RS63610B1 - Oligomerni konjugati za preskakanje egzona za mišićnu distrofiju - Google Patents

Oligomerni konjugati za preskakanje egzona za mišićnu distrofiju

Info

Publication number
RS63610B1
RS63610B1 RS20220837A RSP20220837A RS63610B1 RS 63610 B1 RS63610 B1 RS 63610B1 RS 20220837 A RS20220837 A RS 20220837A RS P20220837 A RSP20220837 A RS P20220837A RS 63610 B1 RS63610 B1 RS 63610B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
exon
dystrophin
antisense
skipping
antisense oligomeric
Prior art date
Application number
RS20220837A
Other languages
English (en)
Inventor
Marco A Passini
Gunnar J Hanson
Original Assignee
Sarepta Therapeutics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sarepta Therapeutics Inc filed Critical Sarepta Therapeutics Inc
Publication of RS63610B1 publication Critical patent/RS63610B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/712—Nucleic acids or oligonucleotides having modified sugars, i.e. other than ribose or 2'-deoxyribose
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7125—Nucleic acids or oligonucleotides having modified internucleoside linkage, i.e. other than 3'-5' phosphodiesters
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/645—Polycationic or polyanionic oligopeptides, polypeptides or polyamino acids, e.g. polylysine, polyarginine, polyglutamic acid or peptide TAT
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C12N2310/111—Antisense spanning the whole gene, or a large part of it

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

Opis
POVEZANE INFORMACIJE
[0001] Ova prijava patenta zahteva korist od SAD Privremene prijave patenta serijski broj 62/436182, podnete 19. decembra 2016. godine, SAD Privremene prijave patenta serijski broj 62/443476, podnete 6. januara 2017. godine, SAD Privremene prijave patenta serijski broj 62/479173, podnete 30. marta 2017. godine, i SAD Privremene prijave patenta serijski broj 62/562080, podnete 22. septembra 2017. godine.
OBLAST PRONALASKA
[0002] Ovo obelodanjivanje se odnosi na nove antisens oligomerne konjugate pogodne za preskakanje egzona 51 u humanom distrofin genu i njihove farmaceutske sastave.
Obelodanjivanje takođe pruža antisens oligomerne konjugate i njihove sastave za upotrebu u indukovanju preskakanja egzona 51, stvaranju distrofina u ispitaniku koji ima mutaciju gena distrofina koji je podložan preskakanju egzona 51 i tretiranju ispitanika koji ima mutaciju gena distrofina koji je podložan preskakanju egzona 51.
STANJE TEHNIKE
[0003] Antisens tehnologije se razvijaju koristeći niz hemikalija kako bi uticale na ekspresiju gena na različitim nivoima (transkripcija, prekrajanje (splajsing), stabilizovanje, translacija). Veći deo tog istraživanja se fokusirao na upotrebu antisens jedinjenja za korigovanje ili kompenzaciju nenormalnih ili gena povezanih sa oboljenjem u širokom spektru indikacija. Antisens molekuli su u stanju da inhibiraju ekspresiju gena sa specifičnošću, i zbog toga, mnogi istraživački napori koji se tiču oligomera kao modulatora ekspresije gena su se fokusirali na inhibiciju ekspresije ciljanih gena ili funkcije cis-delujućih elemenata. Antisens oligomeri su obično usmereni protiv RNK, bilo sens lanca (npr., iRNK), ili minus-lanca u slučaju nekih virusnih RNK ciljeva. Da bi se postigao željeni efekat specifične negativne regulacije gena, oligomeri generalno ili promovišu raspad ciljane iRNK, blokiraju translaciju iRNK ili blokiraju funkciju cis-delujućih RNK elemenata, čime se efektivno sprečava ili de novo sinteza ciljnog proteina ili replikacija virusne RNK.
[0004] Međutim, takve tehnike nisu korisne kada je cilj da se pozitivno reguliše proizvodnja nativnog proteina ili da se kompenzuju mutacije koje indukuju prevremeni prekid translacije, kao što su ne-sens ili mutacije pomeranja okvira. U ovim slučajevima, neispravan transkript gena ne bi trebalo podvrgavati ciljanoj degradaciji ili sternoj inhibiciji, tako da antisens oligomerna hemija ne bi trebalo da promoviše ciljni iRNK raspad ili blokira translaciju.
[0005] U raznim genetskim bolestima, efekti mutacija na eventualnu ekspresiju gena mogu se modulisati kroz proces ciljanog preskakanja egzona tokom procesa prekrajanja (splajsing). Proces prekrajanja je usmeren složenim višekomponentnim mehanizmom koji dovodi susedne spojeve egzon-intron u pre-iRNK u neposrednu blizinu i vrši cepanje fosfodiesterskih veza na krajevima introna sa njihovim naknadnim reformiranjem između egzona koji će biti spojeni. Ovaj složen i visoko precizan proces je posredovan motivima sekvenci u pre-iRNK koji su relativno kratki, polukonzervisani RNK segmenti na koje se vezuju različiti faktori nuklearnog spajanja koji su zatim uključeni u reakcije spajanja. Promenom načina na koji mehanizam spajanja čita ili prepoznaje motive koji su uključeni u obradu pre-iRNK, moguće je stvoriti diferencijalno spojene molekule iRNK. Sada je prepoznato da je većina ljudskih gena alternativno spojena tokom normalne ekspresije gena, iako mehanizmi koji su uključeni u to nisu identifikovani. Bennett et al. (SAD patent br.6,210,892) opisuju antisens modulaciju obrade iRNK divljeg tipa pomoću antisens oligomernih analoga koji ne indukuju cepanje ciljne RNK posredovano RNKzom H. Ovo pronalazi korisnost u mogućnosti da generiše alternativno spojene iRNK koje nemaju specifične egzone (videti, npr., kao što je opisano u Sazani, Kole, i dr.2007. godine za generisanje rastvorljivih receptora TNF nadporodice kojima nedostaju egzoni koji kodiraju domene koji obuhvataju membranu).
[0006] U slučajevima kada je normalno funkcionalni protein prerano prekinut zbog mutacija u njemu, pokazalo se da je sredstvo za obnavljanje proizvodnje nekog funkcionalnog proteina putem antisens tehnologije moguće putem intervencije tokom procesa spajanja, i da ako egzoni povezani sa mutacijama koje uzrokuju bolest mogu biti posebno izbrisani iz nekih gena, ponekad se može proizvesti skraćeni proteinski proizvod koji ima slična biološka svojstva nativnog proteina ili ima dovoljnu biološku aktivnost da ublaži bolest izazvanu mutacijama povezanim sa egzonom (videti npr. Sierakowska, Sambade i dr.1996; Wilton, Lloyd et al.1999; van Deutekom, Bremmer-Bout et al.2001; Lu, Mann et al.2003; Aartsma-Rus, Janson et al.2004). Kole et al. (SAD Patent br.: 5,627,274; 5,916,808; 5,976,879; i 5,665,593) obelodanjuju metode borbe protiv aberantnog spajanja koristeći modifikovane antisens oligomerne analoge koji ne promovišu raspadanje ciljane pre-iRNK. Bennett et al. (SAD patent br.6,210,892) opisuju antisens modulaciju obrade iRNK divljeg tipa pomoću antisens oligomernih analoga koji ne indukuju cepanje ciljne RNK posredovano RNKzom H.
[0007] Proces ciljanog preskakanja egzona će verovatno biti posebno koristan u dugim genima gde ima mnogo egzona i introna, gde postoji redundantnost u genetskoj konstituciji egzona ili gde je protein u stanju da funkcioniše bez jednog ili više određenih egzona.
Nastojanja da se preusmeri obrada gena za tretman genetskih bolesti povezanih sa skraćenjima izazvanih mutacijama u različitim genima fokusirana su na upotrebu antisens oligomera koji se: (1) u potpunosti ili delimično preklapaju sa elementima uključenim u proces spajanja; ili (2) vezuju za pre-iRNK u poziciji dovoljno blizu elementa da poremete vezivanje i funkciju faktora spajanja koji bi obično posredovali određenu reakciju spajanja koja se javlja na tom elementu.
[0008] Dišenova mišićna distrofija (DMD) je uzrokovana defektom u ekspresiji protein distrofina. Gen koji kodira protein sadrži 79 egzona rasprostranjenih na više od 2 miliona nukleotida DNK. Svaka egzonska mutacija koja menja okvir čitanja egzona, ili uvodi stop kodon, ili se karakteriše uklanjanjem celog egzona iz okvira ili egzona, ili duplikacijom jednog ili više egzona, ima potencijal da poremeti proizvodnju funkcionalnog distrofina, što rezultira DMD-om
[0009] Utvrđeno je da je manje težak oblik mišićne distrofije, Bekerova mišićna distrofija (BMD), nastala kada mutacija, obično delecija jednog ili više egzona, rezultira ispravnim okvirom čitanja duž celog transkripta distrofina, tako da se translacija iRNK u protein ne prekine pre vremena. Ako spajanje uzvodnih i nizvodnih egzona u obradi mutiranog distrofina pre-iRNK održava ispravan okvir čitanja gena, rezultat je iRNK kodiranje za protein sa kratkom internom delecijom koja zadržava neku aktivnost, što rezultira Bekerovim fenotipom.
[0010] Dugi niz godina je poznato da bi delecije egzona ili egzoni koji ne menjaju okvir čitanja distrofin proteina dovelo do BMD fenotipa, dok bi delecija egzona koje uzrokuje pomeranje okvira dovela do DMD (Monaco, Bertelson i dr.1988). Generalno, mutacije distrofina koje uključuju mutacije tačaka i delecije egzona koje menjaju okvir čitanja i tako prekidaju pravilnu translaciju proteina rezultiraju DMD-om. Takođe treba napomenuti da neki pacijenti sa BMD i DMD imaju delecije egzona koje pokrivaju više egzona.
[0011] O modulaciji prekrajanja (splajsinga) pre-iRNK mutiranog distrofina sa antisens oligoribonukleotidima i in vitro i in vivo objavljeno je u: (videti npr., Matsuo, Masumura et al.
1991; Takeshima, Nishio et al.1995; Pramono, Takeshima et al.1996; Dunckley, Eperon et al. 1997; Dunckley, Manoharan et al.1998; Wilton, Lloyd et al.1999; Mann, Honeyman et al.
2002; Errington, Mann et al.2003).
[0012] Antisens oligomeri su posebno dizajnirani da ciljaju određene regione pre-iRNK, obično egzone da bi indukovali preskakanje mutacije DMD gena, čime se ove mutacije van okvira obnavljaju u okviru kako bi se omogućila proizvodnja interno skraćenog, ali funkcionalnog distrofin proteina. Poznato je da takvi antisens oligomeri ciljaju u potpunosti unutar egzona (tzv. interne sekvence egzona) ili na splajs donorskom ili splajs akceptorskom spoju koji prelazi iz egzona u deo introna.
[0013] Otkriće i razvoj takvih antisens oligomera za DMD bilo je područje prethodnih istraživanja. Ovi razvoji uključuju one iz: (1) the University of Western Australia and Sarepta Therapeutics (nosilac ove prijave): WO 2006/000057; WO 2010/048586; WO 2011/057350; WO 2014/100714; WO 2014/153240; WO 2014/153220; (2) Academisch Ziekenhuis Leiden/Prosensa Technologies (sada BioMarin Pharmaceutical): WO 02/24906; WO 2004/083432; WO 2004/083446; WO 2006/112705; WO 2007/133105; WO 2009/139630; WO 2009/054725; WO 2010/050801; WO 2010/050802; WO 2010/123369; WO 2013/112053; WO 2014/007620; (3) Carolinas Medical Center: WO
2012/109292; (4) Royal Holloway: patenti prijave sa potraživanjem koristi od, i uključujući SAD patente br.61/096,073 i 61/164,978; kao što je US 8,084,601 i US 2017-0204413 (4) JCR Pharmaceuticals and Matsuo: US 6,653,466; patenti i prijave sa potraživanjem koristi od, i uključujući, JP 2000-125448, kao što je US 6,653,467; patenti prijave sa potraživanjem koristi od, i uključujući, JP 2000-256547, kao što je US 6,727,355; WO 2004/048570; (5) Nippon Shinyaku: WO 2012/029986; WO 2013/100190; WO 2015/137409; WO 2015/194520; i (6) Association Institut de Myologie/Universite Pierre et Marie Curie/Universität Bern/Centre national de la Recherche Scientifique/Synthena AG: WO 2010/115993; WO 2013/053928.
[0014] Pored toga, WO 2017/062835 A2 obelodanjuje modifikovane antisens oligomere za tretman Dišenove mišićne distrofije i povezanih poremećaja. Ovde obelodanjeni oligomeri obuhvataju ciljnu sekvencu komplementarnu sa 12 ili više susednih nukleotida u ciljnom regionu koji se sastoji od egzona humane distrofin pre-iRNK i najmanje jedne podjedinice koja je nukleotidni analog koji ima (i) modifikovanu internukleozidnu vezu, (ii) modifikovani šećerni deo ili (iii) kombinaciju prethodno navedenog.
Dokument WO 2014/144978 obelodanjuje metodu za tretiranje Dišenove mišićne distrofije sa PMO antisens oligonukleotidom Eteplirsen.
[0015] Eteplirsen je fosforodiamidat morfolino oligomer (PMO) dizajniran da preskoči egzon 51 gena za humani distrofin kod pacijenata sa DMD koji su podložni preskakanju egzona 51 kako bi se obnovio okvir čitanja i proizveo funkcionalni kraći oblik proteina distrofina.
Uprava za hranu i lekove Sjedinjenih Država (FDA) odobrila je 2016. godine Exondys 51<™>(eteplirsen) za tretman Dišenove mišićne distrofije (DMD) kod pacijenata kod kojih je potvrđena mutacija gena DMD koja je podložna preskakanju egzona 51.
[0016] Otkriće i razvoj antisens oligomera konjugovanih sa ćelijski-penetrirajućim peptidima za DMD je takođe bila oblast istraživanja (videti PCT Publikaciju br. WO 2010/048586; Wu, B. et al., The American Journal of Pathology, Vol.181 (2): 392-400, 2012; Wu, R. et al., Nucleic acid Research, Vol.35 (15): 5182-5191, 2007; Mulders, S. et al., 19th International Congress of the World Muscle Society, Poster Presentation Berlin, October 2014; Bestas, B. et al., The Journal of Clinical Investigation, doi: 10.1172/JCI76175,
2014; Jearawiriyapaisarn, N. et al., Molecular Therapy, Vol.16(9): 1624-1629,
2008; Jearawiriyapaisarn, N. et al., Cardiovascular Research, Vol.85: 444-453,
2010; Moulton, H.M. et al., Biochemical Society Transactions, Vol.35 (4): 826-828, 2007; Jin, H. et al., Molecular Therapy, Vol.19 (7): 1295-1303, 2011; Abes, R. et al., J. Pept. Sci., Vol.14: 455-460, 2008; Lebleu, B. et al., Advanced Drug Delivery Reviews, Vol.60: 517-529, 2008; McClorey, G. et al., Gene Therapy, Vol.13: 1373-1381, 2006; Alter, J. et al., Nature Medicine, Vol.12 (2): 175-177, 2006; i Youngblood, D. et al., American Chemical Society, Bioconjugate Chem., 2007, 18 (1), pp.50-60).
[0017] Peptidi koji prodiru u ćelije (CPP), na primer, peptidni transportni deo bogat argininom, može biti efikasan za povećanje penetracije u ćeliju, na primer, antisens oligomera konjugovanog sa CPP.
[0018] Uprkos ovim naporima, i dalje postoji potreba za poboljšanim antisens oligomerima koji ciljaju egzon 51 i odgovarajuće farmaceutske sastave koji su potencijalno korisni za terapeutske metode za proizvodnju distrofina i tretiranje DMD
SAŽETAK PRONALASKA
[0019] Sadašnje obelodanjivanje pruža antisens oligomerne konjugate formule (IV):
Prekid A Prekid B Prekid C
ili njihovu farmaceutski prihvatljivu so.
[0020] U drugom vidu, obelodanjivanje pruža antisens oligomerne konjugate formule (IVA):
[0021] U drugom vidu, obelodanjivanje pruža farmaceutske sastave koji uključuju antisens oligomerne konjugate obelodanjivanja i farmaceutski prihvatljiv nosač. U nekim otelotvorenjima, farmaceutski prihvatljiv nosač je rastvor fiziološkog rastvora koji uključuje fosfatni pufer.
[0022] U drugom vidu, obelodanjivanje pruža antisens oligomerne konjugate kao što je gore navedeno i njihove sastave za upotrebu u tretiranju Dišenove mišićne distrofije (DMD) kod ispitanika kome je to potrebno, pri čemu ispitanik ima mutaciju gena distrofina koja je podložna preskakanju egzona 51.
[0023] U drugom vidu, obelodanjivanje pruža antisens oligomerne konjugate kao što je gore navedeno i njihove sastave za upotrebu u restauraciji okvira čitanja iRNK kako bi se indukovala proizvodnja distrofina u ispitaniku koji ima mutaciju gena distrofina koja je podložna preskakanju egzona 51. U drugom vidu, obelodanjivanje pruža antisens oligomerne konjugate kao što je gore navedeno i njihove sastave za upotrebu u isključivanju egzona 51 iz distrofin pre-iRNK tokom obrade iRNK u ispitaniku koji ima mutaciju gena distrofina koja je podložna preskakanju egzona 51. U drugom vidu, obelodanjivanje pruža antisens oligomerne konjugate kao što je gore navedeno i njihove sastave za upotrebu u vezivanju egzona 51 distrofina pre-iRNK u ispitaniku sa mutacijom gena distrofina koji je podložan preskakanju egzona 51.
[0024] U drugom vidu, obelodanjivanje pruža antisens oligomerni konjugat ovde obelodanjeni za upotrebu u terapiji. U drugom vidu, obelodanjivanje takođe pruža komplete za tretiranje Dišenove mišićne distrofije (DMD) u ispitaniku kome je to potrebno, pri čemu ispitanik ima mutaciju gena distrofina koji je podložan preskakanju egzona 51, i koji kompleti sadrže najmanje antisens oligomerni konjugat sadašnjeg obelodanjivanja, upakovan u odgovarajući kontejner i uputstvo za njegovu upotrebu.
[0025] Ovi i drugi objekti i karakteristike će biti u potpunosti shvaćeni kada se sledeći detaljan opis obelodanjivanja pročita zajedno sa slikama.
KRATAK OPIS SLIKA
[0026]
Slika 1 prikazuje deo pre-iRNK i zrele iRNK normalnog distrofina.
Slika 2 prikazuje deo pre-iRNK nenormalnog distrofina (primer DMD) i rezultirajućeg nefunkcionalnog, nestabilnog distrofina.
Slika 3 prikazuje eteplirsen, dizajniran da preskoči egzon 51, obnavljanje "u okviru" čitanja pre-iRNK da bi se proizveo interno izbrisani distrofin.
Slika 4 prikazuje trakasti grafikon procenta preskakanja egzona 51 u diferenciranim humanim miocitima od strane PMO#1 i PPMO#1 u različitim koncentracijama 96 časova nakon tretmana, mereno putem RT-PCR.
Slike 5A-5D (nije deo ovog pronalaska) prikazuju reprezentativne slike Western Blot analize u merenju distrofin proteina u kvadricepsu mdx miševa tretiranih sa PMO (PMO4225) ili PPMO (PPMO4225) za različite vremenske tačke [7 dana (5A), 30 dana (5B), 60 dana (5C) i 90 dana (5D)].
Slika 6A (nije deo ovog pronalaska) daje linijski grafikon koji prikazuje procenat distrofina divljeg tipa indukovanog od strane PMO (PMO4225) ili PPMO (PPMO4225) u kvadricepsu mdx miševa tokom 90 dana nakon ubrizgavanja, kako je utvrđeno analizom Western Blot.
Slika 6B (nije deo ovog pronalaska) daje linijski grafikon koji prikazuje procenat preskakanja egzona 23 indukovanog od strane PMO (PMO4225) ili PPMO (PPMO4225) u kvadricepsu mdx miševa tokom 90 dana nakon ubrizgavanja, kako je utvrđeno putem RT-PCR.
Slike 7A-7D (koje nisu deo ovog pronalaska) prikazuju reprezentativne slike Western Blot analize koje mere distrofin protein u dijafragmi mdx miševa tretiranih sa PMO (PMO4225) ili PPMO (PPMO4225) za različite vremenske tačke [7 dana (7A), 30 dana (7B), 60 dana (7C) i 90 dana (7D)].
Slika 8A (nije deo ovog pronalaska) daje linijski grafikon koji prikazuje procenat distrofina divljeg tipa indukovanog od strane PMO (PMO4225) ili PPMO (PPMO4225) u dijafragmi mdx miševa tokom 90 dana nakon ubrizgavanja, kako je utvrđeno analizom Western Blot.
Slika 8B (nije deo ovog pronalaska) daje linijski grafikon koji prikazuje procenat preskakanja egzona 23 indukovanog od strane PMO (PMO4225) ili PPMO (PPMO4225) u dijafragmi mdx miševa tokom 90 dana nakon ubrizgavanja, kako je utvrđeno putem RT-PCR.
Slike 9A-9D (nije deo ovog pronalaska) prikazuju reprezentativne slike Western Blot analize u merenju distrofin proteina u srcu mdx miševa tretiranih sa PMO (PMO4225) ili PPMO (PPMO4225) za različite vremenske tačke [7 dana (9A), 30 dana (9B), 60 dana (9C) i 90 dana (9D)].
Slika 10A (nije deo ovog pronalaska) daje linijski grafikon koji prikazuje procenat distrofina divljeg tipa indukovanog od strane PMO (PMO4225) ili PPMO (PPMO4225) u srcu mdx miševa tokom 90 dana nakon ubrizgavanja, kako je utvrđeno analizom Western Blot.
Slika 10B (nije deo ovog pronalaska) daje linijski grafikon koji prikazuje procenat preskakanja egzona 23 indukovanog od strane PMO (PMO4225) ili PPMO (PPMO4225) u srcu mdx miševa tokom 90 dana nakon ubrizgavanja, kako je utvrđeno putem RT-PCR.
Slika 11 (nije deo ovog pronalaska) daje imunohistohemijsku analizu koja prikazuje distrofin u levom kvadricepsu mdx miša indukovanog od strane PMO (PMO4225) ili PPMO (PPMO4225).
Slika 12 daje linijske grafikone koji prikazuju procenat preskakanja egzona 51 kod nehumanih primata tretiranih sa PMO#1 ili PPMO#1 nedeljno tokom četiri nedelje u različitim dozama. Procenat preskakanja egzona 51 meren je iz uzoraka mišića dijafragme (levo) i kvadricepsa (desno), kako je utvrđeno putem RT-PCR.
1
Slika 13 daje linijske grafikone koji prikazuju procenat preskakanja egzona 51 kod nehumanih primata tretiranih sa PMO#1 ili PPMO #1 nedeljno tokom četiri nedelje u različitim dozama. Procenat preskakanja egzona 51 meren je iz uzoraka mišića srca (levo) i duodenuma (desno), kako je određeno putem RT-PCR.
Slika 14 daje linijske grafikone koji prikazuju procenat preskakanja egzona 51 kod nehumanih primata tretiranih sa PMO#1 ili PPMO #1 nedeljno tokom četiri nedelje u različitim dozama. Procenat preskakanja egzona 51 meren je iz uzoraka mišića bicepsa (levo) i deltoida (desno), kako je određeno putem RT-PCR.
Slika 15 daje linijske grafikone koji prikazuju procenat preskakanja egzona 51 kod nehumanih primata tretiranih sa PMO#1 ili PPMO #1 nedeljno tokom četiri nedelje u različitim dozama. Procenat preskakanja egzona 51 meren je iz uzoraka mišića ezofagusa (levo) i aorte (desno), kako je određeno putem RT-PCR.
Slike 16A-B (koje nisu deo ovog pronalaska) prikazuju reprezentativne slike analize Western Blot u kojima su mereni distrofin proteini u srcu mdx miševa tretiranih sa PMO (PMO4225) ili PPMO (PPMO4225) za različite doze: 40 mg/kg, 80 mg/kg i 120 mg/kg.
Slika 17 (nije deo ovog pronalaska) daje trakasti grafikon koji prikazuje procenat distrofina divljeg tipa indukovanog od strane PMO (PMO4225) ili PPMO (PPMO4225) u srcu mdx miševa kako je utvrđeno Western Blot analizom 30 dana nakon ubrizgavanja u različitim dozama: 40 mg/kg, 80 mg/kg i 120 mg/kg.
Slike 18A-B (koje nisu deo ovog pronalaska) prikazuju reprezentativne slike analize Western Blot u kojima se meri distrofin protein u dijafragmi mdx miševa tretiranih sa PMO (PMO4225) ili PPMO (PPMO4225) za različite doze 40 mg/kg, 80 mg/kg i 120 mg/kg.
Slika 19 (nije deo ovog pronalaska) daje trakasti grafikon koji prikazuje procenat distrofina divljeg tipa indukovanog od strane PMO (PMO4225) ili PPMO (PPMO4225) u dijafragmi mdx miševa, kako je utvrđeno analizom Western Blot 30 dana nakon ubrizgavanja u različitim dozama: 40 mg/kg, 80 mg/kg i 120 mg/kg.
Slike 20A-B (koje nisu deo ovog pronalaska) prikazuju reprezentativne slike analize Western Blot koje mere distrofin protein u kvadricepsu mdx miševa tretiranih sa PMO (PMO4225) ili PPMO (PPMO4225) u različitim dozama: 40 mg/kg, 80 mg/kg i 120 mg/kg.
Slika 21 (nije deo ovog pronalaska) daje trakasti grafikon koji prikazuje procenat distrofina divljeg tipa indukovanog od strane PMO (PMO4225) ili PPMO
(PPMO4225) u kvadricepsu mdx miševa kako je utvrđeno Western Blot analizom 30 dana nakon ubrizgavanja u različitim dozama: 40 mg/kg, 80 mg/kg i 120 mg/kg. Slika 22 daje trakaste grafikone koji prikazuju procenat preskakanja egzona 51 kod ne-humanih primata koji su tretirani jednom dozom od 40 mg/kg PPMO #130 i 60 dana nakon ubrizgavanja. Procenat preskakanja egzona 51 meren je iz uzoraka mišića kvadricepsa, dijafragme, srca i gastrointestinalnog trakta, kako je određeno putem RT-PCR.
Sika 23 daje cikluse kuplovanja koji su izvedeni pomoću Metode B sinteze PMO. Slika 24 (nije deo ovog pronalaska) pruža imunohistohemijsku analizu koja pokazuje distrofin i laminin u mdx mišjoj dijafragmi i srcu indukovane od strane PPMO (PPMO4225) u poređenju sa fiziološkim rastvorom u mdx miševima i miševima divljeg tipa.
Slika 25 prikazuje trakasti grafikon procenta preskakanja egzona 51 u zdravim humanim mioblastima od strane PMO#1 i PPMO#1 u različitim koncentracijama 96 časova nakon tretmana, mereno putem RT-PCR. Trake grešaka predstavljaju srednju vrednost ± SD.
Slika 26 prikazuje trakasti grafikon procenta preskakanja egzona 51 u zdravim humanim miotubama od strane PMO#1 i PPMO#1 u različitim koncentracijama 96 časova nakon tretmana, mereno putem RT-PCR. Trake grešaka predstavljaju srednju vrednost ± SD.
DETALJAN OPIS OBELODANJIVANJA
[0027] Otelotvorenja ovog obelodanjivanja se generalno odnose na poboljšane antisens oligomerne konjugate i njihovu upotrebu, koji su posebno dizajnirani da indukuju preskakanje egzona u genu humanog distrofina. Distrofin igra vitalnu ulogu u funkciji mišića, a razne bolesti vezane za mišiće karakterišu mutirani oblici ovog gena. Stoga, u određenim otelotvorenjima, poboljšani antisens oligomer konjugati opisani u ovom dokumentu indukuju preskakanje egzona u mutiranim oblicima gena humanog distrofina, kao što su mutirani geni distrofina pronađeni u Dišenovoj mišićnoj distrofiji (DMD) i Bekerovoj mišićnoj distrofiji (BMD).
[0028] Zbog događaja prekrajanja aberantne iRNK izazvanih mutacijama, ovi mutirani humani distrofin geni ili eksprimiraju defektan distrofin protein ili uopšte ne eksprimiraju merljivi distrofin, što je stanje koje dovodi do različitih oblika mišićne distrofije. Da bi se popravilo ovo stanje, antisens oligomer konjugati prezentiranog obelodanjivanja hibridizuju se sa odabranim regionima prethodno obrađene iRNK mutiranog gena za humani distrofin, indukuju preskakanje egzona i diferencijalno prekrajanje u toj inače nenormalno spojenoj iRNK distrofina i time omogućavaju mišićnim ćelijama da proizvedu iRNK transkript koji kodira funkcionalni protein distrofin. U nekim otelotvorenjima, rezultirajući protein distrofin nije nužno "divlji" oblik distrofina, već je skraćeni, ali funkcionalni oblik distrofina.
[0029] Povećanjem nivoa funkcionalnog distrofin proteina u mišićnim ćelijama, ova i srodna otelotvorenja su korisna u profilaksi i tretiranju mišićne distrofije, posebno onih oblika mišićne distrofije, kao što su DMD i BMD, koji se odlikuju ekspresijom defektnih distrofin proteina usled spajanja aberantne iRNK. Specifični antisens oligomerni konjugati opisani u ovom dokumentu dodatno obezbeđuju poboljšano ciljanje specifično za distrofin-egzon u odnosu na druge oligomere, i time nude značajne i praktične prednosti u odnosu na alternativne tretmane relevantnih oblika mišićne distrofije.
[0030] Dakle, obelodanjivanje se odnosi na antisens oligomerne konjugate formule (IV)
ili njihovu farmaceutski prihvatljivu so.
[0031] Mesto kaljenja je H51A(+66+95).
1
[0032] Ukoliko nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni izrazi koji se ovde koriste imaju isto značenje kao i oni koje obično razumeju stručnjaci u stanju tehnike kojoj pripada obelodanjivanje. Iako se bilo koje metode i materijali slični ili ekvivalentni onima opisanim u ovom dokumentu mogu koristiti u praksi ili testiranju ovog obelodanjivanja, opisane su poželjne metode i materijali. Za potrebe ovog obelodanjivanja, sledeći izrazi su definisani u nastavku.
I. Definicije
[0033] Pod "oko" podrazumeva se količina, nivo, vrednost, broj, učestalost, procenat, dimenzija, veličina, iznos, težina ili dužina koja varira za čak 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ili 1% na referentnu količinu, nivo, vrednost, broj, učestalost, procenat, dimenziju, veličinu, iznos, težinu ili dužinu.
[0034] "Podložan preskakanju egzona 51" kao što se ovde koristi u odnosu na ispitanika ili pacijenta ima za cilj da uključi ispitanike i pacijente koji imaju jednu ili više mutacija u genu distrofina koje, u odsustvu preskakanja egzona 51 distrofin pre-iRNK, uzrokuju da okvir čitanja bude van okvira, čime se ometa translacija pre-iRNK što dovodi do nemogućnosti ispitanika ili pacijenta da proizvede funkcionalni ili polufunkcionalni distrofin. Primeri mutacija u genu distrofina koje su podložne preskakanju egzona 51 uključuju, npr., mutacije u egzonima 45-50, 47-50, 48-50, 49-50, 50, 52 i 52-63 (Leiden Duchenne baza podataka o mutacijama mišićne distrofije, Leiden University Medical Center, Holandija). Utvrđivanje da li pacijent ima mutaciju u genu distrofina koja je podložna preskakanju egzona je u delokrugu stručnjaka (vidi npr. Aartsma-Rus et al. (2009) Hum Mutat.30:293-299; Gurvich et al. Hum, Mutat. 2009; 30(4) 633-640; i Fletcher et al. (2010) Molecular Therapy 18(6).1218-1223).
[0035] Izraz "oligomer" koji se ovde koristi odnosi se na niz podjedinica povezanih vezama između podjedinica. U određenim slučajevima, izraz "oligomer" se koristi u vezi sa "antisens oligomerom". Za "antisens oligomere", svaka podjedinica se sastoji od: (i) šećera riboze ili njegovog derivata; i (ii) nukleobaze koja je vezana za njih, tako da redosled baznih spojeva formira baznu sekvencu koja je komplementarna sa ciljnom sekvencom u nukleinskoj kiselini (obično RNK) Votson-Krikovim baznim uparivanjem, da formira heterodupleks nukleinska kiselina:oligomer unutar ciljne sekvence uz uslov da se ili podjedinica, veza između podjedinica, ili oboje ne javljaju prirodno. Antisens oligomer je PMO. Ovde su opisana dodatna primerna otelotvorenja.
[0036] Izrazi "komplementarno" i "komplementarnost" odnose se na dva ili više oligomera (tj. svaki se sastoji od nukleobazne sekvence) koji su međusobno povezani po pravilima Votson-Krikovog osnovnog uparivanja. Na primer, nukleobazma sekvenca "T-G-A (5'→ 3')", je komplementarna nukleobaznoj sekvenci "A-C-T (3'→ 5')."Komplementarnost može biti "delimična" u kojoj se manje od svih nukleobaza date nukleobazne sekvence poklapa sa drugom nukleobaznom sekvencom u skladu sa pravilima osnovnog uparivanja. Na primer, u nekim otelotvorenjima, komplementarnost između date nukleobazne sekvence i druge nukleobazne sekvence može biti oko 70%, oko 75%, oko 80%, oko 85%, oko 90% ili oko 95%. Ili, može postojati "potpuna" ili "savršena" (100%) komplementarnost između date nukleobazne sekvence i druge nukleobazne sekvence da bi se nastavio primer. Stepen komplementarnosti između nukleobaznih sekvenci ima značajne efekte na efikasnost i jačinu hibridizacije između sekvenci.
[0037] Izrazi "efikasna količina" i "terapeutski efikasna količina" koriste se ovde naizmenično i odnose se na količinu terapeutskog jedinjenja, kao što je antisens oligomer, koja se daje ispitaniku sisara, bilo kao jedna doza ili kao deo niza doza, što je efikasno da bi se proizveo željeni terapeutski efekat. Za antisens oligomer, ovaj efekat se obično postiže inhibicijom translacije ili prirodnim prekrajanjem odabrane ciljne sekvence, ili proizvodnjom klinički značajne količine distrofina (statistička značajnost).
[0038] U nekim otelotvorenjima, efikasna količina je najmanje 10 mg/kg, ili najmanje 20 mg/kg sastava uključujući antisens oligomer za određeno vreme za tretiranje ispitanika. U nekim otelotvorenjima, efikasna količina je najmanje 20 mg/kg sastava uključujući antisens oligomer kako bi se broj distrofin-pozitivnih vlakana u ispitaniku povećao na najmanje 20% od normale. U određenim otelotvorenjima, efikasna količina je 10 mg/kg, ili najmanje 20 mg/kg sastava, uključujući antisens oligomer za stabilizaciju, održavanje ili poboljšanje hodne pruge od 20% deficita, na primer u 6 MWT (test 6 minuta hodanja), kod pacijenta, u odnosu na zdravog vršnjaka. U različitim otelotvorenjima, efikasna količina je najmanje 10 mg/kg do oko 30 mg/kg, najmanje 20 mg/kg do oko 30 mg/kg, oko 25 mg/kg do oko 30 mg/kg, ili oko 30 mg/kg do oko 50 mg/kg. Kod nekih otelotvorenja efikasna količina je oko 10 mg/kg, oko 20 mg/kg, oko 30 mg/kg ili oko 50 mg/kg. U drugom vidu, efikasna količina je najmanje 10
1
mg/kg, oko 20 mg/kg, oko 25 mg/kg, oko 30 mg/kg, ili oko 30 mg/kg do oko 50 mg/kg, tokom najmanje 24 nedelje, najmanje 36 nedelja, ili najmanje 48 nedelja, da bi se na taj način povećao broj distrofin-pozitivnih vlakana u ispitaniku na najmanje 20%, oko 30%, oko 40%, oko 50%, oko 60%, oko 70%, oko 80%, oko 90%, oko 95% od normale, i stabilizovala ili poboljšala hodna pruga od deficita 20%, na primer u 6 MWT, kod pacijenta u odnosu na zdravog vršnjaka. Kod nekih otelotvorenja, tretiranje povećava broj distrofin-pozitivnih vlakana na 20-60%, ili 30-50% od normalnog kod pacijenta.
[0039] Pod "poboljšati" ili "poboljšavajući" ili "povećati" ili "povećanje" ili "stimulisati" ili "stimulisanje", generalno se odnosi na sposobnost jednog ili više antisens oligomernih konjugata ili farmaceutskih sastava da proizvedu ili izazovu veći fiziološki odgovor (tj. nizvodne efekte) u ćeliji ili ispitaniku, u poređenju sa odgovorom izazvanim ili bez antisens oligomernog konjugata ili kontrolnog jedinjenja. Veći fiziološki odgovor može uključivati povećanu ekspresiju funkcionalnog oblika distrofin proteina ili povećanu biološku aktivnost povezanu sa distrofinom u mišićnom tkivu, između ostalih odgovora koji su vidljivi iz razumevanja u struci i opisa ovde. Takođe se može meriti povećana mišićna funkcija, uključujući povećanje ili poboljšanje mišićne funkcije za oko 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ili 100%. Takođe se može izmeriti procenat mišićnih vlakana koja eksprimiraju funkcionalni distrofin, uključujući povećanu ekspresiju distrofina kod oko 1%, 2%, 5%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ili 100% mišićnih vlakana. Na primer, pokazalo se da oko 40% poboljšanja mišićne funkcije može nastati ako 25-30% vlakana eksprimira distrofin (videti, npr. DelloRusso et al, Proc Natl Acad Sci USA 99: 12979-12984, 2002). "Povećani" ili "uvećani" iznos je obično "statistički značajan" iznos, i može uključivati povećanje koje je 1,1, 1,2, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50 ili više puta (npr. 500, 1000 puta, uključujući sve cele brojeve i decimalne tačke između i iznad 1), npr.1,5, 1,6, 1,7, 1,8 itd.) količina proizvedena bez antisens oligomernog konjugata (odsustvo agensa) ili kontrolnog jedinjenja.
[0040] Kao što se ovde koristi, izrazi "funkcija" i "funkcionalno" i slično odnose se na biološku, enzimsku ili terapeutsku funkciju.
1
[0041] "Funkcionalni" distrofin protein se generalno odnosi na distrofin protein koji ima dovoljnu biološku aktivnost da smanji progresivnu degradaciju mišićnog tkiva koja je inače karakteristična za mišićnu distrofiju, obično u poređenju sa izmenjenim ili "defektnim" oblikom distrofin proteina koji je prisutan kod određenih ispitanika sa DMD ili BMD. U određenim otelotvorenjima, funkcionalni protein distrofin može imati oko 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ili 100% (uključujući sve cele brojeve između) in vitro ili in vivo biološke aktivnosti distrofina divljeg tipa, mereno prema rutinskim tehnikama u struci. Kao jedan od primera, aktivnost povezana sa distrofinom u mišićnim kulturama in vitro može se meriti prema veličini miotube, organizaciji (ili dezorganizaciji) miofibrila, kontraktilnoj aktivnosti i spontanom grupisanju acetilholinskih receptora (videti, npr. Brown et al., Journal of Cell Science.112:209-216, 1999). Životinjski modeli su takođe dragoceni resursi za proučavanje patogeneze bolesti i pružaju sredstvo za testiranje aktivnosti povezanih sa distrofinom. Dva od najčešće korišćenih životinjskih modela za DMD istraživanje su mdx miš i zlatni retriver sa mišićnom distrofijom (GRMD), od kojih su oboje distrofin negativni (vidi npr. Collins & Morgan, Int J Exp Pathol 84: 165-172, 2003). Ovi i drugi životinjski modeli mogu se koristiti za merenje funkcionalne aktivnosti različitih distrofin proteina. Uključeni su skraćeni oblici distrofina, kao što su oni oblici koji nastaju nakon primene određenih antisens oligomernih konjugata koji preskaču egzon iz prezentovanog obelodanjivanja.
[0042] Izrazi "nepodudaranje" ili "neusklađenosti" se odnose na jednu ili više nukleobaza (bilo da su susedne ili odvojene) u oligomernoj nukleobaznoj sekvenci koje se ne podudaraju sa ciljnom pre-iRNK prema pravilima osnovnog uparivanja. Iako se često želi savršena komplementarnost, neka otelotvorenja mogu uključivati jedno ili više, ali poželjno 6, 5, 4, 3, 2 ili 1 neusklađenosti u odnosu na ciljnu pre-iRNK. Uključene su varijacije na bilo kojoj lokaciji unutar oligomera. U određenim otelotvorenjima, antisens oligomerni konjugati obelodanjivanja uključuju varijacije u nukleobaznoj sekvenci u blizini varijacija terminusa u unutrašnjosti, i ako su prisutni, obično unutar oko 6, 5, 4, 3, 2 ili 1 podjedinica terminusa 5' i/ili 3'.
[0043] Izrazi "morfolino", "morfolino oligomer" i "PMO" se odnose na fosforodiamidat morfolino oligomer sledeće opšte strukture:
1
i kao što je opisano na Slici 2: Summerton, J., et al., Antisense & Nucleic Acid Drug Development, 7: 187-195 (1997). Morfolini kao što je ovde opisano uključuju sve stereoizomere i tautomere prethodno navedene opšte strukture. Sinteza, strukture i karakteristike vezivanja morfolino oligomera su detaljno opisane u SAD patentima br.:
5,698,685; 5,217,866; 5,142,047; 5,034,506; 5,166,315; 5,521,063; 5,506,337; 8,076,476; i 8,299,206;.
[0044] Morfolino sadašnjeg pronalaska konjuguje se na 5' kraju oligomera „repnim“ delom kako bi se povećala njegova stabilnost i/ili rastvorljivost. Repni deo ima sledeću strukturu:
[0045] Prethodni repni deo se takođe ovde naziva "TEG" ili "EG3" .
[0046] Kao što se ovde koristi, izrazi "-G-R6" i "-G-R6-Ac" se koriste naizmenično i odnose se na peptidni deo konjugovan sa antisens oligomerom obelodanjivanja. U raznim otelotvorenjima, "G" predstavlja ostatak glicina konjugovanog sa "R6" amidnom vezom, a svako "R" predstavlja ostatak arginina konjugovanog amidnom vezom, tako da "R6" znači šest (6) ostataka arginina konjugovanih zajedno amidnom vezom. Ostaci arginina su ostaci L-arginina. "-G-R6" ili "-G-R6-Ac" je konjugovan sa azotom iz morfolinskog prstena 3' naj-
1
morfolinske podjedinice PMO antisens oligomera obelodanjivanja. "-G-R6" ili "-G-R6-Ac" je konjugovan sa 3' krajem antisens oligomera obelodanjivanja i ima sledeću formulu:
ili
[0047] Izrazi "nukleobaza" (Nu), "bazni deo uparivanja" ili "baza" se koriste naizmenično da se odnose na purinsku ili pirimidinsku bazu koja se nalazi u prirodno prisutnoj, ili "nativnom" DNK ili RNK (npr. uracil, timin, adenin, citozin i gvanin), kao i analozi ovih prirodno prisutnih purina i pirimidina. Ovi analozi mogu dati poboljšana svojstva, kao što je afinitet vezivanja, za oligomer. Primerni analozi uključuju hipoksantin (bazna komponenta inozina); 2,6-diaminopurin; 5-metil citozin; C5-propinil-modifikovane pirimidine; i 10-(9-(aminoetoksi)fenoksazinil) (G-spona).
[0048] Fraze "parenteralna primena" i "primena parenteralno" kako se ovde koriste podrazumevaju načine primene koji nisu enteralna i lokalna primena, obično injekcijom, i uključuju, bez ograničenja, intravensku, intramuskularnu, intraarterijsku, intratekalnu, intrakapsularnu, intraorbitalnu, intrakardijalnu, intradermalnu, intraperitonealnu, transtrahealnu, subkutanu, subkutikularnu, intraartikularnu, subkapsularnu, subarahnoidnu, intraspinalnu i intrasternalnu injekciju i infuziju.
1
[0049] Radi jasnoće, strukture obelodanjivanja uključujući, na primer, Formulu (IV), su kontinualne od 5' do 3', i, radi lakšeg prikazivanja cele strukture u kompaktnom obliku, uključeni su različiti prekidi za ilustraciju sa oznakama "PREKID A", "PREKID B" i "PREKID C". Kao što bi obučeni stručnjak razumeo, na primer, svaka indikacija "PREKID A" pokazuje nastavak ilustracije strukture u ovim tačkama. Obučeni stručnjak shvata da isto važi za svaki primer "PREKID B" i za "PREKID C" u prethodnim strukturama. Nijedna od ilustracija, međutim, nije namenjena da ukaže, niti bi stručnjak razumeo da one znače, stvarni prekid prethodno navedene strukture.
[0050] Kao što se ovde koristi, set zagrada koji se koristi u strukturnoj formuli ukazuje da se strukturna karakteristika između zagrada ponavlja. Kod nekih otelotvorenja, korišćene zagrade mogu biti "[" i"]", a kod određenih otelotvorenja, zagrade koje se koriste za označavanje ponavljajućih strukturnih karakteristika mogu biti "(" i ")". U nekim otelotvorenjima, broj ponovljenih iteracija strukturne karakteristike između zagrada je broj naznačen izvan zagrada kao što su 2, 3, 4, 5, 6, 7 i tako dalje. U različitim otelotvorenjima, broj ponavljanja iteracija strukturne karakteristike između zagrada označen je promenljivom naznačenom izvan zagrada kao što je „Z“.
[0051] Kao što se ovde koristi, ravna veza ili vijugava veza povučena do hiralnog ugljenika ili atoma fosfora u strukturnoj formuli ukazuje da stereohemija hiralnog ugljenika ili fosfora nije definisana i da je namenjena da obuhvati sve oblike hiralnog centra. Primeri takvih ilustracija su prikazani u nastavku.
[0052] Fraza "farmaceutski prihvatljivo" označava supstancu ili sastav koji moraju biti kompatibilni, hemijski i/ili toksikološki, sa drugim sastojcima koje sadrži formulacija i/ili ispitanik koji se njima tretira.
2
[0053] Fraza "farmaceutski prihvatljiv nosač" kako se koristi ovde označava netoksični, inertni čvrsti, polučvrsti ili tečni punilac, razblaživač, inkapsulirajući materijal ili pomoćnu formulaciju bilo kog tipa. Neki primeri materijala koji mogu poslužiti kao farmaceutski prihvatljivi nosači su: šećeri kao što su laktoza, glukoza i saharoza; skrob kao što su kukuruzni skrob i krompir skrob; celuloza i njeni derivati kao što su natrijum karboksimetil celuloza, etil celuloza i celulozni acetat; sprašeni tragakant; slad; želatina; talk; pomoćne materije (ekscipijensi) kao što su kakao maslac i voskovi za supozitorije; ulja kao što su ulje kikirikija, ulje semenki pamuka, ulje šafrana, susamovo ulje, maslinovo ulje, kukuruzno ulje i sojino ulje; glikoli kao što su propilen glikol; esteri kao što su etil oleat i etil laurin; agar; puferska sredstva kao što su magnezijum hidroksid i aluminijum hidroksid; alginska kiselina; voda bez pirogena; izotonični fiziološki rastvor; Ringerov rastvor; etil alkohol; fosfatni puferski rastvori; netoksični kompatibilni lubrikanti kao što su natrijum lauril sulfat i magnezijum stearat; sredstva za bojenje; sredstva za oslobađanje; sredstva za oblaganje; zaslađivači; arome; sredstva za konzerviranje; i antioksidansi; prema proceni sastavljača formulacije.
[0054] Izraz "obnavljanje" u vezi sa sintezom ili proizvodnjom distrofina se generalno odnosi na proizvodnju distrofin proteina uključujući skraćene oblike distrofina kod pacijenta sa mišićnom distrofijom nakon tretiranja antisens oligomernim konjugatom opisanim u ovom dokumentu. Kod nekih otelotvorenja, tretiranje rezultira povećanjem proizvodnje novog distrofina kod pacijenta za 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili 100% (uključujući sve cele brojeve između). Kod nekih otelotvorenja, tretiranje povećava broj distrofin-pozitivnih vlakana na najmanje oko 20%, oko 30%, oko 40%, oko 50%, oko 60%, oko 70%, oko 80%, oko 90%, ili oko 95% do 100% od normale kod ispitanika. U drugim otelotvorenjima, tretiranje povećava broj distrofin-pozitivnih vlakana na oko 20% do oko 60%, ili oko 30% do oko 50%, od normalnog u ispitaniku. Procenat distrofin-pozitivnih vlakana kod pacijenta nakon tretiranja može se odrediti biopsijom mišića pomoću poznatih tehnika. Na primer, biopsija mišića se može uzeti iz odgovarajućeg mišića, kao što je mišić biceps brachii kod pacijenta.
[0055] Analiza procenta pozitivnih vlakana distrofina može se vršiti pre i/ili posle tretiranja ili u vremenskim tačkama tokom tretiranja. U nekim otelotvorenjima, biopsija nakon tretmana uzima se iz kontralateralnog mišića iz biopsije pre tretmana. Analiza ekspresije distrofina pre i posle tretmana može se izvršiti korišćenjem bilo kog odgovarajućeg testa za distrofin. U nekim otelotvorenjima, imunohistohemijska detekcija se vrši na tkivnim delovima iz biopsije mišića koristeći antitelo koje je marker za distrofin, kao što je monoklonsko ili poliklonsko antitelo. Na primer, može se koristiti antitelo MANDYS106 koje je veoma osetljiv marker za distrofin. Može se koristiti bilo koje odgovarajuće sekundarno antitelo.
[0056] U nekim otelotvorenjima, procenat distrofin-pozitivnih vlakana se izračunava deljenjem broja pozitivnih vlakana sa ukupnim prebrojanim vlaknima. Normalni uzorci mišića imaju 100% distrofin-pozitivna vlakna. Prema tome, procenat distrofin-pozitivnih vlakana se može izraziti kao procenat normalnog. Da bi se kontrolisalo prisustvo nivoa distrofina u tragovima u predtretmanskom mišiću, kao i revertirajućih vlakana, može se postaviti polazni nivo koristeći delove predtretmanskih mišića pacijenta prilikom brojanja distrofin-pozitivnih vlakana u posttretmanskim mišićima. Ovo se može koristiti kao prag za brojanje distrofin-pozitivnih vlakana u delovima mišića nakon tretmana kod tog pacijenta. U drugim otelotvorenjima, sekcije tkiva obojenih antitelima se takođe mogu koristiti za kvantifikaciju distrofina pomoću softvera za analizu Bioquant image (Bioquant Image Analysis Corporation, Nashville, TN). Ukupni intenzitet signala fluorescencije distrofina može se prijaviti kao procenat normalnog. Pored toga, Western Blot analiza sa monoklonskim ili poliklonskim antidistrofin antitelima može se koristiti za određivanje procenta distrofinpozitivnih vlakana. Na primer, može se koristiti anti-distrofin antitelo NCL-Dys1 iz Leica Biosystems. Procenat distrofin-pozitivnih vlakana se takođe može analizirati određivanjem ekspresije komponenti sarkoglikan kompleksa (β,γ) i/ili neuronskih NOS.
[0057] U nekim otelotvorenjima, lečenje antisens oligomernim konjugatom obelodanjivanja usporava ili smanjuje progresivnu disfunkciju respiratornih mišića i/ili nedostatak kod pacijenata sa DMD-om koji bi se očekivali bez tretiranja. U nekim otelotvorenjima, tretman antisens oligomernim konjugatom obelodanjivanja može smanjiti ili eliminisati potrebu za ventilacionom pomoći koja bi se očekivala bez tretmana. U nekim otelotvorenjima, merenja respiratorne funkcije za praćenje toka bolesti, kao i procena potencijalnih terapijskih intervencija uključuju maksimalni inspiratorni pritisak (MIP), maksimalni ekspiratorni pritisak (MEP) i prinudni vitalni kapacitet (FVC). MIP i MEP mere nivo pritiska koji osoba može da generiše tokom udisaja, odnosno izdisaja, i predstavljaju osetljive mere snage respiratornih mišića. MIP je mera slabosti mišića dijafragme.
[0058] U nekim otelotvorenjima, MEP može opasti pre promena u drugim testovima pulmonalne funkcije, uključujući MIP i FVC. U određenim otelotvorenjima, MEP može biti rani indikator respiratorne disfunkcije. U određenim otelotvorenjima, FVC se može koristiti za merenje ukupne zapremine vazduha izbačenog tokom prinudnog izdisaja nakon maksimalne inspiracije. Kod pacijenata sa DMD, FVC se povećava istovremeno sa fizičkim rastom do ranih tinejdžerskih godina. Međutim, kako se rast usporava ili je usporen progresijom bolesti, a slabost mišića napreduje, vitalni kapacitet ulazi u silaznu fazu i opada u proseku oko 8 do 8,5 odsto godišnje nakon 10 do 12 godina starosti. U određenim otelotvorenjima, procenat MIP koji je predviđen (MIP prilagođen težini), procenat MEP koji je predviđen (MEP prilagođen starosti) i procenat FVC koji je predviđen (FVC prilagođen starosti i visini) su podržavajuće analize.
[0059] Izrazi „ispitanik“ i „pacijent“ koji se koriste ovde uključuju bilo koju životinju koja pokazuje simptom ili je pod rizikom da pokaže simptom, koja se može lečiti antisens oligomernim konjugatom obelodanjivanja, kao što je ispitanik (ili pacijent) koji ima ili je pod rizikom da ima DMD ili BMD, ili bilo koji od simptoma povezanih sa ovim stanjima (npr. gubitak mišićnih vlakana). Pogodni ispitanici (ili pacijenti) uključuju laboratorijske životinje (kao što su miš, pacov, zec ili zamorac), farmerske životinje i domaće životinje ili kućne ljubimce (kao što su mačka ili pas). Uključeni su ne-humani primati i, poželjno, humani pacijenti (ili ispitanici). Uključene su i metode proizvodnje distrofina u ispitaniku (ili pacijentu) koji ima mutaciju gena distrofina koja je podložna preskakanju egzona 51.
[0060] Fraze „sistemska primena“, „primenjen sistemski“, „periferna primena“ i „periferno primenjen“ koje se ovde koriste znače primenu jedinjenja, leka ili drugog materijala koja nije direktno u centralni nervni sistem, tako da on ulazi u sistem pacijenta i tako podleže metabolizmu i drugim sličnim procesima, na primer, subkutanom primenom.
[0061] Faza "ciljna sekvenca" se odnosi na sekvencu nukleobaza oligomera koja je komplementarna sekvenci nukleotida u ciljnoj pre-iRNK. Sekvenca nukleotida u ciljnoj preiRNK je mesto kaljenja egzona 51 u distrofin pre-iRNK naznačenoj kao H51A (+66+95).
[0062] "Tretman" ispitanika (npr. sisara, kao što je čovek) ili ćelije je bilo koja vrsta intervencije koja se koristi u pokušaju da se promeni prirodni tok ispitanika ili ćelije. Tretman uključuje, ali nije ograničen na, primenu oligomera ili njegovog farmaceutskog sastava, i
2
može se izvršiti ili profilaktički ili nakon početka patološkog događaja ili kontakta sa etiološkim agensom. Tretman uključuje svako poželjno dejstvo na simptome ili patologiju bolesti ili stanja povezanog sa distrofin proteinom, kao u određenim oblicima mišićne distrofije, i može uključivati, na primer, minimalne promene ili poboljšanja jednog ili više merljivih markera bolesti ili stanja koje se tretira. Uključeni su i „profilaktički“ tretmani, koji mogu biti usmereni na smanjenje brzine progresije bolesti ili stanja koje se tretira, odlaganje nastanka te bolesti ili stanja ili smanjenje težine njenog nastanka. "Tretman" ili "profilaksa" ne ukazuju nužno na potpuno iskorenjivanje, izlečenje ili sprečavanje bolesti ili stanja ili povezanih simptoma.
[0063] U nekim otelotvorenjima, tretman antisens oligomernim konjugatom obelodanjivanja povećava proizvodnju novog distrofina, odlaže progresiju bolesti, usporava ili smanjuje gubitak ambulacije, smanjuje upalu mišića, smanjuje oštećenje mišića, poboljšava funkciju mišića, smanjuje gubitak pulmonalne funkcije i/ili poboljšava regeneraciju mišića koja bi se očekivala bez tretiranja. Kod nekih otelotvorenja, tretiranje održava, odlaže ili usporava napredovanje bolesti. Kod nekih otelotvorenja, tretiranje održava ambulaciju ili smanjuje gubitak ambulacije. Kod nekih otelotvorenja, tretiranje održava pulmonalnu funkciju ili smanjuje gubitak pulmonalne funkcije. U nekim otelotvorenjima, tretman održava ili povećava stabilnu hodnu prugu kod pacijenta, kao što je izmereno, na primer, 6-minutnim testom hodanja (6MWT). Kod nekih otelotvorenja, tretman održava ili smanjuje vreme hodanja/trčanja na 10 metara (tj. test hodanja/trčanja na 10 metara). Kod nekih otelotvorenja, tretman održava ili smanjuje vreme ustajanja iz ležećeg položaja (tj. test vremena ustajanja). Kod nekih otelotvorenja, tretman održava ili smanjuje vreme za penjanje na četiri standardne stepenice (tj. test penjanja na četiri stepenice). U nekim otelotvorenjima, tretman održava ili smanjuje upalu mišića kod pacijenta, što se meri, na primer, putem MRI (npr. MRI mišića nogu). U nekim otelotvorenjima, MRI meri T2 i/ili masnu frakciju za identifikaciju degeneracije mišića. MRI može identifikovati promene u strukturi i sastavu mišića uzrokovane upalom, edemom, oštećenjem mišića i infiltracijom masti.
[0064] U nekim otelotvorenjima, tretman antisens oligomernim konjugatom obelodanjivanja povećava proizvodnju novog distrofina i usporava ili smanjuje gubitak ambulacije koji bi se očekivao bez tretmana. Na primer, tretman može stabilizovati, održati, poboljšati ili povećati sposobnost hodanja (npr. stabilizacija ambulacije) kod ispitanika. U nekim otelotvorenjima, tretman održava ili povećava stabilnu hodnu prugu kod pacijenta, kao što je izmereno, na primer, 6-minutnim testom hodanja (6MWT) što su opisali McDonald et al. (Muscle Nerve, 2010; 42:966-74). Promena u testu od 6 minuta hodanja (6MWD) može se izraziti kao apsolutna vrednost, procentualna promena ili promena %-predviđene vrednosti. U nekim otelotvorenjima, tretman održava ili poboljšava stabilnu hodnu prugu u 6MWT od 20% deficita kod ispitanika u odnosu na zdravog vršnjaka. Učinak pacijenta sa DMD u 6MWT testu u odnosu na tipičan učinak zdravog vršnjaka može se utvrditi izračunavanjem %-predviđene vrednosti. Na primer, % -predviđeni 6MWD može se izračunati pomoću sledeće jednačine za muškarce: 196,72 (39,81 x starost) - (1,36 × starost<2>) (132,28 x visina u metrima). Za žene, % -predviđeni 6MWD može se izračunati pomoću sledeće jednačine: 188,61 (51,50 x starost) - (1,86 × starost<2>)<+>(86,10 x visina u metrima) (Henricson et al. PLoS Curr., 2012, version 2). U nekim otelotvorenjima, tretman antisens oligomerom povećava stabilnu hodnu prugu kod pacijenta od bazne linije do više od 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30 ili 50 metara (uključujući sve cele brojeve između).
[0065] Gubitak mišićne funkcije kod pacijenata sa DMD može se javiti na pozadini normalnog rasta i razvoja u detinjstvu. Zaista, mlađa deca sa DMD mogu pokazati povećanje pređenog rastojanja tokom 6MWT u toku oko 1 godine uprkos progresivnom oštećenju mišića. U nekim otelotvorenjima, 6MWD kod pacijenata sa DMD se upoređuje sa uobičajeno razvijenim kontrolnim ispitanicima i sa postojećim normativnim podacima iz uzrasta i pola odgovarajućih ispitanika. U nekim otelotvorenjima, normalan rast i razvoj se mogu uzeti u obzir korišćenjem jednačine zasnovane na starosti i visini koja je prilagođena normativnim podacima. Takva jednačina se može koristiti za pretvaranje 6MWD u procentno-predviđenu (% -predviđenu) vrednost u ispitanicima sa DMD. U određenim otelotvorenjima, analiza % -predviđenih 6MWD podataka predstavlja metodu za uzimanje u obzir normalnog rasta i razvoja, i može pokazati da dobici u funkciji u ranim godinama (npr., manje ili jednako starosti 7) predstavljaju stabilne umesto poboljšanja sposobnosti kod pacijenata sa DMD (Henricson et al. PLoS Curr., 2012, version 2).
[0066] Predložen je i objavljen sistem nomenklature antisens molekula kako bi se razlikovali različiti antisens molekuli (vidi Mann et al., (2002) J Gen Med 4, 644-654). Ova nomenklatura je postala posebno relevantna prilikom testiranja nekoliko malo različitih antisens molekula, koji su svi usmereni na isti ciljni region, kao što je prikazano u nastavku: H#A/D(x:y).
2
[0067] Prvo slovo označava vrstu (npr. H: humani, M: mišji, C: pseći). "#" označava ciljani broj distrofin egzona. "A/D" označava mesto prekrajanja akceptora ili donora na početku, odnosno na kraju egzona. (x y) predstavlja koordinate kaljenja gde "-" ili "+" označavaju intronske, odnosno egzonske sekvence. Na primer, A(-6+18) označava poslednjih 6 baza introna koji prethodi ciljnom egzonu i prvih 18 baza ciljnog egzona. Najbliže mesto prekrajanja bi bio akceptor tako da bi ovim koordinatama prethodilo "A". Opisivanje koordinata kaljenja na mestu prekrajanja donora može biti D(+2-18) gde poslednje 2 egzonske baze i prvih 18 intronskih baza odgovaraju mestu kaljenja antisens molekula.
Potpune koordinate egzonskog kaljenja koje bi bile predstavljene sa A(+65+85), to je mesto između 65. i 85. nukleotida od početka tog egzona.
II. Antisens oligomeri
A. Antisens oligomer konjugati dizajnirani da izazovu preskakanje egzona 51
[0068] Antisens oligomerni konjugati su formule (IV) i komplementarni su ciljnom regionu egzona 51 distrofin gena i indukuju preskakanje egzona 51. Konkretno, obelodanjivanje se odnosi na antisens oligomerne konjugate komplementarne sa ciljnim regionom egzona 51 distrofin pre-iRNK označenog kao mesto kaljenja. Mesto kaljenja je H51A(+66+95).
[0069] Antisens oligomer konjugati obelodanjivanja ciljaju distrofin pre-iRNK i indukuju preskakanje egzona 51, tako da je isključen ili preskočen iz zrelog, prekrojenog iRNK transkripta. Preskočivši egzon 51, poremećeni okvir čitanja se vraća u mutaciju u okviru. Dok se DMD sastoji od različitih genetskih podtipova, antisens oligomerni konjugati obelodanjivanja su posebno dizajnirani da preskoče egzon 51 distrofin pre-iRNK. DMD mutacije podložne preskakanju egzona 51 obuhvataju podgrupu DMD pacijenata (13%).
B. Hemijske karakteristike oligomera
Morfolino oligomeri
[0070] Antisens oligomerni konjugat ovog pronalaska je u skladu sa formulom (IV):
2
ili njenom farmaceutski prihvatljivom soli.
[0071] U nekim otelotvorenjima, antisens oligomerni konjugat formule (IV) je njena so sa HCl (hlorovodonična kiselina). U određenim otelotvorenjima, HCl so je .6HCl so.
[0072] U nekim otelotvorenjima, uključujući, na primer, otelotvorenja antisens oligomernih konjugata formule (IV), antisens oligomerni konjugat obelodanjivanja je u skladu sa formulom (IVA):
2
Farmaceutski prihvatljive soli antisens oligomernih konjugata
[0073] Pojedina otelotvorenja antisens oligomernih konjugata opisanih u ovom dokumentu mogu da sadrže osnovnu funkcionalnu grupu, kao što su amino ili alkilamino, i stoga su sposobni da formiraju farmaceutski prihvatljive soli sa farmaceutski prihvatljivim kiselinama. Izraz „farmaceutski prihvatljive soli“, u tom smislu, odnosi se na relativno netoksične, adicione soli neorganskih i organskih kiselina i antisens oligomernih konjugata ovog obelodanjivanja. Ove soli se mogu pripremiti in situ u nosiocu za primenu ili dozirnoj formi proizvodnog procesa, ili posebno reagovanjem prečišćenog antisens oligomernog konjugata obelodanjivanja u slobodnom baznom obliku sa odgovarajućom organskom ili neorganskom kiselinom, i izolovanjem soli koja je tako formirana tokom naknadnog prečišćavanja.
Reprezentativne soli uključuju hidrobromid, hidrohlorid, sulfat, bisulfat, fosfat, nitrat, acetat, valerat, oleat, palmitat, stearat, laurat, benzoat, laktat, tosilat, citrat, maleat, fumarat, sukcinat, tartarat, naftilat, mezilat, glukoheptonat, laktobionat i laurilsulfonat soli. (Vidi, npr., Berge et al. (1977) "Pharmaceutical Salts", J. Pharm. Sci.66: 1-19).
[0074] Farmaceutski prihvatljive soli predmetnih antisens oligomernih konjugata uključuju konvencionalne netoksične soli ili kvaternarne amonijum soli antisens oligomernih konjugata, npr. iz netoksičnih organskih ili neorganskih kiselina. Na primer, takve konvencionalne
2
netoksične soli uključuju one koje su izvedene od neorganskih kiselina kao što su hlorovodonična, bromovodonična, sumporna, sulfaminska, fosforna i azotna; i soli pripremljene od organskih kiselina kao što su sirćetna, propionska, ćilibarna, glikolna, stearinska, mlečna, jabučna, vinska, limunska, askorbinska, palmitinska, maleinska, hidroksimaleinska, fenilsirćetna, glutaminska, benzoeva, salicilna, sulfanilna, 2-acetoksibenzoeva, fumarna, toluensulfonska, metansulfonska, etandisulfonska, oksalna i izotionska.
[0075] U određenim otelotvorenjima, antisens oligomerni konjugati sadašnjeg obelodanjivanja mogu da sadrže jednu ili više kiselih funkcionalnih grupa i, na taj način, mogu da formiraju farmaceutski prihvatljive soli sa farmaceutski prihvatljivim bazama. Izraz „farmaceutski prihvatljive soli“, u tom smislu, odnosi se na relativno netoksične, adicione soli neorganskih i organskih kiselina i antisens oligomernih konjugata ovog obelodanjivanja. Ove soli se takođe mogu pripremiti in situ u nosiocu za primenu ili u doznoj formi procesa proizvodnje, ili odvojeno reagovanjem prečišćenog antisens oligomernog konjugata u obliku slobodne kiseline sa odgovarajućom bazom, kao što su hidroksid, karbonat ili bikarbonat farmaceutski prihvatljivog metalnog katjona, sa amonijakom ili sa farmaceutski prihvatljivim organskim primarnim, sekundarnim ili tercijarnim aminom. Reprezentativne alkalne ili zemnoalkalne soli uključuju soli litijuma, natrijuma, kalijuma, kalcijuma, magnezijuma i aluminijuma. Reprezentativni organski amini korisni za formiranje baznih adicionih soli uključuju etilamin, dietilamin, etilendiamin, etanolamin, dietanolamin i piperazin. (Vidi, npr., Berge et al., supra).
III. Formulacije i načini primene
[0076] U određenim otelotvorenjima, sadašnje obelodanjivanje pruža formulacije ili farmaceutske sastave pogodne za terapijsko isporučivanje antisens oligomernih konjugata, kao što je opisano u ovom dokumentu. Otuda, u određenim otelotvorenjima, ovo obelodanjivanje pruža farmaceutski prihvatljive sastave koji čine terapeutski efikasnu količinu jednog ili više ovde opisanih antisens oligomernih konjugata, formulisanih zajedno sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih nosilaca (aditiva) i/ili razblaživača. Iako je moguće da se antisens oligomer konjugat sadašnjeg obelodanjivanja primenjuje sam, poželjno je da se antisens oligomer konjugat primeni kao farmaceutska formulacija (sastav). Antisens oligomerni konjugat formulacije je u skladu sa formulom (IV) ili njenom farmaceutski prihvatljivom solju.
2
[0077] Metode za isporuku molekula nukleinske kiseline, koji se mogu primeniti na antisens oligomerne konjugate ovog obelodanjivanja, opisane su, na primer, u: Akhtar et al., 1992, Trends Cell Bio., 2:139; Delivery Strategies for Antisense Oligonucleotide Therapeutics, ed. Akhtar, 1995, CRC Press; i Sullivan et al., PCT WO 94/02595. Ovi i drugi protokoli mogu se koristiti za isporuku praktično bilo kog molekula nukleinske kiseline, uključujući antisens oligomerne konjugate ovog otkrića.
[0078] Farmaceutski sastavi ovog obelodanjivanja mogu biti posebno formulisani za primenu u čvrstom ili tečnom obliku, uključujući one prilagođene za sledeće: (1) oralnu primenu, na primer, napici (vodeni ili nevodeni rastvori ili suspenzije), tablete (namenjene za bukalnu, sublingvalnu ili sistemsku apsorpciju), bolusi, praškovi, granule, paste za nanošenje na jezik; (2) parenteralnu primenu, na primer, supkutanom, intramuskularnom, intravenskom ili epiduralnom injekcijom, na primer, sterilnim rastvorom ili suspenzijom, ili formulacijom sa trajnim oslobađanjem; (3) topikalnu primenu, na primer, kao krema, mast ili flaster ili sprej sa kontrolisanim oslobađanjem koji se nanose na kožu; (4) intravaginalno ili intrarektalno, na primer, kao pesarijum, krema, ili pena; (5) sublingvalno; (6) okularno (7) transdermalno; (8) nazalno.
[0079] Neki primeri materijala koji mogu da posluže kao farmaceutski prihvatljivi nosioci uključuju, bez ograničenja: (1) šećere, kao što su laktoza, glukoza i saharoza; (2) skrob, kao što su kukuruzni skrob i krompir skrob; (3) celulozu i njene derivate, kao što su natrijum karboksimetil celuloza, etil celuloza i celulozni acetat; (4) trakant u prahu; (5) slad; (6) želatin; (7) talk; (8) pomoćne materije, kao što su kakao maslac i supozitorni voskovi; (9) ulja, kao što su ulje kikirikija, pamukovo ulje, ulje šafrana, susamovo ulje, maslinovo ulje, kukuruzno ulje i sojino ulje; (10) glikole, kao što je propil glikol; (11) poliole, kao što su glicerin, sorbitol, manitol, i polietilen glikol; (12) estre, kao što su etil oleat i etil laurat; (13) agar, (14) puferska sredstva, kao što je magnezijum hidroksid ili alumunijum hidroksid, (15) alginska kiselina, (16) voda bez pirogena, (17) izotonični fiziološki rastvor, (18) Ringerov rastvor, (19) etil alkohol, (20) pH puferski rastvori, (21) poliestri, polikarbonati i/ili polianhidridi, i (22) i druge ne-toksične kompatibilne supstance korišćene u farmaceutskim formulacijama.
[0080] Dodatni neograničavajući primeri agenasa pogodnih za formulacije sa antisens oligomernim konjugatima trenutnog obelodanjivanja uključuju: PEG konjugovane nukleinske kiseline; fosfolipidne konjugovane nukleinske kiseline; nukleinske kiseline koje sadrže lipofilne delove; fosforotioate; inhibitore P-glikoproteina (kao što je Pluronski p85) koji mogu poboljšati unos lekova u različita tkiva; biorazgradive polimere, kao što su poli (D, L-laktidkoglikolid) mikrosfere za isporuku sa održivim oslobađanjem nakon implantacije (Emerich, D F et al., 1999, Cell Transplant, 8, 47-58) Alkermes, Inc. Cambridge, Mass.; i napunjene nanočestice, kao što su one napravljene od polibutilcijanoakrilata, koje mogu da isporuče lekove preko krvne moždane barijere i mogu da promene neuronske mehanizme preuzimanja (Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry, 23, 941-949, 1999).
[0081] Obelodanjivanje takođe sadrži upotrebu sastava koji obuhvata površinski modifikovane liposome koji sadrže poli(etilen glikol) ("PEG") lipide (PEG-modifikovane, razgranate i nerazgranate ili njihove kombinacije, ili liposome sa dugom cirkulacijom ili prikrivene liposome). Ove formulacije nude metodu za povećanje akumulacije lekova u ciljnim tkivima. Ova klasa nosilaca lekova odoleva opsonizaciji i eliminaciji putem mononuklearnog fagocitnog sistema (MPS ili RES), čime se omogućava duže vreme cirkulacije krvi i pojačano izlaganje tkiva inkapsulisanom leku (Lasic et al. Chem. Rev.1995, 95,2601-2627; Ishiwata et al., Chem. Pharm. Bull.1995, 43, 1005-1011). Pokazalo se da se takvi liposomi selektivno akumuliraju u tumorima, pretpostavlja se ekstravazacijom i hvatanjem u neovaskularizovanim ciljnim tkivima (Lasic et al. Science, 1995, 267, 1275-1276; Oku et al., 1995, Biochim. Biophys. Acta, 1238, 86-90). Dugo-cirkulišući liposomi poboljšavaju farmakokinetiku i farmakodinamiku DNK i RNK, posebno u poređenju sa konvencionalnim katjonskim liposomima za koje se zna da se akumuliraju u tkivima MPS (Liu et al., J. Biol. Chem. 1995, 42, 24864-24870; Choi et al., International PCT Publication No. WO 96/10391; Ansell et al., International PCT Publication No. WO 96/10390; Holland et al., International PCT Publication No. WO 96/10392). Dugotrajno-cirkulišući liposomi takođe verovatno štite lekove od razgradnje nukleaze u većoj meri u poređenju sa katjonskim liposomima, na osnovu njihove sposobnosti da izbegnu akumuliranje u metabolički agresivnim MPS tkivima kao što su jetra i slezina.
[0082] U daljem otelotvorenju, ovo otkriće uključuje farmaceutske sastave antisens konjugovanih oligomera pripremljene za isporuku kako je opisano u SAD Pat. Br.:
6.692.911; 7.163.695; i 7.070.807. U tom smislu, u jednom otelotvorenju, ovo
1
obelodanjivanje pruža antisens oligomerni konjugat sadašnjeg obelodanjivanja u sastavu koji se sastoji od kopolimera lizina i histidina (HK) (kako je opisano u SAD Pat. Br.: 7.163.695; 7.070.807; i 6.692.911) bilo sam ili u kombinaciji sa PEG (npr. razgranati ili nerazgranati PEG ili mešavina oba), u kombinaciji sa PEG i ciljnim delom, ili bilo kojim od gore navedenih u kombinaciji sa sredstvom za umrežavanje. U određenim otelotvorenjima, ovo obelodanjivanje pruža antisens oligomerne konjugate u farmaceutskim sastavima koji obuhvataju glukonskom kiselinom modifikovani polihistidin ili glukonilisanipolihistidin/transferin-polilizin. Stručnjak će takođe prepoznati da aminokiseline sa svojstvima sličnim His i Lys mogu biti supstituisane unutar sastava.
[0083] U sastavima mogu biti prisutna i sredstva za kvašenje, emulgatori i lubrikanti (kao što su natrijum lauril sulfat i magnezijum stearat), sredstva za bojenje, sredstva za oslobađanje, sredstva za oblaganje, zaslađivači, sredstva za aromatizaciju, sredstva za parfemisanje, konzervansi i antioksidansi.
[0084] Primeri farmaceutski prihvatljivih antioksidansa uključuju: (1) antioksidanse rastvorljive u vodi, kao što su askorbinska kiselina, cistein hidrohlorid, natrijum bisulfat, natrijum metabisulfit i natrijum sulfit; (2) antioksidanse rastvorljive u ulju, kao što su askorbil palmitat, butilirani hidroksianizol (BHA), butilirani hidroksitoluen (BHT), lecitin, propilgalat i alfa-tokoferol; i (3) metalne helatante, kao što su limunska kiselina, etilendiamin tetrasirćetna kiselina (EDTA), sorbitol, vinska kiselina i fosforna kiselina.
[0085] Formulacije ovog obelodanjivanja uključuju one koje su pogodne za oralnu, nazalnu, lokalnu (uključujući bukalnu i sublingvalnu), rektalnu, vaginalnu i/ili parenteralnu primenu. Formulacije mogu biti prikladno predstavljene u jediničnom doznom obliku i mogu biti pripremljene bilo kojim metodama koje su dobro poznate u farmaceutskoj struci. Količina aktivnog sastojka koji se može kombinovati sa nosećim materijalom da bi se proizvela jedinična dozna forma će varirati u zavisnosti od ispitanika koji se tretira i određenog načina primene. Količina aktivnog sastojka koji se može kombinovati sa nosećim materijalom da bi se proizvela jedinična dozna forma će uglavnom biti ona količina aktivnog sastojka koja proizvodi terapijski efekat. Generalno, ta količina će se kretati od oko 0,1 do oko devedeset devet procenata aktivnog sastojka, poželjno od oko 5 do oko 70 procenata, najpoželjnije od oko 10 do oko 30 procenata.
2
[0086] U određenim otelotvorenjima, formulacija sadašnjeg obelodanjivanja obuhvata pomoćnu supstancu izabranu iz grupe koju čine ciklodekstrini, celuloze, liposomi, sredstava za formiranje micela, npr. žučne kiseline i polimerni nosači, npr. poliestri i polianhidridi; i antisens oligomerni konjugat sadašnjeg obelodanjivanja. Antisens oligomerni konjugat formulacije je u skladu sa formulom (IV) ili njegovom farmaceutski prihvatljivom solju. U određenim otelotvorenjima, pomenuta formulacija pruža oralnu bioraspoloživost antisens oligomernih konjugata ovog otkrića.
[0087] Metode pripreme ovih formulacija ili farmaceutskih sastava uključuju korak dovođenja u vezu antisens oligomernog konjugata sadašnjeg obelodanjivanja sa nosačem i, opciono, jednim ili više pomoćnih sastojaka. Generalno, formulacije se pripremaju tako što se ujednačeno i prisno unosi u asocijaciju antisens oligomerni konjugat sadašnjeg obelodanjivanja sa tečnim nosačima, ili fino usitnjenim čvrstim nosačima, ili oboma, a zatim, ako je potrebno, oblikuje proizvod.
[0088] Formulacije obelodanjivanja pogodne za oralnu primenu mogu biti u obliku kapsula, kesica, pilula, tableta, pastila (korišćenjem aromatizovane osnove, obično saharoze i bagrema ili tragakanta), praškova, granula, ili kao rastvor ili suspenzija u vodenoj ili nevodenoj tečnosti, ili kao emulzija ulja u vodi ili vode u ulju, ili kao eliksir ili sirup, ili kao pastile (korišćenjem inertne osnove, kao što su želatin i glicerin, ili saharoza i akacija) i/ili kao vodice za ispiranje usta, od kojih svaka sadrži unapred određenu količinu antisens oligomer konjugata ovog obelodanjivanja kao aktivnog sastojka. Antisens oligomerni konjugat ovog obelodanjivanja može se primeniti i kao bolus, elektuarijum ili pasta.
[0089] U čvrstim doznim oblicima obelodanjivanja za oralnu primenu (kapsule, tablete, pilule, dražee, praškovi, granule, kesice), aktivni sastojak može biti pomešan sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih nosača, kao što su natrijum citrat ili dikalcijum fosfat, i/ili bilo koji od sledećih: (1) punioci ili ekstenderi, kao što su skrobovi, laktoza, sukroza, glukoza, manitol i/ili silicijumska kiselina; (2) veziva, kao što su, na primer, karboksimetilceluloza, alginati, želatin, polivinil pirolidon, saharoza i/ili akacija; (3) ovlaživači, kao što je glicerol; (4) dezintegraciona sredstva, kao što je agar-agar, kalcijum karbonat, krompirov ili tapioka skrob, alginska kiselina, određeni silikati i natrijum-karbonat; (5) sredstva za usporavanje rastvaranja, kao što je parafin; (6) sredstva za ubrzavanje apsorpcije, kao što su kvaternerna jedinjenja amonijaka i surfaktanti, kao što su poloksamer i natrijum lauril sulfat; (7) sredstva za kvašenje, kao što su, na primer, cetil alkohol, glicerol monostearat i nejonski surfaktanti; (8) sredstva za apsorpciju, kao što su kaolin i bentonitna glina; (9) lubrikanti, kao što su talk, kalcijum stearat, magnezijum stearat, čvrsti polietilen glikoli, natrijum lauril sulfat, cinkov stearat, natrijum stearat, stearinska kiselina i njihove mešavine; (10) sredstva za bojenje; i 11) sredstva sa kontrolisanim oslobađanjem kao što su krospovidon ili etilceluloza. U slučaju kapsula, tableta i pilula, farmaceutski sastavi takođe mogu da sadrže puferna sredstva. Čvrsti farmaceutski sastavi sličnog tipa mogu se koristiti i kao punila u mekim i tvrdim želatinskim kapsulama koristeći pomoćne materije kao što su laktoza ili mlečni šećeri, kao i polietilen glikoli visoke molekulske težine.
[0090] Tableta se može praviti kompresijom ili kalupovanjem, po želji sa jednim ili više pomoćnih sastojaka. Komprimovane tablete se mogu pripremiti pomoću veziva (npr. želatin ili hidroksipropilmetil celuloza), lubrikanta, inertnog razblaživača, konzervansa, dezintegranta (na primer, natrijum-skrob glikolat ili umrežena natrijum karboksimetil celuloza), površinski aktivnog ili dispergujućeg sredstva. Kalupljene tablete se mogu praviti u odgovarajućoj mašini kalupljenjem mešavine jedinjenja u prahu navlaženog inertnim tečnim razblaživačem.
[0091] Tablete i drugi čvrsti oblici doziranja farmaceutskih sastava ovog obelodanjivanja, kao što su dražee, kapsule, pilule i granule, mogu opciono biti zarezane ili pripremljene sa prevlakama i omotačima, kao što su enteričke prevlake i druge prevlake poznate u farmaceutskoj struci formulisanja. Oni takođe mogu biti formulisani tako da omogućavaju sporo ili kontrolisano oslobađanje aktivnog sastojka u njima koristeći, na primer, hidroksipropilmetil celulozu u različitim proporcijama kako bi se obezbedio željeni profil oslobađanja, druge polimerne matrice, liposomi i/ili mikrosfere. Oni mogu biti formulisani za brzo oslobađanje, npr. osušeni zamrzavanjem. Mogu se sterilisati, na primer, filtriranjem kroz filter koji zadržava bakterije ili ugradnjom sterilišućih sredstava u obliku sterilnih čvrstih farmaceutskih sastava koji se mogu rastvoriti u sterilnoj vodi ili nekom drugom sterilnom medijumu za ubrizgavanje neposredno pre upotrebe. Ovi farmaceutski sastavi takođe mogu opciono sadržati sredstva za zamućenje i mogu biti takvog sastava koji oslobađaju aktivni sastojak(e) samo, ili preferencijalno, u određenom delu gastrointestinalnog trakta, opciono, na odložen način. Primeri ugrađivanja sastava koji se mogu koristiti uključuju polimerne materije i voskove. Aktivni sastojak takođe može biti u mikro-kapsuliranom obliku, ako je potrebno, sa jednom ili više gore opisanih pomoćnih supstanci.
4
[0092] Tečni oblici doziranja za oralnu primenu antisens oligomernih konjugata obelodanjivanja uključuju farmaceutski prihvatljive emulzije, mikroemulzije, rastvore, suspenzije, sirupe i eliksire. Pored aktivnog sastojka, tečni dozirni oblici mogu sadržati inertne razređivače koji se obično koriste u struci, kao što su, na primer, voda ili drugi rastvarači, solubilizatori i emulgatori, kao što su etilalkohol, izopropilalkohol, etilkarbonat, etilacetat, benzilalkohol, benzilbenzoat, propilenglikol, 1,3-butilenglikol, ulja (posebno od pamukovog semena, kikirikija, kukuruza, klica, maslinovo, ricinusovo i susamovo ulje), glicerol, tetrahidrofurilalkohol, polietilenglikoli i estri masnih kiselina sorbitana i njihove mešavine.
[0093] Pored inertnih razblaživača, oralni farmaceutski sastavi takođe mogu uključivati adjuvanse kao što su sredstva za kvašenje, emulgatori i suspenzioni agensi, zaslađivači, arome, boje, parfemi i konzervansi.
[0094] Suspenzije, pored aktivnih jedinjenja, mogu da sadrže suspenzione agense kao što su, na primer, etoksilirani izostearil alkoholi, polioksietilen sorbitol i sorbitan estri, mikrokristalična celuloza, aluminijum metahidroksid, bentonit, agar-agar i tragakant i njihove mešavine.
[0095] Formulacije za rektalnu ili vaginalnu primenu mogu se predstaviti kao supozitorij, koji se može pripremiti mešanjem jednog ili više jedinjenja obelodanjivanja sa jednom ili više odgovarajućih neiritirajućih pomoćnih supstanci ili nosača, koji sadrže, na primer, kakao puter, polietilen glikol, supozitorni vosak ili salicilat, i koji je čvrst na sobnoj temperaturi, ali tečan na telesnoj temperaturi i stoga će se istopiti u rektumu ili vaginalnoj šupljini i osloboditi aktivno jedinjenje.
[0096] Formulacije ili dozirne forme za topikalnu ili transdermalnu primenu oligomera kako je ovde predviđeno uključuju praškove, sprejeve, masti, paste, kreme, losione, gelove, rastvore, flastere i inhalatore. Aktivni oligomerni konjugati mogu se mešati u sterilnim uslovima sa farmaceutski prihvatljivim nosačem, i sa bilo kojim konzervansima, puferima ili propelantima (potisnim punjenjima) koji mogu biti potrebni. Masti, paste, kreme i gelovi mogu da sadrže, pored aktivnog jedinjenja ovog obelodanjivanja, pomoćne materije, kao što su masti životinjskog i biljnog porekla, ulja, voskovi, parafini, skrob, tragakant, celulozni derivati, polietilen glikoli, silikoni, bentoniti, silicijumska kiselina, talk i cinkov oksid, ili njihove mešavine.
[0097] Praškovi i sprejevi mogu da sadrže, pored antisens oligomernog konjugata sadašnjeg obelodanjivanja, pomoćne materije (ekscipijense) kao što su laktoza, talk, silicijumska kiselina, aluminijum hidroksid, kalcijum silikati i poliamidni prah, ili smeše ovih supstanci. Sprejevi mogu dodatno da sadrže uobičajena potisna punjenja, kao što su hlorofluoro ugljovodonici i isparljivi nesupstituisani ugljovodonici, kao što su butan i propan.
[0098] Transdermalni flasteri imaju dodatnu prednost u pružanju kontrolisane isporuke antisens oligomernog konjugata sadašnjeg obelodanjivanja u telo. Takvi oblici doziranja mogu se napraviti rastvaranjem ili dispergovanjem oligomera u odgovarajućem medijumu. Pojačivači apsorpcije se takođe mogu koristiti za povećanje protoka agensa preko kože.
Brzina takvog fluksa može se kontrolisati bilo pružanjem membrane koja kontroliše brzinu ili dispergovanjem agensa u polimernoj matrici ili gelu, između ostalih metoda poznatih u struci.
[0099] Farmaceutski sastavi pogodni za parenteralnu primenu mogu se sastojati od jednog ili više oligomernih konjugata obelodanjivanja u kombinaciji sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih sterilnih izotoničnih vodenih ili nevodenih rastvora, disperzija, suspenzija ili emulzija, ili sterilnih praškova koji se mogu rekonstituisati u sterilne rastvore ili disperzije za injektiranje neposredno pre upotrebe, koji mogu sadržati šećere, alkohole, antioksidanse, pufere, bakteriostate, rastvorke koji čine formulaciju izotoničnom sa krvlju predviđenog primaoca ili sredstvima za suspendovanje ili zgušnjavanje. Primeri odgovarajućih vodenih i nevodenih nosača koji mogu biti korišćeni u farmaceutskim sastavima obelodanjivanja uključuju vodu, etanol, poliole (kao što su glicerol, propilen glikol i polietilen glikol), i njihove odgovarajuće mešavine, biljna ulja, kao što je maslinovo ulje, i injektibilni organski estri, kao što je etil oleat. Pravilna fluidnost se može održavati, na primer, upotrebom materijala za prevlačenje, kao što je lecitin, održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju disperzija, i upotrebom površinski aktivnih materija. Antisens oligomerni konjugat garmaceutskog sastava je u skladu sa formulom (IV) ili njenom farmaceutski prihvatljivom solju.
[0100] Ovi farmaceutski sastavi takođe mogu da sadrže adjuvanse kao što su konzervansi, sredstva za kvašenje, emulgatori i dispergatori. Prevencija delovanja mikroorganizama na predmetne oligomerne konjugate može se obezbediti uključivanjem različitih antibakterijskih i antifungalnih agenasa, na primer, parabena, hlorobutanola i fenol sorbinske kiseline. Takođe može biti poželjno uključiti izotonična sredstva, kao što su šećeri, i natrijum hlorid u sastave. Pored toga, produžena apsorpcija farmaceutske forme koja se injektira može biti ostvarena uključivanjem sredstava koja odlažu apsorpciju kao što su aluminijum monostearat i želatin.
[0101] U nekim slučajevima, da bi se produžio efekat leka, poželjno je usporiti apsorpciju leka iz supkutane ili intramuskularne injekcije. To se može postići korišćenjem tečne suspenzije od kristalnog ili amorfnog materijala koji ima slabu rastvorljivost u vodi, između ostalih metoda poznatih u struci. Brzina apsorpcije leka tada zavisi od njegove brzine rastvaranja koja, zauzvrat, može zavisiti od veličine kristala i kristalne forme. Alternativno, odložena apsorpcija parenteralno primenjenog oblika leka postiže se rastvaranjem ili suspenzijom leka u uljanom nosiocu.
[0102] Forme depoa za injektiranje mogu se praviti formiranjem mikroinkapsuliranih matrica predmetnih oligomernih konjugata u biorazgradivim polimerima kao što je polilaktidpoliglikolid. U zavisnosti od odnosa oligomera i polimera, i prirode konkretnog korišćenog polimera, brzina oslobađanja oligomera može se kontrolisati. Primeri drugih biorazgradivih polimera uključuju poli(ortoestere) i poli(anhidride). Depo formulacije za injektiranje se takođe mogu pripremiti zarobljavanjem leka u liposomima ili mikroemulzijama koje su kompatibilne sa telesnim tkivima.
[0103] Kada se antisens oligomerni konjugati sadašnjeg obelodanjivanja daju kao farmaceutski proizvodi, ljudima i životinjama, mogu se dati per se ili kao farmaceutski sastav koji, na primer, sadrži 0,1 do 99% (poželjnije, 10 do 30%) antisens oligomernog konjugata u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivim nosiocem.
[0104] Formulacije ili preparati ovog obelodanjivanja mogu se dati oralno, parenteralno, lokalno ili rektalno. Obično se daju u oblicima pogodnim za svaki put primene. Na primer, primenjuju se u tabletama ili kapsulama, injekcijama, inhalacijama, losionima za oči, mastima, supozitorijama ili infuzijama; uglavnom losionima ili mastima; ili rektalno supozitorijima.
[0105] Bez obzira na izabrani put primene, antisens oligomerni konjugati ovog obelodanjivanja, koji se mogu koristiti u odgovarajućem hidratizovanom obliku, i/ili farmaceutski sastavi ovog obelodanjivanja, mogu se formulisati u farmaceutski prihvatljive oblike doziranja konvencionalnim metodama koje su poznate stručnjacima. Stvarni nivoi doziranja aktivnih sastojaka u farmaceutskim sastavima ovog obelodanjivanja mogu biti različiti kako bi se dobila količina aktivnog sastojka koja je efikasna za postizanje željenog terapijskog odgovora za određenog pacijenta, sastav i način primene, a da nije neprihvatljivo toksična za pacijenta.
[0106] Izabrani nivo doziranja zavisiće od različitih faktora, uključujući aktivnost određenog antisens oligomernog konjugata sadašnjeg korišćenog obelodanjivanja, ili estra, soli ili njegovog amida, načina primene, vremena primene, brzine izlučivanja ili metabolizma određenog korišćenog oligomera, brzine i obima apsorpcije, trajanja tretiranja, drugih lekova, jedinjenja i/ili materijala koji se koriste u kombinaciji sa određenim korišćenim oligomerom, starosti, pola, težine, stanja, opšteg zdravlja i prethodne medicinske istorije pacijenta koji se tretira i sličnih faktora koji su dobro poznati u medicinskoj struci.
[0107] Lekar ili veterinar koji poseduje uobičajeno znanje u struci može lako da odredi i propisuje efikasnu količinu potrebnog farmaceutskog sastava. Na primer, lekar ili veterinar bi mogao da počne sa dozama antisens oligomernih konjugata obelodanjivanja koji se koriste u farmaceutskom sastavu na nivoima nižim od onih koji su potrebni da bi se postigao željeni terapijski efekat i postepeno povećavala doza dok se ne postigne željeni efekat. Generalno, odgovarajuća dnevna doza antisens oligomernog konjugata obelodanjivanja će biti ona količina antisens oligomernog konjugata koja je najniža efikasna doza koja proizvodi terapijski efekat. Takva efikasna doza će generalno zavisiti od faktora opisanih u ovom dokumentu. Generalno, oralne, intravenske, intracerebroventrikularne i supkutane doze antisens oligomernih konjugata ovog obelodanjivanja za pacijenta, kada se koriste za indikovane efekte, kretaće se od oko 0,0001 do oko 100 mg po kilogramu telesne težine dnevno.
[0108] U nekim otelotvorenjima, antisens oligomerni konjugati sadašnjeg obelodanjivanja se primenjuju u dozama uglavnom od oko 10-160 mg/kg ili 20-160 mg/kg. U nekim slučajevima mogu biti potrebne doze veće od 160 mg/kg. Kod nekih otelotvorenja, doze za intravensku primenu su od oko 0,5 mg do 160 mg/kg. Kod nekih otelotvorenja, antisens oligomerni konjugati se primenjuju u dozama od oko 0,5 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg, 6 mg/kg, 7 mg/kg, 8 mg/kg, 9 mg/kg ili 10 mg/kg. Kod nekih otelotvorenja antisens oligomerni konjugati se primenjuju u dozama od oko 10 mg/kg, 11 mg/kg, 12 mg/kg, 15 mg/kg, 18 mg/kg, 20 mg/kg, 21 mg/kg, 25 mg/kg, 26 mg/kg, 27 mg/kg, 28 mg/kg, 29 mg/kg, 30 mg/kg, 31 mg/kg, 32 mg/kg, 33 mg/kg, 34 mg/kg, 35 mg/kg, 36 mg/kg, 37 mg/kg, 38 mg/kg, 39 mg/kg, 40 mg/kg, 41 mg/kg, 42 mg/kg, 43 mg/kg, 44 mg/kg, 45 mg/kg, 46 mg/kg, 47 mg/kg, 48 mg/kg, 49 mg/kg 50 mg/kg, 51 mg/kg, 52 mg/kg, 53 mg/kg, 54 mg/kg, 55 mg/kg, 56 mg/kg, 57 mg/kg, 58 mg/kg, 59 mg/kg, 60 mg/kg, 65 mg/kg, 70 mg/kg, 75 mg/kg, 80 mg/kg, 85 mg/kg, 90 mg/kg, 95 mg/kg, 100 mg/kg, 105 mg/kg, 110 mg/kg, 115 mg/kg, 120 mg/kg, 125 mg/kg, 130 mg/kg, 135 mg/kg, 140 mg/kg, 145 mg/kg, 150 mg/kg, 155 mg/kg, 160 mg/kg, uključujući sve cele brojeve između. Kod nekih otelotvorenja oligomer se daje u dozi od 10 mg/kg. Kod nekih otelotvorenja oligomer se daje u dozi od 20 mg/kg. Kod nekih otelotvorenja oligomer se daje u dozi od 30 mg/kg. Kod nekih otelotvorenja oligomer se daje u dozi od 40 mg/kg. Kod nekih otelotvorenja oligomer se daje u dozi od 60 mg/kg. Kod nekih otelotvorenja oligomer se daje u dozi od 80 mg/kg. Kod nekih otelotvorenja oligomer se daje u dozi od 160 mg/kg. Kod nekih otelotvorenja oligomer se daje u dozi od 50 mg/kg.
[0109] U nekim otelotvorenjima, antisens oligomerni konjugat formule (IV) ili njegova farmaceutski prihvatljiva so se daje u dozama uglavnom od oko 10-160 mg/kg ili 20-160 mg/kg. U nekim otelotvorenjima, doze antisens oligomernog konjugata formule (IV) ili njegove farmaceutski prihvatljive soli za intravensku primenu su od oko 0,5 mg do 160 mg/kg. U nekim otelotvorenjima, antisens oligomerni konjugat formule (IV) ili njegova farmaceutski prihvatljiva so se daje u dozama od oko 0,5 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg, 6 mg/kg, 7 mg/kg, 8 mg/kg, 9 mg/kg ili 10 mg/kg. Kod nekih otelotvorenja antisens oligomerni konjugati se primenjuju u dozama od oko 10 mg/kg, 11 mg/kg, 12 mg/kg, 15 mg/kg, 18 mg/kg, 20 mg/kg, 21 mg/kg, 25 mg/kg, 26 mg/kg, 27 mg/kg, 28 mg/kg, 29 mg/kg, 30 mg/kg, 31 mg/kg, 32 mg/kg, 33 mg/kg, 34 mg/kg, 35 mg/kg, 36 mg/kg, 37 mg/kg, 38 mg/kg, 39 mg/kg, 40 mg/kg, 41 mg/kg, 42 mg/kg, 43 mg/kg, 44 mg/kg, 45 mg/kg, 46 mg/kg, 47 mg/kg, 48 mg/kg, 49 mg/kg 50 mg/kg, 51 mg/kg, 52 mg/kg, 53 mg/kg, 54 mg/kg, 55 mg/kg, 56 mg/kg, 57 mg/kg, 58 mg/kg, 59 mg/kg, 60 mg/kg, 65 mg/kg, 70 mg/kg, 75 mg/kg, 80 mg/kg, 85 mg/kg, 90 mg/kg, 95 mg/kg, 100 mg/kg, 105 mg/kg, 110 mg/kg, 115 mg/kg, 120 mg/kg, 125 mg/kg, 130 mg/kg, 135 mg/kg, 140 mg/kg, 145 mg/kg, 150 mg/kg, 155 mg/kg, 160 mg/kg, uključujući sve cele brojeve između. U nekim otelotvorenjima, antisens oligomerni konjugat formule (IVI) ili njegova farmaceutski prihvatljiva so daje se u dozi od 10 mg/kg. U nekim otelotvorenjima, antisens oligomerni konjugat formule (IV) ili njegova farmaceutski prihvatljiva so daje se u dozi od 20 mg/kg. U nekim otelotvorenjima, antisens oligomerni konjugat formule (IV) ili njegova farmaceutski prihvatljiva so daje se u dozi od 30 mg/kg. U nekim otelotvorenjima, antisens oligomerni konjugat formule (IV) ili njegova farmaceutski prihvatljiva so daje se u dozi od 40 mg/kg. U nekim otelotvorenjima, antisens oligomerni konjugat formule (IV) ili njegova farmaceutski prihvatljiva so daje se u dozi od 60 mg/kg. U nekim otelotvorenjima, antisens oligomerni konjugat formule (IV) ili njegova farmaceutski prihvatljiva so daje se u dozi od 80 mg/kg. U nekim otelotvorenjima, antisens oligomerni konjugat formule (IV) ili njegova farmaceutski prihvatljiva so daje se u dozi od 160 mg/kg. U nekim otelotvorenjima, antisens oligomerni konjugat formule (IV) ili njegova farmaceutski prihvatljiva so daje se u dozi od 50 mg/kg.
[0110] Po želji, efikasna dnevna doza aktivnog jedinjenja može se primeniti kao dve, tri, četiri, pet, šest ili više pod-doza primenjenih odvojeno u odgovarajućim intervalima tokom dana, opciono, u jediničnim doznim formama. U određenim situacijama, doziranje je jedna primena dnevno. U određenim otelotvorenjima, doziranje je jedna ili više primena na svaka 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 dana, ili na svakih 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 nedelja, ili na svakih 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 meseci, po potrebi, kako bi se održao željena ekspresija funkcionalnog proteina distrofina. U određenim otelotvorenjima, doziranje je jedna ili više primena jednom u dve nedelje. U nekim otelotvorenjima, doziranje je jedna primena jednom u dve nedelje. U raznim otelotvorenjima, doziranje je jedna ili više primena svakog meseca. U određenim otelotvorenjima, doziranje je jedna primena svakog meseca.
[0111] U različitim otelotvorenjima, antisens oligomerni konjugati se primenjuju nedeljno u dozi od 10 mg/kg. Kod različitih otelotvorenja, antisens oligomerni konjugati se primenjuju jednom nedeljno u dozi od 20 mg/kg. U raznim otelotvorenjima, antisens oligomerni konjugati se primenjuju nedeljno u dozi od 30 mg/kg. Kod različitih otelotvorenja, antisens oligomerni konjugati se primenjuju jednom nedeljno u dozi od 40 mg/kg. Kod nekih otelotvorenja, antisens oligomerni konjugati se primenjuju jednom nedeljno u dozi od 60 mg/kg. Kod nekih otelotvorenja, antisens oligomerni konjugati se primenjuju nedeljno u dozi od 80 mg/kg. Kod nekih otelotvorenja, antisens oligomerni konjugati se primenjuju nedeljno u dozi od 100 mg/kg. U raznim otelotvorenjima, antisens oligomerni konjugati se primenjuju nedeljno u dozi od 160 mg/kg. Kao što se ovde koristi, pod nedeljno se podrazumeva da ima stručno prihvaćeno značenje svake nedelje.
4
[0112] U različitim otelotvorenjima, antisens oligomerni konjugati se primenjuju dvonedeljno u dozi od 10 mg/kg. Kod različitih otelotvorenja, antisens oligomerni konjugati se primenjuju dvonedeljno u dozi od 20 mg/kg. U raznim otelotvorenjima, antisens oligomerni konjugati se primenjuju dvonedeljno u dozi od 30 mg/kg. Kod različitih otelotvorenja, antisens oligomerni konjugati se primenjuju dvonedeljno u dozi od 40 mg/kg. Kod nekih otelotvorenja, antisens oligomerni konjugati se primenjuju dvonedeljno u dozi od 60 mg/kg. Kod nekih otelotvorenja, antisens oligomerni konjugati se primenjuju dvonedeljno u dozi od 80 mg/kg. Kod nekih otelotvorenja, antisens oligomerni konjugati se primenjuju dvonedeljno u dozi od 100 mg/kg. U nekim otelotvorenjima, antisens oligomerni konjugati se primenjuju dvonedeljno u dozi od 160 mg/kg. Kao što se ovde koristi, pod dvonedeljno se podrazumeva da ima značenje koje se prihvata u struci svake dve nedelje.
[0113] U različitim otelotvorenjima, antisens oligomerni konjugati se primenjuju svake treće nedelje u dozi od 10 mg/kg. Kod različitih otelotvorenja, antisens oligomerni konjugati se primenjuju svake treće nedelje u dozi od 20 mg/kg. Kod različitih otelotvorenja, antisens oligomerni konjugati se primenjuju svake treće nedelje u dozi od 30 mg/kg. Kod različitih otelotvorenja, antisens oligomerni konjugati se primenjuju svake treće nedelje u dozi od 40 mg/kg. Kod nekih otelotvorenja, antisens oligomerni konjugati se primenjuju svake treće nedelje u dozi od 60 mg/kg. Kod nekih otelotvorenja, antisens oligomerni konjugati se primenjuju svake treće nedelje u dozi od 80 mg/kg. Kod nekih otelotvorenja, antisens oligomerni konjugati se primenjuju svake treće nedelje u dozi od 100 mg/kg. Kod nekih otelotvorenja, antisens oligomerni konjugati se primenjuju svake treće nedelje u dozi od 160 mg/kg. Kao što se ovde koristi, pod svaka treća nedelja podrazumeva se da ima stručno prihvaćeno značenje jednom u tri nedelje.
[0114] U različitim otelotvorenjima, antisens oligomerni konjugati se primenjuju mesečno u dozi od 10 mg/kg. Kod različitih otelotvorenja, antisens oligomerni konjugati se primenjuju mesečno u dozi od 20 mg/kg. U raznim otelotvorenjima, antisens oligomerni konjugati se primenjuju mesečno u dozi od 30 mg/kg. Kod različitih otelotvorenja, antisens oligomerni konjugati se primenjuju mesečno u dozi od 40 mg/kg. Kod nekih otelotvorenja, antisens oligomerni konjugati se primenjuju mesečno u dozi od 60 mg/kg. Kod nekih otelotvorenja, antisens oligomerni konjugati se primenjuju mesečno u dozi od 80 mg/kg. Kod nekih otelotvorenja, antisens oligomerni konjugati se primenjuju mesečno u dozi od 100 mg/kg. U raznim otelotvorenjima, antisens oligomerni konjugati se primenjuju mesečno u dozi od 160 mg/kg. Kao što se ovde koristi, pod mesečno se podrazumeva da ima stručno prihvaćeno značenje svakog meseca.
[0115] Kao što se podrazumeva u struci, nedeljne, dvonedeljne, svake treće nedelje ili mesečne primene mogu biti u jednoj ili više primena ili pod-doza kako je ovde navedeno.
[0116] Molekuli nukleinske kiseline i antisens oligomerni konjugati opisani u ovom dokumentu mogu se primeniti na ćelije raznim metodama koje su poznate u struci, uključujući, ali ne ograničavajući se na, inkapsulaciju u liposomima, jontoforezom ili inkorporacijom u druge nosioce, kao što su hidrogelovi, ciklodekstrini, biorazgradive nanokapsule i bioadhezivne mikrosfere, kako je opisano u ovom dokumentu i poznato u stanju tehnike. U određenim otelotvorenjima, mikroemulzifikaciona tehnologija se može koristiti za poboljšanje bioraspoloživosti lipofilnih (vodonerastvorljivih) farmaceutskih agenasa. Primeri uključuju Trimetrin (Dordunoo, S. K., et al., Drug Development and Industrial Pharmacy, 17(12), 1685-1713, 1991) i REV 5901 (Sheen, P. C., et al., J Pharm Sci 80(7), 712-714, 1991). Između ostalih pogodnosti, mikroemulzifikacija obezbeđuje povećanu bioraspoloživost putem preferencijalnog usmeravanja apsorpcije na limfni sistem umesto na cirkulacioni sistem, koji time zaobilazi jetru, i sprečava destrukciju jedinjenja u hepatobilijarnoj cirkulaciji.
[0117] U jednom vidu obelodanjivanja, formulacije sadrže micele formirane od oligomera kako je ovde predviđeno i najmanje jedan amfifilni nosač, u kojem micele imaju prosečan prečnik manji od oko 100 nm. Poželjnija otelotvorenja obezbeđuju micele sa prosečnim prečnikom manjim od oko 50 nm, a još poželjnija otelotvorenja obezbeđuju micele sa prosečnim prečnikom manjim od oko 30 nm, ili čak manjim od oko 20 nm.
[0118] Dok se razmišlja o svim odgovarajućim amfifilnim nosačima, trenutno poželjni nosači su generalno oni koji imaju status generalno-priznati-kao-bezbedni (GRAS), i koji mogu da solubilizuju antisens oligomerni konjugat sadašnjeg obelodanjivanja i mikroemulgiraju ga u kasnijoj fazi kada rastvor dođe u kontakt sa kompleksnom vodenom fazom (kao što je ona koja se nalazi u ljudskom gastro-intestinalnom traktu). Obično amfifilni sastojci koji zadovoljavaju ove zahteve imaju HLB (balans hidrofilno prema lipofilnom) vrednosti od 220, a njihove strukture sadrže ravnolančane alifatske radikale u rasponu od C-6 do C-20. Primeri su polietilen-glikolizovani masni gliceridi i polietilen glikoli.
[0119] Primeri amfifilnih nosača uključuju zasićene i mono-nezasićene polietilenglikolizovane gliceride masnih kiselina, kao što su oni koji su dobijeni iz potpuno ili delimično hidrogenizovanih različitih biljnih ulja. Takva ulja se mogu sastojati od glicerida tri-, di- i mono-masnih kiselina i di- i mono-poli (etilen glikol) estara odgovarajućih masnih kiselina, sa posebno poželjnim sastavom masnih kiselina uključujući kaprinsku kiselinu 4-10%, kaprinsku kiselinu 3-9%, laurinsku kiselinu 40-50%, miristinsku kiselinu 14-24%, palmitinsku kiselinu 4-14% i stearinsku kiselinu 5-15%. Druga korisna klasa amfifilnih nosača obuhvata delimično esterifikovani sorbitan i/ili sorbitol, sa zasićenim ili mononezasićenim masnim kiselinama (SPAN-serija) ili odgovarajućim etoksiliranim analozima (TWEEN-serija).
[0120] Komercijalno dostupni amfifilni nosači mogu biti posebno korisni, uključujući Gelucire serije, Labrafil, Labrasol ili Lauroglycol (sve proizvodi i distribuira Gattefosse Corporation, Saint Priest, France), PEG-mono-oleat, PEG-di-oleat, PEG-mono-laurate i dilaurate, Lecithin, Poysorbate 80, itd. (proizvode i distribuiraju brojne kompanije u SAD i širom sveta).
[0121] U određenim otelotvorenjima, do isporuke može doći upotrebom liposoma, nanokapsula, mikročestica, mikrosfera, lipidnih čestica i vezikula, za uvođenje farmaceutskih sastava ovog obelodanjivanja u odgovarajuće ćelije domaćina. Konkretno, farmaceutski sastavi ovog obelodanjivanja mogu se formulisati za isporuku kao inkapsulirani u lipidnoj čestici, liposomu, vezikuli, nanosferi, nanočestici ili slično. Formulacija i upotreba takvih dostavnih nosilaca može se izvesti korišćenjem poznatih i konvencionalnih tehnika.
[0122] Hidrofilni polimeri pogodni za upotrebu u ovom obelodanjivanju su oni koji su lako rastvorljivi u vodi, mogu se kovalentno vezati za lipid koji formira vezikulu i koji su tolerantni in vivo bez toksičnih efekata (tj. biokompatibilni su). Pogodni polimeri uključuju poli(etilen glikol) (PEG), polilaktik (takođe nazvan polilaktid), poliglikolnu kiselinu (takođe nazvanu poliglikolid), kopolimer polimlečna-poliglikolna kiselina i polivinil alkohol. U određenim otelotvorenjima, polimeri imaju prosečnu molekulsku težinu od oko 100 ili 120 daltona do oko 5.000 ili 10.000 daltona, ili od oko 300 daltona do oko 5.000 daltona. U
4
drugim otelotvorenjima, polimer je poli(etilenglikol) sa prosečnom molekulskom težinom od oko 100 do oko 5.000 daltona, ili sa prosečnom molekulskom težinom od oko 300 do oko 5.000 daltona. U određenim otelotvorenjima, polimer je poli(etilen glikol) sa prosečnom molekulskom težinom od oko 750 daltona, na primer PEG(750). Polimeri se takođe mogu definisati brojem monomera u njima; poželjno otelotvorenje sadašnjeg obelodanjivanja koristi polimere od najmanje tri monomera, a takvi PEG polimeri koji se sastoje od tri monomera imaju molekulsku masu od približno 132 daltona.
[0123] Ostali hidrofilni polimeri koji mogu biti pogodni za upotrebu u ovom obelodanjivanju uključuju polivinilpirolidon, polimetoksazolin, polietiloksazolin, polihidroksipropil metakrilamid, polimetakrilamid, polidimetilakrilamid i derivatne celuloze kao što su hidroksimetilceluloza ili hidroksietilceluloza.
[0124] U određenim otelotvorenjima, formulacija sadašnjeg obelodanjivanja obuhvata biokompatibilni polimer izabran iz grupe koju čine poliamidi, polikarbonati, polialkileni, polimeri akrilnih i metakrilnih estara, polivinil polimeri, poliglikolidi, polisiloksani, poliuretani i njihovi kopolimeri, celuloza, polipropilen, polietileni, polistiren, polimeri mlečne kiseline i glikolne kiseline, polianhidridi, poli(orto)esteri, poli(butinska kiselina), poli(valerijanska kiselina), poli(laktid-koprolaktoni), polisaharidi, proteini, polihijaluronske kiseline, policijanoakrilati i njihove mešavine, smeše ili kopolimeri.
[0125] Ciklodekstrini su ciklični oligosaharidi, koji se sastoje od 6, 7 ili 8 jedinica glukoze, označenih grčkim slovom α, β ili γ. Jedinice glukoze su povezane α-1,4-glukozidnim vezama. Kao posledica konformacije stolice šećernih jedinica, sve sekundarne hidroksilne grupe (na C-2, C-3) nalaze se na jednoj strani prstena, dok su sve primarne hidroksilne grupe na C-6 smeštene na drugoj strani. Kao rezultat toga, spoljne površine su hidrofilne, što ciklodekstrin čini rastvorljivim u vodi. Nasuprot tome, šupljine ciklodekstrina su hidrofobne, jer su obložene vodonikom atoma C-3 i C-5, i atomima etarskog kiseonika. Ove matrice omogućavaju kompleksiranje sa raznim relativno hidrofobnim jedinjenjima, uključujući, na primer, steroidna jedinjenja kao što je 17α-estradiol (vidi, npr., van Uden et al. Plant Cell Tiss. Org. Cult.38:1-3-113 (1994)). Kompleksiranje se odigrava putem Van der Valsovih interakcija i formiranjem vodonične veze. Za opšti pregled hemije ciklodekstrina, vidi, Wenz, Agnew. Chem. Int. – Ed. Engl., 33:803-822 (1994).
[0126] Fizičko-hemijska svojstva derivata ciklodekstrina snažno zavise od vrste i stepena supstitucije. Na primer, njihova rastvorljivost u vodi se kreće od nerastvorljivog (npr. triacetilbeta-ciklodekstrin) do 147% rastvorljivog (m/v) (G-2-beta-ciklodekstrin). Pored toga, oni su rastvorljivi u mnogim organskim rastvaračima. Svojstva ciklodekstrina omogućavaju kontrolu nad rastvorljivošću različitih komponenti formulacije povećanjem ili smanjenjem njihove rastvorljivosti.
[0127] Opisani su brojni ciklodekstrini i metode za njihovu pripremu. Na primer, Parmeter (I), et al. SAD Pat. br.3,453,259) i Gramera, et al. SAD Pat. br.3,459,731) opisanih elektroneutralnih ciklodekstrina. Ostali derivati uključuju ciklodekstrine sa katjonskim svojstvima [Parmeter (II), SAD Pat. Br.3,453,257], nerastvorljive umrežene ciklodekstrine (Solms, SAD Pat. Br.3,420,788), i ciklodekstrine sa anjonskim svojstvima [Parmeter (III), SAD Pat. Br.3.426.011]. Među derivatima ciklodekstrina sa anjonskim svojstvima, karboksilne kiseline, fosforaste kiseline, fosfinaste kiseline, fosfonske kiseline, fosforne kiseline, tiofosfonske kiseline, tiosulfinske kiseline i sulfonske kiseline dodate su u osnovni ciklodekstrin [videti, Parmeter (III), supra]. Nadalje, derivate sulfoalkil eter ciklodekstrina su opisali Stella, et al. (SAD Pat. Br.5,134,127).
[0128] Liposomi se sastoje od najmanje jedne lipidne dvoslojne membrane koja okružuje vodenu unutrašnju komoru. Liposomi se mogu karakterisati po tipu membrane i po veličini. Male jednoslojne vezikule (SUV) imaju jednu membranu i obično se kreću u rasponu između 0,02 i 0,05 µm u prečniku; velike jednoslojne vezikule (LUV) su obično veće od 0,05 µm. Oligoslojne velike vezikule i višeslojne vezikule imaju višestruke, obično koncentrične, membranske slojeve i obično su veće od 0,1 µm. Lipozomi sa nekoliko nekoncentričnih membrana, tj. nekoliko manjih vezikula koje se nalaze unutar veće vezikule, nazivaju se multivezikularne vezikule.
[0129] Jedan vid ovog obelodanjivanja odnosi se na formulacije koje sadrže liposome koji sadrže antisens oligomerni konjugat ovog obelodanjivanja, gde je membrana liposoma formulisana tako da obezbedi liposom sa povećanim kapacitetom nosivosti. Alternativno ili dodatno, antisens oligomerni konjugat ovog obelodanjivanja može biti sadržan unutar ili adsorbovan na liposomski dvosloj liposoma. Antisens oligomerni konjugat ovog obelodanjivanja može biti agregiran sa lipidnim površinski aktivnim sredstvom i nošen unutar
4
unutrašnjeg prostora liposoma; u tim slučajevima, membrana liposoma je formulisana da se odupre remetilačkim efektima aktivnog agensa - površinski aktivnog agregata.
[0130] Prema jednom otelotvorenju sadašnjeg obelodanjivanja, lipidni dvosloj liposoma sadrži lipide izvedene iz poli(etilen glikola) (PEG), tako da se PEG lanci protežu od unutrašnje površine lipidnog dvosloja u unutrašnji prostor inkapsuliran liposomomom, i protežu se od spoljašnjosti lipidnog dvosloja u okolnu sredinu.
[0131] Aktivna sredstva sadržana u liposomima sadašnjeg obelodanjivanja su u rastvorljivom obliku. Agregati surfaktanta i aktivnog agensa (kao što su emulzije ili micele koje sadrže aktivni agens od interesa) mogu biti zarobljeni unutar unutrašnjeg prostora liposoma u skladu sa ovim obelodanjivanjem. Surfaktant deluje na dispergovanje i rastvaranje aktivnog agensa i može biti izabran iz grupe koju čine bilo koji odgovarajući alifatični, cikloalifatični ili aromatični surfaktant, uključujući, ali ne ograničavajući se na biokompatibilne lizofosfatidilholine (LPG) različitih dužina lanca (na primer, od oko C14 do oko C20). Lipidi izvedeni iz polimera kao što su PEG-lipidi takođe se mogu koristiti za formiranje micela jer će delovati na inhibiciju fuzije micela/membrane, a pošto dodavanje polimera molekulima površinski aktivnih materija smanjuje CMC površinski aktivne materije i pomaže u formiranju micela. Poželjne su površinski aktivne supstance sa CMO u mikromolarnom rasponu; više CMC površinski aktivne supstance mogu se koristiti za pripremu micela zarobljenih u liposomima ovog obelodanjivanja.
[0132] Liposomi prema ovom obelodanjivanju mogu biti pripremljeni bilo kojom od različitih tehnika koje su poznate u struci. Vidi, npr. SAD Pat. Br.4.235.871; objavljena PCT prijava WO 96/14057; New RRC, Liposomes: A practical approach, IRL Press, Oxford (1990), pages 33-104; i Lasic DD, Liposomes from physics to applications, Elsevier Science Publishers BV, Amsterdam, 1993. Na primer, liposomi sadašnjeg obelodanjivanja mogu se pripremiti difuzijom derivatizovanog lipida sa hidrofilnim polimerom u prethodno formirane liposome, kao što je izlaganjem prethodno formiranih liposoma micelama sastavljenim od lipidno presađenih polimera, u koncentracijama lipida koje odgovaraju finalnom molskom procentu derivatizovanog lipida koji je poželjan u liposomu. Liposomi koji sadrže hidrofilni polimer mogu se formirati i tehnikama homogenizacije, hidratacije lipidnog polja ili ekstruzije, kao što je poznato u struci.
4
[0133] U drugom primernom postupku formulisanja, aktivni agens se prvo disperguje sonifikacijom u lizofosfatidilholinu ili drugom površinski aktivnom sredstvu sa niskom vrednošću CMC (uključujući polimerno kalemljene lipide) koji lako solubilizuje hidrofobne molekule. Nastala micelarna suspenzija aktivnog sredstva se zatim koristi za rehidrataciju osušenog uzorka lipida koji sadrži odgovarajući molski procenat polimerno-kalemljenog lipida ili holesterola. Suspenzija lipida i aktivnog agensa se zatim formira u liposome koristeći tehnike ekstruzije kao što je poznato u struci, a nastali liposomi su separisani od neinkapsuliranog rastvora putem standardne separacije u koloni.
[0134] U jednom vidu ovog obelodanjivanja, liposomi su pripremljeni tako da imaju u suštini homogene veličine u odabranom rasponu veličina. Jedna efikasna metoda dimenzionisanja uključuje ekstrudiranje vodene suspenzije liposoma kroz niz polikarbonatnih membrana koje imaju izabranu uniformnu veličinu pora; veličina pora membrane će približno odgovarati najvećim veličinama liposoma proizvedenih ekstrudiranjem kroz tu membranu. Vidi, npr. SAD Pat. Br.4,737,323 (Apr.12, 1988). U određenim otelotvorenjima, reagensi kao što su DharmaFECT<®>i Lipofectamine<®>mogu se koristiti za unošenje polinukleotida ili proteina u ćelije.
[0135] Karakteristike otpuštanja formulacije ovog obelodanjivanja zavise od inkapsulirajućeg materijala, koncentracije inkapsuliranog leka i prisustva modifikatora otpuštanja. Na primer, oslobađanjem se može manipulisati tako da bude zavisno od pH, na primer, korišćenjem prevlake osetljive na pH koja oslobađa samo pri niskom pH, kao u želucu, ili višem pH, kao u crevima. Enterička prevlaka se može koristiti da se spreči otpuštanje dok ne prođe kroz želudac. Višestruke prevlake ili smeše cijanamida inkapsulirane u različitim materijalima mogu se koristiti za dobijanje početnog oslobađanja u želucu, nakon čega sledi kasnije oslobađanje u crevima. Oslobađanjem se takođe može manipulisati putem uključivanja soli ili sredstava za formiranje pora, što može povećati apsorpciju vode ili oslobađanje leka difuzijom iz kapsule. Pomoćne supstance koje modifikuju rastvorljivost leka takođe se mogu koristiti za kontrolu brzine oslobađanja. Mogu se ugraditi i agensi koji pojačavaju degradaciju matrice ili oslobađanje iz matrice. Oni se mogu dodati leku, dodati kao zasebna faza (tj. kao čestice), ili se mogu ko-rastvoriti u polimernoj fazi u zavisnosti od jedinjenja. U većini slučajeva količina treba da bude između 0,1 i 30 procenata (tež./tež. polimera). Vrste pojačivača razgradnje uključuju neorganske soli kao što su amonijum sulfat i amonijum hlorid, organske kiseline kao što su limunska kiselina, benzoeva kiselina i askorbinska
4
kiselina, neorganske baze kao što su natrijum karbonat, kalijum karbonat, kalcijum karbonat, cink karbonat i cink hidroksid, i organske baze kao što su protamin sulfat, spermin, holin, etanolamin, dietanolamin i trietanolamin i površinski aktivne supstance kao što su Tween<®>i Pluronic<®>. Kao čestice se dodaju sredstva za formiranje pora koja dodaju mikrostrukturu matricama (tj. jedinjenja rastvorljiva u vodi kao što su neorganske soli i šećeri). Raspon je obično između jedan i trideset procenata (tež./tež. polimera).
[0136] Apsorpcijom se takođe može manipulisati putem promene vremena boravka čestica u crevima. To se može postići, na primer, prevlačenjem čestice sa, ili izborom kao inkapsulirajućeg materijala, mukozno adhezivnim polimerom. Primeri uključuju većinu polimera sa slobodnim karboksilnim grupama, kao što su hitozan, celuloze, a posebno poliakrilati (kao što se ovde koristi, poliakrilati se odnose na polimere koji uključuju akrilatne grupe i modifikovane akrilatne grupe kao što su cijanoakrilati i metakrilati).
[0137] Antisens oligomerni konjugat može biti formulisan da bude sadržan unutar, ili prilagođen za oslobađanje hirurškim ili medicinskim uređajem ili implantatom. U određenim vidovima, implantat može biti prevučen ili na drugi način tretiran antisens oligomernim konjugatom. Na primer, hidrogelovi ili drugi polimeri, kao što su biokompatibilni i/ili biorazgradivi polimeri, mogu se koristiti za oblaganje implantata farmaceutskim sastavom ovog obelodanjivanja (tj. sastav se može prilagoditi za upotrebu sa medicinskim uređajem pomoću hidrogela ili drugog polimera). Polimeri i kopolimeri za oblaganje medicinskih uređaja nekim sredstvom dobro su poznati u struci. Primeri implantata uključuju, ali nisu ograničeni na, stentove, stentove koji eluiraju lekove, hirurške šavove, proteze, vaskularne katetere, katetere za dijalizu, vaskularne transplantate, protetske srčane zaliske, srčane pejsmejkere, implantabilne kardioverter defibrilatore, IV igle, uređaje za podešavanje i formiranje kostiju, kao što su igle, vijci, ploče i drugi uređaji, i veštačke matrice tkiva za zarastanje rana.
[0138] Pored metoda predviđenih u ovom dokumentu, antisens oligomerni konjugati za upotrebu u skladu sa obelodanjivanjem mogu se formulisati za primenu na bilo koji pogodan način za upotrebu u humanoj ili veterinarskoj medicini, po analogiji sa drugim farmaceutskim proizvodima. Antisens oligomer konjugati i njihove odgovarajuće formulacije mogu se primenjivati samostalno ili u kombinaciji sa drugim terapijskim strategijama u tretiranju mišićne distrofije, kao što su transplantacija mioblasta, terapije matičnim ćelijama, primena
4
aminoglikozidnih antibiotika, inhibitora proteasoma i terapija pozitivne regulacije (npr. pozitivna regulacija utrofina, autosomnog paraloga distrofina).
[0139] U nekim otelotvorenjima, dodatna terapijska sredstva mogu se primeniti pre, istovremeno ili naknadno po primeni antisens oligomernog konjugata ovog obelodanjivanja. Na primer, antisens oligomerni konjugati mogu se primeniti u kombinaciji sa steroidom i/ili antibiotikom. U određenim otelotvorenjima, antisens oligomerni konjugati se daju pacijentu koji je na osnovnoj teoriji steroida (npr. intermitentna ili hronična/kontinuirana terapija na bazi steroida). Na primer, u nekim otelotvorenjima pacijent je tretiran kortikosteroidom pre primene antisens oligomera i nastavlja da prima terapiju steroidima. Kod nekih otelotvorenja, steroid je glukokortikoid ili prednizon.
[0140] Opisani putevi primene su namenjeni samo kao vodič jer će kvalifikovani praktičar moći lako da odredi optimalnu rutu primene i bilo koju dozu za bilo koju određenu životinju i stanje. Pokušani su višestruki pristupi za uvođenje funkcionalnog novog genetičkog materijala u ćelije, kako in vitro tako i in vivo (Friedmann (1989) Science, 244:1275-1280). Ovi pristupi uključuju integraciju gena koji se eksprimiraju u modifikovane retroviruse (Friedmann (1989) supra; Rosenberg (1991) Cancer Research 51(18), suppl.: 5074S-5079S); integraciju u neretrovirusne vektore (npr. adeno-asocirane virusne vektore) (Rosenfeld, et al. (1992) Cell, 68:143-155; Rosenfeld, et al. (1991) Science, 252: 431-434); ili isporuku transgena povezanog sa heterolognim elementom promotor-pojačivačem putem liposoma (Friedmann (1989), supra; Brigham, et al. (1989) Am. J. Med. Sci., 298:278-281; Nabel, et al. (1990) Science, 249:1285-1288; Hazinski, et al. (1991) Am. J. Resp. Cell Molecul. Biol., 4:206-209; i Wang and Huang (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 84: 7851-7855); kuplovan sa ligandspecifičnim transportnim sistemima na bazi katjona (Wu and Wu (1988) J. Biol. Chem., 263:14621-14624) ili upotreba gole DNK, vektora ekspresije (Nabel et al. (1990), supra; Wolff et al. (1990) Science, 247:1465-1468). Direktno injektiranje transgena u tkivo proizvodi samo lokalizovanu ekspresiju (Rosenfeld (1992) supra; Rosenfeld et al. (1991) supra; Brigham et al. (1989) supra; Nabel (1990) supra; i Hazinski et al. (1991) supra). Grupa Brigham et al. (Am. J. Med. Sci. (1989) 298: 278-281 i Clinical Research (1991) 39 (abstract)) su prijavili in vivo transfekciju samo pluća miševa nakon intravenske ili intratrahealne primene kompleksa DNK liposoma. Primer preglednog članka o postupcima humane genske terapije je: Anderson, Science (1992) 256:808-813.
4
[0141] U daljem otelotvorenju, farmaceutski sastavi obelodanjivanja mogu dodatno sadržati ugljeni hidrat kako je predviđeno u Han et al., Nat. Comms. 7, 10981 (2016). U nekim otelotvorenjima, farmaceutski sastavi obelodanjivanja mogu sadržati 5% ugljenog hidrata heksoze. Na primer, farmaceutski sastav obelodanjivanja može da sadrži 5% glukoze, 5% fruktoze ili 5% manoze. U određenim otelotvorenjima, farmaceutski sastavi obelodanjivanja mogu sadržati 2,5% glukoze i 2,5% fruktoze. U nekim otelotvorenjima, farmaceutski sastavi obelodanjivanja mogu obuhvatati ugljeni hidrat izabran iz grupe koju čine: arabinoza prisutna u količini od 5% zapreminskih, glukoza prisutna u količini od 5% zapreminskih, sorbitol prisutan u količini od 5% zapreminskih, galaktoza prisutna u količini od 5% zapreminskih, fruktoza prisutna u količini od 5% zapreminskih, ksilitol prisutan u količini od 5% zapreminskih, manoza prisutna u količini od 5% zapreminskih, kombinacije glukoze i fruktoze prisutna u količini od 2,5% zapreminskih, i kombinacija glukoze prisutne u količini od 5,7% zapreminskih, fruktoze prisutne u količini od 2,86% zapreminskih, i ksilitola prisutnog u količini od 1,4% zapreminskih.
IV. Upotrebe
Obnavljanje okvira čitanja distrofina korišćenjem preskakanja egzona
[0142] Potencijalni terapeutski pristup tretiranju DMD koji je izazvan mutacijama van okvira u distrofin genu sugeriše blaži oblik distrofinopatije poznat kao BMD, koji je izazvan mutacijama u okviru. Sposobnost pretvaranja mutacije van okvira u mutaciju u okviru bi hipotetički sačuvala okvir čitanja iRNK i proizvela interno skraćeni, ali funkcionalni distrofin protein. Antisens oligomerni konjugati obelodanjivanja su dizajnirani da to postignu.
[0143] Hibridizacija PMO sa ciljanom pre-iRNK sekvencom ometa formiranje kompleksa prekrajanja pre-iRNK i briše egzon 51 iz zrele iRNK. Struktura i konformacija antisens oligomernih konjugata obelodanjivanja omogućavaju sparivanje baza specifičnih za sekvencu sa komplementarnom sekvencom. Po sličnom mehanizmu, na primer, eteplirsen, koji je PMO koji je dizajniran da preskoči egzon 51 distrofin pre-iRNK, omogućava uparivanje baza specifičnih za sekvencu sa komplementarnom sekvencom sadržanom u egzonu 51 distrofin pre-iRNK.
[0144] Normalni distrofin iRNK koji sadrži svih 79 egzona će proizvesti normalni distrofinski protein. Grafika na slici 1 prikazuje mali deo distrofina pre-iRNK i zrele iRNK, od egzona 47 do egzona 53. Oblik svakog egzona prikazuje kako su kodoni podeljeni između egzona; napomena, jedan kodon se sastoji od tri nukleotida. Egzoni pravougaonog oblika počinju i završavaju se potpunim kodonima. Egzoni u obliku strele počinju sa potpunim kodonom, ali se završavaju sa razdvojenim kodonom, koji sadrži samo nukleotid #1 kodona. Nukleotidi #2 i #3 ovog kodona su sadržani u sledećem egzonu koji će početi sa oblikom simbola.
[0145] iRNK distrofina kojoj nedostaju čitavi egzoni iz gena distrofina po pravilu dovodi do DMD. Grafika na slici 2 ilustruje vrstu genetske mutacije (deleciju egzona 50) za koju se zna da dovodi do DMD. Pošto se egzon 49 završava u potpunom kodonu, a egzon 51 počinje drugim nukleotidom kodona, okvir čitanja posle egzona 49 je pomeren, što rezultira vanokvirnim okvirom čitanja iRNK i inkorporacijom netačnih aminokiselina nizvodno od mutacije. Naknadno odsustvo funkcionalnog C-terminala domena vezivanja distroglikana rezultira stvaranjem nestabilnog distrofin proteina.
[0146] Eteplirsen preskače egzon 51 da bi obnovio okvir čitanja iRNK. Pošto se egzon 49 završava u potpunom kodonu, a egzon 52 počinje sa prvim nukleotidom kodona, delecija egzona 51 obnavlja okvir čitanja, što rezultira proizvodnjom interno skraćenog distrofin proteina sa intaktnim mestom vezivanja distroglikana, slično BMD mutaciji " u okviru" (Sl.
3).
[0147] Izvodljivost ublažavanja DMD fenotipa korišćenjem preskakanja egzona za obnavljanje otvorenog okvira čitanja distrofin iRNK je podržana nekliničkim istraživanjima. Brojne studije u modelima distrofičnih životinja DMD-a pokazale su da obnavljanje distrofina preskakanjem egzona dovodi do pouzdanih poboljšanja mišićne snage i funkcije (Sharp 2011; Yokota 2009; Wu 2008; Wu 2011; Barton-Davis 1999; Goyenvalle 2004; Gregorevic 2006; Yue 2006; Welch 2007; Kawano 2008; Reay 2008; van Putten 2012). Ubedljiv primer za to dolazi iz studije u kojoj su nivoi distrofina nakon terapije preskakanja egzona (primenom PMO) upoređeni sa funkcijom mišića u istom tkivu. Kod distrofičnih mdx miševa, tibialis anterior (TA) mišići tretirani sa PMO specifičnim za miševe održali su ~75% maksimalnog kapaciteta sile nakon kontrakcija koje izaziva stres, dok su netretirani kontralateralni TA mišići održali samo ~25% svog maksimalnog kapaciteta sile (p <0,05) (Sharp 2011). U drugoj studiji, 3 distrofična psa sa CXMD primila su, u uzrastu od 2-5 meseci, terapiju preskakanja egzona koristeći PMO specifičnu za njihovu genetsku mutaciju jednom nedeljno tokom 5 do 7 nedelja ili svake druge nedelje tokom 22 nedelje. Nakon terapije preskakanja egzona, sva 3 psa su pokazala opsežnu, telesnu ekspresiju distrofina u skeletnim mišićima, kao i održanu ili
1
poboljšanu ambulaciju (15 m test trčanja) u odnosu na početnu vrednost. Nasuprot tome, netretirani psi odgovarajućeg uzrasta sa CXMD pokazali su značajno smanjenje ambulacije tokom ispitivanja (Yokota 2009).
[0148] Pokazalo se da PMO imaju više aktivnosti preskakanja egzona u ekvimolarnim koncentracijama od fosforotioata i u mdx miševa i u humanizovanom DMD (hDMD) mišjem modelu, koji eksprimira celokupni humani DMD transkript (Heemskirk 2009). In
vitro eksperimenti koristeći lančanu reakciju reverzne transkripcije polimeraze (RT-PCR) i Western blot (WB) u normalnim humanim ćelijama skeletnih mišića ili mišićnim ćelijama pacijenata sa DMD-om sa različitim mutacijama koje su podložne preskakanju egzona 51 identifikovali su eteplirsen (PMO) kao snažan induktor preskakanja egzona 51. Eteplirsenom indukovano preskakanje egzona 51 je potvrđeno in vivo u hDMD mišjem modelu (Arechavala-Gomeza 2007).
[0149] Klinički ishodi za analizu efekta antisens oligomernog konjugata koji je komplementaran ciljnom regionu egzona 51 humane pre-iRNK distrofina i indukuje preskakanje egzona 51 uključuju procentualna distrofin pozitivna vlakna (PDPF), šestominutni test hoda (6MWT), gubitak ambulacije (LOA), procenu ambulacije North Star (NSAA), testove pučmonalne funkcije (PFT), sposobnost podizanja (iz ležećeg položaja) bez spoljne podrške, proizvodnju de novo distrofina i druga funkcionalna merenja.
[0150] U nekim otelotvorenjima, sadašnje obelodanjivanje pruža antisens oligomerne konjugate kao što je gore navedeno i njihove sastave za upotrebu u proizvodnji distrofina kod ispitanika sa mutacijom gena distrofina koji je podložan preskakanju egzona 51. U određenim otelotvorenjima, ovo obelodanjivanje pruža antisens oligomerne konjugate kao što je gore navedeno i njihove sastave za upotrebu u obnavljanju okvira čitanja iRNK za indukovanje proizvodnje distrofin proteina u ispitaniku sa Dišenovom mišićnom distrofijom (DMD) koji ima mutaciju gena distrofina koja je podložna preskakanju egzona 51. Proizvodnja proteina se može meriti lančanom reakcijom reverzne transkripcije polimeraze (RT-PCR), analizom Western blot ili imunohistohemijom (IHC).
[0151] U nekim otelotvorenjima, sadašnje obelodanjivanje pruža antisens oligomerne konjugate kao što je gore navedeno i njihove sastave za upotrebu u tretiranju DMD kod ispitanika kome je isti potreban, pri čemu ispitanik ima mutaciju gena distrofina koja je
2
podložna preskakanju egzona 51. U različitim otelotvorenjima, tretiranje ispitanika se meri kašnjenjem progresije bolesti. Kod nekih otelotvorenja, tretman ispitanika se meri održavanjem ambulacije kod ispitanika ili smanjenjem gubitka ambulacije kod ispitanika. U nekim otelotvorenjima, ambulacija se meri pomoću 6-minutnog testa hodanja (6MWT). U određenim otelotvorenjima, ambulacija se meri pomoću Procene ambulacije North Start (NSAA).
[0152] U različitim otelotvorenjima, sadašnje obelodanjivanje pruža antisens oligomerne konjugate kao što je gore navedeno i njihove sastave za upotrebu u održavanju pulmonalne funkcije ili smanjenju gubitka pulmonalne funkcije u ispitaniku sa DMD, pri čemu ispitanik ima mutaciju gena DMD koji je podložan preskakanju egzona 51. U nekim otelotvorenjima, pulmonalna funkcija se meri kao maksimalni ekspiratorni pritisak (MEP). U određenim otelotvorenjima, pulmonalna funkcija se meri kao maksimalni inspiratorni pritisak (MIP). U nekim otelotvorenjima, pulmonalna funkcija se meri kao prinudni vitalni kapacitet (FVC).
[0153] U daljem otelotvorenju, farmaceutski sastavi obelodanjivanja mogu se primeniti istovremeno sa ugljenim hidratom u metodama obelodanjivanja, bilo u istoj formulaciji ili je to zasebna formulacija, kao što je predviđeno u Han et al., Nat. Comms.7, 10981 (2016). U nekim otelotvorenjima, farmaceutski sastavi obelodanjivanja mogu se primenjivati istovremeno sa 5% ugljenog hidrata heksoze. Na primer, farmaceutski sastavi obelodanjivanja mogu se istovremeno primenjivati sa 5% glukoze, 5% fruktoze ili 5% manoze. U određenim otelotvorenjima, farmaceutski sastavi obelodanjivanja mogu se primenjivati istovremeno sa 2,5% glukoze i 2,5% fruktoze. U nekim otelotvorenjima, farmaceutski sastavi obelodanjivanja mogu se primenjivati istovremeno sa ugljenim hidratom izabranom iz grupe koju čine: arabinoza prisutna u količini od 5% zapreminskih, glukoza prisutna u količini od 5% zapreminskih, sorbitol prisutan u količini od 5% zapreminskih, galaktoza prisutna u količini od 5% zapreminskih, fruktoza prisutna u količini od 5% zapreminskih, ksilitol prisutan u količini od 5% zapreminskih, manoza prisutna u količini od 5% zapreminskih, kombinacija glukoze i fruktoze prisutnih u količini od po 2,5% zapreminskih, i kombinacije glukoze prisutne u količini od 5,7% zapreminskih, fruktoze prisutne u količini od 2,86% zapreminskih, i ksilitola prisutnog u količini od 1,4% zapreminskih.
[0154] U raznim otelotvorenjima, antisens oligomerni konjugat obelodanjivanja se istovremeno primenjuje sa terapeutski efikasnom količinom nesteroidnog anti-inflamatornog jedinjenja. U nekim otelotvorenjima, nesteroidno anti-inflamatorno jedinjenje je NF-kB inhibitor. Na primer, u nekim otelotvorenjima, NF-kB inhibitor može biti CAT-1004 ili njegova farmaceutski prihvatljiva so. U različitim otelotvorenjima, NF-kB inhibitor može biti konjugat salicilata i DHA. U nekim otelotvorenjima, NF-kB inhibitor je CAT-1041 ili njegova farmaceutski prihvatljiva so. Kod određenih otelotvorenja, NF-kB inhibitor je konjugat salicilata i EPA. U raznim otelotvorenjima, NF-kB inhibitor je
ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.
[0155] U nekim otelotvorenjima, nesteroidno anti-inflamatorno jedinjenje je inhibitor TGF-b. Na primer, u određenim otelotvorenjima, TGF-b inhibitor je HT-100.
U određenim otelotvorenjima, opisan je antisens oligomerni konjugat kako je ovde opisano za primenu u terapiji.
V. Kompleti
[0156] Obelodanjivanje takođe pruža komplete za tretman pacijenta sa genetskom bolešću koji se sastoje od najmanje antisens oligomernog konjugata kao što je gore navedeno, upakovanog u odgovarajući kontejner, zajedno sa uputstvima za njegovu upotrebu. Kompleti takođe mogu da sadrže periferne reagense kao što su puferi, stabilizatori itd. Stručnjaci sa uobičajenim znanjem u ovoj oblasti bi trebalo da cene da primena gore navedene metode ima široku primenu za identifikaciju antisens molekula pogodnih za upotrebu u tretiranju mnogih drugih bolesti. Komplet se sastoji od antisens oligomernog konjugata u skladu sa formulom (IV) ili njene farmaceutski prihvatljive soli.
Primeri
Materijali i metode
Uslovi za tretman ćelijske kulture i tkiva
[0157] Diferencirani humani miociti (ZenBio, Inc.) su korišćeni za merenje preskakanja egzona. Konkretno, mioblasti (ZenBio, Inc., SKB-F) su uzgajani do 80-90% konfluencije na 37°C i 5% CO2u hranljivim podlogama (SKB-M; ZenBio, Inc.). Diferencijacija je inicirana
4
zamenom hranljive podloge podlogom diferencijacije (SKM-D; ZenBio, Inc.). Da bi se ispitalo preskakanje egzona 51, zasejano je 1 ×10<4>diferenciranih ćelija u ploči sa 24 bunara i dodato je 1 ml diferencijacione podloge (SKM-D; ZenBio, Inc.) koja sadrži različite koncentracije PMO ili PPMO u svaki bunar i inkubirano 96 sati.
Western Blot analiza
[0158] Za Western blot analizu, tkivo je homogenizovano sa puferom za homogenizaciju (4% SDS, 4 M urea, 125 mM tris-HCl (pH 6.8)) u odnosu 9 do 18 x 20 µm sekcija tkiva sa prečnikom od približno 5 mm u 133 µL pufera. Odgovarajući lizat je prikupljen i podvrgnut kvantifikaciji proteina korišćenjem kompleta RC DC Protein Assay po uputstvima proizvođača (BioRad Cat.500-0122). Uzorci ekstrakta tkiva su razblaženi u 1:10 koristeći pufer za homogenizaciju da bi bili u opsegu standardne krive BSA. Uzorci su pripremljeni tako da bi 35 µl uzorka sadržalo željenu količinu proteina koristeći 25 µl lizata proteina, 7 µl NuPAGE LDS pufer uzoraka (Life Technologies Cat. NP0008, Carlsbad, California, USA) i 3 µl NuPAGE redukcionog agensa (10×) (Life Technologies Cat. NP0004). Nakon zagrevanja uzoraka proteina u toku 5 minuta na 95 °C, uzorci su centrifugirani i supernatant je unet u bunar NuPAGE Novex 10, 1 mm, mini 3-8% poliakrilamid tris-acetat gel (Life Technologies Cat. EA0375) pri maksimalnom ukupnom opterećenju proteina od 50 µg po traci. Gel je obrađen na 150 volti na sobnoj temperaturi sve dok bojeni front nije nestao sa gela. Nastali proteinski gelovi su prebačeni u PVDF membrane (Life Technologies Cat. LC2007) u toku 75 minuta na sobnoj temperaturi sa 30 volti koristeći NuPAGE transfer pufer (Life Technologies NP006-1), 10% metanol i 0,1% NuPAGE antioksidans (Life Technologies NP0005).
[0159] Nakon transfera proteina, PVDF membrane su uronjene u TTBS pufer (IX TBS (Amresco Cat. J640-4L), 0,1% (v/v) tween-20). Membrane su prebačene u blokatorski pufer (5% (m/v) nemasno suvo mleko (Lab Scientific Cat. M0841) u TTBS) i natopljene preko noći na 4°C uz blago ljuljanje. Nakon blokade, membrane su inkubirane 60 minuta na sobnoj temperaturi u DYS1 (Leica Cat. NCL-DYS1) razblažene u 1:20 koristeći pufer za blokiranje, ili 20 minuta na sobnoj temperaturi u anti-α-aktinin antitelu (Sigma-Aldrich Cat. NA931V) razblaženo 1:100.000 sa puferom za blokiranje, nakon čega sledi šest pranja (po pet minuta sa TTBS). Anti-mišji IgG konjugovan sa ren-peroksidazom (GE Healthcare Cat. NA931V) razblažen je u odnosu 1:40.000 pomoću pufera za blokiranje i dodat membranama u toku 45 minuta (DYS1) ili 15 minuta (α-aktinin), nakon čega je ponovo usledilo šest pranja. Koristeći ECL Prime Western Detection Kit (GE Healthcare Cat. RPN2232), film je bio izložen gelu i razvijen u skladu sa tim. Razvijeni film je skeniran i analiziran pomoću softvera ImageQuant TL Plus (verzija 8.1), a linearna regresiona analiza je izvršena pomoću softvera Graphpad.
[0160] Svaki Western blot gel uključuje standardnu distrofinsku krivu od 4 ili 5 tačaka pripremljenu pomoću ukupnog proteina ekstrahovanog iz normalnog tkiva (mišji kvadriceps, dijafragma ili srce) razblaženog na, na primer, 64%, 16%, 4%, 1% i 0,25% (vidi. Na primer. Slike 5A i 5B) i spajkovanog u ekstrakt DMD tkiva (na primer, kvadriceps mdx miša, dijafragma ili srce, ili NHP kvadriceps, dijafragma ili glatki mišić (GI)). Uzorci standardne krive su obrađeni kao što je gore opisano. Nivoi distrofin proteina kao procenat nivoa distrofina divljeg tipa (%WT) određeni su upoređivanjem intenziteta distrofin trake sa standardnom krivom gela.
RT-PCR analiza
[0161] Za RT-PCR analizu, RNK je izolovana iz ćelija koristeći Ilustra GE spin komplet prateći protokol proizvođača. Koncentracija i čistoća RNK je određena pomoću NanoDrop. Preskakanje egzona 51 je mereno pomoću RT-PCR sa ushodnim prajmerom koji vezuje Egzon 49 SEQ ID NO: 5 (5'-CCAGCCACTCAGCCAGTGAAG-3') i nishodnim prajmerom koji vezuje Egzon 52 SEQ ID NO: 6 (5'-CGATCCGTAATGATTTCTAGCC-3'). Preskočeni egzon 51 rezultirao je amplikonom od 246 bp i nepreskočeni egzon 51 rezultirao je amplikonom od 478 bp.
[0162] Preskakanje mišjeg egzona 23 izmereno je pomoću RT-PCR sa ushodnim prajmerom SEQ ID NOO: 7 (5'-CACATCTTGATGTGGAGG-3') i nishodnim prajmerom: 8 (5'-CAACTTCAGCCATCCATTTCTG-3').
[0163] Nakon što je RNK podvrgnuta RT-PCR-u, uzorci su analizirani pomoću Caliper mašine, koja koristi gel kapilarnu elektroforezu. Procenat preskakanja egzona je izračunat pomoću sledeće jednačine: (površina ispod krive za preskočene trake)/(zbir površine ispod krive za preskočene i nepreskočene trake)x100.
Imunohistohemija: bojenje distrofina:
[0164] Sekcije zamrznutog tkiva mišjeg kvadricepsa od 10 mikrona su korišćene za detekciju distrofina pomoću primarnog antitela distrofina (razblaženje 1:250, zec, abkam, cat# ab15277) u 10% kozjem serumu 1% BSA u PBS i sekundarno antitelo Alexa-Fluoro 488 kozji anti-zečji (razblaženje 1:1000) u 10% kozjem serumu 1% BSA.
Priprema morfolino pod-jedinica
[0165]
. rav a se na
Šema 1: Opšti sintetički put do PMO pod-jedinica
[0166] Pozivajući se na šemu 1, gde B predstavlja deo baznog uparivanja, pod-jedinice morfolina mogu biti pripremljene od odgovarajućeg ribinukleozida (1) kao što je prikazano. Pod-jedinica morfolina (2) može biti opciono zaštićena reakcijom sa odgovarajućim prekursorom zaštitne grupe, na primer tritil hloridom.3' zaštitna grupa se generalno uklanja tokom sinteze oligomera u čvrstom stanju, kao što je detaljnije opisano u nastavku. Deo baznog uparivanja može biti odgovarajuće zaštićen za sintezu oligomera u čvrstoj fazi. Pogodne zaštitne grupe uključuju benzoil za adenin i citozin, fenilacetil za gvanin i pivaloiloksimetil za hipoksantin (I). Pivaloiloksimetil grupa se može uvesti na N1 poziciju hipoksantin heterociklične baze. Iako se može koristiti nezaštićena hipoksantinska podjedinica, prinosi u reakcijama aktivacije su daleko superiorniji kada je baza zaštićena. Druge odgovarajuće grupe za zaštitu uključuju one koje su obelodanjene u SAD patentu br.
8,076,476.
[0167] Reakcija 3 sa aktiviranim fosfornim jedinjenjem 4 dovodi do toga da podjedinice morfolina imaju željeni vezni deo 5.
[0168] Jedinjenja strukture 4 mogu se pripremiti korišćenjem bilo kog broja metoda poznatih stručnjacima. Kuplovanje sa morfolinom se nastavlja kao što je gore navedeno.
[0169] Jedinjenja strukture 5 mogu se koristiti u sintezi oligomera u čvrstoj fazi za pripremu oligomera koji se sastoje od veza između podjedinica. Takve metode su dobro poznate u struci. Ukratko, jedinjenje strukture 5 može se modifikovati na kraju 5' kako bi sadržalo linker za čvrsti nosač. Jednom podržana, zaštitna grupa iz 5 (npr. tritil na 3' kraju)) se uklanja i slobodni amin reaguje sa aktiviranim fosfornim delom drugog jedinjenja strukture 5. Ova sekvenca se ponavlja dok se ne dobije željena dužina oligo. Zaštitna grupa na 3' kraju terminala može ili biti uklonjena ili ostavljena ako se želi 3' modifikacija. Oligo se može ukloniti sa čvrstog nosača koristeći bilo koji broj metoda, ili primer tretmana sa bazom za cepanje veze sa čvrstim nosačem.
[0170] Priprema morfolino oligomera uopšte i specifični morfolino oligomeri obelodanjivanja su detaljnije opisani u Primerima.
Priprema morfolino oligomera
[0171] Preparacija jedinjenja obelodanjivanja vrši se korišćenjem sledećeg protokola u skladu sa Šemom 2:
Šema 2: Priprema aktivirane repne kiseline
[0172] Priprema tritil piperazin fenil karbamata 35: Ohlađenoj suspenziji jedinjenja 11 u dihlorometanu (6 mL/g 11) dodat je rastvor kalijum karbonata (3.2 eq) u vodi (4 mL/g kalijum karbonata). Ovoj dvofaznoj mešavini se polako dodaje rastvor fenil hloroformata (1,03 eq) u dihlorometanu (2 g/g fenil hloroformata). Reakciona smeša je zagrejana na 20 °C.
Po završetku reakcije (1-2 sata) slojevi su razdvojeni. Organski sloj je ispran vodom i osušen na bezvodnom kalijum karbonatu. Proizvod 35 je izolovan kristalizacijom iz acetonitrila.
[0173] Priprema karbamat alkohola 36: Natrijum hidrid (1,2 eq) je suspendovan u 1-metil-2-pirolidinonu (32 mL/g natrijum hidrida). Ovoj suspenziji su dodati trietilenglikol (10,0 eq) i jedinjenje 35 (1,0 eq). Nastala kaša je zagrevana na 95°C. Po završetku reakcije (1-2 časa), smeša je ohlađena na 20 °C. Ovoj smeši je dodato 30% dihlorometan/metil terc-butil etra (v:v) i voda. Organski sloj koji sadrži proizvod sukcesivno je ispran vodenim NaOH, vodenom ćilibarnom kiselinom i zasićenim vodenim natrijum hloridom. Proizvod 36 je izolovan kristalizacijom iz dihlorometan/metil terc-butil etar/heptana.
[0174] Priprema repne kiseline 37: U rastvor jedinjenja 36 u tetrahidrofuranu (7
mL/g 36) dodat je anhidrid ćilibarne kiseline (2,0 eq) i DMAP (0,5 eq). Smeša je zagrejana na 50 °C. Po završetku reakcije (5 časova), smeša je ohlađena na 20°C i podešena na pH 8,5 sa vodenim NaHCO3. Dodat je metil terc-butil eter, a proizvod je ekstrahovan u vodeni sloj. Dihlorometan je dodat, a smeša je podešena na pH 3 sa vodenom limunskom kiselinom. Organski sloj koji sadrži proizvod ispran je mešavinom pH=3 citratnog pufera i zasićenog vodenog natrijum hlorida. Ovaj rastvor dihlorometana 37 je korišćen bez izolovanja u pripremi jedinjenja 38.
[0175] Priprema 38: U rastvor jedinjenja 37 dodat je N-hidroksi-5-norbornen-2,3-dikarboksilna kiselina imid (HONB) (1,02 eq), 4-dimetilaminopiridin (DMAP) (0,34 eq), a zatim 1-(3-dimetilaminopropil)-N'-etilkarbodiimid hlorid (EDC) (1,1 eq). Smeša je zagrejana na 55°C. Po završetku reakcije (4-5 časova), smeša je ohlađena na 20°C i isprana sukcesivno sa 1:10,2 M limunske kiseline/fiziološkog rastvora i fiziološkog rastvora. Rastvor dihlorometana je podvrgnut razmeni rastvarača sa acetonom, a zatim sa N, N-dimetilformamidom, a proizvod je izolovan precipitacijom iz acetona/ N,N-dimetilformamida u zasićeni vodeni natrijum hlorid. Sirovi proizvod je nekoliko puta ponovo razmućen u vodi kako bi se uklonili ostaci N,N-dimetilformamida i soli.
Metoda sinteze PMO A: Upotreba disulfidnog sidra
[0176] Uvođenje aktiviranog „repa“ u smolu sa sidrom (smola za vezivanje) izvedeno je u dimetil imidazolidinonu (DMI) postupkom koji se koristi za ugradnju podjedinica tokom sinteze u čvrstoj fazi.
Amnome
Šema 3: Priprema čvrstog nosioca za sintezu morfolino oligomera
[0177] Ovaj postupak je izveden u silanizovanom, peptidnom sudu sa vodenom košuljicom (ChemGlass, NJ, USA) sa staklenom fritom sa grubom poroznošću (40-60 µm), gornjom mešalicom i 3-putnom teflonskom slavinom kako bi se omogućilo da N2 ispari kroz fritu ili vakuumsku ekstrakciju.
[0178] Koraci obrade/pranja smole u sledećem postupku se sastoje od dve osnovne operacije: fluidizacije smole ili reaktora sa mešanim slojem i ekstrakcije rastvarača/rastvora. Za fluidizaciju smole, slavina je postavljena tako da N2 protiče gore kroz fritu i određena obrada/ispiranje smole je dodato u reaktor i pušteno da prožme i potpuno pokvasi smolu. Potom je započeto mešanje i smolasta kaša mešana za određeno vreme. Za ekstrakciju rastvarača/rastvora, zaustavljeni su mešanje i protok N2 i pokrenuta je vakuumska pumpa, a zatim je slavina postavljena tako da omogućava evakuaciju obrade/pranja smole u otpad. Sve zapremine obrade/pranja smole bile su 15 mL/g smole, osim ako nije drugačije navedeno.
[0179] U aminometilpolistiren smolu (100-200 mesh; ~ 1,0 mmol/g opterećenja na bazi supstitucije azota; 75 g, 1 eq, Polymer Labs, UK, part # 1464-X799) u silanizovanoj, peptidnoj posudi sa vodenom košuljicom je dodat 1-metil-2-pirolidinon (NMP; 20 ml/g smole) i smoli je dozvoljeno da nabubri uz mešanje od 1-2 časa. Nakon evakuacije nabubrelog rastvarača, smola je isprana sa dihlorometanom (2 x 1-2 min), 5% diizopropiletilaminom u 25% izopropanol/dihlorometanu (2 x 3-4 min) i dihlorometanom (2 x 1-2 min). Nakon evakuacije završnog pranja, smola je tretirana rastvorom disulfidnog sidra 34 u 1-metil-2-pirolidinonu (0,17 M; 15 mL/g smole, ~ 2,5 eq) i smeša smole/reagensa
1
je zagrevana na 45°C 60 časova. Po završetku reakcije, zagrevanje je prekinuto, a rastvor sidra je evakuisan i smola je isprana 1-metil-2-pirolidinonom (4 x 3-4 min) i dihlorometanom (6 x 1-2 min). Smola je tretirana rastvorom 10% (v/v) dietil dikarbonata u dihlorometanu (16 mL/g; 2 x 5-6 min), a zatim isprana dihlorometanom (6 x 1-2 min). Smola 39 se sušila pod strujom N2 1-3 časa, a zatim pod vakuumom do konstantne težine (± 2%). Prinos: 110-150% prvobitne težine smole.
[0180] Određivanje opterećenja aminometilpolistiren-disulfidne smole: opterećenje smole (broj potencijalno dostupnih reaktivnih mesta) određuje se spektrometrijskim testom za broj trifenilmetil (tritil) grupa po gramu smole.
[0181] Poznata težina suve smole (25 ± 3 mg) prenosi se u silanizovanu volumetrijsku tikvicu od 25 ml i dodaje se ~5 ml 2% (v/v) trifluorosirćetne kiseline u dihlorometanu. Sadržaj se meša blagim vrtloženjem i ostavlja da odstoji 30 minuta. Zapremina se dovodi do 25 mL sa dodatnom 2% (v/v) trifluorosirćetnom kiselinom u dihlorometanu i sadržaj se temeljno meša. Pomoću pipete za pozitivno potiskivanje, alikvot rastvora koji sadrži tritil (500 µL) se prenosi u volumetrijsku tikvicu od 10 mL, a zapremina se dovodi do 10 mL sa metansulfonskom kiselinom.
[0182] Sadržaj tritil katjona u finalnom rastvoru meri se putem UV apsorbancije na 431,7 nm i opterećenjem smole izračunatim u tritil grupama po gramu smole (µmol/g) koristeći odgovarajuće zapremine, razblaženja, koeficijent ekstinkcije (ε: 41 µmol-1cm-1) i težinu smole. Test se izvodi u triplikatu i izračunava se prosečno opterećenje.
[0183] Postupak opterećenja smole u ovom primeru će obezbediti smoli opterećenje (ili supstituciju) od približno 500 µmol/g. Opterećenje od 300-400 u µmol/g je dobijeno ako se korak inkorporiranja disulfidnog sidra izvodi 24 časa na sobnoj temperaturi.
[0184] Opterećenje repa: Koristeći iste postavke i zapremine kao za preparaciju aminometilpolistiren-disulfidne smole, rep se može uvesti u čvrsti nosač. Smola sa sidrom je prvo deprotektovana u kiselim uslovima, a nastali materijal neutralizovan pre kuplovanja. Za korak kuplovanja korišćen je rastvor od 38 (0,2 M) u DMI koji sadrži 4-etilmorfolin (NEM, 0,4 M) umesto rastvora disulfidnog sidra. Nakon 2 časa na 45 °C, smola 39 je dva puta isprana sa 5% diizopropiletilamina u 25% izopropanol/dihlorometana i jednom sa DCM.
2
Smoli je dodat rastvor benzoevog anhidrida (0,4 M) i NEM (0,4 M). Nakon 25 minuta, reaktorska košuljica je ohlađena na sobnu temperaturu, a smola je dva puta isprana sa 5% diizopropiletilaminom u 25% izopropanol/dihlorometana i osam puta sa DCM. Smola 40 je filtrirana i sušena pod visokim vakuumom. Opterećenje za smolu 40 je definisano kao opterećenje prvobitne aminometilpolistiren-disulfidne smole 39 koja se koristi za opterećenje repa.
[0185] Sinteza u čvrstoj fazi: Morfolino oligomeri su pripremljeni na Gilson AMS-422 automatizovanom sintetizatoru peptida u 2 ml Gilson polipropilenskih reakcionih kolona (Part # 3980270). Aluminijumski blok sa kanalima za protok vode postavljen je oko kolona dok su bile na sintisajzeru. AMS-422 će alternativno dodati rastvor reagensa/sredstva za pranje, držati određeno vreme i evakuisati kolone pomoću vakuuma.
[0186] Za oligomere u rasponu do oko 25 podjedinica dužine, poželjna je aminometilpolistiren-disulfidna smola sa opterećenjem blizu 500 µmol/g smole. Za veće oligomere poželjna je aminometilpolistiren-disulfidna smola sa opterećenjem od 300-400 µmol/g smole. Ako se želi molekul sa 5'- repom, smola koja je opterećena sa repom izabrana je sa istim smernicama za opterećenje.
[0187] Pripremljeni su sledeći rastvori reagensa:
Rastvor za detritilaciju: 10% cijanosirćetna kiselina (m/v) u 4:1 dihlorometan/acetonitril;
Rastvor za neutralizaciju: 5% diizopropiletilamina u 3:1 dihlorometan/izopropanolu; i
Rastvor za kuplovanje: 0,18 M (ili 0,24 M za oligomere koji su narasli na duže od 20 podjedinica) aktivirana Morpholino podjedinica željenog tipa baze i veze i 0,4 M N etilmorfolin, u 1,3-dimetilimidazolidinonu.
[0188] Dihlorometan (DCM) je korišćen kao prelazno pranje koje razdvaja različita ispiranja rastvora reagensa.
[0189] Na sintetizatoru, sa blokom postavljenim na 42°C, svakoj koloni koja sadrži 30 mg aminometilpolistiren-disulfidne smole (ili repne smole) dodato je 2 ml 1-metil-2-pirolidinona i ostavljeno da stoji na sobnoj temperaturi 30 min. Nakon pranja sa 2 puta 2 mL dihlorometana, korišćen je sledeći ciklus sinteze:
[0190] Sekvence pojedinačnih oligomera su programirane u sintetizatoru tako da svaka kolona dobije odgovarajući rastvor za kuplovanje (A,C,G,T,I) u odgovarajućoj sekvenci. Kada je oligomer u koloni završio ugradnju svoje konačne podjedinice, kolona je uklonjena iz
4
bloka i završni ciklus je izveden ručno sa rastvorom za kuplovanje koji se sastoji od 4-metoksitrifenilmetil hlorida (0,32 M u DMI) koji sadrži 0,89 M 4-etilmorfolina.
[0191] Cepanje iz smole i uklanjanje baza i zaštitnih grupa glavnog lanca: Nakon metoksitritilacije, smola je oprana 8 puta sa 2 mL 1-metil-2-pirolidinona. Dodan je jedan mL rastvora za cepanje koji se sastoji od 0,1 M 1,4-ditiotreitola (DTT) i 0,73 M trietilamina u 1-metil-2-pirolidinonu, kolona je zatvorena i ostavljena da stoji na sobnoj temperaturi 30 min. Nakon tog vremena, rastvor je ispušten u Wheaton bočicu od 12 ml. Jako skvrčena smola je dva puta oprana sa 300 µL rastvora za cepanje. Rastvoru je dodato 4,0 ml konc. vodenog amonijaka (čuvanog na -20 °C), bočica je čvrsto zatvorena (sa poklopcem od teflonskog navojnog zatvarača), a mešavina je promućkana da bi se rastvor pomešao. Bočica je stavljena u peć na 45 °C na 16-24 časa kako bi se izvršilo cepanje baznih i zaštitnih grupa glavnog lanca.
[0192] Prečišćavanje sirovog proizvoda: Rastvor amonolize u bočici je uklonjen iz peći i ostavljen da se ohladi na sobnu temperaturu. Rastvor je razblažen sa 20 mL 0,28% vodenog amonijaka i propušten kroz kolonu 2,5x10 cm koja sadrži Macroprep HQ smolu (BioRad). Gradijent soli (A: 0,28% amonijak sa B: 1 M natrijum hlorid u 0,28% amonijaka; 0-100% B u 60 min) je korišćen za eluiranje metoksitritila koji sadrži pik. Kombinovane frakcije su objedinjene i dalje obrađene u zavisnosti od željenog proizvoda.
[0193] Demetoksitritilacija morfolino oligomera: objedinjene frakcije iz prečišćavanja sa Macroprep tretirane su sa 1M H3PO4kako bi se pH snizio na 2,5. Nakon inicijalnog mešanja, uzorci su 4 min. bili na sobnoj temperaturi, nakon čega su neutralisani na pH 10-11 sa 2,8% amonijaka/vode. Proizvodi su prečišćeni ekstrakcijom čvrste faze (SPE).
[0194] Pakovanje i kondicioniranje SPE kolona: Amberchrome CG-300M (Rohm and Haas; Philadelphia, PA) (3 mL) je pakovan u kolone od 20 mL sa fritom (BioRad Econo-Pac Hromatography Column (732-1011)) i smola isprana sa 3 mL sledećeg rastvora: 0,28% NH4OH / 80% acetonitrila; 0,5 M NaOH / 20% etanola; voda; 50 mM H3PO4/ 80% acetonitrila; voda; 0,5 NaOH / 20% etanola; voda; 0,28% NH4OH.
[0195] Prečišćavanje SPE: Rastvor iz demetoksitritilacije je stavljen na kolonu i smola je isprana tri puta sa 3-6 mL 0,28% amonijačne vode. Ispod kolone je stavljena bočica Wheaton (12 ml) i proizvod je eluiran sa dva pranja sa 2 mL 45% acetonitrila u 0,28% amonijačne vode.
[0196] Izolovanje proizvoda: rastvori su zamrznuti u suvom ledu i bočice su stavljene u sušač zamrzavanjem da bi se dobio paperjasti beli prah. Uzorci su rastvoreni u vodi, filtrirani kroz filter od 0,22 mikrona (Pall Life Sciences, Acrodisc 25 mm špric filter, sa membranom od 0,2 mikrona HT Tuffryn) pomoću šprica i optička gustina (OD) je izmerena na UV spektrofotometru za određivanje OD jedinica prisutnog oligomera, kao i uzorak za analizu. Rastvori su zatim vraćeni u Wheaton bočice za liofilizaciju.
[0197] Analiza morfolino oligomera pomoću MALDI: MALDI-TOF masena spektrometrija je korišćena za određivanje sastava frakcija u prečišćavanju, kao i za pružanje dokaza za identitet (molekulska težina) oligomera. Uzorci su prošli nakon razblaživanja sa rastvorom 3,5-dimetoksi-4-hidroksićilibarne kiseline (sinapinske kiseline), 3,4,5-trihidroksiacetofenona (THAP) ili alfa-cijano-4-hidoksićilibarne kiseline (HCCA) kao matrica.
PMO sinteza metoda B: Upotreba NCP2 sidra
Sinteza NCP2 sidra:
1. Priprema metil 4-fluoro-3-nitrobenzoata (1)
[0198]
[0199] U posudu od 100 L je dodato 12,7 kg 4-fluoro-3-nitrobenzoeve kiseline, 40 kg metanola i 2,82 kg koncentrovane sumporne kiseline. Smeša je mešana uz refluks (65 °C) 36 časova. Reakciona smeša je ohlađena na 0°C. Kristali se formiraju na 38°C. Smeša je 4 časa držana na 0°C, a zatim filtrirana u atmosferi azota. Posuda od 100 L je oprana, a filterski kolač je opran sa 10 kg metanola koji je ohlađen na 0°C. Čvrsti filterski kolač je sušen na levku 1 čas, prebačen na tacne, i sušen u vakuum peći na sobnoj temperaturi do konstantne težine od 13,695 kg metil 4-fluoro-3-nitrobenzoata (100% prinos; HPLC 99%).
2. Priprema 3-nitro-4-(2-oksopropil)benzoeve kiseline
A. (Z)-metil 4-(3-hidroksi-1-metoksi-1-oksobut-2-en-2-il)-3-nitrobenzoat (2)
[0200]
[0201] U posudu od 100 L uneto je 3,98 kg metil 4-fluoro-3-nitrobenzoata (1) iz prethodnog koraka 9,8 kg DMF, 2,81 kg metil acetoacetata. Smeša je mešana i ohlađena na 0°C. Tome je dodato 3,66 kg DBU tokom oko 4 časa dok je temperatura održavana na ili ispod 5 °C. Smeša je mešana dodatnih 1 čas. U reakcionu posudu je dodat rastvor od 8,15 kg limunske kiseline u 37,5 kg prečišćene vode, dok je temperatura reakcije održavana na ili ispod 15°C. Nakon dodavanja, reakciona smeša je mešana uz dodatak od 30 minuta, a zatim filtrirana pod azotom. Mokri filter kolač je vraćen u posudu od 100 L zajedno sa 14,8 kg prečišćene vode. Kaša je mešna 10 minuta, a zatim filtrirana. Mokri kolač je ponovo vraćen u posudu od 100 L, kaširan sa 14,8 kg prečišćene vode 10 minuta, i filtriran u sirovi (Z)-metil 4-(3-hidroksi-1-metoksi-1-oksobut-2-en-2-il)-3-nitrobenzoat.
B.3-Nitro-4- (2-oksopropil)benzoeva kiselina
[0202]
[0203] Reakciona posuda od 100 L pod azotom napunjena je sirovim (Z)-metil 4-(3-hidroksi-1-metoksi-1-oksobut-2-en-2-il)-3-nitrobenzoatom. Tome je dodato 14,2 kg 1,4-dioksana i mešano. Smeši je dodat rastvor od 16,655 kg koncentrovane HCl i 13,33 kg prečišćene vode (6 M HCl) tokom 2 časa dok je temperatura reakcione smeše održavana ispod 15°C. Kada je dodavanje završeno, reakciona smešavina je zagrevana uz refluks (80°C) 24 časa, ohlađena na sobnu temperaturu i filtrirana u atmosferi azota. Čvrsti filter kolač je sprašen sa 14,8 kg prečišćene vode, filtriran, ponovo sprašen sa 14,8 kg prečišćene vode, i filtriran. Čvrsta materija je vraćena u posudu od100 L sa 39,9 kg DCM i refluktovana uz mešanje 1 čas.
Dodato je 1,5 kg prečišćene vode da bi se rastvorile preostale čvrste materije. Donji organski sloj je razdeljen u prethodno zagrejanu posudu od 72 L, a zatim vraćen u čistu suvu posudu od 100 L. Rastvor je ohlađen na 0°C, držan 1 čas, a zatim filtriran. Čvrsti filtarski kolač je opran po dva puta sa rastvorom od 9,8 kg DCM i 5 kg heptana, a zatim osušen na levku. Čvrsta materija je preneta u tacne i osušena do konstantne težine od 1,855 kg 3-Nitro-4-(2-oksopropil)benzoeve kiseline. Ukupan prinos 42% od jedinjenja 1. HPLC 99,45%.
3. Priprema N-Tritilpiperazin sukcinata (NTP)
[0204]
[0205] Balon od 72 L sa košuljicom napunjen je pod azotom sa 1,805 kg trifenilmetil hlorida i 8,3 kg toluena (rastvor TPC). Smeša je mešana dok se čvrste materije nisu rastvorile. U reakcionu posudu od 100 L sa košuljicom dodato je pod azotom 5,61 kg piperazina, 19,9 kg toluena i 3,72 kg metanola. Smeša je mešana i ohlađena na 0°C. Tome je polako dodavan u porcijama rastvor TPC tokom 4 časa dok je temperatura reakcije održavana na ili ispod 10°C. Smeša je mešana 1,5 čas na 10°C, zatim je ostavljena da se zagreje na 14° C. U posudu od 72 L uneto je 32,6 kg prečišćene vode, zatim je preneto u posudu od 100 L dok je unutrašnja temperatura šarže održavana na 20 /- 5 °C. Pušteno je da se slojevi razdvoje, i donji vodeni sloj je odvojen i uskladišten. Organski sloj je ekstrahovan tri puta sa po 32 kg prečišćene vode, a vodeni slojevi su razdvojeni i kombinovani sa uskladištenim vodenim rastvorom.
[0206] Preostali organski sloj je ohlađen na 18 °C i rastvor od 847 g ćilibarne kiseline u 10,87 kg prečišćene vode je polako dodavan u porcijama u organski sloj. Smeša je mešana 1,75 časa na 20 /- 5 °C. Smeša je filtrirana, a čvrste materije su isprane sa 2 kg TBME i 2 kg acetona, a zatim osušene na levku. Filterski kolač je dva puta sprašen sa po 5,7 kg acetona i filtriran i opran sa 1 kg acetona između sprašivanja. Čvrsta materija je osušena na levku, a zatim prebačena na tacne i sušena u vakuumskoj peći na sobnoj temperaturi do konstantne težine od 2,32 kg NTP. Prinos 80%.
4. Priprema (4-(2-hidroksipropil) -3-nitrofenilI)(4-tritilpiperazin-1-il)metanona A.
Priprema 1-(2-Nitro-4(4-tritilpiperazin-1-karbonil)fenil)propan-2-ona
[0207]
[0208] U balon sa košuljicom od 100 L uneto je pod azotom 2 kg 3-Nitro-4- (2-oksopropil) benzoeve kiseline (3), 18,3 kg DCM i 1,845 kg N-(3-dimetilaminopropil)-N'-etilkarbodiimidhidrohlorida (EDC.HCl). Rastvor je mešan dok se nije formirala homogena smeša. U toku 30 minuta na sobnoj temperaturi dodato je 3.048 kg NTP i mešano 8 časova. U reakcionu smešu je dodato 5,44 kg prečišćene vode i mešano 30 minuta. Dozvoljeno je da se slojevi razdvoje, a donji organski sloj koji sadrži proizvod je ispušten i uskladišten. Vodeni sloj je dva puta ekstrahovan sa 5,65 kg DCM. Kombinovani organski slojevi isprani su rastvorom od 1,08 kg natrijum hlorida u 4,08 kg prečišćene vode. Organski slojevi osušeni su preko 1,068 kg natrijum sulfata i filtrirani. Natrijum sulfat je ispran sa 1,3 kg DCM. Kombinovani organski slojevi su kaširani sa 252 g silikagela i filtrirani kroz filterski levak koji sadrži sloj od 252 g silikagela. Sloj silikagela je opran sa 2 kg DCM. Kombinovani organski slojevi su upareni na rotovapu. Ostatku je dodato 4,8 kg THF, a zatim je upareno na rotovapu dok nije postignuto 2,5 zapremine sirove 1-(2-nitro-4 (4-trilpiperazin-1-karbonil)fenil)propan-2-ona u THF.
B. Priprema (4-(2-hidroksipropil)-3-Nitrofenil)(4-tritilpiperazin-1-il)metanona (5)
[0209]
[0210] Balon od 100 L sa košuljicom napunjen je pod azotom sa 3600 g jedinjenja 4 iz prethodnog koraka i 9800 g THF. Mešani rastvor je ohlađen na ≤ 5 °C. Rastvor je razblažen sa 11525 g etanola i 194 g natrijum borhidrida je dodato tokom oko 2 časa na ≤ 5 °C.
Reakciona smeša je mešana dodatna 2 časa na ≤ 5 °C. Reakcija je ugašena rastvorom od oko 1,1 kg amonijum hlorida u oko 3 kg vode sporim dodavanjem da bi se održala temperatura na ≤ 10 °C. Reakciona smeša je mešana dodatnih 30 minuta, filtrirana da bi se uklonili neorganski sastojci, i napunjena u balon od100 L sa košuljicom i ekstrahovana sa 23 kg DCM. Organski sloj je odvojen i vodeni sloj je ekstrahovan još dva puta sa po 4,7 kg DCM.
Kombinovani organski slojevi isprani su rastvorom od oko 800 g natrijum hlorida u oko 3 kg vode, a zatim osušeni preko 2,7 kg natrijum sulfata. Suspenzija je filtrirana, i filterski kolač je opran sa 2 kg DCM. Kombinovani filtrati su koncentrisani na 2,0 zapremine, razblaženi sa oko 360 g etilacetata i upareni. Sirovi proizvod je unet na silikagel kolonu od 4 kg silicijumoksida pakovanog sa DCM pod azotom i eluiranog sa 2,3 kg etil acetata u 7,2 kg DCM. Kombinovane frakcije su uparene i ostatak je pokupljen u 11,7 kg toluena. Rastvor toluena je filtriran i filterski kolač je dva puta ispran sa po 2 kg toluena. Filterski kolač je osušen do konstantne težine od 2,275 kg jedinjenja 5 (46% prinosa od jedinjenja 3) HPLC 96,99%.
5. Priprema 2,5-dioksopirolidin-1-il (1-(2-nitro-4- (4-trifenilmetilpiperazin-1) karbonil)fenil)propan-2-il) karbonata (NCP2 sidro)
[0211]
[0212] Balon sa košuljicom od 100 L je napunjen pod azotom sa 4,3 kg jedinjenja 5 (težina prilagođena na osnovu rezidualnog toluena putem H<1>NMR; svi reagensi posle toga su srazmerni u skladu sa tim) i 12,7 kg piridina. Ovome je dodato 3,160 kg DSC (78,91 težinski % po H<1>NMR), dok je unutrašnja temperatura održavana na ≤ 35 °C. Reakciona smeša je odležala oko 22 časa u ambijentalnim uslovima, a zatim filtrirana. Filter kolač je opran sa 200 g piridina. U dve šarže koje obuhvataju 1⁄2 zapremine filtrata, filtrat je polako napunjen u balon od 100 L sa košuljicom, koji sadrži rastvor od oko 11 kg limunske kiseline u oko 50 kg vode i mešano je 30 minuta kako bi se omogućila čvrsti precipitat. Čvrsta materija je prikupljena na filterskom levku, dva puta isprana sa 4,3 kg vode po pranju, i osušena na filterskom levku pod vakuumom.
[0213] Kombinovane čvrste materije su unete u balon od 100 L sa košuljicom i rastvorene u 28 kg DCM i isprane rastvorom 900 g kalijum karbonata u 4,3 kg vode. Nakon 1 časa, dopušteno je da se slojevi odvoje i vodeni sloj je uklonjen. Organski sloj je ispran sa 10 kg vode, separisan i osušen preko 3,5 kg natrijum sulfata. DCM je filtriran, uparen i osušen u vakuumu do 6,16 kg NCP2 sidra(114% prinos).
Sinteza NCP2 smole sa sidrom
[0214] Reaktor za sintezu u čvrstoj fazi od 75 L sa teflonskom zapornom slavinom napunjen je sa oko 52 L NMP i 2300 g aminometil polistirenske smole. Smola je mešana u NMP da nabubri oko 2 časa, a zatim oceđena. Smola je isprana dva puta sa oko 4 L DCM po pranju, zatim dva puta sa 39 L neutralizacionog rastvora po pranju, zatim dva puta sa 39 L DCM po pranju. Rastvor NCP2 sidra je polako dodavan u rastvor smole uz mešanje, mešan 24 časa na sobnoj temperaturi i drenirana. Smola je isprana četiri puta sa 39 L NMP po pranju, i šest puta sa 39 L DCM po pranju. Smola je tretirana i mešana sa 1⁄2 DEDC Capping Solution 30 minuta, drenirana, i tretirana i mešana sa drugom 1⁄2 DEDC Capping Solution 30 minuta i drenirana.
1
Smola je isprana šest puta sa 39 L DCM po pranju, a zatim sušena u peći do konstantne težine od 3573,71 g smole sa sidrom.
Priprema morfolino oligomera pomoću NCP2 sidra
[0215] Referenca 50 L Sinteza u čvrstoj fazi Eteplirsena (PMO#1) sirove supstance za lek
1. Materijali
[0216]
Tabela 2: Početni materijali
[0217] Hemijske strukture polaznih materijala:
2
A. Aktivirani EG3 rep
B. Aktivirana C podjedinica (Za pripremu, vidi SAD patent br.8,067,571)
C. Aktivirana A podjedinica (za pripremu vidi SAD patent br.8,067,571)
D. Aktivirana DPG podjedinica (za pripremu, vidi WO 2009/064471)
E. Aktivirana T podjedinica (za pripremu, vidi W 2013/082551)
F. Smola sa sidrom
gde je R<1>nosilac (suportivno sredstvo)
Tabela 3: Opis rastvora za sintezu u čvrstoj fazi oligomera sirove supstance za lek Eteplirsen
2. Referentna sinteza sirove lekovite supstance Eteplirsen
A. Bubrenje smole
[0218] 750 g smole sa sidrom i 10,5 L NMP je napunjeno u silanizovani reaktor od 50 L i mešano 3 časa. NMP je dreniran i smola sa sidrom je isprana dva puta sa po 5,5 L DCM i dva puta sa po 5,5 L 30% TFE/DCM.
B. Ciklus 0: Kuplovanje EG3 repa
[0219] Smola sa sidrom je oprana tri puta sa po 5,5 L 30% TFE/DCM i drenirana, oprana sa 5,5 L CYFTA rastvora u toku 15 minuta i drenirana, i ponovo oprana sa 5,5 L CYTFA
4
rastvora 15 minuta bez dreniranja, čemu je dodato 122 ml 1:1 NEM/DCM i suspenzija mešana 2 minuta i drenirana. Smola je oprana dva puta sa 5,5 L rastvora za neutralizaciju 5 minuta i drenirana, zatim dva puta sa po 5,5 L DCM i drenirana. Smoli je dodat rastvor od 706,2 g aktiviranog EG3 repa (mol. tež.765,85) i 234 ml NEM u 3 L DMI i mešano 3 časa na sobnoj temperaturi i drenirano. Smola je dva puta isprana sa po 5,5 L rastvora za neutralizaciju 5 minuta po svakom pranju, a jednom sa 5,5 L DCM i drenirana. Rastvor od 374,8 g benzoevog anhidrida i 195 ml NEM u 2680 ml NMP je dopunjen i mešan 15 minuta i dreniran. Smola je mešana sa 5,5 L rastvora za neutralizaciju 5 minuta, zatim je isprana jednom sa 5,5 L DCM i dva puta sa po 5,5 L 30% TFE/DCM. Smola je suspendovana u 5,5 L 30% TFE/DCM i držana 14 časova.
C. Ciklusi 1-30 kuplovanja pod-jedinice
i. Tretmani pre kuplovanja
[0220] Pre svakog ciklusa kuplovanja kao što je opisano na slici 23, smola je: 1) isprana sa 30% TFE/DCM; 2) a) tretirana sa CYTFA rastvorom 15 minuta i drenirana, i b) tretirana sa CYTFA rastvorom 15 minuta, čemu je dodato 1:1 NEM/DCM, mešano i drenirano; 3) mešano tri puta sa neutralizacionim rastvorom; i 4) isprano dva puta sa DCM. Vidi Sliku 23.
ii. Tretmani post-kuplovanja
[0221] Nakon što je svaki rastvor podjedinice dreniran kao što je opisano na Slici 23, smola je: 1) isprana sa DCM; i 2) isprana dva puta sa 30% TFE/DCM. Ako je smola čuvana u vremenskom periodu pre sledećeg ciklusa spajanja, drugo pranje sa TFE/DCM nije drenirano i smola je zadržana u navedenom rastvoru pranja TFE/DCM. Vidi Sliku 23.
iii. Ciklusi kuplovanja aktiviranih podjedinica
[0222] Ciklusi kuplovanja su izvedeni kako je opisano na Slici 23.
iv. Završno IPA pranje
[0223] Nakon što je izvršen korak završnog kuplovanja kako je opisano na Slici 23, smola je oprana 8 puta sa po 19,5 L IPA, i osušena pod vakuumom na sobnoj temperaturi oko 63,5 časova do konstantne težine od 5.579,8 g.
C. Cepanje
[0224] Gore navedena smola vezana za sirovu lekovitu supstancu Eteplirsen podeljena je u dve partije, a svaka partija (lot) je tretirana na sledeći način. Lot smole od 2.789,9 g je bio: 1) mešan sa 10L NMP 2 časa, zatim je NMP dreniran; 2) ispran sa po 10 L 30% TFE/DCM; 3) tretiran sa 10 L CYTFA rastvora 15 minuta; i 4) 10 L CYTFA rastvora 15 minuta u koji je dodato 130 ml 1:1 NEM/DCM i mešano 2 minuta i drenirano. Smola je tretirana tri puta sa po 10 L rastvora za neutralizaciju, isprana šest puta sa 10 L DCM, a osam puta sa po 10 L NMP. Smola je tretirana sa rastvorom za cepanje od 1530,4 g DTT i 2980 DBU u 6,96 L NMP tokom 2 sata kako bi se odvojila Eteplirsen sirova lekovita supstanca od smole. Rastvor za cepanje je dreniran i zadržan u posebnom sudu. Reaktor i smola su isprani sa 4,97 L NMP, što je kombinovano sa rastvorom za cepanje.
D. Uklanjanje zaštite
[0225] Kombinovani rastvor za cepanje i NMP pranje prebačeni su u posudu pod pritiskom kojoj je dodato 39,8 L NH4OH (NH3• H2O), što je ohlađeno na temperaturu od -10 °C do -25 °C u zamrzivaču. Posuda pod pritiskom je bila zatvorena i zagrevana na 45°C 16 časova, a zatim ostavljena da se ohladi na 25°C. Ovaj rastvor za deprotekciju koji sadrži supstancu sirovog leka Eteplirsen razblažen je sa prečišćenom vodom u odnosu 3:1 i pH podešen na 3,0 sa 2 M fosfornom kiselinom, zatim na pH 8,03 sa NH4OH. HPLC (C18) 73-74%.
Referentno prečišćavanje sirove lekovite supstance Eteplirsen (PMO#1)
[0226] Rastvor za deprotekciju iz prethodnog dela D, koji sadrži supstancu sirovog leka Eteplirsen, unet je na kolonu ToyoPearl Super-Q 650S anjonoizmenjivačke smole (Tosoh Bioscience) i eluiran sa gradijentom od 0-35% B preko zapremine od 17 kolona (pufer A: 10 mM natrijum hidroksid; pufer B: 1 M natrijum hlorid u 10 mM natrijum hidroksidu) i frakcije prihvatljive čistoće (C18 i SCX HPLC) objedinjene su u prečišćeni rastvor lekovitog proizvoda. HPLC : 97,74% (C18) 94,58% (SCX).
[0227] Rastvor prečišćene lekovite supstance je desalinizovan i liofilizovan do 1959 g pročišćene supstance leka Eteplirsen. Prinos 61,4%; HPLC : 97,7% (C18) 94,6% (SCX).
Tabela 5. Akronimi
3. WCX i SPE filtracija
sa izmenom hlorid jona
[0228] Analitičke procedure: Maseni spektri vremena leta matrično potpomognute laserske desorpcione jonizacije (MALDI-TOF-MS) snimljeni su na Bruker AutoflexTM Speed, koristeći matricu sinapinske kiseline (SA). SCX-HPLC je izveden na sistemu Thermo Dionex UltiMate 3000 opremljenom sa detektorom diodnog niza 3000 i kolonom ProPacTM SCX-20 (250 x 4 mm) koristeći protok od 1,0 mL/min (pH = 2; temperatura kolone 30 °C). Mobilne faze su bile A (25% acetonitrila u vodi koja sadrži 24mM H3PO4) i B (25% acetonitrila u vodi koja sadrži 1 M KCl i 24mM H3PO4). Upotrebljena je gradijentna eluacija: 0 min, 35% B; 2 min, 35% B; 22 min, 80% B; 25 min, 80% B; 25,1 min, 35% B; 30 min, 35% B.
[0229] Smeši PMO#1 (1,82 g, 0,177 mmol, sveže osušen liofilizacijom tokom dva dana), Ac-L-Arg-L-Arg-L-Arg-L-Arg-L-Arg-L-Arg-Gly-OH heksatrifluoroacetat (614,7 mg, 0,354 mmol) i 1-[Bis(dimetilamino)metilen]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]piridinijum 3-oksid heksafluorofosfat (HATU, 134,4 mg, 0,354 mmol) dodato je dimetil sulfoksidu (DMSO, 20 mL). Smeša je mešana na sobnoj temperaturi 3 minuta, zatim je dodan N, N-diizopropiletilamin (DIPEA, 68,5 mg, 0,530 mmol). Nakon 5 minuta, mutna smeša je postala bistar rastvor. Reakciju je praćena putem SCX-HPLC. Nakon 2 časa dodato je 20 ml 10% rastvora amonijum hidroksida (2,8% NH3). Smeša je mešana na sobnoj temperaturi dodatna 2 časa. Reakcija je prekinuta dodavanjem 400 mL vode. U rastvor je dodat trifluoroetanol (2,0 mL).
[0230] Rastvor je podeljen na dva dela i svaki deo je prečišćen pomoću WCX kolone (10 g smole po koloni). Svaka WCX kolona je prvo isprana sa 20% acetonitrila u vodi (v/v) da bi se uklonio PMO#1 početni materijal. Pranja (225 mL za svaku kolonu) su zaustavljena kada je analiza MALDI-TOF masenog spektra pokazala odsustvo PMO#1 signala. Svaka kolona je zatim isprana vodom (100 mL po koloni). Željeni proizvod, PPMO #1, je eluiran za 2,0 M gvanidin HCl (140 mL za svaku kolonu). Prečišćeni rastvori PPMO #1 su objedinjeni i zatim podeljeni u dva dela i svaki desalinizovan pomoću kolone SPE (10 g smole za svaku kolonu).
[0231] Kolona SPE je prvo isprana sa 1,0 M vodenim rastvorom NaCl (100 mL za svaku kolonu) da bi se generisala heksahidrohloridna so PPMO#1. Svaka SPE kolona je zatim isprana vodom (200 mL za svaku kolonu). Konačni desalinizovani PPMO #1 je eluiran sa 50% acetonitrila u vodi (v/v, 150 mL za svaku kolonu). Acetonitril je uklonjen evakuacijom pri smanjenom pritisku. Nastali vodeni rastvor je liofilizovan da bi se dobio željeni konjugat PPMO#1 heksahidrohlorid (1,93 g, 94,5% prinos).
Referentni primer 1: PMO#1
[0232] Pomoću prethodno opisanog protokola B metode sinteze PMO, sintetisan je PMO#1:
gde je svaki Nu od 1 do 30 i 5' do 3':
gde je A
Cis
Gis
HPLC: 97,7% (C18) 94,6% (SCX).
Primer 2: PPMO#1
[0233] Koristeći gore opisani protokol, PPMO#1 je sintetizovan iz PMO#1:
PPMO#1
gde je svaki Nu od 1 do 30 i 5' do 3':
gde je A
Cis
Gis
a T je
[0234] Analiza SCX-HPLC pokazuje da je čistoća 93,3% po integraciji glavnog pika i 99,69% po integraciji ukupnog PPMO#1. MALDI-TOF maseni spektar: m/z izračunato za C404H647N202O130P30[M 1 ] : 11342.25; nađeno: 11342.12.
Primer 3: Preskakanje egzona 51 in vitro (Miociti)
[0235] Za dva jedinjenja koja ciljaju humani distrofin egzon 51 kao što je opisano u tabeli ispod, PMO#1 i PPMO #1, od kojih su oba sastavljena u istoj sekvenci, procenjeno je da su sposobna da indukuju preskakanje egzona 51.
[0236] Konkretno, diferencirani humani miociti su korišćeni za određivanje sposobnosti gore navedenih jedinjenja da indukuju preskakanje egzona 51 pri različitim koncentracijama (tj.40 µm, 20 µm, 10 µm, 5 µm, 2,5 µm i 1,25 µm). Nakon diferencijacije, ćelije su inkubirane sa jedinjenjima tokom devedeset i šest časova, nakon čega je usledilo izolovanje RNK, a preskakanje egzona 51 mereno je pomoću RT-PCR kao što je gore opisano. Rezultati, koji pokazuju da PPMO#1 značajno povećava preskakanje egzona 51 u poređenju sa PMO#1, prikazani su u sledećoj tabeli i na Slici 4:
1
Referentni primer 4: Studija sa MDX mišem
[0237] Mdx miš je prihvaćen i dobro okarakterisan životinjski model za Dišenovu mišićnu distrofiju (DMD) koji sadrži mutaciju u egzonu 23 gena distrofina. Poznato je da M23D antisens sekvenca (SEQ ID NO: 2) izaziva preskakanje egzona 23 i vraćanje funkcionalne ekspresije distrofina. MDX miševi u dobi od 6-7 nedelja su dobili jednu injekciju PPMO4225 ili PMO4225 u repnu venu (donja tabela) u dozi od 40 mg/kg, ili sa fiziološkim rastvorom.
PMO4225 i PPMO4225 su pripremljeni metodom A PMO i gore opisanim metodama konjugacije CPP.
[0238] Tretirani miševi su žrtvovani 7, 30, 60 i 90 dana nakon jednodozne injekcije (n=6 po grupi). Dijafragma, srce i desni kvadriceps obrađeni su za analizu Western blot za merenje proizvodnje distrofin proteina i RT-PCR analizu za merenje procenta preskakanja egzona, a levi kvadriceps je obrađen za imunohistohemiju i H/E bojenje kao što je gore opisano.
[0239] Obnavljanje distrofin proteina je kvantifikovana putem Western blot, a procenat preskakanja egzona 23 je meren pomoću RT-PCR kao što je gore opisano.
[0240] RT-PCR rezultati su prikazani na Slikama 5A-10B i u tabelama ispod. Iznenađujuće, PPMO4225 je indukovao značajno veće i trajnije nivoe obnove distrofina i preskakanja egzona 23 u poređenju sa PMO4225, sa najvišim nivoima koji su se pojavili 30 dana nakon ubrizgavanja. Još više iznenađujuće, PPMO4225 je povećao nivo distrofina u srcu kada PMO4225 nije; distrofin i preskakanje egzona nisu primećeni u srcu u svim vremenskim tačkama sa PMO4225.
2
[0241] Rezultati imunohistohemije prikazani su na Slici 11. Ovde PPMO4225 obnavlja distrofin u kvadricepsu, dok 4225 proizvodi "krpoliki" obrazac ekspresije. Ujednačena raspodela distrofina sa PPMO4225 tretmanom ukazuje da je široko ciljanje skeletnih mišića ostvarivo. PPMO4225 je značajno poboljšao isporuku u odnosu na PMO4225 in vivo.
Primer 5: Preskakanje egzona 51 u NHP
[0242] Da bi se dodatno demonstrirala efikasnost preskakanja egzona PPMO antisens oligomera, korišćeni su ne-humani primati. Konkretno, majmunima javanski makaki koji imaju netaknuto mišićno tkivo ubrizgan je intravenski PPMO #1, PMO#1 (iz Primera 2), ili fiziološki rastvor u skladu sa rasporedom doziranja u tabeli ispod:
Raspored doziranja javanskog makaki majmuna
[0243]
[0244] Životinje u grupama 1-5 tolerisale su sve 4 doze u iznosu od 20, 40 i 80 mg/kg.
Životinje nisu tolerisale 160 mg/kg nakon treće doze, zbog čega su dve životinje eutanazirane na dan doziranja, a jedna životinja eutanazirana narednog dana. Ove životinje su pokazale gubitak telesne težine.
[0245] Pri svakoj zakazanoj obdukciji, ili eutanaziranoj in ekstremis, delovi dijafragme, glatki mišići duodenuma, jednjaka i aorte, kvadricepsa, deltoida, bicepsa i srca su prikupljeni i zamrznuti. Procenat preskakanja egzona 51 je određen korišćenjem RT-PCR kao što je gore opisano. Rezultati su prikazani na Slikama 12-15, i u tabeli ispod.
no = nije određeno
4
[0246] Iznenađujuće, PPMO#1 je proizveo duboke nivoe preskakanja egzona u testiranim netaknutim tkivima u poređenju sa PMO#1. Konkretno, dok primena PMO#1 nije dovela do bilo kakvog detektovanog preskakanja u bilo kom od prikupljenih tkiva, PPMO #1 je proizveo preskakanje egzona, na primer, preko 90% u kvadricepsu i dijafragmi i preko 60% dvanaestopalačnog creva pri nivou doze od 80 mg/kg. Posebno iznenađuje nivo preskakanja egzona postignut je u srcu pri, na primer, 80 mg/kg gde je preskakanje egzona bilo veće od 60%. Bez želje da budu povezani bilo kojom posebnom teorijom, sistematska primena i isporuka PPMO #1 u netaknuta ne-distrofična NHP mišićna tkiva i postizanje preskakanja egzona 51 do stepena postignutog sa PPMO #1, posebno u srčanom mišiću, nije se moglo predvideti iz gore navedenog mdx miša u Primeru 4. Umesto toga, isporuka zdravom tkivu kao u NHP razlikuje se od isporuke distrofičnom tkivu.
[0247] Za grupe 7 i 8, procenat preskakanja egzona 51 je određen pomoću RT-PCR kao što je gore opisano. Rezultati su prikazani na Slici 22, a u tabeli ispod.
[0248] Kao što se vidi iz rezultata, preskakanje egzona je bilo veće za 30 dana u poređenju sa 60 dana u svakom analiziranom mišiću, što pokazuje da se efikasnost preskakanja egzona smanjuje tokom vremena nakon jedne doze.
Referentni primer 6: Studija odgovora na dozu MDX miša
[0249] MDX miševi u dobi od 6-7 nedelja su dobili jednu injekciju PPMO4225 ili PMO4225 opisanu gore u repnu venu, u dozi od 40 mg/kg, 80 mg/kg ili 120 mg/kg (n=6 po grupi).
[0250] Tretirani miševi su žrtvovani 30 dana nakon injekcije. Dijafragma, kvadriceps i srce obrađeni su za analizu Western blot kako bi se izmerila proizvodnja distrofin proteina na osnovu gore opisanog protokola Western blot (koji se koristi, na primer, u Primeru 4) sa sledećim izmenama:
[0251] Obnavljanje distrofin proteina kao % divljeg tipa prikazana je u tabeli ispod i na Slikama 16-19.
[0252] Iznenađujuće, podaci pokazuju da jedna doza PPMO4225 povećava nivo distrofina na način zavisan od doze kod mdx miševa u znatnoj i suštinski većem iznosu nego PMO4225.
Referentni primer 7: IHC Studija dijafragme i srca MDX Miša
[0253] MDX miševi starosti od 6-7 nedelja su dobili jednu injekciju u repnu venu PPMO4225 u dozi od 80 mg/kg ili fiziološkog rastvora, i divlji miševi starosti od 6-7 nedelja su dobili jednu injekciju fiziološkog rastvora. Tretirani mdx miševi, mdx miševi sa fiziološkim rastvorom i miševi divljeg tipa žrtvovani su 30. dana nakon jedne doze injekcije (n=4 po grupi). Rezultati imunohistohemije prikazani su na Slici 24. Ovde rezultati pokazuju ujednačeno povećanje distrofina u tkivima povezanim sa morbiditetom i mortalitetom u DMD kod mdx miševa tretiranih sa PPMO4225.
Primer 8: Preskakanje egzona 51 in vitro (mioblasti)
[0254] Dva antisens oligomer konjugata koji ciljaju egzon 51 humanog distrofina (DMD) kao što je opisano u tabeli ispod, PMO#1 i PPMO #1, od kojih oba sadrže istu sekvencu, procenjeni su na preskakanje DMD egzona 51 u zdravim humanim mioblastima.
Sekvence PMO#1 i PPMO #1 za humani DMD egzon 51.
[0255]
[0256] Konkretno, zdravi ljudski mioblasti (pasaža 5-6, SKB-F-SL kupljeni od Zen-Bio, Inc.) su zasejani sa ~40% konfluentnosti kada su tretirani sa PMO#1 ili PPMO #1 pri različitim koncentracijama (tj.40 µm, 20 µm, 10 µm, 5 µm, 2,5 µm i 1,25 µm) u SKM-M medijima (Zen-Bio, Inc.). Nakon devedeset šest časova inkubacije, mioblasti su isprani sa PBS i lizirani RA1 liza puferom u Illustra GE RNAspin 96 kompletu (Cat# 25-055-75, GE Healthcare BioSciences). Ukupna RNK je izolovana prema preporuci proizvođača, osim što je 40 µL vode bez RNaze korišćeno za eluiranje RNK.
[0257] Za određivanje preskakanja egzona 51 kod oba jedinjenja, izveden je RT-PCR sa krajnjom tačkom u dva koraka. Konkretno, jedanaest mikrolitara ukupne RNK je prvi put transkribovano na cDNK putem kompleta za sintezu SuperScript IV First-strand (Cat# 18091200, Invitrogen) koristeći randomizirane heksamere u skladu sa uputstvima proizvođača. PCR je urađen dodavanjem 9 µL cDNK u Platinum Taq DNK polimerazu PCR Supermix High Fidelity (Cat# 12532024, Invitrogen) sa prajmerima koji su ciljali humane DMD egzone 49 i 52 [ushodni prajmer (SEQ ID NO: 5): CCAGCCACTCAGCCAGTGAAG; nishodni prajmer (SEQ ID NO: 6): CGATCCGTAATGTTCTAGCC]. PCR pojačanje je izvršeno korišćenjem BioRad CFX96 termociklera u realnom vremenu korišćenjem programa prikazanog u tabeli ispod. Ekspresija preskočenih ili nepreskočenih PCR proizvoda procenjena je unošenjem 32 µL PCR proizvoda u LabChip GX sistem pomoću kompleta DNK reagensa visoke osetljivosti (CLS760672, Perkin Elmer). Procenat preskakanja DMD egzona 51 izračunat je kao procenat molarnosti (nmol/1) za traku preskočenog egzona 51 (246 bp) u poređenju sa sumom molarnosti za preskočenu traku (246 bp) i nepreskočenu traku (478 bp).
[0258] Dvostrani, neupareni Studentov t-test (homoskedastički) je korišćen za procenu da li se srednja vrednost dve grupe statistički razlikuje jedna od druge pri svakoj dozi. P-vrednost < 0,05 se smatra statistički značajnom.
Termocikler program se koristi za pojačavanje DMD amplikona sa ili bez preskakanja egzona 51.
[0259]
[0260] Rezultati su dati u tabeli ispod i na Slici 25.
Procenat preskakanja DMD egzona 51 za PMO#1 i PPMO#1 u humanim mioblastima.
[0262] Ovi in vitro rezultati pokazuju da PPMO#1 značajno povećava
preskakanje DMD egzona 51 u poređenju sa PMO#1 u humanim mioblastima.
Primer 9: Preskakanje egzona 51 in vitro (Miotube)
[0263] Dva antisens oligomer konjugata koji ciljaju humani distrofin (DMD) egzon 51 kao što je opisano u tabeli ispod, PMO#1 i PPMO #1, od kojih oba sadrže istu sekvencu, procenjeni su za preskakanje DMD egzona 51 u zdravim humanim mioblastima.
[0264] Konkretno, zdravi humani mioblasti (pasaža 5-6, SKB-F-SL kupljeni od Zen-Bio, Inc.) su kultivisani da dostignu 80-90% konfluentnosti u SKM-M medijumu pre početka diferencijacije inkubacijom u niskim serumskim medijumima (SKM-D, Zen-Bio, Inc.). Pet dana nakon diferencijacije, zrele miotube su inkubirane sa PMO#1 ili PPMO #1 u različitim koncentracijama (tj.40 µm, 20 µm, 10 µm, 5 µm, 2,5 µm i 1,25 µm). Nakon devedeset šest časova inkubacije, mioblasti su isprani sa PBS i lizirani pomoću RA1 liza pufera u Illustra GE RNAspin 96 kompletu (Cat# 25-055-75, GE Healthcare Bio-Sciences). Ukupna RNK je izolovana prema preporuci proizvođača, osim što je 40 µL vode bez RNaza korišćeno za eluiranje RNK.
[0265] Za određivanje preskakanja DMD egzona 51 od strane PMO#1 ili PPMO #1, izveden je RT-PCR sa krajnjom tačkom u dva koraka. Konkretno, jedanaest mikrolitara ukupne RNK je prvi put reverzno transkribovano na cDNK putem kompleta za sintezu SuperScript IV Firststrand (Cat# 18091200, Invitrogen) koristeći random heksamere u skladu sa uputstvima proizvođača. PCR je urađen dodavanjem 9 µL cDNK u Platinum Taq DNK polimerazu PCR Supermix High Fidelity (Cat# 12532024, Invitrogen) sa prajmerima koji su ciljali humane DMD egzone 49 i 52 [ushodni prajmer (SEQ ID NO: 5):
CCAGCCACTCAGCCAGTGAAG; nishodni prajmer (SEQ ID NO: 6):
CGATCCGTAATGTTCTAGCC]. PCR pojačanje je izvršeno korišćenjem BioRad CFX96 termociklera u realnom vremenu korišćenjem programa prikazanog u tabeli ispod. Ekspresija preskočenih ili nepreskočenih PCR proizvoda procenjena je unošenjem 32 µL PCR proizvoda na LabChip GX sistem pomoću kompleta DNK reagensa visoke osetljivosti (CLS760672, Perkin Elmer). Procenat preskakanja DMD egzona 51 izračunat je kao procenat molarnosti (nmol/1) za traku preskočenog egzona 51 (246 bp) u poređenju sa sumom molarnosti za preskočenu traku (246 bp) i nepreskočenu traku (478 bp).
[0266] Dvostrani, neupareni Studentov t-test (homoskedastički) je korišćen za procenu da li se srednja vrednost dve grupe statistički međusobno razlikuje pri svakoj dozi. P-vrednost < 0,05 se smatra statistički značajnom.
Termocikler program korišćen za pojačavanje DMD amplikona sa ili bez preskakanja egzona 51.
[0268] Rezultati, koji pokazuju da PPMO#1 značajno povećava preskakanje DMD egzona 51 u poređenju sa PMO#1, prikazani su u sledećoj tabeli i na Slici 26.
Procenat preskakanja DMD egzona 51 za PMO#1 i PPMO#1 u humanim mioblastima.
REFERENCE
[0270] Aartsma-Rus, A., A. A. Janson, i dr. (2004). "Antisense-induced multiexon skipping for Duchenne muscular dystrophy makes more sense." Am J Hum Genet 74(1): 83-92.
[0271] Abes, R., i dr. (2008). "Arginine-rich cell penetrating peptides: design, structureactivity, and applications to alter pre-mRNA splicing by steric-block oligonucleotides." J Pept. Sci.14: 455-460.
1
[0272] Alter, J., i dr. (2006). "Systemic delivery of morpholino oligonucleotide restores dystrophin expression bodywide and improves dystrophic pathology." Nat. Med.12(2): 175-177.
[0273] Bestas, B., i dr. (2014). "Splice-correcting ligonucleotides restore BTK function in X-linked agammaglobulinemia model." J. Clin. Invest.
[0274] Cirak, S., V. Arechavala-Gomeza, i dr. (2011). "Exon skipping and dystrophin restoration in patients with Duchenne muscular dystrophy after systemic phosphorodiamidate morpholino oligomer treatment: an open-label, phase 2, dose-escalation study." Lancet 378(9791): 595-605.
[0275] Dunckley, M. G., I. C. Eperon, i dr. (1997). "Modulation of splicing in the DMD gene by antisense oligoribonucleotides." Nucleosides & Nucleotides 16(7-9): 1665-1668.
[0276] Dunckley, M. G., M. Manoharan, i dr. (1998). "Modification of splicing in the dystrophin gene in cultured Mdx muscle cells by antisense oligoribonucleotides." Hum Mol Genet 7(7): 1083-90.
[0277] Errington, S. J., C. J. Mann, i dr. (2003). "Target selection for antisense oligonucleotide induced exon skipping in the dystrophin gene." J Gene Med 5(6): 518-27.
[0278] Goemans, N. M., M. Tulinius, i dr. (2011). "Systemic Administration of PR0051 in Duchenne's Muscular Dystrophy." N Engl J Med.
[0279] Jearawiriyapaisarn, N., H. M. Moulton, i dr. (2008). "Sustained Dystrophin Expression Induced by Peptide-conjugated Morpholino Oligomers in the Muscles of mdx Mice." Mol Ther.
[0280] Jearawiriyapaisarn, N., i dr. (2010). "Long-term improvement in mdx cardiomyopathy after therapy with peptide-conjugated morpholino oligomers." Cardiovascular Research 85: 444-453.
2
[0281] Kinali, M., V. Arechavala-Gomeza, i dr. (2009). "Local restoration of dystrophin expression with the morpholino oligomer AVI-4658 in Duchenne muscular dystrophy: a single-blind, placebo-controlled, dose-escalation, proof-of-concept study." Lancet Neurol 8(10): 918-28.
[0282] Leblue, B., i dr. (2008). "Cell penetrating peptide conjugates of steric block oligonucleotides." Adv. Drug Deliv. Rev.60: 517-529.
[0283] Lu, Q. L., C. J. Mann, i dr. (2003). "Functional amounts of dystrophin produced by skipping the mutated exon in the mdx dystrophic mouse." Nat Med 9(8): 1009-14.
[0284] Mann, C. J., K. Honeyman, i dr. (2002). "Improved antisense oligonucleotide induced exon skipping in the mdx mouse model of muscular dystrophy." J Gene Med 4(6): 644-54.
[0285] Marshall, N. B., S. K. Oda, i dr. (2007). "Arginine-rich cell-penetrating peptides facilitate delivery of antisense oligomers into murine leukocytes and alter pre-mRNA splicing." Journal of Immunological Methods 325(1-2): 114-126.
[0286] Matsuo, M., T. Masumura, i dr. (1991). "Exon skipping during splicing of dystrophin mRNA precursor due to an intraexon deletion in the dystrophin gene of Duchenne muscular dystrophy kobe." J Clin Invest 87(6): 2127-31.
[0287] McClory, G., i dr. (2006) "Antisense oligonucleotide-induced exon skipping restored dystrophin expression in vitro in a canine model of DMD." Gene Therapy 13: 1373-1381.
[0288] Monaco, A. P., C. J. Bertelson, i dr. (1988). "An explanation for the phenotypic differences between patients bearing partial deletions of the DMD locus." Genomics 2(1): 90-5.
[0289] Moulton, H.M., (2007). "Cell-penetrating peptide-morpholino conjugates alter premRNA splicing of DMD (Duchenne muscular dystrophy) and inhibit murine coronavirus replication in vivo." Biochem. Society Trans 35(4): 826-828.
[0290] Pramono, Z. A., Y. Takeshima, i dr. (1996). "Induction of exon skipping of the dystrophin transcript in lymphoblastoid cells by transfecting an antisense oligodeoxynucleotide complementary to an exon recognition sequence." Biochem Biophys Res Commun 226(2): 445-9.
[0291] Sazani, P., R. Kole, i dr. (2007). Splice switching oligomers for the TNF superfamily receptors and their use in treatment of disease. PCT WO2007058894, University of North Carolina
[0292] Sierakowska, H., M. J. Sambade, i dr. (1996). "Repair of thalassemic human betaglobin mRNA in mammalian cells by antisense oligonucleotides." Proc Natl Acad Sci U S A 93(23): 12840-4.
[0293] Summerton, J. and D. Weller (1997). "Morpholino antisense oligomers: design, preparation, and properties." Antisense Nucleic Acid Drug Dev 7(3): 187-95.
[0294] Takeshima, Y., H. Nishio, i dr. (1995). "Modulation of in vitro splicing of the upstream intron by modifying an intra-exon sequence which is deleted from the dystrophin gene in dystrophin Kobe." J Clin Invest 95(2): 515-20.
[0295] van Deutekom, J. C., M. Bremmer-Bout, i dr. (2001). "Antisense-induced exon skipping restores dystrophin expression in DMD patient derived muscle cells." Hum Mol Genet 10(15): 1547-54.
[0296] van Deutekom, J. C., A. A. Janson, i dr. (2007). "Local dystrophin restoration with antisense oligonucleotide PRO051." N Engl J Med 357(26): 2677-86.
[0297] Wilton, S. D., A. M. Fall, i dr. (2007). "Antisense oligonucleotide-induced exon skipping across the human dystrophin gene transcript." Mol Ther 15(7): 1288-96.
[0298] Wilton, S. D., F. Lloyd, i dr. (1999). "Specific removal of the nonsense mutation from the mdx dystrophin mRNA using antisense oligonucleotides." Neuromuscul Disord 9(5): 330-8.
4
[0299] Wu, B., H. M. Moulton, i dr. (2008). "Effective rescue of dystrophin improves cardiac function in dystrophin-deficient mice by a modified morpholino oligomer." Proc Natl Acad Sci U S A 105(39): 14814-9.
[0300] Wu, B., i dr. (2012). "Long-term rescue of dystrophin expression and improvement in muscle pathology and function in dystrophic mdx mice by peptide-conjugated morpholino." The Am. J. Pathol.181(2): 392-400.
[0301] Wu, P., i dr. (2007) "Cell-penetrating peptides as transporters for morpholino oligomers: effects of amino acid composition on intracellular delivery and cytotoxicity." Nucleic Acids Research 35(15): 5182-5191.
[0302] Yin, H., H. M. Moulton, i dr. (2008). "Cell-penetrating peptide-conjugated antisense oligonucleotides restore systemic muscle and cardiac dystrophin expression and function." Hum Mol Genet 17(24): 3909-18.
[0303] Yin, H., i dr. (2011). "Pip5 transduction peptides direct high efficiency oligonucleotidemediated dystrophin exon skipping in heart and phenotypic correction in mdx mice." Mol. Ther 19(7): 1295-1303.
[0304] Youngblood, D., i dr. (2006). "Stability of cell-penetrating peptide- morpholino oligomer conjugates in human serum and in cells." Am. Chem. Soc.
SPISAK SEKVENCI
[0305]
SPISAK SEKVENCI

Claims (12)

  1. Patentni zahtevi 1. Antisens oligomerni konjugat formule (IV):
    ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.
  2. 2. Antisens oligomerni konjugat prema zahtevu 1, pri čemu je antisens oligomer formule (IVA):
    Prekid A Prekid B Prekid C
  3. 3. Farmaceutski sastav, koji se sastoji od antisens oligomernog konjugata prema zahtevu 1 ili 2, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, i farmaceutski prihvatljivi nosač.
  4. 4. Antisens oligomerni konjugat ili njegova farmaceutski prihvatljiva so prema zahtevu 1 ili 2, za primenu u terapiji.
  5. 5. Antisens oligomerni konjugat ili njegova farmaceutski prihvatljiva so prema zahtevu 1 ili 2, ili farmaceutski sastav prema zahtevu 3, za upotrebu u tretiranju Dišenove mišićne distrofije (DMD) kod ispitanika kome je to potrebno, pri čemu ispitanik ima mutaciju gena distrofina koji je podložan preskakanju egzona 51.
  6. 6. Antisens oligomerni konjugat ili njegova farmaceutski prihvatljiva so prema zahtevu 1 ili 2, ili farmaceutski sastav prema zahtevu 3, za upotrebu u obnavljanju okvira čitanja iRNK za indukovanje proizvodnje distrofina u ispitanika koji ima mutaciju gena distrofina koji je podložan preskakanju egzona 51.
  7. 7. Antisens oligomerni konjugat ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, ili farmaceutski sastav, za upotrebu prema zahtevu 5 ili zahtevu 6, pri čemu upotreba obuhvata nedeljno davanje antisens oligomernog konjugata.
  8. 8. Antisens oligomerni konjugat ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, ili farmaceutski sastav, za upotrebu prema zahtevu 5 ili zahtevu 6, pri čemu upotreba obuhvata davanje antisens oligomernog konjugata dvonedeljno.
  9. 9. Antisens oligomerni konjugat ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, ili farmaceutski sastav, za upotrebu prema zahtevu 5 ili zahtevu 6, pri čemu upotreba obuhvata davanje antisens oligomer konjugata svake tri nedelje.
  10. 10. Antisens oligomerni konjugat ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, ili farmaceutski sastav, za upotrebu prema zahtevu 5 ili zahtevu 6, pri čemu upotreba obuhvata davanje antisens oligomer konjugata mesečno. 1 1
  11. 11. Farmaceutski sastav prema zahtevu 3, za upotrebu u isključivanju egzona 51 iz distrofin pre-iRNK tokom obrade iRNK u ispitanika sa mutacijom gena distrofina koji je podložan preskakanju egzona 51.
  12. 12. Farmaceutski sastav prema zahtevu 3, za upotrebu u vezivanju egzona 51 distrofin preiRNK kod ispitanika sa mutacijom gena distrofina koji je podložan preskakanju egzona 51. 1 2
RS20220837A 2016-12-19 2017-12-13 Oligomerni konjugati za preskakanje egzona za mišićnu distrofiju RS63610B1 (sr)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662436182P 2016-12-19 2016-12-19
US201762443476P 2017-01-06 2017-01-06
US201762479173P 2017-03-30 2017-03-30
US201762562080P 2017-09-22 2017-09-22
PCT/US2017/066222 WO2018118599A1 (en) 2016-12-19 2017-12-13 Exon skipping oligomer conjugates for muscular dystrophy
EP17832401.8A EP3554553B1 (en) 2016-12-19 2017-12-13 Exon skipping oligomer conjugates for muscular dystrophy

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS63610B1 true RS63610B1 (sr) 2022-10-31

Family

ID=61006315

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20220837A RS63610B1 (sr) 2016-12-19 2017-12-13 Oligomerni konjugati za preskakanje egzona za mišićnu distrofiju

Country Status (28)

Country Link
US (4) US10888578B2 (sr)
EP (1) EP3554553B1 (sr)
JP (3) JP7118063B2 (sr)
KR (2) KR102552428B1 (sr)
CN (1) CN110290812B (sr)
AU (1) AU2017382723B2 (sr)
CA (1) CA3046793A1 (sr)
CO (1) CO2019007397A2 (sr)
CY (1) CY1125549T1 (sr)
DK (1) DK3554553T3 (sr)
ES (1) ES2927079T3 (sr)
HR (1) HRP20220943T1 (sr)
HU (1) HUE059843T2 (sr)
IL (2) IL267244B (sr)
LT (1) LT3554553T (sr)
MD (1) MD3554553T2 (sr)
MX (1) MX2019006882A (sr)
MY (1) MY195801A (sr)
NZ (1) NZ755416A (sr)
PL (1) PL3554553T3 (sr)
PT (1) PT3554553T (sr)
RS (1) RS63610B1 (sr)
SA (1) SA519402154B1 (sr)
SG (1) SG10202012839TA (sr)
SM (1) SMT202200366T1 (sr)
TW (1) TWI760402B (sr)
WO (1) WO2018118599A1 (sr)
ZA (1) ZA201904092B (sr)

Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI541024B (zh) 2010-09-01 2016-07-11 日本新藥股份有限公司 反義核酸
JP2019513371A (ja) 2016-04-01 2019-05-30 アビディティー バイオサイエンシーズ エルエルシー 核酸ポリペプチド組成物とその使用
TWI737736B (zh) 2016-05-24 2021-09-01 美商薩羅塔治療公司 製備磷醯二胺嗎啉代寡聚物之方法
MA49775A (fr) 2016-05-24 2020-06-10 Sarepta Therapeutics Inc Procédés de préparation d'oligomères morpholino de phosphorodiamidate
SMT202200366T1 (it) * 2016-12-19 2022-11-18 Sarepta Therapeutics Inc Coniugati di oligomeri per salto di esone per distrofia muscolare
IL297528A (en) * 2016-12-19 2022-12-01 Sarepta Therapeutics Inc Exon-skipping oligomer conjugates for muscular dystrophy
SI3554554T1 (sl) 2016-12-19 2023-02-28 Sarepta Therapeutics, Inc. Oligomerni konjugati, ki preskakujejo ekson za mišično distrofijo
MX2019008199A (es) 2017-01-06 2019-11-25 Avidity Biosciences Llc Composiciones de acido nucleico polipeptido y metodos de induccion de la omision de exon.
GB201711809D0 (en) * 2017-07-21 2017-09-06 Governors Of The Univ Of Alberta Antisense oligonucleotide
GB201821269D0 (en) 2018-12-28 2019-02-13 Nippon Shinyaku Co Ltd Myostatin signal inhibitor
EP3955966A1 (en) * 2019-04-18 2022-02-23 Sarepta Therapeutics, Inc. Compositions for treating muscular dystrophy
EP3987029A1 (en) * 2019-06-19 2022-04-27 Sarepta Therapeutics, Inc. Methods for treating muscular dystrophy
CN118109468A (zh) 2019-12-26 2024-05-31 日本新药株式会社 诱导外显子50的跳读的反义核酸
US20230140736A1 (en) * 2020-02-28 2023-05-04 Nippon Shinyaku Co., Ltd. Antisense nucleic acid inducing skipping of exon 51
CA3211038A1 (en) * 2021-02-12 2022-08-18 Oxford University Innovation Limited Cell-penetrating peptide conjugates and methods of their use
MX2023012559A (es) 2021-04-30 2023-12-15 Sarepta Therapeutics Inc Métodos de tratamiento para la distrofia muscular.
WO2022270585A1 (ja) 2021-06-23 2022-12-29 日本新薬株式会社 アンチセンスオリゴマーの組み合わせ
US20240285770A1 (en) 2021-07-08 2024-08-29 Nippon Shinyaku Co., Ltd. Precipitation suppressing agent
CN118475355A (zh) 2021-07-08 2024-08-09 日本新药株式会社 肾毒性减轻剂
US20240285547A1 (en) 2021-07-08 2024-08-29 Nippon Shinyaku Co., Ltd. Nephrotoxicity reducing agent
CN120129745A (zh) 2022-03-10 2025-06-10 日本新药株式会社 抗病毒反义低聚物
JP2025509438A (ja) 2022-03-17 2025-04-11 サレプタ セラピューティクス， インコーポレイテッド ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマーコンジュゲート

Family Cites Families (177)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CH445129A (fr) 1964-04-29 1967-10-15 Nestle Sa Procédé pour la préparation de composés d'inclusion à poids moléculaire élevé
US3459731A (en) 1966-12-16 1969-08-05 Corn Products Co Cyclodextrin polyethers and their production
US3453257A (en) 1967-02-13 1969-07-01 Corn Products Co Cyclodextrin with cationic properties
US3426011A (en) 1967-02-13 1969-02-04 Corn Products Co Cyclodextrins with anionic properties
US3453259A (en) 1967-03-22 1969-07-01 Corn Products Co Cyclodextrin polyol ethers and their oxidation products
US4235871A (en) 1978-02-24 1980-11-25 Papahadjopoulos Demetrios P Method of encapsulating biologically active materials in lipid vesicles
US5521063A (en) 1985-03-15 1996-05-28 Antivirals Inc. Polynucleotide reagent containing chiral subunits and methods of use
JP3022967B2 (ja) 1985-03-15 2000-03-21 アンチバイラルズ インコーポレイテッド 立体規則性ポリヌクレオチド結合ポリマー
US5506337A (en) 1985-03-15 1996-04-09 Antivirals Inc. Morpholino-subunit combinatorial library and method
US5217866A (en) 1985-03-15 1993-06-08 Anti-Gene Development Group Polynucleotide assay reagent and method
US5166315A (en) 1989-12-20 1992-11-24 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US5034506A (en) 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
US4737323A (en) 1986-02-13 1988-04-12 Liposome Technology, Inc. Liposome extrusion method
US5525465A (en) 1987-10-28 1996-06-11 Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine Oligonucleotide-polyamide conjugates and methods of production and applications of the same
US5087617A (en) 1989-02-15 1992-02-11 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for treatment of cancer using oligonucleotides
US5670617A (en) 1989-12-21 1997-09-23 Biogen Inc Nucleic acid conjugates of tat-derived transport polypeptides
KR0166088B1 (ko) 1990-01-23 1999-01-15 . 수용해도가 증가된 시클로덱스트린 유도체 및 이의 용도
US5539082A (en) 1993-04-26 1996-07-23 Nielsen; Peter E. Peptide nucleic acids
US5714331A (en) 1991-05-24 1998-02-03 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having enhanced binding affinity, sequence specificity and solubility
US5719262A (en) 1993-11-22 1998-02-17 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having amino acid side chains
GB9209032D0 (en) 1992-04-25 1992-06-10 Ciba Geigy Ag New peptide derivatives
WO1994002595A1 (en) 1992-07-17 1994-02-03 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Method and reagent for treatment of animal diseases
CA2135642C (en) 1992-08-21 1999-12-14 James G. Barsoum Tat-derived transport polypeptides
ATE208634T1 (de) 1993-01-07 2001-11-15 Univ Jefferson Modulation der proliferation von glatten muskelzellen durch antisense inhibition von c-myc
CN1123038A (zh) 1993-05-11 1996-05-22 北卡罗来纳大学查珀尔希尔分校 阻止异常剪接的反义寡核苷酸及其使用方法
US5885613A (en) 1994-09-30 1999-03-23 The University Of British Columbia Bilayer stabilizing components and their use in forming programmable fusogenic liposomes
US5753613A (en) 1994-09-30 1998-05-19 Inex Pharmaceuticals Corporation Compositions for the introduction of polyanionic materials into cells
US5820873A (en) 1994-09-30 1998-10-13 The University Of British Columbia Polyethylene glycol modified ceramide lipids and liposome uses thereof
IL115849A0 (en) 1994-11-03 1996-01-31 Merz & Co Gmbh & Co Tangential filtration preparation of liposomal drugs and liposome product thereof
US5849727A (en) 1996-06-28 1998-12-15 Board Of Regents Of The University Of Nebraska Compositions and methods for altering the biodistribution of biological agents
IL132941A0 (en) 1997-05-21 2001-03-19 Univ Leland Stanford Junior Composition and method for enhancing transport across biological membranes
US6329501B1 (en) 1997-05-29 2001-12-11 Auburn University Methods and compositions for targeting compounds to muscle
US6794499B2 (en) 1997-09-12 2004-09-21 Exiqon A/S Oligonucleotide analogues
US7572582B2 (en) 1997-09-12 2009-08-11 Exiqon A/S Oligonucleotide analogues
WO1999042091A2 (en) 1998-02-19 1999-08-26 Massachusetts Institute Of Technology Use of polycations as endosomolytic agents
US6683173B2 (en) 1998-04-03 2004-01-27 Epoch Biosciences, Inc. Tm leveling methods
CA2340884A1 (en) 1998-08-25 2000-03-02 Human Genome Sciences, Inc. 49 human secreted proteins
US6210892B1 (en) 1998-10-07 2001-04-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Alteration of cellular behavior by antisense modulation of mRNA processing
JP2000125448A (ja) 1998-10-14 2000-04-28 Yazaki Corp 電気接続箱
JP2002535015A (ja) 1999-01-29 2002-10-22 エイブイアイ バイオファーマ， インコーポレイテッド 標的ｒｎａを検出するための非侵襲性方法
JP2000256547A (ja) 1999-03-10 2000-09-19 Sumitomo Dow Ltd 耐熱性プラスチックカード用樹脂組成物
US7084125B2 (en) 1999-03-18 2006-08-01 Exiqon A/S Xylo-LNA analogues
CA2365984A1 (en) 1999-04-08 2000-10-19 Oasis Biosciences, Inc. Antisense oligonucleotides comprising universal and/or degenerate bases
EP1178999B1 (en) 1999-05-04 2007-03-14 Santaris Pharma A/S L-ribo-lna analogues
JP2000325085A (ja) 1999-05-21 2000-11-28 Masafumi Matsuo デュシェンヌ型筋ジストロフィー治療剤
KR100708573B1 (ko) 1999-05-24 2007-04-18 에이브이아이 바이오파마 인코포레이티드 다낭 신장 질환의 치료를 위한 ｃ-ｍｙｃ에 대한 안티센스
US6303573B1 (en) 1999-06-07 2001-10-16 The Burnham Institute Heart homing peptides and methods of using same
US7229961B2 (en) 1999-08-24 2007-06-12 Cellgate, Inc. Compositions and methods for enhancing drug delivery across and into ocular tissues
US6669951B2 (en) 1999-08-24 2003-12-30 Cellgate, Inc. Compositions and methods for enhancing drug delivery across and into epithelial tissues
CA2381425A1 (en) 1999-08-24 2001-03-01 Cellgate, Inc. Enhancing drug delivery across and into epithelial tissues using oligo arginine moieties
US20030104622A1 (en) 1999-09-01 2003-06-05 Robbins Paul D. Identification of peptides that facilitate uptake and cytoplasmic and/or nuclear transport of proteins, DNA and viruses
US7070807B2 (en) 1999-12-29 2006-07-04 Mixson A James Branched histidine copolymers and methods for using same
US7163695B2 (en) 1999-12-29 2007-01-16 Mixson A James Histidine copolymer and methods for using same
US20020009491A1 (en) 2000-02-14 2002-01-24 Rothbard Jonathan B. Compositions and methods for enhancing drug delivery across biological membranes and tissues
US6653467B1 (en) 2000-04-26 2003-11-25 Jcr Pharmaceutical Co., Ltd. Medicament for treatment of Duchenne muscular dystrophy
US6727355B2 (en) 2000-08-25 2004-04-27 Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. Pharmaceutical composition for treatment of Duchenne muscular dystrophy
US6559279B1 (en) 2000-09-08 2003-05-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Process for preparing peptide derivatized oligomeric compounds
US20040170955A1 (en) 2000-09-08 2004-09-02 Wadih Arap Human and mouse targeting peptides identified by phage display
EP1191097A1 (en) 2000-09-21 2002-03-27 Leids Universitair Medisch Centrum Induction of exon skipping in eukaryotic cells
WO2002038764A2 (en) 2000-11-10 2002-05-16 The Regents Of The University Of California Il-17 receptor-like protein, uses thereof, and modulation of catabolic activity of il-17 cytokines on bone and cartilage
EP1364201A4 (en) 2001-02-06 2005-01-05 Univ Auburn LIGAND SENSOR DEVICES AND USES THEREOF
WO2002062989A2 (en) 2001-02-08 2002-08-15 Sequitur, Inc. Methods of light activated release 0f ligands from endosomes
MXPA03007358A (es) 2001-02-16 2004-12-13 Cellgate Inc Transportadores que contienen porciones de arginina separadas.
US7456146B2 (en) 2001-05-09 2008-11-25 Ghc Research Development Corporation Lytic peptide prodrugs
JP2004537517A (ja) 2001-05-17 2004-12-16 エイブイアイ バイオファーマ， インコーポレイテッド ｃ−ｍｙｃアンチセンスオリゴマーを使用した、癌を処置するための併用アプローチ
JP3735292B2 (ja) 2001-07-26 2006-01-18 三菱重工業株式会社 ダイエット効果のある健康食品および製剤
US6645974B2 (en) 2001-07-31 2003-11-11 Merck & Co., Inc. Androgen receptor modulators and methods for use thereof
US20090075377A1 (en) 2001-08-03 2009-03-19 Arbor Vita Corporation Molecular interactions in cells
AU2002334307A1 (en) 2001-09-04 2003-03-18 Exiqon A/S Novel lna compositions and uses thereof
AU2002359679B2 (en) 2001-12-11 2009-01-08 Cellgate, Inc. Guanidinium transport reagents and conjugates
KR100464261B1 (ko) 2002-01-24 2005-01-03 주식회사 파나진 Ｐｎａ 올리고머를 합성하기 위한 신규한 단량체 및 그의제조방법
KR20030084444A (ko) 2002-04-26 2003-11-01 주식회사 파나진 Ｐｎａ 올리고머를 합성하기 위한 신규한 단량체 및 그의제조방법
US7569575B2 (en) 2002-05-08 2009-08-04 Santaris Pharma A/S Synthesis of locked nucleic acid derivatives
WO2004043978A2 (en) 2002-11-05 2004-05-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2'-methoxy substituted oligomeric compounds and compositions for use in gene modulations
JP4777777B2 (ja) 2002-11-25 2011-09-21 雅文 松尾 ｍＲＮＡ前駆体のスプライシングを修飾するＥＮＡ核酸医薬
WO2004084805A2 (en) 2003-03-19 2004-10-07 The J. David Gladstone Institutes Acetylated tat polypeptides and methods of use thereof
CA2524255C (en) 2003-03-21 2014-02-11 Academisch Ziekenhuis Leiden Modulation of exon recognition in pre-mrna by interfering with the secondary rna structure
CA2523672C (en) 2003-04-29 2012-07-17 Avi Biopharma, Inc. Compositions for enhancing transport of molecules into cells
PL2784084T5 (pl) 2003-07-08 2024-12-02 Novartis Pharma Ag Przeciwciała antagonistyczne heterologicznych polipeptydów il-17a/f
US7211668B2 (en) 2003-07-28 2007-05-01 Panagene, Inc. PNA monomer and precursor
US20050222068A1 (en) 2003-10-23 2005-10-06 Mourich Dan V Method and antisense composition for selective inhibition of HIV infection in hematopoietic cells
US20050203041A1 (en) 2003-09-23 2005-09-15 Mourich Dan V. Antisense compound and method for selectively killing activated T cells
US7786151B2 (en) 2004-01-09 2010-08-31 Kinopharma, Inc. Therapeutic composition of treating abnormal splicing caused by the excessive kinase induction
EP1713332A4 (en) 2004-01-23 2010-08-18 Avi Biopharma Inc ANTISENSE OLIGOMERS AND METHOD FOR INDUCTION OF IMMUNOTHERAPY AND IMMUNOSUPPRESSION
WO2005077333A2 (en) 2004-02-10 2005-08-25 University Of Florida Research Foundation, Inc. Gel-based delivery of recombinant adeno-associated virus vectors
US7402574B2 (en) 2004-03-12 2008-07-22 Avi Biopharma, Inc. Antisense composition and method for treating cancer
US20050288246A1 (en) 2004-05-24 2005-12-29 Iversen Patrick L Peptide conjugated, inosine-substituted antisense oligomer compound and method
US20060014712A1 (en) 2004-05-30 2006-01-19 Cemines, Inc. Controlled delivery of therapeutic compounds
ATE498685T1 (de) 2004-06-28 2011-03-15 Univ Western Australia Antisense-oligonukleotide zur induktion von exon- skipping sowie verfahren zur verwendung davon
CA2572151A1 (en) 2004-06-30 2006-08-24 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides comprising a non-phosphate backbone linkage
US7947645B2 (en) 2004-09-02 2011-05-24 Cognosci, Inc. APO E analogs and methods for their use
US7429481B2 (en) 2004-09-14 2008-09-30 University Of Pittsburgh Targeting viruses using a modified sindbis glycoprotein
US8129352B2 (en) 2004-09-16 2012-03-06 Avi Biopharma, Inc. Antisense antiviral compound and method for treating ssRNA viral infection
US8357664B2 (en) 2004-10-26 2013-01-22 Avi Biopharma, Inc. Antisense antiviral compound and method for treating influenza viral infection
US7524829B2 (en) 2004-11-01 2009-04-28 Avi Biopharma, Inc. Antisense antiviral compounds and methods for treating a filovirus infection
NZ538097A (en) 2005-02-07 2006-07-28 Ovita Ltd Method and compositions for improving wound healing
AU2006213686A1 (en) 2005-02-09 2006-08-17 Avi Bio Pharma, Inc. Antisense composition and method for treating muscle atrophy
CA2596509A1 (en) 2005-02-14 2006-08-24 Wyeth Interleukin-17f antibodies and other il-17f signaling antagonists and uses therefor
NZ563206A (en) 2005-04-22 2009-09-25 Academisch Ziekenhuis Leiden Modulation of exon recognition in pre-mRNA by interfering with the binding or SR proteins and by interfering with secondary RNA structure
JP2008539209A (ja) 2005-04-26 2008-11-13 カリヨン−シーティーティー リミテッド 診断及び治療剤
US8067571B2 (en) 2005-07-13 2011-11-29 Avi Biopharma, Inc. Antibacterial antisense oligonucleotide and method
US7790694B2 (en) 2005-07-13 2010-09-07 Avi Biopharma Inc. Antisense antibacterial method and compound
CA2614191C (en) 2005-07-13 2015-06-30 Avi Biopharma, Inc. Antisense antibacterial method and compound
US8524676B2 (en) 2005-09-08 2013-09-03 Sarepta Therapeutics, Inc. Method for treating enterovirus or rhinovirus infection using antisense antiviral compounds
US8329668B2 (en) 2005-09-08 2012-12-11 Avi Biopharma, Inc. Antisense antiviral compound and method for treating picornavirus infection
EP1941275B1 (en) 2005-09-29 2013-07-24 Medimmune, Inc. Method of identifying membrane lg specific antibodies and use thereof for targeting immunoglobulin-producing precursor cells
CA2628093A1 (en) 2005-11-08 2007-05-18 Avi Biopharma, Inc. Antisense oligonucleotide analog compounds targeting proprocessed ctla-4 mrna
US8501704B2 (en) 2005-11-08 2013-08-06 Sarepta Therapeutics, Inc. Immunosuppression compound and treatment method
KR101789603B1 (ko) 2005-11-10 2017-11-21 더 유니버시티 오브 노쓰 캐롤라이나 엣 채플 힐 Ｔｎｆ 수퍼패밀리 수용체에 대한 스플라이스 스위칭올리고머 및 염증성 질환 치료용 약제학적 조성물
CA2644262C (en) 2006-03-07 2016-01-05 Avi Biopharma, Inc. Antisense antiviral compound and method for treating arenavirus infection
DK2735568T3 (da) 2006-05-10 2017-11-13 Sarepta Therapeutics Inc Oligonukleotidanaloger med kationiske bindinger mellem underenheder
US8785407B2 (en) 2006-05-10 2014-07-22 Sarepta Therapeutics, Inc. Antisense antiviral agent and method for treating ssRNA viral infection
JP3151554U (ja) 2006-05-17 2009-07-02 スヴェトラナ アナトレフナ ソコロヴァ 輸送手段
AU2006345724B2 (en) 2006-06-30 2013-11-21 Lakewood-Amedex, Inc. Compositions and methods for the treatment of muscle wasting
AU2007282224B2 (en) 2006-08-11 2013-08-29 Vico Therapeutics B.V. Methods and means for treating DNA repeat instability associated genetic disorders
US20080199961A1 (en) 2006-08-25 2008-08-21 Avi Biopharma, Inc. ANTISENSE COMPOSITION AND METHOD FOR INHIBITION OF miRNA BIOGENESIS
US20080267978A1 (en) 2006-08-28 2008-10-30 Mary Zutter Anti-angiogenic targets for cancer therapy
EP3034083B1 (en) 2006-09-21 2020-12-09 University of Rochester Antisense oligonucleotides for use in treating myotonic dystrophy
FR2908999B1 (fr) 2006-11-29 2012-04-27 Biomerieux Sa Nouveau medicament destine a l'inhibition, la prevention ou le traitement de la polyarthrite rhumatoide.
EP1938802A1 (en) 2006-12-22 2008-07-02 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Interfering RNAs targeting pro-inflammatory cytokines
EP3443976A1 (en) 2007-06-29 2019-02-20 Sarepta Therapeutics, Inc. Tissue specific peptide conjugates and methods
US20100016215A1 (en) 2007-06-29 2010-01-21 Avi Biopharma, Inc. Compound and method for treating myotonic dystrophy
CA2693742A1 (en) 2007-07-12 2009-01-15 Prosensa Technologies B.V. Molecules for targeting compounds to various selected organs, tissues or tumor cells
US20110300154A1 (en) 2007-08-21 2011-12-08 Children's Medical Center Corporation Treatment of airway hyperreactivity
AU2008317566B2 (en) 2007-10-26 2014-05-01 Academisch Ziekenhuis Leiden Means and methods for counteracting muscle disorders
MX2010004955A (es) 2007-11-15 2010-06-30 Avi Biopharma Inc Metodo de sintesis de oligomeros de morfolina.
US8076476B2 (en) 2007-11-15 2011-12-13 Avi Biopharma, Inc. Synthesis of morpholino oligomers using doubly protected guanine morpholino subunits
US8299206B2 (en) 2007-11-15 2012-10-30 Avi Biopharma, Inc. Method of synthesis of morpholino oligomers
EP2235034B1 (en) 2007-12-28 2016-11-23 Sarepta Therapeutics, Inc. Immunomodulatory agents and methods of use
WO2009127230A1 (en) 2008-04-16 2009-10-22 Curevac Gmbh MODIFIED (m)RNA FOR SUPPRESSING OR AVOIDING AN IMMUNOSTIMULATORY RESPONSE AND IMMUNOSUPPRESSIVE COMPOSITION
EP2119783A1 (en) 2008-05-14 2009-11-18 Prosensa Technologies B.V. Method for efficient exon (44) skipping in Duchenne Muscular Dystrophy and associated means
US20110130346A1 (en) 2008-05-30 2011-06-02 Isis Innovation Limited Peptide conjugates for delvery of biologically active compounds
US8084601B2 (en) 2008-09-11 2011-12-27 Royal Holloway And Bedford New College Royal Holloway, University Of London Oligomers
CN112574988A (zh) 2008-10-24 2021-03-30 萨雷普塔治疗公司 用于dmd的多外显子跳跃组合物
JP5786109B2 (ja) 2008-10-27 2015-09-30 プロセンサ テクノロジーズ ベー．フェー． Ｄｕｃｈｅｎｎｅ型筋ジストロフィーｍＲＮＡ前駆体のエクソン４５の効率的なスキッピングのための方法及び手段
RU2572826C2 (ru) 2008-12-02 2016-01-20 Чиралджен, Лтд. Способ синтеза модифицированных по атому фосфора нуклеиновых кислот
AU2009335740B2 (en) 2008-12-17 2016-04-21 Sarepta Therapeutics, Inc. Antisense compositions and methods for modulating contact hypersensitivity or contact dermatitis
US20120149756A1 (en) 2009-04-10 2012-06-14 Associatin Institut de Myologie Tricyclo-dna antisense oligonucleotides, compositions, and methods for the treatment of disease
CA2759899A1 (en) 2009-04-24 2010-10-28 Prosensa Technologies B.V. Oligonucleotide comprising an inosine for treating dmd
US20110269665A1 (en) 2009-06-26 2011-11-03 Avi Biopharma, Inc. Compound and method for treating myotonic dystrophy
CA2767253A1 (en) 2009-07-06 2011-01-13 Ontorii, Inc. Novel nucleic acid prodrugs and methods of use thereof
EP2479182B8 (en) 2009-09-16 2016-07-13 Wave Life Sciences Japan, Inc. Novel protecting group for synthesizing rna and derivative thereof
LT2499249T (lt) 2009-11-12 2018-12-27 The University Of Western Australia Priešprasmės molekulės ir patologijų gydymo būdai
ES2816898T3 (es) 2010-05-13 2021-04-06 Sarepta Therapeutics Inc Compuestos que modulan la actividad de señalización de las interleucinas 17 y 23
KR20200133284A (ko) 2010-05-28 2020-11-26 사렙타 쎄러퓨틱스, 인코퍼레이티드 변형된 서브유니트간 결합 및/또는 말단 그룹을 갖는 올리고뉴클레오타이드 유사체
TWI541024B (zh) * 2010-09-01 2016-07-11 日本新藥股份有限公司 反義核酸
JP5868324B2 (ja) 2010-09-24 2016-02-24 株式会社Wave Life Sciences Japan 不斉補助基
EP2672977A1 (en) 2011-02-08 2013-12-18 The Charlotte-Mecklenburg Hospital Authority d/b/a Carolina Healthcare System Antisense oligonucleotides
US9161948B2 (en) * 2011-05-05 2015-10-20 Sarepta Therapeutics, Inc. Peptide oligonucleotide conjugates
WO2012150960A1 (en) * 2011-05-05 2012-11-08 Avi Biopharma, Inc. Peptide oligonucleotide conjugates
US9607308B2 (en) 2011-06-29 2017-03-28 American Express Travel Related Services Company, Inc. Spend based digital ad targeting and measurement
EP2581448B1 (en) 2011-10-13 2015-01-28 Association Institut de Myologie Tricyclo-phosphorothioate DNA
ES2727481T3 (es) 2011-11-30 2019-10-16 Sarepta Therapeutics Inc Inclusión inducida de exón en atrofia muscular espinal
CN117721110A (zh) 2011-12-28 2024-03-19 日本新药株式会社 反义核酸
CN112251436A (zh) 2012-01-27 2021-01-22 比奥马林技术公司 治疗杜兴型肌营养不良症和贝克型肌营养不良症的具有改善特性的rna调节性寡核苷酸
DE102012101676A1 (de) 2012-02-29 2013-08-29 Klaus-Dieter Rösler Verfahren und Vorrichtung zum Bearbeiten von Formularen mit einer Datenverarbeitungsanlage
EP2870246B1 (en) 2012-07-03 2019-09-11 BioMarin Technologies B.V. Oligonucleotide for the treatment of muscular dystrophy patients
SG11201500239VA (en) 2012-07-13 2015-03-30 Wave Life Sciences Japan Asymmetric auxiliary group
JP6453212B2 (ja) 2012-07-13 2019-01-16 ウェイブ ライフ サイエンシズ リミテッドＷａｖｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｌｔｄ． キラル制御
CA2894899A1 (en) 2012-12-20 2014-06-26 Sarepta Therapeutics, Inc. Improved exon skipping compositions for treating muscular dystrophy
NZ731587A (en) 2013-03-14 2021-07-30 Sarepta Therapeutics Inc Exon skipping compositions for treating muscular dystrophy
RS58529B1 (sr) 2013-03-14 2019-04-30 Sarepta Therapeutics Inc Sastavi koji preskaču egzon za tretiranje mišićne distrofije
CA2906812A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 Sarepta Therapeutics, Inc. Improved compositions for treating muscular dystrophy
JP6618910B2 (ja) * 2013-09-05 2019-12-11 サレプタ セラピューティクス，インコーポレイテッド 酸性α−グルコシダーゼにおけるアンチセンス誘導エクソン２包含
WO2015108048A1 (ja) 2014-01-15 2015-07-23 株式会社新日本科学 抗腫瘍作用を有するキラル核酸アジュバンド及び抗腫瘍剤
JPWO2015108046A1 (ja) 2014-01-15 2017-03-23 株式会社新日本科学 抗アレルギー作用を有するキラル核酸アジュバンド及び抗アレルギー剤
WO2015108047A1 (ja) 2014-01-15 2015-07-23 株式会社新日本科学 免疫誘導活性を有するキラル核酸アジュバンド及び免疫誘導活性剤
ES2917473T3 (es) 2014-01-16 2022-07-08 Wave Life Sciences Ltd Diseño quiral
SMT201900169T1 (it) 2014-03-12 2019-05-10 Nippon Shinyaku Co Ltd Acido nucleico antisenso
RU2695430C2 (ru) 2014-06-17 2019-07-23 Ниппон Синяку Ко., Лтд. Антисмысловые нуклеиновые кислоты
AU2015338923B2 (en) 2014-11-02 2021-10-21 Arcturus Therapeutics, Inc. Messenger UNA molecules and uses thereof
CN108135921B (zh) 2015-07-22 2023-10-17 波涛生命科学有限公司 寡核苷酸组合物及其方法
JP7511326B2 (ja) 2015-10-09 2024-07-05 ウェイブ ライフ サイエンシズ リミテッド オリゴヌクレオチド組成物およびその方法
EP3858993A1 (en) * 2015-10-09 2021-08-04 Sarepta Therapeutics, Inc. Compositions and methods for treating duchenne muscular dystrophy and related disorders
WO2017192679A1 (en) 2016-05-04 2017-11-09 Wave Life Sciences Ltd. Methods and compositions of biologically active agents
JP2019516680A (ja) 2016-05-04 2019-06-20 ウェイブ ライフ サイエンシズ リミテッドＷａｖｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｌｔｄ． オリゴヌクレオチド組成物およびその方法
SMT202200366T1 (it) * 2016-12-19 2022-11-18 Sarepta Therapeutics Inc Coniugati di oligomeri per salto di esone per distrofia muscolare

Also Published As

Publication number Publication date
CN110290812B (zh) 2023-06-02
JP2020503009A (ja) 2020-01-30
EP3554553B1 (en) 2022-07-20
CY1125549T1 (el) 2026-02-25
KR102552428B1 (ko) 2023-07-06
MD3554553T2 (ro) 2022-10-31
IL267244A (en) 2019-08-29
SA519402154B1 (ar) 2022-12-19
CO2019007397A2 (es) 2019-10-09
BR112019012647A2 (pt) 2019-11-19
HUE059843T2 (hu) 2023-01-28
JP7691462B2 (ja) 2025-06-11
LT3554553T (lt) 2022-08-25
AU2017382723B2 (en) 2025-01-30
KR102810425B1 (ko) 2025-05-21
JP7118063B2 (ja) 2022-08-15
IL287047A (en) 2021-12-01
US20230381216A1 (en) 2023-11-30
DK3554553T3 (da) 2022-09-19
ZA201904092B (en) 2022-01-26
US11642364B2 (en) 2023-05-09
JP2021045160A (ja) 2021-03-25
US10888578B2 (en) 2021-01-12
KR20190099237A (ko) 2019-08-26
CN110290812A (zh) 2019-09-27
PL3554553T3 (pl) 2022-11-07
HRP20220943T1 (hr) 2022-10-28
SG10202012839TA (en) 2021-01-28
EP3554553A1 (en) 2019-10-23
TW201828996A (zh) 2018-08-16
US20220280546A1 (en) 2022-09-08
CA3046793A1 (en) 2018-06-28
IL267244B (en) 2021-10-31
WO2018118599A1 (en) 2018-06-28
SMT202200366T1 (it) 2022-11-18
MX2019006882A (es) 2019-08-16
MY195801A (en) 2023-02-22
JP2023156512A (ja) 2023-10-24
TWI760402B (zh) 2022-04-11
US20210169919A1 (en) 2021-06-10
PT3554553T (pt) 2022-08-04
ES2927079T3 (es) 2022-11-02
AU2017382723A1 (en) 2019-08-01
NZ755416A (en) 2023-05-26
US20180177814A1 (en) 2018-06-28
KR20230110811A (ko) 2023-07-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7728923B2 (ja) 筋ジストロフィーに対するエクソンスキッピングオリゴマーコンジュゲート
EP3554552B1 (en) Exon skipping oligomer conjugates for muscular dystrophy
EP3554553B1 (en) Exon skipping oligomer conjugates for muscular dystrophy
CN112384222A (zh) 用于肌营养不良的外显子跳跃寡聚物缀合物
HK40087674B (en) Exon skipping oligomer conjugates for muscular dystrophy
HK40087674A (en) Exon skipping oligomer conjugates for muscular dystrophy
HK40014131B (en) Exon skipping oligomer conjugates for muscular dystrophy
HK40014131A (en) Exon skipping oligomer conjugates for muscular dystrophy
HK40015449A (en) Exon skipping oligomer conjugates for muscular dystrophy
HK40015449B (en) Exon skipping oligomer conjugates for muscular dystrophy
HK40009617A (en) Exon skipping oligomer conjugates for muscular dystrophy
HK40009617B (en) Exon skipping oligomer conjugates for muscular dystrophy
EA044076B1 (ru) Конъюгаты олигомеров для пропуска экзона при мышечной дистрофии
BR122020025437B1 (pt) Uso de um conjugado de oligômero antissenso para tratar distrofia muscular de duchenne