RS65182B1 - Sastavi, kompleti i postupci za induciranje stečene citorezistencije korišćenjem induktora proteina stresa - Google Patents

Description

Opis

Oblast obelodanjivanja

Predmetno otkriće obezbeđuje sastave i komplete za upotrebu u postupcima za zaštitu organa izazivanjem stečene citoresistencije bez izazivanja povrede organa.

Pozadina obelodanjivanja

Povreda telesnog organa može izazvati zaštitne reakcije organa tako da je u stanju da se bolje zaštiti ako se štetni događaji (tj. inzulti) nastave ili ponovo pojave. Na primer, napad povrede bubrega može izazvati zaštitne reakcije koje, nakon 18 sati kašnjenja, štite bubreg od kasnijih, težih oblika oštećenja bubrega. Ova zaštita može trajati duži vremenski period (od dana do nedelja). Ovaj zaštitni fenomen je poznat u tehnici kao „ishemijsko predkondicioniranje“ ili

„stečena citorezistencija“.

Jedna misao je bila da se koristi fenomen stečene citorezistencije za preventivnu zaštitu organa, posebno kada je poznati inzult neizbežan. Na primer, fenomen bi mogao biti izazvan da se organi zaštite pre inzulta, kao što je izlaganje operaciji, kardiopulmonalni bajpas ili davanje toksičnosti radiokontrasta. Međutim, ovaj pristup nije uveden u kliničku upotrebu, jer nije postojao mehanizam da se indukuje stečena citorezistencija na kontrolisan način bez izazivanja neprihvatljive povrede organa koji treba da se zaštiti.

CN 103355 655 opisuje farmaceutski sastav sa funkcijom poboljšanja alimentarne anemije i postupak pripreme sastava.

E. A. JANKOWSKI ET AL: „Iron deficiency and heart failure: diagnostic dilemmas and therapeutic perspectives“, EUROPEAN HEART JOURNAL, tom 34, br. 11, 25. oktobar 2021., strane 816-829, otkriva nedostatak železa koji predstavlja čest prateći morbiditet kod pacijenata sa srčanom insuficijencijom.

US 2006/166360 otkriva postupak za smanjenje intracelularnog materijala za skladištenje lipida ćelije, tkiva ili organa za transplantaciju i sadrži rastvore.

US 2004/258745 otkriva farmaceutski sastav koji sadrži veštački nosač kiseonika, koji ima visoku efikasnost nošenja kiseonika; potreban koloidni osmotski pritisak, odgovarajući kristaloidni osmotski pritisak, pH i balans elektrolita.

Sažetak obelodanjivanja

Pronalazak je definisan patentnim zahtevima koji navode:

1. Komplet za upotrebu u postupku zaštite organa ljudskog pacijenta od povrede na osnovu zakazanog inzulta koji sadrži terapeutski efikasnu količinu (i) železa saharoze i (ii) jedno od Cr-protoporfirina, Sn-protoporfirina ili Zn -protoporfirin.

2. Sastav za upotrebu u postupku zaštite organa ljudskog pacijenta od povrede na osnovu zakazanog inzulta koji sadrži terapeutski efikasnu količinu (i) železa saharoze i (ii) Sn-protoporfirina.

3. Komplet ili sastav za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačeno time što se postupak sastoji od davanja kompleta ili sastava pacijentu najmanje 2 sata ili najmanje 4 sata pre nego što dođe do zakazanog inzulta, naznačeno time što je zakazani inzult operacija, hemoterapija ili toksičnost radiokontrasta.

4. Komplet ili sastav za upotrebu prema patentnom zahtevu 3, naznačeno time što je zakazani inzult toksičnost radiokontrasta.

5. Komplet ili sastav za upotrebu prema patentnom zahtevu 3, naznačeno time što je zakazani inzult hemoterapija.

6. Komplet ili sastav za upotrebu prema patentnom zahtevu 3, naznačeno time što je zakazani inzult operacija.

7. Komplet ili sastav za upotrebu prema patentnom zahtevu 6, naznačeno time što je zakazani inzult operacija transplantacije organa.

8. Komplet ili sastav za upotrebu prema patentnom zahtevu 7, naznačeno time što je organ srce, bubreg, jetra ili pluća.

Predmetno otkriće obezbeđuje sastave i komplete za upotrebu u postupcima koji dozvoljavaju indukciju stečene citorezistencije bez izazivanja povrede organa. Pošto se stečena citorezistencija može indukovati bez izazivanja povrede organa, ovaj fenomen se može koristiti u kliničkom okruženju za preventivnu zaštitu organa, posebno kada se približava poznati inzult.

Bez vezivanja teorijom, sastavi i kompleti za upotrebu u postupcima indukuju stečenu citorezistenciju pojačavanjem ekspresije zaštitnih proteina stresa. Posebna otelotvorenja indukuju stečenu citorezistenciju davanjem železa saharoze i Sn-Cr- ili Zn-protoporfirina na nivou ili pristupom, tako da železo saharoze i Sn-Cr- ili Zn-protoporfirin ne izazivaju povredu organa koji treba zaštititi.

Pristupi koji indukuju stečenu citorezistenciju bez izazivanja povrede uključuju davanje terapeutski efikasne količine železa saharoze i Sn-Crili Zn-protoporfirina.

Primer oblika železa uključuje železo saharozu. Primeri inhibitora degradacije proteina hema uključuju metalne protoporfirine. Primeri sastava uključuju depoe sa sporim oslobađanjem. Primeri puteva isporuke uključuju intravenski, subkutanu ili intramuskularnu injekciju. Primeri postupka za smanjenje toksičnosti uključuju davanje manitola, glicina i fiziološkog rastvora. Dodatni primeri, otelotvorenja i kombinacije su dati u detaljnom opisu.

Kratak opis slika

SL. 1A i 1B pokazuju ekspresiju mRNA hem oksigenaze (SL.1A) i ekspresiju proteina (SL.1B) nakon vehikule (kontrola), mioglobina (Mgb) ili mioglobina u kombinaciji sa Sn-protoporfirinom (SnPP); Mgb SnPP) primena 18 sati pre inzulta glicerolom. Ova SL. pokazuje da primena samo mioglobina indukuje reprezentativni citoprotektivni molekul hem oksigenaze 1 (HO-1), i da kombinacija HO-1 plus prolaznog inhibitora hem oksigenaze (SnPP) dramatično povećava mioglobin indukovanu HO-1 mRNA i povećanje proteina.

SL. 2 leva panela pokazuju ćelijsko oštećenje bubrega nakon akutne bubrežne insuficijencije izazvane glicerolom. S obzirom da se teška povreda vidi u odsustvu predkondicioniranja (opsežna nekroza, gore levo; teško formiranje gipsa, dole levo), prethodni tretman sa mioglobinom SnPP 18 sati pre injekcije glicerola je rezultirao u suštini normalnom histologijom bubrega (desni paneli gore i dole).

SL. 3 pokazuje da N-Mgb SnPP podiže mRNA za zaštitni protein stresa, interleukin-10 (IL-10).

SL. 4 pokazuje da N-Mgb SnPP podiže mRNA haptoglobin (levo) i nivoe proteina (desno).

SL.5 prikazuje procenu uticaja vezivanja ekvimolarnog nitrita za mioglobin Fe na ekspresiju toksičnosti mioglobina. HK-2 ćelije (proksimalna ćelijska linija tubula izvedena iz normalnog ljudskog bubrega) su inkubirane u medijumu bez seruma keratinocita ili u normalnim (kontrolnim) uslovima ili u prisustvu 10 mg/ml mioglobina konjskih skeletnih mišića ili nitritiranog mioglobina (proizveden ekvimolarnim dodatkom natrita u 10 mg/ml mioglobina). Posle 18 sati inkubacije, težina oštećenja ćelije (% smrti ćelije) procenjena je MTT testom. Mioglobin je izazvao 40% ćelijske smrti (40% smanjenje unosa MTT ćelija), u poređenju sa kontrolnim inkubiranim ćelijama. Vezivanje nitrita za mioglobin smanjilo je smrt ćelije za 75%. Dakle, vezivanje nitrita može da smanji citotoksične efekte mioglobina.

SL. 6 prikazuje odnos doza-odgovor između hem oksigenaze 1 u plazmi (HO-1) i primenjene doze N-mioglobina. Normalnim miševima je ubrizgano intramuskularno (IM) 0, 1, 2 ili 5 mg/kg nitritovanog mioglobina SnPP (konstantna doza od 1 µmola). Osamnaest sati kasnije, nivoi HO-1 u plazmi su procenjeni pomoću ELISA. Primećen je oštar odnos doza-odgovor između primenjene doze N-mioglobina i nivoa HO-1 u plazmi. Dakle, HO-1 test ima potencijalnu biomarkersku korisnost za indukciju HO-1 izazvane N-Mgb/SnPP.

SL. 7 pokazuje održavanje normalnih nivoa kreatinina u serumu preko 25-struke varijacije u dozi N-mioglobina. Miševi su podvrgnuti supkutanoj infuziji u trajanju od 2 sata od 1, 3, 6, 12 ili 25 mg/kg nitritovanog mioglobina (sa držanjem SnPP u konstantnoj dozi od 1 µmola). Osamnaest sati kasnije, potencijalno oštećenje bubrega je procenjeno merenjem serumskih koncentracija kreatinina.

Nije primećeno značajno povećanje ni pri jednoj od doza N-Mgb, što ukazuje na nedostatak prekomerne toksičnosti (n, 2-4 miša/grupi).

SL. 8 prikazuje histologiju bubrega 18 sati nakon primene N-Mgb-SnPP. Gornja 2 panela su PAS obojeni delovi bubrega kontrolnog miša (C) i miša 18 sati nakon tretmana N-Mgb-SnPP (Rx). Tubularni epitel tretiranih miševa održava normalan histološki izgled sa potpuno netaknutom ivicom četkice (tamno bojenje luminalne membrane). Donja 2 panela prikazuju delove obojene hematoksilinom i eozinom. Nikakva histološka povreda nije očigledna pri prethodnom tretmanu N-Mgb-SnPP.

SL. 9 prikazuje sinergističku indukciju HO-1 sa N-Mgb-SnPP tretmanom normalnih miševa. Levi panel prikazuje nivoe HO-1 mRNA 4 sata nakon tretmana. Dok su sam N-Mgb i sam SnPP indukovali skromno povećanje mRNK, 20-struko povećanje HO-1 mRNA se primećuje sa kombinovanom primenom agensa. 18 sati nakon primene, primećeno je sinergističko povećanje proteina HO-1 (P vrednosti u odnosu na kontrolu). GAPDH, gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaza; HO-1, hem oksigenaza 1; mRNA, informaciona RNA; N-Mgb, nitritovani mioglobin; SnPP, kalajni protoporfirin.

SL. 10 prikazuje sinergističku indukciju IL-10 sa N-Mgb-SnPP tretmanom normalnih miševa. Levi panel prikazuje nivoe IL-10 mRNA 4 sata nakon tretmana. Sam N-Mgb i samo SnPP izazvali su ili minimalno ili nikakvo povećanje IL-10 mRNA. Međutim, sa kombinovanom administracijom, primećeno je 10-struko povećanje IL-10 mRNA. Kao što je prikazano na desnom panelu, samo kombinovani tretman indukovanog IL-10 proteina se povećava kao što je procenjeno u vremenskoj tački od 18 sati (P vrednosti u odnosu na kontrole).

SL.11 prikazuje mRNA haptoglobina i ekspresiju proteina nakon primene N-Mgb-SnPP normalnim miševima. Kombinovani N-Mgb 1 SnPP je izazvao daleko veće povećanje mRNA haptoglobina 4 sata nakon injekcije nego što je to učinio bilo koji agens sam. Međutim, do 18 sati nakon primene agensa, sam N-Mgb i N-Mgb SnPP indukovali su uporedivi porast proteina haptoglobina. Ovo sugeriše da je N-Mgb odgovoran za povećanje haptoglobina koje je proizvedeno kombinovanom administracijom N-Mgb SnPP. (P vrednosti u odnosu na kontrole).

SL. 12 pokazuje stepene zaštite izazvane testnim agensima u modelu glicerola AKI izazvanog rabdomiolizom. Kontrolni miševi (C) su razvili obeleženi AKI kao što je označeno koncentracijama BUN i kreatinina. SnPP nije pružio značajnu zaštitu, dok je N-Mgb indukovao skroman zaštitni efekat. Suprotno tome, kombinovana primena N-Mgb-SnPP dala je potpunu funkcionalnu zaštitu koja se meri normalnim nivoima BUN i kreatinina 18 sati nakon primene glicerola (normalni nivoi su prikazani čvrstom horizontalnom linijom).

SL. 13 prikazuje kombinovani tretman N-Mgb 1 SnPP (Rx) koji daje značajnu zaštitu od maleatnog modela AKI. Injekcija maleata izazvala je značajno povećanje BUN-a i kreatinina. Tretman (Rx) je dao skoro potpuni zaštitni efekat (horizontalne linije predstavljaju normalne koncentracije BUN i kreatinina). P vrednost u odnosu na bez tretmana (bez Rx).

SL. 14 pokazuje da je kardiotoksičnost izazvana maleatom smanjena prethodnim tretmanom sa N-Mgb SnPP. Miševi su tretirani sa 1 mg/Kg N-mioglobina 1 µmol SnPP ili IV injekcijom vehikule). Osamnaest sati kasnije, 800 mg/Kg maleata je dato IP. Stepen povrede miokarda određen je 18 sati nakon injekcije maleata merenjem koncentracije troponina I u plazmi (ELISA testom). Injekcija maleata izazvala je 10 puta povećanje nivoa troponina u plazmi.

Prethodni tretman sa N-Mgb+SnPP smanjio je povećanje troponina indukovanog maleatom za 75%.

SL. 15 prikazuje tretman N-Mgb SnPP (Rx) koji daje zaštitu od progresivne bolesti bubrega izazvane jednostranom ishemijom-reperfuzijom (I/R). Miševi su bili podvrgnuti 30-minutnoj ishemiji levog bubrega sa ili bez prethodnog tretmana N-Mgb-SnPP 18 sati ranije. U 2 nedelje nakon postishemije, I/R je doveo do smanjenja bubrežne mase za 38% (izmereno težinom bubrega). Predtretman (Rx) je pružio značajnu zaštitu koja se meri smanjenjem bubrežne mase od samo 12%. Zaštita je takođe implicirana značajnim smanjenjem NGAL mRNA i nivoa proteina u 2-nedeljnom postishemičnom levom bubrezima.

SL.16 prikazuje odnos doza-odgovor između povećanja doze N-Mgb (sa fiksnom dozom SnPP, 1 umol) i nivoa proteina HO-1/haptoglobina u korteksu bubrega i plazmi. Povećane doze N-Mgb, primenjene intraperitonealno, dovele su do povećanja nivoa svakog proteina u plazmi i bubrežnom korteksu. Koeficijenti korelacije za koncentracije u plazmi u odnosu na bubrežne koncentracije bili su 0,57 i 0,82 za HO-1 i haptoglobin, respektivno. Korelacije između primenjene doze i nivoa proteina u plazmi bile su r = 0,85 i r = 0,75 za HO-1 i haptoglobin, respektivno.

SL. 17 prikazuje odnos doza-odgovor između primenjene IP doze N-Mgb u odnosu na koncentracije BUN/kreatinina 18 sati nakon primene glicerola. Povećanje doze N-Mgb (sa fiksnom dozom SnPP; 1 umol) je dovelo do povećanja stepena zaštite od AKI izazvanog glicerolom. Kada se analizira sa rezultatima datim na SL.16, očigledne su jake direktne veze između koncentracija HO-1/haptoglobina u plazmi i kortikalne kore bubrega i stepena zaštite od AKI izazvanog glicerolom. Horizontalne linije pokazuju normalne koncentracije BUN i kreatinina. Kao što je prikazano na desnom panelu, bubrezi su dobro tolerisali primenjene doze, što je dokazano održavanjem normalnih 18-časovnih koncentracija kreatinina u plazmi u ispitivanom opsegu doziranja.

SL. 18 prikazuje povećanje ekspresije gena HO-1, haptoglobina (hapto) i IL-10 u jetri i srcu kombinovanim tretmanom N-Mgb/SnPP. Prikazani su stepeni povećanja sa tretmanom, izraženi kao višestruko povećanje u odnosu na kontrolne vrednosti. Svaki je povećan u jetri (dva gornja panela) i srcu (dva donja panela). Pojedinačne vrednosti su date u tabelama 9 i 10.

SL. 19 prikazuje da predkondicioniranje sa N-Mgb-SnPP ublažava postishemične povrede jetre i hepatotoksične povrede. Stepeni hepatične ishemijsko-reperfuzione (I/R) povrede su procenjeni na osnovu nivoa laktat dehidrogenaze u plazmi (LDH) i alanin aminotransferaze (ALT). Predtretman sa N-Mgb-SnPP značajno je smanjio koncentracije i LDH i ALT (levi i srednji panel). Takođe je smanjio stepen hepatotoksične povrede izazvane intraperitonealnom injekcijom glicerola (desni panel).

SL. 20 prikazuje grubi izgled preseka jetre dobijenih posle 18-časovne postishemije bez (gore) i sa (dole) prethodnog tretmana N-Mgb-SnPP. Ishemija jetre je izazvala opsežnu nekrozu o čemu svedoči beličasto-sivi izgled jetre (gore). Međutim, sa prethodnim tretmanom N-Mgb-SnPP, jetra je zadržala skoro normalan izgled (dole).

SL. 21 pokazuje da vitamin B12 i Fe saharoza izazivaju značajno povećanje proteina HO-1 u roku od 4 sata i opstaju 18 sati od njihove IV injekcije.

SL. 22 pokazuje da je injekcija maleata izazvala teški AKI, što je označeno izraženim porastom BUN i PCr u odnosu na kontrole ubrizgane maleat (C). Ni sam SnPP ni sam FeS nisu značajno promenili težinu povrede bubrega. Međutim, kombinovani FeS SnPP je pružio izraženu zaštitu, što je označeno smanjenjem koncentracije BUN/PCr od 75% (horizontalne linije predstavljaju srednje vrednosti nivoa BUN/PCr kod normalnih miševa).

SL. 23 pokazuje da je u roku od 18 sati od izazivanja IRI došlo do 4-strukog povećanja koncentracija BUN i PCr. Prethodni tretman sa FeS SNPP pružio je značajnu zaštitu, snižavajući nivoe BUN i PCr za 50%. Horizontalne linije predstavljaju srednje nivoe BUN/PCr kod normalnih miševa.

SL. 24 pokazuje da je injekcija maleata izazvala teški AKI. Prethodni tretman sa FeS B12 je značajno ublažio ovu povredu, što je označeno smanjenjem BUN/PCr. Horizontalne linije predstavljaju srednje nivoe BUN/PCr kod normalnih miševa.

SL. 25 prikazuje tešku bubrežnu insuficijenciju koja je nastala u roku od 18 sati od injekcije glicerola. Prethodni tretman sa FeS B12 pružio je značajnu funkcionalnu zaštitu, što je označeno značajnim smanjenjem i 18-časovnih koncentracija BUN i PCr. Horizontalne linije predstavljaju srednje nivoe BUN/PCr kod normalnih miševa.

SL. 26 pokazuje označeno i značajno povećanje HO-1 mRNA, kao što je procenjeno 4 sata nakon injekcije. Do 18 sati, nivoi HO-1 mRNA su se vratili na normalne vrednosti.

SL. 27 pokazuje da je povećanje mRNA za 4 sata povezano sa značajnim povećanjem nivoa proteina HO-1. Ovi nivoi su ostali povišeni u vremenskoj tački od 18 sati, posebno u slučaju primene FeS.

Detaljni opis

Povreda telesnog organa može izazvati zaštitne reakcije organa tako da je u stanju da se bolje zaštiti ako se štetni događaji (tj. inzulti) nastave ili ponovo pojave. Ovaj zaštitni fenomen je poznat u tehnici kao „ishemijsko predkondicioniranje“ ili „stečena citorezistencija“.

Jedna misao je bila da se koristi fenomen stečene citorezistencije za preventivnu zaštitu organa, posebno kada je poznati inzult neizbežan. Na primer, fenomen bi mogao biti indukovan radi zaštite organa pre inzulta, kao što je izlaganje operaciji, balon angioplastika, indukovana srčana ili cerebralna ishemijsko-reperfuziona povreda ili toksičnost radiokontrastom. Alternativno ili dodatno, fenomen se može indukovati kod donatora organa (npr. bubrega, jetre) da bi se sprečila ili smanjila povreda skladištenja na hladnom i/ili reimplantaciona ishemijsko-reperfuziona povreda. Međutim, ovi pristupi nisu primenjeni u kliničku upotrebu, jer do sadašnjeg obelodanjivanja nije postojao mehanizam za uspešno indukovanje stečene citorezistencije na kontrolisan način bez izazivanja povrede organa koji sam treba da bude zaštićen.

Predmetno otkriće obezbeđuje sastave i komplete za upotrebu u postupcima koje dozvoljavaju indukciju stečene citorezistencije bez povrede organa koji treba da se zaštiti. Pošto se stečena citorezistencija može indukovati bez izazivanja povrede organa, ovaj fenomen se može koristiti u kliničkom okruženju za preventivnu zaštitu organa, posebno kada se približava poznati inzult.

Bez vezivanja teorijom, sastavi i kompleti za upotrebu u postupcima indukuju stečenu citorezistenciju pojačavanjem ekspresije zaštitnih proteina stresa. Stečena citorezistencija se može indukovati primenom železa saharoze i Sn-Cr- ili Zn-protoporfirina na nivou ili pristupom da železo saharoze i Sn-Cr- ili Zn-protoporfirin ne izazivaju povredu organa koje treba zaštititi. Indukcija stečene citorezistencije se takođe može postići davanjem jedinjenja koja pojačavaju regulaciju stresnih proteina kroz iste ili slične biološke puteve koje koriste proteini hema. Takva jedinjenja uključuju, na primer, železo i povezane metabolite.

„Inzult“ je pojava koja će verovatno izazvati povredu organa. Primeri inzulta uključuju šok (nizak krvni pritisak), hipoperfuziju bubrega, hiruršku

1

intervenciju, indukovanu srčanu ili cerebralnu ishemijsku reperfuziju, kardiopulmonalni bajpas, balon angioplastiku, davanje radiokontrastne toksičnosti, hemoterapiju, davanje lekova, davanje nefrotoksičnih lekova, traumu tupim udarcem, ubod, punkciju, otrov, pušenje itd.

„Povreda“ je štetan efekat na organ koji se vidi kao smrt ćelije unutar organa, oštećenje ćelije unutar organa, oštećena struktura unutar organa i/ili smanjena funkcija organa u poređenju sa jednom ili više relevantnih kontrolnih grupa, stanja ili referentnih nivoa.

„Odsustvo povrede“ organa, „bez nanošenja povrede“ organa, „ne povređuje organ“ i slične fraze znače da je svaki efekat na organ, u okviru zdrave medicinske procene, srazmeran razumnom odnosu korist/rizik administracije. Odsustvo povrede može se demonstrirati pokazivanjem da funkcija organa nije statistički značajno različita od relevantne kontrolne grupe, stanja ili referentnog nivoa prema poznatom testu funkcije organa u to vreme korišćenjem odgovarajućih statističkih poređenja. Primeri ispitivanja funkcije organa uključuju merenje markera povezanih sa funkcijom organa; merenje izlaza organa; i merenje metrike performansi organa u poređenju sa jednom ili više relevantnih kontrolnih grupa, stanja ili referentnih nivoa.

Indukcijom stečene citorezistencije, sastavi i kompleti za upotrebu u postupcima koji su ovde otkriveni štite organe od povreda, kao što je povreda izazvana inzultom. „Zaštita organa od povrede“ i slične fraze uključuju jednu ili više od sledećeg: povećanje ekspresije zaštitnih proteina stresa; očuvanje funkcije organa u celini ili delimično (npr. merenje izlaza organa; merenje metrike performansi organa); smanjenje oštećenja ćelija organa (u određenim otelotvorenjima, što se manifestuje smanjenim curenjem intracelularnih proteina u cirkulaciju) i smanjenje ćelijske smrti unutar organa u poređenju sa jednom ili više relevantnih kontrolnih grupa, stanja ili referentnih nivoa.

Brojni testovi koji se mogu koristiti za procenu prisustva ili odsustva povrede i povezane zaštite mogu se koristiti u životinjskim i ljudskim modelima funkcije organa. Nedostatak povrede i/ili zaštite organa može se potvrditi upoređivanjem relevantne mere subjekta sa referentnim nivoom. Referentni nivoi mogu uključivati „normalne“ ili „kontrolne“ nivoe ili vrednosti, definisane prema, na primer, granicama diskriminacije ili pragovima koji definišu rizik, kako bi se definisale granične tačke i/ili abnormalne vrednosti za funkciju organa. Referentni nivo može biti nivo indicija koji se tipično nalazi kod subjekta koji ne pati od povrede organa. Drugi termini za „referentne nivoe“ obuhvataju „indeks“, „osnovnu liniju“, „standard“,

„zdravo“, „pre povrede“ itd. Takvi normalni nivoi mogu da variraju u zavisnosti od toga da li se pokazatelj koristi sam ili u formuli u kombinaciji sa drugim indicijama da bi se dobio rezultat. Alternativno, referentni nivo se može izvesti iz baze podataka rezultata prethodno testiranih subjekata koji nisu razvili povredu organa tokom klinički relevantnog vremenskog perioda. Referentni nivoi se takođe mogu izvesti iz, na primer, kontrolnog subjekta ili populacije čiji je status povrede organa poznat.

Referentni nivo može biti izveden od jednog ili više subjekata koji su bili izloženi tretmanu zbog povrede organa, ili od subjekata koji su pokazali poboljšanja u funkciji organa nakon povrede kao rezultat izlaganja tretmanu. Referentni nivo se može izvesti od jednog ili više subjekata sa povredom organa koji nisu bili izloženi lečenju. Referentni nivo se takođe može izvesti iz algoritama ozbiljnosti povreda ili izračunatih indeksa iz populacionih studija.

„Referentni nivo“ se može odnositi na standardizovanu vrednost za funkciju organa koja predstavlja nivo koji nije povezan ni sa kakvom povredom; nivo povezan sa određenom vrstom povrede; nivo povezan sa ozbiljnošću povrede; ili nivo povezan sa određenim subjektom u vreme dijagnoze, na početku lečenja ili u vremenskoj tački tokom lečenja. Referentni nivo može biti univerzalni referentni nivo koji je koristan na različitim lokacijama za testiranje ili može biti referentni nivo specifičan za lokaciju testiranja i specifičan test koji se koristi za merenje funkcije organa. Referentni nivo se izvodi iz (i) pojedinca koji nema povredu organa ili povredu organa određene vrste; ili (ii) grupa pojedinaca koji nemaju povredu organa ili povredu organa određene vrste. Referentni nivoi za subjekta takođe mogu biti povezani sa vremenskim tačkama subjekta koji je podvrgnut tretmanima da bi se pratila prirodna progresija ili regresija povrede organa kod subjekta.

R nivoi se mogu izvesti iz „skupa podataka“. Skup podataka predstavlja skup numeričkih vrednosti koje su rezultat evaluacije uzorka (ili populacije uzoraka) pod željenim uslovima. Vrednosti skupa podataka se mogu dobiti, na primer, eksperimentalnim dobijanjem mera iz uzorka i konstruisanjem skupa podataka iz ovih merenja; ili alternativno, dobijanjem skupa podataka od dobavljača usluga kao što je laboratorija, ili iz baze podataka ili servera na kome je skup podataka uskladišten.

Pojačana regulacija zaštitnih proteina stresa. Bez vezivanja teorijom, pojačana regulacija brojnih stresnih proteina dovodi do indukcije stečene citorezistencije. „Pojačana regulacija“ uključuje povećanje ekspresije gena ili molekula nukleinske kiseline od interesa ili aktivnosti proteina, npr. povećanje ekspresije gena ili aktivnosti proteina u poređenju sa ekspresijom ili aktivnošću u inače identičnom ili uporedivom genu ili protein koji nije pojačan.

Pojačana regulacija sledećih primernih proteina stresa može dovesti do indukcije stečene citorezistencije: hem oksigenaza (HO), haptoglobin, hemopeksin, hepcidin, alfa-1 antitripsin (AAT), interleukin-10 (IL-10), toplotni šok proteini, lipokalin povezan sa neutrofilnom želatinazom (NGAL) i HMG CoA reduktaza.

Hem oksigenaza (HO) je enzim koji ograničava brzinu u katabolizmu hema. Postoje tri različita HO izozima: HO-1 (npr. SEQ ID NO: 1), HO-2 (izoforma A; npr. SEQ ID NO: 2; izoforma B; npr. SEQ ID NO.3; izoforma C; npr. SEQ ID NO: 4) i HO-3 (npr. SEQ ID NO: 5). HO-1 je izozim čija se ekspresija pojačano reguliše nakon različitih oblika stresa tkiva, kao što su izazvani hem proteinima, teškim metalima, hipoksijom i različitim putevima osetljivim na redoks. Nasuprot tome, HO-2 je izozim koji se izražava konstitutivno. HO-3 je nedavno identifikovani izozim čije funkcije su trenutno nepoznate.

Haptoglobin (npr. SEQ ID NO: 6) je protein krvne plazme sa molekulskom težinom od 86.000 do 400.000 i igra važnu ulogu u metabolizmu hemoglobina koji se oslobađa u krvotok. Kada se prekomerno oslobađa u krvi, hemoglobin se izlučuje u urinu kroz bubrežne tubule, što dovodi ne samo do gubitka železa već i do poremećaja bubrežnih tubula. Pošto se haptoglobin selektivno i čvrsto vezuje za hemoglobin in vivo i na taj način formira kompleks hemoglobin-haptoglobin, ima važne funkcije u obnavljanju železa i u prevenciji bubrežnih poremećaja.

Hemopeksin (Hpx; na primer, SEQ ID NO:7) je protein od 60 kDa koji je prisutan u plazmi u velikim količinama, a drugi iza albumina, imunoglobulina i

1

proteaza plazme. Hemopeksin se često naziva i beta-1B-glikoprotein. Hemopeksin ima visok afinitet prema hemu (KD<10<-12>M), i veruje se da je biološka uloga Hpk povezana sa transportom hema, čime se sprečava oksidativna oštećenja izazvana hemom i gubitak železa vezanog za hem. Hemopeksin izdvaja oslobađajući hem iz plazme što izaziva strukturnu promenu, pri čemu kompleks hem-Hpx dobija povećan afinitet prema receptorima u jetri, gde je zahvaćen endocitozom posredovanom receptorom i hem se oslobađa pri niskom pH u endosomima.

Nakon toga, Hpx se vraća u promet i može da prođe dalje runde transporta.

Hemopeksin je presavijen u dva homologna domena, svaki od 200 aminokiselina, spojenih veznikom od 20 aminokiselinskih taloga. Postoji 25% identičnosti sekvence između dva domena. Dva histidina koordiniraju hem železo, odnosno His213 iz povezivača peptida i His270 iz petlje C-terminalnog domena, dajući stabilan bis-histidil Fe(III) kompleks. Numeracija je u odnosu na zreli protein. Clin. Chim. Acta, 312, 2001, 13-23 i DNA Cell Biol., 21, 2002, 297-304 daju preglede hemije Hpx.

Hepcidin (prepropeptid; npr. SEQ ID NO: 8) je ključni signal koji reguliše homeostazu železa (Philpott, Hepatologi 35:993 (2002); Nicolas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:4396 (2002)). Visok nivo humanog hepcidina dovodi do smanjenja nivoa železa, i obrnuto. Mutacije u genu hepcidina koje rezultiraju nedostatkom aktivnosti hepcidina povezane su sa juvenilnom hemohromatozom, teškom bolešću preopterećenja železom (Roetto et al., Nat. Genet., 33:21-22, 2003). Studije na miševima su pokazale ulogu hepcidina u kontroli normalne homeostaze železa (Nicolas et al., Nat. Genet., 34:97-101, 2003); Nicolas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99:4596-4601, 2002; Nicolas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98:8780-8785, 2001).

Pored toga, prikupljaju se podaci koji impliciraju hepcidin u sekvestraciji železa tokom upale (vidi npr. Veinstein et al., Blood, 100:3776-36781,

2002; Kemna et al., Blood, 106:1864-1866, 2005; Nicolas et al., J. Clin. Invest., 110:1037-1044, 2002; Nemeth et al., J. Clin. Invest., 113:1271-1276,

2004; Nemeth et al., Blood, 101:2461-2463, 2003 i Rivera et al., Blood, 105:1797-1802, 2005). Primećeno je da je ekspresija gena za hepcidin snažno pojačana posle upalnih stimulusa, kao što su infekcije, koje izazivaju odgovor akutne faze urođenog imunog sistema kičmenjaka. Pokazalo se da je kod miševa ekspresija gena za hepcidin pojačano regulisana lipopolisaharidom (LPS), terpentinom, Frojndovim kompletnim adjuvansom i adenovirusnim infekcijama. Ekspresiju hepcidina indukuje inflamatorni citokin IL-6. Snažna korelacija između ekspresije hepcidina i anemije upale takođe je pronađena kod pacijenata sa hroničnim inflamatornim oboljenjima, uključujući bakterijske, gljivične i virusne infekcije.

Humani hepcidin, peptid od 25 aminokiselina (npr. SEQ ID NO: 9) sa antimikrobnom aktivnošću i aktivnošću koja reguliše železo, otkriven je nezavisno od strane dve grupe koje su istraživale nove antimikrobne peptide. (Krause et al., FEBS Lett.480:147 (2000); Park et al., J. Biol. Chem.276:7806 (2001)). Takođe se naziva LEAP-1 (antimikrobni peptid izražen u jetri). cDNA hepcidina koja kodira pre-propeptid od 83 aminokiseline kod miševa i pre-propeptid od 84 aminokiseline kod pacova i ljudi su naknadno identifikovani u potrazi za genima specifičnim za jetru koji su regulisani železom (Pigeon et al., J. Biol. Chem.276:7811 (2001)). Signalni peptid od 24 taloga N-terminalnog signala se prvo cepa da bi se proizveo pro-hepcidin, koji se zatim dalje obrađuje da bi se proizveo zreli hepcidin, koji se nalazi i u krvi i u urinu. U ljudskom urinu, preovlađujući oblik sadrži 25 aminokiselina, iako su prisutni i kraći peptidi od 22 i 20 aminokiselina.

Zreli peptid je značajan po tome što sadrži osam cisteinskih taloga povezanih kao četiri disulfidna mosta. Strukturu hepcidina proučavali su Hunter et al., J. Biol. Chem., 277:37597-37603 (2002), NMR korišćenjem hemijski sintetizovanog hepcidina sa identičnim HPLC vremenom zadržavanja kao i prirodni hepcidin prečišćen iz urina. Hunter et al. prijavili su svoju odluku da se hepcidin presavio u strukturu petlje za ukosnicu koja sadrži vicinalnu disulfidnu vezu (C1-C8, C2-C7, C3-C6, C4-C5).

Alfa-1 antitripsin (AAT; npr. SEQ ID NO: 10) je glikoprotein koji luči hepatociti i normalno je prisutan u serumu i u većini tkiva u visokim koncentracijama, gde deluje kao inhibitor serinskih proteaza. Inhibicija proteaze pomoću AAT je suštinska komponenta regulacije proteolize tkiva, a nedostatak AAT je impliciran u patologiji nekoliko bolesti. Osim svoje aktivnosti kao antiproteaze, AAT bi mogao imati važnu antiinflamatornu biološku funkciju jer ima izvanredan inhibitorni kapacitet u

1

pogledu mnogih medijatora zapaljenja i u pogledu oksidativnih radikala (Brantli M. Am J Respir Cell Mol. Biol., 2002; 27: 652-654).

Interleukin-10 (IL-10; npr. SEQ ID NO.11) je pleiotropni citokin koji proizvodi nekoliko tipova ćelija kao što su makrofagi, monociti, Th2 tip i regulatorne T-ćelije i B-ćelije. IL-10 je citokin sa imunosupresivnim i antiinflamatornim svojstvima; reguliše brojne ćelijske mijeloične i limfoidne aktivnosti i direktno inhibira proizvodnju nekoliko inflamatornih citokina od strane T-ćelija i ćelija prirodnog ubice (NK). IL-10 je poznat kao faktor proliferacije B-ćelija i aktivan je u autoimunosti, proizvodnji antitela, tumorigenezi i toleranciji na transplantaciju. Eur. J. Immunogenet.1997 24(I): 1-8. IL-10 takođe menja odgovor makrofaga na infekciju, ali stimuliše Fc receptore na istim ćelijama. Annals Allergi Asthma Immunol.1997 79:469-483; J. Immunol.1993151: 1224-1234; i J.

Immunol. 1992 149:4048-4052.

Prvobitno je primećeno da se proteini toplotnog šoka eksprimiraju u povećanim količinama u ćelijama sisara koje su bile izložene naglim povišenjima temperature, dok je ekspresija većine ćelijskih proteina značajno smanjena. Od tada je utvrđeno da se takvi proteini proizvode kao odgovor na različite vrste stresa, uključujući deprivaciju glukoze.

Proteini toplotnog šoka imaju sposobnost da vežu druge proteine u njihovim ne-nativnim stanjima, a posebno da vezuju peptide u nastajanju koji izlaze iz ribozoma ili ekstrudirani u endoplazmatski retikulum. Hendrik i Hartl., Ann. Rev. Biochem.62:349-384 (1993); Hartl., Nature 381:571-580 (1996). Dalje, pokazalo se da proteini toplotnog šoka igraju važnu ulogu u pravilnom savijanju i sklapanju proteina u citosolu, endoplazmatskom retikulumu i mitohondrijama; s obzirom na ovu funkciju, oni se nazivaju „molekularnim pratiocima“. Fridman et al., Nature 370: 111-117 (1994); Hendrik i Hartl., Ann. Rev. Biochem.62:349-384 (1993); Hartl, Nature 381:571-580 (1996).

Primeri proteina toplotnog šoka uključuju BiP (koji se takođe naziva grp78 (npr. SEQ ID NO: 12)), hsp/hsc70 (npr. SEQ ID NO: 13), gp96 (grp94) (npr. SEQ ID NO: 14) , hsp60 (npr. SEQ ID NO: 15), hsp40 (npr. SEQ ID NO: 16),

1

hsp70/72 (npr. SEQ ID NO: 17) i hsp90 (izoforma 1; npr. SEQ ID NO: 18; izoforma 2; npr. SEQ ID NO.19).

Lipokalini su porodica ekstracelularnih proteina koji vezuju ligand koji se nalazi u različitim organizmima od bakterija do ljudi. Lipokalini imaju mnogo različitih funkcija, kao što su vezivanje i transport malih hidrofobnih molekula, transport hranljivih materija, regulacija rasta ćelija, modulacija imunološkog odgovora, zapaljenje i sinteza prostaglandina.

Lipokalin povezan sa neutrofilnom želatinazom (NGAL; npr. SEQ ID NO: 20), koji je takođe poznat kao humani neutrofil lipokalin (HNL), protein koji vezuje N-formil peptid i protein povezan sa α2-mikroglobulinom od 25 kDa, je protein od 24 kDa, koji može postojati kao monomer , homodimer ili heterodimer sa proteinima, kao što je želatinaza B ili matriks metaloproteinaza-9 (MMP-9). Identifikovan je i trimerni oblik NGAL. NGAL se luči iz specifičnih granula aktiviranih humanih neutrofila. Homologni proteini su identifikovani kod miša (24p3/uterocalin) i pacova (protein povezan sa α2-mikroglobulinom/lipokolin povezan sa neu). Strukturni podaci su potvrdili da NGAL ima osmolančanu β-barel strukturu, što je karakteristično za lipokaline; međutim, NGAL ima neobično veliku šupljinu obloženu sa više polarnih i pozitivno naelektrisanih aminokiselinskih taloga nego što se normalno vidi u lipokalinima. Veruje se da NGAL vezuje male lipofilne supstance, kao što su lipopolisaharidi dobijeni od bakterija i formil peptidi, i može da funkcioniše kao modulator upale.

NGAL je rani marker za akutnu bubrežnu povredu ili bolest. Pored toga što ga luče specifične granule aktiviranih humanih neutrofila, NGAL takođe proizvode nefroni kao odgovor na oštećenje tubularnog epitela i marker je tubulointersticijalne (Tl) povrede. Nivoi NGAL rastu kod akutne tubularne nekroze (ATN) zbog ishemije ili nefrotoksičnosti, čak i nakon blage „subkliničke“ ishemije bubrega. Štaviše, poznato je da se NGAL eksprimira u bubrezima u slučajevima hronične bolesti bubrega (CKD) i akutne povrede bubrega ((AKI); vidi npr., Devarajan et al., Amer. J. Kidney Diseases 52(3); 395-399 (septembar 2008); i Bolignano et al., Amer. J. Kidney Diseases 52(3): 595-605 (septembar 2008)). Povišeni nivoi NGAL u urinu su predloženi kao prediktivni pokazatelji progresivne bubrežne insuficijencije. Ranije je pokazano da je NGAL izrazito izražen u

1

bubrežnim tubulima vrlo rano nakon ishemijske ili nefrotoksične povrede i na životinjskim i na ljudskim modelima. NGAL se brzo izlučuje u urinu, gde se lako može otkriti i izmeriti. NGAL je otporan na proteaze, što sugeriše da se može naći u urinu kao veran marker ekspresije NGAL u tubulima bubrega.

Enzim HMG-CoA reduktaza igra centralnu ulogu u proizvodnji holesterola i drugih izoprenoida u jetri i drugim tkivima putem mevalonatnog puta. Konverzija 3-hidroksi-3-metilglutaril-koenzima A (HMG-CoA) u mevalonat je katalizovana HMG-CoA reduktazom i predstavlja rani korak koji ograničava brzinu u biosintetičkom putu holesterola u jetri i drugim tkivima. Stresom izazvana povećanja HMG CoA reduktaze posreduju u sintezi holesterola što dovodi do povećanja holesterola u plazma membrani.

Ekspresija zaštitnih proteina stresa je pojačana primenom hem proteina. Hem proteini su metaloproteini koji sadrže hem prostetičku grupu (protoporfirinski prsten sa centralnim Fe; protoporfirinski prsten uključuje četiri pirolna prstena povezana metinskim mostovima. Četiri metilna, dva vinilna i dva propionatna bočna lanca takođe mogu biti pričvršćena). Hem proteini mogu biti hem proteini male molekularne težine. „Hem proteini male molekularne težine“ uključuju one sa molekularnom težinom od 25 kDa ili manje; 24 KDa ili manje; 23 kDa ili manje; 22 kDa ili manje; 21 kDa ili manje; 20 kDa ili manje; 19 kDa ili manje; 18 kDa ili manje; 17 kDa ili manje; 16 kDa ili manje; 15 kDa ili manje; 14 kDa ili manje; 13 kDa ili manje; 12 kDa ili manje; 11 kDa ili manje; ili 10 kDa ili manje. Hem proteini se mogu brzo ukloniti kada se daju intravenozno. „Brzo uklanjanje“ označava stopu izlučivanja urina koja ima stopu klirensa urina >50% serumskog kreatinina ili uree. Hem proteini mogu biti hem proteini male molekularne težine koji se brzo uklanjaju kada se daju intravenozno. Mioglobin (npr. SEQ ID NO: 21) je jedan hem protein koji se može koristiti sa sastavima i kompletima za upotrebu u postupcima koji su ovde otkriveni. Reference na hem proteine uključuju modifikovane hem proteine, varijante hem proteina i D-supstituisane analogne hem proteine. Reference na mioglobin uključuju modifikovani mioglobin, varijantni mioglobin i D-supstituisani analogni mioglobin. Mioglobin je prisutan u prugastom mišićnom tkivu i funkcioniše za skladištenje i isporuku kiseonika reverzibilnim vezivanjem O2 na otvorenom mestu vezivanja mioglobina. Kroz ovo reverzibilno vezivanje, mioglobin stvara intracelularni izvor

1

kiseonika za ćelijske mitohondrije. Za razliku od hemoglobina, drugog hem proteina, mioglobin prirodno postoji samo kao monomer.

Kada je mišićno tkivo oštećeno, mioglobin se oslobađa u krvotok. Velike količine mioglobina u krvi mogu izazvati povredu bubrega izazivanjem suženja bubrežnih sudova, formiranjem opstruktivnih izliva u lumi bubrežnih tubula i iniciranjem intersticijalne upale, kao što je opisano u Zager, RA, Ren. Fail., 14, 341-344 (1992). Štaviše, Nath et al. navode da hem proteini, kao što je hemoglobin, kada se otpuste u ekstracelularni prostor, mogu podstaći toksičnost tkiva i da je mioglobin direktno impliciran u patogenezi bubrežne insuficijencije u rabdomiolizi. J. Clin. Invest., 1992. jul (90)1: 267-70. Shodno tome, hem proteini i posebno mioglobin mogu oštetiti bubrežni sistem.

Bilo koje jedinjenje koje blokira vezivanje hema za HO može da funkcioniše kao inhibitor degradacije hem proteina. Na primer, poznati su brojni sintetički analozi železa protoporfirina IX. Ova jedinjenja su komercijalno dostupna i/ili se mogu lako sintetizovati poznatim postupcima. Oni uključuju, na primer, platinu, cink, nikl, kobalt, bakar, srebro, mangan, hrom i kalaj protoporfirin IX. Radi praktičnosti, ova jedinjenja se mogu generalno nazvati Me-protoporfirin ili MePP, gde Me označava metal, a posebno korišćenjem hemijskog simbola za metal kao što je Cr-protoporfirin (CrPP), Sn-protoporfirin (SnPP), Zn-protoporfirin (ZnPP) za jedinjenja protoporfirina hroma, kalaja i cinka.

Neočekivano je da blokiranje delovanja HO može korisno da pomogne u indukciji stečene citorezistencije bez izazivanja povrede. Na primer, Nath et al. su pokazali da je nokautiranje gena HO-1 kod miševa pogoršalo povredu bubrega u modelu glicerola toksičnosti hem proteina. Autori su naveli da je HO-1 kritična zaštita od akutne toksičnosti izazvane hem proteinom in vivo. Sam. J. of Path., 2000. maj 156(5): 1527-1535.

Štaviše, neočekivano je da se Me-protoporfirini mogu koristiti u kombinaciji sa hem proteinom da bi se izazvala stečena citorezistencija bez izazivanja povrede. To je zato što se generalno smatra da Me-protoporfirini negativno utiču na organe u različitim modelima povrede organa. Na primer, Agarval et al. otkrili su da je predtretman sa Sn-protoporfirinom pogoršao povredu

1

bubrega u in vivo modelu hem proteina posredovanog oštećenja bubrega.

Konkretno, predtretman sa Sn-protoporfirinom doveo je do viših vrednosti kreatinina u serumu 3. do 5. dana i nižih klirensa inulina 5. dana. Hemodinamika bubrega proučavana 2. dana nakon cisplatina pokazala je smanjenu brzinu protoka krvi u bubregu, povećanu renalnu vaskularnu rezistenciju i povećano frakciono izlučivanje natrijuma kod pacova lečenih Sn-protoporfirinom. Kidney Int.

1995. oktobar 48(4): 1298-307. U modelu rabdomiolize na glicerolu, Nath et al. su otkrili da bubreg reaguje na velike količine hem proteina indukujući HO i da blokiranje delovanja HO sa kompetitivnim inhibitorom (ovde, Sn-protoporfirin) pogoršava disfunkciju bubrega. J. Clin. Invest.1992. Juli: 90(1): 267-70.

Ferenbach et al., i Goodman et al. su na sličan način pokazali da inhibicija HO upotrebom Me-protoporfirina pogoršava oštećenje bubrega. Vidi Nephron. Exp. Nephrol. 2010. april 115(3): e33-7 i Kidney Int.2007. oktobar 72(8): 945-53. Na osnovu ovih učenja iz predmetne oblasti, stručnjak u ovoj oblasti ne bi očekivao blagotvorne efekte inhibicije HO-1 koji su trenutno otkriveni.

Bez obaveze za vezivanje na teoriju, proteini hema aktiviraju redoks osetljive transkripcione faktore, što dovodi do pojačane regulacije redoks osetljivih citoprotektivnih proteina. Ovaj put je iniciran sadržajem železa Mgb. Prema tome, kao što je ovde pokazano, alternativni pristupi za indukciju signalizacije bubrežnih tubularnih citoprotektivnih gena posredovane železom takođe su efikasni. Oni su alternative davanju železa.

Informacije o sekvenci koje pružaju javne baze podataka mogu se koristiti za identifikaciju dodatnih srodnih i relevantnih sekvenci proteina i povezanih sekvenci nukleinskih kiselina koje kodiraju takve proteine.

Železo. Reference na železo se odnose na komplekse železa ugljenih hidrata. Ovi kompleksi su komercijalno dostupni i/ili se mogu sintetizovati postupcima poznatim u predmetnoj oblasti.

Kompleks ugljenih hidrata železa prema pronalasku je železo saharoze.

„Železo“ u okviru patentnih zahteva i primera otelotvorenja odnosi se na železo saharozu.

2

Sastavi. Železo saharoza i Sn-protoporfirin se mogu obezbediti sami ili u kombinaciji unutar sastava. Sastav uključuje železo saharozu i Sn-protoporfirin i najmanje jedan farmaceutski prihvatljiv nosač. Takođe se mogu koristiti soli i/ili pro-lekovi aktivnih sastojaka.

Farmaceutski prihvatljiva so uključuje bilo koju so koja zadržava aktivnost aktivnog sastojka i prihvatljiva je za farmaceutsku upotrebu. Farmaceutski prihvatljiva so se takođe odnosi na bilo koju so koja se može formirati in vivo kao rezultat primene kiseline, druge soli ili proleka koji se pretvara u kiselinu ili so.

Pogodne farmaceutski prihvatljive kiselinske adicione soli mogu se dobiti od neorganske kiseline ili organske kiseline. Primeri takvih neorganskih kiselina su hlorovodonična, bromovodonična, jodovodonična, azotna, ugljena, sumporna i fosforna kiselina. Odgovarajuće organske kiseline se mogu izabrati između alifatičnih, cikloalifatičnih, aromatičnih, arilalifatičnih, heterocikličnih, karboksilnih i sulfonskih klasa organskih kiselina.

Pogodne farmaceutski prihvatljive bazne adicione soli uključuju metalne soli napravljene od aluminijuma, kalcijuma, litijuma, magnezijuma, kalijuma, natrijuma i cinka ili organske soli napravljene od N,N'-dibenziletilen-diamina, hloroprokaina, holina, dietanolamina, etilenglukamina, N-metila lizina, arginina i prokaina.

Prolek uključuje aktivni sastojak koji se konvertuje u terapeutski aktivno jedinjenje nakon primene, kao što je cepanje proteina ili hidroliza biološki labilne grupe.

Sastavi uključuju aktivne sastojke od najmanje 0,1% w/v sastava; najmanje 1% w/v sastava; najmanje 10% w/v sastava; najmanje 20% w/v sastava; najmanje 30% w/v sastava; najmanje 40% w/v sastava; najmanje 50% w/v sastava; najmanje 60% w/v sastava; najmanje 70% w/v sastava; najmanje 80% w/v sastava; najmanje 90% w/v sastava; najmanje 95% w/v sastava; ili najmanje 99% w/v sastava.

Aktivni sastojci se mogu obezbediti kao deo sastava koji može uključivati, na primer, najmanje 0,1% w/w sastava; najmanje 1% w/w sastava; najmanje 10% w/w sastava; najmanje 20% w/w sastava; najmanje 30% w/w sastava; najmanje 40% w/w sastava; najmanje 50% w/w sastava; najmanje 60% w/w sastava; najmanje 70% w/w sastava; najmanje 80% w/w sastava; najmanje 90% w/w sastava; najmanje 95% w/w sastava; ili najmanje 99% w/w sastava.

Posebna otelotvorenja uključuju železo saharozu, u kombinaciji sa SnPP. Ova otelotvorenja mogu dodatno uključiti hem proteine (npr. mioglobin ili nitritovani mioglobin) i/ili inhibitore degradacije hem proteina (npr. protoporfirine, hemin i/ili hematin i/ili njihove nitrirane oblike).

Primeri opšte korišćenih farmaceutski prihvatljivih nosača obuhvataju bilo koje i sve agense za odlaganje apsorpcije, antioksidante, veziva, puferske agense, agense za povećanje zapremine ili punila, helatnog agensa, obloge, agense za dezintegraciju, disperzione medije, gelove, izotonične agense, maziva, konzervanse ili soli ko-rastvarača, stabilizatoe, surfaktante i/ili vehikule za isporuku.

Primeri antioksidansa uključuju askorbinsku kiselinu, metionin i vitamin E.

Primeri puferskih agenasa uključuju citratne pufere, sukcinatne pufere, tartaratne pufere, fumaratne pufere, glukonatne pufere, oksalatne pufere, laktatne pufere, acetatne pufere, fosfatne pufere, histidinske pufere i/ili trimetilaminske soli.

Primer helatnog agensa je EDTA.

Primeri izotoničnih agenasa uključuju polihidrične šećerne alkohole uključujući trihidrične ili više šećerne alkohole, kao što su glicerin, eritritol, arabitol, ksilitol, sorbitol ili manitol.

Primeri konzervansa uključuju fenol, benzil alkohol, meta-krezol, metil paraben, propil paraben, oktadecildimetilbenzil amonijum hlorid, benzalkonijum halide, heksametonijum hlorid, alkil parabene kao što su metil ili propil paraben, katehol, rezorcinolpenhol,i 3-pentanol.

Stabilizatori se odnose na široku kategoriju ekscipijenata koji mogu biti u funkciji od agensa za povećanje zapremine do aditiva koji rastvara aktivni sastojak ili pomaže da se spreči denaturacija ili prianjanje na zid posude. Tipični stabilizatori mogu uključivati polihidrične šećerne alkohole; aminokiseline, kao što su arginin, lizin, glicin, glutamin, asparagin, histidin, alanin, ornitin, L-leucin, 2fenilalanin, glutaminska kiselina i treonin; organski šećeri ili šećerni alkoholi, kao što su laktoza, trehaloza, stahioza, manitol, sorbitol, ksilitol, ribitol, mioinizitol, galaktitol, glicerol i ciklitoli, kao što je inozitol; PEG; polimeri aminokiselina; redukcioni agensi koji sadrže sumpor, kao što su urea, glutation, tioktična kiselina, natrijum tioglikolat, tioglicerol, alfa-monotioglicerol i natrijum tiosulfat; polipeptide male molekularne težine (tj. <10 taloga); proteini kao što su humani serum albumin, goveđi serum albumin, želatin ili imunoglobulini; hidrofilni polimeri kao što je polivinilpirolidon; monosaharidi kao što su ksiloza, manoza, fruktoza i glukoza; disaharidi kao što su laktoza, maltoza i saharoza; trisaharidi kao što je rafinoza i polisaharidi kao što je dekstran. Stabilizatori su tipično prisutni u opsegu od 0,1 do 10.000 težinskih delova na osnovu težine aktivnog sastojka.

Sastavi se mogu formulisati za primenu, na primer, injekcijom, inhalacijom, infuzijom, perfuzijom, ispiranjem ili gutanjem. Sastavi se dalje mogu formulisati za intravenoznu, intradermalnu, intraarterijsku, intranodalnu, intralimfatičnu, intraperitonealnu, intralezionalnu, intraprostatičnu, intravaginalnu, intrarektalnu, topikalnu, intratekalnu, intratumoralnu, intramuskularnu, intravezikularnu, oralnu i/ili više intravensku primen, intraarterijsku, intranodalnu, intralimfatičku, intraperitonealnu, intralezijsku, intraprostatičnu, intravaginalnu, intrarektalnu, intratekalnu, intratumoralnu, intramuskularnu, intravezikularnu i/ili subkutanu injekciju.

Za injekcije, sastavi se mogu formulisati kao vodeni rastvori, kao što su puferi uključujući Hanksov rastvor, Ringerov rastvor ili fiziološki rastvor. Vodeni rastvori mogu da sadrže sredstva za formulaciju kao što su sredstva za suspendovanje, stabilizaciju i/ili disperziju. Alternativno, formulacija može biti u liofilizovanom i/ili obliku praha za konstituisanje sa odgovarajućim vehikulumom, npr. sterilnom vodom bez pirogena, pre upotrebe. Posebna otelotvorenja su formulisana za intravensku primenu.

Za oralnu primenu, sastavi se mogu formulisati kao tablete, pilule, dražeje, kapsule, tečnosti, gelovi, sirupi, suspenzije i slično. Za oralne čvrste formulacije kao što su, na primer, praškovi, kapsule i tablete, pogodni ekscipijenti uključuju veziva (guma tragakant, bagrem, kukuruzni skrob, želatin), punila kao što su šećeri, npr. laktoza, saharoza, manitol i sorbitol; dikalcijum fosfat, skrob, magnezijum stearat, natrijum saharin, celuloza, magnezijum karbonat; preparati

2

celuloze kao što su kukuruzni skrob, pšenični skrob, pirinčani skrob, krompirov skrob, želatin, guma tragakant, metil celuloza, hidroksipropilmetil-celuloza, natrijum karboksi-metilceluloza, i/ili polivinilpirolidon (PVP); agensi za granulaciju; i vezivni agensi. Ako se želi, mogu se dodati agensi za dezintegraciju, kao što su kukuruzni skrob, krompirov skrob, alginska kiselina, umreženi polivinilpirolidon, agar ili alginska kiselina ili njena so, kao što je natrijum alginat. Po želji, čvrsti dozni oblici mogu biti obloženi šećerom ili enterično obloženi korišćenjem standardnih tehnika. Mogu se koristiti i aromatični agensi, kao što su pepermint, ulje zimzelena, aroma trešnje, aroma pomorandže itd.

Sastavi se mogu formulisati kao aerosol. Aerosol je obezbeđen kao deo inhalatora bezvodnog, tečnog ili suvog praha. Aerosolni sprejevi iz pakovanja pod pritiskom ili raspršivača se takođe mogu koristiti sa odgovarajućim potisnim gasom, na primer, dihlorodifluorometanom, trihlorofluorometanom, dihlorotetrafluoroetanom, ugljen-dioksidom ili drugim pogodnim gasom. U slučaju aerosola pod pritiskom, dozna jedinica se može odrediti obezbeđivanjem ventila za isporuku odmerene količine. Kapsule i kertridži sa želatinom za upotrebu u inhalatoru ili insuflatoru takođe mogu biti formulisani tako da sadrže mešavinu praha hem proteina i pogodne praškaste baze kao što je laktoza ili skrob.

Sastavi se takođe mogu formulisati kao depo preparati. Depo preparati se mogu formulisati sa odgovarajućim polimernim ili hidrofobnim materijalima (na primer kao emulzija u prihvatljivom ulju) ili jonoizmenjivačkim smolama, ili kao slabo rastvorljivi derivati, na primer, kao slabo rastvorljive soli.

Dodatno, sastavi se mogu formulisati kao sistemi sa produženim oslobađanjem koji koriste polupropusne matrice čvrstih polimera koji sadrže najmanje jedan aktivni sastojak. Različiti materijali sa produženim oslobađanjem su uspostavljeni i dobro su poznati stručnjacima u ovoj oblasti. Sistemi sa produženim oslobađanjem mogu, u zavisnosti od svoje hemijske prirode, da oslobađaju aktivne sastojke nakon primene u trajanju od nekoliko nedelja do preko 100 dana. Depo preparati se mogu davati injekcijom; parenteralnom injekcijom; instilacijom; ili implantacijom u meka tkiva, telesnu šupljinu, ili povremeno u krvni sud sa injekcijom kroz fine igle.

Depo formulacije mogu uključivati različite bioerodibilne polimere uključujući poli(laktid), poli(glikolid), poli(kaprolakton) i poli(laktid)-ko(glikolid) (PLG) poželjnih odnosa laktid:glikolid, prosečne molekulske težine, polidisperznosti, i hemije terminalne grupe. Mešanje različitih tipova polimera u različitim odnosima korišćenjem različitih klasa može rezultirati karakteristikama koje su pozajmljene od svakog od polimera koji doprinose.

Upotreba različitih rastvarača (na primer, dihlorometan, hloroform, etil acetat, triacetin, N-metil pirolidon, tetrahidrofuran, fenol ili njihove kombinacije) može promeniti veličinu i strukturu mikročestica u cilju modulacije karakteristika oslobađanja. Drugi korisni rastvarači uključuju vodu, etanol, dimetil sulfoksid (DMSO), N-metil-2-pirolidon (NMP), aceton, metanol, izopropil alkohol (IPA), etil benzoat i benzil benzoat.

Primeri modifikatora oslobađanja mogu uključivati surfaktante, deterdžente, pojačivače viskoziteta unutrašnje faze, agense za stvaranje kompleksa, površinski aktivne molekule, ko-rastvarače, helatore, stabilizatore, derivate celuloze, (hidroksipropil)metil celulozu (HPMC), HPMC acetat, celulozni acetat, pluronik (npr. F68/F127), polisorbati, Span<®>(Croda Americas, Vilmington, Delavare), poli(vinil alkohol) (PVA), Brij<®>(Croda Americas, Vilmington, Delavare), saharoza acetat izobutirat (SAIB), soli i pufere.

Ekscipijenti koji se razdvajaju na spoljnu faznu granicu mikročestica kao što su surfaktanti uključujući polisorbate, dioktilsulfosukcinate, poloksamere, PVA, takođe mogu na povoljan način izmeniti svojstva uključujući stabilnost čestica i stope erozije, hidrataciju i strukturu kanala, međufazni transport i kinetiku.

Dodatna obrada depo formulacija sa produženim oslobađanjem može da koristi stabilizirajuće ekscipijente uključujući manitol, saharozu, trehalozu i glicin sa drugim komponentama kao što su polisorbati, PVA i dioktilsulfosukcinati u puferima kao što su Tris, citrat ili histidin. Ciklus sušenja smrzavanjem se takođe može koristiti za proizvodnju prahova sa veoma malo vlage koji se rekonstituišu u slične veličine i karakteristike performansi originalne suspenzije.

Bilo koji sastav može povoljno da uključi bilo koje druge farmaceutski prihvatljive nosače koji uključuju one koji ne proizvode značajno neželjene,

2

alergijske ili druge neželjene reakcije koje prevazilaze korist od primene. Primeri farmaceutski prihvatljivih nosača i formulacija su otkriveni u Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. izdanje, Mack Printing Company, 1990. Štaviše, formulacije se mogu pripremiti da zadovolje standarde sterilnosti, pirogenosti, opšte bezbednosti i čistoće u skladu sa zahtevima Ureda za biološke standarde FDA SAD i/ili drugih relevantnih stranih regulatornih agencija.

Kompleti. Takođe su otkriveni kompleti. Ovde su opisani kompleti koji uključuju jednu ili više posuda koje uključuju jedan ili više aktivnih sastojaka i/ili sastava. Kompleti mogu uključivati jednu ili više posuda koje sadrže jedan ili više aktivnih sastojaka i/ili sastava koje se koriste u kombinaciji sa aktivnim sastojcima i/ili sastavima. Povezano sa takvim posudama može biti obaveštenje u formi koju je propisala vladina agencija koja reguliše proizvodnju, upotrebu ili prodaju farmaceutskih ili bioloških proizvoda, a koje obaveštenje odražava odobrenje agencije za proizvodnju, upotrebu ili prodaju za ljudsku primenu.

Opciono, kompleti dalje uključuju uputstva za korišćenje kompleta u postupcima. Komplet može da sadrži uputstva u vezi sa pripremanjem aktivnih sastojaka i/ili sastave za primenu; davanje aktivnih sastojaka i/ili sastava; odgovarajući referentni nivoi za tumačenje rezultata povezanih sa korišćenjem kompleta; pravilno odlaganje pripadajućeg otpada; i slično. Uputstva mogu biti u obliku štampanih uputstava koja se nalaze u kompletu ili uputstva mogu biti odštampana na delu samog kompleta. Uputstva mogu biti u obliku lista, pamfleta, brošure, CD-ROM ili uređaja koji se može čitati računarom, ili mogu dati upute za uputstva na udaljenoj lokaciji, kao što je internet lokacija. Uputstva mogu biti na engleskom i/ili na bilo kom nacionalnom ili regionalnom jeziku. Mogu se uključiti mogući neželjeni efekti i kontraindikacije za dalju upotrebu komponenti kompleta na osnovu simptoma subjekta. Kompleti i uputstva takođe mogu biti prilagođeni tipu organa koji treba da se zaštiti i vrsti inzulta na koju organ može naići.

Pakovanje, aktivni sastojci i/ili sastavi i uputstva su kombinovani u mali, kompaktni komplet sa štampanim uputstvima za upotrebu svakog od aktivnih sastojaka i/ili sastava. Kada je obezbeđeno više od jednog aktivnog sastojka i/ili sastava, redosled upotrebe aktivnih sastojaka i/ili sastava može biti obeležen u kompletu.

2

Kompleti uključuju neke ili sve neophodne medicinske potrepštine potrebne za efikasno korišćenje kompleta, čime se eliminiše potreba za lociranjem i prikupljanjem takvog medicinskog materijala. Takvi medicinski materijali mogu uključivati špriceve, ampule, cevčice, masku za lice, uređaj za prenos tečnosti bez igle, kapicu za injekciju, sunđere, sterilne lepljive trake, hloraprep, rukavice i slično. Mogu se napraviti varijacije u sadržaju bilo kog od kompleta. Posebni kompleti obezbeđuju materijale za primenu sastava kroz intravensku primenu.

Postupci upotrebe. Kao što je navedeno, sastavi i kompleti za upotrebu u postupcima koji su ovde otkriveni mogu se koristiti za zaštitu organa od povreda izazivanjem stečene citorezistencije u odsustvu povrede. Postoje brojne potencijalne upotrebe za sastave i komplete za upotrebu u postupcima.

Postupci uključuju lečenje organa aktivnim sastojcima uključujući njihove soli i prolekove. Lečenje organa uključuje isporuku terapeutski efikasnih količina. Terapeutski efikasne količine uključuju one koje obezbeđuju efikasne količine, profilaktičke tretmane i/ili terapeutske tretmane.

Organ je deo subjekta koji je tipično samostalan i ima specifičnu vitalnu funkciju. Primeri organa uključuju srce, jetru, bubrege, slezinu, pankreas, mozak, pluća, creva, želudac itd. Terapijski efikasne količine se mogu davati direktno organima.

Terapijski efikasne količine se takođe mogu davati organima davanjem terapeutski efikasne količine subjektu u kome se organ nalazi. Subjekti su ljudi, veterinarske životinje (psi, mačke, gmizavci, ptice itd.), stoka (konji, goveda, koze, svinje, kokoške itd.) i istraživačke životinje (majmuni, pacovi, miševi, ribe itd.). Lečenje subjekata uključuje davanje terapeutski efikasnih količina. Stoga, osim ako nije drugačije navedeno, davanje organu može biti davanjem subjektu, što rezultira fiziološkom isporukom u organ ili može biti davanjem direktno organu.

„Efikasna količina“ je količina aktivnog sastojka ili sastava neophodna da dovede do željene fiziološke promene u organu ili subjektu. Efikasne količine se često daju u istraživačke svrhe. Efikasne količine štite organe od povreda izazivanjem stečene citorezistencije u odsustvu povrede.

2

„Profilaktički tretman“ obuhvata tretman koji se primenjuje na organ koji ne pokazuje znake ili simptome povrede organa ili pokazuje samo rane znake ili simptome povrede organa tako da se lečenje primenjuje u cilju smanjenja, prevencije ili smanjenja rizika od razvoja daljeg oštećenja organa. Dakle, profilaktički tretman funkcioniše kao preventivni tretman protiv povrede organa.

„Terapeutski tretman“ obuhvata tretman koji se primenjuje na organ koji pokazuje simptome ili znake povrede organa i koji se primenjuje na organ u cilju smanjenja pogoršanja povrede organa.

Stvarnu količinu doze koja se daje određenom organu (ili subjektu) može odrediti lekar, veterinar ili istraživač uzimajući u obzir parametre kao što su fizički i fiziološki faktori uključujući cilj; telesnu težinu; ozbiljnost stanja; predstojeći inzult, kada je poznat; vrsta organa koji zahteva zaštitu; prethodne ili istovremene terapijske intervencije; idiopatija subjekta; i način primene.

Količina i koncentracija aktivnog sastojka u sastavu, kao i količina primenjenog sastava, mogu se izabrati na osnovu klinički relevantnih faktora, rastvorljivosti aktivnog sastojka u sastavu, jačine i aktivnosti aktivnog sastojka i način primene sastava, kao i da li je aktivni sastojak modifikovan (npr. nitrit, PEGiliran) ili se primenjuje u kombinaciji sa inhibitorom degradacije hem proteina (npr. inhibitorom HO-1) između ostalog.

Sastav koji uključuje terapeutski efikasnu količinu aktivnog(ih) sastojka(a) može se primeniti intravenozno subjektu za zaštitu organa na klinički bezbedan i efikasan način, uključujući jednu ili više odvojenih primena sastava. Na primer, 0,05 mg/kg do 5,0 mg/kg može se dati subjektu dnevno u jednoj ili više doza (npr. doze od 0,05 mg/kg KD, 0,10 mg/kg KD, 0,50 mg/kg KD, 1,0 mg /kg KD, 1,5 mg/kg KD, 2,0 mg/kg KD, 2,5 mg/kg KD, 3,0 mg/kg KD, 0,75 mg/kg BID, 1,5 mg/kg BID, ili 2,0 mg/kg BID). Za određene organe i indikacije, ukupna dnevna doza aktivnog sastojka može biti od 0,05 mg/kg do 3,0 mg/kg primenjena subjektu intravenozno jedan do tri puta dnevno, uključujući primenu ukupnih dnevnih doza od 0,05-3,0, 0,1- 3,0, 0,5-3,0, 1,0-3,0, 1,5-3,0, 2,0-3,0, 2,5-3,0 i 0,5-3,0 mg/kg/dan sastava korišćenjem doziranja intravenske infuzije u trajanju od 60 minuta KD, BID ili TID. Sastavi se mogu davati intravenozno KD ili BID subjektu sa, na primer,

2

ukupnim dnevnim dozama od 1,5 mg/kg, 3,0 mg/kg, 4,0 mg/kg sastava sa do 92-98% wt/wt hem proteina.

Dodatne korisne doze često se kreću od 0,1 do 5 µg/kg ili od 0,5 do 1 µg/kg. U drugim primerima, doza može uključivati 1 µg/kg, 5 µg/kg, 10 µg/kg, 15 µg/kg, 20 µg/kg, 25 µg/kg, 30 µg/kg, 35 µg/kg, 40 µg /kg, 45 µg/kg, 50 µg/kg, 55 µg/kg, 60 µg/kg, 65 µg/kg, 70 µg/kg, 75 µg/kg, 80 µg/kg, 85 µg/kg, 90 µg/kg /kg, 95 µg/kg, 100 µg/kg, 150 µg/kg, 200 µg/kg, 250 µg/kg, 350 µg/kg, 400 µg/kg, 450 µg/kg, 500 µg/kg, 550 µg/kg, 600 µg/kg, 650 µg/kg, 700 µg/kg, 750 µg/kg, 800 µg/kg, 850 µg/kg, 900 µg/kg, 950 µg/kg, 1000 µg/kg, 0,1 to 5 mg/kg, odnosno od 0,5 do 1 mg/kg. U drugim primerima, doza može uključivati 1 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 35 mg/kg, 40 mg /kg, 45 mg/kg, 50 mg/kg, 55 mg/kg, 60 mg/kg, 65 mg/kg, 70 mg/kg, 75 mg/kg, 80 mg/kg, 85 mg/kg, 90 mg /kg, 95 mg/kg, 100 mg/kg, 150 mg/kg, 200 mg/kg, 250 mg/kg, 350 mg/kg, 400 mg/kg, 450 mg/kg, 500 mg/kg, 550 mg /kg, 600 mg/kg, 650 mg/kg, 700 mg/kg, 750 mg/kg, 800 mg/kg, 850 mg/kg, 900 mg/kg, 950 mg/kg, 1000 mg/kg ili više.

Svaka od opisanih doza aktivnih sastojaka može biti kombinacija železa saharoze i Sn-Cr- ili Zn-protoporfirina. Kada su uključeni u kombinacije za proizvodnju doze, kao što je doza koja je ovde navedena, supstituenti u kombinaciji mogu biti obezbeđeni u primernim odnosima kao što su: 1:1; 1:1,25; 1:1,5; 1:1,75; 1:8; 1:1,2; 1:1,25; 1:1,3; 1:1,35; 1:1,4; 1:1,5; 1: 1,75; 1:2; 1:3; 1:4; 1:5; 1:6: 1:7; 1:8; 1:9; 1:10; 1:15; 1:20; 1:30; 1:40; 1:50; 1:60; 1:70; 1:80; 1:90; 1:100; 1:200; 1:300; 1:400; 1:500; 1:600; 1:700; 1:800; 1:900; 1:1000; 1:1:1; 1:2:1; 1:3:1; 1:4:1; 1:5;1; 1:10:1; 1:2:2; 1:2:3; 1:3:4; 1:4:2; 1:5;3; 1:10:20; 1:2:1:2; 1:4:1:3; 1:100:1:1000; 1:25:30:10; 1:4:16:3; 1:1000:5:15; 1:2:3:10; 1:5:15:45; 1:50:90:135; 1:1,5:1.8:2,3; 1:10:100:1000 ili dodatnim korisnim odnosima u zavisnosti od broja i identiteta supstituenata u kombinaciji da bi se postigla navedena doza. Supstituenti u kombinaciji mogu biti obezbeđeni u okviru istog sastava ili u okviru različitih sastava.

Terapeutski efikasne količine se mogu postići primenom jedne ili više doza tokom režima lečenja (npr. KID, TID, BID, dnevno, svaki drugi dan, svaka 3 dana, svaka 4 dana, svakih 5 dana, svakih 6 dana, nedeljno, svake 2 nedelje, svake 3 nedelje, mesečno, svaka 2 meseca, svaka 3 meseca, svaka 4 meseca,

2

svakih 5 meseci, svakih 6 meseci, svakih 7 meseci, svakih 8 meseci, svakih 9 meseci, svakih 10 meseci, svakih 11 meseci ili godišnje).

Sastavi se mogu davati u roku od 48 sati od predstojećeg inzulta, u roku od 46 sati od predstojećeg inzulta, u roku od 44 sata od predstojećeg inzulta, u roku od 42 sata od predstojećeg inzulta, u roku od 40 sati od predstojećeg inzulta, u roku od 38 sati od predstojećeg inzulta, u roku od 36 sati od predstojećeg inzulta, u roku od 34 sata od predstojećeg inzulta, u roku od 32 sata od predstojećeg inzulta, u roku od 30 sati od predstojećeg inzulta, u roku od 28 sati od predstojećeg inzulta, u roku od 26 sati od predstojećeg inzulta, u roku od 24 sata od predstojećeg inzulta, u roku od 22 sata od predstojećeg inzulta, u roku od 20 sati od predstojećeg inzulta, u roku od 18 sati od predstojećeg inzulta, u roku od 16 sati od predstojećeg inzulta, u roku od 14 sati od predstojećeg inzulta, u roku od 12 sati od predstojećeg inzulta, u roku od 10 sati od predstojećeg inzulta, u roku od 8 sati od predstojećeg inzulta, u roku od 6 sati od predstojećeg inzulta, u roku od 4 sata od predstojećeg inzulta ili u roku od 2 sata od predstojećeg inzulta. Sastavi se daju u roku od 18 sati od predstojećeg inzulta.

Pored toga, sastavi se mogu davati najmanje 48 sati pre predstojećeg inzulta, najmanje 46 sati pre predstojećeg inzulta, najmanje 44 sata pre predstojećeg inzulta, najmanje 42 sata pre predstojećeg inzulta, najmanje 40 sati pre predstojećeg inzulta, najmanje 38 sati pre predstojećeg inzulta, najmanje 36 sati pre predstojećeg inzulta, najmanje 34 sata pre predstojećeg inzulta, najmanje 32 sata pre predstojećeg inzulta, najmanje 30 sati pre predstojećeg inzulta, najmanje 28 sati pre predstojećeg inzulta, najmanje 26 sati pre predstojećeg inzulta, najmanje 24 sata pre predstojećeg inzulta, najmanje 22 sata pre predstojećeg inzulta, najmanje 20 sati pre predstojećeg inzulta, najmanje 18 sati pre predstojećeg inzulta, najmanje 16 sati pre predstojećeg inzulta, najmanje 14 sati pre predstojećeg inzulta, najmanje 12 sati pre predstojećeg inzulta, najmanje 10 sati pre predstojećeg inzulta, najmanje 8 sati pre predstojećeg inzulta, najmanje 6 sati pre predstojećeg inzulta, najmanje 4 sata pre predstojećeg inzulta, ili najmanje 2 sata pre predstojećeg inzulta. Sastavi se daju najmanje 18 sati pre predstojećeg inzulta.

Zaštita transplantata. Organi mogu biti zaštićeni od povreda tokom transplantacije. Sastavi se mogu davati (i) davaocu organa pre izolacije organa od donora; (ii) izolovanom organu pre transplantacije, i/ili (iii) primaocu transplantiranog organa. Ovaj postupak upotrebe se može primeniti na bilo koji organ sposoban za transplantaciju sa jednog subjekta na drugog. Terapeutski efikasne količine se mogu isporučiti direktno u organ nakon uklanjanja od subjekta ili pre implantacije drugom subjektu.

Zaštita bubrežnog sistema. Do sadašnjeg obelodanjivanja, nije bilo agenasa koji bi mogli da spreče ili ublaže pojavu AKI kod pacijenata sa visokim rizikom, kao što su pojedinci koji su podvrgnuti operaciji, kardiopulmonalnom bajpasu ili radiokontrastnoj toksičnosti. Važno je napomenuti da je akutna bubrežna insuficijencija glavni faktor rizika i za morbiditet i mortalitet, kao i za potrebu za dugotrajnom dijalizom bubrega. Ovo poslednje košta saveznu vladu milijarde dolara u njenom završnom stadijumu bolesti bubrega/Medicare programu. Stoga prevencija AKI/akutne bubrežne insuficijencije predstavljala kritičnu i potpuno neispunjenu kliničku potrebu.

„Akutna povreda bubrega“ (AKI) poznata i kao „akutna bubrežna insuficijencija“ (ARF) ili „akutna insuficijencija bubrega“, odnosi se na bolest ili stanje u kojem dolazi do brzog gubitka bubrežne funkcije zbog oštećenja bubrega, što dovodi do zadržavanje azotnih (urea i kreatinin) i neazotnih otpadnih produkata koji se normalno izlučuju bubrezima. U zavisnosti od težine i trajanja bubrežne disfunkcije, ova akumulacija je praćena metaboličkim poremećajima, kao što su metabolička acidoza (zakiseljavanje krvi) i hiperkalemija (povećan nivo kalijuma), promene u ravnoteži telesnih tečnosti, uticaji na mnoge druge organske sisteme/ otkazivanje sistema organa, preopterećenje intravaskularnog volumena, koma i smrt. Može se okarakterisati oligurijom ili anurijom (smanjenje ili prestanak proizvodnje urina), iako može doći do neoligurične ARF. AKI je ozbiljna komplikacija u bolnicama, što dovodi do produženog boravka u bolnici i visokog mortaliteta. Bolest srca i kardiohirurgija su uobičajeni uzroci AKI. Kada pacijenti imaju AKI, smrtnost je visoka.

AKI može biti posledica različitih uzroka uključujući a) prerenalne (uzroci snabdevanja krvlju), što uključuje hipovolemiju ili smanjen volumen krvi, obično usled šoka ili dehidracije i gubitka tečnosti ili prekomerne upotrebe diuretika; hepatorenalni sindrom, u kojem je bubrežna perfuzija ugrožena zbog

1

otkazivanja jetre; vaskularni problemi, kao što su ateroembolijska bolest i tromboza bubrežnih vena, koji se mogu javiti kao komplikacija nefrotskog sindroma; infekcija, obično sepsa, i sistemsko zapaljenje usled infekcije; teške opekotine; sekvestracija zbog perikarditisa i pankreatitisa; i hipotenzija zbog antihipertenziva i vazodilatatora; b) unutrašnje oštećenje bubrega, koje uključuje ishemiju bubrega (prolazno smanjenje ili prekid protoka krvi) toksine ili lekove (npr. neki NSAIL, aminoglikozidni antibiotici, jodirani kontrast, litijum, fosfatna nefropatija zbog pripreme creva za kolonoskopiju sa natrijum fosfatima); rabdomioliza ili razgradnja mišićnog tkiva, pri čemu nastalo oslobađanje mioglobina u krvi utiče na bubreg, što može biti uzrokovano i povredom (naročito prignječenjem ili obimnom tupom traumom), statinima, stimulansima i nekim drugim lekovima; hemoliza ili raspad crvenih krvnih zrnaca, što može biti uzrokovano raznim stanjima kao što su bolest srpastih ćelija i eritematozni lupus; multipli mijelom, bilo zbog hiperkalcemije ili „livene nefropatije“; akutni glomerulonefritis koji može biti uzrokovan raznim uzrocima, kao što je bolest bazalne membrane glomerula/Godpastureov sindrom, Vegenerova granulomatoza ili akutni lupus nefritis sa sistemskim eritematoznim lupusom; i c) post-renalni uzroci (opstruktivni uzroci u urinarnom traktu) koji uključuju, lekove koji ometaju normalno pražnjenje bešike (npr. antiholinergici); benigna hipertrofija prostate ili rak prostate; kamen u bubregu; abdominalni malignitet (npr. rak jajnika, kolorektalni kancer); opstruiran urinarni kateter; ili lekovi koji mogu izazvati kristaluriju i lekovi koji mogu dovesti do mioglobinurije i cistitisa.

Postupci (nisu prema predmetnom pronalasku) uključuju zaštitu bubrega izazivanjem stečene citorezistencije. Kao što je navedeno, odgovarajuće terapeutski efikasne količine se u početku mogu odrediti korišćenjem životinjskih modela da bi se identifikovali rasponi doza. Naročite terapijski efikasne količine aktivnog sastojka uključuju 10 mg/kg; 20 mg/kg; 30 mg/kg; 40 mg/kg; 50 mg/kg; 60 mg/kg; 70 mg/kg; 80 mg/kg; 90 mg/kg i 100 mg/kg.

Primeri životinjskih modela povrede bubrega uključuju: otkazivanje bubrega izazvano glicerolom (imitira rabdomiolizu); ARF izazvan ishemijomreperfuzijom (simulira promene izazvane smanjenim protokom krvi u bubrezima, što dovodi do ishemije tkiva i smrti ćelija ćelijskih tubula); modeli izazvani lekovima kao što su gentamicin, cisplatin, NSAID, ifosfamidom indukovana ARF (imitira

2

bubrežnu insuficijenciju usled kliničke primene odgovarajućih lekova); ARF izazvan uranijumom, kalijum dihromatom (imitira profesionalnu opasnost); ARF izazvan S-(1,2-dihlorovinil)-L-cisteinom (simulira disfunkciju bubrega izazvanu kontaminiranom vodom); ARF izazvan sepsom (imitira bubrežnu insuficijenciju izazvanu infekcijom); i ARF izazvan radiokontrastom (imitira bubrežnu insuficijenciju kod pacijenata tokom upotrebe radiokontrastnih medija u vreme kateterizacije srca). Za više informacija o ovim modelima, vidi Singh et al., Pharmacol. REP.2012, 64(1): 31-44.

Poznati testovi funkcije bubrega uključuju ultrazvuk; CT skeniranje; i merenje laktat dehidrogenaze (LDH), azota uree u krvi (BUN), kreatinina, klirensa kreatinina, klirensa jotalamata, brzine glomerularne filtracije i klirensa inulina.

Hepatična zaštita. Primeri životinjskih modela povrede jetre uključuju: ishemijsku reperfuzionu povredu; hemijski izazvanu fibrozu jetre korišćenjem hepatotoksina (ugljentetrahlorid, tioacetamid, dimetil ili dietil nitrozamin); ligaciju žučnih kanala; model šistosomije; model hepatitisa Concavalin A; inducibilni HCV transgeni miševi; različite genetske modele; model enteralne infuzije etanola (Tsukamoto-francuski model); i model nedostatka metionina i holina.

Dalje, brojna hepatotoksična jedinjenja, uključujući određene terapeutike, izazivaju citotoksičnost. Hepatotoksična jedinjenja mogu izazvati citotoksičnost jetre direktnim hemijskim napadom ili proizvodnjom toksičnog metabolita. Citotoksičnost može biti izazvana direktnim hemijskim napadom korišćenjem sledećih lekova: Anestetici, kao što su enfluran, fluroksen, halotan i metoksifluran; neuropsihotropni lekovi, kao što su kokain, hidrazidi, metilfenidat i triciklici; antikonvulzanti, kao što su feniloin i valproična kiselina; analgetici, kao što su acetaminofen, hlorzoksazon, dantrolen, diklofenak, ibuprofen, indometacin, salicilati, tolmetin i zoksazolamin; hormoni, kao što su acetoheksamid, karbutamid, glipizid, metaheksamid, propiltiouracil, tamoksifen, dietilstilbestrol; antimikrobna sredstva, kao što su amfotericin B, klindamicin, ketokonazol, mebendazol, metronidazol, oksacilin, paraaminosalicilna kiselina, penicilin, rifampicin, sulfonamidi, tetraciklin i zidovudin; kardiovaskularni lekovi, kao što su amiodaron, dilitiazem, α-metildopa, meksiletin, hidrazalin, nikotinska kiselina, papaverin, perheksilin, prokainamid, kinidin i tokainamid; i imunosupresivi i antineoplastici, kao što su asparaginaza, cisplatin, ciklofosfamid, dakarbazin, doksorubicin, fluorouracil, metotreksat, mitramicin, 6-MP, nitrozouree, tamoksifen, tioguanin i vinkristin; i razni lekovi, kao što su disulfiram, jodid jon, oksifenisatin, vitamin A i paraaminobenzojeva kiselina.

Hepatotoksična jedinjenja koja izazivaju holestazu, zaustavljanje toka žuči, mogu imati nekoliko oblika. Centribularna holestaza je praćena inflamatornim promenama portala. Promene žučnih kanala su prijavljene kod nekih lekova kao što je eritromicin, dok je čista kanalikularna holestaza karakteristična za druge lekove kao što su anabolički steroidi. Hronična holestaza je povezana sa lekovima kao što su metiltestosteron i estradiol. Holestatska bolest može biti izazvana upotrebom hepatotoksičnih jedinjenja uključujući sledeće: kontraceptivne steroide, androgene steroide, anaboličke steroide, acetilsalicilnu kiselinu, azatioprin, benzodiazepin, henodeoksiholnu kiselinu, hlordiazepoksid, eritromicin estolat, furosedefinolat, fluperiozemidol, fluorozemidol 6-Merkaptopurin, metimazol, metotreksat, metildopa, metilendiamin, metiltestosteron, naproksen, nitrofurantoin, penicilamin, perfenazin, prohlorperazin, promazin, tiobendazol, tioridazin, tolbutamid, trimetoprimsulfametoksazol, koper i parakat.

Neki lekovi, iako prvenstveno holestatski, takođe mogu da izazovu hepatoksičnost, pa je zbog toga oštećenje jetre koje izazivaju mešano. Lekovi koji izazivaju mešano oštećenje jetre uključuju, na primer, sledeće: hlorpromazin, fenilbutazon, halotan, hlordiazepoksid, diazepam, alopurinol, fenobarbital, naproksen, propiltiouracil, hloramfenikol, trimetoprimsulfametoksazksol, aminon, disopiramid, azatioprin, cimetitidin i ranitidin.

Detekcija jednog ili više enzima ciklusa arginin/urea/NO, sumpornih enzima i/ili proizvoda povezanih sa razgradnjom spektrina je dijagnostika oštećenja jetre. Primeri ovih markera uključuju: argininosukcinat sintetazu (ASS) i argininosukcinat liazu (ASL), sumporaciju (estrogen sulfotransferazu (EST)), skvalen sintazu (SKS), glikogen fosforilazu jetre (GP), karbamoil-fosfat (CPS sintet-1). αenolaza 1, protein regulisan glukozom (GRP) i produkte razlaganje spektrina.

Detekcija biomarkera kao dijagnostika oštećenja jetre, kao što je povreda usled ishemije, može biti u korelaciji sa postojećim testovima. To može

4

uključivati: alkalnu fosfatazu (AP); 5'-nukleotidazu (5'-ND); α-glutamil transpeptidazu (G-GT); leucin aminopeptidazu (LAP); aspartat transaminazu (AST); alanin transaminazu (ALT); fruktoza-1,6-difosfat aldolazu (ALD); LDH; izocitrat dehidrogenazu (ICDH); ornitin-karbamoiltransferazu (OCT); sorbitol dehidrogenaza (SDH) arginazu; guanazu; kreatin fosfokinazu (CPK); holinesterazu (ChE); nivoe peptida prokolagena tipa III (PIIIP); nivoe amonijaka u krvi kod hepatoencefalopatija; ligand u nivoima kod nekroze i hepatoma; nivoe hijaluronata zbog oštećenja endotelnih ćelija jetre; nivoe α-1-fetoproteina (AFP) za otkrivanje hepatoma; nivoe karcinoembrionalnog antigena (CEA) za otkrivanje metastaza raka u jetri; povećanje antitela protiv različitih ćelijskih komponenti, kao što su mitohondrijalni, i nuklearni i specifični protein membrane jetre; i otkrivanje proteina, kao što su albumin, globin, aminokiseline, holesterol i drugi lipidi. Takođe, biohemijska analiza raznih minerala, metabolita i enzima dobijenih biopsijom jetre može biti korisna u identifikaciji daljih biomarkera kod naslednih, stečenih i eksperimentalno indukovanih poremećaja jetre.

Količina otkrivenih biomarkera može se povezati sa testovima funkcije jetre da bi se dalje procenilo oštećenje jetre. Kao što razume stručnjak u ovoj oblasti, testovi funkcije jetre uključuju sledeće: procenu hepatičnog klirensa organskih anjona, kao što su bilirubin, indocijanin zeleno (ICG), sulfobromoftalein (BSP) i žučne kiseline; procenu krvotoka u jetri merenjem galaktoze i klirensa ICG; i procenu mikrozomalne funkcije jetre, korišćenjem aminopirinskog testa disanja i testa klirensa kofeina. Na primer, serumski bilirubin se može meriti da bi se potvrdilo prisustvo i ozbiljnost žutice i da bi se odredio stepen hiperbilirubinemije, kao što se vidi kod parenhimske bolesti jetre. Povišene vrednosti aminotransferaze (transaminaze) odražavaju ozbiljnost aktivnog oštećenja hepatocelularnog sistema, dok se povišenje alkalne fosfataze nalazi kod holestaze i jetrenih infiltrata (Isselbacher, K. i Podolsky, D. u Hartison's Principles of Internal Medicine, 12. izdanje, Vilson et al. Izd., 2: 1301-1308 (1991)).

Dodatni sistemi bodovanja i parametri koji se koriste za procenu funkcije jetre uključuju Child-Pugh sistem bodovanja kao što sledi:

Child-Pugh sistem bodovanja

Mera 1 tačka 2 tačke 3 tačke

Bilirubin (ukupno) <34 (<2) 34-50 (2-3) >50 (>3)

µmol/l (mg/dl)

Serum albumin >35 28-35 <28

g/l

INR <1,7 1,71-2,20 >2,20

Ascit Nijedan Blagi Teški

Hepatična Nijedan I-II stepen (ili potisnut lekovima) III-IV stepen (ili vatrostalni) encefalopatija

Test klirensa iz plazme indocijanina pomoću senzora za svetlost vrha prsta može se koristiti kao i sistem bodovanja postoperativne funkcije jetre koji su razvili Schindl et al. (Schindl M et al.2005, Archives of Surgery 140(2):183-189). Ovaj sistem ocenjuje disfunkciju jetre na osnovu nivoa mlečne kiseline, ukupnog bilirubina, INR i postoperativnog encefalopatije. Ukupni rezultati od 0, 1-2, 3-4 ili >4 se koriste za klasifikaciju disfunkcije jetre kao odsutne, blage, umerene ili teške. Dalje, može se proceniti odnos žučne soli i fosfolipida.

Zaštita srca. Primeri životinjskih modela srčane povrede uključuju: modele infarkta miokarda (MI), modele remodeliranja nakon IM, modele genske terapije, modele ćelijske terapije, modele poprečne aortne konstrikcije (TAC), modele akutnog ishemijskog moždanog udara, modele ishemije bubrega i ekstremiteta, Langendorff model perfuzije i model kardiomiopatije izazvane doksorubicinom. Pogledajte takođe, na primer, životinjske modele srčanih povreda koje praktikuje Laboratorija za kardiovaskularna istraživanja, Baltimor, MD.

Mogu se koristiti različite postupke otkrivanja srčanih povreda, uključujući neinvazivno snimanje, kao što je magnetna rezonanca (MRI), ultrazvuk, rendgenska kompjuterizovana tomografija (CT), kompjuterizovana tomografija sa jednim fotonom (SPECT) i/ili pozitronska emisiona tomografija (PET). Dodatne mere mogu uključiti ehokardiografiju, elektrokardiogram, kateter pritiska Mikro-tip, telemetriju, imunohistohemiju i molekularne biološke studije. US patent br.2002/0115936 opisuje postupak i aparat za procenu srčane funkcije praćenjem kretanja traheje.

Poznati testovi srčane funkcije uključuju merenje nivoa PDH, nivoa laktata u plazmi i/ili oksidacije srčanih ugljenih hidrata. Markeri povezani sa neishemičnom povredom srca uključuju: Prekursor alfa-2-HS-glikoproteina (npr. SEQ ID NO: 22); Asporin; ATP sintaza podjedinica delta (mitohondrijska); Epikardijalna supstanca krvnih sudova (npr. SEQ ID NO: 23); C6ORF142; Karboanhidraza 1; Karboanhidraza 3; Ceruloplasmin; Faktor koagulacije IKS; Kolagen alfa-3(VI) lanac; Dermatopontin; Protein ekstracelularnog matriksa 1 koji sadrži EGF sličan fibulinu; fibrinogen gama lanac; fibulin-1; fibulin-2; Protein toplotnog šoka HSP 90-beta (npr. SEQ ID NO: 24); Podjedinica hemoglobina alfa; Podjedinica hemoglobina beta; Ig alfa-1 lanac C region; Ig alfa-2 lanac C region; Ig gama-2 lanac C region; Ig lambda lanac C region; Ig mu lanac C region; Latentno-transformišući faktor rasta β-vezujući protein 2;

Glikoprotein 4 povezan sa mikrofibrilima; Myosin-2; serumski amiloid A protein;

Sorbin i protein 2 koji sadrži SH3 domen (npr. SEQ ID NO: 25); i protein 2 koji sadrži sorbin i SH3 domen (npr. SEQ ID NO: 26).

Markeri povezani sa ishemijskom povredom srca uključuju: Prekursor alfa-2-HS-glikoproteina (npr. SEQ ID NO: 22); Alfa-2-makroglobulin;

Karboanhidraza 1; Podjedinica hemoglobina alfa; Podjedinica hemoglobina beta; Ig alfa-1 lanac C region; Ig alfa-2 lanac C region; Ig mu lanac C region; Leiomodin-1 (npr. SEQ ID NO: 27); MRLC2 regulatornog lakog lanca miozina (npr. SEQ ID NO: 28); Neksilin (npr. SEQ ID NO: 29); Komponentna podjedinica α piruvat dehidrogenaze E1; Serumski amiloid A protein; i somatski oblik.

Zaštita pluća. Životinjski modeli povrede pluća, uključujući akutnu povredu pluća, uključuju indukciju povrede intratrahealnom instilacijom endotoksina (LPS), mehaničku ventilaciju, hipoksemiju, žive bakterije (E. coli), hiperoksiju, bleomicin, oleinsku kiselinu, ligaciju i punkciju slepog creva i kiselinu. Za više informacija u vezi sa modelima povrede pluća, pogledajte Assay Depot, opisan kao najveće svetsko tržište na mreži za farmaceutske istraživačke usluge.

Simptomi povrede pluća uključuju otežano, ubrzano disanje, nizak krvni pritisak i kratak dah. Može se koristiti bilo koja vrsta ispitivanja plućne funkcije. Testiranje plućne funkcije generalno se može podeliti u tri glavne oblasti. Prvi tip plućnog testiranja se generalno naziva spirometrija koja obezbeđuje merenja u smislu zapremine i brzine disanja različitih inspiratornih i ekspirijskih napora pacijenata. Pored toga, različite brzine protoka u različitim fazama testa su takođe vrsta podataka dobijenih spirometrijskim testiranjem. Druga oblast plućnog testiranja je skup procedura dizajniranih da se utvrdi ujednačenost distribucije udahnutog vazduha kroz pluća pacijenta. Na osnovu ovakvih testova, plućna insuficijencija se može utvrditi iako je alveolorna ventilacija pacijenta normalna. Treći tip plućnog testiranja tiče se sposobnosti pluća da difuzuju udahnuti vazduh kroz alveolarne membrane i takvi testovi daju indikaciju sposobnosti pluća da arterializuje vensku krv razmenom kiseonika za ugljen-dioksid.

Volumen disanja se može proceniti korišćenjem uređaja za senzor protoka zapremine koji je povezan sa disajnim putevima subjekta (npr. korišćenjem spirometra ili tahimetra) ili merenjem mehaničkih ekskurzija grudnog koša i abdominalnih zidova. Mogu se koristiti i tehnike koje se oslanjaju na snimke pokreta grudnog koša i trbušnog zida koji su zasnovani ili na meraču naprezanja (snimanje promena dužine obima tela), ili na osnovu elastičnih induktivnih električnih provodnih petlji raspoređenih oko grudnog koša i abdomena pacijenta. Snimci induktivnosti petlji se zatim mogu koristiti za procenu veličine varijacija površine poprečnog preseka grudnog i trbušnog dela. US patent broj 4,308,872 je primer ove tehnologije za procenu petlje samoinduktivnosti. Takvi postupci se mogu koristiti za kvantitativna merenja respiratornih zapremina nakon postupka kalibracije.

Testovi plućne funkcije mogu uključivati merenje zapremine disanja, gasova arterijske krvi i/ili gradijenta Aa O2.

Zaštita od sepse. Sepsu, ili sindrom sistemskog inflamatornog odgovora (SIRS), karakteriše inflamatorno stanje celog tela uz prisustvo infekcije. Sepsa može dovesti do groznice, ubrzanog disanja i niskog krvnog pritiska i može da povredi sve organe uključujući organe kardiovaskularnog, imunološkog i endokrinog sistema.

Životinjski modeli sepse uključuju sepsu izazvanu ligacijom slepog creva i punkcijom (CLP) samu ili u kombinaciji sa instilacijom bakterija (npr.

Pseudomonas aeruginosa ili Streptococcus pneumoniae). Životinjski modeli sepse takođe uključuju intravensku ili intraperitonealnu primenu agensa nalik receptoru (TLR) kao što je lipopolisaharid (LPS ili endotoksin) ili zimosan. Drugi modeli sepse uključuju peritonitis uzlaznog stenta debelog creva i imunostimulativne modele u kasnoj fazi. Za više informacija u vezi sa modelima sepse, pogledajte Assay Depot, opisan kao najveće svetsko tržište na mreži za farmaceutske istraživačke usluge.

Zaštita od sepse može se potvrditi merenjem krvnog pritiska, gasova u krvi, merenja citokina i funkcije sekundarnih organa kao što je opisano na drugom mestu (npr. funkcija pluća, jetre, srca, bubrega).

Referentni primer 1. Zaštita bubrega. Podaci opisani na SL.1-4 i tabele 1-7 su prikupljene korišćenjem sledećih protokola:

Glicerol model AKI. Ovo je široko korišćen model AKI izazvanog rabdomiolizom koji se koristi širom sveta već 50 godina. Model je korišćen za testiranje da li profilaktičke intervencije pružaju zaštitu od AKI. U suštini, protokol je sledeći: Proučavani su mužjaci CD-1 miševa (35-45 grama), dobijeni iz Charles River Laboratories, Wilmington, MA. Miševi su održavani u standardnim uslovima vivarijuma i generalno smešteni 1-3 nedelje pre studije. Miševi su stavljeni u cilindrični kavez za zadržavanje, a zatim im testna supstanca ubrizgana u repnu venu (vidi dole) ili nosač testne vehikule. Miševi su zatim vraćeni u svoje kaveze. Osamnaest sati (sati) kasnije, miševi su nakratko anestezirani inhalacijom izoflurana, i data im je intramuskularna injekcija hipertoničnog (50%) glicerola u dozi od 9 ml/kg telesne težine. Doza je podeljena na dva dela, pri čemu se polovina ubrizgava u mišiće svakog od zadnjih udova. Miševi su zatim vraćeni u svoje kaveze. Osamnaest sati kasnije, miševi su duboko anestezirani pentobarbitalom (50-100 mg/kg), trbušna šupljina je otvorena kroz središnji abdominalni rez, uzet je uzorak krvi iz šuplje trbušne vene i resecirani su bubrezi. Dobijen je poprečni presek bubrega i fiksiran u formalinu za naknadnu histološku analizu. Terminalni uzorci krvi su analizirani na BUN i kreatinin, korišćenjem komercijalno dostupnih kompleta za analizu. Preostalo bubrežno tkivo je podvrgnuto kortikalnoj disekciji, a kortikalna tkiva su zatim ekstrahovana za protein i RNA. Uzorci proteina su sačuvani za analizu nivoa HO-1, a uzorci RNA su podvrgnuti RT-PCR da bi se kvantifikovala HO-1 mRNA kao i nivoi drugih mRNA gena za stres (npr. NGAL, haptoglobin, hemopeksin, hepicidin).

Priprema testa: Liofilizovani konjski skeletni mišić (mioglobin) (Sigma Chemicals) je korišćen kao test agens.

Mioglobin SnPP: U 5 mg suvog mioglobina je dodato 0,9 ml PBS 0,1 ml osnovnog rastvora SnPP (50 umola/ml). Dobijene konačne koncentracije bile su 5 mg/ml mioglobina 5 umola/ml SnPP. U repnu venu je ubrizgano 200 ul ovog rastvora, što je jednako 1 mg mioglobina 1 umol SnPP.

Nitritirani mioglobin: Na nitrit je dodat mioglobinu da bi se postigao odnos 1-5 mol/mol prema mioglobinu (npr.1-5 umol nitrita/1 umol mioglobina). Dobijene konačne koncentracije bile su 5-10 mg/ml mioglobina 0,04-0,4 mg/ml nitrita. U repnu venu je ubrizgano 200 ul ovog rastvora.

Mioglobin PEG: U osnovni rastvor od 20 mg/ml Mgb u PBS je dodato 100 mg/ml PEG-6000; 0,250 ul. Ovo je primenjeno kao subkutana injekcija u dorzalni vrat (ukupna injekcija od 250 ul). Za kombinovani Mgb/PEG SnPP, SnPP je dodat gore navedenom u koncentraciji od 3 mg/ml.

Ovo su testni materijali koji se daju miševima da bi se procenila zaštita od glicerol AKI modela, kao što je gore navedeno.

Nezavisni efekti svakog test agenta: Da bi se procenilo da li je mioglobin SnPP imao veći efekat od samog mioglobina ili samog SnPP, kreirana su ista rešenja kao što je gore navedeno: mioglobin SnPP; SnPP sam, ili sam mioglobin. Oni su korišćeni u gore pomenutom modelu glicerola.

Četiri sata nakon samo eksperimenta mioglobin protiv mioglobina SnPP u odnosu na SnPP. Da bi se potvrdilo da mioglobin SnPP ima sinergistički efekat u indukovanju nivoa HO-1 mRNA i HO-1 proteina, svaka od gornjih kombinacija je primenjena sama putem injekcije u repnu venu. Četiri sata kasnije, miševi su žrtvovani kao što je gore navedeno, a bubrezi su sakupljeni za

4

procenu nivoa HO-1 mRNA i proteina. Za dodatne informacije u vezi sa postupcima, vidi Zager et al., Am J Physiol Renal Physiol.30. juli 2014. Pii.

Tabela 1. SnPP učetvorostručava količinu indukcije HO-1 mRNA 4 sata nakon injekcije u odnosu na sam mioglobin (HO-1 / GAPDH mRNA)

Kao što je prikazano u tabeli 2, u vremenskoj tački od 4 sata, postoji preferencijalno povećanje ekspresije proteina HO-1 (pomoću ELISA). S obzirom na to da je prošlo samo 4 sata nakon injekcije, povećanje mRNA je veće od povećanja proteina jer sinteza proteina mora da prati indukciju mRNA, što zahteva više vremena.

Tabela 2. Preferencijalno povećanje ekspresije proteina HO-1 (pomoću ELISA) u vremenskoj tački od 4 sata (korteks: ng HO-1 / mg proteina)

Tabela 3 prikazuje indukciju HO-1 mRNA otprilike 18 sati (preko noći) nakon injekcije u odnosu na sam mioglobin (HO-1 / GAPDH mRNA) u odnosu na mioglobin u kombinaciji sa SnPP.

Tabela 3. Indukcija HO-1 mRNA preko noći nakon injekcije sa kontrolom (PBS), sam mioglobin (HO-1 / GAPDH mRNA) i mioglobin u kombinaciji sa SnPP.

Tabela 4 prikazuje indukciju proteina HO-1 otprilike 18 sati (preko noći) nakon kontrolne injekcije u odnosu na sam mioglobin (HO-1 / GAPDH mRNA) naspram mioglobina u kombinaciji sa SnPP.

Tabela 4. Indukcija proteina HO-1 preko noći nakon kontrolne injekcije, sam mioglobin (HO-1 / GAPDH mRNA) i mioglobin u kombinaciji sa SnPP.

SL. 1A i 1B pokazuju ekspresiju HO mRNA (SL.1A) i ekspresiju proteina (SL. 1B) nakon vehikuluma (kontrola), mioglobina (Mgb) ili mioglobina u kombinaciji sa primenom SnPP (Mgb SnPP) 18 sati pre inzulta glicerolom. Podaci ukazuju da postoji potenciranje mioglobin indukovane indukcije HO-1 uz istovremeni tretman SnPP.

Tabela 5 pokazuje indukciju ekspresije proteina haptoglobina nakon izlaganja samo mioglobina ili mioglobina u kombinaciji sa PEG u poređenju sa kontrolom nosača. Podaci pokazuju da mioglobin PEG indukuju daleko veće povećanje ekspresije citoprotektivnog haptoglobina nego sam mioglobin.

Tabela 5. Ekspresija proteina haptoglobina 4 sata nakon SQ injekcije.

Kontrola Sam mioglobin Mioglobin PEG

9,5 ±-2,9 ng/mg proteina 32,7 ± 6,3 ng/mg proteina 118,8 ±20 ng/mg proteina p<001 u odnosu na kontrolu; p<0,025 u odnosu na sam mioglobin

Tabela 6 pokazuje nivoe LDH u plazmi – osetljivog markera oštećenja jetre, bubrega, pluća i srca. Mioglobin SnPP nisu izazvali povećanje LDH u vremenskoj tački od 4 sata.

Tabela 6. Mioglobin SnPP Ne izaziva povećanje LDH u vremenskoj tački od 4 sata (Plazma: Apsorpcija U LDH/ml)

4

globin i

SL. 2 leve panele pokazuju ćelijsko oštećenje bubrega nakon inzulta glicerolom i SL.2 desne panele pokazuju zaštitni efekat prethodnog tretmana sa mioglobinom u kombinaciji sa SnPP.

SL. 3 pokazuje da N-Mgb SnPP prvenstveno podižu zaštitni protein stresa, interleukin-10 (IL-10).

SL. 4 pokazuje da N-Mgb SnPP podiže zaštitni protein

stresa, haptoglobin.

Referentni primer 2. Hepatična zaštita. Hepatotoksična povreda je procenjena nivoima LDH u plazmi 24 sata nakon inzulta. Inzult jetre je uključivao injekciju glicerola od 9 ml/kg (ovo je isti model koji se koristi za izazivanje povrede bubrega). Povreda jetre podigla je LDH u plazmi sa 3,5 na 114 jedinica/ml. Sa prethodnim tretmanom mioglobin/SnPP, nivoi LDH u plazmi su smanjeni za 75%.

Tabela 7. Hepatotoksična povreda je procenjena nivoima LDH u plazmi 24 sata nakon inzulta.

Subjekt br. Kontrola Povreda jetre Povreda jetre mioglobin SnPP 1 3,7 4,4

2 2,1 130,1 10,4

Subjekt br. Kontrola Povreda jetre Povreda jetre mioglobin SnPP

3 3,9 69,5 20,9

4 4,1 87,5 60,2

5 128,3 38,9

6 155,4 61,3

Srednja vrednost 3,5 114,2 32,7

Sati greška 0,5 15,6 10,1 Neupareni t test (povreda /-p<0,0014 mioglobin SnPP)

Podaci opisani u Primerima 1 i 2 pokazuju da hem protein, modifikovani hem protein i hem protein u kombinaciji sa inhibitorom degradacije hem proteina štite bubrege i jetru od povreda usled inzulta glicerola. Zaštita se dokazuje putem markera povrede (LDH), funkcije organa (BUN i kreatinin) i indukcije zaštitnih proteina stresa (HO-1 i haptoglobina).

Referentni primer 3. SL.5 prikazuje procenu uticaja vezivanja ekvimolarnog nitrita za mioglobin Fe na ekspresiju toksičnosti mioglobina. HK-2 ćelije (proksimalna ćelijska linija tubula izvedena iz normalnog ljudskog bubrega) su inkubirane u medijumu bez seruma keratinocita ili u normalnim (kontrolnim) uslovima ili u prisustvu 10 mg/ml mioglobina konjskih skeletnih mišića ili nitritiranog mioglobina (proizveden ekvimolarnim dodatkom natrita u 10 mg/ml mioglobina). Posle 18 sati inkubacije, težina oštećenja ćelije (% smrti ćelije) procenjena je MTT testom. Mioglobin je izazvao 40% ćelijske smrti (40% smanjenje unosa MTT ćelija), u poređenju sa kontrolnim inkubiranim ćelijama. Vezivanje nitrita za mioglobin smanjilo je smrt ćelije za 75%. Dakle, vezivanje nitrita može da smanji citotoksične efekte mioglobina.

SL. 6 prikazuje odnos doza-odgovor između hem oksigenaze 1 u plazmi (HO-1) i primenjene doze N-mioglobina. Normalnim miševima je ubrizgano IM sa 0, 1, 2 ili 5 mg/kg nitritovanog mioglobina SnPP (konstantna doza od 1 µmola). Osamnaest sati kasnije, nivoi HO-1 u plazmi su procenjeni pomoću ELISA. Primećen je oštar odnos doza-odgovor između primenjene doze N-

4

mioglobina i nivoa HO-1 u plazmi. Dakle, HO-1 test ima potencijalnu biomarkersku korisnost za indukciju HO-1 izazvane N-Mgb/SnPP.

SL. 7 pokazuje održavanje normalnih nivoa kreatinina u serumu preko 25-struke varijacije u dozi N-mioglobina. Miševi su podvrgnuti supkutanoj infuziji u trajanju od 2 sata od 1, 3, 6, 12 ili 25 mg/kg nitritovanog mioglobina (sa držanjem SnPP u konstantnoj dozi od 1 µmola). Osamnaest sati kasnije, potencijalno oštećenje bubrega je procenjeno merenjem serumskih koncentracija kreatinina. Nije primećeno značajno povećanje ni pri jednoj od doza N-Mgb, što ukazuje na nedostatak prekomerne toksičnosti (n, 2-4 miša/grupi).

Referentni primer 4. Uvod. Akutna povreda bubrega (AKI) je dobro poznat faktor rizika za morbiditet, mortalitet i početak hronične bolesti bubrega (CKD; Ishani i dr. J Am Soc Nephrol 2009;20:223-8; Xue et al. J Am Soc Nephrol 2006;17:1135-42; Liangos et al. Clin J Am Soc Nephrol 2006;1:43-51; Wald et al. JAMA 2009; 302:1179-85; Goldberg et al. Kidnei Int 2009;76:900-6). Međutim, trenutno ne postoje dokazani načini za sprečavanje AKI. Dobro je utvrđeno da nakon početnog napada ishemijske ili toksične povrede, bubreg razvija izraženu otpornost na naknadna oštećenja (npr. Honda et al. Kidney Int 1987;31:1233-8; Zager et al. Kidney Int 1984;26:689-700; Zager et al. Lab Invest 1995;72:592-600; Zager, Kidney Int 1995;47:1336-45; Zager, Kidney Int 1995;47:628-37). Ovaj fenomen, koji je delimično posredovan povećanjem citoprotektivnih i antiinflamatornih „stresnih“ proteina (npr. hem oksigenaza 1 (HO-1), feritin, haptoglobin, hemopeksin, alfa 1 antitripsin, interleukin 10 (IL-10) se naziva

„ishemično predkondicioniranje“ ili stanje „stečene citorezistencije“. Zager et al. J Am Soc Nephrol 2014;25:998-1012; Deng et al. Kidney Int 2001;60: 2118-28; Zarjou et al. J Clin Invest 2013;123:4423-34; Nath et al. J Clin Invest 1992;90:267-70; Zager et al. Am J Physiol 2012;303:F1460-72; Fink, J Leukoc Biol 2009;86:203-4 Arredouani et al. Immunology 2005;114:263-71; Blum et al. J Am Coll Cardiol 2007; 49:82-7; Galicia et al. Eur J Immunol 2009;39:3404-12; Zager et al. Am J Physiol 2012;303:F139-48; Zager et al. PLoS One 2014;9:e9838; Hunt i Tuder, Curr Mol Med 2012;12:827-35; Janciauskiene et al. J Biol Chem 2007;282:8573-82.

4

S obzirom na duboku zaštitnu prirodu stečene citorezistencije, istraživači su tražili načine da je bezbedno rekapituliraju kod ljudi. Značajno u ovom pogledu je takozvano „prekondicioniranje na daljinu“, pri čemu se ponavljajući napadi ishemije gornjih i donjih ekstremiteta indukuju periodičnim naduvavanjem i spuštanjem manžeta za krvni pritisak. Yang et al. Am J Kidney Dis 2014;64:574-83; Mohd et al. J Surg Res 2014;186:207-16; Li et al. J Cardiothorac Surg 2013;8:43. Cilj je da se u sistemsku cirkulaciju otpuste nepoznati tkivni „faktori kondicioniranja“ koji će pokrenuti reakcije zaštitnog tkiva (npr. u mozgu, srcu, jetri i bubrezima). Uprkos svojoj privlačnosti, ovaj pristup je imao samo sumnjiv uspeh, verovatno iz sledećih razloga: (1) nepoznati su „faktori“ oslobođeni iz postishemičnih udova koji bi mogli da izazovu „predkondicioniranje“ i koliko je oslobađanje faktora potrebno da bi se izazvalo ovo stanje; (2) ćelijski putevi kojima takvi faktori utiču na udaljene organe da bi izazvali citorezistenciju nisu definisani; i (3) nemoguće je proceniti da li se željena preduslovljanost zaista razvija kod bilo kog pojedinca.

Tražen je alternativni pristup za izazivanje stečene citorezistencije. U tom cilju, farmakološki režim koji uključuje niske doze nitritiranog mioglobina (N-Mgb) kalajni protoporfirin (SnPP), koji značajno i sinergistički regulišu mnoštvo citoprotektora bubrežnih tubularnih ćelija (npr. HO-1, haptoglobin i IL-10) u odsustvu očigledne bubrežne ili ekstrarenalne toksičnosti je razvijena. U roku od 18 sati od primene agensa, rezultuje upečatljiva rezistencija na nefrotoksični AKI, AKI izazvan deplecijom adenozin trifosfata (ATP) i progresija posle AKI do CKD. Pored toga, izražena je zaštita jetre od postishemičnih i toksičnih povreda. Na kraju, primećeno je da se indukcija ovog citorezistentnog stanja može meriti neinvazivno korišćenjem nivoa HO-1 u plazmi i haptoglobina kao „biomarkera“ njegove indukcije.

Postupci. Opšti pristup. Životinje. Svi eksperimenti su sprovedeni korišćenjem muških CD-1 miševa (35-45 g; Charles River Laboratories, Wilmington, Massachusetts). Bili su smešteni u standardnim uslovima vivarijuma sa slobodnim pristupom hrani i vodi. Korišćene protokole je odobrio Institucijski komitet za brigu o životinjama i korišćenje institucionalnih uslova (IACUC) u skladu sa smernicama Nacionalnog instituta za zdravlje.

4

Reagensi koji indukuju citorezistenciju. Skeletni mišić konja (#Mb0360; Sigma) je korišćen kao primarni agens za indukciju citorezistencije. Međutim, pošto mioglobin (Mgb) ima inherentni nefrotoksični potencijal (naročito u uslovima smanjene zapremine i acidurije), korišćena su dva pristupa za ublažavanje potencijalnih štetnih efekata Mgb. Prvo, Mgb je pretvoren u nitritovani oblik dodavanjem ekvimolarne količine natrijum (Na) nitrita. U tom smislu, nitrit je ambidentatni molekul koji se direktno vezuje za mioglobin Fe u odnosu 1:1 bilo preko kiseonika ili azotne komponente. Cotton et al. Advanced inorganic chemistry. Hobocken, NJ: Wiley-Interscience, 1999:1355; Silaghi-Dumitrescu et al. Nitric Oxide 2014; 42C:32-9.

Važno je napomenuti da je Fe dominantni posrednik Mgb citotoksičnog efekta, (Zager et al. J Clin Invest 1992;89:989-95; Zager i Burkhart, Kidney Int 1997;51:728-38) i ova toksičnost je značajno smanjena prethodnim vezivanjem nitrita. Rassaf et al. Circ Res 2014;114:1601-10; Totzeck et al. Circulation 2012;126:325-34 [J Clin Invest 1992;89: 989-95]; Totzeck et al. PLoS One 2014;22:e105951; Hendgen-Cotta et al. Proc Natl Acad Sci US A 2008;105:10256-61.

Pored svoje sposobnosti da smanji toksičnost posredovanu Fe, nitrit je impliciran kao posrednik u „daljinskom predkondicioniranju“, verovatno kroz stvaranje azotnog oksida (NO). Rassaf, supra. U tom smislu, hem proteini direktno smanjuju nitrit, sa rezultujućom proizvodnjom NO. Juncos et al. Am J Pathol 2006;169:21-31; Kellerman, J Clin Invest 1993;92:1940-9; Zager et al. Am J Physiol 2008;294:F187-97. Dakle, vezivanjem nitrita direktno za Mgb, injekcija Mgb sa naknadnim unosom endocita u proksimalni tubul, dovodi do direktnog ciljanja nitrita u proksimalni tubul i NO.

Drugo, da bi hem Fe indukovao većinu svoje citotoksičnosti, on se prvo mora osloboditi sa mesta sekvestracije unutar porfirinskog prstena. Ovo oslobađanje Fe je posredovano cepanjem porfirinskog prstena preko HO-1. Dakle, da bi se ublažila potencijalna citotoksičnost Mgb, davan je zajedno sa prolaznim inhibitorom HO-1, SnPP. S tim u vezi, ranije je objavljeno da dodavanje SnPP u kultivisane ćelije proksimalnog tubula (HK-2) izložene Mgb ili in vivo segmentima proksimalnih tubula miša napunjenim hemom smanjuje toksičnost Mgb za čak 85%. Zager i Burkhart, Kidney Int 1997;51:728-38. Ovo citoprotektivno dejstvo je dalje indicirano zapažanjima da SnPP može ublažiti postishemično akutnu

4

bubrežnu insuficijenciju (ARF). Juncos et al. Am J Pathol 2006;169:21-31; Kaizu et al. Kidney Int 2003;63:1393-403.

Uticaj Mgb, SnPP i Mgb 1 SnPP na signalizaciju bubrežnog kortikalnog hema. Pretpostavljeno je da bi (1) N-Mgb bio moćan signalni molekul, što bi dovelo do regulacije elemenata koji reaguju na hem i gena osetljivih na redoks, koji izazivaju citoprotektivne aktivnosti (npr. HO-1, haptoglobin, hemopeksin i IL-10); (2) SnPP može nezavisno da reguliše takve gene; i (3) kada se daju zajedno, N-Mgb SnPP zajednička primena može dovesti do aditivnog ili sinergističkog signaliziranja elementa koji reaguje na hem. Sledeći eksperiment je testirao ove hipoteze.

Trideset dva miša su podeljena u 4 jednake grupe: (1) kontrolni miševi; (2) miševi tretirani sa 1 mg N-Mgb injekcije (kao bolus kroz repnu venu); (3) miševi tretirani sa 1 mmol SnPP (preko repne vene); i (4) miševi tretirani kombinovanim N-Mgb 1 SnPP. Posle 4 sata (n = 16) ili 18 sati (n = 16), miševi su duboko anestezirani pentobarbitalom (50 mg/kg), abdomen je otvoren kroz središnji abdominalni rez, a bubrezi su uklonjeni. Da bi se utvrdili potencijalni efekti na vanbubrežne organe, uklonjeni su i režanj jetre i srce. Tkiva su zaleđena i zatim ekstrahovana za protein i RNK (RNeasy Plus Mini; Qiagen, Valencia, California) i podvrgnuti testu imunosorbenta vezanog enzima (ELISA) i lančanoj reakciji polimeraze reverzne transkriptaze (RT-PCR) za HO-1, haptoglobin i IL-10 protein informaciona RNA (mRNA). Zager et al. J Am Soc Nephrol 2014;25:998-1012; Zager et al. Am J Physiol 2012;303:F139-48. Kao procena bubrežne funkcije, kontrolnim miševima i 18 sati nakon N-Mgb SnPP-tretiranih miševa izmereni su nivoi azota uree u krvi (BUN) i kreatinina u plazmi. Pored toga, poprečni preseci bubrega fiksirani sa 10% formalinom (3 mM) su isečeni i obojeni hematoksilinom i eozinom (H&E) i periodičnom kiselinom Schiff (PAS) da bi se dalje procenila potencijalna povreda.

Procene citorezistencije. Glicerol model AKI izazvanog rabdomiolizom. Dvadeset miševa je podeljeno u 4 jednake grupe (kontrole, miševi tretirani sa N-Mgb, SnPP, i miševi tretirani injekcijama u repnu venu N-Mgb SnPP) kao što je prethodno opisano. 18 sati kasnije, miševi su nakratko anestezirani izofluranom i odmah im je ubrizgano 9 mk/kg 50% glicerola, primenjenih u podjednako podeljenim dozama u svaki zadnji ekstremitet.18 sati nakon injekcije glicerola,

4

miševi su anestezirani pentobarbitalom, otvoren je abdomen, uzet je uzorak krvi za BUN i procene kreatinina iz šuplje vene, a bubrezi su resecirani. Kontrolna grupa nakon glicerola i grupa sa glicerolom prethodno tretirana N-Mgb SnPP imale su preseke bubrega obojene H&E.

Maleatski model AKI. Kada se ubrizgava u glodare, maleat se podvrgava selektivnom preuzimanju proksimalnih tubula preko organskih anjonskih transportera i indukuje duboko, iscrpljivanje ATP specifično za proksimalne tubule. Kellerman, J Clin Invest 1993;92:1940-9; Zager et al. Am J Physiol 2008;294:F187-97. Ovo kulminira teškim AKI. Sledeći eksperiment je procenio da li predtretman N-Mgb SnPP može da zaštiti od ovog oblika oštećenja bubrega. Dvanaest miševa je podeljeno u 2 jednake grupe, koje su primile ili N-Mgb-SnPP ili injekciju vehikule. Osamnaest sati kasnije, svi su primili intraperitonealnu (IP) injekciju Na maleata (600 mg/kg). Zager et al. Am J Physiol 2008;294:F187-97. 18 sati kasnije, miševi su anestezirani, a završni uzorci krvi su uzeti iz donje šuplje vene za merenje BUN i kreatinina.

Postishemična progresija AKI do CKD. Nakon 30 minuta jednostrane bubrežne ishemije, oštećeni bubreg prolazi kroz tranziciju u CKD, što se manifestuje progresivnim tubularnim ispadanjem, intersticijalnim zapaljenjem i fibrozom, što kulminira gubitkom mase bubrega od 40% (težine bubrega). Zager et al. Am J Physiol 2011;301:F1334-45; Zager et al. Kidney Int 2013;84:703-12. Da bi se utvrdilo da li tretman N-Mgb-SnPP može ublažiti progresiju postishemične bolesti, 6 miševa je prethodno tretirano ovim agensima i 18 sati kasnije su anestezirani pentobarbitalom i podvrgnuti 30-minutnoj okluziji leve bubrežne pedikule koja je izvedena kroz srednji abdominalni rez na telu temperature od 37°C.

Desni bubreg je ostao netaknut. Nakon perioda bubrežne ishemije, vaskularna stezaljka je uklonjena i potpuna reperfuzija je potvrđena gubitkom bubrežne cijanoze. Miševi su zatim zašiveni i ostavljeni da se oporave od anestezije. Šest miševa, podvrgnutih istom hirurškom protokolu, ali bez prethodnog tretmana N-Mgb-SnPP, služilo je kao kontrola. Dve nedelje kasnije, abdominalni rez je ponovo otvoren i bubrezi su resekirani. Relativni stepen oštećenja bubrega između 2 grupe je procenjen gubitkom mase levog bubrega (kako je određeno vlažnom težinom bubrega) u odnosu na težinu levog bubrega kod 6 normalnih miševa. Nivoi mRNA lipokalina (NGAL) i proteina povezani sa neutrofilnom želatinazom bubrega su takođe procenjeni kao dodatni markeri oštećenja bubrega.

Odnosi doza-odgovor nakon IP N-Mgb-SnPP injekcija. Da bi se procenilo da li sporija brzina isporuke N-Mgb-SnPP (u poređenju sa intravenskom [IV] bolus injekcijom) takođe izaziva pojačanu regulaciju citoprotektivnih proteina i bubrežne citorezistencije, miševima je ubrizgano 0, 1, 2,5 ili 5 mg N- Mgb 1 standardna doza SnPP (1 mmol) (po 3 miša; 1 ml fiziološke vehikule). Osamnaest sati kasnije, miševi su anestezirani pentobarbitalom, uzet je uzorak krvi, a bubrezi su resecirani da bi se odredili nivoi HO-1 i mRNK haptoglobina i proteina. Da bi se testiralo da li su nivoi HO-1 i haptoglobina u plazmi porasli i odražavali stepene regulacije bubrežnog HO-1 i haptoglobina, takođe su određeni nivoi HO-1 i haptoglobina u plazmi.

Da bi se procenilo da li su prethodno utvrđeni nivoi HO-1 i haptoglobina u plazmi i bubrezima u korelaciji sa stepenom citorezistencije, dodatnim miševima je ubrizgano 0, 2,5 ili 5 mg N-Mgb 11 mmol SnPP (n = 3 miša po grupi).

Osamnaest sati kasnije, svi miševi su podvrgnuti modelu glicerola AKI kao što je prethodno opisano. Ozbiljnost AKI je određena 18 sati nakon injekcije glicerola pomoću BUN i analiza kreatinina u plazmi.

Eksperimenti sa ishemijom jetre. Četrnaest miševa je podvrgnuto prethodno objavljenom modelu delimične ishemije jetre, koji se sprovodi okluzijom krvotoka (na trijadi portala) do 3 od 5 jetrenih režnja tokom 25 minuta. Zager et al. Am J Physiol Renal Physiol 2014;307:F856-68. Polovina miševa je prethodno tretirana 18 sati ranije sa 1 mg N-Mgb 1 mmol SnPP kao što je prethodno opisano. Reperfuzija nakon ishemijskog perioda je procenjena vraćanjem normalne boje jetre u 3 uključena režnja jetre. Osamnaest sati kasnije, miševi su ponovo anestezirani, trbušna šupljina je ponovo otvorena i uzet je završni uzorak krvi za nivoe alanin aminotransferaze (ALT) i laktat dehidrogenaze (LDH) u plazmi kao markera postishemijskog oštećenja jetre.

Hepatotoksična povreda. Da bi se procenilo da li N-Mgb-SnPP može da zaštiti od toksičnog oblika povrede jetre, 12 anesteziranih miševa je primilo injekcije 50% glicerola. Glicerol (8 mg/kg) je dat putem IP injekcije da bi se

1

favorizovao hepatocelularni unos preko portalne cirkulacije. Polovina miševa je prethodno tretirana 18 sati ranije sa N-Mgb-SnPP (1 mg Mgb/1 mmol SnPP) kao što je prethodno opisano. Četiri sata nakon IP injekcije glicerola, kada su miševi još bili anestezirani, žrtvovani su transekcijom šuplje vene abdomena. Stepen akutnog oštećenja jetre meren je koncentracijama ALT u plazmi.

Proračuni i statistika. Sve vrednosti su date kao srednja vrednost 6 standardne greške srednje vrednosti. Statistička poređenja su vršena neparnim Studentovim t testom. Ako su napravljena višestruka poređenja, primenjena je Bonferonijeva korekcija. Ozbiljnost histološke povrede bubrega u modelu AKI sa glicerolom ocenjena je na skali od 11 do 41 (uočena je od najmanje do najozbiljnije tubularne nekroze i formiranja gipsa). Histološki rezultati su upoređeni Wilcoxon testom sume ranga. Statistička značajnost je uzeta kao P vrednost < 0,05.

Rezultati. Funkcija bubrega i histologija nakon IV N-Mgb SnPP injekcije. Ni BUN ni povećanje kreatinina u plazmi nije primećeno 18 sati nakon IV injekcije 1 mg N-Mgb SnPP (BUN, 22 ± 3 u odnosu na 25 ± 3 mg/dl; kreatinin, 0,32 ± 0,03 u odnosu na 0,30 ± 0,04 mg dl; kontrole u odnosu na tretman Mgb/SnPP, respektivno). Štaviše, nije bilo dokaza o morfološkoj povredi bubrega kao što je dokazano PAS ili H&E bojenjem. Konkretno, u grupi koja je tretirana nije bilo vidljivih dokaza tubularne nekroze ili formiranja hema (vidi SL.8). Proksimalna cevasta ivica četkice kao što je prikazana PAS bojenjem, ostala je potpuno netaknuta (gornja 2 panela). U tom pogledu, mehurići i oticanje proksimalnih tubulnih lumina se smatraju visoko osetljivim svetlosnim mikroskopskim markerima oštećenja tubula. Venkatachalam et al. Kidney Int 1978; 14:31-49; Donohoe et al. Kidney Int 1978;13:208-22. Dakle, ovi podaci ukazuju na to da bubrezi dobro tolerišu IV tretman N-Mgb-SnPP.

Uticaj IV N-Mgb i SnPP, sam i u kombinaciji na ekspresije HO-1, IL-10 i haptoglobina. Procene HO-1 bubrega. Kao što je prikazano na SL.9, levi panel, samo N-Mgb i samo SnPP izazvali su samo skromna povećanja nivoa HO-1 mRNA za 4 sata. Nasuprot tome, 20-struko povećanje HO-1 mRNA primećeno je 4 sata nakon kombinovane injekcije N-Mgb SnPP. Do 18 sati nakon tretmana, ova povećanja mRNA prevedena u izražena povećanja proteina HO-1, koja su 7 puta veća od kontrolnih vrednosti. Nasuprot tome, primećena su samo relativno

2

mala povećanja proteina HO-1 sa samim N-Mgb ili samim SnPP u vremenskoj tački od 18 sati. Da sumiramo, ova 4-časovna povećanja mRNA i 18-časovna povećanja proteina HO-1 ukazuju na sinergistički efekat N-Mgb SnPP na ekspresiju gena HO-1 kore bubrega. (Dodatni HO-1 mRNA [18 sati] i podaci o proteinima [4 sata] su predstavljeni u tabeli 8).

Tabela 8. Vrednosti mRNA bubrega i proteina 4 sata (a) i 18 sati (b) nakon Rx tretmana

Izmerena supstanca Kontrola N-Mgb SnPP SnPP 1 N-Mgb (a) 4 sata nakon Rx tretmana

mRNK bubrega

HO-1 0,61 ± 0,1 3,38 ± 0,38 4,38 ± 0,2810,5 ± 1,23(<0,0001) Haptoglobin 0,20 ± 0,06 1,94 ± 0,31 0,19 ± 0,015,45 ± 1,16 (<0,005) IL-10 0,56 ± 0,20 1,45 ± 0,6 0,39 ± 0,155,18 ± 1,23 (<0,005) HO-1 protein 13,3 ± 1,3 36,1 ± 2,9 22,9 ± 2,6 55,5 ± 3,7 (<0,001) Haptoglobin 7,9 ± 1,9 17,6 ± 1 13,1 ± 1,3 18,9 ± 2,7 (<0,001) IL-10 304 ± 29 265 ± 54 550 ± 86 838 ± 63 (<0,001) (b) 18 sati nakon Rx tretmana

Korteks mRNA bubrega

HO-1 0,61 ± 0,1 0,58 ± 0,18 0,63 ± 0,061,45 ± 0,61 (NS)

Haptoglobin 0,20 ± 0,06 0,24 ± 0,04 0,23 ± 0,080,4 ± 0,19 (NS)

IL-10 0,56 ± 0,20 0,43 ± 0,10 0,18 ± 0,090,57 ± 0,13 (NS)

Proteini bubrega

HO-1 13,3 ± 1,3 30 ± 6 18 ± 2 71 ± 10 (<0,001)

Haptoglobin 10,3 ± 2,7 183,8 ± 20,4 53,5 ± 17,2203 ± 8 (<0,0001) IL-10 304 ± 29 292 ± 54 454 ± 51 840 ± 60 (<0,001) Skraćenice: HO-1, hem oksigenaza 1; IL-10, interleukin 10; mRNA, informaciona RNA; N-Mgb, nitritovani mioglobin; NS, nije značajno; Rx, tretman; SnPP, kalajni protoporfirin. Individualni nivoi bubrežne kortikalne mRNK i proteina izazvani ispitivanim agensima koji su primenjeni sami ili u kombinaciji 4 sata (a) i 18 sati (b) nakon injekcije.

Procene IL-10 bubrega. Kao što je prikazano na SL. 10, levi panel, sam N-Mgb i sam SnPP su imali ili minimalan ili nikakav uticaj na nivoe IL-10 mRNA u vremenskoj tački od 4 sata. Nasuprot tome, kombinovani N-Mgb SnPP izazvali su 10-struko povećanje IL-10 mRNA 4 sata nakon injekcije. Ovim rezultatima odgovaralo je odsustvo povećanja proteina IL-1018 sati nakon samog N-Mgb ili samo SnPP injekcije. Suprotno tome, >2-struko povećanje IL-10 proteina primećeno je 18 sati nakon kombinovane injekcije N-Mgb-SnPP. (Dodatni IL-10 mRNA [18 sati] i podaci o proteinima [4 sata] su predstavljeni u tabeli 8).

Procene bubrežnog kortikalnog haptoglobina. Kao i kod HO-1 i IL-10, kombinacija N-Mgb SnPP je izazvala najveće povećanje mRNA haptoglobina 4 sata nakon injekcije agensa (SL.11).18 sati nakon injekcija, primećeno je masivno (20 puta) povećanje nivoa proteina haptoglobina u kortikalnom bubregu kao odgovor na injekciju N-Mgb-SnPP. Međutim, nivoi proteina haptoglobina su uporedivo povećani sa samim N-Mgb u vremenskoj tački od 18 sati. Ovo implicira da je N-Mgb komponenta kombinovane terapije dovela do 18-časovnog povećanja proteina haptoglobina. (S obzirom na ovo ogromno povećanje, moguće je da kombinovana terapija ne bi mogla izazvati dodatno povećanje). Dodatni podaci o mRNA haptoglobina (18 sati) i podaci o proteinima (4 sata) su predstavljeni u tabeli 8.

Uticaj samo IV N-Mgb, samog SnPP i N-Mgb SnPP na težinu modela glicerol AKI. Kao što je prikazano na SL.12, samo predtretman samo SnPP praktično nije imao uticaja na težinu AKI izazvanog glicerolom. Sam N-Mgb indukovao je skromnu zaštitu prema nivoima BUN/kreatinina. Međutim, kada su N-Mgb SnPP korišćeni zajedno, primećena je potpuna funkcionalna zaštita (nivoi BUN/kreatinina su ostali na normalnim vrednostima). Takođe je primećena istovremena histološka zaštita (3,5 ± 0,25 naspram 1,25 ± 0,25 histoloških rezultata za glicerol u odnosu na grupu tretiranu N-Mgb SnPP; P < 0,05). S tim u vezi, netretirana glicerolna grupa je ispoljila široko rasprostranjenu tubularnu nekrozu i formiranje gipsa kao što je prethodno prikazano. Zager et al. Am J Physiol Renal Physiol 2014;307:F856-68. Ove promene su bile praktično odsutne u predtretman grupi N-Mgb SnPP.

Meleatski AKI model. Kao što je prikazano na SL.13, injekcija maleata izazvala je tešku povredu bubrega, što je označeno izraženim porastom BUN/kreatinina. Predtretman sa N-Mgb SnPP pružio je skoro potpunu zaštitu od ove povrede, što je označeno skoro normalnim nivoima BUN/kreatinina.

4

SL. 14 pokazuje da je kardiotoksičnost izazvana maleatom smanjena prethodnim tretmanom sa N-Mgb SnPP. Miševi su tretirani sa 1 mg/Kg N-mioglobina 1 µmol SnPP ili IV injekcijom vehikule). Osamnaest sati kasnije, 800 mg/Kg maleata je dato IP. Stepen povrede miokarda određen je 18 sati nakon injekcije maleata merenjem koncentracije troponina I u plazmi (ELISA testom). Injekcija maleata izazvala je 10 puta povećanje nivoa troponina u plazmi.

Prethodni tretman sa N-Mgb+SnPP smanjio je povećanje troponina indukovanog maleatom za 75%.

Postishemični AKI model. Do 2 nedelje nakon postishemije, primećeno je smanjenje postishemične mase levog bubrega za 38% kod kontrolnih miševa sa jednostranom ishemijom (SL.15). Nasuprot tome, samo 12% smanjenja je primećeno kod miševa koji su primili profilaktički tretman N-Mgb SnPP (P <0,005). Ovo smanjenje oštećenja bubrega je takođe označeno značajnim smanjenjem nivoa NGAL mRNA i proteina u grupi koja je prethodila tretmanu N-Mgb-SnPP (SL.15).

Odnosi doza-odgovor između nivoa kortikalne funkcije bubrega i nivoa HO-1/haptoglobina u plazmi i stepena zaštite od AKI izazvanog glicerolom. Kao što je prikazano na SL.16, progresivna povećanja doza IP N-Mgb kod normalnih miševa dovela su do progresivnog povećanja nivoa korteksa bubrega i HO-1 i haptoglobina u plazmi. Primećene su značajne korelacije između nivoa HO-1 u plazmi i kortikalne kore bubrega i nivoa haptoglobina (npr. r = 0,82 između nivoa kortikalne i haptoglobina u plazmi). Štaviše, ove rastuće doze N-Mgb bile su povezane sa progresivnom (50%; 100%) zaštitom od glicerol AKI modela (SL. 17). Dakle, ovi podaci impliciraju da stepen povećanja HO-1 ili haptoglobina u plazmi može poslužiti kao biomarkeri indukcije bubrežnih gena izazvanih N-Mgb-SnPP i stepena rezistencije na naknadnu ARF. Uprkos primeni 5 mg N-Mgb (+standardna doza SnPP), nema dokaza o povredi bubrega (normalan BUN, kreatinin; vidi SL.17, desni panel).

Procene jetre. Hepatična ekspresija HO-1, IL-10 i haptoglobina u jetri kao odgovor na injekcije N-Mgb/SnPP. Preklop se povećava u odnosu na kontrolne vrednosti za HO-1, IL-10 i mRNA haptoglobina (4 sata) i za nivoe proteina (18 sati) prikazani su na SL.18, gornji paneli. Primećeno je značajno povećanje u svakom od njih. Pojedinačne vrednosti za svaki agens sam ili u kombinaciji date su u tabeli 9.

Tabela 9. Nivoi mRNA jetre i proteina 4 sata (a) i 18 sati (b) nakon Rx tretmana

Izmerena supstanca Kontrola N-Mgb SnPP SnPP 1 N-Mgb

(a) 4 sata nakon Rx tretmana

mRNK jetre

HO-1 1,1 ± 0,12 1,83 ± 0,33 3,15 ± 0,25 5,66 ± 0,29 (<0,001) Haptoglobin 0,5 ± 0,1 0,98 ± 0,1 0,32 ± 0,02 1,01 ± 0,12 (<0,01) IL-10 0,06 ± 0,02 0,67 ± 0,46 0,14 ± 0,1 1,12 ± 0,64 (<0,001) Proteini jetre

HO-1 protein 10,2 ± 1,2 17 ± 2 7,4 ± 0,7 15,1 ± 1,4 (<0,025) Haptoglobin 115,3 ± 9,6 359,5 ± 39,6 130,0 ± 8,9 351,0 ± 40,7 (<0,001)

IL-10 314 ± 36 286 ± 32 485 ± 47 412 ± 34 (=0,1)

(b) 18 sati nakon Rx tretmana

mRNK jetre

HO-1 1,1 ± 0,12 0,82 ± 0,07 2,56 ± 0,21 2,86 ± 0,4 (<0,001)

Haptoglobin 0,5 ± 0,1 0,91 ± 0,07 0,65 ± 0,17 1,19 ± 0,4 (<0,05)

IL-10 0,06 ± 0,02 0,06 ± 0,02 0,05 ± 0,01 0,06 ± 0,02 (NS)

Proteini jetre

HO-1 protein 10,2 ± 1,2 14,9 ± 0,3 18 ± 2,5 22,9 ± 1,2 (<0,0001) Haptoglobin 115,3 ± 9,6 358,8 ± 32,8 212,0 ± 63,6410 ± 64,3 (<0,001) IL-10 314 ± 36 5988 ± 549 8198 ± 725 8015 ± 225 (<0,001) Skraćenice: HO-1, hem oksigenaza 1; IL-10, interleukin 10; mRNA, informaciona RNA; N-Mgb, nitritovani mioglobin; NS, nije značajno; Rx, tretman; SnPP, kalajni protoporfirin. Individualni nivoi mRNA i proteina jetre izazvani ispitivanim agensima koji su primenjeni sami ili u kombinaciji 4 sata (a) i 18 sati (b) nakon injekcije.

4 sata nakon injekcije, nivoi HO-1, IL-10 i mRNA u jetri bili su značajno viši kod kombinovane injekcije N-Mgb SnPP u odnosu na bilo koji od agensa samostalno (Tabela 9). Ovo je dovelo do većeg povećanja hepatičnog HO-1, IL-10 i proteina haptoglobina kako je procenjeno u vremenskoj tački od 18 sati (P <0,001 za svaki protein u odnosu na kontrolno tkivo).

Model ishemije jetre. Hepatična ishemija je izazvala značajno povećanje koncentracija ALT i LDH u plazmi (vidi SL.19). Povećanja LDH i ALT su smanjena za 75% i 50%, respektivno, uz prethodnu obradu N-Mgb SnPP (što odgovara povećanju hepatičnog HO-1, haptoglobina i IL-10 proteina; Tabela 9). Kao što je prikazano na SL.20 (gore), uočena je rasprostranjena nekroza u velikim delovima postishemične jetre. Predtretman sa N-Mgb SnPP doveo je do mnogo normalnijeg izgleda jetre (SL.20 (dole)).

Hepatotoksična povreda. Kao što je prikazano na desnom panelu SL.

19, tretman N-Mgb SnPP takođe je smanjio stepen povrede jetre izazvane IP glicerolom, procenjeno na osnovu nivoa ALT u plazmi.

Srčani nivoi HO-1, IL-10 i mRNK haptoglobina i proteina. Kao što je prikazano na dnu SL.18, kombinovani N-Mgb SnPP izazvali su 3- do 4-struko povećanje mRNA HO-1, haptoglobina i IL-10 za 4 sata, i do 3- do 15-struko povećanje nivoa njihovih proteina na 18-satnoj vremenskoj tački. Pojedinačne vrednosti su date u tabeli 10.

Tabela 10. Nivoi srčane mRNA i proteina 4 sata (a) i 18 sati (b) nakon Rx tretmana

Izmerena supstanca Kontrola N-Mgb SnPP SnPP N-Mgb (a) 4 sata nakon Rx tretmana

Srčana mRNA

HO-1 0,07 ± 0,01 0,09 ± 0,01 0,14 ± 0,01 0,3 ± 0,01 (<0,001) Haptoglobin 0,31 ± 0,07 0,75 ± 0,10 0,52 ± 0,21 1,32 ± 0,22 (<0,002) IL-10 0,36 ± 0,10 0,86 ± 0,11 0,58 ± 0,16 0,96 ± 0,22 (<0,04) Srčani protein

HO-1 1,50 ± 08 1,64 ± 0,19 1,310,13 1,54 ± 0,09 (NS)

Haptoglobin 15,6 ± 5,0 40,4 ± 8,6 19,1 ± 2,1 29,4 ± 4,1 (<0,1)

IL-10 8,1 ± 5 21 ± 12 15,8 ± 10 41 ± 14 (<0,035)

(b) 18 sati nakon Rx tretmana

Srčana mRNA

HO-1 0,07 ± 0,01 0,08 ± 0,01 0,09 ± 0,03 0,24 ± 0,07 (<0,005)

Haptoglobin 0,31 ± 0,07 0,53 ± 0,21 0,59 ± 0,17 1,28 ± 0,2 (<0,002) Izmerena supstanca Kontrola N-Mgb SnPP SnPP N-Mgb

(a) 4 sata nakon Rx tretmana

IL-10 0,36 ± 0,10 0,67 ± 0,10 0,53 ± 0,10 0,64 ± 0,14 (=0,1) Srčani protein

HO-1 1,5 ± 0,08 1,9,7 ± 0,37 2,67 ± 0,4 4,2 ± 0,98 (<0,01) Haptoglobin 15,6 ± 5,0 249,6 ± 15,0 96,1 ± 36,2 250,7 ± 37,8 (<0,001) L-10 8 ± 5 14,5 ± 10 23,4 ± 14 51,4 ± 19 (<0,035) Skraćenice: HO-1, hem oksigenaza 1; IL-10, interleukin 10; mRNA, informaciona RNA; N-Mgb, nitritovani mioglobin; NS, nije značajno; Rx, tretman; SnPP, kalajni protoporfirin. Individualni nivoi srčane mRNA i proteina izazvani ispitivanim agensima koji su primenjeni sami ili u kombinaciji 4 sata (a) i 18 sati (b) nakon injekcije.

Uopšteno govoreći, primećena su daleko veća povećanja mRNA i proteina sa kombinovanom primenom agensa u odnosu na bilo koji od pojedinačnih agenasa.

Diskusija. Godine 1992, Nath et al. (J Clin Invest 90:267-70) su pokazali da primena hemoglobina kod pacova može da izazove značajnu zaštitu od naknadne (24 sata kasnije) ARF izazvane rabdomiolizom izazvane glicerolom. Ovaj zaštitni odgovor je pripisan hemom posredovanoj regulaciji HO-1, na osnovu 2 ključna zapažanja: (1) predtretman hemom je značajno povećao bubrežnu HO-1 mRNA i nivoe proteina, kao i aktivnost HO-1 enzima, i (2) model glicerola je značajno pogoršan davanjem snažnog inhibitora HO-1, SnPP, u vreme (i posle) injekcije glicerola. Od vremena ovih seminalnih zapažanja, uloga HO-1 kao snažnog antioksidansa i antiinflamatornog molekula je dobro utvrđena u višestrukim modelima AKI (npr. cisplatin, ishemija bubrega, endotoksemija; pogledano u Nath, Curr Opin Nephrol Hypertens 2014;23:17-24). Štaviše, njeni zaštitni efekti su opširno opisani u različitim oblicima oštećenja ekstrarenalnog tkiva (npr. mozak, jetra, srce, transplantacija organa). Kusmic et al. J Transl Med 2014;12:89; Czibik et al. Basic Res Cardiol 2014;109:450; Sharp et al. Transl Stroke Res 2013;6:685-92; Le et al. CNS Neurosci Ther 2013;12:963-8; Huang et al. World J Gastroenterol 2013;21:2937-48; Liu et al. Crit Care Med 2014; 42:e762-71; Wszola et al. Prog Transplant 2014;1: 19-26. Međutim, manje izvesno od postojanja zaštitnih akcija HO je tačan mehanizam kojim se utiče na tu zaštitu. Pošto HO-1 cepanje porfirinskog prstena oslobađa visoko toksičan katalitički Fe (koji ima direktne štetne efekte; Zager i Burkhart, Kidney Int 1997;51:728-38) sada se veruje da su uključene sekundarne posledice povećane aktivnosti HO-1. To uključuje stvaranje antioksidanata biliverdina i bilirubina, citoprotektivnu proizvodnju ugljen monoksida i povećanje nivoa feritina u tkivu (H), sa njegovim velikim kapacitetom za katalitičko vezivanje Fe. Zarjou et al. J Clin Invest 2013;123:4423-34; Nath, Curr Opin Nephrol Hypertens 2014;23:17-24. Dodatne složenosti u tumačenju učešća HO-1 u citoprotekciji proizilaze iz činjenice da induktori HO-1 (npr. hem) takođe povećavaju regulaciju brojnih drugih citoprotektivnih puteva, na primer, haptoglobina (Zager et al. Am J Phisiol 2012;303:F139 -48), hemopeksina (Zager et al. Am J Phisiol 2012;303:F1460-72) alfa 1 antitripsina (Zager et al. PLoS One 2014;9:e9838) i IL-10 (kao što je prikazano u ovom obelodanjivanju). Ovo komplikuje tumačenje efekata HO-1 na povredu tkiva s obzirom na prisustvo višestrukih pojačano regulisanih zaštitnih proteina tkiva.

Interakcija SnPP i HO-1 je takođe složena. Prvo, kao kompetitivni inhibitor HO-1, administracija SnPP može sekundarno povećati nivoe HO-1 mRNA i proteina bilo „povratnom inhibicijom“ enzima ili indukcijom blagog prooksidativnog stanja sa balansiranjem proizvodnje HO-1 (npr. Kaizu et al. Kidney Int 2003;63:1393-403). Drugo, Sn deo SnPP može nezavisno da reguliše HO-1 preko direktnih prooksidativnih efekata. Barrera-Oviedo et al. Ren Fail 2013;35:132-7. Treće, kad god se razmatraju efekti SnPP, važno je prepoznati da bi sekundarna indukcija HO-1 potencijalno mogla biti nadoknađena SNPP indukovanom inhibicijom HO-1. Međutim, važno je napomenuti da SnPP ima relativno kratko vreme poluraspada (2-4 sata; Berglund et al. Hepatology 1988;8:625-31). Stoga, odloženo povećanje HO-1 (npr.18 sati nakon primene glicerola ili tretmana N-Mgb-SnPP) treba da bude slobodno da ispolji svoje biološke efekte zbog prethodne eliminacije SnPP. Ovaj koncept je podržan zapažanjima da je 24 sata nakon primene SnPP, povećani HO-1 bio u stanju da ispoljava citoprotektivni efekat (npr. protiv ishemijske ARF); Juncos et al. Am J Pathol 2006;169:21-31; Kaizu et al. Kidney Int 2003;63:1393-403).

U svetlu prethodno navedenih razmatranja, pretpostavljeno je da kombinacija N-Mgb SnPP može da izazove ili aditivno ili sinergističko povećanje HO-1 i drugih redoks osetljivih citoprotektivnih proteina (npr. haptoglobin i IL-10). Ova hipoteza je testirana merenjem nivoa mRNA HO-1, haptoglobina i IL-10 i proteina 4 i 18 sati nakon injekcije N-Mgb, SnPP ili N-Mgb SnPP. Kao što je prikazano na SL.7-9, kombinovana terapija je generalno izazvala sinergističke ili aditivne odgovore. Na primer, 4 sata nakon injekcije, primećeno je 20-struko povećanje HO-1 mRNA, što je više nego udvostručilo povećanje uočeno samo sa N-Mgb ili SnPP. U 18 sati, ovo rano povećanje mRNA prevedeno u 7-struki porast proteina HO-1. Kvalitativno slični rezultati su primećeni sa IL-10. Posebno je vredan pažnje bilo masivno (20-struko) povećanje proteina haptoglobina 18 sati nakon primene N-Mgb-SnPP. Međutim, u ovom slučaju se činilo da je to bilo N-Mgb, a ne interakcija N-Mgb-SnPP, koja je u velikoj meri bila odgovorna, s obzirom da je sam N-Mgb u odnosu na N-Mgb SnPP indukovao uporedivo povećanje bubrežnog haptoglobina. Jasno je da su dodatni citoprotektivni redoks osetljivi proteini, osim HO-1, IL-10 i haptoglobina, takođe mogli biti indukovani N-Mgb-SnPP protokolom (npr. a1 antitripsin, hemopeksin, hepcidin). Stoga se čini logičnim da višestruki citoprotektivni proteini mogu delovati zajedno kako bi ublažili odgovore na povrede ćelija.

Nakon što je primećeno dramatično povećanje bubrežne kore u citoprotektivnim proteinima nakon primene N-Mgb-SnPP, testirana je efikasnost poslednjeg u zaštiti od 3 oblika AKI. SL.12 prikazuje rezultate u modelu glicerola. Kao što je pokazano, sama primena SnPP nije izazvala značajna smanjenja nivoa BUN ili kreatinina. Kada je primenjen sam N-Mgb, primećen je skroman zaštitni efekat. Međutim, kada se primenjuje zajedno, predtretman N-Mgb SnPP izazvao je u suštini potpunu funkcionalnu zaštitu na šta ukazuju normalne koncentracije BUN i kreatinina u plazmi 18 sati nakon injekcije glicerola. Štaviše, primećena je skoro normalna renalna histologija. Stoga, ovi nalazi podvlače princip da se sinergističko povećanje citoprotektivnih proteina može prevesti u sinergističku zaštitu protiv ARF.

Da bi se dalje istražio obim zaštite posredovane N-Mgb-SnPP, korišćen je maleatni model ARF posredovanog deplecijom proksimalnog tubularnog ATP. Opet, primećena je dramatična ili skoro potpuna zaštita (SL.13). Pošto je sada dobro poznato da AKI može inicirati početak progresivne hronične bubrežne bolesti, da li bi prethodni tretman N-Mgb-SnPP mogao da poništi ovaj proces u prethodno objavljenom modelu jednostranog postishemijskog oštećenja bubrega (Zager et al. Kidney Int 2013;84:703-12; Zager et al. Am J Physiol Renal Physiol 2014;307:F856-68) u kome je procenjen gubitak mase bubrega od 40% koji normalno rezultira za 2 nedelje. Kao što je prikazano na SL.15, postishemijska povreda je bila značajno oslabljena predtretmanom N-Mgb-SnPP, što je dokazano smanjenjem gubitka mase bubrega sa 38% na 12%, i izraženim smanjenjem nivoa NGAL mRNA i proteina. Tako je u svakom od 3 heterogena AKI modela primećena dramatična zaštita. Iako je bubreg najviše izložen 2 test agensa (npr. brza filtracija, Mgb endocitoza), praktično sve ćelije su im prolazno izložene nakon njihove IV injekcije. Štaviše, protoporfirini se mogu vezati za različite ćelije i preuzeti ih. Anderson et al. J Pharmacol Exp Ther 1984;228:327-33. Stoga je postavljeno pitanje da li otkriveni režim N-Mgb-SnPP takođe može povećati zaštitne odgovore u ekstrarenalnim organima. Zaista, ovo je bio slučaj, imajući u vidu da su i jetreno i srčano tkivo ispoljili HO-1, IL-10, i haptoglobin mRNA i povećanje proteina i 4 i 18 sati nakon injekcije N-Mgb-SnPP (kao što je prikazano u tabelama 9 i 10 ). Iznenađujuće je da bi sam N-Mgb mogao da izazove odgovor u ekstrarenalnim tkivima, s obzirom da se smatra da je endocitoza posredovana megalinom-kubilinom specifičan za bubrege. Ovo ili sugeriše potencijalno ekstrarenalno uzimanje, verovatno preko receptora za čišćenje, (Canton et al. Nat Rev 2013;13:621-34) ili da kada su prisutni u mikrocirkulaciji, N-Mgb i SnPP mogu da aktiviraju intracelularne citoprotektivne gene. Da bi se testiralo da li može doći do ekstrarenalne zaštite, procenjen je uticaj prethodnog tretmana N-Mgb SnPP na stepen postishemične povrede jetre. Kao što je prikazano na SL.18, primećeno je značajno smanjenje koncentracija i LDH i ALT u plazmi. Štaviše, očigledna zaštita je naznačena grubim izgledom postishemičnih jetrenih tkiva (SL.19). Da bi se dalje testirala otpornost jetre na povrede, miševi su podvrgnuti IP injekciji glicerola, koji dospevanjem u jetru kroz cirkulaciju portala izaziva skromno oštećenje jetre. U roku od 4 sata od IP injekcije glicerola, došlo je do povećanja ALT u plazmi, koje je u velikoj meri poništeno prethodnom injekcijom N-Mgb-SnPP.

Ranije je pokazano da nivoi haptoglobina ili HO-1 u plazmi mogu poslužiti kao biomarkeri bubrežnog kortikalnog haptoglobina i povećanja HO-1 u okruženju ARF. Z Zager et al. Am J Physiol 2012;303:F139-48; Zager et al. J Am Soc Nephrol 2012;23:1048-2057. Stoga je postavljeno pitanje da li haptoglobin u plazmi i HO-1 mogu takođe poslužiti kao biomarkeri za indukciju ovih proteina u bubrezima nakon primene N-Mgb-SnPP i za nastanak citorezistentnog stanja. Ovo je zaista bio slučaj. Kao što je prikazano na SL.16, povećanje doze N-Mgb-SnPP izazvalo je dozno-zavisno povećanje nivoa haptoglobina u plazmi i HO-1, a ova

1

povećanja su u direktnoj korelaciji sa sadržajem haptoglobina kore bubrega i HO-1. Štaviše, primećeni su upadljivi inverzni odnosi između N-Mgb-SnPP-indukovanog povećanja HO-1 u plazmi i haptoglobina u plazmi i koncentracije BUN nakon glicerola (r, -0,79/r, -0,71 za BUN u odnosu na nivo HO-1 u plazmi i nivo haptoglobina, respektivno). Dakle, povećanje HO-1/haptoglobina u plazmi bi verovatno potvrdilo biološku aktivnost N-Mgb-SnPP u kliničkim ispitivanjima, a stepen povećanja HO-1 i haptoglobina u plazmi takođe može da predvidi stepene rezistencije na naknadni AKI.

Očigledna zabrinutost primenom ove profilaktičke strategije na pacijente je potencijalna bubrežna i/ili vanbubrežna toksičnost. Međutim, u tom pogledu, vredi napomenuti da se već pokazalo da se SnPP dobro toleriše kod ljudi (npr. Berglund et al. Hepatology 1988;8:625-31; Kappas et al. Pediatrics 1988;81:485-97; Reddy et al. J Perinatol 2003;23: 507-12). Štaviše, ranije je dokumentovano u sistemu ćelijske kulture da dodavanje nitrita značajno smanjuje citotoksične efekte mioglobina za 75% (neobjavljeni podaci, 2014). Da bi se procenila potencijalna margina bezbednosti in vivo za N-Mgb SnPP (pogledajte dodatne slike), testirana je maksimalna količina N-Mgb koja se može dati miševima pre nego što je primećena nefrotoksičnost. Do 25 puta upotrebljena doza N-Mgb (sa konstantnom dozom SnPP) mogla bi se primeniti (preko 2 sata) bez indukcije nefrotoksičnosti (normalan BUN i kreatinin, 18 sati kasnije). Konačno, ni standardna doza N-Mgb-SnPP (1 mg N-Mgb/1 mmol SnPP) niti 5 mg IP N-Mgb (Sl. 17) nisu izazvali očiglednu povredu bubrega (18-časovni BUN/kreatinin, ili histologija), niti su podigli nivo ALT u jetri ili srčanog troponina. Zajedno, ovi podaci ukazuju na korisnost u kliničkoj primeni.

Zaključci. Primena N-Mgb, zajedno sa inhibitorom njegove degradacije (SnPP), dovodi do dramatičnog povećanja broja citoprotektivnih proteina u bubrezima. Na snagu ovog odgovora ukazuju zapažanja da je dokumentovano povećanje renalnog HO-1 proteina bilo 15 puta veće od onoga koje je postignuto bardoksolon metilom, dobro priznatim induktorom HO-1 posredovanim Nrf-2. Wu et al. Am J Physiol 2011;300: F1180-92. U roku od 18 sati od primene, N-Mgb SnPP je izazvao dramatičnu zaštitu od 3 različita modela AKI: rabdomiolize izazvane glicerolom, maleatom indukovanog ATP u proksimalnim tubulima i postishemične progresije AKI do CKD. Iznenađujuće, primena N-Mgb SnPP je

2

takođe izazvala sinergističko povećanje citoprotektivnih proteina u jetri, što je dovelo do dramatične zaštite od hepatične ishemijske-reperfuzijske povrede i hepatotoksičnosti. Konačno, N-Mgb SnPP može da reguliše citoprotektivne proteine u srcu, sugerišući zaštitu srca, a samim tim i širok spektar citoprotektivnih efekata. Treba napomenuti da je svaki od ovih odgovora izazvan u odsustvu uočljive toksičnosti za bubrege, jetru ili srce. Dakle, ovi podaci sugerišu da istovremena primena N-Mgb SnPP može da obezbedi kliničku profilaktičku strategiju za zaštitu i od bubrežnih i od vanbubrežnih povreda, kao što mogu da nastanu tokom kardiopulmonalnog bajpasa, popravke aneurizme aorte ili drugih složenih, visoko rizičnih operacija. Dakle, ova strategija bi potencijalno mogla da zadovolji niz značajnih nezadovoljenih kliničkih potreba.

Referentni primer 5. Dva psa mješanca, jedan mužjak, jedna ženka, uzeta je krv za osnovnu liniju za mjerenje hem oksigenaze 1 u plazmi (HO-1; ELISA kod pasa,) BUN, nivoa kreatinina u plazmi i laktata dehidrogenaze (LDH). Takođe je dobijen osnovni uzorak urina za HO-1 test. Pas 1 je zatim dobio 50 ml/50 min infuzije normalnog fiziološkog rastvora/40 mM NaHCO3 koji sadrži 5 mg/kg nitritiranog mioglobina pasa 3,75 mg/kg SnPP. Pas 2 je primio

2,5 mg/kg psećeg N-mioglobina 7,5 mg/kg SnPP. Četiri i 26 sati kasnije, uzeti su ponovljeni uzorci krvi. Drugi uzorak urina je sakupljen 26 sati nakon infuzije. Kao što je prikazano u tabeli 11, infuzija je izazvala masivno povećanje koncentracije HO-1 u plazmi i urinu u odsustvu oštećenja bubrega (na osnovu nivoa pre i BUN i kreatinina u plazmi). Vrednosti LDH su ostale nepromenjene, što implicira odsustvo očiglednog oštećenja bubrežnog/ekstrarenalnog tkiva.

Tabela 11. Indukcija HO-1 kod pasa

Pas 1 (mužjak) Pas 2 (ženka) Osnovni BUN (mg/dl) 20 → 28 →

26 sati BUN 28 23

Osnovni kreatinin (mg/dl) 0,5 → 0,7 →

26 sati kreatinin 0,5 0,6

Pas 1 (mužjak) Pas 2 (ženka) Osnovni LDH (jedinice/dl) 0,4 → 0,31 →

26 sati LDH 0,2 0,31

Osnovni nivo HO-1 u plazmi (mg/ml) 1,3 → 4,0 →

4 sata plazma HO-1 34 → 44,7 →

26 sati plazma HO-1 155 90,6

Osnovni nivo HO-1 u urinu (mg/mg CR) 2 → 0,8 →

26 sati urin HO-1 18,8 11,1

Primer 6. Efekti Fe saharoze i cijanokobalamina (vitamin B12) na indukciju hem oksigenaze 1 u bubrezima. Povećana regulacija hem oksigenaze-1 (HO-1) je kritični medijator citoprotektivne aktivnosti N-mioglobina/SnPP u bubrezima i ekstra-bubrežnim organima. Zbog toga su traženi dodatni agensi koji mogu da indukuju pojačanu regulaciju HO-1 naviše, i time doprinesu nastanku zaštite tkiva od toksičnih i ishemijskih oblika povrede. Pošto je Fe kritični posrednik aktivnosti N-Mgb, uticaj polimera Fe-ugljenih hidrata (Fe saharoza; procenjena je molekularna težina u rasponu od 34-61 kDa) na nivoima HO-1.

Kao alternativna i/ili komplementarna strategija, proučavan je uticaj cijanokobalamina (vitamina B12) na indukciju HO-1 u bubrezima. Obrazloženje za testiranje B12 je da i kobalt i cijanid mogu nezavisno da indukuju HO-1. Dakle, B12 bi mogao predstavljati bezbedan postupak za davanje i cijanida i kobalta, i kao pojedinačni agens, pošto su oba sastavni delovi molekula B12.

Postupci. Za sve eksperimente korišćeni su mužjaci CD-1 miševa (25-40 grama) Charles River, Wilmington, MA. Bili su smešteni u standardnim uslovima vivarijuma sa slobodnim pristupom hrani i vodi. Sve eksperimente je odobrio Fred Hutchinson Cancer Research Center IACUC u skladu sa smernicama NIH.

Efekti Fe saharoze (FeS) / kalajnog protoporfirina (SnPP) na težinu AKI. Maleatski model AKI. Kada se ubrizgava u glodare, maleat se podvrgava relativno selektivnom preuzimanju ćelija proksimalnih tubula preko organskih transportera anjona. Jednom kada dođe do intracelularne akumulacije, maleat je poželjan supstrat za sukcinil-CoA:3-oksokiselu CoA transferazu. Ovo dovodi do formiranja

4

maleil-koenzima A. Uz naknadnu konverziju maleil CoA u stabilan tioetar, dolazi do ozbiljnog iscrpljivanja koenzima A (CoA). Veliki nivoi CoA su neophodni za

„aktivaciju“ masnih kiselina, omogućavajući njihov kasniji metabolizam kroz Krebsov ciklus, dajući ATP. U odsustvu ovog procesa dolazi do iscrpljivanja ATP proksimalnih tubula i oštećenja ćelija. Pored toga, maleat konjuguje sulfhidrilnu grupu glutationa (GSH), što kulminira smanjenjem GSH i potencijalnim oksidativnim tubularnim stresom.

Sledeći eksperiment je testirao da li FeS, SnPP ili kombinovani FeS SnPP mogu da ublaže ovaj oblik akutne povrede bubrega (AKI). Dvadeset sedam miševa je podvrgnuto 200 µl IV injekcijama repa jednog od sledećih: 1) vehikula (fosfatnim puferom, PBS; n, 10); 2) 1 mg FeS (American Regent (Shirley, NY; n, 3); 3) 1 µmola SnPP (Frontier Scientific, Logan, UT; n 7) ili FeS SnPP, n, 7). Osamnaest sati kasnije, svi miševi su primili IP injekciju Na maleata (800 mg/kg; u 500 ul PBS). Osamnaest sati kasnije, miševi su duboko anestezirani pentobarbitalom (50 mg/kg IP), trbušne šupljine su otvorene i uzorci krvi su uzeti iz trbušne šuplje vene. Ozbiljnost oštećenja bubrega procenjivana je određivanjem koncentracije azota uree u krvi (BUN) i kreatinina u plazmi (PCr).

Model AKI sa ishemijsko-reperfuzionom povredom bubrega (IRI). Sledeći eksperiment je procenio da li kombinacija FeS+SnPP može da ublaži model okluzije bubrežne arterije AKI. Miševi su primili 200 µl injekcije u repnu venu ili PBS (n, 9) ili FeS SnPP (n, 8), kao što je gore navedeno. Osamnaest sati kasnije, miševi su duboko anestezirani pentobarbitalom (40-50 mg/Kg IP), trbušne šupljine su otvorene, bubrežni pedikuli su identifikovani i oba su okludirana mikrovaskularnim stezaljkama. Telesna temperatura je održavana na 36-37°C tokom čitavog perioda. Nakon

22 minuta bilateralne bubrežne ishemije, kleme su uklonjene, ujednačena reperfuzija je vizuelno potvrđena ponovnim pojavom normalne bubrežne boje (gubitak cijanoze tkiva), a zatim su trbušne duplje zatvorene u dva sloja svilenim šavom. Osamnaest sati kasnije, miševi su ponovo anestezirani, trbušne šupljine su ponovo otvorene, a završni uzorci krvi su uzeti iz šuplje vene. Ozbiljnost oštećenja bubrega određena je koncentracijama BUN i PCr.

FeS / B12 efekti na težinu AKI. Glicerol model AKI. Miševi su primili injekcije u repnu venu ili PBS vehikulu (n 6), ili kombinacije FeS 1 µmol B12 (n, 6; B12 iz Alfa Aesar, Ward Hill, MA). Osamnaest sati kasnije, miševi su lagano anestezirani izofluranom, a zatim je indukovan glicerinski model rabdomiolize AKI (9 ml/Kg 50% glicerola, dat u dve podjednako podeljene IM injekcije u gornje zadnje udove). Osamnaest sati nakon injekcije glicerola, miševi su duboko anestezirani pentobarbitalom i dobijeni su uzorci krvi terminalne šuplje vene.

Ozbiljnost oštećenja bubrega je merena terminalnim koncentracijama BUN i PCr.

Maleatski model AKI. Miševi su primili injekcije u repnu venu bilo kombinacije FeS+B12 ili vehikule (n, 6 po grupi). Osamnaest sati kasnije primili su injekcije IP maleata, kao što je gore navedeno. Ozbiljnost AKI je određena 18 sati nakon injekcije maleata terminalnim BUN i PCr procenama.

Efekti FeS, SnPP i B12 na bubrežnu kortikalnu indukciju hem oksigenaze 1 (HO-1). Sledeći eksperimenti su procenili efekte FeS, SnPP i B12 na moguću indukciju citoprotektivnog proteina HO-1. U tu svrhu, miševima je ubrizgan svaki od ovih agenasa, kao što je gore navedeno. Ili 4 ili 18 sati kasnije, oni su anestezirani i bubrezi su uklonjeni kroz srednji rez na abdomenu. Kore bubrega su secirane na ledu, a zatim ekstrahovane za protein i mRNA. Uzorci su zatim analizirani na HO-1 protein pomoću ELISA, a HO-1 mRNA pomoću RT-PCR-a, faktorizovanih na osnovu nivoa GAPDH. Pet normalnih miševa dalo je kontrolne vrednosti.

Rezultati. Efekti FeS / SnPP na težinu AKI. AKI izazvan maleatima: Kao što je prikazano na SL.22, injekcija maleata izazvala je teški AKI, što je označeno izraženim porastom BUN i PCr u odnosu na kontrole kojima je ubrizgan maleat (C). Ni sam SnPP ni sam FeS nisu značajno promenili težinu povrede bubrega. Međutim, kombinovani FeS SnPP je pružio izraženu zaštitu, što je označeno smanjenjem koncentracije BUN/PCr od 75% (horizontalne linije predstavljaju srednje vrednosti nivoa BUN/PCr kod normalnih miševa).

AKI izazvan renalnom ishemijom-reperfuzijom (IRI): U roku od 18 sati od izazivanja IRI, došlo je do 4-strukog povećanja koncentracija BUN i PCr (SL.

23). Prethodni tretman sa FeS SNPP pružio je značajnu zaštitu, snižavajući nivoe BUN i PCr za 50%. Horizontalne linije predstavljaju srednje nivoe BUN/PCr kod normalnih miševa.

Efekti FeS / B12 na težinu AKI. AKI izazvan maleatima: Ponovo, injekcija maleata je izazvala teški AKI (SL.24). Prethodni tretman sa FeS B12 je značajno ublažio ovu povredu, što je označeno smanjenjem BUN/PCr.

Horizontalne linije predstavljaju srednje nivoe BUN/PCr kod normalnih miševa.

Glicerol model AKI: Teška bubrežna insuficijencija je rezultirala u roku od 18 sati od injekcije glicerola (SL.25). Prethodni tretman sa FeS B12 pružio je značajnu funkcionalnu zaštitu, što je označeno značajnim smanjenjem i 18-časovnih koncentracija BUN i PCr. Horizontalne linije predstavljaju srednje nivoe BUN/PCr kod normalnih miševa.

Kortikalna HO-1 mRNA i nivoi proteina. Kao što je prikazano na SL.26, svaki od agenasa je izazvao označeno i značajno povećanje HO-1 mRNA, kako je procenjeno 4 sata nakon injekcije. Do 18 sati, nivoi HO-1mRNA su se vratili na normalne vrednosti. Kao što je prikazano na SL.27, korelacija povećanja mRNA od 4 sata bila je značajno povećanje nivoa proteina HO-1. Ovi nivoi su ostali povišeni u vremenskoj tački od 18 sati, posebno u slučaju primene FeS.

Proročki primeri. Proročki primer 1. Biće procenjeno da li depo formulacija daje jednaku ili veću citoprotekciju sa manjom potencijalnom toksičnošću nego intravenski (IV) tretman mioglobina/SnPP i/ili Fe-S i/ili B12. Različite doze mioglobina sa SnPP i/ili Fe-S i/ili B12 će se dodati kao suspenzija u 100 mg/ml PEG (PEG 5000). Postoje dva razloga za sprovođenje ovog eksperimenta. Prvo, ubrizgavanjem bilo intramuskularno (IM) ili subkutano (SK), mioglobin i SnPP i/ili Fe-S i/ili B12 će se apsorbovati relativno sporo (u odnosu na trenutni sistemski mioglobin/SnPP i/ili Fe-S i/ili Izlaganje B12 nakon IV injekcije). Usporavanjem apsorpcije mioglobina i/ili Fe-S i/ili B12 depo PEG injekcijom, rezultiraće sporija, trajnija izloženost bubrega mioglobinu i/ili Fe-S i/ili B12. Ovo će doprineti povećanom unosu mioglobina i/ili Fe-S i/ili B12, a istovremeno će smanjiti potencijal za nefrotoksičnost, što može nastati usled brzog punjenja bubrežnog mioglobina i/ili Fe-S i/ili B12 (što rezultira opstruktivnim formiranjem gipsa unutar tubularnog lumina). Drugo, PEG je osmotski agens i biće podvrgnut bubrežnom izlučivanju. Pošto akutno povećanje osmolalnosti mokraće može samo po sebi da indukuje citoprotektivne proteine, a takođe i obezbedi zaštitu izazivanjem povećane brzine protoka urina, može se primetiti aditivni ili sinergistički povoljan efekat.

Proročki primer 2. Hematin će inhibirati HO, a kao i SnPP, takođe može izazvati povećanje proizvodnje HO (preko inhibicije povratnih informacija enzima). Dakle, hematin treba da rekapitulira korisne efekte tretmana SnPP. Važno je da je FDA odobrila hematin za lečenje kliničke bolesti, porfirije. Dakle, ako je hematin jednako efikasan kao SnPP, hematin može biti odabran za dalje proučavanje i klinički razvoj.

Proročki primer 3. Dobro je dokumentovano da HO štiti od eksperimentalne sepse i endotoksemije. HO-1 će biti pojačan u skladu sa sastavima, kompletima i postupcima, a zatim 18 sati kasnije, miševi će biti izazvani endotoksinom. 2 i 24 sata kasnije, težina sepse se meri nivoima inflamatornih citokina (TNF, MCP-1) u plazmi i u bubrezima. Takođe, pošto endotoksemija izaziva povredu bubrega, biće testirana težina disfunkcije bubrega pomoću BUN i nivoa kreatinina. Rezultati će biti upoređeni sa naivnim miševima koji su bili podvrgnuti injekciji fendotoksina. Kada bude uspešno, ovo će u velikoj meri proširiti korisnost otkrivenih zaštitnih strategija na pacijente sa visokim rizikom od sepse (npr. pacijente na intenzivnoj nezi).

Proročki primer 4. Tekuće studije će pokazati efikasnost železa i/ili vitamina B12 u zaštiti različitih sistema organa od inzulta.

Sastavi, kompleti i postupci koji su ovde otkriveni razlikuju se od

„predkondicioniranja na daljinu“, pri čemu se izaziva ishemija u nogama (npr. naduvavanjem manžeta za krvni pritisak) da bi se preduslovili drugi organi, što je postiglo vrlo ograničen uspeh. U posebnim otelotvorenjima, sastavi i kompleti koji su ovde otkriveni mogu se nazvati „farmakološko predkondicioniranje na daljinu“ (RPR).

Osim ako nije drugačije naznačeno, svi brojevi koji izražavaju količine sastojaka, reakcione uslove i tako dalje korišćeni u specifikaciji i patentnim zahtevima treba shvatiti kao modifikovani u svim slučajevima terminom „oko“. Shodno tome, osim ako nije drugačije naznačeno, numerički parametri navedeni u ovoj specifikaciji i priloženim patentnim zahtevima su aproksimacije koje mogu varirati u zavisnosti od željenih svojstava koja se žele postići predmetnim obelodanjivanjem.

Bez obzira na to što su numerički opsezi i parametri koji određuju širok obim pronalaska aproksimacije, numeričke vrednosti navedene u konkretnim primerima su prikazane što je preciznije moguće. Bilo koja numerička vrednost, međutim, inherentno sadrži određene greške koje su nužno rezultat standardne devijacije pronađene u njihovim odgovarajućim merenjima testiranja.

Definicije i objašnjenja korišćena u predmetnom obelodanjivanju su namenjena da budu kontrolisana u bilo kojoj budućoj konstrukciji osim ako su jasno i nedvosmisleno modifikovana u sledećim primerima ili kada primena značenja čini bilo koju konstrukciju besmislenom ili suštinski besmislenom. U slučajevima kada bi konstrukcija izraza učinila da on bude besmislen ili suštinski besmislen, definiciju treba uzeti iz Vebsterovog rečnika, 3.izdanje ili rečnika poznatog stručnjacima u predmetnoj oblasti, kao što je Oksfordski rečnik biohemije i molekularne Biologija (Izd. Anthony Smith, Oxford University Press, Oxford, 2004).

1

2

4

1

2

4

1

2

4

1

11

12

1

14

1

1

1

1

1

11

11

11

11

11

11

11

12

12

12

12

12

12

12

1

11

12

1

14

1

Claims (8)

PATENTNI ZAHTEVI

1. Komplet za upotrebu u postupku zaštite organa ljudskog pacijenta od povrede na osnovu zakazanog inzulta koji sadrži terapeutski efikasnu količinu (i) železa saharoze i (ii) jedno od Cr-protoporfirina, Sn-protoporfirina ili Zn -protoporfirin.

2. Sastav za upotrebu u postupku zaštite organa ljudskog pacijenta od povrede na osnovu zakazanog inzulta koji sadrži terapeutski efikasnu količinu (i) železa saharoze i (ii) Sn-protoporfirina.

3. Komplet ili sastav za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačeno time što se postupak sastoji od davanja kompleta ili sastava pacijentu najmanje 2 sata ili najmanje 4 sata pre nego što dođe do zakazanog inzulta, naznačeno time što je zakazani inzult operacija, hemoterapija ili toksičnost radiokontrasta.

4. Komplet ili sastav za upotrebu prema patentnom zahtevu 3, naznačeno time što je zakazani inzult toksičnost radiokontrasta.

5. Komplet ili sastav za upotrebu prema patentnom zahtevu 3, naznačeno time što je zakazani inzult hemoterapija.

6. Komplet ili sastav za upotrebu prema patentnom zahtevu 3, naznačeno time što je zakazani inzult operacija.

7. Komplet ili sastav za upotrebu prema patentnom zahtevu 6, naznačeno time što je zakazani inzult operacija transplantacije organa.

8. Komplet ili sastav za upotrebu prema patentnom zahtevu 7, naznačeno time što je organ srce, bubreg, jetra ili pluća.