ES2942749T3 - Vacuna contra el parvovirus porcino y el virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino, y métodos de producción de la misma - Google Patents

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Abstract

La presente invención se refiere a una vacuna contra el parvovirus porcino y el virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino para proteger a un sujeto, preferiblemente cerdo, contra enfermedades asociadas con el parvovirus porcino y el virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino. La presente invención se refiere además a métodos para producir composiciones inmunogénicas así como a dichas composiciones inmunogénicas que exhiben una actividad virucida reducida. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Vacuna contra el parvovirus porcino y el virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino, y métodos de producción de la misma
Listado de secuencias
La presente solicitud contiene un listado de secuencias que cumple con 37 C.F.R. 1.821 - 1.825.
Antecedentes de la invención
Campo de la invención
En una primera consideración, la presente invención se refiere a una vacuna contra el parvovirus porcino y el síndrome reproductivo y respiratorio porcino específica para los aislados que son capaces de reducir las manifestaciones clínicas de enfermedad causadas por parvovirus porcinos y/o el virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino. En una segunda consideración, la presente exposición se refiere, además, a métodos para producir composiciones inmunogénicas, así como composiciones inmunogénicas que muestran una actividad virucida reducida.
Descripción de la técnica relacionada
El virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV, por sus siglas en inglés) es un miembro de la familia de virus Arteriviridae y pertenece, junto con los Coronaviridae, al orden de virus Nidovirales. El PRRSV es un virus con cubierta con un genoma de ARN monocatenario de sentido positivo de aproximadamente 15 kilobases que comprende nueve marcos de lectura abierta (ORF, por sus siglas en inglés): ORF1a, ORF1ab, ORF2a, ORF 2ab y ORF3 a ORF7. Los ORF 1a y 1ab codifican poliproteínas grandes que se procesan en proteínas no estructurales víricas (nsp) mediante autocortes y cortes en trans de las proteasas víricas nsp1, nsp2 y nsp4 (Snijder y Meulenberg, 1998). ORF4 codifica una glucoproteína menor (GP4) que se encuentra, en contigüidad a una glucoproteína mayor (GP5) y dos otras glucoproteínas menores (GP2a y GP3), en la cubierta vírica, en la que la totalidad de dichas glucoproteínas son importantes para la producción de virus infeccioso.
Se considera que PRRSV es uno de los agentes infecciosos económicamente más importantes en cerdos. Causa el fracaso reproductivo en fase tardía en cerdas y enfermedad respiratoria en los cerdos en crecimiento. Con frecuencia, la infección por PRRSV se ve complicada por infecciones bacterianas secundarias, lo que se atribuye a la naturaleza inmunosupresora del virus. Además, la viremia de PRRSV dura varias semanas y posteriormente todavía puede detectarse el virus en órganos linfoides durante varios meses, demostrando la dificultad o fracaso de la respuesta inmunitaria del huésped para eliminar el virus (Allende et al., 2000).
Existen dos genotipos víricos diferentes del PRRSV que causan síntomas clínicos similares y que divergen en aproximadamente el 40 % respecto a la secuencia de nucleótidos: el genotipo I (UE) y el genotipo II (EE. UU.). La cepa prototipo norteamericana (EE. UU.) es VR-2332, mientras que la cepa prototipo europea (UE) es el virus Lelystad.
El parvovirus porcino es un virus de replicación autónoma de la subfamilia Parvovirinae del género Protoparvovirus dentro de la familia Parvoviridae que contiene una molécula de ADN de cadena sencilla de aproximadamente 5100 nucleótidos (Cotmore et al., 2014: Arch Virol.: 159(5): 1239-1247; Molitor et al., 1984: Virology: 137(2):241-54.). Solo la cadena negativa del ADN se empaqueta en viriones. El genoma del virus codifica tres proteínas de cápside (VP1, VP2 y VP3) y una proteína no estructural (NS1). La cápside del parvovirus es de aproximadamente 22 a 25 nanómetros de diámetro y comprende las subunidades VP1 y VP2. Estas proteínas se derivan de versiones de procesamiento alternativo de la misma molécula de ARN y, de esta manera, presentan secuencias solapantes. Además, el parvovirus porcino muestra un nivel elevado de similitud de su secuencia respecto a la del virus de la panleucopenia felina, los parvovirus caninos y los parvovirus murinos (Ranz et al., 1989: J. gen. Virol: 70:2541-2553).
Aunque existen diferencias entre las cepas de parvovirus porcino, siendo algunas extremadamente patogénicas y otras, menos patogénicas o totalmente no patogénicas, una vez el virus ya se ha establecido o se ha convertido en endémico en un país, aparentemente las cepas patogénicas ya circulan en la población.
La infección por parvovirus porcino (PVP) es una causa habitual de fracaso reproductivo en cerdos de reproducción en todo el mundo. Los estudios serológicos muestran que el parvovirus porcino está ampliamente extendido en todas las zonas productoras de porcino de todo el mundo, ya que hasta el 80 % de los animales muestran seroconversión.
El parvovirus porcino (PVP) causa fracaso reproductivo en cerdos, resultando en muerte y momificación fetal, nacidos muertos y otros tipos de fracaso reproductivo en cerdas gestantes. (Joo & Johnson. 1976. Veterinary Bulletin 46, 653­ 660; Mengeling. 1978. J. Am. Vet. Med. Assoc. 172, 1291-1294).
El PVP induce fracaso reproductivo al infectarse las cerdas jóvenes y las cerdas maduras susceptibles (no inmunes) durante el embarazo. Es el único momento en que el virus causa patología. La infección en el cerdo ocurre tras la ingestión o inhalación del virus. A continuación, el PVP circula en el torrente sanguíneo y en la cerda embarazada cruza la placenta e infecta los embriones y fetos en desarrollo. T ras la infección natural, se desarrolla inmunidad activa que probablemente se prolonga durante toda la vida del cerdo. Si se produce inmunidad activa antes del embarazo, los lechones en desarrollo no resultan afectados. En el momento del nacimiento, los lechones reciben inmunidad de la madre a través del calostro y esta inmunidad materna dura como máximo hasta las 20 semanas de edad. Cuanto mayor es el nivel de inmunidad activa en la madre, más inmunidad materna pasa a sus lechones. Posteriormente puede darse la infección natural por el PVP.
La enfermedad causada por el PVP en cerdos con frecuencia se denomina SMEDI, acrónimo en inglés por nacido muerto, momificación, muerte embrionaria e infertilidad. Si la infección se produce entre los días 0 y 30 del embarazo, puede darse mortalidad embrionaria que resulte en un tamaño reducido de la camada. La característica más evidente tras la infección, a los 30 a 70 días de embarazo, es el nacimiento de lechones momificados. La momificación es el proceso de digestión estéril de los tejidos de los lechones que mueren en el útero después de que se haya iniciado la solidificación del esqueleto. La infección por PVP también está asociada a nacidos muertos y lechones nacidos débiles si la infección ocurre en estadios más tardíos del embarazo. El aborto también puede ser el resultado de la infección por el PVP, aunque no es un signo clínico habitual de esta enfermedad. Globalmente, la infección por PVP reduce el número de cerdos nacidos por cerda por año.
Las vacunas de PVP disponibles actualmente se producen mediante el cultivo de virus nativo en células primarias de origen porcino o en líneas celulares establecidas. Después de lo anterior, se aíslan los virus infecciosos y se inactivan con agentes químicos a fin de producir una vacuna vírica muerta de células enteras. Sin embargo, dichos procedimientos de cultivo de virus infecciosos nativos son problemáticos debido a consideraciones de bioseguridad y de seguridad farmacológica.
Las vacunas de subunidades basadas en proteínas recombinantes pueden adolecer de una inmunogenicidad reducida, debido a un plegamiento incorrecto de la proteína diana o una mala presentación al sistema inmunitario. Además, las vacunas muertas de células enteras presentan todos los antígenos del virus nativo, mientras que, en una vacuna de subunidades, están limitadas a una secuencia de aminoácidos específica.
Las vacunas de PVP recombinantes ya han sido descritas en la técnicas anterior. Sin embargo, hasta ahora solo se han encontrado disponibles comercialmente las vacunas muertas de células enteras. De esta manera, aparentemente hasta el momento no se han desarrollado vacunas de subunidades recombinantes adecuadas para el PVP ni se ha demostrado que sean eficaces y seguras. Las vacunas de subunidades recombinantes para el PVP descritas hasta el momento no han sido sometidas a ensayo en experimentos controlados de reto en laboratorio. Las vacunas de subunidades recombinantes para PVP que se han evaluado no han funcionado tan bien como las vacunas muertas de células enteras para PVP o las vacunas de subunidades recombinantes para PVP no han resultado ser seguras (han mostrado reacciones adversas).
Se han identificado aislados de campo del PVP que difieren genética y antigénicamente de las cepas de vacuna. El virus PVP de genotipo 2, PVP-27a, es altamente virulento en cerdas jóvenes gestantes tras la infección experimental, tal como muestra la elevada mortalidad de los fetos de las cerdas infectadas por PVP-27a (85 %) en comparación con las cerdas infectadas por otras cepas de PVP, p. ej., PVP-NADL-2. Sin embargo, las vacunas comerciales disponibles actualmente contra el PVP se basan en preparaciones de virus enteros inactivados de cepas de PVP de genotipo 1 aisladas hace unos 30 años (Jozwik et al 2009; Journal of General Virology; 90; 2437-2441).
La técnica anterior adicional es la siguiente:
Adriaan F.G. Antonis. "A novel recombinant virus-like particle vaccine for prevention of porcine parvovirus-induced reproductive failure", Vaccine 24 (2006) 5481-5490.
Chen Y. Guo W., "A novel recombinant pseudorabies virus expressing parvovirus VP2 gene: Immunogenicity and protective efficacy in swine", Virology Journal 2011, 8:307.
Merenga et al. "Large scale production and downstream processing of a recombinant porcine parvovirus vaccine", Appl Microbiol Biotechnol. junio de 2002; 59(1):45-50. pub. elec. 16 de abril, 2002.
A. Jozwik, J. Manteufel, H.-J. Selbitz y U. Truyen. Vaccination against porcine parvovirus protects against disease, but does not prevent infection and virus shedding after challenge infection with a heterologous virus strain. [La vacunación frente al parvovirus porcino protege frente a la enfermedad, pero no evita la infección y propagación víricas tras el reto de infección con una cepa vírica heteróloga. Journal of General Virology (2009), 90, 2437-2441.
La solicitud de patente china n.° CN 102488 895 A da a conocer una vacuna de partículas de tipo vírico tríplex que consiste en circovirus porcino, parvovirus porcino y PRRSV. Esta vacuna de VLP triple contiene la proteína estructural mayor CAP del virus Pc V-2, el epítopo de proteína VP2 del PVP y el epítopo de la proteína GP5 del PRRSV.
La solicitud de patente rusa n.° RU 2004108484 A da a conocer una vacuna inactivada contra los virus PRRSV y PVP. Dicha vacuna inactivada contiene material antigénico procedente de cepa de virus PRRS, reproducido en cultivo celular Marc-145 e inactivado con aminoetiletilenimina (AEEI) y material antigénico procedente de cepa de PVP reproducido en cultivo celular de YPK e inactivado con AEEI.
La solicitud de patente china n.° CN 104288 760 A da a conocer una composición de vacuna que comprende una cantidad inmunitaria de un antígeno de circovirus porcino de tipo 2, una cantidad inmunitaria de un antígeno del PRRSV y un antígeno del PVP.
La solicitud de patente china n.° CN 102 727 881 A da a conocer una cepa JXAI-R de PRRS y una vacuna viva bigeminal de PVP.
Puig et al. (http://info.hipra.com/DOCS/UNISTRAIN/PUBLICATIONS/ESPHM-2015/1-Clinical-protection.pdf) se refieren a la vacunación de la administración mixta de las vacunas de PRRS ERYSENG Parvo inactivada y UNISTRAIN inactivada fabricadas por Hipra.
Zeew EJL et al. (Journal of General Virology 2007, 88(2): 420-427) describen un estudio de la virulencia y capacidad de neutralización cruzada de aislados de campo de parvovirus recientes y virus de vacuna en cerdas jóvenes gestantes infectadas experimentalmente.
La solicitud de patente n.° US 2014/0322267 A1 se refiere a la proteína ORF2 del virus PCV2 de subtipo A (PCV2A) para la utilización en la protección cruzada.
La solicitud de patente n.° EP 2 460 818 A2 se refiere a composiciones inmunogénicas de PCV2 y a métodos de producción de dichas composiciones.
La patente n.° US 7.700.285 B1 se refiere a composiciones inmunogénicas de PCV2 y a métodos de producción de dichas composiciones.
La solicitud de patente PCT n.° WO 2013/024113 se refiere a las vacunas de virus influenza H5.
La solicitud de patente n.° US 2015/0283229 A1 se refiere a una vacuna del virus de la diarrea epidémica porcina.
Las desventajas de la técnica anterior son, por ejemplo: (i) dudas de que el componente PVP en una vacuna muerta convencional no sea haya inactivado completamente (que en este caso introduciría PVP vivo en la piara), (ii) falta de protección cruzada frente a cepas heterólogas de PVP; falta de un programa de vacunación que proteja las cerdas en edad reproductiva y las cerdas jóvenes, las cerdas maduras y los fetos frente al PVP y la enfermedad reproductiva asociada al PRRSV.
Existe una necesidad de nuevas vacunas de combinación y/o de uso asociado de PRRSV y PVP que puedan utilizarse con éxito contra infecciones por PRRSV y/o PVP. También existe una necesidad de nuevos métodos para reducir la actividad virucida de composiciones que normalmente mostrarían algún grado de actividad virucida, así como de composiciones inmunogénicas con actividad virucida reducida o nula.
Sumario de la invención
La invención se define mediante las reivindicaciones y cualesquiera otros aspectos, consideraciones, configuraciones o realizaciones proporcionadas en la presente memoria no comprendidas dentro del alcance según las reivindicaciones se proporcionan exclusivamente a título informativo.
Cualesquiera referencias en la descripción a métodos de tratamiento se refieren a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para la utilización en un método para el tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia (o para el diagnóstico).
Primera consideración de la presente invención
En una primera consideración, la presente invención se refiere a una composición inmunogénica o una vacuna de combinación, o una combinación que comprende:
a) por lo menos un antígeno de parvovirus porcino (PVP), en el que por lo menos un antígeno de PVP es una o más subunidades del PVP y por lo menos una de las subunidades del PVP es la proteína vírica 2 del PVP (VP2), en la que VP2 del PVP consiste en una secuencia de aminoácidos que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 99 %, preferentemente 100 %, respecto a la secuencia de aminoácidos SEC ID n.° 2, en la que preferentemente VP2 del PVP es el único antígeno del PVP contenido en el PVP, y
b) por lo menos un antígeno del virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRS), en el que por lo menos un antígeno del virus del PRRS es un virus del PRRS vivo atenuado/vivo modificado, seleccionado del grupo que consiste en: virus del PRRS vivo atenuado/vivo modificado de genotipo de tipo 1, virus del PRRS vivo atenuado/vivo modificado de genotipo de tipo 2, virus del PRRS vivo atenuado/vivo modificado de cepa 94881 y el virus del PRRS cepa ATCC n.° de depósito VR-2332 es cualquier antígeno contenido en un virus del PRRS vivo atenuado/vivo modificado.
La presente invención se refiere, además, a un kit que comprende la composición inmunogénica o vacuna de combinación, o combinación tal como se indica en la presente memoria y se reivindica.
La presente invención se refiere, además, a la utilización de la composición inmunogénica o vacuna de combinación, o combinación tal como se indica en la presente invención y se reivindica, o el kit tal como se describe y se reivindica en la presente memoria, para la preparación de un medicamento, preferentemente de una vacuna.
Ventajosamente, los datos experimentales proporcionados mediante la presente invención dan a conocer que el componente de vacuna de subunidad VP2 del PVP de la presente invención es seguro y eficaz en la prevención de la viremia y la infección por PVP de fetos. Además, los datos experimentales proporcionados por la presente invención dan a conocer que el componente de vacuna de subunidad VP2 del PVP de la presente invención presenta un amplio espectro de protección ya que la vacuna protege frente a cepas de reto heterólogas norteamericanas, así como heterólogas europeas.
Ventajosamente, los datos experimentales proporcionados por la presente invención dan a conocer que el componente de vacuna de subunidad VP2 del PVP de la presente invención es seguro y eficaz en la prevención de la viremia y la infección por PVP de fetos. Podrían evitarse largos procedimientos de inactivación (que resultan necesarios para inactivar el PVP nativo durante la generación de las vacunas de virus muerto entero), mediante la utilización de una vacuna de subunidades recombinantes que comprende VP2 del PVP.
Son ventajas adicionales de la invención proporcionada a continuación, por ejemplo: (i) la reducción del número de inyecciones de vacuna administradas en los animales, incrementando de esta manera el bienestar animal y reduciendo el estrés a los animales, (ii) la reducción del personal, (iii) la misma eficacia que una única administración, (iv) los tiempos de la vacuna, ya que ambos componentes tratan la enfermedad reproductiva en las cerdas gestantes, (v) la prevención de la viremia de PVP en cerdas jóvenes vacunadas después del reto con una cepa de PVP heteróloga, (vi) la reducción del número de lechones nacidos muertos y lechos momificados en los grupos vacunados después del reto de PVP, (vii) incremento del número total de fetos en las cerdas maduras vacunadas contra el PVP, (viii) el 100 % de los lechos vacunados contra el PVP están protegidos frente al reto de PVP, (ix) la duración de la inmunidad (DI): 6 meses, (x) tanto ReproCyc® PRRS EU como la mezcla ReproCyc® PRRS EU Vp2 de PVP resultaron eficaces según la reducción de la carga vírica y la proporción de viremia posterior al reto, (xi) se demostró la falta de interferencia con la eficacia de la vacunación contra el virus PRRSV, (xii) puede establecerse un periodo para la aparición de inmunidad de cuatro semanas para ReproCyc® PRRS EU, (xiii) se demostró que una vacuna de combinación (VP2 del PVP 10 |jg Ery) con Ingelvac® PRRS MLV era eficaz en la prevención de la viremia y la infección por el PVP de fetos en el día 40 de gestación (40 dG).
Segunda consideración de la presente exposición
Se da a conocer, además, un método para producir una composición inmunogénica que comprende una proteína recombinante, en la que el método comprende las etapas en el orden siguiente:
(i) proporcionar/obtener una mezcla que comprende:
o un primer líquido,
o proteína recombinante y/o estructuras cuaternarias compuestas de una pluralidad de dichas proteínas recombinantes, y
o un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico codificante de dicha proteína recombinante,
(ii) añadir un segundo líquido a la mezcla de la etapa (i), en la que el segundo líquido es diferente del primer líquido,
(iii) lavar y, opcionalmente, finalmente concentrar, la proteína recombinante y/o las estructuras cuaternarias compuestas de una pluralidad de dichas proteínas recombinantes en la mezcla, mediante la adición suplementaria de segundo líquido adicional a la mezcla que resulta de la etapa (ii) y la eliminación de una parte del primer y/o segundo líquido en dicha mezcla combinada,
(iv) inactivar el vector mediante la adición de un agente inactivador a la mezcla que resulta de la etapa (iii), (v) neutralizar el agente inactivador mediante la adición de un agente neutralizante a la mezcla que resulta de la etapa (iv).
La presente exposición se refiere, además, al método tal como se indica en la presente memoria, en el que la mezcla de la etapa (i), anteriormente, puede obtenerse mediante un procedimiento que comprende las etapas siguientes: (a) permitir la infección de células susceptibles en cultivo con un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico codificante de dicha proteína recombinante y/o estructuras cuaternarias compuestas de una pluralidad de dichas proteínas recombinantes, en la que dichas proteínas recombinantes y/o estructuras cuaternarias compuestas de una pluralidad de dichas proteínas recombinantes se expresa mediante dicho vector,
(b) recuperar seguidamente las proteínas recombinantes y/o estructuras cuaternarias compuestas de una pluralidad de dichas proteínas recombinantes a partir del cultivo celular, en el que preferentemente se separan los residuos celulares respecto de las proteínas recombinantes y/o estructuras cuaternarias compuestas de una pluralidad de dichas proteínas recombinantes mediante una etapa de separación, que preferentemente incluye una microfiltración a través de por lo menos un filtro, más preferentemente dos filtros, en la que por lo menos un filtro preferentemente presenta un tamaño de poro mayor que las proteínas recombinantes y/o estructuras cuaternarias compuestas de una pluralidad de dichas proteínas recombinantes, en particular presenta un tamaño de poro de entre aproximadamente 0,1 pm y aproximadamente 4 pm.
Respecto a las preparaciones de antígeno del PVP, al llevar a cabo la inactivación del baculovirus a 37°C después de la clarificación, y antes de la diafiltración, se observó un grado elevado de precipitación (agregación). Esta agregación, aunque no relacionada con el antígeno del PVP, se cree que interfiere con la cinética de inactivación y los ensayos de actividad virucida. Los datos preliminares sugieren que un procedimiento de diafiltración después de la clarificación del cultivo y antes de la inactivación del baculovirus reduce sustancialmente el grado de agregación en el recolectado de partículas de tipo vírico de PVP (VLP, por sus siglas en inglés) durante el procedimiento de inactivación. Los datos muestran que el grado de agregación se intensificada a temperatura más alta (37°C) y se minimiza a temperaturas más bajas (27°C o 4°C) durante el tiempo: un procedimiento de diafiltración antes de la inactivación del baculovirus a 37°C además elimina la actividad virucida de los inactivadores agente de neutralización tiosulfato sódico y reacción en medio ExCell 420. El procedimiento validado confirma que un producto VLP del PVP expresado en baculovirus inactivado consistentemente resulta no virucida para la vacuna de PRRSV. Dicha vacuna de VLP del PVP posee en particular una ventajosa estabilidad a largo plazo después de la mezcla con el PRRSV, basándose en el efecto virucida ausente, haciendo de esta manera que resulte posible mezclar ambos componentes, PVP y PRRSV, inmediatamente antes de la administración y/o comercializar una forma de administración lista para el uso (p. ej., una vacuna de combinación o kit).
Breve descripción de los dibujos
Los dibujos siguientes forman parte de la presente especificación y se incluyen con el fin de demostrar adicionalmente determinados aspectos de la presente invención. La invención podrá entenderse mejor en referencia a uno o más de dichos dibujos en combinación con la descripción detallada de realizaciones específicas presentada en la presente memoria.
La FIG. 1 muestra la viremia de PRRSV (qPCR, logio GE/ml) por grupo y día.
La FIG. 2 muestra el área bajo la curva (ABC) de la viremia de PRRSV (qPCR, logio GE/ml) por grupo.
La FIG. 3 muestra los títulos de IH del PVP por grupo y día.
Descripción detallada
Antes de explicar los aspectos de la presente invención, debe señalarse que, tal como se utiliza en la presente memoria y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares “un”, “una” y “el” o “la” incluyen los referentes plurales, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. De este modo, por ejemplo, la referencia a “un antígeno" incluye una pluralidad de antígenos; la referencia al "virus" es una referencia a uno o más virus y equivalentes de estos conocidos por el experto en la materia, y así sucesivamente. A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos que se usan en la presente tienen el mismo significado según entienda comúnmente el experto ordinario en la materia a la que se refiere la presente invención. A continuación, se indican los métodos, dispositivos y materiales preferentes. Todas las publicaciones que se mencionan en la presente se dan a conocer con el fin de describir y dar a conocer las líneas celulares, vectores y metodologías según se informan en las publicaciones que podrían usarse en conexión con la invención. No se debe interpretar nada en la presente memoria como una declaración de que la invención no tiene la capacidad de adelantar a dicha exposición en virtud de una invención anterior.
Primera consideración de la presente invención
En un aspecto, la presente invención se refiere a una composición inmunogénica o a una vacuna de combinación, o a una combinación que comprende:
a) por lo menos un antígeno de parvovirus porcino (PVP), en el que por lo menos un antígeno de PVP es una o más subunidades del PVP y por lo menos una de las subunidades del PVP es la proteína vírica 2 del PVP (VP2), en la que VP2 del PVP consiste en una secuencia de aminoácidos que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 99 %, preferentemente 100 %, respecto a la secuencia de aminoácidos SEC ID n.° 2, en la que preferentemente VP2 del PVP es el único antígeno del PVP contenido en el PVP, y
b) por lo menos un antígeno del virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRS), en el que por lo menos un antígeno del virus del PRRS es un virus del PRRS vivo atenuado/vivo modificado, seleccionado del grupo que consiste en: virus del PRRS vivo atenuado/vivo modificado de genotipo de tipo 1, virus del PRRS vivo atenuado/vivo modificado de genotipo de tipo 2, virus del PRRS vivo atenuado/vivo modificado de cepa 94881 y el virus del PRRS cepa ATCC n.° de depósito VR-2332 es cualquier antígeno contenido en un virus del PRRS vivo atenuado/vivo modificado.
La expresión "parvovirus porcino" o "PVP" es bien conocida por el experto en la materia. Sin embargo, "parvovirus porcino" es un virus de replicación autónoma del género parvovirus dentro de la familia Parvoviridae que contiene una molécula de ADN de cadena sencilla. El genoma del virus codifica tres proteínas de cápside (VP1, VP2 y VP3) y una proteína no estructural (NS1). La enfermedad causada por el PVP en cerdos con frecuencia se denomina SMEDI (el acrónimo en inglés de nacido muerto, momificación, muerte embrionaria e infertilidad). La expresión "parvovirus porcino" dentro del alcance de la presente invención comprende todas las cepas, genotipos y serotipos del parvovirus porcino, así como de la subfamilia parovirinae del género Protoparvovirus dentro de la familia Parvoviridae.
La expresión "virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino" o "virus de PRRS" o "PRRSV" es bien conocida por el experto en la materia. El "virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino" es un miembro de la familia de virus Arteriviridae, y pertenece, junto con los Coronaviridae, al orden de virus Nidovirales; es un virus con cubierta que presenta un único genoma de ARN de sentido positivo de cadena sencilla de aproximadamente 15 kilobases que comprende nueve marcos de lectura abierta (ORF, por sus siglas en inglés), que son ORF1a, ORFlab, ORF2a, ORF 2ab y ORF3 a ORF7. Los ORF 1a y lab codifican poliproteínas grandes que se procesan en proteínas no estructurales víricas (nsp) mediante autocortes y cortes en trans de las proteasas víricas nsp1, nsp2 y nsp4 (Snijder y Meulenberg, 1998). ORF4 codifica una glucoproteína menor (GP4) que se encuentra, en contigüidad a una glucoproteína mayor (GP5) y dos otras glucoproteínas menores (GP2a y GP3), en la cubierta vírica, en la que la totalidad de dichas glucoproteínas son importantes para la producción de virus infeccioso. Existen dos genotipos víricos diferentes del PRRSV diferentes que causan síntomas clínicos similares y que divergen en aproximadamente 40 % respecto a la secuencia de nucleótidos: el genotipo I (UE) y el genotipo II (e E. UU.). La cepa prototipo norteamericana (EE. UU.) es VR-2332, mientras que la cepa prototipo europea (UE) es el virus Lelystad. La expresión "virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino" en el alcance de la presente invención comprende todas las cepas, genotipos y serotipos del PRRSV.
En relación al PRRSV se entiende que los términos "genotipo I" y "genotipo II" son equivalentes a los términos "genotipo 1" y "genotipo 2", o a los términos "tipo 1" y "tipo 2", tal como se utilizan con frecuencia en la literatura en el contexto del PRRSV.
Las expresiones "por lo menos un antígeno del parvovirus porcino (PVP)" y "por lo menos un antígeno del virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRS)" dentro del alcance de la presente invención comprenden desde todo antígeno o antígenos de PVP individuales y/o antígenos de PRRSV hasta virus completos que comprenden una multitud de antígenos.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a una composición inmunogénica o vacuna de combinación o combinación tal como se describe y se reivindica en la presente memoria, en la que el PVP se selecciona del grupo que consiste en: virus PVP vivo atenuado/vivo modificado, virus PVP muerto/inactivado, PVP muerto/inactivado cepa 014, aislados de campo alemanes de parvovirus porcino PVP-27a y PVP-143a y virus de vacuna de parvovirus porcino PVP-NADL-2 y PVP-IDT (MSV).
Las expresiones "vivo atenuado" y "vivo modificado" se utilizan intercambiablemente durante el curso de la presente invención y en particular se refieren a una virulencia reducida de un virus PVP y/o PRRSV, en particular de un PVP de tipo salvaje y/o un virus de PRRS, que se consigue mediante múltiple subcultivo convencional de líneas celulares del PVP y/o PRRSV, y/o que se consigue mediante ingeniería genética, en la que se entiende que "virulencia" es el grado de patogenicidad, y en la que "patogenicidad" se refiere a la capacidad del virus de inducir manifestaciones clínicas en el huésped o en la progenie del huésped, tal como, por ejemplo, el fracaso reproductivo.
Los términos "muerto" o "inactivado" en el alcance de la presente invención se refieren a un PVP y/o PRRSV, que no presenta la capacidad de infectar un sujeto apropiado (al contrario que un virus vivo) y/o cuya infectividad no se proporciona en comparación con un virus nativo. En particular, un virus muerto/inactivado (ya) no puede infectar sus células huésped nativas.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a una composición inmunogénica, vacuna de combinación o combinación tal como se describe y se reivindica en la presente memoria, en la que el antígeno o antígenos del PVP es una o más subunidades del virus PVP.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a una composición inmunogénica, o vacuna de combinación, o combinación tal como se describe y se reivindica en la presente memoria, en la que la subunidad o subunidades del PVP son proteína 2 vírica del PVP (VP2), en la que preferentemente VP2 del PVP es el único antígeno del virus PVP.
La expresión "proteína vírica 2" o "VP2" se refiere a la proteína de cápside VP2 del parvovirus porcino. La expresión "proteína vírica 2" o "VP2" es bien conocida por el experto en la materia.
Los términos "proteína", "aminoácido" y "polipéptido" se utilizan intercambiablemente. El término "proteína" se refiere a una secuencia de residuos aminoácidos compuestos de los aminoácidos naturales, así como derivados de los mismos. Los aminoácidos naturales son bien conocidos de la técnica y se describen en libros de texto estándares de bioquímica. En la secuencia de aminoácidos, los residuos aminoácidos están conectados mediante enlace peptídico. Además, los dos extremos de la secuencia de aminoácidos se denomina extremo carboxilo (extremo C-terminal) y extremo amino (extremo N-terminal). El término "proteína" comprende esencialmente proteínas purificadas o preparaciones de proteínas que comprenden adicionalmente otras proteínas. Adicionalmente, el término incluye, además, fragmentos de proteínas. Además, incluye proteínas modificadas químicamente. Dichas modificaciones pueden ser modificaciones artificiales o modificaciones naturales, tales como fosforilación, glucosilación, miristilación y similares.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a una composición inmunogénica, vacuna de combinación o combinación tal como se indica en la presente memoria y se reivindica, en la que la proteína VP2 del PVP presenta:
• en la posición aminoácida 228, un residuo ácido glutámico o un residuo glutamato, y/o
• en la posición aminoácida 414, una residuo de serina, y/o
• en la posición aminoácida 419, un residuo de glutamina, y/o
• en la posición aminoácida 436, un residuo de treonina,
en la que la numeración de las posiciones aminoácidas se refiere a la secuencia de aminoácidos de la proteína VP2 del PPV de tipo salvaje.
La expresión "en la que la numeración de las posiciones aminoácidas se refiere a la secuencia de aminoácidos de la proteína VP2 del PPV de tipo salvaje" se refiere a la numeración de las posiciones aminoácidas referidas a la secuencia de aminoácidos de la proteína VP2 del PPV de tipo salvaje de longitud completa. Preferentemente, la numeración de las posiciones aminoácidas tal como se menciona en la presente memoria es en referencia a la proteína VP2 del PVP de tipo salvaje que presenta 579 residuos aminoácidos, incluyendo un residuo metionina en la posición aminoácida n.° 1 (N-terminal). La expresión "en la que la numeración de las posiciones aminoácidas se refiere a la secuencia de aminoácidos de la proteína VP2 del PPV de tipo salvaje" comprende la VP2 del PVP de tipo salvaje, tal como se proporciona a título ejemplar en SEC ID n.° 1 (VP2 de 27a del PVP).
En otro aspecto, la presente invención se refiere a una composición inmunogénica o vacuna de combinación, o combinación tal como se indica en la presente memoria y se reivindica, en la que la proteína VP2 del PVP presenta, además:
• en la posición aminoácida 25, un residuo de isoleucina, y/o
• en la posición aminoácida 36, un residuo de serina, y/o
• en la posición aminoácida 37, un residuo de isoleucina,
en la que la numeración de las posiciones aminoácidas se refiere a la secuencia de aminoácidos de la proteína VP2 del PPV de tipo salvaje.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a una composición inmunogénica, vacuna de combinación o combinación tal como se indica en la presente memoria y se reivindica, en la que la numeración de las posiciones aminoácidas se refiere a la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID n.° 1.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a una composición inmunogénica, vacuna de combinación o combinación tal como se indica en la presente memoria y se reivindica, en la que la proteína VP2 del PVP es una VP2 del PVP recombinante.
El término "recombinante" tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere en particular a una molécula de proteína que se expresa a partir de una molécula de ADN recombinante, tal como un polipéptido que se produce mediante técnicas de ADN recombinante. Un ejemplo de dichas técnicas incluye el caso en que el ADN codificante de la proteína expresada (p.ej., VP2 del PVP) se inserta en un vector de expresión adecuado, preferentemente un vector de expresión baculovirus, que a su vez se utiliza para la transfección, o en el caso de un vector de expresión baculovirus, para la infección, de una célula huésped para producir la proteína o polipéptido codificado por el ADN. De esta manera, la expresión "VP2 del PVP recombinante" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a una molécula de proteína que se expresa a partir de una molécula de ADN recombinante.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a una composición inmunogénica, vacuna de combinación o combinación tal como se describe y se reivindica en la presente memoria, en la que la proteína VP2 del PVP es una VP2 del PVP que se expresa en baculovirus recombinante.
El término "baculovirus" es bien conocida por el experto en la materia. Tal como se utiliza en la presente memoria, "baculovirus" en particular se refiere a un sistema para producir una proteína deseada en una célula de insecto, que utiliza un vector baculovirus recombinante diseñado para expresar dicha proteína. Un sistema de expresión baculovírico generalmente comprende todos los elementos necesarios para conseguir la expresión de proteínas recombinantes en células de insecto, y típicamente implica la manipulación de un vector baculovirus para expresar una proteína deseada, la introducción del vector baculovirus manipulado en células de insecto, el cultivo de las células de insecto que contienen el vector baculovirus manipulado, en un medio de crecimiento adecuado, de manera que se expresa la proteína deseada, y la recuperación de la proteína. Típicamente, la manipulación de un vector baculovirus implica la construcción y el aislamiento de baculovirus recombinantes en los que se inserta la secuencia codificante para un gen seleccionado después del promotor para un gen vírico no esencial, en el que la mayoría de los sistemas de expresión baculovíricos utilizados actualmente se basan en la secuencia del virus de la poliedrosis nuclear Autographa californica (AcMNPV, por sus siglas en inglés) ((Virology 202 (2), 586-605 (1994), NCBI n.° de acceso: NC_001623). Los sistemas de expresión baculovíricos son bien conocidos de la técnica y se han descrito en, por ejemplo, "Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual", de David R. O'Reilly, Lois Miller, Verne Luckow, pub. por Oxford Univ. Press (1994), "The Baculovirus Expression System: A Laboratory Guide", de Linda A. King, R. D. Possee, publicado por Chapman & Hall (1992). Un ejemplo no limitativo ejemplar de un sistema baculovirus para producir una proteína recombinante se describe en, p. ej., el documento n.° WO 2006/072065 A2.
Entre los vectores baculovíricos preferentes se incluyen baculovirus tales como BaculoGold (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, Calif.) o DiamondBac (Sigma Aldrich), con la condición particular de que las células de producción sean células de insecto. Aunque resulta preferente el sistema de expresión baculovírico, el experto en la materia entenderá que funcionarán otros sistemas de expresión para los fines de la presente invención, es decir, la expresión de la VP2 del PVP, en el sobrenadante de cultivo celular. Dichos otros sistemas de expresión pueden requerir la utilización de una secuencia de señal con el fin de causar la expresión de VP2 del PVP en el medio.
En otro aspecto, la presente exposición se refiere a una composición inmunogénica, vacuna de combinación o combinación tal como se da a conocer y se reivindica en la presente memoria, en la que la VP2 del PVP comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 90 % respecto a la secuencia de aminoácidos de SEC ID n.° 1, Se C ID n.° 2 y/o SEC ID n.° 5 a n.° 16.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a una composición inmunogénica, vacuna de combinación o combinación tal como se da a conocer y se reivindica en la presente memoria, en la que la VP2 del PVP comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 99 %, por lo menos 99,1 %, por lo menos 99,2 %, por lo menos 99,3 %, por lo menos 99,4 %, por lo menos 99,5 %, por lo menos 99,6 %, por lo menos 99,7 %, por lo menos 99,8 % o por lo menos 99, 9% respecto a la secuencia de aminoácidos de SEC ID n.° 2.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a una composición inmunogénica, vacuna de combinación o combinación tal como se da a conocer y se reivindica en la presente memoria, en la que la VP2 del PVP comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEC ID n.° 2.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a una composición inmunogénica, vacuna de combinación o combinación tal como se da a conocer y se reivindica en la presente memoria, en la que la VP2 del PVP comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEC ID n.° 2.
En otro aspecto, la presente exposición se refiere a una composición inmunogénica, vacuna de combinación o combinación tal como se da a conocer y se reivindica en la presente memoria, en la que la VP2 del PVP está codificada por una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 90 % respecto a la secuencia de aminoácidos de SEC ID n.° 1, SEC ID n.° 2 y/o SEC ID n.° 5 a n.° 16.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a una composición inmunogénica, vacuna de combinación o combinación tal como se da a conocer y se reivindica en la presente memoria, en la que la VP2 del PVP está codificada por una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 99 %, por lo menos 99,1 %, por lo menos 99,2 %, por lo menos 99,3 %, por lo menos 99,4 %, por lo menos 99,5 %, por lo menos 99,6 %, por lo menos 99,7 %, por lo menos 99,8 % o por lo menos 99, 9% respecto a la secuencia de aminoácidos de SEC ID n.° 2.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a una composición inmunogénica, vacuna de combinación o combinación tal como se da a conocer y se reivindica en la presente memoria, en la que la VP2 del PVP está codificada por una secuencia de nucleótidos codificante de la secuencia de aminoácidos de SEC ID n.° 2.
La SEC ID n.° 4 es una secuencia de nucleótidos de VP2 del PVP 27a de codones optimizados, que se ha modificado adicionalmente para poseer dos sitios de enzima de restricción Clal (la posición aminoácida 25 es un residuo de isoleucina; la posición aminoácida 36 es un residuo de serina; la posición aminoácida 37 es un residuo de isoleucina) de manera que flanquee la región codificante de VP2 que comprende repeticiones de glicina. Los sitios ClaI se introdujeron de manera que no interrumpiesen la región codificante de VP2. La SEC ID n.° 2 es la secuencia de proteína correspondiente a SEC ID n.° 4. SEC ID NON es la secuencia de nucleótidos de VP2 del PVP 27a de codones optimizados (sin los sitios del enzima de restricción ClaI). La SEC ID n.° 1 es la secuencia de proteína correspondiente a SEC ID NON.
Las expresiones "ácido nucleico", "secuencia de ácido nucleico", "secuencia de nucleótidos" o "polinucleótido" se utilizan intercambiablemente en la presente memoria y se refieren a polinucleótidos que incluyen moléculas de ADN, moléculas de ARN, moléculas de ADNc o derivados de las mismas. La expresión comprende polinucleótidos tanto de cadena sencilla como de doble cadena. El ácido nucleico de la presente invención comprende polinucleótidos aislados (es decir, aislados a partir de su contexto natural) y formas modificadas genéticamente. Además, también se encuentran comprendidos los polinucleótidos modificados químicamente, incluyendo polinucleótidos modificados naturales, tales como polinucleótidos glucosilados o metilados, o modificados artificiales, tales como polinucleótidos biotinilados. Además, las expresiones "ácido nucleico" y "polinucleótido" son intercambiables y se refieren a cualquier ácido nucleico. Las expresiones "ácido nucleico" y "polinucleótido" además incluyen específicamente los ácidos nucleicos compuestos de bases diferentes de las bases biológicamente naturales (adenina, guanina, timina, citosina y uracilo).
La "identidad" o "identidad de secuencia", tal como es conocida en la técnica, se refiere a una relación entre dos o más secuencias polipeptídicas o entre dos o más secuencias polinucleótidas, es decir, una secuencia de referencia y una secuencia dada que deben compararse con la secuencia de referencia. La identidad de secuencia se determina mediante la comparación de la secuencia dada con la secuencia de referencia después de alinear óptimamente las secuencias para producir el grado más alto de similitud de secuencias, según se determina a partir de la correspondencia entre cadenas de dichas secuencias. Después de dicha alineación, se determina la identidad de secuencia posición a posición; p. ej., las secuencias son "idénticas" en una posición particular si en esa posición los nucleótidos o residuos aminoácidos son idénticos. El número total de dichas identidades de posición a continuación se divide por el número total de nucleótidos o residuos en la secuencia de referencia, proporcionando el % de identidad de secuencia. La identidad de secuencia puede calcularse fácilmente mediante métodos conocidos, incluyendo, aunque sin limitación, los descritos en Computational Molecular Biology, Lesk, A. N., ed., Oxford University Press, New York (1988), Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York (1993) ; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M. y Griffin, H. G., editores, Humana Press, New Jersey (1994) ; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinge, G., Academic Press (1987);Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., editores, M. Stockton Press, New York (1991); y en Carillo, H. y Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988. Los métodos preferentes para determinar la identidad de secuencia están diseñados para proporcionar la máxima correspondencia entre las secuencias analizadas. Los métodos para determinar la identidad de secuencia están codificados en programas informáticos disponibles públicamente, que determinan la identidad de secuencia entre las secuencias dadas. Entre los ejemplos de dichos programas se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, el paquete informático del GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research, 12(1):387 (1984)), BLASTP, BLASTN y FASTA (Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990). El programa BLASTX se encuentra disponible públicamente en NCBI y otras fuentes (BLAST Manual, Altschul, S. et al., NCVI NLM NIH Bethesda, MD 20894, Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990). Dichos programas alinean óptimamente las secuencias mediante la utilización de ponderaciones de hueco por defecto a fin de producir el nivel más alto de identidad de secuencia entre la secuencia dada y la de referencia. A título ilustrativo, la referencia a un polinucleótido con una secuencia de nucleótidos que presenta por lo menos, por ejemplo, 85 %, preferentemente 90 %, todavía más preferentemente 95 % de "identidad de secuencia" respecto a una secuencia de nucleótidos de referencia, pretende referirse a que la secuencia de nucleótidos del polinucleótido dado es idéntica a la secuencia de referencia excepto por que la secuencia de polinucleótidos dada puede incluir hasta 15, preferentemente hasta 10, todavía más preferentemente hasta 5, mutaciones puntuales por cada 100 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de referencia. En otras palabras, en un polinucleótido con una secuencia de nucleótidos que presenta por lo menos 85 %, preferentemente 90 %, todavía más preferentemente 95 % de identidad respecto a la secuencia de nucleótidos de referencia, hasta 15 %, preferentemente 10 %, todavía más preferentemente 5 % de los nucleótidos en la secuencia de referencia pueden delecionarse o sustituirse por otro nucleótido, o un número de nucleótidos de hasta 15 %, preferentemente de 10 %, todavía más preferentemente de 5 % de los nucleótidos totales en la secuencia de referencia pueden insertarse en la secuencia de referencia. Dichas mutaciones de la secuencia de referencia pueden ocurrir en las posiciones 5' o 3' terminales de la secuencia de nucleótidos de referencia o en cualquier sitio entre dichas posiciones terminales, dispersados individualmente entre los nucleótidos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. Análogamente, la referencia a un polinucleótido con una secuencia de aminoácidos dada que presenta por lo menos, por ejemplo, 85 %, preferentemente 90 %, todavía más preferentemente 95 % de identidad de secuencia respecto a una secuencia de aminoácidos de referencia, pretende referirse a que la secuencia de aminoácidos del polipéptido es idéntica a la secuencia de referencia excepto por que la secuencia polipeptídica dada puede incluir hasta 15, preferentemente hasta 10, todavía más preferentemente hasta 5, alteraciones de aminoácido por cada 100 aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de referencia. En otras palabras, con el fin de obtener una secuencia polipeptídica dada que presenta por lo menos 85 %, preferentemente 90 %, todavía más preferentemente 95 % de identidad de secuencia respecto a una secuencia de aminoácidos de referencia, hasta 15 %, preferentemente hasta 10 %, todavía más preferentemente hasta 5 % de los residuos aminoácidos en la secuencia de referencia pueden delecionarse o sustituirse por otro aminoácido, o pueden insertarse en la secuencia de referencia varios aminoácidos, hasta 15 %, preferentemente hasta 10 %, todavía más preferentemente hasta 5 % del número total de residuos aminoácidos en la secuencia de referencia. Dichas alteraciones de la secuencia de referencia pueden ocurrir en las posiciones aminoterminales o carboxiterminales de la secuencia de aminoácidos de referencia o en cualquier sitio entre dichas posiciones terminales, dispersadas individualmente entre los residuos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. Preferentemente, las posiciones de residuo que no son idénticas difieren por sustituciones de aminoácidos conservadoras. Sin embargo, las sustituciones conservadoras no se incluyen como correspondencia al determinar la identidad de las secuencias.
Las expresiones "identidad", "identidad de secuencia" y "porcentaje de identidad" se utilizan intercambiablemente en la presente memoria. Para el propósito de la presente invención, se define en la presente memoria que, con el fin de determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos o dos secuencias de ácido nucleico, las secuencias están alineadas con fines de una comparación óptima (p. ej., pueden introducirse huecos en la secuencia de una primera secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico para la alineación óptica con una secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico). A continuación, se comparan los residuos aminoácidos o los nucleótidos en las posiciones correspondientes de aminoácido o de nucleótido. En el caso de que una posición en la primera secuencia esté ocupada por el mismo residuo aminoácido o nucleótido en la posición correspondiente de la secuencia, las moléculas son idénticas en esa posición. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, % de identidad=número de posiciones idénticas/número total de posiciones (es decir, posiciones solapantes) x 100). Preferentemente, las dos secuencias presentan la misma longitud.
Puede llevarse a cabo una comparación de las secuencias a lo largo de las longitudes completas de las dos secuencias que se comparan o a lo largo de un fragmento de las dos secuencias. Típicamente, la composición se lleva a cabo a lo largo de la longitud completa de las dos secuencias que se comparan. Sin embargo, la identidad de las secuencias puede estimarse para una región de, por ejemplo, veinte, cincuenta, cien o más residuos aminoácidos contiguos.
El experto en la materia conocerá el hecho de que se encuentran disponibles varios programas informáticos para determinar la homología entre las dos secuencias. Por ejemplo, puede llevarse a cabo una comparación entre secuencias y la determinación del porcentaje de identidad de las dos secuencias mediante la utilización de un algoritmo matemático. En una realización preferente, el porcentaje de identidad entre las dos secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos se determina mediante la utilización del algoritmo de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. (48): 444­ 453 (1970)), que ha sido incorporado en el programa GAP en el paquete informático Accelrys GCG (disponible en http://www.accelrys.com/products/gcg/), mediante la utilización de una matriz Blosum 62 o una matriz PAM250, y una ponderación de hueco de 16, 14, 12, 10, 8, 6 o 4 y una ponderación de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 o 6. El experto en la materia apreciará que la totalidad de dichos diferentes parámetros rendirá resultados ligeramente diferentes, aunque el porcentaje de identidad global de las dos secuencias no resultará alterado significativamente al utilizar diferentes algoritmos.
Las secuencias de proteína o las secuencias de ácido nucleico de la presente invención pueden utilizarse adicionalmente como una "secuencia problema" para realizar una búsqueda en bases de datos públicas con el fin, por ejemplo, de identificar otros miembros de la familia o secuencias relacionadas. Dichas búsquedas pueden llevarse a cabo mediante la utilización de los programas BLASTN y BLASTP (versión 2.0) de Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol.
215:403-10. Pueden llevarse a cabo búsquedas de proteína en BLAST con el programa BLASTP, puntuación=50, longitud de palabra=3, con el fin de obtener secuencias de aminoácidos homólogas a las moléculas de proteína de la invención. Con el fin de obtener alineaciones con hueco con fines de comparación, puede utilizarse BLAST con huecos ("gapped") tal como se indica en Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25(17): 3389-3402. Al utilizar los programas BLAST y BLAST con huecos, pueden utilizarse los parámetros por defecto de los programas respectivos (p. ej., BLASTP y BLASTN). Ver la página principal del National Center for Biotechnology Information en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/.
En otro aspecto, la presente exposición se refiere a una composición inmunogénica, vacuna de combinación o combinación tal como se da a conocer y se reivindica en la presente memoria, en la que el virus PRRS se selecciona del grupo que consiste en: virus del PRRS de genotipo 1, virus del PRRS de genotipo 2, virus PRRS de genotipo 1, que comprende un genoma codificado por una secuencia de nucleótidos que presenta una identidad de por lo menos 90 %, por lo menos 91 %, por lo menos 92 %, por lo menos 93 %, por lo menos 94 %, por lo menos 95 %, por lo menos 96 %, por lo menos 97 %, por lo menos 98 %, por lo menos 99 %, por lo menos 99,1 %, por lo menos 99,2 %, por lo menos 99,3 %, por lo menos 99,4 %, por lo menos 99,5 %, por lo menos 99,6 %, por lo menos 99,7 %, por lo menos 99,8 %, por lo menos 99,9 % o 100 % respecto a la secuencia de ácido nucleico de SEC ID n.° 17 (secuencia de tipo salvaje de virus Lelystad), virus del PRRS de genotipo 2, que comprende un genoma codificado por una secuencia de nucleótidos que presenta una identidad de por lo menos 90 %, por lo menos 91 %, por lo menos 92 %, por lo menos 93 %, por lo menos 94 %, por lo menos 95 %, por lo menos 96 %, por lo menos 97 %, por lo menos 98 %, por lo menos 99 %, por lo menos 99,1 %, por lo menos 99,2 %, por lo menos 99,3 %, por lo menos 99,4 %, por lo menos 99,5 %, por lo menos 99,6 %, por lo menos 99,7 %, por lo menos 99,8 %, por lo menos 99,9 % o 100 % respecto a la secuencia de ácido nucleico de SEC ID n.° 18 (secuencia de tipo salvaje de VR2332).
En otro aspecto, la presente invención se refiere a una composición inmunogénica, vacuna de combinación o combinación tal como se da a conocer y se reivindica en la presente memoria, en la que el virus del PRRS se selecciona del grupo que consiste en: virus del PRRS vivo atenuado/vivo modificado, virus del PRRS vivo atenuado/vivo modificado de genotipo de tipo 1 (p. ej., PRRS Porcilis, PRRS Unistrain, PRRS Amervac, etc.), virus del PRRS vivo atenuado/vivo modificado de genotipo de tipo 2 (p. ej., Ingelvac® PRRS MLV, Fostera PRRS, etc.), virus del PRRS vivo atenuado/vivo modificado de cepa 94881 [(genotipo 1), ReproCyc® PRRS EU], ATCC depósito n.° VR-2332.
Las expresiones "composición inmunogénica", "vacuna de combinación" o "combinación" se refieren a una composición que comprende por lo menos un antígeno, en el caso de la "vacuna de combinación" o la "combinación" de por lo menos dos antígenos, que induce(n) una respuesta inmunitaria en el huésped en el que se administra la "composición inmunogénica", la "vacuna de combinación" o la "combinación". Dicha respuesta inmunitaria la "composición inmunogénica", "vacuna de combinación" o "combinación" de la invención puede ser una respuesta inmunitaria celular y/o mediada por anticuerpos. Preferentemente, la "composición inmunogénica", "vacuna de combinación" o "combinación" induce una respuesta inmunitaria y, más preferentemente, confiere inmunidad protectora contra una o más de las manifestaciones clínicas de una infección por PVP y/o por el PRRSV. El huésped también se denomina "sujeto". Preferentemente, cualquiera de los huéspedes o sujetos indicados o mencionados en la presente memoria son cerdos.
Habitualmente, una "respuesta inmunitaria" incluye, aunque sin limitación, uno o más de los efectos siguientes: producción o activación de anticuerpos, células B, células T ayudantes, células T supresoras y/o células T citotóxicas, y/o células T gamma-delta, dirigidas específicamente contra un antígeno o antígenos incluidos en la "composición inmunogénica", "vacuna de combinación" o "combinación de la invención. Preferentemente, el huésped mostrará una respuesta inmunitaria protectora o una respuesta terapéutica.
Una "respuesta inmunitaria protectora" o "inmunidad protectora" se demostrará por una reducción o falta de los signos clínicos normalmente manifestados por un huésped infectado, un tiempo de recuperación más corto y/o una menor duración de la infectividad o un título patogénico disminuido en los tejidos, líquidos corporales o excreciones del huésped infectado.
En el caso de que el huésped muestre una respuesta inmunitaria protectora, de manera que la resistencia a la nueva infección resulte potenciada y/o la gravedad clínica de la enfermedad se reduzca, la "composición inmunogénica" o "combinación" se describe como "vacuna".
En otro aspecto, la presente invención se refiere a una composición inmunogénica, vacuna de combinación o combinación tal como se da a conocer y se reivindica en la presente memoria, en la que la composición inmunogénica, vacuna de combinación o combinación se formula para la administración de una dosis única.
El volumen de la administración de una dosis única se ha definido en otro sitio de la presente memoria.
La composición inmunogénica, vacuna de combinación o combinación tal como se da a conocer y se reivindica en la presente memoria, preferentemente se administra por vía tópica o sistémicamente. Las rutas adecuadas de administración utilizadas convencionalmente son la administración oral o parenteral, tales como la vía intranasal, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal y subcutánea, así como la inhalación. Sin embargo, dependiendo de la naturaleza y modo de acción del compuesto, la composición inmunogénica, vacuna de combinación o combinación tal como se da a conocer y se reivindica en la presente memoria también puede administrarse por otras vías. La composición inmunogénica, vacuna de combinación o combinación más preferente tal como se da a conocer y se reivindica en la presente memoria se administra por vía intramuscular.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a una composición inmunogénica, vacuna de combinación o combinación tal como se da a conocer y se reivindica en la presente memoria, en la que la composición inmunogénica, vacuna de combinación o combinación se administra por vía intramuscular.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a una composición inmunogénica, vacuna de combinación o combinación tal como se da a conocer y se reivindica en la presente memoria, en la que la composición inmunogénica, vacuna de combinación o combinación es segura para cerdas jóvenes y/o maduras durante el embarazo y la lactancia.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a una composición inmunogénica, vacuna de combinación o combinación tal como se da a conocer y se reivindica en la presente memoria, en la que la composición inmunogénica, vacuna de combinación o combinación resulta segura para cerdas jóvenes y/o maduras a partir de los 30 días de gestación, preferentemente a partir de los 40 días de gestación.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a una composición inmunogénica, vacuna de combinación o combinación tal como se da a conocer y se reivindica en la presente memoria, en la que la composición inmunogénica, vacuna de combinación o combinación comprende, además, por lo menos un portador farmacéuticamente aceptable.
La expresión "portador farmacéuticamente aceptable" incluye todos y cada uno de los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes estabilizadores, diluyentes, conservantes, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos, agentes retardantes de la adsorción, adyuvantes, inmunoestimuladores y combinaciones de los mismos.
Entre los "diluyentes" pueden incluirse agua, solución salina, dextrosa, etanol, glicerol, solución salina tamponada con fosfato y similares. Entre los agentes isotónicos pueden incluirse cloruro sódico, dextrosa, manitol, sorbitol y lactosa, entre otros. Entre los estabilizantes se incluyen albúmina y sales alcalinas de ácido etilendiaminotetracético, entre otros.
En un aspecto de la presente invención, el portador farmacéuticamente aceptable es un carbómero.
Preferentemente, la composición inmunogénica puede incluir, además, otro u otros agentes inmunomoduladores, tales como, p. ej., interleuquinas, interferones u otras citoquinas. Las cantidades y concentraciones de adyuvantes y aditivos que resultan útiles en el contexto de la presente invención pueden ser fácilmente determinadas por el experto en la materia.
En algunos aspectos, la composición inmunogénica de la presente invención contiene un adyuvante. Entre los "adyuvantes", tal como se utilizan en la presente memoria, pueden incluirse hidróxido de aluminio y fosfato de aluminio, saponinas, p. ej., Quil A, QS-21 (Cambridge Biotech Inc., Cambridge, MA), GPI-0100 (Galenica Pharmaceuticals, Inc., Birmingham, a L), emulsión de agua en aceite, emulsión de aceite en agua y emulsión de agua en aceite en agua. La emulsión puede basarse en particular en aceite de parafina líquido ligero (tipo Farmacopea europea); aceite isoprenoide, tal como escualano o escualeno, aceite resultante de la oligomerización de alquenos, en particular de isobuteno o deceno; ésteres de ácidos o de alcoholes que contienen un grupo alquilo lineal, más particularmente aceites vegetales, oleato de etilo, di-(caprilato/caprato) de propilenglicol, tri-(caprilato/caprato) de glicerilo o dioleato de propilenglicol; ésteres de ácidos grasos o alcoholes ramificados, en particular ésteres de ácido isosteárico. El aceite se utiliza en combinación con emulsionantes para formar la emulsión. Los emulsionantes preferentemente son surfactantes no iónicos, en particular ésteres de sorbitán, de manida (p. ej., oleato de anhidromanitol), de glicol, de poliglicerol, de propilenglicol y de ácido oleico, isoesteárico, ricinoleico o hidroxiesteárico, que opcionalmente se etoxilan, y bloques de copolímero de polioxipropileno-polioxietileno, en particular los productos Pluronic, especialmente L121. Ver Hunter et al., The Theory and Practical Application of Adjuvants (Ed.Stewart-Tull, D. E. S.), JohnWiley and Sons, NY, páginas 51 a 94 (1995) y Todd et al., Vaccine 15:564-570 (1997). Los adyuvantes ejemplares son la emulsión PST indicada en la página 147 de "Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach", editado por M. Powell y M. Newman, Plenum Press, 1995, y la emulsión MF59 indicada en la página 183 de esta misma obra.
Un caso adicional de adyuvante es un compuesto seleccionado de entre los polímeros del ácido acrílico o metacrílico y los copolímeros de anhídrido maleico y derivado alquenilo. Los compuestos adyuvantes ventajosos son los polímeros de ácido acrílico o metacrílico que están entrecruzados, especialmente con éteres de polialquenilo de azúcares o polialcoholes. Dichos compuestos se conocen por el término carbómero (Pharmeuropa vol. 8, n.° 2, junio de 1996). El experto en la materia también puede hacer referencia a la patente U. S. n.° 2.909.462 que describe dichos polímeros acrílicos entrecruzados con un compuesto polihidroxilado con por lo menos 3 grupos hidroxilo, preferentemente no más de 8, en el que los átomos de hidrógeno de por lo menos tres hidroxilo son sustituidos por radicales alifáticos insaturados que presentan por lo menos 2 átomos de carbono. Los radicales preferentes son los que contienen entre 2 y 4 átomos de carbono, p. ej., vinilos, alilos y otros grupos etilénicamente insaturados. Los radicales insaturados pueden contener, a su vez, otros sustituyentes, tales como metilo. Los productos comercializados bajo el nombre Carbopol (BF Goodrich, Ohio, EE. UU.) resultan particularmente apropiados. Están entrecruzados con una alilsucrosa o con alilpentaeritritol. Entre ellos pueden mencionarse Carbopol 974P, 934P y 971P. Más preferentemente se utiliza Carbopol 971P. Entre los copolímeros de anhídrido maleico y derivado alquenilo se encuentran los copolímeros EMA (Monsanto9, que son copolímeros de anhídrido maleico y etileno. La disolución de dichos polímeros en agua conduce a una solución ácida que se neutralizará, preferentemente a pH fisiológico, con el fin de proporcionar la solución de adyuvante en la que se incorporará la composición inmunogénica, inmunitaria o de vacuna misma.
Entre los adyuvantes adecuados adicionales se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, el sistema de adyuvantes RIBI (Ribi Inc.), copolímero en bloque (CytRx, Atlanta, GA), SAF-M (Chiron, Emeryville, CA), lípido A monofosforilado, adyuvante de lípido Avridina-amina, enterotoxina termolábil de E. coli (recombinante o de otro tipo), toxina del cólera, IMS 1314 o dipéptido muramilo, o citoquinas naturales o recombinantes, o análogos de los mismos, o estimulantes de la liberación endógena de citoquinas, entre muchos otros.
Se espera que pueda añadirse un adyuvante en una cantidad de entre aproximadamente 100 |jg y aproximadamente 10 mg por dosis, preferentemente en una cantidad de entre aproximadamente 100 jg y aproximadamente 10 mg por dosis, más preferentemente en una cantidad de entre aproximadamente 500 jg y aproximadamente 5 mg por dosis, todavía más preferentemente en una cantidad de entre aproximadamente 750 jg y aproximadamente 2,5 mg por dosis, y lo más preferentemente, en una cantidad de aproximadamente 1 mg por dosis. Alternativamente, el adyuvante puede encontrarse a una concentración de entre aproximadamente 0,01 % y 50 %, preferentemente a una concentración de entre aproximadamente 2 % y 30 %, más preferentemente a una concentración de entre aproximadamente 5 % y 25 %, todavía más preferentemente a una concentración de entre aproximadamente 7 % y 22 %, y lo más preferentemente, a una concentración de entre 10 % y 20 % en volumen del producto final.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a una composición inmunogénica, vacuna de combinación o combinación tal como se da a conocer y se reivindica en la presente memoria, en la que el portador o portadores farmacéuticamente aceptables son carbómeros.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a una composición inmunogénica, vacuna de combinación o combinación tal como se da a conocer y se reivindica en la presente memoria, en la que la composición inmunogénica, vacuna de combinación o combinación comprende entre 0,1 |jg y 50 |jg del antígeno VP2 del PVP, preferentemente entre 0,5 jg y 10 jg de antígeno VP2 del pVp , más preferentemente entre 1,0 jg y 10 jg del antígeno VP2 del PVP, y/o entre 3,9 y 7,0 log10TCID50 del virus del PRRS vivo atenuado/vivo modificado.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a una composición inmunogénica, vacuna de combinación o combinación tal como se da a conocer y se reivindica en la presente memoria, comprende entre aproximadamente 0,1 jg y 50 jg del antígeno VP2 del PVP. Preferentemente, la composición inmunogénica comprende entre aproximadamente 0,2 jg y 40 jg , más preferentemente entre aproximadamente 0,3 jg y 30 jg , más preferentemente entre aproximadamente 0,4 jg y 20 jg y todavía más preferentemente entre aproximadamente 0,5 jg y 10 jg y todavía más preferentemente entre aproximadamente 1,0 jg y 10 jg , siendo más preferente una cantidad de 0,5 jg , 0,75 jg , 1 jg , 1,25 jg , 1,5 jg , 2 jg , 2,5 jg , 3 jg , 3,5 jg , 4 jg , 4,5 jg , 5 jg , 5,5 jg , 6 jg , 6,5 jg , 7 jg , 7,5 jg , 8 jg , 8,5 jg , 9 jg , 9,5 jg o 10 jg del antígeno VP2 del PVP.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a una composición inmunogénica, vacuna de combinación o combinación tal como se da a conocer y se reivindica en la presente memoria, que comprende entre aproximadamente 3,9 y 7,0 log10TCID50 del virus del PRRS vivo atenuado/vivo modificado.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a una composición inmunogénica, vacuna de combinación o combinación tal como se da a conocer y se reivindica en la presente memoria, en la que la composición inmunogénica o combinación es una vacuna.
El término "vacuna" ya ha sido descrito en otro sitio de la presente memoria. Sin embargo, en el caso de que el huésped muestre una respuesta inmunitaria protectora, de manera que la resistencia a la nueva infección resulte potenciada y/o la gravedad clínica de la enfermedad se reduzca, la composición inmunogénica o combinación se describe como "vacuna".
En otro aspecto, la presente invención se refiere a una composición inmunogénica, vacuna de combinación o combinación tal como se da a conocer y se reivindica en la presente memoria, que protege frente a un reto homólogo y/o heterólogo. Ventajosamente, los datos experimentales proporcionados por la presente invención dan a conocer que la composición inmunogénica, vacuna de combinación o combinación de la presente invención presenta un amplio espectro de protección ya que protege frente a cepas de reto heterólogas norteamericanas y/o heterólogas europeas.
Los términos "protege", "profilaxis" y "preventivo" se utilizan intercambiablemente en la presente solicitud. Dichos términos han sido definidos en otros sitios.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a una composición inmunogénica, vacuna de combinación o combinación tal como se da a conocer y se reivindica en la presente memoria, que protege frente a un reto con aislados norteamericanos y/o europeos.
La expresión "aislados norteamericanos y/o europeos" es bien conocida por el experto en la materia. La expresión "aislados norteamericanos y/o europeos" comprende todos los aislados que han sido aislados o que se aislarán en Norteamérica y Europa.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a una composición inmunogénica, vacuna de combinación o combinación tal como se da a conocer y se reivindica en la presente memoria, que es protectora frente a aislados norteamericanos y/o europeos.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a una composición inmunogénica, vacuna de combinación o combinación tal como se da a conocer y se reivindica en la presente memoria, que resulta eficaz en el tratamiento y/o la profilaxis de las manifestaciones clínicas causadas por la infección por un PVP y/o PRRSV en un sujeto que lo requiere. Las expresiones "tratamiento y/o profilaxis", "manifestaciones clínicas" y "necesarias" se han definido en otro sitio.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a una composición inmunogénica, vacuna de combinación o combinación tal como se da a conocer y se reivindica en la presente memoria, en la que la composición inmunogénica, vacuna de combinación o combinación protege contra un reto homólogo y/o heterólogo con PVP y/o un reto homólogo y/o heterólogo con virus del PRRS.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a una composición inmunogénica, vacuna de combinación o combinación tal como se da a conocer y se reivindica en la presente memoria, en la que la composición inmunogénica, vacuna de combinación o combinación protege contra un reto con aislados norteamericano y/o europeo del PVP y/o contra un reto con aislados norteamericano y/o europeo del virus del PRRS.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a una composición inmunogénica, vacuna de combinación o combinación tal como se da a conocer y se reivindica en la presente memoria, en la que la composición inmunogénica, vacuna de combinación o combinación protege cruzadamente contra los aislados norteamericano y/o europeo del PVP y/o protege cruzadamente contra los aislados norteamericano y/o europeo del virus del PRRS.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a una composición inmunogénica, vacuna de combinación o combinación tal como se da a conocer y se reivindica en la presente memoria, en la que la composición inmunogénica, vacuna de combinación o combinación resulta eficaz en el tratamiento y/o la profilaxis de las manifestaciones clínicas causadas por la infección por una infección por PVP y/o el virus del PRRS en un sujeto que lo requiere.
Además, la presente invención proporciona una partícula de tipo vírico que comprende la VP2 del PVP tal como se describe y reivindica en la presente memoria.
La expresión "partícula de tipo vírico" (VLP, por sus siglas en inglés) comprende una cubierta vírica vacía no replicante de un virus. Las VLP generalmente están compuestas de una o más proteínas víricas, tales como, aunque sin limitación, aquellas proteínas denominadas proteínas de cápside, cubierta, envoltura y/o superficie, o polipéptidos formadores de partícula derivados de dichas proteínas. Las VLP pueden formarse espontáneamente con la expresión recombinante de la proteína en un sistema de expresión apropiado. La presencia de VLP tras la expresión recombinante de proteínas víricas puede detectarse mediante la utilización de técnicas convencionales conocidas de la técnica, tales como la microscopía electrónica, la cristalografía de rayos X y similares. Ver, p. ej., Baker et al., Biophys. J. (1991) 60: 1445-1456; Hagensee et al., J. Virol. (1994) 68: 4503-4505. Por ejemplo, la microscopía crioelectrónica puede llevarse a cabo con muestras acuosas vitrificadas de la preparación de VLP en cuestión, y grabarse imágenes bajo condiciones de exposición apropiadas.
La expresión "partícula de tipo vírico" (VLP) comprende, además, las VLP que están compuestas de una pluralidad de VP2 del PVP.
En otro aspecto de la presente invención, la partícula de tipo vírico está compuesta de una pluralidad de VP2 del PVP tal como se describe y se reivindica en la presente memoria.
Además, la presente invención proporciona una célula que comprende el polinucleótido o el vector tal como se indica en la presente memoria. Preferentemente, el vector es un baculovirus.
El término "célula" es bien conocido por el experto en la materia. El término "célula" comprende células eucarióticas, tales como una célula animal, célula de protista, célula vegetal o célula fúngica. Preferentemente, la célula eucariótica es una célula de mamífero, tal como una célula CHO, BHK, COS o fúngica, tal como Saccharomyces cerevisiae, o una célula de insecto, tal como Sf9.
En otro aspecto de la presente invención, la célula es una célula de insecto.
La expresión "célula de insecto" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a una célula o cultivo celular derivado de una especie de insecto. Resultan de particular interés con respecto a la presente invención las células de insecto derivadas de las especies Spodoptera frugiperda y Trichoplusia ni.
Preferentemente, la célula de insecto, tal como se menciona en la presente memoria, es una célula de Spodoptera frugiperda (Sf) o una célula de una línea celular derivada de Spodoptera frugiperda, y más preferentemente se selecciona del grupo que consiste en célula Sf9 y célula Sf+. Las células de insecto, tal como se menciona en la presente memoria, son preferentemente células de Spodoptera frugiperda (Sf) o células de una línea celular derivada de Spodoptera frugiperda, respectivamente, y más preferentemente se seleccionan del grupo que consiste en células Sf9 y células Sf+.
En otro aspecto de la presente invención, la célula de insecto se selecciona del grupo que consiste en células Sf9 y células Sf+.
Además, la presente invención proporciona un método para producir la VP2 del PVP tal como se describe y se reivindica en la presente memoria, que comprende transfectar una célula con el vector tal como se indica en la presente memoria.
El término "vector" es bien conocida por el experto en la materia. El término "vector" tal como es conocido en la técnica se refiere a un constructo de polinucleótido, típicamente un plásmido o un virus, utilizado para transmitir material genético a una célula huésped. Los vectores pueden ser, por ejemplo, virus, plásmidos, cósmidos o fagos. Un vector tal como se utiliza en la presente memoria puede estar compuesto de ADN o ARN. En algunas realizaciones, un vector está compuesto de ADN.
Un "vector de expresión" es un vector que es capaz de dirigir la expresión de una proteína codificada por uno o más genes que lleva el vector y que se produce cuando se encuentra presente en el medio apropiado. Los vectores preferentemente son capaces de replicarse autónomamente. Típicamente, un vector de expresión comprende un promotor de transcripción, un gen y un terminador de transcripción. La expresión génica habitualmente se deja bajo el control de un promotor y se afirma que el gen está "operablemente ligado a" el promotor.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "operablemente ligado" se utiliza para referirse a la conexión entre elementos reguladores y un gen o su región codificante. Típicamente, la expresión génica está sometida al control de uno o más elementos reguladores, por ejemplo, aunque sin limitación, promotores constitutivos o inducibles, elementos reguladores específicos de tejido, e intensificadores. Se dice que un gen o región codificante está "operablemente ligado" u "operativamente ligado a" u "operablemente asociado a" los elementos reguladores, es decir, que el gen o región codificante está controlado o influido por el elemento regulador. Por ejemplo, un regulador está operablemente ligado a una secuencia codificante si el promotor activa la transcripción o expresión de la secuencia codificante.
Los vectores y métodos para producir y/o utilizar vectores (o recombinantes) para la expresión pueden realizarse mediante, o ser análogos a, los métodos dados a conocer en las patentes US siguientes: n.° 4.603.112. n.° 4.769.330. n.° 5.174.993. n.° 5.505.941. n.° 5.338.683. n.° 5.494.807. n.° 4.722.848. n.° 5.942.235. n.° 5.364.773. n.° 5.762.938. n.° 5.770.212. n.° 5.942.235. n.° 382.425, las publicaciones de patente PCT n.° WO 94/16716, n.° WO 96/39491, y n.° WO 95/30018; Paoletti, "Applications of pox virus vectors to vaccination: An update, "PNAS USA 93: 11349-11353, octubre de 1996; Moss, "Genetically engineered poxviruses for recombinant gene expression, vaccination, and safety", PNAS USA 93: 11341-11348, octubre de 1996; Smith et al., patente US n.° 4,745,051(baculovirus recombinante); Richardson, C. D. (Editor), Methods in Molecular Biology 39, "Baculovirus Expression Protocols" (1995 Humana Press Inc.); Smith et al., "Production of Human Beta Interferon in Insect Cells Infected with a Baculovirus Expression Vector", Molecular and Cellular Biology, December, 1983, vol. 3, n° 12, páginas 2156 a 2165; Pennock et al., "Strong and Regulated Expression of Escherichia coli B-Galactosidase in Infect Cells with a Baculovirus vector, "Molecular and Cellular Biology March 1984, vol. 4, n.° 3, página 406;documento n.° EPA0 370 573; solicitud de patente U.S. n.° 920.197, presentada el 16 de octubre de 1986; la publicación de patente EP n.° 265785; la patente US n.° 4.769.331 (herpesvirus recombinante); Roizman, "The function of herpes simplex virus genes: A primer for genetic engineering of novel vectors", PNAS USA 93:11307-11312, octubre de 1996; Andreansky et al., "The application of genetically engineered herpes simplex viruses to the treatment of experimental brain tumors," PNAS USA 93: 11313-11318, octubre de 1996; Robertson et al., "Epstein-Barr virus vectors for gene delivery to B lymphocytes", PNAS USA 93: 11334-11340, octubre de 1996; Frolov et al., "Alphavirus-based expression vectors: Strategies and applications," PNAS USA 93: 11371-11377, octubre de 1996; Kitson et al., J. Virol. 65, 3068-3075, 1991; patente US n.° 5.591.439, y n.° 5.552.143; documento n.° WO 98/00166; solicitudes concedidas de patente U.S. n.° de serie 08/675,556 y n.° 08/675,566, ambas presentadas el 3 de julio de 1996 (adenovirus recombinante); Grunhaus et al., 1992, "Adenovirus as cloning vectors," Seminars in Virology (vol. 3) páginas 237 a 252, 1993; Ballay et al. EMBO Journal, vol. 4, páginas 3861 a 3865, Graham, Tibtech 8, 85-87, abril de 1990; Prevec et al., J. Gen Virol. 70, 42434; documento de patente PCT n.° WO 91/11525; Felgner et al. (1994), J. Biol. Chem. 269, 2550-2561, Science, 259: 1745-49, 1993; and McClements et al., "Immunization with DNA vaccines encoding glycoprotein D or glycoprotein B, alone or in combination, induces protective immunity in animal models of herpes simplex virus-2 disease", PNAS USA 93: 11414-11420, octubre de 1996 y patentes US n.° 5.591.639, n.° 5.589.466 y n.° 5.580.859, así como los documentos n.° WO 90/11092, n.° WO 93/19183, n.° WO 94/21797, n.° WO 95/11307, n.° WO 95/20660; Tang et al., Nature y Furth et al., Analytical Biochemistry, referidos a los vectores de expresión de ADN, entre otros. Ver también el documento n.° WO 98/33510; Ju et al., Diabetologia, 41: 736-739, 1998 (sistema de expresión lentivírico); Sanford et al., patente U.S. n.° 4.945.050; Fischbachet al. (Intracel); documento n.° WO 90/01543; Robinson et al., Seminars in Immunology vol. 9, páginas 271 a 283 (1997), (sistemas de vector de ADN); Szoka et al., patente U.S. n.° 4.394.448 (método de inserción de ADN en células vivas); McCormick et al., patente U.S. n.° 5.677.178 (uso de virus citopáticos); y patente U.S. n.° 5.928.913 (vectores para la administración génica), así como otros documentos citados en la presente memoria.
Las expresiones "elemento regulador" y "elemento de control de la expresión" se utilizan intercambiablemente y se refieren a moléculas de ácido nucleico que pueden influir sobre la expresión de una secuencia codificante operablemente ligada en un organismo huésped particular. Dichas expresiones se utilizan ampliamente y cubren todos los elementos que promueven o regulan la transcripción, incluyendo promotores, elementos centrales requeridos para la interacción básica de la ARN polimerasa y los factores de transcripción, elementos cadena arriba, intensificadores y elementos de respuesta. Entre los elementos reguladores ejemplares en procariotas se incluyen promotores, secuencias de operador y sitios de unión ribosómica. Entre los elementos reguladores que se utilizan en las células eucarióticas pueden incluirse, aunque sin limitación, secuencias de control transcripcional y traduccional, tales como promotores, intensificadores, señales de procesamiento, señales de poliadenilación, terminadores, señales de degradación de proteínas, secuencias internas de elementos de entrada ribosómica (IRES, por sus siglas en inglés), secuencias 2A, y similares, que proporcionan y/o regulan la expresión de una secuencia codificante y/o la producción de un polipéptido codificado en una célula huésped.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "promotor" es una secuencia de nucleótidos que permite la unión de la ARN polimerasa y dirige la transcripción de un gen. Típicamente, un promotor se localiza en la región no codificante 5' de un gen, próxima al sitio de inicio de transcripción del gen. Los elementos de secuencia dentro de los promotores que funcionan para iniciar la transcripción con frecuencia se caracterizan por secuencias de nucleótidos de consenso. Entre los ejemplos de promotores se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, promotores de bacterias, levaduras, plantas, virus y mamíferos (incluyendo seres humanos). Un promotor puede ser inducible, reprimible y/o constitutivo. Los promotores inducibles inducen niveles incrementados de transcripción a partir del ADN bajo su control en respuesta a algún cambio en las condiciones de cultivo, tal como un cambio de temperatura.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "intensificador" se refiere a un tipo de elemento regulador que puede incrementar la eficiencia de la transcripción, con independencia de la distancia u orientación del intensificador respecto al sitio de inicio de la transcripción.
La generación de un vector vírico puede conseguirse mediante la utilización de cualesquiera técnicas de ingeniería genética adecuadas y bien conocidas de la técnica, incluyendo, aunque sin limitación, las técnicas estándares de digestión con endonucleasa de restricción, la ligación, la transformación, la purificación de plásmido y la secuenciación del ADN, por ejemplo tal como se indica en Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y. (1989)).
Además, la presente invención proporciona un método para producir la VP2 del PVP tal como se describe y se reivindica en la presente memoria, que comprende infectar una célula, preferentemente una célula de insecto, con el baculovirus tal como se indica en la presente memoria.
Las composiciones pueden, si se desea, presentarse en un paquete o dispositivo dispensador que puede contener una o más formas de administración unitaria que contienen el ingrediente activo. El paquete puede comprender, por ejemplo, hoja de metal o plástico, tal como un paquete blíster. El paquete o dispositivo dispensador puede estar acompañado de instrucciones de administración, preferentemente para la administración en animales, especialmente cerdos. Asociado a dicho recipiente o recipientes puede encontrarse un impreso en la forma prescrita por la agencia gubernamental que regula la fabricación, uso o comercialización de farmacéuticos o productos biológicos, impreso en el que se refleje la aprobación de la agencia de fabricación, la utilización o la comercialización para la administración humana.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a una composición inmunogénica, vacuna de combinación o combinación tal como se da a conocer y se reivindica en la presente memoria, en la que el antígeno o antígenos de parvovirus porcino (PVP) y el antígeno o antígenos del virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRS) se encuentran contenidos juntos en un único recipiente o se encuentran separados espacialmente unos de otros, preferentemente están contenidos en dos o más recipientes separados.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un kit que comprende la composición inmunogénica o vacuna de combinación, o combinación tal como se describe y se reivindica en la presente memoria.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un kit tal como se da a conocer y se reivindica en la presente memoria, en la que el antígeno o antígenos de parvovirus porcino (PVP) y el antígeno o antígenos del virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRs ) están contenidos separadamente unos de otros en dos o más recipientes separados, preferentemente tanto independientemente unos de otros en forma liofilizada o en forma congelada, y en el que el kit comprende, además, un manual de instrucciones para mezclar el antígeno o antígenos del PVP separados especialmente y el antígeno o antígenos del virus del PRRS, en los que preferentemente dicho manual de instrucciones contiene indicaciones para combinar el contenido del recipiente o recipientes que contienen el antígeno o antígenos del PVP con el contenido del recipiente o recipientes que contienen el antígeno o antígenos del virus del PRRS, en el que más preferentemente dicho manual de instrucciones contiene indicaciones para que el antígeno o antígenos de parvovirus porcino (PVP) y el antígeno o antígenos del virus reproductivo y respiratorio porcino (PRRS) deben administrarse en el sujeto simultáneamente, más preferentemente de manera separada simultáneamente en el mismo sitio de administración o en diferentes, secuencialmente (en cualquier orden) y/o de forma cronológicamente escalonada.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un kit tal como se da a conocer y se reivindica en la presente memoria, en el que el kit comprende, además, indicaciones para el tratamiento y/o la profilaxis de enfermedades en cerdos y/o comprende, además, indicaciones para el tratamiento y/o la profilaxis de infecciones del PVP y/o infecciones del virus del PRRS, preferentemente dicho kit comprende, además, indicaciones para el uso asociado del componente PVP (preferentemente como un componente separado del kit) y el componente PRRSV (preferentemente como un componente separado del kit) de la composición inmunogénica, vacuna de combinación o combinación tal como se da a conocer y se reivindica en la presente memoria y está contenido en dicho kit.
La expresión "uso asociado" en el alcance de la presente invención se refiere a la utilización de las dos vacunas o componentes de vacuna: PRRSV y PVP (cada uno, independientemente, también denominado en la presente memoria "componente separado del kit") mediante la mezcla de las dos vacunas antes de la administración en un sitio de inyección o la administración de las dos vacunas simultáneamente, aunque en diferentes sitios de administración. Preferentemente, dichas dos vacunas se administran simultáneamente, más preferentemente de manera separada simultáneamente en el mismo sitio o en sitios de administración diferentes, secuencialmente (en cualquier orden) y/o de un modo cronológicamente escalonado.
En otro aspecto de la presente invención, el PVP de la presente invención ha sido inactivado, resultando en un virus inactivado entero con una proteína vírica 2 (VP2) tal como se indica en la presente memoria.
Puede utilizarse cualquier método convencional de inactivación para los fines de la presente invención. De esta manera, la inactivación puede llevarse a cabo mediante tratamientos químicos y/o físicos que sean conocidos por el experto en la materia. Entre los métodos de inactivación preferentes se incluyen la adición de etilenimina binaria ciclizada (BEI, por sus siglas en inglés), incluyendo la adición de una solución de hidrobromuro de 2-bromoetilenamina (BEA), que ha sido ciclizado en etilenimina binaria (BEI). Los agentes de inactivación química adicionales preferentes comprenden, aunque sin limitarse a ellos, Triton X-100, desoxicolato sódico, bromuro de cetiltrimetilamonio, ppropiolactona, timerosal, fenol y formaldehído (formalina). Sin embargo, la inactivación puede comprender, además, una etapa de neutralización. Entre los agentes de neutralización preferentes se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, tiosulfato sódico, bisulfito sódico y similares.
Entre las condiciones de inactivación con formalina preferentes se incluyen una concentración de formalina de entre aproximadamente 0,02 % (v) y 2,0 % (v/v), más preferentemente de entre aproximadamente 0,1 % (v/v) y 1,0 % (v/v), todavía más preferentemente de entre aproximadamente 0,15 % (v/v) y 0,8 % (v/v), aún todavía más preferentemente de entre aproximadamente 0,16 % (v/v) y 0,6 % (v/v), y lo más preferentemente de entre aproximadamente 0,2 % (v/v) y 0,4 % (v/v). El tiempo de incubación depende de la resistencia del PVP y/o PRRSV. En general, el procedimiento de inactivación se lleva a cabo hasta que no pueda detectarse ningún crecimiento del PVP y/o del PRRSV, en un sistema de cultivo adecuado.
Preferentemente, el PVP inactivado de la presente invención se inactiva con formalina, preferentemente utilizando la concentración indicada anteriormente en la presente memoria.
Preferentemente, el PVP inactivado de la presente invención es etilenimina binaria ciclizada (BEI), incluyendo la adición de una solución de hidrobromuro de 2-bromoetilenamina (BEA), que ha sido ciclizado en etilenimina binaria (BEI).
El PVP inactivado de la invención puede incorporarse en liposomas mediante la utilización de tecnología conocida, tal como la descrita en Nature, 1974, 252, 252-254 o en Journal of Immunology, 1978, 120, 1109-1113. En otra realización de la invención, el PVP inactivado de la invención puede conjugarse con compuestos biológicos adecuados, tales como polisacáridos, péptidos, proteínas o similares, o una combinación de los mismos.
El término "inmunizador" se refiere a una inmunización activa mediante la administración de una composición inmunogénica en un sujeto que debe inmunizarse, causando de esta manera una respuesta inmunitaria contra el antígeno incluido en dicha composición inmunogénica.
Preferentemente, la inmunización resulta en la reducción de la incidencia de la infección del PVP y/o PRRSV particular en una manada o en la reducción de la gravedad de las manifestaciones clínicas causadas o asociadas a la infección del PVP y/o PRRSV particular.
Además, la inmunización de un sujeto que necesita las composiciones inmunogénicas proporcionadas en la presente memoria resulta en la prevención de la infección del sujeto por el PVP y/o el PRRSV. Todavía más preferentemente, la inmunización resulta en una respuesta inmunitaria de larga duración y eficaz contra la infección por el PVP y/o el PRRSV. Se entenderá que dicho periodo de tiempo se prolongará durante más de 1 mes, preferentemente más de 2 meses, preferentemente más de 3 meses, más preferentemente más de 4 meses, más preferentemente más de 5 meses, yy más preferentemente más de 6 meses. Debe entenderse que la inmunización puede no resultar eficaz en todos los sujetos inmunizados. Sin embargo, el término requiere que una parte significativa de sujetos de una manada sean inmunizados eficazmente.
Preferentemente, en el presente contexto se contempla una manada de sujetos que normalmente, es decir, sin inmunización, desarrollaría manifestaciones clínicas causadas o asociadas a una infección por el virus PVP y/o el virus PRRSV. Si los sujetos de una manada han sido inmunizados eficazmente o no podrá ser determinado sin más por el experto en la materia. Preferentemente, la inmunización será eficaz en el caso de que las manifestaciones clínicas en por lo menos 33 %, por lo menos 50 %, por lo menos 60 %, por lo menos 70 %, por lo menos 80 %, por lo menos 90 %, todavía más preferentemente en por lo menos 95 % y lo más preferentemente en 100 % de los sujetos de una manada dada se reduzcan en incidencia o gravedad en por lo menos 10 %, más preferentemente en por lo menos 20 %, todavía más preferentemente en por lo menos 30 %, todavía más preferentemente en por lo menos 40 %, todavía más preferentemente en por lo menos 50 %, todavía más preferentemente en por lo menos 60 %, todavía más preferentemente en por lo menos 70 %, todavía más preferentemente en por lo menos 80 %, todavía más preferentemente en por lo menos 90 %, todavía más preferentemente en por lo menos 95 % y lo más preferentemente en 100 % en comparación con sujetos que no han sido inmunizados o han sido inmunizados con una composición inmunogénica que se encontraba disponible antes de la presente invención, pero posteriormente fueron infectados por el PVP particular.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a la utilización de la composición inmunogénica, vacuna de combinación o combinación, o el kit tal como se describe y se reivindica en la presente memoria, para la preparación de un medicamento, preferentemente de una vacuna.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a la utilización de una composición inmunogénica, vacuna de combinación, combinación o kit tal como se describe y se reivindica en la presente memoria, para el tratamiento y/o la prevención de una infección por el virus PVP y/o el virus del PRRS, la reducción, la prevención o el tratamiento de las manifestaciones clínicas causadas por una infección por el virus PVP y/o el virus del PRRS, o para el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad causada por una infección por el virus PVP y/o el virus del PRRS.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método de inmunización de un sujeto, que comprende la administración en dicho sujeto de una composición inmunogénica, vacuna de combinación o combinación (o componentes separados de un kit) tal como se describe y se reivindica en la presente memoria.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método de tratamiento y/o prevención de las manifestaciones clínicas causadas por una infección por PVP y/o por una infección por el virus del PRRS, preferentemente el síndrome reproductivo y respiratorio porcino, preferentemente en cerdos, en un sujeto que lo necesita, en el que el método comprende administrar en el sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición inmunogénica, vacuna de combinación o combinación (o componentes separados de un kit) tal como se describe y se reivindica en la presente memoria.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método de reducción del fracaso reproductivo en un sujeto en comparación con un sujeto de un grupo de control no inmunizado de la misma especie, en el que el método comprende administrar en el sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición inmunogénica, vacuna de combinación o combinación (o componentes separados de un kit) tal como se describe y se reivindica en la presente memoria.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método de reducción de la muerte embrionaria y fetal en un sujeto en comparación con un sujeto de un grupo de control no inmunizado de la misma especie, en el que el método comprende administrar en el sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición inmunogénica, vacuna de combinación o combinación (o componentes separados de un kit) tal como se describe y se reivindica en la presente memoria.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método para la inmunización activa de cerdos reproductores (hembras maduras y jóvenes) para la protección de los embriones y fetos frente a la infección por parvovirus porcino, en el que el método comprende administrar en dichos cerdos (hembras maduras y jóvenes) una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición inmunogénica, vacuna de combinación o combinación (o componentes separados de un kit) tal como se describe y se reivindica en la presente memoria.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a los métodos tal como se describen y se reivindican en la presente memoria, en los que dicho sujeto se selecciona del grupo que consiste en cerdos, vacas, gatos y perros, preferentemente cerdos, más preferentemente cerdas maduras y/o jóvenes.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a métodos tal como se describe y se reivindica en la presente memoria, en los que la composición inmunogénica, la vacuna de combinación o la combinación (o componentes separados de un kit) se administra una vez o en dos o más dosis.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a métodos tal como se describe y se reivindica en la presente memoria, en los que la composición inmunogénica, la vacuna de combinación o la combinación (o componentes separados de un kit) se administra por vía intramuscular.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a métodos tal como se describe y se reivindica en la presente memoria, en los que la composición inmunogénica, vacuna de combinación o combinación (o componentes separados de un kit) se administra en cerdas jóvenes y/o maduras, preferentemente en cerdas jóvenes y/o maduras de por lo menos 3 semanas de edad, más preferentemente cerdas jóvenes y/o maduras antes del embarazo, todavía más preferentemente en cerdas maduras durante el embarazo y la lactancia.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a métodos tal como se describen y se reivindican en la presente memoria, en los que la composición inmunogénica, la vacuna de combinación o la combinación (o componentes separados de un kit) resulta segura para las cerdas jóvenes y/o maduras durante el embarazo y la lactancia, y para las cerdas jóvenes antes del embarazo.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a métodos tal como se describen y se reivindican en la presente memoria, en los que la composición inmunogénica, la vacuna de combinación o la combinación (o componentes separados de un kit) resultan seguros para las cerdas maduras y/o jóvenes a partir de los 30 días de gestación, preferentemente a partir de los 40 días de gestación.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a métodos tal como se dan a conocer y se reivindican en la presente memoria, en los que la composición inmunogénica, la vacuna de combinación o la combinación (o componentes separados de un kit) comprende entre 0,1 |jg y 50 |jg del antígeno VP2 del PVP, preferentemente entre 0,5 |jg y 10 |jg de antígeno VP2 del PVP, más preferentemente entre 1,0 jg y 10 jg del antígeno VP2 del PVP, y/o entre 3,9 y 7,0 logi0TCID50 del virus del PRRS vivo atenuado/vivo modificado.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a métodos tal como se describen y se reivindican en la presente memoria, en los que la composición inmunogénica, la vacuna de combinación o la combinación (o componentes separados de un kit) protege frente a un reto homólogo y/o heterólogo con PVP y/o un reto homólogo y/o heterólogo con virus del PRRS.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a métodos tal como se describen y se reivindican en la presente memoria, en los que la composición inmunogénica, la vacuna de combinación o la combinación (o componentes separados de un kit) protege frente a un reto con aislados norteamericanos y/o europeos del PVP y/o contra un reto con aislados norteamericanos y/o europeos del virus del PRRS.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a métodos tal como se describen y se reivindican en la presente memoria, en los que la composición inmunogénica, la vacuna de combinación o la combinación (o componentes separados de un kit) protege cruzadamente contra los aislados norteamericano y/o europeo del PVP y/o protege cruzadamente contra los aislados norteamericano y/o europeo del virus del PRRS.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a métodos tal como se describen y se reivindican en la presente memoria, en los que dicho método resulta en una mejora de por lo menos un parámetro de eficacia seleccionado del grupo que consiste en: leucopenia transitoria reducida y fracaso reproductivo caracterizado por infección y muerte embrionaria y/o fetal, o combinaciones de los mismos, en comparación con un sujeto de un grupo de control no inmunizado de la misma especie.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a la composición inmunogénica, la vacuna de combinación o la combinación (o componentes separados de un kit) tal como se describen y se reivindican en la presente memoria, para la utilización en un método de inmunización de un sujeto, que comprende administrar dicha composición inmunogénica, vacuna de combinación o combinación en dicho sujeto (o componentes separados de un kit).
En otro aspecto, la presente invención se refiere a la composición inmunogénica, la vacuna de combinación o la combinación (o componentes separados de un kit) tal como se describen y se reivindican en la presente memoria, para la utilización en un método de tratamiento y/o prevención de las manifestaciones clínicas causadas por una infección por PVP y/o una infección por virus del PRRS, preferentemente síndrome reproductivo y respiratorio porcino, preferentemente en cerdos, en un sujeto que lo necesita, en el que el método comprende administrar en el sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición inmunogénica, vacuna de combinación o combinación (o componentes separados de un kit).
En otro aspecto, la presente invención se refiere a la composición inmunogénica, la vacuna de combinación o la combinación (o componentes separados de un kit) tal como se describen y se reivindican en la presente memoria, para la utilización en un método de reducción del fracaso reproductivo en un sujeto en comparación con un sujeto de un grupo de control no inmunizado de la misma especie, en el que el método comprende administrar en el sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de dicha composición inmunogénica, vacuna de combinación o combinación (o componentes separados de un kit).
En otro aspecto, la presente invención se refiere a la composición inmunogénica, la vacuna de combinación o la combinación (o componentes separados de un kit) tal como se describen y se reivindican en la presente memoria, para la utilización en un método de reducción de la muerte embrionaria y fetal en un sujeto en comparación con un sujeto de un grupo de control no inmunizado de la misma especie, en el que el método comprende administrar en el sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de dicha composición inmunogénica, vacuna de combinación o combinación (o componentes separados de un kit).
En otro aspecto, la presente invención se refiere a la composición inmunogénica, la vacuna de combinación o la combinación (o componentes separados de un kit) tal como se describen y se reivindican en la presente memoria, para la utilización en un método para la inmunización activa de cerdos reproductores (hembras maduras y jóvenes) para la protección de los embriones y fetos frente a la infección por parvovirus porcino, en el que el método comprende administrar en dichos cerdos (hembras maduras y jóvenes) dicha composición inmunogénica, vacuna de combinación o combinación (o componentes separados de un kit).
En otro aspecto, la presente invención se refiere a la composición inmunogénica, la vacuna de combinación o la combinación (o componentes separados de un kit) tal como se describen y se reivindican en la presente memoria, en los que dicho sujeto se selecciona del grupo que consiste en cerdos, vacas, gatos y perros, preferentemente cerdos, más preferentemente cerdas maduras y/o jóvenes.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a la composición inmunogénica, la vacuna de combinación o la combinación (o componentes separados de un kit) tal como se describen y se reivindican en la presente memoria, para la utilización tal como se indica y se reivindica en la presente memoria, en la que la composición inmunogénica, vacuna de combinación o combinación (o componentes separados de un kit) se administra una vez o en dos o más dosis.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a la composición inmunogénica, la vacuna de combinación o la combinación (o componentes separados de un kit) tal como se describen y se reivindican en la presente memoria, para la utilización tal como se describe y se reivindica en la presente memoria, en la que la composición inmunogénica, la vacuna de combinación o la combinación (o componentes separados de un kit) se administran por vía intramuscular.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a la composición inmunogénica, la vacuna de combinación o la combinación (o componentes separados de un kit) tal como se describen y se reivindican en la presente memoria, para la utilización tal como se describe y se reivindica en la presente memoria, en la que la composición inmunogénica, vacuna de combinación o combinación (o componentes separados de un kit) se administra en cerdas jóvenes y/o maduras, preferentemente en cerdas maduras de por lo menos 3 semanas de edad, más preferentemente cerdas maduras antes del embarazo, todavía más preferentemente en cerdas maduras durante el embarazo y la lactancia.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a la composición inmunogénica, la vacuna de combinación o la combinación (o componentes separados de un kit) tal como se describen y se reivindican en la presente memoria, para la utilización tal como se describe y se reivindica en la presente memoria, en la que la composición inmunogénica, vacuna de combinación o combinación (o componentes separados de un kit) resulta segura para cerdas jóvenes y/o maduras durante el embarazo y la lactancia.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a la composición inmunogénica, la vacuna de combinación o la combinación (o componentes separados de un kit) tal como se describen y se reivindican en la presente memoria, para la utilización tal como se describe y se reivindica en la presente memoria, en la que la composición inmunogénica, la vacuna de combinación o la combinación (o componentes separados de un kit) resulta segura para cerdas jóvenes y/o maduras a partir de los 30 días de gestación, preferentemente a partir de los 40 días de gestación.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a la composición inmunogénica, la vacuna de combinación o la combinación (o componentes separados de un kit) tal como se describe y se reivindica en la presente memoria, para la utilización tal como se describe y se reivindica en la presente memoria, en la que la composición inmunogénica, vacuna de combinación o combinación (o componentes separados de un kit) comprende entre 0,1 |jg y 50 |jg de antígeno VP2 del PVP, preferentemente entre 0,5 jg y 10 jg de antígeno VP2 del PVP, más preferentemente entre 1,0 jg y 10 jg del antígeno VP2 del PVP, y/o entre 3,9 y 7,0 logi0TCID50 del virus del Pr Rs vivo atenuado/vivo modificado.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a la composición inmunogénica, la vacuna de combinación o la combinación (o componentes separados de un kit) tal como se describe y se reivindica en la presente memoria, para la utilización tal como se describe y se reivindica en la presente memoria, en la que la composición inmunogénica, vacuna de combinación o combinación (o componentes separados de un kit) protege contra un reto homólogo y/o heterólogo con PVP y/o un reto homólogo y/o heterólogo con virus del PRRS.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a la composición inmunogénica, la vacuna de combinación o la combinación (o componentes separados de un kit) tal como se describen y se reivindican en la presente memoria, para la utilización tal como se describe y se reivindica en la presente memoria, en la que la composición inmunogénica, vacuna de combinación o combinación (o componentes separados de un kit) protege contra un reto con aislados norteamericano y/o europeo del PVP y/o contra un reto con aislados norteamericano y/o europeo del virus del PRRS.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a la composición inmunogénica, la vacuna de combinación o la combinación (o componentes separados de un kit) tal como se describen y se reivindican en la presente memoria, para la utilización tal como se describe y se reivindica en la presente memoria, en la que la composición inmunogénica, vacuna de combinación o combinación (o componentes separados de un kit) protege cruzadamente contra los aislados norteamericano y/o europeo del PVP y/o protege cruzadamente contra los aislados norteamericano y/o europeo del virus del PRRS.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a la composición inmunogénica, la vacuna de combinación o la combinación (o componentes separados de un kit) tal como se describen y se reivindican en la presente memoria, para la utilización tal como se describe y se reivindica en la presente memoria, en la que dicho método resulta en una mejora de por lo menos un parámetro de eficacia seleccionado del grupo que consiste en: leucopenia transitoria reducida y fracaso reproductivo caracterizado por infección y muerte embrionaria y/o fetal, o combinaciones de los mismos, en comparación con un sujeto de un grupo de control no inmunizado de la misma especie.
La expresión "tratamiento y/o profilaxis" se refiere a la disminución de la incidencia de la infección del PVP y/o PRRSV particular en una manada, o la reducción de la gravedad de las manifestaciones clínicas causadas o asociadas a la infección del PVP y/o PRRSV particular. De esta manera, la expresión "tratamiento y/o profilaxis" se refiere, además, a la reducción del número de animales en una manada que resultan infectados por el PVP y/o PRRSV particular (=disminución de la incidencia de la infección por el PVP y/o PRRSV particular) o a la reducción de la gravedad de las manifestaciones clínicas normalmente asociadas o causadas por una infección por PVP y/o PRRSV en un grupo de animales, en que los animales han recibido una cantidad eficaz de la composición inmunogénica, la vacuna de combinación o la combinación tal como se proporciona en la presente memoria en comparación con un grupo de animales en que los animales no han recibido dicha composición inmunogénica, vacuna de combinación o combinación.
El "tratamiento y/o profilaxis" generalmente implica la administración de una cantidad eficaz de la composición inmunogénica, vacuna de combinación o combinación de la presente invención en un sujeto o manada de sujetos que requieren o que podrían beneficiarse de dicho tratamiento/profilaxis. El término "tratamiento" se refiere a la administración de una cantidad eficaz de la composición inmunogénica, vacuna de combinación o combinación una vez el sujeto o por lo menos algunos animales de la manada ya se encuentran infectados por dicho virus PVP y/o PRRSV, y en el que dichos animales ya muestran algunas manifestaciones clínicas causadas o asociadas a dicha infección por PVP y/o PRRSV. El término "profilaxis" se refiere a la administración en un sujeto antes de cualquier infección de dicho sujeto con virus PVP y/o PRRSV, o por lo menos en la que dicho animales o ninguno de los animales en un grupo de animales muestra ninguna manifestación clínica causada o asociada a la infección por dicho virus PVP y/o PRRSV. Los términos "profilaxis" y "preventivo" se utilizan intercambiablemente en la presente solicitud.
La expresión "una cantidad eficaz" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere, aunque sin limitación, a una cantidad de antígeno que induce, o es capaz de inducir, una respuesta inmunitaria en un sujeto. Dicha cantidad eficaz es capaz de reducir la incidencia de la infección por el PVP y/o PRRSV particular en una manada, o de reducir la gravedad de las manifestaciones clínicas de la infección del pVp y/o PRRSV particular.
Preferentemente, las manifestaciones clínicas se reducen en incidencia o gravedad en por lo menos 10 %, más preferentemente en por lo menos 20 %, todavía más preferentemente en por lo menos 30 %, todavía más preferentemente en por lo menos 40 %, todavía más preferentemente en por lo menos 50 %, todavía más preferentemente en por lo menos 60 %, todavía más preferentemente en por lo menos 70 %, todavía más preferentemente en por lo menos 80 %, todavía más preferentemente en por lo menos 90 %, todavía más preferentemente en por lo menos 95 % y lo más preferentemente en 100 % en comparación con sujetos que no han sido inmunizados o que han sido inmunizados con una composición inmunogénica que se encontraba disponible antes de la presente invención, pero posteriormente fueron infectados por el PVP y/o PRRSV particular.
La expresión "manifestaciones clínicas" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a manifestaciones de infección en un sujeto por el virus PVP y/o PRRSV. Las manifestaciones clínicas de infección dependen del patógeno seleccionado. Entre los ejemplos de dichas manifestaciones clínicas se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, leucopenia transitoria y fracaso reproductivo caracterizado por infección y muerte embrionaria y/o fetal reducidas, o combinaciones de las mismas. Entre los ejemplos de manifestaciones clínicas que son directamente observables se incluyen un tamaño de camada reducido, incremento de la incidencia de momificación del embrión o feto por camada, autolisis del embrión o feto, tamaño reducido del embrión o feto, peso reducido del embrión o feto, y similares, o combinaciones de los mismos. Entre los ejemplos adicionales de dichas manifestaciones clínicas se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, viremia incrementada, carga vírica incrementada en los tejidos y sangre diana, transmisión/propagación incrementada del PVP a compañeros de corral, y similares, o combinaciones de los mismos.
Preferentemente, se redujo la incidencia y gravedad de las manifestaciones clínicas en el sujeto tratado en comparación con sujetos que no habían sido tratados o que habían sido tratados con una composición inmunogénica que se encontraba disponible antes de la presente invención pero que posteriormente resultaron infectados por un virus PVP y/o PRRSV particular, causando una leucopenia transitoria y fracaso reproductivo caracterizado por infección y muerte embrionaria y/o fetal, o combinaciones de los mismos.
La expresión "que lo requiere" o "necesario" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a que la administración/tratamiento está asociado al refuerzo o mejora de la salud o manifestaciones clínicas o cualquier otro efecto médico positivo sobre la salud de los animales (incluyendo sus embriones o fetos) que reciben la composición inmunogénica de acuerdo con la presente invención.
Los términos "reductor", "reducido", "reducción" y "inferior" se utiliza intercambiablemente en la presente solicitud. El término "reducción" se refiere a que las manifestaciones clínicas se reducen en incidencia o gravedad en por lo menos 10 %, más preferentemente en por lo menos 20 %, todavía más preferentemente en por lo menos 30 %, todavía más preferentemente en por lo menos 40 %, todavía más preferentemente en por lo menos 50 %, todavía más preferentemente en por lo menos 60 %, todavía más preferentemente en por lo menos 70 %, todavía más preferentemente en por lo menos 80 %, todavía más preferentemente en por lo menos 90 %, todavía más preferentemente en por lo menos 95 % y lo más preferentemente en 100 % en comparación con sujetos que no han sido tratados (no inmunizados), pero que posteriormente han resultado infectados por el virus PVP y/o PRRSV particular.
En un aspecto de la presente invención, la composición inmunogénica, vacuna de combinación o combinación (o componentes separados del kit) tal como se describen y se reivindican en la presente memoria se administra en una ocasión. Se entiende que una dosis única se administra solo en una ocasión.
El volumen de dosis por sujeto depende de la vía de vacunación y de la edad del sujeto. Preferentemente, la dosis única presenta un volumen total de entre aproximadamente 0,2 ml y 2,5 ml, más preferentemente entre aproximadamente 0,2 ml y 2,0 ml, todavía más preferentemente entre aproximadamente 0,2 ml y 1,75 ml, todavía más preferentemente entre aproximadamente 0,2 ml y 1,5 ml, todavía más preferentemente entre aproximadamente 0,4 ml y 1,25 ml, todavía más preferentemente entre aproximadamente 0,4 ml y 1,0 ml, siendo más preferente una única dosis de 0,5 ml o de 1,0 ml. La dosis única más preferente presenta un volumen total de 0,5 ml, 1 ml, 1,5 ml o 2 ml.
En un aspecto de la presente invención, la composición inmunogénica, vacuna de combinación o combinación (o componentes separados del kit) tal como se describen y se reivindican en la presente memoria se administra en dos o más dosis.
Sin embargo, la composición inmunogénica, vacuna de combinación o combinación puede administrarse en dos o más dosis, en donde la primera dosis se administra antes que una segunda dosis (de refuerzo). Preferentemente, la segunda dosis se administra por lo menos 15 días después de la primera dosis. Más preferentemente, la segunda dosis se administra entre 15 días y 40 días después de la primera dosis. Todavía más preferentemente, la segunda dosis se administra por lo menos 17 días después de la primera dosis. Aún todavía más preferentemente, la segunda dosis se administra entre 17 días y 30 días después de la primera dosis. Todavía más preferentemente, la segunda dosis se administra por lo menos 19 días después de la primera dosis. Aún todavía más preferentemente, la segunda dosis se administra entre 19 días y 25 días después de la primera dosis. Lo más preferentemente, la segunda dosis se administra por lo menos 21 días después de la primera dosis. Todavía más preferentemente, la segunda dosis se administra entre 21 días después de la primera dosis o 21 días después de la primera dosis. En un aspecto preferente del régimen de administración de dos veces, la primera dosis y la segunda dosis de la composición inmunogénica se administran en la misma cantidad. Preferentemente, cada dosis se encuentra en las cantidades preferentes especificadas anteriormente, siendo más preferente una dosis de 1 ml o 2 ml para la primera y la segunda dosis. Además del régimen de primera y segunda dosis, una realización alternativa comprende dosis posteriores adicionales. Por ejemplo, podría administrarse una tercera, cuarta o quinta dosis en estos aspectos. Preferentemente, los regímenes posteriores de tercera, cuarta y quinta dosis se administran en la misma cantidad que la primera dosis, concordando el marco temporal entre las dosis con los tiempos entre la primera y segunda dosis mencionados anteriormente. Los regímenes de administración anteriormente indicados preferentemente se aplican únicamente a cerdas jóvenes. Las cerdas maduras preferentemente reciben únicamente la administración de la composición inmunogénica, vacuna de combinación o combinación en una sola ocasión/como una sola inyección.
En un aspecto de la presente invención, se selecciona el sujeto del grupo que consiste en cerdos, vacas, gatos y perros.
Preferentemente, el sujeto es un cerdo. Debe entenderse que cerdo incluye animales tanto hembra como macho. El esperma puede contener PVP y, por ello, los animales reproductores hembra y macho están comprendidos en el término "cerdos". De esta manera, el término "cerdos" comprende animales macho, tales como verracos, así como animales hembra, como cerdas jóvenes y cerdas maduras.
La expresión "cerda joven", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a un porcino, preferentemente un cerdo, antes y durante la primera gestación/embarazo. En contraste, la expresión "cerda madura", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a un porcino, preferentemente un cerdo, después del primer parto, como resultado positivo de su primera gestación/embarazo.
El volumen de dosis por sujeto depende de la vía de vacunación y de la edad del sujeto. Preferentemente, el volumen total es de entre aproximadamente 0,2 ml y 5 ml, más preferentemente de entre aproximadamente 0,5 ml y 3,0 ml, todavía más preferentemente de entre aproximadamente 1,0 y 2,5 ml, todavía más preferentemente de entre aproximadamente 1,0 ml y 2,0 ml. El volumen más preferente es de 1 ml, 1,5 ml, 2 ml o 2,5 ml en cada dosis.
La composición inmunogénica, vacuna de combinación o combinación (o componentes separados de un kit) preferentemente se administra por vía tópica o sistémicamente. Las rutas adecuadas de administración utilizadas convencionalmente son la administración oral o parenteral, tales como la vía intranasal, intravenosa, intradérmica, transdérmica, intramuscular, intraperitoneal y subcutánea, así como la inhalación. Sin embargo, dependiendo de la naturaleza y modo de acción del compuesto, la composición inmunogénica también puede administrarse por otras vías. Por ejemplo, entre dichas otras vías se incluyen las vías subcutánea, intravenosa, intravascular, intraarterial, intraperitoneal, intratecal, intratraqueal, subcutánea, intracardiaco, intralobar, intralobular, intramedular, intrapulmonar, intrarrectal e intravaginal. Sin embargo, más preferentemente la composición inmunogénica, vacuna de combinación o combinación se administra por vía subcutánea o intramuscular. Lo más preferentemente, la composición inmunogénica, vacuna de combinación o combinación se administra por vía intramuscular.
Segunda consideración de la presente exposición
En un aspecto, la presente exposición se refiere a un método para producir una composición inmunogénica que comprende una proteína recombinante, en la que el método comprende las etapas en el orden siguiente:
(i) proporcionar/obtener una mezcla que comprende:
o un primer líquido,
o proteína recombinante y/o estructuras cuaternarias compuestas de una pluralidad de dichas proteínas recombinantes, y
o un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico codificante de dicha proteína recombinante,
(ii) añadir un segundo líquido a la mezcla de la etapa (i), en la que el segundo líquido es diferente del primer líquido, (iii) lavar y, opcionalmente, finalmente concentrar, la proteína recombinante y/o las estructuras cuaternarias compuestas de una pluralidad de dichas proteínas recombinantes en la mezcla, mediante la adición suplementaria de segundo líquido adicional a la mezcla que resulta de la etapa (ii) y la eliminación de una parte del primer y/o segundo líquido en dicha mezcla combinada,
(iv) inactivar el vector mediante la adición de un agente inactivador a la mezcla que resulta de la etapa (iii), (v) neutralizar el agente inactivador mediante la adición de un agente neutralizante a la mezcla que resulta de la etapa (iv).
Para los fines de la presente exposición, un "primer líquido" se refiere a un medio líquido, acuoso o fluido utilizado típicamente en combinación con células, antígenos, composiciones inmunogénicas, vacunas y similares. Preferentemente, el primer líquido comprende medios de una composición antigénica; más preferentemente, el primer líquido comprende o preferentemente consiste en medios de cultivo celular utilizados para la producción de proteínas recombinantes en células huésped en cultivo. Dichas células huésped en cultivo pueden ser bacterias, levaduras, células de insecto, células animales y células de mamífero, resultando particularmente preferentes las células de insecto y de mamífero. De esta manera, el primer liquido puede comprender o consistir en medio para el cultivo de bacterias, levaduras, células de insecto, células animales o células de mamífero. Preferentemente, el medio celular es medio celular sin suero, y lo más preferentemente, el medio de cultivo es medio sin suero Excell 420 en el caso de que se utilicen células de insecto.
Un "segundo líquido", para los fines de la presente exposición, se refiere a cualquier líquido utilizado normalmente en combinación con células, antígenos, composiciones inmunogénicas, vacunas y similares, que sea diferente del primer líquido. Preferentemente, el segundo líquido es una solución acuosa, todavía más preferentemente, una solución farmacéuticamente aceptable, y aún todavía más preferentemente, un tampón, tal como una solución salina o tampón de fosfato o similar. Lo más preferentemente, el segundo líquido se caracteriza por no ser virucida frente a ningún virus vivo o bacteria viva, en el caso de que el virus vivo o bacteria viva se cultive o se almacene en dicho líquido.
El término "porción", para los fines de la presente exposición, se refiere a cualquier cantidad que no comprenda la cantidad total. Por ejemplo, una porción de líquido sería cualquier cosa inferior a 100 % del volumen del líquido, tal como 90 % del líquido, 80 % del líquido, 70 % del líquido, y todas las cantidades entre más de 0 % y menos de 100 %.
La expresión "proteína recombinante", para los fines de la presente exposición, se refiere a cualquier proteína recombinante, preferentemente una proteína VP2 del virus PVP, más preferentemente que comprende o que consiste en una secuencia que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 70 %, por lo menos 75 %, por lo menos 80 %, por lo menos 85 %, por lo menos 90 %, por lo menos 91 %, por lo menos 92 %, por lo menos 93 %, por lo menos 94 %, por lo menos 95 %, por lo menos 96 %, por lo menos 97 %, por lo menos 98 %, por lo menos 99 %, por lo menos 99,1 %, por lo menos 99,2 %, por lo menos 99,3 %, por lo menos 99,4 %, por lo menos 99,5 %, por lo menos 99,6 %, por lo menos 99,7 %, por lo menos 99,8 %, por lo menos 99,9 % o 100 % respecto a la secuencia de SEC ID n.° 1, SEC ID n.° 2 y/o SEC ID n.° 5 a n.° 16.
La expresión "estructuras cuaternarias", así como "estructuras cuaternarias compuestas de una pluralidad de dichas proteínas recombinantes", para los fines de la presente exposición, se refiere a una organización tridimensional de una pluralidad de dichas proteínas recombinantes, tal como partículas de tipo vírico y/o homotrímeros.
El término "vector", así como "vector que comprende una secuencia de ácido nucleico codificante de dicha proteína recombinante", para los fines de la presente exposición, se refiere a un vector de expresión adecuado, preferentemente un vector de expresión baculovirus, que a su vez se utiliza para la transfección, o en el caso de un vector de expresión baculovirus, para la infección, de una célula huésped para producir la proteína o polipéptido codificado por el ADN.
Los vectores y métodos para producir y/o utilizar vectores (o recombinantes) para la expresión pueden realizarse mediante, o ser análogos a, los métodos dados a conocer en las patentes US siguientes: n.° 4.603.112, n.° 4.769.330, n.° 5.174.993, n.° 5.505.941, n.° 5.338.683, n.° 5.494.807, n.° 4.722.848, n.° 5.942.235, n.° 5.364.773, n.° 5.762.938, n.° 5.770.212, n.° 5.942.235, n.° 382.425; las publicaciones de patente PCT n.° WO 94/16716, n.° WO 96/39491 y n.° WO 95/30018; y Paoletti, "Applications of pox virus vectors to vaccination: An update, "PNAS USA 93: 11349-11353, octubre de 1996; Moss, "Genetically engineered poxviruses for recombinant gene expression, vaccination, and safety", PNAS USA 93: 11341-11348, octubre de 1996; Smith et al., patente US n.° 4.745.051(baculovirus recombinante); Richardson, C. D. (Editor), Methods in Molecular Biology 39, "Baculovirus Expression Protocols" (1995 Humana Press Inc.); Smith et al., "Production of Human Beta Interferon in Insect Cells Infected with a Baculovirus Expression Vector", Molecular and Cellular Biology, December, 1983, vol. 3, n° 12, páginas 2156 a 2165; Pennock et al., "Strong and Regulated Expression of Escherichia coli B-Galactosidase in Infect Cells with a Baculovirus vector, "Molecular and Cellular Biology March 1984, vol. 4, n.° 3, página 406;documento n.° EPA0 370 573; solicitud de patente U.S. n.° 920.197, presentada el 16 de octubre de 1986; la publicación de patente EP n.° 265785; la patente US n.° 4.769.331 (herpesvirus recombinante); Roizman, "The function of herpes simplex virus genes: A primer for genetic engineering of novel vectors", PNAS USA 93:11307-11312, octubre de 1996; Andreansky et al., "The application of genetically engineered herpes simplex viruses to the treatment of experimental brain tumors," PNAS USA 93: 11313-11318, octubre de 1996; Robertson et al., "Epstein-Barr virus vectors for gene delivery to B lymphocytes", PNAS USA 93: 11334-11340, octubre de 1996; Frolov et al., "Alphavirus-based expression vectors: Strategies and applications," PNAS USA 93: 11371-11377, octubre de 1996; Kitson et al., J. Virol. 65, 3068-3075, 1991; patente US n.° 5.591.439, y n.° 5.552.143; documento n.° WO 98/00166; solicitudes concedidas de patente U.S. n.° de serie 08/675,556 y n.° 08/675,566, ambas presentadas el 3 de julio de 1996 (adenovirus recombinante); Grunhaus et al., 1992, "Adenovirus as cloning vectors," Seminars in Virology (vol. 3) páginas 237 a 252, 1993; Ballay et al. EMBO Journal, vol. 4, páginas 3861 a 3865, Graham, Tibtech 8, 85-87, abril de 1990; Prevec et al., J. Gen Virol. 70, 42434; documento de patente PCT n.° WO 91/11525; Felgner et al. (1994), J. Biol. Chem. 269, 2550-2561, Science, 259: 1745-49, 1993; and McClements et al., "Immunization with DNA vaccines encoding glycoprotein D or glycoprotein B, alone or in combination, induces protective immunity in animal models of herpes simplex virus-2 disease", PNAS USA 93: 11414-11420, octubre de 1996 y patentes US n.° 5.591.639, n.° 5.589.466 y n.° 5.580.859, así como los documentos n.° WO 90/11092, n.° WO 93/19183, n.° WO 94/21797, n.° WO 95/11307, n.° WO 95/20660; Tang et al., Nature y Furth et al., Analytical Biochemistry, referidos a los vectores de expresión de ADN, entre otros. Ver también el documento n.° WO 98/33510; Ju et al., Diabetologia, 41: 736-739, 1998 (sistema de expresión lentivírico); Sanford et al., patente U.S. n.° 4.945.050; Fischbachet al. (Intracel); documento n.° WO 90/01543; Robinson et al., Seminars in Immunology vol. 9, páginas 271 a 283 (1997), (sistemas de vector de ADN); Szoka et al., patente U.S. n.° 4.394.448 (método de inserción de ADN en células vivas); McCormick et al., patente U.S. n.° 5.677.178 (uso de virus citopáticos); y patente U.S. n.° 5.928.913 (vectores para la administración génica), así como otros documentos citados en la presente memoria.
Las células preferentes son aquellas susceptibles de infección con un vector vírico recombinante apropiado, que contiene un ADN de proteína recombinante y que expresa la proteína recombinante. Preferentemente, las células son células de insecto, y más preferentemente, incluyen las células de insecto comercializadas bajo la marca comercial de células de insecto SF+ (Protein Sciences Corporation, Meriden, CT). Los cultivos celulares preferentes presentan un recuento celular de entre aproximadamente 0,3 y 2,0*106 células/ml, más preferentemente de entre aproximadamente 0,35 y 1,9*106 células/ml, todavía más preferentemente de entre aproximadamente 0,4 y 1,8*106 células/ml, aún todavía más preferentemente de entre aproximadamente 0,45 y 1,7*106 células/ml, y lo más preferentemente, de entre aproximadamente 0,5 y 1,5*106 células/ml.
Entre los vectores víricos preferentes se incluyen baculovirus tales como BaculoGold (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, Calif.), en particular con la condición de que las células de producción sean células de insecto. Aunque resulta preferente el sistema de expresión baculovírico, el experto en la materia entenderá que funcionarán otros sistemas de expresión, incluyendo los descritos anteriormente, para los fines de la presente exposición, es decir, la expresión de la proteína recombinante.
El medio de crecimiento apropiado también será determinable por el experto en la materia, siendo un medio de crecimiento preferente un medio para células de insecto sin suero, tal como Excell 420 (JRH Biosciences, Inc., Lenexa, KS) y similares.
El vector vírico recombinante que contiene las secuencias de ADN de proteína recombinante presenta una multiplicidad de infección (MDI) preferente de entre aproximadamente 0,03 y 1,5, más preferentemente de entre aproximadamente 0,05 y 1,3, todavía más preferentemente de entre aproximadamente 0,09 y 1,1 y lo más preferentemente de entre aproximadamente 0,1 y 1,0, al utilizarlo para la infección de las células susceptibles. Preferentemente, los MDI mencionados anteriormente se refieren a un ml de líquido de cultivo celular. Preferentemente, el método indicado en la presente memoria comprende la infección de entre 0,35 y 1,9*106 células/ml, todavía más preferentemente de entre aproximadamente 0,4 y 1,8*106 células/ml, todavía más preferentemente de entre aproximadamente 0,45 y 1,7*106 células/ml, y lo más preferentemente, de entre aproximadamente 0,5 y 1,5xl06 células/ml, con un vector vírico recombinante que contiene un ADN de proteína recombinante y que expresa la proteína recombinante con una MDI (multiplicidad de infección) de entre aproximadamente 0,3 y 1,5, más preferentemente de entre aproximadamente 0,05 y 1,3, todavía más preferentemente de entre aproximadamente 0,09 y 1,1, y lo más preferentemente, de entre aproximadamente 0,1 y 1,0.
La porción del primer líquido puede eliminarse de la mezcla combinada de la etapa (iii) que comprende la proteína recombinante mediante una etapa de filtración mediante la utilización de un filtro. Sin embargo, puede utilizarse cualquier otro método conocido por el experto en la materia para eliminar la porción de cualquier líquido, incluyendo el primero y, en su caso, una porción del segundo líquido a partir de la mezcla combinada de la etapa (iii). Dicho método incluye, por ejemplo, aunque sin limitación, la centrifugación y/o la cromatografía. Sin embargo, la filtración es la más preferente. Un método de filtración preferente para eliminar dicha porción del primer líquido, o cualquier otro líquido, en su caso, comprende la ultrafiltración y/o la diafiltración. La ultrafiltración y la diafiltración son métodos estándares conocidos por el experto en la materia, descritos en detalle en, por ejemplo, Protein Purification Methods - A Practical Approach - editores: E.L. V. Harris y S. Angel, Oxford University Press 1995. En particular, en el capítulo 3 de dicho libro de texto se describen varios métodos y tipos de quipo, la totalidad de los cuales puede ser utilizada por un experto ordinario en la materia de una manera ejemplar para el propósito de la presente exposición.
La expresión "agente inactivador", para los fines de la presente exposición, se refiere a cualquier agente que pueda utilizarse en cualquier método convencional de inactivación. La inactivación puede llevarse a cabo mediante tratamientos químicos y/o físicos que sean conocidos por el experto en la materia. Entre los agentes inactivadores preferentes se incluyen la etilenimina binaria ciclizada (BEI), incluyendo una solución de hidrobromuro de 2-bromoetilenamina (BEA), que ha sido ciclizado en etilenimina binaria (BEI). Los agentes de inactivación química adicionales preferentes comprenden, aunque sin limitarse a ellos, Triton X-100, desoxicolato sódico, bromuro de cetiltrimetilamonio, p-propiolactona, timerosal, fenol y formaldehído (formalina).
La expresión "agente neutralizador" para los fines de la presente exposición se refiere a cualquier agente capaz de neutralizar los agentes inactivadores tal como se indica en la presente memoria de manera que el agente inactivador ya no sea capaz de inactivar el vector. El agente que neutraliza el agente inactivador es preferentemente tiosulfato sódico, bisulfito sódico o similar.
En otro aspecto, la presente exposición se refiere a un método tal como se indica en la presente memoria, en el que puede obtenerse la mezcla de la etapa (i) mediante un procedimiento que comprende las etapas siguientes:
(a) permitir la infección de células susceptibles en cultivo con un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico codificante de dicha proteína recombinante y/o estructuras cuaternarias compuestas de una pluralidad de dichas proteínas recombinantes, en la que dichas proteínas recombinantes y/o estructuras cuaternarias compuestas de una pluralidad de dichas proteínas recombinantes se expresa mediante dicho vector,
(b) recuperar seguidamente las proteínas recombinantes y/o estructuras cuaternarias compuestas de una pluralidad de dichas proteínas recombinantes a partir del cultivo celular, en el que preferentemente se separan los residuos celulares respecto de las proteínas recombinantes y/o estructuras cuaternarias compuestas de una pluralidad de dichas proteínas recombinantes mediante una etapa de separación, que preferentemente incluye una microfiltración a través de por lo menos un filtro, más preferentemente dos filtros, en la que por lo menos un filtro preferentemente presenta un tamaño de poro mayor que las proteínas recombinantes y/o estructuras cuaternarias compuestas de una pluralidad de dichas proteínas recombinantes, en particular presenta un tamaño de poro de entre aproximadamente 0,1 pm y aproximadamente 4 pm.
En otro aspecto, la presente exposición se refiere a un método tal como se describe en la presente memoria, en el que el cultivo celular en la etapa (a) se mantiene a 27±2°C, preferentemente durante la expresión por dicho vector de la proteína recombinante y/o estructuras cuaternarias compuestas de una pluralidad de dichas proteínas recombinantes, y/o en el que la recuperación en la etapa (b) ocurre 6 a 8 días, preferentemente 8 días, después de la inoculación de las células con el vector.
En otro aspecto, la presente exposición se refiere a un método tal como se indica en la presente memoria, en el que la etapa de separación incluye o consiste en:
• una microfiltración a través de por lo menos un filtro con un tamaño de poro de entre aproximadamente 2 pm y aproximadamente 4 pm, y/o
• una microfiltración a través de por lo menos un filtro con un tamaño de poro de entre aproximadamente 0,1 pm y aproximadamente 0,8 pm.
En otro aspecto, la presente exposición se refiere a un método tal como se describe en la presente memoria, en el que dicho primer líquido comprende una porción de medio de cultivo celular o consiste en medio de cultivo celular, y en el que el medio de cultivo celular preferentemente es medio de cultivo de células de insecto.
En otro aspecto, la presente exposición se refiere a un método tal como se describe en la presente memoria, en el que dicha proteína recombinante se selecciona del grupo que consiste en:
• una proteína VP2 del PVP que preferentemente comprende o consiste en una secuencia que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 70 %, por lo menos 75 %, por lo menos 80 %, por lo menos 85 %, por lo menos 90 %, por lo menos 91 %, por lo menos 92 %, por lo menos 93 %, por lo menos 94 %, por lo menos 95 %, por lo menos 96 %, por lo menos 97 %, por lo menos 98 %, por lo menos 99 %, por lo menos 99,1 %, por lo menos 99,2 %, por lo menos 99,3 %, por lo menos 99,4 %, por lo menos 99,5 %, por lo menos 99,6 %, por lo menos 99,7 %, por lo menos 99,8 %, por lo menos 99,9 % o 100 % respecto a la secuencia de SEC ID n.° 1, SEC ID n.° 2 y/o SEC ID n.° 5 a n.° 16.
En otro aspecto, la presente exposición se refiere a un método tal como se describe en la presente memoria, en el que dichas estructuras cuaternarias compuestas de una pluralidad de dichas proteínas recombinantes son partículas de tipo vírico o en el que dichas estructuras cuaternarias compuestas de una pluralidad de dichas proteínas recombinantes son homotrímeros.
En otro aspecto, la presente exposición se refiere a un método tal como se describe en la presente memoria, en el que el vector es un virus recombinante, preferentemente un baculovirus, y/o en el que la secuencia de ácido nucleico es una secuencia de ADN.
En otro aspecto, la presente exposición se refiere a un método tal como se describe en la presente memoria, en el que el vector que comprende un ácido nucleico codificante de dicha proteína recombinante y/o estructuras cuaternarias compuestas de una pluralidad de dichas proteínas recombinantes es un baculovirus recombinante, en el que dicho baculovirus comprende una secuencia de ADN codificante de dicha proteína recombinante y/o estructuras cuaternarias compuestas de una pluralidad de dichas proteínas recombinantes.
En otro aspecto, la presente exposición se refiere a un método tal como se describe en la presente memoria, en el que, en la etapa (iii), dicha proteína recombinante y/o dichas estructuras cuaternarias compuestas de una pluralidad de dichas proteínas recombinantes, se lavan con por lo menos 2x, preferentemente de 2x a 3x, de segundo líquido, y opcionalmente se concentran finalmente, en comparación con el volumen original de dicha proteína recombinante y/o dichas estructuras cuaternarias compuestas de una pluralidad de dichas proteínas recombinantes en la mezcla de la etapa (i). Más preferentemente, en la etapa (ii), dicha etapa o etapas de lavado, es decir, el procedimiento de diafiltración, se llevan a cabo a una temperatura inferior a 37°C, más preferentemente a una temperatura inferior a 30°C, todavía más preferentemente a una temperatura inferior a 20°C, todavía más preferentemente a una temperatura inferior a 10°C, tal como, por ejemplo, a una temperatura de entre 4°C y 29°C, por ejemplo de 27°C o 4°C. De esta manera, se reduce significativamente el grado de precipitación (agregación).
En otro aspecto, la presente exposición se refiere a un método tal como se describe en la presente memoria, en el que en la etapa (iii), la porción del primer y/o segundo líquido se elimina de la mezcla mediante filtración, en la que preferentemente se utiliza un filtro o un filtro hueco que comprende una membrana semipermeable que presenta un tamaño de poro medio que es más pequeño que dicha proteína recombinante y/o que dichas estructuras cuaternarias compuestas de una pluralidad de dichas proteínas recombinantes, y/o evita el paso de la mayoría, preferentemente sustancialmente la totalidad, de las proteínas de 20 a 500 kDa de tamaño a través de la membrana semipermeable.
El filtro puede ser cualquier filtro convencional de la técnica. Preferentemente, dicho filtro incluye una membrana semipermeable. En una forma preferente adicional, dicha membrana semipermeable presenta un tamaño de poro medio que es más pequeño que la proteína recombinante, evitando de esta manera el paso de por lo menos 90 % de dicha proteína recombinante a través de los poros de dicha membrana semipermeable y reteniendo la proteína recombinante por medio del filtro.
En un aspecto adicional, dicho filtro presenta un tamaño de poro medio que evita el paso de por lo menos 90 % de las proteínas de 20 a 500 kDa de tamaño, más preferentemente, dicho filtro presenta un tamaño de poro que evita el paso de por lo menos 90 % de las proteínas de 50 a 400 kDa de tamaño, y lo más preferentemente, dicho filtro presenta un tamaño de poro medio que evita el paso de por lo menos 90 % de las proteínas de 75 a 300 kDa de tamaño. Dicho tamaño de poro resulta preferente cuando la proteína recombinante se produce como virus completo o como partículas de tipo vírico. En un aspecto todavía adicional, dicha membrana semipermeable incluye un material seleccionado del grupo que consiste en polisulfona, poliétersulfona y celulosa regenerada. Sin embargo, puede utilizarse cualquier otro material que permita eliminar una parte del primer líquido y, en el caso de una etapa de un procedimiento múltiple, eliminar una mezcla de primer y segundo líquidos respecto de la proteína recombinante. Dicho filtro puede seleccionarse del grupo que consiste en un cartucho de ultrafiltración de membrana de fibra hueca, láminas planas o un casete, siendo particularmente preferente un cartucho de ultrafiltración de membrana de fibra hueca.
Un segundo líquido preferente que debe utilizarse en cualquier de los métodos descritos es un tampón, preferentemente un tampón fisiológicamente aceptable, resultando particularmente preferente la solución salina.
En otro aspecto, la presente exposición se refiere a un método tal como se describe en la presente memoria, en el que el segundo líquido es una solución tampón, preferentemente solución salina tamponada con fosfato de lavado (WPBS, por sus siglas en inglés).
La etapa de concentración y la etapa de adición de líquido del método tal como se describen en la presente memoria pueden llevarse a cabo de manera sustancialmente simultánea o, alternativamente, la etapa de concentración y la etapa de adición de líquido se llevan a cabo secuencialmente.
En el caso de que la etapa de concentración y la etapa de adición de líquido se lleven a cabo secuencialmente, el orden de las etapas no es importante. Por ejemplo, en un aspecto adicional, la etapa de adición de líquido ocurre antes de dicha etapa de concentración y, en un aspecto alternativo, la etapa de concentración ocurre antes de dicha etapa de adición de líquido. La etapa de adición de líquido y la etapa de concentración, con independencia del orden en que se lleven a cabo, pueden realizarse múltiples veces. Por ejemplo, cada una de dichas etapas respectivas puede llevarse a cabo por lo menos dos, por lo menos tres, por lo menos cuatro, por lo menos cinco, por lo menos 10 y hasta tantas veces como se desee. En un aspecto, la etapa de concentración y la etapa de adición de líquido se llevan a cabo, cada una, por lo menos dos veces. En otro aspecto, la etapa de concentración y la etapa de adición de líquido se llevan a cabo, cada una, por lo menos tres veces.
La etapa de concentración de los métodos proporcionados en la presente memoria puede llevarse a cabo de manera que la proteína recombinante se concentre 3X a 50X respecto al volumen de dicho primer líquido. Más preferentemente, dicha etapa de concentración puede llevarse a cabo de manera que la proteína recombinante se concentre 4X a 20X respecto al volumen de dicho primer líquido. Lo más preferentemente, dicha etapa de concentración puede llevarse a cabo de manera que la proteína recombinante se concentre 7X a 10X respecto al volumen del primer líquido.
En otro aspecto, la presente exposición se refiere a un método tal como se describe en la presente memoria, en el que el volumen del segundo líquido añadido en la etapa (ii) es aproximadamente igual al volumen del primer y/o segundo líquidos eliminados en la etapa (iii). En otras palabras, no se lleva a cabo y/o no se requiere ninguna etapa de concentración.
En el caso de que se utilicen vectores víricos, tales como poxvirus, adenovirus o baculovirus recombinante, para producir la proteína recombinante, se recomienda inactivar el ácido nucleico vírico mediante un tratamiento adecuado de inactivación. Dicha inactivación puede producirse en cualquier momento durante la purificación de la proteína recombinante. De esta manera, la inactivación puede realizarse inmediatamente después de la recolección del líquido de cultivo celular que comprende la proteína recombinante o después de la microfiltración de la proteína recombinante, en el caso de que se lleve a cabo la microfiltración; antes o después de la etapa de purificación, por ejemplo, antes o después de la filtración en gel, y antes o después de la cromatografía de intercambio aniónico, en caso de que se lleve a cabo.
Puede utilizarse cualquier método convencional de inactivación para los fines de la presente exposición. De esta manera, la inactivación puede llevarse a cabo mediante tratamientos químicos y/o físicos. En formas preferentes, el volumen de líquidos recolectados se determina y la temperatura se lleva entre aproximadamente 32°C y 42°C, más preferentemente entre aproximadamente 34°C y 4o°C, y lo más preferentemente entre aproximadamente 35°C y 39°C. Entre los métodos de inactivación preferentes se incluyen la adición de etilenimina binaria ciclizada (BEI, por sus siglas en inglés), preferentemente a una concentración de entre aproximadamente 1 mM y aproximadamente 20 mM, preferentemente de entre aproximadamente 2 mM y aproximadamente 10 mM, todavía más preferentemente de entre aproximadamente 2 mM y aproximadamente 8 mM, todavía más preferentemente de entre aproximadamente 3 mM y aproximadamente 7 mM, y lo más preferentemente de aproximadamente 5 mM. Por ejemplo, la inactivación incluye la adición de una solución de hidrobromuro de 2-bromoetilenamina (BEA, por sus siglas en inglés), preferentemente a una concentración aproximada de 0,4 M, que ha sido ciclizada formando etilenimina binaria (BEl) 0,2 M en NaOH 0,3 N, a los líquidos, proporcionando una concentración final de aproximadamente 5 mM de BEI. Preferentemente, los líquidos seguidamente se someten a agitación continua durante 2 a 96 horas y los líquidos recolectados inactivados pueden almacenarse congelados a -40°C o a una temperatura inferior, o entre aproximadamente 1°C y 7°C. Tras completar la inactivación, se añade una solución de tiosulfato sódico, preferentemente a 1,0 M, para neutralizar cualquier BEI residual. Preferentemente, el tiosulfato sódico se añade en una cantidad equivalente al BEI añadido anteriormente para la inactivación. Por ejemplo, en el caso de que se añada BEI hasta una concentración final de 5 mM, se añade una solución de tiosulfato sódico 1,0 M para obtener una concentración mínima final de 5 mM para neutralizar cualquier BEI residual.
En otro aspecto, la presente exposición se refiere a un método tal como se describe en la presente memoria, en el que el agente inactivador es un compuesto de aziridina, preferentemente etilenimina binaria (BEI), y/o en el que el agente inactivador se añade en exceso molar respecto al vector.
En otro aspecto, la presente exposición se refiere a un método tal como se describe en la presente memoria, en el que el agente neutralizador es tiosulfato sódico y/o en el que se añade el agente neutralizador en exceso molar en relación al agente inactivador.
En otro aspecto, la presente exposición se refiere a un método tal como se describe en la presente memoria, en el que dicho método comprende, además, la etapa de combinar la mezcla que queda después de la etapa (v) con un compuesto adicional seleccionado del grupo que consiste en portadores, adyuvantes, diluyentes, excipientes y combinaciones de los mismos farmacéuticamente aceptables.
En otro aspecto, la presente exposición se refiere a un método tal como se describe en la presente memoria, en el que la actividad virucida de la mezcla que resulta de dicho método se reduce en por lo menos 10 % respecto a la mezcla que no se ha sometido a dicho método, y/o en el que la composición inmunogénica producida mediante dicho método causa una pérdida inferior a 1 log TCID50 por ml de virus vivo, en el caso de que se mezcle virus vivo con la composición inmunogénica durante dos o más horas.
En otro aspecto, la presente exposición se refiere a un método tal como se describe en la presente memoria, en el que el virus vivo es virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRS).
En otro aspecto, la presente exposición se refiere a un método tal como se describe en la presente memoria, en el que el método comprende, además, la etapa (vi) de recolección de la proteína recombinante y/o de las estructuras cuaternarias compuestas de una pluralidad de dichas proteínas recombinantes que quedan después de la etapa (v), y en particular que comprende, además, la etapa de purificar lo recolectado, que comprende la proteína recombinante y/o las estructuras cuaternarias compuestas de una pluralidad de dichas proteínas recombinantes, mediante un procedimiento cromatográfico, preferentemente cromatografía de exclusión por tamaño.
En otro aspecto, la presente exposición se refiere a un método tal como se describe en la presente memoria, en el que el método comprende, además, la etapa de combinar la proteína recombinante recolectada (purificada) y/o las estructuras cuaternarias compuestas de una pluralidad de dichas proteínas recombinantes con por lo menos un antígeno adicional.
En otro aspecto, la presente exposición se refiere a un método tal como se describe en la presente memoria, en el que el antígeno o antígenos adicionales es virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRS).
En un aspecto adicional, el método comprende, además, la etapa de recolectar la proteína recombinante obtenido después de que por lo menos una parte de dicho primer líquido se elimine de dicha proteína recombinante.
Tal como se utiliza en la presente memoria, "recolectar" o "recolectado" se refiere a recoger o recuperar la proteína recombinante. Puede utilizarse cualquier método convencional conocido de la técnica para recuperar la proteína recombinante, sea al producir una proteína recombinante para el uso con los métodos y composiciones de la presente exposición, sea al someter la proteína recombinante a los métodos descritos en la presente memoria. En un modo de recolección particularmente preferente, la parte de dicho primer líquido se separa de dicha proteína recombinante mediante una etapa de filtración y la proteína recombinante se recupera o se recolecta a partir del retenido del filtro. En una forma más preferente, se recolecta o se recoge la proteína recombinante, o se recupera a partir del retenido de la membrana semipermeable con el tamaño de poro indicado en la presente memoria.
La proteína recombinante que queda después de realizar los métodos proporcionados en la presente memoria, preferentemente después de recolectarla del retenido de filtro, se mezcla con un componente adicional seleccionado del grupo que consiste en portadores, adyuvantes, diluyentes y excipientes farmacéuticamente aceptables, y combinaciones de los mismos. Preferentemente, dicho componente adicional es un adyuvante, todavía más preferentemente, dicho adyuvante es un polímero de ácido acrílico o metacrílico, y todavía más preferentemente, dicho adyuvante es un carbómero.
En un aspecto adicional de la presente solicitud, el método descrito anteriormente comprende, además, las etapas de mezclar la proteína recombinante obtenida después de las etapas de inactivación y neutralización con un componente adicional seleccionado del grupo que consiste en portadores, adyuvantes, diluyentes y excipientes farmacéuticamente aceptables, y combinaciones de los mismos. Antes de la mezcla de la proteína recombinante purificada con un adyuvante, también se recomienda dializar la proteína recombinante purificada frente a solución salina tamponada con fosfato, pH 7,4, o cualquier otro tampón fisiológico.
Tal como se utiliza en la presente memoria, "un portador farmacéuticamente aceptable" y un "portador veterinariamente aceptable" incluye todos y cada uno de los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, adyuvantes, agentes estabilizadores, diluyentes, conservantes, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos, agentes retardantes de la adsorción, y similares.
Entre los "adyuvantes", tal como se utilizan en la presente memoria, pueden incluirse hidróxido de aluminio y fosfato de aluminio, saponinas, p. ej., Quil A, QS-21 (Cambridge Biotech Inc., Cambridge, MA), GPI-0100 (Galénica Pharmaceuticals, Inc., Birmingham, AL), emulsión de agua en aceite, emulsión de aceite en agua y emulsión de agua en aceite en agua. La emulsión puede basarse en particular en aceite de parafina líquido ligero (tipo Farmacopea europea); aceite isoprenoide, tal como escualano o escualeno, aceite resultante de la oligomerización de alquenos, en particular de isobuteno o deceno; ésteres de ácidos o de alcoholes que contienen un grupo alquilo lineal, más particularmente aceites vegetales, oleato de etilo, di-(caprilato/caprato) de propilenglicol, tri-(caprilato/caprato) de glicerilo o dioleato de propilenglicol; ésteres de ácidos grasos o alcoholes ramificados, en particular ésteres de ácido isosteárico. El aceite se utiliza en combinación con emulsionantes para formar la emulsión. Los emulsionantes preferentemente son surfactantes no iónicos, en particular ésteres de sorbitán, de manida (p. ej., oleato de anhidromanitol), de glicol, de poliglicerol, de propilenglicol y de ácido oleico, isoesteárico, ricinoleico o hidroxiesteárico, que opcionalmente están etoxilados, y bloques de copolímero de polioxipropileno-polioxietileno, en particular los productos Pluronic, especialmente L l2 l. Ver Hunter et al., The Theory and Practical Application of Adjuvants (ed. Stewart-Tull, D. E. S.). JohnWiley and Sons, NY, páginas 51 a 94 (1995) yTodd et al., Vaccine 15:564-570 (1997). Por ejemplo, resulta posible utilizar la emulsión PST indicada en la página 147 de "Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach", editada por M. Powell y M. Newman, Plenum Press, 1995, y la emulsión MF59 indicada en la página 183 de esta misma obra. Entre los adyuvantes adecuados adicionales se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, el sistema de adyuvantes RIBI (Ribi Inc.), copolímero en bloque (CytRx, Atlanta, GA), SAF-M (Chiron, Emeryville, CA), lípido A monofosforilado, adyuvante de lípido avridina-amina, enterotoxina termolábil de E. coli (recombinante o de otro tipo), toxina del cólera, IMS 1314 o dipéptido muramilo, entre muchos otros. Entre los copolímeros de anhídrido maleico y derivado alquenilo se encuentran los copolímeros EMA (Monsanto), que son copolímeros de anhídrido maleico y etileno. La disolución de dichos polímeros en agua conduce a una solución ácida que se neutralizará, preferentemente a pH fisiológico, con el fin de proporcionar la solución de adyuvante en la que se incorporará la composición inmunogénica, inmunitaria o de vacuna misma.
Un caso adicional de adyuvante es un compuesto seleccionado de entre los polímeros del ácido acrílico o metacrílico y los copolímeros de anhídrido maleico y derivado alquenilo. Los compuestos adyuvantes ventajosos son los polímeros de ácido acrílico o metacrílico que están entrecruzados, especialmente con éteres de polialquenilo de azúcares o polialcoholes. Dichos compuestos se conocen por el término carbómero (Pharmeuropa vol. 8, n.° 2, junio de 1996). El experto en la materia también puede hacer referencia a la patente U. S. n.° 2.909.462 que describe dichos polímeros acrílicos entrecruzados con un compuesto polihidroxilado con por lo menos 3 grupos hidroxilo, preferentemente no más de 8, en el que los átomos de hidrógeno de por lo menos tres hidroxilo son sustituidos por radicales alifáticos insaturados que presentan por lo menos 2 átomos de carbono. Los radicales preferentes son los que contienen entre 2 y 4 átomos de carbono, p. ej., vinilos, alilos y otros grupos etilénicamente insaturados. Los radicales insaturados pueden contener, a su vez, otros sustituyentes, tales como metilo. Los productos comercializados bajo el nombre Carbopol (BF Goodrich, Ohio, EE. UU.) resultan particularmente apropiados. Están entrecruzados con una alilsucrosa o con alilpentaeritritol. Entre ellos pueden mencionarse los Carbopol 974P, 934P y 971P. Más preferentemente se utiliza Carbopol 971P.
Entre los "diluyentes" pueden incluirse agua, solución salina, dextrosa, etanol, glicerol y similares. Entre los agentes isotónicos pueden incluirse cloruro sódico, dextrosa, manitol, sorbitol y lactosa, entre otros. Entre los estabilizantes se incluyen albúmina y sales alcalinas de ácido etilendiaminotetracético, entre otros.
Un "conservante" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un agente antimicrobiológico activo, tal como, por ejemplo, gentamicina, mertiolato y similares. En particular, la adición de un conservante resulta más preferente para la preparación de una composición multidosis. Dichos agentes activos antimicrobiológicos se añaden a concentraciones eficaces para prevenir cualquier contaminación microbiológica de la composición de interés o para la inhibición de cualquier crecimiento microbiológico dentro de la composición de interés.
Puede conseguirse una purificación adicional de la proteína recombinante mediante procedimientos cromatográficos, preferentemente mediante un procedimiento cromatográfico en dos etapas. En el caso de que la proteína recombinante se ensamble con partículas de tipo vírico (VLP), una etapa, preferentemente la primera, es preferentemente una cromatografía de exclusión por tamaños (filtración en gel), que puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante la utilización de una matriz de Sephacryl S300. En el uso a escala de laboratorio de HiPrep26/60, las columnas de Sephacryl S300Hr son las más preferentes. Sin embargo, puede utilizarse cualquier otra matriz de cromatografía de exclusión por tamaños conocida por el experto en la materia, que permita la separación de las VLP de proteína recombinante a partir del filtrado o sobrenadante de cultivo. Se describen matrices adecuadas en, por ejemplo, E.L.V. Harris y S. Angel (editores), Protein purification methods - a practical approach, IRL Press Oxford 1995). La cromatografía de filtración en gel puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante la carga de la columna con la preparación en bruto que comprende la proteína recombinante con un caudal de 1,0 ml/min y eluyendo la columna con un volumen de 1,5 columnas de un tampón que comprende Tris 20 mM, pH 6,5, y DTT 5 mM. Sin embargo, la proteína recombinante también puede purificarse mediante la utilización de cromatografía de afinidad, por ejemplo, mediante unión selectiva a un anticuerpo específico de proteína recombinante inmovilizada, o mediante cualquier otro método conocido por el experto en la materia.
Con el fin de obtener un grado de pureza más elevada, puede llevarse a cabo una segunda etapa de cromatografía, que, sin embargo, es diferente de la primera. Por ejemplo, en el caso de que la primera etapa de purificación/etapa de cromatografía sea la exclusión por tamaños (filtración en gel), la segunda etapa debería ser diferente, p. ej., una cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio iónico, etc. Preferentemente, en el caso de que la primera etapa para purificar la proteína recombinante sea una cromatografía de exclusión por tamaños (filtración en gel, la segunda etapa puede ser de cromatografía de intercambio iónico, preferentemente cromatografía de intercambio aniónico (AIEX). Una matriz de cromatografía de intercambio aniónico preferente para la purificación de la proteína recombinante es la sefarosa Q. A escala pequeña, de aproximadamente 50 ml, resulta más preferente la utilización de columnas HiTrap Q Sepharose HP de 5 ml.
La presente solicitud no solo da a conocer métodos para producir una composición inmunogénica que contiene proteína recombinante, también se refiere a una composición inmunogénica que contiene proteína recombinante.
En otro aspecto, la presente exposición se refiere a una composición inmunogénica que puede obtenerse mediante un método tal como se describe en la presente memoria.
En un aspecto adicional, la actividad virucida de la composición inmunogénica que contiene proteína recombinante producida mediante los métodos en la presente memoria se reduce en por lo menos 10 % respecto a una composición inmunogénica que contiene proteína recombinante y que no se ha sometido a dicho método de producción. Más preferentemente, la actividad virucida de la composición inmunogénica que contiene proteína recombinante se reduce en por lo menos 50 % respecto a la actividad de una composición inmunogénica que contiene proteína recombinante y que no se ha sometido a dicho método de producción. Todavía más preferentemente, la actividad virucida de la composición inmunogénica que contiene proteína recombinante se reduce en por lo menos 70 % respecto a una composición inmunogénica que contiene proteína recombinante y que no se ha sometido a dicho método de producción. Aún todavía más preferentemente, la actividad virucida de la composición inmunogénica que contiene proteína recombinante se reduce en por lo menos 90 % respecto a una composición inmunogénica que contiene proteína recombinante y que no se ha sometido a dicho método de producción.
Para el propósito de la presente exposición, la expresión "actividad virucida" se refiere a que un líquido, fluido, solución, composición o similar inactiva o mata los virus vivos o las bacterias vivas en una medida determinada, cuando dicho líquido, fluido, solución, composición o similar se mezcla con dichos virus vivos o bacterias vivas. De esta manera, una reducción de la actividad virucida de un líquido, fluido, solución, composición o similar en por lo menos 10 % significa que la tasa de supervivencia de los virus vivos o de las bacterias vivas es 90 % más alta en un líquido, fluido, solución, composición o similar que se ha sometido a cualquiera de los métodos de producción descritos en la presente memoria, en comparación con un líquido, fluido, solución, composición o similar que no se ha sometido a ninguno de dichos métodos de producción.
La composición inmunogénica de proteína recombinante producida mediante el método descrito en la presente memoria causa una pérdida de menos de 1 log TCID50 de un virus vivo o de menos de 1 log UFC por ml de una bacteria viva, cuando el virus vivo o la bacteria viva se mezcla con la composición inmunogénica de proteína recombinante y se incuba durante 2 o más horas, preferentemente durante más de 4 horas, todavía más preferentemente durante más de 12 horas, todavía más preferentemente durante más de 24 horas, todavía más preferentemente durante más de 2 días, todavía más preferentemente durante más de 4 días, todavía más preferentemente durante más de 7 días, todavía más preferentemente durante más de 2 semanas, todavía más preferentemente durante más de 4 semanas, todavía más preferentemente durante más de 2 meses, todavía más preferentemente durante más de 3 meses, todavía más preferentemente durante más de 4 meses, todavía más preferentemente durante más de 6 meses, todavía más preferentemente durante más de 9 meses, todavía más preferentemente durante más de 12 meses, todavía más preferentemente durante más de 18 meses, lo más preferentemente durante más de 2 años. Más preferentemente, la composición inmunogénica de proteína recombinante producida mediante el método descrito en la presente memoria causa una pérdida de menos de 0,9 log TCID50 de un virus vivo o de menos de 0,9 log UFC por ml de una bacteria viva, cuando el virus vivo o la bacteria viva se mezcla con la composición inmunogénica de proteína recombinante y se incuba durante 2 o más horas, preferentemente durante más de 4 horas, todavía más preferentemente durante más de 12 horas, todavía más preferentemente durante más de 24 horas, todavía más preferentemente durante más de 2 días, todavía más preferentemente durante más de 4 días, todavía más preferentemente durante más de 7 días, todavía más preferentemente durante más de 2 semanas, todavía más preferentemente durante más de 4 semanas, todavía más preferentemente durante más de 2 meses, todavía más preferentemente durante más de 3 meses, todavía más preferentemente durante más de 4 meses, todavía más preferentemente durante más de 6 meses, todavía más preferentemente durante más de 9 meses, todavía más preferentemente durante más de 12 meses, todavía más preferentemente durante más de 18 meses, lo más preferentemente durante más de 2 años. Todavía más preferentemente, la composición inmunogénica de proteína recombinante producida mediante el método descrito en la presente memoria causa una pérdida de menos de 0,7 log TCID50 de un virus vivo o de menos de 0,7 log UFC por ml de una bacteria viva, cuando el virus vivo o la bacteria viva se mezcla con la composición inmunogénica de proteína recombinante y se incuba durante 2 o más horas, preferentemente durante más de 4 horas, todavía más preferentemente durante más de 12 horas, todavía más preferentemente durante más de 24 horas, todavía más preferentemente durante más de 2 días, todavía más preferentemente durante más de 4 días, todavía más preferentemente durante más de 7 días, todavía más preferentemente durante más de 2 semanas, todavía más preferentemente durante más de 4 semanas, todavía más preferentemente durante más de 2 meses, todavía más preferentemente durante más de 3 meses, todavía más preferentemente durante más de 4 meses, todavía más preferentemente durante más de 6 meses, todavía más preferentemente durante más de 9 meses, todavía más preferentemente durante más de 12 meses, todavía más preferentemente durante más de 18 meses, lo más preferentemente durante más de 2 años. Todavía más preferentemente, la composición inmunogénica de proteína recombinante producida mediante el método descrito en la presente memoria causa una pérdida de menos de 0,5 log TCID50 de un virus vivo o de menos de 0,5 log UFC por ml de una bacteria viva, cuando el virus vivo o la bacteria viva se mezcla con la composición inmunogénica de proteína recombinante y se incuba durante 2 o más horas, preferentemente durante más de 4 horas, todavía más preferentemente durante más de 12 horas, todavía más preferentemente durante más de 24 horas, todavía más preferentemente durante más de 2 días, todavía más preferentemente durante más de 4 días, todavía más preferentemente durante más de 7 días, todavía más preferentemente durante más de 2 semanas, todavía más preferentemente durante más de 4 semanas, todavía más preferentemente durante más de 2 meses, todavía más preferentemente durante más de 3 meses, todavía más preferentemente durante más de 4 meses, todavía más preferentemente durante más de 6 meses, todavía más preferentemente durante más de 9 meses, todavía más preferentemente durante más de 12 meses, todavía más preferentemente durante más de 18 meses, lo más preferentemente durante más de 2 años. Todavía más preferentemente, la composición inmunogénica de proteína recombinante producida mediante el método descrito en la presente memoria causa una pérdida de menos de 0,3 log TCID50 de un virus vivo o de menos de 0,3 log UFC por ml de una bacteria viva, cuando el virus vivo o la bacteria viva se mezcla con la composición inmunogénica de proteína recombinante y se incuba durante 2 o más horas, preferentemente durante más de 4 horas, todavía más preferentemente durante más de 12 horas, todavía más preferentemente durante más de 24 horas, todavía más preferentemente durante más de 2 días, todavía más preferentemente durante más de 4 días, todavía más preferentemente durante más de 7 días, todavía más preferentemente durante más de 2 semanas, todavía más preferentemente durante más de 4 semanas, todavía más preferentemente durante más de 2 meses, todavía más preferentemente durante más de 3 meses, todavía más preferentemente durante más de 4 meses, todavía más preferentemente durante más de 6 meses, todavía más preferentemente durante más de 9 meses, todavía más preferentemente durante más de 12 meses, todavía más preferentemente durante más de 18 meses, lo más preferentemente durante más de 2 años. La TCID50 por ml puede estimarse mediante un ensayo estándar de titulación in vitro que permita la estimación de la cantidad de un virus vivo. Las UFC por ml pueden estimarse mediante un ensayo estándar de titulación in vitro que permita la estimación de la cantidad de una bacteria viva. La expresión "por ml" preferentemente se refiere a 1 ml de un líquido. Dicha proteína recombinante purificada no solo muestra una actividad virucida reducida, tal como se define en la presente memoria, sino que también muestra una inmunogenicidad incrementada en comparación con una proteína recombinante no purificada tal como se define en la presente memoria, preferentemente dicha proteína recombinante incrementa la respuesta inmunitaria celular y/o de anticuerpos en por lo menos 10 %, preferentemente en por lo menos 20 %, más preferentemente en por lo menos 30 %, todavía más preferentemente en por lo menos 40 %, todavía más preferentemente en por lo menos 50 %, todavía más preferentemente en por lo menos 75 %, todavía más preferentemente en por lo menos 100 % respecto a la respuesta inmunitaria celular y/o de anticuerpos inducida por una composición inmunogénica de referencia que comprenda una proteína recombinante no purificada.
Las composiciones inmunogénicas que comprenden la proteína recombinante purificada, preferentemente las que pueden obtenerse mediante los métodos descritos en la presente memoria, se caracterizan por una inmunogenicidad incrementada en comparación con una composición inmunogénica que no comprenda dicha proteína recombinante purificada.
Además, la expresión "inmunogenicidad incrementada o inmunogenicidad mejorada", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a que la respuesta inmunitaria causada por una composición inmunogénica que comprende un antígeno de interés está incrementada respecto a una composición inmunogénica de referencia que comprende un antígeno diferente o un grado de pureza diferente del antígeno, sea esta respuesta inmunitaria de tipo celular o mediada por anticuerpos. Según una realización preferente, la expresión "inmunogenicidad incrementada" o "inmunogenicidad mejorada" significa que la respuesta inmunitaria mediada por anticuerpos que induce una composición inmunogénica que comprende el antígeno de interés está incrementada respecto a la de una composición inmunogénica de referencia que comprende un antígeno diferente o un grado de pureza diferente del antígeno. A este respecto, la respuesta inmunitaria mediada por anticuerpos se refiere a que la producción de anticuerpos que son específicos del antígeno de interés está incrementada respecto a la producción de anticuerpos inducida por una composición inmunogénica de referencia que comprende un antígeno diferente o un grado de pureza diferente del antígeno.
El término "incrementado" significa que la respuesta inmunitaria celular y/o mediada por anticuerpo está incrementada en por lo menos 10 %, preferentemente en por lo menos 20 %, más preferentemente en por lo menos 30 %, todavía más preferentemente en por lo menos 40 %, todavía más preferentemente en por lo menos 50 %, todavía más preferentemente en por lo menos 75 %, todavía más preferentemente en por lo menos 100 %, respecto a la respuesta inmunitaria celular y/o mediada por anticuerpos que induce una composición inmunogénica de referencia que comprende una proteína recombinante o un grado de pureza diferente de la proteína recombinante.
Está comprendido dentro de los conocimientos generales que posee el experto en la materia cómo medir la respuesta inmunitaria celular y/o mediada por anticuerpos. En particular, resulta evidente para dicho experto en la materia la comparación de la respuesta inmunitaria celular de la composición inmunogénica de interés con la respuesta inmunitaria celular de la referencia, o la respuesta inmunitaria mediada por anticuerpos de la composición inmunogénica de interés con la de la composición de referencia, pero la respuesta inmunitaria celular de una composición inmunogénica de interés respecto a la respuesta inmunitaria mediada por anticuerpos de la referencia, o viceversa. Además, la respuesta inmunitaria celular puede medirse, por ejemplo, mediante la medición de la activación de las células T citotóxicas por una composición inmunogénica/antígeno de interés. La respuesta inmunitaria mediada por anticuerpos puede medirse, por ejemplo, mediante la medición de la cantidad de anticuerpos específicos de antígeno generados debido a la administración en un animal de la composición inmunogénica que comprende dicho antígeno. La respuesta inmunitaria celular y/o mediada por anticuerpos puede medirse, por ejemplo, mediante la utilización de un modelo de ratón. Según la exposición actual, el modelo de ratón se utiliza como el método de referencia.
La expresión "composición inmunogénica" se refiere, aunque sin limitación, a una composición de materia que comprende por lo menos un antígeno que induce una respuesta inmunitaria celular y/o mediada por anticuerpos en un huésped contra el antígeno de interés. Habitualmente, una "respuesta inmunitaria" incluye, aunque sin limitación, uno o más de los efectos siguientes: producción o activación de anticuerpos, células B, células T ayudantes, células T supresoras y/o células T citotóxicas y/o células T gamma-delta, dirigidas específicamente contra un antígeno o antígenos incluidos en la composición o vacuna de interés. Preferentemente, el huésped mostrará una respuesta inmunitaria terapéutica o protectora, de manera que se potencia la resistencia a la nueva infección y/o se reduce la gravedad clínica de la enfermedad. En dicho caso, la composición inmunogénica será una "vacuna". Dicha protección se demuestra a partir de una reducción o falta de los síntomas normalmente manifestados por un huésped infectado, un tiempo de recuperación más corto y/o un título vírico reducido en el huésped infectado.
En otro aspecto, la presente exposición se refiere a una composición inmunogénica tal como se describe y se reivindica en la presente memoria, en la que la composición inmunogénica comprende, además, un virus vivo atenuado, preferentemente un virus atenuado del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRS) o una bacteria viva atenuada.
Un virus o bacteria "vivo" para los fines de la presente exposición se refiere a un virus o bacteria que es capaz de replicarse en un huésped. Un virus vivo preferente y una bacteria viva preferente de la presente exposición son el virus de PRRS y la bacteria Mycoplasma hyopneumonia, respectivamente. Sin embargo, la expresión "virus vivo" o "bacteria viva" no se limita a PRRS y a Mycoplasma hypneumoniae, respectivamente.
En otro aspecto, la presente exposición se refiere a una composición inmunogénica tal como se describe y se reivindica en la presente memoria, en la que el virus vivo atenuado es el virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRS).
En otro aspecto, la presente exposición se refiere a una composición inmunogénica tal como se describe y se reivindica en la presente memoria, en la que la composición inmunogénica induce una respuesta inmunitaria protectora contra un patógeno, preferentemente un patógeno que comprende una proteína recombinante tal como se describe y se reivindica en la presente memoria, tras la administración de una dosis de la composición inmunogénica.
En otro aspecto, la presente exposición se refiere a una composición inmunogénica tal como se describe y se reivindica en la presente memoria, en la que la composición inmunogénica induce una respuesta inmunitaria protectora contra el virus de PRRS tras la administración de una dosis de la composición inmunogénica.
La composición inmunogénica de proteína recombinante obtenida según el método descrito anteriormente, o la proteína recombinante utilizada en la etapa i) del método descrito anteriormente, puede combinarse con por lo menos un antígeno adicional, preferentemente un antígeno vírico o bacteriano, y todavía más preferentemente, un antígeno vírico o bacteriano procedente de por lo menos otro organismo patogénico en porcinos. El antígeno adicional puede ser cualquiera de los dados a conocer en la solicitud de patente internacional n.° WO2007/094893. En resumen, los antígenos adicionales pueden ser antígenos de cualesquiera otros organismos patogénicos en porcinos. Preferentemente, los "otros organismos patogénicos" de los porcinos se seleccionan del grupo que consiste en: Actinobacillus pleuropneumonia (1); adenovirus (2); alfavirus, tales como los virus de la encefalomielitis equina del este (3); Bordetella bronchiseptica (4); Brachyspira spp. (5), preferentemente B. hyodyentheriae (6); B. piosicoli (7), Brucella suis, preferentemente biovars 1, 2 y 3 (8); virus de la fiebre porcina clásica (9); Clostridium spp. (10), preferentemente Cl. difficile (11), Cl. perfringens tipos A, B y C (12), Cl. novyi (13), Cl.septicum (14), Cl. tetani (15); Coronavirus (16), preferentemente coronavirus respiratorio porcino (17); Eperythrozoonosis suis (18); Erysipelothrix rhsiopathiae (19) Escherichia coli (20); Haemophilus parasuis, preferentemente los subtipos 1, 7 y 14 (21) virus hemaglutinante de la encefalomielitis (22); virus de la encefalitis japonesa (23); Lawsonia intracellularis (24) Leptospira spp. (25), preferentemente Leptospira australis (26); Leptospira canicola (27); Leptospira grippotyphosa (28); Leptospira icterohaemorrhagicae (29) y Leptospira interrogans (30); Leptospira pomona (31); Leptospira tarassovi (32); Mycobacterium spp. (33) preferentemente M. avium (34), M. intracellulare (35) y M.bovis (36); Mycoplasma hyopneumoniae (37); Pasteurella multocida (38); citomegalovirus porcino (39); parvovirus porcino (40); virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (41); virus de la seudorrabia (42); rotavirus (43); Salmonella spp. (44), preferentemente S. thyhimurium (45) y S. choleraesuis (46); Staph. hyicus (47); Staphylococcus spp. (48) preferentemente Streptococcus spp. (49), preferentemente Strep. suis (50); virus del herpes porcino (51); virus de la gripe porcina (52); virus de la viruela porcina (53); virus de la viruela porcina (54); virus de la estomatitis vesicular (55); virus del exantema vesicular porcino (56); Leptospira hardjo (57) y/o Mycoplasma hyosynoviae (58).
En otro aspecto, la presente exposición se refiere a un kit que comprende un recipiente que contiene la composición inmunogénica tal como se describe y se reivindica en la presente memoria.
En otro aspecto, la presente exposición se refiere a un kit tal como se describe y se reivindica en la presente memoria, que comprende, además, por lo menos un recipiente adicional que contiene por lo menos un antígeno adicional seleccionado del grupo que consiste en virus vivo atenuado, preferentemente virus de PRRS atenuado y bacteria viva atenuada.
En otro aspecto, la presente exposición se refiere a una composición inmunogénica tal como se describe y se reivindica en la presente memoria, para la utilización como medicamento, preferentemente como una vacuna.
En otro aspecto, la presente exposición se refiere a una composición inmunogénica tal como se describe y se reivindica en la presente memoria, y/o el kit tal como se describe y se reivindica en la presente memoria, para la utilización en un método de reducción de uno o más síntomas clínicos de una infección por patógeno en un animal en comparación con un animal que no recibe dicha composición inmunogénica.
La expresión "reducción de la incidencia o gravedad de los signos clínicos" significa que se reduce cualquiera de dichos signos en incidencia o gravedad en los animales que reciben una administración de la vacuna, en comparación con un "grupo de control" de animales en el caso de que ambos hayan sido infectados o retados con el patógeno a partir del que se deriva el componente o componentes inmunitarios activos en la vacuna, y en el que el grupo de control no ha recibido la administración de la vacuna o composición inmunogénica. En el presente contexto, el término "reducido" o "reducción" se refiere a una reducción de por lo menos 10 %, preferentemente 25 %, todavía más preferentemente 50 %, lo más preferentemente más de 100 %, en el grupo vacunado en comparación con el grupo de control, que no está vacunado.
Tal como se utiliza en la presente memoria, "síntomas clínicos" o "signos clínicos" se refiere a signos de infección por patógenos que son directamente observables en un animal vivo, tal como síntomas. Los ejemplos representativos dependerá del patógeno seleccionado, aunque pueden incluir cosas como descarga nasal, letargia, tos, fiebre elevada, ganancia o pérdida de peso, deshidratación, diarrea, hinchazón, cojera y similares.
Tal como se utiliza en la presente memoria, una "respuesta inmunitaria protectora" se refiere a una incidencia reducida o una gravedad reducida de los signos o síntomas clínicos, patológicos o histopatológicos de infección por un patógeno de interés, hasta e incluyendo la prevención completa de tales signos o síntomas.
La expresión "signos patológicos" se refiere a signos de infección que son observables a nivel microscópico o molecular, mediante prueba bioquímicas, o a ojo desnudo con la necropsia.
La expresión "signos histopatológicos" se refiere a signos de cambios tisulares que resultan de la infección.
Las expresiones "síntomas clínicos" y "signos clínicos" se han definido anteriormente.
Ejemplos
Se proporcionan los ejemplos siguientes con el fin de ilustrar realizaciones específicas de la presente invención. Estos ejemplos son meramente ilustrativos y se entiende que no son limitativos del alcance o de los principios subyacentes de la presente invención.
EJEMPLO 1
Producción de VP2 de parvovirus porcino (PVP) 27a - procesamiento previo
La VP2 del PVP 27a se produce en células SF+ infectadas por baculovirus y se inactiva con BEI en un procedimiento bastante similar al de o Rf2 del virus PCV2 (documento n.° WO 2006/072065; Ejemplos 1 a 3). Sin embargo, la VP2 del PVP 27a utiliza un esqueleto baculovírico diferente denominado "DiamondBac" (Sigma Aldrich, D6192) (en lugar del esqueleto BaculoGold más antiguo utilizado para ORF2 del PCV2).
La secuencia de nucleótidos de la VP2 de parvovirus porcino (PVP) 27a se obtiene de GenBank n.° de acceso AY684871.1. La región codificante de la VP2 del PVP 27a se tradujo inversamente y se optimizaron los codones para Drosophila mediante la utilización del software SciTools® Web Tools proporcionado por Integrated DNA Technologies. El gen de VP2 del PVP de codones optimizados se modificó adicionalmente para insertar dos sitios de enzima de restricción Clal en la región codificante de VP2, junto con la adición de los sitios de los enzimas de restricción BamHI y Notl en los extremos 5' y 3', respectivamente. Los sitios Clal se introdujeron de manera que no interrumpiesen la región codificante de VP2. La inserción de los sitios Clal introduce tres cambios de aminoácido menores en la secuencia de aminoácidos de VP227a predicha. Los cambios de aminoácidos resultantes de las inserciones en ClaI se encuentran en la posición 25 (glicina ^ isoleucina), 36 (alanina ^ serina) y 37 (glicina ^ isoleucina). El gen de VP2 de PVP 27a-ClaI de codones optimizados se sintetizó químicamente y seguidamente se clonó en el plásmido de clonación estándar pUC57 en Integrated DNA Technologies (PPV27a-ClaI 38320377). A continuación, se extrajo el gen de PVP 27a-ClaI del plásmido pUC57 proporcionado por Integrated DNA Technologies, mediante digestión con los enzimas de restricción BamHI y NotI, y el gen PVP 27a-ClaI se subclonó en los sitios de enzima respectivos del vector de transferencia baculovírico pVL1393 (BD Pharmingen, 21486P). El plásmido pVL1393 que contenía el gen PVP 27a-ClaI se amplificó en E. coli DH5a (Invitrogen™ MAX Efficiency™) y seguidamente se extrajo y se purificó mediante la utilización de un kit comercial de purificación de plásmidos (QIAprep Spin Miniprep kit, Qiagen). El plásmido pVL1393 purificado que contenía el gen PVP 27a-ClaI y el esqueleto baculovírico DiamondBac® linearizado se cotransfectaron en células de insecto Sf9 mediante la utilización del reactivo de transfección Escort™ (Sigma Aldrich, E9770), generando un baculovirus recombinante. Se llevó a cabo dilución limitante para obtener una reserva purificada de baculovirus recombinante que contenía el gen de VP2 del PVP 27a-ClaI bajo el control del promotor poliedrina. El sistema de vector de expresión baculovirus (BEVS, por sus siglas en inglés) se utiliza para conseguir que el cultivo de células de insecto en suspensión (SF+) produzca antígeno recombinante que comprende la proteína VP2 del PVP 27a. Para este producto, el cultivo de células SF+ infectadas se cultiva en modo por lotes durante aproximadamente siete días y después se procesa para eliminar los residuos celulares y componentes del medio.
EJEMPLO DE REFERENCIA 2
Producción de VP2 de parvovirus porcino (PVP) 27A - procesamiento posterior
Se siguen dos etapas consecutivas que comprenden el procesamiento previo. La eliminación de residuos celulares ocurre en el procedimiento conocido como "clarificación", mientras que la eliminación de los componentes de medio se consigue mediante dos volúmenes de solución salina tamponada con fosfato de lavado (WPBS, por sus siglas en inglés), denominada "diafiltración".
El vector baculovirus de VP2 del PVP 27a se produce en biorreactores. Se añade el medio preesterilizado o filtrado a esterilidad en el biorreactor. Al medio se añaden células SF+ originadas en cultivos de expansión. Se inocularon las células simultáneamente (infección concurrente) con la introducción del inóculo baculovírico de VP2 del PVP 27a. Durante toda la propagación del virus se mantuvo la temperatura a 27±2°C y se realizó un seguimiento del pH. Se controló el oxígeno disuelto (DO) mediante burbujeo de aire limpio-comprimido y oxígeno (O2). La ventana de recolección se abre entre los 6 y 8 días posteriores a la infección por el virus y se satisface el criterio de recolección de < 20 % de viabilidad celular. En la recolección, los líquidos de antígeno de VP2 del PVP 27a se clarifican mediante la utilización de dos conjuntos de filtros: un prefiltro de 2,0 a 4,0 pm de tamaño de poro y un filtro final de 0,1 a 0,8 pm de tamaño de poro. Los líquidos de recolección filtrados se recogen en un tanque.
A continuación, los líquidos de antígeno de VP2 del PVP 27a clarificados se "diafiltran" con > dos volúmenes (2x-2,5x) de WPBS [mediante la utilización de un filtro de fibra hueca de nivel nominal de corte de peso molecular de 300.000 a 500.000 kilodaltons (kDa)] a una temperatura de entre 4°C y 29°C. Tras la filtración, la temperatura del antígeno de la VP2 del PVP 27a se incrementa a 37±2°C para la inactivación mediante adición de etilenimina binaria (BEI) a una concentración final de 5 mM. El antígeno se incuba a 37±2°C y se mezcla durante 72 a 96 horas. El BEI residual se neutraliza con un exceso molar de sodio en solución de tiosulfato durante por lo menos 30 minutos. Los líquidos de antígeno de VP2 del PVP 27a se transfieren a bolsas para el almacenamiento a 4±3°C hasta la combinación en la vacuna.
Los datos a continuación, en las Tablas 1A y 1B, muestran que la vacuna de VP2 del PVP 27a es no virucida respecto a la vacuna ReproCyc® PRRS EU y a la vacuna Ingelvac® PRRS MLV, respectivamente, al mezclarlas durante un máximo de 8 horas (un día laborable).
Tabla 1A: se almacenaron dos (2) series de ReproCyc PRRS EU®, números de lote 3910003A (dosis 10) y 3910004A (dosis 50), a 5°C ± 3°C en los materiales de embalaje hasta su utilización para el estudio. Se utilizaron dos (2) series de VP2 de PVP 27a, números de lote 7600016A (dosis 10) y 7600018B (dosis 50) como diluyente para los lotes de Ingelvac ReproCyc® PRRS EU n.° 3910003A (dosis 10) y n.° 3910004A (dosis 50), respectivamente. Se almacenaron estos dos lotes a 5°C ± 3°C en los materiales de embalaje hasta su utilización para el estudio. La vacuna ReproCyc® PRRS EU, tras la reconstitución (en diluyente que contenía Carbopol en el grupo 1 o la vacuna líquida de VP2 de PVP 27a) se almacenó a temperatura ambiente (15-25°C) durante un periodo máximo de 8 horas y se sometió a ensayo para el título a las cero, dos, cuatro y 8 horas. Los resultados del grupo 1 de titulación vírica (Log10 TCID50/dosis de 2 ml) en la Tabla 1A, a continuación, en T0, T2, T4 y T8 muestran la estabilidad del virus hasta las 8 h. Los resultados del grupo 2 de titulación vírica (Log10 TCID50/dosis de 2 ml) sobre el producto asociado en T0, T2, T4 y T8 mostraron que la vacuna de VP2 de PVP 27a no presenta actividad virucida contra ReproCyc® PPRS EU hasta transcurridas 8 h.
Tabla 1A
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Tabla 1B: se almacenaron dos (2) series de Ingelvac PRRS MLV,, números de lote 2451189A (dosis 10) y 2451188A (dosis 50), a 5°C ± 3°C en los materiales de embalaje hasta su utilización para el estudio. Se utilizaron dos (2) series de VP2 de PVP 27a, números de lote 7600016A (dosis 10) y 7600018B (dosis 50) como diluyente para los lotes de Ingelvac® PRRS MLV n.° 2451189A (dosis 10) y n.° 2451188A (dosis 50), respectivamente. Se almacenaron estos dos lotes a 5°C ± 3°C en los materiales de embalaje hasta su utilización para el estudio. La vacuna ReproCyc® PRRS MLV, tras la reconstitución (en diluyente que contenía Carbopol en el grupo 1 o la vacuna líquida de Vp2 de PVP 27a, en el grupo 2) se almacenaron a temperatura ambiente (15-25°C) durante un periodo máximo de 8 horas y se sometieron a ensayo para el título (TCID50 para una dosis de 2 ml) a las cero, dos, cuatro y 8 horas. Los resultados del grupo 1 de titulación vírica (Log10 TCIDsü/dosis de 2 ml) en la Tabla 1B, a continuación, en T0, T2, T4 y T8 muestran la estabilidad del virus hasta las 8 h. Los resultados del grupo 2 de titulación vírica (Log10 TCID50/dosis de 2 ml) sobre el producto asociado en T0, T2, T4 y T8 mostraron que la vacuna de VP2 de PVP 27a no presenta actividad virucida contra Ingelvac® PRRS MLV hasta transcurridas 8 h.
Tabla 1B
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EJEMPLO 3
Eficacia de la vacuna de PRRSV-EU al mezclar vacuna de PRRSV-EU con vacuna de VP2 de PVP.
Se aleatorizaron treinta y seis (36) cerdas jóvenes en edad reproductora no gestantes a tres grupos de tratamiento, en el que cada grupo comprendía doce cerdas jóvenes. El grupo T01 recibió producto de control de WPBS (solución salina tamponada con fosfato de lavado) (control) los días 0 y 21 (D0 y D21). El grupo T02 recibió ReproCyc® PRRS EU (PRRS cepa 94881), 3,9 log10 TCID50 por dosis y vacuna de parvovirus porcino, VP2 de PVP-27a, 10 |jg por dosis (mezclado) en D0 y VP2 de PVP-27a, 10 jg por dosis, solo en D21. La vacuna ReproCyc® PRRS EU en forma de torta liofilizada se reconstituyó con VP2 de PVP-27A en forma de líquido. El grupo T03 recibió ReproCyc® PRRS EU (solo) en D0. Los tratamientos se formularon de manera que las cerdas jóvenes recibieran ReproCyc® PRRS EU a la dosis inmunizante mínima y VP2 de PVP-27a a la potencia relativa máxima. Las cerdas jóvenes se retaron con 5,5 log10TCID50 /dosis total de 6 ml (2 ml por vía intramuscular y 2 ml por vía intranasal) de PRRSV EU heterólogo, aislado 190136, cuatro semanas después de la vacunación inicial (D28) y se recogieron muestras de suero los días siguientes: D31, D35, D38, D42 y D49. Se sometió a ensayo la viremia de PRRSV mediante PCR cuantitativa (qPCR) [Sandra Revilla-Fernández et al., Journal of Virological Methods 126 (2005) 21-30]. El virus de reto PRRS europeo aislado 190136 se obtuvo originalmente de tejido pulmonar de un cerdo neonato procedente de una granja que mostraba los signos reproductivos típicos de PRRSV (abortos en cerdas maduras y debilidad en lechones neonatos) durante un brote en Baja Sajonia, Alemania, en abril de 2004. Los veterinarios responsables enviaron muestras pulmonares a BioScreen (llegada de muestras el 21 de abril de 2004) para los ensayos diagnósticos. El virus de reto se propagó en células AK-MA104 y se realizaron dos pases antes del reto.
Después del reto se mostró que ambos grupos (mezclado y solo) eran eficaces contra PRRSV virulento con áreas bajo la curva (ABC) cuantitativas de carga vírica entre D28 y D49 de 24,36 EG/ml (EG=equivalentes genómicos) para mezclado (p=0,0002) y 32,54 EG/ml para solo (p=0,0045) en comparación con 50,85 EG/ml en el control. Lo anterior representa una reducción aproximada de 50 % del virus circulante sistémicamente en los cerdos durante el tiempo para el grupo mezclado y una reducción aproximada de 40 % para el grupo de ReproCyc® PRRS EU solo (figura 1), lo que demuestra el sustancial efecto protector de los grupos mezclado y solo. Además, el análisis de qPCR medio cuantitativo de PRRSV mostró reducciones significativas de la carga de virus PRRSV en el grupo de mezclado los días D35 (p<0,0001) y D38 (p=0,0052) y en el grupo de solo en D35 (p<0,0001) en comparación con el control, demostrando el sustancial efecto protector de los grupos mezclado y solo. El análisis de aPCR mostró reducciones significativas de la proporción de cerdas jóvenes positivas en D35 para los grupos mezclado (p=0,0013) y solo (p=0,0046) y en D38 para el grupo mezclado (p=0,0137) en comparación con el control. Aunque no era estadísticamente significativo, se observó una tendencia numérica hacia la reducción de la carga vírica media y la proporción de positivos para PRRSV en la qPCR en el grupo de mezclado los días D42 y D49. Se observaron tendencias similares para el grupo de solo, con una reducción numérica del a carga vírica media en D49 y de la proporción de positivos en la qPCR los días D42 y D49.
La utilización de la vacuna ReproCyc® PRRS EU solo o al mezclarla con vacuna de VP2 de PVP-27a demostró ser eficaz contra una cepa de reto virulenta de PRRSV-EU, mostrando un inicio de inmunidad a las cuatro semanas. A partir de los datos en las figuras 1 y 2, resulta evidente que la mezcla de la vacuna ReproCyc® PRRS EU con VP2 de PVP-27a mejoró la eficacia. Los resultados muestran una falta de interferencia entre el componente PRRSV y el componente PVP en el grupo mixto, mostrando la posibilidad ventajosa del uso asociado mediante la mezcla.
EJEMPLO 4
Eficacia de la vacuna de VP2 de PVP al mezclar la vacuna de PRRSV-EU con vacuna de VP2 de PVP.
Evaluación de la eficacia de las vacunas combinadas: Se evaluó la eficacia del uso asociado de ambas vacunas [ReproCyc® PRRS EU (PRRS cepa 94881) y VP2 de PVP-27a] contra las infecciones experimentales de PVP.
Eficacia contra un reto experimental con cepa salvaje de PVP: se evaluó la eficacia de las vacunas combinadas contra el virus PVP basándose en la infección por PVP de fetos. Se consideró que la vacuna era eficaz si > 80 % de los fetos en cada grupo tratado eran seronegativos para PVP.
Cuidado de los animales: los animales presentaban buenos estados de salud y nutricional antes de iniciar el estudio. Antes de la inclusión y del procedimiento de aleatorización, se llevó a cabo una exploración de su estado de salud. Se utilizó pienso no medicado durante la totalidad del estudio. Las raciones de pienso eran adecuadas a la edad, estado y especie del animal de ensayo de acuerdo con el procedimiento estándar de operaciones de las instalaciones. Se proporcionó agua ad libitum durante todo el estudio.
La evaluación de la eficacia del uso asociado de las vacunas de PVP y PRRSV tras el reto con una cepa heteróloga de PVP: en D0, las cerdas jóvenes no gestantes convencionales de 5 a 6 meses de edad se aleatorizaron equitativamente a tres grupos de tratamiento. El grupo T01 recibió 2 ml IM de producto de control (PBS-diluyente Carbopol (Impran FLEX®) los días 0 y 21 (D0, D21). El grupo T02 recibió 2 ml IM de ReproCyc® PRRS EU (PRRS cepa 94881) y vacuna de parvovirus porcino, VP2 de PVP-27a VP2, en D0 y VP2 de PVP-27a en D21. Respecto al grupo T02, la vacuna ReproCyc® PRRs EU en forma de torta liofilizada se reconstituyó con la solución de vacuna de VP2 de PVP-27a. El grupo T03 recibió 2 ml IM de vacuna de parvovirus porcino, VP2 de PVP-27a (1 pg/dosis) los días D0 y D21. Las cerdas jóvenes se observaron diariamente para su estado general de salud. Los animales fueron retados entre los días 39 y 42 de gestación con la cepa heteróloga de PVP n.° 401/09 (198669), obtenida de BioScreen (Münster, Alemania) a partir del tejido de un lechón momificado, el 15 de junio de 2004, y enviada a la universidad de Leipzig, Alemania (se descongeló el virus de reto y se diluyó en DMEM (1x Gibco, n.° de ref. 119666-025, lote n.° 1632505) hasta una dosis diana de 6,0 log10 TCIDsü/dosis de 6 ml). Se recolectaron los fetos (procedimiento estándar) aproximadamente el día 90 de gestación y se evaluaron para la presencia de PVP mediante PCR (Molitor TW et al., Journal of Virological Methods 1991, 32: 201-211) a partir de muestras líquidas de órganos o tejidos, así como para su estado de salud, tamaño y peso. Los tratamientos se formularon de manera que las cerdas jóvenes recibieran ReproCyc® PRRS EU (PRRS cepa 94881) y vacuna de parvovirus porcino, VP2 de PVP-27a, a la dosis inmunizante máxima de ReproCyc® PRRS EU (1070 TCID50/dosis de 2 ml; media geométrica) y vacuna de parvovirus porcino, VP2 de PVP-27a, a la potencia relativa mínima (1 pg /dosis).
El estudio era válido según la monografía de la Farmacopea europea 8.0 04/2013:0965, ya que la vacuna proporcionaba una protección de 95,7 % (grupo T03) y de 94,3 % (grupo T02), mientras que el grupo T01 (control) presentaba 91,4 % de fetos positivos (ver la Tabla 2).
Se concluyó que la vacunación con la vacuna de PVP sola o mezclada con ReproCyc® PRRS EU es segura y eficaz al completar la vacunación tres semanas antes del apareamiento.
Tabla 2: porcentaje de fetos positivos por grupo
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EJEMPLO 5
Preparación de vacuna de subunidades de PVP
El antígeno de VP2 del PVP se selecciona para expresarse en células de insecto infectadas por baculovirus basándose en el aislado del PVP 2a alemán. La secuencia de nucleótidos de la VP2 de parvovirus porcino (PVP) 27a se obtuvo de GenBank n.° de acceso AY684871.1. La región codificante de VP2 de PVP 27a se tradujo inversamente y se optimizaron los codones para Drosophila (SEC ID n.° 4 y n.° 3). El gen de VP2 del PVP 27a de codones optimizados se sintetizó químicamente en Integrated DNA Technologies. A continuación, el gen de PVP 27a se subclonó en el vector de transferencia baculovírico pVL 1393 y se cotransfectó con el esqueleto baculovírico DiamondBac® linearizado en células de insecto Sf9 para generar baculovirus recombinantes que contuviesen el gen de VP2 del PVP 27a bajo el control del promotor poliedrina.
Al expresarlo en células de insecto Sf9, la proteína VP2 del PVP se autoensambló en una VLP sin cubierta (datos no mostrados).
Al antígeno de VP2 del PVP se añadió carbómero (Carbopol) de adyuvante.
EJEMPLO 6
Estudio de prueba de concepto de la vacuna de PVP
En todos los estudios animales, estos presentaban buenos estados de salud y nutricional antes de iniciar el estudio. Antes del procedimiento de aleatorización, se llevó a cabo una exploración de su estado de salud. Se utilizó pienso no medicado durante la totalidad del estudio. Las raciones de pienso eran adecuadas a la edad, estado y especie del animal de ensayo de acuerdo con el procedimiento estándar de operaciones de las instalaciones. Se proporcionó agua ad libitum durante todo el estudio.
El objetivo de este estudio de reto de vacunación era establecer la prueba de concepto de la eficacia de la determinación de la dosis para una vacuna de subunidades de parvovirus porcino (PVP) previamente a la reproducción (ver el Ejemplo 5). Las cerdas jóvenes fueron vacunas y criadas previamente al reto con un aislado de PVP virulento vivo (PPV 002346-5, una cepa norteamericana) aproximadamente a los 40 días de gestación (dG). Los fetos se evaluaron para la infección por PVP aproximadamente a los 90 dG.
El diseño del estudio se describe en la Tabla 3.
Tabla 3: diseño del estudio
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Se utilizaron sesenta y siete cerdas jóvenes originadas de una manada con resultados previamente negativos para PVP sin antecedentes de enfermedad reproductiva o vacunación contra el PVP. Se aleatorizaron las cerdas jóvenes a 6 grupos de tratamiento (T) de n=9 mezcladas en 3 corrales en los que recibieron la vacunación en D0 y refuerzo en D21: T1 CN (control negativo de agua para inyección), T2 PVP 10 |jg, T3 CP (control positivo; entero, parvovirus porcino (PPV) inactivado, Erysipelothrix rhusiopathiae, Leptospira canicola, L.grippotyphosa, L. hardjo, L. icterohaemorrhagiae y L. Pomona; disponibles comercialmente; se utilizaron de acuerdo con el manual del fabricante). Se incluyeron tres cerdas jóvenes de control no tratadas (NTX), una por corral. Después de la vacunación, las cerdas jóvenes fueron sincronizadas (mediante la administración de Matrix®; altrenogest, Intervet Schering-Plough Animal Health; según etiqueta durante 14 días consecutivos, D18 a D31) y después se aparearon entre D35 y D42. Cincuenta y cuatro de las 67 cerdas jóvenes quedaron embarazadas. En D80 (aproximadamente 40 dG), las cerdas jóvenes NTX fueron necropsiadas y las cerdas jóvenes restantes recibieron la inoculación de 6 ml de la cepa de PVP PPV002346-5 (una cepa norteamericana) a razón de 4,25 logioTCIDso por dosis (2 ml por vía intramuscular y 2 ml por fosa nasal por vía intranasal). Se obtuvieron muestras de sangre de las cerdas jóvenes cada semana durante la sincronización y el apareamiento (D35 a D70). Se realizaron análisis séricos los días D0, D7, D14, D21, D28 y D73; las pruebas de serología y la reacción en cadena de polimerasa (PCR) (tal como se indica en Jozwik et al. 2009; Journal of General Virology, 90, 2437-2441) para viremia llevaron a cabo en sueros los días D87, D94, D101, D108, D115, D122 y D128. Las cerdas jóvenes fueron necropsiadas el día D129 o D130 (aproximadamente 90 dG). En la necropsia, se extrajo cada tracto reproductivo y se registró la posición del feto en el útero, y el estado, tamaño y peso fetales. Se recogieron muestras de lavado torácico y pulmón de cada feto. Las muestras de lavado torácico se recogieron asépticamente de cada feto. Brevemente, se inyectaron 3 ml de PBS estéril en la cavidad torácica con una aguja y jeringa estériles. Se aspiró el líquido con la jeringa y se inyectó en un SST (por sus siglas en inglés, tubo separador de suero) estéril adecuado y de tamaño apropiado. Los lavados torácicos se sometieron a ensayo para la presencia de PPV mediante PCR y para la presencia de anticuerpo de PVP mediante inhibición de la hemaglutinación (IH). El tejido pulmonar se almacenó en estado congelado.
Viremia (PVP) de cerdas jóvenes
Todas las cerdas jóvenes eran negativas para viremia de PVP antes del reto los días D0 y D73 (datos no mostrados) y en D80 (Tabla 4). Todos los controles negativos eran virémicos en D87 y 4/8 eran virémicos en D94.
Después de la vacunación, las cerdas jóvenes de T3 seroconvirtieron tras la vacunación de refuerzo. T2 presentó una respuesta sérica a la vacunación inicial y se mantuvo seropositivo después de la vacunación de refuerzo. Las cerdas jóvenes de control de T1 se mantuvieron séricamente negativas para PVP hasta el reto. Después del reto, todas las cerdas jóvenes de control negativo eran virémicas en D87 (siete días después del reto). Una cerda joven de T7 era virémica en D87. Todas las demás cerdas jóvenes no eran virémicas en estos puntos temporales (ver la Tabla 4).
Las cerdas jóvenes NTX se mantuvieron seronegativas y sus fetos eran todos negativos para PVP según la PCR de las muestras de lavado torácico.
Tabla 4: distribución de frecuencias de cerdas jóvenes positivas para PVP (en PCR) al retarlas con PVP a los 40 días de gestación (dG) en D80.
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Resultados de fetos
Todos los fetos NTX se consideraron normales en la necropsia en D80 (Tabla 5). En la necropsia final en D129 y D13, el 22,5 % de los fetos de T1 (control negativo) eran normales, mientras que 98,39 % de los fetos en T3 y 97,62 % de los fetos en T2 eran normales. El tamaño y peso medios de los fetos de T1 (control negativo) era de 11,5 cm y 168,8 g, respectivamente, mientras que el tamaño y peso medios de los fetos en T2 era de 17,5 cm y 590,1 g, respectivamente.
Todos los fetos de T4 (NTX) eran negativos para PVP, determinado mediante PCR de muestras de lavado torácico (ver la Tabla 3). Se confirmó la infección por PVP en 67/80 fetos de T1 de control negativo (83,75 %). Sesenta y dos de los 67 fetos de control negativo que se había confirmado que habían sido infectados por PVP eran fetos momificados. En contraste, la infección por PVP se confirmó en solo 0,79 % de los fetos de T2.
Basándose en el parámetro de conclusión para establecer la eficacia que se establece en la Farmacopea europea (monografía 01/2008:0965), todas las vacunas (incluyendo el control positivo (PVP inactivado de células enteras)) cumplían los criterios de protección frente a la infección (>80 % de fetos negativos para PVP).
Tabla 5: datos de camada: número, tamaño, peso y estado de los fetos, y confirmación de laboratorio de la infección por PVP (PCR en muestras de lavado torácico).
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Conclusión: la vacuna de PVP de la presente invención mostró protección de los fetos tras el reto con PVP heterólogo virulento. Los resultados del estudio muestran que la vacuna es segura al administrarla previamente al apareamiento y que resulta eficaz para reducir significativamente la viremia y la infección transplacentaria del feto. Además, se ha mostrado que la vacuna protege frente a la cepa de reto de PVP heterólogo norteamericano. Además, se ha mostrado que la proteína VP2 de PVP de subunidades es tan eficaz como el virus muerto entero.
EJEMPLO 7:
Determinación de la dosis inmunizadora mínima de vacuna de PVP: protección frente a la cepa heteróloga de EE. UU. de PVP
El objetivo del presente estudio de reto de vacunación es determinar la dosis inmunizante mínima (DIM) para la vacuna de parvovirus porcino (PVP). Se retaron cerdas jóvenes con un aislado de serotipo 1 de PVP virulento vivo (PVP 002346-5) aproximadamente a los 40 días de gestación (dG). Se considera que una vacuna es eficaz si > 80 % de los fetos en el grupo vacunado son negativos para PVP después del reto. Entre los parámetros de soporte se incluyen el tamaño, el peso y el estado del feto, el estado de viremia post-reto de las cerdas jóvenes y el estado sérico de las mismas.
Las cerdas jóvenes (sin antecedentes de enfermedad reproductiva o vacunación contra PVP) fueron aleatorizadas a los grupos de tratamiento: T01 control negativo (placebo equivalente al producto (PMP, por sus siglas en inglés)) y T02=1,0 |jg de PVP/dosis de 2 ml). Las cerdas jóvenes no tratadas/no retadas (NTX) se asignaron aleatoriamente a los corrales como controles del estado de salud general.
Las cerdas jóvenes recibieron 2 ml del tratamiento apropiado por vía intramuscular los días D0 y D21. Después de la vacunación, las cerdas jóvenes se aparearon entre D37 y D50, y posteriormente se evaluaron para determinar si estaban embarazadas, en D74. En D81, las cerdas jóvenes gestantes se retaron con 6,77 logi0TCID50/6 ml de PVP serotipo 1 por vías intramuscular e intranasal. Se obtuvieron muestras de sangre de las cerdas jóvenes cada semana durante la sincronización del estro y el apareamiento (D36-D73). Se llevaron a cabo ensayos de inhibición de la hemaglutinación (HI) en los sueros de los días D7, D14, D21, D28 y D35; se llevaron a cabo ensayos de HI y reacción en cadena de polimerasa (PCR) (ver el Ejemplo 6) de la viremia en sueros de los días D3, D74, D80, D88, D95, D102 y D127. Las cerdas jóvenes fueron necropsiadas los días D128 y D129 (aproximadamente 90 dG). En la necropsia, se extrajo el tracto reproductivo de cada cerda madura y se registró la posición del feto en el útero, y el estado, tamaño y peso fetales. Se recogieron muestras de lavado torácico (ver el Ejemplo 6) y de cada feto y se sometieron a ensayo para la presencia de PVP mediante PCR.
Viremia (PVP) de cerdas jóvenes
Las vacunas se consideraron seguras, ya que los animales no mostraron una temperatura corporal anormal 24 o 48 horas después de la vacunación, ninguna reacción local anormal atribuible a la vacuna y ningún signo clínico relacionado con la vacunación (datos no mostrados).
Todas las cerdas jóvenes eran negativas para viremia de PVP antes de la vacunación, previamente al reto los días D74 y D80. De esta manera, después de la vacunación no se observaron signos clínicos relacionados con la administración de la vacuna. En D88, la totalidad de las diez cerdas jóvenes de T01 eran virémicas y todas las cerdas jóvenes vacunadas eran negativas. Todas las demás muestras de sangre los días D95, D102 y D127 eran negativas para viremia de PVP para todos los grupos de tratamiento (Tabla 6).
Tabla 6: distribución de frecuencias de cerdas jóvenes positivas para PVP (en PCR) al retarlas con PVP a los ~40 días de gestación (dG) en D81.
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Resultados de fetos
En la necropsia final en D128 y D129, el 38% de los fetos de T01 (control negativo) eran normales, mientras que 95 % de los fetos en el grupo de vacuna presentaban un estado normal. El tamaño y peso medios de los fetos de T01 (control negativo) era de 14,4 cm y 245,9 g, respectivamente, mientras que el tamaño y peso medios de los fetos de las madres vacunadas era de 19,3 cm y 550 g, respectivamente (Tabla 7). De esta manera, el grupo de vacuna cumple los criterios de protección frente a la infección por PVP como parámetro de conclusión para la eficacia de PVP establecida por la Farmacopea europea. 01/2008:0965 es >80 % de fetos en el grupo de tratamiento debe ser negativo para PVP.
Se confirmó la infección por PVP en 113/146 fetos de control negativo (T01) (77 %). Sin embargo, la infección por PVP en el grupo vacunado (T02) era de solo 10 %.
Tabla 7. Datos de camada: número, tamaño, peso y estado de los fetos, y confirmación de laboratorio de la infección por PVP (PCR en muestras de lavado torácico).
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Conclusión: La vacuna de subunidades de VP2 del PVP de la presente invención muestra protección de los fetos tras el reto con un PVP heterólogo virulento. Los resultados del presente estudio revelan que la vacuna resulta segura y eficaz en la prevención de la viremia en cerdas jóvenes y la infección por PVP en feto al utilizar solo 1 |jg de vacuna de subunidades de PVP de PVP. Además, se ha mostrado que la vacuna protege frente a la cepa de reto de PVP heterólogo norteamericano.
EJEMPLO 8
Determinación de la dosis inmunizadora mínima de vacuna de PVP: protección frente a la cepa heteróloga de EE. UU. de PVP
El objetivo del presente estudio es evaluar la aparición de inmunidad de la vacuna de parvovirus porcino (VP2 de PVP; en lo sucesivo denominada vacuna de PVP). Además, se evaluó la seguridad y la eficacia mediante la utilización de un diseño de estudio de reto de vacunación aleatorizado, con enmascaramiento y con control negativo.
Las cerdas jóvenes se asignaron aleatoriamente a tres grupos. En los grupo 1 y 2, las cerdas jóvenes fueron vacunas dos veces en un intervalo de tres semanas (en D0 y D21). La segunda dosis se administró tres semanas antes del apareamiento. Todos los tratamiento se administraron por la vía intramuscular (IM) en un volumen de 2 ml. El grupo 2 recibió la vacuna de PVP, mientras que el grupo 1 era el grupo de placebo, que recibió un diluyente estéril como producto de control y el grupo 3 sirvió de control estricto, sin ningún tratamiento.
Se sincronizó el estro de las cerdas jóvenes y tres semanas después de la segunda vacunación se inseminaron artificialmente. Los animales que quedaron embarazados fueron retados en D84, entre los días de gestación 39 y 42, con una cepa de PVP heteróloga virulenta.
Los días D132-135, aproximadamente el día de gestación 90, las cerdas jóvenes fueron eutanizadas y necropsiadas, y se evaluaron los fetos.
Tabla 8: diseño del estudio
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Evaluación de la viremia de PVP en cerdas jóvenes antes y después del reto, según PCR.
Todos los animales eran negativos para PVP según la PCR los días D6 y D1 antes de la vacunación, cumpliendo los criterios de inclusión. Después de la vacunación, todos los animales en el grupo de control estricto y en el grupo de producto de control eran negativos para el antígeno PVP hasta el reto; por lo tanto, puede excluirse la posibilidad de infección por PVP antes del reto.
Se investigó la viremia los días 7 (D90), 14 (D97) y 21 (D104) después del reto y en el día de la necropsia. Tras el reto no se detectó viremia en los animales vacunados; solo se observó viremia en los animales de control no vacunados. El día D90 (7 días después del reto) ya 95 % de los animales de control no vacunados eran positivos para PVP. En D97, todavía 60 % de estos animales presentaba un resultado positivo, mientras que en D104, todos los animales dieron resultado negativo para PVP. En contraste, en el grupo vacunado todos los animales sometidos a ensayo el día D90, D97 o D104 eran negativos para PVP.
Tabla 9: número de animales con viremia después del reto
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Resultados de fetos
El porcentaje de fetos infectados por PVP era de 91,4 % en el grupo de control, pero de solo 4,3 % en el grupo de PVP (ver la Tabla 10).
Tabla 10: porcentaje de fetos positivos por grupo y tamaño de camada.
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Evaluación del estado de los fetos
Se evaluaron todos los fetos para su estado y se asignaron a tres categorías: normal, momificado y autolisado.
La mayoría de los fetos momificados y autolisados se encontró en el grupo de control. Solo 39,8 % de los fetos en este grupo presentaban un estado normal, mientras que en los grupos vacunados, 97,4 % (grupo de PVP) de los fetos presentaba un estado normal (ver la Tabla 11).
Tabla 11: estado fetal
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Conclusión: La vacuna de PVP de la presente invención mostró protección de los fetos tras el reto con PVP heterólogo virulento, indicando que la vacuna es segura y eficaz en la prevención de la viremia y la infección por PVP en fetos al utilizar únicamente 1 |jg de vacuna. Además, se ha mostrado que la vacuna también protege frente a la cepa de reto de PVP heterólogo europea. De esta manera, la vacuna presenta un amplio espectro de protección, ya que la vacuna protege frente a las cepas de reto heterólogas norteamericana y también europea.
La totalidad de las composiciones y métodos dados a conocer y reivindicados en la presente memoria pueden prepararse y ejecutarse sin necesidad de experimentación indebida a la luz de la presente exposición. Aunque las composiciones y métodos de la presente invención y métodos dados a conocer han sido descritos en términos de realizaciones preferentes, resultará evidente para el experto en la materia que pueden realizarse variaciones de las composiciones y/o métodos, y en las etapas o en la secuencia de etapas del método descrito en la presente memoria, sin apartarse del concepto y alcance de la invención. Más específicamente, resultará evidente que determinados genes que están tanto química como fisiológicamente relacionados pueden sustituirse por los agentes indicados en la presente memoria, consiguiendo resultados iguales o similares. La totalidad de dichos sustitutos similares y modificaciones evidentes para el experto en la materia se considera que se encuentra comprendida en el espíritu y concepto de la invención según se define mediante las reivindicaciones.
EJEMPLO 9:
Prueba de concepto de parvovirus porcino (PVP/Determinación de dosis de vacuna de subunidades de PVP de combinación de Erysipelothrix rhusiopathiae y virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino en cerdas jóvenes en edad reproductiva.
El objetivo del presente estudio de reto de vacunación era proporcionar datos sobre el uso asociado de Ingelvac® PRRSV MLV con una vacuna de combinación experimental de subunidades de parvovirus porcino (PVP) con bacterina de Erysipelothrix rhusiopathiae (Ery) y se utilizó para establecer la prueba de concepto de determinación de dosis eficaz para una vacuna de combinación de PVP con bacteriana de Ery en cerdas jóvenes de 5 a 6 meses de edad.
Se utilizaron sesenta y siete cerdas jóvenes originadas de una manada con resultados previamente negativos para PVP y sin antecedentes de enfermedad reproductiva o vacunación contra el PVP. Se aleatorizaron las cerdas jóvenes a 6 grupos de tratamiento de n=9 mezcladas en 3 corrales en los que recibieron la vacunación en D0 y refuerzo en D21: T1 Control negativo, T2 PVP 10 jg , T3 PVP 0,1 jg Ery 10 logs, T4 PVP 1,0 jg Ery 10 logs, T5 PVP 10 jg Ery 10 logs, T6 Control positivo (FarrowSure® GOLD). Se incluyeron tres cerdas jóvenes de control no tratadas (NTX), una por corral. Además, se alojaron diez cerdas jóvenes en un edificio separado en el que recibieron T7 PVP 10 jg Ery 10 logs utilizados para rehidratar Ingelvac® PRRSV MLV con el fin de evaluar la eficacia de PVP en combinación con la vacuna de síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRS) disponible comercialmente. T7 es el grupo de interés para el presente Ejemplo 9.
Las cerdas jóvenes fueron vacunadas y apareadas; 54 de las 67 cerdas jóvenes quedaron embarazadas. Aproximadamente a los 40 días de gestación (dG), se necropsiaron NTX las cerdas jóvenes y las cerdas jóvenes restantes recibieron la inoculación de 6 ml de la cepa de PVP PPV002346-5 a razón de 4,25 log10TCID50 por dosis (2 ml por vía intramuscular y 2 ml por fosa nasal por vía intranasal). Se obtuvieron muestras de sangre semanalmente de cada cerda joven durante la sincronización y el apareamiento (D35-D70) y los sueros fueron sometidos a ensayo tal como se indica en la Tabla 12.
Tabla 12: muestras y ensayos de laboratorio, cerdas jóvenes
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Las cerdas jóvenes fueron necropsiadas el día D129 o D130 (~90 dG). En la necropsia, se extrajo cada tracto reproductivo y se registró la posición del feto en el útero, y el estado, tamaño y peso fetales. Se recogieron muestras de lavado torácico y pulmón de cada feto. Los lavados torácicos se sometieron a ensayo para la presencia de PPV mediante PCR y para la presencia de anticuerpo de PVP mediante inhibición de la hemaglutinación (IH). El tejido pulmonar se almacenó en estado congelado.
Las cerdas jóvenes de T7 presentaron una respuesta sérica a la vacunación y no eran virémicas después del reto. En la necropsia, 97,37 % (111/114) de los fetos de T7 presentaban un estado normal y solo un feto presentó un resultado positivo para PVP. En contraste, todas las cerdas jóvenes de T1 eran seronegativas durante la etapa de vacunación y seroconvirtieron y se volvieron virémicas después del reto. En la necropsia, solo 22,50 % (18/80) de los fetos de T1 presentaban un estado normal y 83,75 % (67/80) presentaron un resultado positivo para infección por PVP según la PCR del líquido de lavado torácico. En conclusión, la vacuna de combinación (PVP 1o |jg Ery) con Ingelvac PRRS MLV resultó eficaz para prevenir la viremia y la infección por PVP de los fetos en el día 40 dG.
Diseño del estudio:
Tabla 13: diseño del estudio
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Materiales:
Producto de control: el producto de control administrado en los animales de control negativo (T1) era diluyente estéril (lote n.° 240) preparado mediante la utilización de agua para inyección (WFI, por sus siglas en inglés) a partir de agua purificada en BIVi, St. Joseph, MO, EE. UU. El producto de control se suministró en una presentación de 100 ml de volumen de llenado en botellas de plástico. Se administró una dosis de 2 ml en el músculo derecho del cuello en D0 con un refuerzo de 2 ml administrado en el músculo izquierdo del cuello en D21.
Vacuna: la vacuna de combinación de interés para T7 era una vacuna de combinación experimental de subunidades de PVP con bacterina de Ery como diluyente para rehidratar la vacuna Ingelvac® PRRS MLV. La diana era n.° de serie 311-171 a razón de 10 jg/dosis para PVP en combinación con una dosis de 10 logs de bacterina de Ery muerta proporcionada por el científico de laboratorio en botellas de plástico que contenían 20 ml (10 dosis). Se utilizó una única botella de n.° de serie 311-171 para rehidratar una única botella de una serie comercial de Ingelvac® PRRS MLV obtenida por el investigador del estudio, n.° de serie 245-B53. Se administró una dosis de 2 ml en el músculo derecho del cuello en D0 con un refuerzo de 2 ml administrado en el músculo izquierdo del cuello en D21.
Material de reto: el material de reto fue preparado por el científico de laboratorio, BIVI-R&D, Ames IA, previamente al reto. La diana de la cepa de PVP 002346-5 a razón de 5 log10TCID50, dosis de 6 ml (lote asignado n.° 354-021) y se reservó sobre hielo durante el reto. Se determinaron los títulos de reto mediante ensayo de TCID50 en el material post­ reto retenido, manteniendo la temperatura a 4°C. El título final del material de reto era de 3,47 log/ml o 4,25 log/dosis de 6 ml. En D80, se inocularon todas las cerdas jóvenes con 2 ml de material de reto en cada fosa además de 2 ml por vía intramuscular en el lado derecho del cuello.
Métodos:
necropsia y evaluación fetal. En D79, se eutanizaron todas las cerdas jóvenes de NTX mediante inyección intravenosa de barbitúrico, y los días D129 y D130, se eutanizaron todas las cerdas jóvenes restantes. Para cada necropsia se extrajo el tracto reproductor y el parto fue aséptico mediante cesárea. Los fetos se identificaron mediante un ID fetal compuesto del ID de la madre seguido de una letra (R para "cuerno derecho" o L para "cuerno izquierdo", en inglés), seguido del número de orden del feto encontrado a partir de la bifurcación uterina. Se registró el estado fetal (normal o momificado), y el tamaño y peso fetales.
Recogida de muestras fetales: a fin de evitar la contaminación cruzada de las muestras, se utilizaron todas las técnicas apropiadas para esterilizar o limpiar las zonas de trabajo y los utensilios entre manipulación de un feto y el siguiente, y de cada muestra, tanto en la necropsia como en el laboratorio. Las muestras fueron etiquetadas con el ID fetal, tipo de muestra, día de estudio y fecha de recogida. Lo antes posible durante el día de recogida se transportaron las muestras sobre hielo hasta el/la científico/a de laboratorio. El/La científico/a de laboratorio o delgado del mismo proceso cada muestra mediante la utilización de técnicas apropiadas para evitar la contaminación cruzada, generando alícuotas de cada muestra en tubos de tamaño adecuado apropiadamente etiquetados. Se envío una alícuota a ISU-VDL. Se midió la presencia de virus en cada muestra mediante PCR. Las alícuotas restantes se almacenaron a -70°C en BIVI-R&D - Ames.
Recogida de lavado torácico: el investigador del estudio recogió de la manera más aséptica posible un lavado torácico de cada feto. Brevemente, se inyectaron 3 ml de PBS estéril en la cavidad torácica con una aguja y jeringa estériles. Se aspiró la máxima cantidad posible de líquido con la jeringa y después se inyectó en un SST de tamaño adecuado.
Métodos estadísticos:
UNIDAD EXPERIMENTAL: La unidad experimental en T1-T6 era la cerda joven. En el caso de que se realizasen comparaciones con T7, la sala era la unidad experimental, en donde el alojamiento de T7 era independiente de los demás grupos de tratamiento.
Justificación del número de animales: la Farmacopea europea requiere que el reto sea a siete cerdas jóvenes vacunadas y cinco cerdas jóvenes de control (PhE 01/2008:0965). Se obtuvieron nueve o diez cerdas jóvenes para cada tratamiento a fin de tener en cuenta que algunas cerdas jóvenes no quedasen embarazadas.
Aleatorización: antes de iniciar el estudio, se proporcionó al experto en estadística los datos de ID de cerda joven y se aleatorizaron totalmente al azar las cerdas jóvenes a corral y tratamiento. Se aleatorizaron tres cerdas jóvenes al grupo NTX; se aleatorizaron diez cerdas jóvenes al grupo T7 y las cerdas jóvenes restantes se aleatorizaron igualmente a los grupos T1, T2, T3, T4, T5 y T6. Las cerdas jóvenes de T1-6 y las NTX se dividieron igualmente a tres corrales en el Establo 1. Las cerdas jóvenes de T7 se alojaron individualmente en corrales en el Establo 2.
Criterios de enmascaramiento: durante todo el estudio cualquier personal involucrado en recoger datos o realizar ensayos de laboratorio era ciego a la asignación de las cerdas jóvenes a los grupos de tratamiento T1, T2, T3, T4, T5 y T6. Debido a que las cerdas jóvenes de T7 y NTX fueron alojadas por separado y el suero se sometió a ensayo para anticuerpo de PRRSV, el personal no pudo enmascararse a estos dos grupos. Los tratamientos fueron administrados por una persona no involucrada en la recogida de los datos.
Gestión de los datos: el análisis estadístico de los datos fue llevado a cabo por el experto en estadística. Se importaron todos los datos en SAS versión 9.2 (Cary, EE. UU./North Carolina, SAS Institute Inc.) para la gestión y los análisis. Resultados:
en el presente resumen de estudio solo se presentan comparaciones para el control negativo (T1) con PVP 10 |jg Ery 10 logs utilizado para rehidratar Ingelvac® PRRSV MLV (T7), y se presentan datos para los grupos T1, T7 y NTX.
Resultados de cerdas jóvenes: en D0, todas las cerdas jóvenes eran séricamente negativas para PRRSV según ensayo ELISA. En D21, D80 y D128, todas las cerdas jóvenes de T7 eran seropositivas para PRRSV. En D73, todas las cerdas jóvenes de T7 eran seropositivas, y las cerdas jóvenes en todos los demás grupos de tratamiento eran seronegativas.
Las medias geométricas de títulos de IH de PVP se volvieron y permanecieron seropositivas tras la vacunación de refuerzo en D21, mientras que las medias geométricas de títulos de IH de PVP para los tratamientos T1 y NTX se mantuvieron seronegativos (<100) durante la etapa de vacunación. Tras D80, al retar las cerdas jóvenes de T1 y T7 con PVP, ambos grupos eran seropositivos.
Todas las cerdas jóvenes eran negativas para viremia de PVP antes del reto los días D0 y D73 (datos no mostrados) y en D80 (0). Todos los controles negativos eran virémicos en D87 y 4/7 eran virémicos en D94.
Tabla 14: distribución de frecuencias de cerdas jóvenes positivas para PVP (en PCR) al retarlas con PVP a los 40 días de gestación (dG) en D80.
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Resultados de fetos: todos los fetos NTX se consideraron normales en la necropsia en D80 ([00326]). En la necropsia final en D129 y D130, el 22,5 % de los fetos de T1 (control negativo) eran normales, mientras que 99,12 % de los fetos en T7 eran normales. El tamaño y peso medios de los fetos de T1 (control negativo) era de 11,5 cm y 168,8 g, respectivamente, mientras que el tamaño y peso medios de los fetos en T7 era de 17,8 cm y 576,3 g, respectivamente.
Todos los fetos de NTX eran negativos para PVP, determinado mediante PCR de muestras de lavado torácico. Se confirmó la infección por PVP en 67/80 fetos de T1 de control negativo (83,75 %). Sesenta y dos de los 67 fetos de control negativo que se había confirmado que habían sido infectados por PVP eran fetos momificados. La totalidad de los 18 fetos de apariencia normal pertenecía a la misma camada, y solo cinco de estos 18 fetos se confirmó que eran positivos para pVp . Para T7, solo un cerdo resultó infectado, es decir, una tasa de infección <1 %.
Tabla 15. Datos de camada: número, tamaño, peso y estado de los fetos, y confirmación de laboratorio de la infección por PVP (PCR en muestras de lavado torácico).
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COMENTARIO/CONCLUSION
Las cerdas jóvenes del grupo NTX se mantuvieron seronegativas y sus fetos eran todos negativos para PVP según la PCR de las muestras de lavado torácico.
Las cerdas jóvenes en las que se administró T7 (10 |jg PPV+Ery+PRRSV) presentaron una respuesta sérica a la vacunación inicial y se mantuvieron seropositivas después de la vacunación de refuerzo. Ninguna de las cerdas jóvenes de T7 era virémica en los puntos de muestreo semanal después del reto. En la necropsia, solo 97,37% (111/114) de los fetos de T7 presentaban un estado normal y solo un feto presentó un resultado positivo para infección por PVP según la PCR del líquido de lavado torácico. En contraste, las cerdas jóvenes en las que se administró T1 (control negativo) eran seronegativas durante la etapa de vacunación y después del reto, y todas seroconvirtieron y se volvieron virémicas. El tamaño y peso medios de los fetos de T1 eran sustancialmente inferiores a las medias de T7. En la necropsia, solo 22,50 % (18/80) de los fetos de T1 presentaban un estado normal y 83,75 % (67/80) presentaron un resultado positivo para infección por PVP según la PCR del líquido de lavado torácico.
En conclusión, la vacuna de combinación (10 jg PPV+Ery) con PRRS MLV resultó eficaz en la prevención de viremia y de infección por PVP de los fetos en 40 dG.
LISTADO DE SECUENCIAS
La SEC ID n.° 4 es una secuencia de nucleótidos de VP2 del PVP 27a de codones optimizados, que se ha modificado adicionalmente para poseer dos sitios de enzima de restricción ClaI (la posición aminoácida 25 es un residuo de isoleucina; la posición aminoácida 36 es un residuo de serina y la posición aminoácida 37 es un residuo de isoleucina) de manera que flanquee la región codificante de VP2 que comprende repeticiones de glicina. Sin embargo, los sitios ClaI se introdujeron de manera que no interrumpiesen la región codificante de VP2. La SEC ID n.° 2 es la secuencia de proteína correspondiente a SEC ID n.° 4. SEC ID n.° 3 es la secuencia de nucleótidos de VP2 del PVP 27a de codones optimizados (sin los sitios del enzima de restricción ClaI). La SEC ID n.° 1 es la secuencia de proteína correspondiente a la SEC ID n.° 3. Las SEC ID n.° 5 a 16 dan a conocer secuencias de VP2 del PVP adicionales con (SEC ID n.° 5 a n.° 10) o sin sitios ClaI (SEC ID n.° 11 a n.° 16). La SEC ID n.° 17 corresponde a la secuencia de tipo salvaje del PRRSV Lelystad y la SEC iD n.° 18 corresponde a la secuencia de tipo salvaje del PRRSV VR2332.

Claims (10)

  1. REIVINDICACIONES
    i. Composición inmunogénica, una vacuna de combinación o una combinación que comprende:
    a) por lo menos un antígeno de parvovirus porcino (PVP), en el que por lo menos un antígeno de PVP es una o más subunidades del PVP y por lo menos una de las subunidades del PVP es la proteína vírica 2 del PVP (VP2), en la que VP2 del PVP consiste en una secuencia de aminoácidos que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 99 %, preferentemente 100 %, respecto a la secuencia de aminoácidos SEC ID n.° 2, en la que preferentemente VP2 del PVP es el único antígeno del PVP contenido en el PVP, y
    b) por lo menos un antígeno del virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRS), en el que por lo menos un antígeno del virus del PRRS es un virus del PRRs vivo atenuado/vivo modificado, seleccionado del grupo que consiste en: virus del PRRS vivo atenuado/vivo modificado de genotipo de tipo 1, virus del PRRS vivo atenuado/vivo modificado de genotipo de tipo 2, virus del PRRS vivo atenuado/vivo modificado de cepa 94881 y el virus del PRRS cepa ATCC n.° de depósito VR-2332.
  2. 2. Composición inmunogénica, vacuna de combinación o combinación según la reivindicación 1, en la que la composición inmunogénica, vacuna de combinación o combinación se formula para la administración de dosis única o una administración de dos dosis.
  3. 3. Composición inmunogénica, vacuna de combinación o combinación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en la que la composición inmunogénica, vacuna de combinación o combinación comprende, además, por lo menos un portador farmacéuticamente aceptable, preferentemente un carbómero.
  4. 4. Composición inmunogénica, vacuna de combinación o combinación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la composición inmunogénica, vacuna de combinación o combinación comprende entre 0,1 |jg y 50 |jg del antígeno VP2 del PVP, preferentemente entre 0,5 |jg y 10 |jg de antígeno VP2 del PVP, más preferentemente entre 1,0 jig y 10 jig del antígeno VP2 del PVP y/o entre 3,9 y 7,0 log10TCID50 del virus del PRRS vivo atenuado/vivo modificado.
  5. 5. Composición inmunogénica, vacuna de combinación o combinación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que por lo menos un antígeno de parvovirus porcino (PVP) y el antígeno o antígenos del virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRS) están contenidos juntos en un único recipiente o se encuentran separados espacialmente unos de otros, preferentemente están contenidos en dos o más recipientes separados.
  6. 6. Kit que comprende la composición inmunogénica, vacuna de combinación o combinación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
  7. 7. Kit según la reivindicación 6, en el que el antígeno o antígenos de parvovirus porcino (PVP) y el antígeno o antígenos del virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRS) están contenidos separadamente unos de otros en dos o más recipientes separados, preferentemente tanto independientemente unos de otros en forma liofilizada o en forma congelada, y en el que el kit comprende, además, un manual de instrucciones para mezclar el antígeno o antígenos del PVP separados especialmente y el antígeno o antígenos del virus del PRRS, en los que preferentemente dicho manual de instrucciones contiene indicaciones para combinar el contenido del recipiente o recipientes que contienen el antígeno o antígenos del PVP con el contenido del recipiente o recipientes que contienen el antígeno o antígenos del virus del PRRS, en el que más preferentemente el contenido de líquido del recipiente o recipientes que contienen por lo menos un antígeno del PVP se utiliza como un diluyente para el contenido liofilizado del recipiente o recipientes que contienen el antígeno o antígenos del virus de PPRS.
  8. 8. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 7, en el que el kit comprende, además, indicaciones para el tratamiento y/o la profilaxis de enfermedades en cerdos y/o comprende, además, indicaciones para el tratamiento y/o la profilaxis de infecciones del PVP y/o infecciones del virus del PRRS, preferentemente dicho kit comprende, además, indicaciones para el uso asociado del componente PVP (preferentemente como un componente separado del kit) y el componente PRRSV (preferentemente como un componente separado del kit) de la composición inmunogénica, vacuna de combinación o combinación tal como se da a conocer y se reivindica en la presente memoria y que está contenido en dicho kit.
  9. 9. Composición inmunogénica, vacuna de combinación o combinación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, o el kit según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8 para la utilización como un medicamento, preferentemente como una vacuna.
  10. 10. Composición inmunogénica, vacuna de combinación o combinación según la reivindicación 9 para la utilización en un método de tratamiento y/o prevención de una infección por el PVP y/o el virus de PRRS, la reducción, la prevención o el tratamiento de los signos clínicos causados por una infección por PVP y/o el virus de PRRS, o para el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad causada por una infección por PVP y/o el virus de PRRS, en el que preferentemente el antígeno o antígenos del parvovirus porcino (PVP) y el antígeno o antígenos del virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRS) se administran en el sujeto simultáneamente, más preferentemente por separado simultáneamente en el mismo sitio de administración o en sitios de administración diferentes, secuencialmente (en cualquier orden) y/o de una manera escalonada cronológicamente.
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