RS62842B1

RS62842B1 - Jedinjenja cikličnih dinukleotida za lečenje raka

Info

Publication number: RS62842B1
Application number: RS20220079A
Authority: RS
Inventors: Dae-Shik Kim; Frank Fang; Atsushi Endo; Hyeong-Wook Choi; Ming-Hong Hao; Xingfeng Bao; Kuan-Chun Huang
Original assignee: Eisai R&D Man Co Ltd
Priority date: 2017-02-17
Filing date: 2018-02-17
Publication date: 2022-02-28
Also published as: WO2018152450A1; JP6672532B2; PE20191686A1; CN110461416B; EP3582854A1; LT3582853T; EP3582853B1; PL3582853T3; TWI766948B; CN110536719A; BR112019017084A2; PH12019501914B1; MX2019009796A; KR102645790B1; RU2019129127A; US11339188B2; CN110461416A; CY1126855T1; US10618930B2; WO2018152453A1

Description

Opis

REFERENCE NA POVEZANE PRIJAVE

[0001] Ova prijava se nadovezuje na Privremenu patentnu prijavu Sjedinjenih Američkih Država br. 62/460,562, podnetu 17. februara 2017. godine; Privremenu patentnu prijavu Sjedinjenih Američkih Država br. 62/479,169, podnetu 30. marta 2017. godine; Privremenu patentnu prijavu Sjedinjenih Američkih Država br. 62/551,645, podnetu 29. avgusta 2017. godine; Privremenu patentnu prijavu Sjedinjenih Američkih Država br. 62/551,647, podnetu 29. avgusta 2017. godine; i Privremenu patentnu prijavu Sjedinjenih Američkih Država br.

62/551,668, podnetu 29. avgusta 2017. godine.

POZADINA PRONALASKA

[0002] STING (stimulator interferonskih gena) predstavlja signalni molekul urođenog odgovora na dsDNK u citosolu. Delecija STING je prijavljena kod više humanih malignih tumora. Pored toga, deregulacija STING signalizacije kod humanih malignih tumora takođe je prijavljena kod melanoma (Xia T, et al., „Recurrent Loss of STING Signaling in Melanoma Correlates with Susceptibility to Viral Oncolysis“ Cancer Res.2016) i raka debelog creva. (Xia T, et al., „Deregulation of STING Signaling in Colorectal Carcinoma Constrains DNA Damage Responses and Correlates With Tumorigenesis“ Cell Rep.2016;14:282-97). Zanimljivo, u tim studijama, rezultati genomske analize pokazuju da gubitak ekspresije STING nije posledica delecije ili mutacije gena, već do njega dolazi putem epigenetskih promena. (Xia, Cancer Res.

2016; Xia, Cell Rep.2016). Aktivnost STING u zaštiti od raka je takođe potvrđena dokazima koji su dobijeni u studijama na modelu miša. STING nokaut miševi su ispoljili defektnu kontrolu tumora. (Woo SR, et al. „STING-dependent cytosolic DNA sensing mediates innate immune recognition of immunogenic tumors“ Immunity 2014;41:830-42).

[0003] Pored toga, uloga STING u zaštiti ontogeneze je pokazana na nekoliko mišjih spontanih modela, uključujući gliom (Ohkuri T, et al., „Protective role of STING against gliomagenesis: Rational use of STING agonist in anti-glioma immunotherapy“ Oncoimmunology.

2015;4:e999523) i rak debelog creva (Zhu Q, et al., „Cutting edge: STING mediates protection against colorectal tumorigenesis by governing the magnitude of intestinal inflammation“ J. Immunol. 2014;193:4779-82). Ovo antitumorsko dejstvo može biti usled njegove sposobnosti da spreči prekomernu aktivaciju NF-kB i STAT3. (Okihuri 2015). Aktivacija STING puta je takođe pokazala potentnu aktivnost na pretkliničkim mišjim modelima tumora. (Woo 2014; Chandra D, et al. „STING ligand c-di-GMP improves cancer vaccination against metastatic breast cancer“ Cancer Immunol Res. 2014;2:901-10; Corrales L, et al., „Direct Activation of STING in the Tumor Microenvironment Leads to Potent and Systemic Tumor Regression and Immunity“ Cell Rep. 2015;11:1018-30; Curran E, et al. „STING Pathway Activation Stimulates Potent Immunity against Acute Myeloid Leukemia“ Cell Rep. 2016;15:2357-66; Tang CH, et al. „Agonist-Mediated Activation of STING Induces Apoptosis in Malignant B Cells“ Cancer Res. 2016;76:2137-52). Ova antitumorska aktivnost je verovatno posledica poremećaja vaskulature tumora, i praćena je indukcijom adaptivnog imunskog odgovora. (Corrales L, et al., „The host STING pathway at the interface of cancer and immunity“ J. Clin. Invest. 2016;126:2404-11). Ciklični dinukleotidi sa različitim multicikličnim strukturama su nedavno predloženi za moguće modulatore STING (WO 2015/185565 A1). Takođe, opisani su derivati cikličnog-GMP-AMP (cGAMP) kao agensi za izmenu druge informacione signalizacije i kao vezivači STING (WO 2014/179335 A1). Štaviše, istražena je aktivacija STING putem analoga cikličnog adenozin-inozin monofosfata (cAIMP) radi razvoja imunoterapija usmerenih na STING (Lioux T, et al. „Design, Synthesis, and Biological Evaluation of Novel Cyclic Adenosine-lnosine Monophosphate (cAIMP) Analogs That Activate Stimulator of Interferon Genes (STING)“ J. Med. Chem. 2016;59:10253-267). Shodno tome, direktna stimulacija STING u tumorskom mikrookruženju putem agonista može biti pristup za lečenje više vrsta raka.

KRATAK SAŽETAK

[0004] Otelotvorenja mogu da obezbede jedinjenje formule (I):

(gde je P1donji levi fosfor, a P2je gornji desni fosfor, kao što je prethodno prikazano) sa supstituentima i stereohemijom prikazanim u tabeli 1, u nastavku, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so. Simbol

označava jednostruku vezu ili dvostruku vezu.

[0005] Kada atom fosfora ima četiri supstituenta koja se razlikuju, taj atom fosfora će biti stereocentar. SpSp/RpRp/SpRp/RpSp se odnosi na stereohemiju fosfora kako je naznačeno.

TABELA 1

[0006] Otelotvorenja mogu dalje da obezbede jedinjenje formule (II):

sa supstituentima i stereohemijom prikazanim u tabeli 2, u nastavku, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so. Kada atom fosfora ima četiri supstituenta koja se razlikuju, taj atom fosfora će biti stereocentar.

TABELA 2

[0007] Otelotvorenja mogu da obezbede jedinjenje formule (III):

ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, naznačeno time što

R1aje izabran iz grupe koja se sastoji od -H, -OH i -F;

R1bje izabran iz grupe koja se sastoji od -H, -OH i -F, naznačeno time što najmanje jedan od R1ai R1bje -H;

R4aje izabran iz grupe koja se sastoji od -H, -OH i -F;

R4bje izabran iz grupe koja se sastoji od -H, -OH i -F, naznačeno time što najmanje jedan od R4ai R4bje -H;

P1i P2svaki nezavisno ima S ili R stereohemijsku konfiguraciju;

Z je -O- ili -NH-;

X1ai X2asu isti ili različiti, i nezavisno su izabrani od =O ili =S;

X1bi X2bsu isti ili različiti, i nezavisno su izabrani od -OR5i -SR5;

naznačeno time što R5je izabran iz grupe koja se sastoji od -H, C1-6alkila, -C(O)C1-

6alkila i -CH2OC(O)OC1-6alkila;

L1u formuli (III) ima dužinu od četiri, pet ili šest ugljenika, i on je

označava jednostruku vezu, dvostruku vezu ili trostruku vezu, i naznačeno time što (i) 0 ili 1 javljanje

u L1označava trostruku vezu; ili (ii) 0, 1 ili 2 javljanja

u L1označavaju dvostruku vezu, naznačeno time što je geometrija oko svake dvostruke veze cis ili trans; i (iii) naznačeno time što 1 javljanje

u L1označava trostruku vezu, 0 javljanja

u L1označava dvostruku vezu; i (iv) naznačeno time što, kada 2 javljanja

u L1označavaju dvostruku vezu, te dvostruke veze su bilo susedne veze ili naizmenične veze;

naznačeno time što X10, X11, X12, X13, X14i X15su nezavisno izabrani od veze, -CH2-ili - CH-, naznačeno time što je -CH2- ili -CH- nesupstituisan ili supstituisan sa (i) -OH, (ii) -F, (iii) -Cl, (iv) -NH2ili (v) -D, i kada je X10ili X15veza, ta veza nije dvostruka veza ili trostruka veza;

i naznačeno time što bilo koja dva susedna člana grupe koja uključuje X10, X11, X12, X13, X14i X15mogu opciono da grade, sa dodatnim atomima, C3cikloalkil ili C3heterocikloalkil, i navedeni C3heterocikloalkil uključuje N ili O atom;

naznačeno time što su B1i B2nezavisno izabrani od:

pri čemu su veze na tačkama q i r na B1i B2povezane na tačkama q i r na formuli (III).

[0008] U nekim otelotvorenjima, kada L1uključuje trostruku vezu ili više od jedne dvostruke veze, L1može biti, na primer,

[0009] Otelotvorenja mogu takođe da obezbede jedinjenje formule (III):

ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, naznačeno time što

R1aje izabran iz grupe koja se sastoji od -H i -F;

R1bje izabran iz grupe koja se sastoji od -H i -F, naznačeno time što R1ai R1bne moraju oba biti - F;

R4aje izabran iz grupe koja se sastoji od -H i -F;

R4bje izabran iz grupe koja se sastoji od -H i -F, naznačeno time što R4ai R4bne moraju oba biti -F;

P1i P2svaki nezavisno ima S ili R stereohemijsku konfiguraciju;

X1ai X2asu isti ili različiti, i nezavisno su izabrani od =O ili =S;

X1bi X2bsu isti ili različiti, i nezavisno su izabrani od -OR5i -SR5;

naznačeno time što je R5izabran iz grupe koja se sastoji od -H, C1-6alkila i -C(O)C1-

6alkila;

L1u formuli (III) ima dužinu od četiri ili pet ugljenika, i on je

naznačeno time što

označava jednostruku vezu ili dvostruku vezu, i naznačeno time što 0 ili 1 javljanje

u L1označava dvostruku vezu, naznačeno time što je geometrija oko dvostruke veze cis ili trans;

naznačeno time što su X10i X14nezavisno izabrani od veze, -CH- ili -CH2-, i naznačeno time što, kada su X10ili X14veza, ta veza nije dvostruka veza;

1

naznačeno time što su B1i B2nezavisno izabrani od:

[0010] Otelotvorenja mogu da obezbede jedinjenje formule (IV):

(IV) ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, naznačeno time što

R1aje izabran iz grupe koja se sastoji od -H, -OH i -F;

R4aje izabran iz grupe koja se sastoji od -H, -OH i -F;

P1i P2svaki nezavisno ima S ili R stereohemijsku konfiguraciju;

X1ai X2asu isti ili različiti, i nezavisno su izabrani od =O ili =S;

X1bi X2bsu isti ili različiti, i nezavisno su izabrani od -OR5i -SR5;

naznačeno time što R5je izabran iz grupe koja se sastoji od -H, C1-6alkila, -C(O)C1-6alkila i -CH2OC(O)OC1-6alkila;

L1u formuli (IV) ima dužinu od četiri, pet ili šest ugljenika, i on je

naznačeno time što

u L1označava trostruku vezu; ili (ii) 0, 1 ili 2 javljanja

u L1označava trostruku vezu, 0 javljanja

u L1označava dvostruku vezu; i (iv) naznačeno time što, kada 2 javljanja

naznačeno time što su B1i B2nezavisno izabrani od:

1

pri čemu su veze na tačkama q i r na B1i B2povezane na tačkama q i r na formuli (IV).

[0011] Otelotvorenja mogu takođe da obezbede jedinjenje formule (IV):

ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, naznačeno time što

R1aje izabran iz grupe koja se sastoji od -H i -F;

R4aje izabran iz grupe koja se sastoji od -H i -F;

P1i P2svaki nezavisno ima S ili R stereohemijsku konfiguraciju;

X1ai X2asu isti ili različiti, i nezavisno su izabrani od =O ili =S;

X1bi X2bsu isti ili različiti, i nezavisno su izabrani od -OR5i -SR5;

naznačeno time što je R5izabran iz grupe koja se sastoji od -H, C1-6alkila i -C(O)C1-6alkila;

L1u formuli (IV) ima dužinu od četiri ili pet ugljenika i on je

naznačeno time što su B1i B2nezavisno izabrani od:

1

[0012] Otelotvorenja mogu da obezbede jedinjenje formule (V):

ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, naznačeno time što

R1aje izabran iz grupe koja se sastoji od -H, -OH i -F;

R4aje izabran iz grupe koja se sastoji od -H, -OH i -F;

R4bje izabran iz grupe koja se sastoji od -H, -OH i -F, i naznačeno time što najmanje jedan od R4ai R4bje -H;

1

P1i P2svaki nezavisno ima S ili R stereohemijsku konfiguraciju;

X1ai X2asu isti ili različiti, i nezavisno su izabrani od =O ili =S;

X1bi X2bsu isti ili različiti, i nezavisno su izabrani od -OR5i -SR5;

L1u formuli (V) ima dužinu od četiri, pet ili šest ugljenika, i on je

naznačeno time što

u L1označava trostruku vezu; ili (ii) 0, 1 ili 2 javljanja

1

u L1označava trostruku vezu, 0 javljanja

u L1označava dvostruku vezu; i (iv) naznačeno time što, kada 2 javljanja

naznačeno time što su B1i B2nezavisno izabrani od:

1

pri čemu su veze na tačkama q i r na B1i B2povezane na tačkama q i r na formuli (V).

[0013] Otelotvorenja mogu takođe da obezbede jedinjenje formule (V):

ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, naznačeno time što

R1aje izabran iz grupe koja se sastoji od -H i -F;

R4aje izabran iz grupe koja se sastoji od -H i -F;

1

P1i P2svaki nezavisno ima S ili R stereohemijsku konfiguraciju;

X1ai X2asu isti ili različiti, i nezavisno su izabrani od =O ili =S;

X1bi X2bsu isti ili različiti i nezavisno su izabrani od -OR5i -SR5; naznačeno time što je R5izabran iz grupe koja se sastoji od -H, C1-6alkila i -C(O)C1-6alkila;

L1u formuli (V) ima dužinu od četiri ili pet ugljenika, i on je

naznačeno time što

naznačeno time što su B1i B2nezavisno izabrani od:

2

[0014] U nekim otelotvorenjima jedinjenja i/ili soli objavljenih u prethodnim formulama, (i) stereohemijska konfiguracija P1i P2je R, stereohemijska konfiguracija P1je R, a P2je S, ili je stereohemijska konfiguracija P1S, a P2je R; (ii) jedno javljanje

u L1označava dvostruku vezu, naznačeno time što je geometrija oko dvostruke veze trans; i (iii) Z je -O-.

[0015] Dalja otelotvorenja jedinjenja i/ili soli objavljenih u prethodnim formulama mogu se naći u drugim aspektima u ovom tekstu. Na primer, neka otelotvorenja obezbeđuju jedinjenje ili farmaceutski prihvatljivu so, naznačeno time što su R1ai R4aoba -F. U nekim otelotvorenjima, R1bi R4bsu oba -F. U nekim otelotvorenjima, B1i B2su oba

U nekim otelotvorenjima, X1ai X2asu oba =O, i X1bi X2bsu oba -SH. U nekim otelotvorenjima, L1je

[0016] U nekim otelotvorenjima, linker je dug četiri ugljenika. U nekim otelotvorenjima, linker je dug pet ugljenika.

[0017] Neka otelotvorenja obezbeđuju jedinjenje izabrano iz grupe koja se sastoji od:

�

2

�

ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so.

[0018] Otelotvorenja mogu da obezbede jedinjenje ili farmaceutski prihvatljivu so koji imaju jedno ili više od sledećeg: (i) vrednost EC50manju od 100 mikromolarne u testu reporterskih ćelija koje eksprimiraju genetsku varijantu STING HAQ; (ii) vrednost EC50manju od 100 mikromolarne u reporterskim ćelijama koje eksprimiraju humanu varijantu STING AQ; (iii) vrednost EC50manju od 100 mikromolarne u reporterskim ćelijama koje eksprimiraju humanu varijantu STING WT; i (iv) vrednost EC50manju od 100 mikromolarne u reporterskim ćelijama koje eksprimiraju humanu varijantu STING REF. Jedno otelotvorenje obezbeđuje jedinjenje koje ima sledeću strukturu:

2

ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so.

[0019] Dalja otelotvorenja mogu da obezbede ovde objavljenu farmaceutski prihvatljivu so ili jedinjenje, naznačeno time što je so diamonijum so. Dalja otelotvorenja mogu da obezbede ovde objavljena jedinjenja kao so trietil amina (TEA). Dalja otelotvorenja mogu da obezbede farmaceutsku kompoziciju koja sadrži ovde objavljeno jedinjenje ili so i farmaceutski prihvatljiv ekscipijens.

[0020] Otelotvorenja mogu da obezbede postupak za lečenje raka, koji obuhvata primenu na pacijentu ovde objavljenog jedinjenja, farmaceutski prihvatljive soli ili farmaceutske kompozicije.

[0021] Upotreba ovde objavljenog jedinjenja ili njegove farmaceutski prihvatljive soli za pripremu farmaceutske kompozicije za lečenje raka.

[0022] Otelotvorenja mogu da obezbede upotrebu ovde objavljenog jedinjenja, farmaceutski prihvatljive soli ili farmaceutske kompozicije u lečenju raka.

[0023] Otelotvorenja mogu da obezbede postupak za lečenje raka, koji obuhvata identifikovanje pojedinca koji ima rak koji može da se leči ovde objavljenim jedinjenjem, farmaceutski prihvatljivom solju ili farmaceutskom kompozicijom, i primenu na navedenom pojedincu farmaceutski delotvorne količine jedinjenja, farmaceutski prihvatljive soli ili farmaceutske kompozicije pomoću koje je prepoznato da rak može da se leči.

[0024] U nekim otelotvorenjima, na osnovu prisustva alela varijante REF STING kod pacijenta prepoznato je da pojedinac ima rak koji može da se leči ovde objavljenim jedinjenjem, farmaceutski prihvatljivom solju ili farmaceutskom kompozicijom.

[0025] Neka otelotvorenja obezbeđuju postupak za lečenje raka kod pacijenta koji ima REF STING alel, koji obuhvata primenu na navedenom pacijentu ovde objavljenog jedinjenja, farmaceutski prihvatljive soli ili farmaceutske kompozicije.

[0026] Neka otelotvorenja obezbeđuju postupak za lečenje raka kod pacijenta koji ima WT STING alel, koji obuhvata primenu na navedenom pacijentu ovde objavljenog jedinjenja, farmaceutski prihvatljive soli ili farmaceutske kompozicije.

[0027] Neka otelotvorenja obezbeđuju postupak za lečenje raka kod pacijenta koji ima AQ STING alel, koji obuhvata primenu na navedenom pacijentu ovde objavljenog jedinjenja, farmaceutski prihvatljive soli ili farmaceutske kompozicije.

[0028] Neka otelotvorenja obezbeđuju postupak za lečenje raka kod pacijenta koji ima HAQ STING alel, koji obuhvata primenu na navedenom pacijentu ovde objavljenog jedinjenja, farmaceutski prihvatljive soli ili farmaceutske kompozicije.

[0029] U nekim otelotvorenjima, rak je izabran iz grupe koju čine limfom, melanom, kolorektalni karcinom, rak dojke, akutna mijeloidna leukemija, rak debelog creva, rak jetre, rak prostate, rak pankreasa, rak bubrega i gliom. U nekim otelotvorenjima, rak je metastatski.

[0030] U nekim otelotvorenjima jedinjenja ovde predstavljenih formula, jedna od veza u L1je dvostruka veza. U daljim otelotvorenjima, ta dvostruka veza ima trans geometriju. U daljim otelotvorenjima, L1je zasićen. U određenim otelotvorenjima, L1uključuje pet atoma ugljenika. U drugim otelotvorenjima, L1uključuje 4 atoma ugljenika.

[0031] Otelotvorenja mogu dalje da obezbeđuju smeše ovde objavljenih jedinjenja, uključujući smeše stereoizomera ovih jedinjenja. Na primer, može biti obezbeđena smeša jedinjenja 11 i jedinjenja 12, ili može biti obezbeđena smeša jedinjenja 2 i jedinjenja 4. Naravno, ovo nisu ograničavajući primeri, i moguće su druge smeše.

1

[0032] Konkretna otelotvorenja su prikazana u tabeli 3 u nastavku.

TABELA 3

2

4

[0033] U prethodnoj tabeli, jedinjenja 8, 11 i 12 su prikazana istom strukturnom formulom, i odnose se na tri odvojena stereoizomera. Podnosilac predmetne prijave. međutim, navodi da hiralnost fosfora jedinjenja 8 nije nužno ista kao hiralnost fosfora drugih jedinjenja koja su obeležena sa „stereoizomer 1“, kao što je, na primer, jedinjenje 21. Isto važi za sve druge stereoizomere.

[0034] Otelotvorenja mogu da se odnose na C4-C6linkere koji mogu biti kovalentno vezani na bilo kom kraju purinskih ili pirimidinskih baza koje grade deo cikličnog dinukleotida. U jednom otelotvorenju, linkeri su butenski, pentenski ili heksenski linkeri vezani na bilo kom kraju purinskih ili pirimidinskih baza. U drugom otelotvorenju, linkeri su butenski linkeri vezani na bilo kom kraju purinskih baza; u drugom otelotvorenju, linkeri su transbutenski linkeri sa dvostrukom vezom koja se nalazi između centra dva ugljenika.

[0035] Sledeća numerisana otelotvorenja ilustruju upotrebu ovih C4-C6linkera:

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, naznačeno time što:

A1i A2su šećerni ostaci, i mogu biti isti ili različiti;

B3i B4su purinske ili pirimidinske baze koje mogu biti iste ili različite, i koje grade nukleotide sa A1, odnosno A2;

L je alkil linker;

X19i X20su isti ili različiti, i izabrani su iz grupe koja se sastoji od -O-, -CH-, -NH- i -S-, naznačeno time što -CH- i -NH- mogu biti supstituisani ili nesupstituisani.

2. Jedinjenje ili farmaceutski prihvatljiva so iz nabrojanog otelotvorenja 1, naznačeno time što -CH- i -NH- iz X19i X20mogu biti supstituisani C1-6alkilom.

3. Jedinjenje ili farmaceutski prihvatljiva so iz nabrojanog otelotvorenja 1, naznačeno time što L je buten, penten ili heksan.

4. Jedinjenje ili farmaceutski prihvatljiva so iz nabrojanog otelotvorenja 3, naznačeno time što L je transbutenski linker sa dvostrukom vezom u svom centru.

[0036] Jedinjenja ili farmaceutski prihvatljive soli iz numerisanih jedinjenja mogu biti korisni, na primer, za lečenje raka. A1, A2, B3i B4mogu biti dalje supstituisani, na primer, hidroksilom, halogenom ili metoksi grupom. Svaki fosfor u formuli (X) može biti supstituisan, na primer, sa -SH, -OH, =O ili =S sve do ispunjenja valence.

[0037] Primeri za analoge cikličnih dinukleotida koji mogu imati koristi od linkera iz predmetnog pronalaska uključuju, ali nisu ograničeni na one koji su identifikovani u US 2014/0205653 A1; US 2014/0329889 A1; US 2014/0341976 A1; US 2015/0056224 A1; US 2016/0362441 A1; US 2017/0158724 A1; US 2017/044206 A1; US 5,547,941; US 7,569,555 B2; US 7,592,326 B2; US 7,709,458 B2; US 9,549,944 B2; WO 2009/133560 A1; WO 2015/074145 A1; WO 2015/077354 A1; WO 2015/185565 A1; WO 2016/100261 A1; WO 2016/120305 A1; WO 2016/145102 A1; WO 2017/027645 A1; WO 2017/027646 A1; WO

4

2017/075477 A1; WO 2017/093933 A1; WO 2017/123657 A1; WO 2017/175156 A1; EP 1740,192 B1; CN 102199183 A; Corrales, L. et al., „Direct Activation of STING in the Tumor Microenvironment Leads to Potent and Systemic Tumor Regression and Immunity“, Cell Reports, 11: 1018-1030 (2015); i Lioux, T. et al., „Design, Synthesis, and Biological Evaluation of Novel Cyclic Adenosine-Inosine Monophosphate (cAIMP) Analogs That Activate Stimulator of Interferon Genes (STING)“, J. Med. Chem., 59: 10253-10267 (2016). Svi ti dokumenti, uključujući jedinjenja koja se u njima nalaze, obuhvaćeni su referencom u ovom tekstu; ako bilo koji deo bilo kog od tih dokumenata protivreči bilo čemu u ovoj specifikaciji ili je na drugi način nedosledan, onda ova specifikacija ima prednost.

[0038] U nekim otelotvorenjima, ovde objavljeno jedinjenje je slobodna kiselina. U nekim otelotvorenjima, jedinjenje je obezbeđeno kao so NH4ili kao so trietil amina (TEA).

[0039] Otelotvorenja mogu da obezbede postupak za lečenje raka kod pacijenta kome je to potrebno, koji obuhvata primenu na pacijentu terapeutski delotvorne količine ovde objavljenog jedinjenja ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, kao što je prethodno navedeno.

[0040] U nekim otelotvorenjima, jedinjenje se primenjuje kao slobodna kiselina. U nekim otelotvorenjima, jedinjenje se primenjuje kao diamonijumova so (NH4). Razmotrene su farmaceutske kompozicije koje sadrže jedinjenje formule I, formule II, formule III, formule IV, formule V, iz tabele 3, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, kao i farmaceutski prihvatljiv ekscipijens. Otelotvorenja mogu da obezbede jedinjenje prema formuli I u kome je n jednako 1; geometrija oko dvostruke veze je trans; X1i X2su oba SH; stereohemija na P1je S; i stereohemija na P2je R; ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so.

[0041] Otelotvorenja mogu da obezbede postupak za lečenje raka kod pacijenta, koji obuhvata primenu na navedenom pacijentu ovde objavljenog jedinjenja ili njegove farmaceutski prihvatljive soli ili farmaceutske kompozicije. Maligni tumori koji se leče kao što je ovde objavljeno mogu biti metastatski maligni tumori. Oni mogu biti izabrani, na primer, od limfoma, melanoma, kolorektalnog karcinoma, raka dojke, akutne mijeloidne leukemije, raka debelog creva, raka jetre, raka prostate, raka pankreasa, raka bubrega i glioma. Takođe je razmotrena upotreba jedinjenja, soli i farmaceutskih kompozicija za lečenje raka i/ili pripremu leka za lečenje raka.

[0042] Otelotvorenja mogu da obezbede postupak za lečenje raka, koji obuhvata identifikovanje pojedinca koji ima rak koji može da se leči ovde objavljenim jedinjenjem, farmaceutski prihvatljivom solju ili farmaceutskom kompozicijom, i primenu na pojedincu jedinjenja, farmaceutski prihvatljive soli ili farmaceutske kompozicije pomoću koje je prepoznato da pacijent može da se leči. U nekim otelotvorenjima, prepoznato je da pojedinac ima rak koji može da se leči ovde objavljenim jedinjenjem, farmaceutski prihvatljivom solju ili farmaceutskom kompozicijom na osnovu prisustva alela humane REF STING varijante kod pacijenta.

[0043] Otelotvorenja mogu da obezbede postupak za lečenje raka kod pacijenta koji ima REF STING alel, koji obuhvata primenu na navedenom pacijentu ovde objavljenog jedinjenja ili njegove farmaceutski prihvatljive soli ili farmaceutske kompozicije.

[0044] Otelotvorenja mogu da obezbede postupak za lečenje raka kod pacijenta koji ima WT STING alel, koji obuhvata primenu na navedenom pacijentu ovde objavljenog jedinjenja ili njegove farmaceutski prihvatljive soli ili farmaceutske kompozicije.

[0045] Otelotvorenja mogu da obezbede postupak za lečenje raka kod pacijenta koji ima AQ STING alel, koji obuhvata primenu na navedenom pacijentu ovde objavljenog jedinjenja ili njegove farmaceutski prihvatljive soli ili farmaceutske kompozicije.

[0046] Otelotvorenja mogu da obezbede postupak za lečenje raka kod pacijenta koji ima HAQ STING alel, koji obuhvata primenu na navedenom pacijentu ovde objavljenog jedinjenja ili njegove farmaceutski prihvatljive soli ili farmaceutske kompozicije.

KRATAK OPIS SLIKA

[0047]

SL. 1 prikazuje sintezu jedinjenja 1a i jedinjenja 2a.

SL. 2A i SL. 2B prikazuju alternativnu sintezu jedinjenja 1 i jedinjenja 1a. Ta alternativna sinteza je takođe prikazana na SL.2C do SL.2E.

4

SL. 3 prikazuje<1>H NMR spektar jedinjenja 1.

SL. 4A, SL.4B i SL.4C prikazuju rezultate rendgenske kristalografije (ORTEP crteži) za asimetrični kristal jedinjenja 1, prvi molekul iz asimetričnog kristala, odnosno drugi molekul iz asimetričnog kristala.

SL. 4D prikazuje rezultate rendgenske kristalografije (ORTEP crtež) za kristal jedinjenja 2.

SL. 5A i SL.5B prikazuje postupak sinteze za jedinjenja 18, 19 i 20.

SL. 6 prikazuje mapu ekspresionih vektora za WT STING (pLenti-WT humani STING-Puro).

SL. 7 i SL.8 prate primer 108 i prikazuju lekovitu aktivnost jedinjenja 1a na dvojnom modelu tumora CT26.

SL. 9 prati primer 109 i prikazuje grafikon zapremine tumora za lečene tumore i krivu preživljavanja.

SL. 10 prati primer 110 i prikazuje grafikon zapremine tumora za lečene tumore i krivu preživljavanja.

SL. 11 prikazuje sliku rendgenske kristalne strukture humanog WT STING u kompleksu sa jedinjenjem 1.

SL. 12 prikazuje humani REF STING C-terminalni domen u kompleksu sa jedinjenjem 1.

SL. 13 prikazuje primer sinteze jedinjenja 38 i jedinjenja 39.

4

DETALJAN OPIS OTELOTVORENJA

[0048] Ovde su obezbeđena jedinjenja koja mogu biti korisna u lečenju raka. Jedinjenja mogu da aktiviraju stimulator interferonskih gena (STING).

[0049] U nekim otelotvorenjima, jedinjenje je obezbeđeno kao slobodna kiselina. U nekim otelotvorenjima, jedinjenje je obezbeđeno, na primer, kao NH4 so ili TEA so. Referenca na broj jedinjenja praćen slovom „a“ odnosiće se na diamonijumovu so datog jedinjenja. Na primer, „jedinjenje 1a“ se odnosi na diamonijumovu so jedinjenja 1.

[0050] Otelotvorenja mogu da obezbede postupak za lečenje raka kod pacijenta kome je to potrebno, koji obuhvata primenu na pacijentu terapeutski delotvorne količine jedinjenja formule I, formule II, formule III, formule IV ili formule V ili njegove farmaceutski prihvatljive soli.

[0051] U nekim otelotvorenjima, jedinjenje se primenjuje kao slobodna kiselina. U nekim otelotvorenjima, jedinjenje se primenjuje, na primer, kao diamonijumova so (NH4). Mogu takođe biti obezbeđene farmaceutske kompozicije za lečenje raka koje sadrže ovde objavljeno jedinjenje ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, kao i farmaceutski prihvatljiv ekscipijens.

Ovde objavljena otelotvorenja mogu da se koriste za lečenje raka ili za pripremu lekova koji su korisni za lečenje raka. „Rak/maligni tumor“ može da uključuje, ali nije ograničen na, rak debelog creva, rak jetre, melanom, kolorektalni karcinom, rak dojke, akutnu mijeloidnu leukemiju i gliom.

[0052] Stručnjacima za predmetnu oblast će biti jasno da, kada supstituenti koji su vezani za atome fosfora (P1,P2) imaju i jednostruke i dvostruke veze, oni mogu biti podložni tautomerizaciji. Na primer, jedinjenja mogu da se tautomerizuju u ravnoteži. Jedan primer je prikazan u nastavku:

4

[0053] Treba smatrati da su takvi tautomeri u opsegu patentnih zahteva. Strukturni prikaz bilo kog tautomera za dato jedinjenje će predstavljati isto jedinjenje.

[0054] U nekim otelotvorenjima, jedinjenje koje je izabrano iz grupe koja se sastoji od ovde objavljenih jedinjenja obezbeđeno je kao slobodna kiselina ili njena farmaceutski prihvatljiva so. U nekim otelotvorenjima, jedinjenje koje je izabrano iz grupe koja se sastoji od ovde objavljenih jedinjenja obezbeđeno je kao so NH4, koja može biti diamonijumova so.

[0055] Kako se ovde koristi, „C1-6alkil“ ili „C1-C6alkil“ treba da uključuje C1, C2, C3, C4, C5ili C6zasićene alifatične ugljovodonične grupe sa ravnim lancem (linearne) i C3, C4, C5ili C6razgranate zasićene alifatične ugljovodonične grupe. Na primer, C1-6alkil treba da uključuje C1, C2, C3, C4, C5i C6alkil grupe. Primeri za alkil uključuju ostatke koji imaju od jedan do šest atoma ugljenika, kao što su, bez ograničenja, metil, etil, n-propil, i-propil, n-butil, s-butil, tbutil, n-pentil, s-pentil ili n-heksil. Slično tome, „C1-3alkil“ ili „C1-C3alkil“ treba da uključuje C1, C2ili C3zasićene alifatične ugljovodonične grupe sa ravnim lancem (linearne) i C3razgranate zasićene alifatične ugljovodonične grupe.

[0056] Kako se ovde koristi, termin „C3-6cikloalkil“ ili „C3-C6cikloalkil“ odnosi se na zasićeni ili nezasićeni nearomatični ugljovodonični prsten sa 3 do 6 atoma ugljenika (npr. C3-C6). Primeri za cikloalkil uključuju, ali nisu ograničeni na, ciklopropil, ciklobutil, ciklopentil, cikloheksil, cikloheptil, ciklopentenil i cikloheksenil. Termin ili „C5-C6cikloalkil“ odnosi se na zasićeni ili nezasićeni nearomatični ugljovodonični prsten sa 5 do 6 atoma ugljenika (npr. C5-C6).

[0057] Termin „C5-6heterocikloalkil“ ili „C5-C6heterocikloalkil“ odnosi se na zasićeni ili nezasićeni nearomatični 5-6-člani monociklični prsten sa jednim ili više heteroatoma (poput O, N ili S), osim ako nije naznačeno drugačije. Termin ili „C4-C6heterocikloalkil“ odnosi se na zasićeni ili nezasićeni nearomatični 4-6-člani monociklični prsten sa jednim ili više heteroatoma (poput O, N ili S), osim ako nije naznačeno drugačije. Primeri za heterocikloalkil grupe uključuju, ali nisu ograničeni na, piperidinil, piperazinil, pirolidinil, dioksanil, tetrahidrofuranil, izoindolinil, indolinil, imidazolidinil, pirazolidinil, oksazolidinil, izoksazolidinil, triazolidinil, oksiranil, azetidinil, oksetanil, tietanil, 1,2,3,6-tetrahidropiridinil, tetrahidropiranil, tetrahidrotiofen, dihidropiranil, piranil, morfolinil, 1,4-diazepanil, 1,4-oksazepanil, i slično.

4

[0058] Dodatni primeri za heterocikloalkil grupe uključuju, ali nisu ograničeni na, akridinil, azocinil, benzimidazolil, benzofuranil, benzotiofuranil, benzotiofenil, benzoksazolil, benzoksazolinil, benztiazolil, benztriazolil, benztetrazolil, benzizoksazolil, benzizotiazolil, benzimidazolinil, karbazolil, 4aH-karbazolil, karbolinil, hromanil, hromenil, cinolinil, dekahidrohinolinil, 2H,6H-1,5,2-ditiazinil, dihidrofuro[2,3-b]tetrahidrofuran, furanil, furazanil, imidazolidinil, imidazolinil, imidazolil, 1H-indazolil, indolenil, indolinil, indolizinil, indolil, 3H-indolil, izatinoil, izobenzofuranil, izohromanil, izoindazolil, izoindolinil, izoindolil, izohinolinil, izotiazolil, izoksazolil, metilendioksifenil, morfolinil, naftiridinil, oktahidroizohinolinil, oksadiazolil, 1,2,3-oksadiazolil, 1,2,4-oksadiazolil, 1,2,5-oksadiazolil, 1,3,4-oksadiazolil, 1,2,4-oksadiazol5(4H)-on, oksazolidinil, oksazolil, oksindolil, pirimidinil, fenantridinil, fenantrolinil, fenazinil, fenotiazinil, fenoksatinil, fenoksazinil, ftalazinil, piperazinil, piperidinil, piperidonil, 4-piperidonil, piperonil, pteridinil, purinil, piranil, pirazinil, pirazolidinil, pirazolinil, pirazolil, piridazinil, piridooksazol, piridoimidazol, piridotiazol, piridinil, piridil, pirimidinil, pirolidinil, pirolinil, 2H-pirolil, pirolil, hinazolinil, hinolinil, 4H-hinolizinil, hinoksalinil, hinuklidinil, tetrahidrofuranil, tetrahidroizohinolinil, tetrahidrohinolinil, tetrazolil, 6H-1,2,5-tiadiazinil, 1,2,3-tiadiazolil, 1,2,4-tiadiazolil, 1,2,5-tiadiazolil, 1,3,4-tiadiazolil, tiantrenil, tiazolil, tienil, tienotiazolil, tienooksazolil, tienoimidazolil, tiofenil, triazinil, 1,2,3-triazolil, 1,2,4-triazolil, 1,2,5-triazolil, 1,3,4-triazolil i ksantenil.

[0059] Kako se ovde koristi, termin „C5-6aril“ ili „C5-C6aril“ odnosi se na aromatični prsten ugljovodonika sa 5 do 6 atoma ugljenika (npr. C5-C6) koji ne sadrži nijedan heteroatom u strukturi prstena.

[0060] Termin „C3-6heteroaril“ ili „C3-C6heteroaril“ odnosi se na aromatični 3-6-člani monociklični prsten sa jednim ili više heteroatoma (poput O, N ili S), osim ako nije naznačeno drugačije, osim što heteroaril prsten neće sadržati više od jednog atoma kiseonika ili jednog atoma sumpora. Termin uključuje nezasićene alifatične grupe sa 2, 3, 4, 5 ili 6 ugljenika i sa najmanje jednom dvostrukom vezom. Na primer, termin uključuje alkenil grupe sa ravnim lancem (npr. etenil, propenil, butenil, pentenil, heksenil) i razgranate alkenil grupe. U određenim otelotvorenjima, alkenil grupa sa ravnim ili razgranatim lancem ima šest ili manje atoma ugljenika u svom skeletu (npr. C2-C6za ravni lanac, C3-C6za razgranati lanac). Termin uključuje alkenil grupe sa dva do šest atoma ugljenika.

4

[0061] Termin uključuje nezasićene alifatične grupe sa 2, 3, 4, 5 ili 6 atoma ugljenika, ali koje sadrže barem jednu trostruku vezu. Na primer, „alkinil“ uključuje alkinil grupe sa ravnim lancem (npr. etinil, propinil, butinil, pentinil, heksinil) i razgranate alkinil grupe. U određenim otelotvorenjima, alkinil grupa sa ravnim ili razgranatim lancem ima šest ili manje atoma ugljenika u svom skeletu (npr. C2-C6za ravni lanac, C3-C6za razgranati lanac). Termin uključuje alkinil grupe sa dva do šest atoma ugljenika.

Postupci lečenja

[0062] Otelotvorenja mogu da obezbede postupak za lečenje raka kod pacijenta kome je to potrebno, koji obuhvata primenu na pacijentu terapeutski delotvorne količine ovde objavljenog jedinjenja ili njegove farmaceutski prihvatljive soli.

[0063] U nekim otelotvorenjima, primenjeno jedinjenje je obezbeđeno kao slobodna kiselina ili njegova farmaceutski prihvatljiva so. U nekim otelotvorenjima, primenjeno jedinjenje je obezbeđeno kao NH4so, slobodna kiselina ili njegova farmaceutski prihvatljiva so. U nekim otelotvorenjima, jedinjenje je obezbeđeno kao NH4so.

[0064] Termin „opciono supstituisan“ odnosi se na ostatak u kome naznačeni supstituenti zamenjuju jedan ili više atoma vodonika na jednom ili više atoma koji imaju vodonik u ostatku.

[0065] Navedene ili prikazane hemikalije treba da uključuju sve prirodne izotope atoma koji se javljaju u predmetnim jedinjenjima. Izotopi uključuju one atome koji imaju isti atomski broj ali različite masene brojeve. U vidu opšteg primera i bez ograničavanja, izotopi vodonika<1>H uključuju tricijum i deuterijum, a izotopi ugljenika<12>C uključuju<13>C i<14>C.

Doze

[0066] Optimalna doza za lečenje raka može empirijski da se odredi za svakog pojedinca koristeći poznate postupke, i zavisiće od različitih faktora, uključujući aktivnost agensa; starost, telesnu težinu, opšte zdravstveno stanje, pol i ishranu pojedinca; vreme i način primene; i druge lekove koje pojedinac uzima. Optimalne doze mogu da se utvrde koristeći rutinsko testiranje i postupke koji su dobro poznati u struci. Primena prethodnih jedinjenja može da se vrši bilo kojim odgovarajućim putem.

[0067] „Farmaceutski prihvatljiva so“, kako se ovde koristi, odnosi se na kisele adicione soli ili bazne adicione soli jedinjenja iz predmetnog otkrića. Farmaceutski prihvatljiva so je bilo koja so koja zadržava aktivnost matičnog jedinjenja i ne vrši nepotrebno štetno ili neželjeno dejstvo na ispitaniku na kome će se primeniti, i u kontekstu u kome će se primenjivati. Farmaceutski prihvatljive soli uključuju, bez ograničenja, komplekse metala i soli neorganskih i karboksilnih kiselina. Farmaceutski prihvatljive soli takođe uključuju soli metala kao što su soli aluminijuma, kalcijuma, gvožđa, magnezijuma, mangana, i kompleksne soli. Pored toga, farmaceutski prihvatljive soli uključuju, bez ograničenja, soli kiselina kao što su sirćetna, asparaginska, alkilsulfonska, arilsulfonska, aksetilna, benzensulfonska, benzojeva, bikarbonska, bisumporna, bivinska, buterna, kalcijum edetat, kamsilicilna, ugljena, hlorobenzojeva, limunska, etilendiamin tetrasirćetna, etandisulfonska, estolna, esilna, etansulfonska, mravlja, fumarna, glukoheptonska, glukonska, glutaminska, glikolna, glikolilarsanilna, heksaminska, heksilrezorcinska, hidrabaminska, bromovodonična, hlorovodoniča, hidrohlorid, jodovodonična, hidroksinaftoinska, izetionska, mlečna, laktobionska, maleinska, jabučna, malonska, mandelinska, metansulfonska, metilazotna, metilsumporna, mucinska, mukonska, napsilicilna, azotna, oksalna, p-nitrometansulfonska, pamoinska, pantotenska, fosforna, monohidrogen fosforna, dihidrogen fosforna, ftalna, poligalakturonska, propionska, salicilna, stearinska, sukcinska, sulfaminska, sulfanilna, sulfonska, sumporna, taninska, vinska, teoklinska, toluensulfonska, i slično. Takođe mogu da se pripreme i soli natrijuma i soli kalijuma.

[0068] Otelotvorenja mogu biti diamonijumove soli. Farmaceutski prihvatljive soli mogu biti dobijene od aminokiselina, uključujući, bez ograničenja, cistein. Postupci za proizvodnju jedinjenja u obliku soli su poznati stručnjacima za ovu oblast (vidite, npr Stahl et al., Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use, Wiley-VCH; Verlag Helvetica Chimica Acta, Zurich, 2002; Berge et al., J. Pharm. Sci.66: 1, 1977).

[0069] „Delotvorna količina“ terapeutskog agensa je količina koja je dovoljna da se obezbedi uočljiva terapeutska korist u poređenju sa rakom koji je nelečen kod ispitanika ili pacijenta.

1

[0070] Ovde objavljeni aktivni agensi mogu da se kombinuju sa farmaceutski prihvatljivim nosačem kako bi se dobile njegove farmaceutske formulacije. Konkretan izbor nosača i formulacije će zavisiti od konkretnog načina primene za koji je kompozicija predviđena.

„Farmaceutski prihvatljiv nosač“, kako se ovde koristi, odnosi se na netoksični nosač, adjuvans ili vehikulum koji ne uništava farmakološku aktivnost jedinjenja sa kojim se formuliše. Farmaceutski prihvatljivi nosači, adjuvansi ili vehikulumi koji mogu da se koriste u kompozicijama iz ovog pronalaska uključuju, bez ograničenja, sorbinsku kiselinu, kalijum sorbat, smeše delimičnih glicerida zasićenih biljnih masnih kiselina, vode, soli ili elektrolita, dinatrijum hidrogen fosfat, kalijum hidrogen fosfat, natrijum hlorid, cinkove soli, koloidni silicijum dioksid, magnezjium trisilikat, polivinil pirolidon, supstance na bazi celuloze, polietilen glikol, natrijum karboksimetil celulozu, poliakrilate, voskove, polietilen glikol i lanolin.

[0071] Kompozicije iz predmetnog pronalaska mogu biti pogodne za parenteralnu, oralnu primenu, sprej za inhalaciju, topikalnu, rektalnu, nazalnu, bukalnu, vaginalnu primenu ili primenu putem implantiranog rezervoara, itd. U nekim otelotvorenjima, formulacija sadrži sastojke koji su iz prirodnih ili neprirodnih izvora. U nekim otelotvorenjima, formulacija ili nosač mogu da se obezbede u sterilnom obliku. Neograničavajući primeri za sterilni nosač uključuju vodu bez endotoksina ili vodu bez pirogena.

[0072] Termin „parenteralna“, kako se ovde koristi, uključuje supkutane, intravenske, intramuskularne, intraartikularne, intrasinovijalne, intrasternalne, intratekalne, intrahepatičke, intralezione i intrakranijalne tehnike injekcije ili infuzije. U konkretnim otelotvorenjima, jedinjenja se primenjuju intravenski, oralno, supkutano ili putem intramuskularne primene. Sterilni injektabilni oblici kompozicija iz ovog pronalaska mogu biti vodena ili uljana suspenzija. Ove suspenzije mogu biti formulisane u skladu sa tehnikama koje su poznate u struci, koristeći odgovarajuće disperzivne agense ili kvašljivce i suspendujuće agense. Sterilni injektabilni preparat takođe može biti sterilni injektabilni rastvor ili suspenzija u netoksičnom parenteralno prihvatljivom razblaživaču ili rastvaraču. U prihvatljive vehikulume i rastvarače koji mogu da se koriste spadaju voda, Ringerov rastvor i izotonični rastvor natrijum hlorida. Pored toga, sterilna, fiksna ulja se uobičajeno koriste kao rastvarač ili suspendujući medijum.

2

[0073] U tu svrhu može da se koristi bilo koje blago fiksno ulje, uključujući sintetičke monoili digliceride. Masne kiseline i njihovi gliceridni derivati su korisni u pripremi injektabilnih supstanci, kao što su prirodna farmaceutski prihvatljiva ulja, kao što su maslinovo ulje ili ricinusovo ulje, naročito u svojim polioksietilovanim verzijama. Ovi uljani rastvori ili suspenzije mogu takođe da sadrže alkoholni razblaživač ili raspršivač dugog lanca, kao što su karboksimetil celuloza ili slični disperzioni agensi koji se uobičajeno koriste u formulaciji farmaceutski prihvatljivih doznih oblika, uključujući emulzije i suspenzije. Drugi uobičajeno korišćeni surfaktanti, kao što su Tween, Span i drugi emulgatori koji se uobičajeno koriste u proizvodnji farmaceutski prihvatljivih čvrstih, tečnih ili drugih doznih oblika, takođe mogu da se koriste u svrhe formulacije.

[0074] Za oralnu primenu, jedinjenje ili so mogu da se obezbede u prihvatljivom oralnom doznom obliku, uključujući, bez ograničenja, kapsule, tablete, vodene suspenzije ili rastvore. U slučaju tableta za oralnu upotrebu, uobičajeno korišćeni nosači uključuju laktozu i kukuruzni skrob. Takođe mogu biti dodati lubrikansi, kao što je magnezijum stearat. Za oralnu primenu u obliku kapsule, korisni razblaživači uključuju laktozu i osušeni kukuruzni skrob. Kada su potrebne vodene suspenzije za oralnu upotrebu, aktivni sastojak može da se kombinuje sa emulgatorima i suspendujućim agensima. Po želji, mogu da se dodaju i određeni zaslađivači, arome ili boje. Pored toga, mogu da se dodaju i konzervansi. Odgovarajući primeri za farmaceutski prihvatljive konzervanse uključuju, bez ograničenja, različita antibakterijska i antifungalna sredstva, kao što su rastvarači, na primer, etanol, propilen glikol, benzil alkohol, hlorbutanol, kvaternerne amonijumove soli i parabene (kao što je metil paraben, etil paraben, propil paraben, itd.).

[0075] „Trenutno oslobađanje“ treba da obuhvata konvencionalno oslobađanje, kada oslobađanje leka počinje odmah nakon primene. Kako se ovde koristi, termin „trenutno oslobađanje“ uključuje dozne oblike koji omogućavaju da se lek rastvori u gastrointestinalnom traktu, bez namere da se odloži ili produži disolucija ili apsorpcija leka. Cilj je da se lek brzo oslobodi nakon primene, na primer, da bude moguće da se oslobodi najmanje 80% leka u roku od približno 30 minuta nakon početka disolucije u testu disolucije.

„Odloženo oslobađanje“ ili „produženo oslobađanje“ uključuje dozne oblike čije su karakteristike oslobađanja leka u pogledu vremenskog toka i/ili mesta izabrane da se postignu terapeutski ili korisni ciljevi koje ne pružaju uobičajeni dozni oblici, kao što su rastvor ili dozni oblik sa trenutnim oslobađanjem.

Termin „stacionarno stanje“ znači da je nivo u plazmi za dati aktivni agens postignut i održan je pomoću daljih doza aktivnog agensa na nivou koji je iznad minimalno delotvornog terapeutskog nivoa i ispod minimalnog toksičnog nivoa u plazmi za dati aktivni sastojak.

[0076] Termin „jedna formulacija“, kako se ovde koristi, odnosi se na jedan nosač ili vehikulum formulisan za isporuku delotvornih količina oba terapeutska agensa pacijentu. Jedan vehikulum je dizajniran da isporuči delotvornu količinu svakog od agensa zajedno sa farmaceutski prihvatljivim nosačima ili ekscipijensima. U nekim otelotvorenjima, vehikulum je tableta, kapsula, pilula ili flaster.

[0077] Termin „jedinična doza“ ovde se koristi da označi istovremenu primenu oba agensa zajedno, u jednom doznom obliku, na pacijentu koji se leči. U nekim otelotvorenjima, jedinična doza je jedna formulacija. U određenim otelotvorenjima, jedinična doza uključuje jedan ili više vehikuluma tako da svaki vehikulum uključuje delotvornu količinu agensa zajedno sa farmaceutski prihvatljivim nosačima i ekscipijensima. U nekim otelotvorenjima, jedinična doza je jedna ili više tableta, kapsula, pilula ili flastera koji se primenjuju na pacijentu u isto vreme.

[0078] Termin „dozni raspon“, kako se ovde koristi, odnosi se na gornju i donju granicu prihvatljive varijacije količine naznačenog agensa. Uobičajeno, doza agensa u bilo kojoj količini u okviru naznačenog raspona može da se primeni na pacijentima koji su podvrgnuti lečenju.

[0079] Termin „lečiti“ ovde se koristi da znači slabljenje, smanjenje ili ublažavanje najmanje jednog simptoma bolesti kod ispitanika. Na primer, u pogledu raka, termin „lečiti“ može označavati zaustavljanje, odlaganje pojave (tj. perioda pre kliničke manifestacije bolesti ili simptoma bolesti) i/ili smanjenje rizika od razvoja ili pogoršanja simptoma bolesti. Termin „štititi“ ovde se koristi da označava prevenciju, odlaganje ili lečenje, ili sve navedeno, po potrebi, razvoja ili nastavka ili pogoršanja simptoma bolesti kod ispitanika.

4

[0080] Termin „ispitanik“ ili „pacijent“ treba da uključuje životinje koje mogu da obole, ili su obolele od raka. Primeri ispitanika ili pacijenata uključuju sisare, npr. ljude, pse, krave, konje, svinje, ovce, koze, mačke, miševe, zečeve, pacove i transgene nehumane životinje. U određenim otelotvorenjima, ispitanik je čovek, npr. čovek koji boluje od raka, ili je pod rizikom da oboli, ili potencijalno može da oboli.

[0081] Termin „oko“ ili „približno“ obično znači u okviru od 20%, poželjnije u okviru od 10%, a najpoželjnije u okviru od 5% od date vrednosti ili raspona. Alternativno, naročito u biološkim sistemima, termin „oko“ označava približno u okviru reda veličine, poželjno u okviru faktora dva od date vrednosti.

[0082] Treba tumačiti da upotreba pojmova i odrednica za jedninu u kontekstu opisivanja pronalaska (naročito u kontekstu pratećih zahteva) obuhvata i jedninu i množinu, osim ako ovde nije naznačeno drugačije, ili je to jasno opovrgnuto kontekstom. Termine „sadrži“, „ima“, „uključuje“ i „sastoji se“ treba tumačiti kao otvorene termine (tj. sa značenjem „uključuje, ali bez ograničenja“), ako nije drugačije navedeno. Navođenje raspona vrednosti ovde treba samo da služi kao brži metod za ukazivanje na svaku pojedinačnu vrednost koja spada u raspon, osim ako ovde nije drugačije naznačeno, i svaka pojedinačna vrednost je uključena u specifikaciju kao da je ovde pojedinačno navedena.

[0083] Primeri za proliferativne ćelijske poremećaje koji mogu da se leče koristeći jedno ili više ovde otkrivenih jedinjenja uključuju, ali nisu ograničeni na, rak, premalignitet ili premaligno stanje i metastatske lezije u tkivu i organima tela. Proliferativni ćelijski poremećaji mogu da uključuju hiperplaziju, metaplaziju i displaziju.

[0084] Ovde otkriveno jedinjenje ili njegova farmaceutski prihvatljiva so može da se koristi za lečenje ili prevenciju proliferativnog ćelijskog poremećaja, ili za lečenje ili prevenciju raka, kod ispitanika koji ima povećani rizik od nastanka raka u odnosu na ukupnu populaciju, ili da se koristi za identifikovanje odgovarajućih kandidata za te svrhe.

Farmaceutske formulacije i putevi primene

[0085] Ovde su obezbeđene farmaceutske formulacije koje sadrže jedinjenje ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so za lečenje raka. Farmaceutske formulacije mogu dodatno da sadrže nosač ili ekscipijens, stabilizator, aromu i/ili boju.

[0086] Jedinjenje ili njegova farmaceutski prihvatljiva so mogu da se primene koristeći različite puteve primene koji su poznati stručnjacima. Putevi primene uključuju oralnu primenu. U određenim otelotvorenjima, farmaceutska formulacija koja sadrži jedinjenje ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so može da se uzima oralno u vidu tečnosti, sirupa, tablete, kapsule, praška, kapi, tablete za žvakanje ili rastvorljivog diska. Alternativno, farmaceutske formulacije iz predmetnog pronalaska mogu da se primene intravenski ili transdermalno. Stručnjacima za ovu oblast su poznati dodatni putevi primene (vidite, npr. Remington's Pharmaceutical Sciences, Gennaro A. R., Ed., 20. izdanje, Mack Publishing Co., Easton, Pa.).

[0087] U nekim otelotvorenjima, jedinjenje ili farmaceutski prihvatljiva so je formulisana kao pasta, gel ili suspenzija. Na primer, lek je rastvoren, zarobljen ili suspendovan u obliku čestica leka, mikroenkapsuliranih čestica ili čestica lek-polimer u želatinskom rastvoru ili polučvrstoj supstanci. Prednost oralne gel formulacije je ta što je lakše primeniti lek na pacijentima koji imaju teškoće sa gutanjem tableta, kapsula ili pilula. U određenim otelotvorenjima, jedinjenje je temeljno izmešano i suspendovano u odgovarajućem medijumu kako bi se dobila pasta ili gel. Opciono mogu biti pomešani dodatni agensi radi dobijanja ukusa prilikom oralne primene. Kikiriki puter ili alginat, sa ukusom maline i zaslađivačem, primeri su brojnih odgovarajućih agensa za maskiranje ukusa. U različitim otelotvorenjima, pasta ili žele takođe mogu da se formulišu sa odgovarajućim vezivima ili ekscipijensima poznatim u struci za topikalnu primenu.

[0088] U struci su poznati postupci za pripremu formulacija sa odloženim oslobađanjem u vidu tableta, kapsula ili pilula. U nekim otelotvorenjima, formulacija sa odloženim oslobađanjem se priprema oblaganjem aktivnog sastojka leka polimerom, poželjno polimerom koji je nerastvorljiv u vodi. Na primer, polimer nerastvorljiv u vodi koji se koristi u oblasti farmacije kao agens za oblaganje za odloženo oslobađanje, agens za enterično oblaganje ili agens za gastrično oblaganje. Polimer nerastvorljiv u vodi može da uključuje, na primer, etil celulozu, prečišćeni šelak, beli šelak, kopolimer RS aminoalkil metakrilata, hidroksipropil metilcelulozu ftalat, hidroksipropil metilcelulozu acetat sukcinat, karboksimetiletil-celulozu, celulozu acetat ftalat, kopolimer L metakrilne kiseline, kopolimer LD metakrilne kiseline, kopolimer S metakrilne kiseline, kopolimer E aminoalkil metakrilata ili polivinil acetal dietilaminoacetat.

[0089] Vrsta, stepen supstitucije i molekulska masa polimera nerastvorljivih u vodi mogu da zavise od rastvorljivosti aktivnog sastojka u vodi ili alkoholu, nivoa poželjnog odloženog oslobađanja, i slično. Polimeri nerastvorljivi u vodi mogu da se koriste samostalno ili u kombinaciji. Dalje mogu biti uključeni hidrogenovano ulje, stearinska kiselina, ili cetanol kao pomoćni agens za oblaganje, i triglicirid srednjeg lanca, triacetin, trietil citrat ili cetanol kao plastifikator.

U nekim otelotvorenjima, formulacija sa odloženim oslobađanjem je tableta matričnog tipa ili granula. Aktivni sastojak može biti obložen sa najviše 3 različite vrste polimera. Ove tri različite vrste polimera mogu da uključuju: 1) polimer nerastvorljiv u vodi, kao što je etilceluloza; 2) polimer za želiranje nezavisno od pH, kao što je hidroksipropil metilceluloza; i 3) polimer za želiranje zavisno od pH, kao što je natrijum alginat. Ove tri različite vrste polimera mogu da se koriste zajedno kako bi se umanjila brzina oslobađanja lekova.

Dozni oblici: Svojstva oslobađanja

[0090] Formulacije sa odloženim oslobađanjem mogu da postignu određeni stepen odloženog dejstva. Međutim, izloženost i/ili bioraspoloživost aktivnog sastojka može da varira u zavisnosti od različitih faktora, kao što je, na primer, period apsorpcije, nosači ili ekscipijensi koji se koriste u formulaciji, način isporuke formulacije i/ili prolazno vreme aktivnog sastojka kroz gastrointestinalni trakt pacijenta.

[0091] Terapija može da sadrži najmanje jedan deo sa odloženim oslobađanjem koji vrši funkciju odloženog oslobađanja, i jedan deo sa trenutnim oslobađanjem za obavljanje funkcije trenutnog oslobađanja. U određenim otelotvorenjima, kada je terapija u jednom doznom obliku, ona može biti u obliku tableta formiranih od smeše granula sa odloženim oslobađanjem koje čine deo sa odloženim oslobađanjem, i granula sa trenutnim oslobađanjem koje čine deo sa trenutnim oslobađanjem, preparata kapsule dobijenog punjenjem kapsule granulama sa odloženim oslobađanjem i granulama sa trenutnim oslobađanjem, ili tableta obloženih presovanjem, kod kojih je spoljašnji sloj koji čini deo sa trenutnim oslobađanjem formiran na unutrašnjem jezgru koje čini deo sa odloženim oslobađanjem. Međutim, ne postoji ograničenje za prethodna otelotvorenja.

[0092] Štaviše, ne postoje konkretna ograničenja za uslove obuhvatanja leka u kompoziciji ili u delu sa trenutnim oslobađanjem ili delu sa odloženim oslobađanjem; jedinjenje može uniformno da se disperguje u kompoziciji, delu sa trenutnim oslobađanjem ili delu sa odloženim oslobađanjem, ili može biti sadržano samo u jednom delu kompozicije, delu sa trenutnim oslobađanjem ili delu sa odloženim oslobađanjem, ili može biti sadržano tako da postoji gradijent koncentracije.

Deo sa odloženim oslobađanjem u kompoziciji prema predmetnom pronalasku može da sadrži najmanje jednu polimernu supstancu nezavisnu od pH ili polimernu supstancu zavisnu od pH, za kontrolisanje oslobađanja leka.

[0093] Polimerna supstanca nezavisna od pH koja se ovde koristi može da obuhvata polimernu supstancu čije se stanje naelektrisanja slabo menja u pH uslovima koji se obično mogu naći u gastrointestinalnom traktu, naročito od pH 1 do pH 8. To znači, na primer, polimerna supstanca koja nema funkcionalne grupe čije stanje naelektrisanja se menja u zavisnosti od pH, kao što su bazne funkcionalne grupe kao što su amino grupe, ili kisele funkcionalne grupe kao što su grupe karboksilne kiseline. Treba imati u vidu da polimerna supstanca nezavisna od pH može biti uključena radi davanja kompoziciji prema predmetnom pronalasku funkcije odloženog oslobađanja, ali takođe može biti uključena u drugu svrhu. Štaviše, polimerna supstanca nezavisna od pH koja se koristi u predmetnom pronalasku može biti nerastvorljiva u vodi, ili može da bubri u vodi ili da se rastvara u vodi dajući gel.

[0094] Primeri za polimerne supstance nezavisne od pH i nerastvorljive u vodi uključuju, bez ograničenja, celulozne etre, celulozne estre i kopolimere metakrilna kiselina-akrilna kiselina (trgovačko ime Eudragit, proizvodi kompanija Rohm GmbH & Co. KG, Darmstadt, Nemačka). Primeri uključuju, bez ograničenja, celulozne alkil etre kao što je etilceluloza (trgovačko ime Ethocel, proizvodi kompanija Dow Chemical Company, SAD), etil metilceluloza, etil propilceluloza ili izopropilceluloza, i butilceluloza, celulozne aralkil etre kao što je benzil celuloza, celulozne cijanoalkil etre kao što je cijanoetil celuloza, celulozne estre organskih kiselina kao što je celuloza acetat butirat, celuloza acetat, celuloza propionat ili celuloza butirat i celuloza acetat propionat, kopolimere etil akrilat-metil metakrilat (trgovačko ime Eudragit NE, proizvodi kompanija Rohm GmbH & Co. KG, Darmstadt, Nemačka), i kopolimer RS aminoalkil metakrilat (trgovačka imena Eudragit RL, Eudragit RS). Ne postoje konkretna ograničenja za srednji prečnik čestice polimera nerastvorljivog u vodi koji se koristi u predmetnom pronalasku, ali obično važi da što je manji srednji prečnik čestice bolje su performanse, pri čemu je srednji prečnik čestice poželjno od 0,1 do 100 µm, poželjnije od 1 do 50 µm, naročito poželjno od 3 do 15 µm, najpoželjnije od 5 do 15 µm. Štaviše, primeri za polimerne supstance nezavisne od pH i koje su rastvorljive ili bubre u vodi uključuju, bez ograničenja, polietilen oksid (trgovačko ime Polyox, proizvodi kompanija Dow Chemical Company, molekulska masa 100.000 do 7.000.000), nisko supstituisanu hidroksipropil celulozu (trgovačko ime L-HPC, proizvodi kompanija Shin-Etsu Chemical, Japan), hidroksipropil celulozu (trgovačko ime HPC, proizvodi kompanija Nippon Soda, Co., Ltd, Japan), hidroksipropil metilcelulozu (trgovačka imena Metolose 60SH, 65SH, 90SH, proizvodi kompanija Shin-Etsu Chemical, Japan) i metilcelulozu (trgovačko ime Metolose SM, proizvodi kompanija Shin-Etsu Chemical, Japan).

[0095] U nekim otelotvorenjima, samo jedna polimerna supstanca nezavisna od pH može biti sadržana u kompoziciji, ili može biti sadržano više polimernih supstanci nezavisnih od pH. Polimerna supstanca nezavisna od pH, ako se koristi u ovde objavljenim otelotvorenjima, može biti polimerna supstanca nerastvorljiva u vodi, poželjnije etilceluloza, kopolimer etil akrilatmetil metakrilat (trgovačko ime Eudragit NE), ili kopolimer RS aminoalkil metakrilat (trgovačko ime Eudragit RL, Eudragit RS). Naročito je poželjno najmanje jedno od etilceluloze i kopolimera RS aminoalkil metakrilat. Najpoželjnija je etilceluloza. Ne postoje konkretna ograničenja za količinu polimerne supstance nezavisne od pH koja je sadržana u kompoziciji; ta količina može da se podesi po potrebi u skladu sa ciljem kao što je kontrolisanje odloženog oslobađanja leka.

[0096] Polimerna supstanca zavisna od pH koja može da se koristi u ovde objavljenim otelotvorenjima može biti polimerna supstanca čije se stanje naelektrisanja menja u pH uslovima koji se obično mogu naći u gastrointestinalnom traktu, naročito od pH 1 do pH 8. To znači, na primer, polimerna supstanca koja ima funkcionalne grupe čije stanje naelektrisanja se menja u zavisnosti od pH, kao što su bazne funkcionalne grupe kao što su amino grupe, ili kisele funkcionalne grupe kao što su grupe karboksilne kiseline. Funkcionalne grupe zavisne od pH polimerne supstance zavisne od pH poželjno su kisele funkcionalne grupe, pri čemu polimerna supstanca zavisna od pH najpoželjnije ima grupe karboksilne kiseline.

[0097] Polimerna supstanca zavisna od pH koja se koristi u predmetnom pronalasku može biti nerastvorljiva u vodi, ili može da bubri u vodi ili da se rastvara u vodi dajući gel. Primeri za polimerne supstance zavisne od pH koje se koriste u predmetnom pronalasku uključuju, ali nisu ograničeni na, enterične polimerne supstance. Primeri za enterične polimerne supstance uključuju, bez ograničenja, kopolimere metakrilna kiselina-metil metakrilat (Eudragit L100, Eudragit S100, proizvodi kompanija Rohm GmbH & Co. KG, Darmstadt, Nemačka), kopolimere metakrilna kiselina-etil akrilat (Eudragit L100-55, Eudragit L30D-55, proizvodi kompanija Rohm GmbH & Co. KG, Darmstadt, Nemačka), hidroksipropil metilcelulozu ftalat (HP-55, HP-50, proizvodi kompanija Shin-Etsu Chemical, Japan), hidroksipropil metilcelulozu acetat sukcinat (AQOAT, proizvodi kompanija Shin-Etsu Chemical, Japan), karboksimetil etilcelulozu (CMEC, proizvodi kompanija Freund Corporation, Japan) i celulozu acetat ftalat.

[0098] Primeri za polimerne supstance zavisne od pH koje bubre u vodi ili se rastvaraju u vodi dajući gel uključuju, bez ograničenja, alginsku kiselinu, pektin, karboksivinil polimer i karboksimetil celulozu. U predmetnom pronalasku, samo jedna polimerna supstanca zavisna od pH može biti sadržana u kompoziciji, ili može biti sadržano više polimernih supstanci zavisnih od pH. Polimerna supstanca zavisna od pH koja se koristi u predmetnom pronalasku je poželjno enterična polimerna supstanca, poželjnije kopolimer metakrilna kiselina-etil akrilat, kopolimer metakrilna kiselina-metil metakrilat, hidroksipropil metilceluloza ftalat, ili hidroksipropil metilceluloza acetat sukcinat, naročito poželjno kopolimer metakrilna kiselinaetil akrilat.

[0099] Kada se polimerna supstanca zavisna od pH koristi u procesu proizvodnje kompozicije prema predmetnom pronalasku, komercijalno dostupni proizvod praškastog tipa ili granulisanog tipa, ili tipa suspenzije u kojoj je polimerna supstanca zavisna od pH unapred dispergovana u rastvaraču može da se koristi u datom stanju, ili takav komercijalno dostupan proizvod može da se koristi dispergovan u vodi ili u organskom rastvaraču. Što je manji prečnik čestice polimerne supstance zavisne od pH, bolje su performanse, pri čemu je polimerna supstanca zavisna od pH poželjno praškastog tipa. U slučaju kopolimera metakrilna kiselinaetil akrilat, jedan primer je Eudragit L100-55. Ne postoje konkretna ograničenja za srednji prečnik čestice polimerne supstance zavisne od pH koja se koristi u predmetnom pronalasku, ali je srednji prečnik čestice poželjno od 0,05 do 100 µm, poželjnije od 0,05 do 70 µm, najpoželjnije od 0,05 do 50 µm. Štaviše, ne postoje konkretna ograničenja za količinu polimerne supstance zavisne od pH, na primer, u slučaju enterične polimerne supstance, količina je obično od 0,1 do 90 masenih delova, poželjno od 1 do 70 masenih delova, poželjnije od 5 do 60 masenih delova, naročito poželjno od 10 do 50 masenih delova, u odnosu na 100 masenih delova kompozicije.

[0100] Terapija u skladu sa ovde objavljenim otelotvorenjima može dalje da sadrži bilo koji od različitih aditiva, kao što je bilo koji od različitih farmakološki prihvatljivih nosača kao što su razblaživači, lubrikansi, veziva i dezintegransi, kao i konzervanse, boje, zaslađivače, plastifikatore, agense za oblaganje i tako dalje, po potrebi. Primeri za razblaživače uključuju, bez ograničenja, laktozu, manitol, dvobazni kalcijum fosfat, skrob, preželatinizovani skrob, kristalnu celulozu, laki silicijum dioksid amorfni, sintetički aluminijum silikat, magnezijum aluminat metasilikat, i slično. Primeri za lubrikanse uključuju, bez ograničenja, magnezijum stearat, kalcijum stearat, talk, natrijum stearil fumarat, i slično. Primeri za veziva uključuju, bez ograničenja, hidroksipropil celulozu, metilcelulozu, natrijum karboksimetil celulozu, hidroksipropil metilcelulozu, polivinilprolidon, i slično. Primeri za dezintegranse uključuju, bez ograničenja, karboksimetil celulozu, kalcijum karboksimetil celulozu, kroskarmelozu natrijum, natrijum karboksimetil skrob, nisko supstituisanu hidroksipropil celulozu, i slično. Primeri za konzervanse uključuju, bez ograničenja, estre paraoksibenzojeve kiseline, hlorbutanol, benzil alkohol, fenetil alkohol, dehidrosirćetnu kiselinu, sorbinsku kiselinu, i slično. Poželjni primeri za boje uključuju, bez ograničenja, lak pigmente nerastvorljive u vodi, prirodne pigmente (npr. beta-karoten, hlorofil, gvožđe oksid crveni), gvožđe oksid žuti, gvožđe oksid crveni, gvožđe oksid crni, i slično. Poželjni primeri za zaslađivače uključuju, bez ograničenja, natrijum saharin, dikalijum glicirizat, aspartam, steviju, i slično. Primeri za plastifikatore uključuju, bez ograničenja, glicerol estre masnih kiselina, trietil citrat, propilen glikol, polietilen glikol, i slično. Primeri za agense za oblaganje uključuju, bez ograničenja, hidroksipropil metilcelulozu, hidroksipropil celulozu, i slično.

Postupci proizvodnje

[0101] Za proizvodnju ovde objavljenih otelotvorenja može da se koristi jedan uobičajeni postupak, ili kombinacija uobičajenih postupaka. Na primer, prilikom proizvodnje granula koje sadrže lek kao dela sa odloženim oslobađanjem ili dela sa trenutnim oslobađanjem, glavni postupak je granulacija, ali ona može da se kombinuje sa drugim postupcima kao što su mešanje, sušenje, prosejavanje i klasifikacija. Kao postupak granulacije, na primer, može da se

1

koristi postupak vlažne granulacije u kome se vezivo i rastvarač dodaju u prašak i obavlja se granulacija, postupak suve granulacije u kome se prašak komprimuje i obavlja se granulacija, postupak granulacija topljenjem u kome se dodaje vezivo koje se topi prilikom zagrevanja i obavlja se granulacija, i slično.

[0102] Nadalje, u skladu sa postupkom granulacije, može da se koristi radni postupak kao što je postupak granulacije sa mešanjem koristeći planetarni mikser, vijčani mikser, i slično, postupak granulacije sa brzim mešanjem koristeći Henšelov mikser, super mikser, i slično, postupak granulacije sa istiskivanjem koristeći cilindrični granulator, rotacioni granulator, vijčani granulator sa istiskivanjem, tip granulatora sa mlinom za peletiranje, i slično, postupak vlažne granulacije sa velikim smicanjem, postupak granulacije u fluidizovanom sloju, postupak kompresione granulacije, postupak granulacije sa mrvljenjem, ili postupak granulacije sa raspršivanjem. Nakon granulacije, sušenja koristeći sušnicu, fluidizovani sloj, i slično, može da se obavi lomljenje i prosejavanje kako bi se dobile granule ili fine granule za upotrebu. Štaviše, prilikom pripreme kompozicije prema predmetnom pronalasku može da se koristi rastvarač za granulaciju. Ne postoje konkretna ograničenja za takav rastvarač za granulaciju, koji može biti voda ili bilo koji od različitih organskih rastvarača, na primer, voda, niži alkohol kao što je metanol ili etanol, keton kao što je aceton ili metil etil keton, metilen hlorid, ili njihova smeša.

[0103] Za granule sa odloženim oslobađanjem koje su obuhvaćene otelotvorenjima, zajedno su pomešani najmanje jedan lek i najmanje jedan sastojak izabran od polimernih supstanci nezavisnih od pH i polimernih supstanci zavisnih od pH, razblaživač i vezivo se dodaju po potrebi, i vrši se granulacija radi dobijanja granulisane supstance. Dobijena granulisana supstanca je osušena koristeći sušnicu sa tacnama, sušnicu sa fluidizovanim slojem, i slično, i prosejavanje je obavljeno koristeći mlin ili oscilator, čime mogu da se dobiju granule sa odloženim oslobađanjem. Alternativno, kao postupak za proizvodnju granula sa odloženim oslobađanjem u predmetnom pronalasku, moguće je dodati najmanje jedan lek, najmanje jedan sastojak izabran od polimernih supstanci nezavisnih od pH i polimernih supstanci zavisnih od pH, i po potrebi razblaživač i vezivo koristeći suvu presu kao što je presa sa valjkom ili mašina za pravljenje velikih tableta, i obaviti oblikovanje kompresijom uz mešanje, a zatim obaviti granulaciju lomljenjem do odgovarajuće veličine. Granulisana supstanca koja je pripremljena koristeći takav granulator može da se koristi u datom stanju kao granule ili fine granule prema predmetnom pronalasku, ili može dalje da se usitni koristeći električni mlin, granulator sa

2

valjkom, rotacioni brzi mlin, i slično, i da se proseje radi dobijanja granula sa odloženim oslobađanjem. Imajte u vidu da granule sa trenutnim oslobađanjem takođe mogu da se proizvedu kao i granule sa odloženim oslobađanjem.

[0104] Proizvod oblikovan kompresijom može da se proizvede kao deo koji sadrži lek sa odloženim oslobađanjem ili trenutnim oslobađanjem, ili kao kompozicija koja je ovde objavljena, koristeći jedan uobičajeni postupak ili kombinaciju uobičajenih postupaka. Na primer, koristi se najmanje jedan lek, najmanje jedan sastojak izabran od polimernih supstanci nezavisnih od pH i polimernih supstanci zavisnih od pH, razblaživač kao što je manitol ili laktoza, vezivo kao što je polivinilpirolidon ili kristalna celuloza, dezintegrans kao što je natrijum karmeloza ili krospovidon i lubrikans kao što je magnezijum stearat ili talk, i tabletiranje se vrši koristeći uobičajeni postupak, čime može da se dobije proizvod oblikovan kompresijom. U ovom slučaju, tabletiranje je glavna operacija u postupku proizvodnje proizvoda oblikovanog kompresijom, ali može da se kombinuje sa drugim operacijama kao što su mešanje, sušenje, formiranje šećerne obloge i oblaganje.

[0105] Primeri za postupak tabletiranja uključuju, bez ograničenja, oblikovanje direktnom kompresijom u kome se najmanje jedan lek i farmakološki prihvatljivi aditivi zajedno mešaju i zatim se smeša direktnom kompresijom oblikuje u tablete koristeći mašinu za tabletiranje, i kompresiju suvih granula ili kompresiju vlažnih granula kada se granule sa odloženim oslobađanjem ili granule sa trenutnim oslobađanjem prema predmetnom pronalasku podvrgavaju oblikovanju kompresijom, nakon dodavanja lubrikansa ili dezintegransa po potrebi. Nema posebnih ograničenja vezanih za mašinu za tabletiranje koja se koristi u oblikovanju kompresijom; na primer, ekscentrična tabletirka, rotaciona tabletirka, ili mašina za presovanje tableta.

[0106] Granule sa odloženim oslobađanjem ili granule sa trenutnim oslobađanjem koje sadrže lek, ili proizvod oblikovan kompresijom prema otelotvorenjima u ovom tekstu, mogu da se koriste u datom stanju u obliku granula ili tableta kao kompozicija, ali takođe mogu da se podvrgnu daljoj preradi radi proizvodnje kompozicije. Na primer, proizvod oblikovan kompresijom ili granule mogu dobiti film oblogu koristeći materijal na bazi filma kao što je etilceluloza, kazein, metilceluloza, hidroksipropil metilceluloza, kopolimer L metakrilne kiseline, celuloza acetat ftalat, šelak, i slično, ili šećernu oblogu koristeći šećernu tečnost za oblaganje koja sadrži saharozu, šećerni alkohol, arapsku gumu u prahu, talk, i slično, čime se dobijaju film tablete ili tablete sa šećernom oblogom. Jedan rastvarač u ovoj tehnici oblaganja može biti prečišćena voda, ali takođe može da se koristi organski rastvarač kao što je alkohol, keton, etar ili hlorovani ugljovodonik, ili njihova smeša. Na primer, etanol, aceton, metilen hlorid, i slično, mogu da se koriste kao organski rastvarač. Štaviše, kao uređaj za oblaganje može da se koristi uređaj koji se uobičajeno koristi u tehnikama oblaganja za proizvodnju lekova, pri čemu primeri za to uključuju uređaj za oblaganje raspršivanjem u kome se oblaganje vrši raspršivanjem tečnosti za oblaganje, i slično, ili rotacioni granulator sa fluidizovanim slojem za nanošenje slojeva.

[0107] U slučaju proizvodnje preparata kapsula, preparati kapsule mogu da se proizvedu punjenjem granula sa odloženim oslobađanjem ili granula sa trenutnim oslobađanjem kao što su prethodno prikazane, ili mini tableta, u tvrde želatinske kapsule ili HPMC kapsule koristeći mašinu za automatsko punjenje kapsula. Alternativno, u slučaju preparata za primenu preko cevčice ili suvog sirupa koji se koristi pomešan sa vodom, i slično, prilikom uzimanja, granule sa odloženim oslobađanjem ili granule sa trenutnim oslobađanjem, kao što su prethodno prikazane, mogu da se pomešaju sa ugušćivačem ili dispergujućim agensom radi disperzije ovih granula, i smeša se zatim oblikuje u granule ili tablete. Nadalje, tečnost ili gel mogu da se naprave koristeći vodu i supstance izabrane od dispergujućih agensa, emulgatora, agensa za zgušnjavanje, konzervansa, agensa za podešavanje pH, zaslađivača, aroma, mirisa, i slično. Međutim, u pogledu drugih postupaka proizvodnje, nema ograničenja vezanih za prethodno.

[0108] Kako bi ovde opisana otelotvorenja mogla bolje da se razumeju, dati su sledeći primeri. Treba razumeti da ovi primeri služe samo za ilustraciju, i ne treba ih tumačiti kao ograničavajuće.

PRIMERI

[0109] Sledeće skraćenice mogu da se koriste u primerima.

All: alil

BOP: (Benzotriazol-1-iloksi)tris(dimetilamino)fosfonijum heksafluorfosfat

DMT: 4,4'-dimetoksitritil

4

(DMTO-:

)

Bz: benzoil

ib: izobutiril

Hunigova baza: i-Pr2NEt (diizopropiletilamin) AlilOH: alil alkohol

OAll: -OCH2CHCH2

ACN: acetonitril

All: -CH2CHCH2

2-nitroBnBr: 2-nitrobenzil bromidBz: benzoil ib: izobutiril

i-Pr: izopropil

CE: cijanoetil

(-OCE:

DEAD: dietil azodikarboksilat

DIAD: diizopropil azodikarboksilat

DCM: dihlormetan

DDTT: N,N-dimetil-N'-(3-tiokso-3H-1,2,4-ditiazol-5-il)formimidamid

-dimetil-1,3,2-dioksafosfinan 2-oksid

TBS: t-butildimetilsilil

3H-benzo[c][1,2]ditiol-3-on:

Primer 1 – Sinteza jedinjenja 1a

[0110] Kompletna šema za ovu sintezu dostupna je na SL.1.

Korak A

[0111]

[0112] U smešu (2R,3R,4R,5R)-5-(6-benzamido-9H-purin-9-il)-2-((bis(4-metoksifenil)(fenil)metoksi)metil)-4-fluortetrahidrofuran-3-il (2-cijanoetil) diizopropilfosforamidita (jedinjenje 100) (smeša fosfornih dijastereomera; 80,0 g, 91,332 mmol, 1 ekv, ChemGenes Corporation kataloški br. ANP-9151), alil alkohola (9,63 ml, 142 mmol, 1,55 ekv.) i trifenilfosfina (38,3 g, 146 mmol, 1,60 ekv.) u THF-u (1,1 l) dodat je DEAD (40 mas.% rastvor u toluenu; 54,2 ml, 137 mmol, 1,5 ekv.) na temperaturi okoline. Mešanje je nastavljeno na temperaturi okoline, i reakcija je praćena putem LC/MS. Po završetku (19 h), smeša je koncentrovana pod vakuumom (35 °C) i dobijena smeša je prečišćena hromatografijom na koloni silika gela (800 g x 2 kolone, 40 do 60% EtOAc u n-heptanu puferovan sa 0,5% trietilamina) radi dobijanja jedinjenja 101 kao bele pene (84,2 g, kvantitativni prinos, smeša fosfornih dijastereomera).

<1>H NMR (3:2 smeša fosfornih dijastereomera, 400 MHz, CDCl3) δ 1.14 - 1.21 (m, 12 H) 2.40 (t, J=6.2 Hz, 1.2 H) 2.59 (t, J=6.2 Hz, 0.8 H) 3.27 (d, J=8.6 Hz, 1 H) 3.52 - 3.66 (m, 5 H) 3.78 (s 2.4 H) 3.79 (s 3.6 H) 4.28 - 4.34 (m, 1 H) 4.84 - 4.96 (m, 0.4 H) 4.99 (d, J=5.5 Hz, 2 H) 4.95 - 5.10 (m, 0.6 H) 5.05 (d, J=10.9 Hz, 1 H) 5.22 (br d, J=17.6 Hz, 1 H) 5.64 (br d, J=53.2 Hz, 0.6 H) 5.70 (br d, J=51.6 Hz, 0.4 H) 5.96 - 6.75 (m, 1 H) 6.20 (d, J=16.0 Hz, 0.6 H) 6.24 (d, J=17.2Hz, 0.4 H) 6.74 - 6.79 (m, 4 H) 7.02 - 7.06 (m, 2H) 7.17 - 7.24 (m, 8 H) 7.32 - 7.34 (m, 2 H) 7.41 - 7.44 (m, 2 H) 8.11 (s, 1H) 8.52 (s, 0.4 H) 8.54 (s, 0.6 H).

Korak B

[0113]

[0114] U rastvor jedinjenja 101 (3,00 g, 3,28 mmol, 1 ekv.) u acetonitrilu (30 ml) dodata je voda (0,118 ml, 6,55 mmol, 2,0 ekv.) i so piridin trifluoracetat (0,759 g, 3,93 mmol, 1,2 ekv.). Nakon mešanja na temperaturi okoline tokom 1 minuta, dodat je terc-butilamin (14,5 g, 21,0 ml, 0,20 mol, 60 ekv.). Nakon potpunog cepanja cijanoetil grupe (praćeno pomoću LC/MS), reakciona smeša je koncentrovana pod vakuumom i dva puta azeotropski destilisana sa acetonitrilom. Sirova smeša je rastvorena u DCM-u (45,0 ml) i tretirana vodom (0,118 ml, 6,55 mmol, 2,0 ekv.) i pomoću NaHSO4-SiO2(1,18 g, 6,55 mmol, 2 ekv.) na temperaturi okoline. Nakon potpunog cepanja DMT grupe (praćeno pomoću LC/MS, približno 1 sat), reakciona smeša je filtrirana i dva puta isprana pomoću DCM/MeOH (9/1, 20 ml). Kombinovani filtrati su koncentrovani pod vakuumom i tretirani smešom n-heptan/toluen 1:1 (∼30 ml). Gornji sloj je uklonjen dekantovanjem. Isti postupak je još jednom ponovljen sa n-heptanom/toluenom (1/1, 30 ml), i donji sloj je dva puta azeotropski destilisan sa acetonitrilom radi dobijanja jedinjenja 102 (pretpostavljeno 100% teorijskog prinosa). Proizvod je korišćen u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja.

Korak C

[0115]

[0116] U smešu jedinjenja 102 (1,56 g, 3,27 mmol, 1 ekv.) i jedinjenja 101 (3,00 g, 3,28 mmol, 1 ekv.) u acetonitrilu (30 ml) dodata je so piridin trifluoracetat (azeotropski osušena sa piridinom; 0,760 g, 3,94 mmol, 1,25 ekv.). Nakon 5 minuta, dodat je DDTT (0,840 g, 4,09 mmol, 1,30 ekv, ChemGenes Corporation kataloški br. RN-1588) i, nakon potpune sulfurizacije (praćena pomoću LC/MS), reakciona smeša je koncentrovana pod vakuumom. Ostatak je rastvoren u DCM-u (30 ml) i tretiran vodom (0,57 ml, 32 mmol, 10 ekv.) i 6% dihlorsirćetnom kiselinom (1,56 ml, 18,9 mmol, 6,0 ekv.) u DCM-u (30 ml). Nakon 20 minuta, reakcija je prekinuta piridinom (20 ml) i koncentrovana pod vakuumom. Ostatak je azeotropski destilisan sa piridinom radi dobijanja jedinjenja 103 (3,22 g, pretpostavljeno 100% teorijskog prinosa). Proizvod je korišćen u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja.

Korak D

[0117]

[0118] U rastvor jedinjenja 103 (3,22 g, 3,15 mmol, 1 ekv.) u piridinu (100 ml) dodat je DMOCP (1,45 g, 7,88 mmol, 2,50 ekv.) na temperaturi okoline. Nakon potpune makrociklizacije (praćena pomoću LC/MS), dodata je voda (1,7 ml, 94,5 mmol, x10 puta u odnosu na DMOCP), pa zatim 3H-benzo[c][1,2]ditiol-3-on (0,795 g, 4,73 mmol, 1,5 ekv.). Nakon potpune sulfurizacije (oko 40 minuta), reakciona smeša je delimično koncentrovana pod vakuumom do približno 15 ml i sipana u smešu zasićenog vodenog NaHCO3(50 ml) i vode (30 ml). Nakon 10 minuta mešanja na temperaturi okoline, smeša je ekstrahovana pomoću smeše EtOAc/MTBE 1:1 (60 ml x 3 puta). Organski slojevi su kombinovani, isprani zasićenim vodenim rastvorom soli (25 ml), osušeni iznad Mg2SO4i koncentrovani pod vakuumom. Ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni silika gela (0–20% MeOH u DCM-u) radi dobijanja jedinjenja 104 (3,31 g, 3,20 mmol, pretpostavljeno 100% teorijskog prinosa) kao smeđeg ulja. Proizvod je korišćen u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja.

Korak E

[0119]

[0120] U rastvor jedinjenja 104 (3,31 g, 3,20 mmol, 1 ekv.) u acetonitrilu (66,2 ml) dodat je 2-nitrobenzil bromid (2,42 g, 11,2 mmol, 3,50 ekv.) i trietilamin (1,78 ml, 12,8 mmol, 4,00 ekv.). Nakon potpune reakcije (praćeno pomoću LC/MS, približno 20 sati na temperaturi okoline), reakciona smeša je koncentrovana pod vakuumom i prečišćena hromatografijom na koloni silika gela (60% etil acetat/n-heptan do 100% etil acetata) dajući 0,568 g proizvoda kao smeše fosfornih dijastereomera. Preparativna HPLC separacija dijastereomera dala je jedinjenje 105 (SR izomer; 0,225 g, 0,180 mmol, 5,6% ukupnog prinosa od jedinjenja 101) i jedinjenje 106 (RR izomer; 0,187 g, 0,149 mmol, 4,7% ukupnog prinosa od jedinjenja 1).

[0121] Jedinjenje 105 (SpRp)<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 8.63 (s, 1H), δ = 8.61 (s, 1H), 8.04 - 8.00 (m, 2H), 7.99 (s, 1H), 7.90 (s, 1H), 7.65 - 7.44 (m, 8H), 7.40 - 7.31 (m, 4H), 7.25 -7.21 (m, 4H), 6.15 - 5.89 (m, 5H), 5.61 (dd, J = 52.0, 5.1 Hz, 1H), 5.55 (ddd, J = 51.2, 4.7, 2.7 Hz, 1H) 5.51 - 5.42 (m, 1H), 5.31 - 5.22 (m, 2H), 5.11 (dd, J = 3.9, 9.8 Hz, 2H), 5.04 - 4.95 (m, 4H), 4.55 - 4.37 (m, 7H), 4.29 - 4.12 (m, 3H)

[0122] Jedinjenje 106 (RpRp)<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 8.65 (s, 2H), 8.06 (dd, J = 1.4, 8.0 Hz, 2H), 7.98 (s, 2H), 7.57 - 7.52 (m, 6H), 7.47 - 7.32 (m, 6H), 7.25 - 7.21 (m, 4H), 6.15 (d, J = 18.7 Hz, 2H), 6.09 - 5.99 (m, 2H), 5.82-5.76 (m, 2H), 5.60 (dd, J = 51.8, 4.9 Hz, 2H), 5.27 (dd, J = 1.2, 17.2 Hz, 2H), 5.12 (dd, J = 1.0, 10.4 Hz, 2H), 5.06 - 4.96 (m, 4H), 4.55 - 4.40 (m, 4H), 4.36 - 4.24 (m, 4H), 4.21 - 4.02 (m, 2H)

Uslovi preparativne HPLC:

Korak F

[0123]

[0124] U zagrejani (90 °C) rastvor jedinjenja 105 (519 mg, 0,414 mmol, 1 ekv.) u toluenu (519 ml) dodat je Hoveyda-Grubbs Catalyst™ 2. generacije ((1,3-bis-(2,4,6-trimetilfenil)-2-imidazolidiniliden)dihlor(o-izopropoksifenilmetilen)rutenijum; dostupan od SIGMA-ALDRITCH® kataloški br.569755; CAS 301224-40-8; 91 mg, 0,15 mmol, 0,35 ekv.) i hinon (0,102 ml, 1,243 mmol, 3,0 ekv.). Smeša je zagrevana do refluksa, i napredovanje reakcije je

1

praćeno pomoću LC/MS. Nakon 3 sata, dodato je još katalizatora (91 mg, 0,15 mmol, 0,35 ekv.) i reakcija je nastavljena još 3 sata. Nakon hlađenja, smeša je tretirana pomoću DMSO (0,59 ml, 8,3 mmol, 20 ekv.) na temperaturi okoline tokom 15 sati, koncentrovana pod vakuumom i prečišćena hromatografijom na koloni silika gela (SiO225 g, 66% etil acetat u nheptanu do 100% etil acetata) radi dobijanja jedinjenja 107 (200 mg, 0,163 mmol, prinos 39%) kao smeđe suve pene.

<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 8.19 (s, 1H), 8.12 (dd, J = 7.8 Hz, 1.9 Hz, 1H), 8.10 (s, 1H), 8.02 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.89 (s, 1H), 7.63 (br d, J = 7.0 Hz, 1H), 7.53 - 7.41 (m, 10H), 7.35 -7.30 (m, 2H), 7.25 - 7.20 (m, 4H), 6.23 (d, J = 17.6 Hz, 1H), 6.14 (d, J = 18.8 Hz, 1H), 5.86 -5.75 (m, 1H), 5.75 (dt, J = 15.3, 5.0 Hz, 1H), 5.67 (dt, J = 15.3, 4.7 Hz, 1H), 5.60 (dd, J = 52.0, 3.9 Hz. 1H), 5.48 (dd, J = 50.4, 3.9 Hz. 1H)5.50 - 5.39 (m, 1H), 4.91 - 4.64 (m, 4H), 4.57 -4.25 (m, 9H), 4.15 (d, J = 7.03 Hz, 1H), 4.11 (d, J = 7.03 Hz, 1H).

Korak G

[0125]

[0126] U rastvor jedinjenja 107 (88 mg, 0,072 mmol, 1 ekv.) u 1,4-dioksanu (1,76 ml) dodat je tiofenol (0,88 ml, 8,55 mmol, 119 ekv.) i trietilamin (0,88 ml, 6,31 mmol, 88 ekv.). Dobijena smeša je mešana na temperaturi okoline. Nakon potpune reakcije (praćene pomoću LC/MS, 13 sati), dodati su metanol (5,28 ml) i 28% amonijum hidroksid (3,52 ml), i dobijena smeša je zagrevana na 50 °C. Po završetku reakcije (praćeno pomoću LC/MS, 5 sati), smeša je ohlađena na temperaturi okoline, i dobijena smeđasta suspenzija je filtrirana i isprana vodom (15 ml). Filtrat je ponovo filtriran kako bi se uklonile dodatne čvrste supstance. Finalni filtrat je dva puta ekstrahovan smešom toluena i heptana 1:1 (30 ml). Vodeni sloj je koncentrovan pod vakuumom i zatim ponovo suspendovan u vodi (6 ml). Dobijena čvrsta supstanca je uklonjena filtracijom, i filtrat je podvrgnut preparativnoj HPLC radi dobijanja diamonijumove soli

2

jedinjenja 1 (naziva se i jedinjenje 1a) (39 mg, 0,050 mmol, prinos 70%) kao bele čvrste supstance.

[0127] Jedinjenje 1a (SpRp, trans)<1>H NMR (400 MHz, CD3OD) δ = 9.05 (s, 1H), 8.33 (s, 1H), 8.25 (s, 1H), 8.12 (s, 1H), 6.34 (br s, 2H), 5.88 (br s, 2H), 5.66 (br d, J = 51.6 Hz, 1H), 5.59 (br d, J = 52.2 Hz, 1H) 5.01 (br s, 2H), 4.68 - 4.34 (m, 6H), 4.07 - 3.82 (m, 2H), 3.79 - 3.55 (m, 2H);<31>P NMR (162 MHz, CD3OD) δ = 55.48 (s, 1P), 55.16 (s, 1P).

Jedinjenje 1a Uslovi preparativne HPLC:

Primer 1.1 – Alternativna sinteza jedinjenja 1a

[0128] Alternativni sintetički postupak za jedinjenje 1a je prikazan na SL.2A i SL.2B, kao i na SL.2C i objavljen je u nastavku.

Faza 1

[0129]

Faza 1

(1,05 ekv.)

piridin (5 V)

0 °C do rt

[0130] Jedinjenje 129 (570 g, 1,53 mol, 1 mas, 1 V, 1 ekv.) rastvoreno je u piridinu (2,85 l, 35,2 mol, 4,89 mas., 5,0 zapr., 23 ekv.). Smeša je ohlađena na 2,6 °C i tretirana 4,4'-dimetoksitritil hloridom (DMTCl; 543 g, 1,60 mol, 0,953 mas., 1,05 ekv.). Smeša je mešana na 0 do 5 °C tokom 2 h i zatim je ostavljena da se zagreje na temperaturu okoline. Reakcija je praćena pomoću LC/MS, i potpuna konverzija je potvrđena nakon mešanja preko noći. Reakciona smeša je ohlađena na ispod 5 °C i deaktivirana tretiranjem sa MeOH (124 ml, 3,05 mol, 0,172 mas., 0,217 zapr., 2,0 ekv.) tokom 15 minuta. Smeša je uparena zajedno sa toluenom (2,00 l, 3,04 mas., 3,51 zapr.) pod vakuumom i zatim razblažena smešom EtOAc (2,850 l, 4,5 mas., 5,0 zapr.) i n-heptana (2,85 l, 3,42 mas., 5,0 zapr.). Organski sloj je ispran zasićenim NaHCO3(9 mas.% rastvor u vodi; 2,0 l, 3,5 zapr.). Dodato je još EtOAc (2,85 l, 4,5 mas, 5,0 zapr.) radi potpunog rastvaranja sirovog proizvoda. Nakon 5 minuta mešanja, dva sloja su razdvojena. Organski sloj je ispran vodom (2,0 l, 3,5 mas., 3,5 zapr.). Čvrsta supstanca je počela polako da se taloži iz organskog sloja. Vodeni sloj je razdvojen. Organski sloj je zatim koncentrovan do približno 1 zapremine. Sirovi proizvod je suspendovan u smeši n-heptana (2,00 l, 2,40 mas., 3,51 zapr.) i toluena (0,50 l, 0,76 mas., 0,88 zapr.). Nakon mešanja tokom 15 minuta, bledožuta čvrsta supstanca je sakupljena vakuum filtracijom. Filter pogača je redom isprana: (1) smešom n-heptana (0,60 l, 0,72 mas., 1,05 zapr.) i toluena (0,30 l, 0,46 mas., 0,53 zapr.), a zatim (2) n-heptanom (3,00 l, 3,6 mas., 5,26 zapr.). Čvrsta supstanca je osušena bez zagrevanja tokom 30 minuta i zatim prebačena na poslužavnike za sušenje na 50 °C u vakuum sušnici preko noći radi dobijanja jedinjenja 130 kao bledožute čvrste supstance (996,7 g, 1,47 mol, 1,75 mas., prinos 97%).

<1>H NMR (400 MHz, HLOROFORM-d) δ = 8.99 (s, 1H), 8.76 (s, 1H), 8.21 (s, 1H), 8.04 - 8.00 (m, 2H), 7.64 - 7.59 (m, 1H), 7.57 - 7.50 (m, 2H), 7.41 - 7.36 (m, 2H), 7.32 - 7.15 (m, 7H), 6.83 - 6.76 (m, 4H), 6.31 (dd, J = 2.5, 17.0 Hz, 1H), 5.68 (ddd, J = 2.3, 4.7, 52.7 Hz, 1H), 4.88 - 4.77 (m, 1H), 4.26 - 4.21 (m, 1H), 3.77 (s, 6H), 3.57 (dd, J = 3.1, 10.9 Hz, 1H), 3.43 (dd, J = 4.1, 10.7 Hz, 1H), 2.60 (br s, 1H)

4

[0132] Jedinjenje 129 (430 g, 1,15 mol, 1 mas., 1 zapr., 1 ekv.) i imidazol (118 g, 1,73 mol, 0,274 mas., 1,50 ekv.) rastvoreni su u DMF-u (1,72 l, 3,78 mas., 4,0 zapr.) i dobijena smeša je ohlađena na 5 °C. Dodat je TBS-Cl (191 g, 1,27 mol, 0,444 mas., 1,10 ekv.). Smeša je mešana na 0 do 11 °C tokom 2 h, ostavljena da se polako zagreje na temperaturu okoline (napredovanje praćeno pomoću LCMS). Reakcija je završena 6 h nakon dodatka TBS-Cl, onda ostavljena da se meša na temperaturi okoline još 20 h. Smeša je ohlađena na 2 °C i tretirana metanolom (93 ml, 74 g, 2,3 mol, 0,17 mas., 0,22 mas., 2,0 ekv.) tokom 10 minuta. Reakciona smeša je razblažena smešom MTBE (1,72 l, 1,23 kg, 2,96 mas., 4,0 zapr.) i EtOAc (1,72 l, 1,55 kg, 3,60 mas., 4,0 zapr.), zatim zasićenim NH4Cl (28 mas.% rastvor u vodi; 2,15 l, 5,0 zapr.). Čvrste supstance su polako počele da se talože iz rastvora. Smeša je ostavljena da se zagreje na 24 °C i dodata je voda (1,08 l, 1,08 kg, 2,5 mas., 2,5 zapr.) (T-unutrašnja = 22 °C). Još čvrstih supstanci je počelo da se taloži iz smeše. U smešu je dodato još vode (1,08 l, 1,08 kg, 2,5 mas., 2,5 zapr.) i MTBE (1,40 l, 1,04 kg, 2,4 mas., 3,3 zapr.). Beličasta čvrsta supstanca je sakupljena vakuum filtracijom. Reaktor je ispran vodom (320 ml, 0,74 zapr.), zatim sa MTBE (1,80 l, 1,33 kg, 3,10 mas., 4,19 zapr.) kako bi se bilo koja preostala čvrsta supstanca prenela na filter. Filter pogača je redom isprana: (1) vodom (1,80 l, 1,80 kg, 4,2 mas., 4,2 zapr.). (2) vodom (1,80 l, 1,80 kg, 4,2 mas., 4,2 zapr.), (3) smešom MTBE (0,90 l, 0,67 kg, 1,5 mas., 2,1 zapr.) i n-heptana (0,90 l, 0,62 kg, 1,4 mas., 2,1 zapr.), (4) smešom MTBE (0,90 l, 0,67 kg, 1,5 mas., 2,1 zapr.) i n-heptana (0,90 l, 0,62 kg, 1,4 mas., 2,1 zapr.). Izolovana čvrsta supstanca je sušena pod vakuumom na 40 °C tokom 2 dana radi dobijanja jedinjenja 133 kao bele čvrste supstance (483 g, 0,991 mol, 1,12 mas., prinos 86%).

<1>H NMR (400 MHz, HLOROFORM-d) δ = 8.97 (s, 1H), 8.82 (s, 1H), 8.36 (s, 1H), 8.04 - 8.00 (m, 2H), 7.64 - 7.58 (m, 1H), 7.56 - 7.51 (m, 2H), 6.40 (dd, J= 2.3, 16.0 Hz, 1H), 5.45 (ddd, J = 2.7, 4.3, 53.1 Hz, 1H), 4.75 - 4.66 (m, 1H), 4.22 - 4.17 (m, 1H), 4.07 (dd, J = 2.3, 11.7 Hz, 1H), 3.91 (dd, J = 2.7, 11.7 Hz, 1H), 2.38 (dd, J = 2.7, 7.0 Hz, 1H), 0.92 (s, 9H), 0.11 (s, 3H), 0.11 (s, 3H).

Faza 2

[0133]

[0134] Jedinjenje 130 (993 g, 1,47 mol, 1 mas., 1 zapr., 1 ekv.) i imidazol (150 g, 2,20 mol, 0,151 mas., 1,5 ekv.) rastvoreni su u DMF-u (3,48 l, 3,28 kg, 3,3 mas., 3,5 zapr.) i smeša je ohlađena na 5 °C. Dodat je TBS-Cl (244 g, 1,62 mol, 0,245 mas., 1,10 ekv.). Reakcija je mešana na 0 do 5 °C tokom 2 h, ostavljena da se polako zagreje na temperaturu okoline, i praćena pomoću LCMS. Nakon 17 h, dodato je još imidazola (100 g, 1,47 mol, 0,10 mas., 1,0 ekv.) i TBS-Cl (111 g, 735 mmol, 0,112 mas., 0,50 ekv.) i mešanje je nastavljeno na temperaturi okoline još 2 h, i na 35 °C tokom 2 h. Dobijena smeša je ohlađena na 13,6 °C i tretirana pomoću MeOH (119 ml, 2,94 mol, 2 ekv.) tokom 10 minuta. U zasebni reaktor je dodat led (5 kg, 5 mas.) i zasićeni NH4Cl (28 mas.% rastvor u vodi; 5,0 l, 5 zapr.). Reakciona smeša je dodata u smešu leda/NH4Cl. Beličasta čvrsta supstanca je smesta počela da se taloži iz rastvora. U smešu je dodato još 2 kg leda (2 kg, 2 mas.) i voda (3,0 l, 3 zapr.). Reakcioni balon je ispran vodom (0,50 l, 0,5 zapr.) i ispirak je dodat u smešu. U smešu je dodat n-heptan (2,00 l, 2 zapr.) i mešanje je nastavljeno još 10 minuta. Beličasta čvrsta supstanca je sakupljena vakuum filtracijom. Filter pogača je isprana: (1) vodom (4,0 l, 4,0 zapr.), (2) vodom (4,0 l, 4,0 zapr.), (3) n-heptanom (4,0 l, 4,0 zapr.), (4) n-heptanom (4,0 l, 4,0 zapr.). Izolovana čvrsta supstanca je sušena pod vakuumom na 45 °C tokom 4 dana radi dobijanja jedinjenja 131 kao beličaste čvrste supstance (1,095 kg, 1,39 mol, 1,10 mas., prinos 94%).

<1>H NMR (400 MHz, HLOROFORM-d) δ = 9.09 (s, 1H), 8.78 (s, 1H), 8.28 (s, 1H), 8.02 (d, J = 7.4 Hz, 2H), 7.63 - 7.59 (m, 1H), 7.55 - 7.50 (m, 2H), 7.37 (d, J = 7.1 Hz, 2H), 7.29 - 7.17 (m, 7H), 6.79 (d, J = 7.9 Hz, 4H), 6.29 (dd, J = 2.9, 16.2 Hz, 1H), 5.60 (ddd, J = 2.7, 3.9, 53.1 Hz, 1H), 4.78 (ddd, J = 4.7, 6.4, 15.8 Hz, 1H), 4.26 - 4.22 (m, 1H), 3.77 (s, 6H), 3.58 (dd, J = 3.1, 10.9 Hz, 1H), 3.26 (dd, J = 3.7, 10.7 Hz, 1H), 0.85 (s, 9H), 0.10 (s, 3H), 0.02 (s, 3H)

Faza 3

[0135]

Faza 3

[0136] Jedinjenje 131 (1000 g, 1,27 mol, 1 mas., 1 zapr., 1 ekv.) i trans-2-buten-1,4-diol (olefinska geometrija potvrđena putem<1>H-NMR; 335 g, 3,80 mol. 0,335 mas., 3,0 ekv.) azeotropski su destilisani sa THF-om (3,0 l, 3,0 zapr.). Ostatak je rastvoren u smeši THF-a (10 l, 10 zapr.) i toluena (15 l, 15 zapr.). Dodat je trifenilfosfin (432 g, 1,65 mol, 0,432 mas., 1,3 ekv.) i reakciona smeša je zatim ohlađena na -5 °C. Polako je dodat DIAD (0,320 l, 1,65 mol, 333 g, 0,333 mas., 0,320 zapr., 1,3 ekv.) tokom 20 minuta uz održavanje unutrašnje T ispod 5 °C. Reakcija je mešana na 0–5 °C tokom 1 h i praćena pomoću LCMS. Ledeno kupatilo je uklonjeno, i smeša je ostavljena da se zagreje na sobnu temperaturu (rt). Nakon mešanja preko noći (17 h), dodati su trifenilfosfin (83 g, 0,32 mol, 0,083 mas., 0,25 ekv.) i DIAD (62 ml, 0,32 mol, 64 g, 0,064 mas., 0,062 zapr., 0,25 ekv.). Nakon još 1 h na rt, reakciona smeša je razblažena sa MTBE (10 l, 10 zapr.), dva puta isprana poluzasićenim NaCl (18 mas.% rastvor u vodi; 2 x 4 l) i koncentrovana pod vakuumom do gustog ulja. Smeša je ponovo rastvorena u smeši MTBE (4,00 l, 4 zapr.) i n-heptana (0,50 l, 0,5 zapr.) i zatim ohlađena na 0 °C. U rastvor je dodat pelc kristal trifenilfosfin oksida. Čvrste supstance su polako počele da se talože iz rastvora, i mešano je preko noći. Bela čvrsta supstanca je sakupljena vakuum filtracijom i isprana pomoću MTBE (2 l, 2 pelc kristal) radi izolovanja 540 g trifenilfosfin oksida. Filtrat je koncentrovan i prečišćen pomoću Biotage 150L KP-Sil (SiO25 kg; prethodno tretiran pomoću 1% TEA u Hep/etOAc; eluenti: heptan/EtOAc (48 l 33% EtOAc sa 1% TEA, 24 l 50% EtOAc sa 1% TEA, 24 l 66% EtOAc sa 1% TEA) → 100% EtOAc sa 1% TEA). Kolona je praćena pomoću TLC (EtOAc/n-heptan 2:1). Čiste frakcije proizvoda su kombinovane i koncentrovane pod vakuumom radi dobijanja jedinjenja 132 kao mat bele penaste čvrste supstance (634 g, sadrži 14 mas.% koproizvoda dobijenog od DIAD, neto 545 g, 0,63 mol, prilagođeni prinos 50%). Frakcije smeše su kombinovane i koncentrovane pod vakuumom dajući bledožutu penastu čvrstu supstancu (750 g) koja je podvrgnuta ponovnom prečišćavanju putem Biotage 150M HP-Sphere (2,5 kg SiO2; prethodno tretiran sa 1% TEA u Hep/EtOAc; uzorak nanet sa toluenskim eluentima: Hep/EtOAc/1%TEA (12 l 50% EtOAc sa 1% TEA,16 l 66% EtOAc sa 1% TEA) → EtOAc sa 1% TEA). Kolona je praćena pomoću TLC (2/1/0,03 EtOAc/nhep/TEA). Čiste frakcije proizvoda su kombinovane i koncentrovane pod vakuumom radi dobijanja još jedinjenja 132 kao mat bele penaste čvrste supstance (206 g, 0,24 mol, prinos 18%).

<1>H NMR (400 MHz, HLOROFORM-d) δ = 8.58 (s, 1H), 8.10 (s, 1H), 7.43 - 7.37 (m, 2H), 7.32 - 7.28 (m, 2H), 7.24 - 7.15 (m, 8H), 7.03 - 6.98 (m, 2H), 6.78 - 6.73 (m, 4H), 6.18 (dd, J = 2.7, 17.2 Hz, 1H), 5.88 (td, J = 5.5, 15.6 Hz, 1H), 5.77 (td, J = 5.1, 15.6 Hz, 1H), 5.60 (ddd, J = 2.7, 4.3, 53.1 Hz, 1H), 5.03 - 4.96 (m, 2H), 4.91 (ddd, J = 4.5, 6.6, 16.6 Hz, 1H), 4.18 - 4.14 (m, 1H), 3.88 - 3.82 (m, 2H), 3.78 (s, 6H), 3.52 (dd, J = 2.7, 10.9 Hz, 1H), 3.14 (dd, J = 3.5, 10.9 Hz, 1H), 0.85 (s, 9H), 0.10 (s, 3H), 0.01 (s, 3H).

Faza 4

[0137]

[0138] Jedinjenje 132 (800 g, 0,930 mol, 1 mas., 1 zapr., 1 ekv.) i jedinjenje 133 (522 g, 1,07 mol, 0,652 mas., 1,15 ekv.) azeotropski su osušeni sa THF-om (2 x 3 l, 2 x 3,8 zapr.) i ponovo rastvoreni u THF-u (9,60 l, 8,45 kg, 12,0 zapr.) na rt. Dodat je trifenilfosfin (317 g, 1,21 mol, 0,396 mas., 1,30 ekv.) i smeša je ohlađena na temperaturu nižu od -5 °C. Dodat je DIAD (226 ml, 1,16 mol, 235 g, 0,294 mas., 0,283 zapr., 1,25 ekv.) na unutrašnjoj T ispod 7 °C. Reakcija je ostavljena da se polako zagreva na rt. Reakcija je praćena pomoću LCMS. Nakon 21 h, reakciona smeša je koncentrovana pod vakuumom do gustog ulja, azeotropski destilisana sa nheptanom (2,00, 1,37 kg, 1,71 mas., 2,50 zapr.) i zatim ponovo suspendovana u smeši MTBE (2,40 l, 1,78 kg, 2,2 mas., 3,0 zapr.) i n-heptana (800 ml, 547 g, 0,68 mas., 1,0 zapr.). Rastvor je zasejan trifenilfosfin oksidom i ohlađen na 5 °C, razblažen n-heptanom (400 ml, 274 g, 0,34 mas., 0,50 zapr.) i mešan na 5 °C tokom 30 minuta. Beli čvrsti talog je sakupljen vakuum filtracijom i ispran smešom MTBE i n-heptana 2:1 (V/V) (1,8 l), dajući trifenilfosfin oksid (455 g). Filtrat je koncentrovan pod vakuumom i prečišćen pomoću Biotage 150 L KP-Sil (SiO25 kg; prethodno tretiran sa 1% TEA; uzorak nanet rastvaranjem u toluenskim eluentima: 9:1 heptan/EtOAc (16 l) i 15 TEA, 3,6:1 (46 l), 2:1 (20 l) i 1% TEA, 1:1 (30 l) i 1% TEA, i 100% EtOAc (16 l) i 1% TEA). Kombinovane čiste frakcije proizvoda su koncentrovane pod vakuumom, dajući jedinjenje 134 kao beličastu čvrstu penu (662,2 g). Frakcije smeše su kombinovane i koncentrovane pod vakuumom (480 g). Bela nerastvorljiva čvrsta supstanca nastala razblaživanjem toluenom (300 ml) pre nanošenja na Biotage 150L uklonjena je vakuum filtracijom. Supstanca koja je rastvorljiva u toluenu je prečišćena pomoću Biotage 150M HP-Sphere (SiO22,5 kg (prethodno tretiran pomoću 1% TEA); nanošenje uzorka sa toluenom; eluenti: 2:1 heptan/EtOAc (26 l) sa 1% TEA, 1:1 (25 l) sa 1% TEA, 1:4 (34 l) sa 1% TEA). Kolona je praćena pomoću TLC (heptan/EtOAc 1:1). Kombinovane frakcije čistog proizvoda su koncentrovane pod vakuumom, dajući još jedinjenja 134 kao beličaste čvrste pene (165,5 g. ukupno 662,2+165,5 g = 827,7 g, 930 mmol, 1,03 mas., prinos 67%).

<1>H NMR (400 MHz, HLOROFORM-d) δ = 8.47 (s, 1H), 8.39 (s, 1H), 8.20 (s, 1H), 8.01 (s, 1H), 7.38 - 7.31 (m, 5H), 7.27 - 7.19 (m, 6H), 7.14 - 7.06 (m, 3H), 6.93 - 6.87 (m, 2H), 6.76 (d, J = 8.6 Hz, 4H), 6.26 (dd, J = 2.0, 16.0 Hz, 1H), 6.15 (dd, J = 2.7, 17.2 Hz, 1H), 5.86 (dd, J = 4.7, 15.2 Hz, 1H), 5.80 (dd, J = 4.7, 15.2 Hz, 1H), 5.51 (ddd, J = 2.7, 4.3, 52.8 Hz, 1H), 5.31 (ddd, J = 2.0, 4.3, 52.8 Hz, 1H), 4.87 (d, J = 4.7 Hz, 2H), 4.85 - 4.81 (m, 1H), 4.79 (d, J = 4.3 Hz, 2H), 4.71 - 4.59 (m, 1H), 4.20 - 4.13 (m, 2H), 4.06 (dd, J = 2.7, 11.3 Hz, 1H), 3.90 (dd, J = 2.7, 11.7 Hz, 1H), 3.77 (s, 6H), 3.52 (dd, J = 3.1, 10.9 Hz, 1H), 3.18 (dd, J = 3.9, 10.9 Hz, 1H), 0.92 (s, 9H), 0.84 (s, 9H), 0.10 (s, 3H), 0.09 (s, 6H), 0.07 (s, 3H)

Faza 5–6

[0139]

Faza 5

[0140] U rastvor jedinjenja 134 (410,7 g, 309 mmol, 1 mas., 1 zapr., 1 ekv.) u piridinu (1,23 l, 1,21 kg, 15,2 mol, 2,9 mas., 3,0 zapr., 49 ekv.) dodat je difenil fosfit (90 ml, 109 g, 0,46 mol, 0,26 mas., 0,22 zapr., 1,5 ekv.). Reakcija je mešana na rt i praćena pomoću LCMS. Nakon 2 h (80% konverzije) dodato je još difenil fosfita (29,9 ml, 36,2 g, 155 mmol, 0,088 mas., 0,073 zapr., 0,50 ekv.). Nakon još 1 h, dodato je još difenil fosfita (6,0 ml, 7,2 g, 31 mmol, 0,018 mas., 0,015 zapr., 0,10 ekv.) i reakcija je nastavljena još 0,5 h (98% konverzije). Reakciona smeša je dodata u smešu zasićenog NaHCO3(9 mas.% rastvor u vodi; 2,1 l, 5 zapr.) i vode (1,0 l ml, 2,5 zapr.) uz održavanje unutrašnje T na 4,7 do 12 °C. Reaktor je ispran malom zapreminom EtOAc. Mešanje je nastavljeno na rt tokom 30 minuta, i reakcija je praćena pomoću LCMS (100% konverzije). Reakciona smeša je dva puta ekstrahovana smešom EtOAc i MTBE 1:1 (2 x 8,2 l, 2 x 20 zapr.). Kombinovani organski slojevi su isprani vodom (4,1 l, 10 zapr.), koncentrovani pod vakuumom i azeotropski destilisani sa toluenom (3 x 4,1 l, 3 x 10 zapr.; neprekidno dolivanje) radi uklanjanja piridina, dajući jedinjenje 135 (ostalo 0,55 ekv. piridina).

[0141] Faza 6 – Sirovo jedinjenje 135 je rastvoreno u dihlormetanu (3,08 l, 4,07 kg, 9,9 mas., 7,5 zapr.) na temperaturi okoline. Dodata je voda (55,7 ml, 0,136 zapr., 10 ekv.), a zatim rastvor dihlorsirćetne kiseline (77 ml, 120 g, 0,93 mol, 0,29 mas., 0,19 zapr., 3,0 ekv.) u DCM-u (3,08 l, 7,5 zapr.) uz održavanje unutrašnje T ispod 25 °C. (Pretvoren u narandžasti rastvor). Nakon 30 min, dodat je trietilsilan (Et3SiH; 494 ml, 359 g, 3,09 mol, 0,875 mas., 1,20 zapr., 10,0 ekv.) (unutrašnja T promenjena sa 18,2° C na 17 °C) i mešanje je nastavljeno tokom 20 min. Dodat je trietilamin (431 ml, 313 g, 3,09 mol, 0,762 mas., 1,05 zapr., 10,0 ekv.) (unutrašnja T promenjena sa 17,8 °C na 22 °C). Smeša je koncentrovana do 1,55 kg (3,8 mas.), ponovo rastvorena u EtOAc (6,2 l, 5,5 kg, 14 mas., 15 zapr.), redom isprana: (1) vodom (1,0 l, 2,5 zapr.) i zasićenim NaHCO3(9 mas.% rastvor u vodi, 0,82 l, 2,0 zapr.). EtOAc rastvor sirovog proizvoda je čuvan na -20 °C preko noći.; 0,82 l, 2,0 zapr.) i rastvor je sledećeg dana koncentrovan pod vakuumom na 25 °C. Tako dobijena sirova smeša (654 g) je triturirana: (1) n-heptanom (3,01 l, 7,5 zapr.), (2) smešom n-heptana (2,46 l, 6,0 zapr.) i toluena (0,82 l, 2,0 zapr.). Rastvoreni deo (supernatant) uklonjen je dekantovanjem, i čvrsta supstanca preostala na dnu rastvorena je u acetonitrilu (4,1 l, 10 zapr.). Smeša je koncentrovana pod vakuumom na 25 °C i dva puta azeotropski destilisana sa acetonitrilom, dajući jedinjenje 136. Proizvod je korišćen za sledeću fazu bez prečišćavanja (pretpostavljeno 100% teorijskog prinosa).

Faza 7

[0142]

Faza

Faz

Sum

[0143] Faza 7a Jedinjenje 136 (337 g, 309 mmol, 1 mas., 1 zapr., 1 ekv.) rastvoreno je u anhidrovanom piridinu (13,5 l, 13,2 kg, 39 mas., 40 zapr.) na rt. Dodat je trietilamin (129 ml, 927 mmol, 94 g, 0,28 mas., 0,38 zapr., 3,0 ekv.), pa zatim 2-hlor-5,5-dimetil-1,3,2-dioksafosfinan 2-oksid (DMOCP; 103 g, 556 mmol, 0,31 mas., 1,80 ekv.). Dobijena smeša je mešana na temperaturi okoline tokom 30 minuta i praćena pomoću LCMS (100% konverzije), dajući jedinjenje 137.

[0144] Faza 7b TEA (129 ml, 927 mmol, 94 g, 0,28 mas., 0,38 zapr, 3,0 ekv.), voda (100 ml, 5,56 mol, 0,30 mas., 0,30 mas., 18 ekv.) i sumpor (34,7 g, 1,08 mol, 0,10 mas., 3,5 ekv.) dodati su u prethodnu smešu jedinjenja 137. Nakon 90 minuta (100% konverzije), dodat je NaHCO3(9 mas.% rastvor u vodi; 3,37 l, 10 zapr.) uz održavanje unutrašnje T ispod 30 °C (16,6 °C do 27 °C). Dobijena smeša je filtrirana radi uklanjanja soli. Filtrat je koncentrovan pod vakuumom, razblažen pomoću MTBE (5,1 l, 15 zapr.) i dva puta ispran pomoću NaCl (30 mas.% rastvor u

1

vodi, 2 x 1,35 l, 2 x 4 zapr.). Nerastvorljive čvrste supstance su uklonjene filtracijom i filtrat je koncentrovan pod vakuumom i azeotropski destilisan sa toluenom (4,0 l, 12 zapr.). Dobijena čvrsta supstanca je uklonjena filtracijom, i sirova smeša je rastvorena u toluenu i prečišćena pomoću Biotage 150L KP-Sil (SiO25 kg; prethodno tretiran pomoću Hep/EtOAc/TEA (1,5/1,5/0,03 CV); eluiranje sa: EtOAc/TEA (3/0,03 CV), EtOAc/MeOH/TEA (4/0,2/0,04 CV), EtOAC/MeOH/TEA (2/0,2/0,02 CV) Kolona je praćena pomoću TLC (EtOAC/MeOH/TEA=9/1/0,1). Frakcije koje sadrže Sp izomer su kombinovane i koncentrovane pod vakuumom, dajući jedinjenje 138 kao svetloružičastu penastu čvrstu supstancu (Sp izomer; 154 g, 128 mmol, 0,46 mas, prinos 41,3%). Frakcije koje sadrže Rp izomer su kombinovane i koncentrovane pod vakuumom, dajući jedinjenje 240 kao svetloružičastu penastu čvrstu supstancu (Rp izomer; 64 g, 53 mmol, 0,19 mas, prinos 17%).

Jedinjenje 138 (Sp izomer):

[0145]<1>H NMR (400 MHz, HLOROFORM-d) δ = 8.51 (s, 1H), 8.50 (s, 1H), 8.22 (s, 1H), 8.14 (s, 1H), 7.49 - 7.44 (m, 2H), 7.38 - 7.27 (m, 4H), 7.25 - 7.21 (m, 2H), 7.14 (t, J = 7.1 Hz, 2H), 6.44 (dd, J = 2.5, 13.9 Hz, 1H), 6.18 (d, J = 15.2 Hz, 1H), 5.78 (td, J = 6.3, 15.6 Hz, 1H), 5.69 (td, J = 4.7, 15.6 Hz, 1H), 5.56 (dd, J = 3.9, 50.8 Hz, 1H), 5.20 - 5.06 (m, 1H), 4.95 - 4.79 (m, 4H), 4.69 (dd, J = 4.3, 16.0 Hz, 1H), 4.54 - 4.38 (m, 3H), 4.35 (d, J = 5.5 Hz, 1H), 4.32 - 4.29 (m, 1H), 4.05 (dd, J = 1.6, 11.7 Hz, 1H), 3.91 (dd, J = 3.1, 11.7 Hz, 1H), 3.14 - 3.06 (m, 6H), 1.30 (t, J = 7.4 Hz, 9H), 0.91 (s, 9H), 0.90 (s, 9H), 0.12 (s, 3H), 0.08 (s, 3H), 0.06 (s, 3H), 0.05 (s, 3H)

Jedinjenje 240 (Rp izomer):

[0146]<1>H NMR (400 MHz, HLOROFORM-d) δ = 8.54 (s, 1H), 8.38 (s, 1H), 8.33 (s, 1H), 8.01 (s, 1H), 7.39 - 7.09 (m, 10H), 6.39 (dd, J = 2.3, 14.1 Hz, 1H), 6.13 (d, J = 17.2 Hz, 1H), 5.72 (d, J = 3.1 Hz, 2H), 5.68 (dd, J = 4.3, 51.2 Hz, 1H), 5.43 - 5.29 (m, 1H), 5.10 - 4.96 (m, 3H), 4.90 - 4.83 (m, 2H), 4.78 - 4.72 (m, 1H), 4.52 (ddd, J = 3.9, 6.6, 17.2 Hz, 1H), 4.44 - 4.35 (m, 2H), 4.31 - 4.26 (m, 1H), 4.20 - 4.12 (m, 2H), 3.87 (dd, J = 3.5, 11.7 Hz, 1H), 3.79 - 3.77 (m, 1H), 3.15 - 3.09 (m, 6H), 1.33 (t, J = 7.4 Hz, 9H), 0.94 (s, 9H), 0.89 (s, 9H), 0.13 (s, 3H), 0.12 (s, 3H), 0.10 (s, 3H), 0.09 (s, 3H)

2

Faza 8

[0147]

[0148] Jedinjenje 138 (221 g, 183 mmol, 1 mas., 1 zapr., 1 ekv.) rastvoreno je u smeši piridina (530 ml, 6,56 mol, 519 g, 2,3 mas., 2,4 zapr.) i TEA (2,65 l, 19,0 mol, 1,93 kg, 8,7 mas., 12 zapr., 104 ekv.). Dodat je trietilamin trihidrofluorid (264 ml, 1,62 mol, 262 g, 1,2 mas., 1,2 zapr., 8,9 ekv. kao kompleks, 27 ekv. HF) i smeša je mešana na sobnoj temperaturi (RT) dok je konverzija praćena pomoću LCMS. Nakon 3 h (97% konverzije) dodat je metoksitrimetilsilan (TMSOMe; 1,40 l, 10,2 mol, 1,06 kg, 4,8 mas., 6,3 zapr., 55 ekv.) i mešanje je nastavljeno tokom 30 minuta. Lepljiva čvrsta supstanca je obložila reaktor. Rastvoreni deo (supernatant) uklonjen je dekantovanjem. Čvrsta supstanca je dva puta triturirana sa toluenom (2 x 2,2 l, 2 x 10 zapr.; supernatant uklonjen dekantovanjem). Sirova čvrsta supstanca koja je ostala u reaktoru je rastvorena u dihlormetanu (2,2 l, 10 zapr.) i isprana pomoću NH4Cl (28 mas.% rastvor u vodi; 2,2 l, 10 zapr.). Vodeni sloj je ponovo ekstrahovan dihlormetanom (2,2 l, 10 zapr.). Kombinovani organski slojevi su isprani smešom NaCl (36 mas.% rastvor u vodi; 1,1 l, 5 zapr.) i vode (1,1 l, 5 zapr.) i zatim koncentrovani pod vakuumom, dajući jedinjenje 139 kao mrku suvu penu (152 g, 155 mmol, 0,70 mas, prinos 85%). Sirovi proizvod je prenet u sledeći korak bez prečišćavanja.

Faza 9

[0149]

Faza 9

[0150] Jedinjenje 139 (150 g, 153 mmol, 1 mas., 1 zapr., 1 ekv.) azeotropski je destilisano sa acetonitrilom (4 l, 27 zapr.) i ponovo rastvoreno u acetonitrilu (1,05 l, 0,83 kg, 5,5 mas., 7,0 zapr.) na rt. Na rt je dodat 2-nitrobenzil bromid (44,4 g, 205 mmol, 0,30 mas., 1,34 ekv.) i reakcija je praćena pomoću LCMS. Nakon 23 h (100% konverzije), dodati su EtOAc (1,50 l, 10 zapr.), NH4Cl (28 mas.% rastvor u vodi; 300 ml, 2 zapr.) i voda (300 ml, 2 zapr.) (pH = 6) i dobijena smeša je delimično koncentrovana pod vakuumom na 25 °C do težine od 1,11 kg. Dodat je EtOAc (2,25 l, 15 zapr.) i smeša je mešana tokom 5 minuta. Dva sloja su razdvojena. Vodeni sloj je ekstrahovan etil acetatom (750 l, 5 zapr.). Kombinovani organski slojevi su redom isprani: (1) smešom NaCl (36 mas.% rastvor u vodi; 300 ml, 2 zapr.) i vode (300 ml, 2 zapr.) i (2) vodom (600 ml, 4 zapr.). Organski sloj je zatim koncentrovan pod vakuumom i azeotropski destilisan sa n-heptanom (1,50 l, 10 zapr.). U sirovu čvrstu supstancu je dodat MTBE (0,95 l, 6,3 zapr.) i smeša je zagrevana na 40 °C. Smeša je razblažena pomoću EtOAc (300 ml, 2 zapr.) i polako ohlađena na 0 °C. Gusta čvrsta supstanca je ostavljena da se slegne i supernatant je izvučen kroz cev sa filter fritom. Čvrsta supstanca je dva puta isprana pomoću MTBE (2 x 300 ml, 2 x 2 zapr.; supernatant je svaki put izvučen kroz cev sa filter fritom) i osušena pod vakuumom na 40 °C preko noći, dajući jedinjenje 140 kao bledožutu čvrstu supstancu (156 g). Filtrat je koncentrovan pod vakuumom, dajući smeđe ulje (17,8 g), koje je podvrgnuto prečišćavanju pomoću Biotage Snap-Ultra 340 g (eluenti: 0 do 5% MeOH u EtOAc), dajući još jedinjenja 140 kao bledožute čvrste supstance (5,8 g). Ukupno 156 g 5,8 g = 161,8 g (neto 152 mmol, 95% čisto, prinos 99%)

<1>H NMR (400 MHz, HLOROFORM-d) δ = 8.46 (s, 1H), 8.15 (s, 1H), 8.10 (s, 1H), 8.09 - 8.06 (m, 1H), 7.89 (s, 1H), 7.54 - 7.51 (m, 1H), 7.49 - 7.45 (m, 4H), 7.37 - 7.28 (m, 3H), 7.24 - 7.19 (m, 3H), 7.16 - 7.11 (m, 2H), 6.22 (d, J = 16.8 Hz, 1H), 6.14 (dd, J = 2.7, 17.2 Hz, 1H), 5.83 -5.61 (m, 3H), 5.60 - 5.48 (m, 1H), 5.07 (dd, J = 3.5, 51.6 Hz, 1H), 5.06 - 4.96 (m, 1H), 4.79 (dd, J = 4.9, 15.8 Hz, 1H), 4.69 (d, J = 5.9 Hz, 2H), 4.67 - 4.56 (m, 1H), 4.48 - 4.40 (m, 3H), 4.37 - 4.30 (m, 1H), 4.27 (d, J = 5.9 Hz, 2H), 4.19 - 4.13 (m, 1H), 3.93 - 3.85 (m, 1H), 3.85 -3.78 (m, 1H)

Faza 10–11

[0151]

4

Faza 10

[0152] Faza 10 Jedinjenje 140 (95% čisto, neto 73,2 g, 72,3 mmol, 1 mas., 1 zapr., 1 ekv.) i 2-cijanoetil N,N,N',N'-tetraizopropilfosforodiamidit (25,3 ml, 79,5 mmol, 0,33 mas., 0,35 zapr., 1,10 ekv.) tri puta su azeotropski destilisani sa anhidrovanim acetonitrilom (3 x 2 l), ponovo rastvoreni u dihlormetanu (0,73 l, 10 zapr.) i ohlađeni na 0–5 °C. Dodat je diizopropilamonijum tetrazolid (6,19 g, 36,1 mmol, 0,085 mas., 0,50 ekv.). Dobijena reakciona smeša je mešana na 0 °C tokom 10 h, zagrevana na 10 °C tokom 2 h, držana na 10 °C tokom 10 h i zagrevana na rt tokom 2 h. Reakcija je praćena pomoću LCMS i TLC (EtOAc sa 0,5% TEA). Nakon 18 h, dodat je anhidrovani acetonitril (0,73 l, 10 zapr.) i smeša je čuvana na -20 °C tokom 3 dana.

[0153] Faza 11a Smeša iz faze 10 je zagrejana na temperaturu okoline i u porcijama dodata putem levka za ukapavanje (100 ml na svakih 30 minuta, tokom 9 h) u smešu soli piridin trifluoracetata (dva puta unapred azeotropski destilisana sa piridinom; 41,9 g, 217 mmol, 0,57 mas., 3,0 ekv.) i acetonitrila (5,85 l, 80 zapr.). Reakcija je praćena pomoću LCMS. Nakon 13 h, rastvor 2-cijanoetil N,N,N',N'-tetraizopropilfosfordiamidita (5,8 ml, 18 mmol, 0,25 ekv.) u acetonitrilu (24 ml) dodat je tokom 4 h. Količina dodatnog reagensa je određena na osnovu preostalog jedinjenja 140 (∼30% na osnovu LCMS). Dalja konverzija diola je uočena nakon 6 h.

[0154] Faza 11b Dodat je ((dimetilaminometiliden)amino)-3H-1,2,4-ditiazolin-3-tion (DDTT; 20,8 g, 101 mmol, 0,28 mas., 1,4 ekv.) i mešanje je nastavljeno tokom 1 h. Reakciona smeša je delimično koncentrovana do ∼800 ml i razblažena sa MTBE (1,46 l, 20 zapr.), NaHCO3(9 mas.% rastvor u vodi; 1,1 l, 15 zapr.) i vodom (0,37 l, 5 zapr.). pH= 8. Slojevi su razdvojeni i vodeni sloj je ekstrahovan smešom MTBE (1,46 l, 20 zapr.) i EtOAc (1,10 l, 15 zapr.). Kombinovani organski slojevi su dva puta isprani pomoću 30% vod. NaCl (2 x 0,73 l, 2 x 10 zapr.), koncentrovani pod vakuumom na 35 °C i azeotropski destilisani sa toluenom (1,46 l, 20 zapr.). LCMS i TLC (EtOAc) ukazuju na jedinjenje 143 (SpRp, željeno): Jedinjenje 241 (SpSp) = 5: 1

[0155] Sirovi proizvod je prečišćen pomoću Biotage 150M KP-Sil, (SiO22,5 kg; eluenti: EtOAc/Hep: 2:1 (4 CV), 3:1 (2,5 CV), 4:1 (2,5 CV), 100% EA (3 CV), 5–10% MeOH u EA 4 CV), dajući jedinjenje 143 (36 g, 31,5 mmol, prinos 44%).

[0156] Jedinjenje 143 (SpRp):<1>H NMR (400 MHz, HLOROFORM-d) δ = 8.59 (s, 1H), 8.10 (s, 1H), 8.03 - 7.99 (m, 1H), 7.91 (s, 1H), 7.56 - 7.53 (m, 2H), 7.49 - 7.40 (m, 5H), 7.35 - 7.28 (m, 2H), 7.24 - 7.16 (m, 4H), 6.92 (s, 1H), 6.29 (d, J = 14.9 Hz, 1H), 6.08 (d, J = 20.7 Hz, 1H), 5.97 - 5.83 (m, 1H), 5.76 (td, J = 4.7, 15.6 Hz, 1H), 5.61 - 5.51 (m, 2H), 5.40 (d, J = 4.3 Hz, 1H), 5.29 - 5.17 (m, 1H), 4.91 (dd, J = 7.4, 14.9 Hz, 1H), 4.86 - 4.75 (m, 3H), 4.63 (dd, J = 3.7, 9.2 Hz, 1H), 4.58 - 4.43 (m, 5H), 4.34 - 4.19 (m, 4H), 2.79 (td, J = 5.9, 16.8 Hz, 1H), 2.66 (td, J = 6.3, 16.8 Hz, 1H).

[0157] Jedinjenje 241 (SpSp)<1>H NMR (400 MHz, HLOROFORM-d) δ = 8.11 (s, 1H), 8.03 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.94 (s, 1H), 7.90 (s, 1H), 7.61 (s, 1H), 7.56 - 7.40 (m, 7H), 7.33 - 7.28 (m, 2H), 7.23 - 7.17 (m, 4H), 6.22 (d, J = 17.6 Hz, 1H), 6.15 (d, J = 18.8 Hz, 1H), 5.85 (dd, J = 3.5, 51.2 Hz, 1H), 5.75 - 5.45 (m, 5H), 4.95 - 4.23 (m, 14H), 2.82 (t, J = 6.1 Hz, 2H).

Faza 12

[0158]

[0159] Jedinjenje 143 (71,6 g, 62,6 mmol, 1 mas., 1 zapr., 1 ekv.) rastvoreno je u 1,4-dioksanu (0,43 l, 6 zapr.). Dodat je tiofenol (215 ml, 2,09 mol, 230 g, 3,2 mas., 3 zapr., >30 ekv.), pa zatim trietilamin (215 ml, 1,54 mol, 156 g, 2,2 mas., 3 zapr.). Uočeno je postojanje egzotermne reakcije (unutrašnja T povećana za ∼7 °C), stoga su voda/ledeno kupatilo korišćeni za hlađenje i kontrolisanje unutrašnje T ispod 27 °C. Reakcija je praćena pomoću LCMS. Nakon 2 h, dodat je MeOH (0,57 l, 8 zapr.) i NH4OH (28 mas%; 15 mol, 0,57 l, 8 zapr., >200 ekv.). Dobijena smeša je zagrevana na 50 °C tokom 5 h, ohlađena na rt i mešana preko noći. Nakon 14 h, dodata je voda (0,72 l, 10 zapr.) (nisu uočene čvrste supstance) i smeša je tri puta ekstrahovana smešom n-heptana i toluena 1:1 (V/V) (3 x 0,86 l, 3 x 12 zapr.), zatim toluenom (0,57 l, 8 zapr.). Vodeni sloj je koncentrovan pod vakuumom na 40–50 °C i razblažen vodom (1,07 l, 15 zapr.). Dobijena suspenzija je preko noći ostavljena na rt. Dobijena čvrsta supstanca je uklonjena filtracijom, uz ispiranje vodom (0,36 l, 5 zapr.). Filtrat je i dalje bio zamućen i filtriran je kroz celit i Kuno filter. Zamućenost je i dalje bila prisutna. HCl (1,0 M rastvor u vodi; 132 ml, 132 mmol, 2,1 ekv.) dodat je tokom 1 h i proveren je pH (pH <2). Mešanje je nastavljeno na rt tokom 1 h i smeša je filtrirana. Filter pogača je isprana vodom (8 x 0,20 l), sušena u vakuum sušnici na 35 °C tokom 2 dana i bez zagrevanja tokom 1 dana, dajući jedinjenje 1 kao bledonarandžastu čvrstu supstancu (44,88 g, 60,1 mmol, 0,63 mas., prinos 96%).

Faza 13

[0160]

U slobodnu kiselinu jedinjenje 1 (22,42 g, 30,03 mmol, 1 mas., 1 zapr., 1 ekv.) dodat je amonijak (2,0 M rastvor u MeOH; 220 ml, 440 mmol, 10 zapr., 15 ekv.). Dodat je EtOH (55 ml, 2,5 zapr.) i dobijeni rastvor je filtriran kroz Kuno filter (0,45 mikrona; PTFE), uz ispiranje smešom MeOH i EtOH 1:1 (V/V) (90 ml, 4 zapr.). Filtrat je koncentrovan pod vakuumom na 30 °C dajući beličastu čvrstu supstancu koja je osušena na rt preko noći, usitnjena špatulom (lako se lomi) i dalje osušena pod vakuumom na rt. Izolovana čvrsta supstanca je zatim suspendovana u toluenu (250 ml) i mešana na rt tokom 30 minuta. Čvrsta supstanca je zatim sakupljena vakuum filtracijom i dva puta isprana toluenom (2 x 50 ml). Čvrsta supstanca je zatim osušena pod vakuumom u vakuum sušnici, dajući 22,4 g jedinjenja 1a (diamonijumova so jedinjenja 1).

[0161] Prekristalizacija: Jedinjenje 1a (22,14 g, 28,36 mmol, 1 mas., 1 zapr., 1 ekv.) rastvoreno je u smeši vode (664 ml, 30 zapr.) i amonijum hidroksida (28 mas.%; 2,5 ml, 18 mmol, 0,63 ekv.) (pH = 9–10) i tri puta ekstrahovano toluenom (3 x 300 ml, 3 x14 zapr.), tri puta pomoću EtOAc (3 x 200 ml, 3 x 9 zapr.) i tri puta toluenom (3 x 300 ml, 3 x 14 zapr.). Dobijeni vodeni sloj je tretiran sa HCl (1,0 M rastvor u vodi; 90 ml, 90 mmol, 3,2 ekv.) u periodu od 3,5 sati (pH ≤2). Smeša je mešana tokom 30 minuta i čvrsti talog je zatim sakupljen vakuum filtracijom. Filter pogača je tri puta isprana vodom (3 x 200 ml, 3 x 9 zapr.) i osušena pod vakuumom preko noći. Amonijak (2,0 M rastvor u MeOH; 250 ml, 500 mmol, 17,6 ekv.) i etanol (100 ml) dodati su u čvrstu supstancu, i dobijena smeša je koncentrovana pod vakuumom do nastanka kristala (∼100 ml), kada je koncentrovanje zaustavljeno i smeša je mešana tokom 20 minuta. Dodat je etanol (45 ml) i smeša je delimično koncentrovana (uklonjeno 45 ml). Isti postupak je ponovljen još dva puta, i smeša je zatim ohlađena na 0 °C i mešana tokom 3,5 h. Bela čvrsta supstanca je sakupljena vakuum filtracijom i isprana hladnim etanolom (20 ml), zatim etil acetatom (2 x 50 ml). Bela čvrsta supstanca je osušena pod vakuumom na rt tokom 3 dana, dajući jedinjenje 1a kao belu čvrstu supstancu (16,6 g, 21,3 mmol, 0,75 mas., prinos 75%). Filtrat je koncentrovan pod vakuumom i osušen pod vakuumom na rt tokom 3 dana, dajući jedinjenje 1a kao beličastu čvrstu supstancu (4,16 g, 5,3 mmol, prinos 18%).

Primer 1.2 –<1>H NMR analiza jedinjenja 1

[0162]<1>H NMR spektar jedinjenja 1a je prikazan na SL. 3. Dobijeni spektar je bio:<1>H-NMR spektar (400MHz, DMSO-d6, δH2.49 ppm, 80 °C)

δ(ppm) : 3.05-3.13(4H, m), 3.70(1H, dd, J=13, 5 Hz), 3.78(1H, dd, J=12, 4Hz), 4.21-4.24(2H, m), 4.28(1H, m), 4.38(1H, m), 4.53-4.68(2H, m), 5.22(1H, m), 5.76(2H, s), 5.78(1H, m), 6.26(1H, m), 6.29(1H, m), 8.13(1H, s), 8.14(1H, s), 8.36(1H, brs), 8.59(1H, brs).

Primer 1.3 – Rendgenska analiza jedinjenja 1

[0163] Oko 2 mg jedinjenja 1 je rastvoreno u 600 ul vode.120 ul ovog rastvora je stavljeno u drugu staklenu bočicu i ta bočica je zatim skladištena u fiksnoj posudi sa 3 ml MeCN na sobnoj temperaturi tokom 1 nedelje. Ovo je postupak difuzije pare H2O/MeCN za pripremu uzorka.

[0164] Bezbojni pojedinačni blok kristal (0,1 × 0,1 × 0,1 mm) nađen u kristalizacionom rastvoru dispergovan je u tečnom Parabar 10312 i nanet je na Dual-Thickness MicroMounts™ (MiTeGen). Podaci o difrakciji su sakupljeni na -160 °C na XtaLAB PRO P200 MM007HF (Rigaku) postupkom oscilacije ω ose koristeći višeslojno reflektivno monohromatsko zračenje Cu-Kα.

[0165] SL.4A prikazuje ORTEP sliku molekula jedinjenja 1 u asimetričnoj jedinici, zajedno sa brojnim neuređenim molekulima vode. SL. 4B prikazuje kristalnu strukturu jednog od molekula jedinjenja 1 sa SL. 4A. SL. 4C prikazuje kristalnu strukturu drugog od molekula jedinjenja 1 prikazanog na SL.4A.

[0166] Kristalna struktura jedinjenja 1 dobijena je sa finalnim R-faktorom od 0,1354. Flekov parametar je bio skoro nula (0,083(17)), što pokazuje da je apsolutna konfiguracija jedinjenja 1 (R, S). Analiza kristalne strukture je takođe pokazala da su brojni molekuli vode bili prisutni u velikom kanalu jedinjenja 1, što pokazuje da su molekuli vode lako mogli da skliznu iz kanala. Analiza je takođe potvrdila da su konformacije oba kristalografski nezavisna molekula asimetrične jedinice bile skoro identične.

[0167] Dalji parametri rendgenske analize su prikazani u nastavku:

Primer 2 – Sinteza jedinjenja 2

[0168] Jedinjenje 106 (RpRp izomer jedinjenja 105) dobijeno u primeru 1, korak E, zasebno je obrađeno koristeći korak F iz primera 1 i korak G iz primera 1, dajući jedinjenje 2a (RR izomer jedinjenja 1a):

[0169] Jedinjenje 108 (RpRp)<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 8.12 (dd, J =8.2, 0.8 Hz, 2H), 7.99 (s, 2H), 7.96 (s, 2H), 7.65 - 7.48 (m, 10H), 7.38 - 7.33 (m, 2H), 7.26 - 7.24 (m, 4H), 6.22 (d, J = 17.6 Hz, 2H), 5.95 - 5.84 (m, 2H), 5.71 (dd, J = 50.8, 3.9 Hz, 2H) 5.73 - 5.71 (m, 2H), , 4.88 - 4.77 (m, 4H), 4.59 - 4.38 (m, 8H), 4.19 (m, 2H).

[0170] Jedinjenje 2a (RpRp, trans)<1>H NMR (400 MHz, CD3OD) δ = 8.70 (s, 1H), 8.49 (s, 1H), 8.23 (s, 1H), 8.09 (s, 1H), 6.34 (br s, 2H), 5.83 (br s, 2H), 5.73 - 5.53 (m, 2H), 5.38 - 5.01 (m, 2H), 4.76 - 4.32 (m, 6H), 3.95 (br s, 2H), 3.69 - 3.64 (m, 2H);<31>P NMR (162 MHz, CD3OD) δ= 55.57 (s, 1P), 55.32 (s, 1P).

Primer 2.1 – Rendgenska analiza jedinjenja 2

[0171] Jedinjenje 2 (0,5 mg) je izmereno i rastvoreno u acetonitrilu/28% rastvoru amonijaka. Ovaj rastvor je zatim čuvan na sobnoj temperaturi sa labavo fiksiranim zapušačem. Nakon 2 nedelje, pojavio se kristal u obliku štapića.

[0172] Bezbojni pojedinačni blok kristal (0,1 × 0,1 × 0,5 mm) nađen u rastvoru kristalizacije dispergovan je u tečnom Parabar 10312 i nanet je na Dual-Thickness MicroMounts™ (MiTeGen). Podaci o difrakciji su sakupljeni na -160 °C na XtaLAB PRO P200 MM007HF (Rigaku) postupkom oscilacije ω ose koristeći višeslojno reflektivno monohromatsko zračenje Cu-Kα.

1

[0173] SL.4D prikazuje ORTEP sliku molekula jedinjenja 2.

[0174] Dalji parametri ove rendgenske analize su prikazani u nastavku:

2

Primer 3 – Sinteza jedinjenja 3

[0175] Jedinjenje 109 (SpSp izomer jedinjenja 105) dobijeno u primeru 1, korak E, zasebno je obrađeno koristeći korak F iz primera 1 i korak G iz primera 1, dajući jedinjenje 3a (SS izomer jedinjenja 1a):

[0176] Jedinjenje 109 (SpSp izomer jedinjenja 105):<1>H NMR (400 MHz, HLOROFORM-d) δ = 8.52 (s, 2H), 7.99 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.91 (s, 2H), 7.63 - 7.40 (m, 10H), 7.35 - 7.28 (m, 2H), 7.23 - 7.16 (m, 4H), 6.10 - 5.93 (m, 4H), 5.92 - 5.75 (m, 2H), 5.62 - 5.50 (m, 2H), 5.26 -5.16 (m, 2H), 5.09 - 5.03 (m, 2H), 4.98 - 4.91 (m, 4H), 4.61 - 4.25 (m, 10H)

[0177] Jedinjenje 3a (SpSp, trans):<1>H NMR (400 MHz, CD3OD) δ = 8.97 (br s, 1H), 8.84 (br s, 1H), 8.21 (br s, 2H), 6.31 (br s, 2H), 6.08 (br d, J = 53.5 Hz, 1H), 5.89 (br s, 2H), 5.63 (br d, J = 52.4 Hz, 1H), 5.13 - 4.96 (m, 2H), 4.72 - 4.32 (m, 6H), 4.01 (br d, J = 9.8 Hz, 2H), 3.67 (br s, 2H).

Primer 4 – Sinteza jedinjenja 4a

[0178] Jedinjenje 107 dobijeno u primeru 2, korak F, izolovano kao jedini cis izomer putem hromatografije na silika gelu, obrađeno je zasebno koristeći korak G iz primera 1, dajući jedinjenje 4a.

[0179] Jedinjenje 107:<1>H NMR (400 MHz, HLOROFORM-d) δ = 8.13 (s, 2H), 8.12 - 8.08 (m, 2H), 7.91 (s, 2H), 7.65 - 7.55 (m, 4H), 7.54 - 7.45 (m, 6H), 7.33 - 7.27 (m, 2H), 7.23 - 7.16 (m, 4H), 6.14 (d, J = 17.6 Hz, 2H), 5.88 (dd, J = 3.9, 50.8 Hz, 2H), 5.76 - 5.61 (m, 4H), 5.21 4.99 (m, 4H), 4.60 - 4.46 (m, 4H), 4.45 - 4.37 (m, 2H), 4.30 - 4.13 (m, 4H), 3.49 (d, J = 5.1 Hz, 2H)

[0180] Jedinjenje 4a (RpRp, cis iz 1a, jedinjenje 4a):<1>H NMR (400 MHz, METANOL-d4) δ = 8.48 (br s, 2H), 8.02 (br s, 2H), 6.29 (d, J = 14.8 Hz, 2H), 5.99 (br s, 2H), 5.43 (d, J = 51.2 Hz, 2H), 5.03 - 4.88 (m, 2H), 4.43 (br d, J = 11.7 Hz, 2H), 4.32 (br d, J = 9.4 Hz, 2H), 4.27 -4.17 (m, 2H), 4.21 - 4.02 (m, 2H), 3.97 (br dd, J = 6.1, 12.3 Hz, 2H).

Primer 5 – Sinteza jedinjenja 5

[0181] Cis izomer dobijen u primeru 1, korak F, obrađen je zasebno koristeći korak G iz primera 1, dajući jedinjenje 5a.

[0182] Jedinjenje 111 (cis izomer jedinjenja 107):<1>H NMR (400 MHz, HLOROFORM-d) δ = 8.48 (s, 1H), 8.15 - 8.09 (m, 1H), 8.03 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.94 (s, 1H), 7.75 (s, 1H), 7.65 -7.06 (m, 11H), 6.07 (d, J = 17.2 Hz, 1H), 5.98 (d, J = 20.3 Hz, 1H), 5.97 - 5.79 (m, 1H), 5.84 (dd, J = 3.5, 51.2 Hz, 1H), 5.54 - 5.47 (m, 1H), 5.50 (dd, J = 3.9, 52.0 Hz, 1H), 5.38 - 5.21 (m, 2H), 5.18 - 5.02 (m, 2H), 5.02 - 4.95 (m, 1H), 4.78 - 4.69 (m, 1H), 4.60 - 4.16 (m, 10H) Jedinjenje 5a (SpRp, cis iz 1a):<1>H NMR (400 MHz, METANOL-d4) δ = 8.88 (br s, 1H), 8.51 (br s, 1H), 8.16 (s, 1H), 8.05 (s, 1H), 6.38 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 6.33 (d, J = 14.1 Hz, 1H), 6.14 - 6.09 (m, 2H), 6.01 (d, J = 49.2 Hz, 1H), 5.42 (d, J = 49.6 Hz, 1H), 5.02 - 4.87 (m, 2H), 4.76 - 3.92 (m, 8H), 3.75 - 3.56 (m, 2H)

Primer 6 – Sinteza jedinjenja 6a (SpRp)

[0183]

4

[0184] U rastvor jedinjenja 1a (1,5 mg, 2,0 µmol) u MeOH/H2O (0,6/0,5 ml) na temperaturi okoline dodat je paladijum hidroksid na ugljeniku (20 mas.% na bazi suve supstance, 2 mg). Dobijena smeša je tretirana vodonikom (balon) dok je reakcija je praćena pomoću LCMS. Nakon potpune potrošnje polazne supstance, smeša je filtrirana i ispirana metanolom dok sav proizvod nije ispran. Filtrat je koncentrovan pod vakuumom i ostatak je rastvoren u vodi (1 ml). RHPLC prečišćavanjem je dobijeno jedinjenje 6a (0,9 mg).

LCMS (MS m/z 749.2 [M+H]<+>)

Primer 7 – Sinteza jedinjenja 9

[0185]

[0186] U rastvor 107 (3,7 mg, 3,02 µmol) u EtOH (1,5 ml) dodat je amonijum hidroksid (1 ml). Dobijena smeša je zagrevana na 50 °C tokom 8 h i ohlađena na temperaturu okoline. Rastvarač je uklonjen pod sniženim pritiskom. Ostatak je tretiran sa 2 ml vode, i dobijena čvrsta supstanca je uklonjena filtracijom. Filtrat je podvrgnut preparativnoj HPLC, dajući jedinjenje 9a (2,5 mg).

[0187] Jedinjenje 9a:<1>H NMR (400 MHz, METANOL-d4) δ = 8.67 (br s, 1H), 8.50 (br s, 1H), 8.25 (br s, 1H), 8.12 (br s, 1H), 6.47 - 6.28 (m, 2H), 5.92 - 5.79 (m, 2H), 5.74 (d, J= 50.8 Hz, 1H), 5.32 (d, J= 52.4 Hz, 1H), 5.16 - 4.95 (m, 2H), 4.71 - 4.25 (m, 6H), 4.17 - 3.97 (m, 2H), 3.83 - 3.61 (m, 2H).

LCMS: MS m/z 715.2 [M+H]<+>.

Primer 8 – Postupci za sintezu jedinjenja 8a, 11a i 12a

[0188] Uzimajući jedinjenje 112 i jedinjenje 102 kao polazne supstance, jedinjenja 8, 11 i 12 su pripremljena istim reakcionim sekvencama koje su opisane u primeru 1.

Uslovi za preparativnu HPLC za frakcije A i B

[0189] Jedinjenje 8a: Frakcija A je obrađena koristeći korak G iz primera 1, dajući dva izomera koji su razdvojeni pomoću HPLC. Jedinjenje 8a je bilo brži izomer (retenciono vreme: 4,1 min), a jedinjenje 37a (retenciono vreme: 4,5 min) bilo je sporiji izomer.

<1>H NMR (400 MHz, METANOL-d4) δ = 9.01 (s, 1H), 8.61 (s, 1H), 8.22 (s, 1H), 8.20 (s, 1H), 6.34 (d, J = 10.2 Hz, 1H), 6.31 (d, J = 10.9 Hz, 1H), 5.92 (dd, J = 2.7, 51.2 Hz, 1H), 5.85 - 5.71 (m, 2H), 5.37 (d, J = 51.6 Hz, 1H), 4.81 - 4.56 (m, 6H), 4.52 (br d, J = 12.1 Hz, 1H), 4.42 (br d, J = 9.4 Hz, 3H), 4.05 (dd, J = 4.1, 11.9 Hz, 1H), 3.95 (br dd, J = 4.3, 12.1 Hz, 1H), 3.94 -3.84 (m, 1H), 3.62 (br dd, J = 4.9, 15.4 Hz, 1H), 2.71 - 2.58 (m, 1H), 2.46 - 2.33 (m, 1H)<31>P NMR (162 MHz, METANOL-d4) δ = 55.36 (s, 1P), 55.18 (s, 1P) LCMS: MS m/z 761.2 [M+H]<+>

[0190] Jedinjenje 37a:<1>H NMR (400 MHz, METANOL-d4) δ = 8.95 (s, 1H), 8.40 (s, 1H), 8.18 (s, 1H), 8.15 (br s, 1H), 6.34 (d, J = 5.5 Hz, 1H), 6.31 (d, J = 6.6 Hz, 1H), 5.96 - 5.68 (m, 3H), 5.40 (dd, J = 2.7, 51.6 Hz, 1H), 4.85 (s, 3H), 4.58 (br d, J = 12.1 Hz, 1H), 4.49 (br d, J = 12.1 Hz, 1H), 4.43 - 4.33 (m, 3H), 4.29 (dd, J = 8.6, 14.1 Hz, 1H), 4.05 (dd, J = 4.5, 11.9 Hz, 1H), 3.95 (dd, J = 4.9, 12.3 Hz, 1H), 3.94 - 3.86 (m, 1H), 2.67 - 2.55 (m, 1H), 2.52 - 2.40 (m, 1H).

Jedinjenje 8a/37a Uslovi za preparativnu HPLC:

[0191]Frakcija B je obrađena koristeći korak G iz primera 1, dajući dva izomera koji su razdvojeni pomoću preparativne HPLC, kako je opisano u nastavku. Jedinjenje 11a je brži izomer (retenciono vreme: 11,2 min), a jedinjenje 12a je sporiji izomer (retenciono vreme: 12,1 min)

[0192] Jedinjenje 11a:<1>H NMR (400 MHz, METANOL-d4) δ = 8.63 (br s, 2H), 8.18 (br s, 1H), 8.17 (br s, 1H), 6.34 (d, J = 13.3 Hz, 1H), 6.32 (d, J = 12.9 Hz, 1H), 5.86 - 5.65 (m, 2H), 5.48 (d, J = 48.5 Hz, 1H), 5.35 (d, J = 43.8 Hz, 1H), 4.84 - 4.53 (m, 6H), 4.47 - 4.36 (m, 2H), 4.05 - 3.91 (m, 2H), 3.96 - 3.85 (m, 1H), 3.70 - 3.54 (m, 1H), 2.66 - 2.54 (m, 1H), 2.43 - 2.30 (m, 1H)

[0193] Jedinjenje 12a:<1>H NMR (400 MHz, METANOL-d4) δ = 8.56 (br s, 1H), 8.41 (s, 1H), 8.17 (s, 1H), 7.95 (br s, 1H), 6.35 (d, J = 14.8 Hz, 1H), 6.31 (d, J = 15.2 Hz, 1H), 5.82 - 5.65 (m, 2H), 5.50 (d, J = 51.2 Hz, 1H), 5.36 (d, J = 53.9 Hz, 1H), 4.74 - 4.33 (m, 8H), 4.26 - 4.16 (m, 1H), 4.07 - 3.93 (m, 3H), 2.64 - 2.44 (m, 2H).

[0194] Jedinjenje 11a/12a Uslovi za preparativnu HPLC:

Primer 9 – Postupci za sintezu jedinjenja 13 i 14

[0195] Uzimajući jedinjenje 114 i jedinjenje 115 kao polazne supstance, jedinjenja 13 i 14 su pripremljena istim reakcionim sekvencama koje su opisane u primeru 1 uz korak deprotekcije TBS.

Rp1Rp2izomer isto kao iznad

jedinjenje 14a

[0196] Jedinjenje 116:<1>H NMR (400 MHz, HLOROFORM-d) δ = 9.36 (s, 1H), 9.18 (s, 1H), 8.77 (s, 1H), 8.76 (s, 2H), 8.07 (br dd, J = 1.8, 7.6 Hz, 3H), 8.05 - 8.00 (m, 2H), 7.99 (s, 1H), 7.87 - 7.82 (m, 1H), 7.70 - 7.65 (m, 1H), 7.63 - 7.55 (m, 3H), 7.55 - 7.41 (m, 6H), 7.39 - 7.35 (m, 1H), 7.30 - 7.26 (m, 1H), 6.37 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 5.89 (d, J = 4.7 Hz, 1H), 5.36 - 5.27 (m, 2H), 5.15 (ddd, J= 3.7, 8.4, 11.7 Hz, 1H), 4.64 - 4.43 (m, 4H), 4.43 - 4.38 (m, 1H), 4.37 - 4.30 (m, 1H), 4.23 - 4.13 (m, 2H), 4.11 - 3.98 (m, 2H), 3.97 - 3.86 (m, 1H), 0.97 (s, 9H), 0.83 (s, 9H), 0.25 (s, 3H), 0.18 (s, 3H), 0.16 (s, 3H), -0.13 (s, 3H).

[0197] Jedinjenje 13a:<1>H NMR (400 MHz, METANOL-d4) δ = 8.78 (br s, 1H), 8.47 (br s, 1H), 8.21 (br s, 1H), 8.08 (br s, 1H), 6.44 - 6.21 (m, 1H), 6.19 - 6.03 (m, 1H), 6.01 - 5.78 (m, 2H), 5.38 - 4.95 (m, 2H), 4.67- 4.45 (m, 5H), 4.45 - 4.35 (m, 1H), 4.34 - 4.29 (m, 1H), 4.25 (br d, J= 11.3 Hz, 1H), 4.18 - 3.89 (m, 2H), 3.88 - 3.54 (m, 2H).<31>P NMR (162 MHz, METANOL-d4) δ = 56.89 (br s, 1P), 56.37 (br s, 1P)

[0198] Jedinjenje 117 (Rp1Rp2 izomer jedinjenja 116):<1>H NMR (400 MHz, HLOROFORM-d) δ = 9.36 (br s, 1H), 9.11 (br s, 1H), 8.98 (s, 1H), 8.87 (s, 1H), 8.78 (s, 1H), 8.14 - 7.96 (m, 6H), 7.72 - 7.27 (m, 13H), 6.44 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 5.84 (d, J = 6.6 Hz, 1H), 5.59 - 5.50 (m, 1H), 5.48 - 5.44 (m, 1H), 5.33 - 5.24 (m, 1H), 4.75 - 3.85 (m, 11H), 0.90 (s, 9H), 0.79 (s, 9H), 0.20 (s, 3H), 0.11 (s, 3H), 0.07 (s, 3H), -0.21 (s, 3H)

[0199] Jedinjenje 14a (Rp1Rp2izomer jedinjenja 13a) LCMS: MS m/z 743,17 [M+H]+

Primer 10 – Postupci za sintezu jedinjenja 15 i 16

[0200]

1

[0201] U rastvor jedinjenja A (2,63 g, 2,46 mmol) u MeCN (26,3 ml) dodat je terc-butilamin (13,15 ml, 124,1 mmol). Nakon 1 h mešanja na temperaturi okoline, reakciona smeša je koncentrovana pod vakuumom i azeotropski destilisana sa MeCN. Ostatak je rastvoren u MeCN (52,6 ml) i tretiran 1-(brommetil)-2-nitrobenzenom (1,064 g, 4,925 mmol) i trietilaminom (0,755 ml, 5,42 mmol). Po završetku reakcije (praćeno pomoću LC/MS), reakciona smeša je koncentrovana pod vakuumom i prečišćena hromatografijom na koloni silika gela (66% etil acetat/n-heptan do 100% etil acetata), dajući 0,226 g jedinjenja 118.

Izolovani proizvod je rastvoren u DMF-u (5 ml) i dodati su alil bromid (0,046 ml, 0,528 mmol) i kalijum karbonat (0,073 g, 0,528 mmol). Dobijena smeša je mešana na temperaturi okoline dok je napredovanje praćeno pomoću LCMS. Nakon 19 h, dodati su smeša MTBE/EtOAc 1/1 (12/12 ml), zasićeni vodeni rastvor NH4Cl (15 ml) i voda (10 ml). Organski sloj je razdvojen, dva puta ispran zasićenim vodenim rastvorom soli (5 ml), osušen iznad MgSO4i koncentrovan pod vakuumom. Ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni silika gela (50% etil acetat/nheptan do 100% etil acetata), dajući 37 mg bis-alilovanog proizvoda. Izolovani proizvod (37 mg, 0,027 mmol) rastvoren je u toluenu (55 ml) i zagrevan do blagog refluksa (120–125oC uljano kupatilo). Dodat je rastvor Hovejda-Grabsovog katalizatora 2. generacije ((1,3-bis-(2,4,6-trimetilfenil)-2-imidazolidiniliden)dihlor(o-izopropoksifenilmetilen)rutenijum; dostupan od SIGMA-ALDRICH® kataloški br. 569755; CAS 301224-40-8; 8,5 mg, 0,014 mmol) i hinona (5,9 mg, 0,054 mmol) u toluenu (10 ml). Smeša je zagrevana do refluksa, i napredovanje reakcije je praćeno pomoću LC/MS. Nakon kompletne potrošnje polazne supstance, smeša je ohlađena na temperaturu okoline i tretirana pomoću DMSO (0,059 ml, 0,81

1 1

mmol) tokom 15 sati. Dobijena smeša je koncentrovana pod vakuumom i prečišćena hromatografijom na koloni silika gela (SiO210 g, 66% etil acetata u n-heptanu do 100% etil acetata), dajući jedinjenje 119 (2,2 mg).

[0202] Jedinjenje 119:<1>H NMR (400 MHz, HLOROFORM-d) δ = 8.49 (s, 1H), 8.12 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 8.05 - 8.02 (m, 1H), 8.02 (s, 1H), 7.82 (s, 1H), 7.70 - 7.10 (m, 17H), 6.27 (d, J = 16.8 Hz, 1H), 6.15 - 6.05 (m, 1H), 5.97 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 5.94 - 5.72 (m, 3H), 4.94 (br s, 2H), 4.86 - 4.69 (m, 2H), 4.67 - 4.60 (m, 1H), 4.60 - 4.44 (m, 4H), 4.39 - 4.33 (m, 1H), 4.31 -4.10 (m, 6H), 0.96 (s, 9H), 0.25 (s, 3H), 0.19 (s, 3H)

[0203] Jedinjenje 119 je obrađeno koristeći korak G iz primera 1, nakon čega je usledila deprotekcija TBS pomoću TEA 3HF, dajući jedinjenje 15a.

[0204] Jedinjenje 15a:<1>H NMR (400 MHz, METANOL-d4) δ = 8.76 (br s, 1H), 8.44 (br s, 1H), 8.24 (br s, 1H), 8.07 (br s, 1H), 6.45 - 6.19 (m, 2H), 6.12 - 5.75 (m, 2H), 5.54 (br d, J = 51.6 Hz, 1H), 5.67 - 5.06 (m, 2H), 4.66 - 4.37 (m, 3H), 4.47 - 4.37 (m, 1H), 4.36 - 4.22 (m, 2H), 4.17 - 3.94 (m, 2H), 3.94 - 3.80 (m, 1H) 3.80 - 3.59 (m, 2H)

[0205] Jedinjenje 16 je dobijeno od jedinjenja B (RR izomer jedinjenja A) koristeći iste sekvence koje su opisane za jedinjenje 15.

[0206] Jedinjenje 120 (Rp1Rp2 izomer jedinjenja 119):<1>H NMR (400 MHz, HLOROFORM-d) δ = 8.89 (s, 1H), 8.10 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 8.01 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.85 -7.74 (m, 4H), 7.69 - 7.61 (m, 2H), 7.58 (s, 1H), 7.55 - 7.48 (m, 1H), 7.45 - 7.30 (m, 6H), 7.22 - 7.15 (m, 1H), 7.13 - 7.04 (m, 3H), 6.76 - 6.68 (m, 1H), 6.31 - 6.22 (m, 1H), 6.22 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 6.12 - 5.99 (m, 2H), 5.94 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 5.92 - 5.81 (m, 1H), 5.67 (dd, J = 3.5, 51.2 Hz, 1H), 5.08 - 4.93 (m, 2H), 4.87 - 4.77 (m, 1H), 4.60 - 4.22 (m, 8H), 4.21 - 4.16 (m, 1H), 4.11 - 4.02 (m, 1H), 3.94 (br d, J = 11.7 Hz, 1H), 3.66 (dd, J = 4.7, 11.3 Hz, 1H), 0.90 (s, 9H), 0.09 (s, 3H), 0.08 (s, 3H)

[0207] Jedinjenje 16a:<1>H NMR (400 MHz, METANOL-d4) δ = 8.54 (br s, 1H), 8.24 (br s, 1H), 8.17 (br s, 1H), 8.08 (br s, 1H), 6.44 - 6.23 (m, 2H), 6.07 - 5.68 (m, 2H), 5.43 (d, J = 50.4 Hz, 1H), 5.31 - 5.05 (m, 2H), 4.69 - 4.26 (m, 6H), 4.19 - 3.90 (m, 2H), 3.90 - 3.57 (m, 3H)

1 2

Primer 11 – Postupci za sintezu jedinjenja adeninskih/guaninskih (A/G) analoga – Jedinjenje 21, jedinjenje 22 i jedinjenje 23

[0208] Uzimajući jedinjenje 121 i jedinjenje 101 kao polazne supstance, adeninski/guaninski analozi su pripremljeni istim reakcionim sekvencama koje su opisane u primeru 1.

[0209] Uslovi preparativne HPLC za razdvajanje jedinjenja C, D i E

1

[0210] Jedinjenje D:<1>H NMR (400 MHz, HLOROFORM-d) δ = 8.60 (s, 1H), 8.27 (s, 1H), 8.04 - 8.01 (m, 1H), 8.01 (s, 1H), 7.99 - 7.95 (m, 1H), 7.80 (s, 1H), 7.63 - 7.51 (m, 5H), 7.46 -7.41 (m, 1H), 7.39 - 7.30 (m, 3H), 7.25 - 7.20 (m, 2H), 6.96 - 6.84 (m, 1H), 6.19 - 5.99 (m, 4H), 5.67 (dd, J = 4.3, 52.3 Hz, 1H), 5.47 (dd, J = 1.4, 17.4 Hz, 1H), 5.36 - 5.24 (m, 4H), 5.14 - 5.09 (m, 1H), 5.08 (d, J = 5.5 Hz, 2H), 5.04 - 4.98 (m, 2H), 4.51 - 4.30 (m, 10H), 4.21 - 4.13 (m, 1H), 2.83 - 2.67 (m, 1H), 1.16 (d, J = 7.0 Hz, 3H), 1.14 (d, J = 6.6 Hz, 3H)

[0211] Jedinjenje D je obrađeno koristeći korake F i G iz primera 1, dajući jedinjenje 22.

Jedinjenje 22: LCMS: MS m/z 763.07 [M+H]<+>

[0212] Jedinjenje C:<1>H NMR (400 MHz, HLOROFORM-d) δ = 9.08 (s, 1H), 8.60 (s, 1H), 8.07 - 8.02 (m, 2H), 8.02 (s, 1H), 7.80 (s, 1H), 7.55 -7.30 (m, 9H), 7.24 - 7.19 (m, 2H), 6.58 -6.45 (m, 1H), 6.23 - 5.97 (m, 4H), 5.97 - 5.86 (m, 1H), 5.63 - 5.57 (m, 1H), 5.54 - 5.47 (m, 1H), 5.48 - 5.44 (m, 1H), 5.35 - 5.30 (m, 1H), 5.29 - 5.22 (m, 1H), 5.18 - 5.13 (m, 2H), 5.11 -5.07 (m, 1H), 5.02 - 4.97 (m, 2H), 4.51 - 4.22 (m, 9H), 4.14 - 4.07 (m, 1H), 2.99 - 2.85 (m, 1H), 1.20 (d, J = 6.6 Hz, 3H), 1.17 (d, J = 7.0 Hz, 3H)

[0213] Jedinjenje C je obrađeno koristeći korake F i G iz primera 1, dajući jedinjenje 21 Jedinjenje 21: LCMS: MS m/z 763,13 [M+H]<+>

1 4

[0214] Jedinjenje E:<1>H NMR (400 MHz, HLOROFORM-d) δ = 8.99 (s, 1H), 8.57 (s, 1H), 8.02 - 7.94 (m, 2H), 7.93 (s, 1H), 7.82 (s, 1H), 7.68 - 7.63 (m, 1H), 7.60 - 7.55 (m, 1H), 7.54 -7.49 (m, 2H), 7.45 - 7.31 (m, 5H), 7.25 - 7.21 (m, 2H), 6.22 - 5.94 (m, 6H), 5.56 (br dd, J = 5.1, 51.5 Hz, 1H), 5.54 - 5.46 (m, 1H), 5.34 - 5.29 (m, 1H), 5.29 - 5.22 (m, 2H), 5.16 - 5.08 (m, 3H), 5.02 - 4.96 (m, 2H), 4.62 - 4.54 (m, 1H), 4.52 - 4.26 (m, 9H), 2.93 - 2.81 (m, 1H), 1.21 (d, J = 2.3 Hz, 3H), 1.20 (d, J = 2.0 Hz, 3H)

[0215] Jedinjenje E je obrađeno koristeći korake F i G iz primera 1, dajući jedinjenje 23 Jedinjenje 23: LCMS: MS m/z 763.18 [M+H]<+>

Primer 12 – Sinteza jedinjenja 24

[0216] Koristeći jedinjenje F, jedinjenje 24a je pripremljeno istim reakcionim sekvencama koje su opisane u primeru 1.

jedinjenje F

Jedinjenje 24:<1>H NMR (400 MHz, METANOL-d4) δ = 8.95 (br s, 1H), 8.29 (br s, 1H), 8.23 (br s, 1H), 8.08 (br s, 1H), 6.31 (br d, J = 12.9 Hz, 2H), 6.23 - 6.07 (m, 1H), 6.04 - 5.84 (m, 2H), 5.71 (br d, J = 50.8 Hz, 1H), 5.27 - 4.32 (m, 7H), 4.27 - 4.16 (m, 1H), 4.12 (dd, J = 5.7, 11.9 Hz, 1H), 4.07 - 3.98 (m, 1H), 3.78 - 3.62 (m, 2H), 1.40 (d, J = 7.0 Hz, 3H)

Primer 13 – Sinteza jedinjenja 18, jedinjenja 19 i jedinjenja 20

[0217] Postupak za ovu sintezu je prikazan na SL.3.

1

[0218] U rastvor 9-((2R,3R,4R,5R)-3-fluor-4-hidroksi-5-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-2-il)-9H-purin-6-ola (100 mg, ,37 mmol) i Hunigove baze (0,129 ml, 0,74 mmol) u DMF-u (1 ml) dodat je BOP (327 mg, ,74 mmol) na 20 °C. Smeša je mešana na 20 °C preko noći. UPLC-MS pokazuje da je reakcija završena. Rastvarač je uparen na rotacionom uparivaču pod visokim vakuumom. Ostatak je rastvoren u DCM-u i prečišćen koristeći Biotage (kolona sa 24 g Sigela, EtOAc u heptanu= 0 do 100%, 10 zapr., 100%, 10 zapr.), dajući 105 mg BOP adukta sa prinosom 73%.

<1>H NMR (400 MHz, METANOL-d4) δ ppm 3.74 - 3.84 (m, 1 H) 3.92 - 4.00 (m, 1 H) 4.12 -4.19 (m, 1 H) 4.62 - 4.74 (m, 1 H) 5.37 - 5.57 (m, 1 H) 6.41 - 6.52 (m, 1 H) 7.47 - 7.55 (m, 1 H) 7.57 - 7.64 (m, 2 H) 8.03 - 8.14 (m, 1 H) 8.36 - 8.46 (m, 1 H) 8.86 (s, 1 H)

[0219] U rastvor (2R,3R,4R,SR)-5-(6-((1H-benzo[d][1,2,3]triazol-1-il)oksi)-9H-purin-9-il)-4-fluor-2-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-3-ola (135 mg, 0,349 mmol) u alil alkoholu (3 ml) dodat je cezijum karbonat (500 mg, 1,535 mmol) na 20 °C. Smeša je mešana na 20 °C tokom 1 h. UPLC-MS pokazuje da je reakcija završena. Reakcija je tretirana zas. NaHCO3/zas. vodenim rastvorom soli i ekstrahovana pomoću EtOAc/hept. Organski sloj je osušen iznad Na2SO4i filtriran. Rastvarač i ispraljive organske supstance u filtratu su uklonjeni na rotacionom

1

uparivaču. Ostatak je prečišćen koristeći Biotage (kolona sa 12 g Si-gela, EtOAc u heptanu=0 do 100%, 10 zapr., 100%, 10 zapr.), dajući 100 mg željenog alilnog adukta sa 92% prinosa.

<1>H NMR (400 MHz, METANOL-d4) δ ppm 8.56 (s, 1 H) 8.47 (s, 1 H) 6.29 - 6.41 (m, 1 H) 6.06 - 6.21 (m, 1 H) 5.33 - 5.53 (m, 2 H) 5.22 - 5.31 (m, 1 H) 5.02 - 5.14 (m, 2 H) 4.56 - 4.71 (m, 1 H) 4.10 - 4.18 (m, 1 H) 3.88 - 3.96 (m, 1 H) 3.70 - 3.79 (m, 1 H)

[0220] U rastvor diizopropilfosforamidita (150 mg, 0,164 mmol) i (2R,3R,4R,5R)-5-(6-(aliloksi)-9H-purin-9-il)-4-fluor-2-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-3-ola (76 mg, 0,246 mmol) u acetonitrilu (1069 µl, 20,47 mmol) dodata su molekulska sita (3 A, 150 mg) na 20 °C. Smeša je mešana na 20 °C tokom 1 h pre dodavanja 1H-imidazol-4,5-dikarbonitrila (38,7 mg, 0,328 mmol) na RT. Smeša je mešana na RT tokom 1 h. UPLC-MS pokazuje da je reakcija završena. Dodat je (E)-N,N-dimetil-N'-(3-tiokso-3H-1,2,4-ditiazol-5-il)formimidamid (37,0 mg, 0,18 mmol). UPLC-MS pokazuje da je sulfurizacija završena za 30 min. Reakcija je tretirana zas. NaHCO3/zas. vodenim rastvorom soli i ekstrahovana pomoću EtOAc/hept. Organski sloj je osušen iznad Na2SO4i filtriran. Rastvarač i ispraljive organske supstance u filtratu su uklonjeni na rotacionom uparivaču. Ostatak je prečišćen koristeći Biotage (kolona sa 25 g Si-gela, EtOAc u heptanu=0 do 100%, 15 zapr., 100%, 10 zapr.).

<1>H NMR (500 MHz, METANOL-d4, dva dijastereomera ∼1:1) δ ppm 8.62 - 8.63 (m, 1 H) 8.57 - 8.58 (m, 1 H) 8.48 - 8.50 (m, 1 H) 8.44 - 8.46 (m, 1 H) 8.40 - 8.41 (m, 1 H) 8.38 - 8.39 (m, 1 H) 8.33 - 8.35 (m, 1 H) 8.25 - 8.27 (m, 1 H) 7.22 - 7.33 (m, 11 H) 7.11 - 7.20 (m, 17 H) 7.05-7.11 (m, 4 H) 6.83 - 6.92 (m, 6 H) 6.65 - 6.77 (m, 11 H) 6.28 - 6.41 (m, 5 H) 6.23 - 6.28 (m, 2 H) 6.10 - 6.22 (m, 5 H) 6.00 - 6.10 (m, 4 H) 5.89 - 6.00 (m, 5 H) 5.52 - 5.57 (m, 2 H) 5.45 -5.52 (m, 3 H) 5.41 - 5.45 (m, 1 H) 5.24 - 5.34 (m, 4 H) 5.13 - 5.17 (m, 3 H) 5.07 - 5.12 (m, 5 H) 4.93 - 4.98 (m, 4 H) 4.88 - 4.93 (m, 5 H) 4.73 - 4.82 (m, 3 H) 4.50 - 4.59 (m, 2 H) 4.36 -4.48 (m, 4 H) 4.27 - 4.36 (m, 5 H) 4.16 - 4.27 (m, 5 H) 3.83 - 4.04 (m, 5 H) 3.73 - 3.78 (m, 13

1

H) 3.64 - 3.73 (m, 4 H) 3.52 - 3.58 (m, 1 H) 3.45 - 3.51 (m, 2 H) 3.35 - 3.41 (m, 2 H) 3.16 -3.23 (m, 2 H) 3.08 - 3.15 (m, 2 H) 2.84 - 2.93 (m, 2 H) 2.79 - 2.83 (m, 2 H) 2.70 - 2.77 (m, 2 H) 2.61 - 2.69 (m, 3 H)

[0221] U rastvor O-((2R,3R,4R,SR)-5-(6-(N-alilbenzamido)-9H-purin-9-il)-2-((bis(4-metoksifenil)(fenil)metoksi)metil)-4-fluortetrahidrofuran-3-il) O-(((2R,3R,4R,5R)-5-(6-(aliloksi)-9H-purin-9-il)-4-fluor-3-hidroksitetrahidrofuran-2-il)metil) O-(2-cijanoetil) fosforotioata (120 mg, 0,104 mmol) u acetonitrilu (4171 µl, 79,852 mmol) dodata su molekulska sita (3A, 1 mas.) na 20 °C. Smeša je mešana na 20 °C tokom 1 h pre nego što je dodat tripirolidinofosfin (71,6 µl, 0,311 mmol). Zatim je 0,45 M tetrazol u ACN-u (253 µl, 0,114 mmol) dodat u 7 porcija, u intervalu od 2 min. TLC (EtOAc/hept=2:1, RfPS=0,7, RfProd=0,0 do 0,6) nije bio završen. Dodati su 2X fosforilujući reagens i tetrazol. Reakciona smeša je mešana na RT tokom 10 min. Ni UPLC-MS ni TLC nisu pokazivali da je preostalo PS. Reakciona smeša je prebačena u balon koji sadrži acetonitril (20,8 ml), vodu (104 µl, 5,776 mmol) i so piridin trifluoracetat (421 mg, 2,178 mmol). Smeša je mešana tokom 10 min. UPLC-MS pokazuje da je nastao željeni proizvod. Reakciona smeša je mešana sa EtOAc i isprana pomoću HCl [0,1 N]/zas. vodenog rastvora soli, a zatim zas. NaHCO3/zas. vodenim rastvorom soli kako bi se sprečila deprotekcija DMT. Vodeni sloj je ponovo ekstrahovan pomoću EtOAc (1X). Kombinovani organski sloj je osušen iznad Na2SO4i zatim filtriran. Rastvarači i isparljive supstance u filtratu su uklonjeni na rotacionom uparivaču, dajući sirovi proizvod koji je korišćen u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja.

1

[0222] Sirovi intermedijer vodonik fosfonat je rastvoren u DCM-u (2635 µl, 40,946 mmol) i vodi (29,5 µl, 1,638 mmol) pre nego što je dodata dihlorsirćetna kiselina (135 µl, 1,638 mmol) u DCM-u (2635 µl, 40,946 mmol) na 20 °C. Smeša je mešana na 20 °C tokom 5 min. UPLC-MS pokazuje da je reakcija završena. Reakcija je neutralisana piridinom (510 µl, 6,308 mmol). Isparljive supstance su uklonjene na rotacionom uparivaču, a zatim na rotacionom uparivaču pod visokim vakuumom. Ostatak je još jednom azeotropski destilisan sa piridinom pre nego što je korišćen za ciklizaciju.

Sirovi vodonik fosfonat sa deprotekcijom DMT (80 mg, 0,087 mmol) rastvoren je u piridinu (1831 µl, 22,639 mmol) pre nego što je dodat 2-hlor-5,5-dimetil-1,3,2-dioksafosfinan 2-oksid (48,2 mg, 0,261 mmol) na RT. Smeša je mešana na RT tokom 10 min. UPLC ne pokazuje pik PS na 2,1 min. Reakcija je deaktivirana dodatkom vode (47,1 µl, 2,612 mmol), nakon čega je smesta dodat 3H-benzo[c][1,2]ditiol-3-on (21,97 mg, 0,131 mmol). Nakon 10 min, UPLC pokazuje da nema preostalih polaznih supstanci. Reakcija je mešana na RT tokom 1 h. Nikakva promena nije otkrivena na UPLC-MS. Reakciona smeša je razblažena pomoću EtOAc i isprana zas. NaHCO3i zasićenim vodenim rastvorom soli. Organski sloj je pre filtracije osušen iznad Na2SO. Ostatak nakon uparavanja rastvarača je rastvoren u MeOH, pre dodavanja NH3-H2O. Smeša je mešana tokom 5 min, pa su rastvarač i isparljive supstance u potpunosti uklonjeni na rotacionom uparivaču i rotacionom uparivaču pod viskom vakuumom.

[0223] CDN intermedijer je rastvoren u acetonitrilu (1484 µl, 28,417 mmol) i 1,4-dioksanu (496 µl, 5,797 mmol), pa su TEA (39,6 µl, 0,284 mmol) i 1-(brommetil)-2-nitrobenzen (49,1 mg, 0,227 mmol) dodati na 20 °C. Smeša je mešana na 20 °C tokom 16 h. UPLC-MS pokazuje da je reakcija nezavršena. Ni TLC (EtOAc) ni HPLC ne pokazuju da je ostalo o-nitrobenzil bromida. Dodat je 1-(brommetil)-2-nitrobenzen (49,1 mg, 0,227 mmol) i TEA (39,6 µl, 0,284 mmol). Reakcija je mešana tokom 5 h. Reakcija je tretirana zas. NaHCO3/zas. vodenim

1

rastvorom soli i ekstrahovana pomoću EtOAc/hept. Organski sloj je osušen iznad Na2SO4i filtriran. Rastvarač i ispraljive organske supstance u filtratu su uklonjeni na rotacionom uparivaču. Ostatak je prečišćen koristeći Biotage (kolona sa 12 g Si-gela, EtOAc u heptanu=0 do 100%, 15 zapr., 100%, 10 zapr., 10% MeOH u EtOAc, 6 zapr.). Frakcije koje su sadržale željeni proizvod su kombinovane. Uparavanje rastvarača je dalo željeni proizvod. Preparativna TLC (EtOAc) korišćena je za izolovanje najpolarnijeg izomera što dovodi do finalnog proizvoda, jedinjenja 18. Preostala dva izomera su razdvojena koristeći preparativnu TLC (EtOAc/DCM=1:1, obavljena 3 puta). Polarniji izomer je konvertovan u jedinjenje 19, a manje polarni izomer je konvertovan u jedinjenje 20.

[0224] Najpolarniji proizvod iz prve p-TLC (EtOAc), nazvan jedinjenje 128-1:<1>H NMR (500 MHz, hloroform-d) δ ppm 8.62 (s, 1 H) 8.55 (s, 1 H) 8.00 - 8.07 (m, 2 H) 7.99 (s, 1 H) 7.96 (s, 1 H) 7.56 - 7.64 (m, 2 H) 7.48 - 7.56 (m, 3 H) 7.42 - 7.48 (m, 1 H) 7.34 - 7.42 (m, 2 H) 7.29 -7.34 (m, 1 H) 7.18 - 7.25 (m, 2 H) 6.09 - 6.21 (m, 3 H) 5.98 - 6.09 (m, 2 H) 5.63 - 5.75 (m, 1 H) 5.52 - 5.63 (m, 1 H) 5.42 - 5.51 (m, 2 H) 5.32 (dd, J=10.27, 0.98 Hz, 1 H) 5.27 (dd, J=17.12, 1.47 Hz, 1 H) 5.13 (d, J=5.87 Hz, 2 H) 5.09 - 5.12 (m, 1 H) 4.95 - 5.05 (m, 2 H) 4.36 - 4.54 (m, 7 H) 4.23 - 4.31 (m, 2 H) 4.15 - 4.21 (m, 1 H) Polarniji proizvod iz druge p-TLC, nazvan jedinjenje 128-2 (EtOAc/DCM=1:1, 3X)<1>H NMR (400 MHz, metanol-d4) δ ppm 8.75 (s, 1 H) 8.59 (s, 1 H) 8.43 (s, 1 H) 8.39 (s, 1 H) 8.01 - 8.07 (m, 2 H) 7.38 - 7.56 (m, 7 H) 7.27 - 7.35 (m, 1 H) 7.15 - 7.26 (m, 3 H) 6.45 (d, J=19.91 Hz, 1 H) 6.38 (d, J=19.52 Hz, 1 H) 5.95 - 6.26 (m, 4 H) 5.83 (dd, J=51.54, 4.69 Hz, 1 H) 5.73 (dd, J=51.54, 4.69 Hz, 1 H) 5.46 - 5.57 (m, 1 H) 5.28 - 5.36 (m, 1 H) 5.19 - 5.28 (m, 1 H) 5.16 (dt, J=5.56, 1.51 Hz, 2 H) 5.03 - 5.10 (m, 1 H) 4.95 (br d, J=5.50 Hz, 2 H) 4.41 - 4.62 (m, 4 H) 4.28 - 4.40 (m, 2 H) 4.12 - 4.27 (m, 4 H) Manje polaran proizvod iz druge p-TLC, nazvan jedinjenje 128-3 (EtOAc/DCM=1:1, 3X)<1>H NMR (400 MHz, hloroform-d) δ ppm 8.53 (s, 1 H) 8.36 (s, 1 H) 7.95 - 8.02 (m, 2 H) 7.95 (s, 1 H) 7.89 (s, 1 H) 7.53 - 7.61 (m, 2 H) 7.44 - 7.53 (m, 4 H) 7.36 - 7.44 (m, 2 H) 7.25 - 7.31 (m, 1 H) 7.12 - 7.20 (m, 2 H) 5.91 - 6.18 (m, 4 H) 5.85 - 5.91 (m, 1 H) 5.72 - 5.79 (m, 1 H) 5.61 -5.72 (m, 1 H) 5.47 - 5.57 (m, 1 H) 5.40 - 5.47 (m, 1 H) 5.25 - 5.32 (m, 1 H) 5.15 - 5.23 (m, 1 H) 4.99 - 5.14 (m, 3 H) 4.92 (d, J=5.47 Hz, 2 H) 4.52 - 4.60 (m, 2 H) 4.37 - 4.52 (m, 4 H) 4.35 (d, J=3.13 Hz, 1 H) 4.30 (d, J=5.47 Hz, 1 H) 4.25 (d, J=2.74 Hz, 1 H) 4.20 (d, J=4.69 Hz, 1 H)

11

128-2 (Polarniji proizv. iz 50% EtOAc u DCM (3X) pTLC razdvajanja) → Jedinjenje 19

128-3 (Manje polarni proizv. iz 50% EtOAc u DCM (3X) pTLC razdvajanja) → Jedinjenje 20

U refluktovani rastvor CDN zaštićenog 2-nitrobenzilom (10 mg, 8,696 µmol) u toluenu (20 ml, 187,761 mmol) dodat je rastvor Hovejda-Grabsovog katalizatora 2. generacije ((1,3-bis-(2,4,6-trimetilfenil)-2-imidazolidiniliden)dihlor(o-izopropoksifenilmetilen)rutenijum; dostupan od SIGMA-ALDRICH® kataloški br. 569755; CAS 301224-40-8; 2,73 mg, 4,348 µmol) i benzohinona (2,350 mg, 0,022 mmol) u TOLUENU (2 ml). Dobijeni rastvor je refluktovan tokom 4 h (uljano kupatilo temperature 120–125 °C). TLC (EtOAc, Rfps=0,8, Rfprod=0,3) i UPLC-MS pokazuje da je reakcija nezavršena. Dodat je 1 ml rastvora Ru katalizatora. Reakcija je refluktovana tokom još 2 h. I dalje je ostalo puno neizreagovale PS. Dodato je još 1 ml rastvora Ru katalizatora. Reakcija je refluktovana tokom još 2 h. Nije uočena PS prilikom reverzno fazne HPLC. Reakciona smeša je ohlađena na RT i deaktivirana pomoću DMSO (0,019 ml, 0,261 mmol). Uparavanje rastvarača je dalo sirovi proizvod koji je prečišćen na koloni Si gela (kolona sa 10 g Si-gela, eluent od 50 do 100%, 15 zapr., 100%, 10 zapr.). Frakcije koje sadrže proizvode sa željenim MS su kombinovane i uparene na rotacionom uparivaču. Ostatak je još jednom prečišćen na prep. TLC (EtOAc).

[0225] U CDN sa zaključanim mostom prečišćen pomoću pTLC (2,5 mg, 2,228 µmol) (trans izomer) u 1,4-dioksanu (0,5 ml, 5,845 mmol) dodat je tiofenol (0,25 ml, 2,428 mmol) i TEA (0,25 ml, 1,794 mmol) na 20 °C. Smeša je mešana na RT tokom 3 h. UPLC pokazuje da je konverzija završena.

[0226] Dodat je metanol (1,5 ml), a zatim je dodat 29% NH3u H2O (1,0 ml). Dobijena smeša je zagrevana na 50 °C tokom 6 h i ohlađena na RT.

[0227] Suspenzija reakcione smeše je filtrirana i isprana vodom (25 ml). U filtratu je nakon ispiranja vodom nastao talog. Filtrat je ponovo filtriran kako bi se uklonile neke čvrste supstance.

[0228] Dobijeni filtrat je ekstrahovan smešom tol/hep (3X, 1/1, 25 ml oba). Vodeni sloj je koncentrovan pod vakuumom i zatim rastvoren u vodi (6 ml). Talog je još jednom filtriran. UPLC pokazuje da je nastao željeni proizvod. Proizvod je prečišćen reverzno faznom HPLC koristeći isti postupak za prečišćavanje drugih bazno zaključanih analoga CDN.

Za jedinjenje 18, LCMS: MS m/z 748.11 [M+H]<+>746.15 [M-H]-

Za jedinjenje 19, LCMS: MS m/z 748.06 [M+H]<+>746.17 [M-H]-

Za jedinjenje 20, LCMS: MS m/z 748.09 [M+H]<+>746.21 [M-H]-

Primer 13 – Sinteza jedinjenja 26

[0229]

Jedinjenje 151

[0230] U rastvor jedinjenja 150 (0,70 g, 2,256 mmol) u piridinu (10,5 ml) na 0 °C dodat je 4,4'-dimetoksitritil hlorid (0,803 g, 2,369 mmol). Dobijeni rastvor je mešan preko noći dok se zagrevao na temperaturu okoline. Po završetku (praćeno pomoću LCMS), dodati su zas. rastvor NH4Cl (10 ml) i MTBE (20 ml). Slojevi su razdvojeni, i vodeni sloj je ekstrahovan pomoću MTBE/EtOAc (3/1, 12 ml). Kombinovani organski slojevi su isprani 30% vodenim rastvorom NaCl (5 ml), osušeni iznad MgSO4, filtrirani i koncentrovani pod vakuumom. Prečišćavanjem sirovog proizvoda hromatografijom na koloni silika gela (25 g SiO2, 50% do 70% EtOAc u nheptanu) dobijeno je 0,942 g jedinjenja 151.

<1>H NMR (400 MHz, HLOROFORM-d) δ = 8.47 (s, 1H), 8.11 (s, 1H), 7.43 - 7.35 (m, 2H), 7.30 - 7.26 (m, 4H), 7.25 - 7.17 (m, 3H), 6.82 - 6.75 (m, 4H), 6.28 (dd, J = 2.3, 17.6 Hz, 1H), 6.22 - 6.10 (m, 1H), 5.63 (ddd, J = 2.7, 4.7, 53.1 Hz, 1H), 5.47 (qd, J = 1.4, 17.3 Hz, 1H), 5.31 (dd, J = 1.2, 10.6 Hz, 1H), 5.13 (t, J = 1.4 Hz, 1H), 5.12 (t, J = 1.2 Hz, 1H), 4.89 - 4.76 (m, 1H), 4.21 (td, J = 3.2, 6.8 Hz, 1H), 3.78 (s, 6H), 3.55 (dd, J = 2.7, 10.9 Hz, 1H), 3.44 (dd, J = 4.3, 10.9 Hz, 1H), 2.29 - 2.21 (m, 1H).

Jedinjenje 152

[0231] U rastvor jedinjenja 151 (0,942 g, 1,538 mmol) u DMF-u (7,5 ml) na temperaturi okoline su dodati 3-((bis(diizopropilamino)fosfino)oksi)propannitril (0,927 g, 3,075 mmol), 0,45 M 1,2,3,4-tetrazol (2,8 ml, 1,2 mmol) i 1-metilimidazol (30 µl, 0,38 mmol). Dobijena suspenzija je mešana na temperaturi okoline tokom 4 h. Po završetku (praćeno pomoću LCMS), dodati su TEA (0,50 ml, 3,6 mmol), DMF (11,3 ml) i voda (1,9 ml). Dobijena smeša je tri puta

11

ekstrahovana n-heptanom (svaki put po 3 ml). DMF sloj je razblažen vodom (4 ml) i ekstrahovan smešom toluen/n-heptan (1/1, 10 ml). Kombinovani organski slojevi su dva puta isprani 30% vodenim rastvorom NaCl (oba puta po 3 ml), osušeni iznad MgSO4, filtrirani i koncentrovani pod vakuumom. Prečišćavanjem ostatka hromatografijom na koloni silika gela (50 g SiO2, 33% do 40% EtOAc u n-heptanu sa 1% TEA) dobijeno je 1,115 g jedinjenja 152 (dijasteromerna smeša 3:2) kao bele penaste čvrste supstance.

Jedinjenje 153

[0232] Smeša jedinjenja 152 (1,115 g, 1,372 mmol) i jedinjenja 158 (0,650 g, 2,095 mmol) dva puta je azeotropski destilisana sa MeCN (oba puta po 20 ml). U dobijeni ostatak su dodati MeCN (20,0 ml) i 1H-imidazol-4,5-dikarbonitril (0,243 g, 2,058 mmol). Po završetku reakcije (praćeno pomoću LCMS), reakciona smeša je tretirana sa (E)-N,N-dimetil-N'-(3-tiokso-3H-1,2,4-ditiazol-5-il)formimidamidom (0,422 g, 2,058 mmol). Nakon potpune sulfurizacije, dodati su zas. rastvor NaHCO3(20 ml) i MTBE (30 ml). Slojevi su razdvojeni, i vodeni sloj je ekstrahovan smešom MTBE/EtOAc (15/15 ml). Kombinovani organski slojevi su isprani 30% vodenim rastvorom NaCl (10 ml), osušeni iznad MgSO4, filtrirani i koncentrovani pod vakuumom. Prečišćavanjem ostatka hromatografijom na koloni silika gela (50 g SiO2, 33% do 100% EtOAc u n-heptanu sa 1% TEA) dobijeno je 0,88 g jedinjenja 153.

LC/MS (ESI) m/z 1076.48 [M+Na]<+>.

[0233] U rastvor jedinjenja 153 (0,880 g, 0,835 mmol) u piridinu (8,8 ml) na temperaturi okoline dodat je difenil fosfit (0,323 ml, 1,67 mmol). Reakciona smeša je mešana tokom 1 h i praćena pomoću LCMS. Po završetku, smeša je dodata u smešu zas. vodenog rastvora NaHCO3(13,2 ml) i vode (4,4 ml) uz održavanje unutrašnje T ispod 30 °C, ispiranje pomoću EtOAc (8,8 ml). Dobijena smeša je mešana na temperaturi okoline i hidroliza je praćena pomoću LCMS. Po završetku, smeša je dva puta ekstrahovana smešom EtOAc/MTBE (1/1, 26 ml). Kombinovani organski slojevi su isprani 30% vodenim rastvorom NaCl (3 ml), osušeni iznad MgSO4, filtrirani i koncentrovani pod vakuumom. Ostatak je dva puta azeotropski destilisan sa toluenom (oba puta po 7 ml). Sirovi proizvod je rastvoren u dihlormetanu (6,6 ml) i tretiran vodom (0,15 ml, 8,35 mmol) i 6% dihlorsirćetnom kiselinom (0,41 ml, 5,0 mmol) u dihlormetanu (6,6 ml) na temperaturi okoline. Nakon potpune deprotekcije DMT (praćeno pomoću LCMS), dodat je trietilsilan (2,7 ml, 17 mmol). Nakon 10 minuta mešanja, dobijena smeša je tretirana piridinom (4,4 ml) i TEA (1 ml) i koncentrovana pod vakuumom. Ostatak je tri puta trituriran n-heptanom (svaki put po 8,8 ml) i dva puta azeotropski destilisan sa MeCN. Sirovi proizvod (jedinjenje 154) korišćen je u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja.

LC/MS (ESI) m/z 814.29 [M-H]-.

Jedinjenje 155

[0234] U rastvor jedinjenja 154 (0,681 g, 0,835 mmol) u piridinu (68 ml) na temperaturi okoline dodat je 2-hlor-5,5-dimetil-1,3,2-dioksafoforinan-2-oksid (0,462 g, 2,505 mmol). Dobijeni rastvor je mešan tokom 1 h na temperaturi okoline i praćen pomoću LCMS. Po završetku, dodati su voda (0,45 ml, 25 mmol) (10 ekv. DMOCP) i sumpor (0,134 g, 4,175 mmol). Nakon potpune sulfurizacije (praćeno pomoću LCMS), reakciona smeša je tretirana zas. vodenim rastvorom NaHCO3(13,6 ml) i koncentrovana pod vakuumom. Ostatak je tretiran pomoću EtOAc (27 ml) i vodom (13,6 ml). Slojevi su razdvojeni, i vodeni sloj je ekstrahovan smešom EtOAc/MTBE (1/1, 27 ml). Kombinovani organski slojevi su isprani 30% vodenim rastvorom NaCl (13,6 ml), osušeni iznad MgSO4, filtrirani i koncentrovani pod vakuumom.

11

Prečišćavanjem ostatka hromatografijom na koloni silika gela (25 g SiO2, 0% do 10% MeOH u EtOAc) dobijeno je 0,693 g (teoretski prinos) jedinjenja 155.

LC/MS (ESI) m/z 830.23 [M+H]<+>.

Jedinjenje 156

[0235] U rastvor jedinjenja 155 (0,693 g, 0,835 mmol) u acetonitrilu (14 ml) na temperaturi okoline dodat je terc-butilamin (14 ml, 131 mmol). Dobijeni rastvor je mešan tokom 10 min i praćen pomoću LCMS. Po završetku, reakciona smeša je koncentrovana pod vakuumom i dva puta azeotropski destilisana sa MeCN. U ostatak su dodati acetonitril (14 ml) i 2-nitrobenzil bromid (0,541 g, 2,51 mmol). Nakon mešanja preko noći, reakciona smeša je koncentrovana pod vakuumom i prečišćena hromatografijom na koloni silika gela (100 g SiO2, 75% do 100% EtOAc u n-heptanu i 0% do 10% MeOH u EtOAc), dajući 0,103 g jedinjenja 156.

<1>H NMR (400 MHz, HLOROFORM-d) δ = 8.59 (s, 2H), 8.05 (br d, J = 8.2 Hz, 2H), 8.03 (s, 2H), 7.58 (d, J = 7.4 Hz, 2H), 7.48 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 7.45 - 7.37 (m, 2H), 6.20 (br d, J = 18.8 Hz, 2H), 6.21 - 6.08 (m, 2H), 5.98 - 5.83 (m, 2H), 5.69 (dd, J = 4.7, 52.0 Hz, 1H), 5.47 (br d, J = 17.2 Hz, 2H), 5.31 (br d, J = 10.6 Hz, 2H), 5.14 (br d, J = 5.5 Hz, 4H), 4.54 - 4.46 (m, 2H), 4.45 - 4.40 (m, 2H), 4.37 - 4.26 (m, 4H), 4.21 - 4.11 (m, 2H).

[0236] Na osnovu metodologije sinteze, NMR podataka (simetrični) i retencionog vremena HPLC (izomer sa najsporijom elucijom), podnosioci predmetne prijave veruju da jedinjenje 156 ima RR stereohemiju fosfora. Stereohemijski raspored će biti potvrđen rendgenskom kristalografijom.

Jedinjenje 157

11

U rastvor jedinjenja 156 (0,103 g, 0,098 mmol) u toluenu (103 ml) uz refluks dodat je rastvor Hovejda-Grabsovog katalizatora 2. generacije ((1,3-bis-(2,4,6-trimetilfenil)-2-imidazolidiniliden)dihlor(o-izopropoksifenilmetilen)rutenijum; dostupan od SIGMA-ALDRICH® kataloški br.569755; CAS 301224-40-8; 31 mg, 0,049 mmol) i hinona (32 mg, 0,295 mmol) u toluenu (10 ml). Smeša je mešana uz refluks tokom 2 h, i dodato je još katalizatora (16 mg, 0,025 mmol). Po završetku, reakciona smeša je ohlađena na temperaturu okoline i tretirana pomoću DMSO (0,14 ml, 2,0 mmol) preko noći. Dobijena smeša je koncentrovana pod vakuumom i prečišćena hromatografijom na koloni silika gela (10 g SiO2, 0% do 10% metanola u EtOAc), dajući željeni proizvod koji je dalje prečišćen pomoću prep. TLC (EtOAc), dajući 3,6 mg jedinjenja 157.

<1>H NMR (400 MHz, HLOROFORM-d) δ = 8.11 (dd, J = 1.2, 8.2 Hz, 2H), 8.09 (s, 2H), 7.68 (s, 2H), 7.67 - 7.58 (m, 4H), 7.52 - 7.48 (m, 2H), 6.26 (d, J = 17.6 Hz, 2H), 6.02 - 5.97 (m, 2H), 5.97 - 5.88 (m, 2H), 5.68 (dd, J = 3.9, 50.8 Hz, 2H), 5.15 (br d, J = 10.9 Hz, 2H), 4.99 (br d, J= 10.9 Hz, 2H), 4.56 - 4.44 (m, 8H), 4.25 (br t, J= 6.1 Hz, 2H).

Jedinjenje 26

[0237] U jedinjenje 157 (3,6 mg, 3,5 µmol) dodati su 1,4-dioksan (0,11 ml), tiofenol (0,045 ml, 0,44 mmol) i TEA (0,054 ml, 0,39 mmol). Dobijena smeša je mešana na temperaturi okoline dok je reakcija praćena pomoću LCMS. Nakon potpune konverzije, dodata je voda (0,5 ml). Dobijena smeša je tri puta ekstrahovana smešom n-heptan/toluen (1/1, svaki put po 0,4 ml), a

11

zatim toluenom (0,3 ml). Vodeni sloj je koncentrovan pod vakuumom i tretiran vodom (0,5 ml). Dobijena čvrsta supstanca je uklonjena filtracijom, uz ispiranje vodom (0,5 ml). Liofilizacijom kombinovanih filtrata dobijeno je 2,0 mg bis-TEA soli jedinjenja 26 kao bela penasta čvrsta supstanca.

<1>H NMR (400 MHz, METANOL-d4) δ = 8.67 (s, 2H), 8.18 (s, 2H), 6.41 (d, J = 14.8 Hz, 2H), 6.07 - 6.01 (m, 2H), 5.56 (dd, J = 3.1, 51.2 Hz, 2H), 5.48 - 5.41 (m, 2H), 5.08 (br d, J = 12.1 Hz, 2H), 4.99 - 4.88 (m, 2H), 4.52 (br d, J = 12.5 Hz, 2H), 4.40 (br d, J = 9.8 Hz, 2H), 3.98 (dd, J = 5.7, 12.3 Hz, 2H), 3.14 (q, J = 7.4 Hz, 12H), 1.27 (t, J = 7.4 Hz, 18H).

Primer 15 – Sinteza jedinjenja 27

[0238] Jedinjenje 27 je pripremljeno od jedinjenja 159, nusproizvoda iz faze 11b postupka za jedinjenje 1 koji je prikazan na SL.2B.

[0239] U rastvor jedinjenja 159 (2,0 g, 1,75 mmol) u metanolu (24 ml) dodat je 28% amonijum hidroksid (12 ml). Dobijena smeša je mešana na 50 °C tokom 5 h i ohlađena na temperaturu okoline. Po završetku (praćeno pomoću LCMS), reakciona smeša je ohlađena na temperaturu okoline, tretirana vodom (20 ml) i tri puta ekstrahovana smešom toluen/EtOAc (1/1, svaki put po 24 ml). Vodeni sloj je zakiseljen 1,0 M hlorovodoničnom kiselinom (3,5 ml, 3,5 mmol), mešan na temperaturi okoline tokom 30 min i na 0 °C tokom 30 min. Dobijena suspenzija je filtrirana, uz ispiranje vodom (20 ml). Pogača je osušena u vakuum sušnici na 35 °C preko noći i rastvorena u smeši 28% NH4OH (2 ml) i MeOH (20 ml). Dobijeni rastvor je koncentrovan pod vakuumom i tretiran pomoću EtOH (4 ml), dajući suspenziju. Dobijena čvrsta supstanca je sakupljena filtracijom i osušena pod vakuumom. Dobijeno je 70 mg jedinjenja 27 kao bela čvrsta supstanca.

11

<1>H NMR (400 MHz, METANOL-d4) δ = 9.03 (br s, 1H), 8.31 (br s, 1H), 8.26 (br s, 1H), 8.13 (br s, 1H), 6.43 - 6.24 (m, 2H), 5.97 - 5.83 (m, 2H), 5.71 (br d, J = 51.6 Hz, 1H), 5.64 (br d, J = 50.0 Hz, 1H), 5.12 - 4.99 (m, 1H), 4.96 - 4.90 (m, 1H), 4.68 - 4.32 (m, 6H), 4.14 - 3.97 (m, 2H), 3.77 - 3.62 (m, 2H).

Primer 16 – Sinteza jedinjenja 28

[0240]

[0241] Jedinjenje 28 je pripremljeno od jedinjenja 160, proizvoda iz faze 11 postupka za jedinjenje 1 koji je prikazan na SL.2B, koristeći isti postupak za jedinjenje 27.

<1>H NMR (400 MHz, METANOL-d4) δ = 8.70 (br s, 1H), 8.49 (br s, 1H), 8.24 (br s, 1H), 8.10 (br s, 1H), 6.52 - 6.26 (m, 2H), 5.94 - 5.78 (m, 2H), 5.69 (br d, J = 54.7 Hz, 1H), 5.48 - 5.26 (m, 1H), 5.14 (br d, J = 53.1 Hz, 2H), 5.06 - 4.94 (m, 1H), 4.74 - 4.19 (m, 4H), 4.10 - 3.93 (m, 2H), 3.76 - 3.58 (m, 2H)

Primer 17 – Sinteza jedinjenja 29

[0242]

vod. but-2-in-1,4-diol

vod.

0 °C do rt

11

[0243] Jedinjenje 161 (5,0 g, 6,329 mmol) i but-2-in-1,4-diol (1,907 g, 22,153 mmol) dva puta su azeotropski destilisani sa THF-om. Ostatak je rastvoren u THF-u (50,0 ml) i toluenu (75 ml). Dodat je trifenilfosfin (2,158 g, 8,228 mmol) i dobijena suspenzija je ohlađena na temperaturu nižu od 5 °C. Ukapavanjem je dodat DIAD (1,60 ml, 8,23 mmol) uz održavanje unutrašnje T ispod 10 °C. Dobijeni rastvor je mešan na 0–5 °C dok je napredovanje praćeno pomoću LCMS. Po završetku, reakciona smeša je koncentrovana pod vakuumom radi uklanjanja većeg dela THF-a. Ostatak je razblažen dodatkom MTBE (50,0 ml) i dva puta ispran 30% vodenim rastvorom NaCl (oba puta po 40,0 ml) i dva puta vodom (oba puta po 25 ml). Organski rastvor je koncentrovan pod vakuumom i prečišćen hromatografijom na koloni silika gela (100 g SiO2, 50% do 70% EtOAc u n-heptanu puferovanom sa 1% TEA), dajući 4,671 g jedinjenja 162.

<1>H NMR (400 MHz, HLOROFORM-d) δ = 8.61 (s, 1H), 8.14 (s, 1H), 7.43 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 7.33 - 7.27 (m, 3H), 7.24 - 7.18 (m, 8H), 7.05 - 7.01 (m, 2H), 6.76 (d, J = 8.6 Hz, 4H), 6.20 (dd, J = 2.7, 17.2 Hz, 1H), 5.59 (td, J = 3.1, 53.1 Hz, 1H), 5.19 (br d, J = 2.3 Hz, 2H), 4.93 -

12

4.83 (m, 1H), 4.18 - 4.15 (m, 1H), 4.01 (br d, J = 6.3 Hz, 2H), 3.78 (s, 6H), 3.53 (dd, J = 2.7, 10.9 Hz, 1H), 3.17 (dd, J = 3.7, 11.1 Hz, 1H), 0.85 (s, 9H), 0.10 (s, 3H), 0.02 (s, 3H).

Jedinjenje 164

[0244] Jedinjenje 162 (4,671 g, 5,444 mmol), jedinjenje 163 (3,32 g, 6,805 mmol) i trifenil fosfin (1,856 g, 7,077 mmol) rastvoreni su u THF-u (56,1 ml) i ohlađeni na temperaturu nižu od 5° C. U dobijeni rastvor je dodat DIAD (1,3 ml, 6,8 mmol)) uz održavanje unutrašnje T ispod 10 °C. Nakon potpune potrošnje jedinjenja 162 (praćeno pomoću LCMS), reakciona smeša je koncentrovana pod vakuumom i prečišćena hromatografijom na koloni silika gela (340 g SiO2, 55% do 70% EtOAc u n-heptanu puferovanom sa 1% TEA), dajući 3,879 g jedinjenja 164 kao belu penastu čvrstu supstancu.

<1>H NMR (400 MHz, HLOROFORM-d) δ = 8.51 (s, 1H), 8.45 (s, 1H), 8.20 (s, 1H), 8.05 (s, 1H), 7.41 (d, J = 7.1 Hz, 2H), 7.36 - 7.32 (m, 4H), 7.28 - 7.13 (m, 8H), 6.98 (t, J = 7.8 Hz, 2H), 6.79 - 6.74 (m, 4H), 6.29 (dd, J = 2.0, 16.4 Hz, 1H), 6.19 (dd, J = 2.7, 17.2 Hz, 1H), 5.53 (ddd, J = 2.7, 4.7, 53.1 Hz, 1H), 5.33 (ddd, J = 2.0, 3.9, 53.1 Hz, 1H), 5.23 - 5.21 (m, 1H), 5.05 -5.01 (m, 2H), 4.99 - 4.94 (m, 2H), 4.81 (ddd, J = 4.3, 6.7, 16.7 Hz, 1H), 4.71 - 4.60 (m, 1H), 4.21 - 4.14 (m, 2H), 4.08 - 4.03 (m, 1H), 3.89 (dd, J = 3.1, 11.7 Hz, 1H), 3.77 (s, 6H), 0.91 (s, 9H), 0.84 (s, 9H), 0.09 (s, 3H), 0.08 (s, 6H), 0.00 (s, 3H).

Jedinjenje 165

U rastvor jedinjenja 164 (1,5 g, 1,13 mmol) u piridinu (12,0 ml) dodat je difenil fosfit (0,35 ml, 1,8 mmol) na temperaturi okoline. Dobijeni rastvor je mešan na temperaturi okoline i praćen pomoću LCMS. Po završetku, reakciona smeša je dodata u smešu zasićenog vodenog NaHCO3(22,5 ml) i vode (7,5 ml) uz održavanje unutrašnje T ispod 30 °C. Nakon što je hidroliza završena (praćeno pomoću LCMS), dobijena smeša je dva puta ekstrahovana smešom EtOAc/MTBE (30,0/30,0 ml). Kombinovani organski slojevi su isprani 30% vod. NaCl (15,0 ml), osušeni iznad MgSO4, filtrirani i koncentrovani pod vakuumom. Ostatak je tri puta azeotropski destilisan sa toluenom i rastvoren u dihlormetanu (11 ml), vodi (0,20 ml, 11 mmol) i 6% dihlorsirćetnoj kiselini (0,57 ml, 6,9 mmol) u dihlormetanu (11 ml) na temperaturi okoline. Nakon potpunog uklanjanja DMT grupe (praćeno pomoću LCMS), dodat je trietilsilan (1,8 ml, 11 mmol). Nakon 10 min mešanja, dodat je TEA (1,6 ml, 11 mmol) i dobijena smeša je koncentrovana pod vakuumom. Ostatak je rastvoren u EtOAc (22,5 ml), ispran vodom (3,8 ml) i zasićenim vodenim NaHCO3(8%) (3,0 ml), osušen iznad MgSO4, filtriran i koncentrovan pod vakuumom. Sirovi proizvod je dva puta trituriran n-heptanom (33,8 ml) i smešom nheptana (9,0 ml) i toluena (3,0 ml). Supernatant je uklonjen dekantovanjem, i čvrsta supstanca koja je preostala na dnu je rastvorena u acetonitrilu. Dobijeni rastvor je koncentrovan pod vakuumom i dva puta azeotropski destilisan sa acetonitrilom. Sirovi proizvod, jedinjenje 165, korišćeno je u sledećoj fazi bez prečišćavanja (pretpostavljeno 100% teorijskog prinosa).

LC/MS (ESI) m/z 1089.74 [M+H]<+>.

Jedinjenje 166

U rastvor jedinjenja 165 (1,231 g, 1,13 mmol) u piridinu (100 ml) na temperaturi okoline dodati su TEA (0,47 ml, 3,4 mmol) i DMOCP (0,375 mg, 2,03 mml). Dobijeni rastvor je mešan na temperaturi okoline i praćen pomoću LCMS. Po završetku, dodati su voda (0,41 ml, 22,6 mmol) i zatim sumpor (0,181 g, 5,651 mmol). Nakon potpune sulfurizacije (praćeno pomoću LCMS), dodati su zasićeni vodeni NaHCO3(8%) (24,6 ml) i voda (10 ml). Dobijena smeša je koncentrovana pod vakuumom do ∼50 ml i dva puta ekstrahovana smešom MTBE/EtOAc (31/31 ml) svaki put. Kombinovani organski slojevi su isprani 30% vod. NaCl (25 ml), osušeni iznad MgSO4, filtrirani, koncentrovani pod vakuumom i prečišćeni hromatografijom na koloni silika gela (100 g SiO2, 0 do 10% metanola u etil acetatu puferovanom sa 1% TEA), dajući jedinjenje 166 (0,484 g).

LC/MS (ESI) m/z 1103.65 [M+H]<+>.

Jedinjenje 167

[0245] U rastvor jedinjenja 166 (0,484 g, ,402 mmol) u piridinu (1,2 ml) i TEA (5,8 ml) na temperaturi okoline dodat je Et3N 3HF(0,581 ml, 3,563 mmol). Dobijena smeša je mešana na temperaturi okoline uz praćenje pomoću LCMS. Nakon potpune konverzije, dodat je metoksitrimetilsilan (3,9 ml, 28 mmol). Nakon 20 min mešanja na temperaturi okoline, supernatant je dekantovan. U ostatak je dodat toluen (5 ml) i, nakon 10 min mešanja, sloj toluena je dekantovan. Isti postupak je ponovljen još jednom. Dobijeni čvrsti proizvod je rastvoren u dihlormetanu (10 ml), ispran zasićenim vodenim NH4Cl (27 mas.%) (5 ml) i 30% vod. NaCl (2,4 ml) i osušen iznad MgSO4. Filtracija nakon koje je sledilo koncentrovanje dobijenog organskog sloja dala je 0,386 bledosmeđe čvrste supstance koja je dva puta azeotropski destilisana sa MeCN. Dobijeni sirovi proizvod je rastvoren u MeCN (4,6 ml) i tretiran 2-nitrobenzil bromidom (0,103 g, 0,475 mmol) na temperaturi okoline. Nakon što je alkilovanje završeno (praćeno pomoću LCMS), reakciona smeša je koncentrovana pod vakuumom i prečišćena hromatografijom na koloni silika gela (25 g SiO2, 0 do 5% MeOH u EtOAc), dajući 0,251 g jedinjenja 167 kao belu čvrstu supstancu.

<1>H NMR (400 MHz, HLOROFORM-d) δ = 8.42 (br s, 1H), 8.31 (br s, 1H), 8.22 (br s, 1H), 8.10 - 8.04 (m, 1H), 7.93 (s, 1H), 7.53 - 7.37 (m, 8H), 7.32 - 7.27 (m, 3H), 7.24 - 7.16 (m, 2H), 6.18 (br d, J = 16.8 Hz, 1H), 6.26 - 6.14 (m, 1H), 5.56 (d, J = 53.1 Hz, 1H), 5.48 - 5.37 (m, 1H), 5.31 (br s, 1H), 5.15 (br d, J = 17.6 Hz, 1H), 4.92 (d, J = 17.6 Hz, 1H), 4.82 (d, J = 17.2 Hz, 1H), 4.88 - 4.77 (m, 1H), 4.76 - 4.66 (m, 1H), 4.58 - 4.33 (m, 3H), 4.29 (br d, J = 5.9 Hz, 1H), 4.21 (br s, 1H), 4.13 - 4.06 (m, 1H), 3.93 - 3.79 (m, 2H).

12

Jedinjenje 168

[0246] Jedinjenje 167 (0,224 g, 0,222 mmol) i 3-(bis(diizopropilamino)fosfinooksi)propannitril (0,081 ml, 0,255 mmol) rastvoreni su u MeCN (5 ml) i koncentrovani. Isti postupak je ponovljen još dva puta. Dobijena smeša je rastvorena u dihlormetanu (2,2 ml), ohlađena na 0 °C i tretirana diizopropilamonijum tetrazolidom (0,019 g, 0,111 mmol). Reakciona smeša je dovedena na temperaturu okoline preko noći i razblažena pomoću MeCN (2,2 ml). Dobijeni rastvor je dodavan tokom 10 h putem špric pumpe u rastvor soli piridin trifluoracetata (0,129 g, 0,665 mmol) u MeCN (18 ml). Nakon još 1 h mešanja, dodat je 3-(bis(diizopropilamino)fosfinooksi)propannitril (0,04 ml, 0,12 mmol) u MeCN (1 ml) tokom 4 h. Dodat je (E)-N,N-dimetil-N'-(3-tiokso-3H-1,2,4-ditiazol-5-il)formimidamid (0,064 g, 0,311 mmol). Nakon potpune sulfurizacije (praćeno pomoću LCMS), reakciona smeša je koncentrovana pod vakuumom i dobijeni ostatak je prenet u MTBE (4,5 ml). Dobijeni organski rastvor je ispran zasićenim vodenim NaHCO3(8%) (4 ml) i vodom (2 ml). Kombinovani vodeni slojevi su ponovo ekstrahovani pomoću smeše MTBE/EtOAc (4/4 ml). Kombinovani organski slojevi su dva puta isprani 30% vodenim NaCl (oba puta po 2 ml), osušeni iznad MgSO4, filtrirani i koncentrovani pod vakuumom. Ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni silika gela (25 g SiO2, 50% do 100% EtOAc u n-heptanu), dajući 64 mg jedinjenja 168.

<1>H NMR (400 MHz, HLOROFORM-d) δ = 8.57 (s, 1H), 8.18 (s, 1H), 8.06 - 8.01 (m, 1H), 7.91 (s, 1H), 7.62 - 7.56 (m, 2H), 7.55 - 7.50 (m, 2H), 7.49 - 7.43 (m, 3H), 7.42 - 7.34 (m, 2H), 7.30 - 7.18 (m, 5H), 6.33 (d, J= 15.2 Hz, 1H), 6.10 (d, J= 20.7 Hz, 1H), 5.95 - 5.77 (m, 1H), 5.54 (dd, J = 4.3, 52.8 Hz, 1H), 5.46 (dd, J = 3.9, 50.8 Hz, 1H), 5.32 - 5.18 (m, 1H), 5.10 (d, J = 17.6 Hz, 1H), 4.89 (d, J = 17.6 Hz, 1H), 4.85 - 4.81 (m, 2H), 4.78 (br d, J = 12.1 Hz, 1H), 4.64 (br dd, J = 4.1, 9.2 Hz, 1H), 4.55 (dd, J = 2.7, 12.1 Hz, 1H), 4.52 - 4.44 (m, 3H), 4.38 - 4.20 (m, 4H), 2.75 (td, J= 6.3, 17.6 Hz, 1H), 2.58 (td, J= 5.9, 17.2 Hz, 1H).

Jedinjenje 29

[0247] U rastvor jedinjenja 168 (40 mg, 0,035 mmol) u 1,4-dioksanu (0,5 ml) dodati su tiofenol (0,24 ml, 2,3 mmol) i TEA (0,24 ml, 1,7 mmol). Dobijena smeša je mešana na temperaturi okoline dok je reakcija praćena pomoću LCMS. Po završetku, dodati su metanol (0,64 ml) i 28% amonijum hidroksid (0,64 ml). Dobijena smeša je zagrevana na 50 °C, mešana tokom 5 h i ohlađena na temperaturu okoline. Nakon potpune deprotekcije (praćeno pomoću LCMS), dobijena smeša je tretirana vodom (0,80 ml) i tri puta ekstrahovana smešom n-heptan/toluen (1/1, svaki put po 0,5 ml) i zatim toluenom (0,3 ml). Vodeni sloj je koncentrovan pod vakuumom na 40–50 °C i tretiran vodom (1 ml). Dobijena čvrsta supstanca je uklonjena filtracijom, uz ispiranje vodom (0,3 ml). Kombinovani filtrati su tretirani pomoću 1,0 M HCl (0,07 ml, 0,07 mmol). Dobijena suspenzija je filtrirana i isprana vodom (1 ml). Filter pogača je rastvorena u 2,0 M rastvoru amonijaka (1,0 ml, 2,0 mmol) u MeOH. Dobijeni rastvor je koncentrovan pod vakuumom do 0,5 ml i tretiran pomoću EtOH (0,5 ml). Isti postupak je ponovljen još dva puta. U dobijeni rastvor je ukapavanjem dodat EtOAc (0,9 ml). Došlo je do taloženja. Dobijena čvrsta supstanca je sakupljena filtracijom, isprana smešom EtOAc/EtOH 4/1 (0,4 ml) i osušena pod vakuumom preko noći na temperaturi okoline. Dobijeno je 12 mg jedinjenja 29.

<1>H NMR (400 MHz, METANOL-d4) δ = 8.88 (br s, 1H), 8.50 (br s, 1H), 8.20 (br s, 1H), 8.12 (br s, 1H), 6.42 - 6.17 (m, 2H), 5.84 - 5.54 (m, 1H), 5.52 (d, J= 51.6 Hz, 1H), 5.06 - 4.78 (m, 2H), 4.77 - 4.55 (m, 3H), 4.49 (br d, J= 10.2 Hz, 1H), 4.42 (br s, 2H),4.09 - 3.77 (m, 4H).

Primer 18 – Sinteza jedinjenja 25

[0248]

12

Jedinjenje 170

U rastvor Hovejda-Grabsovog katalizatora 2. generacije (0,996 g, 1,585 mmol) u dihlormetanu (40,0 ml) uz refluks je dodat prop-2-en-d5-1-ol (10,0 g, 158 mmol). Nakon 1 h, dodat je još 1 mol% Hovejda-Grabsovog katalizatora 2. generacije (0,996 g, 1,585 mmol). Dobijeni rastvor je mešan uz refluks preko noći, ohlađen na temperaturu okoline i koncentrovan pod vakuumom. Ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni silika gela (340 g SiO2

0% do 10% MeOH u EtOAc), dajući 4,2 g jedinjenja 170 kao smeđe ulje.

[0249]<13>C NMR (101 MHz, METANOL-d4) δ = 130.87 (t, J = 23.8 Hz, 2C), 62.22 (quin, J = 21.9 Hz, 2C).

Jedinjenje 171

[0250] Uzimajući jedinjenje 170 kao polaznu supstancu, jedinjenje 171 je pripremljeno koristeći istu reakcionu sekvencu (faza 1 do 11) koja je opisana u sintetičkom postupku za jedinjenje 1 na SL.2A i SL.2B.

12

<1>H NMR (400 MHz, HLOROFORM-d) δ = 8.59 (s, 1H), 8.10 (s, 1H), 8.02 - 7.96 (m, 1H), 7.93 (s, 1H), 7.58 - 7.50 (m, 2H), 7.48 - 7.37 (m, 5H), 7.34 - 7.27 (m, 2H), 7.24 - 7.14 (m, 4H), 6.90 (s, 1H), 6.28 (d, J = 14.8 Hz, 1H), 6.14 - 6.03 (m, 1H), 5.97 - 5.81 (m, 1H), 5.49 (dd, J = 4.7, 52.3 Hz, 2H), 5.43 (dd, J = 3.9, 50.8 Hz, 1H), 5.30 - 5.15 (m, 1H), 4.75 (br d, J = 12.1 Hz, 1H), 4.61 (br dd, J = 4.3, 9.4 Hz, 1H), 4.53 (dd, J = 2.9, 11.9 Hz, 1H), 4.47 - 4.41 (m, 3H), 4.32 -4.18 (m, 4H), 2.79 (td, J = 7.0, 17.2 Hz, 1H), 2.66 (td, J = 6.3, 16.8 Hz, 1H)

Jedinjenje 25

[0251] Uzimajući jedinjenje 171 kao polaznu supstancu, jedinjenje 25 je pripremljeno koristeći istu reakcionu sekvencu (faza 12–13) koja je opisana na SL.2A i SL.2B.

<1>H NMR (400 MHz, CD3OD) δ = 9.03 (br s, 1H), 8.30 (br s, 1H), 8.24 (br s, 1H), 8.10 (br s, 1H), 6.44 - 6.13 (m, 2H), 0.00 (d, J = 52.4 Hz, 1H), 0.00 (d, J = 51.2 Hz, 1H), 4.71 - 4.32 (m, 6H), 4.09 - 3.98 (m, 1H), 3.97 - 3.87 (m, 1H).

Primer 19 – Sinteza jedinjenja 31 (RpRp ili SpSp)

[0252]

12

[0253] Smeša (E)-but-2-en-1,4-diola (0,10 g, 1,135 mmol) i jedinjenja 172 (2,52 g, 2,55 mmol) dva puta je azeotropski destilisana THF-om i rastvorena u THF-u (5,0 ml) i toluenu (7,5 ml). U dobijeni rastvor je dodat trifenilfosfin (0,714 g, 2,724 mmol). Dobijeni rastvor je ohlađen na temperaturu nižu od 5 °C i tretiran pomoću DIAD (0,53 ml, 2,72 mmol) uz održavanje unutrašnje T ispod 10 °C. Dobijena reakciona smeša je mešana preko noći dok je zagrevana na temperaturu okoline. Nakon završene reakcije (praćeno pomoću LCMS), reakciona smeša je koncentrovana pod vakuumom i prečišćena hromatografijom na koloni silika gela (50 g SiO2prethodno tretirana sa 1% TEA u n-heptanu/EtOAc (1/1), 50% do 66% EtOAc u n-heptanu), dajući 2,46 g jedinjenja 173 kao belu penastu čvrstu supstancu. Ova supstanca je korišćena u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja.

Jedinjenje 174

12

[0254] U rastvor jedinjenja 173 (2,387 g, 1,177 mmol) u acetonitrilu (28,6 ml) dodati su voda (0,085 ml, 4,7 mmol), so piridin trifluoracetat (0,500 g, 2,589 mmol) na temperaturi okoline. Nakon 1 min, dodat je 2-amino-2-metilpropan (19,1 ml, 182 mmol). Dobijena smeša je mešana na temperaturi okoline dok je reakcija praćena pomoću LCMS. Po završetku, reakciona smeša je koncentrovana pod vakuumom i azeotropski destilisana sa MeCN. Ostatak je rastvoren u dihlormetanu (24 ml) i tretiran vodom (0,42 ml) i 6% dihlorsirćetnom kiselinom (1,2 ml, 14 mmol) u dihlormetanu (24 ml). Nakon potpune deprotekcije DMT (praćeno pomoću LCMS), reakcija je deaktivirana piridinom (12 ml) i reakciona smeša je koncentrovana pod vakuumom. Dobijeni ostatak je tretiran smešom n-heptana/toluena (15/15 ml) i gornji sloj je dekantovan. Isti postupak je ponovljen još jednom. Sušenjem preostalog ostatka pod vakuumom dobijeno je jedinjenje 174, koje je korišćeno u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja.

LC/MS (ESI) m/z 1151.64 [M+H]<+>.

Jedinjenje 175

[0255] U rastvor jedinjenja 174 (1,355 g, 1,177 mmol) u piridinu (271 ml) na temperaturi okoline dodati su TEA (0,98 ml, 7,1 mmol) i 2-hlor-5,5-dimetil-1,3,2-dioksafosfinan 2-oksid (0,869 g, 4,708 mmol). Dobijeni rastvor je mešan na temperaturi okoline sve dok polazna supstanca nije potrošena (praćeno pomoću LCMS). Po završetku reakcije, dodati su voda (0,85 ml, 47 mmol) (10 ekv. DMOCP) i zatim sumpor (0,377 g, 11,77 mmol). Dobijena smeša je mešana na temperaturi okoline dok je reakcija praćena pomoću LCMS. Nakon potpune sulfurizacije, reakciona smeša je tretirana zas. vodenim NaHCO3(27 ml) i vodom (10 ml) i koncentrovana pod vakuumom. U dobijeni rastvor su dodati smeša MTBE/EtOAc (34/34 ml), zas. vodeni rastvor NaHCO3(27 ml) i voda (20 ml). Slojevi su razdvojeni, i vodeni sloj je ekstrahovan smešom EtOAc/MTBE (34/34 ml). Kombinovani organski slojevi su isprani 30% vodenim rastvorom NaCl (7 ml), osušeni iznad MgSO4, filtrirani i koncentrovani pod vakuumom. Ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni silika gela (50 g SiO2, 0% do 20%

12

MeOH u EtOAc sa 1% TEA), dajući 56 mg jedinjenja 175 (simetrično na osnovu NMR; RpRp ili SpSp izomer).

<1>H NMR (400 MHz, HLOROFORM-d) δ = 9.09 (s, 2H), 8.46 (s, 2H), 7.56 - 7.05 (m, 10H), 6.37 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 6.28 - 6.22 (m, 2H), 5.29 (ddd, J = 4.7, 7.8, 11.7 Hz, 2H), 5.00 (br d, J = 13.7 Hz, 2H), 4.84 (d, J = 4.3 Hz, 2H), 4.76 (br d, J = 13.3 Hz, 2H), 4.31 (br s, 2H), 4.28 -4.20 (m, 2H), 4.16 - 4.08 (m, 2H), 3.00 - 2.77 (m, 12H), 1.12 - 0.99 (m, 18H), 0.96 (s, 18H), 0.34 (s, 6H), 0.25 (s, 6H).

Jedinjenje 31

U rastvor jedinjenja 175 (56 mg, 0,0405 mmol) u metanolu (1,1 ml) dodat je 28% amonijum hidroksid (0,22 ml). Dobijena smeša je mešana na 50 °C tokom 5 h, ohlađena na temperaturi okoline, koncentrovana pod vakuumom i dva puta azeotropski destilisana sa MeCN. U dobijeni ostatak je dodat piridin (0,22 ml), TEA (0,11 ml) i TEA 3HF (0,11 ml, 0,69 mmol). Dobijena smeša je mešana na 50° tokom 5 h, ohlađena na temperaturu okoline, tretirana metoksitrimetil silanom (0,90 ml, 6,50 mmol) tokom 30 min. Dobijena smeša je koncentrovana pod vakuumom i rastvorena u vodi (5 ml). Dobijeni vodeni rastvor je tri puta ekstrahovan toluenom (svaki put po 5 ml) i koncentrovan pod vakuumom. Sirovi proizvod je rastvoren u 1 ml vode, filtriran kroz špric filter i zakiseljen pomoću 1 N HCl do pH<3. Dobijena smeša je čuvana u frižideru (5 °C) tokom 2 dana, i dobijena čvrsta supstanca je sakupljena filtracijom. Čvrsta supstanca je rastvorena u 2M NH3u MeOH (1,5 ml) i koncentrovana pod vakuumom, dajući 2,8 mg jedinjenja 31 kao smešu NH3i TEA soli. Proizvod je rastvoren u EtOH (1 ml), tretiran sa 0,1 ml TEA, koncentrovan do 0,5 ml i čuvan u zamrzivaču (-20 °C) preko noći. Supernatant je uklonjen, i preostala čvrsta supstanca je dalje osušena pod vakuumom dajući 0,8 mg bis TEA soli jedinjenja 31 (simetrično na osnovu NMR; RpRp ili SpSp izomer).

<1>H NMR (400 MHz, METANOL-d4) δ = 8.26 - 7.83 (m, 4H), 6.37 (br s, 2H), 5.89 (br s, 2H), 5.36 - 5.07 (m, 2H), 4.95 (br d, J = 3.5 Hz, 2H), 4.58 (br dd, J = 6.3, 10.6 Hz, 2H), 4.43 (br s,

1

2H), 4.12 - 4.00 (m, 4H), 3.89 - 3.70 (m, 2H), 3.19 (q, J= 7.2 Hz, 12H), 1.30 (t, J= 7.4 Hz, 18H)

Primer 20 – Sinteza jedinjenja 32

[0256]

U rastvor jedinjenja 177 (2,0 g, 2,532 mmol) i (+)-2,3-O-izopropiliden-L-treitola (jedinjenje 176) (1,232 g, 7,595 mmol) u THF-u (20,0 ml) i toluenu (30,0 ml) dodat je trifenilfosfin (0,930 g, 3,544 mmol). Dobijeni rastvor je ohlađen na temperaturu nižu od 5 °C i tretiran sa DIAD (0,64 ml, 3,3 mmol). Reakciona smeša je zagrejana na temperaturu okoline. Nakon 8 h mešanja na temperaturi okoline, dodato je još DIAD (0,64 ml) i PPh3(0,93 g). Nakon mešanja preko noći na temperaturi okoline, reakciona smeša je mešana na 40 °C tokom 2 dana i koncentrovana pod vakuumom. Prečišćavanjem ostatka hromatografijom na koloni silika gela (100 g SiO2

1 1

prethodno tretiran sa 1% TEA u n-heptanu/EtOAc (1/1), 50% do 70% EtOAc u n-heptanu) dobijeno je 0,524 g jedinjenja 178 kao bele penaste čvrste supstance.

<1>H NMR (400 MHz, HLOROFORM-d) δ = 8.62 (s, 1H), 8.09 (s, 1H), 7.40 - 7.09 (m, 12H), 7.01 - 6.92 (m, 2H), 6.80 - 6.73 (m, 4H), 6.16 (dd, J = 2.7, 16.8 Hz, 1H), 5.49 (ddd, J = 3.1, 4.3, 53.1 Hz, 1H), 4.85 - 4.75 (m, 2H), 4.63 (dd, J= 3.9, 14.8 Hz, 1H), 4.30 - 4.19 (m, 2H), 4.18 - 4.12 (m, 1H), 3.94 (tt, J = 3.5, 8.2 Hz, 1H), 3.84 (td, J = 5.5, 12.1 Hz, 1H), 3.78 (s, 6H), 3.53 (dd, J = 2.7, 10.9 Hz, 1H), 3.17 (dd, J = 3.5, 10.9 Hz, 1H), 2.94 (br t, J = 5.5 Hz, 1H), 0.89 (s, 6H), 0.83 (s, 9H), 0.08 (s, 3H), -0.01 (s, 3H)

Jedinjenje 180

U rastvor jedinjenja 178 (0,409 g, 0,84 mmol) u THF-u (6 ml) dodati su trifenilfosfin (0,191 g, 0,728 mmol) i DIAD (0,142 ml, 0,728 mmol). Nakon 40 h mešanja na temperaturi okoline, reakciona smeša je koncentrovana pod vakuumom i prečišćena hromatografijom na koloni (50 g SiO2prethodno tretiran sa 1% TEA u n-heptanu/EtOAc (1/1), 50% do 66% EtOAc u nheptanu), dajući 0,533 g jedinjenja 180.

LC/MS: LRMS (ESI) m/z 1403.86 [M+H]<+>.

Jedinjenje 181

[0257] Uzimajući jedinjenje 180 kao polaznu supstancu, jedinjenje 181 je pripremljeno koristeći istu reakcionu sekvencu (faza 5–11) koja je opisana na SL.2A i SL.2B.

1 2

<1>H NMR (400 MHz, HLOROFORM-d) δ = 8.72 (s, 1H), 8.14 - 8.06 (m, 1H), 7.93 (s, 1H), 7.69 (s, 1H), 7.62 - 7.53 (m, 6H), 7.53 - 7.45 (m, 1H), 7.43 - 7.33 (m, 2H), 7.30 - 7.24 (m, 3H), 7.19 - 7.12 (m, 2H), 6.11 (d, J = 16.8 Hz, 1H), 6.05 (d, J = 19.5 Hz, 1H), 5.89 (dd, J = 3.5, 52.3 Hz, 1H), 5.57 - 5.46 (m, 1H), 5.41 (dd, J = 3.5, 53.1 Hz, 1H), 5.18 - 5.04 (m, 1H), 4.83 (dd, J= 4.7, 14.4 Hz, 1H), 4.78 - 4.73 (m, 1H), 4.70 (br d, J= 12.1 Hz, 1H), 4.64 - 4.48 (m, 4H), 4.46 - 4.35 (m, 4H), 4.33 - 4.27 (m, 2H), 4.16 - 4.06 (m, 2H), 4.05 - 3.96 (m, 1H), 2.55 (t, J = 6.1 Hz, 2H), 1.26 (s, 6H).

Jedinjenje 182

[0258] U rastvor jedinjenja 181 (3,2 mg, 2,629 µmol) u dihlormetanu (0,5 ml) dodat je tercbutilamin (0,5 ml, 4,7 mmol). Nakon 30 min mešanja, reakcioni rastvor je koncentrovan pod vakuumom i dva puta azeotropski destilisan sa MeCN. Ostatak je rastvoren u acetonitrilu (1 ml) i tretiran 1-(brommetil)-2-nitrobenzenom (1,7 mg, 7,9 µmol). Nakon potpunog alkilovanja (praćeno pomoću LCMS), reakciona smeša je koncentrovana uz produvavanje azotom. Prečišćavanjem ostatka hromatografijom na koloni silika gela (4 g SiO2, 80% do 100% EtOAc u n-heptanu) dobijeno je 2 mg jedinjenja 182.

<1>H NMR (400 MHz, HLOROFORM-d) δ = 8.12 (dd, J = 1.4, 8.0 Hz, 1H), 8.03 - 8.00 (m, 1H), 8.00 (s, 1H), 7.93 (s, 1H), 7.70 (s, 1H), 7.70 - 7.29 (m, 13H), 7.21 (dt, J = 2.7, 7.6 Hz, 4H), 6.07 (d, J= 19.9 Hz, 1H), 5.94(d, J= 21.1 Hz, 1H), 5.91 - 5.77 (m, 1H), 5.81 (dd, J = 4.3, 51.5 Hz, 1H), 5.62 - 5.49 (m, 1H), 5.54 (dd, J = 3.1, 52.7 Hz, 2H), 4.83 (q, J = 5.9 Hz, 1H), 4.72 -4.63 (m, 2H), 4.61 - 4.28 (m, 13H), 1.42 (s, 3H), 1.28 (s, 3H).

1

Jedinjenje 32

[0259] U jedinjenje 182 (2,0 mg, 1,5 µmol) dodati su sirćetna kiselina (0,8 ml) i voda (0,2 ml). Dobijena smeša je mešana na temperaturi okoline tokom 14 h i na 45–50 °C tokom 24 h, koncentrovana pod vakuumom i dva puta azeotropski destilisana sa toluenom. U ostatak su dodati 1,4-dioksan (0,12 ml), tiofenol (60 µl), a zatim TEA (60 µl). Dobijena smeša je mešana na temperaturi okoline dok je reakcija praćena pomoću LCMS. Nakon završetka, dodati su metanol (160 µl) i 28% amonijum hidroksid (160 µl). Dobijena smeša je mešana na 50 °C dok debenzoilovanje nije završeno (praćeno pomoću LCMS). Po završetku, dodata je voda (0,3 ml). Dobijena čvrsta supstanca je uklonjena filtracijom, uz ispiranje vodom (0,2 ml). Filtrat je dva puta ekstrahovan toluenom (oba puta po 0,5 ml) i koncentrovan pod vakuumom na 40–50 °C. Ostatak je tretiran vodom (0,5 ml) i dobijena čvrsta supstanca je uklonjena filtracijom, uz ispiranje vodom (0,1 ml). HPLC prečišćavanjem kombinovanih slojeva u prethodno opisanim uslovima dobijeno je 1,5 mg jedinjenja 32.

LC/MS: LRMS (ESI) m/z 781,23 [M+H]<+>.

Uslovi za preparativnu HPLC za jedinjenje 32:

1 4

Primer 21 – Sinteza jedinjenja 33 i jedinjenja 34

[0260]

[0261] U rastvor 9-((2R,3R,4R,5R)-3-fluor-4-hidroksi-5-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-2-il)-1,9-dihidro-6H-purin-6-ona, jedinjenja 183 (5,00 g, 18,5 mmol) u piridinu (75 ml) na 0 °C dodati su Ac2O (7,0 ml, 74 mmol) i DMAP (0,565 g, 4,626 mmol). Dobijena smeša je zagrejana

1

na temperaturu okoline i mešana, dok je reakcija praćena pomoću LCMS. Po završetku, reakciona smeša je koncentrovana pod vakuumom i tretirana pomoću EtOAc (200 ml) i vode (50 ml). Došlo je do taloženja. Dobijena čvrsta supstanca je sakupljena filtracijom i isprana pomoću MTBE. Sušenjem preko noći pod vakuumom na 40 °C dobijeno je 5,81 g jedinjenja 193 kao bele čvrste supstance.

<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ = 12.53 (br s, 1H), 8.33 (s, 1H), 8.15 (d, J = 4.3 Hz, 1H), 6.37 (dd, J = 2.7, 19.1 Hz, 1H), 5.86 (ddd, J= 2.7, 5.1, 51.6 Hz, 1H), 5.62 (ddd, J= 5.5, 7.0, 16.0 Hz, 1H), 4.49 - 4.38 (m, 2H), 4.26 (dd, J= 4.7, 12.1 Hz, 1H), 2.19 (s, 3H), 2.04 (s, 3H).

Jedinjenje 184

[0262] U rastvor jedinjenja 193 u dihlormetanu (40,0 ml) na 0 °C polako su dodati DMF (1,3 ml, 16,9 mmol) i tionil hlorid (1,28 ml, 17,5 mmol). Dobijena smeša je zagrevana do refluksa i mešana sve dok polazna supstanca nije u celosti potrošena (praćeno pomoću LCMS). Po završetku, reakciona smeša je ohlađena na temperaturu okoline i tretirana zas. vodenim rastvorom NaHCO3(40 ml). Slojevi su razdvojeni, i vodeni sloj je dva puta ekstrahovan dihlormetanom (po 30 ml). Kombinovani organski slojevi su osušeni iznad MgSO4, filtrirani i koncentrovani pod vakuumom, dajući 2,81 g jedinjenja 184 kao svetlosmeđeg ulja.

<1>H NMR (400 MHz, HLOROFORM-d) δ = 8.79 (s, 1H), 8.30 (s, 1H), 6.29 (dd, J = 2.0, 18.0 Hz, 1H), 5.79 (ddd, J = 1.6, 4.7, 51.6 Hz, 1H), 5.53 (ddd, J = 5.1, 7.6, 17.8 Hz, 1H), 4.58 - 4.48 (m, 2H), 4.33 (dd, J = 3.9, 12.5 Hz, 1H), 2.20 (s, 3H), 2.07 (s, 3H).

Jedinjenje 194

1

[0263] U rastvor jedinjenja 184 (0,22 g, 0,59 mmol) u smeši THF-a (7,7 ml) i NMP-a (0,77 ml) na temperaturi okoline dodati su gvožđe(III) acetilacetonat (0,021 g, 0,059 mmol) i 0,5 M 3-butenilmagnezijum bromid (1,77 ml, 0,885 mmol) u THF-u. Po završetku reakcije (praćeno pomoću LCMS), dodati su MTBE (10 ml) i 0,1 N HCl (10 ml). Dobijena smeša je mešana na temperaturi okoline tokom 10 min. Slojevi su razdvojeni, i vodeni sloj je ekstrahovan smešom EtOAc/MTBE (1/1, 10 ml). Kombinovani organski slojevi su isprani 30% vodenim rastvorom NaCl (5 ml), osušeni iznad MgSO4i koncentrovani pod vakuumom. Sirovi proizvod je korišćen u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja.

<1>H NMR (400 MHz, HLOROFORM-d) δ = 8.90 (s, 1H), 8.16 (s, 1H), 6.26 (dd, J = 2.0, 18.4 Hz, 1H), 5.98 - 5.85 (m, 1H), 5.90 - 5.73 (m, 1H), 5.63 (ddd, J = 4.9, 7.5, 17.7 Hz, 1H), 5.12 -5.05 (m, 1H), 4.98 (dd, J= 1.6, 10.2 Hz, 1H), 4.54 - 4.50 (m, 2H), 4.31 (dd, J = 5.1, 12.9 Hz, 1H), 3.30 (t, J= 7.4 Hz, 2H), 2.70 - 2.64 (m, 2H), 2.19 (s, 3H), 2.05 (s, 3H).

Jedinjenje 185

Sirovi proizvod, jedinjenje 194 (0,232 g, 0,590 mmol teorijski), rastvoren je u metanolu (1,5 ml) i tretiran 2,0 M amonijakom (1,5 ml, 3,0 mmol) u MeOH na temperaturi okoline. Nakon potpunog deacetilovanja, reakciona smeša je koncentrovana pod vakuumom i prečišćena hromatografijom na koloni silika gela (10g SiO2, 0% do 5% MeOH u EtOAc), dajući 0,17 g jedinjenja 185.

LCMS: MS (ESI) m/z 309.20 [M+H]<+>

Jedinjenje 195

1

[0264] U rastvor jedinjenja 185 (1,22 g, 2,928 mmol) u piridinu (9,0 ml) na 0° dodat je 4,4'-(hlor(fenil)metilen)bis(metoksibenzen) (1,042 g, 3,075 mmol). Reakciona smeša je ostavljena da se zagreje na temperaturu okoline dok je reakcija praćena pomoću LCMS. Po završetku, dodati su MTBE (18 ml) i zas. vodeni rastvor NaHCO3(9,0 ml). Nakon 10 min mešanja, slojevi su razdvojeni i vodeni sloj je ekstrahovan pomoću MTBE (18,0 ml). Kombinovani organski slojevi su isprani 30% vodenim rastvorom NaCl (10 ml), filtrirani i koncentrovani pod vakuumom. Prečišćavanjem hromatografijom na koloni silika gela (50 g SiO2, 50% do 100% etil acetata u heptanu sa 1% TEA) dobijeno je 1,53 g jedinjenja 195 kao narandžaste čvrste supstance.

<1>H NMR (400 MHz, HLOROFORM-d) δ = 8.86 - 8.78 (m, 1H), 8.21 (s, 1H), 7.40 - 7.36 (m, 2H), 7.31 - 7.18 (m, 7H), 6.79 (d, J = 8.6 Hz, 4H), 6.29 (dd, J = 2.3, 17.2 Hz, 1H), 5.92 (tdd, J = 6.4, 10.4, 17.0 Hz, 1H), 5.70 (ddd, J = 2.7, 4.7, 52.8 Hz, 1H), 5.09 (dd, J = 1.6, 17.2 Hz, 1H), 4.97 (dd, J = 1.6, 10.2 Hz, 1H), 4.90 - 4.77 (m, 1H), 4.26 - 4.19 (m, 1H), 3.78 (s, 6H), 3.56 (dd, J = 3.1, 10.9 Hz, 1H), 3.43 (dd, J = 4.3, 10.9 Hz, 1H), 3.33 - 3.28 (m, 2H), 2.70 - 2.64 (m, 2H), 2.20 (dd, J = 2.5, 7.2 Hz, 1H).

Jedinjenje 186

[0265] U rastvor jedinjenja 195 (1,530 g, 2,505 mmol) u dihlormetanu (23 ml) na temperaturi okoline dodati su 3-(bis(diizopropilamino)fosfinooksi)propannitril (1,20 ml, 3,76 mmol) i diizopropilamonijum tetrazolid (0,493 g, 2,881 mmol). Reakciona smeša je mešana na temperaturi okoline dok je napredovanje praćeno pomoću LCMS. Po završetku, reakciona smeša je koncentrovana pod vakuumom i prečišćena hromatografijom na koloni silika gela (50 g SiO2, 40% do 66% EtOAc u n-heptanu sa 1% TEA), dajući 1,80 g jedinjenja 186 kao bledonarandžaste penaste čvrste supstance.

1

Jedinjenja 196 i 197

[0266] Jedinjenje 186 (1,8 g, 2,22 mmol) i jedinjenje 185 (1,110 g, 2,664 mmol) rastvoreni su u acetonitrilu (21,6 ml) i koncentrovani pod vakuumom. Isti postupak je ponovljen još jednom. Dobijena smeša je rastvorena u acetonitrilu (21,6 ml) i tretirana piridinijum trifluoracetatom (0,514 g, 2,664 mmol) na temperaturi okoline. Po završetku reakcije (praćeno pomoću LCMS), dodat je ((dimetilamino-metiliden)amino)-3H-1,2,4-ditiazaolin-3-tion (0,911 g, 4,439 mmol) i dobijena smeša je mešana na temperaturi okoline. Nakon potpune sulfurizacije (praćeno pomoću LCMS), dodat je zas. vodeni rastvor NaHCO3(30 ml) i dobijena smeša je tri puta ekstrahovana pomoću MTBE (svaki put po 30 ml). Kombinovani organski slojevi su isprani 30% vodenim rastvorom NaCl (20 ml), osušeni iznad MgSO4, filtrirani i koncentrovani pod vakuumom. Prečišćavanjem hromatografijom na koloni silika gela (100 g SiO2, 0% do 10% MeOH u EtOAc sa 1% TEA) dobijeno je 0,481 g jedinjenja 196 i 1,315 g jedinjenja 197.

Jedinjenje 196: LCMS: MS (ESI) m/z 1073.25 [M+Na]<+>

Jedinjenje 197: LCMS: MS (ESI) m/z 995.23 [M-H]-

[0267] U rastvor TEA soli jedinjenja 197 (1,315 g, 1,197 mmol) u MeCN (20 ml) na temperaturi okoline dodat je 2-nitrobenzil bromid (0,388 g, 1,796 mmol). Dobijeni rastvor je mešan na temperaturi okoline dok je reakcija praćena pomoću LCMS. Po završetku, reakciona smeša je koncentrovana pod vakuumom i prečišćena hromatografijom na koloni silika gela (100 g SiO2, 0% do 5% MeOH u EtOAC), dajući 0,90 g jedinjenja 188.

1

LCMS: MS (ESI) m/z 1154.29 [M+Na]<+>

[0268] U rastvor jedinjenja 188 (1,35 g, 1,192 mmol) u toluenu (540 ml) uz blagi refluks (110– 112oC unutrašnja T) dodat je rastvor Hovejda-Grabsovog katalizatora 2. generacije (0,187 g, 0,298 mmol) i hinona (0,322 g, 2,981 mmol)) u toluenu (20 ml). Dobijeni rastvor je mešan na temperaturi od 110–112 °C dok je reakcija praćena pomoću LCMS. Nakon 4 h, dodato je još katalizatora (0,10 g, 0,16 mmol) i mešanje je nastavljeno uz refluks. Po završetku, reakciona smeša je ohlađena na temperaturu okoline i tretirana pomoću DMSO (2,54 ml, 35,8 mmol). Nakon 3 h mešanja, reakciona smeša je koncentrovana pod vakuumom i prečišćena hromatografijom na koloni silika gela (50 g SiO2, 0% do 15% MeOH u EtOAC), dajući smešu jedinjenja 198 i jedinjenja 199. Smeša je rastvorena u dihlormetanu (2 ml) i tretirana vodom (0,021 ml, 1,2 mmol) i 6% dihlorsirćetnom kiselinom (0,098 ml, 1,2 mmol) u dihlormetanu (2 ml). Nakon 10 min, reakcija je prekinuta piridinom (1 ml) i koncentrovana pod vakuumom. Ostatak je rastvoren u dihlormetanu (50 ml) i dva puta ispran 30% vodenim rastvorom NaCl (oba puta po 15 ml) i osušen iznad MgSO4. Prečišćavanjem sirovog proizvoda hromatografijom na koloni silika gela (50 g SiO2, 5% do 10% MeOH u DCM-u) dobijeno je 0,25 g jedinjenja 198.

Jedinjenje 199:LCMS: MS (ESI) m/z 1104.31 [M+H]<+>

Jedinjenje 198:LCMS: MS (ESI) m/z 802.16 [M+H]<+>

Jedinjenje 190

14

[0269] Jedinjenje 198 (0,233 g, 0,291 mmol) i 3-(bis(diizopropilamino)fosfinooksi)propannitril (0,111 ml, 0,349 mmol) rastvoreni su u MeCN (10 ml) i koncentrovani pod vakuumom. Isti postupak je ponovljen još dva puta. Dobijena smeša je rastvorena u dihlormetanu (2,3 ml), ohlađena na 0–5 °C i tretirana diizopropilamonijum tetrazolidom (0,025 g, 0,145 mmol). Reakciona smeša je zagrevana na temperaturu okoline preko noći i zatim razblažena acetonitrilom (2,3 ml). Dobijeni rastvor je dodat tokom 7 h putem špric pumpe u rastvor soli piridin trifluoracetata (0,168 g, 0,872 mmol) u MeCN (18,6 ml). Zatim je dodat 3-(bis(diizopropilamino)fosfinooksi)propannitril (40 mg, 0,133 mmol) u MeCN (2 ml) tokom 2 sata. Nakon 1 h mešanja, dodat je (E)-N,N-dimetil-N'-(3-tiokso-3H-1,2,4-ditiazol-5-il)formimidamid (0,119 g, 0,581 mmol), i reakcioni rastvor je mešan dok sulfurizacija nije završena (praćeno pomoću LCMS). Po završetku, smeša je koncentrovana pod vakuumom, rastvorena u MTBE (5 ml) i tretirana zas. vodenim rastvorom NaHCO3(3,50 ml) i vodom (1,2 ml). Slojevi su razdvojeni, i vodeni sloj je ekstrahovan smešom MTBE/EtOAc (5/3 ml). Kombinovani organski slojevi su dva puta isprani 30% vodenim rastvorom NaCl (2,3 ml), osušeni iznad MgSO4, filtrirani i koncentrovani pod vakuumom. Prečišćavanjem sirovog proizvoda hromatografijom na koloni silika gela (25 g SiO2, 0% do 20% MeOH u EtOAc) dobijeno je 119 mg jedinjenja 190 (58 mg brže eluirajućih izomera i 61 mg sporije eluirajućih izomera).

Jedinjenje 191 (SpRp izomer)

[0270] U rastvor brže eluirajućih izomera jedinjenja 190 (58 mg, 0,062 mmol) u dihlormetanu (1,8 ml) dodat je terc-butilamin (1,2 ml, 11 mmol). Dobijeni rastvor je mešan na temperaturi okoline sve dok polazna supstanca nije potrošena (praćeno pomoću LCMS). Po završetku, reakciona smeša je koncentrovana pod vakuumom, dva puta azeotropski destilisana sa acetonitrilom, i rastvorena u acetonitrilu (1,7 ml). U dobijeni rastvor je dodat 1-(brommetil)-2-nitrobenzen (40,3 mg, 0,187 mmol). Reakciona smeša je mešana na temperaturi okoline dok je reakcija praćena pomoću LCMS. Nakon potpunog alkilovanja, reakciona smeša je koncentrovana pod vakuumom i prečišćena hromatografijom na koloni silika gela (10 g SiO2, 0% do 5% MeOH u EtOAc), dajući 19 mg jedinjenja 191 (SpRp izomer).

<1>H NMR (400 MHz, HLOROFORM-d) δ = 8.42 (s, 1H), 8.27 (s, 1H), 8.13 (dd, J = 1.2, 8.2 Hz, 1H), 8.05 (s, 1H), 7.98 (d, J= 7.8 Hz, 1H), 7.69 - 7.67 (m, 1H), 7.61 - 7.34 (m, 5H), 6.33 (d, J = 17.2 Hz, 1H), 6.19 (d, J = 19.9 Hz, 1H), 6.09 - 5.93 (m, 1H), 5.82 - 5.66 (m, 2H), 5.67 (dd, J = 3.5, 50.8 Hz, 1H), 5.35 - 5.32 (m, 2H), 4.62 - 4.29 (m, 11H), 3.35 - 3.28 (m, 1H), 3.18 - 3.14 (m, 2H), 3.01 - 2.91 (m, 1H), 2.84 - 2.78 (m, 1H), 2.60 - 2.49 (m, 3H).

Jedinjenje Jedinjenje 192 (RpRp izomer)

[0271] Sporije eluirajući izomer jedinjenja 190 (60 mg) obrađen je koristeći istu reakcionu sekvencu koja je opisana za jedinjenje 191, dajući 14 mg jedinjenja 192 i 7 mg jedinjenja 191.

<1>H NMR (400 MHz, HLOROFORM-d) δ = 8.18 (s, 2H), 8.10 (s, 2H), 8.10 (dd, J = 1.0, 8.0 Hz, 2H), 7.66 - 7.57 (m, 4H), 7.53 - 7.46 (m, 2H), 6.31 (d, J = 17.6 Hz, 2H), 6.19 - 6.05 (m, 2H), 5.84 (dd, J = 4.3, 50.8 Hz, 2H), 5.39 - 5.30 (m, 2H), 4.58 - 4.46 (m, 6H), 4.45 - 4.39 (m, 2H), 4.19 (ddd, J = 3.1, 6.3, 10.2 Hz, 2H), 3.32 (td, J = 3.5, 15.6 Hz, 2H), 3.06 (td, J = 6.3, 15.2 Hz, 2H), 2.67 - 2.57 (m, 4H).

[0272] Na osnovu metodologije sinteze, NMR podataka (simetrični), HPLC retencionog vremena (izomer sa najsporijom elucijom) i biološke aktivnosti jedinjenja 34, koje je dobijeno od jedinjenja 192, podnosioci predmetne prijave veruju da jedinjenje 192 ima RR stereohemiju fosfora. Stereohemijski raspored će biti potvrđen rendgenskom kristalografijom

[0273] U rastvor jedinjenja 192 (26 mg, 0,026 mmol) u 1,4-dioksanu (0,52 ml) dodati su tiofenol (0,26 ml, 2,5 mmol) i zatim TEA (0,26 ml, 1,9 mmol). Dobijena smeša je mešana na temperaturi okoline dok deprotekcija nije završena (praćeno pomoću LCMS). Po završetku, dodata je voda (2 ml). Dobijena smeša je tri puta ekstrahovana toluenom (svaki put po 2 ml). Vodeni sloj je koncentrovan pod vakuumom na 40–50 °C i rastvoren u vodi (2 ml). Dobijena smeša je četiri puta ekstrahovana smešom EtOAc/MTBE (svaki put po 1/1 ml). Vodeni sloj je koncentrovan pod vakuumom, dajući bis-TEA so jedinjenja 33.

<1>H NMR (400 MHz, METANOL-d4) δ = 9.06 (s, 1H), 8.73 (s, 1H), 8.56 (s, 1H), 8.47 (s, 1H), 6.43 (d, J = 14.4 Hz, 1H), 6.38 (d, J = 15.2 Hz, 1H), 6.27 (dd, J = 3.5, 51.1 Hz, 1H), 5.63 (dd, J = 2.7, 51.5 Hz, 1H), 5.30 - 5.14 (m, 2H), 5.06 - 4.91 (m, 2H), 4.58 (br d, J = 12.5 Hz, 1H), 4.52 - 4.39 (m, 3H), 4.07 (dd, J = 4.7, 11.7 Hz, 1H), 3.98 (dd, J = 5.1, 12.5 Hz, 1H), 3.43 - 3.34 (m, 2H), 3.22 (q, J = 7.2 Hz, 12H), 2.98 - 2.86 (m, 2H), 2.79 - 2.45 (m, 4H), 1.32 (t, J = 7.4 Hz, 18H)

Jedinjenje 34

Uzimajući jedinjenje 192 kao polaznu supstancu, jedinjenje 34 je pripremljeno koristeći istu reakcionu sekvencu koja je opisana za jedinjenje 33.

<1>H NMR (400 MHz, METANOL-d4) δ = 8.77 (s, 2H), 8.49 (s, 2H), 6.39 (d, J = 15.2 Hz, 2H), 5.71 (dd, J = 3.1, 51.2 Hz, 2H), 5.24 - 5.13 (m, 2H), 5.02 (dtd, J = 3.1, 9.0, 25.4 Hz, 2H), 4.54 (br d, J = 12.1 Hz, 2H), 4.42 (br d, J = 9.8 Hz, 2H), 3.99 (dd, J = 5.9, 12.1 Hz, 2H), 3.20 (q, J = 7.3 Hz, 12H), 2.90 (ddd, J = 3.5, 10.2, 14.1 Hz, 2H), 2.81 - 2.70 (m, 2H), 2.55 - 2.43 (m, 2H), 1.30 (t, J= 7.4 Hz, 18H).

Primer 22 – Sinteza jedinjenja 35 i jedinjenja 36

[0274]

14

[0275] U dinatrijumovu so jedinjenja 200 (0,10 g, 0,126 mmol) dodati su 2-nitrobenzil bromid (0,068 g, 0,316 mmol) i MeCN (2,0 ml). Dobijena smeša je mešana na temperaturi okoline dok je reakcija praćena pomoću LCMS. Po završetku, reakciona smeša je koncentrovana pod vakuumom i prečišćena hromatografijom na koloni silika gela (10 g SiO2, 0% do 5% MeOH u DCM-u), dajući 115 mg jedinjenja 201.

<1>H NMR (400 MHz, HLOROFORM-d) δ = 8.13 (dd, J = 0.8, 8.2 Hz, 1H), 8.06 (s, 1H), 8.03 (dd, J = 1.0, 8.0 Hz, 1H), 7.80 (br s, 1H), 7.75 (s, 1H), 7.70 - 7.65 (m, 1H), 7.62 - 7.54 (m, 2H), 7.53 - 7.47 (m, 2H), 7.45 - 7.39 (m, 1H), 7.34 - 7.27 (m, 1H), 6.23 (br d, J = 16.8 Hz, 1H), 6.14 (br d, J = 18.8 Hz, 1H), 5.95 (br s, 2H), 5.77 (td, J = 5.1, 15.2 Hz, 2H), 5.71 (td, J = 5.1, 15.6 Hz, 1H), 5.63 - 5.55 (m, 1H), 5.47 (br d, J = 11.7 Hz, 1H), 4.58 - 4.27 (m, 11H), 4.18 - 4.10 (m, 1H), 4.05 - 3.71 (m, 2H)

[0276] U rastvor jedinjenja 201 (77 mg, 0,076 mmol) u 2,2,2-frifluoretanolu (2 ml) dodati su O-(2,4-dinitrofenil)hidroksilamin (36,5 mg, 0,183 mmol) i bis[rodijum(α,α,α',α'-tetrametil-1,3-benzendipropionska kiselina)] (5,74 mg, 0,015 mmol) u jednoj porciji. Smeša je mešana na temperaturi okoline preko noći, razblažena DCM-om (10 ml) i tretirana zas. vodenim rastvorom NaHCO3(10 ml). Slojevi su razdvojeni, i vodeni sloj je dva puta ekstrahovan DCM-om (po 10 ml). Kombinovani organski slojevi su osušeni iznad MgSO4i prečišćeni hromatografijom na koloni silika gela (10 g SiO2, 0% do 15% MeOH u EtOAc), dajući 3,3 mg jedinjenja 202.

LCMS: MS m/z 1032.07 [M+H]<+>

Jedinjenje 35 i jedinjenje 36

[0277]

[0278] U rastvor jedinjenja 202 (3,3 mg, 3,2 µmol) u 1,4-dioksanu (0,40 ml) dodati su tiofenol (0,2 ml, 1,9 mmol) i TEA (0,2 ml, 1,4 mmol). Dobijena smeša je mešana na temperaturi okoline dok je reakcija praćena pomoću LCMS. Po završetku, reakciona smeša je tretirana vodom (2 ml) i tri puta ekstrahovana toluenom (svaki put po 2 ml). Vodeni sloj je koncentrovan pod vakuumom na 40–50 °C i rastvoren u vodi (1,5 ml). Dobijena čvrsta supstanca je uklonjena filtracijom, uz ispiranje vodom (0,5 ml). HPLC razdvajanjem kombinovanih filtrata u uslovima koji su opisani u nastavku dobijeno je jedinjenje 35 (retenciono vreme: 8,4 min) i jedinjenje 36 (retenciono vreme: 8,9 min)

14

Jedinjenje 35

[0279] LCMS: MS m/z 762.08 [M+H]<+>

Jedinjenje 36

[0280] LCMS: MS m/z 762.22 [M+H]<+>

Jedinjenje 35/jedinjenje 36 Uslovi za preparativnu HPLC:

Primer - 23 – Sinteza jedinjenja 38 i jedinjenja 39

[0281] SL.13 prikazuje primer sinteze jedinjenja 38 i jedinjenja 39.

Korak 1

[0282]

14

[0283] U rastvor jedinjenja 203 (5,82 g, 9,314 mmol) i alil alkohola (0,95 ml, 14 mmol) u THF-u (50 ml) na 0 °C dodat je rastvor DIAD (2,4 ml, 11,6 mmol) i trifenilfosfina (2,93 g, 11,2 mmol) u toluenu (25 ml) uz održavanje unutrašnje T ispod 10 °C. Dobijeni rastvor je zagrejan na temperaturu okoline dok je reakcija praćena pomoću LCMS. Po završetku (5 h), smeša je koncentrovana pod vakuumom i prečišćena hromatografijom na koloni silika gela (100 g, 20% do 60% EtOAc u n-heptanu), dajući 4,56 g jedinjenja 204 kao rozikastu supstancu.

[0284] Jedinjenje 204:<1>H NMR (400 MHz, HLOROFORM-d) δ = 8.55 (s, 1H), 8.24 (s, 1H), 7.46 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.31 - 7.23 (m, 1H), 7.20 - 7.10 (m, 2H), 6.02 (d, J = 5.1 Hz, 1H), 6.07 - 5.95 (m, 1H), 5.21 (dd, J = 1.6, 17.2 Hz, 1H), 5.05 (dd, J = 1.4, 10.4 Hz, 1H), 5.00 (d, J= 5.5 Hz, 2H), 4.82 (t, J= 4.9 Hz, 1H), 4.22 - 4.16 (m, 1H), 4.05 - 4.00 (m, 2H), 3.82 (dd, J = 2.5, 11.5 Hz, 1H), 0.95 (s, 9H), 0.81 (s, 9H), 0.14 (s, 3H), 0.13 (s, 3H), 0.00 (s, 3H), -0.23 (s, 3H).

Korak 2

[0285]

[0286] U jedinjenje 204 (4,56 g, 6,858 mmol) dodata je sirćetna kiselina (80 ml) i voda (20 ml). Dobijena smeša je mešana na temperaturi okoline preko noći i na 35 °C tokom 1 dana. Dobijena smeša je koncentrovana pod vakuumom i prečišćena hromatografijom na koloni silika gela

14

(SiO2, 50 g, 33% do 60% EtOAc u n-heptanu), dajući 3,22 g jedinjenja 205 kao belu penastu čvrstu supstancu.

[0287] Jedinjenje 205:<1>H NMR (400 MHz, HLOROFORM-d) δ = 8.56 (s, 1H), 7.88 (s, 1H), 7.51 - 7.47 (m, 2H), 7.32 - 7.27 (m, 1H), 7.20 - 7.16 (m, 2H), 6.06 - 5.95 (m, 1H), 5.72 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 5.26 (dd, J = 5.5, 7.8 Hz, 1H), 5.20 (dd, J = 1.6, 17.2 Hz, 1H), 5.06 (dd, J = 1.6, 10.2 Hz, 1H), 5.03 - 4.98 (m, 2H), 4.23 (d, J = 5.5 Hz, 1H), 4.14 (s, 1H), 3.92 (dd, J = 1.6, 12.9 Hz, 1H), 3.68 (br d, J = 12.9 Hz, 1H), 0.75 (s, 9H), -0.14 (s, 3H), -0.62 (s, 3H).

Korak 3

[0288]

[0289] U rastvor jedinjenja 205 (3,22 g, 5,847 mmol) u THF-u (120 ml) na temperaturi okoline dodati su voda (30 ml) i trifenilfosfin (2,454 g, 9,355 mmol). Dobijena smeša je mešana na temperaturi okoline dok je reakcija praćena pomoću LCMS. Po završetku (18 h), reakciona smeša je koncentrovana pod vakuumom i tri puta azeotropski destilisana sa MeCN. Ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni silika gela (SiO2(NH) 55 g, 20% do 100% EtOAc u nheptanu), dajući 4,82 g jedinjenja 206 (pretpostavljena čistoća 63%). Proizvod je korišćen u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja.

[0290] Jedinjenje 206:<1>H NMR (400 MHz, HLOROFORM-d) δ = 8.56 (s, 1H), 7.92 (s, 1H), 7.54 (qd, J = 1.6, 7.6 Hz, 2H), 7.31 - 7.27 (m, 1H), 7.19 - 7.15 (m, 2H), 6.07 - 5.94 (m, 1H), 5.84 (d, J = 6.6 Hz, 1H), 5.50 (br d, J = 10.6 Hz, 1H), 5.20 (dd, J = 1.6, 17.2 Hz, 1H), 5.05 (dd, J = 1.4, 10.4 Hz, 1H), 5.02 - 4.98 (m, 2H), 4.95 - 4.91 (m, 1H), 4.16 - 4.08 (m, 2H), 3.96 (dd, J = 1.6, 12.9 Hz, 1H), 3.73 (dd, J = 2.0, 5.5 Hz, 1H), 3.73 - 3.67 (m, 1H), 0.78 (s, 9H), - 0.20 (s, 3H), -0.46 (s, 3H).

14

Korak 4

[0291]

[0292] U rastvor jedinjenja 206 (4,82 g, čistoća 63%, 5,72 mmol) u piridinu (39,0 ml) na temperaturi okoline dodati su TEA (1,3 ml, 8,6 mmol) i tritil-Cl (1,753 g, 6,289 mmol). Nakon potpune reakcije (praćeno pomoću LCMS), dodat je zas. rastvor NaHCO3(60 ml). Dobijena smeša je tri puta ekstrahovana smešom MTBE/EtOAc (1/1, svaki put po 70 ml). Kombinovani organski slojevi su isprani 30% vodenim rastvorom NaCl (30 ml) i osušeni iznad MgSO4, filtrirani i koncentrovani pod vakuumom. Ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni silika gela (50 g SiO2prethodno tretiran sa 1% TEA u EtOAc/n-heptanu, 20% do 100% EtOAc u n-heptanu sa 1% TEA), dajući 1,484 g jedinjenja 207 kao bele čvrste supstance.

[0293] Jedinjenje 207:<1>H NMR (400 MHz, HLOROFORM-d) δ = 8.49 (s, 1H), 8.10 (s, 1H), 7.50 - 7.46 (m, 8H), 7.31 - 7.22 (m, 7H), 7.20 - 7.14 (m, 5H), 6.11 (d, J= 6.3 Hz, 1H), 6.07 -5.94 (m, 1H), 5.20 (dd, J = 1.2, 17.2 Hz, 1H), 5.06 (dd, J = 1.4, 10.4 Hz, 1H), 5.03 - 4.98 (m, 2H), 4.84 (dd, J= 3.1, 10.6 Hz, 1H), 4.52 (t, J= 5.7 Hz, 1H), 3.78 (d, J= 1.6 Hz, 1H), 3.64 -3.57 (m, 1H), 3.26 - 3.16 (m, 3H), 0.77 (s, 9H), -0.18 (s, 3H), -0.63 (s, 3H).

Korak 5

[0294]

14

[0295] U rastvor jedinjenja 207 (0,50 g, 0,652 mmol) u MeCN (6 ml) na temperaturi okoline dodati su 3-((bis(diizopropilamino)fosfanil)oksi)propannitril (0,393 g, 1,304 mmol) i piridinijum trifluoracetat (0,113 g, 0,587 mmol). Dobijeni rastvor je mešan na temperaturi okoline i praćen pomoću LCMS. Po završetku (1 h), dobijeni rastvor je tretiran gasovitim vodonik sulfidom (barbotiranje) tokom 1 min, zatim piridinijum trifluoracetatom (0,252 g, 1,304 mmol). Dobijeni rastvor je mešan na temperaturi okoline i praćen pomoću LCMS. Po završetku (1 h), dobijena smeša je razblažena dodatkom MTBE (60 ml). Dobijeni rastvor je dva puta ispran vodom (oba puta po 15 ml) i 30% vodenim rastvorom NaCl (15 ml) i osušen iznad Na2SO4, filtriran i koncentrovan pod vakuumom. Ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni silika gela (25 g SiO2, 25% do 40% EtOAc u n-heptanu), dajući 0,411 g jedinjenja 208 (1:1 P dijastereomerna smeša) kao bele penaste čvrste supstance.

[0296] Jedinjenje 208 (1:1 P dijastereomerna smeša)<1>H NMR (400 MHz, HLOROFORM-d) δ = 8.49 (s, 1H), 8.49 (s, 1H), 8.11 (s, 1H), 8.06 (s, 1H), 7.54 - 7.47 (m, 4H), 7.46 - 7.38 (m, 14H), 7.32 - 7.27 (m, 2H), 7.23 - 7.04 (m, 20H), 6.11 - 5.99 (m, 2H), 5.98 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 5.91 (d, J = 1.6 Hz, 1H), 5.27 (dd, J = 1.6, 6.3 Hz, 1H), 5.23 (dd, J = 1.6, 6.3 Hz, 1H), 5.12 (dd, J = 1.6, 6.3 Hz, 1H), 5.09 (dd, J = 1.2, 6.3 Hz, 1H), 5.02 (br d, J = 5.5 Hz, 4H), 4.57 - 4.45 (m, 2H), 4.43 - 4.34 (m, 1H), 4.32 - 4.04 (m, 8H), 3.23 - 3.19 (m, 1H), 3.10 (br s, 2H), 3.06 - 2.99 (m, 1H), 2.96 - 2.89 (m, 2H), 2.73 (dt, J = 1.4, 6.4 Hz, 2H), 2.65 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 0.85 (s, 9H), 0.83 (s, 9H), 0.01 (s, 3H), -0.09 (s, 6H), -0.11 (s, 3H).

Korak 6

[0297]

[0298] U rastvor jedinjenja 208 (0,411 g, ,457 mmol) i jedinjenja 206 (0,293 g, 0,502 mmol) u acetonitrilu (5 ml) na temperaturi okoline dodati su DIEA (0,16 ml, 0,91 mmol) i CCl4(0,18

1

ml, 1,8 mmol). Reakciona smeša je mešana na temperaturi okoline uz praćenje pomoću LCMS. Po završetku (1 h), dobijena smeša je koncentrovana pod vakuumom i prečišćena hromatografijom na koloni silika gela (25 g SiO2, 33% do 100% EtOAc u n-heptanu), dajući 0,461 g jedinjenja 210 (1:1 P dijastereomerna smeša) kao bele penaste čvrste supstance.

[0299] Jedinjenje 210:<1>H NMR (400 MHz, HLOROFORM-d) δ = 8.52 (s, 1H), 8.51 (s, 1H), 8.49 (s, 1H), 8.49 (s, 1H), 8.24 (s, 1H), 8.19 (s, 1H), 8.13 (s, 1H), 8.01 (s, 1H), 7.55 - 7.37 (m, 20H), 7.33 - 6.99 (m, 30H), 6.09 - 5.97 (m, 4H), 5.96 (d, J = 2.7 Hz, 1H), 5.87 (d, J= 1.2 Hz, 1H), 5.82 (d, J = 4.7 Hz, 1H), 5.80 (d, J = 3.9 Hz, 1H), 5.28 - 5.17 (m, 4H), 5.11 - 5.04 (m, 4H), 5.03 - 4.96 (m, 8H), 4.75 (t, J = 5.1 Hz, 1H), 4.70 (t, J = 4.5 Hz, 1H), 4.46 - 4.33 (m, 3H), 4.31 - 4.18 (m, 5H), 4.12 - 3.96 (m, 8H), 3.89 (br d, J = 11.7 Hz, 1H), 3.78 - 3.67 (m, 3H), 3.57 (dd, J = 2.9, 4.1 Hz, 1H), 3.56 - 3.44 (m, 2H), 3.08 - 3.01 (m, 2H), 2.99 - 2.93 (m, 1H), 2.91 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 2.77 - 2.73 (m, 1H), 2.72 - 2.53 (m, 4H), 0.84 (s, 9H), 0.84 (s, 9H), 0.84 (s, 9H), 0.82 (s, 9H), 0.00 (s, 3H), -0.05 (s, 6H), -0.08 (s, 3H), -0.12 (s, 3H), -0.15 (s, 3H), -0.18 (s, 3H), -0.18 (s, 3H).

Korak 7

[0300]

[0301] U rastvor jedinjenja 210 (0,461 g, 0,324 mmol) u MeCN (5,5 ml) na temperaturi okoline dodati su 3-((bis(diizopropilamino)fosfanil)oksi)propannitril (0,195 g, 0,648 mmol) i piridinijum trifluoracetat (0,050 g, 0,259 mmol). Dobijeni rastvor je mešan na temperaturi okoline i praćen pomoću LCMS. Po završetku (40 min), dobijeni rastvor je produvan gasovitim vodonik sulfidom tokom 1 min i zatim tretiran piridinijum trifluoracetatom (0,138 g, 0,713 mmol). Po završetku (praćeno pomoću LCMS), dobijeni rastvor je razblažen dodatkom MTBE (30 ml), dva puta ispran vodom (oba puta po 10 ml) i 30% vodenim rastvorom NaCl (10 ml), osušen iznad Na2SO4, filtriran i koncentrovan pod vakuumom. Ostatak je prečišćen

1 1

hromatografijom na koloni silika gela (25 g SiO2, 33% do 60% EtOAc u n-heptanu), dajući 0,329 g jedinjenja 211 kao bele penaste čvrste supstance.

[0302] Jedinjenje 211: LC/MS (ESI) m/z 1555.48 [M+H]<+>.

Korak 8

[0303]

[0304] U rastvor jedinjenja 211 (0,329 g, 0,211 mmol) u dihlormetanu (7,2 ml) na temperaturi okoline dodati su voda (0,032 ml, 1,8 mmol) i dihlorsirćetna kiselina (0,29 ml, 3,6 mmol). Dobijena smeša je mešana na temperaturi okoline uz praćenje pomoću LCMS. Po završetku (30 min), reakciona smeša je zas. rastvorom NaHCO3(25 ml). Dobijena smeša je dva puta ekstrahovana DCM-om (oba puta po 30 ml). Kombinovani organski slojevi su isprani 30% vodenim rastvorom NaCl (20 ml), osušeni iznad MgSO4, filtrirani i koncentrovani pod vakuumom. Sirovi proizvod, jedinjenje 212 (teorijski prinos 0,278 g), korišćen je u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja.

[0305] Jedinjenje 212: LC/MS (ESI) m/z 1313.40[M+H]<+>.

Korak 9

[0306]

1 2

[0307] U rastvor jedinjenja 212 (0,278 g, 0,212 mmol) u MeCN (55,6 ml) na temperaturi okoline dodati su trietil amin (1,0 ml, 7,2 mmol) i CCl4(1,0 ml, 10 mmol). Dobijeni rastvor je mešan na temperaturi okoline i praćen pomoću LCMS. Po završetku (30 min), reakciona smeša je koncentrovana do ∼20 ml pod vakuumom i razblažena dodatkom MTBE (30 ml). Dobijena smeša je isprana vodom (10 ml) i dva puta 30% vodenim rastvorom NaCl (po 10 ml), osušena iznad MgSO4, filtrirana i koncentrovana pod vakuumom. Ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni silika gela (25 g SiO2, 20% do 75% EtOAc u n-heptanu), dajući 71 mg jedinjenja 213 (SpRp izomer), 43 mg jedinjenja 214 (RpRp ili SpSp izomer, veći rf na TLC (SiO2)) i 24 mg jedinjenja 215 (RpRp ili SpSp izomer, manji rf na TLC (SiO2)).

[0308] Jedinjenje 213 (SpRp izomer)<1>H NMR (400 MHz, HLOROFORM-d) δ = 8.58 (s, 1H), 8.44 (s, 1H), 8.42 (s, 1H), 8.12 (s, 1H), 7.46 (dd, J= 7.2, 15.4 Hz, 4H), 7.36 - 7.27 (m, 2H), 7.18 (q, J= 7.6 Hz, 4H), 6.09 (s, 1H), 5.98 (s, 1H), 6.06 - 5.95 (m, 2H), 5.25 (d, J = 11.3 Hz, 1H), 5.21 (dd, J = 1.4, 10.4 Hz, 1H), 5.12 - 5.03 (m, 3H), 5.00 - 4.92 (m, 3H), 4.87 (d, J= 4.7 Hz, 1H), 4.60 (br d, J = 11.7 Hz, 1H), 4.55 (d, J = 3.9 Hz, 1H), 4.44 (br d, J = 11.3 Hz, 1H), 4.39 - 4.32 (m, 2H), 4.26 - 4.08 (m, 8H), 3.75 (dd, J = 11.3, 16.0 Hz, 1H), 3.49 (dd, J = 8.2, 10.6 Hz, 1H), 2.82 - 2.72 (m, 3H), 2.61 (td, J= 5.9, 17.2 Hz, 1H), 0.99 (s, 9H), 0.96 (s, 9H), 0.32 (s, 3H), 0.23 (s, 6H), 0.22 (s, 3H).

[0309] Jedinjenje 214 (RpRp ili SpSp izomer, veći rf na TLC (SiO2) izomer):<1>H NMR (400 MHz, HLOROFORM-d) δ = 8.60 (s, 2H), 8.18 (s, 2H), 7.50 (d, J = 7.0 Hz, 4H), 7.37 - 7.31 (m, 2H), 7.25 - 7.21 (m, 4H), 6.05 - 5.93 (m, 4H), 5.22 (dd, J = 1.6, 17.2 Hz, 2H), 5.09 (dd, J = 1.0, 10.4 Hz, 2H), 5.00 - 4.83 (m, 6H), 4.61 (dd, J = 1.2, 11.7 Hz, 2H), 4.25 (dq, J = 4.3, 10.8 Hz, 2H), 4.09 (br dd, J = 3.7, 10.4 Hz, 2H), 4.04 (td, J = 5.5, 10.9 Hz, 2H), 3.99 - 3.88 (m, 4H), 3.70 (dd, J = 11.9, 15.0 Hz, 2H), 2.71 (td, J = 5.5, 17.1 Hz, 2H), 2.49 - 2.37 (m, 2H), 0.98 (s, 18H), 0.25 (s, 6H), 0.24 (s, 6H).

1

[0310] Jedinjenje 215 (RpRp ili SpSp izomer, manji rf na TLC (SiO2) izomer):<1>H NMR (400 MHz, HLOROFORM-d) δ = 8.54 (s, 2H), 8.06 (s, 2H), 7.47 - 7.44 (m, 4H), 7.32 - 7.27 (m, 2H), 7.20 - 7.15 (m, 4H), 6.06 - 5.95 (m, 2H), 5.92 (d, J = 3.5 Hz, 2H), 5.22 (dd, J = 1.2, 17.2 Hz, 2H), 5.07 (dd, J = 1.4, 10.4 Hz, 2H), 5.04 - 4.94 (m, 6H), 4.62 - 4.52 (m, 2H), 4.46 - 4.40 (m, 2H), 4.40 - 4.22 (m, 8H), 3.81 (dd, J = 6.6, 12.1 Hz, 2H), 2.89 - 2.71 (m, 4H), 0.88 (s, 18H), 0.08 (s, 6H), -0.07 (s, 6H).

Korak 10

[0311]

[0312] U rastvor jedinjenja 213 (71 mg, 0,054 mmol) u toluenu (28,4 ml) pri refluksu dodat je rastvor Hovejda-Grabsovog katalizatora 2. generacije (17,0 mg, 0,027 mmol) i P-benzohinona (11,70 mg, 0,108 mmol) u toluenu (8 ml). Smeša je zagrevana do refluksa, i napredovanje reakcije je praćeno pomoću LC/MS. Nakon 3 h, dodato je još katalizatora (8,5 mg, 0,0135 mmol) u toluenu (2,5 ml) i reakcija je nastavljena još 2,5 sata. Nakon hlađenja, smeša je koncentrovana pod vakuumom i prečišćena hromatografijom na koloni silika gela (10 g SiO2, 33% do 66% etil acetata u n-heptanu), dajući 17 mg jedinjenja 216 (trans/cis =5/1) kao smeđe suve pene.

[0313] Jedinjenje 216:<1>H NMR (samo trans izomer, 400 MHz, HLOROFORM-d) δ = 8.37 (s, 1H), 8.34 (s, 1H), 8.24 (s, 1H), 8.20 (s, 1H), 7.41 (d, J = 7.1 Hz, 2H), 7.36 - 7.27 (m, 3H), 7.24 - 7.13 (m, 5H), 5.97 (d, J = 5.9 Hz, 2H), 5.75 (td, J = 5.5, 15.2 Hz, 1H), 5.69 (td, J = 5.5, 15.6 Hz, 1H), 5.07 (d, J = 3.9 Hz, 1H), 5.03 (dd, J = 5.1, 15.2 Hz, 1H), 4.94 (t, J = 5.5 Hz, 2H), 4.85 (dd, J = 5.1, 15.2 Hz, 1H), 4.74 (d, J = 3.9 Hz, 1H), 4.67 (br d, J = 12.1 Hz, 1H), 4.45 (br d, J = 10.2 Hz, 1H), 4.42 - 4.34 (m, 2H), 4.28 - 4.19 (m, 2H), 4.19 - 4.06 (m, 4H), 3.96 - 3.84 (m, 1H), 3.82 - 3.68 (m, 1H), 3.56 (br dd, J = 12.1, 14.5 Hz, 1H), 3.33 (dd, J = 9.0, 10.9 Hz,

1 4

1H), 2.83 - 2.78 (m, 2H), 2.72 (td, J = 5.6, 16.6 Hz, 1H), 2.39 (td, J = 6.3, 17.2 Hz, 1H), 1.00 (s, 18H), 0.42 (s, 3H), 0.40 (s, 3H), 0.34 (s, 3H), 0.30 (s, 3H).

Jedinjenje 217

[0314] Jedinjenje 214 dobijeno u koraku 9 je zasebno obrađeno u koraku 10, dajući jedinjenje 217 (smeša trans/cis izomera 5/1).

<1>H NMR (samo trans izomer, 400 MHz, HLOROFORM-d) δ = 8.47 (s, 2H), 8.14 (s, 2H), 7.43 - 7.38 (m, 4H), 7.36 - 7.29 (m, 2H), 7.22 (t, J = 7.0 Hz, 4H), 5.83 (s, 2H), 5.77 (t, J = 3.3 Hz, 2H), 5.17 (d, J = 3.5 Hz, 2H), 5.11 - 5.04 (m, 2H), 4.70 (br dd, J = 3.5, 16.4 Hz, 2H), 4.62 (br d, J = 12.1 Hz, 2H), 4.16 - 4.08 (m, 6H), 3.93 (br dd, J = 3.7, 11.9 Hz, 2H), 3.74 - 3.64 (m, 2H), 3.49 (t, J = 12.9 Hz, 2H), 2.42 (td, J = 5.9, 18.4 Hz, 2H), 2.13 (ddd, J = 5.5, 7.8, 16.8 Hz, 2H), 1.00 (s, 18H), 0.40 (s, 6H), 0.34 (s, 6H).

Jedinjenje 218

[0315] Jedinjenje 215 dobijeno u koraku 9 je zasebno obrađeno u koraku 10, dajući jedinjenje 218.

<1>H NMR (400 MHz, HLOROFORM-d) δ = 8.14 (s, 2H), 8.12 (s, 2H), 7.49 - 7.43 (m, 2H), 7.36 - 7.27 (m, 4H), 7.19 - 7.12 (m, 4H), 5.96 (s, 2H), 5.67 - 5.54 (m, 2H), 4.95 - 4.82 (m, 4H), 4.69 (d, J = 4.3 Hz, 2H), 4.60 - 4.09 (m, 12H), 3.63 (dd, J = 8.8, 16.2 Hz, 2H), 2.93 (td, J = 5.9, 17.2 Hz, 2H), 2.82 - 2.72 (m, 2H), 0.99 (s, 18H), 0.30 (s, 6H), 0.27 (s, 6H).

Korak 11

[0316]

1

[0317] U jedinjenje 216 (trans/cis = 5/1, 17 mg, 0,013 mmol) dodat je rastvor metilaminskog rastvora (2 ml) (33% u EtOH) na temperaturi okoline. Dobijeni rastvor je mešan na temperaturi okoline i praćen pomoću LCMS. Po završetku (1 h), reakciona smeša je koncentrovana pod vakuumom. U ostatak je dodat piridin (0,9 ml), TEA (0,45 ml) i trietilamin trihidrofluorid (0,36 ml, 2,2 mmol). Dobijena smeša je mešana na 50–60 °C tokom 4 h i ohlađena na temperaturu okoline. Nakon potpune deprotekcije TBS (praćene pomoću LCMS), reakciona smeša je tretirana metoksitrimetilsilanom (1,5 ml, 12 mmol) i mešana tokom 1 h. Dodata je voda (3 ml) i dobijena smeša je dva puta ekstrahovana toluenom (oba puta po 3 ml) i dva puta sa EtOAc (oba puta po 2 ml). Vodeni sloj je filtriran špric filterom i filtrat je podvrgnut preparativnoj HPLC, dajući 5,3 mg jedinjenja 38 i 1,1 mg jedinjenja 220.

[0318] Jedinjenje 38 (SpRp, trans):<1>H NMR (400 MHz, METANOL-d4) δ = 9.27 (br s, 1H), 8.47 (br s, 1H), 8.21 (br s, 1H), 8.09 (br s, 1H), 6.19 - 5.96 (m, 2H), 5.94 - 5.71 (m, 2H), 5.13 - 4.68 (m, 2H), 4.55 - 4.39 (m, 2H), 4.38 - 4.23 (m, 1H), 4.20 - 3.91 (m, 5H), 3.75 - 3.50 (m, 4H).

[0319] Jedinjenje 220 (SpRp, cis):<1>H NMR (400 MHz, METANOL-d4) δ = 9.08 (s, 1H), 8.72 (br s, 1H), 8.55 (s, 1H), 8.24 (s, 1H), 8.18 (s, 1H), 6.22 - 6.14 (m, 2H), 6.10 (d, J = 1.6 Hz, 2H), 5.01 (d, J= 3.9 Hz, 1H), 4.41 (br d, J= 9.8 Hz, 1H), 4.34 - 4.25 (m, 3H), 4.24 - 4.18 (m, 1H), 4.15 (dd, J= 6.1, 11.5 Hz, 1H), 4.08 - 3.99 (m, 4H), 3.71 - 3.57 (m, 3H).

Jedinjenje 39 i jedinjenje 222

[0320] Jedinjenje 217 je zasebno obrađeno u koraku 11, dajući jedinjenje 39 i jedinjenje 222.

[0321] Jedinjenje 39 (trans izomer):<1>H NMR (400 MHz, METANOL-d4) δ = 8.83 (br s, 1H), 8.43 (br s, 1H), 8.17 (br s, 1H), 8.11 (br s, 1H), 6.17 - 5.95 (m, 2H), 5.93 - 5.63 (m, 2H), 5.10 - 4.78 (m, 2H), 4.69 - 4.53 (m, 1H), 4.52 - 4.35 (m, 2H), 4.12 - 3.92 (m, 5H), 3.76 - 3.44 (m, 4H).

[0322] Jedinjenje 222 (cis izomer):<1>H NMR (400 MHz, METANOL-d4) δ = 8.71 (br s, 2H), 8.18 (s, 2H), 6.17 - 6.06 (m, 4H), 4.37 (br d, J = 9.8 Hz, 2H), 4.33 (d, J = 3.9 Hz, 2H), 4.27 (br dd, J = 7.0, 13.7 Hz, 2H), 4.06 (dd, J = 7.0, 11.3 Hz, 2H), 4.19 - 4.03 (m, 2H), 4.01 (br d, J = 9.8 Hz, 2H), 3.74 (ddd, J= 3.9, 6.4, 10.5 Hz, 2H).

1

Jedinjenje 40

[0323] Jedinjenje 218 je zasebno obrađeno u koraku 11, dajući jedinjenje 40:<1>H NMR (400 MHz, METANOL-d4) δ = 9.34 - 8.88 (m, 2H), 8.73 (br s, 1H), 8.34 - 8.02 (m, 2H), 6.20 - 5.96 (m, 2H), 5.89 (br s, 2H), 5.25 - 4.95 (m, 2H), 4.76 - 4.64 (m, 1H), 4.47 - 4.22 (m, 2H), 4.20 -4.07 (m, 2H), 4.07 - 3.93 (m, 2H), 3.82 - 3.55 (m, 3H), 3.54 - 3.38 (m, 2H)

Primer 24 – Sinteza jedinjenja 30

[0324]

[0325] Jedinjenje 2 (1,1 mg, 1,4 µmol) dodato je u rastvor jodmetil izopropil karbonata (13,75 mg, 0,056 mmol) u acetonu/vodi (0,4/0,10 ml) na temperaturi okoline. Dobijena smeša je mešana na temperaturi okoline u mraku dok je reakcija praćena pomoću LCMS. Po završetku (2 h), reakciona smeša je razblažena vodom (0,4 ml) i tri puta ekstrahovana n-heptanom (po 0,5 ml). Prečišćavanje sirovog proizvoda u vodenom sloju je dalo 0,5 mg jedinjenja 30.

<1>H NMR (400 MHz, HLOROFORM-d) δ = 7.92 (s, 2H), 7.72 (br s, 2H), 6.22 (d, J = 17.2 Hz, 2H), 6.19 - 6.03 (m, 2H), 5.98 (br t, J = 6.3 Hz, 2H), 5.82 - 5.77 (m, 2H), 5.68 (dd, J = 2.3, 51.6 Hz, 1H), 5.54 (dd, J = 10.9, 13.7 Hz, 2H), 5.48 (dd, J = 10.9, 12.9 Hz, 2H), 4.94 (quin, J = 6.2 Hz, 2H), 4.71 - 4.63 (m, 2H), 4.63 - 4.56 (m, 2H), 4.50 - 4.43 (m, 2H), 4.22 - 4.12 (m, 2H), 4.05 - 3.90 (m, 2H), 1.33 (d, J = 4.3 Hz, 6H), 1.32 (d, J = 4.3 Hz, 6H).

Primer 103 – Reporterski test agonističke aktivnosti HAQ STING

[0326] THP1-Dual™ ćelije (InvivoGen, kat. br. thpd-nfis) primenjene su za određivanje EC50. Dobavljač Invitrogen (Insight 201402-1) projektovao je THP1 Dual™ ćelije da imaju HAQ

1

STING genotip. Ćelije su uzgajane i održavane u uslovima koje preporučuje proizvođač. Indukcija puta regulatornog faktora interferona (IRF) opisana u proizvođačevom uputstvu praćena je radi određivanja EC50. Ukratko, ćelije su zasejane i tretirane različitim koncentracijama jedinjenja tokom 20 h uz inkubaciju na 37 °C, 5% CO2. Ćelije su ponovo suspendovane i dodat je QUANTI-Luc™ rastvor (kat. br: rep-qlc1). Dobijena emisija svetlosti je merena pomoću luminometra (Envision, Perkin Elmer). Dobijeni signali su grafički prikazani, i EC50je izračunat pomoću softvera GraphPad Prism7.

[0327] Vrednosti EC50su prikazane u tabelama 4–8 u nastavku. Vrednosti EC50mogu biti iz jednog testa, ili prosek iz više testova. Pre svake tabele, data je struktura koja se koristi za pregled te tabele.

TABELA 4

1

j j

1

[0328] „N/E“ znači „nije procenjeno“.

[0329] Humani STING EC50 (µM) izmeren je koristeći oblik amonijumove soli svakog jedinjenja u tabeli 4.

TABELA 5

1 1

12

[0330] Humani STING EC50 (µM) izmeren je koristeći oblik amonijumove soli svakog jedinjenja navedenog u tabeli 5.

1

TABELA 6

14

1

[0331] Humani STING EC50 (µM) izmeren je koristeći oblik amonijumove soli svakog jedinjenja navedenog u tabeli 6 sa izuzetkom jedinjenja 26, jedinjenja 31, jedinjenja 33 i jedinjenja 34, koja su sva testirana kao bis-TEA soli.

1

TABELA 7

* Označava aktivnost koja ne može da se izmeri u rasponu eksperimentalnih koncentracija. Humani STING EC50 (µM) izmeren je koristeći oblik amonijumove soli svakog jedinjenja u tabeli 7.

1

Tabela 8

[0332] Humani STING EC50 (µM) izmeren je koristeći oblik amonijumove soli svakog jedinjenja u tabeli 8.

Primer 104 – Reporterski test specifičan za varijantu STING

[0333] Humani STING ima 4 glavne varijante, uključujući varijante WT, HAQ, REF i AQ. REF-STING, koji se naziva i R232H, na primer, javlja se kod oko 14% ljudske populacije. U poređenju sa alelom divljeg tipa, R232H ima smanjeni odgovor na bakterijske i životinjske ciklične dinukleotide. Detaljni podaci za ove 4 glavne varijante, kao i druge retke varijante, objavljeni su u publikaciji Yi G, et al., „Single nucleotide polymorphisms of human STING can affect innate immune response to cyclic dinucleotides“ PLoS One 2013; 8:e77846. Linije

1

reporterskih ćelija specifične za varijantu STING dobijene su koristeći THP1-Dual™ KO-STING ćelije (InvivoGen, kat. br. thpd-kostg) i ekspresione vektore tri varijante STING proteina. Mapa ekspresionog vektora za WT STING je prikazana na SL. 6. Za druga dva ekspresiona vektora, u tom vektoru su korišćene sekvence različitih STING varijanti, pri čemu je WT STING zamenjen odgovarajućom nukleotidnom sekvencom.

[0334] Vektori koji eksprimiraju STING varijantu za WT-STING, REF-STING, i AQ-STING su pripremljeni i stabilno transficirani u THP1-Dual™ KO-STING ćelije radi pripremanja reporterskih testova specifičnih za STING varijantu za WT-STING, REF-STING, odnosno AQ-STING. Vrednosti EC50su određene kako je prethodno opisano u primeru 103 za reporterski test agonističke aktivnosti HAQ STING. Rezultati su prikazani u nastavku u tabeli 9. DNK sekvence koje su korišćene za ove varijante STING prikazane su u SEQ ID NO: 1 (nukleotidna sekvenca WT humanog STING), SEQ ID NO: 2 (nukleotidna sekvenca REF humanog STING) i SEQ ID NO: 3 (nukleotidna sekvenca AQ humanog Sting).

[0335] WT humani STING:

1

[0336] REF humani STING:

Primer 105 -–Reporterski test agonističke aktivnosti mišjeg STING

[0338] RAW-Lucia™ ISG ćelije (InvivoGen, kat. br. rawl-isg) korišćene su u reporterskom testu agonista mišjeg STING. Vrednosti EC50su određene kako je prethodno opisano u primeru 103 za reporterski test agonističke aktivnosti HAQ STING. Rezultati su prikazani u nastavku u tabeli 9.

1

Primer 106 – Test diferencijalne skenirajuće fluorimetrije (DSF)

[0339] DSF test je korišćen za merenje fizičke interakcije između jedinjenja i rekombinantnog STING proteina. Skraćeni rekombinantni STING protein (a.a. 155-341) (SEQ ID NO: 4) eksprimiran je u E. coli i izolovan za test, kako je u nastavku opisano. Matrica za test je pripremljena u pločama sa 384 bunarčića do finalne zapremine od 10 µl po bunarčiću koja sadrži 1 µM rekombinantni STING protein (a.a.155-341) (SEQ ID NO: 4), 100 mM PBS pH 7,4, sa dodatkom 100 mM KC1, 5X SYPRO narandžastom bojom i 50 µM jedinjenja (finalna DMSO konc.0–1%). Testovi su obavljeni na QuantStudio 12K Flex Real-Time PCR sistemu koristeći temperaturni gradijent od 25 °C do 95 °C sa brzinom od 0,05 °C/min, i ekscitacione i emisione filtere na 470, odnosno 586 nm. U skladu sa fluorescentno dobijenim krivama koje su dobijene pomoću softvera Applied Biosystems® Protein Thermal Shift (verzija algoritma 1.3.), izračunati su termalno topljenje (Tm) nevezanog i ligandom vezanog rekombinantnog STING proteina i razlika u termalnom topljenju (dTm D).

[0340] Uopšteno, smatra se da jedinjenja sa vrednostima ΔTm većim od 0 imaju fizičku interakciju sa testiranim proteinom, i vrednost ΔTm je pozitivno povezana sa afinitetom vezivanja jedinjenja. Jedinjenje 1a je ovde imalo ΔTm od 17,6 (tabela 9), što ukazuje na fizičku interakciju sa STING proteinom.

Tabela 9 In vitro karakterizacija jedinjenja 1a

Primer 107 – Ex vivo test stimulacije humanih PBMC

[0341] Ljudska krv 5 zdravih donora je sakupljena koristeći BD Vacutainer epruvete sa heparin natrijumom od 10,0 ml (kat. br. 367874). Izolovanje mononuklearnih ćelija periferne krvi (PBMC) obavljeno je koristeći SIGMA ACCUSPIN epruvete od 50 ml (kat. br. A2055) i sigma ACCUSPIN System-HISTOPAQUE-1077 (kat. br. A7054) prema protokolu proizvođača. Sloj PBMC je sakupljen i ispran 1x fiziološkim rastvorom puferovanim fosfatom (PBS), kao što

1 1

predlaže kompanija Sigma. PBMC su prebrojane i konačno suspendovane sa 1x10e6/ml u RPMI (corning kat. br.10-041-CV) sa dodatkom 10% fetalnog goveđeg seruma (FBS) (Gibco kat. br. 20140.79). 1 ml ćelije (1x10e6) preneto je u Falcon polipropilensku test epruvetu sa okruglim dnom od 5 ml (kat. br.352063) i stimulisano različitim koncentracijama (0, 0,1, 1, 10 uM) tokom 24 sata u inkubatoru sa 5% CO2 na 37 °C.

[0342] Nakon 24 sata inkubacije, epruvete su centrifugirane na 1400 o/min tokom 5 minuta, i supernatanti su sakupljeni. Supernatanti su skladišteni na -80 °C radi kasnijeg merenja IFNβ. Merenje IFNβ je obavljeno koristeći humani IFN-β bazni komplet (Meso Scale Diagnostics kat. br. K151ADA) i prema protokolu proizvođača. Procena IFN-beta je obavljena očitavanjem test ploče na MESO SECTOR Imager 2400 i koristeći program MSD Discovery Workbench 4.0. Nakon 24 sata, IFNβ protein je analiziran. Rezultati su pokazali da jedinjenje 1a može da indukuje proizvodnju IFNβ proteina primarnih humanih PBMC na način zavisan od doze.

[0343] Rezultati prikazani u tabeli 10 predstavljaju prosek merenja koja su obavljena koristeći pet različitih donora.

Tabela 10 Ex vivo test stimulacije humanih PBMC

[0344] Radi kvantifikacije iRNK IFNβ, ukupna RNK je izolovana koristeći RNeasy Mini komplet (Qiagen, Nemačka) prema protokolu proizvođača. iRNK IFNβ je kvantifikovana pomoću qPCR testa. Ukratko, ukupna RNK (400 ng do 1000 ng) konvertovana je u kDNK u reakcionoj zapremini od 60 µl koristeći SuperScript VILO MasterMix (Life Technologies, SAD). Dobijene kDNK (10 ng) zatim su amplifikovane koristeći Applied Biosystems TaqMan ekspresione testove koristeći prajmere za IFNB1 specifične za RNK (Hs01077958_s1), i GAPDH (Hs99999905_m1). qPRC analiza je obavljena sa TaqMan Fast Advanced Master Mix (Life Technologies, SAD) na Applied Biosystems Quantstudio 12K Flex PCR sistemu u realnom vremenu, sa inicijalnim 2-minutnim korakom na 50 °C, nakon čega sledi 95 °C tokom 2 s i 40 ciklusa na 95 °C tokom 1 s i 60 °C tokom 20 s. Relativna ekspresija gena je izračunata

1 2

nakon normalizacije u odnosu na referentni gen GAPDH koristeći postupak 2-ΔΔCT. Proračuni su obavljeni koristeći softver Applied Biosystems Quantstudio 12K Flex v1.2.2. Promene iRNK IFNβ u odnosu na uzorke tretirane vehikulumom su rezimirane u tabeli 11. Rezultati su pokazali da jedinjenje 1a može da indukuje iRNK IFNβ u primarnim PBMC na način zavisan od doze i vremena. Tabela 11 prikazuje prosek izračunat od pet različitih donora.

Tabela 11 – Ex vivo test 3-h i 24-h stimulacije humanih PBMC (iRNK)

i

t

3

2

Primer 108 – Antitumorsko dejstvo jedinjenja 1a na dvojnom modelu tumora CT26

[0345] Jedinjenje 1a je testirano na antitumorsku aktivnost na dvojnom modelu tumora CT26, koji je model raka debelog creva miša. Ženkama 5–6 nedelja starih Balb/cJ miševa (Jackson Labs, Bar Harbor, Maine) supkutano su implantirane CT26 tumorske ćelije na oba boka svake životinje, 10<5>ćelija po boku. Za studiju A, lečenje je započeto 5 dana (1,25 mg/kg, 2,5 mg/kg i 5 mg/kg) nakon implantacije tumora, kada su prosečni tumori dostigli približno 100 mm<3>. Za studiju B, lečenje je započeto 8 dana (0,6 mg/kg i 10 mg/kg) nakon implantacije tumora, kada su prosečni tumori dostigli približno 120 mm<3>. Šema lečenja je opisana u tabeli 12 i tabeli 13.

Tabela 12 Šema doziranja za studiju A

1

[0346] Svi miševi u studiji imaju dva supkutana tumora CT26. „Lečeni tumor“ označava tumor sa direktnom primenom jedinjenja, dok „nelečeni tumor“ označava tumor bez direktne primene jedinjenja. Zapremina tumora je praćena tokom celog eksperimenta. Zapremina tumora je merena dva puta nedeljno nakon početka lečenja. Opterećenje tumorom je izračunato na osnovu merenja pomičnim merilom koristeći formulu za zapreminu izduženog elipsoida (LxW<2>)/2 gde su L i W odgovarajuće mere ortogonalne dužine i širine (mm).

[0347] Jedinjenje 1a je pokazalo potentnu i lekovitu aktivnost na dvojnom modelu tumora CT26 (SL. 7 i SL. 8). Kod lečenih tumora, detektovana je stopa izlečenja od 20% čak i pri najnižoj testiranoj dozi u studiji (slika 8, doza od 0,6 mg/kg). U isto vreme, najveća doza (10 mg/kg) izlečila je 100% životinja od tog tumora na kraju studije. Kod nelečenih tumora, takođe je očevidno antitumorsko dejstvo zavisno od doze. Grupa sa najvećom dozom (10 mg/kg) imala je 80% lekovitog dejstva. Sve manje doze takođe pokazuju inhibitorsku aktivnost na rast tumora. Tako, uočen je terapeutski raspon od 0,6 mg/kg do 10 mg/kg za jedinjenje 1a, pri čemu antitumorska aktivnost nije uočena samo lokalno već i sistemski, na osnovu dejstva na distalnom tumorskom mestu bez injekcije. Dakle, ovi rezultati pokazuju da lokalna primena jedinjenja 1a može da indukuje i lokalnu i sistemsku (apskopsku) antitumorsku aktivnost.

Primer 109 – Antitumorsko dejstvo jedinjenja 1a na metastatskom modelu CT26 jetre

[0348] Jedinjenje 1a je testirano na svoju antitumorsku aktivnost na metastatskom modelu CT26 jetre. Anesteziranim ženkama 5–6 nedelja starih BALB/cJ miševa (Jackson Labs, Bar

1 4

Harbor, Maine) u slezinu su implantirane ćelije tumora CT26 koje eksprimiraju luciferazu (5 x 10<5>ćelija po mišu). Desetominutni period čekanja koji je usledio omogućio je da tumorske ćelije cirkulacijom dođu do jetre životinja. Slezina je odstranjena, i životinje su zašivene i ostavljene da se oporave. Tri dana kasnije, ćelije tumora CT26 (10<5>ćelija po mišu) ponovo su implantirane, ovaj put supkutano (s.c.) u oblast desnog prednjeg ekstremiteta, kako bi se omogućio razvoj tumorske mase za primenu jedinjenja. Devet dana nakon injekcije u slezinu, jedinjenje (10 mg/kg) primenjeno je intratumorski, jedanput, u s.c. tumor.

[0349] Lokalno antitumorsko dejstvo jedinjenja je mereno kroz njegovo dejstvo na s.c. tumor, dok je apskopsko dejstvo jedinjenja procenjeno na osnovu ukupnog preživljavanja lečenih miševa u poređenju sa kontrolnim miševima tretiranim vehikulumom, na osnovu štetnog dejstva rasta tumorske mase u jetri svakog miša. Jedinjenje 1a je pokazalo potentnu aktivnost na lokalne s.c. tumore i lekovitu sistemsku aktivnost kod 9 od 10 lečenih životinja (SL.9). Ovi rezultati pokazuju da lokalna primena jedinjenja 1a može da indukuje i lokalnu i sistemsku (apskopsku) antitumorsku aktivnost, uključujući duboku leziju kao što je u jetri.

Primer 110 – Antitumorsko dejstvo jedinjenja 1a na ortotopskom modelu GL261 mozga

[0350] Jedinjenje 1a je testirano na antitumorsku aktivnost na ortotopskom modelu GL261 mozga. GL261 je ćelijska linija glioma miša. GL261 ćelije glioma miša koje eksprimiraju luciferazu (2x10<4>ćelija/mišu) intrakranijalno su implantirane u 5–6 nedelja stare ženke B6 albino miševa (Jackson Labs, Bar Harbor, Maine). Tri do 4 dana kasnije, GL261 ćelije su supkutano implantirane (10<6>ćelija/mišu) u oblast prednjeg desnog ekstremiteta, kako bi se omogućio razvoj tumorske mase za primenu jedinjenja. Deset dana nakon intrakranijalne implantacije tumorskih ćelija, jedinjenje je primenjeno intratumorski (10 mg/kg), jedanput, u s.c. tumor. Lokalno antitumorsko dejstvo jedinjenja je mereno kroz njegovo dejstvo na s.c. tumor, dok je apskopsko dejstvo jedinjenja procenjeno na osnovu ukupnog preživljavanja lečenih miševa u poređenju sa kontrolnim miševima tretiranim vehikulumom, na osnovu štetnog dejstva rasta tumorske mase u mozgu svakog miša. Jedinjenje 1a je pokazalo potentnu aktivnost na lokalne s.c. tumore, i pokazalo je lekovitu sistemsku aktivnost kod 5 od 8 lečenih životinja (SL.10). Ovi rezultati pokazuju da lokalna primena jedinjenja 1a može da indukuje i lokalnu i sistemsku (apskopsku) antitumorsku aktivnost, uključujući duboku leziju kao što je u mozgu.

1

Primer 111 – Rendgenska struktura koja potvrđuje kompleks sa WT STING

[0351] Kako bi se bolje razumeo mehanizam ciljnog vezivanja naših novih jedinjenja, određena je rendgenska kristalna struktura WT STING u kompleksu sa jedinjenjima.

A. Ekspresija i prečišćavanje C-terminalnog domena WT STING (ostatak 155-341)

[0352] DNK sekvenca koja kodira humani WT STING protein iz aminokiselina 155 do 341 (SEQ ID NO: 4) klonirana je u pET21b vektor, nakon His-TEV-Sumo oznake na N-terminusu (SEQ ID NO: 5). Sekvenca pET21b je deponovana u addgene i dostupna je na: addgene.org/vector-database/2550/; ta sekvenca je ovde obuhvaćena referencom.

[0353] BL21 (DE3) ćelije E. coli sa plus kodonom transformisane su ovim plazmidom, i ekspresija rekombinantnog proteina je indukovana sa 0,1 mM izopropil β-D-1-tiogalaktopiranozidom (IPTG). Protein je prečišćen iz rastvorljive frakcije ćelijskog lizata pomoću afinitetne hromatografije na Ni-NTA. His-TEV-Sumo oznaka je uklonjena putem sumo proteaze, i razdvojena je od WT STING 155-341 bez oznake, koristeći drugu afinitetnu kolonu sa Ni-NTA. Protein je dalje prečišćen anjonsko izmenjivačkom hromatografijom i hromatografijom na molekulskim sitima, i čuvan je u puferu sa 20 mM Tris HCl pH 7,5 i 150 mM NaCl u koncentraciji od 35 mg/ml.

B. Kristalizacija i određivanje strukture C-terminalnog domena WT STING u kompleksu sa jedinjenjem 1

[0354] Radi kokristalizacije WT STING 155-341 sa jedinjenjem 1, WT STING protein je razblažen do 10 mg/ml koristeći pufer za skladištenje (20 mM Tris HCl pH 7,5 i 150 mM NaCl) i pomešan je sa jedinjenjem 1 (100 mM osnovni rastvor u DMSO) u molskom odnosu 1:5. Smeša je inkubirana tokom 4 sata na 4 °C i centrifugirana na 13.000 o/min tokom 20 minuta pre kristalizacije. Posude za skrining kristalizacije pripremljene su koristeći postupak difuzije pare sa visećom kapljicom na 18 °C. Kristali su formirani mešanjem 1 µl rastvora WT STING/jedinjenja 1 sa jednakom zapreminom rastvora iz bunarčića, koji sadrži 100 mM HEPES pH 7,5, 200 mM CaCl2 i 15% (m/V) PEG 8000.20% (m/V) PEG 400 korišćen je kao reagens za krioprotekciju kada su kristali naglo zamrznuti u tečnom azotu. Skupovi podataka

1

o difrakciji sakupljeni su Pilatus detektorom sa SSRF BL19U1 zrakom, i obrađeni sa HKL3000 i programom SCALEPACK2MTZ u softverskom paketu CCP4.

[0355] Struktura WT STING 155-341 vezanog za jedinjenje 1 određena je molekulskom zamenom koristeći program PHASER (molekulska zamena sa maksimalnom verovatnoćom), sa PDB ID 4F9E kao inicijalnim modelom pretrage. Prisustvo jedinjenja 1 između dimerne međupovršine WT STING potvrđeno je u Fo-Fc mapi razlika koja je izračunata sa fazama modela. Model je napravljen i ručno završen pomoću programa Coot i usavršen sa programom Refmac5 iz softverskog paketa CCP4. Konačna usavršena struktura je objavljena kao rezolucija od 2,38 Å u prostornoj grupi P212121 gde je jedinična ćelija izmerena na a = 33,820, b=78,110, c=132,212, α=90,00, β=90,00, y= 90,00. Dve kopije WT STING 155-341 identifikovane su u svakoj asimetričnoj jedinici koja se vezuje za jedan molekul jedinjenja 1 na dimernoj međupovršini.

C. Interakcije jedinjenja 1 sa WT STING uočene na rendgenskoj kristalnoj strukturi

[0356] SL. 11 prikazuje sliku rendgenske kristalne strukture humanog WT STING u kompleksu sa jedinjenjem 1. Ispitali smo rendgensku kristalnu strukturu humanog WT STING u kompleksu sa jedinjenjem 1, koje je kokristalisano iz uzorka jedinjenja 1a. Jedinjenje se vezuje na džep međupovršine koji gradi dimer WT STING proteina. Dve strane adeninske baze jedinjenja grade π-π steking interakciju sa Tyr240, odnosno guanidinskom grupom Arg238. Trans olefinski linker formira Van der Valsovu interakciju sa alifatičnim delom bočnog lanca Arg 238. Fluorni supstituent na poziciji C2' ribozne grupe jedinjenja uklapa se u hidrofobnu rupu koju definišu Thr263, Pro264 i Tyr163. Negativno naelektrisana tiofosfatna grupa jedinjenja gradi soni most sa Arg238 i interakcije H-veze sa Ser162, odnosno Thr267. Pored toga, tiofosfatna grupa takođe formira elektrostatičku interakciju sa guanidinskom grupom Arg 232. Region LID petlje WT STING, koji se sastoji od ostataka 226 do 243, obmotava se oko dve bazne grupe i trans olefinskog linkera.

[0357] Primer 112 – Određivanje rendgenske kristalne strukture REF STING u kompleksu sa jedinjenjem 1.

A. Ekspresija i prečišćavanje C-terminalnog domena REF STING (ostatak 155-341, SEQ ID NO: 6)

1

[0358] DNK sekvenca koja kodira humani REF STING protein iz aminokiselina 155 do 341 (SEQ ID NO: 6) klonirana je u pET21b vektor, nakon His-TEV-Sumo oznake na N-terminusu (SEQ ID NO: 7). Sekvenca pET21b je deponovana u addgene i dostupna je na: addgene.org/vector-database/2550/; ta sekvenca je ovde obuhvaćena referencom.

[0359] BL21 (DE3) ćelije E. coli sa plus kodonom transformisane su ovim plazmidom, i ekspresija rekombinantnog proteina je indukovana sa 0,1 mM izopropil β-D-1-tiogalaktopiranozidom (IPTG). Protein je prečišćen iz rastvorljive frakcije ćelijskog lizata pomoću afinitetne hromatografije na Ni-NTA. His-TEV-Sumo oznaka je uklonjena putem sumo proteaze, i razdvojena je od REF STING_155-341 bez oznake, koristeći drugu afinitetnu kolonu sa Ni-NTA. Protein je dalje prečišćen anjonsko izmenjivačkom hromatografijom i hromatografijom na molekulskim sitima, i čuvan je u puferu sa 20 mM Tris HCl pH 7,5 i 150 mM NaCl u koncentraciji od 24 mg/ml.

B. Kristalizacija i određivanje strukture C-terminalnog domena REF STING u kompleksu sa jedinjenjem 1

[0360] Radi kokristalizacije REF STING_155-341 sa jedinjenjem 1, REF STING protein je razblažen do 10 mg/ml koristeći pufer za skladištenje (20 mM Tris HCl pH 7,5 i 150 mM NaCl) i pomešan je sa jedinjenjem 1 (100 mM osnovni rastvor u DMSO) u molskom odnosu 1:5. Smeša je inkubirana tokom 4 sata na 4 °C i centrifugirana na 13.000 o/min tokom 20 minuta pre kristalizacije. Posude za skrining kristalisanja su pripremljene koristeći postupak ukapavanja sa difuzijom isparenja na 18 °C. Kristali su uzgajani mešanjem 1 µl rastvora REF STING/jedinjenja 1 sa jednakom zapreminom rastvora iz bunarčića, koji sadrži 100 mM HEPES pH 7,5, 200 mM CaCl2 i 15% (m/V) PEG 8000.20% (m/V) PEG 400 korišćen je kao reagens za krioprotekciju kada su kristali naglo zamrznuti u tečnom azotu. Skupovi podataka o difrakciji sakupljeni su Pilatus detektorom sa SSRF BL18U1 zrakom, i obrađeni sa HKL3000 i programom SCALEPACK2MTZ u softverskom paketu CCP4. Struktura je prikazana na SL.

12.

[0361] Struktura REF STING 155-341 vezanog za jedinjenje 1 određena je molekulskom zamenom koristeći program PHASER (molekulska zamena sa maksimalnom verovatnoćom), koristeći prethodno određenu strukturu WT STING 155-341 (kako je prethodno opisana) kao

1

inicijalni model pretrage. Prisustvo jedinjenja 1 između dimerne međupovršine REF STING potvrđeno je u Fo-Fc mapi razlika koja je izračunata sa fazama modela. Model je napravljen i ručno završen pomoću programa Coot i usavršen sa programom Refmac5 iz softverskog paketa CCP4. Konačna usavršena struktura je objavljena kao rezolucija od 2,76 Å u prostornoj grupi P212121 gde je jedinična ćelija izmerena na a = 33,733, b=77,831, c=131,689, α=90,00, β=90,00, y= 90,00. Dve kopije REF STING 155-341 su identifikovane u svakoj asimetričnoj jedinici koja se vezuje za jedan molekul jedinjenja 1 na dimernoj međupovršini.

C. Interakcije jedinjenja 1 sa REF STING uočene na rendgenskoj kristalnoj strukturi

[0362] SL. 12 prikazuje rendgensku strukturu humanog REF STING u kompleksu sa jedinjenjem 1, koje je kokristalisano iz uzorka jedinjenja 1a. Jedinjenje se vezuje na džep međupovršine koji gradi dimer STING proteina. Dve strane adeninske baze jedinjenja grade ππ steking interakciju sa Tyr240, odnosno guanidinskom grupom Arg238. Trans olefinski linker formira Van der Valsovu interakciju sa alifatičnim delom bočnog lanca Arg238, dok guanidinski deo bočnog lanca Arg238 formira π-π steking interakciju sa imidazolnom grupom bočnog lanca His232 sa spoljašnje strane. Olefinski linker je u kontaktu sa interagujućim parom bočnih lanaca Arg238 i His232. Fluorni supstituent na poziciji C2' ribozne grupe jedinjenja uklapa se u hidrofobnu rupu koju definišu Thr263, Pro264 i Tyr163. Negativno naelektrisana tiofosfatna grupa jedinjenja gradi soni most sa Arg238 i interakcije H-veze sa Ser162, odnosno Thr267. Region LID petlje REF STING, koji se sastoji od ostataka 226 do 243, obmotava se oko dve bazne grupe i trans olefinskog linkera.

Primer 113 – Poređenja

[0363] Vrednosti EC50 su izračunate za testove humanog STING za WT STING, HAQ STING, AQ STING i REF STING, u direktnom poređenju koristeći jedinjenje 1a iz predmetnog otkrića, prirodni STING ligand (2'3' cGAMP), i navodni STING agonist ML RR-S2 CDA, kako je objavljeno u publikaciji Corrales, et al., „Direct Activation of STING in the Tumor Microenvironment Leads to Potent and Systemic Tumor Regression and Immunity“, Cell Reports (2015) 11:1018-1030, obuhvaćenoj referencom u ovom tekstu. Testovi su obavljeni kako je opisano u prethodno datim primerima. Imajte u vidu da su vrednosti iz testa u tabeli 14 ograničene na testove koji su izvedeni u direktnom poređenju i ne moraju da prikazuju uprosečene vrednosti koje su određene u većem broju ispitivanja, kako je objavljeno u tabeli 5

1

ili drugde. Nadalje, imajte u vidu da je „2'3' cGAMP“ isto što i „ML cGAMP“, kako je objavljeno u publikaciji Cell Reports.

Tabela 14

[0364] Tabela 14 takođe daje vezujuće konstante disocijacije (Kd) za vezivanje humanog WT STING za svako od tri testirana jedinjenja, kako je izmereno izotermalnom titracionom kalorimetrijom (ITC). ITC je tehnika mikrokalorimetrijske titracije koja meri termodinamička svojstva povezana sa intermolekulskim interakcijama. Na osnovu ovih testova, jedinjenje 1a gradi najjaču vezu sa WT STING od svih testiranih jedinjenja.

Supstance

[0365] Rekombinantni humani STING (aa, 139-379, H232R) protein divljeg tipa dobijen je ekspresijom konstrukta u E. coli koja kodira citosolni domen humanog WT STING koji sadrži aminokiseline 139-379.

Reagensi

[0366] Poreklo reagensa koji su korišćeni u ovoj studiji prikazano je u nastavku:

1

Priprema proteinskog pufera

[0367] STING protein je čuvan na -60 °C u alikvotima od 90 µl i 100 µl, svaki u koncentraciji od 3,0 mg/ml, odnosno 20 mg/ml, u PBS-u, pH 7,5, koji sadrži 5% glicerola. Na dan analize, alikvoti proteina su otopljeni, razblaženi do 400 ul i pufer je zamenjeni PBS-om koristeći Amicon filter jedinicu za ultra centrifugiranje (granična Mm 10.000, 0,5 ml) sa najmanje četiri 10-minutna centrifugiranja na 14.000 x g sa Eppendorf mikrocentrifugom, i zatim su konačno razblaženi na 20 µM do 30 µM (u zavisnosti od eksperimenta) pomoću IX PBS-a. Koncentracija proteina je određena koristeći spektrofotometar Nanodrop 2000 i koeficijent ekstinkcije proteina od 22.140 (M<-1>cm<-1>).

Priprema uzorka

[0368] Dvesta µl 1 mM osnovnog rastvora jedinjenja 1a, 2'3' cGAMP i ML RR-S2CDA obezbeđeno je putem epruveta za mikrocentrifugiranje od 1,5 ml. Pre svakog eksperimenta, uzorci su razblaženi do koncentracije od 200 uM do 500 uM (u zavisnosti od eksperimenta).

Postupci

[0369] Testovi su obavljeni na Affinity ITC uređaju (TA Instruments br.609003.901) koji je opremljen pomoćnim sredstvom za čišćenje ITC (TA Instruments br. 601800.901). Rastvor STING proteina, približno 400 µl sa 20 µM do 30 µM STING proteina, pipetiran je u kalorimetrijsku ćeliju od 185 µl koja može prihvatljivo da se prepuni. Referentna ćelija je sadržala ekvivalentnu količinu Milli-Q vode. Inkubacija je obavljena na 25 °C sa 20 x 2,5 µl

1 1

injektovanja 100 µM do 300 µM jedinjenja. Kontrolni softver je bio ITC Run Ver.3.3.0.0 (TA Instruments) koji je korišćen za dobijanje termograma koji se sastoje od više pikova sirove toplote (µcal/s) koji predstavljaju toplotnu brzinu pri svakom injektovanju. Softver za analizu Nano Analyze Ver. 3.70 (TA Instruments) korišćen je za korekciju na početnu vrednost, korekciju za blanko uzorak ili toplotu razblaženja uzorka (pri zasićenju) i za integrisanje pikova toplotne brzine koji daju grafičke vrednosti „Q“. Dobijene izoterme su unete pomoću nezavisnog modela kako bi se dobili termodinamički parametri.

[0370] Vrednosti Kd i n (molski odnosi na pregibnim tačkama krive) dobijene su i objavljene. Optimalni uslovi za koncentraciju proteina i liganda dobijeni su u preliminarnim eksperimentima.

Rezultati

[0371] Određeni su termogrami toplotne brzine i rezultujuće izoterme za vezivanje testiranih jedinjenja za rekombinantni humani STING divljeg tipa (aa, 139-379, H232R). Vezivanje svakog jedinjenja za STING je bilo endotermno, kako ukazuju negativne toplotne brzine sa egzotermnom (pozitivni smer) toplotom razblaženja (uočeno nakon što je jedinjenje postiglo zasićenje proteina). Pokazalo se da 2', 3' cGAMP proizvodi sličan endotermni odgovor za različite varijante STING. Jedinjenje 1a obezbeđuje najmanju vrednost Kd od 0,04 µM, zatim 2'3' cGAMP sa Kd od 0,07 µM, pa onda ML RR-S2 CDA sa Kd od 0,40 µM. Sva jedinjenja daju vrednosti n blizu 0,5, što nagoveštava da je STING protein bio prisutan kao dimer i vezuje 1 mol jedinjenja na 2 mol STING.

Primer 114 – Identifikacija potencijalnih metabolita

[0372] Jedinjenje 1a je inkubirano u hepatocitima CD-1 miša, pacova tipa Sprag-Doli, bigla, majmuna cinomolgusa i čoveka, kako bi se procenilo formiranje glavnih metabolita.

Supstance

[0373] Zamrznuti objedinjeni hepatociti su kupljeni od kompanije ThermoFisher Scientific (Waltham, MA), Xenotech, LLC (Kansas City, KS) i In Vitro ADMET Laboratories (Columbia, MD), a odgovarajući medijumi su kupljeni od In Vitro ADMET Laboratories (Columbia, MD)

1 2

i Life Technologies (Carlsbad, CA). AOPI rastvor za bojenje i fosfatni pufer su nabavljeni od Corning Life Sciences (Tewksbury, MA), odnosno Nexcelom Bioscience (Lawrence, MA). Sve hemikalije, reagensi i rastvarači korišćeni u analizi bili su analitičke ili HPLC klase čistoće.

Eksperimentalni dizajn i procedure

Inkubacije hepatocita

[0374] Jedinjenje 1a je izmereno i rastvoreno u HPLC-vodi koja sadrži PBS sa 0,12% mravlje kiseline, dajući 1020 mmol/l. Rastvor je zatim pojedinačno razblažen 2,5-puta do 4 mmol/l, a zatim dalje razblažen 21.000 puta sa Vilijamsovim E medijumom sa 0,1% albumina humanog seruma i 2 mmol/l L-glutamina radi dobijanja radnog osnovnog rastvora koncentracije 20 µmol/l.

[0375] Pre inkubacije, zamrznuti hepatociti su otopljeni u vodenom kupatilu na 37 °C. Jedna epruveta zamrznutih hepatocita je dodata u svaku konusnu epruvetu od 50 ml sa medijumom za rekuperaciju zamrznutih hepatocita (UCRM) nabavljenim od In Vitro ADMET Laboratories (Columbia, MD). Ćelije su centrifugirane u Beckman centrifugi (Brea, CA) sa GH 3,8 rotorom na 740 o/min tokom 10 minuta na sobnoj temperaturi 4 °C. Supernatant je uklonjen, i ćelije su ponovo suspendovane u medijumu za zasejavanje radi brojanja. Nakon što su ćelije ponovo suspendovane u medijumu za zasejavanje, 20 µl resuspenzije je preneto i pomešano sa 20 µl AOPI rastvora za bojenje. Rastvor je pažljivo mešan, i ćelije su prebrojane koristeći Cellometer (Nexcelom, Lawrence, MA). Nakon brojanja, ćelije su ponovo suspendovane sa 1 ili 2 miliona vijabilnih ćelija/ml u Vilijamsovom E medijumu sa 2 mmol/l L-glutamina (pH 7,4).

[0376] Suspenzija hepatocita (50 µl/bunarčiću) dodata je na ploču sa 48 bunarčića. Pedeset mikrolitara radnog osnovnog rastvora sa jedinjenjem 1a (20 µmol/l) dodato je radi započinjanja reakcije. Ploča je stavljena u inkubator za uzgajanje tkiva (5% CO2/95% atmosfera vlažnog vazduha i 37 °C) i reakcije su prekinute sa 200 µl zaustavnog rastvora koji se sastoji od 100% metanola/acetonitrila (1/1, V/V) sa 2010 ng/ml furosemida i 0,2 µmol/l (R)-propranolola na 5, 30, 60, 120, 180 i 240 minuta. Smeša je centrifugirana i filtrirana, i supernatant je sakupljen za analizu. Finalne koncentracije zamrznutih hepatocita su bile 1 x 106 ćelija/ml. Finalna koncentracija za inkubaciju jedinjenja 1a bila je 10 µmol/l.

1

Uslovi LC-MS/MS za identifikaciju metabolita

[0377] LC-MS/MS sistem je sastavljen od Shimadzu HPLC i AB-SCIEX TripleTOF 5600 hibridnog kvadrupola i TOF masenog spektrometra (Framingham, MA). Shimadzu HPLC (Kyoto, Japan), sastojao se od komunikacionog modula sabirnice (CBM-20A), automatskog uzorkivača (SIL-30AC) sa priključenim menjačem postolja (Rack Changer II) dve pumpe (LC-30AD) i pećnicom za kolonu (CTO-30A). Maseni spektrometar je kalibrisan koristeći AB-SCIEX APCI negativne i pozitivne rastvore za kalibraciju (Framingham, MA). Uzorci koji su dobijeni inkubacijom sa hepatocitima analizirani su u negativnim i pozitivnim režimima skeniranja. Osnovni analitički postupak i instrumentalni uslovi su sažeti u nastavku. Modifikacija postavki spektrometra zavisila je od potreba analita.

Uslovi LC-MS/MS:

1 4

Analiza podataka o aktivnosti

[0378] Podaci iz masene spektrometrije su dobijeni koristeći AB-Sciex Analyst TF (verzija 1.5.1; Framingham, MA). Hromatogrami i spektri su dobijeni koristeći AB-Sciex PeakView (verzija 2.2.0.1; Framingham, MA). Poređenje relativnih površina pika za izdvojene jonske hromatograme se zasniva na ± 0,0002 Da od očekivanog preciznog odnosa masa-naelektrisanje (m/z) za svaki analit od interesa.

1

Rezultati

[0379] Nijedan metabolit nije detektovan pri inkubaciji sa hepatocitima. U datim analitičkim uslovima, jedinjenje 1a je imalo retenciono vreme od približno 7,8 minuta. U negativnom režimu skeniranja, jedinjenje 1a je imalo deprotonovani molekulski jon m/z 745 (C24H25F2N10O8P2S2-) i dvostruko deprotonovani molekulski jon m/z 372 (C24H24F2N10O8P2S22 -). Uočeni su glavni joni proizvoda MS/MS m/z 533 (C19H19FN10O4PS<->) i m/z 186 (C9H8N5-). U pozitivnom režimu skeniranja, jedinjenje 1a je imalo protonovani molekulski jon m/z 747 (C24H27F2N10O8P2S2<+>) i glavne jone proizvoda MS/MS sa m/z 651 (C24H26F2N10O6PS<+>), m/z 252 (C10H11FN5O2<+>), i m/z 188 (C9H10N5<+>). Podaci MS i MS/MS potvrđuju strukturu jedinjenja 1a.

[0380] Jedinjenje 1a je bilo stabilno pri inkubaciji sa hepatocitima miša, pacova, psa, majmuna i čoveka. U ovoj studiji nije identifikovan prividni metabolit jedinjenja 1a. U uzorcima koji su dobijeni inkubacijom sa hepatocitima, samo jedinjenje 1a je moglo da se detektuje i potvrdi fragmentima tandemske masene spektrometrije (MS/MS).

[0381] Svi dokumenti koji su navedeni u ovom otkriću su inkorporisani referencom u ovom tekstu, mada, u slučaju da bilo koji inkorporisani dokument protivreči ovoj pisanoj specifikaciji, onda će ova pisana specifikacija imati prednost. Stručnjacima će biti jasno da se različite promene i modifikacije mogu načiniti na ovde obezbeđenom materijalu, i da je taj materijal u opsegu i duhu otkrića.

1

SPISAK SEKVENCI

[0382] SEQ ID NO: 1 (WT humani STING):

1

[0384] SEQ ID NO: 3 (AQ humani STING):

1

[0388] SEQ ID NO: 7 (His-TEV-Sumo-REF STING 155-341)

1

11

12

1

14

1

�

Claims

Patentni zahtevi 1. Jedinjenje formule (III):

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, naznačeno time što R1aje izabran iz grupe koja se sastoji od -H, -OH i -F; R1bje izabran iz grupe koja se sastoji od -H, -OH i -F, naznačeno time što najmanje jedan od R1ai R1bje -H; R4aje izabran iz grupe koja se sastoji od -H, -OH i -F; R4bje izabran iz grupe koja se sastoji od -H, -OH i -F, naznačeno time što najmanje jedan od R4ai R4bje -H; P1i P2svaki nezavisno ima S ili R stereohemijsku konfiguraciju; Z je -O- ili -NH-; X1ai X2asu isti ili različiti, i nezavisno su izabrani od =O ili =S; X1bi X2bsu isti ili različiti, i nezavisno su izabrani od -OR5i -SR5; naznačeno time što je R5izabran iz grupe koja se sastoji od -H, -C1-6alkila, -C(O)C1-6alkila i -CH2OC(O)OC1-6alkila; L1u formuli (III) ima dužinu od četiri, pet ili šest ugljenika, i on je

naznačeno time što označava jednostruku vezu, dvostruku vezu ili trostruku vezu, i naznačeno time što (i) 0 ili 1 javljanje u L1označava trostruku vezu; ili (ii) 0, 1 ili 2 javljanja u L1označavaju dvostruku vezu, naznačeno time što je geometrija oko svake dvostruke veze cis ili trans; i (iii) naznačeno time što 1 javljanje u L1označava trostruku vezu, 0 javljanja u L1označava dvostruku vezu; i (iv) naznačeno time što, kada 2 javljanja u L1označavaju dvostruku vezu, te dvostruke veze su bilo susedne veze ili naizmenične veze; naznačeno time što X10, X11, X12, X13, X14i X15su nezavisno izabrani od veze, - CH2-ili -CH-, naznačeno time što je -CH2- ili -CH- nesupstituisan ili supstituisan sa (i) -OH, (ii) -F, (iii) -Cl, (iv) -NH2ili (v) -D, i kada je X10ili X15veza, ta veza nije dvostruka veza ili trostruka veza; i naznačeno time što bilo koja dva susedna člana grupe koja uključuje X10, X11, X12, X13, X14i X15mogu opciono da grade, sa dodatnim atomima, C3cikloalkil ili C3heterocikloalkil, i navedeni C3heterocikloalkil uključuje N ili O atom; naznačeno time što su B1i B2nezavisno izabrani od:

pri čemu su veze na tačkama q i r na B1i B2povezane na tačkama q i r na formuli (III). 2. Jedinjenje ili farmaceutski prihvatljiva so iz zahteva 1, naznačeno time što: R1aje izabran iz grupe koja se sastoji od -H i -F; R1bje izabran iz grupe koja se sastoji od -H i -F, naznačeno time što R1ai R1bne moraju oba biti - F; R4aje izabran iz grupe koja se sastoji od -H i -F; R4bje izabran iz grupe koja se sastoji od -H i -F, naznačeno time što R4ai R4bne moraju oba biti -F; P1i P2svaki nezavisno ima S ili R stereohemijsku konfiguraciju; X1ai X2asu isti ili različiti, i nezavisno su izabrani od =O ili =S; X1bi X2bsu isti ili različiti, i nezavisno su izabrani od -OR5i -SR5; naznačeno time što je R5izabran iz grupe koja se sastoji od -H, C1-6alkila i -C(O)C1-6alkila; L1u formuli (III) ima dužinu od četiri ili pet ugljenika, i on je

naznačeno time što označava jednostruku vezu ili dvostruku vezu, i naznačeno time što 0 ili 1 javljanje u L1označava dvostruku vezu, naznačeno time što je geometrija oko dvostruke veze cis ili trans; naznačeno time što su X10i X14nezavisno izabrani od veze, -CH- ili -CH2- , i naznačeno time što, kada su X10ili X14veza, ta veza nije dvostruka veza; naznačeno time što su B1i B2nezavisno izabrani od:

pri čemu su veze na tačkama q i r na B1i B2povezane na tačkama q i r na formuli (III). 2 1 3. Jedinjenje formule (IV):

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, naznačeno time što R1aje izabran iz grupe koja se sastoji od -H, -OH i -F; R1bje izabran iz grupe koja se sastoji od -H, -OH i -F, naznačeno time što najmanje jedan od R1ai R1bje -H; R4aje izabran iz grupe koja se sastoji od -H, -OH i -F; R4bje izabran iz grupe koja se sastoji od -H, -OH i -F, naznačeno time što najmanje jedan od R4ai R4bje -H; P1i P2svaki nezavisno ima S ili R stereohemijsku konfiguraciju; X1ai X2asu isti ili različiti, i nezavisno su izabrani od =O ili =S; X1bi X2bsu isti ili različiti, i nezavisno su izabrani od -OR5i -SR5; naznačeno time što je R5izabran iz grupe koja se sastoji od -H, C1-6alkila, -C(O)C1-6alkila i -CH2OC(O)OC1-6alkila; L1u formuli (IV) ima dužinu od četiri, pet ili šest ugljenika, i on je

naznačeno time što 2 2 označava jednostruku vezu, dvostruku vezu ili trostruku vezu, i naznačeno time što (i) 0 ili 1 javljanje u L1označava trostruku vezu; ili (ii) 0, 1 ili 2 javljanja u L1označavaju dvostruku vezu, naznačeno time što je geometrija oko svake dvostruke veze cis ili trans; i (iii) naznačeno time što 1 javljanje u L1označava trostruku vezu, 0 javljanja u L1označava dvostruku vezu; i (iv) naznačeno time što, kada 2 javljanja u L1označavaju dvostruku vezu, te dvostruke veze su bilo susedne veze ili naizmenične veze; naznačeno time što X10, X11, X12, X13, X14i X15su nezavisno izabrani od veze, - CH2-ili -CH-, naznačeno time što je -CH2- ili -CH- nesupstituisan ili supstituisan sa (i) -OH, (ii) -F, (iii) -Cl, (iv) -NH2ili (v) -D, i kada je X10ili X15veza, ta veza nije dvostruka veza ili trostruka veza; i naznačeno time što bilo koja dva susedna člana grupe koja uključuje X10, X11, X12, X13, X14i X15mogu opciono da grade, sa dodatnim atomima, C3cikloalkil ili C3heterocikloalkil, i navedeni C3heterocikloalkil uključuje N ili O atom; naznačeno time što su B1i B2nezavisno izabrani od:

pri čemu su veze na tačkama q i r na B1i B2povezane na tačkama q i r na formuli (IV), 2 ili naznačeno time što R1aje izabran iz grupe koja se sastoji od -H i -F; R1bje izabran iz grupe koja se sastoji od -H i -F, naznačeno time što R1ai R1bne moraju oba biti - F; R4aje izabran iz grupe koja se sastoji od -H i -F; R4bje izabran iz grupe koja se sastoji od -H i -F, naznačeno time što R4ai R4bne moraju oba biti -F; P1i P2svaki nezavisno ima S ili R stereohemijsku konfiguraciju; X1ai X2asu isti ili različiti, i nezavisno su izabrani od =O ili =S; X1bi X2bsu isti ili različiti i nezavisno su izabrani od -OR5i -SR5; naznačeno time što je R5izabran iz grupe koja se sastoji od -H, C1-6alkila i -C(O)C1-6alkila; L1u formuli (IV) ima dužinu od četiri ili pet ugljenika i on je

naznačeno time što označava jednostruku vezu ili dvostruku vezu, i naznačeno time što 0 ili 1 javljanje u L1označava dvostruku vezu, naznačeno time što je geometrija oko dvostruke veze cis ili trans; naznačeno time što su X10i X14nezavisno izabrani od veze, -CH- ili -CH2- , i naznačeno time što, kada su X10ili X14veza, ta veza nije dvostruka veza; naznačeno time što su B1i B2nezavisno izabrani od:

pri čemu su veze na tačkama q i r na B1i B2povezane na tačkama q i r na formuli (IV). 2 4 4. Jedinjenje formule (V):

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, naznačeno time što R1aje izabran iz grupe koja se sastoji od -H, -OH i -F; R1bje izabran iz grupe koja se sastoji od -H, -OH i -F, naznačeno time što najmanje jedan od R1ai R1bje -H; R4aje izabran iz grupe koja se sastoji od -H, -OH i -F; R4bje izabran iz grupe koja se sastoji od -H, -OH i -F, i naznačeno time što najmanje jedan od R4ai R4bje -H; P1i P2svaki nezavisno ima S ili R stereohemijsku konfiguraciju; X1ai X2asu isti ili različiti, i nezavisno su izabrani od =O ili =S; X1bi X2bsu isti ili različiti, i nezavisno su izabrani od -OR5i -SR5; naznačeno time što je R5izabran iz grupe koja se sastoji od -H, C1-6alkila, -C(O)C1-6alkila i -CH2OC(O)OC1-6alkila; L1u formuli (V) ima dužinu od četiri, pet ili šest ugljenika, i on je

naznačeno time što označava jednostruku vezu, dvostruku vezu ili trostruku vezu, i naznačeno time što (i) 0 ili 1 javljanje 2 u L1označava trostruku vezu; ili (ii) 0, 1 ili 2 javljanja u L1označavaju dvostruku vezu, naznačeno time što je geometrija oko svake dvostruke veze cis ili trans; i (iii) naznačeno time što 1 javljanje u L1označava trostruku vezu, 0 javljanja u L1označava dvostruku vezu; i (iv) naznačeno time što, kada 2 javljanja u L1označavaju dvostruku vezu, te dvostruke veze su bilo susedne veze ili naizmenične veze; naznačeno time što X10, X11, X12, X13, X14i X15su nezavisno izabrani od veze, - CH2-ili -CH-, naznačeno time što je -CH2- ili -CH- nesupstituisan ili supstituisan sa (i) -OH, (ii) -F, (iii) -Cl, (iv) -NH2ili (v) -D, i kada je X10ili X15veza, ta veza nije dvostruka veza ili trostruka veza; i naznačeno time što bilo koja dva susedna člana grupe koja uključuje X10, X11, X12, X13, X14i X15mogu opciono da grade, sa dodatnim atomima, C3cikloalkil ili C3heterocikloalkil, i navedeni C3heterocikloalkil uključuje N ili O atom; naznačeno time što su B1i B2nezavisno izabrani od:

pri čemu su veze na tačkama q i r na B1i B2povezane na tačkama q i r na formuli (V), ili naznačeno time što R1aje izabran iz grupe koja se sastoji od -H i -F; 2 R1bje izabran iz grupe koja se sastoji od -H i -F, naznačeno time što R1ai R1bne moraju oba biti - F; R4aje izabran iz grupe koja se sastoji od -H i -F; R4bje izabran iz grupe koja se sastoji od -H i -F, naznačeno time što R4ai R4bne moraju oba biti -F; P1i P2svaki nezavisno ima S ili R stereohemijsku konfiguraciju; X1ai X2asu isti ili različiti, i nezavisno su izabrani od =O ili =S; X1bi X2bsu isti ili različiti i nezavisno su izabrani od -OR5i -SR5; naznačeno time što je R5izabran iz grupe koja se sastoji od -H, C1-6alkila i -C(O)C1-6alkila; L1u formuli (V) ima dužinu od četiri ili pet ugljenika, i on je

naznačeno time što označava jednostruku vezu ili dvostruku vezu, i naznačeno time što 0 ili 1 javljanje u L1označava dvostruku vezu, naznačeno time što je geometrija oko dvostruke veze cis ili trans; naznačeno time što su X10i X14nezavisno izabrani od veze, -CH- ili -CH2- , i naznačeno time što, kada su X10ili X14veza, ta veza nije dvostruka veza; naznačeno time što su B1i B2nezavisno izabrani od:

pri čemu su veze na tačkama q i r na B1i B2povezane na tačkama q i r na formuli (V). 5. Jedinjenje ili farmaceutski prihvatljiva so iz bilo kog od zahteva 1–4, naznačeno time što (i) stereohemijska konfiguracija P1i P2je R, stereohemijska konfiguracija P1je R, a P2je S, ili je stereohemijska konfiguracija P1S, a P2je R; 2 (ii) jedno javljanje u L1označava dvostruku vezu, naznačeno time što je geometrija oko dvostruke veze trans; i (iii) Z je -O-i, poželjno, naznačeno time što R1ai R4asu oba -F ili R1bi R4bsu oba -F. 6. Jedinjenje ili farmaceutski prihvatljiva so iz bilo kog od zahteva 1–5, naznačeno time što su B1i B2oba

i, poželjno, naznačeno time što X1ai X2asu oba =O, i X1bi X2bsu oba -SH. 7. Jedinjenje ili farmaceutski prihvatljiva so iz bilo kog od zahteva 1–6, naznačeno time što L1ima dužinu od četiri ili pet ugljenika i, poželjno, naznačeno time što je L1

8. Jedinjenje ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, izabrani iz grupe koja se sastoji od:

2

�

21

21

naznačeno time što su jedinjenje ili njegova farmaceutski prihvatljiva so poželjno izabrani iz grupe koja se sastoji od:

21

21

21

9. Jedinjenje ili farmaceutski prihvatljiva so iz bilo kog od zahteva 1–9, naznačeno time što jedinjenje ili farmaceutski prihvatljiva so ima (i) vrednost EC50manju od 100 mikromolarne u reporterskim ćelijama koje eksprimiraju humanu STING HAQ varijantu; (ii) vrednost EC50manju od 100 mikromolarne u reporterskim ćelijama koje eksprimiraju humanu STING AQ varijantu; (iii) vrednost EC50manju od 100 mikromolarne u reporterskim ćelijama koje eksprimiraju humanu STING WT varijantu; ili (iv) vrednost EC50manju od 100 mikromolarne u reporterskim ćelijama koje eksprimiraju humanu STING REF varijantu. 10. Jedinjenje ili farmaceutski prihvatljiva so iz zahteva 8, naznačeno time što je jedinjenje:

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so. 21 11. Jedinjenje ili farmaceutski prihvatljiva so iz zahteva 8, naznačeno time što je jedinjenje:

, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so. 12. Jedinjenje ili farmaceutski prihvatljiva so iz zahteva 8, naznačeno time što je jedinjenje:

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so. 13. Jedinjenje ili farmaceutski prihvatljiva so iz zahteva 8, naznačeno time što je jedinjenje:

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so. 14. Jedinjenje ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, naznačeno time što je jedinjenje:

15. Farmaceutski prihvatljiva so iz bilo kog od zahteva 1–14, naznačeno time što je so diamonijumova so. 16. Jedinjenje iz bilo kog od zahteva 10–14. 17. Farmaceutska kompozicija koja sadrži jedinjenje prema bilo kom od zahteva 1–15 ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, i farmaceutski prihvatljiv ekscipijens. 18. Jedinjenje, njegova farmaceutski prihvatljiva so ili farmaceutska kompozicija iz bilo kog od zahteva 1–15 i 17 za upotrebu u lečenju raka, naznačeno time što je rak poželjno izabran iz grupe koju čine limfom, melanom, kolorektalni karcinom, rak dojke, akutna mijeloidna leukemija, rak debelog creva, rak jetre, rak prostate, rak pankreasa, rak bubrega i gliom. 19. Jedinjenje, njegova farmaceutski prihvatljiva so ili farmaceutska kompozicija iz bilo kog od zahteva 1–15, 17 ili 18 za upotrebu u lečenju raka kod pacijenta sa • REF STING alelom ili • WT STING alelom ili • AQ STING alelom ili • HAQ STING alelom. 20. Jedinjenje, njegova farmaceutski prihvatljiva so ili farmaceutska kompozicija iz zahteva 18 za upotrebu u lečenju raka, naznačeno time što je navedeni rak metastatski.