RS64025B1 - Soli volframa (vi) za stimulaciju plodnosti i reprodukcije i za poboljšanje efikasnosti tehnika potpomognute reprodukcije - Google Patents

Description

Opis

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na soli volframa (VI) i kompozicije koje ih sadrže, za upotrebu u pospešivanju normalne reprodukcije i plodnosti ženke sisara koja nema dijabetes, kao i za poboljšavanje efikasnosti tehnike potpomognute reprodukcije primenjene kod sisara, kao što je definisano u priloženim patentnim zahtevima.

STANJE TEHNIKE

[0002] Plodnost kod sisara je višestepeni proces koji nije sasvim efikasan prirodno. Faktori kao što su starosna dob, navike u ishrani ili stil života, između ostalog, moduliraju uspeh ovog procesa. U ovom smislu, poznato je, na primer, da stopa zatrudnjivanja kod žena starih 20 do 24 godine iznosi 86%, dok se kod žena starih 35 do 32 godine smanjuje na 50% [Management of the Infertile Woman by Helen A. Carcio; The Fertility Sourcebook by M. Sara Rosenthal, ASAS Summary of FAIR 2012]. Drugi faktori kao što su prekomerna težina ili nedovoljna težina takođe su odgovorni za odloženo ostvarivanje trudnoće prirodnim putem ili čak za nemogućnost da se trudnoća ostvari [Fertil Steril 2013;100:631-7]. Procenjuje se da oko 66% parova ne ostvaruje začeće prirodnim putem tokom prva 3 meseca seksualnih odnosa bez zaštite. Ova cifra se smanjuje na 15% parova tokom prve godine seksualnih odnosa bez zaštite. Neplodnost se definiše (WHO, ASRM, NICE) kao nemogućnost začeća nakon 12 meseci redovnih seksualnih odnosa bez zaštite. Termin "smanjena plodnost" se takođe koristi, naročito u Evropi, kako bi se definisali parovi sa nekim oblikom ili stepenom smanjene plodnosti koji dovodi do odloženog začeća [Gnoth C et al Definition and prevalence of subfertility and infertility, Human reproduction 2005;20(5): 1144-1147].

[0003] Glavni uzroci neplodnosti kod žena uključuju poremećaje ovulacije, patološka stanja reproduktivnog trakta, snižen kvalitet oocita i smanjenje broja folikula svojstveno starenju. Međutim, postoji takođe i značajan procenat žena sa neobjašnjenom neplodnošću, koja se označava i kao idiopatska neplodnost, za koju se jedan od uzroka odnosi na nedostatke prilikom procesa implantacije.

[0004] Razvoj folikula, ovulacija, migracija nezrele jajne ćelije (oocita), kao i začeće i implantacija zigota u zid materice koji slede, regulišu se lučenjem hormona nekih endokrinih organa kao što su hipofiza, hipotalamus i štitna žlezda, na primer. Među različitim biološkim uzrocima neplodnosti kod žena takođe mogu da se istaknu uzroci povezani sa poremećajima hormonskih stimulusa koji regulišu čitav ovaj proces.

[0005] Poznati su različiti tretmani za žensku neplodnost, koji uključuju, između ostalog, primenu lekovitih proizvoda za lečenje hormonskih problema koji uključuju poremećaj ovulacije (kao što su klomifen citrat ili gonadotropini, na primer). Slično tome, postulirani su neki blagotvorni efekti sa različitim tretmanima na bazi uzimanja vitaminskih suplemenata, naročito vitamina B, vitamina C, vitamina E i folne kiseline, mineralnih suplemenata kao što su kompleksi ili soli selena, cinka ili gvožđa, esencijalnih masnih kiselina (omega-3), kao i ekstrakata biljaka kao što su konopljika (Vitex agnus-castus), damijana, sladić, cvet crvene deteline, biberovac, crni kohoš, kineska anđelika (Angelica sinensis), divlji jam ili slatki krompir (Dioscorea villosa), koren lažnog jednoroga, zeleni čaj, kopriva (Urtica dioica), divlji ječam (Avena sativa), maslačak (Taraxacum officinale), itd., iako efikasnost nije jasno pokazana za bilo koji od ovih tretmana.

[0006] Procenat trudnoća koje su ostvarene posredstvom prethodno pomenutih tretmana je ograničen. U ovom smislu, na primer, uočeno je da tretman žena sa neredovnom ovulacijom ili bez ovulacije, primenom klomifen citrata, leka iz familije stilbena, omogućava uspostavljanje ovulacije u visokom procentu, ali da stopa zatrudnjivanja ostaje niska, jednaka ili manja od 50%.

[0007] Tretmani in vitro fertilizacije su veoma efikasni u koraku oplođenja oocita. Međutim, stopa implantacije embriona u zid materice je niska. Zbog toga su zastupljeniji višestruki trasferi embriona po svakom ciklusu in vitro fertilizacije, što za posledicu ima viši procenat rizičnih višeplodnih trudnoća.

[0008] Na kraju, poznato je da metabolički poremećaji kao što su dijabetes ili gojaznost povlače sa sobom i ograničenje plodnosti. Poznato je da delimičan ili potpun oporavak od glikemije, insulinemije i/ili problematične telesne težine kod ženki miša sa dijabetesom ili gojaznošću, koje imaju oštećenu reproduktivnu funkciju, uključuje poboljšanje plodnosti.

[0009] Pokazano je da različiti farmakološki tretmani, kao što su metformin ili soli volframa (VI), ili čak i promene načina života, poboljšavaju dijabetes ili insulinske poremećaje, kao što je insulinska deficijencija, insulinska rezistencija, na primer, čime se potpuno ili delimično ponovo uspostavlja reproduktivna funkcija, kada je neplodnost posledica dijabetesa ili insulinskih poremećaja.

[0010] U specifičnom slučaju natrijum volframata, poznato je da se kod pacova sa dijabetesom ili insulinopenijom koji su indukovani injekcijom streptozotocina ponovo delimično uspostavljaju nivoi insulina u cirkulaciji nakon produženog tretmana (10 nedelja) natrijum volframatom, kao posledica delimične reverzije dijabetesa. Nakon toga, kada se ženke pacova koje su se delimično oporavile od dijabetesa, pare sa zdravim mužjacima pacova, uočava se da se kod njih, paralelno sa delimičnim oporavkom od dijabetesa, delimično iznova uspostavlja i njihova sposobnost za reprodukciju. Konkretno, uočava se da se procenat porođaja u odnosu na broj pozitivnih kiretaža kod ženki miša koje su se delimično oporavile od dijabetesa posle tretmana natrijum volframatom povećava na 66%, što je niži procenat nego kod ženki miša koje nemaju dijabetes, gde taj procenat iznosi 100%. (uporediti sa J. Ballester et. al., "Tungstate administration improves the sexual and reproductive function in female rats with streptozotocininduced diabetes", Human Reproduction, 2007, vol. 22, pp. 2128-2135). Međutim, nije ni uočeno ni postulirano da soli volframa (VI) deluju na ženke životinja koje nemaju dijabetes.

[0011] Volfram se nalazi u tragovima u životinjama i biljkama. Na primer, kod biljaka je opisan sadržaj volframa od maksimalno 100 mg/kg [Gbaruko B.C. & Igwe J.C. Global Tungsten: Occurrence, Chemistry, Environmental and Health Exposure Issues. Journal of Environmental Research 2007;1(1):27-32].

[0012] Imajući u vidu prethodno navedeno, uprkos opsežnom istraživanju i napretku u poznavanju i intervencijama prilikom procesa reprodukcije kod sisara, a posebno kod ljudi, još uvek postoje mnogi parovi koji nemaju koristi od različitih pristupa koji su trenutno dostupni za povećanje plodnosti, s obzirom da su oni neefikasni. Dakle, i dalje postoji potreba za iznalaženjem novih alternativa za poboljšanje prirodne reproduktivne efikasnosti.

OPIS PRONALASKA

[0013] Sada je utvrđeno da je primena soli volframa (VI) ili solvata navedene soli efikasna u lečenju neplodnosti kod ženski sisara koje nemaju dijabetes, za pospešivanje normalnog razmnožavanja i plodnosti kod ženki sisara koje nemaju dijabetes, i za povećanje efikasnosti tehnika potpomognute reprodukcije primenjenih kod sisara. Uprkos činjenici da je poznato da natrijum volframat može delimično da dovede do reverzije poremećaje u reproduktivnoj funkciji ženki miševa koje imaju dabetes jer normalizuje nivo glukoze u krvi, mogućnost da natrijum volframat utiče na funkciju ženskog reproduktivnog sistema kod ženki sisara koje nemaju dijabetes, a koja bi bila predstavljena kao tretman za neplodnost i/ili pospešivanje normalne reprodukcije i plodnosti kod ženki sisara koje nemaju dijabetes, nije opisana niti predložena. Efikasnost primene soli volframa za lečenje neplodnosti ili za poboljšanje ili normalizaciju plodnosti je sada demonstrirana kroz životinjski model, konkretno ženke IRS2-/- miševa, kao što je prikazano u primerima prema predmetnom pronalasku. Efekat soli volframa na implantaciju embriona je takođe demonstriran u istom životinjskom modelu koji je naznačen prethodno u tekstu, kao i pozitivan efekat na endometrijalnu adheziju embriona, na osnovu in vitro testa, čiji su rezultati takođe navedeni u primerima.

[0014] Dakle, prvi aspekt predmetnog pronalaska se odnosi na volframovu (VI) so ili njen solvat, za upotrebu u terapeutskom postupku za poboljšanje normalne reprodukcije i plodnosti kod ženki sisara koje nemaju dijabetes i nisu neplodne, ili u terapijskom postupku poboljšanja efikasnosti tehnike potpomognute reprodukcije kod sisara, pri čemu postupak poboljšanja efikasnosti tehnike potpomognute reprodukcije kod sisara nije postupak za upotrebu u lečenju neplodnosti ženki kod sisara koji nemaju dijabetes, u vezi sa intrauterinom inseminacijom ili in vitro tehnikom fertilizacije, i pri čemu se volframova (VI) so ili njen solvat primenjuju kod navedenog sisara.

[0015] Drugi aspekt predmetnog pronalaska se odnosi na kompoziciju koja sadrži so volframa (VI) ili njen solvat u koncentraciji većoj od 100 mg/kg, kao i najmanje jedan farmaceutski ili dijetetski prihvatljiv ekscipijens ili vehikulum, za upotrebu u terapeutskom postupku za poboljšanje normalne reprodukcije i plodnosti kod ženke sisara koja nema dijabetes ili u terapeutskom postupku za poboljšanje efikasnosti tehnike potpomognute reprodukcije primenjene kod sisara, i pri čemu se kompozicija primenjuje kod navedenog sisara.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0016] Kao što je navedeno prethodno u tekstu, prema prvom aspektu predmetni pronalazak se odnosi na volframovu (VI) so ili njen solvat, za upotrebu u terapeutskom postupku za poboljšanje normalne reprodukcije i plodnosti kod ženki sisara koje nemaju dijabetes i nisu neplodne, ili u terapijskom postupku poboljšanja efikasnosti tehnike potpomognute reprodukcije kod sisara, pri čemu postupak poboljšanja efikasnosti tehnike potpomognute reprodukcije kod sisara nije postupak za upotrebu u lečenju neplodnosti ženki kod sisara koji nemaju dijabetes, u vezi sa intrauterinom inseminacijom ili in vitro tehnikom fertilizacije, i pri čemu se volframova (VI) so ili njen solvat primenjuju kod navedenog sisara.

[0017] Termin "pospešivanje normalne reprodukcije i plodnosti" ili "koji doprinosi normalnoj reprodukciji i plodnosti" odnosi se na doprinos normalnoj reprodukciji i plodnosti ili poboljšanje normalne reprodukcije ili plodnosti (smanjenje vremena za koje se ostvaruje trudnoća), pri čemu se pod "normalna reprodukcija i plodnost" podrazumeva stanje plodnosti u kome se trudnoća ostvaruje u skladu sa definicijama obezbeđenim u nastavku teksta:

* u situaciji kada je plodnost smanjena: trudnoća se ostvaruje u periodu od 12 meseci redovnih seksualnih odnosa bez zaštite; i

* u situaciji kada je prisutna neplodnost: trudnoća se ostvaruje nakon perioda od 12 meseci redovnih seksualnih odnosa bez zaštite. Ovde su uključeni potreba ponovnog uspostavljanja i/ili pospešivanja ovulacije, poboljšanje kvaliteta oocita i embriona, povećanje implantacije zigota u zid materice, regulacija oštećenja osovine hipotalamushipofiza-jajnici, uključujući sindrom policističnih jajnika, metabolički sindrom, hiperprolaktinemiju, endometriozu, hipotireozu, multiplu sklerozu, reumatoidni artritis, eritematozni lupus, cirozu, reumatoidni artritis, celijakiju, hroničnu bubrežnu insuficijenciju, idiopatske uzroke i poremećaje ishrane kao što su anoreksija nervoza i bulimija.

[0018] U kontekstu predmetnog pronalaska, izraz "tehnika potpomognute reprodukcije" obuhvata bilo koju tehniku potpomognute reprodukcije ili veštačku inseminaciju, koje se posmatraju kao grupa biomedicinskih tehnika ili postupaka koji olakšavaju ili zamenjuju najmanje jedan prirodan proces koji se odigrava tokom reprodukcije. Oni uključuju, ali nisu ograničeni na, indukciju ovulacije, veštačku inseminaciju (uključujući veštačku inseminaciju spermom donora) i in vitro inseminaciju (uključujući inseminaciju donorske jajne ćelije ili inseminaciju spermom donora). Dakle, tehnika potpomognute reprodukcije može da se primenjuje usled razloga za neplodnost ili smanjenu plodnost, kako kod ženke sisara (kao što je prethodno u tekstu definisano), tako i kod mužjaka sisara (na primer, promene spermatozoida koje se odražavaju na spermogram, kao što su promene pokretljivosti spermatozoida, promene vitalnosti smermatozoida, kao i promene morfologije spermatozoida). Tehnika potpomognute reprodukcije takođe može da se primenjuje kod žena koje, iako nemaju ni jedan problem sa plodnošću sam po sebi, moraju da pribegnu tehnici iz različitih razloga, na primer (ali ne i ograničeno na), žene bez partnera kojima je neophodno doniranje sperme, parovi koji moraju da pribegnu doniranju jajne ćelije i/ili sperme usled genetičke ili neke druge vrste nekompatibilnosti, ili kod domaćih životinja kod kojih je potreban transfer embriona kako bi se povećala produktivnost. Ove tehnike potpomognute reprodukcije u principu imaju smanjenu stopu uspeha od manje od 50% ili čak 40%. Razlog za to je činjenica da upotreba tehnika potpomognute reprodukcije ima inherentno smanjenu efikasnost procesa reprodukcije. Jedan od glavnih uzroka za ovu nisku efikasnost reprodukcije kada se koriste tehnike potpomognute reprodukcije, odnosi se na teškoće prilikom procesa adhezije embriona i implantacije.

[0019] U kontekstu predmetnog pronalaska, izraz "poboljšanje" u izrazu "poboljšanje efikasnosti tehnike potpomognute reprodukcije", odnosi se na povećanje stope uspeha ovih tehnika potpomognute reprodukcije. Dakle, ako je stopa uspeha u starosnom opsegu sisarskog para kod koga je primenjena tehnika potpomognute reprodukcije bila, preme prethodnim statističkim podacima, 43% na primer, viša stopa od 44% bi uključila poboljšanje efikasnosti ove tehnike. Ovo poboljšanje je u najvećoj meri posledica pospešivanja adhezije i implantacije embriona kao rezultat primene soli volframa (VI).

[0020] Iako se tehnika potpomognute reprodukcije primenjuje zbog promene plodnosti mužjaka sisara iz para, usled poboljšanja adhezije i implantacije embriona, soli volframa (VI) biće primenjene najmanje kod ženke sisara. Alternativno, soli tungstena (VI) mogu da se primenjuju i kod ženke sisara i kod mužjaka sisara.

[0021] Sisar u kontekstu predmetnog pronalaska može da bude bilo koji sisar, uključujući, ali ne i ograničeno na, ljude, miševe, pacove, zečeve, pse, mačke, zamorce, hrčke, krave, konje, svinje, ovce, koze, itd. Prema specifičnom primeru izvođenja, sisar je čovek.

[0022] Prema drugom specifičnom primeru izvođenja, navedena so se primenjuje u dnevnoj dozi između 0,001 mg i 1000 mg soli volframa (VI) po kg telesne težine ženke sisara.

[0023] U drugom specifičnom primeru izvođenja, so volframa (VI) sadrži anjon volframa (VI) i farmaceutski ili veterinarski prihvatljiv katjon. "Farmaceutski ili veterinarski prihvatljiv katjon" odnosi se na bilo koji prihvatljiv, netoksičan, organski ili neorganski katjon koji može da obrazuje terapeutski efikasnu so volframa (VI) i koji je pogodan za njenu upotrebu u terapiji lekovima ili veterinarskoj terapiji. Katjon je poželjno alkalni ili zemnoalkalni katjon. Katjon je poželjnije odabran iz grupe koja se sastoji od natrijuma, kalijuma, magnezijuma, kalcijuma i cinka. Prema specifičnom primeru izvođenja, katjon je natrijum. Prema drugom specifičnom primeru izvođenja, katjon je cink.

[0024] Anjon volframa (VI) u soli volframa (VI), poželjno je izabran od WO4<2->, HWO4-, W2O7<2->i HW2O7- jona. Anjon je poželjno WO4<2->.

[0025] Prema dodatnom specifičnom primeru izvođenja, solvat soli volframa (VI) je hidrat, poželjnije dihidrat.

[0026] Sva svojstva koja su pojedinačno navedena za različite elemente pronalaska mogu da se kombinuju međusobno, pri čemu su sve moguće kombinacije uključene u obim predmetnog pronalaska. na primer, prema poželjnom primeru izvođenja, solvat soli volframa (VI) je dihidrat i katjon je katjon natrijuma. Slično tome, predviđeno je da preostale moguće kombinacije budu uključene u obim predmetnog pronalaska.

[0027] Dodatan aspekt pronalaska je kompozicija koja sadrži so volframa (VI) ili njen solvat kao što je definisano prethodno u tekstu, u koncentraciji koja je jednaka ili veća od 100 mg/kg i najmanje jedan farmaceutski, veterinarski ili dijetetski prihvatljiv ekscipijens ili vehikulum, za upotrebu u terapeutskom postupku za poboljšanje normalne reprodukcije i plodnosti kod ženke sisara koja nema dijabetes ili u postupku za poboljšanje efikasnosti tehnike potpomognute reprodukcije primenjene kod sisara.

[0028] Izraz "farmaceutski, veterinarski ili dijetetski prihvatljiv ekscipijens ili vehikulum" odnosi se na ekscipijense ili vehikulume koji su pogodni za upotrebu u farmaceutskim, veterinarskim i prehrambenim tehnologijama za pripremu kompozicija. Ove komponente, ekscipijensi ili nosači moraju da budu kompatibilni sa drugim sastojcima kompozicije. Takođe moraju da budu pogodni za upotrebu u kontaktu sa tkivom ili organom ljudskih bića i životinja bez prekomerne toksičnosti, iritacije, alergijskog odgovora ili drugih problema i komplikacija usled imunogenosti, u razumnom odnosu koristi i rizika. Oni su supstance koje nemaju farmakološku aktivnost u koncentracijama koje su prisutne u farmaceutskom obliku. Ekscipijensi ili vehikulumi se koriste kako bi farmaceutskom ili veterinarskom obliku obezbedili karakteristike koje osiguravaju stabilnost, biološku raspoloživost, prihvatljivost i lakoću primene jednog ili više aktivnih sastojaka. Što se tiče mere u kojoj ekscipijensi utiču na oslobađanje aktivnog sastojka, oni su u mogućnosti da modifikuju magnitudu i vremenski profil farmakološke aktivnosti leka, posredstvom promena njegove biološke raspoloživosti. Ekscipijensi se takođe koriste kako bi obezbedili pogodan oblik ili konzistenciju za preparaciju. Primeri tipova ekscipijenasa: sredstva za solubilizaciju, dezitegratori ili sredstva za dezintegraciju, emulgatori (agensi za emulgovanje), boje, arome, sredstva za vezivanje, antioksidansi, lubrikansi, konzervansi, sredstva za zgušnjavanje, itd.

[0029] Prema poželjnom primeru izvođenja, ekscipijens ili vehikulum je farmaceutski ili veterinarski prihvatljiv, a kompozicija je farmaceutska kompozicija za tretman nepolodnosti kod ženke sisara koja nema dijabetes ili za povećanje efikasnosti tretmana potpomognute reprodukcije koji se primenjuje kod sisara.

[0030] Farmaceutska kompozicija je poželjno u obliku pilule, tablete, pastile, kapsule, praška, obloge, šumećeg praška ili tableta, rastvora, suspenzije, sirupa ili granula.

[0031] Prema drugom poželjnom primeru izvođenja, kompozicija je prehrambena kompozicija za pospešivanje normalne reprodukcije i plodnosti kod ženke sisara koja nema dijabetes.

[0032] Prehrambena kompozicija može da bude tečna kompozicija ili napitak, čvrsta kompozicija ili nutritivni suplement ili komplement (takođe označen i kao dijetetski ili prehrambeni suplement ili komplement). U kontekstu predmetnog pronalaska, termin "prehrambena kompozicija" bi obuhvatao bilo koju čvrstu ili tečnu hranu koja je obogaćena solju volframa (VI) kao i bilo koji nutritivni suplement ili komplement koji sadrži najmanje jednu so volframa (VI).

[0033] Prehrambena kompozicija može da bude tečna kompozicija, tj. napitak, u skladu sa terminima koji se koriste u najopštijem smislu u društvu. U kontekstu predmetnog pronalaska, ovakva tečna kompozicija uključuje, ali nije ograničena na, bilo koji napitak odabran iz grupe koja se sastoji od životinjskog ili biljnog mleka, kao i bilo koji njegov derivat, kao što su, na primer, mlečni šejkovi, jogurt, kefir, itd.; voće i/ili biljni sokovi; mineralna voda ili gazirana voda, ili aromatizovana ili zaslađena (pomoću nutritivnih zaslađivača (saharoza, fruktoza...) ili veštačkih zaslađivača) voda ili napici, začini, kao što su na primer, bilo koja salsa, dresing, kečap, ulje, sirće ili preparat sirćeta; alkoholni napici bilo kog tipa; čaj, kafa, kao i svi tipovi osvežavajućih pića ili bezalkoholnih pića, ili energetski napici.

[0034] Prehrambena kompozicija može da bude i čvrsta kompozicija. Ovakva čvrsta kompozicija može, na primer, da bude odabrana iz, ali ne ograničeno na, grupe koja se sastoji od derivata životinjskog ili biljnog mleka, kao što su sir, puter, margarin i tofu; bilo koje vrste hleba, uključujući svež, upakovan ili smrznuti hleb, narezan hleb, hleb od integralnog brašna, začinjeni hleb, slatki hleb, slani hleb, itd; testenine pripremljena od bilo kog brašna od žitarica, kao što je pšenično brašno ili griz (makaroni, špageti, rezanci, itd.); peciva, uključujući kolače, keks, mafine, krofne, itd.; infuzija, čaja ili kafe, u rinfuzi ili u kesicama, za pripremu napitaka; želea, bombona, uključujući gumene bombone, poznatije kao "meke voćne bombone"; kao i bilo koje vrste čvrstih začina, na primer, origano, so, korijander, peršun, bosiljak, itd, ili njihovih mešavina.

[0035] Konačno, prehrambena kompozicija može takođe da bude nutritivni, dijetetski ili prehrambeni suplement ili komplement, pri čemu se bilo koji od ovih termina koristi u kontekstu predmetnog pronalaska na ekvivalentan način. Ovi termini se normalno koriste za kompozicije koje se konzumiraju oralno, koje sadrže sastojak namenjen dopunjavanju ishrane, u slučaju predmetnog pronalaska, so/soli volfrma (VI). Oni nikada ne mogu da zamene konvencionalnu hranu ili da budu jedina komponenta obroka ili ishrane. Oni mogu da se nađu u različitim oblicima, kao što su pastile, pilule, tablete, kapsule, meke želatinske kapsule, želatinske kapsule, obloge, šumeće tablete, tečnosti (rastvor, suspenzija, sirup), granule i praškovi, koji su svi uključeni, kao specifični primeri izvođenja, u obim predmetnog pronalaska. Dijetetski ili farmaceutski prihvatljivi ekscipijensi za dobijanje ovih različitih oblika su očigledni za stručnjaka u oblasti, i uključeni su u obim predmetnog pronalaska.

[0036] Prema specifičnom primeru izvođenja, bilo koja od prethodnih kompozicija (farmaceutska kompozicija, čvrsta kompozicija, tečna kompozicija ili nutritivni suplement/komplement) sadrži u svom sastavu najmanje jedan nutritivni zaslađivač, kao što je saharoza ili fruktoza. Ingestija ovih nutritivnih zaslađivača mora da se kontroliše i ograniči kod pacijenata sa dijabetesom, stoga bi prehrambena kompozicija koja sadrži ovakav nutritivni zaslađivač bila kontraindikovana kod sisara sa dijabetesom ili bi se o njoj u najmanju ruku vodilo računa prilikom kontrole njegove ishrane.

[0037] Prema specifičnom primeru izvođenja, ženka sisara koja nema dijabetes je odabrana iz grupe koja se sastoji od ženki sisara koje zahtevaju obnavljanje i/ili pospešivanje ovulacije, poboljšanje kvaliteta oocita i embriona, povećanje implantacije zigota u zid materice, regulaciju oštećenja osovine hipotalamus-hipofiza-jajnici, uključujući sindrom policističnih jajnika, metabolički sindrom, hiperprolaktinemiju, endometriozu, hipotireozu, multiplu sklerozu, reumatoidni artritis, eritematozni lupus, cirozu, reumatoidni artritis, celijakiju, hroničnu bubrežnu insuficijenciju, idiopatske uzroke i poremećaje ishrane kao što su anoreksija nervoza i bulimija.

[0038] Prema drugom konkretnom primeru izvođenja, ženka sisara koja nema dijabetes je odabrana iz grupe koja se sastoji od ženki sisara koje imaju insulinsku rezistenciju (koja je poznata i kao rezistencija na insulin ili insulinična rezistencija); kada se insulinska rezistencija javlja zajedno sa hiperglikemijom, ona može da dovede do razvoja dijabetesa, ali bez obzira na to, sama insulinska rezistencija ne dovodi do stanja dijabetesa. Ženke sisara koje imaju insulinsku rezistenciju su poželjno odabrane iz grupe koja se sastoji od ženki sisara koje imaju jedno ili više od sledećih stanja: gojaznost ili prekomernu težinu, metabolički sindrom, predijabetes, sindrom policističnih jajnika, hipertenziju, srčane bolesti, hiperlipidemije ili dislipidemije, hipertireozu, hiperparatireozu, hiperleptinemija ili reyistenciju na leptin, sedentarni način života, poremećaje u ishrani, opstruktivni sindrom apneje u snu, neuhranjenost fetusa, Prader-Vilijev sindrom, Rabson-Mendenhalov sindrom, masnu jetru, leprikonizam, patologije povezane sa prekomernim lučenjem glukokortikoida (npr. akromegalija), insulinsku rezistenciju uzrokovanu farmakološkim tretmanima (npr. glukokortikoidima, tiazidnim diureticima, beta-blokatorima), stres ili ranu menarhu [Egas Béjar, Daniela et. al Insulinorresistencia/lnsulin resistance Medicina (Guayaquil); 10(2): 159-166, April 2005; Graves, Thomas K. WHY ISN'T THIS INSULIN WORKING? Western Veterinary Conference 2013 (SA113); Ximena Gaete V. Adelanto de la pubertad en Chile y el mundo. Rev Chil Pediatr 77 (5); 456-465, 2006; Leszek Szablewski Glucose Homeostasis and Insulin Resistance (elSBN:

1

978-1-60805-) Bentham e-books]. Mnoge od ovih indikacija su opisane kao nepovezane sa neplodnošću, uključujući predijabetes. [ Acta Diab. Latina 4, 507, 1967].

[0039] U kompozicijama prema pronalasku, so ili soli volfrma (VI) ili njihov solvat, prisutni su u koncentraciji od najmanje 100 mg/kg. Prema specifičnim primerima izvođenja, so ili soli volframa (VI) sadržane su u kompoziciji u koncentracijama od najmanje 150 mg/kg, najmanje 200 mg/kg, najmanje 250 mg/kg, najmanje 300 mg/kg, najmanje 350 mg/kg, najmanje 400 mg/kg, najmanje 450 mg/kg, najmanje 500 mg/kg, najmanje 550 mg/kg, najmanje 600 mg/kg, najmanje 650 mg/kg, najmanje 700 mg/kg, najmanje 750 mg/kg, najmanje 800 mg/kg, najmanje 850 mg/kg, najmanje 900 mg/kg ili najmanje 850 mg/kg.

[0040] Prema drugom specifičnom primeru izvođenja, ukupna koncentracija soli volframa (VI) je jednaka, ili manja od 1000 mg/kg.

[0041] Prema drugom specifičnom primeru izvođenja, prehrambena kompozicija će biti pogodna za primenu soli volframa u dnevnoj dozi između 0,001 kg po kg telesne težine ženke sisara (dalje u tekstu, mg/kg/dan) i maksimalne podnošljive doze za ženku odgovarajuće vrste sisara.

[0042] Prema specifičnijem primeru izvođenja, maksimalna dnevna doza će biti 1000 mg/kg/dan; prema dodatnim specifičnim primerima izvođenja, primena bi se sprovodila u dozama od najmanje 0,001 mg/kg/dan, najmanje 0,01 mg/kg/dan, najmanje 0,1 mg/kg/dan, najmanje 0,5 mg/kg/dan, najmanje 1 mg/kg/dan, najmanje 10 mg/kg/dan, najmanje 25 mg/kg/dan, najmanje 50 mg/kg/dan, najmanje 100 mg/kg/dan, najmanje 200 mg/kg/dan, najmanje 300 mg/kg/dan, najmanje 400 mg/kg/dan, najmanje 500 mg/kg/dan, najmanje 600 mg/kg/dan, najmanje 700 mg/kg/dan, najmanje 800 mg/kg/dan ili najmanje 900 mg/kg/dan.

[0043] Sve definicije i poželjna značenja obezbeđena prethodno u tekstu u vezi sa prvim aspektom pronalaska, primenjiva su na druge aspekte pronalaska. Tako, na primer, so volframa (VI) će sadržati anjon volframa (VI) i prehrambeno ili farmaceutski prihvatljiv katjon, koji će poželjno biti alkalni ili zemnoalkalni katjon, još poželjnije katjon natrijuma, kalijuma, magnezijuma i kalcijuma i cinka. Konkretno, so će biti natrijumova so volframa (VI). Anjon volframa (VI) je ponovo izabran od WO4<2->, HWO4-, W2O7<2->i HW2O<7->jona, poželjno WO4<2->, a a u slučaju da je predstavljen u obliku solvata, solvat će poželjno biti hidrat, tačnije dihidrat. Ostali specifični primeri izvođenja koji su prethodno u tekstu obezbeđeni za prvi aspekt, odnose se takođe i na druge aspekte.

[0044] U tekstu koji sledi, uključen je niz neograničavajućih, ilustrativnih primera predmetnog pronalaska.

PRIMERI

Primer 1. Opis životinjskog modela (ženke IRS2 -/- miša)

[0045] Mišiji model koji se koristi za određivanje aktivnosti soli volframa (VI) u pospešivanju normalne reprodukcije i plodnosti je miš sa nokautiranim Irs2 genom, IRS2<-/->[Burks et. al., "IRS-2 pathways integrate female reproduction and energy homeostasis", Nature, 2000, vol.407, pp. 377-382]. Delecija Irs2 gena translatira se u jasan polni dimorfizam kada je u pitanju plodnost i metabolizam ugljenih hidrata.

[0046] Mužjaci miševa u ovom modelu imaju insulinsku rezistenciju i tešku hiperglikemiju koja otpočinje u ranom dobu. Za razliku od njih, ženke miševa ostaju relativno euglikemične u ranom dobu i razvijaju blagu insulinsku rezistenciju koja opstaje do kasnije životne dobi (4-5 mesici). Ženke IRS2-/- miševa u ranom dobu, kada su stare oko 10 nedelja, pokazuju nizak nivo razvijenosti folikula i perzistentnu anovulaciju, koju prati odsustvo estrusnog ciklusa kod najvećeg broja miševa. Stopa zatrudnjivanja kod ženki IRS2-/- miševa je 9% u poređenju sa 100% kod ženki IRS<wt>(IRS-2<+/+>divljeg tipa) miševa. Imajući u vidu da ženke miševa u ovom uzrastu ostaju euglikemične i da razvijaju znake samo blage insulinske rezistencije, ozbiljno narušavanje plodnosti nije direktan rezultat anomalija u metabolizmu glukoze.

[0047] Ženke IRS2-/- miševa se koriste u uzrastu od 6 i 8 nedelja. Publikacija autora Burks et al, "IRS-2 pathways integrate female reproduction and energy homeostasis", Nature, 2000, vol.407, pp. 377-382, opisuje da, dok su mužjaci IRS2-/- miševa bili već visoko netolerantni na glukozu u uzrastu od 6 nedelja, ženke IRS2-/- miševa su održavale osnovne nivoe glukoze u opsegu od 120-160 mg/dl sve do uzrasta od 4-5 meseci (strana 378, kolona 1, kraj drugog odeljka). Osim toga, ista publikacija opisuje da su ženke miševa u uzrastu mlađem od 10 nedelja relativno euglikemične i blago rezistentne na insulin. Dakle, ozbiljno narušavanje plodnosti u ovom životinjskom modelu nije direktan rezultata abnormalnog metabolizma glukoze kod ženki IRS2-/- miševa. Osnovni nivoi glukoze u krvi od 120-160 mg/dl smatraju se normalnim nivoima ["Ciencia y Tecnologia en protección y experimentación animal", Ed McGraw-Hill/interamericana de España (2001). ISBN:84-486-0310-9 (strana 27): naznačeno je da su normalni nivoi kod miševa između 63 i 176 mg/dl).

[0048] Druge skorašnje studije sprovedene na IRS2-/- miševima proučavale su pomenute razlike koje postoje između mužjaka i ženki miševa; na primer, Biochemical Pharmacology 2011, 81, 279-288, opisuje da nivoi insulina u cirkulaciji nisu značajno različiti kod miševa divljeg tipa i ženki IRS2-/- miševa i da je kao odgovor na nekoliko koncentracija glukoze, odgovor ženki IRS2-/- miševa, u smislu sekrecije insulina, bio identičan kao i kod kontrolnih životinja, miševa divljeg tipa (strana 281, kolona 2, odeljak 1; i strana 284, kolona 2, odeljak 1 u delu pod naslovom "Diskusija"), pri čemu se sekrecija insulina kod mužjaka IRS2-/- miševa povećala u poređenju sa kontrolama divljeg tipa.

[0049] Druge studije sprovedene sa ovim životinjskim modelom pokazale su da IRS2 ima kritične i direktne funkcije u jajniku, naročito u razvoju folikula i ovulaciji, posredstvom regulacije ključnih komponenti mehanizma ćelijskog ciklusa koje su uključene u koordinaciju ćelijske proliferacije i diferencijacije, što jasno i direktno povezuje odsustvo ekspresije IRS2 sa neplodnošću [Biology of Reproduction 2007, 76, 1045-1053].

[0050] IRS2-/- životinski model je primarno model propadanja beta ćelija [Am J Physiol Endocrinol Metab 2014, 306, E36- E47)]. On opisuje kako progresivno gubljenje beta ćelija usled povećanja broja apoptotskih beta ćelija određuje progresiju u dijabetes u ovom životinjskom modelu (videti stranu E36, kolona 2, odeljak 2), samo u starijim uzrastima. Postepeno smanjenje beta ćelija se inicijalno kompenzuje višom aktivnošću ćelija koje opstaju, i tek u starijim uzrastima, smanjenje broja ćelija ne može da se kompenzuje od strane ćelija koje opstaju, usled čega dolazi do pojave hiperglikemije i posledičnog razvoja dijabetesa.

[0051] Plodnost je složeni mehanizam koji uključuje različite faktore. Ne postoji "idealan" životinjski model, nego mnogobrojni životinski modeli, na primer, modeli koje prodaje kompanija Jackson Laboratories (http://jaxmice.jax.org/list/ra861.html).

[0052] Važan faktor koji utiče na plodnost je hormon leptin koji je neophodan za plodnost i kod mužjaka i kod ženki. Leptin utiče na ovulacione cikluse kod ženki, a nivoi leptina izvan idealnog opsega mogu da imaju negativan efekat na kvalitet jajne ćelije. IRS2-/- miševi imaju visoke nivoe leptina u cirkulaciji što je verovatno još jedan faktor koji utiče na plodnost.

[0053] Dakle, ovaj model pokriva niz važnih faktora povezanih sa neplodnošću i predstavlja pogodan model za proučavanje efikasnosti jedinjenja u delovanju na neplodnost kod ženki sisara.

Primer 2. Studije ovulacije, implantacije i trudnoće

A. Životinje

[0054] Deset ženki IRS2<-/->miševa u uzrastu između 6 i 8 nedelja.

[0055] Šest mužjaka (IRS2<wt>) miševa "divljeg tipa" u uzrastu između 6 i 8 nedelja.

[0056] Ženke i mužjaci miševa su čuvani odvojeno u normalnim uslovima, tj. pri ciklusu od 12h svetlo/mrak i kontrolisanoj temperaturi i vlažnosti. Životinje su hranjene po želji (što se označava i kao ad libitum) standardnom prehranom.

1

B. Postupak

Faza pripreme za tretman

[0057] Nakon perioda aklimatizacije, ženke IRS2<-/->miševa su čuvane u grupama od 4-6 miša/kavezu. Tokom faze pripreme za tretman (2 nedelje) kod životinja je primenjivana voda za piće bez soli volframa.

Faza tretmana

[0058] Natrijum volframat je primenjen u vodi za piće (ad libitum) putem rastvora sa 2 mg/ml natrijum volframat dihidrata (prodaje ga kompanija Carlo Erba) u destilovanoj vodi nakon faze pripreme za tretman (dan 0 tretmana) i do 4 nedelje pre žrtvovanja životinja. Dnevna doza natrijum volframata koju su miševi unosili ingestijom je bila oko 180 mg/kg telesne težine.

Ukrštanje

[0059] Nakon prve tri nedelje tretmana ženke IRS2<-/->miševa su čuvane u kavezima u parovima, zajedno sa mužjacima IRS2<wt>miševa, kontinuirano.

[0060] Miševi su svakodnevno posmatrani kako bi se uočili znaci trudnoće ili porođaja.

[0061] Nakon 4 nedelje, mužjaci iz različitih kaveza su zamenjeni i čuvani su u njima još 4 nedelje.

[0062] Primena volframata je održavana 8 nedelja tokom kojih su mužjaci i ženke miševa čuvani zajedno. Nakon ovih 8 nedelja tretman je obustavljen i mužjaci i ženke miševa su čuvani zajedno još 4 dodatne nedelje.

Žrtvovanje

[0063] Nakon ovog peroda ženke miševa su žrtvovane i izvedena je biopsija kako bi se utvrdilo prisustvo znakova trudnoće.

C. Rezultati

Rezultati studije ovulacije

[0064] Tokom perioda pripremnog tretmana i tokom prve 3 nedelje tretmana, vaginalni razmazi su pripremljeni za 6 nasumično odabranih ženki miša na dane -8; -5; -2; -1; 7; 8; 14; 15 i 22, kako bi se odredilo u kojoj su fazi estrusnog ciklusa.

[0065] Između 1 i 2 ml fiziološkog rastvora je uvedeno u vaginu miševa pomoću Pasterove pipete. Vaginalni eksudat je sakupljen istom tom pipetom i razmazan po mikroskopskoj pločici. Kada se osušio na vazduhu, fiksiran je i obojen Papanikolau tehnikom.

[0066] Papanikolau tehnika obuhvata bojenje vaginalnih razmaza fiksiranih na mikroskopskoj pločici, na sledeći način:

- 10 potapanja u 50% zap./zap. alkohol;

- Potapanje u rastvor hematoksilina po Harisu na 3 minuta;

- Ispiranje tekućom vodom;

- 10 potapanja u zakišeljeni alkohol (1% hlorovodonična kiselina);

- Ispiranje tekućom vodom;

- 10 potapanja u 95% zap./zap. alkohol;

- Potapanje u OG-6 rastvor na 30 sekundi;

- 10 potapanja u 96% zap./zap. alkohol;

- potapanje u rastvor eozina na 1 minut;

- 10 potapanja u 96% zap./zap. alkohol;

- 10 potapanja u 86% zap./zap. alkohol; i

- 10 potapanja u ksilen

[0067] Preparate je analiziralo obučeno osoblje uz upotrebu jednostruko slepog kodiranja u cilju eliminacije pristrasnosti.

[0068] Uzorci su identifikovani u sledećim fazama: diestrus, proestrus, estrus, metestrus, anestrus ili procena nije moguća. Ciklična priroda četiri faze u periodima od 4 do 6 dana je pokazatelj normalnog estrusnog ciklusa, dok odsustvo ove ciklične prirode i produžetak faze anestrusa, diestrusa ili proestrusa ukazuje na odsustvo estrusnog cikulusa.

[0069] Od 10 ženki miša koje su proučavane u studiji, u tabeli 1 su sumirane faze estrusnog ciklusa u vaginalnim razmazima napravljenim za 6 od ovih ženki IRS2<-/->miša.

Tabela 1

1

[0070] Faze estrusnog ciklusa su sledeće: A: Anestrus; D: Diestrus; P: Proestrus; E: Estrus; i M: Metestrus.

[0071] Faze estrusnog ciklusa nađene u vaginalnim razmazima ženki IRS2<-/->miševa u tabeli 1 pokazuju da su tokom perioda pripreme za tretman svi miševi bili u fazi proestrusa (P) ili diestrusa (D) tj., bio je odsutan estrusni ciklus.

[0072] Međutim, po otpočinjanju primene volframata, uočeno je da su ženke IRS2<-/->miševa u kasnim fazama estrusnog ciklusa, tj. u fazama estrusa (E) i metestrusa (M), što ukazuje na ponovno uspostavljanje normalnog estrusnog ciklusa.

[0073] Ovi rezultati pokazuju da primena soli volframa (VI) omogućava brzo ponovno uspostavljanje (sedmog dana tretmana) estrusnog ciklusa kod neplodnih ženki IRS2-/- miševa koje nemaju dijabetes, kod 100% analiziranih miševa.

Rezultati studije implantacije i trudnoće

[0074] Nakon peroda ukrštanja postupkom iz odeljka B, ženke miševa su žrtvovane i izvedene su biopsije kako bi se utvrdilo prisustvo znakova trudnoće.

[0075] Tabela 2 sumira uzrast u vreme tretmana, da li je ili nije bilo trudnoće i broj embriona po ženki miša.

Tabela 2

1

[0076] Rezultati iz tabele 2 pokazuje da se, dok stopa zatrudnjivanja kod netretiranih ženki IRS2<-/->miševa iznosi 9%, stopa zatrudnjivanja kod ženki IRS2<-/->miševa koje su tretirane volframatom povećava na 80%.

[0077] Štaviše, ovi rezultati takođe pokazuju da srednja vrednost mladunaca/implantiranih embriona po trudnoj ženki miša iznosi oko 5, što je broj koji može da se smatra uporedivim sa brojem mladunaca kod ženke miša.

[0078] Dakle, rezultati iz tabele 1 i 2 pokazuju da so volframa (VI) predstavlja efikasan tretman za ponovno uspostavljanje ovulacije i/ili povećanje implantacije oocita. Dakle, primena soli volframa (VI) kako je definisana u predmetnom pronalasku, efikasna je za lečenje neplodnosti kod ženki sisara koje nemaju dijabetes.

Primer 3. Studija glikemije i telesne težine

A. Životinje

[0079] Šest ženki IRS2<-/->miševa u uzrastu između 6 i 8 nedelja.

[0080] Ženke miševa su čuvane odvojeno u normalnim uslovima, tj. pri ciklusu od 12h svetlo/mrak i kontrolisanoj temperaturi i vlažnosti. Životinje su hranjene po želji (što se označava i kao ad libitum) standardnom prehranom.

B. Postupak

Faza tretmana

[0081] Nakon perioda aklimatizacije, natrijum volframat je primenjen u vodi za piće (ad libitum) putem rastvora sa 2 mg/ml natrijum volframat dihidrata (prodaje ga kompanija Carlo Erba) u destilovanoj vodi nakon faze pripreme za tretman (dan 0 tretmana) i tokom 12 dana.

C. Rezultati

1

[0082] Telesna težina je određivana na dan 0, 2, 5, 7, 9 i 12 perioda tretmana, a glukoza u krvi je određivana nakon 6 sati gladovanja svakog od tih dana, izvlačenjem krvi iz repne vene i pomoću senzora za glukozu (senzor za glukozu AccuTrend, Roche, Mannheim, Nemačka).

[0083] U tabeli 3 su sumirani glikemijski nivoi izraženi u mg/dl, a u tabeli 4 je sumrana telesna težina miševa u studiji, izražena u gramima.

Tabela 3

Tabela 4

[0084] Rezultati iz Tabela 3 i 4 pokazuju da tokom primene natrijum volframata nisu uočene varijacije telesne težine i glikemije tokom prvih 12 dana tretmana, što predstavlja isti period u kome je ovulacija uspešno ponovo uspostavljena kod testiranih ženki miševa od 7. dana tretmana (videti tabelu 1).

[0085] Dakle, rezultati iz tabela 1 do 4 pokazuju da so volframa (VI) predstavlja tretman koji je efikasan za ponovno uspostavljanje ovulacije i/ili povećanje implantacije oocita, bez obzira na promene telesne težine i metabolizma ugljenih hidrata. Pokazano je, dakle, da primena soli

1

volframa (VI) kako je definisana u predmetnom pronalasku ili kompozicije koja sadrži takvu sovolframa (VI) ima direktan efekat na ženski reproduktivni sistem i da stoga efikasno pospešuje normalnu reprodukciju i plodnost kod ženki sisara koje nemaju dijabetes.

Primer 4. Studija endometrijalne adhezije embriona

A. Model

[0086] "In vitro" humano-humani model adhezije embriona napravljen od HEC1-A endometrijalne ćelijske linije i JEG- 3 trofoektodermalne ćelijske linije, korišćen je kako bi se odredio efekat natrijum volframara na endometrijalnu receptivnost.

[0087] Upotreba in vitro modela i specifično modela koji se zasnivaju na pomenutim ćelijskim linijama (HEC-1A i JEG-3), smatra se standardnim modelom za proučavanje endometrijalne receptivnosti i naročito adhezije trofoblasta za endometrijum (Fertility and Sterility 2011; 96,522-529; Methods in Enzymology 2006;420:3-18 ili FASEB J.201;26:3715-3727).

[0088] JEG-3 ćelijska linija koja simulira ćelije trofoektoderma u humanom embrionu predstavlja ćelije koje se gaje u monoslojevima u laboratoriji, koristeći nisko adherentne ploče, i koje su sposobne da formiraju sferoide koji simuliraju humani embrion; ovo je jedna od najšire korišćenih ćelijskih linija za sprovođenje in vitro testova adhezije embriona.

B. Postupak

[0089] Ćelijske linije su komercijalno kupljene (od organizacije American Type Culture Collection (ATCC); Rockville, MD, SAD) u cilju sprovođenja eksperimenata endometrijalne adhezije embriona. Odmrznute su i propagirane u 4 pasaža kako bi se dobilo dovoljno ćelija za izvođenje svih testova.

[0090] HEC1-A ćelije su zasejane u ploče sa 24 bunara i gajene sa McCoy 5A medijumom za gajenje suplementiranim sa 10% fetalnog goveđeg seruma i 0,1% antibiotika (fungizon i penicilin), dok nije dostignuto 90% konfluencije. Nakon što je konfluencija postignuta, u medijum za gajenje je dodat natrijum volframat u finalnoj koncentraciji od 10 µM, kao i Withaferin A (kao kontrola, jedinjenje koje sprečava adheziju embriona) ili medijum za gajenje (osnovni nivo podataka o adheziji), bez bilo koje dodatne komponente, tokom 24 sata.

[0091] JEG-3 ćelije su zasejane u nisko adherentne ploče sa Iglovim esencijalnim medijumom (EMEM) za gajenje suplementiranim sa 10% fetalnog goveđeg seruma i 0,1% antibiotika

1

(fungizon i penicilin). Dvadeset i četiri sata pre testa za adheziju, iz ove kulture su formirani JEG-3 trofoblasti sferoidi. U tom cilju, JEG-3 ćelije u medijumu koji je prethodno u tekstu opisan, suspendovane su u erlenmajeru i mešane u koncentraciji od 6x 10<5>ćelija/6 ml. Dobijeni sferoidi su sakupljeni u cilju testiranja adhezije.

[0092] Za test adhezije, 24 sata nakon gajenja HEC-1A ćelija sa medijumom za gajenje u koji je dodat natrijum volframat, Withaferin A ili nije dodat nikakav tretman, medijum za gajenje je zamenjen svežim medijumom za gajenje bez tretmana koji su poručavani. Trofoektodermni sferoidi su dodati na monosloj HEC-1A ćelija, po 6 do 10 sferoida u svaki bunar. Adhezija sferoida je merena nakon 60 minuta, pri čemu su se sferodi koji su plutali u medijumu za gajenje računali kao neadherirani sferoidi, a sferoidi koji nisu plutali kao adherirani sferoidi. Ispitivanje je sprovedeno invertovanim mikroskopom (Nikon Diaphot 300; Nikon Corp., Tokyo, Japan). Test je sproveden u triplikatu.

C. Rezultati

[0093] Dobijeni rezultati su navedeni u tabeli 5. Viši procenat adhezije embriona je uočen u uslovima u kojima su HEC-1A linije tretirane natrijum volframatom, u odnosu na uslove kada nisu tretirane. Adhezija uopšte nije uočena sa ćelijama koje su tretirane kao negativna kontrola (C-), Withaferin A.

Tabela 5

SPECIFIČNE KOMPOZICIJE PREMA PRONALASKU

[0094] Prehrambene kompozicije prema pronalasku su pripremljene niže na ilustrativan način. One ni u kom slučaju ne smeju da se interpretiraju kao ograničavajuće za obim pronalaska.

Primer 5

2

[0095] Pripremljen je dresing za salatu obogaćen natrijum volframatom. Količina od 25 mg Na2WO4(100 mg/kg) dodata je u 250 grama komercijalno dostupnog dresinga i mehanički je mešana 30 minuta.

Primer 6

[0096] Pripremljena je salsa tipa kečapa obogaćena solju volframa. U tom cilju, 170 mg CaWO4je dodato u 200 grama komercijalno dostupnog kečapa i mehanički je mešano 1 sat.

Primer 7

[0097] Pripremljeno je mleko obogaćeno solju volframa. U tom cilju, obezbeđen je 1 kg punomasnog kravljeg mleka, dodato je 150 mg ZnWO4i mehanički je mešano 20 minuta. Preporučuje se da se pakovanje promućka neposredno pre upotrebe.

Primer 8

[0098] Pripremljen je voćni sok obogaćen solju volframa. Pet stotina mg MgWO4 je dodato u 1 kg komercijalnog soka i mehanički je mešano 10 minuta. Preporučuje se da se pakovanje promućka neposredno pre upotrebe.

Primer 9

[0099] Pripremljene su obložene tablete sledećeg sastava:

PH200 Mikrokristalna celuloza (diluens/sredstvo za klizanje) 250,00 mg

Koloidni anhidrovani silicijum dioksid (sredstvo za klizanje/adsorbent) 3,00 mg Magnezijum stearat (lubrikans) 5,00 mg

Talk (lubrikans) 7,00 mg

Opadry<®>white (Opadry<®>i-1-7000 White)(*) (film za oblaganje) 8,00 mg

Natrijum volframat dihidrat 200,00 mg

(*) smeša hidroksipropilmetilceluloze, polietilen glikola 6000 i titanijum dioksida (E-171) Primer 10

[0100] Pripremljene su šumeće tablete sledećeg sastava:

Sorbitol, aspartam, sukraloza i ksilitol (zaslađivači) 0,025mg per 10 mg Kalcijum karbonat 0,350 mg na 10 mg

Limunska kiselina (zakišeljivač) 0,650 na 10 mg

Natrijum kiseli karbonat (regulator kiselosti) 0,350 mg na 10 mg Aroma pomorandže 0,25 mg na 10 mg

So volframa

Primer 11

[0101] Pripremljene su obložene tablete sledećeg sastava:

Nifedipin 6 mg

Ksantan guma 5 mg

Aroma pomorandže 0,3 mg

Limunska kiselina 0,4 mg

Gelucire 44/1490 mg

PH10 mikrokristalna celuloza (razblaživač) 92.00 mg/kapsuli Natrijum volframat dihidrat 100,00 mg/kapsuli

Claims (16)

Patentni zahtevi

1. So volframa (VI) ili njen solvat, za upotrebu u terapeutskom postupku za poboljšanje normalne reprodukcije i plodnosti kod neplodne ženke sisara koja nema dijabetes, ili u terapeutskom postupku za poboljšanje efikasnosti tehnike potpomognute reprodukcije kod sisara, pri čemu postupak za poboljšanje efikasnosti tehnike potpomognute reprodukcije nije postupak za upotrebu u lečenju neplodnosti ženke kod sisara koji nemaju dijabetes u vezi sa tehnikom intrauterine inseminacije ili in vitro fertilizacije, i pri čemu se so volframa (VI) ili njen solvat primenjuju kod navedenog sisara.

2. So volframa (VI) za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, pri čemu je sisar čovek

3. So volframa (VI) za upotrebu prema patentnim zahtevima 1 ili 2, pri čemu se navedena so primenjuje u dnevnoj dozi između 0,001 mg i 1000 mg soli volframa (VI) po kg telesne težine sisara.

4. So volframa (VI) za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3, pri čemu navedena so sadrži anjon volframa (VI) i farmaceutski, veterinarski ili prehrambeno prihvatljiv katjon.

5. So volframa (VI) za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4, gde je katjon alkalni ili zemnoalkalni katjon, izborno, katjon je odabran iz grupe koja se sastoji od natrijuma, kalijuma, magnezijuma, kalcijuma i cinka, poželjno natrijuma ili cinka.

6. So volframa (VI) za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5, naznačena time što je anjon volframa (VI) izabran od jona WO4<2->, HWO4-, W2O7<2->i HW2O7<->, izborno WO4<2->.

7. So volframa (VI) za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 6, gde je solvat dihidrat.

8. Kompozicija koja sadrži so volframa (VI) ili njen solvat u koncentraciji koja je jednaka ili veća od 100 mg/kg i najmanje jedan farmaceutski ili veterinarski prihvatljiv ekscipijens ili vehikulum, za upotrebu u terapeutskom postupku za poboljšanje normalne reprodukcije i

2

plodnosti kod ženke sisara koja nema dijabetes ili u terapeutskom postupku za poboljšanje efikasnosti tehnike potpomognute reprodukcije primenjene kod sisara, i pri čemu se kompozicija primenjuje kod navedenog sisara.

9. Kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 8, pri čemu je sisar čovek

10. Kompozicija za upotrebu prema patentnim zahtevima 8 ili 9, pri čemu se navedena so primenjuje u dnevnoj dozi između 0,001 mg i 1000 mg soli volframa (VI) po kg telesne težine sisara.

11. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 8 do 10, pri čemu navedena so sadrži anjon volframa (VI) i farmaceutski, veterinarski ili prehrambeno prihvatljiv katjon.

12. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 8 do 11, pri čemu je katjon alkalni ili zemnoalkalni katjon, izborno, katjon je odabran iz grupe koja se sastoji od natrijuma, kalijuma, magnezijuma, kalcijuma i cinka, poželjno natrijuma ili cinka.

13. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 8 do 12, naznačen time što je anjon volframa (VI) izabran od jona WO4<2->, HWO4-, W2O7<2->i HW2O7<->, izborno WO4<2->.

14. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 8 do 13, gde je solvat dihidrat

15. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 8 do 14, naznačena time što je kompozicija u obliku pilule, tablete, pastile, kapsule, praška, obloge, šumećeg praška ili tableta, rastvora, suspenzije, sirupa ili granula.

16. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 8 do 15, naznačena time što sadrži saharozu.

Izdaje i štampa: Zavod za intelektualnu svojinu, Beograd, Kneginje Ljubice 5