JP2017535522A - ストレスタンパク質誘導剤を使用して獲得細胞抵抗性を誘導するための組成物、キット及び方法 - Google Patents

ストレスタンパク質誘導剤を使用して獲得細胞抵抗性を誘導するための組成物、キット及び方法 Download PDF

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Abstract

本開示は臓器に損傷を生じずに獲得細胞抵抗性を誘導することにより臓器を保護するための組成物、キット及び方法を提供する。組成物、キット及び方法はヘムタンパク質、鉄及び／又はビタミンＢ１２と、場合により、ヘムタンパク質代謝に影響を与える物質を利用する。

Description

本開示は臓器に損傷を生じずに獲得細胞抵抗性を誘導することにより臓器を保護するための組成物、キット及び方法を提供する。組成物、キット及び方法はヘムタンパク質と、場合により、ヘムタンパク質代謝に影響を与える物質を利用することができる。ストレスタンパク質をアップレギュレートする他の化合物（例えば鉄やビタミンＢ１２）も使用してもよい。
生体臓器は損傷を受けると、有害事象（即ち傷害）が持続又は再発したとしてもより十分に自己防衛できるように保護応答を誘発することができる。例えば、一連の腎損傷は保護応答を誘発することができ、１８時間経過後に続発するより重症型の腎損傷に対して腎臓を保護する。この保護は長時間（数日間〜数週間）持続することができる。この保護現象は当分野で「虚血プレコンディショニング」又は「獲得細胞抵抗性」と呼ばれている。
特に事前に分かっている傷害が迫っているときに、臓器を先制的に保護するためにこの獲得細胞抵抗性現象を利用することが考えられている。例えば、外科手術、心肺バイパス手術又はＸ線造影剤の毒性投与等の傷害の前に臓器を保護するためにこの現象を誘導することができる。しかし、保護しようとする臓器に容認できない損傷を生じずに制御下に獲得細胞抵抗性を誘導するためのメカニズムが確立していないため、このアプローチはまだ臨床用に展開されていない。
本開示は臓器に損傷を生じずに獲得細胞抵抗性の誘導を可能にする組成物、キット及び方法を提供する。臓器に損傷を生じずに獲得細胞抵抗性を誘導することができるので、特に事前に分かっている傷害が近付いているときに、臓器を先制的に保護するためにこの現象を臨床状況で使用することができる。
理論に拘泥するものではないが、組成物、キット及び方法は保護性ストレスタンパク質の発現をアップレギュレートすることにより獲得細胞抵抗性を誘導する。特定の実施形態では、保護しようとする臓器に損傷を生じないような濃度又はアプローチでヘムタンパク質を投与することにより獲得細胞抵抗性を誘導する。鉄及び／又はビタミンＢ１２等の他の化合物を投与することにより獲得細胞抵抗性の誘導を実現することもできる。
損傷を生じずに獲得細胞抵抗性を誘導するアプローチとしては、治療有効量のヘムタンパク質、鉄及び／又はビタミンＢ１２（Ｂ１２）を投与する方法；ヘムタンパク質、鉄及び／又はＢ１２の生物学的半減期を延長させる方法；ヘムタンパク質、鉄及び／又はＢ１２の作用を増強する方法；並びにヘムタンパク質、鉄及び／又はＢ１２投与に伴う毒性を低減する方法が挙げられる。これらのアプローチの各々を単独で又は組み合わせて実施することができる。
上記アプローチは治療有効量のヘムタンパク質、鉄及び／もしくはＢ１２を投与する方法；ヘムタンパク質、鉄及び／もしくはＢ１２をヘムタンパク質分解阻害剤と併用投与する方法；修飾ヘムタンパク質、鉄及び／もしくはＢ１２を投与する方法；並びに／又は適切な組成物と送達経路を選択する方法の１種以上により実施することができる。
代表的なヘムタンパク質としては、低分子量ヘムタンパク質、急速排出型ヘムタンパク質及びミオグロビンが挙げられる。鉄の代表的な１形態としては、鉄スクロースが挙げられる。代表的なヘムタンパク質分解阻害剤としては、プロトポルフィリン、金属プロトポルフィリン及びヘマチンが挙げられる。代表的な修飾ヘムタンパク質及びヘムタンパク質分解阻害剤としては、ＰＥＧ化ヘムタンパク質及びヘムタンパク質分解阻害剤と、亜硝酸化ヘムタンパク質及びヘムタンパク質分解阻害剤が挙げられる。代表的な組成物としては遅放性デポ剤が挙げられる。代表的な送達経路としては、静脈内、皮下又は筋肉内注射が挙げられる。代表的な毒性低減方法としては、マンニトール、グリシン及び生理食塩水の投与が挙げられる。その他の例、実施形態及び組み合わせについては詳細な説明の欄に記載する。
グリセロール傷害の１８時間前に溶媒（対照）、ミオグロビン（Ｍｇｂ）又はミオグロビンとＳｎ−プロトポルフィリン（ＳｎＰＰ）の併用（Ｍｇｂ＋ＳｎＰＰ）を投与後のヘムオキシゲナーゼｍＲＮＡ発現（図１Ａ）を示す。同図から明らかなように、ミオグロビンを単独投与すると、代表的な細胞保護分子であるヘムオキシゲナーゼ１（ＨＯ−１）が誘導され、ＨＯ−１と一過性ヘムオキシゲナーゼ阻害剤（ＳｎＰＰ）を併用すると、ミオグロビンにより誘導されるＨＯ−１ｍＲＮＡ及びタンパク質の増加が激増する。 グリセロール傷害の１８時間前に溶媒（対照）、ミオグロビン（Ｍｇｂ）又はミオグロビンとＳｎ−プロトポルフィリン（ＳｎＰＰ）の併用（Ｍｇｂ＋ＳｎＰＰ）を投与後のタンパク質発現（図１Ｂ）を示す。同図から明らかなように、ミオグロビンを単独投与すると、代表的な細胞保護分子であるヘムオキシゲナーゼ１（ＨＯ−１）が誘導され、ＨＯ−１と一過性ヘムオキシゲナーゼ阻害剤（ＳｎＰＰ）を併用すると、ミオグロビンにより誘導されるＨＯ−１ｍＲＮＡ及びタンパク質の増加が激増する。 左はグリセロール誘発急性腎不全後の細胞レベルの腎損傷を示す。プレコンディショニングを行わない場合には重度の損傷が認められる（広範囲の壊死、左上；多量の円柱形成、左下）が、グリセロール注射の１８時間前にミオグロビン＋ＳｎＰＰを前投与すると、本質的に正常な腎組織検査結果が得られた（右上下）。 Ｎ−Ｍｇｂ＋ＳｎＰＰが保護性ストレスタンパク質であるインターロイキン１０（ＩＬ−１０）のｍＲＮＡを上昇させることを示す。 Ｎ−Ｍｇｂ＋ＳｎＰＰがハプトグロビンｍＲＮＡ（左）及びタンパク質レベル（右）を上昇させることを示す。 ミオグロビンＦｅと等モル量の亜硝酸イオンの結合がミオグロビン毒性の発現に及ぼす影響の評価を示す。ケラチノサイト無血清培地で正常（対照）条件下又は１０ｍｇ／ｍＬのウマ骨格筋ミオグロビンもしくは（１０ｍｇ／ｍｌのミオグロビンに等モル量の亜硝酸Ｎａを加えることにより生成した）亜硝酸化ミオグロビンの存在下にＨＫ−２細胞（正常ヒト腎臓に由来する近位尿細管細胞株）をインキュベートした。１８時間インキュベーション後に、細胞損傷の重症度（細胞死％）をＭＴＴアッセイにより評価した。ミオグロビンは対照培養細胞に比較して４０％の細胞死（ＭＴＴ細胞取り込みの４０％低下）を誘導した。ミオグロビンに亜硝酸イオンを結合させると、細胞死は７５％低下した。従って、亜硝酸イオンの結合はミオグロビンの細胞毒性作用を低減させることが可能である。 血漿中ヘムオキシゲナーゼ１（ＨＯ−１）とＮ−ミオグロビン投与量の用量反応関係を示す。亜硝酸化ミオグロビン０ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ又は５ｍｇ／ｋｇ＋ＳｎＰＰ（１μｍｏｌの一定用量）を正常マウスに筋肉内（ＩＭ）注射した。１８時間後に、血漿中ＨＯ−１濃度をＥＬＩＳＡにより評価した。Ｎ−ミオグロビン投与量と血漿中ＨＯ−１濃度の間には強い用量反応関係が認められた。従って、ＨＯ−１アッセイはＮ−Ｍｇｂ／ＳｎＰＰによるＨＯ−１誘導の潜在的バイオマーカーとして有用である。 Ｎ−ミオグロビン用量を２５倍まで変動させた場合に正常な血清クレアチニン濃度が維持されることを示す。マウスに（ＳｎＰＰを１μｍｏｌの一定用量に保持しながら）亜硝酸化ミオグロビン１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、１２ｍｇ／ｋｇ又は２５ｍｇ／ｋｇを２時間皮下輸液した。１８時間後に、血清クレアチニン濃度を測定することにより潜在的腎損傷を評価した。いずれのＮ−Ｍｇｂ用量でも有意な上昇は認められず、過度の毒性はないと判断された（ｎ＝２〜４匹／群）。 Ｎ−Ｍｇｂ−ＳｎＰＰ投与から１８時間後の腎組織検査結果を示す。上段２図は対照マウス（Ｃ）とＮ−Ｍｇｂ−ＳｎＰＰ投与から１８時間後のマウス（Ｒｘ）に由来するＰＡＳ染色腎臓切片を示す。投与群のマウスに由来する尿細管上皮細胞は正常な組織学的外観を維持し、刷子縁が完全に無傷である（管腔側膜の濃い染色）。下段２図はヘマトキシリン・エオジン染色した切片を示す。Ｎ−Ｍｇｂ−ＳｎＰＰを前投与した場合には組織損傷が認められない。 正常マウスにＮ−Ｍｇｂ−ＳｎＰＰを投与することによるＨＯ−１の相乗的な誘導を示す。左図は投与から４時間後のＨＯ−１ｍＲＮＡレベルを示す。Ｎ−Ｍｇｂ単独とＳｎＰＰ単独では若干のｍＲＮＡ増加が誘導されたが、併用投与すると、２０倍のＨＯ−１ｍＲＮＡ増加が認められる。投与から１８時間後には相乗的なＨＯ−１タンパク質増加が認められた（Ｐ値ｖｓ対照）。ＧＡＰＤＨ，グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ；ＨＯ−１，ヘムオキシゲナーゼ１；ｍＲＮＡ，メッセンジャーＲＮＡ；Ｎ−Ｍｇｂ，亜硝酸化ミオグロビン；ＳｎＰＰ，錫プロトポルフィリン。 正常マウスにＮ−Ｍｇｂ−ＳｎＰＰを投与することによるＩＬ−１０の相乗的な誘導を示す。左図は投与から４時間後のＩＬ−１０ｍＲＮＡレベルを示す。Ｎ−Ｍｇｂ単独とＳｎＰＰ単独ではＩＬ−１０ｍＲＮＡ増加は最低限しか又は全く誘起されなかった。一方、併用投与すると、１０倍のＩＬ−１０ｍＲＮＡ増加が認められた。右図に示すように、１８時間の時点で評価した場合にＩＬ−１０タンパク質増加が誘導されたのは、併用投与した場合のみであった（Ｐ値ｖｓ対照）。 正常マウスにＮ−Ｍｇｂ−ＳｎＰＰを投与後のハプトグロビンｍＲＮＡ及びタンパク質発現を示す。Ｎ−Ｍｇｂ＋ＳｎＰＰを併用すると、注射から４時間後に各々単剤よりも著しく大きなハプトグロビンｍＲＮＡ増加が誘起された。一方、投与から１８時間後までにＮ−Ｍｇｂ単独とＮ−Ｍｇｂ＋ＳｎＰＰで同等のハプトグロビンタンパク質増加が誘導された。従って、Ｎ−Ｍｇｂ＋ＳｎＰＰの併用投与により生じたハプトグロビン増加の要因はＮ−Ｍｇｂであったと思われる（Ｐ値ｖｓ対照）。 横紋筋融解症誘発ＡＫＩのグリセロールモデルで被験物質により誘導された保護の程度を示す。ＢＵＮ及びクレアチニン濃度から明らかなように、対照マウス（Ｃ）は顕著なＡＫＩを生じた。ＳｎＰＰでは有意な保護が付与されなかったが、Ｎ−Ｍｇｂでは若干の保護効果が誘導された。一方、Ｎ−Ｍｇｂ−ＳｎＰＰを併用投与すると、グリセロール投与から１８時間後に正常なＢＵＮ及びクレアチニン濃度となったことから、完全な機能的保護が付与されたと判断された（横実線により正常濃度を示す）。 Ｎ−Ｍｇｂ＋ＳｎＰＰ（Ｒｘ）を併用投与すると、ＡＫＩのマレイン酸塩モデルに対して顕著な保護が付与されることを示す。マレイン酸塩を注射すると、ＢＵＮとクレアチニンの顕著な上昇を生じた。投与群（Ｒｘ）ではほぼ完全な保護効果が付与された（横線は正常なＢＵＮ及びクレアチニン濃度を表す）。Ｐ値ｖｓ不投与群（Ｎｏ Ｒｘ）。 マレイン酸塩により誘発させた心毒性がＮ−Ｍｇｂ＋ＳｎＰＰの前投与により低減されることを示す。マウスにＮ−ミオグロビン１ｍｇ／ｋｇ＋ＳｎＰＰ１μｍｏｌ又は溶媒をＩＶ注射により投与した。１８時間後に、マレイン酸塩８００ｍｇ／ｋｇをＩＰ投与した。マレイン酸塩注射から１８時間後に血漿中トロポニンＩ濃度を（ＥＬＩＳＡにより）測定することにより心筋損傷の程度を判定した。マレイン酸塩注射により血漿中トロポニン濃度は１０倍に上昇した。マレイン酸塩により誘発させたトロポニン上昇はＮ−Ｍｇｂ＋ＳｎＰＰ前投与により７５％低減された。 Ｎ−Ｍｇｂ＋ＳｎＰＰ（Ｒｘ）投与により片側虚血再灌流（Ｉ／Ｒ）誘発進行性腎疾患に対する保護が付与されることを示す。１８時間前にＮ−Ｍｇｂ−ＳｎＰＰを前投与した後又は前投与せずにマウスを３０分間左腎虚血させた。虚血から２週間後に（腎臓重量により判定した）腎臓質量はＩ／Ｒにより３８％減少した。前投与（Ｒｘ）した場合には腎臓質量減少が１２％に止まったことから、有意保護が付与されたと判断された。虚血から２週間後の左腎臓でＮＧＡＬｍＲＮＡ及びタンパク質レベルが著しく低下したことからも保護が示唆された。 （ＳｎＰＰ用量は１μｍｏｌの一定として）Ｎ−Ｍｇｂの用量増加と腎皮質及び血漿中のＨＯ−１／ハプトグロビンタンパク質濃度の用量反応関係を示す。Ｎ−Ｍｇｂの用量を増加させながら腹腔内投与すると、血漿及び腎皮質中の各タンパク質の濃度が上昇した。ＨＯ−１及びハプトグロビンの腎臓中濃度に対する血漿中濃度の相関係数は夫々０．５７及び０．８２であった。投与量とＨＯ−１及びハプトグロビンタンパク質の血漿中濃度の相関は夫々ｒ＝０．８５及びｒ＝０．７５であった。 Ｎ−ＭｇｂのＩＰ投与量とグリセロール投与から１８時間後のＢＵＮ／クレアチニン濃度の用量反応関係を示す。（ＳｎＰＰ用量は１μｍｏｌの一定として）Ｎ−Ｍｇｂの用量を増加させると、グリセロール誘発ＡＫＩに対する保護の程度が増した。図１６に示す結果と合わせて分析すると、血漿及び腎皮質中のＨＯ−１／ハプトグロビン濃度とグリセロール誘発ＡＫＩに対する保護の程度の間に強い直接的な関係があることは明白である。横線は正常なＢＵＮ及びクレアチニン濃度を表す。右図に示すように、試験した用量範囲で１８時間後の血漿中クレアチニン濃度が正常に維持されたことから、腎臓はこれらの投与量に十分に耐えられたと判断された。 Ｎ−Ｍｇｂ／ＳｎＰＰを併用投与した場合の肝臓と心臓におけるＨＯ−１、ハプトグロビン（Ｈａｐｔｏ）及びＩＬ−１０遺伝子発現のアップレギュレーションを示す。投与による増加度を対照値に対する増加倍率として表す。各々肝臓（上段２図）と心臓（下段２図）の両方で増加した。個々の数値を表９及び１０に示す。 Ｎ−Ｍｇｂ−ＳｎＰＰによるプレコンディショニングが虚血後肝損傷と肝毒性損傷を軽減させることを示す。乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）とアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）の血漿中濃度により肝虚血再灌流（Ｉ／Ｒ）損傷の程度を判定した。Ｎ−Ｍｇｂ−ＳｎＰＰを前投与すると、ＬＤＨ濃度とＡＬＴ濃度（左図及び中央図）はいずれも有意に低下した。腹腔内グリセロール注射により誘発させた肝毒性損傷の程度も低下した（右図）。 Ｎ−Ｍｇｂ−ＳｎＰＰを前投与しない場合（上）とした場合（下）とで虚血から１８時間後に得られた肝臓切片の肉眼的外観を示す。肝虚血は白っぽい灰色の肝臓外観から判断されるように広範囲の肉眼的壊死を誘起した（上）。一方、Ｎ−Ｍｇｂ−ＳｎＰＰを前投与すると、肝臓はほぼ正常な外観を維持した（下）。 ビタミンＢ１２とＦｅスクロースが各々４時間以内に顕著なＨＯ−１タンパク質増加を誘導することを示す。 ビタミンＢ１２とＦｅスクロースが各々４時間以内に顕著なＨＯ−１タンパク質増加を誘導し、それらのＩＶ注射から１８時間持続することを示す。 マレイン酸塩を注射した対照（Ｃ）ではＢＵＮ及びＰＣｒが顕著に上昇することから明らかなように、マレイン酸塩注射により重度のＡＫＩが生じたことを示す。ＳｎＰＰ単独でもＦｅＳ単独でも腎損傷の重症度はさほど変わらなかった。一方、ＦｅＳ＋ＳｎＰＰを併用すると、ＢＵＮ／ＰＣｒ濃度が７５％低下したことから明らかなように、顕著な保護が付与された（横線は正常マウスにおけるＢＵＮ／ＰＣｒ濃度の平均値を表す）。 ＩＲＩ誘発から１８時間以内にＢＵＮ及びＰＣｒ濃度が４倍に上昇したことを示す。ＦｅＳ＋ＳＮＰＰを前投与すると、有意な保護が付与され、ＢＵＮ及びＰＣｒ濃度は５０％低下した。横線は正常マウスにおけるＢＵＮ／ＰＣｒ濃度の平均値を表す。 マレイン酸塩注射により重度のＡＫＩが誘発されたことを示す。ＢＵＮ／ＰＣｒの低下から明らかなように、この損傷はＦｅＳ＋Ｂ１２の前投与により著しく軽減された。横線は正常マウスにおけるＢＵＮ／ＰＣｒ濃度の平均値を表す グリセロール注射から１８時間以内に重度腎不全が生じたことを示す。１８時間後のＢＵＮ及びＰＣｒ濃度の著しい低下から明らかなように、ＦｅＳ＋Ｂ１２を前投与すると実質的な機能的保護が付与された。横線は正常マウスのＢＵＮ／ＰＣｒ濃度の平均値を表す。 注射から４時間後に評価した場合にＨＯ−１ｍＲＮＡが顕著且つ有意に増加したことを示す。１８時間までにＨＯ−１ｍＲＮＡレベルは正常値に戻った。 ４時間のｍＲＮＡ増加がＨＯ−１タンパク質濃度の有意増加と相関することを示す。これらの濃度は特にＦｅＳ投与の場合には１８時間の時点でも高いままであった。
生体臓器は損傷を受けると、有害事象（即ち傷害）が持続又は再発したとしてもより十分に自己防衛できるように保護応答を誘発することができる。この保護現象は当分野で「虚血プレコンディショニング」又は「獲得細胞抵抗性」と呼ばれている。
特に事前に分かっている傷害が迫っているときに、臓器を先制的に保護するためにこの獲得細胞抵抗性現象を利用することが考えられている。例えば、外科手術、バルーン血管形成術、誘発性心臓もしくは脳虚血再灌流障害又はＸ線造影剤の毒性等の傷害の前に臓器を保護するためにこの現象を誘導することができる。上記の代わりに又は上記に加え、低温保存損傷及び／又は再移植虚血再灌流障害を予防又は抑制するために、臓器ドナー（例えば、腎臓、肝臓）にこの現象を誘導することもできる。しかし、自己防衛させようとする臓器に損傷を生じずに制御下に獲得細胞抵抗性を首尾よく誘導するためのメカニズムが本開示以前には確立していないため、これらのアプローチはまだ臨床用に展開されていない。
本開示は保護しようとする臓器に損傷を生じずに獲得細胞抵抗性の誘導を可能にする組成物、キット及び方法を提供する。臓器に損傷を生じずに獲得細胞抵抗性を誘導することができるので、特に事前に分かっている傷害が接近しているときに、臓器を先制的に保護するためにこの現象を臨床状況で使用することができる。
理論に拘泥するものではないが、組成物、キット及び方法は保護性ストレスタンパク質の発現をアップレギュレートすることにより獲得細胞抵抗性を誘導する。保護しようとする臓器に損傷を生じないような濃度又はアプローチでヘムタンパク質を投与することにより獲得細胞抵抗性を誘導することができる。特定の実施形態では、ヘムタンパク質に利用される経路と同一又は同様の生体経路を介してストレスタンパク質をアップレギュレートする化合物を投与することにより獲得細胞抵抗性の誘導を実現することもできる。このような化合物としては、例えば鉄や、ビタミンＢ１２及び対応する代謝産物が挙げられる。
「傷害」は臓器に損傷を生じる可能性のある事象である。代表的な傷害としては、ショック（低血圧）、腎低灌流、外科手術、誘発性心臓又は脳虚血再灌流、心肺バイパス手術、バルーン血管形成術、Ｘ線造影剤の毒性投与、化学療法、薬物投与、腎毒性薬物投与、鈍的外傷、穿刺、毒素、喫煙等が挙げられる。
「損傷」とは臓器内の細胞死、臓器内の細胞損傷、臓器内の構造損傷及び／又は１以上の関連する対照群、条件もしくは基準レベルと比較した場合の臓器の機能低下により判断される臓器への有害作用である。
臓器に「損傷がない」、臓器に「損傷を生じずに」、「臓器を損傷しない」等の表現は、臓器への影響が適切な医学的判断の範囲内で妥当な投与の利益対危険比に見合うことを意味する。特定の実施形態において、損傷がないことは、その時点で公知の臓器機能検査に従い、適切な統計比較を使用して臓器の機能が関連する対照群、条件又は基準レベルと統計的有意差のないことを示すことにより実証できる。代表的な臓器機能アッセイとしては、臓器機能に対応するマーカーを測定する方法；臓器の出力を測定する方法；及び１以上の関連する対照群、条件又は基準レベルと比較した臓器の性能計測値を測定する方法が挙げられる。
獲得細胞抵抗性を誘導することにより、本願に開示する組成物、キット及び方法は傷害により誘発される損傷等の損傷から臓器を保護する。「損傷から臓器を保護する」等の表現は保護性ストレスタンパク質の発現をアップレギュレートすること；臓器機能を完全又は部分的に維持すること（例えば臓器の出力を測定する；臓器の性能計測値を測定する）；臓器細胞損傷を抑制すること（特定の実施形態では、循環系への細胞内タンパク質の漏出の低下により現れる）；及び１以上の関連する対照群、条件又は基準レベルと比較して臓器内の細胞死を抑制することの１以上を意味する。
損傷及び対応する保護の有無を評価するために使用することができる多数のアッセイを本願に開示し、臓器機能の動物及びヒトモデルで使用することができる。臓器の損傷がないこと及び／又は保護は対象からの関連する測定値を基準レベルと比較することにより確認することができる。基準レベルとしては、臓器機能のカットオフポイント及び／又は異常値を規定するために例えば識別限界又は危険を定める閾値に従って規定された「正常」又は「対照」レベル又は値を挙げることができる。基準レベルは臓器損傷のない対象に典型的に認められる徴候のレベルとすることができる。「基準レベル」の他の用語としては、「指標」、「ベースライン」、「標準」、「健康」、「損傷前」等を挙げることができる。このような正常レベルはスコアを出力するためにある徴候を単独で使用するのか又は他の徴候と組合せた式で使用するのかに応じて変動させることができる。あるいは、事前に試験した対象のうちで臨床的に妥当な期間にわたって臓器損傷を生じなかった対象からのスコアのデータベースから基準レベルを得ることができる。例えば臓器損傷状態が分かっているコントロール対象又は集団から基準レベルを得ることもできる。実施形態によっては、臓器損傷の治療を受けたことがある１以上の対象から基準レベルを得ることもできるし、損傷後に治療の結果として臓器機能の改善を示した対象から基準レベルを得ることもできる。実施形態によっては、臓器損傷の治療を受けていない１以上の対象から基準レベルを得ることもできる。損傷重症度のアルゴリズム又は集団検査の指数計算値から基準レベルを得ることもできる。
特定の実施形態において、「基準レベル」とは臓器機能の標準化値を意味することができ、如何なる損傷にも結び付かないレベル；特定のタイプの損傷に結び付けられるレベル；損傷の重症度に結び付けられるレベル；又は診断時、治療開始時もしくは治療中の１時点の特定の対象に結び付けられるレベルを表す。基準レベルは種々の試験場所で有用な汎用基準レベルでもよいし、臓器機能を測定するために使用する試験場所と特定のアッセイに固有の基準レベルでもよい。所定の実施形態において、基準レベルは（ｉ）臓器損傷もしくは特定の型の臓器損傷をもたない個体；又は（ｉｉ）臓器損傷もしくは特定の型の臓器損傷をもたない個体群から得られる。対象における臓器損傷の自然進行又は退行をモニターするために対象の基準レベルを治療中の対象の時点と関連付けることもできる。
特定の実施形態では、「データセット」から基準レベルを得ることができる。データセットとは所望の条件下の試料（又は試料集団）の評価により得られる１組の数値を表す。データセットの数値は例えば試料からの測定値を実験的に取得し、これらの測定値からデータセットを構成することにより得ることができ、あるいは実験室等のサービス供給元又はデータセットが保存されているデータベースもしくはサーバーからデータセットを取得することにより得ることもできる。
保護性ストレスタンパク質のアップレギュレーション。理論に拘泥するものではないが、多数のストレスタンパク質のアップレギュレーションにより獲得細胞抵抗性が誘導される。「アップレギュレーション」とは着目遺伝子もしくは核酸分子の発現又はタンパク質の活性の増加を意味し、例えばアップレギュレートされていない以外は同一又は同等の遺伝子又はタンパク質の発現又は活性と比較した遺伝子発現又はタンパク質活性の増加を意味する。
アップレギュレーションにより獲得細胞抵抗性を誘導することができる代表的なストレスタンパク質としては、ヘムオキシゲナーゼ（ＨＯ）、ハプトグロビン、ヘモペキシン、ヘプシジン、α１アンチトリプシン（ＡＡＴ）、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）、熱ショックタンパク質、好中球ゼラチナーゼ結合性リポカリン（ＮＧＡＬ）及びＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素が挙げられる。
ヘムオキシゲナーゼ（ＨＯ）はヘム代謝の律速酵素である。ＨＯには、ＨＯ−１（例えば配列番号１）、ＨＯ−２（アイソフォームＡ、例えば配列番号２；アイソフォームＢ、例えば配列番号３；アイソフォームＣ、例えば配列番号４）、及びＨＯ−３（例えば配列番号５）の３種類の異なるアイソザイムがある。ＨＯ−１はヘムタンパク質、重金属、低酸素症及び種々の酸化還元感受性経路により誘導されるような種々の型の組織ストレス後にその発現がアップレギュレートされるアイソザイムである。ＨＯ−２は構成的に発現されるアイソザイムである。ＨＯ−３は最近同定されたアイソザイムであり、その機能は現時点では不明である。
ハプトグロビン（例えば配列番号６）は分子量８６，０００〜４００，０００の血漿タンパク質であり、血流中に遊離されるヘモグロビンの代謝に重要な役割を果たす。ヘモグロビンは血液中に過剰に遊離されると尿細管を通って尿中に排泄され、鉄損失のみならず、尿細管の障害の原因となる。ハプトグロビンは生体内でヘモグロビンと選択的且つ強固に結合してヘモグロビン−ハプトグロビン複合体を形成するので、鉄の回収と腎障害の予防に重要な機能を果たす。
ヘモペキシン（Ｈｐｘ；例えば配列番号７）はアルブミン、免疫グロブリン及び血漿中プロテアーゼに次いで血漿中に多量に存在する６０ｋＤａタンパク質である。ヘモペキシンはβ１Ｂ糖タンパク質と呼ばれることも多い。ヘモペキシンはヘムに対する親和性が高く（ＫＤ＜１０−１２Ｍ）、Ｈｐｘの生物学的役割はヘムの輸送に関係があり、ヘムにより誘発される酸化的損傷と、ヘムに結合した鉄の損失を防ぐと考えられている。ヘモペキシンは血漿からの遊離のヘムと結合して構造変化をもたらし、形成されたヘム−Ｈｐｘ複合体は肝臓内の受容体に対する親和性が高いため、受容体を介するエンドサイトーシスによりに取り込まれ、ヘムはエンドソーム内の低ｐＨで放出される。その後、Ｈｐｘは循環系に戻り、更に輸送過程を経ることができる。
ヘモペキシンは２００アミノ酸を各々２０アミノ酸残基リンカーにより連結させた２つの相同領域に折畳まれている。２領域間の配列一致度は２５％である。リンカーペプチドに由来するＨｉｓ２１３とＣ末端領域のループに由来するＨｉｓ２７０の２個のヒスチジンがヘム鉄と配位し、安定なビスヒスチジルＦｅ（ＩＩＩ）錯体を形成する。残基番号は成熟タンパク質に基づく。Ｈｐｘの化学的性質についてはＣｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，３１２，２００１，１３−２３とＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，２１，２００２，２９７−３０４に記載されている。
ヘプシジン（プレプロペプチド；例えば配列番号８）は鉄恒常性を調節する主要なシグナルである（Ｐｈｉｌｐｏｔｔ，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ３５：９９３（２００２）；Ｎｉｃｏｌａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９９：４３９６（２００２））。ヒトヘプシジン濃度が高いと鉄濃度が低下し、低いと鉄濃度が上昇する。ヘプシジン遺伝子の突然変異の結果、ヘプシジン活性が失われ、重度の鉄過剰症である若年性ヘモクロマトーシスに結び付けられる（Ｒｏｅｔｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，３３：２１−２２，２００３）。マウスでの研究によると、正常な鉄恒常性の制御におけるヘプシジンの役割が立証されている（Ｎｉｃｏｌａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，３４：９７−１０１，２００３；Ｎｉｃｏｌａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９：４５９６−４６０１，２００２；Ｎｉｃｏｌａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９８：８７８０−８７８５，２００１）。
また、ヘプシジンが炎症時の鉄貯蔵に関与しているというデータも蓄積しつつある（例えばＷｅｉｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１００：３７７６−３６７８１，２００２；Ｋｅｍｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１０６：１８６４−１８６６，２００５；Ｎｉｃｏｌａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１１０：１０３７−１０４４，２００２；Ｎｅｍｅｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１１３：１２７１−１２７６，２００４；Ｎｅｍｅｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１０１：２４６１−２４６３，２００３及びＲｉｖｅｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１０５：１７９７−１８０２，２００５参照）。ヘプシジン遺伝子発現は感染等の炎症性刺激後に強くアップレギュレートされ、脊椎動物の自然免疫系の急性期反応を誘導することが認められている。マウスにおいて、ヘプシジン遺伝子発現はリポ多糖（ＬＰＳ）、ターペンタイン、フロイント完全アジュバント及びアデノウイルス感染症によりアップレギュレートされることが示されている。ヘプシジン発現は炎症性サイトカインであるＩＬ−６により誘導される。細菌、真菌及びウイルス感染症を含む慢性炎症性疾患をもつ患者でヘプシジン発現と炎症の貧血の間に強い相関も認められた。
ヒトヘプシジンは抗微生物作用と鉄制御作用をもつ２５アミノ酸ペプチド（例えば配列番号９）であり、新規抗微生物ペプチドを研究する２つのグループにより別々に発見された（Ｋｒａｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４８０：１４７（２０００）；Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：７８０６（２００１））。これはＬＥＡＰ−１（肝臓で発現される抗微生物ペプチド）とも呼ばれている。その後、鉄により制御される肝特異的遺伝子を探求する過程でマウスで８３アミノ酸プレプロペプチドと、ラット及びヒトで８４アミノ酸プレプロペプチドをコードするヘプシジンｃＤＮＡが同定された（Ｐｉｇｅｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：７８１１（２００１））。先ず２４残基Ｎ末端シグナルペプチドが切断されてプロヘプシジンとなった後に更にプロセシングされ、血液中と尿中に存在する成熟ヘプシジンとなる。ヒト尿では、２５アミノ酸が主体であるが、もっと短い２２アミノ酸と２０アミノ酸のペプチドもある。
成熟ペプチドは８個のシステイン残基が４個のジスルフィド結合として連結されている点に注目すべきである。ヘプシジンの構造はＨｕｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７：３７５９７−３７６０３（２００２）により解析され、尿から精製した天然ヘプシジンとＨＰＬＣ保持時間が同一の化学合成ヘプシジンを使用してＮＭＲにより解析されている。Ｈｕｎｔｅｒらはその解析結果として、ヘプシジンは隣接するジスルフィド結合（Ｃ１−Ｃ８、Ｃ２−Ｃ７、Ｃ３−Ｃ６、Ｃ４−Ｃ５）を含むヘアピン型ループ構造で折畳まれていると報告している。
α１アンチトリプシン（ＡＡＴ；例えば配列番号１０）は肝細胞により分泌される糖タンパク質であり、通常では血清中と大半の組織中に高濃度で存在し、セリンプロテアーゼの阻害剤として作用する。ＡＡＴによるプロテアーゼ阻害は組織タンパク分解の調節の必須要素であり、ＡＡＴ欠損は複数の疾患の病理に関係がある。抗プロテアーゼとしてのその作用以外に、ＡＡＴは多数の炎症メディエーターと酸化種ラジカルに対する優れた阻害能をもつため、重要な抗炎症性の生物学的機能をもつと思われる（Ｂｒａｎｔｌｙ Ｍ．Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２００２；２７：６５２−６５４）。
インターロイキン１０（ＩＬ−１０；例えば配列番号１１）はマクロファージ、単球、Ｔｈ２型及び制御性Ｔ細胞及びＢ細胞等の複数の細胞種により産生される多面的サイトカインである。ＩＬ−１０は免疫抑制性と抗炎症性をもつサイトカインであり、多数の骨髄系及びリンパ系細胞活性を制御し、Ｔ細胞とナチュラルキラー（ＮＫ）細胞による複数の炎症性サイトカインの産生を直接阻害する。ＩＬ−１０はＢ細胞増殖因子とも呼ばれ、自己免疫、抗体産生、腫瘍形成及び移植寛容において作用する。Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔ．１９９７ ２４（１）：１−８。ＩＬ−１０は更に、感染に対するマクロファージ反応を変化させると同時に同一細胞上のＦｃ受容体を刺激する。Ａｎｎａｌｓ Ａｌｌｅｒｇｙ Ａｓｔｈｍａ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９７ ７９：４６９−４８３；Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９３ １５１：１２２４−１２３４；及びＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９２ １４９：４０４８−４０５２。
熱ショックタンパク質は急激な温度上昇に暴露された哺乳動物細胞で大半の細胞タンパク質の発現が著しく低下するのに反して多量に発現されることが当初に認められた。それ以来、このようなタンパク質はグルコース欠乏を含む種々のタイプのストレスに応答して産生されるとみなされている。
熱ショックタンパク質はその非天然状態にある他のタンパク質と結合することができ、特にリボソームから抜け出る又は小胞体内に押出される新生ペプチドと結合することができる。Ｈｅｎｄｒｉｃｋ ａｎｄ Ｈａｒｔｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：３４９−３８４（１９９３）；Ｈａｒｔｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３８１：５７１−５８０（１９９６）。更に、熱ショックタンパク質はサイトゾル、小胞体及びミトコンドリアでタンパク質の正しい折り畳みと会合に重要な役割を果たすことが示されており、この機能に鑑みて「分子シャペロン」と呼ばれる。Ｆｒｙｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３７０：１１１−１１７（１９９４）；Ｈｅｎｄｒｉｃｋ ａｎｄ Ｈａｒｔｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：３４９−３８４（１９９３）；Ｈａｒｔｌ，Ｎａｔｕｒｅ ３８１：５７１−５８０（１９９６）。
熱ショックタンパク質の例としては、ＢｉＰ（別称ｇｒｐ７８（例えば配列番号１２））、ｈｓｐ／ｈｓｃ７０（例えば配列番号１３）、ｇｐ９６（ｇｒｐ９４）（例えば配列番号１４）、ｈｓｐ６０（例えば配列番号１５）、ｈｓｐ４０（例えば配列番号１６）、ｈｓｐ７０／７２（例えば配列番号１７）、及びｈｓｐ９０（アイソフォーム１、例えば配列番号１８；アイソフォーム２、例えば配列番号１９）が挙げられる。
リポカリンは細菌からヒトに至る多様な生物に存在する細胞外リガンド結合タンパク質のファミリーである。リポカリンは疎水性低分子の結合と輸送、栄養素輸送、細菌増殖調節、免疫応答の調節、炎症及びプロスタグランジン合成等の多くの異なる機能をもつ。
好中球ゼラチナーゼ結合性リポカリン（ＮＧＡＬ；例えば配列番号２０）はヒト好中球リポカリン（ＨＮＬ）、Ｎ−ホルミルペプチド結合タンパク質及び２５ｋＤａ α２ミクログロブリン関連タンパク質とも呼ばれ、単量体、ホモ二量体又はゼラチナーゼＢやマトリックスメタロプロテアーゼ−９（ＭＭＰ−９）等のタンパク質とのヘテロ二量体として存在することができる２４ｋＤａタンパク質である。三量体のＮＧＡＬも同定されている。ＮＧＡＬは活性化されたヒト好中球の特定の顆粒から分泌される。マウス（２４ｐ３／ウテロカリン）とラット（α２ミクログロブリン関連タンパク質／ｎｅｕ関連リポカリン）でも相同のタンパク質が同定されている。構造データによると、ＮＧＡＬはリポカリンの特徴である８本のβ鎖からなるβバレル構造をとるが、ＮＧＡＬはリポカリンに通常見られるよりも高極性で正電荷をもつアミノ酸残基が内部の非常に大きな空洞に並んでいることが確認された。ＮＧＡＬは細菌由来リポ多糖やホルミルペプチド等の親油性低分子物質と結合すると考えられており、炎症のモジュレーターとして機能するらしい。
ＮＧＡＬは急性腎障害又は疾患の初期マーカーである。ＮＧＡＬは活性化されたヒト好中球の特定の顆粒により分泌される以外に、尿細管上皮細胞損傷に応答してネフロンからも産生され、尿細管間質（ＴＩ）損傷のマーカーである。ＮＧＡＬ濃度は軽度の「亜臨床」腎虚血後でも虚血又は腎毒性からの急性尿細管壊死（ＡＴＮ）で上昇する。更に、ＮＧＡＬ慢性腎疾患（ＣＫＤ）と急性腎障害（ＡＫＩ）の場合に腎臓により発現されることが知られている（例えばＤｅｖａｒａｊａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｋｉｄｎｅｙ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ５２（３）；３９５−３９９（Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２００８）；及びＢｏｌｉｇｎａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｋｉｄｎｅｙ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ５２（３）：５９５−６０５（Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２００８）参照）。尿中ＮＧＡＬ濃度の上昇は進行性腎不全の予測因子であると示唆されている。ＮＧＡＬは動物及びヒトモデルの両方で虚血又は腎毒性損傷の直後に尿細管により顕著に発現されることが既に立証されている。ＮＧＡＬは尿中に急速に分泌されるので容易に検出・測定することができる。ＮＧＡＬはプロテアーゼ耐性であるため、尿細管におけるＮＧＡＬ発現の忠実なマーカーとして尿中で回収できると思われる。
ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素はメバロン酸経路を介して肝臓及び他の組織でコレステロール及び他のイソプレノイドの産生に中心的な役割を果たす。３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素Ａ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）からメバロン酸への変換はＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素により触媒され、肝臓及び他の組織におけるコレステロール生合成経路の初期律速段階である。ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素のストレス誘導性上昇はコレステロール合成をもたらし、血漿膜コレステロールが上昇する。
保護性ストレスタンパク質の発現はヘムタンパク質の投与によりアップレギュレートされる。ヘムタンパク質はヘム補欠分子族（プロトポルフィリン環に中心Ｆｅが配位したもの。プロトポルフィリン環は４個のピロール環がメチン橋により連結されたものである。メチル基４個、ビニル基２個及びプロピオン酸側鎖２個も結合することができる。）を含むメタロプロテインである。特定の実施形態において、ヘムタンパク質は低分子量ヘムタンパク質である。「低分子量ヘムタンパク質」としては、分子量２５ｋＤａ以下、２４ＫＤａ以下、２３ｋＤａ以下、２２ｋＤａ以下、２１ｋＤａ以下、２０ｋＤａ以下、１９ｋＤａ以下、１８ｋＤａ以下、１７ｋＤａ以下、１６ｋＤａ以下、１５ｋＤａ以下、１４ｋＤａ以下、１３ｋＤａ以下、１２ｋＤａ以下、１１ｋＤａ以下又は１０ｋＤａ以下のものが挙げられる。別の実施形態において、ヘムタンパク質は静脈内投与した場合に迅速に排出される。「迅速に排出される」とは、尿中クリアランス速度が血清クレアチニン又は尿素の＞５０％である尿中排泄速度を意味する。別の実施形態において、ヘムタンパク質は静脈内投与した場合に迅速に排出される低分子量ヘムタンパク質である。ミオグロビン（例えば配列番号２１）は本願に開示する組成物、キット及び方法で使用することができる１種のヘムタンパク質である。ヘムタンパク質と言う場合には、修飾ヘムタンパク質、変異体ヘムタンパク質及びＤ置換アナログヘムタンパク質を含む。ミオグロビンと言う場合には、本願の他の箇所に記載するような修飾ミオグロビン、変異体ミオグロビン及びＤ置換アナログミオグロビンを含む。
ミオグロビンは横紋筋組織に存在し、ミオグロビンの空いた結合部位でＯ２と可逆的に結合することにより酸素を貯蔵・放出するように機能する。この可逆的結合により、ミオグロビンは細胞ミトコンドリアの細胞内酸素源を構成する。別のヘムタンパク質であるヘモグロビンと異なり、ミオグロビンは天然では単量体としてしか存在しない。
筋組織が損傷すると、血流中にミオグロビンが放出される。Ｚａｇｅｒ，Ｒ．Ａ．，Ｒｅｎ．Ｆａｉｌ．，１４，３４１−３４４（１９９２）に記載されているように、血液中の多量のミオグロビンは腎血管の狭窄を誘起することにより腎損傷を生じ、尿細管腔内に閉塞性の円柱を形成し、腸炎症を誘発する恐れがある。更に、Ｎａｔｈらの言説によると、ヘモグロビン等のヘムタンパク質は細胞外スペースに放出されると組織毒性を生じ、ミオグロビンは横紋筋融解症における腎不全の病因に直接関与している。Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１９９２ Ｊｕｌ．（９０）１：２６７−７０。従って、ヘムタンパク質、特にミオグロビンは腎系統を損傷させる可能性がある。
ミオグロビンを含むヘムタンパク質にはこれらの有害な作用があることが分かっていたため、ミオグロビン等のヘムタンパク質が臓器損傷を生じずに獲得細胞抵抗性を誘導するのに役割を果たすとは予想されなかった。従って、本開示の１態様は、保護の目的でミオグロビンを投与する臓器に損傷を生じずに獲得細胞抵抗性を誘導するようにミオグロビンを投与するための組成物、キット及び方法を同定することを含む。
臓器損傷を生じずにヘムタンパク質投与により獲得細胞抵抗性を誘導することができるアプローチとしては、ヘムタンパク質の治療有効量を選択する方法；ヘムタンパク質の生物学的半減期を延長させる方法；ヘムタンパク質の作用を増強する方法；及びヘムタンパク質投与に伴う毒性を低減する方法が挙げられる。
本願に開示する１実施形態はミオグロビン等のヘムタンパク質の治療有効量を選択することを含む。治療有効量、治療有効量の決定方法及び治療有効量の例について以下により詳細に説明する。
ヘムタンパク質の生物学的半減期は、ヘムタンパク質をヘムタンパク質分解阻害剤と併用投与することにより延長させることができる。特定の実施形態において、ヘムタンパク質分解阻害剤はヘムタンパク質のポルフィリン環がＨＯにより開裂されるのを抑制又は阻止し、ヘムタンパク質の毒性のＦｅ分が放出されるのを抑制又は阻止することができる。特定の実施形態では、ヘムタンパク質分解阻害剤をヘムタンパク質と併用投与することにより、ヘムタンパク質の投与量を減らすことができる。
特定の実施形態では、ヘムとＨＯの結合を阻止するあらゆる化合物がヘムタンパク質分解阻害剤として機能することができる。例えば、鉄プロトポルフィリンＩＸの多数の合成アナログが知られている。これらの化合物は市販されており、及び／又は公知方法により容易に合成することができる。これらの化合物としては、例えば白金、亜鉛、ニッケル、コバルト、銅、銀、マンガン、クロム及び錫プロトポルフィリンＩＸが挙げられる。便宜上、これらの化合物をＭｅ−プロトポルフィリン又はＭｅＰＰ（式中、Ｍｅは金属を表す）と総称することができ、具体的には金属の化学記号を利用し、例えばクロム、錫及び亜鉛プロトポルフィリン化合物を夫々Ｃｒ−プロトポルフィリン（ＣｒＰＰ）、Ｓｎ−プロトポルフィリン（ＳｎＰＰ）、Ｚｎ−プロトポルフィリン（ＺｎＰＰ）と呼称する。
ヘミン及び／又はヘマチンも競合的ＨＯ−１阻害剤として使用することができる。場合によっては、ヘミンとヘマチンは同義に使用され、第二鉄イオンが塩化物配位子に結合したプロトポルフィリンＩＸを意味する。ヘミンとヘマチンを区別し、Ｃｌ配位子形態をヘミンと呼び、塩化物ではなく水酸化物が鉄イオンと結合した同一化合物をヘマチンと呼ぶ場合もある。どちらも本開示の教示内の競合的ＨＯ−１阻害剤として使用することができる。実際に、上述したように、ヘムとＨＯの結合を阻止するあらゆる化合物がヘムタンパク質分解阻害剤として機能することができる。
ＨＯの作用を阻止すると、損傷を生じずに獲得細胞抵抗性の誘導を有利に助長できるということは予測外であった。例えば、Ｎａｔｈらはヘムタンパク質毒性のグリセロールモデルでマウスのＨＯ−１遺伝子をノックアウトすると、腎損傷が悪化したと報告している。同著者らはＨＯ−１が生体内でヘムタンパク質により誘発される急性毒性に対する極めて重要な保護剤であると述べている。Ａｍ．Ｊ．ｏｆ Ｐａｔｈ．，２０００ Ｍａｙ １５６（５）：１５２７−１５３５。
更に、損傷を生じずに獲得細胞抵抗性を誘導するためにＭｅ−プロトポルフィリンをヘムタンパク質と併用できるということも予想外であった。これはＭｅ−プロトポルフィリンが一般に種々の臓器損傷モデルで臓器に悪影響を与えると考えられているためである。例えば、Ａｇａｒｗａｌらはヘムタンパク質介在性腎損傷のＨＯベースインビボモデルでＳｎ−プロトポルフィリンを前投与すると、腎損傷が悪化することを見出した。特に、Ｓｎ−プロトポルフィリンを前投与すると、３〜５日目に血清クレアチニン値が上昇し、５日目にイヌリンクリアランスが低下した。シスプラチン投与から２日後に腎血行動態を試験した処、Ｓｎ−プロトポルフィリンを投与したラットでは腎血流速度が低下し、腎血管抵抗が増加し、ナトリウム排泄率が上昇することが実証された。Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．１９９５ Ｏｃｔ．４８（４）：１２９８−３０７。グリセロールモデル横紋筋融解症において、Ｎａｔｈらは腎臓がＨＯを誘導することにより多量のヘムタンパク質に応答することと、ＨＯの作用を競合的阻害剤（この場合にはＳｎ−プロトポルフィリン）で阻止すると、腎機能障害が悪化することを見出した。Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１９９２ Ｊｕｌ：９０（１）：２６７−７０。ＦｅｒｅｎｂａｃｈらとＧｏｏｄｍａｎらも同様にＭｅ−プロトポルフィリンを使用してＨＯを阻害すると、腎損傷が悪化することを示している。夫々Ｎｅｐｈｒｏｎ．Ｅｘｐ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．２０１０ Ａｐｒ．１１５（３）：ｅ３３−７及びＫｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．２００７ Ｏｃｔ．７２（８）：９４５−５３参照。従来技術のこれらの教示に鑑み、当業者は本願に開示するＨＯ−１阻害の有益な効果を予想しなかったであろう。
理論に拘泥するものではないが、ヘムタンパク質は酸化還元感受性転写因子を活性化させ、酸化還元感受性細胞保護タンパク質のアップレギュレーションをもたらす。この経路はＭｇｂの鉄分により開始される。従って、本願で実証するように、鉄を介する尿細管細胞保護遺伝子シグナル伝達を誘導する代替アプローチも有効である。これらの代替アプローチとしては、鉄及び／又はビタミンＢ１２の投与が挙げられる。Ｂ１２を挙げる根拠はコバルトとシアン化物がいずれも独立してＨＯ−１を誘導できるからである。即ち、シアン化物とコバルトはいずれもＢ１２分子の主要部分であるので、Ｂ１２はその両方を単剤として投与するための安全な方法である。
修飾ヘムタンパク質及びヘムタンパク質分解阻害剤（例えばプロトポルフィリン、ヘミン、ヘマチン）としては、（ａ）タンパク質血清半減期及び／もしくは機能的インビボ半減期を延長させたもの、（ｂ）タンパク質抗原性を低下させたもの、（ｃ）タンパク質保存安定性を強化したもの、（ｄ）タンパク質溶解度を高くしたもの、（ｅ）循環時間を長くしたもの、並びに／又は（ｆ）バイオアペイラビリティを高めたもの、例えば曲線下面積（ＡＵＣ）を高めたものが挙げられる。
特定の実施形態において、修飾ヘムタンパク質及びヘムタンパク質分解阻害剤（「修飾体」）としては、１以上のアミノ酸を非アミノ酸成分で置換えたものや、アミノ酸を官能基と共役させるか又は他の方法で官能基をアミノ酸と結合させたものが挙げられる。修飾アミノ酸は例えばグリコシル化アミノ酸、ＰＥＧ化アミノ酸、ファルネシル化アミノ酸、アセチル化アミノ酸、ビオチン化アミノ酸、脂質部分と結合させたアミノ酸、又は有機誘導体化剤と結合させたアミノ酸とすることができる。アミノ酸は組換え生産中に例えば翻訳と同時又は翻訳後に修飾する（例えば哺乳動物細胞で発現中にＮ−Ｘ−Ｓ／ＴモチーフをＮ−結合型グリコシル化する）こともできるし、合成手段により修飾することもできる。修飾アミノ酸は配列の内部でもよいし、配列の末端でもよい。修飾体としては更に亜硝酸化ミオグロビン等の亜硝酸化ヘムタンパク質も挙げられる。
その天然状態において、ミオグロビンは１７ｋＤａであるため、迅速に濾過され、腎臓により排泄される。ミオグロビンのサイズを大きくすることにより、その排泄を遅くすることができ、保護効果を延ばし、持続させることができる。１実施形態において、修飾タンパク質はＰＥＧ化ヘムタンパク質又はヘムタンパク質分解阻害剤である。
ＰＥＧ化はミオグロビン及び他の低分子量タンパク質のサイズを大きくするために使用することができる１つの方法である。ＰＥＧ化はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマー鎖を薬物やタンパク質等の他の分子と共有結合させる方法である。タンパク質のＰＥＧ化方法は数種類のものが文献に報告されている。例えば、タンパク質のリジン残基及びＮ末端の遊離アミン基をＰＥＧ化するためにＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）−ＰＥＧが使用されており；還元剤の存在下でタンパク質のアミノ末端をＰＥＧ化するためにアルデヒド基を有するＰＥＧが使用されており；タンパク質のシステイン残基の遊離チオール基を選択的にＰＥＧ化するためにマレイミド官能基を有するＰＥＧが使用されており；アセチル−フェニルアラニン残基の部位特異的ＰＥＧ化を実施することができる。
タンパク質又はペプチドをＰＥＧと共有結合させる方法は生体内のタンパク質及びペプチドの循環半減期を延長させるために有用な方法であることが分かっている（Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，１９８４，７：１７５−１８６；Ｈｅｒｓｈｆｉｅｌｄ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１９８７，３１６：５８９−５９６；及びＭｅｙｅｒｓ，Ｆ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１９９１，４９：３０７−３１３）。ＰＥＧをタンパク質及びペプチドと結合させると、分子を酵素分解から保護できるだけでなく、生体からのそのクリアランス速度も低下する。タンパク質と結合させるＰＥＧのサイズはタンパク質の循環半減期に大きな影響がある。ＰＥＧ化がクリアランスを低下させる効力は一般にタンパク質と結合させるＰＥＧ基の数ではなく、改変後のタンパク質の総分子量に依存する。ＰＥＧ化は分子の見掛けの分子量を増やすことにより血流からのクリアランス速度を低下させる。所定のサイズまで、タンパク質の糸球体濾過量はタンパク質のサイズに反比例する。通常では、ＰＥＧが大きいほど、結合させたタンパク質のインビボ半減期は長くなる。また、ＰＥＧ化はタンパク質凝集を抑制し（Ｓｕｚｕｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈ．Ａｃｔａ ｖｏｌ．７８８，ｐｇ．２４８（１９８４））、タンパク質免疫原性を変化させ（Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．ｖｏｌ．２５２ ｐｇ．３５８２（１９７７））、例えばＰＣＴ公開第ＷＯ９２／１６２２１号に記載されているようにタンパク質溶解度を高めることもできる。
目標とする循環半減期をもつタンパク質を生産するのに適した種々のサイズのＰＥＧが市販されている（Ｎｅｋｔａｒ Ａｄｖａｎｃｅｄ ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ Ｃａｔａｌｏｇ ２００５−２００６；及びＮＯＦ ＤＤＳ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ Ｖｅｒ ７．１）。ｍＰＥＧスクシンイミジルスクシネート、ｍＰＥＧスクシンイミジルカーボネート、及びｍＰＥＧプロピオンアルデヒド等のＰＥＧアルデヒドを含む種々の活性化ＰＥＧが使用されている。
別の実施形態において、修飾タンパク質は亜硝酸化ヘムタンパク質又は亜硝酸化ヘムタンパク質分解阻害剤である。亜硝酸イオンは一酸化窒素合成酵素（ＮＯＳ）に非依存性の経路を介する一酸化窒素（ＮＯ）の生成の調節に関与している。無機亜硝酸イオンは酸素結合性ヘムタンパク質（ヘモグロビン及びミオグロビン）、デオキシヘモグロビン、デオキシミオグロビン、キサンチン酸化還元酵素、内皮型ＮＯＳ、酸不均化、及びミトコンドリア電子伝達系のメンバー（例えばいずれも潜在的な電子供与体であるミトコンドリアヘムタンパク質）により種々のメカニズムを介してＮＯへの一電子還元を受けることができる。
例えばミオグロビン等においてヘム鉄に亜硝酸イオンが結合すると、このヘムタンパク質は熱ショックタンパク質（例えばＨＳＰ７２）、ＨＯ−１、ハプトグロビン、ヘモペキシン、ヘプシジン、ＩＬ−１０、ＡＡＴ、ＮＧＡＬ及び／又はＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素等のストレスタンパク質の発現をアップレギュレートする能力を高めることができる。本願に開示する亜硝酸イオンとＦｅの結合の結果、ヘムタンパク質投与に伴う毒性を低減させることもできる。理論に拘泥するものではないが、ストレスタンパク質の発現のアップレギュレーションは獲得細胞抵抗性を促進するのに役立つ。
理論に拘泥するものではないが、本開示は糸球体濾過後にＮ−ＭｇｂとＳｎＰＰが近位尿細管に取り込まれ、酸化還元感受性転写因子を活性化させ、酸化還元感受性細胞保護タンパク質のアップレギュレーションをもたらすことを示唆するものであるので、特定の実施形態では亜硝酸化型の有効成分を使用する。同様に理論に拘泥するものではないが、この経路はＭｇｂの鉄（Ｆｅ）分により開始される。亜硝酸イオンとＭｇｂＦｅの結合は潜在的なＦｅ毒性を抑えながらＦｅシグナル伝達を助長する。ＳｎＰＰの併用投与もＦｅシグナル伝達を助長する。これらの同一経路はＳｎＰＰ組織結合部位／シグナル伝達とスカベンジャー受容体を介したＭｇｂ取り込みにより腎外臓器で活性化させることができる。
ヘムタンパク質、ヘムタンパク質分解阻害剤及び保護性ストレスタンパク質を含めて本願でタンパク質と記載する場合には、その変異体とＤ置換アナログも含む。
本願に開示するタンパク質の「変異体」としては、本願に開示するタンパク質に比較して１カ所以上のアミノ酸付加、欠失、停止位置又は置換を有するタンパク質が挙げられる。
アミノ酸置換は保存的置換でも非保存的置換でもよい。本願に開示するタンパク質の変異体としては、１カ所以上の保存的アミノ酸置換を有するものを挙げることができる。「保存的置換」とは以下の保存的置換グループ、即ちグループ１：アラニン（ＡｌａないしＡ）、グリシン（ＧｌｙないしＧ）、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；グループ２：アスパラギン酸（ＡｓｐないしＤ）、Ｇｌｕ；グループ３：アスパラギン（ＡｓｎないしＮ）、グルタミン（ＧｌｎないしＱ）；グループ４：Ａｒｇ、リジン（ＬｙｓないしＫ）、ヒスチジン（ＨｉｓないしＨ）；グループ５：Ｉｌｅ、ロイシン（ＬｅｕないしＬ）、メチオニン（ＭｅｔないしＭ）、バリン（ＶａｌないしＶ）；及びグループ６：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐのうちの１つのグループ内で行われる置換を意味する。
また、類似する機能、化学構造又は組成によりアミノ酸を保存的置換グループに分けることもできる（例えば酸性、塩基性、脂肪族、芳香族、含硫）。例えば、脂肪族グループには、置換の目的でＧｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ及びＩｌｅを含むことができる。相互に保存的置換であるとみなされるアミノ酸を含む他のグループとしては、含硫：Ｍｅｔ及びＣｙｓ；酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ及びＧｌｎ；小さい脂肪族で非極性又はやや極性の残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ及びＧｌｙ；極性で負電荷をもつ残基及びそのアミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ及びＧｌｎ；極性で正電荷をもつ残基：Ｈｉｓ、Ａｒｇ及びＬｙｓ；大きい脂肪族で非極性の残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ及びＣｙｓ；大きい芳香族残基：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ及びＴｒｐが挙げられる。その他の情報はＣｒｅｉｇｈｔｏｎ（１９８４）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙに記載されている。
本願に開示するタンパク質の変異体としては、本願に開示するタンパク質に対して少なくとも７０％の配列一致度、少なくとも８０％の配列一致度、少なくとも８５％の配列一致度、少なくとも９０％の配列一致度、少なくとも９５％の配列一致度、少なくとも９６％の配列一致度、少なくとも９７％の配列一致度、少なくとも９８％の配列一致度又は少なくとも９９％の配列一致度をもつ配列も挙げられる。より特定的には、本願に開示するタンパク質の変異体としては、例えば配列番号１〜２９のいずれかに対して７０％の配列一致度、例えば配列番号１〜２９のいずれかに対して８０％の配列一致度、例えば配列番号１〜２９のいずれかに対して８１％の配列一致度、例えば配列番号１〜２９のいずれかに対して８２％の配列一致度、例えば配列番号１〜２９のいずれかに対して８３％の配列一致度、例えば配列番号１〜２９のいずれかに対して８４％の配列一致度、例えば配列番号１〜２９のいずれかに対して８５％の配列一致度、例えば配列番号１〜２９のいずれかに対して８６％の配列一致度、例えば配列番号１〜２９のいずれかに対して８７％の配列一致度、例えば配列番号１〜２９のいずれかに対して８８％の配列一致度、例えば配列番号１〜２９のいずれかに対して８９％の配列一致度、例えば配列番号１〜２９のいずれかに対して９０％の配列一致度、例えば配列番号１〜２９のいずれかに対して９１％の配列一致度、例えば配列番号１〜２９のいずれかに対して９２％の配列一致度、例えば配列番号１〜２９のいずれかに対して９３％の配列一致度、例えば配列番号１〜２９のいずれかに対して９４％の配列一致度、例えば配列番号１〜２９のいずれかに対して９５％の配列一致度、例えば配列番号１〜２９のいずれかに対して９６％の配列一致度、例えば配列番号１〜２９のいずれかに対して９７％の配列一致度、例えば配列番号１〜２９のいずれかに対して９８％の配列一致度、又は例えば配列番号１〜２９のいずれかに対して９９％の配列一致度をもつタンパク質が挙げられる。
ミオグロビンの変異体としては、例えば配列番号２１に対して７０％の配列一致度、例えば配列番号２１に対して８０％の配列一致度、例えば配列番号２１に対して８１％の配列一致度、例えば配列番号２１に対して８２％の配列一致度、例えば配列番号２１に対して８３％の配列一致度、例えば配列番号２１に対して８４％の配列一致度、例えば配列番号２１に対して８５％の配列一致度、例えば配列番号２１に対して８６％の配列一致度、例えば配列番号２１に対して８７％の配列一致度、例えば配列番号２１に対して８８％の配列一致度、例えば配列番号２１に対して８９％の配列一致度、例えば配列番号２１に対して９０％の配列一致度、例えば配列番号２１に対して９１％の配列一致度、例えば配列番号２１に対して９２％の配列一致度、例えば配列番号２１に対して９３％の配列一致度、例えば配列番号１に対して９４％の配列一致度、例えば配列番号２１に対して９５％の配列一致度、例えば配列番号２１に対して９６％の配列一致度、例えば配列番号２１に対して９７％の配列一致度、例えば配列番号２１に対して９８％の配列一致度、例えば配列番号２１に対して９９％の配列一致度をもつミオグロビンタンパク質を挙げることができる。
「配列一致度％」とは配列を比較することにより決定される２以上の配列間の関係を意味する。当分野において、「一致度」とはこのような配列の連鎖間の一致により決定されるタンパク質配列間の配列関連度も意味する。「一致度」（「類似度」と言うことも多い）は公知方法により容易に計算することができ、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．）Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９８８）；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９４）；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ Ｉ（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，ＮＪ（１９９４）；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ，Ｇ．，ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９８７）；及びＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．）Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９２）に記載されている方法が挙げられる。配列一致度を決定するための好ましい方法は試験する配列間で最良の一致が得られるようにデザインされる。配列一致度及び類似度の決定方法は公共入手可能なコンピュータプログラムで体系化されている。配列整列と一致度百分率計算はＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクス計算プログラムパッケージ（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）のＭｅｇａｌｉｇｎプログラムを使用して実施することができる。デフォルトパラメータ（ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０，ＧＡＰ ＬＥＮＧＴＨ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０）を使用してＣｌｕｓｔａｌ整列法（Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ ＣＡＢＩＯＳ，５，１５１−１５３（１９８９））により配列の多重整列を行うこともできる。関連するプログラムとしては、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ９．０，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）；ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）；ＤＮＡＳＴＡＲ（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）；及びＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを搭載したＦＡＳＴＡプログラム（Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，［Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］（１９９４），Ｍｅｅｔｉｎｇ Ｄａｔｅ １９９２，１１１−２０．Ｅｄｉｔｏｒ（ｓ）：Ｓｕｈａｉ，Ｓａｎｄｏｒ．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ｐｌｅｎｕｍ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）も挙げられる。本開示の文脈内では、当然のことながら、配列解析ソフトウェアを解析に使用する場合には、解析の結果は参照するプログラムの「デフォルト値」を基準とする。「デフォルト値」とは最初に初期化する際にソフトウェアで当初にロードされる数値又はパラメータの何らかのセットを意味する。
「Ｄ置換アナログ」としては、本願に開示するタンパク質のうちで１以上のＬ−アミノ酸を１以上のＤ−アミノ酸で置換したものが挙げられる。Ｄ−アミノ酸は参照配列に存在するものと同一種のアミノ酸でもよいし、別のアミノ酸でもよい。従って、Ｄ−アナログは変異体でもよい。
配列の例を本願に記載するが、公共データベースにより提供されている配列情報を使用してその他の近縁及び関連するタンパク質配列と、このようなタンパク質をコードする対応する核酸配列も同定することができる。
鉄。鉄と言う場合には、鉄含有錯体における鉄分子又は鉄を含むことができる。「鉄含有錯体」又は「鉄錯体」は有機化合物と錯形成した（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）酸化状態の鉄を含有する化合物である。鉄錯体としては、鉄高分子錯体、鉄−糖錯体及び鉄アミノグリコサン錯体が挙げられる。これらの錯体は市販されており、及び／又は当分野で公知の方法により合成することができる。
鉄−糖錯体の例としては、鉄−単糖錯体、鉄−オリゴ糖錯体及び鉄−多糖錯体（例えば鉄カルボキシマルトース、鉄スクロース、鉄ポリイソマルトース（鉄デキストラン）、鉄ポリマルトース（鉄デキストリン）、鉄グルコン酸、鉄ソルビタール、鉄水素化デキストラン）が挙げられ、更にソルビタール、クエン酸及びグルコン酸等の他の化合物と錯形成したもの（例えば鉄デキストリン−ソルビトール−クエン酸錯体及び鉄スクロース−グルコン酸錯体）でもよいし、その混合物でもよい。
鉄アミノグリコサン錯体の例としては、鉄コンドロイチン硫酸、鉄デルマチン硫酸、鉄ケラタン硫酸が挙げられ、更に他の化合物と錯形成したものでもよいし、その混合物でもよい。
鉄高分子錯体の例としては、鉄ヒアルロン酸錯体、鉄タンパク質錯体及びその混合物が挙げられる。鉄タンパク質錯体としては、フェリチン、トランスフェリチン、及びフェリチン又はトランスフェリチンのアミノ酸置換体並びにその混合物が挙げられる。
特定の実施形態は低分子量鉄錯体（例えば低分子量鉄スクロース錯体）を利用する。錯体の分子量は２５，０００未満とすることができ、非高分子とすることができる。その他の実施形態において、錯体の分子量は１２，０００未満又は５０００未満又は２５００未満とすることができる。当然のことながら、鉄錯体の分子量が小さいほど、従って、鉄錯体が小さいほど、錯体を迅速に患者の血液内に取り込むことができる。
特定の実施形態において、特許請求の範囲及び具体的な実施形態の範囲内の鉄は鉄スクロースを意味する。
ビタミンＢ１２と代謝産物。ビタミンＢ１２は金属イオンであるコバルトを含むという点でビタミンのうちでもユニークである。特定の実施形態としては、コリン環の内側に三価コバルトイオンが結合した有機金属化合物である水溶性シアノコバラミンが挙げられる。メチルコバラミンと５−デオキシアデノシルコバラミンは主に人体により使用される型のビタミンＢ１２である。その他の型としては、アデノシルコバラミンとヒドロキシルコバラミンが挙げられる。ビタミンＢ１２はあらゆる適切な合成又は天然資源と、全類似体、誘導体、塩及びプロドラッグ並びにその混合物から得られる。
実施形態によっては、ビタミンＢ１２のＰＯ４ −基の少なくとも一部を切断することにより、利用可能なビタミンＢ１２の誘導体を生成する。例えば、ビタミンＢ１２のＰＯ４基はヌクレアーゼを使用して切断することができ、あるいはヌクレアーゼとホスファターゼを併用して除去することができる。ビタミンＢ１２の誘導体は構造：
Figure 2017535522
 をとることができ、式中、Ｒ１は５’−デオキシアデノシル、ＣＨ３、ＯＨ又はＣＮとすることができ；Ｒ２はＯＨ又はＨとすることができ；Ｒ３はＯＨ又はＨとすることができる。
実施形態によっては、ビタミンＢ１２を糖−金属錯体とカップリングさせることができる。また、ビタミンＢ１２の誘導体を糖−金属錯体とカップリングさせることもできる。ある種の実施形態において、糖−金属錯体は二糖類に由来することができる。例えば、糖−金属錯体はスクロースに由来することができる。他の例において、糖−金属錯体はラクトースに由来することができる。具体例では、糖−金属錯体を鉄スクロースとすることができる。ビタミンＢ１２を鉄スクロースとカップリングさせることにより、単一構造を使用して鉄とビタミンＢ１２を臓器に送達することができる。
糖−金属錯体とビタミンＢ１２又はビタミンＢ１２の誘導体の結合は酸に不安定なヒドラジンリンカーを使用して形成することができる。また、糖−金属錯体とビタミンＢ１２又はビタミンＢ１２の誘導体の結合は酸に不安定なヒドラゾンリンカーを使用して形成することもできる。ビタミンＢ１２と共に使用されるヒドラゾンリンカーの例はＢａｇｎａｔｏ ＪＤ，Ｅｉｌｅｒｓ ＡＬ，Ｈｏｒｔｏｎ ＲＡ，Ｇｒｉｓｓｏｎ ＣＢ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｃｏｂａｌａｍｉｎ−ｃｏｌｃｈｉｃｉｎｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ａｓ ａ ｎｏｖｅｌ ｔｕｍｏｒ−ｔａｒｇｅｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｄ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２００４：６９，８９８７−８９９６に記載されている。他の実施形態において、糖−金属錯体とビタミンＢ１２又はビタミンＢ１２の誘導体の結合はポリエーテルを使用して形成することができる。例えば、ポリエチレングリコールを使用して糖−金属錯体をビタミンＢ１２又はビタミンＢ１２の誘導体と連結することができる。他の実施形態において、糖−金属錯体とビタミンＢ１２又はビタミンＢ１２の誘導体の結合はペプチドリンカーを使用して形成することができる。具体例では、ポリグリシン−セリンリンカーを使用して糖−金属錯体をビタミンＢ１２又はビタミンＢ１２の誘導体と連結することができる。更に他の実施形態において、糖−金属錯体とビタミンＢ１２又はビタミンＢ１２の誘導体の結合は１以上のペプチドを使用して形成することができる。他の具体例では、ポリアミドを使用して糖−金属錯体をビタミンＢ１２又はビタミンＢ１２の誘導体と連結することができる。特定の具体例では、プロテアーゼ耐性ポリアミドを使用して糖−金属錯体をビタミンＢ１２又はビタミンＢ１２の誘導体と連結することができる。
場合により、糖−金属錯体とビタミンＢ１２又はビタミンＢ１２の誘導体の結合は糖−金属錯体の複数部位で形成することができる。例えば、糖−金属錯体とビタミンＢ１２又はビタミンＢ１２の誘導体の結合は糖−金属錯体の複数のヒドロキシル部位で形成することができる。他の実施形態において、糖−金属錯体とビタミンＢ１２又はビタミンＢ１２の誘導体の結合は糖−金属錯体の単一部位で形成することができる。例えば、糖−金属錯体とビタミンＢ１２又はビタミンＢ１２の誘導体の結合は糖−金属錯体の単一のヒドロキシル部位で形成することができる。また、糖−金属錯体とビタミンＢ１２の結合はビタミンＢ１２のリン酸基と糖−金属錯体のヒドロキシル基で形成することができる。更に、糖−金属錯体とビタミンＢ１２の誘導体の結合は糖−金属錯体のヒドロキシル基とビタミンＢ１２からリン酸基を切断することにより得られる部位との間で形成することができる。
糖−金属錯体とビタミンＢ１２を結合させた構造の例は以下の形態：
Figure 2017535522
 をとることができ、式中、Ｒ１は５’−デオキシアデノシル、ＣＨ３、ＯＨ又はＣＮとすることができ；Ａはリン酸基であり、Ｌはリンカーであり、Ｂは糖質構造であり、Ｍは糖質構造と錯形成した金属である。具体的な実施形態において、ＡはＰＯ４とるすことができ、Ｌはヒドラゾンリンカーとすることができ、Ｂは糖質構造とすることができ、ＭはＦｅとすることができる。実施形態によっては、Ｂは炭素原子数１０〜１６、酸素原子数９〜１５、及び水素原子数１６〜２８とすることができる。特定の実施形態において、Ｂはスクロースに由来することができる。
糖−金属錯体とビタミンＢ１２の誘導体を結合させた構造の例は以下の形態：
Figure 2017535522
 をとることができ、式中、Ｒ１は５’−デオキシアデノシル、ＣＨ３、ＯＨ又はＣＮとすることができ；Ｒ２はＯＨ又はＨとすることができ；Ｌはリンカーであり、Ｂは糖質構造であり、Ｍは糖質構造と錯形成した金属である。具体的な実施形態において、Ｌはヒドラゾンリンカーとすることができ、ＭはＦｅとすることができる。実施形態によっては、Ｂは炭素原子数１０〜１６、酸素原子数９〜１５、及び水素原子数１６〜２８とすることができる。特定の実施形態において、Ｂはスクロースに由来することができる。
糖−金属錯体とビタミンＢ１２の誘導体を結合させた構造の他の例は以下の形態：
Figure 2017535522
 をとることができ、式中、Ｒ１は５’−デオキシアデノシル、ＣＨ３、ＯＨ又はＣＮとすることができ；Ｒ３はＯＨ又はＨとすることができ；Ｌはリンカーであり、Ｂは糖質構造であり、Ｍは糖質構造と錯形成した金属である。具体的な実施形態において、Ｌはヒドラゾンリンカーとすることができ、ＭはＦｅとすることができる。実施形態によっては、Ｂは炭素原子数１０〜１６、酸素原子数９〜１５、及び水素原子数１６〜２８とすることができる。特定の実施形態において、Ｂはスクロースに由来することができる。
糖−金属錯体とビタミンＢ１２の誘導体を結合させた構造の他の例は以下の形態：
Figure 2017535522
 をとることができ、式中、Ｒ１は５’−デオキシアデノシル、ＣＨ３、ＯＨ又はＣＮとすることができ；Ｌはリンカーであり、Ｂは糖質構造であり、Ｍは糖質構造と錯形成した金属である。具体的な実施形態において、Ｌはヒドラゾンリンカーとすることができ、ＭはＦｅとすることができる。実施形態によっては、Ｂは炭素原子数１０〜１６、酸素原子数９〜１５、及び水素原子数１６〜２８とすることができる。特定の実施形態において、Ｂはスクロースに由来することができる。
複数の糖−金属錯体とビタミンＢ１２の誘導体を結合させた構造の例は以下の形態：
Figure 2017535522
 をとることができ、
式中、Ｒ１は５’−デオキシアデノシル、ＣＨ３、ＯＨ又はＣＮとすることができ；Ｌ１は第１のリンカーであり、Ｌ２は第２のリンカーであり、Ｂ１は第１の糖質構造であり、Ｂ２は第２の糖質構造であり、Ｍ１は糖質構造と錯形成した第１の金属であり、Ｍ２は糖質構造と錯形成した第２の金属である。具体的な実施形態において、Ｌ１及びＬ２はヒドラゾンリンカーとすることができ、Ｍ１及びＭ２はＦｅとすることができる。実施形態によっては、Ｂ１及びＢ２は炭素原子数１０〜１６、酸素原子数９〜１５、及び水素原子数１６〜２８とすることができる。特定の実施形態において、Ｂ１及びＢ２はスクロースに由来することができる。
実施形態によっては、糖−金属錯体は二糖類に由来することができる。例えば、糖−金属錯体はスクロースに由来することができる。他の例において、糖−金属錯体はラクトースに由来することができる。糖−金属錯体の構造の例は以下の形態をとることができる。
Figure 2017535522
 当然のことながら、上記構造は１個のＦｅ原子がスクロース由来化合物と錯形成している場合を示すが、必要に応じて基の電荷のバランスを取るように１個以上のＦｅ原子をスクロース由来化合物の１個以上の繰り返し単位と錯形成させることができる。
組成物。ヘムタンパク質（その修飾体、変異体及びＤ置換アナログを含む）、ヘムタンパク質分解阻害剤（例えばＨＯ−１阻害剤、プロトポルフィリン、ヘミン及び／又はヘマチン）、鉄及びビタミンＢ１２（個々に及び総称して「有効成分」と言う。）を組成物に配合して単独で又は組合せて提供することができる。特定の実施形態において、組成物は少なくとも１種のヘムタンパク質及び／又は少なくとも１種のヘムタンパク質分解阻害剤と、少なくとも１種の医薬的に許容可能な担体を含有する。有効成分の塩及び／又はプロドラッグも使用することができる。
医薬的に許容可能な塩は有効成分の活性を維持する医薬用に許容可能なあらゆる塩を含む。医薬的に許容可能な塩とは、酸、別の塩、又は酸もしくは塩に変換されるプロドラッグの投与の結果として生体内で形成され得るあらゆる塩も意味する。
適切な医薬的に許容可能な酸付加塩は無機酸又は有機酸から製造することができる。このような無機酸の例は塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硝酸、炭酸、硫酸及びリン酸である。適切な有機酸は脂肪族、脂環族、芳香族、芳香脂肪族、複素環族、カルボン酸及びスルホン酸類の有機酸から選択することができる。
適切な医薬的に許容可能な塩基付加塩としては、アルミニウム、カルシウム、リチウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウム及び亜鉛から製造される金属塩又はＮ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、リジン、アルギニン及びプロカインから製造される有機塩が挙げられる。
プロドラッグは投与後に例えばタンパク質の開裂や生物学的に不安定な基の加水分解により治療活性化合物に変換される有効成分を含む。
実施形態によっては、組成物は組成物の少なくとも０．１％ｗ／ｖ、組成物の少なくとも１％ｗ／ｖ、組成物の少なくとも１０％ｗ／ｖ、組成物の少なくとも２０％ｗ／ｖ、組成物の少なくとも３０％ｗ／ｖ、組成物の少なくとも４０％ｗ／ｖ、組成物の少なくとも５０％ｗ／ｖ、組成物の少なくとも６０％ｗ／ｖ、組成物の少なくとも７０％ｗ／ｖ、組成物の少なくとも８０％ｗ／ｖ、組成物の少なくとも９０％ｗ／ｖ、組成物の少なくとも９５％ｗ／ｖ、又は組成物の少なくとも９９％ｗ／ｖの有効成分を含有する。
他の実施形態では、有効成分を組成物の一部として提供することができ、例えば組成物の少なくとも０．１％ｗ／ｗ、組成物の少なくとも１％ｗ／ｗ、組成物の少なくとも１０％ｗ／ｗ、組成物の少なくとも２０％ｗ／ｗ、組成物の少なくとも３０％ｗ／ｗ、組成物の少なくとも４０％ｗ／ｗ、組成物の少なくとも５０％ｗ／ｗ、組成物の少なくとも６０％ｗ／ｗ、組成物の少なくとも７０％ｗ／ｗ、組成物の少なくとも８０％ｗ／ｗ、組成物の少なくとも９０％ｗ／ｗ、組成物の少なくとも９５％ｗ／ｗ、又は組成物の少なくとも９９％ｗ／ｗとすることができる。
特定の実施形態は亜硝酸化ヘムタンパク質と共に亜硝酸化ヘムタンパク質分解阻害剤を含有する。特定の実施形態は亜硝酸化ヘムタンパク質と共に亜硝酸化プロトポルフィリンを含有する。特定の実施形態は亜硝酸化ヘムタンパク質と共に亜硝酸化金属プロトポルフィリンを含有する。特定の実施形態は亜硝酸化ヘムタンパク質と共に亜硝酸化ＳｎＰＰを含有する。特定の実施形態は亜硝酸化ヘムタンパク質と共に亜硝酸化ヘミンを含有する。特定の実施形態は亜硝酸化ヘムタンパク質と共に亜硝酸化ヘマチンを含有する。これらの典型的な実施形態の特定形態において、亜硝酸化ヘムタンパク質はミオグロビンである。特定の実施形態は更にヘムタンパク質（例えばミオグロビン又は亜硝酸化ミオグロビン）と共に２種以上の亜硝酸化ヘムタンパク質分解阻害剤（例えば亜硝酸化プロトポルフィリン、亜硝酸化ヘミン及び／又は亜硝酸化ヘマチン）を含有する。その他の特定の実施形態では、組合せの全成分が亜硝酸化されている訳ではないヘムタンパク質分解阻害剤の組合わせを提供する。
特定の実施形態は場合により金属プロトポルフィリン、ＳｎＰＰ及び／又はビタミンＢ１２と共に鉄を含有する。鉄は鉄スクロースとすることができる。これらの実施形態は更にヘムタンパク質（例えばミオグロビン又は亜硝酸化ミオグロビン）及び／又はヘムタンパク質分解阻害剤（例えばプロトポルフィリン、ヘミン及び／又はヘマチン及び／又はそれらの硝酸化形態）を含有する。実施形態がビタミンＢ１２と共に鉄を利用する場合には、鉄とＢ１２を錯形成又は架橋させて単一単位とすることができる。
代表的な一般に使用される医薬的に許容可能な担体としては、ありとあらゆる吸収遅延剤、酸化防止剤、結合剤、緩衝剤、増量剤ないしフィラー、キレート剤、コーティング剤、崩壊剤、分散媒、ジェル剤、等張剤、滑沢剤、保存剤、塩類、溶媒もしくは補助溶媒、安定剤、界面活性剤及び／又は送達媒体が挙げられる。
代表的な酸化防止剤としては、アスコルビン酸、メチオニン及びビタミンＥが挙げられる。
代表的な緩衝剤としては、クエン酸緩衝液、コハク酸緩衝液、酒石酸緩衝液、フマル酸緩衝液、グルコン酸緩衝液、シュウ酸緩衝液、乳酸緩衝液、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液及び／又はトリメチルアミン塩が挙げられる。
キレート剤の１例はＥＤＴＡである。
代表的な等張剤としては、三価以上の糖アルコール類を含む多価糖アルコール類が挙げられ、例えばグリセリン、エリスリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール又はマンニトールが挙げられる。
代表的な保存剤としては、フェノール、ベンジルアルコール、メタクレゾール、メチルパラベン、プロピルパラベン、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、ハロゲン化ベンザルコニウム、塩化ヘキサメトニウム、アルキルパラベン（例えばメチルパラベンやプロピルパラベン）、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール及び３−ペンタノールが挙げられる。
安定剤とは、増量剤から始まり、有効成分を可溶化させるか又は変性もしくは容器壁への付着を防ぐのに役立つ添加剤に至るまでの機能に対応することができる広義の医薬品添加剤を意味する。典型的な安定剤としては、多価糖アルコール類；アルギニン、リジン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アラニン、オルニチン、Ｌ−ロイシン、２−フェニルアラニン、グルタミン酸及びスレオニン等のアミノ酸；ラクトース、トレハロース、スタキオース、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、リビトール、ミオイニシトール、ガラクチトール、グリセロール及びシクリトール（例えばイノシトール）等の有機糖類又は糖アルコール類；ＰＥＧ；アミノ酸ポリマー；尿素、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、α−モノチオグリセロール及びチオ硫酸ナトリウム等の含硫還元剤；低分子量ポリペプチド（即ち＜１０残基）；ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；キシロース、マンノース、フルクトース及びグルコース等の単糖類；ラクトース、マルトース及びスクロース等の二糖類；ラフィノース等の三糖類；並びにデキストラン等の多糖類を挙げることができる。安定剤は典型的には有効成分重量を基にして０．１〜１０，０００重量部の範囲で存在する。
本願に開示する組成物は例えば注射、吸入、輸液、灌流、洗浄又は経口による投与用に製剤化することができる。本願に開示する組成物は更に静脈内、皮内、動脈内、リンパ節内、リンパ管内、腹腔内、病変内、前立腺内、膣内、直腸内、局所、髄腔内、腫瘍内、筋肉内、膀胱内、経口及び／又は皮下投与用に製剤化することができ、より特定的には静脈内、皮内、動脈内、リンパ節内、リンパ管内、腹腔内、病変内、前立腺内、膣内、直腸内、髄腔内、腫瘍内、筋肉内、膀胱内及び／又は皮下注射用に製剤化することができる。
注射用では、ハンクス液、リンゲル液又は生理食塩水を含む緩衝液等で組成物を水溶液として製剤化することができる。水溶液には懸濁化剤、安定剤及び／又は分散剤等の製剤添加物を添加することができる。あるいは、使用前に適切な溶媒（例えば滅菌パイロジェンフリー水）で再構成する凍結乾燥及び／又は粉末形態の製剤とすることもできる。特定の実施形態は静脈内投与用に製剤化される。
経口投与用では、組成物を錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル剤、液剤、ジェル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤等として製剤化することができる。例えば散剤、カプセル剤及び錠剤等の経口固体製剤に適した医薬品添加剤としては、結合剤（トラガカントガム、アラビアガム、コーンスターチ、ゼラチン）、フィラー（例えばラクトース、スクロース、マンニトール及びソルビトール等の糖類；リン酸二カルシウム、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム；トウモロコシ澱粉、コムギ澱粉、コメ澱粉、ジャガイモ澱粉、ゼラチン、トラガカントガム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム及び／又はポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）等のセルロース調製物）；顆粒化剤；及び結合剤が挙げられる。必要に応じてコーンスターチ、ジャガイモ澱粉、アルギン酸、架橋ポリビニルピロリドン、寒天又はアルギン酸もしくはその塩（例えばアルギン酸ナトリウム）等の崩壊剤を加えてもよい。必要に応じて、標準技術を使用して固体剤形に糖衣又は腸溶コーティングしてもよい。ペパーミント、ウィンターグリーン油、チェリーフレーバー、オレンジフレーバー等の着香剤も使用できる。
組成物をエアゾールとして製剤化することができる。１実施形態において、エアゾールは無水、液体又は乾燥粉末インヘラーの一部として提供される。適切な噴射剤（例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素又は他の適切なガス）と共に加圧パック又はネブライザーからのエアゾールスプレーを使用することもできる。加圧エアゾールの場合には、定量を送達するように弁を設けることにより用量単位を配量することができる。ヘムタンパク質とラクトースや澱粉等の適切な粉末基剤の粉末混合物を収容したインヘラー又はインサフレーター用ゼラチンカプセル及びカートリッジを製剤化することもできる。
組成物をデポ製剤として製剤化することもできる。デポ製剤は（例えば許容可能な油脂に分散したエマルションとして）適切なポリマーもしくは疎水性材料又はイオン交換樹脂を使用して製剤化することもできるし、やや難溶性の誘導体（例えばやや難溶性の塩）として製剤化することもできる。
また、少なくとも１種の有効成分を含有する固体ポリマーの半透過性マトリックスを利用した徐放システムとして組成物を製剤化することもできる。種々の徐放性材料が定着しており、当分野に通常の知識をもつ者に周知である。徐放性システムはその化学的性質に応じて投与後数週間から１００日間までにわたって有効成分を放出する。デポ製剤は注射；非経口注入；点滴注入；又は軟組織、体腔への移植により投与することができ、場合によっては細い針での注射により血管内に投与することもできる。
デポ製剤は種々の生体内崩壊性ポリマーを含むことができ、ポリ（ラクチド）、ポリ（グリコリド）、ポリ（カプロラクトン）、並びに望ましいラクチド対グリコリド比、平均分子量、多分散度及び末端基化学構造の（ラクチド）−（グリコリド）共重合体（ＰＬＧ）が挙げられる。種々のグレードを使用して種々のポリマー種を種々の比でブレンドすると、原料ポリマーの各々に由来する特徴を得ることができる。
使用する溶媒（例えばジクロロメタン、クロロホルム、酢酸エチル、トリアセチン、Ｎ−メチルピロリドン、テトラヒドロフラン、フェノール又はその組合せ）を変え、放出特性を調節するために微粒子サイズ及び構造を変えることができる。他の有用な溶媒としては、水、エタノール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）、アセトン、メタノール、イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）、安息香酸エチル及び安息香酸ベンジルが挙げられる。
代表的な放出調節剤としては、界面活性剤、可溶化剤、内相粘度増加剤、錯形成剤、表面活性分子、補助溶媒、キレート剤、安定剤、セルロース誘導体、（ヒドロキシプロピル）メチルセルロース（ＨＰＭＣ）、酢酸ＨＰＭＣ、酢酸セルロース、プルロニック系（例えばＦ６８／Ｆ１２７）、ポリソルベート類、Ｓｐａｎ（Ｒ）（Ｃｒｏｄａ Ａｍｅｒｉｃａｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，Ｄｅｌａｗａｒｅ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、Ｂｒｉｊ（Ｒ）（Ｃｒｏｄａ Ａｍｅｒｉｃａｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，Ｄｅｌａｗａｒｅ）、ショ糖酢酸イソ酪酸エステル（ＳＡＩＢ）、塩類及び緩衝液を挙げることができる。
微粒子の外相境界を形成する医薬品添加剤（例えばポリソルベート類、ジオクチルスルホコハク酸塩、ポロキサマー、ＰＶＡを含む界面活性剤）も粒子安定性や崩壊速度等の性質、水和及びチャネル構造、界面輸送並びに反応速度を有利に変えることができる。
本願に開示する徐放性デポ製剤のその他の製法では、マンニトール、スクロース、トレハロース及びグリシンを含む安定化添加剤をポリソルベート類、ＰＶＡ及びジオクチルスルホコハク酸塩等の他の成分と共にＴｒｉｓ、クエン酸塩又はヒスチジン等の緩衝液中で利用することもできる。元の懸濁液と同様のサイズ及び性能特徴に再構成する非常に低含水率の粉末を製造するために凍結乾燥サイクルを使用することもできる。
本願に開示するあらゆる組成物は投与の効果を上回る著しく有害、アレルギー性又は不利な反応を生じないものを含む他のあらゆる医薬的に許容可能な担体を有利に含有することができる。医薬的に許容可能な担体及び製剤の例はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄ．Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０に開示されている。更に、米国ＦＤＡ生物学的製剤基準部（Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ）及び／又は他の該当する米国外の監督機関により定められた滅菌度、発熱性、一般安全性及び純度標準を満たすように製剤を製造することができる。
キット。本願に記載する有効成分及び／又は組成物の１種以上を収容した１個以上の容器を含むキットも本願に開示する。各種実施形態において、キットは本願に記載する有効成分及び／又は組成物と併用する１種以上の有効成分及び／又は組成物を収容した１個以上の容器を含む。このような容器には医薬品又はバイオ製品の製造、使用又は販売を規制する政府機関により規定された形式の文書を添付することができ、文書は機関により人体投与用の製造、使用又は販売を承認されていることを表示する。
場合により、本願に記載するキットは更に本願に開示する方法でキットを使用するための説明書を含む。各種実施形態において、キットは有効成分及び／又は組成物の投与準備；有効成分及び／又は組成物の投与；キットの使用に伴う結果を解釈するのに適した基準レベル；関連する廃棄物の適切な廃棄等に関する説明書を含んでいてもよい。説明書は印刷版説明書としてキットに同梱することもできるし、説明書をキット自体の一部に印刷することもできる。説明書はシート、パンフレット、小冊子、ＣＤ−ＲＯＭ又はコンピュータ読取り可能なデバイスの形態でもよいし、ウェブサイトのように遠隔地に説明書の手引きを提供することもできる。説明書は英語でもよいし、及び／又は如何なる国語もしくは地域の言語でもよい。各種実施形態では、考えられる副作用と、対象の症状に基づいてキットの成分の持続使用を禁じる禁忌を表示することができる。保護しようとする臓器の種類と臓器が受ける可能性のある傷害の種類に従ってキットと説明書を特別に作成することもできる。
各種実施形態において、パッケージ、有効成分及び／又は組成物、並びに説明書は小型でコンパクトなキットに同梱され、有効成分及び／又は組成物の各々の印刷版使用説明書を添付する。２種類以上の有効成分及び／又は組成物を提供する各種実施形態では、有効成分及び／又は組成物の使用順序をキットに表示することができる。
各種実施形態において、本願に記載するキットはキットを有効に使用するために必要な医療用具の一部又は全部を含むため、このような医療用具を探し集める必要がなくなる。このような医療用具としては、シリンジ、アンプル、チューブ、フェイスマスク、無針送液デバイス、注射キャップ、スポンジ、滅菌粘着テープ、クロラプレップ、手袋等を挙げることができる。本願に記載するキットはいずれも内容物を変えることができる。特定のキットは静脈内投与により組成物を投与するための材料を提供する。
使用方法。上述したように、本願に開示する組成物、キット及び方法は損傷を生じずに獲得細胞抵抗性を誘導することにより臓器を損傷から保護するために使用することができる。組成物、キット及び方法には多数の潜在的用途があり、本願にはその一部を記載する。
本願に開示する方法はその塩とプロドラッグを含めて本願に開示する有効成分を臓器に投与することを含む。臓器に投与するには治療有効量を送達する。治療有効量としては、有効量、予防処置及び／又は治療処置を提供する量が挙げられる。
臓器は対象の一部であり、一般には体内にあり、特定の重要な機能をもつ。臓器の例としては、心臓、肝臓、腎臓、脾臓、膵臓、脳、肺、腸、胃等が挙げられる。特定の実施形態では、治療有効量を臓器に直接投与することができる。
臓器が帰属する対象に治療有効量を投与することにより、治療有効量を臓器に投与することもできる。対象としては、ヒト、飼育動物（イヌ、ネコ、爬虫類、鳥類等）、家畜（ウマ、ウシ、ヤギ、ブタ、ニワトリ等）及び研究動物（サル、ラット、マウス、魚類等）が挙げられる。対象に投与するには治療有効量を送達する。従って、特に指定しない限り、臓器への投与は対象に投与して臓器に生理的に送達することもできるし、臓器に直接投与することもできる。
「有効量」は臓器又は対象に所望の生理的変化を生じるために必要な有効成分又は組成物の量である。有効量は研究目的で投与することが多い。本願に開示する有効量は損傷を生じずに獲得細胞抵抗性を誘導することにより臓器を損傷から保護する。
「予防処置」とは臓器損傷の徴候もしくは症状を示していないか又は臓器損傷の初期徴候もしくは症状しか示していない臓器に投与し、それ以上の臓器損傷を抑制、防止又は発生の危険を低減する目的で投与する処置を意味する。従って、予防処置は臓器損傷に対する未然防止処置の役割を果たす。
「治療処置」とは臓器損傷の症状又は徴候を示す臓器に投与する処置を意味し、臓器損傷の悪化を抑制する目的で臓器に投与される。
特定の臓器（又は対象）に投与する実際の投与量は標的、体重、病態の重症度、事前に分かっている場合に迫っている傷害、保護を必要とする臓器の種類、過去又は同時治療介入、対象の特発性疾患及び投与経路を含む身体的及び生理的因子等のパラメータを考慮して医師、獣医又は研究者が決定することができる。
組成物中の有効成分の量及び濃度と組成物の投与量は、臨床関連因子、組成物に対する有効成分の溶解度、有効成分の効能と活性、及び組成物の投与方法、加えて特に有効成分が修飾（例えば亜硝酸化、ＰＥＧ化）されているか又はヘムタンパク質分解阻害剤（例えばＨＯ−１阻害剤）と併用投与されるかに基づいて選択することができる。
治療有効量の本願に開示する有効成分を含有する組成物は臨床的に安全且つ有効な方法で臓器を保護するために対象に静脈内投与することができ、組成物を１回又は２回以上に分けて投与することが挙げられる。例えば、１日に０．０５ｍｇ／ｋｇ〜５．０ｍｇ／ｋｇを１回又は２回以上に分けて対象に投与することができる（例えば用量０．０５ｍｇ／ｋｇ ＱＤ（１日１回）、０．１０ｍｇ／ｋｇ ＱＤ、０．５０ｍｇ／ｋｇ ＱＤ、１．０ｍｇ／ｋｇ ＱＤ、１．５ｍｇ／ｋｇ ＱＤ、２．０ｍｇ／ｋｇ ＱＤ、２．５ｍｇ／ｋｇ ＱＤ、３．０ｍｇ／ｋｇ ＱＤ、０．７５ｍｇ／ｋｇ ＢＩＤ（１日２回）、１．５ｍｇ／ｋｇ ＢＩＤ又は２．０ｍｇ／ｋｇ ＢＩＤ）。所定の臓器及び適応症では、有効成分の１日総投与量を０．０５ｍｇ／ｋｇ〜３．０ｍｇ／ｋｇとし、１日１回〜３回に分けて対象に静脈内投与することができ、例えば６０分間ＱＤ、ＢＩＤ又はＴＩＤ（１日３回）静脈内輸液投与を使用して１日総投与量０．０５〜３．０ｍｇ／ｋｇ／日、０．１〜３．０ｍｇ／ｋｇ／日、０．５〜３．０ｍｇ／ｋｇ／日、１．０〜３．０ｍｇ／ｋｇ／日、１．５〜３．０ｍｇ／ｋｇ／日、２．０〜３．０ｍｇ／ｋｇ／日、２．５〜３．０ｍｇ／ｋｇ／日及び０．５〜３．０ｍｇ／ｋｇ／日の組成物を投与する。特定の１例では、例えば９２〜９８％ｗｔ／ｗｔまでのヘムタンパク質を含有する組成物を１．５ｍｇ／ｋｇ、３．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇの１日総投与量で対象にＱＤ又はＢＩＤ静脈内投与することができる。
その他の有用な用量は多くの場合には０．１〜５μｇ／ｋｇ又は０．５〜１μｇ／ｋｇとすることができる。他の例では、投与量として１μｇ／ｋｇ、５μｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ、１５μｇ／ｋｇ、２０μｇ／ｋｇ、２５μｇ／ｋｇ、３０μｇ／ｋｇ、３５μｇ／ｋｇ、４０μｇ／ｋｇ、４５μｇ／ｋｇ、５０μｇ／ｋｇ、５５μｇ／ｋｇ、６０μｇ／ｋｇ、６５μｇ／ｋｇ、７０μｇ／ｋｇ、７５μｇ／ｋｇ、８０μｇ／ｋｇ、８５μｇ／ｋｇ、９０μｇ／ｋｇ、９５μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ、１５０μｇ／ｋｇ、２００μｇ／ｋｇ、２５０μｇ／ｋｇ、３５０μｇ／ｋｇ、４００μｇ／ｋｇ、４５０μｇ／ｋｇ、５００μｇ／ｋｇ、５５０μｇ／ｋｇ、６００μｇ／ｋｇ、６５０μｇ／ｋｇ、７００μｇ／ｋｇ、７５０μｇ／ｋｇ、８００μｇ／ｋｇ、８５０μｇ／ｋｇ、９００μｇ／ｋｇ、９５０μｇ／ｋｇ、１０００μｇ／ｋｇ、０．１〜５ｍｇ／ｋｇ、又は０．５〜１ｍｇ／ｋｇを挙げることができる。他の例では、投与量として１ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、３５ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、４５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、５５ｍｇ／ｋｇ、６０ｍｇ／ｋｇ、６５ｍｇ／ｋｇ、７０ｍｇ／ｋｇ、７５ｍｇ／ｋｇ、８０ｍｇ／ｋｇ、８５ｍｇ／ｋｇ、９０ｍｇ／ｋｇ、９５ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ、１５０ｍｇ／ｋｇ、２００ｍｇ／ｋｇ、２５０ｍｇ／ｋｇ、３５０ｍｇ／ｋｇ、４００ｍｇ／ｋｇ、４５０ｍｇ／ｋｇ、５００ｍｇ／ｋｇ、５５０ｍｇ／ｋｇ、６００ｍｇ／ｋｇ、６５０ｍｇ／ｋｇ、７００ｍｇ／ｋｇ、７５０ｍｇ／ｋｇ、８００ｍｇ／ｋｇ、８５０ｍｇ／ｋｇ、９００ｍｇ／ｋｇ、９５０ｍｇ／ｋｇ、１０００ｍｇ／ｋｇ又はそれ以上を挙げることができる。
上記各用量の有効成分は１種のヘムタンパク質単独、２種以上のヘムタンパク質の組合わせ、１種のヘムタンパク質分解阻害剤単独、２種以上のヘムタンパク質分解阻害剤の組合わせもしくは１種以上のヘムタンパク質と１種以上のヘムタンパク質分解阻害剤の組合わせ、鉄及び／又はビタミンＢ１２とすることができる。特定の実施形態において、本願に記載する用量等の用量となるように組合わせて配合する場合には、組合わせにおける各成分は上記用量となるように組合わせにおける成分の数と種類に応じて例えば１：１、１：１．２５、１：１．５、１：１．７５、１：８、１：１．２、１：１．２５、１：１．３、１：１．３５、１：１．４、１：１．５、１：１．７５、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６：１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１５、１：２０、１：３０、１：４０、１：５０、１：６０、１：７０、１：８０、１：９０、１：１００、１：２００、１：３００、１：４００、１：５００、１：６００、１：７００、１：８００、１：９００、１：１０００、１：１：１、１：２：１、１：３：１、１：４：１、１：５：１、１：１０：１、１：２：２、１：２：３、１：３：４、１：４：２、１：５：３、１：１０：２０、１：２：１：２、１：４：１：３、１：１００：１：１０００、１：２５：３０：１０、１：４：１６：３、１：１０００：５：１５、１：２：３：１０、１：５：１５：４５、１：５０：９０：１３５、１：１．５：１．８：２．３、１：１０：１００：１０００又はその他の有益な比等の比で提供することができる。組合わせにおける成分は同一組成物に配合して提供することもできるし、別の組成物に配合して提供することもできる。
治療有効量は治療レジメンの期間中に単回又は複数回投与することにより達成することができる（例えばＱＩＤ（１日４回）、ＴＩＤ、ＢＩＤ、１日１回、１日おき、２日おき、３日おき、４日おき、５日おき、６日おき、１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回、１カ月に１回、２カ月に１回、３カ月に１回、４カ月に１回、５カ月に１回、６カ月に１回、７カ月に１回、８カ月に１回、９カ月に１回、１０カ月に１回、１１カ月に１回、又は１年に１回）。
特定の実施形態では、次回傷害の４８時間以内、次回傷害の４６時間以内、次回傷害の４４時間以内、次回傷害の４２時間以内、次回傷害の４０時間以内、次回傷害の３８時間以内、次回傷害の３６時間以内、次回傷害の３４時間以内、次回傷害の３２時間以内、次回傷害の３０時間以内、次回傷害の２８時間以内、次回傷害の２６時間以内、次回傷害の２４時間以内、次回傷害の２２時間以内、次回傷害の２０時間以内、次回傷害の１８時間以内、次回傷害の１６時間以内、次回傷害の１４時間以内、次回傷害の１２時間以内、次回傷害の１０時間以内、次回傷害の８時間以内、次回傷害の６時間以内、次回傷害の４時間以内、又は次回傷害の２時間以内に組成物を投与する。特定の１実施形態では、次回傷害の１８時間以内に組成物を投与する。
他の特定の実施形態では、次回傷害の少なくとも４８時間前、次回傷害の少なくとも４６時間前、次回傷害の少なくとも４４時間前、次回傷害の少なくとも４２時間前、次回傷害の少なくとも４０時間前、次回傷害の少なくとも３８時間前、次回傷害の少なくとも３６時間前、次回傷害の少なくとも３４時間前、次回傷害の少なくとも３２時間前、次回傷害の少なくとも３０時間前、次回傷害の少なくとも２８時間前、次回傷害の少なくとも２６時間前、次回傷害の少なくとも２４時間前、次回傷害の少なくとも２２時間前、次回傷害の少なくとも２０時間前、次回傷害の少なくとも１８時間前、次回傷害の少なくとも１６時間前、次回傷害の少なくとも１４時間前、次回傷害の少なくとも１２時間前、次回傷害の少なくとも１０時間前、次回傷害の少なくとも８時間前、次回傷害の少なくとも６時間前、次回傷害の少なくとも４時間前、又は次回傷害の少なくとも２時間前に組成物を投与する。特定の１実施形態では、次回傷害の少なくとも１８時間前に組成物を投与する。
移植保護。特定の実施形態では、移植時に臓器を損傷から保護する。組成物は（ｉ）臓器摘出前の臓器ドナーに；（ｉｉ）摘出した臓器に移植前に、及び／又は（ｉｉｉ）臓器移植レシピエントに投与することができる。この使用方法は第１の個体対象から第２の個体対象に移植することが可能なあらゆる臓器に適用することができる。特定の実施形態では、対象から摘出後又は第２の対象に移植する前の臓器に治療有効量を直接送達することができる。
腎臓系保護。外科手術、心肺バイパス手術又はＸ線造影剤の毒性を受けている個体等の大きな危険に曝されている患者におけるＡＫＩの発生を予防又は軽減することが可能な薬剤は本開示以前には存在していなかった。急性腎不全は罹病率及び死亡率の両方と長期腎臓透析の必要性の主要な危険因子であることに注目すべきである。連邦政府はその末期腎疾患／医療保険プログラムで腎臓透析に何十億ドルも費やしている。従って、ＡＫＩ／急性腎不全の予防は極めて重要でありながら、全く対処されていない臨床上の課題であった。
「急性腎障害」（ＡＫＩ）は「急性腎不全」（ＡＲＦ）又は「急性腎臓不全」とも呼ばれ、腎臓の損傷により腎機能が急速に低下し、その結果、通常であれば腎臓により排泄される窒素系老廃物（尿素及びクレアチニン）及び非窒素系老廃物が滞留する疾患又は病態を意味する。腎機能障害の重症度と持続期間に応じて、この蓄積は代謝性アシドーシス（血液の酸性化）や高カリウム血症（カリウム濃度上昇）等の代謝障害、体液バランスの変化、多くの他の臓器系／臓器系不全に及ぼす影響、血管内容量の過負荷、昏睡及び死を伴う。乏尿又は尿閉（尿生産の低下又は停止）を特徴に挙げることができるが、非乏尿性のＡＲＦが生じる場合もある。ＡＫＩは院内で重大な合併症であり、長期入院と高死亡率に繋がる。心疾患と心臓外科手術はいずれもＡＫＩの一般的な原因である。患者がＡＫＩになると、その死亡率は高い。
ＡＫＩは種々の原因の帰結であると考えられ、ａ）腎前性原因（血液供給に存する原因）として、通常ではショックや脱水及び体液減少又は過剰な利尿薬使用に起因するハイポボレミア即ち循環血液量減少；肝不全により腎灌流が低下する肝腎症候群；ネフローゼ症候群の合併症として生じる場合があるアテローム塞栓症や腎静脈血栓症等の血管の問題；感染症（通常では敗血症）及び感染症に起因する全身炎症；重度火傷；心膜炎及び膵炎に起因する肺分画症；並びに降圧剤及び血管拡張薬による低血圧が挙げられ；ｂ）腎性腎損傷として、腎虚血（一過性血流量低下又は停止）、毒素又は投薬（例えばある種のＮＳＡＩＤ、アミノグリコシド系抗生物質、ヨード造影剤、リチウム、大腸内視鏡検査の前処置としてリン酸ナトリウムによる腸管処置に起因するリン酸腎症）；ミオグロビンが血液中に放出されて腎臓に悪影響を及ぼす病態であり、損傷（特に圧挫損傷又は過度の鈍的外傷）、スタチン、刺激剤及びある種の他の薬物に起因する場合もある横紋筋融解症即ち筋組織の破壊；鎌状赤血球病や紅斑性狼瘡等の種々の病態に起因し得る溶血即ち赤血球の破壊；高カルシウム血症又は「円柱腎症」に起因する多発性骨髄腫；抗糸球体基底膜病／グッドパスチャー症候群、ウェゲナー肉芽腫症又は全身性エリテマトーデスに合併する急性ループス腎炎等の種々の原因に起因し得る急性糸球体腎炎が挙げられ；更にｃ）腎後性原因（尿管閉塞に存する閉塞性原因）として、正常な膀胱排尿を妨害する投薬（例えば抗コリン薬）；良性前立腺肥大もしくは前立腺癌；腎臓結石；腹部悪性腫瘍（例えば卵巣癌、大腸癌）；尿カテーテルの閉塞；又は結晶尿の原因となり得る薬物及びミオグロビン尿症と膀胱炎の原因となり得る薬物が挙げられる。
本開示の方法は、獲得細胞抵抗性を誘導することにより腎臓を保護することを含む。上述したように、用量範囲を特定するために動物モデルを使用して先ず適切な治療有効量を決定することができる。有効成分の治療有効量の特定例としては、１０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、６０ｍｇ／ｋｇ、７０ｍｇ／ｋｇ、８０ｍｇ／ｋｇ、９０ｍｇ／ｋｇ及び１００ｍｇ／ｋｇが挙げられる。
代表的な腎損傷の動物モデルとしては、グリセロール誘発腎不全（横紋筋融解症を模倣）；虚血再灌流誘発ＡＲＦ（腎血流量低下により誘発され、組織虚血と尿細管細胞死をもたらす変化をシミュレート）；ゲンタマイシン、シスプラチン、ＮＳＡＩＤ、イホスファミド誘発ＡＲＦ等の薬物誘発モデル（夫々の薬物の臨床投与に起因する腎不全を模倣）；ウラン、二クロム酸カリウム誘発ＡＲＦ（労働災害を模倣）；Ｓ−（１，２−ジクロロビニル）−Ｌ−システイン誘発ＡＲＦ（汚染水誘発腎機能障害をシミュレート）；敗血症誘発ＡＲＦ（感染症誘発腎不全を模倣）；及びＸ線造影剤誘発ＡＲＦ（心臓カテーテル検査時にＸ線造影剤を使用中の患者における腎不全を模倣）が挙げられる。これらのモデルに関するより詳細な情報については、Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｐ．２０１２，６４（１）：３１−４４参照。
公知の腎機能検査としては、超音波；ＣＴスキャン；並びに乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）、血中尿素窒素（ＢＵＮ）、クレアチニン、クレアチニンクリアランス、イオタラム酸クリアランス、糸球体濾過速度及びイヌリンクリアランスの測定が挙げられる。
肝保護。代表的な肝損傷の動物モデルとしては、虚血再灌流障害；肝毒素（四塩化炭素、チオアセトアミド、ジメチル又はジエチルニトロサミン）を使用した化学誘発肝線維症；胆管結紮；住血吸虫症モデル；コンカナバリンＡ肝炎モデル；誘導型ＨＣＶトランスジェニックマウス；種々の遺伝モデル；経胃管的エタノール注入モデル（Ｔｓｕｋａｍｏｔｏ−Ｆｒｅｎｃｈモデル）；及びメチオニン・コリン欠乏モデルが挙げられる。
更に、所定の治療薬を含む多数の肝毒性化合物は細胞毒性を誘発する。肝毒性化合物は直接的な化学的攻撃により又は毒性の代謝産物の産生により肝細胞毒性を生じることができる。以下の薬物、即ちエンフルラン、フルロキセン、ハロタン及びメトキシフルラン等の麻酔薬；コカイン、ヒドラジド類、メチルフェニデート及び三環系等の向神経精神薬；フェニトインやバルプロ酸等の抗てんかん薬；アセトアミノフェン、クロルゾキサゾン、ダントロレン、ジクロフェナク、イブプロフェン、インドメタシン、サリチル酸系、トルメチン及びゾキサゾラミン等の鎮痛薬；アセトヘキサミド、カルブタミド、グリピジド、メタヘキサミド、プロピルチオウラシル、タモキシフェン、ジエチルスチルベストロール等のホルモン類；アムホテリシンＢ、クリンダマイシン、ケトコナゾール、メベンダゾール、メトロニダゾール、オキサシリン、パラアミノサリチル酸、ペニシリン、リファンピシン、スルホンアミド類、テトラサイクリン及びジドブジン等の抗微生物薬；アミオダロン、ジルチアゼム、αメチルドパ、メキシレチン、ヒドラザリン、ニコチン酸、パパベリン、ペルヘキシリン、プロカインアミド、キニジン及びトカインアミド（Ｔｏｃａｉｎａｍｉｄｅ）等の心臓血管薬；並びにアスパラギナーゼ、シスプラチン、シクロホスファミド、ダカルバジン、ドキソルビシン、フルオロウラシル、メトトレキサート、マイトマイシン、６−ＭＰ、ニトロソウレア、タモキシフェン、チオグアニン及びビンクリスチン等の免疫抑制薬及び抗新生物薬；更にジスルフィラム、ヨウ化物イオン、オキシフェニサチン、ビタミンＡ及びパラアミノ安息香酸等のその他の薬物を使用して直接的な化学的攻撃により細胞毒性を誘発することができる。
胆汁の流れの停止である胆汁鬱滞を誘発する肝毒性化合物には複数の型のものがある。小葉中心性胆汁鬱滞は門脈炎症性変化を伴う。エリスロマイシン等の所定の薬物により胆管変化が生じると報告されており、純毛細胆管性胆汁鬱滞はタンパク同化ステロイド等の他の薬物に特有である。慢性胆汁鬱滞はメチルテストステロンやエストラジオール等の薬物に関係があるとされている。胆汁鬱滞性疾患は避妊薬ステロイド、男性ホルモンステロイド、タンパク同化ステロイド、アセチルサリチル酸、アザチオプリン、ベンゾジアゼピン、ケノデオキシコール酸、クロルジアゼポキシド、エリスロマイシンエストレート、フルフェナジン、フロセミド、グリセオフルビン、ハロペリドール、イミプラミン、６−メルカプトプリン、メチマゾール、メトトレキサート、メチルドパ、メチレンジアミン、メチルテストステロン、ナプロキセン、ニトロフラントイン、ペニシラミン、ペルフェナジン、プロクロロペラジン、プロマジン、チオベンダゾール、チオリダジン、トルブタミド、トリメトプリムスルファメトキサゾール、ヒ素、銅及びパラクアットを含む肝毒性化合物を使用して誘発させることができる。
薬剤のうちには、主として胆汁鬱滞型であるが、肝毒性も生じるものもあるため、このような薬物により生じる肝損傷は混合型である。混合型肝損傷の原因となる薬物としては、例えばクロルプロマジン、フェニルブタゾン、ハロタン、クロルジアゼポキシド、ジアゼパム、アロプリノール、フェノバルビタール、ナプロキセン、プロピルチオウラシル、クロラムフェニコール、トリメトプリムスルファメトキサゾール、アミノン、ジソピラミド、アザチオプリン、シメチジン及びラニチジンが挙げられる。
アルギニン／尿素／ＮＯサイクルの酵素、硫化酵素及び／又はスペクトリン分解関連産物の１種以上の検出は肝損傷の診断に利用できる。これらのマーカーの例としては、アルギニノコハク酸シンテターゼ（ＡＳＳ）及びアルギニノコハク酸リアーゼ（ＡＳＬ）、硫化（エストロゲンスルホトランスフェラーゼ（ＥＳＴ））、スクアレン合成酵素（ＳＱＳ）、肝臓グリコーゲンホスホリラーゼ（ＧＰ）、カルバモイルリン酸シンテターゼ（ＣＰＳ−１）、αエノラーゼ１、グルコース調節タンパク質（ＧＲＰ）及びスペクトリン分解産物が挙げられる。
他の実施形態では、虚血による損傷等の肝損傷の診断手段としてのバイオマーカーの検出を既存検査と相関させることができる。これらのマーカーとしては、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）；５’−ヌクレオチダーゼ（５’−ＮＤ）；γ−グルタミルトランスペプチダーゼ（Ｇ−ＧＴ）；ロイシンアミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）；アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）；アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）；フルクトース−１，６−二リン酸アルドラーゼ（ＡＬＤ）；ＬＤＨ；イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ＩＣＤＨ）；オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（ＯＣＴ）；ソルビトールデヒドロゲナーゼ（ＳＤＨ）；アルギナーゼ；グアナーゼ；クレアチンホスホキナーゼ（ＣＰＫ）；コリンエステラーゼ（ＣｈＥ）；プロコラーゲンタイプＩＩＩペプチド濃度（ＰＩＩＩＰ）；肝性脳症における血中アンモニア濃度；壊死及びヘパトーマにおけるリガンド濃度；肝内皮細胞損傷によるヒアルロン酸濃度；ヘパトーマの検出用としてα−１−フェトプロテイン（ＡＦＰ）濃度；肝臓への癌転移の検出用として癌胎児性抗原（ＣＥＡ）濃度；ミトコンドリア、核内及び特定の肝臓膜タンパク質等の種々の細胞成分に対する抗体の増加；並びにアルブミン、グロビン、アミノ酸、コレステロール及び他の脂質等のタンパク質の検出を挙げることができる。また、遺伝性、後天性及び実験的に誘発させた肝障害の他のバイオマーカーを同定するには肝生検から採取した種々のミネラル、代謝産物及び酵素の生化学分析も有用であり得る。
他の実施形態では、検出されたバイオマーカーの量を肝機能検査と相関させ、肝損傷を更に評価することができる。当業者に自明の通り、肝機能検査としては、ビリルビン、インドシアニングリーン（ＩＣＧ）、スルホブロモフタレイン（ＢＳＰ）及び胆汁酸等の有機アニオンの肝クリアランスの評価；ガラクトース及びＩＣＧクリアランスの測定による肝血流量の評価；並びにアミノピリン呼気検査とカフェインクリアランス検査を利用することによる肝ミクロソーム機能の評価が挙げられる。例えば、実質性肝疾患で認められるような黄疸の出現と重症度を確認し、高ビリルビン血症の程度を判定するためには血清ビリルビンを測定することができる。アミノトランスフェラーゼ（トランスアミナーゼ）上昇は活動性肝細胞損傷の重症度を反映し、アルカリホスファターゼ上昇は胆汁鬱滞と肝浸潤で認められる（Ｉｓｓｅｌｂａｃｈｅｒ，Ｋ．ａｎｄ Ｐｏｄｏｌｓｋｙ，Ｄ．ｉｎ Ｈａｒｔｉｓｏｎ’ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１２ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，２：１３０１−１３０８（１９９１））。
肝機能を評価するために使用されるその他のスコアシステム及びパラメータとしては、以下のチャイルドピュースコアシステムが挙げられる。
Figure 2017535522
フィンガーチップ型光センサーを使用するインドシアニン血漿クリアランス検査と、Ｓｃｈｉｎｄｌら（Ｓｃｈｉｎｄｌ Ｍ ｅｔ ａｌ．２００５，Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｓｕｒｇｅｒｙ １４０（２）：１８３−１８９）により開発された術後肝機能スコアシステムを使用することができる。このシステムは術後に乳酸濃度、総ビリルビン、ＩＮＲ及び脳症に従って肝機能障害を等級付けする。合計スコア０、１〜２、３〜４、又は＞４を使用して肝機能障害を夫々障害なし、軽度、中等度、又は重度に分類する。更に、胆汁酸塩とリン脂質の比を評価することもできる。
心臓保護。代表的な心臓損傷の動物モデルとしては、心筋梗塞（ＭＩ）モデル、ＭＩ後リモデリングモデル、遺伝子治療モデル、細胞治療モデル、横大動脈狭窄（ＴＡＣ）モデル、急性虚血発作モデル、腎・肢虚血モデル、ランゲンドルフ灌流モデル、及びドキソルビシン誘発心筋障害モデルが挙げられる。例えば、心臓血管研究所（Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ），Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤにより実施されている心臓損傷動物モデルも参照。
心臓損傷の検出法としては種々のものを使用することができ、磁気共鳴画像検査（ＭＲＩ）、超音波、Ｘ線コンピュータ断層撮影（ＣＴ）、単一光子放射型コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）及び／又はポジトロン断層撮影（ＰＥＴ）等の非侵襲性画像形成法が挙げられる。その他の方法としては、心エコー検査、心電図、Ｍｉｋｒｏ−ｔｉｐ圧力カテーテル、テレメトリー、免疫組織化学検査及び分子生物学的検査を挙げることができる。米国特許第２００２／０１１５９３６号は気管の動きをモニターすることにより心機能を評価するための方法及び装置について記載している。
公知の心機能検査としては、ＰＤＨ濃度、血漿中乳酸濃度及び／又は心臓糖質酸化の測定が挙げられる。非虚血性心臓損傷に関連するマーカーとしては、α２−ＨＳ糖タンパク質前駆体（例えば配列番号２２）；アスポリン；ＡＴＰ合成酵素δサブユニット（ミトコンドリア）；血管心外膜物質（例えば配列番号２３）；Ｃ６ＯＲＦ１４２；炭酸脱水酵素１；炭酸脱水酵素３；セルロプラスミン；凝固因子ＩＸ；コラーゲンα３（ＶＩ）鎖；デルマトポンチン；ＥＧＦ含有ファイブリン様細胞外マトリックスタンパク質１；フィブリノーゲンγ鎖；ファイブリン１；ファイブリン２；熱ショックタンパク質ＨＳＰ９０β（例えば配列番号２４）；ヘモグロビンαサブユニット；ヘモグロビンβサブユニット；Ｉｇα１鎖Ｃ領域；Ｉｇα２鎖Ｃ領域；Ｉｇγ２鎖Ｃ領域；Ｉｇλ鎖Ｃ領域；Ｉｇμ鎖Ｃ領域；潜在型トランスフォーミング増殖因子β結合タンパク質２；ミクロフィブリル結合糖タンパク質４；ミオシン２；血清アミロイドＡタンパク質；ソルビン・ＳＨ３ドメイン含有タンパク質２（例えば配列番号２５）；及びソルビン・ＳＨ３ドメイン含有タンパク質２（例えば配列番号２６）が挙げられる。
虚血性心臓損傷に関連するマーカーとしては、α２−ＨＳ糖タンパク質前駆体（例えば配列番号２２）；α２−マクログロブリン；炭酸脱水酵素１；ヘモグロビンαサブユニット；ヘモグロビンβサブユニット；Ｉｇα１鎖Ｃ領域；Ｉｇα２鎖Ｃ領域；Ｉｇμ鎖Ｃ領域；Ｌｅｉｏｍｏｄｉｎ−１（例えば配列番号２７）；ミオシン制御性軽鎖ＭＲＬＣ２（例えば配列番号２８）；Ｎｅｘｉｌｉｎ（例えば配列番号２９）；ピルビン酸デヒドロゲナーゼＥ１コンポーネントαサブユニット；血清アミロイドＡタンパク質；及び体細胞マーカーが挙げられる。
肺保護。急性肺損傷を含む肺損傷の動物モデルとしては、内毒素（ＬＰＳ）の気管内注入、人工呼吸、低酸素血症、生菌（大腸菌）、高酸素症、ブレオマイシン、オレイン酸、盲腸結紮穿刺及び酸吸引による損傷誘発が挙げられる。肺損傷モデルに関するその他の情報については、世界最大の医薬品研究調査サービスのオンラインマーケットプレイスと称されるＡｓｓａｙ Ｄｅｐｏｔ参照。
肺損傷の症状としては、苦しく速い呼吸、低血圧及び息切れが挙げられる。あらゆる型の肺機能検査を使用することができる。肺機能検査は一般に主要な３種類に分けることができる。第１種の肺検査は一般にスパイロメトリーと呼ばれ、患者の異なる吸気及び呼気努力の呼吸量と呼吸数として測定値を提供する。また、検査の種々の段階における種々の流速もスパイロメトリー検査から得られる型のデータである。第２種の肺検査は患者の肺全体の吸気分布の均等性を判定するように意図された一連の手順である。このような検査により、患者の肺胞換気量が正常であっても肺動脈弁閉鎖不全症を判定することができる。第３種の肺検査は肺が肺胞膜を介して吸気を拡散させる能力に関し、このような検査は肺が酸素と二酸化炭素を交換することにより静脈血を動脈化する能力の指標を提供する。
呼吸量は対象の気道に挿入した体積流量検知装置を使用して（例えばスパイロメーター又はタキメーターを利用して）評価することもできるし、胸腹壁の物理的可動域を測定することにより評価することもできる。歪みゲージ（体囲の変化の記録）又は患者の胸腹部の周囲に配置した弾性電磁誘導式導電体ループによる胸腹壁運動の記録を利用する技術も使用することができる。その後、ループのインダクタンスの記録を使用し、胸腹部区画の横断面積変化量を推定することができる。米国特許第４，３０８，８７２号はこの自己インダクタンスループ推定技術の１例である。このような方法は校正手順後に呼吸気量の定量的測定に使用することができる。
特定の実施形態において、肺機能検査は呼吸量、動脈血ガス及び／又はＡ−ａＯ２（肺胞気動脈血酸素分圧較差）の測定を含む。
敗血症に対する保護。敗血症ないし全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）は感染の存在を伴う全身炎症状態として特徴付けられる。敗血症は発熱、呼吸促迫及び低血圧を生じる傾向があり、心臓血管系、免疫系及び内分泌系の臓器を含む全臓器を損傷させる可能性がある。
敗血症の動物モデルとしては、盲腸結紮穿刺（ＣＬＰ）を単独で使用するか又は細菌（例えば緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）又は肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ））の喉頭注入と併用して誘発させた敗血症が挙げられる。敗血症動物モデルとしては、リポ多糖（ＬＰＳないし内毒素）又はチモサン等のｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）剤の静脈内又は腹腔内投与も挙げられる。他の敗血症モデルとしては、上行結腸ステント腹膜炎及び後期免疫賦活モデルが挙げられる。敗血症モデルに関するその他の情報については、世界最大の医薬品研究調査サービスのオンラインマーケットプレイスと称されるＡｓｓａｙ Ｄｅｐｏｔ参照。
敗血症に対する保護は血圧、血液ガス、サイトカイン測定及び本願の他の箇所に記載するような二次的臓器機能（例えば肺、肝、心、腎機能）を測定することにより確認することができる。
以下、本開示の特定の実施形態を実証するために実施例を記載する。当分野に通常の知識をもつ者は本開示に鑑み、本開示の趣旨と範囲から逸脱しない限り、本願に開示する特定の実施形態に多くの変更を加えることができ、その場合も同等の結果が得られることを理解するはずである。
代表的な実施形態。
１．対象の臓器を損傷から保護するためのキットであって、前記キットが治療有効量のミオグロビン、鉄及び／又はビタミンＢ１２を含み、前記治療有効量のミオグロビン、鉄及び／又はビタミンＢ１２を対象に投与すると、臓器損傷を生じずに対象の臓器が損傷から保護される、前記キット。
２．対象の臓器を損傷から保護するためのキットであって、前記キットが治療有効量のヘムタンパク質、鉄及び／又はビタミンＢ１２を含み、前記治療有効量のヘムタンパク質、鉄及び／又はビタミンＢ１２を対象に投与すると、臓器損傷を生じずに対象の臓器が損傷から保護される、前記キット。
３．ヘムタンパク質、鉄及び／又はビタミンＢ１２が組成物に配合されている、実施形態２に記載のキット。
４．ヘムタンパク質がヘムタンパク質変異体、ヘムタンパク質ｄ置換アナログ、ヘムタンパク質修飾体又はその組み合わせである、実施形態２又は３のいずれか一項に記載のキット。
５．ヘムタンパク質が修飾ヘムタンパク質である、実施形態２から４のいずれか一項に記載のキット。
６．修飾ヘムタンパク質が亜硝酸化ヘムタンパク質又はＰＥＧ化ヘムタンパク質である、実施形態５に記載のキット。
７．ヘムタンパク質がミオグロビンである、実施形態２から６のいずれか一項に記載のキット。
８．ヘムタンパク質がミオグロビン変異体及び／又はミオグロビン修飾体である、実施形態２から７のいずれか一項に記載のキット。
９．修飾ミオグロビンが亜硝酸化ミオグロビン又はＰＥＧ化ミオグロビンである、実施形態８に記載のキット。
１０．更にヘムタンパク質分解阻害剤、場合により亜硝酸化ヘムタンパク質分解阻害剤を含む、実施形態２から９のいずれか一項に記載のキット。
１１．ヘムタンパク質分解阻害剤が組成物に配合されている、実施形態１０に記載のキット。
１２．ヘムタンパク質分解阻害剤とヘムタンパク質、鉄及び／又はビタミンＢ１２が同一の組成物に配合されている、実施形態１０又は１１のいずれか一項に記載のキット。
１３．ヘムタンパク質分解阻害剤がヘムオキシゲナーゼ阻害剤である、実施形態１０から１２のいずれか一項に記載のキット。
１４．ヘムオキシゲナーゼ阻害剤がプロトポルフィリン、ヘミン及び／又はヘマチンであり、場合により亜硝酸化プロトポルフィリン、ヘミン及び／又はヘマチンである、実施形態１３に記載のキット。
１５．ヘムオキシゲナーゼ阻害剤が金属プロトポルフィリンであり、場合により亜硝酸化金属プロトポルフィリンである、実施形態１３又は１４のいずれか一項に記載のキット。
１６．金属プロトポルフィリンがＳｎ−プロトポルフィリンである、実施形態１５に記載のキット。
１７．更に投与説明書を含む、実施形態２から１６のいずれか一項に記載のキット。
１８．投与に起因する臓器損傷がないことを基準レベルとの比較により確認する、実施形態２から１７のいずれか一項に記載のキット。
１９．基準レベルとの比較により保護を判定する、実施形態２から１８のいずれか一項に記載のキット。
２０．基準レベルがキット内に提供されている、実施形態１８又は１９のいずれか一項に記載のキット。
２１．臓器を傷害による損傷から保護する、実施形態２から２０のいずれか一項に記載のキット。
２２．傷害が予定されている、実施形態２１に記載のキット。
２３．予定された傷害の少なくとも８時間前に投与を行う、実施形態２２に記載のキット。
２４．予定された傷害が外科手術、誘発性心臓／脳虚血再灌流、心臓血管外科手術、バルーン血管形成術、化学療法、腎毒性薬物投与及び／又はＸ線造影剤の毒性である、実施形態２２又は２３のいずれか一項に記載のキット。
２５．外科手術が臓器移植手術である、実施形態２４に記載のキット。
２６．傷害が敗血症である、実施形態２１に記載のキット。
２７．臓器が移植された臓器である、実施形態２から２６のいずれか一項に記載のキット。
２８．臓器が心臓、腎臓、肝臓又は肺である、実施形態２から２７のいずれか一項に記載のキット。
２９．臓器が心臓であり、心機能の改善及び／又は心臓酵素放出の抑制により保護を判定する、実施形態２から２８のいずれか一項に記載のキット。
３０．心臓酵素がトロポニンである、実施形態２９に記載のキット。
３１．臓器が腎臓であり、血中尿素窒素（ＢＵＮ）又は血清クレアチニン上昇の阻止又は抑制により保護を判定する、実施形態２から３０のいずれか一項に記載のキット。
３２．臓器が肝臓であり、肝酵素上昇の阻止又は抑制により保護を判定する、実施形態２から３１のいずれか一項に記載のキット。
３３．臓器が肺であり、血液ガス悪化の抑制、酸素補給の必要性の低下又は人工呼吸器の必要性の低下により保護を判定する、実施形態２から３２のいずれか一項に記載のキット。
３４．対象の臓器に獲得細胞抵抗性を生じるためのキットであって、前記キットが治療有効量のヘムタンパク質、鉄及び／又はビタミンＢ１２を含み、前記治療有効量のヘムタンパク質、鉄及び／又はビタミンＢ１２を対象に投与すると、臓器損傷を生じずに対象の臓器に獲得細胞抵抗性を生じる、前記キット。
３５．ヘムタンパク質、鉄及び／又はビタミンＢ１２が組成物に配合されている、実施形態３４に記載のキット。
３６．ヘムタンパク質がヘムタンパク質変異体、ヘムタンパク質ｄ置換アナログ、ヘムタンパク質修飾体又はその組み合わせである、実施形態３４又は３５のいずれか一項に記載のキット。
３７．ヘムタンパク質が修飾ヘムタンパク質である、実施形態３４から３６のいずれか一項に記載のキット。
３８．修飾ヘムタンパク質が亜硝酸化ヘムタンパク質又はＰＥＧ化ヘムタンパク質である、実施形態３７のキット。
３９．ヘムタンパク質がミオグロビンである、実施形態３４から３８のいずれか一項に記載のキット。
４０．ヘムタンパク質がミオグロビン変異体及び／又はミオグロビン修飾体である、実施形態３４から３９のいずれか一項に記載のキット。
４１．修飾ミオグロビンが亜硝酸化ミオグロビン又はＰＥＧ化ミオグロビンである、実施形態４０に記載のキット。
４２．更にヘムタンパク質分解阻害剤、場合により亜硝酸化ヘムタンパク質分解阻害剤を含む、実施形態３４から４１のいずれか一項に記載のキット。
４３．ヘムタンパク質分解阻害剤が組成物に配合されている、実施形態４２に記載のキット。
４４．ヘムタンパク質分解阻害剤とヘムタンパク質が同一の組成物に配合されている、実施形態４２又は４３のいずれか一項に記載のキット。
４５．ヘムタンパク質分解阻害剤がヘムオキシゲナーゼ阻害剤である、実施形態４２から４４のいずれか一項に記載のキット。
４６．ヘムオキシゲナーゼ阻害剤がプロトポルフィリン、ヘミン及び／又はヘマチンであり、場合により亜硝酸化プロトポルフィリン、ヘミン及び／又はヘマチンである、実施形態４５に記載のキット。
４７．ヘムオキシゲナーゼ阻害剤が金属プロトポルフィリンである、実施形態４５又は４６のいずれか一項に記載のキット。
４８．金属プロトポルフィリンがＳｎ−プロトポルフィリンである、実施形態４７に記載のキット。
４９．更に投与説明書を含む、実施形態３４から４８のいずれか一項に記載のキット。
５０．投与に起因する臓器損傷がないことを基準レベルとの比較により確認する、実施形態３４から４９のいずれか一項に記載のキット。
５１．獲得細胞抵抗性により前記臓器を損傷から保護する、実施形態３４から５０のいずれか一項に記載のキット。
５２．基準レベルとの比較により保護を判定する、実施形態５１に記載のキット。
５３．基準レベルがキット内に提供されている、実施形態５０又は５２のいずれか一項に記載のキット。
５４．臓器を傷害による損傷から保護する、実施形態５１から５３のいずれか一項に記載のキット。
５５．傷害が予定されている、実施形態５４に記載のキット。
５６．予定された傷害の少なくとも８時間前に投与を行う、実施形態５５に記載のキット。
５７．予定された傷害が外科手術、化学療法又はＸ線造影剤の毒性である、実施形態５５又は５６のいずれか一項に記載のキット。
５８．外科手術が臓器移植手術である、実施形態５７に記載のキット。
５９．傷害が敗血症である、実施形態５４に記載のキット。
６０．臓器が移植された臓器である、実施形態３４から５９のいずれか一項に記載のキット。
６１．臓器が心臓、腎臓、肝臓又は肺である、実施形態３４から６０のいずれか一項に記載のキット。
６２．臓器が心臓であり、心機能の改善及び／又は心臓酵素放出の抑制により保護を判定する、実施形態５１から６１のいずれか一項に記載のキット。
６３．心臓酵素がトロポニンである、実施形態６２に記載のキット。
６４．臓器が腎臓であり、ＢＵＮ又は血清クレアチニン上昇の阻止又は抑制により保護を判定する、実施形態５１から６３のいずれか一項に記載のキット。
６５．臓器が肝臓であり、肝酵素上昇の阻止又は抑制により保護を判定する、実施形態５１から６４のいずれか一項に記載のキット。
６６．臓器が肺であり、血液ガス悪化の抑制、酸素補給の必要性の低下又は人工呼吸器の必要性の低下により保護を判定する、実施形態５１から６５のいずれか一項に記載のキット。
６７．対象の臓器における保護性ストレスタンパク質の発現をアップレギュレートするためのキットであって、前記キットが治療有効量のヘムタンパク質、鉄及び／又はビタミンＢ１２を含み、前記治療有効量のヘムタンパク質、鉄及び／又はビタミンＢ１２を対象に投与すると、臓器損傷を生じずに対象の臓器における保護性ストレスタンパク質の発現がアップレギュレートされる、前記キット。
６８．ヘムタンパク質、鉄及び／又はビタミンＢ１２が組成物に配合されている、実施形態６７に記載のキット。
６９．ヘムタンパク質がヘムタンパク質変異体、ヘムタンパク質ｄ置換アナログ、ヘムタンパク質修飾体又はその組み合わせである、実施形態６７又は６８のいずれか一項に記載のキット。
７０．ヘムタンパク質が修飾ヘムタンパク質である、実施形態６７から６９のいずれか一項に記載のキット。
７１．修飾ヘムタンパク質が亜硝酸化ヘムタンパク質又はＰＥＧ化ヘムタンパク質である、実施形態７０に記載のキット。
７２．ヘムタンパク質がミオグロビンである、実施形態６７から７１のいずれか一項に記載のキット。
７３．ヘムタンパク質がミオグロビン変異体及び／又はミオグロビン修飾体である、実施形態６７から７２のいずれか一項に記載のキット。
７４．修飾ミオグロビンが亜硝酸化ミオグロビン又はＰＥＧ化ミオグロビンである、実施形態７３に記載のキット。
７５．保護性ストレスタンパク質がヘムオキシゲナーゼ、ハプトグロビン、ヘモペキシン、ヘプシジン、α１アンチトリプシン、インターロイキン１０、熱ショックタンパク質、好中球ゼラチナーゼ結合性リポカリン及びＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素から選択される、実施形態６７から７４のいずれか一項に記載のキット。
７６．更にヘムタンパク質分解阻害剤、場合により亜硝酸化ヘムタンパク質分解阻害剤を含む、実施形態６７から７５のいずれか一項に記載のキット。
７７．ヘムタンパク質分解阻害剤が組成物に配合されている、実施形態７６に記載のキット。
７８．ヘムタンパク質分解阻害剤とヘムタンパク質が同一の組成物に配合されている、実施形態７６又は７７のいずれか一項に記載のキット。
７９．ヘムタンパク質分解阻害剤がヘムオキシゲナーゼ阻害剤である、実施形態７６から７８のいずれか一項に記載のキット。
８０．ヘムオキシゲナーゼ阻害剤がプロトポルフィリン、ヘミン及び／又はヘマチンであり、場合により亜硝酸化プロトポルフィリン、ヘミン及び／又はヘマチンである実施形態７９に記載のキット。
８１．ヘムオキシゲナーゼ阻害剤が金属プロトポルフィリンである、実施形態７９又は８０のいずれか一項に記載のキット。
８２．金属プロトポルフィリンがＳｎ−プロトポルフィリンである、実施形態８１に記載のキット。
８３．更に投与説明書を含む、実施形態６７から８２のいずれか一項に記載のキット。
８４．投与に起因する臓器損傷がないことを基準レベルとの比較により確認する、実施形態６７から８３のいずれか一項に記載のキット。
８５．保護性ストレスタンパク質のアップレギュレーションにより臓器を損傷から保護する、実施形態６７から８４のいずれか一項に記載のキット。
８６．基準レベルとの比較により保護を判定する、実施形態８５に記載のキット。
８７．基準レベルがキット内に提供されている、実施形態８４又は８６のいずれか一項に記載のキット。
８８．臓器を傷害による損傷から保護する、実施形態８５から８７のいずれか一項に記載のキット。
８９．傷害が予定されている、実施形態８８に記載のキット。
９０．予定された傷害の少なくとも８時間前に投与を行う、実施形態８９に記載のキット。
９１．予定された傷害が外科手術、化学療法又はＸ線造影剤の毒性である、実施形態８９又は９０のいずれか一項に記載のキット。
９２．外科手術が臓器移植手術である、実施形態９１に記載のキット。
９３．傷害が敗血症である、実施形態８８に記載のキット。
９４．臓器が移植された臓器である、実施形態６７から９３のいずれか一項に記載のキット。
９５．臓器が心臓、腎臓、肝臓又は肺である、実施形態６７から９４のいずれか一項に記載のキット。
９６．前記臓器が心臓であり、心機能の改善及び／又は心臓酵素放出の抑制により保護を判定する、実施形態８５から９５のいずれか一項に記載のキット。
９７．心臓酵素がトロポニンである、実施形態９６に記載のキット。
９８．臓器が腎臓であり、ＢＵＮ又は血清クレアチニン上昇の阻止又は抑制により保護を判定する、実施形態８５から９７のいずれか一項に記載のキット。
９９．臓器が肝臓であり、肝酵素上昇の阻止又は抑制により保護を判定する、実施形態８５から９８のいずれか一項に記載のキット。
１００．臓器が肺であり、血液ガス悪化の抑制、酸素補給の必要性の低下又は人工呼吸器の必要性の低下により保護を判定する、実施形態８５から９９のいずれか一項に記載のキット。
１０１．ミオグロビン、ミオグロビン変異体、ミオグロビンｄ置換アナログ、ミオグロビン修飾体又はその組み合わせと、場合により鉄及び／又はビタミンＢ１２を含有する組成物。
１０２．ミオグロビンが修飾ミオグロビンである、実施形態１０１に記載の組成物。
１０３．修飾ミオグロビンが亜硝酸化ミオグロビン又はＰＥＧ化ミオグロビンである、実施形態１０２に記載の組成物。
１０４．ミオグロビンがミオグロビン変異体である、実施形態１０１から１０３のいずれか一項に記載の組成物。
１０５．更にヘムタンパク質分解阻害剤、場合により亜硝酸化ヘムタンパク質分解阻害剤を含有する、実施形態１０１から１０４のいずれか一項に記載の組成物。
１０６．ヘムタンパク質分解阻害剤がヘムオキシゲナーゼ阻害剤である、実施形態１０５に記載の組成物。
１０７．ヘムオキシゲナーゼ阻害剤がプロトポルフィリン、ヘミン及び／又はヘマチンであり、場合により亜硝酸化プロトポルフィリン、ヘミン及び／又はヘマチンである、実施形態１０６に記載の組成物。
１０８．ヘムオキシゲナーゼ阻害剤が金属プロトポルフィリンである、実施形態１０６又は１０７のいずれか一項に記載の組成物。
１０９．金属プロトポルフィリンがＳｎ−プロトポルフィリンである、実施形態１０８に記載の組成物。
１１０．ヘムタンパク質及びヘムタンパク質分解阻害剤と、場合により鉄及び／又はビタミンＢ１２を含有する組成物。
１１１．ヘムタンパク質が修飾ヘムタンパク質である、実施形態１１０に記載の組成物。
１１２．修飾ヘムタンパク質が亜硝酸化ヘムタンパク質又はＰＥＧ化ヘムタンパク質である、実施形態１１１に記載の組成物。
１１３．ヘムタンパク質がミオグロビンである、実施形態１１０から１１２のいずれか一項に記載の組成物。
１１４．ヘムタンパク質がミオグロビン変異体及び／又はミオグロビン修飾体である、実施形態１１０から１１３のいずれか一項に記載の組成物。
１１５．修飾ミオグロビンが亜硝酸化ミオグロビン又はＰＥＧ化ミオグロビンである、実施形態１１４に記載の組成物。
１１６．ヘムタンパク質分解阻害剤がヘムオキシゲナーゼ阻害剤である、実施形態１１０から１１５のいずれか一項に記載の組成物。
１１７．ヘムオキシゲナーゼ阻害剤がプロトポルフィリン、ヘミン及び／又はヘマチンであり、場合により亜硝酸化プロトポルフィリン、ヘミン及び／又はヘマチンである、実施形態１１６に記載の組成物。
１１８．ヘムオキシゲナーゼ阻害剤が金属プロトポルフィリンである、実施形態１１６又は１１７のいずれか一項に記載の組成物。
１１９．金属プロトポルフィリンがＳｎ−プロトポルフィリンである、実施形態１１８に記載の組成物。
１２０．対象の臓器を損傷から保護する方法であって、前記臓器に損傷が生じる前にヘムタンパク質、鉄及び／又はビタミンＢ１２を含有する組成物の治療有効量を臓器に投与することを含み、投与により、臓器損傷を生じずに対象の臓器を損傷から保護する、前記方法。
１２１．組成物が修飾ヘムタンパク質を含有する、実施形態１２０に記載の方法。
１２２．修飾ヘムタンパク質が亜硝酸化ヘムタンパク質又はＰＥＧ化ヘムタンパク質である、実施形態１２１に記載の方法。
１２３．ヘムタンパク質がミオグロビンである、実施形態１２０から１２２のいずれか一項に記載の方法。
１２４．ヘムタンパク質がミオグロビン変異体及び／又はミオグロビン修飾体である、実施形態１２０から１２３のいずれか一項に記載の方法。
１２５．修飾ミオグロビンが亜硝酸化ミオグロビン又はＰＥＧ化ミオグロビンである、実施形態１２４に記載の方法。
１２６．組成物が更にヘムタンパク質分解阻害剤、場合により亜硝酸化ヘムタンパク質分解阻害剤を含有する実施形態１２０から１２５のいずれか一項に記載の方法。
１２７．ヘムタンパク質分解阻害剤、場合により亜硝酸化ヘムタンパク質分解阻害剤を含有する第２の組成物を対象に投与することを更に含む、実施形態１２０から１２６のいずれか一項に記載の方法。
１２８．ヘムタンパク質分解阻害剤がヘムオキシゲナーゼ阻害剤である、実施形態１２６又は１２７のいずれか一項に記載の方法。
１２９．ヘムオキシゲナーゼ阻害剤がプロトポルフィリン、ヘミン及び／又はヘマチンであり、場合により亜硝酸化プロトポルフィリン、ヘミン及び／又はヘマチンである、実施形態１２８に記載の方法。
１３０．ヘムオキシゲナーゼ阻害剤が金属プロトポルフィリンである、実施形態１２８又は１２９のいずれか一項に記載の方法。
１３１．金属プロトポルフィリンがＳｎ−プロトポルフィリンである、実施形態１３０に記載の方法。
１３２．投与に起因する臓器損傷がないことを基準レベルとの比較により確認する、実施形態１２０から１３１のいずれか一項に記載の方法。
１３３．基準レベルとの比較により保護を判定する、実施形態１２０から１３２のいずれか一項に記載の方法。
１３４．損傷が傷害による損傷である、実施形態１２０から１３３のいずれか一項に記載の方法。
１３５．傷害が予定されている、実施形態１３４に記載の方法。
１３６．予定された傷害の少なくとも８時間前に投与を行う、実施形態１３５に記載の方法。
１３７．予定された傷害が外科手術、化学療法又はＸ線造影剤の毒性である、実施形態１３５又は１３６のいずれか一項に記載の方法。
１３８．外科手術が臓器移植手術である、実施形態１３７に記載の方法。
１３９．傷害が敗血症である、実施形態１３４に記載の方法。
１４０．臓器が移植された臓器である、実施形態１２０から１３９のいずれか一項に記載の方法。
１４１．臓器が心臓、腎臓、肝臓又は肺である、実施形態１２０から１４０のいずれか一項に記載の方法。
１４２．臓器が心臓であり、心機能の改善及び／又は心臓酵素放出の抑制により保護を判定する、実施形態１２０から１４１のいずれか一項に記載の方法。
１４３．心臓酵素がトロポニンである、実施形態１４２に記載の方法。
１４４．臓器が腎臓であり、ＢＵＮ又は血清クレアチニン上昇の阻止又は抑制により保護を判定する、実施形態１２０から１４３のいずれか一項に記載の方法。
１４５．臓器が肝臓であり、肝酵素上昇の阻止又は抑制により保護を判定する、実施形態１２０から１４４のいずれか一項に記載の方法。
１４６．臓器が肺であり、血液ガス悪化の抑制、酸素補給の必要性の低下又は人工呼吸器の必要性の低下により保護を判定する、実施形態１２０から１４５のいずれか一項に記載の方法。
１４７．対象の臓器に獲得細胞抵抗性を生じる方法であって、ヘムタンパク質、鉄及び／又はビタミンＢ１２を含有する組成物の治療有効量を対象に投与することを含み、投与により、臓器損傷を生じずに獲得細胞抵抗性を生じる、前記方法。
１４８．組成物が修飾ヘムタンパク質を含有する実施形態１４７に記載の方法。
１４９．修飾ヘムタンパク質が亜硝酸化ヘムタンパク質又はＰＥＧ化ヘムタンパク質である、実施形態１４８に記載の方法。
１５０．ヘムタンパク質がミオグロビンである、実施形態１４７から１４９のいずれか一項に記載の方法。
１５１．ヘムタンパク質がミオグロビン変異体及び／又はミオグロビン修飾体である、実施形態１４７から１５０のいずれか一項に記載の方法。
１５２．修飾ミオグロビンが亜硝酸化ミオグロビン又はＰＥＧ化ミオグロビンである、実施形態１５１に記載の方法。
１５３．組成物が更にヘムタンパク質分解阻害剤を含有する、実施形態１４７から１５２のいずれか一項に記載の方法。
１５４．ヘムタンパク質分解阻害剤、場合により亜硝酸化ヘムタンパク質分解阻害剤を含有する第２の組成物を対象に投与することを更に含む、実施形態１４７から１５３のいずれか一項に記載の方法。
１５５．ヘムタンパク質分解阻害剤がヘムオキシゲナーゼ阻害剤である、実施形態１５３又は１５４のいずれか一項に記載の方法。
１５６．前記ヘムオキシゲナーゼ阻害剤がプロトポルフィリン、ヘミン及び／又はヘマチンであり、場合により亜硝酸化プロトポルフィリン、ヘミン及び／又はヘマチンである、実施形態１５５に記載の方法。
１５７．ヘムオキシゲナーゼ阻害剤が金属プロトポルフィリンである、実施形態１５５又は１５６のいずれか一項に記載の方法。
１５８．金属プロトポルフィリンがＳｎ−プロトポルフィリンである、実施形態１５７に記載の方法。
１５９．投与に起因する臓器損傷がないことを基準レベルとの比較により確認する、実施形態１４７から１５８のいずれか一項に記載の方法。
１６０．獲得細胞抵抗性により臓器を損傷から保護する、実施形態１４７から１５９のいずれか一項に記載の方法。
１６１．基準レベルとの比較により保護を判定する、実施形態１６０に記載の方法。
１６２．損傷が傷害による損傷である、実施形態１６０又は１６１のいずれか一項に記載の方法。
１６３．傷害が予定されている、実施形態１６２に記載の方法。
１６４．予定された傷害の少なくとも８時間前に投与を行う、実施形態１６３に記載の方法。
１６５．予定された傷害が外科手術、化学療法又はＸ線造影剤の毒性である、実施形態１６３又は１６４のいずれか一項に記載の方法。
１６６．外科手術が臓器移植手術である、実施形態１６５に記載の方法。
１６７．傷害が敗血症である、実施形態１６２に記載の方法。
１６８．臓器が移植された臓器である、実施形態１４７から１６７のいずれか一項に記載の方法。
１６９．臓器が心臓、腎臓、肝臓又は肺である、実施形態１４７から１６８のいずれか一項に記載の方法。
１７０．臓器が心臓であり、心機能の改善及び／又は心臓酵素放出の抑制により保護を判定する、実施形態１６０から１６９のいずれか一項に記載の方法。
１７１．心臓酵素がトロポニンである、実施形態１７０に記載の方法。
１７２．臓器が腎臓であり、ＢＵＮ又は血清クレアチニン上昇の阻止又は抑制により保護を判定する、実施形態１６０から１７１のいずれか一項に記載の方法。
１７３．臓器が肝臓であり、肝酵素上昇の阻止又は抑制により保護を判定する、実施形態１６０から１７２のいずれか一項に記載の方法。
１７４．臓器が肺であり、血液ガス悪化の抑制、酸素補給の必要性の低下又は人工呼吸器の必要性の低下により保護を判定する、実施形態１６０から１７３のいずれか一項に記載の方法。
１７５．対象の臓器における保護性ストレスタンパク質の発現をアップレギュレートする方法であって、ヘムタンパク質、鉄及び／又はビタミンＢ１２を含有する組成物の治療有効量を対象に投与することを含み、投与により、臓器損傷を生じずに、対象の臓器における保護性ストレスタンパク質の発現をアップレギュレートする、前記方法。
１７６．保護性ストレスタンパク質がヘムオキシゲナーゼ、ハプトグロビン、ヘモペキシン、ヘプシジン、α１アンチトリプシン、インターロイキン１０、熱ショックタンパク質、好中球ゼラチナーゼ結合性リポカリン及び／又はＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素から選択される、実施形態１７５に記載の方法。
１７７．組成物が更に修飾ヘムタンパク質を含有する、実施形態１７５又は１７６のいずれか一項に記載の方法。
１７８．修飾ヘムタンパク質が亜硝酸化ヘムタンパク質又はＰＥＧ化ヘムタンパク質である、実施形態１７７に記載の方法。
１７９．ヘムタンパク質がミオグロビンである、実施形態１７５から１７８のいずれか一項に記載の方法。
１８０．ヘムタンパク質がミオグロビン変異体及び／又はミオグロビン修飾体である、実施形態１７５から１７９のいずれか一項に記載の方法。
１８１．修飾ミオグロビンが亜硝酸化ミオグロビン又はＰＥＧ化ミオグロビンである実施形態１８０のいずれか一項に記載の方法。
１８２．組成物が更にヘムタンパク質分解阻害剤、場合により亜硝酸化ヘムタンパク質分解阻害剤を含有する実施形態１７５から１８１のいずれか一項に記載の方法。
１８３．ヘムタンパク質分解阻害剤、場合により亜硝酸化ヘムタンパク質分解阻害剤を含有する第２の組成物を対象に投与することを更に含む、実施形態１７５から１８２のいずれか一項に記載の方法。
１８４．ヘムタンパク質分解阻害剤がヘムオキシゲナーゼ阻害剤である、実施形態１８２又は１８３のいずれか一項に記載の方法。
１８５．ヘムオキシゲナーゼ阻害剤がプロトポルフィリン、ヘミン及び／又はヘマチンであり、場合により亜硝酸化プロトポルフィリン、ヘミン及び／又はヘマチンである、実施形態１８４に記載の方法。
１８６．ヘムオキシゲナーゼ阻害剤が金属プロトポルフィリンである、実施形態１８４又は１８５のいずれか一項に記載の方法。
１８７．金属プロトポルフィリンがＳｎ−プロトポルフィリンである、実施形態１８６に記載の方法。
１８８．投与に起因する臓器損傷がないことを基準レベルとの比較により確認する、実施形態１７５から１８７のいずれか一項に記載の方法。
１８９．保護性ストレスタンパク質の発現のアップレギュレートにより、臓器を損傷から保護する、実施形態１７５から１８８のいずれか一項に記載の方法。
１９０．基準レベルとの比較により保護を判定する、実施形態１８９に記載の方法。
１９１．損傷が傷害による損傷である、実施形態１８９又は１９０のいずれか一項に記載の方法。
１９２．傷害が予定されている、実施形態１９１に記載の方法。
１９３．予定された傷害の少なくとも８時間前に投与を行う、実施形態１９２に記載の方法。
１９４．予定された傷害が外科手術、化学療法又はＸ線造影剤の毒性である、実施形態１９２又は１９３に記載の方法。
１９５．外科手術が臓器移植手術である、実施形態１９４に記載の方法。
１９６．傷害が敗血症である、実施形態１９１に記載の方法。
１９７．臓器が移植された臓器である、実施形態１７５から１９６のいずれか一項に記載の方法。
１９８．臓器が心臓、腎臓、肝臓又は肺である、実施形態１７５から１９７のいずれか一項に記載の方法。
１９９．臓器が心臓であり、心機能の改善及び／又は心臓酵素放出の抑制により保護を判定する、実施形態１８９から１９８のいずれか一項に記載の方法。
２００．心臓酵素がトロポニンである、実施形態１９９に記載の方法。
２０１．臓器が腎臓であり、ＢＵＮ又は血清クレアチニン上昇の阻止又は抑制により保護を判定する、実施形態１８９から２００のいずれか一項に記載の方法。
２０２．臓器が肝臓であり、肝酵素上昇の阻止又は抑制により保護を判定する、実施形態１８９から２０１のいずれか一項に記載の方法。
２０３．臓器が肺であり、血液ガス悪化の抑制、酸素補給の必要性の低下又は人工呼吸器の必要性の低下により保護を判定する、実施形態１８９から２０２のいずれか一項に記載の方法。
２０４．組成物が静脈内送達、経口送達、皮下送達又は筋肉内送達用に製剤化されている、実施形態１から２０３のいずれか一項に記載の実施形態。
２０５．組成物が遅放性デポ剤として製剤化されている、実施形態１から２０４のいずれか一項に記載の実施形態。
２０６．下記構造：
Figure 2017535522
 （式中、Ｒ１は５’−デオキシアデノシル、ＣＨ３、ＯＨ又はＣＮであり；Ｒ２はＯＨ又はＨであり；Ｒ３はＯＨ又はＨである。）を含む組成物。
２０７．前記Ｂ１２が構造：
Figure 2017535522
 （式中、Ｒ１は５’−デオキシアデノシル、ＣＨ３、ＯＨ又はＣＮであり；Ｒ２はＯＨ又はＨであり；Ｒ３はＯＨ又はＨである。）を有する、実施形態１から２０５のいずれか一項に記載の実施形態。
２０８．対象に投与することにより臓器に投与するのではなく、臓器に直接投与する、上記実施形態のいずれか一項に記載の実施形態。
２０９．下記構造：
Figure 2017535522
 （式中、Ｒ１は５’−デオキシアデノシル、ＣＨ３、ＯＨ又はＣＮであり；Ａはリン酸基であり、Ｌはリンカーであり、Ｂは糖質構造であり、Ｍは糖質構造と錯形成した金属である。）を含む組成物。
２１０．ＡがＰＯ４であり、Ｌがヒドラゾンリンカーであり、Ｂが糖質構造であり、ＭがＦｅである、実施形態２０９に記載の組成物。
２１１．Ｂが炭素原子数１０〜１６、酸素原子数９〜１５、及び水素原子数１６〜２８である、実施形態２０９又は２１０に記載の組成物。
２１２．Ｂがスクロースに由来する、実施形態２０９、２１０又は２１１に記載の組成物。
２１３．下記構造：
Figure 2017535522
 （式中、Ｒ１は５’−デオキシアデノシル、ＣＨ３、ＯＨ又はＣＮであり；Ｒ３はＯＨ又はＨであり；Ｌはリンカーであり、Ｂは糖質構造であり、Ｍは糖質構造と錯形成した金属である。）を含む組成物。
２１４．Ｌがヒドラゾンリンカーであり、ＭがＦｅである、実施形態２１３に記載の組成物。
２１５．Ｂが炭素原子数１０〜１６、酸素原子数９〜１５、及び水素原子数１６〜２８である、実施形態２１３又は２１４に記載の組成物。
２１６．Ｂがスクロースに由来する実施形態２１３、２１４又は２１５に記載の組成物。
２１７．下記構造：
Figure 2017535522
 （式中、Ｒ１は５’−デオキシアデノシル、ＣＨ３、ＯＨ又はＣＮであり；Ｒ３はＯＨ又はＨであり；Ｌはリンカーであり、Ｂは糖質構造であり、Ｍは糖質構造と錯形成した金属である。）を含む組成物。
２１８．Ｌがヒドラゾンリンカーであり、ＭがＦｅである、実施形態２１７に記載の組成物。
２１９．Ｂが炭素原子数１０〜１６、酸素原子数９〜１５、及び水素原子数１６〜２８である、実施形態２１７又は２１８に記載の組成物。
２２０．Ｂがスクロースに由来する、実施形態２１７、２１８又は２１９に記載の組成物。
２２１．下記構造：
Figure 2017535522
 （式中、Ｒ１は５’−デオキシアデノシル、ＣＨ３、ＯＨ又はＣＮであり；Ｌはリンカーであり、Ｂは糖質構造であり、Ｍは糖質構造と錯形成した金属である。）を含む組成物。
２２２．Ｌがヒドラゾンリンカーであり、ＭがＦｅである、実施形態２２１に記載の組成物。
２２３．Ｂが炭素原子数１０〜１６、酸素原子数９〜１５、及び水素原子数１６〜２８である、実施形態２２１又は２２２に記載の組成物。
２２４．Ｂがスクロースに由来する、実施形態２２１、２２２又は２２３に記載の組成物。
２２５．下記構造：
Figure 2017535522
 （式中、Ｒ１は５’−デオキシアデノシル、ＣＨ３、ＯＨ又はＣＮであり；Ｌ１は第１のリンカーであり、Ｌ２は第２のリンカーであり、Ｂ１は第１の糖質構造であり、Ｂ２は第２の糖質構造であり、Ｍ１は糖質構造と錯形成した第１の金属であり、Ｍ２は糖質構造と錯形成した第２の金属である。）を含む組成物。
２２６．Ｌ１及びＬ２が各々独立してヒドラゾンリンカーであり、Ｍ１及びＭ２が各々独立してＦｅである、実施形態２２５に記載の組成物。
２２７．Ｂ１及びＢ２が各々独立して炭素原子数１０〜１６、酸素原子数９〜１５、及び水素原子数１６〜２８である、実施形態２２５又は２２６に記載の組成物。
２２８．Ｂ１及びＢ２が各々独立してスクロースに由来する、実施形態２２５、２２６又は２２７に記載の組成物。
[実施例１] 腎保護。以下のプロトコールを使用して図１〜４及び表１〜７に記載するデータを取得した。
ＡＫＩのグリセロールモデル。これは広く使用されている横紋筋融解症誘発ＡＫＩのモデルであり、５０年間にわたって世界中で利用されている。このモデルを使用して予防介入がＡＫＩに対する保護を付与するか否かを試験した。基本的に、プロトコールは以下の通りである。Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡから入手した雄性ＣＤ−１マウス（３５〜４５グラム）を試験した。マウスを標準飼育条件下に維持し、一般に試験の１〜３週間前に収容した。マウスを円筒形拘束ケージに入れた後、被験物質（下記参照）又は被験物質溶媒を尾静脈に注射した。次にマウスを元のケージに戻した。１８時間後にマウスにイソフルラン吸入により短時間麻酔し、高張（５０％）グリセロールを９ｍｌ／ｋｇ体重の用量で筋肉内注射した。用量を二等分し、半量ずつ各後足の筋肉に注射した。次にマウスを元のケージに戻した。１８時間後にマウスにペントバルビタール（５０〜１００ｍｇ／ｋｇ）を深麻酔し、腹部正中切開により開腹し、腹部大静脈から血液試料を採取し、腎臓を切除した。腎臓断面切片を作製し、その後の組織学的解析に備えてホルマリン固定した。市販のアッセイキットを使用して終末血液試料をＢＵＮ及びクレアチニンについて解析した。残りの腎臓組織から皮質を剥離した後、皮質組織からタンパク質及びＲＮＡを抽出した。タンパク質試料はＨＯ−１濃度の解析用に取っておき、ＲＮＡ試料をＲＴ−ＰＣＲに供し、ＨＯ−１ｍＲＮＡと他のストレス遺伝子ｍＲＮＡ（例えばＮＧＡＬ、ハプトグロビン、ヘモペキシン、ヘプシジン）のレベルを定量した。
被験製剤：凍結保存ウマ骨格筋（ミオグロビン）（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を被験物質として使用した。
ミオグロビン＋ＳｎＰＰ：乾燥ミオグロビン５ｍｇにＰＢＳ０．９ｍｌ＋ストックＳｎＰＰ溶液（５０μｍｏｌ／ｍｌ）０．１ｍｌを加えた。得られた最終濃度はミオグロビン５ｍｇ／ｍｌ＋ＳｎＰＰ５μｍｏｌ／ｍｌであった。ミオグロビン１ｍｇ＋ＳｎＰＰ１μｍｏｌに相当するこの溶液２００μｌを尾静脈に注射した。
亜硝酸化ミオグロビン：ミオグロビンに対して１〜５モル／モル比となるように亜硝酸Ｎａをミオグロビンに加えた（例えばミオグロビン１μｍｏｌ当たり亜硝酸塩１〜５μｍｏｌ）。得られた最終濃度はミオグロビン５〜１０ｍｇ／ｍｌ＋亜硝酸塩０．０４〜０．４ｍｇ／ｍｌであった。この溶液２００μｌを尾静脈に注射した。
ミオグロビン＋ＰＥＧ：ＰＢＳ中２０ｍｇ／ｍｌ Ｍｇｂのストック溶液に１００ｍｇ／ｍｌのＰＥＧ６０００を加えた（２５０μｌ）。これを皮下注射剤として背側首に投与した（合計２５０μｌ注射）。Ｍｇｂ／ＰＥＧ＋ＳｎＰＰ併用では、これにＳｎＰＰを３ｍｇ／ｍｌの濃度で加えた。
これらを試験材料とし、上記のようにグリセロールＡＫＩモデルに対する保護を評価するためにマウスに投与した。
各被験物質の単独効果：ミオグロビン＋ＳｎＰＰがミオグロビン単独又はＳｎＰＰ単独よりも効果が大きいか否かを評価するために、ミオグロビン＋ＳｎＰＰ、ＳｎＰＰ単独又はミオグロビン単独で上記と同一の溶液を調製した。これらを上記グリセロールモデルで使用した。
ミオグロビンとミオグロビン＋ＳｎＰＰとＳｎＰＰ単独投与から４時間後の結果を比較した実験。ミオグロビン＋ＳｎＰＰがＨＯ−１ｍＲＮＡ及びＨＯ−１タンパク質レベル上昇を誘導するのに相乗的な効果があることを確認するために、上記組合せの各々を単独で尾静脈注射により投与した。４時間後にマウスを上記のように屠殺し、ＨＯ−１ｍＲＮＡ及びタンパク質レベルを評価するために腎臓を摘出した。方法に関するその他の情報については、Ｚａｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｎａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１４ Ｊｕｌ ３０．Ｐｉｉ参照。
Figure 2017535522
表２に示すように、（ＥＬＩＳＡによると）４時間の時点でＨＯ−１タンパク質発現は優先的に増加している。タンパク質合成はｍＲＮＡ誘導後となり、更に時間が必要になるが、注射からちょうど４時間後であるため、ｍＲＮＡ増加のほうがタンパク質増加よりも大きい。
Figure 2017535522
表３はミオグロビン単独及びミオグロビンとＳｎＰＰの併用の注射から約１８時間後（一晩）のＨＯ−１ｍＲＮＡ誘導（ＨＯ−１／ＧＡＰＤＨｍＲＮＡ）を比較して示す。
Figure 2017535522
表４は対照、ミオグロビン単独及びミオグロビンとＳｎＰＰの併用の注射から約１８時間後（一晩）のＨＯ−１タンパク質誘導（ＨＯ−１／ＧＡＰＤＨｍＲＮＡ）を比較して示す。
Figure 2017535522
図１Ａ及び１Ｂはグリセロール傷害の１８時間前に溶媒（対照）、ミオグロビン（Ｍｇｂ）又はミオグロビンとＳｎＰＰの併用（Ｍｇｂ＋ＳｎＰＰ）を投与後のＨＯｍＲＮＡ発現（図１Ａ）及びタンパク質発現（図１Ｂ）を示す。データから明らかなように、ミオグロビンによるＨＯ−１誘導はＳｎＰＰの併用投与により強化されている。
表５は担体対照と比較してミオグロビン単独又はミオグロビンとＰＥＧの併用に暴露後のハプトグロビンタンパク質発現の誘導を示す。データから明らかなように、ミオグロビン＋ＰＥＧはミオグロビン単独よりも細胞保護ハプトグロビン発現の著しく大きな増加を誘導する。
Figure 2017535522
表６は肝臓、腎臓、肺及び心臓損傷の高感度マーカーである血漿中ＬＤＨ濃度を示す。ミオグロビン＋ＳｎＰＰは４時間の時点でＬＤＨ上昇を生じなかった。
Figure 2017535522
図２左はグリセロール傷害後の細胞レベルの腎損傷を示し、図２右はミオグロビンとＳｎＰＰの併用による前投与の保護効果を示す。
図３はＮ−Ｍｇｂ＋ＳｎＰＰが保護性ストレスタンパク質であるインターロイキン１０（ＩＬ−１０）を優先的に上昇させることを示す。
図４はＮ−Ｍｇｂ＋ＳｎＰＰが保護性ストレスタンパク質であるハプトグロビンを優先的に上昇させることを示す。
[実施例２] 肝保護。傷害から２４時間後の血漿中ＬＤＨ濃度により肝毒性損傷を評価した。肝傷害は９ｍｌ／ｋｇのグリセロール注射とした（これは腎損傷を生じるために使用されるものと同一のモデルである）。肝損傷により血漿中ＬＤＨは３．５単位／ｍｌから１１４単位／ｍｌまで上昇した。ミオグロビン／ＳｎＰＰ前投与により、血漿中ＬＤＨ濃度は７５％低下した。
Figure 2017535522
実施例１及び２に記載したデータから明らかなように、ヘムタンパク質、修飾ヘムタンパク質及びヘムタンパク質とヘムタンパク質分解阻害剤の併用は、腎臓と肝臓をグリセロール傷害による損傷から保護する。保護は損傷のマーカー（ＬＤＨ）、臓器機能（ＢＵＮ及びクレアチニン）及び保護性ストレスタンパク質（ＨＯ−１及びハプトグロビン）の誘導により立証される。
[実施例３] 図５はミオグロビンＦｅと等モル量の亜硝酸イオンの結合がミオグロビン毒性の発現に及ぼす影響の評価を示す。ケラチノサイト無血清培地で正常（対照）条件下又は１０ｍｇ／ｍＬのウマ骨格筋ミオグロビンもしくは（１０ｍｇ／ｍｌのミオグロビンに等モル量の亜硝酸Ｎａを加えることにより生成した）亜硝酸化ミオグロビンの存在下にＨＫ−２細胞（正常ヒト腎臓に由来する近位尿細管細胞株）をインキュベートした。１８時間インキュベーション後に、細胞損傷の重症度（細胞死％）をＭＴＴアッセイにより評価した。ミオグロビンは対照培養細胞に比較して４０％の細胞死（ＭＴＴ細胞取り込みの４０％低下）を誘導した。ミオグロビンに亜硝酸イオンを結合させると、細胞死は７５％低下した。従って、亜硝酸イオンの結合はミオグロビンの細胞毒性作用を低下させることが可能である。
図６は血漿中ヘムオキシゲナーゼ１（ＨＯ−１）とＮ−ミオグロビン投与量の用量反応関係を示す。亜硝酸化ミオグロビン０ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ又は５ｍｇ／ｋｇ＋ＳｎＰＰ（１μｍｏｌの一定用量）を正常マウスにＩＭ注射した。１８時間後に、血漿中ＨＯ−１濃度をＥＬＩＳＡにより評価した。Ｎ−ミオグロビン投与量と血漿中ＨＯ−１濃度の間には強い用量反応関係が認められた。従って、ＨＯ−１アッセイはＮ−Ｍｇｂ／ＳｎＰＰによるＨＯ−１誘導の潜在的バイオマーカーとして有用である。
図７はＮ−ミオグロビン用量を２５倍まで変動させた場合に正常な血清クレアチニン濃度が維持されることを示す。マウスに（ＳｎＰＰを１μｍｏｌの一定用量に保持しながら）亜硝酸化ミオグロビン１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、１２ｍｇ／ｋｇ又は２５ｍｇ／ｋｇを２時間皮下輸液した。１８時間後に、血清クレアチニン濃度を測定することにより潜在的腎損傷を評価した。いずれのＮ−Ｍｇｂ用量でも有意な上昇は認められず、過度の毒性はないと判断された（ｎ＝２〜４匹／群）。
[実施例４] 緒言。急性腎障害（ＡＫＩ）は罹病率、死亡率及び慢性腎疾患（ＣＫＤ；Ｉｓｈａｎｉ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ ２００９；２０：２２３−８；Ｘｕｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ ２００６；１７：１１３５−４２；Ｌｉａｎｇｏｓ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ ２００６；１：４３−５１；Ｗａｌｄ ｅｔ ａｌ．ＪＡＭＡ ２００９；３０２：１１７９−８５；Ｇｏｌｄｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ ２００９；７６：９００−６）の発症のよく知られた危険因子である。しかし、確立したＡＫＩの予防方法は今のところ存在しない。虚血又は毒性損傷の最初の発作後に、腎臓が続発する損傷に対して顕著な抵抗性を生じることはよく知られている（例えばＨｏｎｄａ ｅｔ ａｌ．Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ １９８７；３１：１２３３−８；Ｚａｇｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ １９８４；２６：６８９−７００；Ｚａｇｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ １９９５；７２：５９２−６００；Ｚａｇｅｒ，Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ １９９５；４７：１３３６−４５；Ｚａｇｅｒ，Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ １９９５；４７：６２８−３７）。この現象は細胞保護及び抗炎症性「ストレス」タンパク質（例えばヘムオキシゲナーゼ１（ＨＯ−１）、フェリチン、ハプトグロビン、ヘモペキシン、α１アンチトリプシン、インターロイキン１０（ＩＬ−１０））のアップレギュレーションを一因とし、「虚血プレコンディショニング」又は「獲得細胞抵抗性」状態と呼ばれている。Ｚａｇｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ ２０１４；２５：９９８−１０１２；Ｄｅｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ ２００１；６０：２１１８−２８；Ｚａｒｊｏｕ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ２０１３；１２３：４４２３−３４；Ｎａｔｈ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １９９２；９０：２６７−７０；Ｚａｇｅｒ ｅｔ ａｌ．Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２０１２；３０３：Ｆ１４６０−７２；Ｆｉｎｋ，Ｊ Ｌｅｕｋｏｃ Ｂｉｏｌ ２００９；８６：２０３−４ Ａｒｒｅｄｏｕａｎｉ ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２００５；１１４：２６３−７１；Ｂｌｕｍ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ａｍ Ｃｏｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ ２００７；４９：８２−７；Ｇａｌｉｃｉａ ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００９；３９：３４０４−１２；Ｚａｇｅｒ ｅｔ ａｌ．Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２０１２；３０３：Ｆ１３９−４８；Ｚａｇｅｒ ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ２０１４；９：ｅ９８３８；Ｈｕｎｔ ＆ Ｔｕｄｅｒ，Ｃｕｒｒ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ２０１２；１２：８２７−３５；Ｊａｎｃｉａｕｓｋｉｅｎｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２００７；２８２：８５７３−８２。
獲得細胞抵抗性の顕著な保護性に鑑み、研究者らはヒトにおいて安全に再現する方法を追求してきた。この関連では、血圧カフを繰返し膨張・収縮させることにより上肢及び下肢虚血の反復発作を誘発する所謂「遠隔プレコンディショニング」が注目される。Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ａｍ Ｊ Ｋｉｄｎｅｙ Ｄｉｓ ２０１４；６４：５７４−８３；Ｍｏｈｄ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｓｕｒｇ Ｒｅｓ ２０１４；１８６：２０７−１６；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃａｒｄｉｏｔｈｏｒａｃ Ｓｕｒｇ ２０１３；８：４３。その目的は未知の組織「コンディショニング因子」を全身循環に放出させ、（例えば脳、心臓、肝臓及び腎臓に）保護性の組織応答を誘発することである。このアプローチは魅力的であるにも拘わらず、成功に疑問が残るが、その理由は、（１）虚血後の四肢から放出され、「プレコンディショニング」を誘導する「因子」と、この状態を誘導するためにどの程度の因子放出が必要であるかが不明である；（２）このような因子が如何なる細胞経路により細胞抵抗性を誘導するように遠位臓器に作用するかが明らかにされていない；及び（３）所望のプレコンディショニングが所定の個体に実際に生じるか否かを判断することが困難であるという点にあると思われる。
そこで、獲得細胞抵抗性を誘導する代替アプローチを検討した。この目的のために、明白な腎毒性又は腎外毒性を生じずに多数の尿細管細胞保護剤（例えばＨＯ−１、ハプトグロビン及びＩＬ−１０）を顕著且つ相乗的にアップレギュレートする薬物レジメンとして、低用量亜硝酸化ミオグロビン（Ｎ−Ｍｇｂ）＋錫プロトポルフィリン（ＳｎＰＰ）を含むレジメンを開発した。薬物投与から１８時間以内に、腎毒性ＡＫＩ、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）低下誘発ＡＫＩ、及びＡＫＩ後のＣＫＤ結果への進行に対する顕著な抵抗が発現する。また、虚血後損傷と毒性損傷に対する肝保護も発現する。最後に、この細胞抵抗性状態の誘導は血漿中ＨＯ−１及びハプトグロビン濃度をその誘導の「バイオマーカー」として使用することにより非侵襲的に測定できることが分かった。
方法。一般アプローチ。動物。全実験は雄性ＣＤ−１マウス（３５〜４５ｇ；Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を使用して実施した。マウスを標準飼育条件下で収容し、常に飼料と水を自由に摂取できるようにした。使用したプロトコールは米国国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）のガイドラインに従い、所内の動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ））により承認された。
細胞抵抗性誘導試薬。ウマ骨格筋（＃Ｍｂ０３６０；Ｓｉｇｍａ）を主要な細胞抵抗性誘導剤として使用した。しかし、ミオグロビン（Ｍｇｂ）は（特に等張性脱水及び酸性尿の条件下で）内在的な腎毒性の可能性があるため、２つのアプローチを使用してＭｇｂの潜在的な有害作用を軽減させた。先ず、等モル量の亜硝酸ナトリウム（Ｎａ）を加えることによりＭｇｂを亜硝酸化形態に変換した。これに関連して、亜硝酸イオンはその酸素又は窒素成分を介して１：１でミオグロビンＦｅと直接結合するアンビデントな分子である。Ｃｏｔｔｏｎ ｅｔ ａｌ．Ａｄｖａｎｃｅｄ ｉｎｏｒｇａｎｉｃ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｈｏｂｏｃｋｅｎ，ＮＪ：Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９９９：１３５５；Ｓｉｌａｇｈｉ−Ｄｕｍｉｔｒｅｓｃｕ ｅｔ ａｌ．Ｎｉｔｒｉｃ Ｏｘｉｄｅ ２０１４；４２Ｃ：３２−９。注目すべき点として、ＦｅはＭｇｂの細胞毒性作用の主要なメディエーターであり（Ｚａｇｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １９９２；８９：９８９−９５；Ｚａｇｅｒ ＆ Ｂｕｒｋｈａｒｔ，Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ １９９７；５１：７２８−３８）、この毒性は事前の亜硝酸イオンとの結合により実質的に低減される。Ｒａｓｓａｆ ｅｔ ａｌ．Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ ２０１４；１１４：１６０１−１０；Ｔｏｔｚｅｃｋ ｅｔ ａｌ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ２０１２；１２６：３２５−３４［Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １９９２；８９：９８９−９５］；Ｔｏｔｚｅｃｋ ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ２０１４；２２：ｅ１０５９５１；Ｈｅｎｄｇｅｎ−Ｃｏｔｔａ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳ Ａ ２００８；１０５：１０２５６−６１。
Ｆｅによる毒性を低減できることに加え、亜硝酸イオンは恐らく一酸化窒素（ＮＯ）生成により「遠隔プレコンディショニング」のメディエーターであると考えられている。Ｒａｓｓａｆ，前出。これに関連して、ヘムタンパク質は亜硝酸イオンを直接還元し、その結果としてＮＯが生成される。Ｊｕｎｃｏｓ ｅｔ ａｌ．Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ ２００６；１６９：２１−３１；Ｋｅｌｌｅｒｍａｎ，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １９９３；９２：１９４０−９；Ｚａｇｅｒ ｅｔ ａｌ．Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２００８；２９４：Ｆ１８７−９７。従って、亜硝酸イオンをＭｇｂと直接結合させることにより、Ｍｇｂ注射とその後の近位尿細管エンドサイトーシス取り込みの結果、近位尿細管を標的として亜硝酸イオンとＮＯが直接送達される。
第２に、ヘムＦｅがその細胞毒性の大部分を誘発するためには、先ずポルフィリン環内のその結合部位から解放されなければならない。このＦｅ解放はＨＯ−１によるポルフィリン環開裂を介して行われる。従って、潜在的なＭｇｂ細胞毒性を弱めるために、一過性ＨＯ−１阻害剤であるＳｎＰＰと併用投与した。これに関連して、Ｍｇｂに暴露した培養近位尿細管（ＨＫ−２）細胞又は生体内でヘムを投与したマウス近位尿細管セグメントにＳｎＰＰを加えると、Ｍｇｂ毒性は８５％も低下することが従来報告されている。Ｚａｇｅｒ ＆ Ｂｕｒｋｈａｒｔ，Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ １９９７；５１：７２８−３８。この細胞保護作用はＳｎＰＰが虚血後急性腎不全（ＡＲＦ）を軽減させるらしいという報告にも示されている。Ｊｕｎｃｏｓ ｅｔ ａｌ．Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ ２００６；１６９：２１−３１；Ｋａｉｚｕ ｅｔ ａｌ．Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ ２００３；６３：１３９３−４０３。
腎皮質ヘムシグナル伝達に及ぼすＭｇｂ、ＳｎＰＰ及びＭｇｂ＋ＳｎＰＰの影響。次の仮設を立てた。（１）Ｎ−Ｍｇｂは強力なシグナル伝達分子であり、ヘム応答性エレメントと酸化還元感受性遺伝子のアップレギュレーションをもたらし、細胞保護作用を誘発する（例えばＨＯ−１、ハプトグロビン、ヘモペキシン及びＩＬ−１０）；（２）ＳｎＰＰは独立してこのような遺伝子をアップレギュレートすることができる；（３）併用投与した場合に、Ｎ−Ｍｇｂ＋ＳｎＰＰ併用投与により相加的又は相乗的ヘム応答性エレメントのシグナル伝達を生じることができる。以下の実験によりこれらの仮説を試験した。
マウス３２匹を（１）対照マウス；（２）（尾静脈からボーラスとして）Ｎ−Ｍｇｂ１ｍｇを注射したマウス；（３）（尾静脈から）ＳｎＰＰ１ｍｍｏｌを投与したマウス；及び（４）Ｎ−Ｍｇｂ＋ＳｎＰＰを併用投与したマウスの４群に同数ずつ分けた。４時間（ｎ＝１６）又は１８時間（ｎ＝１６）後に、マウスにペントバルビタール（５０ｍｇ／ｋｇ）を深麻酔し、腹部正中切開により開腹し、腎臓を摘出した。腎外臓器への潜在的な影響を調べるために、肝葉と心臓も摘出した。組織を氷冷後、タンパク質及びＲＮＡを抽出し（ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉ；Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）と逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）に供し、ＨＯ−１、ハプトグロビン及びＩＬ−１０タンパク質及びメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を定量した。Ｚａｇｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ ２０１４；２５：９９８−１０１２；Ｚａｇｅｒ ｅｔ ａｌ．Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２０１２；３０３：Ｆ１３９−４８。腎機能の評価として、対照マウスとＮ−Ｍｇｂ＋ＳｎＰＰを投与してから１８時間後のマウスの血中尿素窒素（ＢＵＮ）と血漿中クレアチニン濃度を測定した。また、１０％ホルマリンに固定した腎臓横断面切片（３ｍＭ）を切断し、ヘマトキシリン・エオジン（Ｈ＆Ｅ）と過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）試薬で染色し、潜在的損傷を更に評価した。
細胞抵抗性の評価。横紋筋融解症誘発ＡＫＩのグリセロールモデル。マウス２０匹を上記のように同数ずつ４群に分けた（対照、尾静脈注射によりＮ−Ｍｇｂ、ＳｎＰＰ及びＮ−Ｍｇｂ＋ＳｎＰＰを投与したマウス）。１８時間後にマウスにイソフルランを短時間麻酔し、直ぐに５０％グリセロール９ｍＬ／ｋｇを二等分して各後足に注射した。グリセロール注射から１８時間後に、マウスにペントバルビタールを麻酔し、開腹し、ＢＵＮ及びクレアチニン評価用の血液試料を大静脈から採取し、腎臓を切除した。グリセロール投与後の対照群とＮ−Ｍｇｂ＋ＳｎＰＰを前投与したグリセロール群の腎臓切片をＨ＆Ｅで染色した。
ＡＫＩのマレイン酸塩モデル。齧歯類に注射すると、マレイン酸塩は有機アニオントランスポーターを介して選択的に近位尿細管に取り込まれ、顕著な近位尿細管特異的ＡＴＰ低下を誘発する。Ｋｅｌｌｅｒｍａｎ，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １９９３；９２：１９４０−９；Ｚａｇｅｒ ｅｔ ａｌ．Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２００８；２９４：Ｆ１８７−９７。その結果、重度ＡＫＩに至る。以下の実験により、Ｎ−Ｍｇｂ＋ＳｎＰＰの前投与がこの種の腎損傷に対して保護できるか否かを評価した。マウス１２匹を同数ずつ２群に分け、Ｎ−Ｍｇｂ−ＳｎＰＰ又は溶媒を注射した。１８時間後に、全マウスにマレイン酸Ｎａ（６００ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内（ＩＰ）注射した。Ｚａｇｅｒ ｅｔ ａｌ．Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２００８；２９４：Ｆ１８７−９７。１８時間後にマウスに麻酔し、ＢＵＮ及びクレアチニン測定用に終末血液試料を下大静脈から採取した。
虚血後ＡＫＩからＣＫＤへの進行。３０分間の片側腎虚血後に、損傷した腎臓は進行的な尿細管脱落、腸炎症及び線維症により発現されるＣＫＤに移行し、腎臓質量（腎臓重量）の４０％低下に至る。Ｚａｇｅｒ ｅｔ ａｌ．Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２０１１；３０１：Ｆ１３３４−４５；Ｚａｇｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ ２０１３；８４：７０３−１２。Ｎ−Ｍｇｂ−ＳｎＰＰ投与によって虚血後の疾患進行を軽減できるか否かを検証するために、マウス６匹にこれらの物質を前投与し、１８時間後にペントバルビタールを麻酔し、体温３７℃で腹部正中切開により左腎茎部閉塞を３０分間実施した。
右腎臓は無傷のままとした。腎虚血時間後、血管クランプを外し、腎臓チアノーゼの消失により完全な再灌流を確認した。次にマウスを縫合し、麻酔から覚醒させた。マウス６匹には同一の外科プロトコールを実施したが、Ｎ−Ｍｇｂ−ＳｎＰＰの前投与を行わず、対照として使用した。２週間後に腹部切開部を再び開き、腎臓を切除した。６匹の正常マウスからの左腎臓の重量に比較して（腎臓湿潤重量により測定した）左腎臓質量の低下により２群間の相対的な腎損傷度を評価した。腎損傷の追加マーカーとして腎皮質好中球ゼラチナーゼ結合性リポカリン（ＮＧＡＬ）ｍＲＮＡ及びタンパク質レベルも評価した。
Ｎ−Ｍｇｂ−ＳｎＰＰのＩＰ注射後の用量反応関係。（静脈内［ＩＶ］ボーラス注射に比較して）Ｎ−Ｍｇｂ−ＳｎＰＰの送達速度を遅くしても細胞保護タンパク質のアップレギュレーションと腎臓細胞抵抗性が誘導されるか否かを評価するために、Ｎ−Ｍｇｂ０ｍｇ、１ｍｇ、２．５ｍｇ又は５ｍｇ＋標準用量（１ｍｍｏｌ）のＳｎＰＰをマウスに注射した（各々３匹ずつ；溶媒は生理食塩水１ｍＬ）。１８時間後にマウスにペントバルビタールを麻酔し、血液試料を採取し、ＨＯ−１とハプトグロビンのｍＲＮＡ及びタンパク質レベルの測定用に腎臓を切除した。血漿中ＨＯ−１及びハプトグロビン濃度が上昇して腎臓ＨＯ−１及びハプトグロビンアップレギュレーションの程度を反映したか否かを試験するために、血漿中ＨＯ−１及びハプトグロビン濃度も測定した。
先に測定した血漿中及び腎臓中のＨＯ−１及びハプトグロビン濃度が細胞抵抗性の程度と相関したか否かを評価するために、他のマウスにＮ−Ｍｇｂ０ｍｇ、２．５ｍｇ又は５ｍｇ＋ＳｎＰＰ１ｍｍｏｌを注射した（ｎ＝各群３匹）。１８時間後に、全マウスを上記のように処置し、グリセロールＡＫＩモデルとした。グリセロール注射の１８時間後にＢＵＮ及び血漿中クレアチニン解析によりＡＫＩの重症度を判定した。
肝虚血実験。５葉の肝葉のうちの３葉への血流を（門脈三つ組で）２５分間閉塞することにより、マウス１４匹を従来報告されている部分肝虚血モデルとした。Ｚａｇｅｒ ｅｔ ａｌ．Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｎａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２０１４；３０７：Ｆ８５６−６８。マウスの半数には１８時間前に上記のようにＮ−Ｍｇｂ１ｍｇ＋ＳｎＰＰ１ｍｍｏｌを前投与した。処置した肝葉３葉における正常な肝臓色の回復により虚血時間後の再灌流を評価した。１８時間後にマウスに再麻酔し、再開腹し、虚血後肝損傷のマーカーとして血漿中アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）及び乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）濃度の測定用に終末血液試料を採取した。
肝毒性損傷。Ｎ−Ｍｇｂ−ＳｎＰＰが毒性型の肝損傷に対して保護できるか否かを評価するために、麻酔したマウス１２匹に５０％グリセロールを注射した。門脈循環を介する肝細胞取り込みを助長するようにグリセロール（８ｍｇ／ｋｇ）をＩＰ注射により投与した。マウスの半数には１８時間前に上記のようにＮ−Ｍｇｂ−ＳｎＰＰ（Ｍｇｂ１ｍｇ／ＳｎＰＰ１ｍｍｏｌ）を前投与しておいた。ＩＰグリセロール注射から４時間後にマウスがまだ麻酔下にあるときに腹部大静脈の横切開により屠殺した。血漿中ＡＬＴ濃度により急性肝損傷の程度を測定した。
計算及び統計。全数値は平均±平均の標準偏差として示す。統計比較は対応のないスチューデントのｔ検定により行った。複数の比較を行った場合には、ボンフェローニの補正を適用した。グリセロールＡＫＩモデルにおける腎組織損傷の重症度は１１から４１まで（最低重症度から尿細管壊死と円柱形成が認められる最高重症度まで）の等級に分類した。組織検査結果をウィルコクソンの順位和検定により比較した。Ｐ値＜０．０５であれば統計的に有意であるとみなした。
結果。ＩＶ Ｎ−Ｍｇｂ＋ＳｎＰＰ注射後の腎機能及び組織検査。Ｎ−Ｍｇｂ１ｍｇ＋ＳｎＰＰのＩＶ注射から１８時間後にＢＵＮ上昇も血漿中クレアチニン上昇も認められなかった（対照ｖｓ．Ｍｇｂ／ＳｎＰＰ投与群が夫々ＢＵＮ，２２±３ｖｓ２５±３ｍｇ／ｄＬ；クレアチニン，０．３２±０．０３ｖｓ０．３０±０．０４ｍｇ／ｄＬ）。更に、ＰＡＳ又はＨ＆Ｅ染色によると、形態学的な腎損傷の徴候もなかった。特に、投与群には尿細管壊死又はヘム円柱形成の徴候が全く認められなかった（図８参照）。ＰＡＳ染色によると、近位尿細管刷子縁は全く無傷であった（上段２図）。これに関連して、刷子縁のブレブ形成と近位尿細管腔内への突出は尿細管損傷の非常に高感度の光学顕微鏡マーカーであるとみなされる。Ｖｅｎｋａｔａｃｈａｌａｍ ｅｔ ａｌ．Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ １９７８；１４：３１−４９；Ｄｏｎｏｈｏｅ ｅｔ ａｌ．Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ １９７８；１３：２０８−２２。従って、これらのデータから、腎臓はＩＶ Ｎ−Ｍｇｂ−ＳｎＰＰ投与に十分に耐えられることが分かった。
ＨＯ−１、ＩＬ−１０及びハプトグロビン発現に及ぼす単独及び併用下のＩＶ Ｎ−Ｍｇｂ及びＳｎＰＰの影響。腎臓ＨＯ−１評価。図９左に示すように、Ｎ−Ｍｇｂ単独とＳｎＰＰ単独では４時間ＨＯ−１ｍＲＮＡレベルの若干の増加しか生じなかった。一方、Ｎ−Ｍｇｂ＋ＳｎＰＰ併用の注射から４時間後ではＨＯ−１ｍＲＮＡの２０倍の増加が認められた。投与後１８時間までに、これらのｍＲＮＡ増加は対照値の７倍という顕著なＨＯ−１タンパク質増加をもたらした。他方、Ｎ−Ｍｇｂ単独又はＳｎＰＰ単独では１８時間の時点で比較的小幅のＨＯ−１タンパク質増加しか認められなかった。つまり、これらの４時間ｍＲＮＡと１８時間ＨＯ−１タンパク質の増加はＮ−Ｍｇｂ＋ＳｎＰＰが腎皮質ＨＯ−１遺伝子発現に相乗的な効果をもつことを示している。（その他のＨＯ−１ｍＲＮＡ［１８時間］及びタンパク質データ［４時間］を表８に示す。）
Figure 2017535522
腎臓ＩＬ−１０評価。図１０左に示すように、Ｎ−Ｍｇｂ単独とＳｎＰＰ単独では４時間の時点でＩＬ−１０ｍＲＮＡレベルに殆ど又は全く影響がなかった。一方、Ｎ−Ｍｇｂ＋ＳｎＰＰ併用では注射から４時間後にＩＬ−１０ｍＲＮＡが１０倍に増加した。Ｎ−Ｍｇｂ単独又はＳｎＰＰ単独の注射から１８時間後にＩＬ−１０タンパク質は増加せず、これらの結果に一致した。逆に、Ｎ−Ｍｇｂ−ＳｎＰＰ併用の注射から１８時間後にはＩＬ−１０タンパク質の＞２倍の増加が認められた。（その他のＩＬ−１０ｍＲＮＡ［１８時間］及びタンパク質データ［４時間］を表８に示す。）
腎皮質ハプトグロビン評価。ＨＯ−１及びＩＬ−１０と同様に、Ｎ−Ｍｇｂ＋ＳｎＰＰを併用すると、薬剤注射から４時間後に最大のハプトグロビンｍＲＮＡ増加が誘導された（図１１）。注射から１８時間後に、Ｎ−Ｍｇｂ−ＳｎＰＰ注射に応答して腎皮質ハプトグロビンタンパク質濃度の大幅（２０倍）な増加が認められた。一方、Ｎ−Ｍｇｂ単独でも１８時間の時点でハプトグロビンタンパク質濃度は同等に増加した。従って、１８時間後のハプトグロビンタンパク質増加の要因は併用療法のＮ−Ｍｇｂ成分であったと思われる。（この大幅な増加から見て、併用療法によりそれ以上の増加は誘導されなかったものと考えられる）。その他のハプトグロビンｍＲＮＡ（１８時間）及びタンパク質データ（４時間）を表８に示す。
グリセロールＡＫＩモデルの重症度に及ぼすＩＶ Ｎ−Ｍｇｂ単独、ＳｎＰＰ単独及びＮ−Ｍｇｂ＋ＳｎＰＰの影響。図１２に示すように、ＳｎＰＰ単独を前投与しても、グリセロール誘発ＡＫＩの重症度には事実上全く影響がなかった。ＢＵＮ／クレアチニン濃度によると、Ｎ−Ｍｇｂ単独では若干の保護が誘導された。一方、Ｎ−Ｍｇｂ＋ＳｎＰＰを併用した場合には、完全な機能的保護が認められた（ＢＵＮ／クレアチニン濃度は正常値に維持された）。これと一致する組織学的保護も認められた（グリセロールｖｓ．Ｎ−Ｍｇｂ＋ＳｎＰＰ投与群の組織検査スコア３．５±０．２５ｖｓ１．２５±０．２５；Ｐ＜０．０５）。これに関連して、未投与グリセロール群は従来報告されているように広範な尿細管壊死と円柱形成形成を示した。Ｚａｇｅｒ ｅｔ ａｌ．Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｎａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２０１４；３０７：Ｆ８５６−６８。これらの変化はＮ−Ｍｇｂ＋ＳｎＰＰ前投与群では事実上なかった。
マレイン酸塩ＡＫＩモデル。図１３に示すように、マレイン酸塩を注射すると、ＢＵＮ／クレアチニンが顕著に上昇することから明らかなように重度腎損傷を生じた。Ｎ−Ｍｇｂ＋ＳｎＰＰを前投与すると、ＢＵＮ／クレアチニン濃度がほぼ正常になることから明らかなように、この損傷に対するほぼ完全な保護が付与された。
図１４はマレイン酸塩により誘発させた心毒性がＮ−Ｍｇｂ＋ＳｎＰＰの前投与により低減されることを示す。マウスにＮ−ミオグロビン１ｍｇ／ｋｇ＋ＳｎＰＰ１μｍｏｌ又は溶媒をＩＶ注射により投与した。１８時間後に、マレイン酸塩８００ｍｇ／ｋｇをＩＰ投与した。マレイン酸塩注射から１８時間後に血漿中トロポニンＩ濃度を（ＥＬＩＳＡにより）測定することにより心筋損傷の程度を測定した。マレイン酸塩注射により血漿中トロポニン濃度は１０倍に上昇した。Ｎ−Ｍｇｂ＋ＳｎＰＰを前投与すると、マレイン酸塩により誘発させたトロポニン上昇は７５％低減された。
虚血後ＡＫＩモデル。虚血後２週間までに、対照片側虚血マウスでは虚血後左腎臓質量の３８％の減少が認められた（図１５）。一方、Ｎ−Ｍｇｂ＋ＳｎＰＰを予防投与しておいたマウスでは１２％の減少しか認められなかった（Ｐ＜０．００５）。この腎損傷の抑制はＮ−Ｍｇｂ−ＳｎＰＰ前投与群におけるＮＧＡＬｍＲＮＡ及びタンパク質レベルの顕著な低下によっても確認された（図１５）。
腎皮質及び血漿中ＨＯ−１／ハプトグロビン濃度とグリセロール誘発ＡＫＩに対する保護の程度の用量反応関係。図１６に示すように、用量を漸増させながらＮ−Ｍｇｂを正常マウスにＩＰ投与すると、腎皮質及び血漿中のＨＯ−１及びハプトグロビン濃度が漸増した。血漿中と腎皮質中のＨＯ−１及びハプトグロビン濃度には有意な相関が認められた（例えば腎皮質と血漿中のハプトグロビン濃度ではｒ＝０．８２）。更に、これらのＮ−Ｍｇｂ用量増加はグリセロールＡＫＩモデルに対する漸進的（５０％；１００％）な保護と相関した（図１７）。従って、これらのデータによると、血漿中ＨＯ−１又はハプトグロビン増加の程度はＮ−Ｍｇｂ−ＳｎＰＰによる腎臓遺伝子誘導と後発するＡＲＦに対する抵抗の程度のバイオマーカーとして利用できるのではないかと思われる。Ｎ−Ｍｇｂ５ｍｇ（＋標準用量のＳｎＰＰ）を投与した場合にも、腎損傷の徴候は認められなかった（正常ＢＵＮ，クレアチニン；図１７右参照）。
肝臓評価。Ｎ−Ｍｇｂ／ＳｎＰＰ注射に応答した肝臓における肝臓ＨＯ−１、ＩＬ−１０及びハプトグロビン発現。ＨＯ−１、ＩＬ−１０及びハプトグロビンのｍＲＮＡ（４時間）及びタンパク質レベル（１８時間）を対照値と比較した増加倍率を図１８上段に示す。各々顕著な増加が認められた。各被験物質を単独使用又は併用した場合の個々の値を表９に示す。
Figure 2017535522
Ｎ−Ｍｇｂ＋ＳｎＰＰを併用注射した場合には、注射から４時間後に肝臓ＨＯ−１、ＩＬ−１０及びハプトグロビンｍＲＮＡレベルはどちらかを単独で投与した場合よりも有意に高かった（表９）。この結果、１８時間の時点で評価した肝臓ＨＯ−１、ＩＬ−１０及びハプトグロビンタンパク質増加が大きくなった（各タンパク質のＰ＜０．００１ｖｓ対照組織）。
肝虚血モデル。肝虚血は血漿中ＡＬＴ及びＬＤＨ濃度の顕著な上昇を誘発した（図１９参照）。ＬＤＨ及びＡＬＴ上昇はＮ−Ｍｇｂ＋ＳｎＰＰ前投与により夫々７５％及び５０％抑制された（肝臓ＨＯ−１、ハプトグロビン及びＩＬ−１０タンパク質増加に対応；表９）。図２０（上）に示すように、虚血後肝臓の肉眼的断面に広範囲の壊死が認められた。Ｎ−Ｍｇｂ＋ＳｎＰＰを前投与すると、著しく正常に近い肉眼的肝臓外観となった（図２０（下））。
肝毒性損傷。図１９の右図に示すように、Ｎ−Ｍｇｂ＋ＳｎＰＰを投与すると、血漿中ＡＬＴ濃度により評価した場合にＩＰグリセロール誘発肝損傷の程度も抑制された。
心臓ＨＯ−１、ＩＬ−１０及びハプトグロビンｍＲＮＡ及びタンパク質レベル。図１８の下段に示すように、Ｎ−Ｍｇｂ＋ＳｎＰＰを併用すると、４時間でＨＯ−１、ハプトグロビン及びＩＬ−１０ｍＲＮＡの３〜４倍の増加が誘導され、１８時間の時点でそれらのタンパク質濃度の３〜１５倍までの増加が誘導された。個々の数値を表１０に示す。
Figure 2017535522
一般に、単剤に比較して併用投与のほうが著しく大きなｍＲＮＡ及びタンパク質増加が認められた。
考察。１９９２年にＮａｔｈら（Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ９０：２６７−７０）はラットにヘモグロビンを投与すると、後発する（２４時間後）グリセロール介在性横紋筋融解症誘発ＡＲＦに対して顕著な保護を誘導できることを実証した。（１）ヘムを前投与すると、腎臓ＨＯ−１ｍＲＮＡ及びタンパク質レベルとＨＯ−１酵素活性が著しく増加し、（２）グリセロール注射の時点（以降）に強力なＨＯ−１阻害剤であるＳｎＰＰを投与することによりグリセロールモデルは著しく悪化したという２つの重要な所見に基づき、この保護応答はヘムを介するＨＯ−１アップレギュレーションに起因するとみなされた。これらの独創的な所見が発表されて以来、強力な抗酸化・抗炎症分子としてのＨＯ−１の役割は複数のＡＫＩモデルで確立している（例えばシスプラチン、腎虚血、内毒素血症；Ｎａｔｈ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｎｅｐｈｒｏｌ Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ ２０１４；２３：１７−２４に記載）。更に、その保護効果は種々の型の腎外組織損傷で広く記載されている（例えば脳、肝臓、心臓、臓器移植）。Ｋｕｓｍｉｃ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ２０１４；１２：８９；Ｃｚｉｂｉｋ ｅｔ ａｌ．Ｂａｓｉｃ Ｒｅｓ Ｃａｒｄｉｏｌ ２０１４；１０９：４５０；Ｓｈａｒｐ ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｎｓｌ Ｓｔｒｏｋｅ Ｒｅｓ ２０１３；６：６８５−９２；Ｌｅ ｅｔ ａｌ．ＣＮＳ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｔｈｅｒ ２０１３；１２：９６３−８；Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ ２０１３；２１：２９３７−４８；Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ ２０１４；４２：ｅ７６２−７１；Ｗｓｚｏｌａ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｇ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ２０１４；１：１９−２６。しかし、保護が生じる厳密なメカニズムはＨＯの保護作用の存在ほど明白ではない。ポルフィリン環のＨＯ−１開裂により毒性が高く触媒性のあるＦｅ（直接的な有害作用を発揮する；Ｚａｇｅｒ ＆ Ｂｕｒｋｈａｒｔ，Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ １９９７；５１：７２８−３８）が放出されるので、ＨＯ−１活性増加の二次的な影響があると現在では考えられている。これらの影響としては、抗酸化物質であるビリベルジンとビリルビンの生成、細胞保護性の一酸化炭素の生成、及び触媒性のＦｅとの結合能の高いフェリチンの組織中濃度の増加（Ｈ）が挙げられる。Ｚａｒｊｏｕ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ２０１３；１２３：４４２３−３４；Ｎａｔｈ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｎｅｐｈｒｏｌ Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ ２０１４；２３：１７−２４。ＨＯ−１誘導剤（例えばヘム）は多数の他の細胞保護経路（例えばハプトグロビン（Ｚａｇｅｒ ｅｔ ａｌ．Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２０１２；３０３：Ｆ１３９−４８）、ヘモペキシン（Ｚａｇｅｒ ｅｔ ａｌ．Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２０１２；３０３：Ｆ１４６０−７２）、α１アンチトリプシン（Ｚａｇｅｒ ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ２０１４；９：ｅ９８３８）及び（本開示に示すような）ＩＬ−１０）もアップレギュレートするという事実から、細胞保護へのＨＯ−１の関与を解明するのは更に複雑になる。従って、アップレギュレートされる組織保護性タンパク質が多数存在するため、組織損傷に及ぼすＨＯ−１の影響を解明するのは難しい。
ＳｎＰＰとＨＯ−１の相互作用も複雑である。第１に、ＨＯ−１の競合的阻害剤としてＳｎＰＰを投与すると、酵素「フィードバック阻害」により又は穏和な酸化促進状態の誘導とそれに均衡するＨＯ−１産生によりＨＯ−１ｍＲＮＡ及びタンパク質レベルを二次的に増加させることができる（例えばＫａｉｚｕ ｅｔ ａｌ．Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ ２００３；６３：１３９３−４０３）。第２に、ＳｎＰＰのＳｎ部分は直接的な酸化促進作用により独立してＨＯ−１をアップレギュレートすることができる。Ｂａｒｒｅｒａ−Ｏｖｉｅｄｏ ｅｔ ａｌ．Ｒｅｎ Ｆａｉｌ ２０１３；３５：１３２−７。第３に、ＳｎＰＰの作用を考慮するならば、二次的なＨＯ−１誘導はＳＮＰＰに誘導されるＨＯ−１阻害により潜在的に相殺され得ると認識することが重要である。一方、ＳｎＰＰは半減期が比較的短いことも注目すべきである（２〜４時間；Ｂｅｒｇｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ １９８８；８：６２５−３１）。従って、ＨＯ−１増加を遅らせるならば（例えばグリセロール投与又はＮ−Ｍｇｂ−ＳｎＰＰ投与の１８時間後）、先にＳｎＰＰが排出されるのでその生物学的作用を自由に発揮できるはずである。この発想はアップレギュレートされたＨＯ−１がＳｎＰＰ投与から２４時間後に細胞保護効果を発揮できたという報告により裏付けられる（例えば虚血性ＡＲＦに対する保護；Ｊｕｎｃｏｓ ｅｔ ａｌ．Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ ２００６；１６９：２１−３１；Ｋａｉｚｕ ｅｔ ａｌ．Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ ２００３；６３：１３９３−４０３）。
上記考察に鑑み、Ｎ−Ｍｇｂ＋ＳｎＰＰを併用すると、ＨＯ−１及び他の酸化還元感受性細胞保護タンパク質（例えばハプトグロビンやＩＬ−１０）の相加的又は相乗的増加を誘導できるのではないかという仮説を立てた。Ｎ−Ｍｇｂ、ＳｎＰＰ又はＮ−Ｍｇｂ＋ＳｎＰＰ注射から４時間後と１８時間後にＨＯ−１、ハプトグロビン及びＩＬ−１０のｍＲＮＡ及びタンパク質レベルを測定することによりこの仮説を試験した。図７〜９に示すように、併用療法は一般に相乗的又は相加的な応答を誘導した。例えば注射から４時間後にＨＯ−１ｍＲＮＡの２０倍の増加が認められ、Ｎ−Ｍｇｂ又はＳｎＰＰ単独で認められた増加の倍加を上回った。１８時間後に、この初期のｍＲＮＡ増加は７倍のＨＯ−１タンパク質増加として現れた。ＩＬ−１０でも定量的に同様の結果が認められた。特に注目すべき点はＮ−Ｍｇｂ−ＳｎＰＰ投与から１８時間後のハプトグロビンタンパク質の大幅（２０倍）な増加であった。しかし、この場合には、Ｎ−Ｍｇｂ単独とＮ−Ｍｇｂ＋ＳｎＰＰを比較すると同等の腎臓ハプトグロビン増加が誘導されたため、Ｎ−Ｍｇｂ−ＳｎＰＰ相互作用よりもＮ−Ｍｇｂが主要因であると思われた。明らかに、ＨＯ−１、ＩＬ−１０及びハプトグロビン以外の他の酸化還元感受性細胞保護タンパク質もＮ−Ｍｇｂ−ＳｎＰＰプロトコールにより誘導されているようである（例えばα１アンチトリプシン、ヘモペキシン、ヘプシジン）。従って、複数の細胞保護タンパク質が呼応して細胞損傷応答を軽減させると考えるのは理に適っていると思われる。
Ｎ−Ｍｇｂ−ＳｎＰＰ投与後に細胞保護タンパク質の劇的な腎皮質増加が認められたことから、３種類のＡＫＩに対する保護におけるこの投与の有効性を試験した。図１２はグリセロールモデルにおける結果を示す。図から明らかなように、ＳｎＰＰを投与単独した場合にＢＵＮ又はクレアチニン濃度の有意低下は誘導されなかった。Ｎ−Ｍｇｂを単独投与すると、若干の保護効果が認められた。一方、併用した場合には、グリセロール注射から１８時間後に正常なＢＵＮ及び血漿中クレアチニン濃度が得られることから明らかなように、Ｎ−Ｍｇｂ＋ＳｎＰＰの前投与によりほぼ完全な機能的保護が誘起された。更に、ほぼ正常な腎臓組織像が認められた。従って、これらの結果は細胞保護タンパク質の相乗的な増加がＡＲＦに対する相乗的な保護となり得るという原理を裏付けるものである。
Ｎ−Ｍｇｂ−ＳｎＰＰを介する保護の範囲を更に検討するために、近位尿細管ＡＴＰ低下介在性ＡＲＦのマレイン酸塩モデルを使用した。この場合も、劇的又はほぼ完全な保護が認められた（図１３）。ＡＫＩが進行性慢性腎疾患の発症の発端となり得ることは現在周知であるため、通常では２週間で腎臓質量の４０％減少を生じる既報の片側虚血後腎障害モデル（Ｚａｇｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ ２０１３；８４：７０３−１２；Ｚａｇｅｒ ｅｔ ａｌ．Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｎａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２０１４；３０７：Ｆ８５６−６８）でＮ−Ｍｇｂ−ＳｎＰＰの前投与がこのプロセスを阻止できるか否かを評価した。図１５に示すように、腎臓質量減少が３８％から１２％に抑えられ、ＮＧＡＬｍＲＮＡ及びタンパク質レベルが著しく低下したことから明らかなように、Ｎ−Ｍｇｂ−ＳｎＰＰの前投与により虚血後損傷は著しく軽減された。従って、３種類の異なるＡＫＩモデルの各々で劇的な保護が認められた。腎臓は（例えば迅速濾過、Ｍｇｂエンドサイトーシスにより）これらの２種類の被験物質への暴露が最大になるが、それらのＩＶ注射後にほぼ全細胞が一時的に暴露される。更に、プロトポルフィリンは種々の細胞と結合して取り込まれる。Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ １９８４；２２８：３２７−３３。従って、本願に開示するＮ−Ｍｇｂ−ＳｎＰＰレジメンが腎外臓器でも保護応答をアップレギュレートできるか否かが問題であった。実際に、肝臓及び心臓組織は（表９及び１０に示したように）Ｎ−Ｍｇｂ−ＳｎＰＰ注射から４時間後と１８時間後のいずれでもＨＯ−１、ＩＬ−１０及びハプトグロビンｍＲＮＡ及びタンパク質増加を示したので、これは事実であった。メガリン−キュビリンを介するエンドサイトーシスは腎臓特異的経路であると考えられているので、Ｎ−Ｍｇｂ単独で腎外組織に応答を誘導できることは予想外であった。このことから、恐らくスカベンジャー受容体を介して腎外取り込みが可能である（Ｃａｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｒｅｖ ２０１３；１３：６２１−３４）か、又は微細循環に存在しているときにＮ−ＭｇｂとＳｎＰＰは細胞内細胞保護遺伝子を活性化できると思われる。腎外保護が生じるか否かを試験するために、虚血後肝損傷の程度に及ぼすＮ−Ｍｇｂ＋ＳｎＰＰ前投与の影響を評価した。図１８に示すように、ＬＤＨ及びＡＬＴの両方の血漿中濃度の顕著な低下が認められた。更に、虚血後肝臓組織の肉眼的外観により明白な保護が明らかになった（図１９）。損傷に対する肝抵抗性を更に試験するために、門脈循環を通って肝臓に達すると若干の肝損傷を生じるグリセロールのＩＰ注射をマウスに行った。ＩＰグリセロール注射から４時間以内に、血漿中ＡＬＴの上昇が生じたが、事前のＮ−Ｍｇｂ−ＳｎＰＰ注射によりほぼ阻止された。
ハプトグロビン又はＨＯ−１の血漿中濃度がＡＲＦの状況で腎皮質ハプトグロビン及びＨＯ−１増加のバイオマーカーとして利用できることは従来立証されている。Ｚ Ｚａｇｅｒ ｅｔ ａｌ．Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２０１２；３０３：Ｆ１３９−４８；Ｚａｇｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ ２０１２；２３：１０４８−２０５７。そこで、血漿中ハプトグロビン及びＨＯ−１がＮ−Ｍｇｂ−ＳｎＰＰ投与後の腎臓におけるこれらのタンパク質の誘導と細胞抵抗状態の出現のバイオマーカーにもなるか否かが問題であった。実際に、これは事実であった。図１６に示すように、Ｎ−Ｍｇｂ−ＳｎＰＰの用量を増すにつれて血漿中ハプトグロビン及びＨＯ−１濃度の用量依存的増加が生じ、これらの増加は腎皮質ハプトグロビン及びＨＯ−１含有量と直接相関した。更に、Ｎ−Ｍｇｂ−ＳｎＰＰにより誘導される血漿中ＨＯ−１及び血漿中ハプトグロビンの増加とグリセロール投与後のＢＵＮ濃度の間には顕著な逆関係が認められた（血漿中ＨＯ−１及びハプトグロビン濃度に対するＢＵＮのｒは夫々−０．７９及び−０．７１）。従って、血漿中ＨＯ−１／ハプトグロビン増加は臨床試験においてＮ−Ｍｇｂ−ＳｎＰＰの生物学的活性を確証するものであると思われ、ＨＯ−１及びハプトグロビンの血漿中上昇度は後発するＡＫＩに対する抵抗性の程度の予測因子でもあると思われる。
予防ストラテジーを患者に適用することによる明白な懸念は潜在的な腎及び／又は腎外毒性である。しかし、この点では、ＳｎＰＰがヒトで十分に耐えられると既に示されていることに注目すべきである（例えばＢｅｒｇｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ １９８８；８：６２５−３１；Ｋａｐｐａｓ ｅｔ ａｌ．Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ １９８８；８１：４８５−９７；Ｒｅｄｄｙ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｐｅｒｉｎａｔｏｌ ２００３；２３：５０７−１２）。更に、亜硝酸塩を加えるとミオグロビンの細胞毒性作用が７５％も顕著に低減することが細胞培養系で従来報告されている（未公開データ，２０１４）。Ｎ−Ｍｇｂ＋ＳｎＰＰの安全性の潜在的なインビボ限界（追加図面参照）を評価するために、腎毒性が観測される前にマウスに投与できる最大量のＮ−Ｍｇｂを調べた。腎毒性を誘発せずに（ＳｎＰＰ用量は一定にして）２５倍までのＮ−Ｍｇｂ用量を（２時間かけて）投与することができた（１８時間後にＢＵＮ及びクレアチニンが正常）。最後に、標準Ｎ−Ｍｇｂ−ＳｎＰＰ投与量（Ｎ−Ｍｇｂ１ｍｇ／ＳｎＰＰ１ｍｍｏｌ）でもＩＰ Ｎ−Ｍｇｂ５ｍｇ（図１７）でも明白な腎損傷は誘発されず（１８時間ＢＵＮ／クレアチニン又は組織検査）、肝臓ＡＬＴ又は心臓トロポニン濃度も上昇しなかった。同時に、これらのデータは臨床応用での有用性を示すものである。
結論。Ｎ−Ｍｇｂをその分解阻害剤（ＳｎＰＰ）と併用投与すると、腎臓で多数の細胞保護タンパク質が激増する。この応答の有効性は、記録された腎臓ＨＯ−１タンパク質増加がＮｒｆ−２を介する周知のＨＯ−１誘導剤であるバルドキソロンメチルで達せられている増加の１５倍であるという結果により明らかである。Ｗｕ ｅｔ ａｌ．Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２０１１；３００：Ｆ１１８０−９２。その投与から１８時間以内に、Ｎ−Ｍｇｂ＋ＳｎＰＰは３種類の異なるＡＫＩモデル、即ちグリセロール誘発横紋筋融解症、マレイン酸塩誘発近位尿細管ＡＴＰ低下及び虚血後ＡＫＩからＣＫＤへの進行に対して劇的な保護を誘起した。驚くべきことに、Ｎ−Ｍｇｂ＋ＳｎＰＰを投与すると、肝臓で細胞保護タンパク質の相乗的な増加も誘導され、肝虚血再灌流障害と肝毒性に対する劇的な保護を生じた。最後に、Ｎ−Ｍｇｂ＋ＳｎＰＰは心臓で細胞保護タンパク質をアップレギュレートすることができ、心臓保護作用もあると思われ、従って、広範囲な細胞保護効果があると思われる。注目すべき点として、これらの応答は各々識別し得る腎、肝又は心毒性を生じずに誘導された。従って、これらのデータから、Ｎ−Ｍｇｂ＋ＳｎＰＰ併用投与は心肺バイパス手術、大動脈瘤修復又は他の複雑でハイリスクな外科手術中に発生し得るような腎及び腎外の両方の損傷に対して保護するための臨床予防ストラテジーを提供できると思われる。従って、このストラテジーは多数のまだ対処されていない重大な臨床上の課題を潜在的に解決できると思われる。
[実施例５] 血漿中ヘムオキシゲナーゼ１（ＨＯ−１；イヌ用ＥＬＩＳＡ）、ＢＵＮ、血漿中クレアチニン及び乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）濃度の測定用として、雌雄１匹ずつ２匹の雑種犬からベースライン採血を行った。ＨＯ−１アッセイ用にベースラインスポット尿試料も採取した。次に亜硝酸化イヌミオグロビン５ｍｇ／ｋｇ＋ＳｎＰＰ３．７５ｍｇ／ｋｇを添加した生理食塩水／４０ｍＭ ＮａＨＣＯ３を５０ｍｌ／５０分でイヌ１に輸液した。イヌ２にはイヌＮ−ミオグロビン２．５ｍｇ／ｋｇ＋ＳｎＰＰ７．５ｍｇ／ｋｇを投与した。４時間後と２６時間後に、繰返し血液試料を採取した。輸液から２６時間後に第２の尿試料も採取した。表１１に示すように、この輸液により、（投与前とＢＵＮ及び血漿中クレアチニン濃度を基準として）腎損傷なしに血漿中及び尿中ＨＯ−１濃度の大幅な増加が誘起された。ＬＤＨ値は変わらないままであり、明白な腎／腎外組織損傷はないと思われた。
Figure 2017535522
[実施例６] 腎臓におけるヘムオキシゲナーゼ１誘導に及ぼすＦｅスクロースとシアノコバラミン（ビタミンＢ１２）の影響。ヘムオキシゲナーゼ−１（ＨＯ−１）アップレギュレーションは腎臓及び腎外臓器におけるＮ−ミオグロビン／ＳｎＰＰの細胞保護活性の非常に重要なメディエーターである。そこで、ＨＯ−１アップレギュレーションを誘発することができ、従って、毒性と虚血型の損傷に対する組織保護の出現に寄与することができる他の薬剤を探索した。ＦｅはＮ−Ｍｇｂの活性の非常に重要なメディエーターであるため、ＨＯ−１濃度に及ぼすＦｅ−糖ポリマー（Ｆｅスクロース；分子量３４〜６１ｋＤａ）の影響を評価した。
代替及び／又は補完的ストラテジーとして、腎臓におけるＨＯ−１誘導に及ぼすシアノコバラミン（ビタミンＢ１２）の影響を検討した。Ｂ１２試験の根拠はコバルトとシアン化物がいずれも独立してＨＯ−１を誘導できるからである。即ち、シアン化物とコバルトはいずれもＢ１２分子の主要部分であるので、Ｂ１２はその両方を単剤として投与するための安全な方法であると思われる。
方法。雄性ＣＤ−１マウス（２５〜４０グラム）（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）を全実験で使用した。標準飼育条件下で収容し、飼料と水を自由に摂取できるようにした。全実験はＮＩＨガイドラインに従い、フレッド・ハッチンソン癌研究センター（Ｆｒｅｄ Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ）のＩＡＣＵＣにより承認された。
ＡＫＩ重症度に及ぼすＦｅスクロース（ＦｅＳ）／錫プロトポルフィリン（ＳｎＰＰ）の影響。ＡＫＩのマレイン酸塩モデル。齧歯類に注射すると、マレイン酸塩は有機アニオントランスポーターを介して比較的選択的に近位尿細管細胞に取り込まれる。細胞内蓄積が生じると、マレイン酸塩はスクシニルＣｏＡ：３−オキソ酸ＣｏＡトランスフェラーゼの好ましい基質となる。この結果、マレイン酸補酵素Ａが形成される。その後、マレイン酸塩ＣｏＡが安定なチオエーテルに変換される結果、重度の補酵素Ａ（ＣｏＡ）低下に至る。脂肪酸が「活性化」後にクレブス回路を介して代謝され、ＡＴＰを生成するには十分な濃度のＣｏＡが不可欠である。この過程を経ないと、近位尿細管ＡＴＰ低下と細胞損傷を生じる。また、マレイン酸塩はグルタチオン（ＧＳＨ）のスルフヒドリル基と結合し、ＧＳＨ低下と潜在的な酸化尿細管ストレスに至る。
以下の実験ではＦｅＳ、ＳｎＰＰ又はＦｅＳ＋ＳｎＰＰ併用によりこの型の急性腎障害（ＡＫＩ）を軽減できるか否かを試験した。マウス２７匹に１）溶媒（リン酸緩衝生理食塩水，ＰＢＳ；ｎ＝１０）；２）ＦｅＳ１ｍｇ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｒｅｇｅｎｔ，Ｓｈｉｒｌｅｙ，ＮＹ；ｎ＝３）；３）ＳｎＰＰ１μｍｏｌ（Ｆｒｏｎｔｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ；ｎ＝７）又はＦｅＳ＋ＳｎＰＰ（ｎ＝７）のうちの１種２００μＬを尾静脈注射した。１８時間後に、全マウスにマレイン酸Ｎａ（８００ｍｇ／ｋｇ；ＰＢＳ５００μｌ中）をＩＰ注射した。１８時間後に、マウスにペントバルビタール（５０ｍｇ／ｋｇ ＩＰ）を深麻酔し、開腹し、腹部大静脈から血液試料を採取した。血中尿素窒素（ＢＵＮ）と血漿中クレアチニン（ＰＣｒ）濃度を測定することにより腎損傷の重症度を評価した。
ＡＫの腎虚血再灌流障害（ＩＲＩ）モデル。以下の実験ではＦｅＳ＋ＳｎＰＰ併用によりＡＫＩの腎動脈閉塞モデルを軽減できるか否かを評価した。マウスに上記のようにＰＢＳ（ｎ＝９）又はＦｅＳ＋ＳｎＰＰ（ｎ＝８）２００μｌを尾静脈注射した。１８時間後に、マウスにペントバルビタール（４０〜５０ｍｇ／ｋｇ ＩＰ）を深麻酔し、開腹し、腎茎部を確認し、両腎茎部を微小血管クランプで閉塞した。体温は常に３６〜３７℃に維持した。２２分間の両側腎虚血後にクランプを外し、正常な腎臓の色が再び現われること（組織チアノーゼの消失）により均一な再灌流を目視確認した後、腹腔をシルク縫合糸で２層縫合した。１８時間後に、マウスに再び麻酔し、再び開腹し、大静脈から終末血液試料を採取した。ＢＵＮとＰＣｒ濃度により腎損傷の重症度を判定した。
ＡＫＩの重症度に及ぼすＦｅＳ／Ｂ１２の影響。ＡＫＩのグリセロールモデル。マウスにＰＢＳ溶媒（ｎ＝６）又はＦｅＳ＋１μｍｏｌ Ｂ１２の併用（ｎ＝６；Ｂ１２はＡｌｆａ Ａｅｓａｒ，Ｗａｒｄ Ｈｉｌｌ，ＭＡから入手）を尾静脈注射した。１８時間後に、マウスにイソフルランを浅麻酔した後、横紋筋融解症ＡＫＩのグリセロールモデルを誘発させた（５０％グリセロール９ｍｌ／ｋｇを二等分し、後足上部にＩＭ注射により投与した）。グリセロール注射から１８時間後に、マウスにペントバルビタールを深麻酔し、終末大静脈血試料を採取した。終末ＢＵＮ及びＰＣｒ濃度により腎損傷重症度を判定した。
ＡＫＩのマレイン酸塩モデル。マウスにＦｅＳ＋Ｂ１２の併用又は溶媒（ｎ＝６／群）を尾静脈注射した。１８時間後に、上記のようにマレイン酸塩をＩＰ注射した。マレイン酸塩注射から１８時間後に終末ＢＵＮ及びＰＣｒ評価によりＡＫＩの重症度を判定した。
ヘムオキシゲナーゼ１（ＨＯ−１）の腎皮質誘導に及ぼすＦｅＳ、ＳｎＰＰ及びＢ１２の影響。以下の実験では、細胞保護タンパク質ＨＯ−１の可能な誘導に及ぼすＦｅＳ、ＳｎＰＰ及びＢ１２の影響を評価した。この目的のために、マウスにこれらの被験物質を各々上記のように注射した。４時間後又は１８時間後にマウスに麻酔し、腹部正中切開により腎臓を摘出した。腎皮質を氷冷下に剥離し、タンパク質及びｍＲＮＡを抽出した。次に試料をＥＬＩＳＡによりＨＯ−１タンパク質について定量し、ＧＡＰＤＨレベルに対する比としてＨＯ−１ｍＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲにより定量した。正常マウス５匹から対照値を得た。
結果。ＡＫＩの重症度に及ぼすＦｅＳ／ＳｎＰＰの影響。マレイン酸塩誘発ＡＫＩ：図２２に示すように、マレイン酸塩を注射した対照（Ｃ）でＢＵＮ及びＰＣｒ増加が顕著であることから明らかなように、マレイン酸塩を注射すると重度のＡＫＩを生じた。ＳｎＰＰ単独でもＦｅＳ単独でも腎損傷の重症度は有意に変化しなかった。一方、ＦｅＳ＋ＳｎＰＰを併用すると、ＢＵＮ／ＰＣｒ濃度が７５％低下することから明らかなように、顕著な保護が付与された（横線は正常マウスにおけるＢＵＮ／ＰＣｒ濃度の平均値を表す）。
腎虚血再灌流（ＩＲＩ）誘発ＡＫＩ：ＩＲＩ誘発から１８時間以内に、ＢＵＮ及びＰＣｒ濃度は４倍に上昇した（図２３）。ＦｅＳ＋ＳＮＰＰを前投与すると、有意な保護が付与され、ＢＵＮ及びＰＣｒ濃度は５０％低下した。横線は正常マウスにおける平均ＢＵＮ／ＰＣｒ濃度を表す。
ＡＫＩ重症度に及ぼすＦｅＳ／Ｂ１２の影響。マレイン酸塩誘発ＡＫＩ：この場合も、マレイン酸塩を注射して重度ＡＫＩを誘発させた（図２４）。ＦｅＳ＋Ｂ１２を前投与すると、ＢＵＮ／ＰＣｒの低下から明らかなように、この損傷は著しく軽減された。横線は正常マウスにおける平均ＢＵＮ／ＰＣｒ濃度を表す。
ＡＫＩのグリセロールモデル：グリセロール注射から１８時間以内に重度腎不全が生じた（図２５）。１８時間ＢＵＮ及びＰＣｒ濃度の両者の顕著な低下から明らかなように、ＦｅＳ＋Ｂ１２を前投与すると、実質的な機能的保護が付与された。横線は正常マウスの平均ＢＵＮ／ＰＣｒ濃度を表す。
腎皮質ＨＯ−１ｍＲＮＡ及びタンパク質レベル。図２６に示すように、被験物質は各々注射から４時間後に評価した場合にＨＯ−１ｍＲＮＡの顕著且つ有意な増加が誘導された。１８時間までに、ＨＯ−１ｍＲＮＡレベルは正常値に戻った。図２７に示すように、４時間ｍＲＮＡ増加はＨＯ−１タンパク質濃度の有意な増加と相関した。これらの濃度は特にＦｅＳ投与の場合には、１８時間の時点で高いままであった。
予言的実施例。予言的実施例１。デポ製剤が静脈内（ＩＶ）ミオグロビン／ＳｎＰＰ及び／又はＦｅ−Ｓ及び／又はＢ１２投与と比較して潜在的毒性が低く且つ同等以上の細胞保護を付与するか否かを評価する。種々の用量のミオグロビンとＳｎＰＰ及び／又はＦｅ−Ｓ及び／又はＢ１２を懸濁液として１００ｍｇ／ｍｌのＰＥＧ（ＰＥＧ５０００）に加える。この実験を実施するには２つの根拠がある。第１に、筋肉内（ＩＭ）又は皮下（ＳＱ）注射することにより、ミオグロビンとＳｎＰＰ及び／又はＦｅ−Ｓ及び／又はＢ１２は（ＩＶ注射後の瞬時の全身ミオグロビン／ＳｎＰＰ及び／又はＦｅ−Ｓ及び／又Ｂ１２暴露に比較して）比較的ゆっくりと吸収される。デポＰＥＧ注射によりミオグロビン及び／又はＦｅ−Ｓ及び／又はＢ１２吸収を遅くすることにより、ミオグロビン及び／又はＦｅ−Ｓ及び／又はＢ１２への腎臓暴露が遅くなり、より持続的になる。この結果、ミオグロビン及び／又はＦｅ−Ｓ及び／又はＢ１２取り込みが促進されると同時に、迅速なミオグロビン及び／又はＦｅ−Ｓ及び／又はＢ１２の腎臓負荷（その結果、尿細管腔内に閉塞性の円柱形成を生じる）によって生じ得るような腎毒性の可能性が低下する。第２に、ＰＥＧは浸透剤であり、腎排泄される。尿浸透圧の急性上昇はそれだけで細胞保護タンパク質を誘導できると共に、尿流率増加を生じることにより保護を付与できるので、相加的又は相乗的な有益な効果を観測できる。
予言的実施例２。ヘマチンはＨＯを阻害し、ＳｎＰＰと同様に、（酵素フィードバック阻害により）ＨＯ生成の増加を誘導することができる。従って、ヘマチンはＳｎＰＰ投与の有益な効果を再現するはずである。重要な点として、ヘマチンは臨床疾患であるポルフィリン症の治療用としてＦＤＡにより承認されている。従って、ヘマチンがＳｎＰＰと同等に有効であるならば、後続試験及び臨床開発にヘマチンを選択することができる。
予言的実施例３。ＨＯが実験的敗血症及び内毒素血症に対して保護作用があることは十分に立証されている。本願に開示する組成物、キット及び方法に従ってＨＯ−１をアップレギュレートした後、１８時間後にマウスにエンドトキシンチャレンジを行う。２時間後と２４時間後に敗血症の重症度を血漿中と腎臓中の炎症性サイトカイン（ＴＮＦ、ＭＣＰ−１）濃度により判定する。また、内毒素血症も腎損傷の原因となるので、ＢＵＮ及びクレアチニン濃度により腎機能障害の重症度を試験する。エンドトキシンを注射したナイーブマウスと結果を比較する。これに成功するならば、敗血症の危険の高い患者（例えばＩＣＵ患者）への本願開示の保護ストラテジーの実用性は大幅に拡大するであろう。
予言的実施例４。継続中の試験により、鉄及び／又はビタミンＢ１２は種々の臓器系を傷害から保護するのに有効であることが実証されよう。
「遠隔プレコンディショニング」は他の臓器をプレコンディショニングするために（例えば血圧カフを膨らませることにより）足に虚血を生じる方法であり、非常に限られた成功しか得られていないが、本願に開示する組成物、キット及び方法はこれとは区別される。特定の実施形態では、本願に開示する組成物、キット及び方法を「遠隔薬理学的プレコンディショニング」（ＲＰＲ）と呼ぶことができる。
当分野に通常の知識をもつ者に自明の通り、本願に開示する各実施形態は明記しているその特定の要素、工程、成分又は構成要素を含むことができ、あるいは本質的にこれらから構成することができ、あるいはこれらから構成することができる。従って、「包含する」なる用語は「含む、〜から構成される、又は本質的に〜から構成される」と同義であると解釈すべきである。前半部と後半部を繋ぐ用語である「含む」とは、包含するが、限定されないという意味であり、明記していない要素、工程、成分又は構成要素を包含することも許容している。前半部と後半部を繋ぐ用語である「〜から構成される」とは明記していない要素、工程、成分又は構成要素を除外する。前半部と後半部を繋ぐ用語である「本質的に〜から構成される」とは実施形態の範囲を、明記している要素、工程、成分又は構成要素と、この実施形態に重大な影響を与えない要素、工程、成分又は構成要素に制限するものである。重大な影響とは開示する組成物、キット又は方法が予定された傷害から臓器を保護する能力を統計的に有意に低下させるようなものである。
特に指定しない限り、本明細書と特許請求の範囲で使用する成分の量、分子量等の性質、反応条件等を表す全数値はいずれの場合も「約」なる用語が付いていると理解すべきである。従って、特に指定しない限り、本明細書と特許請求の範囲に記載する数値パラメータは概数であり、本発明により獲得しようとする所望の性質に応じて変動することができる。特許請求の範囲への均等論の適用を制限しようとするものではないが、最低限でも、各数値パラメータは少なくとも報告する有効数字に鑑み、通常の丸め方を適用することにより解釈すべきである。更に明瞭にする必要がある場合には、「約」なる用語は明記する数値又は範囲と共に使用するときに当業者が妥当に割り当てる意味であり、即ち記載値の±２０％、記載値の±１９％、記載値の±１８％、記載値の±１７％、記載値の±１６％、記載値の±１５％、記載値の±１４％、記載値の±１３％、記載値の±１２％、記載値の±１１％、記載値の±１０％、記載値の±９％、記載値の±８％、記載値の±７％、記載値の±６％、記載値の±５％、記載値の±４％、記載値の±３％、記載値の±２％、又は記載値の±１％の範囲内までで明記する数値又は範囲よりも多少大きいか又は多少小さい数値又は範囲を意味する。
本発明の広い範囲を示す数値範囲及びパラメータは概数であるが、具体例に記載する数値は可能な限り正確に報告する。但し、如何なる数値もその夫々の試験測定値に存在する標準偏差により必然的に生じる所定の誤差を内在的に含む。
本発明を説明する文脈（特に以下の特許請求の範囲の文脈）で使用する不定冠詞、定冠詞及び同類の指示語は本願で特に指定する場合又は文脈からそうでないことが明白な場合を除き、単数と複数の両方に対応すると解釈すべきである。本願で数値範囲を記載する場合には、その範囲内に該当する個々の数値を個別に表す省略法として利用する目的に過ぎない。本願で特に指定しない限り、個々の数値を本願に個別に記載しているものとして本明細書に組み入れる。本願で特に指定する場合又は文脈からそうでないことが明白な場合を除き、本願に記載する全方法はあらゆる適切な順序で実施することができる。本願に記載するありとあらゆる例又は例示的文言（例えば「等の」）の使用は本発明をより明瞭にする目的に過ぎず、それ以外の内容で請求されている本発明の範囲に制限を加えるものではない。本明細書中の如何なる文言も本発明の実施に不可欠な請求外の要素を表すと解釈すべきではない。
本願に開示する発明の択一的要素又は実施形態のグループを制限として解釈すべきではない。各グループメンバーを個々に又はそのグループの他のメンバーもしくは本願に記載する他の要素とのあらゆる組合せにおいて言及及び請求することができる。便宜及び／又は特許性の理由からあるグループの１以上のメンバーをあるグループに組み入れることもできるし、削除することもできる。このような組み入れ又は削除が行われる場合には、明細書は変更後のグループを含むものとみなされ、従って、添付の特許請求の範囲で使用される全マーカッシュグループの文言を満足する。
本発明を実施するために本発明者らが知る限り最良の実施形態を含めて、本願には本発明の所定の実施形態を記載する。当然のことながら、記載するこれらの実施形態の変形も上記記載を通読後に当分野に通常の知識をもつ者に容易に理解されよう。本発明者は当業者がこのような変形を適宜利用するものと予想し、また、本発明者らは本願に具体的に記載する以外の方法で本発明が実施されることも想定している。従って、準拠法により許可される範囲において本発明は添付の特許請求の範囲に記載する主題の全変形及び等価物を包含する。更に、本願で特に指定する場合又は文脈からそうでないことが明白な場合を除き、可能な全てのその変形における上記要素のあらゆる組合せを本発明に包含する。
更に、本明細書の随所で特許、印刷刊行物、雑誌論文及び他の文書に何度も言及している（本願の参考資料）。これらの参考資料は各々その参考とする教示についてその開示内容全体を個々に本願に援用する。
本願に示す詳細事項は例示であり、本発明の好ましい実施形態を具体的に説明する目的に過ぎず、本発明の種々の実施形態の原理と概念的側面の最も有用で理解し易い説明であると考えられるものを提供するために提示する。この点については、本発明の基本的な理解に必要である以上に詳細に本発明の構造細部を示そうとするものではなく、本発明の複数の形態を実際にどのように具体化できるかは説明を図面及び／又は実施例と勘案することにより当業者に容易に理解されよう。
後続する実施例で明瞭・明白に変更されている場合又はその意味を適用すると構文の意味が通らなくなるかもしくは本質的に意味が通らなくなる場合を除き、本開示で使用する定義と説明は後続するあらゆる構文に適用されるものとする。用語の構文により意味が通らなくなる場合又は本質的に意味が通らなくなる場合には、Ｗｅｂｓｔｅｒ’ｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ，３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ又はＯｘｆｏｒｄ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｅｄ．Ａｎｔｈｏｎｙ Ｓｍｉｔｈ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，２００４）等の当分野に通常の知識をもつ者に公知の辞書から定義を参照されたい。
終わりに、当然のことながら、本願に開示する発明の実施形態は本発明の原理を例証するものである。利用できる他の変形も本発明の範囲に含まれる。従って、限定するものではないが、例えば本発明の代替構成も本願の教示に従って利用することができる。従って、本発明は厳密に図示及び記載通りの内容に制限されない。

Claims (244)

  1. 臓器を損傷から保護するためのキットであって、前記キットが治療有効量のヘムタンパク質、ビタミンＢ１２、鉄又はその組み合わせを含み、前記治療有効量のヘムタンパク質、ビタミンＢ１２、鉄又はその組み合わせを臓器に投与すると、臓器に損傷を生じずに臓器が保護される、前記キット。
  2. キットが治療有効量のヘムタンパク質を含む、請求項１に記載のキット。
  3. キットが治療有効量のビタミンＢ１２を含む、請求項１に記載のキット。
  4. キットが治療有効量の鉄を含む、請求項１に記載のキット。
  5. キットが治療有効量のビタミンＢ１２と鉄の組み合わせを含む、請求項１に記載のキット。
  6. 更に投与説明書を含む、請求項１に記載のキット。
  7. 投与に起因する臓器損傷がないことを基準レベルとの比較により確認する、請求項１に記載のキット。
  8. 基準レベルがキット内に提供されている、請求項７に記載のキット。
  9. 基準レベルとの比較により保護を判定する、請求項１に記載のキット。
  10. 基準レベルがキット内に提供されている、請求項９に記載のキット。
  11. 臓器を傷害による損傷から保護する、請求項１に記載のキット。
  12. 傷害が予定されている、請求項１１に記載のキット。
  13. 予定された傷害の少なくとも８時間前に投与を行う、請求項１２に記載のキット。
  14. 予定された傷害が外科手術、化学療法又はＸ線造影剤の毒性である、請求項１２に記載のキット。
  15. 外科手術が臓器移植手術である、請求項１４に記載のキット。
  16. 傷害が敗血症である、請求項１１に記載のキット。
  17. 臓器が移植された臓器である、請求項１に記載のキット。
  18. 臓器が心臓、腎臓、肝臓又は肺である、請求項１に記載のキット。
  19. 臓器が心臓であり、基準レベルと比較して心機能の改善又は心臓酵素放出の抑制により保護を判定する、請求項１に記載のキット。
  20. 心臓酵素がトロポニンである、請求項１９に記載のキット。
  21. 臓器が腎臓であり、基準レベルと比較して血中尿素窒素（ＢＵＮ）又は血清クレアチニン上昇の阻止又は抑制により保護を判定する、請求項１に記載のキット。
  22. 臓器が肝臓であり、基準レベルと比較して肝酵素上昇の阻止又は抑制により保護を判定する、請求項１に記載のキット。
  23. 臓器が肺であり、基準レベルと比較して血液ガス悪化の抑制、酸素補給の必要性の低下又は人工呼吸器の必要性の低下により保護を判定する、請求項１に記載のキット。
  24. ヘムタンパク質が組成物に配合されている、請求項２に記載のキット。
  25. ヘムタンパク質がヘムタンパク質変異体、ヘムタンパク質ｄ置換アナログ、ヘムタンパク質修飾体又はその組み合わせである、請求項２に記載のキット。
  26. ヘムタンパク質が修飾ヘムタンパク質である、請求項２に記載のキット。
  27. 修飾ヘムタンパク質が亜硝酸化ヘムタンパク質又はＰＥＧ化ヘムタンパク質である、請求項５に記載のキット。
  28. ヘムタンパク質がミオグロビンである、請求項２に記載のキット。
  29. ヘムタンパク質がミオグロビン変異体又はミオグロビン修飾体である、請求項２に記載のキット。
  30. ミオグロビン修飾体が亜硝酸化ミオグロビン又はＰＥＧ化ミオグロビンである、請求項２９に記載のキット。
  31. 更にヘムタンパク質分解阻害剤を含む、請求項２に記載のキット。
  32. ヘムタンパク質分解阻害剤が組成物に配合されている、請求項３１に記載のキット。
  33. ヘムタンパク質分解阻害剤とヘムタンパク質が同一の組成物に配合されている、請求項３１に記載のキット。
  34. ヘムタンパク質分解阻害剤が亜硝酸化ヘムタンパク質分解阻害剤である、請求項３１に記載のキット。
  35. ヘムタンパク質分解阻害剤がヘムオキシゲナーゼ阻害剤である、請求項３１に記載のキット。
  36. ヘムオキシゲナーゼ阻害剤がプロトポルフィリン、ヘミン又はヘマチンである、請求項３５に記載のキット。
  37. ヘムオキシゲナーゼ阻害剤が金属プロトポルフィリンである、請求項３５に記載のキット。
  38. 金属プロトポルフィリンがＳｎ−プロトポルフィリンである、請求項３７に記載のキット。
  39. ヘムタンパク質がビタミンＢ１２を添加されている；
    ヘムタンパク質が鉄を添加されている；又は
    ヘムタンパク質がビタミンＢ１２と鉄を添加されている、請求項２に記載のキット。
  40. 臓器に獲得細胞抵抗性を生じるためのキットであって、前記キットが治療有効量のヘムタンパク質、ビタミンＢ１２、鉄又はその組み合わせを含み、前記治療有効量のヘムタンパク質、ビタミンＢ１２、鉄又はその組み合わせを臓器に投与すると、臓器の損傷を生じずに臓器に獲得細胞抵抗性が生じる、前記キット。
  41. キットが治療有効量のヘムタンパク質を含む、請求項４０に記載のキット。
  42. キットが治療有効量のビタミンＢ１２を含む、請求項４０に記載のキット。
  43. キットが治療有効量の鉄を含む、請求項４０に記載のキット。
  44. キットが治療有効量のビタミンＢ１２と鉄の組み合わせを含む、請求項４０に記載のキット。
  45. 更に投与説明書を含む、請求項４０に記載のキット。
  46. 投与に起因する臓器損傷がないことを基準レベルとの比較により確認する、請求項４０に記載のキット。
  47. 基準レベルがキット内に提供されている、請求項４６に記載のキット。
  48. 獲得細胞抵抗性により臓器を損傷から保護する、請求項４０に記載のキット。
  49. 基準レベルとの比較により保護を判定する、請求項４８に記載のキット。
  50. 基準レベルがキット内に提供されている、請求項４９に記載のキット。
  51. 臓器を傷害による損傷から保護する、請求項４０に記載のキット。
  52. 傷害が予定されている、請求項５１に記載のキット。
  53. 予定された傷害の少なくとも８時間前に投与を行う、請求項５２に記載のキット。
  54. 予定された傷害が外科手術、化学療法又はＸ線造影剤の毒性である、請求項５２に記載のキット。
  55. 外科手術が臓器移植手術である、請求項５４に記載のキット。
  56. 傷害が敗血症である、請求項５１に記載のキット。
  57. 臓器が移植された臓器である、請求項４０に記載のキット。
  58. 臓器が心臓、腎臓、肝臓又は肺である、請求項４０に記載のキット。
  59. 臓器が心臓であり、基準レベルと比較して心機能の改善又は心臓酵素放出の抑制により保護を判定する、請求項５８に記載のキット。
  60. 心臓酵素がトロポニンである、請求項５９に記載のキット。
  61. 臓器が腎臓であり、基準レベルと比較してＢＵＮ又は血清クレアチニン上昇の阻止又は抑制により保護を判定する、請求項５８に記載のキット。
  62. 臓器が肝臓であり、基準レベルと比較して肝酵素上昇の阻止又は抑制により保護を判定する、請求項５８に記載のキット。
  63. 臓器が肺であり、基準レベルと比較して血液ガス悪化の抑制、酸素補給の必要性の低下又は人工呼吸器の必要性の低下により保護を判定する、請求項５８に記載のキット。
  64. ヘムタンパク質が組成物に配合されている、請求項４１に記載のキット。
  65. ヘムタンパク質がヘムタンパク質変異体、ヘムタンパク質ｄ置換アナログ、ヘムタンパク質修飾体又はその組み合わせである、請求項４１に記載のキット。
  66. ヘムタンパク質が修飾ヘムタンパク質である、請求項４１に記載のキット。
  67. 修飾ヘムタンパク質が亜硝酸化ヘムタンパク質又はＰＥＧ化ヘムタンパク質である、請求項６６に記載のキット。
  68. ヘムタンパク質がミオグロビンである、請求項４１に記載のキット。
  69. ヘムタンパク質がミオグロビン変異体又はミオグロビン修飾体である、請求項４１に記載のキット。
  70. ミオグロビン修飾体が亜硝酸化ミオグロビン又はＰＥＧ化ミオグロビンである、請求項６９に記載のキット。
  71. 更にヘムタンパク質分解阻害剤を含む、請求項４１に記載のキット。
  72. ヘムタンパク質分解阻害剤が組成物に配合されている、請求項７１に記載のキット。
  73. ヘムタンパク質分解阻害剤とヘムタンパク質が同一の組成物に配合されている、請求項７１に記載のキット。
  74. ヘムタンパク質分解阻害剤が亜硝酸化ヘムタンパク質分解阻害剤である、請求項７１に記載のキット。
  75. ヘムタンパク質分解阻害剤がヘムオキシゲナーゼ阻害剤である、請求項７１に記載のキット。
  76. ヘムオキシゲナーゼ阻害剤がプロトポルフィリン、ヘミン又はヘマチンである、請求項７５に記載のキット。
  77. ヘムオキシゲナーゼ阻害剤が金属プロトポルフィリンである、請求項７５に記載のキット。
  78. 金属プロトポルフィリンがＳｎ−プロトポルフィリンである、請求項７７に記載のキット。
  79. ヘムタンパク質がビタミンＢ１２を添加されている；
    ヘムタンパク質が鉄を添加されている；又は
    ヘムタンパク質がビタミンＢ１２と鉄を添加されている、請求項４１に記載のキット。
  80. 臓器における保護性ストレスタンパク質の発現をアップレギュレートするためのキットであって、前記キットが治療有効量のヘムタンパク質、ビタミンＢ１２、鉄又はその組み合わせを含み、前記治療有効量のヘムタンパク質、ビタミンＢ１２、鉄又はその組み合わせを臓器に投与すると、臓器の損傷を生じずに臓器における保護性ストレスタンパク質の発現がアップレギュレートされる、前記キット。
  81. キットが治療有効量のヘムタンパク質を含む、請求項８０に記載のキット。
  82. キットが治療有効量のビタミンＢ１２を含む、請求項８０に記載のキット。
  83. キットが治療有効量の鉄を含む、請求項８０に記載のキット。
  84. キットが治療有効量のビタミンＢ１２と鉄を含む、請求項８０に記載のキット。
  85. 更に投与説明書を含む、請求項８０に記載のキット。
  86. 投与に起因する臓器損傷がないことを基準レベルとの比較により確認する、請求項８０に記載のキット。
  87. 基準レベルがキット内に提供されている、請求項８６に記載のキット。
  88. 保護性ストレスタンパク質のアップレギュレーションにより臓器を損傷から保護する、請求項８０に記載のキット。
  89. 基準レベルとの比較により保護を判定する、請求項８８に記載のキット。
  90. 基準レベルがキット内に提供されている、請求項８９に記載のキット。
  91. 臓器を傷害による損傷から保護する、請求項８０に記載のキット。
  92. 傷害が予定されている、請求項９１に記載のキット。
  93. 予定された傷害の少なくとも８時間前に投与を行う、請求項９２に記載のキット。
  94. 予定された傷害が外科手術、化学療法又はＸ線造影剤の毒性である、請求項９２に記載のキット。
  95. 外科手術が臓器移植手術である、請求項９４に記載のキット。
  96. 傷害が敗血症である、請求項９５に記載のキット。
  97. 臓器が移植された臓器である、請求項８０に記載のキット。
  98. 臓器が心臓、腎臓、肝臓又は肺である、請求項８０に記載のキット。
  99. 臓器が心臓であり、基準レベルと比較して心機能の改善又は心臓酵素放出の抑制により保護を判定する、請求項９８に記載のキット。
  100. 心臓酵素がトロポニンである、請求項９９に記載のキット。
  101. 臓器が腎臓であり、基準レベルと比較してＢＵＮ又は血清クレアチニン上昇の阻止又は抑制により保護を判定する、請求項９８に記載のキット。
  102. 臓器が肝臓であり、基準レベルと比較して肝酵素上昇の阻止又は抑制により保護を判定する、請求項９８に記載のキット。
  103. 臓器が肺であり、基準レベルと比較して血液ガス悪化の抑制、酸素補給の必要性の低下又は人工呼吸器の必要性の低下により保護を判定する、請求項９８に記載のキット。
  104. ヘムタンパク質が組成物に配合されている、請求項８１に記載のキット。
  105. ヘムタンパク質がヘムタンパク質変異体、ヘムタンパク質ｄ置換アナログ、ヘムタンパク質修飾体又はその組み合わせである、請求項８１に記載のキット。
  106. ヘムタンパク質が修飾ヘムタンパク質である、請求項８１に記載のキット。
  107. 修飾ヘムタンパク質が亜硝酸化ヘムタンパク質又はＰＥＧ化ヘムタンパク質である、請求項１０６に記載のキット。
  108. ヘムタンパク質がミオグロビンである、請求項８１に記載のキット。
  109. ヘムタンパク質がミオグロビン変異体又はミオグロビン修飾体である、請求項８１に記載のキット。
  110. ミオグロビン修飾体が亜硝酸化ミオグロビン又はＰＥＧ化ミオグロビンである、請求項１０９に記載のキット。
  111. 保護性ストレスタンパク質がヘムオキシゲナーゼ、ハプトグロビン、ヘモペキシン、ヘプシジン、α１アンチトリプシン、インターロイキン１０、熱ショックタンパク質、好中球ゼラチナーゼ結合性リポカリン及びＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素から選択される、請求項８１に記載のキット。
  112. 更にヘムタンパク質分解阻害剤を含む、請求項８１に記載のキット。
  113. ヘムタンパク質分解阻害剤が組成物に配合されている、請求項１１２に記載のキット。
  114. ヘムタンパク質分解阻害剤とヘムタンパク質が同一の組成物に配合されている、請求項１１２に記載のキット。
  115. ヘムタンパク質分解阻害剤が亜硝酸化ヘムタンパク質分解阻害剤である、請求項１１２に記載のキット。
  116. ヘムタンパク質分解阻害剤がヘムオキシゲナーゼ阻害剤である、請求項１１２に記載のキット。
  117. ヘムオキシゲナーゼ阻害剤がプロトポルフィリン、ヘミン又はヘマチンである、請求項１１６に記載のキット。
  118. ヘムオキシゲナーゼ阻害剤が金属プロトポルフィリンである、請求項１１６に記載のキット。
  119. 金属プロトポルフィリンがＳｎ−プロトポルフィリンである、請求項１１８に記載のキット。
  120. ヘムタンパク質がビタミンＢ１２を添加されている；
    ヘムタンパク質が鉄を添加されている；又は
    ヘムタンパク質がビタミンＢ１２と鉄を添加されている、請求項８１に記載のキット。
  121. 治療有効量のミオグロビン、ミオグロビン変異体、ミオグロビンｄ置換アナログ、ミオグロビン修飾体、ビタミンＢ１２、鉄又はその組み合わせを含有する組成物。
  122. ミオグロビンがミオグロビン修飾体である、請求項１２１に記載の組成物。
  123. ミオグロビン修飾体が亜硝酸化ミオグロビン又はＰＥＧ化ミオグロビンである、請求項１２２に記載の組成物。
  124. ミオグロビンがミオグロビン変異体である、請求項１２１に記載の組成物。
  125. ミオグロビンを含有しており、更にヘムタンパク質分解阻害剤を含有する、請求項１２１に記載の組成物。
  126. ヘムタンパク質分解阻害剤が亜硝酸化ヘムタンパク質分解阻害剤である、請求項１２５に記載の組成物。
  127. ヘムタンパク質分解阻害剤がヘムオキシゲナーゼ阻害剤である、請求項１２５に記載の組成物。
  128. ヘムオキシゲナーゼ阻害剤がプロトポルフィリン、ヘミン又はヘマチンである請求項１２７に記載の組成物。
  129. ヘムオキシゲナーゼ阻害剤が金属プロトポルフィリンである、請求項１２７に記載の組成物。
  130. 金属プロトポルフィリンがＳｎ−プロトポルフィリンである、請求項１２９に記載の組成物。
  131. 治療有効量のヘムタンパク質とヘムタンパク質分解阻害剤を含有する組成物。
  132. ヘムタンパク質が修飾ヘムタンパク質である、請求項１３１に記載の組成物。
  133. 修飾ヘムタンパク質が亜硝酸化ヘムタンパク質又はＰＥＧ化ヘムタンパク質である、請求項１３２に記載の組成物。
  134. ヘムタンパク質がミオグロビンである、請求項１３１に記載の組成物。
  135. ヘムタンパク質がミオグロビン変異体又はミオグロビン修飾体である、請求項１３１に記載の組成物。
  136. ミオグロビン修飾体が亜硝酸化ミオグロビン又はＰＥＧ化ミオグロビンである、請求項１３５に記載の組成物。
  137. ヘムタンパク質分解阻害剤がヘムオキシゲナーゼ阻害剤である、請求項１３１に記載の組成物。
  138. ヘムオキシゲナーゼ阻害剤がプロトポルフィリン、ヘミン又はヘマチンである、請求項１３７に記載の組成物。
  139. ヘムオキシゲナーゼ阻害剤が金属プロトポルフィリンである、請求項１３７に記載の組成物。
  140. 金属プロトポルフィリンがＳｎ−プロトポルフィリンである、請求項１３９に記載の組成物。
  141. ヘムタンパク質分解阻害剤が亜硝酸化ヘムタンパク質分解阻害剤である、請求項１３１に記載の組成物。
  142. 臓器を損傷から保護する方法であって、前記臓器に損傷が生じる前にヘムタンパク質、ビタミンＢ１２、鉄又はその組み合わせを含有する組成物の治療有効量を臓器に投与することを含み、投与により、臓器に損傷を生じずに臓器を損傷から保護する、前記方法。
  143. 組成物がヘムタンパク質を含有する、請求項１４２に記載の方法。
  144. 組成物がビタミンＢ１２を含有する、請求項１４２に記載の方法。
  145. 組成物が鉄を含有する、請求項１４２に記載の方法。
  146. 組成物が鉄とビタミンＢ１２の組み合わせを含有する、請求項１４２に記載の方法。
  147. 投与に起因する臓器損傷がないことを基準レベルとの比較により確認する、請求項１４２に記載の方法。
  148. 基準レベルとの比較により保護を判定する、請求項１４２に記載の方法。
  149. 損傷が傷害による損傷である、請求項１４２に記載の方法。
  150. 傷害が予定されている、請求項１４９に記載の方法。
  151. 予定された傷害の少なくとも８時間前に投与を行う、請求項１５０に記載の方法。
  152. 予定された傷害が外科手術、化学療法又はＸ線造影剤の毒性である、請求項１５０に記載の方法。
  153. 外科手術が臓器移植手術である、請求項１５２に記載の方法。
  154. 傷害が敗血症である、請求項１４９に記載の方法。
  155. 臓器が移植された臓器である、請求項１４２に記載の方法。
  156. 臓器が心臓、腎臓、肝臓又は肺である、請求項１４２に記載の方法。
  157. 臓器が心臓であり、基準レベルと比較して心機能の改善又は心臓酵素放出の抑制により保護を判定する、請求項１４２に記載の方法。
  158. 心臓酵素がトロポニンである、請求項１５７に記載の方法。
  159. 臓器が腎臓であり、基準レベルと比較してＢＵＮ又は血清クレアチニン上昇の阻止又は抑制により保護を判定する、請求項１４２に記載の方法。
  160. 臓器が肝臓であり、基準レベルと比較して肝酵素上昇の阻止又は抑制により保護を判定する、請求項１４２に記載の方法。
  161. 臓器が肺であり、基準レベルと比較して血液ガス悪化の抑制、酸素補給の必要性の低下又は人工呼吸器の必要性の低下により保護を判定する、請求項１４２に記載の方法。
  162. 組成物が修飾ヘムタンパク質を含有する、請求項１４３に記載の方法。
  163. 修飾ヘムタンパク質が亜硝酸化ヘムタンパク質又はＰＥＧ化ヘムタンパク質である、請求項１６２に記載の方法。
  164. ヘムタンパク質がミオグロビンである、請求項１４３に記載の方法。
  165. ヘムタンパク質がミオグロビン変異体又はミオグロビン修飾体である、請求項１４３に記載の方法。
  166. ミオグロビン修飾体が亜硝酸化ミオグロビン又はＰＥＧ化ミオグロビンである、請求項１６５に記載の方法。
  167. 組成物が更にヘムタンパク質分解阻害剤を含有する、請求項１４３に記載の方法。
  168. ヘムタンパク質分解阻害剤が亜硝酸化ヘムタンパク質分解阻害剤である、請求項１６７に記載の方法。
  169. ヘムタンパク質分解阻害剤を含有する第２の組成物を臓器に投与することを更に含む、請求項１４３に記載の方法。
  170. ヘムタンパク質分解阻害剤がヘムオキシゲナーゼ阻害剤である、請求項１６７に記載の方法。
  171. ヘムオキシゲナーゼ阻害剤がプロトポルフィリン、ヘミン又はヘマチンである、請求項１７０に記載の方法。
  172. ヘムオキシゲナーゼ阻害剤が金属プロトポルフィリンである、請求項１７０に記載の方法。
  173. 金属プロトポルフィリンがＳｎ−プロトポルフィリンである、請求項１７２に記載の方法。
  174. ヘムタンパク質がビタミンＢ１２を添加されている；
    ヘムタンパク質が鉄を添加されている；又は
    ヘムタンパク質がビタミンＢ１２と鉄を添加されている、請求項１４３に記載の方法。
  175. 臓器に獲得細胞抵抗性を生じる方法であって、ヘムタンパク質、ビタミンＢ１２、鉄又はその組み合わせを含有する組成物の治療有効量を臓器に投与することを含み、投与により、臓器に損傷を生じずに臓器に獲得細胞抵抗性を生じる、前記方法。
  176. 組成物がヘムタンパク質を含有する、請求項１７５に記載の方法。
  177. 組成物がビタミンＢ１２を含有する、請求項１７５に記載の方法。
  178. 組成物が鉄を含有する、請求項１７５に記載の方法。
  179. 組成物がビタミンＢ１２と鉄を含有する、請求項１７５に記載の方法。
  180. 投与に起因する臓器損傷がないことを基準レベルとの比較により確認する、請求項１７５に記載の方法。
  181. 獲得細胞抵抗性により臓器を損傷から保護する、請求項１７５に記載の方法。
  182. 基準レベルとの比較により保護を判定する、請求項１８１に記載の方法。
  183. 損傷が傷害による損傷である、請求項１７５に記載の方法。
  184. 傷害が予定されている、請求項１８３に記載の方法。
  185. 予定された傷害の少なくとも８時間前に投与を行う、請求項１８４に記載の方法。
  186. 予定された傷害が外科手術、化学療法又はＸ線造影剤の毒性である、請求項１８４に記載の方法。
  187. 外科手術が臓器移植手術である、請求項１８６に記載の方法。
  188. 傷害が敗血症である、請求項１８３に記載の方法。
  189. 臓器が移植された臓器である、請求項１７５に記載の方法。
  190. 臓器が心臓、腎臓、肝臓又は肺である、請求項１７５に記載の方法。
  191. 臓器が心臓であり、基準レベルと比較して心機能の改善又は心臓酵素放出の抑制により保護を判定する、請求項１９０に記載の方法。
  192. 心臓酵素がトロポニンである、請求項１９１に記載の方法。
  193. 臓器が腎臓であり、基準レベルと比較してＢＵＮ又は血清クレアチニン上昇の阻止又は抑制により保護を判定する、請求項１９０に記載の方法。
  194. 臓器が肝臓であり、基準レベルと比較して肝酵素上昇の阻止又は抑制により保護を判定する、請求項１９０に記載の方法。
  195. 臓器が肺であり、基準レベルと比較して血液ガス悪化の抑制、酸素補給の必要性の低下又は人工呼吸器の必要性の低下により保護を判定する、請求項１９０に記載の方法。
  196. 組成物が修飾ヘムタンパク質を含有する、請求項１７６に記載の方法。
  197. 修飾ヘムタンパク質が亜硝酸化ヘムタンパク質又はＰＥＧ化ヘムタンパク質である、請求項１９６に記載の方法。
  198. ヘムタンパク質がミオグロビンである、請求項１７６に記載の方法。
  199. ヘムタンパク質がミオグロビン変異体又はミオグロビン修飾体である、請求項１７６に記載の方法。
  200. 修飾ミオグロビンが亜硝酸化ミオグロビン又はＰＥＧ化ミオグロビンである、請求項１９９に記載の方法。
  201. 組成物が更にヘムタンパク質分解阻害剤を含有する、請求項１７６に記載の方法。
  202. ヘムタンパク質分解阻害剤が亜硝酸化ヘムタンパク質分解阻害剤である、請求項２０１に記載の方法。
  203. ヘムタンパク質分解阻害剤を含有する第２の組成物を臓器に投与することを更に含む、請求項１７６に記載の方法。
  204. ヘムタンパク質分解阻害剤がヘムオキシゲナーゼ阻害剤である、請求項２０１に記載の方法。
  205. ヘムオキシゲナーゼ阻害剤がプロトポルフィリン、ヘミン又はヘマチンである、請求項２０１に記載の方法。
  206. ヘムオキシゲナーゼ阻害剤が金属プロトポルフィリンである、請求項２０４に記載の方法。
  207. 金属プロトポルフィリンがＳｎ−プロトポルフィリンである、請求項２０６に記載の方法。
  208. ヘムタンパク質がビタミンＢ１２を添加されている；
    ヘムタンパク質が鉄を添加されている；又は
    ヘムタンパク質がビタミンＢ１２と鉄を添加されている、請求項１７６に記載の方法。
  209. 臓器における保護性ストレスタンパク質の発現をアップレギュレートする方法であって、ヘムタンパク質、ビタミンＢ１２、鉄又はその組み合わせを含有する組成物の治療有効量を臓器に投与することを含み、投与により、臓器に損傷を生じずに、臓器における保護性ストレスタンパク質の発現をアップレギュレートする、前記方法。
  210. 組成物がヘムタンパク質を含有する、請求項２０９に記載の方法。
  211. 組成物がビタミンＢ１２を含有する、請求項２０９に記載の方法。
  212. 組成物が鉄を含有する、請求項２０９に記載の方法。
  213. 組成物がビタミンＢ１２と鉄の組み合わせを含有する、請求項２０９に記載の方法。
  214. 投与に起因する臓器損傷がないことを基準レベルとの比較により確認する、請求項２０９に記載の方法。
  215. 保護性ストレスタンパク質の発現のアップレギュレーションにより臓器を損傷から保護する、請求項２０９に記載の方法。
  216. 基準レベルとの比較により保護を判定する、請求項２１５に記載の方法。
  217. 損傷が傷害による損傷である、請求項２０９に記載の方法。
  218. 傷害が予定されている、請求項２１７に記載の方法。
  219. 予定された傷害の少なくとも８時間前に投与を行う、請求項２１８に記載の方法。
  220. 予定された傷害が外科手術、化学療法又はＸ線造影剤の毒性である、請求項２１８に記載の方法。
  221. 外科手術が臓器移植手術である、請求項２２０に記載の方法。
  222. 傷害が敗血症である、請求項２１７に記載の方法。
  223. 臓器が移植された臓器である、請求項２０９に記載の方法。
  224. 臓器が心臓、腎臓、肝臓又は肺である、請求項２０９に記載の方法。
  225. 臓器が心臓であり、基準レベルと比較して心機能の改善又は心臓酵素放出の抑制により保護を判定する、請求項２２４に記載の方法。
  226. 心臓酵素がトロポニンである、請求項２２５に記載の方法。
  227. 臓器が腎臓であり、基準レベルと比較してＢＵＮ又は血清クレアチニン上昇の阻止又は抑制により保護を判定する、請求項２２４に記載の方法。
  228. 臓器が肝臓であり、基準レベルと比較して肝酵素上昇の阻止又は抑制により保護を判定する、請求項２２４に記載の方法。
  229. 臓器が肺であり、基準レベルと比較して血液ガス悪化の抑制、酸素補給の必要性の低下又は人工呼吸器の必要性の低下により保護を判定する、請求項２２４に記載の方法。
  230. 保護性ストレスタンパク質がヘムオキシゲナーゼ、ハプトグロビン、ヘモペキシン、ヘプシジン、α１アンチトリプシン、インターロイキン１０、熱ショックタンパク質、好中球ゼラチナーゼ結合性リポカリン又はＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素から選択される、請求項２１０に記載の方法。
  231. 組成物が修飾ヘムタンパク質を含有する、請求項２１０に記載の方法。
  232. 修飾ヘムタンパク質が亜硝酸化ヘムタンパク質又はＰＥＧ化ヘムタンパク質である、請求項２３１に記載の方法。
  233. ヘムタンパク質がミオグロビンである、請求項２１０に記載の方法。
  234. ヘムタンパク質がミオグロビン変異体又はミオグロビン修飾体である、請求項１９８に記載の方法。
  235. 修飾ミオグロビンが亜硝酸化ミオグロビン又はＰＥＧ化ミオグロビンである、請求項２３２に記載の方法。
  236. 組成物が更にヘムタンパク質分解阻害剤を含有する、請求項２１０に記載の方法。
  237. ヘムタンパク質分解阻害剤が亜硝酸化ヘムタンパク質分解阻害剤である、請求項２３６に記載の方法。
  238. ヘムタンパク質分解阻害剤を含有する第２の組成物を臓器に投与することを更に含む、請求項２１０に記載の方法。
  239. ヘムタンパク質分解阻害剤がヘムオキシゲナーゼ阻害剤である、請求項２３６に記載の方法。
  240. ヘムオキシゲナーゼ阻害剤がプロトポルフィリン、ヘミン又はヘマチンである、請求項２３９に記載の方法。
  241. ヘムオキシゲナーゼ阻害剤が金属プロトポルフィリンである、請求項２３９に記載の方法。
  242. 金属プロトポルフィリンがＳｎ−プロトポルフィリンである、請求項２４１に記載の方法。
  243. ヘムタンパク質がビタミンＢ１２を添加されている；
    ヘムタンパク質が鉄を添加されている；又は
    ヘムタンパク質がビタミンＢ１２と鉄を添加されている、請求項２１０に記載の方法。
  244. 治療有効量の下式：
    Figure 2017535522
     （式中、Ｒ１は５’−デオキシアデノシル、ＣＨ３、ＯＨ又はＣＮであり；Ｒ２はＯＨ又はＨであり；Ｒ３はＯＨ又はＨである。）の化合物を含有する組成物。
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