RS62866B1 - Kompozicije peptida i postupci upotrebe - Google Patents

Description

Opis pronalaska

FEDERALNO SPONZORISANO ISTRAŽIVANJE ILI RAZVOJ

[0001] Ovaj pronalazak je napravljen uz podršku Vlade pod brojem granta R44EY022512, koji je dodelio Nacionalni institut za zdravlje (NIH). Vlada ima određena prava na ovaj pronalazak.

OSNOVA PRONALASKA

[0002] Opisane su kompozicije peptida koje štite ćelije, posebno ćelije mrežnjače, uključujući, ali ne ograničavajući se na, fotoreceptore, pigmentni epitel mrežnjače (RPE) i ganglijske ćelije mrežnjače, koje primaju vizuelne informacije od fotoreceptora, od smrti ćelija posredovane spoljašnjim putem, kao što su Fas-posredovana apoptoza, TRAIL-posredovana apoptoza, TNF-posredovana nekroptoza i piroptoza, i postupci upotrebe kompozicija.

[0003] Nekoliko glavnih uzroka gubitka vida, kao što su ablacija mrežnjače, glaukom i degeneracija makule, imaju značajnu komponentu apoptotske signalizacije, što zauzvrat dovodi do programirane ćelijske smrti u određenim veoma važnim tipovima ćelija u mrežnjači. Tri od ovih tipova ćelija su pigmentisane epitelne ćelije mrežnjače, gde se gubitak vidi u izbeljivanju mrežnjače, pigmentnom retinitisu i suvom obliku degeneracije makule povezane sa starenjem, ganglijske ćelije mrežnjače, gde se gubitak vidi kod glaukoma, i same fotoreceptorske ćelije, ćelije primarne vizuelne signalizacije i čiji je gubitak krajnji uzrok gubitka vida usled bolesti mrežnjače.

[0004] Ablacija mrežnjače (RD), definisana kao odvajanje neurosenzorne mrežnjače od susedne RPE, dovodi do apoptotske smrti fotoreceptorskih ćelija (Cook et al. 1995; 36(6):990-996; Hisatomi et al. Curr Eye Res. 2002; 24(3):161-172; Zacks et al. Invest Ophthalmol Vis Sci.

2003; 44(3):1262-1267. Yang et al. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2004; 45(2):648-654). Modeli RD kod glodara i mačaka pokazali su aktivaciju pro-apoptotičkih puteva skoro odmah nakon što se mrežnjača odvoji od RPE (Cook et al. 1995; 36(6):990-996; Hisatomi et al. Curr Eye Res.

2002; 24(3):161-172; Zacks et al. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2003; 44(3): 1262-1267. Yang et al. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2004; 45(2):648-654). Histološki markeri apoptoze, kao što je bojenje terminalne deoksinukleotidil transferaze oznakom na kraju proreza (TUNEL) dostižu vrhunac otprilike tri dana nakon RD, sa apoptotičkom aktivnošću i progresivnom smrću ćelije koja traje tokom perioda ablacije. Ovo je takođe potvrđeno kod ablacije mrežnjače kod ljudi (Arroyo et al. Am J Ophthalmol. 2005 Apr; 139(4):605-10). Međutim, kliničko iskustvo u popravljanju ablacije mrežnjače pokazalo je da postoji prilika za popravku uz očuvanje određene oštrine vida, ali da oštrina vida značajno opada kako se vreme između ablacije i popravke produžava (Burton. Trans Am Ophthalmol Soc. 1982; 80:475-497; Ross et al. Ophthalmology.

1998; 105(11):2149-2153; Hassan et al. Ophthalmology. 2002; 109(1):146-152). Brza stopa aktivacije pro-apoptotičkih puteva i sporija stopa gubitka vida sugerišu da se unutrašnji neuroprotektivni faktori mogu aktivirati unutar neuralne mrežnjače i mogu poslužiti da uravnoteže efekte pro-apoptotičkih puteva koje aktivira mrežnjača-RPE odvajanje.

[0005] Degeneracija makule povezana sa starenjem (AMD) je vodeći uzrok trajnog gubitka vida u Sjedinjenim Državama (Bourne et al. Br J Ophthalmol. 2014; 98:629-638; Klein et al. Arch Ophthalmol. 2011; 129:75-80; Cruciani et al. Clin Ter. 2011; 162:e35-42). Smrt spoljašnje mrežnjače (definisana kao kompleks pigmentnog epitela mrežnjače (RPE) i fotoreceptorskih (PR) ćelija) je osnovni uzrok gubitka vida kod AMD i ograničava efikasnost trenutnih tretmana (Murakami et al. Prog Retin Eye Res. 2013; 37:114-140; Huckfeldt and Vavvas. Int Ophthalmol Clin. 2013; 53:105-117). Poremećaj homeostaze PR-RPE dovodi do PR smrti. Fas je bio značajno izražen u očima ljudi sa uznapredovalom AMD, definisanom kao vlažan ili atrofičan, u poređenju sa zdravim kontrolama i bio je najviše koncentrisan oko aktivnih neovaskularnih i atrofičnih lezija (Dunaief et al. Arch Ophthalmol. 2002; 120:1435-1442). RPE je osetljiv na Fasposredovanu apoptozu u uslovima stresa koji se javljaju tokom progresije AMD, kao što je upala ili oksidativni stres, a veće koncentracije rastvorljivog Fas liganda su identifikovane kod pacijenata sa AMD u poređenju sa njihovim zdravim kolegama iste starosti (Jiang et al. Invest Ophthalmol Vis Sci.2008; 37:114-140). Slično, oksidativni stres, koji se javlja tokom progresije AMD, dovodi do povećane ekspresije Fas u RPE (Lin et al. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2011; 52:6308-6314) i smrti RPE koja se javlja u uslovima oksidativnog stresa zavisi od Fas signalizacije (Wang et al. Apoptosis. 2012; 17:1144-1155). Pored toga, Fas je direktno povezan sa smrću RPE ćelija izazvanom akumulacijom Alu RNK, još jednim priznatim faktorom patologije AMD (Kim et al. Proc Natl Acad Sci USA.2014; 111:16082-16087). Pokazalo se da je TRAIL-RI receptor (DR4), koji deluje delimično kroz isti put, genetički faktor rizika za TRAIL-RI receptor (DR4), koji deluje delimično kroz isti put, pokazao se kao genetički faktor rizika za degeneraciju makule povezanu sa starenjem. (Miyake et al. Invest Ophthalmol Vis Sci 56, 5353 (2015).

[0006] Fas je takođe bio umešan u smrt ganglijskih ćelija mrežnjače povezane sa glaukomom (Gregory et al. PLoS One. 2011; 6(3):e17659). Štaviše, intraokularni pritisak (IOP) je glavni faktor rizika za progresiju glaukoma, a životinjski modeli IOP pokazuju povećanu ekspresiju Fas i FasL (Ju et al. Brain Res. 2006; 1122(1): 209-221) i smrt ganglijskih ćelija mrežnjače usled apoptoze (Ji et al. Vision Res. 2005; 45(2): 169-179). Dok je kontrola IOP glavni princip kliničkog lečenja glaukoma, postoji značajan broj pacijenata koji nastavljaju da doživljavaju progresiju bolesti čak i nakon pravilne kontrole IOP, a dodatni rad je učvrstio ideju da će se možda morati pozabaviti dodatnim faktorima koji doprinose glaukomu (Kamat et al. Semin Ophthalmol. 2016; 31(1-2):147-154).

[0007] Apoptoza (programirana ćelijska smrt) igra centralnu ulogu u razviću i homeostazi svih višećelijskih organizama. Promene u apoptotičkim putevima su umešane u mnoge tipove ljudskih patologija, uključujući poremećaje razvića, kancer, autoimune bolesti, kao i neurodegenerativne poremećaje i degradaciju mrežnjače. To je strogo regulisan put koji upravlja procesima smrti pojedinačnih ćelija i može se pokrenuti ekstrinzično ili intrinzično. Poslednji je intracelularni mehanizam koji pokreću mitohondrije, dok prvi uključuje interakciju 'receptora smrti' sa odgovarajućim ligandom na ćelijskoj membrani. Tako su programirani putevi ćelijske smrti postali privlačni ciljevi za razvoj terapeutskih sredstava. Konkretno, pošto je konceptualno lakše ubiti ćelije nego održati ćelije, pažnja je usmerena na terapije protiv kancera koje koriste pro-apoptotička sredstva. Međutim, postoje mnoge bolesti kod kojih neodgovarajuća aktivacija apoptotičkih puteva dovodi do degeneracije tkiva, pa se moraju osmisliti tretmani da bi se blokirao bilo koji apoptotički put, unutrašnji ili ekstrinzični, aktiviran u ovoj specifičnoj patologiji bolesti.

[0008] Fas receptor je najčešći od receptora smrti uključenih u apoptozu kod degenerativnih oboljenja mrežnjače. (Chinsky et al. Curr Opin Ophthalmol. 2014 25(3); 228-233) Fas je tipičan receptor citokina na površini ćelije i aktivira se trimerizacijom kada se veže za svoj trimerni srodni ligand FasL. Stresirane ćelije mrežnjače, na primer fotoreceptori nakon RD, povećano regulišu Fas receptor. Invazivne imune ćelije, privučene odgovorom na stres, eksprimiraju transmembranski protein Fas ligand (FasL) na svojoj površini. FasL se vezuje za Fas receptore na ćelijama mrežnjače, što dovodi do brze aktivacije spoljašnjeg puta ćelijske smrti sa signalizacijom kroz kaskadu kaspaze. U početku, "inicijator" kaspaza-8 se cepa do aktivnog oblika, koji zauzvrat aktivira kaspazu 3, nizvodnog "izvršioca" apoptotičkog puta smrti ćelije. Međutim, pokazalo se da su u očima miševa inficiranih mišjim citomegalovirusom Fas, kao i srodni receptori smrti TNFRI i TRAIL, aktivirani, a ova aktivnost može dovesti do apoptoze, nekroptoze i piroptoze u ćelijama oka. (Chien and Dix J Virol 86, 10961 (2012))

[0009] Pokazalo se da su fotoreceptorske ćelije u kulturi veoma osetljive na apoptozu izazvanu FasL, što sugeriše da apoptoza izazvana FasL uglavnom doprinosi gubitku vida kod bolesti mrežnjače. (Burton. Trans Am Ophthalmol Soc. 1982; 80:475-497; Ross et al. Ophthalmology.

1998; 105(11):2149-2153; Hassan et al. Ophthalmology. 2002; 109(1):146-152.) Štaviše, pokazalo se da mali peptidni inhibitor Fas receptora, Met-12, H<60>HIYLGAVNYIY<71>(SEQ ID BR:2) izveden iz vanćelijskog domena koji se vezuje za Fas onkoproteina Met, (Zou et al. Nature Medicine 13, 1078 (2007) štiti fotoreceptore, kako u eksperimentima sa ćelijskom kulturom, tako i u okruženju odvajanja mrežnjače i pigmentnog epitela mrežnjače i drugih očnih stanja ili bolesti (Besirli et al., Invest Ophthalmol Vis Sci., 51(4):2177-84 (2010); U.S. Pat. Br.

8,343,931). Štaviše, pokazalo se da c-Met, koji verovatno koristi isti domen za vezivanje sa homologijom sa Met-12, FasL, TNAα i TRAIL, blokira apoptozu izazvanu sa TRAIL u različitim tumorima (Du et al. PLoS One 9, e95490 (2014))

[0010] Sam peptid Met-12 ima biofarmaceutska svojstva, među kojima dominira njegova izuzetno loša rastvorljivost u vodi. Eksperimenti su jasno pokazali da se Met-12 mora dozirati kao rastvor, kako in vitro tako i in vivo, da bi pokazao optimalnu aktivnost, a pokazalo se da je proizvodnja takvih rastvora u pretežno vodenoj sredini veoma teška, posebno pod prihvatljivim uslovima. za intravitrealno ubrizgavanje. Doziranje suspenzija ili gela Met-12 dovodi do velikih gubitaka potencije. Na primer, čak i naizgled bistar rastvor Met-12 od 10 mg/mL u 20 mM citratnog pufera pH 2,8 pokazao je značajan gubitak materijala nakon filtracije, a kada se koristi i u in vitro i in vivo analizama opisanim u nastavku, dovelo je do najmanje petostrukog gubitka aktivnosti. Uprkos opsežnom razvoju, jedine formulacije rastvora Met-12 koje su pronađene uključuju ubrizgavanje rastvora sa veoma niskim pH (≤ pH 2,8) ili ubrizgavanje čistog DMSO, od kojih su sve suboptimalne za intravitrealna ubrizgavanja.

[0011] Kao takve, peptidne kompozicije koje štite ćelije mrežnjače, uključujući, ali ne ograničavajući se na, fotoreceptore, ganglijske ćelije mrežnjače i pigmentni epitel mrežnjače, od spoljašnjeg puta smrti ćelije, uključujući Fas- i TRAIL- posredovanu apoptozu, koje je lako formulisati u rastvor ili suspenziju, koja se može uneti u oko na način da se stvori dovoljna izloženost, bez upotrebe ekscipijenata koji mogu izazvati očnu (ili drugu) toksičnost, i koji su laki za upotrebu, i dalje su potrebni da bi se sačuvao vid.

[0012] US2010226878 opisuje postupke za sprečavanje smrti fotoreceptora. Konkretno, US2010226878 opisuje peptide koji sprečavaju FAS- posredovanu apoptozu fotoreceptora.

[0013] Cagri B. Besirli et al. "Inhibition of Retinal Detachment-Induced Apoptosis in Photoreceptors by a Small Peptide Inhibitor of the Fas Receptor", Investigative Ophthalmology & Visual Science, 2010, vol. 51, no. 4, 2166-2194, diskutuju o efektima Met-12 na aktivaciju spoljašnjih i intrinzičnih puteva apoptoze nakon ablacije mrežnjače.

[0014] WO2007064997 opisuje jedinjenja, kompozicije i postupke za inhibiciju apoptoze i za lečenje stanja povezanih sa tim.

[0015] Kyun-Hwan Kim et al. "Peptide amidation: Production of peptide hormones in vivo and in vitro" Biotechnology and Bioprocesses Engineering, 2001, vol 6, no.4, 244-251, diskutuju o amidaciji, sa posebnim naznačavanjem na industrijsku proizvodnju peptidnih hormona.

[0016] US6001962 opisuje modifikovane polipeptide koji su sposobni za interakciju sa Fas receptorom, nukleinske kiseline koje kodiraju takve polipeptide, ćelijske linije sposobne da eksprimiraju ove nukleinske kiseline i luče polipeptide, i antitela koja su specifično imunoreaktivna sa ovim polipeptidima.

[0017] US2014371161 opisuje postupke i upotrebu C-krajeva peptida za inhibiciju smrti ili disfunkcije neuronskih ćelija, kao što je smrt ili disfunkcija ganglijskih ćelija mrežnjače, lečenje degenerativnih poremećaja mrežnjače, moždani udar, CNS i PNS povrede. Otkriće se takođe odnosi na C-krajeve peptida, fuzione proteine i njihove kompozicije.

SAŽETAK PRONALASKA

[0018] Prema prvom aspektu, ovde je obezbeđeno jedinjenje Formule I,

Formule I

ili njegove farmaceutski prihvatljive soli.

[0019] U drugom aspektu obezbeđena je poliacetatna so ili triacetatna so jedinjenja formule I.

[0020] U trećem aspektu, obezbeđena je kompozicija koja sadrži jedinjenje soli koje je ovde otkriveno, i farmaceutski nosač konfigurisan za isporuku u oči.

[0021] Ovde su obezbeđeni farmaceutski preparati biološki aktivnih, vodenih formulacija fotoreceptor-zaštitnog peptida, njihovi farmaceutski preparati, koji preparati se mogu koristiti u postupcima sprečavanja smrti fotoreceptora.

[0022] Jedinjenje I. His-His-Ile-Tyr-Leu-Gly-Ala-Val-Asn-Tyr-Ile-Tyr-amid (SEQ ID BR:I).

[0023] Neki primeri izvođenja se odnose na jedinjenje I (prethodno navedeno), ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so. Određeni drugi primeri izvođenja se odnose na poliacetatnu so jedinjenja I. Određeni dalji primeri izvođenja se odnose na triacetatnu so jedinjenja I. Jedinjenja mogu biti za upotrebu u farmaceutskoj formulaciji za sprečavanje Fas- ili TRAIL posredovane apoptoze u fotoreceptorima oka. Jedinjenja mogu biti za upotrebu u farmaceutskoj formulaciji za sprečavanje Fas-posredovane apoptoze u ćelijama pigmentiranog epitela mrežnjače oka. Jedinjenja mogu biti za upotrebu u farmaceutskoj formulaciji za lečenje ablacije mrežnjače. Jedinjenja mogu biti za upotrebu u farmaceutskoj formulaciji za lečenje bolesti ganglijskih ćelija mrežnjače, kao što je glaukom. U nekim drugim primerima izvođenja, jedinjenja mogu biti za upotrebu u farmaceutskoj formulaciji za lečenje očnih bolesti ili stanja, uključujući sledeće: makulopatije/degeneraciju retine, kao što su: degeneracija makule, degeneracija makule povezane sa starenjem (AMD), kao što su neeksudativna degeneracije makule povezane sa starenjem i eksudativna degeneracija makule povezana sa starenjem, horoidalna neovaskularizacija, retinopatija, uključujući dijabetičku retinopatiju, akutnu i hroničnu neuroretinopatiju makule, centralnu seroznu horioretinopatiju; i makularni edem, uključujući cistoidni makularni edem i dijabetički makularni edem; uveitis/retinitis/horoiditis, kao što su multifokalna plakoidna pigmentna epiteliopatija, Behcet-sova bolest, birdshot retinohoroidopatija, zaraza (sifilis, lajmska bolest, tuberkuloza, toksoplazmoza), uveitis, uključujući srednji uveitis (pars planitis) i anteriorni uveitis, multifokalni horoiditis, sindrom višestrukih evanescentnih belih tačaka (MEWDS), sarkoidoza oka, posteriorni skleritis, serpignozni horoiditis, subretinalna fibroza, sindrom uveitisa, Vogt-Koyanagi-Harada sindrom; vaskularne bolesti/eksudativne bolesti, kao što su: arterijska okluzivna bolest mrežnjače, okluzija centralne vene mrežnjače, diseminovana intravaskularna koagulopatija, okluzija grane vene mrežnjače, hipertenzivne promene fundusa, sindrom ishemije oka, mikroaneurizme arterija mrežnjače, Coats-ova bolest, parafovealna telangiektazija, okluzije hemiretinalne vene, papiloflebitisa, okluzija centralne arterije mrežnjače, okluzija grane arterije mrežnjače, bolest karotidne arterije (CAD), angitis smrznute grane, retinopatija srpastih ćelija i druge hemoglobinopatije, angioidne pruge, familijarna eksudativna vitreoretinopatija, Eales-ova bolest, traumatske/hirurške bolesti: simpatička oftalmija, uveitska bolest mrežnjače, ablacija mrežnjače, fotokoagulacija izazvana traumom, laserom, PDT, hipoperfuzija tokom operacije, radijaciona retinopatija, retinopatija kod transplantacije koštane srži; proliferativni poremećaji, kao što su: proliferativna vitrealna retinopatija i epiretinalne membrane, proliferativna dijabetička retinopatija. Infektivni poremećaji: okularna histoplazmoza, okularna toksokariaza, sindrom očne histoplazmoze (OHS), endoftalmitis, toksoplazmoza, bolesti mrežnjače povezane sa HIV infekcijom, horoidna bolest povezana sa HIV infekcijom, uveitična bolest povezana sa HIV infekcijom, virusni retinitis, akutna nekroza mrežnjače, progresivna nekroza spoljašnje mrežnjače, gljivične bolesti mrežnjače, okularni sifilis, okularna tuberkuloza, difuzni unilateralni subakutni neuroretinitis, i mijaza; genetički poremećaji, kao što su: pigmentni retinitis, sistemski poremećaj povezan sa distrofijom mrežnjače, kongenitalno stacionarno noćno slepilo, konusne distrofije, Stargardt-ova bolest, fundus flavimaculatus, Best-ova bolest, distrofičnog obrasca pigmentnog epitela mrežnjače, X-vezana retinošiza, Sorsby-ova distrofija fundusa, benigna koncentrična makulopatija, Bietti-ova kristalna distrofija, pseudoxanthoma elasticum. Kidanje mrežnjače/rupe: ablacija mrežnjače, makularna rupa, ogromno kidanje mrežnjače; tumori, kao što su: oboljenje mrežnjače povezano sa tumorima, urođena hipertrofija RPE, posteriorni uvealni melanoma, horoidalni hemangiom, horoidalni osteom, horoidalne metastaze, kombinovani hamartom mrežnjače i pigmentnog epitela mrežnjače, retinoproblastom, vazoproliferativni tumori očnog fundusa, astrocitom mrežnjače, intraokularni limfoidni tumori; i druge bolesti i stanja kao što su: tačkasta unutrašnja horoidopatija, akutna posteriorna multifokalna plakoidna pigmentepitelopatija, miopična degeneracija mrežnjače, akutni retinalni pigmentni epitelitis, distrofije ili displazije rožnjače i slično.

[0024] Dalji primeri izvođenja se odnose na kompoziciju koja uključuje jedinjenje I, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so (npr. poliacetatnu so i triacetatnu so), i farmaceutski nosač konfigurisan za isporuku u oči. Kompozicija se može formulisati za intraokularnu, intravitrealnu ili periokularnu primenu. Jedinjenje I, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so unutar kompozicije, štiti odvojene fotoreceptorske ćelije mrežnjače. Jedinjenje I, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so unutar kompozicije, sprečava ćelijsku smrt na spoljašnjim putevima, uključujući apoptozu u ćelijama pigmentiranog epitela mrežnjače oka. Jedinjenje I, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so unutar kompozicije, sprečavaju bolesti ganglijskih ćelija mrežnjače, kao što je glaukom. Kompozicija je sterilna, nepirogena i nije toksična za oko. Kompozicija može dalje da uključuje najmanje jedan nejonski surfaktant. Najmanje jedan nejonski surfaktant može biti Polysorbate 80, Polysorbate 20, Poloxamer ili Tyloxapol, ali nije ograničen na ove primere. Najmanje jedan nejonski surfaktant može formirati približno 0,01%-20% tež./tež. kompozicije; alternativno, približno 0,05%-10% tež./tež. kompozicije; i alternativno, približno 0,1%-3% tež./tež. od kompozicije. Alternativno, može se koristiti mešavina nejonskih surfaktanata, gde se najmanje dva od prethodno navedenih, ili drugi nejonski surfaktanti, koriste zajedno u odnosu, koji optimizuje željenu farmakokinetiku formulacije, gde ukupne količine surfaktanata spadaju u prethodno opisane granice. Kompozicija može dalje da uključuje organski korastvarač, kao što je propilen glikol ili dimetilsulfoksid. Organski korastvarač može formirati približno 1%-50% tež./tež. kompozicije; alternativno, približno 1%-20% tež./tež. kompozicije; i alternativno, približno 1%-5% tež./tež. kompozicije. Sredstvo za izotoničnost, kao što je trehaloza ili manitol ili sorbitol, ili rastvorljiva neorganska so, kao što je NaCl, takođe se može dodati da bi toničnost rastvora bila u opsegu od 250-400 mOsm/L. Kompozicija može imati pH u opsegu 2,5-6,0 i biti puferovana sredstvima koja su poznata stručnjaku u tehnici.

[0025] Drugi primer izvođenja se odnosi na jedinjenje koje uključuje jedinjenje I ili njegovu farmaceutski prohvatljivu so, i farmaceutski nosač konfigurisan za ispruku u oči za upotrebu u postupku lečenja očnog stanje, bolest ili stanja ili bolest koja utiče na zdravlje oka kod subjekta koji pati od stanja oka, bolesti, ili stanja ili bolesti koja utiče na zdravlje oka. Stanje oka, bolest, ili stanje ili bolest koja utiče na zdravlje oka može biti ablacija mrežnjače, degeneracija makule, degeneracija makule povezane sa starenjem, neeksudativna degeneracije makule povezane sa starenjem, eksudativna degeneracija makule povezana sa starenjem, horoidalna neovaskularizacija, retinopatija, dijabetička retinopatija, akutna i hronična neuroretinopatija makule, centralna serozna horioretinopatija, makularni edem, cistoidni makularni edem, dijabetički makularni edem, uveitis/retinitis/horoiditis, multifokalna plakoidna pigmentna epiteliopatija, Behcet-sova bolest, birdshot retinohoroidopatija, zaraza (sifilis, lajmska bolest, tuberkuloza, toksoplazmoza), uveitis, srednji uveitis (pars planitis), anteriorni uveitis, multifokalni horoiditis, sindrom višestrukih evanescentnih belih tačaka (MEWDS), sarkoidoza oka, posteriorni skleritis, serpignozni horoiditis, subretinalna fibroza, sindrom uveitisa, Vogt-Koyanagi-Harada sindrom; arterijska okluzivna bolest mrežnjače, okluzija centralne vene mrežnjače, diseminovana intravaskularna koagulopatija, okluzija grane vene mrežnjače, hipertenzivne promene fundusa, sindrom ishemije oka, mikroaneurizme arterija mrežnjače, Coats-ova bolest, parafovealna telangiektazija, okluzija hemiretinalne vene, papiloflebitis, okluzija centralne arterije mrežnjače, okluzija grane arterije mrežnjače, bolest karotidne arterije (CAD), angitis smrznute grane, retinopatija srpastih ćelija i druge hemoglobinopatije, angioidne pruge, familijarna eksudativna vitreoretinopatija, Eales-ova bolest, simpatička oftalmija, uveitska bolest mrežnjače, ablacija mrežnjače, fotokoagulacija izazvana traumom, laserom, PDT, hipoperfuzija tokom operacije, radijaciona retinopatija, retinopatija kod transplantacije koštane srži, proliferativna vitrealna retinopatija i epiretinalne membrane, proliferativna dijabetička retinopatija, okularna histoplazmoza, okularna toksokariaza, sindrom očne histoplazmoze (OHS), endoftalmitis, toksoplazmoza, bolesti mrežnjače povezane sa HIV infekcijom, horoidna bolest povezana sa HIV infekcijom, uveitična bolest povezana sa HIV infekcijom, virusni retinitis, akutna nekroza mrežnjače, progresivna nekroza spoljašnje mrežnjače, gljivične bolesti mrežnjače, okularni sifilis, okularna tuberkuloza, difuzni unilateralni subakutni neuroretinitis, mijaza, pigmentni retinitis, sistemski poremećaj povezan sa distrofijom mrežnjače, kongenitalno stacionarno noćno slepilo, konusne distrofije, Stargardt-ova bolest, fundus flavimaculatus, Bestova bolest, distrofičnog obrasca pigmentnog epitela mrežnjače, X-vezana retinošiza, Sorsby-ova distrofija fundusa, benigna koncentrična makulopatija, Bietti-ova kristalna distrofija, pseudoxanthoma elasticum, ablacija mrežnjače, makularna rupa, ogromno kidanje mrežnjače, oboljenje mrežnjače povezano sa tumorima, urođena hipertrofija RPE, posteriorni uvealni melanoma, horoidalni hemangiom, horoidalni osteom, horoidalne metastaze, kombinovani hamartom mrežnjače i pigmentnog epitela mrežnjače, retinoproblastom, vazoproliferativni tumori očnog fundusa, astrocitom mrežnjače, intraokularni limfoidni tumori, tačkasta unutrašnja horoidopatija, akutna posteriorna multifokalna plakoidna pigmentepitelopatija, miopična degeneracija mrežnjače, abnormalna homeostaza pigmentnog epitela mrežnjače, akutni retinalni pigmentni epitelitis, glaukom, distrofije ili displazije rožnjače i slično. Kompozicija se može primeniti u količini dovoljnoj da ublaži ćelijsku smrt unutar subjekta. Kompozicija se primenjuje u količini dovoljnoj da poboljša preživljavanje fotoreceptora unutar navedenog subjekta. Kompozicija se primenjuje u količini dovoljnoj da zaštiti ćelije pigmentiranog epitela mrežnjače unutar navedenog subjekta. Kompozicija se primenjuje u količini koja je dovoljna da zaštiti ganglijske ćelije mrežnjače unutar navedenog subjekta.

[0026] Drugi primer izvođenja se odnosi na kompoziciju koja uključuje jedinjenje I, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, i sterilni, nepirogeni farmaceutski nosač, za upotrebu u postupku sprečavanja smrti fotoreceptora, RPE ili ganglijskih ćelija mrežnjače koji sadrži primenjivanje kompozicije na subjekta koja uključuje jedinjenje I, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, i sterilni, nepirogeni farmaceutski nosač. Smrt fotoreceptora, RPE ili ganglijskih ćelija mrežnjače je apoptoza fotoreceptora ili RPE ćelija posredovana sa Fas. Subjekt može biti izložen riziku od smrti fotoreceptora, RPE ili ganglijskih ćelija mrežnjače. Kompozicija se može primenjivati na subjekta intraokularno, intravitrealno ili periokularno.

[0027] Još jedan primer izvođenja se odnosi na kompoziciju koja sadrži jedinjenje I, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, za upotrebu u postupku povećanja preživljavanja fotoreceptora, RPE ili ganglijskih ćelija mrežnjače, uključujući primenjivanje zaštitne kompozicije fotoreceptora, RPE ili ganglija mrežnjače koja sadrži jedinjenje I, ili njihovu farmaceutski prihvatljivu so. Povećano preživljavanje fotoreceptora, RPE ili ganglijskih ćelija mrežnjače obuhvata inhibiciju apoptoze fotoreceptora, RPE ili ganglijskih ćelija mrežnjače. Smrt fotoreceptora, RPE ili ganglijskih ćelija mrežnjače obuhvata apoptozu Fas-posredovanog fotoreceptora, RPE ili ganglijskih ćelija mrežnjače. Smrt fotoreceptora, RPE ili ganglijskih ćelija mrežnjače obuhvata apoptozu TRAIL-posredovanog fotoreceptora, RPE ili ganglijskih ćelija mrežnjače. Smrt fotoreceptora, RPE ili ganglijskih ćelija mrežnjače obuhvata nekroptozu TNFR-posredovanog fotoreceptora, RPE ili ganglijskih ćelija mrežnjače. Smrt fotoreceptora, RPE ili ganglijskih ćelija mrežnjače obuhvata piroptozu ekstrinzičnim putem-posredovanog fotoreceptora, RPE ili ganglijskih ćelija mrežnjače. Kompozicija se može primenjivati na subjekta sistemski putem intravenskog, subkutanog ili intramuskularnog ubrizgavanja, ili oralno,

1

ili lokalno, tj. intraokularno, intravitrealno, topikalno, suprahoroidalno, subkonjunktivno, subretinalno ili periokularno.

KRATAK OPIS CRTEŽA

[0028]

Slika 1 prikazuje grafik koji prikazuje blokadu Fas-indukovane aktivacije kaspaze 8 pomoću Met 12 i trihidrohloridom jedinjenja I u ćelijama od 661W. Ćelije 661W su prethodno tretirane različitim količinama ili Met-12 ili jedinjenja I rastvorenog u DMSO, oba na 20 mg/mL tokom 1 sata. Zatim je dodat FasL (500 ng/mL) i izmerena je aktivnost kaspaze 8 na 48 sati nakon tretmana sa FasL.

Slika 2 prikazuje grafik koji prikazuje blokadu Fas-indukovane aktivacije kaspaze 8 pomoću Met-12 i trihidrohloridom jedinjenja I u ćelijama od 661W. Ćelije 661W su prethodno tretirane tokom 1 sata različitim količinama Met-12 u DMSO (krug), jedinjenja I u DMSO (20 mg/mL dijamanta) i jedinjenja I u 2% Polysorbate (PS) 20, 2% propilen glikola (PG) pH 4 formulacije (trougao), sve formulacije u koncentraciji od 10 mg/mL. Ćelije su zatim tretirane sa FasL (500 ng/mL) i aktivnost kaspaze 8 je merena 48 sati nakon tretmana sa FasL.

Slika 3 prikazuje grafik koji prikazuje blokadu Fas-indukovane aktivacije kaspaze 8 trihidrohloridom jedinjenja I u ćelijama 661W. Ćelije 661W su prethodno tretirane tokom 1 sata različitim količinama jedinjenja I u DMSO (20 mg/mL) (krug), i u formulaciji 3% Polysorbate 20, 3% propilen glikola pH 4 (trougao) i u 1% Polysorbate 20, 3% propilen glikola pH 4 (dijamant), sve formulacije u koncentraciji od 10 mg/mL. Ćelije su zatim tretirane sa FasL (500 ng/mL) i aktivnost kaspaze 8 je merena 48 sati nakon tretmana sa FasL.

Slika 4 prikazuje grafik koji prikazuje blokadu Fas-indukovane aktivacije kaspaze 8 trihidrohloridom jedinjenja I u ćelijama od 661W. Ćelije 661W su prethodno tretirane različitim količinama trihidrohlorida jedinjenja I u DMSO (20 mg/mL) (krug) i u 0,4% Polysorbate-20, 4,5% manitola, 10 mM acetata pH 4 formulacije (trougao), na 2 mg/mL koncentracije. Ćelije su zatim tretirane sa FasL (500 ng/mL) i aktivnost kaspaze 8 je merena 48 sati nakon tretmana sa FasL.

Slika 5a prikazuje logaritamski grafikon koncentracija jedinjenja I u mrežnjači zeca koje se isporučuje intravitrealno u tri Poloxamer formulacije.

Slika 5b prikazuje logaritamski grafikon koncentracija jedinjenja I u mrežnjači zeca koje se isporučuje intravitrealno da bi se uporedila formulacija na bazi Poloxamer 407 sa formulacijom na bazi Polysorbate-20 tokom vremena.

Slika 6a prikazuje linearni grafikon koncentracija zečjeg staklastog tela (VH) tokom vremena jedinjenja I isporučenog intravitrealno u tri Poloxamer formulacije sa različitim koncentracijama surfaktanta (0,4% ili 0,1%) i različitim koncentracijama jedinjenja I (2 mg/mL nasuprot 0,5 mg/mL ).

Slika 6b prikazuje linearni grafik koncentracija zečjeg VH tokom vremena sa različitim izborom surfaktanta (0,4% Poloxamer 407 nasuprot 0,4% Polysorbate 20) i promenljive količine jedinjenja I (2 mg/mL nasuprot I mg/mL).

Slika 7 prikazuje ukupne količine triacetata jedinjenja I u staklastom telu, (tamno) i koncentracija u mrežnjačama, (svetlo) smeđih norveških pacova 24 i 72 sata nakon nominalnog ubrizgavanja 300 ng triacetata jedinjenja I (5 µL 0,06 mg/ mL) u 4,5% manitola, 10 mM sirćetne kiseline, 0,4% poloxamer (PX) 407, pH 4,5.

Slika 8 prikazuje grafikon sa stubićima koji prikazuje broj apoptotičkih ćelija nakon 72 sata nakon in vivo tretmana ablazovane mrežnjače kod pacova sa Met-12 trihidrohloridom (svetla traka) (5 µg u 5 µL DMSO) i trihidrohloridom jedinjenja I (tamno) (0,5, 1,0, 5 i 10 µg u 5 µL DMSO), ili DMSO sredstvom (svetlo). LHS stubić je neablazovana kontrolna mrežnjača bez ubrizgavanja.

Slika 9 prikazuje dijagram sa stubićima koji prikazuje broj apoptotičkih ćelija nakon 72 sata nakon in vivo tretmana ablazovane mrežnjače kod pacova sa trihidrohloridom jedinjenja I (1,0 i 5 µg u 5 µL F1 ili F2), naspram istog (5 µg u 5 µL) u DMSO ili DMSO sredstvu (sivo). LHS stubić je neablazovana kontrolna mrežnjača bez ubrizgavanja. F1 (5/1 µg) je 1,0/0,2 mg/mL trihidrohlorida jedinjenja I u 3% PG/3% PS-20 na pH 4,0 (crna), a F2 (5/1 µg) je 1,0/0,2 mg/mL trihidrohlorida jedinjenja I u 2% PG/2% PX-407 na pH 4,0 (vertikalne pruge).

Slika 10 prikazuje grafikon sa stubićima koji prikazuje procenat apoptotičkih ćelija nakon 72 sata nakon in vivo tretmana ablazovane mrežnjače kod pacova. Stubić I je kontrolno sredstvo u ablazovanim mrežnjačama. Stubić 2 sa 1 µg triacetata jedinjenja I kao 0,2 mg/mL rastvora DMSO. Stubić 3 je 1 µg trihidrohlorida jedinjenja I kao 0,2 mg/mL rastvora DMSO. Stubić 4 je neablazovana kontrolna mrežnjača bez ubrizgavanja.

DETALJAN OPIS

[0029] Opisani su biološki aktivne kompozicije peptida, farmaceutski preparati biološki aktivnih kompozicija peptida i postupci upotrebe kompozicija peptida.

[0030] Termin "terapeutski efikasna količina" označava količinu leka ili sredstva (npr. jedinjenja I) koja je efikasna da olakša željeni terapeutski efekat u određenoj klasi subjekata (npr. malo dete, dete, adolescent, odrasla osoba). Kako je upotrebljen ovde, termin "subterapeutik" se odnosi na količinu farmaceutskog leka ili sredstva koja je nedovoljna da se postigne željeni i/ili očekivani terapijski rezultat/ishod nakon primene na prosečnom i/ili tipičnom subjektu (npr. prosečna veličina, ne uzimaju kontraindikovana farmaceutska sredstva, imaju sličnu reakciju na dozu kao većina populacije itd.). Preporučene doze američke Uprave za hranu i lekove (FDA) ukazuju na terapijsku dozu.

[0031] Kako su upotrebljeni ovde, termini "farmaceutski lek" ili "farmaceutsko sredstvo" odnose se na jedinjenje, peptid, makromolekul ili drugi entitet koji se primenjuje (npr. u kontekstu farmaceutske kompozicije) na subjekat da izazove željeni biološki odgovor. Farmaceutsko sredstvo može biti "lek" ili bilo koji drugi materijal (npr., peptid, polipeptid), koji je biološki aktivan kod čoveka ili drugog sisara, lokalno i/ili sistemski. Primeri lekova su otkriveni u Merck Index i Physicians Desk Reference.

[0032] Kako je upotrebljen ovde, termin "farmaceutska formulacija" se odnosi na najmanje jedno farmaceutsko sredstvo (npr. jedinjenje I) u kombinaciji sa jednom ili više dodatnih komponenti koje pomažu da se farmaceutsko sredstvo(a) učini pogodnim za postizanje željenog efekta nakon primene na subjekta. Farmaceutska formulacija može uključivati jedan ili više aditiva, na primer farmaceutski prihvatljive ekscipijente, nosače, pojačivače penetracije, premazivače, stabilizatore, pufere, kiseline, baze ili druge materijale koji su fizički povezani sa farmaceutskim sredstvom da bi se poboljšala primena, oslobađanje (npr. vreme oslobađanja), isporučivost, bioraspoloživost, efikasnost, itd. doznog oblika. Formulacija može biti, na primer, tečnost, suspenzija, čvrsta supstanca, nanočestica, emulzija, micela, mast, gel, emulzija, obloga, itd. Farmaceutska formulacija može obuhvatati jedno farmaceutsko sredstvo (npr. jedinjenje I) ili više farmaceutskih sredstava. Farmaceutska kompozicija može da obuhvati jednu farmaceutsku formulaciju ili više farmaceutskih formulacija. U nekim primerima izvođenja, farmaceutsko sredstvo (npr., jedinjenje I) je formulisan za određeni način primene (npr., očna primena (npr. intravitrealna primena, itd.), itd.). Farmaceutska formulacija je sterilna, nepirogena i netoksična za oko.

[0033] Kako je upotrebljen ovde, termin "farmaceutska kompozicija" se odnosi na kombinaciju jednog ili više farmaceutskih sredstava sa jednim ili više nosača, inertnih ili aktivnih, čineći kompoziciju posebno pogodnom za dijagnostičku ili terapeutsku upotrebu in vitro, in vivo ili ex vivo. Farmaceutska kompozicija se sastoji od fizičkog entiteta koji se primenjuje na subjekta i može imati oblik čvrstog, polučvrstog ili tečnog doznog oblika, kao što su tablete, kapsule, tablete za oralno raspadanje, pilule, prah, supozitorije, rastvor, eliksir, sirup, suspenzija, krema, pastila, pasta, sprej, itd. Farmaceutska kompozicija može da sadrži jednu farmaceutsku formulaciju (npr. produženo oslobađanje, trenutno oslobađanje, odloženo oslobađanje, nanočestice, itd.) ili više formulacija (npr. trenutno oslobađanje i odloženo oslobađanje,

1

nanočestice i ne-nanočestice, itd.). Termini "farmaceutska kompozicija" i "farmaceutska formulacija" mogu se koristiti naizmenično.

[0034] Kako je upotrebljen ovde, termin "farmaceutski prihvatljiv nosač" odnosi se na bilo koji od standardnih farmaceutskih nosača, kao što je fiziološki rastvor puferovan fosfatom, voda, emulzije (npr., kao što su emulzije ulje/voda ili voda/ulje), i različite vrste sredstava za vlaženje. Kompozicije takođe mogu uključivati stabilizatore i konzervanase. Za primere nosača, stabilizatora i ađuvanata videti, npr. Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences, 15th Ed., Mack Publ. Co., Easton, Pa. [1975].

[0035] Kako je upotrebljen ovde, termin "farmaceutski prihvatljiva so" odnosi se na bilo koju kiselinu ili bazu farmaceutskog sredstva ili aktivnog metabolita ili njegovog ostatka. Kao što je poznato stručnjacima u tehnici, "soli" jedinjenja ovog pronalaska mogu biti izvedene iz neorganskih ili organskih kiselina i baza. Primeri kiselina uključuju, ali se ne ograničavaju na, hlorovodoničnu, bromovodoničnu, sumpornu, azotnu, perhlornu, fumarnu, maleinsku, fosfornu, glikolnu, mlečnu, salicilnu, sukcinsku, toluen-p-sulfonsku, vinsku, sirćetnu, limunsku, metansulfonsku, etansulfonsku, mravlju, benzojevu, malonsku, naftalen-2-sulfonsku, benzensulfonsku kiselinu i slično. Druge kiseline, kao što je oksalna, iako same po sebi nisu farmaceutski prihvatljive, mogu se upotrebiti u pripremi soli korisnih kao intermedijeri u dobijanju jedinjenja prema pronalasku i njihovih farmaceutski prihvatljivih kiselinskih adicionih soli.

[0036] Kako je upotrebljen ovde, termin "primena" se odnosi na čin davanja leka, proleka ili drugog sredstva, ili terapeutskog tretmana (npr. kompozicije prema ovom pronalasku) subjektu (npr. subjektu ili ćelijama, tkivima i organima in vivo, in vitro ili ex vivo). Ogledni putevi primene u ljudsko telo mogu biti kroz oči (oftalmološki), usta (oralno), kožu (transdermalno), nos (nazalno), pluća (inhalatorno), oralnu sluzokožu (bukalno), uho, rektalno, ubrizgavanjem (npr. intravenozno, subkutano, intratumoralno, intraperitonealno, itd.) i slično.

[0037] Kako je upotrebljen ovde, termin "istovremena primena" se odnosi na primenu najmanje dva sredstva (npr., jedinjenja I i jednog ili više dodatnih terapeutika) ili terapija na subjekta. U nekim primerima izvođenja, istovremena primena dva ili više sredstava/terapija je istovremena. U drugim primerima izvođenja, istovremena primena dva ili više sredstava/terapija je sekvencijalna (npr., prvo sredstvo/terapija se primenjuje pre drugog sredstva/terapije). U nekim primerima izvođenja, dve ili više terapija se primenjuju istovremeno, ali se oslobađaju (npr. apsorbuju, postaju biodostupne, itd.) sekvencijalno. Stručnjaci u tehnici razumeju da formulacije i/ili putevi primene različitih korišćenih sredstava/terapija mogu da variraju. Odgovarajuću dozu za istovremenu primenu može lako odrediti stručnjak u tehnici. U nekim primerima izvođenja, kada se sredstva/terapije primenjuju istovremeno, odgovarajuća sredstva/terapije se primenjuju u nižim dozama od onih koje su odgovarajuće za njihovu samostalnu primenu.

[0038] Pronalazak je izložen u priloženom skupu patentnih zahteva.

[0039] Ovde su obezbeđeni farmaceutski preparati biološki aktivnih, vodenih formulacija peptida za zaštitu fotoreceptora, njihovi farmaceutski preparati i postupci za sprečavanje smrti fotoreceptora sa njima, kao i terapeutski postupci.

Jedinjenje I. His-His-Ile-Tyr-Leu-Gly-Ala-Val-Asn-Tyr-Ile-Tyr-amid (SEQ ID BR:I); Formula I.

[0040] Neki primeri izvođenja se odnose na jedinjenje I (prethodno navedeno), ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so. Određeni primeri izvođenja se odnose na poliacetatnu so jedinjenja I. Određeni dalje primeri izvođenja se odnose na triacetatnu so jedinjenja I.

[0041] Jedinjenja mogu biti za upotrebu u farmaceutskoj formulaciji za sprečavanje Fas- ili TRAIL posredovane apoptoze u fotoreceptorima oka. U FasL-indukovanom modelu toksičnosti fotoreceptora, u 661W ćelijama, jedinjenje I je 10 puta snažnije u sprečavanju aktivacije kaspaze 8 od Met-12 pomoću IC50, i približno 3 puta snažnije od Met-12 mereno jačinom doze na maksimalnoj inhibiciji. U in vivo modelu ablacije mrežnjače kod pacova, jedinjenje I je najmanje 10 puta snažnije od Met-12 u zaštiti fotoreceptorskih ćelija od apoptoze, i, za razliku od Met-12, može se efikasno isporučiti u klinički prihvatljivim formulacijama.

[0042] Kako je pokazano u primerima, Fas inhibicija pomoću jedinjenja I je rezultovala značajnim očuvanjem fotoreceptorskih ćelija in vivo. U 661W ćelijama, tretman jedinjenjem I je rezultovao dubokom inhibicijom aktivacije kaspaze 8. Kao takvo, veruje se da primena jedinjenja I na subjekta sa okularnim stanjem, bolešću ili stanjem ili bolešću koja utiče na zdravlje oka može dati poboljšanu zaštitu ćelija mrežnjače uključujući, ali ne ograničavajući se na, fotoreceptore, ćelije pigmentnog epitela mrežnjače i ganglijske ćelije mrežnjače., od Fasposredovane apoptoze, što dovodi do poboljšanja i/ili lečenja očnog stanja, bolesti ili stanja ili bolesti koje utiču na zdravlje oka.

[0043] U kliničkoj praksi, pacijenti se generalno javljaju sa već nastalom ablacijom. Životinjski modeli mrežnjača-RPE razdvajanja pokazuju da se aktivacija Fas-puta odvija rano i da ostaje

1

povišena tokom čitavog trajanja ablacije (Zacks et al. Arch Ophthalmol 2007; 125:1389-1395, Zacks et al. IOVS 2004; 45(12):4563-4569.8.). Odvajanje mrežnjače i RPE se takođe susreće u širokom spektru bolesti mrežnjače. Smatra se da klinička relevantnost anti-Fas terapije u preživljavanju ćelija mrežnjače nije ograničena na ablaciju mrežnjače. Na primer, Fasposredovana apoptoza može imati ulogu u smrti fotoreceptorskih ćelija u degeneraciji makule povezane sa starenjem (AMD) (Dunaief et al. Arch Ophthalmol. 2002; 120(11):1435-1442; Zacks et al. Arch Ophthalmol 2007; Petrukhin K. New therapeutic targets in atrophic age-related macular degeneration. Expert Opin Ther Targets.2007. 11:625 ― 639; Miller JW. Treatment of age-related macular degeneration: beyond VEGF. Jpn J Ophthalmol. 2010. 54:523 ― 528; Rogala J, Zangerl B, Assaad N, Fletcher EL, Kalloniatis M, Nivison-Smith L. In Vivo Quantification of Retinal Changes Associated with Drusen in Age-Related Macular Degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2015. 56:1689 ― 1700). Degeneracija makule povezane sa starenjem se karakteriše progresivnom degeneracijom RPE i uzrokuje spoljašnju degeneraciju i reorganizaciju mrežnjače slično onoj koja se javlja nakon ablacije mrežnjače (Jager et al. N Engl J Med. 2008; 358:2606-17, Johnson et al. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2003; 44:4481-488). U neovaskularnom obliku AMD takođe postoji eksudacija tečnosti ispod mrežnjače, stvarajući stvarno odvajanje ovog tkiva od osnovnog RPE (Jager et al. N Engl J Med.

2008; 358:2606-17). Neovaskularni AMD može dovesti do produženih perioda odvajanja mrežnjače-RPE i aktivacije Fas-puta. Korisnost anti-Fas tretmana bi najverovatnije bila kao ađuvant koji ima za cilj zaštitu ćelija mrežnjače (kao što su fotoreceptori i pigmentni epitel mrežnjače) dok se osnovni poremećaj leči (Brown et al. N Engl J Med. 2006 Oct. 5; 355(14):1432-44).

[0044] Glaukom je progresivno degenerativno okularno stanje koje se karakteriše smrću ganglijskih ćelija mrežnjače (RGCs), a prethodno objavljeno istraživanje je pokazalo da RGCs umiru apoptozom (Ji et al. Vision Res. 2005; 45(2): 169-179). Intraokularni pritisak (IOP) je glavni faktor rizika za razvoj glaukoma i značajni napori su uloženi u smanjenje IOP korišćenjem analoga prostaglandina da bi se sprečila apoptoza RGC (Doucette and Walter. Ophthalmic Genet. 2016; 12:1-9). Fas je takođe umešan u smrt RGC (Gregory et al. PLoS One.

2011; 6(3):e 17659), a životinjski modeli IOP pokazuju povećanu ekspresiju Fas i FasL (Ju et al. Brain Res. 2006; 1122(1): 209-221), što ukazuje na potencijalnu korisnost Fas inhibicije kao sredstva za zaštitu vijabilnosti RGC i ublažavanje degenerativne prirode glaukoma.

[0045] U nekim primerima izvođenja, opisani polipeptid se može pripremiti postupcima poznatim stručnjacima u tehnici. Na primer, jedinjenje I za koje se traži zaštita može se sintetizovati korišćenjem standardnih tehnika sinteze polipeptida u čvrstoj fazi (npr. Fmoc). Alternativno, polipeptid se može sintetizovati korišćenjem tehnologije rekombinantne DNK (npr.

1

korišćenjem bakterijskih ili eukariotskih ekspresionih sistema), koji prekomerno eksprimiraju i peptid i odgovarajući enzim amidaze da bi se izvršila amidacija C-kraja.

[0046] Konkretno, kao što je opisano u Primeru I, jedinjenje I se može dobiti izgradnjom Met-12 peptidne sekvence, H<60>HIYLGAVNYIY<71>(SEQ ID BR: 2) na amino smoli, kao što je poznatno stručnjacima u tehnici da se proizvodi nakon uklanjanja zaštite i smola cepa njen C-krajnji amid H<60>HIYLGAVNYIY-NH2, jedinjenja I (SEQ ID BR: I). Konkretno, jedinjenje I može se konceptualno dobiti iz c-Met sekvence normalnom hidrolizom amida između ostataka 59 i 60, i neprirodnim prekidom peptidnog lanca između peptidnog azota i α -ugljenika ostatka 72, a ne na karbonil ugljeniku ostatka 71. Ovo nije cepanje, koje se dešava prirodno. Met-12 je prethodno opisan u U.S. Pat. No.8,343,931.

[0047] Upotreba amidiranog peptida na C-kraju, tj. jedinjenja I, zasnivala se na verovanju da ova specifična modifikacija može povećati pH pri kojem je peptid rastvorljiv u vodi ili se meša u micelama uklanjanjem slobodne karboksilne kiseline, koja je značajno deprotonirana iznad pH 3. Rezultujuće vrste ne bi imale anjon na C-kraju pri bilo kom fiziološki relevantnom pH, niti bi bile zvitterion pod bilo kojim fizički relevantnim okolnostima, i bile bi trikatjonska vrsta ispod oko pH 5. Ova promena bi mogla biti najlakša postignuta pretvaranjem u amid ili estar, od kojih nijedan nije deprotonabilan u fiziološkim uslovima. Amidi su biološki i hemijski stabilniji od estara, a takođe i manje hidrofobni, pa je odabran jednostavni primarni amid.

[0048] U određenim primerima izvođenja, jedinjenje I se može proizvesti pretvaranjem Met-12 u njegov primarni amid na C-kraju, da bi se formiralo jedinjenje I, iako je generalno praktičnije izgraditi peptid iz već aminiranog prvog aminokiselinskog ostatka, upotrebom amino smola, poznatih stručnjaku u tehnici. Kako je navedeno u odeljku sa primerima u nastavku, jedinjenje I je dobijeno i prvobitno testirano kao trihidrohlorid, iako se kasnije smatralo da je triacetatna so pogodnija za formulaciju.

[0049] Postoje određene prednosti upotrebe jedinjenja I u odnosu na Met-12. Konkretno, kako je prikazano u primerima u nastavku, jedinjenje I se može formulisati sa surfaktantima da bi se proizveli micelarni rastvori pri pH vrednostima i količinama aditiva, koji su prethodili u formulacijama za oči. Drugo, na osnovu in vitro analize efikasnosti, jedinjenje I je iznenađujuće 10 puta snažnije od Met-12 određivanjem IC50i približno 3 puta snažnije mereno koncentracijom maksimalne inhibicije. Konkretno, kada se Met-12 i jedinjenje I testiraju u istoj formulaciji in vitro, jedinjenje I ima veću jačinu doze od Met-12. Ovo omogućava da se postigne isti fiziološki efekat sa nižim količinama jedinjenja I nego Met-12. Treće, u in vivo testiranju na modelu ablacije mrežnjače kod pacova, jedinjenje I je iznenađujuće najmanje pet puta jače od Met-12 u sprečavanju apoptoze u fotoreceptorskim ćelijama u odvojenom delu mrežnjače. Četvrto, u nekim od otkrivenih formulacija jedinjenja I, efikasnost u modelu ablacije mrežnjače kod pacova

1

se postiže na nivoima koji su više od 10 puta niži nego što se vidi kod Met-12. Konačno, jedinjenje I pokazuje veoma produženi poluživot i u staklastom telu, i u mrežnjači zečeva tretiranih intravitrealno, a ovi poluživoti se mogu produžiti u različitim razmerama korišćenjem različitih formulacija, omogućavajući da se formulacijom kontroliše ukupna izloženost mrežnjače jedinjenju I.

[0050] U nekim primerima izvođenja, jedinjenje I je efikasno u jednom ili više od: sprečavanje/inhibiranje/smanjenje Fas- posredovane apoptoze fotoreceptora, sprečavanje apoptoze u ćelijama pigmentiranog epitela mrežnjače oka, povećanje preživljavanja fotoreceptora, sprečavanje ćelijske smrti povezano sa degeneracijom makule povezanom sa starenjem (AMD), sprečavanje ćelijske smrti povezanom sa ablacijom mrežnjače, itd. U nekim dodatnim primerima izvođenja, jedinjenje I je efikasno u zaštiti ganglijskih ćelija mrežnjače, koje primaju vizuelne informacije od fotoreceptora preko dva intermedijarna tipa neurona: bipolarne ćelije i amakrine ćelije mrežnjače.

[0051] U nekim primerma izvođenja, terapeutski aktivna količina jedinjenja I ili njegovog preparata (tj. formulacija ili kompozicija) se primenjuje na sisarskog subjekta kome je potrebno lečenje (npr. za određeno očno stanje) i na mestu dovoljnom da inhibira ili ublaži apoptozu unutar pacijenta (npr. unutar željenog tkiva). Poželjni subjekt je čovek sa očnim stanjem, bolešću ili stanjem ili bolešću koja utiče na zdravlje oka.

[0052] Primenjena količina je dovoljna da pruži poboljšanu zaštitu ćelija mrežnjače i/ili ganglijskih ćelija mrežnjače, uključujući, ali ne ograničavajući se na, fotoreceptore, pigmentni epitel mrežnjače i ganglije mrežnjače, od Fas-posredovane apoptoze, ili spreči smrt ćelija mrežnjače, što rezultuje poboljšanjem i/ili lečenjem očnog stanja, bolesti ili stanja ili bolesti koje utiču na zdravlje oka.

[0053] Određivanje terapeutski efikasne doze je u mogućnostima praktičara u tehnici. U nekim primerima izvođenja, efikasna doza za ljude biće u opsegu od 5-10,000 µg/oku, 50-5,000 µg/oku ili 100-2,000 µg/oku. Predviđene su ponovljene doze da bi se održao efikasan nivo (npr. nedeljno, svake druge nedelje, mesečno, kvartalno, polugodišnje itd.).

[0054] U nekim primerima izvođenja, farmaceutska formulacija je sterilna, nepirogena tečnost i sadrži najmanje 0,1 mg/ml (npr. >0,1, > 0,2, >0,5, >0,6, >0,7, >0,8 i >0,9), na najmanje I mg/ml (npr. > I mg/ml, >2 mg/ml, >5 mg/ml, > 10 mg/ml, itd.) peptida/polipeptida opisanog ovde (npr.

1 mg/ml, 2 mg/ml, 5 mg/ml, 10 mg/ml ili više) peptida/polipeptida (npr. jedinjenje I).

[0055] U nekim primerima izvođenja, terapeutska doza sadrži najmanje 0,01 ml (npr. 0,01 ml...

0,02 ml...0,05 ml... 0,1 ml...0,2 ml... 0,5 ml... I ml... 2 ml...3 ml... 4 ml, i zapremine i opsege u njima) tečne farmaceutske formulacije koja sadrži fotoreceptor- ili RPE-zaštitni peptid/polipeptid (npr. jedinjenje I). U nekim primerima izvođenja, zapremina tečnosti od 10 do 500 µl se

1

ubrizgava u ljudsko oko (npr.10 µl, 20 µl, 30 µl, 40 µl, 50 µl, 75 µl, 100 µl, 200 µl, 300 µl, 400 µl, 500 µl, i zapremine i opsege u njima). U nekim primerima izvođenja, zapremina od 50 do 600 µl se ubrizgava u ljudsko oko (npr.50 µl, 75 µl, 100 µl, 200 µl, 300 µl, 400 µl, 500 µl, 600 µl i zapremine i opsege u njima). U nekim primerima izvođenja, kada se intraoperativno ubrizgava, mogu se koristiti zapremine mililitarske skale (npr. do ukupne zapremine šupljine staklastog tela (npr. oko 4 ml). U nekim primerima izvođenja jedinjenje se može ugraditi u rastvor perfuzata koji se koristi za održavanje unutrašnjeg očnog pritiska tokom vitrektomije.

[0056] U nekim primerima izvođenja, obezbeđena je jedna doza (npr. za lečenje akutnog stanja (npr. ablacije mrežnjače). U nekim primerima izvođenja, višestruke doze (npr. dnevno, nedeljno, mesečno, itd.) su obezbeđene za lečenje hroničnog stanja Formulacija može biti različita u zavisnosti od potrebnog trajanja izlaganja za stanje koje se leči.

[0057] U nekim primerima izvođenja, doze tretmana se titriraju naviše od niskog nivoa da bi se optimizovala bezbednost i efikasnost. U nekim primerima izvođenja za intravitrealno ubrizgavanje, doza uključuje 0,01 do 5 mg peptida (npr.0,1 i 2,0 mg).

[0058] U nekim primerima izvođenja, farmaceutski preparati (tj. formulacije i/ili kompozicije) sadrže jedan ili više ekscipijenata. Ekscipijenti pogodni za očnu primenu uključuju, ali se ne ograničavaju na, sredstva toničnosti, konzervanase, helatna sredstva, puferske sredstva, surfaktante, ko-rastvarače i antioksidanse. Pogodna sredstva za podešavanje toničnosti uključuju manitol, natrijum hlorid, glicerin, sorbitol i slično. Pogodni konzervanasi uključuju estar phidroksibenzoeve kiseline, benzalkonijum hlorid, benzododecinijum bromid, polikvaternijum-1 i slično. Pogodna helatna sredstva uključuju natrijum edetat i slično. Pogodna puferska sredstva uključuju fosfate, borate, citrate, acetate, trometamin i slično. Pogodni surfaktanti uključuju jonske i nejonske surfaktante, mada su nejonski surfaktanti poželjni, kao što su polisorbati, polietoksilovani derivati ricinusovog ulja, polietoksilovane masne kiseline, polietoksilovani alkoholi, polioksietilen-polioksipropilen blok kopolimeri (Poloxamer), i oksietilovani tercijarni oktilfenol formaldehidni polimer

(Tyloxapol). Drugi pogodni surfaktanti takođe mogu biti uključeni. Pogodni antioksidansi uključuju sulfite, tiosulfate, askorbate, BHA, BHT, tokoferole i slično.

[0059] Kompozicije prema ovom pronalasku izborno sadrže dodatno aktivno sredstvo. Takva dodatna aktivna sredstva mogu uključivati anti-TNF antitela, kao što su Adalimumab (Ophthalmic Surg Lasers Imaging Retina 45, 332 (2014), Curr Eye Res 39, 1106 (2014)) ili etanercept (PLoS One, 7, e40065), ili inhibitori kinasa za koje je dokazano da čuvaju strukturu mrežnjače kao što je ROCK inhibitor Y-27632 (Molecular Medicine Reports 12, 3655 (2015)), inhibitor adenozin kinaze ABT-702 (Life Sci 93, 78 (2013) ili JNK inhibitorni peptid D- JNK-I (Diabetes 50, 77 (2001), Adv Exptl Med Biol 854, 677 (2016)), ili dokozaheksaenoinska kiselina

1

(J Lipid Res, 54,2236 (2013)) ili RXR pan-agonist PA024 (ibid) ili nekrostatin, ili inhibitori RIP kinaze kao što je Dabrafenib. (Cell Death Dis 5, 1278 (2014)).

[0060] U nekim oglednim primerima izvođenja, najmanje jedan od ekscipijenata, kao što je Polysorbate 20 (npr. do 3%), Poloxamer 407 (npr. do 2%), Tyloxapol (npr. do 3%), kremofor (npr. do 1%); i/ili ko-rastvarači (npr. između 0,5 i 50%), kao što su N,N-dimetilacetamid, etanol, PEG-400, propilen glikol, dimetilsulfoksid (DMSO); ulja ili ciklodekstrini se mogu dodati u farmaceutski preparat.

[0061] U daljim oglednim primerima izvođenja, najmanje jedan nejonski surfaktant (npr. 0,1%-20% tež./tež./kompozicije), kao što je Polysorbate 80, Polysorbate 20, Poloxamer ili Tyloxapol može biti uključen u farmaceutsku kompoziciju. Pored toga, organski ko-rastvarač, kao što je propilen glikol ili dimetilsulfoksid u količini od približno 1-50%, može biti uključen u farmaceutsku kompoziciju. Alternativno, organski ko-rastvarač, kao što je N,N-dimetilacetamid, etanol, PEG-400, propilen glikol, DMSO u količini od približno 1-20%, može biti uključen u farmaceutsku kompoziciju. Alternativno, organski ko-rastvarač, kao što je propilen glikol ili dimetilsulfoksid u količini od približno 1-5%, može biti uključen u farmaceutsku kompoziciju. Alternativno, sredstvo izotoničnosti kao što je manitol, sorbitol, glukoza ili trehaloza, ili neorganska so kao što je natrijum hlorid može biti uključen u farmaceutsku kompoziciju, u količinama potrebnim da se toničnost kompozicije dovede na opseg 250-400 mOsm/L.

[0062] pH kompozicije može biti u opsegu 2,5-6,0. pH se može kontrolisati odgovarajućim puferom i biti u opsegu 3,0-5,0 ili 3,5-4,5.

[0063] U drugom oglednom primeru izvođenja, najmanje jedan nejonski surfaktant (npr. 0,5%-10% tež./tež./kompozicije), kao što je Polysorbate 80, Polysorbate 20, Poloxamer ili Tyloxapol može biti uključen u farmaceutsku kompoziciju. Pored toga, organski ko-rastvarač, kao što je propilen glikol ili dimetilsulfoksid u količini od približno 1-50%, može biti uključen u farmaceutsku kompoziciju. Alternativno, organski ko-rastvarač, kao što je propilen glikol ili dimetilsulfoksid u količini od približno 1-20%, može biti uključen u farmaceutsku kompoziciju. Alternativno, organski ko-rastvarač, kao što je N,N-dimetilacetamid, etanol, PEG-400, propilen glikol, DMSO u količini od približno 1-5%, može biti uključen u farmaceutsku kompoziciju. Alternativno, sredstvo izotoničnosti kao što je manitol, sorbitol, glukoza ili trehaloza, ili neorganska so kao što je natrijum hlorid može biti uključen u farmaceutsku kompoziciju, u količinama potrebnim da se toničnost kompozicije dovede u opseg 250-400 mOsm/L. pH kompozicije može biti u opsegu 2,5-6,0. pH se može kontrolisati odgovarajućim puferom i biti u opsegu 3,0-5,0 ili 3,5-4,5.

[0064] U daljem oglednom primeru izvođenja, najmanje jedan nejonski surfaktant (npr., 1%-3% tež./tež./kompozicije), kao što je Polysorbate 80, Polysorbate 20, Poloxamer ili Tyloxapol može

2

biti uključen u farmaceutsku kompoziciju. Pored toga, organski ko-rastvarač, kao što je propilen glikol ili dimetilsulfoksid u količini od približno 1-50%, može biti uključen u farmaceutsku kompoziciju. Alternativno, organski ko-rastvarač, kao što je N,N-dimetilacetamid, etanol, PEG-400, propilen glikol, DMSO u količini od približno 1-20%, može biti uključen u farmaceutsku kompoziciju. Alternativno, organski ko-rastvarač, kao što je propilen glikol ili dimetilsulfoksid u količini od približno 1-5%, može biti uključen u farmaceutsku kompoziciju. Alternativno, sredstvo izotoničnosti kao što je manitol, sorbitol, glukoza ili trehaloza, ili neorganska so kao što je natrijum hlorid može biti uključen u farmaceutsku kompoziciju, u količinama potrebnim da se toničnost kompozicije dovede u opseg od 250-400 mOsm. pH kompozicije može biti u opsegu 2,5-6,0. pH se može kontrolisati odgovarajućim puferom i biti u opsegu 3,0-5,0 ili 3,5-4,5.

[0065] U nekim primerima izvođenja, farmaceutska kompozicija može uključivati jedinjenje I ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so i Poloxamer 407 (npr. 0,1-2% tež./tež./kompozicije) u vodenom medijumu koji ima pH u opsegu 3,0-6,0.

[0066] U nekim primerima izvođenja, farmaceutska kompozicija može uključivati jedinjenje I ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so i Poloxamer 407 (npr. 0,1-2% tež./tež./kompozicije) u vodenom medijumu puferisanom sa natrijum propanoatom/propanoičnom kiselinom ili natrijum acetatom/sirćetnom kiselinom koja ima pH u opsegu 4,0-5,0.

[0067] U nekim primerima izvođenja, farmaceutska kompozicija može uključivati jedinjenje I ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so i Poloxamer 407 (npr. 0,1-2% tež./tež./kompozicije) u vodenom medijumu puferisanom sa natrijum propanoatom/propanoičnom kiselinom ili natrijum acetatom/sirćetnom kiselinom koja ima pH u opsegu 4,0-5,0 i napravljen da bude izotoničan sa 3-5% manitola.

[0068] U nekim dalje primerima izvođenja, farmaceutska kompozicija može uključivati jedinjenje I ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so i Polysorbate-20 (npr. 0,1-3% tež./tež./kompozicije) i propilen glikol (npr. 3% tež./tež./kompozicije) u vodenom medijumu koja ima pH u opsegu 3,0-6,0.

[0069] U nekim dalje primerima izvođenja, farmaceutska kompozicija može uključivati jedinjenje I ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so i Polysorbate-20 (npr. 0,1-3% tež./tež./kompozicije) i propilen glikol (npr. 3% tež./tež./kompozicije) u vodenom medijumu puferisanom sa natrijum acetatom/sirćetnom kiselinom koja ima pH u opsegu 4,0-5,0.

[0070] U nekim dalje primerima izvođenja, farmaceutska kompozicija može uključivati jedinjenje I ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so i Polysorbate-20 (npr. 0,1-3% tež./tež./kompozicije) i manitol (npr.3-5% tež./tež./kompozicije) u vodenom medijumu koja ima pH u opsegu 3,0-6,0.

[0071] U nekim dalje primerima izvođenja, farmaceutska kompozicija može uključivati jedinjenje I ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so i Polysorbate-20 (npr. 0,1-3% tež./tež./kompozicije) i manitol (npr. 3-5% tež./tež./kompozicije) u vodenom medijumu puferisanom sa natrijum acetatom/sirćetnom kiselinom koja ima pH u opsegu 4,0-5,0.

[0072] U nekim primerima izvođenja, farmaceutska kompozicija može uključivati jedinjenje I ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so i Poloxamer 407 (npr. 0,1-2% tež./tež./kompozicije) i Polysorbate 20 (npr., 0,1-2% tež./tež./kompozicije) u vodenom medijumu koji ima pH u opsegu 3,0-6,0.

[0073] U nekim primerima izvođenja, farmaceutska kompozicija može uključivati jedinjenje I ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so i Poloxamer 407 (npr. 0,1-2% tež./tež./kompozicije) i Polysorbate 20 (npr., 0,1-2% tež./tež./kompozicije) u vodenom medijumu puferisanom sa natrijum propanoatom/propanoičnom kiselinom ili natrijum acetatom/sirćetnom kiselinom koji ima pH u opsegu 4,0-5,0.

[0074] U nekim primerima izvođenja, farmaceutska kompozicija može uključivati jedinjenje I ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so i Poloxamer 407 (npr. 0,1-2% tež./tež./kompozicije) i Polysorbate 20 (npr., 0,1-2% tež./tež./kompozicije) u vodenom medijumu puferisanom sa natrijum propanoatom/propanoičnom kiselinom ili natrijum acetatom/sirćetnom kiselinom koji ima pH u opsegu 4,0-5,0, napravljen da bude izotoničan sa 3-5% manitola

[0075] U nekim primerima izvođenja, farmaceutske kompozicije kao što su prethodno opisane mogu uključivati jedinjenje I, ali ne i hlorid kao kontra jon, pri čemu je acetat poželjna alternativa. Takve kompozicije mogu pokazati superiornija svojstva od onih koje sadrže jon hlorida.

[0076] U nekim primerima izvođenja, težinski odnos peptid/polipeptid (npr. jedinjenje I) je 1%-25% u odnosu na težinu ne-vodenih ekscipijenata u farmaceutskoj formulaciji, što je obrnuto 0,1-20% ekscipijenata, kao što je Poloxamer, Polysorbate 20, propilen glikol i manitol.

[0077] Ovaj težinski odnos peptid/polipeptid (npr. jedinjenje I) u odnosu na težinu farmaceutske formulacije može biti najmanje oko 0,1%, najmanje 0,5%, najmanje 1%, najmanje oko 2%, najmanje oko 3%.

[0078] Sledeće dve ogledne kompozicije, koje imaju količinu svakog sastojka u naznačenom opsegu, obezbediće dve od nekoliko kompozicija koje se mogu koristiti za lečenje ili sprečavanje različitih bolesti očiju ili stanja (npr. mrežnjače) ili za sprečavanje smrti ćelija mrežnjače kao posledica bolesti očiju ili stanja ili slično kod subjekta:

Ogledna formulacija I:

Ogledna formulacija II:

[0079] U nekim primerima izvođenja, kompozicije prema ovom pronalasku se primenjuju na oči, na primer, korišćenjem tehnika opisanih ovde, i/ili drugih tehnika (npr. ubrizgavanjem, topikalna primena, itd.) poznatih stručnjacima u tehnici (videti, npr., Janoria et al., Expert Opin Drug Deliv., 4(4): 371-388 (July 2007); Ghate & Edelhauser, Expert Opin Drug Deliv., 3(2):275-87 (2006); Bourges et al., Adv Drug Deliv Rev., 58(11):1182-202 (2006), Epub 2006 Sep.

22; Gomes Dos Santos et al., Curr Pharm Biotechnol., 6(1):7-15 (2005)). Kompozicija se može primeniti korišćenjem bilo kog postupka poznatog stručnjaku u tehnici. Neograničavajući primeri uključuju topikalnu, subkonjunktivnu, sub-Tenon-sku, intravitrealnu, subretinalnu ili ubrizgavanje u prednju komoru oka subjekta. Drugi načini primene uključuju sistemsku primenu, uključujući intravensku primenu, kao i oralnu primenu. U određenim primerima izvođenja, kompozicija se primenjuje intravitrealno.

[0080] Određeni primeri izvođenja se odnose na farmaceutsku kompoziciju koja sadrži polipeptid jedinjenja I i farmaceutski prihvatljiv nosač. Svaki nosač koji može da obezbedi polipeptid bez uništavanja vektora unutar nosača je pogodan nosač, a takvi nosači su dobro poznati u tehnici.

[0081] Kompozicija može biti formulisana i upakovana pogodno za parenteralnu, oralnu ili topikalnu primenu. Na primer, parenteralna formulacija bi bila sterilan, nepirogen proizvod i mogla bi se sastojati od tečnog preparata sa brzim ili produženim oslobađanjem, suvog praha, emulzije, suspenzije ili bilo koje druge standardne formulacije. Oralna formulacija farmaceutske kompozicije može biti, na primer, tečni rastvor, kao što je efikasna količina kompozicije

2

rastvorenog u razblaživačima (npr. voda, fiziološki rastvor, sok, itd.), suspenzije u odgovarajućoj tečnosti ili pogodne emulzije. Oralna formulacija se takođe može isporučiti u obliku tableta i može uključivati ekscipijente, boje, razblaživače, puferska sredstva, sredstva za ovlaživanje, konzervanase, sredstva za aromu i farmakološki kompatibilne ekscipijente. Topikalna formulacija može uključivati jedinjenja koja poboljšavaju apsorpciju ili prodiranje aktivnog sastojka kroz kožu ili druga zahvaćena područja, kao što su dimetilsulfoksid i srodni analozi. Farmaceutska kompozicija takođe može biti isporučena topikalno korišćenjem transdermalnog uređaja, kao što je flaster, koji bi mogao da uključi kompoziciju u odgovarajućem sistemu rastvarača sa sistemom lepka, kao što je akrilna emulzija, i poliesterski flaster. Sterilne kompozicije mogu da se isporučuju putem kapi za oči ili drugog postupka topikalne isporuke u oči. Sterilne, nepirogene kompozicije mogu se davati intraokularno, bilo gde u oku uključujući, na primer, staklastu šupljinu, prednju komoru, itd. Sterilne, nepirogene kompozicije mogu da se primenjuju intravitrealno kao što se obično radi sa intravitrealnim ubrizgavanjima Lucentis (ranabizumab), Avastin (bevazizumab), triamcinolon acetonid, antibiotici, itd. Kompozicije se mogu primeniti periokularno (npr. u tkivo oko očne jabučice (globus) ali unutar koštane orbite). Kompozicije se mogu uneti putem intraokularnog implantata (npr. implantata ganciklovira, implantata fluocinolona, itd.). Prilikom isporuke intraokularnih implantata, uređaji koji sadrže kompozicije prema ovom pronalasku se hirurški implantiraju (npr. unutar šupljine staklastog tela), a lek se oslobađa u oko (npr. unapred određenom brzinom). Kompozicije se mogu primenjivati korišćenjem tehnologije inkapsuliranih ćelija (npr. Neurotech) u kojoj su genetički modifikovane ćelije konstruisane da proizvode i luče kompoziciju koja sadrži polipeptid jedinjenja I. Kompozicije se mogu isporučiti transkleralnom isporukom leka pomoću uređaja zašivenog ili postavljenog pored globusa koji bi polako eluirao lek, koji bi potom difundovao u oko.

[0082] Neki primeri izvođenja se odnose na kompozicije, komplete, sisteme i/ili postupke za sprečavanje, inhibiciju, blokiranje i/ili smanjenje smrti fotoreceptora, RPE ćelija ili ganglijskih ćelija mrežnjače. Neki primeri izvođenja se odnose na inhibiciju apoptoze fotoreceptora. Neki primeri izvođenja se odnose na inhibiciju apoptoze u ćelijama pigmentiranog epitela mrežnjače oka. Neki primeri izvođenja se odnose na inhibiciju apoptoze u ganglijskim ćelijama mrežnjače oka. U nekim primerima izvođenja, smrt fotoreceptora i/ili apoptoza i/ili apoptoza pigmentiranih epitelnih ćelija mrežnjače i/ili apoptoza i/ili apoptoza ganglijskih ćelija mrežnjače i/ili smrt je uzrokovana ablacijom mrežnjače, degeneracijom makule povezane sa starosti, glaukomom, traumom, kancerom, tumorom, upalom, uveitisom, dijabetesom, naslednom degeneracijom mrežnjače, i/ili bolešću koja utiče na fotoreceptorske ćelije, abnormalni pigmentni epitel mrežnjače ili ganglije mrežnjače.

[0083] U nekim primerima izvođenja, ovaj pronalazak poboljšava vijabilnost fotoreceptora, RPE ili ganglijskih ćelija mrežnjače i/ili inhibira smrt fotoreceptora (npr. tokom ablacije mrežnjače i/ili stanja oka koja ne uključuju ablaciju mrežnjače).

[0084] U nekim primerima izvođenja, ovaj pronalazak ima koristi u poboljšanoj vijabilnosti fotoreceptora, RPE ili ganglijskih ćelija mrežnjače i/ili inhibira smrt fotoreceptora, RPE ili ganglijskih ćelija mrežnjače u različitim stanjima i/ili bolestima uključujući, ali ne ograničavajući se na degeneraciju makule (npr. suvi, vlažni, neeksudativni ili eksudativni/neovaskularni), očni tumori, glaukom, nasledne degeneracije mrežnjače (npr. pigmentni retinitis, Stargardt-ova bolest, Usher-ov sindrom, itd.), očne inflamatorne bolesti (npr. uveitis), očne infekcije (npr. bakterijske, gljivične, virusne), autoimuni retinitis (npr. izazvan infekcijom), trauma, dijabetička retinopatija, horoidalna neovaskularizacija, ishemija mrežnjače, vaskularna okluzivna bolest mrežnjače (npr. okluzija grane vene mrežnjače, okluzija centralne vene mrežnjače, okluzija grane arterije mrežnjače, okluzija centralne arterije mrežnjače, itd.), patološka miopija, angioidne pruge, makularni edem (npr. bilo koje etiologije), centralna serozna horioretinopatija.

[0085] Neki primeri izvođenja se odnose na primenjivanje kompozicije za inhibiciju smrti fotoreceptora, RPE ili ganglijskih ćelija mrežnjače (npr. apoptoze). U nekim primerima izvođenja, kompozicija sadrži farmaceutski proizvod, mali molekul, peptid, nukleinsku kiselinu, molekularni kompleks, itd. U nekim primerima izvođenja, ovaj pronalazak obezbeđuje primenjivanje zaštitnog polipeptida fotoreceptora, RPE ili ganglijskih ćelija mrežnjače da bi se inhibirala apoptoza fotoreceptora ili RPE ili ganglijskih ćelija mrežnjače.

[0086] Neki primeri izvođenja se odnose na postupak upotrebe polipeptida za ublažavanje aktivacije jednog ili više članova TNFR superfamilije, poželjno Fas ili TRAIL u fotoreceptorima i/ili mrežnjačama. U nekim primerima izvođenja, takav postupak se koristi, na primer, da inhibira ćelijsku smrt (npr. apoptozu) u ćelijama i tkivima, i može se primeniti in vivo, ex vivo ili in vitro. Prema tome, jedinjenje I može da se koristi za ublažavanje ćelijske smrti (npr. smrti ćelija mrežnjače) u skladu sa takvim postupcima. Za in vitro primenu, jedinjenje I se može obezbediti ćelijama, tipično populaciji ćelija (npr., u okviru pogodnog preparata, kao što je puferovani rastvor) u količini i tokom dovoljnog vremenskog perioda da se inhibira apoptoza unutar ćelija ili da se inhibira upala. Ako se želi, može se posmatrati kontrolisana populacija koja nije tretirana inventivnim polipeptidom da bi se potvrdio efekat inventivnog polipeptida u smanjenju inhibicije smrti ćelija ili zapaljenja unutar slične populacije ćelija.

[0087] U nekim primerima izvođenja ovde su obezbeđeni postupci lečenja različitih očnih bolesti ili stanja (npr. mrežnjače) ili sprečavanja smrti ćelija mrežnjače kao posledica očnih bolesti ili stanja, uključujući sledeće: glaukom, makulopatije/degeneraciju mrežnjače, kao što su:

2

degeneracija makule, uključujući degeneraciju makule povezanu sa starenjem (AMD), kao što su neeksudativna degeneracije makule povezane sa starenjem i eksudativna degeneracija makule povezana sa starenjem, horoidalna neovaskularizacija, retinopatija, uključujući dijabetičku retinopatiju, akutnu i hroničnu neuroretinopatiju makule, centralnu seroznu horioretinopatiju; i makularni edem, uključujući cistoidni makularni edem i dijabetički makularni edem; uveitis/retinitis/horoiditis, kao što su akutna multifokalna plakoidna pigmentna epiteliopatija, Behcet-sova bolest, birdshot retinohoroidopatija, zaraza (sifilis, lajmska bolest, tuberkuloza, toksoplazmoza), uveitis, uključujući srednji uveitis (pars planitis) i anteriorni uveitis, multifokalni horoiditis, sindrom višestrukih evanescentnih belih tačaka (MEWDS), sarkoidoza oka, posteriorni skleritis, serpignozni horoiditis, subretinalna fibroza, sindrom uveitisa i Vogt-Koyanagi-Harada sindrom; vaskularne bolesti/eksudativne bolesti, kao što su: arterijska okluzivna bolest mrežnjače, okluzija centralne vene mrežnjače, diseminovana intravaskularna koagulopatija, okluzija grane vene mrežnjače, hipertenzivne promene fundusa, sindrom ishemije oka, mikroaneurizme arterija mrežnjače, Coats-ova bolest, parafovealna telangiektazija, okluzija hemiretinalne vene, papiloflebitis, okluzija centralne arterije mrežnjače, okluzija grane arterije mrežnjače, bolest karotidne arterije (CAD), angitis smrznute grane, retinopatija srpastih ćelija i druge hemoglobinopatije, angioidne pruge, familijarna eksudativna vitreoretinopatija, Eales-ova bolest, traumatske/hirurške bolesti: simpatička oftalmija, uveitska bolest mrežnjače, ablacija mrežnjače, fotokoagulacija izazvana traumom, laserom, PDT, hipoperfuzija tokom operacije, radijaciona retinopatija, retinopatija kod transplantacije koštane srži; proliferativni poremećaji, kao što su: proliferativna vitrealna retinopatija i epiretinalne membrane, proliferativna dijabetička retinopatija. Infektivni poremećaji: okularna histoplazmoza, okularna toksokariaza, sindrom očne histoplazmoze (OHS), endoftalmitis, toksoplazmoza, bolesti mrežnjače povezane sa HIV infekcijom, horoidna bolest povezana sa HIV infekcijom, uveitična bolest povezana sa HIV infekcijom, virusni retinitis, akutna nekroza mrežnjače, progresivna nekroza spoljašnje mrežnjače, gljivične bolesti mrežnjače, okularni sifilis, okularna tuberkuloza, difuzni unilateralni subakutni neuroretinitis, i mijaza; genetički poremećaji, kao što su: pigmentni retinitis, sistemski poremećaj povezan sa distrofijom mrežnjače, kongenitalno stacionarno noćno slepilo, konusne distrofije, Stargardt-ova bolest, fundus flavimaculatus, Best-ova bolest, distrofičnog obrasca pigmentnog epitela mrežnjače, X-vezana retinošiza, Sorsby-ova distrofija fundusa, benigna koncentrična makulopatija, Bietti-ova kristalna distrofija, pseudoxanthoma elasticum. Kidanje mrežnjače/rupe: ablacija mrežnjače, makularna rupa, ogromno kidanje mrežnjače; tumori, kao što su: oboljenje mrežnjače povezano sa tumorima, urođena hipertrofija RPE, posteriorni uvealni melanoma, horoidalni hemangiom, horoidalni osteom, horoidalne metastaze, kombinovani hamartom mrežnjače i pigmentnog epitela mrežnjače, retinoproblastom, vazoproliferativni

2

tumori očnog fundusa, astrocitom mrežnjače, intraokularni limfoidni tumori; i druge bolesti i stanja kao što su: tačkasta unutrašnja horoidopatija, akutna posteriorna multifokalna plakoidna pigmentepitelopatija, miopična degeneracija mrežnjače, akutni retinalni pigmentni epitelitis, distrofije ili displazije rožnjače i slično.

[0088] Određeni primeri izvođenja obezbeđuju postupke za povećavanje vijabilnosti fotoreceptora, RPE ili ganglija mrežnjače koji sadrže primenjivanje farmaceutske kompozicije koja sadrži jedinjenje I, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so. Farmaceutsko jedinjenje se može primeniti u obliku kompozicije koja je formulisana sa farmaceutski prihvatljivim nosačem i izbornim ekscipijentima, ađuvantima, itd. u skladu sa dobrom farmaceutskom praksom. Kompozicija može biti u obliku čvrstog, polučvrstog ili tečnog oblika doze: kao što je prah, rastvor, eliksir, sirup, suspenzija, krema, kapi, pasta i sprej. Kako će stručnjaci u tehnici prepoznati, u zavisnosti od odabranog puta primene (npr. kapi za oči, ubrizgavanje, itd.), određuje se oblik kompozicije. Generalno, poželjno je koristiti sterilni, jedinični oblik doze inventivnog inhibitora da bi se postigla laka i tačna primena aktivnog farmaceutskog jedinjenja. Uopšteno, terapeutski efikasno farmaceutsko jedinjenje je prisutno u takvom obliku doze na nivou koncentracije u rasponu od oko 0,01% do oko 1,0% po težini ukupne kompozicije: tj., u količini dovoljnoj da obezbedi željenu jediničnu dozu.

[0089] U nekim primerima izvođenja, farmaceutska kompozicija se može primeniti u jednoj ili višestrukim dozama. Određeni način primene, zahtevi za proizvod i režim doziranja će odrediti stručnjak u skladu sa stanjem pojedinca koji se leči i odgovorom pomenute osobe na lečenje. U nekim primerima izvođenja, kompozicija je u obliku jedinične doze za primenu na subjekta, koja sadrži farmaceutsko jedinjenje i jedan ili više netoksičnih farmaceutski prihvatljivih nosača, ađuvanata ili sredstava. Količina aktivnog sastojka koja se može kombinovati sa takvim materijalima da bi se dobio jedan oblik doze variraće u zavisnosti od različitih faktora, kao što je prethodno navedeno. Različiti materijali se mogu koristiti kao nosači, ađuvanti i sredstva u kompoziciji prema pronalasku, kao što je dostupno u farmaceutskoj tehnici. Injektibilni preparati, kao što su uljani rastvori, suspenzije ili emulzije, mogu se formulisati kao što je poznato u tehnici, korišćenjem odgovarajućih sredstava za dispergovanje ili vlaženje i sredstava za suspendovanje, po potrebi. Sterilni injektibilni preparat može da koristi netoksični parenteralno prihvatljiv razblaživač ili rastvarač kao što je sterilna nepirogena voda ili 1,3-butandiol. Među ostalim prihvatljivim sredstvima i rastvaračima koji se mogu koristiti su injekcija dekstroze od 5%, Ringer-ova injekcija i izotonična injekcija natrijum hlorida (kao što je opisano u USP/NF). Pored toga, sterilna, fiksna ulja mogu se konvencionalno koristiti kao rastvarači ili medijumi za suspendovanje. U tu svrhu može se koristiti bilo koje blago fiksno ulje,

2

uključujući sintetičke mono-, di- ili trigliceride. Masne kiseline kao što je oleinska kiselina se takođe mogu koristiti u pripremi injektibilnih kompozicija.

[0090] Postoji nekoliko mogućih puteva isporuke leka u očna tkiva. Put primene zavisi od ciljanog tkiva. U određenim primerima izvođenja, putevi primene mogu biti konvencionalni putevi primene, kao što su topikalni ili sistemski. Topikalna primena, uglavnom u obliku kapi za oči, može se koristiti za lečenje poremećaja koji utiču na prednji segment očiju. Primena takođe može biti direktnim ubrizgavanjem, na primer, intravitrealnim ubrizgavanjem, koji uključuje ubrizgavanje rastvora leka direktno u staklasto telo (VH) korišćenjem, na primer, 30 G igle. Drugi načini primene, na primer, korišćenje nosača leka takođe mogu biti prikladni.

[0091] U nekim primerima izvođenja, kompozicija se može primeniti okularno (tj., u oči), na primer, korišćenjem tehnika opisanih ovde. Ovde se takođe raspravlja o drugim tehnikama (npr. ubrizgavanja, topikalna primena, itd.) koje su poznate stručnjacima u tehnici (videti, na primer, Janoria et al. Expert Opinion on Drug Delivery. July 2007, Vol.4, No.4, Pages 371-388; Ghate & Edelhauser. Expert Opin Drug Deliv. 2006 March; 3(2):275-87; Bourges et al. Adv Drug Deliv Rev. 2006 Nov. 15; 58(11):1182-202. Epub 2006 Sep. 22; Gomes Dos Santos et al. Curr Pharm Biotechnol. 2005 February; 6(1):7-15.

[0092] U nekim primerima izvođenja, kompozicija se može davati zajedno sa jednim ili više drugih sredstava za efikasnu zaštitu fotoreceptora i/ili inhibiciju apoptoze.

[0093] U nekim primerima izvođenja, obezbeđeni su kompleti koji sadrže jedinjenje I, ili njegove farmaceutske preparate. U nekim primerima izvođenja, kompleti dalje obezbeđuju uređaje, materijale, pufere, kontrole, uputstva, posude (npr. bočice, špriceve) itd. (npr. za primenu). Na primer, bilo koja od prethodno navedenih kompozicija i/ili formulacija može biti upakovana. Bilo koja od prethodno navedenih kompozicija i formulacija može se distribuirati u napunjenim špricevima. Kompozicija i obrada rezultuje sterilnim, nepirogenim proizvodom. Pakovanje funkcioniše tako da održava sterilnost proizvoda.

PRIMERI

[0094] Eksperimenti su sprovedeni tokom razvoja opisanih primera izvođenja da bi se razvila biološki aktivna farmaceutska formulacija jedinjenja I (npr. za intravitrealnu primenu). Zaštitna svojstva jedinjenja I za fotoreceptore su ispitivana in vitro i in vivo nakon doziranja rastvora peptida u DMSO. Jedinjenje I ima slabu rastvorljivost u vodi iznad pH~3 i visoku tendenciju da formira gelove ili precipitate u vodenim sredinama. Od proporcionalnog prilagođavanja efikasne doze kod pacova u odnosu na čoveka prema zapremini staklastog tela unutar vrste, ciljana koncentracija od 10-20 mg/mL je definisana kao početni cilj, pri čemu su niže koncentracije

2

(0,5-2,0 mg/mL) postale poželjnije jer je testiranje pokazalo iznenađujuće superiornu jačinu i izloženost opisanih primera izvođenja. (Primeri 1-6).

Primer I: Priprema jedinjenja I i testiranje.

[0095] Peptid jedinjenja I (Peptid His-His-Ile-Tyr-Leu-Gly-Ala-Val-Asn-Tyr-Ile-Tyr-NH2; SEQ ID BR:I) je sintetizovan na Fmoc-Amid-AMS smoli preko Fmoc hemije, od strane više dobavljača. Fmoc zaštićene aminokiseline su kupljene od GL Biochem. Reagensi za kuplovanje i cepanje su kupljeni od Aldrich. Rastvarači su kupljeni od Fisher Scientific.

[0096] Peptidni lanac je sastavljen na smoli ponovnim uklanjanjem Fmoc zaštitne grupe i kuplovanjem zaštićene amino kiseline. DIC i HOBt su korišćeni kao reagens za kuplovanje, a NMM je korišćen kao baza; 20% piperidina u DMF je korišćeno kao de-Fmoc-reagens. Ninhidrinski test je izveden nakon svakog kuplovanja da bi se proverila efikasnost kuplovanja.

[0097] Posle poslednjeg kuplovanja, smola je isprana i osušena, a peptid je odcepljen sa smole tretiranjem koktelom za cepanje (TFA/Tis/H2O/DOTA: 95/3/2/2). Peptid je precipitiran iz hladnog etra i sakupljen filtracijom, dobijeno je 13 g sirovog materijala čistoće 46% (prinos: 127%).

[0098] Za svaki od dva ciklusa preparativnog prečišćavanja, oko 4,4 g sirovog peptida je prečišćeno polimernom kolonom od 2 inča sa TFA puferom (pufer A, 0,1% TFA u vodi; pufer B, 100% acetonitril), nastale frakcije sa čistoćom >85% su dalje prečišćene pomoću C18 kolone od 2 inča sa TFA puferom. Sakupljene frakcije sa čistoćom >95% su liofilizovane da bi se osušile, i 3,68 g materijala kao TFA soli sa čistoćom >95% je dobijeno iz 8,8 g sirovog materijala. U 1,5 g peptida (TFA kao kontra jon), dodato je dovoljno HCl vodenog rastvora da se peptid rastvori. Peptid u HCl vodenom rastvoru je liofilizovan do sušenja. Dobijeno je 1,4 g konačnog peptida kao HCl soli sa čistoćom 97,0%. HPLC 15% ACN u vodi 0,1% TFA, Venusil XBP-C184,6×250 mm 1,0 mL/min; RT 17,79 min. Maseni spektar APCl MH<+>1461.5.

[0099] Mikroanaliza. Pronađeno: C, 52.21; H, 6.49; N, 15.42; Cl, 6.73. KF, 3.75%. Izračunato za C71H100N18O16·3HCl·3.4 H2O: C, 52.24; H, 6.59; N, 15.45; Cl, 6.52. KF, 3.75%. %aktivno = 89.55%.

[0100] Kasniji uzorci peptida su još uvek sintetizovani kao trifluoracetatna so, ali je izvršena anjonska razmena sa acetatom, da bi se dobilo jedinjenje I kao njegova triacetatna so.

Primer 2: pH-profil rastvorljivosti jedinjenja I

[0101] Jedinjenje I dobijeno kao trihidrohloridna so, kao što je opisano u Primeru I, i ispitano je na rastvorljivost u vodi na različitim pH vrednostima, sprovođenjem pH titracije prema sledećem

2

protokolu. U nekim slučajevima Met-12 je sproveden kroz identičnu eksperimentalnu proceduru da bi se odredio njegov pH profil rastvorljivosti pod istim uslovima. Višestruki prethodni eksperimenti nisu uspeli da pronađu uslove u kojima bi Met-12 mogao da se formuliše na zadovoljavajući način u pretežno vodenoj sredini pri bilo kom pH iznad 2,7.

[0102] Jedinjenje I (10 mg) je rastvoreno u vodi (270-900 µL) u prozirnoj plastičnoj vijalici za centrifugiranje od 2 mL uz vorteksiranje da bi se dobio rastvor pH ~2,4. U svim slučajevima peptid je formirao bistar rastvor što ukazuje na rastvorljivost od najmanje 40 mg/mL pri niskom pH. Ovaj rastvor je zatim razblažen odgovarajućom količinom ko-rastvarača ili drugog ekscipijenta (šećer, surfaktant itd.) da bi se dobio bistar kiseli rastvor od 10 mg jedinjenja I u 900 µL testiranog rastvora na sobnoj temperaturi (22-23°C). Mali alikvoti baznog rastvora (obično natrijum hidroksida 1,0 M ili 0,1 M, ali ponekad i druge baze kada se ispituju puferi) su dodavani pomoću mikrolitarskog šprica. Između dodavanja rastvor je mešan vorteksom, a rastvor je vizuelno pregledan na talog različitih tipova, zamućenost, kao verovatan znak mikrotaloga, i viskoznost da bi se otkrilo formiranje gela. Na svim ovim tačkama posmatranja vršena su pH merenja. Neki eksperimenti su titrirali od endogenog niskog pH do pH 10, ali kasnije titracije nisu bile mnogo iznad pH 7, ili ponekad čak niže.

[0103] Titracija vodenog rastvora jedinjenja I sa natrijum hidroksidom sugeriše nešto bolju rastvorljivost ograničenu sa pH od Met-12, sa bistrim pokretnim rastvorom do oko pH 3,3, za razliku od pH 3,0 za Met-12. Međutim, kada su titracije sprovedene korišćenjem pet puferskih baza, Tris, histidin, natrijum citrat, natrijum borat i natrijum fosfat, umesto viskoziteta natrijum hidroksida i znaci agregacije su generalno uočeni u opsegu pH 2,6-2,9. Formiranje fibrila je takođe primećeno ispod pH 3 u jednom ili dva slučaja. Iz ovih eksperimenata se čini da jedinjenje I nema bolji pH profil rastvorljivosti u vodi od Met-12.

Primer 3: Rastvorljivost jedinjenja I u smešama ko-rastvarača zavisna od pH

[0104] Rastvorljivost jedinjenja I zavisna od pH je ispitana korišćenjem ko-rastvarača i aditiva i upoređena sa rastvorljivošću Met-12 pod istim uslovima.

[0105] Eksperiment sa 70% DMSO bio je sličan Met-12 titraciji sa gelom koji se formirao oko pH 5,5, ali u ovom slučaju, verovatno zbog nemogućnosti C-kraja da se jonizuje, gel se nije ponovo rastvorio pri višim pH vrednostima.

[0106] 70% propilen glikol (PG) je poboljšao rastvorljivost jedinjenja I u poređenju sa Met-12, bez stvaranja gela do oko pH 4,7, u poređenju sa pH 3,2 za Met-12, a zatim je ostao gel do pH 10. Ova titracija je ponovljen sa nižim količinama PG (35%, 10%), ali se činilo da nijedan nije poboljšao profil rastvorljivosti u odnosu na samo vodu.

[0107] Izgleda se da rastvori od 70% PEG400 i 70% glicerola nisu korisni, kao ni dva dodatka šećera, 10% manitola ili 10% trehaloze.

[0108] Iz ovih eksperimenata je zaključeno da propilen glikol može biti koristan ko-rastvarač pod nekim ograničavajućim okolnostima za jedinjenje I, ali ne i za Met-12.

Primer 4: Rastvorljivost jedinjenja I u nejonskim smešama surfaktanata zavisna od pH.

[0109] Iznenađujuće, neki od ispitivanih surfaktanata obezbedili su značajna poboljšanja u pH-profilu rastvorljivosti jedinjenja I, dok nijedan od testiranih surfaktanata nije poboljšao profil pH-rastvorljivosti Met-12. Jedinjenje I u prisustvu 10% Tyloxapol je ostalo bistro i prihvatljivog viskoziteta, sve dok pH nije bio iznad 5,87. Sa 10% Polysorbate 80, bistri rastvor nije postao primetno viskozan sve do pH vrednosti iznad 6,36. Sa 10% Polysorbate 20, fibrile su primećene na pH 3,2, ali bez znakova zamućenja ili stvaranja gela do pH 7,14. 10% Poloxamer 407 je bio donekle dvosmislen u pogledu toga gde bi moglo da dođe do početka nerastvorljivosti, pošto je druga faza jasno bila prisutna u opsegu pH 5-9, iako se činilo da je rastvor pokretljiv. Izgledalo je da se sastoji od veoma velikih bistrih loptica formiranih u rastvoru. Veruje se da je ovo artefakt visoke koncentracije Poloxamer-a, jer se 15% rastvora Poloxamer-a potpuno pretvara u gel na 27°C, dok 10% Poloxamer-a ne stvara gel značajno na 25°C, ali različiti aditivi mogu ili povećati ili sniziti sol-gel kritičnu temperaturu, a uobičajena merenja viskoziteta za stvaranje gela neće efikasno otkriti početni izgled odvojene faze gela. Stoga se veruje da nije došlo do gubitka rastvorljivosti peptida u smeši, ali je velika količina Poloxamer-a formirala dve Poloxamer faze, sol fazu i gel fazu. Povidon K30 je proizveo viskozni rastvor na pH 3,60, koji je stvorio gel iznad pH 4,0.

[0110] Neki od surfaktanata su zatim titrirani naniže u odnosu na količinu dodatog surfaktanta. Kada je Polysorbate 20 titriran naniže na koncentracije od 3% i 1%, formiranje fibrila je uočeno ispod pH 2,5, ali u oba slučaja drugi znaci precipitacije nisu primećeni do pH 4,14 i 3,76, respektivno. Poloxamer 407 na 4% proizveo je mali i očigledno ne rastući broj fibrila na početku titracije, ali nije bilo drugih znakova precipitacije sve do pH vrednosti iznad 6,2, a na 2% je proizveo bistar rastvor do pH iznad 5,6. Na 0,5% fibrili su uočeni u rastvoru kada je titracija počela, ali nisu primećeni dalji znaci precipitacije sve do pH vrednosti iznad 4,5.

[0111] Jedinjenje I je očigledno bilo superiornije od Met-12 u većini ispitivanih surfaktanata, posebno Polysorbate 80, Poloxamer 407 i Tyloxapol, pri čemu su podaci o Polysorbate 20 donekle dvosmisleni zbog uočenog početnog formiranja fibrila, iako je bilo jasno da je većine jedinjenja bila u rastvoru na pH 3-6, za razliku od Met-12 u istom sredstvu. Prema tome, rastvorljivosti jedinjenja I su posmatrane u mešavinama ko-rastvarača i surfaktanta, počevši od

1

visokih koncentracija aditiva, a zatim nižih koncentracija jednog ili oba aditiva, u matriksnom eksperimentalnom dizajnu retke populacije.

Primer 5: Studije rastvorljivosti jedinjenja I sa pomešanim nejonskskim surfaktantom/korastvaračem

[0112] Kombinacija 70% PG i 10% Polysorbate 80 rezultovala je bistrim rastvorom koji je postao viskozan pri pH 3,4 i stvoren je gel na pH 5,25, što ga čini ne boljim od 70% PG, a lošijim od 10% PS-80.

[0113] Sa 70% PG, 3% PS, viskozitet je postavljen na pH 4,6, ali je materijal i dalje bio gel sa pH 5,25.

[0114] Sa 35% PG i 3% PS-80, fibrile su se pojavile u rastvoru sa niskim pH 2,66, a agregati su uočeni u rastvoru na pH 3,48.

[0115] 35% PG, 10% PS-80 nisu pokazivali znake fibrila ili agregata, a primetan viskozitet je primećen na pH 4,05, a stvaranje gela na pH 5,71 (inferiorno u odnosu na samo 10% PS-80).

[0116] 10% PG i 10% PS-80 proizveli su bistar rastvor niskog viskoziteta do pH 4,94, a iznad pH 5,13 je počeo da taloži materijal.

[0117] 10% PG i 3% PS-80 proizveli su bistar rastvor do pH 3,16, ali je došlo do određenog taloženja pri pH 3,4.

[0118] Kao što je ranije saopšteno, činilo se da rastvor u 10% Polysorbate 20 daje čiste pokretne rastvore sve do pH 7, ali čak i pri niskom pH uočene su neke fibrile, a njihov broj je imao tendenciju povećanja sa povećanjem pH.

[0119] Iznenađujuće, kombinacija 10% PG i 10% Polysorbate 20 je rezultovala dobrom rastvorljivošću, sa početkom primetnog viskoziteta koji se javlja ponovljivo samo iznad pH 7, i nisu vidljive vizuelne indikacije bilo kakvog taloženja. Međutim, stajanjem preko noći, rastvor je stvorio gel, a pH je opao za oko 0,2 jedinice. Blago mešanje je ponovo pretvorilo gel u tečnost, koja se mogla ubrizgati.

[0120] 3% Polysorbate 20 sa 10% PG proizvelo je bistri pokretni rastvor do pH 5,3, ali opadanje PS-20 na 1% proizvodi fibrile ispod pH 3.

[0121] 10% PG je dodato u formulacije od 4%, 2% i 0,5% Poloxamer-a. Sa formulacijom Poloxamer-a od 4% izgleda da je došlo do blagog poboljšanja, fibrili nisu uočeni pri niskom pH i bistar rastvor do pH najmanje 5,36. 2% Poloxamer 10% PG je bio podjednako dobar sa bistrim pokretnim rastvorom do pH 5,74. Formulacija 0,5% Poloxamer-a je pokazala fibrile na početku titracije i pokazala je izvesnu zamućenost na pH 3,45, ali je ostala niske viskoznosti do pH 6.

2

[0122] 3%, 1% ili nikakav PG je dodat u 2%, 1% i 0,5% Poloxamer formulacije, a stabilnost je izmerena na pH 4,0, pH 5,5 i pH 7,0, nakon stajanja 3 dana na sobnoj temperaturi, korišćenjem vizuelnih i filtracionih analiza (videti sledeći Primer). Vizuelno, fibrile su primećene ređe u novoizrađenim uzorcima, pri čemu je veća verovatnoća da će biti primećene sa manje prisutnih ekscipijenata i pri višoj pH vrednosti, dok su svi uzorci sa pH 7,0 u početku bili zamućeni, a neki su imali očigledno taloženje. Svi uzorci sa pH 4,0 u početku nisu bili zamućeni, sa samo 0,5% PX, 0% PG koji su pokazali malu zamućenost nakon zadržavanja. Sa uzorcima pH 5,5, početna mala zamućenost je primećena u svim uzorcima od 0% PG i uzorku od 1% PG 0,5%PX, ali nakon zadržavanja samo najmanji uzorak ekscipijenta (0,5% PX 0% PG) pokazao je malu zamućenost. Nekoliko ovih uzoraka je postalo malo zamućeno nakon mešanja. Analizom filtracije dobijeni su drugačiji rezultati. Sa 2% Poloxamer formulacijama, sve tri formulacije na pH 4 su imale >98% oporavak nakon filtracije, a na pH 5,5 oporavak je bio >96%, a na pH 7,0 oporavak je bio i dalje 86-93%. U 1% PX formulacijama na pH 4, oporavak je bio 97-98% nakon filtracije, a na pH 5,5 je bio 87-93%, ali je na pH 7 bio samo 1-13%. U 0,5% PX formulacijama oporavak nakon filtracije na pH 4 bio je 73-88%, na pH 5,5 je bio 12-43%, a na pH 7 nije bilo oporavka nakon filtracije ni u jednom od tri uzorka.

[0123] Iz ovih eksperimenata može se zaključiti da relativno male količine PG kao ko-rastvarača mogu biti umereno korisne sa nekim surfaktantima, ali visoke koncentracije su bile štetne, a predvidljivost ovih efekata formulacije nije visoka. U PX formulacijama, količine prisutnog PX i pH formulacije su važniji od nivoa PG. Štaviše, vizuelna očitavanja ne moraju nužno da se slažu sa pouzdanijom filtracionom analizom, a posmatranje fibrila posebno je izgledalo nepovezano sa količinom prisutnog leka koji se može filtrirati.

Primer 6: Studije rastvorljivosti jedinjenja I sa nižom koncentracijom nejonskih surfaktanata

[0124] In vitro, i kasnije, in vivo eksperimenti efikasnosti su pokazali da je jedinjenje I u opsegu od 3 - > 10 puta snažnije u blokiranju apoptoze izazvane sa FasL (ili ablacije mrežnjače) u fotoreceptorskim ćelijama. Ovi iznenađujući rezultati omogućavaju da se projektovana doza za ljude spusti u opseg od 25-200 µg/oku, što je smanjilo maksimalnu potrebnu koncentraciju formulisanog leka na 2,0 mg/mL. Dalji set eksperimenata je sproveden da bi se pronašli optimalni uslovi formulacije na toj koncentraciji, pri čemu su u nekim eksperimentima posmatrane čak niže koncentracije leka. U ovam radu je posmatran ili Poloxamer 407 ili Polysorbate 20 kao surfaktant. I vidljiva zamućenost i vizuelna procena viskoziteta su korisna zapažanja pri skriningu, ali kako je prethodno pomenuto, otkriveno je da oni ne ukazuju uvek na prisustvo agregiranog peptida, a veći deo kasnijeg rada procenjivao je rastvorljivost merenjem količine prisutnog leka u uzorak pre i posle prolaska kroz PVDF membranu od 0,2 mikrona ili PALL 25 mm 0,2 µM Ultipor Nylon 6,6 filter. Zamućene ili visoko viskozne rastvore je bilo generalno teško ili nemoguće filtrirati, a kada su se mogli filtrirati, često su davali veoma mali oporavak leka. Iznenađujuće je da su neki pokretni, bistri rastvori takođe pokazali velike gubitke pri filtraciji, tako da su zadovoljavajuće formulacije definisane kao one koje su dale >90% oporavka leka nakon filtracije. Treba napomenuti da sva merenja rastvorljivosti sa jedinjenjima kao što je jedinjenje I, koja formiraju fibrile, mogu meriti samo kinetičku rastvorljivost. Formiranje fibrila može biti veoma sporo pod mnogim setovima uslova, a može se meriti rastvorljivost metastabilnih rastvora, gde prava termodinamička rastvorljivost, u odnosu na najstabilniji mogući oblik fibrila, može trajati danima do godinama da se u potpunosti postigne. Međutim, formulacije su rutinski držane 24-72 sata pre filtracije, da bi se izbeglo najmanje brzo taloženje nakon formulacije.

[0125] Početnim eksperimentom je posmatrano I mg/mL rastvora jedinjenja I u 3% PS-20/3% PG i 2% PX/2% PG na pH 4. Svi su proizveli bistre rastvore, bez gubitka API nakon filtracije. Sledećim eksperimentom je posmatrao 2 mg/mL u 2% PG i 0,1%, 0,25% i 0,5% PX, kao i 0,5% PG i PX, na pH ~3, pH 4, pH 5,5 i pH 7. Sve je izgledalo bistro i pokretno osim na pH 7, 0,1% PX uzorka koji je bio blago zamućen i naizgled pokretan, ali koji nije proizveo oporavak kada je filtriran. Oporavak na pH 5,5 je bio samo 78%, a na pH 4,0 je bio 92%. Veće količine PX dovele su do potpunog oporavka na pH 3 i 4,0, 93-97% na pH 5,3 i 88-92% na pH 7,0. Visok i nizak PG 0,5% PX su u suštini identični, što sugeriše da PG nije mnogo važan u ovoj oblasti raznovrsnosti formulacije.

[0126] Pošto su tokom ovih eksperimenata povremeno primećene prilično velike promene pH vrednosti tokom dužeg stajanja, sličan eksperiment je rađen sa 2,0 mg/mL jedinjenja I i 0,25% PX. 2% PG je rađen na pH 3, 4, 5,5 i 7, dok je upoređivan samopuferisani materijal (HCl so titrirana sa NaOH) nasuprot 10 mM histidinskim, acetatnim i citratnim puferima, uz analizu pomoću filtracije. Acetatni pufer je bio najmanje jednako dobar samopuferovani materijal na svim pH vrednostima, histidinski pufer je bio neznatno lošiji, a citratni pufer je bio značajno inferioran na sve tri više pH vrednosti, sa samo 75% oporavka na pH 4, naspram 91% za histidinski pufer, 92% nepuferovan i 97% za acetatni pufer. Acetatni pufer je zatim standardizovan.

[0127] Da bi se ispitali efekti sredstva za izotoničnost, ispitivani su rastvori na pH 4 i pH 5,5 sa 10 mM acetatnog pufera na 2 mg mL jedinjenja I, sa 0,25% PX sa 0,5% i 2% PG, 4,5% manitola, 2% glicerina i 0,8% vodenog natrijum hlorid. Svi su imali oporavak od 98-99% na pH 4,0 i 90-94% oporavak na pH 5,5, osim uzoraka natrijum hlorida, koji su imali oporavak od 89%

4

i 79% na dva pH. Svi su bili u opsegu 230-310 mOsm/L osim 0,5% PG koji je bio prilično hipotoničan. Korišćenjem 10 mM acetatnog pufera i 4,5% manitola kao sredstva za izotoničnost, 2 mg/mL jedinjenja I i pH 4,0 i 5,5, posmatrano je pet uslova sa surfaktantima. Nisu bili surfaktanti, 0,1% PS-20, 0,1% PS-20 plus 0,25% PX, 0,25% PX i 0,4% PX. Gde nije bilo surfaktanata je bio 0% filtriran na visokom pH i 23% na pH 4,0, a mešavina 0,4% PX i 0,25% PX/0,1% PS-20 je dala potpuni oporavak na pH 4,0 i 95% i 91% respektivno na pH 5,5. 0,25% PX je bio nešto inferioran sa 96% i 91% respektivno, a 0,1% PS prilično inferioran sa 90% i 65% obnavljanja na pH 4 i 5,5 respektivno.

[0128] Kako je eksperiment izotoničnosti sugerisao da bi hidrohlorid mogao biti loš za rastvorljivost, napravljen je eksperiment korišćenjem 2 mg/mL triacetatne soli jedinjenja I. Zbog slabe kiselosti sirćetne kiseline, inherentni pH ove soli na 2 mg/mL u vodi je 3,4-3,6, ali uprkos tome uzorci su rastvoreni u 10 mM sirćetne kiseline, 4,5% manitola i 0,4%, 0,5%, 0,6%, 0,8% i 1,0% PX ili 0,4%, 0,5%, 0,75%, 1,0% i 1,5% PS-20, a pH je podešen na 4,0 ili 5,5. Svi uzorci sa neprilagođenim pH (3,4-3,6) pokazali su oporavak >97% nakon filtracije i >98% na pH 4. Na pH 5,5, 0,4 i 0,5% PX imali su 96% oporavak, a veće koncentracije PX su proizvele do 98-99% oporavka, dok su formulacije PS-20 imale 92-94% oporavak na tom pH. Iz ovih eksperimenata, optimizovana formulacija bi mogla da sadrži manje PX od slične formulacije zasnovane na PS-20, ali je PS-20 i dalje prihvatljiv i može izbeći neke potencijalne probleme sa PX, čak i kada se daje u višim koncentracijama.

Primer 7: In vitro efikasnost jedinjenja I.

[0129] Ćelijska kultura. Ćelijsku liniju fotoreceptora od 661W velikodušno je obezbedio Muayyad Al-Ubaidi (Department of Cell Biology, University of Oklahoma Health Sciences Center, Oklahoma City, OK). Ćelijska linija 661W je fotoreceptorska linija koja je okarakterisana ekspresijom SV40-T antigena pod kontrolom promotora humanog interfotoreceptorskog retinol-vezujućeg proteina (IRBP) (Al-Ubaidi et al., J Cell Biol., 119(6): 1681-1687 (1992)).661W ćelije eksprimiraju markere konusnih fotoreceptora, uključujući plave i zelene pigmente konusa, transducin i arestin konusa (Tan et al., Invest Ophthalmol Vis Sci., (3):764-768 (2004)), i mogu biti podvrgnute ćelijskoj smrti posredovanoj kaspazom (Kanan et al., Invest Ophthalmol Vis Sci., 48(1):40-51 (2007)).

[0130] Ćelijska linija 661W održavana je u Dulbecco-ovom modifikovanom Eagle-ovom medijumu koji obuhvata 10% fetalnog goveđeg seruma, 300 mg/L glutamina, 32 mg/L putrescina, 40 µL/L β -merkaptoetanola, 40 µg/L hidrokortizon 21-hemisukcinata i 40 µg/L progesterona. Medijum je takođe sadržao penicilin (90 U/mL) i streptomicin (0,09 mg/mL). Ćelije su uzgajane na 37°C u vlažnoj atmosferi od 5% CO2i 95% vazduha.

[0131] Analize aktivnosti. Aktivnosti kaspaze 3, kaspaze 8 i kaspaze 9 merene su pomoću kompleta za kolorimetrijsku analizu cepanja tetrapeptida, prema uputstvima proizvođača (BioVision, Mountain View, Calif). Ukupni (661W/mrežnjače) protein je ekstrahovan prema prethodno objavljenom protokolu (Zacks et al., IOVS, 44(3): 1262-1267 (2003)). Sto mikrograma ukupnog (661W/ mrežnjače) proteina je inkubirano sa supstratima kaspaze 3 (DEVD-pNA), kaspaze 8 (IETD-pNA) ili kaspaze 9 (LEHD-pNA) na konačnoj koncentraciji od 200 µM tokom 60 minuta. Apsorpcija je merena na 405 nm u čitaču mikropločica (Spectra-MAX 190, Molecular Devices, Sunnyvale, Calif). Kao negativna kontrola, (661W/ mrežnjače) protein je inkubiran sa puferom za analiziranje bez tetrapeptida. Korišćena je druga negativna kontrola u kojoj je sam pufer za analiziranje inkubiran sa tetrapeptidom. Kao pozitivna kontrola, prečišćena kaspaza 3, kaspaza 8 ili kaspaza 9 je inkubirana samo sa tetrapeptidom.

[0132] Prethodni eksperimenti sprovedeni tokom razvoja ovog pronalaska pokazali su da Fas signalizacija ima ključnu ulogu u aktivaciji kaspaze 8 i apoptozi fotoreceptora in vivo.

[0133] 661W ćelije su tretirane sa FasL. Dodavanje FasL je dovelo do smrti ćelije. Aktivnost kaspaze 8 merena u lizatima 661W ćelija povećavala se sa povećanjem koncentracije FasL, dostižući vrhunac sa dozom od 500 ng/ml. 661W ćelije su tretirane sa 500 ng/ml FasL i mereni su nivoi aktivnosti u različitim vremenskim tačkama. Aktivnost kaspaze 8 je značajno povećana nakon 48 sati u 661W ćelijama izloženim FasL. Aktivnost kaspaze 8 se pouzdano povećava u zavisnosti od doze za 20-30% u različitim ciklusima.

[0134] Prethodno opisani sistem analize je korišćen kao in vitro sistem za skrining da bi se pronašli potencijalni inhibitori Fas-indukovanog puta aktivacije kaspaze 8. Kada je Met-12 (trihidrohloridna so) testiran u ovoj analizi 661W ćelija, pokazao je smanjenje doze zavisno od FasL-indukovane aktivacije kaspaze 8, maksimiziranje na 10 µM, gde je, u zavisnosti od analize, aktivacija kaspaze 8 smanjena na 0 -25% od osnovne vrednosti. Ova aktivnost veoma zavisi od formulacije u kojoj se isporučuje Met-12 peptid. Konačna formulacija za Met-12 je razblažena 1000 puta za ovu analizu, a da bi se došlo do vrha krive doze, koja je normalno 100 µM, koristi se manja razblaženja. Pod ovim okolnostima, maksimalna jačina doze je primećena sa čistim rastvorom DMSO, koji je isporučio Met-12 peptid kao bistar, pokretljiv, tečan, gde je pojavljeni pH znatno ispod 3,0. Kada su isprobane formulacije na bazi vode, čak i tamo gde nije bilo vizuelnih dokaza taloženja ili agregacije pre dodavanja materijala u testirana udubljenja, formulacije su pokazale znatno manju jačinu doze, pri čemu se maksimalna inhibicija nije postigla sve do 50-100 µM doze.

[0135] Ovo snažno sugeriše da bez obzira na konačnu fizičku formu u testiranim udubljenjima, agregacija u rastvoru za doziranje dovodi do vrsta sa mnogo manje dostupnog leka, čak i u ovim analizama ćelija, nego što se pravi rastvori razblažuju u potpuno istim uslovima, gde verovatno imaju istu intrinzičnu potencijalnu rastvorljivost. Daleko najverovatnije objašnjenje za ovo je da su prethodno formirani agregati u ne-rastvorima dovoljno kinetički i termodinamički stabilni da se ne raspadaju u rastvoru optimalnom brzinom tokom trajanja testa, dok rastvori kada se razblaže u testiranim udubljenjima ili ne formiraju agregate, ili verovatnije formiraju različite agregate, koji se lakše rastvaraju. Glavni razlog zašto su agregati različiti bi bio taj što je peptid u najmanju ruku nešto manje koncentrisan kada se premesti iz svog pH ili rastvorljivog oblika koji je pojačan ko-rastvaračem u 99% vodeni milje na pH 7,4. Međutim, pošto je efikasno mešanje malo verovatno u testiranim udubljenjima i nemoguće u oku, i, kao što je objašnjeno u nastavku, solvatirajući protoni (nizak pH) i rastvarači malih molekula, difunduju u vodi mnogo brže od hidrofobnih i glomaznih peptida, velika je verovatnoća da se ovi peptidi brzo agregiraju u testriranim udubljenjima ili u staklastom telu odmah nakon doziranja. Stoga, iako je doziranje rastvora očigledno superiornije u odnosu na doziranje suspenzije/gela, nema garancije da se i dalje neće izdvojiti mnogo peptida kao nerastvorljive agregate i smanjiti efektivnu koncentraciju leka na stohastički način kada se primenjuje.

[0136] Neočekivano, kao što je prikazano na Slici 1, kada je trihidrohlorid jedinjenja I testiran u ovoj analizi kao nepuferovani rastvor u DMSO, u poređenju sa Met-12 (takođe trihidrohloridom u DMSO), pokazalo se da je 10 puta jači od Met-12 određivanjem IC50, i približno 3 puta jači mereno koncentracijom koja je proizvela maksimalnu inhibiciju FasL-indukovane aktivacije kaspaze 8. EC50je bio 0,4 µM, dok je za sam Met-12 bio 4 µM, a maksimalna inhibicija je primećena na 3 µM. Međutim, iznad 3 µM, jedinjenje I je pokazalo krivu u obliku slova U, a iznad 30 µM je izgledalo skoro neaktivno. Nasuprot tome, Met-12 doziran na isti način dostiže svoju (malo veću) maksimalnu efikasnost na 10 µM, a zatim ima samo blagi povratni gubitak jačine do 100 µM. (Videti Sliku 1; aktivnost kaspaze 8 nakon 48 sati nakon tretmana sa humanim rekombinantnim FasL nakon prethodnog tretmana sa Met-12 i jedinjenjem I.) 0% je nivo aktivnosti kaspaze 8 netretiranih kontrola. 100% je podešeno na aktivnost kaspaze 8 kontrola tretiranih samo sa FasL.

[0137] Kako mehanizam dejstva FasL uključuje trivalentnu ligandnu trimerizaciju Fas receptora, veoma je teško videti kako bi univalentni Met-12 derivati mogli da imaju pomešane krive doze agonista-antagonista, i veruje se da je gubitak jačine rastvorljivosti artefakt analize. Međutim, neočekivano povećanje jačine doze za jedinjenje I bi trebalo da omogući da se daje manja količina leka nego što je potrebna za sam Met-12, što zauzvrat smanjuje zahteve rastvorljivosti za formulaciju peptida za intravitrealno ubrizgavanje.

[0138] Podaci prikazani na Slici 2 su u skladu sa prethodnim objašnjenjem. Još jednom pokazuje da je trihidrohlorid jedinjenja I u DMSO (20 mg/mL) nešto snažnije doze od Met-12, ali da ponovo postaje neaktivno na višim koncentracijama. Nasuprot tome, kada se napravi na koncentraciji od 10 mg/mL u bistrom, filterabilnom, verovatno micelarnom rastvoru od 2% Polysorbate 20 i 2% PG na pH 4, trihidrohlorid jedinjenja I je i znatno snažnije doze, ali i efikasnije od Met-12 ili jedinjenja I u DMSO. Štaviše, postoji vrlo mali gubitak maksimalne efikasnosti pri najvišoj dozi od 30 µM testiranoj u ovoj analizi. Ovaj iznenađujući rezultat pokazuje da sposobnost formulisanja jedinjenja I u surfaktantima može dovesti do velikog povećanja efikasnosti leka.

[0139] Na Slici 3 se upoređuje 20 mg/mL rastvora DMSO sa dve Polysorbate formulacije trihidrohlorida jedinjenja I koje obuhvataju 1% i 3% PS-20 i 3% PG na pH 4, sa svim na koncentraciji od 10 mg/mL. Sva 3 pokazuju sličnu efikasnost u ovom slučaju na nižim koncentracijama, ali samo 1% PS-20 pokazuje slab gubitak aktivnosti od svoje najjače koncentracije od 3 µM, sve do 30 µM, dok 3% PS pokazuje nastavak povećanje aktivnosti sve do 30 µM, najveće testirane doze.

[0140] Na Slici 4 optimizovane formulacije trihidrohlorida jedinjenja I, sa 2 mg/mL na pH 4, 10 mM acetatnog pufera, 4,5% manitola i 0,4% PS-20 (tamni trouglovi) upoređene su sa 20 mg/mL trihidrohlorida jedinjenja I u DMSO (svetli krugovi) u 661W ćelijama. Trihidrohlorid u DMSO pokazuje uobičajenu krivu u obliku slova U sa maksimalnim efektom na 3 µM, i značajnim povratkom na višim koncentracijama. Formulacija je mogla biti testirana samo do 10 µM, zbog niskih koncentracija, ali pokazuje sličnu efikasnost kao i DMSO rastvor.

[0141] Verovatno objašnjenje za veću efikasnost uočenu kod formulacija micela je da se rastvorljivost peptida održava duže vreme zahvaljujući sklonosti surfaktanta ka samosastavljanju, na koju samo polako utiču razblaživanje i disperzija, u oštrom kontrastu sa pH gradijentima ili ko-rastvarači malih molekula. Tako se micele i peptid šire disperguju u vodenom medijumu, pre nego što se peptid otpusti u vodeni medijum, jer se micele samo polako raspadaju, dok se u ko-rastvaraču ili visoko kiselom rastvoru solubilizirajući faktor (joni vodonika, mali molekul), veoma brzo razblaži u vodenom medijumu, pre nego što peptid ima bilo kakvu realnu šansu da disperguje izvan oblasti u kojoj je ubizgavanjem direktno postavljen. Ovo će dovesti do toga da se peptid manje efikasno disperguje iz formulacija rastvora i formira više neaktivnih agregata nego iz micelarne formulacije.

Primer 8: Intravitrealna okularna farmakokinetička studija sa jedinjenjem I kod zečeva

[0142] Ova studija je sprovedena da bi se odredile koncentracije jedinjenja I u staklastom telu (VH) i tkivu mrežnjače nakon intravitrealnih ubrizgavanja mužjaka holandskih pojasanih zečeva. Koncentracije su određene u tkivima 24, 72, 168 i 240 sati nakon doze od 50 µL bilateralne intravitrealne (IVT) doze.

[0143] Dizajn studije je sumarno prikazan u Tabeli I.

Tabela I. Dizajn studije.

Sistem testiranja uključivao je sledeće:

Vrsta/Soj/Pol: Mužjaci holandskih pojasanih zečeva Dobavljač: Covance Research Products, Inc.

Opseg starosti: 4 do 5 meseci

Težina pri prijemu (opseg težina): 1.51 - 1.85 kg

Način primene: Intravitrealnim (IVT) ubrizgavanjem

Trajanje tretmana: Jedna doza po oku

Koncentracije formulacija: 2.0, 1.0 i 0.5 mg/mL triacetata jedinjenja I Zapremina doze: 50 µL po oku

[0144] Intravitrealno (IVT) ubrizgavanje doza za oči od 50 µL je primenjeno na globus svakog oka holandskog pojasanog zeca.

[0145] U odgovarajućim vremenskim tačkama, zečevi su eutanazirani intravenskim predoziranjem barbiturata, a oči su enukleisane i brzo zamrznute. Staklasto telo i mrežnjača su sakupljeni od svih životinja i analizirani na jedinjenje I pomoću LC-MS/MS.

Računanje:

[0146] Procenat koeficijenta varijacije: Koristi se kao procena preciznosti.

Procenat koeficijenta varijacije (%CV) = (Standardna devijacija/prosečna vrednost) * 100

[0147] Kvadratna analiza najmanjih kvadrata: Standardno uklapanje krive je određeno korišćenjem kvadratne jednačine sa 1/x<2>ponderisanjem:

gde:

y = odnos površine vrha standarda za kalibraciju prema internom standardu

x = koncentracija standarda za kalibraciju

a = kvadratni koeficijent od x<2>

b = kvadratni koeficijent od x

c = konstanta kao presek y kalibracione krive

[0148] Kvadratna koncentracija analita: Koncentracija analita se izračunava korišćenjem parametara kalibracione krive prethodno izračunatih, a zatim se rešava za vrednost x.

4

Rezultati

[0149] Koncentracije mrežnjače i VH se nalaze u Tabelama 2 i 3 u nastavku, i grafički su predstavljene na Slikama 1 i 2. Farmakokinetički parametri su izračunati gde je to bilo prikladno i sumirani su u Tabelama 4 i 5 u nastavku.

Tabela 2. Koncentracije jedinjenja I u mrežnjači holandskog pojasanog zeca.

Tabela 3. Koncentracije jedinjenja I u staklastom telu holandskog pojasanog zeca.

4

[0150] Rezultati ove studije na mrežnjači i staklastom telu prikazani su na SLICI 5 (A+B) i SLICI 6 (A+B), respektivno. Koncentracije jedinjenja I u mrežnjači bile su promenljive sa koeficijentom varijabilnosti (%CV) u opsegu od 52 do 156 procenata tokom vremenskog toka studije za sve grupe. Tmaxmrežnjače je zabeležena na 72 (3 dana) ili 168 (7 dana) sati nakon primene za tri formulacije Poloxamer-a, ali nije zavisila od doze, dok je Tmaxmrežnjače za Polysorbate formulaciju bio 24 sata nakon primene. AUC0-poslednjimrežnjače je pratila sličan varijabilni obrazac kao Cmax. T1/2mrežnjače za jedinjenje I mogao se izračunati samo za podatke o mrežnjači od 2 mg/mL Poloxamer (168 sati) i I mg/mL Polysorbate (199 sati).

[0151] Analiza staklastog tela za jedinjenje I pokazala je da je koncentracija relativno konzistentna unutar svake vremenske tačke za Poloxamer formulacije. Kada se normalizuje težina sakupljenog VH, izračunat je teoretski ukupan iznos jedinjenja I. Ukupna količina jedinjenja I ubrizganog u svako oko zeca bila je 100 µg (2 mg/mL ∗ 50 µL) ili 25 µg (0,5 mg/mL ∗ 50 µL) za Poloxamer-e i 50 µg (I mg/mL ∗ 50 µL) za Polysorbate grupu. Najniža srednja

4

koncentracija za sve grupe bila je 10 dana. Srednja vrednost jedinjenja I koja je preostala u VH za Grupu I (100 µg) kretala se od 84,2 µg do 106 µg 24 sata do 10 dana nakon primene IVT. Srednja vrednost jedinjenja I koja je preostala u VH za Grupu 2 (25 µg) kretala se od 19,5 µg do 23,0 µg 24 sata do 10 dana nakon primene IVT. Srednja vrednost jedinjenja I preostalog u VH za Grupu 3 (25 µg) kretala se od 26,0 µg do 20,4 µg 24 sata do 10 dana nakon primene IVT. Srednja vrednost jedinjenja I preostalog u VH za Polysorbate grupu 4 (50 µg) kretala se od visokih 46,8 µg na 24 sata do 19,4 µg 10 dana nakon primene IVT. Polysorbate grupa je bila jedina formulacija sa primetnim smanjenjem koncentracija jedinjenja I tokom vremena. Ipak, u svim grupama su otkrivene značajne količine intaktnog leka 10 dana nakon primene.

[0152] Izračunavanje farmakokinetičkih parametara za jedinjenje I u VH pokazalo je Tmaxod 24 ili 72 sata nakon primene IVT sa Cmaxkoji se blisko podudara sa ukupnom količinom leka primenjenog za svaku grupu (Tabela 4). AUC0-poslednjije bio skoro proporcionalan dozi između grupa Poloxamer sa Grupom I (2 mg/mL) koja je imala približno četiri puta veću AUC nego u Grupama 2 i 3 (obe 0,5 mg/mL). Polysorbate grupa (I mg/mL) bila je manja od proporcionalna dozi u odnosu na Poloxamer grupe, ali se to lako može objasniti jer je to bila jedina grupa koja je imala primetno smanjenje koncentracije jedinjenja I VH tokom trajanja studije. T1/2za Polysorbate grupu bio je 183 sata sa dobrim linearnim uklapanjem, dok je t1/2za Poloaxmer grupe bio >900 sati sa linearnim pristajanjem manjim od optimalnog.

Tabela 4. Farmakokinetički parametri za jedinjenje I u staklastom telu.

Tabela 5. Farmakokinetički parametri za jedinjenje I u mrežnjači.

4

[0153] Ukratko, jedinjenje I kada se primenjuje IVT u Poloxamer ili Polysorbate formulacijama nije pokazalo znake iritacije ili problema sa podnošljivošću tokom 10 dana trajanja studije. Jedinjenje I kada se primenjuje IVT kao Poloxamer formulacija ne smanjuje se lako u koncentraciji tokom perioda do 10 dana, a verovatno i duže, bilo u mrežnjači ili u VH. Kada se jedinjenje I primenjuje u obliku Polysorbate formulacije pokazalo je jasno, ali sporo smanjenje koncentracije tokom perioda ispitivanja od 10 dana, što sugeriše da se intravitrealna farmakokinetika može kontrolisati unutar određenih parametara pažljivim izborom korišćenog nejonskog surfaktanta.

Primer 9: Farmakokinetička studija oka pacova sa jedinjenjem I

[0154] Ova studija je sprovedena da bi se odredile koncentracije trihidrohlorida jedinjenja I u tkivima staklastog tela i mrežnjače nakon intravitrealnih ubrizgavanja smeđih norveških pacova. Koncentracije su određene u tkivima na 24 (Grupa I) i 72 sata (Grupe I i 2) nakon doze od 5 µL bilateralne intravitrealne (IVT) doze.

[0155] Dizajn studije je sumarno prikazan u Tabeli 6.

Tabela 6. Dizajn studije.

4

Sistem testiranja uključivao je sledeće:

Vrsta/Soj/Pol: Norveški smeđi pacovi

Dobavljač: Charles River, Inc.

Opseg starosti: I do 2 meseca

Težina pri prijemu (opseg težina): 165.9 - 181.2 g

Način primene: Intravitrealno (IVT) ubrizgavanje

Trajanje tretmana: Jedna doza po oku

Koncentracije formulacija: 0.06 mg/mL ONL-1204 triacetata

Zapremina doze: 5 µL po oku

Sakupljanje očnih tkiva

[0156] Pacovi su eutanazirani intravenskim predoziranjem barbiturata, a oči su enukleisane i brzo zamrznute. Staklasto telo i mrežnjača su sakupljeni od svih životinja i analizirani na jedinjenje I pomoću LC-MS/MS.

Rezultati

Koncentracije očnog tkiva

[0157] Koncentracije trihidrohlorida jedinjenja I u mrežnjači smeđeg norveškog pacova i u nepoznatom staklastom telu.

Tabela 7. Koncentracije jedinjenja I u mrežnjači smeđeg norveškog pacova.

4

4

Tabela 8. Koncentracije jedinjenja I u staklastom telu smeđeg norveškog pacova.

Homogenizacija tkiva

Uputstvo za homogenizaciju nepoznatog staklastog tela (VH)

[0158] Za svaki nepoznati VH ili praznu kontrolu: Izmeriti VH u epruvetu za homogenizaciju. Dodati 4 puta veću VH težinu (mg) ACN:voda: 1M hlorovodonična kiselina (70:20:10, zapr./ zapr./ zapr.) (µL) u epruvetu za homogenizaciju. Dodati kuglice od cirkonijum oksida, veličine 2,8 i 1,4 mm. Homogenizovati sve uzorke na Precellys<®>: 5500 rpm, 3 X ciklusa od 30 sekundi i 20 sekundi između ciklusa, na temperaturi između -10 do 0°C.

Uputstvo za homogenizaciju standardnog očnog tkiva mrežnjače

Za svaki standard mrežnjače:

[0159] Izmerite prazno tkivo mrežnjače u epruvetu za homogenizaciju.

[0160] Dodati 0,5 puta veću težinu tkiva (mg) mrežnjače radnog kalibracionog standarda (µL) u epruvetu za homogenizaciju.

[0161] Dodati 3,5 puta veću težinu tkiva (mg) ACN:voda: 1M hlorovodonična kiselina (70:20:10, zapr./ zapr./ zapr.) (µL) u epruvetu za homogenizaciju.

[0162] Dodati kuglice od cirkonijum oksida, veličine 1,4 mm.

[0163] Homogenizovati sve uzorke na Precellys<®>: 5500 rpm, 3 X ciklusa od 30 sekundi i 20 sekundi između ciklusa, na temperaturi između -10 do 0°C.

[0164] Uputstva za homogenizaciju prazne kontrole i nepoznatog tkiva mrežnjače

[0165] Za svaku nepoznatu mrežnjaču ili praznu kontrolu:

[0166] Izmerite tkivo mrežnjače u epruvetu za homogenizaciju.

1

[0167] Dodati 4 puta veću težinu tkiva (mg) ACN:voda: 1M hlorovodonična kiselina (70:20:10, zapr./ zapr./ zapr.) (µL) u epruvetu za homogenizaciju.

[0168] Dodati kuglice od cirkonijum oksida, veličine 1,4 mm.

[0169] Homogenizovati sve uzorke na Precellys<®>: 5500 rpm, 3 X ciklusa od 30 sekundi i 20 sekundi između ciklusa, na temperaturi između -10 do 0°C.

[0170] Priprema standarda, uzoraka i praznina

[0171] Priprema osnovnih kalibracija i radnih standarda

[0172] Standardna osnovna kalibracija je pripremljena u dimetilsulfoksidu (DMSO) na koncentraciji od 500 µg/mL za ONL-1204.

[0173] Standardi za radnu kalibraciju pripremljeni su za staklasto telo serijskim razblaženjem radnog osnovnog rastvora sa ACN:voda: 1M hlorovodonična kiselina (70:20:10, zapr./ zapr./ zapr.) preko opsega od 500 ng/mL do 200,000 ng/mL ONL -1204.

[0174] Standardi za radnu kalibraciju pripremljeni su za mrežnjaču serijskim razblaženjem radnog osnovnog rastvora sa acetonitril:voda: 1M hlorovodonična kiselina (70:20:10) preko opsega od 100 ng/mL do 200,000 ng/mL ONL -1204.

[0175] Priprema standarda, nepoznanica, praznina i praznina sa internim standardom za analizu staklastog tela

[0176] U polipropilenskoj epruveti, deset (10) µL (20 µL STD II) radnog kalibracionog standarda ili osnovnog je dodato u 90 µL (80 µL STD II) kontrolnog praznog staklastog tela. Za prazne i prazne uzorke sa internim standardom, dodato je 100 µL kontrolnog praznog uzorka goveđeg staklastog tela. Četiri stotine (400) µL ACN:voda: IM hlorovodonična kiselina (70:20:10, zapr./ zapr./ zapr.) je dodato svakom standardu ili praznom uzorku.

[0177] Sto (100) µL svakog uzorka staklastog tela sa ACN: mravljom kiselinom (1000:1, zapr./ zapr.) je zatim podeljeno u alikvote. Sto (100) µL DMSO:voda:mravlja kiselina (50:40:10) je dodato u svaki uzorak staklastog tela. Uzorci su mešani vorteksom, a zatim centrifugirani 10 minuta na 14.000 rpm (4°C). U 50,0 µL supernatanta dodato je 100 µL radnog internog standarda (50,000 ng/mL APi 1887 u vodi) (voda za prazno bez internog standarda) i 150 µL vode. Uzorci su zatim mešani vorteksom i prebačeni na ploču za automatsko uzorkovanje za analizu.

[0178] Priprema standarda, nepoznanica, praznina i praznina sa internim standardom za analizu mrežnjače.

[0179] U polipropilensku epruvetu dodato je 50 µL nepoznatog homogenata smeđeg norveškog pacova, goveđe prazne kontrole ili kalibracionog standarda goveđeg homogenata. Svakom uzorku je dodato pedeset (50) µL DMSO:voda:mravlja kiselina (50:40:10). Uzorci su zatim mešani vorteksom i centrifugirani 10 minuta na 14,000 rpm (4°C). Osamdeset (80) µL svakog

2

supernatanta uzorka je zatim alikvotirano u pločicu sa 96 udubljenja za automatsko uzorkovanje. Dodato je četrdeset (40) µL radnog internog standarda (5,000 ng/mL APi 1887 u vodi) (voda za prazninu bez internog standarda) i 120 µL vode. Uzorci su zatim pomešani sa višekanalnom pipetom i analizirani.

Računanje

[0180] Procenat koeficijenta varijacije: Koristi se kao procena preciznosti.

Procenat koeficijenta varijacije (%CV) = (Standardna devijacija/prosečna vrednost) * 100

[0181] Kvadratna analiza najmanjih kvadrata: Standardno uklapanje krive je određeno korišćenjem kvadratne jednačine sa 1/x<2>ponderisanjem:

gde:

y = odnos površine vrha standarda za kalibraciju prema internom standardu

x = koncentracija standarda za kalibraciju

a = kvadratni koeficijent od x<2>

b = kvadratni koeficijent od x

c = konstanta kao presek y kalibracione krive

[0182] Kvadratna koncentracija analita: Koncentracija analita se izračunava korišćenjem parametara kalibracione krive prethodno izračunatih, a zatim se rešava za vrednost x.

Analiza

[0183] Globalno prosečni rezultati su prikazani na Slici 7. Za grupu I oba oka svake životinje su kombinovana za jednu analizu. U grupi 2 oba oka su kombinovana od 4 životinje da bi se napravili uzorci. Koncentracije za puliranu mrežnjaču u grupi 2 bile su 462 i 1310 ng/g za A-D i E-H uzorke respektivno. Analiza staklastog tela za jedinjenje I je sprovedena korišćenjem kombinovanih uzoraka iz svakog oka za svaku životinju u grupama I i 2. Kada se normalizuje težina sakupljenog VH, izračunat je teoretski ukupan iznos jedinjenja I. Ukupna količina jedinjenja I ubrizganog u svako oko pacova bila je 0,3 µg (0,06 mg/mL * 5 µL)). Zbog različitih načina prikupljanja podataka za 72 sata, standardna greška nije izračunata. Tamni stubići predstavljaju količinu triacetata jedinjenja I u staklastom telu svakog oka, pri čemu t = 0 stubić predstavlja predviđenu dozu od 300 ng, a svetli stubići predstavljaju koncentraciju jedinjenja I u mrežnjači izraženu u ng/g. U prva 24 sata, otprilike polovina leka je očistila VH, ali je terminalni poluživot bio jasno reda veličine nekoliko dana. U međuvremenu, koncentracije u mrežnjači bile su iznad 1 µg/g u 24 sata, i imaju samo oko 40% do 72 sata. Ovo sugeriše da će mrežnjača pacova biti izložena leku u količinama koje se lako mogu otkriti najmanje nedelju dana.

[0184] Koncentracije jedinjenja I u mrežnjači su od 146 do 3670 ng/g za 24-časovne uzorke Grupe I, i od 409 do 804 ng/g u 72-časovnim uzorcima Grupe I. Srednja vrednost jedinjenja I koja je preostala u VH za Grupu I bila je 0,157 i 0,0994 µg/uzorku u vremenskim tačkama na 24 sata i 72 sata, respektivno. Srednja vrednost jedinjenja I koja je preostala u VH za uzorke Grupe 2 na 72 sata bila je 0,127 µg/uzorku. Podaci pokazuju da znatne količine intaktnog leka ostaju 72 sata nakon primene.

Primer 10: In vivo efikasnost jedinjenja I.

[0185] Ukratko, glodari su anestezirani mešavinom ketamina (100 mg/mL) i ksilazina (20 mg/mL) u odnosu 50:50, a zenice su proširene lokalnim fenilefrinom (2,5%) i tropikamidom (1%). Mikrovitreoretinalna oštrica od 20 (Walcott Scientific, Marmora, NJ) je korišćena da se napravi sklerotomija 2 mm iza limbusa, pažljivo izbegavajući oštećenje sočiva.

[0186] Pod direktnom vizualizacijom kroz operativni mikroskop, subretinalni injektor (Glaser, 32-gauge tip; BD Ophthalmic Systems, Sarasota, FL) je uveden kroz sklerotomiju u staklastu šupljinu, a zatim kroz perifernu retinotomiju u subretinalni prostor. Natrijum hijaluronat (10 mg/mL) je polako ubrizgavan da bi se odvojila neurosenzorna mrežnjača od osnovnog pigmentnog epitela mrežnjače.

[0187] U svim eksperimentima, otprilike jedna trećina do polovina superonazalne neurosenzorne mrežnjače je bilo odvojeno. Kod svih životinja, odvajanja su napravljena na istoj lokaciji da bi se omogućilo direktno poređenje broja ćelija mrežnjače. Na levom oku se stvaraju odvajanja, a desno oko ostaje kao kontrola.

[0188] U nekim očima, Met-12 divljeg tipa (HHIYLGAVNYIY, 5 µg u DMSO) kao njegova trihidrohloridna so je dat kao pozitivna kontrola, a u drugim očima, jedinjenje I (0,5, 1,0, 5,0 ili 10 µg u DMSO) kao njegova trihidrohloridna so, ili sredstvo (dimetil sulfoksid [DMSO]) je ubrizgan u subretinalni prostor u oblasti odvajanja u zapremini od 5 µL koristeći Hamilton špric (Hamilton Company, Reno, NV) odmah nakon stvaranja odvajanja.

[0189] Posle tri dana pacovi su eutanazirani, mrežnjače su izrezane, fiksirane, presečene i obojene za TUNEL analize. Područja odvojene mrežnjače su brojana za broj apoptotičkih ćelija. Svaki eksperiment je uključivao 4 polja iz svake od 4 sekcije dobijene od 5 ili 6 mrežnjača za svaku grupu za doziranje. Rezultati su prikazani na Slici 8.

[0190] Kako je prikazano na Slici 8, kontrolne povezanih mrežnjača nisu pokazale apoptotičke ćelije, dok DMSO kontrolne mrežnjača imaju približno 4% ćelija koje su obojene za TUNEL, a

4

pozitivna kontrola Met-12 (5 µg) sa nešto više od 1% pozitivnih na TUNEL. Tretman soli trihidrohlorida jedinjenja I je doveo do 0,58% na 0,5 µg, 1,14% na 1 µg, 0,82% na 5 µg i 0,9% na 10 µg. Na osnovu značajnog iskustva sa modelom, rezultati za jedinjenje I se smatraju približno međusobno ekvivalentnim i sa 5 µg Met-12 pozitivnom kontrolom. Tako neočekivano, so trihidrohlorida jedinjenja I je mnogo efikasnija od soli trihidrohlorida Met-12 u ovom in vivo modelu.

Primer I I: Studija efikasnosti

[0191] Korišćenjem istog modela odvajanja mrežnjače glodara kao u Primeru 10, visoko efikasna doza jedinjenja I od 5 µg u DMSO je upoređena sa istom dozom i dozom od 1 µg jedinjenja I u dve različite formulacije.

[0192] Prva formulacija je bila 1,0 ili 0,2 mg/mL rastvor trihidrohlorida jedinjenja I u 3% propilen glikola i 3% PS-20 na pH 4,0, a druga formulacija je bila iste koncentracije jedinjenja I u 2% propilen glikolu 2% rastvor poloxamer 407, takođe na pH 4. Rezultati su prikazani na Slici 9.

[0193] Zakačene kontrolne mrežnjače nisu pokazale apoptotičke ćelije, dok su netretirana odvajanja pokazala približno 6,5% apoptotičkih ćelija mereno u ovom trenutku.

[0194] Jedinjenje I u DMSO je smanjilo to na 2,5%, a 5 µg PG/PS-20 je bilo slične jačine smanjujući apoptotičke ćelije na 2,9%. Međutim, formulacija PG/PX je bila znatno bolja na toj koncentraciji, smanjujući apoptotičke ćelije na 0,3% na 5 µg. Kod I µg PG/PX formulacija su smanjene apoptotičke ćelije na 0,4%, ali doza PG/PS-20 od 1 µg je izazvala još veće smanjenje na 0,01%. Podaci pokazuju da ne samo da micelarne formacije mogu da funkcionišu, već i da trihidrohloridna so jedinjenja I može biti još jača u njima nego kada je formulisana u DMSO.

Primer 12: Studija efikasnosti

[0195] Korišćenjem istog modela odvajanja mrežnjače glodara kao u Primeru 10, kao pozitivna kontrola je korišćena so trihidrohlorida jedinjenja I u DMSO (1 µg). Negativna kontrola je bilo ispitivano sredstvo koje se procenjuje (0,4% Poloxamer, 4,5% manitola, 10 mM sirćetne kiseline na pH 4,5.) So triacetata jedinjenja I u DMSO (I µg) je upoređena sa soli trihidrohlorida u istoj dozi.

[0196] Zakačene mrežnjače (stubić 4) nisu imale apoptotičke ćelije, dok su odvojene mrežnjače tretirane sredstvom (stubić 1) pokazale 4,2% apoptotičkih ćelija, što sugeriše da nema aktivnosti, pošto je to unutar istorijskog opsega za netretirane ablacije mrežnjače (videti primer 10). So trihidrohlorida jedinjenja I (DMSO) je dala 2,4% apoptotičkih ćelija, dok je so triacetata (DMSO) dala samo 1,2%, što pokazuje da prelazak sa hidrohloridnih na acetatne soli nema negativne efekte, a vrlo verovatno pozitivne efekte na efikasnost.

[0197] Stručnjacima u tehnici će biti očigledne različite modifikacije i varijacije opisanih postupaka i kompozicija prema pronalasku. Iako je pronalazak opisan u vezi sa specifičnim poželjnim primerima izvođenja, trebalo bi podraumevati da pronalazak za koji se traži zaštita ne bi trebalo da bude neopravdano ograničen na takve specifične primere izvođenja. Zaista, različite modifikacije opisanih načina za sprovođenje pronalaska koje su očigledne stručnjacima u relevantnim oblastima treba da budu u okviru sledećih patentnih zahteva.

[0198] Iako je ovaj pronalazak opisan sa dosta detalja u vezi sa određenim njegovim primerima izvođenja, mogući su i drugi primeri izvođenja bez odstupanja od ovog pronalaska.

[0199] Štaviše, prethodno opisane prednosti nisu nužno jedine prednosti pronalaska, i nije nužno da se očekuje da će sve opisane prednosti biti postignute sa svakim primerom izvođenja pronalaska.

Claims (39)

1. Patentni zahtevi 1. Jedinjenje Formule 1,

   Formule I ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.
2. 2. Poliacetatna ili triacetatna so jedinjenja prema patentnom zahtevu 1.
3. 3. Kompozicija sadrži jedinjenje ili so prema patentnom zatevu 1 ili patentnom zahtevu 2, i farmaceutski nosač konfigurisan za isporuku u oči.
4. 4. Kompozicija prema patentnom zahtevu 3, naznačena time da je kompozicija formulisana za intraokularnu, intravitrealnu ili periokularnu primenu.
5. 5. Kompozicija prema patentnom zahtevu 3 ili patentnom zahtevu 4, naznačena time da jedinjenje unutar kompozicije štiti odvojene fotoreceptorske ćelije mrežnjače, sprečava apoptozu ili nekroptozu u ćelijama pigmentiranog epitela mrežnjače oka, ili sprečava apoptozu ili nekroptozu u ganglijskim ćelijama mrežnjače oka.
6. 6. Kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 3-5, koja dalje sadrži najmanje jedan nejonski surfaktant.
7. 7. Kompozicija prema patentnom zahtevu 6, naznačena time da je najmanje jedan nejonski surfaktant odabran iz grupe koja se sastoji od Polysorbate 80, Polysorbate 20, Poloxamer 407, i Tyloxapol.
8. 8. Kompozicija prema patentnom zahtevu 6 ili patentnom zahtevu 7, naznačena time da najmanje jedan nejonski surfaktant čini približno 0,01%-20% tež./tež. kompozicije, ili pri čemu najmanje jedan nejonski surfaktant čini približno 0,05%-10% tež./tež. kompozicije, ili pri čemu najmanje jedan nejonski surfaktant čini približno 0,25%-3% tež./tež. kompozicije.
9. 9. Kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 6 do 8, naznačena time da se koriste dva ili više nejonska surfaktanata u odnosu koji optimizuje parametre kao što su vitrealna farmakokinetika ili farmakokinetika mrežnjače da bi odgovarali indikaciji koja se leči, bilo da je akutna ili hronična, tako da je ukupna količina dodatog nejonskog surfaktanta 0,01-20% tež./tež. kompozicije.
10. 10. Kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 3-9, koja dalje sadrži najmanje jedan od propilen glikola i dimetilsulfoksida.
11. 11. Kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 3-9, koja dalje sadrži organski korastvarač; izborno naznačeno time da organski korastvarač formira približno 1%-50% tež./tež. kompozicije; približno 1%-20% tež./tež. kompozicije, ili približno 1%-5% tež./tež. kompozicije.
12. 12. Kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 3-11, naznačena time da kompozicija ima pH u opsegu 2,5-6,0.
13. 13. Jedinjenje ili so prema patentnom zahtevu 1 ili patentnom zahtevu 2 za upotrebu u sprečavanju apoptoze posredovane sa Fas ili TRAIL u fotoreceptorima oka, za upotrebu u sprečavanju apoptoze ili nekroptoze u ćelijama pigmentiranog epitela mrežnjače oka, ili za upotrebu u sprečavanju apoptoze ili nekroptoze u ganglijskim ćelijama mrežnjače.
14. 14. Jedinjenje ili so prema patentnom zahtevu 1 ili patentnom zahtevu 2 za upotrebu u lečenju ablacije mrežnjače, smrti ćelija pigmentnog epitela mrežnjače ili smrti ganglijskih ćelija mrežnjače, ili za sprečavanje bolesti ili stanja ganglijskih ćelija mrežnjače.
15. 15. Kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 3-12 za upotrebu u postupku lečenja očnog stanja, bolesti ili stanja ili bolesti koje utiču na zdravlje oka kod subjekta koji pati od očnog stanja, bolesti ili stanja ili bolesti koje utiču na zdravlje oka.
16. 16. Kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 15, naznačena time što je očno stanje, bolest ili stanje ili bolest koja utiče na zdravlje oka odabrana sa liste koja se sastoji od ablacije mrežnjače, degeneracije makule, degeneracije makule povezane sa starenjem, neeksudativne degeneracije makule povezane sa starenjem, eksudativne degeneracije makule povezane sa starenjem, horoidalne neovaskularizacije, retinopatije, dijabetičke retinopatije, akutne i hronične neuroretinopatije makule, centralne serozne horioretinopatije, makularnog edema, cistoidnog makularnog edema, dijabetičkog makularnog edema, uveitisa/retinitisa/horoiditisa, multifokalne plakoidne pigmentne epiteliopatije, Behcet-sove bolesti, birdshot retinohoroidopatije, zaraze (sifilis, lajmska bolest, tuberkuloza, toksoplazmoza), uveitisa, srednjeg uveitisa (pars planitis), anteriornog uveitisa, multifokalnog horoiditisa, sindroma višestrukih evanescentnih belih tačaka (MEWDS), sarkoidoze oka, posteriornog skleritisa, serpignoznog horoiditisa, subretinalne fibroze, sindroma uveitisa, Vogt-Koyanagi-Harada sindroma; arterijske okluzivne bolesti mrežnjače, okluzije centralne vene mrežnjače, diseminovane intravaskularne koagulopatije, okluzije grane vene mrežnjače, hipertenzivne promene fundusa, sindroma ishemije oka, mikroaneurizme arterija mrežnjače, Coats-ove bolesti, parafovealne telangiektazije, okluzije hemiretinalne vene, papiloflebitisa, okluzije centralne arterije mrežnjače, okluzije grane arterije mrežnjače, bolesti karotidne arterije (CAD), angitisa smrznute grane, retinopatije srpastih ćelija i druge hemoglobinopatije, angioidne pruge, familijarne eksudativne vitreoretinopatije, Eales-ove bolesti, simpatičke oftalmije, uveitske bolesti mrežnjače, ablacije mrežnjače, fotokoagulacija izazvane traumom, laserom, PDT, hipoperfuzije tokom operacije, radijacione retinopatije, retinopatije kod transplantacije koštane srži, proliferativne vitrealne retinopatije i epiretinalne membrane, proliferativne dijabetičke retinopatije, okularne histoplazmoze, okularne toksokariaze, sindroma očne histoplazmoze (OHS), endoftalmitisa, toksoplazmoze, bolesti mrežnjače povezane sa HIV infekcijom, horoidne bolesti povezane sa HIV infekcijom, uveitične bolesti povezane sa HIV infekcijom, virusnog retinitisa, akutne nekroze mrežnjače, progresivne nekroze spoljašnje mrežnjače, gljivične bolesti mrežnjače, okularnog sifilisa, okularne tuberkuloze, difuznog unilateralnog subakutnog neuroretinitisa, mijaze, pigmentnog retinitisa, sistemskog poremećaja povezanog sa distrofijom mrežnjače, kongenitalnog stacionarnog noćnog slepila, konusne distrofije, Stargardt-ove bolesti, fundus flavimaculatus, Best-ove bolesti, distrofičnog obrasca pigmentnog epitela mrežnjače, X-vezane retinošize, Sorsby-ove distrofije fundusa, benigne koncentrične makulopatije, Bietti-ove kristalne distrofije, pseudoxanthoma elasticum, ablacije mrežnjače, makularne rupe, ogromnog kidanja mrežnjače, oboljenja mrežnjače povezanog sa tumorima, urođene hipertrofije RPE, posteriornog uvealnog melanoma, horoidalnog hemangioma, horoidalnog osteoma, horoidalne metastaze, kombinovanog hamartoma mrežnjače i pigmentnog epitela mrežnjače, retinoproblastoma, vazoproliferativnog tumora očnog fundusa, astrocitoma mrežnjače, intraokularnog limfoidnog tumora, tačkaste unutrašnje horoidopatije, akutne posteriorne multifokalne plakoidne pigmentepitelopatije, miopične degeneracije mrežnjače, abnormalne homeostaze pigmentnog epitela mrežnjače, akutnog retinalnog pigmentnog epitelitisa, glaukoma, distrofije ili displazije rožnjače, ili abnormalne homeostaze mrežnjače sa RPE (pigmentnim epitelom mrežnjače).
17. 17. Kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 15, naznačena time da postupak sadrži primenu kompozicije u količini dovoljnoj da ublaži smrt fotoreceptorskih ćelija unutar subjekta, pri čemu je smrt fotoreceptorskih ćelija apoptoza fotoreceptora posredovana sa Fas- ili TRAIL; ili u količini dovoljnoj da poboljša preživljavanje fotoreceptora unutar navedenog subjekta.
18. 18. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 15-17, intraokularnom, intravitrealnom ili periokularnom primenom na subjekta.
19. 19. Kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 3-12 za upotrebu u postupku lečenja ablacije mrežnjače.
20. 20. Kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 3-12 za upotrebu u postupku lečenja glaukoma.
21. 21. Kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 3-12 za upotrebu u postupku lečenja degeneracije makule.
22. 22. Kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 21, naznačena time da je degeneracija makule, degeneracija makule povezana sa starenjem, neeksudativna degeneracija makule povezana sa starenjem ili eksudativna degeneracija makule povezana sa starenjem.
23. 23. Kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 3-12 za upotrebu u postupku lečenja pigmentnog retinitisa.
24. 24. Kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 3-12 za upotrebu u postupku lečenja vaskularnih bolesti, naznačeno time da je vaskularna bolest bolest okluzije arterije mrežnjače ili okluzija centralne vene mrežnjače.
25. 25. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 19-24, intraokularnom, intravitrealnom ili periokularnom primenom na subjekta.
26. 26. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1 za upotrebu u postupku lečenja ablacije mrežnjače. 1
27. 27. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1 za upotrebu u postupku lečenja glaukoma.
28. 28. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1 za upotrebu u postupku lečenja degeneracije makule.
29. 29. Kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 28, naznačena time da je degeneracija makule degeneracija makule povezana sa starenjem, neeksudativna degeneracija makule povezana sa starenjem ili eksudativna degeneracija makule povezana sa starenjem.
30. 30. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1 za upotrebu u postupku lečenja pigmentnog retinitisa.
31. 31. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1 za upotrebu u postupku lečenja vaskularnih bolesti, naznačeno time da je vaskularna bolest bolest okluzije arterije mrežnjače ili okluzija centralne vene mrežnjače.
32. 32. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 26-31, intraokularnom, intravitrealnom ili periokularnom primenom na subjekta.
33. 33. So prema patentnom zahtevu 2 za upotrebu u postupku lečenja ablacije mrežnjače.
34. 34. So prema patentnom zahtevu 2 za upotrebu u postupku lečenja glaukoma.
35. 35. So prema patentnom zahtevu 2 za upotrebu u postupku lečenja degeneracije makule.
36. 36. So za upotrebu prema patentnom zahtevu 35, naznačena time da je degeneracija makule degeneracija makule povezana sa starenjem, neeksudativna degeneracija makule povezana sa starenjem ili eksudativna degeneracija makule povezana sa starenjem.
37. 37. So prema patentnom zahtevu 2 za upotrebu u postupku lečenja pigmentnog retinitisa.
38. 38. So prema patentnom zahtevu 2 za upotrebu u postupku lečenja vaskularnih bolesti, naznačeno time da je vaskularna bolest, bolest okluzije arterije mrežnjače ili okluzija centralne vene mrežnjače. 2
39. 39. So za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 33-38, intraokularnom, intravitrealnom ili periokularnom primenom na subjekta.