BRPI0610796B1 - anticorpo humano ou humanizado isolado, ou um fragmento fab ou scfv do mesmo, sequência de ácidos nucleicos, vetor, e, uso de um anticorpo - Google Patents

Abstract

anticorpo humano ou humanizado isolado, ou um fragmento funcional do mesmo, regiao isolada de ligação com antígeno de um anticorpo, ou de um fragmento funcional do anticorpo, cadeia pesada variável, de um anticorpo humano ou humamzado isolado ou de um fragmento funcional do anticorpo, seqoencia isolada de ácidos nucleicos; vetor, célula isolada, composição farmacêutica e metodo de tratar um disturbio ou uma cont)içao associada com a presença não desejada do gm-csf a presente invenção fornece as regiões recombinantes de ligação com antígenos, os anticorpos e os fragmentos funcionais dos mesmos que são específicos para o gm-csf, que desempenham um papel integral emvários distúrbios ou condições. estes anticorpos, conseqúentemente, podem ser usados para tratar, por exemplo, doenças inflamatórias tais como a artrite reumatóide. os anticorpos de acordo com a presente invenção também podem ser usados no campo do diagnóstico, bem como para investigar também o papel do gm-csf relativo à progressão de vários distúrbios. a presente invenção fornece também as seqúências dos ácidos nucleicos que codificam os precedentes anticorpos, vetores contendo as mesmas, composições farmacêuticas e os kits com instruções para uso.

Description

“ANTICORPO HUMANO OU HUMANIZADO ISOLADO, OU UM FRAGMENTO FAB OU SCFV DO MESMO, SEQUÊNCIA DE ÁCIDOS NUCLEICOS, VETOR, E, USO DE UM ANTICORPO”

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

O Fator Estimulador de Colônia Granulócito Macrófago, GMCSF, foi identificado originalmente como um fator de crescimento hematopoiético. É produzido por diversos tipos de célula incluindo linfócitos, monócitos, células endoteliais, fibroblastos e algumas células malignas (Metcalf et al., 1986; Clark e Kamen, 1987; Hart et al., 1988; Metcalf et al., 1986). Além de possuir uma função de estímulo do crescimento e da diferenciação em células precursoras hematopoiéticas, o GM-CSF foi descoberto também como possuindo uma variedade de efeitos sobre as células do sistema imune que expressam o receptor do GM-CSF (para revisão veja: Hamilton, 2002; de Groot et al., 1998). O mais importante dessas funções é a ativação dos monócitos, dos macrófagos e dos granulócitos em diversos processos imunes e inflamatórios (Gasson et al., 1990b; Gasson et al., 1990a; Hart et al., 1988; Rapoport et al., 1992).

O GM-CSF maduro é uma proteína monomérica com 127 aminoácidos com os dois sítios de glicosilação O grau variável da glicosilação resulta em uma faixa de variação de pesos moleculares entre 14 kDa e 35 kDa. Os GM-CSF glicosilados e não glicosilados apresentam atividades similares in vitro (Cebon et al., 1990). A análise cristalográfica do GM-CSF

Petição 870190098140, de 01/10/2019, pág. 7/12

A

My revelou uma estrutura em forma de tambor composta de quatro hélices alfa curtas (Diederichs et al., 1991). A dobradura geral da molécula é similar a outros fatores de crescimento tais como o hormônio do crescimento, a interleucina-2 e a interleucina-4.

O GM-CSF exerce sua atividade biológica pela ligação com seu receptor (Kastelein e Shanafelt, 1993; Sisson e Dinarello, 1988). Os sítios mais importantes de expressão do receptor do GM-CSF (GM-CSF-R) estão na superfície celular de células mielóides e de células endoteliais, enquanto que os linfócitos são negativos quanto aos GM-CSF-R. O receptor nativo é composto pelo menos de duas subunidades, alfa e beta. A subunidade alfa confere a especificidade do ligante e liga o GM-CSF com afinidade nanomolar (Gearing et al., 1989; Gasson et al., 1986). A subunidade beta é também parte dos complexos do receptor da interleucina-3 e da interleucina-5 e, em associação com a subunidade alfa do receptor do GM-CSF e o GMCSF, levam à formação de um complexo com afinidade de ligação picomolar (Hayashida et al., 1990). Os domínios de ligação no GM-CSF para o receptor foram mapeados: GM-CSF interage com a subunidade beta de seu receptor através de uma região muito restringente na primeira hélice alfa do GM-CSF (Shanafelt et aL, 1991b; Shanafelt et al., 1991a; Lopez et al., 1991). A ligação à subunidade alfa podería ser mapeada para a terceira hélice alfa, a hélice C, para os resíduos iniciais do laço de união das hélices C e D, e para a cauda carboxiterminal do GM-CSF (Brown et al., 1994).

A formação do complexo trimérico do receptor do GM-CSF leva à ativação das cascatas dos complexos de sinalização envolvendo moléculas das famílias das JAK/STAT, She, Ras, Raf, as quinases MAP, fosfatidilinositol-3-quinase e NFkB, levando finalmente à transcrição do cmyc, do c-fos e do c-jun. A ativação é induzida principalmente pela subunidade beta do receptor (Hayashida et al., 1990; Kitamura et al., 1991; Sato et al., 1993). A subunidade beta compartilhada é também responsável pelas funções de superposição exercidas pelas IL-3, IL-5 e GM-CSF (para revisão veja: de Groot et al., 1998).

Independente de sua atividade de estímulo do crescimento hematopoiético e da diferenciação, o GM-CSF funciona especialmente como uma citoquina pró-inflamatória. Os macrófagos e os monócitos bem como os neutrófilos e os eosinófilos se tomam ativados pelo GM-CSF, tendo por resultado a liberação de outras citoquinas e quimiocinas, proteases degradantes de matriz, aumentando a expressão de HLA e a aumentando a expressão de moléculas de adesão celular ou de receptores para as quimiocinas-CC. Ao final, por sua vez, leva ao aumento de quimiotaxia das células inflamatórias no tecido inflamado (Chantry et al., 1990; Hamilton, 2002; Sisson e Dinarello, 1988; Zhang et al., 1998; Hamilton et al., 1993; Lopez et al., 1986; Cheng et al., 2001; Gomez-Cambronero et al., 2003). Frequentemente, o GM-CSF exerce sua atividade em sinergia com outros fatores estímulo inflamatório tais como outras citoquinas ou LPS, por exemplo, os neutrófilos tratados com o GM-CSF em combinação com, por exemplo, LPS mostrarão uma queima oxidativa aumentada (Kaufman et aL, 1989; Rapoport et al., 1992).

GM-CSF como alvo para a terapia antiinflamatória:

Devido as suas diversas funções de ativação no sistema imune, o GM-CSF pode ser considerado como um alvo para a terapia antiinflamatória. As doenças inflamatórias crônicas e agudas como a artrite reumatóide (RA), esclerose múltipla (MS), doença de Crohn, psoríase, asma, dermatite atópica ou choque podem trazer benefícios a partir do bloqueio da atividade do GM-CSF e da subseqüente redução das atividades prejudiciais das células de resposta do GM-CSF (Hamilton, 1993; Zhang et al., 1998; Hamilton, 2002).

Artrite:

Diversos grupos mostraram que o GM-CSF, bem como seu receptor, está presente na articulação sinovial de pacientes com artrite (Alvaro-Gracia et al., 1991; Xu et al., 1989; Haworth et aL, 1991). Adicionalmente, o GM-CSF foi mostrado com causador de crises de artrite reumatóide em pacientes tratados com o GM-CSF para a neutropenia durante a síndrome de Felty (Hazenberg et al., 1989) ou após a quimioterapia (de Vries et al., 1991).

As primeiras sugestões da utilidade dos anticorpos que bloqueiam o GM-CSF para o tratamento da artrite vieram de estudos in vivo em ratos (Campbell et al., 1997; Campbell et al., 1998; Cook et al., 2001). Especificamente, Cook et al., mostraram que os anticorpos de neutralização do GM-CSF mostraram eficácia em um modelo de artrite induzida por colágeno. O bloqueio do GM-CSF levou a uma redução da severidade da doença em relação à inflamação, da destruição da cartilagem e da progressão da doença nos membros inicialmente afetados ou da progressão para outros membros.

Há diversos efeitos advindos de uma terapia anti-GM-CSF dos quais os pacientes com artrite reumatóide ou com outras doenças inflamatórias poderíam se beneficiar.

Espera-se que a obstrução do GM-CSF iniba ou reduza:

a) a ativação e o número de monócitos, de macrófagos, e neutrófilos maduros. Especialmente dos neutrófilos e dos macrófagos que são abundantes no líquido e na membrana sinovial. O número de macrófagos na região sinovial foi mostrado estando correlacionado com o grau de erosão das articulações na RA (Mulherin et al., 1996; Burmester et al., 1997). Os macrófagos são a fonte de uma variedade de outras citoquinas próinflamatórias e proteases de degradação da matriz. A produção de H2O2 pelos neutrófilos é parte dos processos destrutivos que ocorrem nas articulações com artrite (Babior, 2000).

b) a diferenciação de células dendríticas mielóides (DCs) e ativação de DCs sinoviais (= sinoviócitos). O GM-CSF super regula e mantêm a expressão da HLA classe II nas DCs e nos sinoviócitos da RA (Alvaro-Gracia JM et al., 1991). As DCs são instruídas dentro da articulação a adquirirem as funções associadas com a ativação seletiva de células-T inflamatórias. Os alelos específicos da HLA-DR estão relacionados com a suscetibilidade à RA, e a ativação das Células-T através da apresentação ao antígeno das DCs pode desempenhar um papel crucial nesse tipo de doença imune (Santiago-Schwarz-Schwarz et al., 2001).

Esclerose Múltipla:

Na esclerose múltipla, os níveis elevados do GM-CSF se correlacionam com a fase ativa da MS (Carrieri et al., 1998; McQualter et al., 2001) e os ratos -/- GM-CSF falharam em desenvolver a doença nos modelos de sistema para o MS, para a encéfalomielite experimental e a EAE (McQualter et al., 2001).

Asma:

Na asma, foram relatadas quantidades aumentadas do GMCSF nos pulmões (Broide e Firestein, 1991). Ao mesmo tempo os eosinófilos estão elevados, de modo que o GM-CSF em sinergia com a interleucina-5 age de três maneiras: i) estimula a diferenciação das células progenitoras em eosinófilos, ii) estimula sua ativação funcional, e iii) prolonga a sobrevivência dos eosinófilos nos pulmões (Broide et al., 1992; Yamashita et al., 2002). Assim, a redução da sobrevivência dos eosinófilos nas vias respiratórias asmáticas pela obstrução do GM-CSF provavelmente melhora a doença. A utilidade de anticorpos neutralizantes anti-GM-CSF foi também mostrada em um modelo de asma para a murina onde a administração de tais anticorpos levou a uma redução significativa da resposta de hipersensibilidade das vias aéreas e da inflamação das vias aéreas (Yamashita et al., 2002).

Em um modelo diferente de rato, a inflamação do pulmão dependente da LPS pode ser reduzida pela aplicação do anticorpo 22E9 anti6

GM-CSF no rato (Bozinovski et al., 2003).

Efeitos Tóxicos:

Os ratos homozigóticos para um gene de ruptura do fator de estímulo de colônia de granulócitos/macrófagos (GM-CSF) desenvolveram-se 5 normalmente e não mostram nenhuma perturbação acentuada da hematopoiese até 12 semanas de idade. Embora a maioria de ratos deficientes em GM-CSF fossem superficialmente saudáveis e férteis, todos desenvolvem uma matriz extracelular vascular desorganizada com feixes rompidos e reduzidos de colágeno e pulmões anormais com prejuízo da limpeza pulmonar 10 tensoativa e redução da resistência aos micróbios patogênicos no pulmão. As características da patologia tardia se assemelham ao distúrbio de proteinose alveolar pulmonar humano (PAP). O GM-CSF não parece ser essencial para a manutenção dos níveis normais dos tipos principais de células hematopoiéticas maduras e de seus precursores no sangue, na medula e no 15 baço. Entretanto, essas características implicam em que o GM-CSF seja essencial para o desenvolvimento vascular normal, a fisiologia pulmonar e para a resistência à infecção local (Stanley et al., 1994; Dranoff et aL, 1994; Plenz et al., 2003; Shibata et al., 2001). Recentemente, uma forte associação dos auto-anticorpos para o GM-CSF com a PAP implicou adicionalmente em 20 que o GM-CSF sinalizasse para anormalidades na patogênese da PAP em seres humanos. Juntas, essas observações demonstram que o GM-CSF possui um papel crítico na regulação da homeostase do tensoativo e das funções imunes inatas dos macrófagos alveolares nos pulmões (Bonfield et al., 2002; Trapnell e Whitsett, 2002; Uchida et al., 2004; Kitamura et al., 1999).

Os títulos elevados dos autoanticorpos com atividade de bloqueio do GM-CSF foram observados nos pacientes com miastenia grave. Estes pacientes não mostraram nenhum outro fenômeno autoimmune nem deficiências hematopoiéticas ou “outros correlates clínicos óbvios” (Meager etal, 1999).

Μ

Ο composto E21R, uma forma modificada do GM-CSF que antagoniza a função do GM-CSF, foi avaliado em um experimento da segurança da fase I e foi encontrado como possuindo um bom perfil de segurança em pacientes de câncer (OIver et al., 2002).

Assim, aparte da função pulmonar, que deve ser monitorada de perto, outros efeitos colaterais não são esperados ao se aplicar uma terapia anti-GM-CSF.

Até o momento, foram gerados somente os anticorpos derivados de espécies não humanas com função de neutralização do GM-CSF.

Por exemplo, a Patente EP 0499161 Al descreve um anticorpo gerado pela imunização de ratos com oligopeptídeos, a seqüência dos mesmos sendo derivada de um GM-CSF. Além disso, tal pedido divulga um método para aliviar, em um mamífero que esteja necessitando, um efeito indesejável do GM-CSF, que compreende a administração ao dito mamífero de uma quantidade de uma imunoglobulina inibidora do GM-CSF. Entretanto, esse anticorpo é um anticorpo de murina, tomando-se inadequado para a administração humana.

Adicionalmente, a WO 03/068920 divulga um anticorpo IgGl inibidor quimérico rato/humano. Os anticorpos contendo seqüências não humanas são os mais prováveis em promover uma resposta imune no paciente humano não sendo adequados para a administração terapêutica. Por exemplo, nas doenças onde é requerido o tratamento a longo prazo (por exemplo, doenças inflamatórias crônicas como a artrite reumatóide, a asma e a esclerose múltipla), a administração continuada de um agente terapêutico não humano aumenta a probabilidade de uma reação inflamatória severa e de produção de anticorpos humanos que podem neutralizar o agente terapêutico.

Consequentemente, à luz de um maior potencial para a terapia com anticorpo anti-GM-CSF, há uma elevada necessidade para anticorpos humanos anti-GM-CSF com afinidade elevada que eficazmente bloqueiem a interação do GM-CSF / receptor do GM-CSF. Adicionalmente, seria vantajoso ter um ou mais anticorpos que pudessem fazer uma reação cruzada o GM-CSF de uma ou mais espécies não humanas a fim testar sua eficácia em um modelo in vivo baseado em um animal.

A presente invenção satisfaz a essas e a outras necessidades fornecendo anticorpos inteiramente anti-GM-CSF altamente eficazes, que são descritos abaixo.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO.

É um objetivo de acordo com a presente invenção fornecer anticorpos humanos e humanizados que podem eficazmente bloquear a interação do GM-CSF/receptor do GM-CSF.

É um outro objetivo de acordo com a presente invenção fornecer anticorpos que sejam seguros para a administração humana.

É também um objetivo de acordo com a presente invenção fornecer métodos para tratamento de doenças e/ou de condições associadas com a presença do GM-CSF pelo uso de um ou mais anticorpos de acordo com a presente invenção. Estes e outros objetivos de acordo com a presente invenção são descritos mais completamente daqui por diante.

Em um aspecto, a presente invenção fornece uma região de ligação com antígeno que é específica para o GM-CSF humano, onde o anticorpo humano ou humanizado isolado, ou o fragmento funcional do mesmo, é capaz de (i) bloquear uma interação de 0,5 pg/ml de GM-CSF humano com a cadeia alfa do receptor do GM-CSF humano expressado em aproximadamente 2x10⁵ células CHO-K1 no mínimo em 50 % sob as seguintes condições: (a) a concentração da cadeia alfa do receptor do GMCSF humano expressado nas células CHO-K1 é semelhante à concentração da cadeia alfa do receptor do GM-CSF humano expressado em aproximadamente 2x10⁵ células CHO-GMRa#l 1, e (b) a concentração do anticorpo humano ou humanizado isolado, ou do fragmento funcional do mesmo, é de aproximadamente 5 pg/ml; e (ii) neutralizar 0,25 ng/ml do GM-CSF humano em um ensaio de proliferação TF-1 com um valor de IC₅o no mínimo cinco vezes mais baixo do que o do anticorpo BVD2-21C11 e/ou o do anticorpo MAB215 usados como referência. Tal como aqui utilizado, um “ensaio de proliferação TF-1” é definido como o ensaio essencialmente tal como descrito no Exemplo 5B. O profissional versado na técnica pode obter as células CHO-K1 que expressam a cadeia alfa do receptor do GM-CSF humano em uma concentração similar àquela que é expressa em aproximadamente 2x10⁵ células CHO-GMRa#l 1 seguindo os ensinamentos aqui fornecidos.

A presente invenção fornece adicionalmente um anticorpo humano ou humanizado isolado ou um fragmento funcional do anticorpo que contenha uma região de ligação com antígeno tal como aqui divulgado. Tal anticorpo ou fragmento funcional do mesmo podem conter uma região de ligação com antígeno que contenha uma região H-CDR3 descrita nas SEQ ID

N°: 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19,20,49,50,51 ou 52; a região de ligação com antígeno pode também incluir uma região H-CDR2 descrita nas SEQ ID

N°: 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 49, 50, 51 ou 52; e a região de ligação com antígeno também podendo conter uma região de H-CDR1 descrita nas SEQ ID N°: 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 49, 50, 51 ou 20 52. Tal anticorpo ou fragmento funcional do mesmo podem conter uma região de ligação com antígeno que contenha uma cadeia pesada variável descrita nas SEQ ID N°: 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 49, 50, 51 ou 52. Tal anticorpo específico para o GM-CSF de acordo com a presente invenção pode conter uma região de ligação com antígeno que contenha uma região L-CDR3 descrita nas SEQ ID N°: 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 58, 59, 60 ou

61; a região de ligação com antígeno pode também incluir uma região LCDR2 descrita nas SEQ ID N°: 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 58, 59, ou 61; e a região de ligação com antígeno também podendo conter uma região de L-CDR1 descrita nas SEQ ID N°: 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39,

40, 58, 59, 60 ou 61. Tal anticorpo ou fragmento funcional do mesmo podendo conter uma região de ligação com antígeno que contenha uma cadeia leve variável descrita nas SEQ ID N°: 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 58, 59, 60 ou 61.

As variantes dos peptídeos das seqüências aqui divulgadas também são abarcadas pela presente invenção. Consequentemente, a invenção inclui os anticorpos anti-GM-CSF possuindo uma seqüência de aminoácidos constituindo uma cadeia pesada com: pelo menos 60 por cento de igualdade de seqüência nas regiões CDR com as regiões CDR descritas nas SEQ ID N°: 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 49, 50, 51 ou 52; e ou pelo menos 80 por cento de homologia da seqüência nas regiões dos CDR com as regiões dos CDR descritas nas SEQ ID N°: 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 49, 50, 51 ou 52. Também incluídos estão os anticorpos anti-GM-CSF possuindo uma seqüência de aminoácidos constituindo uma cadeia leve com: pelo menos 60 por cento de igualdade de seqüência nas regiões CDR com as regiões CDR descritas nas SEQ ID N°: 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 58, 59, 60 ou 61; e ou pelo menos 80 por cento de homologia da seqüência nas regiões dos CDR com as regiões dos CDR descritas nas SEQ ID N°: 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39,40, 58, 59, 60 ou 61.

Um anticorpo de acordo com a presente invenção pode ser uma IgG (por exemplo, uma IgGl), enquanto um fragmento do anticorpo pode ser uma Fab ou uma scFv, por exemplo. Um fragmento de anticorpo de acordo com a presente invenção, consequentemente, pode ser, ou pode conter, uma região de ligação com antígeno que se comporte de um ou mais modos tal como aqui descrito.

A presente invenção também está relacionada com as seqüências isoladas de ácidos nucléicos, cada uma das quais podendo codificar uma região de ligação com antígeno de um anticorpo humano ou humanizado ou um fragmento funcional do anticorpo que seja específico para α ο GM-CSF. Tal seqüência de ácidos nucléicos pode codificar uma cadeia pesada variável de um anticorpo humano ou humanizado isolado ou um fragmento funcional do mesmo compreendendo as SEQ ID N°: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 44, 45, 46, 47 ou 48, ou uma seqüência de ácidos nucléicos que se hibridizam sob elevadas condições de estringência para formar a fita complementar das SEQ ID N°: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 44, 45,46, 47 ou 48. O ácido nucléico podendo codificar uma cadeia leve variável de um anticorpo humano ou humanizado isolado ou um fragmento funcional do mesmo compreendendo as SEQ ID N°: 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 53, 54, 10 55, 56 ou 57, ou uma seqüência de ácidos nucléicos que se hibridizam sob elevadas condições de estringência para formar a fita complementar das SEQ ID N°: 21, 22, 23, 24,25, 26,27, 28,29,30, 53, 54, 55, 56 ou 57.

A seqüência de ácidos nucléicos podendo codificar uma região de ligação com antígeno de um anticorpo humano ou humanizado, ou um 15 fragmento funcional do anticorpo, que seja específico para o GM-CSF humano, onde o anticorpo ou o fragmento funcional do mesmo é capaz de (i) bloquear uma interação de 0,5 pg/ml do GM-CSF humano com a cadeia alfa do receptor do GM-CSF humano expressado em aproximadamente 2x10⁵ células CHO-K1 no mínimo em 50 % sob as seguintes condições: (a) a 20 concentração da dita cadeia alfa do receptor do GM-CSF humano expressado nas ditas células CHO-K1 é semelhante à concentração da cadeia alfa do receptor do GM-CSF humano expressado em aproximadamente 2x10⁵ células CHO-GMRa#ll, e (b) a concentração do dito anticorpo humano ou humanizado isolado, ou do fragmento funcional do mesmo, é de 25 aproximadamente 5 pg/ml; e (ii) neutralizar 0,25 ng/ml do GM-CSF humano em um ensaio de proliferação TF-1 com um valor de IC₅₀ no mínimo cinco vezes mais baixo do que o dos anticorpos BVD2-21C11 e/ou MAB215 usados como referência.

Os ácidos nucléicos de acordo com a presente invenção são adequados para a produção recombinante. Assim, a invenção também se refere aos vetores e às células hospedeiras contendo uma seqüência de ácidos nucléicos de acordo com a presente invenção. Tais células hospedeiras podendo ser células bacterianas ou eucarióticas.

As composições de acordo com a presente invenção podem ser usadas para aplicações terapêuticas ou profíláticas. A presente invenção inclui conseqüentemente uma composição farmacêutica contendo um anticorpo de acordo com a presente invenção (ou fragmento funcional do anticorpo) e um veículo ou um excipiente farmaceuticamente aceitável da mesma. Em um aspecto relacionado, a presente invenção fornece um método para o tratamento de um distúrbio ou de uma condição associados com a presença não desejada do GM-CSF ou das células que expressam o GM-CSF. Tal método contém as etapas de administração a um indivíduo que esteja necessitando da mesma de uma quantidade eficaz da composição farmacêutica contendo um anticorpo de acordo com a presente invenção tal como descrito ou contemplado na mesma. Tal distúrbio ou circunstância podendo ser uma doença inflamatória, tal como a artrite reumatóide, a esclerose múltipla, doença de Crohn, a psoríase, a asma, a dermatite atópica e a comoção.

Os anticorpos humanos ou humanizados (e os fragmentos funcionais dos mesmos) de acordo com a presente invenção podem possuir reação cruzada com o GM-CSF de rato e/ou de macaco rhesus, tal como determinado pela titulação de equilíbrio da solução (TES), e/ou pelo ensaio de proliferação TF-1.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DAS FIGURAS.

A Figura la fornece as seqüências de ácidos nucléicos das regiões de cadeia pesada variável de vários novos anticorpos.

A Figura 1b fornece as seqüências de aminoácidos das regiões de cadeia pesada variável de vários novos anticorpos. As regiões HCDR1,

HCDR2 e HCDR3 do CDR são denominadas a partir das terminações N e C da face em negrito.

A Figura 2a fomece as seqüências de ácidos nucléicos das regiões de cadeia leve variável de vários novos anticorpos.

A Figura 2b fomece as seqüências de aminoácidos das regiões de cadeia leve variável de vários novos anticorpos. As regiões HCDR1, HCDR2 e HCDR3 do CDR são denominadas a partir das terminações N e C da face em negrito.

A Figura 3 fomece as seqüências de aminoácidos das regiões de cadeia pesada variável baseadas no consenso das seqüências do gene mestre do anticorpo HuCAL®. As regiões HCDR1, HCDR2 e HCDR3 dos CDR são denominadas a partir das terminações N e C da face em negrito (SEQ IDN°:41).

A Figura 4 fomece as seqüências de aminoácidos das regiões de cadeia leve variável baseadas no consenso das seqüências do gene mestre do anticorpo HuCAL®. As regiões HCDR1, HCDR2 e HCDR3 dos CDR são denominadas a partir das terminações N e C da face em negrito (SEQ ID N°: 42).

A Figura 5 fomece um exemplo de uma seqüência do DNA do vetor de expressão de pMORPH®X9_MOR03929_FH (SEQ ID N°: 43).

A Figura 6 fomece o nível de expressão do receptor alfa do GM-CSF, tal como determinado pela análise de FACS usando o anticorpo específico MAB 1006 do receptor alfa do GM-CSF. A CHO-GMRa#l 1 (linha contínua) é mostrada em comparação com a CHO-K1 (linha pontilhada). O eixo x representa o valor relativo da fluorescência (RFL), medido no canal FL2; o eixo y representa a contagem de células.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO.

A presente invenção está baseada na descoberta de novos anticorpos que são específicos para, ou possuem elevada afinidade com o ^v GM-CSF e possuem uma ou mais novas propriedades diferentes. Preferivelmente, um anticorpo de acordo com a presente invenção pode fornecer um benefício terapêutico a um indivíduo. Os anticorpos de acordo com a presente invenção, que podem humanos ou humanizados, podem ser 5 usados em diversos contextos, que são aqui mais completamente descritos.

Um anticorpo “humano” ou um fragmento funcional do anticorpo humano é definido daqui por diante como um anticorpo que não é quimérico (por exemplo, “humanizado”) e não é proveniente (ou completamente ou em parte) de uma espécie não humana. Um anticorpo | 10 humano ou um fragmento funcional do anticorpo pode ser derivado de um humano ou pode ser um anticorpo humano sintético. Um “anticorpo humano sintético” é definido aqui como um anticorpo possuindo uma seqüência derivada, completamente ou em parte, in silico das seqüências sintéticas que estão baseadas na análise de seqüências humanas conhecidas do anticorpo. O 15 projeto in silico de uma seqüência de anticorpo humano ou de um fragmento do mesmo pode ser conseguido, por exemplo, analisando uma base de dados de anticorpos humanos ou de seqüências de fragmentos de anticorpos e planejando uma seqüência de polipeptídeo utilizando os dados assim obtidos. Um outro exemplo de um anticorpo humano ou de um fragmento funcional de 20 anticorpo é um anticorpo que é codificado a partir de um ácido nucléico isolado de uma biblioteca de seqüências de anticorpos de origem humana (isto é, tal biblioteca estando baseada nos anticorpos extraídos de uma fonte natural humana).

Um “anticorpo humanizado” ou o fragmento funcional do 25 anticorpo humanizado é definido aqui como aquele que é (i) derivado de uma fonte não humana (por exemplo, um rato transgênico que carregue um sistema imune heterólogo), cujo anticorpo esteja baseado em uma seqüência de germinação humana; ou (ii) quimérico, em que o domínio variável é derivado de uma origem não humana e o domínio constante é derivado de uma origem humana ou (iii) CDR-enxertado, em que os CDRs de domínio variável são de uma origem não humana, enquanto um ou mais sistemas de referência do domínio variável são de origem humana e o domínio constante (se houver) é de origem humana.

Tal como aqui utilizado, um anticorpo “se liga especificamente a”, é “específico a/para” ou “reconhece especificamente” a um antígeno (aqui, o GM-CSF) se tal anticorpo é capaz de discriminar entre tal antígeno e um ou mais antígenos de referência, desde que a especificidade de ligação não seja um valor absoluto, mas uma propriedade relativa. Em sua forma mais geral (e quando nenhuma referência definida for mencionada), a “ligação específica” se refere à capacidade do anticorpo de discriminar entre o antígeno de interesse e um antígeno não relacionado, tal como determinado, por exemplo, de acordo com um dos métodos que se seguem. Tais métodos compreendem, mas não estão limitados aos testes Western blots, ELISA, RIA, ECL, IRMA e varreduras de peptídeo. Por exemplo, um ensaio padrão de ELISA pode ser realizado. O resultado pode ser obtido pelo desenvolvimento da cor padrão (por exemplo, anticorpo secundário com peróxido de rabanete e tetrametil benzidina com peróxido de hidrogênio). A reação em determinados poços é avaliada pela densidade ótica, por exemplo, em 450 nm. O valor de referência típico (= reação negativa) pode ser 0,1 DO; a reação positiva típica pode ser 1 DO. Isto significa que a diferença positivo/negativo pode ser maior do que 10 vezes. Tipicamente, a determinação de especificidade de ligação é realizada usando não somente um único antígeno de referência, mas por um conjunto de aproximadamente três a cinco antígenos não relacionados, tais como o leite em pó, BSA, transferrina ou assemelhados.

Entretanto, a “ligação específica” também pode se referir à capacidade de um anticorpo em discriminar entre o antígeno alvo e um ou mais antígenos proximamente relacionados, que são usados como pontos de referência, por exemplo, entre GM-CSF e IL-3, IL-5, IL-4, IL-13 ou M-CSF.

Adicionalmente, a “ligação específica” pode se relacionar à capacidade de um anticorpo em discriminar entre as partes diferentes de seu antígeno alvo, por exemplo, domínios ou regiões diferentes do GM-CSF, ou entre um ou mais resíduos do aminoácido chave ou estiramentos de resíduos de aminoácido do 5 GM-CSF.

Também, tal como aqui utilizado, uma “imunoglobulina” (Ig) é daqui por diante definida como uma proteína pertencente à classe IgG, IgM, IgE, IgA, ou IgD (ou algum subclasse das mesmas), e inclui todos os anticorpos convencionalmente conhecidos e fragmentos funcionais dos 10 mesmos. Um “fragmento funcional” de um anticorpo/imunoglobulina é definido aqui como um fragmento de um anticorpo/imunoglobulina (por exemplo, uma região variável de uma IgG) que retenha a região de ligação com o antígeno. Uma “região de ligação com o antígeno” de um anticorpo é encontrada tipicamente em uma ou mais regiões hipervariáveis de um 15 anticorpo, ou seja, as regiões CDR-1, 2 e/ou 3; entretanto, as regiões variáveis do “sistema de referência” podem também desempenhar um papel importante na ligação do antígeno, tal como fornecer uma estrutura de suporte para os CDRs. Preferivelmente, a “região de ligação com o antígeno” compreende pelo menos os resíduos 4 a 103 da cadeia leve variável (VL) e os resíduos 5 a 20 109 da cadeia pesada variável (VH), mais preferivelmente os resíduos dos aminoácidos 3 a 107 do VL e os resíduos dos aminoácidos 4 a 111 do VH, e particularmente preferidas são as cadeias completas de VL e de VH (com as posições dos aminoácidos 1 a 109 do VL e 1 a 113 do VH; com a numeração de acordo com a WO 97/08320). Uma classe preferida de imunoglobulinas 25 para o uso na presente invenção é a IgG. Os “fragmentos funcionais” de acordo com a presente invenção incluem o domínio de um fragmento F(ab')2, de um fragmento de Fab, do scFv ou dos construtores compreendendo domínios variáveis de uma única imunoglobulina ou um domínio único dos polipeptídeos do anticorpo, por exemplo, domínios variáveis de cadeias pesadas únicas ou domínios variáveis cadeia leves únicas. O F(ab')₂ ou o Fab pode ser projetado para minimizar ou remover completamente as interações intermoleculares de dissulfeto que ocorrem entre os domínios do Chi e do C_L.

Um anticorpo de acordo com a presente invenção pode ser derivado de uma biblioteca de anticorpo recombinante que seja baseada nas seqüências de aminoácido que foram projetadas in silico e codificadas pelos ácidos nucléicos que são criados sinteticamente. O projeto de uma seqüência do anticorpo in silico é conseguido, por exemplo, analisando uma base de dados de seqüências humanas e planejando uma seqüência de polipeptídeos que utilize os dados obtidos a partir das mesmas. Os métodos para projetar e obter seqüências criadas in silico são descritos, por exemplo, em Knappik et al., J. Mol. Biol. (2000) 296:57; Krebs ET al., J. Immunol. Métodos. (2001) 254:67; e a Patente Americana US 6.300.064 depositada para Knappik et al., que são aqui incorporados pela referência em sua totalidade.

Os anticorpos da invenção.

Em todo esse relatório, são feitas referências aos seguintes anticorpos representativos de acordo com a presente invenção: “anticorpo n°.” ou “MOR” 03684, 04251, 03929, 04252, 04287, 04290, 04302, 04350, 04354, 04357, 03682, 04283, 04297 e 04342. MOR03684 representa um anticorpo possuindo uma região pesada variável correspondendo à SEQ ID N°: 1 (DNA) /SEQ ID N°: 11 (proteína) e uma região leve variável que corresponde à SEQ ID N°: 21 (DNA) /SEQ ID N°: 31 (proteína). MOR04251 representa um anticorpo possuindo uma região pesada variável correspondendo à SEQ ID N°: 2 (DNA) /SEQ ID N°: 12 (proteína) e uma região leve variável que corresponde à SEQ ID N°: 22 (DNA) /SEQ ID N°: 32 (proteína). MOR03929 representa um anticorpo possuindo uma região pesada variável correspondendo à SEQ ID N°: 3 (DNA) /SEQ ID N°: 13 (proteína) e uma região leve variável que corresponde à SEQ ID N°: 23 (DNA) /SEQ ID N°: 33 (proteína). MOR04252 representa um anticorpo possuindo uma região pesada variável correspondendo à SEQ ID N°: 4 (DNA) /SEQ ID N°: 14 (proteína) e uma região leve variável que corresponde à SEQ ID N°: 24 (DNA) /SEQ ID N°: 34 (proteína). MOR04287 representa um anticorpo possuindo uma região pesada variável correspondendo à SEQ ID N°: 5 (DNA) /SEQ ID N°: 15 (proteína) e uma região leve variável que corresponde à SEQ ID N°: 25 (DNA) /SEQ ID N°: 35 (proteína). MOR04290 representa um anticorpo possuindo uma região pesada variável correspondendo à SEQ ID N°: 6 (DNA) /SEQ ID N°: 16 (proteína) e uma região leve variável que corresponde à SEQ ID N°: 26 (DNA) /SEQ ID N°: 36 (proteína). MOR04302 representa um anticorpo possuindo uma região pesada variável correspondendo à SEQ ID N°: 7 (DNA) /SEQ ID N°: 17 (proteína) e uma região leve variável que corresponde à SEQ ID N°: 27 (DNA) /SEQ ID N°: 37 (proteína). MOR04350 representa um anticorpo possuindo uma região pesada variável correspondendo à SEQ ID N°: 8 (DNA) /SEQ ID N°: 18 (proteína) e uma região leve variável que corresponde à SEQ ID N°: 28 (DNA) /SEQ ID N°: 38 (proteína). MOR04354 representa um anticorpo possuindo uma região pesada variável correspondendo à SEQ ID N°: 9 (DNA) /SEQ ID N°: 19 (proteína) e uma região leve variável que corresponde à SEQ ID N°: 29 (DNA) /SEQ ID N°: 39 (proteína). MOR04357 representa um anticorpo possuindo uma região pesada variável correspondendo à SEQ ID N°: 10 ou 48 (DNA) /SEQ ID N°: 20 (proteína) e uma região leve variável que corresponde à SEQ ID N°: 30 ou 57 (DNA) /SEQ ID N°: 40 (proteína). MOR03682 representa um anticorpo possuindo uma região pesada variável correspondendo à SEQ ID N°: 44 (DNA) /SEQ ID N°: 49 (proteína) e uma região leve variável que corresponde à SEQ ID N°: 53 (DNA) /SEQ ID N°: 58 (proteína). MOR04283 representa um anticorpo possuindo uma região pesada variável correspondendo à SEQ ID N°: 45 (DNA) /SEQ ID N°: 50 (proteína) e uma região leve variável que corresponde à SEQ ID N°: 54 (DNA) /SEQ ID N°: 59 (proteína). MOR04297 representa um anticorpo possuindo uma região pesada variável correspondendo à SEQ ID N°: 46 (DNA) /SEQ ID N°: 51 (proteína) e uma região leve variável que corresponde à SEQ ID N°: 55 (DNA) /SEQ ID N°: 60 (proteína). MOR04342 representa um anticorpo possuindo uma região pesada variável correspondendo à SEQ ID N°: 47 (DNA) /SEQ ID N°: 52 (proteína) e uma região leve variável que corresponde à SEQ ID N°: 56 (DNA) /SEQ ID N°: 61 (proteína).

Em um aspecto, a presente invenção fornece os anticorpos possuindo uma região de ligação com antígeno que possa ligar especificamente a ou tenha uma afinidade elevada para o GM-CSF. Um anticorpo é dito como tendo “uma afinidade elevada” para um antígeno se a medida da afinidade for de pelo menos 100 nM (afinidade monovalente do fragmento de Fab). Um anticorpo de acordo com a presente invenção, ou uma região de ligação com antígeno, preferivelmente pode se ligar ao GM-CSF com uma afinidade aproximadamente menor do que 100 nM, mais preferivelmente menor do que de aproximadamente 60 nM, e ainda mais preferivelmente menor do que de aproximadamente 3 0 nM. Também preferidos são os anticorpos que se ligam ao GM-CSF com uma afinidade menor do que de aproximadamente 10 nM, e mais preferivelmente menor do que os aproximadamente 3 nM. Por exemplo, a afinidade de um anticorpo de acordo com a presente invenção contra o GM-CSF pode ser de aproximadamente 10,0 nM ou 1 pM (afinidade monovalente do fragmento Fab).

A Tabela 1 fornece um resumo das afinidades de anticorpos representativos de acordo com a presente invenção, tal como determinado pela análise de ressonância de plasmônio de superfície (Biacore) e de titulação do equilíbrio da solução (TES):

Tabela I: Afinidade dos anticorpos.

	Biacore	TES
MORO	KD(pM)	KD(pM)
3684	6420	16000
4251	70	7,4

3929	4260	2000
4302	174	63,5
4287	nd	17,9
4252	55	6
4290	122	11,1
4350	19	1,1
4354	21	2,8
4357	7	0,4
3682	nd	11406
4283	nd	113
4297	nd	49,2
4342	nd	4,9

nd = não determinado.

Com referência à Tabela 1, as afinidades de MOR03684, 04251, 03929, 04252, 04357, 04290, 04302, 04350 e 04354 foram medidas por ressonância de plasmônio de superfície (Biacore) em GM-CSF recombinante imobilizado. O formato Fab de MOR03684, 04251, 03929, 04252, 04357, 04290, 04302, 04350 e 04354 exibe uma faixa de atividade monovalente entre aproximadamente 6420 e 7 pM.

O formato de Fab foi usado também para a determinação das afinidades pela titulação de equilíbrio da solução (TES). A coluna direita da Tabela 1 mostra a força da ligação entre de aproximadamente 16000 e 0,4 pM dos MORs nesse método.

Um anticorpo de acordo com a presente invenção preferivelmente possui reações cruzadas entre espécies com seres humanos e pelo menos outra uma espécie, que pode ser uma espécie de roedor ou um primata não humano. O primata não humano pode ser o macaco rhesus. A espécie do roedor pode ser o rato. Um anticorpo que possua reação cruzada com pelo menos uma espécie de roedor pode, por exemplo, fornecer uma flexibilidade maior e os benefícios dos anticorpos conhecidos anti-GM-CSF, com as finalidades de conduzir estudos in vivo em múltiplas espécies com o mesmo anticorpo.

Preferivelmente, um anticorpo de acordo com a presente invenção não somente é capaz de se ligar ao GM-CSF, mas pode também bloquear a interação do GM-CSF humano com a cadeia alfa do receptor do

GM-CSF humano expressado em células CHO-K1 em pelo menos 25 %, preferivelmente em pelo menos 50 %, mais preferivelmente em pelo menos 60 %, mais preferivelmente em pelo menos 70 %, preferivelmente em pelo menos 85 % e bem mais preferivelmente em pelo menos 100 %. Em uma modalidade preferida, um anticorpo de acordo com a presente invenção pode bloquear uma interação de 0,5 pg/ml de GM-CSF humano com a cadeia alfa do receptor do GM-CSF humano expressado em aproximadamente 2x10⁵ células CHO-K1 no mínimo em 50 % sob as seguintes condições: a concentração da cadeia alfa do receptor do GM-CSF humano expressado nas células CHO-K1 é semelhante à concentração da cadeia alfa do receptor do GM-CSF humano expressado em aproximadamente 2x10⁵ células CHOGMRa#l 1, e a concentração do anticorpo de acordo com a presente invenção é de aproximadamente 5 pg/ml.

Nesta consideração, o profissional versado na técnica pode obter as células CHO-K1 expressando o receptor alfa do GM-CSF humano em uma concentração semelhante àquela que é expressa em aproximadamente 2x10⁵ células CHO-GMRa#ll através de, por exemplo, transfecção de uma população de células CHO-K1 com um vetor de expressão adequado que codifica o receptor alfa do GM-CSF para gerar as diferentes linhagens de células estáveis expressando níveis definidos do receptor alfa do GM-CSF; e então, as linhagens de células estáveis são analisadas pela análise de FACS para determinar os níveis de expressão do receptor alfa do GM-CSF de acordo com o protocolo essencialmente tal como descrito no Exemplo 3C; uma linhagem de células expressando o receptor alfa humano do GM-CSF em uma concentração semelhante àquela que é expressa em aproximadamente 2x10⁵ células CHO-GMRa#ll é identificada pela comparação do valor da fluorescência média (MFL) de tais células transfectadas com o valor da MFL determinado no Exemplo 3C. Tal como aqui utilizado, uma linhagem da célula é definida como expressando o receptor alfa do GM-CSF em uma concentração “similar” àquela que é expressa em aproximadamente 2x10⁵ células CHO-GMRa# 11 se o valor da MFL da linhagem da célula transfectada não se desviar mais do que um fator de duas vezes o valor da MFL para a célula CHO-GMRa# 11 tal como determinado no Exemplo 3C.

Além disso, um anticorpo de acordo com a presente invenção é capaz de neutralizar o GM-CSF humano em um ensaio de proliferação de TF1 com um valor IC₅₀ mais baixo do que o anticorpo BVD2-21C11 e/ou MAB215 usados como referência, preferivelmente um valor de IC₅₀ cinco vezes menor, mais preferivelmente com um valor de IC₅o pelo menos 10 vezes menor do que o do anticorpo BVD2-21C11 e/ou MAB215 usados como referência, mais preferivelmente com um valor de IC₅o pelo menos 15 vezes menor do que o do anticorpo BVD2-21C11 e/ou MAB215 usados como referência, mais preferivelmente com um valor de IC₅o pelo menos 20 vezes menor do que o do anticorpo BVD2-21C11 e/ou MAB215 usados como referência, mais preferivelmente com um valor de IC₅₀ pelo menos 30 vezes menor do que o do anticorpo BVD2-21C11 e/ou MAB215 usados como referência, mais preferivelmente com um valor de IC50 pelo menos 50 vezes menor do que o do anticorpo BVD2-21C11 e/ou MAB215 usados como referência, mais preferivelmente com um valor de IC₅q pelo menos 100 vezes menor do que o do anticorpo BVD2-21C11 e/ou MAB215 usados como referência, e bem mais preferivelmente com um valor de IC₅₀ pelo menos 120 vezes menor do que o do anticorpo BVD2-21C11 e/ou MAB215 usados como referência.

Variantes dos Peptídeos.

Os anticorpos de acordo com a presente invenção não estão limitados às seqüências específicas de peptídeos aqui fornecidas. Preferivelmente, a invenção incorpora também variantes destes polipeptídeos. Com referência à presente divulgação e as tecnologias e as referências convencionalmente disponíveis, o profissional versado na técnica poderá preparar, testar e utilizar variantes funcionais dos anticorpos aqui divulgados, ao apreciar que as variantes que possuem a capacidade de bloquear a interação do GM-CSF com a cadeia alfa do receptor do GM-CSF caem dentro do alcance de acordo com a presente invenção. Tal como usada nesse contexto, a “capacidade de bloquear a interação do GM-CSF com a cadeia alfa do receptor do GM-CSF” significa uma característica funcional atribuída a um anticorpo anti-GM-CSF de acordo com a presente invenção.

Uma variante pode incluir, por exemplo, um anticorpo que tenha alterada pelo menos uma região determinante de complementaridade (CDR) (hipervariável) e/ou a estrutura (FR) (variável) domínio/posição, perante uma seqüência de peptídeos aqui divulgada. Para ilustrar melhor esse conceito, segue-se uma breve descrição da estrutura do anticorpo.

Um anticorpo é composto de duas cadeias de peptídeo, cada um contendo um (cadeia leve) ou três (cadeia pesada) domínios constantes e uma região variável (VL, VH), o último dos quais é em cada caso composto de quatro regiões FR e três CDRs interespaçadas. O local de ligação do antígeno é formado por uma ou mais CDRs, contudo as regiões FR fornecem a armadura estrutural para as CDRs e podem também desempenhar um importante papel na ligação do antígeno. Alterando um ou o mais resíduos de aminoácido em uma região CDR ou FR, o profissional versado na técnica rotineiramente pode gerar as seqüências mutadas ou diversificadas do anticorpo, que podem ser selecionadas contra o antígeno, por exemplo, para novas ou melhoradas propriedades.

As Tabelas 2a (VH) e 2b (VL) delineiam as regiões de CDR e FR para determinados anticorpos de acordo com a presente invenção e comparam aminoácidos em uma dada posição com cada outro e com as seqüências de consenso correspondentes ou do “gene mestre” (tal como descrito na Patente Americana US N° 6.300.064):

Tabela 2a: Seqüências VH.

Tabela 2a - continuação:

i ii H i! i! !S ί ü li

Tabela 2b: Seqüência VL.

VI sequences OKSF binders

i ii Bi

Tabela 2b - continuação:

ms

RX U

8 8 8 aãfifi

UH

88H

9 88 »«

S 9

9

Os genes mestres originais HuCAL® foram construídos com seus Autênticos N terminais, por exemplo VL lambda 3 contem os aminoácidos “SY” na posição 1 e 2; e VH3 contem o aminoácido “E” na posição 1. Durante a construção das bibliotecas de HuCAL® Fab, incluindo a biblioteca de HuCAL GOLD®, os primeiros dois aminoácidos foram mudados para “Dl” na cadeia de VL lambda 3; e o primeiro aminoácido foi mudado para “Q” na cadeia VH3.

O profissional versado na técnica pode usar os dados nas Tabelas 2a e 2b para projetar as variantes dos peptídeos que estão dentro do escopo de acordo com a presente invenção. Prefere-se que as variantes sejam construídas pela alteração dos aminoácidos dentro de uma ou mais regiões CDR; um variante pode também ter uma ou mais regiões estruturais alteradas. Em referência a uma comparação de novos anticorpos um com o outro, os candidatos a resíduo que podem ser mudados incluem, por exemplo, os resíduos 27 ou 51 das cadeias leves variáveis e, por exemplo, resíduos 32 ou 56 das cadeias pesadas variáveis do MOR04251, desde que essas são posições de variância estejam uma perante a outra. As alterações também podem ser feitas nas regiões da estrutura. Por exemplo, um domínio FR do peptídeo pode ser alterado onde há um desvio em um resíduo comparado a uma seqüência da linha de germinação.

Em referência a uma comparação de novos anticorpos à seqüência de consenso ou do “gene mestre” correspondente, os resíduos candidatos que podem ser mudados incluem por exemplo, os resíduos 27, 50 ou 90 da cadeia leve variável do MOR04251 comparados com o VLZ3 e, por exemplo, os resíduos 33, 52 ou 96 da cadeia pesada variável do MOR04251 comparado com o VH3. Altemativamente, o profissional versado na técnica poderia fazer a mesma análise comparando as seqüências do aminoácido aqui divulgadas com as seqüências conhecidas da mesma classe de tais anticorpos, usando, por exemplo, o procedimento descrito por Knappik et al. (2000), e A Patente Americana US N°. 6.300.064 depositada para Knappik et al.

Além disso, as variantes podem ser obtidas usando uma MOR como o ponto de partida para a otimização pela diversificação de um ou mais resíduos no MOR, preferivelmente resíduos de aminoácidos em uma ou mais CDRs, e selecionando a coleção resultante de variantes de anticorpos para variantes com propriedades melhoradas. É particularmente preferida a diversificação de um ou mais resíduos de aminoácido na CDR-3 do VL, na CDR-3 do VH, na CDR-1 do VL e/ou na CDR-2 do VH. A diversificação pode ser feita pela síntese de uma coleção de moléculas do DNA usando a tecnologia da mutagênese do trinucleotídeo (TRIM) (Vimekas et al., 1994).

Variantes Conservativas do Aminoácido.

As variantes de polipeptídeos podem ser feitas para conservar a estrutura molecular total de uma seqüência do peptídeo do anticorpo aqui descrita. Dadas as propriedades dos aminoácidos individuais, algumas substituições racionais serão reconhecidas pelo profissional versado na técnica. As substituições do aminoácido, isto é, “substituições conservativas” podem ser feitas, por exemplo, com base na similaridade de polaridade, de carga, solubilidade, hidrofobicidade, hidrofílicidade e/ou na natureza anfipática dos resíduos envolvidos.

Por exemplo, (a) os aminoácidos (hidrofóbicos) apoiares incluem a alanina, a leucina, a isoleucina, a valina, a prolina, a fenilalanina, o triptofano e a metionina; (b) os aminoácidos neutros polares incluem a glicina, a serina, a treonina, a cisteína, a tirosina, a asparagina, e a glutamina;

(c) os aminoácidos (básicos) positivamente carregados incluem a arginina, a lisina, e a histidina; e (d) os aminoácidos (ácidos) negativamente carregados incluem o ácido aspártico e o ácido glutâmico. As substituições tipicamente podem ser feitas dentro dos grupos (a) a (d). Além disso, a glicina e a prolina podem ser substituídas por outra, baseando-se em sua capacidade de romper as hélices alfa. Similarmente, determinados aminoácidos, tais como a alanina, a cisteina, a leucina, a metionina, o ácido glutâmico, a glutamina, a histidina e a lisina são mais comumente encontrados nas hélices alfa, enquanto que a valina, a isoleucina, a fenilalanina, a tirosina, o triptofano e a treonina são mais comumente encontrados em lâminas beta pregueadas. A glicina, a serina, o ácido aspártico, a asparagina, e a prolina são encontrados geralmente individualmente. Algumas substituições preferidas podem ser feitas entre os seguintes grupos: (i) S e T; (ii) P e G; e (iii) A, V, L e L Dados o código genético conhecido, e técnicas recombinantes e de síntese do DNA, o cientista versado pode prontamente construir DNAs que codifiquem as variantes conservativas do aminoácido.

Tal como aqui utilizado, a “seqüência de identidade” entre duas seqüências de polipeptídeos, indica a porcentagem de aminoácidos que são idênticos entre as seqüências. A “seqüência de homologia”, indica a porcentagem dos aminoácidos que ou sejam idênticos ou que representem substituições conservativas de aminoácidos. As seqüências preferidas de polipeptídeos de acordo com a presente invenção têm uma identidade de seqüência nas regiões das CDR de pelo menos 60 %, mais preferivelmente, de pelo menos 70 % ou 80 %, ainda mais preferivelmente de pelo menos 90 % e bem mais preferivelmente de pelo menos 95 %. Os anticorpos preferidos têm também uma homologia de seqüência nas regiões das CDR de pelo menos 80 %, mais preferivelmente de 90 % e bem mais preferivelmente de 95 %.

Moléculas de DNA da Invenção.

A presente invenção se relaciona também às moléculas de DNA que codificam um anticorpo de acordo com a presente invenção. Essas seqüências incluem, mas não estão limitadas aquelas moléculas de DNA determinadas nas figuras la e 2a. As moléculas de DNA de acordo com a presente invenção não são limitadas às seqüências aqui divulgadas, mas incluem também variantes das mesmas. As variantes do DNA dentro da invenção podem ser descritas pela referência a suas propriedades físicas na hibridização. O profissional versado na técnica reconhecerá que o DNA pode ser usado para identificar seu complemento e, como o DNA é de dupla fita, também seu equivalente ou homólogo, usando técnicas de hibridização de

ácidos nucleicos. Também será reconhecido que a hibridização pode ocorrer com complementaridade menor do que 100 %. Entretanto, dada uma escolha adequada das condições, as técnicas de hibridização podem ser usadas diferenciar entre as seqüências de DNA baseadas em sua relação estrutural a uma sonda em particular. Para uma orientação a respeito de tais condições veja, Sambrook et al., 1989 (Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, USA) e Ausubel et al., 1995 (Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Sedman, J. G., Smith, J. A., & Struhl, K. eds. (1995). Current Protocols in Molecular Biology. New York: John Wiley and Sons).

A similaridade estrutural entre duas seqüências de polinucleotídio pode ser expressa em função da “estringência” das condições sob as quais duas seqüências hibridizam com uma outra. Tal como aqui utilizado, o termo “estringência” se refere até ao ponto em que as condições desfavoreçam a hibridização. As condições estringentes desfavorecem fortemente a hibridização, e somente as moléculas mais estruturalmente relacionadas se hibridizam uma com a outra sob tais condições. Inversamente, as condições não estringentes favorecem a hibridização das moléculas que indicam pouco grau de relacionamento estrutural. A estringência da hibridização, conseqüentemente, se correlaciona diretamente com as interrelações estruturais de duas seqüências de ácidos nucléicos. As seguintes relações são úteis na hibridização correlacionada e no relacionamento (onde Tm é a temperatura de fusão de uma dupla de ácidos nucléicos):

a. Tm = 69,3 + 0,41 (G+C) %

b. O Tm, de um DNA duplex diminui em 1°C para cada aumento de 1 % no número de pares de bases não combinadas.

c. (Τηι)_μ2 - (Tm)_Hi = 18,5 log₁₀ μ2/μ1 onde μΐ e μ2 são as forças iônicas de duas soluções.

A estringência da hibridização é uma função de muitos fatores, incluindo a concentração total do DNA, da força iônica, da temperatura, do tamanho da sonda e da presença de agentes que rompam as pontes de hidrogênio. Os fatores que promovem a hibridização incluem concentrações 5 elevadas de DNA, forças iônicas elevadas, baixas temperaturas, um maior tamanho da sonda e a ausência dos agentes que rompem a ponte de hidrogênio. A hibridização tipicamente é realizada em duas fases: a fase de “ligação” e a fase de “lavagem”.

Primeiramente, na fase de ligação, a sonda é limitada ao alvo — 10 sob condições que favoreçam a hibridização. A estringência é geralmente controlada nesse estágio alterando-se a temperatura. Para uma estringência elevada, a temperatura estará geralmente entre 65°C e 70°C, a menos que sejam usadas as sondas curtas de oligonucleotídeo (< 20 nt). Uma solução representativa da hibridização compreende 6X SSC, 0,5 % SDS, 5X solução 15 de Denhardt e 100 pg do DNA veículo não específico. Veja Ausubel et al., seção 2.9, suplemento 27 (1994). Naturalmente, são conhecidas condições muito diferentes, ainda que funcionalmente equivalentes, de tamponamento. Onde o grau de relacionamento é mais baixo, uma temperatura mais baixa pode ser escolhida. As temperaturas baixas de ligação da estringência estão 20 entre aproximadamente 25°C e 40°C. A estringência média está entre pelo menos aproximadamente 40°C até menos do que 65°C. A estringência elevada está em pelo menos aproximadamente 65°C.

Em segundo lugar, a sonda adicional é removida por lavagem. É nesta fase que condições mais estringentes são normalmente aplicadas.

Desse modo, é nesse estágio de “lavagem” onde é mais importante a determinação do relacionamento via hibridização. As soluções de lavagem contêm tipicamente mais baixas concentrações de sal. Uma solução exemplo de estringência média contem 2 X SSC e 0,1 % SDS. Uma solução de lavagem com elevada estringência contem o equivalente (em força iônica) a menos do que aproximadamente 0,2 X SSC, com uma solução estringente preferida contendo aproximadamente 0,1 X SSC. As temperaturas associadas com as várias estringêncías são as mesmas discutidas acima para a ligação. A solução de lavagem é também tipicamente substituída algumas vezes durante a lavagem. Por exemplo, as condições típicas de lavagem de elevada estringência compreendem a lavagem duas vezes por 30 minutos a 55° C e três vezes por 15 minutos a 60° C.

Consequentemente, a presente invenção inclui as moléculas de ácidos nucléicos que hibridizam com as moléculas do que está determinado nas Figuras la e 2a sob as condições de ligação e de lavagem de estringência elevada, onde tais moléculas nucléicas codificam um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo que possui propriedades tais como aqui descritas. As moléculas preferidas (a partir da perspectiva do RNAm) são aquelas que possuem uma homologia de pelo menos 75 % ou de 80 % (preferivelmente pelo menos 85 %, mais preferivelmente pelo menos 90 % e bem mais preferivelmente pelo menos 95 %) ou identidade de seqüência com uma das moléculas do DNA tal como aqui descrito.

Variantes Funcionalmente Equivalentes.

Reconhece-se que as variantes das moléculas do DNA aqui fornecidas podem ser construídas de diversas maneiras diferentes. Por exemplo, podem ser construídas como DNAs completamente sintético. Os métodos de sintetizar eficientemente os oligonucleotídieos em uma faixa de 20 a aproximadamente 150 nucleotídeos estão extensamente disponíveis. Veja Ausubel et al., seção 2.11, suplemento 21 (1993). Os oligonucleotídeos de sobreposição podem sintetizados e montados em uma forma primeiramente relatada por Khorana et al., J. Mol. Biol. 72:209-217 (1971); veja também Ausubel et al., supra, seção 8.2. O DNAs sintético é projetado preferivelmente com sítios convenientes de restrição projetados nas extremidades 5' e 3’ do gene para facilitar a clonagem em um vetor adequado.

Tal como indicado, um método de geração de variantes deve começar com um dos DNAs aqui descritos e então ser conduzido ao sítio dirigido para a mutagênese. Veja Ausubel et al., supra, capítulo 8, suplemento 37 (1997). Em um método típico, um DNA alvo é clonado em um DNA de fita simples de um veículo bacteriófago. O DNA de fita simples é isolado e hibridizado com um oligonucleotídeo contendo o nucleotídeo coma alteração desejada. A fita complementar sintetizada e o fago de dupla fita são introduzidos em um hospedeiro. Algumas das progenias resultantes conterão o mutante desejado, que pode ser confirmado usando o seqüenciamento do DNA. Além disso, vários métodos estão disponíveis que aumentam a probabilidade de que a progenia do fago será o mutante desejado. Estes métodos são bem conhecidos daqueles que atuam nessa área e os kits estão comercialmente disponíveis para a geração de tais mutantes.

Construção e expressão do DNA recombinante.

A presente invenção também fornece a construção do DNA recombinante compreendendo uma ou mais das seqüências do nucleotídeo de acordo com a presente invenção. Os construtores recombinantes de acordo com a presente invenção são usadas na conexão com um vetor, tal como um vetor de plasmídeo, de fagomídio, de fago ou viral, no qual é introduzida uma molécula de DNA que codifica um anticorpo de acordo com a presente invenção.

O gene codificado pode ser produzido pelas técnicas descritas em Sambrook et al., 1989, e Ausubel et al., 1989. Altemativamente, as seqüências do DNA podem ser quimicamente sintetizadas usando, por exemplo, sintetizadores. Veja, por exemplo, as técnicas descritas no OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS (1984, Gait, ed., IRL Press, Oxford), que é aqui incorporado pela referência em sua totalidade. Os construtores recombinantes de acordo com a presente invenção são compreendidos com vetores de expressão que são capazes de expressar o RNA e/ou os produtos da proteína do DNA(s) codificado. O vetor pode também compreender seqüências reguladoras, incluindo um promotor ligado operacionalmente à estrutura de leitura aberta (ORF). O vetor pode compreender também uma seqüência selecionável de marcador. A iniciação específica e os sinais secretórios bacterianos também podem ser necessários para a tradução eficiente das seqüências de codificação introduzidas do gene do alvo.

A presente invenção também fornece as células hospedeiras contendo pelo menos um dos DNAs de acordo com a presente invenção. A célula hospedeira pode ser virtualmente toda e qualquer célula para a qual os vetores de expressão estejam disponíveis. Pode ser, por exemplo, uma célula hospedeira eucariótica de categoria mais elevada, tal como uma célula de mamífero, uma célula hospedeira eucariótica de categoria mais baixa, tal como uma célula de levedura ou uma célula procariótica, tal como uma célula bacteriana. A introdução do construtor recombinante na célula hospedeira pode ser realizada por transfecção com fosfato de cálcio, DEAE, por transfecção mediada por dextrano, por eletroporação ou pela infecção de fago.

Expressão Bacteriana.

Os vetores úteis para a expressão bacteriana são construídos introduzindo uma seqüência estrutural do DNA que codifica uma proteína desejada junto com sinais adequados de iniciação e de terminação da tradução na fase da leitura operável com um promotor funcional. O vetor compreenderá um ou mais marcadores fenotípicos selecionáveis e uma origem da replicação para assegurar a manutenção do vetor e, se desejável, fornecer a amplificação dentro do hospedeiro. As células hospedeiras procarióticas adequadas para a transformação incluem a E. coli, o Bacillus subtilis, a Salmonella typhimurium e várias espécies dentro dos gêneros Pseudomonas, Streptomyces e Staphylococcus.

Os vetores bacterianos podem ser baseados, por exemplo, em bacteriófagos, plasmídeos ou fagomídios. Estes vetores podem conter um

marcador selecionável e uma origem bacteriana de replicação derivados dos plasmídeos comercialmente disponíveis contendo tipicamente elementos de um vetor de clonagem bem conhecido o pBR322 (ATCC 37017). Depois da transformação de uma cepa adequada do hospedeiro e de um crescimento da cepa do hospedeiro até uma densidade celular adequada, o promotor selecionado é anti-reprimido/induzido por meios adequados (por exemplo, pelo deslocamento da temperatura ou pela indução química) e as células são cultivadas por um período adicional. As células são colhidas tipicamente por centrifugação, ruptura por meios físicos ou químicos e o extrato cru resultante é retido para uma purificação adicional.

Em sistemas bacterianos, diversos vetores de expressão podem ser vantajosamente selecionados dependendo do uso pretendido para a proteína que está sendo expressa. Por exemplo, quando uma quantidade grande de tal proteína deve ser produzida, para a geração de anticorpos ou para avaliar bibliotecas de peptídeos, por exemplo, os vetores que dirigem a expressão de níveis elevados dos produtos de fusão da proteína podem ser rapidamente purificados caso seja desejável.

Métodos Terapêuticos.

Os métodos terapêuticos envolvem a administração a um indivíduo que esteja necessitando de tratamento de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo contemplado pela invenção. Uma quantidade “terapeuticamente eficaz” é definida assim como a quantidade de um anticorpo que esteja em uma quantidade suficiente para bloquear eficazmente a interação entre o GM-CSF e seu receptor em uma determinada área tratada de um indivíduo - com uma única dose ou de acordo com um regime de múltiplas doses, sozinho, ou em combinação com outros agentes, que levam ao alívio de uma condição adversa, mantendo contudo em uma quantidade que seja toxicologicamente tolerável. O indivíduo pode ser um humano ou um animal não humano (por exemplo, rato ou macaco rhesus).

Um anticorpo de acordo com a presente invenção pode ser coadministrado com medicamentos conhecidos, e em alguns exemplos o próprio anticorpo pode ser modificado. Por exemplo, um anticorpo podería ser conjugado a uma imunotoxina ou a um radioisótopo para potencialmente aumentar mais sua eficácia.

Os anticorpos de acordo com a invenção podem ser usados como uma ferramenta terapêutica ou diagnostica em diversas situações onde o GM-CSF é indesejavelmente expressado ou encontrado. Os distúrbios e as condições particularmente adequadas para o tratamento com um anticorpo de acordo com a invenção são doenças inflamatórios tais como a artrite reumatóide (RA), a esclerose múltipla, a doença de Crohn, a psoríase, a asma, a dermatite atópica ou a comoção.

Para tratar alguns dos distúrbios anteriores, as composições farmacêuticas para uso de acordo com a presente invenção podem ser formuladas de um modo convencional usando um ou mais veículos ou excipientes fisiologicamente aceitáveis. Um anticorpo de acordo com a presente invenção pode ser administrado por todos os meios adequados, que podem variar, dependendo do tipo de distúrbio que estiver sendo tratado. As rotas possíveis de administração incluem administração parenteral (por exemplo, intramuscular, intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal, ou subcutânea), intrapulmonar e intranasal, e, se desejado para um tratamento imunossupressivo local, com administração intralesão. Além disso, um anticorpo de acordo com a presente invenção pode ser administrado por infusão de pulso, com, por exemplo, doses decrescentes do anticorpo. Preferivelmente, a dosagem é dada por injeções, injeções mais preferivelmente intravenosas ou subcutâneas, dependendo em parte se a administração é breve ou crônica. A quantidade a ser administrada dependerá de uma variedade de fatores tais como os sintomas clínicos, peso do indivíduo, se outras drogas são administradas. O clínico versado reconhecerá

4« que a rota de administração variará dependendo do distúrbio ou da condição a ser tratada.

A determinação de uma quantidade terapeuticamente eficaz do novo polipeptídeo, de acordo com a presente invenção, dependerá na maior parte das características particulares dos pacientes, da rota de administração, e da natureza do distúrbio que está sendo tratado. A orientação geral pode ser encontrada, por exemplo, nas publicações da conferência internacional sobre harmonização e no REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCE, capítulos 27 e 28, pp. 484-528 (18^a ed., Alfonso R. Gennaro, Ed., Easton, PA: Mack Pub. Co., 1990). Mais especificamente, a determinação de uma quantidade terapeuticamente eficaz dependerá de fatores tais como a toxicidade e a eficácia do medicamento. A toxicidade poderá ser determinada usando os bem métodos conhecidos na técnica e encontrados nas referências anteriores. A eficácia pode ser determinada utilizando a mesma orientação juntamente com os métodos descritos nos Exemplos abaixo.

Métodos Diagnósticos.

O GM-CSF é expresso por vários tipos de célula incluindo linfócitos, monócitos, células endoteliais, fibroblastos e algumas células malignas; assim, um anticorpo anti-GM-CSF de acordo com a presente invenção pode ser empregado ou para criar a imagem ou para visualizar um local de possível acúmulo do GM-CSF em diferentes tecidos de um paciente. Com essa consideração, um anticorpo pode ser marcado para detecção, com o uso de radioisótopos, marcadores de afinidade (tais como a biotina, a avidina, etc..), marcadores fluorescentes, átomos paramagnéticos, etc. Os procedimentos para realizar tal marcação são bem conhecidos na técnica. A aplicação clínica dos anticorpos no diagnóstico por imagens é revista por Grossman, Η. B., Urol. Clin. North Amer. 13:465-474 (1986)), Unger, E. C. et al., Invest. Radiol. 20:693-700 (1985)), e Khaw, B. A. et al., Science 209:295-297(1980)).

A detecção dos focos de tais anticorpos marcados para detecção pode ser indicativa de um local de inflamação, por exemplo. Em uma modalidade, esse exame é feito removendo-se amostras de tecido ou do sangue e incubando tais amostras na presença dos anticorpos marcados para detecção. Em uma modalidade preferida, esta técnica é feita de um modo não invasivo com o uso da formação de uma imagem magnética, do fluorografia, etc. Tal teste de diagnóstico pode ser empregado em monitorar o sucesso do tratamento das doenças, onde a presença ou a ausência do GM-CSF são um indicador relevante. A presente invenção contempla também o uso de um anticorpo anti-GM-CSF, tal como o aqui descrito para o diagnóstico em uma ambientação ex vivo.

Composições Terapêuticas e Diagnosticas.

Os anticorpos de acordo com a presente invenção podem ser formulados de acordo com métodos conhecidos para preparar composições farmaceuticamente úteis, nas quais um anticorpo de acordo com a presente invenção (incluindo qualquer fragmento funcional do mesmo) é combinado em uma mistura com um veículo carteador farmaceuticamente aceitável. Os veículos adequados e sua formulação são descritos, por exemplo, no REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (18^a ed., Alfonso R. Gennaro, Ed., Easton, PA. Mack Pub. Co., 1990). De modo a dar forma a uma composição farmaceuticamente aceitável adequada para uma administração eficaz, tais composições conterão uma quantidade eficaz de um ou mais dos anticorpos de acordo com a presente invenção, juntamente com uma quantidade adequada de veículo carreador.

As preparações podem ser adequadamente formuladas de modo a fornecerem uma liberação controlada do composto ativo. As preparações de liberação controlada podem ser conseguidas pelo uso de polímeros para complexar ou absorver o anticorpo anti-GM-CSF. A liberação controlada pode ser realizada selecionando-se macromoléculas adequadas (por exemplo, poliésteres, poli (aminoácidos), polivinila, pirrolidona, etileno acetato de vinila, metilcelulose, carboximetilcelulose, ou sulfato de protamina) e a concentração das macromoléculas assim como os métodos da modalidade a fim controlar a liberação. Um outro método possível para 5 controlar a duração da ação através de preparações com liberação controlada deve incorporar o anticorpo anti-GM-CSF em partículas de um material polimérico tal como os poliésteres, os poli (aminoácidos), hidrogéis, o poli (ácido lático) ou os copolímeros do etileno-acetato de vinila. Altemativamente, em vez de incorporar estes agentes em partículas 10 poliméricas, é possível aprisionar esses materiais em microcápsulas preparadas, por exemplo, por técnicas de conservação ou pela polimerização interfacial, por exemplo, utilizando a hidroximetilcelulose ou as microcápsulas de gelatina juntamente com microcápsulas de poli (metacrilato de metila), respectivamente, ou em sistemas coloidais para liberação de droga, 15 por exemplo, em lipossomas, em microesferas de albumina, em microemulsões, em nanopartículas, e em nanocápsulas ou nas macroemulsões. Tais técnicas são divulgadas no Remington’s Pharmaceutical Sciences (1980).

Os compostos podem ser formulados para a administração 20 parenteral por injeção, por exemplo, pela injeção de bolus ou por infusão contínua. As formulações para a injeção podem ser apresentadas na forma de ’dade de dosagem, por exemplo, em ampolas, ou em recipientes de múltipla do. ^xm, com adição de um preservativo. As composições podem tomar vária *mas tais como suspensões, soluções ou emulsões em veículos 25 oleoso xmnsos, e podem conter agentes para formulação tais como agentes de suspensão, estabilizantes e/ou dispersantes. Altemativamente, o componente ativo pode estar na forma de pó para reconstituição com um veículo adequado, por exemplo, água estéril livre de pirogênicos, antes do uso.

As composições podem, se desejável, ser apresentadas em uma embalagem ou um dispositivo de aplicação, que pode conter uma ou mais formas da unidade de dosagem contendo o componente ativo. A embalagem pode, por exemplo, compreender uma folha metálica ou plástica de bolhas, tal como uma embalagem de blister. A embalagem ou um dispositivo de aplicação pode ser acompanhado por instruções para a administração.

A invenção também é compreendida pela referência aos seguintes exemplos de aplicabilidade, com os quais se pretender somente ilustrar e, portanto, não limitar a invenção.

EXEMPLOS.

Exemplo 1: A geração de anticorpos específicos da GM-CSF humana a partir da biblioteca de HuCAL GOLD®.

A. Recuperação do fagomídio, amplificação do fago e purificação.

A biblioteca HuCAL GOLD® foi amplificada em meios 2xYT contendo o cloranfenicol de 34 pg/ml e glicose a 1 % (2x YT-CG). Após a infecção fago auxiliar (VCSM 13) em uma DOeoonm de 0,5 (30 minutos em 37°C sem agitação; 30 minutos em 37°C com agitação a 250 rpm), as células foram centrifugadas (4120 g; 5 minutos; 4°C), ressuspensas em 2xYT / 34 pg/ml de cloranfenicol /50 pg/ml de canamicina / 0,25 mM de IPTG e cultivadas durante a noite a 22°C. Os fagos foram precipitados com PEG a partir do sobrenadante, resuspensos em PBS / glicerol a 20 % e armazenados a -80°C. A amplificação do fago entre duas técnicas de panning foi conduzida como se segue: as células TGI de E. coli na fase midlog foram infectadas com fagos eluídos e semeadas em placas LB ágar suplementadas com 1 % de glicose e 34 pg/ml de cloranfenicol. Após a incubação por uma noite a 30°C, as colônias foram raspadas e usadas para inocular um 2x YT-CG até que uma DO₆₀0nm de 0,5 fosse atingida e fago auxiliar fosse adicionado tal como acima descrito.

B. Técnicas de panning com HuCAL GOLD®.

Para a seleção dos anticorpos que reconhecem o GM-CSF humano, diversas estratégias da técnica de panning foram aplicadas. Em resumo, os anticorpos-fagos da HuCAL GOLD® foram divididos em três agrupamentos compreendendo genes mestres VH diferentes. Esses agrupamentos foram submetidos individualmente ou (a) a técnica de panning em fase sólida sobre a proteína humana do GM-CSF biotiniliada (feita por encomenda por R&D Systems, Minneapolis, MN) revestida diretamente sobre microplacas de 96 poços revestidos com neutravidina (Pierce, Rockford, IL) como um suporte sólido para os três círculos ou (b) a técnica de panning em solução sobre a proteína humana do GM-CSF biotiniliada capturada sobre Dynabeads (Dynal, Oslo, Noruega) revestidas com estreptividina para três círculos.

Detalhadamente, para a técnica de panning sobre GM-CSF biotinilado imobilizado, os poços da placa de neutravidina foram lavados três vezes com 300 μΐ de PBS. O antígeno foi diluído a uma concentração de 3 pg/ml (200 nM) em PBS e 0,1 ml foram revestidos por cada poço por 2h na temperatura ambiente. Após duas etapas de lavagem com 300 μΐ PBS os poços forma incubados com tampão de bloqueio contendo 2x Chemiblocker (Chemicon, Temecula, CA) diluído a 1:1 em PBS.

Antes das seleções, 100 μΐ de fagos da HuCAL GOLD® foram pré-adsorvidos em 100 μΐ solução tampão de bloqueio contendo 0,4 μΐ de Tween20 a 25 % por 0,5 h na temperatura ambiente. Os fagos bloqueados foram transferidos em alíquotas 100 μΐ para os poços de uma placa de neutravidina por 0,5 h na temperatura ambiente. Esta etapa foi repetida duas vezes para a pré-absorção.

Após lavagem (2x 300 μΐ de PBS) da microplaca revestida e bloqueada de neutravidina, 0,1 ml dos fagos pré-adsorvidos foi adicionado aos poços revestidos e incubados por 1,5 h na temperatura ambiente e agitada &

delicadamente. Essa incubação foi seguida por 10 ciclos da lavagem com PBS/ Tween20 a 0,05 % na temperatura ambiente.

Os fagos ligados foram eluídos adicionando 120 μΐ de DTT 20 mM em Tris 10 mM pH 8,0 por poço por 10 minutos na temperatura ambiente. O eluído foi removido e adicionado a 14 ml de TGI de E. coli cultivado até um DO₆₀0nm de 0,6 a 0,8. Os poços foram lavados adicionalmente com 200 μΐ de PBS e esta solução foi adicionada também às células de TGI. A infecção de E. coli com fago foi permitida por 45 minutos a 37°C sem agitação. Adicionalmente, 200 μΐ das células de TG1 cultivadas 10 até uma D0₆oonm de 0,6 a 0,8 foram adicionados aos poços da seleção por 45 minutos a 37°C sem agitação. Essas células de TG1 foram adicionadas a 14 ml da cultura já contendo os fagos da primeira etapa de eluição. Após a centrifugação por 10 minutos em 5000 rpm, as pelotas bacterianas foram cada uma ressuspensas em 500 μΐ do meio 2xYT, semeadas em placas de ágar 15 2xYT-CG e incubadas durante a noite a 30°C. As colônias foram então raspadas das placas e os fagos foram recuperados e amplificados tal como descrito acima.

Os segundos e terceiros círculos da seleção (panning) foram realizados de um modo idêntico ao primeiro círculo da seleção com a única 20 diferença de que as condições de lavagem após a ligação do fago foram mais estringentes. Adicionalmente, no terceiro círculo da seleção, os fagos foram submetidos a uma etapa adicional do pré-adsorção em grânulos revestidos com estreptividina (Dynabeads M-280; Dynal). Os tubos Eppendorf foram bloqueados com a solução da Chemiblocker por uma incubação de 30 25 minutos na temperatura ambiente. De cada agrupamento de fago 0,3 ml foram misturados com uma solução 1:1 com 2x solução da Chemiblocker com 0,05 % de Tween20 e incubados por lh na temperatura ambiente nos tubos Eppendorf bloqueados em um agitador rotativo. Os fagos bloqueados foram transferidos então para tubos Eppendorf recentemente bloqueados e 50 μΐ de * Dynabeads M-280 foram adicionados por outros 30 min para a pré-adsorção. Os grânulos foram removidos usando um dispositivo magnético (Dynal MPCE). As alíquotas de 150 μΐ dos fagos foram transferidas então para as placas de neutravidina para mais uma pré-adsorção tal como nos círculos 1 e 2 (veja acima).

Para a técnica de panning em solução usando GM-CSF biotinilado acoplado a Dynabeads, o seguinte protocolo foi aplicado: Tubos Eppendorf de 1,5 ml foram bloqueados com 1,5 ml de 2xChemiblocker diluídos 1:1 com PBS por uma noite a 4°C. Grânulos magnéticos revestidos 10 com 200 μΐ de estreptividina (Dynabeads M-280; Dynal) foram lavados lx com 200 μΐ PBS e ressuspensos 2m 200 μΐ de IxChemiblocker (diluído lx em PBS). O bloqueio dos grânulos foi realizado dentro dos tubos pré-bloqueados durante uma noite a 4°C. Os fagos diluídos em 500 μΐ PBS para cada condição da técnica de panning foram misturados com 500 μΐ de 15 2xChemiblocker/0,1 % Tween por 1 h na temperatura ambiente (agitador rotativo). A pré-adsorção dos fagos foi realizada duas vezes: o 50 μΐ de grânulos magnéticos bloqueados de estreptividina foram adicionados aos fagos bloqueados e incubados por 30 minutos na temperatura ambiente em um agitador rotativo. Depois da separação dos grânulos através de um 20 dispositivo magnético (Dynal MPC-E) o fago sobrenadante (~ 1 ml) foi transferido para um novo tubo bloqueado e a pré-adsorção foi repetida em 50 μΐ de grânulos bloqueados por 30 minutos. Então, hGM-CSF biotinilado a 200 nM foram adicionados aos fagos bloqueados em um novo tubo bloqueado de 1,5 ml e incubado por 1 h na temperatura ambiente em um agitador 25 rotativo. 100 μΐ de grânulos magnéticos bloqueados de estreptividina foram adicionados a cada agrupamento de fago da técnica de panning e incubados por 10 minutos na temperatura ambiente em um agitador rotativo. O fago ligado ao GM-CSF biotinilado e conseqüentemente imobilizado nos grânulos magnéticos foram coletados com um separador da partícula magnética (Dynal

MPC-E). Os grânulos foram então lavados 7x em PBS/Tween a 0,05 % usando um agitador rotativo, seguido por uma outra lavagem por três vezes com PBS. A eluição do fago do Dynabeads foi realizada adicionando 300 μΐ de DTT 20 mM em Tris/HCl 10 mM em pH 8 a cada tubo por 10 minutos. Os Dynabeads foram removidos pelo separador de partícula magnética e o sobrenadante foi adicionado a 14 ml de uma cultura de E.coli TG1 crescida até uma D0₆oonm de 0,6 a 0,8. Os grânulos foram lavados então uma vez com 200 μΐ PBS e o PBS contendo o fago adicionalmente removido foi acrescentado aos 14 ml da cultura de E.coli TG1.

Após a centrifugação por 10 minutos em 5000 rpm, as pelotas bacterianas foram cada uma ressuspensas em 500 μΐ do meio 2xYT, foram semeadas em placas de ágar de 2xYT-CG e incubadas durante a noite a 30°C. As colônias foram raspadas então das placas e os fagos foram recuperados e amplificados tal como descrito acima.

Os segundos e terceiros círculos da técnica de panning em solução sobre o GM-CSF biotinilado foram realizados de acordo com o protocolo do primeiro círculo com a exceção do aumento da estringência do procedimento de lavagem.

C. Subclonagem de fragmentos Fab selecionados e expressão de fragmentos Fab solúveis.

As inserções codificando o Fab de fagomídios selecionados de HuCAL GOLD® foram subclonados em um vetor de expressão pMORPH®X9_Fab_FH (Fig 5) para facilitar a rápida expressão do Fab solúvel. O DNA dos clones selecionados foi digerido com o Xbal e o EcoRI, cortando desse modo a inserção de codificação do Fab (ompA-VLCL e phoAPhoA-Fd), e clonado no vetor pM0RPH®X9_Fab__FH digerido com Xba/EcoRL O Fabs expressado nestes vetores carrega duas marcações no C terminal (FLAG® e 6xHis, respectivamente) para a detecção e a purificação.

D. Microexpressão de anticorpos HuCAL GOLD® Fab em E.

coli.

As colônias simples do obtidas após subclonagem em pMORPH®X9_Fab_FH foram usadas para inocular os poços de uma microplaca estéril de 96 poços contendo 100 μΐ do meio 2xTY/Cm/l % Glu por poço e cultivado durante uma noite a 37°C. 5 μΐ de cada cultura de E. coli TG1 foram transferidos para uma nova microplaca estéril de 96 poços contendo 100 μΐ do meio 2xTY / Cm / 0,1 % Glu por o poço. As microplacas foram incubadas a 30°C com agitação a 400 rpm em um agitador de microplaca até que as culturas estivessem ligeiramente turvas (aprox. 2 a 4 horas) com uma DO₆₀0nm de 0,5. A essas placas de expressão, foram adicionados 20 μΐ 2xYT / Cm / IPTG 3 mM por poço (concentração final de IPTG 0,5 mM), seladas com fita adesiva permeável a gás e incubadas durante a noite a 30°C com agitação de 400 rpm.

Geração de lisados de células inteiras (extratos BEL).

A cada poço das placas da expressão, foram adicionados 40 μΐ do tampão BEL (2xBBS/EDTA: 24,7 g/1 de ácido bórico, 18,7 g NaCl/1, 1,49 g EDTA/1, pH=8) contendo 2,5 mg/ml de lisozima e incubados por lha 22°C em um agitador de microplaca (400 rpm). Os extratos do BEL foram usados para análise da ligação por ELISA ou por um analisador de BioVeris Mseries® 384 (veja o Exemplo 2).

E. Expressão de anticorpos HuCAL GOLD® Fab em E. coli e purificação.

A expressão dos fragmentos Fab codificados por pMORPH®X9_Fab_FH em células TG1 foi realizada nas culturas em frasco agitador de 1 1 de meio 2xYT suplementadas com 34 pg/ml de cloranfenicol. Após a indução com IPTG 0,5 mM, as células foram cultivadas a 22°C por 16 h. Os extratos de células inteiras das pelotas da célula foram preparados por French Press e por fragmentos Fab isolados por cromatografia de nickel/NTA (Qiagen, Hilden, Alemanha). As concentrações foram determinadas por • espectrometria em UV (Krebs et al., 2001).

Exemplo 2: Identificação de anticorpos específicos de hGMCSF.

Os extratos BEL de clones individuais de E. coli selecionados pelas estratégias acima mencionadas da técnica de panning foram analisados por ELISA ou BioVeris (analisador BioVeris M-series® 384) a fim identificar os clones codificando Fabs específicos de hGM-CSF.

A. Técnicas de Ensaio Imunossorbente de Ligação com Enzimas (ELISA).

I ’ 10 GM-CSF biotinilado humano recombinante (R&D Systems) foi revestido em 1,5 pg/ml de PBS sobre microplacas de Neutravidina por 2h na temperatura ambiente.

Após o revestimento do antígeno os poços foram bloqueados com PBS/0,05 % Tween (PBS-T) com 1 % BSA por 1 h na temperatura 15 ambiente. Após a lavagem dos poços com extrato PBS-T BEL, Hu-CAL® Fab purificado ou IgGs de controle foram diluídos em PBS, adicionado aos poços e incubado por 1 h na temperatura ambiente. Para a detecção dos anticorpos primários, os seguintes anticorpos secundários foram aplicados: fosfatase alcalina conjugada com (AP) e fragmento AffiniPure F(ab')₂, de 20 cabra anti-humano, anti-rato ou anti-rato IgG (Jackson Immuno Research).

Para a detecção de conjugados AP substratos fluorogênicos como AttoPhos (Roche) foram usados de acordo com as instruções do fabricante. Entre todas as etapas de incubação, os poços da microplaca foram lavados com PBS-T três vezes e três vezes após a incubação final com o anticorpo secundário. A 25 fluorescência foi medida em um leitor de microplaca TECAN Spectrafluor.

B. Análise de ligação baseada em electroquimioluminescência (BioVeris) para a detecção da ligação do Fab com GM-CSF nos lisados.

Como alternativa aos experimentos ELISA para a detecção dos anticorpos Fab ligados com GM-CSF nos lisados de E. coli (extratos do

- BEL), a ligação foi analisada em um analisador BioVeris BioVeris MSERIES® 384, Europa, Witney, Oxforfshire, Reino Unido).

Para essa finalidade o extrato BEL foi diluído em pelo menos 1:50 e no máximo em 1:1000 do tampão de ensaio (PBS / 0,05 % Tween20 / 5 0,5 % BSA) para uso na avaliação BioVeris. O GM-CSF biotinilado (R&D

Systems) foi acoplado aos grânulos Dynabeads paramagnéticos revestidos com estreptividina, (Dynal), em uma concentração de 0,1 pg/ml. Por cada poço de uma microplaca de 96 ou 384 poços foram usados 25 μΐ ou 15 μΐ de uma diluição 1:25 da solução de estoque do Dynabead. Os grânulos foram 10 lavados três vezes com o tampão do ensaio antes de adicionar o GM-CSF biotinilado por 30 minutos na temperatura ambiente em um agitador. Os grânulos foram lavados então três vezes com o tampão de ensaio e resuspensos finalmente na solução tampão fresca do ensaio. O (Fab)*2 antihumano (Dianova) foi marcado com rutênio usando o BV-tag® (BioVeris 15 Europa, Witney, Oxfordshire, Reino Unido). Este anticorpo secundário foi adicionado aos grânulos ligados com GM-CSF em uma concentração de 6 pg/ml imediatamente antes do uso. 100 μΐ ou 60 μΐ do extrato diluído do BEL (veja acima) das culturas da expressão do E. coli contendo anticorpos de Fab foram colocados em poços de uma microplaca de 96 ou 384 poços e, 20 respectivamente, 25 μΐ ou 15 μΐ dos grânulos ligados com GM-CSF mais a mistura do anticorpo secundário anti-Fab-BV-tag® foram adicionados em cada poço e incubados por 2h na temperatura ambiente em dispositivo de agitação de microplaca. As placas foram analisadas em um analisador BioVeris M-SERIES® 384.

Depois da análise da seqüência foram identificados setenta e quatro (74) clones únicos que mostraram ligação suficientemente forte (razão sinabruído maior do que 10:1 em ELISA ou 50:1 em BioVeris). Estes clones foram expressos, purificados e testados em ensaios funcionais.

C. Determinação da especificidade molecular e das espécies

753 com reação cruzada dos Fabs anti-hGM-CSF selecionados.

A reatividade cruzada dos anticorpos anti-hGM-CSF foi determinada para os seguintes analíticos: GM-CSF de rato e camundongo, IL3 humana, IL-4 humana, IL-5 humana, IL-13 humana, M-CSF humana (todas da Peprotech, Londres, Reino Unido). Isto foi realizado em um ajuste de captação por ressonância de plasmônio de superfície (Biacore 3000, Upsália, Suécia).

Os chips CM5 (Biacore, Suécia) foram revestidos com 5000 a 6000 RU anti-F(ab)₂ (Dianova, Affinipure Fragmento F(ab)₂ de Cabra Anti IgG Humana, fragmento específico F(ab)₂); 80 pg/ml de tampão acetato 10 mM, pH=4 em todas as 4 células de fluxo, usando padrão EDC-NHS de ligação química com amina. Nas células de fluxo foram capturados de 2 a 4 Fabs específicos do GM-CSF (20 μΐ de Fab 500 nM em uma taxa de fluxo de 5 μΐ/ml, 300 a 400 RU). Após a captura do Fab específico, o tampão foi injetado, para determinar a dissociação da interação anti-Fab/Fab. Em um ciclo seguinte, o fator do crescimento do analito foi injetado (20 μΐ, taxa de fluxo de 20 μΐ/min) em uma faixa de concentração entre 15 nM e 2000 nM para a determinação do sinal específico. Depois disso, o sensograma conseguido do tampão foi manualmente subtraído do sinal específico. Após cada ciclo, as células do fluxo foram regeneradas com HC1 100 mM (5 μΐ).

Sete anticorpos de HuCAL® anti-hGM-CSF incluindo o MOR03684 e o MOR03682 foram testados e se mostraram específicos para GM-CSF humano e não se ligavam a qualquer uma das outras citoquinas ou GM-CSF de rato ou GM-CSF de camundongo. Em contraste o Fab MOR03929 mostrou o reatividade cruzada significativa para o GM-CSF de rato.

Exemplo 3: A identificação dos candidatos Fab do GM-CSF anti-humanos que inibem a interação entre GM-CSF e o receptor alfa do GMCSF.

anticorpos específicos diferentes do hGM-CSF que foram selecionados da biblioteca de HuCAL GOLD® foram testados quanto à potência para inibir a interação entre hGM-CSF e seu receptor. A interação foi testada de dois modos, (i) um sendo um ensaio de proliferação usando a linhagem de células do GM-CSF dependente da TF-1 (Kitamura et al., 1989) e (ii) o outro sendo uma análise FACS com uma linhagem celular recombinante de CHO que expressa a cadeia alfa do receptor do GM-CSF. No ensaio de proliferação de TF-1, a capacidade dos anticorpos anti-GM-CSF de bloquear a interação do GM-CSF com o receptor endógeno do GM-CSF que consiste nas cadeias alfa e beta foi analisado levando à redução na proliferação celular. No ensaio de FACS foi determinada a inibição específica da interação entre o GM-CSF e a cadeia alfa do receptor do GM-CSF.

A. Clonagem e expressão do GM-CSF da macaca mulatta e humano.

O comprimento total do DNAc do GM-CSF da macaca mullata (acesso do GeneBank n°: AY007376) foi sintetizado pela síntese genética (geneART GmbH, Regensburg, Alemanha) e clonado para o vetor pCR-Script-Amp (Stratagene, LaJolla, CA, EUA). Subseqüentemente o cDNA foi clonado no vetor de expressão eucariótica pcDNA3.1 (+) (Invitrogen, Paisley, Reino Unido) produzindo o pcDNA-macGM-CSF. O cDNA do GM-CSF humano (Número de acesso do Genebank NP_000749) foi clonado pela técnica RT-PCR do RNA isolado de lxlO⁷ células de TF-1 usando o kit RNeasy da Qiagen (Hilden, Alemanha). A transcrição reversa foi executada com o kit Superscript!! usando hexâmeros aleatórios (Gibco) seguido da amplificação do cDNA do GM-CSF por PCR. O produto obtido da PCR foi clonado no vetor da expressão pcDNA3.1(+) produzindo pcDNAhuGM-CSF.

As células HEK293 foram transfectadas transientemente respectivamente com estes vetores de expressão usando a lipofectamina t

(Stratagene, LaJolla, EUA). O meio contendo o GM-CSF recombinante secretado de macaco ou humano foi colhido 4 dias após a transfecção.

B. Inibição da proliferação dependente do GM-CSF das células TF-1 pelo Fabs anti-hGM-CSF usando o GM-CSF humano ou de 5 macaco.

As células TF-1 (Kitamura et al., 1989) foram cultivadas de acordo com o protocolo do fornecedor (DSMZ, Bransvique, Alemanha; DSMZ N°. ACC 334). As células de TF-1 foram lavadas duas vezes com o meio RPMI1640 (10 % de FCS) e semeadas então em uma concentração de 2 10 x 10⁵ células/ml em 50 μΐ por poço de uma placa de cultura celular com 96 poços de fundo chato. O GM-CSF recombinante humano (“Leucomax”, ESSEX Pharma, München) a 0,5 ng/ml e em anticorpos de HuCAL® Fab (200 ng/ml a 200 pg/ml diluído em um meio de RPMI1640, 10 % de FCS) foram misturados por 30 minutos e 50 μΐ da mistura foram adicionados às 15 células TF-1, de modo que a concentração final do GM-CSF fosse de 0,25 ng/ml, sem a adição de anticorpos. A máxima proliferação celular (inibição de 0 %) foi medida incubando células TF-1 em um GM-CSF final de concentração de 0,25 ng/ml, sem a adição de anticorpo. A inibição de 100 % de proliferação de TF-1 foi medida pela omissão do GM-CSF do ensaio e 20 mantendo somente as células no meio RPMI1640 (10 % de FCS). As células TF1 foram então incubadas por 72 horas a 37°C com 5 % de CO2 em uma câmara umidifícada. A vitalidade celular foi medida adicionando o reagente de MTT ou de XTT (Roche, Mannheim, Alemanha) de acordo com a recomendação do fabricante. No total, 19 Fab foram identificados mostrando 25 uma inibição significativa da proliferação de TF-1. Os ligantes MOR03682, MOR03684 e MOR03929 mostraram inibição consistente da proliferação das célula TF-1 maior do que 50 % em uma concentração de 2 μΜ. A atividade inibitória não otimizada desses Fabs não foi forte o bastante para determinar uma dose IC50, porque a inibição total não pode ser atingida. Em comparação, os anticorpos monoclonais BVD2-21C11 (BD Biosciences Pharmmgen; Cat#554503) e MAB215 (R&D Systems; Cat#MAB215) foram capazes de inibir inteiramente a proliferação de TF-1.

Adicionalmente, as ligações do MOR03682 e do MOR03684 ao GM-CSF humano nativo foram testadas no ensaio de proliferação de TF-1. Em vez da adição do GM-CSF recombinante humano purificado às células TF-1 foi usado o sobrenadante de células 5637 (DSMZ N°. ACC35) que secretam o GM-CSF humano nativo no meio. De uma curva de resposta de dosagem comparando o efeito do GM-CSF humano recombinante com as diferentes diluições do sobrenadante 5637 foi determinado que o meio continha aproximadamente 5 ng/ml do GM-CSF humano nativo. Pela préincubação do sobrenadante 5637 com Fab MOR03682 ou MOR03684 antiGM-CSF humano a ligação do GM-CFS humano nativo às células TF-1 foi bloqueada de modo que a viabilidade das células fosse reduzida em comparação ao experimento com o GM-CSF humano recombinante. Os MOR03684 e MOR03682 assim, se ligam ao GM-CSF humano nativo. O Fab MOR03929 não foi testado nesse ensaio.

Adicionalmente, a reatividade cruzada ao GM-CSF de macaco foi testada no ensaio de proliferação de TF-1. Em vez de adicionar GM-CSF humano purificado às células TF-1 foi usado um sobrenadante de células HEK293 transfectadas que secretam no meio o GM-CSF recombinante de macaco.

As células TF-1 proliferaram na presença do GM-CSF de macaco contendo o sobrenadante, mas não na presença do sobrenadante das células HEK293 não transfectadas. De uma curva de dosagem de resposta comparando o efeito do GM-CSF humano recombinante com as diferentes diluições do meio HEK-293 foi determinado que do meio de células transfectadas continha aproximadamente 2 pg/ml de GM-CSF de macaco. Pela pré-incubação do sobrenadante do GM-CSF de macaco com o Fab

MOR03682 ou o MOR03684GM-CSF anti-GM-CSF humano a ligação do GM-CSF de macaco às células de TF-1 foi bloqueada de modo que a viabilidade das células fosse significativamente reduzida. Os MOR03682 e MOR03684, assim, fazem reatividade cruzada com GM-CSF de macaco. O Fab MOR03929 não foi testado nesse ensaio.

C. Bloqueio da ligação do GM-CSF ao receptor alfa do GMCSF por Fabs anti-hGM-CSF.

De modo a fim testar a ligação do GM-CSF a um receptor alfa expressado na superfície da célula GM-CSF o cDNA foi clonado em um vetor de expressão e estavelmente transfectado em células CHO-K1 (DSMZ ACC110).

Clonagem de uma linhagem estável de células CHO-K1 que expressam a cadeia alfa do receptor do GM-CSF.

O DNA da cadeia alfa do receptor do GM-CSF humano (Número de Acesso no Genebank M64445) foi clonado pela técnica RT-PCR do RNA isolado de 1x10⁷ células TF-1 usando o kit RNeasy da Qiagen (Hilden, Alemanha). A transcrição reversa foi executada com o kit Superscript!! usando hexâmeros aleatórios (Gibco). O DNA da cadeia alfa do receptor GM-CSF foi amplificado então usando os seguintes iniciadores: 5’:N-GCRa-plusSS:TTCTCTGGATCCGCCACCATGCTTCTCCTGGTGA CA-AGCC e 3':C-flGCRa:ACCCTCCAATTGTCAGGTAATTTCCTTCACGGTC.

A reação de PCR forneceu um produto de aproximadamente 1250 bp que foi digerido com EcoRI e BamHI (BioLabs Nova Inglaterra). O vetor de expressão pcDNA3.1(+) (Invitrogen, Paisley, Reino Unido) foi digerido com as mesmas enzimas. Após a purificação do vetor digerido e do produto de PCR, os fragmentos foram ligados e transformados por eletroporação em células DH10B de E.colL Os clones corretos foram identificados após a preparação do DNA do plasmídeo e do seqüenciamento.

Os clones corretos (pcDNA3.1(+)-GM-CSFRalpha) continham ο comprimento total do alfa cDNA receptor do GM-CSF humano.

As células CHO-K1 foram cultivadas de acordo com o protocolo do fornecedor (DSZM, Bransvique, Alemanha; DSMZ N° ACC110). Para a transfecção as células foram cultivadas até uma confluência de 80 % em uma placa de 6 poços e incubadas com 5 pg de DNA de pcDNA3.1(+)-GM-CSFRalpha misturados com 10 μΐ do reagente Lipofectamina 2000 (Invitrogen). Depois de 48h as células foram alimentadas com 1 mg/ml de G418 (Gibco) e depois de outras 24h foi substituído por outro contendo 2mg/ml de G418. Após duas semanas as células foram semeadas em poços de um disco de cultura de 96 poços. Os clones sozinhos foram cultivados até 5x10⁵ células de cada clone que foram testadas para a expressão do GM-CSFR-alpha pela análise de FACS usando a IgG de murina ΜΑΒΙ006 (Chemicon internacional, Temecula, CA) como anticorpo primário em uma concentração de 1 pg/ml e (R-PE“AffiniPure(Fab’)₂ de cabra anti-IgG de camundongo (Dianova) como o anticorpo secundário em uma diluição de 1:200. Os anticorpos primários e secundários foram incubados com as células por Ih sequencialmente, enquanto as células eram lavadas com a solução tampão de FACS (PBS, FCS 3 %) entre essas etapas. A fluorescência da células coradas foi quantificada no canal FL2 usando um sistema FACSCalibur (Becton Dickinson).

Entre todos os clones analisados o clone CHO-GMRa#ll mostrou a intensidade de fluorescência média mais elevada. Um valor da fluorescência média (valor MFL) de 157 foi determinado para o CHOGMRa#ll (Fig. 6).

Análise de FACS da ligação ao receptor alfa do GM-CSF expressado no CHO-GMRa#l 1:

Antes da adição às células, os anticorpos em concentrações crescentes (de 0,1 pg/ml a 100 pg/ml) foram co-incubados com GM-CSF biotinilado (0,5 pg/ml) na solução tampão de FACS (PBS / 3 % FBS / NaN₃ 0,05 %) por 30 min na temperatura ambiente.

Todos os coramentos foram executados em microplacas de cultura de 96 poços de fundo redondo (Nalge Nunc) com cerca de 1 a 5 x 10⁵ células por poço. 2x10⁵ células CHO-GMRa#ll foram tomadas em 50 μΐ do tampão de FACS contendo anticorpo/GM-CSF e incubadas a 4°C por 1 h. As células foram lavadas então uma vez com 150 μΐ de tampão de FACS/poço e tomadas em 100 μΐ de estreptividina marcada com fícoeritrina (BD Biosciences Pharmingen) que foram diluídas a 1:400 com a solução tampão de FACS. Depois da incubação de 1 h a 4°C nas células foram lavadas duas vezes com o tampão de FACS, ressuspensas em 100 μΐ de tampão de FACS e a ligação do GM-CSF biotinilado foi medida no FACScalibur (Becton Dickinson) através da intensidade da fluorescência FL2 das células. Os valores de IC50 foram determinados pelas curvas de resposta de dose obtidas usando 0 software GraphPad Prism v3.03 aplicando uma regressão não linear de ajuste da curva.

Os anticorpos Fab MOR03682, MOR03684 e MOR03929 mostraram uma inibição significativa da ligação do GM-CSF ao receptor alfa do GM-CSF expressado na superfície da célula.

Exemplo 4: Maturação da afinidade do Fab selecionado pela troca gradativa dos cassetes de CDR.

A. Geração das bibliotecas e da técnica de panning da maturação da afinidade.

De modo a aumentar a afinidade e a atividade inibitória dos fragmentos Fab os clones MOR03682, MOR03684 e MOR03929 anti-GMCSF foram submetidos à maturação da afinidade. Com essa consideração, as regiões de CDR foram otimizadas por mutagênese do cassete usando a mutagênese direcionada do trinucleotídeo (VimekSs et al., 1994; Nagy et al., 2002). A análise da seqüência não revelou nenhuma homologia de seqüência entre os CDRs dos três clones progenitores analisados. As Tabelas 2a e 2b fornecem as seis seqüências CDR dos peptídeos que para os clones progenitores MOR03682, MOR03684 e MOR03929.

Em seguida de descreve resumidamente o protocolo usado para a otimização do Fab. Os fragmentos Fab do vetor de expressão pMORPH®X9Fab_FH foram clonados em um vetor de fagomídio (Patente Americana US N° 6.753.136). Então, duas estratégias diferentes foram aplicadas para otimizar a afinidade e a eficácia do Fabs progenitor.

Primeiramente, uma biblioteca fago do anticorpo Fab foi gerada onde o L-CDR3 de cada progenitor foi substituído por um repertório de seqüências CDR3 individuais com cadeia leve lambda. Em uma segunda biblioteca a região H-CDR2 foi substituída por um repertório de seqüências CDR2 individuais com cadeia pesada.

As bibliotecas da afinidade de maturação foram geradas transformando os clones diversificados no interior das E. coli TOPlOF’(Invitrogen). Os fagos foram preparados tal como descrito no Exemplo IA. Ambas as bibliotecas L-CDR3 de MOR03684 e MOR03682 foram agrupadas e ambas bibliotecas H-CDR2 derivadas de MOR03684 e MOR03682 foram agrupadas, enquanto as bibliotecas L-CDR3 e H-CDR2 derivadas do MOR03929 foram mantidas separadamente durante o procedimento de seleção. AS técnicas de panning foram realizadas sobre o GM-CSF biotinilado em solução para três círculos essencialmente tal como descrito no Exemplo IB e aplicando condições de seleção mais estringentes.

B. Análise por electroquimioluminescência (BioVeris) baseada na ligação para a detecção, nos lisados, do Fab que se liga ao GM-CSF de modo melhorado.

Para a detecção dos anticorpos Fab que se ligam ao GM-CSF em lisados de E. coli (extratos BEL), a ligação foi analisada na estação de trabalho da BioVeris M-384 SERIES® (BioVeris Europa, Witney,

Μ

Oxforfshire, Reino Unido) essencialmente tal como descrito no Exemplo 2B.

Fabs com os valores mais elevados de ECL foram purificados e submetidos à medição da afinidade pela titulação de equilíbrio da solução (TES; Haenel et al, 2005) e a ressonância do plasmônio da superfície (Biacore) (veja o Exemplo 4D).

C. Clonagem-X de VL melhorado (L-CDR3) com o VH melhorado (H-CDR2).

Para uma melhoria adicional da afinidade o H-CDR2 e os LCDR3 independentemente otimizados de Fabs maturados que foram derivados do mesmo clone progenitor foram combinados, porque havia uma probabilidade elevada de que essa combinação levasse a um ganho também na afinidade (Yang et al., 1995; Schier et al., 1996; Chen et al., 1999). Esse procedimento, chamado clonagem-X, foi aplicado para os ligantes que foram derivadas do clone progenitor MOR03929 enquanto os Fabs com afinidades melhoradas foram identificados da biblioteca H-CDR2 e da biblioteca LCDR3. Isso foi realizado pela transferência de cadeias leves inteiras (fragmento Xbal/Sphl) do clone doador otimizado do L-CDR3 otimizado para clone receptor otimizado H-CDR2.

Tabela 3: Combinações da Clonagem-X.

Progenitor	Doador VH		Doador VL	Fab de afinidade melhorada após clonagem-X
MOR03929	MOR04287 MOR04290 MOR04252	X	MOR04302	MOR04350 MOR04354 MOR04357
MOR03682	MOR04283	X	MOR04297	MOR04342

Para os 4 Fabs resultantes o VL e o VH foram seqüenciados para confirmar a transferência do VL correto para a respectiva cadeia principal do vetor H-CDR2 melhorado. A Tabelas 2a e 2b mostram as seqüências das proteínas VH e VL de todos os derivados do MOR03929 e do 3682, que estão listados na Tabela 3.

D. Determinação de afinidades picomolares usando a titulação do equilíbrio da solução (TES) e a ressonância do plasmônio de superfície (Biacore).

Para a determinação de Kd, foram usadas as frações do monômero (pelo menos um conteúdo do monômero de 90 %, analisado pelo SEC analítico; Superdex75, Amersham Pharmacia) do Fab. A determinação baseada da afinidade de electroquimioluminescência (ECL) em solução e a avaliação dos dados foram executadas basicamente tal como descrito por Haenel et al., 2005: Uma quantidade constante de Fab foi equilibrada com concentrações diferentes (série de diluições 5ⁿ) do GM-CSF humano (Leucomax) em solução. O GM-CSF biotinilado humano (R&D Systems) acoplado a grânulos paramagnéticos (M-280 Estreptividina, Dynal) e ao BVTag® (BioVeris Europa, Witney, Oxforfshire, Reino Unido) (Fab)*₂ antihumano marcado (Dianova) foi adicionado e incubado por 15 a 30 minutos. Posteriormente, a concentração de Fab não ligado foi quantificada através da detecção do ECL usando um analisador M-SERIES® 384 (BioVeris Europa).

De acordo com Friguet et al., 1985, foi tomado cuidado para evitar o deslocamento significativo do equilíbrio para a fase sólida durante a detecção.

Usando as condições do ensaio descritas acima foram determinadas as afinidades para o Fabs, e são mostradas na Tabela 4.

A análise cinética do SPR foi executada adicionalmente em chip Fl (Biacore, Suécia) que foi revestido com uma densidade do GM-CSF humano recombinante de — 100 RU (Peprotech) em 10 mM de acetato de sódio pH=4,5 usando o padrão amina EDC-NHS para ligação química. Uma quantidade respectiva de HSA foi imobilizado na célula de fluxo de referência. O PBS (136 mM de NaCl, 2,7 mM de KC1, 10 mM de Na₂HPO4, 1,76 mM de KH₂PO₄, pH=7,4) + 0,005 % de Tween20 foram usados como tampão da corrida. O Fab foi aplicado em uma série de concentrações de 6,3 nM a 200 nM em uma taxa de fluxo de 20 μΐ/min. A fase de associação foi ajustada a 60 s e a fase de dissociação a 120 s (progenitor) ou a até 600 s (afinidade otimizada). A fim monitorar a fase de dissociação sobre um período mais longo, as seguintes condições, basicamente de acordo com Drake et al., (2004), foram usadas: O Fab foi aplicado em uma única concentração de 200 nM; a taxa de fluxo foi ajustada para 100 μΐ/min e a fases de dissociação para de 6000 s a 18.000 s. Com base das taxas extras determinadas sob essas condições de ensaio as afinidade para o Fabs foram estimadas, e estão mostradas na Tabela 4.

Tabela 4: As afinidades dos Fabs anti-hGM-CSF determinadas por Biacore e pela titulação de equilíbrio de solução (TES).

Biacore	TES
MORO	KD(pM)	KD(pM)
3684	6420	16000
4251	70	7,4
3929	4260	2000
4302	174	63,5
4287	nd	17,9
4252	55	6
4290	122	11,1
4350	19	1,1
4354	21	2,8
4357	7	0,4
3682	nd	11406
4283	nd	113
4297	nd	49,2
4342	nd	4,9

E. Determinação das afinidades ao GM-CSF de rato usando a titulação do equilíbrio da solução (TES).

A determinação da afinidade ao GM-CSF de rato foi feita essencialmente tal como descrito no Exemplo 4D usando GM-CSF-rato (Peprotech) como o analito em solução em vez do GM-CSF humano. As afinidades foram calculadas de acordo com Haenel et al (2005). Nesse ensaio a afinidade do Fab MOR04357 ao GM-CSF de rato foi determinada como sendo K_D = 1,0 nM.

Exemplo 5: Caracterização dos Fabs GM-CSF anti-humanos otimizados que inibem a interação entre o GM-CSF e a cadeia alfa do receptor do GM-CSF.

At

A. Ensaio de ligação ao receptor alfa do GM-CSF.

O ensaio de ligação ao receptor do GM-CSF foi executado tal como descrito acima (Exemplo 3C) usando 0,5 pg/ml (35 nM) de GM-CSF biotinilado. A ligação máxima do GM-CSF às células CHO-GMRa#ll (inibição de 0 %) foi medida incubando células em uma concentração final de GM-CSF de 0,5 pg/ml de GM-CSF biotinilado, sem a adição do anticorpo. A inibição de 100 % da ligação do GM-CSF foi medida omitindo o GM-CSF do ensaio. Os valores de IC50 foram determinados das curvas de resposta de dosagem obtidas usando o software GraphPad Prism v3.03 que aplica um ajuste de regressão não linear da curva.

Os Fabs com afinidades melhoradas, o Fabs progenitor e as IgGs monoclonais de referência foram analisados. A Tabela 5 resume os valores de IC50 obtidos nesses ensaios. O percentual de inibição conseguido em uma concentração do anticorpo de 5 pg/ml também é fornecido na Tabela

5.

Tabela 5: Valores de IC₅₀ do Fabs anti-hGM-CSF no ensaio de inibição do receptor.

MORO#	4251	4357	4354	4350	4252	4287	4290	4302	3684	3929	Mab215 21Cll
ICjo (nM)	53	26	26	24	26	25	27	24	>400	35	sem ajuste*	9
% da inibição no anticorpo a 5 ng/ml	-100 %	-75 %	-75 %	-75 %	-75 %	-75 %	-75 %	-75 %	-25 %	-60%	-50%	-100 %

* nenhuma curva de resposta sigmoidal da dose pode se ajustada nesse caso.

Esse ensaio mostrou qualitativamente que os Fabs obtidos da maturação da afinidade e da clonagem-X impedem que o GM-CSF se ligue à cadeia alfa do receptor do GM-CSF, mantendo conseqüentemente o mecanismo de bloqueio de seu Fabs progenitor. O ensaio precisou ser executado com uma concentração de 35 nM (0,5 pg/ml) GM-CSF biotinilado a fim de obter um sinal significativo em FACS. Conseqüentemente um Fab com 17,5 nM (ou 8,75 nM IgG) é teoricamente necessário para bloquear 50 % do GM-CSF, ajustando assim um limite para a determinação dos valores de IC₅₀.

B. Inibição do GM-CSF dependente da proliferação de TF-1 por Fabs antí-hGM-CSF usando GM-CSF humano.

O ensaio de proliferação de TF-1 foi realizado tal como descrito no Exemplo 3B. Foram analisados o Fab com afinidades melhoradas 5 e o Fabs progenitor bem como as IgGs monoclonais de referência. Os valores de IC50 foram determinados das curvas de resposta de dosagem obtidas usando o software GraphPad Prism v3.03 que aplica um ajuste de regressão não linear da curva. A Tabela 6 resume os valores de IC50 obtidos nesses ensaios.

Tabela 6: Valores de IC₅o dos Fabs anti-hGM-CSF e das IgGs de controle no ensaio de proliferação de TF-1.

pq

O CN Ch

CN

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CN

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O Mb ΜΊ

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Em um outro conjunto de experimentos os valores de IC50 no ensaio de proliferação de TF-1 foram determinados para o Fab progenitor MOR03682, seus derivados de afinidade amadurecidos MOR04283, MOR04297 e a variante clonada-X MOR04342. A Tabela 7 resume os valores de IC50 obtidos nesses ensaios.

Tabela 7: Os valores de IC₅₀ do Fabs anti-hGM-CSF no ensaio de proliferação de TF-1.

MORO#	4342	4283	4297	3682
IC50 (pM)	80	17293	13975	>200000

Esses experimentos mostraram as grandes melhorias conseguidas nos valores de IC50 após a maturação de afinidade e a clonagemX. Por exemplo, MOR04357, MOR04350, MOR04354 mostram >2000 vezes melhorados os valores de IC50 comparados a seu MOR03929 progenitor e excede a potência dos B VD2-21C11 e Mab215.

Exemplo 6: Conversão do MORQ4357 para o formato da IgGl humana.

A. Otimização do gene das seqüências do DNA do Fab para a expressão em sistemas de expressão de mamíferos.

Para otimizar o DNA do VH e do VL do MOR04357 para a expressão em genes de mamíferos (por exemplo, o uso da alteração do códon, do conteúdo de GC, etc.) o software GeneOptimizer® da Geneart (Regensburg, Alemanha) foi utilizado para definir tais seqüências otimizadas de VH e de VL do DNA, que foram geneticamente sintetizadas na Geneart (Regensburg, Alemanha) e clonadas nos vetores de pPCR-Script produzindo o 055906pPCR-Script e o 055907pPCR-Script. A SEQ ID N°: 48 mostra a respectiva seqüência da VH, enquanto a SEQ ID N°: 57 mostra a respectiva seqüência da VL.

B. Clonagem do Fab MORQ4357 no formato da IgGl humana e na expressão da IgGl humana.

A fim expressar o comprimento total da imunoglobulina (Ig), fragmentos variáveis do domínio das cadeias pesadas otimizadas (VH) e das cadeias leves otimizadas (VL) do gene foram subclonados a partir dos vetores de pPCR-Script (Exemplo 5a) para as séries do vetor pMORPH®2_h_Ig para IgGl humana. O VH otimizado do códon do MOR04357 foi isolado do 055906pPCR-Script através da digestão via Nhel/VBlpI e inserido no corte do vetor mestre pMorph2_h_IgG com as mesmas enzimas de restrição. Esse vetor já continha uma região constante gama 1 humana. O plasmídeo resultante da expressão foi denominado pMorph2__hJgGlf_MOR04357_co. O VL otimizado do códon do MOR04357 foi isolado do 055907pPCR-Script através da digestão via Nhel/VBlpI e inserido no corte do vetor mestre pMorph2_h_Iglambda2 com as mesmas enzimas de restrição. Esse vetor já continha uma região constante lambda humana. O plasmídeo resultante da expressão foi denominado pM2_h_Iglambda2_MOR04357_co.

C. Expressão e Purificação transientes da IgG humana.

Células eucarióticas HKB11 foram transfectadas com quantidades equimolares das cadeias pesada e leve da IgG do vetor de expressão do DNA. O sobrenadante da cultura de células foi colhido transfecção de 3 a 7 dias depois da transfecção. Após ter ajustado o pH do sobrenadante para 8,0 e da filtração estéril, a solução foi submetida à cromatografia padrão da afinidade da proteína A (rProteinA FF ou MabSelect SURE, da GE Healthcare). O tampão de troca foi realizado com 1 x PBS da Dulbcecco (pH 7,2, Invitrogen) e as amostras foram esterilizadas por filtração (0,2 pm). O MOR04357 IgGl foi dializado contra o 1 x PBS da Dulbcecco (pH 6,5, Invitrogen). A pureza da IgG foi analisada por desnaturação, nas condições de redução do SDS-PAGE ou pela utilização do analisador Agilent BioAnalyzer e no estado nativo por SE-HPLC.

D. Determinação das afinidades picomolares usando a titulação do equilíbrio da solução (TES).

Para a determinação de K_D, foram usadas as frações do monômero (conteúdo de monômero no mínimo de 90 %, analisado por SEC analítica; Superdex75, Amersham Pharmacia) de IgGl. A determinação da afinidade baseada na electroquimioluminescência (ECL) em solução e dos dados da avaliação foram realizados basicamente tal como descrito por Haenel et al., 2005 e tal como descrito no Exemplo 4B. Os valores de K_D para o MOR04357 IgGl contra o GM-CSF recombinante humano foram determinados como sendo de 1,1 pM.

E. Determinação das afinidades ao GM-CSF de rato usando a titulação do equilíbrio da solução (TES).

A determinação da afinidade ao GM-CSF de rato foi feita essencialmente tal como descrito no Exemplo 4D usando a rat-GM-CSF (Peprotech) como o analito da solução em vez do GM-CSF humano. As afinidades foram calculadas de acordo com Haenel et al., (2005). O valor de K_D para o MOR04357 IgGl contra o GM-CSF de rato recombinante foi determinado como sendo de 130 pM.

Exemplo 7: Caracterização da MORQ4357 IgGl derivada do Fabs anti-GM-CSF humano otimizado.

A. Inibição do GM-CSF dependente da proliferação de TF-1 por IgGs anti-hGM-CSF usando o GM-CSF rhesus.

O ensaio de proliferação da TF-1 foi executado tal como descrito no Exemplo 3B. O MOR04357 foi analisado no formato da IgGl e enquanto as IgGs monoclonais de referência do controle eram analisadas. Os valores de IC50 foram determinados das curvas de resposta de dosagem obtidas usando o software GraphPad Prism v3.03 que aplica um ajuste de regressão não linear da curva. A Tabela 8 resume os valores de IC50 obtidos nesses ensaios. Três variantes diferentes do GM-CSF foram usados nesse ensaio: Primeiramente, o GM-CSF humano recombinante em uma concentração de 0,25 ng/ml, produzida em E. coli; em segundo lugar, a cultura do sobrenadante das células HEK293 que foram transientemente transfectadas com o pcDNA-huGM-CSF (veja o Exemplo 3A), contendo o GM-CSF humano recombinante e; em terceiro lugar, a cultura do sobrenadante das células HEK293 que foram transientemente transfectadas com o pcDNA-macGM-CSF (veja o Exemplo 3A), contendo o GM-CSF recombinante do macaca mulatta (rhesus). Para os ensaios de proliferação de TF-1 os sobrenadantes da cultura HEK293 foram usado como uma fonte do GM-CSF respectivo em tais diluições em que as células TF-1 mostraram uma proliferação similar em comparação à proliferação mostrada na concentração definida de 0,25 ng/ml GM-CSF humano recombinante purificado produzido emE. coli.

Tabela 8: Valores de IC₅₀ de MOR04357 IgG e da IgGs de controle no ensaio de proliferação da TF-1.

IC50	(PM):
	GM-CSF humano (E.coli)	GM-CSF humano (HEK293)	GM-CSF macaco (HEK293)
MOR04357 IgGl	48	11	15
21C11	1668	144	128
Mab215	625	54	190

Esse experimento demonstrou as grandes melhorias conseguidas nos valores de IC₅o após a maturação da afinidade e a clonagemX que foram preservados após a conversão do Fab ao formato de IgGl. A IgGl MOR04357 mostrou uma melhoria >2000 vezes nos valores de IC50 comparados ao Fab MOR03929 e excedem a potência do BVD2-21C11 e do Mab215.

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Claims (16)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Anticorpo humano ou humanizado isolado, ou um fragmento Fab ou scFv do mesmo, compreendendo uma região de ligação com antígeno que é específica para o GM-CSF humano, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência H-CDR1, uma sequência H-CDR2 e uma sequência H-CDR3 revelada nas SEQ ID NO: 18, 19 ou 20; e uma sequência L-CDR1, uma sequência L-CDR2 e uma sequência L-CDR3 revelada nas SEQ ID NOs: 38, 39 ou 40.
2. 2. Anticorpo humano ou humanizado, ou um fragmento Fab ou scFv do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, compreendendo uma região de ligação ao antígeno que é específica para o GM-CSF humano, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo humano ou humanizado isolado, ou o fragmento funcional do mesmo, é capaz de (i) bloquear uma interação de 0,5 pg/ml do GM-CSF humano com a cadeia alfa do receptor do GM-CSF humano expressado em aproximadamente 2x10⁵ células CHO-K1 no mínimo em 50% sob as seguintes condições: (a) a concentração da dita cadeia alfa do receptor do GM-CSF humano expressado nas ditas células CHO-K1 é semelhante à concentração da cadeia alfa do receptor do GM-CSF humano expressado em aproximadamente 2x10⁵ células CHO-GMRa#11, e (b) a concentração do dito anticorpo humano ou humanizado isolado, ou do fragmento funcional do mesmo, é de cerca de 5pg/ml; e (ii) neutralizar 0,25 ng/ml do GM-CSF humano em um ensaio de proliferação TF-1 com um valor de IC50 no mínimo cinco vezes mais baixo do que o do anticorpo de referência BVD2-21C11 (BD Biosciences Pharmingen; Cat#554503), e/ou o anticorpo MAB215 (R&D Systems; Cat#MAB215).
3. 3. Anticorpo humano ou humanizado, ou um fragmento Fab ou scFv do mesmo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que compreende uma cadeia pesada variável selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 e SEQ ID NO: 20.

   Petição 870190098140, de 01/10/2019, pág. 8/12
4. 4. Anticorpo humano ou humanizado, ou um fragmento Fab ou scFv do mesmo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que compreende uma cadeia leve variável selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 39; e SEQ ID NO: 40.
5. 5. Anticorpo humano ou humanizado, ou um fragmento Fab ou scFv do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência H-CDR3, uma sequência H-CDR2 e uma sequência H-CDR1 revelada na SEQ ID NO: 20; e uma sequência L-CDR3, uma sequência L-CDR2 e uma sequência L-CDR1 revelada na SEQ ID NO: 40.
6. 6. Anticorpo humano ou humanizado, ou um fragmento Fab ou scFv do mesmo, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que compreende a cadeia pesada variável da SEQ ID NO: 20; e a cadeia leve variável da SEQ ID NO: 40.
7. 7. Anticorpo humano ou humanizado, ou um fragmento Fab ou scFv do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo humano ou humanizado, ou o fragmento funcional do mesmo, possui reação cruzada com o GM-CSF de rato e/ou o GM-CSF de macaco rhesus.
8. 8. Anticorpo humano ou humanizado, ou um fragmento Fab ou scFv do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo, ou fragmento Fab ou scFv do mesmo, é capaz de neutralizar o GM-CSF humano em um ensaio de proliferação de TF-1 com um valor de IC50 pelo menos 10 vezes menor que o anticorpo de referência MAB215 (R&D Systems; Cat#MAB215) e/ou BVD221C11 (BD Biosciences Pharmigen; Cat#554503).
9. 9. Anticorpo humano ou humanizado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de ser um anticorpo humano.

   Petição 870190098140, de 01/10/2019, pág. 9/12
10. 10. Anticorpo humano ou humanizado de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de ser uma IgG.
11. 11. Sequência de ácidos nucleicos, caracterizada pelo fato de que codifica uma região de ligação ao antígeno de um anticorpo humano ou humanizado ou um fragmento funcional do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10;

    em que compreende (i) uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, e SEQ ID NO: 48; ou (ii) uma sequência de ácidos nucleicos que hibridiza sob condições de alta estringência para a fita complementar das sequências das SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10; ou SEQ ID NO: 48, que seja capaz de gerar os peptídeos codificados pelas ditas SEQ ID NOs; ou em que compreende (iii) uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste de SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30 e SEQ ID NO: 57; ou (iv) uma sequência de ácidos nucleicos que hibridiza sob condições de alta estringência para a fita complementar das sequências das SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30; ou SEQ ID NO: 57, que seja capaz de gerar os peptídeos codificados pelas ditas SEQ ID NOs.
12. 12. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de ácidos nucleicos como definida na reivindicação 11.
13. 13. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo humano ou humanizado ou um fragmento funcional como definidos em qualquer uma das reivindicações de 1 a 10, e um veículo ou um excipiente farmaceuticamente aceitável para o mesmo.
14. 14. Uso de um anticorpo humano ou humanizado, ou de um fragmento funcional do mesmo, como definido em qualquer uma das

    Petição 870190098140, de 01/10/2019, pág. 10/12 reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de ser na manufatura de um medicamento para tratar uma condição é uma doença inflamatória.
15. 15. Uso de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a dita doença inflamatória é retirada da lista de artrite reumatoide,

    5 esclerose múltipla, doença de Crohn, psoríase, asma e dermatite atópica.
16. 16. Uso de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a dita doença inflamatória é artrite reumatoide.