RS64144B1

RS64144B1 - Vakcina protiv svinjskog parvovirusa i virusa reproduktivnog i respiratornog sindroma svinja i postupci njegove proizvodnje

Info

Publication number: RS64144B1
Application number: RS20230301A
Authority: RS
Inventors: Sonja Klocke; Robert Thomas Cool; Curtis Robert Edwards; Fuad Tawfiq Haddadin; Gregory Brian Haiwick; Troy James KAISER; Jeremy Kroll; Sonia Regina Cantisano Malburg; Serrat Marta Noguera; Merrill Lynn Schaeffer; Andrea J Headrick Starks; Michael Landon Stewart; Eric Martin Vaughn; Guosong Zhao
Original assignee: Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh
Priority date: 2016-11-03
Filing date: 2017-11-02
Publication date: 2023-05-31
Also published as: JP2020500843A; AU2017353380A1; MX2019005136A; JP2022000031A; MY191895A; CN109922825A; EP3534939A1; JP6941171B2; PL3534939T3; ES2942749T3; CA3042584A1; AU2017353380B2; MX380632B; US11730806B2; KR102664662B1; HUE061972T2; WO2018083156A1; EA201991041A1; EP3534939B1; DK3534939T5

Description

LISTA SEKVENCE

[0001] Ova prijava sadrži þistu sekvenci prema 37 C.F.R. 1.821 – 1.825.

STANJE TEHNIKE

A. Oblast tehnike

[0002] U prvom razmatranju, predmetni pronalazak se odnosi na svinjski parvovirus i vakcinu protiv virusa reproduktivnog i respiratornog sindroma svinja specifiþnu za izolate koji su sposobni da smanje kliniþke znake bolesti izazvane parvovirusom svinje i/ili virusom reproduktivnog i respiratornog sindroma svinja. U drugom razmatranju, predmetni pronalazak se dalje odnosi na metode za proizvodnju imunogenih kompozicija kao i takvih imunogenih kompozicija koje pokazuju smanjenu virucidnu aktivnost.

B. Opis Stanja Tehnike

[0003] Virus reproduktivnog i respiratornog sindroma svinja (PRRSV) je þlan porodice virusa Arteriviridae i pripada, zajedno sa Coronaviridae, redu virusa Nidovirales. PRRSV je virus sa omotaþem sa jednolanþanim genomom RNK pozitivnog smisla od oko 15 kilobaza koji se sastoji od devet otvorenih okvira za þitanje (ORF), odnosno ORF1a, ORF1ab, ORF2a, ORF 2ab i ORF 3 do ORF7. ORF 1a i 1ab kodiraju velike poliproteine koji se obraÿuju u virusne nestrukturne proteine (nsp) auto- i trans-cepanjem virusnih proteaza nsp1, nsp2, i nsp4 (Snijder and Meulenberg, 1998). ORF4 kodira manji glikoprotein (GP4) koji se, pored glavnog glikoproteina (GP5) i dva druga sporedna glikoproteina (GP2a i GP3), nalazi u omotaþu virusa, pri þemu su svi navedeni glikoproteini važni za proizvodnju infektivnog virusa.

[0004] PRRSV se smatra jednim od ekonomski najvažnijih infektivnih agenasa kod svinja koji izazivaju kasni reproduktivni neuspeh kod krmaþa i respiratorne bolesti kod svinja u razvoju. ýesto je PRRSV infekcija komplikovana sekundarnim bakterijskim infekcijama koje se pripisuju imunosupresivnoj prirodi virusa. Takoÿe, PRRSV viremija traje nedeljama, a virus se tada još uvek može otkriti u limfoidnim organima nekoliko meseci, pokazujuüi poteškoüe ili neuspeh imunog odgovora domaüina da oþisti virus (Allende et al., 2000).

[0005] Postoje dva razliþita genotipa virusa PRRSV koji izazivaju sliþne kliniþke simptome koji se razlikuju za oko 40% na nivou nukleotidne sekvence, genotip I (EU) i genotip II (SAD).

Severnoameriþki (SAD) prototipski soj je VR-2332, dok je evropski (EU) prototipski soj Lelistad virus.

[0006] Svinjski parvovirus je autonomni virus koji se replicira iz potfamilije Parvovirinae iz roda Protoparvovirus u okviru porodice Parvoviridae koji sadrži jednolanþani DNK molekul od oko 5100 nukleotida (Cotmore et al., 2014: Arch Virol.: 159(5): 1239–1247; Molitor et al., 1984: Virology: 137(2):241-54.). Samo minus lanac DNK je upakovan u virione. Genom virusa kodira tri kapsidna proteina (VP1, VP2, VP3) i jedan nestrukturni protein (NS1). Kapsid parvovirusa je oko 22-25 nanometara u preþniku i sastoji se od VP1 i VP2 podjedinica. Ovi proteini su izvedeni iz alternativno spojenih verzija istog RNK molekula i tako se preklapaju u nizu. Nadalje, parvovirus svinje pokazuje visok nivo sliþnosti sekvence sa virusom maþje panleukopenije, pseüim parvovirusima i parvovirusom glodara (Ranz et al., 1989: J. gen. Virol: 70:2541-2553).

[0007] Iako postoje razlike u sojevima svinjskih parvovirusa, od kojih su neki izuzetno patogeni, a drugi manje patogeni ili potpuno nepatogeni, kada virus postane uspostavljen ili endemski u nekoj zemlji, þini se da patogeni sojevi cirkulišu u populaciji.

[0008] Infekcija svinjskim parvovirusom (PPV) je þest uzrok reproduktivnog neuspeha kod priplodnih svinja širom sveta. Serološke studije pokazuju da je svinjski parvovirus široko rasprostranjen u svim regionima u svetu koji se bave proizvodnjom svinja sa do 80% životinja koje pokazuju serokonverziju.

[0009] Svinjski parvovirus (PPV) izaziva reproduktivnu insuficijenciju kod svinja, što rezultira smrüu i mumifikacijom fetusa, mrtvoroÿenošüu i drugim reproduktivnim nedostacima kod gravidnih krmaþa. (Joo & Johnson. 1976. Veterinary Bulletin 46, 653-660; Mengeling. 1978. J. Am. Vet. Med. Assoc.172, 1291-1294).

[0010] PPV izaziva reproduktivnu insuficijenciju kada su osetljive (neimune) nazimice i krmaþe inficirane tokom trudnoüe. Ovo je jedini put da virus izaziva bolest. Infekcija kod svinja se javlja nakon gutanja ili udisanja virusa. PPV zatim cirkuliše u krvotoku i u trudnoj svinji prelazi placentu i inficira embrione i fetuse u razvoju. Nakon prirodne infekcije razvija se aktivni imunitet koji verovatno traje doživotno svinje. Ako se aktivni imunitet javi pre trudnoüe, onda prasad u razvoju nije pogoÿena. Pri roÿenju prasad dobijaju majþinski imunitet u kolostrumu od krmaþe i ovaj imunitet majke traje do 20 nedelja starosti. Što je veüi nivo aktivnog imuniteta kod krmaþe, to je veüi imunitet majke koji ona prenosi na svoje prasad. Nakon toga može doüi do prirodne infekcije PPV.

[0011] Bolest koju izaziva PPV kod svinja se þesto naziva SMEDI (akronim za mrtvoroÿenost, mumifikacija, embrionalna smrt i neplodnost). Ako se infekcija dogodi u danima 0-30 trudnoüe, može doüi do embrionalne smrtnosti što rezultira smanjenjem veliþine legla. Najoþiglednija karakteristika nakon infekcije na 30-70 dana trudnoüe je roÿenje mumificiranih prasadi. Mumifikacija je proces sterilnog varenja tkiva prasadi koja uginu u materici nakon što je skelet poþeo da se stvrdnjava. PPV infekcija je takoÿe povezana sa mrtvoroÿenim i slaboroÿenim svinjama ako se infekcija dogodi u kasnijim fazama trudnoüe. Abortus takoÿe može biti posledica PPV infekcije, ali nije uobiþajen kliniþki znak ove bolesti. Sve u svemu, PPV infekcija smanjuje broj svinja roÿenih po krmaþi godišnje.

[0012] Trenutno dostupne PPV vakcine se proizvode uzgajanjem nativnog virusa na primarnim üelijama svinjskog porekla ili u uspostavljenim üelijskim linijama. Nakon toga, infektivni virus se izoluje i inaktivira hemijskim agensima da bi se završila vakcina protiv virusa ubijene cele üelije. Meÿutim, takvi procesi uzgoja nativnog infektivnog virusa su problematiþni u pogledu biološke sigurnosti i sigurnosti uopšte.

[0013] Podjediniþne vakcine zasnovane na rekombinantnim proteinima mogu patiti od slabe imunogenosti zbog nepravilnog savijanja ciljnog proteina ili loše prezentacije imunom sistemu. Dalje, vakcine sa uništenim celim üelijama predstavljaju sve antigene nativnog virusa, dok u podjediniþnim vakcinama postoji ograniþenje na specifiþnu sekvencu aminokiselina.

[0014] Rekombinantne PPV vakcine su veü opisane u prethodnom stanju tehnike. Meÿutim, do sada su komercijalno dostupne samo vakcine sa uništenim celim üelijama. Stoga se þini da do sada nije razvijena odgovarajuüa rekombinantna PPV podjediniþna vakcina koja se pokazala kao efikasna i bezbedna. Do sada opisane rekombinantne PPV podjedinice vakcine nisu testirane u kontrolisanim, laboratorijskim izazovnim eksperimentima. Rekombinantne PPV podjedinice vakcine koje su procenjene nisu delovale kao ni PPV vakcine sa uništenim celim üelijama ili rekombinantne PPV podjedinice vakcine nisu bile bezbedne (prikazane neželjene reakcije).

[0015] Identifikovani su terenski izolati PPV koji se genetski i antigenski razlikuju od sojeva vakcine. Virus PPV genotipa 2, PPV-27a, je visoko virulentan kod trudnih nazimica nakon eksperimentalne infekcije, što je pokazano visokim mortalitetom meÿu fetusima krmaþa zaraženih PPV-27a (85%) u poreÿenju sa krmaþama zaraženim drugim sojevima PPV, npr. PPV-NADL-2. Meÿutim, trenutno dostupne komercijalne vakcine protiv PPV su zasnovane na inaktiviranim preparatima celih virusa sojeva PPV genotipa 1 izolovanih pre nekih 30 godina (Jozwik et al 2009; Journal of General Virology; 90; 2437–2441).

[0016] Dalje stanje tehnike je sledeüe:

[0017] Adriaan F.G. Antonis. “A novel recombinant virus-like particle vaccine for prevention of porcine parvovirus-induced reproductive failure” Vaccine 24 (2006) 5481-5490.

[0018] Chen Y. Guo W. “A novel recombinant pseudorabies virus expressing parvovirus VP2 gene: Immunogenicity and protective efficacy in swine” Virology Journal 2011, 8:307.

[0019] Merenga et al. “Large scale production and downstream processing of a recombinant porcine parvovirus vaccine” Appl Microbiol Biotechnol.2002 Jun;59(1):45-50. Epub 2002 Apr 16.

[0020] A. Jozwik, J. Manteufel, H.-J. Selbitz and U. Truyen. Vaccination against porcine parvovirus protects against disease, but does not prevent infection and virus shedding after challenge infection with a heterologous virus strain. Journal of General Virology (2009), 90, 2437–2441.

[0021] Kineska patentna prijava br. CN 102488895 A opisuje vakcinu þestica nalik tripleks virusu koja se sastoji od svinjskog cirkovirusa, svinjskog parvovirusa i PRRSV. Ova trostruka VLP vakcina sadrži PCV-2 glavni strukturni protein CAP protein, PPV VP2 proteinski epitop i PRRSV GP5 proteinski epitop.

[0022] Ruska patentna prijava br. RU 2004108484 A otkriva inaktiviranu vakcinu protiv PRRSV i PPV. Ova inaktivirana vakcina sadrži antigenski materijal iz soja virusa PRRS, reprodukovan u prolaznoj üelijskoj kulturi Marc-145 i inaktiviran sa aminoetiletileniminom (AEEI) i antigenskim materijalom iz PPV soja.

[0023] Kineska patentne prijava br. CN 104 288 760 A otkriva kompoziciju vakcine koja sadrži imunu koliþinu antigena svinjskog cirkovirusa tipa 2, imunsku koliþinu antigena PRRSV i antigena PPV.

[0024] Kineska patentne prijava br. CN 102727881 A otkriva visoko patogeni PRRS JKSAI-R soj i PPV bigeminalnu živu vakcinu.

[0025] Puig et al. (http://info.hipra.com/DOCS/UNISTRAIN/PUBLICATIONS/ESPHM-2015/1-Clinical-protection.pdf) se odnosi na vakcinaciju kombinovanom primenom inaktiviranih ERISENG Parvo i inaktiviranih UNISTRAIN PRRS vakcina proizvoÿDþa Hipra.

[0026] Zeew EJL et al. (Journal of General Virology 2007, 88(2): 420-427) opisuje studiju virulencije i sposobnosti unakrsne neutralizacije nedavnih izolata iz polja parvovirusa i virusa vakcine kod eksperimentalno zaraženih trudnih nazimica.

[0027] US patentna prijava br. US 2014/0322267 A1 se odnosi na ORF2 protein PCV2 podtipa A (PCV2A) za primenu u unakrsnoj zaštiti.

[0028] EP patentna prijava br. EP 2460818 A2 se odnosi na PCV2 imunogene kompozicije i postupke za proizvodnju takvih kompozicija.

[0029] US patent US 7,700,285 B1 se odnosi na PCV2 imunogene kompozicije i postupke za proizvodnju takvih kompozicija.

[0030] PCT patentna prijava br. WO 2013/024113 se odnosi na vakcine protiv gripa H5.

[0031] US patentna prijava br. US 2015/0283229 A1 se odnosi na vakcinu protiv virusa epidemije dijareje svinja.

[0032] Nedostaci prethodnog stanja tehnike su, na primer, (i) zabrinutost da PPV komponenta u konvencionalnoj mrtvoj vakcini nije potpuno inaktivirana (što bi onda uvelo živi PPV u stado); (ii) nedostatak unakrsne zaštite protiv heterolognih sojeva PPV; nedostatak šeme vakcinacije koja štiti nazimice i krmaþe i fetuse u priplodnoj dobi od reproduktivnih bolesti povezanih sa PPV i PRRSV.

[0033] Postoji potreba za novom kombinovanom i/ili povezanom upotrebom vakcina protiv PRRSV i PPV koje se mogu uspešno primeniti protiv infekcija sa PRRSV i/ili PPV. Takoÿe postoji potreba za novim metodama za smanjenje virucidne aktivnosti kompozicija koje bi normalno pokazale odreÿeni stepen virucidne aktivnosti; kao i za imunogene kompozicije sa smanjenom ili nikakvom virucidnom aktivnošüu.

KRATAK OPIS PRONALASKA

[0034] Pronalazak je definisan patentnim zahtevima i bilo koji drugi aspeci, razmatranja, konfiguracije ili realizacije koji su ovde izloženi ne spadaju u obim patentnih zahteva veü su samo za informaciju.

[0035] Sve reference u opisu na metode leþenja odnose se na jedinjenja, farmaceutske kompozicije i lekove ovog pronalaska za upotrebu u postupku za leþenje ljudskog (ili životinjskog) tela terapijom (ili za dijagnozu).

[0036] Prvo razmatranje predmetnog pronalaska

[0037] U prvom razmatranju predmetni pronalazak se odnosi na imunogenu kompoziciju ili kombinovanu vakcinu ili kombinaciju koja sadrži

a) najmanje jedan antigen parvo virusa svinja (PPV), pri þemu je najmanje jedan PPV antigen jedna ili više PPV podjedinica i najmanje jedna PPV podjedinica je PPV virusni protein 2 (VP2), pri þemu se PPV VP2 sastoji se od aminokiselinske sekvence koja ima najmanje 99%, poželjno 100% identiþnost sekvence sa sekvencom aminokiselina SEQ ID NO:2, pri þemu je poželjno PPV VP2 jedini PPV antigenanski antigen sadržan u PPV, i

b) najmanje jedan antigen virusa reproduktivnog i respiratornog sindroma svinja (PRRS), pri þemu je najmanje jedan antigen virusa PRRS živi atenuirani/modifikovani živi PRRS virus izabran iz grupe koju þine: živi atenuirani/modifikovani živi genotip PRRS virusa tipa 1, živi atenuirani/modifikovani živi genotip PRRS virusa tipa 2, živi atenuirani/modifikovani živi PRRS soj 94881 i PRRS virus soj ATCC depozit VR-2332 je bilo koji antigen sadržan u živom atenuiranom/modifikovanom živom PRRS virusu.

[0038] Predmetni pronalazak se dalje odnosi na komplet koji sadrži imunogenu kompoziciju ili kombinovanu vakcinu ili kombinaciju kao što je ovde opisano i traženo.

[0039] Predmetni pronalazak se dalje odnosi na upotrebu imunogene kompozicije ili kombinovane vakcine ili kombinacije kako je ovde opisano i zahtevano ili komplet kako je ovde opisano i zahtevano za pripremu leka, poželjno vakcine.

[0040] Povoljno, eksperimentalni podaci obezbeÿeni predmetnim pronalaskom otkrivaju da je komponenta vakcine podjedinice PPV VP2 iz predmetnog pronalaska bezbedna i efikasna u prevenciji viremije i PPV infekcije kod fetusa. Dalje, eksperimentalni podaci dati predmetnim pronalaskom otkrivaju da komponenta vakcine PPV VP2 podjedinice predmetnog pronalaska ima širok spektar zaštite pošto vakcina štiti od heterolognih severnoameriþkih, kao i heterolognih evropskih sojeva izazivanja.

[0041] Povoljno, eksperimentalni podaci obezbeÿeni predmetnim pronalaskom otkrivaju da je komponenta vakcine podjedinice PPV VP2 iz predmetnog pronalaska efikasna kao i ceo mrtvi virus. Ekstenzivni procesi inaktivacije (koji su neophodni za inaktivaciju nativnog PPV kada se stvaraju vakcine celog mrtvog virusa) mogu se izbeüi korišüenjem rekombinantne podjedinice vakcine koja se sastoji od PPV VP2.

[0042] Dalje prednosti osnovnog pronalaska su, na primer, (i) smanjenje broja injekcija vakcine koje se daju životinjama, þime se poveüava dobrobit životinja i smanjuje stres za životinje; (ii) smanjenje radne snage; (iii) ista efikasnost kao jednokratna primena; (iv) vremenski raspored vakcinacije jer se obe komponente bave reproduktivnim bolestima kod steonih svinja; (v) prevencija PPV viremije kod vakcinisanih nazimica posle izazivanja heterolognog PPV soja; (vi) smanjenje broja mrtvoroÿenih i mumificiranih prasadi u vakcinisanim grupama nakon izazivanja PPV; (vii) poveüanje ukupnog broja fetusa kod PPV vakcinisanih krmaþa; (viii) 100% PPV vakcinisanih prasadi je zaštiüeno nakon izazivanja PPV; (ix) trajanje imuniteta (DOI): 6 meseci; (x) i ReproCic® PRRS EU i mešoviti ReproCic® PRRS EU PPV VP2 su bili efikasni na osnovu smanjenja virusnog optereüenja i proporcije viremiþne posle izazivanja; (xi) pokazano je nedostatak interferencije sa efikasnošüu protiv PRRSV vakcinacije; (xii) za ReproCic® PRRS EU može se uspostaviti þetvoronedeljni poþetak imuniteta; (xiii) pokazalo se da je kombinovana vakcina (PPV VP210 µg Eri) sa Ingelvac® PRRS MLV efikasna u prevenciji viremije i PPV infekcije fetusa 40 dana nakon gestacije (40 dG).

[0043] Drugo razmatranje predmetnog pronalaska

[0044] Dalje je otkriven postupak proizvodnje imunogenog preparata koji sadrži rekombinantni protein, pri þemu postupak obuhvata korake u sledeüem redosledu:

(i) obezbeÿivanje/dobivanje smeše koja sadrži

- prva teþnost,

- rekombinantni protein i/ili kvaternarnu strukturu sastavljenu od veüeg broja pomenutih rekombinantnih proteina, i

- vektor koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira navedeni rekombinantni protein;

(ii) dodavanje druge teþnosti u smešu iz koraka (i), pri þemu se druga teþnost razlikuje od prve teþnosti;

(iii) ispiranje, i opciono konaþno koncentrisanje, rekombinantnog proteina i/ili kvaternarnih struktura sastavljenih od veüeg broja pomenutih rekombinantnih proteina u smeši daljim dodavanjem dodatne druge teþnosti u smešu koja je rezultat koraka (ii) i uklanjanjem dela prvog i/ ili drugu teþnost iz takve kombinovane smeše;

(iv) inaktiviranje vektora dodavanjem inaktivacionog agensa u smešu koja je rezultat koraka (iii);

(v) neutralisanje agensa za inaktivaciju dodavanjem neutralizacionog agensa u smešu koja je rezultat koraka (iv).

[0045] Predmetni pronalazak se dalje odnosi na postupak kao što je ovde opisan, pri þemu se smeša iz koraka (i) supra može dobiti postupkom koji sadrži korake

(a) dozvoljavanje infekcije osetljivih üelija u kulturi sa vektorom koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira pomenuti rekombinantni protein i/ili kvaternarne strukture sastavljene od veüeg broja pomenutih rekombinantnih proteina, pri þemu se navedeni rekombinantni protein i/ili kvaternarne strukture sastavljene od veüeg broja pomenutih rekombinantnih proteina izražava navedenim vektorom,

(b) nakon toga obnavljanje rekombinantnog proteina i/ili kvaternarnih struktura sastavljenih od veüeg broja pomenutih rekombinantnih proteina iz üelijske kulture, pri þemu se poželjno üelijski ostaci odvajaju od rekombinantnog proteina i/ili kvaternarnih struktura sastavljenih od veüeg broja pomenutih rekombinantnih proteina putem koraka razdvajanja, poželjno

ukljuþujuüi mikrofiltraciju kroz najmanje jedan filter, poželjnije dva filtera, pri þemu je poželjno da najmanje jedan filter ima veliþinu pora veüu od rekombinantnog proteina i/ili kvaternarne strukture sastavljene od veüeg broja pomenutih rekombinantnih proteina, posebno ima veliþine pora od oko 0.1 µm do oko 4 µm.

[0046] Što se tiþe preparata PPV antigena, kada je inaktivacija Bakulovirusa na 37°C izvršena nakon bistrenja i pre dijafiltracije, primeüen je veliki stepen taloženja (agregacije). Smatra se da ova agregacija, iako nije povezana sa PPV antigenom, ometa kinetiku inaktivacije i virucidno testiranje. Preliminarni podaci sugerišu da proces dijafiltracije nakon bistrenja kulture i pre inaktivacije bakulovirusa znaþajno smanjuje stepen agregacije u PPV virusu sliþnih þestica (VLP) tokom procesa inaktivacije. Podaci pokazuju da se stepen agregacije intenzivira na višoj temperaturi (37° C.), a minimizira na nižim temperaturama (27° C ili 4° C) tokom vremena: proces dijafiltracije pre inaktivacije Bakulovirusa na 37° C eliminiše virucidno delovanje agensa za neutralizaciju inaktivanata natrijum tiosulfata i reakcije ExCell 420 medija. Potvrÿeni proces potvrÿuje da je inaktivirani PPV VLP proizvod eksprimiran bakulovirusom bio konzistentno nevirucidan za PRRSV vakcinu. Takva PPV VLP vakcina ima posebno povoljnu dugoroþnu stabilnost nakon mešanja sa PRRSV na osnovu virucidnog efekta koji nedostaje, što omoguüava da se i PPV i PRRSV komponente sveže pomešaju pre primene i/ili da se komercijalizuje oblik davanja spreman za upotrebu. (npr. kombinovana vakcina ili komplet).

KRATAK OPIS SLIKA

[0047] Sledeüe slike þine deo predmetnog opisa i ukljuþene su da dalje demonstriraju odreÿene aspekte predmetnog pronalaska. Pronalazak se može bolje razumeti pozivanjem na jednu ili više ovih slika u kombinaciji sa detaljnim opisom odreÿenih rešenja predstavljenih ovde.

[0048] FIG. 1 prikazuje PRRSV Viraemia (qPCR, log10 GE/mL) po Grupi i Danu.

[0049] FIG. 2 prikazuje podruþje ispid krive (AUC) PRRSV Viraemia (qPCR, log10GE/mL) po Grupi.

[0050] FIG. 3 prikazuje geometrijsku srednju vrednost PPV HI titara po Grupi i Danu.

DETALJAN OPIS

[0051] Pre nego što budu opisani aspekti predmetnog pronalaska, mora se napomenuti da kako se ovde koristi i u priloženim zahtevima, oblici jednine „a“, „an“ i „the“ ukljuþuju referencu u množini osim ako kontekst jasno ne diktira inaþe. Tako, na primer, referenca na "antigen" ukljuþuje mnoštvo antigena; referenca na "virus" je referenca na jedan ili više virusa i njihovih ekvivalenata poznatih struþnjacima, i tako dalje. Osim ako nije drugaþije definisano, svi tehniþki i nauþni termini korišüeni ovde imaju ista znaþenja koja obiþno razumeju struþnjaci iz oblasti tehnike kojoj ovaj pronalazak pripada. Poželjne metode, ureÿaji i materijali su sada opisani. Sve publikacije koje se ovde pominju su otkrivene u svrhu opisa i otkrivanja üelijskih linija, vektora i metodologija kako je objavljeno u publikacijama koje se mogu koristiti u vezi sa pronalaskom. Ništa ovde se ne može tumaþiti kao priznanje da pronalazak nema pravo da prethodi takvom otkrivanju na osnovu prethodnog pronalaska.

[0052] Prvo razmatranje predmetnog pronalaska

[0053] U jednom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na imunogenu kompoziciju ili kombinovanu vakcinu ili kombinaciju koja sadrži

.

[0054] Termin "parvovirus svinja" ili "PPV" je dobro poznat struþnjacima. Meÿutim, "parvovirus svinja" je autonomni replicirajuüi virus iz roda parvovirusa iz porodice Parvoviridae koji sadrži jednolanþani DNK molekul. Genom virusa kodira tri kapsidna proteina (VP1, VP2, VP3) i jedan nestrukturni protein (NS1). Bolest koju izaziva PPV kod svinja þesto se naziva SMEDI (akronim za mrtvoroÿenost, mumifikacija, embrionalna smrt i neplodnost). Termin "parvovirus svinja" u okviru predmetnog pronalaska obuhvata sve sojeve, genotipove i serotipove svinjskog parvovirusa, kao i potfamilije parvovirinae iz roda Protoparvovirus u porodici Parvoviridae.

[0055] Termini "virus reproduktivnog i respiratornog sindroma svinja" ili "PRRS virus" ili "PRRSV" su dobro poznati struþnjacima. „Virus reproduktivnog i respiratornog sindroma svinja“ je þlan porodice virusa Arteriviridae, pripada zajedno sa Coronaviridae u red virusa Nidovirales, i virus je sa omotaþem sa jednolanþanim, pozitivnim sensom RNK genoma od oko 15 kilobaza koje se

1

sastoje od devet otvoreni okviri za þitanje (ORF), odnosno ORF1a, ORF1ab, ORF2a, ORF 2ab i ORF 3 do ORF7. ORF 1a i 1ab kodiraju velike poliproteine koji se obraÿuju u virusne nestrukturne proteine (nsp) auto- i trans-cepanjem virusnih proteaza nsp1, nsp2 i nsp4 (Snijder and Meulenberg, 1998). ORF4 kodira manji glikoprotein (GP4) koji se, pored glavnog glikoproteina (GP5) i dva druga sporedna glikoproteina (GP2a i GP3), nalazi u omotaþu virusa, pri þemu su svi navedeni glikoproteini važni za proizvodnju infektivnog virusa. Postoje dva razliþita genotipa virusa PRRSV koji izazivaju sliþne kliniþke simptome koji se razlikuju za oko 40% na nivou nukleotidne sekvence, genotip I (EU) i genotip II (SAD). Severnoameriþki (SAD) prototipski soj je VR-2332, dok je evropski (EU) prototipski soj Lelistad virus. Termin "virus reproduktivnog i respiratornog sindroma svinja" u okviru predmetnog pronalaska obuhvata sve sojeve, genotipove i serotipove PRRSV.

[0056] U vezi sa PRRSV podrazumeva se da su izrazi “genotip I” i “genotip II” ekvivalentni terminima “genotip 1” i “genotip 2” ili terminima “tip 1” i “tip 2”, kao što se þesto koristi u literaturi u kontekstu PRRSV.

[0057] Izrazi "najmanje jedan antigen parvo virusa svinja (PPV)" i "najmanje jedan antigen virusa reproduktivnog i respiratornog sindroma svinja (PRRS)" u okviru predmetnog pronalaska obuhvataju svaki antigen(e) iz pojedinaþnog PPV i / ili PRRSV antigene na cele viruse koji sadrže mnoštvo antigena.

[0058] U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na imunogenu kompoziciju ili kombinovanu vakcinu ili kombinaciju kao što je ovde opisano i traženo, pri þemu je PPV izabran iz grupe koju þine: živi oslabljeni/modifikovani živi PPV virus, ubijeni/inaktivirani PPV virus, ubijeni/inaktivirani PPV soj 014, nemaþki terenski izolati svinjskog parvovirusa PPV-27a i PPV-143a i vakcinalni virusi svinjskog parvovirusa PPV-NADL-2 i PPV-IDT (MSV).

[0059] Termini "živo oslabljeni" i "modifikovani živi" se naizmeniþno koriste u toku predmetnog pronalaska i posebno se odnose na smanjenu virulenciju PPV i/ili PRRSV, posebno divljeg tipa PPV i/ili PRRS virus, koji se postiže konvencionalnim višestrukim prolazom kroz üelijske linije PPV i/ili PRRSV i/ili koji se postiže genetskim inženjeringom, pri þemu se pod „virulencijom“ podrazumeva stepen patogenosti, i gde je „patogenost“ usmerena na sposobnost virusa da izazove kliniþke znakove kod domaüina ili potomstva domaüina, kao što je na primer reproduktivna neuspeh.

[0060] Termini “ubijen“ ili “inaktiviran“ u okviru predmetnog pronalaska odnose se na PPV i/ili PRRSV koji nemaju sposobnost da inficiraju odgovarajuüi subjekt (za razliku od živog virusa) i/ili þija infektivnost nije data u poreÿenju sa prirodnim virusom. Konkretno, ubijeni/inaktivirani virus ne može inficirati svoje nativne üelije domaüina (više).

[0061] U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na imunogenu kompoziciju ili kombinovanu vakcinu ili kombinaciju kao što je ovde opisano i traženo, pri þemu najmanje jedan PPV antigen je jedna ili više PPV podjedinica.

[0062] U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na imunogenu kompoziciju ili kombinovanu vakcinu ili kombinaciju kao što je ovde opisano i traženo, pri þemu najmanje jedna PPV podjedinica(e) je PPV virusni protein 2 (VP2), pri þemu poželjno PPV VP2 je jedini PPV antigen.

[0063] Termin "virusni protein 2" ili "VP2" odnosi se na kapsidni protein VP2 svinjskog parvovirusa. Izraz "virusni protein 2" ili "VP2" je dobro poznat struþnjacima.

[0064] Termini "protein", "aminokiselina" i "polipeptid" se koriste naizmeniþno. Termin "protein" se odnosi na sekvencu aminokiselinskih ostataka sastavljenih od prirodnih aminokiselina, kao i njihovih derivata. Prirodne aminokiseline su dobro poznate u tehnici i opisane su u standardnim udžbenicima biohemije. Unutar aminokiselinskih sekvenci aminokiselinski ostaci su povezani peptidnim vezama. Dalje, dva kraja aminokiselinske sekvence se nazivaju karboksilni kraj (C-terminus) i amino-kraj (N-terminus). Termin "protein" obuhvata suštinski preþišüene proteine ili proteinske preparate koji pored toga sadrže i druge proteine. Dalje, termin se takoÿe odnosi na fragmente proteina. Štaviše, ukljuþuje hemijski modifikovane proteine. Takve modifikacije mogu biti veštaþke modifikacije ili prirodne modifikacije kao što su fosforilacija, glikozilacija, miristilacija i sliþno.

[0065] U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na imunogenu kompoziciju ili kombinovanu vakcinu ili kombinaciju kao što je ovde opisano i zahtevano, pri þemu PPV VP2 ima

- na poziciji amino kiseline 228 ostatak glutaminske kiseline ili ostatak glutamata, i/ili

- na poziciji amino kiseline 414 ostatak serina, i/ili

- na poziciji amino kiseline 419 ostatak glutamina, i/ili

- na poziciji amino kiseline 436 ostatak treonina,

pri þemu se numerisanje aminokiselinskih pozicija odnosi na sekvencu aminokiselina divljeg tipa PPV VP2.

[0066] Termin “pri þemu se numerisanje aminokiselinskih pozicija odnosi na aminokiselinsku sekvencu divljeg tipa PPV VP2” odnosi se na numerisanje aminokiselinskih pozicija koje se odnose na amino kiselinsku sekvencu pune dužine divljeg tipa PPV VP2 proteina. Poželjno je da se numerisanje amino pozicija kao što je ovde pomenuto odnosi na sekvencu divljeg tipa PPV VP2 proteina koja ima 579 aminokiselinskih ostataka, ukljuþujuüi ostatak metionina na (N-terminalnoj) aminokiselinskoj poziciji 1. Izraz „pri þemu se numerisanje aminokiselinskih pozicija odnosi na sekvencu aminokiselina divljeg tipa PPV VP2” obuhvata divlji tip PPV VP2 kao što je primerno dato u SEQ ID NO:1 (PPV 27a VP2).

[0067] U drugom aspektu, ovaj pronalazak se odnosi na imunogenu kompoziciju ili kombinovanu vakcinu ili kombinaciju prema ovde opisanom i traženom, pri þemu PPV VP2 dalje ima

- na poziciji amino kiseline 25 ostatak izoleucina, i/ili

- na poziciji amino kiseline 36 ostatak serina, i/ili

- na poziciji amino kiseline 37 ostatak izoleucina,

[0068] U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na imunogenu kompoziciju ili kombinovanu vakcinu ili kombinaciju kao što je ovde opisano i zahtevano, pri þemu se numerisanje aminokiselinskih pozicija odnosi na sekvencu amino kiselina kao što je prikazano u SEQ ID NO:1.

[0069] U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na imunogenu kompoziciju ili kombinovanu vakcinu ili kombinaciju kao što je ovde opisano i zahtevano, pri þemu PPV VP2 je rekombinantni PPV VP2.

[0070] Termin “rekombinantni“, kako se ovde koristi, posebno se odnosi na proteinski molekul koji je eksprimiran iz rekombinantnog molekula DNK, kao što je polipeptid koji se proizvodi tehnikama rekombinantne DNK. Primer takvih tehnika ukljuþuje sluþaj kada se DNK koji kodira eksprimirani protein (npr. PPV VP2) ubacuje u odgovarajuüi vektor ekspresije, poželjno vektor ekspresije bakulovirusa, koji se zauzvrat koristi za transfekciju, ili u sluþaju da ekspresioni vektor bakulovirusa inficira, üeliju domaüina za proizvodnju proteina ili polipeptid kodiran DNK. Izraz "rekombinantni PPV VP2", kako se ovde koristi, se stoga posebno odnosi na proteinski molekul koji je eksprimiran iz rekombinantnog molekula DNK.

[0071] U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na imunogenu kompoziciju ili kombinovanu vakcinu ili kombinaciju kao što je ovde opisano i zahtevano, pri þemu PPV VP2 je rekombinantni bakulovirus eksprimiran PPV VP2.

[0072] Termin "bakulovirus" je dobro poznat struþnjacima. Kako se ovde koristi, "bakulovirus" posebno oznaþava sistem za proizvodnju željenog proteina u üeliji insekata korišüenjem rekombinantnog bakulovirusnog vektora dizajniranog da ekspresuje navedeni protein. Sistem ekspresije bakulovirusa generalno obuhvata sve elemente neophodne za postizanje ekspresije

1

rekombinantnog proteina u üelijama insekata, i obiþno ukljuþuje inženjering vektora bakulovirusa za ekspresiju željenog proteina, uvoÿenje konstruisanog vektora bakulovirusa u üelije insekata, kultivisanje üelija insekata koji sadrži projektovani bakulovirusni vektor u pogodnom medijumu za rast tako da se željeni protein eksprimira, i oporavak proteina. Tipiþno, inženjering vektora bakulovirusa ukljuþuje konstrukciju i izolaciju rekombinantnih bakulovirusa u kojima je kodirajuüa sekvenca za izabrani gen umetnuta iza promotera neesencijalnog virusnog gena, pri þemu je veüina trenutno korišüenih ekspresionih sistema bakulovirusa zasnovana na sekvenci virusa Autographa californica nuklearne polihedroze (AcMNPV) ((Virology 202 (2), 586-605 (1994), NCBI Accession No.: NC_001623). Ekspresioni sistemi bakulovirusa su dobro poznati u tehnici i opisani su, na primer, u “Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual” by David R. O'Reilly, Lois Miller, Verne Luckow, pub. by Oxford Univ. Press (1994), “The Baculovirus Expression System: A Laboratory Guide” by Linda A. King, R. D. Possee, published by Chapman & Hall (1992). An exemplary nonlimiting example of a baculovirus system for producing a recombinant protein is e.g. described in WO 2006/072065 A2.

[0073] Poželjni bakulovirusni vektori ukljuþuju bakulovirus kao što je BaculoGold (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, Calif.) ili DiamondBac (Sigma Aldrich), posebno pod uslovom da su proizvodne üelije üelije insekata. Iako je sistem ekspresije bakulovirusa poželjan, struþnjaci u ovoj oblasti razumeju da üe drugi sistemi ekspresije raditi za svrhe predmetnog pronalaska, naime ekspresija PPV VP2 u supernatantu üelijske kulture. Takvi drugi sistemi ekspresije mogu zahtevati upotrebu signalne sekvence da bi izazvali ekspresiju PPV VP2 u medijumu.

[0074] U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na imunogenu kompoziciju ili kombinovanu vakcinu ili kombinaciju kao što je ovde otkriveno i traženo, pri þemu PPV VP2 sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence koja ima najmanje 90% identiþnost sekvence sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 i/ili SEQ ID NO:5 do 16.

[0075] U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na imunogenu kompoziciju ili kombinovanu vakcinu ili kombinaciju kao što je ovde otkriveno i traženo, pri þemu PPV VP2 sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence koja ima najmanje 99%, najmanje 99,1%, najmanje 99,2%, najmanje 99,3%, najmanje 99,4%, najmanje 99,5%, najmanje 99,6%, najmanje 99,7%, najmanje 99,8%, ili najmanje 99,9% identiþnost sekvence sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO:2.

[0076] U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na imunogenu kompoziciju ili kombinovanu vakcinu ili kombinaciju kao što je ovde otkriveno i traženo, pri þemu PPV VP2 sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:2

[0077] U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na imunogenu kompoziciju ili kombinovanu vakcinu ili kombinaciju kao što je ovde otkriveno i traženo, pri þemu PPV VP2 sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:2.

[0078] U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na imunogenu kompoziciju ili kombinovanu vakcinu ili kombinaciju kao što je ovde otkriveno i traženo, pri þemu je PPV VP2 kodiran nukleotidnom sekvencom koja kodira sekvencu aminokiselina koja ima najmanje 90% identiþnost sekvence sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 i/ili SEQ ID NO:5 do 16.

[0079] U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na imunogenu kompoziciju ili kombinovanu vakcinu ili kombinaciju kako je ovde otkriveno i traženo, pri þemu je PPV VP2 kodiran nukleotidnom sekvencom koja kodira aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 99%, najmanje 99,1% , najmanje 99,2%, najmanje 99,3%, najmanje 99,4%, najmanje 99,5%, najmanje 99,6%, najmanje 99,7%, najmanje 99,8%, ili najmanje 99,9% identiþnost sekvence sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO:2.

[0080] U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na imunogenu kompoziciju ili kombinovanu vakcinu ili kombinaciju kako je ovde otkriveno i traženo, pri þemu je PPV VP2 kodiran nukleotidnom sekvencom koja kodira aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:2.

[0081] SEQ ID NO:4 je kodon-optimizovana PPV 27a VP2 nukleotidna sekvenca koja je dalje modifikovana da poseduje dva ClaI restrikciona enzimska mesta (aminokisleinska pozicija 25 je ostatak izoleucina, aminokiselinska pozicija 36 je ostatak serina, aminokiselinska pozicija 37 je izoleucinski ostatak) kako bi se uporedio region kodiranja VP2 koji se sastoji od ponavljanja glicina. ClaI lokacije su uvedene na naþin da se ne ometa region kodiranja VP2. SEQ ID NO:2 je proteinska sekvenca koja odgovara SEQ ID NO:4. SEQ ID NO:3 je kodon-optimizovana PPV 27a VP2 nukleotidna sekvenca (bez ClaI restrikcijskih enzimskih mesta). SEQ ID NO:1 je sekvenca proteina koja odgovara SEQ ID NO:3.

[0082] Izrazi "nukleinska kiselina" ili "sekvenca nukleinske kiseline" ili "nukleotidna sekvenca" ili "polinukleotid" se ovde koriste naizmeniþno i odnose se na polinukleotide ukljuþujuüi DNK molekule, RNK molekule, cDNK molekule ili derivate. Termin obuhvata jednolanþane i dvolanþane polinukleotide. Nukleinska kiselina ovog pronalaska obuhvata izolovane polinukleotide (tj. izolovane iz svog prirodnog konteksta) i genetski modifikovane oblike. Štaviše, obuhvaüeni su i hemijski modifikovani polinukleotidi ukljuþujuüi modifikovane polinukleotide koji se javljaju u prirodi kao što su glikozilovani ili metilovani polinukleotidi ili veštaþki modifikovani polinukleotidi kao što su biotinilovani polinukleotidi. Dalje, izrazi "nukleinska kiselina" i "polinukleotid" su

1

zamenljivi i odnose se na bilo koju nukleinsku kiselinu. Termini "nukleinska kiselina" i "polinukleotid" takoÿe posebno ukljuþuju nukleinske kiseline sastavljene od baza koje nisu pet biološki prisutnih baza (adenin, gvanin, timin, citozin i uracil).

[0083] Termin "identitet" ili "identitet sekvence" je poznat u tehnici i odnosi se na odnos izmeÿu dve ili više polipeptidnih sekvenci ili dve ili više polinukleotidnih sekvenci, odnosno referentne sekvence i date sekvence koja treba da se uporedi sa referentnom sekvencom. Identitet sekvence se utvrÿuje uporeÿivanjem date sekvence sa referentnom sekvencom nakon što su sekvence optimalno poravnate da bi se proizveo najviši stepen sliþnosti sekvence, što je odreÿeno podudaranjem izmeÿu nizova takvih sekvenci. Nakon takvog poravnanja, identitet sekvence se utvrÿuje na osnovu pozicije po poziciji, na primer, sekvence su "identiþne" na odreÿenoj poziciji ako su na toj poziciji nukleotidi ili aminokiselinski ostaci identiþni. Ukupan broj takvih pozicija se zatim deli sa ukupnim brojem nukleotida ili ostataka u referentnoj sekvenci da bi se dobio % identiteta sekvence. Identitet sekvence se može lako izraþunati poznatim metodama, ukljuþujuüi, ali ne ograniþavajuüi se na, one opisane u Computational Molecular Biology, Lesk, A. N., ed., Oxford University Press, New York (1988), Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinge, G., Academic Press (1987); Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York (1991); and Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988). Poželjne metode za odreÿivanje identiteta sekvence su dizajnirane da daju najveüe podudaranje izmeÿu testiranih sekvenci. Metode za odreÿivanje identiteta sekvence su kodifikovane u javno dostupnim kompjuterskim programima koji odreÿuju identitet sekvence izmeÿu datih sekvenci. Primeri takvih programa ukljuþuju, ali nisu ograniþeni na, GCG programski paket (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research, 12(1):387 (1984)), BLASTP, BLASTN and FASTA (Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990). The BLASTX program is publicly available from NCBI and other sources (BLAST Manual, Altschul, S. et al., NCVI NLM NIH Bethesda, MD 20894, Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990). Ovi programi optimalno usklaÿuju sekvence koristeüi podrazumevane težine praznina kako bi proizveli najviši nivo identiteta sekvence izmeÿu date i referentne sekvence. Kao ilustracija, polinukleotidom koji ima nukleotidnu sekvencu koja ima najmanje, na primer, 85%, poželjno 90%, još poželjnije 95% "identiteta sekvence" sa referentnom nukleotidnom sekvencom, podrazumeva se da nukleotidna sekvenca datog polinukleotida je identiþan referentnoj sekvenci osim što data polinukleotidna sekvenca može ukljuþivati do 15, poželjno do 10, još poželjnije do 5 taþaka mutacija na svakih 100 nukleotida referentne nukleotidne sekvence. Drugim reþima, u polinukleotidu koji ima nukleotidnu sekvencu koja ima najmanje 85%, poželjno 90%, još poželjnije 95% identiteta u odnosu na referentnu nukleotidnu sekvencu, do 15%, poželjno 10%, još poželjnije 5% od nukleotidi u referentnoj sekvenci mogu biti obrisani ili supstituisani drugim

1

nukleotidom, ili broj nukleotida do 15%, poželjno 10%, još poželjnije 5% ukupnih nukleotida u referentnoj sekvenci može biti umetnuto u referentnu sekvencu. Ove mutacije referentne sekvence mogu se javiti na 5'- ili 3'-terminalnim pozicijama referentne nukleotidne sekvence ili bilo gde izmeÿu tih terminalnih pozicija, umešane ili pojedinaþno izmeÿu nukleotida u referentnoj sekvenci ili u jednoj ili više susednih grupa unutar referentne sekvence. Analogno tome, polipeptidom koji ima datu aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje, na primer, 85%, poželjno 90%, još poželjnije 95% identiþnost sekvence sa referentnom amino kiselinskom sekvencom, podrazumeva se da data aminokiselinska sekvenca u polipeptidu je identiþna referentnoj sekvenci osim što data polipeptidna sekvenca može ukljuþivati do 15, poželjno do 10, još poželjnije do 5 aminokiselinskih alteracija na svakih 100 aminokiselina referentne aminokiselinske sekvence. Drugim reþima, da bi se dobila data polipeptidna sekvenca koja ima najmanje 85%, poželjno 90%, još poželjnije 95% identiþnost sekvence sa referentnom sekvencom aminokiselina, do 15%, poželjno do 10%, još poželjnije do 5% aminokiselinskih ostataka u referentnoj sekvenci može biti izbrisano ili zamenjeno drugom amino kiselinom, ili broj aminokiselina do 15%, poželjno do 10%, još poželjnije do 5% od ukupnog broja aminokiselinski ostaci u referentnoj sekvenci mogu biti umetnuti u referentnu sekvencu. Ove promene referentne sekvence mogu se desiti na amino- ili karboksi-terminalnim pozicijama referentne aminokiselinske sekvence ili bilo gde izmeÿu tih terminalnih pozicija, umešanih ili pojedinaþno izmeÿu ostataka u referentnoj sekvenci ili u jednoj ili više susednih grupa unutar referentna sekvenca. Poželjno, pozicije ostataka koji nisu identiþni razlikuju se konzervativnim supstitucijama amino kiselina. Meÿutim, konzervativne zamene nisu ukljuþene kao podudaranje prilikom odreÿivanja identiteta sekvence.

[0084] Termini "identitet", "identitet sekvence" i "procenat identiteta" se ovde koriste naizmeniþno. Za potrebe ovog pronalaska, ovde je definisano da u cilju odreÿivanja procenta identiþnosti dve aminokiselinske sekvence ili dve sekvence nukleinske kiseline, sekvence se poravnavaju radi optimalnog poreÿenja (npr. praznine se mogu uvesti u sekvencu prve amino kiseline ili nukleinske kiseline za optimalno poravnanje sa drugom sekvencom amino ili nukleinske kiseline). Zatim se porede ostaci aminokiselina ili nukleotida na odgovarajuüim pozicijama amino kiselina ili nukleotida. Kada je položaj u prvoj sekvenci zauzet istim ostatkom amino kiseline ili nukleotida kao odgovarajuüi položaj u drugoj sekvenci, onda su molekuli identiþni na toj poziciji. Procenat identiþnosti izmeÿu dve sekvence je funkcija broja identiþnih pozicija koje dele sekvence (odn., % identiteta = broj identiþnih pozicija/ukupan broj pozicija (odn., pozicija koje se preklapaju) x 100). Poželjno je da su dve sekvence iste dužine.

[0085] Poreÿenje sekvenci se može izvršiti preko cele dužine dve sekvence koje se porede ili preko fragmenta dve sekvence. Uobiþajeno, poreÿenje üe se vršiti preko cele dužine dve sekvence

1

koje se porede. Meÿutim, identitet sekvence se može izvršiti u regionu od, na primer, dvadeset, pedeset, sto ili više susednih aminokiselinskih ostataka.

[0086] Struþnjak üe biti svestan þinjenice da je dostupno nekoliko razliþitih kompjuterskih programa za odreÿivanje homologije izmeÿu dve sekvence. Na primer, poreÿenje sekvenci i odreÿivanje procenta identiþnosti izmeÿu dve sekvence može se postiüi korišüenjem matematiþkog algoritma. U poželjnom izvoÿenju, procenat identiþnosti izmeÿu dve sekvence aminokiselina ili nukleinskih kiselina se odreÿuje korišüenjem Needleman i Wunsch (J. Mol. Biol. (48): 444-453 (1970)) algoritma koji je ugraÿen u GAP program u softverskom paketu Accelris GCG (dostupnom na http://www.accelrys.com/products/gcg/), koristeüi ili Blosum 62 matricu ili PAM250 matricu, i težinu razmaka od 16, 14, 12, 10, 8, 6 ili 4 i težinom dužine od 1, 2, 3, 4, 5 ili 6. Struþnjak üe shvatiti da üe svi ovi razliþiti parametri dati neznatno razliþite rezultate, ali da se ukupan procentualni identitet dve sekvence znaþajno ne menja kada se koriste razliþiti algoritmi.

[0087] Sekvence proteina ili sekvence nukleinske kiseline iz predmetnog pronalaska mogu se dalje koristiti kao "sekvenca upita" za obavljanje pretrage u javnim bazama podataka da bi se, na primer, identifikovali drugi þlanovi porodice ili srodne sekvence. Takve pretrage se mogu izvršiti korišüenjem programa BLASTN i BLASTP (verzija 2.0) Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol.215:403-10. BLAST pretrage proteina se mogu izvršiti sa BLASTP programom, rezultat=50, dužina reþi=3 da bi se dobile sekvence amino kiselina homologne proteinskim molekulima pronalaska. Da bi se dobila razmaknuta poravnanja u svrhu poreÿenja, Gapped BLAST se može koristiti kao što je opisano u Altschul et al. (1997) Nukleinske kiseline Res. 25(17): 3389-3402. Kada koristite programe BLAST i Gapped BLAST, mogu se koristiti podrazumevani parametri odgovarajuüih programa (npr., BLASTP i BLASTN). Pogledajte poþetnu stranicu National Center for Biotechnology Information na http://www.ncbi.nlm.nih.gov/.

[0088] U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na imunogenu kompoziciju ili kombinovanu vakcinu ili kombinaciju kao što je ovde otkriveno i zatraženo, pri þemu je PRRS virus izabran iz grupe koju þine: genotip PRRS virusa 1, genotip PRRS virusa 2, genotip PRRS virusa 1 koji sadrži genom kodiran nukleotidnom sekvencom koja ima najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99%, najmanje 99.1%, najmanje 99.2%, najmanje 99.3%, najmanje 99.4%, najmanje 99.5%, najmanje 99.6 %, najmanje 99.7%, najmanje 99.8%, najmanje 99.9% ili 100% identiþnost sa sekvencom nukleinske kiseline SEQ ID NO:17 (Lelystad divlji tip sekvence), PRRS virus genotip 2 koji sadrži genom kodiran nukleotidnom sekvencom koja ima najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, na najmanje 98%, najmanje 99%, najmanje 99.1%, najmanje 99.2%, najmanje 99.3%, najmanje 99.4%, najmanje 99.5%, najmanje 99.6%, najmanje 99.7%, najmanje 99.8%, najmanje

1

99.9% ili 100% identiþnost sa sekvencom nukleinske kiseline SEQ ID NO:18 (VR2332 sekvenca divljeg tipa).

[0089] U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na imunogenu kompoziciju ili kombinovanu vakcinu ili kombinaciju kao što je ovde otkriveno i traženo, pri þemu je PRRS virus izabran iz grupe koju þine: živi oslabljeni/modifikovani živi PRRS virus, živi atenuirani/modifikovani živi Genotip PRRS virusa tipa 1 (npr. Porcilis PRRS, Unistrain PRRS, Amervac PRRS, itd.), živi atenuirani/modifikovani živi genotip PRRS virusa tipa 2 (npr. Ingelvac® PRRS MLV, Fostera PRRS, itd.), živi atenuirani/modifikovani živi PR soj virusa 94881 [(genotip 1), ReproCic® PRRS EU], ATCC depozit VR-2332.

[0090] Termini "imunogena kompozicija" ili "kombinovana vakcina" ili "kombinacija" odnose se na kompoziciju koja sadrži najmanje jedan antigen, u sluþaju kombinovane vakcine" ili "kombinacije" najmanje dva antigena, koja izaziva(ju) imunološki odgovor kod domaüina kome se daje "imunogena kompozicija" ili "kombinovana vakcina" ili "kombinacija". Takav imunološki odgovor može biti üelijski i/ili imuni odgovor posredovan antitelom na "imunogenu kompoziciju" ili "kombinovanu vakcinu" ili "kombinaciju" pronalaska. Poželjno, "imunogena kompozicija" ili "kombinovana vakcina" ili "kombinacija" indukuje imuni odgovor i, poželjnije, daje zaštitni imunitet protiv jednog ili više kliniþkih znakova PPV i/ili PRRSV infekcije. Domaüin je takoÿe opisan kao "subjekt". Poželjno, bilo koji od domaüina ili subjekata opisanih ili pomenutih ovde su svinje.

[0091] Obiþno, "imunološki odgovor" ukljuþuje, ali nije ograniþen na jedan ili više od sledeüih efekata: proizvodnju ili aktivaciju antitela, B üelija, pomoünih T üelija, supresorskih T üelija i/ili citotoksiþnih T üelija i/ ili gama-delta T üelije, usmerene specifiþno na antigen ili antigene ukljuþene u "imunogenu kompoziciju" ili "kombinovanu vakcinu" ili "kombinaciju" pronalaska. Poželjno, domaüin üe pokazati ili zaštitni imunološki odgovor ili terapeutski odgovor.

[0092] "Zaštitni imunološki odgovor" ili "zaštitni imunitet" üe se demonstrirati bilo smanjenjem ili nedostatkom kliniþkih znakova koje obiþno pokazuje inficirani domaüin, bržim vremenom oporavka i/ili smanjenim trajanjem infektivnosti ili smanjenim titrom patogena u tkiva ili telesne teþnosti ili izluþevine inficiranog domaüina.

[0093] U sluþaju da domaüin pokazuje zaštitni imunološki odgovor tako da üe otpornost na novu infekciju biti poveüana i/ili smanjena kliniþka težina bolesti, "imunogena kompozicija" ili "kombinacija" se opisuje kao "vakcina".

[0094] U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na imunogenu kompoziciju ili kombinovanu vakcinu ili kombinaciju kako je ovde otkriveno i traženo, pri þemu je imunogena kompozicija ili kombinovana vakcina ili kombinacija formulisana za primenu jedne doze.

1

[0095] Zapremina za primenu jedne doze je definisana na drugom mestu ovde.

[0096] Imunogena kompozicija ili kombinovana vakcina ili kombinacija kao što je ovde otkriveno i zahtevano, poželjno je da se primenjuje lokalno ili sistemski. Pogodni naþini primene koji se uobiþajeno koriste su oralna ili parenteralna primena, kao što su intranazalna, intravenska, intramuskularna, intraperitonealna, subkutana, kao i inhalacija. Meÿutim, u zavisnosti od prirode i naþina delovanja jedinjenja, imunogena kompozicija ili kombinovana vakcina ili kombinacija kao što je ovde otkriveno i zatraženo može se davati i drugim putevima. Najpoželjnija imunogena kompozicija ili kombinovana vakcina ili kombinacija kako je ovde otkriveno i za koju se traži da se primenjuje intramuskularno.

[0097] U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na imunogenu kompoziciju ili kombinovanu vakcinu ili kombinaciju kao što je ovde otkriveno i traženo, pri þemu se imunogena kompozicija ili kombinovana vakcina ili kombinacija primenjuje intramuskularno.

[0098] U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na imunogenu kompoziciju ili kombinovanu vakcinu ili kombinaciju kako je ovde otkriveno i traženo, pri þemu je imunogena kompozicija ili kombinovana vakcina ili kombinacija bezbedna za nazimice i/ili krmaþe tokom trudnoüe i laktacije.

[0099] U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na imunogenu kompoziciju ili kombinovanu vakcinu ili kombinaciju kao što je ovde otkriveno i traženo, pri þemu je imunogena kompozicija ili kombinovana vakcina ili kombinacija bezbedna za nazimice i/ili krmaþe od 30 dana gestacije, poželjno od 40 dana trudnoüe.

[00100] U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na imunogenu kompoziciju ili kombinovanu vakcinu ili kombinaciju kao što je ovde otkriveno i traženo, pri þemu imunogena kompozicija ili kombinovana vakcina ili kombinacija dalje sadrži najmanje jedan farmaceutski prihvatljiv nosaþ.

[00101] Termin "farmaceutski prihvatljivi nosaþ" ukljuþuje sve rastvaraþe, disperzione medije, obloge, stabilizatore, razblaživaþe, konzervanse, antibakterijske i antifungalne agense, izotoniþne agense, agense za odlaganje adsorpcije, adjuvanse, imunološke stimulante i njihove kombinacije.

[00102] "Razblaživaþi" mogu ukljuþivati vodu, fiziološki rastvor, dekstrozu, etanol, glicerol, fiziološki rastvor puferovan fosfatom i sliþno. Izotoniþni agensi mogu ukljuþivati natrijum hlorid, dekstrozu, manitol, sorbitol i laktozu, izmeÿu ostalih. Stabilizatori ukljuþuju albumin i alkalne soli etilendiamintetrasirüetne kiseline, izmeÿu ostalog.

[00103] U jednom aspektu predmetnog pronalaska, farmaceutski prihvatljiv nosaþ je karbomer.

2

[00104] Poželjno, imunogena kompozicija može dalje da sadrži jedan ili više drugih imunomodulatornih agenasa, kao što su, npr., interleukini, interferoni ili drugi citokini. Koliþine i koncentracije pomoünih agenasa (adjuvanasa) i aditiva korisnih u kontekstu predmetnog pronalaska može lako da odredi kvalifikovani struþnjak.

[00105] U nekim aspektima, imunogena kompozicija predmetnog pronalaska sadrži pomoüni agens, adjuvant. „Adjuvansi“ kako se ovde koriste, mogu ukljuþivati aluminijum hidroksid i aluminijum fosfat, saponine, npr. Quil A, QS-21 (Cambridge Biotech Inc., Cambridge MA), GPI-0100 (Galenica Pharmaceuticals, Inc., Birmingham, AL), emulziju voda u ulju, emulziju ulje u vodi, emulzija voda u ulju u vodi. Emulzija se može bazirati posebno na laganom teþnom parafinskom ulju (tip Evropska Farmakopeja); izoprenoidno ulje kao što je skvalan ili skvalen; ulje koje nastaje oligomerizacijom alkena, posebno izobutena ili decena; estri kiselina ili alkohola koji sadrže linearnu alkil grupu, taþnije biljna ulja, etil oleat, propilen glikol di-(kaprilat/kaprat), gliceril tri-(kaprilat/kaprat) ili propilen glikol dioleat; estri razgranatih masnih kiselina ili alkohola, posebno estri izostearinske kiseline. Ulje se koristi u kombinaciji sa emulgatorima za formiranje emulzije. Emulgatori su poželjno nejonski surfaktanti, posebno estri sorbitana, manida (npr., anhidromanitol oleat), glikola, poliglicerola, propilen glikola i oleinske, izostearinske, ricinoleinske ili hidroksistearinske kiseline, koji su opciono etoksilovani, i blokovi kopolimera polioksipropilenpolioksietilena, posebno Pluronic proizvodi, posebno L121. Videti Hunter et al., The Theory and Practical Application of Adjuvants (Ed.Stewart-Tull, D. E. S.), JohnWiley and Sons, NY, pp51-94 (1995) and Todd et al., Vaccine 15:564-570 (1997). Primerni adjuvansi su SPT emulzije opisane na strani 147 “Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach” edited by M. Powell and M. Newman, Plenum Press, 1995, and the emulsion MF59 described on page 183 of this same book.

[00106] Sledeüi primer pomoünog sredstva (adjuvansa) je jedinjenje koje se bira izmeÿu polimera akrilne ili metakrilne kiseline i kopolimera anhidrida maleinske kiseline i derivata alkenila. Pogodna pomoüna jedinjenja su polimeri akrilne ili metakrilne kiseline koji su umreženi, posebno sa polialkenil etrima šeüera ili polialkohola. Ova jedinjenja su poznata pod nazivom karbomer (Phameuropa Vol. 8, No. 2, jun 1996). Struþnjaci se takoÿe mogu pozvati na ameriþki patent br.

2,909,462 koji opisuje takve akrilne polimere umrežene sa polihidroksilovanim jedinjenjem koje ima najmanje 3 hidroksilne grupe, poželjno ne više od 8, pri þemu su atomi vodonika najmanje tri hidroksila zamenjeni sa nezasiüenim alifatiþnim radikalima koji imaju najmanje 2 atoma ugljenika. Poželjni radikali su oni koji sadrže od 2 do 4 atoma ugljenika, npr. vinili, alili i druge etilenski nezasiüene grupe. Nezasiüeni radikali mogu sami da sadrže druge supstituente, kao što je metil. Proizvodi koji se prodaju pod imenom Carbopol; (BF Goodrich, Ohajo, SAD) su posebno prikladni. Oni su unakrsno povezani sa alil saharozom ili sa alil pentaeritritolom. Meÿu njima se mogu pomenuti Carbopol 974P, 934P i 971P. Najpoželjnija je upotreba Carbopol 971P. Meÿu kopolimerima anhidrida maleinske kiseline i derivata alkenila su kopolimeri EMA (Monsanto), koji su kopolimeri anhidrida maleinske kiseline i etilena. Rastvaranje ovih polimera u vodi dovodi do kiselog rastvora koji üe se neutralisati, poželjno do fiziološkog pH, kako bi se dobio pomoüni rastvor u koji üe se ugraditi sama imunogena, imunološka ili vakcinalna kompozicija.

[00107] Dalji pogodni adjuvansi ukljuþuju, ali nisu ograniþeni na, RIBI sistem adjuvansa (Ribi Inc.), Blok kopolimer (CytRx, Atlanta GA), SAF-M (Chiron, Emeriville CA), monofosforil lipid A, Avridin lipid-aminski adjuvans, toplotno labilni enterotoksin iz E. coli (rekombinantni ili drugi), toksin kolere, IMS 1314 ili muramil dipeptid, ili prirodni ili rekombinantni citokini ili njihovi analozi ili stimulansi oslobaÿanja endogenog citokina, izmeÿu mnogih drugih.

[00108] 2þekuje se da se adjuvans može dodati u koliþini od oko 100 µg do oko 10 mg po dozi, poželjno u koliþini od oko 100 µg do oko 10 mg po dozi, poželjnije u koliþini od oko 500 µg do oko 5 mg po dozi, još poželjnije u koliþini od oko 750 ug do oko 2.5 mg po dozi, a najpoželjnije u koliþini od oko 1 mg po dozi. Alternativno, pomoüno sredstvo može biti u koncentraciji od oko 0.01% do 50%, poželjno u koncentraciji od oko 2% do 30%, poželjnije u koncentraciji od oko 5% do 25%, još poželjnije u koncentraciji od oko 7% do 22%, a najpoželjnije u koncentraciji od 10% do 20% zapremine finalnog proizvoda.

[00109] U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na imunogenu kompoziciju ili kombinovanu vakcinu ili kombinaciju kao što je ovde otkriveno i traženo, pri þemu je najmanje jedan farmaceutski prihvatljiv nosaþ karbomer.

[00110] U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na imunogenu kompoziciju ili kombinovanu vakcinu ili kombinaciju kao što je ovde otkriveno i zatraženo, pri þemu imunogena kompozicija ili kombinovana vakcina ili kombinacija sadrži 0.1 µg so 50 µg PPV VP2 antigena, poželjno 0.5 µg do 10 µg PPV VP2 antigena, naroþito 1.0 µg do 10 µg PPV VP2 antigena, i/ili 3.9 do 7.0 log10TCID50živog oslabljenog/modifikovanog živog PRRS virusa.

[00111] U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na imunogenu kompoziciju ili kombinovanu vakcinu ili kombinaciju kao što je ovde otkriveno i za koju se traži da sadrži izmeÿu oko 0.1 µg i 50 µg PPV VP2 antigena. Poželjno, imunogena kompozicija sadrži izmeÿu oko 0.2 µg i 40 µg, poželjnije izmeÿu oko 0.3 µg i 30 µg, poželjnije izmeÿu oko 0.4 µg i 20 µg i još poželjnije izmeÿu oko 0.5 µg i još poželjnije izmeÿu oko 0.5 µg i oko 10 µg 1,0 µg i 10 µg sa koliþinom od 0.5 µg, 0.75 µg, 1 µg, 1.25 µg, 1.5 µg, 2 µg, 2.5 µg, 3 µg, 3.5 µg, 4 µg, 4.5 µg, 5 µg, 5.5 µg, 6 µg, 6.5 µg, 7 µg, 7.5 µg, 8 µg, 8.5 µg, 9 µg, 9.5 µg ili 10 µg najpoželjnijeg PPV VP2 antigena.

[00112] U drugom aspektu, ovaj pronalazak se odnosi na imunogenu kompoziciju ili kombinovanu vakcinu ili kombinaciju kao što je ovde otkriveno i za koju se traži da sadrži izmeÿu oko 3.9 do 7.0 log10TCID50živog oslabljenog/modifikovanog živog PRRS virusa.

[00113] U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na imunogenu kompoziciju ili kombinaciju kako je ovde otkriveno i zahtevano, pri þemu je imunogena kompozicija ili kombinacija vakcina.

[00114] Termin "vakcina" je veü opisan negde drugde ovde. Meÿutim, u sluþaju kada domaüin pokazuje zaštitni imunološki odgovor tako da otpornost na novu infekciju bude poveüana i/ili kliniþka težina bolesti bude smanjena, imunogena kompozicija ili kombinacija se opisuje kao "vakcina".

[00115] U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na imunogenu kompoziciju ili kombinovanu vakcinu ili kombinaciju kako je ovde otkriveno i za koju se tvrdi da štiti od homolognog i/ili heterolognog izazova. Korisno je da eksperimentalni podaci obezbeÿeni predmetnim pronalaskom otkrivaju da imunogena kompozicija ili kombinovana vakcina ili kombinacija predmetnog pronalaska ima širok spektar zaštite pošto štiti od heterolognih severnoameriþkih i/ili heterolognih evropskih izazovnih sojeva.

[00116] Termini "štiti" i "profilaksa" i "spreþavanje" se u ovoj prijavi koriste naizmeniþno. Ovi termini su definisani na drugom mestu.

[00117] U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na imunogenu kompoziciju ili kombinovanu vakcinu ili kombinaciju kako je ovde otkriveno i za koju se tvrdi da štiti od izazova sa severnoameriþkim i/ili evropskim izolatima.

[00118] Termin "severnoameriþki i/ili evropski izolati" je dobro poznat struþnjacima. Termin „severnoameriþki i/ili evropski izolati” obuhvata sve izolate koji su bili ili üe biti izolovani u Severnoj Americi i Evropi.

[00119] U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na imunogenu kompoziciju ili kombinovanu vakcinu ili kombinaciju kako je ovde otkriveno i za koju se tvrdi da je unakrsno zaštitna protiv severnoameriþkih i/ili evropskih izolata.

[00120] U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na imunogenu kompoziciju ili kombinovanu vakcinu ili kombinaciju kako je ovde otkriveno i za koju se tvrdi da je efikasna u leþenju i/ili profilaksi kliniþkih znakova izazvanih PPV i/ili PRRSV infekcijom kod subjekta koji je potreban. Termini „leþenje i/ili profilaksa”, „kliniþki znaci” i „potreba” su definisani na drugom mestu.

2

[00121] U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na imunogenu kompoziciju ili kombinovanu vakcinu ili kombinaciju kako je ovde otkriveno i traženo, pri þemu imunogena kompozicija ili kombinovana vakcina ili kombinacija štiti od homolognog i/ili heterolognog izazova sa PPV i/ili homologni i/ili heterologni izazov sa PRRS virusom.

[00122] U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na imunogenu kompoziciju ili kombinovanu vakcinu ili kombinaciju kao što je ovde otkriveno i traženo, pri þemu imunogena kompozicija ili kombinovana vakcina ili kombinacija štiti od izazova sa severnoameriþkim i/ili evropskim izolatima PPV i/ili ili protiv izazova sa severnoameriþkim i/ili evropskim izolatima PRRS virusa.

[00123] U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na imunogenu kompoziciju ili kombinovanu vakcinu ili kombinaciju kako je ovde otkriveno i traženo, pri þemu je imunogena kompozicija ili kombinovana vakcina ili kombinacija unakrsno zaštitna protiv severnoameriþkih i/ili evropskih izolata PPV i/ili ili je unakrsno zaštitno protiv severnoameriþkih i/ili evropskih izolata PRRS virusa.

[00124] U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na imunogenu kompoziciju ili kombinovanu vakcinu ili kombinaciju kako je ovde otkriveno i zatraženo, pri þemu je imunogena kompozicija ili kombinovana vakcina ili kombinacija efikasna u leþenju i/ili profilaksi kliniþkih znakova izazvanih sa PPV infekcijom i/ili PRRS virusnom infekcijom kod osobe kojoj je potrebna.

[00125] Dalje, predmetni pronalazak obezbeÿuje þesticu nalik virusu koja sadrži PPV VP2 kako je ovde opisano i zahtevano.

[00126] Termin „þestica nalik virusu“ (VLP) obuhvata ne-kopiranu praznu virusnu školjku iz virusa. VLP su uopšteno sastavljene od jednog ili više virusnih proteina, kao što su, ali ne ograniþavajuüi se na one proteine koji se nazivaju kapsid, omotaþ, proteini ljuske, površine i/ili obmotani proteini, ili polipeptidi koji formiraju þestice izvedeni iz ovih proteina. VLP se mogu formirati spontano nakon rekombinantne ekspresije proteina u odgovarajuüem sistemu ekspresije. Prisustvo VLP nakon rekombinantne ekspresije virusnih proteina može se detektovati korišüenjem uobiþajenih tehnika poznatih u tehnici, kao što je elektronska mikroskopija, rendgenska kristalografija i sliþno. Videti, npr., Baker et al., Biophis. J. (1991) 60: 1445-1456; Hagensee et al., J. Virol. (1994) 68: 4503-4505. Na primer, krioelektronska mikroskopija se može izvesti na vitrifikovanim vodenim uzorcima dotiþnog VLP preparata, a slike snimljene pod odgovarajuüim uslovima izlaganja.

[00127] Termin „þestica nalik virusu“ (VLP) takoÿe obuhvata VLP koji se sastoje od više PPV VP2.

[00128] U drugom aspektu predmetnog pronalaska þestica sliþna virusu se sastoji od više PPV VP2 kako je ovde opisano i zahtevano.

[00129] Dalje, predmetni pronalazak obezbeÿuje üeliju koja sadrži polinukleotid ili vektor kao što je ovde opisano. Poželjno, vektor je bakulovirus.

[00130] Termin "üelija" je dobro poznat struþnjacima. Termin „üelija“ obuhvata eukariotsku üeliju kao što je životinjska üelija, üelija protista, üelija biljke ili üelija gljivice. Poželjno, eukariotska üelija je üelija sisara kao što je CHO, BHK ili COS, ili gljiviþna üelija kao što je Saccharomices cerevisiae, ili üelija insekata kao što je Sf9.

[00131] U drugom aspektu predmetnog pronalaska, üelija je üelija insekata.

[00132] ³ûelija insekta” kao što je ovde korišüeno, oznaþava üeliju ili üelijsku kulturu izvedenu iz vrste insekata. Od posebnog interesa u pogledu predmetnog pronalaska su üelije insekata izvedene iz vrste Spodoptera frugiperda i Trichoplusia ni.

[00133] Poželjno, üelija insekata, kao što je ovde pomenuto, je üelija Spodoptera Frugiperda (Sf) ili üelija iz üelijske linije koja potiþe od Spodoptera Frugiperda, i poželjnije je izabrana iz grupe koju þine Sf9 üelija i Sf+ üelija. Odnosno, üelije insekata, kao što je ovde pomenuto, su poželjno üelije Spodoptera Frugiperda (Sf) ili üelije iz üelijske linije izvedene iz Spodoptera Frugiperda, i poželjnije su izabrane iz grupe koju þine Sf9 üelije i Sf+ üelije.

[00134] U drugom aspektu predmetnog pronalaska, üelija insekata je izabrana iz grupe koju þine Sf9 üelije i Sf+ üelije.

[00135] Dalje, predmetni pronalazak obezbeÿuje postupak proizvodnje PPV VP2 kako je ovde opisano i zahtevano, koji obuhvata transfekciju üelije vektorom kako je ovde opisano.

[00136] Termin "vektor" je dobro poznat struþnjacima. Termin "vektor" kako je poznat u tehnici odnosi se na polinukleotidni konstrukt, tipiþno plazmid ili virus, koji se koristi za prenošenje genetskog materijala u üeliju domaüina. Vektori mogu biti, na primer, virusi, plazmidi, kosmidi ili fagi. Vektor kako se ovde koristi može biti sastavljen ili od DNK ili RNK. U nekim izvoÿenjima, vektor se sastoji od DNK.

[00137] "Vektor ekspresije" je vektor koji je sposoban da usmerava ekspresiju proteina kodiranog jednim ili više gena koje nosi vektor kada je prisutan u odgovarajuüem okruženju. Vektori su poželjno sposobni za autonomnu replikaciju. Tipiþno, ekspresioni vektor sadrži promoter transkripcije, gen i terminator transkripcije. Ekspresija gena se obiþno stavlja pod kontrolu promotera, a za gen se kaže da je "operativno vezan za" promoter.

2

[00138] Kao što je korišüen ovde, termin "operativno povezan" se koristi da opiše vezu izmeÿu regulatornih elemenata i gena ili njegovog kodirajuüeg regiona. Tipiþno, ekspresija gena se stavlja pod kontrolu jednog ili više regulatornih elemenata, na primer, bez ograniþenja, konstitutivnih ili inducibilnih promotera, tkivno specifiþnih regulatornih elemenata i pojaþivaþa. Za gen ili kodirajuüi region se kaže da je "operativno povezan sa" ili "operativno povezan sa" ili "operativno povezan sa" regulatornim elementima, što znaþi da je gen ili kodirajuüi region kontrolisan ili pod uticajem regulatornog elementa. Na primer, promoter je operativno vezan za kodirajuüu sekvencu ako promotor utiþe na transkripciju ili ekspresiju kodirajuüe sekvence.

[00139] Vektori i metode za pravljenje i/ili korišüenje vektora (ili rekombinanata) za ekspresiju mogu biti ili analogni metodama otkrivenim u: U.S. Pat. Br. 4,603,112, 4,769,330, 5,174,993, 5,505,941, 5,338,683, 5,494,807, 4,722,848, 5,942,235, 5,364,773, 5,762,938, 5,770,212, 5,942,235, 382,425, PCT objave WO 94/16716, WO 96/39491, WO 95/30018; Paoletti, "Applications of pox virus vectors to vaccination: An update, "PNAS USA 93: 11349-11353, October 1996; Moss, "Genetically engineered poxviruses for recombinant gene expression, vaccination, and safety," PNAS USA 93: 11341-11348, October 1996; Smith et al., U.S. Pat. Br. 4,745,051(recombinant baculovirus); Richardson, C. D. (Editor), Methods in Molecular Biology 39, "Baculovirus Expression Protocols" (1995 Humana Press Inc.); Smith et al., "Production of Human Beta Interferon in Insect Cells Infected with a Baculovirus Expression Vector", Molecular and Cellular Biology, December, 1983, Vol. 3, No.

12, p. 2156-2165; Pennock et al., "Strong and Regulated Expression of Escherichia coli B-Galactosidase in Infect Cells with a Baculovirus vector, "Molecular and Cellular Biology March 1984, Vol. 4, No. 3, p. 406; EPA0370573; U.S. prijava Br. 920,197, filed Oct.16, 1986; EP Patentna objava Br. 265785; U.S. Pat. Br. 4,769,331 (recombinant herpesvirus); Roizman, "The function of herpes simplex virus genes: A primer for genetic engineering of novel vectors," PNAS USA 93:11307-11312, October 1996; Andreansky et al., "The application of genetically engineered herpes simplex viruses to the treatment of experimental brain tumors," PNAS USA 93: 11313-11318, October 1996; Robertson et al., "Epstein-Barr virus vectors for gene delivery to B lymphocytes", PNAS USA 93: 11334-11340, October 1996; Frolov et al., "Alphavirus-based expression vectors: Strategies and applications," PNAS USA 93: 11371-11377, October 1996; Kitson et al., J. Virol. 65, 3068-3075, 1991; U.S. Pat. Br. 5,591,439, 5,552,143; WO 98/00166; odobrena U.S. prijava Ser. Br.

08/675,556, i 08/675,566 obe podnete Jul. 3, 1996 (recombinant adenovirus); Grunhaus et al., 1992, "Adenovirus as cloning vectors," Seminars in Virology (Vol. 3) p. 237-52, 1993; Ballay et al. EMBO Journal, vol. 4, p. 3861-65, Graham, Tibtech 8, 85-87, April, 1990; Prevec et al., J. Gen Virol. 70, 42434; PCT WO 91/11525; Felgner et al. (1994), J. Biol. Chem. 269, 2550-2561, Science, 259: 1745-49, 1993; i McClements et al., "Immunization with DNA vaccines encoding glycoprotein D or glycoprotein B, alone or in combination, induces protective immunity in animal models of herpes simplex virus-2 disease", PNAS USA 93: 11414-11420, October 1996; i U.S. Pat. Br. 5,591,639,

2

5,589,466, i 5,580,859, kao i WO 90/11092, WO 93/19183, WO 94/21797, WO 95/11307, WO 95/20660; Tang et al., Nature, and Furth et al., Analytical Biochemistry, relating to DNA expression vectors, inter alia. Videti takoÿe WO 98/33510; Ju et al., Diabetologia, 41: 736-739, 1998 (lentiviral expression system); Sanford et al., U.S. Pat. Br. 4,945,050; Fischbachet al. (Intracel); WO 90/01543; Robinson et al., Seminars in Immunology vol.9, pp. 271-283 (1997), (DNA vector systems); Szoka et al., U.S. patent No. 4,394,448 (method of inserting DNA into living cells); McCormick et al., U.S. Pat. Br. 5,677,178 (korišüenje citopatiþnih virusa); i U.S. Pat. Br. 5,928,913 (vectors for gene delivery); kao i drugi dokumenti koji se ovde citiraju.

[00140] Termin "regulatorni element" i "element za kontrolu ekspresije" se koriste naizmeniþno i odnose se na molekule nukleinske kiseline koji mogu uticati na ekspresiju operativno povezane kodirajuüe sekvence u odreÿenom organizmu domaüina. Ovi termini se široko koriste i pokrivaju sve elemente koji promovišu ili regulišu transkripciju, ukljuþujuüi promotere, osnovne elemente potrebne za osnovnu interakciju RNK polimeraze i faktora transkripcije, uzvodne elemente, pojaþivaþe i elemente odgovora. Primeri regulatornih elemenata u prokariotima ukljuþuju promotere, sekvence operatera i mesta vezivanja ribozoma. Regulatorni elementi koji se koriste u eukariotskim üelijama mogu ukljuþivati, bez ograniþenja, sekvence kontrole transkripcije i translacije, kao što su promoteri, pojaþivaþi, signali spajanja, signali poliadenilacije, terminatori, signali degradacije proteina, unutrašnji element za ulazak u ribozom (IRES), 2A sekvence, i sliþno, koji obezbeÿuju i/ili regulišu ekspresiju kodirajuüe sekvence i/ili proizvodnju kodiranog polipeptida u üeliji domaüinu.

[00141] Kako se ovde koristi, termin "promotor" je nukleotidna sekvenca koja dozvoljava vezivanje RNK polimeraze i usmerava transkripciju gena. Tipiþno, promoter se nalazi u 5' nekodirajuüem regionu gena, proksimalno od mesta poþetka transkripcije gena. Elemente sekvence unutar promotera koji funkcionišu u inicijaciji transkripcije þesto karakterišu konsenzusne nukleotidne sekvence. Primeri promotera ukljuþuju, ali nisu ograniþeni na, promotere iz bakterija, kvasca, biljaka, virusa i sisara (ukljuþujuüi ljude). Promotor može biti inducibilan, represivan i/ili konstitutivan. Inducibilni promoteri iniciraju poveüane nivoe transkripcije iz DNK pod njihovom kontrolom kao odgovor na neke promene u uslovima kulture, kao što je promena temperature.

[00142] Kako se ovde koristi, termin "pojaþivaþ" se odnosi na tip regulatornog elementa koji može poveüati efikasnost transkripcije, bez obzira na udaljenost ili orijentaciju pojaþivaþa u odnosu na poþetno mesto transkripcije.

[00143] Generisanje virusnog vektora može da se postigne korišüenjem bilo koje pogodne tehnike genetskog inženjeringa dobro poznate u struci, ukljuþujuüi, bez ograniþenja, standardne tehnike digestije restrikcijske endonukleaze, ligacije, transformacije, preþišüavanja plazmida i

2

sekvenciranja DNK, na primer kao što je opisano u Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y. (1989)).

[00144] Dalje, predmetni pronalazak obezbeÿuje postupak proizvodnje PPV VP2 kao što je ovde opisano, koji obuhvata inficiranje üelije, poželjno üelije insekata, bakulovirusom kao što je ovde opisano.

[00145] Kompozicije mogu, po želji, biti predstavljene u pakovanju ili ureÿaju za doziranje koji može da sadrži jedan ili više jediniþnih doznih oblika koji sadrže aktivni sastojak. Pakovanje može na primer da sadrži metalnu ili plastiþnu foliju, kao što je blister pakovanje. Pakovanje ili ureÿaj za doziranje mogu biti propraüeni uputstvima za primenu, poželjno za davanje životinjama, posebno svinjama. Povezano sa takvim posudom(ama) može biti obaveštenje u formi koju je propisala vladina agencija koja reguliše proizvodnju, upotrebu ili prodaju farmaceutskih ili bioloških proizvoda, a koje obaveštenje odražava odobrenje agencije za proizvodnju, upotrebu ili prodaju za ljudsku administraciju.

[00146] U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na imunogenu kompoziciju ili kombinovanu vakcinu ili kombinaciju kako je ovde otkriveno i zatraženo, pri þemu su najmanje jedan antigen svinjskog parvovirusa (PPV) i najmanje jedan antigen virusa reproduktivnog i respiratornog sindroma svinja (PRRS) se nalazi zajedno u jednoj posudi ili su prostorno odvojeni jedan od drugog, poželjno se nalaze u dve ili više odvojenih posuda.

[00147] U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na komplet koji sadrži imunogenu kompoziciju ili kombinovanu vakcinu ili kombinaciju kao što je ovde otkriveno i traženo.

[00148] U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na komplet kako je ovde otkriveno i zahtevano, pri þemu se najmanje jedan antigen svinjskog parvo virusa (PPV) i najmanje jedan antigen virusa reproduktivnog i respiratornog sindroma svinja (PRRS) nalaze odvojeno od jedan drugog u dve ili više odvojenih posuda, poželjno oba nezavisno jedan od drugog, bilo u liofilizovanom ili u zamrznutom obliku, i pri þemu komplet dalje sadrži uputstvo za upotrebu za mešanje prostorno odvojenog najmanje jednog PPV antigena i najmanje jednog antigena PRRS virusa, pri þemu poželjno takvo uputstvo za upotrebu sadrži uputstva za kombinovanje sadržaja posuda koji sadrže najmanje jedan PPV antigen sa sadržajem posude koji sadrži najmanje jedan antigen virusa PPRS, pri þemu je poželjnije da takvo uputstvo za upotrebu sadrži uputstva da se najmanje jedan antigen svinjskog parvovirusa (PPV) i najmanje jedan antigen virusa reproduktivnog i respiratornog sindroma svinja (PRRS) daju subjektu istovremeno, poželjnije odvojeno istovremeno na istim ili razliþitim mestima primene, uzastopno (u bilo kojim redosledom) i/ili na hronološki poreÿani naþin.

2

[00149] U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na komplet kako je ovde otkriveno i zahtevano, pri þemu komplet dalje sadrži uputstva za leþenje i/ili profilaksu bolesti kod svinja i/ili dalje sadrži uputstva za leþenje i/ili profilaksu PPV infekcije i/ili infekcije virusom PRRS, poželjno takav komplet dalje sadrži uputstva za pridruženu upotrebu PPV komponente (poželjno kao odvojene komponente kompleta) i PRRSV komponente (poželjno kao odvojene komponente kompleta) imunogene kompozicije ili kombinovane vakcine ili kombinacije kao što je ovde otkriveno i zatraženo i sadržano u takvom kompletu.

[00150] Termin "povezana upotreba" u okviru predmetnog pronalaska odnosi se na upotrebu dve vakcine ili komponenti vakcine PRRSV i PPV (svaka nezavisno jedna od druge koja se ovde takoÿe naziva "odvojena komponenta kompleta") mešanjem dve vakcine pre primene na jednom mestu injekcije ili davanje dve vakcine u isto vreme, ali na razliþitim mestima primene. Poželjno je da se takve dve vakcine daju istovremeno, poželjnije odvojeno istovremeno na istim ili razliþitim mestima primene, uzastopno (u bilo kom redosledu) i/ili na hronološki poreÿani naþin.

[00151] U drugom aspektu predmetnog pronalaska, PPV predmetnog pronalaska je inaktiviran, što je rezultiralo celim inaktiviranim virusom sa virusnim proteinom 2 (VP2) kako je ovde opisano.

[00152] Bilo koji uobiþajeni metod inaktivacije se može koristiti za svrhe predmetnog pronalaska. Dakle, inaktivacija se može izvesti hemijskim i/ili fiziþkim tretmanima koji su poznati struþnjacima u ovoj oblasti. Poželjne metode inaktivacije ukljuþuju dodavanje ciklizovanog binarnog etilenimina (BEI) ukljuþujuüi dodavanje rastvora 2-bromoetilenamin hidrobromida (BEA), koji je ciklizovan u binarni etilenimin (BEI). Poželjni dodatni agensi za hemijsku inaktivaciju obuhvataju, ali nisu ograniþeni na, Triton X-100, natrijum deoksiholat, cetiltrimetilamonijum bromid, ȕ-propiolakton, timerosal, fenol i formaldehid (formalin). Meÿutim, inaktivacija takoÿe može da sadrži korak neutralizacije. Poželjni agensi za neutralizaciju ukljuþuju, ali nisu ograniþeni na natrijum tiosulfat, natrijum bisulfit i sliþno.

[00153] Poželjni uslovi inaktivacije formalina ukljuþuju koncentraciju formalina izmeÿu od oko 0.02% (v/v) – 2.0% (v/v), poželjnije od oko 0.1% (v/v) – 1.0 % (v/v), još poželjnije od oko 0.15% (v/v) – 0.8% (v/v), još poželjnije od oko 0.16% (v/v) – 0.6 % (v/v), a najpoželjnije oko 0.2% (v/v) – 0.4% (v/v). Vreme inkubacije zavisi od otpornosti PPV i/ili PRRSV. Uopštenoo, proces neaktivnosti se izvodi sve dok se u odgovarajuüem sistemu uzgoja ne može otkriti rast PPV i/ili PRRSV.

[00154] Poželjno, inaktivirani PPV predmetnog pronalaska je inaktiviran formalinom, poželjno koristeüi koncentracije kao što je gore opisano.

2

[00155] Poželjno, inaktivirani PPV predmetnog pronalaska je inaktiviran ciklizovanim binarnim etileniminom (BEI), ukljuþujuüi dodavanje rastvora 2-bromoetilenamin hidrobromida (BEA), koji je ciklizovan u binarni etilenimin (BEI).

[00156] Inaktivirani PPV pronalaska može da se ugradi u lipozome korišüenjem poznate tehnologije kao što je ona opisana u Nature, 1974, 252, 252-254 ili Journal of Immunologi, 1978, 120, 1109-1113. U drugom aspektu pronalaska, inaktivirani PPV pronalaska može biti konjugovan sa pogodnim biološkim jedinjenjima kao što su polisaharidi, peptidi, proteini ili sliþno, ili njihova kombinacija.

[00157] Termin "imunizacija" se odnosi na aktivnu imunizaciju davanjem imunogenog preparata subjektu koji se imunizuje, þime se izaziva imunološki odgovor protiv antigena ukljuþenog u takvu imunogenu kompoziciju.

[00158] Poželjno, imunizacija rezultira smanjenjem incidencije odreÿene PPV i/ili PRRSV infekcije u stadu ili smanjenjem ozbiljnosti kliniþkih znakova uzrokovanih ili povezanih sa odreÿenom PPV i/ili PRRSV infekcijom.

[00159] Dalje, imunizacija subjekta kome je potrebna sa imunogenim kompozicijama kao što je ovde dato, rezultira prevencijom infekcije subjekta PPV i/ili PRRSV infekcijom. Još poželjnije, imunizacija rezultira efikasnim, dugotrajnim imunološkim odgovorom protiv PPV i/ili PRRSV infekcije. Podrazumeva se da üe navedeni vremenski period trajati više od 1 meseca, poželjno više od 2 meseca, poželjno više od 3 meseca, poželjnije više od 4 meseca, poželjnije više od 5 meseci, poželjnije više od 6 meseci. Treba razumeti da imunizacija možda neüe biti efikasna kod svih imunizovanih subjekata. Meÿutim, termin zahteva da znaþajan deo ispitanika u krdu bude efikasno imunizovan.

[00160] Poželjno, u ovom kontekstu je predviÿeno krdo subjekata koji bi normalno, odn., bez imunizacije, razvili kliniþke znake uzrokovane ili povezane sa PPV i/ili PRRSV infekcijom. Struþnjak u ovoj oblasti može bez odlaganja odrediti da li su subjekti iz stada efikasno imunizovani. Poželjno je da imunizacija bude efikasna ako se kliniþki znaci pojave u najmanje 33%, najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, još poželjnije u najmanje 95% i najpoželjnije kod 100% subjekata datog stada je smanjena uþestalost ili ozbiljnost za najmanje 10%, poželjnije za najmanje 20%, još poželjnije za najmanje 30%, još poželjnije za najmanje 40%, još poželjnije za najmanje 50%, još poželjnije za najmanje 60%, još poželjnije za najmanje 70%, još poželjnije za najmanje 80%, još poželjnije za najmanje 90%, još poželjnije za pri najmanje 95%, a najpoželjnije za 100% u poreÿenju sa subjektima koji ili nisu imunizovani ili imunizovani imunogenim preparatom koji je bio dostupan pre predmetnog pronalaska, ali kasnije inficiran odreÿenim PPV.

[00161] U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na upotrebu imunogene kompozicije ili kombinovane vakcine ili kombinacije ili kompleta kako je ovde opisano i zahtevano za pripremu leka, poželjno vakcine.

[00162] U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na upotrebu imunogene kompozicije ili kombinovane vakcine ili kombinacije ili kompleta kako je ovde opisano i zahtevano za leþenje i/ili prevenciju infekcije PPV i/ili PRRS virusom, smanjenje prevenciju ili leþenje kliniþkih znakova izazvanih infekcijom PPV i/ili PRRS virusom, ili za leþenje i/ili prevenciju bolesti izazvanih infekcijom PPV i/ili PRRS virusom.

[00163] U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na metodu imunizacije subjekta koji obuhvata davanje takvom subjektu imunogene kompozicije ili kombinovane vakcine ili kombinacije (ili odvojenih komponenti kompleta) kako je ovde opisano i zahtevano.

[00164] U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na metod leþenja i/ili prevencije kliniþkih znakova izazvanih PPV infekcijom i/ili infekcijom virusom PRRS, poželjno reproduktivnog i respiratornog sindroma svinja, poželjno kod svinja, kod subjekta koji je potreban, metoda koja obuhvata davanje subjektu terapeutski efikasne koliþine imunogene kompozicije ili kombinovane vakcine ili kombinacije (ili odvojenih komponenti kompleta) kako je ovde opisano i zahtevano.

[00165] U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na metodu smanjenja reproduktivnog neuspeha kod subjekta u poreÿenju sa subjektom iz neimunizovane kontrolne grupe iste vrste, metod koji obuhvata davanje subjektu terapeutski efikasne koliþine imunogene kompozicije ili kombinovane vakcine ili kombinacije (ili odvojene komponente kompleta) kako je ovde opisano i zahtevano.

[00166] U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na metodu smanjenja embrionalne i fetalne smrti kod subjekta u poreÿenju sa subjektom iz neimunizovane kontrolne grupe iste vrste, metod koji obuhvata davanje subjektu terapeutski efikasne koliþine imunogene kompozicije ili kombinovane vakcine ili kombinacije (ili odvojenih komponenti kompleta) kako je ovde opisano i zahtevano.

[00167] U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na postupak za aktivnu imunizaciju priplodnih svinja (krmaþe i nazimice) za zaštitu embriona i fetusa od infekcije svinjskim parvovirusom, postupak koji se sastoji od davanja terapijski efikasnog leka takvim svinjama (krmaþe i nazimice), koliþina imunogene kompozicije ili kombinovane vakcine ili kombinacije (ili odvojenih komponenti kompleta) kako je ovde opisano i zahtevano.

1

[00168] U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na metode kako su ovde opisane i tražene, pri þemu je navedeni subjekt izabran iz grupe koju þine svinje, goveda, maþka i pas, poželjno svinje, poželjnije krmaþa i/ili nazimica.

[00169] U drugom aspektu, ovaj pronalazak se odnosi na metode kako su ovde opisane i tražene, pri þemu se imunogena kompozicija ili kombinovana vakcina ili kombinacija (ili odvojene komponente kompleta) daju jednom ili u dve ili više doza.

[00170] U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na metode kako su ovde opisane i tražene, pri þemu se imunogena kompozicija ili kombinovana vakcina ili kombinacija (ili odvojene komponente kompleta) daju intramuskularno.

[00171] U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na metode kako su ovde opisane i tražene, pri þemu se imunogena kompozicija ili kombinovana vakcina ili kombinacija (ili odvojene komponente kompleta) daju nazimicama i/ili krmaþama, poželjno nazimicama i/ili krmaþama starosti od najmanje 3 nedelje, poželjnije za nazimice i/ili krmaþe pre trudnoüe, još poželjnije za krmaþe tokom trudnoüe i laktacije.

[00172] U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na metode kako su ovde opisane i tražene, pri þemu je imunogena kompozicija ili kombinovana vakcina ili kombinacija (ili odvojene komponente kompleta) bezbedne za nazimice i/ili krmaþe tokom trudnoüe i laktacije i nazimice pre trudnoüe.

[00173] U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na metode kako su ovde opisane i tražene, pri þemu je imunogena kompozicija ili kombinovana vakcina ili kombinacija (ili odvojene komponente kompleta) bezbedne za krmaþe i/ili nazimice od 30 dana gestacije, poželjno od 40 dana trudnoüe.

[00174] U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na metode kako su ovde opisane i tražene, pri þemu imunogena kompozicija ili kombinovana vakcina ili kombinacija (ili odvojene komponente kompleta) sadrži 0.1 µg do 50 µg PPV VP2 antigena, poželjno 0.5 µg do 10 µg PPV VP2 antigena, poželjnije 1.0 µg do 10 µg PPV VP2 antigena i/ili 3.9 do 7.0 log10TCID50živog atenuiranog/modifikovanog živog PRRS virusa.

[00175] U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na metode kako su ovde opisane i tražene, pri þemu imunogena kompozicija ili kombinovana vakcina ili kombinacija (ili odvojene komponente kompleta) štiti od homolognog i/ili heterolognog izazova sa PPV i/ili homologni i/ili heterologni izazov sa PRRS virusom.

2

[00176] U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na metode kako su ovde opisane i tražene, pri þemu imunogena kompozicija ili kombinovana vakcina ili kombinacija (ili odvojene komponente kompleta) štiti od izazova sa severnoameriþkim i/ili evropskim izolatima PPV i/ ili protiv izazova sa severnoameriþkim i/ili evropskim izolatima PRRS virusa.

[00177] U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na metode kako su ovde opisane i tražene, pri þemu imunogena kompozicija ili kombinovana vakcina ili kombinacija (ili odvojene komponente kompleta) je unakrsno zaštitna protiv severnoameriþkih i/ili evropskih izolata PPV i/ili ili je unakrsno zaštitno protiv severnoameriþkih i/ili evropskih izolata PRRS virusa.

[00178] U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na metode kako su ovde opisane i tražene, pri þemu navedeni postupak dovodi do poboljšanja najmanje jednog parametra efikasnosti izabranog iz grupe koju þine: smanjena prolazna leukopenija i reproduktivni neuspeh karakterisan embrionalnom i/ili fetalnom infekcijom i smrt, ili njihove kombinacije, u poreÿenju sa subjektom neimunizovane kontrolne grupe iste vrste.

[00179] U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na imunogenu kompoziciju ili kombinovanu vakcinu ili kombinaciju (ili odvojene komponente kompleta) kao što je ovde opisano i za koje se traži da se koriste u metodi imunizacije subjekta koji se sastoji od davanja pomenute imunogene kompozicije ili kombinovane vakcine ili kombinacije za takav predmet (ili odvojene komponente kompleta).

[00180] U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na imunogenu kompoziciju ili kombinovanu vakcinu ili kombinaciju (ili odvojene komponente kompleta) kao što je ovde opisano i za koje se tvrdi da se koristi u postupku leþenja i/ili prevencije kliniþkih znakova izazvanih PPV infekcijom i/ili PRRS virusnom infekcijom, poželjno Reproduktivni i respiratorni sindrom svinja, poželjno kod svinja, kod subjekta koji je potreban, metoda koja obuhvata davanje subjektu terapeutski efikasne koliþine pomenute imunogene kompozicije ili kombinovane vakcine ili kombinacije (ili odvojenih komponenti kompleta).

[00181] U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na imunogenu kompoziciju ili kombinovanu vakcinu ili kombinaciju (ili odvojene komponente kompleta) kako je ovde opisano i zahtevano za upotrebu u metodi smanjenja reproduktivnog neuspeha kod subjekta u poreÿenju sa subjektom koji ima neimunizovana kontrolna grupa iste vrste, metoda koja se sastoji od davanja subjektu terapeutski efikasne koliþine pomenute imunogene kompozicije ili kombinovane vakcine ili kombinacije (ili odvojenih komponenti kompleta).

[00182] U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na imunogenu kompoziciju ili kombinovanu vakcinu ili kombinaciju (ili odvojene komponente kompleta) kao što je ovde opisano i za koje se traži da se koristi u postupku smanjenja embrionalne i fetalne smrti kod subjekta u poreÿenju sa subjektom neimunizovane kontrolne grupe iste vrste, metoda koja se sastoji od davanja subjektu terapeutski efikasne koliþine pomenute imunogene kompozicije ili kombinovane vakcine ili kombinacije (ili odvojenih komponenti kompleta).

[00183] U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na imunogenu kompoziciju ili kombinovanu vakcinu ili kombinaciju (ili odvojene komponente kompleta) kako je ovde opisano i zahtevano za upotrebu u postupku za aktivnu imunizaciju priplodnih svinja (krmaþe i nazimice) za zaštitu embriona i fetusa protiv infekcije svinjskim parvovirusom, metoda koja se sastoji od davanja takvim svinjama (krmaþe i nazimice) pomenute imunogene kompozicije ili kombinovane vakcine ili kombinacije (ili odvojenih komponenti kompleta).

[00184] U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na imunogenu kompoziciju ili kombinovanu vakcinu ili kombinaciju (ili odvojene komponente kompleta) kao što je ovde opisano i zahtevano za upotrebu kao što je ovde opisano i traženo, pri þemu je navedeni subjekt izabran iz grupe koju þine svinje, goveda, maþke i psi, poželjno svinje, poželjnije krmaþe i/ili nazimice.

[00185] U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na imunogenu kompoziciju ili kombinovanu vakcinu ili kombinaciju (ili odvojene komponente kompleta) kao što je ovde opisano i zahtevano za upotrebu kao što je ovde opisano i traženo, pri þemu se imunogena kompozicija ili kombinovana vakcina ili kombinacija (ili odvojene komponente kompleta) primenjuje jednom ili u dve ili više doza.

[00186] U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na imunogenu kompoziciju ili kombinovanu vakcinu ili kombinaciju (ili odvojene komponente kompleta) kao što je ovde opisano i zahtevano za upotrebu kao što je ovde opisano i traženo, pri þemu se imunogena kompozicija ili kombinovana vakcina ili kombinacija (ili odvojene komponente kompleta) primenjuje intramuskularno.

[00187] U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na imunogenu kompoziciju ili kombinovanu vakcinu ili kombinaciju (ili odvojene komponente kompleta) kao što je ovde opisano i zahtevano za upotrebu kao što je ovde opisano i zatraženo, pri þemu se imunogena kompozicija ili kombinovana vakcina ili kombinacija (ili odvojene komponente kompleta) daje nazimicama i/ili krmaþama, poželjno krmaþama koje su stare najmanje 3 nedelje, poželjnije krmaþama pre trudnoüe, još poželjnije krmaþama tokom trudnoüe i laktacije.

[00188] U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na imunogenu kompoziciju ili kombinovanu vakcinu ili kombinaciju (ili odvojene komponente kompleta) kao što je ovde opisano i zahtevano za upotrebu kao što je ovde opisano i traženo, pri þemu je imunogena kompozicija ili

4

kombinovana vakcina ili kombinacija (ili odvojene komponente kompleta) bezbedna za nazimice i/ili krmaþe tokom trudnoüe i laktacije.

[00189] U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na imunogenu kompoziciju ili kombinovanu vakcinu ili kombinaciju (ili odvojene komponente kompleta) kao što je ovde opisano i zahtevano za upotrebu kao što je ovde opisano i zatraženo, pri þemu je imunogena kompozicija ili kombinovana vakcina ili kombinacija (ili odvojene komponente kompleta) bezbedna za nazimice i/ili krmaþe od 30 dana gestacije, poželjno od 40 dana gestacije.

[00190] U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na imunogenu kompoziciju ili kombinovanu vakcinu ili kombinaciju (ili odvojene komponente kompleta) kao što je ovde opisano i zahtevano za upotrebu kao što je ovde opisano i traženo, pri þemu imunogena kompozicija ili kombinovana vakcina ili kombinacija (ili odvojene komponente kompleta) sadrži 0.1 µg do 50 µg PPV VP2 antigena, poželjno 0.5 µg do 10 µg PPV VP2 antigena, poželjnije 1.0 µg do 10 µg PPV VP2 antigena, i/ili 3.9 do 7.0 log10TCID50živog oslabljenog/modifikovanog živog PRRS virusa.

[00191] U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na imunogenu kompoziciju ili kombinovanu vakcinu ili kombinaciju (ili odvojene komponente kompleta) kao što je ovde opisano i zahtevano za upotrebu kao što je ovde opisano i traženo, pri þemu imunogena kompozicija ili kombinovana vakcina ili kombinacija (ili odvojene komponente kompleta) štiti od homolognog i/ili heterolognog izazova sa PPV i/ili štiti od homolognog i/ili heterolognog izazova sa PRRS virusom.

[00192] U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na imunogenu kompoziciju ili kombinovanu vakcinu ili kombinaciju (ili odvojene komponente kompleta) kao što je ovde opisano i zahtevano za upotrebu kao što je ovde opisano i zatraženo, pri þemu imunogena kompozicija ili kombinovana vakcina ili kombinacija (ili odvojene komponente kompleta) štiti od izazova sa severnoameriþkim i/ili evropskim izolatima PPV i/ili štiti od izazova sa severnoameriþkim i/ili evropskim izolatima PRRS virusa.

[00193] U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na imunogenu kompoziciju ili kombinovanu vakcinu ili kombinaciju (ili odvojene komponente kompleta) kao što je ovde opisano i zahtevano za upotrebu kao što je ovde opisano i traženo, pri þemu je imunogena kompozicija ili kombinovana vakcina ili kombinacija (ili odvojene komponente kompleta) unakrsno zaštitna protiv severnoameriþkih i/ili evropskih izolata PPV i/ili je unakrsno zaštitna protiv severnoameriþkih i/ili evropskih izolata PRRS virusa.

[00194] U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na imunogenu kompoziciju ili kombinovanu vakcinu ili kombinaciju (ili odvojene komponente kompleta) kao što je ovde opisano i zatraženo za upotrebu kao što je ovde opisano i traženo, pri þemu pomenuti postupak dovodi do poboljšanja najmanje jednog parametra efikasnosti izabran iz grupe koju þine: smanjena prolazna leukopenija i reproduktivna insuficijencija koju karakteriše embrionalna i/ili fetalna infekcija i smrt, ili njihove kombinacije, u poreÿenju sa subjektom iz neimunizovane kontrolne grupe iste vrste.

[00195] Termin "tretman i/ili profilaksa" se odnosi na smanjenje incidencije odreÿene PPV i/ili PRRSV infekcije u stadu ili smanjenje težine kliniþkih znakova uzrokovanih ili povezanih sa odreÿenom PPV i/ili PRRSV infekcijom. Prema tome, termin "leþenje i/ili profilaksa" se takoÿe odnosi na smanjenje broja životinja u stadu koje se inficiraju odreÿenim PPV i/ili PRRSV (= smanjenje incidencije odreÿene PPV i/ili PRRSV infekcije) ili na smanjenje ozbiljnosti kliniþkih znakova koji su normalno povezani ili uzrokovani infekcijom PPV i/ili PRRSV u grupi životinja þije su životinje primile efikasnu koliþinu imunogene kompozicije ili kombinovane vakcine ili kombinacije kako je ovde dato u poreÿenju grupi životinja þije životinje nisu primile takvu imunogenu kompoziciju ili kombinovanu vakcinu ili kombinaciju.

[00196] "Leþenje i/ili profilaksa" uopšteno ukljuþuje davanje efikasne koliþine imunogene kompozicije ili kombinovane vakcine ili kombinacije predmetnog pronalaska subjektu ili krdu subjekata kojima je potreban ili koji bi mogli imati koristi od takvog leþenja /profilakse. Termin "leþenje" se odnosi na davanje efikasne koliþine imunogene kompozicije ili kombinovane vakcine ili kombinacije kada je subjekt ili barem neke životinje iz stada veü zaražene takvim PPV i/ili PRRSV i kada takve životinje veü pokazuju neke kliniþke znake uzrokovane ili povezane sa takvom PPV i/ili PRRSV infekcijom. Termin "profilaksa" se odnosi na davanje subjekta pre bilo kakve infekcije tog subjekta sa PPV i/ili PRRSV ili barem kada takva životinja ili nijedna životinja u grupi životinja ne pokazuje nikakve kliniþke znake uzrokovane ili povezana sa infekcijom takvim PPV i/ili PRRSV. Termini "profilaksa" i "prevencija" se u ovoj prijavi naizmeniþno koriste.

[00197] Termin "efikasna koliþina" kako se ovde koristi oznaþava, ali nije ograniþen na koliþinu antigena, koja izaziva ili je u stanju da izazove imuni odgovor kod subjekta. Takva efikasna koliþina može da smanji uþestalost odreÿene PPV i/ili PRRSV infekcije u stadu ili da smanji ozbiljnost kliniþkih znakova odreÿene PPV i/ili PRRSV infekcije.

[00198] Poželjno, kliniþki znaci su smanjeni u uþestalosti ili ozbiljnosti za najmanje 10%, poželjnije za najmanje 20%, još poželjnije za najmanje 30%, još poželjnije za najmanje 40%, još poželjnije za najmanje 30%, još poželjnije za najmanje 40%, još poželjnije za najmanje 50%, još poželjnije za najmanje 60%, još poželjnije za najmanje 70%, još poželjnije za najmanje 80%, još poželjnije za najmanje 90%, još poželjnije za najmanje 95% i najviše poželjno za 100% u poreÿenju sa subjektima koji ili nisu leþeni ili leþeni imunogenom kompozicijom ili kombinovanom vakcinom ili kombinacijom koja je bila dostupna pre predmetnog pronalaska, ali naknadno inficirana odreÿenim PPV i/ili PRRSV.

[00199] Termin "kliniþki znaci" kako se ovde koristi odnosi se na znake infekcije subjekta od PPV i/ili PRRSV. Kliniþki znaci infekcije zavise od odabranog patogena. Primeri takvih kliniþkih znakova ukljuþuju, ali nisu ograniþeni na, smanjenu prolaznu leukopeniju i reproduktivnu insuficijenciju koju karakteriše embrionalna i/ili fetalna infekcija i smrt, ili njihove kombinacije. Primeri kliniþkih znakova koji se direktno primeüuju ukljuþuju smanjenu veliþinu legla, poveüanu mumifikaciju embriona ili fetusa po leglu, autolizaciju embriona ili fetusa, smanjenu veliþinu embriona ili fetusa, smanjenu težinu embriona ili fetusa i sliþno ili kombinacije od toga. Dalji primeri takvih kliniþkih znakova ukljuþuju, ali nisu ograniþeni na, poveüanu viremiju, poveüano virusno optereüenje u ciljanim tkivima i krvi, poveüano širenje/prenošenje PPV na druge u leglu i sliþno ili njihove kombinacije.

[00200] Poželjno je da su kliniþki znaci smanjeni u uþestalosti ili ozbiljnosti kod leþenog subjekta u poreÿenju sa subjektima koji ili nisu leþeni ili leþeni imunogenom kompozicijom koja je bila dostupna pre predmetnog pronalaska, ali je kasnije inficirana odreÿenim PPV i/ili PRRSV odnose se na prolaznu leukopeniju i reproduktivnu insuficijenciju koju karakteriše embrionalna i/ili fetalna infekcija i smrt, ili njihove kombinacije.

[00201] Termin "u potrebi" ili "kome je potrebno", kako se ovde koristi, znaþi da je primena/leþenje povezana sa jaþanjem ili poboljšanjem zdravlja ili kliniþkih znakova ili bilo kojim drugim pozitivnim medicinskim efektom na zdravlje životinja (ukljuþujuüi embrioni ili fetusi) koji primaju imunogeni preparat u skladu sa ovim pronalaskom.

[00202] Termini "koji smanjuje" ili "smanjen" ili "smanjenje" ili "niže" se u ovoj prijavi koriste naizmeniþno. Termin "smanjenje" znaþi da se kliniþki znak smanjuje za najmanje 10%, poželjnije za najmanje 20%, još poželjnije za najmanje 30%, još poželjnije za najmanje 40%, još poželjnije za najmanje 50%, još poželjnije za najmanje 60%, još poželjnije za najmanje 70%, još poželjnije za najmanje 80%, još poželjnije za najmanje 90%, još poželjnije za najmanje 95% najpoželjnije za 100% u poreÿenju sa subjektima koji nisu leþeni (nisu imunizovani) ali su naknadno zaraženi odreÿenim PPV i/ili PRRSV.

[00203] U jednom aspektu predmetnog pronalaska, imunogena kompozicija ili kombinovana vakcina ili kombinacija (ili odvojene komponente kompleta) kako je ovde opisano i zahtevano se primenjuje jednom. Podrazumeva se da se pojedinaþna doza primenjuje samo jednom.

[00204] Zapremina doze po subjektu zavisi od puta vakcinacije i starosti subjekta. Poželjno, pojedinaþna doza ima ukupnu zapreminu izmeÿu oko 0.2 ml i 2.5 ml, poželjnije izmeÿu oko 0.2 ml i 2.0 ml, još poželjnije izmeÿu oko 0.2 ml i 1.75 ml, još poželjnije izmeÿu oko 0.2 ml i 1.5 ml, još poželjnije izmeÿu oko 0.4 ml i 1.25 ml, još poželjnije izmeÿu oko 0.4 ml i 1.0 ml, pri þemu je pojedinaþna doza od 0.5 ml ili 1.0 ml najpoželjnija. Najpoželjnija pojedinaþna doza ima ukupnu zapreminu od 0.5 ml, 1 ml, 1.5 ml ili 2 ml.

[00205] U jednom aspektu predmetnog pronalaska, imunogena kompozicija ili kombinovana vakcina ili kombinacija (ili odvojene komponente kompleta) kako je ovde opisano i zahtevano se primenjuje u dve ili više doza.

[00206] Meÿutim, imunogena kompozicija ili kombinovana vakcina ili kombinacija se može primeniti u dve ili više doza, pri þemu se prva doza primenjuje pre primene druge (dopunske) doze. Poželjno, druga doza se primenjuje najmanje 15 dana nakon prve doze. Još poželjnije, druga doza se primenjuje izmeÿu 15 dana i 40 dana nakon prve doze. Još poželjnije, druga doza se daje najmanje 17 dana nakon prve doze. Još poželjnije, druga doza se primenjuje izmeÿu 17 dana i 30 dana nakon prve doze. Još poželjnije, druga doza se daje najmanje 19 dana nakon prve doze. Još poželjnije, druga doza se primenjuje izmeÿu 19 dana i 25 dana nakon prve doze. Najpoželjnije je da se druga doza primenjuje najmanje 21 dan nakon prve doze. Još poželjnije, druga doza se primenjuje oko 21 dan nakon prve doze ili 21 dan nakon prve doze. U poželjnom aspektu režima dvostruke administracije, i prva i druga doza imunogene kompozicije se daju u istoj koliþini. Poželjno, svaka doza je u poželjnim koliþinama navedenim gore, pri þemu je najpoželjnija doza od 1 ml ili 2 ml za prvu i drugu dozu. Pored prvog i drugog režima doziranja, alternativno izvoÿenje obuhvata dalje sledeüe doze. Na primer, treüa, þetvrta ili peta doza se može primeniti u ovim aspektima. Poželjno, sledeüi režimi treüe, þetvrte i pete doze se daju u istoj koliþini kao i prva doza, pri þemu je vremenski okvir izmeÿu doza u skladu sa vremenom izmeÿu prve i druge doze pomenute gore. Gore navedeni režimi primene se poželjno primenjuju samo za nazimice. Krmaþama se poželjno daje samo imunogena kompozicija ili kombinovana vakcina ili kombinacija kao pojedinaþna primena/pojedinaþna injekcija.

[00207] U jednom aspektu predmetnog pronalaska subjekt je izabran iz grupe koju þine svinje, goveda, maþka i pas.

[00208] Poželjno, subjekt je svinja. Treba razumeti da svinje obuhvataju ženske i muške životinje. Seme može da sadrži PPV i iz tog razloga ženske i muške priplodne životinje su obuhvaüene izrazom "svinje". Dakle, termin "svinje" obuhvata muške životinje kao što su veprovi, kao i ženske životinje kao što su nazimice i krmaþe.

[00209] Termin "nazimica", kako se ovde koristi, odnosi se na svinju, poželjno svinju, pre i tokom prve gestacije/trudnoüe. Nasuprot tome, termin "krmaþa", kako se ovde koristi, odnosi se na svinju, poželjno svinju, nakon prvog prasenja, – kao pozitivan rezultat njene prve gestacije/trudnoüe.

[00210] Zapremina doze po subjektu zavisi od puta vakcinacije i starosti subjekta. Poželjno, ukupna zapremina je izmeÿu oko 0.2 ml i 5 ml, poželjnije izmeÿu oko 0.5 ml i 3.0 ml, još poželjnije izmeÿu oko 1.0 ml i 2.5 ml, još poželjnije izmeÿu oko 1.0 ml i 2.0 ml. Najpoželjnija zapremina je 1 ml, 1.5 ml, 2 ml ili 2.5 ml po dozi.

[00211] Imunogena kompozicija ili kombinovana vakcina ili kombinacija (ili odvojene komponente kompleta) se, poželjno, primenjuju lokalno ili sistemski. Pogodni naþini primene koji se uobiþajeno koriste su oralna ili parenteralna primena, kao što su intranazalna, intravenska, intradermalna, transdermalna, intramuskularna, intraperitonealna, subkutana, kao i inhalacija. Meÿutim, u zavisnosti od prirode i naþina delovanja jedinjenja, imunogena kompozicija se može primeniti i na druge naþine. Na primer, takvi drugi putevi obuhvataju intrakutano, intravenozno, intravaskularno, intraarterijsko, intraperitnoealno, intratekalno, intratrahealno, intrakutano, intrakardijalno, intralobalno, intralobaralno, intramedularno, intrapulmonalno, intravaginalno i intravaginalno. Meÿutim, poželjnije je da se imunogena kompozicija ili kombinovana vakcina ili kombinacija primenjuje subkutano ili intramuskularno. Najpoželjnije da se imunogena kompozicija ili kombinovana vakcina ili kombinacija daje intramuskularno.

[00212] Drugo razmatranje predmetnog pronalaska

[00213] U jednom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na posupak proizvodnje imunogene kompozicije koja sadrži rekombinantni protein, pri þemu postupak obuhvata korake u sledeüem redosledu:

(i) obezbeÿivanje/dobivanje smeše koja sadrži

- prvu teþnost,

[00214] Za potrebe predmetnog pronalaska, "prva teþnost" se odnosi na teþne, vodene ili teþne medijume koji se tipiþno koriste u kombinaciji sa üelijama, antigenima, imunogenim kompozicijama, vakcinama i sliþno. Poželjno, prva teþnost sadrži medijum iz antigenske kompozicije; poželjnije, prva teþnost sadrži ili se poželjno sastoji od medijuma üelijske kulture koji se koristi za proizvodnju rekombinantnih proteina u kultivisanim üelijama domaüinima. Pomenute kultivisane üelije domaüini mogu biti bakterije, kvasci, üelije insekata, životinjske üelije i üelije sisara, pri þemu su üelije insekata i sisara posebno poželjne. Dakle, prva teþnost može da sadrži ili da se sastoji od medija za kultivaciju bakterija, kvasca, üelija insekata, životinjskih üelija ili üelija sisara. Poželjno, üelijski medijum je medijum bez seruma, a najpoželjnije je medijum za kulturu Excell 420 bez seruma, kada se koriste üelije insekata.

[00215] "Druga teþnost", za potrebe predmetnog pronalaska, odnosi se na bilo koju teþnost koja se normalno koristi u kombinaciji sa üelijama, antigenom, imunogenim preparatima, vakcinama i sliþno, a koja se razlikuje od prve teþnosti. Poželjno, druga teþnost je vodeni rastvor, još poželjnije farmaceutski prihvatljiv rastvor, a još poželjnije pufer, kao što je slani rastvor ili fosfatni pufer i sliþno. Najpoželjnije, druga teþnost se karakteriše time što nije virucidna ni za jedan živi virus ili žive bakterije, kada se živi virus ili žive bakterije uzgajaju ili þuvaju u takvoj teþnosti.

[00216] "Deo", za potrebe predmetnog pronalaska, se odnosi na bilo koji iznos koji ne obuhvata ceo iznos. Na primer, deo teþnosti bi bio nešto manje od 100% zapremine teþnosti, kao što je 90% teþnosti, 80% teþnosti, 70% teþnosti i sve koliþine izmeÿu više od 0% i manje od 100%.

[00217] "Rekombinantni protein", za potrebe predmetnog pronalaska, odnosi se na bilo koji rekombinantni protein, poželjno na PPV VP2 protein, poželjnije koji sadrži ili se sastoji od sekvence koja ima najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80 %, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98 %, najmanje 99%, najmanje 99,1%, najmanje 99,2%, najmanje 99,3%, najmanje 99,4%, najmanje 99,5%, najmanje 99,6%, pri najmanje 99,7%, najmanje 99,8%, najmanje 99,9%, ili 100% identiþnost sekvence sa sekvencom SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 i/ili SEQ ID NOS 5 do 16.

[00218] "Kvaternarne strukture" kao i "kvaternarne strukture sastavljene od veüeg broja pomenutih rekombinantnih proteina", za potrebe predmetnog pronalaska, odnose se na trodimenzionalni raspored veüeg broja pomenutih rekombinantnih proteina, kao što je virus sliþan þestice i/ili homotrimeri.

[00219] "Vektor" kao i "vektor koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira pomenuti rekombinantni protein", za potrebe predmetnog pronalaska, odnosi se na pogodan ekspresioni vektor, poželjno ekspresioni vektor bakulovirusa, koji se zauzvrat koristi za transfekciju, ili u sluþaju da se

4

ekspresioni vektor bakulovirusa inficira, üelija domaüina da proizvede protein ili polipeptid koji je

kodiran DNK.

[00220] Vektori i metode za pravljenje i/ili korišüenje vektora (ili rekombinanata) za ekspresiju mogu biti ili analogni metodama otkrivenim u: U.S. Pat. Br. 4,603,112, 4,769,330, 5,174,993, 5,505,941, 5,338,683, 5,494,807, 4,722,848, 5,942,235, 5,364,773, 5,762,938, 5,770,212, 5,942,235, 382,425, PCT objave WO 94/16716, WO 96/39491, WO 95/30018; Paoletti, "Applications of pox virus vectors to vaccination: An update, "PNAS USA 93: 11349-11353, October 1996; Moss, "Genetically engineered poxviruses for recombinant gene expression, vaccination, and safety," PNAS USA 93: 11341-11348, October 1996; Smith et al., U.S. Pat. No. 4,745,051(recombinant baculovirus); Richardson, C. D. (Editor), Methods in Molecular Biology 39, "Baculovirus Expression Protocols" (1995 Humana Press Inc.); Smith et al., "Production of Human Beta Interferon in Insect Cells Infected with a Baculovirus Expression Vector", Molecular and Cellular Biology, December, 1983, Vol. 3, No. 12, p. 2156-2165; Pennock et al., "Strong and Regulated Expression of Escherichia coli B-Galactosidase in Infect Cells with a Baculovirus vector, "Molecular and Cellular Biology March 1984, Vol. 4, No. 3, p. 406; EPA0370573; U.S. prijava Br. 920,197, filed Oct. 16, 1986; EP Patentna objava Br. 265785; U.S. Pat. Br. 4,769,331 (recombinant herpesvirus); Roizman, "The function of herpes simplex virus genes: A primer for genetic engineering of novel vectors," PNAS USA 93:11307-11312, October 1996; Andreansky et al., "The application of genetically engineered herpes simplex viruses to the treatment of experimental brain tumors," PNAS USA 93: 11313-11318, October 1996; Robertson et al., "Epstein-Barr virus vectors for gene delivery to B lymphocytes", PNAS USA 93: 11334-11340, October 1996; Frolov et al., "Alphavirus-based expression vectors: Strategies and applications," PNAS USA 93: 11371-11377, October 1996; Kitson et al., J. Virol. 65, 3068-3075, 1991; U.S. Pat. Br. 5,591,439, 5,552,143; WO 98/00166; dozvoljena U.S. prijava Ser. Br.

08/675,556, i 08/675,566 obe podnete Jul. 3, 1996 (recombinant adenovirus); Grunhaus et al., 1992, "Adenovirus as cloning vectors," Seminars in Virology (Vol. 3) p. 237-52, 1993; Ballay et al. EMBO Journal, vol. 4, p. 3861-65, Graham, Tibtech 8, 85-87, April, 1990; Prevec et al., J. Gen Virol. 70, 42434; PCT WO 91/11525; Felgner et al. (1994), J. Biol. Chem. 269, 2550-2561, Science, 259: 1745-49, 1993; and McClements et al., "Immunization with DNA vaccines encoding glycoprotein D or glycoprotein B, alone or in combination, induces protective immunity in animal models of herpes simplex virus-2 disease", PNAS USA 93: 11414-11420, October 1996; i U.S. Pat. Br. 5,591,639, 5,589,466, i 5,580,859, kao i WO 90/11092, WO93/19183, WO94/21797, WO95/11307, WO95/20660; Tang et al., Nature, and Furth et al., Analytical Biochemistry, relating to DNA expression vectors, inter alia. Videti takoÿe WO 98/33510; Ju et al., Diabetologia, 41: 736-739, 1998 (lentiviral expression system); Sanford et al., U.S. Pat. No. 4,945,050; Fischbachet al. (Intracel); WO 90/01543; Robinson et al., Seminars in Immunology vol. 9, pp. 271-283 (1997), (DNA vector systems); Szoka et al., U.S. patent Br. 4,394,448 (method of inserting DNA into living cells); McCormick et al., U.S. Pat. Br. 5,677,178 (use of cytopathic viruses); i U.S. Pat. Br. 5,928,913 (vectors for gene delivery); kao i drugi dokumenti koji se ovde citiraju.

[00221] Poželjne üelije su one osetljive na infekciju sa odgovarajuüim rekombinantnim virusnim vektorom, koji sadrži DNK rekombinantnog proteina i koji ekspresuje rekombinantni protein. Poželjno je da su üelije üelije insekata, a poželjnije, one ukljuþuju üelije insekata koje se prodaju pod zaštitnim znakom SF+ üelije insekata (Protein Sciences Corporation, Meriden, CT). Poželjne üelijske kulture imaju broj üelija izmeÿu oko 0.3 - 2.0 x 10<6>üelija/mL, poželjnije od oko 0.35 - 1.9 x 10<6>üelija/mL, još poželjnije od oko 0.4 - 1.8 x 10<6>üelija/mL, naroþito poželjnije od oko 0.45 -1.7 x 10<6>üelija/mL, i najpoželjnije od oko 0.5 - 1.5 x 10<6>üelija/mL.

[00222] Poželjni virusni vektori ukljuþuju bakulovirus kao što je BaculoGold (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA), posebno pod uslovom da su proizvodne üelije üelije insekata. Iako je sistem ekspresije bakulovirusa poželjan, struþnjaci u ovoj oblasti razumeju da üe drugi sistemi ekspresije, ukljuþujuüi one koji su gore opisani, raditi u svrhe predmetnog pronalaska, naime ekspresija rekombinantnog proteina.

[00223] Odgovarajuüe podloge za rast üe takoÿe moüi da odrede struþnjaci sa iskustvom u ovoj oblasti, a poželjni medijum za rast je medijum üelija insekata bez seruma, kao što je Excell 420 (JRH Biosciences, Inc., Lenexa, KS) i sliþno.

[00224] Rekombinantni virusni vektor koji sadrži rekombinantne proteinske DNK sekvence ima poželjni multiplikat infekcije (MOI) izmeÿu oko 0.03 – 1.5, poželjnije od oko 0.05 – 1.3, još poželjnije od oko 0.09 – 1.1, a najpoželjnije od oko 0.1 – 1.0, kada se koristi za infekciju osetljivih üelija. Poželjno je da se gore pomenuti MOI odnose na jedan mL teþnosti üelijske kulture. Poželjno, ovde opisana metoda obuhvata infekciju od 0.35 – 1.9 x 10<6>üelija/mL, još poželjnije od oko 0.4 – 1.8 x 10<6>üelija/mL, još poželjnije od oko 0.45 – 1.7 x 10<6>üelija/mL, a najpoželjnije od oko 0.5 – 1.5 x 10<6>üelija/mL sa rekombinantnim virusnim vektorom koji sadrži DNK rekombinantnog proteina i koji ekspresuje rekombinantni protein koji ima MOI (multiplikat infekcije) izmeÿu oko 0.03 – 1.5, poželjnije od oko 0.05 – 1.3, još više poželjno od oko 0.09 – 1.1, a najpoželjnije od oko 0.1 - 1.0.

[00225] Deo prve teþnosti može da se ukloni iz kombinovane smeše koraka (iii) koja sadrži rekombinantni protein korakom filtracije koristeüi filter. Meÿutim, bilo koji drugi metod poznat struþnjaku može se koristiti za uklanjanje dela bilo koje teþnosti, ukljuþujuüi prvu i, kad god je primenljivo, deo druge teþnosti iz kombinovane smeše iz koraka (iii). Takav postupak, na primer, ukljuþuje, ali nije ograniþen na, centrifugiranje i/ili hromatografiju. Meÿutim, filtracija je najpoželjnija. Poželjni metod filtracije za uklanjanje pomenutog dela prve teþnosti, ili bilo koje druge teþnosti, kad god je primenljivo, obuhvata ultra- i/ili dijafiltraciju. Ultra- i dijafiltracija su standardne metode poznate osobi sa iskustvom u tehnici, opisane na primer u detalje u Protein Purification Methods - A Practical Approach – editors: E.L.V. Harris and S. Angel, Oxford University Press 1995. Konkretno, u Poglavlju 3 tog udžbenika, opisano je nekoliko postupaka i tipova opreme, od kojih sve može da koristi obiþna osoba u tehnici na primeran naþin u svrhu predmetnog pronalaska.

[00226] "Agens za inaktivaciju", za potrebe predmetnog pronalaska, odnosi se na bilo koji agens koji se može koristiti u bilo kojoj uobiþajenoj metodi inaktivacije. Inaktivacija se može izvesti hemijskim i/ili fiziþkim tretmanima koji su poznati struþnjacima u ovoj oblasti. Poželjni agensi za inaktivaciju ukljuþuju ciklizovani binarni etilenimin (BEI) ukljuþujuüi rastvor 2-bromoetilenamin hidrobromida (BEA), koji je ciklizovan u binarni etilenimin (BEI). Poželjni agensi za hemijsku inaktivaciju obuhvataju, ali nisu ograniþeni na, Triton X-100, natrijum deoksiholat, cetiltrimetilamonijum bromid, ȕ-propiolakton, timerosal, fenol i formaldehid (Formalin).

[00227] "Neutralizujuüi agens", za potrebe predmetnog pronalaska, odnosi se na bilo koji agens sposoban da neutrališe inaktivirajuüe agense kao što je ovde opisano, tako da agens za inaktivaciju više nije sposobno da inaktivira vektor. Agens koji neutrališe agens za inaktivaciju je poželjno natrijum tiosulfat, natrijum bisulfit i sliþno.

[00228] U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na postupak kao što je ovde opisan, pri þemu se smeša iz koraka (i) može dobiti postupkom koji sadrži korake

(a) dozvoljavanje infekcije osetljivih üelija u kulturi vektorom koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira pomenuti rekombinantni protein i/ili kvaternarne strukture sastavljene od veüeg broja pomenutih rekombinantnih proteina, pri þemu se navedeni rekombinantni protein i/ili kvaternarne strukture sastavljene od veüeg broja navedenih rekombinantnih proteina izražava navedenim vektorom,

(b) nakon toga obnavljanje rekombinantnog proteina i/ili kvaternarnih struktura sastavljenih od veüeg broja navedenih rekombinantnih proteina iz üelijske kulture, pri þemu se poželjno üelijski ostaci odvajaju od rekombinantnog proteina i/ili kvaternarnih struktura sastavljenih od veüeg broja navedenih rekombinantnih proteina putem koraka razdvajanja, poželjno ukljuþujuüi mikrofiltraciju kroz najmanje jedan filter, poželjnije dva filtera, pri þemu je poželjno da najmanje jedan filter ima veliþinu pora veüu od rekombinantnog proteina i/ili kvaternarne strukture sastavljene od veüeg broja navedenih rekombinantnih proteina, posebno ima veliþine pora od oko 0.1 µm do oko 4 µm.

[00229] U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na postupak kao što je ovde opisan, pri þemu se üelijska kultura u koraku (a) održava na 27±2°C, poželjno dok se rekombinantni protein i/ili kvaternarne strukture sastavljene od veüeg broja navedenih rekombinantni protein eksprimira sa

4

navedenim vektorom, i/ili pri þemu se oporavak u koraku (b) dešava 6 do 8 dana, poželjno 8 dana, nakon inokulacije üelija sa vektorom.

[00230] U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na postupak kao što je ovde opisan, pri þemu korak razdvajanja ukljuþuje ili se sastoji od:

- mikro filtracije kroz bar jedan filter koji ima veliþinu pore od oko 2 µm do oko 4 µm, i/ili - mikro filtracije kroz bar jedan filter koji ima veliþinu pore od oko 0.1 µm do oko 0.8 µm.

[00231] U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na postupak kao što je ovde opisan, gde pomenuta prva teþnost obuhvata deo medijuma üelijske kulture ili se sastoji od medijuma üelijske kulture, i gde je medijum za üelijsku kulturu poželjno medijum za üelijsku kulturu insekata.

[00232] U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na postupak kao što je ovde opisan, gde je pomenuti rekombinantni protein izabran iz grupe koju þine:

- PPV VP2 protein koji poželjno sadrži ili se sastoji od sekvence koja ima najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99%, najmanje 99,1%, najmanje 99,2%, najmanje 99,3%, na najmanje 99,4%, najmanje 99,5%, najmanje 99,6%, najmanje 99,7%, najmanje 99,8%, najmanje 99,9%, ili 100% identiþnost sekvence sa sekvencom SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 i/ili SEQ ID NOS: 5 do 16.

[00233] U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na postupak kao što je ovde opisan, pri þemu su navedene kvaternarne strukture sastavljene od veüeg broja navedenih rekombinantnih proteina þestice sliþne virusu ili gde su pomenute kvaternarne strukture sastavljene od veüeg broja pomenutih rekombinantnih proteina homotrimeri.

[00234] U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na postupak kao što je ovde opisan, gde je vektor rekombinantni virus, poželjno bakulovirus, i/ili gde je sekvenca nukleinske kiseline sekvenca DNK.

[00235] U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na postupak kao što je ovde opisan, pri þemu je vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira pomenuti rekombinantni protein i/ili kvaternarne strukture sastavljene od veüeg broja navedenih rekombinantnih proteina rekombinantni bakulovirus, pri þemu navedeni bakulovirus sadrži DNK sekvencu koja kodira navedeni rekombinantni protein i/ili kvaternarne strukture sastavljene od veüeg broja navedenih rekombinantnih proteina.

[00236] U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na postupak kao što je ovde opisan, pri þemu se u koraku (iii) navedeni rekombinantni protein i/ili navedene kvaternarne strukture sastavljene od veüeg broja navedenih rekombinantnih proteina isperu sa najmanje 2x, poželjno sa 2x do 3x, druge teþnosti, i opciono konaþno koncentrovana, u poreÿenju sa originalnom zapreminom navedenog rekombinantnog proteina i/ili navedene kvaternarne strukture sastavljene od veüeg broja navedenih rekombinantnog proteina u smeši iz koraka (i). Poželjnije, u koraku (iii) takav(i) korak(ci) ispiranja, odn., proces dijafiltracije, se izvodi na temperaturi nižoj od 37° C, poželjnije na temperaturi nižoj od 30° C, još poželjnije na temperaturi nižoj od 20° C, još poželjnije na temperaturi nižoj od 10° C, kao što je na primer na temperaturi izmeÿu 4° C i 29° C, na primer 27° C ili 4° C. Time je stepen taloženja (agregacije) znaþajno smanjen.

[00237] U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na postupak kao što je ovde opisan, pri þemu se u koraku (iii) deo prve i/ili druge teþnosti uklanja iz smeše filtriranjem, pri þemu je poželjno filter ili šuplji filter korišüen koji sadrži polupropusnu membranu sa proseþnom veliþinom pora koja je manja od navedenog rekombinantnog proteina i/ili navedenih kvaternarnih struktura sastavljenih od veüeg broja navedenih rekombinantnih proteina i/ili spreþava prolaz veüine, poželjno suštinski svih, proteina od 20 kDa do 500 kDa, veliþine kroz polupropusnu membranu.

[00238] Filter može biti bilo koji konvencionalni filter u struci. Poželjno, navedeni filter ukljuþuje polupropusnu membranu. U daljem poželjnom obliku, navedena polupropustljiva membrana ima proseþnu veliþinu pora koja je manja od rekombinantnog proteina da bi na taj naþin spreþila prolaz najmanje 90% navedenog rekombinantnog proteina kroz navedene polupropusne pore membrane i da zadrži rekombinantni protein pomoüu sredstva filtera.

[00239] U daljem aspektu, navedeni filter ima proseþnu veliþinu pora koja spreþava prolaz najmanje 90% proteina veliþine od 20 kDa do 500 kDa, poželjnije, navedeni filter ima proseþnu veliþinu pora koja spreþava prolaz najmanje 90% proteina veliþine 50 kDa do 400 kDa, a najpoželjnije, navedeni filter ima proseþnu veliþinu pora koja spreþava prolaz najmanje 90% proteina veliþine od 75 kDa do 300 kDa. Ova veliþina pora je poželjna kada se rekombinantni protein proizvodi kao ceo virus ili kao virusne þestice. U još jednom aspektu, navedena polupropusna membrana ukljuþuje materijal izabran iz grupe koju þine polisulfon, polietersulfon i regenerisana celuloza. Meÿutim, može se koristiti bilo koji drugi materijal koji omoguüava uklanjanje dela prve teþnosti iu sluþaju višestrukog procesa procesa, uklanjanje mešavine prve i druge teþnosti iz rekombinantnog proteina. Navedeni filter se može izabrati iz grupe koja se sastoji od kartridža za ultrafiltraciju sa membranom od šupljih vlakana, ravnih listova ili kasete, pri þemu je kartridž za ultrafiltraciju sa membranom od šupljih vlakana posebno poželjan.

4

[00240] Poželjna druga teþnost koja se koristi u bilo kojoj od opisanih metoda je pufer, poželjno fiziološki prihvatljiv pufer sa fiziološkim rastvorom koji je posebno poželjan.

[00241] U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na postupak kao što je ovde opisan, gde je druga teþnost puferski rastvor, poželjno fiziološki rastvor sa fosfatnim puferom za ispiranje (WPBS).

[00242] Korak koncentrovanja i korak dodavanja teþnosti postupka kao što je ovde opisano mogu se izvoditi u suštini istovremeno ili alternativno, korak koncentrovanja i korak dodavanja teþnosti se izvode uzastopno.

[00243] Kada se korak koncentrovanja i korak dodavanja teþnosti izvode uzastopno, redosled koraka nije bitan. Na primer, u daljem aspektu, korak dodavanja teþnosti se dešava pre pomenutog koraka koncentrovanja, a u alternativnom aspektu, korak koncentrovanja se dešava pre pomenutog koraka dodavanja teþnosti. Korak dodavanja teþnosti i korak koncentrovanja, bez obzira na redosled kojim se izvode, mogu se izvesti više puta. Na primer, svaki od ovih odgovarajuüih koraka može se izvesti najmanje dva, najmanje tri, najmanje þetiri, najmanje pet, najmanje 10, do onoliko puta koliko se želi. U jednom aspektu, korak koncentrovanja i korak dodavanja teþnosti se izvode najmanje dva puta. U drugom aspektu, korak koncentrovanja i korak dodavanja teþnosti se izvode najmanje tri puta.

[00244] Korak koncentracije ovde datih postupaka se može izvesti tako da se rekombinantni protein koncentriše od 3X do 50X u poreÿenju sa zapreminom pomenute prve teþnosti. Još poželjnije, navedeni korak koncentrovanja može da se uradi tako da se rekombinantni protein koncentriše 4X do 20X u poreÿenju sa zapreminom navedene prve teþnosti. Najpoželjnije, navedeni korak koncentracije se može uraditi tako da se rekombinantni protein koncentriše od 7X do 10X u poreÿenju sa zapreminom prve teþnosti.

[00245] U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na postupak kao što je ovde opisan, pri þemu je zapremina druge teþnosti dodane u koraku (ii) približno zapremini prve i/ili druge teþnosti uklonjene u koraku (iii). Drugim reþima, nijedan korak koncentracije se ne izvodi i/ili zahteva.

[00246] U sluþaju da se virusni vektori kao što su rekombinantni poksvirus, adenovirus ili bakulovirus koriste za proizvodnju rekombinantnog proteina, preporuþuje se inaktivacija virusne nukleinske kiseline odgovarajuüim tretmanom inaktivacije. Takva inaktivacija se može desiti bilo kada tokom preþišüavanja rekombinantnog proteina. Dakle, do inaktivacije može doüi odmah nakon prikupljanja teþnosti üelijske kulture koja sadrži rekombinantni protein ili nakon mikrofiltracije rekombinantnog proteina, ako se mikrofiltracija vrši, pre ili posle koraka preþišüavanja, na primer, pre ili posle gel filtracije, i pre ili posle hromatografije razmene anjona, ako se to uradi.

4

[00247] Bilo koji konvencionalni metod inaktivacije se može koristiti za potrebe predmetnog pronalaska. Dakle, inaktivacija se može izvršiti hemijskim i/ili fiziþkim tretmanima. U poželjnim oblicima, zapremina teþnosti za prikupljanje se odreÿuje i temperatura se dovodi na izmeÿu oko 32° C - 42° C, poželjnije izmeÿu oko 34° C - 40° C, a najpoželjnije izmeÿu oko 35° C - 39° C. Poželjne metode inaktivacije ukljuþuju dodavanje ciklizovanog binarnog etilenimina (BEI), poželjno u koncentraciji od oko 1 mM do oko 20 mM, poželjno od oko 2 mM do oko 10 mM, još poželjnije od oko 2 mM do oko 8 mM, još više poželjno od oko 3 mM do oko 7 mM, najpoželjnije od oko 5 mM. Na primer, inaktivacija ukljuþuje dodavanje rastvora 2-bromoetilenamin hidrobromida (BEA), poželjno od oko 0.4 M, koji je ciklizovan do 0.2 M binarnog etilenimina (BEI) u 0.3 N NaOH, teþnostima da bi se dobilo konaþno koncentracija od oko 5 mM BEI. Poželjno je da se teþnosti zatim neprekidno mešaju 2 - 96 sati i inaktivirane teþnosti za prikupljanje mogu da se þuvaju zamrznute na 40° C ili ispod ili izmeÿu oko 1° C - 7° C. Nakon što je inaktivacija završena, dodaje se rastvor natrijum tiosulfata, poželjno 1.0 M da bi se neutralisao bilo koji preostali BEI. Poželjno, natrijum tiosulfat se dodaje u ekvivalentnoj koliþini u poreÿenju sa BEI dodatom pre inaktivacije. Na primer, u sluþaju da se BEI doda u konaþnu koncentraciju od 5 mM, dodaje se 1.0 M rastvor natrijum tiosulfata da bi se dobila konaþna minimalna koncentracija od 5 mM da bi se neutralisao bilo koji ostatak BEI.

[00248] U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na postupak kao što je ovde opisan, gde je agens za inaktivaciju jedinjenje aziridina, poželjno binarni etilenimin (BEI), i/ili gde se agens za inaktivaciju dodaje u molarnom višku u odnosu na vektor.

[00249] U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na postupak kao što je ovde opisan, gde je agens za neutralizaciju natrijum tiosulfat i/ili gde je agens za neutralizaciju dodat u molarnom višku u odnosu na agens za inaktivaciju.

[00250] U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na postupak kao što je ovde opisan, pri þemu pomenuti postupak dalje obuhvata korak mešanja smeše preostale posle koraka (v) sa daljom komponentom izabranom iz grupe koju þine farmaceutski prihvatljivi nosaþi, adjuvansi, razblaživaþi, ekscipijenti i njihove kombinacije.

[00251] U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na postupak kao što je ovde opisan, pri þemu je virucidna aktivnost smeše koja je rezultat pomenutog postupka smanjena za najmanje 10% u poreÿenju sa smešom koja nije bila podvrgnuta pomenutom postupku, i/ili pri þemu imunogena kompozicija proizvedena pomenutim postupkom izaziva gubitak manje od 1 log TCID50po mL živog virusa, kada se živi virus meša sa imunogenom kompozicijom dva ili više sati.

[00252] U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na postupak kao što je ovde opisan, gde je živi virus virus reproduktivnog i respiratornog sindroma svinja (PRRS).

4

[00253] U drugom aspektu, predmetni pronalzak se odnosi na postupak kao što je ovde opisan, pri þemu postupak dalje obuhvata korak (vi) sakupljanja rekombinantnog proteina i/ili kvaternarnih struktura sastavljenih od veüeg broja navedenih rekombinantnih proteina preostalih nakon koraka (v ), a posebno dalje obuhvata korak preþišüavanja prikupljenog koja se sastoji od rekombinantnog proteina i/ili kvaternarnih struktura sastavljenih od veüeg broja navedenih rekombinantnih proteina, hromatografskom procedurom, poželjno hromatografijom iskljuþivanja veliþine.

[00254] U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na postupak kao što je ovde opisano, pri þemu postupak dalje obuhvata korak kombinovanja (preþišüenog) sakupljenog rekombinantnog proteina i/ili kvaternarnih struktura sastavljenih od veüeg broja navedenih rekombinantnih proteina sa najmanje jednim dodatnim antigenom.

[00255] U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na postupak kao što je ovde opisan, gde je najmanje jedan dodatni antigen virus reproduktivnog i respiratornog sindroma svinja (PRRS).

[00256] U daljem aspektu, postupak dalje obuhvata korak sakupljanja rekombinantnog proteina dobijenog nakon što je najmanje deo navedene prve teþnosti uklonjen iz navedenog rekombinantnog proteina.

[00257] Kao što se ovde koristi, "sakupljanje" ili "prikupljeno" se odnosi na sakupljanje ili obnavljanje rekombinantnog proteina. Bilo koji konvencionalni postupak poznat u tehnici može da se koristi za obnavljanje rekombinantnog proteina bilo kada se proizvodi rekombinantni protein za upotrebu sa metodama i kompozicijama predmetnog pronalaska, ili kada se rekombinantni protein podvrgava postupcima opisanim ovde. U posebno poželjnom naþinu sakupljanja, deo navedene prve teþnosti se uklanja iz navedenog rekombinantnog proteina putem koraka filtracije i rekombinantni protein je dobijen ili sakupljen iz odloženog filtera. U poželjnijem obliku, rekombinantni protein je prikupljen ili sakupljen, ili obnoveljen iz odložene polupropusne membrane koja ima veliþinu pora opisanu ovde.

[00258] Rekombinantni protein koji ostaje nakon što je podvrgnut postupcima koji su ovde dati, poželjno nakon što je sakupljen iz odloženog filtera, pomešan je sa sledeüom komponentom izabranom iz grupe koju þine farmaceutski prihvatljivi nosaþi, adjuvansi, razblaživaþi, ekscipijenti i njihove kombinacije. Poželjno, navedena dodatna komponenta je adjuvans, još poželjnije da je pomenuti adjuvans polimer akrilne ili metakrilne kiseline, a još poželjnije da je pomenuti adjuvans Karbomer.

[00259] U daljem aspektu predmetne prijave, gore opisani postupak dalje obuhvata korake mešanja rekombinantnog proteina dobijenog nakon koraka inaktivacije i neutralizacije sa sledeüom komponentom izabranom iz grupe koju þine farmaceutski prihvatljivi nosaþi, adjuvansi, razblaživaþi,

4

ekscipijenti, i njihove kombinacije. Pre mešanja prHþišüenog rekombinantnog proteina sa adjuvansom, takoÿe se preporuþuje dijaliza preþišüenog rekombinantnog proteina od fiziološkog rastvora puferovanog fosfatom, pH 7.4 ili bilo kog drugog fiziološkog pufera.

[00260] Kao što se ovde koristi, "farmaceutski prihvatljiv nosaþ" i "veterinarski prihvatljiv nosaþ" ukljuþuje bilo koji i sve rastvaraþe, disperzione medije, obloge, stabilizatore, razblaživaþe, konzervanse, antibakterijske i antifungalne agense, izotoniþne agense, agense za odlaganje adsorpcije, i sliþno.

[00261] “Adjuvansi” kao što se ovde koristi, može ukljuþivati aluminijum hidroksid i aluminijum fosfat, saponine npr., Quil A, QS-21 (Cambridge Biotech Inc., Cambridge MA), GPI-0100 (Galenica Pharmaceuticals, Inc., Birmingham, AL), emulziju voda u ulju, emulziju ulje u vodi, emulziju voda u ulju u vodi. Emulzija se može bazirati posebno na laganom teþnom parafinskom ulju (tip European Pharmacopea); izoprenoidno ulje kao što je skvalan ili skvalen; ulje koje nastaje teoligomerizacijom alkena, posebno izobutena ili decena; estri kiselina ili alkohola koji sadrže linearnu alkil grupu, taþnije biljna ulja, etil oleat, propilen glikol di-(kaprilat/kaprat), gliceril tri-(kaprilat/kaprat) ili propilen glikol dioleat; estri razgranatih masnih kiselina ili alkohola, posebno estri izostearinske kiseline. Ulje se koristi u kombinaciji sa emulgatorima za formiranje emulzije. Emulgatori su poželjno nejonski surfaktanti, posebno estri sorbitana, manida (npr., anhidromanitol oleat), glikola, poliglicerola, propilen glikola i oleinske, izostearinske, ricinoleinske ili hidroksistearinske kiseline, koje su opciono etoksilovani, i blokovi kopolimera polioksipropilenpolioksietilena, posebno Pluronic proizvodi, posebno L121. Vidite Hunter et al., The Theory and Practical Application of Adjuvants (Ed.Stewart-Tull, D. E. S.). JohnWiley and Sons, NY, pp51-94 (1995) and Todd et al., Vaccine 15:564-570 (1997). Na primer, moguüe je koristiti SPT emulziju opisanu na strani 147 "Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach" edited by M. Powell and M. Newman, Plenum Press, 1995, i emulziju MF59 opisanu na strani 183 ove iste knjige. Dalji prikladni adjuvansi ukljuþuju, ali nisu ograniþeni na, RIBI sistem adjuvansa (Ribi Inc.), blok kopolimer (CytRx, Atlanta GA), SAF-M (Chiron, Emeriville CA), monofosforil lipid A, avridin lipidamin adjuvans, toplotno labilni enterotoksin iz E. coli (rekombinantni ili na neki drugi naþin), toksin kolere, IMS 1314 ili muramil dipeptid izmeÿu mnogih drugih. Meÿu kopolimere anhidrida maleinske kiseline i derivata alkenila ubrajaju se kopolimeri EMA (Monsanto), koji su kopolimeri anhidrida maleinske kiseline i etilena. Rastvaranje ovih polimera u vodi dovodi do kiselog rastvora koji üe se neutralisati, poželjno do fiziološkog pH, da bi se dobio adjuvans u koji üe se ugraditi sam imunogena, imunološka ili vakcinalna kompozicija.

[00262] Sledeüi primer adjuvansa je jedinjenje koje se bira izmeÿu polimera akrilne ili metakrilne kiseline i kopolimera anhidrida maleinske kiseline i derivata alkenila. Pogodna pomoüna jedinjenja (adjuvansi) su polimeri akrilne ili metakrilne kiseline koji su umreženi, posebno sa

4

polialkenil etrima šeüera ili polialkohola. Ova jedinjenja su poznata pod nazivom karbomer (Phameuropa Vol. 8, No. 2, jun 1996). Struþnjaci se takoÿe mogu pozvati na ameriþki patent br.

2,909,462 koji opisuje takve akrilne polimere umrežene sa polihidroksilovanim jedinjenjem koje ima najmanje 3 hidroksilne grupe, poželjno ne više od 8, pri þemu su atomi vodonika najmanje tri hidroksila zamenjeni sa nezasiüeni alifatiþni radikali koji imaju najmanje 2 atoma ugljenika. Poželjni radikali su oni koji sadrže od 2 do 4 atoma ugljenika, npr. vinili, alili i druge etilenski nezasiüene grupe. Nezasiüeni radikali mogu sami da sadrže druge supstituente, kao što je metil. Proizvodi koji se prodaju pod imenom Carbopol; (BF Goodrich, Ohajo, SAD) su posebno prikladni. Oni su unakrsno povezani sa alil saharozom ili sa alil pentaeritritolom. Meÿu njima se mogu pomenuti Carbopol 974P, 934P i 971P. Najpoželjnija je upotreba Carbopol 971P.

[00263] "Razblaživaþi" mogu ukljuþivati vodu, fiziološki rastvor, dekstrozu, etanol, glicerol i sliþno. Izotoniþni agensi mogu ukljuþivati natrijum hlorid, dekstrozu, manitol, sorbitol i laktozu, izmeÿu ostalih. Stabilizatori ukljuþuju albumin i alkalne soli etilendiamintetrasiUüetne kiseline, izmeÿu ostalog.

[00264] "Konzervans" kao što se ovde koristi se odnosi na antimikrobiološki aktivni agens, kao što je na primer gentamicin, mertiolat i sliþno. Posebno je dodavanje konzervansa najpoželjnije za pripremu kompozicije sa više doza. Ti antimikrobiološki aktivni agensi se dodaju u koncentracijama efikasnim da spreþe kompoziciju od interesa za bilo kakvu mikrobiološku kontaminaciju ili za inhibiciju bilo kakvog mikrobiološkog rasta unutar kompozicije od interesa.

[00265] Dalje preþišüavanje rekombinantnog proteina može se postiüi hromatografskim procedurama, poželjno postupkom hromatografije u dva koraka. Ako je rekombinantni protein sastavljen u virus u vidu þestica (VLP), jedan korak, poželjno prvi korak, je poželjno hromatografija iskljuþivanja veliþine (filtracija na gelu), koja se može uraditi, na primer, korišüenjem Sephacril S300 matrice. U laboratorijskoj skali upotreba HiPrep 26/60 Sephacril S300HR kolona je najpoželjnija. Meÿutim, mogu se koristiti bilo koje druge matrice za hromatografiju za iskljuþenje veliþine koje su poznate struþnjaku, a koje omoguüavaju odvajanje rekombinantnog proteina VLP od filtrata kulture ili supernatanta. Pogodne matrice su opisane, na primer, u E.L.V. Harris i S. Angel (ur.), Metode preþišüavanja proteina – praktiþni pristup, IRL Press Okford 1995). Gel filtraciona hromatografija se može sprovesti, na primer, punjenjem kolone sirovim preparatom koji sadrži rekombinantni protein sa brzinom protoka od 1.0 ml/min i eluiranjem kolone sa 1.5 zapremine kolone pufera koji sadrži 20 mM Tris, pH 6.5, 5 mM DTT. Meÿutim, rekombinantni protein se takoÿe može preþistiti korišüenjem afinitetne hromatografije, na primer, putem selektivnog vezivanja za imobilizovano rekombinantno antitelo specifiþno za protein, ili bilo kojom drugom metodom koja je poznata struþnjaku.

[00266] Da bi se dobio viši stepen þistoüe može se uraditi drugi korak hromatografije, koji se meÿutim razlikuje od prvog. Na primer, ako je prvi korak preþišüavanja / korak hromatografije iskljuþenje veliþine (gel filtracija), drugi bi trebalo da se razlikuje od onog, npr. afinitetna hromatografija, hromatografija sa izmenom jona, itd. Poželjno, ako je prvi korak preþišüavanja rekombinantnog proteina hromatografija sa iskljuþenjem veliþine (gel filtracija), drugi korak može biti hromatografija sa izmenom jona, poželjno hromatografija sa izmenom jona (AIEX). Poželjna matrica za hromatografiju sa izmenom anjona za preþišüavanje rekombinantnog proteina je Q Sepharose. U maloj skali od oko 50 ml, upotreba 5 ml HiTrap Q Sepharose HP kolone je najpoželjnija.

[00267] Predmetna prijava ne samo da otkriva postupke proizvodnje rekombinantnog proteina koji sadrži imunogenu kompoziciju, ona se takoÿe odnosi na rekombinantni protein koji sadrži imunogenu kompoziciju.

[00268] U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na imunogenu kompoziciju koja se može dobiti postupkom kao što je ovde opisano.

[00269] U daljem aspektu, virucidna aktivnost imunogene kompozicije koja sadrži rekombinantni protein proizveden sa postupkom opisanim ovde je smanjena za najmanje 10% u poreÿenju sa imunogenom kompozicijom koja sadrži rekombinantni protein i koja nije bila podvrgnuta navedenim proizvodnim postupkom. Još poželjnije, virucidna aktivnost imunogene kompozicije koja sadrži rekombinantni protein je smanjena za najmanje 50% u poreÿenju sa imunogenom kompozicijom koja sadrži rekombinantni protein koji nije podvrgnut navedenim proizvodnim postupkom. Još poželjnije, virucidna aktivnost imunogene kompozicije koja sadrži rekombinantni protein je smanjena za najmanje 70% u poreÿenju sa rekombinantnim proteinom koji sadrži imunogenu kompoziciju koja nije podvrgnuta navedenim proizvodnim postupkom. Još poželjnije, virucidna aktivnost imunogene kompozicije koja sadrži rekombinantni protein je smanjena za najmanje 90% u poreÿenju sa rekombinantnim proteinom koji sadrži imunogenu kompoziciju koja nije bila podvrgnuta navedenim proizvodnim postupkom.

[00270] Za potrebe sadašnjeg otkrivanja termin "virucidna aktivnost" znaþi da teþnost, fluid, rastvor, kompozicija ili sliþno inaktivira ili ubija žive viruse ili žive bakterije do odreÿene mere, kada pomenuta teþnost, fluid, rastvor, kompozicija ili sliþno se meša sa takvim živim virusima ili živim bakterijama. Dakle, smanjenje virucidne aktivnosti teþnosti, fluida, rastvora, kompozicije ili sliþnog za najmanje 10% znaþi da je stopa preživljavanja živih virusa ili živih bakterija 90% veüa u teþnosti, fluidu, rastvoru, kompoziciji ili sliþno koji je prošao bilo koji od ovde opisanih postupaka proizvodnje, u poreÿenju sa tHþnošüu, fluidom, rastvorom, kompozicijom ili sliþno, koji nije prošao nijednu od takvih postupaka proizvodnje.

1

[00271] Rekombinantna proteinska imunogena kompozicija proizvedena postupkom opisanim ovde uzrokuje gubitak manje od 1 log TCID50živog virusa ili manje od 1 log CFU po ml žive bakterije, kada se živi virus ili živa bakterija pomeša sa rekombinantnom proteinskom imunogenom kompozicijom i inkubiran 2 ili više sati, poželjno više od 4 sata, još poželjnije više od 12 sati, još poželjnije više od 24 sata, još poželjnije više od 2 dana, još poželjnije više od 4 dana, još poželjnije više od 7 dana, još poželjnije više od 2 nedelje, još poželjnije više od 4 nedelje, još poželjnije više od 2 meseca, još poželjnije više od 3 meseca , još poželjnije više od 4 meseca, još poželjnije više od 6 meseci, još poželjnije više od 9 meseci, još poželjnije više od 12 meseci, još poželjnije više od 18 meseci, najpoželjnije duže od 2 godine. Poželjnije, rekombinantna proteinska imunogena kompozicija proizvedena postupkom opisanom ovde uzrokuje gubitak manje od 0.9 log TCID50po ml živog virusa ili manje od 0.9 log CFU po ml žive bakterije, kada se živi virus ili živa bakterija pomeša i inkubira sa rekombinantnom proteinskom imunogenom kompozicijom 2 ili više sati, poželjno više od 4 sata, još poželjnije više od 12 sati, još poželjnije više od 24 sata, još poželjnije više od 2 dana, þak i više poželjno više od 4 dana, još poželjnije više od 7 dana, još poželjnije više od 2 nedelje, još poželjnije više od 4 nedelje, još poželjnije više od 2 meseca, još poželjnije više od 3 meseci, još poželjnije više od 4 meseca, još poželjnije više od 6 meseci, još poželjnije više od 9 meseci, još poželjnije više od 12 meseci, još poželjnije više od 18 meseci, najpoželjnije za više od 2 godine. Još poželjnije, rekombinantna proteinska imunogena kompozicija proizvedena postupkom opisanim ovde uzrokuje gubitak manje od 0.7 log TCID50po ml živog virusa ili manje od 0.7 log CFU po ml žive bakterije, kada živi virus ili živa bakterija se meša i inkubira sa rekombinantnom proteinskom imunogenom kompozicijom 2 ili više sati, poželjno više od 4 sata, još poželjnije više od 12 sati, još poželjnije više od 24 sata, još poželjnije više od 2 dana, još poželjnije više od 4 dana, još poželjnije više od 7 dana, još poželjnije više od 2 nedelje, još poželjnije više od 4 nedelje, još poželjnije više od 2 meseca, još poželjnije duže od 3 meseca, još poželjnije više od 4 meseca, još poželjnije više od 6 meseci, još poželjnije više od 9 meseci, još poželjnije više od 12 meseci, još poželjnije više od 18 meseci, veüina poželjno više od 2 godine. Još poželjnije, rekombinantna proteinska imunogena kompozicija proizvedena koracima ovde opisanim postupkom izaziva gubitak manje od 0.5 log TCID50po ml živog virusa ili manje od 0.5 log CFU po ml žive bakterije, kada živi virus ili živa bakterija se meša i inkubira sa rekombinantnom proteinskom imunogenom kompozicijom 2 ili više sati, poželjno više od 4 sata, još poželjnije više od 12 sati, još poželjnije više od 24 sata, još poželjnije više od 2 sata dana, još poželjnije više od 4 dana, još poželjnije više od 7 dana, još poželjnije više od 2 nedelje, još poželjnije duže od 4 nedelje, još poželjnije više od 2 meseca, još poželjnije više od 3 meseca, još poželjnije više od 4 meseca, još poželjnije više od 6 meseci, još poželjnije više od 9 meseci, još poželjnije više od 12 meseci, još poželjnije više od 18 meseci , najpoželjnije duže od 2 godine. Još poželjnije, rekombinantna proteinska imunogena kompozicija proizvedena postupkom opisanim ovde uzrokuje gubitak manje od 0.3 log TCID50po ml živog virusa ili manje od 0.3 log CFU po ml žive bakterije, kada živi virus ili živa bakterija se meša i inkubira sa rekombinantnom proteinskom

2

imunogenom kompozicijom 2 ili više sati, poželjno više od 4 sata, još poželjnije više od 12 sati, još poželjnije više od 24 sata, još poželjnije više od 2 dana, još poželjnije više od 4 dana, još poželjnije više od 7 dana, još poželjnije više od 2 nedelje, još poželjnije više od 4 nedelje, još poželjnije više od 2 meseca, još poželjnije više od 3 meseca, još poželjnije više od 4 meseca, još poželjnije više od 6 meseci, još poželjnije više od 9 meseci, još poželjnije više od 12 meseci, još poželjnije više od 18 meseci, najpoželjnije više od 2 godine. TCID50po ml se može proceniti standardnim in vitro titracionim testom koji omoguüava procenu koliþine živog virusa. CFU po ml se takoÿe može odrediti standardnim in vitro titracionim testom koji omoguüava procenu koliþine žive bakterije. Termin "po ml" se prvenstveno odnosi na 1 ml teþnosti. Takav preþišüeni rekombinantni protein ne pokazuje samo smanjenu virucidnu aktivnost, kao što je ovde definisano, on takoÿe pokazuje poveüanu imunogenost u poreÿenju sa ne-preþišüenim rekombinantnim proteinom kako je ovde definisan, poželjno takav rekombinantni protein poveüava üelijski i/ili antitelom posredovan imuni odgovor putem najmanje 10%, poželjno za najmanje 20%, još poželjnije za najmanje 30%, još poželjnije za najmanje 40%, još poželjnije za najmanje 50%, još poželjnije za najmanje 75%, najpoželjnije za najmanje 100% u poreÿenju sa üelijskim i/ili antitelom posredovanim imunološkim odgovorom izazvanim referentnom imunogenom kompozicijom koja sadrži nepreþišüeni rekombinantni protein.

[00272] Imunogene kompozicije koje sadrže preþišüeni rekombinantni protein, poželjno one koje se mogu dobiti ovde opisanim postupkom, karakteriše poveüana imunogenost u poreÿenju sa imunogenom kompozicijom koja ne sadrži takav preþišüeni rekombinantni protein.

[00273] Pored toga, termini "poveüana imunogenost ili poboljšana imunogenost" kao što se ovde koriste, znaþe da je imuni odgovor izazvan imunogenom kompozicijom koja sadrži antigen od interesa poveüan u poreÿenju sa referentnom imunogenom kompozicijom koja sadrži drugaþiji antigen ili razliþitu þistoüu stepen antigena, da li je ovaj imuni odgovor imuni odgovor posredovan üelijama i/ili antitelom. U skladu sa poželjnim izvoÿenjem, termin poveüana imunogenost ili poboljšana imunogenost znaþi da je imuni odgovor posredovan antitelom izazvan imunogenom kompozicijom koja sadrži antigen od interesa poveüan u poreÿenju sa referentnom imunogenom kompozicijom koja sadrži drugaþiji antigen ili razliþit stepen þistoüe antigen. U tom smislu imuni odgovor posredovan antitelom znaþi da je proizvodnja antitela, koja su specifiþna za antigen od interesa, poveüana u poreÿenju sa proizvodnjom antitela izazvanom referentnom imunogenom kompozicijom koja sadrži drugaþiji antigen ili razliþit stepen þistoüe antigena.

[00274] Termin "poveüan" znaþi da je üelijski i/ili antitelom posredovan imuni odgovor poveüan za najmanje 10%, poželjno za najmanje 20%, poželjnije za najmanje 30%, još poželjnije za najmanje 40 %, još poželjnije za najmanje 50%, još poželjnije za najmanje 75%, najpoželjnije za najmanje 100% u poreÿenju sa üelijskim i/ili antitelom posredovanim imunološkim odgovorom izazvanim referentnom imunogenom kompozicijom koja sadrži rekombinantni protein ili razliþit stepen þistoüe rekombinantnog proteina.

[00275] U opštem je znanju struüne osobe u ovoj oblasti kako da izmeri üelijski i/ili imuni odgovor posredovan antitelom. Konkretno, takvoj osobi je jasno da ili uporediti üelijski posredovan imuni odgovor imunogene kompozicije od interesa sa üelijskim posredovanim imunološkim odgovorom reference, ili imuni odgovor posredovan antitelom imunogene kompozicije od interesa sa onim referentne kompozicije, ali ni üelijski posredovan imuni odgovor imunogene kompozicije od interesa sa imunim odgovorom posredovanim antitelom referentnog ili obrnuto. Štaviše, üelijski posredovan imuni odgovor može se meriti, na primer, merenjem aktivacije citotoksiþnih T-üelija imunogenom kompozicijom/antigenom od interesa. Imuni odgovor posredovan antitelom može se meriti, na primer, merenjem koliþine antitela specifiþnih za antigen, nastalih zbog primene imunogene kompozicije koja sadrži takav antigen životinji. Imuni odgovor posredovan üelijama i/ili antitelom može se meriti, na primer, korišüenjem modela miša. Prema trenutnom otkriüu, model miša se koristi kao referentni metod.

[00276] Termin "imunogena kompozicija" oznaþava, ali nije ograniþen na, kompoziciju materije koja sadrži najmanje jedan antigen koji izaziva üelijski i/ili antitelom posredovan imuni odgovor kod domaüina protiv antigena od interesa. Obiþno, „imuni odgovor“ ukljuþuje, ali nije ograniþen na jedan ili više od sledeüih efekata: proizvodnju ili aktivaciju antitela, B üelija, pomoünih T üelija, supresorskih T üelija i/ili citotoksiþnih T üelija i/ili gama- delta T üelije, usmerene specifiþno na antigen ili antigene ukljuþene u kompoziciju ili vakcinu od interesa. Poželjno, domaüin üe pokazati ili terapeutski ili zaštitni imuni odgovor tako da üe otpornost na novu infekciju biti poboljšana i/ili smanjena kliniþka težina bolesti. U tom sluþaju imunogena kompozicija je "vakcina". Takva zaštita üe se demonstrirati smanjenjem ili nedostatkom simptoma koje obiþno pokazuje inficirani domaüin, bržim vremenom oporavka i/ili smanjenim titrom virusa u inficiranom domaüinu.

[00277] U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na imunogenu kompoziciju kako je ovde opisano i zahtevano, pri þemu imunogena kompozicija dalje sadrži oslabljeni živi virus, poželjno oslabljeni virus reproduktivnog i respiratornog sindroma svinja (PRRS) ili oslabljenu živu bakteriju.

[00278] “Živi” virus ili bakterja, za potrebe predmetnog pronalaska, odnosi se na virus ili bakteriju koja je sposobna da se replicira u domaüinu. Poželjni živi virus i poželjna živa bakterija ovog pronalaska su PRRS virus i Mycoplasma hyopneumonia bakterija, respektivno. Meÿutim, termin živi virus ili živa bakterija nije ograniþen na PRRS i Mycoplasma hypneumoniae, respektivno.

4

[00279] U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na imunogenu kompoziciju kako je ovde opisano i zahtevano, pri þemu je oslabljeni živi virus virus reproduktivnog i respiratornog sindroma svinja (PRRS).

[00280] U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na imunogenu kompoziciju kako je ovde opisano i zahtevano, pri þemu imunogena kompozicija indukuje zaštitni imuni odgovor protiv patogena, poželjno patogena koji sadrži rekombinantni protein kao što je ovde opisano i zatraženo, nakon primene jedne doze imunogene kompozicije.

[00281] U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na imunogenu kompoziciju kako je ovde opisano i zahtevano, pri þemu imunogena kompozicija indukuje zaštitni imuni odgovor protiv PRRS virusa nakon primene jedne doze imunogene kompozicije.

[00282] Imunogena kompozicija rekombinantnog proteina dobijena prema gore opisanom postupku, ili rekombinantni protein koji se koristi u koraku i) gore opisanog postupka, može se kombinovati sa najmanje jednim dodatnim antigenom, poželjno virusnim ili bakterijskim antigenom, pa þak i poželjnije, virusni ili bakterijski antigen iz najmanje jednog drugog organizma koji izaziva bolest kod svinja. Dodatni antigen može biti bilo koji od onih koji su otkriveni u meÿunarodnoj patentnoj prijavi WO 2007/094893. Ukratko, dodatni antigeni mogu biti antigeni bilo kog drugog organizama svinja koji izazivaju bolesti. Poželjno je da se "drugi organizmi koji izazivaju bolest" svinja biraju iz grupe koju þine: Actinobacillus pleuropneumonia (1); Adenovirus (2); Alfavirusi kao što su virusi istoþnog konjskog encefalomijelitisa (3); Bordetella bronchiseptica (4); Brachyspira spp. (5), poželjno B. hyodyentheriae (6); B. piosicoli (7), Brucella suis, poželjno biovars 1, 2, i 3 (8); Clasical swine fever virus (9); Clostridium spp. (10), poželjno Cl. difficile (11), Cl. perfringens types A, B, i C (12), Cl. novyi (13), Cl.septicum (14), Cl. tetani (15); Coronavirus (16), poželjno Porcine Respiratory Corona virus (17); Eperythrozoonosis suis (18); Erysipelothrix rhsiopathiae (19) Escherichia coli (20); Haemophilus parasuis, poželjno podtipovi 1, 7 i 14 (21) Hemagglutinating encephalomyelitis virus (22); Japanese Encephalitis Virus (23); Lawsonia intracellularis(24) Leptospira spp. (25), poželjno Leptospira australis (26); Leptospira canicola (27); Leptospira grippotyphosa (28); Leptospira icterohaemorrhagicae (29); i Leptospira interrogans (30); Leptospira pomona (31); Leptospira tarassovi (32); Mycobacterium spp. (33) poželjno M. avium (34), M. intracellulare (35) i M.bovis (36); Mycoplasma hyopneumoniae (37); Pasteurella multocida (38); Porcine cytomegalovirus (39); Porcine Parvovirus (40); Svinjski Virus Reproduktivnog i Respiratornog Sindroma (41); Pseudorabies virus (42); Rotavirus (43); Salmonella spp. (44), poželjno S. thyhimurium (45) i S. choleraesuis (46); Staph. hyicus (47); Staphylococcus spp. (48) poželjno Streptococcus spp. (49), poželjno Strep. suis (50); Swine herpes virus (51); Swine Influenza Virus (52); Swine pox virus (53); Swine pox virus (54); Vesicular stomatitis virus (55); Virus vezikularnog eksantema svinja (56); Leptospira Hardjo (57); i/ili Mycoplasma hyosynoviae (58).

[00283] U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na komplet koji se sastoji od posude koja sadrži imunogenu kompoziciju kako je ovde opisano i zahtevano.

[00284] U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na komplet kako je ovde opisan i za koji se dalje traži da sadrži najmanje jednu dodatnu posudu koja sadrži najmanje jedan dodatni antigen izabran iz grupe koju þine oslabljeni živi virus, poželjno atenuirani PRRS virus i oslabljena živa bakterija.

[00285] U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na imunogenu kompoziciju kako je ovde opisano i za koju se traži da se koristi kao lek, poželjno kao vakcina.

[00286] U drugom aspektu, predmetni pronalazak se tiþe imunogene kompozicije kako je ovde opisano i zahtevano i/ili kompleta kako je ovde opisano i zahtevano, za upotrebu u postupku smanjenja jednog ili više kliniþkih simptoma infekcije patogenom kod životinje kao što je u poreÿenju sa životinjom koja ne prima pomenutu imunogenu kompoziciju.

[00287] Termin "smanjenje incidencije ili ozbiljnosti kliniþkih znakova" znaþi da je bilo koji od takvih znakova smanjen u uþestalosti ili ozbiljnosti kod životinja koje primaju vakcinu u poreÿenju sa "kontrolnom grupom" životinja kada su obe inficirane ili izazvane patogenom od kojeg su imunološki aktivna komponenta(e) u vakcini izvedena i pri þemu kontrolna grupa nije primila vakcinu ili imunogenu kompoziciju. U ovom kontekstu, termin "smanjenje" ili "redukcija" oznaþava smanjenje od najmanje 10%, poželjno 25%, još više poželjno 50%, najpoželjnije više od 100% u vakcinisanoj grupi u poreÿenju sa kontrolnom grupom ne vakcinisanom.

[00288] Kao što se ovde koristi, "kliniþki simptomi" ili "kliniþki znaci" üe se odnositi na znake infekcije od patogena koji se mogu direktno primetiti od žive životinje, kao što su simptomi. Reprezentativni primeri üe zavisiti od odabranog patogena, ali mogu ukljuþivati stvari kao što su iscedak iz nosa, letargija, kašalj, povišena temperatura, poveüanje ili gubitak težine, dehidracija, dijareja, otok, hromost i sliþno.

[00289] Kao što se ovde koristi, "zaštitni imuni odgovor" se odnosi na smanjenu incidenciju ili smanjenu ozbiljnost kliniþkih, patoloških ili histopatoloških znakova ili simptoma infekcije od patogena od interesa do i ukljuþujuüi potpunu prevenciju takvih znakova ili simptomi.

[00290] Termin "patološki znaci" üe se odnositi na znakove infekcije koji se mogu uoþiti na mikroskopskom ili molekularnom nivou, putem biohemijskog testiranja, ili golim okom nakon obdukcije.

[00291] Termin "histopatološki znaci" üe se odnositi na znake promena tkiva koje su rezultat infekcije.

[00292] Termini "kliniþki simptomi" ili "kliniþki znaci" su definisani gore.

[00293]

PRIMERI

[00294] Sledeüi primeri su navedeni u nastavku da ilustruju specifiþna izvoÿenja predmetnog pronalaska. Ovi primeri su samo ilustrativni i podrazumeva se da ne ograniþavaju obim ili osnovne principe ovog pronalaska.

PRIMER 1:

Proizvodnja svinjskog parvovirusa (PPV) 27a VP2 – Upstream proces

[00295] PPV 27a VP2 se proizvodi u SF+ üelijama inficiranim bakulovirusom, i BEI-inaktiviran je u procesu donekle sliþnom onom kod PCV2 ORF2 (VO 2006/072065; Primeri 1 do 3). Meÿutim, PPV 27a VP2 koristi drugaþiju bakulovirusnu osnovu oznaþenu kao “DiamondBac” (Sigma Aldrich, D6192) (umesto starije BaculoGold osnove korišüene za PCV2 ORF2).

[00296] Nukleotidna sekvenca svinjskog parvovirusa (PPV) 27a VP2 je dobijena od Genbank Accession AY684871.1. Region kodiranja PPV 27a VP2 je reverzno preveden i kodonski optimizovan za Drosophila korišüenjem softvera SciTools® Veb Tools koji obezbeÿuje Integrated DNK Technologies. Kodonom optimizovan PPV 27a VP2 gen je dalje modifikovan da ubaci dva ClaI mesta restrikcionog enzima u region kodiranja VP2, zajedno sa dodatkom BamHI i NotI restrikcionih enzima na 5'- i 3'-kraju, respektivno. ClaI lokacije su umetnute na naþin da se ne ometa region kodiranja VP2. Umetanje ClaI mesta uvodi tri manje promene aminokiselina u predviÿenu 27a VP2 aminokiselinsku sekvencu. Promene aminokiselina koje su rezultat umetanja ClaI su na poziciji 25 (Glicin Izoleucin), 36 (Alanin Serin) i 37 (Glicin Izoleucin). Kodonom optimizovan PPV 27a-ClaI VP2 gen je hemijski sintetizovan i potom kloniran u standardni plazmid za kloniranje, pUC57, u Integrated DNK Technologies (PPV27a-ClaI 38320377). PPV 27a-ClaI gen je zatim izrezan iz plazmida pUC57 koji je obezbedila Integrated DNK Technologies digestijom sa BamHI i NotI restrikcijskim enzimima, a PPV 27a-ClaI gen je subkloniran u odgovarajuüa enzimska mesta vektora prenosa bakulovirusa pVL1393(BD Pharmigen, 21486P). Plazmid pVL1393 koji sadrži PPV 27a-ClaI gen je amplifikovan u DH5Į E. coli (Invitrogen™ MAKS Efficienci™ ), a zatim ekstrahovan i preþišüen korišüenjem komercijalnog kompleta za preþišüavanje plazmida (QIAprep Spin Miniprep kit, Qiagen). Preþišüeni plazmid pVL1393 koji sadrži PPV 27a-ClaI gen i linearizovani okosnicu bakulovirusa DiamondBac® ko-transfektovan je u Sf9 üelije insekata korišüenjem Escort™ transfekcionog reagensa (Sigma Aldrich, E9770) da se generiše rekombinantni bakulovirus. OgranLþavajuüe razblaživanje je izvršeno da bi se dobio preþišüeni rekombinantni bakulovirusni fond koji sadrži PPV 27a-ClaI VP2 gen pod kontrolom promotora poliedrina. Sistem vektora ekspresije bakulovirusa (BEVS) se koristi da omoguüi suspenziju üelijske kulture insekata (SF+) da proizvede rekombinantni antigen koji se sastoji od proteina PPV 27a VP2. Za ovaj proizvod, inficirana SF+ üelijska kultura se izvodi u serijskom režimu otprilike sedam dana, a zatim se obraÿuje da bi se uklonili üelijski ostaci i komponente medija.

REFERENTNI PRIMER 2:

Proizvodnja svinjskog parvovirus (PPV) 27a VP2 – Downstream proces

[00297] Prate se dva uzastopna koraka koji obuhvataju dalje procesuiranje. Uklanjanje üelijskih ostataka se dešava u procesu poznatom kao "razjašnjavanje", dok se uklanjanje komponenti medija postiže kroz dve zapremine fiziološkog rastvora sa fosfatnim puferom (VPBS), koji se naziva "dijafiltracija".

[00298] PPV 27a VP2 Bakulovirus-vektor se proizvodi u bioreaktorima. Medijum se dodaje prethodno sterilisan ili sterilno filtriran u bioreaktor. Medijumu se dodaju SF+ üelije koje potiþu iz ekspanzionih kultura. ûelije su istovremeno inokulisane (istovremena infekcija) nakon sadnje sa semenom PPV 27a VP2 Baculovirus. Tokom širenja virusa temperatura se održava na 27±2°C, a pH se prati. Rastvoreni kiseonik (DO) se kontroliše prskanjem oþišüenog komprimovanog vazduha i kiseonika (O2). Period sakupljanja se javlja izmeÿu 6 do 8 dana nakon infekcije virusom i postiže se kriterijum prikupljanja od 20% vitalnosti üelije. Prilikom prikupljanja, teþnosti antigena PPV 27a VP2 se bistre pomoüu dva seta filtera, predfiltera veliþine pora 2.0-4.0 µm i konaþnog filtera veliþine pora 0.1-0.8 µm. Filtrirane prikupljene teþnosti se sakupljaju u rezervoaru.

[00299] Preþišüene PPV 27a VP2 antigene teþnosti se zatim "dijafiltriraju" sa dve zapremine (2x-2.5X) WPBS [koristeüi filter od 300.000-500.000 kilo Daltona (kDa) nominalne molekularne težine (NMWC) na šupljem filteru] na temperaturi izmeÿu 4°C i 29°C. Posle dijafiltracije, temperatura antigena PPV 27a VP2 se poveüava na 37±2°C za inaktivaciju dodavanjem binarnog etilenimina (BEI) do konaþne koncentracije od 5mM. Antigen je inkubiran na 37±2°C i mešan 72-96 sati. Preostali BEI se neutrališe sa molarnim viškom rastvora tiosulfata natrijum u trajanju od najmanje 30 minuta. PPV 27a VP2 antigenske teþnosti se prenose u kese za þuvanje na 4±3°C do mešanja vakcine.

[00300] Podaci u nastavku u Tabelama 1A i 1B pokazuju da vakcina PPV 27a VP2 nije virucidna za ReproCic® PRRS EU vakcinu i Ingelvac® PRRS MLV vakcinu, respektivno, kada se mešaju zajedno do 8 sati (jedan radni dan).

[00301] Tabela 1A: Dve (2) serije ReproCyc PRRS EU®, serijski brojevi 3910003A (10 doza) i 3910004A (50 doza), þuvane su na 5°C ± 3°C u materijalima za pakovanje do upotrebe za studiju. Dve (2) serije PPV 27a VP2, brojevi serije 7600016A (10 doza) i 7600018B (50 doza), korišüene su kao razblaživaþ za Ingelvac ReproCyc® PRRS EU serije 3910003A (10 doza) i 49150 doza respektivno. Ove dve serije su þuvane na 5°C ± 3°C u materijalima za pakovanje dok nisu upotrebljene za studiju. ReproCyc® PRRS EU vakcina, nakon rekonstitucije (bilo u razblaživaþu koji sadrži Carbopol u grupi 1 ili teþnoj vakcini PPV 27a VP2 u grupi 2), þuvana je na sobnoj temperaturi (15-25 °C) maksimalno 8 sati i testiran na titar na nula, dva, þetiri i 8 sati. Rezultati Grupe 1 titracije virusa (log10TCID50/2mL doze) u Tabeli 1A ispod na T0, T2, T4 i T8 su pokazali stabilnost virusa do 8 sati. Rezultati grupe 2 titracije virusa (Log10TCID50/2mL doze) na povezanom proizvodu na T0, T2, T4 i T8 su pokazali da vakcina PPV 27a VP2 nema virucidno delovanje protiv ReproCyc® PPRS EU do 8h.

Tabela 1A

[00302] Tabela 1B: Dve (2) serije Ingelvac PRRS MLV, serijski brojevi 2451189A (10 doza) i 2451188A (50 doza), þuvani su na 5°C ± 3°C u materijalima za pakovanje do upotrebe za studiju. Dve (2) serije PPV 27a VP2, brojevi serije 7600016A (10 doza) i 7600018B (50 doza), korišüene su kao razblaživaþ za Ingelvac® PRRS MLV serije 2451189A (10 doza) i 24551188 A (10 doza), respektivno. Ove dve serije su þuvane na 5°C ± 3°C u materijalima za pakovanje dok nisu upotrebljene za studiju. Ingelvac® PRRS MLV vakcina, nakon rekonstitucije (bilo u razblaživaþu koji sadrži Carbopol u grupi 1 ili u teþnoj vakcini PPV 27a VP2 u grupi 2), þuvana je na sobnoj temperaturi (15-25 °C) maksimalno 8 sati i testiran na titar (TCID50 po dozi od 2 mL) na nula, dva, þetiri i 8 sati. Rezultati grupe 1 titracije virusa (log10 TCID50/2 mL doze) u tabeli 1B dole na T0, T2, T4 i T8 pokazali su stabilnost virusa do 8 sati. Rezultati grupe 2 titracije virusa (Log10 TCID50/2mL doze) na povezanom proizvodu na T0, T2, T4 i T8 su pokazali da vakcina PPV 27a VP2 nema virucidno dejstvo protiv Ingelvac® PRRS MLV do 8 sati.

Table 1B

PRIMER 3:

Efikasnost PRRSV-EU vakcine kada se PRRSV-EU vakcina meša sa PPV VP2 vakcinom

[00303] Trideset šest (36) nazimica koje nisu gravidne dobi su nasumiþno podeljene u tri grupe za leþenje, od kojih je svaka grupa sadržala dvanaest nazimica. Grupa T01 je primila kontrolni proizvod VPBS (fiziološki rastvor puferovan sa fosfatom za pranje) (kontrola) 0 i 21 dana (D0, D21). Grupa T02 je primila ReproCyc® PRRS EU (PRRS soj 94881), 3.9 log10 TCID50 po dozi i vakcinu protiv svinjskog parvovirusa, PPV-27a VP2, 10 µg po dozi (mešano) na D0 i PPV-27a VP2, samo 10 g po dozi na D21. ReproCyc® PRRS EU kao liofilizovani kolaþ je rekonstituisan sa teþnim PPV-27a VP2. Grupa T03 je primila ReproCyc® PRRS EU (sam) na D0. Tretmani su formulisani tako da su nazimice primale ReproCyc® PRRS EU u minimalnoj dozi za imunizaciju i PPV-27a VP2 u maksimalnoj relativnoj potenciji. Nazimice su izazvane sa 5.5 log10TCID50 / 6 mL ukupne doze (2 mL intramuskularno i 2 mL po nozdrvi) heterolognog PRRSV EU izolata 190136 þetiri nedelje nakon inicijalne vakcinacije (D28), a uzorci seruma su prikupljeni sledeüih dana: D31, D35 , D42 i D49. PRRSV viremija je testirana kvantitativnim PCR (qPCR) [Sandra Revilla-Fernandez et al., Journal of Virological Methods 126 (2005) 21–30]. Izolat virusa izazovnog evropskog PRRS virusa 190136 prvobitno je dobijen iz pluünog tkiva novoroÿenog prasiüa sa farme koja pokazuje tipiþne reproduktivne znake PRRSV (abortusi kod krmaþa i slabost novoroÿenih prasadi) tokom epidemije u Donjoj Saksoniji, Nemaþka, aprila 2004. Prisutni veterinari su uzorke pluüa predali BioScreen-u (uzorak je stigao 21. aprila 2004. godine) na dijagnostiþko testiranje. Virus izazivanja je propagiran u AK-MA104 üelijama i prošao dva puta pre izazivanja.

[00304] Nakon izazivanja, obe grupe (mešane i same) su se pokazale efikasne protiv virulentnog PRRSV sa kvantitativnim površinama virusnog optereüenja ispod krive (AUC) za D28 do D49 od 24.36 GE/mL (GE = genomski ekvivalenti) za mešane (p=0,0002) i 32,54 GE/mL samo (p=0,0045) u poreÿenju sa 50.85 GE/mL u kontroli. Ovo predstavlja približno 50% smanjenje sistemski cirkulišuüeg virusa kod svinja tokom vremena za mešovitu grupu i približno 40% smanjenje za samo grupu ReproCyc® PRRS EU (slika 1) što pokazuje znaþajan zaštitni efekat mešovitih i pojedinaþnih grupa. Pored toga, kvantitativna srednja PRRSV qPCR analiza je pokazala znaþajno smanjenje PRRSV virusnog optereüenja za mešano na D35 (p<0.0001) i na D38 (p=0.0052) i samo za D35 (p<0.0001) u poreÿenju sa kontrolom koja pokazuje znaþajnu zaštitnu efekat mešovitih i samih grupa. kPCR analiza je pokazala znaþajno smanjenje proporcija pozitivnih nazimica na D35 za mešane (p=0.0013) i same (p=0.0046) i na D38 za mešane (p=0.0137) u poreÿenju sa kontrolom. Iako nije statistiþki znaþajan, uoþen je numeriþki trend ka smanjenju srednjeg virusnog optereüenja i proporcije PRRSV qPCR pozitivnog za mešovito na D42 i D49. Sliþni trendovi su uoþeni samo za samu uz numeriþko smanjenje srednjeg virusnog optereüenja na D49 i proporciju qPCR pozitivnog na D42 i D49.

[00305] Upotreba samo ReproCyc® PRRS EU vakcine ili kada se pomeša sa PPV-27a VP2 vakcinom pokazala se efikasnom protiv virulentnog PRRSV-EU izazovnog soja koji pokazuje þetvoronedeljni poþetak imuniteta. Iz podataka na Slici 1 i Slici 2, oþigledno je da je mešanje ReproCyc® PRRS EU vakcine sa PPV-27a VP2 poboljšalo efikasnost. Rezultati pokazuju nedostatak interferencije izmeÿu PRRSV komponente i PPV komponente u mešovitoj grupi, pokazujuüi povoljnu moguünost povezane upotrebe kroz mešanje.

PRIMER 4:

Efikasnost PPV VP2 vakcine kada se PRRSV-EU vakcina meša sa PPV VP2 vakcinom

[00306] Procena efikasnosti kombinovanih vakcina: Efikasnost povezane upotrebe obe vakcine [ReproCyc® PRRS EU (PRRS Strain 94881) i PPV-27a VP2] se procenjuje u odnosu na eksperimentalne infekcije PPV.

1

[00307] Efikasnost protiv eksperimentalnog izazova sa divljim PPV sojem: Efikasnost kombinovanih vakcina protiv PPV se procenjuje na osnovu PPV infekcije kod fetusa. Vakcina se smatra efikasnom ako je 80% fetusa u svakoj tretiranoj grupi seronegativno na PPV.

[00308] Briga o životinjama: Životinje su dobrog zdravlja i nutritivnog statusa pre nego što se studija zapoþne. Pre ukljuþivanja i postupka nasumiþnog biranja vrši se zdravstveni pregled. Nemedicinska hrana se koristi tokom celog trajanja studije. Obroci hrane odgovaraju uzrastu, stanju i vrsti ogledne životinje prema standardnoj proceduri rada objekta. Voda je obezbeÿena ad libitum kroz studiju.

[00309] Procena efikasnosti povezane upotrebe PPV i PRRSV vakcina nakon izazivanja i heterolognog PPV soja: Na D0, konvencionalne ne-trudne nazimice starosti 5-6 meseci su randomizirane ravnopravno u tri grupe za leþenje. Grupa T01 prima 2mL IM kontrolnog proizvoda (PBS-Carbopol razblaživaþ (Impran FLEX®) dana 0 i 21 (D0, D21). Grupa T02 prima 2mL IM ReproCyc® PRRS EU (PRRS soj 94881) i vakcina protiv svinjskog parvovirusa, PPV-27a VP2, na D0 i PPV-27a VP2 samo na D21. Što se tiþe Grupe T02, ReproCyc® PRRS EU kao liofilizovana pogaþa je rekonstituisan sa rastvorom vakcine PPV-27a VP2 Grupa T03 prima 2mL PPV virusa IM Porcine Parvo -27a VP2, (1 µg/doza) na D0 i na D21. Nazimice se svakodnevno posmatraju radi opšteg zdravlja. Životinje su izazvane izmeÿu 39. i 42. dana gestacije heterolognim PPV sojem 401/09 (198669) dobijenim iz BioScreen-a ( Munster, Nemaþka) iz tkiva mumificiranog prasiüa 15. juna 2004. i poslato na Univerzitet u Lajpcigu, Nemaþka (virus izazova je odmrznut i razblažen u DMEM-u (1x, Gibco, Ref#11966-025, Lot#1632505) do ciljne doze od 6.0 log10 TCID50/6-mL doze). Fetusi se sakupljaju (standardna procedura) oko 90. dana gestacije i procenjuju se na prisustvo PPV pomoüu PCR (Molitor TV et al., Journal of Virological Methods 1991, 32: 201- 211) iz njihovih uzoraka teþnosti organa ili tkiva, kao i za njihovo stanje, veliþinu i težinu. Tretmani su formulisani tako da nazimice primaju ReproCyc® PRRS EU (PRRS soj 94881) i vakcinu protiv svinjskog parvovirusa, PPV-27a VP2, u maksimalnoj ReproCyc® PRRS EU imunizujuüoj dozi (107.0 TCID50/2-mL Porc doza; geometrijska sredina Parvovirusa) vakcina, PPV-27a VP2, sa minimalnom relativnom potencijom (1 µg /doza).

[00310] Studija je bila validna prema Ph.Eur. Monografija 8.004/2013:0965 pošto je vakcina obezbedila zaštitu od 95.7% (T03 grupa) i 94.3% (T02 grupa), dok je T01 grupa (kontrola) imala 91.4% pozitivnih fetusa (videti Tabelu 2).

[00311] Zakljuþeno je da je vakcinacija samo PPV vakcinom ili pomešana sa ReproCyc® PRRS EU bezbedna i efikasna kada se vakcinacija završi tri nedelje pre parenja.

2

Tabela 2 – Procenat pozitivnih fetusa po grupi

<1>Broj pozitivnih PPV fetusa/ Broj fetusa po grupi.

PRIMER 5:

PRIPREMA PODJEDINICA PPV VAKCINE

[00312] Antigen PPV VP2 je odabran da bude eksprimiran u üelijama insekata inficiranih bakulovirusom na osnovu nemaþkog izolata PPV 27a. Nukleotidna sekvenca svinjskog parvovirusa (PPV) 27a VP2 je dobijena od Genbank Accession AI684871.1. Region kodiranja PPV 27a VP2 je reverzno preveden i kodonski optimizovan za Drosophila (SEQ ID NO:4 i SEQ ID NO:3). Kodonom optimizovan PPV 27a VP2 gen je hemijski sintetizovan u Integrated DNK Technologies. PPV 27a gen se zatim subklonira u vektor za prenos bakulovirusa pVL1393 i ko-transfektuje linearizovanom bakulovirusnom kiþmom DiamondBac® u Sf9 üelije insekata da bi se stvorio rekombinantni bakulovirus koji sadrži PPV 27a VP2 gen pod kontrolom promotora poliedrina.

[00313] Kada je eksprimiran u Sf9 üelijama insekata, PPV VP2 samo sastavljene u VLP bez omotaþa (podaci nisu prikazani).

[00314] PPV VP2 antigen je adjuvans sa karbomerom (Carbopol).

PRIMER 6:

DOKAZ KONCEPT STUDIJE PPV VAKCINE

[00315] U svim studijama sa životinjama životinje su u dobrom zdravstvenom i nutritivnom statusu pre poþetka studije. Pre postupka nasumiþnog biranja vrši se zdravstveni pregled. Nemedicinska hrana se koristi tokom trajanja studije. Obroci hrane su odgovarajuüi za uzrast, stanje i vrstu ispitne životinje u skladu sa standardnom operativnom procedurom objekta. Voda se daje ad libitum tokom þitave studije.

[00316] Cilj ove studije izazova vakcinacijom je da se utvrdi dokaz efikasnosti odreÿivanja koncepta doze za vakcinu pred rasplodnu podjedinicu svinjskog parvovirusa (PPV) (videti Primer 5).

Nazimice se vakcinišu i uzgajaju pre izazivanja sa živim virulentnim izolatom PPV (PPV 002346-5; severnoameriþki soj) približno 40 dana gestacije (dG). Fetusi se procenjuju na PPV infekciju na približno 90 dG.

[00317] Dizajn studije je opisan u Tabeli 3.

Tabela 3: Dizajn studija

NTX = Kontrolni Ne-Tretiran/Bez Izazova; IN = intranazal; IM = intramuskular; dG = dani trudnoüe.

[00318] Koristi se 67 nazimica koje potiþu iz stada koje je prethodno bilo negativno na PPV bez prethodne istorije reproduktivnih bolesti ili vakcinacije protiv PPV. Nazimice su nasumiþno podeljene u 6 grupa za tretman (T) od n=9 pomešanih u 3 grupe koje su vakcinisane na D0 i pojaþane na D21: T1 NC (negativna kontrola vode za injekcije), T2 PPV 10µg, T3 PC (pozitivna kontrola; cela, inaktivirani svinjski parvovirus (PPV), Erisipelothrik rhusiopathiae, Leptospira canicola, L.grippotiphosa, L. hardjo, L. icterohaemorrhagiae i L. Pomona; komercijalno dostupno; koristi se prema uputstvu proizvoÿDþa). Ukljuþene su tri netretirane kontrolne (NTX) nazimice, jedna po grupi. Posle vakcinacije, nazimice se sinhronizuju (putem primene Matrix®; altrenogesta, Intervet Schering-Plough Animal Health; po etiketi 14 uzastopnih dana, D18 do D31) i zatim se uzgajaju izmeÿu D35 i D42. Pedeset þetiri od 67 nazimica zatrudne. Na D80 (približno 40dG), NTX nazimice su obdukovane, a preostale nazimice su inokulisane sa 6 mL PPV soja PPV002346-5 (soj Severne Amerike) pri 4.25 log10TCID50po dozi (2 mL intramuskularno intramuskularno i 2 mL). Nazimice se krvare svake nedelje osim tokom sinhronizacije i parenja (D35 – D70). Serologija se vrši na serumima od D0, D7, D14, D21, D28 i D73; serologija i lanþana reakcija polimeraze (PCR) (kao što je opisano u Jozvik et al. 2009; Journal of General Virologi, 90, 2437-2441) za viremiju se izvodi na serumima iz D80, D87, D94, D101, D108, D115, D122, i D128. Nazimice se nekropsiraju na D129 ili D130 (približno 90dG). Prilikom obdukcije, svaki reproduktivni trakt se uklanja i beleži se položaj fetusa u materici, stanje fetusa, veliþina i težina. Sakupljaju se uzorci ispiranja grudnog koša i pluüa od svakog fetusa. Uzorci ispiranja grudnog koša se sakupljaju aseptiþno od svakog fetusa. Ukratko, 3 ml sterilnog PBS se ubrizgava u torakalnu šupljinu sterilnom iglom i špricem. Teþnost se usisava nazad u

4

špric i ubrizgava u odgovarajuüu, sterilnu SST (cev za odvajanje seruma) odgovarajuüe veliþine. Ispiranje grudnog koša se testira na prisustvo PPV pomoüu PCR i na prisustvo PPV antitela inhibicijom hemaglutinacije (HI). Tkivo pluüa se þuva zamrznuto.

[00319] Viremia Nazimica (PPV)

[00320] Sve nazimice su negativne na PPV viremiju pre izazivanja na D0, D73 (podaci nisu prikazani) i D80 (Tabela 4). Sve negativne kontrole su viremiþne na D87, a 4/7 su viremiþne na D94.

[00321] T3 nazimice posle vakcinacije serokonvertuju posle dopunske vakcinacije. T2 ima serološki odgovor na poþetnu vakcinaciju i ostaje seropozitivan nakon dopunske vakcinacije. T1 kontrolne nazimice ostaju serološki negativne na PPV do izazivanja. Posle izazivanja, sve nazimice negativne kontrole su viremiþne na D87 (sedam dana nakon izazivanja). Jedna T3 nazimica je viremiþna na D87. Sve ostale nazimice nisu viremiþne u ovim vremenskim taþkama (vidi Tabelu 4).

[00322] NTX nazimice su ostale seronegativne i svi njihovi fetusi su bili PPV negativni prema PCR na uzorcima ispiranja grudnog koša.

Tabela 4: Distribucija uþestalosti PPV-pozitivnih (PCR) nazimica kada su izazvane PPV na 40 dana trudnoüe (dG) na D80.

[00323] Rezultati fetusa

[00324] Svi NTX fetusi se smatraju normalnim na D80 nekropsiji (Tabela 5). Na konaþnoj obdukciji na D129 i D130, 22.5% fetusa T1 (negativna kontrola) je normalno, dok je 98.39% fetusa u T3 i 97.62% fetusa u T2 normalno. Proseþna veliþina i težina T1 (negativna kontrola) fetusa je 11.5 cm i 168.8 g, respektivno, dok je proseþna veliþina i težina fetusa u T217.5 cm i 590.1 g, respektivno.

[00325] Svi T4 (NTX) fetusi su PPV negativni utvrÿeni PCR na uzorcima ispiranja grudnog koša (videti Tabelu 3). PPV infekcija je potvrÿena kod 67/80 fetusa T1 negativne kontrole (83.75%). Šezdeset dva od 67 fetusa Negativne kontrole za koje je potvrÿeno da su zaraženi PPV su mumije. Nasuprot tome, PPV infekcija je potvrÿena samo kod 0.79% kod T2 fetusa.

[00326] Na osnovu parametra zakljuþka za utvrÿivanje efikasnosti kao što je navedeno u Evropskoj Farmakopeji (monografija 01/2008:0965), sve vakcine (ukljuþujuüi pozitivnu kontrolu (PPV inaktivirani celim üelijama)) ispunjavaju kriterijume za zaštitu od infekcije (>80% fetusi negativni za PPV).

Tabela 5: Podaci o leglu: broj, veliþina, težina i stanje fetusa i laboratorijska potvrda PPV infekcije (PCR na uzorcima ispiranja grudnog koša).

[00327] Zakljuþak: PPV vakcina predmetnog pronalaska je pokazala zaštitu fetusa nakon virulentnog heterolognog izazivanja PPV. Rezultati studije pokazuju da je vakcina bezbedna kada se primenjuje pre parenja i da je efikasna u znaþajnom smanjenju viremije i transplacentalne infekcije kod fetusa. Dalje, pokazano je da vakcina štiti od heterolognog severnoameriþkog soja izazvanog PPV. Štaviše, pokazalo se da je podjedinica PPV VP2 proteina efikasna kao i ceo ubijeni virus.

PRIMER 7:

ODREĈIVANJE MINIMALNE IMUNIZUJUûE DOZE PPV VAKCINE – ZAŠTITA OD

HETEROLOGNOG US PPV SOJA

[00328] Cilj ove studije izazova vakcinacije je da se ustanovi minimalna imunizirajuüa doza (MID) za vakcinu protiv svinjskog parvovirusa (PPV). Nazimice se izazivaju sa živim virulentnim PPV izolatom serotipa 1 (PPV 002346-5) na približno 40 dana trudnoüe (dG). Vakcina se smatra efikasnom ako je 80% fetusa u vakcinisanoj grupi negativno na PPV nakon izazivanja. Parametri podrške ukljuþuju veliþinu, težinu i stanje fetusa, status pozlaüene viremije nakon izazivanja i serološki status pozlaüe.

[00329] Nazimice (bez prethodne istorije reproduktivnih bolesti ili vakcinacije protiv PPV) su nasumiþno podeljene u grupe za tretman: T01 negativna kontrola (Placebo podudaran sa proizvodom (PMP)) i T02 = 1.0 µg PPV/2 mL doze). Netretirane/neizazvane (NTX) nazimice se nasumiþno dodeljuju grupama kao kontrole za opšti zdravstveni status.

[00330] Nazimicama se daje 2 mL odgovarajuüeg tretmana intramuskularno na D0 i D21. Nakon vakcinacije, nazimice se uzgajaju izmeÿu D37 i D50, a zatim se procenjuju na status trudnoüe na D74. Na D81, gestacijske nazimice su izazvane sa 6.77 log10TCID50/6 mL PPV serotipa 1 intramuskularno i intranazalno. Nazimice krvare svake nedelje osim tokom sinhronizacije estrusa i parenja (D36-D73). Testovi inhibicije hemaglutinacije (HI) se izvode na serumima iz D7, D14, D21, D28 i D35; HI i lanþana reakcija polimeraze (PCR) (videti Primer 6) za viremiju se izvode na serumima iz D-3, D74, D80, D88, D95, D102 i D127. Nazimice su obdukovane na D128 i D129 (približno 90 dG). Prilikom obdukcije, reproduktivni trakt svake krmaþe se uklanja i beleži se položaj svakog fetusa u materici, stanje fetusa, veliþina i težina. Uzorci ispiranja grudnog koša (videti Primer 6) se uzimaju od svakog fetusa i testiraju na prisustvo PPV od strane PCR.

[00331] Viremia Nazimice (PPV)

[00332] Vakcine se smatraju bezbednim jer životinje ne pokazuju abnormalnu telesnu temperaturu 24 sata ili 48 sati nakon vakcinacije, nema abnormalnih lokalnih reakcija koje se mogu pripisati vakcini i nema kliniþkih znakova povezanih sa vakcinacijom (podaci nisu prikazani).

[00333] Sve nazimice su negativne na PPV viremiju pre vakcinacije, pre izazivanja na D74 i na D80. Dakle, nakon vakcinacije, nisu primeüeni nikakvi kliniþki znaci u vezi sa primenom vakcine. Na D88, svih deset T01 nazimica su viremiþne, a sve vakcinisane nazimice su negativne. Svi ostali uzorci krvi na D95, D102 i D127 su negativni na PPV viremiju za sve grupe leþenja (Tabela 6).

Tabela 6: Distribucija uþestalosti PPV-pozitivnih (PCR) nazimica kada su izazvane PPV na ~40 dana trudnoüe (dG) na D81.

* 2 nazimice su dijagnostikovane da nisu trudne i stoga su uklonjene iz grupe

[00334] Rezultati Fetusa

[00335] Na završnoj obdukciji na D128 i D129, 38% fetusa T01 (negativna kontrola) je normalno stanje dok je 95% fetusa u grupi sa vakcinom normalno stanje. Proseþna veliþina i težina fetusa T01 (negativna kontrola) je 14.4 cm i 245.9 g, dok je proseþna veliþina i težina fetusa vakcinisanih majki 19.3 cm i 550 g (Tabela 7). Dakle, vakcinalna grupa ispunjava kriterijume za zaštitu od infekcije PPV kao parametrom zakljuþka za efikasnost PPV utvrÿenim od strane Ph. Eur.

01/2008:0965 je >80% fetusa u grupi tretmana mora biti negativan na PPV.

[00336] PPV infekcija je potvrÿena kod 113/146 fetusa negativne kontrole (T01) (77%). Meÿutim, PPV infekcija u vakcinisanoj grupi (T02) je samo 10%.

Tabela 7 Detalji legla: broj, veliþina, težina i stanje fetusa i laboratorijska potvrda PPV infekcije (PCR na uzorcima ispiranja grudnog koša).

[00337] Zakljuþak: PPV VP2 podjediniþna vakcina predmetnog pronalaska pokazuje zaštitu fetusa nakon izazivanja virulentnog heterolognog PPV. Rezultati ove studije otkrivaju da je vakcina bezbedna i efikasna u prevenciji viremije kod nazimica i PPV infekcije kod fetusa kada se koristi samo 1 µg PPV VP2 podjedinice vakcine. Dalje, pokazano je da vakcina štiti od heterolognog severnoameriþkog izazovnog soja.

PRIMER 8:

UTVRĈIVANJE MINIMALNE IMUNIZAJUûE DOZE PPV VAKCINE – ZAŠTITA OD

HETEROLOGNOG EU PPV SOJA

[00338] Cilj ove studije je da proceni poþetak imuniteta vakcine protiv svinjskog parvovirusa (PPV VP2, od sada nazvana PPV vakcina). Pored toga, bezbednost i efikasnost se procenjuju korišüenjem randomizovane, zaslepljene, negativno kontrolisane vakcinacije - dizajn studije izazova.

[00339] Nazimice su nasumiþno rasporeÿene u tri grupe. U grupama 1 i 2 nazimice se vakcinišu dva puta, sa razmakom od tri nedelje (na D0 i D21). Druga doza se daje tri nedelje pre parenja. Svi tretmani se primenjuju intramuskularno (IM) u zapremini od 2 mL. Grupa 2 je primila PPV vakcinu, dok je grupa 1 placebo grupa koja dobija sterilni razblaživaþ kao kontrolni proizvod, a grupa 3 je služila kao stroga kontrola, bez ikakvog tretmana.

[00340] Nazimice su sinhronizovane u estrusu i tri nedelje nakon druge vakcinacije se veštaþki osemeni. Životinje koje su zatrudnele su izazvane na D84 izmeÿu 39. i 42. dana trudnoüe sa virulentnim, heterolognim PPV sojem.

[00341] Na D132-135, oko 90. dana trudnoüe, nazimice su eutanazirane, obdukovane i fetusi su procenjeni.

Tabela 8: Dizajn Studija

[00342] Procena PPV viremije kod nazimica pre i posle izazivanja pomoüu PCR:

[00343] Sve životinje su negativne na PPV na osnovu PCR na D-6 i D-1 pre vakcinacije i ispunjavaju kriterijume za ukljuþivanje. Nakon vakcinacije, sve životinje u strogoj kontrolnoj i kontrolnoj grupi proizvoda su negativne na PPV antigen do izazivanja, stoga se PPV infekcija pre izazivanja može iskljuþiti.

[00344] Viremija je istražena na 7 (D90), 14 (D97) i 21 (D104) dan nakon izazivanja i na dan obdukcije. Nakon izazivanja viremija nije otkrivena kod vakcinisanih životinja, viremija se javlja samo kod nevakcinisanih kontrolnih životinja.

[00345] Na D90, (7 dana nakon izazivanja) veü je 95% nevakcinisanih kontrolnih životinja pozitivno na PPV. Na D97 i dalje 60% ovih životinja ima pozitivan rezultat, dok su na D104 sve životinje negativno testirane na PPV. Nasuprot tome, u vakcinisanoj grupi sve životinje testirane na dan D90, D97 ili D104 su negativne na PPV.

Tabela 9: Broj životinja sa viremijom nakon izazivanja

[00346] Rezultati Fetusa

[00347] Procenat fetusa zaraženog PPV bio je 91.4% u kontrolnoj grupi, ali samo 4.3% u PPV grupi (vidi Tabelu 10).

Tabela 10 Procenat pozitivnih fetusa po grupi i veliþini legla

<1>Broj pozitivnih PPV fetusa/Broj fetusa po grupi. N Ukupan broj

[00348] Procena stanja fetusa

[00349] Svi fetusi se procenjuju u pogledu njihovog stanja i rasporeÿuju u tri kategorije: normalni, mumificirani i autolizovani.

[00350] Veüina mumificiranih i autolizovanih fetusa nalazi se u kontrolnoj grupi. Samo 39.8% fetusa u ovoj grupi je normalnog stanja, dok je u vakcinisanim grupama 97.4% (PPV grupa) fetusa u normalnom stanju (vidi Tabelu 11).

Tabela 11: Fetalno stanje

[00351] Zakljuþak: PPV vakcina predmetnog pronalaska pokazuje zaštitu fetusa nakon virulentnog heterolognog PPV izazova, što ukazuje da je vakcina bezbedna i efikasna u prevenciji viremije i PPV infekcije kod fetusa kada se koristi samo 1 µg vakcine. Dalje, pokazano je da vakcina takoÿe štiti od heterolognog evropskog izazovnog soja PPV. Dakle, vakcina ima širok spektar zaštite jer vakcina štiti od heterolognih severnoameriþkih, kao i heterolognih evropskih izazvanih sojeva.

[00352] Sve kompozicije i postupci koji su ovde otkriveni i koje se zahtevaju mogu biti napravljene i izvedene bez nepotrebnog eksperimentisanja u svetlu predmetnog otkriüa. Dok su kompozicije ovog pronalaska i otkriveni postupci opisani u smislu poželjnih realizacija, struþnjacima u ovoj oblasti üe biti oþigledno da se varijacije mogu primeniti na kompozicije i postupke i u koracima ili u nizu koraka ovde opisani postupaka bez odstupanja od koncepta i obima pronalaska. Taþnije, biüe oþigledno da odreÿeni agensi koja su i hemijski i fiziološki srodni mogu biti zamenjeni ovde opisanim agensima dok bi se postigli isti ili sliþni rezultati. Smatra se da su sve takve sliþne

1

zamene i modifikacije oþigledne struþnjacima u ovoj oblasti u okviru obima i koncepta pronalaska kako je definisano zahtevima.

PRIMER 9:

Svinjski parvovirus (PPV) Dokaz koncepta/odreÿivanje doze vakcine kombinovane vakcine PPV podjedinice sa Erysipelothrix rhusiopathiae i/ili virusom reproduktivnog i respiratornog sindroma svinja u nazimicama u priplodnoj dobi

[00353] Cilj ove studije o izazovu vakcinacije je da obezbedi podatke o povezanoj upotrebi Ingelvac® PRRSV MLV sa eksperimentalnom podjedinicom kombinovane vakcine protiv svinjskog parvovirusa (PPV) sa Erysipelothrix rhusiopathiae (Ery) bakterijom i trebalo je da uspostavi dokaz koncepta odreÿivanja doze efikasnosti za PPV kombinovanu vakcinu sa Eri bakterinom kod nazimica starih od 5 do 6 meseci.

[00354] Šezdeset sedam nazimica potiþe iz stada koje je prethodno negativno testirano na PPV bez prethodne PPV istorije bolesti ili vakcinacije. Nazimice su nasumiþno podeljene u 6 grupa za tretman od n=9 pomešane u 3 grupe koje su primile vakcinu na D0 i pojaþane na D21: T1 negativna kontrola, T2 PPV 10 µg, T3 PPV 0.1 µg Eri 10 logs, T4 PPV 1 µg 1. T5 PPV 10 µg Eri 10 logs, T6 pozitivna kontrola (FarrowSure® GOLD). Ukljuþene su tri netretirane kontrolne (NTX) nazimice, jedna po grupi. Pored toga, deset nazimica je smešteno u odvojenoj zgradi koja je primala T7 PPV 10 µg Eri 10 logs koje su korišüene za rehidrataciju Ingelvac® PRRSV MLV da bi se procenila efikasnost PPV u kombinaciji sa komercijalno dostupnom vakcinom protiv reproduktivnog i respiratornog sindroma svinja (PRRS). T7 je grupa od interesa za ovaj Primer 9.

[00355] Nazimice su vakcinisane i parene; 54 od 67 nazimica su zatrudnele. Na približno 40 dana gestacije (dG), NT nazimice su obdukovane, a preostale nazimice su inokulisane sa 6 mL PPV soja PPV002346-5 pri 4.25 log10TCID50po dozi (2 mL intramuskularno i 2 mL po nozdrvi, osim u jednoj nozdrvi. Nazimice su krvarile svake nedelje osim tokom sinhronizacije i uzgoja (D35 – D70), a serumi su testirani kako je opisano u Tabeli 12.

Tabela 12 Samples and Laboratory Testing, Gilts

2

[00356] Nazimice su nekropsirane na D129 ili D130 (~ 90dG). Prilikom obdukcije, svaki reproduktivni trakt je odstranjen i zabeležen je položaj fetusa u materici, stanje fetusa, veliþina i težina. Sakupljeni su uzorci ispiranja grudnog koša i pluüa od svakog fetusa. Ispiranje grudnog koša je testirano na prisustvo PPV pomoüu PCR i na prisustvo PPV antitela inhibicijom hemaglutinacije (HI). Tkivo pluüa je þuvano zamrznuto.

[00357] T7 nazimice su imale serološki odgovor na vakcinaciju i nisu bile viremiþne nakon izazivanja. Na obdukciji, 97.37% (111/114) fetusa T7 je bilo normalno, a samo jedan fetus je bio pozitivan na PPV. Nasuprot tome, sve nazimice T1 su bile seronegativne tokom faze vakcinacije i serokonvertovale su i postale viremiþne posle izazova. Na obdukciji, samo 22.50% (18/80) T1 fetusa je bilo normalno, a 83.75% (67/80) je bilo pozitivno na PPV infekciju pomoüu PCR teþnosti za ispiranje grudnog koša. U zakljuþku, kombinovana vakcina (PPV 10 µg Eri) sa Ingelvac PRRS MLV bila je efikasna u prevenciji viremije i PPV infekcije fetusa kod 40dG.

[00358] Dizaj Studije:

Tabela 13 – Dizaj Studije

# = broj; NTX = Kontrolni Ne Tretirani/Ne Izazvani; IN = intranazal; IM = intramuskular; dG = dani trudnoüe

[00359] Materijali:

[00360] Kontrolni proizvod: Kontrolni proizvod koji je dat životinjama negativne kontrole (T1) bio je sterilni razblaživaþ (partija #240) pripremljen korišüenjem vode za injekcije (WFI) iz preþišüene vode u BIVI, St. Joseph MO, SAD. Kontrolni proizvod je isporuþen kao 100-mL pune zapremine prezentacije u plastiþnim bocama. Doza od 2 mL je primenjena u desni mišiü vrata na D0, a doza od 2 mL primenjena je u levi mišiü vrata na D21.

[00361] Vakcina: Kombinovana vakcina od interesa za T7 bila je eksperimentalna podjediniþna PPV kombinovana vakcina sa Eri bakterinom korišüenom kao razblaživaþ za rehidrataciju Ingelvac® PRRS MLV. Serijski broj # 311-171 je bio usmeren na 10 µg/dozi za PPV u kombinaciji sa 10 log/dozi ubijenog Eri bakterina koje je obezbedio laboratorijski nauþnik u plastiþnim bocama koje sadrže 20 mL (10 doza). Jedna boca serije # 311-171 korišüena je za rehidrataciju jedne boþice komercijalne serije Ingelvac® PRRS MLV dobijene od strane istraživaþa studije, serijski broj # 245-B53. Doza od 2 mL je primenjena u desni mišiü vrata na D0, a doza od 2 mL primenjena je u levi mišiü vrata na D21.

[00362] Materijal za izazov: Materijal za izazov je pripremio laboratorijski nauþnik, BIVI-R&D, Ames IA, pre izazova. PPV soj 002346-5 bio je ciljan na 5 log10TCID50po dozi, doza od 6 mL (dodeljena serija # 354-021) i držan na ledu tokom izazova. Titri izazivanja su odreÿeni TCID50 testom na zadržanom materijalu nakon izazivanja koji je održan na 4°C. Konaþni titar materijala za izazivanje bio je 3.47 logs/mL ili 4.25 logs/6 mL doze. Na D80, sve nazimice su inokulisane sa 2 mL izazovnog materijala po svakoj nozdrvi pored 2 mL intramuskularno u desnom delu vrata.

[00363] Postupci:

[00364] Nekropsija i procena fetusa: Na D79, sve NTX nazimice su eutanazirane intravenskom injekcijom barbiturata, a na D129 i D130, sve preostale nazimice su eutanazirane. Za svaku obdukciju, reproduktivni trakt je uklonjen, a fetusi su isporuþeni aseptiþno carskim rezom. Fetusi su identifikovani pomoüu ID fetusa koji se sastoji od ID nazimice, zatim slova (R za „desni rog” ili L za levi rog) i zatim broja kako je fetus naÿen iz bifurkacije materice. Zabeleženo je stanje fetusa (normalno ili mumija), veliþina i težina.

[00365] Sakupljanje Fetalnih Uzoraka: Da bi se spreþila unakrsna kontaminacija uzoraka, korišüene su sve odgovarajuüe tehnike za sterilizaciju ili þišüenje radnih površina i pribora izmeÿu rukovanja svakim fetusom i svakim uzorkom, kako na obdukciji tako i u laboratoriji. Uzorci su oznaþeni ID fetusa, tipom uzorka, danom istraživanja i datumom prikupljanja. U najranije moguüe vreme na dan uzimanja, uzorci su transportovani na ledu do laboratorijskog nauþnika. Laboratorijski nauþnik ili ovlašüeno lice obraÿivalo je svaki uzorak koristeüi odgovarajuüe tehnike kako bi spreþio unakrsnu kontaminaciju dok je svaki uzorak alikvotirao u epruvete odgovarajuüe veliþine i odgovarajuüe obeležene. Jedan alikvot je dostavljen ISU-VDL. PCR je mereno prisustvo virusa na svakom uzorku. Preostali alikvoti su pohranjeni na -70° C na BIVI-R&D – Ames.

4

[00366] Sakupljanje Ispiranjem Grudnog Koša: Što je moguüe aseptiþno, istraživaþ studije je sakupio ispiranje grudnog koša sa svakog fetusa. Ukratko, 3 mL sterilnog PBS je ubrizgano u torakalnu šupljinu sterilnom iglom i špricem. Što je više moguüe teþnosti je aspirirano nazad u špric, a zatim je ubrizgano u SST odgovarajuüe veliþine.

[00367] Statistiþke Metode:

[00368] EKSPERIMENTALNA JEDINICA: Nazimica je bila eksperimentalna jedinica za T1-T6. U sluþaju kada su napravljena poreÿenja sa T7, prostorija je bila eksperimentalna jedinica sa razumevanjem da je kuüište T7 odvojeno od drugih grupa tretmana.

[00369] Opravdanje za broj životinja: Evropska Farmakopeja je zahtevala da se izazove najmanje sedam vakcinisanih nazimica i pet kontrolnih nazimica (EPh 01/2008:0965). Devet ili deset nazimica je nabavljeno za svaki tretman da bi se objasnile nazimice koje nisu uspele da zatrudne.

[00370] Randomizacija: Pre poþetka studije, Statistiþar je dobio ID brojeve nazimice i nasumiþno izabrane nazimice iz grupe i tretman potpuno nasumiþno. Tri nazimice su nasumiþno rasporeÿene u NTX grupu, deset nazimica su nasumiþno rasporeÿene u T7 grupu, a preostale nazimice su randomizovane podjednako u T1, T2, T3, T4, T5 i T6 grupe. T1-6 nazimice i NTX nazimice su podjednako podeljene izmeÿu tri obora u štali 1. T7 nazimice su pojedinaþno smeštene u torovima u Štali 2.

[00371] Zaslepljujuüi kriterijumi: Tokom þitave studije, bilo koje osoblje ukljuþeno u prikupljanje podataka ili izvoÿenje laboratorijskih testova bilo je maskirano za raspodelu nazimica u grupe tretmana T1, T2, T3, T4, T5 i T6. Pošto su nazimice T7 i NTX bile smeštene odvojeno i serum je testiran na antitela na PRRSV, osoblje nije moglo biti slepo za ove dve grupe. Tretmane je sprovodila osoba koja nije bila ukljuþena u prikupljanje podataka.

[00372] Upravljanje podacima: Statistiþka analiza podataka je sprovedena od strane Statistiþara. Svi podaci su uvezeni u SAS verziju 9.2 (Cery, SAD/Severna Karolina, SAS Institute Inc.) radi upravljanja i analize.

[00373] Rezultati:

[00374] Samo poreÿenja za Negativnu Kontrolu (T1) u poreÿenju sa evidencijama PPV 10 µg Ery 10 koje se koriste za rehidrataciju Ingelvac® PRRSV MLV grupe (T7) su predstavljene u ovom rezimeu studije, a podaci za T1, T7 i NTX grupe su predstavljeni.

[00375] Rezultati Nazimice: Na D0, sve nazimice su bile serološki negativne na PRRSV pomoüu ELISA. Na D21, D80 i D128, sve nazimice T7 su bile seropozitivne na PRRSV. Na D73, sve nazimice T7 su bile seropozitivne, a nazimice u svim drugim tretiranim grupama bile su seronegativne.

[00376] Geometrijski srednji titri PPV HI za T7 su postali i ostali seropozitivni nakon dopunske vakcinacije na D21, dok su geometrijski srednji titri PPV HI za tretmane T1 i NTX ostali seronegativni (<100) tokom faze vakcinacije. Nakon D80 kada su nazimice T1 i T7 izazvane PPV, obe grupe su bile seropozitivne.

[00377] Sve nazimice su bile negativne na PPV viremiju pre izazivanja na D0, D73 (podaci nisu prikazani) i D80 (0). Sve negativne kontrole su bile viremiþne na D87, a 4/7 su bile viremiþne na D94.

Tabela 14 Distribucija uþestalosti PPV-pozitivnih (PCR) nazimica kada su izazvane PPV na 40 dana trudnoüe (dG) na D80.

[00378] Rezultati fetusa: Svi NTX fetusi su smatrani normalnim na D80 nekropsiji ([00326]). Na završnoj obdukciji na D129 i D130, 22.5% fetusa T1 (negativna kontrola) je bilo normalno dok je 99.12% fetusa u T7 bilo normalno. Proseþna veliþina i težina fetusa T1 (negativna kontrola) bila je 11.5 cm i 168.8 g, respektivno, dok je proseþna veliþina i težina fetusa u T7 bila 17.8 cm i 576.3 g, respektivno.

[00379] Svi NTX fetusi su bili PPV negativni odreÿen PCR na uzorcima ispiranja grudnog koša. PPV infekcija je potvrÿena kod 67/80 fetusa T1 negativne kontrole (83.75%). Šezdeset dva od 67 fetusa Negativne kontrole za koje je potvrÿeno da su zaraženi PPV su bile mumificirani. 18 fetusa normalnog izgleda bili su iz istog legla, a samo pet od ovih 18 fetusa je potvrÿeno da je PPV pozitivno. Za T7, samo jedna svinja je bila zaražena za <1% stope infekcije.

Tabela 15 Podaci o leglu: broj, veliþina, težina i stanje fetusa i laboratorijska potvrda PPV infekcije (PCR na uzorcima ispiranja grudnog koša).

[00380] DISKUSIJA/ZAKLJUýAK

[00381] NTX nazimice su ostale seronegativne, a svi njihovi fetusi su bili PPV negativni prema PCR na uzorcima pranja grudnog koša.

[00382] Nazimice kojima je primenjen T7 (10 µg PPV+Eri+PRRSV) imale su serološki odgovor na poþetnu vakcinaciju i ostale su seropozitivne nakon dopunske vakcinacije. Nijedna T7 nazimica nije bila viremiþna na nedeljnim taþkama uzorkovanja nakon izazivanja. Na obdukciji, 97.37% (111/114) fetusa T7 je bilo normalno stanje, a samo jedan fetus je bio pozitivan na PPV infekciju pomoüu PCR teþnosti za ispiranje grudnog koša. Nasuprot tome, nazimice kojima je primenjen T1 (negativna kontrola) bile su seronegativne tokom faze vakcinacije, a nakon izazivanja, sve nazimice su se serokonvertovale i postale viremiþne. Proseþna veliþina i proseþna težina T1 fetusa su bile znatno manje od T7 proseka. Na obdukciji, samo 22.50% (18/80) T1 fetusa je bilo normalno stanje, a 83.75% (67/80) je bilo pozitivno na PPV infekciju pomoüu PCR teþnosti za ispiranje grudnog koša.

[00383] U zakljuþku, kombinovana vakcina (PPV 10 µg Ery) sa PRRS MLV je bila efikasna u prevenciji viremije i PPV infekcije fetusa kod 40dG.

LISTA SEKVENCE

[00384] SEQ ID NO:4 je kodon-optimizovana PPV 27a VP2 nukleotidna sekvenca koja je dalje modifikovana da ima dva ClaI restrikciona enzimska mesta (pozicija amino kiseline 25 je ostatak izoleucina, aminokiselinska pozicija 36 je ostatak serina, amino kiselina pozicija 37 je izoleucinski ostatak) tako da se pokrije region kodiranja VP2 koji se sastoji od glicinskih ponavljanja. Meÿutim, ClaI lokacije su uvedene na naþin da se ne ometa region kodiranja VP2. SEQ ID NO:2 je proteinska sekvenca koja odgovara SEQ ID NO:4. SEQ ID NO:3 je kodon-optimizovana PPV 27a VP2 nukleotidna sekvenca (bez ClaI mesta restrikcionih enzima). SEQ ID NO:1 je proteinska sekvenca koja odgovara SEQ ID NO:3. SEQ ID NO: 5 do 16 otkrivaju dalje sekvence PPV VP2 proteina sa (SEQ ID NO: 5 do 10) ili bez (SEQ ID NO: 11 do 16) ClaI lokacija. SEQ ID NO:17 odgovara sekvenci divljeg tipa PRRSV Lelistad, a SEQ ID NO:18 odgovara sekvenci divljeg tipa PRRSV VR2332.

Claims

Patentni zahtevi

1. Imunogena kompozicija ili kombinovana vakcina ili kombinacija koja sadrži

a) najmanje jedan antigen svinjskog parvovirusa (PPV), pri þemu je najmanje jedan PPV antigen jedna ili više PPV podjedinica i najmanje jedna PPV podjedinica je PPV virusni protein 2 (VP2), pri þemu se PPV VP2 sastoji od aminokiselinske sekvence koja ima najmanje 99 %, poželjno 100 % identiþnost sekvence sa sekvencom aminokiselina SEQ ID NO:2, pri þemu poželjno PPV VP2 je jedini PPV antigen, i

b) najmanje jedan antigen virusa reproduktivnog i respiratornog sindroma (PRRS) svinja, pri þemu je najmanje jedan antigen virusa PRRS živi oslabljeni/modifikovani živi PRRS virus izabran iz grupe koju þine: živi oslabljeni/modifikovani živi genotip PRRS virusa tipa 1, živi oslabljeni/modifikovani živi genotip PRRS virusa tipa 2, živi oslabljeni/modifikovani živi PRRS soj virusa 94881 i PRRS soj virusa ATCC depozit VR-2332.

2. Imunogena kompozicija ili kombinovana vakcina ili kombinacija prema zahtevu 1, pri þemu je imunogena kompozicija ili kombinovana vakcina ili kombinacija formulisana za primenu sa jednom dozom ili primenu sa dve doze.

3. Imunogena kompozicija ili kombinovana vakcina ili kombinacija prema bilo kom od zahteva 1 do 2, pri þemu imunogena kompozicija ili kombinovana vakcina ili kombinacija dalje sadrži najmanje jedan farmaceutski prihvatljiv nosaþ, poželjno karbomer.

4. Imunogena kompozicija ili kombinovana vakcina ili kombinacija prema bilo kom od zahteva 1 do 3, pri þemu imunogena kompozicija ili kombinovana vakcina ili kombinacija sadrži 0.1 µg do 50 µg PPV VP2 antigena, poželjno 0.5 µg do 10 µg PPV VP2 antigena, prvenstveno 1.0 µg do 10 µg PPV VP2 antigena i/ili 3.9 do 7.0 log10TCID50živog oslabljenog/modifikovanog živog PRRS virusa.

5. Imunogena kompozicija ili kombinovana vakcina ili kombinacija prema bilo kom od zahteva 1 do 4, pri þemu se najmanje jedan antigen svinjskog parvovirusa (PPV) i najmanje jedan antigen virusa reproduktivnog i respiratornog sindroma (PRRS) svinja nalaze zajedno u jednoj posudi ili su prostorno odvojeni jedan od drugog, poželjno je da se nalaze u dve ili više odvojenih posuda.

6. Komplet koji sadrži imunogenu kompoziciju ili kombinovanu vakcinu ili kombinaciju prema bilo kom od zahteva 1 do 5.

7. Komplet prema zahtevu 6, pri þemu se najmanje jedan antigen svinjskog parvovirusa (PPV) i najmanje jedan antigen virusa reproduktivnog i respiratornog sindroma (PRRS) svinja nalaze odvojeno jedan od drugog u dve ili više odvojenih posuda, poželjno oba nezavisno jedan od drugog bilo u liofilizovanom ili u smrznutom obliku, i pri þemu komplet dalje sadrži uputstvo za upotrebu za mešanje prostorno odvojenog najmanje jednog PPV antigena i najmanje jednog antigena virusa PRRS, pri þemu je poželjno da takvo uputstvo za upotrebu sadrži uputstva za kombinovanje sadržaja posude(a) koji sadrži najmanje jedan PPV antigen sa sadržajem posude(a) koji sadrže najmanje jedan antigen virusa PRRS, pri þemu je poželjnije da se teþni sadržaj posude(a) koji sadrži najmanje jedan PPV antigen koristi kao razblaživaþ za liofilizovani sadržaj posude(a) koja sadrži najmanje jedan antigen virusa PPRS.

8. Komplet prema bilo kom od zahteva 6 do 7, pri þemu komplet dalje sadrži uputstva za leþenje i/ili profilaksu bolesti kod svinja i/ili dalje sadrži uputstva za leþenje i/ili profilaksu PPV infekcija i/ili PRRS virusnih infekcija, poželjno takav komplet dalje sadrži uputstva za pridruženu upotrebu PPV komponente (poželjno kao odvojene komponente kompleta) i PRRSV komponente (poželjno kao odvojene komponente kompleta) imunogene kompozicije ili kombinovane vakcine ili kombinacije kao što je ovde otkriveno i zahtevano i sadržano u takvom kompletu.

9. Imunogena kompozicija ili kombinovana vakcina ili kombinacija prema bilo kom od zahteva 1 do 5 ili komplet prema bilo kom od zahteva 6 do 8 za upotrebu kao lek, poželjno kao vakcina.

10. Imunogena kompozicija ili kombinovana vakcina ili kombinacija prema zahtevu 9 za upotrebu u postupku leþenja i/ili prevencije infekcije sa PPV i/ili PRRS virusom, redukciju, prevenciju ili leþenje kliniþkih znakova izazvanih infekcijom sa PPV i /ili PRRS virusom, ili za leþenje i/ili prevenciju bolesti izazvane infekcijom sa PPV i/ili PRRS virusom, pri þemu je poželjno najmanje jedan antigen svinjskog parvovirusa (PPV) i najmanje jedan antigen virusa reproduktivnog i respiratornog sindroma (PRRS) svinje se daje subjektu istovremeno, poželjnije odvojeno istovremeno na istim ili razliþitim mestima primene, uzastopno (u bilo kom redosledu) i/ili na hronološki poreÿani naþin.