RS63991B1

RS63991B1 - Anti-psma antitela, bispecifični antigen-vezujući molekuli koji vezuju psma i cd3, i njihove upotrebe

Info

Publication number: RS63991B1
Application number: RS20230150A
Authority: RS
Inventors: Jessica R Kirshner; Alison Crawford; Gavin Thurston; Eric Smith; Lauric Haber; Drew Dudgeon; Ashique Rafique
Original assignee: Regeneron Pharma
Priority date: 2015-07-31
Filing date: 2016-07-29
Publication date: 2023-03-31
Also published as: JP6975707B2; PT3328888T; DK3328888T5; TW201718649A; ES2935120T3; US20190127480A1; PL3328888T3; HRP20230237T1; WO2017023761A1; AU2016302928B2; EP3328888A1; TWI728990B; SI3328888T1; AU2016302928A1; SMT202300029T1; HK1255971A1; JP2018524396A; EA038603B1; US11155633B2; CN108137700B

Description

Opis

OBLAST PRONALASKA

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na antitela, i njihove fragmente koji vezuju antigen, koji su specifični za prostata-specifični membranski antigen (PSMA), i postupke za njihovu upotrebu. Predmetni pronalazak se takođe odnosi na bispecifične antigen-vezujuće molekule koji vezuju PSMA i CD3, i na postupke za njihovu upotrebu.

STANJE TEHNIKE

[0002] Prostata-specifični membranski antigen (PSMA), takođe poznat kao folatna hidrolaza 1 (FOLH1), je integralni, membranski glikoprotein sa ektodomenom (eng. nonshed) koji je visoko eksprimiran u ćelijama epitela prostate i marker je površine ćelija za kancer prostate. Njegova ekspresija je održavana u kanceru prostate koji je rezistentan na kastraciju, stanje sa slabim ishodom i ograničenim mogućnostima lečenja. Ispitivani su postupci za lečenje kancera prostate ciljanjem PSMA. Na primer, Itrijum-90 kapromab je radioterapeutik koji sadrži monoklonsko antitelo na unutarćelijski epitop PSMA. U drugom primeru, J591, monoklonsko antitelo na vanćelijski epitop PSMA, je deo radioterapeutika Lutetium-177 J591 i u MLN2704, u kome maitansinoid 1 (DM1, antimikrotubularni agens) je konjugovan sa J591. Ove terapije su u vezi sa toksičnošću. PSMA je takođe eksprimiran u neovaskulaturi drugih tumora kao što su karcinomi bešike, bubrega, želudca, i kolorektalnih karcinoma.

[0003] CD3 je homodimerni ili heterodimerni antigen eksprimiran na T ćelijama zajedno sa kompleksom receptora T ćelija (TCR) i neophodan je za aktivaciju T ćelija. Funkcionalni CD3 se formira iz dimernog povezivanja dva od četiri različita lanca:

epsilon, zeta, delta i gama. Dimerni rasporedi CD3 uključuju gama/epsilon, delta/epsilon i zeta/zeta. Pokazano je da antitela protiv CD3 grupišu CD3 na T ćelijama, time dovode do aktivacije T ćelija na način sličan angažovanjem TCR od strane peptidom-napunjenih molekula MHC. Prema tome, anti-CD3 antitela su predložena za terapeutske upotrebe uključujući aktivaciju T ćelija. Dodatno, bispecifična anitela koja su sposobna da vežu CD3 i ciljni antigen su predložena za terapeutske upotrebe koje uključuju ciljanje imunskih odgovora T ćelija na tkivima i ćelijama koje eksprimiraju ciljni antigen.

[0004] Molekuli koji vezuju antigen koji ciljaju PSMA, kao i bispecifični molekuli koji vezuju antigen koji vezuju i PSMA i CD3 bili bi korisni u terapijskim uslovima u kojima je poželjno specifično ciljanje i ubijanje posredovano T ćelijama ćelija koje eksprimiraju PSMA.

[0005] Lutterbuese et al. Cancer Research 71(8): Supplement (Abstract 4561), 2011 se odnosi na prekliničku karakterizaciju MT112/BAY 2010112, PSMA CD3-bispecifično antitelo za lečenje kancera prostate. WO 2011/121110 i WO 2010/037836 se odnose na molekule bispecifičnih jednolančanih antitela specifičnih za unakrsne vrste PSMAxCD3. WO 2013/158856 se odnosi na bispecifična anti CD3 antitela koja vezuju antigene koji su povezani sa tumorom kao što je PSMA. Baum et al. Immunotherapy 5(1): 27-38, 2012 se odnosi na antitumorske aktivnosti PSMAxCD3 diatela preusmeravanjem T ćelijske lize ćelija kancera prostate. Friedrich et al. Cancer Research 72(8) Supplement (Abstract 3526), 2012 se odnosi na subkutano davanje PSMA/CD3-bispecifičnog BiTE antitela MT112/BAY 2010112 miševima sa ksenotransplantatom kancera prostate kod ljudi. Fortmüller et al. The Prostate 71(6): 588-596, 2011 odnosi se na ciljanje kancera prostate od strane limfocita koji su preusmereni od PSMAxCD3 bispecifičnog jedolančanog diatela. Bühler et al. Cancer Immunology, Immunotherapy 57(1): 43-52, 2008 odnosi se na bispecifično diatelo usmereno protiv antigena membrane specifičnog za prostatu i CD3 za indukovanje T-ćelijama posredovane lize kancera prostate.

KRATAK PREGLED PRONALASKA

[0006] Ovde su opisana antitela i njihovi fragmenti koji vezuju antigen koji se vezuju za humani PSMA. Antitela mogu biti korisna, između ostalog, za ciljanje ćelija koje eksprimiraju PSMA. Predmetni pronalazak obezbeđuje bispecifična antitela i njihove fragmente koji vežu antigen koji vežu humani PSMA i humani CD3. Bispecifična antitela iz pronalaska sadrže prvi antigen-vezujući domen koji specifično veže humani CD3, i drugi domen za vezivanje antigena koji specifično veže humani PSMA, pri čemu prvi domen za vezivanje antigena koji specifično veže humani CD3 sadrži varijabilni region teškog lanca (HCVR) koji sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID NO: 1514, ili SEQ ID NO: 1618, i varijabilni region lakog lanca (LCVR) koji sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID NO: 1386, i gde drugi domen za vezivanje antigena koji specifično veže humani PSMA sadrži varijabilni region teškog lanca (HCVR) koji sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID NO: 66, i varijabilni region lakog lanca (LCVR) koji sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID NO: 1386. Ova antitela su korisna, između ostalog, za ciljanje T ćelija koje eksprimiraju CD3, i za stimulaciju aktivacije T ćelija, npr., pod okolnostima gde je ubijanje ćelija koje eksprimiraju PSMA posredstvom T ćelija korisno ili poželjno. Na primer, bispecifična antitela mogu usmeriti posredovanu aktivaciju T ćelija posredovano sa CD3 na ćelije koje specifično eksprimiraju PSMA, kao što su ćelije tumora prostate.

[0007] Primeri anti-PSMA antitela su ovde navedeni u Tabelama 1 i 2. Tabela 1 navodi identifikatore sekvenci aminokiselina varijabilnih regiona teškog lanca (HCVRs) i varijabilnih regiona lakih lanaca (LCVRs), kao i regione koji određuju komplementarnost teškog lanca (HCDR1, HCDR2 i HCDR3), i regione koji određuju komplementarnost lakog lanca (LCDR1, LCDR2 i LCDR3) primera anti-PSMA antitela. Tabela 2 navodi identifikatore sekvenci molekula nukleinskih kiselina koji kodiraju HCVRs, LCVRs, HCDR1, HCDR2 HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 primera anti-PSMA antitela.

[0008] Ovde su opisana antitela, ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen, koji sadrže HCVR koji se sastoji iz aminokiselinske sekvence izabrane iz bilo koje od sekvenci aminokiselina HCVR koje su navedene u Tabeli 1, ili u suštini njihove slične sekvence koje su bar 90%, bar 95%, bar 98% ili bar 99% identične u sekvenci sa njima.

[0009] Ovde su takođe opisana antitela, ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen, koji sadrže LCVR koji se sastoji iz aminokiselinske sekvence koja je izabrana iz bilo koje od sekvenci aminokiselina LCVR koje su navedene u Tabeli 1, u suštini njihove slične sekvence koje su bar 90%, bar 95%, bar 98% ili bar 99% identične u sekvenci sa njima.

[0010] Ovde su takođe opisana antitela, ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen, koji sadrže HCVR i LCVR par sekvenci aminokiselina (HCVR/LCVR) koji sadrži bilo koji od sekvenci aminokiselina HCVR koje su navedene u Tabeli 1 uparene sa bilo kojim od sekvenci aminokiselina LCVR koje su navedene u Tabeli 1. Ovde su opisana antitela, ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen, koji sadrže HCVR/LCVR par sekvenci aminokiselna koji je sadržan u bilo kom od primera anti-PSMA antitela koji se navode u Tabeli 1. HCVR/LCVR par sekvenci aminokiselina može biti odabran iz grupe koja se sastoji iz SEQ ID NOs: 66/1642 (npr., H1H11810P2); i 122/130 (npr., H1H3465P).

[0011] Ovde su takođe opisana antitela, ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen, koja sadrže težak lanac CDR1 (HCDR1) koji se sastoji iz aminokiselinske sekvence koja je odabrana iz bilo koje od HCDR1 sekvenci aminokiselina koje su navedene u Tabeli 1 ili u suštini njihovu sličnu sekvencu koja je bar 90%, bar 95%, bar 98% ili bar 99% identična u sekvenci.

[0012] Ovo izlaganje takođe obezbeđuje antitela, ili njihove fragmente koji vezuju antigen, koji sadrže težak lanac CDR2 (HCDR2) koji se sastoji iz aminokiselinske sekvence koja je odabrana iz bilo koje od HCDR2 sekvenci aminokiselina koje su navedene u Tabeli 1 ili u suštini njihovu sličnu sekvencu koja je bar 90%, bar 95%, bar 98% ili bar 99% identična u sekvenci.

[0013] Ovo izlaganje takođe obezbeđuje antitela, ili njihove fragmente koji vezuju antigen, koji sadrže težak lanac CDR3 (HCDR3) koji se sastoji iz aminokiselinske sekvence koja je odabrana iz bilo koje od HCDR3 sekvenci aminokiselina koje su navedene u Tabeli 1 ili u suštini njihovu sličnu sekvencu koja je bar 90%, bar 95%, bar 98% ili bar 99% identična u sekvenci.

[0014] Ovo izlaganje takođe obezbeđuje antitela, ili njihove fragmente koji vezuju antigen, koji sadrže laki lanac CDR1 (LCDR1) koji se sastoji iz aminokiselinske sekvence koja je odabrana iz bilo koje od LCDR1 sekvenci aminokiselina koje su navedene u Tabeli 1 ili u suštini njihovu sličnu sekvencu koja je bar 90%, bar 95%, bar 98% ili bar 99% identična u sekvenci.

[0015] Ovo izlaganje takođe obezbeđuje antitela, ili njihove fragmente koji vezuju antigen, koji sadrže laki lanac CDR2 (LCDR2) koji se sastoji iz aminokiselinske sekvence koja je odabrana iz bilo koje od LCDR2 sekvenci aminokiselina koje su navedene u Tabeli 1 ili u suštini njihovu sličnu sekvencu koja je bar 90%, bar 95%, bar 98% ili bar 99% identična u sekvenci.

[0016] Ovo izlaganje takođe obezbeđuje antitela, ili njihove fragmente koji vezuju antigen, koji sadrži laki lanac CDR3 (LCDR3) koji se sastoji iz aminokiselinske sekvence koja je odabrana iz bilo koje od LCDR3 sekvenci aminokiselina koje su navedene u Tabeli 1 ili u suštini njihovu sličnu sekvencu koja je bar 90%, bar 95%, bar 98% ili bar 99% identična u sekvenci.

[0017] Ovo izlaganje takođe obezbeđuje antitela, ili njihove fragmente koji vezuju antigen, koji sadrži HCDR3 i LCDR3 par sekvenci aminokiselina (HCDR3/LCDR3) koji sadrži bilo koju od HCDR3 sekvenci aminokiselina koje su navedene u Tabeli 1 uparene sa bilo kojom od LCDR3 sekvenci aminokiselina koje su navedene u Tabeli 1. Ovde su opisana antitela, ili njihovi fragmenti koji vežu antigen, koji sadrže HCDR3/LCDR3 par sekvenci aminokiselina koj su navedene u bilo kom od primera anti-PSMA antitela navedenih u Tabeli 1. HCDR3/LCDR3 par sekvenci aminokiselina može biti odabran iz grupe koja se sastoji iz SEQ ID NOs: 72/1648 (npr., H1H11810P2) i 128/136 (npr., H1H3465P).

[0018] Ovde su takođe opisana antitela, ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen, koji sadrže set od šest CDRs (tj., HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3) koji se nalaze u bilo kom od primera anti-PSMA antitela navedenih u Tabeli 1. HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 aminokiselinski set sekvenci može biti odabran iz grupe koja se sastoji iz SEQ ID NOs: 68-70-72-1644-1646-1648 (npr., H1H11810P2); i 124-126-128-132-134-136 (npr., H1H3465P).

[0019] S tim u vezi, Ovo izlaganje obezbeđuje antitela, ili njihove fragmente koji vezuju antigen, koji sadrže set od šest CDRs (tj., HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3) koji se nalaze u HCVR/LCVR paru sekvenci aminokiselina kao što je definisano u bilo kom od primera anti-PSMA antitela koji su navedeni u Tabeli 1. Na primer, ovde su opisana antitela, ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen, koji sadrže HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 set aminokiselinskih sekvenci koji se nalazi u HCVR/LCVR paru sekvenci aminokiselina koji je odabran iz grupe koja se sastoji iz SEQ ID NOs: 66/146 (npr., H1H11810P2); i 122/130 (npr., H1H3465P). Postupci i tehnike za identifikovanje CDRs u HCVR i LCVR aminokiselinskih sekvenci su dobro poznati u oblasti tehnike i mogu se koristiti za identifikovanje CDRs u naznačenim ovde prikazanim HCVR i/ili LCVR aminokiselinskim sekvencama. Primeri konvencija koje se mogu koristiti za identifikovanje granica CDRs uključuju, npr., definisanje po Kabatu, Chothia definisanje, i AbM definisanje. U opštim terminima, definisanje po Kabat-u je zasnovano na varijabilnosti u sekvenci, Chothia definisanje je zasnovano na položaju strukturnih regiona u petlji, i AbM definicija je kompromis između pristupa po Kabatu i Chothia. Videti, npr., Kabat, "Sequences of Proteins of Immunological Interest," National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991); Al-Lazikani et al., J. Mol. Biol.273:927-948 (1997); i Martin et a/., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:9268-9272 (1989). Javne baze podataka su takođe dostupne za identifikovanje sekvenci CDR unutar antitela.

[0020] Ovo izlaganje takođe obezbeđuje molekule nukleinske kiseline koji kodiraju anti-PSMA antitela ili njegove delove. Na primer, ovde su opisani molekuli nukleinskih kiselina koji kodiraju bilo koju od sekvenci aminokiselina HCVR koje su navedene u Tabeli 1; u određenim slučajevima molekul nukleinske kiseline sadrži polinukleotidnu sekvencu koja je izabrana iz bilo koje od sekvenci nukleinskih kiselina HCVR koje su navedene u Tabeli 2, ili u suštini njihove slične sekvence koja je bar 90%, bar 95%, bar 98% ili bar 99% identična u sekvenci sa njima.

[0021] Ovo izlaganje takođe obezbeđuje molekule nukleinskih kiselina koji kodiraju bilo koje od sekvenci aminokiselina LCVR koje su navedene u Tabeli 1; molekul nukleinske kiseline može sadržati polinukleotidnu sekvencu izabranu iz bilo koje od sekvenci nukleinskih kiselina LCVR koje su navedene u Tabeli 2, ili u suštini njihove slične sekvence koja je bar 90%, bar 95%, bar 98% ili bar 99% identična u sekvenci sa njima.

[0022] Ovo izlaganje takođe obezbeđuje molekule nukleinskih kiselina koji kodiraju bilo koje od sekvenci aminokiselina HCDR1 koje su navedene u Tabeli 1; molekul nukleinske kiseline može sadržati polinukleotidnu sekvencu izabranu iz bilo koje od sekvenci nukleinskih kiselina HCDR1 koje su navedene u Tabeli 2, ili u suštini njihove slične sekvence koja je bar 90%, bar 95%, bar 98% ili bar 99% identična u sekvenci sa njima.

[0023] Ovo izlaganje takođe obezbeđuje molekule nukleinskih kiselina koji kodiraju bilo koje od sekvenci aminokiselina HCDR2 koje su navedene u Tabeli 1; molekul nukleinske kiseline može sadržati polinukleotidnu sekvencu izabranu iz bilo koje od sekvenci nukleinskih kiselina HCDR2 koje su navedene u Tabeli 2, ili u suštini njihove slične sekvence koja je bar 90%, bar 95%, bar 98% ili bar 99% identična u sekvenci sa njima.

[0024] Ovo izlaganje takođe obezbeđuje molekule nukleinskih kiselina koji kodiraju bilo koje od sekvenci aminokiselina HCDR3 koje su navedene u Tabeli 1; molekul nukleinske kiseline može sadržati polinukleotidnu sekvencu izabranu iz bilo koje od sekvenci nukleinskih kiselina HCDR3 koje su navedene u Tabeli 2, ili u suštini njihove slične sekvence koja je bar 90%, bar 95%, bar 98% ili bar 99% identična u sekvenci sa njima.

[0025] Ovo izlaganje takođe obezbeđuje molekule nukleinskih kiselina koji kodiraju bilo koje od sekvenci aminokiselina LCDR1 koje su navedene u Tabeli 1; molekul nukleinske kiseline može sadržati polinukleotidnu sekvencu izabranu iz bilo koje od sekvenci nukleinskih kiselina LCDR1 koje su navedene u Tabeli 2, ili u suštini njihove slične sekvence koja je bar 90%, bar 95%, bar 98% ili bar 99% identična u sekvenci sa njima.

[0026] Ovo izlaganje takođe obezbeđuje molekule nukleinskih kiselina koji kodiraju bilo koje od sekvenci aminokiselina LCDR2 koje su navedene u Tabeli 1; molekul nukleinske kiseline može sadržati polinukleotidnu sekvencu izabranu iz bilo koje od sekvenci nukleinskih kiselina LCDR2 koje su navedene u Tabeli 2, ili u suštini njihove slične sekvence koja je bar 90%, bar 95%, bar 98% ili bar 99% identična u sekvenci sa njima.

[0027] Ovo izlaganje takođe obezbeđuje molekule nukleinskih kiselina koji kodiraju bilo koje od sekvenci aminokiselina LCDR3 koje su navedene u Tabeli 1; molekul nukleinske kiseline može sadržati polinukleotidnu sekvencu izabranu iz bilo koje od sekvenci nukleinskih kiselina LCDR3 koje su navedene u Tabeli 2, ili u suštini njihove slične sekvence koja je bar 90%, bar 95%, bar 98% ili bar 99% identična u sekvenci sa njima.

[0028] Ovo izlaganje takođe obezbeđuje molekule nukleinskih kiselina koji kodiraju HCVR, pri čemu HCVR sadrži set od tri CDR-a (tj., HCDR1-HCDR2-HCDR3), pri čemu HCDR1-HCDR2-HCDR3 aminokiselinski set sekvneci je kao što je definisano sa bilo kojim primerima anti-PSMA antitelima koja su navedena u Tabeli 1.

[0029] Ovo izlaganje takođe obezbeđuje molekule nukleinskih kiselina koji kodiraju LCVR, pri čemu LCVR sadrži set od tri CDR-a (tj., LCDR1-LCDR2-LCDR3), pri čemu LCDR1-LCDR2-LCDR3 aminokiselinski set sekvenci je kao što je definisano sa bilo kojim primerima anti-PSMA antitela koja su navedena u Tabeli 1.

[0030] Ovo izlaganje takođe obezbeđuje molekule nukleinskih kiselina koji kodiraju i HCVR i LCVR, gde HCVR sadrži aminokiselinsku sekvencu bilo koje od sekvenci aminokiselina HCVR koje su navedene u Tabeli 1, i pri čemu LCVR sadrži aminokiselinsku sekvencu bilo koje od LCVR sekvenci aminokiselina koje su navedene u Tabeli 1. Molekul nukleinske kiseline može sadržati polinukleotidnu sekvencu izabranu iz bilo koje od sekvenci nukleinskih kiselina HCVR koje su navedene u Tabeli 2, ili u suštini njihove slične sekvence koja je bar 90%, bar 95%, bar 98% ili bar 99% identična u sekvenci sa njima, i polinukleotidnu sekvencu koja je izabrana iz sekvenci nukleinskih kiselina LCVR koje su navedene u Tabeli 2, ili u suštini njihove slične sekvence koja je bar 90%, bar 95%, bar 98% ili bar 99% identična u sekvenci sa njima. Molekul nukleinske kiseline može kodirati HCVR i LCVR, pri čemu su oba HCVR i LCVR dobijena iz istog anti-PSMA antitela koje je navedeno u Tabeli 1.

[0031] Ovo izlaganje takođe obezbeđuje rekombinantne ekspresione vektore koji su sposobni za ekspresiju polipeptida koji sadrže varijabilni region teškog ili lakog lanca anti-PSMA antitela. Na primer, ovde su opisani rekombinantni ekspresioni vektori koji sadrže bilo koje od gore pomenutih molekula nukleinskih kiselina, tj., molekule nukleinskih kiselina koji kodiraju bilo koje od HCVR, LCVR, i/ili CDR sekvence kao što su navedene u Tabeli 1. Takođe su uključene ćelije domaćina u kojima su takvi vekotri uvedeni, kao i postupci proizvodnje antitela ili njihovih delova kultivisanjem ćelija domaćina u uslovima koji dozvoljavaju proizvodnju antitela ili fragmenata antitela, i obnavljanja antitela i fragmenata antitela koji su na taj način proizvedeni.

[0032] Ovo izlaganje uključuje anti-PSMA antitela koja imaju modifikovani obrazac glikozilacije. Modifikacija kojom bi se uklonila neželjena mesta glikozilacije može biti korisna, ili antitelo kome nedostaje ostaje ostatak fukoze koji se nalazi na oligosaharidnom lancu, na primer, da bi se povećala funkcija citotoksičnosti ćelija koja zavisi od antitela (ADCC) (videti Shield et al. (2002) JBC 277:26733). U drugim primenama, modifikacija galaktozilacijom se može dobiti da bi se modifikovala citotoksičnost koja je zavisna od komplementa (CDC).

[0033] U drugom aspektu, ovde je opisana farmaceutska kompozicija koja sadrži rekombinantno humano antitelo ili njegov fragment koji specifično veže PSMA i farmaceutski prihvatljiv nosač. U srodnom aspektu, prikaz se odnosi na kompoziciju koja je kombinacija anti-PSMA antitela i drugog terapijskog sredstva. Drugo terapijsko sredstvo je bilo koje sredstvo koje se kao prednost kombinuje sa anti-PSMA antitelom. Dodatne kombinovane terapije i zajedničke formulacije uključuju anti-PSMA antitela su ovde prikazane na drugom mestu.

[0034] U drugom aspektu, prikaz obezbeđuje terapijske postupke za ciljanje/ubijanje ćelija tumora koje eksprimiraju PSMA pomoću anti-PSMA antitela, pri čemu terapijski postupci sadrže davanje subjektu kome je to potrebno terapijski efikasne količine farmaceutske kompozicije koja sadrži anti-PSMA antitelo. U nekim slučajevima, anti-PSMA antitela (ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen) se mogu upotrebiti za lečenje kancera prostate, ili mogu biti modifikovani da budu više citotoksični upotrebom postupaka, uključujući npr., modifikovane domene Fc kako bi se povećala ADCC (videti npr. Shield et al. (2002) JBC 277:26733), radioimunoterapija (Akhtar, et al., 2012, Prostate-Specific Membrane Antigen-Based Therapeutics; Adv Urol.2012: 973820), konjugati antitela sa lekom (Olson, WC i Israel, RJ, 2014, Front Biosci (Landmark Ed).19:12-33; DiPippo, et al. Feb 15, 2015, The Prostate, 75(3):303-313, prvi put objavljeno on-line Oct. 18, 2014), ili drugim postupcima za povećanje efikasnosti tumorske ablacije. Bilo koja pozivanja u opisu na postupke lečenja se odnose na jedinjenja, farmaceutske kompozicije i lekove iz predmetnog pronalaska za upotrebu u postupku lečenja humanog (ili životinjskog) tela terapijom (ili za dijagnostikovanje)

[0035] Ovde je takođe opisana upotreba anti-PSMA antitela u dobijanju leka za lečenje bolesti ili poremećaja koji je povezan sa ili je uzrokovan sa ćelijama koje eksprimiraju PSMA.

[0036] U još drugom aspektu, prikaz obezbeđuje monospecifična anti-PSMA antitela za primene u dijagnostici, kao što su, npr., reagensi za snimanja.

[0037] U još drugom aspektu, prikaz obezbeđuje terapijske postupke za stimulisanje aktivacije T ćelija upotrebom anti-CD3 antitela ili dela antitela iz pronalaska koji vezuje antigen, pri čemu terapijski postupci obuhvataju davanje terapijski efikasne količine farmaceutske kompozicije koja sadrži antitelo [0038] U drugom aspektu, Ovo izlaganje obezbeđuje izolovano antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen koji se veže za humani prostata-specifični membranski antigen (PSMA) sa ravnotežnom konstantnom disocijacije vezivanja (KD) manjom od oko 80 nM kao što je mereno testom površinske plazmonske rezonance na 37°C. U još drugom aspektu, Ovo izlaganje obezbeđuje izolovano antitelo ili njegov fragment koji veže antigen koji veže humani PSMA sa polu-životom disocijacije (t<1>/2) većim od oko 10 minuta kao što je mereno u testu površinske plazmonske rezonance na 37°C.

[0039] Prikaz dalje obezbeđuje antitelo ili fragment koji veže antigen koji je u kompeticiji za vezivanje humanog PSMA sa refrentnim antitelom koje sadrži par HCVR/LCVR sekvenci aminokiselina kao što je navedeno u Tabeli 1. U drugom aspektu, prikaz obezbeđuje antitelo ili fragment koji veže antigen koji je u kompeticiji za vezivanje sa humanim PSMA sa referentnim antitelom koje sadrži par HCVR/LCVR sekvenci aminokiselina koji je odabran iz grupe koja se sastoji iz SEQ ID NOs: 2/1642; 10/1642; 18/1642; 26/1642; 34/1642; 42/1642; 50/1642; 58/1642; 66/1642; 74/1642; 82/1642; 90/1642; 98/1642; 106/1642; 114/1642; 122/130; i 138/146.

[0040] Ovde je takođe opisano antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, gde se antitelo ili njegov fragment koji veže antigen veže za isti epitop na humanom PSMA kao referentno antitelo koje sadrži par HCVR/LCVR sekvenci aminokiselina kao što je navedeno u Tabeli 1. U drugom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen veže se za isti epitop na humanom PSMA kao referentno antitelo koje sadrži par HCVR/LCVR sekvenci aminokiselina koji je odabran iz grupe koja se sastoji iz SEQ ID NOs:2/1642; 10/1642; 18/1642; 26/1642; 34/1642; 42/1642; 50/1642; 58/1642; 66/1642; 74/1642; 82/1642; 90/1642; 98/1642; 106/1642; 114/1642; 122/130; i 138/146.

[0041] Ovde je takođe prikazano izolovano antitelo ili njegov fragment koji veže antigen koji vezuje humani PSMA, pri čemu antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen sadrži: regione koji određuju komplementarnost (CDR-i) varijabilnog regiona teškog lanca (HCVR) sa sekvencom aminokiselina kao što je navedena u Tabeli 1; i CDR-i varijabilnog regiona lakog lanca (LCVR) sa sekvencom aminokiselina kao što je navedena u Tabeli 1. U drugom aspektu, izolovano antitelo ili njegov fragment koji veže antigen sadrži CDRs para HCVR/LCVR sekvenci aminokiselina teškog i lakog lanca koji su izabrani iz grupe koja obuhvata: SEQ ID NOs:2/1642; 10/1642; 18/1642; 26/1642; 34/1642; 42/1642; 50/1642; 58/1642; 66/1642; 74/1642; 82/1642; 90/1642; 98/1642; 106/1642; 114/1642; 122/130; i 138/146. U još drugom aspektu, izolovano antitelo ili njegov fragment koji veže antigen sadrži HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 domene, redom, izabrane iz grupe koja sadrži: SEQ ID NOs: 4-6-8-1644-1646-1648; 12-14-16-1644-1646-1648; 20-22-24-1644-1646-1648; 28-30-32-1644-1646-1648; 36-38-40-1644-1646-1648; 44-46-48-1644-1646-1648; 52-54-56-1644-1646-1648; 60-62-64-1644-1646-1648; 68-70-72-1644-1646-1648; 76-78-80-1644-1646-1648; 84-86-88-1644-1646-1648; 92-94-96-1644-1646-1648; 100-102-104-1644-1646-1648; 108-110-112-1644-1646-1648; 116-118-120-1644-1646-1648; 124-126-128-132-134-136; i 140-142-144-148-150-152.

[0042] U drugom aspektu, prikaz obezbeđuje izolovano antitelo ili njegov fragment koji veže antigen koji vezuje humani PSMA, gde antitelo ili njegov fragment koji veže antigen sadrži: (a) varijabilni region teškog lanca (HCVR) sa aminokiselinskim sekvencom koja je izabrana iz grupe koja obuhvata SEQ ID NOs: 2, 10, 18, 26, 34, 42, 50, 58, 66, 74, 82, 90, 98, 106, 114, 122, i 138; i (b) varijabilni region lakog lanca (LCVR) sa aminokiselinskom sekvencom koja je izabrana iz grupe koja obuhvata SEQ ID NOs: 130 i 146. U daljem aspektu, izolovano antitelo ili njegov fragment koji veže antigen sadrži par HCVR/LCVR sekvenci aminokiselina izabran iz grupe koja obuhvata: SEQ ID NOs:2/1642; 10/1642; 18/1642; 26/1642; 34/1642; 42/1642; 50/1642; 58/1642; 66/1642; 74/1642; 82/1642; 90/1642; 98/1642; 106/1642; 114/1642; 122/130; i 138/146.

[0043] Predmetni pronalazak obezbeđuje bispecifične molekule za vezivanje antigena (npr., antitela) koji vežu PSMA i CD3, kao što je definisano u patentnim zahtevima. Takvi bispecifični molekuli koji vezuju antigen su ovde takođe naznačeni kao "anti-PSMA/anti-CD3 bispecifični molekuli," "anti-CD3/anti-PSMA bispecifični molekuli," ili "PSMAxCD3 bsAbs." Deo anti-PSMA od anti-PSMA/anti-CD3 bispecifičnog molekula je koristan za ciljanje ćelija (npr., ćelija tumora) koje eksprimuju PSMA (npr., tumori prostate), i deo anti-CD3 od bispecifičnog molekula je koristan za aktivaciju T-ćelija. Istovremeno vezivanje PSMA na ćeliji tumora i CD3 na T-ćeliji olakšava usmereno ubijanje (lizu ćelija) ciljane ćelije tumora od strane aktivisane T-ćelije. anti-PSMA/anti-CD3 bispecifični molekuli iz pronalaska su prema tome korisni, između ostalog, za lečenje bolesti i poremećaja u vezi sa ili koji su uzrokovani sa tumorima koji eksprimuju PSMA (npr., kanceri prostate).

[0044] Bispecifični molekuli koji vezuju antigen prema ovom aspektu iz predmetnog pronalaska sadrže prvi domen za vezivanje antigena koji specifično veže humani CD3, i drugi domen za vezivanje antigena koji specifično veže PSMA. Predmetni pronalazak uključuje anti-PSMA/anti-CD3 bispecifične molekule (npr., bispecifična antitela) pri čemu je svaki antigen-vezujući domen koji sadrži varijabilni region teškog lanca (HCVR) uparen sa varijabilnim regionom lakog lanca (LCVR). Anti-CD3 antigen-vezujući domen i anti-PSMA antigen vezujući domen svaki sadrži različite, izrazite HCVR-e uparene sa uobičajenim LCVR. Na primer, kao što je ovde navedno u Primeru 4, konstruisana su bispecifična antitela koja sadrže prvi antigen-vezujući domen koji specifično veže CD3, pri čemu prvi antigenvezujući domen sadrži par HCVR/LCVR koji je dobijen iz anti-CD3 antitela; i drugi antigen-vezujući domen koji specifično veže PSMA, pri čemu drugi antigen-vezujući domen sadrži HCVR koji je dobijen iz anti-PSMA antitela koje je upareno sa LCVR dobijenim iz anti-CD3 antitela (npr., isti LCVR koji je uključen u anti-CD3 antigen-vezujući domen). Drugim rečima, u ovde prikazanim primerima molekula, uparivanjem HCVR iz anti-PSMA antitela sa LCVR iz anti-CD3 antitela dobija se domen za vezivanje antigena koji specifično veže PSMA (ali ne veže CD3). U takvim izvođenjima, prvi i drugi domeni za vezivanje antigena sadrže izrazite anti-CD3 i anti-PSMA HCVRs ali imaju zajednički anti-CD3 LCVR. Bispecifični antigen-vezujući molekuli mogu sadržati izrazite anti-CD3 i anti-PSMA HCVRs, ali imaju zajednički LCVR. Prikazana je aminkiselinska sekvenca ovog LCVR, npr., u SEQ ID NO:1642, i aminokiselinske sekvence odgovarajućih CDR-a (tj., LCDR1-LCDR2-LCDR3) su prikazane u SEQ ID NOs:1644, 1646 i 1648, redom. Genski modifikovani miševi se mogu koristiti kako bi se proizveli potpuno humani bispecifični antigen-vezujući molekuli koji sadrže dva različita teška lanca koji se udružuju sa identičnim lakim lancem koji sadrži varijabilni domen koji je izveden iz jednog od dva različita segmenta gena varijabilnog regiona humanog lakog lanca. Alternativno, varijabilni teški lanci mogu biti upareni sa jednim zajedničkim lakim lancem i eksprimovani rekombinantno u ćelijama domaćina. Kao takva, antitela iz pronalaska mogu sadržati teške lance imunoglobulina povezane sa jednim rearanžiranim lakim lancem. Laki lanac može sadržati varijabilni domen izveden iz segmenta gena humanog VK1-39 ili segmenta gena VK3-20. Laki lanac može sadržati varijabilni domen koji je izveden iz segmenta gena humanog VK1-39 rearanžiranog sa humanim JK5 ili segmentom gena humanog JK1.

[0045] Ovde su prikazani anti-CD3/anti-PSMA bispecifični molekuli, pri čemu prvi antigen-vezujući domen koji specifično veže CD3 sadrži bilo koju od HCVR sekvenci aminokiselina, bilo koju od LCVR sekvenci aminokiselina, bilo koju od para HCVR/LCVR sekvenci aminokiselina, bilo koju od sekvenci aminokiselina teškog lanca CDR1-CDR2-CDR3, ili bilo koju od sekvenci aminokiselina lakog lanca CDR1-CDR2-CDR3 kao što je predstavljeno u US objavi 2014/0088295.

[0046] Dodatno, ovde su prikazani anti-CD3/anti-PSMA bispecifični molekuli, pri čemu prvi antigenvezujući domen koji specifično vezuje CD3 sadrži bilo koju od sekvenci aminokiselina HCVR kao što se ovde navode u Tabelama 12, 14, i 18. Prvi antigen-vezujući domen koji specifično vezuje CD3 može takođe sadržati bilo koju od sekvenci aminokiselina LCVR kao što su ovde navedene u Tabelama 12, 15, i 20. Prvi antigen-vezujući domen koji specifično vezuje CD3 može sadržati bilo koji od parova HCVR/LCVR sekvenci aminokiselina kao što je ovde navedeno u Tabelama 12, 14, 15, 18, i 20. Ovde su takođe prikazani anti-CD3/anti-PSMA bispecifični molekuli, pri čemu prvi antigen-vezujući domen koji specifično vezuje CD3 sadrži bilo koji od teškog lanca CDR1-CDR2-CDR3 sekvenci aminokiselina kao što je ovde navedeno u Tabelama 12, 14, i 18, i/ili bilo koji od sekvenci lakog lanca CDR1-CDR2-CDR3 aminokiselina kao što su ovde navedene u Tabelama 12, 15, i 20.

[0047] Ovde su takođe prikazani anti-CD3/anti-PSMA bispecifični molekuli, pri čemu prvi antigenvezujući domen koji specifično vezuje CD3 koji sadrži varijabilni region teškog lanca (HCVR) koji ima aminokiselinsku sekvencu kao što je ovde navedena u Tabelama 12, 14, i 18, ili u suštini njihovu sličnu sekvencu koja je bar 90%, bar 95%, bar 98% ili bar 99% identična u sekvenci.

[0048] Ovde su takođe prikazani anti-CD3/anti-PSMA bispecifični molekuli, pri čemu prvi antigenvezujući domen koji specifično vezuje CD3 sadrži varijabilni region lakog lanca (LCVR) koji ima aminokiselinsku sekvencu kao što je ovde navedena u Tabelama 12, 15, i 20, ili u suštini njihovu sličnu sekvencu koja ima je 90%, bar 95%, bar 98% ili bar 99% identična u sekvenci.

[0049] Ovo izlaganje takođe obezbeđuje anti-CD3/anti-PSMA bispecifične molekule, pri čemu prvi antigen-vezujući domen koji specifično vezuje CD3 sadrži HCVR i LCVR (HCVR/LCVR) par sekvenci aminokiselina kao što je ovde navedeno u Tabelama 12, 14, 15, 18, i 20.

[0050] Ovo izlaganje takođe obezbeđuje anti-CD3/anti-PSMA bispecifične molekule, pri čemu prvi antigen vezujući domen koji specifično vezuje CD3 sadrži domen CDR3 teškog lanca (HCDR3) koji ima aminokiselinsku sekvencu kao što se ovde navodi u Tabelama 12, 14, i 18, ili u suštini sličnu sekvencu sa njima koja je bar 90%, bar 95%, bar 98% ili bar 99% identična u sekvenci; domen CDR3 lakog lanca (LCDR3) koji ima aminokiselinsku sekvencu kao što se ovde navodi u Tabelama 12, 15, i 20, ili u suštini njihovu sličnu sekvencu koja je bar 90%, bar 95%, bar 98% ili bar 99% identična u sekvenci.

[0051] U određenim slučajevima, prvi domen za vezivanje antigena koji specifično veže CD3 sadrži par HCDR3/LCDR3 sekvenci aminokiselina kao što je ovde navedeno u Tabelama 12, 14, 15, 18, i 20.

[0052] Ovo izlaganje takođe obezbeđuje anti-CD3/anti-PSMA bispecifilčne antigen-vezujuće molekule, pri čemu prvi antigen-vezujući domen koji specifično vezuje CD3 sadrži domen CDR1 teškog lanca (HCDR1) koji ima aminokiseline kao što su navedene u Tabelama 12, 14, i 18 ovde, ili u suštini njihovu sličnu sekvencu koja je bar 90%, bar 95%, bar 98% ili bar 99% identična u sekvenci; domen CDR2 teškog lanca (HCDR2) koji ima aminokiseline kao što su navedene u Tabelama 12, 14, i 18, ili u suštini njihove slične sekvence koja je bar 90%, bar 95%, bar 98% ili bar 99% identična u sekvenci; domen CDR3 teškog lanca (HCDR3) koji ima aminokiselinu kao što je predstavljena u Tabelama 12, 14, i 18, ili u suštini njihovu sličnu sekvencu koja je bar 90%, bar 95%, bar 98% ili bar 99% identična u sekvenci; domen CDR1 lakog lanca (LCDR1) koji ima aminokiselinsku sekvencu kao što je navedena u Tabelama 12, 15, i 20 ovde, ili u suštini njihovu sličnu sekvencu koja je bar 90%, bar 95%, bar 98% ili bar 99% identična u sekvenci; domen CDR2 lakog lanca (LCDR2) koji ima aminokiselinsku sekvencu kao što je navedena u Tabelama 12, 15, i 20 herein, ili u suštini njihovu sličnu sekvencu koja je bar 90%, bar 95%, bar 98% ili bar 99% identična u sekvenci, i domen CDR3 lakog lanca (LCDR3) koji im sekvencu aminokiselina kao što je predstavljena u Tabelama 12, 15, i 20 ovde, ili u suštini njihovu sličnu sekvencu koja je bar 90%, bar 95%, bar 98% ili bar 99% identična u sekvenci.

[0053] Određeni neograničavajući, primer anti-CD3/anti-PSMA bispecifilčnih antigen-vezujućih molekula uključuje prvi antigen vezujući domen koji specifično vezuje CD3 koji sadrži domene HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3, redom, koji imaju sekvence aminokiselina kao što su ovde predstavljene u Tabelama 12, 14, 15, 18, i 20.

[0054] Ovo izlaganje dalje obezbeđuje bispecifični antigen-vezujući molekul, pri čemu prvi antigenvezujući domen koji specifično veže humani CD3 sadrži regione koji određuju komplementarnost teškog lanca (HCDR1, HCDR2 i HCDR3) iz varijabilnog regiona teškog lanca (HCVR) koji sadrži sekvencu aminokiseline kao što je predstavljena u Tabeli 12, Tabeli 14, ili Tabeli 18 i regione koji određuju komplementarnost lakog lanca (LCDR1, LCDR2 i LCDR3) iz varijabilnog regiona lakog lanca (LCVR) koji sadrže sekvencu aminokiseline kao što je predstavljena u Tabeli 12, Tabeli 15, ili Tabeli 20.

[0055] Ovde je takođe prikazan bispecifični antigen-vezujući molekul pri čemu prvi antigen-vezujući domen koji specifično veže humani CD3 sadrži regione koji određuju komplementarnost teškog lanca (HCDR1, HCDR2 i HCDR3) iz varijabilnog regiona teškog lanca (HCVR) koji su odabrani iz grupe koja se sastoji iz SEQ ID NOs: 922, 154, 1482, 1490, 1498, 1506, 1514, 1522, 1530, 1538, 1546, 1554, 1562, 1570, 1578, 1586, 1594, 1602, 1610, 1618, i 1626, i regione koji određuju komplementarnost lakog lanca (LCDR1, LCDR2 i LCDR3) iz varijabilnog regiona lakog lanca (LCVR) koji sadrže sekvencu aminokiseline koja je izabrana iz grupe koja sadrži SEQ ID NOs: 162, 930 i 1642.

[0056] Prikaz dalje obezbeđuje bispecifični antigen-vezujući molekul, pri čemu prvi antigen-vezujući domen koji specifično veže human CD3 sadrži tri regiona koji određuju komplementarnost teškog lanca (A1-HCDR1, A1-HCDR2 i A1-HCDR3) i tri regiona koji određuju komplementarnost lakog lanca (A1-LCDR1, A1-LCDR2 i A1-LCDR3), pri čemu A1-HCDR1 sadrži sekvencu aminokiseline koja je izabrana iz grupe koja sadrži SEQ ID NOs: 924, 156; 1484, 1492, 1500, 1508, 1516, 1524, 1532, 1540, 1548, 1556, 1564, 1572, 1580, 1588, 1596, 1604, 1612, 1620, i 1628; A1-HCDR2 sdrži sekvencu aminokiseline koja je izabrana iz grupe koja sadrži SEQ ID NOs: 926, 158, 1486, 1494, 1502, 1510, 1518, 1526, 1534, 1542, 1550, 1558, 1566, 1574, 1582, 1590, 1598, 1606, 1614, 1622, i 1630; A1-HCDR3 sadrži sekvencu aminokiseline koja je izabrana iz grupe koja sadrži SEQ ID NOs: 928, 160, 1488, 1496, 1504, 1512, 1520,

1

1528, 1536, 1544, 1552, 1560, 1568, 1576, 1584, 1592, 1600, 1608, 1616, 1624, i 1632; A1-LCDR1 sadrži sekvencu aminokiseline koja je izabrana iz grupe koja sadrži SEQ ID NOs: 932, 164, i 1644; A1-LCDR2 sadrži sekvencu aminokiseline koja je izabrana iz grupe koja sadrži SEQ ID NOs: 166, 934 i 1646; i A1-LCDR3 sadrži sekvencu aminokiseline koja je izabrana iz grupe koja sadrži SEQ ID NOs: 168, 936 i 1648.

[0057] U daljem aspektu, prikaz obezbeđuje bispecifični antigen-vezujući molekul, pri čemu prvi domen za vezivanje anitigena koji specifično veže humani CD3 sadrži CDRe teškog lanca i lakog lanca para HCVR/LCVR sekvenci aminokiselina koji su odabrani iz grupe koja obuhvata: SEQ ID NOs: 922/930, 154/162, 1482/1642, 1490/1642, 1498/1642, 1506/1642, 1514/1642, 1522/1642, 1530/1642, 1538/1642, 1546/1642, 1554/1642, 1562/1642, 1570/1642, 1578/1642, 1586/1642, 1594/1642, 1602/1642, 1610/1642, 1618/1642, i 1626/1642

[0058] U drugom aspektu, prikaz obezbeđuje bispecifični molekul za vezivanje antigena, gde prvi domen za vezivanje antigena koji specifično vezuje humani CD3 sadrži tri regiona koji određuju komplementarnost teškog lanca (A1-HCDR1, A1-HCDR2 i A1-HCDR3) i tri regiona koji određuju komplementarnost lakog lanca (A1-LCDR1, A1-LCDR2 i A1-LCDR3), i pri čemu drugi antigen-vezujući domen koji specifično veže humani PSMA sadrži tri regiona koji određuje komplementarnost teškog lanca (A2-HCDR1, A2-HCDR2 i A2-HCDR3) i tri regiona koji određuje komplementarnost lakog lanca (A2-LCDR1, A2-LCDR2 i A2-LCDR3); pri čemu A1-HCDR1 sadrži sekvencu aminokiseline koja je odabrana iz grupe koja sadrži SEQ ID NOs: 924, 156, 1484, 1492, 1500, 1508, 1516, 1524, 1532, 1540, 1548, 1556, 1564, 1572, 1580, 1588, 1596, 1604, 1612, 1620, i 1628; A1-HCDR2 sadrži sekvencu aminokiseline koja je odabrana iz grupe koja sadrži SEQ ID NOs: 926, 158, 1486, 1494, 1502, 1510, 1518, 1526, 1534, 1542, 1550, 1558, 1566, 1574, 1582, 1590, 1598, 1606, 1614, 1622, i 1630; A1-HCDR3 sadrži sekvencu aminokiseline koja je odabrana iz grupe koja sadrži SEQ ID NOs:928, 160, 1488, 1496, 1504, 1512, 1520, 1528, 1536, 1544, 1552, 1560, 1568, 1576, 1584, 1592, 1600, 1608, 1616, 1624, i 1632; A1-LCDR1 sadrži sekvencu aminokiseline koja je odabrana iz grupe koja sadrži SEQ ID NOs: 164, 932, i 1644; A1-LCDR2 sadrži sekvencu aminokiseline koja je odabrana iz grupe koja sadrži SEQ ID NOs: 166, 934, i 1646; i A1-LCDR3 c sadrži sekvencu aminokiseline koja je odabrana iz grupe koja sadrži SEQ ID NOs: 168, 936, i 1648; i pri čemu A2-HCDR1 sadrži sekvencu aminokiseline koja je odabrana iz grupe koja sadrži SEQ ID NOs: 124 i 68; A2-HCDR2 sadrži sekvencu aminokiseline koja je odabrana iz grupe koja sadrži SEQ ID NOs: 126 i 70; A2-HCDR3 co sadrži sekvencu aminokiseline koja je odabrana iz grupe koja sadrži SEQ ID NOs: 128 i 72; A2-LCDR1 c sadrži sekvencu aminokiseline koja je odabrana iz grupe koja sadrži SEQ ID NOs: 932, 164, i 1644; A2-LCDR2 sadrži sekvencu aminokiseline koja je odabrana iz grupe koja sadrži SEQ ID NOs: 934, 166, i 1646; i A2-LCDR3 sadrži sekvencu aminokiseline koja je odabrana iz grupe koja sadrži SEQ ID NOs: 936, 168, i 1648.

[0059] Određeni neograničavajući, primer anti-CD3/anti-PSMA bispecifičnih antigen-vezujućih molekula uključuje prvi antigenvezujući domen koji specifično veže CD3 koji sadrži težak lanac koji sadrži regione okvira varijabilnog domena koji imaju sekvencu aminokiseline koja je izabrana od FR1 (SEQ ID NO: 1654), FR2 (SEQ ID NO: 1656), FR3 (SEQ ID NO: 1657), i FR4 (SEQ ID NO: 1658).

[0060] Primeri anti-CD3/anti-PSMA bispecifičnih antigen-vezujućih molekula uključuju bispecifični antigen-vezujući molekul pri čemu prvi domen za vezivanje antigena koji specifično veže humani CD3 sadrži HCVR koji se sastoji iz HCDR1-HCDR2-HCDR3 koji ima sekvence aminokiselina SEQ ID NOs: 1659-1660-1661.

[0061] Ovo izlaganje takođe obezbeđuje anti-CD3/anti-PSMA bispecifične molekule, pri čemu drugi antigen vezujući domen koji specifično veže PSMA koji sadrži varijabilni region teškog lanca (HCVR) koji ima sekvencu aminokiselina koja je odabrana iz grupe koja obuhvata SEQ ID NOs:2, 10, 18, 26, 34, 42, 50, 58, 66, 74, 82, 90, 98, 106, 114, 122, i 138, ili u suštini njihova slična sekvenca koja je bar 90%, bar 95%, bar 98% ili bar 99% identična u sekvenci.

[0062] Ovo izlaganje takođe obezbeđuje anti-CD3/anti-PSMA bispecifične molekule, pri čemu drugi antigen vezujući domen koji specifično veže PSMA sadrži varijabilni region lakog lanca (LCVR) koji ima sekvencu aminokiselina koja je odabrana iz grupe koja obuhvata SEQ ID NOs:930, 162, i 1642, ili u suštini njihove slična sekvenca koja ima bar 90%, bar 95%, bar 98% ili bar 99% identičnost u sekvenci.

[0063] Ovo izlaganje takođe obezbeđuje anti-CD3/anti-PSMA bispecifične molekule, pri čemu drugi antigen vezujući domen koji specifično veže PSMA sadrži HCVR i LCVR (HCVR/LCVR) par sekvenci aminokiselina koji je odabran iz grupe koja sadrži SEQ ID NOs: 122/930, 122/162, i 66/1642.

[0064] Ovo izlaganje takođe obezbeđuje anti-CD3/anti-PSMA bispecifične molekule, pri čemu drugi antigen vezujući domen koji specifično veže PSMA sadrži domen CDR3 teškog lanca (HCDR3) koji ima sekvencu aminokiselina koja je odabrana iz grupe koja sadrži SEQ ID NOs:8, 16, 24, 32, 40, 48, 56, 64, 72, 80, 88, 96, 104, 112, 120, 128, i 144, ili u suštini njihova slična sekvenca koja je bar 90%, bar 95%, bar 98% ili bar 99% identična u sekvenci; i domen CDR3 lakog lanca (LCDR3) koji ima sekvencu aminokiseline koja je odabrana iz grupe koja se sastoji iz SEQ ID NOs: 936, 168, i 1648, ili u suštini njihova slična sekvenca koja je bar 90%, bar 95%, bar 98% ili bar 99% identična u sekvenci.

[0065] U određenim slučajima, drugi antigen vezujući domen koji specifično veže PSMA sadrži par HCDR3/LCDR3 sekvenci aminokiselina koji je odabran iz grupe koja se sastoji iz SEQ ID NOs: 128/936, 128/168, i 72/1648.

[0066] Ovo izlaganje takođe obezbeđuje anti-CD3/anti-PSMA bispecifilčne antigen-vezujuće molekule, pri čemu drugi antigen-vezujući domen koji specifično veže PSMA sadrži domen CDR1 (HCDR1) teškog lanca koji ima sekvencu aminokiselina koja je odabrana iz grupe koja obuhvata SEQ ID NOs:4, 12, 20, 28, 36, 44, 52, 60, 68, 76, 84, 92, 100, 108, 116, 124, i 140, ili u suštini njihove slične sekvence koja je bar 90%, bar 95%, bar 98% ili bar 99% identična u sekvenci; domen CDR2 (HCDR2) teškog lanca koji ima sekvencu aminokiselina koja je odabrana iz grupe koja obuhvata SEQ ID NOs:6, 14, 22, 30, 38, 46, 54, 62, 70, 78, 86, 94, 102, 110, 118, 126 i 142, ili u suštini njihove slične sekvence koja je bar 90%, bar 95%, bar 98% ili bar 99% identična u sekvenci; domen CDR3 (HCDR3) teškog lanca koji ima sekvencu aminokiselina koja je odabrana iz grupe koja obuhvata SEQ ID NOs: 8, 16, 24, 32, 40, 48, 56, 64, 72, 80, 88, 96, 104, 112, 120, 128, i 144, ili u suštini njihove slične sekvence koja je bar 90%, bar 95%, bar 98% ili bar 99% identična u sekvenci; domen CDR1 (LCDR1) lakog lanca koji ima sekvencu aminokiselina koja je odabrana iz grupe koja obuhvata SEQ ID NOs: 932, 164, i 1644, ili u suštini njihove slične sekvence koja je bar 90%, bar 95%, bar 98% ili bar 99% identična u sekvenci; i domen CDR2 (LCDR2) lakog lanca koji ima sekvencu aminokiselina koja je odabrana iz grupe koja obuhvata SEQ ID NOs: 934, 166, i 1646, ili u suštini njihove slične sekvence koja je bar 90%, bar 95%, bar 98% ili bar 99% identična u sekvenci; ; i domen CDR3 (LCDR3) lakog lanca koji ima sekvencu aminokiselina koja je odabrana iz grupe koja obuhvata SEQ ID NOs: 936, 168, i 1648, ili u suštini njihove slične sekvence koja je bar 90%, bar 95%, bar 98% ili bar 99% identična u sekvenci.

[0067] Odgovarajući neograničavajući, primeri anti-CD3/anti-PSMA bispecifičnih antigen-vezujućih molekula uključuju drugi antigen-vezujući domen koji specifično veže PSMA koji sadrži HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 domene, redom, koji imaju sekvence aminokiselina koje su izabrane iz grupe koja obuhvata: SEQ ID NOs: 124-126-128-932-934-936, 124-126-128-164-166-168, i 68-70-72-1644-1646-1648.

[0068] U vezi sa navedenim, prikaz uključuje anti-CD3/anti-PSMA bispecifične antigen-vezujuće molekule gde drugi antigen-vezujući domen koji specifično veže PSMA sadrži CDR domene teškog i lakog lanca koji se nalaze u sekvencama varijabilnog regiona (HCVR/LCVR) teškog i lakog lanca koje su izabrane iz grupe koja se sastoji iz SEQ ID NOs: 122/930, 122/162, i 66/1642.

[0069] U drugom aspektu, prikaz obezbeđuje bispecifični antigen-vezujući molekul koji sadrži prvi antigen vezujući domen koji veže humani CD3 i drugi antigen vezujući domen koji veže humani PSMA, pri čemu drugi antigen-vezujući domen je izveden iz antitela ili njegovog fragmenta koji veže antigen prema bilo kom od ovde prikazanih anti-PSMA antitela. U daljem aspektu, pronalazak obezbeđuje bispecifični antigen-vezujući molekul koji sadrži prvi antigen vezujui domen koji specifično veže humani CD3, i drugi antigen vezujući domen koji specifično veže humani PSMA.

[0070] Bispecifični antigen-vezujući molekul se može vezati za humane ćelije koje eksprimuju humani CD3 i ćelije cinomolgus majmuna koje eksprimuju CD3 cinomolgusa. Bispecifični antigen-vezujući molekul veže humane ćelije koje eksprimuju humani PSMA i ćelije cinomolgus majmuna koje eksprimuju PSMA cinomolgusa.

[0071] Bispecifični antigen-vezujući molekul iz pronalaska inhibira rast tumora kod imunokompromitovanih miševa koji nose ksenotransplantate humanog kancera prostate. Pronalazak dalje obezbeđuje bispecifični antigen-vezujući molekul koji inhibira rast tumora kod imunokompetentnih miševa koji nose ksenotransplantate humanog kancera prostate. Pronalazak dalje obezbeđuje bispecifični antigen-vezujući molekul koji suprimira rast tumora ustanovljenih tumora kod imunokompromitovanih miševa koji nose ksenotransplantate humanog kancera prostate. Pronalazak dalje obezbeđuje bispecifični antigen-vezujući molekul koji redukuje rast tumora ustanovljenih tumora kod imunokompetentnih miševa koji nose ksenotransplantate humanog kancera prostate.

[0072] Bispecifični antigen-vezujući molekul može sadržati i) prvi antigen vezujući domen koji specifično veže efektorsku ćeliju sa EC50vrednosti većom od 40 nM i, i ii) drugi antigen vezujući domen koji specifično vezuje ciljnu ćeliju tumora humane prostate sa EC50vrednosti manjom od 40 nM, pri čemu takva vrednost EC50afiniteta vezivanja je merena u in vitro FACS testu vezivanja.

[0073] Na primer, bispecifični antigen-vezujući molekul može uključiti prvi antigen-vezujući domen koji specifično veže humani CD3 sa EC50vrednosti većom od oko 40 nM, ili većom od oko 100 nM, većom od oko 200 nM, ili većom od oko 1 µM. Bispecifični antigen-vezujući molekul može uključiti drugi antigen-vezujući domen koji specifično veže ciljnu ćeliju tumora prostate sa EC50vrednosti manjom od oko 6 nM. U nekim slučajima, prvi antigen-vezujući domen specifično veže svaki od humanog CD3 i CD3 cinomolgusa sa EC50vrednosti većom od oko 40 nM, većom od oko 100 nM, većom od oko 200 nM, ili većom od oko 1 µM. U nekim slučajima, prvi antigen-vezujući domen specifično veže svaki od humanog CD3 i CD3 cinomolgusa sa slabim do afinitetom koji se ne može izmeriti.

[0074] U nekim izvođenjima, antigen-vezujući molekul indukuje ubijanje ćelija tumora posredovano sa T ćelijama sa EC50vrednosti koja je manja od 1.3 nM, kao što je mereno u in vitro testu ubijanja ćelija tumora posredovano sa T ćelijama, na primer, gde su ćelije tumora C4-2, 22Rv1, i TRAMPC2_PSMA ćelije.

[0075] U nekim primenama, prvi antigen-vezujući domen veže humani CD3 sa vrednosti KDvećom od oko 11 nM, kao što je mereno u in vitro testu vezivanja površinske plazmonske rezonance. U nekim slučajima, prvi antigen-vezujući domen veže svaki od humanog CD3 i CD3 cinomolgusa sa KDvrednosti većom od oko 15 nM, većom od oko 30 nM, većom od oko 60 nM, većom od oko 120 nM, ili većom od oko 300 nM, kao što je mereno u in vitro testu vezivanja površinske plazmonske rezonance.

1

[0076] U određenim izvođenjima, anti-CD3 antitela iz pronalaska, antigen-vezujući fragmenti i njihova bispecifična antitela su napravljena zamenom aminokiselinskih ostataka u parentalnom na način korak po korak zasnovano na razlikama između germinativne sekvence i sekvence parentalnog antitela.

[0077] Ovde je prikazan bispecifični antigen-vezujući molekul, pri čemu drugi antigen-vezujući domen je u kompeticiji za vezivanje za humani PSMA sa referentnim antigen-vezujućim proteinom koji sadrži tri regiona za određivanje komplementarnosti teškog lanca (A2-HCDR1, A2-HCDR2 i A2-HCDR3) i tri regiona za određivanje komplementarnosti lakog lanca (A2-LCDR1, A2-LCDR2 i A2-LCDR3), pri čemu A2-HCDR1 sadrži sekvencu aminokiselina koja je izabrana iz grupe koja se sastoji iz SEQ ID NOs: 124 i 68; A2-HCDR2 koji sadrži sekvencu aminokiselina koja je izabrana iz grupe koja se sastoji iz SEQ ID NOs: 126 i 70; A2-HCDR3 sadrži sekvencu aminokiselina koja je izabrana iz grupe koja se sastoji iz SEQ ID NOs: 128 i 72; A2-LCDR1 sadrži sekvencu aminokiselina koja je izabrana iz grupe koja se sastoji iz SEQ ID NOs: 164, 932 i 1644; A2-LCDR2 sadrži sekvencu aminokiselina koja je izabrana iz grupe koja se sastoji iz SEQ ID NOs: 166, 934 i 1646; i A2-LCDR3 sadrži sekvencu aminokiselina koja je izabrana iz grupe koja se sastoji iz SEQ ID NOs:168, 936, i 1648. Prikaz takođe obezbeđuje bispecifični antigenvezujući molekul, pri čemu drugi antigen-vezujući domen je u kompeticiji za vezivanje za humani PSMA sa referentnim antigen-vezujućim protein koji sadrži varijabilni region (HCVR) teškog lanca koji sadrži sekvencu aminokiselina koja je odabrana iz grupe koja se sastoji iz SEQ ID NOs: 122 i 66, i varijabilni region lakog lanca (LCVR) koji sadrži sekvencu aminokiselina koja je odabrana iz grupe koja se sastoji iz SEQ ID NOs: 162, 930 i 1642.

[0078] Prikaz takođe obezbeđuje bispecifični antigen-vezujući molekul, pri čemu prvi antigen-vezujući domen je u kompeticiji za vezivanje za humani CD3 sa referentnim antigen-vezujućim proteinom koji sadrži tri regiona za određivanje komplementarnosti teškog lanca (A1-HCDR1, A1-HCDR2 i A1-HCDR3) i tri regiona za određivanje komplementarnosti lakog lanca (A1-LCDR1, A1-LCDR2 i A1-LCDR3), pri čemu A1-HCDR1 sadrži sekvencu aminokiselina koja je izabrana iz grupe koja se sastoji iz SEQ ID NOs: 924, 156, 1484, 1492, 1500, 1508, 1516, 1524, 1532, 1540, 1548, 1556, 1564, 1572, 1580, 1588, 1596, 1604, 1612, 1620, i 1628; A1-HCDR2 sadrži sekvencu aminokiselina koja je izabrana iz grupe koja se sastoji iz SEQ ID NOs: 926, 158, 1486, 1494, 1502, 1510, 1518, 1526, 1534, 1542, 1550, 1558, 1566, 1574, 1582, 1590, 1598, 1606, 1614, 1622, i 1630; A1-HCDR3 sadrži sekvencu aminokiselina koja je izabrana iz grupe koja se sastoji iz SEQ ID NOs: 928, 160, 1488, 1496, 1504, 1512, 1520, 1528, 1536, 1544, 1552, 1560, 1568, 1576, 1584, 1592, 1600, 1608, 1616, 1624, i 1632; A1-LCDR1 sadrži sekvencu aminokiselina koja je izabrana iz grupe koja se sastoji iz SEQ ID NOs: 164, 932, i 1644; A1-LCDR2 sadrži sekvencu aminokiselina koja je izabrana iz grupe koja se sastoji iz SEQ ID NOs: 166, 934, i 1646; i A1-LCDR3 sadrži sekvencu aminokiselina koja je izabrana iz grupe koja se sastoji iz SEQ ID NOs: 168, 936, i 1648. Prikaz takođe obezbeđuje bispecifični antigen vezujući molekul, pri čemu prvi antigen-vezujući domen je u kompeticiji za vezivanje za humani CD3 sa referentnim antigen-vezujućim proteinom koji sadrži varijabilni region teškog lanca (HCVR) koji sadrži sekvencu aminokiselina koja je izabrana iz grupe koja se sastoji iz SEQ ID NOs: 922, 154, 1482, 1490, 1498, 1506, 1514, 1522, 1530, 1538, 1546, 1554, 1562, 1570, 1578, 1586, 1594, 1602, 1610, 1618, i 1626, i varijabilni region lakog lanca (LCVR) koji sadrži sekvencu aminokiseline koja je izabrana iz grupe koja se sastoji iz SEQ ID NOs:930, 162, I 1642.

[0079] Prikaz takođe obezbeđuje bispecifični antigen-vezujući molekul, pri čemu prvi antigen-vezujući domen je u kompeticiji za vezivanje za humani CD3 sa referentnim antigen- vezujućim proteinom koji sadrži varijabilni region teškog lanca (HCVR) koji sadrži sekvencu aminokiseline izabranu iz grupe koja sadrži SEQ ID NOs: 922, 154, 1482, 1490, 1498, 1506, 1514, 1522, 1530, 1538, 1546, 1554, 1562, 1570, 1578, 1586, 1594, 1602, 1610, 1618, i 1626, i varijabilni region lakog lanca (LCVR) koji sadrži sekvencu aminokiseline izabranu iz grupe koja sadrži SEQ ID NOs:930, 162, i 1642; i pri čemu drugi antigenvezujući domen je u kompeticiji za vezivanje za humani PSMA sa referentnim antigen-vezujućim proteinom koji sadrži varijabilni region teškog lanca (HCVR) koji sadrži sekvencu aminokiseline izabranu iz grupe koja sadrži SEQ ID NOs:122 i 66, i varijabilni region lakog lanca (LCVR) koji sadrži sekvencu aminokiseline izabranu iz grupe koja sadrži SEQ ID NOs: 930, 162, i 1642.

[0080] U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži anti-PSMA/anti-CD3 bispecifični antigen-vezujući molekul iz pronalaska i farmaceutski prihvatljiv nosač ili rastvarač. Pronalazak dalje obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju za upotrebu u postupku za lečenje kancera kod subjekta. Postupak može obuhvatiti davanje subjektu farmaceutske kompozicije koja sadrži anti-PSMA antigen-vezujući molekul ili anti-PSMA/anti-CD3 bispecifični antigen-vezujući molekul i farmaceutski prihvatljiv nosač ili rastvarač. U nekim izvođenjima, kancer je odabran iz grupe koja koja obuhvata kancer prostate, kancer bubrega, kancer bešike, kolorektalni kancer, i kancer želudca. U nekim slučajevima, kancer je kancer prostate. U nekim slučajevima, kancer prostate je kancer prostate rezistentan na kastraciju.

[0081] Ovo izlaganje takođe obezbeđuje molekule nukleinskih kiselina koji kodiraju bilo koje od HCVR, LCVR ili CDR sekvenci ovde prikazanih anti-CD3/anti-PSMA bispecifičnih antigen-vezujućih molekula, uključujući molekule nukleinskih kiselina koji sadrže polinukleotidne sekvence kao što su ovde predstavljene u Tabelama 2, 13, 15, 17, 19, i 21, kao i molekule nukleinskih kiselina koji sadrže dve ili više polinukleotidnih sekvenci kao što su predstavljene u Tabelama 2, 13, 15, 17, 19, i 21 u bilo kojoj funkcionalnog kombinaciji ili njegovom rasporedu. Rekombinantni ekspresioni vektori koji nose nukleinske kiseline iz pronalaska, i ćelije domaćina u koje su takvi vektori uvedeni, su takođe opisani, kao postupci za dobijanje antitela kultivacijom ćelija domaćina pod uslovima koji dozvoljavaju proizvodnju antitela, i obnavljanje proizvedenih antitela.

[0082] Ovo izlaganje uključuje anti-CD3/anti-PSMA bispecifične antigen-vezujuće molekule gde bilo koji od prethodno pomenutih antigen-vezujućih domena koji specifično veže CD3 su kombinovani, povezani ili na drugi način u vezi sa bilo kojim od prethodno pomenutih antigen-vezujućih domena koji specifično vežu PSMA da bi se obrazovao bispecifični antigen-vezujući molekul koji veže CD3 i PSMA.

[0083] Ovde su takođe opisani anti-CD3/anti-PSMA bispecifični antigen-vezujući molekuli koji imaju modifikovani obrazac glikozilacije. U nekim primenama, modifikacija kojom bi se uklonila neželjena mesta glikozilacije mogu biti korisna, ili antitelo kome nedostaje fukozni ostatak koji se nalazi na oligosaharidnom lancu, na primer, da bi se povećala funkcija ćelijske citotoksičnosti koja zavisi od antitela (ADCC) (videti Shield et al. (2002) JBC 277:26733). U drugim primenama, modifikacija galaktozilacijom se može napraviti da bi se modifikovala citotoksičnost koja zavisi od komplementa (CDC).

[0084] Prikaz takođe obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži anti-CD3/anti-PSMB bispecifični antigen-vezujući molekul i farmaceutski prihvatljiv nosač. Prikaz se odnosi na kompoziciju koja je kombinacija anti-CD3/anti-PSMB bispecifičnog antigen-vezujućeg molekula i drugog terapeutskog sredstva. Drugo terapeutsko sredstvo može biti bilo koje sredstvo koje je u prednosti kombinovano sa anti-CD3/anti-PSMA bispecifičnim antigen vezujućim molekulom. Primeri sredstava koja se mogu u prednosti kombinovati sa anti-CD3/anti-PSMA bispecifičnim antigen-vezujućim molekulom su detaljno ovde razmatrani na drugom mestu.

[0085] Prikaz takođe obezbeđuje terapeutske postupke za ciljane/ubijanje ćelija tumora koje eksprimuju PSMA upotrebom anti-CD3/anti-PSMB bispecifičnog antigen-vezujućeg molekula, pri čemu terapeutski postupci obuhvataju davanje terapeuski efikasne količine farmaceutske kompozicije koja sadrži anti-CD3/anti-PSMA bispecifični antigen-vezujući molekul iz pronalaska subjektu kome je potrebno.

1

[0086] Ovde je takođe opisana upotreba anti-CD3/anti-PSMB bispecifičnog antigen-vezujućeg molekula u dobijanju leka za lečenje bolesti ili poremećaja koji je povezan sa ili je uzrokovan sa ćelijama koje eksprimuju PSMA.

[0087] Druga izvođenja će postati očigledna iz pregleda detaljnog opisa koji sledi. Pronalazak je definisan u patentnim zahtevima 1 i 7. Ostali aspekti i poželjna izvođenja su definisani u zavisnim zahtevima. Bilo koji aspekti, izvođenja i primeri iz predmetnog prikaza koji ne ulaze u obim priloženih zahteva ne čine deo pronalaska i obezbeđeni su samo za ilustrativne svrhe.

KRATAK OPIS SLIKA NACRTA

[0088]

Sl.1 ilustruje da PSMAxCD3 bispecifično antitelo inhibira rast ćelijske linije humane prostate in vivo. NSG miševima je istovremeno subkutanozno implantirano 22Rv1 ćelija i humanih PBMCs. Životinje su dozirane tri puta ukupno u danima 0, 3 i 7 sa 1ug PSMAxCD3 bispecifično i.p. Podaci su izraženi kao srednja vrednost (SEM) i analizirani su upotrebom analize varijanse (ANOVA).

Sl.-e. 2A-2D pokazuju da tretman sa PSMAxCD3 bispecifičnim antitelom indukuje prolazno povećanje koje zavisi od doze u cirkulišućim citokinima, pri čemu nivoi citokina (interferon-gama, IFN-g; faktor nekroze tumora, TNF; interleukin-2, IL-2; i interleukin-6, IL-6) su ispitivani na 4 h nakon tretmana.

Sl.-e 3A-3B pokazuju da tretman sa PSMAxCD3 bispecifičnim antitelom u humanizovanoj T ćeliji miša (100 µg/mišu) indukuje akutno povećanje u citokinima (npr. IFNg) (Sl. 3A) kao i prolazno smanjenje u cirkulišućim T ćelijama (Sl.3B).

Sl.-e. 4A-4C pokazuju efekat PSMAxCD3 bispecifičnih antitela na efektorskim T ćelijama u slezini imunokompetentnih miševa.

DETALJAN OPIS

[0089] Pre nego što se predmetni pronalazak opiše, potrebno je razumeti da ovaj pronalazak nije ograničen na određene postupke i opisane eksperimentalne uslove, jer se takvi postupci i uslovi mogu razlikovati. Takođe treba razumeti da terminologija koja se ovde koristi je za svrhu opisivanja samo određenih izvođenja, i nije namenjena da bude ograničavajuća, s obzirom na to da će obim predmetnog pronalaska biti ograničen samo priloženim patentnim zahtevima.

[0090] Osim ukoliko nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni termini koji su ovde korišćeni imaju isto značenje kao što je uobičajeno jasno običnom stučnjaku iz oblasti tehnike kojoj ovaj pronalazak pripada. Kao što se ovde koristi, termin "oko," kada se koristi u odnosu na određenu navedenu numeričku vrednost, označava da se ta vrednost može razlikovati od navedene vrednosti za ne više od 1%. Na primer, kao što se ovde koristi, izraz "oko 100" uključuje 99 i 101 i sve vrednosti koje se nalaze između (npr., 99.1, 99.2, 99.3, 99.4, itd.).

[0091] Iako su bilo koji postupci i materijali slični ili ekvivalentni sa onima koji su ovde opisani mogu se koristiti u praksi ili ispitivanju predmetnog pronalaska, poželjni postupci i materijali su sada opisani u nastavku.

Definicije

[0092] Izraz "CD3," kao što se ovde koristi, odnosi se na antigen koji je eksprimiran na T ćelijama kao deo multimolekulskog receptora T ćelija (TCR) i koji se sastoji iz homodimera ili heterodimera koji se obrazuje iz udruživanja dva ili više lanaca receptora: CD3-epsilon, CD3-delta, CD3-zeta, i CD3-gama. Human CD3-epsilon sadrži sekvencu aminokiselina kao što je predstavljena u SEQ ID NO:1649; humani

1

CD3-delta sadrži sekvencu aminokiselina kao što je predstavljena u SEQ ID NO:1650. Sve reference na proteine, polipeptide i fragmente proteina ovde su uključene i namenjene su da se odnose na humanu verziju odgovarajućeg proteina, polipeptida ili fragmenta proteina osim ukoliko nije eksplicitno naznačeno da je iz nehumanih vrsta. Prema tome, izraz "CD3" označava humani CD3 osim ukoliko nije naznačeno da je iz nehumanih vrsta, npr., "mišji CD3," "CD3 majmuna," itd.

[0093] Kao što se ovde koristi, "antitelo koje veže CD3" ili "anti-CD3 antitelo" uključuje antitela i njiove fragmente koji vežu antigen koji specifično prepoznaju jednu podjedinicu CD3 (npr., epsilon, delta, gama ili zeta), kao i antitela i njihove fragmente koji vežu antigen koji specifično prepoznaju dimerni kompleks dve podjedinice CD3 (npr., gama/epsilon, delta/epsilon, i zeta/zeta CD3 dimeri). Antitela i fragmenti koji vežu antigen iz predmetnog pronalaska mogu vezati solubilni CD3 i/ili CD3 koji je eksprimovan na ćelijskoj površini. Solubilni CD3 uključuje prirodne CD3 proteine kao i rekombinantne varijante CD3 proteina kao što su, npr., monomerni i dimerni konstrukti CD3, kojima nedostaje transmembranski domen ili koji na drugi način nisu povezani sa ćelijsom membranom.

[0094] Kao što se ovde koristi, izraz "CD3 eksprimiran na ćelijskoj površini" označava jedan ili više CD3 protein(a) koji je/su eksprimirani na površini ćelije in vitro ili in vivo, tako da bar deo CD3 proteina je izložen ekstraćelijskoj strani ćelijske membrane i dostupan je delu antitela koji veže antigen. "CD3 eksprimovan na ćelijskoj površini" uključuje CD3 proteine koji se nalaze u kontekstu funkcionalnog receptora T ćelija u membrani ćelije. Izraz "CD3 eksprimiran na ćelijskog površini" uključuje CD3 protein koji je eksprimovan kao deo homodimera ili heterodimera na površini ćelije (npr., gamma/epsilon, delta/epsilon, i zeta/zeta CD3 dimeri). Izraz, "CD3 eksprimiran na ćelijskoj površini" takođe uključuje CD3 lanac (npr., CD3-epsilon, CD3-delta ili CD3-gama) koji je samostalno eksprimirano, bez drugih vrsta lanaca CD3, na površini ćelije."CD3 koji je eksprimiran na površini ćelije" može sadržati ili se sastojati iz CD3 proteina eksprimovanog na ćelijskoj površini ćelije koja normalno eksprimuje protein CD3. Alternativno, "CD3 eksprimovan na ćelijskoj površini" može sadržati ili se sastojati iz proteina CD3 eksprimovanog na površini ćelije koja normalno ne eksprimuje humani CD3 na svojoj površini ali je veštački modifikovana da eksprimuje CD3 na njegovoj površini.

[0095] Izraz "PSMA," kao što se ovde koristi, odnosi se na prostata-specifični membranski antigen, takođe poznat pod imenom folatna hidrolaza 1 (FOLH1). PSMA je integralni, membranski glikoprotein sa ektodomenom (eng. no-shed) koji je visoko eksprimovan u ćelijama epitela prostate i ćelijski površinski marker je za kancer prostate. Sekvenca aminokiseline humanog PSMA je predstavljena u SEQ ID NO:1651.

[0096] Kao što se ovde koristi, "antitelo koje veže PSMA" ili "anti-PSMA antitelo" uključuje antitela i njihove fragmente koji vežu antigen koji specifično prepoznaju PSMA.

[0097] Termin "antigen-vezujući molekul" uključuje antitela i fragmente antitela koji vežu antigen, uključujući, npr., bispecifična antitela.

[0098] Termin "antitelo", kao što se ovde koristi, označava bilo koji antigen-vezujući molekul ili molekulski kompleks koji se sastoji iz bar jednog regiona koji određuje komplementarnost (CDR) koji se specifično vezuje za ili interaguje sa određenim antigenom (npr., PSMA ili CD3). Termin "antitelo" uključuje molekule imunoglobulina koji sadrže četiri polipeptidna lanca, dva teška (H) lanca i dva laka (L) lanca međusobno spojena disulfidnim vezama, kao i njihovi multimeri (npr., IgM). Svaki težak lanac koji sadrži varijabilni region teškog lanca (ovde skraćeno sa HCVR ili VH) i konstantan region teškog lanca. Konstantni region teškog lanca sadrži tri domena, CH1, CH2 i CH3. Svaki laki lanac sadrži varijabilni region lakog lanca (ovde skraćeno sa LCVR ili VL) i konstantni region lakog lanca. Konstantni region lakog lanca sadrži jedan domen (CL1). Regioni VHi VLmogu dalje biti podeljeni u regione hipervarijabilnosti, poznati pod imenom regioni koji određuju komplementarnost (CDRs), koji su rasuti

1

sa regionima koji su konzervisaniji, koji su poznati pod imenom regioni okvira (FR). Svaki VHi VLse sastoji iz tri CDRs i četiri FRs, koji su uređeni od aminokraja ka karboksi-kraju u sledećem redosledu: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. U različitim izvođenjima iz pronalaska, FRs anti-PSMA antitela ili anti-CD3 antitela (ili njegovog dela koji veže antigen) mogu biti identična sa humanim germinativnim sekvencama, ili mogu biti prirodno ili veštački modifikovana. Aminokiselinska konsenzusna sekvenca se može definisati na osnovu uporedne analize (eng. “side by side”) dva ili više CDRs.

[0099] Termin "antitelo", kao što se ovde koristi, takođe uključuje fragmente koji vežu antigen punih molekula antitela. Termini "deo koji veže antigen" antitela i "fragment koji vezuje antigen" antitela, kao što se ovde koristi, uključuje bilo koji koji se može dobiti prirodno, koji se može dobiti enzimski, sintetički, ili genski modifikovani polipeptid ili glikoprotein koji specifično vezuje antigen da bi se obrazovao kompleks. Fragmenti antitela koji vežu antigen mogu se dobiti, npr., iz punih molekula antitela upotrebom bilo kojih pogodnih standardnih postupaka kao što je proteolitičkom digestijom ili rekombinantnim genetičkim postupcima koji uključuju manipulaciju i ekspresiju DNK koja kodira varijabilne i po potrebi konstante domene antitela. Takva DNK je poznata i/ili jednostavno se može dobiti iz, npr., komercijalnih izvora, biblioteka DNK (uključujući, npr., biblioteke fag-antitelo), ili se mogu sintetisati. DNK se može sekvencirati i hemijski manipulisati ili upotrebom molekularno bioloških postupaka, na primer, da bi se preuredili jedan ili više varijabilnih i/ili konstantnih domena u odgovarajuću konfiguraciju, ili da bi se uveli kodoni, kreirali cisteinski ostaci, modifikovale, dodale ili uklonile aminokiseline, itd.

[0100] Neograničavajući primeri fragmenata koji vežu antigen uključuju: (i) Fab fragmente; (ii) F(ab’)2 fragmente; (iii) Fd fragmente; (iv) Fv fragmente; (v) jednolančane Fv (scFv) molekule; (vi) dAb fragmente; i (vii) minimalne jedinice prepoznavanja koje sadrže aminokiselinske ostatke koji imitiraju hipervarijabilni region antitela (npr., izolovani region za određivanje komplementarnosti (CDR) kao što je CDR3 peptid), ili ograničeni FR3-CDR3-FR4 peptid. Drugi modifikovani molekuli, kao što su antitela specifična za domen, antitela sa jednim domenom, antitela sa uklonjenim domenom, himerna antitela, antitela sa prenetim CDR, diatela, triatela, tetratela, minitela, nanotela (npr. monovalentna nanotela, bivalentna nanotela, itd.), mali modularni imunofarmaceutici (SMIPs), i varijabilni IgNAR domeni ajkula, su takođe obuhvaćeni izrazom "fragment koji veže antigen," kao što se ovde koristi.

[0101] Fragment za vezivanje antigena antitela će obično sadržati bar jedan varijabilni domen. Varijabilni domen može biti bilo koje veličine ili kompozicije aminokiseline i generalno će sadržati bar jedan CDR koji je susedan sa ili je u okviru sa jednom ili više sekvenci regiona okvira. U fragmentima koji vežu antigen koji imaju VHdomen koji je povezan za VLdomenom, domeni VHi VLdomeni mogu biti locirani jedan prema drugom u bilo kom pogodnom rasporedu. Na primer, varijabilni region može biti dimerni i sadržati dimere VH-VH, VH-VLili VL-VL. Alternativno, fragment za vezivanje antigena antitela može sadržati monomerni VHili VL domen.

[0102] U određenim izvođenjima, fragment antitela koji vezuje antigen može sadržati bar jedan varijabilni domen kovalentno povezan sa bar jednim konstantnim domenom. Neograničavajući, primeri konfiguracija varijabilnih i konstantnih domena koji se mogu pronaći u antigen vezujućem fragmentu antitela prema predmetnom pronalasku uključuje: (i) VH-CH1; (ii) VH-CH2; (iii) VH-CH3; (iv) VH-CH1-CH2; (v) VH-CH1-CH2-CH3; (vi) VH-CH2-CH3; (vii) VH-CL; (viii) VL-CH1; (ix) VL-CH2; (x) VL-CH3; (xi) VL-CH1-CH2; (xii) VL-CH1-CH2-CH3; (xiii) VL-CH2-CH3; i (xiv) VL-CL. U bilo kojoj konfiguraciji varijabilnih i konstantnih domena, uključujući bilo koju od konfiguracija koje su gore navedene, varijabilni i konstantni domeni mogu biti ili direktno spojeni jedan sa drugim ili mogu biti spojeni u celosti ili delimičnim zglobnim ili linker regionom. Region zgloba se može sastojati od bar 2 (npr., 5, 10, 15, 20, 40, 60 ili više) aminokiselina koje dovode do fleksibilne ili polu-fleksibilne veze između susednih varijabilnih i/ili konstantnih domena u jednom polipeptidnom molekulu. Osim toga, antigen-vezujući fragment antitela iz predmetnog pronalaska može sadržati homo-dimer ili hetero-dimer (ili drugi

1

multimer) bilo kojih konfiguracija varijabilnih i konstantnih domena koji su gore navedeni u nekovalentnoj vezi jedan sa drugim i/ili sa jednim ili više monomernim VHili VLdomenom (npr., disulfidnim veza(ma)).

[0103] Kao sa punim molekulima antitela, fragmenti koji vežu antigen mogu biti monospecifični ili multispecifični (npr., bispecifični). Multispecifični antigen-vezujući fragment antitela će obično sadržati bar dva različita varijabilna domena, pri čemu je svaki varijabilni domen sposoban da se specifično veže za odvojeni antigen ili za različiti epitop na istom antigenu. Bilo koji format multispecifičog antitela, uključujući primer formata bispecifičnih antitela koja su ovde prikazana, mogu biti prilagođena za upotrebu u kontekstu fragmenta za vezivanje antigena antitela iz predmetnog pronalaska upotrebom rutinskih postupaka koji su dostupni u oblasti tehnike.

[0104] Antitela iz predmetnog pronalaska mogu funkcionisati preko citotoksičnosti koja zavisi od komplementa (CDC) ili citotoksičnosti koja je posredovana ćelijama koja zavisi od antitela (ADCC). "Citotoksičnost koja zavisi od komplementa " (CDC) se odnosi na lizu ćelija koje eksprimuju antigen od antitela iz pronalaska u prisustvu komplementa. "Citotoksičnosti koja je posredovana ćelijama koja zavisi od antitela " (ADCC) odnosi se na reakciju koja je posredovana ćelijama u kojoj nespecifične toksične ćelije koje eksprimuju Fc receptore (FcRs) (npr., prirode ćelije ubice (NK), neutrofili, i makrofagi) prepoznaju vezano antitelo na ciljnoj ćeliji i na taj način dovode do lize ciljne ćelije. CDC i ADCC se mogu izmeriti upotrebom testova koji su dobro poznati i dostupni u oblasti tehnike. (Videti, npr., U.S. Patent br-e 5,500,362 i 5,821,337, i Clynes et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 95:652-656). Konstantni region antitela je važan u sposobnosti antitela da zaustavi komplement i posreduje u citotoksičnosti koja zavisi od ćelija. Prema tome, izotip antitela može biti odabran na osnovu toga da li je poželjno da antitelo posreduje toksičnosti.

[0105] Anti-PSMA monospecifična antitela ili anti-PSMA/anti-CD3 bispecifična antitela mogu biti humana antitela. Izraz "humano antitelo", kao što je ovde koriščen, je namenjen da uključi antitela koja imaju varijabilne i konstantne regione izvedenih iz humanih germinativnih imunoglobulinskih sekvenci. Humana antitela iz pronalaska mogu uključiti aminokiselinske ostatke koji nisu kodirani sa humanim germinativnim imunoglobulinskim sekvencama (npr., mutacije uključene slučajnom ili mutagenezom specifičnom za mesto in vitro ili somatskom mutacijom in vivo), na primer u CDRs i posebno CDR3. Međutim, termin "humano antitelo", kao što je ovde korišćen, nije namenjen da uključi antitela u kojima su sekvence CDR izvedene iz germinativnih ili drugih vrsta sisara, kao što je miš, su prenete na sekvence humanog regiona okvira.

[0106] Antitela iz pronalaska mogu, u nekim izvođenjima, biti rekombinantna humana antitela. Termin "rekombinantno humano antitelo", kao što se ovde koristi, je namenjeno da uključi sva humana antitela koja su pripremljena, eksprimovana, kreirana ili izolovana upotrebom rekombinantnih sredstava, kao što su antitela eksprimovana upotrebom rekombinantnog ekspresionog vektora koji je transfektovan u ćeliju domaćina (dalje opisano ispod), antitela koja su izolovana iz rekombinantne, kombinatorne biblioteke humanog antitela (dalje opisano ispod), antitela koja su izolovana iz životinje (npr., miš) koja je transgena za gene humanih imunoglobulina (videti npr., Taylor et al. (1992) Nucl. Acids Res.20:6287-6295) ili antitela koja su dobijena, eksprimirana, kreirana ili izolovana upotrebom bilo kog postupka koji uključuje spajanje sekvenci gena humanih imunoglobulina sa drugim sekvencama DNK. Takva rekombinantna humana antitela imaju varijabilne i konstantne regione koji su izvedeni iz humanih germinativnih imunoglobulinskih sekvenci. U određenim izvođenjima, međutim, takva rekombinantna humana antitela su izložena mutagenezi in vitro (ili, gde je korišćena životinja koja je transgena za sekvence humanog Ig, in vivo somatska mutageneza) i prema tome sekvence aminokiselina regiona VHi VLrekombinantnih antitela su sekvence koje, dok su izvedene iz i srodne sa humanim germinativnim sekvencama VHi VL, mogu da ne postoje prirodno in vivo u okviru germinativnog repertoara humanih antitela.

1

[0107] Humana antitela mogu postojati u dva oblika koja su povezana sa heterogenošću zgloba. U jednom obliku, molekul imunoglobulina sadrži stabilan konstrukt iz 4 lanca od približno 150-160 kDa u kome se dimeri drže zajedno sa interlanačanom disulfidnom vezom teških lanaca. U drugom obliku, dimeri nisu spojeni preko inter-lančanih disulfidnih veza i obrazovan je molekul od oko 75-80 kDa koji se sastoji iz kovalentno kuplovanih lakog i teškog lanca (pola antitela). Ove oblike je ekstremno teško odvojiti, čak i nakon afinitetnog prečišćavanja.

[0108] Učestalost pojavljivanja drugog oblika u različitim intaktnim izooblicima IgG je usled, npr., strukturalnih razlika koje su povezane sa regoionom zgloba izotipa antitela. Pojedinačna aminokiselinska supstitucija u regionu zgloba zgloba humanog IgG4 može značajno smanjiti pojavu drugog oblika (Angal et al. (1993) Molecular Immunology 30:105) do nivoa koji se obično uočavaju upotrebom zgloba humanog IgG1. Ovaj pronalazak obuhvata antitela koja imaju jednu ili više mutacija u zglobu, CH2 ili CH3 regionu koje mogu biti poželjne, na primer, u proizvodnji, da bi se unapredio prinos željenog oblika antitela.

[0109] Antitela iz pronalaska mogu biti izolovana antitela. "Izolovano antitelo," kao što se ovde koristi, označava antitelo koje je identifikovano i odvojeno i/ili regenerisano iz bar jedne komponente njegovog prirodnog okruženja. Na primer, antitelo koje je razdvojeno ili je uklonjeno iz bar jedne komponente organizma, ili iz tkiva ili ćelije u kojoj se antitelo prirodno nalazi ili je prirodno proizvedeno, je "izolovano antitelo" za svrhe predmetnog pronalaska. Izolovano antitelo takođe uključuje antitelo in situ u rekombinantnoj ćeliji. Izolovana antitela su antitela koja su izložena bar jednom koraku prečišćavanja ili izolacije. Prema određenim izvođenjima, izolovano antitelo može biti u suštini oslobođeno od drugog ćelijskog materijala i/ili hemikalija.

[0110] Ovde su takođe opisana jednokraka (eng. “one-arm”) antitela koja vežu PSMA. Kao što se ovde koristi, "jednokrako antitelo" označava molekul koji veže antigen koji se sastoji iz jednog teškog lanca antitela i jednog lakog lanca antitela. “Jednokraka” antitela mogu sadržati bilo koju od HCVR/LCVR ili sekvenci CDR aminokiselina kao što su predstavljene u Tabeli 1.

[0111] Ovde prikazana anti-PSMA ili anti-PSMA/anti-CD3 antitela mogu sadržati jednu ili više supstitucija aminokiselina, insercija i/ili delecija u regionu okvira i/ili CDR regionima varijabilnih domena teškog i lakog lanca u poređenju sa odgovarajućim germinativnim sekvencama iz kojih su antitela dobijena. Takve mutacije se mogu lako utvrditi poređenjem ovde prikazanih sekvenci aminokiselina sa germinativnim sekvencama dostupnim iz, na primer, javnih baza podataka sekvenci antitela. Ovo izlaganje uključuje antitela, i njihovi fragmenti koji vežu antigen, koji su izvedeni iz bilo kojih od ovde prikazanih sekvenci aminokiselina, gde jedna ili više aminokiselina u jednom ili više regionu okvira i/ili CDR regionima su mutirane u odgovarajuće ostatk(e) germinativne sekvence iz koje je antitelo dobijeno, ili u odgovarajuće ostatk(e) drugih humanih germinativnih sekvenci, ili u konzervativnu supstituciju aminokiselina odgovarajućih germinativnih ostatak(a) (takve promene u sekvenci su označene ovde kolektivno sa "germinativne mutacije"). Osoba koja je uobičajeno verzirana u stanje tehnike, počev od ovde prikazanih sekvenci varijabilnog regiona teškog i lakog lanca, može jednostavno proizvesti brojna antitela i fragmente koji vežu antigen koji sadrže jednu ili više pojedinačnih germinativnih mutacija ili njihovih kombinacija. U određenim slučajima, svaki od regiona okvira i/ili CDR ostataka u domenima VHi/ili VLsu mutirani nazad do ostataka pronađenih u originalnoj germinativnoj sekvenci iz koje je antitelo izvedeno. U drugim slučajima, samo određeni ostaci su mutirani nazad do originalne germinativne sekvence, npr., samo mutirani ostaci koji su pronađeni u prvih 8 aminokiselina FR1 ili u poslednjih 8 aminokiselina FR4, ili samo mutirani ostaci koji su pronađeni u CDR1, CDR2 ili CDR3. U drugim slučajima, jedan ili više regiona okvira i/ili CDR ostatak(a) su mutirani u odgovarajuće ostatk(e) različitih germinativnih sekvenci (tj., germinativna sekvenca koja je različita od germinativne sekvence iz koje je antitelo originalno dobijeno). Dalje, antitela mogu sadržati bilo koju kombinaciju dve ili više germinativnih mutacija u regionu okvira i/ili CDR regionima, npr., pri čemu

2

su određeni pojedinačni ostaci mutirani u odgovarajući ostatak određene germinativne sekvence dok određeni drugi ostaci koji se razlikuju od originalne germinativne sekvence su održavani ili su mutirani u odgovarajući ostatak različite germinativne sekvence. Jednom dobijena, antitela i fragment koji vežu antigen koji sadrže jednu ili više germinativnih mutacija mogu se jednostavno ispitati za jedno ili više željenih svojstava kao što su, poboljšana specifičnost vezivanja, poboljšani afinitet vezivanja, poboljšana ili povećana antagonistička ili agonistička biološka svojstva (kao što može biti slučaj), smanjena imunogenost, itd.

[0112] Ovo izlaganje takođe uključuje anti-PSMA ili anti-PSMA/anti-CD3 antitela koja sadrže varijante prema bilo kojoj od ovde prikazanih HCVR, LCVR, i/ili CDR sekvenci aminokiselina koje imaju jednu ili više konzervativnih supstitucija. Na primer, Ovo izlaganje uključuje anti-PSMA ili anti-PSMA/anti-CD3 antitela koja imaju HCVR, LCVR, i/ili CDR sekvence aminokiselina sa, npr., 10 ili manje, 8 ili manje, 6 ili manje, 4 ili manje, itd. konzervativnih supstitucija aminokiselina u odnosu na bilo koju od HCVR, LCVR, i/ili CDR sekvenci aminokiselina koje su ovde predstavljene u Tabeli 1 ili kao što je ovde opisano u Tabelama 12, 14, 15, 18, i 20.

[0113] Termin "epitop" se odnosi na antigensku determinantu koja interaguje sa specifičnim mestom za vezivanje antigena u varijabilnom regionu molekula antitela koji je poznat pod imenom paratop. Jedan antigen može imati više od jednog epitopa. Prema tome, različita antitela se mogu vezati za različite oblasti na antigenu i mogu imati različite biološke efekte. Epitopi mogu biti ili konformacioni ili linearni. Konformacioni epitop se proizvodi prostorno suprostavljenih aminokiselina iz različitih segmenata linearnog polipeptidnog lanca. Linearni epitop je onaj koji se dobija susednim aminokiselinskim ostacima u polipeptidnom lanca. U određenom slučaju, epitop može uključiti ostatke saharida, fosforil grupa, ili sulfonil grupa na antigenu.

[0114] Termin "suštinski identitet" ili "suštinski identičan," kada se odnosi na nukleinsku kiselinu ili njen fragment, označava da, kada su optimalno poravnane sa odgovarajućim insercijama ili delecijama nukleotida sa drugom nukleinskom kiselinom (ili sa njenim komplementarnim lancem), postoji nukleotidna identičnost u sekvenci u bar oko 95%, i poželjnije bar oko 96%, 97%, 98% ili 99% baza nuklotida, kao što je mereno sa bilo kojim dobro poznatim algoritnom za identičnost u sekvenci, kao što je FASTA, BLAST ili Gap, kao što je razmatrano ispod. Molekul nukleinske kiseline koji je suštinski identičan sa referentnim molekulom nukleinske kiseline može, u određenim slučajima, kodirati polipeptid koji ima istu ili u suštini sličnu sekvencu aminokiseline kao polipeptid kodiran od strane referentnog molekula nukleinske kiseline.

[0115] Kao što je primenjeno na polipeptide, izraz "suštinska sličnost" ili "u suštini sličan" označava da dve peptidne sekvence, kada su optimalno poravnate, upotrebom programa GAP ili BESTFIT upotrebnom podrazumevanih “gap” težina, dele bar 95% identičnost u sekvenci, još poželjnije bar 98% ili 99% identičnost u sekvenci. Poželjno, položaji ostataka koji nisu identični razlikuju se za konzervativne supstitucije aminokiselina. "Konzervativna supstitucija aminokiselina" je ona u kojoj je ostatak aminokiseline zamenjen sa drugim ostatkom aminokiseline koji ima bočni lanac (R grupu) sa sličnim hemijskim svojstvima (npr., šaržom ili hidrofobnosti). Generalno, konzervativna supstitucija aminokiselina neće u suštini promeniti funkcionalna svojstva proteina. U slučajevima u kojima se dve ili više sekvenci aminokiselina razlikuju jedna od druge konzervativnim zamenama, procenat identičnosti u sekvenci ili stepen sličnosti može biti prilagođen nagore da se ispravi konzervativna priroda zamene. Sredstva za dobijanje ovog prilagođavanja su dobro poznata stručnjacima iz oblasti tehnike. Videti, npr., Pearson (1994) Methods Mol. Biol.24: 307-331. Primeri grupa aminokiselina koje imaju bočne lance sa sličnim hemijskim osobinama uključuju (1) alifatične bočne lance: glicin, alanin, valin, leucin i izoleucin; (2) alifatične-hidroksil bočne lance: serin i treonin; (3) bočne lance koji sadrže amid: asparagin i glutamin; (4) aromatične bočne lance: fenilalanin, tirozin, i triptofan; (5) bazne bočne lance: lizin, arginin, i histidin; (6) kisele bočne lance: aspartat i glutamat, i (7) bočne lance koje sadrže sumpor su cistein i metionin. Poželjne konzervativne supstitucione grupe aminokiselina su: valinleucin-izoleucin, fenilalanin-tirozin, lizin-arginin, alanin-valin, glutamat-aspartat, i asparagin-glutamin. Alternativno, konzrvativna zamena je bilo koja promena koja ima pozitivnu vrednost u PAM250 logmatriksu verovatnoće koji je prikazan u Gonnet et a/. (1992) Science 256: 1443-1445. "Umereno konzervativna" zamena je bilo koja promena koja ima nenegativnu vrednost u PAM250 log-matrici verovatnoće.

[0116] Sličnost u sekvenci za polipeptide, koja je takođe naznačena kao identičnost u sekvenci, je obično merena upotrebom softvera za analizu sekvence. Softver za analizu proteina uparuje slične sekvence upotrebom mera sličnosti koja je dodeljena različitim supstitucijama, delecijama i drugim modifikacijama, uključujući konzervativne supstitucije aminokiselina. Na primer, GCG softver sadrži programe kao što su Gap i Bestfit koji se mogu koristiti sa postavljenim parametrima da bi se odredila homologija sekvence ili identičnost u sekvenci između blisko srodnih polipeptida, kao što su homologni polipeptidi iz različitih organizama ili između proteina divljeg tipa i njegovog muteina. Videti, npr., GCG Verzija 6.1. Polipeptidne sekvence mogu takođe biti upoređene upotrebom FASTA upotrebom podrazumevanih ili preporučenih parametara, program u GCG Verziji 6.1. FASTA (npr., FASTA2 i FASTA3) obezbeđuje poravnanja i procenat identičnosti u sekvenci regiona sa najboljim poklapanjem između ispitivane sekvence i pretražene sekvence (Pearson (2000) supra). Drugi poželjni algoritam kada se uporedi sekvenca iz pronalaska sa bazom podataka koja sadrži veliki broj sekvenci iz različitih organizama je kompjuterski program BLAST, posebno BLASTP ili TBLASTN, upotrebom podrazumevanih parametara. Videti, npr., Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol.215:403-410 i Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res.25:3389-402.

Germinativne mutacije

[0117] Ovde prikazana anti-CD3 antitela sadrž jednu ili više aminokiselinskih supstitucija, insercija i/ili delecija u region okvira i/ili CDR regionima varijabilnih domena teškog lanca u poređenju sa odgovarajućim germinativnim sekvencama iz kojih su antitela dobijena.

[0118] Ovde su opisana antitela, i njihovi fragmenti koji vežu antigen, koji su izvedeni iz bilo kojih od ovde prikazanih aminokiselinskih sekvenci, pri čemu su jedna ili više aminokiselina u jednom ili više regionu okvira i/ili CDR regionima mutirane u odgovarajući ostatak(e) germinativne sekvence iz koje je antitelo dobijeno, ili u odgovarajući ostatak(e) druge humane germinativne sekvence, ili u konzervativnu supstituciju aminokiselina odgovarajućih germinativnih ostatak(a) (takve promene u sekvenci su ovde zajednički označene kao "germinativne mutacije"), i imaju slabo ili su bez detektabilnog vezivanja sa CD3 antigenom. Nekoliko takvih primera antitela koji prepoznaju CD3 su ovde opisani u Tabelama 12 i 18.

[0119] Dalje, antitela mogu sadržati bilo koju kombinaciju dve ili više germinativnih mutacija u regionu okvira i/ili CDR regionima, npr., pri čemu su određeni pojedinačni ostaci mutirani u odgovarajući ostatak određene germinativne sekvence dok određeni drugi ostaci koji seu različiti od originalne germinativne sekvence su održavani ili su mutirani u odgovarajući ostatak različite germinativne sekvence. Jednom dobijena, antitela i fragmenti koji vežu antigen koji sadrže jednu ili više germinativnih mutacija se mogu ispitati za jedno ili više željenih svojstava kao što je, poboljšana specifičnost vezivanja, slab ili smanjen afinitet vezivanja, unapređena ili pojačana farmakokinetička svojstva, smanjena imunogenost, itd.

[0120] Ovde su opisana anti-CD3 antitela koja sadrže varijante bilo koje od ovde prikazanih HCVR, LCVR, i/ili CDR aminokiselinskih sekvenci koje imaju jednu ili više konzervativnih supstitucija. Na primer, predmetni predmet uključuje anti-CD3 antitela koja imaju HCVR, LCVR, i/ili CDR sekvence aminokiselina sa, npr., 10 ili manje, 8 ili manje, 6 ili manje, 4 ili manje, itd. konzervativnih supstitucija aminokiselina u odnosu na bilo koju od sekvenci HCVR, LCVR, i/ili CDR aminokiselina koje su ovde navedene u Tabelama 12, 14, 15, 18, i 20. Antitela i bispecifični antigen-vezujući molekuli iz predmetnog prikaza sadrže jednu ili više aminokiselinskih supstitucija, insercija i/ili delecija i regionu okvira i/ili CDR regionima varijabilnih domena teškog i lakog lanca u poređenju sa odgovarajućim germinativnim sekvencama iz koji su izvedeni pojedinačni domeni za vezivanje antigena, dok se održava ili unapređuje željeno slabo do nedetektabilno vezivanje za CD3 antigen. "Konzervativna supstitucija aminokiselina" je ona gde je aminokiselinski ostatak zamenjen sa drugim aminokiselinskim ostatkom koji ima bočnu grupu (R grupu) sa sličnim hemijskim svojstvima (npr., naelektrisanjem ili hidrofobnosti). Uopšteno, konzervativna aminokiselinska supstitucija neće suštinski izmeniti funkcionalne osobine proteina, tj. supstitucija aminokiseline održava ili unapređuje željeno slabo do nedetektabilni afinitet vezivanja u slučaju anti-CD3 vezujućih molekula. Primeri grupa aminokiselina koje imaju bočne lance sa sličnim hemijskim osobinama uključuju (1) alifatične bočne lance: glicin, alanin, valin, leucin i izoleucin; (2) alifatične-hidroksil bočne lance: serin i treonin; (3) bočne lance koji sadrže amid: asparagin i glutamin; (4) aromatične bočne lance: fenilalanin, tirozin, i triptofan; (5) bazne bočne lance: lizin, arginin, i histidin; (6) kisele bočne lance: aspartat i glutamat, i (7) bočni lanci koji sadrže sumpor su cistein i metionin. Poželjne grupe konzervativne supstitucije aminokiselina su: valinleucin-izoleucin, fenilalanin-tirozin, lizin-arginin, alanin-valin, glutamat-aspartat, i asparagin-glutamin. Alternativno, konzervativna zamena je bilo koja izmena koja ima pozitivnu vrednost u PAM250 logmatrici verovatnoće koja je prikazana u Gonnet et al. (1992) Science 256: 1443-1445. "Umereno konzervativna" zamena je bilo koja izmena koja ima nenegativnu vrednost u PAM250 log-matrici verovatnoće.

[0121] Ovo izlaganje takođe uključuje molekule koji vežu antigen koji sadrže domen za vezivanje antigena sa sekvencom HCVR i/ili CDR aminokiselina koja je u suštini identična sa bilo kojom od sekvenci HCVR i/ili CDR aminokiselina koje su ovde prikazane, dok se održava ili se unapređuje željeni slab antitet na CD3 antigen. Termin "suštinski identitet" ili "suštinski identičan," kada se odnosi na aminokiselinsku sekvencu označava da su dve sekvence aminokiselina, kada se optimalno poravnaju, kao što je upotrebom programa GAP ili BESTFIT upotrebom podrazumevanih “gap” težina, dele bar 95% identičnost u sekvenci, još poželjnije bar 98% ili 99% identičnost u sekvenci. Poželjno, pozicije ostataka koje nisu identične se razlikuju u konzervativnim aminokiselinskim supstitucijama. U slučajima u kojima se dve ili više aminokiselinskih sekvenci razlikuju jedna od druge konzervativnim supstitucijama, procenat identičnosti u sekvenci ili stepen sličnosti može biti prilagođen na gore da bi se ispravila konzervativna priroda supstitucije. Načini za sprovođenje ovog podešavanja su dobro poznati u stručnjacima iz oblasti tehnike. Videti, npr., Pearson (1994) Methods Mol. Biol.24: 307-331.

[0122] Sličnost u sekvenci za polipeptide, koja je ovde takođe naznačena kao identičnost u sekvenci, je obično merena upotrebom softvera za analizu sekvence. Softver za analizu proteina poklapa slične sekvence upotrebom merenja sličnosti koje su dodeljene različitim supstitucijama, delecijama i drugim modifikacijama, uključujući konzervativne aminokiselinske supstitucije. Na primer, GCG sofver sadrži programe kao što su Gap i Bestfit koji se mogu koristiti sa podrazumevanim parametrima da bi se odredila homologija sekvence ili identičnost u sekvenci između blisko srodnih polipeptida, kao što su homologni polipeptidi iz različitih vrsta organizama ili između proteina divljeg tipa i njegovog muteina. Videti, npr., GCG Verzija 6.1. Polipeptidne sekvence takođe mogu biti upoređene upotrebom FASTA upotrebom podrazumevanih ili preporučenih parametara, program u GCG Verziji 6.1. FASTA (npr., FASTA2 i FASTA3) obezbeđuje poravnanja i procenat identičnosti u sekvenci u regionima sa najboljim poklapanjem između ispitivane i pretraženih sekvenci (Pearson (2000) supra). Drugi poželjni algoritam kada se uporedi sekvenca iz pronalaska sa bazom podataka koja sadrži veliki broj sekvenci iz različitih organizama je kompjuterski program BLAST, posebno BLASTP ili TBLASTN, upotrebom podrazumevanih parametara. Videti, npr., Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol.215:403-410 i Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res.25:3389-402.

2

[0123] Jednom dobijeni, antigen-vezujući domeni koji sadrže jednu ili više germinativnih mutacija su ispitani za smanjeni afinitet vezivanja upotrebom jednog ili više in vitro testova. Iako je izvršen skrining antitela koja prepoznaju određeni antigen za njihovu svrhu ispitivanja za visok (tj. snažan) afinitet vezivanja prema antigenu, antitela iz predmetnog pronalaska ispoljavaju slabo vezivanja ili bez detektabilnog vezivanja. Bispecifični antigen-vezujući molekuli koji sadrže jedan ili više antigenvezujućih domena koji su dobijeni na ovaj opšti način su bili u prednosti kao terapije vođene aviditetom prema tumoru.

[0124] Neočekivani benefiti, na primer, unapređena farmakokinetička svojstva i niska toksičnost za pacijenta može se realizovati iz ovde prikazanih postupaka.

Vezujuća svojstva antitela

[0125] Kao što je ovde korišćeno, izraz "vezivanje" u kontekstu vezivanja antitela, imunoglobulin, vezujući fragment antitela, ili protein koji sadrži Fc za bilo koji, npr., predodređeni antigen, kao što je protein ćelijske površine ili njegov fragment, obično se odnosi na interakciju ili povezivanje između minimum dva entiteta ili molekularnih struktura, kao što je interakcija antitela sa antigenom.

[0126] Na primer, afinitet vezivanja obično odgovara vrednosti KDod oko 10<-7>M ili manjoj, kao što je oko 10<-8>M ili manje, kao što je oko 10<-9>M ili manje kada je određeno sa, na primer, tehnologijom površinske plazmonske rezonance (SPR) u BIAcore 3000 instrumentu upotrebom antigena kao liganda i antitela, Ig, fragmenta koji veže antitelo, ili proteina koji sadrži Fc kao analita (ili antiliganda). Strategije vezivanja koje su zasnovane na ćeliji, kao što su testovi vezivanja fluorescentno-aktivirano ćelijsko sortiranje (FACS), su takođe u rutinskoj upotrebi, i FACS podaci su u dobroj korelaciji sa drugim postupcima kao što je kompeticija vezivanja radioliganda i SPR (Benedict, CA, J Immunol Methods.

1997, 201(2):223-31; Geuijen, CA, et al. J Immunol Methods.2005, 302(1-2):68-77).

[0127] Prema tome, antitelo ili protein koji veže antigen iz pronalaska veže se za prethodno određeni antigen ili molekul na ćelijskoj površini (receptor) koji ima afinitet koji odgovara vrednosti KDkoja je bar deset puta niža od njenog afiniteta za vezivanje sa nespecifičnim antigenom (npr., BSA, kazein). U skladu sa predmetnim pronalaskom, afinitet antitela koji odgovara vrednosti KDkoja je jednaka sa ili je manja od deset puta niže u odnosu na nespecifični antigen može se smatrati nedetektabilnim vezivanjem, međutim takvo antitelo može biti upareno sa drugim “vezujućim krakom” antitela za dobijanje bispecifičnog antitela iz pronalaska.

[0128] Termin "KD" (M) označava konstantu ravnoteže disocijacije određene interakcije antitela sa antigenom, ili konstantu ravnoteže disocijacije antitela ili vezujućeg fragmenta antitela koji se veže za antigen. Postoji inverzni odnos između KDi afiniteta vezivanja, prema tome što je manja vrednost KD, veći, tj. jači, je afinitet. Prema tome, termini "veći afinitet" ili "jači afinitet" se odnose na veću sposobnost da se obrazuje interakcija i prema tome manja KDvrednost, i obrnuto termini "niži afinitet" ili "slabiji afinitet" odnose se na manju sposobnost da se obrazuje interakcija i prema tome veću KDvrednost. U nekim okolnostima, veći afinitet vezivanja (ili KD) određenog molekula (npr. antitela) sa njegovim interaktivnim partnerskim molekulom (npr. antigen X) u poređenju sa afinitetom vezivanja molekula (npr. antitelom) sa drugim interaktivnim partnerskim molekulom (npr. antigen Y) mogu biti izraženi kao odnos vezivanja koji je određen deljenjem veće vrednosti KD(niži, ili slabiji, afinitet) sa manjom KD(veći, ili jači, afinitet), na primer izraženo kao 5-puta ili 10-puta veći afinitet vezivanja, kao što to može biti slučaj.

[0129] Termin "kd" (sec -1 ili 1/s) se odnosi na konstantu brzine disocijacije određene interakcije antitela sa antigenom, ili konstanta brzine disocijacije antitela ili vezujućeg fragmenta antitela. Pomenuta vrednost je takođe označena kao koffvrednost.

[0130] Termin "ka" (M-1 X sec-1 ili 1/M) se odnosi na konstantu brzine vezivanja određene interakcije antitela sa antigenom, ili konstante brzine vezivanja antitela ili vezujućeg fragmenta antitela.

[0131] Termin "KA" (M-1 ili 1/M) se odnosi na konstantu ravnoteže asocijacije određene interakcije antitelo-antigen, ili konstantu ravnoteže asocijacije antitela ili fragmenta koji se vezuje za antitelo. Konstanta ravnoteže asocijacije se dobija deljenjem kasa kd.

[0132] Termin "EC50" ili "EC50" odnosi se na polovinu maksimalne efikasne koncentracije, koja uključuje koncentraciju antitela koja indukuje odgovor na pola između osnovnog nivoa i maksimuma nakon naznačenog vremena izlaganja. EC50u suštini predstavlja koncentraciju antitela na kojoj je uočeno 50% njegovog maksimalnog efekta. U određenim izvođenjima, vrednost EC50je jednaka koncentraciji antitela iz pronalaska koja dalje polovinu maksimalnog vezivanja za ćelije koje eksprimuju CD3 ili antigen povezan sa tumorom, kao što je određeno sa npr. FACS testom vezivanja. Prema tome, smanjeno ili oslabljeno vezivanje je uočeno sa povećanom EC50, ili vrednosti polovine maksimalne efektivne koncentracije.

[0133] U jednom izvođenju, smanjeno vezivanje se može definisati kao povećana EC50koncentracija antitela koja omogućava vezivanje sa polovinom maksimalne količine ciljnih ćelija.

[0134] U drugom izvođenju, EC50vrednost predstavlja koncentraciju antitela iz pronalaska koja pokreće polovinu-maksimalnog iscrpljivanja ciljnih ćelija aktivnostima citotoksičnih T ćelija. Prema tome, povećana citotoksična aktivnost (npr. ubijanje ćelija tumora posredovano sa T ćelijom) se uočava sa smanjenjem EC50, ili polovinom vrednosti maksimalne efikasne koncentracije.

Bispecifični antigen-vezujući molekuli

[0135] Antitela mogu biti monospecifična, bi-specifična, ili multispecifična. Multispecifična antitela mogu biti specifična za različite epitope jednog ciljnog polipeptida ili mogu sadržati domene koji vežu antigen koji su specifični za više od jednog ciljnog polipeptida. See, npr., Tutt et al., 1991, J. Immunol.

147:60-69; Kufer et al., 2004, Trends Biotechnol.22:238-244. Anti-PSMA monospecifična antitela ili anti-PSMA/anti-CD3 bispecifična antitela mogu biti spojena sa ili istovremeno eksprimovana sa drugim funkcionalnim molekulom, npr., drugim peptidom ili proteinom. Na primer, antitelo ili njegov fragment mogu biti funkcionalno spojeni (npr., hemijskim kuplovanjem, genskim spajanjem, nekovalentnim udruživanjem ili drugačije) sa jednim ili više drugih molekulskih entiteta, kao što je drugo antitelo ili fragment antitela da bi se proizvelo bi-specifično ili multispecifično antitelo sa drugim ili dodatnim afinitetom vezivanja.

[0136] Upotreba izraza "anti-CD3 antitelo" ili "anti-PSMA antitelo" ovde je namenjena da uključi I monospecifična anti-CD3 ili anti-PSMA antitela kao i bispecifična antitela koja sadrže CD3-vezujući krak i PSMA vezujući krak. Prema tome, predmetni pronalazak uključuje bispecifična antitela pri čemu jedan krak imunoglobulina veže humani CD3, i drugi krak imunoglobulina je specifičan za humani PSMA. CD3-vezujući krak može sadržati bilo koju od HCVR/LCVR ili CDR sekvenci aminokiselina kao što su ovde predstavljene u Tabelama 12, 14, 15, 18, i 20.

[0137] U određenim izvođenjima, CD3-vezujući krak veže se za humani CD3 i indukuje aktivaciju humane T ćelije. U određenim izvođenjima, CD3-vezujući krak se veže slabo za humani CD3 I indukuje aktivaciju humane T ćelije. U drugim izvođenjima, CD3-vezujući krak veže se slabo za humani CD3 i indukuje ubijanje ćelija koje eksprimuju antigen koji je povezan sa tumorom u kontekstu bispecifičnog ili multispecifičnog antitela. U drugim izvođenjima, CD3-vezujući krak veže ili se slabo udružuje sa humanim i (mamuna) CD3 cinomolgusa, ipak interakcija vezivanja nije detektabilna u in vitro testovima

2

koji su poznati u oblasti tehnike. PSMA-vezujući krak može sadržati bilo koju od HCVR/LCVR ii CDR sekvenci aminokiselina kao što su ovde predstavljene u Tabeli 1.

[0138] Prema određenim primerima izvođenja, predmetni pronalazak uključuje bispecifilčne antigenvezujuće molekule koji specifično vežu CD3 i PSMA. Ovi molekuli mogu ovde biti naznačeni kao, npr., "anti-CD3/anti-PSMA," ili "anti-CD3xPSMA" ili "CD3xPSMA" bispecifične molekule, ili druga slična terminologija (npr., anti-PSMA/anti-CD3).

[0139] Termin "PSMA," kao što se ovde koristi, odnosi se na humani PSMA protein osim ukoliko nije naznačeno da je iz nehumanih vrsta (npr., "mišji PSMA," "PSMA majmuna," itd.). Humani PSMA protein ima sekvencu aminokiseline koja je prikazana u SEQ ID NO:1651.

[0140] Prethodno pomenuti bispecifični antigen-vezujući molekuli koji specifično vežu CD3 i PSMA mogu sadržati anti-CD3 antigen-vezujući molekul koji se veže za CD3 sa slabim afinitetom vezivanja tako da ispoljava KDveću od oko 40 nM, kao što je mereno in vitro afinitetnim testom vezivanja.

[0141] Kao što se ovde koristi, izraz "antigen-vezujući molekul" označava protein, polipeptid ili molekulski kompleks koji sadrži ili koji sadrži bar jedan region za određivanje komplementarnosti (CDR) koji zasebno, ili u kombinaciji sa jednim ili više dodatnih CDRs i/ili regiona okvira (FRs), se veže specifično za određeni antigen. U određenim izvođenjima, antigen vezujući molekul je antitelo ili fragment antitela, kao što su navedeni izrazi ovde definisani na drugom mestu.

[0142] Kao što se ovde koristi, izraz "bispecifični antigen-vezujući molekul" označava protein, polipeptid ili molekulski kompleks koji sadrži bar prvi antigen-vezujući domen i drugi antigen-vezujući domen. Svaki antigen-vezujući domen u bispecifičnom antigen-vezujućem molekulu sadrži bar jedan CDR koji zasebno, ili u kombinaciji sa jednim ili više dodatnih CDRs i/ili FRs, specifično se veže za određeni antigen. U kontekstu predmetnog pronalaska, prvi antigen-vezujući domen specifično veže prvi antigen (npr., CD3), i drugi antigen-vezujući domen specifično veže drugi, različiti antigen (npr., PSMA).

[0143] U određenim primerima izvođenja iz predmetnog pronalaska, bispecifični antigen-vezujući molekul je bispecifično antitelo. Svaki antigen-vezujući domen bispecifičnog antitela sadrži varijabilni domen teškog lanca (HCVR) i varijabilni domen lakog lanca (LCVR). U kontekstu bispecifičnog antigenvezujućeg molekula koji sadrži prvi i drugi antigen-vezujući domen (npr., bispecifično antitelo), CDRs prvog antigen-vezujućeg domena mogu biti označeni prefiksom "A1" i CDRs drugog antigen-vezujućeg domena mogu biti označeni prefiksnom "A2". Prema tome, CDRs prvog antigen-vezujućeg domena mogu ovde biti označeni kao A1-HCDR1, A1-HCDR2, i A1-HCDR3; i CDRs drugog antigen-vezujućeg domena mogu ovde biti označeni kao A2-HCDR1, A2-HCDR2, i A2-HCDR3.

[0144] Prvi antigen-vezujući domen i drugi antigen-vezujući domen mogu biti direktno ili indirektno povezani jedan sa drugim da se obrazuje bispecifični antigen-vezujući molekul iz predmetnog pronalaska. Alternativno, prvi antigen-vezujući domen i drugi antigen-vezujući domen mogu svaki biti povezani sa odvojenim multimerizujućim domenom. Povezivanje jednog multimerizujućeg domena sa drugim multimerizujućim domenom olakšava povezivanje između dva antigen-vezujuća domena, time obrazujući bispecifilčni antigen-vezujući molekul. Kao što se ovde koristi, "multimerizujući domen" je bilo koji makromolekul, protein, polipeptid, peptid, ili aminokiselina koja ima sposobnost da se veže sa drugim multimerizujućim domenom iste ili slične strukture ili konstitucije. Na primer, multimerizujući domen može biti polipeptid koji sadrži domen CH3 imunoglobulina. Neograničavajući primer multimerizujuće komponente je Fc deo imunoglobulina (koji obuhvata domen CH2-CH3 domen), npr., Fc domen IgG koji je odabran iz izotipova IgG1, IgG2, IgG3, i IgG4, kao i bilo koji alotip u svakoj grupi izotipa.

2

[0145] Bispecifični antigen-vezujući molekul iz predmetnog pronalaska će obično sadržati dva multimerizujuća domena, npr., dva Fc domena koji su svaki pojedinačno deo odvojenog teškog lanca antitela. Prvi i drugi multimerizujući domeni mogu biti istog IgG izotipa kao što su, npr., IgG1/IgG1, IgG2/IgG2, IgG4/IgG4. Alternativno, prvi i drugi multimerizujui domeni mogu biti različitih izotipova IgG kao što su, npr., IgG1/IgG2, IgG1/IgG4, IgG2/IgG4, itd.

[0146] U određenim izvođenjima, multimerizujući domen je Fc fragment ili sekvenca aminokiseline od oko 1 do oko 200 aminokiselina u dužini koji sadrži bar jedan cisteinski ostatak. U drugim izvođenjima, multimerizujući domen je cisteinski ostatak, ili kratak peptid koji sadrži cistein. Drugi multimerizujući domeni uključuju peptide ili polipeptide koji sadrže ili koji se sastoje iz leucinskog zatvarača, zavojnicapetlja motiva, ili motiva upredene zavojnice (eng. coiled-coil).

[0147] Bilo koji format bispecifičnog antitela ili tehnologija se može koristiti da se dobiju bispecifični antigen-vezujući molekuli iz predmetnog pronalaska. Na primer, antitelo ili njegov fragment koji ima specifičnost vezivanja prvog antigena može biti funkcionalno povezan (npr., hemijskim kuplovanjem, genetičkim spajanjem, nekovalentnim udruživanjem ili drugačije) sa jednim ili više drugih molekulskih entiteta, kao što je drugo antitelo ili fragment antitela koji ima specifičnost vezivanja za drugi antigena da bi se proizveo bispecifični antigen-vezujući molekul. Specifični primeri bispecifičnih formata koji se mogu upotrebiti u kontekstu predmetnog pronalaska uključuju, npr., scFv-zasnovano ili diatelo bispecifične formate, IgG-scFv fuzije, dualno varijabilni domain (DVD)-Ig, Quadroma, sa dugme-u-rupi eng. (“knobs-into-holes”), zajednički laki lanac (npr., zajednički laki lanac sa dugme-u-rupi (eng. “knobs-into-holes”=, itd.), Cross-Mab, CrossFab, (SEED)telo, leucinski rajsferšlus, Duotelo, IgG1/IgG2, Fab sa dualnim dejstvom (DAF)-IgG, i Mab2 bispecifični formati (videti, npr., Klein et al.2012, mAbs 4:6, 1-11, i ovde navedene reference, za pregled prethodno navedenih formata).

[0148] U kontekstu bispecifičnih antigen-vezujućih molekula iz predmetnog pronalaska, multimerizujući domeni, npr., Fc domeni, mogu sadržati jednu ili više aminokiselinkih izmena (npr., insercije, delecije ili supstitucije) u poređenju sa divljim tipom, verzijom Fc domena koja se pojavljuje u prirodi. Na primer, pronalazak uključuje bispecifične antigen vezujuće molekule koji sadrže jednu ili više modifikacija u domenu Fc koji rezultuje u modifikovanom Fc domenu koji ima modifikovanu interakciju vezivanja (npr., pojačanu ili umanjenu) između Fc i FcRn. U jednom izvođenju, bispecifični antigen-vezujući molekul sadrži modifikaciju u regionu CH2 ili CH3, pri čemu modifikacija povećava afinitet domena Fc za FcRn u kiselom okruženju (npr., u endozomu gde je pH u opsegu od oko 5.5 do oko 6.0). Neograničavajući primeri takvih Fc modifikacija uključuju, npr., modifikaciju na poziciji 250 (npr., E ili Q); 250 i 428 (npr., L ili F); 252 (npr., L/Y/F/W ili T), 254 (npr., S ili T), i 256 (npr., S/R/Q/E/D ili T); ili modifikaciju na poziciji 428 i/ili 433 (npr., L/R/S/P/Q ili K) i/ili 434 (npr., H/F ili Y); ili modifikaciju na poziciji 250 i/ili 428; ili modifikaciju na poziciji 307 ili 308 (npr., 308F, V308F), i 434. U jednom izvođenju, modifikacija sadrži 428L (npr., M428L) i 434S (npr., N434S) modifikaciju; 428L, 259I (npr., V259I), i 308F (npr., V308F) modifikaciju; 433K (npr., H433K) i 434 (npr., 434Y) modifikaciju; 252, 254, i 256 (npr., 252Y, 254T, i 256E) modifikaciju; 250Q i 428L modifikaciju (npr., T250Q i M428L); i 307 i/ili 308 modifikaciju (npr., 308F ili 308P).

[0149] Predmetni pronalazak takođe uključuje bispecifične antigen-vezujuće molekule koji sadrže prvi CH3 domen i drugi Ig CH3 domen, gde prvi i drugi CH3 domeni Ig se razlikuju jedan od drugog za bar jednu aminokiselinu, i gde razlika u bar jednoj aminokiselini smanjuje vezivanje bispecifičnog antitela za Protein A u poređenju sa bi-specifičnim antitelom kome nedostaje razlika u aminokiselini. U jednom izvođenju, prvi Ig CH3 domen veže Protein A i drugi Ig CH3 domen sadrži mutaciju koja smanjuje ili ukida vezivanje Proteina A tako da modifikacija H95R (sa IMGT obeležavanjem egzona; H435R sa EU obeležavanjem). Drugi CH3 može dalje sadržati modifikaciju Y96F (sa IMGT; Y436F sa EU). Videti, na primer, US Patent br.8,586,713. Ostale modifikacije koje se mogu naći u CH3 uključuju: D16E, L18M, N44S, K52N, V57M, i V82I (sa IMGT; D356E, L358M, N384S, K392N, V397M, i V422I sa EU) u slučaju

2

IgG1 antitela; N44S, K52N, i V82I (IMGT; N384S, K392N, i V422I sa EU) u slučaju IgG2 antitela; i Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q, i V82I (sa IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q, i V422I sa EU) u slučaju IgG4 antitela.

[0150] U određenim izvođenjima, Fc domen može biti himerni, kombinovanjem sekvenci Fc koje su dobijene iz više od jednog izotipa imunoglobulina. Na primer, himerni Fc domen može sadržati deo ili celu sekvencu CH2 koja je izvedena iz humanog IgG1, humanog IgG2 ili humanog IgG4 CH2 regiona, i dela ili cele sekvence CH3 koja je izvedena iz humanog IgG1, humanog IgG2 ili humanog IgG4. Himerni Fc domen može takođe sadržati himerni region zgloba. Na primer, himerni zglob može sadržati sekvencu "gornjeg zgloba", koja je izvedena iz humanog IgG1, humanog IgG2 ili humanog IgG4 regiona zglova, kombinovana sa sekvencom "donjeg zgloba", koja je izvedena iz humanog IgG1, humanog IgG2 ili humanog IgG4 regiona zgloba. Poseban primer određenog domena Fc koji može biti uključen u bilo koje od antigen-vezujućih molekula koji su ovde predstavljeni obuhvata, od N- ka C-kraju: [IgG4 CH1] -[IgG4 gornji zglob] - [IgG2 donji zglob] - [IgG4 CH2] - [IgG4 CH3]. Drugi primer himernog Fc domena koji može biti uključen u bilo koje od ovde prikazanih antigen-vezujućih molekula obuhvata, od N- ka C-kraju: [IgG1 CH1] - [IgG1 gornji zglob] - [IgG2 donji zglob] - [IgG4 CH2] - [IgG1 CH3]. Ovi i drugi primeri himernih Fc domena koji mogu biti uključeni u bilo koje od antigen-vezujućih molekula iz predmetnog pronalaska su opisani u US objavi 2014/0243504, koja je izdata 28 avgusta, 2014. Himerni Fc domeni koji imaju ove opšte strukturalne rasporede, i njihove varijante, mogu imati izmenjeno vezivanje Fc receptora, koje sa druge strane ima uticaj na efektorsku funkciju Fc.

[0151] U određenim izvođenjima, antigen-vezujući molekuli sadrže težak lanac antitela pri čemu region konstantnog regiona teškog lanca (CH) sadrži sekvencu aminokiselina bar 95%, bar 96%, bar 97%, bar 98%, bar 99% identičnu sa bilo kojom od SEQ ID NO: 1663, SEQ ID NO: 1664, SEQ ID NO: 1665, SEQ ID NO: 1666, SEQ ID NO: 1667, SEQ ID NO: 1668, SEQ ID NO: 1669, SEQ ID NO: 1670 SEQ ID NO: 1671 or SEQ ID NO: 1672. U nekim izvođenjima, region konstantnog regiona teškog lanca (CH) sadrži sekvencu aminokiseline izabranu iz grupe koja sadrži SEQ ID NO: 1663, SEQ ID NO: 1664, SEQ ID NO: 1665, SEQ ID NO: 1666, SEQ ID NO: 1667, SEQ ID NO: 1668, SEQ ID NO: 1669, SEQ ID NO: 1670, SEQ ID NO: 1671 i SEQ ID NO: 1672.

[0152] U drugim izvođenjima, antigen-vezujući molekuli sadrže težak lanac antitela pri čemu Fc domen sadrži sekvencu aminokiselina bar 95%, bar 96%, bar 97%, bar 98%, bar 99% identičnu sa bilo kojom od SEQ ID NO: 1673, SEQ ID NO: 1674, SEQ ID NO: 1675, SEQ ID NO: 1676, SEQ ID NO: 1677, SEQ ID NO: 1678, SEQ ID NO: 1679, SEQ ID NO: 1680, SEQ ID NO: 1681 ili SEQ ID NO: 1682. U nekim izvođenjima, Fc domen sadrži sekvencu aminokiselina izabranu iz grupe koja sadrži SEQ ID NO: 1673, SEQ ID NO: 1674, SEQ ID NO: 1675, SEQ ID NO: 1676, SEQ ID NO: 1677, SEQ ID NO: 1678, SEQ ID NO: 1679, SEQ ID NO: 1680, SEQ ID NO: 1681 i SEQ ID NO: 1682.

Varijante sekvenci

[0153] Antitela i bispecifični antigen-vezujući molekuli mogu sadržati jednu ili više aminokiselinskih supstitucija, insercija i/ili delecija u region okvira i/ili CDR regionima varijabilnih domena teškog i lakog lanca u poređenju sa odgovarajućim germinativnim sekvencama iz kojih su izvedeni pojedinačni domeni za vezivanje antigena. Takve mutacije se mogu lako utvrditi poređenjem ovde prikazanih aminokiselinskih sekvenci sa germinativnim sekvencama koje su dostupne iz, na primer, javno dostupnih baza podataka sekvenci antitela. Antigen-vezujući molekuli mogu sadržati domene koji vezuju antigen koji su dobijeni uz bilo koje od ovde prikazanih primera sekvenci aminokiselina, pri čemu jedna ili više aminokiselina u jednom ili više regiona okvira i/ili CDR regiona je mutirana u odgovarajuće ostatak(ke) germinativne sekvence iz koje je antitelo dobijeno, ili u odgovarajući ostatak(e) druge humane germinativne sekvence, ili u odgovarajuću aminokiselinsku supstituciju odgovarajućih germinativnih ostatak(a) (takve promene u sekvenci su ovde kolektivno označene kao

2

"germinativne mutacije"). Osoba koja je uobičajeno verzirana u stanje tehnike, počev od ovde prikazanih sekvenci varijabilnog regiona teškog i lakog lanca, može jednostavno proizvesti brojna antitela i njihove fragmete koji vežu antigen koji sadrže jednui ili više pojedinačnih germinativnih mutacija ili njihovih kombinacija. U određenim slučajevima, svaki od regiona okvira i/ili CDR ostataka u VHi/ili VLdomenima su mutirani nazad do to ostataka koji se nalaze u originalnoj germinativnoj sekvenci iz koje je domen za vezivanje antigena originalno dobijen. U drugim slučajevima, samo određeni ostaci su mutirani nazad do originalne germinativne sekvence, npr., samo mutirani ostaci koji se mogu naći u prvih 8 aminokiselina FR1 ili u poslednjih 8 aminokiselina FR4, ili samo mutirani ostaci koji se nalaze u CDR1, CDR2 ili CDR3. U drugim slučajevima, jedan ili više od regiona okvira i/ili CDR ostatak(a) su mutirani u odgovarajući ostatak(e) različite germinativne sekvence (tj., germinativna sekvenca koja se razlikuje od germinativne sekvence iz koje je domen za vezivanje antigena originalno dobijen). Osim toga, domeni za vezivanje antigena mogu sadržati bilo koju kombinaciju dva ili više germinativnih mutacija u region okvira i/ili CDR regions, npr., pri čemu su određeni pojedinačni ostaci mutirani u odgovarajući ostatak određene germinativne sekvence dok određeni drugi ostaci koji se razlikuju od originalne germinativn sekvence su održavani ili su mutirani u odgovarajući ostatak različite germinativne sekvence. Jednom dobijeni, domeni koji vezuju antigen koji sadrže jednu ili više germinativnih mutacija mogu se jednostavno ispitati za jedno ili više željeno svojstvo kao što je, poboljšana specifičnost vezivanja, povećani afinitet vezivanja, unapređena ili poboljšana antagonistička ili agonistička biološka svojstva (kao što to može biti slučaj), smanjena imunogenost, itd.

[0154] Ovde su takođe opisani antigen-vezujući molekuli pri čemu jedan ili oba domena za vezivanje antigena sadrže varijante bilo koje od ovde prikazanih HCVR, LCVR, i/ili CDR aminokiselinskih sekvenci koje imaju jednu ili više konzervativnih supstitucija. Na primer, molekuli za vezivanje antigena koji sadrže domen za vezivanje antigena koji ima HCVR, LCVR, i/ili CDR aminokiselinske sekvence sa, npr., 10 ili manje, 8 ili manje, 6 ili manje, 4 ili manje, itd. konzervativnih aminoskiselinskih supstitucija u odnosu na bilo koju od ovde prikazanih HCVR, LCVR, i/ili CDR sekvenci aminokiselina. "Konzervativna supstitucija aminokiselina" je ona u kojoj su aminokiselinski ostati supstituisani sa drugim aminokiselinskim ostatkom koji ima bočni lanac (R grupu) sa sličnim hemijskim osobinama (npr., naelektrisanjem ili hidrofobnosti). Uopšteno, konzervativna aminokiselinska supstitucija neće suštinski izmeniti funkcionalne osobine proteina. Primeri grupa aminokiselina koje imaju bočne lance sa sličnim hemijskim osobinama uključuju (1) alifatične bočne lance: glicin, alanin, valin, leucin i izoleucin; (2) alifatične-hidroksilne bočne lance: serin i treonin; (3) bočne lance koji sadrže amid: asparagin i glutamin; (4) aromatične bočne lance: fenilalanin, tirozin, i triptofan; (5) bazne bočne lance: lizin, arginin, i histidin; (6) kisele bočne lance: aspartat i glutamat, i (7) bočni lanci koji sadrže sumpor su cistein i metionin. Poželjne konzervativne supstitucione grupe aminokiselina su: valin-leucinizoleucin, fenilalanin-tirozin, lizin-arginin, alanin-valin, glutamat-aspartat, i asparagin-glutamin. Alternativno, konzervativna zamena je bilo koja izmena koja ima pozitivnu vrednost u PAM250 logmatrici verovatnoće prikazanoj u Gonnet et al. (1992) Science 256: 1443-1445. "Umereno konzervativna" zamena je bilo koja zamena koja ima nenegativnu vrednost u PAM250 log-matrici verovatnoće.

[0155] Ovo izlaganje takođe uključuje molekule za vezivanje antigena koji sadrže domen za vezivanje antigena sa HCVR, LCVR, i/ili CDR aminokiselinskom sekvencom koja je suštinski identična sa bilo kojom od ovde prikazanih HCVR, LCVR, i/ili CDR aminokiselinskih sekvenci. Termin "suštinski identitet" ili "suštinski identična," kada se odnosi na aminokiselinsku sekvencu označava da kada su dve aminokiselinske sekvence, kada su optimalno poravnate, kao što je upotrebom programa GAP ili BESTFIT upotrebom podrazumevanih “gap” težina, dele bar 95% identičnost u sekvenci, još poželjnije bar 98% ili 99% identičnost u sekvenci. Poželjno, položaji ostataka koji nisu identični razlikuju se u konzervativnim aminokiselinskim supstitucijama. U slučajevima u kojima se dve ili više aminokiseline razlikuju jedna od druge konzervativnim supstitucijama, procenat identičnosti u sekvenci ili stepen

2

sličnosti može se podesiti naviše da bi se ispravila konzervativna priroda supstitucije. Sredstva za dobijanje ove promene su dobro poznata stručnjacima iz oblasti tehnike. Videti, npr., Pearson (1994) Methods Mol. Biol.24: 307-331.

[0156] Sličnost u sekvenci za polipeptide, koja je takođe označena kao identičnost u sekvenci, je obično merena upotrebom softvera za analizu sekvence. Softver za analizu sekvence uparuje slične sekvence upotrebom mera sličnosti dodeljenih različitim supstitucijama, delecijama i drugim modifikacijama, uključujući konzervativne aminokiselinske supstitucije. Na primer, GCG softver sadrži programe kao što su Gap i Bestfit koji se mogu koristiti sa podrazumevanim parametrima da bi se odredila homologija u sekvenci ili identičnost u sekvenci između blisko srodnih polipeptida, kao što su homologni polipeptidi iz različitih vrsta organizama ili između proteina divljeg tipa i njegovog muteina. Videti, npr., GCG Verzija 6.1. Polipeptidne sekvence mogu takođe biti upoređene upotrebom FASTA upotrebom podrazumevanih ili preporučenih parametara, program GCG Verzija 6.1. FASTA (npr., FASTA2 i FASTA3) obezbeđuje poravnanja i procenat identičnosti u sekvenci regiona najboljeg poklapanja između ispitivane i sekvenci koje se pretražuju (Pearson (2000) supra). Drugi poželjan algoritam kada se poredi sekvenca iz pronalaska sa bazom podataka koja sadrži veliki broj sekvenci iz razliitih izvora fiz različitih organizama je računarski program BLAST, naročito BLASTP ili TBLASTN, upotrebom podrazumevanih parametara. Videti, npr., Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol.215:403-410 i Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res.25:3389-402.

Vezivanje koje zavisi od pH

[0157] Ovde su opisana anti-PSMA antitela, i anti-CD3/anti-PSMA bispecifične antigen-vezujuće molekule, sa karakteristikama vezivanja koje zavise od pH. Na primer, anti-PSMA antitelo može ispoljiti smanjeno vezivanje za PSMA na kiseloj pH u poređenju sa neutralnom pH. Alternativno, anti-PSMA antitela mogu ispoljiti pojačano vezivanje za PSMA na kiseloj pH u poređenju sa neutralnom pH. Izraz "kisela pH" obuhvata vrednosti pH manje od oko 6.2, npr., oko 6.0, 5.95, 5,9, 5.85, 5.8, 5.75, 5.7, 5.65, 5.6, 5.55, 5.5, 5.45, 5.4, 5.35, 5.3, 5.25, 5.2, 5.15, 5.1, 5.05, 5.0, ili manje. Kao što se ovde koristi, izraz "neutralna pH" označava pH od oko 7.0 do oko 7.4. Izraz "neutralna pH" uključuje vrednosti pH od oko 7.0, 7.05, 7.1, 7.15, 7.2, 7.25, 7.3, 7.35, i 7.4.

[0158] U određenim slučajima, "smanjeno vezivanje ... na kiseloj pH u poređenju sa neutralnom pH" je izraženo u terminima odnosa vrednosti KDvezivanja antitela za njegov antigen na kiseloj pH do vrednosti KDvezivanja antitela za njegov antigen na neutralnoj pH (ili suprotno). Na primer, antitelo ili njegov fragment koji veže antigen može se posmatrati kao izpoljavanje "smanjeno vezivanje za PSMA na kiseloj pH u poređenju sa neutralnom pH" ukoliko antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen ispoljava odnos kiselina/neutralno KDod oko 3.0 ili veći. U određenim primerima izvođenja, odnos kiselina/neutralno KDza antitelo ili njegov fragment koji veže antigen iz predmetnog pronalaska može biti oko 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10.0, 10.5, 11.0, 11.5, 12.0, 12.5, 13.0, 13.5, 14.0, 14.5, 15.0, 20.0.25.0, 30.0, 40.0, 50.0, 60.0, 70.0, 100.0 ili veći.

[0159] Antitela sa karakteristikama vezivanja koje zavise od pH se mogu dobiti, npr., skriningom populacije antitela za smanjeno (ili obogaćeno) vezivanje za određeni antigen na kiseloj pH u poređenju sa neutralnom pH. Dodatno, modifikacije domena koji vezuje antigen na nivou aminokiseline mogu dati prinos antitela sa karakteristikama koje su zavisne od pH. Na primer, zamenom jedne ili više aminokiselina domena koji vezuje antigen (npr., u CDR) sa ostatkom histidina, antitelo sa smanjenim vezivanjem antigen na kiseloj pH u odnosu na neutralnu pH se može dobiti.

Antitela koja sadrže varijante Fc

[0160] Prema određenim aspektima iz predmetnog pronalaska, obezbeđena su anti-PSMA antitela, i anti-CD3/anti-PSMA bispecifični antigen-vezujući molekuli, koji sadrže Fc domen koji sadrži jednu ili više mutacija koje pojačavaju ili smanjuju vezivanje antitela za receptor FcRn, npr., na kiseloj pH u poređenju sa neutralnom pH. Na primer, predmetni pronalazak uključuje antitela koja sadrže mutaciju u CH2 ili CH3 regionu domena Fc, pri čemu mutacija(e) povećava afinitet domena Fc za FcRn u kiselom okruženju (npr., u endozomu gde su opsezi pH od oko 5.5 do oko 6.0). Takve mutacije mogu rezultovati u povećanju polu-života antitela u serumu kada se daje životinji. Neograničavajući primeri takvih modifikacija Fc uključuju, npr., modifikaciju na poziciji 250 (npr., E ili Q); 250 i 428 (npr., L ili F); 252 (npr., L/Y/F/W ili T), 254 (npr., S ili T), i 256 (npr., S/R/Q/E/D ili T); ili modifikaciju na poziciji 428 i/ili 433 (npr., H/L/R/S/P/Q or K) i/ili 434 (npr., H/F ili Y); ili modifikaciju na poziciji 250 i/ili 428; ili modifikaciju na poziciji 307 ili 308 (npr., 308F, V308F), i 434. U jednom aspektu, modifikacija obuhvata 428L (npr., M428L) i 434S (npr., N434S) modifikaciju; 428L, 259I (npr., V259I), i 308F (npr., V308F) modifikaciju; 433K (npr., H433K) i 434 (npr., 434Y) modifikaciju; 252, 254, i 256 (npr., 252Y, 254T, i 256E) modifikaciju; 250Q i 428L modifikaciju (npr., T250Q i M428L); i 307 i/ili 308 modifikaciju (npr., 308F ili 308P)

[0161] Na primer, Ovo izlaganje uključuje anti-PSMA antitela, i anti-CD3/anti-PSMA bispecifične antigen-vezujuće molekule, koji sadrže domen Fc koji sadrži jedan ili više parova ili grupa mutacija koje su odabrane iz grupe koja sadrži: 250Q i 248L (npr., T250Q i M248L); 252Y, 254T i 256E (npr., M252Y, S254T i T256E); 428L i 434S (npr., M428L i N434S); i 433K i 434F (npr., H433K i N434F).

Biološke karakteristike antitela i bispecifični antigen-vezujući molekuli

[0162] Predmetni pronalazak uključuje antitela i njihove fragmente za vezivanje antigena koji vežu humani PSMA sa visokim afinitetom (npr., sub-nanomolarnim vrednostima KD).

[0163] Prema određenim izvođenjima, predmetni pronalazak uključuje antitela i fragmente antitela koji vežu antigen koji se vežu za humani PSMA (npr., na 37°C) sa KDmanjom od oko 80 nM kao što je mereno površinskom plazmonskom rezonancijom, npr., upotrebom formata testa kao što se ovde definiše u Primeru 3. Antitela ili fragmenti za vezivanje antigena mogu vezati PSMA sa KDmanjom od oko 5 nM, manjom od oko 2 nM, manjom od oko 1 nM, manjom od oko 800 pM, manjom od oko 600 pM, manjom od oko 500 pM, manjom od oko 400 pM, manjom od oko 300 pM, manjom od oko 200 pM, manjom od oko 180 pM, manjom od oko 160 pM, manjom od oko 140 pM, manjom od oko 120 pM, manjom od oko 100 pM, manjom od oko 80 pM, manjom od oko 60 pM, manjom od oko 40 pM, manjom od oko 20 pM, ili manjom od oko 10 pM, kao što je mereno površinskom plazmonskom rezonancom, npr., upotrebom formata testa kao što se ovde definiše u Primeru 3 (npr., format za hvatanje mAt ili format za hvatanje antigena), ili suštinski sličan test.

[0164] Ovde su takođe opisana antitela i njihovi fragmenti za vezivanje antigena koji vežu PSMA sa polu-životom disocijacije (t<1>/2) većim od približno 1 minuta ili većim od oko 10 minuta kao što je mereno površinskom plazmonskom rezonancijom na 37°C, npr., upotrebom formata testa kao što je ovde definisano u Primeru 3, ili u suštini sličnom testu. Antitela ili fragmenti koji vežu antigen vežu PSMA sa t<1>/2većim od oko 20 minuta, većim od oko 30 minuta, većim od oko 40 minuta, većim od oko 50 minuta, većim od oko 60 minuta, većim od oko 70 minuta, većim od oko 80 minuta, većim od oko 90 minuta, većim od oko 100 minuta, većim od oko 200 minuta, većim od oko 300 minuta, većim od oko 400 minuta, većim od oko 500 minuta, većim od oko 600 minuta, većim od oko 700 minuta, većim od oko 800 minuta, većim od oko 900 minuta, većim od oko 1000 minuta, ili većim od oko 1100 minuta, kao što je mereno površinskom plazmonskom rezonancom na 25°C ili 37°C, npr., upotrebom formata testa kao što se ovde definiše u Primeru 3 (npr., format za hvatanje mAt ili format za hvatanje

1

antigena), ili suštinski sličnim testom. Predmetni pronalazak uključuje bispecifilčne antigen-vezujuće molekule (npr., bispecifična antitela) koji su sposobni za istovremeno vezivanje za humani CD3 i humani PSMA. Prema određenim izvođenjima, bispecifični antigen-vezujući molekuli iz pronalaska specifično interaguju sa ćelijama koje eksprimuju CD3 i/ili PSMA. Obim u kome se bispecifični antigenvezujući molekul veže za ćelije koje eksprimuju CD3 i/ili PSMA se može proceniti fluorescentno aktiviranim ćelijskim sortiranjem (FACS), kao što je ovde ilustrovano u Primeru 5. Na primer, predmetni pronalazak uključuje bispecifične antigen-vezujuće molekule koji specifično vežu humane T-ćelijske linije koje eksprimuju CD3 (kao što su ćelijske linije koje ne eksprimuju PSMA, npr., Jurkat) i/ili humane linije koje eksprimuju PSMA (takve ćelijske linije ne eksprimuju CD3, npr., B16F10.9/hPSMA ili 22RV1). Predmetni pronalazak uključuje bispecifične antigen-vezujuće molekule koji vežu bilo koju od prethodno pomenutih ćelija i ćelijskih linija sa vrednosti EC50od oko 80 nM, ili manjom, kao što je određeno upotrebom testa FACS kao što je predstavljeno u Primeru 5 ili suštinski sličnom testu.

[0165] Ovo izlaganje takođe uključuje anti-CD3/anti-PSMA bispecifilčne antigen-vezujuće molekule koji vezuju humane T ćelije koje eksprimuju CD3 (npr., Jurkat) i/ili ćelije koje eksprimuju PSMA sa vrednosti EC50između 1.0 pM i 1000 nM. anti-CD3/anti-PSMA bispecifični antigen-vezujući molekuli mogu se vezati za humane T ćelije koje eksprimuju CD3 sa vrednosti EC50između 1 nM i 60 nM. Na primer, ovde su opisani anti-CD3/anti-PSMA bispecifični antigen-vezujući molekuli koji se vežu za humane T ćelije koje eksprimuju CD3 (npr., Jurkat) i/ili ćelije koje eksprimuju PSMA sa vrednosti EC50od oko 1 pM. oko 10 pM, oko 100 pM, oko 500 pM, oko 1 nM, oko 2 nM, oko 5 nM, oko 10 nM, oko 20 nM, oko 30 nM, oko 40 nM, oko 50 nM oko 60 nM, oko 70 nM, oko 80 nM, oko 90 nM, oko 100 nM, oko 200 nM, oko 300 nM, oko 500 nM, oko 800 nM, oko 1000 nM, ili više.

[0166] Predmetni pronalazak takođe uključuje anti-CD3/anti-PSMA bispecifične antigen-vezujuće molekule koji ispoljavaju jednu ili više karakteristika koje su odabrane iz grupe koja sadrži : (a) inhibiciju tumorskog rasta kod imunokompromitovanih miševa koji nose ksenotransplantate kancera humane prostate; (b) inhibiciju tumorskog rasta kod imunokompetentnih miševa koji nose ksenotransplantate kancera humane prostate; (c) suprimiranje tumorskog rasta ustanovljenih tumora kod imunokompromitovanih miševa koji nose ksenotransplantate kancera humane prostate; i (d) smanjenje tumorskog rasta ustanovljenih tumora kod imunokompetentnih miševa koji nose ksenografte kancera humane prostate (videte, npr., Primer 8).

[0167] Ovde su takođe prikazana antitela i njihovi fragmenti koji vezuju antigen koji vežu humani CD3 sa visokim afinitetom. Predmetni pronalazak takođe uključuje antitela i njihove fragmente koji vežu antigen koji vežu humani CD3 sa umerenim ili slabim afinitetom, u zavisnosti od terapeutskog konteksta i određenih ciljanih osobina koje su poželjne. Na primer, u kontekstu bispecifičnog antigenvezujućeg molekula, u kome jedan krak veže CD3 i drugi krak veže ciljni antigen (npr., PSMA), može biti poželjno da se ciljni krak koji vezuje antigen veže za ciljni antigen sa visokim afinitetom dok se anti-CD3 krak vezuje za CD3 sa samo umerenim ili niskim afinitetom. Na ovaj način, preferencijalno ciljanje molekula koji vezuje antigen na ćelije koje eksprimiraju ciljni antigen se može postići dok se izbegava opšte/nespecifično ciljano vezivanje CD3 posledične neželjene nuspojave koje su sa tim u vezi.

[0168] Predmetni pronalazak uključuje bispecifične antigen-vezujuće molekule (npr., bispecifična antitela) koja su sposobna za istovremeno vezivanje za humani CD3 i humani PSMA. Vezujući krak koji interaguje sa ćelijama koje eksprimiraju CD3 mogu imati slabo do bez detektabilnog vezivanja kao što je mereno u pogodnom in vitro testu vezivanja. Opseg u kome bispecifični antigen-vezujući molekul vezuje ćelije koje eksprimuju CD3 i/ili PSMA može se proceniti pomoću fluorescentno aktiviranog ćelijskog sortiranja (FACS), kao što je ilustrovano u Primeru 5.

[0169] Na primer, ovde su opisana antitela, fragmenti koji se vezuju za antigen i njihova bispecifična antitela koja specifično vezuju humane T-ćelijske linije koje eksprimiraju CD3, ali ne eksprimiraju PSMA

2

(npr. Jurkat), T-ćelije primata (npr. ćelije [PBMCs]), i/ili ćelije koje eksprimiraju PSMA. Ovo otkriće uključuje bispecifične molekule koji se vezuju za antigen koji vezuju bilo koju od gore navedenih T ćelija i T ćelijskih linija sa EC50vrednošću od oko 1,8X10<-8>(18 nM) do oko 2,1x10<-7>(210 nM), ili više (tj. slabije). afinitet), ili se EC50ne može detektovati, kao što je određeno korišćenjem FACS testa vezivanja kao što je navedeno u Primeru 5 ili suštinski sličnog testa. Antitela, fragmenti koji se vezuju za antigen i bispecifična antitela ovog otkrića vezuju CD3 sa EC50većim od oko 30 nM, veće od oko 40 nM, veće od oko 45 nM, veće od oko 50 nM, veće od oko 55 nM, veće od oko 60 nM, veće od oko 65 nM, veće od oko 70 nM, veće od oko 75 nM , najmanje 80 nM, veće od oko 90 nM, veće od oko 100 nM, veće od oko 110 nM, najmanje 120 nM, veće od oko 130 nM, veće od oko 140 nM, veće od oko 150 nM, najmanje 160 nM, veće od oko 170 nM, veće od oko 180 nM, veće od ab od 190 nM, veći od oko 200 nM, veći od oko 250 nM, veći od oko 300 nM, veći od oko 1 mM, veći od oko 2 mM, ili veći od oko 3 mM, ili nema detektabilnog afiniteta, mereno pomoću FACS vezivanje, npr., korišćenjem formata testa kao što je definisano u Primeru 5 ovde, ili suštinski sličan test.

[0170] Ovo otkriće takođe uključuje antitela, fragmente koji se vezuju za antigen i njihova bispecifična antitela koja se vezuju za ćelije i ćelijske linije koje eksprimiraju PSMA, sa EC50 vrednošću manjom ili jednakom 5,6 nM (5,6x10<-9>), kako je određeno korišćenjem FACS test vezivanja kao što je navedeno u Primeru 5 ili suštinski sličan test.

[0171] Ovaj pronalazak uključuje antitela, fragmente koji se vezuju za antigen i njihova bispecifična antitela koja vezuju humani CD3 sa slabim (tj. niskim) ili čak bez detektabilnog afiniteta. Prema određenim aspektima, ovo otkriće uključuje antitela i fragmente antitela koji se vezuju za antigen koji vezuju humani CD3 (npr., na 37°C) sa KDvećim od oko 11 nM mereno površinskom plazmonskom rezonancom, npr., korišćenjem testa format kao što je definisano u Primeru 6 ovde. Antitela ili fragmenti koji se vezuju za antigen mogu da vežu CD3 sa KDvećim od oko 15 nM, veći od oko 20 nM, veći od oko 25 nM, veći od oko 30 nM, veći od oko 35 nM, veći od oko 40 nM, veće od oko 45 nM, veće od oko 50 nM, veće od oko 55 nM, veće od oko 60 nM, veće od oko 65 nM, veće od oko 70 nM, veće od oko 75 nM, najmanje 80 nM, veće od oko 90 nM, veće od oko 100 nM, veće od oko 110 nM, najmanje 120 nM, veće od oko 130 nM, veće od oko 140 nM, veće od oko 150 nM, najmanje 160 nM, veće od oko 170 nM, veće od oko 180 nM, veće od oko 190 nM, veće od oko 200 nM, veće od oko 250 nM, veće od oko 300 nM, veće od oko 1 mM, veće od oko 2 mM, ili veće od oko 3 mM, ili ne afinitet koji se može detektovati, meren površinskom plazmonskom rezonancom, npr., korišćenjem formata analize kao što je definisano u Primeru 6 ovde (npr., mAb-ca pture ili format za hvatanje antigena), ili suštinski sličan test.

[0172] Ovo otkriće uključuje antitela, fragmente koji se vezuju za antigen i njihova bispecifična antitela koja vezuju CD3 majmuna (tj. cinomolgus) sa slabim (tj. niskim) ili čak bez detektabilnog afiniteta. Prema određenim aspektima, ovo otkriće uključuje antitela, fragmente koji se vezuju za antigen i njihova bispecifična antitela koja vezuju humani CD3 (npr. na 37°C) sa KDvećim od oko 10 nM mereno površinskom plazmonskom rezonancom, npr. koristeći format analize kao što je definisano u Primeru 6 ovde. U određenim aspektima, antitela ili fragmenti koji se vezuju za antigen vezuju CD3 sa KDvećim od oko 15 nM, veći od oko 20 nM, veći od oko 25 nM, veći od oko 30 nM, veći od oko 35 nM, veći od oko 40 nM, veće od oko 45 nM, veće od oko 50 nM, veće od oko 55 nM, veće od oko 60 nM, veće od oko 65 nM, veće od oko 70 nM, veće od oko 75 nM, najmanje 80 nM, veće od oko 90 nM, veće od oko 100 nM, veće od oko 110 nM, najmanje 120 nM, veće od oko 130 nM, veće od oko 140 nM, veće od oko 150 nM, najmanje 160 nM, veće od oko 170 nM, veće od oko 180 nM, veće od oko 190 nM, veće od oko 200 nM, veće od oko 250 nM, veće od oko 300 nM, veće od oko 1 mM, veće od oko 2 mM ili veće od oko 3 mM ili bez detektabilnog afiniteta, mereno površinskom plazmonskom rezonancom, npr. korišćenjem formata analize kao što je ovde definisano u Primeru 6 (npr., format hvatanja mAt ili hvatanja antigena), ili suštinski sličan test.

[0173] Ovo otkriće uključuje antitela, fragmente koji se vezuju za antigen i njihova bispecifična antitela koja vezuju humani CD3 i indukuju aktivaciju T ćelija. Na primer, ovo otkriće uključuje anti-CD3 antitela koja indukuju aktivaciju humanih T ćelija sa vrednošću EC50manjom od oko 113 pM, kao što je mereno in vitro testom aktivacije T ćelija, na primer, korišćenjem formata testa kao što je definisano u Primeru 7 ovde [npr. procena procenta aktiviranih (CD69+) ćelija od ukupnih T ćelija (CD2+) u prisustvu anti-CD3 antitela], ili suštinski sličan test koji procenjuje njihovo aktivirano stanje T ćelija. U određenim aspektima, antitela ili fragmenti koji se vezuju za antigen indukuju aktivaciju humanih T ćelija [npr. procenat aktiviranih (CD69+) T ćelija] sa vrednošću EC50manjom od oko 100 pM, manjom od oko 50 pM, manjom od oko 20 pM, manje od oko 19 pM, manje od oko 18 pM, manje od oko 17 pM, manje od oko 16 pM, manje od oko 15 pM, manje od oko 14 pM, manje od oko 13 pM, manje od oko 12 pM, manje od oko 11 pM, manje od oko 10 pM, manje od oko 9 pM, manje od oko 8 pM, manje od oko 7 pM, manje od oko 6 pM, manje od oko 5 pM, manje od oko 4 pM, manje od oko 3 pM, manje od oko 2 pM, ili manje od oko 1 pM, kao što je mereno in vitro testom aktivacije T ćelija, npr. upotrebom formata testa kao što je ovde definisano u Primeru 7, ili suštinski sličan test. Anti-CD3 antitela koja imaju slabo ili nikakvo detektabilno vezivanje za CD3 imaju sposobnost da indukuju aktivaciju T ćelija sa visokom potencijom (tj. pM opseg), uprkos tome što imaju slab ili bez detektabilnog afiniteta vezivanja za CD3, kao što je ovde prikazano u Primeru 7.

[0174] Ovaj pronalazak takođe uključuje antitela, fragmente koji se vezuju za antigen i bispecifična antitela koja vezuju humani CD3 i indukuju ubijanje ćelija koje eksprimiraju tumorski antigen posredovano T ćelijama. Na primer, ovaj pronalazak uključuje anti-CD3 antitela koja indukuju ubijanje tumorskih ćelija posredovano T ćelijama sa EC50manjim od oko 1,3 nM, kao što je mereno u in vitro testu ubijanja tumorskih ćelija posredovanim T ćelijama, npr. format testa kao što je definisan u Primeru 7 ovde (npr., procena obima ubijanja ćelija koje eksprimiraju PSMA od strane humanih PBMC u prisustvu anti-CD3 antitela), ili suštinski sličan test. U određenim realizacijama, antitela ili fragmenti koji se vezuju za antigen iz ovog pronalaska indukuju ubijanje tumorskih ćelija posredovano T ćelijama (npr. PBMC posredovano ubijanje C4-2, 22Rv1 i TRAMPC2_PSMA ćelija) sa EC50vrednošću manjom od oko 1 nM manje od oko 400 pM, manje od oko 250 pM, manje od oko 100 pM, manje od oko 50 pM, manje od oko 40 pM, manje od oko 30 pM, manje od oko 20 pM, manje od oko 10 pM, manje od oko 9 pM, manje od oko 8 pM, manje od oko 7 pM, manje od oko 6 pM, manje od oko 5 pM, manje od oko 4 pM, manje od oko 3 pM, manje od oko 2 pM ili manje od oko 1 pM, kao što je mereno in vitro testom ubijanja tumorskih ćelija posredovanim T ćelijama, npr., korišćenjem formata testa kao što je definisano u Primeru 7 ovde, ili suštinski sličnim testom. Ovo otkriće takođe uključuje antitela, fragmente koji se vezuju za antigen i bispecifična antitela koja vezuju CD3 čoveka i/ili majmuna (tj. cinomolgus) sa slabim (tj. niskim) ili čak bez detektabilnog afiniteta (tj. ne vezuju se ili ne pokazuju afinitet koji se može detektovati) i indukuju ubijanje ćelija koje eksprimiraju tumorski antigen posredovano T ćelijama.

[0175] Ovo otkriće takođe uključuje antitela, fragmente koji se vezuju za antigen i bispecifična antitela koja vezuju CD3 sa disocijativnim poluživotom (t<1>/2) manjim od oko 10 minuta mereno površinskom plazmonskom rezonancom na 25°C ili 37°C, npr., koristeći format testa kao što je definisan u Primeru 6 ovde, ili suštinski sličan test. U određenim aspektima, antitela ili fragmenti koji se vezuju za antigen vezuju CD3 sa t<1>/2manjim od oko 9 minuta, manje od oko 8 minuta, manje od oko 7 minuta, manje od oko 6 minuta, manje od oko 5 minuta , manje od oko 4 minuta, manje od oko 3 minuta, manje od oko 2 minuta, manje od oko 1,9 minuta ili manje od oko 1,8 minuta, ili pokazuju veoma slabo ili nikakvo vezivanje mereno površinskom plazmonskom rezonancom na 25°C ili 37°C, npr., korišćenjem formata eseja kao što je definisano u Primeru 6 ovde (npr. format za hvatanje mAb ili za hvatanje antigena), ili suštinski sličan test.

[0176] Anti-CD3/anti-PSMA bispecifični antigen-vezujući molekuli mogu dodatno da ispolje jednu ili više karakteristika izabranih iz grupe koju čine: (a) indukovanje proliferacije PBMC in vitro; (b)

4

aktiviranje T-ćelija putem indukcije oslobađanja IFN-gama i regulacije CD25 u punoj krvi čoveka; i (c) izazivanje citotoksičnosti posredovane T-ćelijama na ćelijskim linijama otpornim na PSMA.

[0177] Ovo otkriće uključuje anti-CD3/anti-PSMA bispecifične molekule za vezivanje antigena koji su sposobni da iscrpe ćelije koje eksprimiraju tumorski antigen kod subjekta (videti, npr., Primer 8). Na primer, u skladu sa određenim aspektima, obezbeđeni su anti-CD3/anti-PSMA bispecifični molekuli koji vezuju antigen, pri čemu pojedinačna primena 1 µg, ili 10 µg, ili 100 µg bispecifičnog molekula koji vezuje antigen subjektu (npr., u dozi od oko 0,1 mg/kg, oko 0,08 mg/kg, oko 0,06 mg/kg oko 0,04 mg/kg, oko 0,04 mg/kg, oko 0,02 mg/kg, oko 0,01 mg/kg, ili manje) izaziva smanjenje broja ćelija koje eksprimiraju PSMA kod subjekta (npr. rast tumora kod subjekta je potisnut ili inhibiran) ispod nivoa koji se mogu detektovati. U određenim aspektima, jednokratna primena anti-CD3/anti-PSMA bispecifičnog antigen-vezujućeg molekula u dozi od oko 0,4 mg/kg izaziva smanjenje rasta tumora kod subjekta ispod nivoa koji se mogu detektovati do oko 7. dana, oko 6. Dana, oko 5. dana, oko 4. dana, oko 3. dana, oko 2. dana ili oko 1. dana nakon primene bispecifičnog molekula koji vezuje antigen subjektu. Prema određenim aspektima, jednokratno davanje anti-CD3/anti-PSMA bispecifičnog molekula koji vezuje antigen, u dozi od najmanje oko 0,01 mg/kg, uzrokuje da broj tumorskih ćelija koje eksprimiraju PSMA ostane ispod nivoa koji se može detektovati sve dok najmanje oko 7 dana, 8 dana, 9 dana, 10 dana, 11 dana, 12 dana, 13 dana, 14 dana, 15 dana, 16 dana, 17 dana ili više, nakon primene. Kako se ovde koristi, izraz "ispod detektabilnih nivoa" znači da se nijedna tumorska ćelija ne može direktno ili indirektno detektovati kako raste subkutano kod subjekta upotrebom standardnih metoda merenja sa kaliperom, npr., kao što je ovde navedeno u Primeru 8.

[0178] Ovaj pronalazak takođe uključuje anti-CD3/anti-PSMA bispecifične molekule za vezivanje antigena koji pokazuju jednu ili više karakteristika izabranih iz grupe koju čine: (a) inhibiranje rasta tumora kod imunokompromitovanih miševa koji nose ksenotransplantate humanog kancera prostate; (b) inhibiranje rasta tumora kod imunokompetentnih miševa koji nose ksenotransplantate humanog kancera prostate; (c) suzbijanje rasta tumora ustanovljenih tumora kod imunokompromitovanih miševa koji nose ksenotransplantate humanog kancera prostate; i (d) smanjenje rasta tumora ustanovljenih tumora kod imunokompetentnih miševa koji nose ksenotransplantate humanog kancera prostate (videti, npr. Primer 8). Ovde su takođe opisani anti-CD3/anti-PSMA bispecifični molekuli koji se vezuju za antigen koji pokazuju jednu ili više karakteristika izabranih iz grupe koju čine: (a) indukuju prolazna povećanja cirkulišućih citokina u zavisnosti od doze, (b) izazivaju prolazna povećanja u cirkulišućim T ćelijama, i (c) ne iscrpljuju efektorske T ćelije (npr. CD4+ T ćelije, CD8+ T ćelije i regulatorne T ćelije, tj. Tregs).

Mapiranje epitopa i srodne tehnologije

[0179] Epitop na CD3 i/ili PSMA za koji se vezuju molekuli koji se vezuju za antigen iz ovog pronalaska može se sastojati od jedne neprekidne sekvence od 3 ili više (npr.3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ili više) aminokiselina CD3 ili PSMA proteina. Alternativno, epitop se može sastojati od više nesusednih amino kiselina (ili sekvenci amino kiselina) CD3 ili PSMA. Antitela pronalaska mogu da stupaju u interakciju sa amino kiselinama sadržanim u jednom CD3 lancu (npr., CD3-epsilon, CD3-delta ili CD3-gama), ili mogu da interaguju sa amino kiselinama na dva ili više različitih CD3 lanaca. Termin "epitop", kako se ovde koristi, odnosi se na antigensku determinantu koja stupa u interakciju sa specifičnim mestom vezivanja antigena u promenljivom regionu molekula antitela poznatog kao paratop. Jedan antigen može imati više od jednog epitopa. Dakle, različita antitela se mogu vezati za različite oblasti na antigenu i mogu imati različite biološke efekte. Epitopi mogu biti ili konformacioni ili linearni. Konformacioni epitop se proizvodi od prostorno postavljenih aminokiselina iz različitih segmenata linearnog polipeptidnog lanca. Linearni epitop je onaj koji proizvode susedni aminokiselinski ostaci u polipeptidnom lancu. U određenim okolnostima, epitop može da sadrži delove saharida, fosforil grupe ili sulfonil grupe na antigenu.

[0180] Različiti postupci koji su poznati osobama koje su uobičajeno verzirane u stanje tehnike mogu se koristiti za određivanje da li domen antitela koji veže antigen "interaguje sa jednom ili više aminokiselina" unutar polipeptida ili proteina. Primeri postupaka uključuju, npr., rutinski test ukrštenog-blokiranja kao što je onaj koji se opisuje u Antibodies, Harlow and Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb., NY), mutaciona analiza skeniranja alanina, analiza peptidnih blotova (Reineke, 2004, Methods Mol Biol 248:443-463), i analiza cepanja peptida. Dodatno, postupci kao što je ekscizija epitopa, ekstrakcija epitopa i hemijska modifikacija antigena se može koristiti (Tomer, 2000, Protein Science 9:487-496). Drugi postupak se nakon toga može koristiti da bi se identifikovale aminokiseline u polipeptidu sa kojim domen za vezivanje antigena antitela interaguje je izmena vodonik/deuterijum koja je detektovana masenom spektrometrijom. U opštim terminima, postupak izmene vodonik/deuterijum uključuje obeležavanje deuterijumom proteina od interesa, nakon čega sledi vezivanje antitela za protein obeležen deuterijumom. Sledeće, kompleks protein/antitelo je prenet u vodu da bi se omogućilo dešavanje izmene vodonik-deuterijum na svim ostacima osim za ostatke koji su zaštićeni sa antitelom (koje ostaje obeleženo deuterijumom). Nakon disocijacije antitela, ciljni protein je izložen cepanju proteazom i maseno spektrometrijskoj analizi, čime se pronalaze ostaci obeleženi deuterijumom koji odgovaraju specifičnim aminokiselinama sa kojima antitelo interaguje. Videti, npr., Ehring (1999) Analytical Biochemistry 267(2):252-259; Engen i Smith (2001) Anal. Chem.73:256A-265A. Kristalografija X-zraka kompleksa antigen/antitelo može takođe biti korišćena u svrhe mapiranja epitopa.

[0181] Predmetni pronalazak dalje uključuje anti-PSMA antitela koji se vežu za isti epitop kao bilo koji od ovde opisanih specifičnih primera antitela (npr. antitela koja sadrže bilo koju od aminokiselinskih sekvenci kao što je predstavljeno ovde u Tabeli 1). Slično tome, Ovo izlaganje takođe uključuje anti-PSMA antitela koji su u kompeticiji za za vezivanje za PSMA sa bilo kojim od ovde opisanih specifičnih primera antitela (npr. antitela koja sadrže bilo koju od aminokiselinskih sekvenci kao što je ovde predstavljeno u Tabeli 1).

[0182] Predmetni pronalazak takođe uključuje bispecifične antigen-vezujuće molekule koji sadrže prvi antigen-vezujući domen koji specifično veže humani CD3 i/ili CD3 cinomolgusa sa niskim ili afinitetom vezivanja koji se ne može detektovati, i drugi domen za vezivanje antigena koji specifično veže humani PSMA, pri čemu prvi antigen-vezujući domen se veže za isti epitop na CD3 kao bilo koji od ovde opisani primera CD3-specifičnih antigen-vezujućih domena, i/ili pri čemu drugi antigen-vezujući domen se veže za isti epitope na PSMA kao bilo koji od specifičnih primera ovde opisanih PSMA-specifičnih antigen-vezujućih domena.

[0183] Slično tome, Ovo izlaganje takođe uključuje bispecifilčne antigen-vezujuće molekule koji sadrže prvi antigen-vezujući domen koji specifično veže humani CD3, i drugi antigen-vezujući domen koji specifično veže humani PSMA, pri ćemu prvi antigen-vezujući domen je u kompeticiji za vezivanje za CD3 sa bilo kojim od takvih specifičnih primera CD3-specifičnih antigen-vezujućih domena koji su opisani ovde, i/ili gde drugi antigen-vezujući domen je u kompeticiji za vezivanje za PSMA sa bilo kojim od specifičnih primera ovde opisanih PSMA-specifičnih antigen-vezujućih domena.

[0184] Može se lako odrediti da li se određeni antigen-vezujući molekul (npr., antitelo) ili njegov antigen-vezujući domen veže za isti epitop kao, ili je u kompeticiji za vezivanje sa, referentnim antigenvezujućim molekulom upotrebom postupaka koji su dobro poznati u oblasti tehnike. Na primer, da bi se odredilo da li se ispitivano antitelo veže za isti epitope na PSMA (ili CD3) ako referentni bispecifični antigen-vezujući molekul, referentnom bispecifičnom molekulu je prvo dozvoljeno da se veže za PSMA protein (ili CD3 protein). Sledeće, procenjena je sposobnost ispitivanog antitela da se veže za PSMA (ili CD3) molekul. Ukoliko je ispitano antitelo sposobno da se veže za PSMA (ili CD3) nakon zasićenja vezivanja sa referentnim bispecifičnim antigenvezujućim molekulom, može se zaključiti da se ispitivano antitelo veže za različiti epitop PSMA (ili CD3) od referentnog bispecifičnog antigenvezujućeg molekula. Sa druge strane, ukoliko ispitivano antitelo nije sposobno da se veže za PSMA (ili CD3) molekul nakon zasićenja vezivanja sa referentnim bispecifičnim antigen-vezujućim molekulom, onda se ispitivano antitelo može vezati za isti epitop PSMA (ili CD3) kao epitope koji je vezan sa refentnim bispecifičnim antigenvezujućim molekulom. Dodatni rutinski eksperimenti (npr., peptidne mutacije i analize vezivanja) se nakon toga mogu izvesti da se potvrdi da li uočeni nedostatak vezivanja ispitivanog antitela je zapravo zbog vezivanja za isti epitop kao referentni bispecifični antigen-vezujući molekul ili ukoliko sterno blokiranje (ili drugi fenomen) je odgovoran za nedostatak uočenog vezivanja. Eksperimenti ove vrste se mogu izvesti upotrebom ELISA, RIA, Biacore, protočne citometrije ili bilo kojim drugim kvantitativnim ili kvalitativnim testom vezivanja antitela koji je dostupan u oblasti tehnike. Dva antigen-vezujuća proteina vežu se za isti (ili preklapajući) epitop ukoliko, npr., 1-, 5-, 10, 20- ili 100-puta višak jednog proteina koji veže antigen inhibira vezivanje drugog za bar 50% ali poželjno 75%, 90% ili čak 99% kao što je mereno u kompetitivnom testu vezivanja (videti, npr., Junghans et al., Cancer Res.1990:50:1495-1502). Alternativno, smatra se da se dva antigen-vezujuća proteina vežu za isti epitop ukoliko u suštini sve aminokiselinske mutacije u antigenu koje smanjuju ili eliminišu vezivanje jednog antigen-vezujućeg proteina smanjuje ili eliminiše vezivanje drugog. Smatra se da dva antigen-vezujuća proteina imaju "epitope koji se preklapaju" ukoliko samo podset aminokiselinskih mutacija koje smanjuju ili eliminišu vezivanje jednog antigen-vezujućeg proteina smanjuju ili eliminišu vezivanje drugog.

[0185] Da bi se odredilo da li antitelo ili njegov domen za vezivanje antigena je u kompeticiji za vezivanje sa referentnim antigen-vezujućim molekulom, gore opisana metodologija vezivanja je sprovedena u dve orijentacije: U prvoj orijentaciji, referentni antigen-vezujućem molekulu je dozvoljeno da se veže za PSMA protein (ili CD3 protein) pod uslovima zasićena koje prati procena vezivanja ispitivanog antitela za PSMA (ili CD3) molekula. U drugoj orijentaciji, ispitivanom antitelu je dozvoljeno da se veže za PSMA (ili CD3) molekul pod uslovima zasićenja koje prati procena vezivanja referentnog antigen-vezujućeg molekula za PSMA (ili CD3) molekula. Ukoliko, u obe orijentacije, samo prvi (zasićujući) antigen-vezujući molekul je sposoban da se veže za PSMA (ili CD3) molekul, onda se zaključuje da se ispitivano antitelo i referentni antigen-vezujući molekul je u kompeticiji za vezivanje sa PSMA (ili CD3). Kao što će to biti jasno osobi koja je uobičajeno verzirana u stanje tehnike, antitelo koje je u kompeticiji za vezivanje sa referentnim antigen-vezujućim molekulom ne moraju se nužno vezati za isti epitop kao referentno antitelo, ali mogu sterno blokirati vezivanje referentnog antitela vezivanjem preklapajućeg ili susednog epitopa.

Dobijanje domena za vezivanje antigena i konstrukcija bispecifičnih molekula

[0186] Antigen-vezujući domeni koji su specifični za određene antigene mogu se pripremiti bilo kojom tehnologijom za generisanje antitela koja je poznata u oblasti tehnike. Jednom kada se dobiju, dva različita antigen-vezujuća domena, specifična za dva različita antigena (npr., CD3 i PSMA), mogu se na odgovarajući način preurediti jedan u odnosu na drugi da bi se proizveo bispecifični antigen-vezujući molekul iz predmetnog pronalaska upotrebom rutinskih postupaka. (Diskusija primera bispecifičnih formata antitela koji se mogu koristiti za konstrukciju bispecifičnih antigen-vezujućih molekula iz predmetnog pronalaska je ovde obezbeđena na drugom mestu). U određenim izvođenjima, jedna ili više od individualnih komponenti (npr., teški i laki lanci) multispecifičnih antigen-vezujućih molekula iz pronalaska su izvedeni iz himernih, humanizovanih ili punih humanih antitela. Postupci za dobijanje takvih antitela su dobro poznati iz oblasti tehnike. Na primer, jedan ili više od teških i/ili lakih lanaca bispecifičnih antigen-vezujućih molekula iz predmetnog pronalaska mogu se dobiti upotrebom VELOCIMMUNE™ tehnologije. Upotreba VELOCIMMUNE ™ tehnologije (ili bilo koju drugu tehnologiju za generisanje humanih antitela), visoko afinitetna himerna antitela na određeni antigen (npr., CD3 ili PSMA) su početno izolovana koji imaju humani varijabilni region i mišji konstantni region. Antitela su karakterisana i odabrana za poželjne karakteristike, uključujući afinitet, selektivnost, epitop, itd. Konstantni regioni miša su zamenjeni sa željenim humanim konstantnim regionom da se generišu potpuno humane teške i/ili lake lance koji mogu biti uključeni u bispecifične antigen-vezujuće molekule iz predmetnog pronalaska.

[0187] Genetički modifikovane životinje se mogu koristiti za dobijanje humanih bispecifičnih antigenvezujućih molekula. Na primer, može se koristiti genetički modifikovani miš koji nije sposoban za rearanžman i ekspresiju endogene varijabilne sekvence lakog lanca imunoglobulina miša, pri čemu miš eksprimira samo jedan od dva varijabilna domena humanog lakog lanca kodiranog sa sekvecama humanog imunoglobulina operativno u vezi sa mišjim kapa konstantnim genom na endogenom mišjem kapa lokusu. Takvi genetički modifikovani miševi se mogu koristiti da bi se proizveli potpuno humani bispecifični antigenvezujući molekuli koji sadrže dva različita teška lanca koja se povezuju sa identičnim lakim lancem koji sadrži varijabilni domen koji je dobijen iz jednog od dva različita segmenta gena varijabilnog regiona humanog lakog lanca. (Videti, npr., US 2011/0195454 za detaljnu diskusiju takvih genski modifikovanih miševa i njihovu upotrebu dа bi se proizveli bispecifični antigen-vezujući molekuli).

Bioekvivalenti

[0188] Ovde su prikazani antigen-vezujući molekuli koji imaju aminokiselinske sekvence koje se razlikuju od onih iz ovde prikazanih primera molekula ali koji zadržavaju sposobnost da se vežu za CD3 i/ili PSMA. Takve varijante molekula mogu sadržati jednu ili više adicija, delecija, ili supstitucija aminokiselina kada se uporede sa matičnom sekvencom, ali ispoljavaju biološku aktivnost koja je u suštini ekvivalentna sa onom koja opisuje bispecifične antigen-vezujuće molekule.

[0189] Ovo izlaganje uključuje antigen-vezujuće molekule koji su bioekvivalenti sa bilo kojim od ovde predstavljenih primera antigen-vezujućih molekula. Dva antigen-vezujuća proteina, ili antitela, su smatrana bioekvivalentima ukoliko su, na primer, oni farmaceutski ekvivalenti ili farmaceutske alternative čija brzina i stepen apsorpcije ne pokazuju značajnu razliku kada se primenjuju u istoj molarnoj dozi pod sličnim eksperimentalnim uslovima, ili u pojedinačnim dozama ili kao višestruka doza. Neki antigen-vezujući proteini će biti smatrani ekvivalentima ili farmaceutskim alternativama ukoliko su ekvivalentni u obimu njihove apsorpcije, ali ne u njihovoj brzini apsorpcije, ipak se mogu smatrati bioekvivalentima zbog toga što takve razlike u brzini apsorpcije su i odražavaju se u obeležavanju, nisu esencijalne na postizanje efikasnih koncentracija leka u telu po, npr., hroničnoj upotrebi, i smatraju se medicinski beznačajnim za određeni lek koji se proučava.

[0190] Dva antigen-vezujuća proteina su bioekvivalenti ukoliko ne postoje klinički značajne razlike u njihovoj bezbednosti, čistoći, i potenciji.

[0191] Dva antigen-vezujuća proteina su bioekvivalenti ukoliko se pacijent može prebaciti jednom ili više puta između referentnog proizvoda i biološkog proizvoda bez očekivanog povećanja u riziku od neželjenih efekata, uključujući klinički značajnu promenu u imunogenosti, ili smanjenu efikasnost, u poređenju sa nastavkom terapije bez takve promene.

[0192] Dva antigen-vezujuća proteina su bioekvivalenti ukoliko oba imaju dejstvo preko zajedničkog mehanizma ili mehanzama dejstva za stanje ili stanja upotrebe, u meri u kojoj su takvi mehanizmi poznati.

[0193] Bioekvivalencija se može dokazati sa in vivo i in vitro postupcima. Merenja bioekvivalencije uključuju, npr., (a) in vivo ispitivanje kod humanih bića ili drugih sisara, gde je koncentracija antitela ili njegovih metabolita merena u krvi, plazmi, serumu, ili drugoj biološkoj tečnosti kao funkcija vremena; (b) in vitro ispitivanje koje je u korelaciji sa i razumno predviđa podatke o biodostupnosti in vivo kod ljudi; (c) in vivo ispitivanje kod humanih bića ili drugih sisara gde odgovarajući akutni farmakološki efekat antitela (ili njegove mete) je izmeren kao funkcija vremena; i (d) u dobro kontrolisanom kliničkom ispitivanju koji uspostavlja bezbednost, efikasnost, ili bioraspoloživost ili bioekvivalencija antigen-vezujućeg proteina.

[0194] Bioekvivalentne varijante primera bispecifičnih antigen-vezujućih molekula koji su ovde predstavljeni mogu se konstruisati sa, na primer, pravljenjem različitih zamena ostataka ili sekvenci ili delecije terminalnih ili unutrašnjih ostataka ili sekvenci koje nisu potrebne za biološku aktivnost. Na primer, ostaci cisteina koji nisu esencijalni za biološku aktivnost mogu biti uklonjeni ili zamenjeni sa drugim aminokiselinama da bi se sprečilo obrazovanje nepotrebnih ili netačnih intramolekulskih disulfidnih mostova pri renaturaciji. U drugim kontekstima, bioekvivalenti antigen-vezujući proteini mogu uključiti varijante primera bispecifičnih antigen-vezujućih molekula koji su ovde predstavljeni koji sadrže aminokiselinske promene koje modifikuju osobine glikozilacije molekula, npr., mutacije koje eliminišu ili uklanjaju glikozilaciju.

Selektivnost prema vrsti i unakrsna reaktivnost prema vrsti

[0195] Prema određenim aspektima iz prikaza, obezbeđeni su antigen-vezujući molekuli koji se vežu za humani CD3 ali ne za CD3 iz drugih vrsta. Takođe su obezbeđeni antigen-vezujući molekuli koji se vežu za humani PSMA ali ne za PSMA iz drugih vrsta. Ovo izlaganje takođe uključuje antigen-vezujuće molekule koji se vežu za humani CD3 i za CD3 iz jedne ili više nehumanih vrsta; i/ili antigen-vezujući molekuli koji se vežu za humani PSMA i za PSMA iz jedne ili više nehumanih vrsta.

[0196] Prema određenim primerima aspekata iz prikaza, obezbeđeni su antigen-vezujući molekuli koji se vezuju za humani CD3 i/ili humani PSMA i mogu se vezati ili ne vežu, kao što slučaj može biti, za jedan ili više od mišjeg, pacovskog, zamorca, hrčak, gerbila, svinje, mačke, psa, zeca, koze, ovce, krave, konja, kamile, cinomolgusa, marmoseta, rezus ili šimpanza CD3 i/ili PSMA. Na primer, bispecifični antigen-vezujući molekuli su opisani koji sadrže prvi antigen-vezujući domen koji veže humani CD3 i CD3 cinomolgusa, i drugi antigen-vezujući domen koji specifično veže humani PSMA.

Imunokonjugati

[0197] Predmetni pronalazak obuhvata antigen-vezujuće molekule koji su konjugovani za terapeutski ostatak ("imunokonjugat"), kao što je citotoksin, hemoterapetuski lek, imunosupresant ili radioizotop. Citotoksični agensi uključuju bilo koji agens koji je štetan za ćelije. Primeri pogodnih citotoksičnih agenasa i hemoterapeutskih agenasa za obrazovanje imunokonjugata su poznati u oblasti tehnike, (videti na primer, WO 05/103081).

Terapeutska formulacija i davanje

[0198] Predmetni pronalazak obezbeđuje farmaceutske kompozicije koje sadrže antigen-vezujuće molekule iz predmetnog pronalaska. Farmaceutske kompozicije iz pronalaska su formulisane sa pogodnim nosačima, ekscipijensima, i drugim agensima koji obezbeđuju unapređeni transfer, isporuku i podnošljivost. Mnoštvo odgovarajućih formulacija se može naći u formularu poznatom svim farmaceutskim hemičarima: Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA. Ove formulacije uključuju, na primer, praškove, paste, masti, želee, voskove, ulja, lipide, vezikule koje sadrže lipide (katjonske ili anjonske) (kao što su LIPOFECTIN™, Life Technologies, Carlsbad, CA), konjugati DNK, anhidrovane apsorpcione pase, emulzije ulja-u-vodi i vode-u-ulju, emulzije karbovaksa (polietilen glikoli različitih molekulskih masa), polu-čvrsti gelovi, i polu-čvrste smeše koje sadrže karbovaks. See also Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA (1998) J Pharm Sci Technol 52:238-311.

[0199] Doza antigen-vezujućeg molekula koja se daje pacijentu može zavisiti od, na primer, starost i veličine pacijenta, ciljne bolesti, stanja, i načina davanja. Poželjna doza je obično izračunata u skladu sa telesnom masom ili površine tela. Kada bispecifični antigen-vezujući molekul iz predmetnog pronalaska je korišćen za terapeutske svrhe u odraslom pacijentu, može biti prednost intravenozna primena bispecifičnog antigen-vezujućeg molekula iz predmetnog pronalaska normalno u pojedinačnog dozi od oko 0.01 do oko 20 mg/kg telesne mase, poželjnije oko 0.02 do oko 7, oko 0.03 do oko 5, ili oko 0.05 do oko 3 mg/kg telesne mase. U zavisnosti od ozbiljnosti stanja, učestalost i trajanje tretmana može biti prilagođeno. Efikasne doze i raspored davanja bispecifičnog antigenvezujućeg molekula se može odrediti empirijski; na primer, napredovanje pacijenta se može pratiti periodičnim procenama, i doza se može u skladu sa tim podesiti. Osim toga, skaliranje doza između vrsta se može izvesti upotrebom dobro poznatih postupaka iz oblasti tehnike (npr., Mordenti et al., 1991, Pharmaceut. Res.8:1351).

[0200] Različiti sistemi za isporuku su poznati i mogu se koristiti za primenu farmaceutske kompozicije iz pronalaska, npr., inkapsuliranje u lipozomima, mikročestice, mikrokapsule, rekombinantne ćelije sposobne za eksprimovanje mutiranih virusa, endocitoza posredovana receptorom (videti, npr., Wu et al., 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432). Postupci za uvođenje uključuju, npr., intradermalno, intramuskularno, intraperitonealno, intravenozno, subkutanozno, intranazalno, epiduralno, i oralni načini davanja. Kompozicija se može davati bilo kojim pogodnim načinom davanja, na primer infuzijom ili bolusnom injekcijom, apsorpcijom kroz epitelne ili mukokutanozne ovojnice (npr., oralna mukoza, rektalna i intestinalna mukoza, itd.) i mogu se davati zajedno sa drugim biološki aktivnim agensima. Primena može biti sistemska ili lokalna.

[0201] Farmaceutska kompozicija ovog pronalaska može se davati subkutano ili intravenozno sa standardnom iglom i špricem. Pored toga, u pogledu potkožnog davanja, uređaj za isporuku olovke lako ima primenu u davanju farmaceutske kompozicije ovog pronalaska. Takav uređaj za isporuku olovke može biti za višekratnu ili jednokratnu upotrebu. Uređaj za isporuku olovke za višekratnu upotrebu generalno koristi zamenljivi kertridž koji sadrži farmaceutsku kompoziciju. Kada je cela farmaceutska kompozicija unutar kertridža primenjena i kertridž je prazan, prazan kertridž se može lako odbaciti i zameniti novim kertridžom koji sadrži farmaceutsku kompoziciju. Uređaj za isporuku olovke se tada može ponovo koristiti. U uređaju za isporuku olovke za jednokratnu upotrebu ne postoji zamenljivi kertridž. Umesto toga, uređaj za isporuku olovke za jednokratnu upotrebu dolazi prethodno napunjen farmaceutskom kompozicijom koja se nalazi u rezervoaru unutar uređaja. Kada se rezervoar isprazni od farmaceutskog sastava, ceo uređaj se odbacuje.

[0202] Brojne olovke za višekratnu upotrebu i autoinjektorske sprave za upotrebu imaju primene u subkutanoznoj primeni farmaceutske kompozicije iz predmetnog pronalaska. Primeri uključuju, npr., AUTOPEN™ (Owen Mumford, Inc., Woodstock, UK), DlSETRONlC™ olovku (Disetronic Medical Systems, Bergdorf, Switzerland), HUMALOG MIX 75/25™ olovku, HUMALOG™ olovku, HUMALIN 70/30™ olovku (Eli Lilly and Co., Indianapolis, IN), NOVOPEN™ I, II i III (Novo Nordisk, Copenhagen, Denmark), NOVOPEN JUNIOR™ (Novo Nordisk, Copenhagen, Denmark), BD™ olovku (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), OPTIPEN™, OPTIPEN PRO™, OPTIPEN STARLET™, i OPTICLIK™ (sanofiaventis, Frankfurt, Germany), navođenje samo nekoliko. Primeri olovaka za jednokratnu upotrebu sprava za isporuku koji imaju primene u subkutanoznoj isporuci farmaceutske kompozicije iz predmetnog pronalaska uključuju, npr., SOLOSTAR™ olovku (sanofi-aventis), FLEXPEN™ (Novo Nordisk), i KWIKPEN™ (Eli Lilly), SURECLICK™ Autoinjektor (Amgen, ThousandOaks, CA), PENLET™ (Haselmeier, Stuttgart, Germany), EPIPEN (Dey, L.P.), i HUMIRA™ olovku (Abbott Labs, Abbott Park IL), navođenje samo nekoliko.

[0203] U određenim situacijama, farmaceutska kompozicija se može isporučiti u sistemu kontrolisanog oslobađanja. Može se koristiti pumpa (videti Langer, supra; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng.

4

14:201). Mogu se koristiti polimerni materijali; videti, Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), 1974, CRC Pres., Boca Raton, Florida. Sistem sa kontrolisanim oslobađanjem se može postaviti u blizini mete kompozicije, pri čemu se zahteva samo deo sistemske doze (videti, npr., Goodson, 1984, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol.2, pp.115-138). Drugi sistemi sa kontrolisanim oslobađanjem su razmotreni u pregledu od strane Langer, 1990, Science 249:1527-1533.

[0204] Injektabilni preparati mogu uključiti dozne oblike za intravenozne, subkutanozne, intrakutanozne i intramuskularne injekcije, infuzije ukapavanjem, itd. Navedeni injektabilni preparati se mogu dobiti postupcima koji su poznati javnosti. Na primer, injektabilni preparati se mogu dobiti, npr., rastvaranjem, suspenzijom ili emulgovanjem gore opisanog antitela ili njegovih soli u sterilnom vodenom medijumu ili uljanom medijumu koji je uobičajeno korišćen za injekcije. Kao vodeni medij za injekcije, postoje, na primer, fiziološki slain rastvor, izotonični rastvor koji sadrži glukozu i dodatne pomoćne agense, itd., koji se mogu koristiti u kombinaciji sa odgovarajućim agensom za rastvaranje kao što je alkohol (npr., etanol), polialkohol (npr., propilen glikol, polietilen glikol), nejonski surfaktant [npr., polisorbat 80, HCO-50 (polioksietilen (50 mol) adukt hidrogenizovanog ricinusovog ulja)], itd. Kao uljani medijum, korišćeni su, npr., susamovo ulje, sojino ulje, itd., koji se mogu koristiti u kombinaciji sa sredstvom za rastvaranje kao što je benzil benzoat, benzil alkohol, itd. Na taj način dobijena injekcija je poželjno napunjena u odgovarajućoj ampuli.

[0205] Kao prednost, gore opisane farmaceutske kompozicije za oralnu i parenteralnu upotrebu su dobijene u doznim oblicima u jediničnoj dozi koja je prilagođena da se uklopi sa dozom aktivnih sastojaka. Takvi dozni oblici u jediničnoj dozi uključuju, na primer, tablete, pilule, kapsule, injekcije (ampule), supozitorije, itd. Količina prethodno navedenog antitela koja se nalazi je generalno oko 5 do oko 500 mg po doznom obliku u jediničnoj dozi; naročito u obliku injekcije, je poželjo da se prethodno pomenuto antitelo nalazi u oko 5 do oko 100 mg i u oko 10 do oko 250 mg za druge dozne oblike. Terapijske upotrebe molekula koji vezuju antigen

[0206] Ovo izlaganje uključuje postupke koji obuhvataju davanje subjektu kome je potrebno terapijske kompozicije koja sadrži anti-PSMA antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, ili bispecifični antigen-vezujući molekul koji specifično veže CD3 i PSMA. Terapijske kompozicija može sadržati bilo koje od antitela ili bispecifičnih antigen-vezujućih molekula kao što je ovde prikazano I farmaceutski prihvatljiv nosač ili rastvarač. Kao što se ovde koristi, izraz "subjekt kome je potrebno" označava humanu ili nehumanu životinju koja ispoljava jedan ili više simptoma ili indikacija kancera (npr., subjekt koji ispoljava tumor ili pati od bilo kojih od ovde gore pomenutih kancera), ili koji bi na drugi nači imali korist od inhibicije ili smanjenja aktivnosti PSMA ili iscrpljivanja PSMA+ ćelija (npr., ćelija kancera prostate).

[0207] Antitela i ovde opisani bispecifični antigen-vezujući molekuli (i terapijske kompozicije koje sadrže iste) su korisni, između ostalog, za lečenje bilo koje bolesti ili poremećaja u kome stimulisanje, aktivacija i/ili ciljanje imunkog odgovora bi moglo biti od koristi. Naročito, anti-PSMA antitela ili anti-CD3/anti-PSMA bispecifilčni antigen-vezujući molekuli mogu se koristiti za lečenje, prevenciju i/ili ublažavanje bilo koje bolesti ili poremećaja koji je povezan sa ili je posredovan sa ekspresijom PSMA ili aktivnosti ili proliferacijom PSMA+ ćelija. Mehanizam delovanja pomoću koga su terapijski postupci postignuti uključuju ubijanje ćelija koje eksprimiraju PSMA u prisustvu efektorskih ćelija, na primer, sa CDC, apoptozom, ADCC, fagocitozom, ili kombinovanjem dva ili više od ovih mehanizama. Ćelije koje eksprimiraju PSMA koje mogu biti inhibirane ili ubijene upotrebom bispecifičnih antigen-vezujućih molekula uključuju, na primer, tumorske ćelije prostate.

[0208] Antigen-vezujući molekuli iz predmetnog pronalaska se mogu koristiti za lečenje, npr., primarnih i/ili metastatskih tumora koji se razvijaju u gastrointestinalnom traktu, prostati, bubregu, i/ili bešici. U određenim izvođenjima, bispecifični antigen-vezujući molekuli iz pronalaska su za upotrebu u postupku lečenja jednog ili više od sledećih kancera: svetloćelijski karcinom bubrežnih ćelija, hromofobni karcinom bubrežnih ćelija, (bubrežni) onkocitom, (bubreg) tranziciono ćelijski karcinom, kancer prostate, kolorektalni kancer, kancer želudca, urotelni karcinom, (bešika) adenokarcinom, ili (bešika) sitnoćelijski karcinom. Anti-PSMA antitela ili anti-PSMA/anti-CD3 bispecifična antitela su korisna za lečenje pacijenta koji je pogođen sa kancerom prostate rezistentnim na kastraciju. U skladu sa drugim srodnim aspektima iz prikaza, obezbeđeni su postupci koji obuhvataju davanje anti-PSMA antitela ili anti-CD3/anti-PSMB bispecifičnog antigen-vezujućeg molekula kao što je ovde prikazano pacijentu koji je pogođen sa kancerom prostate rezistentnim na kastraciju. Analitički/diagnostički postupci koji su poznati u oblasti tehnike, kao što je skrining tumora, itd., mogu se koristiti za utvrđivanje da li pacijent nosi tumor koji je rezistentan na kastraciju.

[0209] Ovo izlaganje takođe uključuje postupke za lečenje rezidualnog kancera kod subjekta. Kako se ovde koristi, izraz "rezidualni kancer" označava postojanje ili postojanost jedne ili više ćelija kancera kod subjekta nakon tretmana terapijom protiv kancera.

[0210] U skladu sa određenim aspektima, Ovo izlaganje obezbeđuje postupke za lečenje bolesti ili poremećaja koji je povezan sa ekspresijom PSMA (npr., kancer prostate) koji obuhvataju davanje jednog ili više od anti-PSMA ili ovde na drugom mestu opisanog bispecifičnog antigen-vezujućeg molekula subjektu nakon što je ustanovljeno da subjekt ima kancer prostate (npr., kancer prostate koji je rezistentan na kastraciju). Na primer, postupci za lečenje kancera prostate koji obuhvataju primenu anti-PSMA antitela ili anti-CD3/anti-PSMB bispecifičnog antigen-vezujućeg molekula pacijentu 1 dana, 2 dana, 3 dana, 4 dana, 5 dana, 6 dana, 1 nedelju, 2 nedelje, 3 nedelje ili 4 nedelje, 2 meseca, 4 meseci, 6 meseci, 8 meseci, 1 godina, ili više nakon što je subjekt primio hormonsku terapiju (npr., anti-androgena terapija) su ovde opisani.

Kombinovane terapije i formulacije

[0211] Ovde su prikazani postupci koji obuhvataju davanje farmaceutske kompozicije koja sadrži bilo koje od primera antitela i ovde opisane bispecifične antigen-vezujuće molekule u kombinaciji sa jednim ili više dodatnih terapeutskih agenasa. Primeri dodatnih terapeutskih agenasa koji se mogu kombinovati sa ili davati u kombinaciji sa antigen-vezujućim molekulom uključuju, npr., EGFR antagonist (npr., anti-EGFR antitelo [npr., cetuksimab ili panitumumab] ili mali molekul inhibitor EGFR [npr., gefitinib ili erlotinib]), antagonist drugog člana EGFR familije kao što je Her2/ErbB2, ErbB3 ili ErbB4 (npr., anti-ErbB2, anti-ErbB3 ili anti-ErbB4 antitelo ili mali molekul inibitor ErbB2, ErbB3 ili ErbB4 aktivnosti), antagonist EGFRvIII (npr., antitelo koje se specifično veže za EGFRvlll), cMET anagonist (npr., anti-cMET antitelo), IGF1R antagonist (npr., anti-IGF1R antitelo), Braf inhibitor (npr., vemurafenib, sorafenib, GDC-0879, PLX-4720), PDGFR-α inhibitor (npr., anti-PDGFR-α antitelo), PDGFR-β inhibitor (npr., anti-PDGFR-β antitelo), VEGF antagonist (npr., VEGF-Trap, videti, npr., US 7,087,411 (takođe ovde naznačen "VEGF-inhibitorni fuzioni protein"), anti-VEGF antitelo (npr., bevacizumab), mali molekul kinazni inhibitor of VEGF receptor (npr., sunitinib, sorafenib or pazopanib)), a DLL4 antagonist (npr., anti-DLL4 antitelo koji je prikazan u US 2009/0142354 kao što je REGN421), Ang2 antagonist (npr., anti-Ang2 antitelo prikazano u US 2011/0027286 kao što je H1H685P), FOLH1 (PSMA) antagonist, PRLR antagonist (npr., anti-PRLR antitelo), STEAP1 ili STEAP2 antagonist (npr., anti-STEAP1 antitelo ili anti-STEAP2 antitelo), TMPRSS2 antagonist (npr., anti-TMPRSS2 antitelo), MSLN antagonist (npr., anti-MSLN antitelo), CA9 antagonist (npr., anti-CA9 antitelo), uroplakin antagonist (npr., anti-uroplakin antitelo), itd. Drugi agensi koji mogu biti od koristi za davanje u kombinaciji sa antigen-vezujućim molekulima iz pronalaska uključuju inhibitore citokina, uključujući male molekule inhibitore citokina i antitela koja vezuju citokine kao što su IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, IL-13, IL-17, IL-18, ili za njihove odgovarajuće receptore. Farmaceutske kompozicije iz predmetnog pronalaska (npr., farmaceutske kompozicije koje sadrže anti-CD3/anti-PSMB bispecifični antigen-vezujući molekul kao što je ovde prikazano) mogu se takođe davati kao deo terapeutskog režima koji sadrži jednu ili više terapeutskih kombinacija koje su izabrane od "ICE": ifosfamida (npr., Ifex®), karboplatina (npr., Paraplatin®), etopozida (npr., Etopophos®, Toposar®, VePesid®, VP-16); "DHAP": deksametazona (npr., Decadron®), citarabina (npr., Cytosar-U®, citozin arabinozida, ara-C), cisplatina (npr., Platinol®-AQ); i "ESHAP": etopozida (npr., Etopophos®, Toposar®, VePesid®, VP-16), metilprednizolona (npr., Medrol®), citarabina u visokoj dozi, cisplatina (npr., Platinol®-AQ).

[0212] Ovde su takođe prikazane terapijske kombinacije koje sadrže bilo koji od ovde pomenutih antigen-vezujućih molekula i inhibitor jednog ili više od VEGF, Ang2, DLL4, EGFR, ErbB2, ErbB3, ErbB4, EGFRvlll, cMet, IGF1R, Braf, PDGFR-α, PDGFR-β, FOLH1 (PSMA), PRLR, STEAP1, STEAP2, TMPRSS2, MSLN, CA9, uroplakina, ili bilo kog od prethodno pomenutih citokina, gde je inhibitor aptamer, antisens molekul, ribozim, siRNK, peptitelo, nanotelo ili fragment antitela (npr., Fab fragment; F(ab’)2 fragment; Fd fragment; Fv fragment; scFv; dAb fragment; ili drugi konstruisani molekuli, kao što su diatela, triatela, tetratela, minitela i minimalne jedinice prepoznavanja). Antigen-vezujući molekuli se takođe mogu davati i/ili istovremeno formulisati u kombinaciji sa antivireticima, antibioticima, analgeticima, kortikosteroidima i/ili NSAID-a. Antigen-vezujući molekuli se mogu takođe davati kao deo režima tretmana koji takođe uključuje tretman zračenjem i/ili konvencionalnu hemioterapiju.

[0213] Dodatne terapeutski aktivne komponeta(e) mogu se davati neposredno pred, istovremeno sa, ili ubrzo nakon davanja molekula koji vezuje antigen; (za svrhe iz predmetnog prikaza, takvi režimi davanja se smatraju primenom molekula koji veže antigen "u kombinaciji sa" dodatnom terapeutski aktivnom komponentom).

[0214] Ovo izlaganje uključuje farmaceutske kompozicije u kojima molekul koji veže antigen iz predmetnog pronalaska je zajedno formulisan sa jednim ili više dodatnih terapeutski aktivnih komponenti(ata) kao što je ovde opisano na drugom mestu.

Režimi davanja

[0215] Više doza molekula koji vezuje antigen (npr., anti-PSMA antitelo ili bispecifični antigen-vezujući molekul koji specifično vezuje PSMA i CD3) mogu se davati subjektu tokom definisanog vremenskog perioda. Postupci prema ovom aspektu obuhvataju sekvencijalno davanje subjektu višestrukih doza molekula koji vezuje antigen. Kako se ovde koristi, "sekvencionalno davanje" znači da se svaka doza molekula koji vezuje antigen daje subjektu u različitom trenutku, npr., u različitim danima razdvojenim unapred određenim intervalom (npr., sati, dani, nedelje ili meseci). Ovo otkriće uključuje postupke koji obuhvataju sekvencijalno davanje na pacijentu jedna početna doza molekula koji vezuje antigen, praćena jednom ili više sekundarnih doza molekula koji vezuje antigen, i opciono praćenom jednom ili više tercijarnih doza molekula koji vezuje antigen.

[0216] Termini "početna doza", "sekundarne doze" i "tercijarne doze" odnose se na vremensku sekvencu primene molekula koji vezuje antigen. Dakle, "početna doza" je doza koja se primenjuje na početku režima lečenja (takođe se naziva "osnovna doza"); "sekundarne doze" su doze koje se daju nakon početne doze; a "tercijarne doze" su doze koje se daju posle sekundarnih doza. Inicijalne, sekundarne i tercijarne doze mogu da sadrže istu količinu molekula koji vezuje antigen, ali generalno mogu da se razlikuju jedna od druge u smislu učestalosti primene. U određenim izvođenjima, međutim, količina molekula koji vezuje antigen sadržana u početnim, sekundarnim i/ili tercijalnim dozama varira jedna od druge (npr., prilagođena naviše ili naniže prema potrebi) tokom lečenja. U

4

određenim slučajevima, dve ili više (npr., 2, 3, 4 ili 5) doza se daju na početku režima lečenja kao „doze za opterećenje“, a zatim slede sledeće doze koje se daju ređe (npr., "doze održavanja").

[0217] U jednom oglednom aspektu ovog otkrića, svaka sekundarna i/ili tercijarna doza se daje 1 do 26 (npr., 1, 1<1>/2, 2, 2<1>/2, 3, 3<1>/2, 4, 4<1>/2, 5, 5<1>/2, 6, 6<1>/2, 7, 7<1>/2, 8, 8<1>/2, 9, 9<1>/2, 10, 10<1>/2, 11, 11<1>/2, 12, 12<1>/2, 13, 13<1>/2, 14, 14<1>/2, 15, 15<1>/2, 16, 16<1>/2, 17, 17<1>/2, 18, 18<1>/2, 19, 19<1>/2, 20, 20<1>/2, 21, 21<1>/2, 22, 22<1>/2, 23, 23<1>/2, 24, 24<1>/2, 25, 25<1>/2, 26, 26<1>/2ili više) nedelja nakon neposredno prethodne doze. Fraza "neposredna prethodna doza", kako se ovde koristi, označava, u nizu višestrukih primena, dozu molekula koji vezuje antigen koji se daje pacijentu pre davanja sledeće doze u nizu bez intervencionih doza.

[0218] Postupci prema ovom aspektu otkrivanja mogu da obuhvataju davanje pacijentu bilo kog broja sekundarnih i/ili tercijalnih doza molekula koji se vezuje za antigen (npr. anti-PSMA antitela ili bispecifičnog molekula koji se vezuje za antigen koji se specifično vezuje PSMA i CD3). Na primer, u određenim slučajevima pacijentu se daje samo jedna sekundarna doza. U drugim slučajevima, pacijentu se daju dve ili više (npr.2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ili više) sekundarnih doza. Isto tako, u određenim slučajevima, pacijentu se daje samo jedna tercijarna doza. U drugim izvođenjima, pacijentu se daju dve ili više (npr.2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ili više) tercijarnih doza.

[0219] U slučajevima koji uključuju višestruke sekundarne doze, svaka sekundarna doza se može primeniti istom učestalošću kao i druge sekundarne doze. Na primer, svaka sekundarna doza se može dati pacijentu 1 do 2 nedelje nakon doze neposredno prethodne. Slično, u slučajevima koji uključuju više tercijarnih doza, svaka tercijarna doza se može primeniti istom učestalošću kao i druge tercijarne doze. Na primer, svaka tercijarna doza se može dati pacijentu 2 do 4 nedelje nakon neposredno prethodne doze. Alternativno, učestalost na kojoj se sekundarne i/ili tercijarne doze daju pacijentu može da varira tokom režima lečenja. Učestalost primene takođe može da se prilagodi tokom lečenja od strane lekara u zavisnosti od potreba pojedinačnog pacijenta nakon kliničkog pregleda.

Dijagnostičke upotrebe antitela

[0220] Anti-PSMA antitela se takođe mogu koristiti za detekciju i/ili merenja PSMA, ili ćelija koje eksprimiraju PSMA u uzorku, npr., u dijagnostičke svrhe. Na primer, anti-PSMA antitelo, ili njegov fragment, može da se koristi za dijagnozu stanja ili bolesti koje karakteriše aberantna ekspresija (npr., prekomerna ekspresija, nedovoljna ekspresija, nedostatak ekspresije, itd.) PSMA. Primeri dijagnostičkih testova za PSMA mogu da obuhvataju, npr., dovođenje u kontakt uzorka, dobijenog od pacijenta, sa anti-PSMA antitelom, pri čemu je anti-PSMA antitelo obeleženo obeleživačem ili reporterskim molekulom koji se može detektovati. Alternativno, neobeleženo anti-PSMA antitelo se može koristiti u dijagnostičkim aplikacijama u kombinaciji sa sekundarnim antitelom koje je samo detektabilno obeleženo. Detektabilna oznaka ili reporterski molekul može biti radioizotop, kao što je<3>H,<14>C,<32>P,<35>S ili<125>I; fluorescentni ili hemiluminiscentni deo kao što je fluorescein izotiocijanat ili rodamin; ili enzim kao što je alkalna fosfataza, beta-galaktozidaza, peroksidaza rena ili luciferaza. Druga primerna dijagnostička upotreba anti-PSMA antitela uključuje<89>Zr-obeleženo, kao što je<89>Zrdesferioksaminom obeleženo, antitelo u svrhu neinvazivne identifikacije i praćenja tumorskih ćelija kod subjekta (npr. pozitronska emisiona tomografija (PET) imidž). (Vidi, npr., Tavare, R. et al. Cancer Res. 2016 Jan 1;76(1):73-82; i Azad, BB. et al. Oncotarget. 2016 Mar 15;7(11):12344- 58.) Specifični ogledni testovi koji se mogu koristiti za detekciju ili merenje PSMA u uzorku uključuju enzimski imunosorbentni test (ELISA), radioimunoesej (RIA) i sortiranje ćelija aktivirano fluorescencijom (FACS).

[0221] Uzorci koji se mogu koristiti u PSMA dijagnostičkim testovima obuhvataju bilo koje uzorke tkiva ili tečnosti koji se mogu dobiti od pacijenta koji sadrže detektabilne količine PSMA proteina, ili njegove fragmente, u normalnim ili patološkim uslovima. Generalno, nivoi PSMA u određenom uzorku dobijenom od zdravog pacijenta (npr. pacijent koji nije oboleo od bolesti ili stanja povezanih sa abnormalnim nivoima ili aktivnošću PSMA) biće izmereni da bi se inicijalno utvrdio osnovni ili standardni nivo PSMA. Ovaj osnovni nivo PSMA se zatim može uporediti sa nivoima PSMA izmerenim u uzorcima dobijenim od pojedinaca za koje se sumnja da imaju bolest povezanu sa PSMA (npr. tumor koji sadrži ćelije koje eksprimiraju PSMA) ili stanje.

PRIMERI

[0222] Sledeći primeri su izneti kako bi osobe koje su uobičajeno verzirane u oblasti tehnike pružili kompletan prikaz i opis kako da naprave i koriste metode i kompozicije pronalaska, Uloženi su napori da se obezbedi tačnost u pogledu upotrebljenih brojeva (npr. količine, temperatura itd.), ali treba uzeti u obzir određene eksperimentalne greške i odstupanja. Osim ako nije drugačije naznačeno, delovi su delovi po težini, molekulska težina je prosečna molekulska težina, temperatura je u stepenima Celzijusa, a pritisak je na ili blizu atmosferskog.

Primer 1: Dobijanje Anti-PSMA Antitela

[0223] Anti-PSMA antitela su dobijena imunizacijom genetički modifikovanog miša sa humanim PSMA antigenom ili imunizacijom konstruisanog miša koji sadrži DNK koja kodira varijabilne regione teškog i kapa lakog lanca humanog imunoglobulina sa humanim PSMA antigenom.

[0224] Miševi su imunizovani sa humanim ćelijama kancera prostate (LNCaP, ATTC®, Manassas, Virginia, USA) koje eksprimuju humani PSMA (SEK ID NO:1651; UniProtKB/Sviss-Prot. No. K04609). Nakon imunizacije, splenočiti su sakupljeni iz svakog miša ii li su (1) spojeni sa ćelijama mijeloma da bi se sačuvala njihova vijabilnost i obrazovale ćelije hibridoma i pregledane za specifičnost na PSMA, ili (2) različite B-ćelije (kao što je opisano u US 2007/0280945A1) upotrebom humanog PSMA sa N-terminalnim 6-His tag-om (R&D, Cat#4234-ZN) kao reagensom sortiranja koji se vezuje i identifikuje reaktivna antitela (antigen-pozitivne B ćelije).

[0225] Himerna antitela na PSMA su prvobitno izolovana sa ljudskim varijabilnim regionom i mišjim konstantnim regionom. Antitela su okarakterisana i odabrana prema poželjnim karakteristikama, uključujući afinitet, selektivnost, itd. Ako je potrebno, mišji konstantni regioni su zamenjeni željenim ljudskim konstantnim regionom, na primer divlji tip ili modifikovani IgG1 ili IgG4, da bi se stvorio potpuno humani anti-PSMA antitelo. Dok odabrani konstantni region može da varira u zavisnosti od specifične upotrebe, karakteristike vezivanja antigena visokog afiniteta i specifičnosti cilja nalaze se u varijabilnom regionu. Oznake naziva antitela kao što su H1H11453N2 i H1M11900N označavaju potpuno ljudska antitela "H1H" ili himerna ljudska antitela varijabilnog/mišjeg konstantnog regiona "H1M". Antitela identifikovana metodom hibridoma su označena ID brojevima antitela koji se završavaju sa "N" ili "N2"; Antitela identifikovana metodom sortiranja B-ćelija su označena ID brojevima antitela koji se završavaju sa „P“ ili „P2“.

[0226] Određene biološke osobine primera anti-PSMA antitela koja su dobijena u skladu sa postupcima iz ovog Primera su detaljno opisani u Primerima koji su predstavljeni ispod.

4

Primer 2: Sekvence aminokiselina i nukleinskih kiselina varijabilnih regiona teškog i lakog lanca anti-PSMA antitela

[0227] Tabela 1 prikazuje identifikatore aminokiselinske sekvence varijabilnih regiona teškog i lakog lanca i CDR-ove odabranih anti-PSMA antitela. Odgovarajući identifikatori sekvence nukleinske kiseline su navedeni u Tabeli 2.

Tabela 1: Identifikatori sekvenci aminokiselina

Tabela 2: Identifikatori sekvenci nukleinskih kiselina

4

Primer 3: Afiniteti vezivanja i kinetičke konstante humanih monoklonskih anti-PSMA antitela izvedene iz površinske plazmonske rezonance

[0228] U ovom primeru, anti-PSMA antitela su procenjena na njihovu sposobnost da se vezuju za humani PSMA. Afiniteti vezivanja i kinetičke konstante anti-PSMA antitela za rastvorljivi humani PSMA protein su određeni površinskom plazmonskom rezonancom na 37°C korišćenjem formata za hvatanje antitela. Rezultati su prikazani u tabelama 3 i 4. Merenja su sprovedena na Biacore T-200 instrumentu (GE Healthcare).

[0229] Ukratko, površina CM5 Biacore senzora je derivatizovana kuplovanjem amina sa monoklonskim mišjim anti-humanim Fc antitelom (GE, # BR-1008-39) ili monoklonskim kozjim anti-mišjim Fc antitelom (GE, # BR-1008- 38) da uhvati prečišćena anti-PSMA antitela. Studije vezivanja su izvedene u HBSP++ puferu sastavljenom od 0,01 M HEPES, 0,15 M NaCl, 2 mM Ca<2+>, 2 mM Mg<2+>, 0,05% v/v Surfaktanta P20, pH 7,4. Različite koncentracije humanog PSMA eksprimirane pomoću N-terminalne heksahistidinske oznake (6h.hPSMA, R&D) pripremljene u HBSP++ puferu (u rasponu od 50 do 0,78 nM, 4-struka razblaženja) su ubrizgane preko površine uhvaćene anti-PSMA antitelom na protok od 30µL/min. Povezivanje antitelo-reagens je praćeno 2 minuta, dok je disocijacija u HBSP++ tekućem puferu praćena 8 minuta.

[0230] Konstante brzine kinetičke asocijacije (ka) i disocijacije (kd) određene su prilagođavanjem senzorgrama u realnom vremenu na model vezivanja 1:1 korišćenjem softvera za prilagođavanje krive Scrubber 2.0c. Konstante ravnoteže disocijacije vezivanja (KD) i disocijativni poluživot (t<1>/2) su izračunati iz konstanti kinetičke brzine kao: KD(M) = kd/ ka; i t1/2(min) = (In2/(60*kd).

[0231] Kao što je prikazano u Tabelama 3 i 4, anti-PSMA antitela vezana za humani PSMA u formatu za hvatanje antitela sa različitim afinitetima i KDvrednostima u rasponu od 19,9 pM do 75,6 nM. Nekoliko primera anti-PSMA antitela, kao što su H1H3465P i H1H11810P2, pokazalo je snažan afinitet prema humanom PSMA proteinu, sa sub-nanomolarnim KDvrednostima.

Tabela 3: Afiniteti anti-PSMA humanih IgG1 antitela na rastvorljivi humani PSMA na 37°C

(nastavak)

4

Tabela 4: Afiniteti anti-PSMA mišjih konstantnih antitela na rastvorljivi humani PSMA na 37°C

Primer 4: Dobijanje bispecifičnih antitela koja vežu prostata-specifični membranski antigen (PSMA) i CD3

[0232] Ovaj pronalazak obezbeđuje bispecifične antigen-vezujuće molekule koje vezuju CD3 i antigen membrane specifičan za prostatu (PSMA); takvi bispecifični antigen-vezujuće molekule se ovde takođe nazivaju "anti-PSMA/anti-CD3 bispecifični molekuli." Anti-PSMA deo bispecifičnog molekula anti-PSMA/anti-CD3 je koristan za ciljanje tumorskih ćelija koje eksprimiraju PSMA, a anti-CD3 deo bispecifičnog molekula je koristan za aktiviranje T-ćelija. Istovremeno vezivanje PSMA na tumorsku ćeliju i CD3 na T-ćeliji olakšava usmereno ubijanje (lizu ćelije) ciljanog tumora ćelije aktiviranom T-ćelijom.

[0233] Bispecifična antitela koja sadrže anti-PSMA-specifični vezujući domen i anti-CD3-specifični vezujući domen su konstruisana korišćenjem standardnih postupaka, pri čemu se domen za vezivanje anti-PSMA antigena i domen za vezivanje anti-CD3 antigena svaki sastoji od različitih, različitih HCVR-a uparenih sa zajedničkim LCVR. U nekim slučajevima bispecifična antitela su konstruisana korišćenjem teškog lanca iz anti-CD3 antitela, teškog lanca iz anti-PSMA antitela i uobičajenog lakog lanca U drugim slučajevima, bispecifična antitela su konstruisana korišćenjem teškog lanca iz anti-CD3 antitela, teškog lanca iz anti-PSMA antitela i lakog lanca iz anti-CD3 antitela.

[0234] Bispecifična antitela opisana u sledećim primerima sastoje se od vezujućih krakova za koje je poznato da se vezuju za humani rastvorljivi heterodimerni hCD3e/d protein (kao što je opisano u Primerima 9-13); i humani PSMA (videti Primere 1-3 iznad). Primeri bispecifičnih antitela su proizvedena sa modifikovanim (himernim) IgG4 Fc domenom kako je navedeno u objavi US patentne prijave br. US20140243504A1, koja je objavljena 28. avgusta 2014. godine.

[0235] Pregled sastavnih delova domena za vezivanje antigena različitih konstruisanih anti-PSMAxCD3 bispecifičnih antitela je prikazan u Tabeli 5.

4

Tabela 5: Pregled sastavnih delova PSMAxCD3 bispecifičnih antitela

4

[0236] Anti-PSMA varijabilni region teškog lanca PSMA-VH-3465 je HCVR H1H3465P (SEQ ID NO:122) iz Tabele 1. Anti-PSMA varijabilni region teškog lanca PSMA-VH-11810 je HCVR H1H11810P2 (SEQ ID NO:66) iz Tabele 1.

[0237] Varijabilni region teškog lanca anti-CD3 CD3-VH-A je HCVR H1H5778P (SEQ ID NO:922) iz Tabele 12. Varijabilni region teškog lanca anti-CD3 CD3-VH-B je HCVR H1H2712N (SEQ ID NO:154) iz Tabele 12. Varijabilni regioni teškog lanca anti-CD3 CD3-VH-G, CD3-VH-G2, CD3-VH-G3, CD3-VH-G4, CD3-VH-G5, CD3 -VHG8, CD3-VH-G9, CD3-VH-G10, CD3-VH-G11, CD3-VH-G12, CD3-VH-G13, CD3-VH-G14, CD3-VH-G15, CD3-VH-G16, CD3-VH-G17, CD3-VH-G18, CD3-VH-G19, CD3-VH-G20 i CD3-VH-G21 opisani su u Tabeli 18.

[0238] Laki lanci u Tabeli 5 bili su zajednički i za CD3 i PSMA ciljane krakove bispecifičnih antitela. Varijabilni region lakog lanca anti-CD3 CD3-VL-A je LCVR H1H5778P (SEQ ID NO:930) iz Tabele 12. Varijabilni region lakog lanca anti-CD3 CD3-VL-B je LCVR H1H2712N (SEQ ID NO:162) iz Tabele 12. Varijabilni region lakog lanca VK 1-39 JK 5 je SEQ ID NO: 1386 iz Tabele 20. Tabela 1 postavlja identifikatore aminokiselinske sekvence za različite varijabilne regione teškog lanca i njihove odgovarajuće CDR-ove, anti-PSMA krakova bispecifičnih antitela iz ovog Primera. Tabela 2 daje identifikatore sekvenci za nukleotidne sekvence koje kodiraju varijabilne regione teškog lanca, i njihove odgovarajuće CDR-ove, domena koji se vezuju za anti-PSMA antigen bispecifičnih antitela iz ovog Primera.

[0239] Tabele 12, 14, 15, 18 i 20 opisuju sekvence aminokiselina varijabilnih regiona teškog lanca i njihove odgovarajuće CDR-ove za anti-CD3 krakove bispecifičnih antitela, kao i sekvence amino kiselina za laka varijabilne regione lanca, i njihove odgovarajuće CDR-ove, zajedničke za oba kraka bispecifičnih antitela iz ovog Primera. Tabele 13, 16, 17, 19 i 21 opisuju odgovarajuće nukleotidne sekvence za ove karakteristike bispecifičnih antitela iz ovog Primera.

Primer 5: Afiniteti vezivanja prikazanih bispecifičnih antitela izmereni FACS analizom

[0240] U ovom primeru, određena je sposobnost anti-PSMA/anti-CD3 bispecifičnih antitela opisanih u Primeru 4 da se vežu za humane ćelijske linije koje eksprimiraju PSMA i za ćelijske linije čoveka i cinomolgusa koje eksprimiraju CD3 putem FACS. Kao što je gore opisano, bispecifična antitela ovog pronalaska su koristila PSMA-specifični vezujući krak za teški lanac (HC) uparenu sa panelom anti-CD3 HC vezujućih krakova i zajedničkim lakim lancem. Krakovi vezivanja PSMA-HC u bispecifičnim antitelima, dole, pokazali su snažno vezivanje za humani PSMA protein preko površinske plazmonske rezonance (Primer 3). Kao što je opisano u Primerima 6 i 13 ovde, CD3-vezujući HC krakovi su takođe pokazali niz afiniteta prema humanom rastvorljivom heterodimernom proteinu hCD3e/d.mFc preko površinske plazmonske rezonance.

[0241] Ukratko, 2x10<5>ćelija/bunariću humanih ćelija koje eksprimiraju CD3 Jurkat, cinomolgus T ili humanih PSMA-specifičnih ćelija su inkubirane sa serijskim razblaženjem bispecifičnih antitela tokom 30 minuta na 4°C. Posle inkubacije, ćelije su isprane i ćelijama je dodata kozja F(ab')2 anti-humana Fcg PE obeležena sekundarna (Jackson Immunolabs) u trajanju u dodatnih 30 minuta. Zatim su ćelije isprane, ponovo suspendovane u hladnom PBS 1% BSA i analizirane protočnom citometrijom na BD FACS Canto II.

[0242] Za FACS analizu, ćelije su zatvorene visinom rasejanja unapred u odnosu na površinu rasejanja unapred za izbor pojedinačnih događaja, nakon čega su usledila bočna i napredna rasipanja. EC50za titraciju vezivanja ćelija je određen korišćenjem Prism softvera. Vrednosti su izračunate korišćenjem 4-parametarske nelinearne regresione analize.

Tabela 6: FACS Vezivanje na CD3 i PSMA-specifične ćelijske linije

(nastavak)

[0243] Kao što je prikazano u Tabeli 6, testirana anti-PSMA/anti-CD3 bispecifična antitela su pokazala specifičnost vezivanja za humane ćelijske linije B16F10.9/hPSMA i 22RV1 koje eksprimiraju PSMA putem FACS. Granica detekcije za FACS vezivanje je 1 µM EC50.

[0244] Kao što je prikazano u Tabeli 6, krakovi koji se vezuju za CD3 svakog CD3xPSMA bispecifičnog antitela su pokazali opseg afiniteta za vezivanje ćelija za humane ćelije Jurkat koje eksprimiraju CD3 (opseg od 15 do 300 nM EC50). Važno je da su CD3 krakovi koji su pokazali slabo ili nikakvo vezivanje za humani CD3 heterodimerni protein preko površinske plazmonske rezonance (videti Tabelu 7 u nastavku) takođe su u korelaciji sa slabim ili neuočljivim vezivanjem na Jurkat ćelije (tj. CD3-VH-G2, CD3-VH -G3, CD3-VH-G5). Nekoliko krakova koji se vezuju za CD3 takođe je pokazalo unakrsnu reaktivnost na T-ćelije cinomolgusa. Sva testirana bispecifična antitela su pokazala slično vezivanje ćelija na odgovarajućim ćelijskim linijama koje eksprimiraju PSMA, potvrđujući da bispecifično

1

uparivanje sa pojedinačnim CD3 kracima nije uticalo ili umanjilo PSMA-specifično vezivanje (PSMA-specifično vezivanje je bilo manje ili jednako 5,6 nM (visok afinitet) u svim testiranim primerima).

[0245] Antitela koja pokazuju slabo ili nevezivanje koje se ne detektuje za humani CD3, a takođe pokazuju slabo ili nevezivanje za CD3 cinomolgusa, smatraju se korisnim za bispecifično uparivanje vođeno aviditetom u skladu sa ovim pronalaskom, i dalje su testirana na citotoksičnost u in vitro i in vivo testovima.

Primer 6: Afiniteti vezivanja primera antitela izmereni testom vezivanja površinske plazmonske rezonance

[0246] Afiniteti vezivanja i kinetičke konstante anti-PSMA x anti-CD3 bispecifičnih antitela za rastvorljivi heterodimerni hCD3e/d.mFc protein (hCD3e =UniProtKB/Sviss-Prot: P07766.2;; SEK_ID = NO: 1hCD3d Sviss-Prot: P04234.1, SEQ ID NO: 1653) određivani su površinskom plazmonskom rezonancom na 37°C korišćenjem formata za hvatanje antigena (Tabela 7). Merenja su sprovedena na instrumentu Sierra Sensors MASS-1.

[0247] U formatu za hvatanje antigena, površina senzora amina visoke gustine MASS-1 je derivatizovana poliklonskim antitelom kozjeg antimišjeg IgG2a (Southern Biotech). Rastvorljivi heterodimerni CD3 protein je uhvaćen i odgovarajuća antitela su ubrizgana preko uhvaćenog antigena.

[0248] Konstante brzine kinetičke asocijacije (ka) i disocijacije (kd) određene su obradom i prilagođavanjem podataka modelu vezivanja 1:1 korišćenjem softvera za podešavanje krive MASS-1 AnaliserR2. Konstante ravnoteže disocijacije vezivanja (KD) i disocijativni poluživot (t1/2) su izračunati iz konstanti kinetičke brzine kao: KD(M) = kd/ ka; i t1/2(min) = (In2/(60*kd).

Tabela 7: Afiniteti anti-CD3 bispecifičnih antitela prema rastvorljivom humanom CD3

2

[0249] Kao što je prikazano u Tabeli 7, anti-CD3xanti-PSMA bispecifična antitela ili održavaju veoma slabo vezivanje za solubilni CD3 u testu vezivanja površinske plazmonske rezonancije, npr. sa KDvrednosti koja je veća od 11 nM do 334 nM koja je slabija od one za bispecifični anti-CD3 krak koji je izveden iz germinativnih regiona okvira, CD3-VH-G, ili koji nije ispoljio bilo koje detektabilno vezivanje.

[0250] Kao takva, nekoliko bispecifičnih antitela pokazalo je veće vrednosti od 50 nM KD, a neka su bila veća od 100 nM (tj. BSPSMA/CD3-900, BSPSMA/CD3-1000, BSPSMA/CD3-1900, BSPSMA/CD3-005) pa čak i iznad granica detekcije testa, tj. nije pokazano da se detektuje vezivanje za rastvorljivi humani CD3 (tj. BSPSMA/CD3-200, BSPSMA/CD3-300, BSPSMA/CD3-400, BSPSMA/CD3-004 i BSPSMA/CD3-1800).

Primer 7: Aktivacija T ćelija i tumor-specifična citotoksičnost koju ispoljavaju bispecifična antitela kao što je mereno In Vitro

[0251] U ovom primeru, specifično ubijanje ciljnih ćelija koje eksprimiraju PSMA u prisustvu anti-PSMA x anti-CD3 bispecifičnih antitela je praćeno protočnom citometrijom. Kao što je ranije objavljeno, bispecifična antitela su pokazala opseg afiniteta prema CD3 proteinu i ćelijskim linijama koje eksprimiraju CD3 (tj. slabo, umereno i snažno vezivanje). Ovaj isti panel bispecifičnih antitela je testiran na sposobnost da indukuje naivne humane T-ćelije da preusmere ubijanje ka ćelijama koje eksprimiraju ciljnu metu.

[0252] Ukratko, ćelijske linije koje eksprimiraju PSMA (C4-2, 22Rv1 i TRAMPC2_PSMA) su obeležene sa 1 µM fluorescentnom bojom za praćenje Violet Cell Tracker. Nakon obeležavanja, ćelije su zasejane preko noći na 37°C. Odvojeno, humane PBMC-e su zasejane u dopunjenom RPMI medijumu na 1x10<6>ćelija/mL i inkubirani preko noći na 37°C da bi se obogatili limfociti iscrpljivanjem adherentnih makrofaga, dendritičnih ćelija i nekih monocita. Sledećeg dana, ciljne ćelije su istovremeno inkubirane sa naivnim PBMC osiromašenim adherentnim ćelijama (odnos efektor/ciljna ćelija 4:1) i serijskim razblaženjem relevantnih bispecifičnih antitela ili kontrolom izotipa (opseg koncentracije: 66,7 nM do 0,25 pM) tokom 48 sati na 37°C. Ćelije su uklonjene sa ploča sa ćelijskom kulturom upotrebom pufera za disocijaciju ćelija bez enzima i analizirane su pomoću FACS.

[0253] Za FACS analizu, ćelije su obojene pomoću tragača daleko crveno mrtvih/živih ćelija (Invitrogen).5x10<5>zrnaca za brojanje je dodato u svaki bunarčić neposredno pre FACS analize. Za svaki uzorak prikupljeno je 1x10<4>zrnaca. Za procenu specifičnosti ubijanja, ćelije su zatvorene na živim populacijama obeleženim ljubičastom bojom. Procenat žive populacije je zabeležen i korišćen za izračunavanje normalizovanog preživljavanja.

[0254] Aktivacija T ćelija je procenjivana inkubacijom ćelija sa direktno konjugovanim antitelima na CD2 i CD69, i izveštavanjem o procentu aktiviranih (CD69+) T ćelija od ukupnih T ćelija (CD2+).

[0255] Kao što rezultati u Tabeli 8 pokazuju, iscrpljivanje ćelija koje eksprimuju PSMA primećeno je sa anti-PSMA x anti-CD3 bispecifičnim antitelima. Većina testiranih bispecifičnih antitela je aktivirala i usmerila humane T ćelije da iscrpe ciljne ćelije sa vrednostima EC50u pikomolarnom opsegu. Pored toga, uočena liza ciljne ćelije je bila povezana sa povećanjem broja CD69 ćelija na CD2+ T ćelijama, sa pM EC50s.

[0256] Važno, rezultati ovog primera pokazuju da je nekoliko bispecifika koje su koristili CD3 vezujući krak koji je pokazao slabo do neuočljivo vezivanje za CD3 protein ili ćelije koje eksprimiraju CD3 (tj. CD3-VH-G5) i dalje zadržavaju sposobnost da aktiviraju T -ćelije i pokazao snažnu citotoksičnost ćelija koje eksprimiraju tumorski antigen.

Tabela 8: Citotoksičnost i svojstva aktivacije T-ćelija odabranih PSMAxCD3 bispecifičnih antitela

Primer 8: Anti-PSMA/anti-CD3 bispecifična antitela ispoljavaju potentnu anti-tumorsku efikasnost in vivo

[0257] Da bi se utvrdila in vivo efikasnost primera anti-PSMA/anti-CD3 bispecifičnih antitela, studije su sprovedene na imunokompromitovanim miševima koji su nosili ksenotransplantate humanog kancera prostate. Dodatne studije su takođe sprovedene na imunokompetentnim miševima koji nose ksenotransplantate kancera prostate kod miša koji su konstruisani da eksprimiraju humani PSMA.

4

Efikasnost anti-PSMAlanti-CD3 bispecifičnih antitela u modelima ksenotransplantata humanog tumora

[0258] Da bi se procenila efikasnost in vivo bispecifičnosti anti-PSMA/anti-CD3 u studijama ksenotransplantata humanog tumora, miševi NOD scid gama (NSG) (Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine) su istovremeno implantirani sa mononuklearnim ćelijama humane periferne krvi (PBMC) zajedno sa 22Rv1 ili C4-2 humanim ćelijama tumora prostate koje endogeno eksprimiraju PSMA.

[0259] Ukratko, ćelije 4x10<6>22Rv1 ili 5x10<6>C4-2 (MD Anderson, TKS) su istovremeno implantirane s.c. sa 1x10<6>humanih PBMC-a (ReachBio, LLC., Seattle, VA) u 50:50 mešavini matrigela (BD Biosciences) u desni bok mužjaka NSG miševa. U studiji 22Rv1, miševi su tretirani i.p. u danima 0, 3 i 7 sa 1 ug BSPSMA/CD3-001 ili kontrolom izotipa (slika 1). U studiji C4-2, miševi su tretirani i.p. u danima 0, 4 i 7 nakon implantacije tumora sa 0,1 mg/kg BSPSMA/CD3-001, BSPSMA/CD3-003 ili BSPSMA/CD3-005.

[0260] U dodatnom ksenogenom modelu, anti-PSMA/anti-CD3 bispecifična antitela su testirana na miševima transplantiranim sa humanim hematopoetskim CD34+ matičnim ćelijama. Ukratko, novorođenim SIRPa BALB/c-Rag2-IL2rg- (BRG) mladuncima su transplantirane hCD34+ ćelije fetalne jetre. 3-6 meseci kasnije SIRPa BRG miševima sa presađenim hCD34 su zatim implantirane C4-2 ćelije (53106 s.c. u matrigelu).8 dana kasnije, miševi su tretirani sa 10 ug BSPSMA/CD3-004 ili kontrolnim antitelom izotipa, praćeno dozama 2x/nedeljno tokom studije.

[0261] U svim studijama, veličina tumora je merena 2x/nedeljno upotrebom kalipera i zapremina tumora je izračunata kao Zapremina = (dužina x širina<2>)<2>.

[0262] Kao što pokazuju rezultati u Tabeli 9, sva bispecifična antitela testirana u gore opisanim ksenogenim modelima su bila potpuno efikasna u inhibiciji rasta tumora u poređenju sa tretmanom sa kontrolom izotipa.

Efikasnost anti-PSMAlanti-CD3 bispecifičnih antitela u ustanovljenom modelu ksenotransplantata humanog tumora

[0263] Nakon toga, je procenjena efikasnost anti-PSMA/anti-CD3 bispecifičnih antitela u supresiji rasta ustanovljenih tumora. NSG miševima je prvo ubrizgano 2,5x10<6>humanih PBMC i.p. da bi se omogućilo transplantiranje humanih T ćelija. Četrnaest dana kasnije, miševima je istovremeno implantirano C4-2 ćelija i PBMC kao gore. 20 ug BSPSMA/CD3-002 ili izotip kontrole je dato i.p. 18 dana nakon implantacije tumora i nastavljeno 2x/nedeljno tokom trajanja studije. Dodatne PBMC-e su dati i.p. u danima 20. i 40. dana nakon implantacije tumora.

[0264] Kao što pokazuju rezultati u Tabeli 9, BSPSMA/CD3-002 je pokazao efikasnost u supresiji rasta ustanovljenih tumora, smanjujući rast tumora za 95%.

Efikasnost anti-PSMAlanti-CD3 bispecifičnih antitela u imunokompetentnom tumorskom modelu [0265] Pored toga, anti-PSMA/anti-CD3 bispecifična antitela su procenjena na antitumorsku aktivnost u imunokompetentnom modelu. Miševi humanizovani za tri lanca (δγε) CD3, kao i za PSMA, implantirani su sa varijantnom ćelijskom linijom mišjeg kancera prostate TRAMP-C2 transfektovanom sa humanim PSMA.

[0266] Pre početka studije, generisana je varijanta tumorogene ćelijske linije TRAMP-C2_hPSMAv#1. Ukratko, 7.53106 TRAMP-C2_hPSMA ćelije su implantirane s.c. u desni bok muških miševa humanizovanih za CD3 i PSMA. Tumor je izrezan i isečen na fragmente od 3 mm, a zatim implantiran u desni bok novih mužjaka humanizovanih miševa. Tumor koji je nastao iz implantiranih fragmenata tumora je zatim sakupljen i razdvojen u suspenziju jedne ćelije. Ove ćelije (TRAMP-C2_hPSMAv#1) su zatim kultivisane in vitro pod selekcijom G418. 4.10<6>ćelija ove varijante ćelijske linije je zatim implantirano u desni bok muških PSMA/CD3 humanizovanih miševa za studije efikasnosti bispecifičnih antitela.

[0267] Humanizovani PSMA/CD3 miševi implantirani sa TRAMPC2_hPSMAv#1 su tretirani sa 100 ug ili 10 ug anti-PSMA/anti-CD3 bispecifičnog antitela BSPSMA/CD3-001 ili BSPSMA/CD3-004 ili kontrolom izotipa 2 x/nedeljno počevši od dana implantacija tumora. Takođe su ispitani nivoi citokina u serumu 4 sata nakon injekcije, kao i nivoi T ćelija slezine. Studija je završena u danu 27.

[0268] Kao što pokazuju rezultati u Tabeli 10, oba anti-PSMA/anti-CD3 bispecifična molekula pokazala su efikasnost u značajnom odlaganju rasta tumora u grupama koje su tretirane. Oslobađanje citokina zavisno od doze primećeno je nakon tretmana sa BSPSMA/CD3-001. Posle primene BSPSMA/CD3-004 primećeno je minimalno oslobađanje citokina, verovatno zbog slabog vezivanja anti-CD3. BSPSMA/CD3-001 pokazao je antitumorski efekat bez iscrpljivanja T ćelija u slezini.

Efikasnost anti-PSMAlanti-CD3 bispecifičnih antitela na ustanovljene tumore u imunokompetentnom modelu

[0269] Na kraju, procenjena je efikasnost odabranih anti-PSMA/anti-CD3 bispecifičnih molekula na smanjenje rasta ustanovljenih tumora kod humanizovanih PSMA/CD3 miševa. Ćelije TRAMP-C2_hPSMAv#1 su transplantirane u humanizovane miševe kako je gore opisano, 100 ug BSPSMA/CD3-001 ili kontrola izotipa je dato i.p.2x/nedeljno 14 dana nakon implantacije tumora, kada su se veličine tumora kretale od 50 mm<3>-100 mm<3>. Kao što pokazuju rezultati u Tabeli 11, BSPSMA/CD3-001 je bio efikasan u ovom ustanovljenom modelu tumora, pokazujući smanjenje rasta tumora od 84% u poređenju sa kontrolnom grupom.

[0270] Ukratko, anti-PSMA/anti-CD3 bispecifična antitela pokazuju potentnu antitumorsku efikasnost i kod imunokompromitovanih i kod imunokompetentnih modela tumora. Pored toga, nekoliko testiranih bispecifičnih antitela (BSPSMA/CD3-001 i 002) pokazalo je potentnu sposobnost da smanje zapreminu ustanovljenih tumora.

[0271] Treba napomenuti da u odsustvu tumorskih ćelija koje eksprimiraju PSMA, nije primećena aktivacija T ćelija.

[0272] Pored toga, kod miševa koji nemaju tumore, uzorci krvi su sakupljeni 4 sata nakon tretmana bispecifičnim antitelom PSMAkCD3 i određeni su nivoi citokina u serumu. Utvrđena su prolazna povećanja nivoa citokina, odnosno interferona-gama (IFN-g), faktora nekroze tumora (TNF), interleukina-2 (IL-2) i interleukina-6 (IL-6), a prolazna povećanja zavise od doze (Sl.-e 2A-2D).

[0273] Da bi se potvrdila specifičnost bispecifičnih antitela, miševi ili humanizovani za PSMA i CD3 ili miševi humanizovani samo za CD3 su dozirani sa 100 mg PSMAxCD3 i ispitani na citokine u serumu (4 sata nakon doze) i prolazni gubitak T ćelija iz krvi (24 sata nakon doze). Tretman sa PSMAxCD3 bispecifičnim antitelom kod humanizovanog T ćelija miša (100 µg/mišu) izaziva akutno povećanje citokina (npr. IFNg) kao i prolazno smanjenje cirkulišućih T ćelija (Sl.-e 3A-3B). Ovaj nalaz reprodukuje promene citokina i T ćelija koje su primećene kod humanih pacijenata koji su lečeni sa tumorskim antigenom x CD3 bispecifičnim antitelima.

[0274] PSMAxCD3 bispecifična antitela su efikasna bez iscrpljivanja efektorskih T ćelija u slezini imunokompetentnih miševa, kao što je prikazano na Sl.-a 4A-4C. Ukratko, humanizovanim miševima PSMA i CD3 Velocigene® implantirani su tumori koji eksprimiraju hPSMA i tretirani su sa PSMAxCD3 dva puta nedeljno. T ćelije su bile prisutne u normalnom broju pri konačnom sakupljanju. Slezine su ispitivane na CD4+ T ćelije, CD8+ T ćelije i Treg-ove na kraju eksperimenta nakon tretmana sa PSMAxCD3 bispecifičnim antitelom dva puta nedeljno tokom studije. Miševima humanizovanim za PSMA i CD3 implantirani su TRAMP-C2_hPSMA tumori i dozirani od dana 0 sa 100 µg ili 10 µg PSMAxCD3. Populacije ćelija u slezini su analizirane protočnom citometrijom. Podaci su analizirani korišćenjem analize varijanse (ANOVA) za sve značajne efekte u poređenju sa kontrolnom grupom izotipa, ali nisu nađene značajne razlike (Sl.-e 4A-4C).

Tabela 9: Efikasnost anti-PSMA/anti-CD3 bispecifičnih antitela u imunokompromitovanim modelima ksenotransplantata

(nastavak)

a m

odelim

enim ngsi

tnim ten pem

unokoim ulatite anihičnecif bisp 3 D

ti-C

A/an

PSM

nti-astsnofika

10:EelaTab

Tabela 11: Efikasnost anti-PSMA/anti-CD3 Bispecifičnih antitela u supresiji ustanovljenog rasta tumora u imunokompetentnom singenom modelu

Primer 9: Dobijanje Anti-CD3 Antitela

[0275] Anti-CD3 antitela su dobijena imunizacijom konstruisanog miša koji sadrži DNK koja kodira varijabilne regione teškog i kapa lakog lanca humanog imunoglobulina sa ćelijama koje eksprimuju CD3 ili sa DNK koja kodira CD3. Imunski odgovor antitela je praćen sa CD3-specifičnim imunskim testom. Kada je postignut željeni imunski odgovor, splenociti su sakupljeni i spojeni sa ćelijama mišjeg mijeloma da bi se sačuvala njihova vijabilnost i obrazovale linije ćelija hibridoma. Linije ćelija hibridoma su pregledane i odabrane da bu se identifikovale ćelijske linije koje proizvode antitela specifična za CD3. Upotrebom ovog postupka dobijeno je nekoliko anti-CD3 himernih antitela (tj., antitela koja imaju humane varijabile domene i mišje konstantne domene). Dodatno, nekoliko potpuno humanih anti-CD3 antitela je izolovano direktno iz antigen-pozitivnih B ćelija bez spajanja sa ćelijama mijeloma, kao što je opisano u US 2007/0280945A1.

[0276] Određene biološke osobine primera anti-CD3 antitela koja su dobijena u skladu sa postupcima iz ovog Primera su detaljno ovde opisani u Primerima.

Primer 10: Sekvence aminokiselina i nukleinskih kiselina varijabilnog regiona teškog i lakog lanca [0277] Tabela 12 prikazuje identifikatore sekvenci aminokiselina varijabilnih regiona teškog i lakog lanca i CDR-e izabranih anti-CD3 antitela. Odgovarajući identifikatori sekvenci nukleinskih kiselina su prikazani u Tabeli 13. Postupci za dobijanje anti-CD3 antitela koji su ovde prikazani se takođe mogu naći u US objavi 2014/0088295.

Tabela 12: Identifikatori sekvenci aminokiselina

(nastavak)

1

Tabela 13: Identifikatori sekvence nukleinskih kiselina

2

(nastavak)

[0278] Antitela se ovde obično pominju u skladu sa sledećom nomenklaturim: Fc prefiks (npr. "H1H," "H1M," "H2M," itd.), nakon čega sledi numerički indentifikator (npr. "2712," "2692," itd., kao što je prikazano u Tabeli 1), koje prati "P," "N," ili "B" sufiks. Prema tome, prema ovoj nomenklaturi, antitelo ovde može biti naznačeno sa, npr., "H1H2712N," "H1M2692N," "H2M2689N," itd. H1H, H1M i H2M prefiksi za oznake antitela koji su ovde korišćeni ukazuju na određeni izotip Fc regiona antitela. Na primer, "H1H" antitelo ima humani IgG1 Fc, "H1M" antitelo ima mišji IgG1 Fc, i "H2M" antitelo ima mišji IgG2 Fc, (svi varijabilni regioni su potpuno humani kao što je naznačeno sa prvim ’H’ u oznaci antitela). Kao što će razumeti osoba koja je uobičajeno verzirana u stanje tehnike, antitelo koje ima određen Fc izotip može da se konvertuje u antitelo sa različitim Fc izotipom (npr., antitelo sa mišjim IgG1 Fc može da se konvertuje u antitelo sa humanim IgG4, itd.), ali u bilo kom slučaju, varijabilni

4

domeni (uključujući CDRs) – koji su naznačeni numeričkim identifikatorima prikazanim u Tabeli 1 – će ostati isti, i očekuje se da osobine vezivanja budu identične ili u sušini identične bez obzira na prirodu Fc domena.

[0279] Tabele 14 i 15 prikazuju identifikatore sekvenci aminokiselina za varijabilne regione teškog lanca (Tabela 14) i varijabilne regione lakog lanca (Tabela 15), i njihove odgovarajuće CDRs, dodatnih anti-CD3 HCVRs i LCVRs koji su korisni u anti-PSMA 3 anti-CD3 bispecifičnim antitelima.

Tabela 14 (Sekvence aminokiselina varijabilnog regiona teškog lanca)

Tabela 15 (Sekvence aminokiselina varijabilnog regiona lakog lanca)

[0280] Varijabilni regioni teškog i lakog lanca CD3-VH-F i CD3-VL-F su dobijeni iz anti-CD3 antitela koji su naznačeni "L2K" kao što je predstavljeno u WO2004/106380.

[0281] Dodatno, Tabele 16 i 17 predstavljaju identifikatore sekvenci za nukleotidne sekvence koje kodiraju varijabilne regione teškog lanca (Tabela 16) i varijabilne regione lakog lanca (Tabela 17), i njihove odgovarajuće CDR-e, dodatnih anti-CD3 HCVR-i i LCVR-i koji su korisni u anti-PSMA X anti-CD3 bispecifičnim antitelima.

Tabela 16 (Nukleotidne sekvence koje kodiraju sekvence varijabilnih regiona teškog lanca)

Tabela 17 (Nukleotidne sekvence koje kodiraju sekvence varijabilnih regiona lakog lanca)

Kontrolni konstrukti koji se koriste u primerima u nastavku

[0282] Različiti kontrolni konstrukti (anti-CD3 antitela) su uključeni u sledećim eksperimentima za uporedne svrhe: "OKT-3," mišje monoklonsko antitelo protiv površinskih antigena humanih T-ćelija dostupno iz američke kolekcije tipa kultura (eng. American Type Culture Collection) (ATCC) pod kataloškim br. CRL-8001; i "SP34," komercijalno dostupno mišje monoklonsko antitelo dobijeno, npr., iz Biolegend, San Diego, CA (Kat. Br.302914) ili BD Pharmagen, Kat.55052, reaktivan protiv epsilon lanca T3 kompleksa na ćelijama humanih T limfocita.

Primer 11: Dobijanje dodatnih Anti-CD3 antitela

[0283] Sledeći postupci su imali za cilj da identifikuju antitela koja su specifično prepoznala CD3 (T ćelijski koreceptor) kao antigen.

[0284] Grupa anti-CD3 antitela je dobijena od genetički modifikovanog miša. Ukratko, miševi su imunizovani sa CD3 antigenom i generisane su B ćelije koje su sadržale raznovrsnost humanih VH rearanžmana kako bi se eksprimirao raznolik repertoar antitela specifičnih za antigen visokog afiniteta. Antitela opisana u Tabelama 18-21 imaju istu sekvencu lakog lanca VK1-39JK5 (LCVR prikazanu u SEQ ID NO: 1386).

[0285] Generisana antitela su testirana na afinitet prema CD3 antigenu humanog i cinomolgus majmuna u in vitro testu vezivanja, i npr. jedno CD3 antitelo: označeno kao CD3-VH-P (HCVR navedeno u SEQ ID NO: 1634) je identifikovano, između nekoliko drugih, za koje je utvrđeno da se vezuju za CD3 čoveka i cinomolgusa koji ima EC50afiniteta između 1 i 40 nM, kao što je određeno u FACS titraciji Jurkat ćelija i cinomolgus T ćelija, tim redom. Vidi, npr. eksperimenti vezivanja FACS-a koji su navedeni u Primeru 5.

[0286] Aminokiselinski ostaci CD3-VH-P germinativne linije su naknadno identifikovani i antitelo označeno kao "CD3-VH-G" je konstruisano da sadrži samo okvirne regione germinativne linije. Drugi derivati antitela su konstruisani dobro poznatim tehnikama molekularnog kloniranja da bi zamenili aminokiselinske ostatke na postepen način na osnovu razlika između sekvence germinativne linije i CD3-VH-P sekvence. Svaki derivat antitela je označen brojem „CD3-VH-G”. Videti Tabelu 18.

[0287] Dok su CD3-VH-G i neka druga konstruisana antitela zadržala svoj afinitet vezivanja kao što se vidi u FACS testovima, nekoliko anti-CD3 antitela vezanih za humani ili cino CD3 in vitro sa slabim ili afinitetom vezivanja koji se ne može izmeriti, kao što je 40 nM EC50. Afiniteti vezivanja, kinetika vezivanja i druga biološka svojstva za razumevanje toksičnosti i farmakokinetički (pK) profili su naknadno ispitani za bispecifična antitela koja sadrže primer anti-CD3 antitela generisanih u skladu sa postupcima iz ovog Primera, detaljno su opisani ovde u Primerima.

Primer 12: Varijabilni regioni teškog i lakog lanca (sekvence aminokiselina i nukleinskih kiselina CDR-a)

[0288] Tabela 18 prikazuje identifikatore aminokiselinske sekvence varijabilnih regiona teškog lanca i CDR-ove izabranih anti-CD3 antitela. Odgovarajući identifikatori sekvence nukleinske kiseline su navedeni u Tabeli 19.

[0289] Za svaku sekvencu teškog lanca antitela određene su sekvence aminokiselina i nukleinskih kiselina. Svakom teškom lancu antitela izvedenom iz sekvence germinativne linije (SEQ ID NO: 1662) dodeljena je oznaka "G" broja za konzistentnu nomenklaturu. Tabela 2 prikazuje identifikatore aminokiselinske sekvence varijabilnih regiona teškog lanca i CDR-ove konstruisanih anti-CD3 antitela. Odgovarajući identifikatori sekvence nukleinske kiseline navedeni su u Tabeli 19. Identifikatori sekvenci aminokiselina i nukleinskih kiselina varijabilnog regiona lakog lanca i CDR-a su takođe identifikovani ispod u Tabelama 20 i 21, tim redom.

Tabela 18: Identifikatori sekvenci aminokiselina teško lanca

(nastavak)

Tabela 19: Identifikatori sekvenci nukleinskih kiselina teško lanca

Tabela 20: Identifikatori sekvenci aminokiselina lako lanca

Table 21: Identifikatori sekvenci nukleinskih kiselina lako lanca

[0290] Kontrolno 1 antitelo označeno "CD3-L2K" je konstruisano na osnovu poznatog anti-CD3 antitela (tj., anti-CD3 antitela "L2K" kao što je navedeno u WO2004/106380).

[0291] Kontrolno antitelo izotipa, pomenuto ovde u Primerima, je antitelo koje se podudara sa izotipom (modifikovani IgG4) koje interaguje sa irelevantnim antigenom, tj. FelD1 antigenom.

Primer 13: Afiniteti vezivanja i kinetičke konstante humanih monoklonskih anti-CD3 antitela izvedene iz površinske plazmonske rezonance

[0292] Afiniteti vezivanja i kinetičke konstante humanih monoklonskih anti-CD3 antitela su određene površinskom plazmonskom rezonancom na 25°C upotrebom formata za hvatanje antitela (Tabele 22, 24 i 26) ili formata za hvatanje antigena (Tabele 23, 25, i 27). Merenja su obavljena na T200 Biacore instrumentu.

[0293] U formatu za hvatanje antitela, površina senzora Biacore je derivatizovana zečjim anti-mišjim Fc za hvatanje hibridoma (prefiks antitela H1M ili H2M) ili mišjim anti-humanim Fc površinom za humana IgG formatirana antitela (prefiks antitela H1H). Rastvorljivi heterodimerni CD3 protein (hCD3-epsilon/hCD3-delta; SEQ ID NOs:1652/1653) sa ili sa humanom Fc tagom (hFcΔAdp/hFc; SEQ ID NOs:1683/1684) ili Fc tagom miša (mFcΔAdp; SEQ ID NOs: 1685/1686) je ubrizgan preko površine uhvaćene antitelom i zabeležen je odgovor vezivanja. Heterodimerni CD3 protein je prečišćen upotrebom postupka koji je opisan u Davis et al. (US2010/0331527).

[0294] U formatu za hvatanje antigena, heterodimerni CD3 protein je uhvaćen upotrebom zečjeg antimišjeg Fc ili mišjeg anti-humanog Fc i odgovarajuća antitela su ubrizgana preko uhvaćenog antigena.

[0295] Antitela su analizirana u njihovom konvencionalnom dvovalentnom formatu (Tabele 22-25) ili u monovalentnoj konfiguraciji sa 1 krakom (Tabele 26-27) u kojoj je drugi Fab iz antitela uklonjen i samo je bio eksprimiran Fc deo (CH2-CH3).

[0296] Konstante brzine kinetičke asocijacije (ka) i disocijacije (kd) određene su obradom i uklapanjem podataka u model vezivanja 1:1 upotrebom softvera za podešavanje krive Scrubber 2.0. Konstante ravnoteže disocijacije vezivanja (KD) i disocijativni poluživoti (t1/2) su izračunati iz konstanti kinetičke brzine kao: KD(M) = kd/ka; i t1/2(min) =(In2/(60*kd). NT = nije testirano; NB = nije primećeno vezivanje.

Tabela 22: Biacore afiniteti vezivanja hibridoma mAt-a (H1M i H2M)

nastavak

Tabela 23: Biacore afiniteti vezivanja hibridoma mAt-a (H1M i H2M)

nastavak

Tabela 24: Biacore afiniteti vezivanja humanih Fc mAt-a (H1H)

1

(nastavak)

2 Tabela 25: Biacore afiniteti vezivanja humanih Fc mAt-a (H1H)

Tabela 26: Biacore afiniteti vezivanja monovalentnih mAt-a sa jednim krakom

(nastavak)

4

Tabela 27: Biacore afiniteti vezivanja monovalentnih mAt-a sa jednim krakom

(nastavak)

[0297] Kao što je prikazano u tabelama 22-27, nekoliko anti-CD3 antitela vezuju CD3, bilo u formatu za hvatanje antitela ili u formatu za hvatanje antigena, sa visokim afinitetom.

Primer 14: Anti-CD3 antitela vezuju i proliferišu humane T-ćelije

[0298] Anti-CD3 antitela su testirana na njihovu sposobnost da se vezuju za humane T-ćelije i indukuju njihovu proliferaciju. Vezivanje je procenjeno korišćenjem Jurkat ćelija (CD3+ humana T-ćelijska linija), dok je proliferacija mononuklearnih ćelija periferne krvi (PBMC) procenjena korišćenjem kvantifikacije katalizovane ATP (CellTiter Glo®). Anti-CD3 antitelo OKT3 delovalo je kao pozitivna kontrola, a irelevantna antitela usklađena sa izotipom su služila kao negativne kontrole.

[0299] FACS podaci su dobijeni korišćenjem sledećeg protokola: Ćelije na 2X10<5>po bunarčiću su inkubirane sa serijski razblaženim antitelima u trajanju od 30 minuta na ledu. Nakon inkubacije, ćelije su isprane i dodato je sekundarno antitelo i inkubirano dodatnih 30 minuta. Nakon inkubacije, ćelije su isprane, ponovo suspendovane u hladnom PBS-u koji sadrži 1% BSA i analizirane protočnom citometrijom sa vijabilnim Jurkat ćelijama koje su zatvorene bočno i napred rasejane. EC50za titraciju vezivanja ćelija su određene upotrebom Prism softvera sa vrednostima izračunatim upotrebom 4-parametarske nelinearne regresione analize.

[0300] Podaci o proliferaciji su dobijeni korišćenjem sledećeg protokola: Humane PBMC (5x10<4>/ bunarčić) su inkubirane sa trostrukim serijskim razblaženjem anti-CD3 i fiksnom koncentracijom komercijalnog anti-CD28 antitela (200 ng/ml) u pločama sa 96 bunarčića tokom 72 h na 37° C. Nakon inkubacije, dodat je CellTiter Glo® i merena je luminiscencija korišćenjem VICTOR X5 čitača ploča sa više oznaka (PerkinElmer). Vijabilnost EC50ćelija (kvantifikacija katalizovana ATP-om) je izračunata korišćenjem 4-parametarske nelinearne regresione analize u GraphPad Prism.

[0301] Rezultati eksperimenata vezivanja i proliferacije sumirani su u tabelama 28-30.

Tabela 28: Anti-CD3 mAt-a hibridoma vezuju & proliferišu humane T-ćelije

(nastavak)

Tabela 29: Humana Fc Anti-CD3 mAt-a vezuju & proliferišu humane T-ćelije

(nastavak)

Tabela 30: Monovalentna Anti-CD3 mAt-a sa jednim krakom vezuju & proliferišu humane T-ćelije

[0302] Kao što je prikazano u Tabelama 7-9, velika većina anti-CD3 antitela vezuje humane T-ćelije i indukuje proliferaciju T-ćelija.

Primer 15: Anti-CD3 antitela vezuju i proliferišu T-ćelije majmuna

[0303] Podset anti-CD3 antitela je testiran za sposobnost da vežu i indukuju proliferaciju T-ćelija majmuna.

[0304] FACS podaci su dobijeni upotrebom sledećeg protokola: Ćelije na 2X10<5>po bunarčiću su inkubirane sa serijski razblaženim antitelima u trajanju od 30 minuta na ledu. Posle inkubacije, ćelije su isprane i dodata su sekundarna antitela i inkubirana dodatnih 30 minuta. Posle inkubacije, ćelije su isprane, ponovo suspendovane u hladnom PBS-u koji sadrži 1% BSA i analizirane protočnom citometrijom. CD4+ T ćelije majmuna su zatvorene bočnim i naprednim rasejanjima, i na CD2+CD4+CD20-populaciji. Vrednosti EC50za titraciju vezivanja ćelija izračunate su korišćenjem 4-parametarske nelinearne regresione analize u GraphPad Prism.

[0305] Podaci o proliferaciji su dobijeni upotrebom sledećeg protokola: Sveže izolovani PBMC dobijeni od majmuna cinomolgusa (5X10<4>/ bunarčiću) su inkubirani sa trostrukim serijskim razblaženjem anti-CD3 antitela i fiksnom koncentracijom komercijalnog anti-CD28 antitela (500 ng/ml) antitelo u pločama sa 96 bunaričića tokom 72 h na 37°C. Posle inkubacije, dodat je CellTiter Glo® i merena je luminiscencija korišćenjem VICTOR X5 čitača ploča sa više obeleživača (PerkinElmer). Vrednosti EC50vijabilnosti ćelija (kvantifikacija katalizovana ATP-om) je izračunata upotrebom 4-parametarske nelinearne regresione analize u GraphPad Prism.

[0306] Rezultati eksperimenata vezivanja i proliferacije sumirani su u Tabelama 31 i 32.

Tabela 31: Anti-CD3 mAt-a vezuju & proliferišu PBMC-e majmuna

(nastavak)

Tabela 32: Monovalentna Anti-CD3 mAt-a sa 1-krakom vezuju & proliferišu PBMC-e majmuna

[0307] Kao što je prikazano u Tabelama 31 i 32, nekoliko anti-CD3 antitela vezuju CD2+CD4+ T-ćelije majmuna i indukuju njihovu proliferaciju. OKT3 nije pokrenuo proliferaciju PBMC majmuna, dok je SP34 bio aktivan protiv PBMC-a majmuna.

Primer 16: Anti-CD3 mAt-a podržavaju ubijanje tumorskih ćelija posredovano sa T-ćelijama [0308] Sposobnost anti-CD3 antitela da preusmere ubijanje posredovano T-ćelijama putem Fc/FcR interakcija je ispitivana upotrebom testa ubijanja U937 zasnovanog na kalceinu. Ukratko, humane PBMC su izolovane preko Ficoll-Paque-a i aktivirane tokom nekoliko dana sa medijumom koji sadrži humani IL-2 (30 U/ml) i zrnca za aktivaciju T-ćelija (anti-CD3/CD28). Ćelije U937 su obeležene kalceinom, i zatim su inkubirane sa aktiviranim T-ćelijama u odnosu efektor: ciljna 10:1 upotrebom trostrukih serijskih razblaženja antitela tokom 3 sata na 37°C. Nakon inkubacije, ploče su centrifugirane i supernatanti su prebačeni u providnu crnu ploču sa prozirnim dnom za fluorescentnu analizu. EC50 vrednosti, definisane kao molarna koncentracija CD3 antitela koje indukuje 50% citotoksičnosti, izračunate su korišćenjem 4-parametarske nelinearne regresione analize u GraphPad Prism. Rezultati dobijeni upotrebom antitela hibridoma, humanih Fc antitela i monovalentnih jednokrakih antitela prikazani su redom u Tabelama 33, 34 i 35.

Tabela 33: Anti-CD3 mAt-a hibridoma preusmeravaju ubijanje T-ćelija na U937 ćelije

1

(nastavak)

Tabela 34: Humana Fc formatirana Anti-CD3 mAt-a preusmeravaju ubijanje T-ćelija na U937 ćelije

2

(nastavak)

Tabela 35: Monovalentna Anti-CD3 mAt-a sa 1-krakom preusmeravaju ubijanje T-ćelija na U937 ćelije

[0309] Kao što je prikazano u Tabelama 33-35, većina anti-CD3 antitela, kao i OKT3, podržavaju preusmereno ubijanje posredovano T-ćelijama u ovom sistemu analize. Uočeno ubijanje, za koje se veruje da zavisi od angažovanja Fc antitela sa Fc receptorom na ćelijama U937, što je dovelo do grupisanja CD3 na susednim T-ćelijama, zaustavljeno je dodavanjem nespecifičnog humanog IgG (podaci nisu prikazani).

4

Claims

Patentni zahtevi

1. Bispecifični molekul za vezivanje antigena koji sadrži prvi domen za vezivanje antigena koji specifično vezuje humani CD3, i drugi domen za vezivanje antigena koji specifično vezuje humani PSMA,

pri čemu prvi domen koji se vezuje za antigen koji se specifično vezuje za humani CD3 obuhvata varijabilni region teškog lanca (HCVR) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1514 ili SEQ ID NO: 1618, i varijabilni region lakog lanca (LCVR) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1386, i

pri čemu drugi domen za vezivanje antigena koji se specifično vezuje za humani PSMA obuhvata varijabilni region teškog lanca (HCVR) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 66, i varijabilni region lakog lanca (LCVR) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1386.

2. Bispecifični molekul za vezivanje antigena prema zahtevu 1, gde prvi domen za vezivanje antigena koji specifično vezuje humani CD3 obuhvata HCVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1514.

3. Bispecifični molekul za vezivanje antigena prema zahtevu 1, gde prvi domen za vezivanje antigena koji specifično vezuje humani CD3 obuhvata HCVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1618.

4. Bispecifični molekul koji vezuje antigen prema bilo kom od zahteva 1 do 3, što:

(i) drugi domen za vezivanje antigena vezuje humane ćelije koje eksprimiraju humani PSMA i ćelije majmuna cinomolgusa koje eksprimiraju PSMA cinomolgusa;

(ii) molekul koji vezuje antigen inhibira rast tumora kod imunokompromitovanih miševa koji nose ksenotransplantate humanog kancera prostate;

(iii) molekul koji vezuje antigen inhibira rast tumora kod imunokompetentnih miševa koji nose ksenotransplantate humanog kancera prostate;

(iv) molekul koji vezuje antigen potiskuje rast tumora ustanovljenog tumora kod imunokompromitovanih miševa koji nose ksenotransplantate humanog kancera prostate; ili (v) molekul koji vezuje antigen smanjuje rast tumora ustanovljenih tumora kod imunokompetentnih miševa koji nose ksenotransplantate humanog kancera prostate.

5. Bispecifični molekul koji vezuje antigen prema bilo kom od zahteva 1 do 4, što:

(i) molekul koji se vezuje za antigen indukuje ubijanje tumorskih ćelija posredovano T ćelijama sa vrednošću EC50manjom od oko 1,3 nM, kao što je mereno u in vitro testu ubijanja tumorskih ćelija posredovano sa T ćelijama; i/ili

(ii) drugi domen za vezivanje antigena specifično vezuje humani PSMA sa KDvrednošću manjom od oko 80 nM, kao što je mereno u in vitro testu vezivanja površinskom plazmonskom rezonancom; i/ili

(iii) drugi domen za vezivanje antigena specifično vezuje svaki od humanih PSMA sa vrednošću KDmanjom od oko 5 nM, manjom od oko 2 nM, manjom od oko 1 nM, manjom od oko 800 pM ili manjom od oko 600 pM, kao što je mereno u in vitro testu vezivanja površinskom plazmonskom rezonancom.

6. Bispecifični molekul koji se vezuje za antigen prema bilo kom od zahteva 1 do 5 koji je bispecifično antitelo ili njegov bispecifični fragment koji vezuje antigen.

7. Farmaceutska kompozicija koja sadrži bispecifični molekul koji vezuje antigen prema bilo kom od zahteva 1 do 6 i farmaceutski prihvatljiv nosač ili razblaživač.

8. Farmaceutska kompozicija prema zahtevu 7 za upotrebu u postupku za lečenje kancera kod subjekta.

9. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema zahtevu 8, što je kancer izabran iz grupe koju čine kancer prostate, kancer bubrega, kancer bešike, kolorektalni karcinom i kancer želudca.

10. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema zahtevu 8, što je kancer kancer prostate, opciono kancer prostate otporan na kastraciju.