RS64266B1

RS64266B1 - Bispecifični molekul koji aktivira t ćeliju koji se aktivira proteazom

Info

Publication number: RS64266B1
Application number: RS20230438A
Authority: RS
Inventors: Peter Bruenker; Rebecca Croasdale-Wood; Christian Klein; Juergen Michael Schanzer; Kay-Gunnar Stubenrauch; Pablo Umana; Martina Geiger; Eric Sullivan; Jigar Patel
Original assignee: Hoffmann La Roche
Priority date: 2016-03-22
Filing date: 2017-03-20
Publication date: 2023-07-31
Also published as: LT3433280T; IL260637B2; US11242390B2; US20260055184A1; US20190119383A1; ES2947230T3; HUE061946T2; US20220275087A1; ZA201804973B; CL2018002507A1; MX2018011542A; PL3433280T3; IL260637A; JP2019514850A; JP7015244B2; SI3433280T1; NZ744390A; PE20231511A1; RU2018136567A; IL260637B1

Description

OPIS

Oblast pronalaska

Predmetni pronalazak se generalno odnosi na nove molekule koji se mogu aktivirati proteazom i koji vezuju antigen, koji sadrže deo protiv vezivanja idiotipa koji reverzibilno maskira vezivanje antigena molekula. Konkretno, pronalazak se odnosi na molekule koji vezuju T ćelije koji imaju deo protiv vezivanja idiotipa koji maskira CD3-vezujući deo dok se ne pocepa proteazom. To omogućava da CD3-vezujući ostatak bude nedostupan ili „maskiran“ sve dok se ne nađe u blizini ciljnog tkiva, kao što je tumor, npr. T ćelije koje infiltriraju tumor. Pored toga, predmetni pronalazak se odnosi na polinukleotide koji kodiraju takve molekule aktivirane proteazom koji vezuju T ćelije i polipeptide specifične za idiotip, i vektore i ćelije domaćine koji sadrže takve polinukleotide. Pronalazak se nadalje odnosi na postupke za proizvodnju molekula aktiviranih proteazom koji vezuju T ćelije prema pronalasku i na postupke za korišćenje istih, npr., u lečenju bolesti.

Osnova

Selektivno uništenje pojedinačne ciljne ćelije ili specifičnog tipa ciljnih ćelija je često poželjno u različitim kliničkim postavkama. Na primer, primarni cilj terapije karcinoma je da ciljano uništi tumorske ćelije, a ostavi zdrave ćelije i tkiva netaknute i neoštećene.

Zanimljiv način da se to postigne je putem indukcije imunog odgovora protiv tumora da bi imunske efektorske ćelije, kao što su ćelije prirodne ubice (NK) ili citotoksični T limfociti (CTL), napale i uništile tumorske ćelije. U tom smislu, bispecifična antitela dizajnirana da se vežu jednim „krakom“ za površinski antigen na ciljnim ćelijama, i drugim „krakom“ za aktivirajuću, nepromenljivu komponentu kompleksa T ćelijskih receptora (TCR), postala su interesantna poslednjih godina. Istovremeno vezivanje takvog antitela za oba cilja će izazvati privremenu interakciju između ciljne ćelije i T ćelije, i uzrokovati aktivaciju bilo koje citotoksične T ćelije, a nakon toga i lizu ciljne ćelije. Tako se imunski odgovor preusmerava na ciljne ćelije i ne zavisi od prezentacije peptidnog antigena od strane ciljne ćelije ili specifičnosti T ćelije, kao što je relevantno za normalnu MHC-ograničenu aktivaciju CTL.

U tom kontekstu ključno je da se CTL aktiviraju samo kada su u neposrednoj blizini ciljne ćelije, tj. imitira se imunološka sinapsa. Naročito poželjni su bispecifični molekuli koji aktiviraju T ćelije koji ne zahtevaju pretkondicioniranje ili kostimulaciju limfocita kako bi se izazvala efikasna liza ciljnih ćelija. Razvijeno je nekoliko formata bispecifičnih antitela, i ispitana je njihova prikladnost za imunoterapiju posredovanu T ćelijama. Tu spadaju molekuli BiTE (bispecifični T ćelijski hvatač) (Nagorsen i Bäuerle, Exp Cell 317, 1255-1260 (2011)), dijatela (Holliger et al., Prot Eng 9, 299-305 (1996)) i njihovi derivati, kao što su tandem dijatela (Kipriyanov et al., J Mol Biol 293, 41-66 (1999)), molekuli DART (ponovno ciljanje dvostrukog afiniteta), (Moore et al., Blood 117, 4542-51 (2011)) i triomab (Seimetz et al., Cancer Treat Rev 36, 458-467 (2010)). WO2016014974 opisuje anti-CD3 antitela koja se mogu aktivirati i postupke za njihovu primenu. Carreno et al 1991 Hum Immunol 33(4):249-58 (1992) opisuju reaktivnost unakrsnih vrsta kaskade anti-idiotipa anti-OKT3.

Zadatak generisanja bispecifičnih molekula pogodnih za lečenje pruža nekoliko tehničkih izazova vezanih za efikasnost, toksičnost, primenljivost i produktivnost koji moraju biti ispunjeni. U slučajevima kada bispecifični molekul cilja antigen na ciljnoj ćeliji, npr. ćeliji raka, koja se takođe eksprimira u neciljanom tkivu, može doći do toksičnosti. Stoga postoji potreba za efikasnim bispecifičnim molekulima koji aktiviraju T ćelije i koji oslobađaju punu aktivaciju T ćelija u prisustvu ciljnih ćelija, ali ne u prisustvu normalnih ćelija ili tkiva.

SAŽETAK PRONALASKA

Pronalazak se generalno odnosi na bispecifične molekule koji aktiviraju T ćelije i koji se selektivno aktiviraju u prisustvu ciljne ćelije.

U jednom aspektu, pronalazak se odnosi na bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom, koji sadrži

(a) prvi antigen vezujući deo sposoban za specifično vezivanje za CD3, pri čemu, prvi antigen vezujući deo je antitelo ili njegov fragment;

(b) drugi antigen vezujući deo sposoban za specifično vezivanje za antigen ciljne ćelije, pri čemu, drugi antigen vezujući deo je antitelo ili njegov fragment; i

(c) maskirni deo kovalentno vezan za bispecifični molekul koji vezuje T ćelije preko proteazno-cepljivog linkera, pri čemu, maskirni deo je sposoban za specifično vezivanje za idiotip prvog ili drugog dela koji vezuje antigen, čime reverzibilno prikriva prvi ili drugi deo koji vezuje antigen, pri čemu, maskirni deo je antiidiotipski scFv.

U jednom otelotvorenju, maskirni deo bispecifičnog molekula koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom je kovalentno vezan za prvi antigen vezujući deo. U jednom otelotvorenju, maskirni deo je kovalentno vezan za varijabilni region teškog lanca prvog dela koji vezuje antigen. U jednom otelotvorenju, maskirni deo je kovalentno vezan za varijabilni region lakog lanca prvog dela koji vezuje antigen. U jednom otelotvorenju, maskirni deo je anti-idiotip scFv.

U jednom otelotvorenju, bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom sadrži drugi maskirajući deo koji reverzibilno prikriva drugi antigen vezujući deo. U jednom otelotvorenju, proteaza sposobna da cepa linker koji može da se cepa proteazom eksprimiran je iod strane ciljne ćelije. U jednom otelotvorenju, drugi antigen vezujući deo je ukršteni molekul Fab u kome su razmenjeni varijabilni ili konstantni regioni lakog lanca Fab i teškog lanca Fab. U jednom otelotvorenju, drugi antigen vezujući deo je ukršteni molekul Fab u kome su razmenjeni konstantni regioni lakog lanca Fab i teškog lanca Fab. U jednom otelotvorenju, prvi antigen vezujući deo je konvencionalni molekul Fab. U jednom otelotvorenju, bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom sadrži najviše jedan antigen vezujući deo sposoban za specifično vezivanje za CD3. U jednom otelotvorenju, bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom sadrži treći antigen vezujući deo koji je molekul Fab sposoban da se specifično veže za antigen ciljne ćelije. U jednom konkretnom otelotvorenju, treći antigen vezujući deo je identičan drugom antigen vezujućem delu. U jednom konkretnom otelotvorenju, treći antigen vezujući deo nije identičan drugom antigen vezujućem delu. U jednom otelotvorenju, drugi antigen vezujući deo je sposoban za specifično vezivanje za FolR1 ili HER1. U jednom otelotvorenju, drugi antigen vezujući deo je sposoban za specifično vezivanje za FolR1, HER1 ili mezotelin. U jednom otelotvorenju, drugi antigen vezujući deo je sposoban za specifično vezivanje za FolR1, HER1, HER2 ili mezotelin.

U jednom otelotvorenju, prvi i drugi antigen vezujući deo su spojeni jedan sa drugim, opciono preko peptidnog linkera. U jednom konkretnom otelotvorenju, drugi antigen vezujući deo je spojen na C-terminalnom kraju teškog lanca Fab sa N-terminalnim krajem teškog lanca Fab prvog antigen vezujućeg dela. U jednom konkretnom otelotvorenju, prvi antigen vezujući deo je spojen na C-terminalnom kraju teškog lanca Fab sa N-terminalnim krajem teškog lanca Fab drugog antigen vezujućeg dela. U jednom konkretnom otelotvorenju, laki lanac Fab prvog antigen vezujućeg dela i laki lanac Fab drugog antigen vevezujućeg dela su spojeni jedan sa drugim, opciono preko peptidnog linkera.

U jednom otelotvorenju, bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom sadrži Fc domen sastavljen od prve i druge podjedinice sposobne za stabilno povezivanje. U jednom otelotvorenju, Fc domen je IgG, posebno IgG1ili IgG4, Fc domen. U jednom otelotvorenju, Fc domen je humani Fc domen. U jednom otelotvorenju, Fc domen pokazuje smanjeni afinitet vezivanja za Fc receptor i/ili smanjenu efektorsku funkciju, u poređenju sa Fc domenom nativnog IgG1. U jednom otelotvorenju, Fc domen sadrži jednu ili više aminokiselinskih supstitucija koje smanjuju vezivanje za Fc receptor i/ili efektorsku funkciju. U jednom konkretnom otelotvorenju, jedna ili više od pomenutih aminokiselinskih supstitucija se nalazi na jednoj ili više pozicija izabranih iz grupe L234, L235 i P329 (numeracija prema Kabatu). U jednom konkretnom otelotvorenju, svaka podjedinica Fc domena sadrži tri aminokiselinske supstitucije koje smanjuju vezivanje za aktivacioni Fc receptor i/ili efektorsku funkciju, pri čemu, navedene aminokiselinske supstitucije su L234A, L235A i P329G. U jednom konkretnom otelotvorenju, Fc receptor je Fcγ receptor. U jednom otelotvorenju, efektorska funkcija je ćelijski posredovana citotoksičnost zavisna od antitela (ADCC). U drugom otelotvorenju, ciljna ćelija je humana ćelija.

U jednom otelotvorenju, maskirni deo sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži najmanje jedno od sledećeg:

(a) aminokiselinsku sekvencu regiona koji određuje komplementarnost teškog lanca (CDR H) 1 aminokiselinske sekvence DYSIH (SEQ ID NO:20);

(b) aminokiselinsku sekvencu CDR H2 WINTETGEPAYADDFKG (SEQ ID NO:21); i

(c) aminokiselinsku sekvencu CDR H3 PYDYDVLDY (SEQ ID NO:22).

U jednom otelotvorenju, maskirni deo sadrži varijabilni region lakog lanca koji sadrži najmanje jedno od sledećeg:

(a) aminokiselinsku sekvencu lakog lanca (CDR L) 1 RASKSVSTSNYSYIH (SEQ ID NO:23);

(b) aminokiselinsku sekvencu CDR L2 YVSYLES (SEQ ID NO:24); i

(c) aminokiselinsku sekvencu CDR L3 QHSREFPWT (SEQ ID NO:25).

U jednom otelotvorenju, maskirni deo sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži: (a) aminokiselinsku sekvencu regiona koji određuje komplementarnost teškog lanca (CDR H) 1 aminokiselinske sekvence DYSIH (SEQ ID NO:20);

(b) aminokiselinsku sekvencu CDR H2 WINTETGEPAYADDFKG (SEQ ID NO:21); (c) aminokiselinsku sekvencu CDR H3 PYDYDVLDY (SEQ ID NO:22); i varijabilni region lakog lanca koji sadrži:

(d) aminokiselinsku sekvencu lakog lanca (CDR L) 1 RASKSVSTSNYSYIH (SEQ ID NO:23);

(e) aminokiselinsku sekvencu CDR L2 YVSYLES (SEQ ID NO:24); i

(f) aminokiselinsku sekvencu CDR L3 QHSREFPWT (SEQ ID NO:25).

(a) aminokiselinsku sekvencu regiona koji određuje komplementarnost teškog lanca (CDR H) 1 aminokiselinske sekvence SYGVS (SEQ ID NO:26);

(b) aminokiselinsku sekvencu CDR H2 IIWGDGSTNYHSALIS (SEQ ID NO:27); i (c) aminokiselinsku sekvencu CDR H3 GITTVVDDYYAMDY (SEQ ID NO:28). U jednom otelotvorenju, maskirni deo sadrži varijabilni region lakog lanca koji sadrži najmanje jedno od sledećeg:

(a) aminokiselinsku sekvencu lakog lanca (CDR L) 1 RASENIDSYLA (SEQ ID NO:29);

(b) aminokiselinsku sekvencu CDR L2 AATFLAD (SEQ ID NO:30); i

(c) aminokiselinsku sekvencu CDR L3QHYYSTPYT (SEQ ID NO:31).

U jednom otelotvorenju, maskirni deo sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži: (a) aminokiselinsku sekvencu regiona koji određuje komplementarnost teškog lanca (CDR H) 1 aminokiselinske sekvence SYGVS (SEQ ID NO:26);

(b) aminokiselinsku sekvencu CDR H2 IIWGDGSTNYHSALIS (SEQ ID NO:27); (c) aminokiselinsku sekvencu CDR H3 GITTVVDDYYAMDY (SEQ ID NO:28); i varijabilni region lakog lanca koji sadrži:

(d) aminokiselinsku sekvencu lakog lanca (CDR L) 1 RASENIDSYLA (SEQ ID NO:29);

(e) aminokiselinsku sekvencu CDR L2 AATFLAD (SEQ ID NO:30); i

(f) aminokiselinsku sekvencu CDR L3QHYYSTPYT (SEQ ID NO:31).

U jednom otelotvorenju, linker koji se cepa proteazom sadrži najmanje jednu sekvencu prepoznavanja proteaze. U jednom otelotvorenju, linker koji se cepa proteazom sadrži sekvencu prepoznavanja proteaze. U jednom otelotvorenju, sekvenca prepoznavanja proteaze je odabrana iz grupe koja sadrži:

(a) RQARVVNG (SEQ ID NO:36);

(b) VHMPLGFLGPGRSRGSFP (SEQ ID NO:37);

(c) RQARVVNGXXXXXVPLSLYSG (SEQ ID NO:38); i

(d) RQARVVNGVPLSLYSG (SEQ ID NO:39)

(e) PLGLWSQ (SEQ ID NO:40), pri čemu, X je bilo koja aminokiselina.

U jednom otelotvorenju, linker koji se cepa proteazom sadrži sekvencu prepoznavanja proteaze. U jednom otelotvorenju, sekvenca prepoznavanja proteaze je odabrana iz grupe koja sadrži:

(a) RQARVVNG (SEQ ID NO:36);

(b) VHMPLGFLGPGRSRGSFP (SEQ ID NO:37);

(c) RQARVVNGXXXXXVPLSLYSG (SEQ ID NO:38);

(d) RQARVVNGVPLSLYSG (SEQ ID NO:39);

(e) PLGLWSQ (SEQ ID NO:40);

(f) VHMPLGFLGPRQARVVNG (SEQ ID NO:97);

(g) FVGGTG (SEQ ID NO:98);

(h) KKAAPVNG (SEQ ID NO:99);

(i) PMAKKVNG (SEQ ID NO:100);

(j) QARAKVNG (SEQ ID NO:101);

(k) VHMPLGFLGP (SEQ ID NO:102);

(l) QARAK (SEQ ID NO:103);

(m) VHMPLGFLGPPMAKK (SEQ ID NO:104);

(n) KKAAP (SEQ ID NO:105); i

(o) PMAKK (SEQ ID NO:106), pri čemu, X je bilo koja aminokiselina.

U jednom otelotvorenju, proteaza sposobna za cepanje linkera koji se cepa proteazom je izabrana iz grupe koja se sastoji od metaloproteinaze, npr. matrice metaloproteinaze (MMP) 1-28 i A dezintegrina i metaloproteinaze (ADAM) 2, 7-12, 15, 17-23, 28-30 i 33, serinske proteaze, npr. aktivatora plazminogena tipa urokinaze i matriptaze, cistein proteaze, asparaginske proteaze i katepsin proteaze. U jednom konkretnom otelotvorenju, proteaza je MMP9 ili MMP2. U daljem konkretnom otelotvorenju, proteaza je matriptaza. U jednom otelotvorenju, linker koji se cepa proteazom sadrži sekvencu prepoznavanja proteaze RQARVVNG (SEQ ID BR:36).

U jednom otelotvorenju ovde opisanog bispecifičnog molekula koji aktivira T ćelije koji se aktivira proteazom, prvi deo koji se vezuje za antigen sadrži najmanje jedan region koji određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci aminokiselina izabranoj iz grupe koju čine SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45 i SEQ ID NO: 46, i najmanje jedan CDR lakog lanca odabran iz grupe koja obuhvata SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 i SEQ ID NO: 19.

U jednom otelotvorenju ovde opisanog bispecifičnog molekula koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom, prvi antigen vezujući deo sadrži region koji određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45 i SEQ ID NO: 46 i CDR lakog lanca SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 i SEQ ID NO: 19.

U jednom otelotvorenju bispecifičnog molekula koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom, prvi antigen vezujući deo sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 43 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 55.

U jednom otelotvorenju bispecifičnog molekula koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom, opisanog ovde, prvi antigen vezujući deo sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 43 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 55.

U jednom otelotvorenju ovde opisanog bispecifičnog molekula koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom, drugi antigen vezujući deo je sposoban za specifično vezivanje za FolR1 i sadrži najmanje jedan region koji određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci izabranoj iz grupe koju čine SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 i SEQ ID NO: 16 i najmanje jedan CDR lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci izabranoj iz grupe koju čine SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 i SEQ ID NO: 19.

U jednom otelotvorenju ovde opisanog bispecifičnog molekula koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom, drugi antigen vezujući deo je sposoban za specifično vezivanje za FolR1 i sadrži najmanje jedan region koji određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci izabranoj iz grupe koju čine SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 152 i SEQ ID NO: 153 i najmanje jedan CDR lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci izabranoj iz grupe koju čine SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 155 i SEQ ID NO: 156.

U jednom otelotvorenju bispecifičnog molekula koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom, drugi antigen vezujući deo sposoban je za specifično vezivanje za FoIR1 i sadrži najmanje jedan region koji određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 i SEQ ID NO: 16, i najmanje jedan CDR lakog lanca odabran iz grupe koja obuhvata SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 i SEQ ID NO: 19.

U jednom otelotvorenju bispecifičnog molekula koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom, drugi antigen vezujući deo sposoban je za specifično vezivanje za FoIR1 i sadrži najmanje jedan region koji određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 152 i SEQ ID NO: 153, i najmanje jedan CDR lakog lanca odabran iz grupe koja obuhvata SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 155 i SEQ ID NO: 156.

U jednom otelotvorenju ovde opisanog bispecifičnog molekula koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom, drugi antigen vezujući deo sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 47 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 55.

U jednom otelotvorenju ovde opisanog bispecifičnog molekula koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom, drugi antigen vezujući deo sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 157 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 158.

U jednom otelotvorenju bispecifičnog molekula koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom, opisanog ovde, drugi antigen vezujući deo sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 47 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 55.

U jednom otelotvorenju bispecifičnog molekula koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom, opisanog ovde, drugi antigen vezujući deo sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 157 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 158.

U jednom otelotvorenju bispecifičnog molekula koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom, drugi antigen vezujući deo je sposoban za specifično vezivanje za mezotelin i sadrži najmanje jedan region koji određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci izabranoj iz grupe koju čine SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108 i SEQ ID NO: 109 i najmanje jedan CDR lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci izabranoj iz grupe koju čine SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111 i SEQ ID NO: 112.

U jednom otelotvorenju ovde opisanog bispecifičnog molekula koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom, drugi antigen vezujući deo je sposoban za specifično vezivanje za mezotelin i sadrži najmanje jedan region koji određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108 i SEQ ID NO: 109, i najmanje jedan CDR lakog lanca odabran iz grupe koja obuhvata SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111 i SEQ ID NO: 112.

U jednom otelotvorenju ovde opisanog bispecifičnog molekula koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom, drugi antigen vezujući deo sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 113 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 114.

U jednom otelotvorenju bispecifičnog molekula koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom, opisanog ovde, drugi antigen vezujući deo sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 113 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 114.

U jednom otelotvorenju ovde opisanog bispecifičnog molekula koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom, drugi antigen vezujući deo je sposoban za specifično vezivanje za HER1 i sadrži najmanje jedan region koji određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca bilo kojih antitela navedenih u WO/2006/082515.

U jednom otelotvorenju ovde opisanog bispecifičnog molekula koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom, drugi antigen vezujući deo je sposoban za specifično vezivanje za HER1 i sadrži najmanje jedan region koji određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci izabranoj iz grupe koju čine SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57 i SEQ ID NO: 58 i najmanje jedan CDR lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci izabranoj iz grupe koju čine SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60 i SEQ ID NO: 61.

U jednom otelotvorenju ovde opisanog bispecifičnog molekula koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom, drugi antigen vezujući deo je sposoban za specifično vezivanje za HER1 i sadrži najmanje jedan region koji određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca izabran iz grupe koju čine SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57 i SEQ ID NO: 58, i najmanje jedan CDR lakog lanca odabran iz grupe koja obuhvata SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60 i SEQ ID NO: 61.

U jednom otelotvorenju ovde opisanog bispecifičnog molekula koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom, drugi antigen vezujući deo sadrži teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 32 i teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 33. U jednom otelotvorenju bispecifičnog molekula koji aktivira T ćeliju koji se

1

aktivira proteazom, opisanog ovde, drugi antigen vezujući deo sadrži teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 32, i laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 33.

U jednom otelotvorenju, prvi antigen vezujući ostatak je sposoban da se specifično vezuje za CD3, i sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 43 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 55, i drugi i treći antigen vezujući deo su sposobni za specifično vezivanje za HER2, pri čemu drugi deo koji vezuje antigen sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 160 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 161, pri čemu treći antigen vezujući deo sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 159 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 161.

U jednom konkretnom otelotvorenju, bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom opisan ovde sadrži

(a) prvi teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:2;

(b) drugi teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:3; i

(c) laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:1.

(a) prvi teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:4;

(b) drugi teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:3; i

(c) laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:1.

(a) najmanje jedan teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:32; (b) najmanje jedan laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:34. U jednom konkretnom otelotvorenju, bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom opisan ovde sadrži

(a) prvi teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:72;

(b) drugi teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:3; i

(c) laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:1.

(a) prvi teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:85;

(b) drugi teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:3; i

(c) laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:1.

(a) prvi teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:73;

(b) drugi teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:3;

(c) prvi laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:1; i

(d) drugi laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 74.

(a) prvi teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:77;

(b) drugi teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:82;

(c) prvi laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:78; i

(d) drugi laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:81.

(a) prvi teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:76;

(b) drugi teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:77;

(c) prvi laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:78; i

(d) drugi laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:79.

(a) prvi teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 132;

(b) drugi teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:136;

(c) prvi laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:81; i

(d) drugi laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:133.

(a) prvi teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:137;

(b) drugi teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:139;

(c) prvi laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:81; i

(d) drugi laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:138.

U jednom aspektu, pronalazak se odnosi na polipeptid specifičan za idiotip za reverzibilno prikrivanje anti-CD3 mesta vezivanja antigena molekula, pri čemu, polipeptid specifičan za idiotip je anti-idiotip scFV, i pri čemu, polipeptid specifičan za idiotip je kovalentno vezan za molekul preko peptidnog linkera. U jednom otelotvorenju, linker je linker koji se cepa proteazom. U jednom otelotvorenju, peptidni linker sadrži najmanje jedno mesto prepoznavanja proteaze. U jednom otelotvorenju, proteaza je izabrana iz grupe koja se sastoji od metaloproteinaze, npr. matrice metaloproteinaze (MMP) 1-28 i dezintegrina i metaloproteinaze (ADAM) 2, 7-12, 15, 17-23, 28-30 i 33, serinske proteaze, npr. aktivatora plazminogena tipa urokinaze i matriptaze, cistein proteaze, asparaginske proteaze i katepsina. U jednom konkretnom otelotvorenju, proteaza je MMP9 ili MMP2. U daljem konkretnom otelotvorenju, proteaza je matriptaza. U jednom otelotvorenju, polipeptid specifičan za idiotip je kovalentno vezan za molekul preko više od jednog linkera. U jednom otelotvorenju, polipeptid specifičan za idiotip je kovalentno vezan za molekul preko dva linkera.

U jednom otelotvorenju, molekul koji sadrži mesto vezivanja antigena anti-CD3 je bispecifični molekul koji aktivira T-ćeliju. U jednom konkretnom otelotvorenju, polipeptid specifičan za idiotip sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži najmanje jedno od sledećeg:

(b) aminokiselinsku sekvencu CDR H2 WINTETGEPAYADDFKG (SEQ ID NO:21); i

(c) aminokiselinsku sekvencu CDR H3 PYDYDVLDY (SEQ ID NO:22).

U jednom konkretnom otelotvorenju, polipeptid specifičan za idiotip sadrži varijabilni region lakog lanca koji sadrži najmanje jedno od sledećeg

(b) aminokiselinsku sekvencu CDR L2 YVSYLES (SEQ ID NO:24); i

(c) aminokiselinsku sekvencu CDR L3 QHSREFPWT (SEQ ID NO:25).

U jednom konkretnom otelotvorenju, polipeptid specifičan za idiotip sadrži:

(a) aminokiselinsku sekvencu regiona koji određuje komplementarnost teškog lanca

1

(CDR H) 1 aminokiselinske sekvence DYSIH (SEQ ID NO:20);

(e) aminokiselinsku sekvencu CDR L2 YVSYLES (SEQ ID NO:24); i

(f) aminokiselinsku sekvencu CDR L3 QHSREFPWT (SEQ ID NO:25).

U jednom konkretnom otelotvorenju, polipeptid specifičan za idiotip sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži najmanje jedno od sledećeg:

(b) aminokiselinsku sekvencu CDR H2 IIWGDGSTNYHSALIS (SEQ ID NO:27); i (c) aminokiselinsku sekvencu CDR H3 GITTVVDDYYAMDY (SEQ ID NO:28). U jednom konkretnom otelotvorenju, polipeptid specifičan za idiotip sadrži varijabilni region lakog lanca koji sadrži najmanje jedno od sledećeg:

(a) aminokiselinsku sekvencu lakog lanca (CDR L) 1 RASENIDSYLA (SEQ ID NO:29);

(b) aminokiselinsku sekvencu CDR L2 AATFLAD (SEQ ID NO:30); i

(c) aminokiselinsku sekvencu CDR L3QHYYSTPYT (SEQ ID NO:31).

U jednom konkretnom otelotvorenju, polipeptid specifičan za idiotip sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži:

(d) aminokiselinsku sekvencu lakog lanca (CDR L) 1 RASENIDSYLA (SEQ ID NO:29);

(e) aminokiselinsku sekvencu CDR L2 AATFLAD (SEQ ID NO:30); i

(f) aminokiselinsku sekvencu CDR L3QHYYSTPYT (SEQ ID NO:31).

Prema drugom aspektu pronalaska, izolovani polinukleotid koji kodira bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom iz pronalaska. Pronalazak dalje obezbeđuje ekspresioni vektor koji sadrži izolovani polinukleotid iz pronalaska, i ćelija domaćina sadrži izolovani polinukleotid ili ekspresioni vektor iz pronalaska. U nekim otelotvorenjima, ćelija domaćin je eukariotska ćelija, posebno ćelija sisara.

U drugom aspektu, obezbeđen je postupak za proizvodnju molekula koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom prema pronalasku, koji obuhvata korake a) uzgajanja ćelije domaćina iz pronalaska pod uslovima pogodnim za ekspresiju molekula T ćelije aktiviranog proteazom i b) rekuperaciju molekula T ćelijue aktiviranog proteazom.

U drugom aspektu dat je samo za referencu postupak proizvodnje polipeptida specifičnog za idiotip kao što je gore opisano, koji obuhvata korake a) uzgajanja ćelije domaćina iz pronalaska pod uslovima pogodnim za ekspresiju molekula T ćelije aktiviranog proteazom i b) rekuperacije polipeptida specifičnog za idiotip.

Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom prema pronalasku i farmaceutski prihvatljiv nosač.

Takođe su obuhvaćenie postupci za upotrebu molekula T ćelije aktiviranog proteazom i farmaceutske kompozicije kao što je ovde ranije opisano. U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje molekul T ćelije aktiviran proteazom ili farmaceutsku kompoziciju iz pronalaska koji bi se koristili kao lek. U jednom aspektu, obezbeđen je molekul T ćelije aktiviran proteazom p ili farmaceutska kompozicija prema pronalasku, za upotrebu u lečenju bolesti kod pojedinca kome je to potrebno. U posebnom otelotvorenju, bolest je kancer.

U posebnom otelotvorenju, bolest je kancer. U bilo kom od gore navedenih otelotvorenja pojedinac je poželjno sisar, naročito čovek.

U drugom aspektu, pronalazak takođe obezbeđuje kompoziciju koja sadrži bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom i farmaceutski prihvatljiv nosač.

U drugom aspektu je za referencu obezbeđena samo kompozicija koja sadrži polipeptid specifičan za idiotip kao što je ovde gore opisano i farmaceutski prihvatljiv nosač.

U drugom aspektu obezbeđen je bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom kao što je iznad opisano, ili kompozicija opisana iznad, za upotrebu kao lek.

U drugom aspektu, pronalazak takođe obezbeđuje bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom kao što je iznad opisano, za upotrebu u lečenju bolesti kod pojedinca kome je to potrebno. U jednom otelotvorenju, bolest je proliferativni poremećaj, konkretno kancer.

U drugom aspektu, pronalazak takođe obezbeđuje antiidiotipsko CD3 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment specifičan za idiotip anti-CD3 antigen vezujućeg molekula, pri

1

čemu antiidiotipsko CD3 antitelo ili njegov fragment, kada je vezan za anti-CD3 antigen vezujući molekul, specifično blokira vezivanje anti-CD3 antigen vezujućeg molekula za CD3, pri čemu, antiidiotipsko CD3 antitelo ili njegov antigen je vezujući fragment reverzibilno povezan sa anti-CD3 antigen vezujućim molekulom preko peptidnog linkera koji sadrži mesto prepoznavanja proteaze. U jednom otelotvorenju, CD3 je CD3 miša, majmuna ili čoveka.

KRATAK OPIS SLIKA

Slike 1A-E prikazuju šeme različitih CD3 vezivača sa maskirajućim delovima. SL.1A: 7859 anti-ID CH2527 scFv 4.15.64 MK062 mesto matriptaze CD3 Fc. SL. 1B: 7860 anti-ID CH2527 scFv 4.32.63 MK062 mesto matriptaze CD3 Fc. SL.1C: 7857 anti-ID CH2527 scFv 4.15.64 linker koji se ne cepa CD3 Fc. SL.1D: ID 7858 anti-ID CH2527 scFv 4.32.63 linker koji se ne cepa CD3 Fc. SL. 1E: 7861 jednovalentni CD3 Fc.

Slika 2 prikazuje tabelu koja rezimira afinitete anti-idiotipskih maskirajućih delova prema CD3 vezivaču (CH2527).

Slika 3A-D prikazuje analizu kapilarnom elektroforezom-SDS molekula prikazanih na slikama 1A i B.3A-B Analiza kapilarnom elektroforezom-SDS molekula prikazanog na Sl.1A pod neredukcionim (Sl. 3A) i redukcionim uslovima (Sl. 3B). Poređenje netretiranog (I) i tretiranog molekula (III) pokazuje potpuno cepanje anti-ID scFv nakon tretmana pomoću rhMatriptaze/ST14 tokom 48 h na 37 °C. Jedan uzorak (II) nije tretiran, ali je inkubiran na 37 °C tokom 48 h. Sl.3C-D Analiza kapilarnom elektroforezom-SDS molekula prikazanog na Sl.

1B pod neredukcionim (Sl. 3C) redukcionim uslovima (Sl. 3D). Poređenje netretiranog (I) i tretiranog molekula (III) pokazuje potpuno cepanje anti-ID scFv nakon tretmana pomoću rhMatriptaze/ST14 tokom 48 h na 37 °C. Jedan uzorak (II) nije tretiran, ali je inkubiran na 37 °C tokom 48 h.

Slika 4A-C pokazuje efekat anti-idiotipskog maskiranja vezivanja CD3. SL. 4A i B prikazuju rezultate Jurkat NFAT reporterskih testova kako bi se pokazao efekat maskiranja anti-idiotipskog CD3 scFv 4.15.64 (Sl. 4A) ili anti-idiotipskog CD3 scFv 4.32.63 (Sl. 4B). Jednovalentni CD3 IgG su umreženi preko antihumanog Fc antitela (obloženog na pločici za test) pre nego što su dodati Jurkat NFAT (reporterska ćelijska linija akutne limfne leukemije sa NFAT promoterom, koja eksprimira humani CD3ε). Jurkat-NFAT reporterska ćelijska linija (Promega) je reporterska ćelijska linija humane akutne limfne leukemije sa NFAT promoterom, koja eksprimira humani CD3ε. Ako CD3 vezivač vezuje CD3ε, eksprimira se luciferaza i to se može meriti luminescencijom nakon dodavanja supstrata One-Glo (Promega). SL. 4C pokazuje poređenje vrednosti EC50 vezivanja CD3ε za maskirani i nemaskirani jednovalentni CD3 vezivač.

1

Slika 5A-H prikazuje šeme različitih bispecifičnih molekula T ćelija sa maskirajućim ostacima. SL. 5A: 7344 anti-ID CH2527 scFv 4.15.64 MK062 mesto matriptaze CD3 16D5 Fc. SL.5B: 7676 anti-ID CH2527 scFv 4.15.64 linker koji se ne cepa CD316D5 Fc. SL.5C: 7496 anti-ID CH2527 scFv 4.32.63 MK062 mesto matriptaze CD3 16D5 Fc. SL. 5D: 7611 anti-ID CH2527 scFv 4.32.63 linker koji se ne cepa CD316D5 Fc. SL. 5E: 6298 GA916-D-16D5-02 sf W(1). FolR116D5 klasični 2+1 TCB sa zajedničkim lakim lancem. SL.5F: 6100 GA916-D-16D5 sf W(3a). FolR116D5 invertovani 2+1 TCB sa zajedničkim lakim lancem. SL. 5G: ID 6182 DP47GS TCB sf CHO W(9a). DP47 invertovani 2+1 TCB. SL. 5H: 7494 anti-ID CH2527 Fab 4.15.64 MK062 mesto matriptaze CD316D5 Fc.

Slika 6 prikazuje prvi odnos plazmida koji se koristi za transfekciju prema hromatografiji ina molekulskim sitima (1(rupica): 1 (dugme): 3 (CLC)).

Slika 7 prikazuje drugi odnos plazmida koji se koriste za transfekciju prema hromatografiji na molekulskim sitima. (1(rupica): 2 (dugme): 3 (CLC)).

Slika 8 prikazuje CE-SDS analizu molekula TCB prikazanog na SL. 5A (ID 7344) (konačni prečišćeni preparat): traka A = neredukovan, traka B = redukovan, traka C = standard proteina.

Slika 9 prikazuje CE-SDS analizu molekula TCB prikazanog na SL. 5B (ID 7676) (konačni prečišćeni preparat): traka A = neredukovan, traka B = redukovan, traka C = standard proteina.

Slika 10 prikazuje CE-SDS analizu molekula TCB prikazanog na SL. 5C (ID 7496) (konačni prečišćeni preparat): traka A = neredukovan, traka B = redukovan, traka C = standard proteina.

Slika 11 prikazuje CE-SDS analizu molekula TCB prikazanog na SL. 5D (ID 7611) (konačni prečišćeni preparat): traka A = neredukovan, traka B = redukovan, traka C = standard proteina.

Slike 12A-D prikazuju analizu kapilarnom elektroforezom-SDS molekula prikazanih na slikama 5A i C. Sl. 12A i B pokazuju kapilarnu elektroforezu molekula prikazanih na slikama 5A (ID 7344) Anti-ID CH2527 scFv 4.15.64 MK062 CD3 16D6 Fc pod neredukujućim (Sl. 12A) i redukujućim uslovima (Sl. 12B). Poređenje netretiranog (I) i tretiranog molekula (III) pokazuje potpuno cepanje anti-ID scFv nakon tretmana pomoću rhMatriptaze/ST14 tokom 48 h na 37 °C. Jedan uzorak (II) nije tretiran, ali je inkubiran na 37 °C tokom 48 h. Prethodno označen protein marker (IV) Mark 12 (Invitrogen) korišćen je za procenu tačne molekulske mase. SL. 12C i D pokazuju kapilarnu elektroforezu molekula prikazanog na Sl. 5C (ID 7496) Anti-ID CH2527 scFv 4.32.63 MK062 CD3 16D6 Fc pod

1

neredukujućim (Sl. 12C) i redukujućim uslovima (Sl. 12D). Poređenje netretiranog (I) i tretiranog molekula (III) pokazuje potpuno cepanje anti-ID scFv nakon tretmana pomoću rhMatriptaze/ST14 tokom 48 h na 37 °C. Jedan uzorak (II) nije tretiran, ali je inkubiran na 37 °C tokom 48 h. Prethodno označen protein marker (IV) Mark 12 (Invitrogen) korišćen je za procenu tačne molekulske mase.

Slika 13 prikazuje kvantifikaciju nivoa ekspresije FolR1 izvršenu putem Qifikit (Dako). Antitela za FolR1: br. LS-C125620-100 (LifeSpan BioSciences Inc); koriste se u koncentraciji od 20 μg/ml; IgG1 izotip miša: br.554121 (BD).

Slike 14A i B pokazuju aktivaciju T ćelija pomoću TCB-a aktiviranih proteazom. SL.

14A prikazuje ubijanje Skov3 ćelija indukovano TCB molekulima aktiviranim proteazom u koncentraciji od 10 nM (TCB sa različitim antiidiotipskim CD3 maskama, cepljivi i necepljivi linker, molekuli prethodno tretirani prečišćenom rhMatriptazom/ST14) i humanim PBMC-ima nakon 48 h inkubacije (E:T = 7:1, efektori su humani PBMC-i). Predtretman rhMatriptazom/ST14 (R&D Systems) obavljen je za 24 h na 37 °C. SL. 14B pokazuje T ćelijsku aktivaciju humanih PBMC indukovanu vezivanjem TCB aktiviranim proteazom 10 nM (TCB sa različitim anti-idiotipskim CD3 maskama, cepljivim i necepljivim linkerom, tretiranim molekulima) na Skov3 ćelijama nakon 48 h inkubacije (E:T = 7:1, efektori su humani PBMC-i). Markeri aktivacije T ćelija CD25 (levi paneli) i CD69 (desni paneli). CD4+i CD8+T ćelije kao što je naznačeno.

Slike 15A i B pokazuju aktivaciju T ćelija pomoću TCB-a aktiviranih proteazom. SL.

15A pokazuje ubijanje Mkn-45 ćelija indukovanoh molekulima TCB aktiviranim proteazom u koncentraciji od 100 nM (TCB sa različitim anti-idiotipskim CD3 maskama, cepljivim i necepljivim linkerom, tretiranim molekulima) i humanim PBMC nakon 48 h inkubacije (E:T = 7:1, efektori su humani PBMC). Predtretman rhMatriptazom/ST14 (R&D Systems) obavljen je za 24 h na 37 °C. SL. 15B pokazuje T ćelijsku aktivaciju humanih PBMC indukovanu vezivanjem TCB aktiviranim proteazom 100nM (TCB sa različitim anti-idiotipskim CD3 maskama, cepljivim i necepljivim linkerom, tretiranim molekulima) na Mkn-45 ćelijama nakon 48 h inkubacije (E:T = 7:1, efektori su humani PBMC). Markeri aktivacije T ćelija CD25 (levi paneli) i CD69 (desni paneli). CD4+i CD8+T ćelije kao što je naznačeno.

Slika 16 pokazuje ubijanje HT29 ćelija indukovano molekulima TCB aktiviranim proteazom u koncentraciji od 10 nM (TCB sa različitim anti-idiotipskim CD3 maskama, cepljivim i necepljivim linkerom, tretiranim molekulima) i humanim PBMC nakon 48 h inkubacije (E:T = 10:1, efektori su humani PBMC). Predtretman rhMatriptazom/ST14 (R&D Systems) obavljen je za 24 h na 37 °C. Stubići sleva nadesno su 7344: anti-ID CH2527 scFv

1

4.15.64 MK062 CD3 16D6Fc; 7344: anti-ID CH2527 scFv 4.15.64 MK062 CD3 16D6Fc_tretirano; 7676: anti-ID CH2527 scFv 4.15.64 necepljivo CD316D6Fc; 7496 anti-ID CH2527 scFv 4.32.63 MK062 CD316D6 Fc; 7496 anti-ID CH2527 scFv 4.32.63 MK062 CD3 16D6 Fc_tretirano; 7611: ID anti CH2527 scFv 4.32.63 necepljivi linker CD316D6 Fc; 6298 GA916-D-16D5-02 sf W(1); 6182 DP47GS TCB sf CHO W(9a).

Slika 17 pokazuje ubijanje Skov3 ćelija indukovanih pmolekulima TCB aktiviranim proteazom u koncentraciji od 10 nM (TCB sa različitim anti-idiotipskim CD3 maskama, cepljivim i necepljivim linkerom, tretiranim molekulima) i humanim PBMC (od različitog donora nego PBMC korišćeni za Sl.14A) nakon 48 h inkubacije (E:T = 10:1, efektori su ljudski PBMC). Predtretman rhMatriptazom/ST14 (R&D Systems) obavljen je za 24 h na 37 °C. Stubići sleva nadesno su 7344: anti-ID CH2527 scFv 4.15.64 MK062 CD3 16D6Fc; 7344: anti-ID CH2527 scFv 4.15.64 MK062 CD3 16D6Fc_tretirano; 7676: anti-ID CH2527 scFv 4.15.64 necepljivo CD316D6Fc; 7496 anti-ID CH2527 scFv 4.32.63 MK062 CD3 16D6 Fc; 7496 anti-ID CH2527 scFv 4.32.63 MK062 CD3 16D6 Fc_tretirano; 7611: ID anti CH2527 scFv 4.32.63 necepljivi linker CD316D6 Fc; 6298 GA916-D-16D5-02 sf W(1); 6182 DP47GS TCB sf CHO W(9a).

Slike 18A i B pokazuju aktivaciju T ćelija pomoću TCB-a aktiviranih proteazom. SL.

18A pokazuje ubijanje HeLA ćelija zavisno od doze indukovano molekulima TCB aktiviranim proteazom (TCB sa anti-idiotipskom CD34.15.64 maskom, cepljivim i necepljivim linkerom, tretiranim molekulom) i humanim PBMC (izolovanim iz frakcije leukocita i trombocita) nakon 48 h inkubacije (E:T = 10:1, efektori su humani PBMC). Predtretman rhMatriptazom/ST14 (R&D Systems) obavljen je za 24 h na 37 °C. SL.18B pokazuje T-ćelijsku aktivaciju humanih PBMC indukovanu vezivanjem TCB aktiviranim proteazom (TCB sa anti-idiotipskom CD3 4.15.64 maskom, cepljivim i necepljivim linkerom, tretiranim molekulom) na HeLA ćelijama nakon 48 h inkubacije (E:T = 10:1, efektori su humani PBMC). Markeri aktivacije T ćelija CD25 (levi paneli) i CD69 (desni paneli). CD4+i CD8+T ćelije kao što je naznačeno.

Slike 19A i B pokazuju aktivaciju T ćelija pomoću TCB-a aktiviranih proteazom. SL.

19A pokazuje ubijanje HeLA ćelija zavisno od doze indukovano molekulima TCB aktiviranim proteazom (TCB sa anti-idiotipskom CD34.32.63 maskom, cepljivim i necepljivim linkerom, tretiranim molekulom) i humanim PBMC (izolovanim iz frakcije leukocita i trombocita) nakon 48 h inkubacije (E:T = 10:1, efektori su humani PBMC). Predtretman rhMatriptazom/ST14 (R&D Systems) obavljen je tokom 24 h na 37° C. Sl.19B pokazuje dozno zavisnu T-ćelijsku aktivaciju humanih PBMC indukovanu vezivanjem TCB aktiviranim proteazom (TCB sa antiidiotipskom CD3 4.32.63 maskom, cepljivim i necepljivim linkerom, tretiranim molekulom)

1

na HeLa ćelijama nakon 48 h inkubacije (E:T = 10:1, efektori su humani PBMC). Markeri aktivacije T ćelija CD25 (levi paneli) i CD69 (desni paneli). CD4+i CD8+T ćelije kao što je naznačeno.

Slike 20A i B pokazuju aktivaciju T ćelija pomoću TCB-a aktiviranih proteazom. SL.

20A pokazuje ubijanje Skov3 ćelija zavisno od doze indukovano molekulima TCB aktiviranim proteazom (TCB sa anti-idiotipskom CD34.15.64 maskom, cepljivim i necepljivim linkerom, tretiranim molekulom) i humanim PBMC (izolovanim iz frakcije leukocita i trombocita) nakon 48 h inkubacije (E:T = 10:1, efektori su humani PBMC). Predtretman rhMatriptazom/ST14 (R&D Systems) obavljen je za 24 h na 37 °C. SL. 20B pokazuje dozno zavisnu T-ćelijsku aktivaciju humanih PBMC-ova indukovanu vezivanjem TCB aktiviranim proteazom (TCB sa antiidiotipskom CD3 4.15.64 maskom, cepljivim i necepljivim linkerom, tretiranim molekulom) na Skov3 ćelijama nakon 48 h inkubacije (E:T = 10:1, efektori su humani PBMC-i). Markeri aktivacije T ćelija CD25 (levi paneli) i CD69 (desni paneli). CD4+i CD8+T ćelije kao što je naznačeno.

Slike 21A i B pokazuju aktivaciju T ćelija pomoću TCB-a aktiviranih proteazom. SL.

21A pokazuje ubijanje Skov3 ćelija zavisno od doze indukovano molekulima TCB aktiviranim proteazom (TCB sa anti-idiotipskom CD34.32.63 maskom, cepljivim i necepljivim linkerom, tretiranim molekulom) i humanim PBMC (izolovanim iz frakcije leukocita i trombocita) nakon 48 h inkubacije (E:T = 10:1, efektori su humani PBMC). Predtretman rhMatriptazom/ST14 (R&D Systems) obavljen je za 24 h na 37 °C. SL. 21B pokazuje dozno zavisnu T-ćelijsku aktivaciju humanih PBMC-ova indukovanu vezivanjem TCB aktiviranim proteazom (TCB sa antiidiotipskom CD3 4.32.63 maskom, cepljivim i necepljivim linkerom, tretiranim molekulom) na Skov3 ćelijama nakon 48 h inkubacije (E:T = 10:1, efektori su humani PBMC-i). Markeri aktivacije T ćelija CD25 (levi paneli) i CD69 (desni paneli). CD4+i CD8+T ćelije kao što je naznačeno.

Slike 22A i B pokazuju aktivaciju T ćelija pomoću TCB-a aktiviranih proteazom. SL.

22A pokazuje dozno zavisnu T-ćelijsku aktivaciju humanih PBMC (drugačiji donor nego u eksperimentima opisanim iznad) indukovanu vezivanjem TCB aktiviranim proteazom (TCB sa anti-idiotipskom CD3 4.15.64 maskom, cepljivim i necepljivim linkerom, tretiranim molekulom) na HT29 ćelijama nakon 48 h inkubacije (E:T = 10:1, efektori su humani PBMC). Markeri aktivacije T ćelija CD25 (levi paneli) i CD69 (desni paneli). CD4+i CD8+T ćelije kao što je naznačeno. SL. 22B pokazuje dozno zavisnu T-ćelijsku aktivaciju humanih PBMC (drugačiji donor nego na slici 16) indukovanu vezivanjem TCB aktiviranim proteazom (TCB sa anti-idiotipskom CD3 4.32.63 maskom, cepljivim i necepljivim linkerom, tretiranim

2

molekulom) na HT29 ćelijama nakon 48 h inkubacije (E:T = 10:1, efektori su humani PBMC). Markeri aktivacije T ćelija CD25 (levi paneli) i CD69 (desni paneli). CD4+i CD8+T ćelije kao što je naznačeno.

Slika 23 pokazuje dozno zavisnu T-ćelijsku aktivaciju humanih PBMC (drugačiji donor nego u eksperimentima opisanim iznad) indukovanu vezivanjem TCB aktiviranim proteazom (TCB sa anti-idiotipskom CD34.15.64 maskom, cepljivim i necepljivim linkerom, tretiranim molekulom) na HRCEpiC ćelijama nakon 48 h inkubacije (E:T = 10:1, efektori su humani PBMC). Markeri aktivacije T ćelija CD25 (levi paneli) i CD69 (desni paneli). CD4+i CD8+T ćelije kao što je naznačeno.

Slika 24 pokazuje ubijanje Ovcar3 ćelija indukovano molekulima TCB aktiviranim proteazom u koncentraciji od 50 nM (TCB sa različitim anti-idiotipskim CD3 maskama, cepljivim i necepljivim linkerom, tretiranim molekulima) i humanim PBMC nakon 48 h inkubacije (E:T = 10:1, efektori su humani PBMC). Predtretman rhMatriptazom/ST14 (R&D Systems) obavljen je za 10 min na 37 °C (bez potpunog cepanja).

Slika 25 pokazuje ubijanje Skov3 ćelija indukovano pomoću 10 nM TCB molekula aktiviranih proteazom (TCB sa anti-idiotipskom CD34.15.64 maskom, cepljivim i necepljivim linkerom, tretiranim molekulom) i humanim PBMC (izolovanim iz frakcije leukocita i trombocita) nakon 48 h inkubacije (E:T = 10:1, efektori su tri različita donora za humane PBMC). Pred-tretman rhMatriptazom/ST14 (R&D Systems) obavljen je za 24 h na 37 °C.

Slika 26 pokazuje ubijanje Skov3 ćelija indukovano pomoću 10 nM TCB molekula aktiviranih proteazom (TCB sa anti-idiotipskom CD34.32.63 maskom, cepljivim i necepljivim linkerom, tretiranim molekulom) i humanim PBMC (izolovanim iz frakcije leukocita i trombocita) nakon 48 h inkubacije (E:T = 10:1, efektori su tri različita donora za humane PBMC). Pred-tretman rhMatriptazom/ST14 (R&D Systems) obavljen je za 24 h na 37 °C.

Slika 27 prikazuje ubijanje HeLA ćelija indukovano pomoću 100 pM molekula TCB aktiviranih proteazom (TCB sa anti-idiotipskom CD34.32.63 maskom, cepljivim i necepljivim linkerom, tretiranim molekulom) i humanim PBMC (izolovanim iz frakcije leukocita i trombocita) nakon 48 sati inkubacije (E: T = 10:1, efektori su tri različita donora za humane PBMC). Pred-tretman rhMatriptazom/ST14 (R&D Systems) obavljen je za 24 h na 37 °C.

Slika 28 prikazuje šemu anti-ID GA201 scFv matričnog mesta metaloproteaze GA201 Fc (Ga201-anti-GA201-scFv).

Slika 29 prikazuje šemu anti-HER1 antitela GA201.

Slike 30A i B prikazuju analizu kapilarnom elektroforezom-SDS molekula prikazanog na Sl. 28 pod neredukcionim uslovima (Sl. 30A) i redukcionim uslovima (Sl. 30B). Molekul prikazan na SL. 28 je prečišćen do homogenosti hromatografijom sa proteinom A i na molekulskim sitima, i podvrgnut analizi kapilarnom elektroforezom-SDS.

Slika 31 prikazuje FACS analizu vezivanja Ga201-anti-Ga201-scFv i GA201 za HER1 eksprimiran na H322M ćelijama kako bi se potvrdio maskirajući efekat anti-idiotipskog GA201 scFv. Ga201-anti-GA201-SCFV je inkubiran preko noći sa matričnom metaloproteazom MMP-2 i vezivanje za H322M ćelije upoređeno je sa necepljenim Ga201-anti-GA201-scFb, GA201 i izotipskim IgG1 kontrolnim antitelom. Vezivanje za HER1 na H322M ćelijama detektovano je sa konjugatom F(ab')2-kozji antihumani IgG Fc sekundarno antitelo FITC i analizirano pomoću FACS koristeći BD FACS Canto II. Srednji intenzitet fluorescencije (MFI) korišćen je za analizu.

Slika 32 prikazuje analizu površinskom plazmonskom rezonancom vezivanja HER1 maskiranog i nemaskiranog GA201, pre i posle cepanja MMP2.

Slike 33A-J prikazuju šeme različitih bispecifičnih molekula T ćelija sa maskirajućim ostacima. SL.33A: ID 8364.16D5 TCB, klasični format, anti ID CH2527 scFv 4.32.63 MMP9-MK062 mesto matriptaze N-terminalno vezane za CD3. SL.33B: ID 8363.16D5 TCB, klasični format, anti ID CH2527 scFv 4.32.63 katepsin S/B mesto N-terminalno vezan za CD3. SL.

33C: ID 8365. 16D5 TCB, invertovani format, anti ID CH2527 scFv 4.32.63 MK062 mesto matriptaze N-terminalno vezane za zajednički laki lanac. SL. 33D: ID 8366. 16D5 TCB, invertovani format, anti ID CH2527 scFv 4.32.63 necepljivi linker N-terminalno spojen sa zajedničkim lakim lancem. SL.33E: ID 8672. aMezotelin RG7787 naelektrisani ostaci TCB, klasični format, anti ID CH2527 scFv 4.32.63 MMP9-MK062 mesto matriptaze N-terminalno vezane za CD3 X Fab. SL. 33F: ID 8673. aMezotelin RG7787 naelektrisani ostaci TCB, klasični format, anti ID CH2527 scFv 4.32.63 linker koji se ne cepa N-terminalno vezan za CD3 X Fab. SL. 33G: ID 8674. aMezotelin RG7787 naelektrisani ostaci TCB, invertovani format, anti ID CH2527 scFv 4.32.63 MMP9-MK062 mesto matriptaze N-terminalno vezane za CD3 XFab. SL. 33H: 8675. aMezotelin RG7787 naelektrisani ostaci TCB, invertovani format, anti ID CH2527 scFv 4.32.63 linker koji se ne cepa N-terminalno vezan za CD3 XFab. SL. 33I: ID 8505. aMezotelin RG7787 naelektrisani ostaci CD3 XFab TCB, invertovani format. SL. 33J: ID 8676. CD3 XFab aMezotelin RG7787 naelektrisani ostaci TCB, klasični format.

Slika 34 prikazuje CE-SDS analizu TCB ID 8365 i TCB ID 8366 (konačni prečišćeni preparat): traka A = standard proteina, traka B = protein koji se čuva na 4 °C, traka C = protein prethodno tretiran rhMatriptazom/ST14 (R&D Systems), traka D = protein inkubiran 72 h na 37 °C i traka E = molekul 3.

Slike 35A i B. prikazuju CE-SDS analizu TCB prikazane na SL.33A (ID 8364) i TCB prikazan na SL. 33B (ID 8363). SL. 35A: CE-SDS analiza TCB 8364 (konačni prečišćeni preparat): traka A = standard proteina, traka B = protein koji se čuva na 4 °C, traka C = protein prethodno tretiran rhMatriptazom/ST14 (R&D Systems), traka D = protein inkubiran 72 h na 37 °C i traka E = konstrukt necepljivog linkera. SL.35B: CE-SDS analiza TCB 8363 (konačni prečišćeni preparat): traka A = standard proteina, traka B = protein koji se čuva na 4 °C, traka C = protein prethodno tretiran rhKatepsinom B (R&D Systems), traka D = protein prethodno tretiran rhKatepsinom S (R & D Systems), traka E = protein inkubiran 72 h na 37 °C i traka F = konstrukt necepljivog linkera.

Slike 36A i B. prikazuju Jurkatov NFAT test aktivacije koristeći HeLa i Skov-3 ćelije kao ciljne ćelije. Svaka tačka predstavlja srednju vrednost triplikata. Standardna devijacija je označena intervalima greške. Jurkat-NFAT reporterska ćelijska linija (Promega) je reporterska ćelijska linija humane akutne limfne leukemije sa NFAT promoterom, koja eksprimira humani CD3ε. Ako CD3 vezivač TCB vezuje ciljni tumor i CD3 (unakrsna veza je neophodna) vezuje CD3ε, ekspresija luciferaze se može meriti luminescencijom nakon dodavanja One-Glo supstrata (Promega).

Upoređeni su FolR1 TCB (crni trouglovi okrenuti nadole) i prethodno tretirani TCB aktiviran proteazom (8364, sivi ispunjeni kvadrati) sa N-terminalno spojenim anti ID CD3 4.32.63 scFv i mestom MMP9-Matriptaze MK062. Molekul je tretiran rhMatriptazom/ST14 (R&D Systems) oko 20 h na 37 °C. Prikazani su i maskirani TCB (koji sadrži GS necepljivi linker, sivi trouglovi koji pokazuju prema gore) i neciljana kontrola TCB (prazan trougao koji pokazuje nadole). Tačkasta linija pokazuje luminescenciju ciljnih ćelija i efektorskih ćelija bez ikakvog TCB.

SL. 36A pokazuje test aktivacije Jurkat NFAT koristeći HeLa ćelije kao ciljne ćelije. SL. 36B pokazuje test aktivacije Jurkat NFAT koristeći Skov-3 ćelije kao ciljne ćelije.

Slike 37A-D prikazuju citotoksičnost tumorskih ćelija posredovanu putem FolR1 TCB i humanih PBMC (efektor: cilj = 10: 1). Svaka tačka predstavlja srednju vrednost triplikata. Standardna devijacija je označena intervalima greške. SL. 37A: citotoksičnost HeLa ciljne ćelije. Poređenje dva različita formata proteazom aktiviranih TCB-a koji sadrže anti-idiotipski CD3 scFv povezan sa linkerom MK062 Matriptaze. SL.37B: citotoksičnost ciljnih ćelija Skov-3. Poređenje dva različita formata proteazom aktiviranih TCB-a koji sadrže anti-idiotipski CD3 scFv povezan sa linkerom MK062 Matriptaze. SL. 37C: citotoksičnost HeLa ciljne ćelije. Poređenje klasičnog TCB aktiviranog proteazom koji sadrži anti-idiotipske CD3 scFv i GS linkere sa različitim mestima proteaze. TCB aktiviran proteazom koji sadrži linker MMP9-

2

matriptaze MK062 (8364, sivi kvadrati), FolR1 TCB (svetlosivi trouglovi okrenuti prema dole), TCB aktiviran proteazom koji sadrži samo MK062 matriptazu (svetlosivi romb)/mesto katepsina (sivi krugovi) ili necepljivi linker (crni trouglovi okrenuti nadole). FIG 37D: citotoksičnost ciljnih ćelija Skov-3. Poređenje klasičnog TCB aktiviranog proteazom koji sadrži anti-idiotipske CD3 scFv i GS linkere sa različitim mestima proteaze. TCB aktiviran proteazom koji sadrži linker MMP9-matriptaze MK062 (8364, sivi kvadrati), FolR1 TCB (svetlosivi trouglovi okrenuti prema dole), TCB aktiviran proteazom koji sadrži samo MK062 matriptazu (svetlosivi romb)/mesto katepsina (sivi krugovi) ili necepljivi linker (crni trouglovi okrenuti nadole).

Slike 38A i B prikazuju kvantifikaciju CD69 CD8 pozitivnih ćelija nakon koinkubacije primarnih humanih bubrežnih epitelnih kortikalnih ćelija (SL. 38A) ili ljudskih bronhijalnih epitelnih ćelija (SL. 38B) sa 200 nM različitih TCB i tri različita donora ljudskih PBMC. T ćelije su obojene nakon 48 h inkubacije. (E:T = 10:1, efektori su humani PBMC). Prikazan je srednji intenzitet fluorescencije markera aktivacije T ćelija CD69 za CD8<+>T ćelije. Svaka tačka predstavlja srednju vrednost triplikata tri različita ljudska donora PBMC-a. Standardna devijacija označena je intervalom greške. Za statističku analizu korišćen je nespareni t test.

Slike 39A i B prikazuju citotoksičnost tumorskih ćelija posredovanu putem MSLN TCB i humanih PBMC (efektor: cilj = 10: 1). Maksimalna liza ciljnih ćelija (= 100%) postignuta je inkubacijom ciljnih ćelija sa 1% Triton X-100 20 h pre očitavanja LDH. Minimalna liza (= 0%) odnosi se na ciljne ćelije koinkubirane sa efektorskim ćelijama bez TCB. Svaka tačka predstavlja srednju vrednost triplikata. Standardna devijacija je označena intervalima greške. FIG.39A: NCI citotoksičnost H596 ciljne ćelije. Proteazom aktivirana MSLN TCB sadrži anti idiotipski CD3 scFv povezan sa linkerom MMP9-MK062 matriptaze. Upoređuju se proteazom aktivirani TCB (8672, svetlosivi krugovi), MSLN TCB (tamnosivi trouglovi okrenuti prema dole) i TCB koji se aktivira proteazom koji sadrži necepljivi linker (8673, sivi trouglovi usmereni prema gore). SL. 39B: citotoksičnost ciljnih ćelija AsPC-1. Proteazom aktivirana MSLN TCB sadrži anti idiotipski CD3 scFv povezan sa linkerom MMP9-MK062 matriptaze. Upoređuju se proteazom aktivirani TCB (8672, svetlosivi krugovi), MSLN TCB (tamnosivi trouglovi okrenuti prema dole) i TCB koji se aktivira proteazom koji sadrži necepljivi linker (8673, sivi trouglovi usmereni prema gore).

Slika 40 prikazuje test aktivacije Jurkat-NFAT sa primarnim uzorcima tumora i FolR1 TCB aktiviranim proteazom. Jurkat NFAT reporterske ćelije se aktiviraju nakon koinkubacije sa FolR1 TCB (6298) i FolR1 TCB aktiviranim proteazom koji sadrži mesto cepanja MMP9-matriptaze (8364). FolR1 TCB aktivirani proteazom (8363, 8408) i kontrolni TCB (8409, 7235) ne indukuju ekspresiju luciferaze. Tačkasta linija označava osnovnu luminescenciju za Jurkatove NFAT ćelije koinkubirane sa tumorom.

Slike 41A-C: kapilarna elektroforeza TCB aktiviranih proteazom nakon inkubacije u humanom serumu. Molekuli su inkubirani 0 ili 14 dana u humanom serumu osiromašenom sa IgG na 37 °C u vlažnom inkubatoru (5% CO2). Svi molekuli su prečišćeni afinitetnom hromatografijom (proteinA), a zatim analizirani kapilarnom elektroforezom. SL.41A: CE-SDS analiza seruma, FolR1 TCB (6298) u serumu 0. i 14. dana. SL.41B: CE-SDS analiza seruma, FolR1 TCB aktivirani proteazom sa linkerom MMP9-matriptaze (8364) u serumu 0. i 14. dana. SL. 41C: CE-SDS analiza seruma, FolR1 TCB aktivirani proteazom sa linkerom matriptaze (8408) u serumu 0. i 14. dana i prethodno pocepani molekul u serumu.

Slike 42A-F prikazuju šeme različitih bispecifičnih molekula T ćelija sa maskirajućim ostacima. SL. 42A: ID 8955. Herceptarg TCB, klasični format, anti ID CH2527 scFv 4.32.63 MK062 MMP9 linker N-terminalno spojen sa VH. SL. 42B: ID 8957. Herceptarg TCB, klasični format, anti ID CH2527 scFv 4.32.63 linker koji se ne cepa N-terminalno spojen sa VH. SL.42C: ID 8959. Herceptarg TCB, klasični format. SL.42D: ID 8997. FolR136F2 TCB, klasični format, anti ID CH2527 scFv 4.32.63 MK062 MMP9 linker N-terminalno spojen sa VH. SL.42E: ID 8998. FolR136F2 TCB, klasični format, anti ID CH2527 scFv 4.32.63 linker koji se ne cepa N-terminalno spojen sa VH. SL. 42F: ID 8996. FolR1 36F2 TCB, klasični format.

Slika 43 prikazuje toksičnost za humane bronhijalne epitelne ćelije posredovanu humanim PBMC i 100 nM ili 10 nM TCB. Maksimalna liza ciljnih ćelija (= 100%) postignuta je inkubacijom ciljnih ćelija sa 1% Triton X-10020 h pre očitavanja LDH. Minimalna liza (= 0%) odnosi se na ciljne ćelije koinkubirane sa efektorskim ćelijama bez TCB. Svaka tačka predstavlja srednju vrednost triplikata. Standardna devijacija je označena intervalima greške.

Slika 44 prikazuje citotoksičnost za negativnu ciljnu ćeliju FolR1 (Mkn-45) posredovanu putem 100 nM FolR1 TCBs i humanih PBMC. Maksimalna liza ciljnih ćelija (= 100%) postignuta je inkubacijom ciljnih ćelija sa 1% Triton X-10020 h pre očitavanja LDH. Minimalna liza (= 0%) odnosi se na ciljne ćelije koinkubirane sa efektorskim ćelijama bez TCB. Svaka tačka predstavlja srednju vrednost triplikata. Standardna devijacija je označena intervalima greške.

DETALJAN OPIS

Definicije

Termini se ovde koriste kao što se tipično koriste u struci, osim ako nije drugačije definisano u nastavku.

2

Kako se ovde koristi, izraz „antigen vezujući molekul“ se u najširem smislu odnosi na molekul koji specifično vezuje antigensku determinantu. Primeri antigen vezujućih molekula su imunoglobulini i njihovi derivati, npr. fragmenti.

Termin „bispecifični“ znači da je antigen vezujući molekul sposoban da se specifično veže za najmanje dve različite antigenske determinante. Tipično, bispecifični antigen vezujući molekul sadrži dva mesta vezivanja antigena, od kojih je svako specifično za različitu antigensku determinantu. U određenim otelotvorenjima, bispecifični antigen vezujući molekul je sposoban da istovremeno vezuje dve antigenske determinante, naročito dve antigenske determinante eksprimirane na dve različite ćelije.

Termin „valentno“ kako se ovde koristi označava prisustvo određenog broja mesta vezivanja antigena u antigen vezujućem molekulu. Kao takav, termin „jednovalentno vezivanje za antigen“ označava prisustvo jednog (i ne više od jednog) mesta vezivanja antigena specifičnog za antigen u antigen vezujućem molekulu.

„Mesto vezivanja antigena“ se odnosi na mesto, tj. jedan ili više aminokiselinskih ostataka, antigen vezujućeg molekula koji osigurava interakciju sa antigenom. Na primer, antigen-vezujući deo antitela sadrži aminokiselinske ostatke iz regiona koji određuju komplementarnost (CDR). Prirodni molekul imunoglobulina obično ima dva mesta vezivanja antigena, molekul Fab obično ima jedno mesto vezivanja antigena.

Kako se ovde koristi, termin „antigen-vezujuća komponenta“ se odnosi na molekul polipeptida koji se specifično vezuje za antigenu determinantu. U jednom otelotvorenju, antigen vezujući ostatak je u stanju da usmeri entitet za koji je vezan (npr. drugi antigen vezujući ostatak) na ciljno mesto, na primer na specifičan tip tumorskih ćelija ili stromu tumora koja nosi antigensku determinantu. U još jednom otelotvorenju, antigen vezujući ostatak je u stanju da aktivira signalizaciju kroz svoj ciljni antigen, na primer antigen kompleksa receptora T ćelija. Antigen vezujući ostaci uključuju antitela i njihove fragmente, kao što je ovde definisano. Konkretni antigen vezujući ostaci uključuju antigen-vezujući domen antitela, koji obuhvata varijabilni region teškog lanca antitela i varijabilni region lakog lanca antitela. U određenim otelotvorenjima, antigen vezujući ostaci mogu obuhvatati konstantne regione antitela kao što je ovde definisano i poznato u struci. Korisni konstantni regioni teškog lanca uključuju bilo koji od pet izotipova: α, δ, ε, γ ili μ. Korisni konstantni regioni lakog lanca uključuju bilo koji od dva izotipa:<Κ>i λ.

Kako se ovde koristi, termin „antigenska determinanta“ je sinonim za „antigen“ i „epitop“, i odnosi se na mesto (npr. susedni deo aminokiselina ili konformacionu konfiguraciju sastavljenu od različitih regiona nesusednih aminokiselina) na polipeptidnom makromolekulu

2

za koji se vezuje antigen vezujući deo, formirajući antigen vezujući kompleks ostatak-antigen. Korisne antigenske determinante mogu se naći, na primer, na površinama tumorskih ćelija, na površinama ćelija inficiranih virusom, na površinama drugih obolelih ćelija, na površini imunih ćelija, slobodne u serumu u krvi i/ili u ekstracelularnoj matrici (ECM). Proteini koji se ovde navode kao antigeni, (npr. FolR1, HER1, HER2, CD3, mezotelin) mogu biti svi nativni oblici proteina koji potiču od bilo kog kičmenjaka, uključujući sisare, kao što su primati (npr. ljudi) i glodari (npr. miševi i pacovi), ako nije drugačije naznačeno. U konkretnom otelotvorenju, antigen je humani protein. Kada se ovde pominje specifični protein, termin obuhvata neprerađeni protein „pune dužine“, kao i bilo koji oblik proteina koji je rezultat obrade u ćeliji. Termin takođe obuhvata prirodno postojeće varijante proteina, npr. splajsovane ili alelne varijante. Primeri humanih proteina koji su korisni kao antigeni uključuju, ali nisu ograničeni na: FolR1, HER1 i CD3, posebno epsilon podjedinica CD3 (vidi UniProt br. P07766 (verzija 130), NCBI RefSeq br. NP_000724.1, SEQ ID NO: 54 za humanu sekvencu; ili UniProt br. Q95LI5 (verzija 49), NCBI GenBank br. BAB71849.1 za sekvencu cinomolgusa [Macaca fascicularis]). U određenim otelotvorenjima, bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom iz ovog pronalaska vezuje se za epitop CD3 ili antigen ciljnih ćelija koji je sačuvan između CD3 ili antigena ciljnih ćelija iz različitih vrsta. U određenim otelotvorenjima, bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom iz ovog pronalaska vezuje se za CD3 i FolR1, ali se ne vezuje za FolR2 ili FolR3. U određenim otelotvorenjima, bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom iz ovog pronalaska vezuje se za CD3 i i HER1. U određenim otelotvorenjima, bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom iz ovog pronalaska vezuje se za CD3 i mezotelin. U određenim otelotvorenjima, bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom iz ovog pronalaska vezuje se za CD3 i i HER2. Pod „specifičnim vezivanjem“ podrazumeva se da je vezivanje selektivno za antigen i može se razlikovati od neželjenih ili nespecifičnih interakcija. Sposobnost antigen vezujućeg ostatka da se veže za specifičnu antigensku determinantu može se meriti bilo putem testa sa enzimski vezanim imunosorbentom (ELISA) ili putem drugih tehnika poznatih stručnim licima, npr. tehnikama površinske plazmonske rezonance (SPR) (analizirano na instrumentu BIAcore) (Liljeblad et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)), i tradicionalnim testovima vezivanja (Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)). U jednom otelotvorenju, stepen vezivanja antigen vezujućeg ostatka na nevezani protein je manji od oko 10% vezivanja antigen vezujućeg ostatka na antigen kao što je mereno, npr. putem SPR. U nekim otelotvorenjima, antigen vezujući ostatak koji se vezuje za antigen, ili antigen vezujući molekul koji sadrži taj antigen vezujući ostatak, ima konstantu disocijacije (KD) od ≤ 1 μM, ≤

2

100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0,1 nM, ≤ 0,01 nM, ili ≤ 0,001 nM (npr., 10<-8>M ili manje, npr., od 10<-8>M do 10<-13>M, npr., od 10<-9>M do 10<-13>M).

„Afinitet“ se odnosi na snagu zbira ukupnih nekovalentnih interakcija između pojedinačnog mesta vezivanja molekula (npr. receptora) i njegovog partnera u vezivanju (npr. liganda). Ukoliko nije drugačije naznačeno, kao što je ovde upotrebljeno, „afinitet vezivanja“ se odnosi na suštinski afinitet vezivanja, koji odražava 1:1 interakciju između članova vezujućeg para (npr. antigen vezujući ostatak i antigen, ili receptor i njegov ligand). Afinitet molekula X prema njegovom partneru Y može se generalno predstaviti preko konstante disocijacije (KD), koja predstavlja odnos konstanti stope disocijacije i stope asocijacije (koffodnosno kon). Tako ekvivalentni afiniteti mogu da uključe različite konstante brzine, dokle god odnos konstanti brzine ostaje isti. Afinitet može da se izmeri uobičajenim postupcima poznatim u struci, uključujući one koji su ovde opisani. Poseban postupak za merenje afiniteta je površinska plazmonska rezonanca (SPR).

„Smanjeno vezivanje“, na primer smanjeno vezivanje za Fc receptor, odnosi se na smanjenje afiniteta za odgovarajuću interakciju, kao što je mereno na primer SPR-om. Radi jasnoće, ovaj termin uključuje i smanjenje afiniteta na nulu (ili ispod granice detekcije analitičkog postupka), odnosno potpuno ukidanje interakcije. Nasuprot tome, „povećano vezivanje“ se odnosi na povećanje afiniteta vezivanja za odgovarajuću interakciju.

„Aktivacija T ćelija“, kako se ovde koristi, odnosi se na jedan ili više ćelijskih odgovora T limfocita, posebno citotoksičnog T limfocita, odabranih od: proliferacije, diferencijacije, sekrecije citokina, otpuštanja citotoksičnog efektorskog molekula, citotoksične aktivnosti i ekspresije aktivacionih markera. Bispecifični molekuli koji aktiviraju T ćelije i koji se aktiviraju proteazom iz pronalaska sposobni su da indukuju aktivaciju T ćelije. Odgovarajući testovi za merenje aktivacije T ćelija su poznati u struci koja je ovde opisana.

„Antigen ciljne ćelije“, kako se ovde koristi, odnosi se na antigensku determinantu koja je predstavljena na površini ciljne ćelije, na primer, ćelija u tumoru, kao što je ćelija kancera ili ćelija tumorske strome.

Termini „prvi“ i „drugi“ kad se koriste ovde u vezi sa antigen vezujućim delovima, itd., koriste se radi pravljenja razlike kada postoji više od jedne vrste svakog dela. Upotreba ovih pojmova nije namenjena da dodeli određeni redosled ili orijentaciju bispecifičnog molekula koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom, osim ako se to eksplicitno ne tvrdi.

„Molekul Fab“ se odnosi na protein koji se sastoji od VH i CH1 domena teškog lanca („teški lanac Fab“) i VL i CL domena lakog lanca („laki lanac Fab“) imunoglobulina.

Pod „spojenim“ se podrazumeva da su komponente (npr. molekul Fab i podjedinica Fc

2

domena) povezane peptidnim vezama, bilo direktno ili preko jednog ili više peptidnih linkera. Kako se ovde koristi, termin „jedan lanac“ se odnosi na molekul koji sadrži aminokiselinske monomere linearno vezane peptidnim vezama. U određenim otelotvorenjima, jedan od antigen vezujućih ostataka je jednolančani molekul Fab, tj. molekul Fab gde su laki lanac Fab i teški lanac Fab povezani peptidnim linkerom da bi formirali jedan peptidni lanac. U jednom takvom posebnom otelotvorenju, C-kraj lakog lanca Fab povezan je sa N-krajem teškog lanca Fab u jednolančanom molekulu Fab.

Pod „unakrsno izmenjenim“ molekulom Fab (koji se naziva i „Crossfab“) podrazumeva se molekul Fab u kojem su bilo varijabilni regioni ili konstantni regioni teškog i lakog lanca Fab razmenjeni, tj. unakrsno izmenjeni molekul Fab sadrži peptidni lanac sastavljen od varijabilnog regiona lakog lanca i konstantnog regiona teškog lanca, i peptidni lanac sastavljen od varijabilnog regiona teškog lanca i konstantnog regiona lakog lanca. Radi jasnoće, u unakrsno izmenjenom molekulu Fab, gde su varijabilni regioni lakog lanca Fab i teškog lanca Fab razmenjeni, peptidni lanac koji sadrži konstantni region teškog lanca ovde se naziva „teški lanac“ unakrsno izmenjenog molekula Fab. Suprotno tome, u unakrsno izmenjenom molekulu Fab gde su konstantni regioni lakog lanca Fab i teškog lanca Fab razmenjeni, peptidni lanac koji sadrži varijabilni region teškog lanca ovde se naziva „teški lanac“ unakrsno izmenjenog molekula Fab.

Nasuprot tome, „konvencionalnim“ molekulom Fab se smatra molekul Fab u svom prirodnom formatu, tj. koji sadrži teški lanac sastavljen od varijabilnih i konstantnih regiona teškog lanca (VH-CH1) i laki lanac sastavljen od varijabilnih i konstantnih regiona lakog lanca (VL-CL).

Termin „molekul imunoglobulina“ se odnosi na protein koji ima strukturu prirodnog antitela. Na primer, imunoglobulini klase IgG su heterotetramerni glikoproteini od oko 150.000 daltona, sastavljeni od dva identična laka lanca i dva identična teška lanca koji su povezani disulfidnim vezama. Od N-terminalnog kraja do C-terminalnog kraja, svaki teški lanac ima varijabilni region (VH), koji se takođe zove varijabilni teški domen ili varijabilni domen teškog lanca, za kojim slede tri konstantna domena (CH1, CH2 i CH3), koji se takođe zovu konstantni regioni teškog lanca. Slično tome, od N-terminalnog do C-terminalnog kraja, svaki laki lanac ima varijabilni region (VL), koji se takođe zove varijabilni laki domen ili varijabilni domen lakog lanca, za kojim sledi konstantni laki (CL) domen, koji se takođe zove konstantni region lakog lanca. Teški lanac imunoglobulina može se svrstati u jednu od pet vrsta, nazvanu α (IgA), δ (IgD), ε (IgE), γ (IgG) ili μ (IgM), od kojih se neke mogu dalje deliti na podvrste, npr. γ1(IgG1), γ2(IgG2), γ3(IgG3), γ4(IgG4), α1(IgA1) i α2(IgA2). Laki lanac imunoglobulina može

2

se svrstati u jedan od dva tipa, koji se zovu kapa (κ) i lambda (λ), na osnovu aminokiselinske sekvence njihovog konstantnog domena. Imunoglobulin se u suštini sastoji od dva molekula Fab i Fc domena, povezana preko regiona šarke imunoglobulina.

Termin „antitelo“ ovde je upotrebljen u najširem smislu i obuhvata različite strukture antitela, uključujući, ali se ne ograničavajući na monoklonska antitela, poliklonska antitela, i fragmente antitela, dokle god oni pokazuju željenu antigen-vezujuću aktivnost.

„Fragment antitela“ ukazuje na molekul koji nije netaknuto antitelo, koji sadrži deo netaknutog antitela koje vezuje antigen za koji se vezuje netaknuto antitelo. Primeri za fragmente antitela uključuju, ali se ne ograničavaju na Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, dijatela, linearna antitela, jednolančane molekule antitela (npr,. scFv) i antitela sa jednim domenom. Pregled fragmenata pojedinih antitela potražite u Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003). Pregled scFv fragmenata potražite npr. u Plückthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, str. 269-315 (1994); vidite takođe WO 93/16185; i U.S. Patent br.5,571,894 i 5,587,458. Raspravu o Fab i F(ab')2fragmentima koji sadrže regenerisane ostatke receptorski vezujućih epitopa i koji imaju produžen poluživot in vivo pogledajte u U.S. Patentu br. 5,869,046. Dijatela su fragmenti antitela sa dva mesta za vezivanje antigena koja mogu biti dvovalentna ili bispecifična. Pogledajte, npr, EP 404,097; WO 1993/01161; Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); i Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993). Trijatela i tetratela su takođe opisana u Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003). Antitela sa jednim domenom su fragmenti antitela koji sadrže kompletan varijabilni domen teškog lanca antitela ili njegov deo, ili kompletan varijabilni domen lakog lanca antitela ili njegov deo. U određenim otelotvorenjima, antitelo sa jednim domenom je humano antitelo sa jednim domenom (Domantis, Inc., Waltham, MA; pogledajte, npr. U.S. Patent br. 6,248,516 B1). Fragmenti antitela se mogu dobiti različitim tehnikama, uključujući, ali se ne ograničavajući na proteolitičku digestiju netaknutog antitela, kao i proizvodnju pomoću rekombinantnih ćelija domaćina (npr. E. coli ili faga), kao što je ovde opisano.

Termin „antigen-vezujući domen“ se odnosi na deo antitela koji sadrži oblast koja se specifično vezuje za deo antigena ili ceo antigen, i komplementaran je sa delom antigena ili celim antigenom. Antigen vezujući domen se može dobiti, na primer, pomoću jednog ili više varijabilnih domena antitela (koja se još zovu i varijabilni regioni antitela). Posebno, antigenvezujući domen sadrži varijabilni region lakog lanca antitela (VL) i varijabilni region teškog lanca antitela (VH).

Izrazi „varijabilni region“ ili „varijabilni domen“ odnose se na domen teškog ili lakog lanca antitela, koji učestvuje u vezivanju antitela za antigen. Varijabilni domeni teškog lanca i lakog lanca (VH odnosno VL) nativnog antitela tipično imaju slične strukture, pri čemu svaki domen sadrži četiri očuvana regiona okvira (FR) i tri hipervarijabilna regiona (HVR). Vidite, npr. Kindt et al., Kuby Immunology, 6. izd, W.H. Freeman and Co., str.91 (2007). Jedan VH ili VL domen može biti dovoljan za dodeljivanje antigen vezujuće specifičnosti.

Termin „hipervarijabilni region“ ili „HVR“ kao što je ovde upotrebljen, ukazuje na svaki od regiona varijabilnog domena antitela koji su hipervarijabilni u sekvenci i/ili formiraju strukturno definisane petlje („hipervarijabilne petlje“). Generalno, nativna četvorolančana antitela sadrže šest regiona HVR: tri u VH (H1, H2, H3) i tri u VL (L1, L2, L3). HVR generalno sadrže ostatke aminokiselina iz hipervarijabilnih petlji i/ili regiona koji određuju komplementarnost (CDR), gde ovi drugi imaju najveću varijabilnost sekvenci i/ili su uključeni u prepoznavanje antigena. Sa izuzetkom CDR1 u VH, CDR generalno sadrže aminokiselinske ostatke koji formiraju hipervarijabilne petlje. Hipervarijabilni regioni (HVR) se takođe pominju kao „regioni koji određuju komplementarnost“ (CDR), i ti termini se ovde koriste naizmenično da ukažu na delove varijabilnog regiona koji formiraju antigen vezujuće regione. Ovaj konkretni region opisali su Kabat et al., U.S. Dept, of Health and Human Services, Sequences of Proteins of Immunological Interest (1983) i Chothia et al., J Mol Biol 196:901-917 (1987), gde definicije uključuju preklapanje ili podskupove aminokiselinskih ostataka u poređenju jedni sa drugima. I pored toga, namera je da primena bilo koje od ove dve definicije koje ukazuju na CDR antitela ili njihove varijante bude obuhvaćena terminom na način kako se on ovde definiše i koristi. Odgovarajući aminokiselinski ostaci koji obuhvataju CDR-ove kao što su definisani svakom od gore navedenih referenci dati su dole u Tabeli 1 radi poređenja. Tačni brojevi ostataka koji sadrže konkretni CDR će varirati u zavisnosti od sekvence i veličine CDR. Stručna lica iz ove oblasti mogu rutinski da odrede koji ostaci sadrže konkretni CDR kada je data aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona datog antitela.

TABELA 1. Definicije CDR<1>

1

Kabat et al. su takođe definisali sistem numeracije sekvenci varijabilnih regiona koji je primenljiv na bilo koje antitelo. Osoba sa uobičajenim znanjem u struci može nedvosmisleno da primeni ovaj sistem „Kabatovog numerisanja“ na svaku sekvencu varijabilnog regiona, ne oslanjajući se ni na kakve eksperimentalne podatke osim same sekvence. U smislu ovog dokumenta, „Kabatova numeracija“ se odnosi na sistem numeracije koji su postavili Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, „Sequence of Proteins of Immunological Interest“ (1983). Ako nije drugačije naglašeno, reference na numeraciju specifičnih položaja aminokiselinskih ostataka u varijabilnom regionu antitela su prema Kabatovom sistemu numeracije.

Polipeptidne sekvence na listi sekvenci nisu numerisane prema Kabatovom sistemu numerisanja. Međutim, osoba sa standardnom stručnošću u ovoj oblasti može da konvertuje numerisanje sekvenci iz redosleda sekvenci na Kabatovu numeraciju.

„Okvir“ ili „FR“ se odnosi na ostatke varijabilnog domena koji nisu ostaci hipervarijabilnog regiona (HVR). FR varijabilnog domena generalno se sastoji od četiri FR domena: FR1, FR2, FR3 i FR4. Shodno tome, HVR i FR sekvence generalno se pojavljuju u sledećem redosledu u VH (ili VL): FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.

„Klasa“ antitela ili imunoglobulina ukazuje na vrstu konstantnog domena ili konstantnog regiona koju ima njegov teški lanac. Postoji pet glavnih klasa antitela: IgA, IgD, IgE, IgG i IgM, a neke od njih mogu dalje da se dele na potklase (izotipove), npr. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, i IgA2. Konstantni domeni teškog lanca koji odgovaraju različitim klasama imunoglobulina zovu se α, δ, ε, γ, odnosno μ.

Izraz „Fc domen“ ili „Fc region“ se ovde koristi da definiše C-terminalni region imunoglobulinskog teškog lanca koji sadrži barem deo konstantnog regiona. Ovaj izraz podrazumeva nativne sekvence Fc regiona i varijante Fc regiona. Iako granice Fc regiona IgG teškog lanca mogu malo da variraju, Fc region teškog lanca humanog IgG tipično se po uobičajenoj definiciji proteže od Cys226 ili Pro230 do karboksi terminusa teškog lanca. Međutim, na C-terminalnom kraju Fc regiona lizin (Lys447) može, ali ne mora da bude prisutan. Ukoliko ovde nije drugačije naznačeno, numeracija ostataka aminokiselina u Fc regionu ili konstantnom regionu je prema EU sistemu numeracije, koji se takođe zove EU

2

indeks, kao što je opisano u Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest 5. izd. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991. „Podjedinica“ Fc domena kako se ovde koristi, odnosi se na jedan od dva polipeptida koji formiraju dimerni Fc domen, tj. polipeptid koji sadrži C-terminalne konstantne regione teškog lanca imunoglobulina, sposobne za stabilno samopovezivanje. Na primer, podjedinica Fc domena IgG sadrži konstantni domen IgG CH2 i IgG CH3.

„Modifikacija koja promoviše povezivanje prve i druge podjedinice Fc domena“ je manipulacija peptidnim skeletom ili posttranslaciona modifikacija podjedinice Fc domena koja smanjuje ili sprečava povezivanje polipeptida koji sadrži podjedinicu Fc domena sa identičnim polipeptidom da formiraju homodimer. Modifikacija koja promoviše povezivanje, kako se ovde koristi, posebno podrazumeva odvojene modifikacije napravljene za svaku od dve podjedinice Fc domena koje treba da se povežu (tj. prva i druga podjedinica Fc domena), pri čemu su modifikacije komplementarne jedna drugoj kako bi se promovisalo povezivanje dve podjedinice Fc domena. Na primer, modifikacija koja promoviše povezivanje može promeniti strukturu ili naelektrisanje jedne ili obe podjedinice Fc domena, kako bi njihovo povezivanje bilo sterno odnosno elektrostatički povoljno. Tako se (hetero)dimerizacija javlja između polipeptida koji sadrži prvu podjedinicu Fc domena i polipeptida koji sadrži drugu podjedinicu Fc domena, koja može biti neidentična u smislu da dodatne komponente spojene na svaku od podjedinica (npr., antigen vezujući delovi) nisu iste. U nekim otelotvorenjima, modifikacija koja podstiče povezivanje uključuje aminokiselinsku mutaciju u Fc domenu, posebno aminokiselinsku supstituciju. U posebnom otelotvorenju, modifikacija koja promoviše povezivanje sadrži odvojenu aminokiselinsku mutaciju, konkretno aminokiselinsku supstituciju, u svakoj od dve podjedinice Fc domena.

Termin „efektorske funkcije“ ukazuje na one biološke aktivnosti koje mogu da se pripišu Fc regionu antitela, koji varira sa izotipom antitela. Primeri za efektorske funkcije antitela uključuju: vezivanje C1q i citotoksičnost zavisnu od komplementa (CDC), vezivanje Fc receptora; ćelijski posredovanu citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC); ćelijsku fagocitozu zavisnu od antitela (ADCP), sekreciju citokina, preuzimanje antigena posredstvom imunskog kompleksa od strane antigen prezentujućih ćelija, smanjenje površinskih ćelijskih receptora (npr,. B-ćelijski receptor), i aktivaciju B ćelija.

Kako se ovde koriste, pojmovi „konstruisati, konstruisano, inženjering“ uključuju bilo kakvu manipulaciju peptidne osnove ili posttranslacionih modifikacija prirodnog ili rekombinantnog polipeptida ili njegovog fragmenta. Inženjering obuhvata modifikacije aminokiselinske sekvence, glikozilacionog obrasca ili grupe bočnih lanaca pojedinačnih aminokiselina, kao i kombinacije ovih pristupa.

Izraz „mutacija aminokiselina“, kako se ovde koristi, obuhvata supstitucije, brisanje, umetanje i modifikacije aminokiselina. Svaka kombinacija supstitucije, brisanja, umetanja i modifikacije može se načiniti tako da se dođe do finalnog konstrukta, pod uslovom da finalni konstrukt ima željene karakteristike, npr. smanjeno vezivanje za Fc receptor, ili povećano povezivanje sa drugim peptidom. Brisanja i umetanja aminokiselinske sekvence uključuju brisanja i umetanja aminokiselina na amino i/ili karboksi terminusu. Konkretne aminokiselinske mutacije su aminokiselinske supstitucije. U cilju izmene npr. karakteristika vezivanja Fc regiona, naročito su poželjne nekonzervativne aminokiselinske supstitucije, tj. zamena jedne aminokiseline drugom aminokiselinom koja ima različita strukturna i/ili hemijska svojstva. Aminokiselinske supstitucije podrazumevaju zamenu aminokiselinama koje ne nastaju prirodno, ili derivatima prirodnih aminokiselina, dvadeset standardnih aminokiselina (npr., 4-hidroksiprolin, 3-metilhistidin, ornitin, homoserin, 5-hidroksilizin). Aminokiselinske mutacije se mogu generisati pomoću genetičkih ili hemijskih postupaka koji su dobro poznati u struci. Genetski postupci mogu obuhvatati mutagenezu usmerenu na mesto, PCR, sintezu gena, i slično. Smatra se da su takođe korisni postupci izmene grupe bočnih lanaca aminokiseline drugim postupcima osim genetskog inženjeringa, kao što je hemijska modifikacija. Ovde se mogu koristiti različite oznake kako bi se ukazalo na istu mutaciju aminokiselina. Na primer, supstitucija iz prolina u položaju 329 Fc domena u glicin se može označiti kao 329G, G329, G329, P329G ili Pro329Gly.

Kako se ovde koristi, termin „polipeptid“ se odnosi na molekul sastavljen od monomera (aminokiselina) koji su linearno povezani amidnim vezama (poznatim i kao peptidne veze). Termin „polipeptid“ se odnosi na bilo koji lanac dve ili više aminokiselina i ne odnosi se na određenu dužinu proizvoda. Stoga, peptidi, dipeptidi, tripeptidi, oligopeptidi, „protein“, „aminokiselinski lanac“ ili bilo koji drugi izraz koji se koristi da se odnosi na lanac dve ili više aminokiselina, uključeni su u definiciju „polipeptida“, i izraz „polipeptid“ se može koristiti umesto ili kao sinonim bilo kog od ovih izraza. Termin „polipeptid“ se takođe odnosi na proizvode postekspresione modifikacije polipeptida, uključujući, bez ograničenja, glikozilaciju, acetilovanje, fosforilaciju, amidaciju, derivatizaciju poznatih zaštitnih/blokirajućih grupa, proteolitičko cepanje ili modifikacije sa aminokiselinama koje se ne sreću u prirodi. Polipeptid može biti izveden iz prirodnog biološkog izvora ili proizveden rekombinantnom tehnologijom, ali nije nužno preveden iz određene sekvence nukleinske kiseline. Može se generisati na bilo koji način, uključujući i hemijsku sintezu. Polipeptid iz pronalaska može biti veličine od oko 3 ili više, 5 ili više, 10 ili više, 20 ili više, 25 ili više, 50

4

ili više, 75 ili više, 100 ili više, 200 ili više, 500 ili više, 1000 ili više, ili 2000 ili više aminokiselina. Polipeptidi mogu imati definisanu trodimenzionalnu strukturu, iako ne moraju nužno imati takvu strukturu. Polipeptidi sa definisanom trodimenzionalnom strukturom se nazivaju presavijeni, a polipeptidi koji nemaju definisanu trodimenzionalnu strukturu, već mogu usvojiti veliki broj različitih konformacija se nazivaju odmotani.

Pod „izolovanim“ polipeptidom ili varijantom, ili njihovim derivatom, podrazumeva se polipeptid koji nije u svom prirodnom okruženju. Nije potreban određeni nivo prečišćavanja. Na primer, izolovani polipeptid se može ukloniti iz svog nativnog ili prirodnog okruženja. Rekombinantno proizvedeni polipeptidi i proteini ieksprimirani u ćelijama domaćina smatraju se izolovanim u svrhu pronalaska, kao što su nativni ili rekombinantni polipeptidi koji su odvojeni, frakcionisani ili delimično ili suštinski prečišćeni bilo kojom odgovarajućom tehnikom.

„Procenat (%) identičnosti aminokiselinske sekvence“ u odnosu na sekvencu referentnog polipeptida definisan je kao procenat aminokiselinskih ostataka u sekvenci kandidatu koji su identični sa aminokiselinskim ostacima u sekvenci referentnog polipeptida, nakon poravnavanja sekvenci i uvođenja praznina, ako je potrebno, da bi se postigao maksimalni procenat identičnosti sekvence, ne uzimajući u obzir nikakve konzervativne supstitucije kao deo identičnosti sekvence. Poravnavanje radi određivanja procenta identičnosti aminokiselinske sekvence može se postići na različite načine koji su poznati u okviru struke, na primer, pomoću javno dostupnog kompjuterskog softvera, kao što je BLAST, BLAST-2, ALIGN ili Megalign (DNASTAR) softver. Stručna lica iz ove oblasti mogu da odrede odgovarajuće parametre za poravnavanje sekvenci, uključujući sve potrebne algoritme za postizanje maksimalnog poravnavanja u kompletnoj dužini sekvenci koje se porede. Međutim, ovde su u tu svrhu vrednosti za % identičnosti aminokiselinske sekvence dobijene pomoću računarskog programa za poređenje sekvenci ALIGN-2. Računarski program za poređenje sekvenci ALIGN-2 delo je kompanije Genentech, Inc., a izvorni kod je podnet sa korisničkom dokumentacijom u U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559, gde je registrovan pod patentnim brojem U.S. Copyright Registration No. TXU510087. Program ALIGN-2 je javno dostupan od Genentech, Inc., South San Francisco, California ili može biti kompiliran iz izvornog koda.

Program ALIGN-2 treba da se kompilira za primenu na operativnom sistemu UNIX, uključujući digitalni UNIX V4.0D. Sve parametre poređenja sekvenci je postavio program ALIGN-2 i nisu se menjali. U slučajevima kada je ALIGN-2 korišćen za poređenja aminokiselinskih sekvenci, % identičnosti aminokiselinske sekvence date aminokiselinske sekvence A sa datom aminokiselinskom sekvencom B, ili u odnosu na nju (što alternativno može da se izrazi kao data aminokiselinska sekvenca A koja ima ili sadrži određeni % identičnosti aminokiselinske sekvence prema, sa ili u odnosu na datu aminokiselinsku sekvencu B) izračunava se na sledeći način:

100 puta količnik X/Y

gde je X broj aminokiselinskih ostataka za koje je dobijen rezultat da su identični putem programa za poređenje sekvenci ALIGN-2 pri poravnavanju A i B u tom programu, i gde je Y ukupan broj aminokiselinskih ostataka u B. Treba shvatiti da, u slučaju da dužina aminokiselinske sekvence A nije jednaka dužini aminokiselinske sekvence B, % identičnosti aminokiselinske sekvence A u odnosu na B neće biti isti kao % identičnosti aminokiselinske sekvence B u odnosu na A. Osim ako nije drugačije objavljeno, sve ovde upotrebljene vrednosti % identičnosti aminokiselinske sekvence dobijene su, kao što je opisano u prethodnom paragrafu, pomoću računarskog programa ALIGN-2.

Termin „polinukleotid“ se odnosi na izolovani molekul ili konstrukt nukleinske kiseline, npr. informacionu RNK (mRNK), viralno dobijenu RNK ili plazmidnu DNK (pDNK). Polinukleotid može sadržati konvencionalnu vezu fosfodiestra ili nekonvencionalnu vezu (npr. amidnu vezu, kao što je nađeno u peptidnim nukleinskim kiselinama (PNK). Termin „molekul nukleinske kiseline“ se odnosi na bilo koji jedan ili više segmenata nukleinske kiseline, npr. fragmente DNK ili RNK, prisutne u polinukleotidu.

„Izolovanim“ molekulom nukleinske kiseline ili polinukleotidom smatra se molekul nukleinske kiseline, DNK ili RNK, koji je uklonjen iz svog izvornog okruženja. Na primer, rekombinantni polinukleotid koji kodira polipeptid sadržan u vektoru smatra se izolovanim u svrhe predmetnog pronalaska. Dalji primeri za izolovani polinukleotid uključuju rekombinantne polinukleotide koji se održavaju u heterolognim ćelijama domaćina ili prečišćene (delimično ili suštinski) polinukleotide u rastvoru. Izolovani polinukleotid uključuje molekul polinukleotida koji se nalazi u ćelijama koje uobičajeno sadrže molekul polinukleotida, ali je molekul polinukleotida prisutan ekstrahromozomski ili na hromozomskoj lokaciji koja se razlikuje od njegove prirodne hromozomske lokacije. Izolovani molekuli RNK uključuju in vivo ili in vitro transkripte RNK, iz predmetnog pronalaska, kao i pozitivne i negativne lančane forme i dvolančane forme. Izolovani polinukleotidi ili nukleinske kiseline prema predmetnom pronalasku dalje uključuju takve molekule proizvedene sintetički. Pored toga, polinukleotid ili nukleinska kiselina mogu da budu ili mogu da uključuju regulatorni element kao što je promoter, mesto vezivanja ribozoma ili terminator transkripcije.

Za nukleinsku kiselinu ili polinukleotid koji ima nukleotidnu sekvencu, na primer, najmanje 95% „identičnu“ referentnoj nukleotidnoj sekvenci iz predmetnog pronalaska, predviđeno je da je nukleotidna sekvenca polinukleotida identična referentnoj sekvenci, osim što polinukleotidna sekvenca može uključivati do pet tačkastih mutacija na svakih 100 nukleotida referentne nukleotidne sekvence. Drugim rečima, da bi se dobio polinukleotid sa nukleotidnom sekvencom najmanje 95% identičnom referentnoj sekvenci nukleotida, do 5% nukleotida u referentnoj sekvenci može biti uklonjeno ili supstituisano drugim nukleotidom, ili broj nukleotida do 5% ukupnih nukleotida u referentnoj sekvenci može biti ubačen u referentnu sekvencu. Te izmene referentne sekvence mogu se desiti na 5' ili 3' terminalnim mestima referentne sekvence nukleotida ili bilo gde između tih terminalnih mesta, pojedinačno razbacane između ostataka u referentnoj sekvenci ili u jednoj ili više susednih grupa u referentnoj sekvenci. U praktičnom smislu, pomoću poznatih kompjuterskih programa (npr. , ALIGN-2), kao što su oni gorenavedeni za polipeptide, može na konvencionalan način odrediti da li je neka konkretna polinukleotidna sekvenca najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična nukleotidnoj sekvenci iz predmetnog pronalaska.

Termin „ekspresiona kaseta“ odnosi se na polinukleotid generisan rekombinantno ili sintetički, sa nizom specifičnih elemenata nukleinske kiseline koji omogućavaju transkripciju određene nukleinske kiseline u ciljanu ćeliju. Rekombinantna ekspresiona kaseta može se inkorporirati u plazmid, hromozom, mitohondrijsku DNK, plastidnu DNK, virus ili fragment nukleinske kiseline. Tipično, deo rekombinantne ekspresione kasete ekspresionog vektora sadrži, između ostalih sekvenci, sekvencu nukleinske kiseline koja se transkribuje i promoter. U određenim otelotvorenjima, ekspresiona kaseta prema pronalasku sadrži polinukleotidne sekvence koje kodiraju bispecifične antigen vezujuće molekule iz ovog pronalaska ili njihove fragmente.

Termin „vektor“ ili „vektor ekspresije“ je sinonim za „konstrukt ekspresije“ i odnosi se na molekul DNK koji se koristi za uvođenje i usmeravanje ekspresije specifičnog gena na koji je operativno povezan u ciljanu ćeliju. Ovaj termin obuhvata vektor kao samoumnožavajuću strukturu nukleinske kiseline, kao i vektor ugrađen u genom ćelije domaćina u koju je uveden. Ekspresioni vektor iz predmetnog pronalaska sadrži ekspresionu kasetu. Ekspresioni vektori omogućavaju transkripciju velikih količina stabilne mRNK. Kada se ekspresioni vektor nađe unutar ciljne ćelije, molekul ribonukleinske kiseline ili protein koji je kodiran tim genom proizvodi se pomoću mehanizma ćelijske transkripcije i/ili translacije. U jednom otelotvorenju, ekspresioni vektor iz pronalaska sadrži ekspresionu kasetu koja sadrži polinukleotidne sekvence koje kodiraju bispecifične antigen vezujuće molekule iz pronalaska ili njihove fragmente.

Termini „ćelija domaćin“, „linija ćelija domaćina“ i „kultura ćelija domaćina“ koriste se naizmenično, i ukazuju na ćelije u koje je uvedena egzogena nukleinska kiselina, uključujući potomstvo takvih ćelija. Ćelije domaćini uključuju „transformante“ i „transformisane ćelije“, koje uključuju primarne transformisane ćelije i potomstvo dobijeno od njih, bez obzira na broj presejavanja. Potomstvo ne mora biti po sadržaju nukleinskih kiselina sasvim istovetno matičnoj ćeliji, već može da sadrži mutacije. Ovde se uključuje mutantno potomstvo koje ima istu funkciju ili biološku aktivnost kakva je ispitana ili odabrana u originalno transformisanoj ćeliji. Ćelija domaćin je bilo koja vrsta ćelijskog sistema koji se može koristiti za dobijanje bispecifičnih antigen vezujućih molekula iz ovog pronalaska. Ćelije domaćini uključuju uzgajane ćelije, npr. uzgajane ćelije sisara, kao što su CHO ćelije, BHK ćelije, NS0 ćelije, SP2/0 ćelije, YO ćelije mijeloma, P3X63 ćelije mišjeg mijeloma, PER ćelije, PER.C6 ćelije ili ćelije hibridoma, ćelije kvasaca, ćelije insekata i biljne ćelije, da navedemo samo nekoliko, ali i ćelije koje se nalaze u transgenoj životinji, transgenoj biljci ili uzgajenom biljnom ili životinjskom tkivu.

„Aktivirajući Fc receptor“ je Fc receptor koji nakon angažovanja Fc domena antitela izaziva signalizirajuće događaje koji stimulišu receptorsku noseću ćeliju da izvede efektorske funkcije. Humani aktivirajući Fc receptori uključuju FcγRIIIa (CD16a), FcγRI (CD64), FcγRIIa (CD32) i FcαRI (CD89).

Citotoksičnost posredovana ćelijama zavisna od antitela (ADCC) je imunološki mehanizam koji dovodi do lize ciljanih ćelija obloženih antitelima pomoću imunoloških efektorskih ćelija. Ciljne ćelije su ćelije za koje se antitela ili njihovi derivati koji sadrže Fc region specifično vezuju, najčešće preko proteinskog dela koji je N-kraj Fc regiona. Kao što se ovde koristi, termin „smanjen ADCC“ je definisan ili kao smanjenje broja ciljnih ćelija koje su lizirane u datom vremenu, pri datoj koncentraciji antitela u medijumu koji okružuje ciljne ćelije, putem mehanizma ADCC definisanog iznad, i/ili povećanje koncentracije antitela u medijumu koji okružuje ciljne ćelije, potrebno da se postigne liza datog broja ciljnih ćelija u datom vremenu, putem mehanizma ADCC. Smanjenje ADCC je u odnosu na ADCC posredovanu istim antitelom koje proizvodi isti tip ćelija domaćina, korišćenjem istih standardnih postupaka stvaranja, prečišćavanja, formulisanja i čuvanja (koji su poznati stručnjacima u ovoj oblasti), ali koje nije konstruisano. Na primer, smanjenje ADCC posredovane antitelom koje sadrži u svom Fc domenu aminokiselinsku supstituciju koja smanjuje ADCC, je u odnosu na ADCC posredovanu istim antitelom bez ove aminokiselinske supstitucije u Fc domenu. Odgovarajući testovi za merenje ADCC su dobro poznati u struci (vidi npr. PCT publikaciju br. WO2006/082515 ili PCT publikaciju br. WO2012/130831).

„Delotvorna količina“ agensa se odnosi na količinu koja je neophodna da bi se dovelo do fiziološke promene u ćeliji ili tkivu na koje se primenjuje.

„Terapeutski delotvorna količina“ agensa, npr. farmaceutske kompozicije, odnosi se na količinu koja je u potrebnim dozama i vremenskim periodima delotvorna za postizanje željenog terapeutskog ili profilaktičkog rezultata. Terapeutski efikasna količina agensa, na primer, eliminiše, smanjuje, odlaže, minimizuje ili sprečava štetne efekte bolesti.

„Pojedinac“ ili „ispitanik“ je sisar. Sisari uključuju, ali nisu ograničeni na, domaće životinje (npr. krave, ovce, mačke, pse i konje), primate (npr. ljude i nehumane primate, poput majmuna), zečeve i glodare (npr. miševi i pacovi). Konkretno, pojedinac ili ispitanik je čovek.

Termin „farmaceutska kompozicija“ odnosi se na preparat koji je u takvom obliku da omogućuje da biološka aktivnost aktivnog sastojka koji se u njemu nalazi bude delotvorna, i koji ne sadrži dodatne komponente koje su neprihvatljivo toksične za ispitanika na kome bi se formulacija primenjivala.

„Farmaceutski prihvatljiv nosač“ upućuje na sastojak farmaceutske kompozicije koji nije aktivni sastojak i koji je netoksičan za ispitanika. Farmaceutski prihvatljiv nosač uključuje, ali nije ograničen na pufer, ekscipijens, stabilizator ili konzervans.

Kao što je ovde upotrebljeno, „lečenje“ (i gramatičke varijacije, kao što je „lečiti“) odnosi se na kliničku intervenciju u pokušaju da se izmeni prirodni tok bolesti kod pojedinca koji se leči, i može se primenjivati ili radi profilakse ili tokom kliničke patologije. Poželjni efekti lečenja uključuju, bez ograničenja, sprečavanje pojave ili recidiva bolesti, ublažavanje simptoma, smanjenje svih direktnih ili indirektnih patoloških posledica bolesti, sprečavanje metastaze, usporavanje brzine napredovanja bolesti, poboljšavanje ili ublažavanje stanja bolesti, i remisiju ili poboljšanu prognozu. U nekim otelotvorenjima, proteazom aktivirani bispecifični molekuli koji aktiviraju T ćelije prema pronalasku koriste se da odlože razvoj bolesti ili da uspore napredovanje bolesti.

Termin „uputstvo za upotrebu“ koristi se da se ukaže na uputstvo koje se tipično nalazi u komercijalnim pakovanjima terapeutskih proizvoda, koje sadrži informacije o indikacijama, upotrebi, doziranju, primeni, kombinovanoj terapiji, kontraindikacijama i/ili upozorenjima u vezi sa upotrebom takvog terapeutskog proizvoda.

„Polipeptid specifičan za idiotip“ kako se ovde koristi odnosi se na polipeptid koji prepoznaje idiotip antigen-vezujućeg dela, npr., antigen-vezujući deo specifičan za CD3. Polipeptid specifičan za idiotip je sposoban da se specifično veže za promenljivi region antigen-vezujućeg dela i na taj način smanjuje ili sprečava specifično vezivanje antigenvezujućeg dela za njegov srodni antigen. Kada je povezan sa molekulom koji sadrži deo koji vezuje antigen, polipeptid specifičan za idiotip može funkcionisati kao maskirajući deo molekula. Ovde su posebno otkrivena antitela protiv idiotipa ili fragmenti antitela koji vežu antiidiotipove specifične za idiotip anti-CD3 vezujućih molekula.

„Proteaza“ ili „proteolitički enzim“, kako se ovde koristi, odnosi se na bilo koji proteolitički enzim koji cepa linker na mestu prepoznavanja i koji se eksprimira ciljanom ćelijom. Takve proteaze mogu biti izlučene od strane ciljne ćelije ili ostati povezane sa ciljnom ćelijom, npr. na površini ciljne ćelije. Primeri proteaza uključuju, ali nisu ograničeni na metaloproteinaze, npr. matrična metaloproteinaza 1-28 i dezintegrin i metaloproteinaza (ADAM) 2, 7-12, 15, 17-23, 28-30 i 33, serinska proteaza, npr. aktivator plazminogena tipa urokinaze i matriptaza, cistein proteaza, asparaginske proteaze i članovi porodice katepsina.

Termin „koji se aktivira proteazom“, kako se ovde koristi, u odnosu na bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju, odnosi se na bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji ima smanjenu ili ukinutu sposobnost aktiviranja T ćelija usled maskirajućeg dela koji smanjuje ili ukida sposobnost bispecifičnog molekula koji aktivira T ćeliju da se veže za CD3. Nakon disocijacije maskirajućeg dela proteolitičkim cepanjem, npr. proteolitičkim cepanjem linkera koji povezuje maskirni deo sa bispecifičnim molekulom koji aktivira T ćeliju, vezivanje za CD3 se obnavlja i na taj način se aktivira bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju.

„Reverzibilno prikrivanje“, kako se ovde koristi, odnosi se na vezivanje maskirajućeg dela ili polipeptida specifičnog za idiotip na deo ili molekul koji vezuje antigen, kao što je sprečavanje antigen-vezujućeg dela ili molekula iz njegovog antigena, npr. CD3. Ovo prikrivanje je reverzibilno po tome što se polipeptid specifičan za idiotip može osloboditi iz antigen-vezujućeg ostatka ili molekula, npr. cepanjem proteaze, i time oslobađajući antigenvezujući deo ili molekul da se veže za njegov antigen.

Detaljan opis

4

Prvi antigen vezujući deo sposoban za specifično vezivanje za CD3 sadrži idiotip. U jednom otelotvorenju, maskirni deo bispecifičnog molekula koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom je kovalentno vezan za prvi antigen vezujući deo. U jednom otelotvorenju, maskirni deo je kovalentno vezan za varijabilni region teškog lanca prvog dela koji vezuje antigen. U jednom otelotvorenju, maskirni deo je kovalentno vezan za varijabilni region lakog lanca prvog dela koji vezuje antigen. Ova kovalentna veza je odvojena od specifičnog vezivanja, koje je poželjno nekovalentno, maskirajućeg dela za idiotipsko prvo mesto vezivanja antigena. Idiotip prvog dela za vezivanje antigena obuhvata njegov varijabilni region. U jednom otelotvorenju, maskirni deo se vezuje za aminokiselinske ostatke koji stupaju u kontakt sa CD3 kada je prvi antigen vezujući ostatak vezan za CD3. U poželjnom otelotvorenju, maskirni deo nije srodni antigen ili njegovi fragmenti prvog antigen vezujućeg dela, tj., maskirajući deo nije CD3 ili njegovi fragmenti. U jednom otelotvorenju, maskirni deo je antiidiotipsko antitelo ili njegov fragment. U jednom otelotvorenju, maskirni deo je anti-idiotipski scFv. Primeri otelotvorenja maskirajućih ostataka koji su anti-idiotipski scFV, i bispecifičnog molekula koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom koji sadrže takve maskirajuće delove, detaljno su opisani u primerima.

U jednom otelotvorenju, bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom sadrži drugi maskirajući deo koji reverzibilno prikriva drugi antigen vezujući deo.

U jednom otelotvorenjubispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom sadrži

(i) prvi antigen vezujući deo, koji je Fab molekul sposoban za specifično vezivanje za CD3, i koji sadrži najmanje jedan region koji određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca odabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45 i SEQ ID NO: 46, i najmanje jedan CDR lakog lanca odabran iz grupe koja obuhvata SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19;

(ii) drugi antigen vezujući ostatak koji je molekul Fab sposoban da se specifično vezuje za antigen ciljne ćelije.

U jednom otelotvorenju, prvi antigen vezujući ostatak sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična SEQ ID NO: 43 i varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 55.

U jednom otelotvorenju, prvi antigen vezujući deo sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 43 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 55.

U konkretnom otelotvorenju, drugi antigen vezujući deo je sposoban za specifično vezivanje za FolR1 i sadrži najmanje jedan region koji određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca odabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 i SEQ ID NO: 16, i najmanje jedan CDR lakog lanca odabran iz grupe koja obuhvata SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 i SEQ ID NO: 19.

U drugom konkretnom otelotvorenju, drugi antigen vezujući ostatak je sposoban da se specifično vezuje za FolR1, i sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 47 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 55.

U konkretnom otelotvorenju, drugi antigen vezujući deo je sposoban za specifično vezivanje za FolR1 i sadrži najmanje jedan region koji određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca odabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 152 i SEQ ID NO: 153, i najmanje jedan CDR lakog lanca odabran iz grupe koja obuhvata SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 155 i SEQ ID NO: 156.

U drugom konkretnom otelotvorenju, drugi antigen vezujući ostatak je sposoban da se specifično vezuje za FolR1, i sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 157 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 158.

U još jednom konkretnom otelotvorenju, drugi antigen vezujući deo sposoban za specifično vezivanje za HER1 sadrži najmanje jedan region koji određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca odabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57 i SEQ ID NO: 58, i najmanje jedan CDR lakog lanca odabran iz grupe koja obuhvata SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60 i SEQ ID NO: 61.

U još jednom konkretnom otelotvorenju, prvi antigen vezujući ostatak je sposoban da se specifično vezuje za HER1, i sadrži teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci izabranoj iz grupe od: 32 i laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 33.

U drugom konkretnom otelotvorenju, drugi antigen vezujući ostatak je sposoban da se specifično vezuje za HER1, i sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 115 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 116.

U konkretnom otelotvorenju, drugi antigen vezujući deo sposoban za specifično vezivanje za mezotelin sadrži najmanje jedan region koji određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca odabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108 i SEQ ID NO: 109, i najmanje jedan CDR lakog lanca odabran iz grupe koja obuhvata SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111 i SEQ ID NO: 112.

U drugom konkretnom otelotvorenju, drugi antigen vezujući ostatak je sposoban da se specifično vezuje za mezotelin, i sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 113 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 114.

U jednom otelotvorenju, predmetni pronalazak obezbeđuje bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom koji sadrži

(i) prvi antigen vezujući deo, a to je molekul Fab sposoban za specifično vezivanje za CD3, koji sadrži najmanje jedan region koji određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca odabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45 i SEQ ID NO: 46, i najmanje jedan CDR lakog lanca odabran iz grupe koja obuhvata SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19;

(ii) drugi antigen vezujući deo, a to je molekul Fab sposoban za specifično vezivanje za FolR1, koji sadrži najmanje jedan region koji određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca odabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 i SEQ ID NO: 16, i najmanje jedan CDR lakog lanca odabran iz grupe koja obuhvata SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 i SEQ ID NO: 19.

(i) prvi antigen vezujući ostatak koji je molekul Fab sposoban da se specifično vezuje za CD3, i sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ

4

ID NO: 43 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 55,

(ii) drugi antigen vezujući ostatak je molekul Fab sposoban da se specifično vezuje za FolR1, i sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 47 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 55.

(ii) drugi antigen vezujući deo, a to je molekul Fab sposoban za specifično vezivanje za FolR1, koji sadrži najmanje jedan region koji određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca odabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 152 i SEQ ID NO: 153, i najmanje jedan CDR lakog lanca odabran iz grupe koja obuhvata SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 155 i SEQ ID NO: 156.

(i) prvi antigen vezujući ostatak koji je molekul Fab sposoban da se specifično vezuje za CD3, i sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 43 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 55,

(ii) drugi antigen vezujući ostatak je molekul Fab sposoban da se specifično vezuje za FolR1, i sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 157 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 158.

(ii) drugi antigen vezujući deo, a to je molekul Fab sposoban za specifično vezivanje za HER1, koji sadrži najmanje jedan region koji određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca odabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57 i SEQ ID NO: 58, i najmanje jedan CDR lakog lanca odabran iz grupe koja obuhvata SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60 i SEQ ID NO: 61.

(i) prvi antigen vezujući ostatak koji je molekul Fab sposoban da se specifično vezuje za CD3, i sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 43 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 55.

(ii) drugi antigen vezujući ostatak koji je molekul Fab sposoban da se specifično vezuje za HER1, i sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 115 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 116.

U konkretnom otelotvorenju, prvi antigen vezujući deo je ukršteni Fab molekul u kome su razmenjeni varijabilni ili konstantni regioni lakog lanca Fab i teškog lanca Fab.

(i) prvi antigen vezujući deo, a to je molekul Fab sposoban za specifično vezivanje za CD3, koji sadrži najmanje jedan region koji određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca odabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45 i SEQ ID NO: 46, i

4

najmanje jedan CDR lakog lanca odabran iz grupe koja obuhvata SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19;

(ii) drugi antigen vezujući deo, a to je molekul Fab sposoban za specifično vezivanje za mezotelin, koji sadrži najmanje jedan region koji određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca odabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108 i SEQ ID NO: 109, i najmanje jedan CDR lakog lanca odabran iz grupe koja obuhvata SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111 i SEQ ID NO: 112.

(ii) drugi antigen vezujući ostatak koji je molekul Fab sposoban da se specifično vezuje za mezotelin, i sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 113 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 114.

U jednom otelotvorenju, drugi antigen vezujući deo je konvencionalni Fab molekul. U jednom konkretnom otelotvorenju, prvi antigen vezujući ostatak je unakrsno izmenjeni molekul Fab u kojem su razmenjeni konstantni regioni lakog lanca Fab i teškog lanca Fab, a drugi antigen vezujući ostatak je konvencionalni molekul Fab. U jednom drugom konkretnom otelotvorenju, prvi i drugi antigen vezujući ostaci su spojeni jedan sa drugim, opciono preko peptidnog linkera.

U konkretnim otelotvorenjima, bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom sadrži Fc domen sastavljen od prve i druge podjedinice sposobne za stabilno povezivanje.

U još jednom konkretnom otelotvorenju, ne više od jednog antigen vezujućeg dela, sposobnog za specifično vezivanje za CD3, prisutno je u bispecifičnom molekulu koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom (tj. bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom omogućava jednovalentno vezivanje za CD3).

4

Formati bispecifičnog molekula koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom Komponente bispecifičnog molekula koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom mogu biti spojene jedne sa drugom u različitim konfiguracijama. Primeri konfiguracije su prikazani na slikama 1A-E i 5A-H. Dalji primeri konfiguracije su prikazani na slikama 33A-K.

U konkretnim otelotvorenjima, bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom sadrži Fc domen sastavljen od prve i druge podjedinice sposobne za stabilno povezivanje. U nekim otelotvorenjima, drugi antigen vezujući ostatak je spojen na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem prve ili druge podjedinice Fc domena.

U jednom takvom otelotvorenju, prvi antigen vezujući ostatak je spojen na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem teškog lanca Fab drugog antigen vezujućeg ostatka. U jednom takvom posebnom otelotvorenju, bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom u suštini se sastoji od prvog i drugog antigen vezujućeg dela, Fc domena sastavljenog od prve i druge podjedinice, i opciono jednog ili više peptidnih linkera, pri čemu, prvi antigen vezujući deo je spojen na C-terminalnom kraju teškog lanca Fab sa N-terminalnim krajem teškog lanca Fab drugog antigen vezujućeg dela, i drugi antigen vezujući deo je spojen na C-terminalnom kraju teškog lanca Fab sa N-terminalnim krajem prve ili druge podjedinice Fc domena. Opciono, laki lanac Fab prvog antigen vezujućeg dela i laki lanac Fab drugog antigen vezujućeg dela mogu dodatno biti spojeni jedan sa drugim. U drugom takvom otelotvorenju, prvi antigen vezujući ostatak je spojen na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem prve ili druge podjedinice Fc domena. U jednom takvom posebnom otelotvorenju, bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom se u osnovi sastoji od prvog i drugog antigen vezujućeg ostatka, Fc domena sastavljenog od prve i druge podjedinice, i opciono jednog ili više peptidnih linkera, pri čemu, prvi i drugi antigen vezujući ostatak su spojeni na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem jedne od podjedinica Fc domena.

U drugim otelotvorenjima, prvi antigen vezujući deo je spojen na C-terminalnom kraju teškog lanca Fab sa N-terminalnim krajem prve ili druge podjedinice Fc domena.

U takvom jednom konkretnom otelotvorenju, drugi antigen vezujući deo je spojen na C-terminalnom kraju teškog lanca Fab sa N-terminalnim krajem teškog lanca Fab prvog antigen vezujućeg dela. U takvom jednom specifičnom otelotvorenju, bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom u suštini se sastoji od prvog i drugog antigen vezujućeg dela, Fc domena sastavljenog od prve i druge podjedinice, i opciono jednog ili više peptidnih linkera, pri čemu, drugi antigen vezujući deo je spojen na C-terminalnom kraju teškog lanca Fab sa N-terminalnim krajem teškog lanca Fab prvog antigen vezujućeg dela, i prvi antigen vezujući deo je spojen na C-terminalnom kraju teškog lanca Fab sa N-terminalnim

4

krajem prve ili druge podjedinice Fc domena. Opciono, laki lanac Fab prvog antigen vezujućeg dela i laki lanac Fab drugog antigen vezujućeg dela mogu dodatno biti spojeni jedan sa drugim. Antigen vezujući delovi mogu biti spojeni sa Fc domenom ili međusobno direktno ili preko peptidnog linkera, koji sadrži jednu ili više aminokiselina, najčešće oko 2-20 aminokiselina. Peptidni linkeri su poznati u struci i ovde opisani. Odgovarajući neimunogeni peptidni linkeri obuhvataju, na primer, (G4S)n, (SG4)n, (G4S)nili G4(SG4)npeptidne linkere. „n“ je uopšteno broj između 1 i 10, tipično između 2 i 4. Posebno pogodan peptidni linker za međusobno spajanje lakih lanaca Fab prvog i drugog antigen vezujućeg ostatka je (G4S)2. Primer peptidnog linkera pogodnog za povezivanje teških lanaca Fab prvog i drugog antigen vezujućeg ostatka je EPKSC(D)-(G4S)2(SEQ ID NO: 105 i 106). Dodatno, linkeri mogu sadržati imunoglobulinski region šarke (ili njegov deo). Naročito ako je antigen vezujući deo spojen sa N-terminalnim krajem podjedinice Fc domena, tada se može spojiti preko imunoglobulinskog regiona šarke ili njegovog dela, uz prisustvo dodatnog peptidnog linkera ili bez njega.

Bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom sa jednim antigen vezujućim delom koji je sposoban za specifično vezivanje za antigen ciljne ćelije je koristan, naročito u slučajevima kada se očekuje internalizacija antigena ciljnih ćelija nakon vezivanja antigen vezujućeg ostatka sa velikim afinitetom. U takvim slučajevima, prisustvo više od jednog antigen-vezujućeg ostatka specifičnog za antigen ciljnih ćelija može pojačati internalizaciju antigena ciljnih ćelija, čime se smanjuje njegova dostupnost.

U mnogim drugim slučajevima, međutim, bilo bi korisno imati bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom koji sadrži dva ili više antigen vezujućih delova specifičnih za antigen ciljne ćelije (vidi primere prikazane na Slici 5A-H), na primer, kako bi se optimizovalo ciljanje ciljne lokacije ili omogućilo unakrsno vezivanje antigena ciljne ćelije.

Shodno tome, u nekim otelotvorenjima, bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom iz pronalaska sadrži treći deo koji se vezuje za antigen, koji je molekul Fab sposoban da se specifično veže za antigen ciljne ćelije. U jednom otelotvorenju, treći antigen vezujući deo je konvencionalni Fab molekul. U jednom otelotvorenju, treći antigen vezujući ostatak je sposoban da se specifično vezuje za iste antigene ciljne ćelije kao i drugi antigen vezujući ostatak. U jednom konkretnom otelotvorenju, prvi antigen vezujući ostatak je sposoban da se specifično vezuje za CD3, i drugi i treći antigen vezujući ostatak su sposobni da se specifično vezuju za antigen ciljne ćelije. U jednom konkretnom otelotvorenju, drugi i treći antigen vezujući ostatak su identični (tj. sadrže iste aminokiselinske sekvence).

U određenom otelotvorenju, prvi antigen vezujući deo je sposoban za specifično vezivanje za CD3, i drugi i treći antigen vezujući deo je sposoban za specifično vezivanje za

4

FolR1, pri čemu drugi i treći antigen vezujući deo sadrži najmanje jedan region koji određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca izabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 i SEQ ID NO: 16, i najmanje jedan CDR lakog lanca odabran iz grupe koja obuhvata SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 i SEQ ID NO: 19.

U određenom otelotvorenju, prvi antigen vezujući deo je sposoban za specifično vezivanje za CD3 i sadrži najmanje jedan region koji određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca odabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45 i SEQ ID NO: 46, i najmanje jedan CDR lakog lanca odabran iz grupe koja obuhvata SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19; i drugi i treći antigen vezujući deo sposoban za specifično vezivanje za FolR1, pri čemu drugi i treći antigen vezujući deo sadrži najmanje jedan region koji određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca odabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 i SEQ ID NO: 16, i najmanje jedan CDR lakog lanca odabran iz grupe koja obuhvata SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 i SEQ ID NO: 19.

U jednom određenom otelotvorenju, prvi antigen vezujući ostatak je sposoban da se specifično vezuje za CD3, i sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 43 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 55, i drugi i treći antigen vezujući deo antigen su sposobni za specifično vezivanje za FolR1, pri čemu drugi i treći antigen vezujući deo sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 47 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 55.

U jednom otelotvorenju, prvi antigen vezujući deo je sposoban za specifično vezivanje

4

za CD3, i drugi i treći antigen vezujući deo antigen su sposobni za specifično vezivanje za HER1, pri čemu drugi i treći antigen vezujući deo sadrži najmanje jedan region koji određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca izabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57 i SEQ ID NO: 58, i najmanje jedan CDR lakog lanca odabran iz grupe koja obuhvata SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60 i SEQ ID NO: 61.

U jednom otelotvorenju, prvi antigen vezujući deo je sposoban za specifično vezivanje za CD3, i sadrži najmanje jedan region koji određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca odabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45 i SEQ ID NO: 46, i najmanje jedan CDR lakog lanca odabran iz grupe koja obuhvata SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19; i drugi i treći antigen vezujući deo sposoban za specifično vezivanje za HER1, pri čemu drugi i treći antigen vezujući deo sadrži najmanje jedan region koji određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca odabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57 i SEQ ID NO: 58, i najmanje jedan CDR lakog lanca odabran iz grupe koja obuhvata SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60 i SEQ ID NO: 61.

U jednom otelotvorenju, prvi antigen vezujući deo je sposoban za specifično vezivanje za CD3, i sadrži najmanje jedan region koji određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca odabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45 i SEQ ID NO: 46, i najmanje jedan CDR lakog lanca odabran iz grupe koja obuhvata SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 i SEQ ID NO: 19; i drugi i treći antigen vezujući deo sposoban za specifično vezivanje za HER1, pri čemu drugi i treći antigen vezujući deo sadrži najmanje jedan region koji određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca odabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57 i SEQ ID NO: 58, i najmanje jedan CDR lakog lanca odabran iz grupe koja obuhvata SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60 i SEQ ID NO: 61.

U jednom otelotvorenju, prvi antigen vezujući ostatak je sposoban da se specifično vezuje za CD3, i sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 43 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 55, i drugi i treći antigen vezujući deo antigen su sposobni za specifično vezivanje za HER1, pri čemu drugi i treći antigen vezujući deo sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 115 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 116.

U jednom otelotvorenju, prvi antigen vezujući deo je sposoban za specifično vezivanje za CD3, i drugi i treći antigen vezujući deo su sposobni za specifično vezivanje za HER2, pri čemu drugi antigen vezujući deo sadrži najmanje jedan region koji određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca izabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 143 i SEQ ID NO: 144, i najmanje jedan CDR lakog lanca odabran iz grupe koja obuhvata SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 149 i SEQ ID NO: 150, i pri čemu treći antigen vezujući deo sadrži najmanje jedan region koja određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca odabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 146 i SEQ ID NO: 147, i najmanje jedan CDR lakog lanca odabran iz grupe koja obuhvata SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 149 i SEQ ID NO: 150.

U određenom otelotvorenju, prvi antigen vezujući deo je sposoban za specifično vezivanje za CD3 i sadrži najmanje jedan region koji određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca odabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45 i SEQ ID NO: 46, i najmanje jedan CDR lakog lanca odabran iz grupe koja obuhvata SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19; i drugi i treći antigen vezujući deo su sposobni za specifično vezivanje za HER2, pri čemu drugi antigen vezujući deo sadrži najmanje jedan region koji određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca odabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 143 i SEQ ID NO: 144, i najmanje jedan CDR lakog lanca odabran iz grupe koja obuhvata SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 149 i SEQ ID NO: 150, i pri čemu treći antigen vezujući deo sadrži najmanje jedan region koja određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca odabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 146 i SEQ ID NO: 147, i najmanje jedan CDR lakog lanca odabran iz grupe koja obuhvata SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 149 i SEQ ID NO: 150.

U jednom otelotvorenju, prvi antigen vezujući ostatak je sposoban da se specifično vezuje za CD3, i sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 43 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 55, i drugi i treći antigen vezujući deo su sposobni za specifično vezivanje za HER2, pri čemu drugi deo koji vezuje antigen sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 160 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 161, pri čemu treći antigen vezujući deo sadrži

1

varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 159 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 161.

U određenom otelotvorenju, prvi antigen vezujući deo je sposoban za specifično vezivanje za CD3, i drugi i treći antigen vezujući deo je sposoban za specifično vezivanje za mezotelin, pri čemu drugi i treći antigen vezujući deo sadrži najmanje jedan region koji određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca izabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108 i SEQ ID NO: 109, i najmanje jedan CDR lakog lanca odabran iz grupe koja obuhvata SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111 i SEQ ID NO: 112.

U određenom otelotvorenju, prvi antigen vezujući deo je sposoban za specifično vezivanje za CD3 i sadrži najmanje jedan region koji određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca odabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45 i SEQ ID NO: 46, i najmanje jedan CDR lakog lanca odabran iz grupe koja obuhvata SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19; i drugi i treći antigen vezujući deo sposoban za specifično vezivanje za mezotelin, pri čemu drugi i treći antigen vezujući deo sadrži najmanje jedan region koji određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca odabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108 i SEQ ID NO: 109, i najmanje jedan CDR lakog lanca odabran iz grupe koja obuhvata SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111 i SEQ ID NO: 112.

U jednom određenom otelotvorenju, prvi antigen vezujući ostatak je sposoban da se specifično vezuje za CD3, i sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 43 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 55, i drugi i treći antigen vezujući deo su sposobni za specifično vezivanje za mezotelin, pri čemu drugi i treći antigen vezujući deo sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 113 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 114.

U jednom otelotvorenju, prvi antigen vezujući deo je sposoban za specifično vezivanje za CD3, i drugi i treći antigen vezujući deo antigen su sposobni za specifično vezivanje za HER1, pri čemu drugi i treći antigen vezujući deo sadrži najmanje jedan region koji određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca izabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 56,

2

SEQ ID NO: 57 i SEQ ID NO: 58, i najmanje jedan CDR lakog lanca odabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60 i SEQ ID NO: 61.

U određenom otelotvorenju, prvi antigen vezujući deo je sposoban za specifično vezivanje za CD3 i sadrži najmanje jedan region koji određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca odabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45 i SEQ ID NO: 46, i najmanje jedan CDR lakog lanca odabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 i SEQ ID NO: 19; i drugi i treći antigen vezujući deo sposoban za specifično vezivanje za HER1, pri čemu drugi i treći antigen vezujući deo sadrži najmanje jedan region koji određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca odabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57 i SEQ ID NO: 58, i najmanje jedan CDR lakog lanca odabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60 i SEQ ID NO: 61.

U jednom otelotvorenju, treći antigen vezujući ostatak je spojen na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem prve ili druge podjedinice Fc domena. U jednom posebnom otelotvorenju, drugi i treći antigen vezujući ostatak je svaki spojen na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem jedne od podjedinica Fc domena, i prvi antigen vezujući ostatak je spojen na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem teškog lanca Fab drugog antigen vezujućeg ostatka. Opciono, laki lanac Fab prvog antigen vezujućeg dela i laki lanac Fab drugog antigen vezujućeg dela mogu dodatno biti spojeni jedan sa drugim.

Drugi i treći antigen vezujući ostatak mogu biti spojeni sa Fc domenom direktno ili preko peptidnog linkera. U posebnom otelotvorenju, drugi i treći antigen vezujući ostatak je svaki spojen sa Fc domenom preko imunoglobulinskog regiona šarke. U posebnom otelotvorenju, imunoglobulinski region šarke je region šarke humanog IgG1. U jednom otelotvorenju, drugi i treći antigen vezujući ostatak i Fc domen su deo molekula imunoglobulina. U konkretnom otelotvorenju, molekul imunoglobulina je imunoglobulin IgG klase. U jednom konkretnijem otelotvorenju, imunoglobulin je imunoglobulin potklase IgG1. U jednom drugom otelotvorenju, imunoglobulin je imunoglobulin potklase IgG4. U još jednom konkretnom otelotvorenju, imunoglobulin je humani imunoglobulin. U drugim otelotvorenjima, imunoglobulin je himerni imunoglobulin ili humanizovani imunoglobulin. U jednom otelotvorenju, bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom u suštini se sastoji od molekula imunoglobulina koji je sposoban da se specifično vezuje za antigen ciljne ćelije, i antigen vezujućeg ostatka koji je sposoban da se specifično vezuje za CD3, pri čemu, antigen vezujući ostatak je molekul Fab, naročito unakrsno izmenjeni molekul Fab, spojen sa N-krajem jednog od teških lanaca imunoglobulina, opciono putem peptidnog linkera.

U jednom konkretnom otelotvorenju, prvi i treći antigen vezujući ostatak je svaki spojen na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem jedne od podjedinica Fc domena, i drugi antigen vezujući ostatak je spojen na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem teškog lanca Fab prvog antigen vezujućeg ostatka. U jednom takvom posebnom otelotvorenju, bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom u suštini se sastoji od prvog, drugog i trećeg antigen vezujućeg ostatka, Fc domena sastavljenog od prve i druge podjedinice, i opciono jednog ili više peptidnih linkera, pri čemu, drugi antigen vezujući ostatak je spojen na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem teškog lanca Fab prvog antigen vezujućeg ostatka, i prvi antigen vezujući ostatak je spojen na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem prve podjedinice Fc domena, i pri čemu, treći antigen vezujući ostatak je spojen na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem druge podjedinice Fc domena. Opciono, laki lanac Fab prvog antigen vezujućeg dela i laki lanac Fab drugog antigen vezujućeg dela mogu dodatno biti spojeni jedan sa drugim.

(i) prvi antigen vezujući deo, a to je Fab molekul sposoban za specifično vezivanje za CD3, koji sadrži region koji određuje komplementarnost (CDR) 1 teškog lanca SEQ ID NO: 44, CDR 2 teškog lanca SEQ ID NO: 45, CDR 3 teškog lanca SEQ ID NO: 46, CDR 1 lakog lanca SEQ ID NO: 17, CDR 2 lakog lanca SEQ ID NO: 18 i CDR 3 lakog lanca SEQ ID NO: 19, pri čemu, prvi antigen vezujući deo je ukršteni molekul Fab u kome su razmenjeni varijabilni ili konstantni regioni, posebno konstantni regioni, lakog lanca Fab i teškog lanca Fab;

(ii) drugi i treći antigen vezujući deo od kojih je svaki molekul Fab sposoban za specifično vezivanje za FolR1 koji sadrži CDR 1 tešog lanca SEQ ID NO: 14, CDR 2 teškog lanca SEQ ID NO: 15, CDR 3 teškog lanca SEQ ID NO: 16, CDR 1 lakog lanca SEQ ID NO: 17, CDR 2 lakog lanca SEQ ID NO: 18 i CDR3 lakog lanca SEQ ID NO: 19.

(i) prvi antigen vezujući ostatak koji je molekul Fab sposoban da se specifično vezuje za CD3, i sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 43 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 55, pri čemu, prvi antigen vezujući deo je ukršteni molekul Fab u kome su razmenjeni varijabilni ili konstantni regioni, posebno konstantni regioni, lakog lanca Fab i teškog lanca

4

Fab;

(ii) drugi i treći antigen vezujući ostatak od kojih je svaki molekul Fab sposoban da se specifično vezuje za FolR1, i sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 47 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 55.

(ii) drugi i treći antigen vezujući deo od kojih je svaki molekul Fab sposoban za specifično vezivanje za FolR1 koji sadrži CDR 1 tešog lanca SEQ ID NO: 151, CDR 2 teškog lanca SEQ ID NO: 152, CDR 3 teškog lanca SEQ ID NO: 153, CDR 1 lakog lanca SEQ ID NO: 154, CDR 2 lakog lanca SEQ ID NO: 155 i CDR3 lakog lanca SEQ ID NO: 156.

(i) prvi antigen vezujući ostatak koji je molekul Fab sposoban da se specifično vezuje za CD3, i sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 43 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 55, pri čemu, prvi antigen vezujući deo je ukršteni molekul Fab u kome su razmenjeni varijabilni ili konstantni regioni, posebno konstantni regioni, lakog lanca Fab i teškog lanca Fab;

(ii) drugi i treći antigen vezujući ostatak od kojih je svaki molekul Fab sposoban da se specifično vezuje za FolR1, i sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 157 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 158.

(ii) drugi i treći antigen vezujući deo od kojih je svaki molekul Fab sposoban za specifično vezivanje za HER1 koji sadrži CDR 1 tešog lanca SEQ ID NO: 56, CDR 2 teškog lanca SEQ ID NO: 57, CDR 3 teškog lanca SEQ ID NO: 58, CDR 1 lakog lanca SEQ ID NO: 59, CDR 2 lakog lanca SEQ ID NO: 60 i CDR3 lakog lanca SEQ ID NO: 61.

(ii) drugi i treći antigen vezujući ostatak od kojih je svaki molekul Fab sposoban da se specifično vezuje za HER1, i sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 115 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 116.

(ii) drugi i treći antigen vezujući deo od kojih je svaki molekul Fab sposoban za specifično vezivanje za HER2, pri čemu drugi antigen vezujući deo sadrži CDR 1 teškog lanca iz SEQ ID NO: 142, CDR 2 teškog lanca SEQ ID NO: 143, CDR 3 teškog lanca SEQ ID NO: 144, CDR 1 lakog lanca SEQ ID NO: 148, CDR 2 lakog lanca SEQ ID NO: 149 i CDR3 lakog lanca SEQ ID NO: 150, pri čemu treći antigen vezujući deo sadrži CDR 1 teškog lanca SEQ ID NO: 145, CDR 2 teškog lanca SEQ ID NO: 146, CDR 3 teškog lanca SEQ ID NO: 148, CDR 1 lakog lanca SEQ ID NO: 148, CDR 2 lakog lanca SEQ ID NO: 149 i CDR3 lakog lanca SEQ ID NO: 150.

(ii) drugi i treći antigen vezujući ostatak od kojih je svaki molekul Fab sposoban da se specifično vezuje za HER2, pri čemu drugi antigen vezujući deo sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 160 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 161, pri čemu treći antigen vezujući deo sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 159 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 161.

(ii) drugi i treći antigen vezujući deo od kojih je svaki molekul Fab sposoban za specifično vezivanje za mezotelin koji sadrži CDR 1 teškog lanca iz SEQ ID NO: 107, CDR 2 teškog lanca SEQ ID NO: 108, CDR 3 teškog lanca SEQ ID NO: 109, CDR 1 lakog lanca SEQ ID NO: 110, CDR 2 lakog lanca SEQ ID NO: 111 i CDR3 lakog lanca SEQ ID NO: 112.

(ii) drugi i treći antigen vezujući ostatak od kojih je svaki molekul Fab sposoban da se specifično vezuje za mezotelin, i sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 113 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 114.

Bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom prema bilo kom od prethodnih deset otelotvorenja može dalje da sadrži (iii) Fc domen sastavljen od prve i druge podjedinice sposobne za stabilno povezivanje, pri čemu, drugi antigen vezujući ostatak je spojen na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem teškog lanca Fab prvog antigen vezujućeg ostatka, i prvi antigen vezujući ostatak je spojen na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem prve podjedinice Fc domena, i pri čemu, treći antigen vezujući ostatak je spojen na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem druge podjedinice Fc domena.

U nekim od ovde opisanih bispecifičnih molekula koji aktiviraju T ćeliju koji se aktiviraju proteazom iz ovog pronalaska, laki lanac Fab prvog antigen vezujućeg ostatka i laki lanac Fab drugog antigen vezujućeg ostatka su spojeni jedan sa drugim, opciono preko peptidnog linkera. U zavisnosti od konfiguracije prvog i drugog antigen vezujućeg ostatka, laki lanac Fab prvog antigen vezujućeg ostatka može se spojiti na svom C-kraju sa N-krajem lakog lanca Fab drugog antigen vezujućeg ostatka, ili laki lanac Fab drugog antigen vezujućeg ostatka može biti spojen na svom C-kraju sa N-krajem lakog lanca Fab prvog antigen vezujućeg ostatka. Spajanje lakih lanaca Fab prvog i drugog antigen vezujućeg ostatka dalje smanjuje pogrešno sparivanje neusklađenih teških i lakih lanaca Fab, i takođe smanjuje broj plazmida potrebnih za ekspresiju nekih bispecifičnih molekula koji aktiviraju T ćeliju koji se aktiviraju proteazom iz pronalaska.

U određenim otelotvorenjima, bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom sadrži polipeptid, pri čemu varijabilni region lakog lanca Fab prvog antigen vezujućeg ostatka deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa konstantnim regionom teškog lanca Fab prvog antigen vezujućeg ostatka (tj. prvi antigen vezujući ostatak sadrži unakrsno izmenjeni teški lanac Fab, pri čemu, varijabilni region teškog lanca je zamenjen varijabilnim regionom lakog lanca), koji zauzvrat deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa podjedinicom Fc domena (VL(1)-CH1(1)-CH2-CH3(-CH4)), i polipeptid u kome teški lanac Fab drugog antigen vezujućeg ostatka deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa podjedinicom Fc domena (VH(2)-CH1(2)-CH2-CH3(-CH4)). U nekim otelotvorenjima, bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom dalje sadrže polipeptid u kome varijabilni region teškog lanca Fab prvog antigen vezujućeg ostatka deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa konstantnim regionom lakog lanca Fab prvog antigen vezujućeg ostatka (VH(1)-CL(1)) i polipeptidom lakog lanca Fab drugog antigen vezujućeg ostatka (VL(2)-CL(2)). U određenim otelotvorenjima, polipeptidi su kovalentno vezani, npr. disulfidnom vezom.

U alternativnim otelotvorenjima, bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom sadrži polipeptid, pri čemu varijabilni region teškog lanca Fab prvog antigen vezujućeg ostatka deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa konstantnim regionom lakog lanca Fab prvog antigen vezujućeg ostatka (tj. prvi antigen vezujući ostatak sadrži unakrsno izmenjeni teški lanac Fab, pri čemu, konstantni region teškog lanca je zamenjen konstantnim regionom lakog lanca), koji zauzvrat deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa podjedinicom Fc domena (VH(1)-CL(1)-CH2-CH3(-CH4)), i polipeptid u kome teški lanac Fab drugog antigen vezujućeg ostatka deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa podjedinicom Fc domena (VH(2)-CH1(2)-CH2-CH3(-CH4)). U nekim otelotvorenjima, bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom dalje sadrži polipeptid u kome varijabilni region lakog lanca Fab prvog antigen vezujućeg ostatka deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa konstantnim regionom teškog lanca Fab prvog antigen vezujućeg ostatka (VL(1)-CH1(1)) i polipeptidom lakog lanca Fab drugog antigen vezujućeg ostatka (VL(2)-CL(2)). U određenim otelotvorenjima, polipeptidi su kovalentno vezani, npr. disulfidnom vezom.

U nekim otelotvorenjima, bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom sadrži polipeptid, pri čemu varijabilni region lakog lanca Fab prvog antigen vezujućeg ostatka deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa konstantnim regionom teškog lanca Fab prvog antigen vezujućeg ostatka (tj. prvi antigen vezujući ostatak sadrži unakrsno izmenjeni teški lanac Fab, pri čemu, varijabilni region teškog lanca je zamenjen varijabilnim regionom lakog lanca), koji zauzvrat deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa teškim lancem Fab drugog antigen vezujućeg ostatka, koji zauzvrat deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa podjedinicom Fc domena (VL(1)-CH1(1)-VH(2)-CH1(2)-CH2-CH3(-CH4)). U drugim otelotvorenjima, bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom sadrži polipeptid, pri čemu varijabilni region teškog lanca Fab prvog antigen vezujućeg ostatka deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa konstantnim regionom lakog lanca Fab prvog antigen vezujućeg ostatka (tj. prvi antigen vezujući ostatak sadrži unakrsno izmenjeni teški lanac Fab, pri čemu, konstantni region teškog lanca je zamenjen konstantnim regionom lakog lanca), koji zauzvrat deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa teškim lancem Fab drugog antigen vezujućeg ostatka, koji zauzvrat deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa podjedinicom Fc domena (VH(1)-CL(1)-VH(2)-CH1(2)-CH2-CH3(-CH4)). U još nekim otelotvorenjima, bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom sadrži polipeptid, pri čemu teški lanac Fab drugog antigen vezujućeg ostatka deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa varijabilnim regionom lakog lanca Fab prvog antigen vezujućeg ostatka, koji zauzvrat deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa konstantnim regionom teškog lanca Fab prvog antigen vezujućeg ostatka (tj. prvi antigen vezujući ostatak sadrži unakrsno izmenjeni teški lanac Fab, pri čemu, varijabilni region teškog lanca je zamenjen varijabilnim regionom lakog lanca), koji pak deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa podjedinicom Fc domena (VH(2)-CH1(2)-VL(1)-CH1(1)-CH2-CH3(-CH4)). U drugim otelotvorenjima, bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom sadrži polipeptid, pri čemu teški lanac Fab drugog antigen vezujućeg ostatka deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa varijabilnim regionom teškog lanca Fab prvog antigen vezujućeg ostatka, koji zauzvrat deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa konstantnim regionom lakog lanca Fab prvog antigen vezujućeg ostatka (tj. prvi antigen vezujući ostatak sadrži unakrsno izmenjeni teški lanac Fab, pri čemu, konstantni region teškog lanca je zamenjen konstantnim regionom lakog lanca), koji pak deli karboksiterminalnu peptidnu vezu sa podjedinicom Fc domena (VH(2)-CH1(2)-VH(1))-CL(1)-CH2-CH3(-CH4)).

U nekim od ovih otelotvorenja, bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom dalje sadrži polipeptid unakrsno izmenjenog lakog lanca Fab prvog antigen vezujućeg ostatka u kome varijabilni region teškog lanca Fab prvog antigen vezujućeg ostatka deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa konstantnim regionom lakog lanca Fab prvog antigen vezujućeg ostatka (VH(1)-CL(1)) i polipeptidom lakog lanca Fab drugog antigen vezujućeg ostatka (VL(2)-CL(2)). U drugim ovim otelotvorenjima, bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom sadrži polipeptid unakrsno izmenjenog lakog lanca Fab u kome varijabilni region lakog lanca Fab prvog antigen vezujućeg ostatka deli karboksiterminalnu peptidnu vezu sa konstantnim regionom teškog lanca Fab prvog antigen vezujućeg ostatka (VL(1)-CH1(1)) i polipeptidom lakog lanca Fab drugog antigen vezujućeg ostatka (VL(2)-CL(2)). U još nekim od ovih otelotvorenja, bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom dalje sadrži polipeptid u kome varijabilni region lakog lanca Fab prvog antigen vezujućeg ostatka deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa konstantnim regionom teškog lanca Fab prvog antigen vezujućeg ostatka koji zauzvrat deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa polipeptidom lakog lanca Fab drugog antigen vezujućeg ostatka (VL(1)-CH1(1)-VL(2)-CL(2)), polipeptid u kome varijabilni region teškog lanca Fab prvog antigen vezujućeg ostatka deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa konstantnim regionom lakog lanca Fab prvog antigen vezujućeg ostatka koji zauzvrat deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa polipeptidom lakog lanca Fab drugog antigen vezujućeg ostatka (VH(1)-CL(1)-VL(2)-CL(2)), polipeptid u kome polipeptid lakog lanca Fab drugog antigen vezujućeg ostatka deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa varijabilnim regionom lakog lanca Fab prvog antigen vezujućeg ostatka koji zauzvrat deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa konstantnim regionom teškog lanca Fab prvog antigen vezujućeg ostatka (VL(2)-CL(2)-VL(1)-CH1(1)), ili polipeptid u kome polipeptid lakog lanca Fab drugog antigen vezujućeg ostatka deli karboksiterminalnu peptidnu vezu sa varijabilnim regionom teškog lanca Fab prvog antigen vezujućeg ostatka koji zauzvrat deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa konstantnim regionom lakog lanca Fab prvog antigen vezujućeg ostatka (VL(2)-CL(2)-VH(1)-CL(1)).

Bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom prema ovim

1

otelotvorenjima može dalje sadržati (i) polipeptid podjedinice Fc domena (CH2-CH3(-CH4)), ili (ii) polipeptid u kome teški lanac Fab trećeg antigen vezujućeg ostatka deli karboksiterminalnu peptidnu vezu sa podjedinicom Fc domena (VH(3)-CH1(3)-CH2-CH3(-CH4)) i polipeptidom lakog lanca Fab trećeg antigen vezujućeg ostatka (VL(3)-CL(3)). U određenim otelotvorenjima, polipeptidi su kovalentno vezani, npr. disulfidnom vezom.

Prema bilo kom od gore navedenih otelotvorenja, komponente bispecifičnog molekula koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom (npr. antigen vezujući ostatak, Fc domen) mogu biti spojene direktno ili preko različitih linkera, posebno peptidnih linkera koji sadrže jednu ili više aminokiselina, tipično oko 2-20 aminokiselina, koji su ovde opisani ili su poznati u struci. Odgovarajući neimunogeni peptidni linkeri uključuju, na primer, peptidne linkere (G4S)n, (SG4)n, (G4S)nili G4(SG4)n, pri čemu, n je obično broj između 1 i 10, najčešće između 2 i 4.

Fc domen

Fc domen bispecifičnog molekula koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom sastoji se od para polipeptidnih lanaca koji sadrže domene teškog lanca molekula imunoglobulina. Na primer, Fc domen molekula imunoglobulina G (IgG) je dimer, čija svaka podjedinica sadrži konstantne domene IgG teškog lanca CH2 i CH3. Dve podjedinice Fc domena su sposobne za stabilno povezivanje jedne sa drugom. U jednom otelotvorenju, bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom iz ovog pronalaska sadrži ne više od jednog Fc domena.

U jednom otelotvorenju prema pronalasku, Fc domen bispecifičnog molekula koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom je Fc domen IgG. U konkretnom otelotvorenju, Fc domen je Fc domen IgG1. U drugom otelotvorenju, Fc domen je Fc domen IgG4. U konkretnijem otelotvorenju, Fc domen je Fc domen IgG4koji sadrži aminokiselinsku supstituciju u položaju S228 (Kabatova numeracija), konkretno aminokiselinsku supstituciju S228P. Ova aminokiselinska supstitucija smanjuje in vivo razmenu Fab kraka IgG4 antitela (vidi Stubenrauch et al., Drug Metabolism i Disposition 38, 84-91 (2010)). U drugom konkretnom otelotvorenju, Fc domen je humani domen.

Modifikacije Fc domena koje podstiču heterodimerizaciju

Bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom prema pronalasku sadrži različite antigen vezujuće delove, spojene sa jednom ili drugom podjedinicom Fc domena, tako da su dve podjedinice Fc domena tipično sadržane u dva neidentična polipeptidna lanca. Rekombinantna koekspresija ovih polipeptida i naknadna dimerizacija dovode do nekoliko mogućih kombinacija dva polipeptida. Da bi se poboljšali prinos i čistoća bispecifičnog molekula koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom u rekombinantnoj

2

proizvodnji, biće korisno da se u Fc domen bispecifičnog molekula koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom uvede modifikacija koja podstiče povezivanje željenih polipeptida.

Shodno tome, u određenim otelotvorenjima, Fc domen bispecifičnog molekula koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom prema ovom pronalasku sadrži modifikaciju koja podstiče povezivanje prve i druge podjedinice Fc domena. Mesto najveće proteinskoproteinske interakcije između dve podjedinice Fc domena humanog IgG nalazi se u CH3 domenu Fc domena. Tako se u jednom otelotvorenju pomenuta modifikacija nalazi u CH3 domenu Fc domena.

U konkretnom otelotvorenju, pomenuta modifikacija je takozvana modifikacija „dugme u rupici“, koja sadrži modifikaciju „dugmeta“ u jednoj od dve podjedinice Fc domena i modifikaciju „rupice“ u drugoj od dve podjedinice Fc domena.

Tehnologija „dugme u rupici“ opisana je npr. u US 5,731,168; US 7,695,936; Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996) i Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001). Po pravilu, ova metoda podrazumeva uvođenje izbočine („dugme“) na interfejsu prvog polipeptida i odgovarajuće šupljine („rupice“) na interfejsu drugog polipetida, tako da se izbočina može uklopiti u šupljinu da bi se podstaklo formiranje heterodimera i sprečilo nastajanje homodimera. Izbočine su napravljene zamenom malih bočnih lanaca aminokiselina sa interfejsa prvog polipeptida većim bočnim lancima (npr. tirozinom ili triptofanom). Odgovarajuće šupljine, iste ili slične veličine kao izbočine, stvaraju se na interfejsu drugog polipeptida zamenom velikih bočnih lanaca aminokiselina manjim (npr. alaninom ili treoninom).

Shodno tome, u posebnom otelotvorenju, u CH3 domenu prve podjedinice Fc domena bispecifičnog molekula koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom, aminokiselinski ostatak je zamenjen aminokiselinskim ostatkom koji ima veći volumen bočnog lanca, čime se stvara izbočina unutar CH3 domena prve podjedinice koja može da se uklopi u šupljinu unutar CH3 domena druge podjedinice, a u CH3 domenu druge podjedinice Fc domena jedan aminokiselinski ostatak je zamenjen aminokiselinskim ostatkom koji ima manji volumen bočnog lanca, čime se stvara šupljina unutar CH3 domena druge podjedinice unutar koje se može uklopiti izbočina u CH3 domenu prve podjedinice.

Izbočina i šupljina se mogu napraviti izmenom nukleinske kiseline koja kodira polipeptide, npr. mutagenezom specifičnom za mesto, ili sintezom peptida.

U konkretnom otelotvorenju, u CH3 domenu prve podjedinice Fc domena, treoninski ostatak na poziciji 366 zamenjen je triptofanskim ostatkom (T366W), a u CH3 domenu druge podjedinice Fc domena, tirozinski ostatak na poziciji 407 zamenjen je valinskim ostatkom (Y407V). U jednom otelotvorenju, u drugoj podjedinici Fc domena, dodatno je treoninski ostatak na poziciji 366 zamenjen serinskim ostatkom (T366S) i leucinski ostatak na poziciji 368 je zamenjen alaninskim ostatkom (L368A).

U još jednom otelotvorenju, u prvoj podjedinici Fc domena, dodatno je serinski ostatak na poziciji 354 zamenjen cisteinskim ostatkom (S354C), a u drugoj podjedinici Fc domena, dodatno je tirozinski ostatak na poziciji 349 zamenjen cisteinskim ostatkom (Y349C). Uvođenje ova dva ostatka cisteina dovodi do stvaranja disulfidnog mosta između dve podjedinice Fc domena, što dodatno stabilizuje dimer (Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)).

U konkretnom otelotvorenju, antigen vezujući deo sposoban da se vezuje za CD3 je spojen (opciono putem antigen vezujućeg dela koji je sposoban da se vezuje za antigen ciljne ćelije) sa prvom podjedinicom Fc domena (koja sadrži modifikaciju „dugmeta“). Bez želje da se ograničimo teorijom, spajanje antigen vezujućeg dela koji je sposoban da se vezuje za CD3 sa ovom podjedinicom Fc domena će (dodatno) smanjiti stvaranje antigen vezujućih molekula koji sadrže dva antigen vezujuća ostatka sposobna da se vezuju za CD3 (sterni sukob dva polipeptida koji sadrže „dugme“).

U alternativnom otelotvorenju, modifikacija koja podstiče povezivanje prve i druge podjedinice Fc domena sadrži modifikaciju koja posreduje u elektrostatičkim efektima upravljanja, npr. kao što je opisano u publikaciji PCT WO 2009/089004. Po pravilu, ovaj postupak podrazumeva zamenu jednog ili više aminokiselinskih ostataka na interfejsu dve podjedinice Fc domena naelektrisanim aminokiselinskim ostacima, tako da formiranje homodimera postaje elektrostatički nepovoljno, a heterodimerizacija elektrostatički povoljna.

Modifikacije Fc domena koje smanjuju vezivanje Fc receptora i/ili efektorsku funkciju Fc domen daje bispecifičnom molekulu koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom povoljne farmakokinetičke osobine, uključujući i dug poluživot u serumu, koji doprinosi dobroj akumulaciji u ciljnom tkivu i povoljnom stepenu raspodele između tkiva i krvi. Istovremeno, on može dovesti do nepoželjnog usmeravanja bispecifičnog molekula koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom na ćelije koje eksprimiraju Fc receptore, a ne na željene ćelije koje nose antigene. Štaviše, koaktivacija signalnih puteva Fc receptora može dovesti do otpuštanja citokina, što u kombinaciji sa svojstvima aktiviranja T ćelija i dugim poluživotom antigen vezujućeg molekula dovodi do prekomerne aktivacije receptora citokina i teških neželjenih efekata kod sistemske primene. Aktivacija imunskih ćelija (koje nose Fc receptore), osim T ćelija, može čak i smanjiti efikasnost bispecifičnog molekula koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom zbog potencijalne destrukcije T ćelija, npr. NK ćelijama.

4

U skladu sa ovim, u pojedinim otelotvorenjima, Fc domen bispecifičnog molekula koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom prema ovom pronalasku ispoljava smanjeni afinitet vezivanja za Fc receptor i/ili smanjenu efektorsku funkciju, u odnosu na Fc domen nativnog IgG1. U jednom takvom otelotvorenju, Fc domen (ili bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom, koji sadrži pomenuti Fc domen) pokazuje manje od 50%, poželjno manje od 20%, poželjnije manje od 10%, a najpoželjnije manje od 5% afiniteta vezivanja prema Fc receptoru, u poređenju sa Fc domenom nativnog IgG1(ili bispecifičnim molekulom koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom, koji sadrži Fc domen nativnog IgG1), i/ili manje od 50%, poželjno manje od 20%, poželjnije manje od 10%, a najpoželjnije manje od 5% efektorske funkcije, u poređenju sa Fc domenom nativnog IgG1(ili bispecifičnim molekulom koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom, koji sadrži Fc domen nativnog IgG1). U jednom otelotvorenju, domen Fc domena (ili bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom, koji sadrži pomenuti Fc domen) ne vezuje se značajno za Fc receptor i/ili ne indukuje efektorsku funkciju. U konkretnom otelotvorenju, Fc receptor je Fcγ receptor. U jednom otelotvorenju, Fc receptor je humani Fc receptor. U jednom otelotvorenju, Fc receptor je aktivirajući Fc receptor. U konkretnom otelotvorenju, Fc receptor je aktivirajući humani Fcγ receptor, konkretnije humani FcγRIIIa, FcγRI ili FcγRIIa, najkonkretnije humani FcγRIIIa. U jednom otelotvorenju, efektorska funkcija je jedna ili više njih izabranih iz grupe koja se sastoji od CDC, ADCC, ADCP i sekrecije citokina. U konkretnom otelotvorenju, efektorska funkcija je ADCC. U jednom otelotvorenju, domen Fc domena pokazuje suštinski sličan afinitet vezivanja za neonatalni Fc receptor (FcRn) u poređenju sa domenom Fc domena nativnog IgG1. Suštinski slično vezivanje za FcRn postiže se kada Fc domen (ili bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom, koji sadrži navedeni Fc domen) pokazuje afinitet vezivanja za FcRn veći od oko 70%, konkretno veći od oko 80%, konkretnije veći od oko 90% Fc domena nativnog IgG1(ili bispecifičnog molekula koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom, koji sadrži Fc domen nativnog IgG1).

U određenim otelotvorenjima, Fc domen je konstruisan tako da ima smanjeni afinitet vezivanja za Fc receptor i/ili redukovanu efektorsku funkciju, u poređenju sa nekonstruisanim Fc domenom. U konkretnim otelotvorenjima, Fc domen bispecifičnog molekula koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom sadrži jednu ili više aminokiselinskih mutacija koje smanjuju afinitet vezivanja Fc domena za Fc receptor i/ili efektorsku funkciju. Najčešće su jedna ili više aminokiselinskih mutacija prisutne u svakoj od dve podjedinice Fc domena. U jednom otelotvorenju, aminokiselinska mutacija smanjuje afinitet vezivanja Fc domena za Fc receptor. U jednom otelotvorenju, aminokiselinska mutacija smanjuje afinitet vezivanja Fc domena za Fc receptor najmanje 2 puta, najmanje 5 puta ili najmanje 10 puta. U otelotvorenjima gde postoji više od jedne aminokiselinske mutacije koja smanjuje afinitet vezivanja Fc domena za Fc receptor, kombinacija ovih aminokiselinskih mutacija može smanjiti afinitet vezivanja Fc domena za Fc receptor najmanje 10 puta, najmanje 20 puta ili čak najmanje 50 puta. U jednom otelotvorenju, bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom, koji sadrži konstruisani Fc domen pokazuje manje od 20%, konkretno manje od 10%, konkretnije manje od 5% afiniteta vezivanja za Fc receptor u poređenju sa bispecifičnim molekulom koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom, koji sadrži nekonstruisani Fc domen. U konkretnom otelotvorenju, Fc receptor je Fcγ receptor. U nekim otelotvorenjima, Fc receptor je humani Fc receptor. U nekim otelotvorenjima, Fc receptor je aktivirajući Fc receptor. U konkretnom otelotvorenju, Fc receptor je aktivirajući humani Fcγ receptor, konkretnije humani FcγRIIIa, FcγRI ili FcγRIIa, najkonkretnije humani FcγRIIIa. Poželjno je da vezivanje za svaki od ovih receptora bude smanjeno. U nekim otelotvorenjima, afinitet vezivanja za komponentu komplementa, posebno afinitet vezivanja za C1q, takođe je smanjen. U jednom otelotvorenju, afinitet vezivanja za neonatalni Fc receptor (FcRn) nije smanjen. Suštinski slično vezivanje za FcRn, tj. očuvanje afiniteta vezivanja Fc domena za navedeni receptor, postiže se kada Fc domen (ili bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom, koji sadrži navedeni Fc domen) ima više od oko 70% afiniteta vezivanja nekonstruisanog oblika Fc domena (ili bispecifičnog molekula koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom, koji sadrži pomenuti nekonstruisani oblik Fc domena) za FcRn. Fc domen, ili bispecifični molekuli koji aktiviraju T ćeliju koji se aktiviraju proteazom iz pronalaska koji sadrže navedeni Fc domen, mogu pokazivati više od oko 80%, a čak i više od oko 90% takvog afiniteta. U određenim otelotvorenjima, Fc domen bispecifičnog molekula koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom je konstruisan tako da ima smanjenu efektorsku funkciju, u poređenju sa nekonstruisanim Fc domenom. Smanjena efektorska funkcija može da obuhvata, ali nije ograničena na, jednu ili više od sledećih stvari: smanjenu citotoksičnost zavisnu od komplementa (CDC), smanjenu ćelijsku citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC), smanjenu ćelijsku fagocitozu zavisnu od antitela (ADCP), smanjenu sekreciju citokina, smanjeno preuzimanje antigena posredstvom imunog kompleksa od strane antigen prezentujućih ćelija, smanjeno vezivanje za NK ćelije, smanjeno vezivanje za makrofage, smanjeno vezivanje za monocite, smanjeno vezivanje za polimorfonuklearne ćelije, smanjenu direktnu signalizaciju koja indukuje apoptozu, smanjeno unakrsno povezivanje antitela vezanih za cilj, smanjenu zrelost dendritskih ćelija, ili smanjen prajming T ćelija. U jednom otelotvorenju, smanjena efektorska funkcija je jedna ili više izabranih iz grupe u kojoj se nalazi smanjena CDC, smanjena ADCC, smanjena ADCP i smanjena sekrecija citokina. U jednom konkretnom otelotvorenju, smanjena efektorska funkcija je smanjena ADCC. U jednom otelotvorenju, smanjena ADCC je manja od 20% citotoksičnosti ADCC indukovane nekonstruisanim Fc domenom (ili bispecifičnim molekulom koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom, koji sadrži nekonstruisani Fc domen).

U jednom otelotvorenju, aminokiselinska mutacija koja smanjuje afinitet vezivanja Fc domena za Fc receptor i/ili efektorsku funkciju je aminokiselinska supstitucija. U jednom otelotvorenju, Fc domen sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji izabranoj iz grupe od E233, L234, L235, N297, P331 i P329. U još konkretnijem otelotvorenju, Fc domen sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji izabranoj iz grupe od L234, L235 i P329. U nekim otelotvorenjima, Fc domen sadrži aminokiselinske supstitucije L234A i L235A. U jednom takvom otelotvorenju, Fc domen je Fc domen IgG1, konkretno Fc domen humanog IgG1. U jednom otelotvorenju, Fc domen sadrži aminokiselinsku supstituciju u položaju P329. U još konkretnijem otelotvorenju, aminokiselinska supstitucija je P329A ili P329G, konkretno P329G. U jednom otelotvorenju, Fc domen sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji P329 i drugu aminokiselinsku supstituciju na poziciji izabranoj od E233, L234, L235, N297 i P331. U još konkretnijem otelotvorenju, dodatna aminokiselinska supstitucija je E233P, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D ili P331S. U konkretnim otelotvorenjima, Fc domen obuhvata aminokiselinske supstitucije na pozicijama P329, L234 i L235. U konkretnijim otelotvorenjima, Fc domen obuhvata aminokiselinske mutacije L234A, L235A i P329G („P329G LALA“). U jednom takvom otelotvorenju, Fc domen je Fc domen IgGi, konkretno Fc domen humanog IgG1. „P329G LALA“ kombinacija aminokiselinskih supstitucija skoro potpuno ukida vezivanje Fcγ receptora (kao i komplementa) za Fc domen humanog IgG1, kako je opisano u publikaciji PCT br. WO 2012/130831. WO2012/130831 takođe opisuje postupke za pripremu takvih mutantnih Fc domena i postupke za određivanje njihovih svojstava, kao što su vezivanje za Fc receptore ili efektorske funkcije.

IgG4antitela pokazuju smanjen afinitet vezivanja za Fc receptore i smanjene efektorske funkcije u poređenju sa IgG1antitelima. Stoga, u nekim otelotvorenjima, Fc domen bispecifičnog molekula koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom iz pronalaska je Fc domen IgG4, konkretno Fc domen humanog IgG4. U jednom otelotvorenju, Fc domen IgG4sadrži aminokiselinske supstitucije na poziciji S228, konkretno aminokiselinsku supstituciju S228P. Da bi se dodatno smanjio afinitet vezivanja za Fc receptor i/ili njegova efektorska funkcija, u jednom otelotvorenju Fc domen IgG4sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji L235, konkretno aminokiselinsku supstituciju L235E. U jednom drugom otelotvorenju, Fc domen IgG4sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji P329, konkretno aminokiselinsku supstituciju P329G. U jednom konkretnom otelotvorenju, Fc domen IgG4sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama S228, L235 i P329, konkretno aminokiselinske supstitucije S228P, L235E i P329G. Takvi mutanti Fc domena IgG4i njihova svojstva vezivanja Fcγ receptora opisani su u publikaciji PCT br. WO 2012/130831.

U jednom konkretnom otelotvorenju, Fc domen koji ispoljava smanjen afinitet vezivanja za Fc receptor i/ili smanjenu efektorsku funkciju u odnosu na Fc domen nativnog IgG1je Fc domen humanog IgG1koji sadrži aminokiselinske supstitucije L234A, L235A i opciono P329G, ili Fc domen humanog IgG4koji sadrži aminokiselinske supstitucije S228P, L235E i opciono P329G.

U određenim otelotvorenjima, eliminisana je N-glikozilacija Fc domena. U jednom takvom otelotvorenju, Fc domen sadrži aminokiselinsku mutaciju na poziciji N297, posebno aminokiselinsku supstituciju koja zamenjuje asparagin alaninom (N297A) ili asparaginskom kiselinom (N297D).

Pored Fc domena opisanih gore i u publikaciji PCT br. WO 2012/130831, Fc domeni sa smanjenim vezivanjem za Fc receptor i/ili efektorskom funkcijom, takođe obuhvataju one sa supstitucijom jednog ili više ostataka Fc domena 238, 265, 269, 270, 297, 327 i 329 (US Patent br.6,737,056). Takvi Fc mutanti obuhvataju Fc mutante sa supstitucijama na dva ili više položaja aminokiselina 265, 269, 270, 297 i 327, uključujući takozvani „DANA“ Fc mutant sa supstitucijom ostataka 265 i 297 alaninom (US Patent br.7,332,581).

Mutantni Fc domeni se mogu pripremiti uklanjanjem, supstitucijom, umetanjem ili modifikacijom aminokiselina, uz upotrebu genetičkih ili hemijskih metoda dobro poznatih u struci. Genetički postupci mogu obuhvatiti mutagenezu specifičnu za mesto kodiranja DNK sekvence, PCR, sintezu gena i slično. Tačne promene nukleotida mogu se potvrditi, na primer, sekvenciranjem.

Vezivanje za Fc receptore se može lako odrediti npr. ELISA testom ili površinskom plazmonskom rezonancom (SPR) upotrebom standardnih instrumentata kao što je BIAcore instrument (GE Healthcare), a takvi Fc receptori se mogu dobiti rekombinantnom ekspresijom. Ovde je opisan takav pogodan test vezivanja. Alternativno, afinitet vezivanja Fc domena ili bispecifičnih antigen vezujućih molekula koji aktiviraju ćelije koji sadrže Fc domen za Fc receptore može se proceniti pomoću ćelijskih linija za koje je poznato da eksprimiraju određene Fc receptore, kao što su NK ćelije koje eksprimiraju Fcγllla receptor.

Efektorska funkcija Fc domena ili bispecifičnog molekula koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom, koji sadrži Fc domen, može se izmeriti postupcima poznatim u struci. Ovde je opisan pogodan test za merenje ADCC. Drugi primeri in vitro testova za određivanje ADCC aktivnosti željenog molekula opisani su u U.S. Patentu br.5,500,362; Hellstrom et al. Proc Natl Acad Sci USA 83, 7059-7063 (1986) i Hellstrom et al, Proc Natl Acad Sci USA 82, 1499-1502 (1985); US Patent br. 5,821,337; Bruggemann et al, J Exp Med 166, 1351-1361 (1987). Alternativno, mogu se koristiti neradioaktivni postupci analiza (videti, npr. ACTI™ neradioaktivni test citotoksičnosti za protočnu citometriju (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA); i CytoTox 96<®>neradioaktivni test citotoksičnosti (Promega, Madison, WI)). U korisne efektorske ćelije za takve testove spadaju mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) i ćelije prirodne ubice (NK). Alternativno, ili dodatno, ADCC aktivnost željenog molekula se može odrediti in vivo, npr. na životinjskom modelu, kao što je objavljeno u Clynes et al., Proc Natl Acad Sci USA 95, 652-656 (1998).

U nekim otelotvorenjima, vezivanje Fc domena za komponentu komplementa, posebno za C1q, je smanjeno. U skladu sa tim, u nekim realizacijama, kada je Fc domen konstruisan da ima smanjenu efektorsku funkciju, pomenuta smanjena efektorska funkcija uključuje smanjeni CDC. Testiranje vezivanja C1q se može obaviti radi utvrđivanja da li je bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom sposoban da vezuje C1q i da li stoga ima CDC aktivnost. Videti, npr. ELISA test C1q i C3c vezivanja u WO2006/029879 i WO2005/100402. Da bi se ocenila aktivacija komplementa, može se izvesti CDC test (videti, npr. Gazzano-Santoro et al, J Immunol Methods 202, 163 (1996); Cragg et al, Blood 101, 1045-1052 (2003); i Cragg i Glennie, Blood 103, 2738-2743 (2004)).

Antigen vezujući ostaci

Antigen vezujući molekul prema pronalasku je bispecifičan, tj. sadrži najmanje dva antigen vezujuća ostatka sposobna za specifično vezivanje za dve različite antigenske determinante. Prema ovom pronalasku, antigen vezujući delovi su Fab molekuli (tj. antigen vezujući domeni sastavljeni od teškog i lakog lanca, od kojih svaki sadrži varijabilni i konstantni region). U jednom otelotvorenju, ovi Fab molekuli su humani. U drugom otelotvorenju, navedeni Fab molekuli su humanizovani. U još jednom otelotvorenju, navedeni Fab molekuli sadrže konstantne regione humanih teških i lakih lanaca.

Najmanje jedan antigen vezujući ostatak je unakrsno izmenjeni molekul Fab. Takva modifikacija smanjuje pogrešno sparivanje teških i lakih lanaca iz različitih molekula Fab, čime se poboljšava prinos i čistoća bispecifičnog molekula koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom iz pronalaska u rekombinantnoj proizvodnji. U određenom unakrsno izmenjenom molekulu Fab koji je koristan za ovde opisani bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom, konstantni regioni lakog lanca Fab i teškog lanca Fab su razmenjeni. U drugom ukrštenom molekulu Fab koji je koristan za ovde opisani bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom, razmenjeni su varijabilni regioni lakog lanca Fab i teškog lanca Fab.

U određenom otelotvorenju u skladu sa ovim pronalaskom, bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom je sposoban da se istovremeno vezuje za antigen ciljnih ćelija, posebno antigen ćelija tumora, i CD3. U jednom otelotvorenju, bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom je sposoban za unakrsno povezivanje T ćelije i ciljne ćelije istovremenim vezivanjem za antigen ciljne ćelije i CD3. U još konkretnijem otelotvorenju, takvo simultano vezivanje dovodi do lize ciljne ćelije, posebno tumorske ćelije. U jednom otelotvorenju, takvo simultano vezivanje dovodi do aktivacije T ćelije. U drugim otelotvorenjima, takvo simultano vezivanje dovodi do ćelijskog odgovora T limfocita, konkretno citotoksičnog T limfocita, odgovora izabranog iz sledeće grupe: proliferacija, diferencijacija, sekrecija citokina, otpuštanje citotoksičnog efektorskog molekula, citotoksična aktivnost i ekspresija aktivacionih markera. U jednom otelotvorenju, vezivanje bispecifičnog molekula koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom za CD3, bez istovremenog vezivanja za antigen ciljnih ćelija, ne dovodi do aktivacije T ćelija.

U jednom otelotvorenju, bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom je sposoban da preusmeri citotoksičnu aktivnost T ćelije na ciljnu ćeliju. U određenom otelotvorenju, pomenuto preusmeravanje je nezavisno od prezentacije peptidnog antigena posredstvom MHC od strane ciljne ćelije i/ili specifičnosti T ćelije.

Naročito, T ćelija prema bilo kom otelotvorenju ovog pronalaska je citotoksična T ćelija. U nekim otelotvorenjima, T ćelija je CD4<+>ili CD8<+>T ćelija, konkretno CD8<+>T ćelija.

Ostatak koji vezuje CD3

Ovde opisani bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom iz pronalaska sadrži najmanje jedan antigen vezujući deo sposoban da se vezuje za CD3 (ovde se naziva i „CD3 antigen vezujući deo“ ili „prvi antigen vezujući deo“). U posebnom otelotvorenju, bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom sadrži ne više od jednog antigen vezujućeg dela sposobnog za specifično vezivanje za CD3. U jednom otelotvorenju, bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom obezbeđuje jednovalentno vezivanje za CD3. Vezivanje CD3 antigena je unakrsno izmenjeni molekul Fab, tj. molekul Fab u kome su ili varijabilni ili konstantni regioni teškog i lakog lanca Fab razmenjeni. U otelotvorenjima u kojima ima više od jednog antigen vezujućeg ostatka sposobnog da se specifično vezuje za antigen ciljne ćelije, koji je sadržan u bispecifičnom molekulu koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom, antigen vezujući ostatak sposoban da se specifično vezuje za CD3 poželjno je unakrsno izmenjeni molekul Fab, i antigen vezujući ostaci sposobni za specifično vezivanje za antigen ciljne ćelije su konvencionalni molekuli Fab.

U posebnom otelotvorenju, CD3 je humani CD3 ili CD3 cinomolgusa, konkretno humani CD3. U posebnom otelotvorenju, CD3 antigen vezujući deo je unakrsno reaktivan za (tj. specifično se vezuje za) CD3 čoveka i cinomolgusa. U nekim otelotvorenjima, prvi antigen vezujući ostatak je sposoban da se specifično vezuje za epsilon podjedinicu CD3.

CD3 antigen vezujući deo sadrži najmanje jedan region koji određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca odabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 i SEQ ID NO: 13, i najmanje jedan CDR lakog lanca odabran iz grupe koja obuhvata SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19.

U jednom otelotvorenju, antigen vezujući deo CD3 sadrži CDR1 teškog lanca SEQ ID NO: 11, CDR2 teškog lanca SEQ ID NO: 12, CDR3 teškog lanca SEQ ID NO: 13, CDR1 lakog lanca SEQ ID NO: 17, CDR2 lakog lanca SEQ ID NO: 18 i CDR3 lakog lanca SEQ ID NO: 19.

U jednom otelotvorenju, antigen vezujući deo CD3 sadrži CDR1 teškog lanca SEQ ID NO: 44, CDR2 teškog lanca SEQ ID NO: 45, CDR3 teškog lanca SEQ ID NO: 46, CDR1 lakog lanca SEQ ID NO: 17, CDR2 lakog lanca SEQ ID NO: 18 i CDR3 lakog lanca SEQ ID NO: 19.

U jednom otelotvorenju, antigen vezujući deo CD3 sadrži sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 43, i varijabilni region lakog lanca koji je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičan aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 55.

U jednom otelotvorenju, CD3 antigen vezujući deo sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 43 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 55.

U jednom otelotvorenju, CD3 antigen vezujući deo sadrži varijabilni region teškog lanca SEQ ID NO: 43 i sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca SEQ ID NO: 55.

Antigen vezujući ostatak ciljne ćelije

Ovde opisani bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom sadrži najmanje jedan antigen vezujući ostatak sposoban da se vezuje za antigen ciljne ćelije (ovde se naziva i „vezujući ostatak antigena ciljne ćelije“ ili „drugi“ ili „treći“ antigen vezujući ostatak). U određenim otelotvorenjima, bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom sadrži dva antigen vezujuća dela koji su sposobni da se vežu za antigen

1

ciljne ćelije. U jednom takvom konkretnom otelotvorenju, svaki od ovih antigen vezujućih delova specifično se vezuje za istu antigensku determinantu. U još jednom konkretnom otelotvorenju, svi ovi antigen vezujući delovi su identični. U jednom otelotvorenju, bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom sadrži molekul imunoglobina koji je sposoban da se specifično veže za antigen ciljne ćelije. U jednom otelotvorenju, bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom sadrži ne više od dva antigen vezujuća dela sposobna za vezivanje za antigen ciljne ćelije.

U poželjnom otelotvorenju, antigen vezujući deo ciljne ćelije je molekul Fab, posebno konvencionalni molekul Fab koji se vezuje za specifičnu antigensku determinantu, i sposoban je da usmeri bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom na ciljno mesto, na primer, na određeni tip tumorske ćelije koja nosi antigensku determinantu.

U određenim otelotvorenjima, antigen vezujući ostatak ciljne ćelije specifično se vezuje za površinski ćelijski antigen. U određenom otelotvorenju, antigen vezujući deo ciljne ćelije specifično se vezuje za folatni receptor 1 (FolR1) na površini ciljne ćelije. U drugom takvom posebnom otelotvorenju, antigen vezujući deo ciljne ćelije specifično se vezuje za receptor epidermalnog faktora rasta (EGFR), specifično, humani EGFR, npr. HER1. U drugom takvom posebnom otelotvorenju, antigen vezujući deo ciljne ćelije specifično se vezuje za HER2. U drugom takvom posebnom otelotvorenju, antigen vezujući deo ciljne ćelije specifično se vezuje za mezotelin, posebno za humani mezotelin.

U određenim otelotvorenjima, antigen vezujući ostatak ciljne ćelije je usmeren na antigen koji je povezan sa patološkim stanjem, kao što je antigen prezentovan na tumorskoj ćeliji, ili na ćeliji inficiranoj virusom. Odgovarajući antigeni su, na primer, površinski ćelijski antigeni ali nisu ograničeni na receptore na površini ćelija. U konkretnim otelotvorenjima, antigen je humani antigen. U specifičnom otelotvorenju, antigen ciljne ćelije je izabran od folatnog receptora 1 (FolR1) i receptora epidermalnog faktora rasta (EGFR), specifično, humanog EGFR, npr. HER1 U daljem posebnom otelotvorenju, antigen ciljne ćelije je HER2. U daljem posebnom otelotvorenju, antigen ciljne ćelije je mezotelin.

U nekim otelotvorenjima, bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom sadrži najmanje jedan antigen vezujući deo koji je specifičan za HER1. U jednom otelotvorenju, antigen vezujući deo koji je specifičan za HER1 sadrži najmanje jedan region koji određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca izabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57 i SEQ ID NO: 58, i najmanje jedan CDR lakog lanca odabran iz grupe koja obuhvata SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, i SEQ ID NO: 61.

U jednom otelotvorenju, antigen vezujući deo koji je specifičan za HER1 sadrži CDR1

2

teškog lanca SEQ ID NO: 56, CDR2 teškog lanca SEQ ID NO: 57, CDR3 teškog lanca SEQ ID NO: 58, CDR1 lakog lanca SEQ ID NO: 59, CDR2 lakog lanca SEQ ID NO: 60 i CDR3 lakog lanca SEQ ID NO: 61.

U jednom otelotvorenju, antigen vezujući deo koji je specifičan za HER1 sadrži CDR sekvence teškog lanca i lakog lanca anti-HER1 antitela otkrivene u PCT aplikaciji, publikacija broj WO2006/082515.

U jednom otelotvorenju, bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom, koji sadrži najmanje jedan antigen vezujući deo koji je specifičan za HER1 sadrži najmanje jednu od polipeptidnih sekvenci koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa SEQ ID NO: 32, polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci SEQ ID NO: 33, polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci SEQ ID NO: 34. U jednom otelotvorenju, bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom, koji sadrži najmanje jedan antigen vezujući deo koji je specifičan za HER1 sadrži polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 32, polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 33 i polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 34.

U jednom otelotvorenju, bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom, koji sadrži najmanje jedan antigen vezujući deo koji je specifičan za HER1 dalje sadrži anti-idiotipski CD3 scFv koji sadrži najmanje jedan od CDR1 teškog lanca SEQ ID NO: 20, CDR2 teškog lanca SEQ ID NO: 21, CDR3 teškog lanca SEQ ID NO: 22, CDR1 lakog lanca SEQ ID NO: 23, CDR2 lakog lanca SEQ ID NO: 24 i CDR3 lakog lanca SEQ ID NO: 25. U jednom otelotvorenju, anti-idiotipski scFv sadrži CDR1 teškog lanca iz SEQ ID NO: 20, CDR2 teškog lanca SEQ ID NO: 21, CDR3 teškog lanca SEQ ID NO: 22, CDR1 lakog lanca SEQ ID NO: 23, CDR2 lakog lanca SEQ ID NO: 24 i CDR3 lakog lanca SEQ ID NO: 25.

U jednom otelotvorenju, bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom, koji sadrži najmanje jedan antigen vezujući deo koji je specifičan za HER1 dalje sadrži anti-idiotipski CD3 scFv koji sadrži najmanje jedan od CDR1 teškog lanca SEQ ID NO: 26, CDR2 teškog lanca SEQ ID NO: 27, CDR3 teškog lanca SEQ ID NO: 28, CDR1 lakog lanca SEQ ID NO: 29, CDR2 lakog lanca SEQ ID NO: 30 i CDR3 lakog lanca SEQ ID NO: 31. U jednom otelotvorenju, anti-idiotipski scFv sadrži CDR1 teškog lanca iz SEQ ID NO: 26, CDR2 teškog lanca SEQ ID NO: 27, CDR3 teškog lanca SEQ ID NO: 28, CDR1 lakog lanca SEQ ID NO: 29, CDR2 lakog lanca SEQ ID NO: 30 i CDR3 lakog lanca SEQ ID NO: 31.

U jednom otelotvorenju, bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom, koji sadrži najmanje jedan antigen vezujući deo koji je specifičan za HER1 dalje sadrži anti-idiotipski CD3 scFv koji sadrži polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa SEQ ID NO: 41 ili 42. U jednom otelotvorenju, anti-idiotipski scFv sadrži polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 41 ili 42.

U jednom otelotvorenju, bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom, koji sadrži najmanje jedan antigen vezujući deo koji je specifičan za HER1 dalje sadrži anti-idiotipski HER1 scFv koji sadrži najmanje jedan od CDR1 teškog lanca SEQ ID NO: 48, CDR2 teškog lanca SEQ ID NO: 49, CDR3 teškog lanca SEQ ID NO: 50, CDR1 lakog lanca SEQ ID NO: 51, CDR2 lakog lanca SEQ ID NO: 52 i CDR3 lakog lanca SEQ ID NO: 53. U jednom otelotvorenju, anti-idiotipski scFv sadrži CDR1 teškog lanca iz SEQ ID NO: 48, CDR2 teškog lanca SEQ ID NO: 49, CDR3 teškog lanca SEQ ID NO: 50, CDR1 lakog lanca SEQ ID NO: 51, CDR2 lakog lanca SEQ ID NO: 52 i CDR3 lakog lanca SEQ ID NO: 53.

U jednom otelotvorenju, bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom, koji sadrži najmanje jedan antigen vezujući deo koji je specifičan za HER1 dalje sadrži linker koji sadrži polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa SEQ ID NO: 35.

U jednom otelotvorenju, bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom, koji sadrži najmanje jedan antigen vezujući deo koji je specifičan za HER1 dalje sadrži linker koji ima mesto prepoznavanja proteaze koje sadrži polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa SEQ ID NO: 36, 37, 38, 39, 40, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105 ili 106. U jednom otelotvorenju, mesto za prepoznavanje proteaze sadrži polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 36, 37, 38, 39, 40, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105 ili 106. U jednom otelotvorenju, mesto za prepoznavanje proteaze sadrži polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 36. U jednom otelotvorenju, mesto za prepoznavanje proteaze sadrži polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 97. U jednom otelotvorenju, bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom, koji sadrži najmanje jedan antigen vezujući deo koji je specifičan za HER1 dalje sadrži linker koji sadrži polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95 ili 96. U jednom otelotvorenju, linker sadrži polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95 ili 96. U jednom otelotvorenju, linker sadrži polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 7. U jednom otelotvorenju, linker sadrži polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 86.

U nekim otelotvorenjima, bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom sadrži najmanje jedan antigen vezujući deo koji je specifičan za HER2. U jednom otelotvorenju, antigen vezujući deo koji je specifičan za HER2 sadrži najmanje jedan region

4

koji određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca odabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 143 i SEQ ID NO: 144, i najmanje jedan CDR lakog lanca odabran iz grupe koja obuhvata SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 149, i SEQ ID NO: 150. U jednom daljem otelotvorenju, antigen vezujući deo specifičan za HER2 sadrži najmanje jedan region koji određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca odabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 146 i SEQ ID NO: 147, i najmanje jedan CDR lakog lanca odabran iz grupe koja obuhvata SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 149, i SEQ ID NO: 150.

U jednom otelotvorenju, antigen vezujući deo koji je specifičan za HER2 sadrži CDR1 teškog lanca SEQ ID NO: 142, CDR2 teškog lanca SEQ ID NO: 143, CDR3 teškog lanca SEQ ID NO: 144, CDR1 lakog lanca SEQ ID NO: 148, CDR2 lakog lanca SEQ ID NO: 149 i CDR3 lakog lanca SEQ ID NO: 150. U daljem otelotvorenju, antigen vezujući deo koji je specifičan za HER2 sadrži CDR1 teškog lanca SEQ ID NO: 145, CDR2 teškog lanca SEQ ID NO: 146, CDR3 teškog lanca SEQ ID NO: 147, CDR1 lakog lanca SEQ ID NO: 148, CDR2 lakog lanca SEQ ID NO: 149 i CDR3 lakog lanca SEQ ID NO: 150.

U jednom otelotvorenju, bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom, koji sadrži najmanje jedan antigen vezujući deo koji je specifičan za HER2 dalje sadrži anti-idiotipski CD3 scFv koji sadrži najmanje jedan od CDR1 teškog lanca SEQ ID NO: 20, CDR2 teškog lanca SEQ ID NO: 21, CDR3 teškog lanca SEQ ID NO: 22, CDR1 lakog lanca SEQ ID NO: 23, CDR2 lakog lanca SEQ ID NO: 24 i CDR3 lakog lanca SEQ ID NO: 25. U jednom otelotvorenju, anti-idiotipski scFv sadrži CDR1 teškog lanca iz SEQ ID NO: 20, CDR2 teškog lanca SEQ ID NO: 21, CDR3 teškog lanca SEQ ID NO: 22, CDR1 lakog lanca SEQ ID NO: 23, CDR2 lakog lanca SEQ ID NO: 24 i CDR3 lakog lanca SEQ ID NO: 25.

U jednom otelotvorenju, bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom, koji sadrži najmanje jedan antigen vezujući deo koji je specifičan za HER2 dalje sadrži anti-idiotipski CD3 scFv koji sadrži najmanje jedan od CDR1 teškog lanca SEQ ID NO: 26, CDR2 teškog lanca SEQ ID NO: 27, CDR3 teškog lanca SEQ ID NO: 28, CDR1 lakog lanca SEQ ID NO: 29, CDR2 lakog lanca SEQ ID NO: 30 i CDR3 lakog lanca SEQ ID NO: 31. U jednom otelotvorenju, anti-idiotipski scFv sadrži CDR1 teškog lanca iz SEQ ID NO: 26, CDR2 teškog lanca SEQ ID NO: 27, CDR3 teškog lanca SEQ ID NO: 28, CDR1 lakog lanca SEQ ID NO: 29, CDR2 lakog lanca SEQ ID NO: 30 i CDR3 lakog lanca SEQ ID NO: 31.

U jednom otelotvorenju, bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom, koji sadrži najmanje jedan antigen vezujući deo koji je specifičan za HER2 dalje sadrži anti-idiotipski CD3 scFv koji sadrži polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa SEQ ID NO: 41 ili 42. U jednom otelotvorenju, anti-idiotipski scFv sadrži polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 41 ili 42.

U jednom otelotvorenju, bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom, koji sadrži najmanje jedan antigen vezujući deo koji je specifičan za HER2 dalje sadrži anti-idiotipski HER2 scFv koji sadrži najmanje jedan od CDR1 teškog lanca SEQ ID NO: 48, CDR2 teškog lanca SEQ ID NO: 49, CDR3 teškog lanca SEQ ID NO: 50, CDR1 lakog lanca SEQ ID NO: 51, CDR2 lakog lanca SEQ ID NO: 52 i CDR3 lakog lanca SEQ ID NO: 53. U jednom otelotvorenju, anti-idiotipski scFv sadrži CDR1 teškog lanca iz SEQ ID NO: 48, CDR2 teškog lanca SEQ ID NO: 49, CDR3 teškog lanca SEQ ID NO: 50, CDR1 lakog lanca SEQ ID NO: 51, CDR2 lakog lanca SEQ ID NO: 52 i CDR3 lakog lanca SEQ ID NO: 53.

U jednom otelotvorenju, bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom, koji sadrži najmanje jedan antigen vezujući deo koji je specifičan za HER2 dalje sadrži linker koji sadrži polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa SEQ ID NO: 35.

U jednom otelotvorenju, bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom, koji sadrži najmanje jedan antigen vezujući deo koji je specifičan za HER2 dalje sadrži linker koji ima mesto prepoznavanja proteaze koje sadrži polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa SEQ ID NO: 36, 37, 38, 39, 40, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105 ili 106. U jednom otelotvorenju, mesto za prepoznavanje proteaze sadrži polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 36, 37, 38, 39, 40, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105 ili 106. U jednom otelotvorenju, mesto za prepoznavanje proteaze sadrži polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 36. U jednom otelotvorenju, mesto za prepoznavanje proteaze sadrži polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 97. U jednom otelotvorenju, bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom, koji sadrži najmanje jedan antigen vezujući deo koji je specifičan za HER2 dalje sadrži linker koji sadrži polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95 ili 96. U jednom otelotvorenju, linker sadrži polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95 ili 96. U jednom otelotvorenju, linker sadrži polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 7. U jednom otelotvorenju, linker sadrži polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 86.

U jednom otelotvorenju, bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom sadrži polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci SEQ ID NO: 132, polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci SEQ ID NO: 136, polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci SEQ ID NO: 81 i polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci SEQ ID NO: 133.

U jednom otelotvorenju, bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom sadrži polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 132, polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 136, polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 81 i polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 133.

U određenim otelotvorenjima, bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom sadrži najmanje jedan antigen vezujući deo koji je specifičan za FolR1. U jednom otelotvorenju, FolR1 je humani FolR1. U jednom otelotvorenju, bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom sadrži najmanje jedan antigen vezujući deo koji je specifičan za humani FolR1 i ne vezuje humani FolR2 ili humani FolR3. U jednom otelotvorenju, antigen vezujući deo koji je specifičan za FolR1 sadrži najmanje jedan region koji određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca odabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 i SEQ ID NO: 16, i najmanje jedan CDR lakog lanca odabran iz grupe koja obuhvata SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 i SEQ ID NO: 19.

U jednom otelotvorenju, antigen vezujući deo koji je specifičan za FolR1 sadrži CDR1 teškog lanca SEQ ID NO: 14, CDR2 teškog lanca SEQ ID NO: 15, CDR3 teškog lanca SEQ ID NO: 16, CDR1 lakog lanca SEQ ID NO: 17, CDR2 lakog lanca SEQ ID NO: 18 i CDR3 lakog lanca SEQ ID NO: 19.

U još jednom otelotvorenju, antigen vezujući deo specifičan za FolR1 sadrži sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci SEQ ID NO: 47, i sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci SEQ ID NO: 55, ili njene varijante koje zadržavaju funkcionalnost.

U jednom otelotvorenju, antigen vezujući deo koji je specifičan za FolR1 sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO: 47 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 55.

U jednom otelotvorenju, antigen vezujući deo koji je specifičan za FolR1 sadrži najmanje jedan region koji određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca odabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 152 i SEQ ID NO: 153, i najmanje jedan CDR lakog lanca odabran iz grupe koja obuhvata SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 155 i SEQ ID NO: 156.

U jednom otelotvorenju, antigen vezujući deo koji je specifičan za FolR1 sadrži CDR1 teškog lanca SEQ ID NO: 151, CDR2 teškog lanca SEQ ID NO: 152, CDR3 teškog lanca SEQ ID NO: 153, CDR1 lakog lanca SEQ ID NO: 154, CDR2 lakog lanca SEQ ID NO: 155 i CDR3 lakog lanca SEQ ID NO: 156.

U još jednom otelotvorenju, antigen vezujući deo specifičan za FolR1 sadrži sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci SEQ ID NO: 157, i sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci SEQ ID NO: 158, ili njene varijante koje zadržavaju funkcionalnost.

U jednom otelotvorenju, antigen vezujući deo koji je specifičan za FolR1 sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO: 157 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 158.

U jednom otelotvorenju, bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom sadrži polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci SEQ ID NO: 2, i polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci SEQ ID NO: 1.

U jednom otelotvorenju, bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom sadrži polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 2 i polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 1.

U jednom otelotvorenju, bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom, koji sadrži najmanje jedan antigen vezujući deo koji je specifičan za FolR1 dalje sadrži anti-idiotipski CD3 scFv koji sadrži najmanje jedan od CDR1 teškog lanca SEQ ID NO: 20, CDR2 teškog lanca SEQ ID NO: 21, CDR3 teškog lanca SEQ ID NO: 22, CDR1 lakog lanca SEQ ID NO: 23, CDR2 lakog lanca SEQ ID NO: 24 i CDR3 lakog lanca SEQ ID NO: 25. U jednom otelotvorenju, anti-idiotipski scFv sadrži CDR1 teškog lanca iz SEQ ID NO: 20, CDR2 teškog lanca SEQ ID NO: 21, CDR3 teškog lanca SEQ ID NO: 22, CDR1 lakog lanca SEQ ID NO: 23, CDR2 lakog lanca SEQ ID NO: 24 i CDR3 lakog lanca SEQ ID NO: 25.

U jednom otelotvorenju, bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom, koji sadrži najmanje jedan antigen vezujući deo koji je specifičan za FolR1 dalje sadrži anti-idiotipski CD3 scFv koji sadrži najmanje jedan od CDR1 teškog lanca SEQ ID NO: 26, CDR2 teškog lanca SEQ ID NO: 27, CDR3 teškog lanca SEQ ID NO: 28, CDR1 lakog lanca SEQ ID NO: 29, CDR2 lakog lanca SEQ ID NO: 30 i CDR3 lakog lanca SEQ ID NO: 31. U jednom otelotvorenju, anti-idiotipski scFv sadrži CDR1 teškog lanca iz SEQ ID NO: 26, CDR2 teškog lanca SEQ ID NO: 27, CDR3 teškog lanca SEQ ID NO: 28, CDR1 lakog lanca SEQ ID NO: 29, CDR2 lakog lanca SEQ ID NO: 30 i CDR3 lakog lanca SEQ ID NO: 31.

U jednom otelotvorenju, bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom, koji sadrži najmanje jedan antigen vezujući deo koji je specifičan za FolR1 dalje sadrži anti-idiotipski CD3 scFv koji sadrži polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa SEQ ID NO: 41 ili 42. U jednom otelotvorenju, anti-idiotipski scFv sadrži polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 41 ili 42.

U jednom otelotvorenju, bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom, koji sadrži najmanje jedan antigen vezujući deo koji je specifičan za FolR1 dalje sadrži linker koji ima mesto prepoznavanja proteaze koji sadrži polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa SEQ ID NO: 36, 37, 38, 39, 40, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105 ili 106. U jednom otelotvorenju, mesto za prepoznavanje proteaze sadrži polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 36, 37, 38, 39, 40, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105 ili 106. U jednom otelotvorenju, mesto za prepoznavanje proteaze sadrži polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 36. U jednom otelotvorenju, mesto za prepoznavanje proteaze sadrži polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 97. U jednom otelotvorenju, bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom, koji sadrži najmanje jedan antigen vezujući deo koji je specifičan za ForR1 dalje sadrži linker koji sadrži polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95 ili 96. U jednom otelotvorenju, linker sadrži polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95 ili 96. U jednom otelotvorenju, linker sadrži polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 7. U jednom otelotvorenju, linker sadrži polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 86.

U jednom otelotvorenju, bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom sadrži polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci SEQ ID NO: 1, polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci SEQ ID NO: 3 i polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci SEQ ID NO: 72.

U jednom otelotvorenju, bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom sadrži polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci SEQ ID NO: 1, polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci SEQ ID NO: 3 i polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci SEQ ID NO: 85.

U jednom otelotvorenju, bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom sadrži polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci SEQ ID NO: 1, polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci SEQ ID NO: 3, polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci SEQ ID NO: 73 i polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci SEQ ID NO: 74.

U jednom otelotvorenju, bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom sadrži polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 1, polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 3 i polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 72.

U jednom otelotvorenju, bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom sadrži polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 1, polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 3 i polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 85.

U jednom otelotvorenju, bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom sadrži polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 1, polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 3, polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 73 i polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 74.

U jednom otelotvorenju, bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom sadrži polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci SEQ ID NO: 137, polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci SEQ ID NO: 139, polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci SEQ ID NO: 81 i polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci SEQ ID NO: 138.

U jednom otelotvorenju, bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom sadrži polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 137, polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 139, polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 81 i polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 138.

U određenim otelotvorenjima, bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom sadrži najmanje jedan antigen vezujući deo koji je specifičan za mezotelin. U jednom otelotvorenju, mezotelin je humani mezotelin. U jednom otelotvorenju, bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom sadrži najmanje jedan antigen vezujući deo koji je specifičan za humani mezotelin. U jednom otelotvorenju, antigen vezujući deo koji je specifičan za mezotelin sadrži najmanje jedan region koji određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca odabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108 i SEQ ID NO: 109, i najmanje jedan CDR lakog lanca odabran iz grupe koja obuhvata SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111 i SEQ ID NO: 112.

U jednom otelotvorenju, vezujući deo antigena koji je specifičan za mezotelin sadrži CDR1 teškog lanca SEQ ID NO: 107, CDR2 teškog lanca SEQ ID NO: 108, CDR3 teškog lanca SEQ ID NO: 109, CDR1 lakog lanca SEQ ID NO: 110, CDR2 lakog lanca SEQ ID NO: 111 i CDR3 lakog lanca SEQ ID NO: 112.

U još jednom otelotvorenju, antigen vezujući deo specifičan za mezotelin sadrži sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci SEQ ID NO: 113, i sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci SEQ ID NO: 114, ili njene varijante koje zadržavaju funkcionalnost.

U jednom otelotvorenju, antigen vezujući deo koji je specifičan za mezotelin sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu teškog lanca SEQ ID NO: 113 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 114.

U jednom otelotvorenju, bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom, koji sadrži najmanje jedan antigen vezujući deo koji je specifičan za mezotelin dalje sadrži anti-idiotipski CD3 scFv koji sadrži najmanje jedan od CDR1 teškog lanca SEQ ID NO: 20, CDR2 teškog lanca SEQ ID NO: 21, CDR3 teškog lanca SEQ ID NO: 22, CDR1 lakog lanca SEQ ID NO: 23, CDR2 lakog lanca SEQ ID NO: 24 i CDR3 lakog lanca SEQ ID NO: 25. U jednom otelotvorenju, anti-idiotipski scFv sadrži CDR1 teškog lanca iz SEQ ID NO: 20, CDR2 teškog lanca SEQ ID NO: 21, CDR3 teškog lanca SEQ ID NO: 22, CDR1 lakog lanca SEQ ID NO: 23, CDR2 lakog lanca SEQ ID NO: 24 i CDR3 lakog lanca SEQ ID NO: 25.

U jednom otelotvorenju, bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom, koji sadrži najmanje jedan antigen vezujući deo koji je specifičan za mezotelin dalje sadrži anti-idiotipski CD3 scFv koji sadrži najmanje jedan od CDR1 teškog lanca SEQ ID NO: 26, CDR2 teškog lanca SEQ ID NO: 27, CDR3 teškog lanca SEQ ID NO: 28, CDR1 lakog lanca SEQ ID NO: 29, CDR2 lakog lanca SEQ ID NO: 30 i CDR3 lakog lanca SEQ ID NO: 31. U jednom otelotvorenju, anti-idiotipski scFv sadrži CDR1 teškog lanca iz SEQ ID NO: 26, CDR2 teškog lanca SEQ ID NO: 27, CDR3 teškog lanca SEQ ID NO: 28, CDR1 lakog lanca SEQ ID NO: 29, CDR2 lakog lanca SEQ ID NO: 30 i CDR3 lakog lanca SEQ ID NO: 31.

U jednom otelotvorenju, bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom, koji sadrži najmanje jedan antigen vezujući deo koji je specifičan za mezotelin dalje sadrži anti-idiotipski CD3 scFv koji sadrži polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa SEQ ID NO: 41 ili 42. U jednom otelotvorenju, anti-idiotipski scFv sadrži polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 41 ili 42.

1

U jednom otelotvorenju, bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom, koji sadrži najmanje jedan antigen vezujući deo koji je specifičan za mezotelin dalje sadrži linker koji ima mesto prepoznavanja proteaze koje sadrži polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa SEQ ID NO: 36, 37, 38, 39, 40, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105 ili 106. U jednom otelotvorenju, mesto za prepoznavanje proteaze sadrži polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 36, 37, 38, 39, 40, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105 ili 106. U jednom otelotvorenju, mesto za prepoznavanje proteaze sadrži polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 36. U jednom otelotvorenju, mesto za prepoznavanje proteaze sadrži polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 97. U jednom otelotvorenju, bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom, koji sadrži najmanje jedan antigen vezujući deo koji je specifičan za mezotelin dalje sadrži linker koji sadrži polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95 ili 96. U jednom otelotvorenju, linker sadrži polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95 ili 96. U jednom otelotvorenju, linker sadrži polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 7. U jednom otelotvorenju, linker sadrži polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 86.

U jednom otelotvorenju, bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom sadrži polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci SEQ ID NO: 77, polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci SEQ ID NO: 78, polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci SEQ ID NO: 81 i polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci SEQ ID NO: 82.

U jednom otelotvorenju, bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom sadrži polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci SEQ ID NO: 76, polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci SEQ ID NO: 77, polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci SEQ ID NO: 78 i polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci SEQ ID NO: 79.

U jednom otelotvorenju, bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom sadrži polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 77, polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 78, polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 81 i polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 82.

U jednom otelotvorenju, bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira

2

proteazom sadrži polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 76, polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 77, polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 78 i polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 79.

U jednom otelotvorenju, dat je bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju, koji sadrži polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci SEQ ID NO: 76, polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci SEQ ID NO: 77, polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci SEQ ID NO: 78 i polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci SEQ ID NO: 81.

U jednom otelotvorenju, bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju sadrži polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci SEQ ID NO: 77, polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci SEQ ID NO: 78, polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci SEQ ID NO: 81 i polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci SEQ ID NO: 84.

U jednom otelotvorenju, bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju sadrži polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 76, polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 77, polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 78 i polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 81.

U jednom otelotvorenju, bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju sadrži polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 77, polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 78, polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 81 i polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 84.

Maskirajući deo

Bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom iz pronalaska sadrži najmanje jedan maskirajući deo. Drugi su pokušali da maskiraju vezivanje antitela zatvaranjem vezujućeg dela fragmentom antigena koji je prepoznat od strane vezivnog dela (npr. WO2013128194). Ovaj pristup ima nekoliko ograničenja. Na primer, korišćenje antigena omogućava manju fleksibilnost u smanjenju afiniteta vezujućeg dela. To je zato što afinitet mora biti dovoljno veliki da bi se pouzdano maskirao antigenskom maskom. Takođe, disosovani antigen bi se potencijalno mogao vezati i komunicirati sa svojim srodnim receptorom(ima) in vivo i izazvati neželjene signale ćeliji koja eksprimira takav receptor. Nasuprot tome, ovde opisani pristup koristi anti-idiotipsko antitelo ili njegov fragment kao masku. Dva nadoknađujuća razmatranja za dizajniranje efikasnog maskirajućeg dela su 1. efikasnost maskiranja i 2. reverzibilnost maskiranja. Ako je afinitet previše mali, maskiranje bi bilo neefikasno. Međutim, ako je afinitet previše veliki, postupak maskiranja možda neće biti lako reverzibilan. Nije se moglo predvideti da li će maska protiv idiotipa velikog afiniteta ili maska protiv idiotipa malog afiniteta bolje funkcionisati. Kao što je ovde opisano, maskiajući deo sa većim afinitetom je uopšteno bolji u maskiranju antigen vezujuće strane i istovremeno se može efikasno ukloniti radi aktivacije molekula. U jednom otelotvorenju, anti-idiotipska maska ima KD od 1-8 nM. U jednom otelotvorenju, anti-idiotipska maska ima KD od 2 nM na 37°C. U jednom otelotvorenju, maska za maskiranje prepoznaje idiotip prvog antigenskog vezujućeg dela sposobnog za specifično vezivanje za CD3, npr. ljudski CD3. U jednom posebnom otelotvorenju, maskirajući deo prepoznaje idiotip drugog antigen vezujućeg dela koji se može vezati za antigen ciljne ćelije.

U jednom otelotvorenju, maskirajući deo maskira CD3-vezujući deo i sadrži najmanje jedan CDR1 teškog lanca SEQ ID NO: 20, CDR2 teškog lanca SEQ ID NO: 21, CDR3 teškog lanca SEQ ID NO: 22, CDR1 lakog lanca SEQ ID NO: 23, CDR2 lakog lanca SEQ ID NO: 24 i CDR3 lakog lanca SEQ ID NO: 25. U jednom otelotvorenju, maskirajući deo sadrži CDR1 teškog lanca SEQ ID NO: 20, CDR2 teškog lanca SEQ ID NO: 21, CDR3 teškog lanca SEQ ID NO: 22, CDR1 lakog lanca SEQ ID NO: 23, CDR2 lakog lanca SEQ ID NO: 24 i CDR3 lakog lanca SEQ ID NO: 25.

U jednom otelotvorenju, maskirajući deo maskira CD3-vezujući deo i sadrži polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci SEQ ID NO: 41. U jednom otelotvorenju, maskirajući deo maskira CD3-vezujući deo i sadrži polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 41.

U jednom poželjnom otelotvorenju, maskirajući deo maskira CD3-vezujući deo i sadrži najmanje jedan CDR1 teškog lanca SEQ ID NO: 26, CDR2 teškog lanca SEQ ID NO: 27, CDR3 teškog lanca SEQ ID NO: 28, CDR1 lakog lanca SEQ ID NO: 29, CDR2 lakog lanca SEQ ID NO: 30 i CDR3 lakog lanca SEQ ID NO: 31. U jednom otelotvorenju, maskirajući deo sadrži CDR1 teškog lanca SEQ ID NO: 26, CDR2 teškog lanca SEQ ID NO: 27, CDR3 teškog lanca SEQ ID NO: 28, CDR1 lakog lanca SEQ ID NO: 29, CDR2 lakog lanca SEQ ID NO: 30 i CDR3 lakog lanca SEQ ID NO: 31. U jednom otelotvorenju, maskirajući deo maskira CD3-vezujući deo i sadrži polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci SEQ ID NO: 42. U jednom poželjnom otelotvorenju, maskirajući deo maskira CD3-vezujući deo i sadrži polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 42.

U jednom otelotvorenju, maskirajući deo maskira HER1-vezujući deo i sadrži najmanje jedan CDR1 teškog lanca SEQ ID NO: 48, CDR2 teškog lanca SEQ ID NO: 49, CDR3 teškog lanca SEQ ID NO: 50, CDR1 lakog lanca SEQ ID NO: 51, CDR2 lakog lanca SEQ ID NO: 52 i CDR3 lakog lanca SEQ ID NO: 53. U jednom otelotvorenju, anti-idiotipski scFv sadrži CDR1

4

teškog lanca iz SEQ ID NO: 48, CDR2 teškog lanca SEQ ID NO: 49, CDR3 teškog lanca SEQ ID NO: 50, CDR1 lakog lanca SEQ ID NO: 51, CDR2 lakog lanca SEQ ID NO: 52 i CDR3 lakog lanca SEQ ID NO: 53.

U jednom aspektu samo za referencu, otkrće se odnosi na polipeptid specifičan za idiotip za reverzibilno prikrivanje antigenskog vezivanja antigen vezujućeg dela molekula. U jednom otelotvorenju, pronalazak se odnosi na polipeptid specifičan za idiotip za reverzibilno prikrivanje anti-CD3 mesta vezivanja antigena molekula, pri čemu, polipeptid specifičan za idiotip je anti-idiotip scFV, i pri čemu, polipeptid specifičan za idiotip je kovalentno vezan za molekul preko peptidnog linkera. U jednom otelotvorenju, linker je linker koji se cepa proteazom. U jednom otelotvorenju, linker sadrži sekvencu SEQ ID NO: 7, 8, 9 ili 10. U jednom otelotvorenju, linker sadrži sekvencu SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95 ili 96. U jednom otelotvorenju, linker sadrži polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 7. U jednom otelotvorenju, linker sadrži polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 86. U jednom otelotvorenju, peptidni linker sadrži najmanje jedno mesto prepoznavanja proteaze. U jednom otelotvorenju, mesto za prepoznavanje proteaze sadrži polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 36, 37, 38, 39, 40, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105 ili 106. U jednom poželjnom otelotvorenju, mesto za prepoznavanje proteaze sadrži sekvencu prepoznavanja proteaze RQARVVNG (SEQ ID BR: 36). U daljem otelotvorenju, linker sadrži više od jednog mesta prepoznavanja proteaze. U jednom poželjnom otelotvorenju, mesto za prepoznavanje proteaze sadrži sekvencu prepoznavanja proteaze VHMPLGFLGPRQARVVNG (SEQ ID BR:97). U jednom otelotvorenju, proteaza je izabrana iz grupe koja se sastoji od metaloproteinaze, npr. matrice metaloproteinaze (MMP) 1-28 i dezintegrina i metaloproteinaze (ADAM) 2, 7-12, 15, 17-23, 28-30 i 33, serinske proteaze, npr. aktivatora plazminogena tipa urokinaze i matriptaze, cistein proteaze, asparaginske proteaze i katepsina. U jednom konkretnom otelotvorenju, proteaza je MMP9 ili MMP2. U daljem konkretnom otelotvorenju, proteaza je matriptaza.

U jednom otelotvorenju, molekul koji sadrži mesto vezivanja antigena anti-CD3 je bispecifični molekul koji aktivira T-ćeliju. U jednom posebnom otelotvorenju, polipeptid specifičan za idiotip sadrži varijabilni region teškog lanca koja sadrži najmanje jedan od regiona za određivanje komplementarnosti teškog lanca (CDR H) 1 aminokiselinske sekvence DYSIH (SEQ ID NO:20); CDR H2 aminokiselinske sekvence WINTETGEPAYADDFKG (SEQ ID NO:21); i CDR H3 aminokiselinske sekvence PYDYDVLDY (SEQ ID NO:22). U jednom posebnom otelotvorenju, polipeptid specifičan za idiotip sadrži varijabilni region lakog lanca koji sadrži najmanje jedan od lakog lanca (CDR L)1 aminokiselinske sekvence RASKSVSTSNYSYIH (SEQ ID NO:23); CDR L2 aminokiselinske sekvence YVSYLES (SEQ ID NO:24); i CDR L3 aminokiselinske sekvence QHSREFPWT (SEQ ID NO:25). U jednom posebnom otelotvorenju, polipeptid specifičan za idiotip sadrži: region za određivanje komplementarnosti teškog lanca (CDR H) 1 aminokiselinske sekvence DYSIH (SEQ ID NO: 20); CDR H2 aminokiselinske sekvence WINTETGEPAYADDFKG (SEQ ID NO:21); CDR H3 aminokiselinske sekvence PYDYDVLDY (SEQ ID NO:22); i varijabilni region lakog lanca koji sadrži: laki lanac (CDR L) 1 aminokiselinske sekvence RASKSVSTSNYSYIH (SEQ ID NO: 23); CDR L2 aminokiselinske sekvence YVSYLES (SEQ ID NO:24); i CDR L3 aminokiselinske sekvence QHSREFPVT (SEQ ID NO: 25). U jednom posebnom otelotvorenju, polipeptid specifičan za idiotip sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži najmanje jedan od regiona za određivanje komplementarnosti teškog lanca (CDR H) 1 aminokiselinske sekvence SYGVS (SEQ ID NO:26); CDR H2 aminokiselinske sekvence IIWGDGSTNYHSALIS (SEQ ID NO:27); i CDR H3 aminokiselinske sekvence GITTVVDDYYAMDY (SEQ ID NO:28). U jednom posebnom otelotvorenju, polipeptid specifičan za idiotip sadrži varijabilni region lakog lanca koja sadrži najmanje jedan od: lakog lanca (CDR L)1 aminokiselinske sekvence RASENIDSYLA (SEQ ID NO:29); CDR L2 aminokiselinske sekvence AATFLAD (SEQ ID NO:30); i CDR L3 aminokiselinske sekvence QHYYSTPYT (SEQ ID NO:31). U jednom posebnom otelotvorenju, ipolipeptid specifičan za idiotip sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži: region za određivanje komplementarnosti teškog lanca (CDR H) 1 aminokiselinske sekvence SYGVS (SEQ ID NO: 26); CDR H2 aminokiselinske sekvence IIWGDGSTNYHSALIS (SEQ ID NO:27); CDR H3 aminokiselinske sekvence GITTVVDDYYAMDY (SEQ ID NO:28); i varijabilni region lakog lanca koji sadrži: laki lanac (CDR L) 1 aminokiselinske sekvence RASENIDSYLA (SEQ ID NO: 29); CDR L2 aminokiselinske sekvence AATFLAD (SEQ ID NO:30); i CDR L3 aminokiselinske sekvence QHYYSTPYT (SEQ ID NO: 31). U jednom otelotvorenju, polipeptid specifičan za idiotip sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži najmanje jedan od: regiona za određivanje komplementarnosti teškog lanca (CDR H) 1 aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:48; CDR H2 aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:49; i CDR H3 aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:50. U jednom otelotvorenju, polipeptid specifičan za idiotip sadrži varijabilni region lakog lanca koji sadrži najmanje jedan od: regiona za određivanje komplementarnosti lakog lanca (CDR L) 1 aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:51; CDR L2 aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:52; i CDR L3 aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:53. U jednom otelotvorenju, polipeptid specifičan za idiotip sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži region za određivanje komplementarnosti teškog lanca (CDR H) 1 aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 48; CDR H2 aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:49; i CDR H3 aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:50; i varijabilni region lakog lanca koji sadrži region za određivanje komplementarnosti lakog lanca (CDR L) 1 aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:51; CDR L2 aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:52; i CDR L3 aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:53.

Polinukleotidi

Pronalazak dalje obezbeđuje izolovane polinukleotide koji kodiraju bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom kao što je ovde opisano

Polinukleotidi iz pronalaska uključuju one koji su najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identični sekvencama navedenim u SEQ ID NO 62-71 ili SEQ ID NO. Polinukleotidi iz pronalaska dalje uključuju one koji su najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identični sekvencama navedenim u SEQ ID NO 117-131. Polinukleotidi iz pronalaska dalje uključuju one koji su najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identični sekvencama navedenim u SEQ ID NO 162-170.

Polinukleotidi koji kodiraju bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom iz ovog pronalaska mogu se eksprimirati kao jedan polinukleotid koji kodira ceo bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom, ili kao više (npr. dva ili više) polinukleotida koji su koeksprimirani. Polipeptidi kodirani polinukleotidima koji su koeksprimirani mogu se povezati, na primer, putem disulfidnih veza ili drugih sredstava, dajući funkcionalni bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom. Na primer, deo lakog lanca antigen vezujućeg ostatka može biti kodiran odvojenim polinukleotidom iz dela bispecifičnog molekula koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom, koji sadrži deo teškog lanca antigen vezujućeg ostatka, podjedinicu Fc domena i opciono drugi antigen vezujući ostatak (ili njegov deo). Kad su koeksprimirani, polipeptidi teškog lanca će se povezati sa polipeptidima lakog lanca kako bi formirali antigen vezujući ostatak. U drugom primeru, deo bispecifičnog molekula koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom koji sadrži jednu od dve podjedinice Fc domena i opciono jedan ili više antigen vezujućih ostataka (ili njegov/njihov deo) može biti kodiran odvojenim polinukleotidom iz dela bispecifičnog molekula koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom koji sadrži drugu od dve podjedinice Fc domena i opciono antigen vezujući ostatak (ili njegov deo). Kada su koeksprimirane, podjedinice Fc domena će se udružiti da formiraju Fc domen.

U nekim otelotvorenjima, izolovani polinukleotid kodira cele bispecifične molekule koji aktiviraju T ćeliju koji se aktiviraju proteazom prema pronalasku, kao što je ovde opisano.

U drugom otelotvorenju, predmetni pronalazak je usmeren na izolovani polinukleotid koji kodira bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom iz ovog pronalaska, pri čemu polinukleotid sadrži sekvencu koja kodira sekvencu varijabilnog regiona. U drugom otelotvorenju, predmetni pronalazak je usmeren na izolovani polinukleotid koji kodira bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom, pri čemu polinukleotid sadrži sekvencu koja kodira polipeptidnu sekvencu kao što je prikazano u SEQ ID NO 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 47 ili 55. U drugom otelotvorenju, predmetni pronalazak je usmeren na izolovani polinukleotid koji kodira bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom, pri čemu polinukleotid sadrži sekvencu koja kodira polipeptidnu kao što je prikazano u SEQ ID NO 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 47, 55, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85. U još jednom otelotvorenju, predmetni pronalazak je usmeren na izolovani polinukleotid koji kodira bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom, pri čemu polinukleotid sadrži sekvencu koja kodira polipeptidnu sekvencu kao što je prikazano u SEQ ID NO 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 47, 55, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140 ili 141. U drugom otelotvorenju, pronalazak je dalje usmeren na izolovani polinukleotid koji kodira bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom, pri čemu polinukleotid sadrži sekvencu koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična nukleotidnoj sekvenci prikazanoj u SEQ ID NO 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70 ili 71. U drugom otelotvorenju, pronalazak je dalje usmeren na izolovani polinukleotid koji kodira bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom iz pronalaska, pri čemu polinukleotid sadrži sekvencu koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična nukleotidnoj sekvenci kao što je prikazano u SEQ ID NO 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130 ili 131. U drugom otelotvorenju, pronalazak je usmeren na izolovani polinukleotid koji kodira bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom iz pronalaska, pri čemu polinukleotid sadrži sekvencu koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična nukleotidnoj sekvenci kao što je prikazano u SEQ ID NO 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169 ili 170. U drugom otelotvorenju, pronalazak je usmeren na izolovani polinukleotid koji kodira bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom iz pronalaska, pri čemu polinukleotid sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja je prikazana u SEQ ID NO 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, ili 71. U drugom otelotvorenju, pronalazak je usmeren na izolovani polinukleotid koji kodira bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom iz pronalaska, pri čemu polinukleotid sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja je prikazana u SEQ ID NO 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130 ili 131. U drugom otelotvorenju, pronalazak je usmeren na izolovani polinukleotid koji kodira bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom iz pronalaska, pri čemu polinukleotid sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja je prikazana u SEQ ID NO 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169 ili 170. U drugom otelotvorenju, pronalazak je usmeren na izolovani polinukleotid koji kodira bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom iz pronalaska, pri čemu polinukleotid sadrži sekvencu koja kodira sekvencu varijabilnog regiona koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična aminokiselinskoj sekvenci u SEQ ID NO 43, 47 ili 55. Pronalazak obuhvata izolovani polinukleotid koji kodira bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom iz ovog pronalaska, pri čemu polinukleotid sadrži sekvencu koja kodira sekvencu varijabilnog regiona SEQ ID NO 43, 47, ili 55 sa konzervativnim aminokiselinskim supstitucijama.

U drugom otelotvorenju, predmetni pronalazak je usmeren na izolovani polinukleotid koji kodira bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom iz pronalaska, pri čemu polinukleotid sadrži sekvencu koja kodira sekvencu varijabilnog regiona koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična aminokiselinskoj sekvenci u SEQ ID NO 43, 47, 55, 113, 114, 115 ili 116. Pronalazak obuhvata izolovani polinukleotid koji kodira bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom iz pronalaska, pri čemu polinukleotid sadrži sekvencu koja kodira sekvencu varijabilnog regiona SEQ ID NO 43, 47, 55, 113, 114, 115 ili 116 sa konzervativnim aminokiselinskim supstitucijama.

U drugom otelotvorenju, pronalazak je usmeren na izolovani polinukleotid koji kodira bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom iz pronalaska, pri čemu polinukleotid sadrži sekvencu koja kodira sekvencu varijabilnog regiona koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična aminokiselinskoj sekvenci u SEQ ID NO 43, 47, 55, 113, 114, 115, 116, 157, 158, 159, 160 ili 161. Pronalazak obuhvata izolovani polinukleotid koji kodira bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom iz pronalaska, pri čemu polinukleotid sadrži sekvencu koja kodira sekvencu varijabilnog regiona SEQ ID NO 43, 47, 55, 113, 114, 115, 116, 157, 158, 159, 160 ili 161 sa konzervativnim aminokiselinskim supstitucijama.

U određenim otelotvorenjima, polinukleotid ili nukleinska kiselina je DNK. U drugim otelotvorenjima, polinukleotid iz predmetnog pronalaska je RNK, na primer, u obliku informacione RNK (mRNK). RNK iz predmetnog pronalaska može biti jednolančana ili dvolančana.

Otkriće daje samo kao referencu izolovane polinukleotide koji kodiraju polipeptid specifičan za idiotip kao što je ovde opisano. U nekim aspektima, spomenuti fragment je idiotip vezujući, tj. anti-idiotipsko specifično antitelo ili njegov fragment. U jednom aspektu, polipeptid specifičan za idiotip je anti-idiotipski scFv.

Otkriće daje samo kao referencu izolovani polinukleotid koji kodira polipeptid specifičan za idiotip, pri čemu polinukleotid sadrži sekvencu koja kodira polipeptidnu sekvencu jedne ili više od SEQ ID NO 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 48, 49, 50, 51, 52 i 53. Otkriće daje samo kao referencu izolovani polinukleotid koji kodira polipeptid specifičan za idiotip, pri čemu polinukleotid sadrži sekvencu koja kodira polipeptidnu sekvencu jedne ili više od SEQ ID NO 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 48, 49, 50, 51, 52 i 53 sa konzervativnim aminokiselinskim supstitucijama.

Polinukleotidi koji kodiraju polipeptide specifične za idiotip korisni u pronalasku mogu biti eksprimirani kao pojedinačni polinukleotid koji kodira celokupni polipeptid specifičan za idiotip ili kao više (npr. dva ili više) polinukleotida koji su koeksprimirani. Polipeptidi kodirani polinukleotidima koji su koeksprimirani mogu se povezati, na primer, putem disulfidne veze ili drugih sredstava za stvaranje funkcionalnog polipeptida specifičnog za idiotip, npr. maskirajućeg dela. Na primer, u jednom otelotvorenju, polipeptid specifičan za idiotip je antiidiotipski scFv (jednolančani varijabilni fragment) pri čemu varijabilni deo lakog lanca antiidiotipskog scFV može biti kodiran odvojenim polinukleotidom iz dela anti-idiotipskog scFV koji sadrži varijabilni deo teškog lanca anti-idiotipskog scFV. Kada su koeksprimirani, polipeptidi teškog lanca će se povezati sa polipeptidima lakog lanca i formirati anti-idiotipski scFv. U nekim otelotvorenjima, izolovani polinukleotid kodira polipeptid specifičan za idiotip koji je koristan u pronalasku kako je ovde opisano.

Postupci rekombinacije

Bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom iz pronalaska može se dobiti, na primer, sintezom peptida u čvrstom stanju (npr. Merifildova sinteza u čvrstoj fazi) ili rekombinantnom proizvodnjom. Za rekombinantnu proizvodnju, jedan ili više polinukleotida koji kodiraju bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom (fragment), npr. kao što je gore opisano, izoluju se i ubacuju u jedan ili više vektora radi daljeg kloniranja i/ili ekspresije u ćeliji domaćina. Takav polinukleotid može biti lako izolovan i sekvenciran pomoću konvencionalnih procedura. U jednom otelotvorenju, obezbeđen je vektor, poželjno ekspresioni vektor, koji sadrži jedan ili više polinukleotida iz pronalaska. Postupci koji su dobro poznati stručnim licima iz ove oblasti mogu se primeniti za konstrukciju ekspresionih vektora koji sadrže kodirajuću sekvencu bispecifičnog molekula koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom (fragment), uz odgovarajuće transkripcione/translacione kontrolne signale. Ti postupci uključuju in vitro tehnike rekombinantne DNK, sintetičke tehnike i in vivo rekombinaciju/genetsku rekombinaciju. Videti, na primer, tehnike koje su opisali Maniatis et al., M<OLECULAR>C<LONING>: A L<ABORATORY>M<ANUAL>, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989); i Ausubel et al., C<URRENT>P<ROTOCOLS IN>M<OLECULAR>B<IOLOGY>, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y (1989). Ekspresioni vektor može biti deo plazmida, virusa, ili može biti fragment nukleinske kiseline. Ekspresioni vektor uključuje ekspresionu kasetu u koju je kloniran polinukleotid koji kodira bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom (fragment) (tj. kodirajući region) u operabilnoj asocijaciji sa promoterom i/ili drugim elementima kontrole transkripcije ili translacije. U smislu ovog dokumenta, „kodirajući region“ je deo nukleinske kiseline koji se sastoji od kodona translatovanih u aminokiseline. Iako „zaustavni kodon“ (TAG, TGA ili TAA) nije translatovan u aminokiselinu, može se smatrati delom kodirajućeg regiona, ako je prisutan, ali sve ostale granične sekvence, kao što su promoteri, mesta vezivanja ribozoma, terminatori transkripcije, introni, 5' i 3' netranslatovani regioni i slično, nisu deo kodirajućeg regiona. Dva ili više kodirajućih regiona mogu da se nalaze u jednom konstruktu polinukleotida, npr. u jednom vektoru, ili u odvojenim konstruktima polinukleotida, npr. na odvojenim (različitim) vektorima. Pored toga, svaki vektor može da sadrži jedan kodirajući region, ili može da obuhvata dva ili više kodirajućih regiona, npr. vektor iz predmetnog pronalaska može da kodira jedan ili više polipeptida, koji su post- ili kotranslaciono razdvojeni u krajnje proteine putem proteolitičkog cepanja. Pored toga, vektor, polinukleotid ili nukleinska kiselina iz pronalaska mogu kodirati heterologe kodirajuće regione, spojene ili nespojene sa polinukleotidom koji kodira bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom (fragment) iz pronalaska, njegovu varijantu ili njegov derivat. Heterologni kodirajući regioni obuhvataju, bez ograničenja, specijalizovane elemente ili motive, kao što su sekretorni signalni peptid ili heterologni funkcionalni domen. Operabilna asocijacija se dešava kada se kodirajući region za genski proizvod, npr. polipeptid, poveže sa jednom ili više regulatornih sekvenci, tako da postavi ekspresiju genskog proizvoda

1

pod uticaj ili kontrolu regulatorne sekvence (ili sekvenci). Dva DNK fragmenta (kao što je kodirajući region polipeptida i asocirani promoter) „funkcionalno su asocirani“ ako indukcija promoterske funkcije izaziva transkripciju mRNK koja kodira željeni genski proizvod, i ako priroda veze između dva DNK fragmenta ne utiče na sposobnost ekspresije regulatornih sekvenci za usmeravanje ekspresije genskog proizvoda ili na sposobnost transkripcije DNK obrasca. Stoga bi region promotera bio operabilno povezan sa nukleinskom kiselinom koja kodira polipeptid da je promoter sposoban za vršenje transkripcije te nukleinske kiseline. Promoter može da bude ćelijski specifičan promoter koji usmerava značajnu transkripciju DNK samo u predodređenim ćelijama. Drugi elementi koji kontrolišu transkripciju, pored promotera, na primer pojačivači, operatori, represori i signali okončanja transkripcije, mogu operabilno da se povežu sa polinukleotidom radi usmeravanja transkripcije specifične za određene ćelije. Ovde su opisani odgovarajući promoteri i drugi regioni koje kontrolišu transkripciju. Veliki broj regiona koji kontrolišu transkripciju poznat je stručnim licima iz ove oblasti. Ta grupa uključuje, bez ograničenja, regione koji kontrolišu transkripciju, i koji funkcionišu u ćelijama kičmenjaka, kao što su, bez ograničenja, segmenti za promociju i pojačavanje iz citomegalovirusa (npr. momentalni rani promoter u konjukciji sa intronom-A), virusa SV40 (npr. rani promoter) i retrovirusa (takav je, npr. Rausov sarkoma virus). Drugi regioni koji kontrolišu transkripciju obuhvataju one dobijene iz gena kičmenjaka, kao što su aktin, protein toplotnog stresa, goveđi hormon rasta i â-globin zeca, kao i druge sekvence sposobne za kontrolu ekspresije gena u eukariotskim ćelijama. Dodatni odgovarajući regioni koji kontrolišu transkripciju uključuju promotere specifične za tkivo i pojačivače, kao i inducibilne promotere (npr. inducibilni promoteri tetraciklina). Slično tome, veliki broj elemenata koji kontrolišu translaciju poznat je stručnim licima iz ove oblasti. Ta grupa uključuje, bez ograničenja, mesta vezivanja ribozoma, kodone početka i kraja translacije i elemente dobijene iz viralnih sistema (naročito unutrašnje ribozomalno ulazno mesto ili IRES, poznato i kao CITE sekvenca). Transporter ekspresije može da sadrži i druge karakteristike kao što je mesto početka replikacije i/ili elemente integracije hromozoma, kao što su duga terminalna ponavljanja retrovirusa (LTR) ili invertovana terminalna ponavljanja (ITR) adenoasociranih virusa (AAV).

Kodirajući regioni polinukleotida i nukleinske kiseline iz predmetnog pronalaska mogu biti asocirani sa dodatnim kodirajućim regionima koji kodiraju sekretorne ili signalne peptide, koji usmeravaju sekreciju polipeptida kodiranih od strane polinukleotida iz predmetnog pronalaska. Na primer, ako je poželjna sekrecija bispecifičnog molekula koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom, DNK koja kodira signalnu sekvencu može biti postavljena ushodno od nukleinske kiseline koja kodira bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira

2

proteazom iz ovog pronalaska ili njegov fragment. U skladu sa hipotezom signala, proteini koji se luče putem ćelija sisara imaju signalni peptid ili sekretornu vodeću sekvencu koja je isečena iz zrelog proteina nakon što je započet izvoz rastućeg lanca proteina širom endoplazmatičnog retikuluma. Osobe sa uobičajenim znanjem u struci svesne su da polipeptidi izlučeni iz ćelija kičmenjaka imaju signalni peptid vezan za N-kraj polipeptida, koji je isečen iz translatovanog polipeptida radi proizvodnje sekretornog ili „zrelog“ oblika peptida. U određenim otelotvorenjima, nativni signalni peptid, npr. koristi se signalni peptid imunoglobulinskog teškog ili lakog lanca, ili se koristi funkcionalni derivat te sekvence koja zadržava sposobnost usmeravanja izlučivanja polipeptida sa kojim je funkcionalno povezana. Alternativno, može se koristiti heterologni signalni peptid sisara ili njegov funkcionalni derivat. Na primer, vodeća sekvenca divljeg tipa se može supstituisati vodećom sekvencom aktivatora plazminogena u ljudskom tkivu (TPA) ili β-glukuronidaze miša.

DNK koja kodira kratku sekvencu proteina koja bi se mogla koristiti za olakšavanje kasnijeg prečišćavanja (npr. histidinski rep) ili kao pomoć u obeležavanju bispecifičnog molekula koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom, može biti uključena unutar, ili na krajevima polinukleotida koji kodira bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom (fragmenta).

U dodatnom otelotvorenju, obezbeđena je ćelija domaćin koja sadrži jedan polinukleotid iz pronalaska, ili više njih. U određenim otelotvorenjima, obezbeđena je ćelija domaćin koja sadrži jedan vektor iz pronalaska ili više njih. Polinukleotidi i vektori mogu da sadrže bilo koju od karakteristika, pojedinačno ili u kombinaciji, kao što je ovde opisano u vezi sa polinukleotidima odnosno vektorima. U jednom konkretnom otelotvorenju, ćelija domaćin sadrži (npr. prethodno je transformisana ili transficirana njime) vektor koji sadrži polinukleotid koji kodira bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom iz predmetnog pronalaska. Kao što je ovde korišćen, termin „ćelija domaćin“ odnosi se na bilo koji ćelijski sistem koji može biti projektovan da proizvodi bispecifične molekule koji aktiviraju T ćeliju koji se aktiviraju proteazom iz predmetnog pronalaska ili njihove fragmente. Ćelije domaćini pogodne za replikaciju i podržavanje ekspresije bispecifičnog molekula koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom su dobro poznate u struci. Takve ćelije mogu da budu transficirane ili transdukovane u skladu sa određenim ekspresionim vektorom, i velike količine ćelija koje sadrže vektor mogu se uzgajati za zasejavanje velikih fermentora za dobijanje dovoljnih količina bispecifičnog molekula koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom za kliničku primenu. Odgovarajuće ćelije domaćini sadrže prokariotske mikroorganizme, kao što je E. coli ili različite eukariotske ćelije, kao što su jajne ćelije kineskog hrčka (CHO), ćelije insekata i slično. Na primer, polipeptidi se mogu proizvesti u bakterijama, naročito kada nije neophodna glikozilacija. Nakon ekspresije, polipeptid može da se izoluje iz paste bakterijskih ćelija u rastvorljivoj frakciji, a može i dalje da se prečišćava. Osim prokariota, eukariotski mikrobi, kao što su filamentozne gljivice ili kvasci su pogodni domaćini za kloniranje ili ekspresiju vektora koji kodiraju polipeptid, uključujući sojeve gljivica i kvasaca čiji su putevi glikozilacije „humanizovani“, što dovodi do stvaranja polipeptida sa delimično ili potpuno humanim glikozilacionim obrascem. Videti Gerngross, Nat Biotech 22, 1409-1414 (2004), i Li et al, Nat Biotech 24, 210-215 (2006). Pogodne ćelije domaćini za ekspresiju (glikozilovanih) polipeptida se takođe izvode iz višećelijskih organizama (beskičmenjaka i kičmenjaka). Primeri ćelija beskičmenjaka uključuju ćelije biljaka i insekata. Identifikovani su brojni sojevi bakulovirusa koji mogu da se koriste zajedno sa ćelijama insekata, naročito za transfekciju ćelija Spodoptera frugiperda. Kulture biljnih ćelija se takođe mogu koristiti kao domaćini. Pogledajte npr. US Patent br.5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978 i 6,417,429 (gde se opisuje tehnologija PLANTIBODIES™za proizvodnju antitela u transgenim biljkama). Ćelije kičmenjaka se, slično tome, mogu upotrebiti kao domaćini. Na primer, mogu se koristiti ćelijske linije sisara koje su adaptirane za rast u suspenziji. Druge primere korisnih ćelijskih linija domaćina sisara predstavljaju CV1 linija bubrega majmuna transformisana pomoću SV40 (COS-7); humana embrionska linija bubrega (ćelije 293 ili 293T, kao što opisuju npr. Graham et al., J Gen Virol 36, 59 (1977)), ćelije bubrega mladunca hrčka (BHK), Sertolijeve ćelije miša (TM4 ćelije kao što opisuje npr. Mather, Biol Reprod 23, 243-251 (1980)), ćelije bubrega majmuna (CV1), ćelije bubrega afričkog zelenog majmuna (VERO-76), humane ćelije cervikalnog karcinoma (HELA), ćelije bubrega psa (MDCK), ćelije jetre pacova (BRL3A), humane ćelije pluća (W138), humane ćelije jetre (Hep G2), tumorske ćelije mlečne žlezde miša (MMT 060562), TRI ćelije (kao što opisuju npr. Mather et al., Annals N.Y. Acad Sci 383, 44-68 (1982)); MRC5 ćelije i FS4 ćelije. Druge korisne ćelijske linije domaćina sisara predstavljaju jajne ćelije kineskog hrčka (CHO), uključujući dhfr<->CHO ćelije (Urlaub et al., Proc Natl Acad Sci USA77, 4216 (1980)); i ćelijske linije mijeloma, kao što su: YO, NS0, P3X63 i Sp2/0. Za pregled određenih ćelijskih linija domaćina sisara, pogodnih za proizvodnju proteina, vidi, npr., Yazaki i Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, izd., Humana Press, Totowa, NJ), str. 255-268 (2003). Ćelije domaćini obuhvataju gajene ćelije, između ostalog, gajene ćelije sisara, ćelije kvasca, ćelije insekata, bakterijske ćelije i biljne ćelije, ali i ćelije sadržane u transgenim životinjama, transgenim biljkama ili gajenom biljnom ili životinjskom tkivu. U jednom otelotvorenju, ćelija domaćin je eukariotska ćelija, poželjno ćelija sisara, kao što je jajna ćelija kineskog hrčka (CHO), humana embrionska ćelija bubrega

4

(HEK) ili limfoidna ćelija (npr., Y0, NS0, Sp20 ćelija). U struci su poznate standardne tehnologije za ekspresiju stranih gena u ovim sistemima. Ćelije koje eksprimiraju polipeptid koji sadrži teški ili laki lanac antigen vezujućeg domena, kao što je antitelo, mogu se konstruisati tako da takođe eksprimiraju i drugi lanac antitela, tako da je eksprimirani proizvod antitelo koje ima teški i laki lanac.

U jednom otelotvorenju, obezbeđen je postupak za proizvodnju bispecifičnog molekula koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom prema pronalasku, pri čemu ovaj postupak obuhvata uzgajanje ćelije domaćina koja sadrži polinukleotid koji kodira bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom, kako je ovde predviđeno, pod uslovima pogodnim za ekspresiju bispecifičnog molekula koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom, i za izolovanje bispecifičnog molekula koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom iz ćelije domaćina (ili medijuma za uzgajanje ćelija domaćina).

Komponente bispecifičnog molekula koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom genetski su spojene jedna sa drugom. Bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom može biti projektovan tako da se njegove komponente spoje direktno jedna sa drugom, ili indirektno putem sekvence linkera. Kompozicija i dužina linkera se može odrediti u skladu sa postupcima dobro poznatim u struci, i njihova efikasnost se može ispitati. Primeri za sekvence linkera između različitih komponenata bispecifičnog molekula koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom nalaze se u ovde navedenim sekvencama. Dodatne sekvence mogu takođe biti uključene da pripoje mesto cepanja da bi se razdvojile pojedine komponente fuzije ako je potrebno, na primer sekvenca prepoznavanja endopeptidaze.

U određenim otelotvorenjima, jedan ili više antigen-vezujućih delova bispecifičnog molekula koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom obuhvataju najmanje jedan varijabilni region antitela sposoban za vezivanje antigenske determinante. Varijabilni regioni mogu da formiraju deo, ili da budu derivati antitela koja se nalaze ili ne nalaze u prirodi, i njihovi fragmenti. Postupci stvaranja poliklonskih antitela i monoklonskih antitela dobro su poznati u struci (videti, npr. Harlow and Lane, „Antibodies, a laboratory manual“, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). Antitela koja se ne nalaze u prirodi mogu se konstruisati pomoću sinteze peptida na čvrstoj podlozi, mogu se proizvesti rekombinacijom (npr. kao što je opisano u U.S. patentu br.4,186,567) ili se mogu dobiti, na primer, skriningom kombinatornih biblioteka koje sadrže varijabilne teške i lake lance (videti, npr. U.S. Patent. br.5,969,108 McCafferty).

Antitelo, fragment antitela, antigen vezujući domen ili varijabilni region antitela bilo koje životinjske vrste može se koristiti u bispecifičnom molekulu koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom iz ovog pronalaska. Neograničavajuća antitela, fragmenti antitela, antigen vezujući domeni ili varijabilni regioni korisni u ovom pronalasku mogu biti mišjeg, primatskog ili humanog porekla. Ako je bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom namenjen za humanu upotrebu, himerni oblik antitela može da se koristi ako konstantni regioni antitela potiču od čoveka. Humanizovani ili potpuno humani oblik antitela takođe se može dobiti u skladu sa metodama poznatim u struci (videti, npr. U.S. Patent br.

5,565,332, Winter). Humanizacija se može postići različitim metodama, uključujući, bez ograničenja, (a) graftovanje nehumanih (npr. donorskih antitela) CDR u humani (npr. antitelo primalac) okvir i konstantne regione sa zadržavanjem ili bez zadržavanja kritičnih ostataka okvira (npr. onih koji su važni za održavanje dobrog afiniteta za vezivanje antigena ili funkciju antitela), (b) graftovanje samo nehumanih regiona koji određuju specifičnost (SDR ili α-CDR; ostaci ključni za interakciju antitelo-antigen) na humani okvir i konstantne regione, ili (c) transplantacija čitavih nehumanih varijabilnih domena, koji se „prekrivaju“ sekcijom nalik na humanu tako što se zamenjuju površinski ostaci. Humanizovana antitela i postupci njihovog dobijanja razmotreni su npr. u Almagro i Fransson, Front Biosci 13, 1619-1633 (2008), a dodatno su opisani npr. u Riechmann et al., Nature 332, 323-329 (1988); Queen et al., Proc Natl Acad Sci USA 86, 10029-10033 (1989); US Patent br.5,821,337, 7,527,791, 6,982,321 i 7,087,409; Jones et al., Nature 321, 522-525 (1986); Morrison et al., Proc Natl Acad Sci 81, 6851-6855 (1984); Morrison i Oi, Adv Immunol 44, 65-92 (1988); Verhoeyen et al., Science 239, 1534-1536 (1988); Padlan, Molec Immun 31(3), 169-217 (1994); Kashmiri et al., Methods 36, 25-34 (2005) (opis SDR (a-CDR)graftovanja); Padlan, Mol Immunol 28, 489-498 (1991) (opis „vraćanja na površinu“); Dall’Acqua et al., Methods 36, 43-60 (2005) (opis „FR mešanja“); i Osbourn et al., Methods 36, 61-68 (2005) i Klimka et al., Br J Cancer 83, 252-260 (2000) (opis pristupa „usmerene selekcije“ FR mešanju). Humana antitela i humani varijabilni regioni mogu se dobiti primenom različitih tehnika poznatih u struci. Humana antitela načelno su opisana u van Dijk i van de Winkel, Curr Opin Pharmacol 5, 368-74 (2001) i Lonberg, Curr Opin Immunol 20, 450-459 (2008). Humani varijabilni regioni mogu da formiraju deo ili da budu izvedeni iz humanih monoklonskih antitela dobijenih metodom hibridoma (videti npr. Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, str. 51–63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)). Humana antitela i humani varijabilni regioni se mogu dobiti i primenom imunogena na transgenu životinju koja je modifikovana da proizvodi netaknuta humana antitela ili netaknuta antitela sa humanim varijabilnim regionima kao odgovor na antigenski izazov (videti, npr. Lonberg, Nat Biotech 23, 1117–1125 (2005). Humana antitela i humani varijabilni regioni se takođe mogu generisati izolovanjem sekvenci varijabilnog regiona Fv klona izabranih iz biblioteka displeja faga humanog porekla (videti npr., Hoogenboom et al Methods in Molecular Biology 178, 1–37 (O’Brien et al, izdav., Human Press, Totowa, NJ, 2001); i McCafferty et al, Nature 348, 552–554; Clackson et al, Nature 352, 624–628 (1991)). Fagi tipično vrše displej fragmenata antitela, bilo kao jednolančani Fv (scFv) fragmenti ili kao Fab fragmenti.

U određenim otelotvorenjima, antigen vezujući delovi korisni u ovom pronalasku mogu biti konstruisani tako da imaju povećan afinitet vezivanja u skladu sa, na primer, metodama objavljenim u US Pat. Appl. Publ. br.2004/0132066. Sposobnost bispecifičnog molekula koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom iz pronalaska da se veže za specifičnu antigensku determinantu može se meriti pomoću testa sa enzimski vezanim imunosorbentom (ELISA) ili drugih tehnika poznatih u struci, npr. tehnikom površinske plazmonske rezonance (koja se vrši na sistemu BIACORE T100) (Liljeblad, et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)), i tradicionalnim testovima vezivanja (Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)). Kompetitivni testovi se mogu koristiti za identifikovanje antitela, fragmenta antitela, antigen vezujućeg domena ili varijabilnog domena koji se takmiči sa referentnim antitelom u pogledu vezivanja za određeni antigen, npr. antitelo koje se takmiči sa antitelom V9 u vezivanju za CD3. U određenim otelotvorenjima, takvo konkurentsko antitelo se vezuje za isti epitop (npr. linearni ili konformacioni epitop) za koji se vezalo referentno antitelo. Detaljne primere metoda za mapiranje epitopa za koji se vezuje antitelo daje Morris (1996) „Epitope Mapping Protocols“, u Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ). U primeru kompetitivnog testa, imobilisani antigen (npr. CD3) inkubira se u rastvoru koji sadrži prvo obeleženo antitelo koje se vezuje za antigen (npr. antitelo V9, opisano u US 6,054,297) i drugo neobeleženo antitelo, čija se sposobnost takmičenja sa prvim antitelom u pogledu vezivanja za antigen ispituje. Drugo antitelo može da se nalazi u supernatantu hibridoma. Kao kontrola, imobilisani antigen se inkubira u rastvoru koji sadrži prvo obeleženo antitelo, ali ne i drugo neobeleženo antitelo. Nakon inkubacije pod uslovima koji dopuštaju vezivanje prvog antitela za antigen, višak nevezanog antitela se uklanja i meri se količina obeleživača vezanog za imobilisani antigen. Ako je količina obeleživača vezanog za imobilisani antigen u test-uzorku značajno smanjena u odnosu na kontrolni uzorak, to ukazuje da se drugo antitelo takmiči sa prvim antitelom u pogledu vezivanja za antigen. Videti Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual pogl.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).

Bispecifični molekuli koji aktiviraju T ćeliju koji se aktiviraju proteazom pripremljeni kao što je ovde opisano mogu se prečistiti tehnikama poznatim u struci, kao što su tečna hromatografija visokih performansi, jonska hromatografija, gel elektroforeza, afinitetna hromatografija, gel hromatografija, i slično. Stvarni uslovi korišćeni za prečišćavanje određenog proteina delimično će zavisiti od faktora kao što su ukupno naelektrisanje, hidrofobnost, hidrofilnost itd. i biće jasni stručnim licima iz ove oblasti. Za prečišćavanje afinitetnom hromatografijom se može koristiti antitelo, ligand, receptor ili antigen za koji se vezuje bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom. Na primer, za prečišćavanje bispecifičnog molekula koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom iz predmetnog pronalaska afinitetnom hromatografijom može se koristiti matrica sa proteinom A ili proteinom G. Afinitetna hromatografija pomoću sekvencijalnog proteina A ili G i gel hromatografija se mogu koristiti za izolovanje bispecifičnog molekula koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom suštinski kao što je opisano u primerima. Čistoća bispecifičnog molekula koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom može se utvrditi različitim analitičkim metodama poznatim u struci, uključujući gel elektroforezu, tečnu hromatografiju pod visokim pritiskom, i slično. Na primer, dokazano je da je teški lanac fuzionog proteina eksprimiran prema opisu u Primerima netaknut i pravilno povezan, kao što je pokazala redukujuća SDS PAGE (videti npr. Sl. 8-12). Tri trake su razložene na približno Mr 25.000, Mr 50.000 i Mr 75.000, što odgovara predviđenim molekulskim masama lakog lanca, teškog lanca i fuzionog proteina teškog lanca/lakog lanca bispecifičnog molekula koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom.

Testovi

ovde navedeni bispecifični molekuli koji aktiviraju T ćeliju koji se aktiviraju proteazom mogu se identifikovati, pretražiti ili okarakterisati prema fizičkim/hemijskim osobinama i/ili biološkoj aktivnosti, putem različitih testova poznatih u struci.

Testovi za merenje afiniteta

Afinitet bispecifičnog molekula koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom prema Fc receptoru ili ciljnom antigenu se može odrediti prema postupcima koji su navedeni u primerima pomoću površinske plazmonske rezonance (SPR), koristeći standardne instrumente kao što je instrument BIAcore (GE Healthcare), i receptore ili ciljne proteine, kakve je moguće dobiti rekombinantnom ekspresijom. Alternativno, vezivanje bispecifičnog molekula koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom za različite receptore ili ciljne antigene može se proceniti korišćenjem ćelijskih linija koje eksprimiraju određeni receptor ili ciljni antigen, na primer, putem protočne citometrije (FACS). Specifično ilustrativan i egzemplaran primer otelotvorenja za merenje vezivnog afiniteta nalazi se u daljem tekstu i u Primerima.

Prema jednom otelotvorenju, Kdje meren površinskom plazmonskom rezonancom pomoću uređaja BIACORE® T100 (GE Healthcare) na 25°C.

Da bi se analizirala interakcija između Fc dela i Fc receptora, His-označeni rekombinantni Fc receptor je uhvaćen anti-Penta His antitelom (Qiagen) imobilisanim na CM5 čipovima, i bispecifični konstrukti se koriste kao analiti. Ukratko, biosenzorski čipovi sa karboksimetilovanim dekstranom (CM5, GE Healthcare) aktiviraju se pomoću N-etil-N’-(3-dimetilaminopropil)-karbodiimid hidrohlorida (EDC) i N-hidroksisukcinimida (NHS) prema uputstvu dobavljača. Anti Penta-His antitelo je razblaženo 10 mM natrijum acetatom, pH 5,0, do 40 μg/ml pre injektovanja pri protoku od 5 μl/minut, da se dobije oko 6500 jedinica odgovora (RU) kuplovanog proteina. Nakon injektovanja liganda, 1 M etanolamin se injektuje da bi blokirao neizreagovale grupe. Nakon toga se Fc receptor hvata tokom 60 s pri 4 ili 10 nM. Za kinetička merenja, četvorostruka serijska razblaženja bispecifičnog konstrukta (raspon od 500 nM do 4000 nM) injektuju se u HBS-EP (GE Healthcare, 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0,05% surfaktant P20, pH 7,4) na 25 °C pri protoku od oko 30 μl/min tokom 120 s.

Da bi se odredio afinitet prema ciljnom antigenu, bispecifični konstrukti su uhvaćeni anti-humanim Fab specifičnim antitelom (GE Healthcare) koje je imobilisano na aktiviranoj površini CM5-senzorskoj čipa, kako je opisano za anti Penta-His antitelo. Konačna količina vezanog proteina je oko 12.000 RU. Bispecifični konstrukti se hvataju tokom 90 s na 300 nM. Ciljni antigeni se propuštaju kroz protočne ćelije tokom 180 s u rasponu koncentracija od 250 do 1000 nM, uz protok od 30 µl/min. Disocijacija se prati tokom 180 s.

Ukupne razlike indeksa prelamanja su korigovane oduzimanjem odgovora dobijenog na referentnoj protočnoj ćeliji. Odgovor stacionarnog stanja korišćen je da bi se dobila konstanta disocijacije KDnelinearnim uklapanjem krive Lengmirove izoterme vezivanja. Brzina asocijacije (kon) i brzina disocijacije (koff) su izračunate pomoću jednostavnog jedanna-jedan Lengmirovog modela vezivanja (BIACORE® T100 Evaluation Software verzija 1.1.1) simultanim podešavanjem senzorgrama asocijacije i disocijacije. Ravnotežna konstanta disocijacije (KD) izračunata je kao odnos koff/kon. Videti, npr. Chen et al. J. Mol. Biol.293:865-881 (1999).

Testovi za merenje aktivnosti

Biološka aktivnost bispecifičnog molekula koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom iz ovog pronalaska može se meriti različitim testovima, kao što je opisano u Primerima. Biološka aktivnost može, na primer, uključivati indukciju proliferacije T ćelija, indukciju signalizacije u T ćelijama, indukciju ekspresije aktivacionih markera u T ćelijama, indukciju sekrecije citokina pomoću T ćelija, indukciju lize ciljnih ćelija kao što su tumorske ćelije, i indukciju regresije tumora i/ili poboljšanje preživljavanja.

Kompozicije, formulacije i načini primene

U daljem aspektu, pronalazak daje farmaceutske kompozicije koje sadrže bilo koji od ovde datih bispecifičnih molekula koji aktiviraju T ćeliju koji se aktiviraju proteazom, npr. za upotrebu u bilo kom od donjih terapeutskih postupaka. U jednom otelotvorenju, farmaceutska kompozicija uključuje bilo koji od ovde datih bispecifičnih molekula koji aktiviraju T ćeliju koji se aktiviraju proteazom i farmaceutski prihvatljiv nosač. U drugom otelotvorenju, farmaceutska kompozicija uključuje bilo koji od ovde datih bispecifičnih molekula koji aktiviraju T ćeliju koji se aktiviraju proteazom i najmanje jedno dodatno terapeutsko sredstvo, npr. kao što je dole opisano.

Dalje, obezbeđen je postupak za proizvodnju bispecifičnog molekula koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom iz ovog pronalaska u obliku pogodnom za davanje in vivo, pri čemu postupak obuhvata (a) dobijanje bispecifičnog molekula koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom prema pronalasku, i (b) formulisanje bispecifičnog molekula koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom sa najmanje jednim farmaceutski prihvatljivim nosačem, pri čemu je preparat bispecifičnog molekula koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom formulisan za davanje in vivo.

Farmaceutske kompozicije iz predmetnog pronalaska sadrže terapeutski efektivnu količinu jednog ili više bispecifičnih molekula koji aktiviraju T ćeliju koji se aktiviraju proteazom rastvorenih ili dispergovanih u farmaceutski prihvatljivom nosaču. Fraze „farmaceutski ili farmakološki prihvatljivo“ odnose se na molekulske entitete i kompozicije koje su uglavnom netoksične za primaoce u primenjenim dozama i koncentracijama, tj. ne dovode do neželjenih, alergijskih i drugih nepovoljnih reakcija kada se primene na životinjama ili ljudima, po potrebi. Preparat farmaceutske kompozicije koji sadrži najmanje jedan bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom i, po potrebi, dodatni aktivni sastojak, biće poznat stručnjacima u ovoj oblasti u smislu predmetnog pronalaska, kao što je objašnjeno u Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. izd. Mack Printing Company, 1990. Pored toga, za primenu na životinjama (npr. ljudima), podrazumevaće se da preparati treba da ispune standarde sterilnosti, pirogenosti, opšte bezbednosti i čistoće u skladu sa zahtevima FDA Kancelarije za biološke standarde ili odgovarajućeg autoriteta u drugim zemljama. Poželjne kompozicije su liofilizovane formulacije ili vodeni rastvori. Kako se ovde koristi, termin „farmaceutski prihvatljiv nosač“ podrazumeva sve rastvarače, pufere, disperzione medijume, obloge, surfaktante, antioksidanse, konzervanse (npr. antibakterijske agense, antifungalne agense), izotonične agense, agense za odlaganje apsorpcije, soli, konzervanse, antioksidanse, proteine, lekove, stabilizatore lekova, polimere, gelove, veziva, ekscipijense, dezintegratore, lubrikante, zaslađivače, arome, boje, slične supstance i njihove

1

kombinacije, kao što je poznato stručnjacima u ovoj oblasti (videti, na primer, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. izd. Mack Printing Company, 1990, str. 1289-1329). Osim ako se ne ukaže da je neki od konvencionalnih nosača nekompatibilan sa aktivnim sastojkom, njegova upotreba u terapeutskim ili farmaceutskim kompozicijama je razmotrena.

Ova kompozicija može da sadrži različite vrste nosača u zavisnosti od toga da li treba da se primeni u čvrstom, tečnom ili u obliku aerosola i da li je potrebno da budu sterilni za takvu vrstu primene u obliku injekcije. Bispecifični molekuli koji aktiviraju T ćeliju koji se aktivira proteazom iz predmetnog pronalaska (i sva dodatna lekovita sredstva) mogu se primenjivati intravenski, intradermalno, intraarterijski, intraperitonealno, intraleziono, intrakranijalno, intraartikularno, intraprostatički, intraslezinski, intrarenalno, intrapleuralno, intratrahealno, intranazalno, intravitrealno, intravaginalno, intrarektalno, intratumoralno, intramuskularno, intraperitonealno, supkutano, supkonjuktivalno, intravezikularno, mukozalno, intraperikardijalno, intraumbilikalno, intraokularno, oralno, topički, lokalno, inhalacijom (npr. inhalacija aerosola), injekcijama, infuzijom, koninualnom infuzijom, lokalizovanom perfuzijom ciljanih ćelija direktno putem katetera, ispiranja, u kremama, lipidnim kompozicijama (npr. lipozomima) ili drugim postupkom ili kombinacijom prethodno navedenog, kao što je poznato stručnjacima iz ove oblasti (videti, na primer, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990). Parenteralna primena, posebno intravenska injekcija, najčešće se koristi za primenu molekula polipeptida, kao što je bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom iz predmetnog pronalaska.

Parenteralne kompozicije obuhvataju one namenjene primeni putem injekcija, npr. supkutano, intradermalno, intraleziono, intravenski, intraarterijski, intramuskularno, intratekalno ili intraperitonealno ubrizgavanje. Za injekciju, bispecifični molekuli koji aktiviraju T ćeliju koji se aktiviraju proteazom iz pronalaska mogu biti formulisani u vodenim rastvorima, poželjno u fiziološki kompatibilnim puferima, kao što je Henksov rastvor, Ringerov rastvor ili puferisani fiziološki rastvor. Rastvor može da sadrži agense za formulisanje, kao što su agensi za suspendovanje, stabilizaciju i/ili dispergovanje. Alternativno, bispecifični molekuli koji aktiviraju T ćeliju koji se aktiviraju proteazom mogu da budu u obliku praha za mešanje sa odgovarajućim nosačem, npr. sterilnom nepirogenom vodom, pre upotrebe. Sterilni rastvori za ubrizgavanje pripremljeni su mešanjem bispecifičnih molekula koji aktiviraju T ćeliju koji se aktiviraju proteazom iz pronalaska u potrebnoj količini u odgovarajućem rastvoru sa različitim drugim dolenavedenim sastojcima, po potrebi. Sterilnost se može lako postići, npr. filtracijom kroz sterilne filtracione membrane. Uglavnom, disperzije se pripremaju mešanjem različitih sterilnih aktivnih sastojaka u sterilnom nosaču

1 1

koji sadrži osnovni disperzioni medijum i/ili druge sastojke. U slučaju sterilnog praha za pripremu sterilnih rastvora za injekcije, suspenzija ili emulzija, poželjni postupak pripreme je vakuum sušenje ili liofilizacija, kojima se dobija prah aktivnog sastojka, kao i ostalih poželjnih sastojaka iz prethodno sterilno filtriranog tečnog medijuma. Tečni medijum treba da bude odgovarajuće puferovan, ako je potrebno, a tečni diluent izotoničan pre ubrizgavanja sa odgovarajućom količinom soli ili glukoze. Kompozicija treba da bude stabilna u uslovima stvaranja i čuvanja, izolovana od kontaminirajućeg uticaja mikroorganizama, kao što su bakterije i gljivice. Poželjno je da kontaminacija endotoksinom bude svedena na minimalni bezbedni nivo, na primer, manje od 0,5 ng/mg proteina. Odgovarajući farmaceutski prihvatljivi nosači uključuju, bez ograničenja: pufere, kao što je fosfatni, citratni i puferi drugih organskih kiselina; antioksidanse, uključujući askorbinsku kiselinu i metionin; konzervanse (kao što je oktadecildimetilbenzil amonijum hlorid; heksametonijum hlorid; benzalkonijum hlorid, benzetonijum hlorid; fenol, butil alkohol ili benzil alkohol; alkil parabene, kao što je metil paraben ili propil paraben; katehol; rezorcinol; cikloheksanol; 3-pentanol; i m-krezol); polipeptide male molekulske mase (manje od oko 10 ostataka); proteine, kao što je albumin iz seruma, želatin ili imunoglobulini; hidrofilne polimere, kao što je polivinil pirolidon; aminokiseline, kao što je glicin, glutamin, asparagin, histidin, arginin ili lizin; monosaharide, disaharide i druge ugljene hidrate, uključujući glukozu, manozu ili dekstrine; helatne agense, kao što je EDTA; šećere, kao što je saharoza, manitol, trehaloza ili sorbitol; kontrajone koji grade soli, kao što je natrijum; metalne komplekse (npr. kompleksi Zn-protein); i/ili nejonske surfaktante, kao što je polietilen glikol (PEG). Suspenzije za vodene injekcije mogu da sadrže jedinjenja koja povećavaju viskozitet suspenzije, kao što su natrijum karboksimetil celuloza, sorbitol, dekstran, i slično. Po potrebi, suspenzija može da sadrži i odgovarajuće stabilizatore ili agense koji povećavaju rastvorljivost jedinjenja i omogućavaju pripremu visoko koncentrovanih rastvora. Takođe, suspenzije aktivnih sastojaka mogu se pripremiti u obliku odgovarajućih injekcija uljane suspenzije. Odgovarajući lipofilni rastvarači ili vehikulumi obuhvataju masna ulja, kao što je susamovo ulje, ili sintetičke estre masnih kiselina, kao što su etil oleati ili trigliceridi ili lipozomi.

Aktivni sastojci mogu biti zarobljeni u pripremljenim mikrokapsulama, na primer, tehnikom koacervacije ili interfacijalne polimerizacije, na primer, hidroksimetilceluloze, odnosno želatinskih mikrokapsula, odnosno poli-(metilmetakrilat) mikrokapsula, u koloidnim sistemima za isporuku lekova (na primer, lipozomi, albuminske mikrosfere, mikroemulzije, nanočestice i nanokapsule) ili u makroemulzijama. Takve tehnike su prikazane u Remington's Pharmaceutical Sciences (18. izd. Mack Printing Company, 1990). Mogu se pripremiti

1 2

preparati sa produženim oslobađanjem. Pogodni primeri preparata sa produženim oslobađanjem obuhvataju semipermeabilne matrice čvrstih hidrofobnih polimera koje sadrže polipeptid, pri čemu su matrice uobličeni proizvodi, npr. film ili mikrokapsule. U posebnom primeru otelotvorenja, prolongirana apsorpcija kompozicije za ubrizgavanje može se izazvati upotrebom u kompozicijama agensa za odlaganje apsorpcije, kao što su aluminijum monostearat, želatin, ili njihove kombinacije.

Pored prethodno opisanih preparata, bispecifični molekuli koji aktiviraju T ćeliju koji se aktiviraju proteazom se mogu formulisati i kao depo preparat. Takve dugo delujuće formulacije mogu se primeniti implantacijom (na primer, supkutano ili intramuskularno) ili intramuskularnom injekcijom. Stoga, na primer, bispecifični molekuli koji aktiviraju T ćeliju koji se aktiviraju proteazom se mogu formulisati sa odgovarajućim polimernim ili hidrofobnim materijalima (na primer, kao emulzija u odgovarajućem ulju), jonoizmenjivačkim smolama ili slabo rastvorljivim derivatima, na primer, kao slabo rastvorljiva so.

Farmaceutski preparati koji sadrže bispecifične molekule koji aktiviraju T ćeliju koji se aktiviraju proteazom iz predmetnog pronalaska mogu se proizvesti pomoću konvencionalnih postupaka mešanja, rastvaranja, emulgovanja, inkapsuliranja ili liofilizacije. Farmaceutski preparati mogu biti formulisani na konvencionalni način pomoću jednog ili više fiziološki prihvatljivih nosača, diluenata, ekscipijenasa ili dodatnih sredstava koja olakšavaju obradu proteina u preparate koji se mogu koristiti u farmaceutske svrhe. Pravilna formulacija zavisi od izabranog načina primene.

Bispecifični molekuli koji aktiviraju T ćeliju koji se aktiviraju proteazom se mogu formulisati u kompoziciju u obliku slobodne kiseline ili baze, u neutralnom obliku ili u obliku soli. Farmaceutski prihvatljive soli su soli koje zadržavaju značajnu biološku aktivnost slobodne kiseline ili baze. U njih spadaju kisele adicione soli, npr. one formirane sa slobodnim amino grupama proteinske kompozicije ili one formirane sa neorganskom kiselinom kao što je, na primer, hlorovodonična ili fosforna kiselina, ili organskim kiselinama poput sirćetne, oksalne, vinske ili bademove kiseline. Soli formirane sa slobodnim karboksilnim grupama mogu se dobiti iz neorganskih baza, kao što su: natrijum, kalijum, amonijum, kalcijum ili gvožđe hidroksid, ili organskih baza, kao što je izopropilamin, trimetilamin, histidin ili prokain. Farmaceutske soli su uglavnom rastvorljivije u vodi i drugim protičnim rastvaračima od odgovarajućih oblika slobodnih baza.

Postupci lečenja i preparati

Bilo koji od bispecifičnih molekula koji aktiviraju T ćeliju koji se aktiviraju proteazom koji su ovde navedene mogu se koristiti u terapijskim metodama. Bispecifični molekuli koji

1

aktiviraju T ćeliju koji se aktiviraju proteazom iz ovog pronalaska mogu se koristiti kao imunoterapijska sredstva, na primer u lečenju kancera.

Za upotrebu u terapeutskim postupcima, bispecifični molekuli koji aktiviraju T ćeliju koji se aktiviraju proteazom iz predmetnog pronalaska formulišu se, doziraju i primenjuju na način u skladu sa dobrom medicinskom praksom. U ovom kontekstu se mogu razmatrati faktori kao što su konkretni poremećaj koji se leči, konkretni sisar koji se leči, kliničko stanje pojedinačnog pacijenta, uzrok poremećaja, mesto isporuke agensa, postupak primene, raspored primene, i drugi faktori poznati lekarima.

U jednom aspektu, obezbeđeni su bispecifični molekuli koji aktiviraju T ćeliju koji se aktiviraju proteazom iz ovog pronalaska za upotrebu kao lek. U daljim aspektima, obezbeđeni su bispecifični molekuli koji aktiviraju T ćeliju koji se aktiviraju proteazom iz pronalaska za upotrebu u lečenju bolesti. U određenim otelotvorenjima, obezbeđeni su bispecifični molekuli koji aktiviraju T ćeliju koji se aktiviraju proteazom iz pronalaska za upotrebu u postupku lečenja. U jednom otelotvorenju, pronalazak takođe obezbeđuje bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom kao što je ovde opisano, za upotrebu u lečenju bolesti kod pojedinca kome je to potrebno. U određenim otelotvorenjima, pronalazak obezbeđuje bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom za upotrebu u postupku lečenja pojedinca koji ima bolest, koji se sastoji od davanja pojedincu terapeutski efikasne količine bispecifičnog molekula koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom, pri čemu je bolest kancer. U određenim otelotvorenjima, bolest koja se leči je proliferativni poremećaj. U konkretnom otelotvorenju bolest je kancer. U određenim otelotvorenjima, postupak se dalje sastoji od primene terapeutski efikasne količine najmanje jednog dodatnog terapeutskog agensa, npr. antikancerogenog agensa, ako je lečena bolest kancer. U daljim otelotvorenjima, ovaj pronalazak obezbeđuje bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom, kako je ovde opisano, za upotrebu u indukciji lize ciljne ćelije, posebno ćelije tumora. U određenim otelotvorenjima, ovaj pronalazak obezbeđuje bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom za upotrebu u postupku za indukciju lize ciljne ćelije, posebno ćelije tumora, kod pojedinca, koji se sastoji od davanja pojedincu efektivne količine bispecifičnog molekula koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom, da izazove lizu ciljne ćelije. Prema svim gorenavedenim otelotvorenjima „pojedinac“ je sisar, poželjno čovek.

U daljem aspektu, pronalazak obezbeđuje upotrebu bispecifičnog molekula koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom prema pronalasku u proizvodnji ili pripremi medikamenta. U jednom otelotvorenju, medikament je za lečenje bolesti kod pojedinca kome je to potrebno.

1 4

U daljem otelotvorenju, lek je za upotrebu u postupku lečenja bolesti koji uključuje davanje pojedincu koji ima bolest terapeutski efikasne količine leka. U određenim otelotvorenjima, bolest koja se leči je proliferativni poremećaj. U konkretnom otelotvorenju bolest je kancer. U jednom otelotvorenju, postupak se dalje sastoji od davanja pojedincu terapeutski efikasne količine najmanje jednog dodatnog terapeutskog agensa, npr. antikancerogenog agensa, ako je lečena bolest kancer. U daljem otelotvorenju, lek služi za indukciju lize ciljne ćelije, posebno ćelije tumora. Prema svim gorenavedenim otelotvorenjima, „pojedinac“ može da bude sisar, poželjno čovek. U daljem aspektu, pronalazak obezbeđuje postupak za lečenje bolesti. U jednom otelotvorenju, metod se sastoji od davanja pojedincu koji ima takvu bolest terapeutski efektivne količine bispecifičnog molekula koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom iz pronalaska. U jednom otelotvorenju, kompozicija se daje pomenutom pojedincu, koja sadrži ovde opisani bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom u farmaceutski prihvatljivom obliku. U određenim otelotvorenjima, bolest koja se leči je proliferativni poremećaj. U konkretnom otelotvorenju bolest je kancer. U određenim otelotvorenjima, postupak se dalje sastoji od primene terapeutski efikasne količine najmanje jednog dodatnog terapeutskog agensa, npr. antikancerogenog agensa, ako je lečena bolest kancer. Prema svim gorenavedenim otelotvorenjima, „pojedinac“ može da bude sisar, poželjno čovek. U jednom otelotvorenju, „pojedinac“ je čovek.

U određenimrealizacijama, bolest koja se leči je proliferativni poremećaj, konkretno kancer. Neograničavajući primeri kancera uključuju kancer bešike, mozga, glave i vrata, pankreasa, pluća, dojke, jajnika, materice, grlića materice, endometrijalni kancer, kancer jednjaka, debelog creva, kolorektalni kancer, rektalni kancer, kancer želuca, kancer prostate, krvi, kože, karcinom skvamoznih ćelija, kancer kostiju i kancer bubrega. Ostali poremećaji proliferacije ćelija koji se mogu lečiti pomoću bispecifičnog molekula koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom iz predmetnog pronalaska uključuju, bez ograničenja, neoplazme locirane u: stomaku, kostima, dojkama, digestivnom sistemu, jetri, pankreasu, peritoneumu, endokrinim žlezdama (adrenalinskoj, paratiroidnoj, hipofizi, testisima, jajnicima, grudnoj, tiroidnoj žlezdi), očima, glavi i vratu, nervnom sistemu (centralnom i perifernom), limfnom sistemu, karlici, koži, mekom tkivu, slezini, grudnom košu i urogenitalnom sistemu. Obuhvaćena su i pretkancerozna stanja ili lezije i metastaze kancera. U određenim otelotvorenjima, kancer je izabran iz grupe koja obuhvata kancer renalnih ćelija, kancer kože, kancer pluća, kolorektalni kancer, kancer dojke, kancer mozga, kancer glave i vrata. Obučeni stručnjak zna da u mnogim slučajevima bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom možda neće obezbediti lek, već samo delimično olakšanje. U nekim

1

otelotvorenjima, fiziološka promena koja ima određene koristi takođe se smatra terapeutski korisnom. Stoga, u nekim otelotvorenjima, količina bispecifičnog molekula koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom koja obezbeđuje fiziološku promenu smatra se „delotvornom količinom“ ili „terapeutski delotvornom količinom“. Ispitanik, pacijent ili pojedinac kome treba lečenje tipično je sisar, konkretnije čovek.

U nekim otelotvorenjima, efikasna količina bispecifičnog molekula koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom iz pronalaska daje se ćeliji. U drugim otelotvorenjima, terapeutski delotvorna količina bispecifičnog molekula koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom iz pronalaska se primenjuje na pojedinca radi lečenja bolesti.

Za prevenciju ili lečenje bolesti, odgovarajuća doza bispecifičnog molekula koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom iz pronalaska (kada se koristi sam ili u kombinaciji sa jednim terapeutskim agensom, ili više drugih dodatnih terapeutskih agenasa) zavisiće od vrste bolesti koja se leči, načina primene, telesne težine pacijenta, vrste bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije, težine i toka bolesti, bilo da se bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije primenjuje u preventivne ili terapeutske svrhe, kao i od prethodne ili istovremene terapije, kliničke istorije pacijenta i njegovog odgovora na bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom, i odluke nadležnog lekara. Lekar zadužen za primenu, u svakom slučaju, određuje koncentraciju aktivnog sastojka (sastojaka) u kompoziciji i odgovarajuću dozu za svakog ispitanika. Ovde su razmatrani različiti rasporedi doziranja uključujući, bez ograničenja, pojedinačnu ili višestruku primenu u različitim terminima, bolusnu primenu i pulsnu infuziju.

Bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom je pogodan za primenu na pacijentu jednokratno, ili u seriji terapija. U zavisnosti od vrste i težine bolesti, oko 1 µg/kg do 15 mg/kg (npr., 0,1 mg/kg – 10 mg/kg) bispecifičnog molekula koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom može biti kandidat za početnu dozu za primenu na pacijentu, na primer, bilo kao jedna ili više odvojenih primena, ili kao kontinualna infuzija. Jedna tipična dnevna doza se može kretati u opsegu od oko 1 µg/kg do 100 mg/kg ili više, u zavisnosti od gorepomenutih faktora. Kod ponovljene primene u trajanju od nekoliko dana ili duže, u zavisnosti od stanja, lečenje će po pravilu biti nastavljeno sve do željenog suzbijanja simptoma bolesti. Jedan primer doze bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije bio bi u opsegu od oko 0,005 mg/kg do oko 10 mg/kg. U drugim primerima bez ograničenja, doza može da obuhvati od približno 1 mikrogram/kg telesne težine, približno 5 mikrograma/kg telesne težine, približno 10 mikrograma/kg telesne težine, približno 50 mikrograma/kg telesne težine, približno 100 mikrograma/kg telesne težine, približno 200 mikrograma/kg telesne

1

težine, približno 350 mikrograma/kg telesne težine, približno 500 mikrograma/kg telesne težine, približno 1 milligram/kg telesne težine, približno 5 milligrama/kg telesne težine, približno 10 milligrama/kg telesne težine, približno 50 milligrama/kg telesne težine, približno 100 milligrama/kg telesne težine, približno 200 milligrama/kg telesne težine, približno 350 milligrama/kg telesne težine, približno 500 milligrama/kg telesne težine, do približno 1000 mg/kg telesne težine ili više po primeni, i svaki opseg koji se dobija iz toga. U primerima bez ograničenja raspona dobijenog iz ovde navedenih brojeva, može se primenjivati, na osnovu gore opisanih brojeva, raspon od približno 5 mg/kg telesne težine do približno 100 mg/kg telesne težine, približno 5 mikrograma/kg telesne težine do približno 500 miligrama/kg telesne težine, itd. Stoga se jedna ili više doza od oko 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 5,0 mg/kg ili 10 mg/kg (ili bilo koja njihova kombinacija) može dati pacijentu. Takve doze mogu da se primenjuju povremeno, npr. svake nedelje ili svake tri nedelje (npr. tako da pacijent primi od približno dve do približno dvadeset ili npr. približno šest doza bispecifičnog molekula koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom). Može se primeniti veća početna doza, a nakon toga jedna ili više manjih doza. Međutim, mogu biti korisni i drugi dozni režimi. Napredak ove terapije jednostavno se prati klasičnim tehnikama i testovima.

Bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom iz ovog pronalaska će se generalno koristiti u količini efektivnoj za postizanje željene svrhe. Za lečenje ili prevenciju stanja bolesti, bispecifični molekuli koji aktiviraju T ćeliju koji se aktiviraju proteazom iz pronalaska, ili njihove farmaceutske kompozicije, daju se ili primenjuju u terapeutski delotvornim količinama. Određivanje terapeutski delotvorne količine poznato je stručnim licima iz ove oblasti, naročito u smislu ovog detaljnog obrazloženja.

U pogledu sistemske primene, terapeutski efikasna doza se može inicijalno proceniti putem in vitro testova, kao što su testovi kulture ćelija. Zatim doza može biti formulisana prema životinjskom modelu kako bi se dostigao raspon koncentracija u krvotoku koji uključuje IC50, kao što je utvrđeno kulturom ćelija. Takve informacije mogu da se koriste za preciznije utvrđivanje korisnih doza za ljude.

Inicijalne doze takođe mogu da se procene na osnovu in vivo podataka, npr. životinjskih modela, koristeći tehnike koje su dobro poznate u struci. Lice standardne stručnosti iz ove oblasti može brzo da optimizuje davanje leka ljudima na osnovu podataka o životinjama.

Doza i interval primene se mogu pojedinačno podesiti kako bi se obezbedili nivoi bispecifičnih molekula koji aktiviraju T ćeliju koji se aktiviraju proteazom u plazmi koji su dovoljni za održavanje terapeutskog dejstva. Uobičajena doza za primenu na pacijentima putem injekcija ima raspon od oko 0,1 mg/kg/dan do 50 mg/kg/dan, tipično od oko 0,5

1

mg/kg/dan do 1 mg/kg/dan. Terapeutski delotvorni nivoi u plazmi se mogu dostići primenom višestrukih doza svakog dana. Nivoi u plazmi se mogu meriti, na primer, HPLC hromatografijom.

U slučajevima lokalne primene ili selektivnog unosa, delotvorna lokalna koncentracija bispecifičnih molekula koji aktiviraju T ćeliju koji se aktiviraju proteazom ne mora da bude u vezi sa koncentracijom u plazmi. Stručnjaci u ovoj oblasti mogu da optimizuju terapeutski efikasnu lokalnu dozu bez nepotrebnog eksperimentisanja.

Terapeutski delotvorna doza ovde opisanih bispecifičnih molekula koji aktiviraju T ćeliju koji se aktiviraju proteazom uopšteno obezbeđuje terapeutsku korist bez izazivanja značajne toksičnosti. Toksičnost i terapeutska efikasnost bispecifičnog molekula koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom mogu se odrediti standardnim farmaceutskim procedurama u ćelijskoj kulturi ili na eksperimentalnim životinjama. Testovi u kulturi ćelija i studije na životinjama mogu se koristiti za utvrđivanje LD50(doza koja je smrtonosna za 50% populacije) i ED50(doza terapeutski delotvorna za 50% populacije). Odnos toksičnih i terapeutskih dejstava doze predstavlja terapeutski indeks, koji se može izraziti kao odnos LD50/ED50. Poželjni su bispecifični molekuli koji aktiviraju T ćeliju koji se aktiviraju proteazom koji pokazuju veliki terapeutski indeks. U jednom otelotvorenju, bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom prema predmetnom pronalasku pokazuje visok terapeutski indeks. Podaci dobijeni iz testova kulture ćelija i studija na životinjama mogu se koristiti za formulisanje raspona doza pogodnih za ljudsku upotrebu. Poželjno je da se doza nalazi u rasponu koncentracija u krvotoku koji uključuje ED50sa malom količinom ili bez toksičnosti. Doza može da varira u okviru raspona u zavisnosti od različitih faktora, npr. primenjeni oblik doze, način primene, stanje ispitanika, i slično. Tačnu formulaciju, način primene i dozu može izabrati lekar nakon uvida u stanje pacijenta (videti, npr., Fingl et al., 1975, u: The Pharmacological Basis of Therapeutics, gl.1, str.1).

Lekar zadužen za pacijente koji se leče bispecifičnim molekulima koji aktiviraju T ćeliju koji se aktiviraju proteazom iz pronalaska zna kada i kako treba da okonča, prekine ili podesi primenu zbog toksičnosti, nepravilnog rada organa, i slično. Sa druge strane, lekar zna i da podesi lečenje na viši nivo, ako klinički odgovor nije adekvatan (isključujući toksičnost). Jačina primenjene doze radi kontrole bolesti menjaće se u skladu sa ozbiljnošću stanja koje se leči, načina primene, i slično. Ozbiljnost bolesti može se, na primer, oceniti standardnim postupcima prognostičke evaluacije. Takođe, doza i možda učestalost doze takođe će se menjati u zavisnosti od godina, telesne težine i odgovora pojedinačnih pacijenata.

Ostali agensi i tretmani

1

Bispecifični molekuli koji aktiviraju T ćeliju koji se aktiviraju proteazom iz predmetnog pronalaska mogu se primenjivati u kombinaciji sa jednim agensom ili više agenasa tokom terapije. Na primer, bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom iz predmetnog pronalaska može biti primenjen uz barem jedan dodatni terapeutski agens. Termin „terapeutski agens“ obuhvata sve agense za lečenje simptoma ili bolesti pojedinca kome treba lečenje. Takvi dodatni terapeutski agensi takođe mogu da sadrže bilo koji aktivni sastojak pogodan za određene indikacije koje se leče, poželjno one sa komplementarnim aktivnostima koje ne utiču negativno jedna na drugu. U određenim otelotvorenjima, dodatni terapeutski agens je imunomodulatorski agens, citostatički agens, inhibitor ćelijske adhezije, citotoksični agens, aktivator ćelijske apoptoze ili agens koji povećava osetljivost ćelija na apoptičke induktore. U posebnom otelotvorenju, dodatni terapeutski agens je antikancerogeni agens, na primer, uništavač mikrotubula, antimetabolit, inhibitor topoizomeraze, DNK interkalator, alkilujući agens, hormonska terapija, inhibitor kinaze, antagonist receptora, aktivator apoptoze tumorske ćelije ili antiangiogenski agens.

Takvi drugi agensi su pogodno prisutni u kombinaciji u količinama koje su efikasne za nameravane svrhe. Efikasna količina takvih drugih agenasa zavisi od količine bispecifičnog molekula koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom koji se koristi, vrste poremećaja ili lečenja, kao i drugih faktora koji su razmatrani u gornjem tekstu. Bispecifični molekuli koji aktiviraju T ćeliju koji se aktiviraju proteazom se generalno koriste u istim dozama i sa istim načinom primene kao što je gore opisano, ili od oko 1% do 99% doza koje su ovde opisane, ili u bilo kojoj dozi i sa bilo kojim načinom primene za koje je empirijski/klinički dokazano da su odgovarajući.

Takve kombinovane terapije koje su pomenute obuhvataju kombinovanu primenu (gde su dva ili više terapeutskih agenasa uključeni u istu kompoziciju ili u različite kompozicije) i odvojenu primenu, što znači da primena bispecifičnog molekula koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom iz predmetnog pronalaska može da se odigra pre primene dodatnog terapeutskog agensa i/ili adjuvansa, istovremeno sa njim i/ili nakon njegove primene. Bispecifični molekuli koji aktiviraju T ćeliju koji se aktiviraju proteazom iz ovog pronalaska mogu se takođe koristiti u kombinaciji sa zračenjem.

Proizvodi

U drugom aspektu pronalaska, obezbeđen je proizvod koji sadrži materijale korisne u lečenju, prevenciji i/ili dijagnostikovanju prethodno opisanih poremećaja. Proizvod uključuje pakovanje i etiketu ili uputstvo za upotrebu, na pakovanju ili uz njega. Pogodno pakovanje uključuje, na primer, boce, bočice, špriceve, kese za IV rastvor, itd. Pakovanje može biti

1

izrađeno od različitih materijala, kao što je staklo ili plastika. Pakovanje sadrži preparat koji je sam po sebi ili u kombinaciji sa drugim preparatom efikasan u lečenju, prevenciji i/ili dijagnostikovanju stanja, i može imati priključak za sterilni pristup (na primer, pakovanje može biti kesa za intravenski rastvor ili bočica sa zapušačem koji može da se probuši iglom za potkožnu injekciju). Najmanje jedno aktivno sredstvo u kompoziciji je bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom iz ovog pronalaska. Etiketa ili uputstvo za upotrebu ukazuje na to da se preparat koristi za lečenje stanja po izboru. Pored toga, proizvod može da sadrži (a) prvo pakovanje sa kompozicijom koja se u njemu nalazi, pri čemu kompozicija sadrži bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom iz pronalaska; i (b) drugo pakovanje sa kompozicijom koja se u njemu nalazi, naznačeno time što kompozicija sadrži dodatni citotoksični ili drugi terapeutski agens. Proizvod u ovom otelotvorenju predmetnog pronalaska može dodatno da sadrži uputstvo za upotrebu koje ukazuje da kompozicije mogu da se koriste za lečenje određenog stanja. Alternativno, ili dodatno, proizvod može dalje da sadrži drugo (ili treće) pakovanje koje sadrži farmaceutski prihvatljiv pufer, kao što je bakteriostatska voda za injekcije (BWFI), fiziološki rastvor sa fosfatnim puferom, Ringerov rastvor i rastvor dekstroze. Proizvod može dodatno da sadrži druge materijale poželjne sa komercijalnog aspekta i sa aspekta upotrebe, uključujući druge pufere, razblaživače, filtere, igle i špriceve.

Primeri

U nastavku su dati primeri za postupke i preparate iz pronalaska. Podrazumeva se da mogu biti primenjena razna druga otelotvorenja, na osnovu opšteg opisa koji je gore dat.

Primer 1

Sinteza jednovalentnih molekula anti-CD3 IgG sa anti-idiotipskim scFv.

Ovde su opisani CD3 vezivači koji su maskirani N-terminalno vezanim anti-idiotipskim CD3 scFv. Ovi konstrukti uključuju mesto prepoznavanja proteaze koje prepoznaje proteaza specifična za tumor. U prisustvu tumorskih ćelija koje eksprimiraju proteaze, linker koji povezuje maskirajući deo će se cepati i na taj način se regeneriše vezivanje CD3 putem vezivača CD3. Proizvedeno je nekoliko jednovalentnih anti-CD3 IgG molekula sa različitim anti-idiotipskim scFv i šematski su prikazani na Sl.1A-E sa odgovarajućim identifikacionim brojem. Pripremljeni su sledeći molekuli:

Identifikacija br.7859: jednovalentni CD3 IgG, (anti-idiotipski scFv 4.15.64 - MK062 mesto matriptaze - CD3 - N-terminalno spojen na CD3 Fab - inertni Fc) sa N-terminalno spojenim anti CD3 scFv 4.15.64 i linkerom koji se cepa proteazom.

Identifikacija br.7860: jednovalentni CD3 IgG, (anti-idiotipski scFv 4.32.63 - MK062

11

mesto matriptaze - CD3 - N-terminalno spojen na CD3 Fab - inertni Fc) sa N-terminalno spojenim anti CD3 scFv 4.32.63 i linkerom koji se cepa proteazom.

Identifikacija br.7857: jednovalentni CD3 IgG, (anti-idiotipski scFv 4.15.64 -- necepivi linker - CD3 - N-terminalno spojen na CD3 Fab - inertni Fc) sa N-terminalno spojenim anti CD3 scFv 4.15.64 i linkerom koji se cepa proteazom.

Identifikacija br.7858: jednovalentni CD3 IgG, (anti-idiotipski scFv 4.32.63 - necepivi linker - CD3 - N-terminalno spojen na CD3 Fab - inertni Fc) sa N-terminalno spojenim anti CD3 scFv 4.32.63 i linkerom koji se cepa proteazom.

Identifikacija br.7861: jednovalentni CD3 IgG, (CD3 Fab - inertni Fc) sa N-terminalno spojenim anti CD3 scFv 4.15.64/4.32.63 i proteaznim linkerom.

Anti-idiotipske (ID) vezivne sekvence dobijene su putem RACE-PCR (brzom amplifikacijom krajeva cDNK) iz RNK ćelija Hibridoma. Ćelije hibridoma su dobijene imunizacijom miševa Fab-fragmentom CH2527 (VL_7-46 (13) /VH_3-23 (12)). Sinteza sekvence jednolančanog Fv (ScFv) naručena je od kompanije Invitrogen, uključujući potrebna restrikciona mesta za kloniranje. Šest različitih anti-idiotipskih CH2527 vezivača upoređeno je zprema afinitetu (Sl.2, rezultat Biacore-Analitics (AG M Schräml) na 25 °C/37 °C (analit: MaK<CEA/CD3>rH)) i dva od njih su klonirani kao N-terminalne fuzije na teškom lancu CD3 Fab - Fc.

Anti-ID jednolančane sekvence Fv DNK su subklonirane u okviru sa CD3 VH lancem unapred ubačenim u odgovarajući vektor ekspresije sisara primaoca. Ekspresiju proteina pokreće promoter MPSV, i sintetska poliA signalna sekvenca je prisutna na 3' kraju CDS. Pored toga, svaki vektor sadrži EBV OriP sekvencu.

Molekuli su proizvedeni kotransfekcijom HEK293-EBNA ćelija uzgajanih u suspenziji sa ekspresionim vektorima sisara, koristeći polietilenimin (PEI). Ćelije su transficirane odgovarajućim ekspresionim vektorima u odnosu 1:1:2 („Fc rupica (CH2-CH3)“: „zajednički laki lanac (CLC)“: „dugme vektora teškog lanca (scFv-VH-CH1-CH2-CH3)“).

Za transfekciju, HEK293 EBNA ćelije su uzgajane u ExCell medijumu za uzgajanje bez seruma sa 6 mM L-glutaminom i 250 mg/l G418. Za proizvodnju u tubespin bocama od 600 ml (maksimalna radna zapremina 400 ml), 800 miliona ćelija HEK293 EBNA je zasejano 24 sata pre transfekcije bez G418. Za transfekciju, 800 miliona ćelija je centrifugirano 5 minuta na 210 x g, i supernatant je zamenjen sa 40 ml prethodno zagrejanog CD CHO medijuma koji sadrži 6 mM L-glutamin. Ekspresioni vektori su pomešani sa 40 ml CD CHO medijuma koji sadrži 6 mM L-glutamin do konačne količine od 400 µg DNK. Nakon dodavanja 1080 µl rastvora PEI (2,7 µg/ml), smeša je mešana na vorteksu tokom 15 s, i zatim inkubirana 10 minuta na sobnoj temperaturi. Nakon toga, ćelije su pomešane sa rastvorom DNK/PEI, prebačene u tubespin bocu od 600 ml i inkubirane 3 sata na 37°C u inkubatoru, u atmosferi sa 5% CO2. Nakon inkubacije, dodato je 320 ml ExCell 6 mM L-glutamin 5 g/L Pepsoy 1,0 mM VPA 3 g/l glukoznog medijuma, i ćelije su kultivisane 24 sata pre dodavanja 7% Feed 7. Nakon 6-7 dana kultivacije, supernatant je prikupljen za prečišćavanje centrifugiranjem 20-30 min na 210 x g (centrifuga Sigma 8K ). Rastvor je sterilno filtriran (filter 0,22 µm) i dodat je natrijum azid u konačnoj koncentraciji od 0,01% m/m. Rastvor je čuvan na 4 °C do prečišćavanja. Izlučeni protein je prečišćen iz supernatanata ćelijske kulture afinitetnom hromatografijom, upotrebom afinitetne hromatografije sa proteinom A, zatim jednim ili dva hromatografska koraka gel filtracije.

Kod afinitetne hromatografije, supernatant je nanet na kolonu HiTrap Protein A FF (CV = 5 ml, GE Healthcare), ekvilibrisan sa 25 ml 20 mM natrijum fosfata, 20 mM natrijum citrata, 0,5 M natrijum hlorida, 0,01% Tween-20, pH 7,5. Nevezani protein je uklonjen ispiranjem sa najmanje 10 zapremina kolone 20 mM natrijum fosfata, 20 mM natrijum citrata, 0,5 M natrijum hlorida, 0,01% Tween-20 pH 7,5, i ciljni protein je eluiran sa 20 zapremina kolone (gradijent od 0% do 100%) 20 mM natrijum citrata, 0,5 M natrijum hlorida, 0,01% Tween-20, pH 2,5. Proteinski rastvor je neutralisan dodavanjem 1/10 2 M Tris pH 10,5. Ciljni protein je koncentrovan pomoću uređaja Amicon®Ultra-15 Ultracel 30K (Merck Millipore Ltd.) do zapremine od maksimalno 4 ml pre nanošenja na kolonu HiLoad Superdex 200 (GE Healthcare) ekvilibrisanu 20 mM histidinom, 140 mM natrijum hloridom, pH 6,0, 0,01% Tween20.

Za analitiku nakon gel hromatografije, čistoća i molekulska masa molekula u pojedinačnim frakcijama analizirani su pomoću SDS-PAGE u odsustvu redukcionog sredstva i bojenjem sa Coomassie (InstantBlue™, Expedeon). NuPAGE® Pre-Cast gel sistem (4-12% Bis-Tris, Invitrogen ili 3-8% Tris-acetat, Invitrogen) korišćen je prema uputstvu proizvođača.

Koncentracija proteina u prečišćenim proteinskim uzorcima određena je merenjem optičke gustine (OD) na 280 nm, podeljeno koeficijentom molarne ekstinkcije izračunatim na bazi aminokiselinske sekvence.

Čistoća i molekulska masa molekula nakon završnog koraka prečišćavanja analizirani su CE-SDS analizama u prisustvu i odsustvu redukcionog sredstva. Caliper LabChip GXII sistem (Caliper lifescience) korišćen je prema uputstvu proizvođača. Ukupni sadržaj u molekulima je analiziran pomoću analitičke kolone za gel hromatografiju TSKgel G3000 SW XL (Tosoh) u radnom puferu 25 mM K2HPO4, 125 mM NaCl, 200 mM L-arginin monohidrohlorid, 0,02% (m/v) NaN3, pH 6,7 na 25°C. Konačni kvalitet svih molekula je bio dobar, sa sadržajem monomera ≥ 92%.

TABELA 2. Rezime proizvodnje i prečišćavanja jednovalentnih CD3 IgG molekula aktiviranih proteazom.

Primer 2

Cepanje i stabilnost IgG aktiviranih proteazom.

Kapilarna elektroforeza molekula IgG aktiviranih proteazom. Poređenje netretiranog uzorka i tretiranog uzorka pokazalo je da je anti-ID scFV potpuno otcepljen nakon tretmana pomoću rhMatriptaze/ST14 (R&D Systems) što je naznačeno promenom veličine u analizi SDS page (Sl.3). Analiza uzoraka inkubiranih 48 sati na 37 °C potvrdila je stabilnost molekula u puferu formulacije (Sl.3A-D).

Primer 3

Maskirajući efekat anti-idiotipskog scFv za CD3 IgG.

Efikasnost maskiranja CD3 vezivača N-terminalnom fuzijom anti-idiotipskog CD3 scFv dokazana je pomoću Jurkat-NFAT reporterskog testa. Jurkat-NFAT reporterske ćelije (reporterska ćelijska linija humane akutne limfne leukemije sa ekspresijom luciferaze regulisanom NFAT promoterom, GloResponse Jurkat NFAT-RE-Luc2P, Promega br. CS176501) eksprimiraju aktivnu luciferazu svica ako se NFAT promoter aktivira vezivanjem CD3ε. Intenzitet signala luminescencije nakon dodavanja supstrata luciferaze je proporcionalan intenzitetu aktivacije i signalizacije CD3. Potpuno nemaskirani jednovalentni CD3 molekuli služili su kao pozitivna kontrola. Tretman je urađen pomoću rhMatriptaze/ST14 (R & D Systems) tokom 48 h na 37 °C. Paralelno, 8 ug/ml anti humanog Fc antitela (BioLegends) obloženo je u 0,025 ul/bunarčiću PBS tokom 48 h na 4 °C na (ravnoj ploči) sa belim zidovima, sa 96 bunarčića sa providnim dnom (Greiner Bio-One). PBS je uklonjen pipetiranjem pre nego što su dodati jednovalentni IgG u naznačenom opsegu koncentracije od 200 nM - 2,56 pM. Ploče su inkubirane oko 30 minuta na 4 °C. Nakon toga, Jurkat-NFAT reporterske ćelije su sakupljene i vijabilnost je procenjena korišćenjem ViCell. Ćelije su resuspendovane u Jurkatovom medijumu (RPMI1640, 2g/l glukoze, 2 g/l NaHCO3, 10% FCS,

11

25 mM HEPES, 2 mM L-glutamin, 1 x NEAA, 1 x natrijum-piruvat) bez higromicina i 100 µl po bunarčiću (25.000 ćelija/bunarčiću) dodato je u umreženi jednovalentni CD3 IgG. Ćelije su inkubirane 3 h na 37°C u vlažnom inkubatoru. Ploče su izvađene iz inkubatora na oko 10 minuta da bi se prilagodile sobnoj temperaturi pre nego što se očita luminescencija. 100 µl/bunarčiću rastvora ONE-Glo (1:1 ONE-Glo i zapremina test medijuma po bunarčiću) dodato je u bunarčiće i inkubirano 10 minuta na sobnoj temperaturi u mraku. Luminescencija je detektovana pomoću WALLAC Victor3 ELISA čitača (PerkinElmer2030), detekciono vreme 1 sekundi/bunarčiću. 7857 (4.15.64 maska sa necepljivim linkerom) i 7859 (netretiran) pokazuju značajno smanjeno vezivanje CD3ε u poređenju sa nemaskiranim (7861) i prethodno tretiranim molekulom (7859 tretiran) (Sl.4A). 7760 je uključen kao kontrola da pokaže da N-terminalna veza ne blokira CD3 vezivanje. 7858 (4.32.63 maska sa necepljivim linkerom) i 7860 (netretiran) pokazuju značajno smanjeno vezivanje CD3ε u poređenju sa nemaskiranim (7861) i prethodno tretiranim molekulom (7860 tretiran) (Sl.4B). U skladu sa afinitetima antiidiotipskih CD3 vezivača, maska 4.32.63 je mnogo efikasnija od 4.15.64. U pogledu EC50 vrednosti (Sl.4C) 4.32.63 maskirani CD3 vezivač vezuje 54 puta manje od nemaskiranog CD3 vezivača 7861. Za masku 4.15.64 to je samo 16 puta manje vezivanja nego za 7861. U zavisnosti od cilja tumora i ciljnog vezivača, može se proceniti najbolja maska.

Primer 4

Priprema anti FolR1/anti-CD3 T ćelijskih bispecifičnih (TCB) molekula sa anti CD3 scFv.

Proizvedeno je nekoliko bispecifičnih molekula T ćelija (TCB) sa različitim antiidiotipskim scFv i šematski su prikazani na slikama. 5A-H sa odgovarajućim ID brojem. Pripremljeni su sledeći molekuli:

ID7344: FolR1 16D5 2+1 IgG, klasičnog formata (anti-idiotipski scFv 4.15.64 -MK062 mesto matriptaze - CD3 - N-terminalno spojen na FolR1 VH - inertni Fc) sa N-terminalno spojenim anti CD3 scFv 4.15.64 i proteaznim linkerom (Sl.5A, SEQ ID NO 1, 2 i 3).

ID7496: FolR1 16D5 2+1 IgG, klasičnog formata (anti-idiotipski scFv 4.32.63 -MK062 mesto matriptaze - CD3 - N-terminalno spojen na FolR1 VH - inertni Fc) sa N-terminalno spojenim anti CD3 scFv 4.32.63 i proteaznim linkerom (Sl.5C, SEQ ID NO 1, 3 i 4).

ID7676: FolR1 16D5 2+1 IgG, klasičnog formata (anti-idiotipski scFv 4.15.64 -necepivi GS linker - CD3 - N-terminalno spojen na FolR1 VH - inertni Fc) sa N-terminalno spojenim anti CD3 scFv 4.15.64 i proteaznim linkerom (Sl.5B, SEQ ID NO 1, 3 i 6).

ID7611: FolR1 16D5 2+1 IgG, klasičnog formata (anti-idiotipski scFv 4.32.63 -necepivi GS linker - CD3 - N-terminalno spojen na FolR1 VH - inertni Fc) sa N-terminalno spojenim anti CD3 scFv 4.32.63 i proteaznim linkerom (Sl.5D, SEQ ID NO 1, 3 i 5).

Anti-idiotipske (ID) vezivne sekvence dobijene su putem RACE-PCR (brzom amplifikacijom krajeva cDNK) iz RNK ćelija Hibridoma. Ćelije hibridoma su dobijene imunizacijom miševa. Sinteza sekvence jednolančanog Fv (ScFv) naručena je od kompanije Invitrogen, uključujući potrebna restrikciona mesta za kloniranje. Upoređeno je šest različitih anti-idiotipskih CH2527 vezivača prema afinitetu (Sl. 2, rezultat Biacore-Analytics (AG M Schräml) na 25 °C/37 °C (analit: MAK<CEA/CD3>rH)) i četiri od njih su klonirani kao N-terminalne fuzije na HC CD3 - FolR116D5 TCB.

Anti-ID jednolančane sekvence Fv DNK su subklonirane u okviru sa CD3 VH lancem unapred ubačenim u odgovarajući vektor ekspresije sisara primaoca. Ekspresiju proteina pokreće promoter MPSV, i sintetska poliA signalna sekvenca je prisutna na 3' kraju sekvence kodiranja (CDS). Pored toga, svaki vektor sadrži EBV OriP sekvencu.

Molekuli su proizvedeni kotransfekcijom HEK293-EBNA ćelija uzgajanih u suspenziji sa ekspresionim vektorima sisara, koristeći polietilenimin (PEI). Ćelije su transficirane odgovarajućim ekspresionim vektorima u odnosu 1:3:2 („rupica vektorskog teškog lanca (VH-CH1-CH2-CH3)“: „zajednički laki lanac (CLC)“: „dugme vektora teškog lanca (scFv-VH-CH1-VH-CH1-CH2-CH3)“).

Za transfekciju HEK293 EBNA ćelije su uzgajane u ExCell medijumu za uzgajanje bez seruma sa 6 mM L-glutaminom i 250 mg/l G418. Za proizvodnju u tubespin bocama od 600 ml (maksimalna radna zapremina 400 ml), 800 miliona ćelija HEK293 EBNA je zasejano 24 sata pre transfekcije bez G418. Za transfekciju, 800 miliona ćelija je centrifugirano 5 minuta na 210 x g, i supernatant je zamenjen sa 40 ml prethodno zagrejanog CD CHO medijuma koji sadrži 6 mM L-glutamin. Ekspresioni vektori su pomešani sa 40 ml CD CHO medijuma koji sadrži 6 mM L-glutamin do konačne količine od 400 µg DNK. Nakon dodavanja 1080 µl rastvora PEI (2,7 µg/ml), smeša je mešana na vorteksu tokom 15 s, i zatim inkubirana 10 minuta na sobnoj temperaturi. Nakon toga, ćelije su pomešane sa rastvorom DNK/PEI, prebačene u tubespin bocu od 600 ml i inkubirane 3 sata na 37°C u inkubatoru, u atmosferi sa 5% CO2. Nakon inkubacije, dodato je 320 ml ExCell 6 mM L-glutamin 5 g/L Pepsoy 1,0 mM VPA 3 g/l glukoznog medijuma, i ćelije su kultivisane 24 sata pre dodavanja 7% Feed 7. Nakon 6-7 dana kultivacije, supernatant je prikupljen za prečišćavanje centrifugiranjem 20-30 min na 210 x g (centrifuga Sigma 8K ). Rastvor je sterilno filtriran (filter 0,22 µm) i dodat je natrijum azid u konačnoj koncentraciji od 0,01% m/m. Rastvor je čuvan na 4 °C do

11

prečišćavanja.

Izlučeni protein je prečišćen iz supernatanata ćelijske kulture afinitetnom hromatografijom, upotrebom afinitetne hromatografije sa proteinom A, zatim jednim ili dva hromatografska koraka gel filtracije.

Kod afinitetne hromatografije, supernatant je nanet na kolonu HiTrap Protein A FF (CV = 5 ml, GE Healthcare), ekvilibrisan sa 25 ml 20 mM natrijum fosfata, 20 mM natrijum citrata, 0,5 M natrijum hlorida, 0,01% Tween-20, pH 7,5. Nevezani protein je uklonjen ispiranjem sa najmanje 10 zapremina kolone 20 mM natrijum fosfata, 20 mM natrijum citrata, 0,5 M natrijum hlorida, 0,01% Tween-20 pH 7,5, i ciljni protein je eluiran sa 20 zapremina kolone (gradijent od 0% do 100%) 20 mM natrijum citrata, 0,5 M natrijum hlorida, 0,01% Tween-20, pH 2,5.

Proteinski rastvor je neutralisan dodavanjem 1/102 M Tris pH 10,5. Ciljni protein je koncentrovan pomoću uređaja Amicon®Ultra-15 Ultracel 30K (Merck Millipore Ltd.) do zapremine od maksimalno 4 ml pre nanošenja na kolonu HiLoad Superdex 200 (GE Healthcare) ekvilibrisanu 20 mM histidinom, 140 mM natrijum hloridom, pH 6,0, 0,01% Tween20.

Čistoća i molekulska masa molekula nakon završnog koraka prečišćavanja analizirani su CE-SDS analizama u prisustvu i odsustvu redukcionog sredstva. Caliper LabChip GXII sistem (Caliper lifescience) korišćen je prema uputstvu proizvođača.

Ukupni sadržaj u molekulima je analiziran pomoću analitičke kolone za gel hromatografiju TSKgel G3000 SW XL (Tosoh) u radnom puferu 25 mM K2HPO4, 125 mM NaCl, 200 mM L-arginin monohidrohlorid, 0,02% (m/v) NaN3, pH 6,7 na 25°C. Konačni kvalitet svih molekula je bio dobar, sa sadržajem monomera ≥ 92%.

11

TABELA 2. Rezime proizvodnje i prečišćavanja molekula TCB aktiviranih proteazom.

Primer 5

Prelazna ekspresija TCB aktiviranih proteazom.

Različiti odnosi plazmida koji se koriste za transfekciju upoređeni su gel hromatografijom zbog toga što se sumnjalo da je lanac dugmeta eksprimiran na nižim nivoima u poređenju sa lancem rupice i lakim lancem. Kao što je prikazano na SL.6 i 7, koristeći odnos plazmida 1 (rupica): 2 (dugme): 3 (CLC) (SL.7) umesto 1 (rupica): 1 (dugme): 3 (CLC) (SL.

6) povećan je prinos ispravnog molekula (levi pik) i smanjena je količina homodimera rupice (desni pik).

Primer 6

Cepanje i stabilnost proteazom aktiviranog TCB.

Proteazom aktivirani TCB analizirani su kapilarnom elektroforezom. Poređenje netretiranog uzorka i tretiranog uzorka pokazalo je da je anti-idiotip scFc deo potpuno otcepljen nakon tretmana pomoću rhMatriptaze/ST14. Analiza uzoraka inkubiranih 48 sati na 37 °C potvrdila je stabilnost molekula u puferu formulacije (Sl.12A-D).

Primer 7

Ubijanje ćelija pomoću ciljnih ćelijskih linija koje eksprimiraju različite nivoe FolR1.

Ubijanje ćelija posredovano T-ćelijama izazvano proteazom aktiviranim TCB molekulima procenjeno je korišćenjem ciljnih ćelijskih linija koje eksprimiraju različite nivoe FolR1 (Sl. 13). Humani PBMC su korišćeni kao efektorske ćelije, i ubijanje je detektovano nakon 48 h inkubacije sa TCB molekulima aktiviranim proteazom. Ljudske mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) izolovane su iz sveže uzete krvi ili iz frakcije leukocita i trombocita dobijenih od zdravih humanih donatora. Za pripremu sveže krvi korišćene su Leucosep epruvete od 50 ml (GreinerBioOne). Za obogaćene preparate limfocita (frakcija leukocita i trombocita) korišćena je gustina pripreme Histopaque-1077. Krv/frakcije leukocita i trombocita je razblažena 1:1 sterilnim PBS-om i raslojena putem gradijenta Histopaque

11

(Sigma, br. H8889). Nakon centrifugiranja (450 x g, 30 minuta, bez pauze, sobna temperatura), plazma iznad međufaze koja sadrži PBMC je odbačena, i PBMC su preneti u novu Falcon epruvetu koja je zatim napunjena sa 50 ml PBS-a. Smeša je centrifugirana (400 x g, 10 minuta, sobna temperatura), supernatant je odbačen, i pelet PBMC resuspendovan u 2 ml ACK pufera za lizu eritrocita. Nakon inkubacije na 37 °C tokom oko 2-3 minuta, epruvete su napunjene sterilnim PBS-om do 50 ml i centrifugirane na 350 x g tokom 10 minuta. Ovaj korak pranja ponovljen je jednom pre resuspenzije PBMC u medijumu RPMI1640 koji sadrži 2% FCS i 1X GlutaMax na 37 °C, 5% CO2u ćelijskom inkubatoru do dalje upotrebe. Ukratko, adherentne ciljne ćelije sakupljene su tripsinom/EDTA, prebrojane, proverena im je vijabilnost, i resuspendovane su na 0,4 x10<6>ćelija/ml u medijumu za ispitivanje (RPMI1640, 2% FCS, 1X GlutaMax). Ciljne ćelije su postavljene na ploču pri gustini od 20.000 ćelija/bunarčiću korišćenjem ploča sa 96 bunarčića sa okruglim dnom. Za test ubijanja, molekuli su dodati u naznačenim koncentracijama u tri primerka. FolR1 16D5 TCB je uključen kao pozitivna kontrola i neciljani TCB molekul (vezuje se za CD3, ali ne i za antigen ciljne ćelije) uključen je kao negativna kontrola. PBMC su dodavani u ciljne ćelije u konačnom odnosu E:T od 10:1. Ubijanje ciljnih ćelija je procenjeno nakon 48 h inkubacije na 37 °C, 5% CO2, kvantifikacijom LDH oslobođenog u ćelijske supernatante od strane apoptotičnih/nekrotičnih ćelija (komplet za detekciju LDH, Roche Applied Science, br.11 644793 001). Maksimalna liza ciljnih ćelija (= 100%) postignuta je inkubacijom ciljnih ćelija sa 1% Triton X-1001 h pre očitavanja LDH. Minimalna liza (= 0%) odnosi se na ciljne ćelije koinkubirane sa efektorskim ćelijama bez TCB.

Rezultati (Sl. 14A, 15A, 16, 17, 18A, 19A i 20A) pokazuju da su TCB aktivirani proteazom sa anti-idiotipskim CD3 scFv delom N-terminalno povezanim sa necepljivim linkerom (br.7676 odnosno br.7611, Sl.5B i D) mogli značajno da smanje lizu ćelija na Skov3 i HT29 ćelijama. Br. 7611 (Sl. 5D) doveo je do smanjenog ubijanja na Hela ćelijama dok je anti-idiotipski CD3 scFv 4.15.64 u br.7676 (Sl.5B) bio manje efikasan u smanjenju lize ćelija. Ovo je u skladu sa afinitetima anti-idiotipskog CD3 scFv N dela. scFv deo većeg afiniteta maskira efikasnije.

Uporediva potentnost tretiranih i netretiranih TCB ukazuje na ekspresiju matriptaze Hela i Skov3 ćelija. Čini se da je ekspresija matriptaze manja u HT29 ćelijama. Tretman Mkn-45, negativne ćelijske linije FolR1, pokazuje samo slabo ubijanje sa svim molekulima koji se ovde koriste (Sl.15A).

Primer 8

Aktivacija T-ćelija nakon koinkubacije tumorskih ćelijskih linija sa ljudskim

11

PBMC.

Aktivacija T-ćelija posredovana proteazom aktiviranim TCB molekulima procenjena je na ćelijama Hela, Skov3 i HT29. Humani PBMC su korišćeni kao efektorske ćelije i aktivacija T ćelija je otkrivena na 48 h inkubacije sa ciljnim ćelijama i antitelima. Ciljne ćelije su postavljene na ploču pri gustini od 20.000 ćelija/bunarčiću korišćenjem ploča sa 96 bunarčića sa okruglim dnom. Molekuli su dodati u naznačenim koncentracijama u tri kopije. FolR116D5 TCB je uključen kao pozitivna kontrola i neciljani TCB molekul (vezuje se za CD3, ali ne i za antigen ciljne ćelije) uključen je kao negativna kontrola. PBMC su dodavani u ciljne ćelije u konačnom odnosu E:T od 10:1. Aktivacija T-ćelija procenjena je nakon 48 h inkubacije na 37 °C, 5% CO2kvantifikacijom CD25 i CD69 na CD4 pozitivnim i CD8 pozitivnim T ćelijama. Rezultati aktivacije T ćelija su u skladu sa rezultatima posmatranim u prethodnom primeru procene ubijanja ciljnih ćelija (primer 7).

Primer 9

Aktivacija T-ćelija posredovana proteazom aktiviranim TCBS-om i ciljnim ćelijskim linijama koje izražavaju niske nivoe antigena.

Aktivacija T-ćelija posredovana proteazom aktiviranim TCB molekulima procenjena je na HT29 ćelijama koje izražavaju samo niske nivoe FolR1 (Sl.13). Ljudski PBMC izolovani iz frakcija leukocita i trombocita korišćeni su kao efektorske ćelije. Za obogaćene preparate limfocita (frakcija leukocita i trombocita) korišćena je gustina pripreme Histopaque-1077. Frakcija leukocita i trombocita je razblažena 1:1 sterilnim PBS-om i raslojena putem gradijenta Histopaque (Sigma, br. H8889). Nakon centrifugiranja (450 x g, 30 minuta, bez pauze, sobna temperatura), plazma iznad međufaze koja sadrži PBMC je odbačena, i PBMC su preneti u novu Falcon epruvetu koja je zatim napunjena sa 50 ml PBS-a. Smeša je centrifugirana (400 x g, 10 minuta, sobna temperatura), supernatant je odbačen, i pelet PBMC resuspendovan u 2 ml ACK pufera za lizu eritrocita. Nakon inkubacije na 37 °C tokom oko 2-3 minuta, epruvete su napunjene sterilnim PBS-om do 50 ml i centrifugirane na 350 x g tokom 10 minuta. Ovaj korak pranja ponovljen je jednom pre resuspenzije PBMC u medijumu RPMI1640 koji sadrži 2% FCS i 1X GlutaMax na 37 °C, 5% CO2u ćelijskom inkubatoru do dalje upotrebe. Ukratko, adherentne ciljne ćelije sakupljene su tripsinom/EDTA, prebrojane, procenjene radi održivosti i resuspendovane na 0,4 x10<6>ćelija/ml u medijumu za ispitivanje (RPMI1640, 2% FCS, 1X GlutaMax). Ciljne ćelije su postavljene na ploču pri gustini od 20.000 ćelija/bunarčiću korišćenjem ploča sa 96 bunarčića sa okruglim dnom. Molekuli su dodati u naznačenim koncentracijama u tri kopije. FolR1 16D5 TCB je uključen kao pozitivna kontrola i neciljani TCB molekul (vezuje se za CD3, ali ne i za antigen ciljne ćelije) uključen je kao negativna

11

kontrola. PBMC su dodavani u ciljne ćelije u konačnom odnosu E:T od 10:1. Aktivacija T-ćelija procenjena je nakon 48 h inkubacije na 37 °C, 5% CO2kvantifikacijom CD25 i CD69 na CD4 pozitivnim i CD8 pozitivnim T ćelijama. Potentnost tretiranog TCB aktiviranog proteazom je uporediva sa 16D5 TCB (6298). 16D5 TCB (obrnuti format) pokazuje veću potentnost od klasičnog formata. Maskirani TCB sa necepivim linkerom ili bez prethodnog tretmana matriptazom ne indukuju aktivaciju T ćelija na ovoj ćelijskoj liniji. Za ćelijske linije sa niskim ili srednjim nivoima ekspresije FolR1 oba anti-idiotipska scFv su dovoljna za maskiranje CD3 Fab (Sl.22A i B).

Primer 10

Aktivacija T-ćelija posredovana proteazom aktiviranim TCB sa primarnom ćelijskom linijom HRCEpiC.

Aktivacija T-ćelija posredovana proteazom aktiviranim TCB molekulima procenjena je na primarnim ćelijama humanih bubrežnih kortikalnih epitelnih ćelija (ScienceCell) koje eksprimiraju samo vrlo male količine FolR1 (sl. 13). Ljudski PBMC izolovani iz frakcija leukocita i trombocita korišćeni su kao efektorske ćelije. Za obogaćene preparate limfocita (frakcija leukocita i trombocita) korišćena je gustina pripreme Histopaque-1077. Frakcija leukocita i trombocita je razblažena 1:1 sterilnim PBS-om i raslojena putem gradijenta Histopaque (Sigma, br. H8889). Nakon centrifugiranja (450 x g, 30 minuta, bez pauze, sobna temperatura), plazma iznad međufaze koja sadrži PBMC je odbačena, i PBMC su preneti u novu Falcon epruvetu koja je zatim napunjena sa 50 ml PBS-a. Smeša je centrifugirana (400 x g, 10 minuta, sobna temperatura), supernatant je odbačen, i pelet PBMC resuspendovan u 2 ml ACK pufera za lizu eritrocita. Nakon inkubacije na 37 °C tokom oko 2-3 minuta, epruvete su napunjene sterilnim PBS-om do 50 ml i centrifugirane na 350 x g tokom 10 minuta. Ovaj korak pranja ponovljen je jednom pre resuspenzije PBMC u medijumu RPMI1640 koji sadrži 2% FCS i 1X GlutaMax na 37 °C, 5% CO2u ćelijskom inkubatoru do dalje upotrebe. Ukratko, adherentne ciljne ćelije sakupljene su tripsinom/EDTA, prebrojane, proverena im je vijabilnost, i resuspendovane su na 0,4 x10<6>ćelija/ml u medijumu za ispitivanje (RPMI1640, 2% FCS, 1X GlutaMax). Ciljne ćelije su postavljene na ploču pri gustini od 20.000 ćelija/bunarčiću korišćenjem ploča sa 96 bunarčića sa okruglim dnom. Proteazom aktivirani TCB molekuli su dodati u naznačenim koncentracijama u tri kopije. FolR116D5 TCB je uključen kao pozitivna kontrola i neciljani TCB molekul (vezuje se za CD3, ali ne i za antigen ciljne ćelije) uključen je kao negativna kontrola. PBMC su dodavani u ciljne ćelije u konačnom odnosu E:T od 10:1. Aktivacija T-ćelija procenjena je nakon 48 h inkubacije na 37 °C, 5% CO2kvantifikacijom CD25 i CD69 na CD4 pozitivnim i CD8 pozitivnim T ćelijama. Maskirani 16D5 TCB ne

12

indukuje aktivaciju T ćelija nakon inkubacije sa primarnim ljudskim bubrežnim kortikalnim epitelnim ćelijama uprkos niskom nivou ekspresije FolR1 u najvećoj koncentraciji od 10.000 pM TCB, pokazujući efikasnost maskirajućeg dela anti-idiotipa. Mala aktivacija T ćelija može se posmatrati za 16D5 TCB (obrnuti i klasični format) (Sl.23).

Primer 11

Anti-ID CD3 Fab maskirajući CD3 vezivač 16D5 TCB. Ubijanje na Ovcar3 ćelijama.

Ubijanje ciljnih ćelija posredovano T-ćelijama posredovano proteazom aktiviranim TCB molekulima procenjeno je na OVCAR3 ćelijama (Sl.24). Humani PBMC-i korišćeni kao efektorske ćelije i ubijanje ćelija su detektovani nakon 48 h inkubacije sa molekulima. Ljudske mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) izolovane su iz sveže uzete krvi zdravog davaoca. Leucosep epruvete od 50 ml (GreinerBioOne) korišćene su za pripremu. Krv je razblažena 1:1 sterilnim PBS-om i raslojena putem gradijenta Histopaque (Sigma, br. H8889). Nakon centrifugiranja (450 x g, 30 minuta, bez pauze, sobna temperatura), plazma iznad međufaze koja sadrži PBMC je odbačena, i PBMC su preneti u novu Falcon epruvetu koja je zatim napunjena sa 50 ml PBS-a. Smeša je centrifugirana (400 x g, 10 minuta, sobna temperatura), supernatant je odbačen, i pelet PBMC resuspendovan u 2 ml ACK pufera za lizu eritrocita. Nakon inkubacije na 37 °C tokom oko 2-3 minuta, epruvete su napunjene sterilnim PBS-om do 50 ml i centrifugirane na 350 x g tokom 10 minuta. Ovaj korak pranja ponovljen je jednom pre resuspenzije PBMC u medijumu RPMI1640 koji sadrži 2% FCS i 1X GlutaMax na 37 °C, 5% CO2u ćelijskom inkubatoru do dalje upotrebe. Ukratko, adherentne ciljne ćelije sakupljene su tripsinom/EDTA, prebrojane, proverena im je vijabilnost, i resuspendovane su na 0,4 x10<6>ćelija/ml u medijumu za ispitivanje (RPMI1640, 2% FCS, 1X GlutaMax). Ciljne ćelije su postavljene na ploču pri gustini od 20.000 ćelija/bunarčiću korišćenjem ploča sa 96 bunarčića sa okruglim dnom. Za test ubijanja, molekuli su dodati u naznačenim koncentracijama u tri primerka. FolR116D5 TCB je uključen kao pozitivna kontrola i neciljani TCB molekul (vezuje se za CD3, ali ne i za antigen ciljne ćelije) uključen je kao negativna kontrola. PBMC su dodavani u ciljne ćelije u konačnom odnosu E:T od 10:1. Ubijanje ciljnih ćelija je procenjeno nakon 48 h inkubacije na 37 °C, 5% CO2, kvantifikacijom LDH oslobođenog u ćelijske supernatante od strane apoptotičnih/nekrotičnih ćelija (komplet za detekciju LDH, Roche Applied Science, br.11 644 793 001). Maksimalna liza ciljnih ćelija (= 100%) postignuta je inkubacijom ciljnih ćelija i PBMC-a sa 1% Triton X-1001 h pre LDH čitanja. Minimalna liza (= 0%) odnosi se na ciljne ćelije koinkubirane sa efektorskim ćelijama bez TCB. Rezultat (slika 24) pokazuje da proteazom aktivirani TCB sa anti-idiotipskim CD34.15.64 ukršten Fab Nterminalno povezan sa necepljivim linkerom ne maskira značajno CD3 vezivač. Dalje, izgleda da Ovcar3 ćelije eksprimiraju matriptazu jer netretirani molekul takođe indukuje ubijanje ovih ćelija.

Primer 12

Ubijanje na Skov3 i HeLa ćelijama sa tri različita ljudska donora PBMC.

Ubijanje T-ćelija posredovano proteazom aktiviranim TCB molekulima procenjeno je na dve različite ćelijske linije koje eksprimiraju različite nivoe FolR1 (Sl. 25-27). Humani PBMC-i korišćeni kao efektorske ćelije i ubijanje ćelija su detektovani nakon 48 h inkubacije sa molekulima. Ljudske mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) izolovane su iz frakcije leukocita i trombocita dobijene od zdravih humanih donatora. Za obogaćene preparate limfocita (frakcija leukocita i trombocita) korišćena je gustina pripreme Histopaque-1077. Krv/frakcije leukocita i trombocita je razblažena 1:1 sterilnim PBS-om i raslojena putem gradijenta Histopaque (Sigma, br. H8889). Nakon centrifugiranja (450 x g, 30 minuta, bez pauze, sobna temperatura), plazma iznad međufaze koja sadrži PBMC je odbačena, i PBMC su preneti u novu Falcon epruvetu koja je zatim napunjena sa 50 ml PBS-a. Smeša je centrifugirana (400 x g, 10 minuta, sobna temperatura), supernatant je odbačen, i pelet PBMC resuspendovan u 2 ml ACK pufera za lizu eritrocita. Nakon inkubacije na 37 °C tokom oko 2-3 minuta, epruvete su napunjene sterilnim PBS-om do 50 ml i centrifugirane na 350 x g tokom 10 minuta. Ovaj korak pranja ponovljen je jednom pre resuspenzije PBMC u medijumu RPMI1640 koji sadrži 10% FCS i 1X GlutaMax. PBMC su resuspendovane u medijumu RPMI1640 koji sadrži 10% FCS, 1X GlutaMax i 10% DMSO. PBMC su zamrznute preko noći na -80 °C u Cool Cell kutijama pre nego što su prebačeni u tečni azot. 24 h pre početka testa, PBMC su odmrznute i držane u medijumu RPMI1640 koji sadrži 10% FCS i 1X GlutaMax na 37 °C, 5% CO2 u ćelijskom inkubatoru. Dan pre početka testa, adherentne ciljne ćelije sakupljene su tripsinom/EDTA, prebrojane, proverena im je vijabilnost i resuspendovane na 0,4 x10<6>ćelija/ml u odgovarajućem medijumu. Ciljne ćelije su postavljene na ploču pri gustii od 20.000 ćelija/bunarčiću korišćenjem ploča sa 96 bunarčića sa ravnim dnom. Na dan početka testa PBMC su prebrojane i proverena im je vijabilnost. PBMC su centrifugirane na 350 g tokom 5 minuta i resuspendovane u test medijumu (RPMI1640, 2% FCS, 1X GlutaMax). Medijum ciljnih ćelija je uklonjen i PBMC su dodate ciljnim ćelijama pre nego što su razblažena antitela dodata u naznačenim koncentracijama u tri primerka. FolR116D5 TCB je uključen kao pozitivna kontrola i neciljani TCB molekul (vezuje se za CD3, ali ne i za antigen ciljne ćelije) uključen je kao negativna kontrola. PBMC su dodavane u ciljne ćelije u odnosu E:T od 10:1. Ubijanje ciljnih ćelija je procenjeno nakon 48 h inkubacije na 37 °C, 5% CO2, kvantifikacijom LDH oslobođenog u ćelijske supernatante od strane apoptotičnih/nekrotičnih ćelija (komplet za detekciju LDH, Roche Applied Science, br.11 644 793 001). Maksimalna liza ciljnih ćelija (= 100%) postignuta je inkubacijom ciljnih ćelija sa 1% Triton X-1002 h pre očitavanja LDH. Minimalna liza (= 0%) odnosi se na ciljne ćelije koinkubirane sa efektorskim ćelijama bez TCB.

Rezultati (slike 25-27) pokazuju da je FolR1 TCB sa scFv 4.32.63 N-terminalno povezan necepljivim linkerom (slika 5D) indukovao smanjeno ubijanje na Hela ćelijama u koncentraciji od 100 pM i na Skov3 ćelijama u koncentraciji od 10 nM. FolR1 TCB sa scFv 4.15.64 N-terminalno povezan necepljivim linkerom (slika 5B) bio je manje efikasan u smanjenju ubijanja na Skov3 ćelijama u koncentraciji od 10 nM. Jača maska što znači antiidiotipski scFv 4.32.63 sa većim afinitetom, efikasnija je u maskiranju CD3 vezivača nego slabi anti-idiotipski scFv 4.15.64. Uporediva potentnost tretiranih i netretiranih TCB-a ukazuje na ekspresiju proteaze, npr. matriptaze, iod strane Hela i Skov3 ćelija.

Primer 13

Priprema HER1 vezujućeg antitela GA201 maskiranog anti-idiotipom GA201 scFv.

Sledeći molekuli su pripremljeni u ovom primeru:

1: GA201 IgG1 antitelo sa N-terminalnom fuzijom anti-idiotipskog GA201 scFV i mestom matrične metaloproteaze u glicin serinskom linkeru (SEQ ID NO 32 i 34); i

2: HER1-vezujuće IgG1 antitelo GA201 (SEQ ID NO 32 i 33).

Njihove šematske ilustracije su prikazane na Sl. 28 i 29. GA201 anti-idiotipska (ID) vezivna sekvenca dobijena je putem RT-PCR (reverzna transkripcija) iz RNK ćelija hibridoma korišćenjem degenerisanih prajmera koji se vezuju za krajeve varijabilnog lakog, odnosno teškog lanca. Ćelije hibridoma su dobijene imunizacijom miševa. Sinteza DNK sekvence jednolančanog Fv (scFv) sa bočnim mestima jedne restrikcije endonukleaze naručena je u kompaniji Geneart i klonirana kao N-terminalna fuzija u lakom lancu GA201.

Roche ekspresioni vektor korišćen je za konstrukciju svih teških i lakih lanaca scFv fuzionih proteina koji kodiraju ekspresione plazmide. Vektor se sastoji od sledećih elemenata:

- gen za otpornost na higromicin kao selekcioni marker,

- mesto početka replikacije, oriP, Epštajn-Barov virus (EBV),

- mesto početka replikacije iz vektora pUC18 koje dozvoljava replikaciju ovog plazmida u E. coil

- gen beta-laktamaze koji daje otpornost na ampicilin u E. coli,

- trenutnog ranog pojačivača i promotera iz humanog citomegalovirusa (HCMV),

12

- poliadenilacije humanog 1-imunoglobulina („poli A“) signalne sekvence, i

- jedinstvenih mesta ograničenja BamHi i XbaI.

Molekuli su proizvedeni kotransfekcijom humanih embrionalnih ćelija bubrega 293-F koje rastu u suspenziji sa vektorima ekspresije sisara koristeći FreeStyle™ 293 ekspresioni sistem prema uputstvu proizvođača (Invitrogen, SAD). Ukratko, suspenzija FreeStyle™ 293-F ćelija su gajene u FreeStyle™ 293 ekspresionom medijumu na 37 °C/8% CO2i ćelije su zasejane u svežem medijumu pri gustini od 1-2 x 10<6>vijabilnih ćelija/ml na dan transfekcije. DNK-293fectin™ kompleksi su pripremljeni u medijumu Opti-mem I (Invitrogen, SAD) koristeći 325 μl 293fectin™ (Invitrogen, Nemačka) i 250 μg teškog („GA201 teški lanac“) i lakog lanca („anti-GA201 VH-VL scFv cepivi linker G4S GA201 laki lanac“ ili „GA201 laki lanac“) plazmidne DNK u molarnom odnosu 1:1 za konačnu zapreminu transfekcije od 250 ml. Antitelo koje sadrži supernatante ćelijske kulture sakupljeno je 7 dana nakon transfekcije centrifugiranjem na 14.000 g tokom 30 minuta i filtrirano kroz sterilni filter (0,22 μm). Supernatanti su čuvani na -20 °C do prečišćavanja.

Izlučeni protein je prečišćen iz supernatanata ćelijske kulture afinitetnom hromatografijom, upotrebom afinitetne hromatografije sa proteinom A, praćenom gel hromatografijom. Ukratko, sterilni filtrirani supernatanti ćelijske kulture naneti su na kolonu HiTrap proteinA HP (5 ml) ekvilibrisanu PBS puferom (10 mM Na2HPO4, 1 mM KH2PO4, 137 mM NaCl i 2,7 mM KCl, pH 7,4). Nevezani proteini su isprani puferom za ekvilibraciju. Antitela i varijante antitela su eluirani 0,1 M citratnim puferom, pH 2,8, a frakcije koje sadrže protein su neutralisane sa 0,1 ml 1 M Tris, pH 8,5. Zatim su eluirane proteinske frakcije objedinjene, koncentrovane pomoću centrifugalnog filter uređaja Amicon Ultra (MWCO: 30 K, Millipore) do zapremine od 3 ml i nanete na kolonu Superdex200 HiLoad 120 ml 16/60 za gel filtraciju (GE Healthcare, Švedska) ekvilibrisanu 20 mM histidinom, 140 mM NaCl, pH 6,0. Frakcije koje sadrže prečišćene Ga201-anti-Ga201-scFv ili GA201 sa manje od 5% agregata velike molekulske mase su objedinjene i čuvane kao alikvoti 1,0 mg/ml na -80 °C.

Za analitiku proteina nakon gel hromatografije, čistoća i molekulska masa molekula u pojedinačnim frakcijama analizirani su pomoću SDS-PAGE u odsustvu redukcionog sredstva i bojenja bojom Coomassie (InstantBlue™, Expedeon). NuPAGE® Pre-Cast gel sistem (4-12% Bis-Tris, Invitrogen ili 3-8% Tris-acetat, Invitrogen) korišćen je prema uputstvu proizvođača.

Koncentracija proteina u prečišćenim proteinskim uzorcima određena je merenjem optičke gustine (OD) na 280 nm, podeljeno koeficijentom molarne ekstinkcije izračunatim na bazi aminokiselinske sekvence. Čistoća i molekulska masa molekula nakon završnog koraka prečišćavanja analizirani su CE-SDS analizama u prisustvu i odsustvu redukcionog sredstva.

Caliper LabChip GXII sistem (Caliper lifescience) korišćen je prema uputstvu proizvođača. Sadržaj agregata u molekulima analiziran je gel hromatografijom visokih performansi koristeći analitičku kolonu za gel hromatografiju Superdex 200 (GE Healthcare, Švedska) u radnom puferu 200 mM KH2PO4, 250 mM KCl, pH 7,0 na 25 °C.25 µg proteina je injektovano na kolonu pri protoku od 0,5 ml/min i eluirano izokratski tokom 50 minuta.

Konačna čistoća svih molekula bila je ≥ 95% sadržaja monomera koji je detektovan gel hromatografijom visokih performansi. Molekulska masa anti-idiotipskog GA201 maskiranog sa scFv određena je CE-SDS analizom i iznosi 216,3 kDa pod uslovima bez redukcije (slika 1A) i 58,3 kDa pod redukcionim uslovima za teški lanac GA201 i 60,3 kDa za laki lanac GA201 povezan sa scFv (slika 30B). Molekulska masa zasnovana na sekvenci aminokiselina izračunata je kao 49,2 kDa za teški lanac i 51,9 kDa za laki lanac scFv fuzionisanog GA201, što ukazuje na glikozilaciju oba lanca u ćelijama HEK293.

TABELA 3. Rezime proizvodnje i prečišćavanja proteazno aktiviranih GA201 IgG (slika 28) i kontrolnih molekula GA201 (slika 29).

Primer 14

Maskirajući efekat anti-idiotipskog scFv za GA201 IgG.

Efikasnost maskiranja HER1 vezivanja GA201 N-terminalnom fuzijom antiidiotipskog GA201 scFv prikazana je FACS analizom na H322M ćelijama koje eksprimiraju HER1 i analizom površinskom plazmonskom rezonancom (SPR) na površini čipa obloženoj sa HER1. Za proteolitičko cepanje GA201-anti-GA201-scFv korišćen je rekombinantni aktivni humani MMP2 (Calbiochem).1 mg GA201 anti-idiotipskog scFv spojenog sa GA201 pomoću glicin serinskog linkera koji sadrži mesto cepanja MMP inkubiran je sa 1,2 μg MMP2 preko noći na 37 °C u PBS-u.

Za FACS analizu vezivanja HER1 cepanog i necepanog GA201-anti-GA201-scFv, korišćena je linija nemikrocelularnog karcinoma pluća H322M. Ćelije su podešene na 1x10<6>/ml i raspoređene na ploču sa okruglim dnom sa 96 bunarčića. Molekuli su dodati i inkubirani na ledu tokom 30 minuta. Ćelije su jednom isprane FACS puferom (PBS 2% FCS 0,1% natrijum azida) i ponovo suspendovane sa konjugatom F(ab')2-kozji antihumani IgG Fc sekundarno antitelo FITC (ThermoFisher Scientific). Nakon još 20 minuta na ledu, ćelije su dva puta isprane i ponovo suspendovane u FACS puferu i analizirane u BD FACS Canto II.

12

Izmereno je 10.000 ćelija i srednja vrednost fluorescentnog signala je korišćena za analizu. Pre cepanja MMP-2 GA201-anti-GA201-scFv nije bilo merljivo vezivanje za FIERI na H322M ćelijama, što ukazuje na potpuno maskiranje domena vezivanja GA201 anti-idiotipskim scFv (slika 31). Vezivanje necepanog Ga201-anti-GA201-scFv bilo je uporedivo sa kontrolnim antitelom nespecifičnog izotipa IgG (slika 31). Nasuprot tome, MMP cepanje anti-idiotipskog scFv dovodi do aktivacije GA201, i vezivanje za HER1 na H322M ćelijama je obnovljeno do sličnog nivoa kao nemaskirano matično antitelo GA201 (slika 31)

Da bismo potvrdili FACS podatke o vezivanju maskiranog GA201 vezivanja nakon cepanja MMP, izveli smo i SPR eksperiment kao drugu analitičku metodu koristeći Biacore T100 instrument (GE Healthcare Biosciences AB, Uppsala, Švedska). HER1 je imobilisan na površini CM5 biosenzorskog čipa koristeći standardnu hemiju kuplovanja amina. Ekstracelularni domen HER1 je injektovan u natrijum acetat, pH 5,0 pri 1 μg/ml. Referentne kontrolne protočne ćelije tretirane su na isti način, ali samo sa puferom vehikuluma. Ga201-anti-Ga201-scFv, pre i posle MMP cepanja preko noći, i GA201 razblaženi su u 1xPBS pH 7,4, 0,05% Tween20 Roche Diagnostics GmbH) i injektovani u rastućim koncentracijama od 3,125 do 50 nM pri protoku od 30 μl/min. Faza asocijacije bila je 3 minuta, a vreme disocijacije 10 minuta. Vezivanje HER1 regenerisano je ubrizgavanjem 0,85% fosforne kiseline tokom 30 s pri protoku od 5 μl/min. Kinetičke konstante brzine i ravnotežne konstante disocijacije izračunate su korišćenjem 1:1 Lengmirovog modela vezivanja u softveru Biaevaluation. Vrednost KDod 1 nM za vezivanje HER1 određena je za matično nemaskirano antitelo GA201 (Slika 32). Nakon inkubacije MMP-2 GA201-anti-Ga201-scFv preko noći, izmerena je vrednost KDod 2 nM sa sličnim konstantama brzine kai kdza asocijaciju i disocijaciju kao kod nemaskiranog kontrolnog antitela, što ukazuje na potpunu obnovu vezivanja HER1 cepanjem proteaze (Slika 32). Necepani GA201-anti-GA201-scFv nije pokazao nikakvo vezivanje za HER1 na SPR analizi (slika 32). Ukratko, pokazali smo potpuni gubitak vezivanja za HER1 fuzijom anti-idiotipskog scFv na N-kraj IgG1 antitela GA201 putem dve nezavisne analitičke metode. Nadalje, vezivanje za HER1 je u potpunosti obnovljeno uklanjanjem scFv putem cepanja proteaze na mestu cepanja MMP u glicin serinskom linkeru.

Primer 15

Priprema anti FolR1/anti-CD3 i antiMezotelin/anti-CD3 bispecifičnih molekula T ćelija (TCB) sa anti-CD3-scFv

Proizvedeno je nekoliko bispecifičnih molekula T ćelija (TCB) sa različitim antiidiotipskim scFv i šematski su prikazani na Sl. 33A-J sa odgovarajućim identifikacionim brojem. Pripremljeni su sledeći molekuli:

12

ID 8364: „FolR1 16D5 2+1 IgG, klasičnog formata (anti idiotipski scFv 4.32.63 -MMP9 - MK062 mesto matriptaze - CD3 - N-terminalno spojen na FolR1 VH - inertni Fc) sa N-terminalno spojenim anti CD3 scFv 4.32.63 i MMP9- MK062 proteaznim linkerom“ (Sl.

33A, SEQ ID NO 1, 3 i 72).

ID 8363: „FolR1 16D5 2+1 IgG, klasičnog formata (anti idiotipski scFv 4.32.63 -katepsin S/B mesto - CD3 - N-terminalno spojen na FolR1 VH - inertni Fc) sa N-terminalno spojenim anti CD3 scFv 4.32.63 i katespin S/B proteaznim linkerom“ (Sl.33B, SEQ ID NO 1, 3 i 85).

ID 8365: „FolR1 16D5 2+1 IgG, obrnutog formata (anti idiotipski scFv 4.32.63 -MK062 linker matriptaze - CD3 - N-terminalno spojen na CD3 VL - inertni Fc) sa N-terminalno spojenim anti CD3 scFv 4.32.63 i MK062 linkerom matriptaze“ (Sl.33C, SEQ ID NO 1, 3, 73 i 74).

ID 8366: „FolR1 16D5 2+1 IgG, obrnutog formata (anti-idiotipski scFv 4.32.63 -necepivi GS linker - CD3 - N-terminalno spojen na CD3 VL - inertni Fc) sa N-terminalno spojenim anti CD3 scFv 4.32.63 i necepivim GS linkerom (Sl.33D).

ID 8672: „aMezotelin 2+1 IgG, klasični format, MSLN napunjene varijante, ukršteni CD3 (anti idiotipski scFv 4.32.63 - MMP9 - MK062 matriptaza - CD3 - N-terminalno spojen na aMezotelin VH - inertni Fc) sa N-terminalno spojenim anti CD3 scFv 4.32.63 i MMP9 -062 matriptazom“ (Sl.33E, SEQ ID NO 77, 78, 81, 82).

ID 8673: „aMezotelin 2+1 IgG, klasični format, MSLN napunjene varijante, ukršteni CD3 (anti idiotipski scFv 4.32.63 - necepivi GS linker - CD3 - N-terminalno spojen na aMezotelin VH - inertni Fc) sa N-terminalno spojenim anti CD3 scFv 4.32.63 necepivim linkerom“ (Sl.33F).

ID 8674: „aMezotelin 2+1 IgG, klasični format, MSLN napunjene varijante, ukršteni CD3 (anti idiotipski scFv 4.32.63 - MMP9 - MK062 Matriptaza - CD3 - N-terminalno spojen na CD3 VH - inertni Fc) sa N-terminalno spojenim anti CD3 scFv 4.32.63 i MMP9 - MK062 Matriptazom“ (Sl.33G, SEQ ID NO 76, 77, 78, 79).

ID 8675: „aMezotelin 2+1 IgG, klasični format, MSLN napunjene varijante, ukršteni CD3 (anti idiotipski scFv 4.32.63 - necepivi GS linker - CD3 - N-terminalno spojen na CD3 VH - inertni Fc) sa N-terminalno spojenim anti CD3 scFv 4.32.63 i necepivim GS linkerom“ (Sl. 33H).

ID 8505: „aMezotelin 2+1 IgG, obrnuti format, MSLN napunjene varijante, CD3 (aMezotelin HC N-terminalno spojen na CD3 VL - inertni Fc)“ (Sl.33I).

ID 8676: „aMezotelin 2+1 IgG, klasični format, MSLN napunjene varijante, ukršteni

12

CD3 (aMezotelin IgG sa CD3 - N-terminalno spojen na aMezotelin VH - inertni Fc)“ (Sl.33J) Promenljivi domeni su potklonirani u okviru sa unapred umetnutim domenima u odgovarajući vektor ekspresije sisara primaoca. Ekspresiju proteina pokreće promoter MPSV, i sintetska poliA signalna sekvenca je prisutna na 3' kraju CDS. Pored toga, svaki vektor sadrži EBV OriP sekvencu.

Molekuli (osim 8505, ovaj molekul je proizveden kotransfekcijom CHO ćelija koje rastu u suspenziji sa vektorima ekspresije sisara. Prolazna transfekcija je urađena u Evitria AG (Švajcarska) i proizvedena kotransfekcijom HEK293-EBNA ćelija uzgajanih u suspenziji sa ekspresionim vektorima sisara, koristeći polietilenimin (PEI). Za transfekciju HEK293 EBNA ćelije su uzgajane u ExCell kulturi za uzgajanje bez seruma sa 6 mM L-glutaminom i 250 mg /l G418. Za proizvodnju u tubespin bocama od 600 ml (maksimalna radna zapremina 400 ml), 800 miliona ćelija HEK293 EBNA je zasejano 24 sata pre transfekcije bez G418. Za transfekciju, 800 miliona ćelija je centrifugirano 5 minuta na 210 x g, i supernatant je zamenjen sa 40 ml prethodno zagrejanog CD CHO medijuma koji sadrži 6 mM L-glutamin. Ekspresioni vektori su pomešani sa 40 ml CD CHO medijuma koji sadrži 6 mM L-glutamina do ukupne količine od 400 μg DNK. Nakon dodavanja 1080 μl rastvora PEI (2,7 μg/ml), smeša je mešana na vorteksu tokom 15 s, i zatim inkubirana 10 minuta na sobnoj temperaturi. Nakon toga, ćelije su pomešane sa rastvorom DNK/PEI, prebačene u tubespin bocu od 600 ml i inkubirane 3 sata na 37°C u inkubatoru, u atmosferi sa 5% CO2. Nakon inkubacije, dodato je 320 ml ExCell 6 mM L-glutamin 5 g/L Pepsoy 1,0 mM VPA 3 g/l glukoznog medijuma, i ćelije su kultivisane 24 sata pre dodavanja 7% Feed 7. Nakon 6-7 dana kultivacije supernatant je prikupljen za prečišćavanje centrifugiranjem 20-30 min na 210 x g (Sigma 8K centrifuge). Rastvor je sterilno filtriran (filter 0,22 µm) i dodat je natrijum azid u konačnoj koncentraciji od 0,01% m/m. Rastvor je čuvan na 4 °C do prečišćavanja.

Za afinitetnu hromatografiju, supernatant je nanet na kolonu Protein A MabSelectSure (CV = 5 ml, GE Healthcare) ekvilibrisanu sa 20 mM natrijum citrata, 20 mM natrijum fosfata, pH 7,5. Nevezani protein je uklonjen ispiranjem sa najmanje 10 zapremina kolone 20 mM natrijum citrata, 20 mM natrijum fosfata, pH 7,5 i ciljni protein je eluiran u 20 zapremina kolone (gradijent od 0% - 100%) 20 mM natrijum citrata, 100 mM natrijum citrata, 100 mM glicina, pH 3,0. Proteinski rastvor je neutralisan dodavanjem 1/10 0,5 M Na2HPO4 pH 8,0. Ciljni protein je koncentrovan pomoću Amicon®Ultra-15 Ultracel 30K (Merck Millipore Ltd.)

12

do maksimalne zapremine od 4 ml pre nanošenja na kolonu HiLoad Superdex 200 (GE Healthcare) ekvilibrisanu 20 mM histidinom, 140 mM NaCl, 0,01% Tween pH 6,0.

Ukupni sadržaj molekula je analiziran pomoću analitičke kolone za gel hromatografiju TSKgel G3000 SW XL (Tosoh) u radnom puferu 25 mM K2HPO4, 125 mM NaCl, 200 mM L-arginin monohidrohlorid, 0,02% (m/v) NaN3, pH 6,7 na 25 °C.

Konačni kvalitet svih molekula je bio dobar, sa ≥ 95% sadržaja monomera.

TABELA 4. Rezime proizvodnje i prečišćavanja molekula TCB aktiviranih proteazom.

Primer 16

Kontrola kvaliteta i stabilnost - kapilarna elektroforeza SDS analiza različitih molekula TCB.

Čistoća i molekulska masa molekula nakon završnog koraka prečišćavanja analizirani su CE-SDS analizama u prisustvu i odsustvu redukcionog sredstva. Caliper LabChip GXII sistem (Caliper lifescience) korišćen je prema uputstvu proizvođača. Poređenje netretiranih molekula (čuvanih na 4 °C), tretiranih molekula (tretiranih odgovarajućom rekombinantnom

12

proteazom (R&D Systems) tokom 24 h na 37 °C i molekula inkubiranog 72 h na 37 °C (Sl.34, 35A i 35B).

Poređenje netretiranog i tretiranog molekula pokazuje potpuno cepanje anti ID scFv nakon tretmana rhMatriptazom/ST14 za obrnuti format koji sadrži linker MK062 Matriptaze, ali nepotpuno cepanje linkera MMP9-MK062 Matriptaze. rhKatepsin B i rhKatepsin S tretman takođe nije kompletan. Uslovi za prečišćene enzime nisu bili optimalni.

Molekuli inkubirani na 37 °C tokom 72 sata funkcionišu na istom nivou kao čisti molekuli, što sugeriše da su molekuli stabilni na 37 °C za vreme trajanja in vitro testa. Prethodno obojeni protein marker Mark 12 (Invitrogen) korišćen je za procenu korektne molekulske mase.

Primer 17

Poređenje različitih linkera i formata FolR1 TCB aktiviranih proteazom Jurkat-NFAT test aktivacije. Jurkat NFAT test aktivacije za poređenje različitih formata i linkera proteazom aktiviranog TCB. Jurkat-NFAT reporterska ćelijska linija (Promega) je reporterska ćelijska linija humane akutne limfne leukemije sa NFAT promoterom, koja eksprimira humani CD3ε. Ako TCB vezuje ciljni tumor i CD3 vezivač (umrežavanje) vezuje CD3ε luciferazu, ekspresija se može meriti luminescencijom nakon dodavanja supstrata One-Glo (Promega).20.000 ciljnih ćelija zasejano je na ploču sa belim zidom i prozirnim dnom sa 96 bunarčića (Greiner BioOne) u 50 ul/bunarčiću Jurkat medijuma (RPMI1640, 2g/l glukoze, 2 g/l NaHCO3, 10% FCS, 25 mM HEPES, 2 mM L-glutamin, 1 x NEAA, 1 x natrijum piruvat) bez higromicina. Ploče su inkubirane oko 20 sati na 37 °C. Jurkat-NFAT reporterske ćelije su sakupljene i vijabilnost je procenjena korišćenjem ViCell. Ćelije su resuspendovane u Jurkatovom medijumu bez higromicina i dodato je 50 μl po bunarčiću (50.000 ćelija/bunarčiću). Odnos E:T je bio 2,5:1 (na osnovu broja zasejanih ćelija). Antitela su razblažena u Jurkatovom medijumu bez higromicina i dodato je 50 ul/bunarčiću. Ćelije su inkubirane na 37 °C tokom 6 h u vlažnom inkubatoru pre nego što su izvađene iz inkubatora na oko 10 min da bi se prilagodile sobnoj temperaturi pre čitanja luminescencije. 50 μl/bunarčiću rastvora ONE-Glo dodato je u bunarčiće i inkubirano 10 minuta na sobnoj temperaturi u mraku. Luminescencija je detektovana pomoću WALLAC Victor3 ELISA čitača (PerkinElmer2030), detekciono vreme 1 sekundi/bunarčiću. Poređenje prethodno tretiranog proteazom aktiviranog TCB (8364, sivi ispunjeni kvadrati) i FolR1 TCB (crni trouglovi usmereni prema dole) pokazalo je da se potentnost nakon cepanja potpuno oporavlja. Nijedna luminiscencija nije mogla biti detektovana za maskirane TCB (koji sadrže GS necepivi linker, sivi trouglovi usmereni prema gore) i neciljanu TCB kontrolu (prazan trougao usmeren prema

1

dole) za obe ćelijske linije u ovom opsegu koncentracije. Iscrtana linija pokazuje luminescenciju ciljnih ćelija i efektorskih ćelija bez ikakvog TCB (Sl.36A i 36B).

Primer 18

Citotoksičnost tumorskih ćelija posredovana različitim formatima TCB aktiviranog proteazom

Ubijanje T-ćelija posredovano proteazom aktiviranim TCB molekulima procenjeno je na različitim ćelijskim linijama koje ieksprimiraju različite nivoe FolR1. Ljudske mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) izolovane su iz frakcije leukocita i trombocita dobijene od zdravih humanih donatora. Frakcija leukocita i trombocita je razblažena 1:1 sterilnim PBS-om i raslojena putem gradijenta Histopaque (Sigma, br. H8889). Nakon centrifugiranja (450 x g, 30 minuta, bez pauze, sobna temperatura) međufaza koja sadrži PBMC preneta je u novu Falcon epruvetu koja je zatim napunjena sa 50 ml PBS-a. Smeša je centrifugirana (400 x g, 10 minuta, sobna temperatura), supernatant je odbačen i pelet PBMC je resuspendovan u 2 ml ACK pufera za lizu eritrocita. Nakon inkubacije tokom oko 2-3 minuta na 37 °C, epruvete su napunjene sterilnim PBS-om do 50 ml i centrifugirane 10 minuta na 350 x g. Ovaj korak ispiranja ponovljen je jednom pre resuspenzije PBMC-a u medijumu RPMI1640 koji sadrži 10% FCS, 1X GlutaMaX i 10% DMSO. PBMC su polako zamrznute u kontejnerima za zamrzavanje ćelija CoolCell® (BioCission) na -80 °C, a zatim prebačene u tečni azot. Jedan dan pre početka testa, adherentne ciljne ćelije sakupljene su tripsinom/EDTA, prebrojane, proverena im je vijabilnost i resuspendovane su u test medijumu (RPMI1640, 2% FCS, 1X GlutaMaX). Ciljne ćelije su postavljene na ploču pri gustini od 20.000 ćelija/bunarčiću koristeći ploče sa ravnim dnom sa 96 bunarčića i inkubirane oko 20 h na 37 °C u vlažnom inkubatoru. Oko 20 h pre početka testa, PBMC su odmrznute u medijumu RPMI1640 (10% FCS, 1X GlutaMax). PBMC su centrifugirane na 350 g tokom 7 min. Pelet je resuspendovan u svežem medijumu (RPMI1640, 10% FCS, 1X GlutaMax) i inkubiran maksimalno 24 h na 37 °C u vlažnom inkubatoru. Na dan početka testa, PBMC su sakupljene i centrifugirane na 350 g tokom 7 min. Pelet je resuspendovan u test medijumu, a 0,2 miliona PBMC u 100 ul/bunarčiću (E:T 10:1, na osnovu broja zasejanih ciljnih ćelija) dodato je ciljnim ćelijama. Molekuli su razblaženi u test medijumu (RPMI1640, 2% FCS, 1X GlutaMax) i dodato je 50 ul/bunarčiću u naznačenim koncentracijama u tri primerka pre nego što su ploče inkubirane oko 48 h na 37 °C u vlažnom inkubatoru. Ubijanje ciljnih ćelija je procenjeno nakon 48 h inkubacije na 37 °C, 5% CO2, kvantifikacijom LDH oslobođenog u ćelijske supernatante od strane apoptotičnih/nekrotičnih ćelija (komplet za detekciju LDH, Roche Applied Science, br. 11 644 793 001). Maksimalna liza ciljnih ćelija (= 100%) postignuta je inkubacijom ciljnih

1 1

ćelija sa 1% Triton X-10020 h pre očitavanja LDH. Minimalna liza (= 0%) odnosi se na ciljne ćelije koinkubirane sa efektorskim ćelijama bez TCB.

Rezultati (Sl.37A i 37B) pokazuju poređenje dva različita formata TCB-a aktiviranih proteazom koji sadrže anti idiotipski CD3 scFv 4.32.63 povezan sa MK062 matriptaza linkerom. Čini se da je obrnuti format TCB aktiviranog proteazom (8365, sivi krugovi) potentniji u ubijanju (ciljne ćelije HeLa i Skov-3) od klasičnog formata TCB aktiviranog proteazom (8408, tamnosivi trouglovi usmereni prema gore). Međutim, invertovani molekul koji sadrži necepivi linker (8366, svetlosivi kvadrati) je manje efikasan u maskiranju od klasičnog molekula (8409, tamnosivi trouglovi okrenuti prema dole).

SL. 37C Citotoksičnost ciljnih HeLa ćelija. Poređenje klasičnog TCB aktiviranog proteazom koji sadrži anti idiotipske CD3 scFv 4.32.63 i GS linkere sa različitim mestima proteaze. TCB aktiviran proteazom koji sadrži MK062 linker MMP9-matriptaze (8364, sivi kvadrati) dostiže potentnost FolR1 TCB (svetlosivi trouglovi usmereni prema dole) dok je TCB aktiviran proteazom koji sadrži samo matriptazu MK062 (svetlosivi romb) manje potentan u ubijanju HeLa ćelija. Molekuli koji sadrže mesto katepsina (sivi krugovi) ili necepivi linker (crni trouglovi koji pokazuju nadole) su uporedivi.

SL. 37D Citotoksičnost Skov-3 ciljne ćelije. Poređenje klasičnog TCB aktiviranog proteazom koji sadrži anti idiotipske CD3 scFv 4.32.63 i GS linkere sa različitim mestima proteaze. TCB aktiviran proteazom koji sadrži MK062 linker MMP9-matriptaze (8364, sivi kvadrati) skoro dostiže potentnost FolR1 TCB (svetlosivi trouglovi usmereni prema dole) dok je TCB aktiviran proteazom koji sadrži samo matriptazu MK062 (svetlosivi romb) manje potentan u ubijanju Skov-3 ćelija. Molekul koji sadrži mesto katepsina (sivi krugovi) je manje potentan od molekula koji sadrži samo mesto matriptaze MK062, a molekul koji sadrži necepivi linker (crni trouglovi usmereni prema dole) samo indukuje ubijanje ispod 10% u naznačenom opsegu koncentracije za Skov-3 ćelije.

Primer 19

Aktivacija T-ćelija nakon koinkubacije humanih bubrežnih epitelnih kortikalnih ćelija ili humanih bronhijalnih epitelnih ćelija sa TCB-om i humanim PBMC

Aktivacija T-ćelija posredovana proteazom aktiviranim TCB molekulima procenjena je za HRCEpi (humane bubrežne kortikalne epitelne ćelije) i HBEpiC (humane bronhijalne epitelne ćelije koje eksprimiraju samo male količine FolR1. Humane PBMC korišćene su kao efektorske ćelije, i markeri aktivacije T ćelija obojeni su nakon 48 h inkubacije sa molekulima i ćelijama. Ljudske mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) izolovane su iz frakcije leukocita i trombocita dobijene od zdravih humanih donatora. Frakcija leukocita i trombocita

1 2

je razblažena 1:1 sterilnim PBS-om i raslojena putem gradijenta Histopaque (Sigma, br. H8889). Nakon centrifugiranja (450 x g, 30 minuta, bez pauze, sobna temperatura) međufaza koja sadrži PBMC preneta je u novu Falcon epruvetu koja je zatim napunjena sa 50 ml PBS-a. Smeša je centrifugirana (400 x g, 10 minuta, sobna temperatura), supernatant je odbačen i pelet PBMC je resuspendovan u 2 ml ACK pufera za lizu eritrocita. Nakon inkubacije tokom oko dva minuta na 37 °C, epruvete su napunjene sterilnim PBS-om do 50 ml i centrifugirane 10 minuta na 350 x g. Ovaj korak ispiranja ponovljen je jednom pre resuspenzije PBMC-a u medijumu RPMI1640 koji sadrži 10% FCS, 21 X GlutaMax i 10% DMSO. PBMC su polako zamrznute u kontejnerima za zamrzavanje ćelija CoolCell® (BioCission) na -80 °C, a zatim prebačene u tečni azot. Jedan dan pre početka testa, adherentne ciljne ćelije su sakupljene tripsinom/EDTA, prebrojane, proverena im je vijabilnost i resuspendovane su u test medijumu (RPMI1640, 2% FCS, 1 X GlutaMax). Ciljne ćelije su postavljene na ploču pri gustini od 20.000 ćelija/bunarčiću koristeći ploče sa ravnim dnom sa 96 bunarčića i inkubirane oko 20 h na 37 °C u vlažnom inkubatoru. Oko 20 h pre početka testa, PBMC su odmrznute u medijumu RPMI1640 (10% FCS, 1 X GlutaMax). PBMC su centrifugirane 7 min na 350 g. Pelet je resuspendovan u svežem medijumu (RPMI1640, 10% FCS, 1 X GlutaMaX) i inkubiran tokom maksimalno 24 h na 37 °C u vlažnom inkubatoru. Na dan početka testa, PBMC su sakupljene i centrifugirane tokom 7 minuta na 350 g. Pelet je resuspendovan u test medijumu i 0,2 miliona PBMC u 100 ul/bunarčiću(E:T 10:1, na osnovu broja zasejanih ciljnih ćelija) dodato je ciljnim ćelijama. Molekuli su razblaženi u test medijumu (RPMI1640, 2% FCS, 1 X GlutaMax) i dodati u naznačenim koncentracijama u tri primerka pre nego što su ploče inkubirane oko 48 h na 37 °C u vlažnom inkubatoru.

Aktivacija T-ćelija procenjena je nakon 48 h inkubacije na 37 °C, 5% CO2, kvantifikacijom CD25 i CD69 na CD4 pozitivnim i CD8 pozitivnim T ćelijama. FolR116D5 TCB (6298) i neciljani TCB (vezivanje za CD3, ali ne i za antigen ciljne ćelije, 7235) uključeni su kao kontrole. Svaka tačka predstavlja srednju vrednost triplikata tri različita ljudska donora PBMC-a. Standardna devijacija označena je intervalom greške. Za statističku analizu korišćen je nespareni t test. Rezultati pokazuju povećanje CD69 za CD8 pozitivne ćelije za FolR1 TCB koji je značajno veći od srednjeg intenziteta fluorescencije za proteazom aktivirane TCB (Sl 38A i 38B).

Primer 20

Citotoksičnost tumorskih ćelija posredovana različitim formatima proteazom aktiviranog mezotelin (MSLN) TCB-a

Ubijanje T-ćelija posredovano proteazom aktiviranim TCB molekulima procenjeno je

1

na različitim ćelijskim linijama koje eksprimiraju različite nivoe mezotelina (MSLN). Ljudske mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) izolovane su iz frakcije leukocita i trombocita dobijene od zdravih humanih donatora. Frakcija leukocita i trombocita je razblažena 1:1 sterilnim PBS-om i raslojena putem gradijenta Histopaque (Sigma, br. H8889). Nakon centrifugiranja (450 x g, 30 minuta, bez pauze, sobna temperatura) međufaza koja sadrži PBMC preneta je u novu Falcon epruvetu koja je zatim napunjena sa 50 ml PBS-a. Smeša je centrifugirana (400 x g, 10 minuta, sobna temperatura), supernatant je odbačen i pelet PBMC je resuspendovan u 2 ml ACK pufera za lizu eritrocita. Nakon inkubacije tokom oko dva minuta na 37 °C, epruvete su napunjene sterilnim PBS-om do 50 ml i centrifugirane 10 minuta na 350 x g. Ovaj korak ispiranja ponovljen je jednom pre resuspenzije PBMC-a u medijumu RPMI1640 koji sadrži 10% FCS, 21 X GlutaMax i 10% DMSO. PBMC su polako zamrznute u kontejnerima za zamrzavanje ćelija CoolCell® (BioCission) na -80 °C, a zatim prebačene u tečni azot. Adherentne ciljne ćelije sakupljene su tripsinom/EDTA, prebrojane, proverena im je vijabilnost i resuspendovane su u test medijumu (RPMI1640, 2% FCS, 1 X GlutaMax) jedan dan pre početka testa. Ciljne ćelije su postavljene na ploču pri gustini od 20.000 ćelija/bunarčiću koristeći ploče sa ravnim dnom sa 96 bunarčića i inkubirane oko 20 h na 37 °C u vlažnom inkubatoru. PBMC su odmrznute u medijumu RPMI1640 (10% FCS, 1 X GlutaMax) oko 20 h pre početka testa. PBMC su centrifugirane 7 min na 350 g. Pelet je resuspendovan u svežem medijumu (RPMI1640, 10% FCS, 1 X GlutaMaX) i inkubiran tokom maksimalno 24 h na 37 °C u vlažnom inkubatoru. Na dan početka testa, PBMC su sakupljene i centrifugirane tokom 7 minuta na 350 g. Pelet je resuspendovan u test medijumu i 0,2 miliona PBMC u 100 ul/bunarčiću(E:T 10:1, na osnovu broja zasejanih ciljnih ćelija) dodato je ciljnim ćelijama. Molekuli su razblaženi u test medijumu (RPMI1640, 2% FCS, 1 X GlutaMax) i dodati u naznačenim koncentracijama u tri primerka pre nego što su ploče inkubirane oko 48 h na 37 °C u vlažnom inkubatoru. Ubijanje ciljnih ćelija je procenjeno nakon 48 h inkubacije na 37 °C, 5% CO2, kvantifikacijom LDH oslobođenog u ćelijske supernatante od strane apoptotičnih/nekrotičnih ćelija (komplet za detekciju LDH, Roche Applied Science, br.11644 793 001). Maksimalna liza ciljnih ćelija (= 100%) postignuta je inkubacijom ciljnih ćelija sa 1% Triton X-10020 h pre očitavanja LDH. Minimalna liza (= 0%) odnosi se na ciljne ćelije koinkubirane sa efektorskim ćelijama bez TCB.

Rezultati (Sl. 39A i 39B) pokazuju ubijanje ciljnih ćelija posredovano proteazom aktiviranim MSLN TCB (8672) za ćelijske linije NCI H596 i AsPC-1. TCB-ovi aktivirani proteazom skoro dostižu potentnost MSLN TCB (8676) za NCI H596 i AsPC-1. Molekul koji sadrži necepivi GS linker (8673) ne indukuje ubijanje u naznačenom opsegu koncentracije za

1 4

obe ćelijske linije.

Primer 21

Jurkat-NFAT reporterski test za praćenje ciljne ekspresije (FolR1 TCB) i aktivnosti proteaze (proteazom aktivirani FolR1 TCB) u primarnim uzorcima tumora Namera ovog testa bila je da pokaže ekspresiju tumorskog ciljnog antigena (FolR1) i aktivnost proteaza specifičnih za tumor poput MMP9, matriptaze ili katepsina u uzorcima humanog tumora.

Jurkat-NFAT reporterska ćelijska linija (Promega) je reporterska ćelijska linija humane akutne limfne leukemije sa NFAT promoterom, koja eksprimira humani CD3ε. Ekspresija luciferaze se može meriti ako bispecifični molekul T ćelije vezuje ciljni tumor i CD3ε (umrežavanje). Luminescencija se meri nakon dodavanja One-Glo supstrata (Promega).

Primarni uzorci tumora dobijeni su od kompanije Indivumed GmbH, Nemačka. Uzorci su isporučeni preko noći u transportnom medijumu. Oko 24 h nakon operacije, uzorak je isečen u male komadiće. Ravna (providna) donja ploča sa 96 bunarčića belih zidova je pripremljena dodavanjem 18 ul hladnog matrigela (Matrigel (734-1101, Corning/VWR). Ploča je inkubirana 2 min na 37 °C pre nego što su dodati komadići tumora (triplikati). 33 ul hladnog matrigela dodato je po bunarčiću i ploča je ponovo inkubirana tokom 2 min na 37 °C.50 ul razblaženog antitela (u Jurkatovom medijumu bez higromicina ali sadrži 2X penicilin/streptomicin) dodato je po bunarčiću i pločica je inkubirana oko 48 sati na 37 °C, 5% CO2.

Sakupljene su Jurkat-NFAT reporterske ćelije i procenjena je vijabilnost pomoću ViCell-a. Ćelije su centrifugirane na 350 x g, 7 minuta pre nego što su resuspendovane u Jurkatovom medijumu bez higromicina i dodato je 50 μl po bunarčiću (50.000 ćelija/bunarčiću). Pločica je inkubirana 5 h na 37 °C u vlažnom inkubatoru pre nego što je izvađena za čitanje luminescencije. 80 ul iz svakog bunarčića prebačeno je na ploču sa 96 bunarčića belih zidova. 27 μl/bunarčiću rastvora ONE-Glo dodato je u svaki bunarčić i inkubirano 10 minuta na sobnoj temperaturi u mraku. Luminescencija je detektovana pomoću WALLAC Victor3 ELISA čitača (PerkinElmer2030), detekciono vreme 1 sekundi/bunarčiću. Jurkat NFAT reporterske ćelije se aktiviraju nakon koinkubacije sa FolR1 TCB (6298) i FolR1 TCB aktiviranim proteazom koji sadrži mesto cepanja MMP9-matriptaze (8364). FolR1 TCB aktivirani proteazom (8363, 8408) i kontrolni TCB (8409, 7235) ne indukuju ekspresiju luciferaze. Tačkasta linija označava osnovnu luminescenciju za Jurkat NFAT ćelije koinkubirane sa tumorom (Sl.40).

Primer 22

Serumska stabilnost TCB-a aktiviranih proteazom

1

Kapilarna elektroforeza TCB aktiviranih proteazom nakon inkubacije u humanom serumu.

Molekuli su inkubirani 0 ili 14 dana u humanom serumu osiromašenom sa IgG na 37 °C u vlažnom inkubatoru (5% CO2). Svi molekuli su prečišćeni afinitetnom hromatografijom (proteinA), a zatim analizirani kapilarnom elektroforezom.

100 ug svakog molekula je dodato bilo u puferu (histidinski pufer (Bichsel) sa 0,01% Tween-20) ili u humanom serumu (IgG osiromašeni, SP1839, TL-15216, 16FSP63814). Koncentracija molekula bila je veća od 2 mg/ml, a konačna koncentracija je bila 0,5 mg/ml. Predtretman za jedan molekul (8408) urađen je rhMatriptazom (R&D Systems) tokom 24 sata na 37 °C, 5% CO2 u vlažnom inkubatoru (inače pH seruma može da se promeni). Uzorci za 0. dan su direktno zamrznuti u tečnom azotu i čuvani na -80 °C do analize. Uzorci za 14. dan inkubirani su 14 dana na 37 °C, 5% CO2 u vlažnom inkubatoru dok nisu takođe naglo zamrznuti.

Pre CE-SDS analize svi uzorci su prečišćeni putem HPLC afinitetne hromatografije (Agilent technologies 1200series, kolona: Upchurch scientific C-130B, materijal za pakovanje: Applied Biosystems POROS 20A 60 μl, pufer: 10 mM Tris, 50 mM glicin, 500 mM NaCl pH 8,0 i pH 2,0, zapremina ubrizgavanja: 100 μl, protok 1 ml/min, sakupljanje: na bazi pika, neutralizacija: 0,5 M Na fosfat pH 8,010% zapremine). TCB aktiviran proteazom je stabilan u humanom serumu osiromašenom sa IgG najmanje 14 dana (Sl.41A-C).

Primer 23

Dizajn anti Her2/anti-CD3 i antiFolR1/anti-CD3 T ćelijskih bispecifičnih (TCB) molekula sa anti-CD3-scFv

Nekoliko T ćelijskih bispecifičnih (TCB) molekula je dizajnirano, i šematski prikazano na Sl.42A-F sa odgovarajućim identifikacionim brojem. Dizajnirani su sledeći molekuli:

ID 8955: „Herceptarg 2+1 IgG, klasični format, herceptarg naelektrisane varijante, ukršteni CD3 (anti idiotipski scFv 4.32.63 - MMP9 - MK062 atriptaza - CD3 - N-terminalno spojen na herceptarg VH - inertni Fc) sa N-terminalno spojenim anti CD3 scFv 4.32.63 i MMP9 - MK062 matripaza“ (Sl.42A, SEQ ID NO 81, 132, 133 i 136).

ID 8957: „Herceptarg 2+1 IgG, klasičnog formata, herceptarg naelektrisane varijante, ukršteni CD3 (anti idiotipski scFv 4.32.63 - necepljivi GS linker - CD3 - N-terminalno spojen na herceptarg VH - inertni Fc) sa N-terminalno spojenim anti CD3 scFv 4.32.63 i necepljivim GS linkerom“ (Sl.42B, SEQ ID NO 81, 132, 133 i 135).

ID 8959: „Herceptarg 2+1 IgG, klasičnog formata, herceptarg naelektrisane varijante, ukršteni CD3 (herceptarg IgG sa CD3 - N-terminalno spojen na herceptarg VH - inertni Fc)“

1

(Sl. 42C, SEQ ID NO 81, 132, 133 i 134).

ID 8997: „FolR1 36F2 2+1 IgG, klasični format, FolR1 36F2 naelektrisane varijante, ukršteni CD3 (anti idiotipski scFv 4.32.63 - MMP9 - MK062 matriptaza - CD3 - N-terminalno spojen na FolR1 36F2 VH - inertni Fc) sa N-terminalno spojenim anti CD3 scFv 4.32.63 i MMP9 - MK062 matriptaza“ (Sl.42D, SEQ ID NO 81, 137, 138 i 139).

ID 8998: „FolR1 36F2 2+1 IgG, klasični format, FolR1 36F2 naelektrisane varijante, ukršteni CD3 (anti idiotipski scFv 4.32.63 - necepljivi GS linker - CD3 - N-terminalno spojen na FolR136F2 VH - inertni Fc) sa N-terminalno spojenim anti CD3 scFv 4.32.63 i necepljivim GS linkerom“ (Sl.42E, SEQ ID NO 81, 137, 138 i 140).

ID 8996: „FolR136F2 2+1 IgG, klasičan format, FolR136F2 naelektrisane varijante, ukršteni CD3 (FolR136F2 IgG sa CD3 - N-terminalno spojen na FolR136F2 VH - inertni Fc)“ (Sl. 42F, SEQ ID NO 81, 137, 138 i 141).

Promenljivi domeni su potklonirani u okviru sa unapred umetnutim domenima u odgovarajući vektor ekspresije sisara primaoca. Ekspresiju proteina pokreće MPSV ili CMV (za herceptarg) promoter, i sintetska poliA signalna sekvenca je prisutna na 3' kraju CDS. Pored toga, svaki vektor sadrži EBV OriP sekvencu.

Primer 24

Primarna ćelijska citotoksičnost posredovana proteazom aktiviranim FolR1 TCB Ubijanje T-ćelija posredovano proteazom aktiviranim FlR1 TCB molekulom procenjeno je na primarnim ćelijskim linijama koje izražavaju niske nivoe FolR1 (Sl. 43). Ljudske mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) izolovane su iz frakcije leukocita i trombocita dobijene od zdravih humanih donara. Frakcija leukocita i trombocita je razblažena 1:1 sterilnim PBS-om i raslojena putem gradijenta Histopaque (Sigma, br. H8889). Nakon centrifugiranja (450 x g, 30 minuta, bez pauze, sobna temperatura) međufaza koja sadrži PBMC preneta je u novu Falcon epruvetu koja je zatim napunjena sa 50 ml PBS-a. Smeša je centrifugirana (400 x g, 10 minuta, sobna temperatura), supernatant je odbačen i pelet PBMC je resuspendovan u 2 ml ACK pufera za lizu eritrocita. Nakon inkubacije tokom oko 2-3 minuta na 37 °C, epruvete su napunjene sterilnim PBS-om do 50 ml i centrifugirane 10 minuta na 350 x g. Ovaj korak ispiranja ponovljen je jednom pre resuspenzije PBMC-a u medijumu RPMI1640 koji sadrži 10% FCS, 1X GlutaMaX i 10% DMSO. PBMC su polako zamrznute u kontejnerima za zamrzavanje ćelija CoolCell® (BioCission) na -80 °C, a zatim prebačene u tečni azot. Jedan dan pre početka testa, adherentne ciljne ćelije sakupljene su tripsinom/EDTA, prebrojane, proverena im je vijabilnost i resuspendovane su u test medijumu (RPMI1640, 2% FCS, 1X GlutaMaX). Ciljne ćelije su postavljene na ploču pri gustini od 20.000

1

ćelija/bunarčiću koristeći ploče sa ravnim dnom sa 96 bunarčića i inkubirane oko 20 h na 37 °C u vlažnom inkubatoru. Oko 20 h pre početka testa, PBMC su odmrznute u medijumu RPMI1640 (10% FCS, 1X GlutaMax). PBMC su centrifugirane na 350 g tokom 7 min. Pelet je resuspendovan u svežem medijumu (RPMI1640, 10% FCS, 1X GlutaMax) i inkubiran maksimalno 24 h na 37 °C u vlažnom inkubatoru. Na dan početka testa, PBMC su sakupljene i centrifugirane na 350 g tokom 7 min. Pelet je resuspendovan u test medijumu, a 0,2 miliona PBMC u 100 ul/bunarčiću (E:T 10:1, na osnovu broja zasejanih ciljnih ćelija) dodato je ciljnim ćelijama. Molekuli su razblaženi u test medijumu (RPMI1640, 2% FCS, 1 X GlutaMax) i dodato je 50 ul/bunarčiću u naznačenim koncentracijama u tri primerka pre nego što su ploče inkubirane oko 48 h, 72 h ili 96 h na 37 °C u vlažnom inkubatoru. Ubijanje ciljnih ćelija je procenjeno nakon 48 h, 72 h i 96 h inkubacije na 37 °C, 5% CO2, kvantifikacijom LDH oslobođenog u ćelijske supernatante od strane apoptotičnih/nekrotičnih ćelija (komplet za detekciju LDH, Roche Applied Science, br.11644 793 001). Maksimalna liza ciljnih ćelija (= 100%) postignuta je inkubacijom ciljnih ćelija sa 1% Triton X-10020 h pre očitavanja LDH. Minimalna liza (= 0%) odnosi se na ciljne ćelije koinkubirane sa efektorskim ćelijama bez TCB.

Toksičnost humanih bronhijalnih epitelnih ćelija posredovana humanim PBMC-ima i 100 nM ili 10 nM FolR1 TCB veća je u poređenju sa TCB aktiviranim proteazom.

Primer 25

FolR1 negativna citotoksičnost ciljnih ćelija posredovana proteazom aktiviranim FolR1 TCB

Ubijanje T-ćelija posredovano proteazom aktiviranim molekulom FolR1 TCB procenjeno je na FolR1 negativnoj Mkn-45 ćelijskoj liniji (Sl. 44). Ljudske mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) izolovane su iz frakcije leukocita i trombocita dobijene od zdravih humanih donatora. Frakcija leukocita i trombocita je razblažena 1:1 sterilnim PBS-om i raslojena putem gradijenta Histopaque (Sigma, br. H8889). Nakon centrifugiranja (450 x g, 30 minuta, bez pauze, sobna temperatura) međufaza koja sadrži PBMC preneta je u novu Falcon epruvetu koja je zatim napunjena sa 50 ml PBS-a. Smeša je centrifugirana (400 x g, 10 minuta, sobna temperatura), supernatant je odbačen i pelet PBMC je resuspendovan u 2 ml ACK pufera za lizu eritrocita. Nakon inkubacije tokom oko 2-3 minuta na 37 °C, epruvete su napunjene sterilnim PBS-om do 50 ml i centrifugirane 10 minuta na 350 x g. Ovaj korak ispiranja ponovljen je jednom pre resuspenzije PBMC-a u medijumu RPMI1640 koji sadrži 10% FCS, 1X GlutaMaX i 10% DMSO. PBMC su polako zamrznute u kontejnerima za zamrzavanje ćelija CoolCell® (BioCission) na -80 °C, a zatim prebačene u tečni azot. Jedan dan pre početka

1

testa, adherentne ciljne ćelije sakupljene su tripsinom/EDTA, prebrojane, proverena im je vijabilnost i resuspendovane su u test medijumu (RPMI1640, 2% FCS, 1X GlutaMaX). Ciljne ćelije su postavljene na ploču pri gustini od 20.000 ćelija/bunarčiću koristeći ploče sa ravnim dnom sa 96 bunarčića i inkubirane oko 20 h na 37 °C u vlažnom inkubatoru. Oko 20 h pre početka testa, PBMC su odmrznute u medijumu RPMI1640 (10% FCS, 1X GlutaMax). PBMC su centrifugirane na 350 g tokom 7 min. Pelet je resuspendovan u svežem medijumu (RPMI1640, 10% FCS, 1X GlutaMax) i inkubiran maksimalno 24 h na 37 °C u vlažnom inkubatoru. Na dan početka testa, PBMC su sakupljene i centrifugirane na 350 g tokom 7 min. Pelet je resuspendovan u test medijumu, a 0,2 miliona PBMC u 100 ul/bunarčiću (E:T 10:1, na osnovu broja zasejanih ciljnih ćelija) dodato je ciljnim ćelijama. Molekuli su razblaženi u test medijumu (RPMI1640, 2% FCS, 1 X GlutaMax) i dodato je 50 ul/bunarčiću u naznačenim koncentracijama u tri primerka pre nego što su ploče inkubirane oko 48 h ili 72 h na 37 °C u vlažnom inkubatoru. Ubijanje ciljnih ćelija je procenjeno nakon 48 h, 72 h i 96 h inkubacije na 37 °C, 5% CO2, kvantifikacijom LDH oslobođenog u ćelijske supernatante od strane apoptotičnih/nekrotičnih ćelija (komplet za detekciju LDH, Roche Applied Science, br.11 644 793 001). Maksimalna liza ciljnih ćelija (= 100%) postignuta je inkubacijom ciljnih ćelija sa 1% Triton X-10020 h pre očitavanja LDH. Minimalna liza (= 0%) odnosi se na ciljne ćelije koinkubirane sa efektorskim ćelijama bez TCB. TCB aktiviran proteazom nije izazvao ubijanje ciljnih ćelija pri 100 nM.

PRIMERI ZA SEKVENCE

1

14

1

11

12

1

14

1

11

12

1

14

1

11

12

1

14

1

11

12

1

14

1

Iako je pronalazak koji prethodi opisan prilično detaljno pomoću ilustracija i primera za lakše razumevanje, opise i primere ne treba tumačiti kao ograničenja za opseg primene ovog pronalaska.

1

LISTA SEKVENCI

<110> F.Hoffmann-La Roche Ltd

<120> Bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom

<130> P33331

<160> 170

<170> Verzija PatentIn 3,5

<210> 1

<211> 215

<212> PRT

<213> Himerno

<400> 1

1

�

<211> 971 <212> PRT <213> Himerno

<400> 2

1

�

11

��

�

<211> 450 <212> PRT <213> Himerno

<400> 3

14

�

<211> 971 <212> PRT <213> Himerno

<400> 4

1

�

21

22

<212> PRT <213> Himerno <400> 5

2

��

�

<211> 971 <212> PRT

2

<213> Himerno <400> 6

2

21

<211> 33 <212> PRT <213> Himerno

<400> 7

<211> 28 <212> PRT <213> Himerno

<400> 8

<210> 9 <211> 41 <212> PRT <213> Himerno

<400> 9

<210> 10 <211> 36 <212> PRT

21

<213> Himerno

<400> 10

<210> 11 <211> 5 <212> PRT <213> Himerno

<400> 11

<210> 12 <211> 19 <212> PRT <213> Himerno

<400> 12

<210> 13 <211> 14 <212> PRT <213> Himerno

21

<210> 14 <211> 5 <212> PRT <213> Himerno

<400> 14

<210> 15 <211> 19 <212> PRT <213> Himerno

<400> 15

<210> 16 <211> 9 <212> PRT <213> Himerno

<400> 16

<210> 17 <211> 14 <212> PRT <213> Himerno

21

<210> 18 <211> 7 <212> PRT <213> Himerno

<400> 18

<210> 19 <211> 9 <212> PRT <213> Himerno

<400> 19

<210> 20 <211> 5 <212> PRT <213> Himerno

<400> 20

<210> 21 <211> 17 <212> PRT <213> Himerno

<400> 21

21

<211> 9 <212> PRT <213> Himerno

<400> 22

<210> 23 <211> 15 <212> PRT <213> Himerno

<400> 23

<210> 24 <211> 7 <212> PRT <213> Himerno

<400> 24

<210> 25 <211> 9 <212> PRT <213> Himerno

<400> 25

21

<211> 5 <212> PRT <213> Himerno

<400> 26

<210> 27 <211> 16 <212> PRT <213> Himerno

<400> 27

<210> 28 <211> 14 <212> PRT <213> Himerno

<400> 28

<210> 29 <211> 11 <212> PRT <213> Himerno

<400> 29

22

<211> 7 <212> PRT <213> Himerno

<400> 30

<210> 31 <211> 9 <212> PRT <213> Himerno

<400> 31

<210> 32 <211> 450 <212> PRT <213> Himerno

<400> 32

22

<211> 213 <212> PRT <213> Himerno

<400> 33

22

<211> 492 <212> PRT <213> Himerno

<400> 34

22

<211> 35 <212> PRT <213> Himerno

<400> 35

<210> 36 <211> 8 <212> PRT

22

<213> Himerno

<400> 36

<210> 37

<211> 18

<212> PRT

<213> Himerno

<400> 37

<210> 38

<211> 21

<212> PRT

<213> Himerno

<220>

<221> X

<222> (9)..(13)

<223> X je aminokiselina

<220>

<221> X

<222> (9)..(13)

<223> X ili Xaa je aminokiselina

<400> 38

2

<211> 16 <212> PRT <213> Himerno

<400> 39

<210> 40 <211> 7 <212> PRT <213> Himerno

<400> 40

<210> 41 <211> 249 <212> PRT <213> Himerno

<400> 41

2 1

22

<211> 249 <212> PRT <213> Himerno

<400> 42

2

��

<211> 125 <212> PRT <213> Himerno

<400> 43

2

<211> 5 <212> PRT <213> Himerno

<400> 44

<210> 45 <211> 19 <212> PRT <213> Himerno

2

<210> 46 <211> 14 <212> PRT <213> Himerno

<400> 46

<210> 47 <211> 120 <212> PRT <213> Himerno

<400> 47

2

<211> 5 <212> PRT <213> Himerno

<400> 48

<210> 49 <211> 17 <212> PRT <213> Himerno

<400> 49

2

<211> 8 <212> PRT <213> Himerno

<400> 50

<210> 51 <211> 11 <212> PRT <213> Himerno

<400> 51

<210> 52 <211> 7 <212> PRT <213> Himerno

<400> 52

<210> 53 <211> 9 <212> PRT <213> Himerno

2

<210> 54

<211> 207

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 54

24

<212> PRT <213> Himerno

<400> 55

<210> 56 <211> 5 <212> PRT <213> Himerno

<400> 56

<210> 57 <211> 17 <212> PRT

<213> Himerno

<400> 57

<210> 58 <211> 11 <212> PRT <213> Himerno

<400> 58

<210> 59 <211> 11 <212> PRT <213> Himerno

<400> 59

<210> 60 <211> 7 <212> PRT <213> Himerno

<400> 60

<210> 61 <211> 8 <212> PRT

24

<213> Himerno

<400> 61

<210> 62 <211> 648 <212> DNK <213> Himerno

<400> 62

<211> 2916 <212> DNA <213> Himerno

<400> 63

24

��

<211> 1353 <212> DNA <213> Himerno

<400> 64

24

��

<211> 2916 <212> DNA <213> Himerno

<400> 65

2

21

22

�

<211> 2916 <212> DNA <213> Himerno

<400> 66

24

�

<211> 2916 <212> DNA <213> Himerno

<400> 67

2

�

21

<212> DNA <213> Himerno

<400> 68

<210> 69 <211> 1350 <212> DNA <213> Himerno

<400> 69

2 2

�

<211> 639 <212> DNA <213> Himerno

<400> 70

24

<211> 1476 <212> DNA <213> Himerno

<400> 71

2

�

<211> 971 <212> PRT <213> Himerno

<400> 72

2

�

21

<211> 689 <212> PRT

22

<213> Himerno <400> 73

2

��

�

<211> 497 <212> PRT <213> Himerno

<400> 74

2

�

<211> 497 <212> PRT <213> Himerno

<400> 75

2

21

22

<211> 674 <212> PRT <213> Himerno

<400> 76

2

��

�

<211> 449 <212> PRT <213> Himerno

<400> 77

2

�

<211> 213 <212> PRT <213> Himerno

<400> 78

2

21

<211> 514 <212> PRT <213> Himerno

<400> 79

22

�

��

<211> 514 <212> PRT <213> Himerno

<400> 80

2

�

<211> 232 <212> PRT <213> Himerno

<400> 81

2

�

<211> 956 <212> PRT <213> Himerno

<400> 82

�

<211> 956 <212> PRT

<213> Himerno

<400> 83

�

<211> 674 <212> PRT <213> Himerno

<400> 84

11

��

�

��

<211> 971 <212> PRT <213> Himerno

<400> 85

1

�

<211> 33 <212> PRT <213> Himerno

<400> 86

2

<211> 35 <212> PRT <213> Himerno

<400> 87

<210> 88 <211> 33 <212> PRT <213> Himerno

<400> 88

<210> 89 <211> 33

21

<212> PRT <213> Himerno

<400> 89

<210> 90 <211> 33 <212> PRT <213> Himerno

<400> 90

<210> 91 <211> 33 <212> PRT <213> Himerno

<400> 91

22

<211> 33 <212> PRT <213> Himerno

<400> 92

<210> 93 <211> 33 <212> PRT <213> Himerno

<400> 93

<210> 94 <211> 33 <212> PRT

2

<213> Himerno

<400> 94

<210> 95 <211> 33 <212> PRT <213> Himerno

<400> 95

<210> 96 <211> 33 <212> PRT <213> Himerno

<400> 96

24

<211> 18 <212> PRT <213> Himerno

<400> 97

<210> 98 <211> 6 <212> PRT <213> Himerno

<400> 98

<210> 99 <211> 8 <212> PRT <213> Himerno

<400> 99

<210> 100

2

<212> PRT <213> Himerno

<400> 100

<210> 101 <211> 8 <212> PRT <213> Himerno

<400> 101

<210> 102 <211> 10 <212> PRT <213> Himerno

<400> 102

<210> 103 <211> 5 <212> PRT <213> Himerno

<400> 103

<210> 104 <211> 15

2 <212> PRT <213> Himerno

<400> 104

<210> 105 <211> 5 <212> PRT <213> Himerno

<400> 105

<210> 106 <211> 5 <212> PRT <213> Himerno

<400> 106

<210> 107 <211> 5 <212> PRT <213> Himerno

<400> 107

<210> 108 <211> 17 <212> PRT <213> Himerno

2

<210> 109 <211> 10 <212> PRT <213> Himerno

<400> 109

<210> 110 <211> 10 <212> PRT <213> Himerno

<400> 110

<210> 111 <211> 7 <212> PRT <213> Himerno

<400> 111

<210> 112 <211> 9 <212> PRT <213> Himerno

2

<210> 113 <211> 119 <212> PRT <213> Himerno

<400> 113

<210> 114 <211> 106 <212> PRT <213> Himerno

2

<210> 115 <211> 120 <212> PRT <213> Himerno

<400> 115

<211> 106 <212> PRT <213> Himerno

<400> 116

1

<211> 648 <212> DNK <213> Himerno

<400> 117

2

<211> 2916 <212> DNA <213> Himerno

<400> 118

�

<211> 2070 <212> DNA <213> Himerno

<400> 119

<211> 1494 <212> DNA <213> Himerno

<400> 120

�

<211> 1494 <212> DNA <213> Himerno

<400> 121

41

42

<211> 2025 <212> DNA <213> Himerno

<400> 122

4

44

�

<211> 1350 <212> DNA <213> Himerno

<400> 123

4

<211> 642

4

<212> DNA <213> Himerno

<400> 124

<210> 125 <211> 1545 <212> DNK <213> Himerno

<400> 125

4

�

<212> DNK <213> Himerno <400> 126

1

<211> 699

2

<212> DNK <213> Himerno

<400> 127

<210> 128 <211> 2871 <212> DNK

<213> Himerno

<400> 128

4

<211> 2871 <212> DNK <213> Himerno

<400> 129

<211> 2025 <212> DNK <213> Himerno

<400> 130

1

�

<211> 2916 <212> DNK <213> Himerno

<400> 131

�

<211> 449 <212> PRT <213> Himerno

<400> 132

<211> 214 <212> PRT <213> Himerno

<400> 133

�

<211> 675 <212> PRT <213> Himerno

<400> 134

2

�

<211> 957 <212> PRT <213> Himerno

<400> 135

<211> 957 <212> PRT <213> Himerno

<400> 136

1

�

<211> 449 <212> PRT <213> Himerno

<400> 137

<211> 216 <212> PRT <213> Himerno

<400> 138

<211> 956 <212> PRT <213> Himerno

<400> 139

1

�

<211> 956 <212> PRT <213> Himerno

<400> 140

�

<211> 674 <212> PRT <213> Himerno

<400> 141

41

42

�

44

<211> 5 <212> PRT <213> Himerno

<400> 142

<210> 143 <211> 17 <212> PRT <213> Himerno

<400> 143

<210> 144 <211> 10 <212> PRT <213> Himerno

4

<210> 145 <211> 7 <212> PRT <213> Himerno

<400> 145

<210> 146 <211> 20 <212> PRT <213> Himerno

<400> 146

<210> 147 <211> 5 <212> PRT <213> Himerno

<400> 147

<210> 148 <211> 11 <212> PRT

4

<213> Himerno

<400> 148

<210> 149 <211> 7 <212> PRT <213> Himerno

<400> 149

<210> 150 <211> 9 <212> PRT <213> Himerno

<400> 150

<210> 151 <211> 5 <212> PRT <213> Himerno

<400> 151

<210> 152 <211> 17 <212> PRT <213> Himerno

4

<210> 153 <211> 10 <212> PRT <213> Himerno

<400> 153

<210> 154 <211> 12 <212> PRT <213> Himerno

<400> 154

<210> 155 <211> 7 <212> PRT <213> Himerno

<400> 155

<210> 156 <211> 10 <212> PRT <213> Himerno

4

<210> 157 <211> 119 <212> PRT <213> Himerno

<400> 157

<210> 158 <211> 109 <212> PRT <213> Himerno

4

<210> 159 <211> 119 <212> PRT <213> Himerno

<400> 159

41

<211> 120 <212> PRT <213> Himerno

<400> 160

<211> 107 <212> PRT <213> Himerno

<400> 161

<211> 1350 <212> DNK <213> Himerno

<400> 162

41

<211> 645 <212> DNK <213> Himerno

<400> 163

<210> 164

41

<212> DNK <213> Himerno <400> 164

41

<211> 2874 <212> DNK <213> Himerno

<400> 165

42

<212> DNK <213> Himerno <400> 166

42

<211> 651 <212> DNK <213> Himerno

<400> 167

<210> 168 <211> 2871 <212> DNK <213> Himerno

<400> 168

42

<211> 2857 <212> DNK <213> Himerno

4

<400> 169

41

42

�

<211> 2025 <212> DNK <213> Himerno

<400> 170

4 4

�

Claims

PATENTNI ZAHTEVI

1. Bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom koji sadrži (a) prvi antigen vezujući deo sposoban za specifično vezivanje za CD3, pri čemu, prvi antigen vezujući deo je antitelo ili njegov fragment;

(c) maskirajući deo kovalentno vezan za bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom preko linkera koji se cepa proteazom, pri čemu je maskirajući deo sposoban za specifično vezivanje za idiotip prvog ili drugog antigen vezujućeg dela, čime reverzibilno prikriva prvi ili drugi antigen vezujući deo, pri čemu, maskirajući deo je antiidiotipski scFv.

2. Bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom prema zahtevu 1, pri čemu, maskirajući deo je kovalentno vezan za prvi antigen vezujući deo i reverzibilno prikriva prvi antigen vezujući deo.

3. Bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom prema zahtevu 1 ili 2, pri čemu, maskirajući deo je kovalentno vezan za varijabilni region teškog lanca prvog antigen vezujućeg dela.

4. Bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom prema bilo kom od zahteva 1 do 3, pri čemu drugi antigen vezujući deo je sposoban za specifično vezivanje za antigen ciljne ćelije odabran iz grupe koju čine FolR1, HER1, HER2 i mezotelin.

5. Bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom prema bilo kom od zahteva 1 do 4, pri čemu, prvi i drugi antigen vezujući deo su spojeni jedan sa drugim, opciono preko peptidnog linkera.

6. Bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom prema bilo kom od zahteva 1 do 5, dodatno sadrži Fc domen sastavljen od prve i druge podjedinice sposobne za stabilnu asocijaciju.

7. Bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom prema zahtevu 6, pri čemu, Fc domen je IgG, specifično IgG1ili IgG4.

8. Bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom prema bilo kom od zahteva 6 ili 7, pri čemu Fc domen pokazuje smanjen afinitet vezivanja za Fc receptor i/ili smanjenu efektorsku funkciju u odnosu na Fc domen nativnog IgG1.

9. Bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom prema bilo kom od zahteva 1 do 8, pri čemu maskirajući deo sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži:

(a) region određivanja komplementarnosti teškog lanca CDR H1 aminokiselinske

4

sekvence SYGVS (SEQ ID NO:26);

(d) aminokiselinsku sekvencu lakog lanca (CDR L) 1 RASENIDSYLA (SEQ ID NO:29);

(e) aminokiselinsku sekvencu CDR L2 AATFLAD (SEQ ID NO:30); i (f) aminokiselinsku sekvencu CDR L3QHYYSTPYT (SEQ ID NO:31).

10. Bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom prema bilo kom od zahteva 1 do 9, pri čemu linker koji se cepa proteazom sadrži najmanje jednu sekvencu prepoznavanja proteaze.

11. Bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom prema zahtevu 10, pri čemu linker koji se cepa proteazom sadrži sekvencu prepoznavanja proteaze RQARVVNG (SEQ ID NO:36).

12. Bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom prema bilo kom od zahteva 1 do 11, pri čemu, prvi antigen vezujući deo je sposoban za specifično vezivanje za CD3 i sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži:

a) region određivanja komplementarnosti teškog lanca CDR H1 aminokiselinske sekvence TYAMN (SEQ ID NO:44);

b) CDR H2 aminokiselinska sekvenca RIRSKYNNYATYYADSVKG (SEQ ID NO:45); i

c) CDR H3 aminokiselinska sekvenca HGNFGNSYVSWFAY (SEQ ID NO:46); i varijabilni region lakog lanca koji sadrži:

d) aminokiselinsku sekvencu lakog lanca (CDR L) 1 GSSTGAVTTSNYAN (SEQ ID NO:17);

e) aminokiselinsku sekvencu CDR L2 GTNKRAP (SEQ ID NO:18); i f) aminokiselinsku sekvencu CDR L3 ALWYSNLWV (SEQ ID NO:19).

13. Bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom prema bilo kom od zahteva 1 do 12, pri čemu je prvi antigen vezujući deo sposoban za specifično vezivanje za CD3 i sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 43 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 55.

14. Bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom prema bilo kom od zahteva 1 do 13, pri čemu je drugi antigen vezujući deo sposoban za specifično vezivanje za FolR1 i sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži:

4

a) region određivanja komplementarnosti teškog lanca CDR H1 aminokiselinske sekvence NAWMS (SEQ ID NO:14);

b) aminokiselinsku sekvencu CDR H2 RIKSKTDGGTTDYAAPVKG (SEQ ID NO:15); i

c) aminokiselinsku sekvencu CDR H3 PWEWSWYDY (SEQ ID NO:16); i varijabilni region lakog lanca koji sadrži:

e) aminokiselinsku sekvencu CDR L2 GTNKRAP (SEQ ID NO:18); i

f) aminokiselinsku sekvencu CDR L3 ALWYSNLWV (SEQ ID NO:19).

15. Polipeptid specifičan za idiotip za reverzibilno prikrivanje anti-CD3 mesta vezivanja antigena molekula, pri čemu, polipeptid specifičan za idiotip je anti-idiotip scFV, pri čemu polipeptid specifičan za idiotip kovalentno је vezan za molekul preko peptidnog linkera.

16. Polipeptid specifičan za idiotip prema zahtevu 15, pri čemu, linker je linker koji može da se cepa proteazom.

17. Polipeptid specifičan za idiotip prema zahtevu 15 ili zahtevu 16, pri čemu peptidni linker sadrži najmanje jedno mesto prepoznavanja proteaze.

18. Polipeptid specifičan za idiotip prema zahtevu 17, pri čemu linker koji se cepa proteazom sadrži sekvencu prepoznavanja proteaze RQARVVNG (SEQ ID NO:36).

19. Polipeptid specifičan za idiotip prema bilo kom od zahteva 17 ili 18, pri čemu, molekul je bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju.

20. Polipeptid specifičan za idiotip prema bilo kom od zahteva 15 do 19, sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži:

(a) region određivanja komplementarnosti teškog lanca CDR H1 aminokiselinske sekvence SYGVS (SEQ ID NO:26);

(d) aminokiselinsku sekvencu lakog lanca (CDR L) 1 RASENIDSYLA (SEQ ID NO:29);

(e) aminokiselinsku sekvencu CDR L2 AATFLAD (SEQ ID NO:30); i (f) aminokiselinsku sekvencu CDR L3 QHYYSTPYT (SEQ ID NO:31).

21. Farmaceutska kompozicija koja sadrži bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom iz bilo kog od zahteva 1 do 14 ili polipeptid specifičan za idiotip

4

prema bilo kom od zahteva 15 do 20 i farmaceutski prihvatljiv nosač.

22. Bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom prema bilo kom od zahteva 1 do 14, polipeptid specifičan za idiotip prema bilo kom od zahteva 15 do 20 ili farmaceutska kompozicija prema zahtevu 21 koja se koristi kao lek.

23. Bispecifični molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom za upotrebu prema zahtevu 22, pri čemu je lek namenjen za lečenje ili odlaganje progresije kancera, lečenje ili odlaganje progresije bolesti povezane sa imunskim sistemom, ili za poboljšanje ili stimulaciju imunološkog odgovora ili funkcije kod pojedinca.

24. Izolovani polinukleotid koji kodira bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom prema bilo kom od zahteva 1 do 14 ili polipeptid specifičan za idiotip prema bilo kom od zahteva 15 do 20.

25. Vektor, posebno ekspresioni vektor, koji sadrži polinukleotid prema zahtevu 24.

26. Ćelija domaćin koja sadrži polinukleotid prema zahtevu 24 ili vektor prema zahtevu 25.

27. Postupak proizvodnje bispecifičnog molekula koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom ili polipeptida specifičnog za idiotip, koji sadrži korake a) uzgajanja ćelije domaćina prema zahtevu 26 pod uslovima pogodnim za ekspresiju bispecifičnog molekula koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom ili polipeptida specifičnog za idiotip i b) rekuperaciju bispecifičnog molekula koji aktivira T ćeliju koji se aktivira proteazom ili polipeptida specifičnog za idiotip.