RS65333B1 - Postupak enzimske hidrolize lignoceluloznog materijala i fermentacije šećera - Google Patents

Postupak enzimske hidrolize lignoceluloznog materijala i fermentacije šećera

Info

Publication number
RS65333B1
RS65333B1 RS20240359A RSP20240359A RS65333B1 RS 65333 B1 RS65333 B1 RS 65333B1 RS 20240359 A RS20240359 A RS 20240359A RS P20240359 A RSP20240359 A RS P20240359A RS 65333 B1 RS65333 B1 RS 65333B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
fermentation
lignocellulosic material
enzyme
reactor
acid
Prior art date
Application number
RS20240359A
Other languages
English (en)
Inventor
Johannes Augustinus Kroon
Pierre Louis Woestenborghs
Original Assignee
Versalis Spa
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=60043058&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS65333(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Versalis Spa filed Critical Versalis Spa
Publication of RS65333B1 publication Critical patent/RS65333B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/06—Ethanol, i.e. non-beverage
    • C12P7/08—Ethanol, i.e. non-beverage produced as by-product or from waste or cellulosic material substrate
    • C12P7/10—Ethanol, i.e. non-beverage produced as by-product or from waste or cellulosic material substrate substrate containing cellulosic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/14—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a carbohydrase (EC 3.2.x), e.g. by alpha-amylase, e.g. by cellulase, hemicellulase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01004—Cellulase (3.2.1.4), i.e. endo-1,4-beta-glucanase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01021—Beta-glucosidase (3.2.1.21)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01032—Xylan endo-1,3-beta-xylosidase (3.2.1.32), i.e. endo-1-3-beta-xylanase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01091—Cellulose 1,4-beta-cellobiosidase (3.2.1.91)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Landscapes

  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Description

Opis
Oblast pronalaska
[0001] Prijava se odnosi na postupak za dobijanje šećernog proizvoda od lignoceluloznog materijala enzimskom hidrolizom i postupak za pripremu proizvoda fermentacije fermentacijom šećera.
Oblast tehnike
[0002] Lignocelulozni materijal se prvenstveno sastoji od celuloze, hemiceluloze i lignina i pruža atraktivnu platformu za generisanje alternativnih izvora energije za fosilna goriva. Materijal je dostupan u velikim količinama i može se pretvoriti u vredne proizvode npr. šećera ili biogoriva, kao što je bioetanol.
[0003] Proizvodnja fermentacionog proizvoda od lignoceluloznog materijala je poznata u tehnici i generalno uključuje korake prethodnog tretmana, hidrolize, fermentacije i izborno izolacije fermentacionog proizvoda.
[0004] Tokom hidrolize, koja može da sadrži korake likvifikacije, presaharifikacije i/ili saharifikacije, celuloza prisutna u lignoceluloznom materijalu je delimično (obično 30 do 95 %, zavisno od aktivnosti enzima i uslova hidrolize) konvertovana u šećere pomoću celulolitičkih enzima. Hidroliza se obično odvija tokom postupka koji traje od 6 do 168 sati (videti Kumar, S., Chem. Eng. Technol.32 (2009), 517-526) na povišenim temperaturama od 45 do 50°C i nesterilnim uslovima.
[0005] Obično se šećeri zatim pretvaraju u vredne fermentacione proizvode kao što je etanol od strane mikroorganizama poput kvasca. Fermentacija se odvija u posebnom, poželjno anaerobnom, postupku, bilo u istoj ili u drugoj posudi. Temperatura tokom fermentacije se podešava na 30 do 33°C da bi se prilagodio rastu i proizvodnji etanola od strane mikroorganizama, obično kvasaca. Tokom postupka fermentacije, preostali celulozni materijal se pretvara u šećere pomoću enzima koji su već prisutni u koraku hidrolize, dok se stvaraju mikrobna biomasa i etanol. Fermentacija je završena kada se celulozni materijal pretvori u fermentabilne šećere i svi fermentabilni šećeri se pretvore u etanol, ugljen-dioksid i mikrobnu biomasu. Ovo može trajati do 6 dana. Generalno, ukupno vreme postupka hidrolize i fermentacije može iznositi do 13 dana.
[0006] Generalno, troškovi proizvodnje enzima su glavni faktor troškova u celokupnom postupku proizvodnje proizvoda fermentacije od lignoceluloznog materijala (videti Kumar, S., Chem. Eng. Technol.32 (2009), 517-526). Do sada se smanjenje troškova proizvodnje enzima postiže primenom enzimskih proizvoda iz jednog ili iz više mikrobnih izvora (videti WO 2008/008793) sa širom i/ili većom (specifičnom) hidrolitičkom aktivnošću. Ovo dovodi do manjih potreba za enzimima, bržih stopa konverzije i/ili većeg prinosa konverzije i samim tim do nižih ukupnih troškova proizvodnje.
[0007] Pored optimizacije enzima, optimizacija dizajna postupka je ključno sredstvo za smanjenje ukupnih troškova proizvodnje proizvoda od šećera i proizvoda fermentacije. Na primer, gubitak šećera putem proizvoda razgradnje šećera se povećava sa smanjenjem prinosa. Pošto proizvodi razgradnje šećera mogu inhibirati fermentaciju, dizajn postupka treba optimizovati kako bi se smanjila količina ovih proizvoda razgradnje šećera.
[0008] Ahi M. et al., 2013 (Chemical Engineering & Technology, vol. 36(11): 1997-2005) izveštava o hidrolizi bagasa šećerne trske koja je optimizovana za dobijanje odgovarajućih koncentracija redukujućih šećera i inhibitora (furfurala i fenola) prethodnim tretmanom uz pomoć mikrotalasa razblaženom kiselinom i naknadnim enzimskim tretmanom za proizvodnju bioetanola.
[0009] Patentni dokument WO2016145350 A1 (15.09.2016.) otkriva postupak poboljšanja prinosa glukoze ili ksiloze saharifikacije lignoceluloznog materijala, koji sadrži prethodni tretman pomenutog lignoceluloznog materijala parnom eksplozijom u prisustvu razblažene sumporne kiseline na temperaturama od 180-200°C tokom 4-5 minuta, a zatim a) prvu fazu saharifikacije u kontinualnom reaktoru na ~ 20% suve materije, 50°C i pH 4.9-5.0 sa prvom enzimskom kompozicijom koja sadrži ksilanazu, beta-ksilozidazu i endoglukanazu; i b) drugu fazu koja sadrži kombinovanje materijala iz koraka a) sa drugom enzimskom kompozicijom koja sadrži jednu ili više celulaza da bi se formirao hidrolizat.
[0010] Iz ekonomskih razloga, stoga je poželjno uključiti nove i inovativne konfiguracije postupka koje imaju za cilj smanjenje ukupnih troškova proizvodnje u postupku koji uključuje prethodni tretman, hidrolizu i fermentaciju lignoceluloznog materijala.
Kratak opis
[0011] Cilj prijave je da obezbedi poboljšani postupak za pripremu šećernih proizvoda i/ili proizvoda fermentacije od lignoceluloznog materijala. Postupak je poboljšan korišćenjem specifičnih uslova prethodnog tretmana, hidrolize i fermentacije kao što je navedeno u priloženim patentnim zahtevima.
Detaljan opis
[0012] U ovoj specifikaciji i pratećim zahtevima, reči "sadrže" i "uključuju" i varijacije kao što su "sadrži", "koji sadrži", "uključuje" i "uključujući" treba da se tumače inkluzivno. Odnosno, ove reči imaju za cilj da prenesu moguće uključivanje drugih elemenata ili celih brojeva koji nisu posebno navedeni, gde to kontekst dozvoljava. Članovi "a" i "an" se ovde koriste da upućuju na jedan ili više od jednog (tj. na jedan ili najmanje jedan) gramatički objekat člana. Na primer, "element" može značiti jedan element ili više od jednog elementa.
[0013] Ova prijava se odnosi na postupak za pripremu šećernog proizvoda od lignoceluloznog materijala, koji sadrži sledeće korake: (a) prethodni tretman lignoceluloznog materijala na temperaturi od 170°C do 190°C pri pH od 1.9 do 2.2. tokom 2.5 do 6 minuta; (b) enzimskom hidrolizom prethodno obrađenog lignoceluloznog materijala koji ima težinu suve materije od 15 do 25% (tež./tež.) na temperaturi od 50°C do 65°C i pH od 4 do 6 tokom 40 sati do 150 sati koristeći ceo fermentacioni bujon filamentozne gljive, pri čemu pomenuti bujon sadrži najmanje celobiohidrolazu, endoglukanazu, beta-glukozidazu, ksilanazu, beta-ksilozidazu i litičku monosaharid oksigenazu; i (c) izborno, dobijanje šećernog proizvoda. Termin "šećerni proizvod", "jedan ili više šećera" ili "šećer" se ovde koriste naizmenično. Alternativno, termin "hidrolizovani lignocelulozni materijal" se može koristiti umesto ovih termina.
[0014] Ova prijava se takođe odnosi na postupak za pripremu proizvoda fermentacije od lignoceluloznog materijala, koji sadrži korake (a) izvođenja postupka za pripremu proizvoda od šećera od lignoceluloznog materijala kao što je ovde opisano, (b) fermentaciju proizvoda od šećera da se dobije proizvod fermentacije, i (c) izborno, izolaciju proizvoda fermentacije. U jednom primeru izvođenja, ova prijava se odnosi na postupak za pripremu proizvoda fermentacije od lignoceluloznog materijala, koji sadrži sledeće korake: (a) prethodni tretman lignoceluloznog materijala na temperaturi od 170°C do 190°C pri pH od 1.9 do 2.2 tokom 2.5 do 6 minuta; (b) enzimsku hidrolizu prethodno tretiranog lignoceluloznog materijala koji ima težinu suve materije od 15 do 25% (tež./tež.) na temperaturi od 50°C do 65°C i pH od 4 do 6 tokom 40 sati do 150 sati koristeći ceo fermentacioni bujon filamentozne gljive, pri čemu pomenuti bujon sadrži najmanje celobiohidrolazu, endoglukanazu, beta-glukozidazu, ksilanazu, beta-ksilozidazu i litičku monosaharid oksigenazu, da bi se dobio hidrolizovan lignocelulozni materijal; (c) fermentaciju hidrolizovanog lignoceluloznog materijala da bi se dobio proizvod fermentacije; i (d) izborno, izolaciju proizvoda fermentacije.
[0015] U jednom primeru izvođenja, enzimska hidroliza se izvodi u reaktoru. Enzimska hidroliza se takođe može obaviti u dva, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet, deset ili čak više reaktora. Dakle, termin "reaktor" nije ograničen na jedan reaktor, već može značiti više reaktora.
[0016] U postupcima koji su ovde opisani, prethodno tretirani lignocelulozni materijal se dodaje u reaktor u kome se odvija enzimska hidroliza. Ovo može da se uradi na šaržni način, dolivni način ili kontinualno. U jednom primeru izvođenja, enzimska kompozicija se dodaje u reaktor u kome se odvija enzimska hidroliza. Ovo može da se uradi šaržni način, dolivni način ili kontinualno. Kompozicija enzima može biti vodena kompozicija. U nekim aspektima hidrolizovani lignocelulozni materijal i/ili delimično hidrolizovani lignocelulozni materijal se reciklira nazad u reaktor u kome se odvija enzimska hidroliza. Hidrolizovani lignocelulozni materijal i/ili delimično hidrolizovani lignocelulozni materijal može se ohladiti pre dodavanja u reaktor u kome se odvija enzimska hidroliza. Hidrolizovani lignocelulozni materijal i/ili delimično hidrolizovani lignocelulozni materijal mogu biti podvrgnuti razdvajanju čvrsta/tečnost pre dodavanja u reaktor u kome se odvija enzimska hidroliza. Odvajanje čvrstog/tečnog materijala može se obaviti pre koraka hlađenja. U nekim alternativama se hladi samo tečna frakcija dobijena nakon razdvajanja čvrsta/tečnost. U drugim alternativama i tečna i čvrsta frakcija se dodaju u reaktor u kome se odvija enzimska hidroliza.
[0017] U nekim aspektima, ukupno vreme enzimske hidrolize je 10 sati ili više, 12 sati ili više, 14 sati ili više, 16 sati ili više, 18 sati ili više, 20 sati ili više, 30 sati ili više, 40 sati ili više, 50 sati ili više, 60 sati ili više, 70 sati ili više, 80 sati ili više, 90 sati ili više, 100 sati ili više, 110 sati ili više, 120 sati ili više, 130 sati ili više, 140 sati ili više, 150 sati ili više, 160 sati ili više, 170 sati ili više, 180 sati ili više, 190 sati ili više, 200 sati ili više. U jednom primeru izvođenja, vreme enzimske hidrolize je 40 do 150 sati.
[0018] U jednom primeru izvođenja kiseonik se dodaje prethodno obrađenom lignoceluloznom materijalu tokom enzimske hidrolize. Kiseonik se može dodati tokom najmanje dela enzimske hidrolize. Kiseonik se može dodavati kontinuirano ili diskontinuirano tokom enzimske hidrolize. Kiseonik se može dodati jednom ili više puta tokom postupka za pripremu šećernog proizvoda od lignoceluloznog materijala kao što je ovde opisano. U jednom primeru izvođenja kiseonik se može dodati tokom prethodnog tretmana, tokom dodavanja (prethodno tretiranog) lignoceluloznog materijala u reaktor, tokom dodavanja enzima u reaktor, tokom dodavanja hidrolizovanog lignoceluloznog materijala i/ili delimično hidrolizovanog lignoceluloznog materijala u reaktor, tokom hlađenja hidrolizovanog lignoceluloznog materijala i/ili delimično hidrolizovanog lignoceluloznog materijala, tokom razdvajanja čvrstog/tečnog materijala hidrolizovanog lignoceluloznog materijala i/ili delimično hidrolizovanog lignoceluloznog materijala ili bilo koje njihove kombinacije. Kiseonik se može dodati u reaktore koji se koriste u enzimskoj hidrolizi.
[0019] Kiseonik se može dodati u nekoliko oblika. Na primer, kiseonik se može dodati kao gas kiseonika, gas obogaćen kiseonikom, kao što je vazduh obogaćen kiseonikom, ili vazduh. Kiseonik se takođe može dodati pomoću in situ stvaranja kiseonika.
[0020] Primeri za dodavanje kiseonika uključuju, ali nisu ograničeni na, dodavanje kiseonika pomoću prskanja, duvanja, elektrolize, hemijskog dodavanja kiseonika, punjenje reaktora koji se koristi u enzimskoj hidrolizi sa vrha (uranjanje hidrolizata u reaktor i posledično uvođenje kiseonika u hidrolizat) i dodavanje kiseonika u gornji prostor reaktora. Kada se kiseonik doda u gornji deo reaktora, može se obezbediti dovoljno kiseonika neophodnog za reakciju hidrolize. Generalno, količina kiseonika koja se dodaje u reaktor može se kontrolisati i/ili menjati. Ograničenje isporučenog kiseonika je moguće dodavanjem samo kiseonika tokom dela vremena hidrolize u reaktoru. Druga opcija je dodavanje kiseonika u niskoj koncentraciji, na primer upotrebom smeše vazduha i recikliranog vazduha (vazduh koji izlazi iz reaktora) ili „razređivanjem“ vazduha inertnim gasom. Povećanje količine dodatog kiseonika može se postići dodavanjem kiseonika tokom dužih perioda hidrolize, dodavanjem kiseonika u višoj koncentraciji ili dodavanjem više vazduha. Drugi način za kontrolu koncentracije kiseonika je dodavanje potrošača kiseonika i/ili generatora kiseonika. Kiseonik se može uvesti u (prethodno obrađeni) lignocelulozni materijal prisutan u reaktoru. Takođe se može uvesti u prednji prostor reaktora. Kiseonik se može uduvati u (prethodno obrađeni) lignocelulozni materijal prisutan u reaktoru. Takođe se može uduvati u prednji prostor reaktora.
[0021] Kiseonik se može dodati u reaktor koji se koristi u enzimskoj hidrolizi pre i/ili tokom i/ili posle dodavanja prethodno obrađenog lignoceluloznog materijala u reaktor. Kiseonik se može uvesti zajedno sa prethodno tretiranim lignoceluloznim materijalom koji ulazi u reaktor. Kiseonik se može uvesti u tok materijala koji će ući u reaktor ili sa delom sadržaja reaktora koji prolazi kroz spoljnu petlju reaktora. Poželjno, kiseonik se dodaje kada je (prethodno tretiran) lignocelulozni materijal prisutan u reaktoru.
[0022] U jednom primeru izvođenja, enzimska hidroliza se izvodi u reaktoru zapremine 10 -5000 m<3>, poželjno od 50 - 5000 m<3>. U slučaju da se više reaktora koristi u enzimskoj hidrolizi postupka kako je ovde opisan, oni mogu imati istu zapreminu, ali takođe mogu imati različitu zapreminu.
[0023] U jednom primeru izvođenja, reaktor u kome se izvodi enzimska hidroliza ima odnos visine i prečnika od 2:1 do 8:1.
[0024] U jednom primeru izvođenja prethodni tretman se izvodi u reaktoru zapremine 30 - 200 m<3>, poželjno od 100 - 150 m<3>. U slučaju da se više reaktora koristi u prethodnom tretmanu postupka kako je ovde opisan, oni mogu imati istu zapreminu, ali takođe mogu imati različitu zapreminu.
[0025] U jednom primeru izvođenja, reaktor za prethodni tretman koji se koristi u postupcima koji su ovde opisani ima odnos visine i prečnika od 3:1 do 12:1.
[0026] Enzimska kompozicija koja se koristi u koraku likvifikacije i/ili koraku saharifikacije postupka kao što je ovde opisan može biti iz gljive, poželjno filamentozne gljive. U nekim aspektima enzimi u enzimskoj kompoziciji su izvedeni iz gljive, poželjno filamentozne gljive ili enzimi sadrže enzim gljive, poželjno enzim filamentozne gljive. Enzimi koji se koriste u enzimskoj hidrolizi postupaka kao što je ovde opisano su izvedeni iz gljive ili enzimi koji se koriste u enzimskoj hidrolizi postupaka kako su ovde opisani sadrže enzim gljive. "Filamentozne gljive" obuhvataju sve filamentne oblike podrazdela Eumicota i Oomicota (kako su definisali Hawksworth et al., In, Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, 8th edition, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK). Filamentne gljive uključuju, ali nisu ograničene na Acremonium, Agaricus, Aspergillus, Aureobasidium, Beauvaria, Cephalosporium, Ceriporiopsis, Chaetomium paecilomyces, Chrysosporium, Claviceps, Cochiobolus, Coprinus, Cryptococcus, Cyathus, Emericella, Endothia, Endothia mucor, Filibasidium, Fusarium, Geosmithia, Gilocladium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Myrothecium, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Piromyces, Panerochaete, Pleurotus, Podospora, Pyricularia, Rasamsonia, Rhizomucor, Rhizopus, Scylatidium, Schizophyllum, Stagonospora, Talaromyces, Thermoascus, Thermomyces, Thielavia, Tolypocladium, Trametes pleurotus, Trichoderma i Trichophyton. U poželjnom primeru izvođenja gljiva je Rasamsonia, pri čemu je Rasamsonia emersonii najpoželjnija. Dakle, postupci kao što su ovde opisani povoljno se primenjuju u kombinaciji sa enzimima dobijenim iz mikroorganizma iz roda Rasamsonia ili enzimi koji se koriste u postupcima koji su ovde opisani sadrže enzim Rasamsonia.
[0027] Nekoliko sojeva filamentoznih gljiva lako je dostupno javnosti u brojnim zbirkama kultura, kao što su American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS), i Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL).
[0028] Poželjno je da se postupci kako su ovde opisani izvode sa termostabilnim enzimima. "Termostabilni" enzim kako se ovde koristi znači da enzim ima temperaturni maksimum od 50°C ili više, 60°C ili više, 70°C ili više, 75°C ili više, 80°C ili više, ili čak 85° C ili više. Oni na primer mogu biti izolovani od termofilnih mikroorganizama ili mogu biti dizajnirani od strane stručnjaka i veštački sintetisani. U jednom primeru izvođenja, polinukleotidi koji kodiraju termostabilne enzime mogu biti izolovani ili dobijeni iz termofilnih ili termotolerantnih filamentoznih gljiva ili izolovani iz netermofilnih ili netermotolerantnih gljiva, ali je utvrđeno da su termostabilni. Pod "termofilnom gljivom" se podrazumeva gljiva koja raste na temperaturi od 50°C ili više. Pod "temotolerantnom" gljivom se podrazumeva gljiva koja raste na temperaturi od 45°C ili više, sa maksimumom blizu 50°C.
[0029] Odgovarajuće termofilne ili termotolerantne gljivične ćelije mogu biti Humicola, Rhizomucor, Myceliophthora, Rasamsonia, Talaromyces, Thermomyces, Thermoascus ili Thielavia cells, poželjno Rasamsonia cells. Poželjne termofilne ili termotolerantne gljive su Humicola grisea var. thermoidea, Humicola lanuginosa, Myceliophthora thermophila, Papulaspora thermophilia, Rasamsonia byssochlamydoides, Rasamsonia emersonii, Rasamsonia argillacea, Rasamsonia eburnean, Rasamsonia brevistipitata, Rasamsonia cylindrospora, Rhizomucor pusillus, Rhizomucor miehei, Talaromyces bacillisporus, Talaromyces leycettanus, Talaromyces thermophilus, Thermomyces lenuginosus, Thermoascus crustaceus, Thermoascus thermophilus Thermoascus aurantiacus i Thielavia terrestris.
[0030] Rasamsonia je novi rod koji sadrži termotolerantne i termofilne vrste Talaromyces i Geosmithia. Na osnovu fenotipskih, fizioloških i molekularnih podataka, vrsta Talaromyces emersonii, Talaromices byssochlamydoides, Talaromyces eburneus, Geosmithia argillacea i Geosmithia cylindrospora su prebačene u Rasamsonia gen. nov. Talaromyces emersonii, Penicillium geosmithia emersonii i Rasamsonia emersonii se ovde koriste naizmenično.
[0031] U postupcima koji su ovde opisani koriste se enzimske kompozicije. U jednom primeru izvođenja kompozicije su stabilne. "Stabilne enzimske kompozicije" kako se ovde koristi znači da enzimske kompozicije zadržavaju aktivnost nakon 30 sati reakcionog vremena hidrolize, poželjno najmanje 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% njegove početne aktivnosti nakon 30 sati reakcije hidrolize. U jednom primeru izvođenja, enzimska kompozicija zadržava aktivnost posle 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 sati reakcionog vremena hidrolize.
[0032] Enzimi se mogu pripremiti fermentacijom odgovarajućeg supstrata sa odgovarajućim mikroorganizmom, npr. Rasamsonia emersonii ili Aspergillus niger, pri čemu enzime proizvodi mikroorganizam. Mikroorganizam se može promeniti da bi poboljšao ili napravio enzime. Na primer, mikroorganizam može biti mutiran klasičnim postupcima poboljšanja soja ili tehnikama rekombinantne DNK. Stoga, mikroorganizmi pomenuti ovde mogu da se koriste kao takvi za proizvodnju enzima ili mogu biti izmenjeni da povećaju proizvodnju ili da proizvode izmenjene enzime koji mogu uključivati heterologne enzime, npr. celulaze, dakle enzimi koje taj mikroorganizam prvobitno ne proizvodi. Poželjno, za proizvodnju enzima se koristi gljiva, poželjnije filamentozna gljiva. Poželjno je da se koristi termofilni ili termotolerantni mikroorganizam. Izborno, koristi se supstrat koji indukuje ekspresiju enzima od strane mikroorganizma koji proizvodi enzim.
[0033] Enzimi se koriste za pretvaranje lignoceluloznog materijala u tečnost i/ili oslobađanje šećera iz lignoceluloznog materijala koji sadrži polisaharide. Glavni polisaharidi su celuloze (glukani) i hemiceluloze (ksilani, heteroksilani i ksiloglukani). Pored toga, neke hemiceluloze mogu biti prisutne kao glukomanani, na primer u lignoceluloznom materijalu dobijenom od drveta. Enzimska hidroliza ovih polisaharida do rastvorljivih šećera, uključujući i monomere i multimere, na primer glukozu, celobiozu, ksilozu, arabinozu, galaktozu, fruktozu, manozu, ramnozu, ribozu, galakturonsku kiselinu, glukuronsku kiselinu i druge pentoheksoze, nastaje pod dejstvom pentoheksoza. različitih enzima koji deluju zajedno. Šećerni proizvod sadrži rastvorljive šećere, uključujući i monomere i multimere. U jednom primeru izvođenja, šećerni proizvod i/ili hidrolizovani lignocelulozni materijal sadrži glukozu, galaktozu i arabinozu. Primeri drugih šećera su celobioza, ksiloza, arabinoza, galaktoza, fruktoza, manoza, ramnoza, riboza, galakturonska kiselina, glukoronska kiselina i druge heksoze i pentoze. Šećerni proizvod se može koristiti kao takav ili može biti dalje obrađen, na primer, regenerisan i/ili prečišćen.
[0034] Pored toga, pektini i druge pektinske supstance kao što su arabinani mogu činiti značajan deo suve mase tipičnih ćelijskih zidova iz nedrvenastog biljnog tkiva (otprilike četvrtina do polovina suve mase mogu biti pektini).
[0035] Enzimi koji se mogu koristiti u postupcima koji su ovde opisani su detaljnije opisani u nastavku.
[0036] Litičke polisaharidne monooksigenaze, endoglukanaze (EG) i egzo-celobiohidrolaze (CBH) katalizuju hidrolizu nerastvorljive celuloze do proizvoda kao što su celooligosaharidi (celobioza kao glavni proizvod), dok β-glukozidaze (BG) prevode oligosaharide, uglavnom celobiozu i celotriozu, u glukozu.
[0037] Ksilanaze zajedno sa drugim pomoćnim enzimima, na primer α-L-arabinofuranozidazama, feruloil i acetilksilan esterazama, glukuronidazama i β-ksilozidazama) katalizuju hidrolizu hemiceluloza.
[0038] Enzimska kompozicija za upotrebu u postupcima kako su ovde opisani može da sadrži najmanje dve aktivnosti, iako će tipično kompozicija sadržati više od dve aktivnosti, na primer, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet ili čak više aktivnosti. Tipično, enzimska kompozicija za upotrebu u postupcima kako su ovde opisani sadrži najmanje dve celulaze. Najmanje dve celulaze mogu da sadrže iste ili različite aktivnosti. Kompozicija enzima za upotrebu u postupcima kako su ovde opisani može takođe da sadrži najmanje jedan enzim osim celulaze. Poželjno, najmanje jedan drugi enzim ima pomoćnu aktivnost enzima, tj. dodatnu aktivnost koja direktno ili indirektno dovodi do razgradnje lignoceluloze. Primeri takvih pomoćnih aktivnosti su pomenuti ovde i uključuju, ali nisu ograničeni, na hemicelulaze. Enzimska kompozicija za upotrebu u postupcima kako su ovde opisani najmanje sadrži litičku polisaharid monooksigenazu (LPMO), endoglukanazu (EG), celobiohidrolazu (CBH), ksilanazu, betaksilozidazu (BKS) i beta-glukozidazu ( BG). Kompozicija enzima može da sadrži više od jedne enzimske aktivnosti po klasi aktivnosti. Na primer, kompozicija može da sadrži dve endoglukanaze, na primer endoglukanazu koja ima aktivnost endo-1,3(1,4)-β glukanaze i endoglukanazu koja ima aktivnost endo-β-1,4-glukanaze.
[0039] Kompozicija za upotrebu u postupcima kao što su ovde opisani može biti izvedena iz gljive, kao što je filamentozna gljiva, kao npr. Rasamsonia, kao što je Rasamsonia emersonii. U jednom aspektu, najmanje jedan od enzima može biti izveden iz Rasamsonia emersonii. U jednom aspektu, litička polisaharid monooksigenaza i/ili beta-ksilozidaza su izvedeni iz Rasamsonia emersonii. Ako je potrebno, enzim se može dopuniti dodatnim enzimima iz drugih izvora. Takvi dodatni enzimi mogu biti izvedeni iz klasičnih izvora i/ili proizvedeni od genetski modifikovanih organizama.
[0040] Pored toga, enzimi u enzimskim kompozicijama za upotrebu u postupcima koji su ovde opisani mogu biti u stanju da rade pri niskom pH. Za svrhe ovog pronalaska, nizak pH označava pH od 5.5 ili niži, 5 ili niži, 4.9 ili niži, 4.8 ili niži, 4.7 ili niži, 4.6 ili niži, 4.5 ili niži, 4.4 ili niži, 4.3 ili niži, 4.2 ili niže, 4.1 ili manje, 4.0 ili manje 3.9 ili manje, 3.8 ili manje, 3.7 ili manje, 3.6 ili manje, 3.5 ili manje.
[0041] Enzimska kompozicija za upotrebu u postupcima kako su ovde opisani može da sadrži celulazu i/ili hemicelulazu i/ili pektinazu iz Rasamsonia. Oni takođe mogu sadržati celulazu i/ili hemicelulazu i/ili pektinazu iz izvora koji nije Rasamsonia. Mogu se koristiti zajedno sa
1
jednim ili više enzima Rasamsonia ili se mogu koristiti bez dodatnih prisutnih enzima Rasamsonia.
[0042] Kompozicija enzima za upotrebu u postupcima kao što su ovde opisani sadrži litičku polisaharid monooksigenazu, endoglukanazu, celobiohidrolazu I (CBHI), celobiohidrolazu II (CBHII), beta-glukozidazu, endoksilanazu (EKS) i beta-ksilozidazu.
[0043] Enzimska kompozicija za upotrebu u postupcima kako su ovde opisani može sadržati jedan tip aktivnosti celulaze i/ili aktivnosti hemicelulaze i/ili aktivnosti pektinaze obezbeđene kompozicijom kao što je ovde opisano i drugi tip aktivnosti celulaze i/ili aktivnosti hemicelulaze i/ili aktivnost pektinaze koju obezbeđuje dodatna celulaza/hemicelulaza/pektinaza.
[0044] Kako se ovde koristi, celulaza je bilo koji polipeptid koji je sposoban da razgradi ili modifikuje celulozu. Polipeptid koji je sposoban da razgradi celulozu je onaj koji je sposoban da katalizuje postupak razlaganja celuloze na manje jedinice, bilo delimično, na primer u celodekstrine, ili potpuno u monomere glukoze. Celulaza kao što je ovde opisana može dovesti do mešovite populacije celodekstrina i monomera glukoze. Takva razgradnja će se obično odvijati reakcijom hidrolize.
[0045] Kako se ovde koristi, hemicelulaza je bilo koji polipeptid koji je sposoban da razgradi ili modifikuje hemicelulozu. To znači da hemicelulaza može biti sposobna da razgradi ili modifikuje jedan ili više od ksilana, glukuronoksilana, arabinoksilana, glukomanana i ksiloglukana. Polipeptid koji je sposoban da razgradi hemicelulozu je onaj koji je sposoban da katalizuje postupak razlaganja hemiceluloze na manje polisaharide, bilo delimično, na primer na oligosaharide, ili potpuno u monomere šećera, na primer heksozu ili monomere šećera pentoze. Hemicelulaza kao što je ovde opisana može dovesti do mešovite populacije oligosaharida i monomera šećera. Takva degradacija će se obično odvijati reakcijom hidrolize.
[0046] Kako se ovde koristi, pektinaza je bilo koji polipeptid koji je sposoban da razgradi ili modifikuje pektin. Polipeptid koji je sposoban da razgradi pektin je onaj koji je sposoban da katalizuje postupak razlaganja pektina na manje jedinice, bilo delimično, na primer u oligosaharide, ili potpuno u monomere šećera. Pektinaza kao što je ovde opisana može dovesti do mešovite populacije oligosaharida i monomera šećera. Takva razgradnja će se obično odvijati reakcijom hidrolize.
[0047] Shodno tome, enzimska kompozicija za upotrebu u postupcima kako su ovde opisani može da sadrži jedan ili više od sledećih enzima, litičku polisaharid monooksigenazu (npr. GH61), celobiohidrolazu, endo-β-1,4-glukanazu, beta-glukozidazu i β-(1,3)(1,4)-glukanazu. Kompozicija za upotrebu u postupcima kako su ovde opisani može takođe da sadrži jednu ili više hemicelulaza, na primer, endoksilanazu, β-ksitozidazu, α-L-arabionofuranozidazu, α-D-glukuronidazu, acetil ksilan esterazu, feruloil esterazu, kumaroil esterazu, α-galaktozidazu, βgataktozidazu, β-mananazu i/ili β-manozidazu. Kompozicija za upotrebu u postupcima kako su ovde opisani može takođe da sadrži jednu ili više pektinaza, na primer, endo-poligalakturonazu, pektin-metil esterazu, endo-galaktanazu, beta-galaktozidazu, pektin-acetil esterazu, endopektin liazu, pektat liazu, alfa-ramnozidazu, egzo-galakturonazu, ekspoligalakturonat liazu, ramnogalakturonan hidrolazu, ramnogalakturonan liazu, ramnogalakturonan acetil esterazu, ramnogalakturonan galakturonohidrolazu i/ili ksilogalakturonazu. Pored toga, jedan ili više od sledećih enzima, amilaza, proteaza, lipaza, ligninaza, heksoziltransferaza, glukuronidaza, ekspansin, celulozom indukovani protein ili protein koji integriše celulozu ili sličan protein mogu biti prisutni u kompoziciji za upotrebu u postupcima koji su ovde opisani (oni se gore pominju kao pomoćne aktivnosti).
[0048] Kako se ovde koriste, litičke polisaharidne monooksigenaze su enzimi koje je CAZy nedavno klasifikovao u familiju AA9 (familija pomoćnih aktivnosti 9) ili familiju AA10 (familija pomoćnih aktivnosti 10). Stoga, postoje AA9 litičke polisaharid monooksigenaze i AA10 litičke polisaharid monooksigenaze. Litičke polisaharidne monooksigenaze su u stanju da otvore kristalnu strukturu glukana i pojačaju dejstvo celulaza na supstrate lignoceluloze. Oni su enzimi koji imaju celulolitičku aktivnost. Litičke polisaharidne monooksigenaze takođe mogu uticati na celulo-oligosaharide. Prema najnovijoj literaturi, (videti Isaksen et al., Journal of Biological Chemistry, vol.289, no. 5, p.2632-2642), proteini pod nazivom GH61 (familija glikozid hidrolaze 61 ili se ponekad nazivaju EGIV) su litičke polisaharidne monooksigenaze. GH61 je prvobitno klasifikovan kao endoglukanaza na osnovu merenja veoma slabe aktivnosti endo-1,4-β-d-glukanaze kod jednog člana porodice, ali ga je CAZy nedavno reklasifikovao u porodicu AA9. CBM33 (familija 33 modul za vezivanje ugljenih hidrata) je takođe litička polisaharid monooksigenaza (videti Isaksen et al, Journal of Biological Chemistry, vol. 289, no. 5, pp.2632-2642). CAZy je nedavno reklasifikovao CBM33 u porodicu AA10.
[0049] Litička polisaharid monooksigenaza može da sadrži AA9 litičku polisaharid monooksigenazu. To znači da najmanje jedna od litičkih polisaharid monooksigenaza u enzimskoj kompoziciji je AA9 litička polisaharid monooksigenaza. U jednom primeru izvođenja, sve litičke polisaharid monooksigenaze u enzimskoj kompoziciji su AA9 litička polisaharid monooksigenaza.
[0050] Kompozicija enzima može da sadrži litičku polisaharid monooksigenazu iz Thermoascus, kao što je Thermoascus aurantiacus, kao što je opisano u WO 2005/074656 kao SEQ ID NO:2 i SEQ ID NO:1 u WO2014/130812 i u WO 2010/065830; ili od Thielavia, kao što je Thielavia terrestris, kao što je onaj opisan u WO 2005/074647 kao SEQ ID NO: 8 ili SEQ ID NO: 4 u WO2014/130812 i u WO 2008/148131, i WO 2011/035027; ili od Aspergillus, kao što je Aspergillus fumigatus, kao što je opisan u WO 2010/138754 kao SEQ ID NO:2 ili SEQ ID NO: 3 u WO2014/130812; ili odPenicillium, kao što je Penicillium emersonii, kao što je onaj koji je otkriven kao SEQ ID NO:2 u WO 2011/041397 ili SEQ ID NO:2 u WO2014/130812. Druge pogodne litičke polisaharidne monooksigenaze uključuju, ali nisu ograničene na, Trichoderma reesei (videti WO 2007/089290), Myceliophthora thermophila (videti WO 2009/085935, WO 2009/085859, WO 2009/085864, WO 2009/085868), Penicillium pinophilum (videti WO 2011/005867), Thermoascus sp. (videti WO 2011/039319), i Thermoascus crustaceous (videti WO 2011/041504). Drugi celulolitički enzimi koji mogu biti sadržani u enzimskoj kompoziciji su opisani u WO 98/13465, WO 98/015619, WO 98/015633, WO 99/06574, WO 99/10481, WO 99/025847, WO 99/031255, WO 2002/101078, WO 2003/027306, WO 2003/052054, WO 2003/052055, WO 2003/052056, WO 2003/052057, WO 2003/052118, WO 2004/016760, WO 2004/043980, WO 2004/048592, WO 2005/001065, WO 2005/028636, WO 2005/093050, WO 2005/093073, WO 2006/074005, WO 2006/117432, WO 2007/071818, WO 2007/071820, WO 2008/008070, WO 2008/008793, US 5,457,046, US 5,648,263, i US 5,686,593, da spomenemo samo neke. Poželjno, litička polisaharid monooksigenaza je iz Rasamsonia, npr. Rasamsonia emersonii (videti WO 2012/000892).
[0051] Kako se ovde koriste, endoglukanaze su enzimi koji su sposobni da katalizuju endohidrolizu 1,4-β-D-glukozidnih veza u celulozi, liheninu ili β-D-glukanima žitarica. Oni pripadaju EC 3.2.1.4 i mogu takođe biti sposobni da hidrolizuju 1,4-veze u β-D-glukanima koji takođe sadrže 1,3-veze. Endoglukanaze se takođe mogu nazvati celulaze, avicelaze, β-1,4-endoglukan hidrolaze, β-1,4-glukanaze, karboksimetil celulaze, celudekstrinaze, endo-1,4-β-D-gtukanaze, endo-14,-β-D-glukanohidrolaze ili endo-1,4-β-glukanaze.
[0052] Endoglukanaza sadrži GH5 endoglukanazu i/ili GH7 endoglukanazu. To znači da je najmanje jedna od endoglukanaza u enzimskoj kompoziciji GH5 endoglukanaza ili GH7 endoglukanaza. U slučaju da u enzimskoj kompoziciji ima više endoglukanaza, ove endoglukanaze mogu biti GH5 endoglukanaze, GH7 endoglukanaze ili kombinacija GH5 endoglukanaza i GH7 endoglukanaza. U poželjnom primeru izvođenja endoglukanaza sadrži GH5 endoglukanazu.
[0053] Enzimska kompozicija može da sadrži endoglukanazu iz Trichoderma, kao što je Trichoderma reesei; iz Humicola, kao što je soj Humicola insolens; iz Aspergillus, kao što je Aspergillus aculeatus ili Aspergillus kawachii; iz Erwinia, kao što je Erwinia carotovara; iz Fusarium, kao što je Fusarium oxysporum; iz Thielavia, kao što je Thielavia terrestris; iz
1
Humicola, kao takav Humicola grisea var. thermoidea ili Humicola insolens; iz Melanocarpus, kao što je Melanocarpus albomyces; iz Neurospora, kao što je Neurospora crassa; iz Myceliophthora, kao što je Myceliophthora thermophila; iz Cladorrhinum, kao što je Cladorrhinum foecundissimum; i/ili iz Chrysosporium, kao što je soj Chrysosporium lucknowense. U poželjnom primeru izvođenja endoglukanaza je iz Rasamsonia, kao što je soj Rasamsonia emersonii (videti WO 01/70998). U jednom primeru izvođenja čak i bakterijska endoglukanaza može da se koristi uključujući, ali bez ograničenja na, endoglukanaza Acidothermus cellulolyticus (videti WO 91/05039; WO 93/15186; US 5,275,944; WO 96/02551; US 5,536,655, WO 00/70031, WO 05/093050); endoglukanaza III Thermobifida fusca (videti WO 05/093050); i endoglukanaza V Thermobifida fusca (videti WO 05/093050).
[0054] Kako se ovde koriste, beta-ksilozidaze (EC 3.2.1.37) su polipeptidi koji su sposobni da katalizuju hidrolizu 1,4-β-D-ksilana, da uklone uzastopne ostatke D-ksiloze sa neredukcionih krajeva. Beta-ksilozidaze takođe mogu hidrolizovati ksilobiozu. Beta-ksilozidaza se takođe može nazvati ksilan 1,4-β-ksilozidaza, 1,4-β-D-ksilan ksilohidrolaza, egzo-1,4-β-ksilozidaza ili ksilobijaza.
[0055] Beta-ksilozidaza može da sadrži GH3 beta-ksilozidazu. To znači da najmanje jedna od beta-ksilozidaza u enzimskoj kompoziciji je GH3 beta-ksilozidaza. U nekim aspektima, sve beta-ksilozidaze u enzimskoj kompoziciji su GH3 beta-ksilozidaze.
[0056] Enzimska kompozicija može da sadrži beta-ksilozidazu iz Neurospora crassa, Aspergillus fumigatus ili Trichoderma reesei. U poželjnom primeru izvođenja enzimska kompozicija sadrži beta-ksilozidazu iz Rasamsonia, kao što je Rasamsonia emersonii (videti WO 2014/118360).
[0057] Kako se ovde koristi, endoksilanaza (EC 3.2.1.8) je bilo koji polipeptid koji je sposoban da katalizuje endohidrolizu 1,4-β-D-ksilozidnih veza u ksilanima. Ovaj enzim se takođe može nazvati endo-1,4-β-ksilanaza ili 1,4-β-D-ksilan ksilanohidrolaza. Alternativa je EC 3.2.1.136, glukuronoarabinoksilan endoksilanaza, enzim koji je u stanju da hidrolizuje 1,4 ksilozidne veze u glukuronoarabinoksilanima.
[0058] U nekim aspektima, endoksilanaza može da sadrži GH10 ksilanazu. To znači da najmanje jedna od endoksilanaza u enzimskoj kompoziciji je GH10 ksilanaza. U jednom aspektu, sve endoksilanaze u enzimskoj kompoziciji su GH10 ksilanaze.
[0059] Kompozicija enzima može da sadrži endoksilanazu iz Aspergillus aculeatus (videti WO 94/21785), Aspergillus fumigatus (videti WO 2006/078256), Penicillium pinophilum (videti WO 2011/041405), Penicillium sp. (videti WO 2010/126772), Thielavia terrestris NRRL 8126 (videti WO 2009/079210), Talaromyces leycettanus, Thermobifida fusca, ili Trichophaea saccata GH10 (videti WO 2011/057083). U poželjnom primeru izvođenja enzimska kompozicija sadrži endoksilanazu iz Rasamsonia, kao što je Rasamsonia emersonii (videti WO 02/24926).
[0060] Kako se ovde koristi, beta-glukozidaza (EC 3.2.1.21) je bilo koji polipeptid koji je sposoban da katalizuje hidrolizu terminalnih, neredukcionih ostataka β-D-glukoze uz oslobađanje β-D-glukoze. Takav polipeptid može imati široku specifičnost za β-D-glukozide i takođe može da hidrolizuje jedno ili više od sledećeg: β-D-galaktozid, α-L-arabinozid, β-D-ksilozid ili β-D-fukozid. Ovaj enzim se takođe može nazvati amigdalaza, β-D-glukozid glukohidrolaza, celobijaza ili gentobiaza.
[0061] U nekim aspektima, enzimska kompozicija sadrži beta-glukozidazu iz Aspergillus, kao što je Aspergillus oryzae, kao što je ona otkrivena u WO 02/095014 ili fuzioni protein koji ima aktivnost beta-glukozidaze otkriven u WO 2008/057637, ili Aspergillus fumigatus, kao što je onaj koji je otkriven kao SEQ ID NO:2 u WO 2005/047499 ili SEQ ID NO:5 u WO 2014/130812 ili Aspergillus fumigatus varijanta beta-glukozidaze, kao što je onaj otkriven u WO 2012/044915, kao što je onaj sa sledećim supstitucijama: F100D, S283G, N456E, F512Y (upotrebom SEQ ID NO: 5 u WO 2014/130812 za numerisanje), ili Aspergillus aculeatus, Aspergillus niger ili Aspergillus kawachi. U sledećem primeru izvođenja beta-glukozidaza je izvedena iz Penicillium, kao što je Penicillium brasilianum otkrivena kao SEQ ID NO:2 u WO 2007/019442, ili od Trichoderma, kao što je Trichoderma reesei, kao što su opisane u US 6,022,725, US 6,982,159, US 7,045,332, US 7,005,289, US 2006/0258554 US 2004/0102619. Čak se može koristiti i bakterijska beta-glukozidaza. Beta-glukozidaza se može dobiti iz Thielavia terrestris (WO 2011/035029) ili Trichophaea saccata (WO 2007/019442). Poželjno, enzimska kompozicija sadrži beta-glukozidazu iz Rasamsonia, kao što je Rasamsonia emersonii (videti WO 2012/000886).
[0062] Kako se ovde koristi, celobiohidrolaza (EC 3.2.1.91) je bilo koji polipeptid koji je sposoban da katalizuje hidrolizu 1,4-β-D-glukozidnih veza u celulozi ili celotetraozi, oslobađajući celobiozu sa krajeva lanaca. Ovaj enzim se takođe može nazvati celulaza 1,4-βcelobiozidaza, 1,4-β-celobiohidrolaza, 1,4-β-D-glukan celobiohidrolaza, avicelaza, egzo-1,4-β-D-glukanaza, egzocelobiohidrolaza ili egzoglukanaza.
[0063] Enzimska kompozicija može da sadrži celobiohidrolazu I iz Aspergillus, kao što je Aspergillus fumigatus, kao što je Cel7A CBH I otkriven u SEQ ID NO: 6 u WO 2011/057140 ili SEQ ID NO:6 u WO 2014/130812; iz Trichoderma, kao što je Trichoderma reesei; iz Chaetomium, kao što je Chaetomium thermophilum; iz Talaromyces, kao što je Talaromyces leycettanus ili iz Penicillium, kao što je Penicillium emersonii. U poželjnom primeru izvođenja
1
enzimska kompozicija sadrži celobiohidrolazu I iz Rasamsonia, kao što je Rasamsonia emersonii (videti WO 2010/122141).
[0064] U nekim aspektima, enzimska kompozicija sadrži celubiohidrolazu II iz Aspergillus, kao što je Aspergillus fumigatus, kao što je onaj u SEQ ID NO:7 u WO 2014/130812 ili od Trichoderma, kao što je Trichoderma reesei, ili od Talaromyces, kao što je Talaromyces leycettanus, ili od Thielavia, kao što je Thielavia terrestris, kao što je celobiohidrolaza II CEL6A iz Thielavia terrestris. U poželjnom primeru izvođenja enzimska kompozicija sadrži celubiohidrolazu II iz Rasamsonia, kao što je Rasamsonia emersonii (videti WO 2011/098580).
[0065] Enzimska kompozicija takođe može da sadrži II jedan ili više od dole navedenih enzima.
[0066] Kao što je ovde korišćena, β-(1,3)(1,4)-glukanaza (EC 3.2.1.73) je bilo koji polipeptid koji je sposoban da katalizuje hidrolizu 1,4-β-D-glukozidnih veza u β-D-glukanima koji sadrže 1,3- i 1,4-veze. Takav polipeptid može da deluje na lihenin i β-D-glukane žitarica, ali ne i na β-D-glukane koji sadrže samo 1,3- ili 1,4-veze. Ovaj enzim se takođe može nazvati liheninaza, 1,3-1,4-β-D-glukan 4-glukanohidrolaza, β-glukanaza, endo-β-1,3-1,4 glukanaza, lihenaza ili βglukanaza sa mešanom vezom. Alternativa za ovaj tip enzima je EC 3.2.1.6, koji je opisan kao endo-1,3(4)-beta-glukanaza. Ovaj tip enzima hidrolizuje 1,3- ili 1,4-veze u beta-D-glukanazi kada je ostatak glukoze čija je redukujuća grupa uključena u vezu koja se hidrolizuje sama supstituisana na C-3. Alternativni nazivi uključuju endo-1,3-beta-glukanazu, laminarinazu, 1,3-(1,3;1,4)-beta-D-glukan 3 (4) glukanohidrolazu; supstrati uključuju laminarin, lihenin i beta-D-glukane žitarica.
[0067] Kako se ovde koristi, α-L-arabinofuranozidaza (EC 3.2.1.55) je bilo koji polipeptid koji je sposoban da deluje na α-L-arabinofuranozide, α-L-arabinane koji sadrže (1,2) i/ili (1,3) - i/ili (1,5)-veze, arabinoksilane i arabinogalaktane. Ovaj enzim se takođe može nazvati α-N-arabinofuranozidaza, arabinofuranozidaza ili arabinozidaza. Primeri arabinofuranozidaza koje mogu biti sadržane u enzimskoj kompoziciji uključuju, ali nisu ograničene na, arabinofuranozidaze iz Aspergillus niger, Humicola insolens DSM 1800 (videti WO 2006/114094 i WO 2009/073383) i M. giganteus (videti WO 2006/114094).
[0068] Kako se ovde koristi, α-D-glukuronidaza (EC 3.2.1.139) je bilo koji polipeptid koji je sposoban da katalizuje reakciju sledećeg oblika: alfa-D-glukuronozid H(2)O = alkohol D-glukuronat. Ovaj enzim se takođe može nazvati alfa-glukuronidazom ili alfaglukoziduronazom. Ovi enzimi takođe mogu da hidrolizuju 4-O-metilovanu glukoronsku kiselinu, koja takođe može biti prisutna kao supstituent u ksilanima. Alternativa je EC 3.2.1.131: ksilan alfa-1,2-glukuronozidaza, koja katalizuje hidrolizu alfa-1,2-(4-O-metil)glukuronozil veza. Primeri alfa-glukuronidaza koje mogu biti sadržane u enzimskoj
1
kompoziciji uključuju, ali nisu ograničene na, alfa-glukuronidaze iz Aspergillus clavatus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus niger, Aspergillus terreus, Humicola insolens (videti WO 2010/014706), Penicillium aurantiogriseum (videti WO 2009/068565) i Trichoderma reesei.
[0069] Kako se ovde koristi, acetil ksilan esteraza (EC 3.1.1.72) je bilo koji polipeptid koji je sposoban da katalizuje deacetilaciju ksilana i ksilo-oligosaharida. Takav polipeptid može katalizovati hidrolizu acetil grupa iz polimernog ksilana, acetilovane ksiloze, acetilovane glukoze, alfa-naftil acetata ili p-nitrofenil acetata, ali, tipično, ne iz triacetilglicerola. Takav polipeptid tipično ne deluje na acetilovani manan ili pektin. Primeri acetilksilan esteraza koje mogu biti sadržane u kompoziciji enzima uključuju, ali nisu ograničene na, acetilksilan esteraze iz Aspergillus aculeatus (videti WO 2010/108918), Chaetomium globosum, Chaetomium gracile, Humicola insolens DSM 1800 (videti WO 2009/073709), Hypocrea jecorina (videti WO 2005/001036), Myceliophtera thermophila (videti WO 2010/014880), Neurospora crassa, Phaeosphaeria nodorum i Thielavia terrestris NRRL 8126 (videti WO 2009/042846). Poželjno, enzimska kompozicija sadrži acetil ksilan esterazu iz Rasamsonia, kao što je Rasamsonia emersonii (videti WO 2010/000888)
[0070] Kako se ovde koristi, feruloil esteraza (EC 3.1.1.73) je bilo koji polipeptid koji je sposoban da katalizuje reakciju u obliku: feruloil-saharid H2O = ferulat saharid. Saharid može biti, na primer, oligosaharid ili polisaharid. Tipično može da katalizuje hidrolizu 4-hidroksi-3-metoksicinamoil (feruloil) grupe iz esterifikovanog šećera, koji je obično arabinoza u 'prirodnim' supstratima. p-nitrofenol acetat i metil ferulat su tipično lošiji supstrati. Ovaj enzim se takođe može nazvati hidrolaza cinamoil estra, esteraza ferulne kiseline ili hidroksicinamoil esteraza. Takođe se može nazvati dodatnim enzimom hemicelulaze, jer može pomoći ksilanazama i pektinazama da razbiju hemicelulozu i pektin ćelijskog zida biljaka. Primeri feruloil esteraza (esteraze ferulne kiseline) koje mogu biti sadržane u enzimskoj kompoziciji uključuju, ali nisu ograničeni na, forme feruloil esteraze Humicola insolens DSM 1800 (videti WO 2009/076122), Neosartorya fischeri, Neurospora crassa, Penicillium aurantiogriseum (videti WO 2009/127729), i Thielavia terrestris (videti WO 2010/053838 i WO 2010/065448).
[0071] Kao što je ovde korišćena, kumaroil esteraza (EC 3.1.1.73) je bilo koji polipeptid koji je sposoban da katalizuje reakciju u obliku: kumaroil-saharid H(2)O = kumarat saharid. Saharid može biti, na primer, oligosaharid ili polisaharid. Ovaj enzim se takođe može nazvati trans-4-kumaroil esteraza, trans-p-kumaroil esteraza, p-kumaroil esteraza ili p-kumaroil esteraza. Ovaj enzim takođe spada u EC 3.1.1.73, pa se takođe može nazvati i kao feruloil esteraza.
1
[0072] Kao što je ovde korišćena, α-galaktozidaza (EC 3.2.1.22) je svaki polipeptid koji je sposoban da katalizuje hidrolizu terminalnih, neredukcionih ostataka α-D-galaktoze u α-D-galaktozidima, uključujući oligosaharide galaktoze, galaktomanane, galaktane i arabinogalaktane. Takav polipeptid takođe može biti sposoban da hidrolizuje α-D-fukozide. Ovaj enzim se takođe može nazvati melibijazom.
[0073] Kao što je ovde korišćena, β-galaktozidaza (EC 3.2.1.23) je bilo koji polipeptid koji je sposoban da katalizuje hidrolizu terminalnih neredukcionih ostataka β-D-galaktoze u β-D-galaktozidima. Takav polipeptid takođe može biti sposoban da hidrolizuje α-L-arabinozide. Ovaj enzim se takođe može nazvati egzo-(1->4)-β-D-galaktanaza ili laktaza.
[0074] Kao što je ovde korišćena, β-mananaza (EC 3.2.1.78) je bilo koji polipeptid koji je sposoban da katalizuje slučajnu hidrolizu 1,4-β-D-manozidnih veza u mananima, galaktomananima i glukomananima. Ovaj enzim se takođe može nazvati manan endo-1,4-βmanozidaza ili endo-1,4-mananaza.
[0075] Kao što je ovde korišćena, β-manozidaza (EC 3.2.1.25) je bilo koji polipeptid koji je sposoban da katalizuje hidrolizu terminalnih, neredukcionih ostataka β-D-manoze u β-D-manozidima. Ovaj enzim se takođe može nazvati mananaza ili manaza.
[0076] Kao što je ovde korišćena, endo-poligalakturonaza (EC 3.2.1.15) je bilo koji polipeptid koji je sposoban da katalizuje slučajnu hidrolizu 1,4-α-D-galaktoziduronskih veza u pektatu i drugim galakturonanima. Ovaj enzim se takođe može nazvati poligalakturonaza pektin depolimeraza, pektinaza, endopoligalakturonaza, pektolaza, pektin hidrolaza, pektin poligalakturonaza, poli-α-1,4-galakturonid glikanohidrolaza, endogalakturonaza; endo-D-galakturonaza ili poli(1,4-α-D-galakturonid) glikanohidrolaza.
[0077] Kao što je ovde korišćena, pektin metil esteraza (EC 3.1.1.11) je bilo koji enzim koji je sposoban da katalizuje reakciju: pektin n H2O = n metanol pektat. Enzim može biti poznat i kao pektinesteraza, pektin demetoksilaza, pektin metoksilaza, pektin metilesteraza, pektaza, pektinoesteraza ili pektin pektilhidrolaza.
[0078] Kao što je ovde korišćena, endo-galaktanaza (EC 3.2.1.89) je bilo koji enzim sposoban da katalizuje endohidrolizu 1,4-β-D-galaktozidnih veza u arabinogalaktanima. Enzim može biti poznat i kao arabinogalaktana endo-1,4-β-galaktozidaza, endo-1,4-β-galaktanaza, galaktanaza, arabinogalaktanaza ili arabinogalaktana 4-β-D-galaktanohidrolaza.
[0079] Kao što je ovde korišćena, pektin acetil esteraza je ovde definisana kao bilo koji enzim koji ima aktivnost acetil esteraze koja katalizuje deacetilaciju acetil grupa na hidroksilnim grupama GalUA ostataka pektina
1
[0080] Kao što je ovde korišćena, endopektin liaza (EC 4.2.2.10) je bilo koji enzim sposoban da katalizuje eliminaciono cepanje (1→4)-α-D-galakturonan metil estra da bi se dobili oligosaharidi sa 4-deoksi-6-O-metil-α-D-galakt-4-enuronozil grupama na njihovim neredukcionim krajevima. Enzim može biti poznat i kao pektin liaza, pektin trans-eliminaza; endo-pektin liaza, polimetilgalakturonska transeliminaza, pektin metiltranseliminaza, pektoliaza, PL, PNL ili PMGL ili (1→4)-6-O-metil-α-D-galakturonan liaza.
[0081] Kao što je ovde korišćena, pektat liaza (EC 4.2.2.2) je bilo koji enzim sposoban da katalizira eliminativno cepanje (1→4)-α-D-galakturonana da bi se dobili oligosaharidi sa 4-deoksi-α-D-galakt-4-enuronozil grupama na njihovim neredukcionim krajevima. Enzim takođe može biti poznat kao poligalakturonska transeliminaza, transeliminaza pektinske kiseline, poligalakturonat liaza, endopektin metiltranseliminaza, pektat transeliminaza, endogalakturonat transeliminaza, liaza pektinske kiseline, pektinska liaza, liaza α-1,4-D-endopoligalakturonske kiseline, PGA liaza, Ppaza-N, liaza endo-α-1,4-poligalakturonske kiseline, liaza poligalakturonske kiseline, pektin trans-eliminaza, poligalakturonska kiselina trans-eliminaza ili (1→4)-α-D-galakturonan liaza.
[0082] Kao što je ovde korišćena, alfa-ramnozidaza (EC 3.2.1.40) je bilo koji polipeptid koji je sposoban da katalizuje hidrolizu terminalnih neredukcionih ostataka α-L-ramnoze u α-L-ramnozidima ili alternativno u ramnogalakturonanu. Ovaj enzim može biti poznat i kao α-L-ramnozidaza T, α-L-ramnozidaza N ili α-L-ramnozidaza ramnohidrolaza.
[0083] Kao što je ovde korišćena, egzo-galakturonaza (EC 3.2.1.82) je bilo koji polipeptid sposoban za hidrolizu pektinske kiseline sa neredukcionog kraja, oslobađajući digalakturonat. Enzim može biti poznat i kao egzo-poli-α-galakturonozidaza, egzopoligalakturonozidaza ili egzopoligalakturanozidaza.
[0084] Kao što je ovde korišćena, egzo-galakturonaza (EC 3.2.1.67) je bilo koji polipeptid sposoban da katalizuje: (1,4-α-D-galakturonid)n+ H2O = (1,4-α-D-galakturonid)n-1+ D-galakturonat. Enzim može biti poznat i kao galakturan 1,4-α-galakturonaza, egzopoligalakturonaza, poli(galakturonat) hidrolaza, egzo-D-galakturonaza, egzo-D-galakturonanaza, egzopoli-D-galakturonaza ili poli(1,4-α-D-galakturonid) galakturonohidrolaza.
[0085] Kao što je ovde korišćena, egzopoligalakturonat liaza (EC 4.2.2.9) je svaki polipeptid sposoban da katalizuje eliminativno cepanje 4-(4-deoksi-α-D-galakt-4-enuronozil)-D-galakturonata sa redukcionog kraja pektata, tj. deesterifikovani pektin. Ovaj enzim može biti poznat kao pektat disaharid-liaza, pektat egzo-liaza, transeliminaza egzopektinske kiseline,
1
egzopektat liaza, egzopoligalakturna kiselina-trans-eliminaza, PATE, egzo-PATE, egzo-PGL ili (1→4)-α-D-galakturonan redukujuća-kraj-disaharid-liaza.
[0086] Kao što je ovde korišćena, ramnogalakturonan hidrolaza je svaki polipeptid koji je sposoban da hidrolizuje vezu između galaktoziluronske kiseline i ramnopiranozila na endonačin u striktno naizmeničnim strukturama ramnogalakturonana, koji se sastoje od disaharid [(1,2-alfa-L-(1,2-ramnoil-L-1-4)-alfa-galaktoziluronske kiseline].
[0087] Kao što je ovde korišćena, ramnogalakturonan liaza je bilo koji polipeptid koji je bilo koji polipeptid koji je sposoban da cepa α-L-Rhap-(1→4)-α-D-GalpA veze na endo-način u ramnogalakturonanu beta-eliminacijom.
[0088] Kao što je ovde korišćena, ramnogalakturonan acetil esteraza je bilo koji polipeptid koji katalizuje deacetilaciju kičme naizmeničnih ostataka ramnoze i galakturonske kiseline u ramnogalakturonu.
[0089] Kao što je ovde korišćena, ramnogalakturon galakturonohidrolaza je bilo koji polipeptid koji je sposoban da hidrolizuje galakturonsku kiselinu sa neredukcionog kraja striktno naizmeničnih ramnogalakturonanskih struktura na egzo-način.
[0090] Kao što je ovde korišćena, ksilogalakturonaza je bilo koji polipeptid koji deluje na ksilogalakturonan cepanjem kičme galakturonske kiseline supstituisane β-ksilozom na endonačin. Ovaj enzim može biti poznat i kao ksilogalakturonan hidrolaza.
[0091] Kao što je ovde korišćena, α-L-arabinofuranozidaza (EC 3.2.1.55) je svaki polipeptid koji je sposoban da deluje na α-L-arabinofuranozide, α-L-arabinane koji sadrže (1,2) i/ili (1,3)-i /ili (1,5)-veze, arabinoksilane i arabinogalaktane. Ovaj enzim se takođe može nazvati α-N-arabinofuranozidaza, arabinofuranozidaza ili arabinozidaza.
[0092] Kao što je ovde korišćena, endo-arabinanaza (EC 3.2.1.99) je bilo koji polipeptid koji je sposoban da katalizuje endohidrolizu 1,5-α-arabinofuranozidnih veza u 1,5-arabinanima. Enzim može biti poznat i kao endo-arabinaza, arabinan endo-1,5-α-L-arabinozidaza, endo-1,5-α-L-arabinaza, endo-α-1,5-arabanaza, endo-arabanaza ili 1,5-α-L-arabinan 1,5-α-L-arabinanohidrolaza.
[0093] „Proteaza“ obuhvata enzime koji hidrolizuju peptidne veze (peptidaze), kao i enzime koji hidrolizuju veze između peptida i drugih delova, kao što su šećeri (glikopeptidaze). Mnoge proteaze su okarakterisane prema EC 3.4, i pogodne su za upotrebu u postupcima kao što su ovde opisani. Neke specifične vrste proteaza uključuju cisteinske proteaze uključujući pepsin, papain i serin proteaze uključujući himotripsine, karboksipeptidaze i metaloendopeptidaze.
[0094] "Lipaza" uključuje enzime koji hidrolizuju lipide, masne kiseline i acilgliceride, uključujući fospogliceride, lipoproteine, diacilglicerole i slično. U biljkama, lipidi se koriste
2
kao strukturne komponente za ograničavanje gubitka vode i infekcije patogenom. Ovi lipidi uključuju voskove dobijene od masnih kiselina, kao i kutin i suberin.
[0095] „Ligninaza“ uključuje enzime koji mogu hidrolizovati ili razbiti strukturu ligninskih polimera. Enzimi koji mogu da razgrađuju lignin uključuju lignin peroksidaze, mangan peroksidaze, lakaze i feruloil esteraze, i druge enzime opisane u stanju tehnike za koje je poznato da depolimerizuju ili na drugi način razlažu polimere lignina. Takođe su uključeni enzimi sposobni da hidrolizuju veze nastale između hemiceluloznih šećera (posebno arabinoze) i lignina. Ligninaze uključuju, ali nisu ograničene na sledeću grupu enzima: lignin peroksidaze (EC 1.11.1.14), mangan peroksidaze (EC 1.11.1.13), lakaze (EC 1.10.3.2) i feruloil esteraze (EC 3.1.1.73).
[0096] „Heksoziltransferaza“ (2.4.1-) obuhvata enzime koji su sposobni da katalizuju reakciju transferaze, ali koji takođe mogu katalizovati reakciju hidrolize, na primer celuloze i/ili proizvoda razgradnje celuloze. Primer heksoziltransferaze koja se može koristiti je βglukanoziltransferaza. Takav enzim može biti u stanju da katalizuje razgradnju (1,3)(1,4)glukana i/ili celuloze i/ili proizvoda razgradnje celuloze.
[0097] "Glukuronidaza" uključuje enzime koji katalizuju hidrolizu glukoronozida, na primer βglukuronozida da bi se dobio alkohol. Mnoge glukuronidaze su okarakterisane i mogu biti pogodne za upotrebu, na primer β-glukuronidaza (EC 3.2.1.31), hijalurono-glukuronidaza (EC 3.2.1.36), glukuronozil-disulfoglukozamin glukuronidaza (3.2.1.56), glicirizinat βglukuronidaza (3.2.1.128) ili α-D-glukuronidaza (EC 3.2.1.139).
[0098] Ekspanzini su uključeni u labavljenje strukture ćelijskog zida tokom rasta biljnih ćelija. Predloženo je da ekspanzini poremete vodoničnu vezu između celuloze i drugih polisaharida ćelijskog zida bez hidrolitičke aktivnosti. Smatra se da na ovaj način omogućavaju klizanje celuloznih vlakana i povećanje ćelijskog zida. Svolenin, protein sličan ekspanzinu, sadrži domen porodice 1 N-terminalnog modula za vezivanje ugljenih hidrata (CBD) i C-terminalni domen sličan ekspanzinu. Kao što je ovde opisan, protein sličan ekspanzinu ili protein sličan svoleninu može da sadrži jedan ili oba takva domena i/ili može da poremeti strukturu ćelijskih zidova (kao što je narušavanje strukture celuloze), izborno bez stvaranja uočljivih količina redukcionih šećera.
[0099] Protein indukovan celulozom, na primer polipeptidni proizvod cip1 ili cip2 gena ili sličnih gena (videti Foreman et al., J. Biol. Chem. 278(34), 31988-31997, 2003), protein koji integriše celulozu/celulozom, na primer polipeptidni proizvod cipA ili cipC gena, ili skafoldin ili protein sličan skafoldinu. Skafoldini i proteini koji integrišu celulozu su multifunkcionalne integracione podjedinice koje mogu da organizuju celulolitičke podjedinice u multienzimski kompleks. Ovo se postiže interakcijom dve komplementarne klase domena, tj. kohezioni domen na skafoldinu i domen dokerina na svakoj enzimskoj jedinici. Podjedinica skafoldina takođe nosi modul za vezivanje celuloze (CBM) koji posreduje vezivanje celulozoma za njegov supstrat. Skafoldin ili protein koji integriše celulozu mogu da sadrže jedan ili oba takva domena.
[0100] Katalaza, termin "katalaza" označava vodonik-peroksid: vodonik-peroksid oksidoreduktazu (EC 1.11.1.6 ili EC 1.11.1.21) koja katalizuje konverziju dva vodonikperoksida u kiseonik i dve vode. Aktivnost katalaze se može odrediti praćenjem razgradnje vodonik peroksida na 240 nm na osnovu sledeće reakcije: 2H2O2→ 2H2O O2. Reakcija je sprovedena u 50 mM fosfata pH 7.0 na 25°C sa 10.3 mM supstrata (H2O2) i približno 100 jedinica enzima po ml. Apsorpcija se prati spektrofotometrijski u roku od 16-24 sekunde, što bi trebalo da odgovara smanjenju apsorpcije sa 0.45 na 0.4. Jedna jedinica aktivnosti katalaze može se izraziti kao jedan mikromol H2O2razložen u minuti na pH 7.0 i 25°C.
[0101] Termin "amilaza" kako se ovde koristi označava enzime koji hidrolizuju alfa-1,4-glukozidne veze u skrobu, kako u amilozi tako i u amilopektinu, kao što je alfa-amilaza (EC 3.2.1.1), beta-amilaza (EC 3.2.1.2) , glukan 1,4-alfa-glukozidaza (EC 3.2.1.3), glukan 1,4-alfamaltotetraohidrolaza (EC 3.2.1.60), glukan 1,4-alfa-maltoheksaozidaza (EC 3.2.1.98), glukan 1,4 -alfa-maltotriohidrolaza (EC 3.2.1.116) i glukan 1,4-alfa-maltohidrolaza (EC 3.2.1.133), i enzimi koji hidrolizuju alfa-1,6-glukozidne veze, koji su tačke grananja u amilopektinu, kao što je pululanaza (EC 3.2.1.41) i granična dekstinaza (EC 3.2.1.142).
[0102] Kompozicija za upotrebu u postupcima kao što su ovde opisani može biti sastavljena od enzima (1) komercijalnih dobavljača; (2) kloniranih gena koji eksprimiraju enzime; (3) bujona (kao što je onaj koji je rezultat rasta mikrobnog soja u medijumu, pri čemu sojevi luče proteine i enzime u medijum; (4) ćelijskih lizata sojeva uzgajanih kao u (3); i/ili (5) biljnog materijala koji eksprimira enzime. Različiti enzimi u kompoziciji pronalaska mogu se dobiti iz različitih izvora.
[0103] Enzimi se mogu proizvesti bilo egzogeno u mikroorganizmima, kvascima, gljivama, bakterijama ili biljkama, zatim izolovati i dodati, na primer, lignoceluloznom materijalu. Alternativno, enzim se može proizvesti u fermentaciji koja koristi (prethodno tretirani) lignocelulozni materijal (kao što je kukuruzni stover ili pšenična slama) da obezbedi ishranu organizmu koji proizvodi enzim(e). Na ovaj način, biljke koje proizvode enzime mogu same da služe kao lignocelulozni materijal i da se dodaju u lignocelulozni materijal.
[0104] U ovde opisanim upotrebama i postupcima, komponente gore opisanih kompozicija mogu biti obezbeđene istovremeno (tj. kao jedna kompozicija per se) ili odvojeno ili uzastopno.
[0105] Prema pronalasku, ceo fermentacioni bujon za filamentoznih gljiva koji sadrži najmanje celubiohidrolazu, endoglukanazu, beta-glukozidazu, ksilanazu, beta-ksilozidazu i litičku polisaharid monooksigenazu se koristi za enzimsku hidrolizu prethodno tretiranog lignoceluloznog materijala.
[0106] Enzimska kompozicija je poželjno ceo fermentacioni bujon Rasamsonia. Ceo fermentacioni bujon se može pripremiti od fermentacije nerekombinantnih i/ili rekombinantnih filamentoznih gljiva. U jednom primeru izvođenja, filamentozna gljiva je rekombinantna filamentozna gljiva koja sadrži jedan ili više gena koji mogu biti homologni ili heterologni filamentoznoj gljivi. U jednom aspektu, filamentozna gljiva je rekombinantna filamentozna gljiva koja sadrži jedan ili više gena koji mogu biti homologni ili heterologni filamentoznoj gljivi, pri čemu jedan ili više gena kodiraju enzime koji mogu razgraditi celulozni supstrat. Ceo fermentacioni bujon može da sadrži bilo koji od polipeptida opisanih gore ili bilo koju njihovu kombinaciju.
[0107] Poželjno, kompozicija enzima je ceo fermentacioni bujon u kojoj su ćelije ubijene. Ceo fermentacioni bujon može da sadrži organsku(e) kiselinu(e) (koje se koriste za ubijanje ćelija), ubijene ćelije i/ili ćelijske ostatke i medijum za kulturu.
[0108] Generalno, filamentozne gljive se kultivišu u medijumu za ćelijsku kulturu pogodnom za proizvodnju enzima sposobnih da hidrolizuju celulozni supstrat. Kultivacija se odvija u pogodnom hranljivom medijumu koji sadrži izvore ugljenika i azota i neorganske soli, primenom postupaka poznatih u tehnici. Pogodni medijumi za kulturu, temperaturni opseg i drugi uslovi pogodni za rast i proizvodnju celulaze i/ili hemicelulaze i/ili pektinaze su poznati u tehnici. Ceo fermentacioni bujon se može pripremiti uzgajanjem filamentoznih gljiva do stacionarne faze i održavanjem filamentoznih gljiva pod ograničenim uslovima ugljenika tokom vremenskog perioda koji je dovoljan za ekspresiju jedne ili više celulaza i/ili hemicelulaza i/ili pektinaza. Kada se enzimi, kao što su celulaze i/ili hemicelulaze i/ili pektinaze, luče od strane filamentoznih gljiva u medijum za fermentaciju, može se koristiti ceo fermentacioni bujon. Ceo fermentacioni bujon ovog pronalaska može da sadrži filamentozne gljive. U nekim primerima izvođenja, ceo fermentacioni bujon sadrži nefrakcionisani sadržaj fermentacionih materijala dobijenih na kraju fermentacije. Tipično, ceo fermentacioni bujon sadrži istrošeni medijum za kulturu i ostatake ćelija prisutne nakon što se filamentozne gljive uzgajaju do zasićenja, inkubiraju pod uslovima koji ograničavaju ugljenik da bi se omogućila sinteza proteina (posebno, ekspresija celulaza i/ili hemicelulaza i/ili pektinaza). U nekim primerima izvođenja, ceo fermentacioni bujon sadrži istrošeni medijum ćelijske kulture, ekstracelularne enzime i filamentozne gljive. U nekim primerima izvođenja, filamentozne
2
gljive prisutne u celom fermentacionom bujonu mogu biti lizirane, permeabilizovane ili ubijene korišćenjem postupaka poznatih u tehnici da bi se proizveo ceo fermentacioni bujon sa uništenenim ćelijama. U jednom primeru izvođenja, ceo fermentacioni bujon je ceo fermentacioni bujon sa ubijenim ćelijama, pri čemu se ceo fermentacioni bujon koji sadrži ćelije filamentoznih gljiva koje su lizirane ili ubijene. U nekim primerima izvođenja, ćelije se ubijaju lizom filamentoznih gljiva hemijskim i/ili pH tretmanom da bi se stvorio ceo fermentacioni bujon filamentoznih gljiva sa ubijenim ćelijama. U nekim primerima izvođenja, ćelije se ubijaju lizom filamentoznih gljiva hemijskim i/ili pH tretmanom i podešavanjem pH fermentacione mešavine sa uništenim ćelijama na odgovarajući pH. U jednom primeru izvođenja, ceo fermentacioni bujon sadrži prvu komponentu organske kiseline koja sadrži najmanje jednu organsku kiselinu od 1-5 ugljenika i/ili njenu so i drugu komponentu organske kiseline koja sadrži najmanje 6 ili više ugljeničnih organskih kiselina i/ili njihovu so. U jednom primeru izvođenja, prva komponenta organske kiseline je sirćetna kiselina, mravlja kiselina, propionska kiselina, njihova so ili bilo koja njihova kombinacija, a druga komponenta organske kiseline je benzojeva kiselina, cikloheksankarboksilna kiselina, 4-metilvalerinska kiselina, fenilsirćetna kiselina, njihova so ili bilo koja njihova kombinacija.
[0109] Termin "ceo fermentacioni bujon" kako se ovde koristi odnosi se na preparat proizveden ćelijskom fermentacijom koji ne podleže nikakvoj izolaciji i/ili prečišćavanju ili je to minimalno. Na primer, celi fermentacioni bujoni se proizvode kada se mikrobne kulture uzgajaju do zasićenja, inkubiraju u uslovima koji ograničavaju ugljenik da bi se omogućila sinteza proteina (npr. ekspresija enzima od strane ćelija domaćina) i izlučivanje u medijum ćelijske kulture. Tipično, ceo fermentacioni bujon je nefrakcionisan i sadrži istrošeni medijum za ćelijsku kulturu, ekstracelularne enzime i mikrobne, poželjno nevijabilne ćelije.
[0110] Ako je potrebno, ceo fermentacioni bujon se može frakcionisati i može se koristiti jedan ili više frakcionisanih sadržaja. Na primer, ubijene ćelije i/ili ćelijski ostaci mogu da se uklone iz celog fermentacionog bujona da bi se dobila kompozicija koja ne sadrži ove komponente.
[0111] Ceo fermentacioni bujon može dalje da sadrži konzervans i/ili antimikrobno sredstvo. Takvi konzervansi i/ili sredstva su poznati u tehnici.
[0112] Ceo fermentacioni bujon kao što je ovde opisan je tipično tečnost, ali može da sadrži nerastvorljive komponente, kao što su ubijene ćelije, ćelijski ostaci, komponente medijuma za kulturu i/ili nerastvorljivi enzimi. U nekim primerima izvođenja, nerastvorljive komponente mogu da se uklone da bi se dobio prečišćeni ceo fermentacioni bujon.
[0113] Ceo fermentacioni bujon može biti dopunjen sa jednom ili više enzimskih aktivnosti koje nisu eksprimirane endogeno, ili eksprimirane na relativno niskom nivou od strane filamentoznih gljiva, da bi se poboljšalo razlaganje celuloznog supstrata, na primer, do fermentabilnih šećera kao što je kao glukoza ili ksiloza. Dodatni enzim(i) se može dodati kao dodatak celom fermentacionom bujonu i enzimi mogu biti komponenta odvojenog celog fermentacionog bujona, ili mogu biti prečišćeni, ili minimalno izolovani i/ili prečišćeni.
[0114] Ceo fermentacioni bujon može da sadrži ceo fermentacioni bujon fermentacije rekombinantne filamentozne gljive koje prekomerno eksprimiraju jedan ili više enzima da bi se poboljšalo razlaganje celuloznog supstrata. Alternativno, ceo fermentacioni bujon može da sadrži mešavinu celog fermentacionog bujona fermentacije nerekombinantne filamentozne gljive i rekombinantne filamentozne gljive koja prekomerno eksprimira jedan ili više enzima da bi se poboljšalo razlaganje celuloznog supstrata. U jednom primeru izvođenja, ceo fermentacioni bujon sadrži ceo fermentacioni bujon fermentacije filamentozne gljive koje prekomerno eksprimiraju beta-glukozidazu. Alternativno, ceo fermentacioni bujon za upotrebu u ovim postupcima i reaktivnim kompozicijama može da sadrži mešavinu celog fermentacionog bujona fermentacije nerekombinantne filamentozne gljive i ceo fermentacioni bujon fermentacije rekombinantne filamentozne gljive koje prekomerno eksprimiraju betaglukozidazu.
[0115] Lignocelulozni materijal kao što je ovde korišćen uključuje bilo koji lignocelulozni i/ili hemicelulozni materijal. Lignocelulozni materijal pogodan za upotrebu u postupcima kao što su ovde opisani uključuje biomasu, npr. devičansku biomasu i/ili nedevičansku biomasu kao što je poljoprivredna biomasa, komercijalna organska materija, građevinski otpad i otpad od rušenja, komunalni čvrsti otpad, otpadni papir i otpad iz dvorišta. Uobičajeni oblici biomase uključuju drveće, žbunje i travu, pšenicu, pšeničnu slamu, šećernu trsku, slamu od šećerne trske, bagasu od šećerne trske, travu, miskantus, energetsku trsku, kukuruz, kukuruzni stover, ljuske kukuruza, klipove, vlakna kukuruza, zrna kukuruza, stabljike repice, stabljike soje, slatki sirak, zrno kukuruza uključujući vlakna iz zrna, proizvode i nusproizvode od mlevenja žitarica kao što su kukuruz, pšenica i ječam (uključujući mokro mlevenje i suvo mlevenje) koji se često nazivaju „mekinje ili vlakna“, zrna sušena destilatorima, kao i opštinski čvrsti otpad, otpadni papir i otpad iz dvorišta. Biomasa takođe može biti, ali nije ograničena na, zeljasti materijal, poljoprivredni ostaci, ostaci šumarstva, komunalni čvrsti otpad, otpadni papir i ostaci iz fabrike celuloze i papira. „Poljoprivredna biomasa“ obuhvata granje, žbunje, trske, kukuruz i kukuruzne ljuske, energetske useve, šume, voće, cveće, žitarice, travu, zeljaste useve, lišće, koru, iglice, trupce, korenje, mladice, drvenaste kulture kratke rotacije, žbunje, muhar, drveće, povrće, koru voća, vinovu lozu, pulpu šećerne repe, sredinu pšenice, ljuske ovsa i tvrdo i meko drveće (ne uključujući šume sa štetnim materijalima). Pored toga, poljoprivredna biomasa
2
uključuje organske otpadne materijale koji nastaju u poljoprivrednim postupcima uključujući poljoprivredne i šumarske aktivnosti, posebno uključujući šumski drveni otpad. Poljoprivredna biomasa može biti bilo koja od gore navedenih pojedinačno ili u bilo kojoj kombinaciji ili mešavini istih.
[0116] Prema pronalasku, lignocelulozni materijal se prethodno tretira pre enzimske hidrolize. Prethodni tretman se izvodi pomoću toplotne i hemijske modifikacije:
Lignocelulozni materijal se prethodno tretira na temperaturi od 170°C do 190°C.
[0117] Lignocelulozni materijal je prethodno tretiran na pH od 1.9 do 2.2.
[0118] Lignocelulozni materijal se prethodno tretira 2.5 do 6 minuta.
[0119] Lignocelulozni materijal se može prethodno tretirati pod pritiskom od 5 do 25 bara.
[0120] Lignocelulozni materijal se može isprati. Lignocelulozni materijal se može isprati nakon prethodnog tretmana. Korak ispiranja se može koristiti za uklanjanje jedinjenja rastvorljivih u vodi koja mogu delovati kao inhibitori za korak fermentacije i/ili hidrolize. Korak ispiranja može se izvesti na način poznat stručnjaku. Pored ispiranja, postoje i drugi postupci detoksikacije. Lignocelulozni materijal se takođe može detoksikovati bilo kojim (ili bilo kojom kombinacijom) od ovih postupaka koji uključuju, ali nisu ograničeni na, razdvajanje čvrste/tečne materije, vakuumsko isparavanje, ekstrakciju, adsorpciju, neutralizaciju, preklapanje, dodavanje redukcionih sredstava, dodavanje enzima za detoksikaciju kao što su lakaze ili peroksidaze, dodavanje mikroorganizama sposobnih za detoksikaciju hidrolizata.
[0121] Kompozicija enzima koja se koristi u postupku kao što je ovde opisan može izuzetno efikasno da hidrolizuje lignocelulolitički materijal, na primer kukuruznu slamu, pšeničnu slamu, slamu od trske i/ili bagasu šećerne trske, koja se zatim može dalje pretvoriti u proizvod, kao što je etanol, biogas, butanol, plastika, organska kiselina, rastvarač, dodatak hrani za životinje, farmaceutski proizvod, vitamin, aminokiselina, enzim ili hemijska sirovina. Pored toga, intermedijarni proizvodi iz postupka koji sledi nakon hidrolize, na primer mlečna kiselina kao intermedijer u proizvodnji biogasa, mogu se koristiti kao gradivni blok za druge materijale.
[0122] U jednom aspektu, količina dodatog enzima (ovde se takođe naziva doza enzima ili opterećenje enzima) je niska. U jednom aspektu, količina enzima je 0.1 - 10 mg proteina/g suve materije.
[0123] pH tokom enzimske hidrolize prethodno obrađenog lignoceluloznog materijala je 4 do 6. Temperatura tokom enzimske hidrolize prethodno obrađenog lignoceluloznog materijala je 50°C do 65°C, poželjno 55°C do 65°C.
[0124] Korak hidrolize se može izvoditi sve dok se ne oslobodi 70% - 90%, poželjno 70% -95%, poželjnije 70% - 100% dostupnog šećera u lignoceluloznom materijalu.
2
[0125] Enzimska hidroliza postupka kako je ovde opisan se izvodi korišćenjem prethodno obrađenog lignoceluloznog materijala koji ima težinu suve materije od 15 do 25% (tež./tež.).
[0126] Kao što je gore opisan, ovaj pronalazak se takođe odnosi na postupak za pripremu proizvoda fermentacije od lignoceluloznog materijala, koji sadrži korake (a) izvođenja postupka za pripremu šećernog proizvoda od lignoceluloznog materijala kao što je gore opisan, (b) fermentacije šećernog proizvoda da bi se dobio proizvod fermentacije; i (c) izborno, izolaciju proizvoda fermentacije. Kao što je gore opisano, šećerni proizvod se takođe može nazvati hidrolizovanim lignoceluloznim materijalom.
[0127] Fermentacija se može obaviti u reaktoru. U jednom primeru izvođenja, fermentacija se takođe može obaviti u dva, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet, deset ili čak više reaktora. Dakle, termin "reaktor" nije ograničen na jedan reaktor, već može značiti više reaktora.
[0128] Fermentacija se može obaviti u reaktoru zapremine od 1 - 5000 m<3>. U slučaju da se više reaktora koristi u fermentaciji postupaka kao što su ovde opisani, oni mogu imati istu zapreminu, ali takođe mogu imati različitu zapreminu.
[0129] U jednom primeru izvođenja, reaktor u kome se izvodi fermentacija ima odnos visine i prečnika od 2:1 do 8:1.
[0130] Fermentaciju može obaviti mikroorganizam koji proizvodi alkohol da bi proizveo alkohol. Fermentacija mikroorganizmom koji proizvodi alkohol da bi se proizveo alkohol može se obaviti u istom reaktoru u kome se izvodi hidroliza. Poželjno je da se fermentacija mikroorganizmom koji proizvodi alkohol radi proizvodnje alkohola izvodi u posebnom reaktoru.
[0131] U jednom primeru izvođenja, fermentaciju izvodi kvasac. U jednom primeru izvođenja mikroorganizam koji proizvodi alkohol je kvasac. U jednom primeru izvođenja, mikroorganizam koji proizvodi alkohol je u stanju da fermentiše najmanje C5 šećer i najmanje C6 šećer. U jednom primeru izvođenja, fermentacija se izvodi sa kvascem koji je u stanju da pretvori najmanje jedan C5 šećer. U jednom primeru izvođenja, prijava se odnosi na postupak za pripremu proizvoda fermentacije od lignoceluloznog materijala, koji sadrži sledeće korake: (a) prethodni tretman lignoceluloznog materijala na temperaturi od 160°C do 200°C pri pH od 1.0 do 2.5 od 1 do 15 minuta; (b) enzimsku hidrolizu prethodno tretiranog lignoceluloznog materijala koji ima težinu suve materije od 15 do 25% (tež./tež.) na temperaturi od 50°C do 65°C i pH od 4 do 6 tokom 40 sati do 150 sati koristeći ceo fermentacioni bujon filamentozne gljive, pri čemu pomenuti bujon sadrži najmanje celobiohidrolazu, endoglukanazu, betaglukozidazu, ksilanazu, beta-ksilozidazu i litičku polisaharid monooksigenazu, da bi se dobio hidrolizovan lignocelulozni materijal; (c) fermentaciju hidrolizovanog lignoceluloznog
2
materijala da bi se dobio proizvod fermentacije; i (d) izborno, izolaciju proizvoda fermentacije, pri čemu hidrolizovani lignocelulozni materijal sadrži glukozu, galaktozu i arabinozu. U jednom primeru izvođenja, hidrolizovani lignocelulozni materijal sadrži sirćetnu kiselinu, poželjno 0.3% (tež./tež.) ili više. U jednom primeru izvođenja hidrolizovani lignocelulozni materijal sadrži glicerol. U jednom primeru izvođenja hidrolizovani lignocelulozni materijal sadrži sirćetnu kiselinu, glicerol i C6 šećer i/ili C5 šećer. U jednom primeru izvođenja, mikroorganizam koji se koristi za fermentaciju fermentiše sirćetnu kiselinu, glicerol i C6 šećer i/ili C5 šećer u proizvod fermentacije. U jednom primeru izvođenja, kvasac koji se koristi za fermentaciju fermentiše sirćetnu kiselinu, glicerol i C6 šećer i/ili C5 šećer u proizvod fermentacije. U jednom primeru izvođenja, kvasac koji se koristi za fermentaciju fermentiše sirćetnu kiselinu, glicerol i C6 šećer i/ili C5 šećer u etanol. U jednom primeru izvođenja hidrolizovani lignocelulozni materijal sadrži Mn<2+>.
[0132] U dodatnom aspektu, prijava uključuje postupak kao što je ovde opisan u kome se mikroorganizam koristi za fermentaciju izvora ugljenika koji sadrži šećer(e), npr. glukozu, L-arabinozu, galaktozu i/ili ksilozu. Izvor ugljenika može uključivati bilo koji ugljeni hidrat oligoili polimer koji sadrži L-arabinozu, galaktozu, ksilozu ili jedinice glukoze, kao što su npr. lignoceluloza, ksilani, celuloza, skrob, arabinan i slično. Za oslobađanje jedinica ksiloze ili glukoze iz takvih ugljenih hidrata, odgovarajuće karbohidraze (kao što su ksilanaze, glukanaze, amilaze i slično) mogu da se dodaju medijumu za fermentaciju ili mogu biti proizvedene od strane modifikovane ćelije domaćina. U poslednjem slučaju, modifikovana ćelija domaćin može biti genetski modifikovana da proizvodi i izlučuje takve ugljene hidrate. Dodatna prednost korišćenja oligo- ili polimernih izvora glukoze je to što omogućava održavanje niske(niže) koncentracije slobodne glukoze tokom fermentacije, npr. upotrebom količina karbohidraza koje ograničavaju brzinu. Ovo će zauzvrat sprečiti potiskivanje sistema potrebnih za metabolizam i transport neglukoznih šećera kao što je ksiloza. U jednom primeru izvođenja, modifikovana ćelija domaćina fermentira i L-arabinozu (opciono ksilozu) i glukozu, poželjno istovremeno, u kom slučaju se poželjno koristi modifikovana ćelija domaćina koja je neosetljiva na suzbijanje glukoze da bi se sprečio dijauksički rast. Pored izvora L-arabinoze, izborno ksiloze (i glukoze) kao izvora ugljenika, medijum za fermentaciju će dalje sadržati odgovarajući sastojak potreban za rast modifikovane ćelije domaćina.
[0133] Postupak fermentacije može biti aerobni ili anaerobni postupak fermentacije. Postupak anaerobne fermentacije je ovde definisan kao postupak fermentacije koji se odvija u odsustvu kiseonika ili u kome se kiseonik praktično ne troši, poželjno manje od 5, 2.5 ili 1 mmol/L/h, poželjnije 0 mmol/L/h. (tj. potrošnja kiseonika se ne može detektovati), a pri čemu organski
2
molekuli služe i kao donori elektrona i kao akceptori elektrona. U nedostatku kiseonika, NADH proizveden u glikolizi i formiranju biomase, ne može se oksidovati oksidativnom fosforilacijom. Da bi rešili ovaj problem, mnogi mikroorganizmi koriste piruvat ili jedan od njegovih derivata kao akceptor elektrona i vodonika i na taj način regenerišu NAD<+>. Dakle, u poželjnom postupku anaerobne fermentacije piruvat se koristi kao elektron (i akceptor vodonika) i redukuje se do proizvoda fermentacije kao što su etanol, mlečna kiselina, 3-hidroksi-propionska kiselina, akrilna kiselina, sirćetna kiselina, ćilibarna kiselina, limunska kiselina, jabučna kiselina, fumarna kiselina, aminokiselina, 1,3-propan-diol, etilen, glicerol, butanol, β-laktamski antibiotici i cefalosporin. U poželjnom primeru izvođenja, postupak fermentacije je anaeroban. Anaerobni postupak je povoljan jer je jeftiniji od aerobnih postupaka: potrebno je manje specijalne opreme. Pored toga, očekuje se da će anaerobni postupci dati veći prinos proizvoda od aerobnih postupaka. U aerobnim uslovima, obično je prinos biomase veći nego u anaerobnim uslovima. Kao posledica toga, obično u aerobnim uslovima, očekivani prinos proizvoda je manji nego u anaerobnim uslovima.
[0134] U sledećem aspektu, postupak fermentacije je u uslovima ograničenim kiseonikom. Poželjnije, postupak fermentacije je aeroban i pod uslovima ograničenim kiseonikom. Postupak fermentacije ograničen kiseonikom je postupak u kome je potrošnja kiseonika ograničena prenosom kiseonika iz gasa u tečnost. Stepen ograničenja kiseonika je određen količinom i sastavom ulaznog toka gasa, kao i stvarnim svojstvima mešanja/prenosa mase korišćene opreme za fermentaciju. Poželjno, u postupku pod uslovima ograničenim kiseonikom, brzina potrošnje kiseonika je najmanje 5.5, poželjnije najmanje 6 i još poželjnije najmanje 7 mmol/L/h. U primeru izvođenja fermentacija je anaerobna.
[0135] Poželjno je da se postupak fermentacije odvija na temperaturi koja je optimalna za korišćeni mikroorganizam. Dakle, za većinu ćelija kvasca ili gljiva, postupak fermentacije se izvodi na temperaturi koja je niža od 42°C, poželjno 38°C ili niža. Za ćelije domaćina kvasca ili filamentoznih gljiva, postupak fermentacije se poželjno izvodi na temperaturi koja je niža od 35, 33, 30 ili 28°C i na temperaturi koja je viša od 20, 22 ili 25°C. U jednom primeru izvođenja, fermentacija se izvodi između 25°C i 35°C.
[0136] U jednom primeru izvođenja, fermentacije se izvode sa fermentirajućim mikroorganizmom. U jednom primeru izvođenja pronalaska, alkoholna (npr. etanolska) fermentacija C5 šećera se sprovodi sa C5 fermentirajućim mikroorganizmom. U jednom primeru izvođenja pronalaska, alkoholne (npr., etanolske) fermentacije C6 šećera se sprovode sa C5 fermentirajućim mikroorganizmom ili komercijalnim C6 fermentirajućim mikroorganizmom. Komercijalno dostupan kvasac pogodan za proizvodnju etanola uključuje,
2
ali nije ograničen na, BIOFERM<™>AFT i XR (NABC-North American Bioproducts Corporation, GA, SAD), ETHANOL RED<™>kvasac (Fermentis/Lesaffre, SAD), FALI<™>(Fleischmann's Yeast, SAD), FERMIOL<™>(DSM Specialties), GERT STRAND<™>(Gert Strand AB, Švedska) i SUPERSTART<™>i THERMOSACC<™>svež kvasac (Ethanol Technology, WI, SAD).
[0137] U jednom primeru izvođenja, mikroorganizam koji proizvodi alkohol je mikroorganizam koji je u stanju da fermentiše najmanje jedan C5 šećer. Poželjno, takođe može da fermentiše najmanje jedan C6 šećer. U jednom primeru izvođenja, prijava opisuje postupak za pripremu etanola od lignoceluloznog materijala, koji sadrži korake (a) izvođenja postupka za pripremu proizvoda šećera od lignoceluloznog materijala kao što je gore opisan, (b) fermentaciju proizvoda od šećera do proizvodi etanol; i (c) izborno, izolaciju etanola. Fermentacija se može obaviti sa kvascem koji je u stanju da fermentiše najmanje jedan C5 šećer.
[0138] Mikroorganizam koji se koristi u fermentaciji može biti prokariotski ili eukariotski organizam. Korišćeni mikroorganizam može biti genetski modifikovan mikroorganizam. Primeri pogodnih mikroorganizama su kvasci, na primer Saccharomyces, npr. Saccharomyces pastorianus ili Saccharomyces uvarum, Hansenula, Issatchenkia, npr. Issatchenkia orientalis, Pichia, npr. Pichia stipites ili Pichia pastoris, Kluyveromyces, npr. Kluyveromyces fagilis, Candida, npr. Candida pseudotropicalis ili Candida acidothermophilum, Pachysolen, npr. Pachysolen tannophilus ili bakterije, na primer Lactobacillus, npr. Lactobacillus lactis, Geobacillus, Zymomonas, npr. Zymomonas mobilis, Clostridium, npr. Clostridium phytofermentans, Escherichia, npr. E. coli, Klebsiella, npr. Klebsiella oxytoca. U jednom primeru izvođenja mikroorganizam koji je u stanju da fermentiše najmanje jedan C5 šećer je kvasac. U jednom primeru izvođenja, kvasac pripada rodu Saccharomyces, poželjno od vrste Saccharomyces cerevisiae. kvasac, npr. Saccharomyces cerevisiae, koji se koristi u postupcima kako su ovde opisan je sposoban da konvertuje heksozne (C6) šećere i pentozne (C5) šećere. Kvasac, npr. Saccharomyces cerevisiae, koji se koristi u postupcima kako su ovde opisani može anaerobno fermentisati najmanje jedan C6 šećer i najmanje jedan C5 šećer. U jednom primeru izvođenja, kvasac kako je ovde opisan je sposoban da koristi L-arabinozu i ksilozu pored glukoze anaerobno. U jednom primeru izvođenja, kvasac je sposoban da konvertuje L-arabinozu u L-ribulozu i/ili ksiluloza 5-fosfat i/ili u željeni proizvod fermentacije, na primer u etanol. Organizmi, na primer sojevi Saccharomyces cerevisiae, sposobni da proizvode etanol iz L-arabinoze, mogu se proizvesti modifikacijom kvasca domaćina uvođenjem araA (L-arabinoza izomeraze), araB (L-ribuloglioksalata) i araD (L-ribuloza-5-P4-epimeraze) gena iz odgovarajućeg izvora. Takvi geni se mogu uvesti u ćeliju domaćina da bi ona bila sposobna da koristi arabinozu. Takav pristup je dat kao što je opisano u WO2003/095627. araA, araB i araD geni iz Lactobacillus plantarum mogu se koristiti i otkriveni su u WO2008/041840. araA gen iz Bacillus subtilis i araB i araD geni iz Escherichia coli mogu se koristiti i otkriveni su u EP1499708. U sledećem primeru izvođenja, araA, araB i araD geni mogu biti izvedeni iz najmanje jednog roda Clavibacter, Arthrobacter i/ili Gramella, posebno jedan od Clavibacter michiganensis, Arthrobacter aurescens, i/ili Gramella forsetii, kako je otkriveno u WO 2009011591. U jednom primeru izvođenja, kvasac može takođe da sadrži jednu ili više kopija gena ksiloza izomeraze i/ili jednu ili više kopija ksiloza reduktaze i/ili ksilitol dehidrogenaze.
[0139] Kvasac može da sadrži jednu ili više genetskih modifikacija da bi se omogućilo kvascu da fermentiše ksilozu. Primeri genetskih modifikacija su uvođenje jednog ili više xylA-gena, XYL1 gena i XYL2 gena i/ili XKS1-gena; delecija gena za aldoza reduktazu (GRE3); prekomerna ekspresija PPP-gena TAL1, TKL1, RPE1 i RKI1 da bi se omogućilo povećanje protoka kroz pentozofosfatni put u ćeliji. Primeri genetski modifikovanog kvasca su opisani u EP1468093 i/ili WO2006/009434.
[0140] Primer odgovarajućeg komercijalnog kvasca je RN1016 koji je soj Saccharomyces cerevisiae koji fermentiše ksilozu i glukozu iz DSM, Holandija.
[0141] U jednom aspektu, postupak fermentacije za proizvodnju etanola je anaeroban. Anaerobno je već ranije definisano. U sledećem aspektu, postupak fermentacije za proizvodnju etanola je aeroban. U sledećem aspektu, postupak fermentacije za proizvodnju etanola je u uslovima ograničenim kiseonikom, npr. aerobno i pod uslovima sa ograničenim kiseonikom. Uslovi ograničeni kiseonikom su već ranije definisani.
[0142] Alternativno, gore opisanim postupcima fermentacije, mogu se koristiti najmanje dve različite ćelije, što znači da ovaj postupak je postupak kofermentacije. Svi aspekti postupka kao što je gore opisan su takođe aspekti ovog postupka kofermentacije: identitet proizvoda fermentacije, identitet izvora L-arabinoze i izvora ksiloze, uslovi fermentacije (aerobni ili anaerobni uslovi, uslovi ograničeni kiseonikom, temperatura na kojoj se odvija postupak, produktivnost etanola, prinos etanola).
[0143] Proizvodi fermentacije koji se mogu proizvesti postupcima pronalaska mogu biti bilo koja supstanca dobijena fermentacijom. Oni uključuju, ali nisu ograničeni na, alkohol (kao što su arabinitol, butanol, etanol, glicerol, metanol, 1,3-propandiol, sorbitol i ksilitol); organsku kiselinu (kao što su sirćetna kiselina, acetonska kiselina, adipinska kiselina, askorbinska kiselina, akrilna kiselina, limunska kiselina, 2,5-diketo-D-glukonska kiselina, mravlja kiselina, fumarna kiselina, glukarna kiselina, glukonska kiselina, glukuronska kiselina, glutarna kiselina
1
kiselina, 3-hidroksipropionska kiselina, itakonska kiselina, mlečna kiselina, maleinska kiselina, jabučna kiselina, malonska kiselina, oksalna kiselina, oksalosirćetna kiselina, propionska kiselina, ćilibarna kiselina i ksilonska kiselina); ketone (kao što je aceton); aminokiseline (kao što su asparaginska kiselina, glutaminska kiselina, glicin, lizin, serin, triptofan i treonin); alkane (kao što su pentan, heksan, heptan, oktan, nonan, dekan, undekan i dodekan), cikloalkane (kao što su ciklopentan, cikloheksan, cikloheptan i ciklooktan), alkene (kao što su penten, heksen, ciklohepten); i gasove (kao što su metan, vodonik (H2), ugljen-dioksid (CO2), i ugljen monoksid (CO)). Proizvod fermentacije takođe može biti protein, vitamin, farmaceutski proizvod, dodatak hrani za životinje, specijalna hemikalija, hemijska sirovina, plastika, rastvarač, etilen, enzim, kao što je proteaza, celulaza, amilaza, glukanaza, laktaza, lipaza, liaza, oksidoreduktaza, transferaza ili ksilanaza. Poželjno, alkohol se priprema u postupcima fermentacije kako su ovde opisani. Poželjno, etanol se priprema u postupcima fermentacije kako su ovde opisani.
[0144] Postupci kako su ovde opisani mogu da sadrže izolaciju svih vrsta proizvoda napravljenih tokom postupka uključujući proizvode fermentacije kao što je etanol. Proizvod fermentacije može se odvojiti od fermentacionog bujona na način koji je stručnjaku poznat. Primeri tehnika za dobijanje uključuju, ali nisu ograničeni na, hromatografiju, elektroforetske postupke, diferencijalnu rastvorljivost, destilaciju ili ekstrakciju. Za svaki proizvod fermentacije stručnjak će tako moći da izabere odgovarajuću tehniku razdvajanja. Na primer, etanol se može odvojiti od fermentacionog bujona kvasca destilacijom, na primer destilacijom vodenom parom/vakuumskom destilacijom na konvencionalni način.
[0145] Postupci kako su ovde opisani takođe proizvode energiju, toplotu, električnu energiju i/ili paru.
PRIMERI
Primer 1
Uslovi za prethodni tretman i enzimsku hidrolizu lignoceluloznog materijala
[0146] Kukuruzni stover (sa sastavom na bazi suve materije od 36.5% (tež./tež.) glukana, 0.2% (tež./tež.) manana, 1.0% (tež./tež.) galaktana, 2.3% (tež./tež.) arabinana, 19.4% (tež./tež.) ksilana, 2.9% (tež./tež.) acetila i 0.6% (tež./tež.) formila) su osušeni u pećnici na 40°C pod vakuumom do sadržaja vlage od 9.3% (tež./tež.). Nakon toga, osušeni materijal je mleven u čestice <2 mm i samleveni materijal je korišćen za dalje eksperimente.
2
[0147] Šipka za mešanje, 0.83 grama mlevenog osušenog kukuruznog stovera (= 0.75 grama suve težine) i 9.17 grama rastvora sumporne kiseline ili vode dodati su u bočice od 20 ml, što je rezultiralo koncentracijom kukuruznog stovera od 7.5% (tež./tež.). Bočice su čuvane preko noći i nakon toga podvrgnute koraku prethodnog tretmana korišćenjem mikrotalasa (Biotage Initiator 2.0 Microwave sintetizer) pod sledećim uslovima:
Tabela 1: Uslovi prethodnog tretmana.
[0148] Nakon prethodnog tretmana, uzorci su podvrgnuti enzimskoj hidrolizi. Bočice koje su korišćene za postupke prethodnog tretmana su otvorene i njihov sadržaj je prebačen u epruvetu za centrifugiranje od 40 ml. Nakon toga, pH prethodno tretiranih uzoraka je podešen na pH 4.5 korišćenjem 2 M rastvora NaOH. Dodati rastvor ukupne zapremine NaOH je korišćen za korekciju konačnog sadržaja suve materije u svakoj epruveti (različito prethodno tretirani uzorci zahtevali su različite zapremine 2M NaOH da bi se pH podesio na 4.5 u rasponu od 0.05 ml do 0.5 ml). Sledeće, Talaromyces emersonii celulazni koktel (tj. ceo fermentacioni bujon) koji sadrži 2.0% Talaromyces emersonii beta-glukozidaza na ukupnom proteinu (tež./tež.) je dodata konačnoj dozi od 30 mg proteina po gramu suve materije. Koktel je proizveden u skladu sa postupcima inokulacije i fermentacije opisanim u WO 2011/000949. Koncentracija proteina u koktelu određena je metodom TCA-biureta. Ukratko, napravljena su razblaženja goveđeg serumskog albumina (BSA) (0, 1, 2, 5, 8 i 10 mg/ml) da bi se napravila kalibraciona kriva. Pored toga, razblaženja koktela su napravljena vodom. Od svakog razblaženog uzorka (BSA i koktela), 270 µl je prebačeno u epruvetu od 10 ml koja sadrži 830 µl 12% (tež./v) rastvora trihlor sirćetne kiseline u acetonu i dobro promešano. Nakon toga, epruvete su inkubirane na ledenoj vodi jedan sat i centrifugirane 30 minuta na 4°C i 6000 rpm. Supernatant je odbačen i pelete su osušene okretanjem epruveta na maramicu i ostavljene da stoje 30 minuta na sobnoj temperaturi. Zatim, 3 ml BioQuant Biuret mešavine reagensa je dodato peletu u epruvetama i pelet je rastvoren posle mešanja, a zatim dodavanjem n x 1 ml vode. Epruvete su temeljno pomešane i inkubirane na sobnoj temperaturi 30 minuta. Apsorpcija smeša je merena na 546 nm i uzorak vode je korišćen kao slepa mera. Za izračunavanje ukupne koncentracije proteina u koktelu preko BSA kalibracione linije korišćena su razblaženja koktela koji su dali vrednost apsorpcije na 546 nm unutar opsega kalibracione linije.
[0149] Centrifugalne epruvete koje sadrže prethodno obrađeni materijal i enzimski koktel su inkubirane u inkubatoru u pećnici na 62°C, uz rotaciju. Nakon inkubacije od 72 sata na pH 4.5, 62°C, dobijeni hidrolizati su centrifugirani i sadržaj glukoze i ksiloze u supernatantu je analiziran korišćenjem sistema tečne hromatografije visokih performansi (Agilent 1100) opremljenog detektorom indeksa refleksije (Agilent 1260 Infinity). Razdvajanje šećera je postignuto korišćenjem Aminex HPX-87P (Bio Rad) kolone od 300 X 7.8 mm koja sadrži Micro Guard Carbo-P (Bio Rad) pre-kolonu. Pokretna faza je bila HPLC voda, brzina protoka je bila 0.6 ml/min i temperatura kolone je bila 85°C. Pre-kolona je držana na sobnoj temperaturi. Zapremina injekcije je bila 10 µl. Uzorci su razblaženi sa HPLC vodom do procenjenog maksimuma od 2 g/l glukoze i filtrirani korišćenjem filtera od 0.2 µm (Afridisc LC25mm filter za špric PVDF membrana). Sadržaj glukoze i ksiloze je identifikovan prema vremenu zadržavanja i kvantitativno određen preko kalibracione krive glukoze i ksiloze generisane sa standardima glukoze (D-(+)-glukoza, Sigma) u rasponu od 0.2; 0.4; 1.0; 2.0 g/l i standardima ksiloze (ksiloza, Sigma) u rasponu od 0.2; 0.4; 1.0; 2.0 g/l. Rezultati su prikazani u tabeli 2.
Tabela 2: Glukan, ksilan i ukupna konverzija.
Broj Konverzija glukana u Konverzija ksilana u Ukupna konverzija uzorka glukozu (mol%) ksilozu (mol%) biomase u šećere
4
Tabela 3: Gubitak ksilana usled razgradnje u furfural.
[0150] Podaci u Tabeli 2 pokazuju da je izvođenje postupka sa uslovima prethodnog tretmana i hidrolize prema ovom pronalasku (videti uzorke 1-3) rezultiralo većim stopama konverzije nego kada je postupak izveden sa različitim uslovima prethodnog tretmana i hidrolize (videti uzorke 4 -5). Prilikom izvođenja postupka sa prethodno obrađenim lignoceluloznim materijalom koji ima težinu suve materije od 15 do 25% (tež./tež.) razlika u stopama konverzije između postupka koji se izvodi uz prethodni tretman i uslove hidrolize prema ovom pronalasku i postupka koji se izvodi sa različitim uslovima prethodnog tretmana i hidrolize je čak i veća (tj. postupak koji se izvodi sa uslovima prethodnog tretmana i hidrolize prema ovom pronalasku ima veće stope konverzije).
[0151] Podaci u tabeli 3 pokazuju da su manji gubici razgradnje ksilana u furfural uočeni za uzorke koji su bili podvrgnuti postupku sa uslovima prethodnog tretmana i hidrolize prema ovom pronalasku (tj. uzorci 1-3) u poređenju sa uzorcima koji su bili podvrgnuti različitim uslovima prethodnog tretmana i hidrolize (tj. uzorci 4-5). Najmanji gubitak razgradnje ksilana u furfural se vidi za uzorak 2, tj. uzorak koji je bio podvrgnut prethodnom tretmanu na temperaturi od 170°C do 190°C i pH od 1.9 do 2.2 tokom 2.5 do 6 minuta.

Claims (10)

Patentni zahtevi
1. Postupak za pripremu šećernog proizvoda od lignoceluloznog materijala, koji sadrži sledeće korake:
a) prethodni tretman lignoceluloznog materijala na temperaturi od 170°C do 190°C pri pH od 1.9 do 2.2 u trajanju od 2.5 do 6 minuta;
b) enzimsku hidrolizu prethodno obrađenog lignoceluloznog materijala koji ima težinu suve materije od 15 do 25% (tež./tež.) na temperaturi od 50°C do 65°C i pH od 4 do 6 tokom 40 sati do 150 sati upotrebom celog fermentacionog bujona filamentozne gljive, pri čemu pomenuti bujon sadrži najmanje celobiohidrolazu, endoglukanazu, betaglukozidazu, ksilanazu, beta-ksilozidazu i litičku polisaharid monooksigenazu; i c) izborno, izolaciju šećernog proizvoda.
2. Postupak za pripremu proizvoda fermentacije od lignoceluloznog materijala, koji sadrži sledeće korake:
a) prethodni tretman lignoceluloznog materijala na temperaturi od 170°C do 190°C pri pH od 1.9 do 2.2 u trajanju od 2.5 do 6 minuta;
b) enzimsku hidrolizu prethodno tretiranog lignoceluloznog materijala koji ima težinu suve materije od 15 do 25% (tež./tež.) na temperaturi od 50°C do 65°C i pH od 4 do 6 tokom 40 sati do 150 sati koristeći ceo fermentacioni bujon filamentozne gljive, pri čemu pomenuti bujon sadrži najmanje celobiohidrolazu, endoglukanazu, betaglukozidazu, ksilanazu, beta-ksilozidazu i litičku polisaharid monooksigenazu, da bi se dobio hidrolizovan lignocelulozni materijal;
c) fermentaciju hidrolizovanog lignoceluloznog materijala da bi se proizveo proizvod fermentacije; i
d) izborno, izolaciju proizvoda fermentacije.
3. Postupak prema patentnom zahtevu 1 ili 2, naznačen time što se tokom enzimske hidrolize kiseonik dodaje prethodno tretiranom lignoceluloznom materijalu.
4. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3, naznačen time što se enzimska hidroliza izvodi u reaktoru zapremine 10 - 5000 m<3>.
5. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4, naznačen time što se enzimska hidroliza izvodi na temperaturi od 55°C do 65°C.
6. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 2 do 5, naznačen time što se fermentacija izvodi sa kvascem koji je u stanju da konvertuje najmanje jedan C5 šećer.
7. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 6, naznačen time što se prethodni tretman izvodi u reaktoru zapremine 30 - 200 m<3>.
8. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 7, naznačen time što reaktor za prethodni tretman ima odnos visine i prečnika od 3:1 do 12:1.
9. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 8, naznačen time što se enzimska hidroliza izvodi u reaktoru koji ima odnos visine i prečnika od 2:1 do 8:1.
10. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 2 do 9, naznačen time što se fermentacija izvodi u reaktoru koji ima odnos visine i prečnika od 2:1 do 8:1.
Izdaje i štampa: Zavod za intelektualnu svojinu, Beograd, Kneginje Ljubice 5
RS20240359A 2017-10-09 2018-10-08 Postupak enzimske hidrolize lignoceluloznog materijala i fermentacije šećera RS65333B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP17195379 2017-10-09
PCT/EP2018/077255 WO2019072732A1 (en) 2017-10-09 2018-10-08 PROCESS FOR ENZYMATIC HYDROLYSIS OF LIGNOCELLULOSIC MATERIAL AND FERMENTATION OF SUGARS
EP18782449.5A EP3695001B1 (en) 2017-10-09 2018-10-08 Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS65333B1 true RS65333B1 (sr) 2024-04-30

Family

ID=60043058

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20240359A RS65333B1 (sr) 2017-10-09 2018-10-08 Postupak enzimske hidrolize lignoceluloznog materijala i fermentacije šećera

Country Status (15)

Country Link
US (1) US11319559B2 (sr)
EP (1) EP3695001B1 (sr)
CN (1) CN111225982A (sr)
CA (1) CA3075592A1 (sr)
DK (1) DK3695001T3 (sr)
ES (1) ES2974426T3 (sr)
FI (1) FI3695001T3 (sr)
HR (1) HRP20240435T1 (sr)
HU (1) HUE065658T2 (sr)
LT (1) LT3695001T (sr)
PL (1) PL3695001T3 (sr)
PT (1) PT3695001T (sr)
RS (1) RS65333B1 (sr)
SI (1) SI3695001T1 (sr)
WO (1) WO2019072732A1 (sr)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SG10201907529RA (en) * 2019-08-15 2021-03-30 Ngee Ann Polytechnic Talaromyces pinophilus strain for producing cellulolytic enzymes

Family Cites Families (101)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5776757A (en) 1988-03-24 1998-07-07 Novo Nordisk A/S Fungal cellulase composition containing alkaline CMC-endoglucanase and essentially no cellobiohydrolase and method of making thereof
US5275944A (en) 1989-09-26 1994-01-04 Midwest Research Institute Thermostable purified endoglucanas from acidothermus cellulolyticus ATCC 43068
US5536655A (en) 1989-09-26 1996-07-16 Midwest Research Institute Gene coding for the E1 endoglucanase
US5110735A (en) 1989-09-26 1992-05-05 Midwest Research Institute Thermostable purified endoglucanase from thermophilic bacterium acidothermus cellulolyticus
DK115890D0 (da) 1990-05-09 1990-05-09 Novo Nordisk As Enzym
DK0562003T4 (en) 1990-12-10 2015-07-13 Danisco Us Inc Improved saccharification of cellulose by cloning and amplification of.-Glucosidase gene from Tricodermareesei
NL9201481A (nl) * 1992-08-20 1994-03-16 Dsm Nv Werkwijze voor de verwijdering van teer uit een fenolbereidingsproces.
EP0695349B1 (en) 1993-03-10 2004-01-21 Novozymes A/S Enzymes with xylanase activity from aspergillus aculeatus
US20030044956A1 (en) 1995-08-23 2003-03-06 Short Jay M. Enzymes having carboxymethyl cellulase activity and methods of use thereof
US6451063B1 (en) 1996-09-25 2002-09-17 Genencor International, Inc. Cellulase for use in industrial processes
US6017870A (en) 1996-10-09 2000-01-25 Genencor International, Inc. Purified cellulase and method of producing
US7883872B2 (en) 1996-10-10 2011-02-08 Dyadic International (Usa), Inc. Construction of highly efficient cellulase compositions for enzymatic hydrolysis of cellulose
US5811381A (en) 1996-10-10 1998-09-22 Mark A. Emalfarb Cellulase compositions and methods of use
US6558937B1 (en) 1997-07-31 2003-05-06 Dsm N.V. Cellulose degrading enzymes of aspergillus
US5871550A (en) 1997-08-26 1999-02-16 Genencor International, Inc. Mutant Thermonospora spp. cellulase
CA2309886A1 (en) 1997-11-19 1999-05-27 Genencor International, Inc. Cellulase produced by actinomycetes and method of producing same
DE69836227T2 (de) 1997-12-16 2007-08-23 Genencor International, Inc., Palo Alto Verfahren zur herstellung egiii-ähnlicher enzyme
AU5279100A (en) 1999-05-19 2000-12-05 Midwest Research Institute E1 endoglucanase variants y245g, y82r and w42r
PT1621628E (pt) 2000-03-20 2011-09-01 Basf Se Beta-glucanases do talaromyces emersonii
CA2422748C (en) 2000-09-21 2011-08-09 Dsm N.V. Talaromyces xylanases
CN1509330A (zh) 2001-05-18 2004-06-30 ŵ��ø�ɷ����޹�˾ 具有纤维二糖酶活性的多肽和编码其的多核苷酸
US6982159B2 (en) 2001-09-21 2006-01-03 Genencor International, Inc. Trichoderma β-glucosidase
US7045332B2 (en) 2001-12-18 2006-05-16 Genencor International, Inc. BGL4 β-glucosidase and nucleic acids encoding the same
US7045331B2 (en) 2001-12-18 2006-05-16 Genencor International, Inc. EGVII endoglucanase and nucleic acids encoding the same
US7056721B2 (en) 2001-12-18 2006-06-06 Genencor International, Inc. EGVI endoglucanase and nucleic acids encoding the same
US7005289B2 (en) 2001-12-18 2006-02-28 Genencor International, Inc. BGL5 β-glucosidase and nucleic acids encoding the same
US7049125B2 (en) 2001-12-18 2006-05-23 Genencor International, Inc. EGVIII endoglucanase and nucleic acids encoding the same
EP1468093B2 (en) 2002-01-23 2018-01-24 DSM IP Assets B.V. Fermentation of pentose sugars
SE0202090D0 (sv) 2002-05-08 2002-07-04 Forskarpatent I Syd Ab A modifierd yeast consuming L-arabinose
US7972832B2 (en) 2002-08-16 2011-07-05 Danisco Us Inc. Variant Hypocrea jecorina CBH1 cellulases
US7582462B2 (en) 2002-11-07 2009-09-01 Danisco Us Inc., Genencor Division BGL6 beta-glucosidase and nucleic acids encoding the same
US7407788B2 (en) 2002-11-21 2008-08-05 Danisco A/S, Genencor Division BGL7 beta-glucosidase and nucleic acids encoding the same
CN1898381B (zh) 2003-03-21 2013-07-17 金克克国际有限公司 Cbh1同源物和cbh1纤维素酶变体
WO2005001065A2 (en) 2003-04-01 2005-01-06 Genencor International, Inc. Variant humicola grisea cbh1.1
CA2915553A1 (en) 2003-05-29 2005-01-06 Genencor International, Inc. Trichoderma genes
DK1682656T3 (da) 2003-10-28 2013-11-18 Novozymes Inc Polypeptider med beta-glucosidaseaktivitet og polynukleotider, der koder for dem
DK1713825T3 (da) 2004-01-30 2012-11-05 Novozymes Inc Polypeptider med cellulolytisk forøgende aktivitet og polynukleotider der koder for samme
DK1733033T3 (da) 2004-02-06 2012-09-24 Novozymes Inc Polypeptider med cellulolytisk forbedrende aktivitet og polynukleotider, der koder for disse
WO2006078256A2 (en) 2004-02-12 2006-07-27 Novozymes, Inc. Polypeptides having xylanase activity and polynucleotides encoding same
EP1735447A2 (en) 2004-03-25 2006-12-27 Genencor International, Inc. Cellulase fusion protein and heterologous cellulase fusion construct encoding the same
US8097445B2 (en) 2004-03-25 2012-01-17 Danisco Us Inc. Exo-endo cellulase fusion protein
PL1781772T3 (pl) 2004-07-16 2017-03-31 Dsm Ip Assets B.V. Metaboliczne modyfikowanie fermentujących ksylozę komórek eukariotycznych
EP1838849B1 (en) 2004-12-30 2015-08-26 Danisco US Inc. Variant hypocrea jecorina cbh2 cellulases
AR053066A1 (es) 2005-04-26 2007-04-18 Novozymes As Arabinofuranosidasas
ES2458301T3 (es) 2005-04-29 2014-04-30 Ab Enzymes Oy Celulasas mejoradas
CN101287751A (zh) 2005-08-04 2008-10-15 诺维信股份有限公司 具有β-葡糖苷酶活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸
BRPI0616721A2 (pt) 2005-09-30 2011-06-28 Novozymes Inc métodos para degradar ou converter um material celulósico e para produzir uma substáncia, e, composição detergente
EP1969123B1 (en) 2005-12-22 2017-07-12 AB Enzymes Oy Novel enzymes
FI120045B (fi) 2005-12-22 2009-06-15 Roal Oy Selluloosamateriaalin käsittely ja siinä käyttökelpoiset entsyymit
US8304212B2 (en) 2006-07-10 2012-11-06 Dyadic International, Inc. Methods and compositions for degradation of lignocellulosic material
WO2008057637A2 (en) 2006-07-21 2008-05-15 Novozymes, Inc. Methods of increasing secretion of polypeptides having biological activity
WO2008041840A1 (en) 2006-10-02 2008-04-10 Dsm Ip Assets B.V. Metabolic engineering of arabinose- fermenting yeast cells
EP2069489A1 (en) 2007-05-31 2009-06-17 Novozymes, Inc. Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
WO2009011591A2 (en) 2007-07-19 2009-01-22 Royal Nedalco B.V. Novel arabinose-fermenting eukaryotic cells
EP2195421B1 (en) 2007-09-28 2015-09-16 Novozymes A/S Polypeptides having acetylxylan esterase activity and polynucleotides encoding same
US7867745B2 (en) 2007-11-27 2011-01-11 Novozymes A/S Polypeptides having alpha-glucuronidase activity and polynucleotides encoding same
DK2238243T3 (en) 2007-11-30 2019-04-15 Novozymes As Polypeptides with arabinofuranosidase activity and polynucleotides encoding them
US7851193B2 (en) 2007-12-05 2010-12-14 Novozymes A/S Polypeptides having xylanase activity and polynucleotides encoding same
ES2490608T3 (es) 2007-12-06 2014-09-04 Novozymes A/S Polipéptidos con actividad de esterasa de acetilxilano y polinucleótidos que codifican los mismos
EP2225370A1 (en) 2007-12-07 2010-09-08 Novozymes A/S Polypeptides having feruloyl esterase activity and polynucleotides encoding same
CA2709367A1 (en) 2007-12-19 2009-07-09 Novozymes A/S Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
EP2245050A2 (en) 2007-12-19 2010-11-03 Novozymes A/S Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
BRPI0822031A2 (pt) 2007-12-19 2017-06-13 Novozymes As polipeptídeo e polinicleotídeo isolados, construção de ácido nucleico, célula hospedeira recombinante, métodos para produzir o polipeptídeo, um mutante de uma célula precursora, uma proteína e um produto de fermentação, para inibir a expressão de um polipeptídeo, para degradar ou converter um material celulósico, e para fermentar um material celulósico, planta transgênica, parte de planta ou célula de planta, e, molécula de rna inibidora
EP2235173A2 (en) 2007-12-19 2010-10-06 Novozymes A/S Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
WO2009127729A1 (en) 2008-04-17 2009-10-22 Novozymes A/S Polypeptides having ferulic acid esterase activity and polynucleotides encoding same
ES2331505B2 (es) 2008-07-04 2010-09-20 Universidad Politecnica De Valencia Preparacion de carbamatos con catalizadores solidos.
US8735128B2 (en) 2008-07-29 2014-05-27 Novozymes A/S Polypeptides having alpha-glucuronidase activity and polynucleotides encoding same
CA2732099A1 (en) 2008-07-31 2010-02-04 Novozymes A/S Polypeptides having acetylxylan esterase activity and polynucleotides encoding same
US20100044210A1 (en) * 2008-08-20 2010-02-25 The Board Of Regents Of The University Of Texas System METHOD OF DIGESTING CELLULOSE TO GLUCOSE USING SALTS AND MICROWAVE (muWAVE) ENERGY
US8058513B2 (en) 2008-11-10 2011-11-15 Novozymes, Inc. Polypeptides having feruloyl esterase activity and polynucleotides encoding same
WO2010065448A1 (en) 2008-12-04 2010-06-10 Novozymes, Inc. Polypeptides having feruloyl esterase activity and polynucleotides encoding same
US7771983B2 (en) 2008-12-04 2010-08-10 Novozymos, Inc. Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
CN102365360A (zh) 2009-03-24 2012-02-29 诺维信公司 具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸
WO2010122141A1 (en) 2009-04-24 2010-10-28 Dsm Ip Assets B.V. Carbohydrate degrading polypeptide and uses thereof
CN102482680B (zh) 2009-04-30 2014-09-10 诺维信股份有限公司 具有木聚糖酶活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸
EP2435561B1 (en) 2009-05-29 2018-08-08 Novozymes Inc. Methods for enhancing the degradation or conversion of cellulosic material
US20120114797A1 (en) 2009-07-03 2012-05-10 Dsm Ip Assets B.V. Talaromyces strains and enzyme compositions
CA2767169A1 (en) 2009-07-07 2011-01-13 Novozymes, Inc. Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
DK3269804T3 (da) 2009-09-17 2020-11-23 Novozymes Inc Polypeptider med cellulolyseforbedrende aktivitet og polynukleotider, som koder for dem
EP2478095A1 (en) 2009-09-18 2012-07-25 Novozymes Inc. Polypeptides having beta-glucosidase activity and polynucleotides encoding same
WO2011041397A1 (en) 2009-09-29 2011-04-07 Novozymes, Inc. Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
CA2775347A1 (en) 2009-09-29 2011-04-07 Novozymes A/S Polypeptides having xylanase activity and polynucleotides encoding same
BR112012007375A2 (pt) 2009-09-30 2016-11-22 Novozymes As polipeptídeo isolado, polinucleotídeo isolado, métodos para produzir um polipeptídeo, para produzir um mutante de uma célula precursora, para inibir a expressão de um polipeptídeo, para produzir uma proteína, para degradar ou converter um material celulósico, para produzir um produto de fermentação e para fermentar um material celulósico, planta transgênica, parte de planta ou célula de planta transformada, molécula de rna inibitória de filamento duplo, e, composição detergente
WO2011039319A1 (en) 2009-09-30 2011-04-07 Novozymes A/S Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
DK3222716T3 (da) 2009-11-06 2020-11-16 Novozymes Inc Sammensætninger til saccharificering af cellulosemateriale
DK2496692T3 (en) 2009-11-06 2016-06-27 Novozymes Inc POLYPEPTIDES WITH xylanase AND POLYNUCLEOTIDES ENCODING THEM
AU2011214327B2 (en) 2010-02-11 2014-09-18 Dsm Ip Assets B.V. Polypeptide having cellobiohydrolase activity and uses thereof
PL2588492T3 (pl) 2010-06-29 2016-09-30 Polipeptyd mający aktywność beta-glukozydazy i jego zastosowania
EP2588603B1 (en) 2010-06-29 2017-03-22 DSM IP Assets B.V. Polypeptide having or assisting in carbohydrate material degrading activity and uses thereof
MX2013002586A (es) 2010-10-01 2013-03-21 Novozymes Inc Variantes de beta-glucosidasa y polinucleotidos que codifican las mismas.
US9879294B2 (en) * 2011-03-25 2018-01-30 Novozymes A/S Methods for degrading or converting cellulosic material
MY176707A (en) * 2012-11-09 2020-08-19 Dsm Ip Assets Bv Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
CN104854074A (zh) * 2012-12-07 2015-08-19 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 生产生物质水解物的方法
EP3686280B1 (en) 2013-02-04 2022-06-22 DSM IP Assets B.V. Carbohydrate degrading polypeptide and uses thereof
EP3848469A1 (en) 2013-02-21 2021-07-14 Novozymes A/S Methods of saccharifying and fermenting a cellulosic material
EA035212B1 (ru) * 2014-04-30 2020-05-18 ДСМ АйПи АССЕТС Б.В. Способ ферментативного гидролиза лигноцеллюлозного материала и ферментации сахаров
EP3152315B1 (en) 2014-06-06 2018-08-15 Novozymes A/S Enzyme compositions and uses thereof
PL3209787T3 (pl) * 2014-10-21 2022-04-04 Dsm Ip Assets B.V. Sposób enzymatycznej hydrolizy materiału lignocelulozowego i fermentacji cukrów
US10513721B2 (en) 2015-03-12 2019-12-24 Novozymes A/S Two-stage process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic biomass
DK3268484T3 (da) * 2015-03-12 2020-08-17 Beta Renewables Spa Enzymatisk flertrinshydrolyse af lignocelluloseholdig biomasse
US10150843B2 (en) * 2015-03-17 2018-12-11 Georgia-Pacific LLC Process for liquefaction of lignocellulosic biomass

Also Published As

Publication number Publication date
PT3695001T (pt) 2024-01-26
PL3695001T3 (pl) 2024-05-27
EP3695001A1 (en) 2020-08-19
CN111225982A (zh) 2020-06-02
EP3695001B1 (en) 2024-01-10
ES2974426T3 (es) 2024-06-27
US20200332319A1 (en) 2020-10-22
SI3695001T1 (sl) 2024-03-29
HUE065658T2 (hu) 2024-06-28
HRP20240435T1 (hr) 2024-06-21
WO2019072732A1 (en) 2019-04-18
CA3075592A1 (en) 2019-04-18
FI3695001T3 (fi) 2024-02-14
LT3695001T (lt) 2024-02-26
DK3695001T3 (da) 2024-01-29
BR112020005439A2 (pt) 2020-09-24
US11319559B2 (en) 2022-05-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RS65254B1 (sr) Postupak enzimske hidrolize lignoceluloznog materijala i fermentacije šećera
US20240271110A1 (en) Enzyme composition
US20200347422A1 (en) Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
EP3802843B1 (en) Process for producing sugars from carbohydrate materials
US11499142B2 (en) Enzyme composition
US12157906B2 (en) Process for producing a fermentation broth
EP3695001B1 (en) Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
WO2018185071A1 (en) Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
WO2020058248A1 (en) Process for enzymatic hydrolysis of carbohydrate material and fermentation of sugars
WO2019086370A1 (en) Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
CA3043966C (en) Enzyme composition
WO2016207146A1 (en) Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
WO2016169892A1 (en) Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
WO2020058253A1 (en) Process for enzymatic hydrolysis of carbohydrate material and fermentation of sugars
WO2020058249A1 (en) Process for enzymatic hydrolysis of carbohydrate material and fermentation of sugars
BR112020005439B1 (pt) Processo para hidrólise enzimática de material lignocelulósico e fermentação de açúcares
BR112019009796B1 (pt) Composição de enzimas