RS63551B1 - Poboljšani postupak za proizvodnju crm na visokom nivou - Google Patents

Poboljšani postupak za proizvodnju crm na visokom nivou

Info

Publication number
RS63551B1
RS63551B1 RS20220813A RSP20220813A RS63551B1 RS 63551 B1 RS63551 B1 RS 63551B1 RS 20220813 A RS20220813 A RS 20220813A RS P20220813 A RSP20220813 A RS P20220813A RS 63551 B1 RS63551 B1 RS 63551B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
crm197
acid
amino acids
production
medium
Prior art date
Application number
RS20220813A
Other languages
English (en)
Inventor
Balamurali Masilamani
Rajan Sriraman
Mandar Shirish Dixit
Deviprasanna Chakka
Satyam Naidu Sureddi
Ramesh Venkat Matur
Narender Dev Mantena
Mahima Datla
Original Assignee
Biological E Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biological E Ltd filed Critical Biological E Ltd
Publication of RS63551B1 publication Critical patent/RS63551B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/34—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Corynebacterium (G)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/05—Actinobacteria, e.g. Actinomyces, Streptomyces, Nocardia, Bifidobacterium, Gardnerella, Corynebacterium; Propionibacterium
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1077—Pentosyltransferases (2.4.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Forging (AREA)
  • Manufacture Of Electron Tubes, Discharge Lamp Vessels, Lead-In Wires, And The Like (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

Opis
Oblast pronalaska
[0001] Ovaj pronalazak odnosi se na poboljšani postupak za proizvodnju CRM197sa visokim prinosom uz upotrebu dizajniranog soja Corynebacterium diphtheriae sa povećanim brojem kopija CRM197gena.
Pozadina pronalaska
[0002] CRM197je genetski detoksikovan oblik difteričnog toksina. Jedna mutacija na položaju 52, koja supstituiše glutaminsku kiselinu sa glicinom, prouzrokuje gubitak aktivnosti ADP-riboziltransferaze nativnog toksina. Razjašnjena je strukturna osnova CRM197za nedostatak toksičnosti i ona se naširoko koristi kao proteinski nosač za konjugovane vakcine. CRM197, poput difteričnog toksina, predstavlja jedan polipeptidni lanac od 535 aminokiselina (58,4 KD) koji se sastoji od dveju podjedinica (povezanih disulfidnim mostovima).
[0003] CRM197se koristi kao proteinski nosač u nekoliko odobrenih konjugovanih vakcina kao što su Haemophilus influenza tip b konjugat koji se na tržištu javlja pod trgovačkom markom Hibtiter TM, 13-valentni pneumokokni polisaharidni konjugat koji se na tržištu javlja pod trgovačkom markom PREVNAR 13<®>i slični.
[0004] Ruth M. Drew et al., Bacteriol.1951 Nov; 62 (5): 549-59; otkriva hemijski definisane podloge prikladne za proizvodnju difteričnog toksina visokog titra i rezimira zahteve Corynebacterium diphtheriae, Toronto soja Park-Vilijamsovog br.8 za aminokiselinama. Podloge sadrže aminokiseline koje efikasno zamenjuju komponentu životinjskog porekla tj. kazeinhidrolizat. Aminokiseline uključuju glutaminsku kiselinu, cistin, prolin, triptofan, leucin, valin, metionin i glicin.
[0005] Rappuoli et al; Applied and Environmental Microbiology 1983 Vol.46(3):560-564 otkriva da su neudvojeni dvostruki lizogeni stabilni i da mogu da daju visoke prinose CRM197, do tri puta više od monolizogena.
[0006] R Fass. et al., Applied Microbiology and Biotechnology; April 1995, Volume 43(1): 83-88; otkriva pristup sa veoma gustim rastom za proizvodnju mutiranog difteričnog toksina od dvaju sojeva Corynebacterium diphtheriae: C7 (β) (tox-201, tox-9) i C7 (β)(tox-107). Postupak uključuje upotrebu modifikovane, nedeferizovane podloge za rast koja obezbeđuje brz i veoma gust rast bakterija, i koja, kada se poveže sa istovremenim trošenjem glukoze i železa, poboljšava proizvodnju toksina. Obezbeđen je vazduh obogaćen kiseonikom kako bi se omogućio rast bakterija do ćelijske gustine koja daje apsorbanciju od 70 do 600 nm (15-20 g/L suva materija). Maksimalna koncentracija toksina u supernatantu kulture bila je 150 mg/l.
[0007] Parag P.Nagarkar et al., Journal of Applied Microbiology 2002, 92, 215-220; otkriva obrazac korišćenja aminokiselina tokom rasta Corynebacterium diphtheriae i pokazuje da su od devet ispitivanih aminokiselina samo četiri, to jest cistin, histidin, aspartat i metionin, bile kritične za rast i proizvodnju toksina od strane Corynebacterium diphtheriae.
[0008] Evropski patent br.1849860 B1 otkriva upotrebu proteinskog materijala koji nije životinjskog porekla, kao što su proteini iz zrna soje, semenki pamuka, krompira, itd., kao konstituenta podloge za kultivisanje patogenih bakterija.
[0009] US patent br.6,962,803 B2 otkriva postupak za prečišćavanje difteričnog toksina pomoću fermentacije soja mikroorganizama koji može da proizvede difterični toksin, gde pomenuti postupak obuhvata dodavanje glukoze u rastuću kulturu pri čemu dodavanje glukoze održava rast mikroorganizama efikasnim kako bi podržao proizvodnju difteričnog toksina. Nadalje otkriva da pored izvora ugljenika, postoje drugi minimalni nutritivni zahtevi za rast koji uključuju metale u tragovima, fosfat, izvor azota, obično kazaminokiseline i ekstrakt kvasca.
[0010] Objava US patentne prijave br.2011/0097359 A1 otkriva podloge za kultivisanje soja Corynebacterium diphtheriae radi proizvodnje nivoa difteričnog toksina ili njegovog analoga, pri čemu je podloga suštinski bez proizvoda životinjskog porekla i obuhvata: vodu; izvor ugljenih hidrata; izvor azota; i nekoliko slobodnih aminokiselina u početnoj koncentraciji pri čemu početna koncentracija svake slobodne aminokiseline nije ograničavajuća za nivo proizvodnje difteričnog toksina ili njegovog analoga. Nadalje otkriva da je izvor ugljenih hidrata bez glukoze.
[0011] WO 2006/100108 A1 otkriva proces fermentacije koji obuhvata fazu rasta soja Corynebacterium diphtheriae u podlozi unutar fermentora pod uslovima mešanja dovoljnim za održavanje homogene kulture i ograničenog provetravanja tako da pO2 unutar kulture pada na manje od 4% tokom većeg dela faze fermentacije. Nadalje otkriva da se pH unutar fermentora održava između 7,0 i 7,8 pomoću stepena provetravanja bez potrebe za dodavanjem kiseline ili baze.
[0012] CRM197postupak je obično osetljiv na male promene u komponentama postupka kao i u parametrima postupka. Proizvodnja CRM197iz Corynebacterium diphtheriae izvodi se širom sveta mada sa ograničenim uspehom za komercijalnu realizaciju. Nijedan od navedenih ne pominje otkriveni postupak za proizvodnju CRM197sa visokim prinosima kao što je >150 mg/l uz upotrebu dizajniranog soja Corynebacterium diphtheriae. Pronalazači ovog pronalaska razvili su model metaboličkih tokova za proizvodnju CRM197sa visokim prinosom uz upotrebu dizajniranog soja Corynebacterium diphtheriae.
Predmet pronalaska
[0013] Glavni predmet ovog pronalaska je da obezbedi poboljšani postupak za proizvodnju CRM197na visokom nivou.
[0014] Još jedan predmet ovog pronalaska je da obezbedi poboljšani postupak za proizvodnju CRM197na visokom nivou koji je isplativ i može se koristiti za proizvodnju konjugovanih vakcina.
Kratak sadržaj pronalaska
[0015] Ovaj pronalazak obezbeđuje poboljšani postupak za proizvodnju CRM197sa visokim prinosom uz upotrebu dizajniranog soja Corynebacterium diphtheriae sa povećanim brojem kopija CRM197gena, pri čemu taj postupak obuhvata rast soja u fermentacionoj podlozi koja obuhvata jednu aminokiselinu ili više njih i nema komponente životinjskog porekla.
[0016] Ovaj pronalazak obezbeđuje poboljšani postupak za proizvodnju CRM197pri čemu taj postupak obuhvata kultivisanje dizajniranog soja Corynebacterium diphtheriae sa povećanim brojem kopija CRM197gena u fermentacionoj podlozi koja nema komponente životinjskog porekla i obuhvata više od 10 aminokiselina i dodavanje nutrijenata podlozi.
[0017] Ovaj pronalazak obezbeđuje i poboljšani postupak za proizvodnju CRM197pri čemu taj postupak obuhvata kultivisanje dizajniranog soja Corynebacterium diphtheriae sa povećanim brojem kopija CRM197gena u fermentacionoj podlozi koja nema komponente životinjskog porekla i obuhvata više od 10 aminokiselina i dodavanje nutrijenata na bazi modela metaboličkih tokova podlozi.
Kratak opis nacrta
[0018]
Fig.1- Građenje plazmida koji je označen kao pBE33
Fig.2- Dijagram toka modela balansa metaboličkih tokova.
Detaljan opis pronalaska
[0019] Ovaj pronalazak obezbeđuje poboljšani postupak za proizvodnju CRM197sa visokim prinosom uz upotrebu dizajniranog soja Corynebacterium diphtheriae sa povećanim brojem kopija CRM197gena, pri čemu taj postupak obuhvata rast soja u fermentacionoj podlozi koja obuhvata više od 10 aminokiselina i nema komponente životinjskog porekla.
[0020] Dizajnirani Corynebacterium diphtheriae soj (C7Ep) ovog pronalaska odnosi se na Corynebacterium diphtheriae sa epizomalno postavljenim višestrukim kopijama CRM197gena kog reguliše isti mehanizam kao kod CRM197gena domaćina, a genetsku pozadinu pomenutog soja predstavlja jedan lizogen.
[0021] Aminokiseline korišćene u ovom pronalasku odabrane su iz grupe koju čine alanin, arginin, asparaginska kiselina, cistein, glutaminska kiselina, glutamin, glicin, histidin, izoleucin, leucin, lizin, metionin, fenilalanin, prolin, serin, treonin, triptofan, valin i njegove soli, a svaka aminokiselina se koristi u količini od oko 0,05 do 2 g/l.
[0022] Ispitivan je efekat aminokiselina, vitamina i uslova postupka za proizvodnju CRM197. Utvrđeno je da su određene aminokiseline pokazale negativan efekat na rast bakterija. Međutim, utvrđeno je da se proizvodnja CRM197povećava ukoliko se koristi više od 10 aminokiselina u optimalnoj koncentraciji. Koncentracija aminokiselina je optimizovana pomoću Plaket-Burmanovog dizajna eksperimenata.
[0023] Plaket-Burmanovi dizajni prestavljaju eksperimentalne dizajne za istraživanje zavisnosti neke merene vrednosti od nekoliko nezavisnih varijabli (faktora), na takav način da se varijansa procena tih zavisnosti svede na minimum pomoću ograničenog broja eksperimenata. Rezultati su pokazali da aminokiselina kao što je asparaginska kiselina, glutamin, glicin izoleucin leucin, valin i na temperaturi od 35 do 36 °C ima pozitivan uticaj na sintezu CRM197, a aminokiseline kao što su alanin, izoleucin i na temperaturi od 35 do 36 °C imaju negativan efekat na sintezu CRM197. Nekoliko nivoa Dizajna eksperimenata izvedeni su na različitim koncentracijama kako bi se postigla proizvodnja CRM197na visokom nivou. Upotreba tirozina i asparagina dovela je do smanjenja u celokupnom prinosu CRM197pa samim tim te aminokiseline nisu deo ovog pronalaska.
[0024] U poželjnom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, fermentaciona podloga sadrži kombinaciju fenilalanina, arginina i jedne druge aminokiseline ili više njih pri čemu je količina korišćenog fenilalanina i arginina oko manje od oko 1g/L.
[0025] U poželjnijem načinu ostvarivanja ovog pronalaska, fermentaciona podloga obuhvata kombinaciju fenilalanina, arginina i jedne druge aminokiseline ili više njih pri čemu je količina fenilalanina oko 0,25 do 0,75g/l, a arginina je oko 0,1 do 0,5 g/l.
[0026] Ovaj pronalazak obezbeđuje poboljšani postupak za proizvodnju CRM197uz upotrebu dizajniranog soja Corynebacterium diphtheriae sa povećanim brojem kopija CRM197gena, pri čemu taj postupak obuhvata rast soja u fermentacionoj podlozi koja obuhvata više od 10 aminokiselina, dodavanje vitamina podlozi u opsegu od oko 0,05 do 20 mg po litru, pri čemu ta podloga nema komponente životinjskog porekla.
[0027] U drugom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, fermentacionoj podlozi se tokom kultivisanja kao nutrijenti dodaju aminokiseline, vitamini, elementi u tragovima i slični.
[0028] Različiti nutrijenti koji su u ovom pronalasku korišćeni kao dodaci uključuju vitamine odabrane iz grupe koju čine nikotinska kiselina, tiamin, pantotenska kiselina, biotin, riboflavin, folna kiselina; pimelinska kiselina; fosfat, izvor azota i metali u tragovima i slični, a svaki vitamin se koristi u količini u opsegu od oko 0,05 do 20 mg po litru.
[0029] Fermentaciona podloga korišćena u ovom pronalasku je nedeferizovana i u potpunosti bez komponenata životinjskog porekla. Nadalje, podloga je takođe bez tradicionalnih Leflerovih podloga baziranih na mesu i deferizovanih YC podloga sa niskim sadržajem železa baziranih na kazaminokiselinama. Komponente fermentacione podloge ovog pronalaska obuhvataju ekstrakt kvasca, biljni pepton, kalijumdihidrogenfosfat (KH2PO4), triptofan, glukozu, YC rastvor soli u tragovima.
[0030] U drugom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, sastav podloge za kultivisanje dizajniranog soja Corynebacterium diphtheriae sa povećanim brojem kopija CRM197gena obuhvata baznu fermentacionu podlogu koja obuhvata ekstrakt kvasca, biljni pepton, kalijumdihidrogenfosfat (KH2PO4), triptofan, glukozu, YC rastvor soli u tragovima; jednu aminokiselinu, vitamin, element u tragovima i slično ili više njih.
[0031] Prikladni metali u tragovima uključuju kalijum, magnezijum, kalcijum, hlorid, holin, bakar, mangan, sulfat, cink i slične.
[0032] Ovaj pronalazak obezbeđuje poboljšani postupak za proizvodnju CRM197uz upotrebu dizajniranog soja Corynebacterium diphtheriae sa povećanim brojem kopija CRM197gena, pri čemu taj postupak obuhvata dodavanje nutrijenata na bazi modela metaboličkih tokova fermentacionoj podlozi.
[0033] Model metaboličkih tokova odnosi se na kompletnu mrežu prenosa toplote, prenosa mase, brzine prenosa kiseonika (OTR), brzine unosa kiseonika (OUR) i kinetike prenosa jona pri čemu se OTR održava pomoću mešanja, protivpritska i upumpavanja čistog kiseonika. Taj model je prikazan na Fig.2.
Razvoj modela metaboličkih tokova.
[0034] Ovaj model je napravljen na osnovu onlajn interpretacije podataka akumulacija jona vodonika u postupku kao primarne varijable koje su praćene rastvorenim kiseonikom, pretvaranjem kiseonika u CO2uporedo sa toplotom oslobođenom u tom postupku. Na primer, model funkcioniše na uslovima ograničavanja izvora ugljenika. Taj se izvor ugljenika pulsira, a odgovor se procenjuje u postupku. Na osnovu odgovora izvode se korektivne mere na stvaranju jona vodonika. Potom se uvođenje optimizuje kako bi se dobio stalan pH i rastvoreni kiseonik (DO) i brzina prenosa toplote (Npr. pH od 7,4; rezidualni DO od > 2 do 20; brzina prenosa toplote HTR).
[0035] U jednom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, postupak obuhvata dodavanje glukoze podlozi tokom čitavog procesa fermentacije.
[0036] Ovaj pronalazak ne uključuje upotrebu maltoze kao izvora ugljenika i fazu deferizacije.
[0037] CRM197proizveden prema ovom pronalasku može se koristiti za proizvodnju konjugovanih vakcina kao što su pneumokokni konjugat, tifoidni konjugat, Hib konjugat i slični.
[0038] U još jednom načinu ostvarivanja, ovaj pronalazak obezbeđuje poboljšani postupak za proizvodnju CRM197pri čemu taj postupak obuhvata kultivisanje dizajniranog soja Corynebacterium diphtheriae sa povećanim brojem kopija CRM197gena u fermentacionoj podlozi koja nema komponente životinjskog porekla i obuhvata više od 10 aminokiselina i dodavanje nutrijenata na bazi modela metaboličkih tokova podlozi, pri čemu su te aminokiseline odabrane iz grupe koju čine alanin, arginin, asparaginska kiselina, cistein, glutaminska kiselina, glutamin, glicin, histidin, izoleucin, leucin, lizin, metionin, fenilalanin, prolin, serin, treonin, triptofan, valin i njegove soli.
[0039] U još jednom načinu ostvarivanja, ovaj pronalazak obezbeđuje poboljšani postupak za proizvodnju CRM197pri čemu taj postupak obuhvata kultivisanje dizajniranog soja Corynebacterium diphtheriae sa povećanim brojem kopija CRM197gena u fermentacionoj podlozi koja nema komponente životinjskog porekla i obuhvata više od 10 aminokiselina, pri čemu se svaka aminokiselina koristi u količini od oko 0,05 do 2 g/l.
[0040] U još jednom načinu ostvarivanja, ovaj pronalazak obezbeđuje poboljšani postupak za proizvodnju CRM197pri čemu taj postupak obuhvata kultivisanje dizajniranog soja Corynebacterium diphtheriae sa povećanim brojem kopija CRM197gena u fermentacionoj podlozi koja nema komponente životinjskog porekla i obuhvata više od 10 aminokiselina i dodavanje nutrijenata na bazi modela metaboličkih tokova podlozi, pri čemu se svaka aminokiselina koristi u količini od oko 0,05 do 2 g/l.
[0041] U još jednom načinu ostvarivanja, ovaj pronalazak obezbeđuje poboljšani postupak za proizvodnju CRM197pri čemu taj postupak obuhvata kultivisanje dizajniranog soja Corynebacterium diphtheriae sa povećanim brojem kopija CRM197gena u fermentacionoj podlozi koja nema komponente životinjskog porekla i obuhvata bazne podloge, više od 10 aminokiselina i dodavanje nutrijenata na bazi modela metaboličkih tokova podlozi, pri čemu se svaka aminokiselina koristi u količini od oko 0,05 do 2 g/l.
[0042] U još jednom načinu ostvarivanja, ovaj pronalazak obezbeđuje poboljšani postupak za proizvodnju CRM197pri čemu taj postupak obuhvata kultivisanje dizajniranog soja Corynebacterium diphtheriae sa povećanim brojem kopija CRM197gena u fermentacionoj podlozi koja nema komponente životinjskog porekla i obuhvata više od 10 aminokiselina i dodavanje nutrijenata na bazi modela metaboličkih tokova podlozi, pri čemu su te aminokiseline odabrane iz grupe koju čine alanin, arginin, asparaginska kiselina, cistein, glutaminska kiselina, glutamin, glicin, histidin, izoleucin, leucin, lizin, metionin, fenilalanin, prolin, serin, treonin, triptofan, valin i njegove soli pri čemu se svaka aminokiselina koristi u količini od oko 0,05 do 2 g/l.
[0043] U još jednom načinu ostvarivanja, ovaj pronalazak obezbeđuje poboljšani postupak za proizvodnju CRM197pri čemu taj postupak obuhvata kultivisanje dizajniranog soja Corynebacterium diphtheriae sa povećanim brojem kopija CRM197gena u fermentacionoj podlozi koja nema komponente životinjskog porekla i obuhvata više od 10 aminokiselina, pri čemu su te aminokiseline odabrane iz grupe koju čine alanin, arginin, asparaginska kiselina, cistein, glutaminska kiselina, glutamin, glicin, histidin, izoleucin, leucin, lizin, metionin, fenilalanin, prolin, serin, treonin, triptofan, valin i njegove soli pri čemu se svaka aminokiselina koristi u količini od oko 0,05 do 2 g/l.
[0044] U poželjnom načinu ostvarivanja, ovaj pronalazak obezbeđuje poboljšani postupak za proizvodnju CRM197pri čemu taj postupak obuhvata
i) kultivisanje dizajniranog soja Corynebacterium diphtheriae sa povećanim brojem kopija CRM197gena u fermentacionoj podlozi koja nema komponente životinjskog porekla i obuhvata bazne podloge i više od 10 aminokiselina odabranih iz grupe koju čine alanin, arginin, asparaginska kiselina, cistein, glutaminska kiselina, glutamin, glicin, histidin, izoleucin, leucin, lizin, metionin, fenilalanin, prolin, serin, treonin, triptofan, valin i njegove soli i
ii) dodavanje glukoze i nutrijenata na bazi modela metaboličkih tokova podlozi.
[0045] U još jednom načinu ostvarivanja, temperatura se tokom procesa fermentacije održava u opsegu od 30 do 40 °C, a pH se održava na 7,0 do 8,0, poželjno 7,4 do 7,6 pomoću 20% ortofosforne kiseline, 12,5% amonijumhidroksida. Proces fermentacije se izvodi tokom perioda od 15 do 24 sata, poželjno 16 do 20 sati.
[0046] U jednom načinu ostvarivanja, ovaj pronalazak obezbeđuje fermentacionu kompoziciju i postupak koji je bez tirozina i asparagina. U jednom načinu ostvarivanja, postupak ovog pronalaska je bez deferizovanih YC podloga sa niskim sadržajem železa baziranih na kazaminokiselinama, maltoze kao izvora ugljenika i faze deferizacije.
[0047] Ovaj pronalazak obezbeđuje poboljšani postupak za proizvodnju CRM197pri čemu taj postupak obuhvata kultivisanje dizajniranog soja Corynebacterium diphtheriae sa povećanim brojem kopija CRM197gena u fermentacionoj podlozi koja nema komponente životinjskog porekla i sadrži kombinaciju fenilalanina, arginina u količini od oko manje od Ig/L i jednu drugu aminokiselinu ili više njih.
[0048] U jednom načinu ostvarivanja, ovaj pronalazak obezbeđuje poboljšani postupak za proizvodnju CRM197pri čemu taj postupak obuhvata kultivisanje dizajniranog soja Corynebacterium diphtheriae sa povećanim brojem kopija CRM197gena u fermentacionoj podlozi koja nema komponente životinjskog porekla i obuhvata više od 10 aminokiselina i dodavanje nutrijenata na bazi modela metaboličkih tokova podlozi, pri čemu je prinos dobijenog CRM197veći od 150 mg/L.
[0049] U jednom načinu ostvarivanja, ovaj pronalazak omogućava izradu konjugovane vakcine koja obuhvata konjugovanje polisaharida iz Salmonella typhi, Streptococcus pneumoniae, meningococcus, Haemophilus influenzae sa CRM197pripremljenim prema ovom pronalasku.
[0050] Ovaj pronalazak obezbeđuje poboljšani postupak za proizvodnju CRM197sa visokim prinosom uz upotrebu dizajniranog soja Corynebacterium diphtheriae sa povećanim brojem kopija CRM197gena, pri čemu taj postupak obuhvata rast soja u podlogama bez komponenata životinjskog porekla koje obuhvataju više od 10 aminokiselina i dodavanje nutrijenata na bazi modela metaboličkih tokova podlozi.
[0051] U jednom načinu ostvarivanja, ovaj pronalazak obezbeđuje poboljšani postupak za proizvodnju CRM197sa prinosima kao što su 150mg/L, 200mg/L, 300mg/L, 500mg/L, Ig/L, 1,5g/L, 2 g/L, 2,5g/L, 3g/L, 3,5g/L, 4g/l, 4,5g/L i 5g/L.
[0052] U jednom načinu ostvarivanja, ovaj pronalazak obezbeđuje dizajnirani Corynebacterium diphtheriae soj C7 (β 197) pri čemu je pBE33 plazmid prenet elektroporacijom.
[0053] CRM197proizveden prema ovom pronalasku kvantifikovan je imunohvatajućom imunoenzimskom probom (IC-ELISA).
[0054] Razvoj Dizajniranog soja Corynebacterium diphtheriae sa povećanim brojem kopija CRM197gena na ekspresionom vektorskom plazmidu.
[0055] Corynebacterium diphtheriae C7 (β-197) ATCC 53821, kodiranje gena za CRMi97 postoji kao jedna kopija, a mutantski CRM197protein se luči u podloge za kultivisanje ćelija pod regulacijom železa. Prinos CRM197raste tri puta više u Corynebacterium diphtheriae C7 soju koji ima dve kopije korinefag-beta (ATCC 39255). To upućuje na činjenicu da je broj kopija gena povezan sa povećanom produktivnošću. Kako bi se proizvodnja CRM197iz Corynebacterium diphtheriae učinila komercijalno isplativom, poželjno je povećati nivo ekspresije. Tehnički je izazovno integrisati veći broj kopija u bakterijski genom.
Integranti faga sa više kopija su genetski nestabilni i gube dodatne kopije CRM gena. Pronalazači su nameravali da poboljšaju nivoe ekspresije CRM197povećavanjem kopija gena CRM197dostavljenih na plazmide sa markerom za selekciju antibiotika, uporedo sa nativnim regulatornim elementima CRM197. Prema tome, pronalazači su razvili soj Corynebacterium diphtheriae sa povećanim brojem kopija CRM197gena i procenili stabilnost soja. Modifikovani soj je imao više nivoe ekspresije CRM197u poređenju sa nemodifikovanim Corynebacterium sojevima.
[0056] Ovaj pronalazak je konkretnije prikazan uz pozivanje na primere date u nastavku. Međutim, podrazumeva se da ovaj pronalazak nije ni na koji način ograničen jednim primerom, nego uključuje njegove varijacije unutar ovde opisanih parametara, što je poznato stručnjacima iz ove oblasti.
Primer 1
Poboljšanje ekspresije CRM197epizomalnom kopijom CRM197:
[0057] Pripremljen je vektor koji se može stabilno replikovati u Corynebacterium diphtheriae C7 (β 197). Izolacija Nativnog plazmida iz Corynebacterium C7 diphtheriae izvedena je pomoću protokola za izolaciju velikih plazmida kao što je opisano u T.C Currier et al., Anal Biochem.1976; 76(2): 431441. Pomoću nativnog plazmidnog DNK preparata, amplifikovano je 1,87Kb mesto početka replikacije (oriR).
Istovremeno je pomoću pUC4-KIXX templata DNK i tupog kraja koji je povezan sa oriR amplifikovana 1,033Kb kanR sekvenca kako bi se stvorio pBE30. Nadalje, 2,13 Kb sekvenca gena CRMi97 koja obuhvata region promotora pTox (Boyd et al., 1988), cru i predviđenu terminatorsku sekvencu amplifikovana je iz Corynebacterium diphtheriae C7 (β 197) genomske DNK i klonirana u jedinstveno Spel restrikciono mesto označeno u pBE30. GAG mutacija u tom amplikonu verifikovana je alel specifičnim PCR testom (Pushnova et al., Analytical Biochemistry.1998; 260: 24 do 29) i DNK sekvenciranjem. Tako dobijen plazmid označen je kao pBE33 (Fig.1).
[0058] pBE33 plazmid je prenet elektroporacijom prateći procedure optimizovane za Corynebacterium diphtheriae C7 (β 197). Transformisane Corynebacterium diphtheriae C7 (β 197) (pBE33) kolonije potvrđene su specifičnim kolonskim PCR-om i izolacijom plazmida i restrikcionom digestijom. Ekspresija CRM197u kolonijama analizirana je SDS-PAGE-om i Vestern blotovanjem. CRM197u podlogama kvantifikovan je ELISA-om i HPLC-om i predstavljen je kao koncentracija eksprimovanog CRM197po litru podloge za kultivisanje ćelija.
Primer 2
Proizvodnja CRM197sa dizajniranim Corynebacterium diphtheriae C7Ep sojem na baznoj podlozi - bez komponenata životinjskog porekla.
[0059] Za ovaj postupak korišćen je Corynebacterium diphtheriae C7Ep soj. Dvofazno kultivisanje je praćeno radi pripremanja inokuluma u boci za mućkanje. Podloge za kultivisanje u boci za mućkanje obuhvataju ekstrakt kvasca (YE) 10 g/L, biljni pepton 15g/L, KH2PO44,3g/L, triptofan 50mg/L, glukozu 4,0g/L, nikotinsku kiselinu 0,8 mg/L, pimelinsku kiselinu 0,08 mg/L, CuSO4.5H2O 25 mg/L, ZnSO4.5H2O 12,5 mg/L, MnCl2.4H2O 6,25 mg/L, cistin 0,5 g/L, kanamicin 25 mg/L, glukozu 4,0 g/L.
[0060] U 20 L fermentorske podloge dodat je 5% inokulum kako bi se započeo postupak. Podloga za fermentorsko kultivisanje obuhvata YE 15g/L, biljni pepton 30 g/L, KH2PO44,3g/L, triptofan 50mg/L,
1
nikotinsku kiselinu 0,8 mg/L, pimelinsku kiselinu 0,08 mg/L, CuSO4.5H2O 25 mg/L, ZnSO4.5H2O 12,5 mg/L, MnCl2.4H2O 6,25 mg/L, cistin 0,5 g/L, kanamicin 25mg/L, glukozu 4,0 g/L.
[0061] Kultura je mućkana na 300 O/MIN kroz šaržu. Temperatura je održavana na 35 °C, a pH je održavan na 7,4 pomoću 20% ortofosforne kiseline i 5 N NaOH. Kultura je provetrena pomoću 1,0 wm vazduha. Kultura je obogaćena kiseonikom kako bi se nivo rastvorenog kiseonika (DO) održavao na 20%. Nakon prvih nekoliko sati, DO nivoi nastavljaju da padaju ispod 20% kada se dostigne granica O2obogaćivanja. DO nivo za ostatak šarže ostaje blizu nuli sa porastom ka krajnjim satima. Kada rezidualna glukoza u bujonu padne ispod 0,5 g/L, daje se 40% dopuna glukoze pri 2 g/L/h. Šarža je sakupljena nakon 14 h kultivisanja kada su gustine ćelija dostigle oko 90 jedinica OD 600nm. Pena u reaktoru kontrolisana je 30% organskim sredstvom protiv penušanja. Proizvodnja CRM197dostigla je titar od 60 do 65 mg/L fermentacionog bujona.
[0062] Fermentacija izvedena pod sličnim uslovima pomoću nedizajniranog Corynebacterium diphtheriae C7 CRM197soja proizvela je oko 35 do 40 mg/L CRM197što je manje od dizajniranog soja. To pokazuje uticaj dodatnih kopija gena ka povećanoj proizvodnji CRM197.
Primer 3:
[0063] Proizvodnja CRM197sa dizajniranim Corynebacterium diphtheriae C7Ep sojem na baznim podlogama bez komponenata životinjskog porekla praćenjem modela balansa metaboličkih tokova. Za taj postupak korišćen je Corynebacterium diphtheriae C7Ep soj. Dvofazno kultivisanje praćeno je radi pripremanja inokuluma u boci za mućkanje. Podloge za kultivisanje u boci za mućkanje obuhvataju YE 10 g/L, biljni pepton 15g/L, KH2PO44,3g/L, triptofan 50mg/L, glukozu 4,0g/L nikotinsku kiselinu 0,8 mg/L, pimelinsku kiselinu 0,08 mg/L, CuSO4.5H2O 25 mg/L, ZnSO4.5H2O 12,5 mg/L, MnCl2.4H2O 6,25 mg/L, cistin 0,5 g/L, kanamicin 25mg/L, glukozu 4,0 g/L.
[0064] U 20 L fermentorske podloge dodat je 5% inokulum kako bi se započeo postupak. Podloga za fermentorsko kultivisanje obuhvata YE 15 g/L, biljni pepton 30 g/L, KH2PO44,3g/L, triptofan 50mg/L, nikotinsku kiselinu 0,8 mg/L, pimelinsku kiselinu 0,08 mg/L, CuSO4.5H2O 25 mg/L, ZnSO4.5H2O 12,5 mg/L, MnCl2.4H2O 6,25 mg/L, cistin 0,5 g/L, kanamicin 25mg/L, glukozu 4,0 g/L.
[0065] Kultura je mućkana na 300 O/MIN kroz šaržu. Temperatura je održavana na 35 °C, a pH je održavan na 7,4 pomoću 20% ortofosforne kiseline i 12,5% amonijumhidroksida. Kultura je provetrena pomoću 1,0 wm vazduha. Kultura je obogaćena kiseonikom kako bi se DO nivo održavao na 20%.
Uveden je model koji prati metaboličku brzinu konverzije u datoj tački vremena, pri čemu taj model uzima ulazne podatke iz onlajn parametra rezidualnog DO u vezi sa promenama u odnosu na pH, CO2, stvaranje toplote. U logaritamskoj fazi, DO nivoi nastavljaju da padaju ispod 20% bez obzira na to što je dostignuta granica O2obogaćivanja. DO nivo za ostatak šarže ostaje blizu nuli sa porastom ka krajnjim satima. Kada rezidualna glukoza u bujonu padne ispod 0,5 g/L, uvodi se 40% dopuna glukoze kako bi se potvrdio model metaboličkih tokova. Šarža je sakupljena nakon 14 h kultivisanja kada su gustine ćelija dostigle oko 90 jedinica OD 600nm. Pena u reaktoru kontrolisana je 30% organskim sredstvom protiv penušanja. Proizvodnja CRM197dostigla je titar od 150 mg/L fermentacionog bujona.
Primer 4:
Proizvodnja CRM197prema ovom pronalasku
[0066] Trofazno kultivisanje je praćeno radi pripremanja inokuluma. Prve dve faze izvedene su u bocama za mućkanje. Podloga za kultivisanje u bocama za mućkanje obuhvata YE 10 g/L, biljni pepton 15g/L, KH2PO44,3g/L, triptofan 50mg/L, glukozu 4,0g/L, YC rastvor soli u tragovima 2 ml/L, dodatak cistina 1 ml/L, kanamicin 25mg/L, glukozu 4,0 g/L.
[0067] Sastav bazne podloge za fermentor za zasejavanje bio je YE 15g/L, biljni pepton 30 g/L, KH2PO44,3 g/L, triptofan 50mg/L, nikotinska kiselina 0,8 mg/L, pimelinska kiselina 0,08 mg/L, CuSO4. 5H2O 25 mg/L, ZnSO4.5H2O 12,5 mg/L, MnCl2.4H2O 6,25 mg/L, cistin 0,5 g/L, kanamicin 25mg/L, glukoza 4,0 g/L.
[0068] U nastavku su dati sastav fermentorske podloge (Tabela I) i sastojci koji su dizajnirani prateći Plaket-Burmanov dizajn.
Tabela I
[0069] U 20 L fermentora sa gorepomenutim komponentama sa baznom podlogom (YE 15 g/L, biljni pepton 30 g/L, KH2PO44,3 g/L, triptofan 50 mg/L, nikotinska kiselina 0,8 mg/L, pimelinska kiselina 0,08 mg/L, CuSO4.5H2O 25 mg/L, ZnSO4.5H2O 12,5 mg/L, MnCl2.4H2O 6,25 mg/L, cistin 0,5 g/L, kanamicin 25mg/L, glukoza 4,0 g/L.), dodat je 5% inokulum iz fermentora za zasejavanje kako bi se započeo postupak. Temperatura je održavana na 35 °C, a pH je održavan na 7,4 do 7,6 pomoću 20% ortofosforne kiseline, 12,5% amonijumhidroksida, a model je zasnovan na modulaciji metaboličkih tokova (Fig.2) dopune glukoze i OTR. Kultura je provetrena pomoću 1,0 wm vazduha. Kultura je obogaćena kiseonikom kako bi se DO nivo održavao na 20%. U logaritamskoj fazi, DO nivoi nastavljaju da padaju ispod 20% bez obzira na to što je dostignuta granica O2obogaćivanja. DO nivo za ostatak šarže ostaje blizu nuli sa porastom ka krajnjim satima. Kada rezidualna glukoza u bujonu padne ispod 0,5 g/L, daje se dopuna sa 40% rastvorom glukoze pri 4,5 g/L/h. Vitamini i elementi u tragovima dodavani su intermitentno na sledećim nivoima; nikotinska kiselina 6,425 mg/L, pimelinska kiselina 0,465 mg/L, CuSO4.5H2O 25 mg/L, ZnSO4.5H2O 12,5 mg/L, MnCl2.4H2O 6,25 mg/L, tiamin 0,08 mg/L, pantotenska kiselina 0,25 mg/L, biotin 0,006 mg/L, riboflavin 0,3 mg/L, folna kiselina 0,06 mg/L. Šarža je sakupljena nakon 18 h kultivisanja kada su gustine ćelija dostigle oko 132 jedinice OD 600nm. Pena u reaktoru kontrolisana je 30% organskim sredstvom protiv penušanja. Proizvodnja CRM197dostigla je titar od 450 do 500 mg/L fermentacionog bujona.
1

Claims (15)

Patentni zahtevi
1. Poboljšani postupak za proizvodnju CRM197sa visokim prinosom uz upotrebu dizajniranog soja Corynebacterium diphtheriae sa povećanim brojem kopija CRM197gena, pri čemu taj postupak obuhvata rast soja u nedeferizovanoj fermentacionoj podlozi koja obuhvata više od 10 aminokiselina različitih od tirozina i asparagina i koja nema komponente životinjskog porekla, pri čemu se kao izvor ugljenika ne koristi maltoza.
2. Postupak prema zahtevu 1, pri čemu taj postupak obuhvata dodavanje nutrijenata podlozi.
3. Postupak prema zahtevu 2, pri čemu je dodatak sa nutrijentima baziran na modelu metaboličkih tokova.
4. Postupak prema zahtevu 1, pri čemu su aminokiseline izabrane iz grupe koju čine alanin, arginin, asparaginska kiselina, cistein, glutaminska kiselina, glutamin, glicin, histidin, izoleucin, leucin, lizin, metionin, fenilalanin, prolin, serin, treonin, triptofan, valin i njegove soli.
5. Postupak prema zahtevu 4, pri čemu se svaka aminokiselina koristi u količini od 0,05 do 2 g/l.
6. Postupak prema zahtevu 1, pri čemu fermentaciona podloga sadrži kombinaciju fenilalanina, arginina i drugih aminokiselina pri čemu je količina fenilalanina i arginina manja od 1 g/L.
7. Postupak prema zahtevu 2, pri čemu su nutrijenti izabrani iz grupe koju čine vitamini kao što su nikotinska kiselina, tiamin, pantotenska kiselina, biotin, riboflavin, folna kiselina; pimelinska kiselina; fosfat, izvor azota i metali u tragovima.
8. Postupak prema bilo kom od prethodnih zahteva, pri čemu je fermentaciona podloga u potpunosti bez komponenata životinjskog porekla.
9. Postupak prema bilo kom od prethodnih zahteva, pri čemu fermentaciona podloga obuhvata bazne fermentacione podloge koje obuhvataju ekstrakt kvasca, biljni pepton, kalijumdihidrogenfosfat (KH2PO4), triptofan, glukozu, YC rastvor soli u tragovima.
10. Postupak prema bilo kom od prethodnih zahteva, pri čemu postupak obuhvata dodavanje glukoze podlozi tokom čitavog procesa fermentacije.
11. Poboljšani postupak za proizvodnju CRM197pri čemu taj postupak obuhvata:
i) kultivisanje dizajniranog soja Corynebacterium diphtheriae sa povećanim brojem kopija CRM197gena u nedeferizovanoj fermentacionoj podlozi koja nema komponente životinjskog porekla i obuhvata bazne podloge i više od 10 aminokiselina izabranih iz grupe koju čine alanin, arginin, asparaginska kiselina, cistein, glutaminska kiselina, glutamin, glicin, histidin, izoleucin, leucin, lizin, metionin, fenilalanin, prolin, serin, treonin, triptofan, valin i njegove soli i ii) dodavanje glukoze i nutrijenata na bazi modela metaboličkih tokova podlozi, pri čemu se kao izvor ugljenika ne koristi maltoza.
12. Poboljšani postupak za proizvodnju CRM197, pri čemu taj postupak obuhvata kultivisanje dizajniranog soja Corynebacterium diphtheriae sa povećanim brojem kopija CRM197gena u nedeferizovanoj fermentacionoj podlozi koja nema komponente životinjskog porekla i obuhvata više od 10 aminokiselina različitih od tirozina i asparagina i dodavanje nutrijenata na bazi modela metaboličkih tokova podlozi, pri čemu se svaka aminokiselina koristi u količini od 0,05 do 2 g/l, pri čemu se kao izvor ugljenika ne koristi maltoza.
13. Postupak prema bilo kom od prethodnih zahteva, pri čemu se fermentacija izvodi na temperaturi između 30 do 40 °C i pri pH u opsegu od 7,0 do 8,0, poželjno 7,4 do 7,6.
14. Postupak prema bilo kom od prethodnih zahteva, pri čemu je prinos dobijenog CRM197veći od 150 mg/L, 200 mg/L, 300 mg/L, 500 mg/L.
15. Postupak za proizvodnju konjugovane vakcine koja obuhvata konjugovanje polisaharida iz Salmonella typhi, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae sa CRM197pripremljenim prema bilo kom od prethodnih zahteva.
1
RS20220813A 2017-04-22 2018-04-19 Poboljšani postupak za proizvodnju crm na visokom nivou RS63551B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
IN201741014335 2017-04-22
PCT/IN2018/050235 WO2018193475A2 (en) 2017-04-22 2018-04-19 An improved method for high level production of crm
EP18773868.7A EP3612553B1 (en) 2017-04-22 2018-04-19 An improved method for high level production of crm

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS63551B1 true RS63551B1 (sr) 2022-09-30

Family

ID=63678648

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20220813A RS63551B1 (sr) 2017-04-22 2018-04-19 Poboljšani postupak za proizvodnju crm na visokom nivou

Country Status (31)

Country Link
US (1) US11098089B2 (sr)
EP (1) EP3612553B1 (sr)
JP (1) JP7161493B2 (sr)
KR (1) KR102637436B1 (sr)
CN (1) CN110741013B (sr)
AU (1) AU2018255959B2 (sr)
BR (1) BR112019022093A2 (sr)
CL (1) CL2019003003A1 (sr)
CO (1) CO2019011643A2 (sr)
CU (1) CU24668B1 (sr)
CY (1) CY1125525T1 (sr)
DK (1) DK3612553T3 (sr)
EA (1) EA201992527A1 (sr)
ES (1) ES2926535T3 (sr)
HR (1) HRP20221060T1 (sr)
HU (1) HUE059629T2 (sr)
IL (1) IL270075B2 (sr)
LT (1) LT3612553T (sr)
MX (1) MX2019012563A (sr)
MY (1) MY194242A (sr)
PH (1) PH12019550214A1 (sr)
PL (1) PL3612553T3 (sr)
PT (1) PT3612553T (sr)
RS (1) RS63551B1 (sr)
SA (1) SA519410306B1 (sr)
SG (1) SG11201909765XA (sr)
SI (1) SI3612553T1 (sr)
SM (1) SMT202200356T1 (sr)
UA (1) UA127497C2 (sr)
WO (1) WO2018193475A2 (sr)
ZA (1) ZA201906270B (sr)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX2021003358A (es) 2018-09-23 2021-05-27 Biological E Ltd Polisacaridos capsulares purificados de streptococcus pneumoniae.
CN113755380A (zh) * 2021-09-23 2021-12-07 艾美卫信生物药业（浙江）有限公司 一种发酵生产白喉毒素crm197蛋白的菌种培养基、配制方法以及菌种复苏培养方法
CN115058474B (zh) * 2022-05-23 2025-02-14 艾美坚持生物制药有限公司 一种提高crm197蛋白产量的发酵培养方法
USD1055994S1 (en) 2023-01-02 2024-12-31 Samsung Electronics Co., Ltd. Refrigerator
CN119716089B (zh) * 2024-12-27 2025-12-09 浙江毓昌生物技术有限公司 一种基于高表达的crm197蛋白特异性中和检测方法

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE280235T1 (de) 1993-03-05 2004-11-15 Wyeth Corp Plasmid zur herstellung von crm-protein und diphtherie-toxin
DE69838383T2 (de) 1997-05-28 2008-06-05 Novartis Vaccines And Diagnostics S.R.L. Kulturmedium mit sojabohnenextrakt als aminosäuren-quelle und ohne proteinkomplexe tierischen ursprungs
US20040087020A1 (en) 1997-05-28 2004-05-06 Chiron S.P.A. Culture medium with yeast or soy bean extract as amino acid source and no protein complexes of animal origin
GB9904582D0 (en) 1999-02-26 1999-04-21 Nycomed Imaging As Process
US20110097359A1 (en) 2003-12-12 2011-04-28 Tim Lee Production of diphtheria toxin
GB0505996D0 (en) 2005-03-23 2005-04-27 Glaxosmithkline Biolog Sa Fermentation process
AU2010201410B2 (en) 2010-03-30 2015-04-30 Pelican Technology Holdings, Inc. High level expression of recombinant CRM197
GB2495341B (en) 2011-11-11 2013-09-18 Novartis Ag Fermentation methods and their products
FR2992656B1 (fr) * 2012-07-02 2016-10-07 Sanofi Pasteur Procede de production d'antigenes haemophilus influenzae type b
ITMI20130142A1 (it) * 2013-01-31 2014-08-01 Biosynth Srl Vaccini glicoconiugati comprendenti unita' di base di un costrutto molecolare esprimente epitopi multipli incorporati
WO2015134402A1 (en) * 2014-03-03 2015-09-11 Scarab Genomics, Llc Enhanced production of recombinant crm197 in e. coli

Also Published As

Publication number Publication date
CU24668B1 (es) 2023-07-12
CL2019003003A1 (es) 2020-02-14
US11098089B2 (en) 2021-08-24
BR112019022093A2 (pt) 2020-05-05
AU2018255959A1 (en) 2019-11-14
WO2018193475A2 (en) 2018-10-25
HRP20221060T1 (hr) 2022-11-11
IL270075A (sr) 2019-12-31
CY1125525T1 (el) 2026-02-25
AU2018255959A8 (en) 2022-02-17
KR102637436B1 (ko) 2024-02-15
CN110741013B (zh) 2023-08-08
EP3612553A2 (en) 2020-02-26
LT3612553T (lt) 2022-09-26
EP3612553B1 (en) 2022-06-08
MY194242A (en) 2022-11-24
ZA201906270B (en) 2020-07-29
JP2020517274A (ja) 2020-06-18
IL270075B1 (en) 2024-02-01
PH12019550214A1 (en) 2020-09-14
SA519410306B1 (ar) 2022-02-02
PT3612553T (pt) 2022-09-08
PL3612553T3 (pl) 2022-11-07
AU2018255959B2 (en) 2022-02-17
SG11201909765XA (en) 2019-11-28
US20200277341A1 (en) 2020-09-03
CO2019011643A2 (es) 2020-01-17
ES2926535T3 (es) 2022-10-26
DK3612553T3 (da) 2022-08-29
EA201992527A1 (ru) 2020-02-28
CU20190083A7 (es) 2020-10-20
HUE059629T2 (hu) 2022-12-28
CN110741013A (zh) 2020-01-31
WO2018193475A3 (en) 2018-12-27
SI3612553T1 (sl) 2022-11-30
MX2019012563A (es) 2019-12-02
IL270075B2 (en) 2024-06-01
JP7161493B2 (ja) 2022-10-26
SMT202200356T1 (it) 2022-11-18
CA3060723A1 (en) 2018-10-25
KR20200010218A (ko) 2020-01-30
NZ758483A (en) 2024-10-25
UA127497C2 (uk) 2023-09-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RS63551B1 (sr) Poboljšani postupak za proizvodnju crm na visokom nivou
JP5966016B2 (ja) Ｌ−アミノ酸及びリボフラビンを同時に生産する微生物及びそれを用いたｌ−アミノ酸及びリボフラビンの生産方法
JP4427878B2 (ja) 析出を伴う発酵法によるｌ−グルタミン酸の製造法
TWI583790B (zh) 具有產生ｌ－精胺酸能力的棒狀桿菌屬微生物及使用該微生物產生ｌ－精胺酸的方法
JP4599726B2 (ja) Ｌ−グルタミン酸の製造法
CN107034250A (zh) 谷氨酸类l‑氨基酸的制造方法
TWI736816B (zh) 產生ｌ-精胺酸之棒狀桿菌屬之微生物及使用該微生物產生ｌ-精胺酸之方法
BRPI0717476A2 (pt) Produção de etanol
TW201718863A (zh) 用於製造腐胺或鳥胺酸的微生物及使用該微生物用於製造腐胺或鳥胺酸的方法
CN103497979B (zh) 用于改良生产天冬氨酸衍生的氨基酸及化学品的改变的乙醛酸支路
TW202100749A (zh) 製造ｌ－胺基酸的微生物及使用該微生物製造ｌ－胺基酸的方法
WO2017213142A1 (ja) ヒポタウリンまたはタウリンの製造法
CN101198702B (zh) 产生l-苏氨酸的方法
CN105980544B (zh) 生产l-氨基酸的微生物及使用所述微生物生产l-氨基酸的方法
JP2010161970A (ja) Ｌ−グルタミン酸生産菌及びｌ−グルタミン酸の製造方法
CN105980545B (zh) 具有增强的l-氨基酸生产能力的微生物和使用该微生物生产l-氨基酸的方法
CN105670982A (zh) 重组菌株及其构建方法、应用
CN106701649A (zh) 生产l‑谷氨酰胺的菌株和生产l‑谷氨酰胺的方法
CN101128479B (zh) 可在肠杆菌科中自主复制的新质粒
CA3060723C (en) An improved method for high level production of crm197
EA045614B1 (ru) Улучшенный способ крупномасштабного производства crm197
OA20586A (en) An improved method for high level production of CRM
WO2024162450A1 (ja) Ｌ－グルタミン酸の製造法