RS64301B1 - Rekombinantna humana kisela alfa-glukozidaza - Google Patents

Description

Opis

UNAKRSNO POZIVANJE NA POVEZANE PATENTE PRIJAVE

[0001] Ova prijava polaže pravo na Privremenu patentnu prijavu u SAD, serijski broj 62/506,561, podnetu 15. maja 2017. godine; Privremenu patentnu prijavu u SAD, serijski broj 62/506,569, podnetu 15. maja 2017. godine; Privremenu patentnu prijavu u SAD, serijski broj 62/506,574, podnetu 15. maja 2017. godine; Privremenu patentnu prijavu u SAD, serijski broj 62/564,083, podnetu 27. septembra 2017. godine; Privremenu patentnu prijavu u SAD, serijski broj 62/567,334, podnetu 3. oktobra 2017. godine; Privremenu patentnu prijavu u SAD, serijski broj 62/618,021, podnetu 16. januara 2018. godine;

Privremenu patentnu prijavu u SAD, serijski broj 62/624,638, podnetu 31. januara 2018. godine i Privremenu patentnu prijavu u SAD, serijski broj 62/660,758, podnetu 20. aprila 2018. godine, na svaku od kojih se traži pravo prioriteta.

OBLAST PRONALASKA

[0002] Ovaj pronalazak obuhvata oblasti medicine, genetike i biohemije rekombinantnih glikoproteina, a posebno se odnosi na sastave rekombinantne humane α-glukozidaze (rhGAA) sa većim ukupnim sadržajem N-glikana koji nose manozu-6-fosfat i koji efikasno ciljaju CIMPR u ćelijama i zatim isporučuju rhGAA u lizozome gde on ima mogućnost da razgradi abnormalno visoke nivoe akumuliranog glikogena. RhGAA prema ovom pronalasku pokazuje superiorno preuzimanje u mišićne ćelije i naknadnu isporuku u lizozome u poređenju sa konvencionalnim proizvodima sa rhGAA i pokazuje druga farmakokinetička svojstva koja ga čine posebno efikasnim u enzimskoj supstitucionoj terapiji kod subjekata koji imaju Pompeovu bolest.

[0003] Ovo otkriće takođe navodi metod za lečenje Pompeove bolesti koji se sastoji od davanja pojedincu kombinacije rhGAA i farmakološkog šaperona. Na primer, u nekim primerima, ovo otkriće navodi metod za lečenje Pompeove bolesti koji se sastoji od davanja pojedincu kombinacije rhGAA i miglustata. RhGAA iz ovog pronalaska pokazuje iznenađujuću efikasnost u lečenju i preokretanju progresije bolesti kod subjekata koji pate od Pompeove bolesti.

OSNOVNE INFORMACIJE

[0004] Pompeova bolest je nasledna lizozomalna bolest skladištenja koja je rezultat deficita aktivnosti kisele α-glukozidaze (GAA). Osoba koja ima Pompeovu bolest nema ili ima smanjen nivo kisele α-glukozidaze (GAA), enzima koji razlaže glikogen do glukoze, glavnog izvora energije za mišiće. Ovaj nedostatak enzima uzrokuje prekomernu akumulaciju glikogena u lizozomima, intraćelijskim organelama koje sadrže enzime koji obično razgrađuju glikogen i druge ćelijske ostatke ili otpadne proizvode. Akumulacija glikogena u određenim tkivima subjekta koji boluje od Pompeove bolesti, posebno u mišićima, narušava sposobnost ćelija da funkcionišu normalno. Kod Pompeove bolesti, glikogen se ne metaboliše pravilno i progresivno se akumulira u lizozomima, posebno u ćelijama skeletnih mišića i, kod novorođenčadi, u ćelijama srčanog mišića. Akumulacija glikogena oštećuje mišićne i nervne ćelije, kao i one u drugim zahvaćenim tkivima.

[0005] Tradicionalno, u zavisnosti od uzrasta početka, Pompeova bolest se klinički prepoznaje ili kao rani infantilni oblik ili kao oblik sa kasnim početkom. Starost na početku bolesti često je paralelna sa ozbiljnošću genetske mutacije koja uzrokuje Pompeovu bolest. Najteže genetske mutacije uzrokuju potpuni gubitak GAA aktivnosti i manifestuju se kao rana bolest tokom detinjstva. Genetske mutacije koje smanjuju aktivnost GAA, ali je ne eliminišu u potpunosti, povezane su sa oblicima Pompeove bolesti sa odloženim početkom i progresijom. Infantilni početak Pompeove bolesti manifestuje se ubrzo nakon rođenja i karakteriše je se slabošću mišića, respiratornom insuficijencijom i srčanom insuficijencijom. Ako se ne leči, obično je fatalna u roku od dve godine. Juvenilna Pompeova bolest i Pompeova bolest u odraslom dobu manifestuju se kasnije u životu i obično napreduju sporije od infantilnog oblika bolesti. Ovi oblici bolesti, iako generalno ne utiču na srce, takođe mogu dovesti do smrtnog ishoda, zbog slabljenja skeletnih mišića i mišića uključenih u disanje.

[0006] Trenutno nepalijativno lečenje Pompeove bolesti uključuje enzimsku supstitucionu terapiju (ERT) primenom rekombinantne humane GAA (rhGAA) poznate kao Lumizyme<®>, Myozyme<®>, ili alglukozidaza alfa. Ova konvencionalna enzimska supstituciona terapija ima za cilj lečenje Pompeove bolesti supstitucijom nedostajućeg GAA u lizozomima primenom rhGAA čime se obnavlja sposobnost ćelija da razgrađuju lizozomski glikogen.

„Lumizyme<®>“ i „Myozyme<®>“ su konvencionalni oblici rhGAA proizvedeni ili stavljeni na tržište kao biološki lekovi od strane kompanije Genzyme i odobreni od strane američke Uprave za hranu i lekove, i opisani su pozivanjem na publikaciju „Physician's Desk Reference“ (2014). Alglukozidaza alfa je identifikovana kao hemijsko ime [199-arginin, 223-histidin]prepro-α-glukozidaza (humana); molekularna formula, C4758H7262N1274O1369S35; CAS broj 420794-05-0. Ovi proizvodi se daju osobama sa Pompeovom bolešću, takođe poznatom kao bolest skladištenja glikogena tipa II (GSD-II) ili bolest nedostatka kiselinske maltaze.

[0007] Ćelijski unos rhGAA molekula olakšan je specijalizovanim ugljenim hidratima, manoza-6-fosfatom (M6P), koji se vezuje za katjonski nezavisan manoza-6-fosfatni receptor (CIMPR) prisutan na ciljnim ćelijama kao što su mišićne ćelije. Nakon vezivanja, molekul rhGAA preuzimaju ciljne ćelije i on se naknadno transportuje u lizozome unutar ćelija.

Većina konvencionalnih rhGAA proizvoda, međutim, nema visok ukupan sadržaj N-glikana koji nose mono-M6P i bis-M6P (odnosno, N-glikana koji nose jedan M6P ostatak ili N-glikana koji nose dva M6P ostatka, respektivno), što ograničava njihov ćelijski unos putem CIMPR-a i lizozomske isporuke, što konvencionalnu enzimsku supstitucionu terapiju čini nedovoljno efikasnom. Na primer, dok konvencionalni rhGAA proizvodi pri 20 mg/kg ili većim dozama poboljšavaju neke simptome Pompeove bolesti, oni nisu u stanju da adekvatno, između ostalog, (i) tretiraju osnovnu ćelijsku disfunkciju, (ii) obnove mišićne strukture ili (iii) smanje akumulirani glikogen u mnogim ciljnim tkivima, kao što su skeletni mišići, kako bi preokrenuli progresiju bolesti. Dalje, veće doze mogu nametnuti dodatna opterećenja subjektu, kao i medicinskim stručnjacima koji su zaduženi za lečenje subjekta, kao što je produženje vremena infuzije potrebnog za intravensku primenu rhGAA. Ostaje potreba za daljim poboljšanjima enzimske supstitucione terapije za lečenje Pompeove bolesti, kao što je rhGAA sa poboljšanim unosom u tkiva, poboljšanom enzimskom aktivnošću, poboljšanom stabilnošću ili smanjenom imugenošću.

[0008] Glikozilacija GAA ili rhGAA može biti enzimski modifikovana in vitro pomoću fosfotransferaze i „otkrivajućih“ enzima koje su opisali Canfield, et al., SAD patent br.

6,534,300, da bi se generisale M6P grupe. Enzimska glikozilacija se ne može adekvatno kontrolisati i može proizvesti rhGAA sa nepoželjnim imunološkim i farmakološkim svojstvima. Enzimski modifikovani rhGAA može da sadrži samo oligosaharide sa visokim sadržajem manoze koji bi svi mogli biti potencijalno enzimski fosforilisani in vitro sa fosfotransferazom ili enzimom za otkrivanje i može sadržati u proseku 5-6 M6P grupa po GAA. Obrasci glikozilacije proizvedeni in vitro enzimskim tretmanom GAA su problematični jer dodatni terminalni ostaci manoze, posebno nefosforilisani terminalni ostaci manoze, negativno utiču na farmakokinetiku modifikovanog rhGAA. Kada se takav enzimski modifikovani proizvod primenjuje in vivo, ove grupe manoze povećavaju neproduktivni klirens GAA, povećavaju preuzimanje enzimski modifikovanog GAA od strane imunoloških ćelija i smanjuju terapijsku efikasnost rhGAA zbog manjeg broja GAA koji dospeva do ciljanih tkiva, kao što su miociti skeletnih mišića. Na primer, terminalni nefosforilisani ostaci manoze su poznati ligandi za manozne receptore u jetri i slezini, što dovodi do brzog klirensa enzimski modifikovanog rhGAA i smanjenog usmeravanja rhGAA na ciljno tkivo. Štaviše, obrazac glikozilacije enzimski modifikovanog GAA sa N-glikanima sa visokim sadržajem manoze sa terminalnim nefosforilisanim ostacima manoze podseća na glikoproteine proizvedene u kvascima i plesnima, i povećava rizik od izazivanja imunoloških ili alergijskih odgovora, kao što su teške alergijske (anafilaktičke) reakcije koje ugrožavaju život ili reakcije preosetljivosti, na enzimski modifikovani rhGAA.

[0009] Imajući u vidu ove nedostatke konvencionalnih rhGAA proizvoda i in vitro metoda za fosforilaciju rhGAA, pronalazači su tražili i identifikovali načine za proizvodnju rhGAA sa optimizovanim N-glikanskim profilom za poboljšanu biodistribuciju i lizozomsko preuzimanje i na taj način minimizovali neproduktivni klirens rhGAA nakon primene. Ovaj pronalazak obezbeđuje pacijentima sa Pompeovom bolešću, koji su u stabilnom stanju ili čije stanje se pogoršava, efikasnu terapiju koja preokreće progresiju bolesti na ćelijskom nivou. Pronalazači takođe izveštavaju da rhGAA iz ovog pronalaska preokreće smer progresije bolesti – uključujući čišćenje lizozomalnog glikogena, efikasnije od trenutnog standarda nege – te da pacijenti lečeni sa rhGAA iz ovog pronalaska pokazuju iznenađujuća i značajna poboljšanja zdravstvenog stanja, uključujući poboljšanja mišićne snage, motoričkih funkcija i/ili plućne funkcije, i/ili uključujući reverziju progresije bolesti, kao što je i dokazano različitim rezultatima efikasnosti (npr. primeri 10 i 11) iz sprovedenih kliničkih studija.

[0010] WO 2016/054231 otkriva sastav rekombinantne humane alfa glukozidaze (rhGAA), izveden iz CHO ćelija, koji sadrži optimizovaniji sastav glikana koji se sastoji od veće količine rhGAA (koji sadrži N-glikane koji nose manozu-6-fosfat (M6P) ili bis-M6P) od konvencionalnih rhGAA, zajedno sa malom količinom nefosforilisanih glikana sa visokim sadržajem manoze i malom količinom terminalne galaktoze na kompleksnim oligosaharidima. Opisani su sastavi koji sadrže rhGAA i metode upotrebe.

REZIME

[0011] Ovaj pronalazak je naveden u priloženim patentnim zahtevima.

KRATAK OPIS CRTEŽA

[0012]

Slika 1A prikazuje nefosforilisani N-glikan sa visokom manozom, mono-M6P N-glikan i bis-M6P N-glikan. Slika 1B prikazuje hemijsku strukturu M6P grupe. Svaki kvadrat predstavlja N-acetil glukozamin (GlcNAc), svaki krug predstavlja manozu, a svako P predstavlja fosfat.

Slika 2A opisuje produktivno usmeravanje rhGAA preko N-glikana koji nose M6P na ciljna tkiva (npr. mišićno tkivo subjekta sa Pompeovom bolešću). Slika 2B opisuje neproduktivni klirens leka do neciljnih tkiva (npr. jetre i slezine) ili vezivanjem N-glikana koji nisu M6P do neciljnih tkiva.

Slika 3 je šematski dijagram primera procesa za proizvodnju, hvatanje i prečišćavanje rekombinantnog lizozomalnog proteina.

Slika 4 prikazuje DNK konstrukt za transformaciju CHO ćelija sa DNK koja kodira rhGAA.

Slika 5 je grafikon koji prikazuje rezultate CIMPR afinitetne hromatografije ATB200 rhGAA sa (Otelotvorenje 2) i bez (Otelotvorenje 1) hvatanja na koloni anjonske izmene (AEX).

Slike 6A-6H prikazuju rezultate analize N-glikozilacije specifične za mesto ATB200 rhGAA, korišćenjem dve različite analitičke tehnike LC-MS/MS. Slika 6A prikazuje popunjenost mesta za sedam potencijalnih mesta N-glikozilacije za ATB200. Slika 6B prikazuje dve analize profila N-glikozilacije prvog potencijalnog mesta N-glikozilacije za ATB200. Slika 6C prikazuje dve analize profila N-glikozilacije drugog potencijalnog mesta N-glikozilacije za ATB200. Slika 6D prikazuje dve analize profila N-glikozilacije trećeg potencijalnog mesta N-glikozilacije za ATB200. Slika 6E prikazuje dve analize profila N-glikozilacije četvrtog potencijalnog mesta N-glikozilacije za ATB200. Slika 6F prikazuje dve analize profila N-glikozilacije petog potencijalnog mesta N-glikozilacije za ATB200. Slika 6G prikazuje dve analize profila N-glikozilacije šestog potencijalnog mesta N-glikozilacije za ATB200. Slika 6H rezimira relativni procenat mono-fosforilisanih i bis-fosforilisanih vrsta za prvo, drugo, treće, četvrto, peto i šesto potencijalno mesto N-glikozilacije.

Slika 7 je grafikon koji prikazuje Polywax profile elucije leka Lumizyme<®>(alglukozidaza alfa, tanja linija, eluiranje levo) i ATB200 (deblja linija, eluiranje desno).

Slika 8 je tabela koja prikazuje rezime N-glikanskih struktura preparata Lumizyme<®>u poređenju sa tri različita preparata ATB200 rhGAA, identifikovanih kao BP-rhGAA, ATB200-1 i ATB200-2.

Slike 9A i 9B su grafikoni koji prikazuju rezultate CIMPR afinitetne hromatografije preparata Lumizyme<®>i Myozyme<®>, respektivno.

Slika 10A je grafikon koji upoređuje CIMPR afinitet vezivanja ATB200 rhGAA (levi trag) sa afinitetom preparata Lumizyme<®>(desni trag). Slika 10B je tabela koja upoređuje bis-M6P sadržaj preparata Lumizyme<®>i ATB200 rhGAA.

Slika 11A je grafikon koji upoređuje ATB200 rhGAA aktivnost (levi trag) sa aktivnošću rhGAA preparata Lumizyme<®>(desni trag) unutar normalnih fibroblasta pri različitim koncentracijama GAA. Slika 11B je tabela koja upoređuje aktivnost ATB200 rhGAA (levi trag) sa aktivnošću rhGAA preparata Lumizyme<®>(desni trag) unutar fibroblasta subjekta koji ima Pompeovu bolest pri različitim koncentracijama GAA. Slika 11C je tabela u kojoj se poredi Kpreuzimanjefibroblasta kod normalnih subjekata i subjekata sa Pompeovom bolešću.

Slika 12 prikazuje stabilnost ATB200 u kiselim ili neutralnim pH puferima procenjenu u testu termostabilnosti korišćenjem SYPRO Orange, pošto se fluorescencija boje povećava sa denaturacijom proteina.

Slika 13 prikazuje sadržaj glikogena u tkivu WT miševa ili Gaa KO miševa tretiranih vehikulumom, alglukozidazom alfa ili ATB200/AT2221, utvrđen primenom digestije amiloglukozidaze. Stupci predstavljaju srednju vrednost ± SEM za 7 miševa/grupa. * p<0,05 u poređenju sa alglukozidazom alfa u višestrukom poređenju uz primenu Dunett-ove metode pod jednosmernom ANOVA analizom.

Slika 14 prikazuje LAMP1-pozitivne vezikule u mišićnim vlaknima Gaa KO miševa tretiranih vehikulumom, alglukozidazom alfa ili ATB200/AT2221 ili WT miševa. Slike su snimljene sa mišića vastus lateralis i predstavljale su 7 miševa po grupi. Uvećanje = 200x (1.000x u umecima).

Slika 15A prikazuje LC3-pozitivne agregate u mišićnim vlaknima Gaa KO miševa tretiranih vehikulumom, alglukozidazom alfa ili ATB200/AT2221 ili WT miševa. Slike su snimljene sa mišića vastus lateralis i predstavljale su 7 miševa po grupi. Uvećanje = 400x. Slika 15B prikazuje Western Blot analizu proteina LC3 II. U svaku traku je ubačeno ukupno 30 mg proteina.

Slika 16 prikazuje ekspresiju disferlina u mišićnim vlaknima Gaa KO miševa tretiranih vehikulumom, alglukozidazom alfa ili ATB200/AT2221 ili WT miševa. Slike su snimljene sa mišića vastus lateralis i predstavljale su 7 miševa po grupi. Uvećanje = 200x.

Slika 17 prikazuje koimunofluorescentno bojenje LAMP1 (zeleno) (videti na primer, „B“) i LC3 (crveno) (videti, na primer, „A“) u pojedinačnim vlaknima izolovanim od belog mišića gastroknemijusa Gaa KO miševa tretiranih vehikulumom, alglukozidazom alfa ili ATB200. „C“ prikazuje klirens autofagnih ostataka i odsustvo uvećanog lizozoma. Pregledano je najmanje 30 vlakana svake životinje.

Slika 18 prikazuje stabilizaciju ATB200 pomoću AT2221 na 17 µM, odnosno 170 µM AT2221, u poređenju sa samo ATB200.

Na slikama 19A i 19B prikazan je dizajn studije ATB200-02. Niska doza = 130 mg. Visoka doza = 260 mg. Na slici 26A, „6MWT“ = 6-minutni test hoda; „FVC“ = forsirani vitalni kapacitet; „QOW“ = svake druge nedelje. „a“ = podaci o bezbednosti od 2 pacijenta iz prvobitnog ispitivanja iz kohorte 1 pregledani su na svakom nivou doze pre doziranja u kohortama 2 i 3; „b“ = tokom faza 2 i 3, AT2221 je oralno primenjen pre početka intravenske infuzije ATB200. Za sve doze, ATB200 je intravenozno infundiran u trajanju od 4 sata, „c“ = prva 2 pacijenta u kohortama 2 i 3 služili su kao pacijenti za prvobitno ispitivanje za svoje kohorte. Slika 19C rezimira osnovne karakteristike pacijenata uključenih u kohorte 1, 2 i 3. „n.p.“ = nije primenljivo. „SD“ = standardna devijacija. „a“ = Pacijenti iz kohorte 1 morali su da uzimaju alglukozidazu alfa 2-6 godina na početku. LOPD = Pompeova bolest sa kasnim početkom.

Slika 20 prikazuje farmakokinetičke podatke za AT2221. „AUC“ = površina ispod krive; „CL/F“ = klirens plazme prilagođen za oralnu bioraspoloživost AT2221;

= maksimalna koncentracija leka; „CV“ = koeficijent varijabilnosti; „t1/2“ = poluživot; „tmax“ = vreme do maksimalne koncentracije leka; „Vz/F“ = očigledni volumen distribucije terminalne faze prilagođen za oralnu bioraspoloživost AT2221. „a“ = geometrijska sredina (CV%); „b“ = medijana (min. - maks.); „c“ = aritmetička sredina (CV%).

Slika 21 prikazuje ukupni GAA protein prema signaturnom peptidu T09 za kohorte 1 i 3. „AUC“ = površina ispod krive; „CLT“ = ukupni klirens tela; „Cmax“ = maksimalna koncentracija leka; „CV“ = koeficijent varijabilnosti; „MD“ = višestruke doze;

„t1/2“ = poluživot; „tmax“ = vreme do maksimalne koncentracije leka; „Frel“ =AUC odnos 20 mg/kg ATB 200 samostalno i 10 mg/kg ATB200 samostalno naspram 5 mg/kg ATB200 samostalno i 20 mg/kg ATB200 niska doza ili visoka doza AT2221 naspram 20 mg/kg ATB200 samostalno. „a“ = geometrijska sredina (CV%); „b“ = medijana (min. - maks.); „c“ = aritmetička sredina (CV%); „d“ = n=11;

Niska doza = 130 mg. Visoka doza = 260 mg.

Slike 22A, 22B, 22C, 22D, 22E i 22F prikazuju ukupni GAA protein po kohorti. Niska doza = 130 mg. Visoka doza = 260 mg. Slika 22A prikazuje profile srednjih vrednosti ukupne koncentracije GAA proteina u vremenu za kohortu 1 (pojedinačna doza). Slika 22B prikazuje profile srednjih vrednosti ukupne koncentracije GAA proteina u vremenu za kohortu 1 (višestruke doze). Slika 22C prikazuje profile srednjih vrednosti ukupne koncentracije GAA proteina u vremenu za kohortu 1 u odnosu na kohortu 3 (pojedinačna doza). Slika 22D prikazuje profile srednjih vrednosti ukupne koncentracije GAA proteina u vremenu za kohortu 1 u odnosu na kohortu 3 (višestruke doze). Slika 22E prikazuje ukupna poređenja GAA proteina sa 20 mg/kg ATB20012 sati nakon doze; * = p<0,05; ** = p <0,01; *** p<0,001. Slika 22F prikazuje ukupna poređenja GAA proteina sa 20 mg/kg ATB20024 sata nakon doze; * = p<0,05; ** = p <0,01; „n.s.“ = nije značajno.

Slika 23 prikazuje analizu varijanse (ANOVA) za ukupni GAA protein na osnovu signaturnog peptida T09. Površina ispod krive (AUC) je data u µg·h/mL; „CI“ = interval pouzdanosti.

Slika 24A prikazuje rezime analiza i dostupnih privremenih podataka iz 6-minutnog testa hoda („6MWT“), pokazujući promenu u odnosu na početne vrednosti („CFBL“) u mesecima 6, 9 i 12 za pacijente u kohorti 1 i kohorti 3.

Slika 24B prikazuje podatke o testu 6MWT za pojedinačne pacijente iz kohorte 1 i kohorte 3.

Sl. 24C prikazuje rezime analize i dostupne privremene podatke iz drugih testova motoričkih funkcija: test motoričkih funkcija Timed up and Go („TUG“); test penjanja na 4 stepenika; test hoda na deset metara (10M); Gauerov znak; test motoričkih funkcija Gait-Stair-Gower's-Chair („GSGC“), koji prikazuje promenu od početne vrednosti („CFBL“) u mesecima 6, 9 i 12 za pacijente u kohorti 1 i kohorti 3. GSGC je kombinovana ocena četiri tipa procene motoričke funkcije koju daje posmatrač: hod (hod na 10 metara), penjanje na 4 stepenika, Gauerov znak (ustajanje sa poda) i pridizanje sa stolice. Svaki test se boduje od 1 (normalno) do 7 (ne može se izvesti; maksimalni rezultat 6 za test pridizanja sa stolice). Ukupni rezultati se kreću od 4 do 27. „a“ = n=9, nedostajuće vrednosti nisu dobijene zbog odbijanja pacijenta da izvrši test; „b“ = medijana promene od početne vrednosti je bila -1,5, a 7/9 pacijenata je imalo smanjenje; „c“ = medijana promene od početne vrednosti je bila -0,8, a 4/5 pacijenata je imalo smanjenje.

Slika 25 prikazuje rezime analiza i dostupne privremene podatke iz Testa mišićne snage (QMT), koji pokazuje promenu od početne vrednosti („CFBL“) u mesecu 6 i mesecu 9 za pacijente u kohorti 2. QMT = kvantifikovani test mišića. Prikazane vrednosti predstavljaju kilograme sile za desnu i levu stranu zajedno. „a“ = adukcija ramena nije dostupna za jednog subjekta; „b“ = bodovanje: (1) vidljivo kretanje mišića, ali bez kretanja u zglobu; (2) kretanje u zglobu, ali ne u odnosu na gravitaciju; (3) kretanje u odnosu na gravitaciju, ali ne u odnosu na dodatni otpor; (4) kretanje u odnosu na otpor, ali manje od normalnog; (5) normalna snaga.

Slika 26A prikazuje rezime analiza i dostupne privremene podatke iz Manuelnog mišićnog testa (MMT) kod pacijenata iz kohorte 1. MMT rezultati su izračunati za gornji deo tela (maksimalni rezultat: 40), donji deo tela (maksimalni rezultat: 40) i celo telo (maksimalni rezultat: 80). Povećanja manuelne mišićne snage uočena su kod pacijenata iz kohorte 1 u mesecima 6, 9 i 12. „SD“ = standardna devijacija.

Slika 26B prikazuje rezime analiza i dostupne privremene podatke iz Manuelnog mišićnog testa (MMT) kod pacijenata iz kohorte 2. MMT rezultati su izračunati za gornji deo tela (maksimalni rezultat: 40). Povećanja manuelne mišićne snage uočena su kod pacijenata iz kohorte 2 u mesecima 6 i 9. „SD“ = standardna devijacija. MMT rezultati su generalno bili u skladu sa QMT rezultatima (prikazanim na slici 28).

Slika 26C prikazuje rezime analiza i dostupne privremene podatke iz Manuelnog mišićnog testa (MMT) kod pacijenata iz kohorte 3. MMT rezultati su izračunati za gornji deo tela (maksimalni rezultat: 40), donji deo tela (maksimalni rezultat: 40) i celo telo (maksimalni rezultat: 80). Povećanja manuelne mišićne snage uočena su kod pacijenata iz kohorte 3 u mesecima 6, 9 i 12. „SD“ = standardna devijacija.

Slika 27 prikazuje rezime analize i dostupne privremene podatke za forsirani vitalni kapacitet u sedećem položaju („FVC“), maksimalni inspiratorni pritisak („MIP“) i maksimalni ekspiracioni pritisak („MEP“), koji pokazuju promenu od početne vrednosti („CFBL“) u mesecu 6, mesecu 9 i mesecu 12 za pacijente u kohorti 1 i kohorti 3. „a“ = FVC nije dostupan za jednog subjekta. MEP i MIP su mereni u cmH2O.

Slika 28 prikazuje rezime analize i dostupne privremene podatke za Skalu ozbiljnosti umora („FSS“), upitnik za samoprocenu koji se sastoji od devet pitanja, od kojih je svako ocenjeno na skali od 1 do 7. Ukupan rezultat se kreće od 9 do 63, pri čemu veće vrednosti predstavljaju viši nivo umora usled stanja bolesti. Normativna vrednost u zdravoj populaciji je ~21. Slika 28 prikazuje promenu od početne vrednosti („CFBL“) u mesecu 6, mesecu 9 i mesecu 12 za pacijente u kohorti 1, kohorti 2 i kohorti 3.

Slike 29A-29C prikazuju srednju vrednost procentualne promene od početne vrednosti u markerima povrede (alanin aminotransferaze, aspartat aminotransferaze i kreatin kinaze) u svim kohortama pacijenata. Slika 29A prikazuje podatke za pacijente iz kohorte 1 tokom 58 nedelja, slika 29B prikazuje podatke za pacijente iz kohorte 2 tokom 24 nedelje, a slika 29C prikazuje podatke za pacijente iz kohorte 3 tokom 36 nedelja. Slika 29D prikazuje srednju vrednost procentualne promene od početne vrednosti u markerima povrede mišića (CK = kreatin kinaza) i supstratu bolesti (Hex4 = urin heksoza tetrasaharid) do 12 meseci za pacijente u kohorti 1, kohorti 2 i kohorti 3. „BL“ = početna vrednost. „SG“ = standardna greška. „NED.“ = nedelja. „M.“ = mesec.

Slika 30 rezimira bezbednosne podatke iz studije ATB200-02. „ND“ = neželjeni događaji. „RPI“ = reakcija povezana sa infuzijom; „a“ = prijavljeno kroz privremenu analizu podataka (maksimalno 20+ meseci); „b“ = uključuje bol u gornjem i donjem delu abdomena.

Slika 31 rezimira dostupne podatke o efikasnosti i bezbednosti iz studije ATB200-02.

Na slikama 32A-32H prikazani su rezultati analize N-glikozilacije ATB200 rhGAA specifične za mesto, uključujući profil N-glikozilacije za sedmo potencijalno mesto N-glikozilacije, korišćenjem LC-MS/MS analize ATB200 digestiranog proteazom. Slike 32A-32H daju prosečne podatke za deset serija ATB200 proizvedenih u različitim razmerama.

Slika 32A prikazuje prosečnu zauzetost mesta za sedam potencijalnih mesta N-glikozilacije za ATB200. Mesta N-glikozilacije su predviđena prema SEQ ID NO: 1. CV = koeficijent varijacije.

Slike 32B-32H prikazuju analize N-glikozilacije specifične za mesto svih sedam potencijalnih mesta N-glikozilacije za ATB200, sa brojevima mesta datim u skladu sa SEQ ID NO: 5. Stupci predstavljaju maksimalni i minimalni procenat vrsta N-glikana identifikovanih kao posebna grupa N-glikana za deset analiziranih serija ATB200. Slika 32B prikazuje profil N-glikozilacije prvog potencijalnog mesta N-glikozilacije za ATB200. Slika 32C prikazuje profil N-glikozilacije drugog potencijalnog mesta N-glikozilacije za ATB200. Slika 32D prikazuje profil N-glikozilacije trećeg potencijalnog mesta N-glikozilacije za ATB200. Slika 32E prikazuje profil N-glikozilacije četvrtog potencijalnog mesta N-glikozilacije za ATB200. Slika 32F prikazuje profil N-glikozilacije petog potencijalnog mesta N-glikozilacije za ATB200. Slika 32G prikazuje profil N-glikozilacije šestog potencijalnog mesta N-glikozilacije za ATB200. Slika 32H prikazuje profil N-glikozilacije sedmog potencijalnog mesta N-glikozilacije za ATB200.

Slike 33A-33B dalje karakterišu i rezimiraju profil N-glikozilacije ATB200, kao što je takođe prikazano na slikama 32A-32H. Slika 33A prikazuje mapiranje glikana 2-antranilne kiseline (2-AA) i LC/MS-MS analizu ATB200 i rezimira vrste N-glikana identifikovane u ATB200 kao procenat ukupne fluorescencije. Podaci iz mapiranja 2-AA glikana i LC-MS/MS analize su takođe prikazani u tabeli 5. Slika 33B sumira prosečnu zauzetost mesta i prosečan profil N-glikana, uključujući ukupnu fosforilaciju, mono-fosforilaciju, bis-fosforilaciju i sijalizaciju, za svih sedam potencijalnih mesta N-glikozilacije za ATB200. ND = nije detektovano.

DETALJAN OPIS

[0013] Pre navođenja opisa nekoliko uglednih primera otelotvorenja pronalaska, potrebno je istaći da pronalazak nije ograničen na detalje konstrukcije ili procesne korake koji su navedeni u sledećem opisu. Moguća su dodatna otelotvorenja pronalaska i moguće je praktikovati ili sprovoditi pronalazak na različite načine.

I. Definicija

[0014] Termini koji se koriste u ovoj specifikaciji uglavnom imaju uobičajena značenja koja su dobro poznata u struci i u kontekstu ovog pronalaska i u specifičnim kontekstima u kojima se koristi svaki termin. Određeni termini su razmotreni u nastavku ili na drugom mestu u okviru specifikacije, kako bi se obezbedile dodatne smernice praktičarima u pogledu opisa sastava pronalaska, kao i u pogledu opisa načina spravljanja i upotrebe ovih sastava. Članovi „a“ i „an“ se (u verziji na engleskom jeziku) odnose na jedan ili više (npr. na najmanje jedan) gramatičkih objekata. Termin „ili“ znači ili se koristi naizmenično sa terminom „i/ili“, ukoliko kontekst jasno ne naznačava drugačije. U ovoj patentnoj prijavi, gramatički oblici u jednini takođe uključuju množinu, osim ako nije izričito navedeno drugačije. Štaviše, upotreba termina „uključujući“, kao i drugih oblika ovog termina, kao što su „uključuje“ i „uključeno“, nisu ograničavajući. Podrazumeva se da svaki opseg opisan u ovom dokumentu uključuje parametre praćenja i sve vrednosti između parametara praćenja. U okviru ove specifikacije, osim ako kontekst ne zahteva drugačije zasnovano na izričitim izjavama ili neophodnim implikacijama, termin „obuhvata“, ili varijacije ovog termina, kao što je „obuhvat“, koriste se u inkluzivnom smislu, odnosno kako bi se odredilo prisustvo navedenih karakteristika, ali ne i kako bi se isključilo prisustvo ili dodatak drugih karakteristika u različitim otelotvorenjima pronalaska.

[0015] Termin „GAA“ se odnosi na enzim humane kisele α-glukozidaze (GAA) koji katalizuje hidrolizu α-1,4- i α-1,6-glikozidnih veza lizozomalnog glikogena, kao i na insercione, relacione ili supstitucione varijante aminokiselinske sekvence GAA i fragmente duže GAA sekvence koji ispoljavaju enzimsku aktivnost. Humana kisela α-glukozidaza je kodirana genom GAA (National Centre for Biotechnology Information (NCBI) Gene ID 2548), koji je mapiran na dugi krak hromozoma 17 (lokacija 17q25.2-q25.3). Primer DNK sekvence koja kodira GAA je NP 000143.2. Trenutno je identifikovano više od 500 mutacija u humanom GAA genu, od kojih se mnoge dovode u vezu sa Pompeovom bolešću. Mutacije koje rezultuju pogrešnim savijanjem ili pogrešnom obradom enzima kisele α-glukozidaze uključuju T1064C (Leu355Pro) i C2104T (Arg702Cys). Pored toga, GAA mutacije koje utiču na maturaciju i obradu enzima uključuju Leu405Pro i Met519Thr. Konzervirani heksapeptid WIDMNE na aminokiselinskim ostacima 516-521 je neophodan za aktivnost proteina kisele α-glukozidaze. Na način na koji se koristi ovde, skraćenica „GAA“ se odnosi na enzim humane kisele α-glukozidaze, dok se skraćenica „GAA“ ispisana kurzivom odnosi na humani gen koji kodira enzim humane kisele α-glukozidaze. Skraćenica „Gaa“ ispisana kurzivom odnosi se na ne-humane gene koji kodiraju enzime ne-humane kisele αglukozidaze, uključujući, bez ograničenja, gene pacova ili miševa, dok se skraćenica „Gaa“ odnosi na enzime ne-humane kisele α-glukozidaze.

[0016] Termin „rhGAA“ odnosi se na enzim rekombinantne humane kisele α-glukozidaze i koristi se za razlikovanje endogenog GAA od sintetičkog ili rekombinantno-proizvedenog GAA (npr. GAA proizveden iz CHO ćelija transformisanih sa DNK koja kodira GAA).

Termin „rhGAA“ obuhvata populaciju pojedinačnih rhGAA molekula. Karakteristike populacije rhGAA molekula su date ovde. Termin „konvencionalni rhGAA proizvod“ odnosi se na proizvode koji sadrže alglukozidazu alfa, kao što su Lumizyme<®>ili Myozyme<®>.

[0017] Termin „genetski modifikovano“ ili „rekombinantno“ odnosi se na ćelije, kao što su CHO ćelije, koje eksprimiraju određeni genski proizvod, kao što je rhGAA, nakon uvođenja nukleinske kiseline koja se sastoji od sekvence kodiranja koja kodira genski proizvod, zajedno sa regulatornim elementima koji kontrolišu ekspresiju sekvence kodiranja. Uvođenje nukleinske kiseline može se postići bilo kojom metodom koja je poznata u struci, uključujući targetiranje gena i homolognu rekombinaciju. Na način na koji se koristi ovde, termin takođe uključuje ćelije koje su projektovane da eksprimiraju ili prekomerno eksprimiraju endogeni gen ili genski proizvod koji takva ćelija obično ne eksprimira, npr. tehnologijom aktivacije gena.

[0018] Termin „prečišćeni“, na način na koji se koristi ovde, odnosi se na materijal koji je izolovan pod uslovima koji smanjuju ili eliminišu prisustvo stranih materijala, odnosno zagađivača, uključujući izvorne materijale iz kojih se materijal dobija. Na primer, poželjno je da prečišćeni protein bude suštinski bez prisustva drugih proteina ili nukleinskih kiselina sa kojima je povezan u ćeliji; poželjno je da prečišćeni molekul nukleinske kiseline bude suštinski bez proteina ili drugih nepovezanih molekula nukleinske kiseline sa kojima se može naći u ćeliji. Na način na koji se koristi ovde, termin „suštinski bez prisustva“ se koristi operativno, u kontekstu analitičkog ispitivanja materijala. Poželjno, prečišćeni materijal u kome suštinski nema prisustva kontaminanata je najmanje 95% čist; poželjnije, najmanje 97% čist, a još poželjnije najmanje 99% čist. Čistoća se može proceniti hromatografijom, gel elektroforezom, imunološkom analizom, analizom sastava, biološkom analizom, enzimskom analizom i drugim metodama koje su poznate u struci. U određenom otelotvorenju, termin „prečišćeno“ znači da je nivo kontaminanata ispod nivoa prihvatljivog regulatornim organima za bezbednu primenu kod ljudi ili životinja. Rekombinantni proteini, kao što je rhGAA, mogu biti izolovani ili prečišćeni iz CHO ćelija korišćenjem metoda koje su dobro poznate u struci, uključujući hromatografiju sa separacijom na osnovu veličine, afinitetnu hromatografiju ili anjonsku jonoizmenjivačku hromatografiju. U nekim otelotvorenjima, rhGAA se prečišćava metodom koja obuhvata anjonsku jonoizmenjivačku hromatografije praćenu imobilizovanom metal-afinitetnom hromatografijom, opciono praćeno prečišćavanjem uz upotrebu treće kolone za hromatografiju.

[0019] Na način na koji se koristi ovde, termin „alglukozidaza alfa“ odnosi se na rekombinantnu humanu kiselu α-glukozidazu identifikovanu kao [199-arginin, 223-histidin]prepro-α-glukozidaza (humana); Registarski broj hemijskih sažetaka 420794-05-0. Alglukozidaza alfa je odobrena za marketing u Sjedinjenim Državama od strane kompanije Genzyme, u vidu proizvoda Lumizyme<®>and Myozyme<®>.

[0020] Na način na koji se koristi ovde, termin „ATB200“ označava rekombinantnu humanu kiselu α-glukozidazu opisanu u Međunarodnoj patentnoj prijavi PCT/US2015/053252.

[0021] Na način na koji se koristi ovde, termin „glikan“ odnosi se na polisaharidni lanac kovalentno vezan za aminokiselinski ostatak na proteinu ili polipeptidu. Na način na koji se koristi ovde, termin „N-glikan“ ili „N-vezani glikan“ odnosi se na polisaharidni lanac vezan za aminokiselinski ostatak na proteinu ili polipeptidu kroz kovalentno vezivanje za atom azota u aminokiselinskom ostatku. Na primer, N-glikan može biti kovalentno vezan za atom azota u bočnom lancu asparaginskog ostatka. Glikani mogu sadržati jednu ili više monosaharidnih jedinica, a monosaharidne jedinice mogu biti kovalentno povezane da formiraju ravan lanac ili razgranati lanac. N-glikanske jedinice vezane za rhGAA mogu sadržati jednu ili više monosaharidnih jedinica svaka nezavisno odabrana od N-acetilglukozamina, manoze, galaktoze, fukoze, manoza-6-fosfata ili sijalinske kiseline.

Jedinice N-glikana na proteinu mogu se odrediti odgovarajućom analitičkom tehnikom, kao što je masena spektrometrija. Jedinice N-glikana vezane za rhGAA određuju se tečnom hromatografijom – tandem masenom spektrometrijom (LC-MS/MS) koristeći instrument kao što je maseni spektrometar Thermo Scientific<™>Orbitrap Velos Pro<™>, maseni spektrometar Thermo Scientific<™>Orbitrap Fusion<™>Lumos Tribid<™>ili maseni spektrometar Waters Xevo<®>G2-XS QTof.

[0022] Na način na koji se koristi ovde, termin „N-glikan visoke manoze“ odnosi se na N-glikan koji ima jednu do šest ili više jedinica manoze. Jedinica N-glikana visoke manoze može sadržati bis(N-acetil glukozamin) lanac vezan za asparaginski ostatak i dalje vezan za razgranati polimanozni lanac. Na način na koji se ovde naizmenično koristi, termin „M6P“ ili „manoza-6-fosfat“ odnosi se na jedinicu manoze fosforilisanu na poziciji 6, odnosno onu koja ima fosfatnu grupu vezanu za hidroksilnu grupu na poziciji 6. Jedna ili više jedinica manoze od jedne ili više jedinica N-glikana su fosforilisane na poziciji 6 da bi se formirale manoza-6-fosfatne jedinice. Termin „M6P“ ili „manoza-6-fosfat“ odnosi se i na manoza fosfodiestar koji ima N-acetilglukozamin (GlcNAc) kao „kapu“ na fosfatnoj grupi, kao i na manoza jedinicu koja ima izloženu fosfatnu grupu kojoj nedostaje GlcNAc kapa. U najmanje jednom otelotvorenju, N-glikani proteina mogu imati višestruke M6P grupe, sa najmanje jednom M6P grupom koja ima GlcNAc kapu i najmanje jednom drugom M6P grupom kojoj nedostaje GlcNAc kapa.

[0023] Na način na koji se koristi ovde, termin „kompleksni N-glikan“ odnosi se na N-glikan koji sadrži tipove saharida koji nisu GlcNac i manoza, na primer, jedna ili više jedinica galaktoze i/ili sijalinske kiseline. Kompleksni N-glikan može biti visoko manozni N-glikan u kome su jedna ili manozna jedinica dalje vezane za jednu ili više monosaharidnih jedinica od kojih je svaka nezavisno izabrana između N-acetilglukozamina, galaktoze i sijalinske kiseline. Na način na koji se koristi ovde, „hibridni N-glikan“ odnosi se na N-glikan koji se sastoji od najmanje jedne grane visoke manoze i najmanje jedne složene grane.

Reprezentativne strukture za nefosforilisane, mono-M6P i bis-M6P N-glikane prikazane su na slici 1A. Manoza-6-fosfatna grupa prikazana je na slici 1B.

[0024] Na način na koji se koristi ovde, „normalizacija“ lizozoma u mišiću se odnosi na proces vraćanja zahvaćenog mišića u lizozomalnu morfologiju mišića divljeg tipa smanjenjem veličine i broja njegovog akumuliranog glikogena tako da bi zahvaćeni mišić u suštini ličio na normalnu morfologiju lizozoma, što na kraju dovodi do obrnute progresije bolesti.

[0025] Na način na koji se koristi ovde, „reverzija progresije bolesti“ označava, između ostalog, adekvatnu (i) redukciju ili eliminaciju akumulacije glikogena, (ii) redukciju ili eliminaciju lizozomskog otoka i/ili disfunkcije i (iii) redukciju ili eliminaciju nakupljanja autofagnih ostataka. Reverzija progresije bolesti može se manifestovati kod pokretnog pacijenta sa Pompeovom bolešću sa iskustvom ERT u vidu dva ili više sledećih „kliničkih poboljšanja“: (a) prosečno povećanje razdaljine pređene tokom šestominutnog hoda od najmanje 20 metara, (b) prosečno poboljšanje maksimalnog ekspiratornog pritiska od najmanje 16 cmH2O i (c) prosečno smanjenje na skali težine umora od najmanje 7. Reverzija progresije bolesti može se manifestovati kod nepokretnog pacijenta sa Pompeovom bolešću sa iskustvom ERT u vidu dva ili više sledećih „kliničkih poboljšanja“: (a) prosečno poboljšanje adukcije ramena od najmanje 3,6 kilograma sile (8 funti), (b) prosečno poboljšanje ekstenzije lakta od najmanje 2,3 kilograma sile (5 funti) i (c) prosečno smanjenje na skali težine umora od najmanje 3,5. Reverzija progresije bolesti može se manifestovati kod pacijenta sa Pompeovom bolešću bez iskustva ERT u vidu dva ili više sledećih „kliničkih poboljšanja“: (a) prosečno povećanje pređene udaljenosti tokom šestominutnog testa hoda od najmanje 40 metara, (b) prosečno poboljšanje forsiranog vitalnog kapaciteta u uspravnom stavu (sedeći) od najmanje 4%, (c) prosečno poboljšanje maksimalnog inspiratornog pritiska od najmanje 11 cmH2O i (d) prosečno smanjenje na skali težine umora od najmanje 5.

[0026] Prednost ovde objavljenog načina lečenja u poređenju sa primenom alglukozidaze alfa je u tome što pacijenti sa Pompeovom bolešću koji se leče prvim pokazuju produženo kliničko poboljšanje. Na primer, poboljšanja se mogu uočiti dve do tri godine od primene prvog tretmana ili kasnije, uključujući, na primer, četiri, pet ili šest godina od primene prvog tretmana. Nasuprot tome, nakon dve godine enzimske supstitucione terapije uz primenu standardne nege (npr. alglukozidaza alfa), pacijenti sa Pompeovom bolešću ili (i) održavaju svoj napredak u odnosu na početno stanje pre lečenja, ali ne pokazuju primetno poboljšanje nakon dve ili tri godine ili (ii) doživljavaju postepeno opadanje napretka i gube sve dobiti postignute tokom dve ili tri godine nakon lečenja uz primenu standardne nege. Kuperus et al.

2017. Long-term benefit of enzyme replacement therapy in Pompe disease: A 5-year prospective study. Neurology.89:2365-2373. Nasuprot tome, ovde opisana rhGAA čisti lizozomski glikogen efikasnije od standardne terapije i pokazalo se da dovodi do poboljšanja kod pacijenata (npr. „Pokretni pacijenti koji prelaze sa ERT“, kohorta 1 studije ATB200-02) kod kojih se ne očekuju poboljšanja nakon uzimanja enzimske supstitucione terapije najmanje dve godine. Dosadašnji klinički podaci sugerišu da se očekuje da će upotreba rhGAA ili farmaceutskog sastava koji je ovde opisan doneti kontinuiranom poboljšanju ishoda kod pacijenata čak i dve godine posle tretmana. Tako, u nekim otelotvorenjima, pacijent tretiran sa rhGAA ili farmaceutskim sastavom opisanim u ovom dokumentu nastavlja da pokazuje napredak u jednom ili više kliničkih poboljšanja više od dve godine nakon tretmana (npr. dolazi do dodatnih koristi izvan opsega koristi postignutih nakon dve godine primene).

[0027] Na način na koji se koristi ovde, „reverzija lizozomske patologije“ označava delimični ili potpuni klirens glikogena koji se akumulirao u ćeliji usled nedostatka optimalne aktivnosti GAA.

[0028] Na način na koji se koristi ovde, forsirani vitalni kapacitet, ili skraćeno „FVC“, predstavlja količinu vazduha koja se forsirano izbacuje iz pluća subjekta nakon najdubljeg mogućeg udaha.

[0029] Na način na koji se koristi ovde, „šestominutni test hoda“ (6MWT) je test za merenje udaljenosti koju pojedinac može da pređe za ukupno šest minuta na tvrdoj, ravnoj površini. Test se sprovodi tako što se od pojedinca traži da hoda što je duže moguće tokom šest minuta.

[0030] Na način na koji se koristi ovde, „test hoda od deset metara“ (10MWT) je test za merenje vremena koje je potrebno pojedincu da, u cipelama za hodanje, pređe deset metara po ravnoj površini.

[0031] Na način na koji se koristi ovde, jedinjenje miglustat, takođe poznato kao N-butil-1-deoksinojirimicin ili NB-DNJ ili (2R,3R,4R,5S)-1-butil-2-(hidroksimetil) piperidin-3,4,5-triol, je jedinjenje koje ima sledeću hemijsku formulu:

[0032] Jedna formulacija miglustata se komercijalno prodaje pod trgovačkim imenom Zavesca<®>kao monoterapija za Gošeovu bolest tipa 1. U nekim otelotvorenjima, miglustat se naziva AT2221.

[0033] Kao što je objašnjeno u nastavku, farmaceutski prihvatljive soli miglustata se takođe mogu koristiti u ovom pronalasku. Kada se koristi so miglustata, doza soli će biti prilagođena tako da doza miglustata koju primi pacijent bude ekvivalentna količini koju bi pacijent primio da je korišćena slobodna baza miglustata.

[0034] Na način na koji se koristi ovde, jedinjenje duvoglustat, takođe poznato kao 1-deoksinojirimicin ili DNJ ili (2R,3R,4R,5S)-2-(hidroksimetil)piperidin-3,4,5-triol, je jedinjenje koje ima sledeću hemijsku formulu:

[0035] Na način na koji se koristi ovde, termin „farmakološki šaperon“ ili ponekad jednostavno termin „šaperon“ označava molekul koji se specifično vezuje za kiselu αglukozidazu i proizvodi jedan ili više sledećih efekata:

● poboljšava formiranje stabilne molekularne konformacije proteina;

● poboljšava pravilan promet proteina iz endoplazmatskog retikuluma na drugu ćelijsku lokaciju, poželjno na nativnu ćelijsku lokaciju, kako bi se sprečila degradacija proteina povezana sa endoplazmatskim retikulumom;

● sprečava agregaciju konformaciono nestabilnih ili pogrešno savijenih proteina;

● obnavlja i/ili poboljšava bar delimično funkciju divljeg tipa, stabilnost i/ili aktivnost proteina; i/ili

● poboljšava fenotip ili funkciju ćelije koja sadrži kiselu α-glukozidazu.

[0036] Dakle, farmakološki šaperon za kiselu α-glukozidazu je molekul koji se vezuje za kiselu α-glukozidazu, što dovodi do pravilnog savijanja, prometa, neagregacije i aktivnosti kisele a-glukozidaze. Na način na koji se koristi ovde, ovaj termin uključuje, bez ograničenja, aktivne šaperone specifične za mesto (ASSC) koji se vezuju za aktivno mesto enzima, inhibitore ili antagoniste i agoniste. Farmakološki šaperon je inhibitor ili antagonist kisele αglukozidaze. Na način na koji se koristi ovde, termin „antagonist“ označava bilo koji molekul koji se vezuje za kiselu α-glukozidazu i delimično ili potpuno blokira, inhibira, smanjuje ili neutrališe aktivnost kisele α-glukozidaze. Farmakološki šaperon je miglustat.

[0037] Na način na koji se koristi ovde, termin „aktivno mesto“ označava region proteina koji je povezan sa i neophodan za određenu biološku aktivnost proteina. Aktivno mesto može biti mesto koje vezuje supstrat ili drugog partnera za vezivanje i doprinosi aminokiselinskim ostacima koji direktno učestvuju u formiranju i razbijanju hemijskih veza. Aktivna mesta u ovom pronalasku obuhvataju katalitička mesta enzima, mesta za vezivanje antigena antitela, domene receptora za vezivanje liganda, vezujuće domene regulatora ili domene za vezivanje receptora sekretiranih proteina. Aktivna mesta takođe mogu obuhvatiti transaktivaciju, interakciju protein-protein, ili domene vezivanja DNK transkripcionih faktora i regulatora.

[0038] Na način na koji se koristi ovde, skraćenica „AUC“ ili termin „površina ispod krive“ označava matematički proračun za procenu ukupne izloženosti tela datom leku tokom vremena. Na grafikonu koji prikazuje kako se koncentracija leka koji se daje subjektu u krvi menja sa vremenom nakon doziranja, varijabla koncentracije leka leži na y osi, a vreme leži na x osi. Područje između krive koncentracije leka i x ose za određeni vremenski interval je AUC (površina ispod krive). Površine ispod krive se koriste kao vodič za raspored doziranja i za poređenje bioraspoloživosti različitih lekova u telu.

[0039] Na način na koji se koristi ovde, termin „Cmax“ označava maksimalnu koncentraciju leka u plazmi koja se postiže nakon primene kod subjekta.

[0040] Na način na koji se koristi ovde, termin „obim distribucije“ ili „V“ označava teorijsku zapreminu koja bi bila neophodna da bi se sadržala ukupna količina primenjenog leka u istoj koncentraciji kao što se uočava u krvnoj plazmi i predstavlja stepen u kome se lek distribuira u telesnom tkivu koje nije plazma. Veće vrednosti V ukazuju na veći stepen distribucije u tkivu. „Centralna zapremina distribucije“ ili „Vc“ označava zapreminu distribucije u krvi i tkivima koja su visoko perfuzirana krvlju. „Periferna zapremina distribucije“ ili

„V2“ označava zapreminu distribucije unutar perifernog tkiva.

[0041] Na način na koji se ovde naizmenično koristi, termin „klirens“, „sistemski klirens“ ili skraćeno „CL“ označavaju zapreminu plazme iz koje je primenjeni lek u potpunosti iščišćen po jedinici vremena. „Periferni klirens“ označava zapreminu perifernog tkiva iz kog je primenjeni lek u potpunosti iščišćen po jedinici vremena.

[0042] Na način na koji se koristi ovde, termin „farmaceutski prihvatljiv“ označava molekularne entitete i sastave koji su fiziološki podnošljivi i obično ne proizvode nepovoljne reakcije u primeni kod ljudi. Poželjno, na način na koji se koristi ovde, termin „farmaceutski prihvatljivo“ označava da je nešto odobreno od strane regulatorne agencije savezne ili državne vlade ili navedeno u Farmakopeji SAD ili drugoj opšte priznatoj farmakopeji za upotrebu kod životinja, a posebno kod ljudi. Na način na koji se koristi ovde, termin „nosač“ označava razblaživač, adjuvans, ekscipijens ili vehikulum sa kojim se primenjuje jedinjenje. Pogodni farmaceutski nosači poznati su u struci i, u najmanje jednom otelotvorenju, opisani su u publikaciji „Remington's Pharmaceutical Sciences“, autora E. W. Martin, 18th Edition, ili u drugim izdanjima ove publikacije.

[0043] Termin „farmaceutski prihvatljiva so“, na način na koji se koristi ovde, označava so koja je, u okviru razumne medicinske procene, pogodna za upotrebu u kontaktu sa tkivima ljudi i nižih životinja bez nepotrebne toksičnosti, iritacije, alergijskog odgovora i slično, proporcionalna razumnom odnosu koristi i rizika, uglavnom rastvorljiva u vodi ili ulju ili disperzibilna i efikasna za svoju predviđenu upotrebu. Termin uključuje farmaceutski prihvatljive kiselinske adicione soli i farmaceutski prihvatljive bazne adicione soli. Spiskovi pogodnih soli nalaze se, na primer, u S. M. Berge et al., J. Pharm. Sci., 1977, 66, pp.1 -19. Termin „farmaceutski prihvatljiva kiselinska adiciona so“, na način na koji se koristi ovde, označava one soli koje zadržavaju biološku efikasnost i svojstva slobodnih baza i koje nisu biološki ili na drugi način nepoželjne, formirane sa neorganskim kiselinama. Termin „farmaceutski prihvatljiva bazna adiciona so“, na način na koji se koristi ovde, označava one soli koje zadržavaju biološku efikasnost i svojstva slobodnih kiselina i koje nisu biološki ili na drugi način nepoželjne, formirane sa neorganskim bazama.

[0044] Na način na koji se koristi ovde, termin „pufer“ se odnosi na rastvor koji sadrži slabu kiselinu i njenu konjugovanu bazu koja pomaže u sprečavanju promena pH.

[0045] Na način na koji se koriste ovde, termini „terapijski efikasna doza“ i „efikasna količina“ označavaju količinu kisele α-glukozidaze i/ili miglustata i/ili njihove kombinacije, koja je dovoljna da izazove terapijski odgovor kod subjekta. Terapijski odgovor može biti bilo koji odgovor koji će korisnik (na primer, kliničar) prepoznati kao efikasan odgovor na terapiju, uključujući sve surogatne kliničke markere ili simptome opisane u ovom dokumentu i poznate u struci. Dakle, u najmanje jednom otelotvorenju, terapijski odgovor može biti poboljšanje ili inhibicija jednog ili više simptoma ili markera Pompeove bolesti kao što su oni koji su dobro poznati u struci. Simptomi ili markeri Pompeove bolesti uključuju, bez ograničenja, smanjenu aktivnost enzima kisele α-glukozidaze; kardiomiopatiju; kardiomegaliju; progresivnu slabost mišića, posebno u trupu ili donjim ekstremitetima; duboku hipotoniju; makroglosiju (a u nekim slučajevima i izbačenost jezika); poteškoće u gutanju, sisanju i/ili hranjenju; respiratornu insuficijenciju; hepatomegaliju (umerenu); slabost mišića lica; arefleksiju; netoleranciju na vežbanje; egzervativnu dispneju; ortopneju; apneju u snu; jutarnje glavobolje; somnolenciju; lordozu i/ili skoliozu; smanjene duboke tetivne reflekse; bol u donjem delu leđa; i neuspeh u ostvarivanju razvojnih prekretnica u motoričkom razvoju. Treba napomenuti da koncentracija miglustata koja ima inhibitorno dejstvo na kiselu α-glukozidazu može predstavljati „efikasnu količinu“ za potrebe ovog pronalaska zbog razblaživanja (i posledičnog pomaka u vezivanju zbog promene ravnoteže i pH), bioraspoloživosti i metabolizma miglustata nakon primene in vivo.

[0046] Terapijski odgovor takođe može uključivati molekularne odgovore kao što su akumulacija glikogena, lizozomska proliferacija i formiranje autofagnih zona. Terapijski odgovori mogu se proceniti upoređivanjem fizioloških i molekularnih odgovora biopsija mišića pre i nakon tretmana sa rhGAA opisanom ovde. Na primer, količina glikogena prisutna u uzorcima za biopsiju može se koristiti kao marker za utvrđivanje terapijskog odgovora. Drugi primer su biomarkeri kao što su LAMP-1, LC3 i disferlin, koji se mogu koristiti kao indikatori disfunkcije lizozomalnog skladištenja. Na primer, mišićne biopsije prikupljene pre i nakon tretmana sa rhGAA opisanom ovde mogu biti obojene antitelima koja prepoznaju neki od biomarkera.

[0047] Na način na koji se koristi ovde, termin „enzimska zamenska terapija“ ili

„ERT“ označava uvođenje ne-nativnog, prečišćenog enzima u organizam pojedinca sa nedostatkom takvog enzima. Primenjeni protein se može dobiti iz prirodnih izvora ili rekombinantnom ekspresijom. Termin se takođe odnosi na uvođenje pročišćenog enzima u organizam pojedinca koji na drugi način zahteva ili ima koristi od primene pročišćenog enzima. U najmanje jednom otelotvorenju, takva osoba pati od enzimske insuficijencije. Uvedeni enzim može biti prečišćeni, rekombinantni enzim proizveden in vitro, ili protein prečišćen iz izolovanog tkiva ili tečnosti, na primer, iz placente ili mleka animalnog porekla, ili iz biljaka.

[0048] Na način na koji se koristi ovde, termin „kombinovana terapija“ označava svaki vid terapije u kojoj se dve ili više pojedinačnih terapija primenjuju istovremeno ili sekvencijalno. Rezultati kombinovane terapije su poboljšani u poređenju sa efektom svake terapije kada se primenjuje pojedinačno. Ovo poboljšanje može uključivati bilo kakvo poboljšanje efekta različitih terapija koje za posledicu mogu imati povoljniji rezultat u poređenju sa rezultatima koji se postižu pojedinačnom primenom ovih terapija. Poboljšani efekat ili rezultati mogu uključivati sinergijsko poboljšanje, pri čemu je poboljšani efekat izraženiji od aditivnih efekata svake terapije primenjene pojedinačno; aditivno poboljšanje, pri čemu je poboljšani efekat suštinski jednak aditivnom efektu svake terapije primenjene pojedinačno; ili manji od aditivnog efekta, pri čemu je poboljšani efekat manje izražen od aditivnog efekta svake terapije primenjene pojedinačno, ali ipak izraženiji od efekta svake terapije primenjene pojedinačno. Poboljšani efekat se može meriti bilo kojim sredstvom poznatim u struci predviđenim za merenje efikasnosti tretmana ili ishoda.

[0049] Termin „istovremeno“, na način na koji se koristi ovde, označava istovremeno ili u razumno kratkom vremenskom periodu pre ili posle, što će biti jasno stručnjacima u oblasti. Na primer, ako se dva tretmana primenjuju istovremeno, jedan tretman se može primeniti pre ili posle drugog tretmana, kako bi se omogućilo vreme potrebno za pripremu za kasniji od dva tretmana. Stoga „istovremena primena“ dva tretmana uključuje, bez ograničenja, jedan tretman oko 30 minuta ili manje, oko 30 minuta, 20 minuta ili manje, oko 20 minuta, oko 15 minuta, oko 10 minuta, oko 9 minuta, oko 8 minuta, oko 7 minuta, oko 6 minuta oko 5 minuta, oko 4 minuta, oko 3 minuta, oko 2 minuta, oko 1 minut ili manje od 1 minuta nakon drugog tretmana.

[0050] „Pompeova bolest“ se odnosi na autozomno recesivni LSD koji se karakteriše deficitarnom aktivnošću kisele alfa glukozidaze (GAA) čime se narušava metabolizam lizozomalnog glikogena. Nedostatak enzima dovodi do akumulacije lizozomskog glikogena i do progresivne slabosti skeletnih mišića, smanjene srčane funkcije, respiratorne insuficijencije i/ili oštećenja CNS-a u kasnim stadijumima bolesti. Genetske mutacije u GAA genu rezultuju ili nižom ekspresijom ili proizvodnjom mutantnih oblika enzima izmenjene stabilnosti i/ili biološke aktivnosti, što na kraju dovodi do bolesti (videti generalno kod Hirschhorn R, 1995, Glycogen Storage Disease Type II: Acid α-Glucosidase (Acid Maltase) Deficiency, The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease, Scriver et al., eds., McGraw-Hill, New York, 7th ed., pages 2443-2464). Tri priznata klinička oblika Pompeove bolesti (infantilna, juvenilna i odrasla) su u korelaciji sa nivoom rezidualne aktivnosti αglukozidaze (Reuser A J et al., 1995, Glycogenosis Type II (Acid Maltase Deficiency), Muscle & Nerve Supplement 3, S61-S69). Infantilna Pompeova bolest (tip I ili A) je najčešći i najteži oblik ove bolesti koji karakteriše izostanak razvojnog napretka, generalizovana hipotonija, srčana hipertrofija i kardiorespiratorna insuficijencija u drugoj godini života. Juvenilna Pompeova bolest (tip II ili B) je srednje težine i karakteriše se predominantno mišićnim simptomima bez kardiomegalije. Maloletni pojedinci oboleli od Pompeove bolesti obično umiru pre nego što napune 20 godina usled respiratorne insuficijencije. Pompeova bolest u odraslom dobu (tip III ili C) često se predstavlja kao sporo progresivna miopatija u tinejdžerskim godinama pa sve do šeste decenije (Felicia K J et al., 1995, Clinical Variability in Adult-Onset Acid Maltase Deficiency: Report of Affected Sibs and Review of the Literature, Medicine 74, 131-135). Kod Pompeove bolesti je pokazano da se α-glukozidaza ekstenzivno modifikuje posttranslaciono glikozilacijom, fosforilacijom i proteolitičkom obradom. Za optimalnu katalizu glikogena potrebna je konverzija prekursora od 110 kilodaltona (kDa) u zrele forme od 76 i 70 KDa proteolizom u lizozomu. Na način na koji se koristi ovde, termin „Pompeova bolest“ odnosi se na sve vrste Pompeove bolesti. Formulacije i režimi doziranja otkriveni u ovoj patentnoj prijavi mogu se koristiti za lečenje, na primer, Pompeove bolesti tipa I, tipa II ili tipa III.

[0051] Poželjno je da „subjekt“ ili „pacijent“ bude čovek, iako se mogu tretirati i drugi sisari i ne-humane životinje obolele od poremećaja koji uključuju akumulaciju glikogena. Subjekt može biti fetus, novorođenče, dete, maloletnik ili odrasla osoba sa Pompeovom bolešću ili drugim poremećajem skladištenja ili akumulacije glikogena. Jedan primer pojedinca koji je lečen kao pojedinac (fetus, novorođenče, dete, omladinac, adolescent ili odrasla osoba) koji ima GSD-II (npr. infantilni GSD-II, juvenilni GSD-II ili GSD-II koji se javlja kod odraslih). Pojedinac može imati rezidualnu aktivnost GAA ili merljiva aktivnost može izostati. Na primer, pojedinac koji ima GSD-II može imati aktivnost GAA koja je manja od oko 1% normalne aktivnosti GAA (infantilna GSD-II), aktivnost GAA koja je oko 1-10% normalne aktivnosti GAA (juvenilna GSD-II) ili aktivnost GAA koja je oko 10-40% normalne aktivnosti GAA (GSD-II u odraslom dobu). U nekim otelotvorenjima, subjekt ili pacijent je pacijent sa „iskustvom ERT“ ili „prelaskom sa (druge) ERT“, što se odnosi na pacijenta sa Pompeovom bolešću koji je prethodno primao enzimsku supstitucionu terapiju U nekim otelotvorenjima, subjekt ili pacijent je „ERT-naivan“ pacijent, što se odnosi na pacijenta sa Pompeovom bolešću koji prethodno nije primao enzimsku supstitucionu terapiju. U određenim otelotvorenjima, subjekt ili pacijent su pokretni pacijenti (npr. pacijent koji prelazi sa ERT ili ERT-naivan pacijent koji su pokretni). U određenim otelotvorenjima, subjekt ili pacijent je nepokretan (npr. nepokretni pacijent koji prelazi sa ERT). Pokretni ili nepokretni status se može odrediti šestominutnim testom hoda (6MWT). U nekim otelotvorenjima, pokretni pacijent je pacijent sa Pompeovom bolešću koji je u stanju da hoda najmanje 200 metara u testu 6MWT. U nekim otelotvorenjima, nepokretni pacijent je pacijent sa Pompeovom bolešću koji ne može da hoda bez pomoći ili koji je vezan za invalidska kolica.

[0052] Termini „lečenje“ i „tretman“, na način na koji se koriste ovde, odnose se na ublažavanje jednog ili više simptoma povezanih sa bolešću, sprečavanje ili odlaganje početka jednog ili više simptoma bolesti i/ili smanjenje ozbiljnosti ili učestalosti jednog ili više simptoma bolesti. Na primer, lečenje se može odnositi na poboljšanje srčanog statusa (npr. povećanje krajnjeg dijastoličkog i/ili krajnjeg sistolnog volumena, ili smanjenje, poboljšanje ili prevencija progresivne kardiomiopatije koja se obično uočava u GSD-II) ili plućne funkcije (npr. povećanje vitalnog kapaciteta tokom plakanja u odnosu na početni kapacitet, i/ili normalizacija desaturacije kiseonika tokom plakanja); poboljšanje neuro-razvoja i/ili razvoja motoričkih veština (npr. povećanje rezultata AIMS); smanjenje nivoa glikogena u tkivu pojedinca pogođenog bolešću; ili bilo koja kombinacija ovih efekata. U jednom poželjnom otelotvorenju, lečenje uključuje poboljšanje srčanog statusa, posebno smanjenje ili prevenciju kardiomiopatije koja se dovodi u vezu sa GSD-II.

[0053] Termini „poboljšati“, „povećati“ i „smanjiti“, na način na koji se koriste ovde, ukazuju na vrednosti u odnosu na osnovno merenje, kao što je merenje kod istog pojedinca pre početka tretmana opisanog u ovom dokumentu, ili merenje kod kontrolnog pojedinca (ili više kontrolnih pojedinaca) u odsustvu tretmana opisanog u ovom dokumentu. Kontrolni pojedinac je pojedinac koji je pogođen istim oblikom GSD-II (bilo infantilnim, juvenilnim ili odraslim) kao i pojedinac koji se leči, koji je približno istog uzrasta kao i pojedinac koji se leči (kako bi se osiguralo da su faze bolesti kod tretiranog pojedinca i kontrolnog pojedinca uporedive).

[0054] Na način na koji se koriste ovde, termini „oko“ i „približno“ imaju za cilj da se odnose na prihvatljiv stepen greške za izmerenu količinu s obzirom na prirodu ili preciznost merenja. Na primer, stepen greške se može označiti brojem značajnih cifara predviđenih za merenje, kako se razume u struci, i uključuje, bez ograničenja, varijaciju od ±1 u najpreciznijoj značajnoj cifri prijavljenoj prilikom merenja. Tipični primeri stepeni greške su unutar 20 procenata (%), poželjno unutar 10%, a još poželjnije unutar 5% od date vrednosti ili opsega vrednosti. Numeričke količine date u ovom dokumentu su približne vrednosti, ukoliko nije drugačije navedeno, što znači da se pojam „oko“ ili „približno“ može naslutiti ukoliko nije izričito naveden.

II. Rekombinantna humana kisela α-glukozidaza (rhGAA)

[0055] U nekim otelotvorenjima, rekombinantna humana kisela α-glukozidaza (rhGAA) je enzim koji ima aminokiselinsku sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 ili SEQ ID NO: 5. U nekim otelotvorenjima, rhGAA je kodirana nukleotidnom sekvencom kako je navedeno u SEQ ID NO: 2.

Tabela 1 Nukleotidne sekvence i sekvence proteina

SE Sekvence

SEQ Sekvence SEQ Sekvence SEQ Sekvence SEQ Sekvence

[0056] U nekim otelotvorenjima, rhGAA ima aminokiselinsku sekvencu divljeg tipa GAA kao što je navedeno u SEQ ID NO: 1, na način opisan u SAD patentu br.8,592,362 i ima GenBank pristupni broj AHE24104.1 (GI:568760974). U nekim otelotvorenjima, rhGAA ima aminokiselinsku sekvencu divljeg tipa GAA kao što je kodirano u SEQ ID NO: 2, pri čemu mRNK sekvenca ima GenBank pristupni broj Y00839.1. U nekim otelotvorenjima, rhGAA ima aminokiselinsku sekvencu divljeg tipa GAA kao što je navedeno u SEQ ID NO: 3. U nekim otelotvorenjima, rhGAA ima aminokiselinsku sekvencu GAA kao što je navedeno u SEQ ID NO: 4, i ima pristupni broj Nacionalnog centra za biotehnološke informacije (NCBI) NP_000143.2. U nekim otelotvorenjima, rhGAA je alglukozidaza alfa, enzim humane kisele α-glukozidaze kodiran najdominantnijim od devet uočenih haplotipova gena GAA.

[0057] U nekim otelotvorenjima, rhGAA se inicijalno eksprimira kao da ima sekvencu pune dužine 952 aminokiselina divljeg tipa GAA kao što je navedeno u SEQ ID NO: 1, a rhGAA se podvrgava intraćelijskoj obradi koja uklanja deo aminokiselina, npr. prvih 56 aminokiselina. Shodno tome, rhGAA koja se izlučuje od strane ćelije domaćina može imati kraću sekvencu aminokiselina od rhGAA koja je inicijalno eksprimirana unutar ćelije. U jednom otelotvorenju, kraći protein ima aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 5, koja se razlikuje od SEQ ID NO: 1 samo po tome što je prvih 56 aminokiselina koje se sastoje od signalnog peptida i prekursorskog peptida uklonjeno, što dovodi do toga da protein ima 896 aminokiselina. Moguće su i druge varijacije u broju aminokiselina, npr.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ili više delecija, supstitucija i/ili umetanja u odnosu na sekvencu aminokiselina opisanu u SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 5. U nekim otelotvorenjima, rhGAA proizvod uključuje mešavinu rekombinantnih molekula humane kisele α-glukozidaze koji imaju različite dužine aminokiselina.

[0058] U nekim otelotvorenjima, rhGAA sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 90%, 95%, 98% ili 99% identična SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 5. Različiti algoritmi poravnanja i/ili programi mogu se koristiti za izračunavanje identiteta između dve sekvence, uključujući FASTA ili BLAST koji su dostupni kao deo paketa analize GCG sekvenci (Univerzitet u Viskonsinu, Madison, Vis.), i mogu se koristiti sa, npr. podrazumevanim podešavanjem. Na primer, razmatraju se polipeptidi koji imaju najmanje 90%, 95%, 98% ili 99% identičnosti sa specifičnim polipeptidima opisanim u ovom dokumentu i poželjno pokazuju suštinski iste funkcije, kao i polinukleotid koji kodira takve polipeptide. Osim ako nije drugačije naznačeno, ocena sličnosti će se zasnivati na primeni BLOSUM62. Kada se koristi BLASTP, procenat sličnosti se zasniva na BLASTP pozitivnim rezultatima, a procenat identiteta sekvence se zasniva na BLASTP rezultatu identiteta. Opcija BLASTP „Identiteti“ prikazuje broj i udeo ukupnih rezidua u parovima sekvenci sa visokim rezultatom koji su identični; a opcija BLASTP „Pozitivni“ prikazuje broj i udeo rezidua za koje rezultati poravnanja imaju pozitivne vrednosti i koji su međusobno slični. Aminokiselinske sekvence sa ovim stepenima identičnosti ili sličnosti ili sa bilo kojim srednjim stepenom sličnosti sa sekvencama aminokiselina koje su ovde otkrivene, razmatraju se i obuhvaćene su ovim pronalaskom. Polinukleotidne sekvence sličnih polipeptida se izvode korišćenjem genetskog koda i mogu se dobiti na konvencionalne načine, posebno reverznom translacijom njegove aminokiselinske sekvence korišćenjem genetskog koda.

[0059] U nekim otelotvorenjima, rhGAA prolazi post-translacione i/ili hemijske modifikacije na jednom ili više aminokiselinskih ostataka u proteinu. Na primer, ostaci metionina i triptofana mogu biti podvrgnuti oksidaciji. Kao još jedan primer, N-terminalni glutamin može da formira piro-glutamat. Kao drugi primer, ostaci asparagina mogu deamidacijom biti prevedeni u asparaginsku kiselinu. U još jednom primeru, ostaci asparaginske kiseline mogu izomerizacijom biti prevedeni u izo-asparaginsku kiselinu. U još jednom primeru, neupareni ostaci cisteina u proteinu mogu formirati disulfidne veze sa slobodnim glutationom i/ili cisteinom. Shodno tome, u nekim otelotvorenjima, enzim je inicijalno eksprimiran kao da ima aminokiselinsku sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 ili SEQ ID NO: 5, ili aminokiselinsku sekvencu kodiranu sa SEQ ID NO: 2 i enzim prolazi kroz jednu ili više ovih post-translacionih i/ili hemijskih modifikacija. Takve modifikacije su takođe obuhvaćene obimom ovog otkrića.

III. N-vezana glikozilacija rhGAA

[0060] Postoji sedam potencijalnih N-vezanih mesta glikozilacije na jednom molekulu rhGAA. Ova potencijalna mesta glikozilacije nalaze se na sledećim pozicijama SEQ ID NO: 5: N84, N177, N334, N414, N596, N826 i N869. Slično tome, za celu dužinu aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 1, ova potencijalna mesta glikozilacije se nalaze na sledećim pozicijama: N140, N233, N390, N470, N652, N882 i N925. Druge varijante rhGAA mogu imati slična mesta glikozilacije, u zavisnosti od lokacije ostataka asparagina.

Generalno, sekvence Asn-X-Ser ili Asn-X-Thr u aminokiselinskoj sekvenci proteina ukazuju na potencijalna mesta glikozilacije, uz izuzetak da X ne može biti His ili Pro.

[0061] Ovde opisani molekuli rhGAA mogu imati, u proseku, 1, 2, 3 ili 4 manoza-6-fosfatne (M6P) grupe na svojim N-glikanima. Na primer, samo jedan N-glikan na molekulu rhGAA može imati M6P (monofosforilisani ili mono-M6P), jedan N-glikan može imati dve M6P grupe (bis-fosforilisani ili bis-M6P), ili dva različita N-glikana na istom rhGAA molekulu mogu imati po jednu grupu M6P. U ovom pronalasku, ovde opisani molekuli rhGAA u proseku imaju 3-4 M6P grupe na svojim N-glikanima. Rekombinantni molekuli humane kisele α-glukozidaze takođe mogu imati N-glikane koji ne nose M6P grupe. U drugom otelotvorenju, u proseku rhGAA sadrži više od 2,5 mola M6P po molu rhGAA i više od 4 mola sijalinske kiseline po molu rhGAA. U nekim otelotvorenjima, u proseku rhGAA sadrži oko 3-3,5 mola M6P po molu rhGAA. U nekim otelotvorenjima, u proseku, rhGAA sadrži oko 4-5,4 mola sijalinske kiseline po molu rhGAA. U proseku, najmanje oko 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili 20% ukupnih N-glikana na rhGAA može biti u obliku mono-M6P N-glikana, na primer, oko 6,25% ukupnih N-glikana može nositi jednu M6P grupu i u proseku, najmanje oko 0,5, 1, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0% ukupnih N-glikana na rhGAA su u obliku bis-M6P N-glikana i u proseku manje od 25% ukupnih rhGAA ne sadrži fosforilisani N-glikan koji se vezuje za CIMPR. U nekim otelotvorenjima, u proseku oko 10% do oko 14% ukupnih N-glikana na rhGAA su monofosforilisani. U nekim otelotvorenjima, u proseku oko 7% do oko 25% ukupnih N-glikana na rhGAA su bis-fosforilisani. U nekim otelotvorenjima, u proseku rhGAA sadrži oko 1,3 mola bis-M6P po molu rhGAA.

[0062] Ovde opisani rhGAA može imati prosečan sadržaj N-glikana koji nose M6P u rasponu od 0,5 do 7,0 mola M6P po molu rhGAA ili bilo koju njegovu srednju vrednost ili podopseg, uključujući 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 3,5; 4,0; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5 ili 7,0 mola M6P po molu rhGAA. RhGAA se može frakcionisati kako bi se dobili preparati rhGAA sa različitim prosečnim brojem N-glikana koji nose mono-M6P ili bis-M6P, što omogućava dalje prilagođavanje targetiranja rhGAA na lizozome u ciljnim tkivima odabirom određene frakcije ili selektivnim kombinovanjem različitih frakcija.

[0063] U nekim otelotvorenjima, do 60% N-glikana na rhGAA može biti potpuno sijalizirano, na primer, do 10%, 20%, 30%, 40%, 50% ili 60% N-glikana može biti potpuno sijalizirano. U nekim otelotvorenjima, ne više od 50% N-glikana na rhGAA su potpuno sijalizirani. U nekim otelotvorenjima, od 4% do 20% ukupnih N-glikana je potpuno sijalizirano. U drugim realizacijama, ne više od 5%, 10%, 20% ili 30% N-glikana na rhGAA nosi sijalinsku kiselinu i terminalni ostatak galaktoze (Gal). Ovaj opseg obuhvata sve srednje vrednosti i podopsege, na primer, 7% do 30% ukupnih N-glikana na rhGAA može da nosi sijalinsku kiselinu i terminalnu galaktozu. U drugim otelotvorenjima, ne više od 5%, 10%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% ili 20% N-glikana na rhGAA imaju samo terminalnu galaktozu i ne sadrže sijalinsku kiselinu. Ovaj opseg obuhvata sve srednje vrednosti i podopsege, na primer, od 8% do 19% ukupnih N-glikana na rhGAA u sastavu mogu imati samo terminalnu galaktozu i ne sadrže sijalinsku kiselinu.

[0064] U nekim otelotvorenjima, 40%, 45%, 50% ili 55% do 60% ukupnih N-glikana na rhGAA su N-glikani kompleksnog tipa; ili ne više od 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6% ili 7% ukupnih N-glikana na rhGAA su N-glikani hibridnog tipa; ne više od 5%, 10%, 15%, 20% ili 25% N-glikana sa visokim sadržajem manoze na rhGAA nije fosforilisano; najmanje 5% ili 10% N-glikana sa visokim sadržajem manoze na rhGAA je mono-fosforilisano; i/ili najmanje 1% ili 2% N-glikana sa visokim sadržajem manoze na rhGAA je bis-fosforilisano. Ove vrednosti uključuju sve srednje vrednosti i podopsege. RhGAA može zadovoljiti jedan ili više gore opisanih opsega sadržaja.

[0065] U nekim otelotvorenjima, rhGAA može imati, u proseku, 2,0 do 8,0 mola ostataka sijalinske kiseline po molu rhGAA. Ovaj opseg obuhvata sve srednje vrednosti i njihove podopsege, uključujući 2,0; 2,5; 3,0; 3,5; 4,0; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5 i 8,0 mola ostataka sijalinske kiseline po molu rhGAA. Bez vezivanja teorijom, veruje se da prisustvo N-glikanskih jedinica koje nose ostatke sijalinske kiseline može sprečiti neproduktivni klirens rhGAA od strane asijaloglikoproteinskih receptora.

[0066] RhGAA ima određeni profil N-glikozilacije na određenim potencijalnim mestima N-glikozilacije. RhGAA ima sedam potencijalnih N-glikozilacionih mesta. U nekim otelotvorenjima, najmanje 20% rhGAA je fosforilisano na prvom potencijalnom mestu N-glikozilacije (npr. N84 za SEQ ID NO: 5 i N140 za SEQ ID NO: 1). Na primer, najmanje 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ili 95% rhGAA može biti fosforilisano na prvom potencijalnom mestu N-glikozilacije. Ova fosforilacija može biti rezultat mono-M6P i/ili bis-M6P jedinica. U nekim otelotvorenjima, najmanje 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ili 95% rhGAA nosi mono-M6P jedinicu na prvom potencijalnom mestu N-glikozilacije. U nekim otelotvorenjima, najmanje 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ili 95% rhGAA nosi bis-M6P jedinicu na prvom potencijalnom mestu N-glikozilacije. U nekim otelotvorenjima, rhGAA sadrži u proseku oko 1,4 mola M6P (mono-M6P i bis-M6P) po molu rhGAA na prvom potencijalnom mestu N-glikozilacije. U nekim otelotvorenjima, rhGAA se sastoji u proseku od najmanje 0,5 mola bis-M6P po molu rhGAA na prvom potencijalnom mestu N-glikozilacije. U nekim otelotvorenjima, rhGAA sadrži u proseku oko 0,25 mola mono-M6P po molu rhGAA na prvom potencijalnom mestu N-glikozilacije. U nekim otelotvorenjima, rhGAA sadrži u proseku oko 0,2 mola do oko 0,3 mola sijalinske kiseline po molu rhGAA na prvom potencijalnom mestu N-glikozilacije. U najmanje jednom otelotvorenju, rhGAA podrazumeva popunjenost prvog potencijalnog mesta N-glikozilacije kao što je prikazano na slici 6A i profil N-glikozilacije kao što je prikazano na slici 6B. U najmanje jednom otelotvorenju, rhGAA sadrži popunjenost prvog potencijalnog mesta N-glikozilacije kao što je prikazano na slici 32A i profil N-glikozilacije kao što je prikazano na slici 32B ili slici 33B.

[0067] U nekim otelotvorenjima, najmanje 20% rhGAA je fosforilisano na drugom potencijalnom mestu N-glikozilacije (npr. N177 za SEQ ID NO: 5 i N223 za SEQ ID NO: 1). Na primer, najmanje 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ili 95% rhGAA može biti fosforilisano na drugom mestu N-glikozilacije. Ova fosforilacija može biti rezultat mono-M6P i/ili bis-M6P jedinica. U nekim otelotvorenjima, najmanje 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ili 95% rhGAA nosi mono-M6P jedinicu na drugom mestu N-glikozilacije. U nekim otelotvorenjima, najmanje 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ili 95% rhGAA nosi bis-M6P jedinicu na drugom mestu N-glikozilacije. U nekim otelotvorenjima, rhGAA sadrži u proseku oko 0,5 mola M6P (mono-M6P i bis-M6P) po molu rhGAA na drugom potencijalnom mestu N-glikozilacije. U nekim otelotvorenjima, rhGAA sadrži u proseku oko 0,4 do oko 0,6 mola mono-M6P po molu rhGAA na drugom potencijalnom mestu N-glikozilacije. U najmanje jednom otelotvorenju, rhGAA podrazumeva popunjenost drugog potencijalnog mesta N-glikozilacije kao što je prikazano na slici 6A i profil N-glikozilacije kao što je prikazano na slici 6C. U najmanje jednom otelotvorenju, rhGAA podrazumeva popunjenost drugog potencijalnog mesta N-glikozilacije kao što je prikazano na slici 32A i profil N-glikozilacije kao što je prikazano na slici 32C ili slici 33B.

[0068] U jednom ili više otelotvorenja, najmanje 5% rhGAA je fosforilisano na trećem potencijalnom mestu N-glikozilacije (npr. N334 za SEQ ID NO: 5 i N390 za SEQ ID NO: 1). U drugim otelotvorenjima, manje od 5%, 10%, 15%, 20% ili 25% rhGAA je fosforilisano na trećem potencijalnom mestu N-glikozilacije. Na primer, treće potencijalno mesto N-glikozilacije može imati mešavinu nefosforilisanih N-glikana sa visokom manozom, di-, tri- i tetra-antenarni kompleks N-glikana i hibridnih N-glikana kao glavne vrste. U nekim otelotvorenjima, najmanje 3%, 5%, 8%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% ili 50% rhGAA je sijalizirano na trećem potencijalnom mestu N-glikozilacije. U nekim otelotvorenjima, rhGAA sadrži u proseku oko 0,9 do oko 1,2 mola sijalinske kiseline po molu rhGAA na trećem potencijalnom mestu N-glikozilacije. U najmanje jednom otelotvorenju, rhGAA podrazumeva popunjenost trećeg potencijalnog mesta N-glikozilacije kao što je prikazano na slici 6A i profil N-glikozilacije kao što je prikazano na slici 6D. U najmanje jednom otelotvorenju, rhGAA podrazumeva popunjenost trećeg potencijalnog mesta N-glikozilacije kao što je prikazano na slici 32A i profil N-glikozilacije kao što je prikazano na slici 32D ili slici 33B.

[0069] U nekim otelotvorenjima, najmanje 20% rhGAA je fosforilisano na četvrtom potencijalnom mestu N-glikozilacije (npr. N414 za SEQ ID NO: 5 i N470 za SEQ ID NO: 1). Na primer, najmanje 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ili 95% rhGAA može biti fosforilisano na četvrtom potencijalnom mestu N-glikozilacije. Ova fosforilacija može biti rezultat mono-M6P i/ili bis-M6P jedinica. U nekim otelotvorenjima, najmanje 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ili 95% rhGAA nosi mono-M6P jedinicu na četvrtom potencijalnom mestu N-glikozilacije. U nekim otelotvorenjima, najmanje 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ili 95% rhGAA nosi bis-M6P jedinicu na četvrtom potencijalnom mestu N-glikozilacije. U nekim otelotvorenjima, najmanje 3%, 5%, 8%, 10%, 15%, 20% ili 25% rhGAA se sijalizira na četvrtom potencijalnom mestu N-glikozilacije. U nekim otelotvorenjima, rhGAA sadrži u proseku oko 1,4 mola M6P (mono-M6P i bis-M6P) po molu rhGAA na četvrtom potencijalnom mestu N-glikozilacije. U nekim otelotvorenjima, rhGAA sadrži u proseku oko 0,4 do oko 0,6 mola bis-M6P po molu rhGAA na četvrtom potencijalnom mestu N-glikozilacije. U nekim otelotvorenjima, rhGAA sadrži u proseku oko 0,3 do oko 0,4 mola mono-M6P po molu rhGAA na četvrtom potencijalnom mestu N-glikozilacije. U najmanje jednom otelotvorenju, rhGAA podrazumeva popunjenost četvrtog potencijalnog mesta N-glikozilacije kao što je prikazano na slici 6A i profil N-glikozilacije kao što je prikazano na slici 6E. U najmanje jednom otelotvorenju, rhGAA podrazumeva popunjenost četvrtog potencijalnog mesta N-glikozilacije kao što je prikazano na slici 32A i profil N-glikozilacije kao što je prikazano na slici 32E ili slici 33B.

[0070] U nekim otelotvorenjima, najmanje 5% rhGAA je fosforilisano na petom potencijalnom mestu N-glikozilacije (npr. N596 za SEQ ID NO: 5 i N692 za SEQ ID NO: 1). U drugim otelotvorenjima, manje od 5%, 10%, 15%, 20% ili 25% rhGAA je fosforilisano na petom potencijalnom mestu N-glikozilacije. Na primer, peto potencijalno mesto N-glikozilacije može imati fukozilovane di-antenarne kompleksne N-glikane kao glavnu vrstu. U nekim otelotvorenjima, najmanje 3%, 5%, 8%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ili 95% rhGAA se sijalizira na petom potencijalnom mestu N-glikozilacije. U nekim otelotvorenjima, rhGAA sadrži u proseku oko 0,8 do oko 0,9 mola sijalinske kiseline po molu rhGAA na petom potencijalnom mestu N-glikozilacije. U najmanje jednom otelotvorenju, rhGAA podrazumeva popunjenost petog potencijalnog mesta N-glikozilacije kao što je prikazano na slici 6A i profil N-glikozilacije kao što je prikazano na slici 6F. U najmanje jednom otelotvorenju, rhGAA podrazumeva popunjenost petog potencijalnog mesta N-glikozilacije kao što je prikazano na slici 32A i profil N-glikozilacije kao što je prikazano na slici 32F ili slici 33B.

[0071] U nekim otelotvorenjima, najmanje 5% rhGAA je fosforilisano na šestom mestu N-glikozilacije (npr. N826 za SEQ ID NO: 5 i N882 za SEQ ID NO: 1). U drugim otelotvorenjima, manje od 5%, 10%, 15%, 20% ili 25% rhGAA je fosforilisano na šestom potencijalnom mestu N-glikozilacije. Na primer, šesto mesto N-glikozilacije može imati mešavinu di-, tri- i tetra-antenarskih kompleksnih N-glikana kao glavne vrste. U nekim otelotvorenjima, najmanje 3%, 5%, 8%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ili 95% rhGAA se sijalizira na šestom potencijalnom mestu N-glikozilacije. U nekim otelotvorenjima, rhGAA sadrži u proseku oko 1,5 do oko 4,2 mola sijalinske kiseline po molu rhGAA na šestom potencijalnom mestu N-glikozilacije. U nekim otelotvorenjima, rhGAA sadrži u proseku oko 0,9 mola sijalinske kiseline po molu rhGAA na šestom potencijalnom mestu N-glikozilacije. U najmanje jednom otelotvorenju, rhGAA podrazumeva popunjenost šestog potencijalnog mesta N-glikozilacije kao što je prikazano na slici 6A i profil N-glikozilacije kao što je prikazano na slici 6G. U najmanje jednom otelotvorenju, rhGAA podrazumeva popunjenost šestog potencijalnog mesta N-glikozilacije kao što je prikazano na slici 32A i profil N-glikozilacije kao što je prikazano na slici 32G ili slici 33B.

[0072] U nekim otelotvorenjima, najmanje 5% rhGAA je fosforilisano na sedmom potencijalnom mestu N-glikozilacije (npr. N869 za SEQ ID NO: 5 i N925 za SEQ ID NO: 1). U drugim otelotvorenjima, manje od 5%, 10%, 15%, 20% ili 25% rhGAA je fosforilisano na sedmom potencijalnom mestu N-glikozilacije. U nekim otelotvorenjima, manje od 40%, 45%, 50%, 55%, 60% ili 65% rhGAA ima bilo koji N-glikan na sedmom potencijalnom mestu N-glikozilacije. U nekim otelotvorenjima, najmanje 30%, 35% ili 40% rhGAA ima N-glikan na sedmom potencijalnom mestu N-glikozilacije. U nekim otelotvorenjima, rhGAA sadrži u proseku oko 0,86 mola sijalinske kiseline po molu rhGAA na sedmom potencijalnom mestu N-glikozilacije. U najmanje jednom otelotvorenju, svi N-glikani identifikovani na sedmom potencijalnom mestu N-glikozilacije su kompleksni N-glikani. U najmanje jednom otelotvorenju, rhGAA podrazumeva popunjenost sedmog potencijalnog mesta N-glikozilacije kao što je prikazano na slici 6A ili 32A i profil N-glikozilacije kao što je prikazano na slici 32H ili 33B.

[0073] U nekim otelotvorenjima, rhGAA sadrži u proseku 3-4 M6P ostataka po rhGAA molekulu i oko 4 do oko 7,3 mola sijalinske kiseline po molu rhGAA. U nekim otelotvorenjima, rhGAA dalje obuhvata u proseku najmanje oko 0,5 mola bis-M6P po molu rhGAA na prvom potencijalnom mestu N-glikozilacije, oko 0,4 do oko 0,6 mola mono-M6P po molu rhGAA na drugom potencijalnom mestu N-glikozilacije, oko 0,9 do oko 1,2 mola sijalinske kiseline po molu rhGAA na trećem potencijalnom mestu N-glikozilacije, oko 0,4 do oko 0,6 mola bis-M6P po molu rhGAA na četvrtom potencijalnom mestu N-glikozilacije, oko 0,3 do oko 0,4 mola mono-M6P po molu rhGAA na četvrtom potencijalnom mestu N-glikozilacije, oko 0,8 do oko 0,9 mola sijalinske kiseline po molu rhGAA na petom potencijalnom mestu N-glikozilacije, i oko 1,5 do oko 4,2 mola sijalinske kiseline po molu rhGAA na šestom potencijalnom mestu N-glikozilacije. U najmanje jednom otelotvorenju, rhGAA dalje sadrži u proseku oko 0,86 mola sijalinske kiseline po molu rhGAA na sedmom potencijalnom mestu N-glikozilacije. U najmanje jednom otelotvorenju, rhGAA podrazumeva sedam zauzetih potencijalnih mesta N-glikozilacije i profile N-glikozilacije kao što je prikazano na slikama 6A-6H. U najmanje jednom otelotvorenju, rhGAA podrazumeva sedam zauzetih potencijalnih mesta N-glikozilacije i profile N-glikozilacije kao što je prikazano na slikama 32A-32H i 33A-33B.

[0074] Metode izrade rhGAA otkrivene su u Privremenoj patentnoj prijavi u SAD, br.

62/057,842, koja je podneta 30. septembra 2014. godine.

[0075] Jednom kada uđe u lizozom, rhGAA može enzimski razgraditi akumulirani glikogen. Međutim, konvencionalni proizvodi rhGAA imaju niske ukupne nivoe N-glikana koji nose mono-M6P- i bis-M6P i, prema tome, slabo targetiraju mišićne ćelije, što dovodi do inferiorne isporuke rhGAA u lizozome. Većina rhGAA molekula u ovim konvencionalnim proizvodima nema fosforilisane N-glikane, pa im nedostaje afinitet za CIMPR.

Nefosforilisani N-glikani sa visokim sadržajem manoze takođe mogu da se oslobode receptorom za manozu, što rezultuje neproduktivnim klirensom ERT (slika 2B). Nasuprot tome, kao što je prikazano na slici 2A, rhGAA opisan ovde može sadržati veću količinu N-glikana koji nose mono-M6P- i bis-M6P, što dovodi do produktivnog preuzimanja rhGAA u određena tkiva kao što su mišići.

IV. Proizvodnja i prečišćavanje N-vezanog glikoziliranog rhGAA

[0076] Kao što je navedeno u Međunarodnoj patentnoj prijavi PCT/US2015/053252, za proizvodnju opisanog rhGAA mogu se koristiti ćelije poput jajne ćelije kineskog hrčka (CHO). Ekspresija rhGAA sa visokim sadržajem M6P u CHO ćelijama ima prednost u odnosu na modifikovanje profila glikana rhGAA post-translaciono, barem delimično, jer samo prvi može da se konvertuje degradacijom glikana u oblik rhGAA sa optimalnom hidrolizom glikogena, čime se povećava terapijska efikasnost.

[0077] RhGAA se proizvodi od strane jedne ili više ćelijskih linija CHO transformisanih konstruktom DNK koji kodira opisani rhGAA. Takve ćelijske linije CHO mogu sadržati više kopija gena, npr.5, 10, 15 ili 20 ili više kopija polinukleotida koji kodiraju GAA. DNK konstrukti, koji eksprimiraju alelne varijante kisele α-glukozidaze ili druge varijante kisele αglukozidaze aminokiselinskih sekvenci kao što su one koje su najmanje 90%, 95%, 98% ili 99% identične SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 5, mogu biti konstruisani i eksprimirani u CHO ćelijama. Stručnjaci u oblasti mogu izabrati alternativne vektore pogodne za transformaciju CHO ćelija za proizvodnju takvih DNK konstrukata.

[0078] Metode za izradu takvih CHO ćelijskih linija opisane su u Međunarodnoj patentnoj prijavi PCT/US2015/053252. Ukratko, ove metode uključuju transformaciju CHO ćelije sa DNK koja kodira GAA ili GAA varijantu, odabir CHO ćelije koja stabilno integriše DNK koja kodira GAA u svoj(e) hromozom(e) i koja stabilno eksprimira GAA, i odabir CHO ćelije koja eksprimira GAA koja ima visok sadržaj N-glikana koji nose mono-M6P ili bis-M6P, i, opciono, odabir CHO ćelije koja ima N-glikane sa visokim sadržajem sijalinske kiseline i/ili N-glikane sa niskim nefosforilisanim sadržajem visoke manoze. Izabrane CHO ćelijske linije mogu se koristiti za proizvodnju rhGAA i rhGAA sastava kultivacijom CHO ćelijske linije i dobijanjem navedene kompozicije iz kulture CHO ćelija. U nekim otelotvorenjima, rhGAA proizveden iz izabranih CHO ćelijskih linija sadrži visok sadržaj N-glikana koji nose mono-M6P ili bis-M6P koji targetiraju CIMPR. U nekim otelovljenjima, rhGAA proizveden kao što je ovde opisano ima nizak nivo kompleksnih N-glikana sa terminalnom galaktozom. U nekim otelotvorenjima, izabrane CHO ćelijske linije se nazivaju GA-ATB200 ili ATB200-X5-14. U nekim otelotvorenjima, izabrane CHO ćelijske linije obuhvataju subkulturu ili derivat takve CHO ćelijske kulture. U nekim otelotvorenjima, rhGAA proizveden iz izabranih CHO ćelijskih linija naziva se ATB200.

[0079] RhGAA proizveden na način opisan ovde može se prečišćavati primenom sledećih metoda opisanih u Međunarodnoj patentnoj prijavi PCT/US2017/024981 i u Privremenoj patentnoj prijavi u SAD br.62/506,569. Primer procesa za proizvodnju, hvatanje i prečišćavanje rhGAA proizvedenog iz CHO ćelijskih linija prikazan je na slici 3.

[0080] Ukratko, bioreaktor 601 sadrži kulturu ćelija, kao što su CHO ćelije, koje izražavaju i luče rhGAA u okolne medijume tečne kulture. Bioreaktor 601 može biti bilo koji odgovarajući bioreaktor za kultivaciju ćelija, kao što je bioreaktor sa perfuzijom, šaržom ili polukontinualni bioreaktor. Medijum kulture se uklanja iz bioreaktora nakon vremenskog perioda koji je dovoljan da ćelije proizvedu rhGAA. Takvo uklanjanje medija može biti kontinuirano u slučaju bioreaktora sa perfuzijom ili može biti šaržno u slučaju šaržnog ili polukontinualnog bioreaktora. Medijum se može filtrirati pomoću sistema za filtriranje 603 da bi se uklonile ćelije. Sistem filtracije 603 može biti bilo koji odgovarajući sistem filtracije, uključujući sistem naizmenične tangencijalne filtracije protoka (ATF), sistem tangencijalne filtracije protoka (TFF) i/ili sistem centrifugalne filtracije. U različitim otelotvorenjima, sistem filtracije koristi filter sa veličinom pora između oko 10 nanometara i oko 2 mikrometra.

[0081] Nakon filtracije, filtrat se unosi u sistem za hvatanje proteina 605. Sistem za hvatanje proteina 605 može da sadrži jednu ili više hromatografskih kolona. Ukoliko se koristi više od jedne hromatografske kolone, kolone se mogu postaviti u nizove tako da sledeća kolona može početi sa učitavanjem nakon što je prva kolona učitana. Alternativno, proces uklanjanja medija može se zaustaviti tokom perioda zamene kolona.

[0082] U različitim otelotvorenjima, sistem za hvatanje proteina 605 uključuje jednu ili više kolona za razmenu anjona (AEX) za direktno hvatanje proizvoda rhGAA, posebno rhGAA sa visokim sadržajem M6P. RhGAA uhvaćen sistemom za hvatanje proteina 605 se eluira iz kolone (kolona) promenom vrednosti pH i/ili sadržaja soli u koloni. Primer uslova za AEX kolonu dati su u tabeli 2.

Tabela 2 Primer uslova za AEX kolonu

Postupak Pufer Brzina Zapremina Temperatura

[0083] Eluirani rhGAA može biti podvrgnut daljim koracima prečišćavanja i/ili osiguranja kvaliteta. Na primer, eluirani rhGAA može biti podvrgnut koraku uništavanja virusa 607. Takvo uništavanje virusa 607 može uključivati jedan ili više postupaka ubijanja sa niskim pH, uništavanje deterdžentom ili druge tehnike poznate u struci. RhGAA iz koraka uništavanja virusa 607 može se uvesti u drugi hromatografski sistem 609 radi daljeg pročišćavanja rhGAA proizvoda. Alternativno, eluirani rhGAA iz sistema za hvatanje proteina 605 može se ubaciti direktno u drugi hromatografski sistem 609. U različitim otelotvorenjima, drugi hromatografski sistem 609 uključuje jednu ili više kolona metal-jon imobilisane afinitetne hromatografije (IMAC) za dalje uklanjanje nečistoća. Primer uslova za kolonu IMAC dati su u tabeli 3 u nastavku.

Tabela 3 Primer uslova za IMAC kolonu

[0084] Nakon što se rhGAA unese u drugi hromatografski sistem 609, rekombinantni protein se eluira iz kolone (kolona). Eluirani rhGAA se može podvrgnuti koraku uništavanja virusa 611. Kao i u slučaju uništavanja virusa 607, uništavanje virusa 611 može uključivati jedan ili više postupaka ubijanja sa niskim pH, uništavanje deterdžentom ili druge tehnike poznate u struci. U nekim otelotvorenjima, koristi se samo jedan od postupaka uništavanja virusa, 607 ili 611, ili se virusi uništavaju u istoj fazi procesa prečišćavanja.

[0085] RhGAA iz koraka uništavanja virusa 611 može se uvesti u treći hromatografski sistem 613 kako bi se dalje pročistio rekombinantni proteinski proizvod. Alternativno, eluirani rekombinantni protein iz drugog hromatografskog sistema 609 može se ubaciti direktno u treći hromatografski sistem 613. U različitim otelotvorenjima, treći sistem hromatografije 613 uključuje jednu ili više kolona za hromatografiju izmene katjona (CEX) i/ili kolona za hromatografiju za isključivanje veličine (SEC) radi daljeg uklanjanja nečistoća. Proizvod rhGAA se zatim eluira iz trećeg hromatografskog sistema 613. Primer uslova za CEX kolonu dati su u tabeli 4, u nastavku.

Tabela 4 Primer uslova za CEX kolonu

[0086] Proizvod rhGAA takođe može biti podvrgnut daljoj obradi. Na primer, može se koristiti još jedan sistem za filtraciju 615 za uklanjanje virusa. U nekim otelotvorenjima, takva filtracija može uključivati filtere sa veličinama pora između 5 i 50 µm. Druga obrada proizvoda može uključiti korak prilagođavanja proizvoda 617, u kome se rekombinantni proteinski proizvod može sterilisati, filtrirati, koncentrovati, čuvati i/ili mu mogu biti dodate dodatne komponente za postizanje finalne formulacije proizvoda.

[0087] Na način na koji se koristi ovde, termin „ATB200“ se odnosi na rhGAA sa visokim sadržajem N-glikana koji nose mono-M6P i bis-M6P, koji se proizvodi iz GA-ATB200 ćelijske linije i prečišćava primenom ovde opisanih metoda.

V. Farmaceutski sastav

[0088] U različitim otelotvorenjima, naveden je farmaceutski sastav koji sadrži ovde opisani rhGAA, bilo samostalno ili u kombinaciji sa drugim terapijskim agensima i/ili farmaceutski prihvatljivim nosačem.

[0089] U jednom ili više otelotvorenja, farmaceutski sastav opisan u ovom dokumentu sadrži farmaceutski prihvatljivu so.

[0090] U nekim otelotvorenjima, farmaceutski prihvatljiva so koja se ovde koristi je farmaceutski prihvatljiva kiselinska adiciona so. Farmaceutski prihvatljiva kisela adiciona so može uključivati, bez ograničenja, hlorovodoničnu kiselinu, bromovodoničnu kiselinu, sumpornu kiselinu, sulfaminsku kiselinu, azotnu kiselinu, fosfornu kiselinu i slično, kao i organske kiseline uključujući, bez ograničenja, sirćetnu kiselinu, trifluorosirćetnu kiselinu, adipinsku kiselinu, askorbinsku kiselinu, asparaginsku kiselinu, benzensulfonsku kiselinu, benzoičnu kiselinu, buternu kiselinu, kamfornu kiselinu, kamforsulfonsku kiselinu, cimetnu kiselinu, limunsku kiselinu, diglukonsku kiselinu, etansulfonsku kiselinu, glutaminsku kiselinu, glikolnu kiselinu, glicerofosfornu kiselinu, hemisulfonsku kiselinu, heksansku kiselinu, mravlju kiselinu, fumarnu kiselinu, 2-hidroksietansulfonsku kiselinu (isetionsku kiselinu), mlečnu kiselinu, hidroksimaleinsku kiselinu, maličnu kiselinu, malonsku kiselinu, mandelnu kiselinu, mezitilensulfonsku kiselinu, metansulfonsku kiselinu, naftalensulfonsku kiselinu, nikotinsku kiselinu, 2-naftalensulfonsku kiselinu, oksalnu kiselinu, pamoičnu kiselinu, pektinsku kiselinu, fenilsirćetnu kiselinu, 3-fenilpropionsku kiselinu, pivalinsku kiselinu, propionsku kiselinu, piruvičnu kiselinu, salicilnu kiselinu, stearinsku kiselinu, jantarnu kiselinu, sulfaninsku kiselinu, vinsku kiselinu, p-toluensulfonsku kiselinu, undekansku kiselinu i slično.

[0091] U nekim otelotvorenjima, farmaceutski prihvatljiva so koja se ovde koristi je farmaceutski prihvatljiva bazna adiciona so. Farmaceutski prihvatljiva bazna adiciona so može uključivati, bez ograničenja, amonijak ili hidroksid, karbonat ili bikarbonat amonijuma ili metalni katjon kao što su natrijum, kalijum, litijum, kalcijum, magnezijum, gvožđe, cink, bakar, mangan, aluminijum i slično. Soli izvedene iz farmaceutski prihvatljivih organskih netoksičnih baza uključuju, bez ograničenja, soli primarnih, sekundarnih i tercijarnih amina, jedinjenja kvaternarnih amina, supstituisane amine uključujući prirodno prisutne supstituisane amine, ciklične amine i bazične jonoizmenjivačke smole, kao što su metilamin, dimetilamin, trimetilamin, etilamin, dietilamin, trietilamin, izopropilamin, tripropilamin, tributilamin, etanolamin, dietanolamin, 2-dimetilaminoetanol, 2-dietilaminoetanol, dicikloheksilamin, lizin, arginin, histidin, kofein, hidrabamin, holin, betain, etilendiamin, glukozamin, metilglukamin, teobromin, purini, piperazin, piperidin, N-etilpiperidin, jedinjenja tetraetilamonijuma, piridin, N,N-dimetilanilin, N-metilpiperidin, N-metilmorfolin, dicikloheksilamin, dibenzilamin, N,N-dibenzilfenetilamin, 1-efenamin, N,N'-dibenziletilendiamin, poliaminske smole i slično.

[0092] U nekim otelotvorenjima, rhGAA ili njena farmaceutski prihvatljiva so može se formulisati u vidu farmaceutskog sastava prilagođenog za intravensku primenu. U nekim otelotvorenjima, farmaceutski sastav je rastvor u sterilnom izotoničnom vodenom puferu. Po potrebi, sastav može sadržati sredstvo za rastvaranje i lokalni anestetik za ublažavanje bola na mestu injekcije. Sastojci farmaceutskog sastava mogu biti isporučeni pojedinačno ili pomešani zajedno u obliku jedinične doze, na primer, u vidu suvog liofilizovanog praha ili koncentrata bez vode u hermetički zatvorenoj posudi kao što je ampula ili vrećica, sa naznačenom količinom aktivnog agensa. Kada se sastav primenjuje infuzijom, moguće je njegovo izdavanje sa bočicom za infuziju koja sadrži sterilnu farmaceutsku vodu, fiziološki rastvor ili dekstrozu/vodu. U nekim otelotvorenjima, infuzija se može dati u bolnici ili u kliničkim uslovima. U nekim otelotvorenjima, infuzija se može dati izvan bolnice ili izvan kliničkih uslova, na primer, u prebivalištu subjekta. Ako se sastav daje injekcijom, može se obezbediti ampula sterilne vode za injekciju ili fiziološki rastvor tako da se sastojci mogu pomešati pre primene.

[0093] U nekim otelotvorenjima, rhGAA ili njena farmaceutski prihvatljiva so mogu biti formulisani za oralnu primenu. Sastavi za oralnu primenu mogu se formulisati u obliku tableta, kapsula, ovula, eliksira, rastvora ili suspenzija, gelova, sirupa, sredstva za ispiranje usta ili suvog praha za rekonstituciju vodom ili drugim pogodnim sredstvom pre upotrebe, opciono sa agensima za aromatizaciju i bojenje za primenu sa trenutnim, odloženim, modifikovanim, trajnim, pulsiranim ili kontrolisanim oslobađanjem. Čvrste kompozicije kao što su tablete, kapsule, pastile, pilule, bolusi, prah, paste, granule, supozitorije, dražeje ili premiks preparati se takođe mogu koristiti. Čvrsti i tečni sastavi za oralnu primenu mogu se pripremiti prema metodama koje su dobro poznate u struci. Takvi sastavi takođe mogu sadržati jedan ili više farmaceutski prihvatljivih nosača i ekscipijenasa koji mogu biti u čvrstom ili tečnom obliku. Tablete ili kapsule se mogu pripremiti konvencionalnim putem sa farmaceutski prihvatljivim ekscipijensima, uključujući, bez ograničenja, sredstva za vezivanje, punila, maziva, sredstva za dezintegraciju ili sredstva za vlaženje. Pogodni farmaceutski prihvatljivi ekscipijensi su poznati u struci i uključuju, bez ograničenja, prethodno gelirani skrob, polivinilpirolidon, povidon, hidroksipropil metilcelulozu (HPMC), hidroksipropil etil celulozu (HPEC), hidroksipropil celulozu (HPC), saharozu, želatin, akaciju, laktozu, mikrokristalnu celulozu, kalcijum hidrogen fosfat, magnezijum stearat, stearinsku kiselinu, gliceril behenat, talk, silicijum dioksid, kukuruzni, krompirski ili tapioka skrob, natrijum skrob glikolat, natrijum lauril sulfat, natrijum citrat, kalcijum karbonat, dibazni kalcijum fosfat, glicin karmelozu natrijum i kompleksne silikate. Tablete se mogu premazati pomoću metoda koje su dobro poznate u struci.

[0094] U nekim otelotvorenjima, ovde opisani farmaceutski sastav može biti formulisan u skladu sa Međunarodnom patentnom prijavom PCT/US2017/024982 i Privremenom patentnom prijavom u SAD br.62/506,574. Na primer, u nekim otelotvorenjima, pH farmaceutskog sastava opisanog ovde je od oko 5,0 do oko 7,0 ili oko 5,0 do oko 6,0. U nekim otelotvorenjima, pH se kreće od oko 5,5 do oko 6,0. U nekim otelotvorenjima, pH farmaceutskog sastava je 6,0. U nekim otelotvorenjima, pH se može podesiti na ciljni pH koristeći pH regulatore (npr. sredstva za alkalizaciju i sredstva za zakiseljavanje) kao što su natrijum hidroksid i/ili hlorovodonična kiselina.

[0095] Ovde opisani farmaceutski sastav može se sastojati od puferskog sistema kao što je citratni sistem, fosfatni sistem i njihova kombinacija. Citrat i/ili fosfat mogu biti natrijum citrat ili natrijum fosfat. Ostale soli uključuju soli kalijuma i amonijuma. U jednom ili više otelotvorenja, pufer sadrži citrat. U daljim otelotvorenjima, pufer sadrži natrijum citrat (npr. mešavinu natrijum citrat dehidrata i citratne kiseline monohidrata). U jednom ili više otelotvorenja, puferski rastvori koji sadrže citrat mogu sadržati natrijum citrat i limunsku kiselinu. U nekim otelotvorenjima prisutni su i citratni i fosfatni pufer.

[0096] U nekim otelotvorenjima, ovde opisani farmaceutski sastav sadrži najmanje jedan ekscipijens. Ekscipijens može da funkcioniše kao agens za tonicitet, sredstvo za povećanje zapremine i/ili stabilizator. Sredstva za tonicitet su komponente koje pomažu da se obezbedi da formulacija ima osmotski pritisak sličan ili isti kao ljudska krv. Sredstva za povećanje zapremine su sastojci koji dodaju masu formulacijama (npr. liofilizovani) i obezbeđuju adekvatnu strukturu kolača. Stabilizatori su jedinjenja koja mogu sprečiti ili minimizirati formiranje agregata na hidrofobnim međupovršinama vazduh-voda. Jedan ekcipijens može istovremeno da funkcioniše kao sredstvo za tonicitet i sredstvo za povećanje zapremine. Na primer, manitol može funkcionisati kao sredstvo za tonicitet i takođe ima prednosti kao sredstvo za povećanje zapremine.

[0097] Primeri agenasa za tonicitet uključuju natrijum hlorid, manitol, saharozu i trehalozu. U nekim otelotvorenjima, agens za tonicitet sadrži manitol. U nekim otelotvorenjima, ukupna količina agenasa za tonicitet varira u količini od oko 10 mg/mL do oko 50 mg/mL. U daljim otelotvorenjima, ukupna količina agenasa za tonicitet varira u količini od oko 10, 11, 12, 13, 14 ili 15 mg/mL do oko 16, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ili 50 mg/mL.

[0098] U nekim otelotvorenjima, ekcipijens se sastoji od stabilizatora. U nekim otelotvorenjima, stabilizator je surfaktant. U nekim otelotvorenjima, stabilizator je polisorbat 80. U jednom ili više otelotvorenja, ukupna količina stabilizatora kreće se od oko 0,1 mg/mL do oko 1,0 mg/mL. U daljim otelotvorenjima, ukupna količina stabilizatora se kreće od oko 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 ili 0,5 mg/mL do oko 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 ili 1,0 mg/mL. U daljim otelotvorenjima, ukupna količina stabilizatora je oko 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 ili 1,0 mg/mL.

[0099] U nekim otelotvorenjima, farmaceutski sastav sadrži (a) rhGAA (kao što je ATB200), (b) najmanje jedan pufer izabran iz grupe koja se sastoji od citrata, fosfata i njihove kombinacije, i (c) najmanje jedan ekscipijens izabran iz grupe koja se sastoji od manitola, polisorbata 80 i njihove kombinacije, i ima pH od (i) od oko 5,0 do oko 6,0, ili (ii) od oko 5,0 do oko 7,0. U nekim otelotvorenjima, sastav dalje sadrži vodu. U nekim otelotvorenjima, sastav može dalje da sadrži sredstvo za zakiseljavanje i/ili sredstvo za alkalizaciju.

[0100] U nekim otelotvorenjima, farmaceutski sastav sadrži (a) rhGAA (kao što je ATB200) u koncentraciji od oko 5-50 mg/mL, oko 5-30 mg/mL, ili oko 15 mg/mL, (b) pufer natrijum citrata u koncentraciji od oko 10-100 mM ili oko 25 mM, (c) manitol u koncentraciji od oko 10-50 mg/mL, ili oko 20 mg/mL, (d) polisorbat 80, prisutan u koncentraciji od oko 0,1-1 mg/mL, oko 0,2-0,5 mg/mL, ili oko 0,5 mg/mL, i (e) vodu, i ima pH od oko 6,0. U najmanje jednom otelotvorenju, farmaceutski sastav sadrži (a) 15 mg/mL rhGAA (kao što je ATB200) (b) 25 mM pufer natrijum citrata, (c) 20 mg/mL manitola (d) 0,5 mg/mL polisorbata 80 i (e) vodu, i ima pH od oko 6,0. U nekim otelotvorenjima, sastav može dalje da sadrži sredstvo za zakiseljavanje i/ili sredstvo za alkalizaciju.

[0101] U nekim otelotvorenjima, farmaceutski sastav koji se sastoji od rhGAA se razblažuje pre primene na subjektu kojem je to potrebno.

[0102] U nekim otelotvorenjima, farmaceutski sastav opisan u ovom dokumentu sadrži šaperona. U nekim otelotvorenjima, šaperon je miglustat ili njegova farmaceutski prihvatljiva so. U drugom otelotvorenju, šaperon je duvoglustat ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.

[0103] U nekim otelotvorenjima, rhGAA opisan ovde je formulisan u jednom farmaceutskom sastavu, dok je šaperon kao što je miglustat formulisan u drugom farmaceutskom sastavu. U nekim otelotvorenjima, farmaceutski sastav koji se sastoji od miglustata zasniva se na formulaciji koja je komercijalno dostupna kao Zavesca<®>(Actelion Pharmaceuticals).

[0104] U nekim otelotvorenjima, ovde opisani farmaceutski sastav može biti podvrgnut postupku liofilizacije kako bi se obezbedio kolač ili prah. Shodno tome, drugi aspekt pronalaska odnosi se na farmaceutski sastav nakon liofilizacije. Liofilizovana smeša može se sastojati od ovde opisanog rhGAA (npr. ATB200), pufera izabranog iz grupe koja se sastoji od citrata, fosfata i njihovih kombinacija, i najmanje jednog ekscipijensa izabranog iz grupe koja se sastoji od trehaloze, manitola, polisorbata 80 i njihove kombinacije. U nekim otelotvorenjima, drugi sastojci (npr. drugi ekscipijensi) mogu se dodati liofilizovanoj smeši. Farmaceutski sastav koji sadrži liofilizovanu formulaciju može biti bočica, koja se zatim može skladištiti, transportovati, u kojoj se može vršiti rekonstitucija i/ili se ona može iskoristiti za primenu kod pacijenta.

VI. Metode lečenja

A. Lečenje bolesti

[0105] Drugi aspekt otkrića odnosi se na metod lečenja bolesti ili poremećaja povezanog sa disregulacijom skladištenja glikogena primenom rhGAA ili farmaceutskog sastava opisanog u ovom dokumentu. U nekim primerima, bolest je Pompeova bolest (takođe poznata kao deficit enzima kisele maltaze (AMD) i bolest skladištenja glikogena tipa II (GSD II)). U nekim otelotvorenjima, rhGAA je ATB200. U nekim otelotvorenjima, farmaceutski sastav sadrži ATB200.

[0106] Ovde opisani rhGAA ili farmaceutski sastav se primenjuje odgovarajućim putem. RhGAA ili farmaceutski sastav se primenjuje intravenozno u ovom pronalasku.

[0107] U nekim otelotvorenjima, terapijski efekti rhGAA ili farmaceutskog sastava opisanog u ovom dokumentu mogu se proceniti na osnovu jednog ili više sledećih kriterijuma: (1) srčanog statusa (npr. povećanje krajnjih dijastoličkih i/ili krajnjih sistolnih zapremina, ili smanjenje, poboljšanje ili prevencija progresivne kardiomiopatije koja se obično nalazi kod GSD-II), (2) plućne funkcije (npr. povećanje vitalnog kapaciteta plakanja u odnosu na početni kapacitet i/ili normalizacija desaturacije kiseonika tokom plakanja), (3) neurološki razvoj i/ili razvoj motoričkih sposobnosti (npr. povećanje skora AIMS) i (4) smanjenje nivoa glikogena u tkivu pojedinca pogođenog bolešću.

[0108] U nekim otelotvorenjima, srčani status subjekta se poboljšava za 10%, 20%, 30%, 40% ili 50% (ili bilo koji procenat između) nakon primene jedne ili više doza rhGAA ili farmaceutskog sastava opisanog u ovom dokumentu, u poređenju sa subjektom koji je tretiran vehikulumom ili sa subjektom pre tretmana. Srčani status subjekta može se proceniti merenjem krajnjih dijastoličkih i/ili krajnjih sistolnih zapremina i/ili kliničkom procenom kardiomiopatije. U nekim otelotvorenjima, plućna funkcija subjekta se poboljšava za 10%, 20%, 30%, 40% ili 50% (ili bilo koji procenat između) nakon primene jedne ili više doza ATB200 ili farmaceutskog sastava koji sadrži ATB200, u poređenju sa subjektom tretiranim vehikulumom ili sa subjektom pre tretmana. U određenim otelotvorenjima, poboljšanje se postiže nakon 1 nedelje, 2 nedelje, 3 nedelje, 1 mesec, 2 meseca ili više od primene (ili bilo kog vremenskog perioda između). U određenim otelotvorenjima, ATB200 ili farmaceutski sastav koji sadrži ATB200 poboljšava plućnu funkciju subjekta nakon 1 nedelje, 2 nedelje, 3 nedelje, 1 meseca, 2 meseca ili više od primene (ili nakon bilo kog vremenskog perioda između).

[0109] U nekim otelotvorenjima, plućna funkcija subjekta se poboljšava za 10%, 20%, 30%, 40% ili 50% (ili bilo koji procenat između) nakon primene jedne ili više doza rhGAA ili farmaceutskog sastava opisanog u ovom dokumentu, u poređenju sa subjektom koji je tretiran vehikulumom ili sa subjektom pre tretmana. Plućna funkcija subjekta može se proceniti na osnovu vitalnog kapaciteta plakanja u odnosu na početni kapaciteta i/ili na osnovu normalizacije desaturacije kiseonika tokom plakanja. U nekim otelotvorenjima, plućna funkcija subjekta se poboljšava za 10%, 20%, 30%, 40% ili 50% (ili bilo koji procenat između) nakon primene jedne ili više doza ATB200 ili farmaceutskog sastava koji sadrži ATB200, u poređenju sa subjektom tretiranim vehikulumom ili sa subjektom pre tretmana. U određenim otelotvorenjima, poboljšanje se postiže nakon 1 nedelje, 2 nedelje, 3 nedelje, 1 mesec, 2 meseca ili više od primene (ili bilo kog vremenskog perioda između). U određenim otelotvorenjima, ATB200 ili farmaceutski sastav koji sadrži ATB200 poboljšava plućnu funkciju subjekta nakon 1 nedelje, 2 nedelje, 3 nedelje, 1 meseca, 2 meseca ili više od primene (ili nakon bilo kog vremenskog perioda između).

[0110] U nekim otelotvorenjima, neurološki razvoj i/ili razvoj motoričkih funkcija subjekta se poboljšava za 10%, 20%, 30%, 40% ili 50% (ili za bilo koji procenat između) nakon primene jedne ili više doza rhGAA ili farmaceutskog sastava opisanog u ovom dokumentu, u poređenju sa subjektom koji je tretiran vehikulumom ili sa subjektom pre tretmana.

Neurološki razvoj i/ili razvoj motoričkih funkcija subjekta mogu se proceniti određivanjem AIMS skora. AIMS je standardizovana skala od 12 stavki koju primenjuje kliničar i koja se boduje (videti Rush JA Jr., Handbook of Psychiatric Measures, American Psychiatric Association, 2000, 166-168). Stavke 1-10 se ocenjuju na skali od 5 tačaka. Tačke 1-4 procenjuju orofacijalne pokrete. Stavke 5-7 bave se diskinezijom ekstremiteta i trupa. Stavke 8-10 bave se globalnom ozbiljnošću u skladu sa procenom ispitivača i pacijentovom svešću o pokretima i distresu koji se dovodi u vezu sa njima. Stavke 11-12 su da/ne pitanja koja se tiču problema sa zubima i/ili protezama (takvi problemi mogu dovesti do pogrešne dijagnoze diskinezije). U nekim otelotvorenjima, neurološki razvoj i/ili razvoj motoričkih funkcija subjekta se poboljšava za 10%, 20%, 30%, 40% ili 50% (ili bilo koji procenat između) nakon primene jedne ili više doza ATB200 ili farmaceutskog sastava koji sadrži ATB200, u poređenju sa subjektom tretiranim vehikulumom ili sa subjektom pre tretmana. U određenim otelotvorenjima, poboljšanje se postiže nakon 1 nedelje, 2 nedelje, 3 nedelje, 1 mesec, 2 meseca ili više od primene (ili bilo kog vremenskog perioda između). U određenim otelotvorenjima, ATB200 ili farmaceutski sastav koji sadrži ATB200 poboljšava neurološki razvoj i/ili razvoj motoričkih funkcija subjekta nakon 1 nedelje, 2 nedelje, 3 nedelje, 1 meseca, 2 meseca ili više od primene (ili nakon bilo kog vremenskog perioda između).

[0111] U nekim otelotvorenjima, nivo glikogena u određenom tkivu kod subjekta se smanjuje za 10%, 20%, 30%, 40% ili 50% (ili bilo koji procenat između) nakon primene jedne ili više doza rhGAA ili farmaceutskog sastava opisanog u ovom dokumentu, u poređenju sa subjektom koji je tretiran vehikulumom ili sa subjektom pre tretmana. U nekim otelotvorenjima, tkivo je mišić kao što je kvadriceps, triceps i gastroknemijus. Nivo glikogena u tkivu može se analizirati primenom metoda koje su poznate u struci. Određivanje nivoa glikogena je dobro poznato na osnovu digestije amiloglukozidaze, i opisano je u publikacijama kao što su: Amalfitano et al. (1999), "Systemic correction of the muscle disorder glycogen storage disease type ii after hepatic targeting of a modified adenovirus vector encoding human acid-alphaglucosidase," Proc Natl Acad Sci USA, 96:8861-8866. U nekim otelotvorenjima, nivo glikogena u mišićima subjekta se smanjuje za 10%, 20%, 30%, 40% ili 50% (ili bilo koji procenat između) nakon primene jedne ili više doza ATB200 ili farmaceutskog sastava koji sadrži ATB200, u poređenju sa subjektom tretiranim vehikulumom ili sa subjektom pre tretmana. U određenim otelotvorenjima, redukcija se postiže nakon 1 nedelje, 2 nedelje, 3 nedelje, 1 mesec, 2 meseca ili više od primene (ili bilo kog vremenskog perioda između). U određenim otelotvorenjima, ATB200 ili farmaceutski sastav koji sadrži ATB200 smanjuje nivo glikogena u mišićima subjekta nakon 1 nedelje, 2 nedelje, 3 nedelje, 1 meseca, 2 meseca ili više od primene (ili nakon bilo kog vremenskog perioda između).

B. Biomarkeri

[0112] Biomarkeri akumulacije glikogena u mišićnom vlaknu kod subjekta, kao što je urin heksoza tetrasaharid (Hex4), mogu se koristiti za procenu i poređenje terapijskih efekata enzimske supstitucione terapije kod subjekata sa Pompeovom bolešću. U nekim otelotvorenjima, terapijski efekat rhGAA ili farmaceutskog sastava koji sadrži rhGAA na akumulaciju glikogena se procenjuje merenjem nivoa Hex4 kod subjekta.

[0113] Biomarkeri povrede ili oštećenja mišića kao što su kreatin kinaza (CK), alanin aminotransferaza (ALT) i aspartat aminotransferaza (AST) mogu se koristiti za procenu i poređenje terapijskih efekata enzimske supstitucione terapije kod subjekata sa Pompeovom bolešću. U nekim otelotvorenjima, terapijski efekat rhGAA ili farmaceutskog sastava koji sadrži rhGAA na oštećenje mišića se procenjuje merenjem nivoa CK, ALT i/ili AST kod subjekta. U najmanje jednom otelotvorenju, terapijski efekat rhGAA ili farmaceutskog sastava koji sadrži rhGAA na oštećenje mišića se procenjuje merenjem nivoa CK kod subjekta.

[0114] Biomarkeri kao što su LAMP-1, LC3 i disferlin takođe se mogu koristiti za procenu i poređenje terapijskih efekata rhGAA ili farmaceutskog sastava opisanog u ovom dokumentu. Kod Pompeove bolesti, neuspeh GAA da hidrolizuje lizozomski glikogen dovodi do abnormalne akumulacije velikih lizozoma ispunjenih glikogenom u nekim tkivima. (Raben et al., JBC 273: 19086-19092, 1998.) Studije na mišjem modelu Pompeove bolesti pokazale su da uvećani lizozomi u skeletnim mišićima ne mogu adekvatno opravdati smanjenje mehaničkih performansi, te da prisustvo velikih inkluzija koje sadrže degradirane miofibrile (tj. nakupljanje autofaga) doprinosi oštećenju mišićne funkcije. (Raben et al., Human Mol Genet 17: 3897-3908, 2008.) Izveštaji takođe sugerišu da je poremećeni tok autofagije povezan sa lošim terapijskim ishodom kod pacijenata sa Pompeom. (Nascimbeni et al., Neuropathology and Applied Neurobiology doi: 10.1111/nan.12214, 2015; Fukuda et al., Mol Ther 14: 831-839, 2006.) Pored toga, kasna Pompeova bolest je preovlađujuća u neklasifikovanim mišićnim distrofijama ekstremiteta (LGMD) (Preisler et al., Mol Genet Metab 110: 287-289, 2013), što je grupa genetski heterogenih neuromuskularnih bolesti sa više od 30 genetski definisanih podtipova različite težine. IHC ispitivanje je otkrilo značajno sarkoplazmatsko prisustvo disferlina u skeletnim mišićnim vlaknima Gaa KO miševa u većem stepenu.

[0115] Različite poznate metode mogu se koristiti za merenje nivoa ekspresije gena i/ili nivoa proteina takvih biomarkera. Na primer, može se dobiti uzorak od subjekta tretiranog sa rhGAA ili farmaceutskim sastavom opisanim u ovom dokumentu, kao što je biopsija tkiva, posebno mišića. U nekim otelotvorenjima, uzorak je biopsija mišića kod subjekta. U nekim otelotvorenjima, mišić se bira između kvadricepsa, tricepsa i gastroknemijusa. Uzorak dobijen od subjekta može biti obojen sa jednim ili više antitela ili drugih agenasa za detekciju koji detektuju takve biomarkere ili mogu biti identifikovani i kvantifikovani masenom spektrometrijom. Uzorci se takođe mogu ili alternativno obraditi za otkrivanje prisustva nukleinskih kiselina, kao što su iRNK, kodiranje biomarkera putem, npr. RT-qPCR metoda.

[0116] U nekim otelotvorenjima, nivo ekspresije gena i/ili nivo proteina jednog ili više biomarkera meri se u biopsiji mišića dobijenoj od pojedinca pre i nakon tretmana sa rhGAA ili farmaceutskim sastavom opisanim u ovom dokumentu. U nekim otelotvorenjima, nivo ekspresije gena i/ili nivo proteina jednog ili više biomarkera se meri biopsijom mišića dobijenom od pojedinca tretiranog vehikulumom. U nekim otelotvorenjima, nivo ekspresije gena i/ili nivo proteina jednog ili više biomarkera se smanjuje za 10%, 20%, 30%, 40% ili 50% (ili bilo koji procenat između) nakon primene jedne ili više doza rhGAA ili farmaceutskog sastava opisanog u ovom dokumentu, u poređenju sa onim kod subjekta tretiranog vehikulumom ili kod subjekta pre tretmana. U nekim otelotvorenjima, nivo ekspresije gena i/ili nivo proteina jednog ili više biomarkera se smanjuje za 10%, 20%, 30%, 40% ili 50% (ili bilo koji procenat između) nakon primene jedne ili više doza ATB200 ili farmaceutskog sastava koji sadrži ATB200, u poređenju sa onim kod subjekta tretiranog vehikulumom ili kod subjekta pre tretmana. U određenim otelotvorenjima, redukcija se postiže nakon 1 nedelje, 2 nedelje, 3 nedelje, 1 mesec, 2 meseca ili više od primene (ili bilo kog vremenskog perioda između). U određenim otelotvorenjima, ATB200 ili farmaceutski sastav koji sadrži ATB200 redukuje nivo ekspresije gena i/ili nivo proteina jednog ili više biomarkera nakon 1 nedelje, 2 nedelje, 3 nedelje, 1 meseca, 2 meseca ili više od primene (ili u bilo kom vremenskom periodu između).

C. Doziranje rhGAA

[0117] Farmaceutska formulacija ili rekonstituisani sastav se primenjuje u terapijski efikasnoj količini (npr. količina doze koja je, kada se primenjuje u redovnim intervalima, dovoljna za lečenje bolesti, npr. ublažavanjem simptoma povezanih sa bolešću, sprečavanjem ili odlaganjem početka bolesti i/ili smanjenjem ozbiljnosti ili učestalosti simptoma bolesti). Količina koja je terapijski efikasna u lečenju bolesti može zavisiti od prirode i obima efekata bolesti, a može se odrediti standardnim kliničkim tehnikama. Pored toga, in vitro ili in vivo testovi se mogu opciono koristiti kako bi se identifikovali optimalni opsezi doziranja. U najmanje jednom otelotvorenju, rhGAA opisan ovde ili farmaceutski sastav koji sadrži rhGAA daje se u dozi od oko 1 mg/kg do oko 100 mg/kg, npr. oko 5 mg/kg do oko 30 mg/kg, obično oko 5 mg/kg do oko 20 mg/kg. U najmanje jednom otelotvorenju, ovde opisani rhGAA ili farmaceutski sastav se daje u dozi od oko 5 mg/kg, oko 10 mg/kg, oko 15 mg/kg, oko 20 mg/kg, oko 25 mg/kg, oko 30 mg/kg, oko 35 mg/kg, oko 40 mg/kg, oko 50 mg/kg, oko 50 mg/kg, oko 60 mg/kg, oko 70 mg/kg, oko 80 mg/kg, oko 90 mg/kg ili oko 100 mg/kg. U nekim otelotvorenjima, rhGAA se daje u dozi od 5 mg/kg, 10 mg/kg, 20 mg/kg, 50 mg/kg, 75 mg/kg ili 100 mg/kg. U najmanje jednom otelotvorenju, rhGAA ili farmaceutski sastav se daje u dozi od oko 20 mg/kg. U nekim otelotvorenjima, rhGAA ili farmaceutski sastav se primenjuje istovremeno ili sekvencijalno sa farmakološkim šaperonom. U nekim otelotvorenjima, farmakološki šaperon je miglustat. U najmanje jednom otelotvorenju, miglustat se primenjuje u vidu oralne doze od oko 260 mg. Efikasna doza za određenog pojedinca može se menjati (npr. povećavati ili smanjivati) tokom vremena, u zavisnosti od potreba pojedinca. Na primer, u vreme fizičke bolesti ili stresa, ili ako antitela na αglukozidazu postanu prisutna ili se njihov nivo poveća, ili ako se simptomi bolesti pogoršaju, količina se može povećati.

[0118] U nekim otelotvorenjima, terapijski efikasna doza rhGAA ili farmaceutskog sastava opisanog ovde je niža od doza konvencionalnih rhGAA proizvoda. Na primer, ako je terapijski efikasna doza konvencionalnog rhGAA proizvoda 20 mg/kg, doza rhGAA ili farmaceutskog sastava opisanog u ovom dokumentu potrebna da proizvede iste ili bolje terapijske efekte od konvencionalnog rhGAA proizvoda može biti manja od 20 mg/kg.

Terapijski efekti se mogu proceniti na osnovu jednog ili više gore navedenih kriterijuma (npr. srčani status, nivo glikogena ili ekspresija biomarkera). U nekim otelotvorenjima, terapijski efikasna doza rhGAA ili farmaceutskog sastava opisanog u ovom dokumentu je najmanje oko 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili više niža od konvencionalnih rhGAA proizvoda.

[0119] U nekim otelotvorenjima, terapijski efekat rhGAA ili farmaceutskog sastava opisanog u ovom dokumentu obuhvata poboljšanje motoričke funkcije, poboljšanje mišićne snage (gornjeg tela, donjeg tela ili celog tela), poboljšanje plućne funkcije, smanjenje umora, smanjenje nivoa najmanje jednog biomarkera povrede mišića, smanjenje nivoa najmanje jednog biomarkera akumulacije glikogena ili kombinaciju ovih poboljšanja. U nekim otelotvorenjima, terapijski efekat rhGAA ili farmaceutske kompozicije koja je ovde opisana obuhvata preokret lizozomalne patologije u mišićnom vlaknu, bržu i/ili efikasniju redukciju sadržaja glikogena u mišićnom vlaknu, povećanje pređene udaljenosti prilikom 6-minutnog testa hoda, smanjenje vremena „Timed Up and Go“ (TUG), smanjenje vremena u testu penjanja na četiri stepenika, smanjenje vremena u testu hodanja na deset metara, smanjenje skora na testu GSGC („Hod – Stepenice – Gauerov znak – Stolica“), povećanje snage gornjih ekstremiteta, poboljšanje adukcije ramena, poboljšanje abdukcije ramena, poboljšanje fleksije lakta, poboljšanje ekstenzije lakta, poboljšanje snage gornjeg dela tela, poboljšanje snage donjeg dela tela, poboljšanje ukupne snage tela, poboljšanje vrednosti forsiranog vitalnog kapaciteta u uspravnom (sedećem) stavu, poboljšanje vrednosti maksimalnog ekspiratornog pritiska, poboljšanje vrednosti maksimalnog inspiratornog pritiska, smanjenje skora na skali ozbiljnosti umora, smanjenje nivoa heksoza tetrasaharida u urinu, smanjenje nivoa kreatin kinaze, smanjenje nivoa alanin aminotransferaze, smanjenje nivoa aspartat aminotransferaze, ili bilo koja kombinacija ovih poboljšanja.

[0120] U nekim otelotvorenjima, rhGAA ili farmaceutski sastav opisan u ovom dokumentu postiže željene terapijske efekte brže od konvencionalnih rhGAA proizvoda kada se primenjuju u istoj dozi. Terapijski efekti se mogu proceniti na osnovu jednog ili više gore navedenih kriterijuma (npr. srčani status, nivo glikogena ili ekspresija biomarkera). Na primer, ako jedna doza konvencionalnog rhGAA proizvoda smanji nivo glikogena u tkivu tretiranog pojedinca za 10% za nedelju dana, isti stepen smanjenja može se postići za manje od nedelju dana prilikom primene iste doze rhGAA ili farmaceutskog sastava opisanog u ovom dokumentu. U nekim otelotvorenjima, kada se primenjuje u istoj dozi, rhGAA ili farmaceutski sastav opisan u ovom dokumentu može postići željene terapijske efekte najmanje oko 1,25; 1,5; 1,75; 2,0; 3,0 puta ili brže od konvencionalnih rhGAA proizvoda.

[0121] U nekim otelotvorenjima, terapijski efikasna količina rhGAA (ili sastava ili leka koji sadrži rhGAA) primenjuje se više od jednom. U nekim otelotvorenjima, rhGAA ili farmaceutski sastav opisan u ovom dokumentu se primenjuje u redovnim intervalima, u zavisnosti od prirode i obima efekata bolesti, i na kontinuiranoj osnovi. Primena u „redovnom intervalu“, na način na koji se ovaj izraz ovde koristi, ukazuje na to da se terapijski efikasna količina daje periodično (za razliku od jednokratne doze). Interval se može odrediti standardnim kliničkim tehnikama. U određenim otelotvorenjima, rhGAA se primenjuje dvomesečno, mesečno, dvonedeljno, nedeljno, dva puta nedeljno ili dnevno. U nekim otelotvorenjima, rhGAA se daje intravenozno dva puta nedeljno, nedeljno ili svake druge nedelje. Interval primene za jednog pojedinca ne mora biti fiksni interval, ali može varirati tokom vremena, u zavisnosti od potreba pojedinca. Na primer, u vreme fizičke bolesti ili stresa, ako anti-rhGAA antitela postanu prisutna ili se njihov nivo poveća, ili ako se simptomi bolesti pogoršaju, interval između doza može se smanjiti.

[0122] U nekim otelotvorenjima, kada se koriste u istoj dozi, rhGAA ili farmaceutski sastav kao što je ovde opisano mogu se davati ređe od konvencionalnih rhGAA proizvoda, a ipak proizvesti iste ili bolje terapijske efekte od konvencionalnih rhGAA proizvoda. Na primer, ako se konvencionalni rhGAA proizvod primenjuje u dozi od 20 mg/kg nedeljno, rhGAA ili farmaceutski sastav kao što je opisano u ovom dokumentu mogu proizvesti iste ili bolje terapijske efekte od konvencionalnog rhGAA proizvoda kada se primenjuje u dozi od 20 mg/kg, iako se rhGAA ili farmaceutski sastav primenjuje ređe, npr. dvonedeljno ili mesečno. Terapijski efekti se mogu proceniti na osnovu jednog ili više gore navedenih kriterijuma (npr. srčani status, nivo glikogena ili ekspresija biomarkera). U nekim otelotvorenjima, interval između dve doze rhGAA ili farmaceutskog sastava opisanog u ovom dokumentu je duži od intervala kod konvencionalnih rhGAA proizvoda. U nekim otelotvorenjima, interval između dve doze rhGAA ili farmaceutskog sastava je najmanje oko 1,25; 1,5; 1,75; 2,0; 3,0 puta ili duži od onog kod konvencionalnih rhGAA proizvoda.

[0123] U nekim otelotvorenjima, pod istim uslovima tretmana (npr. ista doza primenjena u istom intervalu), rhGAA ili farmaceutski sastav opisan u ovom dokumentu obezbeđuje terapijska dejstva u stepenu koji je superiorniji od onog koji obezbeđuju konvencionalni rhGAA proizvodi. Terapijski efekti se mogu proceniti na osnovu jednog ili više gore navedenih kriterijuma (npr. srčani status, nivo glikogena ili ekspresija biomarkera). Na primer, u poređenju sa konvencionalnim rhGAA proizvodom koji se primenjuje u dozi od 20 mg/kg nedeljno, rhGAA ili farmaceutski sastav koji se primenjuje u dozi od 20 mg/kg nedeljno može smanjiti nivo glikogena u tkivu tretiranog pojedinca u većem stepenu. U nekim otelotvorenjima, kada se primenjuje pod istim uslovima lečenja, rhGAA ili farmaceutski sastav opisan u ovom dokumentu obezbeđuje terapijske efekte koji su najmanje oko 1,25; 1,5; 1,75; 2,0; 3,0 puta ili veći od onih konvencionalnih rhGAA proizvoda.

D. Kombinovana terapija

[0124] U okviru pronalaska, rhGAA ili farmaceutski sastav koji sadrži rhGAA opisan u ovom dokumentu se primenjuje istovremeno ili sekvencijalno sa farmakološkim šaperonom. Farmakološki šaperon se primenjuje oralno, dok se rhGAA ili farmaceutski sastav primenjuje intravenozno.

[0125] U okviru pronalaska, farmakološki šaperon je miglustat i daje se u oralnoj dozi od oko 260 mg.

[0126] U okviru pronalaska, rhGAA se daje intravenozno u dozi od oko 20 mg/kg, a miglustat se daje oralno u dozi od oko 260 mg.

[0127] U nekim otelotvorenjima, miglustat i rhGAA se primenjuju istovremeno. Na primer, miglustat se može primeniti u roku od 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ili 1 minuta pre ili posle primene rhGAA. U nekim otelotvorenjima, miglustat se primenjuje u roku od 5, 4, 3, 2 ili 1 minuta pre ili posle primene rhGAA.

[0128] U nekim otelotvorenjima, miglustat i rhGAA se primenjuju sekvencijalno. U najmanje jednom otelotvorenju, miglustat se primenjuje pre primene rhGAA. U najmanje jednom otelotvorenju, miglustat se primenjuje manje od tri sata pre primene rhGAA. U najmanje jednom otelotvorenju, miglustat se primenjuje oko dva sata pre primene rhGAA. Na primer, miglustat se može primeniti oko 1,5 sata, oko 1 sata, oko 50 minuta, oko 30 minuta ili oko 20 minuta pre primene rhGAA. U najmanje jednom otelotvorenju, miglustat se primenjuje oko jedan sat pre primene rhGAA.

[0129] U nekim otelotvorenjima, miglustat se primenjuje nakon primene rhGAA. U najmanje jednom otelotvorenju, miglustat se primenjuje u roku od tri sata nakon primene rhGAA. U najmanje jednom otelotvorenju, miglustat se primenjuje u roku od dva sata nakon primene rhGAA. Na primer, miglustat se može primeniti u roku od oko 1,5 sata, oko 1 sat, oko 50 minuta, oko 30 minuta ili oko 20 minuta nakon primene rhGAA.

[0130] U nekim otelotvorenjima, subjekt se uzdržava od unosa hrane najmanje dva sata pre i najmanje dva sata nakon primene miglustata.

E. Komplet

[0131] Drugi aspekt otkrića odnosi se na komplete koji sadrže rhGAA ili farmaceutski sastav opisan u ovom dokumentu. U jednom ili više primera, komplet se sastoji od posude (npr. bočice, ampule, vrećice, itd.) koja sadrži rhGAA ili farmaceutski sastav (bilo pre ili posle liofilizacije) i uputstva za rekonstituciju, razblaživanje i primenu.

PRIMERI

Primer 1: Priprema CHO ćelija koje proizvode rhGAA sa visokim sadržajem N-glikana koji nose mono- ili bis-M6P.

[0132] DG44 CHO (DHFR-) ćelije su transfektovane sa DNK konstruktom koji eksprimira rhGAA. Konstrukt DNK je prikazan na slici 4. Posle transfekcije, CHO ćelije koje sadrže stabilno integrisani GAA gen su odabrane sa medijumom sa nedostatkom hipoksantina/timidina (-HT). Ekspresija GAA u ovim ćelijama je indukovana tretmanom metotreksatom (MTX, 500 nM).

[0133] Grupe ćelija koje su eksprimovale velike količine GAA identifikovane su testovima aktivnosti GAA enzima i korišćene su za uspostavljanje pojedinačnih klonova koji proizvode rhGAA. Pojedinačni klonovi su generisani na pločama of polučvrstog medijuma, odabrani ClonePix sistemom i prebačeni u ploče sa 24 duboka bazenčića. Pojedinačni klonovi su analizirani na aktivnost GAA enzima da bi se identifikovali klonovi koji eksprimiraju visok nivo GAA. Kondicionirani medijum za određivanje aktivnosti GAA koristio je supstrat 4-MU-α-glukozidaze. Klonovi koji proizvode više nivoe GAA, mereno GAA enzimskim testovima, dalje su procenjeni na održivost, sposobnost rasta, produktivnost GAA, strukturu N-glikana i stabilnu ekspresiju proteina. CHO ćelijske linije, uključujući CHO ćelijsku liniju GA-ATB200, koje eksprimiraju rhGAA sa unapređenim mono-M6P ili bis-M6P N-glikanima, izolovane su primenom ove procedure.

Primer 2: Prečišćavanje rhGAA

[0134] Više serija rhGAA u skladu sa pronalaskom proizvedeno je u bocama za mućkanje i u perfuzionim bioreaktorima korišćenjem CHO ćelijske linije GA-ATB200, čiji se proizvod naziva „ATB200“. Tečna hromatografija slabe anjonske izmene („WAX“) je korišćena za frakcionisanje ATB200 rhGAA prema terminalnom fosfatu i sijalinskoj kiselini. Profili eluacije su generisani eluiranjem ERT sa sve većom količinom soli. Profili su praćeni pomoću UV (A280nm). Slični profili vezivanja CIMPR receptora (najmanje -70%) uočeni su za prečišćeni ATB200 rhGAA iz različitih proizvodnih serija (slika 5), što ukazuje da se ATB200 rhGAA može dosledno proizvoditi.

Primer 3: Karakterizacija oligosaharida ATB200 rhGAA

[0135] ATB200 rhGAA je analiziran na profile N-glikana specifične za mesto korišćenjem različitih analitičkih tehnika LC-MS/MS. Rezultati prve dve LC-MS/MS metode su prikazani na slikama 6A-6H. Rezultati treće LC-MS/MS metode sa 2-AA mapiranjem glikana prikazani su na slikama 32A-32H, slikama 33A-33B i u tabeli 5.

[0136] U prvoj LC-MS/MS analizi, protein je denaturisan, redukovan, alkilovan i digestiran pre LC-MS/MS analize. Tokom denaturacije i redukcije proteina, 200 µg uzorka proteina, 5 µL 1 mol/L tris-HCl (konačna koncentracija 50 mM), 75 µL 8 mol/L gvanidina HCl (konačna koncentracija 6 M), 1 µL 0,5 mol /L EDTA (konačna koncentracija 5 mM), 2 µL 1 mol/L DTT (konačna koncentracija 20 mM) i Milli-Q<®>voda su dodati u epruvetu od 1,5 mL da bi se obezbedila ukupna zapremina od 100 µL. Uzorak je pomešan i inkubiran na 56°C tokom 30 minuta u suvom kupatilu. Tokom alkilacije, denaturisani i redukovani uzorak proteina je pomešan sa 5 µL 1 mol/L jodoacetamida (IAM, konačna koncentracija 50 mM), zatim inkubiran na 10-30°C u mraku 30 minuta. Nakon alkilacije, 400 µL prethodno ohlađenog acetona je dodato u uzorak i smeša je zamrznuta na -80°C u frižideru 4 sata.

Uzorak je zatim centrifugiran 5 minuta na 13000 rpm na 4°C i supernatant je uklonjen.400 µL prethodno ohlađenog acetona je dodato u pelete, koji su zatim centrifugirani 5 minuta na 13000 rpm na 4°C i supernatant je uklonjen. Uzorak je zatim osušen na vazduhu na ledu u mraku da bi se uklonio ostatak acetona. U uzorak je dodato 40 mikrolitara 8M uree i 160 µL 100 mM NH4HCO3da bi se protein rastvorio. Tokom digestije tripsina, 50 µg proteina je zatim dodato sa puferom za digestiju tripsina do konačne zapremine od 100 µL i dodato je 5 µL 0,5 mg/mL tripsina (odnos proteina i enzima 20/1 w/w). Rastvor je dobro izmešan i inkubiran preko noći (16 ± 2 sata) na 37°C. Dodata su dva i po mikrolitra 20% TFA (konačna koncentracija 0,5%) da bi se reakcija ugasila. Uzorak je zatim analiziran korišćenjem Thermo Scientific<™>Orbitrap Velos Pro<™>masenog spektrometra.

[0137] U drugoj LC-MS/MS analizi, uzorak ATB200 je pripremljen prema sličnoj proceduri denaturacije, redukcije, alkilacije i digestije, osim što je jodosirćetna kiselina (IAA) korišćena kao reagens za alkilaciju umesto IAM, a zatim je analiziran korišćenjem Thermo Scientific<™>Orbitrap Fusion<™>Lumos Tribid<™>masenog spektrometra.

[0138] Rezultati prve i druge analize prikazani su na slikama 6A-6H. Na slikama 6A-6H, rezultati prve analize su predstavljeni levim stupcem (tamno siva), a rezultati druge analize su predstavljeni desnim stupcem (svetlo siva). Nomenklatura simbola za prikaz glikana je u skladu sa Varki, A., Cummings, R.D., Esko J.D., et al., Essentials of Glycobiology, 2nd edition (2009).

[0139] Kao što se može videti iz slika 6A-6H, dve analize su dale slične rezultate, iako je bilo nekih varijacija između rezultata. Ove varijacije može biti posledica niza faktora, uključujući korišćeni instrument i kompletnost analize N-glikana. Na primer, ako neke vrste fosforilisanih N-glikana nisu identifikovane i/ili nisu kvantifikovane, onda ukupan broj fosforilisanih N-glikana može biti nedovoljno zastupljen, a procenat rhGAA koji nosi fosforilisanih N-glikane na tom mestu može biti nedovoljno zastupljen. Kao drugi primer, ako neke vrste nefosforilisanih N-glikana nisu identifikovane i/ili nisu kvantifikovane, onda ukupan broj nefosforilisanih N-glikana može biti nedovoljno zastupljen, a procenat rhGAA koji nosi fosforilisane N-glikane na tom mestu može biti prekomerno zastupljen.

[0140] Slika 6A prikazuje popunjenost N-glikozilacionog mesta ATB200. Kao što se može videti sa slike 6A, prvo, drugo, treće, četvrto, peto i šesto mesto N-glikozilacije su uglavnom popunjena, pri čemu obe analize otkrivaju oko ili preko 90% i do oko 100% enzima ATB200 koji ima N-glikan detektovan na svakom potencijalnom mestu N-glikozilacije. Međutim, sedmo potencijalno mesto N-glikozilacije je N-glikozilovano oko polovine vremena.

[0141] Slika 6B prikazuje profil N-glikozilacije prvog potencijalnog mesta N-glikozilacije, N84. Kao što se može videti sa slike 6B, glavna vrsta N-glikana su bis-M6P N-glikani. I prva i druga analiza otkrile su da preko 75% ATB200 ima bis-M6P na prvom mestu, što odgovara prosečnoj vrednosti od oko 0,8 mola bis-M6P po molu ATB200 na prvom mestu.

[0142] Slika 6C prikazuje profil N-glikozilacije drugog potencijalnog mesta N-glikozilacije, N177. Kao što se može videti sa slike 6C, glavne vrste N-glikana su mono-M6P N-glikani i nefosforilisani N-glikani sa visokim sadržajem manoze. I prva i druga analiza su otkrile da preko 40% ATB200 ima mono-M6P na drugom mestu, što odgovara prosečnoj vrednosti od oko 0,4 do oko 0,6 mola mono-M6P po molu ATB200 na drugom mestu.

[0143] Slika 6D prikazuje profil N-glikozilacije trećeg potencijalnog mesta N-glikozilacije, N334. Kao što se može videti sa slike 6D, glavne vrste N-glikana su nefosforisani N-glikani sa visokim sadržajem manoze, di-, tri- i tetra-antenarski kompleksni N-glikani i hibridni N-glikani. I prva i druga analiza su otkrile da preko 20% ATB200 ima ostatak sijalinske kiseline na trećem mestu, što odgovara prosečnoj vrednosti od oko 0,9 do oko 1,2 mola sijalinske kiseline po molu ATB200 na trećem mestu.

[0144] Slika 6E prikazuje profil N-glikozilacije četvrtog potencijalnog mesta N-glikozilacije, N414. Kao što se može videti sa slike 6E, glavne vrste N-glikana su bis-M6P i mono-M6P N-glikani. I prva i druga analiza otkrile su da preko 40% ATB200 ima bis-M6P na četvrtom mestu, što odgovara prosečnoj vrednosti od oko 0,4 do oko 0,6 mola bis-M6P po molu ATB200 na četvrtom mestu. I prva i druga analiza su takođe otkrile da preko 25% ATB200 ima mono-M6P na četvrtom mestu, što odgovara prosečnoj vrednosti od oko 0,3 do oko 0,4 mola mono-M6P po molu ATB200 na četvrtom mestu.

[0145] Slika 6F prikazuje profil N-glikozilacije petog potencijalnog mesta N-glikozilacije, N596. Kao što se može videti sa slike 6F, glavne vrste N-glikana su fukozilovani di-antenarni kompleksni N-glikani. I prva i druga analiza su otkrile da preko 70% ATB200 ima ostatak sijalinske kiseline na petom mestu, što odgovara prosečnom sadržaju od oko 0,8 do oko 0,9 mola sijalinske kiseline po molu ATB200 na petom mestu.

[0146] Slika 6G prikazuje profil N-glikozilacije šestog potencijalnog mesta N-glikozilacije, N826. Kao što se može videti sa slike 6G, glavne vrste N-glikana su di-, tri- i tetra-antenarski kompleksni N-glikani. I prva i druga analiza su otkrile da preko 80% ATB200 ima ostatak sijalinske kiseline na šestom mestu, što odgovara prosečnoj vrednosti od oko 1,5 do oko 1,8 mola sijalinske kiseline po molu ATB200 na šestom mestu.

[0147] Analiza N-glikozilacije na sedmom mestu, N869, pokazala je približno 40% N-glikozilacije, pri čemu su najčešći N-glikani A4S3S3GF (12%), A5S3G2F (10%), A4S2G2F (8%) i A6S3G3F (8%).

[0148] Slika 6H prikazuje rezime fosforilacije na svakom od sedam potencijalnih mesta N-glikozilacije. Kao što se može videti sa slike 6H, i prva i druga analiza su otkrile visoke nivoe fosforilacije na prvom, drugom i četvrtom potencijalnom mestu N-glikozilacije. Obe analize su otkrile da je preko 80% ATB200 mono- ili bis-fosforilisano na prvom mestu, preko 40% ATB200 je monofosforilisano na drugom mestu, a preko 80% ATB200 je mono- ili bisfosforilisano na četvrtom mestu.

[0149] Još jedna analiza N-glikozilacije ATB200 izvršena je prema LC-MS/MS metodi kao što je opisano u nastavku. Ova analiza je dala prosečan profil N-glikozilacije preko deset serija ATB200 (slike 32A-32H, slike 33A-33B).

[0150] N-vezani glikani iz ATB200 su oslobođeni enzimski sa PNGazom-F i obeleženi sa 2-antranilnom kiselinom (2-AA). N-glikani obeleženi sa 2-AA su dalje obrađeni ekstrakcijom čvrste faze (SPE) da bi se uklonio višak soli i drugih zagađivača. Prečišćeni 2-AA N-glikani su rastvoreni u acetonitrilu/vodi (20/80; v/v), i 10 mikrograma je postavljeno na aminopolimernu analitičku kolonu (apHera<™>, Supelco) za tečnu hromatografiju visokih performansi sa detekcijom fluorescencije (HPLC-FLD) i masenu spektrometriju visoke rezolucije (HRMS).

[0151] Tečna hromatografska (LC) separacija je izvedena u uslovima normalne faze u režimu gradijenta eluacije sa mobilnom fazom A (2% sirćetne kiseline u acetonitrilu) i mobilnom fazom B (5% sirćetne kiseline; 20 milimolara amonijum acetata u vodi prilagođene vrednosti pH 4,3 sa amonijum hidroksidom). Početni sastav mobilne faze bio je 70% A/30% B. Za detekciju fluorescencije, parametri za detektor (RF-20Axs, Shimadzu) bili su Ekscitacija (Ex):320 nm; Emisija (Em):420 nm. HRMS analiza je sprovedena korišćenjem masenog spektrometra Quadrupole Time of Flight (Sciex X500B QTOF) koji je radio u režimu nezavisne akvizicije podataka (IDA). Dobijene datoteke su konvertovane u mzML fajlove koristeći MSConvert iz ProteoWizard-a, a zatim je GRITS Toolbox 1.2 Morning Blend softver (UGA) korišćen za pretragu glikanske baze podataka i naknadno beleženje identifikovanih N-glikana. N-glikani su identifikovani korišćenjem prekursorskih monoizotopskih masa (m/z) i jona proizvoda m/z. Joni eksperimentalnog proizvoda i obrasci fragmentacije su potvrđeni in-silico korišćenjem GlycoWorkbench 2 aplikacije.

[0152] Da bi se odredila relativna kvantitacija N-vezanih glikana iz ATB200, podaci dobijeni iz HPLC-FLD-QTOF MS/MS eksperimenta su obrađeni na sledeći način. Svi pikovi N-glikana u FLD hromatogramu su integrisani, a svakom piku je dodeljen procenat ukupne površine svih pikova u FLD hromatogramu. Fluorescentni signal, izražen kao površina pika, je kvantitativna mera količine svakog N-glikana u uzorku (slika 33A). Međutim, u najvećem broju slučajeva, više vrsta N-glikana bilo je sadržano u istom FLD piku. Stoga su podaci masenog spektrometra takođe bili potrebni da bi se dobila relativna kvantitacija svake vrste N-glikana (Tabela 5). Signal intenziteta jona za svaki N-glikan je „ekstrahovan“ iz podataka da bi se stvorio hromatografski pik nazvan ekstrahovani jonski hromatogram (XIC). XIC se poravnao sa FLD hromatografskim vrhom i bio je specifičan za samo jednu N-glikansku vrstu. XIC pik nastao iz signala intenziteta jona je tada integrisan i ova površina pika je uzeta kao relativna kvantitativna mera količine prisutnog glikana. I površine pikova FLD i površine pikova XIC masenog spektrometra korišćene su da bi se omogućila relativna kvantitacija svih N-vezanih glikanskih vrsta ATB200 koji su ovde navedeni.

[0153] Rezultati ove LC-MS/MS analize dati su u tabeli 5 u nastavku. Nomenklatura simbola za glikansku reprezentaciju je u skladu sa Wopereis W, et al.2006. Abnormal glycosylation with hypersialylated O-glycans in patients with Sialuria. Biochimica et Biophysica Acta. 1762:598-607; Gornik O, et al.2007. Changes of serum glycans during sepsis and acute pancreatitis. Glycobiology. 17:1321-1332 https://doi.org/10.1093/glycob/cwm106; Kattla JJ, et al.2011. Biologic protein glycosylation. In: Murray Moo-Young (ed.), Comprehensive Biotechnology, Second Edition, 3:467-486; Tharmalingam-Jaikaran T, et al. N-glycan profiling of bovine follicular fluid at key dominant follicle developmental stages. 2014. Reproduction. 148:569-580; Clerc F, et al. Human plasma protein N-glycosylation. 2015. Glycoconj J. DOI 10.1007/s10719-015-9626-2; and Blackler RJ, et al.2016. Single-chain antibody-fragment M6P-1 possesses a mannose 6-phosphate monosaccharide-specific binding pocket that distinguishes N-glycan phosphorylation in a branch-specific manner. Glycobiology. 26-2:181-192.

Tabela 5: Vrsta i prevalencija oligosaharida identifikovanih na ATB200 na osnovu mapiranja 2-AA glikana i LC-MS/MS identifikacije

N-glikani % Kompleksni % Kompleksni % Kompleksni % sa visokim ukupn N-glikani ukupn N-glikani ukupn N-glikani ukupn

N-glikani % Kompleksni % Kompleksni % Kompleksni % sa visokim ukupn N-glikani ukupn N-glikani ukupn N-glikani ukupn sadržajem o o o o manoze

N-glikani % Kompleksni % Kompleksni % Kompleksni % sa visokim ukupn N-glikani ukupn N-glikani ukupn N-glikani ukupn sadržajem o o o o manoze

[0154] Na osnovu ove 2-AA i LC-MS/MS analize, i kao što je dalje rezimirano na slici 33C, testirani ATB200 ima prosečan sadržaj M6P od 3-5 mola po molu ATB200 (računajući i mono-M6P i bis- M6P) i sadržaj sijalinske kiseline od 4-7 mola po molu ATB200.

[0155] Kao što je prikazano na slikama 32A-32H i sažeto na slici 33B, prvo potencijalno mesto N-glikozilacije ATB200 ima prosečan sadržaj M6P od oko 1,4 mola M6P po molu ATB200, što predstavlja prosečan sadržaj mono-M6P od oko 0,25 mola mono-M6P po molu ATB200 i prosečan sadržaj bis-M6P od oko 0,56 mola bis-M6P po molu ATB200; drugo potencijalno mesto N-glikozilacije ATB200 ima prosečan sadržaj M6P od oko 0,5 mola M6P po molu ATB200, pri čemu su primarno fosforilisane vrste N-glikana mono-M6P N-glikani; treće potencijalno mesto N-glikozilacije ATB200 ima prosečan sadržaj sijalinske kiseline od oko 1 mol sijalinske kiseline po molu ATB200; četvrto potencijalno mesto N-glikozilacije ATB200 ima prosečan sadržaj M6P od oko 1,4 mola M6P po molu ATB200, što predstavlja prosečan sadržaj mono-M6P od oko 0,35 mola mono-M6P po molu ATB200 i prosečan sadržaj bis-M6P od oko 0,52 mola bis-M6P po molu ATB200; peto potencijalno mesto N-glikozilacije ATB200 ima prosečan sadržaj sijalinske kiseline od oko 0,86 mola sijalinske kiseline po molu ATB200; šesto potencijalno mesto N-glikozilacije ATB200 ima prosečan sadržaj sijalinske kiseline od oko 4,2 mola sijalinske kiseline po molu ATB200; a sedmo potencijalno mesto N-glikozilacije ATB200 ima prosečan sadržaj sijalinske kiseline od oko 0,86 mol sijalinske kiseline po molu ATB200.

[0156] Takođe, prema ovoj 2-AA i LC-MS/MS analitičkoj tehnici, u proseku oko 65% N-glikana na prvom potencijalnom mestu N-glikozilacije ATB200 su N-glikani sa visokim sadržajem manoze, oko 89% N-glikana na drugom potencijalnom mestu N-glikozilacije ATB200 su N-glikani sa visokim sadržajem manoze, preko polovine N-glikana na trećem potencijalnom mestu N-glikozilacije ATB200 je sijalizovano (pri čemu je skoro 20% potpuno sijalizovano) i oko 85% N-glikana na trećem potencijalnom mestu N-glikozilacije ATB200 su kompleksni N-glikani, oko 84% N-glikana na četvrtom potencijalnom mestu N-glikozilacije ATB200 su N-glikani sa visokim sadržajem manoze, oko 70% N-glikana na petom potencijalnom mestu N-glikozilacije ATB200 je sijalizovano (pri čemu je oko 26% potpuno sijalizovano) i oko 100% N-glikana na petom potencijalnom mestu N-glikozilacije ATB200 su kompleksni N-glikani, oko 85% N-glikana na šestom potencijalnom mestu N-glikozilacije ATB200 je sijalizovano (pri čemu je skoro 27% potpuno sijalizovano) i oko 98% N-glikana na šestom potencijalnom mestu N-glikozilacije ATB200 su kompleksni N-glikani, i oko 87% N-glikana na sedmom potencijalnom mestu N-glikozilacije ATB200 je sijalizovano (pri čemu je skoro 8% potpuno sijalizovano) i oko 100% N-glikana na sedmom potencijalnom mestu N-glikozilacije ATB200 su kompleksni N-glikani.

Primer 4: Analitičko poređenje ATB200 i preparata Myozyme<®>/Lumizyme<®>

[0157] MALDI-TOF je procenio prečišćene ATB200 i Lumizyme<®>N-glikane kako bi odredio pojedinačne strukture N-glikana pronađene u svakoj ERT. Lumizyme<®>je dobijen iz komercijalnog izvora. Kao što je prikazano na slici 7, ATB200 je pokazao četiri istaknuta pika koji su eluirali desno od preparata Lumizyme<®>. Ovo potvrđuje da je ATB200 fosforilisan u većoj meri negoLumizyme<®>, pošto je ova procena zasnovana na terminalnom naelektrisanju, a ne na CIMPR afinitetu. Kao što je sažeto prikazano na slici 8, pronađeno je da uzorci ATB200 sadrže niže količine nefosforilisanih N-glikana sa visokim sadržajem manoze nego<®>.

[0158] Da bi se procenila sposobnost konvencionalnih rhGAA u preparatima Myozyme<®>i Lumizyme<®>da interaguju sa CIMPR-om, dva konvencionalna preparata rhGAA su ubrizgana u CIMPR afinitetnu kolonu (koja vezuje rhGAA sa M6P grupama) i protok je sakupljen.

Vezani materijal je eluiran sa slobodnim M6 gradijentom. Frakcije su sakupljene na ploči sa 96 bazenčića i aktivnost GAA je ispitana supstratom 4MU-α-glukozidaze. Relativne količine nevezanog (protok) i vezanog (eluiran M6P) rhGAA su određene na osnovu GAA aktivnosti i prikazane kao frakcija ukupnog enzima. Slike 9A i 9B prikazuju profil vezivanja rhGAA u preparatima Myozyme<®>i Lumizyme<®>: 73% rhGAA u preparatu Myozyme<®>(slika 9B) i 78% rhGAA u preparatu Lumizyme<®>(slika 9A) se nije vezalo za CIMPR. Zaista, samo 27% rhGAA u preparatu Myozyme<®>i 22% rhGAA u preparatu Lumizyme<®>sadržalo je M6P koji je mogao biti produktivan tako da usmerava na CIMPR u mišićnim ćelijama. Nasuprot tome, kao što je prikazano na slici 5, pod istim uslovima, utvrđeno je da se više od 70% rhGAA u ATB200 vezuje za CIMPR.

[0159] Pored toga što ima veći procenat rhGAA koji se može vezati za CIMPR, važno je razumeti kvalitet ove interakcije. Vezivanje preparata Lumizyme<®>i ATB200 za receptore je utvrđeno korišćenjem CIMPR analize vezivanja na ploči. Ukratko, ploče obložene sa CIMPR su korišćene za hvatanje GAA. Različite koncentracije rhGAA primenjene su na imobilizovani receptor i nevezani rhGAA je ispran. Količina preostalog rhGAA utvrđena je aktivnošću GAA. Kao što je prikazano na slici 10A, ATB200 se vezivao za CIMPR značajno bolje od preparata Lumizyme<®>. Slika 10B prikazuje relativni sadržaj bis-M6P N-glikana u preparatu Lumizyme<®>(konvencionalni rhGAA proizvod) i ATB200 u skladu sa pronalaskom. U slučaju preparata Lumizyme<®>, u proseku postoji samo 10% molekula koji imaju bis-fosforilisani N-glikan. Nasuprot tome, u proseku svaki rhGAA molekul u ATB200 ima najmanje jedan bis-fosforilisani N-glikan.

[0160] U načelu, veći sadržaj M6P N-glikana u ATB200 nego u preparatu Lumizyme<®>ukazuje na to da veći deo rhGAA molekula u ATB200 može bolje ciljati mišićne ćelije. Kao što je gore prikazano, visok procenat mono-fosforilisanih i bis-fosforilisanih struktura koje je odredio MALDI slaže se sa CIMPR profilima koji su ilustrovali značajno bolje vezivanje ATB200 za CIMPR receptor. Analiza N-glikana putem MALDI-TOF masene spektrometrije potvrdila je da u proseku svaki molekul ATB200 sadrži najmanje jednu prirodnu bis-M6P N-glikansku strukturu. Ovaj viši sadržaj bis-M6P N-glikana u ATB200 direktno je korelirao sa vezivanjem visokog afiniteta za CIMPR u testovima vezivanja za M6P receptor na ploči (KDoko 2-4 nM).

[0161] Relativna ćelijska apsorpcija rhGAA iz ATB200 i preparata Lumizyme<®>je upoređena korišćenjem ćelijskih linija sa normalnim i Pompeovim fibroblastima. Poređenja su uključivala 5-100 nM ATB200 u skladu sa pronalaskom sa 10-500 nM konvencionalnog rhGAA preparata Lumizyme<®>. Posle 16-časovne inkubacije, spoljašnji rhGAA je inaktiviran sa TRIS bazom i ćelije su isprane 3 puta sa PBS pre žetve. Internalizovani GAA je izmeren hidrolizom 4MU-α-glukozida i prikazan je grafikonom u odnosu na ukupni ćelijski protein, a rezultati su prikazani na Sl.11A-11C.

[0162] Takođe je pokazano da se ATB200 efikasno internalizuje u ćelije. Kao što je prikazano na slikama 11A-11B, ATB200 se internalizuje u normalne i Pompeove ćelije fibroblasta i internalizuje se u većem stepenu nego konvencionalni rhGAA preparat Lumizyme<®>. ATB200 zasićuje ćelijske receptore na oko 20 nM, dok je oko 250 nM preparata Lumizyme<®>potrebno za zasićenje ćelijskih receptora. Konstanta efikasnosti apsorpcije (Kuptake) ekstrapolirana iz ovih rezultata je 2-3 nm za ATB200 i 56 nM za Lumizyme<®>, kao što je prikazano na slici 11C. Ovi rezultati sugerišu da je ATB200 dobro ciljani tretman za Pompeovu bolest.

Primer 5: ATB200 i farmakološki šaperon

[0163] Stabilnost ATB200 u kiselim ili neutralnim pH puferima je procenjena u testu termostabilnosti korišćenjem SYPRO Orange, budući da se fluorescencija boje povećava kada proteini denaturiraju. Kao što je prikazano na slici 12, dodatak AT2221 stabilizovao je ATB200 pri vrednosti pH 7,4 na način zavisan od koncentracije, što je uporedivo sa stabilnošću ATB200 pri vrednosti pH 5,2, što je stanje koje oponaša kiselo okruženje lizozoma. Kao što je rezimirano u tabeli 6, dodatak AT2221 povećao je temperaturu topljenja (Tm) ATB200 za skoro 10°C.

Tabela 6 Stabilnost ATB200 u kombinaciji sa AT2221

Primer 6: Istovremena primena ATB200 i AT2221 kod Gaa KO miševa

[0164] Terapijski efekti ATB200 i AT2221 su procenjeni i upoređeni sa efektima alglukozidaze alfa kod miševa Gaa KO. U studiji su korišćeni muški miševi Gaa KO (stari od 3 do 4 meseca) i miševi divljeg tipa ujednačeni po uzrastu (WT). Alglukozidaza alfa je primenjena bolusnom intravenskom (IV) injekcijom u repnu venu. U režimu istovremene primene, AT2221 je primenjen putem oralne gavaže (PO) 30 minuta pre intravenske injekcije ATB200. Lečenje je administrirano na dvonedeljnoj osnovi. Tretirani miševi su žrtvovani nakon 14 dana od poslednje primene i različita tkiva su prikupljena za dalju analizu. Tabela 7 sadrži rezime dizajna studije:

Tabela 7 Dizajn studije istovremene primene

Genotip Tretman Doziranje leka po Broj administracije

[0165] Sadržaj glikogena tkiva u uzorcima tkiva određen je korišćenjem digestije amiloglukozidaze, kao što je gore navedeno. Kao što je prikazano na slici 13, kombinacija 20 mg/kg ATB200 i 10 mg/kg AT2221 značajno je smanjila sadržaj glikogena u četiri različita tkiva (kvadriceps, triceps, gastroknemijus i srce) u poređenju sa istom dozom alglukozidaze alfa.

[0166] Uzorci tkiva su takođe analizirani na promene u biomarkerima u skladu sa metodama opisanim kod: Khanna R, et al. (2012), "The pharmacological chaperone AT2220 increases recombinant human acid α-glucosidase uptake and glycogen reduction in a mouse model of Pompe disease," Plos One 7(7): e40776; and Khanna, R et al. (2014), "The Pharmacological Chaperone AT2220 Increases the Specific Activity and Lysosomal Delivery of Mutant Acid α-Glucosidase, and Promotes Glycogen Reduction in a Transgenic Mouse Model of Pompe Disease," PLoS ONE 9(7): e102092. Kao što je prikazano na slici 14, uočeno je izraženo povećanje i uvećanje LAMP1-pozitivnih vezikula u mišićnim vlaknima Gaa KO životinja u poređenju sa WT, što ukazuje na lizozomsku proliferaciju. Zajednička primena ATB200/AT2221 dovela je do većeg broja vlakana sa normalizovanim nivoom LAMP1, dok su preostale LAMP1-pozitivne vezikule takođe smanjene u veličini (umeci).

[0167] Slično tome, intenzivni LC3-pozitivni agregati u mišićnim vlaknima netretiranih Gaa KO miševa ukazuju na prisustvo autofagnih zona i nakupljanja autofaga. LC3-pozitivni agregati (crveno) su preferencijalno redukovani kod miševa tretiranih istovremenom primenom ATB200 /AT2221 u poređenju sa miševima tretiranim alglukozidazom alfa (slika 15A). Slično zapažanje je uočeno kada je ekspresija LC3 procenjena korišćenjem Western blot metode. Kao što je prikazano na slici 15B, većina životinja tretiranih sa ATB200/AT2221 pokazala je značajnu redukciju nivoa LC3 II, lipidovanog oblika koji je povezan sa autofagozomima, što ukazuje na poboljšani tok autofagije. U poređenju sa tim, efekat alglukozidaze alfa na autofagiju je bio skroman.

[0168] Takođe je procenjen disferlin, protein koji je uključen u popravku membrane i čiji je nedostatak/pogrešan rad povezan sa brojnim mišićnim distrofijama. Kao što je prikazano na slici 16, disferlin (braon) je bio veoma akumuliran u sarkoplazmi Gaa KO miševa. U poređenju sa alglukozidazom alfa, ATB200/AT2221 je uspeo da vrati disferlin u sarkolemu u većem broju mišićnih vlakana.

[0169] Ovi podaci su u skladu sa poboljšanjima na ćelijskom nivou koja su uočena kod pacijenata sa humanom Pompeovom bolešću lečenih preparatom ATB200 i miglustatom (npr. pacijenti pokazuju redukciju nivoa biomarkera akumulacije glikogena i povrede mišića), što dovodi ne samo do efikasnog lečenja Pompeove bolesti, već i do preokreta u progresiji bolesti. Klinički podaci kod humanih pacijenata sa Pompeovom bolešću su sumirani u primerima 8-13, u nastavku.

Primer 7: Analiza pojedinačnih vlakana

[0170] Kao što je prikazano na slici 17, većina miševa tretiranih vehikulumom pokazala je izrazito uvećane lizozome (zeleno) (vidi, na primer „B“) i prisustvo masivnog nakupljanja autofaga (crveno) (vidi, na primer, „A“). Miševi tretirani preparatom Myozyme<®>nisu pokazali nikakvu značajnu razliku u poređenju sa miševima tretiranim vehikulumom.

Nasuprot tome, većina vlakana izolovanih od miševa tretiranih preparatom ATB200 pokazala je dramatično smanjenu veličinu lizozoma (vidi, na primer, Štaviše, područje sa nakupljanjem autofaga je takođe redukovano na različite stepene (vidi, na primer, „C“). Kao rezultat toga, značajan deo analiziranih mišićnih vlakana (36-60%) kod miševa tretiranih preparatom ATB200 izgledao je normalno ili skoro normalno. Tabela 8 u nastavku rezimira analizu pojedinačnih vlakana prikazanu na slici 17.

Tabela 8 Analiza pojedinačnih vlakana

preparatom ATB200 u poređenju sa grupom koja je tretirana vehikulumom ili alglukozidazom alfa.

[0171] U načelu, podaci ukazuju na to da je ATB200 sa većim sadržajem M6P, kako samostalno tako i u obliku koji je dalje stabilizovan farmakološkim šaperonom AT2221 pri neutralnoj pH vrednosti krvi, efikasniji u ciljanju tkiva i prometu lizozoma u poređenju sa alglukozidazom alfa kada se daje Gaa KO miševima, u skladu sa stabilizacijom ATB200 pomoću AT2221 kako je prikazano na slici 18. Kao rezultat toga, primena ATB200 i istovremena primena ATB200/AT2221 pokazala se efikasnijom od primene alglukozidaze alfa u ispravljanju nekih patologija relevantnih za bolest, kao što su akumulacija glikogena, lizozomska proliferacija i formiranje autofagnih zona. Zbog ovih pozitivnih terapijskih efekata, pokazalo se da istovremena primena ATB200 i ATB200/AT2221 poboljšava šanse za oporavak mišićnih vlakana od oštećenja, pa čak i šanse za reverziju oštećenja, čišćenjem glikogena koji se akumulirao u ćeliji usled nedostatka optimalne GAA aktivnosti. Kao i kod primera 6, ovi podaci su takođe u skladu sa poboljšanjima na ćelijskom nivou koja su pokazana kod humanih pacijenata sa Pompeovom bolešću koja su dovela i do efikasnog lečenja Pompeove bolesti i do preokreta u progresiji bolesti nakon primene ATB200 i miglustata. Klinički podaci kod humanih pacijenata sa Pompeovom bolešću su sumirani u primerima 8-13, u nastavku.

Primer 8: Ispitivanje ATB200-02: ispitivanje ATB200/AT2221 na ljudima kod pacijenata sa Pompeovom bolešću

[0172] Pretkliničke studije su sprovedene na Gaa nokaut miševima kako bi se procenila farmakokinetička svojstva (PK) i efikasnost redukcije glikogena pri različitim režimima ATB200 enzimske supstitucione terapije (ERT) i različitim dozama šaperona AT2221. Ovi podaci su korišćeni za procenu uporedivih doza šaperona AT2221 kod ljudi. Ispitivanje ATB200-02 (NCT02675465) je zatim osmišljeno kao otvoreno, prvi put sprovedeno na ljudima ispitivanje, faze 1/2, fiksne sekvence, uzlazne doze za procenu bezbednosti, tolerabilnosti, farmakokinetičkih svojstava, farmakodinamike i efikasnosti ATB200 primenjenog zajedno sa AT2221 kod pacijenata sa Pompeovom bolešću. Slike 19A-19B predstavljaju dizajn studije ATB200-02. Pokretni pacijenti koji su prethodno primali enzimsku supstitucionu terapiju alglukozidaze alfa nazivaju se pokretni pacijenti koji prelaze sa ERT (ili pokretni koji prelaze sa ERT) ili pacijenti iz kohorte 1. Nepokretni pacijenti koji su prethodno primali enzimsku supstitucionu terapiju alglukozidaze alfa nazivaju se nepokretni pacijenti koji prelaze sa ERT (ili nepokretni koji prelaze sa ERT) ili pacijenti iz kohorte 2. Pokretni pacijenti koji prethodno nisu primali enzimsku supstitucionu terapiju alglukozidaze alfa nazivaju se pacijenti bez iskustva sa ERT (ili ERT naivni) ili pacijenti iz kohorte 3.

[0173] Šesnaest kliničkih lokacija u pet zemalja učestvovalo je u studiji ATB200-02. Studija je primenjivala sledeće ključne kriterijume uključivanja: muškarci i žene starosti 18-65 godina kojima je dijagnostikovana Pompeova bolest na osnovu dokumentovanog nedostatka aktivnosti GAA enzima ili na osnovu GAA fenotipizacije, i koji su primali enzimsku supstitucionu terapiju alglukozidazom alfa 2-6 godina (ili > 2 godine za kohortu 2) pre početka ispitivanja (kohorta 1). Ispitanici koji ispunjavaju uslove bili su oni koji su trenutno primali alglukozidazu alfa sa učestalošću svake druge nedelje i koji su završili poslednje 2 infuzije bez neželjenog događaja povezanog sa primenom leka (ND) što je dovelo do prekida u primanju doze leka (kohorte 1 i 2). Ispitanici su morali da budu u stanju da hodaju između 200 i 500 metara na 6-minutnom testu hoda (6MWT) (kohorte 1 i 3), da postižu forsirani vitalni kapacitet (FVC) u uspravnom stavu od 30-80% predviđene normalne vrednosti (kohorte 1 i 3), ili da budu vezani za invalidska kolica bez mogućnosti samostalnog hoda (kohorta 2). Protokoli za testove 6MWT i FVC mogu se naći, na primer, kod Lachman and Schoser, Journal of Rare Diseases, 2013, 8:160, kao i kod Bittner and Singh, The 6 Minute Walk Test, Cardiology Advisor, 2013. Slika 19C prikazuje osnovne karakteristike za 20 subjekata. Bezbednost, tolerabilnost i biomarkeri su procenjeni za kohorte 1, 2 i 3. Sledeće funkcionalne procene su procenjene za kohorte 1 i 3: 6MWT, testovi drugih motoričkih funkcija (testovi sa merenjem vremena i GSGC (Test „Hod – stepenice – Gauerov znak – stolica“), manuelni mišićni test i plućna funkcija (FVC, maksimalni inspiratorni pritisak (MIP)/ maksimalni ekspiratorni pritisak (MEP))). Protokoli za testove sa merenjem vremena i GSGC mogu se naći, na primer, kod Lachman and Schoser, Journal of Rare Diseases, 2013, 8:160. Za kohortu 2, funkcionalne procene su uključivale testove mišićne snage.

Primer 9: Privremeni rezultati farmakokinetičkih svojstava iz ispitivanja ATB200-02

[0174] Rezime farmakokinetičkih podataka za AT2221 dat je na slici 20. Ukupne koncentracije GAA proteina u plazmi za ATB200 u dozama od 5 mg/kg, 10 mg/kg i 20 mg/kg utvrđene su validiranom kvantifikacijom „signaturnih“ peptida specifičnih za rhGAA – T09 (primarni) i T50 (potvrdni), putem metode LC-MS/MS, za 11 pacijenata iz kohorte 1 koji su prošli faze 1 i 2, kao i za pet pacijenata iz kohorte 2 koji su prošli farmakokinetičku studiju u fazi 3. Za fazu 1, uzorci krvi za ukupnu koncentraciju GAA proteina u plazmi prikupljeni su pre početka infuzije ATB200 i na 1; 2; 3; 3,5; 4; 4,5; 5; 6; 8; 10; 12 i 24 sata nakon početka infuzije. Za fazu 2 i fazu 3, uzorci krvi za ukupnu koncentraciju GAA proteina u plazmi prikupljeni su pre početka infuzije i na 1; 2; 3; 3,5; 4; 4,5; 5; 6; 8; 10; 12 i 24 sata nakon početka infuzije.

[0175] Analize farmakokinetičkih svojstava AT2221 su takođe izvršene za 11 pacijenata iz kohorte 1 koji su prošli faze 1 i 2, kao i za pet pacijenata iz kohorte 2 koji su prošli farmakokinetičku studiju u fazi 3. Uzorci krvi za koncentracije AT2221 u plazmi uzeti su neposredno pre oralne primene AT2221 (vreme 0) i u 1; 1,5; 2; 2,5; 3; 4; 5; 6; 9; 11 i 25 sati nakon oralne primene AT2221. AT2221 u plazmi je određen validiranom analizom LC-MS/MS.

[0176] Kao što je prikazano na slici 21, nivoi ATB200 su se povećali nešto više od proporcionalnog u odnosu na dozu, u slučaju samostalne primene. Istovremena primena ATB200 u dozi od 20 mg/kg sa jednom visokom dozom (260 mg) AT2221 povećala je ukupnu površinu izloženosti GAA proteinima ispod krive (AUC) za približno 17%, u poređenju sa ATB200 u dozi od 20 mg/kg primenjenom samostalno (slika 21, slika 22C). Istovremena primena ATB200 u dozi od 20 mg/kg sa višestrukim visokim dozama (260 mg) AT2221 povećala je ukupnu površinu izloženosti GAA proteinima ispod krive (AUC) za približno 29%, u poređenju sa ATB200 u dozi od 20 mg/kg primenjenom samostalno (slika 21, slika 22D). Uočeni su povećanje poluvremena distribucije i delimični AUC-24h na log skali, tokom faze terminalne eliminacije (slika 21, slika 22A, slika 22B). Kao što je prikazano na slici 21, poluvreme distribucije (α-faza) povećalo se za 40%, u skladu sa stabilizacionim efektom visoke doze AT2221 na ATB200 u plazmi. Povećanje poluvremena distribucije je praćeno povećanjem parcijalnog AUC, od vremena primene do maksimalne koncentracije u plazmi, u periodu od 24 sata nakon doze, za 42,2% (slika 21, slika 22B). Daljnji dokazi o stabilizaciji ATB200 pomoću AT2221 uočeni su u 12- i 24-časovnim poređenjima niske i visoke doze AT2221 naspram samostalne primene ATB200 (slike 22E i 22F). Nije bilo statistički značajne razlike u ukupnoj izloženosti GAA proteinima u plazmi između pacijenata bez iskustva ERT (kohorta 3) i pacijenata koji se prešli sa ERT (kohorta 1) (slika 23). Farmakokinetička dispozicija signaturnog peptida T50 nije se razlikovala od dispozicije signaturnog peptida T09 (AUC odnos: 1,00).

Primer 10: Privremeni rezultati efikasnosti iz ispitivanja ATB200-02

[0177] Kao što je prikazano na slikama 24A i 24B, rezultati testa 6MWT su se poboljšali u slučaju pokretnih pacijenata koji su prešli sa ERT, kao i u slučaju pacijenata bez iskustva ERT, u 6. mesecu, uz kontinuiranu korist uočenu do 12. meseca. Rezultati testa 6MWT su se povećali kod 7/10, 8/10 i 8/8 pacijenata koji su prešli sa ERT u mesecima 6, 9 i 12, respektivno. Rezultati testa 6MWT su se povećali kod 5/5, 5/5 i 2/2 pacijenata bez prethodnog iskustva sa ERT u mesecima 6, 9 i 12, respektivno.

[0178] Kao što je prikazano na slici 24C, slici 26A i slici 26C, poboljšanja u rezultatima testova motoričkih funkcija i manuelne mišićne snage, zajedno sa rezultatima 6MWT, bila su u skladu sa ukupnim poboljšanjem mišićne funkcije i u slučaju pacijenata koji su prešli sa ERT i u slučaju pacijenata bez iskustva sa ERT, tokom 12 meseci.

[0179] Kao što je prikazano na slici 25 i slici 26B, dosledna i značajna poboljšanja su uočena u snazi gornjih ekstremiteta kod svih nepokretnih pacijenata koji su prešli sa ERT u 6. i 9. mesecu.

[0180] Kao što je prikazano na slici 27, vrednost FVC je bila stabilna ili se povećala kod 5/9, 6/9 i 3/7 pacijenata koji su prešli sa ERT u mesecima 6, 9 i 12, respektivno, a vrednost FVC je bila stabilna ili se povećala kod 5/5, 5/5 i 2/2 pacijenata bez iskustva ERT u mesecima 6, 9 i 12, respektivno. Takođe, kao što je prikazano na slici 27, maksimalni inspiratorni pritisak (MIP) je bio stabilan, dok je maksimalni ekspiratorni pritisak (MEP) povećan kod pokretnih pacijenata koji su prešli sa ERT, dok je MIP povećan a MEP je ostao stabilan kod pacijenata bez iskustva sa ERT.

[0181] Skala ozbiljnosti umora („FSS“) je upitnik za samoprocenu koji se sastoji od devet pitanja, od kojih se svako boduje na skali od 1 do 7. Ukupan rezultat se kreće od 9 do 63, pri čemu veće vrednosti predstavljaju viši nivo umora usled stanja bolesti. Normativna vrednost u zdravoj populaciji je oko 21 (Grace J et al. Parkinsonism Relat Disord.2007;13:443-445). Kao što je prikazano na slici 28, sve kohorte su bile značajno pogođene zamorom na početku i sve kohorte su pokazale poboljšanje u rezultatima na FSS nakon administracije ATB200/AT2221.

Primer 11: Privremeni rezultati ispitivanja ATB200-02: Markeri povrede mišića

[0182] Procenjivani su sledeći markeri oštećenja mišića: enzim kreatin kinaze (CK), alanin aminotransferaza (ALT) i aspartat aminotransferaza (AST). Rezultati dostupni nakon devet meseci kliničkog ispitivanja prikazani su na slikama 29A-29C (podaci za najviše 58 nedelja, 24 nedelje i 36 nedelja za kohorte 1, 2 i 3, respektivno; niže n vrednosti odražavaju da neki podaci ili nisu bili raspoloživi za analizu ili još uvek nisu analizirani). Smanjenja srednjih vrednosti u odnosu na početne vrednosti uočena u ovim odgovarajućim vremenskim tačkama iznosila su približno 30-35% u slučaju pokretnih pacijenata koji su prešli sa ERT (n=9), 5-20% u slučaju nepokretnih pacijenata koji su prešli sa ERT (n=4) i 40-55% u slučaju pacijenata bez iskustva ERT (n=5). Rezultati za enzim CK dostupni nakon dvanaest meseci kliničkog ispitivanja prikazani su na slici 29D (podaci iz najviše 12 meseci za kohorte 1, 2 i 3; niže n vrednosti odražavaju da neki podaci ili nisu bili raspoloživi za analizu ili još uvek nisu analizirani).

[0183] Urin heksoza tetrasaharid (Hex4) je procenjen kao marker akumulacije glikogena. Rezultati za Hex4 dostupni nakon dvanaest meseci kliničkog ispitivanja prikazani su na slici 29D (podaci iz najviše 12 meseci za kohorte 1, 2 i 3; niže n vrednosti odražavaju da neki podaci ili nisu bili raspoloživi za analizu ili još uvek nisu analizirani).

Primer 12: Privremeni bezbednosni rezultati ispitivanja ATB200-02

[0184] Najduže trajanje lečenja trajalo je preko 20 meseci. Neželjeni događaji (ND) su generalno bili blagi i prolazne prirode, sa veoma niskom stopom reakcija povezanih sa davanjem infuzije (manje od 1%) nakon preko 400 ukupnih infuzija u sve tri kohorte. Ove pojave su kontrolisane standardnom premedikacijom.

[0185] Najčešći neželjeni događaji prijavljeni u vezi sa lečenjem do 72 nedelje bili su mučnina (3/20), tremor (3/20), glavobolja (3/20), umor (3/20), dijareja (2/20), spazam mišića (2/20) i oticanje zglobova (2/20).

[0186] Najčešći neželjeni događaji prijavljeni u vezi sa lečenjem do 20+ meseci bili su bol u abdomenu (uključujući bol u gornjem i donjem delu abdomena) (8/20), dijareja (8/20), nazofaringitis (6/20), mučnina (5/20), glavobolja (5/20) i infekcija gornjeg respiratornog trakta (5/20) (slika 30). Prijavljen je jedan ozbiljan ND, koji nije bio povezan sa ispitivanim lekom (hospitalizacija usled infekcije donjeg respiratornog trakta). Nijedan pacijent nije prekinuo učešće u studiji usled ND.

[0187] Bilo je tri incidenta reakcija povezanih sa infuzijom (RPI) u 550+ infuzija, koje su kontrolisane standardnom premedikacijom. Jedan događaj RPI (diskoloracija kože) se dogodio kod nepokretnog pacijenta koji je prešao sa ERT (kohorta 2). Dva događaja RPI (lokalizovani pruritus, eritem i peckanje) desila su se kod pacijenta bez iskustva sa ERT (kohorta 3) (slika 30).

Primer 13: Rezime i zaključci privremenih rezultata ispitivanja ATB200-02

[0188] Kao što je sažeto na slici 31, postoji podudarnost u privremenim podacima iz ispitivanja ATB200-02 koji pokazuju značajna i neočekivana paralelna poboljšanja markera povreda mišića i akumulacije supstrata, testova mišićne funkcije (testovi sa merenjem vremena i izdržljivost), manuelne mišićne snage i stabilizacije i/ili poboljšanja rezultata testova respiratorne funkcije u različitim kohortama. Mišićna funkcija se poboljšala kod 16/18 i 10/10 pacijenata u 6. i 9. mesecu, respektivno. Povećanja pređene udaljenosti u testu 6MWT bila su konzistentna i trajna kod pokretnih pacijenata koji su prešli sa ERT i kod pacijenata bez iskustva ERT do 12. meseca, kao i poboljšanja u drugim testovima motoričkih funkcija kod pokretnih pacijenata koji su prešli sa ERT i kod pacijenata bez iskustva ERT. Kvalitativne i kvantitativne mere pokazale su povećanje jačine gornjih ekstremiteta kod nepokretnih pacijenata koji su prešli sa druge ERT u 6. i 9. mesecu. Vrednosti FVC, MIP i MEP su generalno bile stabilne u slučaju pacijenata koji su prešli sa druge ERT i povećale su se kod pacijenata bez iskustva sa ERT. Uočeno je poboljšanje rezultata vezanih za umor u svim kohortama. Nivoi biomarkera (npr. nivoi CK i Hex4) smanjeni su u svim kohortama i ATB200/AT2221 je generalno dobro tolerisan.

[0189] Dakle, višedimenzionalni uticaj terapije sugeriše da kombinovani režim ATB200/AT2221 ima potencijal da postane važna opcija lečenja za pacijente sa Pompeovom bolešću. Ovi klinički rezultati podržavaju rezultate studija analize pojedinačnih vlakana opisanih u primeru 7, koje pokazuju da je tretman efikasan u čišćenju patoloških supstrata iz mišićnih vlakana. U toku je dalja studija kliničkog ispitivanja.

Claims (9)

Patentni zahtevi

1. Sastav koji se sastoji od populacije molekula rekombinantne humane kisele αglukozidaze (rhGAA) za primenu u lečenju Pompeove bolesti kod subjekata kojima je potrebno takvo lečenje, pri čemu su molekuli rhGAA proizvedeni iz jajnih ćelija kineskog hrčka (CHO);

pri čemu molekuli rhGAA sadrže sedam potencijalnih N-glikozilacionih mesta;

pri čemu molekuli rhGAA u proseku sadrže 3-4 ostatka manoza-6-fosfata (M6P); pri čemu molekuli rhGAA u proseku sadrže najmanje oko 0,5 mol bis-manoza-6-fosfata (bis-M6P) po molu rhGAA na prvom potencijalnom mestu N-glikozilacije kako je utvrđeno tečnom hromatografijom – tandem masenom spektrometrijom (LC-MS/MS); pri čemu se populacija molekula rhGAA primenjuje istovremeno ili sekvencijalno sa farmakološkim šaperonom, i pri čemu je farmakološki šaperon miglustat ili njegova farmaceutski prihvatljiva so;

pri čemu se populacija molekula rhGAA daje intravenski u dozi od oko 20 mg/kg i miglustat ili njegova farmaceutski prihvatljiva so se daje oralno u dozi od oko 260 mg; i pri čemu

(i) subjekt je pacijent koji prelazi sa enzimske supstitucione terapije (ERT) i, u poređenju sa početnom vrednošću, plućna funkcija subjekta, merena testom forsiranog vitalnog kapaciteta (FVC) u uspravnom položaju, je stabilna ili se poboljšava šest meseci nakon tretmana; i/ili

(ii) subjekt je pokretni pacijent koji prelazi sa enzimske supstitucione terapije (ERT) i, u poređenju sa početnom vrednošću, nivoi kreatin kinaze kod subjekta se smanjuju za najmanje 15% šest meseci nakon tretmana; i/ili

(iii) subjekt je nepokretni pacijent koji prelazi sa enzimske supstitucione terapije (ERT) i, u poređenju sa početnom vrednošću, nivoi kreatin kinaze kod subjekta se smanjuju za najmanje 20% šest meseci nakon tretmana; i/ili

(iv) subjekt je pacijent koji prelazi sa enzimske supstitucione terapije (ERT) i, u poređenju sa početnom vrednošću, nivoi urin heksoza tetrasaharida kod subjekta smanjuju se za najmanje 35% šest meseci nakon tretmana.

2. Sastav predviđen za primenu iz patentnog zahteva 1, pri čemu se miglustat ili njegova farmaceutski prihvatljiva so daju pre primene rhGAA.

3. Sastav predviđen za primenu iz patentnog zahteva 1 ili patentnog zahteva 2, pri čemu molekuli rhGAA sadrže aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 95% identična SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:5.

4. Sastav predviđen za primenu iz bilo kog od patentnih zahteva 1 do 3, pri čemu molekuli rhGAA sadrže u proseku od oko 0,5 mola do oko 7,0 mola mono-M6P ili bis-M6P po molu rhGAA, kako je utvrđeno pomoću metode LC-MS/MS.

5. Sastav predviđen za primenu iz bilo kog od patentnih zahteva 1 do 4, pri čemu molekuli rhGAA sadrže u proseku najmanje 2,5 mola M6P po molu rhGAA i najmanje 4 mola sijalinske kiseline po molu rhGAA, kako je utvrđeno pomoću metode LC-MS/MS.

6. Sastav predviđen za primenu iz bilo kog od patentnih zahteva 1 do 5, pri čemu, po molu rhGAA, molekuli rhGAA sadrže u proseku:

(a) oko 0,4 do oko 0,6 mola mono-M6P na drugom potencijalnom mestu N-glikozilacije; (b) oko 0,4 do oko 0,6 mola bis-M6P na četvrtom potencijalnom mestu N-glikozilacije; i (c) oko 0,3 do oko 0,4 mola mono-M6P na četvrtom potencijalnom mestu N-glikozilacije;

pri čemu se (a)-(c) određuju primenom metode LC-MS/MS.

7. Sastav predviđen za primenu iz bilo kog od patentnih zahteva 1 do 6, pri čemu, po molu rhGAA, molekuli rhGAA dalje sadrže oko 4 mola do oko 7,3 mola sijalinske kiseline; i

pri čemu, po molu rhGAA, molekuli rhGAA sadrže u proseku:

(a) oko 0,9 do oko 1,2 mola sijalinske kiseline na trećem potencijalnom mestu N-glikozilacije;

(b) oko 0,8 do oko 0,9 mola sijalinske kiseline na petom potencijalnom mestu N-glikozilacije; i

(c) oko 1,5 do oko 4,2 mola sijalinske kiseline na šestom potencijalnom mestu N-glikozilacije;

pri čemu se (a)-(c) određuju primenom metode LC-MS/MS.

8. Sastav predviđen za primenu iz bilo kog od patentnih zahteva 1 do 7, pri čemu je populacija molekula rhGAA formulisana u farmaceutskom sastavu, i pri čemu farmaceutski sastav dalje sadrži najmanje jedan pufer izabran iz grupe koja se sastoji od citrata, fosfata i njihove kombinacije, i najmanje jedan ekscipijens izabran iz grupe koja se sastoji od manitola, polisorbata 80 i njihove kombinacije; pri čemu farmaceutski sastav ima pH od oko 5,0 do oko 7,0.

9. Sastav predviđen za primenu iz bilo kog od patentnih zahteva 1 do 8, pri čemu je, u farmaceutskom sastavu, populacija molekula rhGAA prisutna u koncentraciji od oko 5-50 mg/mL, najmanje jedan pufer je pufer natrijum citrata prisutan u koncentraciji od oko 10-100 mM, najmanje jedan ekscipijens je manitol prisutan u koncentraciji od oko 10-50 mg/mL i polisorbat 80 prisutan u koncentraciji od oko 0,1-1 mg/mL, a farmaceutski sastav dalje sadrži vodu i opciono sadrži sredstvo za zakiseljavanje i/ili alkalizaciju; pri čemu farmaceutski sastav ima pH od oko 6,0.