RS63663B1 - Imunokonjugati anti-pd-1 antitela sa mutantom il-2 ili sa il-15 - Google Patents

Imunokonjugati anti-pd-1 antitela sa mutantom il-2 ili sa il-15

Info

Publication number
RS63663B1
RS63663B1 RS20220957A RSP20220957A RS63663B1 RS 63663 B1 RS63663 B1 RS 63663B1 RS 20220957 A RS20220957 A RS 20220957A RS P20220957 A RSP20220957 A RS P20220957A RS 63663 B1 RS63663 B1 RS 63663B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
amino acid
domain
seq
cells
polypeptide
Prior art date
Application number
RS20220957A
Other languages
English (en)
Inventor
Deak Laura Codarri
Christian Klein
Laura Lauener
Valeria G Nicolini
Stefan Seeber
Pablo Umaña
Inja Waldhauer
Original Assignee
Hoffmann La Roche
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hoffmann La Roche filed Critical Hoffmann La Roche
Publication of RS63663B1 publication Critical patent/RS63663B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A61K38/2013—IL-2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A61K38/2086—IL-13 to IL-16
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6813—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin the drug being a peptidic cytokine, e.g. an interleukin or interferon
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6891—Pre-targeting systems involving an antibody for targeting specific cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5443—IL-15
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/55—IL-2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

OPIS
Oblast pronalaska
Ovaj pronalazak se uopšteno odnosi na imunokonjugate, posebno imunokonjugate koji sadrže mutantni polipeptid interleukina-2 i antitelo koje se vezuje za PD-1. Pored toga, pronalazak se odnosi na molekule polinukleotida koji kodiraju imunokonjugate i na vektore i ćelije domaćina koji sadrže takve molekule polinukleotida. Pronalazak se dalje odnosi na postupke za proizvodnju mutantnih imunokonjugata, farmaceutskih kompozicija koje ih sadrže, kao i njihovu upotrebu.
Osnova
Interleukin-2 (IL-2), poznat i kao faktor rasta T-ćelija (TCGF), globalni je glikoprotein 15,5 kDa koji igra centralnu ulogu u stvaranju limfocita, preživljavanju i homeostazi. Ima dužinu od 133 aminokiseline i sastoji se od četiri antiparalelna, amfipatska α-heliksa koja formiraju kvaternernu strukturu koja je neophodna za njegovu funkciju (Smith, Science 240, 1169-76 (1988); Bazan, Science 257, 410-413 (1992)). Sekvence IL-2 iz različitih vrsta nalaze se pod NCBI referentnim brojem NP000577 (čovek), NP032392 (miš), NP446288 (pacov) ili NP517425 (šimpanza).
IL-2 posreduje svoje delovanje vezivanjem za IL-2 receptore (IL-2R), koji se sastoje od do tri pojedinačne podjedinice, čija različita asocijacija može da proizvodi receptorske forme koje se razlikuju u njihovom afinitetu prema IL-2. Asocijacija α (CD25), β (CD122) i γ (γc, CD132) podjedinica rezultira trimernim receptorom visokog afiniteta za IL-2. Dimerni receptor IL-2 koji se sastoji od β i γ podjedinica naziva se IL-2R srednjeg afiniteta. Podjedinica α formira monomerni IL-2 receptor niskog afiniteta. Iako dimerni IL-2 receptor srednjeg afiniteta vezuje IL-2 sa oko 100 puta nižim afinitetom od trimernog receptora visokog afiniteta, i dimerne i trimerne varijante receptora IL-2 mogu da prenose signal nakon vezivanja IL-2 (Minami et al., Annu Rev Immunol 11, 245-268 (1993)). Shodno tome, α-podjedinica, CD25, nije neophodna za signalizaciju IL-2. Ona daje vezivanje sa velikim afinitetom za njegov receptor, dok su β-podjedinica, CD122, i γ-podjedinica ključni za transdukciju signala (Krieg et al., Proc Natl Acad Sci 107, 11906-11 (2010)). Trimerne IL-2 receptore, uključujući CD25, eksprimiraju (u mirovanju) CD4<+>regulatorne T (Treg) ćelije skurfina (FoxP3)<+>. Takođe su tranzitivno indukovani na konvencionalne aktivirane T-ćelije, dok u stanju mirovanja ove ćelije izražavaju samo dimerne receptore IL-2. Tregćelije stalno izražavaju najviši nivo CD25 in vivo (Fontenot et al., Nature Immunol 6, 1142-51 (2005)).
IL-2 se sintetiše uglavnom aktiviranim T-ćelijama, posebno CD4<+>pomoćnim Tćelijama. Podstiče proliferaciju i diferencijaciju T-ćelija, indukuje nastanak citotoksičnih T limfocita (CTL) i diferencijaciju limfocita periferne krvi na citotoksične ćelije i limfokin stimulisane ćelije ubice (LAK), promoviše ekspresiju citokina i citolitičkih molekula pomoću T-ćelija, olakšava proliferaciju i diferencijaciju B-ćelija i sintezu imunoglobulina pomoću B-ćelija i stimuliše generisanje, proliferaciju i aktivaciju ćelija prirodnih ubica (NK) (pregledano npr. u Waldmann, Nat Rev Immunol 6, 595-601 (2009), Olejniczak i Kasprzak, Med Sci Monit 14, RA179-89 (2008), Malek, Annu Rev Immunol 26, 453-79 (2008)).
Njegova sposobnost širenja populacija limfocita in vivo i povećanje efektorskih funkcija ovih ćelija doprinosi antitumorskim efektima na IL-2, čineći imunoterapiju IL-2 atraktivnom opcijom lečenja za određene metastatske karcinome. Shodno tome, tretman visokim dozama IL-2 je odobren za upotrebu kod pacijenata sa metastatskim karcinomom bubrežnih ćelija i malignim melanomom.
Međutim, IL-2 ima dualnu funkciju u imunološkom odgovoru jer ne posreduje samo ekspanziju i aktivnost efektorskih ćelija već je i značajno uključen u održavanje periferne imunološke tolerancije.
Glavni mehanizam, koji je u osnovi periferna samotolerancija, zapravo je indukovana ćelijska smrt indukovana aktivacijom IL-2 (AICD) u T-ćelijama. AICD je proces kojim potpuno aktivirane T-ćelije proživljavaju programiranu ćelijsku smrt putem angažovanja receptora smrti eksprimiranih na površini ćelije, kao što su CD95 (takođe poznat kao Fas) ili TNF receptor. Kada se antigenom aktivirane T-ćelije, koje eksprimiraju IL-2 receptor sa visokim afinitetom (nakon prethodnog izlaganja IL-2) tokom proliferacije, ponovo stimulišu antigenom preko kompleksa T-ćelijskog receptora (TCR)/CD3, indukuje se ekspresija Fas liganda (FasL) i/ili faktora nekroze tumora (TNF), što čini ćelije podložnim Fas-posredovanoj apoptozi. Ovaj proces je zavisan od IL-2 (Lenardo, Nature 353, 858-61 (1991)) i posredovan putem STAT5. Procesom AICD u T limfocitima ne samo da se tolerancija može uspostaviti na endogenim antigenima, nego i na perzistentnim antigenima koji očigledno ne potiču od domaćina, kao što su tumorski antigeni.
Štaviše, IL-2 je takođe uključen u održavanje perifernih CD4<+>CD25<+>regulatornih T (Treg) ćelija (Fontenot et al., Nature Immunol 6, 1142-51 (2005); D’Cruz i Klein, Nature Immunol 6, 1152-59 (2005); Maloy i Powrie, Nature Immunol 6, 1171-72 (2005) koji su takođe poznati kao supresorske T-ćelije. Oni potiskuju efektorske T-ćelije da uništavaju svoj (samo-)cilj, bilo putem kontakta ćelija-ćelija, tako što inhibiraju pomoć i aktivaciju T-ćelija ili putem oslobađanja imunosupresivnih citokina kao što su IL-10 ili TGF-β. Za iscrpljivanje Tregćelija je utvrđeno da poboljšava imunitet indukovan IL-2 protiv tumora (Imai et al., Cancer Sci 98, 416-23 (2007)).
Shodno tome, IL-2 nije optimalan za inhibiranje rasta tumora jer u prisustvu IL-2 čak i proizvedeni CTL mogu prepoznati tumor kao sopstveni i podvrgnuti procesu AICD ili imuni odgovor može biti inhibiran IL-2 zavisnim Tregćelijama.
Još jedna zabrinutost u vezi sa imunoterapijom IL-2 su neželjeni efekti koji se dobijaju rekombinantnim humanim IL-2 tretmanom. Pacijenti koji primaju visokokoncentrovane terapije IL-2 često doživljavaju teške kardiovaskularne, plućne, bubrežne, hepatične, gastrointestinalne, neurološke, kutane, hematološke i sistemske neželjene događaje, koji traže intenzivno praćenje i upravljanje pacijentom. Većina ovih neželjenih efekata može se objasniti razvojem tzv. sindroma vaskularnog (ili kapilarnog) curenja (VLS), patološkog porasta vaskularne permeabilnosti koja dovodi do ekstravazacije tečnosti u više organa (uzrokuje npr. plućni i kožni edem i oštećenje ćelija jetre) i smanjenje intravaskularne tečnosti (izazivajući pad krvnog pritiska i kompenzaciono povećanje srčane frekvencije). Ne postoji tretman za VLS, osim povlačenja IL-2. IL-2 režimi u malim dozama su testirani kod pacijenata kako bi se izbegao VLS, međutim, na račun suboptimalnih terapijskih rezultata. Verovalo se da je VLS uzrokovan oslobađanjem proinflamatornih citokina, kao što je faktor tumorske nekroze (TNF)-α iz IL-2 aktiviranih NK ćelija, međutim nedavno je pokazano da je plućni edem izazvan IL-2 rezultat direktnog vezivanja IL-2 za plućne endotelne ćelije, koje su eksprimirale niske do srednje vrednosti nivoa funkcionalnih αβγ IL-2 receptora (Krieg et al., Proc Nat Acad Sci USA107, 11906-11 (2010)).
Nekoliko pristupa je preduzeto kako bi se prevazišli ovi problemi u vezi sa imunoterapijom IL-2. Na primer, utvrđeno je da kombinacija IL-2 sa određenim anti-IL-2 monoklonskim antitelima poboljšava efekte tretmana IL-2 in vivo (Kamimura et al., J Immunol 177, 306-14 (2006); Boyman et al., Science 311, 1924-27 (2006)). U alternativnom pristupu, IL-2 je mutiran na različite načine kako bi se smanjila njegova toksičnost i/ili povećala njegova efikasnost. Hu et al. (Blood 101, 4853-4861 (2003), US Pat. Publ. br. 2003/0124678) supstituisali su ostatak arginina na poziciji 38 IL-2 triptofanom radi eliminacije aktivnosti vazopermeabilnosti IL-2. Shanafelt et al. (Nature Biotechnol 18, 1197-1202 (2000)) mutirali su asparagin 88 u arginin radi poboljšanja selektivnosti prema T-ćelijama u odnosu na NK ćelije. Heaton et al. (Cancer Res 53, 2597-602 (1993); US Pat. br. 5,229,109) uveli su dve mutacije, Arg38Ala i Phe42Lys, za smanjenje sekrecije proinflamatornih citokina iz NK ćelija. Gillies et al. (US Pat. Publ. br. 2007/0036752) zamenili su tri ostatka IL-2 (Asp20Thr, Asn88Arg i Gln126Asp) koji doprinose afinitetu prema IL-2 receptoru srednjeg afiniteta da smanje VLS. Gillies et al. (WO2008/0034473) takođe su mutirali interfejs IL-2 sa CD25 aminokiselinskom supstitucijom Arg38Trp i Phe42Lys kako bi smanjili interakciju sa CD25 i aktivaciju Tregćelija radi poboljšanja efikasnosti. U istom cilju, Wittrup et al. (WO2009/061853) proizveli su IL-2 mutante koji imaju poboljšani afinitet prema CD25, ali ne aktiviraju receptor, te tako deluju kao antagonisti. Uvedene mutacije bile su usmerene na poremećaj interakcije sa β- i/ili γ-podjedinicom receptora.
Posebni mutantni polipeptid IL-2, dizajniran da prevlada gore navedene probleme povezane sa imunoterapijom pomoću IL-2 (toksičnost uzrokovana indukcijom VLS, tolerancija tumora uzrokovana indukcijom AICD-a i imunosupresija uzrokovana aktivacijom Tregćelija), opisan je u WO 2012/107417. Supstitucija ostatka fenilalanina na poziciji 42 alaninom, ostatka tirozina na poziciji 45 alaninom i ostatka leucina na poziciji 72 IL-2 glicinom u suštini ukida vezivanje ovog mutantnog polipeptida IL-2 za α-podjedinicu IL-2 receptora (CD25).
Pored gore navedenih pristupa, imunoterapija pomoću IL-2 može da se poboljša selektivnim usmeravanjem IL-2 na tumore, npr. u obliku imunokonjugata koji sadrže antitelo koje se vezuje za antigen eksprimiran na tumorskim ćelijama. Opisano je nekoliko takvih imunokonjugata (vidi npr. Ko et al., J Immunother (2004) 27, 232–239; Klein et al., Oncoimmunology (2017) 6(3), e1277306).
Međutim, tumori mogu imati sposobnost da izbegnu takvo ciljanje odvajanjem, mutacijom ili smanjenjem koncentracije ciljnog antigena antitela. Štaviše, IL-2 usmeren tumor možda neće doći u optimalan kontakt sa efektorskim ćelijama kao što su citotoksični T limfociti (CTL), u tumorskom mikrookruženju koje aktivno isključuje limfocite.
Stoga ostaje potreba za daljim poboljšanjem imunoterapije pomoću IL-2. Pristup kojim može da se zaobiđe problem ciljanja tumora, jeste usmeravanje IL-2 direktno na efektorske ćelije, posebno na CTL.
Ghasemi et al. opisali su fuzioni protein IL-2 i NKG2D vezujući protein (Ghashemi et al., Nat Comm (2016) 7, 12878), za usmeravanje IL-2 na ćelije koje nose NKG2D, kao što su ćelije prirodne ubice (NK).
Protein programirane ćelijske smrti 1 (PD-1 ili CD279) je inhibitorski član familije CD28 receptora, koja takođe uključuje CD28, CTLA-4, ICOS i BTLA. PD-1 je receptor na ćelijskoj površini i eksprimira se na aktiviranim B ćelijama, T ćelijama i mijeloidnim ćelijama (Okazaki et al (2002) Curr. Opin. Immunol. 14: 391779-82; Bennett et al. (2003) J Immunol 170:711-8). Struktura PD-1 je monomerni transmembranski protein tipa 1, koji se sastoji od jednog vanćelijskog domena sličnog varijabilnom imunoglobulinu i citoplazmatskog domena koji sadrži imunoreceptorski inhibitorni motiv na bazi tirozina (ITIM) i imunoreceptorski motiv prekidača na bazi tirozina (ITSM). Identifikovana su dva liganda za PD-1, PD-L1 i PD-L2, za koje je pokazano da snižavaju aktivaciju T ćelija nakon vezivanja za PD-1 (Freeman et al (2000) J Exp Med 192: 1027-34; Latchman et al (2001) Nat Immunol 2:261-8; Carter et al (2002) Eur J Immunol 32:634-43). I PD-L1 i PD-L2 su homolozi B7 koji se vezuju za PD-1, ali se ne vezuju za druge članove familije CD28. Jedan ligand za PD-1, PD-L1 obiluje u raznim vrstama kancera kod ljudi (Dong et al (2002) Nat. Med 8:787-9). Interakcija između PD-1 i PD-L1 dovodi do smanjenja limfocita koji se infiltriraju u tumor, smanjenja proliferacije posredovane receptorima T-ćelija i imunološke evazije ćelija kancera (Dong et al. (2003) J. MoI. Med.81:281-7; Blank et al. (2005) Cancer Immunol. Immunother. 54:307-314; Konishi et al. (2004) Clin. Cancer Res. 10:5094-100). Imunološka supresija se može poništiti inhibiranjem lokalne interakcije PD-1 sa PD-L1, a efekat je aditivan kada je i interakcija PD-1 sa PD-L2 blokirana (Iwai et al. (2002) Proc. Nat 7. Acad. ScL USA99: 12293-7; Brown et al. (2003) J. Immunol.170:1257-66).
Antitela koja se vezuju za PD-1 su opisana, npr., u WO 2017/055443 A1.
Sažetak tehničkih pouka
Ovaj pronalazak, koji je definisan u priloženim patentnim zahtevima, pruža novi pristup usmeravanja mutantnog oblika IL-2, koji ima povoljna svojstva za imunoterapiju, direktno na imunološke efektorske ćelije, kao što su citotoksični T limfociti, a ne na tumorske ćelije. Usmeravanje na imunološke efektorske ćelije se postiže konjugacijom mutantnog molekula IL-2 sa antitelom koje se vezuje za PD-1.
Mutantni IL-2 koji se koristi u predmetnom pronalasku dizajniran je da prevlada probleme povezane sa imunoterapijom putem IL-2, a posebno toksičnost uzrokovanu indukcijom VLS-a, toleranciju tumora uzrokovanu indukcijom AICD-a i imunosupresiju uzrokovanu aktivacijom Tregćelija. Pored zaobilaženja izbegavanja tumora od ciljanja, kao što je gore spomenuto, ciljanje mutantnog IL-2 na imunološke efektorske ćelije može dodatno da poveća preferencijalnu aktivaciju CTL u odnosu na imunosupresivne Tregćelije. Korišćenjem antitela koje se vezuje za PD-1, supresija aktivnosti T-ćelija izazvana interakcijom PD-1 sa njegovim ligandom PD-L1 može dodatno da se preokrene, čime se dodatno pojačava imunski odgovor.
Fuzioni protein IL-2 koji sadrži anti PD-L1 antitelo atezolizumab opisali su Chen et al. (Chen et al., Biochem Biophys Res Comm (2016) 480, 160-165).
Treba napomenuti da imunokonjugat iz ovog pronalaska, koji sadrži antitelo koje se vezuje za PD-1, pokazuje značajno bolju antitumorsku efikasnost in vivo u poređenju sa sličnim imunokonjugatom usmerenim na PD-L1 (videti Primer 3 u nastavku).
Ovde je obezbeđen imunokonjugat koji sadrži antitelo koje se vezuje za PD-1 i IL-2 polipeptid. U prvom aspektu, pronalazak obezbeđuje imunokonjugat koji sadrži mutantni polipeptid IL-2 i antitelo koje se vezuje za PD-1, pri čemu, mutantni polipeptid IL-2 je molekul humanog IL-2 koji sadrži aminokiselinske supstitucije F42A, Y45A i L72G (numeracija u odnosu na sekvencu humanog IL-2 SEQ ID NO: 19).
U daljem aspektu, pronalazak obezbeđuje imunokonjugat koji sadrži mutantni polipeptid IL-2 i antitelo koje se vezuje za PD-1, pri čemu, mutantni polipeptid IL-2 je molekul humanog IL-2 koji sadrži aminokiselinske supstitucije F42A, Y45A i L72G (numeracija u odnosu na sekvencu humanog IL-2 SEQ ID NO: 19); i pri čemu antitelo sadrži (a) varijabilni region teškog lanca (VH) koji sadrži HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1, HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 2, HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 3, i FR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:7 na pozicijama 71-73 prema Kabatovoj numeraciji, i (b) varijabilni region lakog lanca (VL) koji sadrži HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 4, HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 5 i HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 6, ili pri čemu antitelo sadrži (a) varijabilni region teškog lanca (VH) koji sadrži HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 8, HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 9, i HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 10, i (b) varijabilni region lakog lanca (VL) koji sadrži HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 11, HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 12, i HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 13.
U drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje imunokonjugat koji sadrži mutantni polipeptid IL-2 i antitelo koje se vezuje za PD-1, pri čemu, mutantni polipeptid IL-2 je molekul humanog IL-2 koji sadrži aminokiselinske supstitucije F42A, Y45A i L72G (numeracija u odnosu na sekvencu humanog IL-2 SEQ ID NO: 19); i pri čemu antitelo sadrži (a) varijabilni region teškog lanca (VH) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 14 i (b) varijabilni region lakog lanca (VL) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci izabranoj iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, i SEQ ID NO: 18.
U nekim otelotvorenjima imunokonjugata prema pronalasku, mutantni polipeptid IL-2 dalje sadrži aminokiselinsku supstituciju T3A i/ili aminokiselinsku supstituciju C125A. U nekim otelotvorenjima, mutantni polipeptid IL-2 sadrži sekvencu SEQ ID NO: 20. U nekim otelotvorenjima, imunokonjugat sadrži ne više od jednog mutantnog polipeptida IL-2. U nekim otelotvorenjima, antitelo sadrži Fc domen sastavljen od prve i druge podjedinice. U nekim takvim otelotvorenjima, Fc domen je Fc domen klase IgG, posebno potklase IgG1, i/ili je Fc domen humani Fc domen. U nekim otelotvorenjima, antitelo je klase IgG, posebno imunoglobulin potklase IgG1.
U nekim otelotvorenjima gde imunokonjugat sadrži Fc domen, Fc domen sadrži modifikaciju koja promoviše asocijaciju prve i druge podjedinice Fc domena. U nekim otelotvorenjima, u CH3 domenu prve podjedinice Fc domena, aminokiselinski ostatak je zamenjen aminokiselinskim ostatkom koji ima veći volumen bočnog lanca, čime se stvara izbočina u CH3 domenu prve podjedinice koja može da se pozicionira u šupljinu u CH3 domenu druge podjedinice, a u CH3 domenu druge podjedinice Fc domena, aminokiselinski ostatak je zamenjen aminokiselinskim ostatkom koji ima manji volumen bočnog lanca, čime se stvara šupljina u CH3 domenu druge podjedinice u koju može da se pozicionira izbočina u CH3 domenu prve podjedinice. U nekim otelotvorenjima, u prvoj podjedinici Fc domena, ostatak treonina u položaju 366 je zamenjen ostatkom triptofana (T366W), a u drugoj podjedinici Fc domena, ostatak tirozina u položaju 407 je zamenjen ostatkom valina (Y407V), i opciono, ostatak treonina u položaju 366 je zamenjen serinskim ostatkom (T366S), a ostatak leucina u položaju 368 je zamenjen ostatkom alanina (L368A) (numeracija prema Kabatovom EU indeksu). U nekim takvim otelotvorenjima, u prvoj podjedinici Fc domena dodatno je serinski ostatak u položaju 354 zamenjen cisteinskim ostatkom (S354C), ili je ostatak glutaminske kiseline u položaju 356 zamenjen cisteinskim ostatkom (E356C), a u drugoj podjedinici Fc domena dodatno je tirozinski ostatak u položaju 349 zamenjen cisteinskim ostatkom (Y349C) (numeracija prema Kabatovom EU indeksu). U nekim otelotvorenjima, mutantni polipeptid IL-2 je fuzionisan na svojoj amino-terminalnoj aminokiselini sa karboksiterminalnom aminokiselinom jedne od podjedinica Fc domena, posebno prve podjedinice Fc domena, opciono preko peptidnog linkera. U nekim takvim otelotvorenjima, peptidni linker ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 21.
U nekim otelotvorenjima u kojima imunokonjugat sadrži Fc domen, Fc domen sadrži jednu ili više aminokiselinskih supstitucija koje smanjuju vezivanje za Fc receptor, posebno za Fcγ receptor, i/ili efektorsku funkciju, posebno ćelijski posredovanu citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC). U nekim takvim otelotvorenjima, jedna ili više od pomenutih aminokiselinskih supstitucija se nalazi na jednoj ili više pozicija izabranih iz grupe L234, L235 i P329 (numeracija prema Kabatovom EU indeksu). U nekim otelotvorenjima, svaka podjedinica Fc domena sadrži aminokiselinske supstitucije L234A, L235A i P329G (numeracija prema Kabatovom EU indeksu).
U nekim otelotvorenjima, imunokonjugat prema pronalasku sadrži polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci SEQ ID NO: 22, polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci SEQ ID NO: 23 ili SEQ ID NO: 24, i polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci SEQ ID NO: 25. U nekim otelotvorenjima, imunokonjugat se u suštini sastoji od mutantnog polipeptida IL-2 i molekula imunoglobulina IgG1, spojenih sekvencom linkera.
Pronalazak dalje obezbeđuje jedan ili više izolovanih polinukleotida koji kodiraju imunokonjugat iz pronalaska, jedan ili više vektora (posebno ekspresionih vektora) koji sadrži navedene polinukleotide, i ćelije domaćina koje sadrže pomenute polinukleotide ili pomenute vektore.
Takođe je obezbeđen postupak za proizvodnju imunokonjugata koji sadrži mutantni polipeptid IL-2 i antitelo koje se vezuje za PD-1, koji obuhvata (a) uzgajanje ćelije domaćina prema pronalasku u uslovima pogodnim za ekspresiju imunokonjugata, i opciono (b) rekuperovanje imunokonjugata.
Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži imunokonjugat iz ovog pronalaska i farmaceutski prihvatljiv nosač.
Konkretno, pronalazak obuhvata imunokonjugat prema pronalasku za upotrebu kao lek i za upotrebu u lečenju bolesti, pri čemu je navedena bolest kancer.
Detaljan opis
Definicije
Termini se ovde koriste kao što se tipično koriste u struci, osim ako nije drugačije definisano u nastavku.
Termin „interleukin-2” ili „IL-2”, u smislu ovog dokumenta, ukazuje na svaki nativni IL-2 koji potiče od bilo kog kičmenjaka, uključujući sisare, kao što su primati (npr. ljudi) i glodari (npr. miševi i pacovi) ako nije drugačije naglašeno. Termin obuhvata neobrađeni IL-2, kao i svaki oblik IL-2 koji je rezultat obrade u ćeliji. Termin takođe obuhvata prirodno postojeće varijante IL-2, npr. splajsovane ili alelne varijante. Sekvenca aminokiselina primera humanog IL-2 je prikazana u SEQ ID NO: 19. Neobrađeni humani IL-2 dodatno sadrži N-terminalni signalni peptid od 20 aminokiselina koji ima sekvencu SEQ ID NO: 26, koji je odsutan u zrelom molekulu IL-2.
Termin „IL-2 mutant” ili „mutantni polipeptid IL-2”, kao što je ovde korišćen, ima za cilj da obuhvati bilo koji mutantni oblik različitih oblika molekula IL-2, uključujući IL-2 kompletne dužine, skraćene oblike IL-2 i oblike kod kojih je IL-2 povezan sa drugim molekulom, na primer putem fuzije ili hemijske konjugacije. „Kompletna dužina” kada se koristi u odnosu na IL-2, označava zreli molekul IL-2 prirodne dužine. Na primer, humani IL-2 kompletne dužine se odnosi na molekul koji ima 133 aminokiseline (videti npr. SEQ ID NO: 19). Različiti oblici mutantnih IL-2 su okarakterisani time što imaju najmanje jednu aminokiselinsku mutaciju koja utiče na interakciju IL-2 sa CD25. Ova mutacija može uključivati zamenu, brisanje, skraćivanje ili modifikaciju nemutiranog aminokiselinskog ostatka koji se tipično nalazi na tom položaju. Mutanti dobijeni supstitucijom aminokiselina su poželjni. Osim ako nije drugačije naznačeno, mutantni IL-2 može ovde biti označen kao mutantna peptidna sekvenca IL-2, mutantni polipeptid IL-2, mutantni protein IL-2 ili mutantni analog IL-2.
Označavanje različitih oblika IL-2 je ovde izvršeno u odnosu na sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 19. Ovde se mogu koristiti različite oznake kako bi se ukazalo na istu mutaciju. Na primer, mutacija iz fenilalanina na položaju 42 u alanin može biti označena kao 42A, A42, A42,F42A ili Phe42Ala.
Pod „molekulom humanog IL-2”, kako se ovde koristi, podrazumeva se molekul IL-2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 90%, najmanje oko 91%, najmanje oko 92%, najmanje oko 93%, najmanje oko 94%, najmanje oko 95% ili najmanje oko 96% identična sekvenci humanog IL-2 SEQ ID NO:19. Konkretno, identičnost sekvence je najmanje oko 95%, konkretnije najmanje oko 96%. U određenim otelotvorenjima, molekul humanog IL-2 je u molekul IL-2 pune dužine.
Izraz „mutacija aminokiselina”, kako se ovde koristi, obuhvata supstitucije, brisanje, umetanje i modifikacije aminokiselina. Svaka kombinacija supstitucije, brisanja, umetanja i modifikacije može se načiniti tako da se dođe do finalnog konstrukta, pod uslovom da finalni konstrukt ima željene karakteristike, npr. smanjeno vezivanje za CD25. Brisanja i umetanja aminokiselinske sekvence uključuju brisanja i umetanja aminokiselina na amino i/ili karboksi terminusu. Primer terminalnog brisanja je brisanje ostatka alanina na poziciji 1 humanog IL-2 pune dužine. Poželjne aminokiselinske mutacije su supstitucije aminokiselina. U cilju izmene npr. karakteristika vezivanja polipeptida IL-2, naročito su poželjne nekonzervativne supstitucije aminokiselina, tj. zamena jedne aminokiseline drugom aminokiselinom koja ima različita strukturna i/ili hemijska svojstva. Poželjne supstitucije aminokiselina uključuju zamenu hidrofobne aminokiseline hidrofilnom aminokiselinom. Aminokiselinske supstitucije podrazumevaju zamenu aminokiselinama koje ne nastaju prirodno, ili derivatima prirodnih aminokiselina, dvadeset standardnih aminokiselina (npr. 4-hidroksiprolin, 3-metilhistidin,
1
ornitin, homoserin, 5-hidroksilizin). Aminokiselinske mutacije se mogu generisati pomoću genetičkih ili hemijskih postupaka koji su dobro poznati u struci. Genetski postupci mogu obuhvatati mutagenezu usmerenu na mesto, PCR, sintezu gena, i slično. Smatra se da su takođe korisni postupci izmene grupe bočnih lanaca aminokiseline drugim postupcima osim genetskog inženjeringa, kao što je hemijska modifikacija.
U smislu ovog dokumenta, „nemutirani” oblik IL-2 je oblik IL-2 koji je inače isti kao mutantni polipeptid IL-2, osim što nemutirani oblik ima nemutiranu aminokiselinu na svakoj poziciji aminokiseline polipeptida mutantnog IL-2. Na primer, ako je IL-2 mutant IL-2 pune dužine (tj. IL-2 nije spojen ili konjugovan sa bilo kojim drugim molekulom), nemutirani oblik ovog mutanta je nativni IL-2 pune dužine. Ako je mutantni IL-2 fuzija između IL-2 i drugog polipeptida koji je kodiran nishodno od IL-2 (npr. lanac antitela), oblik divljeg tipa ovog IL-2 mutanta je IL-2 sa aminokiselinskom sekvencom divljeg tipa spojen sa istim nishodnim polipeptidom. Pored toga, ako je IL-2 mutant skraćeni oblik IL-2 (mutirana ili modifikovana sekvenca u neskraćenom delu IL-2), onda je oblik divljeg tipa ovog IL-2 mutanta slično skraćeni IL-2 koji ima sekvencu divljeg tipa. U cilju upoređivanja afiniteta vezivanja IL-2 receptora ili biološke aktivnosti različitih oblika mutanata IL-2 do odgovarajućeg oblika IL-2 divljeg tipa, termin „divljeg tipa“ obuhvata oblike IL-2 koji sadrže jednu ili više aminokiselinskih mutacija koje ne utiču na vezivanje IL-2 receptora u poređenju sa prirodnim, nativnim IL-2, kao što je npr. supstitucija cisteina na poziciji koja odgovara ostatku 125 humanog IL-2 u alanin. U nekim otelotvorenjima, nemutirani IL-2, za potrebe predmetnog pronalaska, sadrži aminokiselinsku supstituciju C125A (videti SEQ ID NO: 29). U određenim otelotvorenjima prema pronalasku, polipeptid IL-2 divljeg tipa, sa kojim se poredi mutantni polipeptid IL-2, sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 19. U drugim otelotvorenjima, IL-2 polipeptid divljeg tipa, sa kojim se poredi mutantni IL-2 polipeptid, sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 29.
Termin „CD25” ili „α-podjedinica IL-2 receptora”, u smislu ovog dokumenta, ukazuje na svaki nativni CD25 koji potiče od bilo kog kičmenjaka, uključujući sisare, kao što su primati (npr. ljudi) i glodare (npr. miševe i pacove), ako nije drugačije naglašeno. Termin obuhvata neobrađeni CD25 „pune dužine”, kao i svaki oblik CD25 koji je rezultat obrade u ćeliji. Termin takođe obuhvata prirodno postojeće varijante CD25, npr. splajsovane ili alelne varijante. U određenim izvođenjima CD25 je humani CD25. Aminokiselinska sekvenca humanog CD25 može se naći, npr. u UniProt unosu br. P01589 (verzija 185).
Termin „receptor IL-2 velikog afiniteta”, kako se ovde koristi, odnosi se na heterotrimerni oblik receptora IL-2, koji se sastoji od receptorske γ-podjedinice (takođe poznate kao uobičajena γ-podjedinica citokinskog receptora, γcili CD132, videti UniProt unos br. P14784 (verzija 192)), receptorske β-podjedinice (takođe poznata kao CD122 ili p70, videti UniProt unos br. P31785 (verzija 197)) iα-podjedinice receptore (takođe poznata kao CD25 ili p55, videti UniProt unos br. P01589 (verzija 185)). Termin „IL-2 receptor srednjeg afiniteta” se nasuprot tome odnosi na receptor IL-2 koji uključuje samo γ-podjedinicu i β-podjedinicu, bez α-podjedinice (za pregled videti, npr. Olejniczak i Kasprzak, Med Sci Monit 14, RA179-189 (2008)).
„Afinitet” se odnosi na snagu zbira ukupnih nekovalentnih interakcija između pojedinačnog mesta vezivanja molekula (npr. receptora) i njegovog partnera u vezivanju (npr. liganda). Ukoliko nije drugačije naznačeno, kao što je ovde upotrebljeno, „afinitet vezivanja” se odnosi na suštinski afinitet vezivanja, koji odražava 1:1 interakciju između članova vezujućeg para (npr. antigen vezujući ostatak i antigen, ili receptor i njegov ligand). Afinitet molekula X prema njegovom partneru Y može se opšte predstaviti preko konstante disocijacije (KD), koja predstavlja odnos konstanti brzine disocijacije i brzine asocijacije (koffodnosno kon). Tako ekvivalentni afiniteti mogu da uključe različite konstante brzine, dokle god odnos konstanti brzine ostaje isti. Afinitet može da se izmeri uobičajenim postupcima poznatim u struci, uključujući one koji su ovde opisani. Poseban postupak za merenje afiniteta je površinska plazmonska rezonanca (SPR).
Afinitet mutantnog polipeptida ili polipeptida divljeg tipa IL-2 prema različitim oblicima IL-2 receptora može da se odredi u skladu sa postupkom izloženim u WO 2012/107417 putem površinske plazmonske rezonance (SPR), koristeći standardne instrumente kao što je BIAcore instrument (GE Healthcare), i receptorske podjedinice koje se mogu dobiti rekombinantnom ekspresijom (vidite, npr. Shanafelt et al., Nature Biotechnol 18, 1197-1202 (2000)). Alternativno, afinitet vezivanja mutanata IL-2 za različite oblike IL-2 receptora može se proceniti pomoću ćelijskih linija za koje je poznato da eksprimiraju jedan ili drugi takav oblik receptora. Specifična otelotvorenja data kao ilustracija i primer za merenje afiniteta vezivanja opisana su u nastavku.
Pod „regulatornom T ćelijom” ili „Tregćelijom” podrazumeva se specijalizovana vrsta CD4<+>T ćelija koja može da potisne odgovore drugih T ćelija. Tregćelije se karakterišu ekspresijom α-podjedinice receptora IL-2 (CD25) i transkripcionog faktora za skurfin (FOXP3) (Sakaguchi, Annu Rev Immunol 22, 531-62 (2004)) i igraju kritičnu ulogu u indukciji i održavanju periferne samotolerancije na antigene, uključujući i one eksprimirane tumorima. Tregćelije zahtevaju IL-2 za svoj rad i razvoj, i indukciju supresivnih karakteristika.
Kako se ovde koristi, termin „efektorske ćelije” odnosi se na populaciju limfocita koji posreduju citotoksične efekte IL-2. Efektorske ćelije uključuju efektorske T ćelije kao što su CD8<+>citotoksične T ćelije, NK ćelije, ćelije ubice aktivirane limfokinom (LAK) i makrofage/monocite.
Kako se ovde koristi, termin „PD1”, „humani PD1”, „PD-1” ili „humani PD-1” (takođe poznat kao protein programirane ćelijske smrti 1, ili programirana smrt 1) odnosi se na humani protein PD1 (SEQ ID NO: 27, protein bez signalne sekvence) / (SEQ ID NO: 28, protein sa signalnom sekvencom). Videti takođe UniProt unos br. Q15116 (verzija 156). Kako se ovde koristi, antitelo „koje se vezuje za PD-1”, „specifično se vezuje za PD-1”, „koje se vezuje za PD-1” ili „anti-PD-1 antitelo” odnosi se na antitelo koje može da veže PD-1, posebno PD-1 polipeptid eksprimiran na površini ćelije, sa dovoljnim afinitetom tako da je antitelo korisno kao dijagnostički i/ili terapeutski agens u ciljanju PD-1. U jednom otelotvorenju, stepen vezivanja anti-PD-1 antitela za nepovezani protein koji nije PD-1 manji je od oko 10% vezivanja antitela za PD-1 mereno, npr. radioimunološkim testom (RIA) ili protočnom citometrijom (FACS) ili testom površinske plazmonske rezonance koristeći biosenzorski sistem kao što je sistem Biacore®. U određenim otelotvorenjima, antitelo koje se vezuje za PD-1 ima KD vrednost afiniteta vezivanja za vezivanje za humani PD-1 od ≤ 1 µM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0,1, ≤ 0,01 nM, ili ≤ 0,001 nM (npr.10<-8>M ili manje, npr. od 10<-8>M do 10<-13>M, npr. od 10<-9>M do 10<-13>M). U jednom otelotvorenju, KD vrednost afiniteta vezivanja određena je u testu površinske plazmonske rezonance koristeći ekstracelularni domen (ECD) humanog PD-1 (PD-1-ECD, videti SEQ ID NO: 43) kao antigen.
Pod „specifičnim vezivanjem” podrazumeva se da je vezivanje selektivno za antigen i može se razlikovati od neželjenih ili nespecifičnih interakcija. Sposobnost antitela da se vezuje za specifični antigen (npr. PD-1) može se meriti bilo putem testa sa imunosorbentom vezanim za enzim (ELISA) ili putem drugih tehnika poznatih stručnim licima, npr. tehnikama površinske plazmonske rezonance (SPR) (analizirana npr. na instrumentu BIAcore) (Liljeblad et al., Glyco J17, 323-329 (2000)), i tradicionalnim testovima vezivanja (Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)). U jednom otelotvorenju, obim vezivanja antitela za nepovezani protein manji je od oko 10% od vezivanja antitela za antigen kao što je izmereno, npr. tehnikom SPR. Antitelo sadržano u ovde opisanom imunokonjugatu specifično se vezuje za PD-1.
Kako se ovde koristi, pojam „polipeptid” se odnosi na molekul sastavljen od monomera (aminokiselina) koji su linearno povezani amidnim vezama (poznatim i kao peptidne veze). Pojam „polipeptid” se odnosi na bilo koji lanac dve ili više aminokiseline, i ne se odnosi na određenu dužinu proizvoda. Tako su peptidi, dipeptidi, tripeptidi, oligopeptidi, „protein”, „aminokiselinski lanac” ili bilo koji drugi izraz koji se koristi da se ukaže na lanac dve ili više
1
aminokiselina, uključeni u definiciju „polipeptida” i izraz „polipeptid” se može koristiti umesto bilo kog od ovih izraza ili kao njegov sinonim. Termin „polipeptid” se takođe odnosi na proizvode post-ekspresione modifikacije polipeptida, uključujući bez ograničenja glikozilaciju, acetilovanje, fosforilaciju, amidaciju, derivatizaciju poznatih zaštitnih/blokirajućih grupa, proteolitičko cepanje ili modifikaciju sa neprirodno nastalim aminokiselinama. Polipeptid može biti izveden iz prirodnog biološkog izvora ili proizveden rekombinantnom tehnologijom, ali nije nužno preveden iz određene sekvence nukleinske kiseline. Može se generisati na bilo koji način, uključujući i hemijsku sintezu. Polipeptidi mogu imati definisanu trodimenzionalnu strukturu, iako ne moraju nužno imati takvu strukturu. Polipeptidi sa definisanom trodimenzionalnom strukturom se nazivaju presavijeni, a polipeptidi koji nemaju definisanu trodimenzionalnu strukturu, već mogu usvojiti veliki broj različitih konformacija se nazivaju odmotani.
„Izolovanim” polipeptidom ili varijantom ili njegovim derivatom smatra se polipeptid koji nije u svom prirodnom miljeu. Nije potreban određeni nivo prečišćavanja. Na primer, izolovani polipeptid se može ukloniti iz svog nativnog ili prirodnog okruženja. Rekombinantno proizvedeni polipeptidi i proteini eksprimirani u ćelijama domaćina smatraju se izolovanim u svrhu pronalaska, kao što su nativni ili rekombinantni polipeptidi koji su odvojeni, frakcionisani ili delimično ili suštinski prečišćeni bilo kojom odgovarajućom tehnikom.
„Procenat (%) identičnosti aminokiselinske sekvence” u poređenju sa sekvencom referentnog polipeptida definisan je kao procenat onih aminokiselinskih ostataka u sekvencikandidatu koji su identični aminokiselinskim ostacima u sekvenci referentnog polipeptida, nakon poravnavanja sekvenci i uvođenja praznina, ako je potrebno, da bi se postigao maksimalni procenat identičnosti sekvence, pri tom ne uzimajući u obzir bilo koje konzervativne supstitucije kao deo identiteta sekvence. Poravnavanje radi određivanja procenta identičnosti aminokiselinske sekvence može se postići na različite načine koji su poznati u okviru struke, na primer, pomoću javno dostupnog kompjuterskog softvera, kao što je BLAST, BLAST-2, Clustal W, Megalign (DNASTAR) softver ili FASTA programski paket. Stručna lica iz ove oblasti mogu da odrede odgovarajuće parametre za poravnavanje sekvenci, uključujući sve potrebne algoritme za postizanje maksimalnog poravnavanja u kompletnoj dužini sekvenci koje se porede. Međutim, za potrebe ovog dokumenta, % vrednosti identičnosti aminokiselinske sekvence generišu se korišćenjem programa ggsearch iz paketa FASTA verzije 36.3.8c ili novije sa BLOSUM50 matricom za poređenje. Autori programskog paketa FASTA su W. R. Pearson i D. J. Lipman (1988), “Improved Tools for Biological Sequence Analysis”, PNAS 85:2444-2448; W. R. Pearson (1996) “Effective protein sequence comparison” Meth. Enzymol. 266:227− 258; i Pearson et. al. (1997) Genomics 46:24-36, i javno je dostupan na http://fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_down.shtml. Alternativno, javni server koji je dostupan na http://fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/index.cgi može se koristiti za upoređivanje sekvenci, koristeći ggsearch (globalni protein:protein) program i podrazumevane opcije (BLOSUM50; praznina: -10; ekst: -2; Ktup = 2) kako bi se obezbedilo da se izvrši globalno, a ne lokalno poravnanje. Procenat aminokiselinske identičnosti dat je u zaglavlju izlaznog poravnanja.
Termin „polinukleotid” se odnosi na izolovani molekul ili konstrukt nukleinske kiseline, npr. informacionu RNK (mRNK), viralno dobijenu RNK ili plazmidnu DNK (pDNK). Polinukleotid može sadržati konvencionalnu vezu fosfodiestra ili nekonvencionalnu vezu (npr. amidnu vezu, kao što je pronađeno u peptidnim nukleinskim kiselinama (PNK). Termin „molekul nukleinske kiseline” se odnosi na bilo koji jedan ili više segmenata nukleinske kiseline, npr. fragmente DNK ili RNK, prisutne u polinukleotidu.
„Izolovanim” molekulom nukleinske kiseline ili polinukleotidom smatra se molekul nukleinske kiseline, DNK ili RNK, koji je uklonjen iz svog izvornog okruženja. Na primer, rekombinantni polinukleotid koji kodira polipeptid sadržan u vektoru smatra se izolovanim u svrhe predmetnog pronalaska. Dalji primeri za izolovani polinukleotid uključuju rekombinantne polinukleotide koji se održavaju u heterolognim ćelijama domaćina ili prečišćene (delimično ili suštinski) polinukleotide u rastvoru. Izolovani polinukleotid uključuje molekul polinukleotida koji se nalazi u ćelijama koje uobičajeno sadrže molekul polinukleotida, ali je molekul polinukleotida prisutan ekstrahromozomski ili na hromozomskoj lokaciji koja se razlikuje od njegove prirodne hromozomske lokacije. Izolovani molekuli RNK uključuju in vivo ili in vitro transkripte RNK, iz predmetnog pronalaska, kao i pozitivne i negativne lančane forme i dvolančane forme. Izolovani polinukleotidi ili nukleinske kiseline prema predmetnom pronalasku dalje uključuju takve molekule proizvedene sintetički. Pored toga, polinukleotid ili nukleinska kiselina mogu da budu ili mogu da uključuju regulatorni element kao što je promoter, mesto vezivanja ribozoma ili terminator transkripcije.
„Izolovani polinukleotid (ili nukleinska kiselina) koji kodira [npr. imunokonjugat iz pronalaska]” odnosi se na jedan ili više molekula polinukleotida koji kodiraju teške i lake lance antitela i/ili IL-2 polipeptide (ili njihove fragmente), uključujući takve molekule polinukleotida u jednom vektoru ili odvojenim vektorima, i takve molekule nukleinske kiseline prisutne na jednoj ili više lokacija u ćeliji domaćinu.
Termin „ekspresiona kaseta” se odnosi na polinukleotid generisan rekombinantno ili
1
sintetički, sa nizom specifičnih elemenata nukleinske kiseline koji omogućavaju transkripciju određene nukleinske kiseline u ciljanu ćeliju. Rekombinantna ekspresiona kaseta može se inkorporirati u plazmid, hromozom, mitohondrijsku DNK, plastidnu DNK, virus ili fragment nukleinske kiseline.
Tipično, deo rekombinantne ekspresione kasete ekspresionog vektora sadrži, između ostalih sekvenci, sekvencu nukleinske kiseline koja se transkribuje i promoter. U određenim aspektima otkrića, ekspresiona kaseta sadrži polinukleotidne sekvence koje kodiraju imunokonjugate iz pronalaska ili njihove fragmente.
Termin „vektor” ili „ekspresioni vektor” se odnosi na molekul DNK koji se koristi za uvođenje i usmeravanje ekspresije specifičnog gena sa kojim je on operativno povezan u ćeliji. Ovaj termin obuhvata vektor kao samoumnožavajuću strukturu nukleinske kiseline, kao i vektor ugrađen u genom ćelije domaćina u koju je uveden. Ekspresioni vektor iz predmetnog pronalaska sadrži ekspresionu kasetu. Ekspresioni vektori omogućavaju transkripciju velikih količina stabilne mRNK. Kada se ekspresioni vektor nađe unutar ćelije, molekul ribonukleinske kiseline ili protein koji je kodiran tim genom proizvodi se pomoću mehanizma ćelijske transkripcije i/ili translacije. U jednom otelotvorenju, ekspresioni vektor iz pronalaska sadrži ekspresionu kasetu koja sadrži polinukleotidne sekvence koje kodiraju imunokonjugate iz pronalaska ili njihove fragmente.
Termini „ćelija domaćin”, „linija ćelija domaćina” i „kultura ćelija domaćina” koriste se naizmenično, i ukazuju na ćelije u koje je uvedena egzogena nukleinska kiselina, uključujući potomstvo takvih ćelija. Ćelije domaćini uključuju „transformante“ i „transformisane ćelije“, u koje spadaju primarne transformisane ćelije i potomstvo dobijeno od njih, bez obzira na broj presejavanja. Potomstvo ne mora biti po sadržaju nukleinskih kiselina sasvim istovetno matičnoj ćeliji, već može da sadrži mutacije. Ovde se uključuje mutantno potomstvo koje ima istu funkciju ili biološku aktivnost kakva je ispitana ili odabrana u originalno transformisanoj ćeliji. Ćelija domaćin je bilo koja vrsta ćelijskog sistema koji se može koristiti za dobijanje imunokonjugata iz ovog pronalaska. Ćelije domaćini uključuju uzgajane ćelije, npr. uzgajane ćelije sisara, kao što su HEK ćelije, CHO ćelije, BHK ćelije, NS0 ćelije, SP2/0 ćelije, YO ćelije mijeloma, P3X63 ćelije mišjeg mijeloma, PER ćelije, PER.C6 ćelije ili ćelije hibridoma, ćelije kvasaca, ćelije insekata i biljne ćelije, da navedemo samo nekoliko, ali i ćelije koje se nalaze u transgenoj životinji, transgenoj biljci ili uzgajenom biljnom ili životinjskom tkivu.
Termin „antitelo” ovde je upotrebljen u najširem smislu i obuhvata različite strukture antitela, uključujući, ali se ne ograničavajući na monoklonska antitela, poliklonska antitela, multispecifična antitela (npr. bispecifična antitela) i fragmente antitela, dokle god oni pokazuju
1
željenu antigen-vezujuću aktivnost.
Termin „monoklonsko antitelo“, u smislu ovog dokumenta, odnosi se na antitelo dobijeno iz populacije suštinski homogenih antitela, tj. pojedinačna antitela koja čine ovu populaciju su identična i/ili se vezuju za isti epitop, sa izuzetkom mogućih varijanti antitela, npr. koje sadrže mutacije koje postoje u prirodi ili se mogu razviti tokom stvaranja preparata monoklonskog antitela, a takve varijante su tipično prisutne u neznatnim količinama. Nasuprot preparatima poliklonskih antitela, koji tipično uključuju različita antitela, usmerena na različite determinante (epitope), svako monoklonsko antitelo iz preparata monoklonskog antitela je usmereno na pojedinačnu determinantu na antigenu. Stoga reč „monoklonsko“ ukazuje na karakter antitela, da je dobijeno iz suštinski homogene populacije antitela, i ne bi je trebalo tumačiti kao da podrazumeva zahtev za proizvodnju antitela bilo kojim posebnim postupkom. Na primer, monoklonska antitela koja će se koristiti u skladu sa predmetnim pronalaskom mogu se dobiti različitim tehnikama, uključujući, ali se ne ograničavajući na metodu hibridoma, postupke rekombinantne DNK, postupke displeja faga i postupke u kojima se koriste transgene životinje koje sadrže kompletne lokuse humanog imunoglobulina ili njihove delove, i ovde su opisani takvi postupci i primeri drugih postupaka za dobijanje monoklonskih antitela.
„Izolovano“ antitelo je ono koje je odvojeno od komponente svog prirodnog okruženja, odnosno koji nije u svom prirodnom miljeu. Nije potreban određeni nivo prečišćavanja. Na primer, izolovano antitelo se može ukloniti iz svog nativnog ili prirodnog okruženja. Rekombinantno proizvedena antitela eksprimirana u ćelijama domaćinima smatraju se izolovanim u svrhu pronalaska, kao što su nativna ili rekombinantna antitela koja su odvojena, frakcionisana ili delimično ili suštinski prečišćena bilo kojom odgovarajućom tehnikom. Kao takvi, imunokonjugati iz ovog pronalaska su izolovani. U nekim otelotvorenjima, antitelo je prečišćeno do čistoće veće od 95% ili 99%, kao što je određeno, na primer, elektroforetski (npr. SDS-PAGE, izoelektrično fokusiranje (IEF), kapilarna elektroforeza) ili hromatografski (npr. jonskom izmenom ili reversno faznom HPLC metodom). Za pregled metoda za procenu čistoće antitela, pogledajte npr. Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007).
Termini „antitelo pune dužine”, „netaknuto antitelo” i „kompletno antitelo” u ovom dokumentu se koriste kao sinonimi koji označavaju antitelo koje ima strukturu suštinski sličnu strukturi nativnog antitela.
„Fragment antitela“ ukazuje na molekul koji nije netaknuto antitelo, a koji sadrži deo netaknutog antitela koje vezuje antigen za koji se vezuje netaknuto antitelo. Primeri za fragmente antitela uključuju, ali se ne ograničavaju na Fv, Fab, Fab’, Fab’-SH, F(ab’)2, dijatela,
1
linearna antitela, jednolančane molekule antitela (npr. scFv) i antitela sa jednim domenom. Pregled fragmenata pojedinih antitela potražite u Holliger i Hudson, Nature Biotechnology 23:1126-1136 (2005). Pregled scFv fragmenata potražite npr. u Pluckthün, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol.113, Rosenburg i Moore izd., Springer-Verlag, New York, str.
269-315 (1994); pogledajte takođe WO93/16185; i U.S. Patent br. 5,571,894 i 5,587,458. Raspravu o Fab i F(ab')2fragmentima koji sadrže regenerisane ostatke receptorski vezujućih epitopa i koji imaju produžen poluživot in vivo pogledajte u U.S. Patentu br. 5,869,046. Dijatela su fragmenti antitela sa dva mesta za vezivanje antigena koja mogu biti dvovalentna ili bispecifična. Pogledajte, npr., EP404,097; WO1993/01161; Hudson et al., Nat. Med.9:129-134 (2003); i Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA90:6444-6448 (1993). Trijatela i tetratela su takođe opisana u Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003). Antitela sa jednim domenom su fragmenti antitela koji sadrže kompletan varijabilni domen teškog lanca antitela ili njegov deo, ili kompletan varijabilni domen lakog lanca antitela ili njegov deo. U određenim otelotvorenjima, antitelo sa jednim domenom je humano antitelo sa jednim domenom (Domantis, Inc., Waltham, MA; pogledajte, npr. U.S. Patent br. 6,248,516 B1). Fragmenti antitela se mogu dobiti različitim tehnikama, uključujući, ali se ne ograničavajući na proteolitičku digestiju netaknutog antitela, kao i proizvodnju pomoću rekombinantnih ćelija domaćina (npr. E. coli ili faga), kao što je ovde opisano.
Termin „molekul imunoglobulina” se odnosi na protein koji ima strukturu prirodnog antitela. Na primer, imunoglobulini klase IgG su heterotetramerni glikoproteini od oko 150.000 daltona, sastavljeni od dva identična laka lanca i dva identična teška lanca koji su povezani disulfidnim vezama. Od N-kraja do C-kraja, svaki teški lanac ima varijabilni domen (VH), koji se takođe zove varijabilni teški domen ili varijabilni region teškog lanca, za kojim slede tri konstantna domena (CH1, CH2 i CH3), koji se takođe zovu konstantni regioni teškog lanca. Slično tome, od N- do C-kraja, svaki laki lanac ima varijabilni domen (VL), koji se takođe zove varijabilni laki domen ili varijabilni region lakog lanca, za kojim sledi konstantni laki (CL) domen, koji se takođe zove konstantni region lakog lanca. Teški lanac imunoglobulina može biti dodeljen jednom od pet tipova, koji se zovu α (IgA), δ (IgD), ε (IgE), γ (IgG), ili μ (IgM), od kojih se neki mogu dalje podeliti na podtipove, npr. γ1(IgG1), γ2(IgG2), γ3(IgG3), γ4(IgG4), α1(IgA1) i α2(IgA2). Laki lanac imunoglobulina može se svrstati u jedan od dva tipa, koji se zovu kapa (κ) i lambda (λ), na osnovu aminokiselinske sekvence njihovog konstantnog domena. Imunoglobulin se u suštini sastoji od dva molekula Fab i Fc domena, povezana preko regiona šarke imunoglobulina.
Termin „antigen vezujući domen” se odnosi na deo antitela koji sadrži oblast koja se
1
specifično vezuje za deo antigena ili ceo antigen, i komplementaran je sa delom antigena ili celim antigenom. Antigen vezujući domen se može dobiti, na primer, pomoću jednog ili više varijabilnih domena antitela (koja se još zovu i varijabilni regioni antitela). Posebno, antigenvezujući domen sadrži varijabilni domen lakog lanca antitela (VL) i varijabilni domen teškog lanca antitela (VH).
Izrazi „varijabilni region“ ili „varijabilni domen“ odnose se na domen teškog ili lakog lanca antitela, koji učestvuje u vezivanju antitela za antigen. Varijabilni domeni teškog lanca i lakog lanca (VH odnosno VL) nativnog antitela tipično imaju slične strukture, pri čemu svaki domen sadrži četiri očuvana regiona okvira (FR) i tri hipervarijabilna regiona (HVR). Vidite, npr. Kindt et al., Kuby Immunology, 6. izd, W.H. Freeman and Co., str.91 (2007). Jedan VH ili VL domen može biti dovoljan za dodeljivanje antigen vezujuće specifičnosti. Kako se ovde koristi u vezi sa sekvencama varijabilnih regiona, „Kabatova numeracija“ se odnosi na sistem numeracije koji su izradili Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. izd. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991).
Kako se ovde koriste, aminokiselinski položaji svih konstantnih regiona i domena teškog i lakog lanca su numerisani u skladu sa Kabatovim sistemom za numeraciju koji je opisan u Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. izd., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), i ovde se naziva „numeracija prema Kabatu“ ili „Kabatova numeracija“. Konkretno, Kabatov sistem numeracije (vidi stranice 647-660 Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. izd., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)) koristi se za konstantni domen lakog lanca CL kapa i lambda izotipa, i sistem numeracije prema Kabatovom EU indeksu (vidi strane 661-723) koristi se za konstantne domene teškog lanca (CH1, šarka, CH2 i CH3), što je ovde dalje objašnjeno pozivajući se na „numeraciju prema Kabatovom EU indeksu“ u ovom slučaju.
Termin „hipervarijabilni region“ ili „HVR“ kao što je ovde upotrebljen, ukazuje na svaki od regiona varijabilnog domena antitela koji su hipervarijabilni u sekvenci („regioni koji određuju komplementarnost“ ili „CDR“) i/ili formiraju strukturno definisane petlje („hipervarijabilne petlje“) i/ili sadrže ostatke u kontaktu sa antigenom („antigenski kontakti“). Generalno, antitela obuhvataju šest HVR regiona, tri u VH (H1, H2, H3) i tri u VL (L1, L2, L3). U ovom dokumentu, primeri za HVR uključuju:
(a) hipervarijabilne petlje koje se pojavljuju na aminokiselinskim ostacima 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2), i 96-101 (H3) (Chothia i Lesk, J. Mol. Biol.
196:901-917 (1987));
1
(b) CDR koji se pojavljuju na aminokiselinskim ostacima 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50-65 (H2), i 95-102 (H3) (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. izd. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991));
(c) kontakte antigena koji se javljaju na ostacima aminokiselina 27c-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (H1), 47-58 (H2) i 93-101 (H3) (MacCallum et al. J. Mol. Biol.262: 732-745 (1996)); i
(d) kombinacije (a), (b) i/ili (c), uključujući aminokiselinske ostatke HVR 46-56 (L2), 47-56 (L2), 48-56 (L2), 49-56 (L2), 26-35 (H1), 26-35b (H1), 49-65 (H2), 93-102 (H3) i 94-102 (H3).
Ako nije drugačije naznačeno, HVR ostaci i drugi ostaci u varijabilnom domenu (npr. FR ostaci) ovde su numerisani prema radu Kabat et al, supra.
„Okvir“ ili „FR“ se odnosi na ostatke varijabilnog domena koji nisu ostaci hipervarijabilnog regiona (HVR). FR varijabilnog domena generalno se sastoji od četiri FR domena: FR1, FR2, FR3 i FR4. Shodno tome, HVR i FR sekvence generalno se pojavljuju po sledećem redosledu u VH (ili VL): FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
„Humanizovano“ antitelo se odnosi na himerno antitelo koje sadrži aminokiselinske ostatke nehumanih HVR-ova i aminokiselinske ostatke humanih FR-ova. U određenim otelotvorenjima, humanizovano antitelo će sadržati u suštini sve, ili najmanje jedan, a tipično dva varijabilna domena, u kojima svi, ili suštinski svi HVR-ovi (npr. CDR), odgovaraju onima iz nehumanog antitela, a svi, ili suštinski svi FR-ovi, odgovaraju onima iz humanog antitela. Takvi varijabilni domeni se ovde nazivaju „humanizovani varijabilni region”. Humanizovano antitelo opciono može da sadrži najmanje deo konstantnog regiona antitela dobijenog od humanog antitela. U nekim otelotvorenjima, neki FR ostaci u humanizovanom antitelu su supstituisani odgovarajućim ostacima nehumanog antitela (npr. antitela sa koga su dobijeni HVR ostaci), npr. da bi se povratila ili poboljšala specifičnost antitela ili njegov afinitet. „Humanizovani oblik“ antitela, npr. nehumanog antitela, odnosi se na antitelo koje je pretrpelo humanizaciju. Drugi oblici „humanizovanih antitela“ obuhvaćenih ovim pronalaskom su oni u kojima je konstantni region dodatno modifikovan ili promenjen u odnosu na onaj originalnog antitela, da bi se generisale karakteristike u skladu sa pronalaskom, posebno u vezi sa vezivanjem C1q i/ili vezivanjem Fc receptora (FcR).
„Humano antitelo“ je ono koje ima aminokiselinsku sekvencu koja odgovara aminokiselinskoj sekvenci antitela koju proizvodi čovek ili humana ćelija, ili ono dobijeno iz nehumanog izvora koji koristi humani repertoar antitela ili druge sekvence za kodiranje
2
humanog antitela. Ova definicija humanog antitela posebno isključuje humanizovano antitelo koje sadrži antigen vezujuće ostatke koji nisu ljudskog porekla. U određenim otelotvorenjima, humano antitelo je dobijeno od nehumanog transgenog sisara, na primer miša, pacova ili zeca. U određenim otelotvorenjima, humano antitelo je dobijeno od ćelijske linije hibridoma. Antitela ili fragmenti antitela izolovani iz biblioteka humanih antitela se ovde takođe smatraju humanim antitelima ili fragmentima humanih antitela.
„Klasa“ antitela ili imunoglobulina ukazuje na vrstu konstantnog domena ili konstantnog regiona koju ima njegov teški lanac. Postoji pet glavnih klasa antitela: IgA, IgD, IgE, IgG i IgM, a neke od njih mogu dalje da se dele na potklase (izotipove), npr. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, i IgA2. Konstantni domeni teškog lanca koji odgovaraju različitim klasama imunoglobulina zovu se α, δ, ε, γ, odnosno μ.
Izraz „Fc domen“ ili „Fc region“ se ovde koristi da definiše C-terminalni region imunoglobulinskog teškog lanca koji sadrži barem deo konstantnog regiona. Ovaj izraz podrazumeva nativne sekvence Fc regiona i varijante Fc regiona. Iako granice Fc regiona IgG teškog lanca mogu malo da variraju, Fc region teškog lanca humanog IgG tipično se po uobičajenoj definiciji proteže od Cys226 ili Pro230 do karboksi terminusa teškog lanca. Međutim, antitela koja proizvode ćelije domaćini mogu biti podvrgnuta posttranslacionom cepanju jedne ili više, posebno jedne ili dve aminokiseline sa C-kraja teškog lanca. Shodno tome, antitelo proizvedeno od strane ćelije domaćina ekspresijom specifičnog molekula nukleinske kiseline koji kodira teški lanac pune dužine može uključivati teški lanac pune dužine, ili može uključivati cepanu varijantu teškog lanca pune dužine (takođe se u ovom tekstu naziva „cepana varijanta teškog lanca“). Ovo može biti slučaj kada su poslednje dve aminokiseline C-kraja teškog lanca glicin (G446) i lizin (K447, numeracija prema Kabatovom EU indeksu). Shodno tome, C-terminalni lizin (Lys447), ili C-terminalni glicin (Gly446) i lizin (K447), Fc regiona mogu, ili ne moraju biti prisutni. Aminokiselinske sekvence teških lanaca, uključujući Fc domene (ili podjedinicu Fc domena, kao što je ovde definisana), ovde su označene bez C-terminalnog dipeptida glicin-lizin, ako nije drugačije naznačeno. U jednom aspektu otkrića, teški lanac koji uključuje podjedinicu Fc domena kao što je ovde naznačeno, sadržan u imunokonjugatu prema pronalasku, sadrži dodatni C-terminalni dipeptid glicin-lizin (G446 i K447, numeracija prema Kabatovom EU indeksu). U jednom aspektu otkrića, teški lanac koji uključuje podjedinicu Fc domena kako je ovde naznačeno, sadržan u imunokonjugatu prema pronalasku, sadrži dodatni C-terminalni glicinski ostatak (G446, numeracija prema Kabatovom EU indeksu). Kompozicije iz pronalaska, kao što su farmaceutske kompozicije koje su ovde opisane, obuhvataju populaciju imunokonjugata iz pronalaska. Populacija imunokonjugata može da sadrži molekule koji imaju teški lanac pune dužine i molekule koji imaju cepanu varijantu teškog lanca. Populacija imunokonjugata se može sastojati od smeše molekula koji imaju teški lanac pune dužine i molekula koji imaju cepanu varijantu teškog lanca, pri čemu najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80% ili najmanje 90% imunokonjugata ima cepanu varijantu teškog lanca. U jednom aspektu otkrića, kompozicija koja sadrži populaciju imunokonjugata iz ovog pronalaska sadrži imunokonjugat koji sadrži teški lanac koji obuhvata podjedinicu Fc domena, kao što je ovde naznačeno, sa dodatnim C-terminalnim dipeptidom glicin-lizin (G446 i K447, numeracija prema Kabatovom EU indeksu). U jednom aspektu otkrića, kompozicija koja sadrži populaciju imunokonjugata iz ovog pronalaska sadrži imunokonjugat koji sadrži teški lanac koji obuhvata podjedinicu Fc domena, kao što je ovde naznačeno, sa dodatnim C-terminalnim ostatkom glicina (G446, numeracija prema Kabatovom EU indeksu). U jednom aspektu otkrića, takva kompozicija sadrži populaciju imunokonjugata sastavljenih od molekula koji sadrže teški lanac, uključujući podjedinicu Fc domena, kao što je ovde naznačeno; molekula koji sadrže teški lanac, koji obuhvata podjedinicu Fc domena, kao što je ovde naznačeno, sa dodatnim C-terminalnim ostatkom glicina (G446, numeracija prema Kabatovom EU indeksu); i molekula koji sadrže teški lanac, uključujući podjedinicu Fc domena, kao što je ovde naznačeno, sa dodatnim C-terminalnim dipeptidom glicin-lizin (G446 i K447, numeracija prema Kabatovom EU indeksu). Ako ovde nije drugačije naznačeno, numeracija ostataka aminokiselina u Fc regionu ili konstantnom regionu je prema EU sistemu numeracije, koji se takođe zove EU indeks, kao što je opisano u Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. izd. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991. (videti i gore iznad). „Podjedinica“ Fc domena, kako se ovde koristi, odnosi se na jedan od dva polipeptida koji formiraju dimerni Fc domen, tj. polipeptid koji sadrži C-terminalne konstantne regione teškog lanca imunoglobulina, sposobne za stabilno samoudruživanje. Na primer, podjedinica Fc domena IgG sadrži konstantni domen IgG CH2 i IgG CH3.
„Modifikacija koja promoviše povezivanje prve i druge podjedinice Fc domena“ je manipulacija peptidnim skeletom ili posttranslaciona modifikacija podjedinice Fc domena koja smanjuje ili sprečava povezivanje polipeptida koji sadrži podjedinicu Fc domena sa identičnim polipeptidom da formiraju homodimer. Modifikacija koja promoviše povezivanje, kako se ovde koristi, posebno podrazumeva odvojene modifikacije napravljene za svaku od dve podjedinice Fc domena koje treba da se povežu (tj. prva i druga podjedinica Fc domena), pri čemu su modifikacije komplementarne jedna drugoj kako bi se promovisalo povezivanje dve podjedinice Fc domena. Na primer, modifikacija koja promoviše povezivanje može promeniti strukturu ili naelektrisanje jedne ili obe podjedinice Fc domena, kako bi njihovo povezivanje bilo sterno odnosno elektrostatički povoljno. Tako se (hetero)dimerizacija javlja između polipeptida koji sadrži prvu podjedinicu Fc domena i polipeptida koji sadrži drugu podjedinicu Fc domena, koja može biti neidentična u smislu da dodatne komponente spojene na svaku od podjedinica (npr. antigen vezujući delovi) nisu iste. U nekim otelotvorenjima, modifikacija koja podstiče povezivanje uključuje aminokiselinsku mutaciju u Fc domenu, posebno aminokiselinsku supstituciju. U posebnom otelotvorenju, modifikacija koja promoviše povezivanje sadrži odvojenu aminokiselinsku mutaciju, konkretno aminokiselinsku supstituciju, u svakoj od dve podjedinice Fc domena.
Termin „efektorske funkcije”, kada se koristi u odnosu na antitela, ukazuje na one biološke aktivnosti koje mogu da se pripišu Fc regionu antitela, koji varira sa izotipom antitela. Primeri za efektorske funkcije antitela uključuju: Vezivanje C1q i citotoksičnost zavisnu od komplementa (CDC), vezivanje Fc receptora; ćelijski posredovanu citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC); ćelijsku fagocitozu zavisnu od antitela (ADCP), sekreciju citokina, preuzimanje antigena posredstvom imunskog kompleksa od strane antigen prezentujućih ćelija, smanjenje regulacije površinskih ćelijskih receptora (npr. B-ćelijski receptor), i aktivaciju B ćelija.
Citotoksičnost posredovana ćelijama zavisna od antitela (ADCC) je imunološki mehanizam koji dovodi do lize ciljanih ćelija obloženih antitelima pomoću imunoloških efektorskih ćelija. Ciljne ćelije su ćelije za koje se antitela ili njihovi derivati koji sadrže Fc region specifično vezuju, najčešće preko proteinskog dela koji je N-kraj Fc regiona. Kao što se ovde koristi, termin „smanjen ADCC“ je definisan ili kao smanjenje broja ciljnih ćelija koje su lizirane u datom vremenu, pri datoj koncentraciji antitela u medijumu koji okružuje ciljne ćelije, putem mehanizma ADCC definisanog iznad, i/ili povećanje koncentracije antitela u medijumu koji okružuje ciljne ćelije, potrebno da se postigne liza datog broja ciljnih ćelija u datom vremenu, putem mehanizma ADCC. Smanjenje ADCC je u odnosu na ADCC posredovanu istim antitelom koje proizvodi isti tip ćelija domaćina, korišćenjem istih standardnih postupaka stvaranja, prečišćavanja, formulisanja i čuvanja (koji su poznati stručnjacima u ovoj oblasti), ali koje nije konstruisano. Na primer, smanjenje ADCC posredovane antitelom koje sadrži u svom Fc domenu aminokiselinsku supstituciju koja smanjuje ADCC, je u odnosu na ADCC posredovanu istim antitelom bez ove aminokiselinske supstitucije u Fc domenu. Odgovarajući testovi za merenje ADCC su dobro poznati u struci (vidi npr. PCT publikaciju br. WO2006/082515 ili PCT publikaciju br. WO2012/130831).
„Aktivirajući Fc receptor” je Fc receptor koji nakon angažovanja Fc domena antitela
2
izaziva signalizirajuće događaje koji stimulišu receptorsku noseću ćeliju da izvede efektorske funkcije. Humani aktivirajući Fc receptori uključuju FcγRIIIa (CD16a), FcγRI (CD64), FcγRIIa (CD32) i FcαRI (CD89).
Kako se ovde koriste, pojmovi „konstruisati, konstruisano, inženjering” uključuju bilo kakvu manipulaciju peptidne osnove ili posttranslacionih modifikacija prirodnog ili rekombinantnog polipeptida ili njegovog fragmenta. Inženjering obuhvata modifikacije aminokiselinske sekvence, glikozilacionog obrasca ili grupe bočnih lanaca pojedinačnih aminokiselina, kao i kombinacije ovih pristupa.
„Smanjeno vezivanje”, na primer, smanjeno vezivanje za Fc receptor ili CD25, odnosi se na smanjenje afiniteta za odgovarajuću interakciju, kao što je mereno, na primer, SPR-om. Radi jasnoće, ovaj termin uključuje i smanjenje afiniteta na nulu (ili ispod granice detekcije analitičkog postupka), odnosno potpuno ukidanje interakcije. Nasuprot tome, „povećano vezivanje” se odnosi na povećanje afiniteta vezivanja za odgovarajuću interakciju.
Kako se ovde koristi, termin „imunokonjugat” se odnosi na molekul polipeptida koji uključuje najmanje jedan molekul IL-2 i najmanje jedno antitelo. IL-2 molekul može da se spoji sa antitelom različitim interakcijama i u različitim konfiguracijama, kao što je ovde opisano. U posebnim otelotvorenjima, molekul IL-2 je spojen sa antitelom preko peptidnog linkera. Posebni imunokonjugati prema pronalasku u suštini se sastoje od jednog molekula IL-2 i antitela koji su spojeni preko jedne ili više sekvenci linkera.
Termin „spojen” podrazumeva da su komponente (npr. antitelo i IL-2 molekul) povezani peptidnim vezama, bilo direktno ili preko jednog ili više peptidnih linkera.
Termini „prvi” i „drugi” kada se koriste ovde u odnosu na podjedinice Fc domena, itd. koriste se radi razlikovanja kada postoji više od jedne vrste svakog ostatka. Upotreba ovih pojmova nije namenjena da daje određeni red ili orijentaciju imunokonjugata, osim ako to nije eksplicitno naznačeno.
„Efikasna količina” agensa se odnosi na količinu koja je neophodna da bi se dovelo do fiziološke promene u ćeliji ili tkivu na koje se primenjuje.
„Terapeutski efikasna količina” agensa, npr. farmaceutske kompozicije, odnosi se na količinu koja je u potrebnim dozama i vremenskim periodima efikasna za postizanje željenog terapeutskog ili profilaktičkog rezultata. Terapeutski efikasna količina agensa, na primer, eliminiše, smanjuje, odlaže, minimizuje ili sprečava štetne efekte bolesti.
„Pojedinac“ ili „ispitanik“ je sisar. Sisari uključuju, ali se ne ograničavaju na, domaće životinje (npr. krave, ovce, mačke, pse i konje), primate (npr. ljude i ne-humane primate, kao što su majmuni), zečeve i glodare (npr. miševe i pacove). Konkretno, pojedinac ili ispitanik je čovek.
Termin „farmaceutska kompozicija” se odnosi na preparat, koji je u takvom obliku da omogućuje da biološka aktivnost aktivnog sastojka koji se u njemu nalazi bude delotvorna, i koji ne sadrži dodatne komponente koje su neprihvatljivo toksične za ispitanika na kome bi se kompozicija primenjivala.
„Farmaceutski prihvatljiv nosač” upućuje na sastojak farmaceutske kompozicije koji nije aktivni sastojak i koji je netoksičan za ispitanika. Farmaceutski prihvatljiv nosač uključuje, ali nije ograničen na pufer, ekscipijens, stabilizator ili konzervans.
Kao što je ovde upotrebljeno, „lečenje” (i gramatičke varijacije, kao što je „lečiti”) odnosi se na kliničku intervenciju u pokušaju da se izmeni prirodni tok bolesti kod pojedinca koji se leči, i može se primenjivati ili radi profilakse ili tokom kliničke patologije. Poželjni efekti lečenja uključuju, bez ograničenja, sprečavanje pojave ili recidiva bolesti, ublažavanje simptoma, smanjenje svih direktnih ili indirektnih patoloških posledica bolesti, sprečavanje metastaze, usporavanje brzine napredovanja bolesti, poboljšavanje ili ublažavanje stanja bolesti, i remisiju ili poboljšanu prognozu. U nekim otelotvorenjima, imunokonjugati iz predmetnog pronalaska se primenjuju da odlože razvoj bolesti ili da uspore njeno napredovanje.
Mutantni polipeptid IL-2
Imunokonjugati prema ovom pronalasku sadrže mutantni polipeptid IL-2 koji ima povoljna svojstva za imunoterapiju. Konkretno, farmakološka svojstva IL-2 koja doprinose toksičnosti, ali nisu nužna za efikasnost IL-2, eliminišu se u mutantnom polipeptidu IL-2. Takvi mutantni polipeptidi IL-2 su detaljno opisani u WO 2012/107417, koji je ovde uključen kao referenca u celosti. Kao što je prethodno rečeno, različiti oblici receptora IL-2 sastoje se od različitih podjedinica i pokazuju različite afinitete za IL-2. Receptor IL-2 srednjeg afiniteta, koji se sastoji od β i γ receptorskih podjedinica, eksprimira se na efektorskim ćelijama u mirovanju, i dovoljan je za signalizaciju IL-2. Receptor IL-2 velikog afiniteta, koji dodatno sadrži α-podjedinicu receptora, uglavnom je eksprimiran na regulatornim T (Treg) ćelijama, kao i na aktiviranim efektorskim ćelijama u kojima njegovo angažovanje od strane IL-2 može da promoviše imunosupresiju posredovanu Tregćelijama, odnosno ćelijsku smrt izazvanu aktivacijom (AICD). Tako, bez želje da se vezujemo za teoriju, smanjenje ili ukidanje afiniteta IL-2 prema α-podjedinici receptora IL-2 treba da smanji IL-2 indukovanu negativnu regulaciju funkcije efektorskih ćelija pomoću regulatornih T ćelija i razvoj tolerancije tumora prema procesu AICD. Sa druge strane, održavanje afiniteta prema receptoru IL-2 srednjeg afiniteta treba da sačuva indukciju proliferacije i aktivaciju efektorskih ćelija poput NK i T ćelija
2
pomoću IL-2.
Mutantni polipeptid interleukina-2 (IL-2) koji se nalazi u imunokonjugatu prema pronalasku sadrži najmanje jednu mutaciju aminokiseline koja ukida ili smanjuje afinitet mutantnog polipeptida IL-2 prema α-podjedinici receptora IL-2 i čuva afinitet mutantnog polipeptida IL-2 prema receptoru IL-2 srednjeg afiniteta u poređenju sa polipeptidom IL-2 divljeg tipa.
Mutanti humanog IL-2 (hIL-2) sa smanjenim afinitetom prema CD25 mogu, na primer, biti generisani aminokiselinskom supstitucijom na poziciji aminokiselina 35, 38, 42, 43, 45 ili 72 ili njihovim kombinacijama (numeracija u odnosu na sekvencu humanog IL-2 SEQ ID NO: 19). Primeri za aminokiselinske supstitucije uključuju K35E, K35A, R38A, R38E, R38N, R38F, R38S, R38L, R38G, R38Y, R38W, F42L, F42A, F42G, F42S, F42T, F42Q, F42E, F42N, F42D, F42R, F42K, K43E, Y45A, Y45G, Y45S, Y45T, Y45Q, Y45E, Y45N, Y45D, Y45R, Y45K, L72G, L72A, L72S, L72T, L72Q, L72E, L72N, L72D, L72R i L72K. Određeni mutanti IL-2 korisni u imunokonjugatima iz pronalaska obuhvataju aminokiselinsku mutaciju na poziciji aminokiseline koja odgovara ostatku 42, 45 ili 72 humanog IL-2 ili njihovoj kombinaciji. U jednom otelotvorenju, navedena aminokiselinska mutacija je zamena aminokiselina izabrana iz grupe F42A, F42G, F42S, F42T, F42Q, F42E, F42N, F42D, F42R, F42K, Y45A, Y45G, Y45S, Y45T, Y45Q, Y45E, Y45N, Y45D, Y45R, Y45K, L72G, L72A, L72S, L72T, L72Q, L72E, L72N, L72D, L72R i L72K, konkretno supstitucija aminokiselina odabrana iz grupe F42A, Y45A i L72G. Ovi mutanti pokazuju suštinski sličan vezujući afinitet za IL-2 receptor srednjeg afiniteta i imaju značajno smanjeni afinitet prema α-podjedinici receptora IL-2 i receptora IL-2 visokog afiniteta u poređenju sa oblikom divljeg tipa mutanta IL-2.
Druge karakteristike korisnih mutanata mogu uključivatii sposobnost indukcije proliferacije T i/ili NK ćelija koje imaju receptor IL-2, sposobnost indukcije signalizacije IL-2 u T i/ili NK ćelijama koje imaju receptor IL-2, sposobnost stvaranja interferona (IFN)-γ kao sekundarnog citokina putem NK ćelija, smanjenu sposobnost indukcije razvoja sekundarnih citokina – posebno IL-10 i TNF-α – mononuklearnim ćelijama periferne krvi (PBMC), smanjenu sposobnost aktiviranja regulatornih T ćelija, smanjenu sposobnost indukcije apoptoze u T ćelijama i smanjeni profil toksičnosti in vivo.
Konkretni korisni mutantni polipeptidi IL-2 obuhvataju tri aminokiselinske mutacije koje ukidaju ili smanjuju afinitet mutantnog polipeptida IL-2 prema α-podjedinici receptora IL-2, ali čuvaju afinitet mutantnog polipeptida IL-2 prema receptoru IL-2 srednjeg afiniteta. U jednom aspektu otkrića, navedene tri aminokiselinske mutacije su na pozicijama koje
2
odgovaraju ostatku 42, 45 i 72 humanog IL-2. U jednom otelotvorenju, pomenute tri mutacije aminokiselina su supstitucije aminokiselina. U jednom otelotvorenju, pomenute tri aminokiselinske mutacije su supstitucije aminokiselina izabrane iz grupe F42A, F42G, F42S, F42T, F42Q, F42E, F42N, F42D, F42R, F42K, Y45A, Y45G, Y45S, Y45T, Y45Q, Y45E, Y45N, Y45D, Y45R, Y45K, L72G, L72A, L72S, L72T, L72Q, L72E, L72N, L72D, L72R i L72K. U konkretnom otelotvorenju, navedene tri aminokiselinske mutacije su aminokiselinske supstitucije F42A, Y45A i L72G (numeracija u odnosu na sekvencu humanog IL-2 SEQ ID NO: 19).
U određenim aspektima otkrića, pomenuta mutacija aminokiseline smanjuje afinitet mutantnog polipeptida IL-2 prema α-podjedinici IL-2 receptora najmanje 5 puta, konkretno najmanje 10 puta, još konkretnije najmanje 25 puta. U jednom aspektu otkrića, kada postoji više od jedne aminokiselinske mutacije koja smanjuje afinitet mutantnog polipeptida IL-2 prema α-podjedinici receptora IL-2, kombinacija ovih aminokiselinskih mutacija može smanjiti afinitet mutantnog polipeptida IL-2 prema α-podjedinici receptora IL-2 najmanje 30 puta, najmanje 50 puta ili čak najmanje 100 puta. U jednom aspektu otkrića, navedena aminokiselinska mutacija ili kombinacija aminokiselinskih mutacija ukida afinitet mutantnog polipeptida IL-2 prema α-podjedinici IL-2 receptora tako da se površinskom plazmonskom rezonancom ne može detektovati vezivanje.
Suštinski slično vezivanje za receptor srednjeg afiniteta, odnosno očuvanje afiniteta mutantnog IL-2 polipeptida prema navedenom receptoru, postiže se kada mutant IL-2 pokazuje više od oko 70% afiniteta oblika divljeg tipa mutanta IL-2 do receptora IL-2 srednjeg afiniteta. Mutanti IL-2 iz pronalaska mogu prikazati više od oko 80%, pa čak i više od oko 90% takvog afiniteta.
Smanjenje afiniteta IL-2 prema α-podjedinici receptora IL-2 u kombinaciji sa eliminacijom O-glikozilacije IL-2 dovodi do proteina IL-2 sa poboljšanim svojstvima. Na primer, eliminacija mesta O-glikozilacije dovodi do homogenijeg proizvoda kada je mutantni polipeptid IL-2 eksprimiran u ćelijama sisara kao što su CHO ili HEK ćelije.
Shodno tome, u određenim otelotvorenjima mutantni polipeptid IL-2 sadrži dodatnu aminokiselinsku mutaciju koja eliminiše mesto O-glikozilacije IL-2 na poziciji koja odgovara ostatku 3 humanog IL-2. U jednom otelotvorenju, pomenuta dodatna mutacija aminokiseline koja eliminiše mesto O-glikozilacije IL-2 na poziciji koja odgovara ostatku 3 humanog IL-2 je aminokiselinska supstitucija. Primerni za zamene aminokiselina uključuju T3A, T3G, T3Q, T3E, T3N, T3D, T3R, T3K i T3P. U konkretnom otelotvorenju, pomenuta dodatna aminokiselinska mutacija je aminokiselinska supstitucija T3A.
2
U određenim aspektima otkrića, mutantni polipeptid IL-2 je u suštini IL-2 molekul pune dužine. U određenim aspektima otkrića, mutantni polipeptid IL-2 je molekul humanog IL-2. U jednom aspektu otkrića, mutantni polipeptid IL-2 sadrži sekvencu SEQ ID NO: 19 sa najmanje jednom aminokiselinskom mutacijom koja ukida ili smanjuje afinitet mutantnog polipeptida IL-2 prema α-podjedinici receptora IL-2, ali zadržava afinitet mutantnog polipeptida IL-2 prema receptoru IL-2 srednjeg afiniteta, u poređenju sa polipeptidom IL-2 koji sadrži SEQ ID NO: 19 bez pomenute mutacije. U drugom aspektu otkrića, mutantni polipeptid IL-2 sadrži sekvencu SEQ ID NO: 29 sa najmanje jednom aminokiselinskom mutacijom koja ukida ili smanjuje afinitet mutantnog polipeptida IL-2 prema α-podjedinici receptora IL-2, ali zadržava afinitet mutantnog polipeptida IL-2 prema receptoru IL-2 srednjeg afiniteta, u poređenju sa polipeptidom IL-2 koji sadrži SEQ ID NO: 29 bez pomenute mutacije.
U konkretnom aspektu otkrića, mutantni polipeptid IL-2 može izazvati jedan ili više ćelijskih odgovora izabranih iz grupe koja se sastoji od: proliferacije u aktiviranoj T limfocitnoj ćeliji, diferencijacije u aktiviranoj T limfocitnoj ćeliji, citotoksične aktivnosti T ćelije (CTL), proliferacije u aktiviranoj B ćeliji, diferencijacije u aktiviranoj B ćeliji, proliferacije u ćeliji prirodnoj ubici (NK), diferencijacije u NK ćeliji, sekrecije citokina od strane aktivirane T ćelije ili NK ćelije i antitumorske toksičnosti NK/aktiviranih ubica limfocita (LAK).
U jednom aspektu otkrića, mutantni polipeptid IL-2 ima smanjenu sposobnost da indukuje signalizaciju IL-2 u regulatornim T ćelijama, u poređenju sa polipeptidom IL-2 divljeg tipa. U jednom otelotvorenju, mutantni IL-2 polipeptid manje indukuje smrt ćelije izazvanu aktivacijom (AICD) u T ćelijama, u poređenju sa IL-2 polipeptidom divljeg tipa. U jednom aspektu otkrića, mutantni polipeptid IL-2 ima smanjeni profil toksičnosti in vivo, u poređenju sa polipeptidom IL-2 divljeg tipa. U jednom aspektu otkrića, mutantni polipeptid IL-2 ima produženi poluživot u serumu, u poređenju sa polipeptidom IL-2 divljeg tipa.
Posebni mutantni polipeptid IL-2 koristan u pronalasku sadrži četiri aminokiselinske supstitucije na pozicijama koje odgovaraju ostacima 3, 42, 45 i 72 humanog IL-2. Specifične aminokiselinske supstitucije su T3A, F42A, Y45A i L72G. Kao što je prikazano u WO 2012/107417, pomenuti četvorostruko mutirani polipeptid IL-2 ne pokazuje uočljivo vezivanje za CD25, smanjenu sposobnost indukcije apoptoze u T ćelijama, smanjenu sposobnost indukcije IL-2 signalizacije u Tregćelijama i smanjen profil toksičnosti in vivo. Međutim, zadržava sposobnost da aktivira signalizaciju IL-2 u efektorskim ćelijama, indukuje proliferaciju efektorskih ćelija, i da generiše IFN-γ kao sekundarni citokin putem NK ćelija.
Pored toga, pomenuti mutantni polipeptid IL-2 poseduje dodatna pogodna svojstva, kao što je smanjena površinska hidrofobnost, dobra stabilnost i dobar prinos ekspresije, kako je
2
opisano u WO 2012/107417. Neočekivano, pomenuti mutantni polipeptid IL-2 takođe obezbeđuje produženi poluživot u serumu, u poređenju sa IL-2 divljeg tipa.
Korisni mutanti IL-2 iz pronalaska, pored mutacija u regionu IL-2 koji formira interfejs IL-2 sa CD25 ili mesto glikozilacije, takođe može imati jednu ili više mutacija u sekvenci aminokiselina van ovih regiona. Takve dodatne mutacije u humanom IL-2 mogu pružiti dodatne prednosti, kao što je povećana ekspresija ili stabilnost. Na primer, cistein na poziciji 125 može se zameniti neutralnom aminokiselinom kao što je serin, alanin, treonin ili valin, čime se dobijaju C125S IL-2, C125A IL-2, C125T IL-2 ili C125V IL-2, kako je opisano u U.S. patentu br. 4,518,584. Kao što je opisano u njemu, može se takođe izbrisati N-terminalni alaninski ostatak IL-2 koji daje takve mutante kao des1 C125S ili des1 C125A. Alternativno ili kao dopuna, mutant IL-2 može uključivati mutaciju u kojoj se metionin koji se tipično javlja na položaju 104 humanog IL-2 divljeg tipa zamenjuje neutralnom aminokiselinom kao što je alanin (videti U.S. Patent br.5,206,344). Dobijeni mutanti, npr. des-A1 M104A IL-2, des-A1 M104A C125S IL-2, M104A IL-2, M104A C125A IL-2, des-A1 M104A C125A IL-2 ili M104A C125S IL-2 (ovi i drugi mutanti mogu se naći u US patentu br.5,116,943 i u Weiger et al., Eur J Biochem 180, 295-300 (1989)) mogu se koristiti zajedno sa određenim mutacijama IL-2 koje su opisane u pronalasku.
Shodno tome, u određenim otelotvorenjima, mutantni polipeptid IL-2 sadrži dodatnu aminokiselinsku mutaciju na poziciji koja odgovara ostatku 125 humanog IL-2. U jednom otelotvorenju, pomenuta dodatna aminokiselinska mutacija je aminokiselinska supstitucija C125A.
Stručna osoba će moći da odredi koje dodatne mutacije mogu pružiti dodatne prednosti u svrhu pronalaska. Na primer, razumeće da mutacije aminokiselina u sekvenci IL-2 koje smanjuju ili ukidaju afinitet IL-2 prema receptoru IL-2 srednjeg afiniteta, kao što su D20T, N88R ili Q126D (videti npr. US 2007/0036752), možda nisu pogodne za uključivanje u mutantni polipeptid IL-2 u skladu sa pronalaskom.
U jednom otelotvorenju, mutantni polipeptid IL-2 sadrži ne više od 12, ne više od 11, ne više od 10, ne više od 9, ne više od 8, ne više od 7, ne više od 6 ili ne više od 5 aminokiselinskih mutacija u poređenju sa odgovarajućom sekvencom IL-2 divljeg tipa, npr. sekvencom humanog IL-2 SEQ ID NO: 19. U konkretnom otelotvorenju, mutantni polipeptid IL-2 ne sadrži više od 5 aminokiselinskih mutacija u poređenju sa odgovarajućom sekvencom IL-2 divljeg tipa, npr. sekvencom humanog IL-2 SEQ ID NO: 19.
U jednom otelotvorenju, mutantni polipeptid IL-2 sadrži sekvencu SEQ ID NO: 20. U jednom otelotvorenju, mutantni polipeptid IL-2 sastoji se od sekvence SEQ ID NO: 20.
2
Imunokonjugati
Imunokonjugati kako su ovde opisani sadrže IL-molekul i antitelo. Takvi imunokonjugati značajno povećavaju efikasnost terapije pomoću IL-2 direktnim ciljanjem IL-2, npr. u mikrookruženje tumora. Prema predmetnom pronalasku, antitelo sadržano u imunokonjugatu može biti celo antitelo ili imunoglobulin, ili njegov deo ili varijanta koji imaju biološku funkciju kao što je specifični afinitet za vezivanje antigena.
Opšte prednosti terapije imunokonjugatom su očigledne. Na primer, antitelo sadržano u imunokonjugatu prepoznaje epitop specifičan za tumor i dovodi do usmeravanja molekula imunokonjugata na mesto tumora. Shodno tome, visoke koncentracije IL-2 mogu biti isporučene u mikrookruženju tumora, što rezultira aktivacijom i proliferacijom različitih imunih efektorskih ćelija koje su ovde navedene, koristeći mnogo nižu dozu imunokonjugata nego što bi bilo potrebno za nekonjugovani IL-2. Štaviše, pošto primena IL-2 u obliku imunokonjugata dozvoljava niže doze samog citokina, potencijal za neželjene efekte IL-2 je ograničen i usmeravanje IL-2 na određeno mesto u telu pomoću imunokonjugata takođe može dovesti do smanjenja sistemskog izlaganja i time do manje neželjenih efekata nego što se dobija sa nekonjugovanim IL-2. Osim toga, povećani poluživot imunokonjugata u krvotoku u poređenju sa nekonjugovanim IL-2 doprinosi efikasnosti imunokonjugata. Međutim, ova karakteristika imunokonjugata IL-2 može ponovo pogoršati potencijalne neželjene efekte molekula IL-2: Zbog značajno dužeg cirkulišućeg poluživota imunokonjugata IL-2 u krvotoku u odnosu na nekonjugovani IL-2, povećana je verovatnoća da IL-2 ili drugi delovi molekula fuzionog proteina aktiviraju komponente koje su tipično prisutne u vaskulaturi. Isti problem se odnosi na druge fuzione proteine koji sadrže IL-2 spojen sa drugim delom kao što je Fc ili albumin, što dovodi do produženog poluživota IL-2 u krvotoku. Zbog toga je posebno pogodan imunokonjugat koji sadrži mutantni polipeptid IL-2, kao što je opisano ovde i u WO 2012/107417, sa smanjenom toksičnošću u poređenju sa oblicima IL-2 divljeg tipa.
Kao što je ovde prethodno opisano, usmeravanje IL-2 direktno na imunološke efektorske ćelije, a ne na tumorske ćelije, može biti korisno za imunoterapiju pomoću IL-2.
Shodno tome, pronalazak obezbeđuje mutantni polipeptid IL-2, kao što je gore prethodno opisano, i antitelo koje se vezuje za PD-1. U jednom otelotvorenju, mutantni polipeptid IL-2 i antitelo formiraju fuzioni protein, tj. mutantni polipeptid IL-2 deli peptidnu vezu sa antitelom. U nekim otelotvorenjima, antitelo sadrži Fc domen sastavljen od prve i druge podjedinice. U specifičnom otelotvorenju, mutantni polipeptid IL-2 je fuzionisan na svojoj amino-terminalnoj aminokiselini sa karboksi-terminalnom aminokiselinom jedne od podjedinica Fc domena, opciono preko peptida linkera. U nekim otelotvorenjima, antitelo je kompletno antitelo. U nekim otelotvorenjima, antitelo je molekul imunoglobulina, naročito molekul imunoglobulina IgG klase, posebno molekul imunoglobulina potklase IgG1. U jednom takvom obliku, mutantni polipeptid IL-2 deli amino-terminalnu peptidnu vezu sa jednim od teških lanaca imunoglobulina. U nekim otelotvorenjima, antitelo je fragment antitela. U nekim otelotvorenjima, antitelo je Fab molekul ili scFv molekul. U jednom otelotvorenju, antitelo je Fab molekul. U još jednom otelotvorenju, antitelo je scFv molekul. Imunokonjugat takođe može da sadrži više od jednog antitela. Kada se u imunokonjugatu nalazi više od jednog antitela, npr. prvo i drugo antitelo, svako antitelo može da bude nezavisno izabrano od različitih oblika antitela i fragmenata antitela. Na primer, prvo antitelo može da bude Fab molekul, a drugo antitelo može da bude scFv molekul. U određenom otelotvorenju, svako od pomenutog prvog i pomenutog drugog antitela je scFv molekul ili svako od pomenutog prvog i pomenutog drugog antitela je Fab molekul. U određenom otelotvorenju, svako od pomenutog prvog i pomenutog drugog antitela je Fab molekul. U jednom otelotvorenju, svako od pomenutog prvog i pomenutog drugog antitela se vezuje za PD-1.
Formati imunokonjugata
Primeri za formate imunokonjugata su opisani u PCT publikaciji br. WO 2011/020783, koja je ovde uključena referencom u celosti. Ovi imunokonjugati sadrže najmanje dva antitela. Shodno tome, u jednom otelotvorenju, imunokonjugat prema predmetnom pronalasku sadrži mutantni polipeptid IL-2 kao što je ovde opisano, i najmanje prvo i drugo antitelo. U posebnom otelotvorenju, pomenuto prvo i drugo antitelo su nezavisno izabrani iz grupe koja se sastoji od Fv molekula, posebno scFv molekula i Fab molekula. U specifičnom otelotvorenju, pomenuti mutantni polipeptid IL-2 deli amino- ili karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa navedenim prvim antitelom, a navedeno drugo antitelo deli amino- ili karboksi-terminalnu peptidnu vezu bilo sa i) mutantnim polipeptidom IL-2 ili ii) prvim antitelom. U posebnom otelotvorenju, imunokonjugat se u suštini sastoji od mutantnog polipeptida IL-2 i prvog i drugog antitela, posebno Fab molekula, spojenih pomoću jedne ili više sekvenci linkera. Ovakvi formati imaju prednost da se vezuju sa visokim afinitetom za ciljni antigen (PD-1), ali pružaju samo monomerno vezivanje za receptor IL-2, čime se izbegava ciljanje imunokonjugata na imunske ćelije koje sadrže receptor IL-2 na mestima različitim od ciljnog mesta. U posebnom otelotvorenju, mutantni polipeptid IL-2 deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa prvim antitelom, posebno prvim Fab molekulom, i dalje deli amino-terminalnu peptidnu vezu sa drugim antitelom, posebno drugim Fab molekulom. U drugom otelotvorenju, prvo antitelo, posebno prvi Fab molekul, deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa mutantnim polipeptidom IL-2, i dalje deli amino-terminalnu peptidnu vezu sa drugim antitelom, posebno drugim Fab
1
molekulom. U drugom otelotvorenju, prvo antitelo, posebno prvi Fab molekul, deli aminoterminalnu peptidnu vezu sa prvim mutantnim polipeptidom IL-2, i dalje deli karboksiterminalni peptid sa drugim antitelom, posebno drugim Fab molekulom. U posebnom otelotvorenju, mutantni polipeptid IL-2 deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa prvim varijabilnim regionom teškog lanca i dalje deli amino-terminalnu peptidnu vezu sa drugim varijabilnim regionom teškog lanca. U još jednom otelotvorenju, mutantni polipeptid IL-2 deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa prvim varijabilnim regionom lakog lanca i dalje deli amino-terminalnu peptidnu vezu sa drugim varijabilnim regionom lakog lanca. U još jednom otelotvorenju, prvi varijabilni region teškog ili lakog lanca spojen je karboksi-terminalnom peptidnom vezom sa mutantnim polipeptidom IL-2 i dalje je spojen amino-terminalnom peptidnom vezom sa drugim varijabilnim regionom teškog ili lakog lanca. U još jednom otelotvorenju, prvi varijabilni region teškog ili lakog lanca spojen je amino-terminalnom peptidnom vezom sa mutantnim polipeptidom IL-2 i dalje je spojen karboksi-terminalnom peptidnom vezom sa drugim varijabilnim regionom teškog ili lakog lanca. U jednom otelotvorenju, mutantni polipeptid IL-2 deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa prvim teškim ili lakim lancem Fab i dalje deli amino-terminalnu peptidnu vezu sa drugim teškim ili lakim lancem Fab. U još jednom otelotvorenju, prvi teški ili laki lanac Fab deli karboksiterminalnu peptidnu vezu sa mutantnim polipeptidom IL-2 i dalje deli amino-terminalnu peptidnu vezu sa drugim teškim ili lakim lancem Fab. U drugim otelotvorenjima, prvi teški ili laki lanac Fab deli amino-terminalnu peptidnu vezu sa mutantnim polipeptidom IL-2 i dalje deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa drugim teškim ili lakim lancem Fab. U jednom otelotvorenju, imunokonjugat sadrži mutantni polipeptid IL-2 koji deli amino-terminalnu peptidnu vezu sa jednim ili više scFv molekula i dalje deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa jednim ili više molekula scFv.
Posebno pogodni formati za imunokonjugate prema ovom pronalasku, međutim, sadrže molekul imunoglobulina kao antitelo. Takvi formati imunokonjugata su opisani u WO 2012/146628, koji je ovde uključen kao referenca u celosti.
Shodno tome, u posebnim otelotvorenjima, imunokonjugat sadrži mutantni polipeptid IL-2 kako je ovde opisan i molekul imunoglobulina koji se vezuje za PD-1, posebno molekul IgG, tačnije molekul IgG1. U jednom otelotvorenju, imunokonjugat sadrži ne više od jednog mutantnog polipeptida IL-2. U jednom otelotvorenju, molekul imunoglobulina je humani. U jednom otelotvorenju, molekul imunoglobulina sadrži humani konstantni region, npr. humani CH1, CH2, CH3 i/ili CL domen. U jednom otelotvorenju, imunoglobulin sadrži humani Fc domen, posebno Fc domen humanog IgG1. U jednom otelotvorenju, mutantni polipeptid IL-2
2
deli amino- ili karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa molekulom imunoglobulina. U jednom otelotvorenju, imunokonjugat se u suštini sastoji od mutantnog polipeptida IL-2 i molekula imunoglobulina, naročito molekula IgG, a posebno molekula IgG1, spojenog sa jednom ili više sekvenci linkera. U specifičnom otelotvorenju, mutantni polipeptid IL-2 je fuzionisan na svojoj amino-terminalnoj aminokiselini sa karboksi-terminalnom aminokiselinom jednog od teških lanaca imunoglobulina, opciono preko linker peptida.
Mutantni polipeptid IL-2 može biti fuzionisan sa antitelom direktno ili preko linker peptida, koji sadrži jednu ili više aminokiselina, tipično oko 2-20 aminokiselina. Linker peptidi su poznati u struci i ovde su opisani. Prikladni, neimunogeni linker peptidi uključuju, na primer, (G4S)n, (SG4)n, (G4S)nili G4(SG4)nlinker peptide, „n“ je uopšteno ceo broj od 1 do 10, tipično od 2 do 4. U jednom otelotvorenju, linker peptid ima dužinu od najmanje 5 aminokiselina, u jednom otelotvorenju dužinu od 5 do 100, u sledećem otelotvorenju od 10 do 50 aminokiselina. U posebnom otelotvorenju, linker peptid ima dužinu od 15 aminokiselina. U jednom otelotvorenju, linker peptid je (GxS)nili (GxS)nGm, gde je G=glicin, S=serin i (x=3, n= 3, 4, 5 ili 6, i m=0, 1, 2 ili 3) ili (x=4, n=2, 3, 4 ili 5 i m= 0, 1, 2 ili 3), u jednom otelotvorenju, x=4 i n=2 ili 3, u sledećem otelotvorenju x=4 i n=3. U posebnom otelotvorenju, linker peptid je (G4S)3(SEQ ID NO: 21). U jednom otelotvorenju, linker peptid ima aminokiselinsku sekvencu (ili se od nje sastoji) SEQ ID NO: 21.
U posebnom otelotvorenju, imunokonjugat sadrži mutantni IL-2 molekul i molekul imunoglobulina, posebno molekul imunoglobulina potklase IgG1, koji se vezuje za PD-1, pri čemu je mutantni molekul IL-2 fuzionisan na svojoj amino-terminalnoj aminokiselini sa karboksi-terminalnom aminokiselinom jednog od teških lanaca imunoglobulina preko linker peptida SEQ ID NO: 21.
U posebnom otelotvorenju, imunokonjugat sadrži mutantni molekul IL-2 i antitelo koje se vezuje za PD-1, pri čemu antitelo sadrži Fc domen, posebno Fc domen humanog IgG1, sastavljen od prve i druge podjedinice, i mutantni molekul IL-2 je fuzionisan na svojoj aminoterminalnoj aminokiselini sa karboksi-terminalnom aminokiselinom jedne od podjedinica Fc domena preko linker peptida SEQ ID NO: 21.
PD-1 antitela
Antitelo sadržano u imunokonjugatu iz ovog pronalaska vezuje se za PD-1, posebno za humani PD-1, i može usmeriti mutantni polipeptid IL-2 na ciljno mesto gde je PD-1 eksprimiran, posebno na T ćeliju koja eksprimira PD-1, na primer, povezan sa tumorom.
Pogodna PD-1 antitela koja mogu da se koriste u imunokonjugatu iz pronalaska su opisana u WO 2017/055443 A1.
Imunokonjugat iz ovog pronalaska može da sadrži dva ili više antitela, koja mogu da se vezuju za iste ili različite antigene. Međutim, u posebnim otelotvorenjima, svako od ovih antitela se vezuje za PD-1. U jednom otelotvorenju, antitelo sadržano u imunokonjugatu iz pronalaska je monospecifično. U posebnom otelotvorenju, imunokonjugat sadrži jedno, monospecifično antitelo, posebno monospecifični molekul imunoglobulina.
Antitelo može biti bilo koji tip antitela ili njegov fragment koji zadržava specifično vezivanje za PD-1, posebno za humani PD-1. Fragmenti antitela uključuju, ali nisu ograničeni na, Fv molekule, scFv molekul, Fab molekul i F(ab')2molekule. U posebnim otelotvorenjima, međutim, antitelo je antitelo pune dužine. U nekim otelotvorenjima, antitelo sadrži Fc domen, sastavljen od prve i druge podjedinice. U nekim otelotvorenjima, antitelo je imunoglobulin, posebno klase IgG, konkretnije imunoglobulin potklase IgG1.
U nekim otelotvorenjima, antitelo je monoklonsko antitelo.
U nekim otelotvorenjima, antitelo sadrži HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1, HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 2, HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 3, FR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 7 na pozicijama 71-73 prema Kabatovoj numeraciji, HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 4, HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 5, i HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 6.
U nekim otelotvorenjima, antitelo sadrži (a) varijabilni region teškog lanca (VH) koji sadrži HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1, HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 2, HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 3, i FR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 7 na pozicijama 71-73 prema Kabatovoj numeraciji, i (b) varijabilni region lakog lanca (VL) koji sadrži HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 4, HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 5, i HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 6. U nekim otelotvorenjima, varijabilni region teškog i/ili lakog lanca je humanizovani varijabilni region. U nekim otelotvorenjima, varijabilni region teškog i/ili lakog lanca sadrži humane regione okvira (FR).
U nekim otelotvorenjima, antitelo sadrži HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 8, HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 9, HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 10 , HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 11, HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 12, i HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 13.
U nekim otelotvorenjima, antitelo sadrži (a) varijabilni region teškog lanca (VH) koji
4
sadrži HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 8, HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 9 i HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 10, i (b) varijabilni region lakog lanca (VL) koji sadrži HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 11, HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 12, i HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 13. U nekim otelotvorenjima, varijabilni region teškog i/ili lakog lanca je humanizovani varijabilni region. U nekim otelotvorenjima, varijabilni region teškog i/ili lakog lanca sadrži humane regione okvira (FR).
U nekim otelotvorenjima, antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca (VH) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 14. U nekim otelotvorenjima, antitelo sadrži varijabilni region lakog lanca (VL) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci izabranoj iz grupe koju čine SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, i SEQ ID NO: 18. U nekim otelotvorenjima, antitelo sadrži (a) varijabilni region teškog lanca (VH) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 14, i (b) varijabilni region lakog lanca (VL) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci izabranoj iz grupe koju čine SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, i SEQ ID NO: 18.
U posebnom otelotvorenju, antitelo sadrži (a) varijabilni region teškog lanca (VH) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 14 i (b) varijabilni region lakog lanca (VL) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 15.
U nekim primerima izvođenja, antitelo je humanizovano antitelo. U jednom otelotvorenju, antitelo je molekul imunoglobulina koji sadrži humani konstantni region, posebno molekul imunoglobulina klase IgG koji sadrži humani CH1, CH2, CH3 i/ili CL domen. Primeri sekvenci humanih konstantnih domena dati su u SEQ ID NO: 31 i 32 (humani kapa, odnosno lambda CL domen) i SEQ ID NO: 33 (CH1-CH2-CH3 konstantni domeni teškog lanca humanog IgG1). U nekim otelotvorenjima, antitelo sadrži konstantni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 31 ili SEQ ID NO: 32, posebno aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 31. U nekim otelotvorenjima, antitelo sadrži konstantni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 33. Posebno, konstantni region teškog lanca može da sadrži mutacije aminokiselina u Fc domenu kao što je ovde opisano.
Fc domen
U posebnim otelotvorenjima, antitelo sadržano u imunokonjugatima prema pronalasku obuhvata Fc domen, sastavljen od prve i druge podjedinice. Fc domen antitela se sastoji od para polipeptidnih lanaca koji sadrže domene teškog lanca molekula imunoglobulina. Na primer, Fc domen molekula imunoglobulina G (IgG) je dimer, čija svaka podjedinica sadrži konstantne domene IgG teškog lanca CH2 i CH3. Dve podjedinice Fc domena su sposobne za stabilno povezivanje jedne sa drugom. U jednom otelotvorenju, imunokonjugat iz pronalaska ne sadrži više od jednog Fc domena. U jednom otelotvorenju, Fc domen antitela koji je sadržan u imunokonjugatu je Fc domen IgG. U konkretnom otelotvorenju, Fc domen je Fc domen IgG1. U drugom otelotvorenju, Fc domen je Fc domen IgG4. U konkretnijem otelotvorenju, Fc domen je Fc domen IgG4koji sadrži aminokiselinsku supstituciju u položaju S228 (numeracija prema Kabatovom EU indeksu), konkretno aminokiselinsku supstituciju S228P. Ova aminokiselinska supstitucija umanjuje in vivo razmenu Fab kraka IgG4antitela (vidi Stubenrauch et al., Drug Metabolism and Disposition 38, 84-91 (2010)). U daljem konkretnom otelotvorenju, Fc domen je humani Fc domen. U još konkretnijem, otelotvorenju, Fc domen je humani Fc domen IgG1. Primer sekvence humanog IgG1Fc regiona je dat u SEQ ID NO: 30.
Modifikacije Fc domena koje podstiču heterodimerizaciju
Imunokonjugati prema pronalasku sadrže mutantni polipeptid IL-2, posebno jedan (ne više od jednog) mutantni polipeptid IL-2, fuzionisan sa jednom ili drugom od dve podjedinice Fc domena, dakle dve podjedinice Fc domena su tipično sadržane u dva neidentična polipeptidna lanca. Rekombinantna koekspresija ovih polipeptida i naknadna dimerizacija dovode do nekoliko mogućih kombinacija dva polipeptida. Da bi se poboljšao prinos i čistoća imunokonjugata u rekombinantnoj proizvodnji, biće korisno da se u Fc domen antitela uvede modifikacija koja promoviše asocijaciju željenih polipeptida.
Shodno tome, u posebnim otelotvorenjima, Fc domen antitela sadržan u imunokonjugatu prema pronalasku sadrži modifikaciju koja promoviše asocijaciju prve i druge podjedinice Fc domena. Mesto najveće proteinsko-proteinske interakcije između dve podjedinice Fc domena humanog IgG nalazi se u CH3 domenu Fc domena. Tako se u jednom otelotvorenju pomenuta modifikacija nalazi u CH3 domenu Fc domena.
Postoji nekoliko pristupa za modifikacije u CH3 domenu Fc domena kako bi se sprovela heterodimerizacija, koji su dobro opisani npr. u WO96/27011, WO98/050431, EP1870459, WO2007/110205, WO2007/147901, WO2009/089004, WO2010/129304, WO2011/90754, WO2011/143545, WO2012058768, WO2013157954, WO2013096291. Tipično, u svim takvim pristupima, i CH3 domen prve podjedinice Fc domena i CH3 domen druge podjedinice Fc domena su konstruisani na komplementaran način, tako da svaki CH3 domen (ili teški lanac koji ga sadrži) više ne može da se homodimerizuje sam sa sobom, već je primoran da se heterodimerizuje sa komplementarno konstruisanim drugim CH3 domenom (tako da se prvi i drugi CH3 domen heterodimerizuju i ne formiraju se homodimeri između dva prva ili dva druga CH3 domena).
U konkretnom primeru otelotvorenja, pomenuta modifikacija koja promoviše povezivanje prve i druge podjedinice Fc domena je takozvana modifikacija „dugme u rupici“, koja sadrži modifikaciju „dugmeta“ u jednoj od dve podjedinice Fc domena i modifikaciju „rupice“ u drugoj od dve podjedinice Fc domena.
Tehnologija „dugme u rupici” je opisana npr. u US5.731.168; US7,695,936; Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996) i Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001). Po pravilu, ova metoda podrazumeva uvođenje izbočine („dugme“) na interfejsu prvog polipeptida i odgovarajuće šupljine („rupice“) na interfejsu drugog polipetida, tako da se izbočina može uklopiti u šupljinu da bi se podstaklo formiranje heterodimera i sprečilo nastajanje homodimera. Izbočine su napravljene zamenom malih bočnih lanaca aminokiselina sa interfejsa prvog polipeptida većim bočnim lancima (npr. tirozinom ili triptofanom). Odgovarajuće šupljine, iste ili slične veličine kao izbočine, stvaraju se na interfejsu drugog polipeptida, zamenom velikih bočnih lanaca aminokiselina manjim (npr. alaninom ili treoninom).
Shodno tome, u posebnom otelotvorenju, u CH3 domenu prve podjedinice Fc domena antitela sadržanog u imunokonjugatu, aminokiselinski ostatak je zamenjen aminokiselinskim ostatkom koji ima veći volumen bočnog lanca, čime se stvara izbočina unutar CH3 domena prve podjedinice koja može da se uklopi u šupljinu unutar CH3 domena druge podjedinice, a u CH3 domenu druge podjedinice Fc domena jedan aminokiselinski ostatak je zamenjen aminokiselinskim ostatkom koji ima manji volumen bočnog lanca, čime se stvara šupljina unutar CH3 domena druge podjedinice unutar koje se može uklopiti izbočina u CH3 domenu prve podjedinice.
Poželjno je da navedeni aminokiselinski ostatak koji ima veći volumen bočnog lanca bude izabran iz grupe koja se sastoji od arginina (R), fenilalanina (F), tirozina (Y) i triptofana (W).
Poželjno je da navedeni aminokiselinski ostatak koji ima manji volumen bočnog lanca bude izabran iz grupe koja se sastoji od alanina (A), serina (S), treonina (T) i valina (V).
Izbočina i šupljina se mogu napraviti izmenom nukleinske kiseline koja kodira polipeptide, npr. mutagenezom specifičnom za lokaciju, ili sintezom peptida.
U specifičnom otelotvorenju, u CH3 domenu prve podjedinice Fc domene (podjedinica „dugmeta“) treoninski ostatak u položaju 366 zamenjen je triptofanskim ostatkom (T366W), a u CH3 domenu druge podjedinice Fc domena (podjedinica „rupice“) tirozinski ostatak u položaju 407 zamenjen je ostatkom valina (Y407V). U jednom otelotvorenju, u drugoj podjedinici Fc domena dodatno je treoninski ostatak u položaju 366 zamenjen serinskim ostatkom (T366S) i leucinski ostatak u položaju 368 zamenjen je alaninskim ostatkom (L368A) (numeracija prema Kabatovom EU indeksu).
U još jednom otelotvorenju, u prvoj podjedinici Fc domena dodatno je serinski ostatak na poziciji 354 zamenjen cisteinskim ostatkom (S354C), ili je ostatak glutaminske kiseline na poziciji 356 zamenjen cisteinskim ostatkom (E356C) (posebno serinski ostatak na poziciji 354 je zamenjen ostatkom cisteina), a u drugoj podjedinici Fc domena dodatno je ostatak tirozina na poziciji 349 zamenjen cisteinskim ostatkom (Y349C) (numeracije prema Kabatovom EU indeksu). Uvođenje ova dva ostatka cisteina dovodi do stvaranja disulfidnog mosta između dve podjedinice Fc domena, što dodatno stabilizuje dimer (Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)).
U posebnom otelotvorenju, prva podjedinica Fc domena sadrži aminokiselinske supstitucije S354C i T366W, a druga podjedinica Fc domena sadrži aminokiselinske supstitucije Y349C, T366S, L368A i Y407V (numeracija prema Kabatovom EU indeksu).
U nekim otelotvorenjima, druga podjedinica Fc domena dodatno sadrži aminokiselinske supstitucije H435R i Y436F (numerisanje prema Kabatovom EU indeksu).
U posebnom otelotvorenju, mutantni IL-2 polipeptid je fuzionisan (opciono preko linker peptida ) sa prvom podjedinicom Fc domena (koja sadrži modifikaciju „dugme“). Bez želje da se vežemo za teoriju, fuzija mutantnog IL-2 polipeptida sa podjedinicom Fc domena koja sadrži dugme će (dodatno) smanjiti stvaranje imunokonjugata koji sadrže dva mutantna IL-2 polipeptida (sterni sudar dva polipeptida koji sadrže dugme).
Ostale tehnike CH3-modifikacije za sprovođenje heterodimerizacije su razmatrane kao alternative prema pronalasku, i opisane su npr. u WO96/27011, WO98/050431, EP1870459, WO2007/110205, WO2007/147901, WO2009/089004, WO2010/129304, WO2011/90754, WO2011/143545, WO2012/058768, WO2013/157954, WO2013/096291.
U jednom otelotvorenju, alternativno se koristi heterodimerizacioni pristup opisan u EP 1870459. Ovaj pristup se zasniva na uvođenju naelektrisanih aminokiselina sa suprotnim naelektrisanjima na specifičnim aminokiselinskim položajima u interfejs CH3/CH3 domena između dve podjedinice Fc domena. Jedno poželjno otelotvorenje za antitelo sadržano u imunokonjugatu iz pronalaska su aminokiselinske mutacije R409D; K370E u jednom od dva CH3 domena (Fc domena) i aminokiselinske mutacije D399K; E357K u drugom CH3 domenu Fc domena (numeracija prema Kabatovom EU indeksu).
U još jednom otelotvorenju, antitelo sadržano u imunokonjugatu iz pronalaska obuhvata aminokiselinsku mutaciju T366W u CH3 domenu prve podjedinice Fc domena i aminokiselinske mutacije T366S, L368A, Y407V u CH3 domenu druge podjedinice Fc domena, i dodatno aminokiselinske mutacije R409D; K370E u CH3 domenu prve podjedinice Fc domena i aminokiselinske mutacije D399K; E357K u CH3 domenu druge podjedinice Fc domena (numeracije prema Kabatovom EU indeksu).
U još jednom otelotvorenju, antitelo sadržano u imunokonjugatu iz pronalaska sadrži aminokiselinske mutacije S354C, T366W u CH3 domenu prve podjedinice Fc domena i aminokiselinske mutacije Y349C, T366S, L368A, Y407V u CH3 domenu druge podjedinice Fc domena, ili pomenuto antitelo sadrži aminokiselinske mutacije Y349C, T366W u CH3 domenu prve podjedinice Fc domena i aminokiselinske mutacije S354C, T366S, L368A, Y407V u CH3 domenima druge podjedinice Fc domena, i dodatno aminokiselinske mutacije R409D; K370E u CH3 domenu prve podjedinice Fc domena i aminokiselinske mutacije D399K; E357K u CH3 domenu druge podjedinice Fc domena (sve numeracije prema Kabatovom EU indeksu).
U jednom otelotvorenju, alternativno se koristi heterodimerizacioni pristup opisan u WO 2013/157953. U jednom otelotvorenju, prvi CH3 domen sadrži aminokiselinsku mutaciju T366K, a drugi CH3 domen sadrži aminokiselinsku mutaciju L351D (numeracija prema Kabatovom EU indeksu). U daljem otelotvorenju, prvi CH3 domen sadrži još jednu aminokiselinsku mutaciju L351K. U daljem otelotvorenju, drugi CH3 domen dalje sadrži aminokiselinsku mutaciju izabranu od Y349E, Y349D i L368E (poželjno L368E) (numeracija prema Kabatovom EU indeksu).
U jednom otelotvorenju, alternativno se koristi heterodimerizacioni pristup opisan u WO 2012/058768. U jednom otelotvorenju, prvi CH3 domen sadrži aminokiselinske mutacije L351Y, Y407A, i drugi CH3 domen sadrži aminokiselinske mutacije T366A, K409F. U daljem otelotvorenju, drugi CH3 domen sadrži dodatnu aminokiselinsku mutaciju na položaju T411, D399, S400, F405, N390, ili K392, npr. odabranu od a) T411N, T411R, T411Q, T411K, T411D, T411E ili T411W, b) D399R, D399W, D399Y ili D399K, c) S400E, S400D, S400R, ili S400K, d) F405I, F405M, F405T, F405S, F405V ili F405W, e) N390R, N390K ili N390D, f) K392V, K392M, K392R, K392L, K392F ili K392E (numeracija prema Kabatovom EU indeksu). U daljem otelotvorenju, prvi CH3 domen sadrži aminokiselinske mutacije L351Y, Y407A, a drugi CH3 domen sadrži aminokiselinske mutacije T366V, K409F. U daljem otelotvorenju, prvi CH3 domen sadrži aminokiselinsku mutaciju Y407A, a drugi CH3 domen sadrži aminokiselinske mutacije T366A, K409F. U daljem otelotvorenju, drugi CH3 domen dalje sadrži aminokiselinske mutacije K392E, T411E, D399R i S400R (numeracija prema Kabatovom EU indeksu).
U jednom otelotvorenju, heterodimerizacioni pristup opisan u WO 2011/143545 koristi se alternativno, npr. sa aminokiselinskom modifikacijom u položaju izabranom iz grupe koja se sastoji od 368 i 409 (numeracija prema Kabatovom EU indeksu).
U jednom otelotvorenju, alternativno se koristi heterodimerizacioni pristup opisan u WO 2011/090762, koji takođe koristi gore opisanu tehnologiju dugmeta u rupici. U jednom otelotvorenju, prvi CH3 domen sadrži aminokiselinsku mutaciju T366W, a drugi CH3 domen sadrži aminokiselinsku mutaciju Y407A. U jednom otelotvorenju, prvi CH3 domen sadrži aminokiselinsku mutaciju T366Y, a drugi CH3 domen sadrži aminokiselinsku mutaciju Y407T (numeracija prema Kabatovom EU indeksu).
U jednom otelotvorenju, antitelo sadržano u imunokonjugatu ili njegovom Fc domenu je potklase IgG2i alternativno se koristi pristup heterodimerizacije opisan u WO 2010/129304.
U alternativnom otelotvorenju, modifikacija koja podstiče povezivanje prve i druge podjedinice Fc domena sadrži modifikaciju koja posreduje u elektrostatičkim efektima upravljanja, npr. kao što je opisano u publikaciji PCT WO 2009/089004. Po pravilu, ovaj postupak podrazumeva zamenu jednog ili više aminokiselinskih ostataka na interfejsu dve podjedinice Fc domena naelektrisanim aminokiselinskim ostacima, tako da formiranje homodimera postaje elektrostatički nepovoljno, a heterodimerizacija elektrostatički povoljna. U jednom takvom otelotvorenju, prvi CH3 domen uključuje aminokiselinsku supstituciju K392 ili N392 sa negativno naelektrisanom aminokiselinom (npr. glutaminska kiselina (E), ili asparaginska kiselina (D), poželjno K392D ili N392D), i drugi CH3 domen sadrži aminokiselinsku supstituciju D399, E356, D356 ili E357 sa pozitivno naelektrisanom aminokiselinom (npr. lizin (K) ili arginin (R), poželjno D399K, E356K, D356K, ili E357K, i još poželjnije D399K i E356K). U daljem otelotvorenju, prvi CH3 domen dalje sadrži aminokiselinsku supstituciju K409 ili R409 sa negativno naelektrisanom aminokiselinom (npr. glutaminska kiselina (E), ili asparaginska kiselina (D), poželjno K409D ili R409D). U daljem otelotvorenju, prvi CH3 domen dodatno ili alternativno sadrži aminokiselinsku supstituciju K439 i/ili K370 sa negativno naelektrisanom aminokiselinom (npr. glutaminska kiselina (E), ili asparaginska kiselina (D)) (sve numeracije prema Kabatovom EU indeksu).
U još jednom otelotvorenju, alternativno se koristi heterodimerizacioni pristup opisan
4
u WO 2007/147901. U jednom otelotvorenju, prvi CH3 domen sadrži aminokiselinske mutacije K253E, D282K i K322D, i drugi CH3 domen sadrži aminokiselinske mutacije D239K, E240K i K292D (numeracije prema Kabatovom EU indeksu).
U još jednom otelotvorenju, heterodimerizacioni pristup opisan u WO 2007/110205 može se koristiti alternativno.
U jednom otelotvorenju, prva podjedinica Fc domena sadrži aminokiselinske supstitucije K392D i K409D, a druga podjedinica Fc domena uključuje aminokiselinske supstitucije D356K i D399K (numeracija prema Kabatovom EU indeksu).
Modifikacije Fc domena koje smanjuju vezivanje Fc receptora i/ili efektorsku funkciju Fc domen daje imunokonjugatu povoljne farmakokinetičke osobine, uključujući i dugotrajni poluživot u serumu koji doprinosi dobroj akumulaciji u ciljnom tkivu i povoljnom odnosu distribucije tkivo-krv. Istovremeno, može dovesti do nepoželjnog ciljanja imunokonjugata na ćelije koje eksprimiraju Fc receptore, a ne na željene ćelije koje nose antigene. Štaviše, koaktivacija Fc receptorskih puteva signalizacije može dovesti do otpuštanja citokina koje, u kombinaciji sa IL-2 polipeptidom i dugim poluživotom imunokonjugata, dovodi do prekomerne aktivacije receptora citokina i teških neželjenih efekata na sistemsku primenu. U skladu s tim, opisani su konvencionalni imunokonjugati IgG-IL-2 koji su povezani sa infuzionim reakcijama (videti npr. King et al., J Clin Oncol 22, 4463-4473 (2004)).
U skladu sa ovim, u posebnim otelotvorenjima, Fc domen antitela sadržanog u imunokonjugatu prema pronalasku pokazuje smanjeni afinitet vezivanja za Fc receptor i/ili smanjenu efektorsku funkciju, u odnosu na Fc domen nativnog IgG1. U jednom takvom otelotvorenju, Fc domen (ili antitelo koje sadrži navedeni Fc domen) pokazuje manje od 50%, poželjno manje od 20%, poželjnije manje od 10% i najpoželjnije manje od 5% afiniteta vezivanja za Fc receptor, u poređenju sa Fc domenom nativnog IgG1(ili antitelom koje sadrži Fc domen nativnog IgG1), i/ili manje od 50%, poželjno manje od 20%, poželjnije manje od 10% i najpoželjnije manje od 5% efektorske funkcije, u poređenju sa Fc domenom nativnog IgG1(ili antitelom koje sadrži Fc domen nativnog IgG1). U jednom otelotvorenju, domen Fc domena (ili antitelo koje sadrži navedeni Fc domen) suštinski se ne vezuje za Fc receptor i/ili ne indukuje efektorsku funkciju. U konkretnom otelotvorenju, Fc receptor je Fcγ receptor. U jednom otelotvorenju, Fc receptor je humani Fc receptor. U jednom otelotvorenju, Fc receptor je aktivirajući Fc receptor. U konkretnom otelotvorenju, Fc receptor je aktivirajući humani Fcγ receptor, konkretnije humani FcγRIIIa, FcγRI ili FcγRIIa, najkonkretnije humani FcγRIIIa. U jednom otelotvorenju, efektorska funkcija je jedna ili više njih izabranih iz grupe koja se sastoji od CDC, ADCC, ADCP i sekrecije citokina. U konkretnom otelotvorenju, efektorska funkcija je ADCC. U jednom otelotvorenju, domen Fc domena pokazuje suštinski sličan afinitet vezivanja za neonatalni Fc receptor (FcRn) u poređenju sa domenom Fc domena nativnog IgG1. Suštinski slično vezivanje za FcRn se postiže kada Fc domen (ili antitelo koje sadrži pomenuti Fc domen) pokazuje više od oko 70%, posebno više od oko 80%, tačnije više od oko 90% afiniteta vezivanja Fc domena nativnog IgG1(ili antitelo koje sadrži Fc domen nativnog IgG1) za FcRn.
U određenim otelotvorenjima, Fc domen je konstruisan tako da ima smanjeni afinitet vezivanja za Fc receptor i/ili redukovanu efektorsku funkciju, u poređenju sa nekonstruisanim Fc domenom. U konkretnim otelotvorenjima, Fc domen antitela sadržan u imunokonjugatu sadrži jednu ili više aminokiselinskih mutacija koje smanjuju afinitet vezivanja Fc domena za Fc receptor i/ili efektorsku funkciju. Najčešće su jedna ili više aminokiselinskih mutacija prisutne u svakoj od dve podjedinice Fc domena. U jednom otelotvorenju, aminokiselinska mutacija smanjuje afinitet vezivanja Fc domena za Fc receptor. U jednom otelotvorenju, aminokiselinska mutacija smanjuje afinitet vezivanja Fc domena za Fc receptor najmanje 2 puta, najmanje 5 puta ili najmanje 10 puta. U otelotvorenjima gde postoji više od jedne aminokiselinske mutacije koja smanjuje afinitet vezivanja Fc domena za Fc receptor, kombinacija ovih aminokiselinskih mutacija može smanjiti afinitet vezivanja Fc domena za Fc receptor najmanje 10 puta, najmanje 20 puta ili čak najmanje 50 puta. U jednom otelotvorenju, antitelo koje sadrži konstruisani Fc domen pokazuje manje od 20%, naročito manje od 10%, posebno manje od 5% afiniteta vezivanja za Fc receptor u poređenju sa antitelom koje sadrži nekonstruisani Fc domen. U konkretnom otelotvorenju, Fc receptor je Fcγ receptor. U nekim otelotvorenjima, Fc receptor je humani Fc receptor. U nekim otelotvorenjima, Fc receptor je aktivirajući Fc receptor. U konkretnom otelotvorenju, Fc receptor je aktivirajući humani Fcγ receptor, konkretnije humani FcγRIIIa, FcγRI ili FcγRIIa, najkonkretnije humani FcγRIIIa. Poželjno je da vezivanje za svaki od ovih receptora bude smanjeno. U nekim otelotvorenjima, afinitet vezivanja za komponentu komplementa, posebno afinitet vezivanja za C1q, takođe je smanjen. U jednom otelotvorenju, afinitet vezivanja za neonatalni Fc receptor (FcRn) nije smanjen. Suštinski slično vezivanje za FcRn, tj. očuvanje afiniteta vezivanja Fc domena prema navedenom receptoru, postiže se kada Fc domen (ili antitelo koje sadrži navedeni Fc domen) ima više od oko 70% afiniteta vezivanja nekonstruisanog oblika Fc domena (ili antitela koje sadrži pomenuti nekonstruisani oblik Fc domena) za FcRn. Fc domen, ili antitelo sadržano u imunokonjugatu iz pronalaska koji sadrži navedeni Fc domen, može da pokazuje više od oko 80%, pa čak i više od oko 90% takvog afiniteta. U određenim otelotvorenjima, Fc domen antitela koji se nalazi u imunokonjugatu je konstruisan tako da ima smanjenu efektorsku funkciju, u poređenju sa nekonstruisanim Fc domenom. Smanjena efektorska funkcija može da obuhvata, ali nije ograničena na, jednu ili više od sledećih stvari: smanjenu citotoksičnost zavisnu od komplementa (CDC), smanjenu ćelijsku citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC), smanjenu ćelijsku fagocitozu zavisnu od antitela (ADCP), smanjenu sekreciju citokina, smanjeno preuzimanje antigena posredstvom imunog kompleksa od strane antigen prezentujućih ćelija, smanjeno vezivanje za NK ćelije, smanjeno vezivanje za makrofage, smanjeno vezivanje za monocite, smanjeno vezivanje za polimorfonuklearne ćelije, smanjenu direktnu signalizaciju koja indukuje apoptozu, smanjeno unakrsno povezivanje antitela vezanih za cilj, smanjenu zrelost dendritskih ćelija, ili smanjen prajming T ćelija. U jednom otelotvorenju, smanjena efektorska funkcija je jedna ili više izabranih iz grupe u kojoj se nalazi smanjena CDC, smanjena ADCC, smanjena ADCP i smanjena sekrecija citokina. U jednom konkretnom otelotvorenju, smanjena efektorska funkcija je smanjena ADCC. U jednom otelotvorenju, smanjena ADCC je manja od 20% ADCC indukovane nekonstruisanim Fc domenom (ili antitelom koje sadrži nekonstruisani Fc domen).
U jednom otelotvorenju, aminokiselinska mutacija koja smanjuje afinitet vezivanja Fc domena za Fc receptor i/ili efektorsku funkciju je aminokiselinska supstitucija. U jednom otelotvorenju, Fc domen sadrži aminokiselinsku supstituciju u položaju izabranom iz grupe od E233, L234, L235, N297, P331 i P329 (numeracija prema Kabatovom EU indeksu). U specifičnijom otelotvorenju, Fc domen sadrži aminokiselinsku supstituciju u položaju izabranom iz grupe L234, L235 i P329 (numeracija prema Kabatovom EU indeksu). U nekim otelotvorenjima, Fc domen sadrži aminokiselinske supstitucije L234A i L235A (numeracija prema Kabatovom EU indeksu). U jednom takvom otelotvorenju, Fc domen je Fc domen IgG1, konkretno Fc domen humanog IgG1. U jednom otelotvorenju, Fc domen sadrži aminokiselinsku supstituciju u položaju P329. U konkretnijem primeru otelotvorenja, aminokiselinska supstitucija je P329A ili P329G, naročito P329G (numeracija prema Kabatovom EU indeksu). U jednom otelotvorenju, Fc domen sadrži aminokiselinsku supstituciju u položaju P329 i drugu aminokiselinsku supstituciju u položaju izabranom od E233, L234, L235, N297 i P331 (numeracija prema Kabatovom EU indeksu). U još konkretnijem otelotvorenju, dodatna aminokiselinska supstitucija je E233P, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D ili P331S. U posebnom primeru otelotvorenja, Fc domen obuhvata aminokiselinske supstitucije na položajima P329, L234 i L235 (numeracija prema Kabatovom EU indeksu). U konkretnijim otelotvorenjima, Fc domen obuhvata aminokiselinske mutacije L234A, L235A i P329G („P329G LALA“, „PGLALA“ ili „LALAPG“). Konkretno, u određenim otelotvorenjima, svaka podjedinica Fc domena sadrži aminokiselinske supstitucije
4
L234A, L235A i P329G (numeracija prema Kabatovom EU indeksu), tj. u svakoj od prve i druge podjedinice Fc domena, leucinski ostatak na poziciji 234 je zamenjen alaninskim ostatkom (L234A), leucinski ostatak na poziciji 235 je zamenjen alaninskim ostatkom (L235A), a prolinski ostatak na poziciji 329 zamenjen je glicinskim ostatkom (P329G) (numeracija prema Kabatovom EU indeksu). U jednom takvom otelotvorenju, Fc domen je Fc domen IgG1, konkretno Fc domen humanog IgG1. Kombinacija aminokiselinskih supstitucija „P329G LALA“ skoro potpuno ukida vezivanje Fcy receptora (kao i komplementa) za Fc domen humanog IgG1, kao što je opisano u PCT publikaciji br. WO 2012/130831, koja je ovde uključena kao referenca u celosti. WO2012/130831 takođe opisuje postupke za pripremu takvih mutantnih Fc domena i postupke za određivanje njihovih svojstava, kao što su vezivanje za Fc receptore ili efektorske funkcije.
IgG4antitela pokazuju smanjen afinitet vezivanja za Fc receptore i smanjene efektorske funkcije u poređenju sa IgG1antitelima. Prema tome, u nekim otelotvorenjima, Fc domen antitela sadržan u imunokonjugatu iz pronalaska je Fc domen IgG4, konkretno Fc domen humanog IgG4. U jednom otelotvorenju, Fc domen IgG4sadrži aminokiselinske supstitucije u položaju S228, konkretno supstituciju aminokiseline S228P (numeracija prema Kabatovom EU indeksu). Da bi se dodatno smanjio njegov afinitet vezivanja za Fc receptor i/ili njegova efektorska funkcija, u jednom otelotvorenju, Fc domen IgG4sadrži supstituciju aminokiselina na poziciji L235, konkretno supstituciju aminokiseline L235E (numeracija prema Kabatovom EU indeksu). U drugom otelotvorenju, Fc domen IgG4sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji P329, konkretno supstituciju aminokiseline P329G (numeracija prema Kabatovom EU indeksu). U konkretnom otelotvorenju, Fc domen IgG4sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama S228, L235 i P329, posebno aminokiselinske supstitucije S228P, L235E i P329G (numeracija prema Kabatovom EU indeksu). Takvi mutanti Fc domena IgG4i njihova svojstva vezivanja Fcγ receptora opisani su u publikaciji PCT br. WO 2012/130831, koja je ovde uvrštena kao referenca u celini.
U određenom otelotvorenju, Fc domen koji pokazuje smanjen afinitet vezivanja za Fc receptor i/ili smanjenu efektorsku funkciju u odnosu na Fc domen nativnog IgG1je humani Fc domen IgG1koji sadrži aminokiselinske supstitucije L234A, L235A i opciono P329G, ili Fc domen humanog IgG4koji sadrži aminokiselinske supstitucije S228P, L235E i opciono P329G (numeracije prema Kabatovom EU indeksu).
U određenim otelotvorenjima, eliminisana je N-glikozilacija Fc domena. U jednom takvom otelotvorenju, Fc domen sadrži aminokiselinsku mutaciju na poziciji N297, posebno aminokiselinsku supstituciju koja zamenjuje asparagin alaninom (N297A) ili asparaginskom kiselinom (N297D) (numeracija prema Kabatovom EU indeksu).
Pored Fc domena opisanih gore i u publikaciji PCT br. WO2012/130831, Fc domeni sa smanjenim vezivanjem Fc receptora i/ili efektorskom funkcijom, takođe uključuju one sa supstitucijom jednog ili više ostataka Fc domena 238, 265, 269, 270, 297, 327 i 329 (US Patent br. 6,737,056) (numeracija prema Kabatovom EU indeksu). Takvi Fc mutanti obuhvataju Fc mutante sa supstitucijama na dva ili više položaja aminokiselina 265, 269, 270, 297 i 327, uključujući takozvani „DANA” Fc mutant sa supstitucijom ostataka 265 i 297 alaninom (US Patent br.7,332,581).
Mutantni Fc domeni se mogu pripremiti uklanjanjem, supstitucijom, umetanjem ili modifikacijom aminokiselina, uz upotrebu genetičkih ili hemijskih metoda dobro poznatih u struci. Genetički postupci mogu obuhvatiti mutagenezu specifičnu za mesto kodiranja DNK sekvence, PCR, sintezu gena i slično. Tačne promene nukleotida mogu se potvrditi, na primer, sekvenciranjem.
Vezivanje za Fc receptore se može lako odrediti npr. testom ELISA ili površinskom plazmonskom rezonancom (SPR) upotrebom standardnih instrumenata kao što je BIAcore instrument (GE Healthcare), a takvi Fc receptori se mogu dobiti rekombinantnom ekspresijom. Alternativno, afinitet vezivanja Fc domena ili antitela koja sadrže Fc domen za Fc receptore može se proceniti pomoću ćelijskih linija za koje je poznato da eksprimiraju određene Fc receptore, kao što su humane NK ćelije koje eksprimiraju FcγIIIa receptor.
Efektorska funkcija Fc domena ili antitela koje sadrži Fc domen se može izmeriti postupcima poznatim u struci. Primeri in vitro testova za određivanje ADCC aktivnosti željenog molekula opisani su u U.S. Patentu br.5,500,362; Hellstrom et al. Proc Natl Acad Sci USA83, 7059-7063 (1986) i Hellstrom et al, Proc Natl Acad Sci USA82, 1499-1502 (1985); US Patent br.5,821,337; Bruggemann et al, J Exp Med 166, 1351-1361 (1987). Alternativno, mogu se koristiti neradioaktivni postupci analiza (videti, npr. ACTI™ neradioaktivni test citotoksičnosti za protočnu citometriju (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA); i CytoTox 96<®>neradioaktivni test citotoksičnosti (Promega, Madison, WI)). U korisne efektorske ćelije za takve testove spadaju mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) i ćelije prirodne ubice (NK). Alternativno, ili dodatno, ADCC aktivnost željenog molekula se može odrediti in vivo, npr. na životinjskom modelu, kao što je objavljeno u Clynes et al., Proc Natl Acad Sci USA 95, 652-656 (1998).
U nekim otelotvorenjima, vezivanje Fc domena za komponentu komplementa, posebno za C1q, je smanjeno. U skladu sa tim, u nekim realizacijama, kada je Fc domen konstruisan da ima smanjenu efektorsku funkciju, pomenuta smanjena efektorska funkcija uključuje smanjeni
4
CDC. Testovi vezivanja C1q se mogu obaviti da bi se utvrdilo da li su Fc domen, ili antitelo koje sadrži Fc domen, sposobni da vežu C1q i stoga imaju CDC aktivnost. Videti, npr. ELISA test C1q i C3c vezivanja u WO2006/029879 i WO2005/100402. Da bi se ocenila aktivacija komplementa, može se izvesti CDC test (videti, npr. Gazzano-Santoro et al, J Immunol Methods 202, 163 (1996); Cragg et al, Blood 101, 1045-1052 (2003); i Cragg i Glennie, Blood 103, 2738-2743 (2004)).
Vezivanje FcRn i in vivo određivanje klirensa/poluživota može takođe da se izvrši pomoću postupaka poznatih u struci (pogledajte, npr. Petkova S.B. et al., Int’l. Immunol.
18(12):1759-1769 (2006); WO 2013/120929).
Posebni aspekti pronalaska
U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje imunokonjugat koji sadrži mutantni polipeptid IL-2 i antitelo koje se vezuje za PD-1, pri čemu je mutantni polipeptid IL-2 humani molekul IL-2 koji sadrži aminokiselinske supstitucije F42A, Y45A i L72G (numeracija u odnosu na sekvencu humanog IL-2 SEQ ID NO: 19); i gde antitelo sadrži (a) varijabilni region teškog lanca (VH) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 14, i (b) varijabilni region lakog lanca (VL) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 15.
U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje imunokonjugat koji sadrži mutantni polipeptid IL-2 i antitelo koje se vezuje za PD-1, pri čemu je mutantni polipeptid IL-2 humani molekul IL-2 koji sadrži aminokiselinske supstitucije T3A, F42A, Y45A, L72G I C125A (numeracija u odnosu na sekvencu humanog IL-2 SEQ ID NO: 19); i gde antitelo sadrži (a) varijabilni region teškog lanca (VH) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 14, i (b) varijabilni region lakog lanca (VL) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 15.
U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje imunokonjugat koji sadrži mutantni polipeptid IL-2 i antitelo koje se vezuje za PD-1, pri čemu mutantni polipeptid IL-2 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 20; i gde antitelo sadrži (a) varijabilni region teškog lanca (VH) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 14, i (b) varijabilni region lakog lanca (VL) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 15.
U jednom otelotvorenju prema bilo kom od gornjih aspekata pronalaska, antitelo je imunoglobulin klase IgG, koji sadrži Fc domen humanog IgG1sastavljen od prve i druge podjedinice, pri čemu je u prvoj podjedinici Fc domena ostatak treonina na poziciji 366 zamenjen ostatkom triptofana (T366W), a u drugoj podjedinici Fc domena, ostatak tirozina na poziciji 407 je zamenjen ostatkom valina (Y407V) i opciono, ostatak treonina na poziciji 366 je zamenjen ostatkom serina (T366S) a ostatak leucina na poziciji 368 je zamenjen ostatkom alanina (L368A) (numeracije prema Kabatovom EU indeksu), i pri čemu dalje svaka
4
podjedinica Fc domena sadrži aminokiselinske supstitucije L234A, L235A i P329G (numeracija prema Kabatovom EU indeksu).
U ovom otelotvorenju, mutantni polipeptid IL-2 može biti fuzionisan na svojoj aminoterminalnoj aminokiselini sa karboksi-terminalnom aminokiselinom prve podjedinice Fc domena, preko linker peptida SEQ ID NO: 21.
U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje imunokonjugat koji sadrži polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci SEQ ID NO: 22, polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci SEQ ID NO: 23 ili SEQ ID NO: 24, i polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci SEQ ID NO: 25.
Polinukleotidi
Pronalazak dalje obezbeđuje izolovane polinukleotide koji kodiraju imunokonjugat kao što je ovde opisano ili njegov fragment. U nekim otelotvorenjima, pomenuti fragment je antigen vezujući fragment.
Polinukleotidi koji kodiraju imunokonjugate iz pronalaska mogu biti eksprimirani kao pojedinačni polinukleotidi koji kodiraju celokupni imunokonjugat ili kao višestruki (npr. dva ili više) polinukleotidi koji su koeksprimirani. Polipeptidi kodirani polinukleotidima koji su koeksprimirani mogu se povezati putem, na primer, disulfidne veze ili drugih sredstava za stvaranje funkcionalnog imunokonjugata. Na primer, deo lakog lanca antitela može biti kodiran odvojenim polinukleotidom od dela imunokonjugata koji sadrži deo teškog lanca antitela i mutantni IL-2 polipeptid. Kad su koeksprimirani, polipeptidi teškog lanca će se povezati sa polipeptidima lakog lanca kako bi formirali imunokonjugat. U drugom primeru, deo imunokonjugata koji sadrži jednu od dve podjedinice Fc domena i mutantni IL-2 polipeptid mogu biti kodirani posebnim polinukleotidom od dela imunokonjugata koji sadrži drugu od dve podjedinice Fc domena. Kada su koeksprimirane, podjedinice Fc domena će se udružiti da formiraju Fc domen.
U nekim otelotvorenjima, izolovani polinukleotid kodira ceo imunokonjugat prema pronalasku kako je ovde opisano. U drugim otelotvorenjima, izolovani polinukleotid kodira polipeptid koji se nalazi u imunokonjugatu prema pronalasku kako je ovde opisano.
U jednom otelotvorenju, izolovani polinukleotid iz pronalaska kodira teški lanac antitela koji se nalazi u imunokonjugatu (npr. teški lanac imunoglobulina) i mutantni polipeptid IL-2. U drugom otelotvorenju, izolovani polinukleotid iz pronalaska kodira laki lanac antitela
4
sadržanog u imunokonjugatu.
U određenim otelotvorenjima, polinukleotid ili nukleinska kiselina je DNK. U drugim otelotvorenjima, polinukleotid iz predmetnog pronalaska je RNK, na primer, u obliku informacione RNK (mRNK). RNK iz predmetnog pronalaska može biti jednolančana ili dvolančana.
Rekombinantni postupci
Mutantni IL-2 polipeptidi korisni u pronalasku mogu biti pripremljeni brisanjem, supstitucijom, insercijom ili modifikacijom korišćenjem genetskih ili hemijskih postupaka dobro poznatih u tehnici. Genetički postupci mogu obuhvatiti mutagenezu specifičnu za mesto kodiranja DNK sekvence, PCR, sintezu gena i slično. Tačne promene nukleotida mogu se potvrditi, na primer, sekvenciranjem. U tom smislu, nukleotidnu sekvencu nativnog IL-2 opisali su Taniguchi et al. (Nature 302, 305-10 (1983)) i nukleinska kiselina koja kodira humani IL-2 je dostupna iz javnih spremišta, kao što je American Type Culture Collection (Rockville MD). Sekvenca nativnog humanog IL-2 je prikazana u SEQ ID NO: 19. Zamena ili ubacivanje može uključivati i prirodne i veštački dobijene ostatke aminokiselina. Modifikacija aminokiseline uključuje poznate postupke hemijske modifikacije, kao što je dodavanje mesta glikozilacije ili ugljovodoničnih dodataka, i slično.
Imunokonjugati iz pronalaska se mogu dobiti, na primer, putem peptidne sinteze čvrstog stanja (npr. Merifildova sinteza čvrste faze) ili rekombinantne proizvodnje. Za rekombinantnu proizvodnju jednog ili više polinukleotida koji kodiraju imunokonjugat (fragment), npr. kao što je gore opisano, izoluje se i ubacuje u jedan ili više vektora radi daljeg kloniranja i/ili ekspresije u ćeliji domaćina. Takav polinukleotid može biti lako izolovan i sekvenciran pomoću konvencionalnih procedura. U jednom otelotvorenju, obezbeđen je vektor, poželjno ekspresioni vektor, koji sadrži jedan ili više polinukleotida iz pronalaska. Postupci koji su dobro poznati stručnjacima u ovoj oblasti mogu se primeniti za konstrukciju ekspresionih vektora koji sadrže kodirajuću sekvencu imunokonjugata (fragmenta) uz odgovarajuće signale transkripcione/translacione kontrole. Ti postupci uključuju in vitro tehnike rekombinantne DNK, sintetičke tehnike i in vivo rekombinaciju/genetsku rekombinaciju. Videti, na primer, tehnike opisane u Maniatis et al., M<OLECULAR>C<LONING>: A L<ABORATORY>M<ANUAL>, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989); i Ausubel et al., C<URRENT>P<ROTOCOLS IN>M<OLECULAR>B<IOLOGY>, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y (1989). Ekspresioni vektor može biti deo plazmida, virusa, ili može biti fragment nukleinske kiseline. Vektor ekspresije uključuje ekspresionu kasetu u koju je kloniran polinukleotid koji kodira imunokonjugat (fragment) (tj. kodirajući region) u operabilnoj
4
asocijaciji sa promoterom i/ili drugim elementima kontrole transkripcije ili translacije. U smislu ovog dokumenta, „kodirajući region” je deo nukleinske kiseline koja se sastoji od kodona translatovanih u aminokiseline. Iako „stop kodon” (TAG, TGA ili TAA) nije translatovan u aminokiselinu, može se smatrati delom kodirajućeg regiona, ako je prisutan, ali sve ostale granične sekvence, kao što su promoteri, mesta vezivanja ribozoma, terminatori transkripcije, introni, 5' i 3' netranslatovane regije i slično, nisu deo kodirajućeg regiona. Dva ili više kodirajućih regiona može biti prisutno u jednom polinukleotidnom konstruktu, npr. na jednom vektoru, ili u odvojenim polinukleotidnim konstruktima, npr. na odvojenim (različitim) vektorima. Pored toga, svaki vektor može da sadrži jedan kodirajući region, ili može da obuhvata dva ili više kodirajućih regiona, npr. vektor iz predmetnog pronalaska može da kodira jedan ili više polipeptida, koji su post- ili kotranslaciono razdvojeni u krajnje proteine putem proteolitičkog cepanja. Pored toga, vektor, polinukleotid ili nukleinska kiselina prema pronalasku može kodirati heterologne kodirajuće regione, bilo fuzionisane ili nefuzionisane sa polinukleotidom koji kodira imunokonjugat iz pronalaska, ili njegovu varijantu ili derivat. Heterologni kodirajući regioni obuhvataju, bez ograničenja, specijalizovane elemente ili motive, kao što su sekretorni signalni peptid ili heterologni funkcionalni domen. Funkcionalna asocijacija se odvija kada se kodirajući region genskog proizvoda, npr. polipeptida, poveže sa jednom ili više regulatornih sekvenci tako da postavi ekspresiju genskog proizvoda pod uticaj ili kontrolu regulatorne sekvence (regulatornih sekvenci). Dva DNK fragmenta (kao što je kodirajući region polipeptida i asocirani promoter) su „funkcionalno povezani” ukoliko indukcija promoterske funkcije izaziva transkripciju mRNK koja kodira željeni genski proizvod i ako priroda veze između dva DNK fragmenta ne ometa sposobnost ekspresije regulatornih sekvenci da usmeravaju ekspresiju genskog proizvoda ili utiču na sposobnost transkripcije DNK obrasca. Stoga bi region promotera bio operabilno povezan sa nukleinskom kiselinom koja kodira polipeptid da je promoter sposoban za vršenje transkripcije te nukleinske kiseline. Promoter može da bude ćelijski specifičan promoter koji usmerava značajnu transkripciju DNK samo u predodređenim ćelijama. Drugi elementi koji kontrolišu transkripciju, pored promotera, na primer pojačivači, operatori, represori i signali okončanja transkripcije, mogu operabilno da se povežu sa polinukleotidom radi usmeravanja transkripcije specifične za određene ćelije. Ovde su opisani odgovarajući promoteri i drugi regioni koje kontrolišu transkripciju. Veliki broj regiona koji kontrolišu transkripciju poznat je stručnim licima iz ove oblasti. To uključuje, bez ograničenja, regione koji kontrolišu transkripciju, a funkcionišu u ćelijama kičmenjaka, kao što su, bez ograničenja, segmenti promotera i pojačivača iz citomegalovirusa (npr. trenutni rani promoter zajedno sa intronom-A), simijan
4
virusa 40 (npr. rani promoter) i retrovirusa (kao što je, npr. Rausov virus sarkoma). Drugi regioni koji kontrolišu transkripciju obuhvataju one dobijene iz gena kičmenjaka, kao što su aktin, protein toplotnog stresa, goveđi hormon rasta i β-globin zeca, kao i druge sekvence sposobne za kontrolu ekspresije gena u eukariotskim ćelijama. Dodatni pogodni regioni koji kontrolišu transkripciju uključuju promotere specifične za tkivo i pojačivače, kao i inducibilne promotere (npr. inducibilni promoteri tetraciklina). Slično tome, veliki broj elemenata koji kontrolišu translaciju poznat je stručnim licima iz ove oblasti. Ta grupa uključuje, bez ograničenja, mesta vezivanja ribozoma, kodone početka i kraja translacije i elemente dobijene iz viralnih sistema (naročito unutrašnje ribozomalno ulazno mesto ili IRES, poznato i kao CITE sekvenca). Transporter ekspresije može da sadrži i druge karakteristike kao što je mesto početka replikacije i/ili elemente integracije hromozoma, kao što su duga terminalna ponavljanja retrovirusa (LTR) ili invertovana terminalna ponavljanja (ITR) adenoasociranih virusa (AAV).
Kodirajući regioni polinukleotida i nukleinske kiseline iz predmetnog pronalaska mogu biti asocirani sa dodatnim kodirajućim regionima koji kodiraju sekretorne ili signalne peptide, koji usmeravaju sekreciju polipeptida kodiranih od strane polinukleotida iz predmetnog pronalaska. U skladu sa hipotezom signala, proteini koji se luče putem ćelija sisara imaju signalni peptid ili sekretornu vodeću sekvencu koja je isečena iz zrelog proteina nakon što je započet izvoz rastućeg lanca proteina širom endoplazmatičnog retikuluma. Lica standardne stručnosti iz ove oblasti su upoznata s tim da polipeptidi izlučeni iz ćelija kičmenjaka po pravilu imaju signalni peptid spojen za N-terminalni kraj polipeptida, koji je isečen iz translatovanog polipeptida radi stvaranja sekretornog ili „zrelog” oblika peptida. Na primer, ljudski IL-2 je translatovan sa 20 aminokiselinskih signalnih sekvenci na N-terminusu polipeptida, koji se kasnije odvaja kako bi se proizvele zrele, 133 aminokiseline humanog IL-2. U određenim otelotvorenjima, izvorni signalni peptid, npr. koristi se IL-2 signalni peptid ili teški lanac imunoglobulina ili laki lanac signalnog peptida ili funkcionalni derivat te sekvence koja zadržava sposobnost usmeravanja izlučivanja polipeptida s kojim je funkcionalno asocirana. Alternativno, može se koristiti heterologni signalni peptid sisara ili njegov funkcionalni derivat. Na primer, vodeća sekvenca divljeg tipa se može supstituisati vodećom sekvencom aktivatora plazminogena u ljudskom tkivu (TPA) ili β-glukuronidaze miša.
DNK koja kodira kratku sekvencu proteina koja bi se mogla koristiti za olakšanje kasnijeg prečišćavanja (npr. histidinski rep) ili kao pomoć u obeležavanju imunokonjugata može biti uključena unutar ili na krajevima imunokonjugata (fragmenta) kodiranih polinukleotidom.
U dodatnom otelotvorenju, obezbeđena je ćelija domaćin koja sadrži jedan polinukleotid iz pronalaska, ili više njih. U određenim otelotvorenjima, obezbeđena je ćelija domaćin koja sadrži jedan vektor iz pronalaska ili više njih. Polinukleotidi i vektori mogu da sadrže bilo koju od karakteristika, pojedinačno ili u kombinaciji, kao što je ovde opisano u vezi sa polinukleotidima odnosno vektorima. U jednom takvom otelotvorenju, ćelija domaćin sadrži jedan ili više vektora (npr. transformisana je ili transficirana njima) koji sadrže jedan ili više polinukleotida koji kodiraju imunokonjugat iz pronalaska. Kao što je korišćen ovde, termin „ćelija domaćin” se odnosi na bilo koji ćelijski sistem koji može biti konstruisan da proizvodi imunokojugate iz pronalaska ili njihove fragmente. Ćelije domaćini koje imaju sposobnost replikacije i podržavanja ekspresije imunokonjugata dobro su poznate u struci. Takve ćelije mogu da budu transficirane ili transdukovane u skladu sa određenim ekspresionim vektorom, a velike količine vektora koji sadrže ćelije mogu se uzgajati za zasejavanje velikih fermentora za dobijanje dovoljnih količina imunokonjugata za kliničku primenu. Odgovarajuće ćelije domaćini sadrže prokariotske mikroorganizme, kao što je E. coli ili različite eukariotske ćelije, kao što su jajne ćelije kineskog hrčka (CHO), ćelije insekata i slično. Na primer, polipeptidi se mogu proizvesti u bakterijama, naročito kada nije neophodna glikozilacija. Nakon ekspresije, polipeptid može da se izoluje iz paste bakterijskih ćelija u rastvorljivoj frakciji, a može i dalje da se prečišćava. Osim prokariota, eukariotski mikrobi, kao što su filamentozne gljivice ili kvasci su pogodni domaćini za kloniranje ili ekspresiju vektora koji kodiraju polipeptid, uključujući sojeve gljivica i kvasaca čiji su putevi glikozilacije „humanizovani”, što dovodi do stvaranja polipeptida sa delimično ili potpuno humanim glikozilacionim obrascem. Videti Gerngross, Nat Biotech 22, 1409-1414 (2004), i Li et al, Nat Biotech 24, 210-215 (2006). Pogodne ćelije domaćini za ekspresiju (glikozilovanih) polipeptida se takođe izvode iz višećelijskih organizama (beskičmenjaka i kičmenjaka). Primeri ćelija beskičmenjaka uključuju ćelije biljaka i insekata. Identifikovani su brojni sojevi bakulovirusa koji mogu da se koriste zajedno sa ćelijama insekata, naročito za transfekciju ćelija Spodoptera frugiperda. Kulture biljnih ćelija se takođe mogu koristiti kao domaćini. Videti npr. US Patent br.
5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978, i 6,417,429 (gde se opisuje PLANTIBODIES™ tehnologija za proizvodnju antitela u transgenim biljkama). Ćelije kičmenjaka se, slično tome, mogu upotrebiti kao domaćini. Na primer, mogu se koristiti ćelijske linije sisara koje su adaptirane za rast u suspenziji. Druge primere korisnih ćelijskih linija domaćina sisara predstavljaju CV1 linija bubrega majmuna transformisana pomoću SV40 (COS-7); humana embrionska linija bubrega (ćelije 293 ili 293T, kao što opisuju npr. Graham et al., J Gen Virol 36, 59 (1977)), ćelije bubrega mladunca hrčka (BHK), Sertolijeve ćelije miša (TM4 ćelije kao
1
što opisuje npr. Mather, Biol Reprod 23, 243-251 (1980)), ćelije bubrega majmuna (CV1), ćelije bubrega afričkog zelenog majmuna (VERO-76), humane ćelije cervikalnog karcinoma (HELA), ćelije bubrega psa (MDCK), ćelije jetre pacova (BRL3A), humane ćelije pluća (W138), humane ćelije jetre (Hep G2), tumorske ćelije mlečne žlezde miša (MMT060562), TRI ćelije (kao što opisuju npr. Mather et al., Annals N.Y. Acad Sci 383, 44-68 (1982)); MRC5 ćelije i FS4 ćelije. Druge korisne ćelijske linije domaćina sisara predstavljaju jajne ćelije kineskog hrčka (CHO), uključujući dhfr<->CHO ćelije (Urlaub et al., Proc Natl Acad Sci USA77, 4216 (1980)); i ćelijske linije mijeloma, kao što su: YO, NS0, P3X63 i Sp2/0. Za pregled određenih ćelijskih linija domaćina sisara, pogodnih za proizvodnju proteina, vidi, npr., Yazaki i Wu, Methods in Molecular Biology, Vol.248 (B.K.C. Lo, izd., Humana Press, Totowa, NJ), str. 255-268 (2003). Ćelije domaćini obuhvataju gajene ćelije, između ostalog, gajene ćelije sisara, ćelije kvasca, ćelije insekata, bakterijske ćelije i biljne ćelije, ali i ćelije sadržane u transgenim životinjama, transgenim biljkama ili gajenom biljnom ili životinjskom tkivu. U jednom otelotvorenju, ćelija domaćin je eukariotska ćelija, poželjno ćelija sisara, kao što je jajna ćelija kineskog hrčka (CHO), humana embrionska ćelija bubrega (HEK) ili limfoidna ćelija (npr., Y0, NS0, Sp20 ćelija).
U struci su poznate standardne tehnologije za ekspresiju stranih gena u ovim sistemima. Ćelije koje eksprimiraju mutantni polipeptid IL-2 spojene sa teškim ili lakim lancem antitela mogu se konstruisati tako da takođe eksprimiraju i druge lance antitela tako da eksprimirani proizvod fuzije mutantnog IL-2 bude antitelo koje ima teški i laki lanac.
U jednom otelotvorenju, obezbeđen je postupak za proizvodnju imunokonjugata prema pronalasku, gde postupak obuhvata kultivisanje ćelije domaćina koja sadrži jedan ili više polinukleotida koji kodiraju imunokonjugat, kao što je ovde predviđeno, u uslovima koji su pogodni za ekspresiju imunokonjugata i opciono rekuperaciju imunokonjugata iz ćelije domaćina (ili medijuma za uzgajanje ćelije domaćina).
U imunokonjugatu iz pronalaska, mutantni polipeptid IL-2 može biti genetski fuzionisan sa antitelom ili može biti hemijski konjugovan sa antitelom. Genetska fuzija polipeptida IL-2 sa antitelom može biti dizajnirana tako da se sekvenca IL-2 spoji sa polipeptidom direktno, ili indirektno preko linkerske sekvence. Kompozicija i dužina linkera se može odrediti u skladu sa postupcima dobro poznatim u struci, i njihova efikasnost se može ispitati. Ovde su opisani određeni linkerski peptidi. Dodatne sekvence mogu takođe biti uključene da pripoje mesto cepanja da bi se razdvojile pojedine komponente fuzije ako je potrebno, na primer sekvenca prepoznavanja endopeptidaze. Pored toga, fuzioni protein IL-2 takođe može biti sintetisan hemijski korišćenjem postupaka sinteze polipeptida, kao što je
2
poznato u struci (npr. sinteza na Merifildovoj smoli). Mutantni polipeptidi IL-2 mogu biti hemijski konjugovani sa drugim molekulima, npr. antitelima, koristeći poznate postupke hemijske konjugacije. Za ovu svrhu mogu se koristiti bifunkcionalni reagensi za unakrsno povezivanje, kao što su homofunkcionalni i heterofunkcionalni reagensi za unakrsno povezivanje, dobro poznati u struci. Tip unakrsnog povezivanja reagensa koji se koristi zavisi od prirode molekula koji se spaja sa IL-2 i može se odmah identifikovati od strane stručnjaka u ovoj oblasti. Alternativno, ili pored toga, mutirani IL-2 i/ili molekul koji je namenjen da bude konjugovan, može biti hemijski derivatizovan tako da se ova dva molekula mogu konjugovati u odvojenoj reakciji, što je takođe dobro poznato u struci.
Imunokonjugati iz ovog pronalaska sadrže antitelo. Postupci stvaranja antitela dobro su poznati u struci (videti, npr. Harlow i Lane, „Antibodies, a laboratory manual”, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). Antitela koja se ne nalaze u prirodi mogu se konstruisati pomoću sinteze peptida na čvrstoj podlozi, mogu se proizvesti rekombinacijom (npr. kao što je opisano u U.S. patentu br. 4,186,567) ili se mogu dobiti, na primer, skriningom kombinatornih biblioteka koje sadrže varijabilne teške i lake lance (videti, npr. U.S. Patent. br. 5,969,108 McCafferty). Imunokonjugati, antitela i postupci za njihovu proizvodnju su takođe detaljno opisani, npr. u PCT publikacijama br. WO 2011/020783, WO 2012/107417 i WO 2012/146628, od kojih je svaka ovde u celosti uključena putem reference.
Bilo koja životinjska vrsta antitela može da se koristi u imunokonjugatima iz pronalaska. Neograničavajuća antitela korisna u ovom pronalasku mogu biti mišjeg, primatskog ili ljudskog porekla. Ako je imunokonjugat namenjen za ljudsku upotrebu, himerni oblik antitela može da se koristi ako su konstantni regioni antitela humani. Humanizovani ili potpuno humani oblik antitela takođe se može dobiti u skladu sa metodama poznatim u struci (videti, npr. U.S. Patent br. 5,565,332, Winter). Humanizacija se može postići različitim metodama, uključujući, bez ograničenja, (a) graftovanje nehumanih (npr. donorskih antitela) CDR u humani (npr. antitelo primalac) okvir i konstantne regione sa zadržavanjem ili bez zadržavanja kritičnih ostataka okvira (npr. onih koji su važni za održavanje dobrog afiniteta za vezivanje antigena ili funkciju antitela), (b) graftovanje samo nehumanih regiona koji određuju specifičnost (SDR ili α-CDR; ostaci ključni za interakciju antitelo-antigen) na humani okvir i konstantne regione, ili (c) transplantacija čitavih nehumanih varijabilnih domena, koji se „prekrivaju” sekcijom nalik na humanu tako što se zamenjuju površinski ostaci. Pregled humanizovanih antitela i metoda za njihovo dobijanje daje se npr. u Almagro i Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008), a dodatno su opisani npr. u Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989); US patentima br. 5, 821,337, 7,527,791, 6,982,321 i 7,087,409; Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005) (gde se opisuje graftovanje regiona koji određuje specifičnost (SDR)); Padlan, Mol. Immunol.
28:489-498 (1991) (gde se opisuje „preuređivanje površine“); Dall’Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005) (gde se opisuje „mešanje FR“); i Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) i Klimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) (gde se opisuje pristup „vođene selekcije“ kod mešanja FR). Humani okvirni regioni koji mogu da se koriste za humanizaciju uključuju, ali se ne ograničavaju na: okvirne regione izabrane metodom "najboljeg slaganja" (pogledajte, npr. Sims et al. J. imunol. 151:2296 (1993)); okvirne regione dobijene od konsenzusne sekvence humanih antitela konkretne podgrupe varijabilnih regiona lakog ili teškog lanca (videti npr. Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); i Presta et al. J. Immunol., 151:2623 (1993)); humane zrele (somatski mutirane) regione okvira ili regione okvira humane germinativne linije (videti, npr. Almagro i Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)); i okvirne regione dobijene pregledanjem FR biblioteka (videti npr. Baca et al., J. Biol. Chem.
272:10678-10684 (1997) i Rosok et al., J. Biol. Chem.271:22611-22618 (1996)).
Humana antitela se mogu dobiti primenom različitih tehnika poznatih u struci. Humana antitela načelno su opisana u van Dijk i van de Winkel, Curr Opin Pharmacol 5, 368-74 (2001) i Lonberg, Curr Opin Immunol 20, 450-459 (2008). Humana antitela se mogu dobiti primenom imunogena na transgenu životinju koja je modifikovana da proizvodi netaknuta humana antitela ili netaknuta antitela sa humanim varijabilnim regionima kao odgovor na antigenski izazov. Takve životinje tipično sadrže kompletne lokuse humanog imunoglobulina ili njihov deo, koji zamenjuju lokuse endogenog imunoglobulina, ili koji su prisutni ekstrahromozomski ili su nasumično integrisani u životinjske hromozome. U takvim transgenim miševima, lokusi endogenog imunoglobulina su po pravilu inaktivirani. Pogledajte pregled metoda za dobijanje humanih antitela od transgenih životinja u Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005). Pogledajte takođe, npr. U.S. Patente br.6,075,181 i 6,150,584 koji opisuju XENOMOUSE™ tehnologiju; U.S. Patent br. 5,770,429 koji opisuje H<U>M<AB>® tehnologiju; U.S. Patent br.
7,041,870 koji opisuje K-M MOUSE® tehnologiju, i U.S. publikaciju patentne prijave br. US2007/0061900, koja opisuje V<ELOCI>M<OUSE>® tehnologiju). Humani varijabilni regioni netaknutih antitela koje stvaraju takve životinje mogu se dalje modifikovati, npr. kombinovanjem sa različitim humanim konstantnim regionom.
Humana antitela se mogu takođe dobiti postupcima na bazi hibridoma. Opisane su ćelijske linije humanog mijeloma i mišjeg-humanog heteromijeloma za proizvodnju humanih monoklonskih antitela. (Pogledajte, npr. Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, str. 51-63 (Marcel Dekker,
4
Inc., New York, 1987); i Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991).) Humana antitela proizvedena putem tehnologije hibridoma humanih B-ćelija takođe su opisana u Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006). Dodatni postupci uključuju one opisane, na primer, u U.S. Patentu br.7,189,826 (opisuje proizvodnju monoklonskih humanih IgM antitela iz ćelijskih linija hibridoma) i Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006) (opisuje humanohumane hibridome). Tehnologija humanih hibridoma (tehnologija trioma) takođe je opisana u Vollmers i Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) i u Vollmers i Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3): 185-91 (2005).
Ljudska antitela se takođe mogu stvoriti izolacijom iz biblioteka ljudskih antitela, kao što je ovde opisano.
Antitela korisna u pronalasku mogu da se izoluju pretraživanjem kombinatornih biblioteka u potrazi za antitelima sa željenom aktivnošću ili aktivnostima. Metodi za pretraživanje kombinatornih biblioteka su sumirani, na primer, u Lerner et al. u Nature Reviews 16:498-508 (2016). Na primer, u struci je poznat veliki broj metoda za stvaranje biblioteka prikaza faga i pretraživanje takvih biblioteka za antitela koja imaju željene karakteristike vezivanja. Takve metode su sumirane, na primer, u Frenzel et al. u mAbs 8:1177-1194 (2016); Bazan et al. u Human Vaccines and Immunotherapeutics 8:1817-1828 (2012) i Zhao et al. u Critical Reviews in Biotechnology 36:276-289 (2016) kao i u Hoogenboom et al. u Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001) i u Marks i Bradbury u Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003).
Kod pojedinih metoda displeja faga, repertoari VH i VL gena su odvojeno klonirani putem lančane reakcije polimeraze (PCR) i nasumično rekombinovani u bibliotekama faga, koje zatim mogu da se pretražuju prema antigen-vezujućem fagu, kao što opisuju Winter et al. u Annual Review of Immunology 12: 433-455 (1994). Fagi tipično vrše displej fragmenata antitela, bilo kao jednolančani Fv (scFv) fragmenti ili kao Fab fragmenti. Biblioteke iz imunizovanih izvora daju antitela velikog afiniteta prema imunogenu, ne zahtevajući konstruisanje hibridoma. Alternativno, naivni repertoar može biti kloniran (npr. od ljudi) da bi se dobio jedan izvor antitela za širok spektar nesvojstvenih, kao i svojstvenih antigena bez ikakve imunizacije, kao što opisuju Griffiths et al. u EMBO Journal 12: 725-734 (1993). Najzad, naivne biblioteke mogu takođe da se naprave sintetički, kloniranjem nepreuređenih segmenata V-gena iz matičnih ćelija, i upotrebom PCR prajmera koji sadrže nasumične sekvence za kodiranje veoma varijabilnih CDR3 regiona i za postizanje premeštanja in vitro, kao što opisuju Hoogenboom i Winter u Journal of Molecular Biology 227: 381-388 (1992). Patentne publikacije koje opisuju biblioteke faga humanih antitela su, na primer, sledeće: US patenti br. 5,750,373; 7,985,840; 7,785,903 i 8,679,490, kao i US patentne publikacije br.
2005/0079574, 2007/0117126, 2007/0237764 i 2007/0292936. Dalji primeri metoda poznatih u tehnici za pretraživanje kombinatornih biblioteka na antitela sa željenom aktivnošću ili aktivnostima uključuju displej ribozoma i mRNK, kao i metode za displej i selekciju antitela na bakterijama, ćelijama sisara, ćelijama insekata ili ćelijama kvasca. Metodi za prikaz površine kvasca su pregledani, na primer, u Scholler et al. u Methods in Molecular Biology 503:135-56 (2012) i u Cherf et al. u Methods in Molecular biology 1319:155-175 (2015) kao i u Zhao et al. u Methods in Molecular Biology 889:73-84 (2012). Metodi za displej ribozoma su opisani, npr. u He et al. u Nucleic Acids Research 25:5132-5134 (1997) i u Hanes et al. u PNAS 94:4937-4942 (1997).
Može biti poželjna dalja hemijska modifikacija imunokonjugata iz pronalaska. Na primer, problemi imunogenosti i kratkog poluživota mogu se poboljšati konjugacijom na polimere ravnog lanca, kao što su polietilen glikol (PEG) ili polipropilen glikol (PPG) (videti npr. WO87/00056).
Imunokonjugati pripremljeni u skladu sa ovde navedenim uputstvom mogu se prečistiti tehnikama poznatim u struci, kao što su tečna hromatografija visokih performansi, jonska hromatografija, gel elektroforeza, afinitetna hromatografija, hromatografija na molekulskim sitima, i slično. Stvarni uslovi korišćeni za prečišćavanje određenog proteina delimično će zavisiti od faktora kao što su ukupno naelektrisanje, hidrofobnost, hidrofilnost itd. i biće jasni stručnim licima iz ove oblasti. Za afinitetnu hromatografiju kojom se prečišćava antitelo može se koristiti antitelo, ligand, receptor ili antigen za koji se imunokonjugat vezuje. Na primer, može se koristiti antitelo koje specifično vezuje mutantni IL-2 polipeptid. Za prečišćavanje imunokonjugata iz pronalaska afinitetnom hromatografijom može se koristiti matrica sa proteinom A ili proteinom G. Na primer, sekvencijalna afinitetna hromatografija pomoću proteina A ili G i na molekulskim sitima može se koristiti za izolaciju imunokonjugata onako kako je opisano u Primerima. Čistoća imunokonjugata se može utvrditi različitim analitičkim postupcima poznatim u struci, uključujući gel elektroforezu, tečnu hromatografiju, i slično.
Kompozicije, formulacije i načini primene
U daljem aspektu, pronalazak obezbeđuje farmaceutske kompozicije koje sadrže imunokonjugat kako je ovde opisano, npr. za upotrebu u bilo kom od dole navedenih terapijskih metoda. U jednom otelotvorenju, farmaceutska kompozicija uključuje bilo koji od ovde datih imunokonjugata i farmaceutski prihvatljiv nosač. U sledećem otelotvorenju, farmaceutska kompozicija uključuje bilo koje od ovde datih imunokonjugata, i najmanje jedno dodatno lekovito sredstvo, npr. kao što je dole opisano.
Sledeći aspekt otkrića je postupak za proizvodnju imunokonjugata iz pronalaska u obliku pogodnom za primenu in vivo, pri čemu postupak obuhvata (a) dobijanje imunokonjugata prema pronalasku i (b) formulisanje imunokonjugata sa najmanje jednim farmaceutski prihvatljivim nosačem, pri čemu je preparat imunokonjugata formulisan za primenu in vivo.
Farmaceutske kompozicije iz ovog pronalaska sadrže terapeutski efikasnu količinu imunokonjugata rastvorenog ili dispergovanog u farmaceutski prihvatljivom nosaču. Fraze „farmaceutski ili farmakološki prihvatljivo” odnose se na molekulske entitete i kompozicije koje su uglavnom netoksične za primaoce u primenjenim dozama i koncentracijama, tj. ne dovode do neželjenih, alergijskih i drugih nepovoljnih reakcija kada se primene na životinjama, kao što je, na primer, čovek, po potrebi. Priprema farmaceutske kompozicije koja sadrži imunokonjugat i opciono dodatni aktivni sastojak biće poznata stručnjacima u smislu ovog otkrića, kao što je prikazano u Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. izd. Mack Printing Company, 1990, što se uključuje ovde referencom. Pored toga, za primenu na životinjama (npr. ljudima), podrazumevaće se da preparati treba da ispune standarde sterilnosti, pirogenosti, opšte bezbednosti i čistoće u skladu sa zahtevima FDA Kancelarije za biološke standarde ili odgovarajućeg autoriteta u drugim zemljama. Poželjne kompozicije su liofilizovane formulacije ili vodeni rastvori. Kako se ovde koristi, termin „farmaceutski prihvatljiv nosač” podrazumeva sve rastvarače, pufere, disperzione medijume, obloge, surfaktante, antioksidanse, konzervanse (npr. antibakterijske agense, antifungalne agense), izotonične agense, agense za odlaganje apsorpcije, soli, konzervanse, antioksidanse, proteine, lekove, stabilizatore lekova, polimere, gelove, veziva, ekscipijense, dezintegratore, lubrikante, zaslađivače, arome, boje, slične supstance i njihove kombinacije, kao što je poznato stručnjacima u ovoj oblasti (videti, na primer, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. izd. Mack Printing Company, 1990, str.
1289-1329, što se uključuje ovde referencom). Osim ako se ne ukaže da je neki od konvencionalnih nosača nekompatibilan sa aktivnim sastojkom, njegova upotreba u terapeutskim ili farmaceutskim kompozicijama je razmotrena.
Imunokonjugat iz predmetnog pronalaska (i svaki dodatni terapeutski agens) može biti primenjen bilo kojim pogodnim postupkom, uključujući parenteralnu, intrapulmonarnu i intranazalnu, i, ako se želi za lokalno lečenje, intralezionu primenu. Parenteralne infuzije uključuju intramuskularnu, intravensku, intraarterijsku, intraperitonealnu ili supkutanu primenu. Doziranje može biti bilo kojim prikladnim načinom, npr. putem injekcija, kao što su intravenske ili supkutane injekcije, što delimično zavisi od toga da li je primena kratkotrajna ili hronična.
Parenteralni preparati obuhvataju one namenjene primeni putem injekcija, npr. supkutano, intradermalno, intraleziono, intravenski, intraarterijski, intramuskularno, intratekalno ili intraperitonealno ubrizgavanje. Za injekciju, imunokonjugati iz pronalaska mogu biti formulisani kao vodeni rastvori, poželjno u fiziološki kompatibilnim puferima, kao što je Henksov rastvor, Ringerov rastvor ili fiziološki slani pufer. Rastvor može da sadrži agense za formulisanje, kao što su agensi za suspendovanje, stabilizaciju i/ili dispergovanje. Alternativno, imunokonjugati mogu da budu u obliku praha za mešanje sa odgovarajućim nosačem, npr. sterilnom nepirogenom vodom, pre upotrebe. Sterilni injektabilni rastvori su pripremljeni mešanjem imunokonjugata iz pronalaska u potrebnoj količini u odgovarajućem rastvaraču sa različitim drugim dolenavedenim sastojcima, po potrebi. Sterilnost se može lako postići, npr. filtracijom kroz sterilne filtracione membrane. Uglavnom, disperzije se pripremaju mešanjem različitih sterilnih aktivnih sastojaka u sterilnom nosaču koji sadrži osnovni disperzioni medijum i/ili druge sastojke. U slučaju sterilnog praha za pripremu sterilnih rastvora za injekcije, suspenzija ili emulzija, poželjni postupak pripreme je vakuum sušenje ili liofilizacija, kojima se dobija prah aktivnog sastojka, kao i ostalih poželjnih sastojaka iz prethodno sterilno filtriranog tečnog medijuma. Tečni medijum treba da bude odgovarajuće puferovan, ako je potrebno, a tečni diluent izotoničan pre ubrizgavanja sa odgovarajućom količinom soli ili glukoze. Kompozicija treba da bude stabilna u uslovima stvaranja i čuvanja, izolovana od kontaminirajućeg uticaja mikroorganizama, kao što su bakterije i gljivice. Poželjno je da kontaminacija endotoksinom bude svedena na minimalni bezbedni nivo, na primer, manje od 0,5 ng/mg proteina. Odgovarajući farmaceutski prihvatljivi nosači uključuju, bez ograničenja: pufere, kao što je fosfatni, citratni i puferi drugih organskih kiselina; antioksidanse, uključujući askorbinsku kiselinu i metionin; konzervanse (kao što je oktadecildimetilbenzil amonijum hlorid; heksametonijum hlorid; benzalkonijum hlorid, benzetonijum hlorid; fenol, butil alkohol ili benzil alkohol; alkil parabene, kao što je metil paraben ili propil paraben; katehol; rezorcinol; cikloheksanol; 3-pentanol; i m-krezol); polipeptide male molekulske mase (manje od oko 10 ostataka); proteine, kao što je albumin iz seruma, želatin ili imunoglobulini; hidrofilne polimere, kao što je polivinil pirolidon; aminokiseline, kao što je glicin, glutamin, asparagin, histidin, arginin ili lizin; monosaharide, disaharide i druge ugljene hidrate, uključujući glukozu, manozu ili dekstrine; helatne agense, kao što je EDTA; šećere, kao što je saharoza, manitol, trehaloza ili sorbitol; kontrajone koji grade soli, kao što je natrijum; metalne komplekse (npr. kompleksi Zn-protein); i/ili nejonske surfaktante, kao što je polietilen glikol (PEG). Suspenzije za vodene injekcije mogu da sadrže jedinjenja koja povećavaju viskozitet suspenzije, kao što su natrijum karboksimetil celuloza, sorbitol, dekstran, i slično. Po potrebi, suspenzija može da sadrži i odgovarajuće stabilizatore ili agense koji povećavaju rastvorljivost jedinjenja i omogućavaju pripremu visoko koncentrovanih rastvora. Takođe, suspenzije aktivnih sastojaka mogu se pripremiti u obliku odgovarajućih injekcija uljane suspenzije. Odgovarajući lipofilni rastvarači ili vehikulumi obuhvataju masna ulja, kao što je susamovo ulje, ili sintetičke estre masnih kiselina, kao što su etil oleati ili trigliceridi ili lipozomi.
Aktivni sastojci mogu biti zarobljeni u pripremljenim mikrokapsulama, na primer, tehnikom koacervacije ili interfacijalne polimerizacije, na primer, hidroksimetilceluloze, odnosno želatinskih mikrokapsula, odnosno poli-(metilmetakrilat) mikrokapsula, u koloidnim sistemima za isporuku lekova (na primer, lipozomi, albuminske mikrosfere, mikroemulzije, nanočestice i nanokapsule) ili u makroemulzijama. Takve tehnike su prikazane u Remington's Pharmaceutical Sciences (18. izd. Mack Printing Company, 1990). Mogu se pripremiti preparati sa produženim oslobađanjem. Pogodni primeri preparata sa produženim oslobađanjem obuhvataju semipermeabilne matrice čvrstih hidrofobnih polimera koje sadrže polipeptid, pri čemu su matrice uobličeni proizvodi, npr. film ili mikrokapsule. U posebnom primeru otelotvorenja, prolongirana apsorpcija kompozicije za ubrizgavanje može se izazvati upotrebom u kompozicijama agensa za odlaganje apsorpcije, kao što su aluminijum monostearat, želatin, ili njihove kombinacije.
Pored prethodno opisanih kompozicija, imunokonjugati se mogu formulisati i kao depo preparat. Takve dugo delujuće formulacije mogu se primeniti implantacijom (na primer, supkutano ili intramuskularno) ili intramuskularnom injekcijom. Stoga, na primer, imunokonjugati se mogu formulisati sa odgovarajućim polimernim ili hidrofobnim materijalima (na primer, kao emulzija u odgovarajućem ulju), jonoizmenjivačkim smolama ili slabo rastvorljivim derivatima, na primer, kao slabo rastvorljiva so.
Farmaceutske kompozicije koje sadrže imunokonjugate iz pronalaska mogu se proizvesti uobičajenim procesima mešanja, rastvaranja, emulgovanja, kapsuliranja, hvatanja ili liofilizacije. Farmaceutski preparati mogu biti formulisani na konvencionalni način pomoću jednog ili više fiziološki prihvatljivih nosača, diluenata, ekscipijenasa ili dodatnih sredstava koja olakšavaju obradu proteina u preparate koji se mogu koristiti u farmaceutske svrhe. Pravilna formulacija zavisi od izabranog načina primene.
Imunokonjugati se mogu formulisati u kompoziciju u obliku slobodne kiseline ili baze, u neutralnom obliku ili u obliku soli. Farmaceutski prihvatljive soli su soli koje zadržavaju značajnu biološku aktivnost slobodne kiseline ili baze. U njih spadaju kisele adicione soli, npr. one formirane sa slobodnim amino grupama proteinske kompozicije ili one formirane sa neorganskom kiselinom kao što je, na primer, hlorovodonična ili fosforna kiselina, ili organskim kiselinama poput sirćetne, oksalne, vinske ili bademove kiseline. Soli formirane sa slobodnim karboksilnim grupama mogu se dobiti iz neorganskih baza, kao što su: natrijum, kalijum, amonijum, kalcijum ili gvožđe hidroksid, ili organskih baza, kao što je izopropilamin, trimetilamin, histidin ili prokain. Farmaceutske soli su uglavnom rastvorljivije u vodi i drugim protičnim rastvaračima od odgovarajućih oblika slobodnih baza.
Postupci lečenja i preparati
Svaki od imunokonjugata koji su ovde dati može biti upotrebljen u postupcima lečenja. Imunokonjugati iz predmetnog pronalaska se mogu koristiti kao imunoterapeutski agensi, na primer, u lečenju raka.
Za upotrebu u terapeutskim postupcima, imunokonjugati iz predmetnog pronalaska se formulišu, doziraju i primenjuju na način saglasan sa dobrom medicinskom praksom. U ovom kontekstu se mogu razmatrati faktori kao što su konkretni poremećaj koji se leči, konkretni sisar koji se leči, kliničko stanje pojedinačnog pacijenta, uzrok poremećaja, mesto isporuke agensa, postupak primene, raspored primene, i drugi faktori poznati lekarima.
Imunokonjugati iz predmetnog pronalaska mogu biti posebno korisni u lečenju bolesti kod kojih je stimulacija imunog sistema domaćina korisna, posebno stanja kod kojih je poželjan pojačan ćelijski imunološki odgovor. Ovo može uključivati bolesti gde imunski odgovor domaćina nije dovoljan ili je deficijentan. Bolesti za koje se imunokonjugati iz pronalaska mogu primeniti obuhvataju, na primer, tumor ili infekciju, gde bi ćelijski imunološki odgovor bio kritični mehanizam za specifični imunitet. Imunokonjugati iz ovog pronalaska mogu se primenjivati samostalno ili u bilo kojoj pogodnoj farmaceutskoj kompoziciji.
U jednom aspektu, obezbeđeni su imunokonjugati iz pronalaska za upotrebu kao lek. U daljim aspektima, obezbeđeni su imunokonjugati iz pronalaska za upotrebu u lečenju bolesti. U određenim otelotvorenjima, obezbeđeni su imunokonjugati iz pronalaska za upotrebu u postupku lečenja. U jednom aspektu otkrića, imunokonjugat je obezbeđen kako je ovde opisano za upotrebu u lečenju bolesti kod pojedinca kome je to potrebno, pri čemu je bolest kancer. U određenim otelotvorenjima, pronalazak obezbeđuje imunokonjugat za upotrebu u postupku lečenja pojedinca koji ima bolest koji se sastoji od davanja pojedincu terapeutski efikasne količine imunokonjugata, pri čemu je bolest kancer. U određenim otelotvorenjima, postupak se dalje sastoji od primene terapeutski efikasne količine najmanje jednog dodatnog terapeutskog agensa, npr. antikancerogenog agensa, ako je lečena bolest kancer. U daljim aspektima otkrića, obezbeđen je imunokonjugat za upotrebu u stimulaciji imunskog sistema. U određenim aspektima otkrića, imunokonjugat je obezbeđen za upotrebu u postupku stimulacije imunskog sistema kod pojedinca koji se sastoji od davanja pojedincu efikasne količine imunokonjugata za stimulaciju imunskog sistema. Prema svim gorenavedenim otelotvorenjima „pojedinac” je sisar, poželjno čovek. Prema svim gorenavedenim otelotvorenjima ili aspektima, „stimulacija imunog sistema” može uključivati jedno ili više od opšteg povećanja imunološke funkcije, povećanja funkcije T ćelija, povećanja funkcije B ćelija, restauracije funkcije limfocita, povećanja ekspresije receptora IL-2, povećanja T ćelijske reakcije, povećanja aktivnosti ćelija prirodnih ubica ili aktivnosti ćelija ubica aktiviranih limfokinom (LAK), i slično.
U daljem aspektu otkrića, obezbeđena je upotreba imunokonjugata iz pronalaska u proizvodnji ili pripremi leka. U jednom aspektu otkrića, lek je namenjen za lečenje bolesti kod pojedinca kome je to potrebno. U jednom aspektu otkrića, lek je namenjen za upotrebu u postupku lečenja bolesti koji obuhvata davanje pojedincu koji ima bolest terapeutski efikasne količine leka. U određenim aspektima otkrića, bolest koja se leči je proliferativni poremećaj. U posebnom aspektu otkrića, bolest je kancer. U jednom aspektu otkrića, postupak se dalje sastoji od davanja pojedincu terapeutski efikasne količine najmanje jednog dodatnog terapeutskog agensa, npr. antikancerogenog agensa, ako je lečena bolest kancer. U daljem aspektu otkrića, lek je za stimulisanje imunološkog sistema. U daljem aspektu otkrića, lek je za upotrebu u postupku stimulisanja imunskog sistema kod pojedinca, što obuhvata davanje pojedincu efikasne količine leka za stimulaciju imunskog sistema. „Pojedinac”, prema bilo kom od gornjih aspekata otkrića, može biti sisar, poželjno čovek. Prema svim gorenavedenim primerima aspektima otkrića, „stimulacija imunskog sistema” može uključivati jedno ili više od opšteg povećanje imunološke funkcije, povećanja funkcije T ćelija, povećanja funkcije B ćelija, restauracije funkcije limfocita, povećanja ekspresije receptora IL-2, povećanja T ćelijske reakcije, povećanja aktivnosti ćelija prirodnih ubica ili aktivnosti ćelija ubica aktiviranih limfokinom (LAK), i slično.
U daljem aspektu, otkriće obezbeđuje postupak za lečenje bolesti kod pojedinca. U jednom aspektu otkrića, postupak uključuje davanje pojedincu koji ima takvu bolest terapeutski efikasne količine imunokonjugata iz pronalaska. U jednom aspektu otkrića, na pomenutoj osobi se primenjuje kompozicija koja sadrži imunokonjugat iz pronalaska u farmaceutski prihvatljivom obliku. U određenim aspektima otkrića, bolest koja se leči je proliferativni poremećaj. U posebnom aspektu otkrića, bolest je kancer. U određenim aspektima otkrića, metod se dalje sastoji od primene na pojedincu terapeutski delotvorne količine najmanje jednog
1
dodatnog terapeutskog agensa, npr. antikancerogenog agensa, ako je lečena bolest kancer. U daljem aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje postupak za stimulaciju imunskog sistema kod pojedinca, koji obuhvata davanje pojedincu efektivne količine imunokonjugata radi stimulacije imunološkog sistema. „Pojedinac”, prema bilo kom od gornjih aspekata otkrića, može biti sisar, poželjno čovek. Prema svim gorenavedenim primerima aspektima otkrića, „stimulacija imunskog sistema” može uključivati jedno ili više od opšteg povećanje imunološke funkcije, povećanja funkcije T ćelija, povećanja funkcije B ćelija, restauracije funkcije limfocita, povećanja ekspresije receptora IL-2, povećanja T ćelijske reakcije, povećanja aktivnosti ćelija prirodnih ubica ili aktivnosti ćelija ubica aktiviranih limfokinom (LAK), i slično.
U određenim otelotvorenjima ili aspektima pronalaska, bolest koja se leči je proliferativni poremećaj, posebno kancer. Neograničavajući primeri kancera uključuju kancer bešike, mozga, glave i vrata, pankreasa, pluća, dojke, jajnika, materice, grlića materice, endometrijalni kancer, kancer jednjaka, debelog creva, kolorektalni kancer, rektalni kancer, kancer želuca, kancer prostate, krvi, kože, karcinom skvamoznih ćelija, kancer kostiju i kancer bubrega. Drugi poremećaji proliferacije ćelija koji se mogu lečiti korišćenjem imunokonjugata iz predmetnog pronalaska uključuju, ali nisu ograničeni na, neoplazme locirane u: stomaku, kostima, dojci, digestivnom sistemu, jetri, pankreasu, peritoneumu, endokrinim žlezdama (nadbubrežnoj, paratiroidnoj, hipofizi, testisima, jajnicima, grudnoj, tiroidnoj žlezdi), očima, glavi i vratu, nervnom sistemu (centralnom i perifernom), limfnom sistemu, karlici, koži, mekom tkivu, slezini, grudnom košu ili urogenitalnom sistemu. Obuhvaćena su i pretkancerozna stanja ili lezije i metastaze kancera. U određenim otelotvorenjima, kancer je izabran iz grupe koju čine kancer bubrega, kancer kože, kancer pluća, kolorektalni kancer, kancer dojke, kancer mozga, kancer glave i vrata, kancer prostate i kancer bešike. Obučeni stručnjak zna da u mnogim slučajevima imunokonjugat možda neće obezbediti lek, već samo delimično olakšanje. U nekim otelotvorenjima, fiziološka promena koja ima određene koristi takođe se smatra terapeutski korisnom. Stoga, u nekim otelotvorenjima, količina imunokonjugata koja obezbeđuje fiziološku promenu smatra se „efektivnom količinom” ili „terapeutski efektivnom količinom”. Ispitanik, pacijent ili pojedinac kome treba lečenje tipično je sisar, konkretnije čovek.
U nekim aspektima otkrića, efektivna količina imunokonjugata iz pronalaska se primenjuje na ćeliju. U drugim aspektima otkrića, terapeutski efektivna količina imunokonjugata iz pronalaska se primenjuje na pojedincu radi lečenja bolesti.
Za prevenciju ili lečenje bolesti, odgovarajuća doza imunokonjugata iz predmetnog pronalaska (kada se koristi samostalno ili u kombinaciji sa jednim ili više drugih dodatnih
2
terapeutskih agensa) zavisiće od vrste bolesti koja se leči, vrste primene, telesne težine pacijenta, vrste molekula (npr. sadrži Fc domen ili ne), težine i toka bolesti, od toga da li se imunokonjugat primenjuje u preventivne ili terapeutske svrhe, kao i od prethodne ili konkurentne terapije, kliničke istorije pacijenta i njegovog odgovora na imunokonjugat, i odluke nadležnog lekara. Lekar zadužen za primenu, u svakom slučaju, određuje koncentraciju aktivnih sastojaka u kompoziciji i odgovarajuću dozu (odgovarajuće doze) za svakog ispitanika. Ovde su razmatrani različiti rasporedi doziranja uključujući, bez ograničenja, pojedinačnu ili višestruku primenu u različitim terminima, bolusnu primenu i pulsnu infuziju.
Imunokonjugat se pogodno primenjuje na pacijenta jednokratno ili kao serija terapija. U zavisnosti od vrste i težine bolesti, oko 1 µg/kg do 15 mg/kg (npr. 0,1 mg/kg − 10 mg/kg) imunokonjugata može biti kandidat za početnu dozu za primenu na pacijentu, na primer, putem jedne ili više odvojenih primena, ili kao kontinualna infuzija. Jedna tipična dnevna doza se može kretati u opsegu od oko 1 µg/kg do 100 mg/kg ili više, u zavisnosti od gorepomenutih faktora. Kod ponovljene primene u trajanju od nekoliko dana ili duže, u zavisnosti od stanja, lečenje će po pravilu biti nastavljeno sve do željenog suzbijanja simptoma bolesti. Doza imunokonjugata navedena kao primer bila bi u opsegu od oko 0,005 mg/kg do oko 10 mg/kg. U drugim neograničavajućim primerima, doza može da sadrži i od oko 1 mikrogram/kg telesne težine, oko 5 mikrograma/kg telesne težine, oko 10 mikrograma/kg telesne težine, oko 50 mikrograma/kg telesne težine, oko 100 mikrograma/kg telesne težine, oko 200 mikrograma/kg telesne težine, oko 350 mikrograma/kg telesne težine, oko 500 mikrograma/kg telesne težine, oko 1 miligram/kg telesne težine, oko 5 miligrama/kg telesne težine, oko 10 miligrama/kg telesne težine, oko 50 miligrama/kg telesne težine, oko 100 miligrama/kg telesne težine, oko 200 miligrama/kg telesne težine, oko 350 miligrama/kg telesne težine, oko 500 miligrama/kg telesne težine, do oko 1000 mg/kg telesne težine ili više po primeni, i svaki raspon dobijen iz toga. U neograničavajućim primerima raspona dobijenih iz ovde navedenih brojeva, može se primeniti raspon od oko 5 mg/kg telesne težine do oko 100 mg/kg telesne težine, oko 5 mikrograma/kg telesne težine do oko 500 miligrama/kg telesne težine, itd., na osnovu gore opisanih brojeva. Stoga se jedna ili više doza od oko 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 5,0 mg/kg ili 10 mg/kg (ili bilo koja njihova kombinacija) može dati pacijentu. Takve doze se mogu primenjivati povremeno, npr., svake nedelje ili svake tri nedelje (npr. tako da pacijent primi od oko dve do oko dvadeset, ili npr. oko šest doza imunokonjugata). Može se primeniti veća početna doza, a nakon toga jedna ili više manjih doza. Međutim, mogu biti korisni i drugi dozni režimi. Napredak ove terapije jednostavno se prati klasičnim tehnikama i testovima.
Imunokonjugati iz pronalaska će se uopšteno koristiti u količini koja je efektivna za postizanje predviđene svrhe. Za lečenje ili prevenciju stanja bolesti, imunokonjugati iz pronalaska, ili njihove farmaceutske kompozicije, daju se ili primenjuju u terapeutski delotvornim količinama. Određivanje terapeutski delotvorne količine poznato je stručnim licima iz ove oblasti, naročito u smislu ovog detaljnog obrazloženja.
U pogledu sistemske primene, terapeutski efikasna doza se može inicijalno proceniti putem in vitro testova, kao što su testovi kulture ćelija. Zatim doza može biti formulisana prema životinjskom modelu kako bi se dostigao raspon koncentracija u krvotoku koji uključuje IC50, kao što je utvrđeno kulturom ćelija. Takve informacije mogu da se koriste za preciznije utvrđivanje korisnih doza za ljude.
Inicijalne doze takođe mogu da se procene na osnovu in vivo podataka, npr. životinjskih modela, koristeći tehnike koje su dobro poznate u struci. Lice standardne stručnosti iz ove oblasti može brzo da optimizuje davanje leka ljudima na osnovu podataka o životinjama.
Doza i interval primene mogu se pojedinačno podesiti kako bi se obezbedili nivoi imunokonjugata u plazmi koji su dovoljni za održavanje terapeutskog dejstva. Uobičajena doza za primenu na pacijentima putem injekcija ima raspon od oko 0,1 mg/kg/dan do 50 mg/kg/dan, tipično od oko 0,5 mg/kg/dan do 1 mg/kg/dan. Terapeutski delotvorni nivoi u plazmi se mogu dostići primenom višestrukih doza svakog dana. Nivoi u plazmi se mogu meriti, na primer, HPLC hromatografijom.
U slučajevima lokalne primene ili selektivnog unosa, efikasna lokalna koncentracija imunokonjugata ne mora da bude u vezi sa koncentracijom u plazmi. Stručnjaci u ovoj oblasti mogu da optimizuju terapeutski efikasnu lokalnu dozu bez nepotrebnog eksperimentisanja.
Terapeutski efikasna doza ovde opisanih imunokonjugata uopšteno obezbeđuje terapeutske koristi bez izazivanja značajne toksičnosti. Toksičnost i terapeutska efikasnost imunokonjugata mogu se odrediti standardnim farmaceutskim procedurama u ćelijskoj kulturi ili eksperimentalnim životinjama. Testovi u kulturi ćelija i studije na životinjama mogu se koristiti za utvrđivanje LD50(doza koja je smrtonosna za 50% populacije) i ED50(doza terapeutski delotvorna za 50% populacije). Odnos toksičnih i terapeutskih dejstava doze predstavlja terapeutski indeks, koji se može izraziti kao odnos LD50/ED50. Poželjni su imunokonjugati koji pokazuju visoke terapeutske indekse. U jednom otelotvorenju, imunokonjugat prema predmetnom pronalasku pokazuje visok terapeutski indeks. Podaci dobijeni iz testova kulture ćelija i studija na životinjama mogu se koristiti za formulisanje raspona doza pogodnih za ljudsku upotrebu. Poželjno je da se doza nalazi u rasponu koncentracija u krvotoku koji uključuje ED50sa malom količinom ili bez toksičnosti. Doza može da varira u okviru raspona u zavisnosti od različitih faktora, npr. primenjeni oblik doze,
4
način primene, stanje ispitanika, i slično. Tačnu formulaciju, način primene i dozu može izabrati lekar nakon osvrta na stanje pacijenta. (Videti, npr., Fingl et al., 1975, u: The Pharmacological Basis of Therapeutics, pogl. 1, str. 1, ovde uključeno u celini putem reference).
Lekar zadužen za pacijente koji se leče imonokonjugatima iz pronalaska zna kada i kako treba da okonča, prekine ili podesi primenu zbog toksičnosti, nepravilnog rada organa, i slično. Sa druge strane, lekar zna i da podesi lečenje na viši nivo, ako klinički odgovor nije adekvatan (isključujući toksičnost). Jačina primenjene doze radi kontrole bolesti menjaće se u skladu sa ozbiljnošću stanja koje se leči, načina primene, i slično. Ozbiljnost bolesti može se, na primer, oceniti standardnim postupcima prognostičke evaluacije. Takođe, doza i možda učestalost doze takođe će se menjati u zavisnosti od godina, telesne težine i odgovora pojedinačnih pacijenata.
Maksimalna terapijska doza imunokonjugata koji sadrži mutantni polipeptid IL-2 kako je ovde opisano može se povećati u odnosu na one korišćene za imunokonjugat koji sadrži IL-2 divljeg tipa.
Ostali agensi i tretmani
Imunokonjugati iz predmetnog pronalaska mogu se primenjivati u kombinaciji sa jednim ili više agensa tokom terapije. Na primer, imunokonjugat iz predmetnog pronalaska može biti primenjen uz najmanje jedan dodatni terapeutski agens. Termin „terapeutski agens” obuhvata sve agense za lečenje simptoma ili bolesti pojedinca kome treba lečenje. Takvi dodatni terapeutski agensi takođe mogu da sadrže bilo koji aktivni sastojak pogodan za određene indikacije koje se leče, poželjno one sa komplementarnim aktivnostima koje ne utiču negativno jedna na drugu. U određenim otelotvorenjima, dodatni terapeutski agens je imunomodulatorski agens, citostatički agens, inhibitor ćelijske adhezije, citotoksični agens, aktivator ćelijske apoptoze ili agens koji povećava osetljivost ćelija na apoptičke induktore. U posebnom otelotvorenju, dodatni terapeutski agens je antikancerogeni agens, na primer, uništavač mikrotubula, antimetabolit, inhibitor topoizomeraze, DNK interkalator, alkilujući agens, hormonska terapija, inhibitor kinaze, antagonist receptora, aktivator apoptoze tumorske ćelije ili antiangiogeni agens.
Takvi drugi agensi su pogodno prisutni u kombinaciji u količinama koje su efikasne za nameravane svrhe. Efikasna količina takvih drugih agensa zavisi od količine imunokonjugata koji se koriste, vrste poremećaja ili lečenja, kao i drugih faktora koji su razmatrani u gornjem tekstu. Imunokonjugati se opšte koriste u istim dozama i sa istim načinom primene kao što je gore opisano, ili od oko 1 do 99% doza koje su ovde opisane, ili u bilo kojoj dozi i sa bilo kojim načinom primene za koje je empirijski/klinički dokazano da su odgovarajući.
Takve kombinovane terapije koje su gore pomenute obuhvataju kombinovanu primenu (gde su dva ili više terapeutskih agensa uključeni u istu kompoziciju ili u različite kompozicije) i odvojenu primenu, što znači da primena imunokonjugata iz predmetnog pronalaska može da se odigra pre primene dodatnog terapeutskog agensa i/ili adjuvansa, istovremeno sa njim i/ili nakon njegove primene. Imunokonjugati iz pronalaska mogu se takođe upotrebiti u kombinaciji sa radijacionom terapijom.
Proizvodi
U drugom aspektu predmetnog pronalaska, obezbeđen je proizvod koji sadrži materijale korisne za lečenje, prevenciju i/ili dijagnostikovanje gore opisanih poremećaja. Proizvod uključuje pakovanje i etiketu ili uputstvo za upotrebu, na pakovanju ili uz njega. Odgovarajuća ambalaža uključuje, na primer, boce, bočice, špriceve, kese za i.v. rastvor itd.
Pakovanja mogu biti od različitih materijala, kao što su staklo ili plastika. Pakovanje sadrži preparat koji je sam po sebi ili u kombinaciji sa drugim preparatom efikasan u lečenju, prevenciji i/ili dijagnostikovanju stanja, i može imati priključak za sterilni pristup (na primer, pakovanje može biti kesa za intravenski rastvor ili bočica sa zapušačem koji može da se probuši iglom za potkožnu injekciju). Najmanje jedan aktivni agens u kompoziciji je imunokonjugat iz predmetnog pronalaska. Etiketa ili uputstvo za upotrebu ukazuje na to da se preparat koristi za lečenje stanja po izboru. Pored toga, proizvod može da sadrži (a) prvo pakovanje sa kompozicijom koja se u njemu nalazi, pri čemu kompozicija sadrži imunokonjugat iz pronalaska; i (b) drugo pakovanje sa kompozicijom koja se u njemu nalazi, pri čemu kompozicija sadrži dodatni citotoksični ili drugi terapeutski agens. Proizvod u ovom otelotvorenju predmetnog pronalaska može dodatno da sadrži uputstvo za upotrebu koje ukazuje da kompozicije mogu da se koriste za lečenje određenog stanja. Alternativno, ili dodatno, proizvod može dalje da sadrži drugo (ili treće) pakovanje koje sadrži farmaceutski prihvatljiv pufer, kao što je bakteriostatska voda za injekcije (BWFI), fiziološki rastvor sa fosfatnim puferom, Ringerov rastvor i rastvor dekstroze. Proizvod može dodatno da sadrži druge materijale poželjne sa komercijalnog aspekta i sa aspekta upotrebe, uključujući druge pufere, razblaživače, filtere, igle i špriceve.
Kratak opis slika
Slika 1. Šematski prikaz formata imunokonjugata IgG-IL-2, koji sadrži mutantni polipeptid IL-2.
Slika 2. Vezivanje PD1-IL2v za CD4 T ćelije (A) i CD8 T ćelije (B) unutar PHA aktiviranih PBMC, u poređenju sa PD1 IgG i CEA-IL2v.
Slika 3. Proliferacija NK ćelija (A), CD8 T ćelija (B) i CD4 T ćelija (C) unutar PBMC sa PD1-IL2v, CEA-IL2v i kombinacijom PD1 IgG i CEA-IL2v. PD1 IgG je uključen kao kontrola.
Slika 4. Aktivacija NK ćelija (A), CD8 T ćelija (B) i CD4 T ćelija (C) unutar PBMC sa PD1-IL2v, CEA-IL2v i kombinacijom PD1 IgG i CEA-IL2v. PD1 IgG je uključen kao kontrola. Ekspresija CD25 na NK ćelijama, CD4 T ćelijama i CD8 T ćelijama korišćena je kao marker aktivacije.
Slika 5. Proliferacija PHA prethodno aktiviranih CD8 T ćelija (A) i CD4 T ćelija (B) unutar PBMC sa PD1-IL2v, CEA-IL2v i kombinacijom PD1 IgG i CEA-IL2. PD1 IgG je uključen kao kontrola.
Slika 6. Aktivacija PHA prethodno stimulisanih CD8 T ćelija (A) i CD4 T ćelija (B) unutar PBMC sa PD1-IL2v, CEA-IL2v i kombinacijom PD1 IgG i CEA-IL2v. PD1 IgG je uključen kao kontrola. Ekspresija CD25 na CD4 T ćelijama i CD8 T ćelijama korišćena je kao marker aktivacije.
Slika 7. Proliferacija humane NK92 ćelijske linije NK izazvana sa PD-L1-IL2v u poređenju sa CEA-IL2v (A), ili sa PD-L1-IL2v u poređenju sa PD1-IL2v (B), merena nakon 2 dana.
Slika 8. Vezivanje PD-L1-muIL2v i PD-L1 muIgG1 za PD-L1 pozitivnu T ćelijsku liniju miša CTLL2.
Slika 9. Proliferacija mišje PD-L1 pozitivne T ćelijske linije CTLL2 indukovana sa PD1-muIL2v u poređenju sa CEA-muIL2v (A), ili sa PD1-muIL2v u poređenju sa PD-L1-muIL2v (B), određena nakon 3 dana.
Slika 10. Rezultati eksperimenta efikasnosti sa PD1-IL2v, PD-L1-IL2v ili PD1 i PD-L1 antitelima kao pojedinačnim agensima. Panc02-H7-Fluc transficirana ćelijska linija karcinoma pankreasa injektovana je u pankreas crnih 6 miševa kako bi se proučilo preživljavanje na ortotopskom singenskom modelu pankreasa.
Slika 11. Rezultati eksperimenta efikasnosti sa PD1-IL2v, PD-L1-IL2v ili PD1 i PD-L1 antitelima kao pojedinačnim agensima. Panc02-H7-Fluc transficirana ćelijska linija karcinoma pankreasa injektovana je u pankreas crnih 6 miševa kako bi se proučilo preživljavanje na ortotopskom singenskom modelu pankreasa pomoću bioluminiscencije.
Slika 12. Sposobnost CD4 T ćelija da luče IL-2 (A), IL-2 i IFN-γ (B) ili IFN-γ (C) nakon 48 sati opoziva sa CMV imunogenim proteinom pp65 u prisustvu anti-PD-1 ili anti-PD-L1 samostalno, u kombinaciji sa IL-2v, ili u vidu fuzionih proteina.
Slika 13. Stanje diferencijacije CD4 T ćelija specifičnih za virus koje luče samo IL-2 (A), i IL-2 i IFN-γ (B), ili samo IFN-γ (C i D) nakon 48 sati opoziva sa CMV imunogenim proteinom pp65 u prisustvu anti-PD-1 ili anti-PD-L1 samostalno, u kombinaciji sa IL-2v, ili u vidu fuzionih proteina.
Slika 14. Test kompetitivnog vezivanja PD1 i PD1-IL2v za aktivirane konvencionalne i regulatorne T ćelije. Razlika frekvencije vezivanja za Tkonvnaspram Treg(Slika 14A) i vezivanje za Tkonvi Treg(Slika 14B).
Slika 15. Reverzibilnost PD1-IL2v Tregsupresije Tkonv. Procenat supresije pomoću Treggranzima B (Slika 15A) i interferona-γ (Slika 15B) koje luči Tkonvposle 5 dana zajedničkog uzgajanja.
Slika 16. Rezultati eksperimenta efikasnosti koji poredi muPD1-IL2v sa muFAP-IL2v i muPD-1 antitelima kao pojedinačnim agensima i u kombinaciji.
Slika 17. Rezultati eksperimenta efikasnosti koji poredi muPD1-IL2v sa FAP-IL2v, muPD1 i njihovu kombinaciju.
Slika 18A i 18B. Imunohistohemijske slike tumora pankreasa obojene na anti-mišji CD3 (Slika 18A) i analiza kvantifikacije T ćelija (Slika 18B).
Slika 19. Imunohistohemijske slike tumora pankreasa obojene na anti-mišji PD1. Slika 20. Imunohistohemijske slike tumora pankreasa obojene na anti-mišji ICOS. Slika 21. Rezultati eksperimenta efikasnosti koji poredi muPD1-IL2v sa FAP-IL2v i muPD1 kao pojedinačnim agensima i u kombinaciji.
Slika 22. Rezultati eksperimenta efikasnosti koji porede muPD1-IL2v sa FAP-IL2v, muPD1 i njihovu kombinaciju sa dve različite doze.
Slika 23. Imunohistohemijske slike tumora pankreasa obojene na anti-mišji CD3. Slika 24A i 24B. Imunohistohemijske slike tumora pankreasa obojene na anti-mišji CD8 (Slika 24A) i analiza kvantifikacije T ćelija (Slika 24B).
Slika 25A i 25B. Imunohistohemijske slike tumora pankreasa obojene na anti-granzim B (Slika 25A) i analiza kvantifikacije površine markera granzima B (Slika 25B).
Slika 26A i 26B. Imunohistohemijske slike tumora pankreasa obojene na anti-mišji PD1 (Slika 26A) i analiza kvantifikacije PD1 pozitivnih ćelija (Slika 26B).
Slika 27A-D. Sposobnost CD4 T ćelija da luče IL-2 (A), IL-2 i IFN-γ (B) ili IFN-γ (C) i da se umnožavaju (D) nakon 48 sati opoziva sa CMV imunogenim proteinom pp65 u prisustvu bilo anti-PD-1 samog, u kombinaciji sa IL-2v, ili kao fuzionog proteina.
Slika 28. Stanje diferencijacije, prema ekspresiji CD45RO i CD62L, CD4 T ćelija specifičnih za virus koje luče IFN-γ nakon 48 sati opoziva sa CMV imunogenim proteinom pp65 u prisustvu anti-PD-1 samostalno, u kombinaciji sa IL-2v, ili kao fuzionog proteina.
Slika 29A-D. STAT5 test na PBMC u mirovanju prvog donora (CD8 T-ćelije (A), NK ćelije (B), CD4 T-ćelije (C) i regulatorne T-ćelije (D)).
Slika 30A-D. STAT5 test na PBMC u mirovanju drugog donora (CD4 T-ćelije (A), CD8 T-ćelije (B), regulatorne T-ćelije (C) i NK ćelije (D)).
Slika 31A-D. STAT5 test na PBMC u mirovanju trećeg donora (CD8 T-ćelije (A), NK ćelije (B), CD4 T-ćelije (C) i regulatorne T-ćelije (D)).
Slika 32A-D. STAT5 test na PBMC u mirovanju četvrtog donora (CD8 T-ćelije (A), NK ćelije (B), CD4 T-ćelije (C) i regulatorne T-ćelije (D).
Aminokiselinske sekvence
1
2
4
Primeri
U nastavku su dati primeri za postupke i preparate iz pronalaska. Podrazumeva se da mogu biti primenjena razna druga otelotvorenja, na osnovu opšteg opisa koji je gore dat.
Primer 1
Primer 1A. Priprema PD1-IL2v fuzionih proteina
Ekspresiona kaseta za fuzioni protein teškog lanca antitela − interleukina-2 (IL-2) [varijabilni region teškog lanca anti-humanog PD-1 antitela, teški lanac humanog IgG1(koji nosi mutacije L234A, L235A i P329G (EU numeracija) za uklanjanje efektorskih funkcija, i mutacije S354C i T366W (EU numeracija) za heterodimerizaciju („dugme“)), (G4S)3linker i humani IL-2v (koji nosi mutacije T3A, F42A, Y45A, L72G i C125A)], ekspresiona kaseta za teški lanac antitela [varijabilni region teškog lanca anti-humanog PD-1 antitela i teški lanac humanog IgG1(sa mutacijama L234A, L235A i P329G (EU numeracija) za uklanjanje efektorskih funkcija, mutacije Y349C, T366S, L368A i Y410V (EU numeracija) za heterodimerizaciju („rupica“), i opciono mutacije H435R i I436F (EU numeracija)] i ekspresiona kaseta za laki lanac antitela [varijabilni region lakog lanca anti-humanog PD-1 antitela, i konstantni region humanog Ckapa] i proizvedena je sintezom gena.
Svaka od njih je klonirana putem HindIII i NheI digestije u ekspresioni vektor pod kontrolom CMV-promotora, praćen intronom A i prekinut BGH-poly A signalom. Vektor je dalje sadržao gen otpornosti na bakterijski ampicilin i poreklo replikacije iz E.coli.
Humani PD1-IL-2v fuzioni protein (SEK ID NO 22, 24 i 25) generisan je kotransfekcijom ćelija HEK293F (Invitrogen) sa gore opisanim vektorima u odnosu 1:1:1 u bocama za mućkanje. Posle nedelju dana supernatant je sakupljen i filtriran kroz sterilne filtere.
Fuzioni protein je prečišćen iz supernatanta kombinacijom afinitetne hromatografije sa proteinom A i hromatografije na molekulskim sitima. Identitet dobijenog proizvoda je okarakterisan masenom spektrometrijom i analitičkim osobinama kao što su čistoća na osnovu kapilarne elektroforeze (CE-SDS), sadržaj monomera i stabilnost.
Mišji surogat fuzioni protein PD1-IL2v (SEQ ID NO 34-36) proizveden je analogno. Surogat molekul sadrži mišje IgG1 anti-mišje PD-1 antitelo (koje nosi Fc mutacije za uklanjanje efektorske funkcije i za heterodimerizaciju) i mišji interleukin-2 sa mutacijama analognim humanom molekulu.
Oba fuziona proteina se mogu proizvesti u dobrim prinosima i stabilni su.
Primer 1B. Priprema fuzionih proteina PD-L1-IL2v
Ekspresiona kaseta za fuzioni protein teškog lanca antitela − interleukin-2 (IL-2) [varijabilni region teškog lanca anti-humanog PD-L1 antitela, teški lanac humanog IgG1(koji nosi mutacije L234A, L235A i P329G (EU numeracija) za uklanjanje efektorskih funkcija i mutacije S354C i T366W (EU numeracija) za heterodimerizaciju („dugme“)), (G4S)3linker i humani IL-2v (koji nosi mutacije T3A, F42A, Y45A, L72G i C125A)], ekspresiona kaseta za teški lanac antitela [varijabilni region teškog lanca anti-humanog PD-L1 antitela i teški lanac humanog IgG1(sa mutacijama L234A, L235A i P329G (EU numeracija) za uklanjanje efektorskih funkcija, mutacije Y349C, T366S, L368A i Y410V (EU numeracija) za heterodimerizaciju („rupica“))], i ekspresiona kaseta za laki lanac antitela [varijabilni region lakog lanca anti-humanog PD-L1 antitela i konstantni region humanog Ckapa] proizvedeni su sintezom gena. Ekspresiju antitela pokretao je himerni MPSV promotor, a sintetička polyA signalna sekvenca se nalazila na 3' kraju CDS-a. Pored toga, svaki vektor je sadržao sekvencu EBV OriP.
Molekuli su proizvedeni kotransfekcijom HEK293-EBNA ćelija uzgajanih u suspenziji sa ekspresionim vektorima sisara, koristeći polietilenimin. Ćelije su transficirane odgovarajućim ekspresionim vektorima u odnosu 1:1:2 („vektorski teški lanac (VH-CH1-CH2-CH3-IL2v)“: „vektorski teški lanac (VH-CH1-CH2-CH3)“: „vektorski laki lanac (VL-CL)“).
Za transfekciju HEK293 EBNA ćelije su uzgajane u suspenziji u medijumu za uzgajanje Excell bez seruma koji sadrži 6 mM L-glutamin i 250 mg/l G418 medijuma za uzgajanje. Za proizvodnju u tubespin bocama od 600 ml (maksimalna radna zapremina 400 ml), 600 miliona ćelija HEK293 EBNA je zasejano 24 sata pre transfekcije. Za transfekciju, ćelije su centrifugirane 5 minuta na 210 x g, a supernatant je zamenjen sa 20 ml prethodno zagrejanog CD CHO medijuma. Ekspresioni vektori su pomešani u 20 ml CD CHO medijuma do konačne količine od 400 µg DNK. Nakon dodavanja 1080 µl rastvora PEI (2,7 µg/ml), smeša je mešana na vorteksu tokom 15 s, i zatim inkubirana 10 minuta na sobnoj temperaturi. Nakon toga, ćelije su pomešane sa rastvorom DNK/PEI, prebačene u tubespin bocu od 600 ml i inkubirane 3 sata na 37 °C u inkubatoru, u atmosferi sa 5% CO2. Posle inkubacije, dodato je 360 ml Excell 6 mM L-glutamina 5 g/l Pepsoy 1,0 mM VPA medijuma i ćelije su uzgajane 24 sata. Dan nakon transfekcije dodato je 7% Feed 7. Nakon 7 dana uzgajanja, supernatant je sakupljen za prečišćavanje centrifugiranjem tokom 20-30 minuta na 3600 x g (Sigma 8K centrifuga), rastvor je sterilno filtriran (filter od 0,22 mm) i dodat je natrijum azid u finalnoj koncentraciji od 0,01% (m/V). Rastvor je čuvan na 4 °C.
Humani PD-L1-IL2v konstrukt (SEQ ID NO: 37-39) prečišćen je jednim afinitetnim korakom sa proteinom A (MabSelectSure, GE Healthcare) nakon čega je usledila hromatografija na molekulskim sitima (HiLoad 16/60 Superdex 200, GE Healthcare). Kod afinitetne hromatografije, supernatant je nanet na kolonu HiTrap ProteinA HP (CV = 5 ml, GE Healthcare), ekvilibrisan sa 25 ml 20 mM natrijum fosfata, 20 mM natrijum citrata, pH 7,5. Nevezani protein je uklonjen ispiranjem sa najmanje 10 zapremina kolone 20 mM natrijum fosfata, 20 mM natrijum citrata, pH 7,5, i ciljni protein je eluiran sa 6 zapremina kolone 20 mM natrijum citrata, 100 mM natrijum hlorida, 100 mM glicina, 0,01% Tween20, pH 3,0. Proteinski rastvor je neutralisan dodavanjem 1/100,5 M natrijum fosfata, pH 8,0. Ciljni protein je koncentrovan i filtriran pre nanošenja na kolonu HiLoad Superdex 200 (GE Healthcare) ekvilibrisanu rastvorom 20 mM histidina, 140 mM natrijum hlorida, pH 6,0, 0,01% Tween20.
Mišji PD-L1-IL2v konstrukt (SEQ ID NO: 40-42) takođe je prečišćen jednim afinitetnim korakom sa proteinom A (MabSelectSure, GE Healthcare) nakon čega je usledila hromatografija na molekulskim sitima (HiLoad 16/60 Superdex 200, GE Healthcare). Za afinitetnu hromatografiju, supernatant je pomešan 1:1 sa 2 M glicinom, 0,6 M NaCl pH 8,6 i nanet na HiTrap ProteinA HP kolonu (CV=5 ml, GE Healthcare) ekvilibrisanu sa 25 ml 1 M glicina, 0,3 M NaCl pH 8,6. Nevezani protein je uklonjen ispiranjem u najmanje 10 zapremina kolone 1 M glicinom, 0,3 M NaCl pH 8,6 i ciljni protein je eluiran sa 6 zapremina kolone 1 M glicinom, 0,3 M NaCl pH 4,0. Proteinski rastvor je neutralisan dodavanjem 1/100,5 M natrijum fosfata, pH8,0. Ciljni protein je koncentrovan i filtriran pre nanošenja na kolonu HiLoad Superdex 200 (GE Healthcare) ekvilibrisanu rastvorom 20 mM histidina, 140 mM natrijum hlorida, pH 6,0, 0,01% Tween20.
Finalni preparat humanog PD-L1-IL2v sadržao je 99% monomera (određeno na TSKgel G3000 SW KSL analitičkoj koloni sa molekulskim sitima (Tosoh) u 25 mM K2HPO4, 125 mM NaCl, 200 mM L-arginin monohidrohlorida, 0,02% (m/V) NaN3, pH 6,7 radnog pufera na 25°C) i imao je čistoću 100% (određeno neredukovanom SDS kapilarnom elektroforezom na sistemu Caliper LabChip GXII (Caliper lifescience) koji se koristi prema uputstvima proizvođača). Proizvodni prinos je bio 23 mg/l. Analiza masenom spektrometrijom otkrila je uglavnom pravilno sastavljen molekul sa tragovima (<5%) molekula bez interleukina-2 (masena spektrometrija izvedena na Agilent LC-MS sistemu (Agilent Technologies) sa NUCLEOGEL RP1000-8, 250 mm x 4,6 mm kolonom (MACHEREY-NAGEL GmbH) i gradijentom acetonitril-mravlja kiselina).
Za mišji surogat PD-L1-IL2v, sadržaj monomera je bio 96%, čistoća 100% i proizvodni prinos 3,8 mg/l.
Primer 1C. Priprema mišjeg surogata CEA-IL2v i mišjeg surogata FAP-IL2v Murinizovani surogatni molekul IL-2 varijante imunocitokina sa ciljanim delovanjem na CEA, CEA-IL2v, nazvan muCEA-muIL2v (takođe se naziva muCEA-muIL2v), stvoren je za upotrebu na in vivo modelima tumora u potpuno imunokompetentnim miševima kako bi se smanjilo stvaranje antitela na lek (ADA). Dodatno, murinizovana himerna verzija IL-2 varijante imunocitokina sa ciljanim delovanjem na FAP, FAP-IL2v, nazvana muFAP-muIL2v (takođe se naziva muFAP-IL2v), stvorena je za upotrebu na in vivo modelima tumora u potpuno imunokompetentnim miševima kako bi se smanjilo stvaranje antitela na lek (ADA). U murinizovanim surogatnim molekulima, mutacije Fc domena „dugme u rupici“ zamenjene su DDKK mutacijama na muIgG1, a mutacije LALA P329G su zamenjene DAPG mutacijama na muIgG1 (kao što je otkriveno u PCT prijavi WO 2016/0330350 A1, koja je referencom uvrštena u celosti).
Na primer, muCEA-muIL2v karakterišu sledeća svojstva. Kao matično antitelo, primenjuje se humano-mišje himerno IgG1 antitelo sa humanim (humanizovanim) varijabilnim regionima, ali mišjim konstantnim regionima. Kako bi se izbegla potencijalna imunogenost, korišćen je odgovarajući alotip Black 6 (sekvencu objavio Mouse Genomes Project). Vezivanje za muIL2Ra ukinuto je putem tri mutacije koje su homologe onima identifikovanim u humanom IL-2v, i uklonjeno je odgovarajuće mesto O-glikozilacije: T23A (O-Glyco), F76A, Y79A, L106G. Pored toga, kao u aldesleukinu, cisteinski ostatak je mutiran kako bi se izbegla agregacija pomoću mutacije C160A (numeracija zasnovana na UniProt ID P04351, uključujući signalni peptid). Iako muIgG1 već ima smanjeno vezivanje FcγR, vezivanje za mišji FcγRs je potpuno ukinuto uvođenjem DAPG mutacija (D265A, P329G), dok je vezivanje muFcRn
1
zadržano. muIL-2v je fuzionisan pomoću neimunogenog (G4S)2konektora samo sa C terminusom jednog teškog lanca muIgG1 antitela. Da bi se to postiglo, imunocitokin je konstruisan elektrostatičkim upravljanjem putem DDKK mutacija u Fc domenu kako bi se omogućila heterodimerizacija na mišjoj osnovi.
Polipeptidne sekvence muCEA-muIL2v su sledeće:
Teški lanac sa DD mutacijom i sa fuzionisanim muIL2v (SEQ ID NO: 44):
Polipeptidne sekvence muFAP-muIL2v su sledeće:
Teški lanac sa DD mutacijom i sa fuzionisanim muIL2v (SEQ ID NO: 47):
2
Polipeptidne sekvence muPD1 su sledeće: Teški lanac (SEQ ID NO: 50):
Laki lanac (SEQ ID NO: 51):
Imunokonjugati pripremljeni u ovom primeru su dalje korišćeni u sledećim primerima.
Primer 2
Primer 2A. Vezivanje PD1-IL2v za aktivirane CD8 i CD4 T ćelije
Sveže izolovane PBMC od zdravih ljudskih donora stimulisane su preko noći sa CD3 i CD28 da bi se indukovala ushodna regulacija PD1 na T ćelijama. PBMC su zasejane u medijumu (RPMI1640, 10% FCS, 2 mM glutamin) u boce za uzgajanje ćelija koje su obložene 1 h na 37°C sa 1 µg/ml CD3 (klon OKT3, br.317304, BioLegend). CD28 je dodat u rastvor u PBMC u koncentraciji od 2 µg/ml (klon CD28.2, br. 302914, BioLegend). Sledećeg dana PBMC su sakupljene i prebačene na ploču sa okruglim dnom sa 96 bunarčića (200.000 ćelija po bunarčiću). Ćelije su isprane FACS puferom (PBS, 2% FBS, 5 mM EDTA, 0,025% NaN3) i obojene sa 40 µl naznačenih molekula (PD1 IgG, PD1-IL2v i CEA-IL2v) u FACS puferu 30 min na 4°C. Ćelije su dva puta isprane FACS puferom da bi se uklonili nevezani molekuli. Zatim je u ćelije dodato 40 µl razblaženog PE anti-humanog Fc specifičnog sekundarnog antitela (br.109-116-170, Jackson ImmunoResearch). Nakon 30 min inkubacije na 4°C, ćelije su dva puta isprane FACS puferom. Da bi se detektovale T ćelije, PBMC su obojene sa 40 µl mešavine CD3 FITC (klon UCHT1, br. 300406, BioLegend), CD4 APC (klon RPA-T4, 300514, BioLegend) i CD8 BV421 (klon RPA-T8, br.301036, BioLegend) 30 minuta na 4°C. Nevezana antitela su uklonjena ispiranjem dva puta FACS puferom. Na kraju su ćelije fiksirane sa 1% PFA u FACS puferu i izmerene pomoću BD Fortessa razdvajanja na CD3+CD4+ ćelije (CD4 T ćelije) i CD3+CD8+ ćelije (CD8 T ćelije).
Kao što je prikazano na Slici 2, PD1-IL2v i odgovarajući PD1 IgG vezuju se slično za CD4 i CD8 T ćelije. Analogni imunocitokin: CEA-IL2v, ciljan na CEA na tumorskim ćelijama umesto na PD1, služio je kao neciljana kontrola za upoređivanje sa efektom samo imunocitokina na bazi IL2v koji nije ciljan na PD1.
Primer 2B. Aktivacija i proliferacija T ćelija i NK ćelija sa PD1-IL2v
Sveže izolovane PBMC od zdravih ljudskih donora su inkubirane preko noći, a zatim obeležene sa CFSE (5(6)-karboksifluorescein diacetat N-sukcinimidil estrom, br. 21888, Sigma-Aldrich). Ukratko, 30 miliona PBMC ćelija je jednom isprano PBS-om. Paralelno, osnovni rastvor CSFE (2 mM u DMSO) razblažen je 1:20 u PBS-u. PBMC ćelije su ponovo suspendovane u 30 ml prethodno zagrejanog PBS-a, dodato je 30 µl rastvora CFSE i ćelije su
4
odmah pomešane. Za optimalno obeležavanje, ćelije su inkubirane 15 minuta na 37°C. Zatim je dodato 10 ml prethodno zagrejanog medijuma (RPMI1640, 10% FCS, 1% glutamina) da bi se zaustavila reakcija obeležavanja. Ćelije su centrifugirane 10 min na 400 x g i ponovo suspendovane u 20 ml svežeg medijuma i inkubirane dodatnih 30 min na 37°C. Na kraju, ćelije su jednom isprane medijumom i ponovo suspendovane u svežem medijumu sa 1 milion ćelija po ml. Obeležene PBMC ćelije su zasejane na ploču sa okruglim dnom sa 96 bunarčića (200.000 ćelija po bunarčiću) i 5 dana tretirane naznačenim molekulima (PD1-IL2v, CEA-IL2v, PD1 IgG i kombinacijom PD1 IgG i CEA-IL2v). Nakon inkubacije, ćelije su jednom isprane FACS puferom i obojene sa 20 µl mešavine CD3 APC/Cy7 (klon UCHT1, br.300426, BioLegend), CD56 APC (klon HCH56, 3br.18310, BioLegend), CD4 PE (klon RPA-T4, br.
300508, BioLegend) i CD25 BV421 (klon M-A251, BioLegend) u FACS puferu 30 minuta na 4°C. Nakon toga, PBMC su dva puta isprane FACS puferom pre nego što su fiksirane sa 1% PFA u FACS puferu i fluorescencija je izmerena pomoću BD Fortessa. Proliferacija je određena merenjem CFSE razblaženja CD8 T ćelija (CD3+CD4-), CD4 T ćelija (CD3+CD4+) i NK ćelija (CD3-CD56+).
Kao što je prikazano na Slici 3, aktivnost PD1-IL2v je uporediva sa aktivnošću CEA-IL2v, i CEA-IL2v u kombinaciji sa PD1 IgG. Sam PD1 IgG nema aktivnost u ovom okruženju.
Slika 4 pokazuje da PD1-IL2v indukuje aktivaciju (mereno povećanjem CD25) NK ćelija, CD8 T ćelija i CD4 T ćelija. Aktivacija izazvana sa CEA-IL2v i kombinacijom CEA-IL2v sa PD1 IgG je slična. PD1 IgG sam po sebi ne indukuje aktivaciju u ovom okruženju.
Primer 2C. Aktivacija i proliferacija prethodno aktiviranih CD8 i CD4 T ćelija sa PD1-IL2v
Sveže izolovane PBMC ćelije od zdravih ljudskih donora su obeležene CFSE (5(6)-karboksifluorescein diacetat N-sukcinimidil estrom, br. 21888, Sigma-Aldrich). Ukratko, 30 miliona PBMC ćelija je jednom isprano PBS-om. Paralelno, osnovni rastvor CSFE (2 mM u DMSO) razblažen je 1:20 u PBS-u. PBMC ćelije su ponovo suspendovane u 30 ml prethodno zagrejanog PBS-a, dodato je 30 µl rastvora CFSE i ćelije su odmah pomešane. Za optimalno obeležavanje, ćelije su inkubirane 15 minuta na 37°C. Zatim je dodato 10 ml prethodno zagrejanog medijuma (RPMI1640, 10% FCS, 1% glutamina) da bi se zaustavila reakcija obeležavanja. Ćelije su centrifugirane 10 min na 400 x g i ponovo suspendovane u 20 ml svežeg medijuma i inkubirane dodatnih 30 min na 37°C. Na kraju, ćelije su jednom isprane medijumom i ponovo suspendovane u svežem medijumu sa 1 milion ćelija po ml. CFSE obeležene PBMC ćelije su prethodno aktivirane preko noći sa 1 µg/ml PHA (br. L8902, Sigma-Aldrich) da bi se indukovala pojačana regulacija PD-1 na T ćelijama. Sledećeg dana prethodno aktivirane PBMC ćelije su sakupljene i prebrojane. PBMC su zatim zasejane na ploču sa okruglim dnom sa 96 bunarčića (200.000 ćelija po bunarčiću) i 4 dana tretirane naznačenim molekulima (PD1-IL2v, CEA-IL2v, PD1 IgG i kombinacijom PD1 IgG plus CEA -IL2v). Nakon inkubacije, ćelije su jednom isprane FACS puferom i obojene sa 20 µl mešavine CD3 APC/Cy7 (klon UCHT1, br.300426, BioLegend), CD8 APC (klon SK1, BioLegend) i CD25 BV421 (klon M-A251, BioLegend) u FACS puferu 30 minuta na 4°C. Nakon toga su PBMC dva puta isprane FACS puferom pre nego što su fiksirane sa 1% PFA u FACS puferu i fluorescencija izmerena pomoću BD Fortessa. Proliferacija je određena merenjem CFSE razblaženja CD8 T ćelija (CD3+CD8+) i CD4 T ćelija (CD3+CD8-).
Slika 5 pokazuje da PD1-IL2v indukuje proliferaciju PHA aktiviranih CD8 i CD4 T ćelija koje eksprimiraju PD-1. Aktivnost je uporediva sa CEA-IL2v i kombinacijom CEA-IL2v sa PD1 IgG. Sam PD1 IgG nema aktivnost u ovom okruženju. Ne može se primetiti nikakav dodatni efekat blokiranja PD-1 u ovom okruženju verovatno zbog odsustva PD-L1 pozitivnih tumorskih ćelija.
Kao što je prikazano na Slici 6, PD1-IL2v indukuje aktivaciju PHA aktiviranih CD8 i CD4 T ćelija koje eksprimiraju PD-1 (koristeći ekspresiju CD25 kao marker aktivacije). CEA-IL2v i kombinacija CEA-IL2v sa PD1 IgG izazivaju uporedivu aktivaciju T ćelija. Sam PD1 IgG nema aktivnost u ovom okruženju. Ne može se primetiti nikakav dodatni efekat blokiranja PD-1 u ovom okruženju verovatno zbog odsustva PD-L1 pozitivnih tumorskih ćelija.
Primer 2D. Proliferacija NK92 sa PD1-IL2v i PD-L1-IL2v
NK92 ćelije su sakupljene, prebrojane i procenjene u pogledu održivosti. Ćelije su isprane tri puta PBS-om da bi se uklonio rezidualni IL-2 i ponovo su suspendovane u medijumu (RPMI1640, 10% FCS, 1% glutamin) bez IL-2. Isprane NK92 ćelije su inkubirane dva sata u ćelijskom inkubatoru (IL-2 starvacija). Nakon starvacije, ćelije su ponovo suspendovane u svežem medijumu bez IL2- do 200.000 ćelija po ml, i 50 µl ćelijske suspenzije je prebačeno na ploču sa ravnim dnom sa 96 bunarčića tretiranu ćelijskom kulturom i dodato je 50 µl razblaženih antitela (u medijumu bez IL-2), proleukina (konačna koncentracija 1,5 µg/ml) ili medijuma (kontrolni bunarčići) da bi se postigla konačna zapremina od 100 µl po bunarčiću. Ploča je inkubirana 2 dana u inkubatoru. Nakon 2 dana reagensi CellTiter-Glo (Promega) i ploča sa ćelijskom kulturom uravnoteženi su na sobnoj temperaturi. Rastvor CellTiter-Glo je pripremljen kako je opisano u uputstvima proizvođača, i 100 µl rastvora je dodato u svaki bunarčić. Posle 10 minuta inkubacije, preostali agregati su ponovo suspendovani pipetiranjem, i 150 µl smeše je prebačeno na belu ploču sa ravnim dnom. Luminescencija je merena čitačem Tecan Spark 10M multimode.
Slika 7A pokazuje da PD-L1-IL2v indukuje proliferaciju NK92 ćelija jednako efikasno kao i CEA-IL2v. Slika 7B pokazuje da PD-L1-IL2v i PD1-IL2v imaju istu aktivnost u izazivanju proliferacije NK92 ćelija. NK92 ćelije su PD1 negativne.
Primer 2E. Vezivanje PD-L1-IL2v za CTLL2 ćelije
Mišja T ćelijska linija CTLL2 eksprimira PD-L1. Ove ćelije su korišćene za testiranje vezivanja PD-L1-IL2v (mišji surogat) za PD-L1. Ćelije su sakupljene, vijabilnost je proverena, i prebačene su na ploču s okruglim dnom sa 96 bunarčića (200.000 ćelija po bunarčiću). Ćelije su isprane FACS puferom (PBS, 2% FBS, 5 mM EDTA, 0,025% NaNs) i obojene sa 40 µl naznačenih molekula u FACS puferu tokom 30 minuta na 4°C. Ćelije su dva puta isprane FACS puferom da bi se uklonili nevezani molekuli. Zatim je u ćelije dodato 40 µl razblaženog APC anti-mišjeg Fc specifičnog sekundarnog antitela (br.115-136-071, Jackson ImmunoResearch). Nakon 30 min inkubacije na 4°C, ćelije su dva puta isprane FACS puferom. Ćelije su analizirane pomoću BD LSR Fortessa.
Slika 8 pokazuje da se PD-L1-IL2v vezuje jednako dobro kao i odgovarajući PD-L1 muIgG1 za CTLL2 ćelije. Ove ćelije su PD1 negativne.
Primer 2F. Proliferacija CTLL2 ćelija sa PD1-IL2v i PD-L1-IL2v
CTLL2 ćelije su sakupljene, prebrojane i procenjene u pogledu vijabilnosti. Ćelije su isprane tri puta PBS-om (da bi se uklonio rezidualni IL-2), ponovo suspendovane u medijumu (RPMI1640, 10% FCS, 1% glutamin) bez IL-2, i inkubirane dva sata u ćelijskom inkubatoru (IL-2 starvacija). Nakon starvacije, 200.000 CTLL2 ćelija po ml je ponovo suspendovano u svežem medijumu bez IL2, i 50 µl ćelijske suspenzije je prebačeno na ploču sa ravnim dnom sa 96 bunarčića tretiranu ćelijskom kulturom. U bunarčiće je dodato 50 µl razblaženog mišjeg surogatnog PD1-IL2v, mišjeg surogatnog PD-L1-IL2v, mišjeg surogatnog CEA-IL2v, razblaženog proleukina (konačna koncentracija 1,5 µg/ml) ili samog medijuma (sve koristeći medijum bez IL-2) do konačne zapremine od 100 µl po bunarčiću. Uzorci su inkubirani 3 dana u ćelijskom inkubatoru i proliferacija je procenjena korišćenjem CellTiter-Glo prema uputstvima proizvođača. Ukratko, 100 µl reagensa je dodato u svaki bunarčić i inkubirano 10 min. Preostali agregati su ponovo suspendovani pipetiranjem, i 150 µl smeše je prebačeno na belu ploču sa ravnim dnom. Luminescencija je merena čitačem Tecan Spark 10M multimode.
Slika 9A pokazuje da PD-L1-IL2v indukuje proliferaciju CTLL2 ćelija. Čini se da je aktivnost veća u poređenju sa CEA-IL2v, verovatno zbog ekspresije PD-L1 na CTLL2 ćelijama.
Slika 9B ponovo pokazuje da PD1-IL2v indukuje proliferaciju CTLL2 ćelija. Čini se da je aktivnost niža u poređenju sa PD-L1-IL2v verovatno zato što ove ćelije eksprimiraju samo PD-L1, ali ne i PD1.
Primer 3
In vivo efikasnost PD1-IL2v i PD-L1-IL2v na modelu singenog mišjeg tumora PD1-IL2v i PD-L1-IL2v imunokonjugati (mišji surogati) testirani su sami i u poređenju sa odgovarajućim PD1 i PD-L1 antitelima na antitumorsku efikasnost na Panc02-Fluc singenom modelu.
Panc02-H7 ćelije (mišji karcinom pankreasa) originalno su dobijene od MD Anderson cancer center (Texas, SAD) i posle ekspanzije deponovane su u internoj banci ćelija Roche-Glycart. Panc02-H7-Fluc ćelijska linija je proizvedena interno pomoću tehnika transfekcije kalcijumom i subkloniranja. Panc02-H7-Fluc je uzgajana u RPMI medijumu koji sadrži 10% FCS (Sigma), 500 µg/ml higromicina i 1% glutamaksa. Ćelije su kultivisane na 37 °C u atmosferi zasićenoj vodom na 5 % CO2. Presejavanje 23 je korišćeno za transplantaciju. Vijabilnost ćelija bila je 90,4 %. 1x10<5>ćelija po životinji injektovano je u pankreas crnih 6 miševa pomoću tuberkulinskog šprica od 0,3 ml (BD Biosciences, Nemačka). U tu svrhu je napravljen mali rez na levoj strani abdomena miša pod anestezijom. Peritonealni zid je otvoren i pankreas je pažljivo izolovan pincetom. Deset mikrolitara (1x10<5>Panc02-H7-Pluc ćelija u RPMI medijumu) ćelijske suspenzije je injektovano u rep pankreasa. Peritonealni zid i rane na koži su zatvorene primenom rastvorljivih šavova 5/0.
Ženke crnih 6 miševa stare 10-12 nedelja na početku eksperimenta (Charles Rivers, Lyon, Francuska) održavane su u uslovima bez specifičnog patogena, sa dnevnim ciklusima od 12 h svetla/12 h mraka prema datim smernicama (GV-Solas; Felasa; TierschG). Protokol eksperimentalne studije pregledale su i odobrile lokalne vlasti (ZH193/2014).
Po dolasku, životinje su držane nedelju dana kako bi se privikle na novu okolinu i radi posmatranja. Redovno je praćeno njihovo zdravstveno stanje.
Miševima je 0. dana studije intra-pankreasno injektovano 1x10<5>Panc02-Fluc ćelija, randomizovani su i izmereni. Nedelju nakon injekcije tumorskih ćelija miševima su i.v. injektovana PD1-IL2v, PD-L1-IL2v ili PD1 i PD-L1 antitela, jednom nedeljno tokom četiri nedelje.
Svim miševima je i.v. injektovano 200 μl odgovarajućeg rastvora. Miševima u grupi sa vehikulumom je injektovan histidinski pufer, a terapijskim grupama konjugati mišjeg surogata PD1-IL2v i PD-L1-IL2v ili odgovarajuća PD1 i PD-L1 antitela, razblaženi histidinskim puferom po potrebi. Količina antitela injektovanih po mišu u mg/kg je bila sledeća: 1,5 mg/kg PD1-IL2v i PD-L1-IL2v, 10 mg/kg PD1 i PD-L1 antitela.
Slika 10 i Tabela 1 pokazuju da je PD1-IL2v posredovao značajno bolju efikasnost u smislu poboljšane medijane i ukupnog preživljavanja u poređenju sa svim drugim testiranim pojedinačnim agensima, posebno uključujući PD-L1-IL2v.
Tabela 1. Medijana i ukupno preživljavanje crnih 6 miševa lečenih PD1-IL2v, PD-L1-IL2v, PD1 ili PD-L1 antitelima, u Panc02-Fluc modelu singenog tumora.
Za bioluminescentno snimanje pomoću IVIS® SPECTRUM, miševima je intraperitonealno ubrizgano 150 mg/kg D-luciferina 10 minuta pre akvizicije snimanja bioluminiscencijom (BLI) i kasnije su anestezirani sa 4% izoflurana. Nakon toga, miševi su prebačeni u izolacionu komoru, koja je postavljena u IVIS® spektar. In vivo BLI akvizicije su izvedene akvizicijom signala luminescencije u trajanju od 10-50 sekundi. Podaci su sačuvani kao zračenje (fotoni)/s/cm2/sr. In vivo BLI analiza podataka je obavljena pomoću softvera Living Image® 4.4 i predstavljena je krivom inhibicije tumora.
Slika 11 pokazuje superiornu efikasnost PD1-IL2v u smislu smanjenja signala bioluminescencije (fotona/sekundi) u poređenju sa svim drugim grupama, posebno uključujući PD-L1-IL2v. Već nakon prve primene terapije 7. dana, IVIS® Spectrum je detektovao smanjenje Panc02-Fluc bioluminescentnog signala u nekoliko tretiranih grupa, ali samo PD1-IL2v pokazuje potpuni nestanak BLI signala kod većine miševa koji je trajao celokupno trajanje eksperimenta, što ukazuje na potpuni odgovor kod 7 od 8 miševa.
Primer 4
Dejstvo isporuke IL-2v u iscrpljene T ćelije specifične za virus kroz blokadu PD-1 ili PD-L1
Ekspresija PD-1 je prvi put opisana na iscrpljenim T ćelijama specifičnim za virus kao posledica hronične izloženosti virusnim antigenima i povezana je sa nesposobnošću T-ćelija da postignu efikasan antivirusni odgovor. CD4 T ćelije specifične za virus sposobne da istovremeno luče IL-2 i IFN-γ daju zaštitu od reaktivacije virusa kod hroničnih infekcija. Zaista, polifunkcionalni potpis CD4 T ćelija je povezan sa virusnom kontrolom kod zdravih osoba inficiranih citomegalovirusom (CMV), Epštajn-Barovim virusom (EBV) i virusom herpes simpleks (HSV), kao i kod onih osoba zaraženih virusom humane imunodeficijencije (HIV) koji ostaju bez simptoma nekoliko godina.
U kontekstu hroničnih virusnih infekcija, stoga smo razvili in-vitro test za procenu efekta ciljanja PD-1 i PD-L1 za isporučivanje mutirane verzije IL-2 (IL-2v) disfunkcionalnim T ćelijama specifičnim za antigen. Da bismo izbegli ograničenja u pogledu količine odgovarajućih donora za naš test, odlučili smo se za CMV imunogeni virusni protein (pp65) kao antigen opoziva za T ćelije, s obzirom na to da je otprilike 80% populacije CMV-seropozitivno. Stoga smo stimulisali mononuklearne ćelije periferne krvi zdravih donora (PBMC) sa CMV-pp65 nekoliko sati pre nego što smo dodali naše konstrukte u koncentraciji od 10 µg/ml. 43 sata kasnije blokirali smo transport proteina iz Goldžijevog aparata dodavanjem Golgi Plug (Brefeldin A) i Golgi Stop (Monensin) i inkubirali smo ćelije na 37°C dodatnih 5 sati. Ćelije su zatim isprane, obojene na površini anti-humanim CD3, CD4, CD8, CD62L i CD45RO antitelima pre fiksiranja / permeabilizacije puferom za fiksiranje/permeabilizaciju (BD Bioscience). Konačno smo izvršili intracelularno bojenje za IL-2, IFN-γ i Ki67 (oba od eBioscience).
Uočili smo da i PD1-IL2v i PD-L1-IL2v, kao i kombinacija odgovarajućih IgG antitela sa IL-2v, povećavaju, na uporedivim nivoima, učestalost polifunkcionalnih (Slika 12B) i IL-2 i IFN-γ monofunkcionalnih (Slika 12A i 12C) CD4 T ćelija, koje pružaju poboljšani efekat u poređenju sa anti-PD-1 i anti-PD-L1 blokadom. Proširene populacije u polifunkcionalnim (Slika 13B) i IFN-γ monofunkcionalnim CD4 T ćelijama (Slika 13C i 13D) pokazuju efektorsku memoriju (CD45RO<+>CD62L-) i terminalno diferencirani efektorski profil (CD45RO<->CD62L-). Nasuprot tome, IL-2-monofunkcionalne CD4 T ćelije izazvane antagonizmom PD-L1, i dalje proširene zajedničkom isporukom IL-2v, pokazuju naivni potpis (CD62L<+>CD45RO-) (Slika 13A).
Možemo zaključiti da je isporuka IL-2v iscrpljenim CMV-specifičnim CD4 T ćelijama preko fuzionog proteina PD1-IL-2v dovela do ekspanzije dugovečne zaštitne populacije specifične za viruse koju karakteriše sposobnost zajedničkog lučenja IL-2 i IFN-γ.
Primer 5
Primer 5A. Preferencijalno vezivanje PD1-IL2v za aktivirane konvencionalne T ćelije u odnosu na aktivirane regulatorne T ćelije
Svojstva vezivanja PD1-IL2v za aktivirane konvencionalne i regulatorne T ćelije su procenjena u kompetitivnom testu vezivanja. CD4<+>CD25<+>CD127<dim>regulatorne T ćelije (Treg) izolovane su pomoću kompleta za izolaciju regulatornih T ćelija u dva koraka (Miltenyi, br.
130-094-775). Paralelno sa CD4<+>CD25<−>konvencionalne T ćelije (Tkonv) izolovane su prikupljanjem negativne frakcije CD25 pozitivne selekcije (Miltenyi, br.130-092-983) nakon čega je sledilo obogaćivanje pomoću CD4<+>(Miltenyi, br.130-045-101). Tkonvsu označene sa CFSE (eBioscience, br.65-0850-84), a Treg su označene sa Cell Trace Violet (ThermoFisher scientific, C34557) kako bi se pratila proliferacija obe populacije. Tkonvi Tregsu zajedno zasejane na ploču za uzgajanje koja je obložena preko noći na 4°C sa 1 µg/ml CD3 (klon OKT3, br. 317315, BioLegend). CD28 je dodat u rastvor u koncentraciji od 1 µg/ml CD28 (klon CD28.2, br.302923, BioLegend). Nakon 5 dana stimulacije, sproveden je test vezivanja sa PD1 (0376) i PD1-IL2v (0590), pri čemu su oba označena interno sa AF647.
PD1-IL2v bispecifično antitelo pokazuje uporediv profil vezivanja kao PD1 (Slika 14A i 14B). Slika 14A prikazuje razliku frekvencije datog antitela vezanog za Tkonvu odnosu na Tregu istom uzorku. Svaki simbol predstavlja zasebnog donora, horizontalne linije označavaju medijane sa N=4. Oba molekula pokazuju veći kapacitet vezivanja za Tkonvu odnosu na Tregzbog viših nivoa ekspresije PD-1 na Tkonvnego na Treg(Slika 14B; podaci od jednog reprezentativnog donora koji pokazuju vezivanje za Tkonv(crna linija) i Treg(siva)). Stoga bispecifično antitelo PD1-IL2v održava karakteristike vezivanja PD1 uprkos tome što je IL2v spojen sa antitelom.
Primer 5B. Spasavanje Tkonvefektorske funkcije nakon tretmana pomoću PD1-IL2v u testu supresije Treg
U sledećem koraku je testirano da li PD1-IL2v može da preokrene Tregsupresiju Tkonv. Stoga je uspostavljen test supresivne funkcije, gde su Tkonvi Treguzgajani zajedno 5 dana, sa blokirajućim antitelima ili bez njih, u prisustvu CD4<->CD25<−>od nepovezanog donora za alospecifičnu stimulaciju. U tu svrhu Tkonvi Tregsu izolovani i označeni kao što je gore opisano. Akumulacija citokina u Goldžijevom kompleksu je poboljšana primenom inhibitora transporta proteina (GolgiPlug br.555029, BD i GolgiStop br.554724, BD) 5 sati pre FACS bojenja.
Izmerena je sposobnost proliferisanih Tkonvda luče granzim B (GrzB; slika 15A) i interferon gama (IFNγ; slika 15B) u prisustvu i odsustvu Treg. Supresija Tregje izračunata sledećom formulom:
% supresije citokina = 100-(% citokinaTkonv-Treg ± blokirajuće antitelo)/(% citokinaTkonv
netretirane)*100)
, gde je % citokinaTkonv+Treg ± blokirajuće antitelonivo citokina koji luči Tkonvu prisustvu Treg± blokirajuće antitelo, % citokinaTkonv netretiraneje nivo citokina koji luči Tkonvu odsustvu Treg. Na slikama 15 A i 15B, svaki simbol predstavlja zasebnog donora, horizontalne linije označavaju medijane sa N=5, isprekidane linije na 0% predstavljaju izostanak supresije sa Treg. P je izračunat korišćenjem jednostranog ANOVA testa (*p < 0,05,**p < 0,01,***p <
1
0,001,****p < 0,0001).
Slika 15A pokazuje da tretman PD1 antitelom (0376) daje medijanu supresije funkcije Tkonvod 47,7%, u poređenju sa medijanom supresije od 68,6% u nelečenoj grupi (bez statističke značajnosti). Slično tome, blokiranje interakcije PD-1/PD-L1 sa atezolizumabom, nivolumabom i pembrolizumabom pokazalo je istu tendenciju kao i kod PD1 antitela. Zanimljivo je da su DP47-IL2v (medijana = -11,3%, p = 0,0011) i PD1-IL2v (medijana = -43,6%, p < 0,0001) spasili TkonvGrzB efektorsku funkciju od Tregsupresije. Nadalje, PD1-IL2v je bio čak značajno (p = 0,0026) jači od samog PD1 antitela.
Paralelno je obavljena ista analiza za INFy supresiju Tkonvputem Treg(Slika 15B). DP47-IL2v (medijana = 51,77%, p = 0,0251) i PD1-IL2v (medijana = 31,23%, p = <0,0001) spasili su TkonvIFNy efektorsku funkciju od Tregsupresije.
Primer 6
In vivo efikasnost imunokonjugata PD1-IL2v na singenom modelu ćelijskih linija tumora miša u poređenju sa PD1 i FAP-IL2v antitelima kao pojedinačnim agensima i u kombinaciji
Mišji surogatni imunokonjugat PD1-IL2v (muPD1-IL2v) testiran je u poređenju sa kombinacijom mišjeg surogatnog PD1 i mišjeg surogatnog FAP-IL2v (muFAP-IL2v) na njegovu antitumorsku efikasnost u singenom modelu. Korišćeni singeni model bio je Panc02-Fluc singeni model pankreasa.
Mišji surogatni imunokonjugat PD1-IL2v je testiran u transfektantskoj ćelijskoj liniji Panc02-Fluc pankreasa miša koja je intrapankreasno ubrizgana u crne 6 miševe. Panc02-H7 ćelije (mišji karcinom pankreasa) originalno su dobijene od MD Anderson cancer center (Texas, SAD) i posle ekspanzije deponovane su u internoj banci ćelija Roche-Glycart. Panc02-H7-Fluc ćelijska linija je proizvedena interno pomoću tehnika transfekcije kalcijumom i subkloniranja. Panc02-H7-Fluc je uzgajana u RPMI medijumu koji sadrži 10% FCS (Sigma), 500 µg/ml higromicina i 1% glutamaksa. Ćelije su kultivisane na 37 °C u atmosferi zasićenoj vodom na 5 % CO2. Presejavanje 23 je korišćeno za transplantaciju. Vijabilnost ćelija bila je 87,5%. 1x10<5>ćelija po životinji injektovano je u pankreas miševa pomoću tuberkulinskog šprica od 0,3 ml (BD Biosciences, Nemačka). U tu svrhu je napravljen mali rez na levoj strani abdomena crnog 6 miša pod anestezijom. Peritonealni zid je otvoren i pankreas je pažljivo izolovan pincetom. Deset mikrolitara (1x10<5>Panc02-H7-Pluc ćelija u RPMI medijumu) ćelijske suspenzije je injektovano u rep pankreasa. Peritonealni zid i rane na koži su zatvorene primenom rastvorljivih šavova 5/0.
Ženke crnih 6 miševa stare 10-12 nedelja na početku eksperimenta (Charles Rivers,
2
Lyon, Francuska) održavane su u uslovima bez specifičnog patogena, sa dnevnim ciklusima od 12 h svetla/12 h mraka prema datim smernicama (GV-Solas; Felasa; TierschG). Protokol eksperimentalne studije pregledale su i odobrile lokalne vlasti (ZH193/2014). Po dolasku, životinje su držane nedelju dana kako bi se privikle na novu okolinu i radi posmatranja. Redovno je praćeno njihovo zdravstveno stanje.
Miševima je 0. dana studije intra-pankreasno injektovano 1x10<5>Panc02-Fluc ćelija, randomizovani su i izmereni. Nedelju dana nakon injekcije tumorskih ćelija miševima su intravenski ubrizgane dve različite doze PD1-IL2v i upoređene sa kombinacijom PD1 i FAP-IL2v antitela, jednom nedeljno tokom četiri nedelje.
Svim miševima je intravenski injektovano 200 μl odgovarajućeg rastvora. Miševima u grupi sa vehikulumom ubrizgan je histidinski pufer, a grupama za lečenje PD1-IL2v (0,5 mg/kg ili 1 mg/kg), PD1 (10 mg/kg) i FAP-IL2v (2,5 mg/kg) antitela ili kombinacija PD1 i FAP-IL2v (10 mg/kg PD1 i 2,5 mg/kg FAP-IL2v) antitela. Da bi se dobila odgovarajuća količina imunokonjugata na 200 μl, osnovni rastvori su razblaženi histidinskim puferom po potrebi, kao što je prikazano u tabeli 2.
Tabela 2. Jedinjenja, doze, puferi za formulaciju i koncentracija osnovnog rastvora.
Za bioluminescentno snimanje pomoću IVIS® SPECTRUM, miševima se intraperitonealno ubrizgava 150 mg/kg D-luciferina 10 minuta pre akvizicije snimanja bioluminescencijom (BLI) i kasnije su anestetisani 4% izofluranom. Nakon toga, miševi su prebačeni u izolacionu komoru, koja je postavljena u IVIS® spektar. In vivo BLI akvizicije su izvedene akvizicijom signala luminescencije u trajanju od 10-50 sekundi. Podaci se čuvaju kao zračenje (fotoni)/s/cm<2>/sr. In vivo BLI analiza podataka je obavljena pomoću softvera Living Image® 4.4 i predstavljena je krivom inhibicije tumora.
Da bi se histološki procenila imuno-farmakodinamika, 3 miša po grupi su žrtvovana 4 dana nakon prve terapije dislokacijom vrata. Tumori pankreasa su sakupljeni i odmah fiksirani u 10% formalinu. Tkivo je ostavljeno u rastvoru formalina preko noći i kasnije je obrađeno za FFPET (Leica 1020, Nemačka). Parafinske sekcije od 4 µm su naknadno izrezane u mikrotomu (Leica RM2235, Nemačka). Imunohistohemija CD3, PD1 i ICOS miša je izvedena u uređaju Leica autostainer (Leica ST5010, Nemačka) prema protokolima proizvođača. Slike su skenirane Olympus skenerom.
Slika 16 prikazuje rezultate eksperimenta efikasnosti koji poredi surogatni mišji PD1-IL2v sa mišjim surogatnim FAP-IL2v i mišjim surogatnim PD-1 antitelima kao pojedinačnim agensima i u kombinaciji. Panc02-H7-CEA transficirana ćelijska linija karcinoma pankreasa injektovana je u pankreas crnih 6 miševa kako bi se proučilo preživljavanje na ortotopskom singenom modelu pankreasa. Količina antitela injektovanih po mišu u mg/kg je bila sledeća: 0,5 i 1 mg/kg mišjeg surogatnog PD1-IL2v, 10 mg/kg mišjeg surogatnog PD1 i 2,5 mg/kg mišjeg surogatnog FAP-IL2v antitela. Antitela su injektovana intravenski jednom nedeljno tokom 4 nedelje. Uočena je značajano superiorna medijana i ukupno preživljavanje sa 0,5 i 1 mg/kg mišjeg surogatnog PD1-IL2v u poređenju sa svim drugim pojedinačnim agensima i kombinacijom mišjeg surogatnog PD-1 i mišjeg surogatnog FAP-IL2v. Slika 16 i tabela 3 pokazuju da su obe doze PD1-IL2v posredovale superiornu efikasnost u smislu poboljšane medijane i ukupnog preživljavanja u poređenju sa svim drugim pojedinačnim agensima, kao i kombinacijom PD1 i FAP-IL2v.
Tabela 3: Medijana i ukupno preživljavanje crnih 6 miševa tretiranih sa PD1-IL2v, PD1, FAP-IL2v i kombinacijom PD-1 i FAP-IL2v antitela, u Panc02-Fluc modelu singenog tumora.
Slika 17 prikazuje rezultate eksperimenta efikasnosti koji upoređuje mišji surogatni
4
PD1-IL2v sa FAP-IL2v, mišjim surogatnim PD1 i njihovom kombinacijom. Panc02-H7-Fluc transficirana ćelijska linija karcinoma pankreasa injektovana je u pankreas crnih 6 miševa kako bi se proučilo preživljavanje na ortotopskom singenskom modelu pankreasa pomoću bioluminiscencije. Već nakon prve primene terapije 7. dana, IVIS® Spectrum je detektovao smanjenje bioluminescentnog signala Panc02-Fluc u nekoliko tretiranih grupa, ali samo PD1-IL2v pokazuje potpuni nestanak BLI signala kod većine miševa koji je trajao tokom celog eksperimenta, što ukazuje na potpuni odgovor kod 4 od 7 miševa za dozu od 0,5 mg/kg i 7 od 7 miševa za dozu od 1 mg/kg. Slika 17 pokazuje da su obe doze PD1-IL2v posredovale superiornu efikasnost u smislu smanjenja signala bioluminescencije (fotona/sekundi) u poređenju sa svim drugim pojedinačnim agensima i kombinovanom grupom.
Slike 18A i 18B prikazuju rezultate imunohistohemijskih slika tumora pankreasa obojenih za anti-mišji CD3 (Slika 18A) i kvantifikacionu analizu T ćelija (Slika 18B). Imunohistohemijsko bojenje CD3 T ćelija je izvedeno na tumorima pankreasa crnih 6 miševa koji su dobijeni od naznačenih grupa za lečenje. Uzorci tkiva su pripremljeni za imunohistohemijsko bojenje: tumori su sakupljeni od životinja nakon primene tretmana, fiksirani su u 10% formalinu (Sigma, Nemačka) i kasnije obrađeni za FFPET (Leica 1020, Nemačka). Parafinske sekcije od 4 µm su naknadno izrezane u mikrotomu (Leica RM2235, Nemačka). Imunohistohemija CD3 miša je izvedena sa anti-mišjim CD3 (Diagnostic Biosystem, Nemačka) u uređaju Leica autostainer (Leica ST5010, Nemačka) prema protokolima proizvođača. Slike su skenirane Olympus skenerom. Kvantifikacija muCD3 pozitivnih T ćelija je izvršena pomoću softvera Definiens (Definiens, Nemačka). Statistički parametri su analizirani jednostranim ANOVA testom sa višestrukim uporednim testovima. Već posle prve primene terapije, 4. dana, detektovano je značajno povećanje broja CD3 pozitivnih T ćelija u grupama koje su tretirane pomoću PD1-IL2v u poređenju sa grupom sa vehikulumom. Tendencija povećanja CD3 pozitivnih ćelija takođe je primećena u kombinaciji mišjeg surogatnog PD1 i mišjeg surogatnog FAP-IL2v u odnosu na vehikulum, ali nije bila značajna. Slike 18A i 18B pokazuju da je PD1-IL2v izazvao povećanje infiltracije CD3 u tumoru pankreasa 4 dana nakon prve terapije u poređenju sa svim grupama.
Slika 19 prikazuje rezultate imunohistohemijskih slika tumora pankreasa obojenih na anti-mišji PD1. Imunohistohemijsko bojenje T ćelija pozitivnih na PD1 je izvedeno na tumorima pankreasa crnih 6 miševa koji su dobijeni iz naznačenih grupa za lečenje. Uzorci tkiva su pripremljeni za imunohistohemijsko bojenje: tumori su sakupljeni od životinja nakon primene tretmana, fiksirani su u 10% formalinu (Sigma, Nemačka) i kasnije obrađeni za FFPET (Leica 1020, Nemačka). Parafinske sekcije od 4 µm su naknadno izrezane u mikrotomu (Leica RM2235, Nemačka). Imunohistohemija PD1 miša je izvedena sa antimišjim PD1 (R&D Sistem, Nemačka) u uređaju Leica autostainer (Leica ST5010, Nemačka) u skladu sa protokolima proizvođača. Slike su skenirane Olympus skenerom. Već posle prve primene terapije, 4. dana, detektovano je veliko povećanje broja PD1 pozitivnih T ćelija u grupama koje su tretirane sa PD1-IL2v u poređenju sa grupom sa vehikulumom. Takođe, umereno povećanje PD1 pozitivnih ćelija primećeno je u kombinaciji mišjeg surogatnog PD1 i mišjeg surogatnog FAP-IL2v u poređenju sa vehikulumom. Slika 19 pokazuje da je PD1-IL2v izazvao povećanje infiltracije PD1 pozitivnih T ćelija u tumor pankreasa 4 dana nakon prve terapije u poređenju sa svim grupama.
Slika 20 prikazuje rezultate imunohistohemijskih slika tumora pankreasa obojenih na antimišji ICOS. Imunohistohemijsko bojenje T ćelija pozitivnih na ICOS je izvedeno na tumorima pankreasa crnih 6 miševa koji su dobijeni iz naznačenih grupa za lečenje. Uzorci tkiva su pripremljeni za imunohistohemijsko bojenje: tumori su sakupljeni od životinja nakon primene tretmana, fiksirani su u 10% formalinu (Sigma, Nemačka) i kasnije obrađeni za FFPET (Leica 1020, Nemačka). Parafinske sekcije od 4 µm su naknadno izrezane u mikrotomu (Leica RM2235, Nemačka). Imunohistohemija ICOS miša je izvedena sa antimišjim ICOS (My Biosource, Nemačka) u uređaju Leica autostainer (Leica ST5010, Nemačka) u skladu sa protokolima proizvođača. Slike su skenirane Olympus skenerom. Već posle prve primene terapije, 4. dana, detektovano je smanjenje broja ICOS pozitivnih T ćelija u grupama koje su tretirane pomoću PD1-IL2v u poređenju sa grupom sa vehikulumom. Slika 20 pokazuje da je PD1-IL2v izazvao smanjenje infiltracije ICOS pozitivnih T ćelija u tumor pankreasa 4 dana nakon prve terapije u poređenju sa svim grupama.
Primer 7
In vivo efikasnost imunokonjugata PD1-IL2v u singenom modelu ćelijskih linija tumora miša u poređenju sa antitelima na PD1 i FAP-IL2v (dve različite doze) kao pojedinačnim agensima i u kombinaciji.
Imunokonjugat PD1-IL2v je testiran u poređenju sa kombinacijom mišjeg surogatnog PD1 i mišjeg surogatnog FAP-IL2v sa dve različite doze na njegovu antitumorsku efikasnost na jednom singenom modelu. Korišćeni singeni model bio je Panc02-Fluc singeni model pankreasa. Mišji surogatni imunokonjugat PD1-IL2v testiran je u transfektantnoj ćelijskoj liniji Panc02-Fluc pankreasa miša koja je intrapankreasno ubrizgana u crne 6 miševe. Panc02-H7 ćelije (mišji karcinom pankreasa) originalno su dobijene od MD Anderson cancer center (Texas, SAD) i posle ekspanzije deponovane su u internoj banci ćelija Roche-Glycart. Panc02-H7-Fluc ćelijska linija je proizvedena interno pomoću tehnika transfekcije kalcijumom i subkloniranja. Panc02-H7-Fluc je uzgajana u RPMI medijumu koji sadrži 10% FCS (Sigma), 500 µg/ml higromicina i 1% glutamaksa. Ćelije su kultivisane na 37 °C u atmosferi zasićenoj vodom na 5 % CO2. Presejavanje 16 je korišćeno za transplantaciju. Vijabilnost ćelija bila je 83,3%. 1x105ćelija po životinji injektovano je u pankreas miševa pomoću tuberkulinskog šprica od 0,3 ml (BD Biosciences, Nemačka). U tu svrhu je napravljen mali rez na levoj strani abdomena crnog 6 miša pod anestezijom. Peritonealni zid je otvoren i pankreas je pažljivo izolovan pincetom. Deset mikrolitara (1x10<5>Panc02-H7-Pluc ćelija u RPMI medijumu) ćelijske suspenzije je injektovano u rep pankreasa. Peritonealni zid i rane na koži su zatvorene primenom rastvorljivih šavova 5/0.
Ženke crnih 6 miševa stare 10-12 nedelja na početku eksperimenta (Charles Rivers, Lyon, Francuska) održavane su u uslovima bez specifičnog patogena, sa dnevnim ciklusima od 12 h svetla/12 h mraka prema datim smernicama (GV-Solas; Felasa; TierschG). Protokol eksperimentalne studije pregledale su i odobrile lokalne vlasti (ZH193/2014). Po dolasku, životinje su držane nedelju dana kako bi se privikle na novu okolinu i radi posmatranja. Redovno je praćeno njihovo zdravstveno stanje.
Miševima je 0. dana studije intra-pankreasno injektovano 1x10<5>Panc02-Fluc ćelija, randomizovani su i izmereni. Nedelju dana nakon injekcije tumorskih ćelija miševima je intravenski ubrizgan PD1-IL2v i upoređen sa kombinacijom PD1 FAP-IL2v Mab u dve različite doze, jednom nedeljno tokom tri nedelje.
Svim miševima je intravenski injektovano 200 μl odgovarajućeg rastvora. Miševima u grupi sa vehikulumom je ubrizgan histidinski pufer, a terapijskim grupama PD1-IL2v (1 mg/kg), PD1 (10 mg/kg) i FAP-IL2v (0,625 mg/kg ili 1,25 mg/kg) antitela ili kombinacija PD1 FAP-IL2v (10 mg/kg 1,25 mg/kg ili 10 mg/kg 0,625 mg/kg) antitela. Da bi se dobila odgovarajuća količina imunokonjugata na 200 μl, osnovni rastvori su razblaženi histidinskim puferom po potrebi, kao što je navedeno u tabeli 4.
Tabela 4. Jedinjenja, doze, puferi za formulaciju i koncentracija osnovnog rastvora.
Za bioluminescentno snimanje pomoću IVIS® SPECTRUM, miševima se intraperitonealno ubrizgava 150 mg/kg D-luciferina 10 minuta pre akvizicije snimanja bioluminescencijom (BLI) i kasnije su anestetisani 4% izofluranom. Nakon toga, miševi su prebačeni u izolacionu komoru, koja je postavljena u IVIS® spektar. In vivo BLI akvizicije su izvedene akvizicijom signala luminescencije u trajanju od 10-50 sekundi. Podaci se čuvaju kao zračenje (fotoni)/s/cm<2>/sr. In vivo BLI analiza podataka je obavljena pomoću softvera Living Image® 4.4 i predstavljena je krivom inhibicije tumora.
Da bi se histološki procenila imuno-farmakodinamika, 3 miša iz izabranih grupa su žrtvovana 4 dana nakon prve terapije dislokacijom vrata. Tumori pankreasa su sakupljeni i odmah fiksirani u 10% formalinu. Tkivo je ostavljeno u rastvoru formalina preko noći i kasnije je obrađeno za FFPET (Leica 1020, Nemačka). Parafinske sekcije od 4 µm su naknadno izrezane u mikrotomu (Leica RM2235, Nemačka). Imunohistohemija CD3, CD8, PD1 i granzima B miša je izvedena u Leica autostainer (Leica ST5010, Nemačka) prema protokolima proizvođača. Slike su skenirane Olympus skenerom.
Slika 21 i tabela 5 prikazuju rezultate eksperimenta efikasnosti koji upoređuje muPD1-IL2v sa muFAP-IL2v i muPD-1 antitelima kao pojedinačnim agensima i u kombinaciji. Panc02-H7-CEA transficirana ćelijska linija karcinoma pankreasa injektovana je u pankreas crnih 6 miševa kako bi se proučilo preživljavanje na ortotopskom singenom modelu pankreasa. Količina antitela injektovanih po mišu u mg/kg je bila sledeća: 1 mg/kg muPD1-IL2v, 10 mg/kg muPD1 i 0,625 ili 1,25 mg/kg muFAP-IL2v antitela. Antitela su injektovana intravenski jednom nedeljno tokom 4 nedelje. Uočena je značajno superiorna medijana i ukupno preživljavanje sa 1 mg/kg muPD1 - IL2v u poređenju sa svim drugim pojedinačnim agensima i kombinacijom muPD-1 muFAP-IL2v u obe testirane doze. Dakle, može se zaključiti da je PD1-IL2v posredovao superiornu efikasnost u smislu poboljšane medijane i ukupnog preživljavanja u poređenju sa svim drugim pojedinačnim agensima, kao i kombinacijama PD1 + FAP-IL2v u obe testirane doze.
Tabela 5: Medijana i ukupno preživljavanje crnih 6 miševa tretiranih sa PD1-IL2v, PD1, FAP-IL2v i kombinacijom PD-1 i FAP-IL2v antitela, u Panc02-Fluc modelu singenog tumora.
Slika 22 prikazuje rezultate eksperimenta efikasnosti koji upoređuje muPD1-IL2v sa FAP-IL2v, muPD1 i njihovom kombinacijom sa dve različite doze. Panc02-H7-Fluc transficirana ćelijska linija karcinoma pankreasa injektovana je u pankreas crnih 6 miševa kako bi se proučilo preživljavanje na ortotopskom singenskom modelu pankreasa pomoću bioluminiscencije. Tokom studije, IVIS® Spectrum je detektovao smanjenje Panc02-Fluc bioluminescentnog signala u nekoliko tretiranih grupa, ali je samo terapija sa muPD1-IL2v pokazala potpuni nestanak BLI signala kod svih miševa koji je trajao tokom celokupnog trajanja eksperimenta, što ukazuje na potpuni odgovor kod svih 6 miševa. Slika 22 pokazuje da PD1-IL2v posreduje superiornu efikasnost u smislu smanjenja signala bioluminescencije (fotona/sekundi) u poređenju sa svim drugim pojedinačnim agensima i kombinovanim grupama.
Slika 23 prikazuje rezultate imunohistohemijskih slika tumora pankreasa obojenih na anti-mišji CD3. Imunohistohemijsko bojenje CD3 T ćelija je izvedeno na tumorima pankreasa crnih 6 miševa koji su dobijeni od naznačenih grupa za lečenje. Uzorci tkiva su pripremljeni za imunohistohemijsko bojenje: tumori su sakupljeni od životinja nakon primene tretmana, fiksirani su u 10% formalinu (Sigma, Nemačka) i kasnije obrađeni za FFPET (Leica 1020, Nemačka). Parafinske sekcije od 4 µm su naknadno izrezane u mikrotomu (Leica RM2235, Nemačka). Imunohistohemija CD3 miša je izvedena sa anti-mišjim CD3 (Diagnostic Biosystem, Nemačka) u uređaju Leica autostainer (Leica ST5010, Nemačka) prema protokolima proizvođača. Slike su skenirane Olympus skenerom. Već posle prve primene terapije, 4. dana, detektovano je veliko povećanje broja CD3 pozitivnih T ćelija u grupama koje su tretirane muPD1-IL2v u poređenju sa grupom sa vehikulumom. Takođe, umereno povećanje CD3 pozitivnih ćelija je primećeno u svim drugim lečenim grupama u poređenju sa vehikulumom. Slika 23 pokazuje da je PD1-IL2v izazvao povećanje infiltracije CD3 pozitivnih T ćelija u tumor pankreasa 4 dana nakon prve terapije u poređenju sa svim grupama.
Slike 24A i 24B i tabela 6 prikazuju rezultate imunohistohemijskih slika tumora pankreasa obojenih na anti-mišji CD8 (Slika 24A) i kvantifikacione analize T ćelija (Slika 24B). Imunohistohemijsko bojenje CD8 T ćelija je izvedeno na tumorima pankreasa crnih 6 miševa koji su dobijeni od naznačenih grupa za lečenje. Uzorci tkiva su pripremljeni za imunohistohemijsko bojenje: tumori su sakupljeni od životinja nakon primene tretmana, fiksirani su u 10% formalinu (Sigma, Nemačka) i kasnije obrađeni za FFPET (Leica 1020, Nemačka). Parafinske sekcije od 4 µm su naknadno izrezane u mikrotomu (Leica RM2235, Nemačka). Imunohistohemija CD8 miša je izvedena sa antimišjim CD8 (Serotec, Nemačka) u uređaju Leica autostainer (Leica ST5010, Nemačka) u skladu sa protokolima proizvođača. Slike su skenirane Olympus skenerom. Kvantifikacija muCD8 pozitivnih T ćelija je izvršena pomoću softvera Definiens (Definiens, Nemačka). Statistički parametri su analizirani jednostranim ANOVA testom sa višestrukim uporednim testovima. Već posle prve primene terapije, 4. dana, detektovano je značajno povećanje broja CD8 pozitivnih T ćelija u grupama koje su tretirane pomoću muPD1-IL2v u poređenju sa svim drugim grupama. Tendencija povećanja CD8 pozitivnih ćelija je takođe primećena u svim drugim ispitivanim lečenim grupama, ali nije bila značajna.
Prema tome, slike 24A i 24B pokazuju da je PD1-IL2v izazvao povećanje infiltracije CD8 u tumoru pankreasa 4 dana nakon prve terapije u poređenju sa svim grupama.
Tabela 6. CD8 pozitivne T ćelije.
1
Slike 25A i 25B i tabela 7 prikazuju rezultate imunohistohemijskih slika tumora pankreasa obojenih za kvantifikaciju područja anti-granzima B (5A) i markera granzima B (5B). Imunohistohemijsko bojenje granzima B izvedeno je na tumorima pankreasa crnih 6 miševa koji su izvedeni iz navedenih grupa za lečenje. Uzorci tkiva su pripremljeni za imunohistohemijsko bojenje: tumori su sakupljeni od životinja nakon primene tretmana, fiksirani su u 10% formalinu (Sigma, Nemačka) i kasnije obrađeni za FFPET (Leica 1020, Nemačka). Parafinske sekcije od 4 µm su naknadno izrezane u mikrotomu (Leica RM2235, Nemačka). Imunohistohemija mišjeg granzima B je izvedena sa antimišjim granzimom B (Abeam, Nemačka) u uređaju Leica autostainer (Leica ST5010, Nemačka) u skladu sa protokolima proizvođača. Slike su skenirane Olympus skenerom. Kvantifikacija područja markera granzima B je izvršena pomoću softvera Definiens (Definiens, Nemačka). Statistički parametri su analizirani jednostranim ANOVA testom sa višestrukim uporednim testovima. Već nakon prve primene terapije, 4. dana, otkriveno je značajno povećanje granzima B u grupama koje su lečene sa muPD1-IL2v u poređenju sa svim drugim grupama. Tendencija povećanja površine markera granzima B takođe je uočena u svim drugim testiranim lečenim grupama, ali nije bila značajna. Tako, slike 25A i 25B pokazuju da je PD1-IL2v izazvao povećanje površine pozitivne na granzim B u tumoru pankreasa 4 dana nakon prve terapije u poređenju sa svim grupama.
Tabela 7. Površina pozitivna na granzim B.
1 1
Slike 26A i 26B i tabela 8 predstavljaju rezultate imunohistohemijskih slika tumora pankreasa obojenih na anti-mišji PD1 (slika 26A) i kvantifikacione analize PD1 pozitivnih ćelija (slika 26B). Imunohistohemijsko bojenje PD1 ćelija je izvedeno na tumorima pankreasa crnih 6 miševa koji su izvedeni iz navedenih grupa za lečenje. Uzorci tkiva su pripremljeni za imunohistohemijsko bojenje: tumori su sakupljeni od životinja nakon primene tretmana, fiksirani su u 10% formalinu (Sigma, Nemačka) i kasnije obrađeni za FFPET (Leica 1020, Nemačka). Parafinske sekcije od 4 µm su naknadno izrezane u mikrotomu (Leica RM2235, Nemačka). Imunohistohemija PD1 miša je izvedena sa antimišjim PD1 (Serotec, Nemačka) u uređaju Leica autostainer (Leica ST5010, Nemačka) u skladu sa protokolima proizvođača. Slike su skenirane Olympus skenerom. Kvantifikacija muPD1 pozitivnih ćelija je izvršena pomoću softvera Definiens (Definiens, Nemačka). Statistički parametri su analizirani jednostranim ANOVA testom sa višestrukim uporednim testovima. Već posle prve primene terapije, 4. dana, detektovano je značajno povećanje broja PD1 pozitivnih ćelija u grupama koje su tretirane sa muPD1-IL2v u poređenju sa svim drugim grupama. Tendencija povećanja PD1 pozitivnih ćelija je takođe primećena u svim drugim ispitivanim lečenim grupama, ali nije bila značajna. Prema tome, slike 26A i 26B pokazuju da je PD1-IL2v izazvao povećanje PD1 pozitivnih ćelija u tumoru pankreasa 4 dana nakon prve terapije u poređenju sa svim grupama.
Tabela 8. PD1 pozitivne ćelije.
Primer 7
Efekat isporuke IL-2v u iscrpljene T ćelije specifične za virus kroz blokadu PD-1 Ekspresija PD-1 je prvi put opisana na iscrpljenim T ćelijama specifičnim za virus kao rezultat hronične izloženosti virusnim antigenima i povezana je sa nesposobnošću T ćelija da postignu efikasan antivirusni odgovor. CD4 T ćelije specifične za virus sposobne da istovremeno luče IL-2 i IFN-γ pružaju zaštitu od reaktivacije virusa kod hroničnih infekcija. Zaista, polifunkcionalni potpis CD4 T ćelija je povezan sa virusnom kontrolom kod zdravih
1 2
osoba inficiranih citomegalovirusom (CMV), Epštajn-Barovim virusom (EBV) i virusom herpes simpleks (HSV), kao i kod onih osoba zaraženih virusom humane imunodeficijencije (HIV) koji ostaju bez simptoma nekoliko godina.
U kontekstu hroničnih virusnih infekcija, stoga smo razvili in vitro test za procenu efekta ciljanja PD-1 za isporučivanje mutirane verziju IL-2 (IL-2v) disfunkcionalnim T ćelijama specifičnim za antigen. Da bismo izbegli ograničenja u pogledu količine odgovarajućih donora za naš test, odlučili smo se za CMV imunogeni virusni protein (pp65) kao antigen opoziva za T ćelije, s obzirom na to da je otprilike 80% populacije CMV-seropozitivno. Dakle, stimulisali smo mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) zdravih donora sa CMV-pp65 (Miltenyi) u prisustvu naših konstrukta u koncentraciji od 10 µg/ml. 43 sata kasnije blokirali smo transport proteina iz Goldžijevog aparata dodavanjem Golgi Plug (BD Bioscience, Brefeldin A) i Golgi Stop (BD Bioscience, Monensin) i inkubirali smo ćelije na 37°C dodatnih 5 sati. Ćelije su zatim isprane, obojene na površini anti-humanim CD3, CD4, CD8, CD62L i CD45RO antitelima pre fiksiranja / permeabilizacije setom pufera za bojenje transkripcionog faktora FoxP3 (eBioscience). Konačno smo izvršili intracelularno bojenje za IL-2, IFN-γ i Ki67 (sve od eBioscience) da bismo izmerili proliferaciju ćelija.
Slika 27 pokazuje sposobnost CD4 T ćelija da luče IL-2 (A), IL-2 i IFN-γ (B) ili IFN-γ (C) i da se umnožavaju (D) nakon 48 sati opoziva sa CMV imunogenim proteinom pp65 u prisustvu bilo anti-PD-1 samog, u kombinaciji sa IL-2v, ili kao fuzionog proteina. Uočili smo trend u sposobnosti PD1-IL2v da poveća frekvencije polifunkcionalnih CD4 T ćelija, sposobnih da zajedno luče IL-2 i IFN-γ (slika 21B), i značajnog povećanja populacije sa pojedinačnim izlučivanjem IFN-γ (slika 21C), u poređenju sa uzorcima tretiranim sa pp65 i anti-PD1. Suprotno tome, kombinacija pp65 i neciljanog IL-2v (DP47-IL2v) povećala je učestalost IL-2 monofunkcionalnih CD4 T ćelija (slika 21 A). Kao što se očekivalo, sve ćelije tretirane ciljanim ili neciljanim IL-2v su se umnožavale na šta ukazuje pozitivnost na Ki67 bojenje.
Slika 28 prikazuje stanje diferencijacije, prema ekspresiji CD45RO i CD62L, CD4 T ćelija specifičnih za virus koje luče IFN-γ nakon 48 sati opoziva sa CMV imunogenim proteinom pp65 u prisustvu bilo anti-PD-1 samog, u kombinaciji sa IL-2v, ili kao fuzionog proteina. Karakterizacija fenotipa proširenih CD4 T ćelija specifičnih za virus koje luče IFN-γ (slika 22) otkrila je profil efektorske memorije (CD45RO+CD62L-). Možemo zaključiti da isporuka IL-2v iscrpljenim CD4 T ćelijama specifičnim za CMV preko fuzionog proteina PD1-IL2v dovodi do ekspanzije dugovečne zaštitne populacije specifične za virus koju karakteriše diferenciran memorijski profil i sposobnost da luče i IL-2 i IFN-γ.
1
Primer 8
Primer 8A. Aktivacija ćelija donora 1 i 2 (pSTAT5 test)
Sveže izolovane PBMC od zdravih donora su zasejane u toplom medijumu (RPMI1640, 10% FCS, 2 mM glutamin) na ploču sa 96 bunarčića sa okruglim dnom (200.000 ćelija/bunarčiću). Ploče su centrifugirane na 300 g tokom 10 min i supernatant je uklonjen. Ćelije su ponovo suspendovane u 50 µl medijuma koji sadrži molekule IL2, i stimulisane 20 minuta na 37°C. Da bi se očuvao status fosforilacije, ćelije su odmah nakon stimulacije fiksirane jednakom količinom prethodno zagrejanog Cytofix pufera (554655, BD Bioscience) u trajanju od 10 minuta na 37°C. Nakon toga, ploče su centrifugirane 10 minuta na 300 g i supernatant je uklonjen. Da bi se omogućilo intracelularno bojenje, ćelije su permeabilizovane u 200 µl Phosflow Perm pufera III (558050, BD Bioscience) tokom 30 minuta na 4°C. Ćelije su zatim isprane dva puta sa 150 µl hladnog FACS pufera i podeljene u dve ploče sa 96 bunarčića sa okruglim dnom, i obojene sa po 20 µl mešavine antitela I ili II tokom 60 minuta u frižideru. Mešavina antitela I je korišćena za bojenje pSTAT5 u CD4 T ćelijama i regulatornim T ćelijama, a mešavina antitela II je korišćena za bojenje pSTAT5 u CD8 T ćelijama i NK ćelijama. Nakon toga, ćelije su dva puta isprane FACS puferom i ponovo suspendovane u 200 µl FACS pufera koji sadrži 2% PFA po bunarčiću. Analiza je izvedena pomoću BD Fortessa protočnog citometra.
Korišćene su mešavine FACS antitela prema tabeli 9 i tabeli 10.
Tabela 9. FACS mešavina antitela I (CD4 T ćelije i regulatorne T ćelije)
Tabela 10. FACS mešavina antitela II (CD8 T ćelije i NK ćelije)
1 4
Slika 29 prikazuje fosforilaciju STAT5 u CD8 T ćelijama (A), NK ćelijama (B), CD4 T ćelijama (C) i regulatornim T ćelijama (D) nakon tretmana PBMC ćelija donora 1 u mirovanju sa PD1-IL2v, FAP-IL2v i FAP-IL2wt. Sva tri testirana molekula su podjednako potentna na CD8 T ćelije, NK ćelije i CD4 T ćelije (isključujući Treg). FAP-IL2wt je potentniji u indukovanju fosforilacije STAT5 u Treg ćelijama, a zatim PD1-IL2v. FAP-IL2v ima najmanju aktivnost na Treg.
Slika 30 prikazuje fosforilaciju STAT5 u CD4 T ćelijama (A), CD8 T ćelijama (B), regulatornim T ćelijama (C) i NK ćelijama (D) nakon tretmana PBMC ćelija donora 2 u mirovanju sa FAP-IL2v, PD1-IL2c, FAP-IL2wt i PD1-TIM3-IL2v. Sva četiri testirana molekula imaju uporedivu aktivnost na CD8 T ćelije, NK ćelije i CD4 T ćelije (isključujući Treg). FAP-IL2wt je potentniji u indukovanju fosforilacije STAT5 u Treg ćelijama, a zatim PD1-IL2v. FAP-IL2v ima najmanju aktivnost na Treg.
Primer 8B. Aktivacija ćelija donora 3 i 4 (pSTAT5 test)
Zamrznute PBMC ćelije izolovane od zdravih donora su odmrznute i uzgajane preko noći na 37°C. Sledećeg dana ćelije su zasejane u toplom medijumu (RPMI1640, 10% FCS, 2 mM glutamin) na ploči sa 96 bunarčića sa okruglim dnom (200.000 ćelija/bunarčiću). Ploče su centrifugirane na 300 g tokom 10 min i supernatant je uklonjen. Ćelije su ponovo suspendovane u 50 µl medijuma koji sadrži molekule IL2, i stimulisane 20 minuta na 37°C. Da bi se očuvao status fosforilacije, ćelije su odmah nakon stimulacije fiksirane jednakom količinom prethodno zagrejanog Cytofix pufera (554655, BD Bioscience) u trajanju od 10 minuta na 37°C. Nakon toga, ploče su centrifugirane 10 minuta na 300 g i supernatant je uklonjen. Da bi se omogućilo intracelularno bojenje, ćelije su permeabilizovane u 200 µl Phosflow Perm pufera III (558050, BD Bioscience) tokom 30 minuta na 4°C. Ćelije su zatim isprane dva puta sa 150 µl hladnog FACS pufera i podeljene u dve ploče sa 96 bunarčića sa okruglim dnom, i obojene sa po 20 µl mešavine antitela I ili II tokom 60 minuta u frižideru. Mešavina antitela I je korišćena za bojenje pSTAT5 u CD4 T ćelijama i regulatornim T ćelijama, a mešavina antitela II je korišćena za bojenje pSTAT5 u CD8 T ćelijama i NK ćelijama. Nakon toga, ćelije su dva puta isprane FACS puferom i ponovo suspendovane u 200 µl FACS pufera koji sadrži 2% PFA po bunarčiću. Analiza je izvedena pomoću BD Fortessa protočnog citometra. Korišćene su mešavine FACS antitela prema tabeli 11 i tabeli 12.
1
Tabela 11. FACS mešavina antitela I (CD4 T ćelije i regulatorne T ćelije)
Tabela 12. FACS mešavina antitela II (CD8 T ćelije i NK ćelije)
Slika 31 prikazuje fosforilaciju STAT5 u CD8 T ćelijama (A), NK ćelijama (B), CD4 T ćelijama (C) i regulatornim T ćelijama (D) nakon tretmana PBMC ćelija donora 3 u mirovanju sa FAP-IL2v, PD1-IL2v, FAP-IL2wt, PD1-TIM3-IL2v. Sva četiri testirana molekula imaju uporedivu aktivnost na CD8 T ćelije, NK ćelije i CD4 T ćelije (isključujući Treg). FAP-IL2wt je potentniji u indukovanju fosforilacije STAT5 u Treg ćelijama, a zatim PD1-IL2v. FAP-IL2v ima najmanju aktivnost na Treg.
Slika 32 prikazuje fosforilaciju STAT5 u CD8 T ćelijama (A), NK ćelijama (B), CD4 T ćelijama (C) i regulatornim T ćelijama (D) nakon tretmana PBMC ćelija donora 4 u mirovanju sa FAP-IL2v, PD1-IL2v, FAP-IL2wt, PD1-TIM3-IL2v. Sva četiri testirana molekula imaju uporedivu aktivnost na CD8 T ćelije, NK ćelije i CD4 T ćelije (isključujući Treg). FAP-IL2wt je potentniji u indukovanju fosforilacije STAT5 u Treg ćelijama, a zatim PD1-IL2v. FAP-IL2v ima najmanju aktivnost na Treg.
Iako je prethodni pronalazak detaljno opisan pomoću ilustracija i primera radi lakšeg razumevanja, opisi i primeri ne bi trebalo da se tumače kao ograničenje obima pronalaska, koji je definisan priloženim zahtevima.
1
1
1
1
11
11
11
11
11
11
11
��
12
��
12
12
��
12
1
11
12
1
14
�
1
�
1
1
��
14
��
14
��
14
14
1
11
12
1
14
1
1
1
�
�
�
11
��
�
14
1
1
�
1
1
�
11
12
1
��
1
1
�

Claims (29)

PATENTNI ZAHTEVI
1. Imunokonjugat koji sadrži (i) antitelo koje se vezuje za PD-1 i (ii) mutantni IL-2 polipeptid,
pri čemu, mutantni polipeptid IL-2 je humani polipeptid IL-2 koji sadrži aminokiselinske supstitucije F42A, Y45A i L72G, a numeracija je u odnosu na sekvencu humanog IL-2 SEQ ID NO: 19.
2. Imunokonjugat prema zahtevu 1, pri čemu, polipeptid IL-2 je mutantni polipeptid IL-2,
pri čemu, mutantni polipeptid IL-2 je molekul humanog IL-2 koji sadrži aminokiselinske supstitucije F42A, Y45A i L72G, a numeracija je u odnosu na sekvencu humanog IL-2 SEQ ID NO: 19; i
pri čemu, antitelo sadrži (a) varijabilni region teškog lanca (VH) koji sadrži HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1, HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 2, HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 3, i FR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 7 na pozicijama 71-73 prema Kabatovoj numeraciji, i (b) varijabilni region lakog lanca (VL) koji sadrži HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 4, HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 5, i HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 6.
3. Imunokonjugat prema zahtevu 1, pri čemu, polipeptid IL-2 je mutantni polipeptid IL-2,
pri čemu, mutantni polipeptid IL-2 je molekul humanog IL-2 koji sadrži aminokiselinske supstitucije F42A, Y45A i L72G, a numeracija je u odnosu na sekvencu humanog IL-2 SEQ ID NO: 19; i
pri čemu, antitelo sadrži (a) varijabilni region teškog lanca (VH) koji sadrži HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 8, HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 9 i HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 10, i (b) varijabilni region lakog lanca (VL) koji sadrži HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 11, HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 12, i HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 13.
4. Imunokonjugat prema zahtevu 1, pri čemu, polipeptid IL-2 je mutantni polipeptid IL-2,
pri čemu, mutantni polipeptid IL-2 je molekul humanog IL-2 koji sadrži aminokiselinske supstitucije F42A, Y45A i L72G, a numeracija je u odnosu na sekvencu humanog IL-2 SEQ ID NO: 19; i
pri čemu, antitelo sadrži (a) varijabilni region teškog lanca (VH) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 14 i (b) varijabilni region lakog lanca (VL) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci izabranoj iz grupe koju čine SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 i SEQ ID NO: 18.
5. Imunokonjugat prema bilo kom od zahteva 1 do 4, pri čemu, mutantni polipeptid IL-2 dalje sadrži aminokiselinsku supstituciju T3A i/ili aminokiselinsku supstituciju C125A.
6. Imunokonjugat prema bilo kom od zahteva 1 do 5, pri čemu, mutantni polipeptid IL-2 sadrži sekvencu SEQ ID NO: 20.
7. Imunokonjugat prema bilo kom od zahteva 1 do 6, pri čemu, imunokonjugat ne sadrži više od jednog mutantnog polipeptida IL-2.
8. Imunokonjugat prema bilo kom od zahteva 1 do 7, pri čemu, antitelo sadrži Fc domen sastavljen od prve i druge podjedinice.
9. Imunokonjugat prema zahtevu 8, pri čemu, Fc domen je klase IgG, posebno Fc domen potklase IgG1.
10. Imunokonjugat prema zahtevu 8 ili 9, pri čemu, Fc domen je humani Fc domen.
11. Imunokonjugat prema bilo kom od zahteva 1 do 10, pri čemu, antitelo je klase IgG, posebno potklase imunoglobulina IgG1.
12. Imunokonjugat prema bilo kom od zahteva 8 do 11, pri čemu, Fc domen sadrži modifikaciju koja promoviše povezivanje prve i druge podjedinice Fc domena.
13. Imunokonjugat prema bilo kom od zahteva 8 do 12, pri čemu, u CH3 domenu prve podjedinice Fc domena aminokiselinski ostatak je zamenjen aminokiselinskim ostatkom koji ima veći volumen bočnog lanca, čime se stvara izbočina u CH3 domenu prve podjedinice koja može da se pozicionira u šupljinu u CH3 domenu druge podjedinice, a u CH3 domenu druge podjedinice Fc domena, aminokiselinski ostatak je zamenjen aminokiselinskim ostatkom koji ima manji volumen bočnog lanca, čime se stvara šupljina u CH3 domenu druge podjedinice u koju može da se pozicionira izbočina u CH3 domenu prve podjedinice.
14. Imunokonjugat prema bilo kom od zahteva 8 do 13, pri čemu, u prvoj podjedinici Fc domena ostatak treonina na poziciji 366 zamenjen je ostatkom triptofana (T366W), a u drugoj podjedinici Fc domena, ostatak tirozina na poziciji 407 zamenjen je ostatkom valina (Y407V) i opciono, ostatak treonina na poziciji 366 zamenjen je ostatkom serina (T366S), a ostatak leucina na poziciji 368 zamenjen je ostatkom alanina (L368A), pri čemu je numeracija prema Kabatovom EU indeksu.
1
15. Imunokonjugat prema zahtevu 14, pri čemu, u prvoj podjedinici Fc domena ostatak serina na poziciji 354 dodatno je zamenjen ostatkom cisteina (S354C) ili je ostatak glutaminske kiseline na poziciji 356 zamenjen ostatkom cisteina (E356C), a u drugoj podjedinici Fc domena ostatak tirozina na poziciji 349 dodatno je zamenjen ostatkom cisteina (Y349C), pri čemu je numeracija prema Kabatovom EU indeksu.
16. Imunokonjugat prema bilo kom od zahteva 8 do 15, pri čemu, mutantni IL-2 polipeptid je fuzionisan na svojoj amino-terminalnoj aminokiselini sa karboksi-terminalnom amino kiselinom jedne od podjedinica Fc domena, posebno prve podjedinice Fc domena, opciono preko linker peptida.
17. Imunokonjugat prema zahtevu 16, pri čemu, linker peptid ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 21.
18. Imunokonjugat prema bilo kom od zahteva 8 do 16, pri čemu, Fc domen sadrži jednu ili više aminokiselinskih supstitucija koje smanjuju vezivanje za Fc receptor, posebno za Feγ receptor, i/ili efektorsku funkciju, posebno ćelijski posredovanu citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC).
19. Imunokonjugat prema zahtevu 18, pri čemu, pomenuta jedna ili više aminokiselinskih supstitucija je na jednoj ili više pozicija izabrana iz grupe od L234, L235 i P329, pri čemu je numeracija prema Kabatovom EU indeksu.
20. Imunokonjugat prema bilo kom od zahteva 8 do 19, pri čemu svaka podjedinica Fc domena sadrži aminokiselinske supstitucije L234A, L235A i P329G, pri čemu je numeracija prema Kabatovom EU indeksu.
21. Imunokonjugat prema bilo kom od zahteva 1 do 20, koji sadrži polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci SEQ ID NO: 22, polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci SEQ ID NO: 23 ili SEQ ID NO: 24, i polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci SEQ ID NO: 25.
22. Imunokonjugat prema bilo kom od zahteva 1 do 21, koji se u suštini sastoji od mutantnog polipeptida IL-2 i molekula imunoglobulina IgG1, spojenih sekvencom linkera.
23. Jedan ili više izolovanih polinukleotida koji kodiraju imunokonjugat prema bilo kom od zahteva 1 do 22.
24. Jedan ili više vektora, posebno ekspresioni vektor, koji sadrži polinukleotid(e) prema zahtevu 23.
1
25. Ćelija domaćin koja sadrži polinukleotid(e) prema zahtevu 23 ili vektor(e) prema zahtevu 24.
26. Postupak za proizvodnju imunokonjugata koji sadrži mutantni polipeptid IL-2 i antitelo koje se vezuje za PD-1, koji obuhvata (a) uzgajanje ćelije domaćina prema zahtevu 25 pod uslovima pogodnim za ekspresiju imunokonjugata, i opciono (b) rekuperovanje imunokonjugata.
27. Farmaceutska kompozicija koja sadrži imunokonjugat prema bilo kom od zahteva 1 do 22 i farmaceutski prihvatljiv nosač.
28. Imunokonjugat prema bilo kom od zahteva 1 do 22 za upotrebu kao lek.
29. Imunokonjugat prema bilo kom od zahteva 1 do 22 za upotrebu u lečenju bolesti, pri čemu, navedena bolest je kancer.
1 1
RS20220957A 2017-04-03 2018-03-29 Imunokonjugati anti-pd-1 antitela sa mutantom il-2 ili sa il-15 RS63663B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP17164533 2017-04-03
EP18715008.1A EP3606946B1 (en) 2017-04-03 2018-03-29 Immunoconjugates of an anti-pd-1 antibody with a mutant il-2 or with il-15
PCT/EP2018/058034 WO2018184964A1 (en) 2017-04-03 2018-03-29 Immunoconjugates of an anti-pd-1 antibody with a mutant il-2 or with il-15

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS63663B1 true RS63663B1 (sr) 2022-11-30

Family

ID=58488892

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20220957A RS63663B1 (sr) 2017-04-03 2018-03-29 Imunokonjugati anti-pd-1 antitela sa mutantom il-2 ili sa il-15

Country Status (30)

Country Link
US (3) US11413331B2 (sr)
EP (2) EP4201953A1 (sr)
JP (3) JP7426825B2 (sr)
KR (2) KR102461885B1 (sr)
CN (2) CN110392692B (sr)
AR (2) AR111400A1 (sr)
AU (1) AU2018247765B2 (sr)
CL (1) CL2019002346A1 (sr)
CO (1) CO2019009354A2 (sr)
CR (1) CR20190426A (sr)
DK (1) DK3606946T3 (sr)
ES (1) ES2928718T3 (sr)
HR (1) HRP20221254T1 (sr)
HU (1) HUE059885T2 (sr)
IL (1) IL269395B2 (sr)
LT (1) LT3606946T (sr)
MA (1) MA49033B1 (sr)
MX (2) MX2019011770A (sr)
MY (1) MY201482A (sr)
PE (1) PE20191494A1 (sr)
PH (1) PH12019502273A1 (sr)
PL (1) PL3606946T3 (sr)
PT (1) PT3606946T (sr)
RS (1) RS63663B1 (sr)
RU (1) RU2761377C2 (sr)
SG (1) SG11201909205YA (sr)
TW (1) TWI800506B (sr)
UA (1) UA125700C2 (sr)
WO (1) WO2018184964A1 (sr)
ZA (1) ZA201905517B (sr)

Families Citing this family (92)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017055404A1 (en) 2015-10-02 2017-04-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific antibodies specific for pd1 and tim3
KR20190062515A (ko) * 2016-10-06 2019-06-05 화이자 인코포레이티드 암의 치료를 위한 아벨루맙의 투약 용법
EP3596108A4 (en) 2017-03-15 2020-12-23 Pandion Operations, Inc. TARGETED IMMUNOTOLERANCE
CN107082812B (zh) * 2017-03-29 2018-11-13 上海科医联创生物科技有限公司 一种恢复衰竭性免疫细胞功能的融合蛋白及其应用
MY201482A (en) 2017-04-03 2024-02-26 Hoffmann La Roche Immunoconjugates of an anti-pd-1 antibody with a mutant il-2 or with il-15
EP4516809A3 (en) 2017-04-05 2025-09-03 F. Hoffmann-La Roche AG Bispecific antibodies specifically binding to pd1 and lag3
US10676516B2 (en) 2017-05-24 2020-06-09 Pandion Therapeutics, Inc. Targeted immunotolerance
EP4029877B1 (en) 2017-08-03 2024-01-17 Amgen Inc. Interleukin-21 muteins and methods of treatment
KR102777151B1 (ko) 2017-11-21 2025-03-05 더 보드 어브 트러스티스 어브 더 리랜드 스탠포드 주니어 유니버시티 인터루킨-2의 부분 효능제
US10174092B1 (en) 2017-12-06 2019-01-08 Pandion Therapeutics, Inc. IL-2 muteins
USRE50550E1 (en) 2017-12-06 2025-08-26 Pandion Operations, Inc. IL-2 muteins and uses thereof
US10946068B2 (en) 2017-12-06 2021-03-16 Pandion Operations, Inc. IL-2 muteins and uses thereof
TW201930344A (zh) 2018-01-12 2019-08-01 美商安進公司 抗ｐｄ-１抗體及治療方法
US11492384B2 (en) 2018-09-17 2022-11-08 Gi Innovation, Inc. Fusion protein comprising IL-2 protein and CD80 protein, and use thereof
CA3098930A1 (en) 2018-09-21 2020-03-26 Innovent Biologics (Suzhou) Co., Ltd. Novel interleukin-2 and use thereof
TWI840433B (zh) * 2018-10-29 2024-05-01 大陸商北京強新生物科技有限公司 新穎合理設計的蛋白質組合物
KR20210108978A (ko) * 2018-12-21 2021-09-03 오제 이뮈노테라프틱스 이작용성 항-pd-1/il-7 분자
WO2020127369A1 (en) * 2018-12-21 2020-06-25 Ose Immunotherapeutics Bifunctional molecule directed against human pd-1
BR112021023345A2 (pt) 2019-05-20 2022-02-01 Pandion Operations Inc Imunotolerância com alvo em madcam
EP3980051A4 (en) * 2019-06-05 2023-09-13 Asher Biotherapeutics, Inc. FUSIONS OF MUTANT INTERLEUKIN-2 POLYPEPTIDES WITH ANTIGEN-BINDING MOLECULES TO MODULATE THE FUNCTION OF IMMUNE CELLS
WO2020259536A1 (zh) * 2019-06-24 2020-12-30 南京金斯瑞生物科技有限公司 单克隆抗体-细胞因子融合蛋白二聚体及其应用
CN116574183A (zh) * 2019-08-22 2023-08-11 盛禾(中国)生物制药有限公司 多功能抗体、其制备及其用途
CN112679615B (zh) * 2019-10-17 2023-09-22 瑞阳(苏州)生物科技有限公司 一种融合蛋白
CN115551594A (zh) * 2019-10-24 2022-12-30 米诺陶治疗公司 经细胞因子修饰的嵌合抗体及其使用方法
IL291909A (en) * 2019-11-20 2022-06-01 Gi Cell Inc Regulatory t cell culture composition and use thereof
AU2020389422B2 (en) * 2019-11-20 2024-08-08 Gi Cell, Inc. Medium composition for culturing T cells and method for culturing T cells using same
TW202128961A (zh) 2019-11-20 2021-08-01 美商安維塔生物科學股份有限公司 細胞激素融合蛋白及其醫藥組合物及治療應用
KR102351020B1 (ko) 2019-11-20 2022-01-14 주식회사 지아이셀 자연살해세포 배양용 조성물 및 이를 이용한 자연살해세포 제조방법
IL292935A (en) * 2019-11-27 2022-07-01 Gi Cell Inc A compound for anti-cancer treatment, which includes nk cells and a fusion protein including il-2 protein and cd80 protein
MX2022007202A (es) * 2019-12-13 2022-10-07 Cugene Inc Fármacos bioactivables a base de citocinas y metodos de uso de los mismos.
CN114829385A (zh) * 2019-12-17 2022-07-29 Ose免疫疗法公司 包含il-7变体的双功能分子
WO2021127487A2 (en) 2019-12-20 2021-06-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Novel il2 agonists and methods of use thereof
JP7730817B6 (ja) * 2019-12-20 2025-09-26 アレス トレーディング ソシエテ アノニム ＩｇＧ：ＴＧＦβＲＩＩ融合タンパク質組成物
CN114929734A (zh) * 2020-01-09 2022-08-19 豪夫迈·罗氏有限公司 新型含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子
US11633488B2 (en) 2020-01-10 2023-04-25 Bright Peak Therapeutics Ag Modified IL-2 polypeptides and uses thereof
KR102559355B1 (ko) * 2020-01-31 2023-07-25 주식회사 제넥신 항-taa 항체, 항-pd-l1 항체 및 il-2를 포함하는 융합단백질 및 이의 용도
IL295143B2 (en) 2020-02-13 2026-02-01 Hoffmann La Roche A method for determining the loading state of AAV particles using nuclear magnetic resonance relaxometry
EP4107187A4 (en) 2020-02-21 2024-07-03 Pandion Operations, Inc. TISSUE-TARGETED IMMUNOTOLERANCE WITH A CD39 EFFECTOR
AU2021256936A1 (en) * 2020-04-15 2022-07-21 F. Hoffmann-La Roche Ag Immunoconjugates
WO2021222150A2 (en) 2020-04-28 2021-11-04 Anwita Biosciences, Inc. Interleukin-2 polypeptides and fusion proteins thereof, and their pharmaceutical compositions and therapeutic applications
JP2023527690A (ja) 2020-05-11 2023-06-30 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 改変ｐｂｍｃと免疫抱合体との併用療法
IL298136A (en) 2020-05-13 2023-01-01 Bonum Therapeutics Inc Preparations of protein complexes and methods of using them
CN113667004B (zh) * 2020-05-14 2026-04-24 上海盖浦生物科技有限公司 一种白介素2突变体
EP4174088A4 (en) * 2020-06-30 2024-01-24 GI Innovation, Inc. FUSION PROTEIN COMPRISING AN ANTI-LAG-3 AND IL-2 ANTIBODY AND USE THEREOF
JP2022045530A (ja) * 2020-09-09 2022-03-22 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト Ｐｄ－１標的化ｉｌ－２変異体免疫サイトカインとヒトｐｄ－ｌ１に対する抗体との併用療法
US11865082B2 (en) 2020-09-09 2024-01-09 Hoffmann-La Roche Inc. Combination therapy of PD-1-targeted IL-2 variant immunocytokines and antibodies against human PD-L1
KR20230112632A (ko) 2020-10-23 2023-07-27 애셔 바이오테라퓨틱스, 인크. 면역 세포 기능을 조절하기 위한 cd8 항원 결합 분자와의 융합
WO2022098954A1 (en) 2020-11-06 2022-05-12 Nektar Therapeutics Tlr agonist compounds and related cancer immunotherapy methods
WO2022115865A2 (en) 2020-11-25 2022-06-02 Xilio Development, Inc. Tumor-specific cleavable linkers
KR20230117122A (ko) 2020-12-04 2023-08-07 에프. 호프만-라 로슈 아게 pH 의존성 돌연변이체 인터류킨-2 폴리펩티드
WO2022125694A1 (en) * 2020-12-09 2022-06-16 Asher Biotherapeutics, Inc. Fusions of interleukin polypeptides with bispecific antigen binding molecules for modulating immune cell function
US20220195006A1 (en) 2020-12-22 2022-06-23 Neogene Therapeutics B.V. Peptide markers to track genetically engineered cells
CN114712495B (zh) * 2021-01-06 2024-08-20 盛禾(中国)生物制药有限公司 一种多功能抗体的组合物
WO2022148853A1 (en) * 2021-01-11 2022-07-14 F. Hoffmann-La Roche Ag Immunoconjugates
EP4304724A1 (en) * 2021-03-09 2024-01-17 F. Hoffmann-La Roche AG Combination therapy of pd-1-targeted il-2 variant immunoconjugate and anti-tyrp1/anti-cd3 bispecific antibodies
WO2022189377A1 (en) 2021-03-09 2022-09-15 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy of pd-1-targeted il-2 variant immunoconjugates and fap/4-1bb binding molecules
EP4314032A1 (en) 2021-03-30 2024-02-07 F. Hoffmann-La Roche AG Protease-activated polypeptides
MX2023011964A (es) 2021-04-09 2024-01-08 Ose Immunotherapeutics Nuevo andamio para moléculas bifuncionales con propiedades mejoradas.
TW202317623A (zh) 2021-06-14 2023-05-01 美商再生元醫藥公司 基於il2之治療劑及其使用方法
WO2022268983A2 (en) 2021-06-23 2022-12-29 Cytune Pharma Interleukin-15 based immunocytokines
CN117597355A (zh) 2021-06-23 2024-02-23 赛腾制药 白细胞介素15变体
AU2022306974A1 (en) 2021-07-09 2024-01-04 Bright Peak Therapeutics Ag Modified il-2 polypeptides for treatment of inflammatory and autoimmune diseases
CN115521379B (zh) * 2021-07-16 2023-12-22 南京吉盛澳玛生物医药有限公司 Pd-1抗体及其用途
EP4406965A4 (en) * 2021-09-22 2025-12-17 Fortvita Biologics Singapore Pte Ltd INTERLEUKIN-2 MUTANT AND FUSION PROTEIN OF WHICH
EP4405487A4 (en) * 2021-09-26 2025-12-03 Wuxi Biologics Ireland Ltd IL-2 VARIANTS AND THEIR FUSING PROTEINS
CA3238260A1 (en) * 2021-11-17 2023-05-25 John Thomas MULLIGAN Compositions of protein complexes and methods of use thereof
TWI857396B (zh) * 2021-11-18 2024-10-01 大陸商山東先聲生物製藥有限公司 Il-15突變體融合蛋白藥物組合物
CN116554344A (zh) * 2022-01-30 2023-08-08 中国科学院生物物理研究所 一种pd1抗体与白介素2融合的双功能分子
WO2023151661A1 (zh) * 2022-02-11 2023-08-17 江苏恒瑞医药股份有限公司 免疫缀合物及其用途
AU2023226512A1 (en) 2022-02-23 2024-08-29 Bright Peak Therapeutics Ag Immune antigen specific il-18 immunocytokines and uses thereof
IL316174A (en) * 2022-04-26 2024-12-01 Novartis Ag Multiple specific antibodies targeting IL-13 and IL-18
US20240076343A1 (en) 2022-06-16 2024-03-07 Cephalon Llc Anti-pd-1 antibody-attenuated il-2 immunoconjugates and uses thereof
JP2025527694A (ja) * 2022-08-23 2025-08-22 マストバイオ株式会社 Ｉｌ２変異体及びそれを含むタンパク質複合体
JP2025534285A (ja) 2022-09-29 2025-10-15 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト プロテアーゼ活性化ポリペプチド
CN116041539B (zh) * 2022-10-31 2023-07-21 山东博安生物技术股份有限公司 Il-2突变体免疫缀合物
EP4491631A1 (en) 2023-07-13 2025-01-15 Anaveon AG Anti-pd-1 antibody binding domain and immunoconjugate
EP4431525A1 (en) 2023-03-16 2024-09-18 Anaveon AG Il-2 fusion protein
JP2026501338A (ja) 2022-12-22 2026-01-14 アナヴェオン アーゲー 抗ｐｄ－１抗体抗原結合ドメイン及び免疫抱合体
CN118359730A (zh) * 2023-01-17 2024-07-19 上海君赛生物科技有限公司 包含细胞因子的靶向型融合蛋白
CR20250288A (es) 2023-01-20 2025-08-29 Hoffmann La Roche POLIPÉPTIDOS DE DOMINIO Fc -VARIANTE DE IL2 RECOMBINANTES Y POLITERAPIA CON POLIPÉPTIDOS DE UNIÓN AL ANTÍGENO ANCLADOS A LA MEMBRANA
WO2024165454A1 (en) 2023-02-06 2024-08-15 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy and uses thereof
CN118725136A (zh) * 2023-03-21 2024-10-01 上海赛金生物医药有限公司 抗pd-1/抗tigit双特异性抗体与il-2的融合蛋白及应用
CN118680877A (zh) 2023-03-21 2024-09-24 信达生物制药(苏州)有限公司 抗pd-1与突变il-2免疫缀合物制剂
WO2024199458A1 (en) * 2023-03-29 2024-10-03 Wuxi Biologics (Shanghai) Co., Ltd. Il-2 variants with improved stability and compositions thereof
AU2024273454A1 (en) 2023-05-16 2025-11-27 F. Hoffmann-La Roche Ag Pd-1-regulated il-2 immunocytokine and uses thereof
TW202508641A (zh) * 2023-08-16 2025-03-01 大陸商上海邁晉生物醫藥科技有限公司 一種包含免疫綴合物的醫藥組成物及其用途
US20250195677A1 (en) 2023-12-19 2025-06-19 Cephalon Llc Uses for attenuated il-2 immunoconjugates
WO2025202147A1 (en) 2024-03-27 2025-10-02 F. Hoffmann-La Roche Ag Interleukin-7 immunoconjugates
WO2025233304A1 (en) 2024-05-08 2025-11-13 F. Hoffmann-La Roche Ag Recombinant fc domain – il7 variant polypeptides and combination therapy with membrane-anchored antigen binding polypeptides
WO2025242835A1 (en) 2024-05-22 2025-11-27 Ose Immunotherapeutics Molecules comprising masking linkers and uses thereof for the treatment of cancer
WO2025242836A1 (en) 2024-05-22 2025-11-27 Ose Immunotherapeutics Molecules comprising masking linkers and uses thereof for the treatment of auto-immune or inflammatory diseases and disorders
WO2026033134A1 (en) 2024-08-09 2026-02-12 Twain Therapeutics Pte. Ltd. Antigen-binding molecules

Family Cites Families (196)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2388385B1 (fr) 1977-04-18 1982-01-08 Hitachi Metals Ltd Piece d'ornement fixee par des aimants permanents
US4518584A (en) 1983-04-15 1985-05-21 Cetus Corporation Human recombinant interleukin-2 muteins
US5116943A (en) 1985-01-18 1992-05-26 Cetus Corporation Oxidation-resistant muteins of Il-2 and other protein
US5206344A (en) 1985-06-26 1993-04-27 Cetus Oncology Corporation Interleukin-2 muteins and polymer conjugation thereof
JP2524586B2 (ja) 1985-06-26 1996-08-14 シタス コーポレイション ポリマ−接合を利用する医薬組成物用蛋白質の可溶化
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
EP0368684B2 (en) 1988-11-11 2004-09-29 Medical Research Council Cloning immunoglobulin variable domain sequences.
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
CA2095633C (en) 1990-12-03 2003-02-04 Lisa J. Garrard Enrichment method for variant proteins with altered binding properties
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
EP1400536A1 (en) 1991-06-14 2004-03-24 Genentech Inc. Method for making humanized antibodies
GB9114948D0 (en) 1991-07-11 1991-08-28 Pfizer Ltd Process for preparing sertraline intermediates
US5565332A (en) 1991-09-23 1996-10-15 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
FI941572A7 (fi) 1991-10-07 1994-05-27 Oncologix Inc Anti-erbB-2-monoklonaalisten vasta-aineiden yhdistelmä ja käyttömenete lmä
CA2372813A1 (en) 1992-02-06 1993-08-19 L.L. Houston Biosynthetic binding protein for cancer marker
US5229109A (en) 1992-04-14 1993-07-20 Board Of Regents, The University Of Texas System Low toxicity interleukin-2 analogues for use in immunotherapy
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US6066322A (en) 1995-03-03 2000-05-23 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Methods for the treatment of immune disorders
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
PT941329E (pt) 1996-11-29 2004-11-30 Applied Research Systems Metodo para prevenir a rejeicao de enxertos em transplantacao e para produzir uma celula-hospedeiro para terapia genetica universal utilizando activacao de linfocitos (lag-3)
ATE299938T1 (de) 1997-05-02 2005-08-15 Genentech Inc Ein verfahren zur herstellung multispezifischer antikörper die heteromultimere und gemeinsame komponenten besitzen
US6040498A (en) 1998-08-11 2000-03-21 North Caroline State University Genetically engineered duckweed
US6610833B1 (en) 1997-11-24 2003-08-26 The Institute For Human Genetics And Biochemistry Monoclonal human natural antibodies
DK1034298T3 (da) 1997-12-05 2012-01-30 Scripps Research Inst Humanisering af murint antistof
US6660843B1 (en) 1998-10-23 2003-12-09 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
ES2248127T3 (es) 1999-10-04 2006-03-16 Medicago Inc. Metodo para regular la transcripcion de genes foraneos en presencia de nigtrogeno.
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
EP1240319A1 (en) 1999-12-15 2002-09-18 Genentech, Inc. Shotgun scanning, a combinatorial method for mapping functional protein epitopes
JP2003531588A (ja) 2000-04-11 2003-10-28 ジェネンテック・インコーポレーテッド 多価抗体とその用途
KR100919593B1 (ko) 2000-06-29 2009-09-29 아보트 러보러터리즈 이중 특이성 항체 및 이의 제조 방법 및 이를 포함하는 조성물
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
CA2430013C (en) 2000-11-30 2011-11-22 Medarex, Inc. Transgenic transchromosomal rodents for making human antibodies
WO2003015697A2 (en) 2001-08-13 2003-02-27 University Of Southern California Interleukin-2 mutants with reduced toxicity
CA2466279A1 (en) 2001-11-13 2003-05-22 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Agents that modulate immune cell activation and methods of use thereof
DK1454138T3 (da) 2001-12-04 2012-02-13 Merck Patent Gmbh Immunocytokiner med moduleret selektivitet
US7470428B2 (en) 2002-01-30 2008-12-30 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Compositions and methods related to TIM-3, a Th1-specific cell surface molecule
WO2004087754A1 (en) 2003-04-03 2004-10-14 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Broad-spectrum in-vivo effective superantigen toxin antagonists based on the interaction between cd28 and the superantigen and uses thereof
CA2488441C (en) 2002-06-03 2015-01-27 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
AU2003281200A1 (en) 2002-07-03 2004-01-23 Tasuku Honjo Immunopotentiating compositions
WO2004032961A1 (en) 2002-10-10 2004-04-22 Merck Patent Gmbh Bispecific anti-erb-b antibodies and their use in tumor therapy
CN101899114A (zh) 2002-12-23 2010-12-01 惠氏公司 抗pd-1抗体及其用途
WO2004065416A2 (en) 2003-01-16 2004-08-05 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
US7563869B2 (en) 2003-01-23 2009-07-21 Ono Pharmaceutical Co., Ltd. Substance specific to human PD-1
US7772188B2 (en) * 2003-01-28 2010-08-10 Ironwood Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for the treatment of gastrointestinal disorders
US20060235201A1 (en) 2003-02-06 2006-10-19 Roman Kischel Enduring T cell response
PL1897548T5 (pl) 2003-02-28 2025-03-17 The Johns Hopkins University Regulacja komórek T
NZ592039A (en) 2003-08-27 2013-03-28 Ophthotech Corp Combination therapy for the treatment of ocular neovascular disorders
EP1740615B1 (en) 2004-03-31 2014-11-05 Genentech, Inc. Humanized anti-tgf-beta antibodies
US7785903B2 (en) 2004-04-09 2010-08-31 Genentech, Inc. Variable domain library and uses
PT1737891E (pt) 2004-04-13 2013-04-16 Hoffmann La Roche Anticorpos anti p-selectina
TWI380996B (zh) 2004-09-17 2013-01-01 Hoffmann La Roche 抗ｏｘ４０ｌ抗體
DK1791565T3 (en) 2004-09-23 2016-08-01 Genentech Inc Cysteingensplejsede antibodies and conjugates
PL1871805T3 (pl) 2005-02-07 2020-03-31 Roche Glycart Ag Cząsteczki wiążące antygen, które wiążą egfr, wektory kodujące te cząsteczki oraz ich zastosowania
AU2006232287B2 (en) 2005-03-31 2011-10-06 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for producing polypeptides by regulating polypeptide association
DK2439273T3 (da) 2005-05-09 2019-06-03 Ono Pharmaceutical Co Humane monoklonale antistoffer til programmeret død-1(pd-1) og fremgangsmåder til behandling af cancer ved anvendelse af anti-pd-1- antistoffer alene eller i kombination med andre immunterapeutika
CA2611861C (en) 2005-06-08 2017-11-28 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Methods and compositions for the treatment of persistent infections
JP2006345852A (ja) 2005-06-16 2006-12-28 Virxsys Corp 抗体複合体
PT1907424E (pt) 2005-07-01 2015-10-09 Squibb & Sons Llc Anticorpos monoclonais humanos para o ligando 1 de morte programada (pd-l1)
US7612181B2 (en) 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
ES2577292T3 (es) 2005-11-07 2016-07-14 Genentech, Inc. Polipéptidos de unión con secuencias hipervariables de VH/VL diversificadas y consenso
EP1962961B1 (en) 2005-11-29 2013-01-09 The University Of Sydney Demibodies: dimerisation-activated therapeutic agents
EP1973951A2 (en) 2005-12-02 2008-10-01 Genentech, Inc. Binding polypeptides with restricted diversity sequences
PT1999154E (pt) 2006-03-24 2013-01-24 Merck Patent Gmbh Domínios proteicos heterodiméricos modificados
TW200812616A (en) 2006-05-09 2008-03-16 Genentech Inc Binding polypeptides with optimized scaffolds
CN101490085A (zh) 2006-06-12 2009-07-22 特鲁比昂药品公司 具有效应功能的单链多价结合蛋白
NZ573646A (en) 2006-06-12 2012-04-27 Wyeth Llc Single-chain multivalent binding proteins with effector function
JP2009541275A (ja) 2006-06-22 2009-11-26 ノボ・ノルデイスク・エー／エス 二重特異性抗体の生産
ES2368868T3 (es) 2006-09-20 2011-11-23 Mt-Biomethan Gmbh Procedimiento y dispositivo para la separación de metano y dióxido de carbono de biogás.
AU2007331672A1 (en) 2006-12-15 2008-06-19 Ablynx N.V. Amino acid sequences that modulate the interaction between cells of the immune system
KR101523391B1 (ko) 2006-12-27 2015-05-27 에모리 유니버시티 감염 및 종양 치료를 위한 조성물 및 방법
US9244059B2 (en) 2007-04-30 2016-01-26 Immutep Parc Club Orsay Cytotoxic anti-LAG-3 monoclonal antibody and its use in the treatment or prevention of organ transplant rejection and autoimmune disease
WO2009015917A2 (en) 2007-05-14 2009-02-05 F. Hoffmann-La Roche Ag Dihydroquinone and dihydronaphthridine inhibitors of jnk
JP5545814B2 (ja) 2007-06-18 2014-07-09 中外製薬株式会社 抗体依存性細胞障害活性を模擬する抗体の結合活性測定法
BR122017025062B8 (pt) 2007-06-18 2021-07-27 Merck Sharp & Dohme anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo para o receptor de morte programada humano pd-1, polinucleotídeo e composição compreendendo o referido anticorpo ou fragmento
WO2009014708A2 (en) 2007-07-23 2009-01-29 Cell Genesys, Inc. Pd-1 antibodies in combination with a cytokine-secreting cell and methods of use thereof
WO2009024531A1 (en) 2007-08-17 2009-02-26 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Method for treating and diagnosing hematologic malignancies
EP2212350B1 (en) 2007-10-26 2013-08-28 Governing Council of the University of Toronto Treating chronic viral infection by targetting TIM-3
WO2009061853A2 (en) 2007-11-05 2009-05-14 Massachusetts Institute Of Technology Mutant interleukin-2 (il-2) polypeptides
JP6157046B2 (ja) 2008-01-07 2017-07-05 アムジェン インコーポレイテッド 静電的ステアリング（ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃｓｔｅｅｒｉｎｇ）効果を用いた抗体Ｆｃヘテロ二量体分子を作製するための方法
CN101970499B (zh) 2008-02-11 2014-12-31 治疗科技公司 用于肿瘤治疗的单克隆抗体
EP2262837A4 (en) 2008-03-12 2011-04-06 Merck Sharp & Dohme PD-1 BINDING PROTEINS
ES2538122T3 (es) 2008-07-21 2015-06-17 Apogenix Gmbh Moléculas de una sola cadena de TNFSF
AR072999A1 (es) 2008-08-11 2010-10-06 Medarex Inc Anticuerpos humanos que se unen al gen 3 de activacion linfocitaria (lag-3) y los usos de estos
JP2012500855A (ja) 2008-08-25 2012-01-12 アンプリミューン、インコーポレーテッド Ｐｄ−１アンタゴニストおよび感染性疾患を処置するための方法
AU2009288730B2 (en) 2008-08-25 2013-06-20 Amplimmune, Inc. Compositions of PD-1 antagonists and methods of use
AU2009290544B2 (en) 2008-09-12 2015-07-16 Oxford University Innovation Limited PD-1 specific antibodies and uses thereof
US9181342B2 (en) 2008-09-12 2015-11-10 Isis Innovation Limited PD-1 specific antibodies and uses thereof
US8552154B2 (en) 2008-09-26 2013-10-08 Emory University Anti-PD-L1 antibodies and uses therefor
MX2011005691A (es) 2008-11-28 2011-07-20 Univ Emory Metodos para el tratamiento de infecciones y tumores.
WO2010084999A1 (en) 2009-01-26 2010-07-29 Protegene, Inc. Immunosuppressive agents and prophylactic and therapeutic agents for autoimmune diseases
JP5844159B2 (ja) 2009-02-09 2016-01-13 ユニヴェルシテ デクス−マルセイユＵｎｉｖｅｒｓｉｔｅ Ｄ’Ａｉｘ−Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ Ｐｄ−１抗体およびｐｄ−ｌ１抗体ならびにその使用
US20110313129A1 (en) 2009-02-11 2011-12-22 Life Technologies Corporation Large stokes shift dyes
CA2756244A1 (en) 2009-04-02 2010-10-07 Roche Glycart Ag Multispecific antibodies comprising full length antibodies and single chain fab fragments
WO2010129304A2 (en) 2009-04-27 2010-11-11 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Method for making heteromultimeric molecules
US9676845B2 (en) 2009-06-16 2017-06-13 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific antigen binding proteins
JP5764127B2 (ja) 2009-08-17 2015-08-12 ロシュ グリクアート アーゲー 標的化イムノコンジュゲート
WO2011066342A2 (en) 2009-11-24 2011-06-03 Amplimmune, Inc. Simultaneous inhibition of pd-l1/pd-l2
CA2785907A1 (en) 2009-12-29 2011-07-28 Emergent Product Development Seattle, Llc Ron binding constructs and methods of use thereof
CA3253628A1 (en) * 2010-03-05 2025-11-29 The Johns Hopkins University Compositions and methods for targeted immunomodulatory antibodies and fusion proteins
TW201134488A (en) 2010-03-11 2011-10-16 Ucb Pharma Sa PD-1 antibodies
EP2545078A1 (en) 2010-03-11 2013-01-16 UCB Pharma, S.A. Pd-1 antibody
US9527926B2 (en) 2010-05-14 2016-12-27 Rinat Neuroscience Corp. Heterodimeric proteins and methods for producing and purifying them
AU2011262758B8 (en) 2010-06-11 2014-09-04 Kyowa Kirin Co., Ltd. Anti-tim-3 antibody
WO2011159877A2 (en) 2010-06-18 2011-12-22 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Bi-specific antibodies against tim-3 and pd-1 for immunotherapy in chronic immune conditions
CA2806021C (en) 2010-08-13 2019-05-21 Roche Glycart Ag Anti-fap antibodies and methods of use
ES2758994T3 (es) 2010-11-05 2020-05-07 Zymeworks Inc Diseño anticuerpo heterodimérico estable con mutaciones en el dominio Fc
SG192673A1 (en) * 2011-02-10 2013-09-30 Roche Glycart Ag Mutant interleukin-2 polypeptides
ES2692268T5 (en) 2011-03-29 2025-02-26 Roche Glycart Ag Antibody fc variants
JP6047142B2 (ja) 2011-04-01 2016-12-21 ウニヴェルズィテート シュトゥットガルト 抗体結合ドメインを有する組換えｔｎｆリガンドファミリーメンバーポリペプチドおよびそれらの使用
JP6072771B2 (ja) 2011-04-20 2017-02-01 メディミューン，エルエルシー Ｂ７−ｈ１およびｐｄ−１に結合する抗体およびその他の分子
EA201892619A1 (ru) 2011-04-29 2019-04-30 Роше Гликарт Аг Иммуноконъюгаты, содержащие мутантные полипептиды интерлейкина-2
WO2013006490A2 (en) 2011-07-01 2013-01-10 Cellerant Therapeutics, Inc. Antibodies that specifically bind to tim3
FR2977674B1 (fr) 2011-07-06 2015-08-14 Cisbio Bioassays Methode amelioree de detection et/ou de quantification d'un analyte present a la surface d'une cellule
EP2543680A1 (en) 2011-07-07 2013-01-09 Centre National de la Recherche Scientifique Multispecific mutated antibody Fab fragments
CA2840018C (en) 2011-07-24 2019-07-16 Curetech Ltd. Variants of humanized immunomodulatory monoclonal antibodies
SG2014012298A (en) 2011-08-11 2014-06-27 Medarex Llc Human antibodies that bind lymphocyte activation gene-3 (lag-3), and uses thereof
FR2980271B1 (fr) 2011-09-16 2013-10-11 Cisbio Bioassays Procede de determination de la glycosylation d'un anticorps
RS60499B1 (sr) 2011-12-20 2020-08-31 Medimmune Llc Modifikovani polipeptidi za bispecifične skelete antitela
WO2013113663A1 (en) 2012-02-01 2013-08-08 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for the detection of a binding partner of a multispecific binder
MX360352B (es) 2012-02-15 2018-10-30 Hoffmann La Roche Cromatografia de afinidad basada en receptores fc.
JP5585973B2 (ja) 2012-03-22 2014-09-10 三井造船株式会社 Ｆｒｅｔ計測装置及びｆｒｅｔ計測方法
US9248181B2 (en) 2012-04-20 2016-02-02 Merus B.V. Methods and means for the production of Ig-like molecules
PL3489254T3 (pl) 2012-04-30 2023-01-30 Biocon Limited Ukierunkowujące/immunomodulujące białko fuzyjne i sposoby jego otrzymywania
UY34887A (es) 2012-07-02 2013-12-31 Bristol Myers Squibb Company Una Corporacion Del Estado De Delaware Optimización de anticuerpos que se fijan al gen de activación de linfocitos 3 (lag-3) y sus usos
SG11201408538PA (en) 2012-07-13 2015-02-27 Roche Glycart Ag Bispecific anti-vegf/anti-ang-2 antibodies and their use in the treatment of ocular vascular diseases
MY175687A (en) 2012-08-07 2020-07-06 Roche Glycart Ag Composition comprising two antibodies engineered to have reduced and increased effector function
EP2904093B1 (en) 2012-10-03 2019-04-10 Zymeworks Inc. Methods of quantitating heavy and light chain polypeptide pairs
US10344088B2 (en) 2013-03-15 2019-07-09 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Antigen binding proteins
SMT202100065T1 (it) 2013-05-02 2021-03-15 Anaptysbio Inc Anticorpi diretti contro la proteina della morte programmata (pd-1)
PT3444271T (pt) * 2013-08-08 2022-01-05 Inst Nat Sante Rech Med Modulocinas baseadas em il-15 e no domínio sushi de il-15ralfa
JP6595458B2 (ja) 2013-09-20 2019-10-23 ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニー 腫瘍を処置するための抗ｌａｇ−３抗体と抗ｐｄ−１抗体との組合せ
WO2015048312A1 (en) 2013-09-26 2015-04-02 Costim Pharmaceuticals Inc. Methods for treating hematologic cancers
SG10201804945WA (en) 2013-12-12 2018-07-30 Shanghai hengrui pharmaceutical co ltd Pd-1 antibody, antigen-binding fragment thereof, and medical application thereof
WO2015095423A2 (en) 2013-12-17 2015-06-25 Genentech, Inc. Combination therapy comprising ox40 binding agonists and pd-1 axis binding antagonists
RU2727639C2 (ru) 2014-01-15 2020-07-22 Ф.Хоффманн-Ля Рош Аг Варианты fc-области с модифицированной способностью связываться с fcrn и с сохраненной способностью связываться с белком а
US10794898B2 (en) 2014-01-17 2020-10-06 Regents Of The University Of Minnesota High-throughput, high-precision methods for detecting protein structural changes in living cells
TWI681969B (zh) * 2014-01-23 2020-01-11 美商再生元醫藥公司 針對ｐｄ-１的人類抗體
PE20170255A1 (es) 2014-01-24 2017-03-22 Dana Farber Cancer Inst Inc Moleculas de anticuerpo que se unen a pd-1 y usos de las mismas
HUE057817T2 (hu) 2014-01-28 2022-06-28 Bristol Myers Squibb Co Anti-LAG-3 antitestek haematológiai malignitások kezelésére
KR102442436B1 (ko) 2014-03-14 2022-09-15 노파르티스 아게 Lag-3에 대한 항체 분자 및 그의 용도
UA117289C2 (uk) 2014-04-02 2018-07-10 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Мультиспецифічне антитіло
KR20160141857A (ko) 2014-04-25 2016-12-09 제넨테크, 인크. 트라스투주맙-mcc-dm1 및 퍼투주맙을 이용하는 초기 유방암의 치료방법
TWI693232B (zh) 2014-06-26 2020-05-11 美商宏觀基因股份有限公司 與pd-1和lag-3具有免疫反應性的共價結合的雙抗體和其使用方法
JO3663B1 (ar) 2014-08-19 2020-08-27 Merck Sharp & Dohme الأجسام المضادة لمضاد lag3 وأجزاء ربط الأنتيجين
DK3186283T3 (da) 2014-08-29 2020-03-02 Hoffmann La Roche Kombinationsbehandling med tumormålrettede IL-2- immuncytokinervarianter og antistoffer mod humant PD-L1
SI3215532T1 (sl) 2014-11-06 2020-02-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Protitelesa proti TIM3 in postopki uporabe
EP3224275B1 (en) 2014-11-14 2020-03-04 F.Hoffmann-La Roche Ag Antigen binding molecules comprising a tnf family ligand trimer
EP4141032B1 (en) 2014-11-20 2024-05-29 F. Hoffmann-La Roche AG Combination therapy of t cell activating bispecific antigen binding molecules and pd-1 axis binding antagonists
TWI595006B (zh) 2014-12-09 2017-08-11 禮納特神經系統科學公司 抗ｐｄ－１抗體類和使用彼等之方法
DK3237446T3 (en) 2014-12-22 2021-07-26 Pd 1 Acquisition Group Llc Anti-PD-1-antistoffer
MA41463A (fr) 2015-02-03 2017-12-12 Anaptysbio Inc Anticorps dirigés contre le gène d'activation 3 des lymphocytes (lag-3)
EP3064507A1 (en) * 2015-03-06 2016-09-07 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts Fusion proteins comprising a binding protein and an interleukin-15 polypeptide having a reduced affinity for IL15ra and therapeutic uses thereof
TWI773646B (zh) 2015-06-08 2022-08-11 美商宏觀基因股份有限公司 結合lag-3的分子和其使用方法
KR20180019725A (ko) 2015-06-23 2018-02-26 메모리얼 슬로안-케터링 캔서 센터 신규의 피디 1 면역 조절제
CN114853891A (zh) 2015-07-22 2022-08-05 索伦托药业有限公司 与lag3结合的抗体治疗剂
CN117510633A (zh) 2015-09-02 2024-02-06 伊缪泰普有限公司 抗lag-3抗体
WO2017055314A1 (en) 2015-10-02 2017-04-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific anti-cd19xcd3 t cell activating antigen binding molecules
EP3150636A1 (en) 2015-10-02 2017-04-05 F. Hoffmann-La Roche AG Tetravalent multispecific antibodies
AU2016330807B2 (en) 2015-10-02 2023-08-10 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-human CD19 antibodies with high affinity
JP6734919B2 (ja) 2015-10-02 2020-08-05 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 同時結合を測定するための細胞ベースのｆｒｅｔアッセイ法
ES2895034T3 (es) 2015-10-02 2022-02-17 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-PD1 y procedimientos de uso
WO2017055404A1 (en) 2015-10-02 2017-04-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific antibodies specific for pd1 and tim3
AU2016334623A1 (en) 2015-10-07 2018-02-15 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific antibodies with tetravalency for a costimulatory TNF receptor
JP6668468B2 (ja) 2015-11-03 2020-03-18 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ Ｈｂｖキャプシドアセンブリ阻害剤とインターフェロンの併用療法
JP7003036B2 (ja) 2015-12-02 2022-02-04 エスティーキューブ，インコーポレイテッド グリコシル化ｐｄ－１に対して特異的な抗体およびその使用方法
WO2017097728A1 (en) 2015-12-10 2017-06-15 F. Hoffmann-La Roche Ag Bridged piperidine derivatives
CN109071636A (zh) 2016-03-29 2018-12-21 斯特库比股份有限公司 用于选择特异性结合糖基化免疫检查点蛋白的抗体的方法
WO2017194442A1 (en) 2016-05-11 2017-11-16 F. Hoffmann-La Roche Ag Antigen binding molecules comprising a tnf family ligand trimer and a tenascin binding moiety
EP3243836A1 (en) 2016-05-11 2017-11-15 F. Hoffmann-La Roche AG C-terminally fused tnf family ligand trimer-containing antigen binding molecules
EP3243832A1 (en) 2016-05-13 2017-11-15 F. Hoffmann-La Roche AG Antigen binding molecules comprising a tnf family ligand trimer and pd1 binding moiety
CN106519034B (zh) * 2016-12-22 2020-09-18 鲁南制药集团股份有限公司 抗pd-1抗体及其用途
JP7148539B2 (ja) 2017-04-03 2022-10-05 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 免疫抱合体
MY201482A (en) 2017-04-03 2024-02-26 Hoffmann La Roche Immunoconjugates of an anti-pd-1 antibody with a mutant il-2 or with il-15
EP4516809A3 (en) 2017-04-05 2025-09-03 F. Hoffmann-La Roche AG Bispecific antibodies specifically binding to pd1 and lag3
KR102294136B1 (ko) 2017-04-05 2021-08-26 에프. 호프만-라 로슈 아게 항-lag3 항체
WO2018185135A1 (en) 2017-04-05 2018-10-11 Boehringer Ingelheim International Gmbh Anticancer combination therapy
UA129904C2 (uk) 2017-04-05 2025-09-10 Ле Лаборатуар Сервьє Комбінація антитіла до tim-3 й антитіла до pd-1 для лікування раку
CN110505883A (zh) 2017-04-13 2019-11-26 豪夫迈·罗氏有限公司 供治疗癌症的方法中使用的白介素-2免疫缀合物,cd40激动剂,和任选地pd-1轴结合拮抗剂
MY205342A (en) 2017-11-01 2024-10-16 Hoffmann La Roche Bispecific 2+1 contorsbodies
BR112020007630A2 (pt) 2017-11-01 2020-11-17 F. Hoffmann-La Roche Ag anticorpo biespecífico ox40, produto farmacêutico, composição farmacêutica e anticorpos biespecíficos anti-fap/ anti-ox40
CA3248329A1 (en) 2019-07-31 2025-11-29 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies binding to gprc5d
AU2021256936A1 (en) 2020-04-15 2022-07-21 F. Hoffmann-La Roche Ag Immunoconjugates
AU2021295549A1 (en) 2020-06-23 2022-11-24 F. Hoffmann-La Roche Ag Agonistic CD28 antigen binding molecules targeting Her2
CN115916830A (zh) 2020-06-25 2023-04-04 豪夫迈·罗氏有限公司 抗cd3/抗cd28双特异性抗原结合分子
US11865082B2 (en) 2020-09-09 2024-01-09 Hoffmann-La Roche Inc. Combination therapy of PD-1-targeted IL-2 variant immunocytokines and antibodies against human PD-L1
JP2024503826A (ja) 2021-01-06 2024-01-29 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト Ｐｄ１－ｌａｇ３二重特異性抗体及びｃｄ２０ ｔ細胞二重特異性抗体を用いる併用療法
WO2022148853A1 (en) 2021-01-11 2022-07-14 F. Hoffmann-La Roche Ag Immunoconjugates
WO2022189377A1 (en) 2021-03-09 2022-09-15 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy of pd-1-targeted il-2 variant immunoconjugates and fap/4-1bb binding molecules
EP4304724A1 (en) 2021-03-09 2024-01-17 F. Hoffmann-La Roche AG Combination therapy of pd-1-targeted il-2 variant immunoconjugate and anti-tyrp1/anti-cd3 bispecific antibodies

Also Published As

Publication number Publication date
CA3053357A1 (en) 2018-10-11
TWI800506B (zh) 2023-05-01
ZA201905517B (en) 2021-05-26
JP2022062001A (ja) 2022-04-19
CN117003887A (zh) 2023-11-07
KR20190121816A (ko) 2019-10-28
UA125700C2 (uk) 2022-05-18
HRP20221254T1 (hr) 2022-12-23
PT3606946T (pt) 2022-10-17
AR111400A1 (es) 2019-07-10
CO2019009354A2 (es) 2019-09-09
RU2019134338A (ru) 2021-05-05
IL269395B2 (en) 2025-01-01
ES2928718T3 (es) 2022-11-22
CL2019002346A1 (es) 2020-01-10
WO2018184964A1 (en) 2018-10-11
AR126987A2 (es) 2023-12-06
TW201900220A (zh) 2019-01-01
US20250073308A1 (en) 2025-03-06
DK3606946T3 (da) 2022-10-24
PE20191494A1 (es) 2019-10-21
CN110392692A (zh) 2019-10-29
CN110392692B (zh) 2023-07-21
MY201482A (en) 2024-02-26
MA49033A (fr) 2020-02-12
AU2018247765A1 (en) 2019-08-22
US12023368B2 (en) 2024-07-02
JP2024045143A (ja) 2024-04-02
MA49033B1 (fr) 2022-10-31
AU2018247765B2 (en) 2023-11-23
RU2761377C2 (ru) 2021-12-07
KR102461885B1 (ko) 2022-11-03
US11413331B2 (en) 2022-08-16
IL269395B1 (en) 2024-09-01
JP7426825B2 (ja) 2024-02-02
US20230134606A1 (en) 2023-05-04
HUE059885T2 (hu) 2023-01-28
IL269395A (en) 2019-11-28
MX2019011770A (es) 2020-01-09
SG11201909205YA (en) 2019-11-28
KR20210124518A (ko) 2021-10-14
JP2020515275A (ja) 2020-05-28
US20180326010A1 (en) 2018-11-15
EP3606946A1 (en) 2020-02-12
NZ756507A (en) 2025-06-27
EP3606946B1 (en) 2022-08-24
LT3606946T (lt) 2022-10-25
CR20190426A (es) 2019-11-01
MX2023003397A (es) 2023-03-31
EP4201953A1 (en) 2023-06-28
PH12019502273A1 (en) 2020-12-07
RU2019134338A3 (sr) 2021-05-05
BR112019017329A2 (pt) 2020-04-14
PL3606946T3 (pl) 2022-11-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US12023368B2 (en) Immunoconjugates
US20230071733A1 (en) Immunoconjugates
EP3994169A1 (en) Immunoconjugates comprising a mutant interleukin-2 and an anti-cd8 antibody
US20260083855A1 (en) Immunoconjugates
CA3053357C (en) Immunoconjugates of an anti-pd-1 antibody with a mutant il-2 or with il-15
HK40103019A (zh) 抗pd-1抗体与突变体il-2或与il-15的免疫缀合物
HK40123337A (zh) 免疫缀合物
BR112019017329B1 (pt) Iimunoconjugado, método para a produção de um imunoconjugado, composição farmacêutica e uso do imunoconjugado
HK40015970A (en) Immunoconjugates of an anti-pd-1 antibody with a mutant il-2 or with il-15
HK40015970B (zh) 抗pd-1抗体与突变体il-2或与il-15的免疫缀合物
HK40015869B (zh) 免疫缀合物
HK40015869A (en) Immunoconjugates