RS63382B1 - Anti-gm-csf antitela i njihova upotreba - Google Patents

Description

Opis

STANJE TEHNIKE

[0001] Faktor stimulacije kolonije granulocita-makrofaga, GM-CSF, prvobitno je identifikovan kao hemopoetski faktor rasta. Proizvode ga brojni tipovi ćelija uključujući limfocite, monocite, endotelne ćelije, fibroblaste i neke maligne ćelije (Metcalf et al., 1986; Clark i Kamen, 1987; Hart et al., 1988; Metcalf et al., 1986). Pored toga što ima funkciju stimulacije rasta i diferencijacije na hemopoetskim prekursorskim ćelijama, otkriveno je i da GM-CSF ima različite efekte na ćelije imunog sistema koje eksprimiraju GM-CSF receptor (za pregled videti: Hamilton, 2002; de Groot et al., 1998). Najvažnija od ovih funkcija je aktivacija monocita, makrofaga i granulocita u nekoliko imunoloških i inflamatornih procesa (Gasson et al., 1990b; Gasson et al., 1990a; Hart et al., 1988; Rapoport et al., 1992)..

[0002] Zreli GM-CSF je monomerni protein od 127 aminokiselina sa dva mesta glikozilacije. Promenljivi stepen glikozilacije dovodi do raspona molekulske težine između 14kDa i 35kDa. Neglikozilovani i glikozilovani GM-CSF pokazuju sličnu aktivnost in vitro (Cebon et al., 1990). Kristalografska analiza GM-CSF otkrila je strukturu u obliku bureta koja se sastoji od četiri kratke alfa spirale (Diederichs et al., 1991). Ukupno savijanje je slično drugim faktorima rasta kao što su hormon rasta, interleukin-2 i interleukin-4.

[0003] GM-CSF ispoljava svoju biološku aktivnost vezivanjem za svoj receptor (Kastelein i Shanafelt, 1993; Sisson i Dinarello, 1988). Najvažnija mesta ekspresije GM-CSF receptora (GM-CSF-R) su na ćelijskoj površini mijeloidnih ćelija i endotelnih ćelija, dok su limfociti GM-CSF-R negativni. Nativni receptor se sastoji od najmanje dve podjedinice, alfa i beta. Alfa podjedinica daje specifičnost liganda i vezuje GM-CSF sa nanomolarnim afinitetom (Gearing et al., 1989; Gasson et al., 1986). Beta podjedinica je takođe deo kompleksa receptora interleukina-3 i interleukina-5 i, u vezi sa alfa podjedinicom GM-CSF receptora i GM-CSF, dovodi do formiranja kompleksa sa afinitetom za pikomolarno vezivanje (Haiashida et al. , 1990). Domeni vezivanja na GM-CSF za receptor su mapirani: GM-CSF interaguje sa beta podjedinicom svog receptora preko veoma ograničenog regiona u prvoj alfa spirali GM-CSF (Shanafelt et al., 1991b; Shanafelt et al., 1991a; Lopez et al., 1991).

Vezivanje za alfa podjedinicu bi se moglo mapirati na treću alfa heliks, heliks C, početne ostatke petlje koje spajaju spirale C i D, i na karboksiterminalni rep GM-CSF (Brovn et al., 1994).

[0004] Formiranje kompleksa trimernog receptora GM-CSF dovodi do aktivacije složenih signalnih kaskada koje uključuju molekule JAK/STAT familije, Shc, Ras, Raf, MAP kinaze, fosfatidilinozitol-3-kinaze i NFkB, što konačno dovodi do transkripcije c -mic, c-fos i c-jun. Aktivaciju uglavnom indukuje beta podjedinica receptora (Haiashida et al., 1990; Kitamura et al., 1991; Sato et al., 1993). Zajednička beta podjedinica je takođe odgovorna za funkcije preklapanja koje vrše IL-3, IL-5 i GM-CSF (za pregled videti: de Groot et al., 1998).

[0005] Osim što stimuliše hemopoetski rast i diferencijaciju, GM-CSF funkcioniše posebno kao proinflamatorni citokin. Makrofagi i monociti, kao i neutrofili i eozinofili postaju aktivirani od strane GM-CSF, što dovodi do oslobađanja drugih citokina i hemokina, proteaza koje razgrađuju matriks, povećane ekspresije HLA i povećane ekspresije molekula ćelijske adhezije ili receptora za CC-hemokine. Ovo poslednje, zauzvrat, dovodi do povećane hemotakse inflamatornih ćelija u zapaljeno tkivo (Chantri et al., 1990; Hamilton, 2002; Sisson i Dinarello, 1988; Zhang et al., 1998; Hamilton et al., 1993; sar., 1986; Cheng et al., 2001; Gomez-Cambronero et al., 2003). Često, GM-CSF ispoljava svoju aktivnost u sinergiji sa drugim faktorima stimulacije zapaljenja kao što su drugi citokini ili LPS, npr. neutrofili tretirani GM-CSF u kombinaciji sa npr. LPS će pokazati povećan oksidativni nalet (Kaufman et al., 1989; Rapoport et al., 1992).

[0006] GM-CSF kao meta za antiinflamatornu terapiju:

Zbog svojih raznovrsnih aktivacionih funkcija u imunološkom sistemu, GM-CSF se može smatrati metom za antiinflamatornu terapiju. Hronične i akutne inflamatorne bolesti kao što su reumatoidni artritis (RA), multipla skleroza (MS), Kronova bolest, psorijaza, astma, atopijski dermatitis ili šok mogu imati koristi od blokiranja aktivnosti GM-CSF i naknadnog smanjenja štetnih aktivnosti GM-CSF ćelije koje reaguju (Hamilton, 1993; Zhang et al., 1998; Hamilton, 2002).

[0007] Artritis:

Nekoliko grupa je pokazalo da su GM-CSF, kao i njegov receptor, prisutni u sinovijalnom zglobu pacijenata sa artritisom (Alvaro-Gracia et al., 1991; Ksu et al., 1989; Havorth et al., 1991). Pored toga, pokazalo se da GM-CSF izaziva napade reumatoidnog artritisa kod pacijenata lečenih GM-CSF zbog neutropenije kod Feltijevog sindroma (Hazenberg et al., 1989) ili nakon hemoterapije (de Vries et al., 1991).

[0008] Prvi nagoveštaji o korisnosti antitela koja blokiraju GM-CSF za lečenje artritisa došli su iz in vivo studija na miševima (Campbell et al., 1997; Campbell et al., 1998; Cook et al., 2001). Konkretno, Cook et al. su pokazali da su neutralizujuća antitela na GM-CSF pokazala efikasnost u modelu artritisa izazvanog kolagenom. Blokiranje GM-CSF dovelo je do smanjenja težine bolesti u vezi sa zapaljenjem, destrukcijom hrskavice i progresijom bolesti u prvobitno zahvaćenim udovima ili progresijom na druge udove.

[0009] Postoji nekoliko efekata anti-GM-CSF terapije od kojih pacijenti sa reumatoidnim artritisom ili sa drugim inflamatornim oboljenjima mogu imati koristi.

[0010] Očekuje se da će blokiranje GM-CSF inhibirati ili smanjiti:

a) aktivaciju i broj zrelih monocita, makrofaga i neutrofila. Posebno su neutrofili i makrofagi u izobilju u sinovijalnoj tečnosti i membrani. Pokazalo se da je broj makrofaga u sinovijumu u korelaciji sa stepenom erozije u RA zglobovima (Mulherin et al., 1996; Burmester et al., 1997). Makrofagi su izvor niza drugih proinflamatornih citokina i proteaza koje razgrađuju matriks. Produkcija H2O2neutrofilima je deo destruktivnih procesa koji se odvijaju u artritičnim zglobovima (Babior, 2000). b) diferencijaciju mijeloidnih dendritičnih ćelija (DC) i aktivaciju sinovijalnih DC (= sinoviociti). GM-CSF pojačava i održava ekspresiju HLA klase II na DC i RA sinoviocitima (Alvaro-Gracia JM et al., 1991). DC su upućeni unutar zgloba da steknu funkcije povezane sa selektivnom aktivacijom inflamatornih T-ćelija. Specifični HLA-DR aleli su povezani sa osetljivošću na RA, a aktivacija T-ćelija putem antigenske prezentacije DC može igrati ključnu ulogu u ovoj vrsti imunoloških bolesti (Santiago-Schvarz et al., 2001).

[0011] Multipla skleroza:

Kod multiple skleroze, povišeni nivoi GM-CSF koreliraju sa aktivnom fazom MS (Carrieri et al., 1998; McKualter et al., 2001) i GM-CSF-/- miševi ne uspevaju da razviju bolest u model sistemu za MS , eksperimentalni encefalomijelitis, EAE (McKualter et al., 2001).

[0012] Astma:

Kod astme su prijavljene povećane količine GM-CSF u plućima (Broide i Firestein, 1991). Istovremeno su povišeni eozinofili, na koje GM-CSF u sinergiji sa interleukinom-5 deluje na tri načina: i) stimuliše diferencijaciju iz progenitornih ćelija u eozinofile, ii) stimuliše njihovu funkcionalnu aktivaciju i iii) produžava preživljavanje eozinofila u plućima (Broide et al., 1992; Iamashita et al., 2002). Dakle, smanjenje preživljavanja eozinofila u astmatičnim disajnim putevima blokiranjem GM-CSF verovatno će ublažiti bolest. Korisnost anti-GM-CSF neutralizujućih antitela je dalje prikazana u modelu za mišju astmu gde je primena takvih antitela dovela do značajnog smanjenja hiperreaktivnosti disajnih puteva i upale disajnih puteva (Iamashita et al., 2002).

[0013] U drugom modelu miša, LPS-zavisna upala pluća mogla bi se smanjiti primenom anti-GM-CSF antitela 22E9 kod miša (Bozinovski et al., 2003).

[0014] Toksični efekti:

Miševi homozigotni za poremećeni gen faktora stimulacije kolonije granulocita/makrofaga (GM-CSF) razvijaju se normalno i ne pokazuju veće poremećaje hematopoeze do starosti od 12 nedelja. Dok je većina miševa sa nedostatkom GM-CSF-a na površini zdrava i plodna, svi razvijaju neorganizovani vaskularni ekstracelularni matriks sa poremećenim i smanjenim snopovima kolagena i abnormalnim plućima sa poremećenim klirensom plućnog surfaktanta i smanjenom otpornošću na mikrobne patogene u plućima. Karakteristike ove druge patologije liče na ljudski poremećaj plućne alveolarne proteinoze (PAP). Čini se da GM-CSF nije od suštinskog značaja za održavanje normalnih nivoa glavnih tipova zrelih hematopoetskih ćelija i njihovih prekursora u krvi, srži i slezini. Međutim, oni impliciraju da je GM-CSF neophodan za normalan vaskularni razvoj, plućnu fiziologiju i za otpornost na lokalnu infekciju (Stanlei et al., 1994; Dranoff et al., 1994; Plenz et al., 2003; Shibata et al. , 2001). Nedavno je jaka povezanost auto-antitela na GM-CSF sa PAP dodatno implicirala abnormalnosti signalizacije GM-CSF u patogenezi PAP kod ljudi. Zajedno, ova zapažanja pokazuju da GM-CSF ima ključnu ulogu u regulaciji homeostaze surfaktanta i urođenih imunih funkcija alveolarnih makrofaga u plućima (Bonfield et al., 2002; Trapnell i Vhitsett, 2002; Uchida et al., 2004; Kitamura et al. al., 1999).

[0015] Visoki titri autoantitela sa blokirajućim delovanjem na GM-CSF opisani su kod pacijenata sa mijastenijom gravis. Ovi pacijenti nisu pokazali nikakve druge autoimune fenomene ili hemopoetske nedostatke ili „druge očigledne kliničke korelacije“ (Meager et al., 1999).

[0016] Jedinjenje E21R, modifikovani oblik GM-CSF koji antagonizuje funkciju GM-CSF, procenjeno je u bezbednosnom ispitivanju faze I i utvrđeno je da ima dobar bezbednosni profil kod pacijenata sa kancerom (Olver et al., 2002).

[0017] Dakle, osim funkcije pluća, koju treba pažljivo pratiti, ne očekuju se drugi neželjeni efekti pri primeni anti-GM-CSF terapije.

[0018] Do sada su generisana samo antitela dobijena od ne-humanih vrsta sa funkcijom neutralizacije GM-CSF. Na primer, EP 0499161 A1 opisuje antitelo generisano imunizacijom miševa oligopeptidima, čija sekvenca je izvedena iz GM-CSF. Dalje, prijava otkriva postupak za ublažavanje neželjenog efekta GM-CSF kod sisara kome je to potrebno, koji obuhvata davanje navedenom sisaru količine imunoglobulina koja inhibira GM-CSF. Međutim, to antitelo je mišje antitelo, što ga čini neprikladnim za primenu kod ljudi.

[0019] Pored toga, WO 03/068920 otkriva himerno mišje/humano IgG1 antitelo, koje se ovde pominje kao himerno 19/2, za koje se navodi da pokazuje neutralizujuću aktivnost GM-CSF stimulisanog rasta ćelija. Antitela koja sadrže ne-humane sekvence verovatno će izazvati imuni odgovor kod humanog pacijenta i nisu prikladna za terapijsku primenu. Na primer, kod bolesti gde je potrebno dugotrajno lečenje (npr. hronične inflamatorne bolesti kao što su reumatoidni artritis, astma i multipla skleroza), nastavak primene nehumanog terapeutskog agensa povećava verovatnoću ozbiljne inflamatorne reakcije i proizvodnju humanih antitela. koji mogu neutralisati terapeutsko sredstvo.

[0020] Shodno tome, u svetlu velikog potencijala za terapiju anti-GM-CSF antitelima, postoji velika potreba za humanim anti-GM-CSF antitelima sa visokim afinitetom koja efikasno blokiraju interakciju GM-CSF/GM-CSF receptora. Pored toga, bilo bi korisno imati jedno ili više antitela koja mogu unakrsno da reaguju sa GM-CSF jedne ili više ne-humanih vrsta da bi se testirala njihova efikasnost u in vivo modelima zasnovanim na životinjama.

[0021] Ovaj pronalazak zadovoljava ove i druge potrebe obezbeđivanjem potpuno visoko efikasnih anti-GM-CSF antitela, koja su opisana u nastavku.

[0022] Sve reference u opisu na postupake lečenja odnose se na jedinjenja, farmaceutske kompozicije i lekove ovog pronalaska za upotrebu u postupku za lečenje humanog (ili životinjskog) tela terapijom (ili za dijagnozu).

REZIME PRONALASKA

[0023] Predmet pronalaska je da obezbedi humana antitela koja mogu efikasno da blokiraju interakciju GM-CSF/GM-CSF receptora. Pronalazak obezbeđuje izolovano humano IgG1 antitelo koje sadrži region koji se vezuje za antigen koji je specifičan za GM-CSF koji obuhvata

(i) varijabilnu aminokiselinsku sekvencu teškog lanca koja odgovara SEQ ID NO: 20; i

(ii) varijabilnu aminokiselinsku sekvencu lakog lanca koja odgovara SEQ ID NO: 40.

[0024] Drugi cilj pronalaska je da obezbedi antitela koja su bezbedna za primenu kod ljudi.

[0025] Kompozicije pronalaska mogu se koristiti za terapeutske ili profilaktičke primene. Pronalazak stoga obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži humano IgG1 antitelo koje sadrži region koji se vezuje za antigen koji je specifičan za GM-CSF koji sadrži

(i) varijabilnu aminokiselinsku sekvencu teškog lanca koja odgovara SEQ ID NO: 20; i

(ii) varijabilnu aminokiselinsku sekvencu lakog lanca koja odgovara SEQ ID NO: 40 i njen farmaceutski prihvatljiv nosač ili ekscipijent.

[0026] U srodnom aspektu, pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži izolovano humano IgG1 antitelo koje sadrži region koji se vezuje za antigen koji je specifičan za GM-CSF koji sadrži

(i) varijabilnu aminokiselinsku sekvencu teškog lanca koja odgovara SEQ ID NO: 20; i

(ii) varijabilnu aminokiselinsku sekvencu lakog lanca koja odgovara SEQ ID NO: 40 i njen farmaceutski prihvatljiv nosač ili ekscipijent, za upotrebu u lečenju inflamatorne bolesti.

[0027] U drugom aspektu pronalaska, obezbeđeno je izolovano humano IgG1 antitelo koje sadrži region koji se vezuje za antigen koji je specifičan za GM-CSF koji sadrži

(i) varijabilnu aminokiselinsku sekvencu teškog lanca koja odgovara SEQ ID NO: 20; i

(ii) varijabilnu aminokiselinsku sekvencu lakog lanca koja odgovara SEQ ID NO: 40,

za upotrebu u lečenju inflamatorne bolesti.

[0028] U jednom aspektu, inflamatorna bolest je uzeta sa spiska reumatoidnog artritisa, multiple skleroze, Kronove bolesti, psorijaze, astme, atopijskog dermatitisa i šoka. U drugom izvođenju, inflamatorna bolest je reumatoidni artritis.

[0029] Humana antitela iz ovog pronalaska mogu biti unakrsno reaktivna sa GM-CSF pacova i/ili rezus (makaki) GM-CSF, što je određeno ravnotežnom titracijom rastvora (SET) i/ili testom proliferacije TF1.

KRATAK OPIS SLIKA

[0030]

Slika 1a prikazuje sekvence nukleinskih kiselina različitih novih varijabilnih regiona teškog lanca antitela.

Slika 1b daje sekvence aminokiselina različitih novih varijabilnih regiona teškog lanca antitela. CDR regioni HCDR1, HCDR2 i HCDR3 su označeni od N- do C-kraja podebljanim slovima.

Slika 2a daje sekvence nukleinskih kiselina različitih novih varijabilnih regiona lakog lanca antitela.

Slika 2b daje sekvence aminokiselina različitih novih varijabilnih regiona lakog lanca antitela. CDR regioni LCDR1, LCDR2 i LCDR3 su označeni od N- do C-kraja podebljanim slovima.

Slika 3 daje sekvence aminokiselina varijabilnih regiona teškog lanca zasnovanog na konsenzusu sekvence HuCAL<®>master gena antitela. CDR regioni HCDR1, HCDR2 i HCDR3 su označeni od N- do C-kraja podebljanim slovima.

Slika 4 daje sekvence aminokiselina varijabilnih regiona lakog lanca zasnovanog na konsenzusu sekvence HuCAL<®>master gena antitela. CDR regioni LCDR1, LCDR2 i LCDR3 su označeni od N- do C-kraja podebljanim slovima.

Slika 5 daje primer sekvence DNK pMORPH<®>Ks9_MOR03929_FH vektor ekspresije (SEQ ID NO: 43).

Slika 6 daje nivo ekspresije alfa receptora GM-CSF, kao što je određeno FACS analizom korišćenjem antitela specifičnog za GM-CSF receptor alfa MAB1006. CHO-GMRa#11 (puna linija) je prikazana u poređenju sa CHO-K1 (isprekidana linija). X-osa predstavlja relativnu vrednost fluorescencije (RFL), merenu u FL2 kanalu; Y-osa predstavlja broj ćelija.

DETALjAN OPIS PRONALASKA

[0031] Ovaj pronalazak je zasnovan na otkriću novih antitela koja su specifična ili imaju visok afinitet za GM-CSF i poseduju jedno ili više drugih novih osobina. Poželjno, antitelo pronalaska može da pruži terapeutsku korist subjektu. Antitela pronalaska, koja su humana, mogu se koristiti u mnogim kontekstima, koji su ovde potpunije opisani.

[0032] "Humano" antitelo ili funkcionalni fragment humanog antitela se ovde definiše kao antitelo koje nije himerno (npr. nije "humanizovano") i nije (bilo u celini ili delimično) nehumane vrste. Humano antitelo ili funkcionalni fragment antitela može biti izvedeno od čoveka ili može biti sintetičko humano antitelo. "Sintetičko humano antitelo" je ovde definisano kao antitelo koje ima sekvencu izvedenu, u celini ili delimično, in silico od sintetičkih sekvenci koje se zasnivaju na analizi poznatih sekvenci humanih antitela. In silico dizajn sekvence humanog antitela ili njegovog fragmenta može se postići, na primer, analizom baze podataka sekvenci humanog antitela ili fragmenta antitela i osmišljavanjem polipeptidne sekvence koristeći podatke dobijene iz toga. Drugi primer humanog antitela ili funkcionalnog fragmenta antitela je onaj koji je kodiran nukleinskom kiselinom izolovanom iz biblioteke sekvenci antitela humanog porekla (tj. takva biblioteka je zasnovana na antitelima uzetim iz humanog prirodnog izvora).

[0033] Kako se ovde koristi, antitelo se „specifično vezuje za“, je „specifično za/prema“ ili „specifično prepoznaje“ antigen (ovde, GM-CSF) ako je takvo antitelo u stanju da razlikuje takav antigen i jedan ili više referentnih antigena, pošto specifičnost vezivanja nije apsolutno, već relativno svojstvo. U svom najopštijem obliku (i kada se ne pominje nikakva definisana referenca), “specifično vezivanje” se odnosi na sposobnost antitela da razlikuje antigen od interesa i nesrodni antigen, kao što je određeno, na primer, u skladu sa jednim od sledećih postupaka. Takvi postupci obuhvataju, ali nisu ograničeni na Western blot, ELISA-, RIA-, ECL-, IRMA-testove i skeniranje peptida. Na primer, može se izvesti standardni ELISA test. Bodovanje se može izvršiti standardnim razvojem boje (npr. sekundarno antitelo sa peroksidom rena i tetrametil benzidin sa vodonikperoksidom). Reakcija u određenim bunarčićima se ocenjuje optičkom gustinom, na primer, na 450 nm. Tipična pozadina (= negativna reakcija) može biti 0,1 OD; tipična pozitivna reakcija može biti 1 OD. To znači da razlika pozitivna/negativna može biti više od 10 puta. Tipično, određivanje specifičnosti vezivanja se vrši korišćenjem ne jednog referentnog antigena, već skupa od oko tri do pet nesrodnih antigena, kao što su mleko u prahu, BSA, transferin ili slično.

[0034] Međutim, "specifično vezivanje" se takođe može odnositi na sposobnost antitela da razlikuje ciljni antigen i jedan ili više blisko povezanih antigena, koji se koriste kao referentne tačke, npr. između GM-CSF i IL3, IL5, IL-4, IL13 ili M-CSF. Dodatno, "specifično vezivanje" može da se odnosi na sposobnost antitela da razlikuje različite delove svog ciljnog antigena, npr. različitih domena ili regiona GM-CSF, ili između jednog ili više ključnih aminokiselinskih ostataka ili delova aminokiselinskih ostataka GM-CSF.

[0035] Takođe, kako se ovde koristi, "imunoglobulin" (Ig) je ovde definisan kao protein koji pripada klasi IgG, IgM, IgE, IgA ili IgD (ili bilo kojoj njihovoj podklasi), i uključuje sva konvencionalno poznata antitela i njihove funkcionalne fragmente . "Funkcionalni fragment" antitela/imunoglobulina se ovde definiše kao fragment antitela/imunoglobulina (na primer., varijabilni region IgG) koji zadržava region koji se vezuje za antigen. "Region koji se vezuje za antigen" antitela se tipično nalazi u jednom ili više hipervarijabilnih regiona antitela, tj. CDR-1, -2 i/ili -3 regiona; međutim, promenljivi „okvirni“ regioni takođe mogu igrati važnu ulogu u vezivanju antigena, kao što je obezbeđivanje potpore za CDR. Poželjno, "region koji se vezuje za antigen" sadrži najmanje aminokiselinske ostatke 4 do 103 varijabilnog lakog (VL) lanca i 5 do 109 varijabilnog teškog (VH) lanca, poželjnije aminokiselinske ostatke 3 do 107 VL i 4 do 111 od VH, a posebno poželjni su kompletni VL i VH lanci (pozicije aminokiselina 1 do 109 VL i 1 do 113 VH; numerisanje prema WO 97/08320). „Funkcionalni fragmenti“ obuhvataju domen F(ab')2fragment, Fab fragment, scFv ili konstrukti koji sadrže pojedinačne varijabilne domene imunoglobulina ili polipeptide antitela sa jednim domenom, npr. pojedinačni varijabilni domeni teškog lanca ili varijabilni domeni jednog lakog lanca. F(ab')2ili Fab može biti projektovan tako da minimizira ili potpuno ukloni intermolekularne disulfidne interakcije koje se javljaju između CH1i CLdomena.

[0036] Antitelo pronalaska može biti izvedeno iz biblioteke rekombinantnih antitela koja se zasniva na sekvencama amino kiselina koje su dizajnirane in silico i kodirane nukleinskim kiselinama koje su sintetički stvorene. In silico dizajn sekvence antitela se postiže, na primer, analizom baze podataka humanih sekvenci i osmišljavanjem polipeptidne sekvence korišćenjem podataka dobijenih iz toga. Postupci projektovanja i dobijanja in sekvence stvorene silikonom opisani su, na primer, u Knappik et al., J. Mol. Biol. (2000) 296:57; Krebs et al., J. Immunol. Methods. (2001) 254:67; i U.S. Patent No.6,300,064 izdato Knappik et al.

Antitela

1

[0037] U ovom dokumentu se pominje sledeća antitela: „antitela br. ili "MOR" 03684, 04251, 03929, 04252, 04287, 04290, 04302, 04350, 04354, 04357, 03682, 04283, 04283, 04292, 04292, 04292, 04290, 04290, 04302, 04350, 04354, 04357, 03682, 04283, 04283, 04283, 04292, 04292, 04283, 04292, 04, 04, 04. )/SEQ ID NO: 11 (protein) i varijabilni laki region koji odgovara SEQ ID NO: 21 (DNK)/SEQ ID NO: 31 (protein). MOR04251 predstavlja antitelo koje ima varijabilni teški region koji odgovara SEQ ID NO: 2 (DNK)/SEQ ID NO: 12 (protein) i varijabilni laki region koji odgovara SEQ ID NO: 22 (DNK)/SEQ ID NO: 32 (protein). MOR03929 predstavlja antitelo koje ima varijabilni teški region koji odgovara SEQ ID NO: 3 (DNK)/SEQ ID NO: 13 (protein) i varijabilni laki region koji odgovara SEQ ID NO: 23 (DNK)/SEQ ID NO: 33 (protein). MOR04252 predstavlja antitelo koje ima varijabilni teški region koji odgovara SEQ ID NO: 4 (DNK)/SEQ ID NO: 14 (protein) i varijabilni laki region koji odgovara SEQ ID NO: 24 (DNK)/SEQ ID NO: 34 (protein). MOR04287 predstavlja antitelo koje ima varijabilni teški region koji odgovara SEQ ID NO: 5 (DNK)/SEQ ID NO: 15 (protein) i varijabilni laki region koji odgovara SEQ ID NO: 25 (DNK)/SEQ ID NO: 35 (protein). MOR04290 predstavlja antitelo koje ima varijabilni teški region koji odgovara SEQ ID NO: 6 (DNK)/SEQ ID NO: 16 (protein) i varijabilni laki region koji odgovara SEQ ID NO: 26 (DNK)/SEQ ID NO: 36 (protein). MOR04302 predstavlja antitelo koje ima varijabilni teški region koji odgovara SEQ ID NO: 7 (DNK)/SEQ ID NO: 17 (protein) i varijabilni laki region koji odgovara SEQ ID NO: 27 (DNK)/SEQ ID NO: 37 (protein). MOR04350 predstavlja antitelo koje ima varijabilni teški region koji odgovara SEQ ID NO: 8 (DNK)/SEQ ID NO: 18 (protein) i varijabilni laki region koji odgovara SEQ ID NO: 28 (DNK)/SEQ ID NO: 38 (protein). MOR04354 predstavlja antitelo koje ima varijabilni teški region koji odgovara SEQ ID NO: 9 (DNK)/SEQ ID NO: 19 (protein) i varijabilni laki region koji odgovara SEQ ID NO: 29 (DNK)/SEQ ID NO: 39 (protein). MOR04357 predstavlja antitelo koje ima varijabilni teški region koji odgovara SEQ ID NO: 10 ili 48 (DNK)/SEQ ID NO: 20 (protein) i varijabilni laki region koji odgovara SEQ ID NO: 30 ili 57 (DNK)/SEK ID NE: 40 (proteini). MOR03682 predstavlja antitelo koje ima varijabilni teški region koji odgovara SEQ ID NO: 44 (DNK)/SEQ ID NO: 49 (protein) i varijabilni laki region koji odgovara SEQ ID NO: 53 (DNK)/SEQ ID NO: 58 (protein). MOR04283 predstavlja antitelo koje ima varijabilni teški region koji odgovara SEQ ID NO: 45 (DNK)/SEQ ID NO: 50 (protein) i varijabilni laki region koji odgovara SEQ ID NO: 54 (DNK)/SEQ ID NO: 59 (protein). MOR04297 predstavlja antitelo koje ima varijabilni teški region koji odgovara SEQ ID NO: 46 (DNK)/SEQ ID NO: 51 (protein) i varijabilni laki region koji odgovara SEQ ID NO: 55 (DNK)/SEQ ID NO: 60 (protein). MOR04342 predstavlja antitelo koje ima varijabilni teški region koji odgovara SEQ ID NO: 47 (DNK)/SEQ ID NO: 52 (protein) i varijabilni laki region koji odgovara SEQ ID NO: 56 (DNK)/SEQ ID NO: 61 (protein).

[0038] U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje antitela koja imaju region za vezivanje antigena koji se može vezati specifično za GM-CSF ili ima visok afinitet za GM-CSF. Za antitelo se kaže da ima "visok afinitet" za antigen ako je merenje afiniteta najmanje 100 nM (monovalentni afinitet Fab fragmenta). Inventivno antitelo ili region koji se vezuje za antigen poželjno se može vezati za GM-CSF sa afinitetom od oko 100 nM, poželjnije manjim od oko 60 nM, a još poželjnije manjim od oko 30 nM. Dalje poželjna su antitela koja se vezuju za GM-CSF sa afinitetom manjim od oko 10 nM, a poželjnije manjim od oko 3 nM. Na primer, afinitet antitela pronalaska protiv GM-CSF može biti oko 10,0 nM ili 1 pM (monovalentni afinitet Fab fragmenta).

[0039] Tabela 1 daje rezime afiniteta reprezentativnih antitela, utvrđenih rezonanacom površinskog plazmona (Biacore) i analizom ravnotežne titracije rastvora (SET):

Tabela 1: Afiniteti antitela

"nd": nije utvrđeno

[0040] Pozivajući se na tabelu 1, afinitet MOR03684, 04251, 03929, 04252, 04357, 04290, 04302, 04350 i 04354 je meren rezonanacom površinskog plazmona (BiaCS recombin) na imobilisanom GMF-u. Fab format MOR03684, 04251, 03929, 04252, 04357, 04290, 04302, 04350 i 04354 pokazuje raspon monovalentnog afiniteta između oko 6420 i 7 pM.

[0041] Fab format je takođe korišćen za određivanje afiniteta ravnotežnom titracijom rastvora (SET). Desna kolona tabele 1 označava snagu vezivanja između oko 16000 i 0,4 pM MOR-a u ovoj postupaki.

[0042] Poželjno je da je antitelo prema pronalasku unakrsno reaktivno sa ljudima i najmanje jednom drugom vrstom, koja može biti vrsta glodara ili primat koji nije čovek. Primat koji nije čovek može biti rezus. Vrsta glodara može biti pacov. Antitelo koje je unakrsno reaktivno sa najmanje jednom vrstom glodara, na primer, može da obezbedi veću fleksibilnost i prednosti u odnosu na poznata anti-GM-CSF antitela, u svrhu sprovođenja in vivo studije na više vrsta sa istim antitelom.

[0043] Poželjno, antitelo iz ovog pronalaska ne samo da je u stanju da se veže za GM-CSF, već je takođe u stanju da blokira interakciju humanog GM-CSF sa alfa lancem humanog GM-CSF receptora eksprimiranog na CHO-K1 ćelijama najmanje 25%, poželjno za najmanje 50%, poželjnije za najmanje 60%, poželjnije za najmanje 70%, poželjno za najmanje 85% i najpoželjnije za najmanje 100%. U poželjnoj realizaciji, antitelo pronalaska je u stanju da blokira interakciju od 0,5 µg/ml humanog GM-CSF sa alfa lancem humanog GM-CSF receptora eksprimiranog na oko 2×10<5>CHO-K1 ćelije za najmanje 50% pod sledećim uslovima: koncentracija alfa lanca humanog GM-CSF receptora eksprimirana na CHO-K1 ćelijama je slična koncentraciji alfa lanca humanog GM-CSF receptora eksprimiranom na oko 2× 10<5>CHO-GMRa#11 ćelije, a koncentracija inventivnog antitela je oko 5 ug/ml.

[0044] S tim u vezi, kvalifikovani stručnjak može da dobije CHO-K1 ćelije koje eksprimiraju humani GM-CSF receptor alfa u koncentraciji sličnoj onoj koja je eksprimirana na oko 2×10<5>CHO-GMRa#11 ćelije od, na primer., transfekcijom populacije CHO-K1 ćelija sa odgovarajućim ekspresionim vektorom koji kodira GM-CSF receptor alfa da bi se generisale različite stabilne ćelijske linije koje eksprimiraju definisane nivoe GM-CSF receptora alfa; zatim, stabilne ćelijske linije se analiziraju u FACS analizi da bi se odredili nivoi ekspresije alfa receptora GM-CSF u skladu sa protokolom u suštini kao što je opisano u Primeru 3C; ćelijska linija koja eksprimira humani GM-CSF receptor alfa u koncentraciji sličnoj onoj koja je eksprimirana na oko 2×10<5>ćelija CHO-GMRa#11 koje se identifikuju poređenjem srednje vrednosti fluorescencije (MFL) takvih transfektovanih ćelija sa MFL vrednošću datom u

1

Primeru 3C. Kako se ovde koristi, ćelijska linija je definisana kao ekspresija GM-CSF receptora alfa u koncentraciji "sličnoj" onoj koja je eksprimirana na oko 2×10<5>CHO-GMRa#11 ćelije" ako MFL vrednost transficirane ćelijske linije ne odstupa više od dvostrukog faktora od MFL vrednosti za ćeliju CHO-GMRa#11 kao što je navedeno u Primeru 3C.

[0045] Štaviše, antitelo pronalaska je u stanju da neutrališe humani GM-CSF u testu proliferacije TF-1 sa nižom IC50vrednošću od referentnog antitela BVD2-21C11 i/ili MAB215, poželjno najmanje pet puta nižom IC50vrednošću, poželjnije sa najmanje 10 puta nižom IC50vrednošću od referentnog antitela BVD2-21C11 i/ili MAB215, poželjnije sa najmanje 15 puta nižom IC50vrednošću od referentnog antitela BVD2-21C11 i/ili MAB215, poželjnije sa najmanje 20 puta nižom IC50vrednošću od referentnog antitela BVD2-21C11 i/ili MAB215, poželjnije sa najmanje 30 puta nižom IC50vrednošću od referentnog antitela BVD2-21C11 i/ili MAB215, poželjnije sa najmanje 50 puta nižom IC50vrednošću od referentnog antitela BVD2-21C11 i/ili MAB215, poželjnije sa najmanje 100 puta nižom IC50vrednošću od referentnog antitela BVD2-21C11 i/ili MAB215 i najpoželjnije sa najmanje 120 puta nižom IC50vrednošću od referentnog antitela BVD2-21C11 i/ili MAB215.

DNK molekuli

[0046] Ovde su otkriveni molekuli DNK koji kodiraju antitelo pronalaska. Ove sekvence uključuju, ali nisu ograničene na, one molekule DNK prikazane na slikama 1a i 2a.

[0047] Stručnjak će prepoznati da se DNK može koristiti za identifikaciju svog komplementa i, pošto je DNK dvolančana, njen ekvivalent ili homolog, korišćenjem tehnika hibridizacije nukleinske kiseline. Takođe će biti poznato da se hibridizacija može desiti sa manje od 100% komplementarnosti. Međutim, uz odgovarajući izbor uslova, tehnike hibridizacije mogu se koristiti za razlikovanje DNK sekvenci na osnovu njihove strukturne srodnosti sa određenom probom. Za uputstva u vezi sa takvim uslovima videti, Sambrook et al., 1989 (Sambrook, J., Fritsch, E. F. i Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, SAD) i Ausubel et al., 1995 (Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Sedman, J. G., Smith, J. A., & Struhl, K. ur. (1995). Current Protocols in Molecular Biology. New York: John Wiley and Sons).

[0048] Strukturna sličnost između dve polinukleotidne sekvence može se izraziti kao funkcija "stringentnosti" uslova pod kojima će se dve sekvence hibridizovati jedna sa drugom. Kako se ovde koristi, izraz " stringentnost" se odnosi na stepen u kome uslovi ne favorizuju hibridizaciju. Stringentni uslovi snažno ne favorizuju hibridizaciju, a samo strukturno najsrodniji molekuli će se hibridizovati jedan sa drugim pod takvim uslovima. Nasuprot tome, nestringentni uslovi favorizuju hibridizaciju molekula koji pokazuju manji stepen strukturne srodnosti. Stoga je stringentnost hibridizacije direktno povezana sa strukturnim odnosima dve sekvence nukleinskih kiselina. Sledeći odnosi su korisni u korelaciji hibridizacije i srodstva (gde je Tmje temperatura topljenja dupleksa nukleinske kiseline): a.

b. Tmdupleks DNK se smanjuje za 1°C sa svakim povećanjem od 1% u broju pogrešno uparenih baznih parova.

c.

gde su µ1 i µ2 jonske jačine dva rastvora.

[0049] Stringentnost hibridizacije je funkcija mnogih faktora, uključujući ukupnu koncentraciju DNK, jonsku snagu, temperaturu, veličinu probe i prisustvo agenasa koji ometaju vodoničnu vezu. Faktori koji promovišu hibridizaciju uključuju visoke koncentracije DNK, visoku jonsku snagu, niske temperature, dužu probu i odsustvo agenasa koji ometaju vodoničnu vezu. Hibridizacija se obično izvodi u dve faze: faza "vezivanja" i faza "ispiranja".

[0050] Prvo, u fazi vezivanja, proba je vezana za cilj pod uslovima koji favorizuju hibridizaciju. Stringentnost se obično kontroliše u ovoj fazi promenom temperature. Za visoku stringentnost, temperatura je obično između 65°C i 70°C, osim ako se ne koriste kratke (< 20 nt) oligonukleotidne probe. Reprezentativni rastvor za hibridizaciju sadrži 6Ks SSC, 0,5% SDS, 5Ks Denhardtov rastvor i 100 µg nespecifične DNK nosača. Videti Ausubel et al., section 2.9, supplement 27 (1994). Naravno, poznati su mnogi različiti, ali funkcionalno ekvivalentni uslovi bafera. Tamo gde je stepen srodnosti niži, može se izabrati niža temperatura. Temperature vezivanja niske stringentnosti su između oko 25°C i 40°C. Srednja stringentnost je između najmanje oko 40°C do manje od oko 65°C. Visoka stringentnost je najmanje oko 65°C.

[0051] Drugo, višak probe se uklanja sipiranjem. U ovoj fazi se obično primenjuju stringentniji uslovi. Dakle, ova faza "ispiranja" je najvažnija u određivanju srodstva putem hibridizacije. Rastvori za ispiranje obično sadrže niže koncentracije soli. Jedno rešenje srednje stringentnosti sadrži 2Ks SSC i 0,1% SDS. Rastvor za ispiranje visoke stringentnosti sadrži ekvivalent (u jonskoj snazi) manje od oko 0,2Ks SSC, sa poželjnim stringentnim

1

rastvorom koji sadrži oko 0,1Ks SSC. Temperature povezane sa različitim stringentnostima su iste kao što je gore razmotreno za „vezivanje“. Rastvor za ispiranje se takođe obično menja nekoliko puta tokom ispiranja. Na primer, tipični uslovi ispiranja visoke stringentnosti obuhvataju ispiranje dva puta po 30 minuta na 55°C i tri puta po 15 minuta na 60°C.

Funkcionalno ekvivalentne varijante

[0052] Prepoznato je da se varijante molekula DNK koje su ovde date mogu konstruisati na nekoliko različitih načina. Na primer, mogu se konstruisati kao potpuno sintetičke DNK. Postupci efikasne sinteze oligonukleotida u opsegu od 20 do oko 150 nukleotida su široko dostupni. Vidi Ausubel et al., section 2.11, supplement 21 (1993). Oligonukleotidi koji se preklapaju mogu se sintetizovati i sastaviti na način koji je prvi objavio Khorana et al., J. Mol. Biol. 72:209-217 (1971.).); videti takođe Ausubel et al., supra, section 8.2. Sintetičke DNK su poželjno dizajnirane sa pogodnim restrikcijskim mestima konstruisanim na 5' i 3' krajevima gena da bi se olakšalo kloniranje u odgovarajući vektor.

[0053] Kao što je naznačeno, postupak za generisanje varijanti je da se počne sa jednom od DNK koje su ovde otkrivene, a zatim da se sprovede mutageneza usmerena na mesto. Videti Ausubel et al., supra, chapter 8, supplement 37 (1997). U tipičnom postupku, ciljna DNK se klonira u jednolančani DNK bakteriofagni nosač. Jednolančana DNK je izolovana i hibridizovana sa oligonukleotidom koji sadrži željenu (željene) nukleotidnu (nukleotidne) alteraciju (alteracijee). Komplementarni lanac se sintetiše i dvolančani fag se uvodi u domaćina. Neki od rezultujućih potomaka će sadržati željeni mutant, što se može potvrditi korišćenjem DNK sekvenciranja. Pored toga, dostupni su različiti postupci koji povećavaju verovatnoću da će fag potomstva biti željeni mutant. Ovi postupci su dobro poznati stručnjacima u ovoj oblasti i kompleti su komercijalno dostupni za generisanje takvih mutanata.

Rekombinantne DNK konstrukcije i ekspresija

[0054] Ovo otkriće dalje obezbeđuje rekombinantne DNK konstrukte koji sadrže jednu ili više nukleotidnih sekvenci pronalaska. Rekombinantni konstrukti se koriste u vezi sa vektorom, kao što je plazmid, fagemid, fag ili virusni vektor, u koji je umetnut molekul DNK koji kodira antitelo pronalaska.

[0055] Kodirani gen može biti proizveden tehnikama opisanim u Sambrook et al., 1989, i

1

Ausubel et al., 1989. Alternativno, DNK sekvence mogu biti hemijski sintetizovane korišćenjem, na primer, sintetizatora. Pogledajte, na primer, tehnike opisane u OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS (1984, Gait, Ed., IRL Press, Oxford). Rekombinantni konstrukti iz ovog otkrića se sastoje od ekspresionih vektora koji su sposobni da eksprimiraju RNK i/ili proteinske proizvode kodirane DNK (ili više njih). Vektor može dalje da sadrži regulatorne sekvence, uključujući promotor koji je operativno vezan za otvoreni okvir čitanja (ORF). Vektor može dalje da sadrži sekvencu markera koja se može birati. Specifični inicijacijski i bakterijski sekretorni signali takođe mogu biti potrebni za efikasno prevođenje sekvenci koje kodiraju umetnuti ciljni gen.

[0056] Ovo otkriće dalje obezbeđuje ćelije domaćina koje sadrže najmanje jednu od DNK iz ovog otkrića. Ćelija domaćin može biti praktično svaka ćelija za koju su dostupni ekspresioni vektori. To može biti, na primer, viša eukariotska ćelija domaćin, kao što je ćelija sisara, niža eukariotska ćelija domaćin, kao što je ćelija kvasca ili prokariotska ćelija, kao što je bakterijska ćelija. Uvođenje rekombinantnog konstrukta u ćeliju domaćina može se izvršiti transfekcijom kalcijum fosfatom, DEAE, transfekcijom posredovanom dekstranom, elektroporacijom ili infekcijom fagom.

Bakterijska ekspresija

[0057] Korisni ekspresioni vektori za bakterijsku upotrebu su konstruisani umetanjem strukturne DNK sekvence koja kodira željeni protein zajedno sa odgovarajućim inicijacijskim i terminacionim signalima translacije u operativnoj fazi čitanja sa funkcionalnim promotorom. Vektor će sadržati jedan ili više fenotipskih selektabilnih markera i oridžin replikacije da bi se obezbedilo održavanje vektora i, ako je poželjno, da bi se obezbedila amplifikacija unutar domaćina. Pogodni prokariotski domaćini za transformaciju uključuju E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella tiphimurium i razne vrste u okviru rodova Pseudomonas, Streptomices i Staphilococcus.

[0058] Bakterijski vektori mogu biti zasnovani na, na primer, bakteriofagima, plazmidima ili fagemidima. Ovi vektori mogu da sadrže selektabilni marker i bakterijski oridžin replikacije izveden iz komercijalno dostupnih plazmida koji tipično sadrže elemente dobro poznatog vektora za kloniranje pBR322 (ATCC 37017). Nakon transformacije odgovarajućeg soja domaćina i rasta soja domaćina do odgovarajuće gustine ćelija, odabrani promotor se derepresuje/indukuje odgovarajućim sredstvima (npr. promena temperature ili hemijska indukcija) i ćelije se kultivišu u dodatnom periodu. Ćelije se obično sakupljaju

1

centrifugiranjem, razbijaju fizičkim ili hemijskim sredstvima, a dobijeni sirovi ekstrakt se zadržava za dalje prečišćavanje.

[0059] U bakterijskim sistemima, određeni broj ekspresionih vektora može biti izabran u zavisnosti od upotrebe namenjene proteinu koji se eksprimira. Na primer, kada treba da se proizvede velika količina takvog proteina, za stvaranje antitela ili za skrining peptidnih biblioteka, na primer, mogu biti poželjni vektori koji usmeravaju ekspresiju visokih nivoa proizvoda fuzionog proteina koji se lako prečišćavaju.

Terapeutski postupci

[0060] Terapeutski postupci uključuju davanje subjektu kome je potrebno lečenje terapeutski efikasne količine antitela predviđenog pronalaskom. „Terapeutski efikasna“ količina je ovde definisana kao količina antitela koja je dovoljna da efikasno blokira interakciju između GM-CSF i njegovog receptora u tretiranoj oblasti subjekta – bilo kao pojedinačna doza ili prema režimu višestrukog doziranja, sam ili u kombinaciji sa drugim agensima, koji dovodi do ublažavanja neželjenog stanja, ali pri čemu je količina toksikološki tolerantna. Subjekt može biti čovek ili životinja koja nije čovek (npr. pacov ili rezus).

[0061] Antitelo prema pronalasku može se davati zajedno sa poznatim lekovima, a u nekim slučajevima i samo antitelo može biti modifikovano. Na primer, antitelo se može konjugovati sa imunotoksinom ili radioizotopom da bi se potencijalno dodatno povećala efikasnost.

[0062] Inventivna antitela se mogu koristiti kao terapeutsko ili dijagnostičko sredstvo u različitim situacijama gde je GM-CSF nepoželjno eksprimiran ili pronađen. Poremećaji i stanja posebno pogodna za lečenje antitelom prema pronalasku su inflamatorne bolesti kao što su reumatoidni artritis (RA), multipla skleroza, Kronova bolest, psorijaza, astma, atopijski dermatitis ili šok.

[0063] Za lečenje bilo kog od prethodnih poremećaja, farmaceutske kompozicije za upotrebu u skladu sa ovim pronalaskom mogu biti formulisane na konvencionalni način korišćenjem jednog ili više fiziološki prihvatljivih nosača ili ekscipijenata. Antitelo pronalaska se može primeniti na bilo koji pogodan način, koji može varirati u zavisnosti od tipa poremećaja koji se leči. Mogući putevi primene uključuju parenteralnu (npr. intramuskularnu, intravensku, intraarterijsku, intraperitonealnu ili subkutanu), intrapulmonalnu i intranazalnu, i, po želji za lokalni imunosupresivni tretman, intralezijsku primenu. Pored toga, antitelo prema pronalasku može da se primeni pulsnom infuzijom, sa, na primer, opadajućim dozama antitela. Poželjno, doziranje se daje injekcijama, najpoželjnije intravenskim ili subkutanim

1

injekcijama, u zavisnosti od toga da li je primena kratka ili hronična. Količina koja će se primeniti zavisiće od niza faktora kao što su klinički simptomi, težina pojedinca, da li se primenjuju drugi lekovi. Stručnjak će prepoznati da će put primene varirati u zavisnosti od poremećaja ili stanja koje treba lečiti.

[0064] Određivanje terapeutski efikasne količine novog polipeptida, prema ovom pronalasku, u velikoj meri će zavisiti od specifičnih karakteristika pacijenta, načina primene i prirode poremećaja koji se leči. Opšte smernice se mogu naći, na primer, u publikacijama International Conference on Harmonisation i u REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES, chapters 27 and 28, pp.484-528 (18th ed., Alfonso R. Gennaro, Ed., Easton, Pa.: Mack Pub. Co., 1990). Tačnije, određivanje terapeutski efikasne količine zavisiće od faktora kao što su toksičnost i efikasnost leka. Toksičnost se može odrediti korišćenjem postupaka koji su dobro poznati u tehnici i koje se nalaze u prethodnim referencama. Efikasnost se može odrediti korišćenjem istih smernica u vezi sa postupcima opisanim u nastavku u Primerima.

Dijagnostički postupci

[0065] GM-CSF se eksprimira u različitim tipovima ćelija uključujući limfocite, monocite, endotelne ćelije, fibroblaste i neke maligne ćelije; prema tome, anti-GM-CSF antitelo pronalaska može da se koristi da bi se prikazalo ili vizuelizovalo mesto moguće akumulacije GM-CSF u različitim tkivima kod pacijenta. S tim u vezi, antitelo se može detektabilno obeležiti, upotrebom radioizotopa, afinitetnih oznaka (kao što su biotin, avidin, itd.), fluorescentnih oznaka, paramagnetnih atoma, itd. Postupci za postizanje takvog obeležavanja su dobro poznati u tehnici. Kliničku primenu antitela u dijagnostičkom imidžingu su pregledno date u Grossman, H.B., Urol. Clin. North Amer. 13:465-474 (1986.).)), Unger, E.C. et al., Invest. Radiol. 20: 693-700 (1985.).)), i Khav, B.A. et al., Science 209:295-297 (1980.)).

[0066] Detekcija žarišta takvih detektabilno obeleženih antitela može da ukazuje na mesto upale, na primer. U jednom aspektu, ovo ispitivanje se vrši uklanjanjem uzoraka tkiva ili krvi i inkubacijom takvih uzoraka u prisustvu detektabilno obeleženih antitela. U poželjnoj realizaciji, ova tehnika se radi na neinvazivan način korišćenjem magnetne slike, fluorografije, itd. Takav dijagnostički test se može primeniti u praćenju uspeha lečenja bolesti, gde prisustvo ili odsustvo GM-CSF je relevantan indikator.

Terapeutske i dijagnostičke kompozicije

1

[0067] Antitela iz ovog pronalaska se mogu formulisati prema poznatim postupacima za pripremu farmaceutski korisnih kompozicija, pri čemu se antitelo pronalaska kombinuje u smeši sa farmaceutski prihvatljivim nosačem. Odgovarajuća sredstva i njihova formulacija su opisani, na primer, u REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SIENCES (18<th>ed., Alfonso R. Gennaro, Ed., Easton, Pa: Mack Pub. Co., 1990). Da bi se formirala farmaceutski prihvatljiva kompozicija pogodna za efikasnu primenu, takve kompozicije će sadržati efikasnu količinu jednog ili više antitela iz ovog pronalaska, zajedno sa odgovarajućom količinom nosača.

[0068] Preparati mogu biti na odgovarajući način formulisani da daju kontrolisano oslobađanje aktivnog jedinjenja. Preparati sa kontrolisanim oslobađanjem mogu se postići upotrebom polimera za kompleksiranje ili apsorpciju anti-GM-CSF antitela. Kontrolisana isporuka se može ostvariti odabirom odgovarajućih makromolekula (na primer poliestera, poliaminokiselina, polivinila, pirolidona, etilenvinil-acetata, metilceluloze, karboksimetilceluloze ili protamina, sulfata) i koncentracije makromolekula, kao i postupaka prema redosledu za kontrolno oslobađanje. Drugi mogući postupak za kontrolu trajanja dejstva preparata sa kontrolisanim oslobađanjem je inkorporacija anti-GM-CSF antitela u čestice polimernog materijala kao što su poliestri, poliamino kiseline, hidrogelovi, poli(mlečna kiselina) ili kopolimeri etilen vinilacetata. Alternativno, umesto ugrađivanja ovih agenasa u polimerne čestice, moguće je da se ovi materijali zarobe u mikrokapsulama pripremljenim, na primer, tehnikama koacervacije ili interfacijskom polimerizacijom, na primer, hidroksimetilceluloza ili želatin-mikrokapsule i poli(metilmetacilat), respektivno, mikrokapsule, ili u koloidnim sistemima za isporuku lekova, na primer, lipozomi, albuminske mikrosfere, mikroemulzije, nanočestice i nanokapsule ili u makroemulzijama. Takve tehnike su otkrivene u Remington’s Pharmaceutical Sciences (1980).

[0069] Jedinjenja se mogu formulisati za parenteralnu primenu injekcijom, npr. bolusnom injekcijom ili kontinuiranom infuzijom. Formulacije za injekcije mogu biti predstavljene u obliku jedinične doze, na primer, u ampulama, ili u kontejnerima za više doza, sa dodatkom konzervansa. Kompozicije mogu imati takve oblike kao što su suspenzije, rastvori ili emulzije u uljnim ili vodenim nosačima, i mogu sadržati sredstva za formulaciju kao što su agensi za suspendovanje, stabilizaciju i/ili disperziju. Alternativno, aktivni sastojak može biti u obliku praha za konstituisanje sa odgovarajućim nosačem, na primer, sterilnom vodom bez pirogena, pre upotrebe.

[0070] Kompozicije mogu, po želji, biti predstavljene u pakovanju ili uređaju za doziranje, koji može da sadrži jedan ili više jediničnih doznih oblika koji sadrže aktivni sastojak.

2

Pakovanje može na primer da sadrži metalnu ili plastičnu foliju, kao što je blister pakovanje. Pakovanje ili uređaj za doziranje mogu biti propraćeni uputstvima za primenu.

[0071] Pronalazak se dalje može shvatiti pozivanjem na sledeće radne primere.

PRIMERI

Primer 1: Generisanje humanih GM-CSF specifičnih antitela iz HuCAL GOLD-a<®>Biblioteka

A. Rekuperacija fagemida, amplifikacija i prečišćavanje faga

[0072] HUCAL GOLD<®>biblioteka je amplifikovana u 2kIT medijumu koji sadrži 34 µg/ml hloramfenikola i 1% glukoze (2kIT-CG). Posle infekcije helper fagom (VCSM13) na OD600od 0,5 (30 min na 37°C bez mućkanja; 30 min na 37°C uz mućkanje pri 250 o/min), ćelije su centrifugirane (4120 g; 5 min; 4°C), resuspendovane u 2×IT/34 µg/ml hloramfenikol / 50 µg/ml kanamicin / 0,25 mM IPTG i uzgajana preko noći na 22°C. Fagi su precipitirani sa PEG iz supernatanta, resuspendovani u PBS/20% glicerola i čuvani na -80°C. Amplifikacija faga između dva kruga paninga je sprovedena na sledeći način: mid-log faza E. coli TG1 ćelije su inficirane eluiranim fagima i postavljene na LB-agar sa dodatkom 1% glukoze i 34 µg/ml hloramfenikola. Posle inkubacije preko noći na 30°C, kolonije su ostrugane i korišćene za inokulaciju 2kIT-CG do OD600nmod 0,5 i dodat je helper fag kao što je gore opisano.

B. Paning sa HuCAL GOLD<®>

[0073] Za selekciju antitela koja prepoznaju humani GM-CSF primenjeno je nekoliko paning strategija. Ukratko, HuCAL GOLD<®>antitela-fagi su podeljeni u tri grupe koje sadrže različite VH master gene. Ovi pulovi su pojedinačno podvrgnuti ili a) čvrstoj fazi na biotinilovanom humanom GM-CSF proteinu (napravljeno po narudžbi R&D Systems, Minneapolis, MN) direktno obloženom na pločama sa 96 bunarčića obloženim neutravidinom (Pierce, Rockford, IL) kao čvrsta potpora za tri runde ili b) nanošenjem rastvora na biotinilovani humani GM-CSF protein uhvaćen na Dinabeads obložene streptavidinom (Dinal, Oslo, Norveška) tokom tri kruga.

[0074] Detaljnije, za paning na imobilizovani biotinilovani GM-CSF, bunarčići neutravidin ploče su isprani tri puta sa 300 µl PBS. Antigen je razblažen do koncentracije od 3 µg/ml (200 nM) u PBS i 0,1 ml je obloženo po bunarčiću tokom 2 h na sobnoj temperaturi. Posle dva koraka ispiranja sa 300 µl PBS, bunarčići su inkubirani sa puferom za blokiranje koji sadrži 2x Chemiblocker (Chemicon, Temecula, CA) razblaženim 1:1 u PBS.

[0075] Pre selekcije, 100 µl HuCAL GOLD-a<®>fagi su prethodno adsorbovani u 100 ul pufera za blokiranje koji sadrži 0,4 ul 25% Tveen20 tokom 0,5 h na sobnoj temperaturi. Blokirani fagi su prebačeni u alikvotima od 100 µl u bazenčiće neutravidinske ploče tokom 0,5 h na sobnoj temperaturi. Ovaj korak je ponovljen dva puta za prethodnu apsorpciju.

[0076] Posle ispiranja (2 x 300 µl PBS) obložene i blokirane mikrotitarske ploče neutravidina, 0,1 ml prethodno adsorbovanih faga je dodato u obložene bunarčiće i inkubirano 1,5 h na sobnoj temperaturi uz lagano mućkanje. Nakon ove inkubacije usledilo je 10 ciklusa ispiranja sa PBS/0,05% Tveen20 na sobnoj temperaturi.

[0077] Vezani fagi su eluirani dodavanjem 120 ul 20 mM DTT u 10 mM Tris pH 8,0 po bunarčiću tokom 10 minuta na sobnoj temperaturi. Eluat je uklonjen i dodat u 14 ml E. coli TG1 narastao do OD600nmod 0,6-0,8. Bunarčići su dodatno isprani sa 200 ul PBS i ovaj rastvor je takođe dodat TG1 ćelijama. Infekcija fagom E. coli je ostavljena 45 minuta na 37°C bez mućkanja. Dodatno, 200 µl TG1 ćelija je poraslo do OD600nmod 0,6-0,8 dodato je u selekcione bunarčiće tokom 45 minuta na 37°C bez mućkanja. Ove TG-1 ćelije su dodate kulturi od 14 ml koja već sadrži fage iz prvog koraka eluiranja. Posle centrifugiranja od 10 minuta na 5000 rpm, svaka bakterijska peleta je resuspendovana u 500 µl 2kIT medijuma, postavljena na 2kIT-CG agar ploče i inkubirana preko noći na 30°C. Kolonije su zatim sastrugane sa ploča i fagi su rekuperovani i amplifikovani kao što je prethodno opisano.

[0078] Drugi i treći krug selekcije izvedeni su na identičan način kao i prvi krug selekcije sa jedinom razlikom što su uslovi ispiranja nakon vezivanja faga bili stringentniji. Pored toga, u trećem krugu selekcije, fagi su podvrgnuti dodatnom koraku preadsorpcije na kuglicama obloženim streptavidinom (Dinabeads M-280; Dinal). Eppendorf epruvete su blokirane rastvorom Chemiblocker inkubacijom od 30 minuta na sobnoj temperaturi. Od svake grupe faga 0,3 ml je pomešano 1:1 sa 2x Chemiblocker rastvorom koji sadrži 0,05% Tveen20 i inkubirano 1 h na sobnoj temperaturi u blokiranim Eppendorf epruvetama na rotatoru. Blokirani fagi su zatim prebačeni u novoblokirane Eppendorf epruvete i dodato je 50 µl Dinabeads M-280 još 30 minuta radi preadsorpcije. Perle su uklonjene pomoću magnetnog uređaja (Dinal MPC-E). Alikvoti od 150 µl faga su zatim prebačeni na neutravidinske ploče za dalju preadsorpciju kao u krugu 1 i 2 (vidi prethodno).

[0079] Za pakovanje rastvora korišćenjem biotinilovanog GM-CSF spojenog sa Dinabeads primenjen je sledeći protokol: Eppendorf epruvete od 1,5 ml su blokirane sa 1,5 ml 2xChemiblocker-a razblaženog 1:1 sa PBS-om preko noći na 4°C. Magnetne kuglice obložene streptavidinom (Dinabeads M-280; Dinal) od 200 µl su isprane 1 x sa 200 µl PBS i resuspendovane u 200 µl 1x Chemiblocker-a (razblaženog u 1 x PBS). Blokiranje perli je izvedeno u prethodno blokiranim epruvetama preko noći na 4°C. Fagi razblaženi u 500 µl PBS za svaki uslov paninga su pomešani sa 500 µl 2x Chemiblocker / 0.1% Tveen 1 h na ST (rotator). Preadsorpcija faga je izvedena dva puta: 50 µl blokiranih streptavidinskih magnetnih perli je dodato blokiranim fagima i inkubirano 30 minuta na sobnoj temperaturi na rotatoru. Nakon odvajanja kuglica putem magnetnog uređaja (Dinal MPC-E), supernatant faga (~ 1 ml) je prebačen u novu blokiranu epruvetu i predadsorpcija je ponovljena na 50 µl blokiranih kuglica tokom 30 minuta. Zatim je 200 nM biotinilovanog hGM-CSF dodato u blokirane fage u novoj blokiranoj epruveti od 1,5 ml i inkubirano 1 h na sobnoj temperaturi na rotatoru. 100 µl blokiranih streptavidin magnetnih perlica je dodato u svaki bunarčić faga za pakovanje i inkubirano 10 minuta na sobnoj temperaturi na rotatoru. Fagi vezan za biotinilovani GM-CSF i stoga imobilisan za magnetne perle sakupljeni su pomoću magnetnog separatora čestica (Dinal MPC-E). Perle su zatim isprane 7x u PBS/0,05% Tveen koristeći rotator, nakon čega je praćeno još tri puta sa PBS. Eluacija faga iz Dinabeads je izvedena dodavanjem 300 µl 20 mM DTT u 10 mM Tris/HCl pH8 u svaku epruvetu tokom 10 minuta. Dinabeads su uklonjene magnetnim separatorom čestica i supernatant je dodat u 14 ml E.coli TG-1 kultura uzgojena do OD600nmod 0,6-0,8. Perle su zatim jednom isprane sa 200 µl PBS i PBS koji je sadržao dodatni uklonjeni fag je dodat u 14 ml E.coli TG-1 kultura.

[0080] Posle centrifugiranja od 10 minuta na 5000 rpm, svaka bakterijska peleta je resuspendovana u 500 µl 2xIT medijuma, postavljena na 2xIT-CG agar ploče i inkubirana preko noći na 30°C. Kolonije su zatim sastrugane sa ploča i fagi su rekuperovani i amplifikovani kao što je prethodno opisano.

[0081] Drugi i treći krug ispiranja rastvora na biotinilovanom GM-CSF-u obavljen je prema protokolu prvog kruga osim povećanja stringentnosti postupka ispiranja.

C. Subkloniranje odabranih Fab fragmenata i ekspresija rastvorljivih Fab fragmenata

[0082] Fab kodirajući inserti izabranog HuCAL GOLD-a<®>fagemida su subklonirani u ekspresioni vektor pMORPH<®>Ks9_Fab_FH (slika 5) da bi se olakšala brza ekspresija rastvorljivog Fab. DNK odabranih klonova je digestirana sa Ksbal i EcoRI, čime se iseče Fab kodirajući insert (ompA-VLCL i phoA-Fd) i klonira u Ksbal / EcoRI digestirani vektor pMORPH<®>Ks9_Fab_FH. Fabs eksprimirane u ovim vektorima nose dve C-terminalne oznake

2

(FLAG<™>i 6kHis, respektivno) za detekciju i prečišćavanje.

D. Mikroekspresija HUKAL GOLD<®>Fab antitela u E. coli

[0083] Pojedinačne kolonije dobijene nakon subkloniranja u pMORPH<®>Ks9_Fab_FH su korišćene za inokulaciju bunarčića sterilne mikrotitarske ploče sa 96 bunarčića koja sadrži 100 µl 2×TI/Cm/1% Glu medijuma po bunarčiću i uzgajane preko noći na 37°C. 5 µl svake TG-1 E.coli kulture je prebačeno u novu sterilnu mikrotitarsku ploču sa 96 bunarčića koja sadrži 100 µl 2×TI/Cm/0,1% Glu medijuma po bunarčiću. Mikrotitarske ploče su inkubirane na 30°C uz mućkanje pri 400 obrtaja u minuti na šejkeru za mikroploče sve dok kulture nisu bile blago zamućene (~2-4 sata) sa OD600nmod 0,5. Ovim ekspresionim pločama je dodato 20 µl 2kIT/Cm/ 3mM IPTG po bunarčiću (krajnja koncentracija 0,5 mM IPTG), zapečaćeno trakom propustljivom za gas i inkubirano preko noći na 30°C mućkajući pri 400 rpm.

Stvaranje lizata celih ćelija (BEL ekstrakti)

[0084] U svaki bunarčić ploča za ekspresiju, dodato je 40 µl BEL pufera (2kBBS/EDTA: 24,7 g/l borne kiseline, 18,7 g NaCl/l, 1,49 g EDTA/I, pH8) koji sadrži 2,5 mg/ml lizozima i inkubirano 1 h na 22°C na šejkeru za mikrotitarsku ploču (400 rpm). BEL ekstrakti su korišćeni za analizu vezivanja pomoću ELISA ili BioVeris M-serije<®>384 analizatora (videti Primer 2).

E. Ekspresija HuCAL<®>GOLD Fab antitela u E. coli i prečišćavanje

[0085] Ekspresija Fab fragmenata kodiranih pMORPH<®>Ks9_Fab_FH u TG-1 ćelijama je izvedena u kulturama u tikvici sa 1 I 2xIT medijuma sa dodatkom 34 µg/ml hloramfenikola. Posle indukcije sa 0,5 mM IPTG, ćelije su uzgajane na 22 ° C tokom 16 h. Ekstrakti celih ćelija ćelijskih peleta su pripremljeni pomoću French Press-a i Fab fragmenata izolovanih nikl/NTA hromatografijom (Kiagen, Hilden, Nemačka). Koncentracije su određene UV-spektrofotometrijom (Krebs et al., 2001).

Primer 2: Identifikacija hGM-CSF specifičnih antitela

[0086] BEL ekstrakti pojedinačnih E. coli klonova odabrani prethodno pomenutim strategijama paninga analizirani su pomoću ELISA ili BioVeris (BioVeris M-Series<®>384 analizator) kako bi se identifikovali klonovi koji kodiraju hGM-CSF specifične Fabs.

A. Tehnike imunoenzimskog testa (ELISA).

[0087] Humani rekombinantni biotinilovani GM-CSF (R&D Systems) je obložen sa 1,5 µg/ml u PBS na mikrotitarskim pločama neutravidina tokom 2 h na sobnoj temperaturi.

[0088] Nakon oblaganja antigenom, bunarčići su blokirani sa PBS / 0,05 % Tveen (PBS-T) sa 1 % BSA tokom 1 h na sobnoj temperaturi. Nakon ispiranja bunarčića sa PBS-T BEL-ekstraktom, prečišćen je HuCAL<®>Fab ili kontrolni IgG su razblaženi u PBS-u, dodati u bunarčiće i inkubirani 1 h na ST. Za detekciju primarnih antitela primenjena su sledeća sekundarna antitela: alkalna fosfataza konjugovani AffiniPure F(ab') fragment, kozji antihumani, -anti-mišji ili -anti-pacovski IgG (Jackson Immuno Research). Za detekciju AP-konjugata korišćeni su fluorogeni supstrati poput AttoPhos (Roche) prema uputstvima proizvođača. Između svih koraka inkubacije, bunarčići mikrotitarske ploče su isprani PBS-T tri puta i tri puta nakon završne inkubacije sa sekundarnim antitelom. Fluorescencija je merena u TECAN Spectrafluor čitaču ploča.

B. Analiza vezivanja zasnovana na elektrohemiluminescenciji (BioVeris) za detekciju GM-CSF vezujućeg Fab u lizatima

[0089] Kao alternativa ELISA eksperimentima za detekciju Fab antitela koja se vezuju za GM-CSF kod E. coli lizata (BEL ekstrakti), vezivanje je analizirano u BioVeris M-SERIES<®>384 AnalizerBioVeris, Evropa, Vitnei, Oxfordshire, UK).

[0090] U tu svrhu BEL ekstrakt je razblažen najmanje 1:50 i maksimalno 1:1000 u puferu za ispitivanje (PBS/0,05%Tveen20/0,5%BSA) za upotrebu u BioVeris skriningu. Biotinilovani GM-CSF (R&D Systems) je spojen na paramagnetne perle obložene streptavidinom, Dinabeads (Dinal), u koncentraciji od 0,1 µg/ml. Po bunarčiću ploče sa 96 ili 384 bunarčića korišćeno je 25 ili 15 µl 1:25 rastvora Dinabead matičnog rastvora. Perle su isprane tri puta puferom za ispitivanje pre dodavanja biotinilovanog GM-CSF tokom 30 minuta na sobnoj temperaturi u šejkeru. Perle su zatim isprane tri puta puferom za ispitivanje i na kraju resuspendovane u svežem puferu za ispitivanje. Anti-humani (Fab)'2(Dianova) je obeležen rutenijumom korišćenjem BV-tag<™>(BioVeris Europe, Vitnei, Oxfordshire, UK). Ovo sekundarno antitelo je dodato u GM-CSF kuplovane kuglice u koncentraciji od 6 µg/ml

2

neposredno pre upotrebe. 100 µl ili 60 µl razblaženog BEL ekstrakta (videti prethodno) E. coli ekspresione kulture koje sadrže Fab antitela su punjene u bunarčiće ploče sa 96 ili 384 bunarčića i, respektivno, 25 ili 15 µl GM-CSF kuplovanih perli plus anti-Fab-BV-tag<™>. Mešavina sekundarnih antitela je dodata u svaki bunarčić i inkubirana 2 h na sobnoj temperaturi na uređaju za šejkiranje ploče. Ploče su analizirane u BioVeris M-Series<®>384 analizatoru.

[0091] Posle analize sekvence identifikovano je sedamdeset četiri (74) jedinstvena klona koji su pokazali dovoljno snažno vezivanje (odnos signal:šum veći od 10:1 u ELISA testu ili 50:1 u BioVeris-u). Ovi klonovi su eksprimirani, prečišćeni i testirani u funkcionalnim testovima.

C. Određivanje molekularne specifičnosti i unakrsne reaktivnosti vrsta odabranih antihGM-CSF Fabs.

[0092] Unakrsna reaktivnost anti-hGM-CSF antitela je određena na sledeće analite: GM-CSF pacova i miša, humani IL-3, humani IL-4, , humani IL-5, , humani IL-13, , humani M-CSF (svi iz Peprotech, London, UK). Ovo je izvedeno u postavci za hvatanje rezonancom površinskog plazmona (Biacore 3000, Upsala, Švedska).

[0093] CM5 čipovi (Biacore, Švedska) su obloženi sa 5000-6000RU anti-F(ab)2(Dianova, Affinipure F(ab)2Fragment kozjeg anti-humanog IgG, F(ab)2specifičan fragment); 80 µg/ml 10 mM acetatnog pufera, pH4 na sve 4 protočne ćelije, korišćenjem standardne hemije spajanja EDC-NHS amina. Na protočnim ćelijama su uhvaćena 2-4 specifična GM-CSF Fab (20 µl 500 nM Fab pri protoku od 5 µl/ml, 300-400 RU). Nakon hvatanja specifičnog Fab, pufer je ubrizgan, da bi se odredila disocijacija anti-Fab/Fab interakcije. U sledećem ciklusu, faktor rasta analita je ubrizgan (20 µl, brzina protoka 20 µl/min) u opsegu koncentracija između 15 i 2000 nM za određivanje specifičnog signala. Zatim je postignuti pufer senzogram ručno oduzet od specifičnog. Posle svakog ciklusa, protočne ćelije su regenerisane sa 100 mM HCl (5 µl).

[0094] Sedam HuCAL<®>anti-hGM-CSF antitela uključujući MOR03684 i MOR03682 su testirana i bila su specifična za humani GM-CSF i nisu se vezivala ni za jedan od drugih citokina ili GM-CSF miša ili pacova. Nasuprot tome, Fab MOR03929 je pokazao značajnu unakrsnu reaktivnost na GM-CSF pacova.

Primer 3: Identifikacija anti-humanih GM-CSF Fab kandidata koji inhibiraju interakciju između GM-CSF i alfa receptora GM-CSF

2

[0095] 74 različita hGM-CSF specifična antitela koja su odabrana od HuCAL GOLD<®>biblioteka je testirana na potenciju da inhibira interakciju između hGM-CSF i njegovog receptora. Interakcija je testirana na dva načina, (i) jedan je bio test proliferacije koristeći GM-CSF zavisnu TF-1 ćelijsku liniju (Kitamura et al., 1989) i (ii) drugi je bio FACS analiza sa rekombinantnom CHO ćelijskom linijom koja eksprimira alfa lanac GM-CSF receptora. U testu proliferacije TF-1, analizirana je sposobnost anti-GM-CSF antitela da blokiraju interakciju GM-CSF sa endogenim GM-CSF receptorom koji se sastoji od alfa i beta lanca što dovodi do smanjenja proliferacije ćelija. U FACS testu određena je specifična inhibicija interakcije između GM-CSF i alfa lanca GM-CSF receptora.

A. Kloniranje i ekspresija Macaca mulatta i humanog GM-CSF

[0096] Macaca mulatta GM-CSF cDNK pune dužine (GenBank pristupni broj: AI007376) je sintetizovana sintezom gena (geneART GmbH, Regensburg, Nemačka) i klonirana u pCR-Script-Amp vektor (Stratagene, LaJolla, California, SAD). Zatim je cDNK klonirana u eukariotski ekspresioni vektor pcDNA3.1 (+) (Invitrogen, Paislei, UK) dajući pcDNA-macGM-CSF. cDNK humanog GM-CSF (Genbank pristupni broj NP_000749) klonirana je RT-PCR tehnikom iz RNK izolovane iz 1×10e7 TF-1 ćelija korišćenjem kompleta RNeasy iz Qiagen (Hilden, Nemačka). Reverzna transkripcija je izvedena sa kompletom SuperscriptII korišćenjem nasumičnih heksamera (Gibco) nakon čega je usledila amplifikacija GM-CSF cDNK pomoću PCR. Dobijeni PCR-proizvod je kloniran u ekspresioni vektor pcDNA3.1(+) dajući pcDNA-huGM-CSF.

[0097] Ćelije HEK293 su prolazno transfektovane ovim ekspresionim vektorima korišćenjem lipofektamina (Stratagene, LaJolla, SAD). Medijum koji sadrži izlučenu rekombinantni makaka ili humani GM-CSF je sakupljen 4 dana nakon transfekcije.

B. Inhibicija proliferacije TF-1 ćelija zavisne od GM-CSF anti-hGM-CSF Fabs korišćenjem humanog ili makaki GM-CSF

[0098] TF-1 (Kitamura et al., 1989) ćelije su uzgajane u skladu sa protokolom provajdera (DSMZ, Braunschveig, Nemačka; DSMZ br. ACC 334). TF-1 ćelije su isprane dva puta sa medijumom RPMI1640 (10% FCS), a zatim zasejane u koncentraciji od 2 x 10<5>ćelije/ml u 50 µl po bunarčiću posude za kulturu ćelija sa ravnim dnom sa 96 bunarčića. Humani

2

rekombinantni GM-CSF („Leucomax“, ESSEX Pharma, Minhen) na 0,5 ng/ml i HuCAL<®>Fab antitela (200 ng/ml - 200 µg/ml razblaženo u medijumu RPMI1640, 10% FCS) su mešana 30 minuta i 50 µl mešavine je dodato u TF-1 ćelije, tako da je konačna koncentracija GM-CSF bila 0,25 ng/ml. Maksimalna ćelijska proliferacija (0% inhibicije) je merena inkubacijom TF-1 ćelija na konačnoj GM-CSF koncentraciji od 0,25 ng/ml, bez dodavanja antitela. Izmerena je 100% inhibicija proliferacije TF-1 tako što je GM-CSF izostavljen iz testa i ćelije su držane samo u medijumu RPMI1640 (10% FCS). TF1 ćelije su zatim inkubirane 72 sata na 37°C sa 5% CO2u vlažnoj komori. Vitalnost ćelije je merena dodavanjem MTT ili KSTT reagensa (Roche, Mannheim, Nemačka) prema preporuci proizvođača. Ukupno je identifikovano 19 Fab koji su pokazali značajnu inhibiciju proliferacije TF-1. Vezujući MOR03682, MOR03684 i MOR03929 pokazali su doslednu inhibiciju proliferacije TF1 ćelija veću od 50% pri koncentraciji od 2 µM. Inhibiciona aktivnost ovih neoptimizovanih Fab nije bila dovoljno jaka da odredi IC50doze, jer se potpuna inhibicija nije mogla postići. Za poređenje, monoklonska antitela BVD2-21C11 (BD Biosciences Pharmingen; Cat#554503) i MAB215 (R&D Sistems; Cat#MAB215) su bila u stanju da u potpunosti inhibiraju proliferaciju TF-1.

[0099] Dodatno, vezivanje MOR03682 i MOR03684 za nativni humani GM-CSF je testirano u testu proliferacije TF-1. Umesto dodavanja prečišćenog humanog rekombinantnog GM-CSF ćelijama TF-1 korišćen je supernatant od 5637 ćelija (DSMZ br. ACC 35) koji luče nativni humani GM-CSF u medijum. Iz krive odgovora na dozu upoređujući efekat rekombinantnog humanog GM-CSF sa različitim razblaženjima supernatanta 5637, utvrđeno je da medijum sadrži ~ 5 ng/ml prirodnog humanog GM-CSF. Preinkubacijom supernatanta 5637 sa anti-humanim GM-CSF Fab MOR03682 ili MOR03684, vezivanje nativnog humanog GM-CSF za TF-1 ćelije je blokirano tako da je vitalnost ćelija smanjena u poređenju sa eksperimentom sa rekombinantnim humanim GM-CSF. MOR03684 i MOR03682 se stoga vezuju za nativni humani GM-CSF. Fab MOR03929 nije testiran u ovom testu.

[0100] Pored toga, unakrsna reaktivnost na GM-CSF makaki je testirana u testu proliferacije TF-1. Umesto dodavanja prečišćenog humanog GM-CSF ćelijama TF-1 korišćen je supernatant transfektovanih ćelija HEK293 koje luče rekombinantni makaki GM-CSF u medijum.

[0101] TF-1 ćelije su proliferisale u prisustvu makaki GM-CSF koji sadrži supernatant, ali ne i u prisustvu supernatanta iz netransfektovanih ćelija HEK293. Iz krive odgovora na dozu upoređujući efekat rekombinantnog humanog GM-CSF sa različitim razblaženjima medijuma

2

HEK-293, utvrđeno je da medijum transficiranih ćelija sadrži ~2 µg/ml makaki GM-CSF. Preinkubacijom GM-CSF supernatanta makaki sa anti-humanim GM-CSF Fab MOR03682 ili MOR03684, vezivanje GM-CSF makaki za TF-1 ćelije je blokirano tako da je vitalnost ćelija značajno smanjena. MOR03682 i MOR03684 su stoga unakrsno reaktivni sa makaki GM-CSF. Fab MOR03929 nije testiran u ovom testu.

C. Blokiranje vezivanja GM-CSF za alfa receptor GM-CSF anti-hGM-CSF Fabs

[0102] Da bi se testiralo vezivanje GM-CSF za alfa lanac GM-CSF receptora eksprimiranih na površini ćelije, cDNK je klonirana u ekspresioni vektor i stabilno transfektovana u CHO-K1 ćelije (DSMZ ACC 110).

[0103] Kloniranje stabilne ćelijske linije CHO-K1 koja eksprimira alfa lanac GM-CSF receptora cDNK alfa lanca humanog GM-CSF receptora (Genbank pristupni broj M64445) klonirana je RT-PCR tehnikom iz RNK izolovane iz 1x10e7 TF-1 ćelija korišćenjem kompleta RNeasy iz Qiagen (Hilden, Nemačka). Reverzna transkripcija je izvedena sa kompletom SuperscriptII korišćenjem nasumičnih heksamera (Gibco). cDNK alfa lanca GM-CSF receptora je zatim amplifikovan korišćenjem sledećih prajmera:

5': N-GCRa-plusSS: TTCTCTGGATCCGCCACCATGCTTCTCCTGGTGACAAGCC i 3': C-fIGCRa: ACCCTCCAATTGTCAGGTAATTTCCTTCACGGTC.

[0104] PCR reakcija je dala proizvod od ~1250 bp koji je digestiran sa EcoRI i BamHI (New England BioLabs). Ekspresioni vektor pcDNA3.1(+) (Invitrogen, Paisley, UK) je digestiran istim enzimima. Nakon prečišćavanja digestiranog vektora i PCR proizvoda, fragmenti su vezani i transformisani elektroporacijom u E.coli DH10B ćelije. Tačni klonovi su identifikovani nakon pripreme plazmidne DNK i sekvenciranja. Ispravni klonovi (pcDNA3.1(+)-GM-CSFRalpha) sadržali su cDNK humanog GM-CSF receptora pune dužine alfa.

[0105] CHO-K1 ćelije su uzgajane u skladu sa protokolom provajdera (DSZM, Braunschweig, Nemačka; DSMZ br. ACC 110). Za transfekciju ćelije su uzgajane do 80% konfluence u ploči sa 6 bunarčića i inkubirane sa 5 ug DNK pcDNA3.1(+)-GM-CSFRalpha pomešane sa 10 ul reagensa Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Posle 48h ćelije su hranjene sa 1mg/ml G418 (Gibco) i nakon još 24h medijum je zamenjen takvim koji sadrži 2 mg/ml G418. Posle dve nedelje, pojedinačne ćelije su zasejane u bunarčiće posude za kulturu sa 96

2

bunarčića. Odrasli su pojedinačni klonovi i 5x10<5>ćelija svakog klona je testirano na ekspresiju GM-CSFR-alfa FACS analizom koristeći mišji IgG MAB1006 (Chemicon International, Temecula, CA) kao primarno antitelo u koncentraciji od 1µg/ml i (R-PE-AffiniPure (Fab')2kozji anti-miš-IgG (Dianova) kao sekundarno antitelo u razblaženju 1:200. Primarna i sekundarna antitela su inkubirana sa ćelijama 1 čas uzastopno, dok su ćelije isprane u FACS puferu (PBS, 3% FCS) između ovih koraka. Fluorescencija obojenih ćelija je kvantifikovana u FL2 kanalu korišćenjem FACSCalibur sistema (Becton Dickinson).

[0106] Među analiziranim klonovima, klon CHO-GMRa#11 je pokazao najveći srednji intenzitet fluorescentnog zračenja. Srednja vrednost fluorescencije (MFL vrednost) od 157 je određena za CHO-GMRa#11 (slika 6)

FACS analiza vezivanja GM-CSF za GM-CSF receptor alfa eksprimiran na CHO-GMRa#11:

[0107] Pre dodavanja ćelijama, antitela u rastućim koncentracijama (0,1 do 100 µg/ml) su koinkubirana sa biotinilovanim GM-CSF (0,5 µg/ml) u FACS puferu (PBS/3% FBS/NaN30,05%) tokom 30 minuta na sobnoj temperaturi.

[0108] Sva bojenja su izvedena u pločama za kulturu sa 96 bunarčića sa okruglim dnom (Nalge Nunc) sa 1-5 x 10<5>ćelije po bunarčiću. 2×10E5 CHO-GMRa#11 ćelije su uzete u 50 µl antitela/GM-CSF koji sadrži FACS pufer i inkubirane na 4°C tokom 1 h. Ćelije su zatim jednom isprane sa 150 µl FACS pufera/bunarčiću i prenete u 100 µl streptavidin obeleženog fikoeritrinom (BD Biosciences Pharmingen) koji je razblažen 1:400 u FACS puferu. Posle 1 h inkubacije na 4°C ćelije su isprane dva puta sa FACS puferom, resuspendovane u 100 µl FACS pufera i vezivanje biotinilovanog GM-CSF je mereno preko FL2 intenziteta fluorescencije ćelija u FACScaliburu (Becton Dickinson). IC50vrednosti su određene iz krive odgovora na dozu dobijene korišćenjem softvera GraphPad Prism v3.03 primenom nelinearne regresione krive.

[0109] Fab antitela MOR03682, MOR03684 i MOR03929 pokazala su značajnu inhibiciju vezivanja GM-CSF za ćelijsku površinu eksprimiranog GM-CSF receptora alfa.

Primer 4: Sazrevanje prema afinitetu odabranih Fab postepenim izmenama CDR kaseta

A. Generisanje Fab biblioteka sazrevanja prema afinitetu i paning

[0110] Da bi se povećao afinitet i inhibitorna aktivnost anti-GM-CSF Fab fragmenata, klonovi MOR03682, MOR03684 i MOR03929 su podvrgnuti sazrevanju prema afinitetu. S tim u vezi, CDR regioni su optimizovani kasetnom mutagenezom korišćenjem mutageneze usmerene na trinukleotide (Virnekas et al., 1994; Nagi et al., 2002). Analiza sekvence nije otkrila homologiju sekvence između CDR tri analizirana roditeljska klona. Tabela 2a i 2b daje šest CDR peptidnih sekvenci za roditeljske klonove MOR03682, MOR03684 i MOR03929.

[0111] Sledeće ukratko opisuje protokol koji se koristi za Fab optimizaciju. Fab fragmenti iz ekspresionog vektora pMORPH<®>Ks9Fab_FH su klonirani u fagemid vektor (US 6,753,136). Zatim su primenjene dve različite strategije za optimizaciju afiniteta i efikasnosti roditeljskih Fabs.

[0112] Prvo, jedna Fab biblioteka fag antitela je generisana gde je L-CDR3 svakog roditelja zamenjen repertoarom pojedinačnih CDR3 sekvenci lambda lakog lanca. U drugoj biblioteci H-CDR2 region je zamenjen repertoarom pojedinačnih CDR2 sekvenci teškog lanca.

[0113] Biblioteke sazrevanja prema afinitetu su generisane transformacijom raznovrsnih klonova u E. coli TOP10F' (Invitrogen). Fagi su pripremljeni kao što je opisano u Primeru 1A. Obe L-CDR3 biblioteke MOR03684 i MOR03682 su objedinjene i obe H-CDR2 biblioteke izvedene iz MOR03684 i MOR03682 su objedinjene, dok su L-CDR3 i H-CDR2 biblioteke izvedene iz MOR03929 čuvane odvojeno tokom postupka selekcije. Panning je izveden na biotinilovanom GM-CSF u rastvoru za tri kruga u suštini kao što je opisano u Primeru 1B i primenom stringentnih uslova selekcije.

B. Analiza vezivanja zasnovana na elektrohemiluminescenciji (BioVeris) za detekciju poboljšanog vezivanja Fab za GM-CSF u lizatima

[0114] Za detekciju Fab antitela koja se vezuju za GM-CSF kod E. coli lizati (BEL ekstrakti), vezivanje je analizirano u BioVeris M-384 SERIES<®>Workstation (BioVeris Europe, Witney, Oxforgshire, UK) u suštini kao što je opisano u Primeru 2B.

[0115] Fab sa najvišim ECL vrednostima su prečišćeni i podvrgnuti merenju afiniteta ravnotežnom titracijom rastvora (SET; Haenel et al, 2005) i rezonancom površinskog plazmona (Biacore) (videti Primer 4D)

C. X-kloniranje poboljšanog VL (L-CDR3) sa poboljšanim VH (H-CDR2)

1

[0116] Za dalje poboljšanje afiniteta kombinovani su nezavisno optimizovani H-CDR2 i L-CDR3 iz zrelih Fab koji su izvedeni iz istog roditeljskog klona, jer je postojala velika verovatnoća da će ova kombinacija dovesti do daljeg dobijanja afiniteta (Iang et. al., 1995; Schier et al., 1996; Chen et al., 1999). Ova procedura, nazvana X-kloniranje, primenjena je za vezujuća sredstva koja su izvedena iz roditeljskog klona MOR03929 pošto su Fab sa poboljšanim afinitetima identifikovani i iz H-CDR2 i L-CDR3 biblioteke. Ovo je postignuto prenosom celih lakih lanaca (Xbal/Sphl fragment) sa L-CDR3-optimizovanog donorskog klona u H-CDR2-optimizovani akceptorski klon.

Tabela 3: Kombinacije X-kloniranja

[0117] Za rezultujuća 4 Fabs, VL i VH su sekvencionirani da bi se potvrdio transfer ispravnog VL na odgovarajuću H-CDR2 poboljšanu vektorsku osnovu. U tabeli 2a i 2b prikazane su sekvence VH i VL proteina svih derivata MOR03929 i 3682, koji su navedeni u tabeli 3.

D. Određivanje pikomolarnih afiniteta korišćenjem ravnotežne titracije rastvora (SET) i rezonance površinskog plazmona (Biacore)

[0118] Za KDza određivanje, korišćene su frakcije monomera (najmanje 90% sadržaja monomera, analizirano analitičkom SEC; Superdex75, Amersham Pharmacia) Fab. Određivanje afiniteta zasnovano na elektrohemiluminescenciji (ECL) u rastvoru i evaluacija podataka su u osnovi izvedeni kako su opisali Haenel et al., 2005: Konstantna količina Fab je uravnotežena sa različitim koncentracijama (serija 5<n>razblaženja) humanog GM-CSF (Leucomax) u rastvoru. Biotinilovani humani GM-CSF (R&D Systems) kuplovan na

2

paramagnetne perle (M-280 Streptavidin, Dinal) i BV-tag<™>(BioVeris Europe, Witney, Oxfordshire, UK) označen kao anti-human (Fab)'2(Dianova) je dodat i inkubiran 15 - 30 min. Nakon toga, koncentracija nevezanog Fab je kvantifikovana putem ECL detekcije korišćenjem M-SERIES<®>384 analizatora (BioVeris Europe).

[0119] U skladu sa Friguet et al., 1985, vodilo se računa da se izbegne značajna promena ravnoteže u čvrstu fazu tokom detekcije.

[0120] Koristeći gore opisane uslove analize, određeni su afiniteti za Fabs, koji su prikazani u tabeli 4.

[0121] Dodatno, izvedena je kinetička SPR analiza na F1 čipu (Biacore, Švedska) koji je obložen gustinom od -100 RU rekombinantnog humanog GM-CSF (Peprotech) u 10 mM Naacetatu pH 4,5 korišćenjem standardne hemije kuplovanja EDC-NHS amina. Odgovarajuća količina HSA je imobilisana na referentnoj protočnoj ćeliji. PBS (136 mM NaCl, 2,7 mM KCI, 10 mM Na2HPO4, 1,76 mM KH2PO4pH 7,4) 0,005 % Tveen 20 je korišćen kao tekući pufer. Fab je primenjen u seriji koncentracija od 6,3 - 200 nM pri brzini protoka od 20 µl/min. Faza asocijacije je podešena na 60 s, a faza disocijacije na 120 s (roditeljska) ili do 600 s (optimizovana afinitetom). Da bi se pratila faza disocijacije tokom dužeg perioda, korišćeni su sledeći uslovi, u osnovi prema Drake et al., (2004): Fab je primenjen u jednoj koncentraciji od 200 nM; brzina protoka je podešena na 100 µl/min i faza disocijacije na 6000 - 18.000 s. Na osnovu odstupanja utvrđenih u ovim uslovima analize procenjeni su afiniteti za Fabs, koji su prikazani u tabeli 4.

Tabela 4: Afiniteti anti-hGM-CSF Fabs određeni Biacore i ravnotežnom titracijom rastvora (SET)

E. Određivanje afiniteta prema GM-CSF pacova korišćenjem ravnotežne titracije rastvora (SET)

[0122] Određivanje afiniteta prema GM-CSF pacova je urađeno u suštini kao što je opisano u Primeru 4D korišćenjem pacovskog GM-CSF (Peprotech) kao analita u rastvoru umesto humanog GM-CSF. Afiniteti su izračunati prema Haenelu et al (2005). U ovom testu, utvrđeno je da je afinitet Fab MOR04357 prema GM-CSF pacova KD= 1,0 nM.

Primer 5: Karakterizacija optimizovanih anti-humanih GM-CSF Fabs koje inhibiraju interakciju između GM-CSF i alfa lanca GM-CSF receptora

A. Ispitivanje alfa vezivanja GM-CSF receptora

[0123] Test vezivanja GM-CSF receptora je izveden kao što je gore opisano (Primer 3C) korišćenjem 0,5 ug/ml (35 nM) biotinilovanog GM-CSF. Maksimalno vezivanje GM-CSF za ćelije CHO-GMRa#11 (0% inhibicije) mereno je inkubacijom ćelija pri konačnoj koncentraciji GM-CSF od 05µg/ml biotinilovanog GM-CSF, bez dodavanja antitela. 100% inhibicija vezivanja GM-CSF je izmerena izostavljanjem GM-CSF iz testa. IC50vrednosti su

4

određene iz krive odgovora na dozu dobijene korišćenjem softvera GraphPad Prism v3.03 primenom nelinearne regresione krive.

[0124] Analizirani su Fabs sa poboljšanim afinitetima, roditeljski Fabs i monoklonski referentni IgG. Tabela 5 sumira vrednosti IC50dobijene u ovim testovima. % inhibicije postignute pri koncentraciji antitela od 5 µg/ml je takođe dat u tabeli 5.

Tabela 5: IK50vrednosti anti-hGM-CSF Fabs u testu inhibicije receptora

[0125] Ovaj test je kvalitativno pokazao da Fabs dobijeni sazrevanjem prema afinitetu i X-kloniranjem sprečavaju GM-CSF da se veže za alfa lanac GM-CSF receptora i stoga su zadržali mehanizam blokiranja svojih roditeljskih Fabs. Test je trebalo da se izvede sa koncentracijom od 35 nM (0,5 µg/ml) biotinilovanog GM-CSF da bi se dobio značajan signal u FACS. Stoga je teoretski potrebno 17,5 nM Fab (ili 8,75 nM IgG) da blokira 50% GM-CSF, postavljajući na taj način granicu za određivanje IC50vrednosti.

B. Inhibicija proliferacije TF-1 zavisne od GM-CSF anti-hGM-CSF Fabs korišćenjem humanog GM-CSF

[0126] Test proliferacije TF-1 je izveden kao što je opisano u Primeru 3B. Analizirani su Fab sa poboljšanim afinitetima i roditeljski Fab kao i monoklonski referentni IgG. IC50vrednosti su određene iz krive odgovora na dozu dobijene korišćenjem softvera GraphPad Prism v3.03 primenom nelinearne regresione krive. Tabela 6 rezimira IK50vrednosti dobijene u ovim testovima.

Tabela 6: IK50vrednosti anti-hGM-CSF Fabs i kontrolnih IgG u testu proliferacije TF-1

[0127] U drugom skupu eksperimenata IC50vrednosti u testu proliferacije TF-1 određene su za roditeljski Fab MOR03682, njegove afinitetno zrele derivate MOR04283, MOR04297 i xkloniranu varijantu MOR04342. Tabela 7 rezimira IK50vrednosti dobijene u ovim testovima.

Tabela 7: IK50vrednosti anti-hGM-CSF Fabs u testu proliferacije TF-1

[0128] Ovi eksperimenti su pokazali velika poboljšanja postignuta u IC50vrednosti nakon sazrevanja afiniteta i X-kloniranja. Na primer, MOR04357, MOR04350, MOR04354 pokazuju >2000 puta poboljšane IC50vrednosti u poređenju sa njihovim roditeljskim MOR03929 i premašuju snagu BVD2-21C11 i Mab215.

Primer 6: Konverzija MOR04357 u format humanog IgG1

A. Optimizacija gena Fab DNK sekvenci za ekspresiju u ekspresionim sistemima sisara.

[0129] Za optimizaciju DNK VH i VL MOR04357 za ekspresiju gena sisara (npr. promena upotrebe kodona, GC sadržaja, itd.) GeneOptimizer<™>softver kompanije Geneart (Regensburg, Nemačka) je korišćen za definisanje takvih optimizovanih VH i VL DNK sekvenci, koje su genski sintetizovane u Geneartu (Regensburg, Nemačka) i klonirane u pPCR-Script vektore dajući 055906pPCR-Script i 055907pPCR-Script. SEQ ID NO: 48 prikazuje odgovarajuću VH sekvencu, dok SEQ ID NO: 57 prikazuje odgovarajuću VL sekvencu.

B. Kloniranje Fab MOR04357 u humani IgG1 format i ekspresija IgG1

[0130] Da bi se eksprimirao imunoglobulin pune dužine (Ig), fragmenti varijabilnog domena optimizovanih za gen teških (VH) i lakih lanaca (VL) su subklonirani iz pPCR-Script vektora (Primer 5a) u pMORPH<®>2_h_Ig vektorska serija za humani IgG1. Kodonom optimizovan VH MOR04357 je izolovan iz 055906pPCR-Script preko Nhel/BIpl digestije i umetnut u pMorph2_h_IgG1f master vektor isečen sa istim restrikcijskim enzimima. Ovaj vektor je već sadržao humani gama 1 konstantni region. Dobijeni ekspresioni plazmid je nazvan pMorph2_h_IgG1f_MOR04357_co. Kodonom optimizovan VL MOR04357 je izolovan iz 055907pPCR-Script preko Nhel/Hpal digestije i umetnut u pMorph2_h_Iglambda2 master vektor isečen sa istim restrikcijskim enzimima. Ovaj vektor je već sadržao humani lambda konstantni region. Dobijeni ekspresioni plazmid je nazvan pM2_h_Iglambda2_MOR04357_co.

C. Prolazna ekspresija i prečišćavanje humanog IgG

[0131] Eukariotske HKB11 ćelije su transfektovane sa ekvimolarnom količinom DNK vektora ekspresije teškog i lakog lanca IgG. Supernatant ćelijske kulture je sakupljen od 3 do 7 dana nakon transfekcije. Nakon podešavanja pH supernatanta na 8,0 i sterilne filtracije, rastvor je podvrgnut standardnoj afinitetnoj hromatografiji za protein A (rProteinA FF ili MabSelect SURE, GE Healthcare). Zamena pufera je izvršena na 1 x Dulbcecco-ov PBS (pH 7,2, Invitrogen) i uzorci su sterilno filtrirani (0,2 µm). MOR04357 IgG1 je dijaliziran nasuprot 1 x Dulbcecco-ovog PBS-a (pH 6,5, Invitrogen). Čistoća IgG je analizirana u uslovima denaturacije, redukcije u SDS-PAGE ili korišćenjem Agilent BioAnalizer-a i u prirodnom stanju pomoću SE-HPLC.

D. Određivanje pikomolarnih afiniteta korišćenjem ravnotežne titracije rastvora (SET)

[0132] Za KDza određivanje, korišćene su frakcije monomera (najmanje 90% sadržaja monomera, analizirano analitičkom SEC; Superdex75, Amersham Pharmacia) IgG1. Određivanje afiniteta zasnovano na elektrohemiluminescenciji (ECL) u rastvoru i evaluacija podataka su u osnovi izvedeni kao što su opisali Haenel et al., 2005 i kao što je opisano u Primeru 4B. KDvrednosti za MOR04357 IgG1 protiv humanog rekombinantnog GM-CSF utvrđene su na 1,1 pM.

E. Određivanje afiniteta prema GM-CSF pacova korišćenjem ravnotežne titracije rastvora (SET)

[0133] Određivanje afiniteta prema GM-CSF pacova je urađeno u suštini kao što je opisano u Primeru 4D korišćenjem pacovskog GM-CSF (Peprotech) kao analita u rastvoru umesto humanog GM-CSF. Afiniteti su izračunati prema Haenelu et al (2005). KDUtvrđeno je da vrednost za MOR04357 IgG1 protiv rekombinantnog GM-CSF pacova iznosi 130 pM.

Primer 7: Karakterizacija MOR04357 IgG1 dobijenog iz optimizovanih anti-humanih GM-CSF Fabs

A. Inhibicija proliferacije TF-1 zavisne od GM-CSF anti-hGM-CSF IgG upotrebom humanog i rezus GM-CSF

[0134] Test proliferacije TF-1 je izveden kao što je opisano u Primeru 3B. MOR04357 je analiziran u IgG1 formatu i kao kontrolni monoklonski referentni IgG su analizirani. IC50vrednosti su određene iz krive odgovora na dozu dobijene korišćenjem softvera GraphPad Prism v3.03 primenom nelinearne regresione krive. Tabela 8 rezimira IK50vrednosti dobijene u ovim testovima. U ovom testu su korišćene tri različite varijante GM-CSF: Prvo, rekombinantni humani GM-CSF u koncentraciji od 0,25 ng/ml, proizveden u E.coli , drugo, supernatant kulture iz HEK293 koji je prolazno transfektovan sa pcDNA-huGM-CSF (videti Primer 3A), koji sadrži rekombinantni humani GM-CSF i treće, supernatant kulture iz HEK293 ćelija koje su privremeno transfektovane sa pcDNA-macGM-CSF (videti Primer 3A), koji sadrže rekombinant Macaca mulatta (rezus) GM-CSF. Za testove proliferacije TF1, supernatanti kulture HEK293 su korišćeni kao izvor odgovarajućeg GM-CSF u takvim razblaženjima da su TF-1 ćelije pokazale sličnu proliferaciju u poređenju sa proliferacijom datom pri definisanoj koncentraciji od 0,25 ng/ml prečišćenog rekombinantnog humanog GM-CSF proizveden u E.coli.

Tabela 8: IK50vrednosti MOR04357 IgG i kontrolnih IgG u testu proliferacije TF-1

[0135] Ovaj eksperiment je pokazao velika poboljšanja postignuta u IC50vrednosti nakon sazrevanja prema afinitetu i X-kloniranja gde su sačuvane nakon konverzije iz Fab u IgG1 format. IgG1 MOR04357 pokazuje >2000 puta poboljšani IC50vrednosti u poređenju sa Fab MOR03929 i premašuje potenciju BVD2-21C11 i Mab215.

Reference:

[0136]

Alvaro-Gracia JM, Zvaifler NJ, Brown CB, Kaushansky K, and Firestein GS. (1991). Cytokines in chronic inflammatory arthritis. VI. Analysis of the synovial cells involved in granulocyte-macrophage colony-stimulating factor production and gene expression in rheumatoid arthritis and its regulation by IL-1 and tumor necrosis factor-alpha. J Immunol 146, 3365-3371.

Babior, B. (2000). Phagocytes and oxidative stress. Am J Med 109, 33-44.

Bonfield,T.L., Kavuru,M.S., and Thomassen,M.J. (2002). Anti-GM-CSF titer predicts response to GM-CSF therapy in pulmonary alveolar proteinosis. Clin Immunol 105, 342-350.

Bozinovski,S., Jones,J., Beavitt,S.J., Cook,A.D., Hamilton,J.A., and Anderson,G.P. (2003). Innate immune responses to lipopolysaccharide in mouse lung are suppressed and reversed by neutralization of GM-CSF via repression of TLR-4. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol.

Broide,D.H. and Firestein,G.S. (1991). Endobronchial allergen challenge in asthma. Demonstration of cellular source of granulocyte macrophage colony-stimulating factor by in situ hybridization. J Clin Invest 88, 1048-1053.

Broide,D.H., Paine,M.M., and Firestein,G.S. (1992). Eosinophils express interleukin 5 and granulocyte macrophage-colony-stimulating factor mRNA at sites of allergic inflammation in asthmatics. J Clin Invest 90, 1414-1424.

Brown,C.B., Pihl,C.E., and Kaushansky,K. (1994). Mapping of human granulocytemacrophage-colony-stimulating-factor domains interacting with the human granulocytemacrophage-colony-stimulating-factor-receptor alpha-subunit. Eur J Biochem 225, 873-880.

Burmester,G.R., Stuhlmuller,B., Keyszer,G., and Kinne,R.W. (1997). Mononuclear phagocytes and rheumatoid synovitis. Mastermind or workhorse in arthritis? Arthritis Rheum 40, 5-18.

Campbell,I.K., Bendele,A., Smith,D.A., and Hamilton,J.A. (1997). Granulocyte-macrophage colony stimulating factor exacerbates collagen induced arthritis in mice. Ann Rheum Dis 56, 364-368.

Campbell,I.K., Rich,M.J., Bischof,R.J., Dunn,A.R., Grail,D., and Hamilton,J.A. (1998). Protection from collagen-induced arthritis in granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-deficient mice. J Immunol 161, 3639-3644.

Carrieri,P.B., Provitera,V., De Rosa,T., Tartaglia,G., Gorga,F., and Perella,O. (1998). Profile of cerebrospinal fluid and serum cytokines in patients with relapsing-remitting multiple sclerosis: a correlation with clinical activity. Immunopharmacol Immunotoxicol. 20, 373-382.

4

Cebon,J., Nicola,N.A., Ward,M., Gardner,I., Dempsey,P.J., Layton,J.E., Dührsen,U., Burgess,A., Nice,E.C., and Morstyn,G. (1990). Granulocyte-macrophage stimulating factor from human lymphocytes. J Biol Chem 265, 4483-4491.

Chantry,D., Turner,M., Brennan,F., Kingsbury,A., and Feldmann,M. (1990). Granulocytemacrophage colony stimulating factor induces both HLA-DR expression and cytokine production by human monocytes. Cytokine 2, 60-67.

Chen Y., Wiesmann C., Fuh G., Li B., Christinger H.W., McKay .P, de Vos A.M., Lowman H.B. (1999) Selection and analysis of an optimized anti-VEGF antibody: crystal structure of an affinity-matured Fab in complex with antigen. J Mol Biol.293, 865-81.

Cheng,S.S., Lai,J.J., Lukacs,N.W., and Kunkel,S.L. (2001). Granulocyte-macrophage colony stimulating factor up-regulates CCR1 in human neutrophils. J Immunol 166, 1178-1184.

Clark,S.C. and Kamen,R. (1987). The human hematopoietic colony-stimulating factors. Science 236, 1229-1237.

Cook,A.D., Braine,E.L., Campbell,I.K., Rich,M.J., and Hamilton,J.A. (2001). Blockade of collagen-induced arthritis post-onset by antibody to granulocyte-macrophage colonystimulating factor (GM-CSF): requirement for GM-CSF in the effector phase of disease. Arthritis Res 3, 293-298.

de Groot,R.P., Coffer,P.J., and Koenderman,L. (1998). Regulation of proliferation,differentiation and survival by the IL-3/IL-5/GM-CSF receptor family. Cell Signal. 10, 619-628.

de Vries,E.G., Willemse,P.H., Biesma,B., Stern,A.C., Limburg,P.C., and Vellenga,E. (1991). Flare-up of rheumatoid arthritis during GM-CSF treatment after chemotherapy. Lancet 338, 517-518.

Diederichs,K., Boone,T., and Karplus,P.A. (1991). Novel fold and putative receptor binding site of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor. Science 254, 1779-1782.

Drake A.W., Myszka D.G., Klakamp S.L. (2004) Characterizing high-affinity antigen/antibody complexes by kinetic- and equilibrium-based methods. Anal Biochem.328, 35-43.

Dranoff,G., Crawford,A.D., Sadelain,M., Ream,B., Rashid,A., Bronson,R.T., Dickersin,G.R., Bachurski,C.J., Mark,E.L., Whitsett,J.A., and (1994). Involvement of granulocytemacrophage colony-stimulating factor in pulmonary homeostasis. Science 264, 713-716.

Friguet B., Chaffotte A..F, Djavadi-Ohaniance L., Goldberg M.E. (1985),

Measurements of the true affinity constant in solution of antigen-antibody complexes by enzyme-linked immunosorbent assay. J Immunol Methods.77,305-19.

Gasson,J.C., Baldwin,G.C., Sakamoto,K.M., and DiPersio,J.F. (1990a). The biology of human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF). Prog Clin Biol Res 352, 375-384.

Gasson,J.C., Fraser,J.K., and Nimer,S.D. (1990b). Human granulocyte-macrophage colonystimulating factor (GM-CSF): regulation of expression. Prog Clin Biol Res 338, 27-41.

Gasson,J.C., Kaufman,S.E., Weisbart,R.H., Tomonaga,M., and Golde,D.W. (1986). Highaffinity binding of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor to normal and leukemic human myeloid cells. Proc Natl Acad Sci U S A.83, 669-673.

Gearing,D.P., King,J.A., Gough,N.M., and Nicola,N.A. (1989). Expression cloning of a receptor for human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor. EMBO J. 12, 3667-3676.

Gomez-Cambronero,J., Horn,J., Paul,C.C., and Baumann,M.A. (2003). Granulocytemacrophage colony-stimulating factor is a chemoattractant cytokine for human neutrophils: involvement of the ribosomal p70 S6 kinase signaling pathway. J Immunol 171, 6846-6855.

Haenel, C., Satzger, M., Della Ducata, D., Ostendorp, R. and Brocks, B. (2005). Characterization of high-affinity antibodies by electrochemiluminescence-based equilibrium titration. Analytical Biochemistry, 339, 1, 182-184.

Hamilton,J.A. (1993). Rheumatoid arthritis: opposing actions of hemopoietic growth factors and slow acting anti-rheumatic drugs. Lancet 342, 536-539.

Hamilton,J.A. (2002). GM-CSF in inflammation and autoimmunity. Trends Immunol 23, 403-408.

Hart,P.H., Whitty,G.A., Piccoli,D.S., and Hamilton,J.A. (1988). Synergistic activation of human monocytes by granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and IFN-gamma. Increased TNF-alpha but not IL-1 activity. J Immunol 141, 1516-1521.

Haworth,C., Brennan,F.M., Chantry,D., Turner,M., Maini,R.N., and Feldmann,M. (1991). Expression of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor in rheumatoid arthritis: regulation by tumor necrosis factor-alpha. Eur J Immunol 21, 2575-2579.

Hayashida,K., Kitamura,T., Gorman,D.M., Arai,K., Yokota,K., and Miyajima,A. (1990). Molecular cloning of a second subunit of the receptor for human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF): reconstitution of a high-affinity GM-CSF receptor. Proc Natl Acad Sci U S A 87, 9655-9659.

Hazenberg BP, Van Leeuwen MA, Van Rijswijk MH, Stern AC, and Vellenga E (1989).

Correction of granulocytopenia in Felty's syndrome by granulocyte-macrophage colonystimulating factor. Simultaneous induction of interleukin-6 release and flare-up of the arthritis. Blood 74, 2769-2780.

Kastelein,R.A. and Shanafelt,A.B. (1993). GM-CSF receptor: interactions and activation. Oncogene 8, 231-236.

Kaufman,S.E., DiPersio,J.F., and Gasson,J.C. (1989). Effects of human GM-CSF on neutrophil degranulation in vitro. Exp Hematol 17, 800-804.

Kitamura,T., Sato,N., Arai,K., and Miyajima,A. (1991). Expression cloning of the human IL-

4

3 receptor cDNA reveals a shared beta subunit for the human IL-3 and GM-CSF receptors. Cell 66, 1165-1174.

Kitamura,T., Tanaka,N., Watanabe,J., Uchida, Kanegasaki,S., Yamada,Y., and Nakata,K. (1999). Idiopathic pulmonary alveolar proteinosis as an autoimmune disease with neutralizing antibody against granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J Exp Med 190, 875-880.

Kitamura T., Tange T., Terasawa T., Chiba S., Kuwaki T., Miyagawa K., Piao Y.F., Miyazono K., Urabe A., Takaku F. (1989).

Establishment and characterization of a unique human cell line that proliferates dependently on GM-CSF, IL-3, or erythropoietin J Cell Physiol.140, 323-34.

Knappik,A., Ge,L., Honegger,A., Pack,P., Fischer,M., Wellnhofer,G., Hoess,A., Wolle,J., Pluckthun,A., and Virnekas,B. (2000). Fully synthetic human combinatorial antibody libraries (HuCAL) based on modular consensus frameworks and CDRs randomized with trinucleotides. J Mol Biol 296, 57-86.

Krebs,B., Rauchenberger,R., Reiffert,S., Rothe,C., Tesar,M., Thomassen,E., Cao,M., Dreier,T., Fischer,D., Hoss,A., Inge,L., Knappik,A., Marget,M., Pack,P., Meng,X.Q., Schier,R., Sohlemann,P., Winter,J., Wolle,J., and Kretzschmar,T. (2001). High-throughput generation and engineering of recombinant human antibodies. J Immunol Methods 254, 67-84.

Lopez,A.F., Williamson,D.J., Gamble,J.R., Begley,C.G., Harlan,J.N., Klebanoff,S.J., Waltersdorph,A., Wong,G., Clark,S.C., and Vadas,M.A. (1986). Recombinant human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor stimulates in vitro mature human neutrophil and eosinophil function, surface receptor expression, and survival. J Clin Invest 78, 1220-1228.

McQualter,J.L., Darwiche,R., Ewing,C., Onuki,M., Kay,T.W., Hamilton,J.A., Reid,H.H., and Bernard,C.C. (2001). Granulocyte macrophage colony-stimulating factor: a new putative therapeutic target in multiple sclerosis. J Exp Med 194, 873-882.

Meager,A., Wadhwa,M., Bird,C., Dilger,P., Thorpe,R., Newsom-Davis,J., and Willcox,N. (1999). Spontaneously occurring neutralizing antibodies against granulocyte-macrophage colony-stimulating factor in patients with autoimmune disease. Immunology 97, 526-532.

Metcalf,D., Begley,C.G., Johnson,G.R., Nicola,N.A., Vadas,M.A., Lopez,A.F., Williamson,D.J., Wong,G.G., Clark,S.C., and Wang,E.A. (1986). Biologic properties in vitro of a recombinant human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor. Blood 67, 37-45.

Mulherin,D., Fitzgerald,O., and Bresnihan,B. (1996). Synovial tissue macrophage populations and articular damage in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum 39, 115-124.

Nagy Z.A., Hubner B., Lohning C., Rauchenberger R., Reiffert S., Thomassen-Wolf E., Zahn S., Leyer S., Schier E.M., Zahradnik A., Brunner C., Lobenwein K., Rattel B., Stanglmaier M., Hallek M., Wing M., Anderson S., Dunn M., Kretzschmar T., Tesar M. (2002) Fully human, HLA-DR-specific monoclonal antibodies efficiently induce programmed death of malignant lymphoid cells. Nat Med.8, 801-7

Olver,I.N., Hercus,T., Lopez,A., Vadas,M., Somogyi,A.A., Doyle,I., Foster,D.J., Keefe,D., Taylor,A., Brown,M., To,L.B., Cole,J., Rawling,T., Cambareri,B., Myers,M., Olszewski,N., Bastiras,S., Senn,C., Hey,A., Verma,M., and Wigley,P. (2002). A phase I study of the GM-CSF antagonist E21R. Cancer Chemother Pharmacol 50, 171-178.

Plenz,G., Eschert,H., Beissert,S., Arps,V., Sindermann,J.R., Robenek,H., and Völker,W. (2003). Alterations in the vascular extracellular matrix of granulocyte-macrophage colonystimulating factor (GM-CSF)-deficient mice. FASEB J.17, 1451-1457.

Rapoport,A.P., Abboud,C.N., and DiPersio,J.F. (1992). Granulocyte-macrophage colonystimulating factor (GM-CSF) and granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF): receptor biology, signal transduction, and neutrophil activation. Blood Rev 6, 43-57.

Rauchenberger,R., Borges,E., Thomassen-Wolf,E., Rom,E., Adar,R., Yaniv,Y., Malka,M., Chumakov,I., Kotzer,S., Resnitzky,D., Knappik,A., Reiffert,S., Prassler,J., Jury,K., Waldherr,D., Bauer,S., Kretzschmar,T., Yayon,A., and Rothe,C. (2003). Human

4

combinatorial Fab Library yielding specific and functional antibodies against the human fibroblast growth factor receptor 3. J Biol Chem.

Santiago-Schwarz F, Anand P,L.S., and Carsons SE (2001). Dendritic cells (DCs) in rheumatoid arthritis (RA): progenitor cells and soluble factors contained in RA synovial fluid yield a subset of myeloid DCs that preferentially activate Th1 inflammatory-type responses. J Immunol 167, 1758-1768.

Sato,N., Sakamaki,K., Terada,N., Arai,K., and Miyajima,A. (1993). Signal transduction by the high-affinity GM-CSF receptor: two distinct cytoplasmic regions of the common beta subunit responsible for different signaling. EMBO J 12, 4181-4189.

Schier R., McCall A., Adams G..P, Marshall K.W., Merritt H., Yim M., Crawford R.S., Weiner L.M., Marks C., Marks J.D. (1996) Isolation of picomolar affinity anti-c-erbB-2 single-chain Fv by molecular evolution of the complementarity determining regions in the center of the antibody binding site. J Mol Biol.8, 263:551-67.

Shanafelt,A.B., Johnson,K.E., and Kastelein,R.A. (1991a). Identification of critical amino acid residues in human and mouse granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and their involvement in species specificity. J Biol Chem 266, 13804-13810.

Shanafelt,A.B., Miyajima,A., Kitamura,T., and Kastelein,R.A. (1991b). The amino-terminal helix of GM-CSF and IL-5 governs high affinity binding to their receptors. EMBO J 10, 4105-4112.

Shibata,Y., Berclaz,P.-Y., Chroneos,Z., Yoshida,H., and Trapnell,B.C. (2001). GM-CSF regulates alveolar macrophage differentiation and innate immunity in the lung through PU. Immunity 15, 557-567.

Sisson,S.D. and Dinarello,C.A. (1988). Production of interleukin-1 alpha, interleukin-1 beta and tumor necrosis factor by human mononuclear cells stimulated with granulocytemacrophage colony-stimulating factor. Blood 72, 1368-1374.

Stanley,E., Lieschke,G.J., Grail,D., Metcalf,D., Hodgson,G., Gall,J.A., Maher,D.W.,

4

Cebon,J., Sinickas,V., and Dunn,A.R. (1994). Granulocyte/macrophage colony-stimulating factor-deficient mice show no major perturbation of hematopoiesis but develop a characteristic pulmonary pathology. Proc Natl Acad Sci U S A 91, 5592-5596.

Trapnell,B.C. and Whitsett,J.A. (2002). GM-CSF regulates pulmonary surfactant homeostasis and alveolar macrophage-mediated innate host defense. Annu Rev Physiol 64, 775-802.

Uchida,K., Nakata,K., Trapnell,B.C., Terakawa,T., Hamano,E., Mikami,A., Matsushita,I., Seymour,J.F., Oh-Eda,M., Ishige,I., Eishi,Y., Kitamura,T., Yamada,Y., Hanaoka,K., and Keicho,N. (2004). High-affinity autoantibodies specifically eliminate granulocytemacrophage colony-stimulating factor activity in the lungs of patients with idiopathic pulmonary alveolar proteinosis. Blood 103, 1089-1098.

Virnekäs, B., Ge, L., Plückthun, A., Schneider, K.C., Wellnhofer, G. & Moroney, S.E., (1994). Nucleic Acids Research 22, 5600-5607.

Xu,W.D., Firestein,G.S., Taetle,R., Kaushansky,K., and Zvaifler,N.J. (1989). Cytokines in chronic inflammatory arthritis. II. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor in rheumatoid synovial effusions. J Clin Invest 83, 876-882.

Yamashita,N., Tashimo,H., Ishida,H., Kaneko,F., Nakano,J., Kato,H., Horiuchi,T., and Ohta,K. (2002). Attenuation of airway hyperresponsiveness in a murine asthma model by neutralization of GM-CSF. Cell Immunol 219, 92-97.

Yang W.P., Green K., Pinz-Sweeney S., Briones A.T., Burton D.R., Barbas C.F.3rd. (1995). CDR walking mutagenesis for the affinity maturation of a potent human anti-HIV-1 antibody into the picomolar range. J Mol Biol.254, 392-403

Zhang,Y., McCluskey,K., Fujii,K., and Wahl,L.M. (1998). Differential regulation of monocyte matrix metalloproteinase and TIMP-1 production by TNF-alpha, granulocytemacrophage CSF, and IL-1 beta through prostaglandin-dependent and -independent mechanisms. J Immunol 161, 3071-3076.

4

Claims (10)

1. Patentni zahtevi 1. Izolovano humano IgG1 antitelo koje sadrži region koji se vezuje za antigen koji je specifičan za GM-CSF koji obuhvata (i) varijabilnu sekvencu aminokiselina teškog lanca

   I (ii) varijabilnu aminokiselinsku sekvencu lakog lanca
2. 2. Farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo kao što je definisano u patentnom zahtevu 1 i njegov farmaceutski prihvatljiv nosač ili ekscipijent.
3. 3. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 2 za upotrebu u lečenju inflamatorne bolesti.
4. 4. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 3, naznačena time da je navedena inflamatorna bolest izabrana sa spiska od reumatoidnog artritisa, multiple skleroze, Kronove bolesti, psorijaze, astme i atopijskog dermatitisa.
5. 5. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 3 ili patentnom zahtevu 4, naznačena time što je navedena inflamatorna bolest reumatoidni artritis.
6. 6. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 3 ili patentnom zahtevu 4, naznačena time što je navedena inflamatorna bolest atopijski dermatitis.
7. 7. Antitelo prema patentnom zahtevu 1, za upotrebu u lečenju inflamatorne bolesti.
8. 8. Antitelo za upotrebu prema patentnom zahtevu 7, naznačeno time da je navedena inflamatorna bolest izabrana sa spiska od reumatoidnog artritisa, multiple skleroze, Kronove bolesti, psorijaze, astme i atopijskog dermatitisa.
9. 9. Antitelo za upotrebu prema patentnom zahtevu 7 ili patentnom zahtevu 8, naznačeno time da je inflamatorna bolest reumatoidni artritis.
10. 10. Antitelo za upotrebu prema patentnom zahtevu 7 ili patentnom zahtevu 8, naznačeno time da je inflamatorna bolest atopijski dermatitis.