RS64940B1 - Agonisti glukagonu sličnog peptid 1 receptora - Google Patents

Description

Opis

[0001] Ovaj pronalazak se odnosi na agoniste glukagonu-sličnog peptid-1 receptora i terapeutsku upotrebu jedinjenja za lečenje dijabetes melitusa tip II.

[0002] Glukagonu-sličan peptid-1 (GLP-1) je član inkretin familije peptida hormona koje luče endokrine L-ćelije tankog creva. GLP-1 indukuje oslobađanje insulina iz beta ćelija u zaisnosti od glukoze. Međutim, GLP-1 se brzo metaboliše tako da samo mali procenat GLP-1 može da se koristi za indukciju sekrecije insulina. Kako bi se ovo kompenzovalo, kao tretman za dijabetes melitus tip II se razvijaju agonisti GLP-1 receptora (GLP-1R) da se poveća sekrecija insulina.

[0003] Glavni agonisti GLP-1R koji su odobreni za lečenje dijabetes melitusa tip II su injektabilna sredstva. Pacijenti često daju prednost lekovima koji se oralno primenjuju zbog neprijatnosti povezanih sa injekcijom kao što su neugodnost, bol i potencijalna iritacija na mestu injektovanja.

[0004] WO2018/109607 otkriva neke derivate benzimidazola, koji su opisani kao GLP-1R agonisti.

[0005] Međutim, postoji potreba za alternativnim GLP-1R agonistima. Preciznije, postoji potreba za GLP-1R agonistima koji mogu da se primene oralno. Posebno postoji potreba za GLP-1R agonistima koji imaju povećanu potenciju, povoljan toksikološki profil i/ili farmakokinetički profil koji omogućava doziranje jedanput dnevno.

[0006] U skladu sa tim, ovaj pronalazak obezbeđuje jedinjenje izabrano od:

ili njihove farmaceutski prihvatljive soli.

[0007] Ovaj pronalazaka dalje obezbeđuje jedinjenje koje je:

[0008] U jednom ostvarenju, ovde je obezbeđeno jedinjenje formule:

gde je R<1>H ili F, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.

[0009] U jednom ostvarenju, ovde je obezbeđeno jedinjenje formule:

gde je R<1>H ili F, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.

[0010] U jednom ostvarenju, jedinjenje je jedinjenje formule:

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so. U preferiranom ostvarenju, jedinjenje je jedinjenje formule:

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.

[0011] U jednom ostvarenju, jedinjenje je jedinjenje formule:

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so. U preferiranom ostvarenju, jedinjenje je jedinjenje formule:

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so. U posebno preferiranom ostvarenju, ovde je obezbeđena terc-butilamin so (takođe poznata kao erbumin so):

[0012] U jednom ostvarenju, jedinjenje je jedinjenje formule:

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so. U preferiranom ostvarenju, jedinjenje je jedinjenje formule:

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.

[0013] Ovde su otkrivena jedinjenja formule:

Referentna Formula I

gde

R<1>je H ili F;

R<2>je H ili F; i

R<3>je H ili CH3;

ili njihova farmaceutski prihvatljiva so.

[0014] Referentna Formula I obuhvata Formule II, IIa i IIb a niže data referenca za Formulu I, na primer u terapeutskoj upotrebi, takođe treba da se tumači kao referenca za svaku i sve od tih sub-formula.

[0015] Formula I uključuje sve pojedinačne enantiomere i njihove smeše, kao i racemate i njihove farmaceutski prihvatljiva soli.

[0016] U još jednom ostvarenju, ovde je data farmaceutski prihvatljiva kompozicija koja uključuje jedinjenje Formule I, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, i najmanje jedan farmaceutski prihvatljiv nosač, razblaživač ili ekscipijent. U preferiranom ostvarenju, farmaceutski prihvatljiva kompozicija je formulisana za oralnu primenu.

[0017] U jednom ostvarenju, ovde je dato jedinjenje Formule I, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, za upotrebu u terapiji.

[0018] U još jednom ostvarenju, ovde je dato jedinjenje Formule I, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, za upotrebu u tretmanu dijabetes melitusa tip II.

[0019] U još jednom ostvarenju, ovde je dato jedinjenje Formule I, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, za upotrebu u smanjenju vrednosti glukoze u krvi.

[0020] U još jednom ostvarenju, ovde je takođe dato jedinjenje Formule I, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, za upotrebu u lečenju hiperglikemije.

[0021] U preferiranom ostvarenju, jedinjenje Formule I se primenjuje oralno. U preferiranom ostvarenju, jedinjenje Formule I se primenjuje jedanput dnevno. U narednom preferiranom ostvarenju, terapeutska upotreba je na ljudima.

[0022] Naziv "farmaceutski prihvatljiva so" kako se ovde koristi, se odnosi na so jedinjenja iz pronalaska koja se smatra prihvatljivom za kliničku i/ili veterinarsku upotrebu. Primeri farmaceutski prihvatljivih soli i uobičajene metodologije za njihovu upotrebu mogu da se nađu u "Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection and Use" P. Stahl, i saradnici, 2nd Revised Edition, Wiley-VCH, 2011 i S.M. Berge, i saradnici, "Pharmaceutical Salts", Journal of Pharmaceutical Sciences, 1977, 66(1), 1-19.

[0023] Primeri farmaceutskih kompozicija i procesi za njihovu izradu mogu da se nađu u "Remington: The Science and Practice of Pharmacy", Loyd, V., i saradnici Eds., 22nd Ed., Mack Publishing Co., 2012. U jednom ostvarenju, farmaceutske kompozicije mogu da budu formulisane za oralnu primenu. Preferirano, farmaceutske kompozicije su formulisane kao tablete, kapsule ili rastvori. Tablete, kapsule ili rastvori mogu da uključe jedinjenje Formule I u količini efikasnoj za lečenje pacijenta kome je tretman potreban.

[0024] Naziv "efektivna količina" se odnosi na količinu ili dozu jedinjenja Formule I, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, koja nakon primenjene jedne ili više doza na pacijentu, obezbeđuje traženi efekat kod pacijenta sa dijagnozom ili koji je pod tretmanom. Ordinirajući lekar, kao stručnjak u tehnici, može lako da odredi efektivnu količinu korišćenjem uobičajenih tehnika i razmatranjem rezultata dobijenih pod analognim okolnostima. Faktori koji se razmatraju pri određivanju efektivne količine ili doze jedinjenja uključuju: koje će jedinjenje ili njegova so da se primene; ko-primena drugih sredstava, ukoliko se koriste; rod sisara koji se tretira; njegova veličina, starost i opšte zdravstveno stanje; stepen uključenosti ili ozbiljnosti poremećaja; odgovor pojedinačnog sisara; način primene; karakteristike bioraspoloživosti preparata koji se primenjuje; izabrani režim doziranja; i druge relevantne okolnosti. Jedinjenja iz ovog pronalaska su efikasna u dnevnoj dozi koja je u opsegu od približno 0.01 do približno 15 mg/kg telesne težine.

[0025] Kako se ovde koristi, nazivi "lečenje", "lečiti", ili "tretman", se odnose na snižavanje, umanjenje ili zaustavljanje progresije ili ozbiljnosti postojećih simptoma, poremećaja ili stanja, kao što je hiperglikemija, koji mogu da uključe povećanje sekrecije insulina.

[0026] Jedinjenja Formule I mogu da se formulišu kao farmaceutske kompozicije za primenu bilo kojim načinom koji obezbeđuje bioraspoloživost jedinjenja. Preferirano, ove kompozicije su za oralnu primenu. Ovakve farmaceutske kompozicije i procesi za njihovu izradu su dobro poznati u tehnici (videti, na primer, Remington, J. P., "Remington: The Science and Practice of Pharmacy", L.V. Allen, Editor, 22nd Edition, Pharmaceutical Press, 2012).

[0027] Jedinjenja Formule i njihove farmaceutski prihvatljive soli su korisni u terapeutskoj upotrebi pronalaska, pri čemu prednost imaju neke konfiguracije.

[0028] Jedinjenja iz ovog pronalaska uključuju:

ili njihove farmaceutski prihvatljive soli.

[0029] Mada ovaj pronalazak obuhvata sve pojedinačne enantiomere, njihove smeše i racemate, jedinjenja Formule IIa i njihove farmaceutski prihvatljive soli imaju posebnu prednost.

[0030] Stručnjak sa uobičajenim iskustvom u tehnici može da izdvoji ili razdvoji pojedinačne enantiomere u bilo kojoj pogodnoj tački u toku sinteze jedinjenja iz pronalaska, postupcima kao što su tehnike selektivne kristalizacije, asimetrična hromatografija (videtina primer, J. Jacques, i saradnici, "Enantiomers, Racemates i Resolutions", John Wiley and Sons, Inc., 1981 i E.L. Eliel and S.H. Wilen," Stereochemistry of Organic Compounds", Wiley-Interscience, 1994), ili superkritična hromatografija fluida (SFC) (videti na primer, T. A. Berger; "Supercritical Fluid Chromatography Primer," Agilent Technologies, July 2015).

[0031] Farmaeutski prihvatljiva so jedinjenja iz pronalaska može da se formira, na primer, reakcijom jedinjenja Formule I i odgovarajuće farmaceutski prihvatljive baze u pogodnom rastvaraču, pod standardnim uslovima dobro poznatim u tehnici (videti, na primer, Bastin, R.J., i saradnici; Org. Process. Res. Dev., 4, 427-435, 2000 and Berge, S.M., i saradnici; J. Pharm. Sci., 66, 1-19, 1977). Preferirana so je terc-butil amin (ili erbumin) so.

[0032] Neke skraćenice koje su ovde korišćene su definisane u skladu sa Daub G.H., i saradnici, "The Use of Acronyms in Organic Chemistry" Aldrichimica Acta, 1984, 17(1), 6-23. Neke skraćenice su definisane na sledeći način: "ACN" se odnosi na acetonitril; "ATP" se odnosi na adenozin trifosfat; "BSA" se odnosi na albumin seruma govečeta; "cAMP" se odnosi na ciklični adenozin-3’,5’- monofosfat; "DCM" se odnosi na dihlormetan ili metilen hlorid; "DIPEA" se odnosi na N,N-diizopropiletilamin; "DMF" se odnosi na N,N-dimetilformamid; "DMSO" se odnosi na dimetil sulfoksid; "EC50" se odnosi na koncentraciju sredstva koja produkuju 50% odgovora ciljanog delovanja u poređenju sa prethodno definisanom pozitivnom kontrolom jedinjenja (apsolutni EC50); "ES/MS" se odnosi na elektrosprej masenu spektrometriju; "EtOAc" se odnosi na etil acetat; "HATU" se odnosi na 1-[bis(dimetilamino)metilen]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]piridinijum 3-oksid heksafluorofosfat; "HEK" se odnosi na bubreg humanog embriona; "HEPES" se odnosi na 4-(2-hidroksietil)-1-piperazinetansulfonsku kiselinu; "h" se odnosi na sate ili sat, tim redom; "MeOH" se odnosi na metanol ili metil alkohol; "min" se odnosi na minut ili minute; "Pd(dppf)Cl2" se odnosi na [1,1’-bis(difenilfosfino)ferocen]dihlorpaladijum(II); "RT" se odnosi na sobnu temperaturu; i "THF" se odnosi na tetrahidrofuran.

[0033] Jedinjenja iz ovog pronalaska mogu da se izrade različitim procedurama od kojih su neke ilustrovane u niže datim izradama ili primerima. Specifične faze sinteze za svaki opisani postupak mogu da se kombinuju na različite načine u toku izrade jedinjenja iz pronalaska ili njihovih soli. Produkt svake niže faze može da se obnovi uobičajenim postupcima uključujući ekstrakciju, evaporaciju, precipitaciju, hromatografiju, filtraciju, trituraciju i kristalizaciju. Reagensi i početni materijali su lako raspoloživi za stručnjaka sa uobičajenim iskustvom u tehnici. Pojedinačni izomeri, enantiomeri i diastereomeri mogu da se izdvoje ili razdvoje u bilo kojoj pogodnoj tački sinteze postupcima kao što su tehnike selektivne kristalizacije ili asimetična hromatografija (videti na primer, J. Jacques, i saradnici, "Enantiomers, Racemates i Resolutions", John Wiley and Sons, Inc., 1981, and E.L. Eliel and S.H. Wilen," Stereochemistry of Organic Compounds", Wiley-Interscience, 1994). Bez ograničavanja okvira pronalaska, niže date izrade i primeri su dati da dalje ilustruju pronalazak.

Šema 1

LG = odlazeća grupa

1

R<1>, R<2>i R<3>su kao što je definisano za Formulu I

[0034] Šema 1 pokazuje sintezu međuproizvoda 6, koji se koristi u izradi jedinjenja Formule I. Prvo se benzoeva kiselina 1 podvrgne redukciji sa kompleksom boran dimetilsulfid u Fazi 1 da se dobije alkohol 2. Alkohol se konvertuje u odlazeću grupu (LG, međuproizvod 3). Na primer, alkohol u međuproizvodu 2 može da se konvertuje u mesilatnu grupu koristeći metansulfonil hlorid na -15 °C u Fazi 2, ili može da se konvertuje u bromid koristeći fosfor tribromid na 0 °C. Međuproizvod 3 reaguje sa NaCN u Fazi 3 da se dobije nitril 4. Nitril 4 se konvertuje sa KOH na povišenoj temperaturi u Fazi 4 da se dobije kiselina 5, koja se nakon toga esterifikuje u Fazi 5 da se dobije međuproizvod 6 koristeći oksalil hlorid, DMF i metanol.

Šema 2

R<1>, R<2>i R<3>su kao što je definisano za Formulu I

[0035] Šema 2 opisuje izradu ključnog međuproizvoda 12 za izradu jedinjenja Formule I na dva načina. U prvom načinu, aril halid 6 se podvrgava jednokratnoj Miyura borilaciji/Suzuki udvajanju: upotrebom bis(pinakolato)diborona, Pd(dppf)Cl2i kalijum acetata na povišenoj temperaturi, aril halid 6 se konvertuje u Fazi 1a u boratni estar 7, nakon čega se u reakciju dodaju bromopiridin 8 i K2CO3(Faza 2a) da se dobije međuproizvod 12. U drugom načinu, primenjuje se dvo-fazni proces: Suzuki udvajanjem aril halida 6 sa 6-hidroksipiridin-2-borna kiselina pinakol estar 9 koristeći Pd(dppf)Cl2i K2CO3na povišenoj temperaturi (Faza 1b) se dobija međuproizvod 10, koji se nakon toga alkiluje sa 4-(bromometil)-3-fluorobenzonitrilom 6 koristeći Ag2CO3na povišenoj temperaturi (Faza 2b) da se dobije međuproizvod 12. Hidrolizom estra međuproizvoda 12 u Fazi 3 upotrebom LiOH se dobija kiselina, međuproizvod 13.

Šema 3

R<1>, R<2>i R<3>su kao što je definisano za Formulu I

[0036] Alternativno, ključni međuproizvodi 12 i 13 mogu da se izrade u skladu sa Šemom 3, udvajanjem bromopiridina 8 sa boratnim estrom 7 ili boratnom kiselinom 14 koristeći Pd(dppf)Cl2i kalijum karbonat na povišenoj temperaturi.

Šema 4

1

R<1>, R<2>i R<3>su kao što je definisano za Formulu I

[0037] Šema 4 pokazuje konverziju ključnog međuproizvoda 13 u jedinjenja Formule I.

Udvajanjem amida u Fazi 1 upotrebom HATU i dianilina 15 se dobija međuproizvod 16. Ciklizacija (Faza 2) se izvodi zagrevanjem međuproizvoda 16 u sirćetnoj kiselini da se dobije benzimidazol 17. Konačno, u Fazi 3 se jedinjenja Formule I dobijaju hidrolizom 17 upotrebom LiOH.

Izrade i Primeri

[0038] LC-ES/MS se izvodi na AGILENT® HP1200 sistemu za tečnu hromatografiju.

Merenja elektrosprej masene spektrometrije (dobijena u pozitivnom i/ili negativnom modu) se izvode na Mass Selective Detector kvadropolnom masenom spektrometru povezanom sa HPLC koji može ili ne mora da ima ELSD. LC-ES/MS uslovi (nizak pH): kolona:

PHENOMENEX® GEMINI® NX C182.0 x 50 mm 3.0 µm, 110 Å; gradijent: 5-95% B za 1.5 min, nakon toga 95% B za 0.5 min temperatura kolone: 50 °C /-10 °C; brzina protoka: 1.2 mL/min; 1 µL zapremina injektovanja; Rastvarač A: dejonizovana voda sa 0.1% HCOOH; Rastvarač B: ACN sa 0.1% mravlje kiseline; talasna dužina 200-400 nm i 212-216 nm.

Ukoliko je HPLC opremljena sa ELSD podešavanja su temperatura evaporatora 45 °C, temperatura nebulizera je 40 °C i brzina protoka gasa je 1.6 SLM. Alternativni LC-MS uslovi (visoki pH): kolona: Waters xBridge® C18 kolona 2.1x50 mm, 3.5 µm; gradijent: 5-95% B za 1.5 min, nakon toga 95% B za 0.50 min; temperatura kolone: 50 °C /-10 °C; brzina protoka: 1.2 mL/min; 1µL zapremina injektovanja; Rastvarač A: 10 mM NH4HCO3pH 9; Rastvarač B: ACN; talasna dužina: 200-400 nm i 212-216nm; ukoliko ima ELSD: temperatura evaporatora je 45°C, temperatura nebulizera je 40°C i brzina protoka gasa je 1.60 SLM.

[0039] Modeli difrakcije X-zraka praška (XRPD) kristalnih čvrstih susptanci su dobijeni na Bruker D4 Endeavor difraktometru X-zraka praška, opremljenim sa izvorom CuKα i Vantec detektorom, koji radi na 35 kV i 50 mA. Uzorak se skenira između 4 i 402θ°, uz veličinu faze od 0.0082θ° i uz brzinu skeniranja od 0.5 sekundi/faza i korišćenjem 1.0 mm divergenciju, 6.6 mm fiksni anti-skater i 11.3 mm detektorske proreze. Suvi prašak se stavi na kvarcni držač uzorka a glatka površina se dobija korišćenjem staklenih ljuspica. Modeli difrakcije kristalnog oblika se dobijaju na sobnoj temperaturi i pri relativnoj vlažnosti.

Pozicije pika kristala se određuju u MDI-Jade nakon pomeranja celog uzorka na bazi unutrašnjeg NIST 675 standarda sa pikovima za 8.853 i 26.7742θ°. U tehnici kristalografije je dobro poznato da, za bilo koji dati kristalni oblik, relativni intenziteti pikova difrakcije mogu da variraju zbog preferirane orijentacije nastale zbog faktora kao što su morfologija i karakteristike kristala. Kada su prisutni efekti preferirane orijentacije, intenziteti pika su izmenjeni, ali su pozicije karakterističnog pika polimorfa nepromenjene. Videti, na primer The United States Pharmacopeia #23, National Formulary #18, pages 1843-1844, 1995. Osim toga, u tehnici kristalografije je takođe dobro poznato da za bilo koji dati kristalni oblik pozicije uglova pika mogu blago da variraju. Na primer, pozicija pika može da se menja zbog promene u temperaturi na kojoj je uzorak ispitivan, zbog pomeranja uzorka ili zbog prisustva ili odsustva unutrašnjeg standarda. U ovom slučaju, pretpostavlja se da je promena pozicije pika od ± 0.22θ° uzela u obzir ove potencijalne varijacije bez neželjenog uticaja na identifikaciju naznačenog kristalnog oblika. Potvrda kristalnog oblika može da se izvrši na osnovu bilo koje jedinstvene kombinacije karakterističnih pikova.

Izrada 1

(4-Bromo-2-fluoro-5-metilfenil)metanol

[0040]

[0041] U bocu se dodaju: 4-bromo-2-fluoro-5-metilbenzoeva kiselina (100 g, 421 mmol), THF (200 mL) i boran (dimetil sulfid kompleks, 2 mol/L rastvor u THF, 210 mL, 10 mmol). Smeša se meša na RT u toku noći. Reaktivna smeša se neutrališe sa HCl (1.0 N vodeni rastvor, 50 mL) i smeša filtrira. Filtrat se koncentruje pod vakuumom i ostatak podeli između EtOAc (400 mL) i vode (400 mL). Organske supstance se isperu sa zasićenim vodenim rastvorom NaCl (400 mL), suše preko Na2SO4, filtriraju i koncentruju da se dobije naslovljeno jedinjenje kao čvrsta supstanca (93.5 g, 99%).<1>H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.29 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 7.26 (d, J = 9.1 Hz, 1H), 4.69 (s, 2H), 2.38 (s, 3H).

1

Izrada 2

(4-Bromo-2-fluoro-3-metil-fenil)metanol

[0042]

[0043] Naslovljeno jedinjenje se u suštini izrađuje kako je opisano za Izradu 1 koristeći 4-bromo-2-fluoro-3-metilbenzoevu kiselinu. Produkt se prečisti hromatografijom na silika gelu uz gradijent od 10 do 35% EtOAc u heksanima. LC-ES/MS pik vreme zadržavanja: 1.01 min. Izrada 3

2-(4-Bromo-2-fluoro-5-metilfenil)acetonitril

[0044]

[0045] Rastvori se (4-bromo-2-fluoro-5-metilfenil)metanol (92 g, 420 mmol) u DCM (500 mL) i doda se trietilamin (120 mL, 861 mmol). Smeša se ohladi na -15 °C i u reaktivnu smešu se u kapima dodaje rastvor metansulfonil hlorida (40 mL, 517 mmol) u DCM (30 mL). Smeša se meša 30 min na RT. Reaktivna smeša se podeli između DCM (500 mL) i vode (500 mL). Organske supstance se isperu sa zasićenim vodenim rastvorom NaCl (500 mL), suše preko Na2SO4, filtriraju i koncentruju. Ostatak se rastvori u DMF (400 mL) i smeša ohladi u ledenom kupatilu. U reaktivnu smešu se u jednoj porciji doda NaCN (21.0 g, 429 mmol) i meša na RT u toku noći. Smeša se podeli između EtOAc (400 mL) i vode (500 mL).

Organske supstance se isperu sa zasićenim vodenim rastvorom NaCl (500 mL), suše preko Na2SO4, filtriraju i koncentruju. Ostatak se prečisti hromatografijom na silika gelu uz

1

gradijent od 10 do 30% EtOAc u heksanima da se dobije naslovljeno jedinjenje (47.0 g, 48%) kao ulje.<1>H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.34 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.32 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 3.71 (s, 2H), 2.41 (s, 3H).

Izrada 4

2-(4-Bromo-2-fluoro-3-metil-fenil)acetonitril

[0046]

[0047] Izmešaju se (4-bromo-2-fluoro-3-metil-fenil)metanol (1.90 g, 8.67 mmol) i DCM (20 mL). Smeša se ohladi na 0 °C, nakon toga se u kapima dodaje fosfor tribromid (1.0 mL, 11 mmol). Smeša se meša na 0 °C u toku 15 min, nakon toga smeša zaalkališe sa zasićenim vodenim rastvorom NaHCO3(10 mL). Smeša se ekstrahuje sa DCM (40 mL). Organske supstance se isperu sa slanim rastvorom (30mL), suše preko (Na2SO4), filtriraju i koncentruju da se dobije čvrsta supstanca. Čvrsta supstanca se rastvori u DMSO (10 mL), nakon toga se doda NaCN (0.60 g, 13.0 mmol) i meša 1 h. Smeša se podeli između EtOAc (50 mL) i vode (50 mL). Organske supstance se isperu sa slanim rastvorom (50 mL), suše preko Na2SO4, filtriraju i koncentruju da se dobije produkt kao čvrsta supstanca (1.3 g, 64%). LC- ES/MS pik vreme zadržavanja: 1.17 min

Izrada 5

Metil 2-(4-bromo-2-fluoro-5-metil-fenil)acetat

[0048]

1

[0049] U bocu se dodaju: 2-(4-bromo-2-fluoro-5-metilfenil)acetonitril (1.20 g, 5.10 mmol), etanol (5 mL), voda (3 mL) i kalijum hidroksid (0.90 g, 16 mmol). Smeša se zagreva na 90 °C u toku noći. Smeša se ohladi u ledenom kupatilu i zakiseli sa 1.0 M HCl do pH 4-5, a nakon toga smeša podeli između EtOAc (30 mL) i vode (30 mL). Organske supstance se isperu sa zasićenim vodenim rastvorom NaCl (30 mL), suše preko Na2SO4, filtriraju i koncentruju da se dobije 2-(4-bromo-2-fluoro-5-metil-fenil)sirćetna kiselina kao čvrsta supstanca. Ovo se rastvori u DCM (10 mL), nakon toga se na RT dodaju DMF (0.05 mL, 0.6 mmol) i oksalil hlorid (0.5 mL, 6 mmol). Smeša se meša 30 min na RT, nakon toga se u kapima dodaje MeOH (2 mL, 49.4 mmol). Nakon 30 min, rastvarač se ukoni pod vakuumom i ostatak podeli između EtOAc (40 mL) i 5% NaHCO3(30 mL). Organske supstance se isperu sa zasićenim vodenim rastvorom NaCl (40 mL), suše preko Na2SO4, filtriraju i koncentruju da se dobije naslovljeno jedinjenje kao ulje (1.1 g, 80%). ES/MS m/z (<79>Br,<81>Br) 278,280 (M+NH4<+>).

Izrada 6

Metil 2-(4-bromo-2-fluoro-3-metil-fenil)acetat

[0050]

[0051] Naslovljeno jedinjenje se u suštini izrađuje kako je opisano za Izradu 5 koristeći 2-(4-bromo-2-fluoro-3-metil-fenil)acetonitril. LC-ES/MS pik vreme zadržavanja: 1.22 min.

Izrada 7

Metil 2-(4-bromo-2,6-difluorofenil)acetat

1

[0053] Izmešaju se 4-bromo-2,6-difluorofenilsirćetna kiselina (3.30 g, 12.5 mmol), DCM (20 mL), DMF (0.05 mL, 0.6 mmol) i oksalil hlorid (1.3 mL, 15 mmol). Smeša se meša 30 min na RT, nakon toga se u kapima dodaje MeOH (1.5 mL, 37 mmol, 100 mass%). Smeša se koncentruje i podeli između EtOAc (30 mL) i zasićenbog vodenog rastvora NaHCO3(15 mL). Organske supstance se isperu sa zasićenim vodenim rastvorom NaCl (30 mL), suše preko Na2SO4, filtriraju i koncentruju da se dobije naslovljeno jedinjenje kao ulje (3.41 g, kvantitativan prinos), koje se koristi bez daljeg prečišćavanja u Izradi 10. ES/MS m/z (<79>Br,<81>Br) 265,267 (M+H).

Izrada 8

4-[(6-Bromo-2-piridil)oksimetil]-3-fluoro-benzonitril

[0054]

[0055] Rastvore se 2-bromo-6-fluoropiridin (2.50 g, 13.8 mmol) i 3-fluoro-4-(hidroksimetil)benzonitril (2.15 g, 13.8 mmol) u 1,4-dioksanu (25 mL) i u kapima se u toku 12 min dodaje rastvor kalijum terc-butoksida (20 mt% u THF, 10.0 mL, 16.6 mmol) na RT. Reaktivna smeša se zagreva 30 min na 40 °C. Smeša se sipa u vodeni rastvor K2CO3(1M) i dva puta ekstrahuje sa EtOAc. Organske supstance se isperu sa vodom i zasićenim vodenim

1

rastvorom NaCl, suše preko Na2SO4, filtriraju i koncentruju. Ostatak se suši u vakuumskoj pećnici na 50 °C da se dobije naslovljeno jedinjenje (4.23 g, 95%) kao svetlo žuta čvrsta supstanca. ES/MS m/z (<79>Br,<81>Br) 307,309 (M+H).

Izrada 9

Metil 2-[2-fluoro-4-(6-hidroksi-2-piridil)-5-metil-fenil]acetat

[0056]

[0057] U bocu se dodaju pinakol estar 6-hidroksipiridin-2-boratne kiseline (1.6 g, 6.9 mmol), metil 2-(4-bromo-2-fluoro- 5-metil-fenil)acetat (2.2 g, 8.4 mmol), THF (15 mL), voda (1 mL) i kalijum karbonat (2.0 g, 14 mmol). Smeša se prečisti sa azotom u toku 10 min, nakon toga se doda Pd(dppf)Cl2(0.26 g, 0.35 mmol) i zagreva 2 h na 75 °C. Smeša se podeli između EtOAc (30 mL) i vode (30 mL). Organske supstance se isperu sa zasićenim vodenim rastvorom NaCl (30 mL), suše preko Na2SO4, filtriraju i koncentruju da se dobije naslovljeno jedinjenje (1.4 g, 74%) kao čvrsta supstanca. ES/MS m/z 276 (M+H), 274 (M-H).

Izrada 10

Metil 2-[2,6-difluoro-4-(6-hidroksi-2-piridil)fenil]acetat

[0058]

2

[0059] Naslovljeno jedinjenje se u suštini izrađuje kako je opisano za Izradu 9 koristeći metil 2-(4-bromo-2,6-difluorofenil)acetat, zagrevajući reakciju na 75 °C u toku noći. ES/MS m/z 280 (M+H).

Izrada 11

Metil 2-[2-fluoro-4-(6-hidroksi-2-piridil)-3-metil-fenil]acetat

[0060]

Naslovljeno jedinjenje se u suštini izrađuje kako je opisano za Izradu 9 koristeći metil 2-(4-bromo-2-fluoro-3-metil-fenil)acetat, uz zagrevanje reakcije na 75 °C u toku noći (18 h). ES/MS m/z 276 (M+H), 274 (M-H).

Izrada 12

Metil 2-[4-[6-[(4-cijano-2-fluoro-fenil)metoksi]-2-piridil]-3-metil-fenil]acetat

[0061]

[0062] Rastvori se 2-(4-bromo-3-metilfenil)sirćetna kiselina (10.7 g, 45.8 mmol) u DCM (50 mL). Smeša se ohladi u vodenom kupatilu sa ledom i nakon toga se dodaju oksalil hlorid (4.8 mL, 55 mmol) i DMF (0.1 mL). Kupatilo led voda se ukloni a smeša meša 2 h na RT. U kapima se u toku 2 min dodaje MeOH (6.0 mL) i meša 1 h na RT. Reaktivna smeša se koncentruje pod vakuumom i ostatak rastvori u EtOAc. Organske supstance se isperu sa zasićenim vodenim rastvorom NaHCO3i zasićenim vodenim rastvorom NaCl. Organske supstance se suše preko Na2SO4, nakon toga filtriraju i koncentruju. U ostatak se dodaju bis(pinakolato)diboron (12.8 g, 50.4 mmol) i kalijum acetat (13.6 g, 137 mmol). Azot se u mehurićima propušta kroz reaktivnu smešu u toku 15 min, nakon toga se doda Pd(dppf)Cl2(kompleks sa DCM, 1.13 g, 1.37 mmol). Reakcija se zagreva u atmosferi azota 15 h na 85 °C u uljanom kupatilu, a nakon toga se reaktivna boca ukloni iz uljanog kupatila. Rastvori se kalijum karbonat (9.49 g, 68.7 mmol) u vodi (60 mL), azot se u mehurićima 10 min propušta kroz rastvor i nakon toga se u reaktivnu smešu dodaju ovaj rastvor i 4-[(6- bromo-2-piridil)oksimetil]-3-fluoro-benzonitril (14.1 g, 45.8 mmol). Azot se u mehurićima propušta kroz celu reaktivnu smešu u toku 5 min i zagreva u atmosferi azota 6 h na 85 °C. Reakcija se ohladi na približno RT i koncentruje pod vakuumom da se ukloni većina 1,4-dioksana. Ova smeša se razblaži sa EtOAc (200 mL) i ispere sa vodom i zasićenim vodenim rastvorom NaCl. Organske supstance se suše preko Na2SO4, nakon toga filtriraju i koncentruju. Sirovi produkt se prečisti hromatografijom na silika gelu uz gradijent od 5 do 50% EtOAc u heksanima da se dobije naslovljeno jedinjenje (13.3 g, 70%) kao svetlo žuta čvrsta supstanca. ES/MS m/z 391 (M+H).

Izrada 13

Metil 2-[4-[6-[(4-cijano-2-fluoro-fenil)metoksi]-2-piridil]-2-fluoro-5-metilfenil] acetat

[0063]

[0064] U bocu se dodaju metil 2-[2-fluoro-4-(6-hidroksi-2-piridil)-5-metilfenil]acetat (1.40 g, 5.09 mmol), 1,4-dioksan (35 mL), srebro karbonat (1.7 g, 6.2 mmol) i 4-(bromometil)-3-fluorobenzonitril (1.4 g, 6.2 mmol). Smeša se zagreva na 60 °C u toku noći. Čvrsta supstanca se izdvoji filtriranjem i filtrat koncentruje. Ostatak se prečisti hromatografijom na silika gelu koristeći 12 do 55% EtOAc u heksanima da se dobije naslovljeno jedinjenje (1.60 g, 77%) kao čvrsta supstanca. ES/MS m/z 409 (M+H), 407 (M-H).

Izrada 15

Metil 2-[4-[6-[(4-cijano-2-fluoro-fenil)metoksi]-2-piridil]-2,6-difluorofenil] acetat

[0065]

[0066] Naslovljeno jedinjenje se u suštini izrađuje kako je opisano za Izradu 13 koristeći metil 2-[2,6-difluoro-4-(6-hidroksi-2-piridil)fenil]acetat, uz zagrevanje reakcije na 80°C u toku noći. ES/MS m/z 413 (M+H).

Izrada 16

Metil 2-[4-[6-[(4-cijano-2-fluoro-fenil)metoksi]-2-piridil]-2-fluoro-3-metilfenil] acetat

[0067]

[0068] Naslovljeno jedinjenje se u suštini izrađuje kako je opisano za Izradu 13 koristeći metil 2-[2-fluoro-4-(6-hidroksi-2-piridil)-3-metil-fenil]acetat, uz zagrevanje reakcije na 80 °C u toku 3 h. ES/MS m/z 409 (M+H).

2

Izrada 17

2-[4-[6-[(4-Cijano-2-fluoro-fenil)metoksi]-2-piridil]-3-metil-fenil]sirćetna kiselina

[0069]

[0070] U bocu se dodaju metil 2-[4-[6-[(4-cijano-2-fluoro-fenil)metoksi]-2-piridil]-3-metilfenil]acetat (1.20 g, 3.07 mmol), ACN (20 mL), voda (10 mL) i litijum hidroksid (0.35 g, 15 mmol). Smeša se zagreva 3 h na 45 °C. Smeša se ohladi u ledenom kupatilu i zakiseli sa 1.0 M HCl do pH = 4-5. Smeša se podeli između EtOAc (30 mL) i vode (30 mL). Organske supstance se isperu sa slanim rastvorom (30 mL), suše preko Na2SO4, filtriraju i koncentruju da se dobije naslovljeno jedinjenje (1.1g, 95%) kao čvrsta supstanca. ES/MS m/z 377 (M+H).

Izrada 18

2-[4-[6-[(4-Cijano-2-fluoro-fenil)metoksi]-2-piridil]-2-fluoro-5-metil-fenil]sirćetna kiselina

[0071]

[0072] U bočicu se dodaju metil 2-[4-[6-[(4-cijano-2-fluoro-fenil)metoksi]-2-piridil]-2-fluoro-5-metil-fenil]acetat (1.6 g, 3.9 mmol), ACN (20 mL), voda (6 mL) i litijum hidroksid (0.45 g, 19 mmol). Smeša se zagreva 2 h na 45 °C, zatim ohladi u ledenom kupatilu i zakiseli sa 1.0 M HCl do pH = 4-5. Smeša se podeli između EtOAc (50 mL) i vode (50 mL). Organske supstance se isperu sa zasićenim vodenim rastvorom NaCl (50 mL), suše preko Na2SO4, filtriraju i koncentruju da se dobije naslovljeno jedinjenje (1.55g, 100%) kao čvrsta supstanca. ES/MS m/z 395 (M+H).

Izrada 20

2-[4-[6-[(4-Cijano-2-fluoro-fenil)metoksi]-2-piridil]-2,6-difluoro-fenil]sirćetna kiselina

[0073]

[0074] Naslovljeno jedinjenje se u suštini izrađuje kako je opisano za Izradu 18 koristeći metil 2-[4-[6-[(4-cijano-2-fluoro-fenil)metoksi]-2-piridil]-2,6-difluoro-fenil]acetat. ES/MS m/z 399 (M+H).

Izrada 21

2-[4-[6-[(4-Cijano-2-fluoro-fenil)metoksi]-2-piridil]-2-fluoro-3-metil-fenil]sirćetna kiselina

[0075]

[0076] Naslovljeno jedinjenje se u suštini izrađuje kako je opisano za Izradu 17 koristeći metil 2-[4-[6-[(4-cijano-2-fluoro-fenil)metoksi]-2-piridil]-2-fluoro-3-metilfenil]acetat. ES/MS m/z 395 (M+H).

2

Izrada 23

Metil 4-amino-3-[[(2S)-oksetan-2-ilmetil]amino]benzoat

[0077]

[0078] U rastvor metil 3-fluoro-4-nitro-benzoata (2.0 g, 10 mmol) u THF (10 mL) i DMF (10 mL) se na RT doda trietilamin (3.1 mL, 22 mmol). U žućkasti rastvor se doda [(2S)-oksetan-2-il]metanamin (Austin Chemical Company, 1.0 g, 11 mmol) i rastvor boje rđe se meša u toku noći. Reakcija se razblaži sa EtOAc (100 mL) i vodom (50 mL). Organski sloj se izdvoji i nakon toga vodeni sloj ponovo ekstrahuje sa EtOAc (2 x 50 mL). Organski slojevi se kombinuju i isperu sa zasićenim vodenim rastvorom NaCl. Organske supstance se suše preko Na2SO4, filtriraju, koncentruju i ostatak suši pod visokim vakuumom. Ovim se dobija sirovi metil 4-nitro-3-[[(2S)-oksetan-2-ilmetil]amino]benzoat (2.8 g, 10 mmol) kao žuta čvrsta supstanca (ES/MS m/z 267 (M+H)).

[0079] Sledeće, rastvori se metil 4-nitro-3-[[(2S)-oksetan-2-ilmetil]amino]benzoat (2.8 g, 10 mmol) u THF (50 mL) i doda se paladijum na ugljeniku (5% prethodno ovlažen sa vodom, 0.5 g). Reaktivna smeša se prečisti pod vakuumom sa vodonikom, nakon toga meša u balonu vodonika 2 h na RT, za koje vreme žuta boja nestaje. Smeša se filtrira kroz Celite® i koncentruje da se dobije naslovljeno jedinjenje (2.4g, 99%). ES/MS m/z 237 (M+H).

Izrada 24

Metil 4-[[2-[4-[6-[(4-cijano-2-fluoro-fenil)metoksi]-2-piridil]-3-metilfenil]acetil]amino]-3-[[(2S)-oksetan-2-ilmetil]amino]benzoat

[0080]

2

[0081] U bočicu se dodaju 2-[4-[6-[(4-cijano-2-fluoro-fenil)metoksi]-2-piridil]-3-metilfenil]sirćetna kiselina (1.10 g, 2.92 mmol), DMF (10 mL), HATU (1.4 g, 3.6 mmol), metil 4-amino-3-[[(2S)-oksetan-2-ilmetil]amino]benzoat (0.76 g, 3.2 mmol) i DIPEA (1.5 mL, 8.6 mmol). Smeša se meša 30 min na RT, nakon toga podeli između EtOAc (30 mL) i vode (30 mL). Organske supstance se isperu sa zasićenim vodenim rastvorom NaCl (30 mL), zatim suše preko Na2SO4, filtriraju i koncentruju. Ostatak se prečisti hromatografijom na silika gelu uz gradijent od 10 do 35% EtOAc u DCM da se dobije naslovljeno jedinjenje (1.2 g, 69%) kao čvrsta supstanca. ES/MS m/z 595 (M+1), 593 (M-1).

Izrada 25

Metil 4-[[2-[4-[6-[(4-cijano-2-fluoro-fenil)metoksi]-2-piridil]-2-fluoro-5-metilfenil]acetil]amino]-3-[[(2S)-oksetan-2-ilmetil]amino]benzoat

[0082]

[0083] U bocu se dodaju: 2-[4-[6-[(4-cijano-2-fluoro-fenil)metoksi]-2-piridil]-2-fluoro-5-metil-fenil]sirćetna kiselina (1.20 g, 3.04 mmol), DMF (15 mL), HATU (1.2 g, 3.1 mmol), metil 4-amino-3-[[(2S)-oksetan-2-ilmetil]amino]benzoat (0.80 g, 3.4 mmol) i DIPEA (1.5 mL, 8.6 mmol). Smeša se meša 30 min na RT, nakon toga podeli između EtOAc (30 mL) i vode (30 mL). Organske supstance se isperu sa sa zasićenim vodenim rastvorom NaCl (30 mL), zatim suše preko Na2SO4, filtriraju i koncentruju. Ostatak se prečisti hromatografijom na

2

silika gelu uz gradijent od 10 do 35% EtOAc u DCM da se dobije naslovljeno jedinjenje kao čvrsta supstanca (1.20 g, 64%). ES/MS m/z 613 (M+1), 611 (M-H).

Izrada 27

Metil 4-[[2-[4-[6-[(4-cijano-2-fluoro-fenil)metoksi]-2-piridil]-2,6-difluorofenil]acetil]amino]-3-[[(2S)-oksetan-2-il-metil]amino]benzoat

[0084]

[0085] Naslovljeno jedinjenje se u suštini izrađuje kako je opisano za Izradu 24 koristeći 2-[4-[6-[(4-cijano-2-fluoro-fenil)metoksi]-2-piridil]-2,6-difluoro-fenil]sirćetnu kiselinu.

Filtriranjem se sakupi produkt koji precipitira i koristi bez daljeg prečišćavanja. ES/MS m/z 617 (M+H), 615 (M-H).

Izrada 28

Metil 4-[[2-[4-[6-[(4-cijano-2-fluoro-fenil)metoksi]-2-piridil]-2-fluoro-3-metilfenil]acetil]amino]-3-[[(2S)-oksetan-2-ilmetil]amino]benzoat

[0086]

2

[0087] Naslovljeno jedinjenje se u suštini izrađuje kako je opisano za Izradu 24 koristeći 2-[4-[6-[(4-cijano-2-fluoro-fenil)metoksi]-2-piridil]-2-fluoro-3-metil-fenil]sirćetnu kiselinu.

ES/MS m/z 613 (M+H), 611 (M-H).

Primer 1

2-[[4-[6-[(4-Cijano-2-fluoro-fenil)metoksi]-2-piridil]-3-metil-fenil]metil]-3-[[(2S)-oksetan-2-il]metil]benzimidazol-5-karboksilna kiselina

[0088]

[0089] U bočicu se dodaju metil 4-[[2-[4-[6-[(4-cijano-2-fluoro-fenil)metoksi]-2-piridil]-3-metil-fenil]acetil]amino]-3-[[(2S)-oksetan-2-ilmetil]amino]benzoat (1.2 g, 2.0 mmol) i sirćetna kiselina (6 mL). Smeša se zagreva 2 h na 80 °C, nakon toga se rastvarač ukoni pod vakuumom. Ostatak se podeli između EtOAc (30 mL) i vodenog rastvora NaHCO3(5%, 20 mL). Organske supstance se isperu sa zasićenim vodenim rastvorom NaCl (30 mL), suše preko Na2SO4, filtriraju i koncentruju. Ostatak se rastvori u ACN (5 mL) i vodi (3 mL), nakon toga se u smešu doda LiOH (0.22 g, 9.2 mmol) i meša 2 h na 50 °C. Rastvarač se ukloni pod vakuumom. Ostatak se prečisti reverzno-faznom fleš hromatografijom uz gradijent od 20 do 35% ACN u 5% vodenom rastvoru NH4HCO3da se dobije naslovljeno jedinjenje (900 mg, 79%) kao čvrsta supstanca. ES/MS m/z 563 (M+H), 561 (M-H).

Primer 2

2-[[4-[6-[(4-Cijano-2-fluoro-fenil)metoksi]-2-piridil]-2-fluoro-5-metilfenil]metil]-3-[[(2S)-oksetan-2-il]metil]benzimidazol-5-karboksilna kiselina

2

[0091] U bočicu se dodaju metil 4-[[2-[4-[6-[(4-cijano-2-fluoro-fenil)metoksi]-2-piridil]-2-fluoro-5-metil-fenil]acetil]amino]-3-[[(2S)-oksetan-2-ilmetil]amino]benzoat (1.20 g, 1.96 mmol) i sirćetna kiselina (15 mL), nakon toga se smeša zagreva 2 h na 80 °C. Rastvarač se ukloni pod vakuumom. Ostatak se podeli između EtOAc (30 mL) i vodenog rastvora NaHCO3(5%, 20 mL). Organske supstance se isperu sa zasićenim vodenim rastvorom NaCl (30 mL), suše preko Na2SO4, filtriraju i koncentruju. Ostatak se rastvori u ACN (10 mL) i vodi (4 mL), nakon toga se u smešu doda LiOH (0.24 g, 10 mmol) i meša 2 h na 50 °C. Smeša se zakiseli sa zasićenim vodenim rastvorom limunske kiseline do pH = 4-5. Rastvarač se ukloni pod vakuumom. Ostatak se prečisti reverzno-faznom fleš hromatografijom uz gradijent od 20 do 35% ACN u 5% vodenom rastvoru NH4HCO3da se dobije naslovljeno jedinjenje (745 mg, 66%) kao čvrsta supstanca. ES/MS m/z 581 (M+H), 579 (M-H).

Primer 2a

terc-Butilamonijum; 2-[[4-[6-[(4-cijano-2-fluoro-fenil)metoksi]-2-piridil]-2-fluoro-5-metilfenil]metil]-3-[[(2S)-oksetan-2-il]metil]benzimidazol-5-karboksilat

[0092]

Postupak 1 – izrada bez semena kristala

[0093] 2-[[4-[6-[(4-cijano-2-fluoro-fenil)metoksi]-2-piridil]-2-fluoro-5-metil-fenil]metil]-3-[[(2S)-oksetan-2-il]metil]benzimidazol-5-karboksilna kiselina (555 mg, 0.96 mmol) se suspenduje se u acetonu (6 mL) uz mešanje pri 800 opm na 50 °C, da se dobije žitka masa bele čvrste supstance. Doda se terc-butilamin (115 mL, 1.09 mmol, 1.14 eq) uočavajući kratko bistrenje smeše a nakon toga čvrsta supstanca precipitira. Žitka masa se meša 1 h na 50 °C, nakon čega se prestane sa zagrevanjem i uzorak ostavi da se meša dok ne dostigne RT. Čvrsta supstanca se izdvoji filtriranjem pod vakuumom i suši 15 min u struji azota, nakon toga suši 1 h pod vakuumom na 50 °C da se dobije naslovljeno jedinjenje (612 mg, 98%).

Postupak 2 – izrada sa semenom kristala

[0094] Izmešaju se 2-[[4-[6-[(4-cijano-2-fluoro-fenil)metoksi]-2-piridil]-2-fluoro-5-metilfenil]metil]-3-[[(2S)-oksetan-2-il]metil]benzimidazol-5-karboksilna kiselina (50 g, 86.1 mmol), aceton (658 mL) i voda (42 mL) i smeša zagreje na 50 °C. Smeša se filtrira kroz GF/F papir i ispere sa 94:6 v:v aceton:voda (25 mL). Dobijeni rastvor se zagreje na 50 °C. Izradi se rastvor terc-butilamina (10 mL, 94.7 mmol, 1.1 eq) i 94:6 v:v aceton:voda (25 mL). Doda se deo terc-butilamin rastvora (7 mL) a nakon toga seme kristala terc-butilamonijuma; 2-[[4-[6-[(4-cijano-2-fluorofenil)metoksi]-2-piridil]-2-fluoro-5-metil-fenil]metil]-3-[[(2S)-oksetan-2-il]metil]benzimidazol-5-karboksilata (50 mg). Pomoću pumpe sa špricom se dodaje preostali terc-butilamin rastvor u toku približno 1 h brzinom od 0.47 mL/min. Dobijena suspenzija se zagreva 2 h na 50 °C, nakon toga se smeša ohladi na temperaturu sredine u toku noći. Žitka masa se filtrira i ispere sa acetonom (2 x 100 mL). Vlažna pogača se suši na 50 °C pod vakuumom do konstantne težine da se dobije naslovljeno jedinjenje (51.8 g, 92%) kao bledo žuta čvrsta supstanca.

[0095] Izrađeni uzorak naslovljenog jedinjenja se karakteriše XRD profilom koristeći CuKα zračenjem time što ima pikove difrakcije (2-teta vrednosti) kako je opisano u niže datoj Tabeli 1 a posebno što ima pikove za 6.9 u kmobinaciji sa jednim ili više pikova izabranih iz grupe koja se sastoji od 16.3 i 22.5; sa tolerancijom za uglove difrakcije od 0.2 stepena.

1

Tabela 1. Pikovi difrakcije X-zraka praška terc-butilamonijum;2-[[4-[6-[(4-cijano-2-fluoro-fenil)metoksi]-2-piridil]-2-fluoro-5-metil-fenil]metil]-3-[[(2S)-oksetan-2-il]metil]benzimidazol-5-karboksilata

Primer 4

2-[[4-[6-[(4-Cijano-2-fluoro-fenil)metoksi]-2-piridil]-2,6-difluoro-fenil]metil]-3-[(2S)-oksetan-2-ilmetil]benzimidazol-5-karboksilna kiselina

[0096]

[0097] Naslovljeno jedinjenje se u suštini izrađuje kako je opisano u Primeru 1 koristeći metil 4-[[2-[4-[6-[(4-cijano-2-fluoro-fenil)metoksi]-2-piridil]-2,6-difluorofenil]acetil]amino]-3-[[(2S)-oksetan-2-ilmetil]amino]benzoat. Produkt se prečisti reverzno-faznom fleš

2

hromatografijom uz gradijent od 30 do 50% ACN u vodenom rastvoru NH4HCO3(10 mM, pH 10). ES/MS m/z 585 (M+H), 583 (M-H).

Primer 5

2-[[4-[6-[(4-Cijano-2-fluoro-fenil)metoksi]-2-piridil]-2-fluoro-3-metilfenil]metil]-3-[[(2S)-oksetan-2-il]metil]benzimidazol-5-karboksilna kiselina

[0098]

[0099] Naslovljeno jedinjenje se u suštini izrađuje kako je opisano u Primeru 2 koristeći metil 4-[[2-[4-[6-[(4-cijano-2-fluoro-fenil)metoksi]-2-piridil]-2-fluoro-3-metilfenil]acetil]amino]-3-[[(2S)-oksetan-2-ilmetil]amino]benzoat. Produkt se prečisti reverzno-faznom fleš hromatografijom uz gradijent od 5 do 40% ACN u 5% vodenom rastvoru NH4HCO3. ES/MS m/z 581 (M+H), 579 (M-H).

Biološka ispitivanja

Analiza cAMP humanog GLP-1 receptora HEK293 ćelija

[0100] Funkcionalna aktivnost GLP-1 receptora se određuje korišćenjem formiranja cAMP u HEK293 klonalnoj ćelijskoj liniji u kojoj se ekspresuje humani GLP-1R (NCBI pristupni broj NP_002053) pri gustini ekspresije od 581 ± 94 (n=6) i 104 ± 12 (n=5) fmol/mg proteina (određeno korišćenjem analize vezivanja homologne kompeticije [125I]GLP-1(7-36)NH2). Ćelije u kojima se ekspresuje hGLP-1R receptor se tretiraju sa jedinjenjem (kriva koncentracija-odgovor od 20 tačaka u DMSO, 2.75-puta Labcyte Echo direktno razblaženje, ploča sa 384 udubljenja Corning Cat# 3570) u DMEM (Gibco Cat# 31053) obogaćenim sa 1X GlutaMAX™ (Gibco Cat# 35050), 0.1% kazeinom govečeta (Sigma C4765-10ML), 250 µM IBMX (3-Isobutil-1-metilksantin, Acros Cat# 228420010) i 20 mM HEPES (Gibco Cat# 15630) u 20 µL zapremine za analizu (finalna koncentracija DMSO je 0.5%). Nakon 30 min inkubacije na 37 °C, nastalo povećanje u intracelularnom cAMP se kvantitativno određuje koristeći CisBio cAMP Dynamic 2 HTRF kit za analizu (62AM4PEJ). Ukratko, vrednosti cAMP unutar ćelije se određuju dodavanjem cAMP-d2 konjugata u puferu za lizu ćelija (10 µL) a nakon toga dodavanjem antitela anti-cAMP-Eu3+-Cryptate, takođe u puferu za lizu ćelija (10 µL). Dobijena kompetitivna analiza se inkubira najmanje 60 min na RT, a nakon toga detektuje koristeći PerkinElmer Envision® instrument uz ekscitaciju na 320 nm i emisiju na 665 nm i 620 nm. Envizione jedinice (emisija na 665nm/620nm*10,000) su inverzno proporcionalne količini prisutnog cAMP i konvertuju se u nM cAMP po udubljenju koristeći cAMP standardnu krivu. Količina generisanog cAMP (nM) u svakom udubljenju se konvertuje u procenat maksimalnog odgovora uočenog sa humanim GLP-1(7-36)NH2.

Relativna EC50vrednost i maksimalni procenat (Emax) su izvedeni nelinearnom regresionom analizom koristeći procenat maksimalnog odgovora u odnosu na koncentraciju dodatog jedinjenja, prilagođenu logističkoj jednačini sa četiri parametra. Rezultati EC50i Emax, kada su testirana jedinjenja iz Primera 1, 2, 4 i 5 u cAMP analizi prethodno opisanoj koristeći HEK293 ćelije uz ekspresiju 581 i 104 fmol/mg GLP-1R, su pokazani u Tabelama 2 i 3, tim redom. Ovi rezultati ukazuju da su jedinjenja iz Primera 1, 2, 4 i 5 agonisti humanog GLP-1 receptora.

Tabela 2. HEK293 ćelijska linija sa gustinom ekspresije GLP-1R od 581 fmol/mg, intracelularni cAMP odgovor

4

Tabela 3. HEK293 ćelijska linija sa gustinom ekspresije GLP-1R od 104 fmol/mg, intracelularni cAMP odgovor

In vivo test tolerancije intraperitonealne glukoze u humanim GLP-1R Knock-In miševa

[0101] Potencijal primernih jedinjenja da snižavaju koncentraciju glukoze u krvi je in vivo određen koristeći miševe u kojima se ekspresuje humani GLP-1R (NCBI pristupni broj NP_002053) od miševa Glp-1r genetskog lokusa (Jun, L.S., i saradnici, PLoS One.2014 9:e93746). Na miševima ostavljenim bez hrane u toku noći se oralno primeni test jedinjenje solubilizovano u 10% Kolliphor® (HS15) u polietilen glikolu 400 (PEG400). Jedan sat nakon doze, na životinjama se intraperitonealnom injekcijom (2 g/kg) primeni glukoza i vrednosti glukoze u krvi se povremeno mere u toku naredna dva sata pomoću glukometra. Utvrdi se opseg doze test jedinjenja a odrede se izračunavanja oblasti ispod krive za svaku doznu grupu i prenesu u model četiri parametarske logističke jednačine za izračunavanje in vivo potencije kao ED50uz 95% intervala pouzdanosti. Kada se testiraju u in vivo testu tolerancije intraperitonealne glukoze kako je prethodno opisano, jedinjenja iz Primera 1 i 2 ispoljavaju potenciju da snižavaju koncentraciju glukoze u krvi miševa uz ekspresiju humanog GLP-1R sa ED50(i 95% intervala pouzdanosti) vrednostima kako je pokazano u Tabeli 4, što ukazuje da su ova jedinjenja oralno raspoloživo potentni GLP-1R agonisti kod miševa.

Tabela 4. Efikasnost snižavanja glukoze u krvi kod miševa sa ekspresovanim humanim GLP-1R

Farmakokinetika ne-humanih primata (NHP):

[0102] Test jedinjenje je primenjeno na izgladnelim mužjacima cinomolgus majmuna intravenski (IV) u količini od 0.5 mg/kg (koristeći zapreminu doze od 1 mL/kg). Serijski uzorci krvi su sakupljeni u 0.08, 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8, 12 i 24 sata nakon IV bolus doze. Nakon tretmana sa EDTA koagulantom, centrifugiranjem je dobijena plazma i ostavljena na

-70 °C sve do analize sa LC-MS/MS. U plazmi je određena koncentracija test uzorka.

Nekompartmentalna analiza je korišćena za izračunavanje klirensa plazme i zapremine distribucije u stabilnom stanju. Tabela 5 pokazuje farmakokinetičke rezultate za jedinjenja iz Primera 1 i 2 u ovom ispitivanju. Ovi rezultati su delimično korišćeni za informisanje humanih mehaničkih PK projekcija koje sugerišu humani farmakokinetički profil koji podržava doziranje jednom dnevno.

Tabela 5. Farmakokinetički rezultati cinomolgus majmuna

Ispitivanje aktivnosti enzima fosfodiesteraze 10 (PDE10)

[0103] Za generisanje fosfodiesteraza 10A1 (PDE10A1) proteina, cela dužina PDE10A1 klona koji odgovara Gen-Bank ID AAD32595.1 je klonirana u pFastBac1 (Invitrogen).

PDE10A1 protein sa C-terminalom FLAG-repića se ekspresuje bakulovirusnom infekcijom ćelija insekata i prečisti korišćenjem anti-FLAG M2-agaroze (Sigma) i hromatografiom za isključivanje po veličini na Superdex 200 koloni (GE Healthcare) i čuva na -80 °C u malim alikvotama (20 mM Tris-HCl, Ph 7.5, 150 mM NaCl, 10% glicerol).

[0104] Aktivnosti PDE10A1 enzima se mere na bazi itrijum silikata (SPA) koji detektuje radioaktivne nukleotidne monofosfate, ali ne i ciklične monofosfate. Pufer za analizu se sastoji od 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 8 mM MgCl2, 3.4 mM EDTA i 0.1% BSA (Sigma).

Analize se izvode u pločama sa 384 udubljenja (3706, Corning) u ukupnoj zapremini od 50 µl: sastoji se od 24 µl PDE10A1 enzima, 1 µl test jedinjenja i 25 µl cikličnog nukleotida. Test jedinjenja se razblaže u čistom DMSO koristeći krive odgovora sa deset tačaka koncentracije sa faktorom trostrukog razblaženja i 1 µl se akustično distribuira u ploče za analizu koristeći Echo555 (LabCite).24 µl PDE10A1 proteina se inkubia sa 1 µl jedinjenja u toku 30 min pre nego što reakcija započne dodavanjem [8-3H]-cGMP substrata (6.5 Ci/mmol, Perkin Elmer). Finalna koncentracija komponenti je 70 pM PDE10A1, 80 nM (3H -cGMP) i 2% DMSO u puferu za analizu. Maksimalna koncentracija jedinjenja u reaktivnoj smeši je 10 µM.

Reakcije se inkubiraju 60 min na RT pre neutralizacije i dodavanja 400 mg/po udubljenju SPA perli (RPNQ0150, Perkin Elmer). Vezivanje radioaktivnosti za perle (produkt) se kvantifikuje 12 h kasnije pomoću Microbeta brojača (Perkin Elmer). Rezultat se normalizuje u % inhibicije a IC50vrednosti se izračunavaju pomoću 4 parametarske logističke jednačine kako je opisano (Campbell, R.M.; Dymshitz, J.; Eastwood, B.J.; i saradnici "Data Standardization for Results Management." In: Sittampalam, G.S.; Grossman, A.;

Brimacombe, K.; i saradnici; eds. Assay Guidance Manual. Bethesda (MD): Eli Lilly & Company i National Center for Advancing Translational Sciences; 2004.). Tabela 6 pokazuje aktivnost jedinjenja iz Primera 1, 2 i 4 u ovoj analizi. Ovi rezultati pokazuju da jedinjenja iz Primera 1, 2 i 4 imaju slab afinitet vezivanja za PDE10A, što ukazuje na smanjenji toksični rizik.

Tabela 6. In vitro potencija za inhibiciju PDE10A1

Analiza afiniteta vezivanja radioliganda za humani hERG K+ kanal

[0105] Afinitet jedinjenja za humani hERG K+ kanal u transfektovanim HEK-293 ćelijama je procenjen u analizi vezivanja radioliganda kako je ovde opisano. Homogenati ćelijske membrane (približno 40 µg proteina) se inkubiraju 60 min na 22 °C sa 3 nM [3H]dofetilida bez prisustva ili u prisustvu test jedinjenja u puferu koji sadrži 50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 10 mM KCl i 1 mM MgCh. Analiza se izvodi u formatu ploče sa 96 udubljenja sa zapreminom od 200 µl koja sadrži maksimum 1% DMSO od početne solubilizacije test jedinjenja. Nakon inkubacije, uzorci se brzo filtriraju pod vakuumom kroz filtere od staklenih vlakana (GF/B, Packard) prethodno natopljenih sa 0.3% PEI i isperu nekoliko puta sa ledeno hladnim 50 mM Tris-HCl, 10 mM KCl i 1 mM MgCh koristeći sakupljač ćelija u 96 udubljenja (Unifilter, Packard). Filteri se suše a nakon toga se broji radioaktivnost u brojaču scintilacije (Topcount, Packard) koristeći koktel scintilacije (Microscint 0, Packard). Tabela 7 pokazuje aktivnosti iz Primera 1 i 2 u ovoj analizi, izraženo kao procenat inhibicije specifičnog vezivanja kontrolnog radioliganda. Ovi rezultati pokazuju da jedinjenja iz Primera 1 i 2 imaju slabu hERG inhibitornu aktivnost, što ukazuje na smanjeni toksični rizik.

Tabela 7. Procenat inhibicije afiniteta radioliganda za humani hERG K+ kanal

Claims (11)

1. Patentni zahtevi 1. Jedinjenje naznačeno time što je izabrano od:
2. ili njegove farmaceutski prihvatljive soli. 2. Jedinjenje u skladu sa patentnim zahtevom 1, naznačeno time što je izabrano od:
3. ili njegove farmaceutski prihvatljive soli. 3. Jedinjenje u skladu sa patentnim zahtevom 2, naznačeno time što je to jedinjenje:
4. ili njegova farmaceutski prihvatljiva so. 4. Jedinjenje u skladu sa patentnim zahtevom 3, naznačeno time što je to terc-butilamin so:
5. 4 5. Jedinjenje naznačeno time što je to:
6. 6. Farmaceutska kompozicija, naznačena time što uključuje jedinjenje, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 5 i najmanje jedan farmaceutski prihvatljiv nosač, razblaživač ili ekscipijent.
7. 7. Jedinjenje, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 5, naznačeno time što je za upotrebu u terapiji.
8. 8. Jedinjenje, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 5, naznačeno time što je za upotrebu u tretmanu dijabetes melitusa tip II.
9. 9. Jedinjenje, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 5, naznačeno time što je za upotrebu u snižavanju vrednosti glukoze u krvi.
10. 10. Jedinjenje, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 5, naznačeno time što je za upotrebu u tretmanu hiperglikemije.
11. 11. Jedinjenje, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, za upotrebu u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 7 do 10, naznačeno time što se jedinjenje primenjuje oralno. Izdaje i štampa: Zavod za intelektualnu svojinu, Beograd, Kneginje Ljubice 5