RS63117B1 - Nehumane životinje sposobne za dh-dh uređenje u kodirajućim sekvencama teškog lanca imunoglobulina - Google Patents

Nehumane životinje sposobne za dh-dh uređenje u kodirajućim sekvencama teškog lanca imunoglobulina

Info

Publication number
RS63117B1
RS63117B1 RS20220366A RSP20220366A RS63117B1 RS 63117 B1 RS63117 B1 RS 63117B1 RS 20220366 A RS20220366 A RS 20220366A RS P20220366 A RSP20220366 A RS P20220366A RS 63117 B1 RS63117 B1 RS 63117B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
human
gene segment
gene
rodent
segment
Prior art date
Application number
RS20220366A
Other languages
English (en)
Inventor
Andrew J Murphy
Lynn Macdonald
Chunguang Guo
John Mcwhirter
Vera Voronina
Original Assignee
Regeneron Pharma
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Regeneron Pharma filed Critical Regeneron Pharma
Publication of RS63117B1 publication Critical patent/RS63117B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A01K67/0278—Knock-in vertebrates, e.g. humanised vertebrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
    • C12N5/16—Animal cells
    • C12N5/163—Animal cells one of the fusion partners being a B or a T lymphocyte
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2207/00—Modified animals
    • A01K2207/15—Humanized animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A01K2217/052—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic) inducing gain of function
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/20—Animal model comprising regulated expression system
    • A01K2217/206—Animal model comprising tissue-specific expression system, e.g. tissue specific expression of transgene, of Cre recombinase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/01—Animal expressing industrially exogenous proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • C12N2015/8518—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic expressing industrially exogenous proteins, e.g. for pharmaceutical use, human insulin, blood factors, immunoglobulins, pseudoparticles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • C12N2015/8527—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic for producing animal models, e.g. for tests or diseases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/02—Cells for production
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2517/00—Cells related to new breeds of animals
    • C12N2517/02—Cells from transgenic animals

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Fodder In General (AREA)

Description

Opis
[0001] [Obrisano]
LISTA SEKVENCI
[0002] Specifikacija obuhvata listu sekvenci koja je elektronski podneta preko EFS-Web kao ASCII formatirana lista sekvenci sa nazivom dosijea "10347_ST25.txt", pri čemu je dosije kreiran 13 juna, 2019, ima veličinu oko 50 kilobajta, i podnet je istovremeno sa specifikacijom.
STANJE TEHNIKE
[0003] Proizvodi monoklonalnih antitela su revolucionizovali biofarmaceutsku industriju i postigli su značajne prednosti u lečenju nekoliko bolesti. Mnogi od ovih proizvoda monoklonalnih antitela iskoristili su prirodne karakteristike molekula antitela (tj., tradicionalni segmenti gena imunoglobulina) i, u nekim slučajevima, uključuje druge karakteristike kao što je obeležavanje (npr., pegilovanje, radioobeležavanje) ili spajanje sa drugim lekovima. Sa trenutnom brzinom odobravanja, očekuje se da da približno 70 proizvoda monoklonalnih antitela bude na tržištu do 2020. Pored ovih prednosti i znanja koje je stečeno korišćenjem monoklonalnih antitela za terapeutsku upotrebu, bolesti su povezane metama koje su teške za vezivanje i/ili trajanje monoklonalnih antitela, što naglašava potrebu za različitim pristupima za razvijanje efikasnih tretmana.
[0004] Pominju se sledeći dokumenti:
• Jung et al (2006) Annual Review Immunology, 24: 541-570 koji se bavi mehanizmom i kontrolom V(D)J rekombinacije u lokusu teškog lanca imunoglobulina;
• Kokubu et al (1988) The EMBO Journal, 7(11): 3413-3422 koji se odnosi na raznoliku organizaciju lokusa VH gena imunoglobulina kod primitivnih kičmenjaka;
• Tuaillon et al (2000) European Journal of Immunology, 30: 2998-3005 koji se odnosi na preuređivanje u mini lokusu teškog lanca humanog imunoglobulina kod transgenih miševa; • Meek et al (1989) Journal of Experimental Medicine, 170: 39-57 koji se odnosi na nova preuređenja u lokusu D imunoglobulina; i
• Taylor et al (1992) Nucleic Acids Research, 20(23): 6287-6295 koji se odnosi na transgeni miš koji eksprimira raznolikost humane sekvence teškog i lakog lanca imunoglobulina.
SUŠTINA
[0005] Predmetni pronalazak proizilazi iz spoznaje da je poželjno modifikovati glodare (npr., pacova, npr., miša) da bi se uspostavili dodatni in vivo sistemi za identifikovanje i razvijanje novih terapeutika koji su zasnovani na antitelu i, u nekim izvođenjima, sredstvima na bazi antitela (npr., monoklonalna antitela i/ili njihovi fragmenti), koji se mogu koristiti za lečenje različitih bolesti. Specifično, predmetni pronalazak se fokusira na glodare koji imaju modifikovani region raznolikosti (eng. diversity) teškog lanca (DH) unutar varijabilnog regiona teškog lanca imunoglobulina (npr., heterologni varijabilni region teškog lanca imunoglobulina, npr., varijabili region teškog lanca humanog imunoglobulina) koji sadrži jedan ili više DHsegmenata modifikovanih da budu operativno u vezi sa rekombinacionom signalnom sekvencom koja omogućava DH-u-DHpreuređivanje, koje može dovesti do povećane ekspresije antitela koja sadrže tri regiona koja određuju komplementarnost (eng. complementary determining region) (CDR3s) koje karakteriše duža dužina aminokiselina u poređenju sa divljim tipom (ili referentnim) CDR3s i po raznolikosti što, u nekim izvođenjima, usmerava vezivanje sa određenim antigenima. Ovde opisani glodari obezbeđuju in vivo sisteme za razvoj antitela i/ili terapeutike koji se zasnivaju na antitelu koje je namenjeno da se daje humanim bićima.
Pronalazak
[0006] Prema tome, predmetni pronalazak obezbeđuje nukleotidni molekul koji sadrži modifikovani region raznolikosti (DH) teškog lanca imunoglobulina ("modifikovani DHregion") koji sadrži:
(i) modifikovani DHgenski segment koji sadrži DHgenski segment neposredno uz 23-mer RSS ("modifikovani DHgenski segment ") i
(ii) neuređeni DHgenski segment sa prvom 12-mer RSS bočno u odnosu na njegovu 5’ stranu i sa drugom 12-mer RSS bočno u odnosu na njegovu 3’ stranu ("neuređeni DHgenski segment "), gde (i) modifikovani DHgenski segment i (ii) neuređeni DHgenski segment su operativno u vezi tako da (i) modifikovani DHgenski segment i (ii) neuređeni DHgenski segment su sposobni da se spoje u DH-DHdogađaju rekombinacije prema pravilu 12/23, u kome je nukleotidni molekul pogodan za dobijanje glodara koji imaju modifikovani DHregion, i opciono gde modifikovani DHregion obuhvata samo humane DHgenske segmente.
[0007] Predmetni pronalazak dalje obezbeđuje vektor za ciljanje koji sadrži nukleotidni molekul iz predmetnog pronalaska, koji obuhvara 5’-i 3’-krakove homologije konfigurisane da omoguće homolognu rekombinaciju sa sekvencom teškog lanca imunoglobulina u endogenom lokusu teškog lanca imunoglobulina glodara, opciono gde sekvenca teškog lanca imunoglobulina obuhvata humani ili humanizovani varijabilni region teškog lanca imunoglobulina, ili njihovu kombinaciju.
[0008] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje postupak modifikovanja varijabilnog regiona teškog lanca imunoglobulina da bi se modifikovala DH-DHrekombinacija, postupak obuhvata:
(a) dobijanje sekvence varijabilnog lanca teškog lanca imunoglobulina koja sadrži DHregion koji sadrži jedan ili više neuređenih DHgenskih segmenata, od kojih je svaki neuređeni DHgenski segment sa prvom 12-mer RSS bočno u odnosu na njegovu 5’ stranu i sa drugom 12-mer RSS bočno u odnosu na njegovu 3’ stranu, opciono gde jedan ili više neuređenih DHgenskih segmenata obuhvataju bar jedan neuređeni humani DHgenski segment, dalje opciono gde bar jedan neuređeni humani DHgenski segment obuhvata sve funkcionalne humane DHgenske segmente koji se potežu između i uključujući neuređeni humani DH1-1 genski segment i neuređeni humani DH7-27 genski segment, opciono gde svi funkcionalni humani DHgenski segmenti su u germinativnoj konfiguraciji, i
(b) modifikovanje DHregiona da dalje sadrži bar jedan modifikovani DHgenski segment, gde modifikovani DHgenski segment obuhvata DHgenski segment neposredno uz 23-mer RSS, gde, u dobijenom modifikovanom DHregionu, modifikovani DHgenski segment i bar jedan od jednog ili više neuređenih DHgenskih segmenata je operativno u vezi i sposoban da se spoji u DH-DHdogađaju rekombinacije prema pravilu 12/23, opciono gde dobijeno modifikovani DHregion obuhvata samo humane DHgenske segmente.
[0009] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje lokus teškog lanca imunoglobulina koji sadrži nukleotidni molekul, vektor za ciljanje, ili varijabilni region teškog lanca imunoglobulina modifikovan prema predmetnom pronalasku.
[0010] Predmetni pronalazak dalje obezbeđuje genom glodara, koji sadrži nukleotidni molekul iz predmetnog pronalaska, vektor za ciljanje iz predmetnog pronalaska, varijabilni region teškog lanca imunoglobulina modifikovan prema postupku iz predmetnog pronalaska, ili lokus teškog lanca imunoglobulina iz predmetnog pronalaska, u kome je genom glodara po potrebi germinativni genom glodara.
[0011] Predmetnim pronalaskom je takođe obezbeđena ćelija glodara koja sadrži germinativni genom glodara iz predmetnog pronalaska, po potrebi gde je ćelija od glodara pacova, miša, ćelija pacova, ili mišja ćelija. U jednom izvođenju, ćelija glodara je embrionalna matična ćelija (eng. embryonic stem cell). Predmetni pronalazak dalje obezbeđuje glodara ili embrion glodara koji je razvijen iz takve embrionalne matične ćelija glodara iz predmetnog pronalaska.
[0012] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje postupak za dobijanje glodara čiji genom sadrži modifikovani DHregion, postupak obuhvata
(A) dobijanje glodara iz embrionalne matične ćelije iz predmetnog pronalaska; ili
(B)
(a) modifikovanje genoma embrionalne matične ćelije glodara da sadrži fragment DNK koji sadrži jedan ili više modifikovanih DHgenskih segmenata svaki sadrži DHgenski segment neposredno uz a 23-mer RSS, opciono gde fragment DNK obuhvata nukleotidni molekul iz predmetnog pronalaska, vektor za ciljanje iz predmetnog pronalaska, varijabilni region teškog lanca imunoglobulina modifikovan prema predmetnom pronalasku, ili težak lanac imunoglobulina iz predmetnog pronalaska, i
(b) dobijanje glodara korišćenjem modifikovane embrionalne matične ćelije glodara (a).
[0013] Predmetni pronalazak dalje obezbeđuje postupak za proizvodnju antitela ili za dobijanje nukleinske kiseline koja isto kodira, postupak obuhvata
imunizovanje glodara sa antigenom, u kome glodar sadrži germinativni genom koji se sastoji iz modifikovanog DHregiona koji sadrži jedan ili više DHsegmenata gde su svaki neposredno uz 23-mer RSS, opciono gde je glodar glodar iz predmetnog pronalaska ili je dobijen u skladu sa predmetnim pronalaskom, i
omogućavanje glodaru da proizvede imuni odgovor na antigen uključujući antitelo, ili nukleinsku kiselinu koja isto kodira, koje veže antigen.
poželjno gde:
(a) postupak je još jedan koji dalje obuhvata obnavljanje antitela, ili nukleinske kiseline koja isto kodira, iz glodara ili ćelije glodara ili gde je ćelija glodara B ćelija ili hibridom;
(b) jedan ili više DHsegmenata gde su svaki neposredno uz 23-mer RSS obuhvata DHgenski segment operativno u vezi sa 5’ 23-mer RSS;
(c) jedan ili više DHsegmenata gde su svaki neposredno uz 23-mer RSS obuhvata DHgenski segment operativno u vezi sa 3’ 23-mer RSS; i/ili
(d) glodar je pacov ili miš.
[0014] Takođe su obezbeđeni vektori za ciljanje, glodari (npr., pacovi ili miševi) i ćelije glodara (npr., ćelije pacova ili mišje ćelije) koje sadrže ovde opisani nukleotidni molekul, postupke za korišćenje ovde opisanog nukleotidnog molekula, itd.
Specifična izvođenja i tehnički detalji
[0015] U nekim izvođenjima, DHgenski segment operativno u vezi sa sa 23-mer RSS obuhvata humani DHgenski segment operativno u vezi sa 23-mer RSS. U nekim izvođenjima, humani DHgenski segment obuhvata bar 19 nukleotida i/ili kodira dva cisteina. U nekim izvođenjima, humani DHgenski segment obuhvata bar 20 nukleotida i/ili kodira dva cisteina. U nekim izvođenjima, humani DHgenski segment obuhvata bar 23 nukleotida i/ili kodira dva cisteina. U nekim izvođenjima, humani DHgenski segment obuhvata bar 28 nukleotida i/ili kodira dva cisteina. U nekim izvođenjima, humani DHgenski segment obuhvata bar 31 nukleotid i/ili kodira dva cisteina. U nekim izvođenjima, humani DHgenski segment obuhvata bar 37 nukleotida i/ili kodira dva cisteina. U nekim izvođenjima, humani DHgenski segment operativno u vezi sa sa 23-mer RSS obuhvata humani DH2 genski segment operativno u vezi sa 23-mer RSS. U nekim izvođenjima, DH2 genski segment obuhvata bar 30 nukleotida i/ili kodira dva cisteina. U nekim izvođenjima, humani DHgenski segment operativno u vezi sa 23-mer RSS obuhvata DHgenski segment izabran iz grupe koja obuhvata humani DH3-3 genski segment, DH3-9 genski segment, DH3-10 genski segment, DH3-16 genski segment, DH3-22 genski segment, humani DH2-2 genski segment, humani DH2-8 genski segment, ili humani DH2-15 genski segment. U nekim izvođenjima, humani DHgenski segment operativno u vezi sa 23-mer RSS obuhvata humani DHgenski segment izabran iz grupe koja obuhvata humani DH3-3 genski segment, humani DH2-2 genski segment, humani DH2-8 genski segment, i humani DH2-15 genski segment. U nekim izvođenjima, humani DHgenski segment operativno u vezi sa 23-mer RSS obuhvata humani DHgenski segment izabran iz grupe koja obuhvata humani DH3-3 genski segment, humani DH2-2 genski segment, humani DH2-8 genski segment, i humani DH2-15 genski segment. U nekim izvođenjima, humani DHgenski segment obuhvata humani DH3-3 genski segment. U nekim izvođenjima, humani DHgenski segment obuhvata humani DH2-2 genski segment. U nekim izvođenjima, humani DHgenski segment obuhvata humani DH2-8 genski segment. U nekim izvođenjima, humani DHgenski segment obuhvata humani DH2-15 genski segment.
[0016] U nekim izvođenjima, DHgenski segment operativno u vezi sa 23-mer RSS obuhvata: (a) humani DH3-3 genski segment operativno u vezi sa 23-mer RSS, opciono gde 23-mer RSS je susedna sa 5’-krajem humanog DH3-3 genskog segmenta, (b) humani DH2-2 genski segment operativno u vezi sa 23-mer RSS, opciono gde 23-mer RSS je susedna sa 3’-krajem humanog DH2-2 genskog segmenta, (c) humani DH2-8 genski segment operativno u vezi sa 23-mer RSS, opciono gde 23-mer RSS je susedna sa 3’-krajem humanog DH2-8 genskog segmenta, (d) humani 2-15 genski segment operativno u vezi sa 23-mer RSS, opciono gde 23-mer RSS je susedan sa 3’-krajem humanog DH2-15 genskog segmenta, ili (e) bilo koja kombinacija pod (a)-(d)
[0017] U nekim izvođenjima, ovde opisani nukleotidni molekul (npr., DHgenski segment operativno u vezi sa 23-mer RSS, modifikovani DHregion, varijabilni region teškog lanca imunoglobulina, itd.) obuhvata nukleotidnu sekvencu koja sadrži sekvencu kao što je predstavljena u SEQ ID NO:52.
[0018] U nekim izvođenjima, ovde opisani nukleotidni molekul (npr., DHgenski segment operativno u vezi sa 23-mer RSS, modifikovani DHregion, varijabilni region teškog lanca imunoglobulina, itd.) obuhvata nukleotidnu sekvencu koja sadrži sekvencu kao što je predstavljena u SEQ ID NO:61.
[0019] U nekim izvođenjima, ovde opisani nukleotidni molekul (npr., DHgenski segment operativno u vezi sa 23-mer RSS, modifikovani DHregion, varijabilni region teškog lanca imunoglobulina, itd.) obuhvata nukleotidnu sekvencu koja sadrži sekvencu kao što je predstavljena u SEQ ID NO:70.
[0020] U nekim izvođenjima, ovde opisani nukleotidni molekul (npr., DHgenski segment operativno u vezi sa 23-mer RSS, modifikovani DHregion, varijabilni region teškog lanca imunoglobulina, itd.) obuhvata nukleotidnu sekvencu koja sadrži sekvencu kao što je predstavljena u SEQ ID NO:71.
[0021] U nekim izvođenjima, ovde opisani nukleotidni molekul (npr., DHgenski segment operativno u vezi sa 23-mer RSS, modifikovani DHregion, varijabilni region teškog lanca imunoglobulina, itd.) obuhvata nukleotidnu sekvencu koja sadrži sekvencu kao što je predstavljena u SEQ ID NO:72.
[0022] U nekim izvođenjima, DHgenski segment operativno u vezi sa 23-mer RSS obuhvata od 5’ ka 3’ 23-mer RSS i DHgenski segment, npr., obuhvata od 5’ ka 3’ 23-mer RSS, (humani) DHgenski segment, i 12-mer RSS, npr., 23-mer RSS je susedan sa 5’-krajem DHgenskog segmenta, npr., DHgenski segment je operativno u vezi sa 5’-krajem 23-mer RSS. U nekim izvođenjima, DHgenski segment operativno u vezi sa 23-mer RSS obuhvata humani DH3-3 genski segment operativno u vezi sa 5’ krajem 23-mer RSS, npr., nukleotidni molekul obuhvata od 5’ ka 3’ 23-mer RSS, humani DH3-3 genski segment, i 12-mer RSS.
[0023] Modifikovani DHregioni koji sadrže bar jedan DHgenski segment sa 23-mer RSS na 5’-kraju mogu dalje sadržati neuređeni DHgenski segment sa prvom 12-mer RSS bočno u odnosu na njegovu 5’ stranu i sa drugom 12-mer RSS bočno u odnosu na njegovu 3’ stranu (npr., neuređeni DHgenski segment sa prvom 12-mer RSS bočno u odnosu na njegovu 5’ stranu i sa drugom 12-mer RSS bočno u odnosu na njegovu 3’ stranu obuhvata germinativni DHgenski segment, npr., DHgenski segment je u njegovoj germinativnoj konfiguraciji, itd.) gde neuređeni DHgenski segment je ushodno od i operativno u vezi sa bar jednom DHgenskim segmentom operativno u vezi sa 5’-krajem 23-mer. U nekim izvođenjima, neuređeni DHgenski segment sa prvom 12-mer RSS bočno u odnosu na njegovu 5’ stranu i sa drugom 12-mer RSS bočno u odnosu na njegovu 3’ stranu obuhvata neuređeni humani DHgenski segment sa prvom 12-mer RSS bočno u odnosu na njegovu 5’ stranu i sa drugom 12-mer RSS bočno u odnosu na njegovu 3’ stranu.
[0024] U nekim izvođenjima, DHgenski segment operativno u vezi sa 23-mer RSS obuhvata od 5’ ka 3’ DHgenski segment i 23-mer RSS, npr., obuhvata od 5’ ka 3’ 12-mer RSS, (humani) DHgenski segment, i 23-mer RSS, npr., 23-mer RSS je susedan sa 3’-krajem DHgenskog segmenta, npr., DHgenski segment je operativno u vezi sa 3’-krajem 23-mer, itd. U nekim izvođenjima, DHgenski segment operativno u vezi sa 3’ krajem 23-mer RSS obuhvata humani DH2 genski segment operativno u vezi sa 3’-krajem 23-mer RSS, gde DH2 genski segment je izabran iz grupe koja se sastoji iz humanog DH2-2 genskog segmenta, humanog DH2-8 genskog segmenta, i humanog DH2-15 genskog segmenta. U nekim izvođenjima, DHgenski segment operativno u vezi sa 23-mer RSS obuhvata od 5’ ka 3’: humani DH2-2 genski segment operativno u vezi sa 3’ krajem 23-mer RSS, humani DH2-8 genski segment operativno u vezi sa 3’ krajem 23-mer RSS, i humani DH2-15 genski segment operativno u vezi sa 3’ krajem 23-mer RSS. U nekim izvođenjima, DHgenski segment operativno u vezi sa 3’ krajem 23-mer RSS obuhvata od 5’ ka 3’: prvu kontinuiranu nukleotidnu sekvencu koja sadrži 12-mer RSS, humani DH2-2 genski segment, i 23-mer RSS, drugu kontinuiranu nukleotidnu sekvencu koja sadrži 12-mer RSS, humani DH2-8 genski segment, i 23-mer RSS, i treću kontinuiranu nukleotidnu sekvencu koja sadrži 12-mer RSS, humani DH2-15 genski segment, i 23-mer RSS.
[0025] Modifikovani DHregioni koji sadrže bar jedan DHgenski segment operativno u vezi sa 3’-krajem 23-mer RSS mogu dalje sadržati neuređeni DHgenski segment sa prvom 12-mer RSS bočno u odnosu na njegovu 5’ stranu i sa drugom 12-mer RSS bočno u odnosu na njegovu 3’ stranu (npr., neuređeni DHgenski segment sa prvom 12-mer RSS bočno u odnosu na njegovu 5’ stranu i sa drugom 12-mer RSS bočno u odnosu na njegovu 3’ stranu sadrži germinativni DHgenski segment , npr., DHgenski segment je u njegovoj germinativnoj konfiguraciji, itd.) gde neuređeni DHgenski sa prvom 12-mer RSS bočno u odnosu na njegovu 5’ stranu i sa drugom 12-mer RSS bočno u odnosu na njegovu 3’ stranu je nishodno od i operativno u vezi sa bar jednim DHgenskim segmentom operativno u vezi m sa 3’-krajem 23-mer RSS. U nekim izvođenjima, neuređeni DHgenski segment sa prvom 12-mer RSS bočno u odnosu na njegovu 5’ stranu i sa drugom 12-mer RSS bočno u odnosu na njegovu 3’ stranu obuhvata neuređeni humani DHgenski segment sa prvom 12-mer RSS bočno u odnosu na njegovu 5’ stranu i sa drugom 12-mer RSS bočno u odnosu na njegovu 3’ stranu.
[0026] U nekim izvođenjima, modifikovani DHregion kao što je ovde opisano obuhvata (i) jedan ili više neuređenih humanih DHgenskih segmenata, gde je svaki od jednog ili više humanih DHgenskih segmenata sa 12-mer RSS bočno u odnosu na njegove 5’ i 3’ krajeve, i (ii) bar jedan DHgenski segment operativno u vezi sa 23-mer RSS koji sadrži humani DHgenski segment, npr., humani DH3-3 genski segment) operativno u vezi na njegovim 5’-kraju sa 23-mer RSS. U nekim izvođenjima, modifikovani DH region kao što je ovde opisano obuhvata od 5’ ka 3’(i) bar jedan DHgenski segment operativno u vezi sa 23-mer RSS, npr., bar jedan humani DH2 genski segment operativno u vezi na njegovom 3’ kraju sa 23-mer RSS, opciono gde bar jedan humani DH2 genski segment operativno u vezi na njegovom 3’kraju sa 23-mer RSS obuhvata humani DH2-2 genski segment operativno u vezi na njegovom 3’ kraju sa 23-mer RSS, humani DH2-8 genski segment operativno u vezi na njegovom 3’ kraju sa 23-mer RSS, humani DH2-15 genski segment operativno u vezi na njegovom 3’ kraju sa 23-mer RSS, ili bilo koja njihova kombinacija, i (ii) jedan ili mnoštvo humanih DHgenskih segmenata, gde je svaki od jednog ili mnoštva humanih DHgenskih segmenata sa 12-mer RSS bočno u odnosu na njegove 5’ i 3’ krajeve.
[0027] U nekim izvođenjima, modifikovani DHregion kao što je ovde opisano obuhvata samo humane DHgenske segmente.
[0028] U nekim izvođenjima, ovde opisani nukleotidni molekul (npr., modifikovani DHregioni, varijabilni regioni teškog lanca imunoglobulina, itd.) obuhvata DHgenski segment operativno u vezi sa 23-mer RSS i neuređeni DHgenski segment sa prvom 12-mer RSS bočno u odnosu na njegovu 5’ stranu i sa drugom 12-mer RSS bočno u odnosu na njegovu 3’ stranu, gde DHgenski segment operativno u vezi sa 23-mer RSS i neuređeni DHgenski segment sa prvom 12-mer RSS bočno u odnosu na njegovu 5’ stranu i sa drugom 12-mer RSS bočno u odnosu na njegovu 3’ stranu nisu prošli kroz rekombinaciju sa (i) drugim DHgenskim segmentom, (ii) VHgenskim segmentom, (iii) JHgenskim segmentom, ili (iv) bilo kojom njihovom kombinacijom. U nekim izvođenjima, ovde opisani nukleotidni molekuli uključuju molekule koji sadrže modifikovane DHregione koji sadrže jedan ili više DHgenskih segmenata koji su rekombinovani sa (i) drugim DHgenskim segmentom, (ii) VHgenskim segmentom, (iii) JHgenskim segmentom, ili bilo koja njihova kombinacija, npr., nukleotidni molekuli koji sadrže preuređenu VDJ ili VDDJ kodirajuću sekvencu koja kodira za varijabilni region teškog lanca imunoglobulina.
[0029] Prema tome, u nekim izvođenjima, ovde opisani nukleotidni molekul sadrži modifikovani DHregion kao što je ovde opisano dalje obuhvata u operativnoj vezi: (a) bar jedan neuređeni varijabilni genski segment teškog lanca imunoglobulina (VH) (npr., neuređeni humani VH6-1 genski segment) koji je ushodno i operativno u vezi sa modifikovanim DHregionom, (b) bar jedan neuređeni genski segment spajanja (eng. joining) teškog lanca imunoglobulina (JH) (npr., neuređeni humani JH6) genski segment koji je nishodno od i operativno u vezi sa modifikovanim DHregionom, ili njihovom kombinacijom pd (a) i (b).
[0030] U nekim izvođenjima, bar jedan neuređeni VHgenski segment obuhvata pun repertoar funkcionalnih neuređenih humanih VHgenskih segmenata koji se protežu između i uključuju neuređeni humani VH3-74 i neuređene humane VH1-6 genske segmente. U nekim izvođenjima, bar jedan neuređeni VHgenski segment obuhvata pun repertoar funkcionalnih neuređenih humanih VHgenskih segmenata koji se protežu između i uključuju neuređeni humani VH3-74 i neuređene humane VH1-6 genske segmente u germinativnoj konfiguraciji. U nekim izvođenjima, bar jedan neuređeni JHgenski segment obuhvata neuređeni humani JH4 genski segment, neuređeni humani JH5 genski segment, i neuređeni humani JH6 genski segment. U nekim izvođenjima, bar jedan neuređeni JHgenski segment obuhvata neuređeni humani JH1 genski segment, neuređeni humani JH2 genski segment, neuređeni humani JH3 genski segment, neuređeni humani JH4 genski segment, neuređeni humani JH5 genski segment, i neuređeni humani JH6 genski segment. U nekim izvođenjima, bar jedan neuređeni JHgenski segment obuhvata neuređeni humani JH1 genski segment, neuređeni humani JH2 genski segment, neuređeni humani JH3 genski segment, neuređeni humani JH4 genski segment, neuređeni humani JH5 genski segment, i neuređeni humani JH6 genski segment u geminativnoj konfiguraciji.
[0031] U nekim izvođenjima, ovde opisani nukleotidni molekul obuhvata varijabilni region teškog lanca imunoglobulina (VH) koji sadrži modifikovani DHregion kao što je ovde opisano, npr., obuhvata u operativnoj vezi od 5’ ka 3’:
(a) bar jedan neuređeni varijabilni genski segment teškog lanca imunoglobulina (VH),
(b) modifikovani DHregion obuhvata bar jedan DHgenski segment operativno u vezi sa 23-mer RSS, i
(c) bar jedan neuređeni genski segment spajanja teškog lanca imunoglobulina (JH).
[0032] U nekim izvođenjima,
(a) bar jedan neuređeni VHgenski segment obuhvata
(i) neuređeni humani VH6-1 genski segment,
(ii) neuređeni humani VH2-1 genski segment i neuređeni humani VH6-1 genski segment i/ili (iii) sve funkcionalne neuređene humane VHgenske segmente koji se protežu između i uključuju neuređeni humani VH3-74 do neuređeni humani VH6-1 genski segment, npr., sve funkcionalne neuređene humane VHgenske segmente u germinativnoj konfiguraciji, opciono, gde glodarski Adam6 gen zamenjuje pseudogen između neuređenih humanih VH2-1 i VH6-1 genskih segmenata; (b) modifikovani DHregion obuhvata od 5’ ka 3’:
(i) jedan ili više, npr., moštvo, neuređeniih humanih DHgenskih segmenata, gde je svaki od mnoštva neuređeniih humanih DHgenskih segmenata sa 12-mer RSS bočno u odnosu na njegove 5’ i 3’ krajeve, i humani DHgenski segment operativno u vezi na njegovom 5’-kraju sa 23-mer RSS, opciono gde mnoštvo neuređenih humanih DHgenskih segmenata obuhvataju neuređene humane DHgenske segmente koji se protežu između i uključuju neuređeni humani DH1-1 genski segment i neuređeni humani DH1-26 genski segment u germinativnoj konfiguraciji i/ili gde humani genski segment operativno u vezi na njegovom 5’-kraju sa 23-mer RSS je humani DH3-3 genski segment, npr., gde the modifikovani DHobuhvata pun repertoar neuređenih humanih DHgenskih segmenata u germinativnoj konfiguraciji sa izuzećem neuređenog humanog DH7-27 genskog segmenta, koji je zamenjen sa DH3-3 genskim segmentom operativno u vezi sa 5’-krajem 23-mer RSS;
(ii) bar jedan humani DHgenski segment operativno u vezi na njegovom 3’-kraju sa 23-mer RSS, i jedan ili više, npr., mnoštvo, humanih DHgenskih segmenata, gde svaki od jednog ili mnoštva humanog DHgenskog segment(a) sa 12-mer RSS bočno u odnosu na njegove 5’ i 3’ krajeve, opciono gde bar jedan humani DHgenski segment operativno u vezi na njegovom 3’-kraju sa 23-mer RSS obuhvata DH2-2 genski segment operativno u vezi na njegovom 3’ kraju sa 23-mer RSS, humani DH2-8 genski segment operativno u vezi na njegovom 3’ kraju sa 23-mer RSS, humani DH2-15 genski segment operativno u vezi na njegovom 3’ kraju sa 23-mer RSS i/ili gde jedan ili mnoštvo humanih DHgenskih segmen(a)ta obuhvata DHgenske segmente koji se protežu između i uključuju neuređeni humani DH1-1 genski segment i neuređeni humani DH7-27 genski segment, opciono gde modifikovani DHobuhvata pun repertoar neuređenih humanih DHgenskih segmenata u germinativnoj konfiguraciji sa izuzetkom da neuređeni humani DH2-2, DH2-8, i DH2-15 genski segmenti su redom zamenjeni sa DH2-2 genskim segmentom operativno u vezi na njegovom 3’ kraju sa 23-mer RSS, humani DH2-8 genski segment operativno u vezi na njegovom 3’ kraju sa 23-mer RSS, i humani DH2-15 genski segment operativno u vezi na njegovom 3’ kraju sa 23-mer RSS; (iii) ili kombinacija pod (b)(i) i (b)(ii);i
(c) bar jedan neuređeni JHgenski segment obuhvata
(i) neuređeni humani JH6 genski segment,
(ii) neuređeni humani JH4 genski segment, neuređeni humani JH5 genski segment, i neuređeni humani JH6 genski segment, i/ili
(iii) pun repertoar neuređenih humanih JHgenskih segmenata, npr., neuređeni humani JH1 genski segment, neuređeni humani JH2 genski segment, neuređeni humani JH3 genski segment, neuređeni humani JH4 genski segment, neuređeni humani JH5 genski segment, i neuređeni humani JH6 genski segment, opciono gde neuređeni humani JH1, JH2, JH3, JH4, JH5, i JH6 genski segmenti se nalaze u germinativnoj konfiguraciji. U nekim izvođenjima, VHregion imunoglobulina (koji sadrži bar jedan funkcionalni VHgenski segment, modifikovani DHregion, i bar jedan funkcionalni JHgenski segment) je VHregion humanog imunoblobulina, npr., svaki genski segment (npr., svaki VH, DH, i JHgenski segment ovde), uključujući DHgenski segment operativno u vezi sa 23-mer RSS, je humani (VH, DH, ili JH) genski segment .
[0033] U nekim izvođenjima, nukleotidni molekul koji sadrže an immunoglobulin VHregion kao što je ovde opisano obuhvata u operativnoj vezi od 5’ ka 3’
(a) bar neuređeni humani VH6-1 genski segment, npr., u celosti ili ceo svih funkcionalnih neuređenih humanih VHgenskih segmenata koji se protežu između i uključuju neuređeni humani VH3-74 do neuređeni humani VH6-1 genski segment, npr., pun repertoar funkcionalnih neuređenih humanih VHgenskih segmenata, opciono uključujući glodarski Adam6 gen između dva neuređena humana VHgenska segmenta, npr., (npr., gde je glodarski Adam6 gen lociran između humanog VH1-2 genskog segmenta i humanog VH6-1 genskog segmenta)
(b) humani modifikovani DHregion koji sadrži od 5’ do 3’ neuređenih humanih DHgenskih segmenata koji se protežu između i uključuju neuređeni humani DH1-1 genski segment i neuređeni humani DH1-26 genski segment u germinativnoj konfiguraciji i neuređeni humani DH3-3 genski segment operativno u vezi sa 5’-krajem 23-mer RSS, npr., pun repertoar neuređenih humanih DHgenskih segmenata u germinativnoj konfiguraciji sa izuzećem neuređenog humanog DH7-27 genskog segmenta, koji je zamenjen sa neuređenim humanim DH3-3 genskim segmentom operativno u vezi sa 5’-krajem 23-mer RSS, i
(c) bar neuređeni humani JH6 genski segment.
[0034] U nekim izvođenjima, nukleotidni molekul koji sadrži VHregion imunoglobulina kao što je ovde opisano obuhvata u operativnoj vezi od 5’ ka 3’:
(a) bar neuređeni humani VH6-1 genski segment, npr., u celosti ili deo svih funkcionalnih neuređenih humanih VHgenskih segmenata koji se protežu između i uključuju neuređeni humani VH3-74 do neuređeni humani VH6-1 genski segment, npr., pun repertoar funkcionalnih neuređenih humanih VHgenskih segmenata, opciono uključujući glodarski Adam6 gen između dva neuređena humana VHgenska segmenta, npr., (npr., gde je glodarski Adam6 gen je lociran između humanog VH1-2 genskog segmenta i humanog VH6-1 genskog segmenta)
(b) humani modifikovani DHregion koji sadrži od 5’ ka 3’ neuređene humane DHgenske segmente koji se protežu između i uključuju neuređeni humani DH1-1 genski segment i neuređeni humani DH1-26 genski segment u germinativnoj konfiguraciji, i neuređeni humani DH3-3 genski segment operativno u vezi sa 5’-krajem 23-mer RSS, npr., pun repertoar neuređenih humanih DHgenskih segmenata u germinativnoj konfiguraciji sa izuzetkom neuređenog humanog DH7-27 genskog segmenta, koji je zamenjen sa neuređenim humanim DH3-3 genskim segmentom operativno u vezi m sa 5’-krajem 23-mer RSS, i
(c) neuređeni humani JH4 genski segment, neuređeni humani JH5 genski segment, i neuređeni humani JH6 genski segment.
[0035] U nekim izvođenjima, nukleotidni molekul koji obuhvata VHregion imunoglobulina kao što je ovde opisano sadrži u operativnoj vezi od 5’ ka 3’
(a) bar neuređeni humani VH6-1 genski segment, npr., u celosti ili deo svih funkcionalnih neuređenih humanih VHgenskih segmenata koji se protežu između i uključujući neuređeni humani VH3-74 do neuređeni humani VH6-1 genski segment, npr., pun repertoar funkcionalnih neuređenih humanih VHgenskih segmenata, opciono uključujući glodarski Adam6 gen između dva neuređena humana VHgenska segmenta, npr., (npr., gde je glodarski Adam6 gen lociran između humanog VH1-2 genskog segmenta i humanog VH6-1 genskog segmenta)
(b) humani modifikovani DHregion koji sadrži od 5’ ka 3’ neuređeni humani DH1-1 genski segment, DH2-2 genski segment operativno u vezi na njegovom 3’ kraju sa 23-mer RSS, humani DH2-8 genski segment operativno u vezi na njegovom 3’ kraju sa 23-mer RSS, humani DH2-15 genski segment operativno u vezi na njegovom 3’ kraju sa 23-mer RSS, i neuređene humane DHgenske segmente koji se protežu između i uključuju neuređeni humani DH3-16 genski segment i neuređeni humani DH7-27 genski segment, opciono gde modifikovani DHobuhvata pun repertoar neuređenih humanih DHgenskih segmenata u germinativnoj konfiguraciji sa izuzećem da neuređeni humani DH2-2, DH2-8, i DH2-15 genski segmenti su respektivno zamenjeni sa DH2-2 genskim segmentom operativno u vezi na njegovom 3’ kraju sa 23-mer RSS, humanim DH2-8 genskim segmentom operativno u vezi na njegovom 3’ kraju sa 23-mer RSS, i humanim DH2-15 genskim segmentom operativno u vezi na njegovom 3’ kraju sa 23-mer RSS, i
(c) pun repertoar neuređenih humanih JHgenskih segmenata, npr., neuređeni humani JH1 genski segment, neuređeni JH2 humani genski segment, neuređeni JH3 humani genski segment, neuređeni JH4 humani genski segment, neuređeni JH5 humani genski segment, i neuređeni JH6 human genski segment, opciono gde neuređeni humani JH1, JH2, JH3, JH4, JH5, i JH6 genski segmenti su u germinativnoj konfiguraciji.
[0036] U nekim izvođenjima, nukleotidni molekul kao što je ovde opisano obuhvata od 5’ ka 3’ (a) (humani) varijabilni region teškog lanca imunoglobulina (VH) koji obuhvata bar jedan (humani) VHgenski segment, (humani) modifikovani DHregion kao što je ovde opisano, i bar jedan (humani) JHgenski segment operativno u vezi sa (b) konstantnim regionom teškog lanca imunoglobulina (CH) ili njegov deo, opciono gde je CHglodarski CHkoji obuhvata glodarski pojačivač regina introna, glodarski IgM gen, glodarski IgD gen, glodarski IgG gen, glodarski IgA gen, glodarski IgE gen, ili bilo koju njihovu kombinaciju. U nekim izvođenjima, nukleotidni molekul kao što je ovde opisano obuhvata od 5’ ka 3’ (a) humani VHregion teškog lanca imunoglobulina koji sadrži bar jedan humani VHgenski segment, humani modifikovani DHregion kao što je ovde opisano, i bar jedan humani JHgenski segment operativno u vezi sa (b) glodarskim CHregionom koji sadrži bar glodarski pojačivač regiona introna, i opciono glodarski gen koji kodira IgM. U nekim izvođenjima, ovde opisani nukleotidni molekul obuhvata od 5’ ka 3’ (a) humani VHregion koji sadrži bar jedan human VHgenski segment, humani modifikovani DHregion kao što je ovde opisano, i bar jedan humani JHgenski segment operativno u vezi sa (b) glodarskim CHregionom koji sadrži bar glodarski pojačivač regiona introna i glodarski gen koji kodira IgM. U nekim izvođenjima, ovde opisani nukleotidni molekul obuhvata od 5’ ka 3’ (a) humani VHregion koji sadrži bar jedan humani VHgenski segment, humani modifikovani region DHkao što je ovde opisano, i bar jedan humani JHgenski segment operativno u vezi sa (b) endogenim glodarskim regionom CH, npr., u endogenom lokusu teškog lanca imunoglobulina glodara. U nekim izvođenjima, glodar može biti pacov. U nekim izvođenjima, glodar može biti miš.
1
[0037] U nekim izvođenjima, nukleotidni molekul kao što je ovde opisano dalje obuhvata Adam6 gen glodara. U nekim izvođenjima, Adam6 gen glodara je lociran između humanih VH2-1 i VH6-1 genskih segmenata, npr., zamenjuje humani Adam6 gen koji je lociran između humanog VH2-1 i VH6-1 genskog segmenta u germinativnoj konfiguraciji. U nekim izvođenjima, glodar može biti pacov. U nekim izvođenjima, glodar može biti miš.
[0038] U nekim izvođenjima, nukleotidni molekul kao što je ovde opisano sadrži jednu ili više selekcionih kaseta leka, npr., gen za rezistenciju na lek sa jednim ili više rekombinacionih mesta koja su specifična za mesto u odnosu na bočne strane, npr., gen za rezistenciju na lek neomicin sa loxP mesto specifičnim-mestom za prepoznavanje rekombinacije u odnosu na bočne strane, pri čemu najmanje jedan od jedne ili više kaseta za rezistenciju na lek je opciono odmah ushodno od bar jednog DHgenskog segmenta operativno u vezi sa 23-mer RSS. U nekim izvođenjima nukleotidni molekul obuhvata sekvencu koja je ilustrovana na Slici 2.
[0039] Ovde su takođe opisani vektori za ciljanje, npr., za modifikovanje genoma (npr., germinativni genom) glodara, kao što je pacov ili miš, da sadrži modifikovani DHregion kao što je ovde opisano. Generalno, vektor za ciljanje kao što je ovde opisan obuhvata bilo koji od ovde opisanih nukleotidnih molekula, i opciono obuhvata 5’-i 3’-homologe krakove za homolognu rekombinaciju unutar varijabilnog regiona teškog lanca imunoglobulina, opciono gde varijabilni region teškog lanca imunoglobulina je humani ili humanizovani varijabilni region teškog lanca imunoglobulina. U nekim izvođenjima, vektor za ciljanje kao što je ovde opisano obuhvata 5’ homologi krak koji sadrži neuređeni humani genski segment, npr., VH6-1 genski segment i/ili 3’ homologi krak koji sadrži glodarski (npr., mišji) CHregion ili njegov deo, npr., glodarski (mišji) CHregion pojačivača introna i/ili glodarski (mišji) IgM gen.
[0040] U nekim izvođenjima, vektor za ciljanje obuhvata nukleotidni molekul kao što je ovde opisan, i 5’-i 3’-homologe krakove konfigurisane da omoguće homolognu rekombinaciju sa sekvencom teškog lanca imunoglobulina, gde sekvenca teškog lanca imunoglobulina može opciono biti locirana u endogenom lokusu teškog lanca imunoglobulina i/ili sadržati varijabilni region humanog ili humanizovanog teškog lanca imunoglobulina. U nekim izvođenjima, vektor za ciljanje kao što se ovde opisuje obuhvata 5’ homologi krak koji obuhvata neuređeni humani genski segment (npr., VH6-1 genski segment), humani modifikovani DHregion, bar jedan neuređeni humani JHgenski segment, i 3’ krak homologije koji sadrži glodarski (mišji) CHregion pojačivača u intronu i/ili glodarski (mišji) može biti biti koristan u modifikovanju DHregiona kod glodara koji obuhvata lokus humanizovanog teškog lanca imunoglobulina, npr., miš koji obuhvata zamenu mišjih imunoglobulinskih varijabilnih sekvenci sa humanim imunoglobulinskim varijabilnim sekvencama, npr., VELOCIMMUNE<®>miševa, koji mogu opciono sadržati funkcionalni ADAM6 gen koji uspostavlja njihov fertilitet, modifikovanu sekvencu gena za endogeni konstantni region teškog lanca koja sadrži intaktni endogeni IgM gen i drugi endogeni gen modifikovanog konstantnog regiona (npr., IgG) za proizvodnju reverznih himernih ne-IgM antitela kojima nedostaje funkcionalni CH1 domen, sekvenca koja kodira reverzni himerni humanizovani zajednički laki lanac, sekvenca koja kodira reverzni himerni humanizovani kapa laki lanac, sekvenca koja kodira reverzni himerni humanizovani lambda laki lanac, sekvenca koja kodira hibrid kapa/lambda ili kapa/lambda laki lanac, neuređene germinativne humane teške genske segmente i/ili (ne)uređene germinativne genske segmente lakog lanca modifikovane sa histidinskim kodonom za ekspresiju varijabilnih domena koji imaju aminokiseline histidine i mogu ispoljiti pH senzitivno vezivanje antigena, i/ili terminalnu deoksinukleotidil transferazu (TdT) za povećanu raznolikost antigenskog receptora. Videti, npr., U.S. Patent br-e. 9,035,128; 9,066,502; 9,163,092; 9,150,662; 9,334,333; 9,850,462; 9,844,212; 9,029,628; 9,006,511; 9,394,373; 9,206,261; 9,206,262; 9,206,263; 9,226,484; 9,399,683; 9,540,452; 9,012,717; 9,796,788, 8,697,940; 8,754,287; 9,334,334; 9,801,362; 9,332,742; 9,969,814; U.S. objave patenta 2011/0195454, 2012/0021409, 2012/0192300, 2013/0185821, 2013/0302836, 2013/0045492, i 2018/0125043; PCT objava patenta. WO2017210586, i WO2019/113065.
[0041] Kao takvi, ovde su opisani postupci za modifikovanje DHregiona za DH-DHrekombinaciju kod glodara. U nekim izvođenjima, postupak obuhvata modifikovanje DHregiona koji sadrži jedan ili više neuređenih DHgenskih segmenata da sadrže bar jedan DHgenski segment operativno u vezi sa 23-mer RSS. U nekim izvođenjima, postupak modifikacije varijabilnog regiona teškog lanca imunoglobulina da se modifikuje DH-DHrekombinacija obuhvata dobijanje varijabilnog regiona teškog lanca imunoglobulina koji sadrži DHregion koji sadrži jedan ili više neuređenih DHgenskih segmenata od kojih je svaki neuređeni DHgenski segment sa prvom 12-mer RSS bočno u odnosu na njegovu 5’ stranu i sa drugom 12-mer RSS bočno u odnosu na njegovu 3’ stranu, i modifikovanje DHregiona da dalje sadrži bar jedan DHgenski segment operativno u vezi sa 23-mer RSS. U nekim izvođenjima, DHregion je humani DHregion koji sadrži jedan ili mnoštvo neuređenih humanih DHgenskih segmenata, npr., gde mnoštvo neuređenih humanih DHgenskih segmenata opciono obuhvata sve funkcionalne neuređene humane DHgenske segmente koji se nalaze između, i uključujući, DH1-1 i DH7-27 genske segmente, npr., u germinativnoj konfiguraciji. U nekim izvođenjima, modifikovanje obuhvata zamenu jedne ili više od jedne ili mnoštva neuređenih DHgenskih segmenata sa 12-mer RSS bočno u odnosu na jednu stranu i na sa 12-mer RSS bočno u odnosu na drugu stranu, npr., funkcionalno neuređeni humani DHgenski segment, sa bar jednim DHgenskim segmentom operativno u vezi m sa 23-mer RSS. U nekim izvođenjima, većina 3’ neuređenih DHgenskih segmenata sa 12-mer RSS bočno u odnosu na jednu stranu i na sa 12-mer RSS bočno u odnosu na drugu stranu DHregiona je zamenjena sa DHgenskim segmentom operativno u vezi m sa 23-mer RSS, pri čemu DHgenski segment operativno u vezi sa 23-mer RSS obuhvata od 5’ do 3’ 23-mer RSS, DHgenski segment, i 12-mer RSS. U nekim izvođenjima, neuređeni DHgenski segment sa prvom 12-mer RSS bočno u odnosu na njegovu 5’ stranu i sa drugom 12-mer RSS bočno u odnosu na njegovu 3’ stranu je zamenjen sa odgovarajućim DHgenskim segmentom modifikovanim da bude operativno u vezi sa 23-mer RSS. U nekim izvođenjima, u kojima DHregion obuhvata neuređeni humani DH7-27 genski segment (npr., germinativni DH7-27 genski segment), neuređeni humani DH7-27 genski segment je zamenjen sa humanim DHgenskim segmentom (npr., neuređeni humani DH3-3 genski segment) operativno u vezi sa 5’-krajem 23-mer RSS. U nekim izvođenjima, gde DHregion obuhvata neuređeni DH2-2 genski segment, neuređeni DH2-8 genski segment, i/ili neuređeni DH2-15 genski segment (npr., gde modifikovani DHobuhvata pun repertor neuređenih humanih DHgenskih segmenata u germinativnoj konfirguraciji) neuređeni DH2-2 genski segment, neuređeni DH2-8 genski segment, i/ili neuređeni DH2-15 genski segment su redom zamenjeni sa DH2-2 genskim segmentom operativno u vezi m na njegovom 3’ kraju sa 23-mer RSS, humani DH2-8 genski segment operativno u vezi na njegovom 3’ kraju sa 23-mer RSS, i/ili humani DH2-15 genski segment operativno u vezi na njegovom 3’ kraju sa 23-mer RSS. U nekim izvođenjima, modifikovanje obuhvata zamenu jedne od dve 12-mer RSS bočno u odnosu na neuređeni DHgenski segment (npr., humani germinativni DHgenski segment) sa 23-mer RSS. U nekim izvođenjima, varijabilni region teškog lanca imunoglobulina koji treba modifikovati obuhvata, pored DHregiona, JHregion (opciono koji sadrži pun repertoar humanih germinativnih JHgenskih segmenata koji sadrže humani germinativni JH1 genski segment, humani germinativni JH2 genski segment, humani germinativni JH3 genski segment, humani germinativni JH4 genski segment, humani germinativni JH5 genski segment, i humani germinativni JH6 genski segment, opcino gde humani germinativni JH1, JH2, JH3, JH4, JH5, i JH6 genski segmenti su u germinativnoj konfiguraciji) operativno u vezi sa DHregionom, i zamena neuređenog DHgenskog segmenta bočno na na jednoj strani sa 12-mer RSS i na drugoj strani sa drugom 12-mer RSS obuhvata deleciju bar jednog neuređenog JHgenskog segmenta koji je obuhvaćen JHregionom, npr., dovodi do delecije neuređenih humanih JH1, JH2, JH3, JH4, i/ili JH5 genskih segmenata koji su susedni sa DHregionom. U nekim izvođenjima, delecija bar jednog germinativnog JHgenskog segmenta koji je obuhvaćen JHregionom obuhvata deleciju neuređenih humanih JH1, JH2, i JH3 genskih segmenata, i opcino dalju deleciju JH4 i JH5 genskih segmenata. U nekim izvođenjima, zamena jednog ili više od svih funkcionalnih DHgenskih segmenata, npr., zamena DH7-27 genskog segmenta sa DHgenskim segmentom operativno u vezi m sa 5’-krajem 23-mer RSS, npr., DH3-3 genski segment operativno u vezi sa 5’-krajem 23-mer RSS, dovodi do delecije neuređenih humanih JH1, JH2, i JH3 genskih segmenata koji su susedni sa DHregionom. U nekim izvođenjima, zamena jednog ili više od svih funkcionalnih DHgenskih segmenata, npr., zamena DH7-27 genskog segmenta sa DHgenskim segmentom operativno u vezi m sa 5’-krajem 23-mer RSS, npr., DH3-3 genski segment operativno u vezi sa 5’-krajem 23-mer RSS, dovodi do delecije neuređenih humanih JH1, JH2, JH3, JH4, i JH5 genskih segmenata koji su susedni sa DHregionom. U nekim izvođenjima, DHregion je modifikovan sa sadrži bar jedan DHgenski segment operativno u vezi sa 23-mer RSS, pri čemu bar jedan DHgenski segment operativno u vezi sa 23-mer RSS obuhvata (a) humani DH3-3 genski segment operativno u vezi sa 23-mer RSS, opcino gde 23-mer RSS je susedan sa 5’-krajem DH3-3 genskog segmenta, (b) humani DH2-2 genski segment operativno u vezi sa 23-mer RSS, opciono gde 23-mer RSS je susedan sa 3’-krajem DH2-2 genskog segmenta, (c) humani DH2-8 genski segment operativno u vezi sa 23-mer RSS, opciono gde 23-mer RSS je susedan sa 3’-krajem DH2-8 genskog segmenta, (d) humani DH2-15 genski segment operativno u vezi sa 23-mer RSS, opciono gde 23-mer RSS je susedan sa 3’-krajem DH2-15 genskog segmenta , ili (e) bilo koja kombinacija od (a)-(d).
[0042] Takvi postupci mogu dovesti do varijabilnog regiona teškog lanca imunoglobulina koji sadrži modifikovani DHregion, npr., nukleotidni molekul koji sadrži (humani) varijabilni region teškog lanca imunoglobulina kao što je ovde opisano, pri čemu (ne)preuređeni (humani) region teškog lanca imunoglobulina može opciono biti povezan sa nehumanim konstantnim regionom teškog lanca imunoglobulina ili njegovim delom, npr., glodarskim konstantnim regionom teškog lanca imunoglobulina koji sadrži bar glodarski CHregion pojačivača introna i/ili glodarski IgM gen, npr., opciono u endogenom lokusu nehumanog teškog lanca imunoglobulina. U nekim izvođenjima, nakon rekombinacije, takav lokus teškog lanca imunoglobulina, npr., endogeni lokus teškog lanca imunoglobulina, obuhvata kodirajuću sekvencu preuređenog varijabilnog regiona teškog lanca imunoglobulina koja kodira varijabilni domen teškog lanca imunoglobulina, npr., varijabilni domen teškog lanca imunoglobulina koji ima region koji određuje komplementarnost 3 (CDR3) dužine aminokiselina više od 20 aminokiselina, čija dužina može biti rezultat VH(DHA-DHB)JH, VHDHJH6, ili VH(DHA-DHB)JH6 rekombinacije. Prema tome, ovde su obezbeđeni glodari, ćelije glodara, lokusi i/ili nukleotidni molekuli koji sadrže sekvencu preuređenog imunoglobulinskog teškog lanca VH(DHA-DHB)JH, VH(DH)JH6, ili VH(DHA-DHB)JH6 koja kodira varijabilni domen teškog lanca imunoglobulina koji sadrži CDR3, pri čemu je dužina CDR3 najmanje 20 aminokiselina u dužini.
[0043] Ovde su takođe opisani glodari koji sadrže modifikovani region DHiz pronalaska, npr., nukleinske kiseline, vektore za ciljanje i/ili lokuse teškog lanca imunoglobulina kao što je ovde opisano, npr., u njegovom genomu, npr., germinativnom genomu. Ovde su takođe opisani takvi genomi glodara. U nekim izvođenjima, ovde je opisan glodar čiji germinativni genom obuhvata, ili glodar čiji se germinativni genom sastoji iz, varijabilnog regiona teškog lanca imunoglobulina kao što je opisano, pri čemu varijabilni region teškog lanca imunoglobulina obuhvata: (i) bar jedan neuređeni varijabilni genski segment teškog lanca (VH), (ii) modifikovani region diverziteta (DH) varijabilnog regiona teškog lanca, gde modifikovani region DHregion sadrži jedan ili više neuređeni DHgenski segment svaki sa 5’strane sa prvom 12-mer RSS u odnosu na bočnu stranu i sa 3’ strane sa drugom 12-mer RSS i jedan ili više DHgenskih segmenata svaki operativno u vezi sa 23-mer rekombinacionom signalnom sekvencom (RSS), i (iii) bar jedan neuređeni segment gena spajanja (JH) teškog lanca, pri čemu (i)-(iii) su u operativnoj vezi tako da, nakon rekombinacije, varijabilni region teškog lanca imunoglobulina obuhvata sekvencu preuređenog varijabilnog regiona teškog lanca koji kodira varijabilni domen teškog lanca imunoglobulina, opciono gde uređena sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca je obrazovana nakon događaja VH(DH-DH)JHrekombinacije, opciono gde bar jedan od jednog ili više DHgenskih segmenata svaki operativno u vezi sa 23-mer rekombinacionom signalnom sekvencom (RSS) spaja jedan od jednog ili više neuređenih DHgenskih segmenata svaki sa 5’ strane sa 12-mer RSS u odnosu na bočnu strani i sa 3’ strane sa drugom 12-mer RSS u odnosu na bočnu stranu tokom događaja VH(DH-
1
DH) rekombinacije. U nekim izvođenjima, jedan ili više DHsegmenata operativno u vezi h sa 23-mer RSS obuhvataju DHgenski segment operativno u vezi sa 3’ 23-mer RSS. U nekim izvođenjima, jedan ili više DHsegmenata operativno u vezi h sa 23-mer RSS obuhvataju DHgenski segment operativno u vezi sa 5’ 23-mer RSS. U nekim izvođenjima, varijabilni region teškog lanca imunoglobulina je varijabilni region teškog lanca humanog imunoglobulina koji sadrži samo humane VH, DH, i JHgenske segmente. U nekim izvođenjima, varijabilni region teškog lanca humanog imunoglobulina je operativno u vezi sa konstantnim regionom teškog lanca imunoglobulina. U nekim izvođenjima, konstantni region teškog lanca imunoglobulina je endogeni konstantni region teškog lanca imunoglobulina glodara ili genoma glodara, npr., u endogenom lokusu teškog lanca imunoglobulina. U nekim izvođenjima, varijabilni region teškog lanca imunoglobulina obuhvata humane VHgenske segmente koji se prostiru između VH3-74 do VH6-1 u germinativnoj konfiuraciji. U nekim izvođenjima, varijabilni region teškog lanca imunoglobulina obuhvata humani JH6 genski segment. U nekim izvođenjima, varijabilni region teškog lanca imunoglobulina sadrži jedan ili više nukleotidnih molekula koji kodiraju jedan ili više glodarskih Adam6 polipeptida (npr., Adam6 gen glodara), koji po potrebi može biti insertovan između dva humana VHgenska segmenta (npr., insertovani između humanog VH1-2 genskog segmenta i humanog VH6-1 genskog segmenta) i/ili insertovani umesto humanog Adam6 pseudogena. U nekim izvođenjima, glodarski genom je heterozigotni za modifikovani DHregion. U nekim izvođenjima, glodarski genom je homozigotan za modifikovani DHregion. U nekim izvođenjima, glodar može biti pacov. U nekim izvođenjima, glodar može biti miš. U nekim izvođenjima, glodar, glodarski genom, ili glodarska ćelija je pacov, miš, genom pacova, mišji genom, ćelija pacova, ili mišja ćelija, npr., glodarska (pacov ili miš) embrionska matična ćelija.
[0044] U nekim izvođenjima, glodar, genom glodara, ili ćelija glodara koji su ovde opisani dalje obuhvataju preuređeni teški lanac VDJ i/ili VH(DHA-DHB)JHkodirajuće sekvence koje kodiraju varijabilne domene teškog lanca imunoglobulina. U nekim izvođenjima, ovde je opisan glodar, npr., pacov ili miš, koji obuhvata (1) u njegovom germinativnom genomu, npr., u germinativnoj-ćeliji, lokus teškog lanca imunoglobulina koji sadrži modifikovani region DHregion koji sadrži DHgenski segment operativno u vezi sa 23-mer RSS, i (2) u njegovom somatskom genomu, npr., u B ćeliji, kodirajuću sekvencu preuređenog varijabilnog regiona teškog lanca VH(DHA-DHB)JH, pri čemu prvi ili drugi DHgenski segment (DHA ili DHB, redom) je dobijen iz DHgenskog segmenta operativno vezanog sa 23-mer RSS, ili njegovim delom (npr., obuhvata sekvencu koja je identična sa onom od bar dela DHgenskog segmenta operativno vezanog sa 23-mer RSS, njegova somatski hipermutirana varijanta i/ili degenerisana varijanta). U nekim izvođenjima, u kojima je B ćelija naivna B ćelija i/ili kodirajuća sekvenca preuređenog varijabilnog regiona teškog lanca je operativno u vezi sa sekvencom konstantnog regiona IgM, bar jedan od DHA i DHB genskog segmenta obuhvata najmanje 9 susednih nukleotida koji su u skladu sa molekulom nukleotida koji je kodiran od strane DHgenskog segmenta operativno vezanog sa 23-mer RSS, i svaki od DHA i DHB genskih segmenata obuhvata bar 5 susednih nukleotida koji su u skladu sa nukleotidnim molekulom germinativnog DHgenskog segmenta. U nekim izvođenjima, u kojima je B ćelija plazma ili memorijska B ćelija i/ili preuređena kodirajuća sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca je somatski hipermutirana i/ili operativno vezana sa ne-IgM sekvencom konstantnog regiona (npr., IgG, IgA, IgE, itd.), svaki od DHA i DHB redom pokazuje 40% identičnost sa prvim i drugim germinativnim DHgenskim segmentom, sa maksimumom mutacije u 1 nukleotidu. U nekim izvođenjima, bar 95% od svih preuređenih kodirajućih sekvenci teškog lanca VDJ i/ili VH(DHA-DHB)JHu glodaru imaju dužinu CDR3 od najmanje 10 aminokiselina, opcionog gde najmanje 70% od svih preuređenih kodirajućih sekvenci teškog lanca VDJ i/ili VH(DHA-DHB)JHu glodaru imaju dužinu CDR3 od najmanje 11 aminokiselina, opciono najmanje 15% od svih preuređenih kodirajućih sekvenci teškog lanca VDJ i/ili VH(DHA-DHB)JHu glodaru imaju dužinu CDR3 od najmanje 14 aminokiselina. U nekim izvođenjima, populacija VDJ i/ili VH(DHA-DHB)JHkodirajućih sekvenci u glodaru imaju dužinu CDR3 od najmanje 15 aminokiselina, opciono najmanje 16 aminokiselina, opciono najmanje 17 aminokiselina, i opciono najmanje 18 aminokiselina. U nekim izvođenjima, ovde je opisan glodar ili ćelija glodara koja eksprimira, ili nukleinsku kiselinu ili imunoglobulinski lokus koji obuhvata, preuređenu kodirajuću sekvencu teškog lanca VH(DHA-DHB)JH, pri čeu drugi germinativni DHgenski segment je DH3-3, opciono gde preuređena kodirajuća sekvenca teškog lanca VH(DHA-DHB)JHkodira CDR3 dužine od preko 20 aminokiselina. U nekim izvođenjima, ovde je opisan glodar ili ćelija glodara koja eksprimira, ili nukleinsku kiselinu ili imunoglobulinski lokus koji obuhvata, kodirajuću sekvencu preuređenog teškog lanca VH(DHA-DHB)JH, pri čemu prvi germinativni DHgenski segment je DH2-2, DH2-8 ili DH2-15, opciono gde kodirajuća sekvenca preuređenog teškog lanca VH(DHA-DHB)JHkodira CDR3 dužine od preko 20 aminokiselina. U nekim izvođenjima, ovde je opisan glodar ili ćelija glodara koja eksprimira kodirajuću sekvencu preuređenog teškog lanca VH(DHA-DHB)JH6 koja kodira CDR3 dužine od preko 20 aminokiselina.
[0045] Takođe je prikazan genom glodara, nukleinska kiselina ili imunoglobulinski lokus koji se sastoji iz preuređene kodirajuće sekvence teškog lanca humanog imunoglobulina VH(DHA-DHB)JHoperativno vezane sa sekvencom konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina glodara. U nekom slučaju, DHB genski segment je izveden iz humanog germinativnog DH3-3 genskog segmenta. U nekim slučajevima DHA genski segment je izveden iz humanog germinativnog DH2-2, DH2-8 ili DH2-15 genskog segmenta. U nekim slučajevima preuređeni teški lanac je određen da bude VH(DHA-DHB)JHkodirajuća sekvenca s obzirom na to da svaki od DHA i DHB redom pokazuje 40% identičnost sa prvim i drugim germinativnim DHgenskim segmentom, sa maksimumom mutacije u 1 nukleotidu. U nekim slučajevima, kodirajuća sekvenca preuređenog teškog lanca VH(DHA-DHB)JHkodira CDR3 dužine od preko 20 aminokiselina. U nekim slučajevima, JHgenski segment je dobijen iz humanog germinativnog JH6 genskog segmenta. U nekim slučajevima, glodar ili ćelija glodara koja sadrži VH(DHA-DHB)JHkodirajuću sekvencu je obezbeđena. U nekim slučajevima, glodar je pacov ili miš ili ćelija glodara je ćelija pacova ili mišja ćelija. U nekim izvođenjima, ćelija glodara je B ćelija glodara. U nekim slučajevima, obezbeđen je hibridom koji se sastoji iz B ćelije glodara koja eksprimira preuređenu kodirajuću sekvencu teškog lanca VH(DHA-DHB)JHkoja je spojena sa ćelijom mijeloma. U nekim slučajevima, VH(DHADHB)JHsekvenca je potvrđena da bude rezultat događaja DH-DHrekombinacije kada su sekvence identifikovane kao DHA i DHB sva redom pokazuje 40% identičnost sa prvim i drugim DHgenskim segmentom, sa maksimumom mutacije u 1 nukleotidu.
[0046] Takođe je prikazan glodar ili ćelija glodara, čiji genom obuhvata varijabilni region teškog lanca imunoglobulina koji uključuje modifikovani region DH, gde modifikovani region DHobuhvata bar jedan DHsegment koji je operativno u vezi sa prvom i drugom rekombinacionom sekvencom (RSS). U nekim izvođenjima, prva RSS je 23-mer RSS i druga RSS je 12-mer RSS. U nekim izvođenjima, prva RSS je 12-mer RSS i druga RSS je 23-mer RSS.
[0047] Takođe je prikazan glodar, čiji genom obuhvata varijabilni region teškog lanca imunoglobulina koji uključuje modifikovani region DH, gde modifikovani region DHsadrži jedan ili više DHsegmenata gde su svaki operativno u vezi sa 23-mer rekombinacionom signalnom sekvencom (RSS).
[0048] U nekim izvođenjima, obezbeđena je ćelija glodara koja sadrži germinativni genom glodara iz predmetnog pronalaska, poželjno gde je ćelija glodara pacovska, mišja, ćelija pacova, ili mišja ćelija. U nekim izvođenjima, ćelija je iz limfoidne ili mijeloidne linije. U nekim izvođenjima, ćelija je limfocit. U nekim izvođenjima, ćelija je izabrana od B ćelije, dkrajemritične ćelije, makrofaga, monocita, i T ćelije. U nekim izvođenjima, tkivo je izabrano od adipoznog, bešike, mozga, dojke, koštane srži, oka, srca, creva, bubrega, jetre, pluća, limfnog čvora, mišića, pankreasa, plazme, seruma, kože, slezine, stomaka, timusa, testisa, ovuma, ili bilo koje njihove kombinacije.
1
[0049] U nekim izvođenjima, obezbeđena je imortalizovana ćelija koja je dobijena iz ćelije glodara kao što je ovde opisano, npr., ćelija hybridoma dobijena iz spajanja B ćelije izolovane iz glodara kao što je ovde opisano sa ćelijom mijeloma.
[0050] U nekim izvođenjima, ćelija glodara je embrionalna matična ćelija (ES) glodara. U nekim izvođenjima, embrionalna matična ćelija glodara je mišja embionalna matična ćelija i ona je iz 129 soja, C57BL soja, ili njihova mešavina. U nekim izvođenjima, embrionalna matična ćelija glodara je mišja embrionalna matična ćelija i to je mešavina 129 i C57BL sojeva.
[0051] U nekim izvođenjima, obezbeđena je upotreba matične ćelije glodara kao što je ovde opisana da se dobije nehumana životinja. U nekim izvođenjima, embrionalna matična ćelija glodara je mišja embrionalna matična ćelija i korišćena je da se dobije miš iz predmetnog pronalaska. U nekim izvođenjima, embrionalna matična ćelija glodara je embrionalna matična ćelija glodara i korišćena je da se dobije pacov koji sadrži varijabilni region teškog lanca imunoglobulina koji uključuje modifikovani DHregion kao što se ovde opisuje. U nekim izvođenjima, ne-ograničavajući primer postupka za dobijanje pacova koji sadrži iz varijabilni region teškog lanca imunoglobulina koji uključuje modifikovani DHregion može uključiti postupke koji su predstavljeni u US20140309487.
[0052] U nekim izvođenjima, obezbeđen je embrion glodara koji sadrži, napravljen je od, dobijen je od, ili je generisan iz embrionalne matične ćelije glodara kao što se ovde opisuje. U nekim izvođenjima, embrion glodara je mišji embrion; u nekim izvođenjima, embrion pacova.
[0053] U nekim izvođenjima, obezbeđena je upotreba embriona glodara kao što je ovde opisana da bi se dobio glodar prema predmetnom pronalasku. U nekim izvođenjima, embrion glodara je mišji embrion i korišćen je da se dobije miš iz predmetnog pronalaska koji sadrži varijabilni region teškog lanca imunoglobulina koji uključuje modifikovani DHregion kao što je ovde opisano. U nekim izvođenjima, embrion glodara je embrion pacova i korišćen je da se dobije pacov iz predmetnog pronalaska koji sadrži varijabilni region teškog lanca imunoglobulina koji uključuje modifikovani DHregion kao što je ovde opisano.
[0054] Ovde je obezbeđen postupak za dobijanje glodara čiji genom obuhvata modifikovani DHregion, postupak obuhvata:
(A) dobijanje glodara iz embrionalne stem ćelije iz predmetnog pronalaska, ili
(B)
(a) modifikovanje genoma embrionalne matične ćelije glodara da obuhvati DNK fragment koji sadrži jedan ili više modifikovanih DHgenskih segmenata svaki sadrži DHgenski segment neposredno pored i u susedstvu sa 23-mer RSS, opciono gde DNK fragment obuhvata nukleotidni molekul iz predmetnog pronalaska, vektor za ciljanje iz predmetnog pronalaska, varijabilni region teškog lanca imunoglobulina modifikovan prema postupku iz predmetnog pronalaska, ili težak lanac imunoglobulina iz predmetnog pronalaska, i
(b) dobijanje glodara korišćenjem modifikovane embrionalne matične stem ćelije pod (a).
U nekim izvođenjima, modifikovanje obuhvata zamenu jednog ili više neuređenih humanih DHgenskih segmenata, i po potrebi zamenu ili deleciju jednog ili više JHgenskih segmenata, sa bar jednim od DHsegmenata operativno u vezi m sa 23-mer RSS. U nekim izvođenjima, varijabilni region teškog lanca imunoglobulina je varijabilni region teškog lanca humanog imunoglobulina, npr., pri čemu varijabilni region teškog lanca humanog imunoglobulina obuhvata neuređeni humani VHgenski kluster teškog lanca imunoglobulina koji sadrži bar jedan VHgenski segment, neuređeni humani DHregion teškog lanca imunoglobulina koji sadrži jedan ili više neuređenih humanih DHgenskih segmenata, i neuređeni
1
humani JHgenski kluster teškog lanca imunoglobulina koji sadrži na jednom neuređeni humani JHgenski segment, u kome neuređeni humani DHregion teškog lanca imunoglobulina je modifikovan da sadrži bar jedan DHsegment operativno u vezi sa 23-mer RSS. U nekim izvođenjima, korak modifikovanja dovodi do varijabilnog regiona teškog lanca imunoglobulina koji obuhvata (i) pun repertoar funkcionalnih humanih VHgenskih segmenata, npr., svi funkcionalni VHgenski segmenti koji se nalaze (prostiru) između i uključujući VH3-74 do VH6-1, (ii) pun repertoar neuređenih humanih DHgenskih segmenata izuzev za DH7-27 koji je zamenjen sa bar jednim DHgenskim segmentom operativno u vezi m sa 23-mer RSS, i (iii) bar neuređeni humani JH6 genski segment, i opciono bar neuređeni JH4 genski segment, neuređeni JH5 genski segment, I neuređeni JH6 genski segment. U nekim izvođenjima, bar jedan DHgenski segment operativno u vezi sa 23-mer RSS obuhvata DH3-3 genski segment operativno u vezi sa 5’ -23-mer RSS. U nekim izvođenjima, korak modifikovanja dovodi do varijabilnog regiona teškog lanca imunoglobulina koji se sastoji iz (i) punog repertoara funkcionalnih humanih VHgenskih segmenata, npr., svi funkcionalni VHgenski segmenti koji se nalaze između i uključujući VH3-74 do VH6-1, (ii) pun repertoar neuređenih humanih DHgenskih segmenata izuzev što neuređeni humani DH2-2, DH2-8, i DH2-15 genski segmenti su redom zamenjeni sa DH2-2 genskim segmentom operativno u vezi m na njegovom 3’ kraju sa 23-mer RSS, humani DH2-8 genski segment operativno u vezi na njegovom 3’ kraju sa 23-mer RSS, I humani DH2-15 genski segment operativno u vezi na njegovom 3’ kraju sa 23-mer RSS, i (iii) pun repertoar neuređenih humanih JHgenskih segmenata, npr., neuređeni humani JH1 genski segment, neuređeni humani JH2 genski segment, neuređeni humani JH3 genski segment, neuređeni humani JH4 genski segment, neuređeni humani JH5 genski segment, i neuređeni humani JH6 genski segment. U nekim izvođenjima, varijabilni region teškog lanca imunoglobulina (a) dalje sadrži jedan ili više Adam6 gena glodara, opciono gde jedan ili više Adam6 gena glodara su locirani između dva nepreuređena VHgenska segmenta, npr., između neuređenog humanog VH1-2 genskog segmenta i neuređenog humanog VH6-1 genskog segmenta, i/ili (b) je operativno u vezi sa konstantnim regionom teškog lanca imunoglobulina, opciono gde konstantni region teškog lanca imunoglobulina je endogeni konstantni region teškog lanca imunoglobulina glodara, npr., endogeni konstantni region teškog lanca imunoglobulina glodara u lokusu za endogeni teški lanac imunoglobulina. U nekim izvođenjima, glodar je pacov ili miš.
[0055] Takođe je prikazan komplet, koji obuhvata glodara kao što je ovde opisan, ćeliju glodara ili tkivo kao što je ovde opisano, imortalizovanu ćeliju kao što je ovde opisano, embrionalnu matičnu ćeliju glodara kao što je ovde opisano, ili glodara kao što je ovde opisano.
[0056] Takođe je prikazan komplet, za upotrebu u dobijanju i/ili razvoju leka (npr., antitela ili njegovog fragmenta koji veže antigen) za terapiju ili dijagnozu. U nekim slučajevima, obezbeđen je komplet kao što se ovde opisuje, za upotrebu u dobijanju i/ili razvoju leka (npr., antitela ili njegovog fragmenta koji veže antigen) za lečenje, prevenciju ili ublažavanje bolesti, poremećaja ili stanja.
[0057] U nekim izvođenjima, transgen, konstrukt nukleinske kiseline, DNK konstrukt, ili vektor za ciljanje kao što je ovde opisan je obezbeđen da obuhvata modifikovani DHregion kao što je ovde opisano. U nekim izvođenjima, transgen, konstrukt nukleinske kiseline, DNK konstrukt, ili vektor za ciljanje dalje sadrži jedan ili više selekcionih markera. U nekim izvođenjima, transgen, konstrukt nukleinske kiseline, DNK konstrukt, ili vektor za ciljanje dalje sadrži jedan ili više rekombinacionih mesta specifičnih za mesto (npr., loxP, Frt, ili njihove kombinacije). U nekim izvođenjima, transgen, konstrukt nukleinske kiseline, DNK konstrukt, ili vektor za ciljanje je predstavljen na Slici 2.
[0058] U nekim izvođenjima, obezbeđena je upotreba transgena, konstrukta nukleinske kiseline, DNK konstrukta, ili vektora za ciljanje kao što je ovde opisano da bi se dobio glodar, ćelija glodara, embrionalna matična ćelija glodara, i/ili embrion glodara.
1
[0059] U nekim izvođenjima, jedan ili više DHsegmenata su svaki operativno u vezi sa 3’ 23-mer RSS. U nekim izvođenjima, jedan ili više DHsegmenata su svaki operativno u vezi sa 5’ 23-mer RSS.
[0060] U nekim izvođenjima, modifikovani DHregion sadrži jedan DHsegment operativno u vezi sa 5’ 23-mer RSS. U nekim izvođenjima, modifikovani DHregion sadrži jedan DHsegment operativno u vezi sa 3’ RSS. U nekim izvođenjima jedan DHsegment operativno u vezi sa 5’ 23-mer RSS, jedan DHsegment je sintetički DHsegment; U nekim izvođenjima, sintetički humani DHsegment; U nekim izvođenjima, sintetički humani DHsegment koji ima sekvencu koja je identična ili u suštini identična sa humanim DH3-3 segmentom. U nekim izvođenjima jedan DHsegment operativno u vezi sa 3’ 23-mer RSS, jedan DHsegment je sintetički DHsegment; U nekim izvođenjima, sintetički humani DHsegment; U nekim izvođenjima, sintetički humani DHsegment koji ima sekvencu koja je identična ili je u suštini identična sa humanim DH3-3 segmentom.
[0061] U nekim izvođenjima, modifikovani DHregion sadrži tri DHsegmenta svaki operativno u vezi sa 5’ 23-mer RSS. U nekim izvođenjima triDHsegmenata svaki su operativno u vezi sa 5’ 23-mer RSS, triDHsegmenta su sintetički DHsegmenti. U nekim izvođenjima tri DHsegmenata svaki operativno u vezi sa 5’ 23-mer RSS, tri DHsegmenta su segmenti humane DH2 familije. U nekim izvođenjima tri DHsegmenta svaki operativno u vezi sa 5’ 23-mer RSS, tri DHsegmenta su izabrana od humanog DH2-2, humanog DH2-8, humanog DH2-15, humanog DH2-21 i njihovih kombinacija. U nekim izvođenjima tri DHsegmenta svaki operativno u vezi sa 5’ 23-mer RSS, tri DHsegmenta su humani DH2-2, humani DH2-8 i humani DH2-15.
[0062] U nekim izvođenjima, modifikovani DHregion sadrži tri DHsegmenta svaki operativno u vezi sa 3’ 23-mer RSS. U nekim izvođenjima tri DHsegmenta svaki operativno u vezi sa 3’ 23-mer RSS, tri DHsegmenta su sintetički DHsegmenti. U nekim izvođenjima tri DHsegmenti svaki operativno u vezi sa 3’ 23-mer RSS, tri DHsegmenti su segmenti humane DH2 familije. U nekim izvođenjima tri DHsegmenti svaki operativno u vezi sa 3’ 23-mer RSS, tri DHsegmenti su izabrani od humanog DH2-2, humanog DH2-8, humanog DH2-15, humanog DH2-21 i njihovih kombinacija. U nekim izvođenjima tri DHsegmenti svaki operativno u vezi sa 3’ 23-mer RSS, tri DHsegmenti su humani DH2-2, humani DH2-8 i humani DH2-15.
[0063] U nekim izvođenjima, modifikovani DHregion kao što je ovde opisano uključuje mnoštvo humanih DHsegmenata, pri čemu bar jedan od mnoštva humanih DHgenskih segmenata je operativno u vezi sa 5’ ili 3’ RSS; U nekim izvođenjima, 5’ 23-mer RSS. U nekim izvođenjima, modifikovani DHregion kao što je ovde opisano uključuje mnoštvo humanog DHsegmenta, pri čemu bar tri od mnoštva humanih DHgenskih segmenata su svaki operativno u vezi sa 5’ ili 3’ RSS; U nekim izvođenjima, 3’ 23-mer RSS.
[0064] U nekim izvođenjima, genomu obezbeđenog glodara, ćelije glodara ili tkiva glodara nedostaje jedan ili više DHsegmenata divljeg tipa. U nekim izvođenjima, genomu obezbeđenog glodara, ćelije glodara ili tkiva glodara nedostaju svi ili u suštini svi segmenti DHdivljeg tipa. U nekim izvođenjima, genom obezbeđenog glodara, ćelije glodara ili tkiva glodara sadrži samo humane DHsegmente.
[0065] U nekim izvođenjima, varijabilni region teškog lanca imunoglobulina je varijabilni region teškog lanca humanog imunoglobulina. U nekim izvođenjima, varijabilni region teškog lanca humanog imunoglobulina je operativno u vezi sa konstantnim regionom teškog lanca imunoglobulina. U nekim izvođenjima, konstantni region teškog lanca imunoglobulina je endogeni (npr., nehumani) konstantni region teškog lanca imunoglobulina.
[0066] U nekim izvođenjima, varijabilni region teškog lanca humanog imunoglobulina uključuje humane VHgenske segmente iz VH3-74 do VH6-1. U nekim izvođenjima, varijabilni region teškog lanca
1
humanog imunoglobulina uključuje bar humani JHgenski segment JH6. U nekim izvođenjima, varijabilni region teškog lanca humanog imunoglobulina uključuje bar humane JHgenske segmente JH4, JH5 i JH6. U nekim izvođenjima, varijabilni region teškog lanca humanog imunoglobulina uključuje humane JHgenske segmente JH1, JH2, JH3, JH4, JH5 i JH6.
[0067] U nekim izvođenjima glodara, ćelije glodara ili tkiva glodara, genomu nedostaje endogeni Adam6 gen. U nekim izvođenjima životinje glodara, ćelije glodara ili tkiva, genom dalje sadrži inserciju jedne ili više nukleotidnih sekvenci koje kodiraju jedan ili više Adam6 polipeptida glodara; u nekim izvođenjima, jedna ili više nukleotidnih sekvenci su insertovane između prvog i drugog humanog VHgenskog segmenta; u nekim izvođenjima, jedna ili više nukleotidnih sekvenci su insertovane umesto humanog Adam6 pseudogena; u nekim izvođenjima, jedna ili više nukleotidnih sekvenci su insertovane između humanog VHgenskog segmenta i humanog DHgenskog segmenta. U nekim izvođenjima, prvi humani VHgenski segment je humani VH1-2 i drugi humani VHgenski segment je humani VH6-1.
[0068] U nekim izvođenjima, obezbeđeni glodar, ćelija glodara ili tkivo glodara je homozigot, heterozigot ili poluzigot za modifikovani DHregion kao što se ovde opisuje. U nekim izvođenjima, obezbeđeni glodar, ćelija glodara ili tkivo glodara je transgeno za modifikovani DHregion kao što se ovde opisuje.
[0069] U nekim izvođenjima, obezbeđen je postupak dobijanja glodara čiji genom obuhvata varijabilni region teškog lanca imunoglobulina koji uključuje modifikovani DHregion, postupak obuhvata (a) inserciju fragmenta DNK u matične embrionalne ćelije glodara, čiji DNK fragment sadrži jedan ili više DHsegmenata koji su svaki operativno u vezi sa 23-mer RSS; (b) dobijanje matičnih embrionalnih ćelija glodara generisanih pod (a); i (c) kreiranja glodara korišćenjem matičnih embrionskih ćelija glodara pod (b).
[0070] U nekim izvođenjima, DNK fragment sadrži jedan ili više DHsegmenata su svaki operativno u vezi sa 3’ 23-mer RSS. U nekim izvođenjima, DNK fragment sadrži jedan DHsegment operativno u vezi sa 3’ 23-mer RSS. U nekim izvođenjima, DNK fragment sadrži jedan sintetički humani DHsegment operativno u vezi sa 3’ 23-mer RSS. U nekim izvođenjima, DNK fragment sadrži jedan sintetički humani DH3-3 segment operativno u vezi sa 3’ 23-mer RSS. U nekim izvođenjima, DNK fragment obuhvata tri DHsegmenta svaki operativno u vezi sa 3’ 23-mer RSS. U nekim izvođenjima, DNK fragment obuhvata tri humana DHsegmenta svaki operativno vezana sa 3’ 23-mer RSS. U nekim izvođenjima, DNK fragment obuhvata tri humana DHsegmenta svaki operativno u vezi sa 3’ 23-mer RSS, gde humani DHsegmenti su humani DH2-2, humani DH2-8 i humani DH2-15.
[0071] U nekim izvođenjima, DNK fragment sadrži jedan ili više DHsegmenata, svaki koji je operativno u vezi sa 5’ 23-mer RSS. U nekim izvođenjima, DNK fragment sadrži jedan DHsegment operativno u vezi sa 5’ 23-mer RSS. U nekim izvođenjima, DNK fragment sadrži jedan sintetički humani DHsegment operativno u vezi sa 5’ 23-mer. U nekim izvođenjima, DNK fragment sadrži jedan sintetički humani DH3-3 segment operativno u vezi sa 5’ 23-mer RSS. U nekim izvođenjima, fragment DNK sadrži jedan sintetički humani DH3-3 segment operativno u vezi sa 5’ 23-mer RSS, gde sintetički humani DH3-3 segment je pozicioniran u humanom DHregionu umesto humanog DH7-27 segmenta.
[0072] U nekim izvođenjima, DNK fragment sadrži jedan ili više markera za selekciju. U nekim izvođenjima, DNK fragment sadrži jedan ili više mesta za rekombinaciju koja su specifična za mesto.
[0073] Takođe je prikazan postupak za dobijanje glodara čiji genom sadrži varijabilni region teškog lanca imunoglobulina koji uključuje modifikovani DHregion, postupak obuhvata korak modifikovanja genoma glodara ili ćelije glodara tako da obuhvata varijabilni region teškog lanca imunoglobulina koji
1
uključuje modifikovani DHregion, gde modifikovani DHregion sadrži jedan ili više DHsegmenata gde su svaki operativno u vezi sa 23-mer RSS, čime se stvara glodar.
[0074] U nekim izvođenjima dobijanja glodara, genom glodara ili ćelija glodara je modifikovana da uključi jedan ili više DHsegmenata koji su svaki operativno u vezi sa 5’ 23-mer RSS. U nekim izvođenjima dobijanja glodara, genom glodara ili ćelija glodara je modifikovana da uključi jedan ili više DHsegmenata gde su svaki operativno u vezi sa 3’ 23-mer RSS.
[0075] U nekim izvođenjima, obezbeđen je postupak za proizvodnju antitela ili dobijanje nukleinske kiseline koja kodira isto, postupak obuhvata:
imunizovanje glodara sa antigenom, pri čemu glodar obuhvata germinativni genom koji se sastoji iz modifikovanog DHregiona koji obuhvata jedan ili više segmenata DHgde je svaki u neposrednoj blizini 23-mer RSS, opciono gde je glodar glodar iz predmetnog pronalaska ili je dobijen u skladu sa predmetnim pronalaskom, i
omogućavanje glodaru da proizvede imuni odgovor prema antigenu uključujući antitelo, ili nukleinsku kiselinu koja isto kodira, koje veže antitelo.
poželjno gde:
(a) postupak je onaj koji dalje obuhvata obnavljanje antitela, ili nukleinske kiseline koja kodira isto, iz glodara ili ćelije glodara ili gde je ćelija glodara B ćelija ili hibridom;
(b) jedan ili više segmenata DHgde su svaki u neposrednoj blizini 23-mer RSS obuhvata DHgenski segment operativno u vezi sa 5’ 23-mer RSS;
(c) jedan ili više segmenata DHgde su svaki u neposrednoj blizini 23-mer RSS obuhvata DHgenski segment operativno u vezi sa 3’ 23-mer RSS; i/ili
(d) glodar je pacov ili miš.
[0076] U nekim izvođenjima, postpak dalje obuhvata obnavljanje antitela, ili nukleinske kiseline koja isto kodira, iz glodara ili ćelije glodara, npr., koja je B ćelija ili hibridom. U nekim izvođenjima, jedan ili više segmenata DHsu svaki operativno u vezi sa 5’ 23-mer RSS. U nekim izvođenjima, jedan ili više segmenata DHsu svaki operativno u vezi sa 3’ 23-mer RSS.
[0077] U nekim izvođenjima, postupak obuhvata korake pod (a) imunizovanje životinje glodara sa antigenom, pri čemu glodar ima genom koji se sastoji iz varijabilnog regiona teškog lanca imunoglobulina koji uključuje modifikovani DHregion, pri čemu modifikovani DHregion obuhvata jedan ili više DHsegmenata koji su svaki operativno u vezi sa 23-mer RSS; (b) održavanje glodara pod uslovima dovoljnim da glodar proizvede imuni odgovor prema antigenu; i (c) obnavljanje antitela iz nehumane životinje, ili ne humane životinjske ćelije, koja vezuje antigen. U nekim izvođenjima, ćelija glodara je B ćelija. U nekim izvođenjima, ćelija glodara je hibridom.
[0078] Takođe je prikazan glodar čiji se genom sastoji iz varijabilnog regiona teškog lanca humanog imunoglobulina koji sadrži jedan ili više humanih VHgenskih segmenata, modifikovani DHregion koji uključuje bar jedan humani DHsegment operativno u vezi sa 23-mer RSS, i bar jedan humani JHgenski segment, u kome je varijabilni region teškog lanca humanog imunoglobulina operativno u vezi sa jednim ili više endogenih gena konstantnog regiona imunoglobulina tako da se glodar karakteriše time da kada je imunizovan sa antigenom, počinje da stvara antitela koja se sastoje iz varijabilnih domena humanog teškog lanca koji uključuje CDR3 regione koji su generisani sa humanom DH-DHrekombinacijom i/ili pojačanom rekombinacijom sa JH6 genskim segmentom, i gde antitela pokazuju specifično vezivanje sa antigenom. U nekim slučajevima, bar jedan humani DHsegment operativno u vezi sa 23-mer RSS je pozicioniran umesto humanog DH7-27 segmenta. U nekim slučajevima, varijabili region teškog lanca humanog imunoglobulina obuhvata manje od svih šest humanih JHgenskih
2
segmenata. U nekim slučajevima, varijabilni region teškog lanca humanog imunoglobulina obuhvata samo jedan od šest humanih JHgenski segment. U nekim slučajevima, varijabilni region teškog lanca humanog imunoglobulina obuvata humani JH6 genski segment i nedostaje funkcionalni JH1 genski segment, nedostaje funkcionalni JH2 genski segment, nedostaje funkcionalni JH3 genski segment, nedostaje funkcionalni JH4 genski segment, i nedostaje funkcionalni JH5 genski segment. U nekim slučajevima, varijabilni region teškog lanca humanog imunoglobulina obuhvata samo tri od šest humanih JHgenskih segmenata. U nekim slučajevima, varijabilni region teškog lanca humanog imunoglobulina sadrži samo humani JH4 genski segment, humani JH5 genski segment, i humani JH6 genski segment, i nedostaje funkcionalni JH1 genski segment, nedostaje funkcionalni JH2 genski segment, i nedostaje funkcionalni JH3 genski segment. U nekim slučajevima, u kojima glodar čiji se genom sastoji iz varijabilnog regiona teškog lanca humanog imunoglobulina obuhvata manje od svih šest humanih JHgenskih segmenata , npr., varijabilni region teškog lanca humanog imunoglobulina koji sadrži samo jedan od šest humanih JHgenskih segmenata (npr., varijabilni region teškog lanca humanog imunoglobulina koji sadrži humani JH6 genski segment i nedostaje JH1 genski segment, nedostaje funkcionalni JH2 genski segment, nedostaje funkcionalni JH3 genski segment, nedostaje funkcionalni JH4 genski segment, i nedostaje funkcionalni JH5 genski segment), ispoljava pojačanu rekombinaciju JH6 genskog segmenta u poređenju sa kontrolnim glodarom čiji se genom sastoji iz varijabilnog regiona teškog lanca humanog imunoglobulina koji obuhvata svih šest humanih JHgenskih segmenata, npr., glodar obuhvata veći procenat preuređenih sekvenci teškog lanca imunoglobulina koje sadrže sekvencu JH6 genskog segmenta ili njegov deo i/ili kodiranje CDR3 dužine od njihovih bar 20 aminokiselina u odnosu na kontrolnu nehumanu životinju. U nekim slučajevima, u kojima glodar čiji genom sadrži varijabilni region teškog lanca humanog imunoglobulina obuhvata manje od svih šest humanih JHgenskih segmenata, npr., varijabilni region teškog lanca humanog imunoglobulina koji sadrži samo tri od šest humanih JHgenskih segmenata (npr., varijabilni region teškog lanca humanog imunoglobulina koji sadrži varijabili region teškog lanca humanog imunoglobulina obuhvata humani JH4 genski segment, humani JH5 genski segment, i humani JH6 genski segment, i nedostaje funkcionalni JH1 genski segment, nedostaje funkcionalni JH2 genski segment, i nedostaje funkcionalni JH3 genski segment), ispoljava pojačanu rekombinaciju sa JH6 genskim segmentom u poređenju sa kontrolnim glodarom čiji se genom sastoji iz varijabilnog regiona teškog lanca humanog imunoglobulina koji sadrži svih šest humanih JHgenskih segmenata , npr., glodar obuhvata veći procenat preuređenih sekvenci teškog lanca imunoglobulina koje obuhvataju sekvencu JH6 genskog segmenta ili njegov deo i/ili kodira CDR3 dužine od bar 20 aminokiselina u poređenju sa kontrolnim glodarom.
[0079] Takođe je prikazan glodar čiji se genom sastoji iz varijabilnog regiona teškog lanca humanog imunoglobulina koji obuhvata jedan ili više humanih VHgenskih segmenata , modifikovani DHregion koji uključuje bar jedan humani DHsegment 3’ sa 23-mer RSS u odnosu na bočnu stranu, i bar dva humana JHgenska segmenta, pri čemu varijabilni region teškog lanca humanog imunoglobulina je operativno u vezi sa jedan ili više endogenih gena konstantnog regiona imunoglobulina tako da se glodar karakteriše time što kada se imunizuje sa antigenom, počinje da stvara antitela koja se sastoje iz humanih varijabilnih domena teškog lanca koji uključuju CDR3 regione generisane humanom DH-DHrekombinacijom, i gde antitela pokazuju specifično vezivanje za antigen. U nekim slučajevima, modifikovani DHregion uključuje bar tri humana DHsegmenta pri čemu je svaki 3’ sa 23-mer RSS u odnosu na bočnu stranu. U nekim slučajevima, modifikovani DHregion uključuje tri humana DHsegmenta pri čemu je svaki 3’ sa 23-mer RSS u odnosu na bočnu stranu, gde su tri humana DHsegmenta humani DH2-2, humani DH2-8 i humani DH2-15. U nekim slučajevima, varijabilni region teškog lanca humanog imunoglobulina uključuje humane VHgenske segmente od VH3-74 do VH6-1.
[0080] U nekim izvođenjima, antigen je patogen, npr., bakterijski, gljivični, ili virusni patogen. U nekim izvođenjima, imunizovanje glodara ovde obuhvata infekciju glodara sa patogenom, npr., bakterijskim, gljivičnim, ili virusnim patogenom. U nekim izvođenjima, imunizovanje glodara ovde obuhvata davanje glodaru genomskog ili proteinoznog materijala koji je izolovan iz patogena, npr., bakterije, gljive, ili virusnog patogena. U nekim izvođenjima, antigen je receptor (npr., receptor komplementa, receptor hemokina, itd.), ili njegov deo. U nekim izvođenjima, antigen je nukleinska kiselina koja kodira za receptor, ili njegov deo. U nekim izvođenjima, antigen je ćelija koja eksprimira receptor, ili njegov deo. U nekim izvođenjima, antigen je jonski receptor, ili njegov deo. U nekim izvođenjima, antigen je nukleinska kiselina koja kodira za jonski kanal ili njegov deo. U nekim izvođenjima, antigen je ćelija koja eksprimira jonski kanal, ili njegov deo.
[0081] U nekim izvođenjima, obezbeđeni glodar, ćelija glodara ili tkivo glodara ima genom koji dalje obuhvata inserciju jednog ili više humanih VLgenskih segmenata i jedan ili više humanih JLgenskih segmenata u endogeni lokus lakog lanca. U nekim izvođenjima, humani VLi JLsegmenti su Vκ i Jκ genski segmenti i insertovani su u endogeni lokus κ lakog lanca. U nekim izvođenjima, humani Vκ i Jκ genski segmenti su operativno u vezi sa Cκ genom glodara (npr. Cκ gen miša ili pacova). U nekim izvođenjima, humani VLi JLsegmenti su Vλ i Jλ genski segmenti i inserovani su u endogeni lokus λ lakog lanca. U nekim izvođenjima, humani Vλ i Jλ genski segmenti su operativno u vezi sa Cλ genom (npr., Cλ gen miša ili pacova).
[0082] Takođe je prikazana upotreba glodara, ćelije glodara ili tkiva glodara kao što je ovde opisano u dobijanju i/ili razvoju leka ili vakcine za upotrebu u medicini, kao što je upotreba kao lek. U nekim izvođenjima, obezbeđena je upotreba glodara, ćelije glodara ili tkiva glodara kao što je ovde opisano u dobijanju i/ili razvoju antitela za davanje ljudima. Takođe je prikazana upotreba glodara, ćelije glodara ili tkiva glodara kao što je ovde opisano u dobijanju leka za lečenje, prevenciju ili ublažavanje bolesti, poremećaja ili stanja.
[0083] Takođe je prikazan glodar, ćelija glodara ili tkivo glodara kao što je ovde opisano za upotrebu u dobijanju i/ili razvoju leka za terapiju ili dijagnozu. Takođe je prikazana životinja glodar, ćelija glodara ili tkivo glodara kao što je opisano za dobijanje leka za lečenje, prevenciju ili ublažavanje bolesti, poremećaja ili stanja.
[0084] U nekim izvođenjima, obezbeđeni glodar je miš; u nekim izvođenjima, pacov. U mnogim izvođenjima, ćelija glodara je mišja ćelija; u nekim izvođenjima, ćelija pacova. U mnogim izvođenjima, ovde obezbeđeno tkivo glodara je tkivo miša; u nekim izvođenjima, tkivo pacova.
[0085] U nekim izvođenjima, 23-mer RSS obuhvata nukleotidnu sekvencu koja sadrži sekvencu koja je predstavljena u SEQ ID NO: 151.
KRATAK OPIS NACRTA
[0086] Ovde uključeni nacrti, koji se sastoje iz sledećih Slika, je samo za svrhu ilustracije a ne kao ograničenje.
Slika 1 prikazuje opštu ilustraciju, koja nije u srazmeri, izvođenja iz predmetnog pronalaska pokazuje uređeno sklapanje genskih segmenata u događaju DJ rekombinacije za segmente gena varijabilnog regiona teškog lanca imunoglobulina sa nemodifikovanim DHregionom (panel na vrhu) i modifikovanim DHregionom (panel na dnu).12-mer rekombinacione signalne sekvence (RSS) su predstavljene kao nepopunjeni trouglovi.23-mer RSS su prikazane kao trouglovi sa sa vertikalnim prugama. Ilustrativni nemodifikovani segmenti VHgena (nepopunjene kutije) i segmenti DHgena (popunjene kutije) redom su predstavljeni kao nepopunjene i popunjene kutije i obezbeđena im je generička nomenklatura korišćenjem slova alfabeta. Segmenti D gena (npr., DH3-3) operativno u vezi sa 23-mer RSS i nemodifikovani JHgenski segmenti su redom prikazani kao kutije popunjene sa horizontalnim prugama i nepopunjene kutije i obezbeđena je njihova odgovarajuća nomenklatura. Takođe je prikazan µ0 promotor (µ 0 pro). Nije prikazana rekombinacija VHgenskog segmenta sa rekombinovanim DJ genskim segmentom.
Slika 2 prikazuje ilustracije, nije u srazmeri, primera izvođenja vektora za ciljanje koji su dobijeni prema Primeru 1. Heš linije (eng. hash lines) predstavljaju segmente DHgena koji su uključeni u vektor za ciljanje ali nisu specifično prikazani.
Slika 3 pokazuje ilustraciju, nije u srazmeri, ne-ograničavajućeg primera izvođenja insertovanja vektora za ciljanje 23:DH3-3:12/JH6 u lokus varijabilnog regiona teškog lanca humanizovanog imunoglobulina u genom mišjih ES ćelija pomoću elektroporacije (EP). Heš linije predstavljaju segmente VHgena ili segmente DHgena koji su uključeni u lokus varijabilnog regiona teškog lanca ali nisu specifično prestavljeni.
Slika 4 pokazuje ilustraciju, nije u srazmeri, ne-ograničavajućeg primera izvođenja Creposredovane delecije selekcionih kaseta u lokusima teškog lanca humanizovanog imunoglobulina posle elektroporacije i integracije vektora za ciljanje 23:DH3-3:12/JH6 kao što je opisano u Primerima 1 i 2. Heš linije predstavljaju VHgenske segmente ili DHgenske segmente koji su uključeni u lokus varijabilnog regiona teškog lanca ali nisu specifično predstavljeni.
Slika 5 pokazuje ilustraciju, nije u srazmeri, ne-ograničavajućeg primera izvođenja insertovanja vektora za ciljanje 23:DH3-3:12/JH4-6 vektorom za ciljanje u lokus varijabilnog regiona teškog lanca humanizovanog imunoglobulina u genom mišjih ES ćelija preko elektroporacije (EP). Heš linije predstavljaju VHgenske segmente ili DHgenske segmente koji su uključeni u lokus varijabilnog regiona teškog lanca ali nisu specifično predstavljeni.
Slika 6 pokazuje ilustraciju, nije u srazmeri, ne-ograničavajućeg primera izvođenja Creposredovane delecije selekcionih kaseta u lokusima teškog lanca humanizovanog imunoglobulina posle elektroporacije i integracije vektora za ciljanje 23:DH3-3:12/JH4-6 kao što je opisano u Primerima 1 i 2. Heš linije predstavljaju VHgenske segmente ili DHgenske segmente koji su uključeni u lokus varijabilnog regiona teškog lanca ali nisu specifično predstavljeni.
Slika 7 pokazuje ilustraciju, nije u srazmeri, ne-ograničavajućeg primera izvođenja insertovanja vektora za ciljanje 12:DH2-2:23|12:DH2-8:23|12:DH2-15:23/JH1-6 u lokus varijabilnog regiona teškog lanca humanizovanog imunoglobulina u genom mišjih ES ćelija pomoću elektroporacije (EP). Heš linije predstavljaju VHgenske segmente ili DHgenske segmente koji su uključeni u lokus varijabilnog regiona teškog lanca ali nisu specifično prikazani. Popunjeni trouglovi predstavljaju pseudogene.
Slika 8 pokazuje ilustraciju, nije u srazmeri, primera ne-ograničavajućeg izvođenja Creposredovane delecije selekcionih kaseta u lokusu teškog lanca humanizovanog imunoglobulina nakon elektroporacije i integracije vektora za ciljanje 12:DH2-2:23|12:DH2-8:23|12:DH2-15:23 kao što je opisano u Primerima 1 i 2. Heš linije predstavljaju VHgenske segmente ili DHgenske segmente koji su uključeni u lokus varijabilnog regiona teškog lanca ali nisu specifično prikazani
Slika 9A pokazuje rezultate u vezi sa izvođenjem predmetnog pronalaska, grafički predstavljene procente (y-ose) očitavanja svih funkcionalnih imunoglobulina (Ig) koja su rezultat iz događaja DH-DHrekombinacije (panel na dnu) koja imaju CDR3 određene dužine aminokiselina (x-ose) izolovane iz životinja modifikovanih sa vektorom za ciljanje 12:DH2-2:23|12:DH2-8:23|12:DH2-15:23. "S1," "S2," i "S3" svaki predstavlja različitog eksperimentalnog miša.
Slika 9B pokazuje rezultate u vezi sa izvođenjem predmetnog pronalaska, grafički predstavljene procente (y-ose) očitavanja svih Ig koja su rezultat događaja DH-DHrekombinacije (panel na dnu)
2
koji imaju CDR3 određene dužine aminokiselina (x-ose) izolovanih iz životinja modifikovanih sa vektorom za ciljanje 12:DH2-2:23|12:DH2-8:23|12:DH2-15:23. "S1," "S2," i "S3" svaki predstavlja različitog eksperimentalnog miša.
Slika 10A pokazuje rezultate u vezi sa izvođenjem predmetnog pronalaska, grafički predstavljene procente (y-ose) očitavanja svih funkcionalnih imunoglobulina (Ig) koja su rezultat događaja DH-DHrekombinacije koji imaju CDR3 koji sadrži određeni broj cisteinskih ostataka (x-ose) izolovanih iz životinja modifikovanih da vektorom za ciljanje 12:DH2-2:23|12:DH2-8:23|12:DH2-15:23. "S1," "S2," i "S3" svaki predstavlja različitog eksperimentalnog miša.
Slika 10B pokazuje rezultate u vezi sa izvođenjem predmetnog pronalaska, grafički predstavljene procente (y-ose) očitavanja svih imunoglobulina (Ig) koja su rezultat događaja DH-DHrekombinacije koji imaju CDR3 koji sadrži određeni broj ostataka cisteina (x-ose) izolovanih iz životinja modifikovanih da vektorom za ciljanje 12:DH2-2:23|12:DH2-8:23|12:DH2-15:23. "S1," "S2," i "S3" svaki predstavlja različitog eksperimentalnog miša.
Slika 11 pokazuje rezultate u vezi sa izvođenjem predmetnog pronalaska, grafički predstavljenih titara antitela (y-osa) u pojedinačnim miševima koji imaju lokuse varijabilnog regiona teškog i κ lanca humanizovanog imunoglobulina (VI; videti, npr., U.S. Patent Nos. 8,697,940 i 8,642,835) i miševi modifikovani sa vektorom za ciljanje 23:DH3-3:12/JH6 kao što je ovde opisano (V(DD)J), od kojih su obe kohorte imunizovane sa imunogenom DNK koja kodira receptor kuplovan sa G proteinom (GPCR). Titri antitela su određivani sa vezivanjem MSD ćelija na 293 ćelije modifikovane da eksprimiraju GPCR (GPCR; x-ose) i na ćelijama koje ne eksprimiraju GPCR (kontrola; x-osa). Slika 12A pokazuje rezutate u vezi sa izvođenjem predmetnog pronalaska, pokazujući procenat (%; y-ose) preuređenih genskih sekvenci teškog lanca imunoglobulina VHDHJHi pretpostavljeno je da su genske sekvence rezultat VHDHA-DHBJHuređenja prema strogom kriterijumu predstavljenom u Tabeli 7 koje su izolovane iz kostne srži (BM) ili slezine miševa modifikovanih sa vektorom za ciljanje 23:DH3-3:12/JH6 i koji kodiraju teški lanac CDR3 (HCDR3) koji ima dužinu aminokiselina (AA) od 5 do 30 aminokiselina (x-ose). Brojevi ćelija BM i slezine nisu normalizovani jedan prema drugima. n=1.
Slika 12B pokazuje rezultate u vezi sa izvođenjem predmetnog pronalaska, pružajući uvećanje grafikona pokazanog na panelu Slike 12A. Brojevi ćelija BM i slezine nisu normalizovani jedan prema drugima. n=1.
Slika 12C pokazuje rezutate u vezi sa izvođenjem predmetnog pronalaska, pokazujući procenat očitavanja koji ima CDR3 veći od 21 aminokiselina u dužini i u koštanoj srži ili slezini miševa modifikovanih sa vektorom za ciljanje 23:DH3-3:12/JH6. Brojevi ćelija BM i slezine nisu normalizovani jedan prema drugima. n=1.
Slika 13 pokazuje rezultate u vezi sa izvođenjem predmetnog pronalaska, pokazujući procenat (%; y-ose) pretpostavljenih preuređenih genskih sekvenci teškog lanca imunoglobulina VHDHA-DHBJH(prema strogom kriterijumu datom u Tabeli 7) koje su izolovane iz kostne srži (BM) ili slezine miševa modifikovanih sa vektorom za ciljanje23:DH3-3:12/JH6 i koji kodiraju teški lanac CDR3 (HCDR3) koji ima dužinu aminokiselina (AA), od kojih su sve bile preko dužine 20 aminokiselina (x-ose). Brojevi ćelija BM i slezine nisu normalizovani jedan prema drugima. n=1.
DEFINICIJE
[0087] Uopšteno, terminologija je u skladu sa svojim značenjem koje se razume u oblasti tehnike, osim ukoliko nije jasno naznačeno drugačije. Eksplicitne definicije određenih izraza su obezbeđene ovde i u tekstu ispod; značenja ovih i drugih izraza u određenim slučajevima kroz ovu specifikaciju će biti jasna stručnjacima iz oblasti tehnike iz konteksta u kome se nalaze. Dodatne definicije za sledeće izraze i druge termine su predstavljene kroz specifikaciju.
[0088] Upotreba običnih termina kao što su "prvi," "drugi," "treći," itd., u zahtevima kako bi se modifikovao element zahteva samo po sebi ne znači bilo koji prioritet, prvenstvo, ili redosled jednog elementa zahteva u odnosu na drugi ili vremenski redosled po kome se radnje nekog postupka sprovode, ali su korišćeni samo kao oznake za razikovanje jednog elementa zahteva sa određenim imenom od drugog elementa koji ima isto ime (ali za upotrebu rednog termina) kako bi se razlikovali elementi zahteva.
[0089] Članovi jednine u specifikaciji i u zahtevima, osim ukoliko nisu jasno naznačeni drugačije, treba razumeti da uključuju množinu reference. Zahtevi ili opisi koji uključuju "ili" između jednog ili više članova u grupi smatraju se zadovoljenim ukoliko jedan, više od jednog, ili svaki od članova grupe se nalaze u, korišćeni su u, ili su na drugi način relevantni u datom proizvodu ili postupku osim ukoliko nije naznačeno suprotno ili je na drugi način očigledno iz konteksta. Pronalazak uključuje izvođenja u kojima tačno jedan član iz grupe se nalazi u, koristi se u, ili je na drugi način relevantan za dati proizvod ili postupak. Pronalazak takođe uključuje izvođenja u kojima više od jednog, ili čitava grupa članova se nalaze u, korišćeni su u, ili su na drugi način relevantni za dati proizvod ili postupak. Osim toga, treba razumeti da pronalazak obuhvata sve varijacije, kombinacije, i permutacije u kojima jedan ili više ograničenja, elemenata, klauzula, opisnih termina, itd., iz jednog ili više od navedenih zahteva je uveden u drugi zahtev koji je zavisan od istog osnovnog zahteva (ili, kao relevantnog, bilo kog drugog zahteva) osim ukoliko nije drugačije naznačeno ili osim ukoliko bi bilo očigledno stručnjaku iz oblasti tehnike da bi se pojavila kontradikcija ili nedoslednost. Gde su elementi predstavljeni kao liste, (npr., u Markush grupi ili sličnom formatu) treba razumeti da je svaka podgrupa elemenata je takođe prikazana, i bilo koji element(i) mogu biti uklonjeni iz grupe. Treba razumeti da, uopšteno, gde pronalazak, ili aspekti iz pronalaska, je/su naznačeni tako da obuhvataju određene elemente, karakteristike, itd., izvođenja iz pronalasla ili aspekti iz pronalaska sadrže, ili se u suštini sastoje iz, takvih elemenata, karakteristika, itd. Radi jednostavnosti ova izvođenja nisu u svakom slučaju posebno ovde posebno izložena u tako mnogo reči. Takođe treba razumeti da bilo koje izvođenje ili aspekt iz pronalaska može biti eksplicitno isključeno iz zahteva, bez obzira na to da li je specifično isključenje navedeno u specifikaciji.
[0090] Kao što je korišćeno u ovoj prijavi, termini "oko" i "približno" su korišćeni kao ekvivalenti. Bilo koji brojevi koji su korišćeni u ovoj prijavi sa ili bez oko/približno imaju za cilj da pokriju bilo koje normalne fluktuacije, npr., /-5%, što će proceniti stručnjak u relevantnoj oblasti tehnike.
[0091] Davanje: odnosi se na davanje kompozicije subjektu ili sistemu (npr., ćeliji, organu, tkivu, organizmu, ili relevantnoj komponenti ili skupu njegovih komponenti). Stručnjaci iz oblasti tehnike će razumeti da način davanja može da se razlikuje u zavisnosti od, na primer, subjekta ili sistema kome se kompozicija daje, prirode kompozicije, svrhe davanja, itd.
[0092] Na primer, u nekim izvođenjima, davanje subjektu životinji (npr., humanom biću ili glodaru) može biti bronhijalno (uključujući bronhijalnu instilaciju), bukalno, enteralno, intradermalno, intraarterijalno, intradermalno, intraželudačno, intramedularno, intramuskularno, intranazalno, intraperitonealno, intratekalno, intravenozno, intraventrikularno, mukozalno, nazalno, oralno, rektalno, subkutanozno, sublingvalno, lokalno, trahealno (uključujući intratrahealnu instilaciju),
2
transdermalno, vaginalno i/ili vitrealno. U nekim izvođenjima, davanje može uključiti povremeno doziranje. U nekim izvođenjima, davanje može uključiti kontinuirano doziranje (npr., perfuzija) bar za odabrani vremenski period. U nekim izvođenjima, antitelo koje je proizvedeno od strane ovde prikazanog glodara može se davati subjektu (npr., humanom subjektu ili glodaru). U nekim izvođenjima, farmaceutska kompozicija uključuje antitelo koje je proizvedeno od strane ovde prikazanog glodara. U nekim izvođenjima, farmaceutska kompozicija može uključiti pufer, razblaživač, ekscipijens, ili bilo koju njihovu kombinaciju. U nekim izvođenjima, farmaceutska kompozicija uključujući antitelo koje je proizvedeno od strane ovde prikazanog glodara može biti uključena u kontejner za skladištenje ili davanje, na primer bočica, špric (npr., IV špric), ili kesica (npr., IV kesica).
[0093] Biološki aktivan: odnosi se na karakteristiku bilo kojeg sredstva koje ima aktivnost u biološkom sistemu, in vitro ili in vivo (npr., u organizmu). Na primer, sredstvo koje, kada je prisutno u organizmu, ima biološki efekat unutar organizma je smatrano biološki aktivnim.
[0094] U posebnim izvođenjima gde je protein ili polipeptid biološki aktivna, deo tog proteina ili polipeptida koji daje bar jednu biološku aktivnost proteinu ili polipeptidu je obično naznačen sa "biološki aktivnim" delom.
[0095] Uporedivo: odnosi se na dva ili više sredstva, entiteta, situacija, skupova uslova, itd. koji ne moraju biti identični jedan sa drugim ali su dovoljno slični da bi se omogućilo poređenje između njih tako da se zaključci mogu razumno izvući na osnovu uočenih različitosti ili sličnosti. Osobe koje su uobičajeno verzirane u stanje tehnike će razumeti, u kontekstu, koji stepen identičnosti je neophodan u bilo kojoj datoj okolnosti za dva ili više takvih sredstava, entiteta, situacija, skupova uslova, itd. da bi se mogli smatrati uporedivim.
[0096] Konzervativni: odnosi se na konzervativnu supstituciju aminokiselina, tj., supstituciju aminokiselinskog ostatka sa drugim aminokiselinskim ostatkom koji ima R grupu u bočnom lancu sa sličnim hemijskim svojstvima (npr., naelektrisanje ili hidrofobnost). Generalno, konzervativna supstitucija aminokiselina neće suštinski promeniti funkcionalna svojstva od interesa kod proteina, na primer, sposobnost vezivanja receptora za ligand. Primeri grupa aminkiselina koje imaju bočne lance sa sličnim hemijskim svojstvima uključuju: alifatične bočne lance kao što su glicin, alanin, valin, leucin, i izoleucin; alifatične-hidroksil bočne lance kao što su serin i treonin; bočne lance koji sadrže amid kao što su asparagin i glutamin; aromatični bočni lanci kao što su fenilalanin, tirozin, i triptofan; bazni bočni lanci kao što su lizin, arginin, i histidin; kiseli bočni lanci kao što su asparaginska kiselina i glutaminska kiselina; i bočni lanci koji sadrže sumpor kao što su cistein i metionin. Konzervativne aminokiselinske supstitucione grupe uključuju, na primer, valin/leucin/izoleucin, fenilalanin/tirozin, lizin/arginin, alanin/valin, glutamat/aspartat, i asparagin/glutamin.
[0097] U nekim izvođenjima, konzervativna aminokiselinska supstitucija može biti supstitucija bilo kog nativnog ostatka u proteinu sa alaninom, kao što je korišćeno u, na primer, alanin skenirajućoj mutagenezi. U nekim izvođenjima, konzervativna supstitucija je dobijena tako da ima pozitivnu vrednost u matrici PAM250 log-verovatnoće prikazanoj u Gonnet, G. H. et al., 1992, Science 256:1443-1445. U nekim izvođenjima, supstitucija je umereno konzervativna supstitucija u kojoj supstitucija ima nenegativnu vrednost u matrici PAM250 log-verovatnoće.
[0098] Kontrola: odnosi na značenje koje se razume u oblasti tehnike za "kontrolu" kao standard sa kojim se rezultati porede. Uobičajeno, kontrole su korišćenje za povećanje integriteta u eksperimentima izolovanjem promenjivih da bi se dobio zaključak o takvim promenjivim. U nekim izvođenjima, kontrola je reakcija ili test koji se sprovodi istovremeno sa reakcijom koja se ispituje ili test da bi se obezbedio komparator. "Kontrola" se može odnositi na "kontrolnu životinju." "Kontrolna životinja" može imati modifikaciju kao što je ovde opisano, modifikacija koja je različita kao što je ovde
2
opisano, ili bez modifikacije (npr., životinja divljeg tipa). U jednom eksperimentu, "test" (tj., promenjiva koja se ispituje) je primenjen. U drugom eksperimentu, "kontrola," promenjiva koja se ispituje nije primenjena. Kontrola može biti pozitivna kontrola ili negativna kontrola.
[0099] U nekim izvođenjima, kontrola je istorijska kontrola (tj., ispitivanje ili test koji je prethodno sproveden, ili količina ili rezultat koji je prethodno poznat). U nekim izvođenjima, kontrola je ili obuhvata odštampan ili na drugačiji način sačuvan zapis.
[0100] Disrupcija: odnosi se na rezultat događaja homologne rekombinacije sa molekulom DNK (npr., sa endogenom homolognom sekvencom kao što je gen ili genski lokus).
[0101] U nekim izvođenjima, disrupcija može postići ili predstavljati inserciju, deleciju, supstituciju, zamenu, mutaciju pogrešnog smisla, ili promenu okvira sekvenc(i)e DNK, ili bilo koju njihovu kombinaciju. Insercije mogu uključiti inserciju čitavih gena, fragmenata gena, npr., egzoni, koji mogu biti drugog porekla u odnosu na krajemogenu sekvencu (npr., heterologna sekvenca), ili kodirajuće sekvence koje su izvedene iz ili izolovane iz određenog gena od interesa. U nekim izvođenjima, disrupcija može povećati ekspresiju i/ili aktivnost gena ili genskog proizvoda (npr., proteina kodiranog od strane gena). U nekim izvođenjima, disrupcija može smanjiti ekspresiju i/ili aktivnost gena ili genskog proizvoda. U nekim izvođenjima, disrupcija može izmeniti sekvencu gena ili kodiranog proizvoda gena (npr., kodirani protein). U nekim izvođenjima, distrupcija može izmeniti sekvencu hromozoma ili položaja hromozoma u genomu. U nekim izvođenjima, disrupcija može prekinuti ili fragment gena ili kodirani genski proizvod (npr., kodirani protein). U nekim izvođenjima, disrupcija može proširiti gen ili kodirani genski proizvod. U nekim takvim izvođenjima, disrupcija može postići sastavljanje fuzionog (spojenog) proteina. U nekim izvođenjima, distupcija može uticati na nivo, ali ne aktivnost, gena ili genskog proizvoda. U nekim izvođenjima, disrupcija može uticati na aktivnost, ali ne na nivo, gena ili genskog proizvoda. U nekim izvođenjima, disrupcija može nemati značajnog efekta na nivo gena ili genskog proizvoda. U nekim izvođenjima, disrupcija može nemati značajnog efekta na aktivnost gena ili genskog proizvoda. U nekim izvođenjima, disrupcija može nemati značajnog efekta na ili nivo ili na aktivnost gena ili genskog proizvoda. U nekim izvođenjima, značajan efekat se može izmeriti pomoću, npr., ali bez ograničenja na, Studentov T-test.
[0102] Endogeni lokus ili endogeni gen: odnosi se na genski lokus koji se nalazi u matičnom ili referentnom organizmu (ili ćeliji) pre uvođenja izmena, disrupcija, delecija, insercija, modifikacija, supstitucija ili zamena kao što je ovde opisano.
[0103] U nekim izvođenjima, endogeni lokus obuhvata sekvencu, u celosti li deo, koja se može naći u prirodi. U nekim izvođenjima, endogeni lokus je lokus divljeg tipa. U nekim izvođenjima, referentni organizam je organizam divljeg tipa. U nekim izvođenjima, referentni organizam je modifikovani organizam. U nekim izvođenjima, referentni organizam je laboratoriski gajeni organizam (bilo divljeg tipa ili modifikovani).
[0104] Endogeni promotor: odnosi se na promotor koji je prirodno povezan, npr., u organizmu divljeg tipa, sa endogenim genom ili genskim lokusom.
[0105] Modifikovani: odnosi se, uopšteno, na aspekt manuelnog manipulisanja od strane čoveka. Kao što je uobičajeno u praksi i jasno stručnjacima iz oblasti tehnike, potomstvo modifikovanog polinukleotida ili ćelije je obično i dalje označeno sa "modifikovani čak iako je stvarna manipulacija sprovedena na prethodnom entitetu. Dalje, kao što će biti jasno stručnjacima iz oblasti tehinke, različite metodologije su dostupne kroz koje se "modifikovanje" kao što je ovde opisano može postići.
2
[0106] U nekim izvođenjima, može se smatrati da je polinukleotid "modifikovan" kada dve ili više sekvenci koje nisu povezane zajedno tim redom u prirodi su manipulisane ručno od strane čoveka man da bi bile direktno spojene jedna sa drugom u modifikovanom polinukleotidu. U nekim izvođenjima, modifikovani polinukleotid može sadržati regulatornu sekvencu, koja se nalazi u prirodi u operativnoj vezi sa prvom kodirajućom sekvencom ali nije u operativnoj vezi sa drugom kodirajućom sekvencom, spojene ručno od strane čoveka tako da je operativno u vezi sa drugom kodirajućom sekvencom. U ovde navedenim izvođenjima modifikovanog DHgenskog segmenta, DHgenski segment je manipulisan ručno od strane čoveka da bude neposredno uz 23-mer RSS. U nekim izvođenjima DHgenski segment modifikovan da bude operativno u vezi sa 23-mer RSS je izveden iz drugog DHgenskog segmenta, npr., DHgenski segment operativno u vezi sa 23-mer RSS obuhvata nukleotidnu sekvencu koja je identična sa onom za drugi DHgenski segment ali za razlike usled degeneracije genetičnog koda i/ili zamene 12-mer RSS sa 23-mer RSS. Bilo koji drugi DHgenski segment i modifikovani DHgenski segment izveden iz njega (npr., DHgenski segment operativno u vezi sa 23-mer RSS) može se smatrati odgovarajućim genskim segmentima. Na primer humani DH3-3 genski segment operativno u vezi sa 23-mer RSS može se smatrati da odgovara DH3-3 genskom segmentu sa 12-mer RSS u odnosu na bočnu stranu i sa drugom 12-mer RSS u odnosu na drugu bočnu stranu, gde DH3-3 genski segment operativno u vezi sa 23-mer RSS i DH3-3 genski segment 12-mer RSS u odnosu na jednu bočnu stranu i 12-mer RSS u odnosu na drugu bočnu stranu dele identičnu nukleotidnu sekvencu izuzev razlika zbog degeneracije genetičkog koda i/ili zamene jedne od dve 12mer RSS sa 23-mer RSS. Alternativno, ili dodatno, u nekim izvođenjima, prve i druge sekvence nukleinskih kiselina gde svaka kodira polipeptidne elemente ili domene koji u prirodi nisu povezani jedni sa drugim mogu biti povezane jedna sa drugom u jednom modifikovanom polinukleotidu. Uporedivo, u nekim izvođenjima, ćelija ili organizam može se smatrati da je "modifikovana ″ ukoliko je manipulisana na način da je njegova genetička informacija izmenjena (npr., novi genetički materijal koji prethodno nije bio prisutan se uvodi, ili je prethodno prisutni genetički materijal izmenjen ili uklonjen).
[0107] U nekim izvođenjima, "modifikovanje" može uključiti selekciju ili dizajn (npr., nukleinskih kiselina, polipeptidnih sekvenci, ćelija, tkiva, i/ili organizama) preko upotrebe kompjuterskih sistema koji su programirani da izvode analizu ili poređenje, ili drugačije analiziraju, preporuče, i/ili selektuju sekvence, izmene, itd.). Alternativno, ili dodatno, u nekim izvođenjima, "modifikovanje" može uključiti upotrebu metodologija in vitro hemijske sinteze i/ili tehnologija rekombinantne nukleinske kiseline kao što su, na primer, na primer, umožavanje nukleinske kiseline (npr., pomoću reakcije lančanog umnožavanja) hibridizacije, mutacije, transformacije, transfekcije, itd., i/ili bilo koja od različitih metodologija sparivanja. Kao što će razumeti stručnjak iz oblasti tehnike, takve različite uspostavljene tehnike (npr., za rekombinantnu DNK, sintezu oligonukleotida, i kulturu tkiva i transformaciju (npr., electroporacija, lipofekcija, itd.) su dobro poznate u oblasti tehnike i opisane su u različitim opštim specifičnijim referencama koje su navedene i/ili razmotrene kroz predmetnu specifikaciju. Videti npr., Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989).
[0108] Gen: odnosi se na sekvencu DNK u hromozomu koja kodira za proizvod (npr., proizvod RNK pi/ili proizvod polipeptida). Za svrhu jasnoće, termin "gen" se generalno odnosi na deo nukleinske kiseline koja kodira polipeptid; termin može opciono obuhvatiti regulatorne sekvence, kao što će to biti jasno iz konteksta osobi koja je stručna iz oblasti tehnike. Ova definicija nije namenjena da isključi primenu termina "gen" na jedinice za ekspresiju koje ne kodiraju za protein već radije da pojasni, u većini slučajeva, termin kao što je korišćen u ovom dokumentu se odnosi na nukleinsku kiselinu koja kodira za polipeptid.
[0109] U nekim izvođenjima, gen uključuje kodirajuću sekvencu (tj., sekvencu koja kodira odgovarajući proizvod). U nekim izvođenjima, gen uključuje ne-kodirajuću sekvencu. U nekim izvođenjima, gen može uključiti obe kodirajuću (npr., egzonsku) i ne-kodirajuću (npr., intronsku) sekvencu. U nekim
2
izvođenjima, gen može uključiti jednu ili više regulatornih sekvenci (npr., promotori, pojačivači, itd.) i/ili intronske sekvence koje, na primer, mogu kontrolisati ili uticati na jedan ili više aspekata ekspresije gena (npr., ekspresija koja je specifična za ćelijski tip, inducibilna ekspresija, itd.).
[0110] Heterologni: odnosi se na sredstvo ili entitet iz različitog izvora. Na primer, kada je korišćen u referenci na polipeptid, gen, ili genski proizvod koji je prisutan u odgovarajućoj ćeliji ili organizmu, termin pojašnjava da je relevantni polipeptid ili njegov fragment, gen ili njegov fragment, ili genski proizvod ili njegov fragment: (1) ručno modifikovan od strane čoveka; (2) uveden u ćeliju ili organizam (ili njegov prekursor) ručno od strane čoveka (npr., pomoću genetičke modifikacije); i/ili (3) nije prirodno proizveden ili se ne nalazi u relevantnoj ćeliji ili organizmu (npr., relevantnom ćelijskom tipu ili tipu organizma). Drugi primer uključuje polipeptid ili njegov fragment, gen ili njegov fragment, ili genski proizvod ili njegov fragment koji se normalno nalazi u određenoj naivnoj ćeliji ili organizmu, ali je modifikovan, na primer, mutacijom ili postavljanjem pod kontrolu ne-prirodno povezanih, u nekim izvođenjima, ne-endogenih regulatornih elemenata (npr., promoter).
[0111] Ćelija domaćina: odnosi se na ćeliju u koju je uvedena heterologna (npr., egzogena) nukleinska kiselina ili protein. Stručnjaci će nakon čitanja ovog prikaza razumeti da se takvi termini odnose ne samo na određenu individualnu ćeliju, već da se takođe odnose na potomstvo takve ćelije. Zbog toga što se određene modifikacije mogu pojaviti u generacijama koje slede ili zbog mutacije ili uticaja iz okruženja, takvo potomstvo ne mora, u stvari, biti identično sa matičnom roditeljskom ćelijom, ali su i dalje obuhvaćeni obimom termina "ćelija domaćina".
[0112] U nekim izvođenjima, ćelija domaćia je ili obuhvata prokariotsku ili eukariotsku ćeliju. U nekim izvođenjima, ćelija domaćina je ili obuhvata sisarsku ćeliju. Generalno, ćelija domaćina je bilo koja ćelija koja je pogodna za primanje i/ili proizvodnju heterologne nukleinske kiseline ili proteina, bez obzira za carstvo života kojim je ćelija naznačena. Primeri ćelija uključuju one kod prokariota i eukariota (jedno ćelijske ili višećelijske), bakterijske ćelije (npr., sojeve Escherichia coli, Bacillus spp., Streptomyces spp., itd.), ćelija mikobakterija, ćelije gljiva, ćelije kvasaca (npr., Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris, Pichia methanolica, itd.), ćelije biljaka, ćelije insekata (npr., SF-9, SF-21, ćelija insekata koje su inficirane bakulovirusom, Trichoplusia ni, itd.), ćelije nehumanih životinja, humane ćelije, ili ćelijske fuzije kao što su, na primer, hibridomi ili kvadromi.
[0113] U nekim izvođenjima, ćelija je od humanog bića, majmuna, primata, hrčka, pacova, ili mišja ćelija. U nekim izvođenjima, ćelija je eukariotska i izabrana je iz sledećih ćelija: CHO (npr.,CHO K1, DXB-11 CHO, Veggie-CHO), COS (npr.,COS-7), ćelija mrežnjače, Vero, CV1, bubrega (npr., HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo205, HB 8065, HL-60, (npr., BHK21), Jurkat, Daudi, A431 (epidermalna), CV-1, U937, 3T3, L ćelija, C127 ćelija, SP2/0, NS-0, MMT 060562, Sertolijeva ćelija, BRL 3A ćelija, HT1080 ćelija, ćelija mijeloma, ćelija tumora, i ćelijska linija koja je izvedena iz prethodno pomenute ćelije. U nekim izvođenjima, ćelija sadrži jedan ili više virusnih gena, npr., ćelija mrežnjače koja eksprimira virusni gen (npr., PER.C6<®>ćelija). U nekim izvođenjima, ćelija domaćina je ili obuhvata izolovanu ćeliju. U nekim izvođenjima, ćelija domaćina je deo tkiva. U nekim izvođenjima, ćelija domaćina je deo organizma.
[0114] Humanizovani: odnosi se na molekul (npr., nukleinsku kiselinu, protein, itd.) koji je nehumanog porekla i za koji je deo zamenjen sa odgovarajućim delom odgovarajućeg humanog molekula na takav način da modifikovani (npr., humanizovani) molekul zadržava svoju biološku funkciju i/ili održava strukturu koja obavlja zadržanu biološku funkciju. Sa druge strane "humani" i slično obuhvata molekule koji imaju samo humano poreklo, npr., humani nukleotid ili protein koji se sastoji samo iz humanih nukleotidnih i aminokiselinskih sekvenci, redom. Termin "human(izovan)" je korišćen da pokaže da human(izovani) molekul može biti (a) humani molekul ili (b) humanizovani molekul.
2
[0115] Identitet: U vezi sa poređenjem sekvenci, odnosi se na identitet kao što je određeno sa brojnim različitim algoritmima koji su poznati u oblasti tehnike koji se mogu koristiti za merenje identiteta nukleotidne i/ili aminokiselinske sekvence.
[0116] U nekim izvođenjima, identiteti kao što je ovde opisano su određeni korišćenjem ClustalW v.
1.83 (sporog) poravnanja upotrebom “open gap penalty” od 10.0, “extend gap penalty “ od 0.1, i korišćenjem Gonnet matrice sličnosti (MACVECTOR™ 10.0.2, MacVector Inc., 2008).
[0117] In vitro: odnosi se na događaje koji se pojavljuju u veštačkom okruženju, npr., u test epruveti ili reakcionom sudu, u ćelijskoj kulturi, itd., pre nego unutar višećelijskog organizma.
[0118] In vivo: odnosi se na događaje koji se pojavljuju u višećelijskom organizmu, kao što je humana i/ili nehumana životinja. U kontekstu Sistema koji su zasnovani na ćeliji, termin se može koristiti da se odnosi na događaje koji se pojavljuju unutar žive ćelije (nasuprot, na primer, in vitro sistemima).
[0119] Izolovani: odnosi se na supstancu i/ili entitet koji je bio (1) odvojen od bar nekih komponenti sa kojima je bio povezan kada je inicijalno proizveden ( i/ili u eksperimentalnoj postavci), i/ili (2) dizajnirani, proizvedeni, pripremljeni, i/ili ručno dobijeni od strane čoveka. Izolovane supstance i/ili entiteti mogu biti razdvojeni od oko 10 ili više drugih komponenti sa kojima su početno bili povezani. U nekim izvođenjima, izolovana sredstva imaju čistoću bar oko 80% ili više. Supstanca je "čista" ukoliko je suštinski oslobođena od drugih komponenti. U nekim izvođenjima, kao što će biti jasno od strane stručnjaka iz oblasti tehnike, supstanca se može smatrati "izolovanom" ili čak "čistom", nakon što je kombinovana sa određenim drugim komponentama kao što su, na primer, jedan ili više nosača ili ekscipijenasa (npr., pufer, rastvarač, voda, itd.); u takvim izvođenjima, procenat izolovanja ili čistoća supstance je izračunata bez uključivanja takvih nosača ili ekscipijenasa.
[0120] Da bi se naveo jedan primer, u nekim izvođenjima, biološki polimer kao što je polipeptid ili polinukleotid koji se pojavljuje u prirodi se smatra "izolovanim" kada: (a) na osnovu svog porekla ili izvora iz kog proističe nije povezan sa nekim ili svim od komponenata koje su pridružene u njegovom nativnom stanju u prirodi; (b) suštinski je oslobođen od drugih polipeptida ili nukleinskih kiselina iz istih vrsta od vrsta koje ga proizvode u prirodi; ili (c) eksprimiran je od ili je na drugi način u vezi sa komponentama ćelije ili drugim sistemom za ekspresiju koji nije od vrsta koje ga proizvode u prirodi. Prema tome, na primer, u nekim izvođenjima, smatra se da polipeptid koji je hemijski sintetisan ili je sintetisan u ćelijskom sistemu koji je različit od onog koji ga proizvodi u prirodi je "izolovani" polipeptid. Alternativno, ili dodatno, u nekim izvođenjima, polipeptid koji je bio izložen jednoj ili više tehhika prečišćavanja može se smatrati "izolovanim" polipeptidom u obimu u kome je bio odvojen od drugih komponenata: a) sa kojima je povezan u prirodi; i/ili b) sa kojima je bio u vezi kada je inicijalno proizveden.
[0121] Nehumana životinja: odnosi se na bilo koji organizam kičmenjaka koji nije humano biće.
[0122] Nehumana životinja može biti ciklostom, riba sa koštanim skeletom, riba sa hrskavičavim skeletom (npr., ajkula ili raža), vodozemac, reptil, sisar, i ptica. U nekim izvođenjima, nehumani sisar je primat, koza, ovca, svinja, pas, krava, ili glodar. Nehumana životinja iz predmetng pronalaska je glodar. U nekim izvođenjima, glodar je pacov ili miš.
[0123] Nukleinska kiselina: u svom najširem smislu, odnosi se na bilo koje jedinjenje i/ili supstancu koja je ili može biti uključena u oligonukleotidni lanac i generalno je zamenjiva sa molekulom nukleinske kiseline, sekvencom nukleinske kiseline, nukleotidnim molekulom, nukleotidnim molekulom, gde su termini takođe zamenjivi jedan sa drugim.
[0124] U nekim izvođenjima, "nukleinska kiselina″ je jedinjenje i/ili supstanca koja je ili može biti uključena u oligonukleotidni lanac pomoću fosfodiestarske veze. Kao što će biti jasno iz konteksta, u nekim izvođenjima, "nukleinska kiselina″ odnosi se na individualne ostatke nukleinske kiseline (npr., nukleotide i/ili nukleozide); U nekim izvođenjima, "nukleinska kiselina″ se odnosi na oligonukleotidni lanac koji sadrži individualne ostatke nukleinske kiseline. U nekim izvođenjima, "nukleinska kiselina″ je ili obuhvata RNK; U nekim izvođenjima, "nukleinska kiselina″ je ili obuhvata DNK. U nekim izvođenjima, "nukleinska kiselina″ je, obuhvata, ili se sastoji iz jednog ili više prirodnih ostataka nukelinske kiseline. U nekim izvođenjima, " nukleinska kiselina ″ je, obuhvata, ili se sastoji iz jednog ili više analoga nukleinske kiseline. U nekim izvođenjima, analog nukleinske kiseline se razlikuje od "nukleinske kiseline″ po tome što ne koristi fosfodiestarsku okosnicu. Na primer, u nekim izvođenjima, "nukleinska kiselina″ je, obuhvata, ili se sastoji iz jedne ili više "peptidih nukleinskih kiselina", koje su poznate u oblasti tehnike i imaju peptidne veze umesto diestarskih veza u okosnici, uzete su u razmatranje obimom predmetnog pronalaska. Alternativno, ili dodatno, u nekim izvođenjima, "nukleinska kiselina″ ima jednu ili više fosfotioatnih i/ili 5’-N-fosforamiditnih veza radije fosfodiestarskih veza. U nekim izvođenjima, "nukleinska kiselina″ je, obuhvata, ili se sastoji iz jednog ili više prirodnih nukleozida (npr., adenozin, timidin, guanozin, citidin, uridin, deoksiadenozin, deoksitimidin, deoksiguanozin, i deoksicitidin). U nekim izvođenjima, "nukleinska kiselina″ je, obuhvata, ili se sastoji iz jednog ili više analoga nukleozida (npr., 2-aminoadenozin, 2-tiotimidin, inozin, pirolo-pirimidin, 3-metil adenozin, 5-metilcitidin, C-5 propinil-citidin, C-5 propinil-uridin, 2-aminoadenozin, C5-bromouridin, C5-fluorouridin, C5-jodouridin, C5-propinil-uridin, C5-propinilcitidin, C5-metilcitidin, 2-aminoadenozin, 7-deazaadenozin, 7-deazaguanozin, 8-oksoadenozin, 8-oksoguanozin, O(6)-metilguanin, 2-tiocitidin, metilovane baze, interkalirajuće baze, i njihova kombinacija). U nekim izvođenjima, "nukleinska kiselina″ sadrži jedan ili više modifikovanih šećera (npr., 2’-fluororibozu, ribozu, 2’-deoksiribozu, arabinozu, i heksozu) u poređenju sa onima u prirodnim nukleinskim kiselinama. U nekim izvođenjima, "nukleinska kiselina ″ ima nukleotidnu sekvencu koja kodira funkcionalnu genski proizvod kao što je RNK ili protein. U nekim izvođenjima, "nukleinska kiselina″ ima nukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptidni fragment (npr., peptid). U nekim izvođenjima, "nukleinska kiselina″ uključuje jedan ili više introna. U nekim izvođenjima, " nukleinska kiselina ″ uključuje jedan ili više egzona. U nekim izvođenjima, "nukleinska kiselina″ uključuje jednu ili više kodirajućih sekvenci. U nekim izvođenjima, "nukleinska kiselina ″ je dobijena sa jednim ili više izolovanja iz prirodnog izvora, enzimskom sintezom polimerizacijom koja je zasnovana na komplementarnoj matrici (in vivo ili in vitro), reprodukovanjem u rekombinantnoj ćeliji ili sistemu, i hemijskom sintezom. U nekim izvođenjima, "nukleinska kiseiina″ je 3 ili više ostataka dužine. U nekim izvođenjima, "nukleinska kiselina″ je jednolančana; U nekim izvođenjima, "nukleinska kiselina″ je dvolančana. U nekim izvođenjima, "nukleinska kiselina″ sadrži nukleotidnu sekvencu koja se sastoji iz bar jednog elementa koji kodira, ili je komplement nukleotidne sekvence koja kodira, polipeptid ili njegov fragment. U nekim izvođenjima, "nukleinska kiselina″ ima enzimsku aktivnost.
[0125] Operativno u vezi : odnosi se na suprostavljanje gde su opisane komponente u vezi koja im dozvoljava da funkcionišu na predviđeni način.
[0126] U nekim izvođenjima, operativno vezane nukleotidne sekvence su susedne jedna sa drugom, npr., sekvenca nukleinske kiseline koja sadrži genski segment imunoglobulina operativno u vezi sa RSS obuhvata nukleotidnu sekvencu genskog segmenta imunoglobulina susedno sa RSS nukleotidnom sekvencom, npr., genski segment imunoglobulina je bar na jednoj strani (npr.,abuts) sa RSS nukleotidnom sekvnom bočno u odnosu na stranu na susedan način tako da je genski segment imunoglobulina is neposredno uz RSS nukleotidnu sekvencu.
[0127] U drugim izvođenjima, operativna veza ne zahteva susednost. Na primer, neuređeni varijabilni regioni genskih segmenata "operativno u vezi " jedan sa drugim sposobni su za uređenje da bu se obrazovao preuređeni varijabilni region gena, pri čemu neuređeni varijabilni regioni genskih
1
segmenata ne moraju biti susedni jedan u odnosu na drugi. Neuređeni varijabilni region genskih segmenata operativno u vezi jedan sa drugim i sa susednim konstantnim regionom gena su sposobni za uređenje da bi se obrazovao preuređeni varijabilni region gena koji je eksprimiran zajedno sa konstantnim regionom gena kao polipeptidni lanac antigen vezujućeg protena. Kontrolna sekvenca "operativno vezana" sa kodirajućom sekvencom je spojena na takav način da se ekspresija kodirajuće sekvence postiže pod uslovima koji su kompatibilni sa kontrolnim sekvencama. "Operativno vezane" sekvence uključuju i sekvence za ekspresiju i kontrolne sekvence koje su susuedne u odnosu na gen od interesa i ekspresione kontrolne sekvence koje deluju “in trans” na daljinu da bi kontrolisale gen od interesa.
[0128] Termin "ekspresija kontrolne sekvence", se odnosi na polinukleotidne sekvence, koje su neophodne da utiču na ekspresiju i obradu kodirajućih sekvenci za koje su vezane. "Ekspresione kontrolne sekvence" uključuju: odgovarajuće sekvence za inicijaciju trаnskripcije, terminaciju, promotor i sekvence pojačivača; efikasne signale za obradu RNK kao što su signali za spajanje i poliadenilaciju; sekvence koje stabilizuju iRNK u citoplazmi; sekvence koje pojačavaju efikasnost translacije (tj., Kozak konsenzusna sekvenca); sekvence koje pojačavaju stabilnost proteina; i kada je potrebno, sekvence koje pojačavaju lučenje proteina. Priroda takvih kontrolnih sekvenci razlikuje se u zavisnosti od domaćina organizma. Na primer, kod prokariota, takve kontrolne sekvence generalno uključuju promotor, mesto vezivanja ribozoma i sekvencu za terminaciju transkripcije, dok kod eukariota obično, takve kontrolne sekvence uključuju promotore i sekvencu za terminaciju transkripcije. Termin "kontrolne sekvence" je namenjen da uključi komponente čije prisustvo je esencijalno za ekspresiju i obradu i može takođe uključiti dodatne komponente čije je prisustvo prednost, na primer, vodeće sekvence i sekvence fuzionog partnera.
[0129] Generalno, svaki neuređeni V genski segment imunoglobulina, D genski segment, ili J genski segment je operativno u vezi sa (npr., pobezan sa, bočno u odnosu na jednu ili obe strane sa, susedno sa, itd.) rekombinacionom signalnom sekvencom (RSS), koja može biti tipa 12-mer RSS ili 23-mer RSS. Bilo koji genski segment sa RSS bočno u odnosu na svaku stranu (uključujući DHgenski segment operativno u vezi sa 23-mer RSS) nije prošao kroz rekombinaciju, i prema tome, može se smatrati "neuređenim" genskim segmentom. U nekim izvođenjima, neuređeni genski segment ovde može sadržati genski segment u njegovoj germinativnoj (npr., divlji tip) konfiguraciji, npr., germinativni VHgenski segment i germinativni JHgenski segment je svaki sa 23-mer RSS bočno u odnosu na obe strane. Suprotno tome, germinativni DHgenski segment, npr., neuređeni DHgenski segment, je svaki sa 12-mer RSS bočno u odnosu na obe strane. DHgenski segment operativno u vezi sa 23-mer RSS, npr., modifikovani DHgenski segment, takođe nije prošao kroz rekombinaciju, i prema tome, obuhvata (i) 23-mer RSS i (ii) 12-mer RSS. Modifikovani DHgenski segment (npr., DHgenski segment operativno u vezi sa 23-mer RSS) je sposoban za uređenje sa drugim DHgenskim segmentom operativno u vezi m sa 12-mer RSS u skladu sa 12/23 pravilom rekombinacije.
[0130] Fiziološki uslovi: ima svoje značenje u oblasti tehnike koje se odnosi na referentne uslove pod kojima ćelije ili organizmi žive i/ili se reprodukuju. U nekim izvođenjima, termin se odnosi na uslove spoljneg ili unutrašnjeg miljea koji se mogu pojaviti u prirodi za organizam ili ćelijski sistem. U nekim izvođenjima, fiziološki uslovi su oni uslovi koji se nalaze u telu humane ili nehumane životinje, naročito oni uslovi koji se nalaze na i/ili unutar hirurškog mesta. Fiziološki uslovi obično uključuju, npr., temperaturni opseg od 20-40°C, atmosferski pritisak od 1, pH 6-8, koncentraciju glukoze od 1-20 mM, koncentraciju kiseonika na atmosferskim nivoima, i gravitaciju kakva se sreće na zemlji. U nekim izvođenjima, uslovi u laboratoriji su manipulisani i/ili održavani na fiziološkim uslovima. U nekim izvođenjima, fiziološki uslovi se susreću u organizmu (npr., nehumanoj životinji).
2
[0131] Polipeptid: odnosi se na polimerni lanac aminokiselina.
[0132] U nekim izvođenjima, polipeptid ima aminokiselinsku sekvencu koja se pojavljuje u prirodi. U nekim izvođenjima, polipeptid ima aminokiselinsku sekvencu koja se ne pojavljuje u prirodi. U nekim izvođenjima, polipeptid ima aminokiselinsku sekvencu koja sadrži delove koji se pojavljuju u prirodi odvojeno jedan od drugog (tj., od dva ili više različita organizma, na primer, human i nehumani delovi). U nekim izvođenjima, polipeptid ima aminokiselinsku sekvencu koja je modifikovana u tome što je dizajnirana i/ili proizvena dejstvom ruke čoveka. U nekim izvođenjima, polipeptid može sadržati ili se sastojati iz mnoštva fragmenata, od koji se svaki nalazi u istom matičnom polipeptidu u različitom prostornom uređenju relativno jedan u odnosu na drugi koji je pronađen u polipeptidu od interesa (npr., fragmenti su direktno povezani u matičnom mogu biti prostorno razdvojeni u polipeptidu od interesa ili obrnuto, i/ili fragmenti se mogu nalaziti u različitom redosledu u polipeptidu od interesa u odnosu na matični), tako da je polipeptid od interesa derivat njegovog matičnog polipeptida.
[0133] Rekombinant: odnosi se na polipeptide koji su dizajnirani, modifikovani, pripremljeni, eksprimirani, kreirani ili izolovani sa rekombinantnim načinima, kao što su polipeptidi koji su eksprimirani korišćenjem rekombinantnog ekspresionog vektora transfektovanog u ćeliju domaćina, polipeptidi koji su izolovani iz rekombinantne, kombinatorne biblioteke humanih polinukleotida (Hoogenboom H. R., 1997 TIB Tech.15:62-70; Hoogenboom H., i Chames P., 2000, Immunology Today 21:371-378; Azzazy H., i Highsmith W. E., 2002, Clin. Biochem.35:425-445; Gavilondo J. V., i Larrick J. W., 2002, BioTechniques 29:128-145), antitela izolovana iz životinje (npr., miša) koji je transgen za humane imunoglobulinske gene (videti npr.,Taylor, L. D., et al., 1992, Nucl. Acids Res.20:6287-6295; Little M. et al., 2000, Immunology Today 21:364-370; Kellermann S. A. and Green L. L., 2002, Current Opinion in Biotechnology 13:593-597; Murphy, A.J., et al., 2014, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.
111(14):5153-5158) ili polipeptidi koji su pripremljeni, eksprimirani, kreirani ili izolovani pomoću drugih načina koji uključuju spajanje odabranih elemenata sekvenci jedan sa drugim.
[0134] U nekim izvođenjima, jedan ili više takvih odabranih elemenata sekvenci se nalazi u prirodi. U nekim izvođenjima, jedan ili više takvih odabranih elemenata sekvenci je dizaniran in silico. U nekim izvođenjima, jedan ili više takvih odabranih elemenata sekvenci je rezultat mutageneze (npr., in vivo ili in vitro) poznate sekvence elementa, npr., iz prirodnog ili sintetičkog izvora. Na primer, u nekim izvođenjima, rekombinantni polipeptid obuhvata sekvence koje se mogu naći u genomu (ili polipeptidu) iz izvora organizma od interesa (npr., čovek, miš, itd.). U nekim izvođenjima, rekombinantni polipeptid obuhvata sekvence koje se pojavljuju u prirodi odvojeno jedna od druge (tj., od dva ili više različitih organizama, na primer, humani i nehumani delovi) u dva različita organizma (npr., humani i nehumani organizam). U nekim izvođenjima, rekombinantni polipeptid ima aminokiselinsku sekvencu koja je rezultat mutageneze (npr., in vitro ili in vivo, na primer u nehumanoj životinji), tako da aminokiselinske sekvence rekombinantnih polipeptida su sekvence koje, iako potiču od i povezane su sa polipeptidnim sekvencama, ne moraju postojati u prirodi unutar genoma nehumane životinje in vivo.
[0135] Referentni: odnosi se na standard ili kontrolno sredstvo, životinju, kohortu, individuu, populaciju, uzorak, sekvencu ili vrednost protiv koje je sredstvo, životinja, kohorta, individua, populacija, uzorak, sekvenca ili vrednost od interesa upoređena. "Referentni" se može odnositi na "referentnu životinju". "Referentna životinja" može imati modifikaciju kao što je ovde opisano, modifikacija koja je različita kao što je ovde opisano ili biti bez modifikacije (tj., životinja divljeg tipa). Obično, kao što će razumeti stručnjak iz oblasti tehnike, referentno sredstvo, životinja, kohorta, individua, populacija, uzorak, sekvenca ili vrednost je određena ili karakterisana pod uslovima koji su uporedivi sa onima koji se koriste za određivanje ili karakterisanje sredstva, životinje (npr., sisara), kohorta, individue, populacije, uzorka, sekvence ili vrednosti od interesa.
[0136] U nekim izvođenjima, referentno sredstvo, životinja, kohorta, individua, populacija, uzorak, sekvenca ili vrednost je ispitana i/ili određena u suštini istovremeno sa ispitivanjem ili određivanjem sredstva, životinja, kohorta, individue, populacije, uzorka, sekvence ili vrednosti od interesa. U nekim izvođenjima, referentno sredstvo, životinja, kohorta, individua, populacija, uzorak, sekvenca ili vrednost je istorijska refenca, opciono oličena u vidljivom medijumu. U nekim izvođenjima, referenca se može odnositi na kontrolu.
[0137] Suštinski: odnosi se na kvalitativni uslov ispoljavanja ukupnog ili blizu ukupnog obima ili stepena karakteristika ili svojstava od interesa. Stručnjak iz biološke oblasti će razumeti da biološki i hemijski fenomeni retko, ukoliko ikada, idu do završetka i/ili nastavljaju do kompletnosti ili da se postigne ili izbegne apsolutni rezultat. Termin "suštinski" je prema tome korišćen da bi se uhvatio potencijalni nedostatak kompletnosti koji je svojstven u mnogim biološkim i hemijskim fenomenima.
[0138] Suštinska homologija: odnosi se na poređenje između dve sekvence aminokiselina ili nukleinskih kiselina. Kao što će biti jasno stručnjaku iz oblasti tehnike, dve sekvence se generalno smatraju "suštinski homolognim" ukoliko one sadrže homologne ostatke u odogovarajućim pozicijama. Homologni ostaci mogu biti identični ostaci. Alternativno, homologni ostaci mogu biti neidentični ostaci sa odgovarajućim sličnim strukturalnim i/ili funkcionalnim karakteristima. Na primer, kao što je dobro poznato stručnjacima iz oblasti tehnike, određene aminokiseline se obično klasifikuju kao "hidrofobne" ili "hidrofilne" aminokiseline, i/ili tako da imaju "polarne" ili "ne-polarne" bočne lance. Supstitucija jedne aminokiseline sa drugom istog tipa može se često smatrati "homolognom" supstitucijom. Uobičajene kategorije aminokiselina su date pregledom u tekstu ispod:
Alanin Ala A Nepolarna Neutralna 1.8
Arginin Arg R Polarna Pozitivna -4.5
Asparagin Asn N Polarna Neutralna -3.5
Asparaginska Asp D Polarna Negativna -3.5
kiselina
Cistein Cys C Nepolarna Neutralna 2.5
Glutaminska Glu E Polarna Negativna -3.5
kiselina
Glutamin Gln Q Polarna Neutralna -3.5
Glicin Gly G Nepolarna Neutralna -0.4
Histidin His H Polarna Pozitivna -3.2
Izoleucin Ile I Nepolarna Neutralna 4.5
Leucin Leu L Nepolarna Neutralna 3.8
Lizin Lys K Polarna Pozitivna -3.9
Metionin Met M Nepolar Neutralna 1.9
Fenilalanin Phe F Nepolarna Neutralna 2.8
Prolin Pro P Nepolarna Neutralna -1.6
Serin Ser S Polarna Neutralna -0.8
Treonin Thr T Polarna Neutralna -0.7
Triptofan Trp W Nepolarna Neutralna -0.9
Tirozin Tyr Y Polarna Neutralna -1.3
Valin Val V Nepolarna Neutralna 4.2
Neodređene aminokiseline 3-Slova 1-Slovo
Asparagin ili asparaginska kiselina Asx B
Glutamin ili glutaminska kiselina Glx Z
Leucin ili Izoleucin Xle J
Nedefinisana ili nepoznata Xaa X
aminokiselina
4
[0139] Kao što je dobro poznato u oblasti tehnike, sekvence aminokiselina i nukleinskih kiselina mogu se uporediti korišćenjem bilo kog od različitih algoritama, uključujući one koji su dostupni u komercijalnim kompjuterskim programima kao što su BLASTN za nukleotidne sekvence i BLASTP, “gapped” BLAST, i PSI-BLAST za aminokiselinske sekvence. Primeri takvih programa su opisani u Altschul, S. F. et al., 1990, J. Mol. Biol., 215(3): 403-410; Altschul, S. F. et al., 1996, Methods in Enzymol.
266:460-80; Altschul, S. F. et al., 1997, Nucleic Acids Res., 25:3389-402; Baxevanis, A.D., and B. F. F. Ouellette (eds.) Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley, 1998; and Misener et al. (eds.) Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol.
132), Humana Press, 1998. Pored identifikovanja homolognih sekvenci, gore pomenuti programi obično obezbeđuju indikaciju stepena homologije.
[0140] U nekim izvođenjima, dve sekvence se smatraju suštinski homolognim ukoliko bar 95% ili više njihovih odgovarajućih ostataka homologno na relevantnom region ostataka. U nekim izvođenjima, relevantni region je kompletna sekvenca. U nekim izvođenjima, relevantni region je bar 9 ili više ostataka. U nekim izvođenjima, relevantni region uključuje susedne ostatke duž kompletne sekvence. U nekim izvođenjima, relevantni region uključuje nesusedne ostatke duž kompletne sekvence, na primer, nesusedni ostaci koji su dovedeni zajedno u savijenoj konformaciji polipeptida ili njegovog dela. U nekim izvođenjima, relevantni region je bar 10 ili više ostaka.
[0141] Suštinski identitet: odnosi se na poređenje između aminokiselinskih ili sekvenci nukleinskih kiselna. Kao što će biti jasno osobi koja je uobičajeno verzirana u stanje tehnike, dve sekvence su generalno smatrane "suštinski identičnim" ukoliko one sadrže identične ostatke u odgovarajućim položajima. Kao što je dobro poznato u ovoj oblasti tehnike, aminokiselinske ili sekvence nukleinskih kiselina mogu biti upoređene uporebom bilo kojih različitih algoritama, uključujući one koji su dostupni u komercijalnim kompjuterskim programima kao što je BLASTN za nukleotidne sekvence i BLASTP, “gapped” BLAST, i PSI-BLAST za aminokiselinske sekvence. Primeri takvih programa su opisani u Altschul, S. F. et al., 1990, J. Mol. Biol., 215(3): 403-410; Altschul, S. F. et al., 1996, Methods in Enzymol. 266:460-80; Altschul, S. F. et al., 1997, Nucleic Acids Res., 25:3389-3402; Baxevanis, A.D., and B. F. F. Ouellette (eds.) Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley, 1998; and Misener et al. (eds.) Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol. 132), Humana Press, 1998. Pored indentifikacije identičnih sekvenci, gore pomenuti programi obično daju oznaku stepena identiteta.
[0142] U nekim izvođenjima, smatra se da su dve sekvence suštinski identične ukoliko je bar 95% ili više njihovih odgovarajućih ostataka identično na relevantnom delu ostataka. U nekim izvođenjima, relevantni deo je potpuna sekvenca. U nekim izvođenjima, relevantni deo je bar 10 ili više ostataka.
[0143] Vektor za ciljanje ili ciljajući konstrukt: odnosi se na polinukleotidni molekul koji obuhvata ciljajući region. Ciljajući region obuhvata sekvencu koja je identična ili u suštini identična sa sekvencom u ciljnoj ćeliji, tkivu ili životinji i obezbeđuje za integraciju ciljajućeg kontrukta u poziciju unutar genoma ćelije, tkiva ili životinje preko homologne rekombinacije. Takođe su uključeni ciljajući regioni koji ciljaju korišćenjem specifičnih za mesto rekombinaznih mesta za prepoznavanje (npr., loxP ili Frt mesta).
[0144] U nekim izvođenjima, ciljni konstrukt kao što je ovde opisano dalje obuhvata nukleinsku sekvencu ili gen od posebnog interesa, selektabilni marker, kontrolne ili regulatorne sekvence, i druge sekvence nukleinskih kiselina koje omogućuju rekombinaciju posredovanu preko egzogenog dodavanja proteina koji pomažu u ili olakšavaju rekombinaciju koja uključuje takve sekvence. U nekim izvođenjima, ciljni konstrukt kao što je ovde opisano dalje obuhvata gen od interesa u celosti ili deo, gde je gen od interesa heterologni gen koji kodira polipeptid, u celosti ili deo, koji ima sličnu funkciju kao protein koji je kodiran endogenom sekvencom. U nekim izvođenjima, ciljni konstrukt kao što je ovde opisano dalje obuhvata humanizovani gen od interesa, u celosti ili deo, gde humanizovani gen od interesa kodira polipeptid, u celosti ili deo, koji ima sličnu funkciju kao polipeptid koji je kodiran od strane endogene sekvence. U nekim izvođenjima, ciljni konstrukt (ili vektor za ciljanje) mogu sadržati sekvencu nukleinske kiseline koja je ručno manipulisana od strane čoveka. Na primer, u nekim izvođenjima, ciljni konstrukt (ili vektor za ciljanje) može biti konstruisan da sadrži modifikovani ili rekombinantni polinukleotid koji sadrži dve ili više sekvenci koje nisu spojene zajedno tim redosledom u prirodi već su manipulisane ručno od strane čoveka da budu direktno spojene jedna sa drugom u modifikovanom ili rekombinantnom polinukleotidu.
[0145] Transgen ili konstrukt transgena: odnosi se na sekvencu nukleinske kiseline (kodiranjem npr., polipeptida od interesa, u celosti ili deo) koja je uvedena u ćeliju rukom čoveka kao što je korišćenjem ovde opisanih postupaka. Transgen može biti delom ili u celosti heterologan, tj., strani, prema transgenoj životinji ili ćeliji u koju je uveden. Transgen može uključiti jednu ili više regulatornih sekvenci transkripcije i bilo koja druga nukleinska kiselina, kao što su introni ili promotori, koji mogu biti potrebni za ekspresiju odabrane sekvence nukleinske kiseline. Transgen može uključiti jedan ili više selektabilnih markera koji omogućavaju za naknadnu selekciju potomstva (npr., ćelije) koje su unele transgen.
[0146] Transgena životinja, transgena nehumana životinja ili Tg<+>: su ovde korišćeni naizmenično i odnose se na bilo koju ne-prirodnu koja se pojavljuje nehumanu životinju gde je jedna ili više od ćelija nehumane životinje sadrži heterolognu nukleinsku kiselinu i/ili gen koji kodira polipeptid od interesa, u celosti ili deo. Nehumana životinja iz predmetnog pronalaska je glodar.
[0147] U nekim izvođenjima, heterologna sekvenca nukleinske kiseline i/ili gen je uvedena u ćeliju, direktno ili indirektno uvođenjem u prekursorsku ćeliju, putem namerne genetske manipulacije, kao što je mikroinjekciom ili infekcijom sa rekombinantnim virusom. Termin genetska manipulacija ne uključuje klasične tehnike uzgoja, već je pre usmerena na uvođenje rekombinantnog DNK molekul(a). Ovaj molekul može biti integrisan u hromozom, ili može biti DNK koja se replicira ekstrahromozomalno. Termin "Tg<+>" uključuje životinje koje su heterozigoti ili homozigoti za heterolognu nukleinsku kiselinu i/ili gen, i/ili životinje koje imaju pojedinačne ili višestruke kopije heterologne nukleinske kiseline i/ili gena.
[0148] Vektor: odnosi se na molekul nukleinske kiseline koji je sposoban za transport druge nukleinske kiseline sa kojom je povezan.
[0149] U nekom izvođenju, vektori su sposobni za ekstrahromozomsku replikaciju i/ili ekspresiju nukleinskih kiselina za koje su vezani u ćeliji domaćina kao što je eukariotska i/ili prokariotska ćelija. Vektori koji su sposobni da usmeravaju ekspresiju operativno u vezi gena ovde su naznačeni sa "ekspresioni vektori."
[0150] Divlji tip: ima svoje značenje koje je jasno u oblasti tehnike koje se odnosi na entitet koji ima strukturu i/ili aktivnost kao se može naći u prirodi u "normalnom" (u suprotnosti sa mutantnim, bolesnim, modifikovanim, izmenjenim, itd.) stanjem ili kontekstom. Osobe koje su stručne iz oblasti tehnike će razumeti da se divlji tip gena i polipeptida često može naći u brojnim različitim oblicima (npr., aleli).
[0151] [Obrisano].
DETALJNI OPIS
[0152] Predmetni pronalazak obezbeđuje između ostalih stvari, transgene ili modifkovane glodare koji imaju heterologni genetički materijal koji kodira jedan ili više delova (funkcionalnih fragmenata, vezujućih delova, itd.) humanih imunoglobulina, gde je heterologni genetički materijal insertovan u lokus varijabilnog regiona teškog lanca imunoglobulina tako da heterologni genetički materijal je operativno u vezi sa konstantnim genima (CH) teškog lanca. Razmatra se da takvi glodari ispoljavaju kapacitet da generišu antitela koja su kodirana sa uređenim V(DD)J sekvencama. Takođe se razmatra da takvi glodari ispoljavaju populaciju antitela koja se karakteriše varijabilnim regionima teškog lanca koji imaju povećanje u raznolikosti CDR3 u poređenju sa populacijom antitela koja ima raznolikost varijabilnog CDR3 teškog lanca imunoglobulina koja je generisana iz divljeg tipa lokusa varijabilnog regiona teškog lanca imunoglobulina (ili lokusa varijabilnog regiona teškog lanca imunoglobulina koji je prisutan u prirodi). Prema tome, obezbeđeni glodari su posebno od koristi za razvijanje terapeutika zasnovanog na antitelu koji se veže za određeni antigen, posebno, antigene koji su povezani sa niskom i/ili slabom imunogenosti ili antigenima koji su karakterisani sa jednim ili više epitopa koji nisu poželjni za vezivanje sa tradicionalnim (ili divljim tipom) antitela. Posebno, predmetni pronalazak obuvata uvođenje 23-mer rekombinacione signalne sekvence koja je susedna u odnosu na (npr.,5’ ili 3’) jednog ili više DHsegmenata u DHregionu u varijabilnom regionu teškog lanca imunoglobulina šo rezultira kapacitetom za DH-to-DHuređenje segmenta u toku VDJ rekombinacije, i ekspresijom antitela koja imaju varijabilne regione teškog lanca i, posebno, CDR3 regione, koji se mogu karakterisati dužom dužinom aminokiselina u poređenju sa antitelima koja su generisana sa VDJ rekombinacijom koja uključuje pojedinačne DHsegmente. Takvi transgeni glodari obezbeđuju in vivo system za identifikovanje i razvijanje antitela i/ili terapeutika koji su zasnovani na antitelu koji se vežu za mete bolesti koje su iznad ciljajućeg kapaciteta uspostavljenih tehnologija za otkriće lekova. Dalje, takvi transgeni glodari obezbeđuju koristan životinjski model sistem za razvijanje antitela i/ili terapeutika koji su zasnovani na antitelu koji su usmereni na ili dizajnirani na narušavanje protein-protein interakcija koje su centralne za različite bolesti i/ili patologije bolesti koje pogađaju humana bića.
[0153] Kao što je prikazano na Slici 1, panel na vrhu, rekombinacija između dva genska segmenta imunoglobulina prati pravilo koje je uobičajeno naznačeno kao 12/23 pravilo, u kome su genski segmenati sa rekombinacionim signalim sekvencama (RSS) bočno sa obe strane spojeni u uređenom procesu. Svaka RSS sastoji se iz konzervisanog bloka od sedam nukleotida (heptamer; 5’-CACAGTG3’; SEQ ID NO: 144) koja je susedna sa kodirajućom sekvencom (npr., VH, DHili JHsegment) koji prati nekonzervisani region, poznat kao spejser koji je ili 12bp ili 23bp u dužini, i drugi konzervisani blok od devet nukleotida (nonamer; 5’-ACAAAAACC-3’; SEQ ID NO:145). Spejser se može razlikovati u sekvenci, ali njegova konzervisana dužina odgovoara jednom ili dva okreta (eng. urn) u dvostrukoj zavojnici DNK. Ovo dovodi sekvence heptamera i nonamera na istu stranu zavojnice DNK, gde oni mogu biti vezani od strane kompleksa proteina koji kataliziraju rekombinaciju. RSS sa 23bp spejserom je 23-mer RSS i RSS sa 12bp spejserom je 12-mer RSS. Pravilo 12/23 rekombinacije generalno promoviše rekombinaciju između 12-mer RSS i 23-mer RSS i sprečava rekombinaciju između 23-mer RSS i druge 23-mer RSS, ili između 12-mer RSS i druge 12-mer RSS, npr., sprečava direktnu germinativni VH-sagerminativnim JHrekombinaciju (tj., 23-mer-sa-23-mer spajanje) ili germinativni DH-germinativni DHrekombinaciju (tj., 12-mer-sa-12-mer spajanje), iako su odstupanja prijavljena.
[0154] U nekim izvođenjima, glodari kao što je ovde opisano sadrže modifikovani region raznolikosti teškog lanca imunoglobulina (DH) ("modifikovani DHregion") koji sadrži:
(i) modifikovani DHgenski segment koji sadrži DHgenski segment neposredno uz 23-mer RSS ("modifikovani DHgenski segment ") i
(ii) neuređeni DHgenski segment sa prvom 12-mer RSS bočno u odnosu na njegovu 5’ stranu i sa drugom 12-mer RSS bočno u odnosu na njegovu 3’ stranu ("neuređeni DHgenski segment "), gde (i) modifikovani DHgenski segment i (ii) neuređeni DHgenski segment su operativno u vezi tako da (i) modifikovani DHgenski segment i (ii) neuređeni DHgenski segment su sposobni da se spoje u DH-DHdogađaju rekombinacije prema 12/23 pravilu, gde je nukleotidni molekul pogodan za dobijenje glodara koji imaju modifikovani DHregion, i opciono gde modifikovani DHregion obuhvata samo humane DHgenske segmenate. U nekim izvođenjima, antitela koja sadrže CDR3s generisane takvom rekombinacijom mogu se karakterisati da imaju povećanu raznolikost koja je rezultata od duže dužine aminokiselina da bi se usmerilo vezivanje sa određenim antigenima (npr., virusi, membranski kanali, itd.). U nekim izvođenjima, ovde opisani glodari sadrže huamne varijabilne (VH) i genske segmente spajanja (JH) teškog lanca operativno vezane sa modifikovanim DHregionom tako da se VDJ rekombinacija dešava između pomenutog VH, JHi više od jednog DHsegmenta da bi se dobio varijabilni region teškog lanca koji vezuje antigen od interesa. U nekim izvođenjima, modifikovani DHregion kao što je ovde opisano sadrži jedan ili više (npr.,1, 2, 3, 4, 5, 10 ili više) humanih DHsegmenata modifikovanih da se omogući (ili promoviše) DH-sa-DHrekombinacija u povećanoj učestalosti u poređenju sa referentnim lokusom varijabilnog regiona teškog lanca imunoglobulina.
[0155] U nekim izvođenjima, glodari kao što je ovde opisano dalje sadrže humani ili humanizovani lokus lakog lanca imunoglobulina (npr., κ i/ili λ) tako da nehumane životinje proizvode antitela koja se sastoje iz humanih varijabilnih regiona (tj., teški i laki) i nehumanih konstantnih regiona. U nekim izvođenjima, pomenuti humani ili humanizovani lokus lakog lanca imunoglobulina obuhvata humane VLi JLgenske segmente operativno vezane sa konstantnim regionom lakog lanca glodara (npr., glodarski Cκ ili Cλ). U nekim izvođenjima, ovde opisani glodari dalje sadrže lokus lakog lanca imunoglobulina kao što je opisano u U.S. Patent br-i.9,796,788; 9,969,814; U.S. objavi prijave patenta br-i.2011/0195454 A1, 2012/0021409 A1, 2012/0192300 A1, 2013/0045492 A1, 2013/0185821 A1, 2013/0302836 A1, 2018/0125043; Objavi međunarodne prijave patenta br-i.WO 2011/097603, WO 2012/148873, WO 2013/134263, WO 2013/184761, WO 2014/160179, WO 2014/160202; i WO2019/113065).
[0156] Različiti aspekti iz pronalaska su detaljno opisani u sledećim odeljcima. Korišćenje odeljaka nije namenjeno da bude ograničavajuće u odnosu na ovde opisana izvođenja. Svaki odeljak se može primeniti na bilo koji aspekt ili ovde opisano izvođenje. U ovoj prijavi, upotreba "ili" označava "i/ili" osim ukoliko nije drugačije naznačeno.
VDJ Rekombinacija
[0157] Geni koji su odgovorni za sintezu imunoglobulina mogu se naći u svim ćelijama životinja i uređeni su u genskim segmentima, sekvencijalno smešteni duž hromozoma. Konfiguracija humanih genskih segmenata koji su nasleđeni, npr., germinativna konfiguracija humanih genskih segmenata, npr., redosled humanih genskih segmenata u germinativnom genomu (npr., genom koji se prenosi u sledeću generaciju) čoveka, mogu se pronaći kod Lefranc, M.-P., Exp. Clin. Immunogenet., 18, 100-116 (2001), koji takođe pokazuju funkcionalne genske segmente i pseudogne pronađene u imunoglobulinskom lokusu humanog teškog lanca u germinativnoj konfiguraciji. Serije rekombinacionih događaja, uključujući nekoliko genetičkih komponenti, služe sa sklapanje imunoglobulina iz redosleda aranžmana genskih segmenata (npr., V, D i J). Pokazano je da ovo sklapanje genskih segmenata nije precizno i, prema tome, imunoglobulinska raznovrsnost je postignuta i kombinacijom različitih genskih segmenata i obrazovanjem jedinstvenih veza kroz neprecizno spajanje. Dalje raznovrsnost je generisana pomoću postupka koji je poznat pod imenom somatska hipermutacija u kome sekvenca varijabilnog regiona imunoglobulina je izmenjena da bi se povećao afinitet i specifičnost za antigen. Imunoglobulinski molekul je polipeptid Y-oblika koji se sastoji iz dva identična teška i dva identična laka lanca, od kojih svaki ima dve strukturne komponente: jedan varijabilni domen i jedan konstantni domen. Varijabilni domeni teških i lakih lanaca su obrazovani sklapanjem genskih segmenata, dok su konstantni domeni fuzionisani sa varijabilnim domenima preko spajanja RNK. Iako mehanizam sklapanja (ili spajanja) genskih segmenata je sličan za teške i lake lance, samo jedan događaj spajanja je potreban za lake lance (tj., V do J) dok su dva neophodna za teške lance (tj., D sa J i V sa DJ).
[0158] Sklapanje genskih segmenata za varijabilne regione teškog i lakog lanca (redom označeno kao VDJ rekombinacija i VJ rekombinacija) je vođena sa konzervisanim ne-kodirajućim sekvencama DNK koje su bočno u odnosu na vaki genski segment, imenovane sa rekombinacione signalne sekvence (RSSs), koje osiguravaju DNK uređenja na preciznim lokacijama u odnosu na V, D i J kodirajuće sekvence (videti, npr.,Ramsden, D.A. et al., 1994, Nuc. Acids Res. 22(10):1785-96). Reprezentativni šematski prikaz sekvenci koje su uključene u VDJ rekombinaciju genskih segmenata teškog lanca kao što to razume stručnjak iz oblasti tehnike su predstavljene na Slici 1. Svaka RSS sastoji se iz konzervisanog bloka od sedam nukleotida (heptamer) koji je susedan sa kodirajućom sekvencom (npr., V, D ili J segmenta) koji prati spejser (ili 12bp ili 23bp) i drugi konzervisani blok od devet nukleotida (nonamer). Iako je tolerisana značajna divergencija u sekvenci u 12bp ili 23Bp spejseru između individua, dužina ovih sekvenci obično se ne razlikuje. Rekombinacija između dva genska segmenta imunoglobulina prati prati pravilo koje obično naznačeno kao 12/23 pravilo, u kome genski segmetni sa RSS sa 12bp spejserom sa bočne strane (ili 12-mer) su obično spojeni sa genskim segmentom sa 23bp spejserom sa bočne strane (ili 23-mer; videti, npr.,Hiom, K. and M. Gellert, 1998, Mol. Cell.
1(7):1011-9). Prijavljeno je da sekvenca RSS utiče na efikasnost i/ili učestalost rekombinacije sa određenim genskim segmentom (see, npr., Ramsden, D.A and G.E. Wu, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88:10721-5; Boubnov, N.V. et al., 1995, Nuc. Acids Res. 23:1060-7; Ezekiel, U.R. et al., 1995, Immunity 2:381-9; Sadofsky, M. et al., 1995, Genes Dev.9:2193-9; Cuomo, C.A. et al., 1996, Mol. Cell Biol.16:5683-90; Ramsden, D.A. et al., 1996, EMBO J 15:3197-3206). Zaista, mnogi izveštaji ukazuju na veoma određenu i varijabilnu upotrebu genskih segmenata, posebno, DHsegmenti, između individua. Osim ukoliko nije drugačije naznačeno ili osim ukoliko bi bilo očigledno stručnjaku iz oblasti tehnike da bi se razvila kontradikcija ili nedoslednost, pretpostavlja se da neuređeni genski segment bez reference na RSS sadrži dve RSS sa kojima je genski segment prirodno u vezi, npr., sa bočne strane u odnosu na, operativno u vezi sa, itd. U nekim izvođenjima, ovde navedeni neuređeni genski segment može sadržati genski segment u svojoj germinativnoj (npr., divlji tip) konfoguraciji, npr., germinativni VHgenski segment i germinativni JHgenski segment su svaki sa 23-mer RSS bočno u odnosu na obe strane. Suprotno, germinativni DHgenski segment, npr., neuređeni DHgenski segment, je sa 12-mer RSS bočno u odnosu na obe strane.
[0159] Kao takav, neuređeni genski segment može se takođe odnositi na genski segment u svojoj germinativnoj konfiguraciji, uključujući bilo koju RSS koja je povezana sa takvom germinativnom konfiguracijom. Osim toga, mnoštvo genskih segmenata u njihovoj germinativnoj konfiguraciji generalno se odnosi ne samo na svaki individualni genski segment koji je u svojoj germinativnoj (npr., neuređeni) konfiguraciji, već takođe na redosled i/ili lokaciju funkcionalnih genskih segmenata. Videti, npr.,Lefranc, M.-P., Exp. Clin. Immunogenet., 18, 100-116 (2001).
[0160] Sklapanje genskih segmenata da bi se obrazovali regioni varijabilnih teških i lakih lanaca dovodi do obrazovanja regiona za vezivanje antigena (ili mesta) u imunoglobulinima. Takvi regioni za veivanje antigena su karakterisani, u delom, prisustvom hipervarijabilnih regiona, koji su obično naznačeni sa regionima koji određuju komplementarnost (CDRs). Postoje tri CDRs za oba teške i lake lance (tj., ukupno šest CDRs) pri čemu su CDR1 i CDR2 u celosti kodirani sa V genskim segmentom. CDR3, međutim, je kodiran sa sekvencom koja je nastala kao rezultat spajanja V i J segmenata za lake lance, i V, D i J segmenata za teške lance. Prema tome, dodatni genski segment koji je korišćen tokom rekombinacije da se obrazuje kodirajuća sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca značajno povećava raznolikost mesta za vezivanja antigena u teškim lancima. Prema tome, obezbeđene nehumane životinje koje sadrže modifikovani DHregion kao što je ovde opisano generišu raznolikost CDR3 koja je karakterisana sa DH-to-DHrekombinacijom i ima povećanu dužinu aminokiselina u poređenju sa regionima CDR3 za varijabilne regione teškog lanca koji su generisani sa tradicionalnom VDJ rekombinacijom.
[0161] Bez želje za vezivanjem za teoriju, smatra se da dalja raznolikost u repertoaru CDR3 teškog lanca može biti moguća preko povećavanja veza koje obrazuju uređenu gensku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca i/ili povećanje dužine u CDR3 regionu. Jedan mehanizam za povećanje veza i/ili povećanje dužine CDR3 regiona može biti preko spajanja prvog DHsegmenta (koji se generički može naznačiti DH"A") sa drugim DHsegmentom (oji se generički može naznačiti DH"B") u DH-DHdogađaju rekombinacije pre sledećih DH-JHi V-DHJHdogađaja rekombinacije, dovodeći do VH(DHA-DHB)JHgenske sekvence. Dugo je smatrano da su u prirodi DH-DHdogađaji rekombinacije bili nedozvoljeni pravilom 12/23 (Alt, F.W. et al., 1984, EMBO J. 3(6):1209-19). Međutim, izgleda da se događaji DH-DHrekombinacije pojavljuju u veoma niskoj učestalosti kod ljudi u suprotnosti sa 12/23 pravilom, (1 u 800 or ~0.125% naivnih B ćelija; videti, npr.,Ollier, P.J. et al.1985, EMBO J.4(13B):3681-88; Milner, E.C.B. et al.1986, Immunol. Today 7 :36-40; Liu, Z. et al., 1987, Nucleic Acids Res.15(11):4688; Liu, Z. et al., 1987, Nucleic Acids Res.15(15):6296; Meek, K.D. et al., 1989, J. Exp. Med.169(2):519-33; Meek, K.D. et al., 1989, J. Exp. Med.170:39-57; Baskin, B. et al.1998, Clin. Exp. Immunol.112:44-7; Briney, B.S. et al., 2012 Immunol. 137: 56-64) i smatra se da predstavljaju primarni mehanizam za generisanje neuobičajeno dugih CDR3s koji su uočeni u nekim teškim lancima (Janeway’s Immunobiology. 9th Edition. Kenneth Murphy, Casey Weaver. Chapter 5, 2017). Međutim, određene potencijalne terapeutske metre (npr. ali nije ograničeno na, viruse, receptore ćelijske površine, tip IV transmembranskih proteina kao što su GPCRs, jonski kanali) imaju sakrivene ili uvučene epitope kojima normalna antitela ne mogu da pristupe ali mogu biti prepoznati od strane antitela sa dugim HCDR3 sekvencama. Na primer, antitela sa veoma dugim HCDR3s se često mogu naći kod pacijenata sa hroničnim virusnim infekcijama i u nekim slučajevima imaju široku neutrališuću aktivnost (npr. široko neutrališuća antitela na HIV-1 ili influenca). Da bi se selektovala antitela koja su sposobna da dodju do ovih sakrivenih epitopa, bilo bi korisno povećati učestalost teških lanaca sa veoma dugim HCDR3s. Bez želje za vezivanjem za teoriju, jedan način da se ovo postigne je povećanje učetalosti uređenja teškog lanca VH(DHA-DHB)JHmodifikovanjem DHsegmenata da sadrže 23-mer RSS i/ili povećanjem učestalosti rekombinacije DHgenskih segmenata sa dužim JH6 genskim segmentom. Kod miša, smatra se da se DH-JHspajanje dešava kroz dva uređena koraka: (1) primarno uređenje proksimalnog DQ52 segmenta (naznačen sa DH7-27 kod humanih bića) sa jednim od najbližih JHsegmenata (JH1 ili JH2). Jak µ0 promotor ushodno od DQ52 zatim omogućava preostalim JHsegmentima (JH3 i JH4) da budu pristupačniji genima za aktivaciju rekombinacije (RAGs); (2) sekundarno uređenje distalnog DHsegmenta sa jednim od preostalih JHsegmenata (JH3 ili JH4). Videti, Slika 1, panel na vrhu. Ovo je u skladu sa češćom upotrebom nishodnih JHsegmenata koje je uočeno i kod miševa (JH3-JH4) i humani bića (JH4-JH6) (Nitschke et al.2001 J. Immunol.166:2540-52). Bez želje za vezivanjem za teoriju, pretpostavlja se da zamena DH7-27 i JH1-JH3 (ili JH1-JH5) sa sintetičkim DHgenom (npr., sintetički DH3-3 segment) koji ima 5’ 23-mer RSS i 3’ 12-mer RSS bi dovela do veće učestalosti VH(DH-DH)JHrekombinacije i može se pojaviti u mehanizmu iz tri koraka: (1) 23-DH-12 uređenje sa JH4, JH5, ili JH6 da se dobije 23(DH)JH, (2) uređenje distalnog DH(DH1-1 sa DH1-26) sa 23(DH)JHda se dobije 12(DH-DH)JH(VHuređenje 23(DH)JHbilo bi sprečeno sa 12/23 pravilom), (3) VHsa 12(DH-DH)JHuređenje da se dobije VDDJ kodirajuća sekvenca koja kodira varijabilni region teškog lanca imunoglobulina. Videti, npr., Slika 1, panel na dnu. Takođe se pretpostavlja da zamena DH2-2, DH2-8, i DH2-15 genskih segment, koji su dugi DHgenski segmenti (koji sadrže više od 31 nukleotida koji kodiraju dva cisteina koji obrazuju mogu obrazovati disulfidnu vezu za koju se smatra da stabilizuje duge HCDR3 regione [videti, npr.,Wang et al.2013 Cell 153:1379-93], redom sa onim genskim segmentima koji su operativno u vezi sa 5’krajem 12-mer RSS i 3’krajem 23-mer RSS takođe bi dovely do veće učestalosti VH(DH-DH)JHrekombinacije koja se može pojaviti kroz mehanizam iz tri koraka: (1) 12:DH-12 uređenje sa JH4, JH5, ili JH6 da se dobije 12(DH)JH, (2) uređenje distalnog 12:DH2-2:23, 12:DH2-8:23, ili 12:DH2-15-23 sa 12(DH)JHda se dobije 12(DH-DH)JH, i (3) VHsa 12(DH-DH)JHuređenje da se dobije VDDJ kodirajuća sekvenca koja kodira varijabilni domen teškog lanca imunoglobulina. Kao što je ovde opisano, modifikovani DHregion je
4
konstruisan postavljanjem 23-mer spejsera bočno u odnosu na ili 5’ ili 3’ poziciju koja je u susedstvu sa jednim ili više DHsegmenata, time omogućavajući DrHsa DHrekombinaciju u lokusu humanizovanog varijabilnog regiona teškog lanca imunoglobulina.
[0162] U nekim izvođenjima ovde opisani glodari sadrže lokus varijabilnog regiona teškog lanca imunoglobulina koji ispoljava VDJ rekombinaciju koja je prati pravilo 12/23 u poređenju sa referentnim glodarom. U nekim izvođenjima, ovde opisani glodari sadrže jednu ili više RSSs susedno sa ili koji okružuju jedan ili više DHsegmenata koji su modifikovani u poređenju sa DHsegmentima divljeg tipa. U nekim izvođenjima, jedan ili više DHgenskih segmenata varijabilnog regiona teškog lanca imunoglobulina nehumane životinje kao što je ovde opisano su svaki operativno u vezi sa ili 5’ ili 3’ 23-mer RSS tako da je učestalost DH-DHrekombinacije povećana kod glodara u poređenju sa referentnim glodarom. Efikasnost rekombinacije i/ili učestalost se može odrediti, u nekim izvođenjima, korišćenjem učestalosti genskih segmenata u populaciji sekvenci antitela (npr., individue ili grupe individua; videti npr., Arnaout, R. et al., 2011, PLoS One 6(8):e22365; Glanville, J. et al., 2011, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108(50):20066-71). Prema tome, ovde opisani glodari mogu, u nekim izvođenjima, sadržati jedan ili više DHsegmenta gde su svaki operativno u vezi sa ili sa 23-mer RSS u odnosu na bočnu stranu tako da se DH-DHrekombinacija pojavljuje u povećanoj učestalosti u poređenju sa DH-DHrekombinacijom u referentnoj nehumanoj životinji. U nekim izvođenjima, glodar koji sadrži modifikovani DHregion kao što je ovde opisano ispoljava bar 3-puta povećanu učestalost DH-DHrekombinacije u poređenju sa DH-DHrekombinacijom u referentnoj nehumanoj životinji. U nekim izvođenjima, glodar koji sadrži modifikovani DHregion kao što je ovde opisano ispoljava bar 4- puta povećanu učestalost DH-DHrekombinacije u poređenju sa DH-DHrekombinacijom u referentnom glodaru. U nekim izvođenjima, glodar koji sadrži modifikovani DHregion kao što je ovde opisano ispoljava bar 5-puta povećanu učestalost DH-DHrekombinacije u poređenju sa DH-DHrekombinacijom u referentnom glodaru. U nekim izvođenjima, glodar koji sadrži modifikovani DHregion kao što je ovde opisano ispoljava bar 10-puta povećanu učestalost DH-DHrekombinacije u poređenju sa DH-DHrekombinacijom u referentnom glodaru. U nekim izvođenjima, glodar koji sadrži modifikovani DHregion kao što je ovde opisano ispoljava 20-puta povećanu učestalost DH-DHrekombinacijom u poređenju sa DH-DHrekombinacijom u referentnoj nehumanoj životinji. U nekim izvođenjima, glodar koji sadrži modifikovani DHregion kao što je ovde opisano ispoljava 30- puta povećanu učestalost DH-DHrekombinacije u poređenju sa DH-DHrekombinacijom u referentnom glodaru. U nekim izvođenjima, glodar koji sadrži modifikovani DHregion kao što je ovde opisano ispoljava bar 40- puta povećanu učestalost DH-DHrekombinacije u poređenju sa DH-DHrekombinacijom u referentnom glodaru. U nekim izvođenjima, glodar koji sadrži modifikovani DHregion kao što je ovde opisano ispoljava bar 50-puta povećanu učestalost DH-DHrekombinacije u poređenju sa DH-DHrekombinacijom u referentnom glodaru.
Obezbeđeni in vivo sistemi
[0163] Predmetni pronalazak je zasnovan na prepoznavanju da su određeni antigeni povezani sa niskom i/ili slabom imunogenosti i, prema tome, slabe su mete za terapeutike zasnovane na antitelu. Zaista, mnoge mete bolesti (npr., virusi, proteini kanala) su karakterisani tako da se ne mogu pratiti ili tretirati lekom. Prema tome, predmetni pronalazak je zasnovan na stvaranju in vivo sistema za razvijanje antitela i terapeutika koji su zasnovani na antitelima koji prevazilaze poteškoće koje su povezane sa uspostavljenim tehnologijama za otkriće leka i/ili pristupima. U nekim izvođenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje in vivo sistem koji se karakteriše prisustvom imunoglobulinskih lokusa, naročito, imunoglobulinskih lokusa humanizovanog varijabilnog regiona teškog lanca, koji uključuje modifikovani DHregion u kome su jedna ili više DHRSS izmenjene, modifikovane ili modifikovane iz 12-mer-DH-12-mer formata u 12-mer-DH-23-mer ili 23-mer-DH-12-mer format, time omogućujući DH-sa-DHrekombinaciju u povećanoj učestalosti u poređenju sa DH-sa-DHrekombinacijom koja je uočena u referentnom in vivo sistemu. Predmetni prikaz specifično pokazuje konstrukciju transgenog glodara čiji genom obuhvata varijabilni region teškog lanca imunoglobulina koji uključuje modifikovani DHregion, gde modifikovani DHregion uključuje jedan ili više DHsegmenata gde su svaki operativno u vezi sa 23-mer RSS pozicionirane relativno u odnosu na svaki od jednog ili više DHsegmenta da se omogući povećana učestalost DH-DHrekombinacije. Ovde opisani postupci mogu biti usvojeni da se postigne bilo koji broj DHsegmenata (npr., tradicionalni ili sintetički) gde su svaki operativno u vezi sa 5’ ili 3’ 23-mer RSS za dobijanje modifikovanog DHregiona kao što je ovde opisano. Modifikovani DHregion, jednom kada je integrisan u varijabilni region teškog lanca imunoglobulina (tj., postavljen u operativnoj vezi sa VHi JHgenskim segmentima i/ili jednim ili više konstantnim regionima), obezbeđuje za rekombinaciju VHi JHgenskih segmenata sa više od jednim DHsegmentom, npr., da se generišu antitela koja su karakterisana sa teškim lancima koji imaju dodatnu raznolikost (tj., duge CDR3s, npr., gde bar 95% CDR3 sekvenci teškog lanca su bar 14 aminokiselina u dužini) sa direktnom vezivanjem za određene antigene. U nekim izvođenjima, takvi varijabilni regioni teškog lanca imaju sposobnost da pristupe epitopima u virusima do kojih je teško doći, proteinima kanala, GPCRs, itd.
[0164] Bez želje za vezivanjem za bilo koju određenu teoriju, napominjemo da ovde obezbeđeni podaci pokazuju da, u nekim izvođenjima, glodari čiji genom obuhvata varijabilni lokus teškog lanca imunoglobulina koji uključuje modifikovani DHregion koji se karakteriše uključivanjem DHsegmenta operativno u vezi sa 5’ 23-mer RSS efikasno generiše antitela koja su proizvedena sa V(DD)J rekombinacijom. Takođe napominjemo da ovde obezbeđeni podaci pokazuju da, u nekim izvođenjima, glodari čiji genom obuhvata varijabilni lokus teškog lanca imunoglobulina koji uključuje modifikovani DHregion koji se karakteriše uključivanjem tri DHsegmenta svaki operativno u vezi sa 3’ 23-mer RSS efikasno generiše antitela koja su proizvedena sa V(DD)J rekombinacijom. Ovde se takođe napominje da delecija nekih ili svih pet JHgenskih segmenata uzvodno od JH6 genskih segmenata dovodi do preferencijalne rekombinacije sa JH6 genskim segmentom. Kao što se može primetiti, JH6 genski segment obuhvata 63 nukleotida, npr., 10 više nukleotida u odnosu na JH1, JH2, JH3, JH4, i JH5 genske segmente, koji redom sadrže 52, 53, 50, 40, i 51 nukleotida. Prema tome, predmetni pronalazak, u bar nekim izvođenjima, obuhvata razvoj in vivo sistema za generisanje antitela i/ili terapeutika koji su zasnovani na antitelu na mete koje se ne mogu pratiti, npr., obezbeđivanjem glodara koji generišu uređene genske sekvence varijabilnog regiona teškog lanca imunoglobulina, npr.,VHDHJHand VH(DHA-DHB)JH, npr.,VH(DHA-DHB)JH6, sekvence koje kodiraju varijabilne domene teškog lanca sa CDR3 dužinama od bar 20 aminokiselina, npr., CDR3 dužinama između 20-30 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, bar 8-10% od uređenih genskih sekvenci varijabilnog regiona teškog lanca imunoglobulina, npr., VHDHJHi VH(DHA-DHB)JHgenske sekvence ovde opisane nehumane životinje kodiraju regione CDR3 koji su bar 21 aminokiselna u dužini.
[0165] U nekim izvođenjima, ovde je opisan., glodar, npr., pacov ili miš, koji sadrži (1) u njegovom germinativnom genomu, npr., u germinativnoj ćeliji, lokus teškog lanca imunoglobulina koji sadrži modifikovani DHregion koji sadržo DHgenski segment operativno u vezi sa 23-mer RSS, i (2) u njegovom somatskom genomu, npr., u B ćeliji, uređenu kodirajuću sekvencu teškog lanca VH(DHA-DHB)JH, gde prvi ili drugi DHgenski segment (tj., DHA ili DHB od VH(DHA-DHB)JHkodirajuće sekvence, redom) obuhvata DHgenski segment operativno u vezi sa 23-mer RSS, ili njegov deo, npr., gde prvi ili drugi DHgenski segment ima bar 9 uzastopnih nukleotida koji su poravnani sa DHgenskim segmentom operativno u vezi sa 23-mer RSS, i gde svaki od prvih i drugih DHgenskih segmenata obuhvata bar 5 uzastopnih nukleotida koji su poravnani sa odgovarajućim DHgenskim segmentom ne uzimajući u obzir bilo koje preklapanje.
[0166] U nekim izvođenjima, obezbeđeni glodari sadrže lokus teškog lanca imunoglobulina koji se karakteriše prisustvom mnoštva humanih VH, DHi JHgenskih segmenata uređenih u germinativnoj konfiguraciji i operativno u vezi sa nehumanim genima konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina, pojačivačima i regulatornim regionima. U nekim izvođenjima, obezbeđeni glodari sadrže jedan ili više humanih VHgenskih segmenata, jedan ili više humanih DHgenskih segmenata i jedan ili više humanih JHgenskih segmenata operativno u vezi sa nehumanim konstantnim regionom teškog lanca imunoglobulina.
[0167] U nekim izvođenjima, obezbeđeni glodari sadrže bar humane VHgenske segmente VH3-74, VH3-73, VH3-72, VH2-70, VH1-69, VH3-66, VH3-64, VH4-61, VH4-59, VH1-58, VH3-53, VH5-51, VH3-49, VH3-48, VH1-46, VH1-45, VH3-43, VH4-39, VH4-34, VH3-33, VH4-31, VH3-30, VH4-28, VH2-26, VH1-24, VH3-23, VH3-21, VH3-20, VH1-18, VH3-15, VH3-13, VH3-11, VH3-9, VH1-8, VH3-7, VH2-5, VH7-4-1, VH4-4, VH1-3, VH1-2 i VH6-1.
[0168] U nekim izvođenjima, obezbeđeni glodari sadrže humane DHgenske segmente DH1-1, DH2-2, DH3-3, DH4-4, DH5-5, DH6-6, DH1-7, DH2-8, DH3-9, DH3-10, DH5-12, DH6-13, DH2-15, DH3-16, DH4-17, DH5-18, DH6-19, DH1-20, DH2-21, DH3-22, DH6-25 i DH1-26. U nekim izvođenjima, obezbeđeni glodari dalje sadrže DH1-14, DH4-11, DH4-23, DH5-24, ili njihovu kombinaciju. U nekim izvođenjima, obezbeđeni glodari dalje sadrže humani DH7-27.
[0169] U nekim izvođenjima, ovde je opisan glodar, npr., pacov ili miš, koji sadrži (1) u svom genomu germinativne linije, npr., u germinativnoj ćeliji, lokus teškog lanca imunoglobulina koji sadrži modifikovani DHregion koji sadrži DHgenski segment operativno u vezi sa 23-mer RSS, i (2) u svom somatskom genomu, npr., u B ćeliji, uređena kodirajuća sekvenca teškog lanca VH(DHA-DHB)JH, pri čemu prvi ili drugi DHgenski segment (tj., DHA ili DHB od VH(DHA-DHB)JHkodirajuće sekvence, redom) sadrži DHgenski segment operativno u vezi sa 23-mer RSS, ili njegovim delom, npr., gde prvi ili drugi DHgenski segment ima bar 9 uzastopnih nukleotida koji se poravnaju sa DHgenskim segmentom koji je operativno u vezi sa 23-mer RSS, i pri čemu svaki od prvog i drugog DHgenskog segmenta sadrži bar 5 uzastopnih nukleotida koji se poravnaju sa odgovarajućim germinativnim segmentom DHgena, bez obzira na bilo kakvo preklapanje. U nekim izvođenjima, obezbeđeni su glodari koji sadrže humane segmente DHgena koji su operativno u vezi sa 23-mer RSS. U nekim izvođenjima, humani segment DHgena operativno je povezan sa 23-mer RSS sadrži dva kodona cisteina. U nekim izvođenjima, humani segment DHgena operativno u vezi sa 23-mer RSS sadrži najmanje 37 nukleotida. U nekim izvođenjima, humani segment DHgena operativno je povezan sa 23-mer RSS sadrži najmanje 19 nukleotida. U nekim izvođenjima, humani segment DHgena operativno je povezan sa 23-mer RSS sadrži najmanje 20 nukleotida. U nekim izvođenjima, humani segment DHgena operativno je povezan sa 23-mer RSS sadrži najmanje 23 nukleotida. U nekim izvođenjima, humani segment DHgena operativno je povezan sa 23-mer RSS sadrži najmanje 28 nukleotida. U nekim izvođenjima, humani segment DHgena operativno je povezan sa 23-mer RSS sadrži najmanje 31 nukleotida. U nekim izvođenjima, humani segment DHgena operativno je povezan sa 23-mer RSS sadrži najmanje 37 nukleotida.
[0170] U nekim izvođenjima, humani DHgenski segment operativno u vezi sa 23-mer RSS obuhvata humani DH1 genski segment. U nekim izvođenjima, humani DHgenski segment operativno u vezi sa 23-mer RSS obuhvata humani DH2 genski segment. U nekim izvođenjima, humani DHgenski segment operativno u vezi sa 23-mer RSS obuhvata humani DH3 genski segment. U nekim izvođenjima, humani DHgenski segment operativno u vezi sa 23-mer RSS obuhvata humani DH4 genski segment. U nekim izvođenjima, humani DHgenski segment operativno u vezi sa 23-mer RSS obuhvata humani DH5 genski segment. U nekim izvođenjima, humani DHgenski segment operativno u vezi sa 23-mer RSS obuhvata humani DH6 genski segment. U nekim izvođenjima, humani DHgenski segment operativno u vezi sa 23-mer RSS obuhvata humani DH7genski segment.
[0171] U nekim izvođenjima, humani DHgenski segment operativno u vezi sa 23-mer RSS obuhvata humani DH1-1 genski segment. U nekim izvođenjima, humani DHgenski segment operativno u vezi sa 23-mer RSS obuhvata humani DH2-2 genski segment. U nekim izvođenjima, humani DHgenski segment operativno u vezi sa 23-mer RSS obuhvata humani DH3-3 genski segment. U nekim izvođenjima, humani DHgenski segment operativno u vezi sa 23-mer RSS obuhvata humani DH4-4 genski segment.
4
U nekim izvođenjima, humani DHgenski segment operativno u vezi sa 23-mer RSS obuhvata humani DH5-5 genski segment. U nekim izvođenjima, humani DHgenski segment operativno u vezi sa 23-mer RSS obuhvata humani DH6-6 genski segment. U nekim izvođenjima, humani DHgenski segment operativno u vezi sa 23-mer RSS obuhvata humani DH1-7 genski segment. U nekim izvođenjima, humani DHgenski segment operativno u vezi sa 23-mer RSS obuhvata humani DH2-8 genski segment. U nekim izvođenjima, humani DHgenski segment operativno u vezi sa 23-mer RSS obuhvata humani DH3-9 genski segment. U nekim izvođenjima, humani DHgenski segment operativno u vezi sa 23-mer RSS obuhvata humani DH3-10 genski segment. U nekim izvođenjima, humani DHgenski segment operativno u vezi sa 23-mer RSS obuhvata humani DH5-12 genski segment. U nekim izvođenjima, humani DHgenski segment operativno u vezi sa 23-mer RSS obuhvata humani DH6-13 genski segment. U nekim izvođenjima, humani DHgenski segment operativno u vezi sa 23-mer RSS obuhvata humani DH2-15 genski segment. U nekim izvođenjima, humani DHgenski segment operativno u vezi sa 23-mer RSS obuhvata humani DH3-16 genski segment. U nekim izvođenjima, humani DHgenski segment operativno u vezi sa 23-mer RSS obuhvata humani DH4-17 genski segment. U nekim izvođenjima, humani DHgenski segment operativno u vezi sa 23-mer RSS obuhvata humani DH5-18 genski segment. U nekim izvođenjima, humani DHgenski segment operativno u vezi sa 23-mer RSS obuhvata humani DH6-19 genski segment. U nekim izvođenjima, humani DHgenski segment operativno u vezi sa 23-mer RSS obuhvata humani DH1-20 genski segment. U nekim izvođenjima, humani DHgenski segment operativno u vezi sa 23-mer RSS obuhvata humani DH2-21 genski segment. U nekim izvođenjima, humani DHgenski segment operativno u vezi sa 23-mer RSS obuhvata humani DH3-22 genski segment. U nekim izvođenjima, humani DHgenski segment operativno u vezi sa 23-mer RSS obuhvata humani DH6-25 genski segment. U nekim izvođenjima, humani DHgenski segment operativno u vezi sa 23-mer RSS obuhvata humani DH1-26 genski segment. U nekim izvođenjima, humani DHgenski segment operativno u vezi sa 23-mer RSS obuhvata humani DH1-14 genski segment. U nekim izvođenjima, humani DHgenski segment operativno u vezi sa 23-mer RSS obuhvata humani DH4-11 genski segment. U nekim izvođenjima, humani DHgenski segment operativno u vezi sa 23-mer RSS obuhvata humani DH4-23 genski segment. U nekim izvođenjima, humani DHgenski segment operativno u vezi sa 23-mer RSS obuhvata humani DH5-24 genski segment. U nekim izvođenjima, humani DHgenski segment operativno u vezi sa 23-mer RSS obuhvata humani DH7-27 genski segment.
[0172] U nekim izvođenjima, obezbeđeni glodari sadrže pun ili u suštini pun repertoar humanih DHgenskih segmenata generalno uređenih u redosledu koji se nalazi u neuređenim humanom genomskom varijabilnom lokusu, gde jedan od humanih DHgenskih segmenata punog ili suštinski punog repertoara je zamenjen sa DHgenskim segmentom modifikovanim da bude operativno u vezi sa 23-mer RSS.
U nekim izvođenjima jedan od humanih DHgenskih segmenata punog ili suštinski punog repertoara is je zamenjen sa odgovarajućim DHgenskim segmentom modifikovanim da bude operativno u vezi sa sa 23-mer RSS, npr., divlji tip DH2-2 genskog segmenta je zamenjen sa DH2-2 genskim segmentom modifikovanim da bude operativno u vezi sa 23-mer RSS.U nekim izvođenjima, jedan od humanih DHgenskih segmenata punog ili suštinski punog repertoara je zamenjen sa drugim DHgenskim segmentom modifikovanim da bude operativno u vezi sa 23-mer RSS, npe., divlji tip DH7-27 genskog segmenta je zamenjen sa DH3-3 genskim segmentom modifikovanim da bude operativno u vezi sa 23-mer RSS. U nekim izvođenjima, DH1-1 genski segment punog ili suštinski punog repertoara humanih DHgenskih segmenata generalno uređenih u redosledu koji je pronađen u neuređenom varijabilnom lokusu humanog genoma je zamenjen sa odgovarajućim ili drugim DHgenskim segmentom modifikovanim da bude operativno u vezi sa 23-mer RSS, npr., 3’ 23-mer RSS. U nekim izvođenjima, DH1-1, DH2-2, DH2-8, DH2-15, DH2-21 genski segment (i) ili bilo koja njihova kombinacija punog ili suštinski punog repertoara humanih DHgenskih segmenata generalno uređenih u redosledu koji je pronađen u neuređenom humanom genomskom varijabilnom lokusu je zamenjen sa odgovarajućim ili drugim DHgenskim segmentom modifikovanim da bude operativno u vezi sa 23-mer RSS, npr., 3’ 23-mer RSS. U nekim izvođenjima, svaki od DH2-2, DH2-8, i DH2-15 genskih segmenata punog ili suštinski punog repertoara humanih DHgenskih segmenata generalno uređenih u redosledu koji se nalazi u neuređenom humanom genomskom varijabilnom lokusu je zamenjen sa odgovarajućim ili drugim DHgenskim segmentom modifikovanim da bude operativno u vezi sa 23-mer RSS, npr., 3’ 23-mer RSS.
[0173] U nekim izvođenjima, obezbeđeni glodari sadrže bar humani JHgenski segment JH6. U nekim izvođenjima, obezbeđeni glodari sadrže bar humane JHgenske segmente JH4, JH5 and JH6. U nekim izvođenjima, obezbeđeni glodari sadrže humane JHgenske segmente JH1, JH2, JH3, JH4, JH5 i JH6.
[0174] U nekim izvođenjima, nehumani konstantni region teškog lanca imunoglobulina uključuje jedan ili više nehumanih imunoglobulinskih gena konstantnih regiona teškog lanca imunoglobulina kao što su, na primer, imunoglobulin M (IgM), imunoglobulin D (IgD), imunoglobulin G (IgG), imunoglobulin E (IgE) i imunoglobulin A (IgA). U nekim izvođenjima, nehumani konstantni region teškog lanca imunoglobulina uključuje gene konstantnog regiona glodarskog IgM, glodarskog IgD, glodarskog IgG3, glodarskog IgG1, glodarskog IgG2b, glodarskog IgG2a, glodarskog IgE i glodarskog IgA. U nekim izvođenjima, pomenuti humani VH, DHi JHgenskih segmenti su operativno u vezi za jedan ili više nehumanih pojačivača teškog lanca imunoglobulina (tj., sekvence pojačivača ili regioni pojačivača). U nekim izvođenjima, pomenuti humani VH, DHi JHgenski segmenti su operativno u vezi sa jednim ili više regulatornim regionoma teškog lanca nehumanog imunoglobulina (ili regulatorne sekvence). U nekim izvođenjima, pomenuti humani VH, DHi JHgenski segmenti su operativno u vezi sa jednim ili više pojačivača teškog lanca nehumanog imunoglobulina (ili sekvencom pojačivača) i jedan ili više regulatornih regiona teškog lanca nehumanog imunoglobulina (ili regulatornom sekvencom).
[0175] U nekim izvođenjima, obezbeđeni glodari ne sadrže (ili im nedostaje) endogeni Adam6 gen. U nekim izvođenjima, obezbeđeni glodari ne sadrže ili im nedostaje endogeni Adam6 gen (ili sekvenca koja kodira za Adam6) u istoj germinativnoj genomskoj poziciji kao što je pronađeno u germinativnom genomu divljeg tipa glodara istih vrsta. U nekim izvođenjima, obezbeđeni glodari ne sadrže ili im nedostaje humani Adam6 pseudogen. U nekim izvođenjima, obezbeđeni glodari sadrže inserciju bar jedne nukleotidne sekvence koja kodira jedan ili više glodarskih Adam6 polipeptida. Pomenuta insercija može biti izvan modifikovanog lokusa teškog lanca imunoglobulina kao što je ovde opisano (npr., ushodno od 5’ većine VHgenskih segmenata), u modifikovanom lokusu teškog lanca imunoglobulina ili na drugom mestu u germinativnom genomu glodara (npr., nasumično uvedena sekvenca koja kodira nehumani Adam6), ćelija ili tkivo. U nekim izvođenjima, obezbeđeni glodari ne sadrže ili im nedostaje funkcionalni endogeni Adam6 pseudogen.
[0176] U nekim izvođenjima, obezbeđeni glodar, ćelija glodara ili tkivo glodara kao što je ovde opisano ne eksprimira detektabilno, u celosti ili deo, endogeni glodarski VHregion u molekulu antitela. U nekim izvođenjima, obezbeđeni glodar, ćelija glodara ili tkivo glodara kao što je ovde opisano ne sadrži (ili im nedostaje ili sadrži deleciju) jednu ili više nukleotidnu sekvencu koja kodira, u celosti ili deo, endogeni nehumani VHregion (npr., VH, DHi/ili JH) u molekulu antitela. U nekim izvođenjima, obezbeđeni glodar, ćelija glodara ili tkivo glodara kao što je ovde opisano ima germinativni genom koji uključuje deleciju endogenih nehumanih VH, DHi JHgenskih segmenata, u celosti ili deo. U nekim izvođenjima, obezbeđeni glodar je fertilan.
[0177] U nekim izvođenjima, obezbeđeni glodari dalje sadrže modifikovani lokus κ lakog lanca imunoglobulina koji se karakteriše prisustvom mnoštva humanih Vκ i Jκ genskih segmenata koji su uređeni u germinativnoj konfiguraciji i koji su insertovani ushodno od, i operativno u vezi sa, nehumanim Cκ genom. U nekim izvođenjima, modifikovani lokus κ lakog lanca imunoglobulina obuhvata bar humane Vκ genske segmente koji se pojavljuju u proksimalnom klasteru varijabli (ili proksimalnom kraku, ili proksimalnoj duplikaciji) lokusa κ lakog lanca humanog imunoglobulina. U nekim izvođenjima, modifikovani lokus κ lakog lanca imunoglobulina obuhvata bar humane Vκ genske
4
segmente Yκ2-40, Vκ1-39, Vκ1-33, Vκ2-30, Vκ2-8, Vκ1-27, Vκ2-24, Vκ6-21, Vκ3-20, Vκ1-17, Vκ1-16, Vκ3-15, Vκ1-12, Vκ3-11, Vκ1-9, Vκ1-8, Vκ1-6, Vκ1-5, Vκ5-2 i Vκ4-1. U nekim izvođenjima, modifikovani lokus κ lakog lanca imunoglobulina obuhvata bar 1, 2, 3, 4, 5, 10, ili 15 humanih Vκ genskih segmenata koji su izabrani između Vκ2-40, Vκ1-39, Vκ1-33, Vκ2-30, Vκ2-8, Vκ1-27, Vκ2-24, Vκ6-21, Vκ3-20, Vκ1-17, Vκ1-16, Vκ3-15, Vκ1-12, Vκ3-11, Vκ1-9, Vκ1-8, Vκ1-6, Vκ1-5, Vκ5-2 i Vκ4-1. U nekim izvođenjima, modifikovani lokus κ lakog lanca imunoglobulina obuhvata humane Jκ genske segmente Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4 i Jκ5. U nekim izvođenjima, modifikovani lokus κ lakog lanca imunoglobulina obuhvata bar 1, 2, 3, ili 4 humana Jκ genska segmenta koji su izabrani iz Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4 i Jκ5.
[0178] U mnogim izvođenjima, pomenuti humani Vκ i Jκ genski segmenti su operativno u vezi sa jednim ili više pojačivača κ lakog lanca nehumanog imunoglobulina (tj., sekvence pojačivača ili regioni pojačivača). U nekim izvođenjima, pomenuti humani Vκ i Jκ genski segmenti su operativno u vezi sa regionom pojačivača introna mišjeg Igκ lakog lanca (Igκ Ei ili Eiκ). U mnogim izvođenjima, pomenuti humani Vκ i Jκ genski segmenti su operativno u vezi sa jednim ili više nehumanim imunoglobulinskim regulatornim regionima κ lakog lanaca (ili regulatornim sekvencama). U nekim izvođenjima, pomenuti humani Vκ i Jκ genski segmenti su operativno u vezi sa 3’ regionom pojačivača mišjeg Igκ lakog lanca (Igκ 3’E ili 3’Eκ). U nekim izvođenjima, pomenuti humani Vκ i Jκ genski segmenti su operativno u vezi sa mišjim Eiκ i operativno u vezi sa mišjim 3’Eκ. U nekim izvođenjima, pomenuti humani Vκ i Jκ genski segmenti su operativno u vezi sa jednim ili više pojačivača κ lakog lanca nehumanog imunoglobulina (ili sekvence pojačivača ili regioni pojačivača) i jedan ili više regulatornih regiona κ lakog lanca nehumanog imunoglobulina (ili regulatorne sekvence). U nekim izvođenjima, modifikovani lokus κ lakog lanca imunoglobulina sadrži iste regione pojačivača κ lakog lanca (ili sekvence pojačivača) nehumanog imunoglobulina koji se pojavljuju u divljem tipu lokusa κ lakog lanca imunoglobulina. U nekim izvođenjima, modifikovani lokus κ lakog lanca imunoglobulina sadrži regione pojačivača Igκ lakog lanca nehumanog imunoglobulina (ili sekvence pojačivača) koji se pojavljuju u divljem tipu lokusa κ lakog lanca imunoglobulina različitih vrsta (npr., različitih vrsta glodara).
[0179] U nekim izvođenjima, modifikovani lokus κ lakog lanca imunoglobulina kao što je ovde opisano ne sadrži (tj., nedostaje mu) humani VpreB gen (ili sekvenca koja kodira humani VpreB gen).
[0180] U nekim izvođenjima, nehumani Cκ gen lokusa κ lakog lanca modifikovanog imunoglobulina uključuje Cκ gen glodara kao što je, na primer, mišji Cκ gen ili Cκ gen pacova. U nekim izvođenjima, nehumani Cκ gen lokusa κ lakog lanca modifikovanog imunoglobulina je ili sadrži mišji Cκ gen iz genske pozadine koja uključuje 129 soj, BALB/c soj, C57BL/6 soj, mešani 129xC57BL/6 soj ili njihove kombinacije.
[0181] U nekim izvođenjima, obezbeđeni glodar, ćelija glodara ili tkivo glodara kao što je ovde opisano ne eksprimira detektabilno, u celosti ili deo, endogeni glodarski Vκ region u molekulu antitela. U nekim izvođenjima, obezbeđeni glodar, ćelija glodara ili tkivo glodara kao što je ovde opisano ne sadrži (ili mu nedostaje, ili sadrži deleciju) jedne ili više nukleotidnih sekvenci koje kodiraju, u celosti ili deo, endogeni ili glodarski Vκ region u molekulu antitela. U nekim izvođenjima, obezbeđeni glodar, ćelija glodara ili tkivo glodara kao što je ovde opisano ima germinativni genom koji uključuje deleciju endogenih glodarskih Vκ i Jκ genskih segmenata, u celosti ili deo.
[0182] U nekim izvođenjima, obezbeđeni glodar dalje sadrži divlji tip ili inaktivisani (npr., genskim ciljanjem) lokus λ lakog lanca imunoglobulina.
[0183] U nekim izvođenjima, obezbeđeni glodar, ćelija glodara ili tkivo glodara kao što je ovde opisano ne eksprimira detektabilno, u celosti ili deo, endogeni glodarski Vλ region u molekulu antitela. U nekim izvođenjima, obezbeđeni glodar, ćelija glodara ili tkivo glodara kao što je ovde opisano ne sadrži (ili mu nedostaje, ili sadrži deleciju) jedne ili više nukleotidnih sekvenci koje kodiraju, u celosti ili deo,
4
endogeni glodarski Vλ region u molekulu antitela. U nekim izvođenjima, obezbeđeni glodar, ćelija glodara ili tkivo glodara kao što je ovde opisano ima germinativni genom koji uključuje deleciju endogenih glodarskih Vλ i Jλ genskih segmenata, u celosti ili deo. U nekim izvođenjima, obezbeđeni glodar, ćelija glodara ili tkivo glodara kao što je ovde opisano kao germinativni genom koji uključuje deleciju endogenih nehumanih Vλ, Jλ i Cλ genskih segmenata, u celosti ili deo.
[0184] Smernice za kreiranje ciljajućih vektora, nehumanih ćelija i životinja koje nose takve modifikovane imunoglobulinske lokuse mogu se pronaći u U.S. Patent br-a. 8,642,835, 8,697,940, 9,006,511, 9,012,717, 9,029,628, 9,035,128, 9,066,502, 9,150,662 i 9,163,092. Stručnjak iz oblasti tehnike će uvideti raznovrsnost tehnologija, koje su poznate u oblasti tehnike, za postizanje takvih genskih modifikacija i/ili manipulacija nehumanim (npr., sisarskim) genomima ili za drugačije dobijanje, obezbeđivanje, proizvodnju takvih sekvenci za uvođenje u germinativni genom nehumanih životinja.
Konstrukti DNK
[0185] Obično, polinukleotidni molekul koji sadrži genske segmente imunoglobulina kao što je ovde opisano, naročito, jedan ili više DHsegmenata gde su svaki operativno u vezi sa 5’ ili 3’ 23-mer RSS je insertovan u vektor, poželjno vektor DNK, kako bi se polinukleotidni molekul replicirao u odgovarajućoj ćeliji domaćinu.
[0186] Zbog njihove veličine, DHsegmenti mogu biti direktno klonirani iz genomskih izvora koji su dostupni iz komercijalnih dobavljača ili dizajnirani u in silico zasnovani na objavljenim sekvencama dostupnim iz GenBank. Alternativno, biblioteke bakterijskog veštačkog hromozoma (BAC) mogu obezbediti imunoglobulinske sekvene. BAC biblioteke sadrže prosečnu veličinu inserta 100-150kb i sposobni su da nose inserte velike veličine od 300kb (Shizuya, et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 89:8794-8797; Swiatek, et al., 1993, Genes and Development 7:2071-2084; Kim, et al., 1996, Genomics 34 213-218). Na primer, humane i mišje genomske BAC biblioteke su konstruisane i komercijalno su dostupne (npr., Invitrogen, Carlsbad Calif.). Genomske BAC biblioteke mogu takođe služiti kao izvor sekvenci imunoglobulina kao i regioni za kontrolu transkripcije.
[0187] Alternativno, sekvence imunoglobulina mogu biti izolovane, klonirane i/ili prenete iz kvaščevih veštačkih hromozoma (YACs). Celokupni lokus imunoglobulina, ili njihov suštinski deo, može biti kloniran i sadržan su u jednom ili nekoliko YACs. Ukoliko je više YACs korišćeno i sadrži regione preklapajuće homologije, oni se mogu rekombinovati unutar sojeva domaćina kvasca da bi se proizveo pojedinačni konstrukt koji predstavlja celokupni lokus. YAC kraci mogu biti dodatno modifikovani sa sisarskim selekcionim kasetama retrouklapanjem da bi se pomoglo u uvođenju konstrukata nehumane embrionalne matične ćelije ili nehumane embrione pomoću postupaka koji su poznati u oblasti tehnike i/ili ovde opisani.
[0188] Konstrukti DNK mogu biti dobijeni korišćenjem postupaka koji su dobro poznati u oblasti tehnike. Na primer, konstrukt DNK se može dobiti kao deo većeg plazmida. Takvi preparati omogućavaju kloniranje i selekciju za ispravnu konstrukciju na efikasan način kao što je poznato u oblasti tehnike. DNK fragmenti koji sadrže jedan ili više DHsegmenata that su svaki operativno u vezi sa 5’ ili 3’ 23-mer RSS kao što je ovde opisano mogu se locirati između pogodnih restrikcionih mesta na plazmidu tako da se mogu jednostavno izolovati iz preostalih plazmidnih sekvenci za uključivanje u željenu životinju.
[0189] U nekim izvođenjima, postupci koji su korišćeni u dobijanju plazmida i transformaciji organizama domaćina su poznati u oblasti tehnike. Za druge pogodne ekspresione sisteme i za
4
prokariotske i eukariotske ćelije, kao i generalne postupke rekombinacije, videti Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., ed. od Sambrook, J. et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989.
Dobijanje glodara
[0190] Obezbeđeni su glodari koji eksprimiraju antitela koja imaju raznovrsnost CDR3 teškog lanca koja se karakteriše dugačkim dužinama aminokiselina koje nastaju od integrisanja 23-mer RSSs susednog uz jedan ili više DHsegmenata koji omogućuju DH-to-DHrekombinaciju unutar varijabilnog regiona teškog lanca imunoglobulina u genomu glodara. Pogodni primeri koji su ovde opisani naročito uključuju, miševe. Jedan ili više DHsegmenata, u mnogim izvođenjima, uključuju heterologne segmente DH(npr., humane DHsegmente). Takođe su obezbeđene životinje glodari, embrioni, ćelije i ciljni konstrukti za dobijanje glodara, embriona glodara, i ćelija koje sadrže pomenute segmente DHkoji su sposobni za DH-DHrekombinaciju u povećanoj učestalosti u poređenju sa divljim tipom ili referentnim glodarima.
[0191] U nekim izvođenjima, jedan ili više DHsegmenata su modifikovani da budu neposredno uz 5’ ili 3’ 23-mer RSS unutar klastera raznovrsnosti (tj., DHregion) varijabilnog regiona teškog lanca imunoglobulina u genomu glodara. U nekim izvođenjima, DHregion (ili njegov deo) varijabilnog regiona teškog lanca imunoglobulina nije deletiran (tj., intaktan). U nekim izvođenjima, DHregion (ili njegov deo) varijabilnog regiona teškog lanca imunoglobulina je izmenjen, narušen, deletiran, modifikovan ili zamenjen sa jednim ili više DHsegmenata gde su svaki operativno u vezi sa 5’ ili 3’ 23-mer RSS. U nekim izvođenjima, svaki ili u suštini svaki DHregion je zamenjen sa jednim ili više sintetičkih DHsegmenata gde su svaki operativno u vezi sa 5’ ili 3’ 23-mer RSS; U nekim izvođenjima, jedan ili više tradicionalnih DHgenskih segmenata nisu deletirani ili zamenjeni u DHregionu varijabilnog regiona teškog lanca imunoglobulina. U nekim izvođenjima, DHregion sadrži oba tradicionalna DHsegmenta (tj., jedan ili više DHsegmenata svaki operativno u vezi sa 5’ 12-mer RSS i 3’ 12-mer RSS) i modifikovane DHgenske segmente (tj., jedan ili više DHsegmenata svaki operativno u vezi sa 5’ ili 3’ 23-mer RSS. U nekim izvođenjima, DHregion kao što je ovde opisano je sintetički DHregion. U nekim izvođenjima, DHregion je humani DHregion. U nekim izvođenjima, DHregion je mišji DHregion. U nekim izvođenjima, modifikovani DHregion (ili njegov deo) kao što je ovde opisano je insertovan u varijabilni region teškog lanca imunoglobulina tako da pomenuti modifikovani DHregion (ili njegov deo) is operativno u vezi sa jednim ili više VHgenskih segmenata i/ili jednim ili više JHgenskim segmentima. U nekim izvođenjima, pomenuti modifikovani DHregion je insertovan u jednu od dve kopije varijabilnog regiona teškog lanca imunoglobulina, pri čemu se stvara glodar koji je heterozigotan u odnosu na pomenuti modifikovani DHregion. U nekim izvođenjima, obezbeđen je glodar koji je homozigotan za modifikovani DHregion. U nekim izvođenjima, obezbeđen je glodar koji je heterozigotan za modifikovani DHregion.
[0192] U nekim izvođenjima, glodar kao što je ovde opisano sadrži nasumično integrisani varijabilni region teškog lanca humanog imunoglobulina koji uključuje DHregion koji sadrži jedan ili više DHsegmenata gde su svaki operativno u vezi sa 5’ ili 3’ 23-mer RSS unutar njegovog genoma. Prema tome, takvi glodari se mogu opisati da imaju transgen teškog lanca humanog imunoglobulina koji sadrži modifikovani DHregion. Modifikovani DHregion se može detektovati korišćenjem različitih postupaka uključujući, na primer, PCR, “Western” blot, “Southern” blot, polimorfizme dužina restrikcionog fragmenta (RFLP), ili testa za sticanje alela (GOA) ili gubitak alela (LOA). U nekim takvim izvođenjima, glodar kao što je ovde opisano je heterozigot u odnosu na modifikovani DHregion kao što je ovde opisano. U nekim takvim izvođenjima, glodar kao što je ovde opisano je homozigotan u odnosu na modifikovani DHregion kao što je ovde opisano. U nekim takvim izvođenjima, glodar kao što je ovde opisano je hemizigot u odnosu na modifikovani DHregion kao što je ovde opisano. U nekim takvim izvođenjima, glodar kao što je ovde opisano sadrži jednu ili više kopija modifikovanog DHregiona kao što je ovde opisano.
4
[0193] U nekim izvođenjima, modifikovani DHregion glodara kao što je ovde opisano uključuje bar jedan DHsegment koji je u vezi sa (ili operativno u vezi sa) 5’ 23-mer RSS. U nekim izvođenjima, modifikovani DHregion glodara kao što je ovde opisano uključuje bar jedan DHsegment koji je povezan sa (ili operativno u vezi sa) 3’ 23-mer RSS. U nekim izvođenjima, modifikovani DHregion glodara kao što je ovde opisano uključuje bar humani DH3-3 segment koji je u vezi sa (ili operativno u vezi sa) 5’ 23-mer RSS. U nekim izvođenjima, modifikovani DHregion glodara kao što je ovde opisano uključuje bar humani DH2 segment koji je povezan sa (ili operativno u vezi sa) 3’ 23-mer RSS, pri čemu humani DH2 segment je izabran iz grupe koja se sastoji iz humanog DH2-2, humanog DH2-8, humanog DH2-15 i humanog DH2-21.
[0194] U nekim izvođenjima, modifikovani DHregion glodara kao što je ovde opisano uključuje više od jednog DHsegmenta gde su svaki u vezi sa sa (ili operativno u vezi sa) 5’ 23-mer RSS. U nekim izvođenjima, modifikovani DHregion glodara kao što je ovde opisano uključuje više od jednog DHsegmenta gde su svaki u vezi sa (ili operativno u vezi sa) 3’ 23-mer RSS. U nekim izvođenjima, modifikovani DHregion glodara kao što je ovde opisano uključuje humane DH2-2, humane DH2-8, i humae DH2-15 segmente gde svaki u vezi sa (ili operativno u vezi sa) 3’ 23-mer RSS.
[0195] Kompozicije i postupci za dobijanje glodara čiji genom obuhvata varijabilni region teškog lanca imunoglobulina koji uključuje modifikovani DHregion, pri čemu modifikovani DHregion uključuje jedan ili više DHsegmenata koji su svaki povezani sa (ili operativno u vezi sa) 5’ ili 3’ 23-mer RSS, su obezbeđene, uključujući kompozicije i postupke za dobijanje glodara koji eksprimiraju antitela koja se sastoje iz varijabilnog regiona teškog lanca koji uključuje CDR3 region koji ima aminokiselinsku sekvencu kodiranu sa više od jednim DHsegmentom iz lokusa teškog lanca imunoglobulina koji sadrži humane VHi JHgenske segmente operativno vezane sa jednim ili više nehumanim genima za konstantni region teškog lanca. U nekim izvođenjima, kompozicije i postupci za dobijanje glodara koji eksprimiraju takva antitela pod kontrolom endogenih pojačivača i/ili endogenih regulatornih sekvenci su takođe obezbeđeni. U nekim izvođenjima, kompozicije i postupci za dobijanje glodara koji eksprimiraju takva antitela pod kontrolom heterolognih pojačivača i/ili heterolognih regulatornih sekvenci su takođe obezbeđeni. Postupci uključuju inserciju jednog ili više DHsegmenata i drugih sekvenci koje omogućuju DH-DHrekombinaciju u povećanoj učestalosti u poređenju sa divljim tipom DHsegmenata, u genomu glodara tako da je eksprimirano antitelo koje uključuje teške lance imunoglobulina koji nastaju iz V(DD)J rekombinacije.
[0196] U nekim izvođenjima, postupci uključuju inserciju DNK koja uključuje DHgenski segment sa 5’ 23-mer RSS i 3’ 12-mer RSS operativno u vezi sa jednim ili više JHgenskih segmenata. Kao što je ovde opisano, DHgenski segment je pozicioniran nishodno od µ0 sekvence promotora. U nekim izvođenjima, postupci uključuju inserciju DHsegmenta sa 5’ 23-mer RSS i 3’ 12-mer RSS u poziciji u odnosu na µ0 sekvencu promotora tako da pomenuti JHgenski segment je pristupačan za RAG gene (npr., RAG-1 i/ili RAG-2) u toku rekombinacije. Genetski materijal koji uključuje DHsegment i RSSs na bočnim stranama koji opisani gore u tekstu mogu biti insertovani u genom glodara, na taj način stvarajući nehumanu životinju sa modifikovanim DHregionom koji sadrži pomenuti DHsegment i neophodne RSSs da bi se omogućila rekombinacija sa susednim DHgenskim segmentom i VHi JHgenskim segmentima.
[0197] U nekim izvođenjima, postupci uključuju inserciju DNK koja uključuje tri segmeta gena DHsvaki povezan sa 5’ 12-mer RSS i 3’ 23-mer RSS operativno u vezi sa šest JHgenskih segmenata. Kao što je ovde opisano, segmenti DHgena su pozicionirani između mnoštva DHgenskih segmenata gde su svaki u vezi sa 5’ i 3’ 12-mer RSS. U nekim izvođenjima, postupci uključuju inserciju DH2-2, DH2-8 i DH2-15 genskih segmenata svaki u vezi sa 5’ 12-mer RSS i 3’ 23-mer RSS u klasteru raznolikosti sa mnoštvom drugih DH segmenata gena svaki u vezi sa tradicionalnim ili divljim tipom RSS. Genetski materijal koji uključuje DHsegmente gena i RSSs na bočnim stranama koji su gore opisani mogu biti insertovani u genom glodara, na taj način stvarajući glodara koji ima modifikovani DHregion koji sadrži pomenute
4
DHsegmente i neophodne RSSs da bi se omogućila rekombinacija sa susednim DHgenskim segmentima i VHi JHgenskim segmentima.
[0198] Gde je pogodno, sekvence koje odgovaraju (ili kodiraju) DHsegmente mogu biti modifikovane da uključe kodone koji su optimizovani za ekspresiju u nehumanoj životinji (npr., videti U.S. Patent bre. 5,670,356 i 5,874,304). Sekvence optimizovane kodonom su sintetičke sekvence, i poželjno kodiraju identični polipeptid (ili biološki aktivni fragment polipeptida pune dužine koji u suštini ima istu aktivnost kao polipeptid pune dužine) koji je kodiran matičnim polinukleotidom optimizovanim bez kodona. U nekim izvođenjima, sekvence koje odgovaraju (ili kodiraju) DHsegmente mogu uključiti izmenjenu sekvencu da bi se optimizovalo korišćenje kodona za određeni ćelijski tip (npr., ćelija glodara). Na primer, kodoni sekvenci koje odgovaraju segmentima DHkoje treba insertovati u genom glodara mogu biti optimizovani za ekspresiju u ćeliji nehumane životinje. Takva sekvenca može biti opisana kao sekvenca optimizovana kodonom.
[0199] Insercija DHsegmenata koji su operativno u vezi sa 5’ ili 3’ 23-mer RSS u DHregionu tako da su pomenuti DHsegmenti operativno u vezi sa VHi JHgenskim segmentima (npr., brojni VHi JHgenski segmenti) koristi relativno minimalnu modifikaciju genoma i dovodi do ekspresije antitela koja se sastoje iz teških lanaca koji su karakterisani sa CDR3s imaju veće dužine aminokiselina.
[0200] Postupci za dobijanje transgenih nehumanih životinja, uključujući one sa izbačenim i ubačenim genima (eng “knockouts” i “knockins”), su dobro poznati u oblasti tehnike (videti, npr., Gene Targeting: A Practical Approach, Joyner, ed., Oxford University Press, Inc. (2000)). Na primer, generisanje transgenih glodara može opciono uključiti disrupciju genetskih lokusa jednog ili više endogenih gena glodara (ili genskih segmenata) i uvođenje jednog ili više segmenata DHpri čemu je svaki operativno u vezi za 23-mer RSS u genomu glodara, u nekim izvođenjima, na istoj lokaciji kao endogeni gen glodara (ili genski segmenti). U nekim izvođenjima, jedan ili više segmenata DHsvaki je operativno u vezi sa 23-mer RSS su uvedeni u DHregionu nasumično umetnutog lokusa teškog lanca imunoglobulina u genom glodara. U nekim izvođenjima, jedan ili više segmenata DHsu svaki 23-mer RSS uvedeni u DHregion endogenog lokusa teškog lanca imunoglobulina u genom glodara; U nekim izvođenjima, endogeni lokus teškog lanca imunoglobulina je izmenjen, modifikovan, ili dizajniran da sadrži humane genske segmente (npr., V i/ili J) operativno u vezi sa jednim ili više gena konstantnog regiona (npr., humanim ili mišjim).
[0201] Šematski prikaz (nije u srazmeri) reprezentativnih vektora za ciljanje za konstruisanje modifikovanog DHregiona i integraciju u embrionalne matične ćelije (eng. embryonic stem cells) (ES) za stvaranje glodara čiji genom sadrži varijabilni region teškog lanca imunoglobulina koji uključuje modifikovani klaster raznovrsnosti (tj., DHregion), pri čemu klaster raznovrsnosti uključuje jedan ili više DHsegmenata svaki operativno u vezi sa 5’ ili 3’ 23-mer RSS je obezbeđen na Slici 2. Primeri strategija i postupaka za inserciju takvih vektora u varijabilne regione teškog lanca imunoglobulina u genom ES ćelija glodara su obezbeđeni na Slikama 3-8. U svakoj od Slika 2-8, mesta prepoznavanja NotI restrikcionog enzima su naznačena gde je potrebno, nazivi i približne lokacije (male crte) različitih setova prajmera/proba (videti Tabela 4) su naznačeni za različite prikazane alele (nije u srazmeri), i osim ukoliko nije drugačije naznačeno, otvoreni simboli i linije predstavljaju humanu sekvencu, dok zatvoreni simboli i tamne linije predstavljaju mišju sekvencu. Sledeće skraćenice su korišćene za svaku od Slika, spec: gen za rezistenciju na spektinomicin; neo: gen za rezistenciju na neomicin; hyg: gen za rezistenciju na higromicin; lp: loxP mesto – specifično mesto prepoznavanja rekombinacije; Ei: intronski pojačivač mišjeg teškog lanca; IgM: gen za konstantni region mišjeg imunoglobulina M; L: sekvenca loxP mesta; Frt: ciljna sekvenca za prepoznavanje Flipaze; µ0 pro: µ0 sekvenca promotora.
[0202] Kao što je ilustrovano na Slici 2, DNK fragmenti koji sadrže veliki broj DHsegmenata sa jednim DHsegmentom operativno u vezi sa 5’ 23-mer RSS (Slika 2, vrh i sredina) ili sa tri DHsegmenata svaki operativno u vezi sa 3’ 23-mer RSS (Slika 2, dno) su dobijeni korišćenjem VELOCIGENE<®>tehnologije (videti, npr., U.S. Patent No. 6,586,251 i Valenzuela et al., 2003, Nature Biotech. 21(6):652-659) i molekularno biloškim postupcima koji su poznati u oblasti tehnike. Na Slici 2, osim ukoliko nije drugačije naznačeno, otvoreni simboli i linije predstavljaju humanu sekvencu, dok zatvoreni simboli i tamne linije predstavljaju mišju sekvencu. Relativne lokacije koje nisu u srazmeri humanih VH6-1, DH2-2, DH2-8, DH2-15, DH3-3, and JH1, JH2, JH3, JH4, JH5 and JH6 genskih segmenata su prikazane, kada su prisutni i bilo koji genski segment koji ostaje neimenovan je DHgenski segment. Obično, DHregion kao što je predstavljen sa tarabom (eng. hash marks) obuhvata puni repertoar neuređenih humanih DHgenskih segmenata (videti, npr., www.imgt.org/IMGTrepertoire/index.php?section=LocusGenes&repertoire=locus&species=human &group=IGH) sa sledećim izuzecima: dva vektora za ciljanje na vrhu kojima nedostaje DH7-27 gen, kkoji je zamenjen sa sekvencom koja sadrži DH3-3 genski segment sa 23-mer RSS bočno u odnosu na 5’-kraj i 12-mer RSS bočno u odnosu na 3’-kraj (prikazano kao otvorena strelica); vektoru za ciljanje na dnu nedostaje neuređeni humani DH2-2 genski segment, the neuređeni humani DH2-8 genski segment, i DH2-15 genski segmenti , koji su redom zamenjeni sa DH2-2 genskim segmentom sa 12-mer RSS bočno u odnosu na 5’-kraj i 23-mer RSS bočno u odnosu na 3’-kraj, DH2-8 genski segment sa 12-mer RSS bočno u odnosu na 5’-kraj i 23-mer RSS bočno u odnosu na 3’-kraj, i DH2-15 genski segment sa 12-mer RSS bočno u odnosu na 5’-kraj i 23-mer RSS bočno u odnosu na 3’-kraj (od koji svaki modifikovani DH2-2, DH2-8, i DH2-15 genski segment je predstavljen kao otvorena strelica). Nepopunjeni vertikalni trougli predstavljaju lokacije jedinstvenih veštačkih 40-mers homolognih sa sekvencama prajmera i probama koje su postavljene u 12:DH2-2:23|12:DH2-8:23|12:DH2-15:23 vektoru za ciljanje da bi se osigurala ispravna modifikacija vektorom za ciljanje/ES ćelije. Sekvence za jedinstveni veštački 40-mers naznačene su sa "1," "2," "10," "16," "8," i "18" i redom su predstavljene u SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:77, i SEQ ID NO:78,.
[0203] DNK fragmenti su skopljeni sa krakovima za homologiju za preciznu ciljanu inserciju u lokus humanizovanog varijabilnog regiona teškog lanca imunoglobulina (Slike 3, 5, 7). Selekciona kaseta (npr., neomicin) sa mesto specifičnim mestima za prepoznavanje rekombinacije u odnosu na bočnu stranu (npr., loxP) su uključene u vektorima za ciljanje radi olakšanog skrininga odgovarajuće insercije u klonovima ES ćelija i mogu se ukloniti sa priveremenom ekspresijom rekombinaze (npr., Cre) u pozitivnim ES ćelijskim klonovima (Slike 4, 6, 8). Fragmenti DNK uključuju neophodne sekvence za odgovarajuće sklapanje (tj., rekombinaciju), transkripciju i ekspresiju varijabilnih regiona teškog lanca jednom kada se integrišu u lokus teškog lanca imunoglobulina. Vektori za ciljanje su dizajnirani tako da modifikovani DHregion ima humanu VHgenomsku DNK bočno u odnosu na 5’ i humanu JHgenomsku DNK bočno u odnosu na 3’ i nehumani (npr., glodarski) genomsku konstantni region DNK teškog lanca (npr., intronski pojačivač i gen za konstanti region IgM). Finalni vektori za ciljanje za uključivanje u genom nehumane ćelije (npr., embrionalna matična ćelija glodara) sadrži VHgenomsku DNK (npr., koja sadrži jedan ili više VHgenskih segmenata), modifikovani DHregion, 3’ JHgenomsku DNK, i nehumani (npr., glodarski) genomski konstantni region DNK teškog lanca, od kojih su svi operativno u vezi da bi se omogućila rekombinacija između VHgenskih segmenata, modifikovani DHregion i JHgenski segment jednom kada se integrišu u genom nehumane životinje. Jednom sklopljeni, vektori za ciljanje su linearizovani i elektoporacijom uvedeni u glodarske ES ćelije.
[0204] Vektori za ciljanje su uvedeni u glodarske (npr., mišje) embrionalne matične ćelije tako da sekvenca koja je sadržana u vektoru za ciljanje (i.e., modifikovani DHregion) dovodi do kapaciteta nehumane ćelije ili nehumane životinje (npr., miš) koji eksprimira antitela koja sadrže CDR3s sa aminokiselinama kodiranim sa više od jednim DHsegmentom.
[0205] Kao što je ovde opisano, generisani su transgeni glodari u kojima je modifikovani DHregion uveden u lokus teškog lanca imunoglobulina genoma glodara (npr., lokus teškog lanca imunoglobulina
1
modifikovan da sadrži humani variable region genskih segmenata, koji može biti endogeni lokus teškog lanca imunoglobulina tako modifikovani).
[0206] Immunoglobulinski lokusi koji sadrže humani varijabilni region genskih segmenata su poznati u oblasti tehnike i mogu se naći u, na primer, u U. S. Pat. Br-a. 5,633,425; 5,770,429; 5,814,318; 6,075,181; 6,114,598; 6,150,584; 6,998,514; 7,795,494; 7,910,798; 8,232,449; 8,502,018; 8,697,940; 8,703,485; 8,754,287; 8,791,323; 8,809,051; 8,907,157; 9,035,128; 9,145,588;9,206,263; 9,447,177; 9,551,124; 9,580,491 i 9,475,559, kao i u U.S. Pat. Ob. Br-a. 20100146647, 20110195454, 20130167256, 20130219535, 20130326647, 20130096287, and 2015/0113668, and in PCT Pub. Nos. WO2007117410, WO2008151081, WO2009157771, WO2010039900, WO2011004192, WO2011123708 i WO2014093908.
[0207] U nekim izvođenjima, glodari kao što je ovde prikazano sadrže egzogene potpuno humane transgene imunoglobulina koji sadrže modifikovani DHregion, koji su sposobni da se preurede u prekurskorskim B ćelijama kod miševa (Alt et al., 1985, Immunoglobulin genes in transgenic mice, Trends Genet 1:231-236). U ovim izvođenjima, potpuno humani transgeni imunoglobulina koji sadrže modifikovani DHregion mogu biti (nasumično) insertovani endogeni imunoglobulinski geni mogu biti takođe izbačeni (Green et al., 1994, Antigen-specific human monoclonal antitela from mice engineered with human Ig heavy and light chain YACs, Nat Genet 7:13-21; Lonberg et al., 1994, Antigen-specific human antibodies from mice comprising four distinct genetic modifications, Nature 368:856-859; Jakobovits et al., 2007, From XenoMouse technology to panitumumab, the first fully human antibody product from transgenic mice, Nat Biotechnol 25:1134-1143 ) npr., gde endogeni lokusi za težak lanac imunoglobulina i κ laki lanac su inaktivisani, npr., ciljanom delecijom malih ali kritičnih delova svakog endogenog lokusa, koje prati uvođenje lokusa gena humanog imunoglobulina kao nasumično integrisanih velikih transgena, ili mini hromozoma (Tomizuka et al., 2000, Double transchromosomic mice: maintenance of two individual human chromosome fragments containing Ig heavy and kappa loci and expression of fully human antibodies, PNAS USA 97:722-727.
[0208] U nekim izvođenjima, lokusi humanog ili humanizovanog teškog i lakog lanca imunoglobulina koji sadrže modifikovani DHregion su u endogenim lokusima teškog i lakog lanca imunoglobulina, redom. Postupak za veliku in situ gensku zamenu mišjih lokusa germinativnog varijabilnog gena imunoglobulina sa lokusima humanih germinativnih varijabilnih gena imunoglobulina dok se održava sposobnost miševa da generišu potomstvo prethodno je opisana. Videti, npr., U.S. Patent Br-e.
6,596,541 i 8,697,940. Specifično, precizna zamena šest megabaza u oba mišjem teškom lancu i κ light lancu lokusa varijabilnih gena imunoglobulina sa njihovim humanim parnjacima dok su mišji konstantni regioni ostavljeni netaknuti je opisana. Kao rezultat, kreirani su miševi sa preciznom zamenom njihovog čitavog germinativnog varijabilnog repertoara imunoglobulina sa ekvivalentnim humanim germinativnim varijabilnim sekvencama imunoglulina, dok se održavaju mišji konstantni regioni. Humani varijabilni regioni su povezani sa mišjim konstantnim regionima da bi se obrazovali himerni humani-mišji imunoglobulinski lokusi koji su uređeni i eksprimiraju na fiziološkim odgovarajućim nivoima. Eksprimirana antitela su "Reverzne himere," tj., sadrže sekvence humanog varijabilnog regiona i sekvence mišjeg konstantnog regiona. Ovi miševi sa humanizovanim varijabilnim regionima imunoglobulina koji eksprimiraju antitela sa humanim ili humanizovanim i mišjim konstantnim regionima su nazvani VELOCIMMUNE<®>miševi.
[0209] VELOCIMMUNE<®>humanizovani miševi ispoljavaju potpuno funkcionalni humoralni imuni sisem koji se u suštini ne razlikuje od miševa divljeg tipa. Ispoljavaju normalne ćelijske populacije u svim stadijumima B ćelijskog razvoja. Ispoljavaju normalnu morfologiju linfoidnog organa. Sekvence antitela VELOCIMMUNE<®>miševa ispoljavaju normalno V(D)J uređenje i normalne učestalosti somatskih hipermutacija. Populacije antitela u ovim miševima odražavaju distribucije izotipa koji su rezultat normalnog prekopčavanja izotipa klase (npr., normalno cis-prekopčavanje izotipa). Imunozovanje
2
VELOCIMMUNE<®>miševa za rezultat ima robustne humoralne imune odgovore koji generišu velike, raznovrsne repertoire antitela koji imaju varijabilne domene humanog imunoglobulina koji su pogodni za upotrebu kao terapeutski kandidati. Ova platforma obezbeđuje bogat izvor prirodnih sekvenci sazrelog afiniteta humanog varijabilnog regiona imunoglobulina za dobijanje farmaceutski prihvatljivih antitela i drugih antigen vezujućih proteina. Takođe je pokazano da zamena čak jednog endogenog VHgenskog segmenta sa humanim VHgenskim segmentom može dovesti do iimunog odgovora koji sadrži humanizovani varijabilni domen imunoglobulina. Videti, npr.,Tien et al. (2016) Cell 166:1471-84. Precizna zamena varijabilnih sekvenci mišjeg imunoglobulina sa varijabilnim sekvencama humanog imunoglobulina tako da su varijabilne sekvence humanog imunoglobulina operativno u vezi sa endogenim nehumanim genskim sekvencama konstantog regiona u reverznom himernom načinu koji omogućava dobijanje VELOCIMMUNE<®>miševa.
[0210] Miševi koji su modifikovani u u reverznom himernom načinu uključuju miševe koji su modifikovani sa sadrže u endogenom lokusu imunoglobulona human(izovani) varijabilni region (npr., koji sadrži (D), J, i jedan ili više humanih V genskih segmenata) operativno u vezi sa endogenim konstantnim regionom, npr.,
(a) na endogenom lokusu teškog lanca:
(i) neuređeni humani (zovani) varijabilni region teškog lanca imunoglobulina u operativnoj vezi sa konstantnim regionom endogenog teškog lanca , gde the neuređeni humani (zovani) varijabilni region teškog lanca imunoglobulina obuhvata mnoštvo VHgenskih segmenata neuređenih humanih varijabilnih regiona teškog lanca (npr.,svi funkcionalni human neuređeni humani VHgenski segmenti), jedan ili više neuređenih DHgenskih segmenata teškog lanca imunoglobulina i jedan ili više neuređenih JHgenskih segmenata teškog lanca imunoglobulina, opciono gde jedan ili više neuređeni DHgenski segmenti teškog lanca imunoglobulina i jedan ili više neuređeni JHgenski segmenti teškog lanca imunoglobulina su jedan ili više neuređeni DHgenski segmenti humanog teškog lanca imunoglobulina (npr., svi funkcionalni humani DHgenski segmenti) i/ili jedan ili više neuređeni humani JHgenski segmenatti teškog lanca imunoglobulina (npr., svi funkcionalni humani JHgenski segmenti);
(ii) ograničeni neuređeni humani (zovani) varijabilni region teškog lanca u operativnoj vezi sa konstantnim regionom endogenog teškog lanca , gde ograničeni neuređeni humani (zovani) varijabilni region teškog lanca u suštini se sastoji iz jednog neuređenog humanog VHgenskog segmenta varijabilnog regiona teškog lanca operativno u vezi sa jednim ili više neuređenih DHgenskih segmenata teškog lanca imunoglobulina i jedan ili više neuređenih JHgenskih segmenata teškog lanca imunoglobulina, opciono gde jedan ili više neuređenih DHgenskih segmenata teškog lanca imunoglobulina i jedan ili više neuređenih JHgenskih segmenata teškog lanca imunoglobulina su are jedan ili više neuređenih humanih DHgenskih segmenata teškog lanca imunoglobulina.
i/ili one ili više neuređenih humanih JHgenskih segmenata teškog lanca imunoglobulina, redom; (iii) histidinom modifikovani neuređeni humani (zovani) varijabilni region teškog lanca u operativnoj vezi sa konstantnim regionom endogenog teškog lanca, gde histidinom modifikovani neuređeni humani (zovani) varijabilni region teškog lanca obuhvata neuređenu gensku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca imunoglobulina koja sadrži u kodirajućoj sekvenci regiona koji određuje komplementarnost 3 (CDR3) supstituciju od bar jednog kodona koji nije za histidin sa kodonom koji je za histidin ili inserciju od bar jednog kodonna koji je za histidin; ili
(iv) kodirajuću sekvencu samo teškog lanca imunoglobulina koja sadrži neuređeni humani (zovani) varijabilni region teškog lanca u operativnoj vezi sa konstantnim regionom endogenog teškog lanca, gde konstantni regionom endogenog teškog lanca obuhvata (1) intaktni endogeni IgM gen koji kodira IgM izotip koji se povezuje sa lakim lancem i (2) ne-IgM gen, npr., IgG gen, kome nedostaje sekvenca koja kodira za funkcionalni CH1 domen, gde ne-IgM gen kodira za ne-IgM izotip kome nedostaje CH1 domen koji je sposoban da se kovalentno veže sa konstantnim domenom lake sekvence; i/ili
(b) na endogenom lokusu teškog lanca:
(i) neuređeni humani (zovani) varijabilni region lakog lanca imunoglobulina u operativnoj vezi sa endogenim konstantnim regionom lakog lanca, gde neuređeni humani (zovani) varijabilni region lakog lanca imunoglobulina obuhvata mnoštvo neuređenih humanih VLgenskih segmenata varijabilnog regiona lakog lanca (npr.,svi funkcionalni humani neuređeni humani VLgenski segmenti) i jedan ili više neuređenih JLgenskih segmenata lakog lanca imunoglobulina , opciono gde jedan ili više neuređenih JLgenskih segmenata lakog lanca imunoglobulina su jedan ili više neuređenih humanih JLgenskih segmenata lakog lanca imunoglobulina (npr.,svi funkcionalni humani JHL genski segmenti), opciono gde the endogeni lokus lakog lanca imunoglobulina je endogeni kapa (κ) lokus lakog lanca imunoglobulina, neuređeni humani (zovani) varijabilni region lakog lanca imunoglobulina obuhvata humani variabilne κ (Vκ) i za spajanje κ (JK) genske segmente, i gde konstantni regiono endogenog lakog lanca je endogena sekvenca konstantog regiona κ lanca i/ili gde endogeni lokus lakog lanca imunoglobulina je endogeni lambda (λ) laki lanac imunoglobulina, neuređeni humani (zovani) varijabilni region lakog lanca imunoglobulina obuhvata humane varijabilne λ (Vλ) i za spajanje λ (Jλ) genske segmente, i konstantni region endogenog lakog lanca je endogena sekvenca λ lanca konstantog regiona, opciono gde endogeni lokus lakog lanca λ imunoglobulina obuhvata (a) jedan ili više humanih Vλgenskih segmenata, (b) jedan ili više humanih Jλgenskih segmenata, i (c) jedan ili više humanih Cλgenskih segmenata gde (a) i (b) su operativno u vezi sa (c) (Cλ) genskim segmentom konstantnog regiona lakog lanca imunoglobulina glodara, i gde endogeni lokus λ lakog lanca imunoglobulina dalje obuhvata : jedan ili više pojačivača λ lakog lanca(Eλ) imunoglobulina glodara, i jedan ili više pojačivača λ lakog lanca(Eλ) humanog imunoglobulina, opciono koji sadrže tri humana Eλs;
(ii) kodirajuću sekvencu zajedničkog lakog lanca koja sadrži uređenu human(izovanu) sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca u operativnoj vezi sa endogenim konstantnim regionom lakog lanca, gde uređena human(izovana) sekvenca lakog lanca varijabilnog regiona obuhvata humani VLgenski segment varijabilnog regiona lakog lanca uređen sa JLgenskim segmentom lakog lanca imunoglobulina;
(iii) ograničeni neuređeni humani (zovani) varijabilni region lakog lanca u operativnoj vezi sa endogenim konstantnim regionom lakog lanca, gde ograničeni neuređeni humani (zovani) varijabilni region lakog lanca obuhvata ne više od dva neuređenih humanih (VL) genskih segmenata varijabilnog lakog lanca imunoglobulina operativno u vezi sa jednim ili više neuređenim humanim (JL) genskim segmentima spajanja lakog lanca imunoglobulina ;
(iv) histidinom modifikovani neuređeni humani (zovani) varijabilni region lakog lanca u operativnoj vezi sa endogenim konstantnim regionom lakog lanca, gde gde histidinom modifikovani uređeni humani(ized) varijabilni region lakog lanca obuhvata uređenu human(izovanu) gensku sekvencu varijabilnog lakog lanca imunoglobulina koja sadrži u kodirajućoj sekvenci koja određuje komplementarnost 3 (CDR3) supstituciju od bar jednog kodona koji nije za histidin koji nije za histidin sa a kodonom koji je za histidin inserciju od bar jednog kodona koji je za histidin; ili
(v) histidinom modifikovani uređeni human(zovani) varijabilni region lakog lanca u operativnoj vezi sa endogenim konstantnim regionom lakog lanca, gde histidinom modifikovani uređeni human(izovani) varijabilni region lakog lanca obuhvata uređenu human(izovanu) gensku sekvencu varijabilnog lakog lanca imunoglobulina koja sadrži u kodirajućoj sekvenci koja određuje komplementarnost 3 (CDR3) supstituciju od bar jednog kodona koji nije za histidin sa a kodonom koji je za histidin ili inserciju od bar jednog kodona koji je za histidin ,
4
opciono gde miš dalje obuhvata
(i) human(izovani) lokus teškog lanca imunoglobulina koji sadrži funkcionalni ADAM6 gen tako da miš ispoljava fertilitet divljeg tipa nehumane životinje; i/ili
(ii) egzogeni gen terminalne deoksinukleotidil transferaze (TdT) za povećanu raznolikost antigenskog receptora, opciono tako da bar 10% preuređenih gena varijabilnog regiona sadrže dodavanja nezavisna od matrice,
pri čemu su miševi prethodno opisani. Videti, npr., U.S. Patent br.-e.8,697,940; 8,754,287; 9,204,624; 9,334,334; 9,801,362; 9,332,742; i 9,516,868; U.S. objave patenta 20110195454, 20120021409, 20120192300, 20130045492; 20150289489; 20180125043; 20180244804; PCT objava br. WO2019/113065, WO2017210586, i WO2011163314; Lee et al. (2014) Nature Biotechnology 32:356.
[0211] U nekim izvođenjima, predmetni pronalazak uključuje genetički modifikovanu nehumanu životinju čiji genome, npr., germinativni genom, obuhvata:
endogeni lokus imunoglobulina koji sadrži varijabilni region teškog lanca imunoglobulina koji sadrži humani VHgenski segment, humani modifikovani DHgenski region iz pronalaska, i humani JHgenski segment, gde varijabilni region teškog lanca imunoglobulina je operativno u vezi sa konstantnim regionom, i/ili
endogeni lokusom lanca koji sadrži varijabilni region lakog lanca imunoglobulina koji sadrži humani VL genski segment i humane JL genske segmente, gde je varijabilni region lakog lanca imunoglobulina je operativno u vezi sa konstantnim regionom.
[0212] U nekim izvođenjima, glodar, npr., pacov ili miš, sadrži u njegovom genomu zamenu jednog ili više endogenih VH, DH, i JHsegmenata na endogenom lokusu teškog lanca imunoglobulina sa jednim ili više humanih VH, DH, i JHsegmenata, gde su jedan ili više humanih VH, DH, i JHsegmenata sadrži humani DHgenski segment operativno u vezi sa 23-mer RSS i operativno u vezi sa endogenim genom teškog lanca imunoglobulina; i opciono neuređeni ili uređeni humani VLi humani JLsegment operativno u vezi sa konstantnim (CL) regionom gena lakog lanca imunoglobulina glodara, npr. miša ili pacova, npr., na endogenom lokusu nehumanog lakog lanca.
[0213] U određenim izvođenjima, genetički modifikovani glodari sadrže u njihovom genomu, npr., germinativnom genomu, lokus imunoglobulina (egzogeni ili endogeni) koji sadrži varijabilni region imunoglobulina koji sadrži jedan ili više neuređenih segmenata gena varijabilnih regiona humanih imunoglobulina uključujući modifikovani DHregion i konstantni region imunoglobulina koji sadrže gen konstantnog regiona imunoglobulina i u kome jedan ili više neuređeni humani varijabilni region imunoglobulina genskih segmenata su operativno u vezi sa genom konstantnim regionom imunoglobulina.
[0214] Generalno, genski modifikovani lokus imunoglobulina obuhvata varijabilni region imunoglobulina (koji sadrže varijabilnog regiona imunoglobulina genskih segmenata) operativno u vezi sa konstantnim regionom imunoglobulina. U nekim izvođenjima, genski modifikovani lokus imunoglobulina obuhvata jedan ili više humanih neuređenih genskih segmenata varijabilnog regiona teškog lanca imunoglobulina, uključujući modifikovani DHregion, operativno u vezi sa genom konstantog regiona teškog lanca. U nekim izvođenjima, genski modifikovani lokus imunoglobulina obuhvata humane neuređene κ genske segmente varijabilnog regiona imunoglobulina s operativno u vezi sa genom za konstantni region κ lanca. U nekim izvođenjima, genski modifikovani lokus imunoglobulina obuhvata humane neuređene genske λ segmente varijabilnog regiona imunoglobulina operativno u vezi sa genom za konstantni region κ lanca. U nekim izvođenjima, genski modifikovani lokus imunoglobulina obuhvata humane neuređene λ genske segmente varijabilnog regiona imunoglobulina operativno u vezi genom konstantog regiona λ lanca.
[0215] U određenim izvođenjima, glodar obuhvata u endogenom lokusu teškog lanca neuređeni humani (zovani) varijabilni region teškog lanca imunoglobulina koji sadrže modifikovani DHregion u operativnoj vezi sa konstantnim regionom endogenog teškog lanca, gde varijabilni region imunoglobulina sadrži jedan ili više genskih segmenata neuređenih humanih varijabilni regiona teškog lanca Ig. U nekim izvođenjima, jedan ili više neuređeni genskih segmenata varijabilnog regiona humanog Ig obuhvata bar jedan varijabilni (VH) segment teškog lanca humanog imunoglulina, jedan ili više segmenata raznolikosti teškog lanca imunoglobulina (DH) (npr., jedan ili više neuređeni humani DHsegmenti operativno u vezi sa 23-mer RSS), i jedan ili više segmenata spajanja teškog lanca imunoglobulina (JH) (opciono jedan ili više neuređenih humanih JHsegmenata). U nekim izvođenjima, neuređeni genski segmenti varijabilnog regiona Ig sadrži mnoštvo neuređenih humanih VHsegmenata , jedan ili više neuređenih (humanih) DHsegmenata (npr., jedan ili više neuređeni (human) DHsegmenti operativno u vezi sa 23-mer RSS) i jedan ili više neuređeni (humani) JHsegmenti . U nekim izvođenjima, neuređeni genski segmenti varijabilnog regiona Ig sadrže bar 3 VHgenska segmenta, bar 18 VHgenskih segmenata, bar 20 VHgenskih segmenata, bar 30 VHgenskih segmenata, bar 40 VHgenskih segmenata, bar 50 VHgenskih segmenata, bar 60 VHgenskih segmenata, bar 70 VHgenskih segmenata, ili bar 80 VHgenskih segmenata. U nekim izvođenjima, neuređeni humani genski segmenti Ig uključuju svaki od funkcionalnih humanih DHgenskih segmenata, gde bar jedan od funkcionalnih humanih DHgenskih segmenata je modifikovan da bude operativno u vezi sa 23-mer RSS. U nekim izvođenjima, neuređeni humani genski segmenti Ig uključuju svaki od funkcionalnih humanih JHgenskih segmenata. Primeri varijabilnih regiona koji sadrže genske segmente teškog lanca Ig su obezbeđeni, na primer, u Macdonald et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 111 :5147-52.
[0216] U nekim izvođenjima, ovde obezbeđeni glodari sadrže u endogenom lokusu teškog lanca ograničeni neuređeni humani (zovani) varijabilni region teškog lanca u operativnoj vezi sa konstantnim regionom endogenog teškog lanca koji sadrži bar nehumani IgM gen, gde ograničeni neuređeni humani (zovani) varijabilni region teškog lanca je karakterisan sa jednim humanim VHgenskim segmentom, mnoštvom DHgenskih segmenata (npr., humanih DHgenskih segmenata, uključujući jedan ili više neuređenih (humanih) DHsegmenata operativno u vezi h sa 23-mer RSS) i mnoštvom JHgenskih segmenata (npr. humani JHgenski segmenati), gde ograničeni lokus teškog lanca imunoglobulina je sposoban za uređenje i obrazovanje mnoštva različitih uređenja, gde je svako uređenje izvedeno iz jednog humanog VHgenskog segmenta, jednog od DHsegmenata, i jednog od JHsegmenata, i gde svako uređenje kodira za različiti varijabilni domen teškog lanca (npr., kao što je opisano u U.S. Pat. Pub. No.20130096287). U nekim izvođenjima jedan humani VHgenski segment je VH1-2 ili VH1-69.
[0217] U određenim izvođenjima, glodar obuhvata u endogenom lokusu lakog lanca neuređeni humani (izovani) varijabilni region lakog lanca imunoglobulina u operativnoj vezi sa endogenim konstantnim regionom lakog lanca. U nekim izvođenjima neuređeni humani (zovani) varijabilni region lakih lanaca imunoglobulina sadrži neuređene humane genske segmente κ varijabilnog regiona Ig. U nekim izvođenjima, neuređeni humani (zovani) varijabilni region imunoglobulina obuhvata mnoštvo neuređenih humanih Vκ segmenata i jedan ili više neuređenih humanih JKsegmenata. U nekim izvođenjima, neuređeni genski segmenti varijabilnog regiona humanog imunoglobulina sadrže svaki od humanih Jκ segmenata. U nekim izvođenjima, varijabilni region genskih segmenata imunoglobulina sadrži četiri funkcionalna Vκ segmenta i sve humane Jκ segmente. U nekim izvođenjima, varijabilni regioni genskih segmenata imunoglobulina sadrže 16 funkcionalnih Vκ segmenata i sve humane Jκ segmente (npr., sve funkcionalne humane Vκ segmente i Jκ segmente). U nekim izvođenjima, neuređeni genski segmenti varijabilnog regiona humanog imunoglobulina sadrže sve humane Vκ segmente i sve humane Jκ segmente. Primeri varijabilnih regiona koji sadrže κ genske segmente Ig su obezbeđeni, na primer, u Macdonald et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1 11 :5147-52 i dodatne informacije.
[0218] U nekim izvođenjima, ograničeni neuređeni humani(zovani) varijabilni region lakog lanca u operativnoj vezi sa konstantnim regionom endogenog lakog lanca je karakterisan time što neuređeni humani (zovani) varijabilni region lakog lanca obuhvata ne više od dva humana VLgenskih segmenata i mnoštvo JLgenskih segmenata (npr., dvostruki laki lanac miševa, ili DLC, kao što je opisano u U. S. Pat. No. 9,796,788). U nekim izvođenjima the VLgenskih segmenti su Vκ genski segmenti. U nekim izvođenjima VLgenski segmenti su Vλ genski segmenti. U nekim izvođenjima tVκ genski segmenti su IGKV3-20 i IGKV1 -39. U nekim izvođenjima, glodar obuhvata tačno dva neuređena humana Vκ genska segmenta i pet neuređenih humanih Jκ genskih segmenata koji su operativno u vezi sa konstantnim regionom mišjeg lakog lanca u lokusu endogenog κ lakog lanca miša, opciono gde tačno dva neuređena humana Vκ genska segmenta su humani Vκ1-39 genski segment i humani Vκ3-20 genski segment, gde pet neuređenih humanih Jκ genskih segmenata su humani Jκ1 genski segment, humani Jκ2 genski segment, humani Jκ3 genski segment, humani Jκ4 genski segment, i humani Jκ5 genski segment, gde neuređeni genski segmenti humanog kapa lakog lanca su sposobni za uređenje i kodirajući varijabilni domeni humanog antitela, i opciono dalje gde nehumana životinja ne sadrži endogeni Vκ genski segment koji je sposoban za uređenje da se obrazuje varijabilni region lakog lanca imunoglobulina.
[0219] U određenim izvođenjima, neuređeni humani (zovani) varijabilni region lakog lanca imunoglobulina u operativnoj vezi sa konstantnim regionom endogenog lakog lanca sadrži neuređene genske segmente varijabilnog regiona humanog Igλ. U nekim izvođenjima, neuređeni genski segmenti varijabilnog regiona humanog imunoglobulina sadrži mnoštvo humanih Vλ segmenata i jedan ili više humanih Jλ segmenata. U nekim izvođenjima, neuređeni genski segmenti varijabilnog regiona humanog imunoglobulina sadrže jedan ili više humanih Vλ segmenata, jedan ili više humanih Jλ segmenata, i jednu ili više sekvenci humanog Cλ konstantnog regiona. U nekim izvođenjima, neuređeni genski segmenti varijabilnog regiona humanog imunoglobulina sadrže svaki od humanih Vλ segmenata. U nekim izvođenjima, neuređeni genski segmenti varijabilnog regiona humanog imunoglobulina sadrže svaki od humanih Jλ segmenata. Primeri varijabilnih regiona koji sadrže Ig λ genske segmente su obezbeđeni, na primer, U. S. Pat. Nos. 9,035,128 i 6,998,514. U nekim izvođenjima, neuređeni humani (zovani) varijabilni region lakog lanca imunoglobulina u operativnoj vezi sa konstantnim regionom endogenog lakog lanca obuhvata (a) jedan ili više humanih Vλ genskih segmenata , (b) jedan ili više humanih Jλ genskih segmenata, i (c) jedan ili više humanih Cλ genskih segmenata, gde (a) i (b) su operativno u vezi sa (c) i endogenim (npr., glodarskim) Cλ genskim segmentom, i gde endogeni lokus λ lakog lanca imunoglobulina dalje obuhvata: jedan ili više glodarskih pojačivača λ lakog lanca imunoglobulina (Eλ), i jedan ili više pojačivača λ lakog lanaca imunoglobulina (Eλ), opciono koji sadrže tri humana Eλ.
[0220] U određenim izvođenjima, neuređeni humani(zovani) varijabilni region lakog lanca imunoglobulina u operativnoj vezi sa konstantnim regionom endogenog lakog lanca obuhvata neuređene genske segmente humanog Igλ varijabilnog regiona operativno vezane sa endogenim (npr., glodar, npr., pacov ili miš) Cκ genom tako da nehumana životinja eskprimira laki lanac imunoglobulina koji obuhvata sekvencu humanog λ varijabilnog domena koja je izvedena iz Vλ i Jλ genskih segmenata fuzionisanih sa endogenim κ konstantnim domenom, videti, npr., US Patent Br.9,226,484.
[0221] U nekim izvođenjima, varijabilni region imunoglobulina sadrži neuređene genske segmente varijabilnog regiona humanog imunoglobulina takođe uključuje intergenske sekvence humanog varijabilnog regiona imunoglobulina. U nekim izvođenjima, varijabilni region imunoglobulina uključuje intergenske sekvence varijabilog regiona nehumanog (npr., glodar, pacov, miš) Ig. U nekim izvođenjima, intergenska sekvenca je porekla endogene vrste.
[0222] U nekim izvođenjima, varijabilni region imunoglobulina je uređeni varijabilni region lakog lanca (univerzalni varijabilni region lakog lanca). U nekim izvođenjima, uređeni gen varijabilnog regiona Ig lakog lanca je humani uređeni gen varijabilnog regiona Ig lakog lanca. Primeri uređenih varijabilnih regiona lakog lanca Ig su obezbeđeni u, npr.,U.S. Patent Nos.: 9,969,814; 10,130,181, i 10,143,186 i U.S. Patent Pub. Nos.20120021409, 20120192300, 20130045492, 20130185821, 20130302836, and 20150313193. U nekim izvođenjima, glodar ("univerzalni laki lanac" organizam) koji sadrži varijabilni region univerzalnog lakog lanca je korišćen za proizvodnju bispecifičnih antitela . U nekim izvođenjima, kodirajuća sekvenca zajedničkog lakog lanca obuhvata jednu Yκ/Jκ sekvencu jednog uređenog lakog lanca humanog imunoglobulina operativno u vezi sa endogenim konstantnim regionom lakog lanca, gde jedna r Yκ/Jκ sekvencu jednog uređenog lakog lanca humanog imunoglobulina je ili (i) humana Vκ1-39/Jκ5 sekvenca koja sadrži humani Vκ1-39 genski segment spojen sa humanim Jκ5 genskim segmentom, ili (ii) humana Vκ3-20/Jκ1 sekvenca koja sadrži humani Vκ3-20 genski segment spojen sa humanim Jκ1 genskim segmentom .
[0223] U nekim izvođenjima, varijabilni region imunoglobulina je laki lanac i/ili težak lanac varijabilnog regiona imunoglobulina koji uključuje insercije i/ili zamene kodona za histidin naznačene da uvedu pH-zavisna svojstva vezivanja u antitelima koja su generisana za takav nehumani organizam. U nekim od takvih izvođenja, kodoni za histidine su insertovani i/ili zamenjeni u sekvencama nukleinskih kiselina koje kodiraju CDR3. Različiti lokusi takvih teških i/ili lakih imunoglobulina su obezbeđeni U.S. Patent Nos.9,301,510; 9,334,334; and 9,801,362 i U.S. Patent Application Publication No. 20140013456. U nekim izvođenjima, histidinom modifikovani uređeni human(izovani) varijabilni region lakog lanca u operativnoj vezi sa konstantnim regionom endogenog lakog lanca obuhvata jednu uređenu gensku sekvencu variajbilnog regiona lakog lanca humanog imunoglobulina koja sadrži sekvence humanih Vκ i Jκ segmenata, opciono gde sekvenca Vκ segmenta je izvedena iz Vκ1-39 ili Vκ3-20 genskog segmenta, i gde jedna uređena genska sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca humanog imunoglobilina obuhvata supstituciju od bar jednog kodona koji nije za histidin sekvence Vκ segmenta sa kodonom koji je za histidin koji je eksprimiran u položaju koji je izabran iz grupe koja se sastoji iz 105, 106, 107, 108, 109, 111 i njihove kombinacije (u skladu sa IMGT numerisanjem). U nekim izvođenjima, histidinom modifikovani neuređeni humani (zovani) varijabilni region teškog lanca u operativnoj vezi sa konstantnim regionom endogenog teškog lanca obuhvata neuređenu humani (zovanu) gensku sekvencu varijabilnog teškog lanca imunoglobulina koji sadrže u regionu za određivanje komplementarnosti 3 (CDR3) kodirajuću sekvencu (npr., u (humanom) DHgenskom segmentu modifikovanom da buse operativno u vezi sa 23-mer RSS) supstituciju od bar jednog kodona koji nije za histidin sa kodonom koji je za histidin ili inserciju od bar jednog kodona koji je za histidin. U nekim izvođenjima, neuređena humani (zovana) genska sekvenca varijabilnog regiona imunoglobulina obuhvata neuređeni humani VH, neuređeni humani DHor sintetički DHuključujući DHgenski segment operativno u vezi sa 23-mer RSS, i neuređene humane JHgenske segmenate, opciono gde je neuređeni humani DHili sintetički DHgenski segment ili DHgenski segment operativno u vezi sa 23-mer RSS obuhvata supstituciju od bar jednog kodona koji nije za histidin sa a kodonom koji je za histidin ili inserciju bar jednog kodona koji je za histidin. U nekim izvođenjima, histidinom modifikovani neuređeni humani (zovani) varijabilni region lakog lanca u operativnoj vezi sa konstantnim regionom endogenog teškog lanca obuhvata neuređeni VLi neuređene JLgenske segmente. U nekim izvođenjima, histidinom modifikovani neuređeni humani (zovani) varijabilni region lakog lanca obuhvata ne više od dva neuređena humana VL(npr., ne više od dva Vκ genska segmenta) i jedan ili više neuređenih humanih JL(npr.,Jκ) genskih segmen(t)a, gde svaki od ne više od dva humana VLgenska segmenata obuhvata u CDR3 kodirajućoj sekvenci supstiticiju od bar jednog kodona koji nije za histidin sa kodonom koji je za histidin ili inserciju bar jedog kodona koji je za histidin. U nekim izvođenjima, ne više od dva neuređena humana Vκ genska segmenta su humani Vκ1-39 i Vκ3-20 genski segmenti svaki koji sadrže jednu ili više supstitucija kodina koji nije za histidin sa kodonom koji je za histidin, i gde humani Vκ i Jκ genski segmenti su sposobni za uređenje i humani Vκ i Jκ genski segmenti kodiraju varijabilni domen humanog lakog lanca koji sadrži jedan ili više histidina u položaju koji je izabran iz grupe koja se sastoji iz 105, 106, 107, 108, 109, 111 (prema IGMT numerisanju), i njihova kombinacija, gde jedan ili više histidina su izvedeni iz jedne ili više supstitucija.
[0224] U nekim izvođenjima, konstantni region imunoglobulina obuhvata gen za konstantni region teškog lanca. U nekim izvođenjima, gen konstantnog regiona teškog lanca je humani gen konstantnog regiona teškog lanca. U nekim izvođenjima, gen konstantog regiona teškog lanca je porekla endogenih vrsta. U nekim izvođenjima, gen konstantog regiona teškog lanca je mišji gen konstantnog regiona ili gen konstantnog regiona pacova. U nekim izvođenjima, gen konstantnog regiona je mešavina humane i nehumane sekvence. Na primer, u nekim izvođenjima, gen konstantnog regona kodira humani CH1 region i nehumani (npr., porekla endogene vrste, miš, pacov) CH2 i/ili CH3 region. U nekim izvođenjima, gen konstantog regiona teškog lanca je C μ, Cδ, Cγ (Cγ1, Cγ2, Cγ3, Cγ4), Cα ili Cε gen konstantnog regiona. U nekim izvođenjima, konstantni region gena je endogeni konstantni region gena. U nekim izvođenjima, gen konstantnog regiona kodira za mutirani CH1 region tako da nehumana životinja eksprimira samo teški lanac antitela (videti., npr.,U.S. Patent No. 8,754,287, U.S. Patent Application Publication No.2015/0289489). U nekim izvođenjima, npr., u kojima je cilj generisati teške lance da bi se dobila bispecifična antitela (npr., u zajedničkim ili organizmima sa dvostrukim lakim lancima), Fc domeni teških lanaca sadrže modifikacije da bi se olakšalo obrazovanje heterodimera teškog lanca i/ili da bi se inhibiralo obrazovanje homodimera teškog lanca. Takve modifikacije su obezbeđene, na primer, in U.S. Pat. Br-a.5,731,168; 5,807,706; 5,821,333; 7,642,228 i 8,679,785 I u U.S. Pat. Pub. No.2013/0195849.
[0225] U nekim izvođenjima, konstantni region imunoglobulina obuhvata gen za konstantni region lakog lanca. U nekim izvođenjima, gen konstantnog regiona lakog lanca je κ gen konstantnog regiona. U nekim izvođenjima, gen konstantnog regiona lakog lanca je gen λ konstantnog regiona. U nekim izvođenjima, gen konstantnog regiona lakog lanca je porekla endogenih vrsta. U nekim izvođenjima, gen konstantnog regiona lakog lanca je gen mišjeg konstantog regiona ili gen konstantnog regiona pacova. U nekim izvođenjima, gen konstantnog regiona lakog lanca je mešavina humane i nehumane sekvence.
[0226] U nekim izvođenjima, varijabilni region imunoglobulina koji sadrži genske segmente humanog varijabilnog regiona i gen za konstantni region imunoglobulina sa kojim su varijabilni regioni genskih segmenata operativno u vezi su locirani u endogenom immunoglobulinskom lokusu. U nekim izvođenjima, endogeni imunoglobulinski lokus je endogeni lokus teškog lanca. U nekim izvođenjima, endogeni imunoglobulinski lokus je endogeni κ lokus. U nekim izvođenjima, endogeni imunoglobulinski lokus je endogeni λ lokus. U nekim izvođenjima, konstantni region gena sa kojim su genski segmenti humanog varijabilnog regiona operativno u vezi je gen endogenog konstantnog regiona.
[0227] U nekim izvođenjima, jedan ili više endogenih lokusa imunoglobulina ili deo jednog ili više endogenih lokua (npr., varijabilni region i/ili konstantni region) u ovde obezbeđenom genomu glodara je inaktivisan. Endogeni lokusi gena varijabilnog regiona imunoglobulina i njihovi delovi se mogu inaktivisati korišćenjem bilo kog postupka koji je poznat u oblasti tehnike, uključujući, ali bez ograničenja na, deleciju lokusa ili njegov deo genoma organizma, zamenu lokusa ili njegovog dela sa različitom sekvencom nukleinske kiseline, inverzijom dela lokusa i/ili izmeštanjem dela lokusa na drugu poziciju u genomu nehumanog organizma. U nekim izvođenjima inaktivacija lokusa je samo delimična inaktivacija. U nekim izvođenjima, varijabilni region lokusa je inaktivisan ili konstantni regiom ostaje funkcionalan (npr., zbog toga je operativno u vezi sa ne-endogenim genskim segmentima varijabilnog regiona).
[0228] U nekim izvođenjima, genetički modifikovani glodar uključuje inaktivisani endogeni lokus teškog lanca imunoglobulina. U nekim izvođenjima, endogeni lokus teškog lanca imunoglobulina ili njegov deo je inaktivisan delecijom, zamenom, izmeštanjem i/ili inverzijom bar dela endogenog varijabilnog regiona endogenog lokusa teškog lanca. U nekim izvođenjima, bar deo varijabilnog regiona endogenog lokusa teškog lanca koji je deletiran, zamenjen, izmešten, i/ili invertovan obuhvata J segmente varijabilnog regiona. U nekim izvođenjima, endogeni lokus teškog lanca imunoglobulina ili njegov deo je inaktivisan delecijom, zamenom, izmeštanjem i/ili inverzijom bar delom endogenog konstantnog regiona endogenog lokusa teškog lanca. U nekim izvođenjima, bar deo konstantnog regiona endogenog lokusa teškog lanca koji je deletiran, zamenjen, izmešten, i/ili invertovan obuhvata Oµ gen endogenog konstantnog regiona.
[0229] U nekim izvođenjima, genski modifikovani glodar uključuje inaktivisani endogeni lokus κ lanca imunoglublina. U nekim izvođenjima, endogeni lokus κ lanca imunoglobulina ili njegov deo je inaktiviran delecijom, zamenom, izmenom i/ili inverzijom bar dela endogenog varijabilnog regiona loksa endogenog κ lanca. U nekim izvođenjima, bar deo varijabilnog regiona u lokusu endogenog κ lanca koji je deletiran, zamenjen, izmenjen, i/ili invertovan obuhvata J segmente varijabilnog regiona. U nekim izvođenjima, lokus endogenog κ lanca imunoglobulina ili njegov deo je inaktiviran delecijom, zamenom, izmenom i/ili inverzijom bar dela endogenog konstantnog regiona lokusa endogenog κ lanca. U nekim izvođenjima, bar deo konstantnog regiona lokusa endogenog κ lanca koji je deletiran, zamenjen, izmenjen, i/ili invertovan obuhvata Cκ gen endogenog konstantnog regiona.
[0230] U nekim izvođenjima, genski modifikovani glodar uključuje inaktivisani endogeni lokus λ lanca imunoglublina. U nekim izvođenjima, endogeni lokus λ lanca imunoglobulina ili njegov deo je inaktiviran delecijom, zamenom, izmenom i/ili inverzijom bar dela endogenog varijabilnog regiona loksa endogenog λ lanca. U nekim izvođenjima, bar deo od bar jednog V-J-C klastera gena u lokusu endogenog λ lanca je deletiran, zamenjen, izmenjen, i/ili invertovan. U nekim izvođenjima, lokus endogenog λ lanca imunoglobulina ili njegov deo je inaktiviran delecijom, zamenom, izmenom i/ili inverzijom bar dela endogenog konstantnog regiona lokusa endogenog λ lanca. U nekim izvođenjima, bar deo konstantnog regiona lokusa endogenog λ lanca koji je deletiran, zamenjen, izmenjen, i/ili invertovan obuhvata C gen endogenog konstantnog regiona.
[0231] U različitim izvođenjima, modifikacije lokusa imunoglobulina nemaju uticaja na fertilitet glodara. U nekim izvođenjima, lokus teškog lanca obuhvata funkcionalni, npr., endogeni ADAM6a gen, ADAM6b gen, ili oba, i genska modifikacija nema uticaja na ekspresiju i/ili funkciju endogenog ADAM6a gena, ADAM6b gena, ili oba. U nekim izvođenjima, genom genski modifikovanog glodara dalje obuhvata ektopično locirani funkcionalni, npr., endogeni ADAM6a gen, ADAM6b gen, ili oba. Primeri glodara koji eksprimiraju egzogeni ADAM6a i/ili ADAM6b opisani su u U.S. Pat. Nos.8,642,835 i 8,697,940.
[0232] U nekim izvođenjima, genetički modifikovani glodar dalje obuhvata i eksprimira egzogenu terminalnu deoksinukleotidil transferazu (TdT) za povećanu raznolikost antigenskog receptora. Primer nehumanih životinja koje eksprimiraju egzogenu TdT opisane su u PCT Objavi WO 2017210586.
[0233] U nekim izvođenjima, genom obezbeđenog glodara dalje obuhvata jedan ili više humanih gena za teški i/ili laki lanac imunoglobulina (videti, npr.,U.S. Patent Br.8,502,018; U.S.
[0234] Patent No. 8,642,835; U.S. Patent No. 8,697,940; U.S. Patent No: 8,791,323; i U.S. Patent Application Publication Nos. 2013/0096287 A1 i 2018/0125043 A1; i PCT Publication No. WO2019/113065). Alternativno, modifikovani DHregion može biti uveden u embrionalnu matičnu ćeliju različitog modifikovanog soja kao što je, npr., VELOCIMMUNE<®>soj (videti, npr., U.S. Patent No.
8,502,018 ili U.S. Patent No.8,642,835). U nekim izvođenjima, glodari kao što je ovde opisano mogu se dobiti uvođenjem vektora za ciljanje kao što je ovde opisano, u ćeliju ili modifikovani soj. Da bi se dao jedan primer, vektor za ciljanje kao što je ovde opisano, može biti uveden u glodara kao što je opisano u U.S. Patent Nos. 8,642,835 i 8,697,940, pri čemu glodar eksprimira antitela koja imaju potpuno humane varijabilne regione i mišje konstantne regione. U nekim izvođenjima, glodari kao što je ovde opisano su pripremljeni da dalje sadrže humane imunoglobulinske gene (gene za varijabilni i/ili konstantni region). U nekim izvođenjima, glodari kao što je ovde opisano sadrže modifikovani DHregion kao što je ovde opisano, i genski materijal heterolognih vrsta (npr.,humanih bića), pri čemu genski materijal kodira, u celosti ili deo, jedan ili više humanih varijabilnih regiona teškog i/ili lakog lanca.
[0235] Glodari kao što je ovde opisano mogu se dobiti kao što je gore opisano, ili korišćenjem postupaka poznatih u oblasti tehnike, da sadrže dodatne humane ili humanizovane gene, često u zavisnosti od namenjene upotrebe glodara. Genski materijal takvih dodatnih humanih ili humanizovanih gena može biti uveden kroz dalju izmenu genoma ćelija (npr., embrionalnih matičnih ćelija) koje imaju genske modifikacije kao što je opisano gore u tekstu ili kroz postupka za razmnožavanje koji su poznati u oblasti tehnike sa drugim genski modifikovanim sojevima po potrebi.
[0236] Na primer, kao što je ovde opisano, glodari koji sadrže modifikovani DHregion mogu dalje sadržati (npr., unakrsnim razmnožavanjem ili strategijama ciljanja brojnih gena) jednu ili više modifikacija kao što je opisano u U.S. Patent Application Publication Nos. 2011-0195454 A1, 2012-0021409 A1, 2012-0192300 A1, 2013-0045492 A1, 2013-0185821 A1, 2013-0198880 A1, 2013-0302836 A1, 2015-0059009 A1; International Patent Application Publication Nos. WO 2011/097603, WO 2012/148873, WO 2013/134263, WO 2013/184761, WO 2014/160179, WO 2014/160202.
[0237] Transgeni osnivač glodar može se identifikovati na osnovu prisustva modifikovanog DHregiona u njegovom genomu i/ili ekspresiji antitela koja uključuje CDR3 regione koji sadrže aminokiseline koje su rezultat DH-DHrekombinacije u tkivima ili ćelijama nehumane životinje. Transgeni osnivački glodar može nakon toga da se koristi za razmnožavanje dodatnih glodara koji nose modifikovani DHregion time stvarajući serije ne-glodara u kojima svaki nosi jedan ili više kopija modifikovanog DHregiona. Osim toga, transgeni glodari koji nose modifikovani DHregion mogu dalje da se razmnožavaju sa drugim transgenim glodarima koji nose druge transgene (npr., gene humanog imunoglobulina) po potrebi.
[0238] Glodari mogu takođe biti proizvedeni sa sadrže odabrane sisteme koji omogućuju regulisanu usmerenu ekspresiju transgena. Primeri Sistema uključuju Cre/loxP sistem rekombinaza bakteriofaga PI (videti, npr., Lakso, M. et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6232-6236) i FLP/Frt sistem rekombinaza S. cerevisiae (O’Gorman, S. et al, 1991, Science 251:1351-1355). Takve životinje mogu biti obezbeđene konstruisanje "dvostrukih" transgenih žiivotinja, npr., parenjem dve transgene životinje, jedna koja sadrži transgen koji sadrži odabranu modifikaciju (npr., modifikovani DHregion) i druga koja sadrži tansgen koji kodira za rekombinazu (npr., Cre rekombinaza).
[0239] Iako izvođenja koja koriste modifikovani DHregion kod miševa (tj., miš sa modifikovanim DHregionom operativno u vezi sa humanim VHi JHgenskin segmentima, gde su svi operativno u vezi sa jednim ili više genima konstantnog regona teškog lanca miša) ovde su detaljno razmtrani, drugi glodari koji sadrže modifikovani DHregion su takođe obezbeđeni. U nekim izvođenjima, takvi glodari sadrže modifikovani DHregion operativno u vezi sa endogenim VHi JHgenskim segmentima. U nekim izvođenjima, takvi ne-glodari sadrže modifikovani DHregion operativno u vezi sa humanizovanim VHi JHgenskim segmentima. Such glodari uključuju bilo koji od onih koji mogu biti genetički modifikovani da eksprimiraju antitela sa CDR3s koja uključuju aminokiseline koje nastaju od DH-DHrekombinacije u povećanoj učestalosti u poređenju sa divljim tipom lokusa teškog lanca imunoglobulina kao što je ovde opisano, uključujući, npr., miša, pacova, itd. Na primer, za ove glodare za koje su pogodnepodložne modifikaciji ES ćelije nisu odmah dostupne, drugi postupci su korišćeni da bi se dobila nehumana životinja koja sadrži gensku modifikaciju. Takvi postupci uključuju, npr., modifikovanje ne-ES ćelijskog
1
genoma (npr., fibroblasta ili indukovane pluripotentne ćelije) i korišćenje somatskog ćelijskog nukleusnog transfera (SCNT) da bi se izvršio transfer genski modifikovanog genoma u odgovarajuću ćeliju, npr., oocit bez nukleusa, i gestiranje modifikovane ćelije (npr., modifikovanog oocita) u glodaru pod pogodnim uslovima da se obrazuje embrion.
[0240] Postupci za modifikovanje nehumanog životinjskog genoma (npr., svinje, krave, glodara, kokoši, itd.) uključuju, npr., korišćenje nukleaze sa cinkanim prstima (ZFN), aktivatora transkripcijesličnog efektorskoj nukleazi (TALEN) ili Cas proteina (tj., CRISPR/Cas sistem) da bi se genom modifikovano da uključi modifikovani DHregion kao što je ovde opisano. Uputstva za postupke modifikovanja germinativnog genoma nehumane životinje mogu se naći u, npr., U.S. Objavi prijave patenta br.2015-0376628 A1, US 2016-0145646 A1 i US 2016-0177339 A1.
[0241] U nekim izvođenjima, glodar kao što je ovde opisano je izabran iz miša, pacova, i hrčka. U nekim izvođenjima, glodar kao što je ovde opisano je izabran iz superfamilije Muroidea. U nekim izvođenjima, genetički modifikovana životinja kao što je ovde opisano je iz familije koja je odabrana iz Calomyscidae (npr., mišoliki hrčci), Cricetidae (npr., hrčak, pacovi i miševi Novog sveta, volovke), Muridae (pravi miševi i zečevi, gerbili, bodljasti miševi, grivasti pacovi), Nesomyidae (planinski miševi, miševi stenovitih predela, “with-tailed” pacovi, Malagasy pacovi i miševi), Platacanthomyidae (npr., “spiny dormice!), i Spalacidae (npr., pacovi krtice, “bamboo” pacovi, i zokori). U nekim izvođenjima, genetički modifikovani glodar kao što je ovde opisano je izabran i pravog miša ili pacova (familija Muridae), gerbila, bodljastih miševa, i grivastih pacova. U nekim izvođenjima, genetički modifikovani miš kao što je ovde opisano je član familije Muridae. U nekim izvođenjima, glodar kao što je ovde opisano je izabran iz miša ili pacova. U nekim izvođenjima, glodar kao što je ovde opisano je miš.
[0242] U nekim izvođenjima, glodar kao što je ovde opisano je glodar koji je miš iz soja C57BL izabran od C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr, i C57BL/Ola. U nekim izvođenjima, miš iz predmetnog pronalaska je 129-soja izabran iz grupe koja se sastoji iz soja koji je 129P1, 129P2, 129P3, 129X1, 129S1 (npr.,129S1/SV, 129S1/SvIm), 129S2, 129S4, 129S5, 129S9/SvEvH, 129/SvJae, 129S6 (129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129T1, 129T2 (videti, npr., Festing et al., 1999, Mammalian Genome 10:836; Auerbach, W. et al., 2000, Biotechniques 29(5):1024-1028, 1030, 1032). U nekim izvođenjima, genetički modifikovani miš kao što je ovde opisano je mešavina prethodno pomenutog 129 soja i prethodno pomenutog C57BL/6 soja. U nekim izvođenjima, miš kao što je ovde opisano je mešavina prethodno pomenutih 129 sojeva, ili je mešavina prethodno pomenutih BL/6 sojeva. U nekim izvođenjima, 129 soj mešavine kao što je ovde opisano je 129S6 (129/SvEvTac) soj. U nekim izvođenjima, miš kao što je ovde opisano je BALB soj, npr., BALB/c soj. U nekim izvođenjima, miš kao što je ovde opisano je mešavina BALB soja i drugog pomenutog soja.
[0243] U nekim izvođenjima, glodar kao što je ovde opisano je pacov. U nekim izvođenjima, pacov kao što je ovde opisano je izabran od Wistar pacova, LEA soja, Sprague Dawley soja, Fischer soja, F344, F6, i Dark Agouti. U nekim izvođenjima, soj pacova kao što je ovde opisano je mešavina dva ili više soja koja su izabrana iz grupe koja se sastoji iz Wistar, LEA, Sprague Dawley, Fischer, F344, F6, i Dark Agouti.
2
Postupci
[0244] Nekoliko in vitro i in vivo postupaka je razvijeno za proizvodnju terapeutika koji su zasnovani na antitelima. Posebno, in vivo postupci se karakterišu proizvodnjom transgenih životinja (tj., glodara) koji sadrže humane imunoglobulinske gene ili slučajno ubačene u genom životinje (npr., videti U.S. Patent Br.5,569,825) ili precizno postavljene u endogenom lokusu imunoglobulina u operativnoj vezi sa endogenim konstantnim regionima imunoglobulina životinje (npr., videti U.S. Patent br-e.
8,502,018; 8,642,835; 8,697,940; i 8,791,323). Oba pristupa su bila produktivna u proizvodnji obećavajućih terapeutskih kandidata antitela za upotrebu kod humanih bića. Dalje, oba pristupa imaju prednost tokom in vitro pristupa u tome što su kandidati antitela izabrani od repertoara antitela koja su generisana in vivo, koja uključuju selekciju za afinitet i specifičnost za antigen unutar unutrašnjeg miljea imunog sistema domaćina. Na ovaj način, antitela se vežu za antigen koji se nalazi u prirodi (unutar relevantnih bioloških epitopa i površina) radije u odnosu na veštačko okruženje ili in silico predviđanja koje mogu da prate in vitro tehnologije. Pored robustnog repertoara antitela proizvedenog sa in vivo postupcima, antitela na komplekse (npr., viruse, polypeptide kanala) ili antigene u citoplazmi ostaju teški. Dalje, generisanje antitela na polipeptide koji dele visok stepen identiteta u sekvenci između vrsta (npr., humano biće i miš) ostaje izazov zbog imunske tolerancije.
[0245] Prema tome, predmetni pronalazak je, među ostalim stvarima, zasnovan na prepoznavanju da konstruisanje in vivo sistema koji se karakteriše proizvodnjom antitela koja imaju dodatnu raznolikost u CDRs, posebno, CDR3s, generisani od ne-tradicionalnim uređenjem genskog segmenta (tj., DHsa DHrekombinacija) može se dobiti korišćenjem jednog ili više DHsegmenata pri čemu su svaki operativno u vezi sa 5’ ili 3’ 23-mer RSS. Imajući 5’ ili 3’ 23-mer RSS, rekombinacija između DHsegmenata je povećana u poređenju sa lokusom teškog lanca imunoglobulina kome nedostaje takvi modifikovani DHgenski segmenti. Takva dodata raznolikost može usmeriti vezivanje sa određenim antigenima (npr., virusi, polipeptidi kanala). Nakon rekombinacije VHgenskog segmenta, bar dva DHgenska segmenta, i JHgenski segment, kodirajuća sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca je obrazovana koja sadrži CDR3 region koji ima aminokiselinsku sekvencu koja nastaje od DH-sa-DHrekombinacije. Osim toga, ovaj CDR3 koji nastaje iz DHsa DHrekombinacijom sadrži dodatnu raznolikost zbog povećane dužine aminokiselina. Osim toga, takav CDR3 region ima sposobnost da usmeri vezivanje sa određenim antigenom (ili epitopom) koji je na drugi način nije sposoban da se veže za antitelo koje je generisano tradicionalnom VDJ rekombinacijom.
[0246] Obezbeđeni glodari mogu biti korišćeni za dobijanje humanog antitela, pri čemu humano antitelo obuhvata varijabilne domene izvedene iz jedne ili više sekvenci nukleinskih kiselina koje su kodirane sa genetičkim materijalom ćelije glodara kao što je ovde opisano. Na primer, obezbeđeni glodar je imunizovan sa antigenom od interesa (npr., virus ili polipeptid kanala, u celosti ili deo) pod uslovima i u vremenu dovoljnom da glodar razvije imuni odgovor na pomenuti antigen od interesa. Antitela su izolovana iz glodara (ili jedna ili više ćelija, na primer, jedna ili više B ćelija) i karakterisana su korišćenjem različitih testova kojima se meri, na primer, afinitet, specifičnost, mapiranje epitopa, sposobnost za blokiranje interakcije liganda sa receptorom, inhibicije aktivacije receptora, itd. U nekim izvođenjima, antitela koja su proizvedena od strane obezbeđenih glodara sadrže jedan ili više humanih varijabilnih domena koji su izvedeni iz jedne ili više nukleotidnih sekvenci humanih varijabilnih regiona koji su izolovani iz glodara. U nekim izvođenjima, antitela protiv leka (npr., anti-idiotip antitelo) mogu se razviti kod obezbeđenih glodara.
[0247] Glodari kao što je ovde opisano obezbeđuju unapređeni in vivo system i izvor bioloških materijala (npr., ćelija) za proizvodnju humanih antitela koja su korisna za različite testove. U nekim izvođenjima, obezbeđeni glodari su korišćeni da bi se razvili terapeutici koji ciljaju jedan ili više virusa i/ili moduliraju aktivnost virusa i/ili moduliraju interakcije virusa sa drugim vezujućim partnerima (npr., receptor na ćelijskoj površini). U nekim izvođenjima, obezbeđeni glodari su korišćeni da bi se razvili terapeutici koji ciljaju jedan ili više proteina kanala i/ili moduliraju aktivnost proteina kanala i/ili moduliraju interakcije proteina kanala sa drugim vezujućim partnerima. U nekim izvođenjima, obezbeđeni glodari su korisni za identifikovanje, skrining i/ili razvoj kandidata terapeutika (npr., antitela, siRNK, itd.) koji se vežu za jedan ili više virus, kanal ili polupeptidima receptora kuplovanog sa G-proteinom (GPCR). U nekim izvođenjima, obezbeđeni glodari su korišćeni za skrining i razvoj kandidata terapeutika (npr., antitela, siRNK, itd.) koja blokiraju aktivnost jednog ili više polipeptida virusa, jednog ili više polipeptida humanih kanala ili jednog ili više humanih GPCR polipeptida. U nekim izvođenjima, obezbeđeni glodari su korišćeni za određivanje profila vezivanja antagonista i/ili agonista jednog ili više humanih GPCR polipeptida ili jednog ili više polipeptida humanih kanala. U nekim izvođenjima, obezbeđeni glodari su korišćeni za određivanje jednog ili više epitopa jednog ili više kandidata terapeutskih antitela koja vežu jedan ili više humanih GPCR polipeptida ili koja vežu jedan ili više polipeptida humanih kanala.
[0248] U nekim izvođenjima, obezbeđeni glodari su korišćeni za određivanje farmakokinetičkih profila antitela. U nekim izvođenjima, jedan ili više obezbeđenih glodara i jedan ili više kontrola ili referentih glodara su svaki izloženi jednom ili više kandidatu terapeutskog antitela u promenjivim dozaam (npr., 0.1 mg/kg, 0.2 mg/kg, 0.3 mg/kg, 0.4 mg/kg, 0.5 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/mg, 7.5 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 40 mg/kg, or 50 mg/kg ili više). Kandidati terapeutskih antitela mogu se dozirati bilo kojim pogodnim načinom davanja uključujući parenteralne i ne-parenteralne načine davanja. Parenteralni načini uključuju, npr., intravenozni, intraarterialni, intraportalni, intramuskularni, subkutanozni, intraperitonealni, intraspinalni, intratekalni, intracerebroventrikularni, intrakranijalni, intrapleuralni ili druge načine injekcija Neparenteralni načini uključuju, npr., oralni, nazalni, transdermalni, pulmonarni, rektalni, bukalni, vaginalni, okularni. Davanje može biti neprekidnom infuzijom, lokalno davanje, implantima sa odloženim oslobađanjem (gelovi, membrane ili slično), i/ili intravenoznom injekcijom, npr., korišćenjem intravenozne kesice sa tečnosti. Krv je izolovana iz nehumanih životinja (humanizovane i kontrole) u raličitim vremenskim tačkama (npr., 0 hr, 6 hr, 1 dan, 2 dana, 3 dana, 4 dana, 5 dana, 6 dana, 7 dana, 8 dana, 9 dana, 10 dana, 11 dana, ili do 30 ili više dana). Mogu se izvesti različiti testovi kako bi se odredili farmakokinetički profili primenjenih kandidata terapetuskih antitela korišćenjem uzoraka koji su dobijeni iz glodara kao što je ovde opisano uključujući, ali bez ograničenja na, ukupne IgG, odgovora antitela protiv terapije, aglutinacija, itd.
[0249] U nekim izvođenjima, obezbeđeni glodari kao takvi su korišćeni za merenje terapeutskog efekta blokiranja ili aktivnosti modulacije ciljnog antigena i efekta na ekspresiju gena kao rezultata ćelijskih promena ili gustine ciljnog antigena na ćelijskoj površini (u slučaju receptora na ćelijskog površini) ćelija glodara kao što je ovde opisano. U nekim izvođenjima, obezbeđeni glodar ili njegove izolovane ćelije su izložene kandidatu terapeutiku koji se veže za antigen od interesa i, nakon narednog vremenskog perioda, analizirani za efekte u postupcima koji su zavisni od ciljnog antigena (ili interakcija), na primer, interakcija liganda sa receptorom ili signalizacija koja je povezana sa antigenom.
[0250] U nekim izvođenjima, obezbeđeni glodari su korišćeni za merenje terapeutskog efekta blokiranja ili modulacije aktivnosti kanala (ili signalizacije kanala, ili interakcija koje su posredovane kanalom, ili akcionim potenicijalima kanala) i efekta na ekspresiju gena kao rezultata ćelijskih promena ili gustine kanala u ćelijama glodara kao što je ovde opisano. U nekim izvođenjima, obezbeđeni glodari ili ćelije koje su od njih izolovane su izloženi kandidatu terapeutiku koji veže polipeptid humanog kanala (ili njegov deo) i, nakon narednog vremenskog perioda, analizirani za efekte u postupcima koji su zavisni od kanala (ili interakcija), na primer, interakcija liganda sa receptorom akcionim potenicijalima kanala.
4
[0251] U nekim izvođenjima, obezbeđeni glodari eksprimiraju antitela, prema tome ćelije, ćelijske linije, i ćelijske kulture se mogu generisati da služe kao izvor antitela za upotrebu u vezivanju i funkcionalnim testovima, npr., da bi se ispitalo za vezivanje ili funkciju antagonista ili agonista, posebno gde antagonist ili agonist je specifičan za humanu polinukleotidnu sekvencu ili epitop ili, alternativno, specifična za humanu polipeptidnu sekvencu ili epitop koji funkcioniše u interakciji ligand-receptor (vezivanje). U nekim izvođenjima, epitopi koji su vezani od strane kandidata terapeutskih antitela ili siRNK mogu se odrediti korišćenjem ćelija koje su izolovane iz obezbeđenih glodara.
[0252] U nekim izvođenjima, ćelije iz obezbeđenog glodara mogu se izolovati i korišćene na ad hoc osnovi ili se mogu održavati u kulturi za mnoge generacije. U nekim izvođenjima, ćelije iz obezbeđenog glodara su imortalizovane (npr., korišćenjem virusa) i održavane su beskonačno u kulturi (npr., u serijskim kulturama).
[0253] U nekim izvođenjima, glodari kao što je ovde opisano obezbeđuju in vivo sistem za dobijanje varijanti antitela koja vežu humani ciljni antigen. Takve varijante uključuju antitela koja imaju željenu funkcionalnost, specifičnost, nisku unakrsnu reaktivnost sa zajedničkim epitopom kojeg dele dva ili više humanih ciljnih antigena. U nekim izvođenjima, obezbeđeni glodari su korišćeni za dobijanje panela antitela da bi se dobile serije varijanti antitela koje se nakon toga izlažu skriningu za željenu ili unapređenu funkcionalnost.
[0254] U nekim izvođenjima, glodari kao što je ovde opisano provide obezbeđuju in vivo sistem za dobijanje biblioteka antitela. Takve biblioteke obezbeđuju izvor za sekvece varijabilnog regiona teškog i lakog lanca koje se mogu graftovati na različite Fc regione zasnovano na željenoj efektorskoj funkciji i/ili su korišćeni kao izvor za sarevanje afiniteta sekvenci varijabilnog regiona korišćenjem postupaka koji su poznati u oblasti tehnike (npr., mutageneza koja je usmerena na mesto, PCR sklon greškama, itd.).
[0255] U nekim izvođenjima, glodari kao što je ovde opisano obezbeđuju in vivo sistem za analizu ispitivanja leka ili vakcine. U nekim izvođenjima, kandidat lek ili vakcina mogu se isporučiti jednom ili više obezbeđenom glodaru, zatim sledi praćenje glodara da bi se odredio jedan ili više imunih odgovora na lek ili vakcinu, profil bezbednosti leka ili vakcine, ili efekat na bolest ili stanje i/ili jednog ili više simptoma bolesti ili stanja. Primeri postupaka koji su korišćeni za određivanje profila bezbednosti uključuju merenje toksičnosti, koncentracije optimalne doze, odgovora antitela (tj., protiv leka), efikasnost leka ili vakcine, i moguće faktore rizika. Takvi lekovi ili vakcine mogu biti unapređeni i/ili razvijeni kod takvih glodara.
[0256] Efikasnost vakcina dalje može biti određena brojnim različitim načinima. Ukratko, ovde opisani glodari su vakcinisani korišćenjem postupaka koji su poznati iz oblasti tehnike i zatim su izazvani sa vakcinom ili je vakcina primenjena u već inficiranim glodarima. Odgovor nehumanih životinja na vakcinu može se meriti praćenjem, i/ili izvođenjem jednog ili više testova na, glodar(ima)u (ili ćelijama koje su iz njih izolovane) da bi se odredila efikasnost vakcine. Odgovor glodar(a) na vakcinu je zatim upoređen sa kontrolnim životinjama, upotrebom jednog ili više merenja koji su poznati u oblasti tehike i/ili ovde opisani.
[0257] Efikasnost vakcina dalje može biti određena testovima neutralizacije virusa. Ukratko, nehumane životinje kao što je ovde opisano su imunizovane i serum je sakupljen u različitim danima posle-imunizacije. Serijska razblaženja seruma su prethodno inkubirana sa virusom u vremenu u kome su antitela u serumu gde će antitela koja su specifična za virus njega vezati. Smeša virusa/seruma je nakon toga dodata permisivnim ćelijama da bi se odredila infektivnost pomoću testa plaka ili testa mikroneutralizacije. Ukoliko su antitela u serumu neutralizovala virus, prisutno je manje plaka ili niže relativne jednice luciferaze u poređenju sa kontrolnom grupom.
[0258] Glodari kao što je ovde opisano obezbeđuju unapređen in vivo sistem za razvijanje i karakterizaciju terapeutika koji su zasnovani na antitelu za upotrebu u kanceru i/ili inflamatornim bolestima. Inflamacija je dugo bila pridružena kanceru (za pregled dato u, npr., Grivennikov, S.I. et al., 2010, Cell 140:883-99; Rakoff-Nahoum, S., 2006, Yale J. Biol. Med. 79:123-30). Zaista, okruženje u kome se razvija tumor se karakteriše, delom, infiltriranjem različitih inflamatornih medijatora. Takođe, uporna inflamacija može voditi ka većoj verovatnoći za razvijanje kancera. Prema tome, u nekim izvođenjima, glodar kao što je ovde opisano obezbeđuje in vivo sistem za razvijanje i/ili identifikaciju terapeutika protiv kancera i/ili protiv zapaljenja. U nekim izvođenjima, obezbeđeni glodari ili kontrole glodara (npr., imaju genetičku modifikaciju koja se razlikuje od one koja je ovde opisana ili nemaju genetičku modifikaciju, tj., divlji tip) mogu se implantirati sa tumorom (ili tumorskim ćelijama), nakon čega sledi davanje jednog ili više kandidata terapeutika. U nekim izvođenjima, kandidati terapeutici mogu uključiti multispecifično antitelo (npr., bispecifično antitelo) ili koktel antitela. U nekim izvođenjima, kandidati terapeutici uključuju kombinovanu terapiju kao što je, na primer, davanje dve ili više monospecifična antitela dozirana sekvencijalno ili istovremeno. Tumoru može biti omogućeno dovoljno vreme da se uspostavi na jednoj ili više lokacija unutar nehumane životinje pre davanja jednog ili više kandidata terapeutika. Proliferacija ćelija tumora, rast, preživljavanje, itd. može se izmeriti i pre i nakon primene kandidata terapeutik(a). Citotoksičnost kandidata terapeutika može se takođe meriti u glodaru po potrebi.
Kitovi
[0259] Takođe je prikazano pakovanje ili kit koje sadrži jedan ili više kontejnera napunjenih sa bar jednim nehumanim animalnim, nehumanom ćelijom, fragmentom DNK, i/ili vektorom za ciljanje kao što je ovde opisano. Kitovi se mogu koristiti u bilo kom primenjivom postupku (npr., postupku za istraživanje). Opciono povezani sa takvim kontejnerom(ima) može biti obaveštenje u obliku prepisanom od strane državne agencije kojim se reguliše dobijanje, upotreba ili prodaja farmaceutika ili bioloških proizvoda, gde se obaveštenje o(a) odobrenje agenije za dobijanje, upotrebu ili prodaju za humanu primenu, (b) smernice za upotrebu, ili oba, ili ugovor koji reguliše transfer materijala i/ili bioloških proizvoda (npr., glodar ili ćelija glodara kao što je ovde opisano) između dva ili više entiteta.
[0260] Druge karakteristike iz pronalaska će biti očigledne tokom sledećeg opisa iz primera izvođenja, koja su data za ilustraciju i nisu namenjena da ih ograniče.
PRIMERI
[0261] Primeri koji slede su obezbeđeni da bi osobi koja je uobičajeno verzirana u stanje tehnike opisali kako se mogu napraviti i koristiti postupci i kompozicije iz pronalaska, i nisu namenjeni da ograniče obim onoga što pronalazači smatraju svojim pronalaskom. Osim ukoliko nije drugačije naznačeno, temperatura je označena u stepenima celzijusa, i pritisak je na ili blizu atmosferskom.
Primer 1. Dizajn i konstrukcija vektora za ciljanje
[0262] Ovaj primer ilustruje konstrukciju vektora za ciljanje za inserciju u genom nehumane životinje kao što je glodar (npr., miš). Posebno, postupci koji su opisani u ovom primeru pokazuju da proizvodnja vektora za ciljanje za inserciju u genom glodara (npr., miš) embrionalnih (ES) matičnih ćelija da bi se proizveo glodar čiji genom obuhvata varijabilni region teškog lanca imunoglobulina that uključuje modifikovani region raznolikosti teškog lanca (DH) , gde modifikovani DHregion uključuje jedan ili više DHsegmenta gde su svaki operativno u vezi sa 5’ ili 3’ 23-mer RSS. U ovom primeru, opisana su tri vektora za ciljanje: prvi vektor za ciljanje koji sadrži modifikovani DHregion that uključuje proksimalni (ili 3’) DHsegment operativno u vezi sa 5’ 23-mer RSS i operativno u vezi sa jednim humanim JHsegment, drugi vektor za ciljanje koji sadrži modifikovani DHregion koji uključuje proksimalni (ili 3’) DHsegment operativno u vezi sa 5’ 23-mer RSS i operativno u vezi sa tri humana JHsegmenta, i treći vektor za ciljanje koji sadrži modifikovani DHregion koji uključuje tri DHsegmenta svaki povezan sa 3’ 23-mer RSS i operativno u vezi sa šest humanim JHsegmentima (Slika 2). Svaki od ovih vektora za ciljanje je generisan i odvojeno insertovan u humanizovani varijabilni region teškog lanca imunoglobulina (Slike 3, 5, 7). Kao što je opisano u tekstu ispod, modifikovani DHregion je postavljen u operativnoj vezi sa varijabilnim teškim (VH) i segmentima za spajanje teškog lanca (JH) tako da, nakon VDJ rekombinacije antitela koja imaju CDR3s koja se dobijaju od DH-DHrekombinacije se eksprimiraju.
[0263] Vektori za ciljanje koji sadrže jedan ili više humanih DHsegmenata svaki povezan sa 5’ ili 3’ 23-mer RSS za inserciju u varijabilni region teškog lanca imunoglobulina su kreirani korišćenjem VELOCIGENE<®>tehnologije (videti, npr., Patent Br.6,586,251 i Valenzuela et al., 2003, Nature Biotech.
21(6):652-659) i molekularno bioloških postupaka koji su poznati u oblasti tehnike. Postupci koji su opisani u ovom primeru mogu se koristiti za upotrebu bilo kog DHsegmenta, set DHsegmenata, ili kombinacije DHsegmenata po potrebi.
A.23:DH3-3:12/JH6 vektor za ciljanje (Slika 2)
[0264] Ukratko, prvi vektor za ciljanje je konstruisan korišćenjem fragmenta genomske DNK koji sadrži mnoštvo humanih DHsegmenata i sintetički humani DH3-3 segment pozicioniran umesto humanog DH7-27. Donor zа in vitro Cas9/GA modifikaciju je dobijen preko de novo sinteze (Blue Heron Bio) i sadrži od 5’ k 3: (a) 100 bp krak homologije počev od 350 bp ushodno od 5’ 12-mer RSS DH7-27 (b) AgeI i XhoI mesta za inserciju kasete za rezistenciju na neomicin, (c) 250bp region ushodno od 5’-kraja 12 RSS DH7-27, (d) a sintetički humani DH3-3 segment modifikovani sa 5’krajem 23-mer RSS (od JH4) i 3’krajem 12-mer RSS (od DH3-3), i (3) 100bp “homology box” počev od 3bp nishodno od JH5. loxp-UbC-Em7-Neo-loxp kaseta, npr., gen za rezistenciju na neomicin sa loxP mesto-specifičnim mestima za prepoznavanje rekombinaze u odnosu na bočne strane, pozicioniran je ~250bp ushodno od sintetičkog DHsegmenta i nishodno spajanjem u AgeI i XhoI mesta da bi se omogućila selekcija E. coli i mišjih ES ćelija. Ovaj 23:DH3-3:12/JH6 donor (SEQ ID NO:61) uključujući kasetu neomicina je korišćen za modifikovanje BAC sa in vitro Cas9/GA korišćenjem dva Cas9:gRNK kompleksa. Pre modifikovanja, BAC je bio identičan u sekvenci sa himernim IgH lokusom VELOCIMMUNE<®>miševa (videti, npr., Slike 3 i 4, koje pokazuju primer ne-ograničavajućeg endogenog lokus teškog lanca imunoglobulina VELOCIMMUNE<®>miša koji je heterozigot za 6394 alel koji sadrži humanizovani varijabilni region kome nedostaju JHgenski segmenti i je operativno u vezi sa sekvencom endogenog mišjeg konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina i 1460 alel koji sadrži humanizovani varijabilni region operativno u vezi sa sekvencom endogenog mišjeg konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina.). Specifično, BAC je identičan sa 1460 alelom počev od najviše proksimalnog humanog VHgena (VH6-1) i uključujući svih 27 humaneihDHgena, sve 6 humane JHgene, mišji IgH pojačivač introna (Em), mišji IgM region prekopčavanja (Sm), i prva 4 egzona mišjeg gena za IgM. BAC je takođe uključio kasetu za rezistenciju na streptomicin (spec) i ~29kb humane intergenske sekvence ushodno od VH6-1 gena. Humana-mišja veza he 222bp 3’ humanog JH6 gena i 490 bp 5’ u odnosu na mišji Em pojačivač. Insercija 23:D3-3:12/JH6 donora u BAC preko GA dovela je do finalnog 23:D3-3:12/JH6 vektora za ciljanje koji sadrži zamenu DH7-7 genskog segmenta sa modifikovanim 23:D3-3:12 segmentom i deleciju JH1, JH2, JH3, JH4, i JH5 genskih segmenata (Slika 2). Tabela 1 obezbeđuje sekvencu za gRNK, prajmere i probe koje su korišćene da se odredi precizna konstrukcija 23:DH3-3:12/JH6 vektora za ciljanje.
Tabela 1: Prajmer i sekvence gRNK za konstrukciju 23:DH3-3:12/JH6 vektora za ciljanje
[0265] 23 :D3-3:12/JH6 vektor za ciljanje je linearizovan sa NotI i elektroporisan u embrionalne matične ćelije koje imaju genom koji je heterozigot za humanizovani varijabilni region teškog lanca imunoglobulina (tj., alel prvog teškog lanca (1460het) koji se sastoji iz mnoštva humanih VH, DH, i JHsegmenata operativno u vezi sa konstantnim regionom teškog lanca imunoglobulina glodara uključujući pojačivače teškog lanca glodara i regulatorne regione, i sadrži insertovanu nukleotidnu sekvencu koja kodira jedan ili više mišjih Adam6 gena (npr.,U.S. Patent Nos.8,642,835 i 8,697,940); I alel drugog teškog lanca (6394het) koji se sastoji iz mnoštva humanih VHi DHsegmenata, deleciju JHregiona, i konstantni region teškog lanca imunoglobulina glodara uključujući pojačivače teškog lanca I regulatorne regione, i sadrži insertovanu nukleotidnu sekvencu koja kodira jedan ili više mišjih Adam6 gena (npr., Patent Nos.8,642,835 i 8,697,940)) i koji je homozigotan (HO) za humanizovani endogeni κ locus koji sadrži pun repertoar genskih segmenata Vκ i Jκ lakog lanca humanog imunoglobulina operativno u vezi sa endogenim mišjim Cκ regionom teškog lanca imunoglobulina (1293) (videti Slika 3).6799 alel je kreiran nakon elektroporacije i odgovarajuće homologne rekombinacije 1460 alela sa 23 :D3-3: 12/JH6 vektorom za ciljanje koji sadrži kasetu neomicina. (Slika 3). Ove modifikovane mišje ES ćelije heterozigoti za 6394 i 679 alele su korišćene kako bi se olakšao efikasan skrining pozitivnih ES klonova (videti ispod) i naknadno cre-posredovano uklanjanje kaseta za rezistenciju na lek, nakon čega je delecija 6394 i 6799 alela redom naznačena sa 6643 i 6800 (Slika 4).
B.23:DH3-3:12/JH4-6 vektorom za ciljanje (Slika 2)
[0266] Na sličan način, drugi vektor za ciljanje (23:DH3-3:12/JH4-6 ) je konstruisan korišćenjem istog genomskog fragmenta DNK koji se sastoji iz mnoštva humanih DHsegmenata i sintetičkog humanog DH3-3 segmenta pozicioniranog umesto humanog DH7-27. Međutim, ovaj drugi vektor za ciljanje uključuje tri od šest humanih JHsegmenata (tj., JH4, JH5, JH6). Da bi se kreirao finalni 23:DH3-3:12/JH4-6 vektor za ciljanje, donor je korišćen za modifikovanje BAC identičnog u sekvenci sa himernim IgH lokusom VELOCIMMUNE<®>miša (videti, npr., Slike 3 i 4, pokazuju primer ne-ograničavajućeg endogenog lokusa teškog lanca imunoglobulina VELOCIMMUNE<®>miša koji je heterozigot za 6394 alel koji sadrži humanizovani varijabilni region kome nedostaju JHgenski segmenti je operativno u vezi sa i endogenom sekvencom mišjeg konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina i 1460 alel koji sadrži humanizovani varijabilni region operativno u vezi sa endogenom sekvencom mišjeg konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina). Donor sadrži, od 5’ ka 3’: (a) 100bp “homology box” počev od 350bp ushodno od 5’-kraja 12 RSS D7-27, (b) AgeI i XhoI mesta za inserciju kasete za rezistenciju na neomicin, (c) 250bp region ushodno od 5’-kraja 12 RSS D7-27, (d) sintetički humani DH3-3 segment sa 23-mer RRS u odnosu na bočnu stranu 5’ (od JH4) i 12-mer RSS u odnosu na bočnu stranu 3’ (od DH3-3), i (e) 100bp “homology box” počev od 3bp nishodno od JH3. loxp-UbC-Em7-Neoloxp kaseta, npr., gen za rezistenciju na neomicina sa loxP mestom specifičnim mestom prepoznavanje rekombinacije u odnosu na bočne strane, je pozicioniran ~250bp ushodno od sintetičkog DHsegmenta spajajnjem u AgeI i XhoI mesta da bi se omogućila selekcija u E. coli i mišjim ES ćelijama. 23:D3-3:12/JH4-6 donor koji sadrži nukleotidnu sekvencu kao što je predstavljena u SEQ ID NO:52, uključujući kasetu neomicina, je korišćen za modifikovanje BAC identično u sekvenci sa 1460 alelom (Slike 3 i 4). Specifično, BAC je bio identičan sa 1460 alelom počev od najviše proksimalnog humanog VHgena (VH6-1) i uključujući svih 27 humanih DHgena, svih 6 humanih JHgena, mišji IgH pojačivač u intronu (Em), mišji IgM region prekopčavanja (Sm), i prva 4 egzona mišjeg IgM gena. BAC je takođe uključio kasetu sa rezistencijom na spektinomicin (spec) i ~29kb humane intergenske sekvence ushodno od VH6-1 gena. Humana mišja veza 222bp 3’ humaog JH6 gena i 490 bp 5’ mišjeg Em pojačivača. Insercija 23:D3-3:12/JH4-6 donora u BAC pomoću in vitro Cas9/GA korišćenjem dva Cas9:gRNK kompleksa dovela je do finalnog 23:D3-3:12/JH4-6 vektora za ciljanje (Slika 2) koji sadrži zamenu DH7-7 genskog segmenta sa modifikovanim 23:D3-3:12 segmentom i deleciju JH1, JH2, i JH3 genskih segmenata. Tabela 2 obezbeđuje sekvencu gRNK, prajmere i probe koji su korišćeni za određivanje precizne konstrukcije 23:DH3-3:12/JH6 vektora za ciljanje.
Tabela 2: Prajmer i gRNK sekvence za konstruisanje 23:DH3-3:12/JH4-6 vektora za ciljanje
[0267] The 23:D3-3:12/JH4-6 vektor za ciljanje je takođe linearizovan sa NotI i elektroporcijom uveden u mišje embrionalne matične ćelije koje imaju genom koji je heterozigotan za humanizovani varijabilni region teškog lanca imunoglobulina (tj., alel prvog teškog lanca (1460het) koji se sastoji iz mnoštva humanih VH, DH, i JHsegmenata operativno u vezi h sa konstantnim regionom teškog lanca imunoglobulina glodara uključujući pojačivače teškog lanca glodara i regulatorne regione, i sadrži insertovanu nukleotidnu sekvencu koja kodira jedan ili više mišjih Adam6 gena [npr.,U.S. Patent Br.-i.
8,642,835 i 8,697,940]; i alel drugog teškog lanca (6394het) koji se sastoji iz mnoštva humanih VHi DHsegmenata, delecije JHregiona, konstantnim regionom teškog lanca imunoglobulina glodara uključujući pojačivače teškog lanca glodara i regulatorne regione, i sadrži insertovanu nukleotidnu sekvencu koja kodira jedan ili više mišjih Adam6 gena [npr., Patent Br-i.8,642,835 i 8,697,940]) i koji je homozigotan (HO) za humanizovani endogeni κ lokus koji se sastoji iz punog repertoara Vκ i Jκ genskih segmenata lakog lanca humanog imunoglobulina operativno u vezi sa endogenim Cκ regionom teškog lanca mišjeg imunoglobulina (1293) (videti, Slika 5).6797 alel je kreiran nakon elektroporacije i odgovarajuće homologne rekombinacije 1460 alela sa 23:D3-3:12/JH4-6 vektorom za ciljanje koji sadrži kasetu neomicina. (Slika 5). Ove modifikovane mišje ES ćelije heterozigoti za 6394 i 6797 alele su korišćeni da bi se olakšao skrining pozitivnih ES klonova (videti u tekstu ispod) i naknadno creposredovano uklanjanje kaseta na rezistenciju na lek, nakon čega je delecija alela 6394 i 6797 redom naznačena sa 6643 i 6798 (Slika 6).
C. 12:DH2-2:23|12:DH2-8:23|12:DH2-15:23 /JH1-6 vektor za ciljanje (Slika 2)
[0268] Ukratko, treći vektor za ciljanje je konstruisan korišćenjem DNK fragmenta koji sadrži mnoštvo humaniih DHsegmenata koji su uključili tri DH2 familije genskih segmenata (DH2-2, DH2-8 i DH2-15) svaka ima 12-mer 5’ RSS i 23-mer 3’ RSS. Prvo, BAC identičan u sekvenci sa himernim IgH lokusom VELOCIMMUNE<®>miševa (videti, npr.,Slike 3 i 4, pokazuje primer ne-ograničavajućeg endogenog lokusa teškog lanca imunoglobulina VELOCIMMUNE<®>miša koji je heterozigot za 6394 alel koji sadrži humanizovani varijabilni region kome nedostaje JHgenskih segmenata i operativno je u vezi sa sekvencom endogenim mišjim teškim lancem konstantnog regiona imunoglobulina i 1460 alelom koji sadrži humanizovani variabilni region operativno u vezi sa imunoglobulinskom sekvencom mišjeg endogenog konstantnog regiona teškog lanca). Specificično, BAC je identičan sa 1460 alelom počev od najviše proksimalnog humanog VHgena (VH6-1) i uključujući svih 27 humanih DHgena, svih 6 human JHgena, mišji IgH intronski pojačivač (Em), mišji IgM region za prekopčavanje (Sm), i prva 4 egzona mišjeg IgM gena je modifikovano korišćenjem bakerijske homologne rekombinacije (BHR) da bi se insertobala loxp-UbC-Em7-Neo-loxp kaseta, npr., gen za rezistenciju na neomycin sa bočne stane ograničen sa loxP mestom-specifičnim mestom prepoznavanja rekombinacije, 512 bp ushodno od prvog humanog DHsegmenta (DH1-1) za selekciju u E. coli i mišjim ES ćelijama. Ovaj dobijeni BAC je naknadno modifovan sa tri donora upotrebom in vitro Cas9/GA.
1. Prvi donor za modifikaciju DH2-2 sadržao je, od 5’ ka 3’, 50bp “homology box” počev od 1419bp ushodno od 5’-kraja 12 RSS DH2-2, višestruko mesto kloniranja (MreI-NsiI-EcoRI-KpnI-MreI), modifikovani D2-2 gen sa 3’-krajem 12-mer RSS zamenjen sa optimizovanim 3’-krajem 23-mer RSS izvedenim iz humanog VH1-69 (CACAGTGTGA AAACCCACAT CCTGAGAGTG ACACAAACC; T->A, G->C; SEQ ID NO:151), i 50bp “homology box” koji se završava 863bp nishodno od 3’-kraja 23-mer RSS D2-2. Nukleotidna sekvenca ovog drugog donora za modifikaciju DH2-2 je predstavljena kao SEQ ID NO:70. S obzirom na to da DHregion sadrži četiri direktna ponovka od ~10kb, označavajući jedinstvene prajmere i probe za skrining je ekstremo teško. Da bi se ovaj problem prevazišao, dve jedinstvene sekvence od 40bp su insertovane: jedna 74bp nishodno od 5’ “homology box” i jedna 40bp ushodno od 3’ “homology box”. Ovi jedinstveni 40-mers su korišćeni kao mesta vezivanja za PCR/prajmere sekvenciranja i Taqman probe, označeni su sa nepopunjenim vertilalnim trouglovima "1" i "2" Slika 2 i sadrže set nukleotidne sekvence kao što je predstavljeno redom u SEQ ID NO:73 i SEQ ID NO:74
2. Drugi donor za modifikaciju DH2-8 sadržao je, od 5’ ka 3’, 50bp “homology box” počev od 552bp ushodno od 5’-kraja 12 RSS DH2-8, višestruko mesto kloniranja (MreI-NsiI-EcoRI-KpnI-MreI), modifikovani D2-8 gen sa 3’-krajem 12-mer RSS zamenjen sa optimizovanim 3’-krajem 23-mer RSS izvedenim iz humnanog VH1-69 (CACAGTGTGA AAACCCACAT CCTGAGAGTG ACACAAACC; T->A, G->C SEQ ID NO: 151), i 50bp ”homology box” koji se završava 867bp nishodno od 3’-kraja 23-mer RSS D2-8. Nukleotidna sekvenca ovog drugog donora za modifikaciju DH2-8 je predstavljena kao SEQ ID NO:71. S obzirom na to da DHregion sadrži četiri direktna ponovka od ~10kb, označavajući jedinstvene prajmere i probe za skrining je ekstremo teško. Da bi se ovaj problem prevazišao, dve jedinstvene sekvence od 40bp su insertovane: jedna 74bp nishodno od 5’ “homology box” i jedna 40bp ushodno od 3’ “homology box”. Ovi jedinstveni 40-mers su korišćeni kao mesta vezivanja za PCR/prajmere sekvenciranja i Taqman probe, označeni su sa nepopunjenim vertilalnim trouglovima "10" i "16" Slika 2 i sadrže set nukleotidne sekvence kao što je predstavljeno redom u SEQ ID NO:75 i SEQ ID NO:76.
3. Treći donor za modifikaciju DH2-15 sadržao je, od 5’ ka 3’, 50bp “homology box” počev od 391bp ushodno od 5’-kraja 12 RSS of DH2-15, višestruko mesto kloniranja (MreI-NsiI-EcoRI-KpnI-MreI), modifikovani D2-15 gen sa 12-mer RSS bočno u odnosu na 3’-kraj zamenjen sa i optimizovan sa 23-mer RSS bočno u odnosu na 3’-kraj izvedeno iz humanog VH1-69 (CACAGTGTGA AAACCCACAT CCTGAGAGTG ACACAAACC; T->A, G->C SEQ ID NO: 151), i 50bp “homology box” koji se završava 867bp nishodno od 3’-kraja 23-mer RSS D2-15. Nukleotidna sekvenca ovog trećeg donora za modifikaciju DH2-2 je predstavljena u SEQ ID NO:72. S obzirom na to da DHregion sadrži četiri direktna ponovka od ~10kb, označavajući jedinstvene prajmere i probe za skrining je ekstremo teško. Da bi se ovaj problem prevazišao, dve jedinstvene sekvence od 40bp su insertovane: jedna 74bp nishodno od 5’ “homology box” i jedna 40bp ushodno od 3’ “homology box”. Ovi jedinstveni 40-mers su korišćeni kao mesta vezivanja za PCR/prajmere sekvenciranja i Taqman probe, označeni su sa nepopunjenim vertilalnim trouglovima "8” i "18" Slika 2 i sadrže set nukleotidne sekvence kao što je predstavljeno redom u SEQ ID NO:77 i SEQ ID NO:78.
[0269] Nakon in vitro Cas9/GA modifikacije sa tri donora, finalni vektoro za ciljanje je sadržao, od 5’ ka 3’, 49kb 5’ krak homologije koji sadrži humani varijabilni region DNK, Neomicin selekcionu kasetu, modifikovani human DHregion uključujući tri humana DH segmenta svaki sa 12-mer RSS u bočno u odnosu na 5’ is a 23-mer RSS bočno u odnosu na 3’, šest humanih JHsegmenata, i 24kb 3’ krak homologije koji sadrži pojačivač u intronu mišjeg teškog lanca (Ei) i gen konstatnog regiona mišjeg IgM. (Slika 2). Tabela 3 obezbeđuje sekvencu za gRNK, prajmere i probe koji su korišćeni da bi se odredila tačna konstrukcija 12:DH2-2:23|12:DH2-8:23|12:DH2-15:23 /JH1-6 vektora za ciljanje.
1
Tabela 3: Prajmer i sekvence gRNK sequences za konstruisanje 12:DH2-2:23|12:DH2-8:23|12:DH2-
15:23/JH1-6
2
4
[0270] 12:DH2-2:23:|12:DH2-8:23|12:DH2-15:2333/JH1-6 vektor za ciljanje je takođe linearizovan sa NotI i elektroporacijom unet u mišje embrionalne matične ćelije koje imaju genom koji je homozigotan za humanizovani varijabilni region teškog lanca imunoglobulina koji je sadržao pun repertoar funkcionalnih humanih VHgenskih segmenata, deleciju DHregiona izuzev za DH7-27, i pun repertoar funkcionalnih human JHgenskih segmenata (6011) i koji je bio homozigotan za (HO) za humanizovani endogeni κ lokus koji sadrži pun repertoar Vκ lakog lanca humanog imunoglobulina i Jκ genskih segmenata operativno u vezi h sa endogenim Cκ regionom teškog lanca mišjeg imunoglobulina (1293) (see, Slika 7). 20187 alel je kreiran nakon elektroporacije i odgovarajuća homologna rekombinacija 6011 alela sa 12:DH2-2:23|12:DH2-8:23|12:DH2-15:23 /JH1-6 vektorom za ciljanje koji sadrži kasetu neomicina. (Slika 7). Ove modifikovane mišje ES ćelije su korišćene da bi se olakšao facilitate efikasni skrining pozitivnih ES klonova (videti ispod) i naknadno cre-posredovano uklanjanje kasete za rezistenciju na lek neomicin, nakon čega se uklanja 20187 alel kao 20188 (Slika 8).
Primer 2. Skrining embrionalnih matičnih (ES) ćelija
[0271] Ovaj primer pokazuje proizvodnju nehumanih životinja (npr., glodari) čiji genom obuhvata varijabilni region teškog lanca imunoglobulina koji uključuje modifikovani region raznolikosti (DH) teškog lanca, gde modifikovani DHregion uključuje jedan ili više DHsegmenta pri čemu su su svaki operativno u vezi sa 23-mer RSS.
[0272] Ispravno sklapanje sa vektorima za ciljanje koji su opisani u Primeru 1 i ciljana insercija fragmenata DNK u klaster raznolikosti lokusa humanizovanog teškog lanca imunoglobulona koji su sadržani u BAC DNK klonovoma potvrđena je sekvenciranjem u lačnanom reakcijom polimeraznog umnožavanja tokom konstrukcije svakog vektora za ciljanje. Ciljani BAC DNK, potvrđeni reakcijom lančanog umnožavanja, nakon toga je uveden u mišje embrionalne matične ćelije (ES) preko elektroporacije zatim sledi kultivisanje u selekcionom medijumu. Genom ES ćelija used korišćen za elektroporaciju svakog vektorom za ciljanje je predstavljen redom na slikama 3, 5 i 7. Kolonije koje su rezistentne na lek su sakupljene 10 dana posle elektroporacije i izvršen je skrining sa TAQMAN<™>i određivanje kariotipa za ispravno ciljanje kao što je prethodno opisano (Valenzuela et al., supra; Frendmewey, D. et al., 2010, Methods Enzymol.476:295-307) korišćenjem prajmera/proba postavki koje su detektovali ispravno integrisanje modifikovanih DHgenskih segmenata (Tabela 4; F: Prednji prajmer, P: proba, R: Reverzni prajmer).
[0273] VELOCIMOUSE<®>postupak (DeChiara, T.M. et al., 2010, Methods Enzymol. 476:285-294; DeChiara, T.M., 2009, Methods Mol. Biol. 530:311-324; Poueymirou et al., 2007, Nat. Biotechnol.
25:91-99) je korišćen, u kome su ciljanje ES ćelije ubrizgane u nekompaktovani 8-ćelijsku fazu Swiss Webster embriona, da bi se proizvele zdrave pune ES ćelija izvedena F0 generacija miševa koji su heterozigoti za modifikovani DHregion i koji eksprimiraju antitela koja sadrže varijabilne regione teškog lanca koji uključuju CDR3 regione generisane iz DH-DHrekombinacije. F0 generacija heterozigoting miševa je ukrštena sa C57B16/NTac ženkama da bi se generisali F1 heterozigoti koji su ukršteni da bi se proizveli homozigoti F2 generacije i miševi divljeg tipa.
[0274] Kaseta za selekciju leka može po potrebi biti uklonjenja naknadnim dodavanjem rekombinaze (npr., Cre tretman) ili razmnožavanjem Cre deleter mišjeg soja (videti, npr., International Patent Application Publication No. WO 2009/114400) da bi se uklonila bilo koja loxed selekciona kaseta koja je uvedena ciljajućim konstruktom koja nije uklonjena, npr., u ES ćelijskom stadijumu ili embrionu. Opciono, selekciona kaseta je zadržana kod miševa. Ovde opisane selekcione kasete koje su modifikovane vektorom za ciljanje uklonjene su u pozitivnom ES ćelijama privremennom ekspresijom Cre rekombinaze (videti Slike 4, 6 i 8, redom).
Tabela 4. Skupovi prajmera/proba za skrining ES ćelija
Primer 3. Karakterizacija miševa modifikovanih sa 23:DH3-3:12/JH6, 23:DH3-3:12/JH4-6, ili 12:DH2-2:23|12:DH2-8:23|12:DH2-15:23 /JH1-6 ciljajućim vektorima
Imunofenotipizacija
[0275] Imunofenotipska analiza životinja modifikovanih sa 23:DH3-3:12/JH6 ili 23:DH3-3:12/JH4-6 ciljnim vektorima je sprovedena za miševe koji su heterozigoti za respektivne 6800 ili 6795 modifikovane alele (videti Slike 4 i 6). Imunofenotipska analiza životinja koje su modifikovane sa 12:DH2-2:23|12:DH2-8:2-23| 12:DH2-15:23/JH1-6 vektorom za ciljanje je sprovedena za miševe gajene za homozigotnost za 20188 modifikovani alel. Razvoj B ćelije je analiziran kod ovih životinja pomoću sortiranja ćelija koje su aktivirane fluorescencijom (FACS). Ukratko, slezine i nosi noge (femur i tibija) su sakupljene od:
VELOCIMMUNE<®>miševa (n=3, 26% C57BL/623% 129S6/SvEvTac 51% Balb/cAnNTac; videti, npr., U.S. Patent br-e. 8,502,018 i 8,642,835), 6643het/6800het//1293ho miševa (25% C57BL/6NTac 25% 129S6/SvEvTac 50% Balb/cAnNTac modifikovanih sa 23:DH3-3:12/JH6 vektorom za ciljanje; videti Slika 4; n=3; 6643het/6798het//1293ho miševa (25% C57BL/6NTac 25% 129S6/SvEvTac 50% Balb/cAnNTac modifikovanih sa 23:DH3-3:12/JH4-6 vektorom za ciljanje; videti Slika 6; n=3); ili 20188ho/1293ho miševima (25% C57BL/6NTac 25% 129S6/SvFvTac 50% Balb/cAnNTac modifikovanim sa 12:DH2-2:23|12:DH2-8:23|12:DH2.1523/JH1-6 vektorom za ciljanje; n= 3).
[0276] Koštana srž je sakupljena iz femura pomoću centrifugiranja. Preparati crvenih krvnih zrnaca iz slezine i kostne srži su lizirani sa ACK puferom za lizu (Gibco) zatim sledi ispiranje sa 1xPBS sa 2% FBS. Izolovane ćelije (1X10<6>) su inkubirane sa odabranim koktelom antitela u trajanju od 30 min na 4°C: Soj 1:pacovski anti-mišji CD43-FITC (Biolegend 121206, klon 1B11), pacovski anti-mišji c-kit-PE (Biolegkrajem 105808, klon 2B8), pacovski anti-mišji IgM-PeCy (eBiosciences 25-5790-82, klon II/41), pacovski anti-mišji IgD-PerCP-Cy5.5 (Biolegkrajem 405710, klon 11-26c.2a), pacovski anti-mišji CD3-PB (Biolegkrajem 100214, klon 17-A2), pacovski anti-mišji B220-APC (eBiosciences 17-0452-82, klon RA3-6B2), i pacovski anti-mišji CD19-APC-H7 (BD 560143 klon 1D3). Soj 2: pacovski anti-mišji kapa-FITC (BD 550003, klon 187.1), pacovski anti-mišji lambda-PE (Biolegkrajem 407308, klon RML-42), pacovski antimišji IgM-PeCy (eBiosciences 25-5790-82, klon II/41), pacovski anti-mišji IgD-PerCP-Cy5.5 (Biolegkrajem 405710, klon 11-26c.2a), pacovski anti-mišji CD3-PB (Biolegend 100214, klon 17-A2), pacovski anti-mišji B220-APC (eBiosciences 17-0452-82, klon RA3-6B2), i pacovski anti-mišji CD19APC-H7 (BD 560143 klon 1D3). Nakon bojenja, ćelije su isprane i zatim fiksirane u 2% formaldehidu. Dobijanje podataka je sprovedeno na BD LSRFORTESSA™ protočnom citometru (BD Biosciences) i analizirani su sa FLOWJO™ softverom (BD Biosciences).
[0277] U miševima koji su heterozigoti za 6800 ili 6798 alele, ukupni brojevi B ćelija bili su smanjeni i u slezini i u kostnoj srži, i bilo je povećanje u pro-B ćelijama kada su upoređene sa kontrolnim VELOCIMMUNE<®>miševima (podaci nisu prikazani). Sveukupno, B ćelije su imale sličnu κ i λ upotrebu (podaci nisu prikazani). U miševima koji su homozigoti za 20188 alel, nešto veći nivo λ<+>B ćelija u slezini je uočen (podaci nisu prikazani). Nijedna od uočenih razlika u populacijama B ćelija kod miševa koje eksprimiraju 6800, 6798, ili 20188 alele u poređenju sa kontrolnim VELOLCIMMUNE<®>miševima su smatrane da imaju uticaj na razvoj B ćelija kod ovih životinja (podaci nisu prikazani).
Učestalosti DH-DHuređenja i karakteristike
[0278] Uređenja gena kod neimunizovanih naivnih miševa koji su modifikovani sa 23:DH3-3:12/JH6 vektorom za ciljanje, 23:DH3-3:12/JH4-6 vektorom za ciljanje, ili 12:DH2-2:23|12:DH2-8:23|12:DH2-15:23 vektorom za ciljanje su analizirani pomoću repertoara IgM sekvenciranja. Biblioteka IgM repertoara iz B ćelija slezine je dobijena korišćenjm SMARTer™ RACE (brzog umnožavanja cDNK krajeva) cDNK kitom za umnožavanje (Clontech) sa prajmerima koji su specifični za mišji konstantni IgM (Tabela 5, "nnnnnn" predstavlja 6bp indeks sekvence da bi se omogućilo multipleksovanje uzoraka za sekvenciranje). Pripremljena biblioteka repertoara je nakon toga sekvencirana sa MiSeq sekvencerom (Illumina).
[0279] Illumina MiSeq paired-end sekvence (2x300 ciklusa) su spojene i filtrirane na osnovu kvaliteta i perfektnog poklapanja sa prajmerom konstantnog regiona teškog lanca IgM. Preuređene sekvence teškog lanca su poravnane sa referentnim bazama podataka germinativnih V, D, i J (IMGT). Naknadne analize su takođe sadržale produktivna preuređenja, definisane su kao sekvence bez stop kodona u otvorenom okviru čitanja i VDJ vezom u okviru.
Tabela 5: Prajmeri korišćeni u dobijanju biblioteke za sekvencioniranje IgM repertoara
(nastavak)
[0280] U neimunizovanim životinjama koje su modifikovane sa 23:DH3-3:12/JH6 vektorom za ciljanje ili 23:DH3-3:12/JH4-6 vektorom za ciljanje, nije uočena ekspresija DH7-27, i upotreba JHusage je redom ograničena na JH6, ili JH4, JH5, and JH6, kao što je očekivano (podaci nisu prikazani). U neimunizovanim životinjama koje su modifikovane sa 12:DH2-2:23|12:DH2-8:23|12:DH2-15:23 vektorom za ciljanje, uočena je rekombinacija sa svim JH1-6 genskim segmentima, iako je rekombinacija sa JH4 uočena u većim učestalostima (oko 50%) i kod modifikovanih i kontrolnih životinja (podaci nisu prikazani). U svim modifikovanim životinjama, korišćeni su različiti VHgenski segmeti (npr., ali nije ograničeno na VH4-39, VH3-23, itd.) i različiti DHgenski segmenti (npr., ali nije ograničeno na DH1-7, DH3-10, i DH5-12) rekombinovani sa modifikovanim DHgenskim segmentima. Zanimljivo, korišćenje DH2-2, DH2-8, i DH2-15 genskih segmenata ima veći trkrajem kod životinja modifikovanih sa 12:DH2-2:23|12:DH2-8:23|12:DH2-15:23 vektorom za ciljanje (2.41%; 6.34%; 6.91%; n=3) u poređenju sa kontrolama životinjama (2.57%, 3.44%; 3.58%; n=3). (Tabela 6).
[0281] Funkcionalne sekvence sa minimumom od dva uzastopna DHsegmenta identifikovana u region spajanja dalje su potvrđeni kao rezultat DH-DHdogađaja rekombinacije upotrebom sledećih kriterijuma. U sekvencama koje su izolovane iz miševa modifikovanim sa 23:DH3-3:12/JH6 vektorom za ciljanje ili 23:DH3-3:12/JH4-6 vektorom za ciljanje, DH-DHdogađaj rekombinacije je potrvrđen kada (1) identifikovani "uzastopni" ili 3’ DHsegment poravnan sa minimumom od 9 uzastopnih baznih parova sa germinativnom sekvencom IGHD3-3 DHgenskog segmenta i (2) obe identifikovana vodeći 5’ i sukcesivni 3’ DHgenski segmenti su poravnani sa minimumom od 5 uzastopnih baznih parova sa germinativnim DHgenskim segmentom, ne uzimajući u obzir bilo koje preklapanje. U sekvencama koje su izolovane iz miševa modifikovanim sa 12:DH2-2:23|12:DH2-8:23|12:DH2-15:23 vektorom za ciljanje, DH-DHdogađaj rekombinacije je potrvrđen kada (1) identifikovani "vodeći" ili 5’ DHsegment poravnan sa minimumom od 9 uzastopnih baznih parova sa germinativnom sekvencom IGHD2-2 DHgenskog segmenta, IGHD2-8 DHgenskog segmenta, ili IGHD2-15 DHgenskog segmenta, i (2) oba identifikovana vodeći 5’ i uzastopni 3’ DHgenski segmenti koji su poravnani sa minimumom od 5 uzastopnih nukleotida sa germinativnim DHgenskim segmentom, ne uzimajući u obzir bilo koje preklapanje.
[0282] Tabela 6 obezbeđuje broj funkcionalnih Ig očitavanja kao apsolutna količina i procenat ukupnih očitavanja, procenat od svih funkcionalnih očitavanja koji je izveden iz DH2-2 genskog segmenta, DH2-8 genskog segmenta, ili DH2-15 genskog segmenta, i procenat svih očitavanja koji su izvedeni iz DH2-2 genskog segmenta, DH2-8 genskog segmenta, ili DH2-15 genskog segmenta koji zadovoljavaju kriterijum da budu potvrđeni kao rezultat DH-DHdogađaja rekombinacije.
Tabela 6
[0283] Kao što je prikazano u Tabeli 6, sve neimunizovane modifikovane životinje su pokazale povećanje u DH-DHrekombinacionim događajima u poređenju sa kontrolnim životinjama. U životinjama koje su modifikovane sa 2-2, 2-8 i 2-15 genskim segmentima, npr., homozigotnim za 20188 alel, DH-DHrekombinacioni događaji u 1.69% do 4.16% od svih uređenja obuhvataju jedan od tri modifikovanih 2-2, 2-8, 2-15 DHgenskih segmenata. Suprotno tome, DH-DHrekombinacija je potvrđena u manje od 0.2% od svih uređenja izvedenih iz 2-2, 2-8, ili 2-15 genskog segmenta u kontrolnim životinjama. U odvojenom eksperimentu, učestalost potvrđenih DH-DHdogađaja rekombinacije uključuje modifikovani DH3-3 genski segment kod miševa koji su heterozigotni za 6800 miševe (Slika 4) u opsegu od 0.6 do 1.2% svih funkcionalnih očitavanja koja su izvedena za DH3-3 genski segment.
[0284] U svim modifikovanim životinjama, uređeni VH(DHA-DHB)JHkodirali su duže CDR3 dužine (npr. ali nisu ograničeni na dužine CDR3 od oko 21 aminokiselina) i uključivali su više cisteinskih ostataka. (npr., Slike 9 i 10).
[0285] U suštini, miševi koji su modifikovani DHgenskim segmentom ispoljili su relativno normalni fenotip B ćelija sa povećanom učestalošću DH-DHrekombinacionih događaja zbog korišćenja modifikovanog DHgenskog segmenta. Dodatno, DH-DHrekombinovane sekvence kodirale su za CDR3 koje su bile duže u dužini i imale su veću brzinu uključivanja cisteina.
Primer 4. Proizvodnja antitela
[0286] Ovaj primer pokazuje proizvodnju antitela u glodaru čiji genom obuhvata varijabilni region teškog lanca imunoglobulina koji uključuje modifikovani DHregion kao što je ovde opisano. Postupci koji su opisani u ovom primeru, i/ili postupci imunizovanja koji su poznati u oblasti tehnike, mogu se
1
koristiti za imunizovanje glodara koji sadrže modifikovani DHregion kao što je ovde opisano sa polipeptidima ili njihovim fragmentima (npr., peptidi izvedeni iz željenog epitopa), ili kombinacija polipeptida ili njihovih fragmenata, po potrebi.
[0287] Ukratko, kohorte miševa koji uključuju modifikovani DHregion kao što je ovde opisano su imunizovani sa antigenom od interesa korišćenjem postupaka imunizacije koji su poznati iz oblasti tehnike. Imuni odgovor antitela (tj., serumski titar) je praćen sa ELISA imunskim testom i/ili na ćelijama koje su modifikovane sa MSD. Kada je postignut željeni imuni odgovor, splenociti (i/ili druga limfatična tkiva) su sakupljena i spojena su sa mišjim ćelijama mijeloma da bi se sačuvala njihova vijabilnost i obrazovale besmrtne ćelije hibridoma. Izvršen je skrining linija ćelija hibridoma (npr., sa ELISA testom ili MSD) i odabrane su za identifikovanje linija hibroma ćelija koje proizvode antitela specifična za antigen. Hibridomi mogu dalje biti karakterisani za relativni afinitet vezivanja i izotip po potrebi. Korišćenjem ovog postupka, nekoliko himernih antitela koja su specifična za antigen (tj., antitela koja poseduju humane varijabilne domene i konstantne regione glodara) je dobijeno.
[0288] DNK koja kodira varijabilne regione teškog lanca i lakih lanaca može se izolovati i vezati sa željenim izotipovima (konstantni regioni) tepkog lanca i lakog lanca za dobijanje potpuno humanih antitela. Takvo antitelo se može proizvesti u ćeliji, kao što je CHO ćelija. Potpuno humana antitela su zatim karakterisana za za relativni afinitet vezivanja i/ili neutrališuću aktivnost antigena od interesa.
[0289] DNK koja kodira himerna antitela koja su specifična za antigen, ili varijabilne domene teških i lakih lanaca, može biti izolovana direktno iz antigen-specifičnih limfocita. Inicijalno, visoko afinitetna himerna antitela su izolovana koja imaju humani varijabilni region i glodarski konstantni region i karakterisana su i selektovana za poželjne karakteristike, uključujući, ali bez ograničenja na, afinitet, selektivnost, epitop, itd. glodarski (npr., ali bez ograničenja na, pacova, miša, itd.) konstantni regioni su zamenjeni sa željenim humanim konstantnim regionom da bi se generisala potpuno humana antitela. Dok selektovani konstantni region može da se razlikuje u zavisnosti od specifične upotrebe, karakteristike vezivanja antigena sa visokim afinitetom i ciljana specifičnost nalaze se u varijabilnom regionu. Antitela koja su specifična za antigen su takođe direktno izolovana iz antigen-pozitivnih B ćelija (od imunizovanih miševa) bez fuzije sa ćelijama mijeloma, kao što je opisano u, npr.,U.S. Patent Br.7,582,298,. Korišćenjem ovog postupka, nekoliko potpuno humanih antigen specifičnih antitela (tj., antitela koja poseduju humane varijabilne domene i humane konstantne domene) su dobijena.
[0290] U jednom eksperimentu, kontrolni miševi (npr., VELOCIMMUNE<®>miševi sa humanizovanim lokusima varijabilnog regiona teškog i κ lakog lanca humanizovanog imunoglobulina (n= 4-6; videti, npr., U.S. Patent Br-e.8,697,940 and 8,642,835)) i ispitivanih miševa (npr., miševi koji su modifikovani sa sadrže modifikovani 23:DH3-3:12/JH4-6 ili 23:DH3-3:12/JH6 region kao što je ovde opisano (n= 4-6)) su imunizovani sa različitim antigenima i/ili nukleinskim kiselinama koje isto kodiraju (receptor kuplovan sa G proteinom (GPCR), jonski kanal, hemokinski receptor, ili patogen).
[0291] Miševi su bili sposobni da generišu odogovore na svaki od ispitanih antigena, sa odgovorima u opsegu od niskih titara do visokih specifičnih titara (podaci nisu prikazani). Miševi koji imaju modifikovani 23:DH3-3:12/JH6 region kao što je ovde opisano pokazali su titre prema GPCR koji je eksprimiran od strane ćelijske linije uporedivo sa kontrolnim miševima sa lokusima varijabilnog regiona teškog i κ lakog lanca humanizivanog imunoglobulina (Slika 11; popunjeni kružići predstavljaju modifikovanu ćelijsku liniju koja eksprimira GPCR; nepopunjeni kružići su kontrolne ćelije koje ne eksprimiraju GPCR).
2
[0292] Dodatno, 100% od 23 ispitanih antitela specifičnih na receptor kuplovan sa G proteinom (GPCR) koja su generisana kod miševa koji sadrže modifikovani DHregion imala su dužinu CDR3 teškog lanca od 10 ili više aminokiselina; 20% imalo je CDR3 dužinu od 14 aminokiselina i 1 antitelo imalo je CDR3 dužinu od 18 aminokiselina (podaci nisu prikazani). Suprotno tome, samo oko 60% od 8 ispitanih antitela specifičnih na GPCR koja su generisana kod miševa koji imaju lokuse varijabilnog regiona teškog i κ lakog lanca humanizovanog imunoglobulina, ali ne modifikovani DHregion, imali su CDR3 dužine od 10 aminokiselina ili više, od kojih nijedna nije imala CDR3 dužine 14 ili više (podaci nisu prikazani).
[0293] Mnoštvo antitela protiv virusa je izolovano iz miša koji ima modifikovani 23:DH3-3:12/JH4-6 region, sa bar jednim koji pokazuje aktivnost neutralizacije koja je superiorna u odnosu na molekul komparator (podaci nisu prikazani).
[0294] Antitela miša koji ima modifikovani 23:DH3-3:12/JH6 i koji je imunizovan sa jonskim kanalom sadrže populaciju antitela koja ima HCDR3 dužine veće od 21 aminokiselina koji proizilazi iz oba VHDHJHi VHDHA-DHBJHuređenja (kao što je određeno strogim kriterijumom koji je opisan za ovaj primer), sa sekvencama koje kodiraju duže HCDR3 dužine koje se više mogu naći u koštanoj srži u poređenju sa slezinom (Slika 12). Analiza CDR3 dužina koje su kodirane sekvencama je određena kao rezultat VHDHA-DHBJHuređenja u skladu sa strogim kriterijumom iz ovog primera (kada se koristi strogi kritrerijum iz ovog primera each DHgenski segment koji se detektuje mora ispoljiti minimum 40% identičnost sa germinativnim D genskim segmentom, 3’ DHgenski segment mora biti izveden iz DH3-3 genskog segmenta, i maksimim od 1 nukleotida mutacije u svakom DHgenskom segmentu) je prikazano na Slici 13. Tabela 7 ispod obezbeđuje poređenje učestalosti VHDHA-DHBJHrekombinacije u koštanoj srži ili slezini korišćenjem strogog kriterijuma opisanog u ovom primeru, ili ne-strogog kriterijuma u ovom primeru (kada se koristi ne-strogi kriterijum u ovom primeru svaki detektovani DHgenski segment mora ispoljiti minimum 5 identičnih nukleotida sa germinativnim D genskim segmentom, 3’ DHgenski segment mora biti izveden iz DH3-3 genskog segmenta).
Tabela 7: Učestalost rekombinacije VHDHA-DHBJH
4
1
2
4
1
11
12
1
14
�
�
1
�
1
11
11
11
11
11
11
11
12
12
12
12
12
12

Claims (23)

Patentni zahtevi
1. Nukleotidni molekul koji sadrži modifikovani region raznovrsnosti teškog lanca imunoglobulina (DH) ("modifikovani DHregion") koji obuhvata:
(i) modifikovani DHgenski segment koji sadrži DHgenski segment neposredno uz 23-mer RSS ("modifikovani DHgenski segment ") i
(ii) neuređeni DHgenski segment sa prvom 12-mer RSS bočno u odnosu na njegovu 5’ stranu i sa drugom 12-mer RSS bočno u odnosu na njegovu na njegovu 3’ stranu ("neuređeni DHgenski segment "),
gde (i) modifikovani DHgenski segment i (ii) neuređeni DHgenski segment su operativno u vezi tako da (i) modifikovani DHgenski segment i (ii) neuređeni DHgenski segment su sposobni da se spoje u događaju DH-DHrekombinacije prema pravilu 12/23,
gde je nukleotidni molekul pogodan za dobijanje glodara koji imaju modifikovani DHregion, i opciono gde modifikovani DHregion obuhvata samo humane DHgenske segmente.
2. Nukleotidni molekul prema zahtevu 1, gde nukleotidni molekul dalje obuhvata:
(a) bar jedan neuređeni varijabilni genski segment teškog lanca imunoglobulina (VH) ("neuređeni VHgenski segment") koji je ushodno od i operativno u vezi sa modifikovanim DHregionom;
(b) bar jedan neuređeni genski segment spajanja teškog lanca imunoglobulina (JH) genski segment ("neuređeni JHgenski segment") koji je nishodno od i operativno u vezi sa modifikovanim DHregionom; ili
(c) kombinaciju pod (a) i (b).
3. Nukleotidni molekul prema zahtevu 2, gde:
(a) bar jedan neuređeni VHgenski segment obuhvata neuređeni humani VH6-1 genski segment, bar jedan neuređeni JHgenski segment obuhvata neuređeni humani JH6 genski segment, ili njihovu kombinaciju;
(b) bar jedan neuređeni JHgenski segment obuhvata neuređeni humani JH4 genski segment, neuređeni humani JH5 genski segment, i neuređeni humani JH6 genski segment;
(c) bar jedan neuređeni JHgenski segment obuhvata neuređeni humani JH1 genski segment, neuređeni humani JH2 genski segment, neuređeni humani JH3 genski segment, neuređeni humani JH4 genski segment, neuređeni humani JH5 genski segment, i neuređeni humani JH6 genski segment, opciono gde neuređeni humani JH1 genski segment, neuređeni humani JH2 genski segment, neuređeni humani JH3 genski segment, neuređeni humani JH4 genski segment, neuređeni humani JH5 genski segment, i neuređeni humani JH6 genski segment se nalaze u germinativnoj konfiguraciji; i/ili
(d) bar jedan neuređeni VHgenski segment obuhvata pun repertoar funkcionalnih neuređenih humanih VHgenskih segmenata koji se prostiru između i uključujući neuređeni humani VH3-74 genski segment i neuređeni humani VH1-6 genski segment ("pun repertoar funkcionalnih neuređenih humanih VHgenskih segmenata"), opciono gde pun repertoar funkcionalnih neuređenih humanih VHgenskih segmenata je u germinativnoj konfiguraciji.
4. Nukleotidni molekul prema bilo kom od prethodnih zahteva, gde:
(a) nukleotidni molekul dalje sadrži jedan ili više funkcionalnih glodarskih Adam6 gena, opciono gde jedan ili više funkcionalnih glodarskih Adam6 gena je locirano između humanog VH1-2 genskog segmenta i humanog VH6-1 genskog segmenta i/ili zamenjuje humani Adam6 gen;
(b) modifikovani DHgenski segment obuhvata 23-mer RSS neposredno uz 5’-kraj DHgenskog segmenta;
(c) modifikovani DHgenski segment obuhvata 23-mer RSS neposredno uz 3’-kraj DHgenskog segmenta;
(d) modifikovani DHgenski segment obuhvata:
(i) humani DH3-3 genski segment neposredno uz 23-mer RSS, opciono gde 23-mer RSS is neposredno uz 5’-kraj DH3-3 genskog segmenta;
(ii) humani DH2-2 genski segment neposredno uz 23-mer RSS, opciono gde 23-mer RSS je neposredno uz 3’-kraj DH2-2 genskog segmenta;
(iii) humani DH2-8 genski segment neposredno uz 23-mer RSS, opciono gde 23-mer RSS je neposredno uz 3’-kraj DH2-8 genskog segmenta;
(iv) humani DH2-15 genski segment neposredno uz 23-mer RSS, opciono gde 23-mer RSS je neposredno uz 3’-kraj DH2-15 genskog segmenta; ili
(v) bilo koja kombinacija (i)-(iv);
(e) nukleotidni molekul obuhvata sekvencu nukleotida predstavljenu u SEQ ID NO:52 ili obuhvata sekvencu nukleotida predstavljenu u SEQ ID NO:61;
(f) nukleotidni molekul obuhvata sekvencu nukleotida predstavljenu u SEQ ID NO:70;
(g) nukleotidni molekul obuhvata sekvencu nukleotida predstavljenu u SEQ ID NO:71; i/ili (h) nukleotidni molekul obuhvata sekvencu nukleotida predstavljenu u SEQ ID NO:72.
5. Nukleotidni molekul prema bilo kom od zahteva 1-4, koji sadrži u operativnoj vezi od 5’ ka 3’: (a) bar jedan neuređeni humani VHgenski segment,
(b) modifikovani DHregion, gde modifikovani DHgenski segment obuhvata humani DH3-3 genski segment neposredno uz 23-mer RSS, gde 23-mer RSS je neposredno uz 5’ kraj humanog DH3-3 genskog segmenta, i
(c) bar jedan neuređeni humani JHgenski segment.
6. Nukleotidni molekul prema bilo kom od zahteva 1-4, koji sadrži u operativnoj vezi od 5’ ka 3’: (a) bar jedan neuređeni humani VHgenski segment,
(b) modifikovani DHregion, gde modifikovani DHgenski segment obuhvata humani DH2 genski segment neposredno uz 23-mer RSS, gde 23-mer RSS je neposredno uz 3’ kraj humanog DH2 genskog segmenta, opciono gde:
(i) modifikovani DHgenski segment obuhvata humani DH2-2 genski segment neposredno uz 23-mer RSS;
(ii) modifikovani DHgenski segment obuhvata humani DH2-8 genski segment neposredno uz 23-mer RSS;
(iii) modifikovani DHgenski segment obuhvata humani DH2-15 genski segment neposredno uz 23-mer RSS; ili
(iv) bilo koja njihova kombinacija, i
(c) bar jedan neuređeni humani JHgenski segment.
1
7. Nukleotidni molekul prema zahtevu 5 ili zahtevu 6, gde:
(a) bar jedan neuređeni humani VHgenski segment obuhvata od 5’ ka 3’ neuređeni humani VH1-2 genski segment i neuređeni humani VH6-1 genski segment, gde nukleotid dalje sadrži jedan ili više funkcionalnih glodarskih Adam6 gena između neuređenog humanog VH1-2 genskog segmenta i neuređenog humanog VH6-1 genskog segmenta, i gde neuređeni humani VH1-2 genski segment, jedan ili više funkcionalnih glodarskih Adam6 gena, i neuređeni humani VH6-1 genski segment su susedni;
(b) bar jedan neuređeni humani VHgenski segment obuhvata pun repertoar funkcionalnih neuređenih humanih VHgenskih segmenata, opciono gde pun repertoar funkcionalnih neuređenih humanih VHgenskih segmenata je u germinativnoj konfiguraciji; i/ili
(c) bar jedan neuređeni humani JHgenski segment obuhvata neuređeni humani JH6 genski segment, opciono gde:
(i) bar jedan neuređeni humani JHgenski segment obuhvata neuređeni humani JH4 genski segment, neuređeni humani JH5 genski segment, i neuređeni humani JH6 genski segment; i/ili
(ii) gde bar jedan neuređeni humani JHgenski segment obuhvata neuređeni humani JH1 genski segment, neuređeni humani JH2 genski segment, neuređeni humani JH3 genski segment, neuređeni humani JH4 genski segment, neuređeni humani JH5 genski segment, i neuređeni humani JH6 genski segment, dalje opciono gde neuređeni humani JH1 genski segment, neuređeni JH2 genski segment, neuređeni JH3 genski segment, neuređeni JH4 genski segment, neuređeni JH5 genski segment, i neuređeni JH6 genski segment su u germinativnoj konfiguraciji.
8. Nukleotidni molekul prema bilo kom od zahteva 1-7, dalje opciono:
(a) na njegovom 3’-kraju, konstantni (CH) region teškog lanca imunoglobulina ili njegov deo;
(b) na njegovom 3’-kraju, glodarski CHregion ili njegov deo;
(c) na njegovom 3’-kraju, glodarski CHregion ili njegov deo koji sadrži glodarski pojačivač regiona introna i glodarski IgM gen; i/ili
(d) kaseta za selekciju leka locirana ushodno od modifikovanog DHgenskog segmenta, opciono gde su bočno u odnosu na kasetu za selekciju leka jedno ili više rekombinacionih mesta specifičnih za mesto.
9. Vektor za ciljanje koji sadrži nukleotidni molekul prema bilo kom od zahteva 1-8, koji obuhvata 5’-i 3’-krakove homologije konfigurisane da omoguće homolognu rekombinaciju sa sekvencom teškog lanca imunoglobulina u endogenom imunogloblinskom lokusu teškog lanca glodara, opciono gde sekvenca teškog lanca imunoglobulina obuhvata humani ili humanizovani varijabilni region teškog lanca imunoglobulina.
10. Postupak za modifikovanje varijabilnog regiona teškog lanca imunoglobulina da bi se modifikovala DH-DHrekombinacija, postupak obuhvata:
(a) dobijanje sekvence varijabilnog lanca imunoglobulinskog teškog lanca koja sadrži DHregion koji sadrži jedan ili više neuređenih DHgenskih segmenata, od kojih svaki neuređeni DHgenski segment je sa prvom 12-mer RSS bočno u odnosu na njegovu 5’ stranu i sa drugom 12-mer RSS bočno u odnosu na njegovu na njegovoj 3’ stranu, opciono gde jedan ili više neuređenih DHgenskih segmenata obuhvataju bar jedan neuređeni humani DHgenski segment, dalje opciono gde bar jedan neuređeni humani DHgenski segment obuhvata sve funkcionalne humane DHgenske segmente koji se protežu između i uključuju neuređeni humani DH1-1 genski segment i neuređeni humani DH7-27 genski segment, opciono gde svi funkcionalni humani DHgenski segmenti su u germinativnoj konfiguraciji, i
1 1
(b) modifikovanje DHregiona da dalje obuhvati bar jedan modifikovani DHgenski segment, gde modifikovani DHgenski segment obuhvata DHgenski segment neposredno uz 23-mer RSS, gde, u dobijenom modifikovanom DHregionu, modifikovani DHgenski segment i bar jedan od jednog ili više neuređenih DHgenskih segmenata su operativno u vezi i sposobni su da se spoje u DH-DHdogađaju rekombinacije prema pravilu 12/23,
opciono gde dobijeni modifikovani DHregion obuhvata samo humane DHgenske segmente.
11. Postupak prema zahtevu 10, gde DHregion prema zahtevu 10(a) obuhvata dva ili više neuređenih DHgenskih segmenata, gde je svaki sa prvom 12-mer RSS bočno u odnosu na njegovu njegovu 5’ stranu i sa drugom 12-mer RSS bočno u odnosu na njegovu na njegovu 3’ stranu , i
gde modifikovanje obuhvata
(a) zamenu bar jednog od dva ili više neuređenih DHgenskih segmenata sa modifikovanim DHgenskim segmentom kao što je definisano u zahtevu 10(b),
(b) zamenu prve 12-mer RSS ili druge 12-mer RSS bar jednog od dva ili više neuređenih DHgenskih segmenata sa 23-mer RSS, ili
(c) kombinaciju pod (a) i (b),
opciono gde sekvenca varijabilnog lanca teškog lanca imunoglobulina dalje obuhvata JHregion koji sadrži bar jedan neuređeni JHgenski segment,
gde je JHregion operativno u vezi sa DHregionom, i
gde zamena bar jednog od dva ili više neuređenih DHgenskih segmenata sa modifikovanim DHgenskim segmentom kao što je definisano u zahtevu pod 10(b) obuhvata deleciju bar jednog neuređenog JHgenskog segmenta,
dalje opciono gde JHregion obuhvata pun repertoar humanih germinativnih JHgenskih segmenata koji sadrži neuređeni humani JH1 genski segment, neuređeni humani JH2 genski segment, neuređeni humani JH3 genski segment, neuređeni humani JH4 genski segment, neuređeni humani JH5 genski segment, i neuređeni humani JH6 genski segment, opciono gde neuređeni humani JH1 genski segment, neuređeni humani JH2 genski segment, neuređeni humani JH3 genski segment, neuređeni humani JH4 genski segment, neuređeni humani JH5 genski segment, i neuređeni humani JH6 genski segment se nalaze u germinativnoj konfiguraciji, i
gde delecija bar jednog germinativnog JHgenskog segmenta obuhvata deleciju neuređenog humanog JH1 genskog segmenta, neuređenog humanog JH2 genskog segmenta, i neuređenog humanog JH3 genskog segmenta, i opciono dalje deleciju neuređenog humanog JH4 genskog segmenta i neuređenog humanog JH5 genskog segmenta.
12. Postupak prema zahtevu 10 ili 11, gde:
(a) modifikovani DHgenski segment kao što je definisano u zahtevu 10(b) obuhvata
(i) humani DH3-3 genski segment neposredno uz 23-mer RSS, opciono gde 23-mer RSS je neposredno uz 5’-kraj DH3-3 genskog segmenta,
(ii) humani DH2-2 genski segment neposredno uz 23-mer RSS, opciono gde 23-mer RSS je neposredno uz 3’-kraj DH2-2 genskog segmenta,
(iii) humani DH2-8 genski segment neposredno uz 23-mer RSS, opciono gde 23-mer RSS je neposredno uz 3’-kraj DH2-8 genskog segmenta,
(iv) humani DH2-15 genski segment neposredno uz 23-mer RSS, opciono gde 23-mer RSS je neposredno uz 3’-kraj DH2-15 genskog segmenta, ili
1 2
(v) bilo koju kombinaciju (i)-(iv);
(b) modifikovanje obuhvata zamenu najviše 3’ neuređenog DHgenskog segmenta DHregiona kao što je definisano u zahtevu 10(a) sa modifikovanim DHgenskim segmentom kao što je definisano u zahtevu 10(b); i/ili
(c) modifikovanje obuhvata zamenu bar jednog od jednog ili više neuređenih DHgenskih segmenata koja odgovara modifikovanom DHgenskom segmentu kao što je definisan u zahtevu 10(b) sa modifikovanim DHgenskim segmentom kao što je definisano u zahtevu 10(b).
13. Lokus teškog lanca imunoglobulina koji sadrži nukleotidni molekul prema bilo kom od zahteva 1-8, vektor za ciljanje prema zahtevu 9, ili varijabilni region teškog lanca imunoglobulina modifikovan u skladu sa postupkom prema bilo kom od zahteva 10-12.
14. Genom glodara koji sadrži nukleotidni molekul prema bilo kom od zahteva 1-8, vektor za ciljanje prema zahtevu 9, varijabilni region teškog lanca imunoglobulina modifikovan u skladu sa postupkom porema bilo kom od zahteva 10-12, ili imunoglobulinski lokus teškog lanca prema zahtevu 13, gde je genom glodara po potrebi germinativni genom glodara.
15. Genom glodara prema zahtevu 14, gde genom glodara obuhvata varijabilni region teškog lanca imunoglobulina koji sadrži:
(a) neuređene VHgenske segmente,
(b) modifikovani DHregion, opciono gde modifikovani DHregion obuhvata samo humane DHgenske segmente, i
(c) neuređene JHgenske segmente,
gde (a)-(c) su u operativnoj vezi tako da, nakon rekombinacije, varijabilni region teškog lanca imunoglobulina obuhvata uređenu sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca koja kodira za varijabilni domen teškog lanca imunoglobulina, opciono gde uređena sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca je obrazovana nakon VH(DH-DH)JHdogađaja rekombinacije, opciono gde:
(aa) modifikovani DHgenski segment obuhvata DHsegment neposredno uz 3’ 23-mer RSS;
(bb) modifikovani DHgenski segmenti obuhvataju DHgenski segment neposredno uz 5’ 23-mer RSS; (cc) varijabilni region teškog lanca imunoglobulina je varijabilni regiona teškog lanca humanog imunoglobulina koji sadrži samo humane VHgenske segmente, humane DHgenske segmente, i humane JHgenske segmente, opciono gde varijabilni region teškog lanca humanog imunoglobulina je operativno u vezi sa CHregionom, dalje opciono gde CHregion je endogeni CHregion, opciono u endogenom imunoglobulinkom lokusu teškog lanca;
(dd) neuređeni VHgenski segmenti sadrže pun repertoar funkcionalnih neuređenih humanih VHgenskih segmenata, opciono gde pun repertoar funkcionalnih neuređenih humanih VHgenskih segmenata je u germinativnoj konfiguraciji;
(ee) neuređeni JHgenski segmenti sadrže humani JH6 genski segment; i/ili
(ff) (i) genomu glodara nedostaje endogeni Adam6 gen; ili
(ii) genom glodara dalje sadrži jedan ili više glodarskih Adam6 gena, opciono gde:
jedan ili više glodarskih Adam6 gena obuhvataju endogeni glodarski Adam6 gen;
jedan ili više glodarskih Adam6 gena su insertovani između dva humana VHgenska segmenta, opciono gde jedan ili više glodarskih Adam6 gena je insertovano između neuređenog humanog VH1-2 genskog segmenta i neuređenog humanog VH6-1 genskog segmenta
jedan ili više jedan ili više glodarskih Adam6 gena su insertovani umesto humanog Adam6 pseudogena; i/ili
1
jedan ili više jedan ili više glodarskih Adam6 gena su insertovani između neuređenog humanog VHgenskog segmenta i neuređenog humang DHgenskog segmenta.
16. Genom glodara prema zahtevu 14 ili 15, gde:
(a) genom glodara dalje obuhvata gen za terminalnu deoksinukleotidil transferazu;
(b) genom glodara naznačen time da je homozigotan za modifikovani DHregion ili genom glodara naznačen time da je heterozigotan za modifikovani DHregion; i/ili
(c) genom glodara je genom pacova ili genom miša.
17. Ćelija glodara koja sadrži genom glodara prema bilo kom od zahteva 14 do 16, opciono gde je ćelija glodara ćelija pacova ili ćelija miša.
18. Ćelija glodara prema zahtevu 17, gde ćelija glodara je embrionalna matična ćelija glodara.
19. Glodar koji je dobijen iz embrionalne matične ćelije glodara prema zahtevu 18, gde glodar obuhvata genom glodara u svom germinativnom.
20. Glodar prema zahtevu 19, gde:
(a) glodar dalje obuhvata somatski genom koji obuhvata uređenu kodirajuću sekvencu teškog lanca VH(DHA-DHB)JH, opciono gde uređena kodirajuća sekvenca teškog lanca VH(DHA-DHB)JHje operativno vezana sa genskom sekvencom konstantnog regiona IgM i/ili gde DHA ili DHB je izveden iz modifikovanog DHgenskog segmenta ili njegovog dela i bar 9 baznih parova DHA ili DHB je identično sa bar 9 baznih parova modifikovanog DHgenskog segmenta; i/ili
(b) bar 95% od svih uređenih VDJ kodirajućih sekvenci teškog lanca u glodaru imaju dužinu CDR3 od bar 10 aminokiselina, opciono gde bar 70% od svih uređenih VDJ genskih sekvenci teškog lanaca u glodaru imaju dužinu CDR3 od bar 11 aminokiselina, opciono gde bar 15% od svih uređenih VDJ genskih sekvenci teškog lanaca u glodaru imaju dužinu CDR3 od bar 14 aminokiselina, dalje opciono naznačeno time da glodar ispoljava bar najmanje 3-puta povećanu učestalost DH-DHrekombinacije u poređenju sa učestalosti rekombinacije DH-DHu referentnom glodaru.
21. Postupak za dobijanje glodara čiji genom obuhvata modifikovani DHregion, postupak obuhvata: (A) dobijanje glodara iz embrionalne matične ćelije prema zahtevu 18, ili
(B)
(a) modifikovanje genoma embrionalne matične ćelije glodara da sadrži fragment DNK koji sadrži jedan ili više modifikovanih DHgenskih segmenata, svaki koji sadrži DHgenski segment neposredno uz 23-mer RSS, opciono gde DNK fragment obuhvata nukleotidni molekul prema bilo kom od zahteva 1-8, vektor za ciljanje prema zahtevu 9, varijabilni region teškog lanca imunoglobulina modifikovan u skladu sa postupkom prema bilo kom od zahteva 10-12, ili težak lanac imunoglobulina prema zahtevu 13, i
(b) dobijanje glodara korišćenjem modifikovane embrionalne matične ćelije glodara pod (B)(a).
22. Postupak prema zahtevu 21, gde glodar je pacov ili miš.
23. Postupak za proizvodnju antitela ili dobijanja nukleinske kiseline koja kodira isto, postupak obuhvata
1 4
imunizovanje glodara antigenom, u kome glodar sadrži germinativni genom koji sadrži modifikovani DHregion koji sadrži jedan ili više modifikovanih DHgenskih segmenata gde su svaki neposredno uz 23-mer RSS, opciono gde glodar je glodar prema bilo kom od zahteva 19 do 20 ili je dobijen prema zahtevu 21, i
glodaru je omogućeno da proizvede imuni odgovor na antigen uključujući antitelo, ili nukleinsku kiselinu koja isti kodira, koji veže antigen, opciono gde:
(a) postupak je onaj koji dalje obuhvata obnavljanje antitela, ili nukleinske kiseline koja isto kodira, iz glodara ili ćelije glodara, gde ćelija glodara je B ćelija ili hibridom;
(b) jedan ili više modifikovanih DHgenskih segmenata gde je svaki neposredno uz 23-mer RSS sadrži DHgenski segment operativno u vezi sa 5’ 23-mer RSS;
(c) jedan ili više modifikovanih DHgenskih segmenata gde je svaki neposredno uz 23-mer RSS sadrži DHgenski segment operativno u vezi sa 3’ 23-mer RSS; i/ili
(d) glodar je pacov ili miš.
1
RS20220366A 2018-06-14 2019-06-14 Nehumane životinje sposobne za dh-dh uređenje u kodirajućim sekvencama teškog lanca imunoglobulina RS63117B1 (sr)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201862685203P 2018-06-14 2018-06-14
US201862702206P 2018-07-23 2018-07-23
US201962812580P 2019-03-01 2019-03-01
PCT/US2019/037285 WO2019241692A1 (en) 2018-06-14 2019-06-14 Non-human animals capable of dh-dh rearrangement in the immunoglobulin heavy chain coding sequences
EP19737613.0A EP3629720B1 (en) 2018-06-14 2019-06-14 Non-human animals capable of dh-dh rearrangement in the immunoglobulin heavy chain coding sequences

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS63117B1 true RS63117B1 (sr) 2022-05-31

Family

ID=67220854

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20241384A RS66298B1 (sr) 2018-06-14 2019-06-14 Nehumane životinje sposobne za dh-dh preuređenje u kodirajućim sekvencama teškog lanca imunoglobulina
RS20220366A RS63117B1 (sr) 2018-06-14 2019-06-14 Nehumane životinje sposobne za dh-dh uređenje u kodirajućim sekvencama teškog lanca imunoglobulina

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20241384A RS66298B1 (sr) 2018-06-14 2019-06-14 Nehumane životinje sposobne za dh-dh preuređenje u kodirajućim sekvencama teškog lanca imunoglobulina

Country Status (25)

Country Link
US (2) US20210251202A1 (sr)
EP (3) EP3629720B1 (sr)
JP (5) JP7182647B2 (sr)
KR (3) KR102617284B1 (sr)
CN (2) CN113430207A (sr)
AU (3) AU2019287727B2 (sr)
CA (1) CA3103646C (sr)
CY (1) CY1125121T1 (sr)
DK (2) DK4023059T3 (sr)
ES (2) ES2994581T3 (sr)
FI (1) FI4023059T3 (sr)
HR (2) HRP20220509T8 (sr)
HU (1) HUE069544T2 (sr)
IL (3) IL318469A (sr)
LT (2) LT3629720T (sr)
MX (2) MX391767B (sr)
PL (2) PL4023059T3 (sr)
PT (2) PT4023059T (sr)
RS (2) RS66298B1 (sr)
SG (1) SG11202012084WA (sr)
SI (2) SI3629720T1 (sr)
SM (2) SMT202400501T1 (sr)
TW (2) TWI840372B (sr)
WO (1) WO2019241692A1 (sr)
ZA (1) ZA202007560B (sr)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
LT3424947T (lt) 2011-10-28 2021-03-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Genetiškai modifikuotos t ląstelių receptorių pelės
IL318469A (en) * 2018-06-14 2025-03-01 Regeneron Pharma Non-human animals capable of reorganizing transgenic DH-DH, and their uses
CA3187680A1 (en) 2020-09-11 2022-03-17 Yashu Liu Identification and production of antigen-specific antibodies
WO2022132943A1 (en) 2020-12-16 2022-06-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mice expressing humanized fc alpha receptors
TW202430558A (zh) * 2023-01-18 2024-08-01 美商基利科學股份有限公司 人類免疫球蛋白重鏈長cdr3轉殖基因構築體及其用途
WO2026030428A2 (en) 2024-08-01 2026-02-05 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Prostate-specific antigen peptides and uses thereof
WO2026035843A2 (en) 2024-08-06 2026-02-12 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals having modified immunoglobulin heavy chain constant region locus and uses thereof

Family Cites Families (67)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
EP1690934A3 (en) 1990-01-12 2008-07-30 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
ATE300615T1 (de) 1990-08-29 2005-08-15 Genpharm Int Transgene mäuse fähig zur produktion heterologer antikörper
DE69424134T2 (de) 1993-12-03 2000-09-21 Terumo K.K., Tokio/Tokyo Stereoskopisches Bildanzeigesystem
US5670356A (en) 1994-12-12 1997-09-23 Promega Corporation Modified luciferase
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5874304A (en) 1996-01-18 1999-02-23 University Of Florida Research Foundation, Inc. Humanized green fluorescent protein genes and methods
EP1500329B1 (en) 1996-12-03 2012-03-21 Amgen Fremont Inc. Human antibodies that specifically bind human TNF alpha
GB9823930D0 (en) 1998-11-03 1998-12-30 Babraham Inst Murine expression of human ig\ locus
US6586251B2 (en) 2000-10-31 2003-07-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
CA2440676A1 (en) 2001-03-22 2002-10-03 Abbott Gmbh & Co. Kg Transgenic animals expressing antibodies specific for genes of interest and uses thereof
US7744893B2 (en) * 2002-06-05 2010-06-29 Baylor College Of Medicine T cell receptor CDR3 sequences associated with multiple sclerosis and compositions comprising same
US20100069614A1 (en) 2008-06-27 2010-03-18 Merus B.V. Antibody producing non-human mammals
AU2007235496B2 (en) 2006-03-31 2013-11-21 E. R. Squibb & Sons, L.L.C. Transgenic animals expressing chimeric antibodies for use in preparing human antibodies
ES2398076T3 (es) 2006-06-02 2013-03-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anticuerpos de alta afinidad contra el receptor de IL-6 humano
DK2602323T3 (en) 2007-06-01 2018-04-16 Open Monoclonal Tech Inc Compositions and Methods for Inhibiting Endogenous Immunoglobin Genes and Producing Transgenic Human Idiotypic Antibodies
EP2262898B1 (en) 2008-03-07 2018-01-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Es cell-derived mice from diploid host embryo injection
PL3456190T3 (pl) 2008-06-27 2022-06-06 Merus N.V. Wytwarzające przeciwciała transgeniczne zwierzę z gatunku myszy
EP2346994B1 (en) 2008-09-30 2022-02-16 Ablexis, LLC Knock-in mice for the production of chimeric antibodies
BR112012000536A2 (pt) 2009-07-08 2020-08-11 Kymab Limited métodos para produção de anticorpo ou cadeia leve ou pesada de anticorpo específico para um antígeno desejado, para produção de anticorpo ou cadeia de anticorpo e seu uso, composição farmacêutica e derivado de anticorpo quimérico
US8754287B2 (en) 2009-12-10 2014-06-17 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mice that make heavy chain antibodies
US20130045492A1 (en) 2010-02-08 2013-02-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods For Making Fully Human Bispecific Antibodies Using A Common Light Chain
US20120021409A1 (en) 2010-02-08 2012-01-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Common Light Chain Mouse
SI2501817T2 (sl) 2010-02-08 2021-09-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Miš z navadno lahko verigo
US9796788B2 (en) 2010-02-08 2017-10-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mice expressing a limited immunoglobulin light chain repertoire
US20130185821A1 (en) 2010-02-08 2013-07-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Common Light Chain Mouse
KR102203727B1 (ko) 2010-03-31 2021-01-18 아블렉시스, 엘엘씨 키메라 항체의 제조를 위한 비-인간 동물의 유전적 조작
US9012717B2 (en) 2010-06-22 2015-04-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Human lambda light chain mice
JP6482757B2 (ja) 2010-07-26 2019-03-13 トリアンニ インコーポレイテッドＴｒｉａｎｎｉ，Ｉｎｃ． トランスジェニック動物および使用方法
SG10201912639SA (en) 2010-08-02 2020-02-27 Regeneron Pharma Mice that make binding proteins comprising vl domains
RU2722373C2 (ru) 2011-02-25 2020-05-29 Редженерон Фармасьютикалс, Инк. Мыши adam6
BR112014006394A2 (pt) * 2011-09-19 2017-03-28 Kymab Ltd manipulação de diversidade genética de imunoglobulina e terapêuticos multi-anticorpos
CA2791109C (en) 2011-09-26 2021-02-16 Merus B.V. Generation of binding molecules
KR20160098514A (ko) 2011-10-17 2016-08-18 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. 제한된 면역글로불린 중쇄 마우스
CA2854233C (en) 2011-11-04 2020-05-12 Zymeworks Inc. Stable heterodimeric antibody design with mutations in the fc domain
RS62023B1 (sr) * 2012-02-01 2021-07-30 Regeneron Pharma Humanizovani glodari koji eksprimiraju teške lance koji sadrže vl domene
IN2014DN08163A (sr) 2012-03-06 2015-05-01 Regeneron Pharma
KR102228296B1 (ko) 2012-03-16 2021-03-17 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 히스티딘 공학처리된 경쇄 항체 및 그것을 생성하기 위한 유전자 변형된 비-사람 동물
SG10201700360VA (en) 2012-03-16 2017-03-30 Regeneron Pharma Non-human animals expressing ph-sensitive immunoglobulin sequences
MX2014011047A (es) 2012-03-16 2015-04-08 Regeneron Pharma Ratones que producen proteinas de union a un antigeno con caracteristicas de union dependientes del ph.
US20140013456A1 (en) 2012-03-16 2014-01-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Histidine Engineered Light Chain Antibodies and Genetically Modified Non-Human Animals for Generating the Same
RU2014153674A (ru) 2012-06-05 2016-07-27 Регенерон Фармасьютикалз, Инк. Способ получения полностью человеческих биспецифических антител с применением общей легкой цепи
PT3597037T (pt) * 2012-06-12 2021-06-01 Regeneron Pharma Animais não humanos humanizados com lócus de cadeia pesada de imunoglobulina restrito
HRP20231356T1 (hr) 2012-12-14 2024-02-16 Omniab, Inc. Polinukleotidi koji kodiraju protutijela glodavaca s ljudskim idiotipovima i životinje koje ih sadrže
EP2840892B1 (en) * 2013-02-20 2018-04-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals with modified immunoglobulin heavy chain sequences
WO2014160202A1 (en) 2013-03-13 2014-10-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mice expressing a limited immunoglobulin light chain repertoire
CN105189545A (zh) 2013-03-13 2015-12-23 瑞泽恩制药公司 常见轻链小鼠
SI2986729T1 (sl) 2013-04-16 2019-02-28 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Ciljana sprememba genoma podgane
US9475559B2 (en) 2013-07-03 2016-10-25 Hobie Cat Company Foot operated propulsion system for watercraft
WO2015143406A2 (en) * 2014-03-21 2015-09-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Vl antigen binding proteins exhibiting distinct binding characteristics
KR102276752B1 (ko) * 2014-03-21 2021-07-13 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 단일 도메인 결합 단백질을 생산하는 비-인간 동물
HUE049405T2 (hu) 2014-06-23 2020-09-28 Regeneron Pharma Nukleáz-közvetített DNS-összeállítás
ES2731437T3 (es) 2014-11-21 2019-11-15 Regeneron Pharma Métodos y composiciones para la modificación genética dirigida mediante el uso de pares de ARN guías
US9410301B2 (en) 2014-12-09 2016-08-09 Theophile Bourgeois Patch system and method for oil boom
KR102530821B1 (ko) 2014-12-19 2023-05-10 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 단일 단계 다중 표적화를 통한 표적화된 유전자 변형을 위한 방법 및 조성물
EP3271403A1 (en) 2015-03-19 2018-01-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals that select for light chain variable regions that bind antigen
HUE061619T2 (hu) 2016-06-03 2023-07-28 Regeneron Pharma Exogén terminális dezoxinukleotid-transzferázt expresszáló rágcsálók
WO2018128691A1 (en) * 2016-11-04 2018-07-12 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals having an engineered immunoglobulin lambda light chain locus
CN207626880U (zh) 2017-05-19 2018-07-20 厦门汇成峰户外用品有限公司 一种导演椅
EP3476942B1 (en) * 2017-10-27 2022-01-26 Trianni, Inc. Long germline dh genes and long hcdr3 antibodies
DK4140297T3 (da) 2017-12-05 2025-06-23 Regeneron Pharma Mus med en konstrueret immunglobulin-lambda-letkæde og anvendelser deraf
IL318469A (en) * 2018-06-14 2025-03-01 Regeneron Pharma Non-human animals capable of reorganizing transgenic DH-DH, and their uses

Also Published As

Publication number Publication date
SI4023059T1 (sl) 2025-03-31
TW202500752A (zh) 2025-01-01
IL305557B1 (en) 2025-03-01
IL305557A (en) 2023-10-01
IL318469A (en) 2025-03-01
AU2019287727A1 (en) 2021-01-14
PL4023059T3 (pl) 2025-03-10
MX2020013652A (es) 2022-04-21
ZA202007560B (en) 2022-06-29
JP7182647B2 (ja) 2022-12-02
ES2907067T3 (es) 2022-04-21
BR112020025279A2 (pt) 2021-03-09
EP4023059A1 (en) 2022-07-06
HRP20241705T1 (hr) 2025-02-28
EP3629720A1 (en) 2020-04-08
HUE069544T2 (hu) 2025-03-28
JP7815335B2 (ja) 2026-02-17
IL279311B2 (en) 2024-02-01
DK4023059T3 (da) 2024-12-02
KR102617284B1 (ko) 2023-12-27
CN113430207A (zh) 2021-09-24
TWI840372B (zh) 2024-05-01
KR102933824B1 (ko) 2026-03-05
WO2019241692A1 (en) 2019-12-19
EP3629720B1 (en) 2022-01-19
EP4464720A2 (en) 2024-11-20
SI3629720T1 (sl) 2022-04-29
SG11202012084WA (en) 2021-01-28
US20210251202A1 (en) 2021-08-19
CY1125121T1 (el) 2024-12-13
MX391767B (es) 2025-03-21
PL3629720T3 (pl) 2022-05-02
IL279311B1 (en) 2023-10-01
IL305557B2 (en) 2025-07-01
AU2019287727B2 (en) 2022-12-01
PT3629720T (pt) 2022-03-08
DK3629720T3 (da) 2022-03-07
HRP20220509T1 (hr) 2022-05-27
FI4023059T3 (fi) 2025-01-30
CN112312766A (zh) 2021-02-02
TW202012424A (zh) 2020-04-01
PT4023059T (pt) 2024-11-27
JP2022079617A (ja) 2022-05-26
SMT202200126T1 (it) 2022-05-12
KR20220130830A (ko) 2022-09-27
EP4464720A3 (en) 2025-02-19
SMT202400501T1 (it) 2025-01-14
AU2025200075A1 (en) 2025-01-30
JP2021528057A (ja) 2021-10-21
CA3103646A1 (en) 2019-12-19
IL279311A (en) 2021-01-31
US20190380316A1 (en) 2019-12-19
CA3103646C (en) 2023-06-27
RS66298B1 (sr) 2025-01-31
MX2022004537A (es) 2022-05-10
AU2022268350B2 (en) 2024-11-07
EP4023059B1 (en) 2024-11-06
ES2994581T3 (en) 2025-01-28
KR102444180B1 (ko) 2022-09-16
LT3629720T (lt) 2022-03-10
AU2022268350A1 (en) 2022-12-15
LT4023059T (lt) 2024-12-27
KR20230147213A (ko) 2023-10-20
KR20210020031A (ko) 2021-02-23
JP2024019660A (ja) 2024-02-09
JP2026016787A (ja) 2026-02-03
JP2024111243A (ja) 2024-08-16
HRP20220509T8 (hr) 2022-07-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2017391167B2 (en) Non-human animals having an engineered immunoglobulin lambda light chain locus
JP7815335B2 (ja) 免疫グロブリン重鎖コーディング配列におけるｄｈ－ｄｈ再構成が可能な非ヒト動物
RS63772B1 (sr) Miševi koji imaju modifikovani lambda laki lanac imunoglobulina i njihove upotrebe
JP2025138773A (ja) カッパ遺伝子座から発現される限られたラムダ軽鎖レパートリーを有する非ヒト動物及びその使用
JP2026069737A (ja) 免疫グロブリン重鎖コーディング配列におけるｄｈ－ｄｈ再構成が可能な非ヒト動物
HK40076920B (en) Non-human animals capable of dh-dh rearrangement in the immunoglobulin heavy chain coding sequences
HK40118853A (en) Non-human animals capable of dh-dh rearrangement in the immunoglobulin heavy chain coding sequences
HK40076920A (en) Non-human animals capable of dh-dh rearrangement in the immunoglobulin heavy chain coding sequences
HK40129793A (en) Non-human animals having an engineered immunoglobulin lambda light chain and uses thereof
HK40016068B (en) Non-human animals capable of dh-dh rearrangement in the immunoglobulin heavy chain coding sequences
HK40016068A (en) Non-human animals capable of dh-dh rearrangement in the immunoglobulin heavy chain coding sequences
BR122021026772B1 (pt) Molécula nucleotídica e vetor de direcionamento
BR112020025279B1 (pt) Método de produção de um roedor cujo genoma compreende uma região de diversidade de cadeia pesada manipulada (dh) e método de produção de um roedor cujo genoma compreende uma região dh manipulada