati baza stereotaksičnog okvira (zavijanjem u lobanju). Mozak sa bazom stereotaksičnog okvira (kompatibilan sa MRI sa fiducijarnim oznakama) biće snimljen korišćenjem MRI visoke rezolucije. MRI snimci će zatim biti preneti na računar koji pokreće stereotaksični softver. Niz koronarnih, sagitalnih i aksijalnih snimaka biće korišćen za određivanje ciljnog mesta injekcije vektora i putanje. Softver direktno prevodi putanju u 3-dimenzionalne koordinate prikladne za stereotaksični okvir. Rupe se buše iznad mesta ulaska i stereotaksični aparat se lokalizuje sa iglom implantiranom na datoj dubini. Vektor u farmaceutski prihvatljivom nosaču će zatim biti injektovan. Vektor se zatim primenjuje direktnom injekcijom na primarno ciljno mesto i retrogradno transportuje do distalnih ciljnih mesta putem aksona. Dodatni putevi primene mogu se koristiti, npr.
površinska kortikalna primena pod direktnom vizualizacijom, ili druga nestereotaksična primena.
[0144] Rekombinantni AAV bilo kog serotipa može se koristiti kako je ovde obelodanjeno, pri čemu rekombinantni AAV može biti ili samokomplementarni AAV ili nesamokomplementarni AAV. Serotip virusnog vektora koji se koristi kako je ovde obelodanjeno odabran je iz grupe koja se sastoji od AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 i AAV9 (videti npr. Gao et al. (2002) PNAS, 99:1185411859; i Viral Vectors for Gene Therapy: Methods and Protocols, ed. Machida, Humana Press, 2003). Mogu se koristiti i drugi serotipovi osim onih navedenih ovde. Nadalje, pseudotipovani AAV vektori se takođe mogu koristiti u ovde opisanim metodama. Pseudotipovani AAV vektori su oni koji sadrže genom jednog AAV serotipa u kapsidu drugog AAV serotipa; na primer, AAV vektor koji sadrži AAV2 kapsid i AAV1 genom ili AAV vektor koji sadrži AAV5 kapsid i AAV2 genom (Auricchio et al., (2001) Hum. Mol. Genet., 10(26):3075-81). Rekombinantni virion korišćen u skladu sa pronalaskom definisan je u patentnim zahtevima.
[0145] Rekombinantni virioni ili ćelije transdukovane in vitro mogu se isporučiti direktno u neuralno tkivo kao što su periferni nervi, retina, dorzalni korenski gangliji, neuromuskularni spoj, kao i CNS, injekcijom u, npr., ventrikularni region, kao što je jedna ili obe lateralne komore, kao i u striatum (npr. kaudatno jezgro ili putamen striatuma), mali mozak, kičmenu moždinu i neuromuskularni spoj, iglom, kateterom ili srodnim uređajem, koristeći neurohirurške tehnike poznate u struci, kao što je stereotaksična injekcija (videti npr. Stein et al., J Virol 73:3424-3429, 1999; Davidson et al., PNAS 97:3428-3432, 2000 ; Davidson et al., Nat. Genet.3:219-223, 1993; and Alisky and Davidson, Hum. Gene Ther.11:2315-2329, 2000). U ilustrativnom otelotvorenju, isporuka se ostvaruje direktnom injekcijom rastvora vektora visokog titra u kičmenu moždinu subjekta ili pacijenta.
[0146] U drugom ilustrativnom otelotvorenju, metoda za isporuku transgena u kičmenu moždinu i/ili region moždanog stabla subjekta je primenom rekombinantnog AAV vektora koji sadrži transgen u barem jednu regiju dubokih cerebelarnih jezgara (DCN) regiona malog mozga subjekta. Duboko unutar malog mozga nalazi se siva masa nazvana duboka cerebelarna jezgra: medijalno (fastigijalno) jezgro, interponirano (interpositus) jezgro i lateralno (dentatno) jezgro. Kako se ovde koristi, termin „duboka cerebelarna
jezgra“ kolektivno se odnosi na ove tri regije, pri čemu se jedna ili više ovih tri regija mogu ciljati. Viralna isporuka je pod uslovima koji pogoduju ekspresiji transgena u kičmenoj moždini i/ili regionu moždanog stabla u barem jednoj podcelini kičmene moždine subjekta. Ove podceline uključuju jednu ili više cervikalnih, torakalnih, lumbalnih ili sakralnih.
[0147] Ne obavezujući se na teoriju, jedan aspekt obelodanjen ovde odnosi se na sposobnost da se obezbedi terapijski molekul (na primer, protein ili peptid) svakoj podeli kičmene moždine. Ovo se može postići injektiranjem AAV vektora, uključujući scAAV vektor u DCN. Nadalje, može biti važno ciljati pojedinačne lamine unutar svake podele kičmene moždine. Lamine su specifični podregioni unutar regiona mozga i kičmene moždine. Može biti poželjno ciljati specifične lamine unutar određene podele kičmene moždine. Pošto se oštećenje motornih neurona može javiti i unutar gornjih motornih neurona, takođe može biti poželjno obezbediti terapijski molekul (na primer, protein ili peptid) i u delove moždanog stabla. Može biti poželjno obezbediti terapijski molekul i kičmenoj moždini, uključujući neke ili sve podceline, kao i moždanom stablu, uključujući neke ili sve podceline. Predmetno obelodanjivanje koristi uvođenje AAV vektora u DCN kako bi se ostvarila gore opisana primena terapijskog molekula u regione kičmene moždine i/ili moždanog stabla.
[0148] Druga metoda za ciljanje kičmene moždine (npr. glijalnih ćelija) je intratekalna isporuka, a ne u samo tkivo kičmene moždine. Takva isporuka nudi mnoge prednosti. Ciljani protein se oslobađa u okolnu CSF i, za razliku od virusa, oslobođeni proteini mogu prodreti u parenhim kičmene moždine, baš kao što to čine nakon akutnih intratekalnih injekcija. Zaista, intratekalna isporuka viralnih vektora može zadržati ekspresiju lokalnom. Dodatna prednost intratekalne genske terapije je što intratekalni put imitira primenu lumbalne punkcije (tj. spinalne slavine) koja je već u rutinskoj upotrebi kod ljudi.
[0149] Druga metoda za primenjivanje rekombinantnih vektora ili transdukovanih ćelija je isporukom neuronima dorzalnih korenskih ganglija (DRG), npr. injekcijom u epiduralni prostor sa naknadnom difuzijom do DRG. Na primer, rekombinantni vektori ili transdukovane ćelije mogu se isporučiti putem intratekalne kanulacije pod uslovima gde se protein difuzno širi do DRG. Videti npr. Chiang et al., Acta Anaesthesiol. Sin. (2000) 38:31-36; Jain, K.K., Expert Opin. Investig. Drugs (2000) 2:2403-2410.
[0150] Još jedan način primene u CNS koristi sistem konvekcijski pojačane isporuke (CED), što je bilo koja isporuka vektora koja nije ručna. U jednom primeru CED, gradijent pritiska se stvara upotrebom sistema isporuke koji nije ručni. Korišćenjem CED, rekombinantni vektori se mogu isporučiti mnogim ćelijama preko velikih područja CNS. Štaviše, isporučeni vektori efikasno eksprimiraju transgene u CNS ćelijama (npr. glijalnim ćelijama). Bilo koji uređaj za konvekcijski pojačanu isporuku može biti pogodan za isporuku rekombinantnih vektora. Uređaj može biti osmotska pumpa ili infuziona pumpa. I osmotske i infuzione pumpe su komercijalno dostupne od različitih dobavljača, na primer Alzet Corporation, Hamilton Corporation, Alza, Inc., Palo Alto, California. Tipično, rekombinantni vektor se isporučuje putem CED uređaja na sledeći način. Kateter, kanila ili drugi uređaj za injekciju se ubacuje u tkivo CNS kod odabranog subjekta. Stereotaksične mape i uređaji za pozicioniranje su dostupni, na primer od ASI Instruments, Warren, MI. Pozicioniranje se takođe može sprovesti korišćenjem anatomskih mapa dobijenih CT i/ili MRI snimanjem kako bi se pomoglo usmeravanje uređaja za injekciju do odabrane mete. Štaviše, budući da se ovde opisane metode mogu primeniti tako da relativno velika područja subjekta preuzimaju rekombinantne vektore, potrebno je manje infuzionih kanila. Pošto su hirurške komplikacije često povezane sa brojem penetracija, ovaj način isporuke služi za smanjenje neželjenih efekata koji se primećuju kod konvencionalnih tehnika isporuke. Za detaljan opis primene CED, videti američki patent br.6,309,634.
[0151] Intracerebroventrikularna, ili intraventrikularna, isporuka rekombinantnog AAV vektora može se izvršiti u bilo kojoj jednoj ili više komora mozga, koje su ispunjene cerebrospinalnom tečnošću (CSF). CSF je bistra tečnost koja ispunjava komore, prisutna je u subarahnoidnom prostoru, i okružuje mozak i kičmenu moždinu. CSF se proizvodi horioidnim pleksusima i putem prodiranja ili prenosa tkivne tečnosti iz mozga u komore. Horoioidni pleksus je struktura koja oblaže dno lateralne komore i krov treće i četvrte komore. Određene studije su pokazale da su ove strukture sposobne da proizvode 400-600 ccm tečnosti dnevno u skladu sa količinom dovoljnom da ispuni prostore centralnog nervnog sistema četiri puta dnevno. Kod odraslih ljudi, zapremina ove tečnosti izračunata je da iznosi od 125 do 150 ml (4-5 unci). CSF je u neprekidnom stvaranju, cirkulaciji i apsorpciji.
Određene studije su pokazale da se približno 430 do 450 ml (skoro 2 šolje) CSF može proizvesti svakog dana.
[0152] Određeni proračuni procenjuju da proizvodnja iznosi približno 0,35 ml po minuti kod odraslih i 0,15 po minuti kod dojenčadi. Horoioidni pleksusi lateralnih komora proizvode većinu CSF. On teče kroz Monroov otvor u treću komoru gde mu se dodaje proizvodnja iz treće komore i nastavlja naniže kroz Silvijev akvadukt do četvrte komore. Četvrta komora dodaje više CSF; tečnost zatim putuje u subarahnoidni prostor kroz Mažandijev i Luškin otvor. Zatim cirkuliše kroz bazu mozga, naniže oko kičmene moždine i nagore preko cerebralnih hemisfera. CSF se prazni u krv putem arahnoidnih vilusa i intrakranijalnih vaskularnih sinusa.
[0153] U jednom aspektu, obelodanjene metode uključuju primenjivanje rAAV viriona koji nosi transgen koji kodira terapeutski produkt u CNS obolelog subjekta i omogućavanje ekspresije transgena unutar CNS blizu mesta primene na nivou dovoljnom da ispolji terapijski efekat dok se eksprimirani protein transportuje putem CSF kroz ceo CNS. U nekim slučajevima, metode obuhvataju primenu kompozicije viriona visokog titra koja nosi terapeutski transgen tako da se produkt transgena eksprimira na terapijskom nivou na prvom mestu unutar CNS distalno od krajnjeg mesta delovanja eksprimiranog produkta.
[0154] U eksperimentalnim miševima, ukupna zapremina injektovanog rastvora AAV je na primer, između 1 i 20 µl. Za druge sisare, uključujući ljude, zapremine i stope isporuke su odgovarajuće skalirane. Tretman se može sastojati od jedne injekcije po ciljnom mestu, ili se može ponoviti na jednom ili više mesta. Može se koristiti više mesta za injekcije. Na primer, u nekim slučajevima, pored prvog mesta primene, kompozicija koja sadrži viralni vektor koji nosi transgen primenjuje se na drugo mesto koje može biti kontralateralno ili ipsilateralno u odnosu na prvo mesto primene. Injekcije mogu biti pojedinačne ili višestruke, unilateralne ili bilateralne.
[0155] Režim doziranja može biti jednokratna doza, kontinuirano ili intermitentno, ili višestruki režim doziranja. Štaviše, subjektu se može primeniti onoliko doza koliko je prikladno. Ako se primenjuje više doza, prva primenjena formulacija može biti ista ili različita od naknadnih formulacija. Tako, na primer, prva primena može biti u obliku AAV vektora i druga primena u obliku adenovirusnog vektora, plazmidne DNK, proteinske kompozicije, ili slično. Štaviše, naknadna isporuka takođe može biti ista ili različita od drugog načina isporuke.
[0156] Dodatno, subjekt može primiti rAAV vektor obelodanjen ovde kombinacijom obelodanjenih metoda isporuke. Dakle, subjekt može primiti injekcije AAV vektora na barem dva mesta injekcije odabrana iz grupe koja se sastoji od intracerebroventrikularnih injekcija, direktnih injekcija u kičmenu moždinu, intratekalnih injekcija i intraparenhimalnih moždanih injekcija (npr. striatum, mali mozak, uključujući duboka cerebelarna jezgra). U jednom otelotvorenju, subjekt može primiti rAAV vektor putem 1) barem jedne intracerebroventrikularne injekcije, i barem jedne direktne injekcije u kičmenu moždinu ili 2) barem jedne intracerebroventrikularne injekcije i barem jedne intratekalne injekcije ili 3) barem jedne intracerebroventrikularne injekcije i barem jedne intraparenhimalne moždane injekcije ili 4) barem jedne direktne injekcije u kičmenu moždinu i barem jedne intratekalne injekcije ili 5) barem jedne direktne injekcije u kičmenu moždinu i barem jedne intraparenhimalne moždane injekcije ili 6) barem jedne intratekalne injekcije i barem jedne intraparenhimalne moždane injekcije.
[0157] Treba razumeti da se više od jednog transgena može eksprimirati isporučenim rekombinantnim virionom. Alternativno, odvojeni vektori, svaki koji eksprimira jedan ili više različitih transgena, mogu se takođe isporučiti subjektu kako je ovde opisano. Dakle, višestruki transgeni se mogu isporučiti istovremeno ili sekvencijalno. Nadalje, takođe se namerava da se vektori isporučeni metodama kako je obelodanjeno mogu kombinovati sa drugim pogodnim kompozicijama i terapijama. Dodatno, kombinacije proteinskih i nukleinsko-kiselinskih tretmana mogu se koristiti.
[0158] Metode određivanja najefikasnijih sredstava primene i terapijski efikasnih doza dobro su poznate stručnjacima u ovoj oblasti i variraće sa vektorom, sastavom terapije, ciljnim ćelijama i subjektom koji se tretira. Terapijski efikasne doze mogu se lako odrediti korišćenjem, na primer, jednog ili više životinjskih modela određene bolesti u pitanju.
„Terapijski efikasna količina“ će spadati u relativno širok opseg koji se može odrediti kliničkim ispitivanjima. Na primer, za in vivo injekciju rAAV viriona, doza će biti reda veličine od oko 10<6>do 10<15>genomskih čestica rekombinantnog virusa, poželjnije 10<8>do 10<14>genomskih čestica rekombinantnog virusa, ili bilo koja doza unutar ovih opsega koja je dovoljna da obezbedi željeni efekat. U određenim otelotvorenjima, koncentracija ili titar vektora u kompoziciji je najmanje: (a) 56, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, or 50 (x 10<12>gp/ml); (b) 5 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, or 50 (x10<9>tu/ml); ili (c) 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, ili 50 (x10<10>iu/ml).
[0159] Za in vitro transdukciju, efikasna količina rAAV viriona koji se primenjuje na ćelije biće reda veličine od 10<8>do 10<13>rekombinantnog virusa. Količina transdukovanih ćelija u farmaceutskim kompozicijama, zauzvrat, biće od oko 10<4>do 10<10>ćelija, poželjnije 10<5>do 10<8>ćelija. Druge efikasne doze mogu se lako uspostaviti od strane stručnjaka u ovoj oblasti putem rutinskih ispitivanja koja uspostavljaju krive doza-odgovor.
[0160] Generalno, biće primenjeno od 1 µl do 1 ml kompozicije, kao što je od 0,01 do oko 0,5 ml, na primer oko 0,05 do oko 0,3 ml, kao što je 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, itd. i bilo koji broj unutar ovih opsega, kompozicije.
Životinjski modeli
[0161] Terapijska efikasnost i sigurnost korišćenjem AAV viriona uključujući transgene kao što je gore opisano mogu se testirati na odgovarajućem životinjskom modelu. Na primer, životinjski modeli koji se čine najsličnijim ljudskoj bolesti uključuju životinjske vrste koje ili spontano razvijaju visoku učestalost određene bolesti ili one kod kojih je to indukovano.
[0162] Posebno, poznato je i generisano je nekoliko životinjskih modela za SMA. Videti npr. Sumner C.J., NeuroRx (2006) 3:235-245; Schmid et al., J. Child Neurol. (2007) 22:1004-1012. Kao što je gore objašnjeno, molekulska osnova SMA, autosomno recesivnog neuromuskularnog poremećaja, je homozigotni gubitak gena za preživljavanje motornog neurona 1 (SMN1). Gotovo identična kopija SMN1 gena, nazvana SMN2, nalazi se kod ljudi i modulira težinu bolesti. Za razliku od ljudi, miševi imaju jedan gen (SMN) koji je ekvivalentan SMN1. Homozigotni gubitak ovog gena je letalan za embrione i rezultira masovnom ćelijskom smrću, što ukazuje da je SMN genski produkt neophodan za ćelijsko preživljavanje i funkciju. Uvođenje 2 kopije SMN2 u miševe kojima nedostaje SMN spašava embrionalnu letalnost, što rezultira miševima sa SMA fenotipom (Monani et al., Hum. Mol. Genet. (2000) 9:333-339. Veliki broj kopija SMN2 spašava miševe jer se u motornim neuronima proizvodi dovoljna količina SMN proteina. Videti takođe Hsieh-Li, et al., Nat. Genet. (2000) 24:66-70, koji izveštavaju o proizvodnji transgenih mišjih linija koje su eksprimirale humani SMN2. Posebno, transgeni miševi koji sadrže SMN2 u SMN-/- pozadini pokazuju patološke promene u kičmenoj moždini i skeletnim mišićima slične onima kod pacijenata sa SMA. Ozbiljnost patoloških promena kod ovih miševa korelira sa količinom SMN proteina koji je sadržao region kodiran egzonima 7. Fenotipovi u ovom mišjem modelu uključuju gubitak ćelija motornih neurona, atrofiju skeletnih mišića, aberantne neuromuskularne spojeve (NMJ), bihevioralne deficite, paralizu i skraćen životni vek od oko dve nedelje. Le et al., Hum. Mol. Genet. (2005) 14:845-857.
[0163] Slično, poznati su životinjski modeli za ALS. ALS je fatalna neurodegenerativna bolest koja se karakteriše selektivnim gubitkom motornih neurona u korteksu, moždanom stablu i kičmenoj moždini. Progresija bolesti može dovesti do atrofije mišića udova, aksijalnih i respiratornih mišića. Smrt ćelija motornih neurona praćena je reaktivnom gliozom, abnormalnostima neurofilamenata i značajnim gubitkom velikih mijelinizovanih vlakana u kortikospinalnim putevima i ventralnim korenima. Iako je etiologija ALS slabo razumljiva, sve više dokaza ukazuje da sporadični (SALS) i familijarni (FALS) ALS dele mnoge slične patološke karakteristike; stoga, pružajući nadu da će proučavanje bilo kog oblika dovesti do zajedničkog tretmana. FALS čini približno 10% dijagnostikovanih slučajeva, od čega je 20% povezano sa dominantno nasleđenim mutacijama u Cu/Zn superoksid dizmutazi (SOD1). Transgeni miševi koji eksprimiraju mutantni humani SOD1 protein (npr. SOD1G93A miševi) rekapituliraju mnoge patološke karakteristike ALS i predstavljaju dostupan životinjski model za proučavanje ALS. Za SALS, bezbroj patoloških mehanizama je implicirano kao osnovni uzrok, uključujući ekscitotoksičnost izazvanu glutamatom, izloženost toksinima, disfunkciju proteazoma, mitohondrijalno oštećenje, dezorganizaciju neurofilamenata i gubitak neurotrofične podrške.
[0164] Eksperimentalni autoimuni encefalomijelitis (EAE), takođe nazvan Eksperimentalni alergijski encefalomijelitis, pruža životinjski model za MS. EAE vrlo blisko liči na različite oblike i stadijume MS. EAE je akutna ili hronična-relapsirajuća, stečena, inflamatorna i demijelinizujuća autoimuna bolest. Da bi se kreirala bolest, životinje se injektiraju proteinima koji čine mijelin, izolacioni omotač koji okružuje neurone. Ovi proteini indukuju autoimuni odgovor kod injektiranih životinja koje razvijaju proces bolesti koji vrlo blisko liči na MS kod ljudi. EAE je indukovan kod niza različitih životinjskih vrsta, uključujući miševe, pacove, zamorce, zečeve, makake, rezus majmune i marmozete.
[0165] Spinalna i bulbarna mišićna atrofija (SBMA) je bolest motornih neurona sa kasnim početkom kod odraslih, uzrokovana ekspanzijom trinukleotidnog ponavljanja (TNR) u egzonu 1 gena androgenog receptora (AR). Ovaj poremećaj karakteriše degeneracija motornih i senzornih neurona, proksimalna mišićna atrofija i endokrine abnormalnosti, kao što su ginekomastija i smanjena plodnost. Samo mužjaci razvijaju simptome, dok su ženke nosioci obično asimptomatske. Molekulska osnova SBMA je ekspanzija trinukleotidnog CAG ponavljanja, koje kodira poliglutaminski (polyQ) trakt, u prvom egzonu gena androgenog receptora (AR). Patološki znak su nuklearne inkluzije (NIs) koje sadrže mutantni i skraćeni AR sa proširenim polyQ u rezidualnim motornim neuronima u moždanom stablu i kičmenoj moždini, kao i u nekim drugim visceralnim organima. Kreirano je nekoliko transgenih mišjih modela za proučavanje patogeneze SBMA. Videti npr. Katsuno et al., Cytogen. and Genome Res. (2003) 100:243-251. Na primer, transgeni mišji model koji nosi čiste 239 CAG pod humanim AR promoterom i drugi model koji nosi skraćeni AR sa proširenim CAG pokazuju motorno oštećenje i nuklearne NIs u spinalnim motornim neuronima. Transgeni miševi koji nose humani AR pune dužine sa proširenim polyQ pokazuju progresivno motorno oštećenje i neurogensku patologiju, kao i seksualnu razliku fenotipova. Ovi modeli rekapituliraju fenotipsku ekspresiju primećenu kod SBMA.
[0166] Mačado-Džozefa bolest (MJD), takođe nazvana spinocerebelarna ataksija tip 3, uzrokovana je mutantnim ataksinom-3 sa poliglutaminskom ekspanzijom. Mišji modeli MJD, kao i drugih poliglutaminskih spinocerebelarnih ataksija su generisani. Za pregled ovih modela, videti npr. Gould, V.F.C. NeuroRX(2005) 2:480-483.
[0167] U skladu s tim, dostupni su životinjski modeli standardni u struci za skrining i/ili procenu aktivnosti i/ili efikasnosti ovde obelodanjenih metoda i kompozicija za tretman poremećaja motornih neurona.
Kompleti pronalaska
[0168] Pronalazak se odnosi na komplete koji mogu obuhvatati jednu ili više posuda koje obuhvataju rekombinantne vektore koji kodiraju protein od interesa. Kompleti mogu dalje obuhvatati odgovarajući set uputstava, generalno pisanih uputstava, koja se odnose na upotrebu vektora za bilo koju od ovde opisanih metoda.
[0169] Kompleti mogu obuhvatati komponente u bilo kojem prikladnom, odgovarajućem pakovanju. Na eprimer, ako su rekombinantni vektori obezbeđeni kao suva formulacija (npr. liofilizovana ili suvi prah), bočica sa elastičnim čepom se normalno koristi, tako da se vektori mogu lako resuspendovati injektiranjem tečnosti kroz elastični čep. Ampule sa neelastičnim, uklonjivim zatvaračima (npr. zapečaćeno staklo) ili elastičnim čepovima su najpogodnije za tečne formulacije. Takođe su predviđeni paketi za upotrebu u kombinaciji sa specifičnim uređajem, kao što je špric ili uređaj za infuziju kao što je mini pumpa.
[0170] Uputstva koja se odnose na upotrebu ili rekombinantnih vektora generalno uključuju informacije o doziranju, rasporedu doziranja i putu primene za nameravanu metodu upotrebe. Posude mogu biti jedinične doze, rasuti paketi (npr. višedozni paketi) ili podjedinične doze. Uputstva priložena u kompletima pronalaska su tipično pisana uputstva na etiketi ili umetka pakovanja (npr. papirni list uključen u komplet), ali su prihvatljiva i mašinski čitljiva uputstva (npr. uputstva na magnetnom ili optičkom disku za skladištenje).
2. EKSPERIMENTALNI DEO
[0171] Primeri su dati isključivo u ilustrativne svrhe.
[0172] Uloženi su napori da se osigura tačnost u pogledu korišćenih brojeva (npr. količina, temperatura, itd.), ali je, naravno, potrebno dopustiti određene eksperimentalne greške i odstupanja.
Materijali i metode
[0173] AAV vektori. Otvoreni okvir čitanja oglednog humanog SMN1 gena (sekvenca otvorenog okvira čitanja je prikazana na slici 9A; odgovarajuća aminokiselinska sekvenca je prikazana na slici 9B; kompletna nukleotidna sekvenca se nalazi pod GenBank pristupnim brojem NM_000344) je kloniran u šatl plazmid koji sadrži ili invertovana terminalna ponavljanja (ITR) AAV2 i 1,6 kb citomegalovirusni pojačivač/pileći β-aktin (CBA) promoter ili scAAV2 ITR i 0,4kb humani β-glukuronidazni (GUSB) promoter. Ograničenje veličine rekombinantnog genoma u scAAV reakciji pakovanja zahtevalo je upotrebu malog promotera (McCarty, D.M. Molec. Ther. (2008) 16:1648-1656). Stoga je odabran 0,4 kb GUSB promoter jer je univerzalno eksprimiran u celom CNS, uključujući motorne neurone kičmene moždine (Passini et al., J. Virol. (2001) 75:12382-12392). Rekombinantni plazmidi su svaki pakovani u AAV serotip-8 kapsid trostrukom plazmidnom kotransfekcijom humanih 293 ćelija (videti npr. američki patent br.6,001,650)
i virioni su prečišćeni kolonom kao što je ranije prijavljeno (O'Riordan et al., J. Gene Med. (2000) 2:444-454.). Dobijeni vektori AAV2/8-CBA-hSMN1 (AAV-hSMN1) i scAAV2/8-GUSB-hSMN1 (scAAV-hSMN1) imali su titre od 8,3 e12 i 2,8 e12 genomskih kopija po ml, respektivno.
[0174] Životinje i postupci. Heterozigotni (SMN<+/->, hSMN2<+/+>, SMNΔ7<++>) parovi za uzgoj su ukrštani i, na dan rođenja (P0), novorođeni mladunci su primili ukupno 3 injekcije po 2 µl svaka u cerebralne lateralne komore obe hemisfere i gornju lumbalnu kičmenu moždinu. Ukupne doze viralnih vektora bile su 5,0 e10 i 1,7 e10 genomskih kopija za AAV-hSMN1 i scAAV-hSMN1, respektivno. Sve injekcije su izvršene finom staklenom mikropipetnom iglom kako je opisano (Passini et al, J. Virol. (2001) 75:12382-12392). Nakon injekcija, mladuncima su isečeni prstići na šapama radi obeležavanja i urađena je genotipizacija (Le et al., Hum. Mol. Genet. (2005) 14:845-857) radi identifikacije SMA (SMN<-/->, hSMN2<+/+>, SMNΔ7<++>), heterozigotnih i miševa divljeg tipa (SMN<+/+>, hSMN2<+/+>, SMNΔ7<++>). Sva legla su smanjena na po 7 mladunaca kako bi se kontrolisala veličina legla u svrhu praćenja preživljavanja. Neka legla nisu dobijala injekcije kako bi se formirale grupe kontrolnih životinja koje nisu tretirane.
[0175] Western blot testovi. Za biohemijsku analizu, tretirani i netretirani miševi su ubijeni u dobi od 16 i 58-66 dana, perfundovani sa fosfatno-puferovanim fiziološkim rastvorom (PBS), kičmene moždine su disekovane i podeljene na lumbalne, torakalne i cervikalne segmente, i brzo zamrznute u tečnom azotu. Tkiva su homogenizovana u koncentraciji od 50 mg/mL korišćenjem T-Per pufera za lizu i koktela inhibitora proteaze (Pierce, Rockford, IL). Homogenati su pročišćeni centrifugiranjem na 10.000 RCF tokom 6 minuta, a koncentracija proteina je izmerena BCA testom (Pierce, Rockford, IL).10-20 µg proteina homogenata je razdvojeno na 4-12% SDS-PAGE, preneto na nitroceluloznu membranu, i sondirano mišjim monoklonskim anti-SMN (1:5,000 BD Biosciences, San Jose, CA) i zečjim poliklonskim anti-β-tubulin (1:750, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) antitelima. Membrane su inkubirane sa infracrvenim sekundarnim antitelima (1:20,000, LI-COR Biosciences, Lincoln NB), a proteinske trake su vizualizovane kvantitativnom fluorescencijom korišćenjem Odyssey (LI-COR Biosciences). Markeri molekulske težine su potvrdili veličine traka.
[0176] Imunohistohemija. Za histološku analizu, tretirani i netretirani miševi su ubijeni u dobi od 16 i 58-66 dana, perfundovani sa 4% paraformaldehidom (pH 7,4), kičmene moždine su uklonjene i stavljene u 30% saharozu tokom 48-72 sata, ugrađene u OCT i isečene na 10 µm smrznute preseke pomoću kriostata. Preseci kičmene moždine su blokirani 1 sat na sobnoj temperaturi (RT), a zatim inkubirani ili sa mišjim monoklonskim anti-SMN antitelom (razređenje 1:200) za identifikaciju AAV-izvedene ekspresije hSMN, ili sa kozjim poliklonalnim antitelom protiv holin acetil transferaze (ChAT) (Millipore; Burlington, MA; razređenje 1:100) za identifikaciju motornih neurona lamina 8 i 9 (ventralni rog) kičmene moždine, ili zečjim poliklonalnim antitelom protiv glijalnog fibrilarnog kiselog proteina (GFAP) (Sigma-Aldrich, razređenje 1:2,500) za detekciju astrocita. Primarna antitela su inkubirana 1 sat na sobnoj temperaturi, nakon čega je usledila noćna inkubacija na 4°C u vlažnoj komori. Preseci kičmene moždine su zatim inkubirani 1h na RT sa ili FITC-konjugovanim sekundarnim antitelom protiv zečjeg primarnog antitela ili Cy3-konjugovanim sekundarnim antitelom protiv kozjeg primarnog antitela (Jackson ImmunoResearch; West Grove, PA; razređenje 1:250). Da bi se povećao SMN i ChAT imunopozitivni signal, korišćen je TSA komplet za amplifikaciju signala (Perkin Elmer; Waltham, MA) ili protokol za oporavak antigena limunskom kiselinom (Vector Labs; Burlingame, CA) prema uputstvima proizvođača, respektivno. Preseci su pokriveni pokrovnim staklom pomoću Vectashield sredstva za postavljanje (Vector Labs; Burlingame, CA).
[0177] Brojanje motornih neurona. Broj ChAT imunopozitivnih ćelija je prebrojan u cervikalnim, torakalnim i lumbalnim segmentima. Bilateralno brojanje je izvršeno pod 100x uvećanjem u ventralnim rogovima duž rostrokaudalne ose tri segmenta kičmene moždine. Susedni preseci bili su udaljeni najmanje 100 mikrona kako bi se sprečilo dvostruko brojanje iste ćelije. Posebna pažnja posvećena je poređenju anatomski usklađenih preseka između različitih životinja, a sve brojeve ćelija je slepo procenjivao jedan posmatrač. Ćelije locirane u laminama 8 i 9 kičmene moždine koje su pokazivale fluorescentni ChAT signal značajno iznad pozadine smatrane su motornim neuronima.
[0178] Veličina miofibera. Za histološku analizu periferije, fiksirani kvadriceps, gastroknemijus i interkostalni mišići sa desne strane svakog miša su obrađeni parafinom i obojeni hematoksilinom-eozinom radi određivanja veličine miofibera kako je prijavljeno (Avila et al., J. Clin. Invest. (2007) 117:659-671). Približno 500 miofibera koji se ne preklapaju iz svakog mišića po životinji nasumično je odabrano i fotografisano pod 60X uvećanjem. Površine poprečnog preseka svakog miofibera su merene korišćenjem softvera Metamorph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).
[0179] Bojenje neuromuskularnog spoja (NMJ). Fiksirane mišićne grupe sa leve strane svakog miša su čuvane u PBS za NMJ analizu. In toto bojenje na razdvojenim mišićnim vlaknima iz kvadricepsa, gastroknemijusa i interkostalnih mišića izvršeno je kako je prijavljeno (Lesbordes et al., Hum. Mol. Genet. (2003) 12:1233-1239). Presinaptički nervni terminali su obeleženi noćnom inkubacijom na 4°C sa zečjim poliklonskim antitelom protiv 150 kD neurofilament izoforme (NF-M, Millipore, Billerica, MA, razređenje 1:200), nakon čega je usledilo biotinilirano sekundarno antitelo protiv zečjeg primarnog antitela (Jackson ImmunoResearch, razređenje 1:200). Acetilholinski receptori na mišićnim krajnjim pločama su obeleženi Alexa 555-konjugovanim α-bungarotoksinom (Molecular Probes, Eugene, OR) u razređenju 1:5000 tokom 3 sata na sobnoj temperaturi. Obojena mišićna vlakna su postavljena na staklene pločice, pokrivena sa Vectashield sredstvom, i posmatrana pod epifluorescencijom. Za NMJ kvantifikaciju, najmanje 100 NMJ iz svakog mišića po životinji nasumično je odabrano i procenjeno pod mikroskopom. Konfokalne slike su snimljene korišćenjem Zeiss LSM 510-META mikroskopa.
[0180] Bihevioralni testovi. U testu refleksa ispravljanja, svaki miš je postavljen u ležeći položaj i mereno je vreme potrebno da se miš repozicionira na sve četiri šape. Postupak je ponovljen tri puta za svaku životinju, a prosek tri rezultata je označen kao rezultat ispravljanja. Ako miš nije reagovao u roku od 60 sekundi, test je prekinut. U testu negativne geotakse, svaki miš je postavljen na platformu pod uglom od 45° okrenut nadole. Test se smatrao uspešnim ako se miš okrenuo za 180° u položaj „glava nagore“. Svakom mišu su data tri pokušaja da izvrši zadatak za 180 sekundi ili manje. U testu snage stiska, prednje i zadnje šape su postavljene zajedno na žičanu mrežu i nežno vučene horizontalno duž mreže. Otpor je beležen u gramima pomoću transduktora sile. U testu širenja zadnjih udova, svaki miš je suspendovan za rep tokom 5 sekundi, a rezultirajuće širenje je bodovano na osnovu arbitrarnog sistema. Zdravo širenje oba zadnja uda slično onom primećenom kod miševa divljeg tipa dobilo je ocenu 4. Akutni ugao širenja ili „slabo širenje“ oba zadnja uda bila je ocena 3. Širenje jedne noge dodeljeno je ocena 2. Miš koji nije pokazivao širenje dobio je ocenu 1. Konačno, ocena 0 se javljala kada je štenac povukao oba zadnja uda zajedno, efektivno ih prekrstivši preko drugog.
[0181] Statistika. Bihevioralni testovi, broj motornih neurona, površine poprečnog preseka miofibera i NMJ analizirani su jednosmernom ANOVA i Bonferonijevim višestrukim post hoc poređenjima i neparenim dvostranim Studentovim t-testovima. Kaplan-Majerova kriva preživljavanja analizirana je log-rank testom ekvivalentnim Mantel-Henzelovom testu. Sve statističke analize su izvršene pomoću GraphPad Prism v4.0 (GraphPad Software, San Diego, CA). Vrednosti sa p < 0,05 smatrane su značajnim.
Primer 1
Značajno povećanje preživljavanja tretmanom primenom AAV-posredovane isporuke SMN1
[0182] SMA miševi na postnatalni dan 0 (P0) su primili intracerebroventrikularnu injekciju AAV-hSMN1 u obe cerebralne lateralne komore i direktnu injekciju u gornju lumbalnu kičmenu moždinu za ukupnu dozu od 5,0 e10 genomskih kopija po mišu. Tretirani i netretirani SMA miševi su nasumično podeljeni ili u kohortu za preživljavanje u kojoj su svi miševi ostavljeni netaknuti i žrtvovani u humanom krajnjem stadijumu, ili u starosnousklađenu kohortu u kojoj su svi miševi žrtvovani 16. dana radi poređenja sa netretiranim SMA miševima u završnoj fazi.
[0183] U kohorti za preživljavanje, SMA miševi tretirani sa AAV-hSMN1 pokazali su značajno povećanje medijane preživljavanja na 50 dana (p < 0,0001), u poređenju sa 15 dana kod netretiranih SMA kontrola (slika 1). Svi tretirani SMA miševi su bili živi 15. dana , a 87,5% tretiranih SMA miševa je bilo živo 19. dana u poređenju sa 0% kod netretiranih SMA. Kaplan-Majerova kriva je pokazala bimodalnu distribuciju preživljavanja sa tretmanom, pri čemu je prva grupa uginula između 17. i 27. dana, a druga grupa između 58. i 66. dana (slika 1). U prvoj grupi, većina tretiranih SMA miševa pokazivala je kretanje, ali su miševi bili zakržljali u rastu i na kraju su pronađeni mrtvi u kavezu. Druga grupa tretiranih SMA miševa od 58-66 dana pokazivala je kretanje i povećanje težine, ali je na kraju razvila tešku nekrozu zadnjih udova koja je rezultirala eutanazijom životinje. Kao takvi, miševi stari 58-66 dana analizirani su paralelno sa starosno-usklađenom kohortom od 16 dana.
Primer 2
AAV-posredovana ekspresija SMN u kičmenoj moždini i brojanje motornih neurona
[0184] Nivoi hSMN proteina su se povećali u celoj kičmenoj moždini nakon primene AAV-hSMN1 u CNS. Kod SMA miševa tretiranih sa AAV 16. dana, došlo je do približno 34,0- i 3,6-puta povećanja nivoa hSMN proteina u injektiranom lumbalnom segmentu u poređenju sa netretiranim SMA i miševima divljeg tipa, respektivno (slika 2A). Povećanje ekspresije hSMN proteina proširilo se i na druge segmente, što je uključivalo >2,0-puta povećanje iznad nivoa divljeg tipa u torakalnoj i cervikalnoj kičmenoj moždini 16. dana (slike 2B i 2C). U drugoj grupi, ekspresija hSMN proteina je održana kod SMA miševa tretiranih sa AAV 58-66. dana. Injektovani lumbalni i susedni torakalni i cervikalni regioni bili su približno 2,5-, 2,2- i 1,2-puta viši od kontrola divljeg tipa iste starosti, respektivno.
[0185] Imunobojenje tkivnih preseka pokazalo je hSMN protein u dorzalnim i ventralnim rogovima kičmene moždine kod tretiranih SMA miševa 16. i 58-66. dana (slika 3). Pri bližem pregledu transdukovanih ćelija, ekspresija hSMN izvedena iz vektora detektovana je u punktiformnom obrascu širom citosola, i u strukturama nalik draguljima u jezgru (slika 3A). Nadalje, hSMN protein je lokalizovan u neuritima u posebnim strukturama nalik granulama koje su se mogle videti kako se protežu duž dendrita i aksona (slike 3B-3D). Vrlo nizak nivo endogenog hSMN proteina kod SMA miševa bio je ispod praga imunodetekcije u ćelijama (slika 3E).
[0186] Ko-lokalizacija sa ChAT i hSMN potvrdila je da je podskup transdukovanih ćelija zaista bio motorni neuroni (slike 3F-3I).16. dana, približno 18-42% ChAT-pozitivnih ćelija u lumbalnim, torakalnim i cervikalnim segmentima kičmene moždine transdukovano je AAV-hSMN1 (slika 3J). Ovaj procenat je bio viši 58-66. dana, gde je 60-70% motornih neurona eksprimiralo egzogeni hSMN u tri segmenta kičmene moždine (slika 3J). Došlo je do opšteg povećanja broja motornih neurona kod tretiranih SMA miševa u poređenju sa netretiranim mutantima (slika 4). Međutim, bilo je značajno manje motornih neurona kod tretiranih SMA miševa u poređenju sa miševima divljeg tipa 16. i 58-66. dana (slika 4).
[0187] hSMN imunobojenje cervikalnih tkivnih preseka od netretiranih, samo intracerebroventrikularno (ICV) injektovanih i samo lumbalno injektovanih heterozigotnih miševa je izvršeno. Samo ICV injekcije nisu doprinele značajnim AAV transdukcionim obrascima u mozgu, ali su ipak generisale značajno ciljanje cervikalne kičmene moždine koje nije bilo moguće postići samo lumbalnim injekcijama. Posebno, samo ICV injekcije rezultirale su ekspresijom hSMN u cervikalnoj kičmenoj moždini. Ovo je bilo u suprotnosti sa intraparenhimalnom injekcijom lumbalnog segmenta koja je pokazala vrlo malu transdukciju cervikalne kičmene moždine, verovatno zbog udaljenosti od mesta injekcije. Povremeno je primećen SMN imunopozitivni signal koji je imao izgled nalik dragulju u jezgru netretiranih heterozigotnih miševa i miševa divljeg tipa. Međutim, ovaj obrazac imunobojenja nije primećen u jezgru netretiranih SMA miševa.
[0188] Stoga, kombinacija ICV i lumbalnih injekcija kod P0 miševa obezbedila je široku, raširenu transdukciju kičmene moždine. ICV injekcije AAV8-hSMN ciljale su cervikalnu kičmenu moždinu za transdukciju.
Primer 3
Efekti AAV tretmana na veličinu miofibera, NMJ i ponašanje
[0189] Kvadriceps (proksimalni), gastroknemijus (distalni) i interkostalni (respiratorni) mišići odabrani su za analizu jer pokazuju izraženu degeneraciju. Kod netretiranih SMA miševa 16. dana, miofiberi su bili mali i većina pojedinačnih ćelija sadržala je površinu poprečnog preseka <100 um<2>(slika 5A). Manje od 10% miofibera od netretiranih SMA miševa sadržalo je površinu poprečnog preseka veću od 200 um<2>. Nasuprot tome, distribucija veličina miofibera kod SMA miševa tretiranih sa AAV-hSMN1 bila je slična divljem tipu, i mnoge ćelije su posedovale površinu poprečnog preseka veću od 200 i veću od 400 µm<2>16. i 58-66. dana, respektivno (slike 5A i 5B). Ukupan prosek 16. dana pokazao je da su miofiberi od tretiranih SMA miševa bili više od 2 puta veći od onih iz netretiranih SMA miševa (slika 5C). Nadalje, prosečna površina poprečnog preseka miofibera kod tretiranih SMA miševa 58-66. dana iznosila je 67%, 76%, i 82% od one kod miševa divljeg tipa u kvadricepsu, gastroknemijusu i interkostalnim mišićima, respektivno (slika 5C).
[0190] Analiza neuromuskularnog spoja (NMJ) od netretiranih SMA miševa 16. dana pokazala je abnormalnu akumulaciju neurofilament proteina na presinaptičkim terminalima (slika 6A). Približno 75-90% presinaptičkih terminala iz kvadricepsa, gastroknemijusa i interkostalnih mišića pokazalo je ovu karakterističnu patologiju kod netretiranih SMA miševa (slika 6F). Nasuprot tome, većina presinaptičkih terminala od SMA miševa tretiranih sa AAV-hSMN1 nije sadržala ovu kolabiranu strukturu (slike 6B, 6D). Samo 10-25% i 5% presinaptičkih terminala od tretiranih SMA miševa pokazalo je ovu karakterističnu patologiju 16. i 58-66. dana, respektivno (slika 6F). Međutim, tretman je rezultirao većim grananjem na presinaptičkim terminalima u poređenju sa divljim tipom (slike 6B-6E). Na postsinaptičkom NMJ-u od tretiranih SMA miševa i miševa divljeg tipa, bojenje α-bungarotoksinom proizvelo je strukturu nalik „pereci“ što je ukazivalo na funkcionalnu mrežu acetilholinskih receptora (slike 6B-6E).
[0191] Tretirani i netretirani miševi su podvrgnuti periodičnim bihevioralnim testovima koji su validirani za ovaj životinjski model (Butchbach et al., Neurobiol. Dis. (2007) 27:207-219; El-Khodar et al., Exp. Neurol. (2008) 212:29-43). Tretirani SMA miševi imali su dobre telesne ocene i motoričke sposobnosti kretanja, dok su netretirani SMA miševi bili iscrpljeni i paralizovani (slika 7A). Tretirani SMA miševi su bili značajno teži od netretiranih SMA kontrola, iako nikada nisu dostigli veličinu divljeg tipa (slika 7B). Tretirani SMA miševi su pokazali značajno poboljšanje u latentnosti ispravljanja (slika 7C). Takođe je došlo do značajnog poboljšanja kod tretiranih SMA miševa u izvršavanju testa negativne geotakse, koji meri prostorno lokomotorno ponašanje (slika 7D). Nadalje, tretirani SMA miševi su pokazali značajna poboljšanja u snazi stiska i u sposobnosti da rašire zadnje udove (slike 7E, 7F).
Primer 4
Efekti na dugovečnost korišćenjem samokomplementarnog AAV
[0192] Ne obavezujući se na teoriju, samokomplementarni AAV (scAAV) vektori se predviđaju da imaju bržu kinetiku ekspresije zbog dvolančanog rekombinantnog genoma (pregledano u McCarty, D.M. Molec. Ther. (2008) 16:1648-1656). Ovo brzo povećanje ekspresije može biti korisno kod visoko agresivnih bolesti ili stanja gde je temporalni prozor intervencije mali. Stoga, da bi se utvrdilo da li ranija ekspresija može poboljšati efikasnost, scAAV vektor (scAAV-hSMN1) je genetski modifikovan i testiran. Korišćenjem istog mesta injekcija kao u primeru 1, doza od 1,7 e10 genomskih kopija scAAV-hSMN1 je primenjena P0 SMA miševima.
[0193] Tretman sa scAAV-hSMN1 rezultirao je izuzetnim i značajnim poboljšanjem medijane preživljavanja od 157 dana (p <0,0001), što je bilo povećanje od 214% i 881% u poređenju sa SMA miševima tretiranim sa AAV-hSMN1 i netretiranim SMA miševima, respektivno (slika 8 ). Približno 42% miševa tretiranih sa scAAV imalo je više od 1000% povećanja (logaritamsko povećanje) u medijani preživljavanja. Nadalje, tretman scAAV2/8-GUSB-hSMN1 rezultirao je time da je 88% SMA miševa živelo duže od 66 dana, nasuprot 0% kod AAV2/8-CBA-hSMN1. SMA miševi tretirani sa scAAV imali su zdrave telesne ocene, bili su dobro negovani, dobijali su na težini i održavali kretanje tokom celog života. Zanimljivo je da su SMA miševi tretirani sa scAAV razvili samo blagu nekrozu zadnjih udova koja nikada nije napredovala u težak fenotip. Većina SMA miševa tretiranih sa scAAV žrtvovana je zbog neočekivane i iznenadne pojave respiratornog distresa, što je uključivalo čujne kliktajuće udahe pri disanju i smanjenu brzinu disanja.
[0194] Da bi se bolje razumeo osnov za primećeno povećanje preživljavanja sa scAAV8-hSMN, dodatni SMA miševi su tretirani pri P0 i žrtvovani 16. ili 64. (58-66d) dana nakon injekcije, i analizirani sa dugovečnim miševima tretiranim scAAV8 iz krive preživljavanja (slika 8 ).16. dana, nivoi ekspresije SMN iz scAAV8-hSMN grupe bili su približno 60-90% u poređenju sa onima primećenim kod WT životinja. Ovi nivoi su bili značajno manji od onih postignutih tretmanom AAV8-hSMN u ovom vremenskom trenutku. Kod SMA miševa tretiranih scAAV8-hSMN, nivoi SMN u lumbalnim i torakalnim segmentima bili su iznad ili na nivoima WT 58-66. i 120-220. dana, respektivno (slike 2A i 2B ). Nasuprot tome, nivoi SMN u cervikalnoj kičmenoj moždini ostali su relativno niski u svim vremenskim tačkama.
[0195] Poređenje tropizma AAV vektora u lumbalnoj kičmenoj moždini ispitano je korišćenjem hSMN imunobojenja na smrznutim tkivnim presecima od netretiranih SMA miševa, SMA miševa tretiranih sa AAV8-hSMN, i SMA miševa tretiranih sa scAAV8-hSMN, 16. i 157. dana nakon injekcije. Difuzni hSMN imunobojeni obrazac u skladu sa morfologijom glijalnih ćelija primećen je 16. dana sa AAV8-hSMN. Dvostruko imunobojenje hSMN i mGFAP potvrdilo je da je podskup ćelija transdukovanih sa AAV8-hSMN bio astrociti. Nasuprot tome, tretman sa scAAV8 rezultirao je ekspresijom hSMN samo u posebnim ćelijskim telima sa neuronskom morfologijom, koja se nije ko-lokalizovala sa GFAP. Dvostruko imunobojenje hSMN i markera motornih neurona mChAT potvrdilo je da je podskup ćelija transdukovanih sa scAAV8-hSMN i AAV8-hSMN bio motorni neuroni. Ekspresija hSMN je takođe primećena u interneuronskim ćelijskim slojevima kičmene moždine sa oba viralna vektora, kao što je prikazano scAAV8-hSMN 157. dana. Dakle, u kontrastu sa AAV8-hSMN-, histološka analiza SMA miševa tretiranih sa scAAV8-hSMN pokazala je da je ekspresija hSMN uglavnom ograničena na neurone.
[0196] Nadalje, dvostruko imunobojenje hSMN i mChAT pokazalo je značajno povećanje procenta motornih neurona transdukovanih scAAV8-hSMN u poređenju sa AAV8-hSMN (slika 10A ). Efikasnije ciljanje motornih neurona sa scAAV koreliralo je sa značajnim povećanjem broja ChAT-pozitivnih ćelija (slike 10B-10D ). Analiza NMJ u kvadricepsu i interkostalnim mišićima 16. dana takođe je pokazala značajno smanjenje broja kolabiranih struktura sa scAAV-hSMN u poređenju sa AAV8-hSMN (slike 10E i 10F ). Međutim, došlo je do povećanja broja aberantnih NMJ 216-269. dana, što je bilo istovremeno sa smanjenjem broja ćelija motornih neurona u scAAV-hSMN grupi (slike 10B-10F ).
[0197] Ukratko, injekcija AAV8-hSMN pri rođenju u CNS mišjeg modela SMA rezultirala je raširenom ekspresijom SMN u celoj kičmenoj moždini koja se pretočila u snažno poboljšanje fiziologije skeletnih mišića. Tretirane SMA životinje su takođe pokazale značajna poboljšanja na bihevioralnim testovima što ukazuje da je neuromuskularni spoj bio funkcionalan. Važno je da je tretman sa AAV8-hSMN povećao srednji životni vek SMA miševa na 50 dana u poređenju sa 15 dana za netretirane kontrole. Štaviše, SMA miševi injektirani samokomplementarnim AAV vektorom rezultirali su poboljšanom efikasnošću uključujući značajno produženje medijane preživljavanja na 157 dana. Ovi podaci dokazuju da je AAV-posredovano povećanje SMN, usmereno na CNS, visoko efikasno u rešavanju i neuronskih i mišićnih patologija teškog mišjeg modela SMA.
[0198] Stoga su obelodanjene kompozicije i metode za tretman poremećaja kičmene moždine.

Claims (7)

Patentni zahtevi
1. Komplet za upotrebu u metodi tretmana spinalne mišićne atrofije (SMA) kod subjekta, pri čemu komplet obuhvata jednu ili više posuda koje obuhvataju rekombinantni AAV virion koji obuhvata samokomplementarni adeno-asocirani virus (scAAV) vektor, pri čemu navedeni scAAV vektor obuhvata polinukleotid, pri čemu polinukleotid kodira protein preživljavanja motornog neurona (SMN) koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu sa najmanje 90% identiteta sekvence sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 2, pri čemu ekspresija navedenog proteina u CNS rezultira barem delimičnom korekcijom neuropatologije i/ili stabilizacijom progresije SMA, i pri čemu scAAV vektor obuhvata kapsidne proteine iz serotipa AAV8.
2. Komplet za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, pri čemu se rekombinantni AAV virion: (i) primenjuje putem primene u barem jednu regiju dubokih cerebelarnih jezgara malog mozga;
(ii) primenjuje putem direktne injekcije u kičmenu moždinu;
(iii) primenjuje putem intracerebroventrikularne injekcije; ili
(iv) primenjuje putem intratekalne injekcije.
3. Komplet za upotrebu u metodi tretmana spinalne mišićne atrofije (SMA) kod subjekta, pri čemu komplet obuhvata jednu ili više posuda koje obuhvataju rekombinantni AAV virion koji obuhvata samokomplementarni adeno-asocirani virus (scAAV) vektor, pri čemu navedeni scAAV vektor obuhvata polinukleotid, pri čemu polinukleotid kodira protein preživljavanja motornog neurona (SMN) koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu sa najmanje 90% identiteta sekvence sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 2, pri čemu ekspresija navedenog proteina u CNS rezultira barem delimičnom korekcijom neuropatologije i/ili stabilizacijom progresije SMA, i pri čemu scAAV vektor obuhvata kapsidne proteine iz serotipa AAV9, i pri čemu se AAV virion:
(i) primenjuje putem primene u barem jednu regiju dubokih cerebelarnih jezgara malog mozga;
(ii) primenjuje putem direktne injekcije u kičmenu moždinu;
(iii) primenjuje putem intracerebroventrikularne injekcije; ili
(iv) primenjuje putem intratekalne injekcije.
4. Komplet za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-3, pri čemu SMN protein obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 2.
5. Komplet za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-4, pri čemu se rekombinantni AAV virion primenjuje u barem jednu cerebralnu lateralnu komoru.
6. Komplet za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-4, pri čemu se rekombinantni AAV virion primenjuje putem i intracerebroventrikularne injekcije i direktne injekcije u kičmenu moždinu.
7. Komplet za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-4, pri čemu se rekombinantni AAV virion primenjuje putem intratekalne injekcije.
RS20250772A 2009-05-02 2010-04-27 Genska terapija za neurodegenerativne poremećaje RS67077B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US17498209P 2009-05-02 2009-05-02
US26805909P 2009-06-08 2009-06-08
EP21200213.3A EP3988660B1 (en) 2009-05-02 2010-04-27 Gene therapy for neurodegenerative disorders

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS67077B1 true RS67077B1 (sr) 2025-08-29

Family

ID=43050324

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20220002A RS62779B1 (sr) 2009-05-02 2010-04-27 Genska terapija neurodegenerativnih poremećaja
RS20250772A RS67077B1 (sr) 2009-05-02 2010-04-27 Genska terapija za neurodegenerativne poremećaje
RS20250773A RS67078B1 (sr) 2009-05-02 2010-04-27 Genska terapija za neurodegenerativne poremećaje

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20220002A RS62779B1 (sr) 2009-05-02 2010-04-27 Genska terapija neurodegenerativnih poremećaja

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20250773A RS67078B1 (sr) 2009-05-02 2010-04-27 Genska terapija za neurodegenerativne poremećaje

Country Status (22)

Country Link
US (9) US20130287736A1 (sr)
EP (5) EP3421603B1 (sr)
JP (3) JP5879256B2 (sr)
KR (2) KR101835490B1 (sr)
CN (2) CN107083400A (sr)
CA (1) CA2759801C (sr)
CY (1) CY1120982T1 (sr)
DK (4) DK3988660T3 (sr)
ES (4) ES3038109T3 (sr)
FI (2) FI3988660T3 (sr)
HR (4) HRP20250897T1 (sr)
HU (4) HUE072713T2 (sr)
IL (2) IL216094A0 (sr)
LT (4) LT3421603T (sr)
MX (4) MX341073B (sr)
PL (4) PL3421603T3 (sr)
PT (4) PT2424991T (sr)
RS (3) RS62779B1 (sr)
RU (2) RU2743398C2 (sr)
SG (3) SG10202109219SA (sr)
SI (4) SI2424991T1 (sr)
WO (1) WO2010129021A1 (sr)

Families Citing this family (101)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9217155B2 (en) 2008-05-28 2015-12-22 University Of Massachusetts Isolation of novel AAV'S and uses thereof
US11219696B2 (en) 2008-12-19 2022-01-11 Nationwide Children's Hospital Delivery of polynucleotides using recombinant AAV9
HRP20250897T1 (hr) 2009-05-02 2025-09-26 Genzyme Corporation Genska terapija za neurodegenerativne poremećaje
US8734809B2 (en) 2009-05-28 2014-05-27 University Of Massachusetts AAV's and uses thereof
EP2561073B1 (en) 2010-04-23 2016-08-24 University of Massachusetts Cns targeting aav vectors and methods of use thereof
EP3444346B1 (en) 2010-04-23 2022-07-27 University of Massachusetts Aav-based treatment of cholesterol-related disorders
JP6312436B2 (ja) * 2010-11-16 2018-04-18 ニューロダイン ライフ サイエンシズ インコーポレイテッドＮｅｕｒｏｄｙｎ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ． ネプリライシンの発現および活性を増大させるための方法および医薬組成物
GB201103062D0 (en) * 2011-02-22 2011-04-06 Isis Innovation Method
CN103476399A (zh) * 2011-04-18 2013-12-25 独立行政法人国立精神·神经医疗研究中心 药剂递送粒子及其制造方法
EP3318635A1 (en) 2011-04-21 2018-05-09 University of Massachusetts Raav-based compositions and methods for treating alpha-1 anti-trypsin deficiencies
US20130039888A1 (en) 2011-06-08 2013-02-14 Nationwide Children's Hospital Inc. Products and methods for delivery of polynucleotides by adeno-associated virus for lysosomal storage disorders
US20150182637A1 (en) * 2012-06-21 2015-07-02 Association Institut De Myologie Widespread gene delivery of gene therapy vectors
AU2013296425B2 (en) 2012-08-01 2018-06-07 Nationwide Children's Hospital Intrathecal delivery of recombinant adeno-associated virus 9
CN103638604B (zh) * 2012-12-31 2016-05-04 深圳先进技术研究院 一种助行系统
US20160045617A1 (en) * 2013-04-10 2016-02-18 Justin C. Lee Treatment of proximal spinal muscular atrophy
MX380973B (es) * 2013-05-01 2025-03-12 Genzyme Corp Composiciones y metodos para tratar la atrofia muscular espinal.
HK1222673A1 (zh) 2013-07-12 2017-07-07 The Children's Hospital Of Philadelphia Aav载体和用於抗aav(腺相关病毒)中和抗体的检测
US10072251B2 (en) 2014-02-19 2018-09-11 University Of Massachusetts Recombinant AAVS having useful transcytosis properties
EP3119406B1 (en) 2014-03-18 2021-01-20 Carmel-Haifa University Economic Corporation Ltd Methods for improving cognitive function via modulation of quinone reductase 2
CA2942515C (en) 2014-03-18 2025-12-09 University Of Massachusetts Raav-based compositions and methods for treating amyotrophic lateral sclerosis
EP2933335A1 (en) * 2014-04-18 2015-10-21 Genethon A method of treating peripheral neuropathies and motor neuron diseases
WO2015164786A1 (en) 2014-04-25 2015-10-29 University Of Massachusetts Recombinant aav vectors useful for reducing immunity against transgene products
WO2015164723A1 (en) 2014-04-25 2015-10-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods and compositions for treating metastatic breast cancer and other cancers in the brain
WO2015187825A2 (en) 2014-06-03 2015-12-10 University Of Massachusetts Compositions and methods for modulating dysferlin expression
EP3200830B1 (en) 2014-10-03 2020-09-09 University of Massachusetts High efficiency library-identified aav vectors
US10370432B2 (en) 2014-10-03 2019-08-06 University Of Massachusetts Heterologous targeting peptide grafted AAVS
CN107073051B (zh) 2014-10-21 2021-08-24 马萨诸塞大学 重组aav变体及其用途
RU2716991C2 (ru) 2014-11-05 2020-03-17 Вояджер Терапьютикс, Инк. Полинуклеотиды aadc для лечения болезни паркинсона
WO2016100575A1 (en) 2014-12-16 2016-06-23 Board Of Regents Of The University Of Nebraska Gene therapy for juvenile batten disease
HRP20190992T1 (hr) * 2014-12-24 2019-09-20 Uniqure Ip B.V. Suprimiranje gena za huntingtin inducirano s rnai
EP3256170B1 (en) 2015-02-13 2020-09-23 University of Massachusetts Compositions and methods for transient delivery of nucleases
US11046955B2 (en) 2015-04-24 2021-06-29 University Of Massachusetts Modified AAV constructs and uses thereof
CA2995733A1 (en) * 2015-08-31 2017-03-09 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Aav-epo for treating companion animals
ES2865487T3 (es) 2015-09-28 2021-10-15 Univ North Carolina Chapel Hill Métodos y composiciones para vectores virales que evaden los anticuerpos
WO2017070516A1 (en) 2015-10-22 2017-04-27 University Of Massachusetts Prostate-targeting adeno-associated virus serotype vectors
EP3364997B1 (en) 2015-10-22 2024-01-17 University of Massachusetts Aspartoacylase gene therapy in the treatment of canavan disease
CA3011939A1 (en) 2016-02-02 2017-08-10 University Of Massachusetts Method to enhance the efficiency of systemic aav gene delivery to the central nervous system
CA3012344A1 (en) 2016-02-12 2017-08-17 University Of Massachusetts Anti-angiogenic mirna therapeutics for inhibiting corneal neovascularization
US20190328906A1 (en) * 2016-03-02 2019-10-31 The Children's Hospital Of Philadelphia Therapy for frontotemporal dementia
US11207426B2 (en) 2016-04-05 2021-12-28 University Of Massachusetts Compositions and methods for selective inhibition of grainyhead-like protein expression
US11413356B2 (en) 2016-04-15 2022-08-16 University Of Massachusetts Methods and compositions for treating metabolic imbalance
JP6671664B2 (ja) * 2016-05-24 2020-03-25 学校法人東京女子医科大学 Ｓｍｎタンパク質の核内構造体の発現解析方法
US11882815B2 (en) 2016-06-15 2024-01-30 University Of Massachusetts Recombinant adeno-associated viruses for delivering gene editing molecules to embryonic cells
US10457940B2 (en) 2016-09-22 2019-10-29 University Of Massachusetts AAV treatment of Huntington's disease
AU2017341849B2 (en) 2016-10-13 2024-03-21 University Of Massachusetts AAV capsid designs
EP3535403A4 (en) * 2016-11-07 2020-08-12 MacQuarie University MODULATION OF PROTEIN ACCUMULATION AND ASSOCIATED USES
JOP20190200A1 (ar) 2017-02-28 2019-08-27 Univ Pennsylvania تركيبات نافعة في معالجة ضمور العضل النخاعي
US11859179B2 (en) 2017-05-09 2024-01-02 University Of Massachusetts Methods of treating amyotrophic lateral sclerosis (ALS)
JOP20190269A1 (ar) 2017-06-15 2019-11-20 Voyager Therapeutics Inc بولي نوكليوتيدات aadc لعلاج مرض باركنسون
JP2020531047A (ja) * 2017-08-16 2020-11-05 エッレジヴ１・ソチエタ・ア・レスポンサビリタ・リミタータ 神経疾患及び神経損傷における使用のためのｂｐｉｆｂ４タンパク質のｖｔｆｔアイソフォーム
CN111448321A (zh) 2017-09-22 2020-07-24 马萨诸塞大学 Sod1双表达载体及其用途
BR112020006661A2 (pt) 2017-10-03 2020-10-13 Prevail Therapeutics, Inc. terapias de genes para distúrbios lipossomais
CN112501208A (zh) 2017-10-03 2021-03-16 普利维尔治疗公司 用于溶酶体障碍的基因疗法
WO2019094253A1 (en) 2017-11-08 2019-05-16 Avexis Inc. Means and method for preparing viral vectors and uses of same
CN108096243B (zh) * 2017-11-24 2020-05-29 江苏康缘药业股份有限公司 银杏内酯组合物的医药用途
CA3086046C (en) 2017-12-29 2023-02-21 Helixmith Co., Ltd. Adeno-associated virus (aav) vector having hybrid hgf gene introduced thereto
CN119679944A (zh) * 2018-01-25 2025-03-25 渤健马萨诸塞州股份有限公司 治疗脊髓性肌萎缩症的方法
US20190256867A1 (en) 2018-02-01 2019-08-22 Homology Medicines, Inc. Adeno-associated virus compositions for restoring pah gene function and methods of use thereof
US10610606B2 (en) 2018-02-01 2020-04-07 Homology Medicines, Inc. Adeno-associated virus compositions for PAH gene transfer and methods of use thereof
BR112020016170A2 (pt) 2018-02-09 2020-12-15 Genentech, Inc. Oligonucleotídeos terapêutico e antissenso, conjugado, sal farmaceuticamente aceitável, composição farmacêutica, método in vitro ou in vivo para modular a expressão de tmem106b, método para tratar ou prevenir uma doença, uso do oligonucleotídeo e uso ou método
AU2019247748A1 (en) 2018-04-03 2020-10-08 Ginkgo Bioworks, Inc. Antibody-evading virus vectors
MX2020010465A (es) 2018-04-03 2021-01-08 Vectores de virus para direccionamiento a tejidos oftalmicos.
EP3774852A1 (en) 2018-04-03 2021-02-17 Stridebio, Inc. Antibody-evading virus vectors
WO2019204369A1 (en) * 2018-04-17 2019-10-24 Applied Stemcell, Inc. Compositions and methods for treating spinal muscular atrophy
KR20210019996A (ko) 2018-05-15 2021-02-23 보이저 테라퓨틱스, 인크. 파킨슨병의 치료를 위한 조성물 및 방법
EP3801638A1 (en) * 2018-06-08 2021-04-14 Novartis AG Cell-based assay for measuring drug product potency
WO2019236995A1 (en) 2018-06-08 2019-12-12 University Of Massachusetts Antisense oligonucleotides to restore dysferlin protein expression in dysferlinopathy patient cells
CN114908099B (zh) * 2018-06-28 2024-07-02 北京锦篮基因科技有限公司 携带设计smn1基因表达框的重组腺相关病毒及应用
EP3856762A1 (en) 2018-09-28 2021-08-04 Voyager Therapeutics, Inc. Frataxin expression constructs having engineered promoters and methods of use thereof
CN109266682B (zh) * 2018-09-29 2022-04-01 中国科学院武汉物理与数学研究所 一种神经细胞快速逆行跨突触标记的方法及应用
US12429487B2 (en) 2018-12-06 2025-09-30 Biogen Ma Inc. Neurofilament protein for guiding therapeutic intervention in amyotrophic lateral sclerosis
RU2731514C2 (ru) * 2018-12-21 2020-09-03 Селл энд Джин Терапи Лтд Генотерапевтический ДНК-вектор на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущий целевой ген, выбранный из группы генов SHH, CTNNB1, NOG, WNT7A для повышения уровня экспрессии этих целевых генов, способ его получения и применения, штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-SHH, или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-CTNNB1, или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-NOG, или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-WNT7A, несущий генотерапевтический ДНК-вектор, способ его получения, способ производства в промышленных масштабах генотерапевтического ДНК-вектора
WO2020160458A1 (en) * 2019-02-01 2020-08-06 Avrobio, Inc. Compositions and methods for treating neurocognitive disorders
BR112021015817A2 (pt) 2019-02-22 2021-10-13 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Vírus adeno-associado recombinante para tratamento de neurodegeneração com início na idade adulta associado a grn
AR118465A1 (es) 2019-03-21 2021-10-06 Stridebio Inc Vectores de virus adenoasociados recombinantes
EP3947700A4 (en) 2019-04-01 2023-01-04 Tenaya Therapeutics, Inc. Adeno-associated virus with engineered capsid
CA3136004A1 (en) 2019-04-10 2020-10-15 Prevail Therapeutics, Inc. Gene therapies for lysosomal disorders
EP3952924A4 (en) * 2019-04-12 2023-05-24 Encoded Therapeutics, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS OF ADMINISTRATION OF THERAPEUTIC PRODUCTS
US12611436B2 (en) 2019-10-17 2026-04-28 Sarepta Therapeutics, Inc. AAV transfer cassette
JP2022551739A (ja) 2019-10-17 2022-12-13 ストライドバイオ，インコーポレイテッド ニーマン・ピック病ｃ型の治療のためのアデノ随伴ウイルスベクター
MX2022004812A (es) * 2019-10-22 2023-02-23 Applied Genetic Tech Corporation Sistemas de virus adeno-asociados (aav) para el tratamiento de enfermedades o trastornos neurodegenerativos asociados a la progranulina.
WO2021119622A1 (en) * 2019-12-12 2021-06-17 Northwestern University Modulation of ubiquitin carboxy-terminal hydrolase ligase 1 expression
TW202140791A (zh) 2020-01-13 2021-11-01 美商霍蒙拉奇醫藥公司 治療苯酮尿症之方法
CN115867650A (zh) 2020-04-20 2023-03-28 克里斯蒂安娜基因编辑研究公司 用于肺癌治疗的aav递送系统
TW202208632A (zh) 2020-05-27 2022-03-01 美商同源醫藥公司 用於恢復ｐａｈ基因功能的腺相關病毒組成物及其使用方法
AU2021328475A1 (en) 2020-08-19 2023-03-16 Sarepta Therapeutics, Inc. Adeno-associated virus vectors for treatment of Rett syndrome
CN112121179A (zh) * 2020-09-15 2020-12-25 山东兴瑞生物科技有限公司 一种组合物及其在治疗脊髓性肌萎缩症中的应用
BR112023006305A2 (pt) 2020-10-09 2023-05-09 Tenaya Therapeutics Inc Métodos e composições de terapia gênica com placofilina-2
CR20230363A (es) * 2021-01-29 2024-02-20 Biocad Joint Stock Co Efecto sinérgico de smn1 y mir-23a en el tratamiento de la atrofia muscular espinal
IL307633A (en) * 2021-04-12 2023-12-01 Univ Pennsylvania Useful preparations in the treatment of spinal muscular atrophy (SBMA)
CN116179605B (zh) * 2021-08-12 2025-11-11 蓝图生物医药(广州)有限公司 一种重组腺相关病毒载体及其应用
WO2023150544A1 (en) * 2022-02-01 2023-08-10 Seattle Children's Hospital D/B/A Seattle Children's Research Institute Simplified method of preparing cells for patient administration
EP4504951A2 (en) * 2022-04-05 2025-02-12 The Johns Hopkins University Methods and materials for treating syngap1-associated neurodevelopmental disorders
WO2023201207A1 (en) 2022-04-11 2023-10-19 Tenaya Therapeutics, Inc. Adeno-associated virus with engineered capsid
WO2023219394A1 (ko) * 2022-05-10 2023-11-16 서울대학교산학협력단 인간 smn1 단백질 변이체 및 이의 용도
CN114903010B (zh) * 2022-05-19 2024-06-07 暨南大学 神经退行性疾病模型的构建方法
WO2023240236A1 (en) 2022-06-10 2023-12-14 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of spinal muscular atrophy related disorders
CN116042719B (zh) * 2022-12-28 2025-11-11 蓝图生物医药(广州)有限公司 一种重组腺相关病毒载体及其应用
WO2024215655A1 (en) 2023-04-10 2024-10-17 Tenaya Therapeutics, Inc. Cardioprotective bag3 therapies
WO2024215653A1 (en) 2023-04-10 2024-10-17 Tenaya Therapeutics, Inc. Guide rnas, vectors, and virions for targeting mutations in the pln gene
CN118045206B (zh) * 2024-04-12 2024-07-05 四川至善唯新生物科技有限公司 一种治疗脊髓型肌肉萎缩的药物组合物及其用途

Family Cites Families (91)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4703008A (en) 1983-12-13 1987-10-27 Kiren-Amgen, Inc. DNA sequences encoding erythropoietin
NZ210501A (en) 1983-12-13 1991-08-27 Kirin Amgen Inc Erythropoietin produced by procaryotic or eucaryotic expression of an exogenous dna sequence
US5139941A (en) 1985-10-31 1992-08-18 University Of Florida Research Foundation, Inc. AAV transduction vectors
JPS62171696A (ja) 1986-01-23 1987-07-28 Sumitomo Chem Co Ltd ヒトエリスロポエチンの製造方法
US4954437A (en) 1986-09-15 1990-09-04 Integrated Genetics, Inc. Cell encoding recombinant human erythropoietin
US5328470A (en) 1989-03-31 1994-07-12 The Regents Of The University Of Michigan Treatment of diseases by site-specific instillation of cells or site-specific transformation of cells and kits therefor
US5399346A (en) 1989-06-14 1995-03-21 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Gene therapy
US5605690A (en) 1989-09-05 1997-02-25 Immunex Corporation Methods of lowering active TNF-α levels in mammals using tumor necrosis factor receptor
US5436146A (en) 1989-09-07 1995-07-25 The Trustees Of Princeton University Helper-free stocks of recombinant adeno-associated virus vectors
AU8200191A (en) 1990-07-09 1992-02-04 United States of America, as represented by the Secretary, U.S. Department of Commerce, The High efficiency packaging of mutant adeno-associated virus using amber suppressions
US5173414A (en) 1990-10-30 1992-12-22 Applied Immune Sciences, Inc. Production of recombinant adeno-associated virus vectors
US5747469A (en) * 1991-03-06 1998-05-05 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions comprising DNA damaging agents and p53
DE69233013T2 (de) 1991-08-20 2004-03-04 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of National Institute Of Health, Office Of Technology Transfer Adenovirus vermittelter gentransfer in den gastrointestinaltrakt
US5587308A (en) 1992-06-02 1996-12-24 The United States Of America As Represented By The Department Of Health & Human Services Modified adeno-associated virus vector capable of expression from a novel promoter
US5478745A (en) 1992-12-04 1995-12-26 University Of Pittsburgh Recombinant viral vector system
US5869305A (en) 1992-12-04 1999-02-09 The University Of Pittsburgh Recombinant viral vector system
US6686200B1 (en) 1993-08-31 2004-02-03 Uab Research Foundation Methods and compositions for the large scale production of recombinant adeno-associated virus
PT728214E (pt) 1993-11-09 2004-11-30 Ohio Med College Linhas celulares estaveis capazes de expressar o gene de replicacao do virus adeno-associado
WO1995013365A1 (en) 1993-11-09 1995-05-18 Targeted Genetics Corporation Generation of high titers of recombinant aav vectors
ATE386131T1 (de) 1994-04-13 2008-03-15 Univ Rockefeller Aav-vermittelte überbringung von dna in zellen des nervensystems
US5658785A (en) 1994-06-06 1997-08-19 Children's Hospital, Inc. Adeno-associated virus materials and methods
EP0708178A1 (en) * 1994-10-19 1996-04-24 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Survival motor neuron (SMN) gene: a gene for spinal muscular atrophy
CA2207927A1 (en) 1994-12-06 1996-06-13 Targeted Genetics Corporation Packaging cell lines for generation of high titers of recombinant aav vectors
US5756283A (en) 1995-06-05 1998-05-26 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Method for improved production of recombinant adeno-associated viruses for gene therapy
US6281010B1 (en) 1995-06-05 2001-08-28 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Adenovirus gene therapy vehicle and cell line
US5882914A (en) 1995-06-06 1999-03-16 The Johns Hopkins University School Of Medicine Nucleic acids encoding the hypoxia inducible factor-1
US5677158A (en) 1995-06-07 1997-10-14 Research Foundation Of State University Of New York In vitro packaging of adeno-associated virus DNA
US6001650A (en) 1995-08-03 1999-12-14 Avigen, Inc. High-efficiency wild-type-free AAV helper functions
US5622856A (en) 1995-08-03 1997-04-22 Avigen High efficiency helper system for AAV vector production
US6004797A (en) 1995-11-09 1999-12-21 Avigen, Inc. Adenovirus helper-free recombinant AAV Virion production
AU2064297A (en) 1996-02-29 1997-09-16 Immusol, Inc Hepatitis c virus ribozymes
JP2002514899A (ja) 1996-03-04 2002-05-21 ターゲティッド ジェネティックス コーポレイション 組換えａａｖベクターを用いて血管中の細胞を形質導入するための方法
US20040076613A1 (en) * 2000-11-03 2004-04-22 Nicholas Mazarakis Vector system
US6261823B1 (en) 1996-12-13 2001-07-17 Schering Corporation Methods for purifying viruses
JP2001506133A (ja) 1996-12-18 2001-05-15 ターゲティッド ジェネティクス コーポレイション 組換えａａｖベクターの産生における使用のための、ａａｖスプリット−パッケージング遺伝子およびこのような遺伝子を含む細胞株
JP2001506132A (ja) 1996-12-18 2001-05-15 ターゲティッド ジェネティクス コーポレイション Ａａｖベクターの産生における使用のためのリコンビナーゼ活性化可能ａａｖパッケージングカセット
US6605429B1 (en) 1997-01-23 2003-08-12 Immusol, Incorporated Gene functional analysis and discovery using randomized or target-specific ribozyme gene vector libraries
US6156303A (en) 1997-06-11 2000-12-05 University Of Washington Adeno-associated virus (AAV) isolates and AAV vectors derived therefrom
US6989264B2 (en) 1997-09-05 2006-01-24 Targeted Genetics Corporation Methods for generating high titer helper-free preparations of released recombinant AAV vectors
US6566118B1 (en) 1997-09-05 2003-05-20 Targeted Genetics Corporation Methods for generating high titer helper-free preparations of released recombinant AAV vectors
DK1009808T3 (da) 1997-09-05 2013-01-21 Genzyme Corp Fremgangsmåder til generering af hjælper-frie præparater af rekombinante aav-vektorer med høj titer
AU756827B2 (en) 1997-10-21 2003-01-23 Targeted Genetics Corporation Transcriptionally-activated AAV inverted terminal repeats (ITRs) for use with recombinant AAV vectors
WO1999020779A1 (en) 1997-10-21 1999-04-29 Targeted Genetics Corporation Amplifiable adeno-associated virus (aav) packaging cassettes for the production of recombinant aav vectors
NZ504847A (en) 1997-12-04 2003-02-28 Genzyme Corp Chimeric protein comprising a hypoxia inducible factor protein and a transcriptional activation domain and pharmaceutical use
IL137510A0 (en) 1998-02-17 2001-07-24 Schering Corp Compositions comprising viruses and methods for concentrating virus preparations
AUPP249298A0 (en) 1998-03-20 1998-04-23 Ag-Gene Australia Limited Synthetic genes and genetic constructs comprising same I
EP1064393B1 (en) 1998-03-20 2004-12-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for helper-free production of recombinant adeno-associated viruses
US6146874A (en) 1998-05-27 2000-11-14 University Of Florida Method of preparing recombinant adeno-associated virus compositions
WO1999061066A2 (en) 1998-05-27 1999-12-02 Avigen, Inc. Convection-enhanced delivery of aav vectors
CA2342849C (en) 1998-09-04 2013-01-29 Genzyme Corporation Methods for generating high titer helper-free preparations of released recombinant aav vectors
US6646113B1 (en) * 1998-09-17 2003-11-11 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Nucleic acid molecule encoding human survival of motor neuron-interacting protein 1 (SIP1) deletion mutants
US6759050B1 (en) 1998-12-03 2004-07-06 Avigen, Inc. Excipients for use in adeno-associated virus pharmaceutical formulations, and pharmaceutical formulations made therewith
US6893865B1 (en) 1999-04-28 2005-05-17 Targeted Genetics Corporation Methods, compositions, and cells for encapsidating recombinant vectors in AAV particles
DK1180159T3 (da) 1999-05-28 2008-11-17 Targeted Genetics Corp Fremgangsmåder og sammensætninger til at sænke niveauet af Tumor-Nekrose-Faktor (TNF) i TNF-associerede lidelser
CA2379166C (en) 1999-08-09 2013-03-26 Targeted Genetics Corporation Enhancement of expression of a single-stranded, heterologous nucleotide sequence from recombinant viral vectors by designing the sequence such that it forms instrastrand base pairs
US20020099025A1 (en) * 1999-12-30 2002-07-25 Heywood James A. Treatment of neurological disorders
JP5118798B2 (ja) 2000-03-07 2013-01-16 メルク・シャープ・エンド・ドーム・コーポレイション アデノウイルス製剤
AU2001257611A1 (en) 2000-04-28 2001-11-12 Avigen, Inc. Polynucleotides for use in recombinant adeno-associated virus virion production
ATE318923T1 (de) 2000-06-01 2006-03-15 Univ North Carolina Doppelsträngige parvovirus-vektoren
US6593123B1 (en) 2000-08-07 2003-07-15 Avigen, Inc. Large-scale recombinant adeno-associated virus (rAAV) production and purification
JP2004516016A (ja) 2000-09-18 2004-06-03 ジェンザイム・コーポレイション ハイブリッドユビキチンプロモーターを含む発現ベクター
EP1402043A1 (en) 2001-07-03 2004-03-31 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Methods of administering vectors to synaptically connected neurons
US20030050273A1 (en) * 2001-08-29 2003-03-13 Keiya Ozawa Compositions and methods for treating neurodegenerative diseases
AU2002348151A1 (en) 2001-11-05 2003-05-19 Genvec, Inc. Viral vector production methods and compositions
US20030134404A1 (en) 2001-11-26 2003-07-17 Lochrie Michael A. Methods for producing stocks of recombinant AAV virions
DK2573170T3 (en) 2001-12-17 2018-04-09 Univ Pennsylvania Sequences of adeno-associated virus (AAV) serotype 9, vectors containing them, and their use
AU2003221733A1 (en) * 2002-04-17 2003-11-03 University Of Florida Research Foundation, Inc. Improved raav vectors
EP1620133B1 (en) 2003-05-01 2015-12-09 Genzyme Corporation Gene therapy for neurometabolic disorders
US7765583B2 (en) 2005-02-28 2010-07-27 France Telecom System and method for managing virtual user domains
CA2606490C (en) * 2005-05-02 2018-02-06 Genzyme Corporation Gene therapy for spinal cord disorders
JP5829372B2 (ja) 2005-05-02 2015-12-09 ジェンザイム・コーポレーション 神経代謝性疾患のための遺伝子治療
AR059089A1 (es) 2006-01-20 2008-03-12 Genzyme Corp Administracion intraventricular de una enzima para enfermedades de almacenamiento lisosomal
WO2008016391A2 (en) 2006-01-31 2008-02-07 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Self-complementary parvoviral vectors, and methods for making and using the same
WO2007120533A2 (en) 2006-03-30 2007-10-25 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Minigene expression cassette
HUE031156T2 (en) 2006-06-07 2017-06-28 Genzyme Corp Gene therapy for amyotrophic lateral sclerosis and other spinal cord disorders
EP2066791B1 (en) 2006-10-03 2012-09-12 Genzyme Corporation Gene therapy for amyotrophic lateral sclerosis and other spinal cord disorders
ITMI20070127A1 (it) 2007-01-29 2008-07-30 Fond I R C C S Proteine e-o peptidi per la prevenzione e-o cura di malattie neurodegenerative
US20080187512A1 (en) * 2007-02-07 2008-08-07 Academia Sinica Treatment for spinal muscular atrophy
EP2176283B1 (en) 2007-07-14 2016-11-02 University of Iowa Research Foundation Methods and compositions for treating brain diseases
EP2019143A1 (en) * 2007-07-23 2009-01-28 Genethon CNS gene delivery using peripheral administration of AAV vectors
EP2058401A1 (en) * 2007-10-05 2009-05-13 Genethon Widespread gene delivery to motor neurons using peripheral injection of AAV vectors
WO2009151546A2 (en) 2008-05-27 2009-12-17 Ptc Therapeutics, Inc. Methods for treating spinal muscular atrophy
WO2010071832A1 (en) 2008-12-19 2010-06-24 Nationwide Children's Hospital Delivery of polynucleotides across the blood brain barrier using recombinant aav9
US11219696B2 (en) 2008-12-19 2022-01-11 Nationwide Children's Hospital Delivery of polynucleotides using recombinant AAV9
US9415121B2 (en) 2008-12-19 2016-08-16 Nationwide Children's Hospital Delivery of MECP2 polynucleotide using recombinant AAV9
HRP20250897T1 (hr) 2009-05-02 2025-09-26 Genzyme Corporation Genska terapija za neurodegenerativne poremećaje
AU2013296425B2 (en) 2012-08-01 2018-06-07 Nationwide Children's Hospital Intrathecal delivery of recombinant adeno-associated virus 9
FR3002237B1 (fr) 2013-02-15 2017-12-15 Genethon Methodes pour la production de particules virales aav double brin
MX380973B (es) 2013-05-01 2025-03-12 Genzyme Corp Composiciones y metodos para tratar la atrofia muscular espinal.
LT3137497T (lt) 2014-05-02 2021-07-26 Genzyme Corporation Aav vektoriai, skirti tinklainės ir cns genų terapijai
EP3411484B1 (en) 2016-02-05 2023-10-04 Emory University Injection of single-stranded or self-complementary adeno-associated virus 9 into the cerebrospinal fluid

Also Published As

Publication number Publication date
PL4342992T3 (pl) 2025-09-22
JP6397391B2 (ja) 2018-09-26
EP3421603A1 (en) 2019-01-02
US20230084580A1 (en) 2023-03-16
MX2023006169A (es) 2023-06-09
JP2012526046A (ja) 2012-10-25
RU2016140850A3 (sr) 2019-11-25
EP4585263A2 (en) 2025-07-16
ES2903127T3 (es) 2022-03-31
HUE057606T2 (hu) 2022-05-28
DK2424991T3 (en) 2018-09-17
CA2759801C (en) 2019-04-02
CN102459611A (zh) 2012-05-16
EP3988660B1 (en) 2025-05-14
MX2011011594A (es) 2011-11-18
US11911440B2 (en) 2024-02-27
US12350311B2 (en) 2025-07-08
SG10202109219SA (en) 2021-10-28
PT2424991T (pt) 2018-10-19
US20230135379A1 (en) 2023-05-04
US20160051699A1 (en) 2016-02-25
RU2016140850A (ru) 2018-12-14
PL3988660T3 (pl) 2025-09-22
US9415119B2 (en) 2016-08-16
PT4342992T (pt) 2025-07-31
LT4342992T (lt) 2025-08-25
MX2018006955A (es) 2020-11-12
HUE072713T2 (hu) 2025-12-28
HUE072183T2 (hu) 2025-10-28
RS67078B1 (sr) 2025-08-29
SG10201404528SA (en) 2014-10-30
IL259898A (en) 2018-07-31
HUE039345T2 (hu) 2018-12-28
PL3421603T3 (pl) 2022-02-14
RU2603740C2 (ru) 2016-11-27
ES3038109T3 (en) 2025-10-09
CA2759801A1 (en) 2010-11-11
SI4342992T1 (sl) 2025-09-30
SI3988660T1 (sl) 2025-09-30
KR20120006073A (ko) 2012-01-17
SI2424991T1 (sl) 2018-11-30
IL216094A0 (en) 2012-01-31
LT3421603T (lt) 2022-01-10
CN107083400A (zh) 2017-08-22
BRPI1010868A2 (en) 2018-06-12
US20200384076A1 (en) 2020-12-10
HRP20212024T1 (hr) 2022-04-01
SG175409A1 (en) 2011-12-29
EP3421603B1 (en) 2021-10-06
EP4342992A2 (en) 2024-03-27
EP4585263A3 (en) 2025-10-22
KR20180027619A (ko) 2018-03-14
FI3988660T3 (fi) 2025-08-14
US20240033323A1 (en) 2024-02-01
DK3988660T3 (da) 2025-08-18
JP2016052309A (ja) 2016-04-14
JP5879256B2 (ja) 2016-03-08
HRP20250892T1 (hr) 2025-09-26
US11975043B2 (en) 2024-05-07
WO2010129021A1 (en) 2010-11-11
ES3041882T3 (en) 2025-11-17
LT3988660T (lt) 2025-08-11
EP2424991A4 (en) 2012-11-14
PT3421603T (pt) 2022-01-10
EP2424991A1 (en) 2012-03-07
HRP20181423T1 (hr) 2018-11-30
MX341073B (es) 2016-08-05
US20250288644A1 (en) 2025-09-18
SI3421603T1 (sl) 2022-02-28
HRP20250897T1 (hr) 2025-09-26
CN102459611B (zh) 2016-11-09
ES2686504T3 (es) 2018-10-18
EP4342992B1 (en) 2025-05-14
US10369193B2 (en) 2019-08-06
US20240350584A1 (en) 2024-10-24
CY1120982T1 (el) 2019-12-11
KR101835490B1 (ko) 2018-03-08
US20170087212A1 (en) 2017-03-30
MX356669B (es) 2018-06-08
JP2018148927A (ja) 2018-09-27
RU2011149094A (ru) 2013-06-10
PT3988660T (pt) 2025-07-31
EP2424991B1 (en) 2018-06-06
US20130287736A1 (en) 2013-10-31
FI4342992T3 (fi) 2025-08-12
PL2424991T3 (pl) 2018-11-30
RS62779B1 (sr) 2022-01-31
DK4342992T3 (da) 2025-08-18
EP3988660A1 (en) 2022-04-27
DK3421603T3 (da) 2022-01-10
LT2424991T (lt) 2018-09-25
RU2743398C2 (ru) 2021-02-18
EP4342992A3 (en) 2024-04-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US12350311B2 (en) Gene therapy for neurodegenerative disorders
RU2836835C2 (ru) Генная терапия нейродегенеративных нарушений
HK40129483A (en) Gene therapy for neurodegenerative disorders
HK40106863A (en) Gene therapy for neurodegenerative disorders
HK40106863B (en) Gene therapy for neurodegenerative disorders
HK40073109B (en) Gene therapy for neurodegenerative disorders
HK40073109A (en) Gene therapy for neurodegenerative disorders
BRPI1010868B1 (pt) Composição compreendendo um virion de aav recombinante, e uso do referido vírion