RS65449B1 - Supstance i sistemi koji obuhvataju vezikule kompetentne za transfekciju bez organskih rastvarača i deterdženata i metode za to - Google Patents

Supstance i sistemi koji obuhvataju vezikule kompetentne za transfekciju bez organskih rastvarača i deterdženata i metode za to

Info

Publication number
RS65449B1
RS65449B1 RS20240470A RSP20240470A RS65449B1 RS 65449 B1 RS65449 B1 RS 65449B1 RS 20240470 A RS20240470 A RS 20240470A RS P20240470 A RSP20240470 A RS P20240470A RS 65449 B1 RS65449 B1 RS 65449B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
lipid
competent
transfection
tcv
vesicle
Prior art date
Application number
RS20240470A
Other languages
English (en)
Inventor
Jayesh Kulkarni
Austin Hill
Pieter Cullis
Blair Leavitt
Terri Petkau
Pamela Wagner
Original Assignee
Univ British Columbia
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univ British Columbia filed Critical Univ British Columbia
Publication of RS65449B1 publication Critical patent/RS65449B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/88—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microencapsulation, e.g. using amphiphile liposome vesicle
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/465—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1), e.g. lipases, ribonucleases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
    • A61K47/10—Alcohols; Phenols; Salts thereof, e.g. glycerol; Polyethylene glycols [PEG]; Poloxamers; PEG/POE alkyl ethers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
    • A61K47/12—Carboxylic acids; Salts or anhydrides thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
    • A61K47/14—Esters of carboxylic acids, e.g. fatty acid monoglycerides, medium-chain triglycerides, parabens or PEG fatty acid esters
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/16—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing nitrogen, e.g. nitro-, nitroso-, azo-compounds, nitriles, cyanates
    • A61K47/18—Amines; Amides; Ureas; Quaternary ammonium compounds; Amino acids; Oligopeptides having up to five amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/16—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing nitrogen, e.g. nitro-, nitroso-, azo-compounds, nitriles, cyanates
    • A61K47/18—Amines; Amides; Ureas; Quaternary ammonium compounds; Amino acids; Oligopeptides having up to five amino acids
    • A61K47/186—Quaternary ammonium compounds, e.g. benzalkonium chloride or cetrimide
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/24—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing atoms other than carbon, hydrogen, oxygen, halogen, nitrogen or sulfur, e.g. cyclomethicone or phospholipids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/28—Steroids, e.g. cholesterol, bile acids or glycyrrhetinic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0091—Purification or manufacturing processes for gene therapy compositions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Synthetic bilayered vehicles, e.g. liposomes or liposomes with cholesterol as the only non-phosphatidyl surfactant
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes or liposomes coated or grafted with polymers
    • A61K9/1272—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes or liposomes coated or grafted with polymers comprising non-phosphatidyl surfactants as bilayer-forming substances, e.g. cationic lipids or non-phosphatidyl liposomes coated or grafted with polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Synthetic bilayered vehicles, e.g. liposomes or liposomes with cholesterol as the only non-phosphatidyl surfactant
    • A61K9/1277—Preparation processes; Proliposomes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/5005—Wall or coating material
    • A61K9/5015—Organic compounds, e.g. fats, sugars
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases [RNase]; Deoxyribonucleases [DNase]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering nucleic acids [NA]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPR]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Manufacturing & Machinery (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)

Description

Opis
OBLAST TEHNIKE
[0001] Jedno od važnih područja za naučno istraživanje i medicinske terapije jeste želja da se selektivno i efikasno isporuči RNK, DNK, i druge nukleinske kiseline i/ili proteinski teret na ciljna mesta kao što su specifične ciljne ćelije. Ovo može biti korisno iz raznoraznih razloga uključujući poboljšanje lečenja pacijenta kao što je terapija genima i za lečenje kancera i drugih stanja. Na primer, terapija genima može potencijalno da se koristi na mozgu i kroz ceo centralni nervni sistem za lečenje nekih od klasičnih strašnih neuroloških poremećaja od kojih ljudi mogu bolovati, kao što je Alchajmerova bolest, Parkinsonova bolest, Hantingtonova bolest, demencija prednjeg režnja (frontotemporalna), amiotrofna lateralna skleroza, atrofija mišića kičme, i druge. Sadašnji pristupi terapiji genima imaju nekoliko problema sa svojom široko rasprostranjenom primenom, posebno za čovečje pacijente, na primer zbog potrebe za ponovljenim doziranjem i toksičnošću pakovanja koje unosi terapijske nukleinske kiseline u pacijenta. Sadašnje supstance, postupci, itd., ovde pomažu da se ispravi jedan ili više od ovih ili drugih takvih problema.
[0002] Okretanje mnogo naučnijoj raspravi o isporuci DNK i drugih nukleinskih kiselina u ciljna mesta kao što su obolele ćelije u mozgu, postojeći postupci za takvu isporuku uključuju čestice lipida, u nekim slučajevima nanočestice lipida ("LNP") ili lipozome. Pojam nanočestice lipida ili "LNP" se koristi da bi opisao na lipidima zasnovane čestice na oko neutralne pH vrednosti koje uobičajeno sadrže nukleinsku kiselinu i imaju gusto jezgro elektrona. Lipozomi, takođe poznati kao vezikule, su na lipidima zasnovane strukture sa samo jednim dvoslojem i vodenastim jezgrom. Uobičajeni uspostavljeni postupci formiranja tereta nanočestica lipida (LNP) prenosnika specifičnim teretom u vreme prvobitnog formiranja vezikule. Ovi procesi još koriste specijalizovanu instrumentaciju, organske rastvarače i/ili deterdžente, zahtevaju velike količine materijala, i čine da vreme prerade bude reda veličine u danima, a sve to ozbiljno šteti korisnosti, dostupnosti i terapijskoj korisnosti.
[0003] Nanočestice lipida (LNP) i druge čestice lipida uobičajeno obuhvataju jonizabilni katjonski lipid, jedan ili više fosfolipid(a), holesterol (Chol), i polietietilenglikol-lipid (PEG-lipid) (Maurer, Wong et al.2001; Semple, Klimuk et al.2001; Semple, Akinc et al. 2010; Belliveau, Huft et al. 2012; Leung, Hafez et al. 2012; Suhr, Coelho et al.
2015). (Različite reference se daju ovde koje razmatraju izvesne sisteme, aparat, metode i druge informacije; sve takve reference su ovde ugrađene u potpunosti u vidu reference i za sve njihove opise i otkrivanja, bez obzira u kom delu u ovoj prijavi te reference mogu da se pojave. Citiranje u ovom spisu neke reference nije priznanje da takva referenca čini prethodno stanje tehnike ove prijave.) Primer supstance nanočestice lipida (LNP) je kombinacija jonizabilnih katjonskih lipida, fosfolipida, holesterola i polietilen glikol (PEG) lipida u odnosu od 50/10/38,5/1,5 mol % (prema opisanom redosledu). Ova supstanca je pokazala da prikazuje jako utišavanje gena hepatocita (siRNK) ili ekspresiju (iRNK) posle intravenske isporuke pacijentu (Semple, Akinc et al. 2010; Jayaraman, Ansell et al.2012; Pardi, Tuyishime et al.2015; Suhr, Coelho et al.2015). Drugi su opisali da supstance lipidnih nanočestica (LNP) koje su sastavljene od jonizabilnih katjonskih lipida, fosfolipida, holesterola i polietilen glikol (PEG) lipida u odnosu 50/10/38,5/1,5 molarnih% kao siRNK isporuka primarnih neuronskih ćelija u kulturi i za isporuku u mozak (Rungta, Choi et al.2013).
[0004] Formulacije nanočestica lipida (LNP) mogu da se generišu kroz brzo mešanje lipidnih komponenata rastvorenih u etanolu (sa kiselinskom vodenastom fazom koja se sastoji od tereta nukleinske kiseline (Jeffs, Palmer et al.2005; Belliveau, Huft et al.
2012; Leung, Hafez et al. 2012). Uspostavljena metoda za brzo mešanje za proizvodnju nanočestica lipida (LNP) uključuje mikrofluidno mešanje kroz mikromešač tipa riblja kost (SHM) (Belliveau, Huft et al.2012; Rungta, Choi et al.2013; Leung, Tam et al. 2015), ili mešanjem tipa T raskrsnice sa specijalizovanim pumpama (Jeffs, Palmer et al. 2005) ili mnogo zastarelijim pristupom etanol-/deterdžentdestabilizovanog punjenja prethodno formiranih vezikula (Wheeler, Palmer et al.1999; Tam, Monck et al. 2000; Maurer, Wong et al. 2001; Semple, Klimuk et al. 2001). Za sva tri postupka, neophodno je da etanolni rastvor (ili deterdžent) obezbedi dovoljnu fluidnost membrane za reorganizaciju lipida i da dođe do uklještenja, i u slučaju mikromešača sa bodežom tipa kost haringe (SHM) i tehnikama T raskrsnice, formiranje čestice se takođe javlja posle razblaženja etanolnog rastvora u vodenastu fazu (Belliveau, Huft et al.2012; Zhigaltsev, Belliveau et al.2012; Zhigaltsev, Tam et al. 2016). Međutim, suspenzija dobijena kao rezultat nije "spremna za upotrebu" usled organskog rastvarača i kiselinske vrednosti pH i tako daje kao rezultat suspenziju koja zahteva značajnu preradu u daljem toku postupka. U smislu troškova materijala vremena, ovi pristup imaju značajne prepreke da bi se dobila formulacija kompetentna za transfekciju u razmerama odgovarajućim za laboratoriju za in vitro primenu ili za terapijske nivoe za direktnu isporuku. Dalje, pre otkrivanja prethodnog stanja tehnike upotreba katjonskih lipida za proizvodnju transfekcionih vezikula može da se pronađe u međunarodnim dokumentima WO 2013/004234 A2, WO 2008/040556 A1, WO 2007/051303 A1 i prijavi u Sjedinjenim Američkim Državama US 5,776,486 A.
[0005] Ostaje potreba da reagensi transfekcije efikasno isporuče nukleinsku kiselinu i teret proteina u ćelije sisara na netoksičan način, uključujući za kultivisane primarne ćelije sisara (generalno, primarne ćelije su netransformisane, neumrtvljene ćelije dobijene direktno iz ciljnog tkiva). Kako je važnost korišćenja primarnih ćelija i njihove prednosti nad upotrebom linija ćelija su sasvim razumljive, teškoća se nailazi na transfekciju takvih ćelija koja je onemogućila njihovu upotrebu skoro u potpunosti iz bilo kog tipa otkrića ili studija validacije koje zahtevaju selektivne laboratorijske kopije gena. Pored toga, pomak prema personalizovanom leku nametanjem funkcionalnog genomskog skrininga i validacije može da se uradi primarnim ćelijama pacijenta, povećanjem potrebe za robusnim i netoksičnim metodama transfekcije za ove tipove ćelije teške da se transfektuju.
[0006] Ovi sistemi i metode, itd., obezbeđuju rešenja jedne ili više od ovih teškoća i/ili obezbeđuju druge prednosti.
KRATAK OPIS PRONALASKA
[0007] Ovaj pronalazak obezbeđuje metod za inkapsuliranje izabranog tereta u na lipidu zasnovanoj transfekciono kompetentnoj vezikuli (TCV) prema predmetu za koji se zaštita traži u patentnim zahtevima 1 do 11. Supstanca prema ovom pronalasku se definiše predmetom za koji se zaštita traži u patentnim zahtevima 12 do 25. Sistemi, supstance, uređaji i postupci, itd., ovde obezbeđuju na lipidu zasnovane vezikule, najčešće se ovde zovu transfekciono kompetentne vezikule (TCV), konfigurisane da bezbedno i efikasno isporuče proteine, ribonukleoproteine (RNP), RNK, DNK, i druge terete nukleinske kiseline i druge izabrane terete u ciljne ćelije. Bezbedni i efikasni su svaki, i oba, postignuta delimično eliminisanjem destabilizujućih agenasa kao što su organski rastvarači kao što je etanol i deterdženti kao što je natrijum dodecil sulfat iz transfekciono kompetentnih vezikula (TCV) procesa punjenja (tj. umetanjem izabranog tereta u transfekciono kompetentne vezikule (TCV)), procese skladištenja transfekciono kompetentne vezikule (TCV), i/ili procese isporuke transfekciono kompetentne vezikule (TCV). Dakle, transfekciono kompetentne vezikule (TCV) se zadržavaju u destabilizacionom rastvoru bez agensa, na primer kao destabilizaciona suspenzija bez agensa.
[0008] Kako je ovde korišćeno, transfekciono kompetentna vezikula (TCV) je tip lipozoma ili druge vezikule koja je zasnovana na lipidu i koja se generiše i/ili skladišti bez destabilizacionih agenasa i bez izabranog unutrašnjeg tereta. Jedna prednost takvih transfekciono kompetentnih vezikula (TCV) je da one mogu da se skladište u rastvoru ili kao suspenzija bez prisustva destabilizacionih agenasa, mogu da obuhvate izabrane terete bez prisustva ili destabilizacionih agenasa, i mogu da isporuče takve izabrane terete na ciljne ćelije bez prisustva destabilizacionih agenasa. Izabrani tereti označavaju RNP, RNK, DNK, proteine, itd., koji kreiraju željeno dejstvo na ciljnoj ćeliji i/ili ciljnom pacijentu koji se transfektuje transfekciono kompetentnom vezikulom (TCV) koja obuhvata izabrani teret. Dakle, osim ako kontekstom nije drugačije nagovešteno, transfekciono kompetentne vezikule (TCV) ovde nedostaje im krajnje izabran teret, i u izvesnim izvođenjima su prazni izuzev ambijentalnog rastvora i sličnog. Takve transfekciono kompetentne vezikule (TCV) se konfigurišu da bezbedno i efikasno isporuče nukleinsku kiselinu i proteinski teret, itd., u ćelije sisara bez upotrebe organskih rastvarača ili drugih destabilišućih agenasa.
[0009] Procesi isporuke transfekciono kompetentne vezikule (TCV) mogu obuhvatiti transfekciju ćelija sisara kao što su primarne ćelije sa izabranim teretom. Tereti mogu takođe da obuhvataju nukleinske kiseline u kompleksu sa proteinom, kao što je ribonukleoprotein (RNP). Sistemi, supstance, uređaji i metode, itd. ovde, u nekim izvođenjima, mogu da obezbede prazne transfekciono kompetentne vezikule (TCV), ili pune transfekciono kompetentne vezikule (TCV).
[0010] U nekim varijantnim rešenjima, sistemi, supstance, uređaji i metode, itd. ovde obezbeđuju transfekciono kompetentne vezikule (TCV) bez organskih rastvarača i druge destabilizacione agense od kojih se prethodnodno tražilo da uhvate (ili napune) teret u lipidne vezikule ili lipozome i/ili da skladište takve vezikule. Supstance, metode, itd. ovde mogu da se koriste ili izvedu bez upotrebe specijalizovanih instrumenata, a primer prethodno formirane transfekciono kompetentne vezikule (TCV) ovde mogu da se napune pažljivim mešanjem prazne suspenzije koja sadrži transfekciono kompetentne vezikule (TCV) sa različitim tipovima izabranog tereta recipročno pipetom . Supstance, metode, itd. ovde mogu posebno biti korisne za ''punjenje na vrhu radnog stola'', i mogu da se koriste sa malim ili velikim količinama izabranog materijala tereta. Pored toga, pojedinačna šarža prazne transfekciono kompetentne vezikule (TCV) može da se puni na vrhu radnog stola sa više različitih izabranih tereta paralelno.
[0011] U nekim izvođenjima, sistemi, supstance, jedinjenja, uređaji i metode, itd. opisani ovde obezbeđuju prazne transfekciono kompetentne vezikule (TCV) koje su organski bez rastvarača i bez deterdženta. Ako se koristi etanol ili deterdžent ili drugi destabilizacioni agens da generiše transfekciono kompetentne vezikule (TCV), uklanja se preko dijaliza ili drugog pogodnog metoda da obezbedi organsku supstancu bez rastvarača, supstancu transfekciono kompetentne vezikule (TCV) bez deterdženta. Transfekciono kompetentne vezikule (TCV) može da se puni pažljivim mešanjem kao što je ponovljeno ručno recipročno transfekciono kompetentnom vezikulom (TCV) generisanje fluida u pipeti, mikrofluidno mešanje kroz mikromešač tipa riblja kost (SHM), metoda mešanja tipa T raskrsnice ili metoda ekstruzije, ili druge metode mešanja transfekciono kompetentne vezikule (TCV) po želji.
[0012] U jednom varijantnom rešenju, na lipidima zasnovane transfekciono kompetentne vezikule (TCV) obuhvataju mešavinu katjonskog lipida koji može da se jonizuje, fosfolipid, holesterol i PEG lipid, i transfekciono kompetentne vezikule (TCV) koje sadrže supstancu je organski rastvarač i/ili bez deterdženta, čija se terminologija koristi u svojoj normalnoj upotrebi da bi označila da ukaže na takav organski rastvarač i deterdžent jesu u suštini izostavljeni tako da nema značajnih štetnih dejstava prouzrokovanih organskim rastvaračem i/ili deterdžent iako manje, moguće je da neke količine u tragovima ostanu u toj supstanci.
[0013] U nekim varijantnim rešenjima, jonizacioni katjonski lipid obuhvata između 20-50% komponente lipida tih transfekciono kompetentnih vezikula (TCV). U jednom varijantnom rešenju, na lipidima zasnovane prazne transfekciono kompetentne vezikule (TCV) sadrže komponente lipida u odnosu od DODMA/DOPE/DSPC/Chol/PEG lipida sa (procentom mola od) 20/30/10/39/1 mol%. U jednom varijantnom rešenju, na lipidima zasnovane prazne transfekciono kompetentne vezikule (TCV) sadrže komponente lipida u odnosu od DODMA/DOPE/DSPC/Chol lipida sa (procentom mola od) 20/30/10/40 mol%. U nekom drugom varijantnom rešenju, na lipidima zasnovane prazne transfekciono kompetentne vezikule (TCV) sadrže komponente lipida u odnosu od DODMA/DSPC/Chol/PEG lipida sa (procentom mola od) 50/10/39/1 mol%. U jednom varijantnom rešenju, na lipidima zasnovane prazne transfekciono kompetentne vezikule (TCV) sadrže komponente lipida u odnosu od DODMA/DOPE/DSPC/Chol sa (procentom mola od) 50/10/39/1 mol%. Dodatni opsezi komponenata je takođe moguće koristiti po želji. U izvesnim varijantnim rešenjima, odnos jonizabilnog katjonskog lipida je smanjen. Na primer, odnos jonizabilnog katjonskog lipida može da bude oko 10 mol%, 20 mol%, 30 mol%, 40 mol%, 50 mol% ili 60 mol%.
[0014] U jednom varijantnom rešenju, na lipidima zasnovane prazne transfekciono kompententne vezikule (TCV) pomešane sa izabranim teretom nukleinske kiseline tokom 5 sekundi, 10 sekundi, 15 sekundi, 20 sekundi, 30 sekundi, 45 sekundi, 1 minut ili 2 minuta po želji, na primer 10-30 sekundi. Transfekciono kompetentne vezikule (TCV) organske bez rastvarača, bez deterdženta je moguće zatim skladištiti u okruženju organskom bez rastvarača, i bez deterdženta i/ili isporučiti u ciljne ćelije kao što su, opet, ćelije sisara u organskom okruženju bez rastvarača, bez deterdženta.
[0015] U nekim varijantnim rešenjima, izabrani teret nukleinske kiseline može da bude dvolančana DNK, jednolančana DNK, RNK, mala interferirajuća RNK, kratka ukosnica RNK, informaciona RNK, komplementarna DNK, mikroRNK, plazmid DNK, ili njihova kombinacija. U nekim varijantnim rešenjima, izabrani teret nukleinske kiseline može obuhvatiti sintetičke ili hemijski modifikovane oligonukleotide, na primer da bi poboljšali stabilnost izabranog tereta. Izabrani teret može da bude protein koji se kompleksira sa nekom nukleinskom kiselinom (PNA) Izabrani teret proteina mogu biti proteini obuhvaćeni u editovanje gena ili proteina koji funkcionišu kao reporteri za označavanje ćelije (kao što su fluorescentni markeri i slično). U nekim izvođenjima, izabrani teret na bazi proteina koji se kompleksira sa nekom nukleinskom kiselinom je ribonukleoprotein.
[0016] U nekim varijantnim rešenjima, ovi sistemi, uređaji i metode, itd., obezbeđuju metode inkapsuliranja izabranog tereta u na lipidu zasnovanoj transfekciono kompetentnoj vezikuli (TCV) koja obuhvata:
<->obezbeđivanje rastvora na bazi vode koji sadrži na lipidu zasnovanu transfekciono kompetentnu vezikulu (TCV), taj rastvor na bazi vode može biti bez agensa destabilizacije; i,
<->mešanje izabranog tereta u rastvor pod uslovima pogodnim i tokom vremenskog perioda dovoljnog da se izabrani teret inkapsulira unutar na lipidu zasnovane transfekciono kompetentne vezikule (TCV) da bi se dobio inkapusliran izabrani teret u na lipidu zasnovanoj transfekciono kompetentnoj vezikuli (TCV), mešanje može da bude izvedeno bez prisustva organskog rastvarača ili deterdženta.
[0017] Agens destabilizacije može da bude barem jedan od organskog rastvarača ili deterdženta. Organski rastvarač može da bude, na primer, metanol, izopropil alkohol, tetrahidrofuran (THF), dimetilsulfoksid (DMSO), dimetilformamid (DMF), ili acetonitril (ACN). Deterdžent može da bude, na primer, natrijum dodecil sulfat (SDS). Agens destabilizacije može da bude temperatura. Rastvor na bazi vode može da bude 25 mM do 100 mM acetat pufera.
[0018] Na lipidu zasnovana transfekciono kompetentna vezikula (TCV) može da bude prazna pre inkapsulacije, i te metode mogu još da obuhvate:
- dobijanje inkapusliranog izabranog tereta u na lipidu zasnovanoj transfekciono kompetentnoj vezikuli (TCV) u rastvoru na bazi vode pretežno bez rastvarača i deterdženata.
[0019] Na lipidu zasnovana transfekciono kompetentna vezikula (TCV) može obuhvatati katjonski lipid, kao što je jonizabilni katjonski lipid. Na lipidu zasnovana transfekciono kompetentna vezikula (TCV) može da sadrži oko 20 mol% do 50 mol% katjonskog lipida. Jonizabilni katjonski lipid može obuhvatiti 1,2-dioleiloksi-3-dimetilamino propan (DODMA). Na lipidu zasnovana transfekciono kompetentna vezikula (TCV) može obuhvatiti mešavinu 1,2-dioleiloksi-3-dimetilamino-propan (DODMA), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoholin (DOPC), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamin (DOPE), i 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoholin (DSPC). Mešavina može još da sadrži najmanje jedno od polietilen glikola (PEG) ili holesterola.
[0020] Na lipidu zasnovana transfekciono kompetentna vezikula (TCV) može obuhvatiti mešavinu DODMA/DOPE/DSPC/Chol/PEG lipida sa oko 20/30/10/39/1 mol%, može obuhvatiti mešavinu DODMA/DOPE/DSPC/Chol sa oko 20/30/10/40 mol%, mešavina DODMA/DSPC/Chol sa oko 50/10/40 mol%, mešavina DODMA/DSPC/Chol/PEG lipida sa oko 50/10/39/1 mol%, ili mešavina DODMA/DSPC/Chol/PEG sa oko 50/10/39/1 mol%.
[0021] Izabrani teret može da bude nukleinska kiselina, kao što je neka modifikovana kiselina. Modifikovana nukleinska kiselina može obuhvatiti, na primer, najmanje jedno od 2’-O-metilacije (2’-O-ME), fosforotioata, ili morpholinom, premoštene, ili, zaključane, nukleinske kiseline. Nukleinska kiselina može da bude dezoksiribonukleinska kiselina (DNK). DNK može obuhvatiti dvolančanu DNK, jednolančanu DNK, komplementarnu DNK, (kDNK) ili plazmidnu DNK. Nukleinska kiselina može da sadrži ribonukleinsku kiselinu (RNK) RNK može da sadrži malu interferirajuću RNK (siRNK), kratku ukosničku RNK, informacionu RNK (iRNK), mikroRNK (miRNK). Izabrani kargo može da sadrži protein. Protein može da bude deo ribonukleoproteina (RNP), koji može da bude funkcionalni ribonukleoprotein (RNP). Ribonukleoprotein (RNP) može da sadrži najmanje jedno od Cas9 proteina ili vodeće RNK, i Cas9 protein i vodeću RNK, ili obuhvata Cas9 protein i vodeću RNK i jednolančanu RNK (ssDNK).
[0022] Kargo može da obuhvati najmanje jedno od enzima, nukleaze, i endonukleaze, ili početnicu (prajmer). Teret može da sadrži najmanje jedno od nukleaze prstena cinka (ZFN), TALEN, Cas9, Cas10, Cas11, Cas12, ili Cpf1. Teret može da obuhvati najmanje jedno od enzima, nukleaze, i endonukleaze, ili početnicu (prajmer). Teret može da obuhvati iRNK koja kodira nukleazu ili antigen.
[0023] Metode mogu još da obuhvate mešanje na lipidu zasnovane transfekciono kompetentne vezikule (TCV) sa izabranim teretom, izabrani teret može da bude nukleinska kiselina koja može da bude prisutna u odnosu od oko 0,022-0,058 mg izabranog tereta po µmolu katjonskog lipida. Metode mogu još da obuhvate mešanje na lipidu zasnovane transfekciono kompetentne vezikule (TCV) sa izabranim teretom, izabrani teret može da bude nukleinska kiselina koja može da bude prisutna u odnosu od oko 0,029-0,116 mg izabranog tereta po µmolu katjonskog lipida. Na lipidu zasnovana transfekciono kompetentna vezikule (TCV) i izabrani teret mogu da budu mešani sa oko 467 odnosom molara transfekciono kompetentne vezikule (TCV):izabranom teretu. Izabrani teret može da bude ribonukleoprotein (RNP). Transfekciono kompetentna vezikule (TCV) i izabrani teret mogu da budu mešani sa oko 400 do 1200 odnosom molara transfekciono kompetentna vezikule (TCV):izabranom teretu. Na lipidu zasnovana transfekciono kompetentna vezikula (TCV) i izabrani teret mogu da budu mešani sa oko 473 do 1173 odnosom molara transfekciono kompetentne vezikule (TCV):izabranom teretu. Na lipidu zasnovana transfekciono kompetentna vezikula (TCV) i izabrani teret mogu da budu mešani sa oko 3000 da 5000 odnosom molara transfekciono kompetentna vezikula (TCV):izabranom teretu.
[0024] Na lipidu zasnovana transfekciono kompetentna vezikula (TCV) i izabrani teret mogu da budu pomešani na oko sobnoj temperaturi tokom oko 10 do 15 sekundi, ili tokom oko 10 do 30 sekundi. Mešanje je moguće izvesti korišćenjem mikromešača sa bodežom tipa riblje kosti ili mešanjem tipa T raskrsnica. Mešanje je moguće izvesti recipročno u pipeti.
[0025] U nekim varijantnim rešenjima, ovi sistemi, uređaji i postupci, itd., daju supstance koje obuhvataju na lipidu zasnovanu transfekciono kompetentnu vezikulu (TCV) u rastvoru na bazi vode. Supstance mogu da budu bez agenasa destabilizacije organskih rastvarača i deterdženata. Supstanca i/ili na lipidu zasnovana transfekciono kompetentna vezikula (TCV) može još da bude konfigurisana kako je razmatrano u Kratkom opisu pronalaska, Slikama, Detaljnom opisu ili Patentnim zahtevima. Ovi sistemi, uređaji i postupci, itd. obezbeđuju supstance koje sadrže na lipidu zasnovanu transfekciono kompetentnom vezikulom (TCV) inkapusliran izabrani teret u rastvoru na bazi vode pretežno bez agenasa destabilizacije kao što su organski rastvarači i deterdženti. Inkapusliran izabrani teret u na lipidu zasnovanoj transfekciono kompetentnoj vezikuli (TCV) je kao što je ovde razmatrano.
[0026] Ovi sistemi, uređaji i postupci, itd. takođe obezbeđuju metode transfekcije, metode koji obuhvataju transfektovanje ciljne ćelije sa inkapsulirani izabrani teret u na lipidu zasnovanoj inkapsuliranoj transfekciono kompetentnoj vezikuli (TCV) kako je ovde objašnjeno. Ciljna ćelija može da bude ćelija sisara, kao što je primarna ćelija sisara, primarna neuronska ćelija sisara, kultivisana ćelija sisara, ili ćelija iz nekog pacijenta koji je sisar.
[0027] Ovde date metode mogu da se izvedu u nekoj laboratoriji, na primer za punjenje na vrhu radnog stola. Metode je moguće izvesti u fabrici da bi se proizvele komercijalne količine transfektovanih ćelija. Metode je moguće izvesti kao deo in vivo procedure, medicinske procedure, terapijske procedure ili procedure terapije genom. Metode je moguće izvesti kao deo lečenja Alchajmerove bolesti, Parkinsonove bolesti, Hantingtonove bolesti, demencije prednjeg režnja, amiotrofne lateralne skleroze, ili atrofije mišića kičme. Metode još mogu da obuhvate isporučivanje inkapsuliranog izabranog tereta na lipidu zasnovanu inkapsuliranu transfekciono kompetentnu vezikulu (TCV) u mozak pacijenta.
[0028] U nekim daljim varijantnim rešenjima, ovi sistemi, uređaji i metode, itd. obezbeđuju pribore koji obuhvataju ovde date supstance. Supstance mogu da budu u posudi i pribori mogu da sadrže instrukcije za upotrebu tih supstanci. Instrukcije mogu da usmere upotrebu supstanci prema bilo kom od ovde datih supstanci. Posuda može da bude konfigurisana da isporuči najmanje jednu dozu supstance sisaru, taj pribor još obuhvata najmanje jednu nalepnicu koja obuhvata uputstva za isporučivanje.
[0029] U nekim varijantnim rešenjima, ovi sistemi, uređaji i metode, itd. obezbeđuju izolovane i prečišćene supstance ovde za upotrebu u proizvodnji leka za inhibiranje, sprečavanje, ili lečenje bolesti ili stanja kod nekog pacijenta, koji može biti sisar.
[0030] Ova i druga varijantna rešenja, svojstva i izvođenja se iznose u okviru ove prijave, uključujući Detaljan opis, i priložene slike koji slede. Osim ako nije izričito navedeno drugačije, sva izvođenja, varijantna rešenja, svojstva, itd. mogu da se pomešaju i upare, kombinuju i permutuju na bilo koji željeni način.
KRATAK OPIS SLIKA NACRTA
[0031]
Slike 1A-1D. Transfekciono kompetentne vezikule (TCV) proizvedene prema ovde datim postupcima predstavljaju laboratorijske kopije za besmrtne (HeLa) ćelije i primarne neurone. (A) Relativna ekspresija luciferaze u HEK-Luc ćelijama posle transfekcije sa transfekciono kompetentnim vezikulama (TCV) organskim bez rastvarača, bez deterdženta sastavljena od 50% jonizabilni katjonski lipid. (B) Održivost ćelije iz iste grupacije transfekcija predstavljenih u (A) kao % kontrolnih (samo ćelije) pregrada. (C) Relativna ekspresija hdh iRNK u primarnim neuronima korteksa posle organske bez rastvarača, bez deterdženta vezikulama kompetentnim za transfekciju (TCV) posredovane transfekcije siRNK izabran kargo u neuronima. siRNK će ciljala hdh, i transfekciono kompetentne vezikule (TCV) su proizvedene korišćenjem istog panela jonizabilnih katjonskih lipida predstavljeno u 1(A). (D) Održivost ćelije kako je izmereno redukcijom MTT za ekvivalentan skup transfekcija primarnih neurona korteksa korišćenjem organskih vezikula kompetentnih za transfekciju (TCV) bez rastvarača, bez deterdženta da bi se isporučila neciljna (luciferaza) siRNK. N=4 po stanju za HEK-Luc ćelije, N=3 pregrade po stanju za primarne neurone. Podaci predstavljaju srednju vrednost ±SEM.
*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001 Bonforonijevom (Bonforroni) post-hoc analizom posle jednosmerne ANOVA sa svakim stanjem u poređenju sa kontrolnim (ćelijama samo) stanjem.
Slika 2A-2D. Jačina organskih vezikula kompetentnih za transfekciju bez rastvarača, bez deterdženta ne zavisi od postupka mešanja korišćenog da se generišu prazne transfekciono kompetentne vezikule (TCV). (A) Relativna ekspresija luciferaze u HEK-Luc ćelijama posle transfekcije sa vezikulama kompetentnim za transfekciju sastavljena od 50% jonizabilnog lipida i formirana bilo mešanjem tipa T raskrsnice (DODMA-50%) ili ekstruzije (DODMA-50%X). (B) Održivost ćelije iz iste skupine transfekcija predstavljenih u (A) kao % kontrolnih (samo ćelije) pregrada. (C) Relativna ekspresija hdh iRNK u primarnim neuronima korteksa posle organskih bez rastvarača, bez deterdženta transfekciono kompetentnim vezikulama (TCV) posredovane transfekcije siRNK cilja hdh korišćenjem istog panela vezikula kompetentnih za transfekciju (TCV) prikazano na 2(A). (D) Održivost ćelije kako je izmereno redukcijom MTT za ekvivalentan skup transfekcija primarnih neurona korteksa korišćenjem organskih vezikula kompetentnih za transfekciju (TCV) bez rastvarača, bez deterdženta da bi se isporučila neciljna (luciferaza) siRNK. N=4 po stanju za HEK-Luc ćelije, N=3 pregrade po stanju za primarne neurone. Podaci predstavljaju srednju vrednost ±SEM. *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001 Bonforonijevom (Bonforroni) post-hoc analizom posle jednosmerne ANOVA sa svakim stanjem u poređenju sa kontrolnim (ćelijama samo) stanjem.
Slika 3A-3D. Organske transfekciono kompetentne vezikule bez rastvarača, bez deterdženta sadrže smanjenu količinu jonizabilnog lipida olakšavaju snažnu isporuku siRNK sa smanjenom toksičnošću. (A) Relativna ekspresija luciferaze u HEK-Luc ćelijama posle transfekcije sa vezikulama kompetentnim za transfekcijama sastavljenim od bilo 20% ili 50% jonizabilnog lipida 1,2-dioleiloksi-3-dimetilaminopropana (DODMA). (B) Održivost ćelije iz iste skupine transfekcija predstavljenih u (A) kao % kontrolnih (samo ćelije) pregrada. (C) Relativna ekspresija hdh iRNK u primarnim neuronima korteksa posle organskih transfekciono kompetentnih vezikula (TCV) bez rastvarača, bez deterdženta posredovane transfekcije siRNK koja cilja hdh korišćenjem istog panela vezikula kompetentnih za transfekciju (TCV) prikazano na 3(A) (D) Održivost ćelije kako je izmereno redukcijom MTT za ekvivalentnu skupinu transfekcija primarnih neurona korteksa korišćenjem organskih transfekciono kompetentnih vezikula (TCV) bez rastvarača, bez deterdženta da bi se isporučila neciljna (luciferaza) siRNK. N=4 po stanju za HEK-Luc ćelije, N=3 pregrade po stanju za primarne neurone. Podaci predstavljaju srednju vrednost ±SEM. *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001 Bonforonijevom (Bonforroni) posthoc analizom posle jednosmerne ANOVA sa svakim stanjem u poređenju sa kontrolnim (ćelijama samo) stanjem.
Slike 4A, 4B. Inkorporiranje DOPE u organskoj praznoj transfekciono kompetentnoj vezikuli (TCV) bez rastvarača, bez deterdženta ne menja morfologiju transfekciono kompetentne vezikule (TCV). Cryo-TEM analiza je izvedena na transfekciono kompetentnim vezikulama (TCV) (A) DODMA/DOPE/DSPC/Chol/PEG-lipida pri 20/30/10/39/1 mol% (DOPE = 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamin; DSPC = 1,2-distearoil-sn-glicero3-fosfoholin; PEG = polietilen glikol), i (B) DODMA/DSPC/Chol/PEG lipid (50/10/39/1 mol%). Skala razmere = 100 nm.
Slika 5. Organske prazne transfekciono kompetentne vezikule (TCV) bez rastvarača, bez deterdženta ovde mogu da se koriste da bi isporučile funkcionalne ribonukleoproteine (RNP). HEK293 ćelije su transfektovane sa Cas9 funkcionalnim ribonukleoproteinima (RNP) i jednolančanim uzorkom popravke oligodeoksinukleotida (ssODN), oba su isporučena organskim transfekciono kompetentnim vezikulama (TCV) bez rastvarača, bez deterdženta proizvedena prema ovde datim metodama. Cas9 protein je kompleksovan da vodi ciljanje GRN gena. DNK je ekstrahovana iz ćelija 48 sati posle transfekcije. Polimerazna lančana reakcija (PCR) je korišćena da specifično detektuje divlji tip (WT) GRN alela ili mutirani GRN alel, koji je prisutan tek kada homologijom usmerena popravka (HDR) obuhvati isporučen ssODN u DNK dvolančan prekid proizveden pomoću Cas9. Mutirani GRN alel može da se detektuje posle transfekciono kompetentne vezikule (TCV) posredovanom isporukom Cas9 funkcionalnih ribonukleoproteina (RNP) ali nije prisutan u kontrolnim (Ctrl) ćelijama. Slika 6. Fotomikrografski snimci za Cas9 smešten unutar primarnog neurona. Ribonukleoproteini (RNP) su isporučeni preko organske transfekciono kompetentne vezikule (TCV) bez rastvarača, bez deterdženta kako je ovde razmatrano mogu da budu detektovani korišćenjem fluorescentnog antitela naspram Cas9 proteina, prikazano crvenom. Netretirana kontrolna grupa nema takve crvene fluorescentne signale. Plavi signal = nukleinska kiselina (DAPI bojenje), zeleni signal = faloidin (F aktin bojenje).
Slika 7. Grafikon pokazuje transkripcionu kopiju pomoću ribonukleoproteina (RNP) isporučenog na vrhu stola preko punjenja ribonukleoproteina (RNP) u prazne organske transfekciono kompetentne vezikule (TCV) bez rastvarača, bez deterdženta u HEK ćelije. HEK293 ćelije su transfektovane sa Cas9 ribonukleoproteinima (RNP) koji ciljaju luciferazu. Transfekciono kompetentne vezikule (TCV) iz formule (DODMA/DOPE/DSPC/Chol (20/30/10/40)) su napunjene na vrhu radnog stola. Relativni nivoi luciferaze iRNK u HEK ćelijama pokazuju značajno utišan gen od interesa u poređenju sa kontrolnom ("ctrl" na grafikonu) kada je izmereno pomoću kvantifikacione polimerazne lančane reakcije (qPCR). Po grupi je bilo 3 (N=3). Podaci predstavljaju srednju SEM. p=0,0018 pomoću Studentskog t-testa.
Slika 8. Grafikon pokazuje proteinsku kopiju pomoću ribonukleoproteina (RNP) isporučenog punjenjem na vrhu radnog stola ribonukleoproteina (RNP) u prazne organske transfekciono kompetentne vezikule (TCV) bez rastvarača, bez deterdženta u HEK ćelije. HEK293 ćelije su transfektovane sa Cas9 ribonukleoproteinima (RNP) koji ciljaju luciferazu. Transkripciono kompetentne vezikule (TCV) iz formule (DODMA/DOPE/DSPC/Chol (20/30/10/40)) su napunjene na radnom stolu. Relativni nivoi luciferaze proteina u HEK ćelijama pokazuju značajno utišan gen od interesa u poređenju sa kontrolnom ("ctrl" na grafikonu) kada je izmereno pomoću ONE-Glo. Po grupi je bilo 3 (N=3). Podaci predstavljaju srednju ± SEM. p=0,0003 pomoću Studentskog t-testa.
Slika 9. Grafikon pokazuje transfekciono utišanu kopiju ribonukleoproteina (RNP) isporučenog punjenjem na vrhu stola ribonukleoproteina (RNP) u prazne organske transfekciono kompetentne vezikule (TCV) bez rastvarača, bez deterdženta u primarnim neuronima korteksa. Primarni neuroni korteksa su transfektovani sa Cas9 ribonukleoproteinima koji ciljaju čovečji Huntingtin (HTT). Transfekciono kompetentne vezikule (TCV) iz formule (DODMA/DOPE/DSPC/Chol (20/30/10/40)) su napunjene na radnom stolu. Relativni nivoi HTT iRNK u primarnim neuronima pokazuju značajno utišan gen od interesa u poređenju sa kontrolnom ("gLuc" na grafikonu) kada je izmereno pomoću kvantifikacione polimerazne lančane reakcije (qPCR). Po grupi je bilo 3 (N=3). Podaci predstavljaju srednju ± SEM. p=0,0039 pomoću Studentskog ttesta.
Slika 10. Grafikon koji pokazuje eksprimovanje iRNK za iRNK isporučenu preko organske transfekciono kompetentne vezikule (TCV) bez rastvarača, bez deterdženta u HEK ćelije. Luciferazna iRNK je isporučena preko organske transfekciono kompentente vezikule (TCV) bez rastvarača, bez deterdženta (DODMA/DOPE/DSPC/Chol (20/30/10/40)) u HEK ćelije na u različitim odnosima nizak=0,029 mg iRNK/µmol lipid, mid=0,058 mg iRNK/µmol lipid, visok=0,116 mg iRNK/µmol lipid. Svi odnosi su pokazali značajno eksprimovanje u poređenju sa kontrolom, sa najnižim odnosom koji je pokazivao najviše eksprimovanje. iRNK eksprimovanje je izmereno pomoću ONEGlo+Tox pribora (Promega), N=3 ukupno po stanju.
Slika 11. Grafikon koji pokazuje eksprimovanje iRNK za iRNK isporučenu preko organske transfekciono kompetentne vezikule (TCV) bez rastvarača, bez deterdženta u primarnim neuronima korteksa. Luciferaza iRNK je isporučena preko organske transfekciono kompetentne vezikule (TCV) bez rastvarača, bez deterdženta (DODMA/DOPE/DSPC/Chol (20/30/10/40)) u primarne neurone korteksa u različitim dozama. Sve doze su pokazale značajno eksprimovanje u poređenju sa kontrolom. iRNK eksprimovanje je izmereno pomoću ONE-Glo+Tox pribora (Promega), N=3 ukupno po stanju.
Slika 12. Grafikon koji pokazuje održivost ćelije za ribonukleoprotein (RNP) u organskim transfekciono kompetentnim vezikulama (TCV) bez rastvarača, bez deterdženta u HEK ćelije. Ribonukleoproteini (RNP) su bili isporučeni preko organskih transfekciono kompetentnih vezikula (TCV) bez rastvarača, bez deterdženta (DODMA/DOPE/DSPC/Chol (20/30/10/40)) ili korišćenjem RNKiMax ("Rmaks" na slici; ThermoFisher Scientific) u HEK ćelije za procenu citotoksičnosti. Organske transfekciono kompetentne vezikule (TCV) bez rastvarača, bez deterdženta su bile značajno manje toksične u poređenju sa RNKiMaks, p = 0,0002. Toksičnost je procenjena korišćenjem ONE-Glo Tox pribora (Promega), N=3 ukupno po grupi. Slika 13. Fotomikrografi koji pokazuju održivost ćelije za punjenje na vrhu stola siRNK u prazne organske transfekciono kompetentne vezikule (TCV) bez rastvarača, bez deterdženta u primarne neurone. siRNK su bile isporučene preko organskih transfekciono kompetentnih vezikula (TCV) bez rastvarača, bez deterdženta (DODMA/DOPE/DSPC/Chol/PEG lipid (20/30/10/39/1)) ili korišćenjem komercijalno dostupnog Mirus TKO sistema (Mirus Bio) u primarne neurone za procenu neurotoksičnosti. siRNK isporučena punjenjem na vrhu radnog stola organskih transfekciono kompetentnih vezikula (TCV) bez rastvarača, bez deterdženta je bila značajno manje toksična u poređenju sa Mirus TKO sistemom, kako je prikazano pomoću fotomikrografskih snimaka.
Slika 14. Grafikon koji pokazuje utišan gen od interesa (modifikovan organizam sa smanjenom aktivnošću ili ekspresijom gena u svojim hromozomima /laboratorijske primerke) za organske transfekciono kompetentne vezikule (TCV) bez rastvarača, bez deterdženta u HEK ćelijama. siRNK su isporučene preko organskih transfekciono kompetentnih vezikula (TCV) bez rastvarača, bez deterdženta DODMA nivoi na 50% ("D-50%"), napravljeno mešanjem tipa T raskrsnice), 50% ("D-50% Ex", napravljeno ekstruzijom) i preko komercijalno dostupnog Mirus TKO sistema (Mirus Bio). Sadašnje 50% DODMA formulacije su pokazale nokdaun oko 50%, međutim, Mirus TKO sistem je dao lošiji učinak.
DETALJAN OPIS
[0032] Sistemi, supstance, uređaji i postupci, itd., ovde obezbeđuju na lipidu zasnovane vezikule, najčešće se ovde zovu transfekciono kompetentne vezikule (TCV), konfigurisane da bezbedno i efikasno isporuče DNK, i druge izabrane terete nukleinske kiseline u ciljne ćelije. Bezbedni i efikasni su svaki pojedinačno, i oba, postignuto delimično eliminisanjem destabilizujućih agenasa kao što su organski rastvarači kao što je etanol i deterdženti kao što je natrijum dodecil sulfat iz transfekciono kompetentnih vezikula (TCV) procesa punjenja i skladištenja (tj., umetanjem izabranog tereta u transfekciono kompetentne vezikule (TCV)), i/ili procese isporuke transfekciono kompetentne vezikule (TCV). Procesi isporuke transfekciono kompetentne vezikule (TCV) mogu obuhvatiti transfekciju ćelija sisara kao što su primarne ćelije sa izabranim teretom. Izabrani tereti mogu takođe da obuhvataju nukleinske kiseline u kompleksu sa proteinom, kao što je ribonukleoprotein (RNP).
[0033] U nekim izvođenjima, sistemi, jedinjena, supstance, uređaji i metode, itd. ovde opisani obezbeđuju organske na lipidu zasnovane prazne transfekciono kompetentne vezikule (TCV) koje su bez rastvarača i bez deterdženta. Punjene transfekciono kompetentne vezikule (TCV) mogu se generisati pažljivim mešanjem kao što je ponovljeno ručno naizmenično transfekciono kompetentne vezikule (TCV) generisanje fluida u pipeti, mikrofluidno mešanje kroz mikromešač tipa riblja kost (SHM), metoda mešanja tipa T raskrsnice ili metoda ekstruzije, ili druge metode mešanja transfekciono kompetentne vezikule (TCV) po želji.
[0034] U jednom varijantnom rešenju, na lipidu zasnovane transfekciono kompetentne vezikule (TCV) se sastoje od mešavine jonizabilnog katjonskog lipida, fosfolipida, holesterola i PEG lipida, i supstanca koja sadrži transfekciono kompetentne vezikule (TCV) je organski rastvarač i/ili bez deterdženta.
[0035] Organske transfekciono kompetentne vezikule (TCV) bez rastvarača, bez deterdženta kako se ovde razmatra mogu da se koriste za lečenje odgovarajućih bolesti i stanja, na primer preko terapije genom. Organske transfekciono kompetentne vezikule (TCV) bez rastvarača, bez deterdženta kako se ovde razmatra poboljšavaju isporuku proizvoda terapije genom RNK, DNK, i ribonukleoproteina (RNP) čovečjim pacijentima. Organske transfekciono kompetentne vezikule (TCV) bez rastvarača, bez deterdženta efikasno isporučuju terapiju genom (uključujući ali bez ograničenja na proizvode iRNK, siRNK, i ribonukleoprotein (RNP)) u ćelije mozga ili druge ciljne ćelije. Polazni uzrok brojnih poremećaja kod ljudi je gubitak funkcije neophodnog proteina ili toksično sticanje funkcije mutiranog proteina. Ovi uzroci se leče, i čak reverzibilno, korišćenjem organskih transfekciono kompetentnih vezikula (TCV) bez rastvarača, bez deterdženta ovde datih.
[0036] Neki primeri takvog lečenja uključuju terapiju genom u centralnom nervnom sistemu za lečenje neuroloških poremećaja (neki slučajevi Alchajmerove bolesti, Parkinsonove bolesti, Hantingtonove bolesti, frontotemporalna demencija, amiotrofna lateralna skleroza, atrofija mišića kičme, itd.).
[0037] Organske transfekciono kompetentne vezikule (TCV) bez rastvarača, bez deterdženta kako se ovde razmatra takođe genetski ''smanjuju'' mutirane gene/genske proizvode, na primer preko ciljane, bezbedne isporuke siRNK ili ribonukleoproteina (RNP), terapije zamene gena sa iRNK, ili korekcije uzroka, prirodne mutacije DNK sa uređivanjem gena posredovanim ribonukleoproteinom (RNP). Dva specifična primera humanih bolesti koje je moguće ciljati na ovaj način su Hantingtonova bolest (HD) i demencija prednjeg režnja (FTD).
[0038] Hantingtonova bolest je progresivna, neizlečiva, neurodegenerativna bolest sa dominantnim obrascem nasleđivanja. Produžena sekvenca ponavljanja CAG nukleotida u genu Huntingtin (HTT) je odgovorna za tu bolest. Huntingtin protein (HTT) kodiran pomoću mutiranog HTT gena sadrži produženo ponavljanje poliglutamina koje daje toksično dobijanje funkcije za proizvod gena. Spuštanje nivoa mozga mutiranog huntingtin proteina je osnovna terapijska strategija koja se sada prati da uspori ili zaustavi napredovanje bolesti u Hantingtonovu bolest (HD), i može se na nju uticati i poboljšati korišćenjem organskih transfekciono kompetentnih vezikula (TCV) bez rastvarača, bez deterdženta kako se ovde razmatra. Transfekciono kompetentne vezikule (TCV) napunjene sa siRNK koje ciljaju HTT ekspresiju ili sa ribonukleoproteinima (RNP) izabranim teretima da bi se smanjla ekspresija huntingtin ekspresija ili toksičnost da budu delotvorne terapije za Hantingtonovu bolest (HD). Demencija prednjeg režnja ima mnoge uzroke, ali gubitak proteina progranulina (potencijalni činilac preživljavanja mozga) je jedan dobro opisan uzrok. Organske transfekciono kompetentne vezikule (TCV) bez rastvarača, bez deterdženta kako se ovde razmatra mogu isporučiti progranulin iRNK ili ribonukleoproteine (RNP) projektovane tako da mogu bilo da izraze progranulin ili da isprave polaznu DNK mutaciju koja prouzrokuje gubitak progranulina (prema odgovarajućem redosledu) će povećati nivoe progranulina u mozgu i biće delotvorne terapije za demenciju prednjeg režnja (FTD). Povećanje progranulina sa transfekciono kompetentnim vezikulama (TCV) koje eksprimuju progranulin iRNK može takođe da bude neurozaštitna strategija za brojna česta neurološka oboljenja kao što je Alchajmerova bolest, Parkinsonova bolest, i amiotrofna lateralna skleroza.
PRIMERI MATERIJALA I METODA
Materijali
[0039] 1,2-dioleiloksi-3-dimetilamino-propan (DODMA) je kupljen iz kompanije Cayman Chemical (Ann Arbor, MI). 1,2-dioleoil-3-dimetilamonijum-propan (DODAP), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoholin (DOPC), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamin (DOPE), i 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoholin (DSPC) su kupljeni iz kompanije Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL). Holesterol je kupljen iz kompanije Sigma Aldrich (St. Louis, MO). PEG-DMG je sintetizovan prethodno opisano (Akinc, Zumbuehl et al.
2008). Svi lipidi su zadržani kao zalihe etanola. siRNK cilja luciferazu svica (siLuc) (Basha, Ordobadi et al.2016) je kupljen od kompanije Integrated DNA Technologies (Integrisane DNK tehnologije) (Coralville, IA). siRNK naspram mišjeg hdh je kupljena iz Ambion (Silencer® Select Pre-designed siRNK, Invitrogen, Carlsbad, CA).
Dobijanje transfekciono kompetentnih vezikula (TCV)
[0040] Komponente lipida (jonizabilni katjonski lipidi, fosfolipidi, holesterol i PEG-lipid) su rastvoreni u etanolu u odgovarajućim odnosima da bi se postigla krajnja koncentracija od 20-35 mM ukupnog lipida. Vodenasta faza je pripremljena koja sadrži 25 nM natrijum acetatnog puferskog sredstva sa pH vrednošću 4. Dva rastvora su kombinovana korišćenjem dve utvrđene tehnike pripreme nanočestice: brzo mešanje i ekstruzija.
Brzo mešanje:
[0041] Organska faza koja sadrži lipide je mešana sa vodenastom fazom kroz mešač tipa T raskrsnice izrađen da zadovolji specifikacije sklopa sa niskim pritiskom pod nazivom PEEK Low Pressure Tee Assembly (1/16", 0,02 u prolaznoj rupi, deo # P-712) pri finalnoj brzini protoka od 20 mL/min sa 1:3 organsko: vodenastog (v/v) odnosa (Jeffs, Palmer et al. 2005; Kulkarni, Tam et al. 2017; Kulkarni, Darjuan et al. 2018). Suspenzija dobijena kao rezultat je dijalizovana protiv 1000-struke zapremine pufera od 25 mM natrijum acetata pH vrednosti 4 da bi uklonila etanol.
Ekstruzija:
[0042] Lipidi su rastvoreni u etanolu do krajnje koncentracije od 35 mM. Čestice su generisane brzim dodavanjem 25 mM natrijum acetata pH 4 je bila na etanolnom rastvoru da bi se dobila krajnja koncentracija od 30% etanola (v/v) kako su opisali autori drugde (Maurer, Wong et al. 2001). Suspenzija nanočestice dobijena kao rezultat je ekstrudirana tri puta kroz 2x 80nm polikarbonatne membrane na temperaturi okoline. Posle ekstruzije, čestice su puferski izmenjene da bi se uklonio etanol.
Analiza transfekciono kompetentnih vezikula (TCV)
[0043] Koncentracije lipida su određene ogledom za sadržaj holesterola korišćenjem pribora za testiranje T holesterola (Wako Chemicals, Mountain View, CA) i ekstrapolaciju ukupne koncentracije lipida kako je opisano drugde (Chen, Tam et al.
2014). Hvatanje nukleinske kiseline je određeno korišćenjem testa RiboGreen Assay kako je prethodno opisano (Chen, Tam et al.2014; Leung, Tam et al.2015).
Kriogena transmisiona elektronska mikroskopija
[0044] Cryo-TEM je izveden kako je opisano prethodno (Kulkarni, Darjuan et al.2018). Ukratko, transfekciono kompetentne vezikule (TCV) su koncentrovane na ukupnu koncentraciju lipida od približno 20 mg/mL korišćenjem centrifugalnog koncentratora (10kDa NWCO). Mala količina (3-5 uL) materijala je naneta na žarenjem izlivenu bakarnu rešetku i hladno zaronjeno korišćenjem FEI Mark IV Vitrobot (Hillsboro, OR). Rešetke su čuvane pod tečnim azotom sve dok nisu snimljene. Snimanje je izvedeno korišćenjem FEI Tecnai G2 instrumenta u režimu male doze na 200 kV. Slike su snimljene korišćenjem na dnu montiranog detektora FEI Eagle 4k CCD. Sva priprema uzorka i snimanje je izvedena na UBC BioImaging Facility (Vancouver, BC).
Kultura ćelija i reagensi:
[0045] Sve osnovne podloge kulture ćelija i B27 neuronski dodatak su kupljeni iz kompanije Gibco (Thermo Fisher, Waltham, MA). Henkov (Hank’s) balansirani slani rastvor (HBSS), penicilin-streptomicin, L-glutamin, i tripsin rastvori su dobijeni iz kompanije Hyclone (Logan, UT). HEK293 ćelije su raspoređene na providno / čisto dno, ploča sa belim zidovima iz kompanije Corning (Corning, NY). Primarne ćelije kroteksa su raspoređene na ploče za tretiranje kulture tkiva (Fisher), obložene sa poli-D-lizinom (Sigma, St. Louis, MO). Higromicin B je dobijen iz kompanije Invitrogen (Carlsbad, CA). Rekombinantan ApoE4 je dobijen od kompanije Peprotech (Rocky Hill, NJ).
[0046] Da bi se izmerila održivost ćelije i nivoi luciferaze u HEK293 ćelijama, korišćen je ONE-Glo Tox pribor iz kompanije Promega (Madison, WI). Održivost ćelije u primarnim neuronima je izmerena preko MTT in vitro toksikološkog pribora iz kompanije Sigma (St. Louis, MO).
HEK293 ćelije reporteri luciferaze:
[0047] Generisanje HEK293 linije ćelija sa stabilno integrisanim konstruktom reportera luciferaze (HEK-Luc ćelije) je prethodno opisano (De Souza, Islam et al.2016). Ćelije su održavane na 37°C u navlaženoj atmosferi sa 95% vazduha, 5% CO2 u DMEM visokoj glukozi, suplementirane sa 10% seruma goveđeg fetusa, 2mM L-glutamina i 125 µg/mL higromicina B. Ćelije su raspoređene sa gustinom od 12.000-20.000 ćelija/pregradi na ploči sa 96 pregrada sa belim zidovima.
Primarna kultura ćelije:
[0048] Kulture korteksa su pripremljene iz embrionskog dana miševa E17.5 C57BL/6J i FVB.YAC128. Ukratko, korteksi su secirani u ledeno hladnom Henkovom (Hank’s) balansiranom slanom rastvoru (HBSS), i tkiva su razgrađena korišćenjem 0,05%-og rastvora tripsina (Hyclone) tokom 10 minuta na 37°C. Korteksi su zatim triturisani kroz 5mL pipetu 5 puta, i dodatnih 5-7 puta sa 200µL je dodato vrhom pipete. Ćelije su peletirane centrifugiranjem tokom 5 minuta na 800 ob./min, oprane sa Henkovim (Hank’s) balansiranom slanom rastvor (HBSS), i zatim vraćene u suspenziju u toploj neurobazalnoj podlozi suplementiranoj sa B27, 2mM L-glutamina (Hyclone) i 1% penicilina/streptomicina (Hyclone).
Kortikalne kulture neurona su raspoređene na ploče na poli-D lizinom obložene ploče sa 24 pregrade, pri čemu je gustina bila 1,5 x 10<5>ćelija/pregradi. Ćelije su održavane na 37°C u vlažnoj atmosferi sa 95% vazduha, 5% CO2.
Transfekcija:
[0049] Svi reagensi su pomešan na vrhu stola. Prazne transfekciono kompetentne vezikule (TCV) sadrže 50% katjonskog lipida su pomešani sa siRNK u odnosu od 0,058 mg siRNK per µmolu lipida. Transfekciono kompetentne vezikule (TCV) sadrže 20% katjonskog lipida su pomešane sa siRNK u odnosu od 0,022 mg siRNK po µmolu lipida. Suspenzija transfekciono kompetentne vezikule (TCV) je pomešana sa siRNK kratko pipetom i inkubirana na sobnoj temperaturi tokom 10 minuta.
[0050] HEK293 ćelije su raspoređene na ploče 24 sata pre transfekcije. Kompletna DMEM podloga je dodata u TCV:siRNK mešavinu za krajnju koncentraciju od 3,3µg/mL siRNK, i potpuna zamena podloge je izvedena u vreme transfekcije.
[0051] Primarne neuronske ćelije su rasle in vitro tokom 7 dana pre transfekcije. Kompletna neurobazalna podloga sa 2-6 µg/mL rekombinantnog ApoE4 je dodata u TCV:siRNK suspenziju, i polovina podloge je zamenjena iz svake pregrade.
Test luciferaze:
[0052] Četrdeset osam do sedamdeset dva sata posle transfekcije, HEK293 ćelije su testirane na održivost i luminiscenciju ćelije korišćenjem ONE-Glo Tox pribora (Promega) prema uputstvima proizvođača. Ukratko, reagens žive ćelije je dodat u svaku pregradu, i ćelije su inkubirane na 37 °C tokom 30 minuta. Ploča je testirana na čitaču ploče (POLARstar Omega čitač ploče, BMG LABTECH) pri ekscitaciji od 400nm, i očitana na talasnoj dužini emisije od 510nm. ONE-Glo reagens je zatim dodat, i ploča je inkubirana na sobnoj temperaturi tokom 3 minuta. Luminescencija je izmerena preko izlaza svetla kroz sočiva tog istog čitača ploče. Vrednosti su predstavljene kao % kontrole i predstavljaju N=4 pregrade po stanju.
MTT test:
[0053] Neuroni primarnog korteksa su testirani za održivost ćelije preko MTT ogleda 72 sata posle transfekcije na ploči sa 24 pregrade. MTT reagens (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolijum bromid, ili MTT) je rekonstituisan u HBSS do krajnje koncentracije od 5 mg/mL, i dodat u svaku pregradu na 10% v/v. Ćelije su inkubirane na 37°C tokom 4 sata. Podloga je uklonjena, i 250 µL rastvora za rastvaranje je dodato u svaku pregradu. Apsorpcija je izmerena na 570 nm.
Vrednosti su predstavljene kao % kontrole i predstavljaju N=3 pregrade po stanju.
Kvantitativna RT-PCR
[0054] Ćelije primarnog korteksa koje su prionule su oprane jednom u sterilnom fosfat puferskom rastvoru (PBS) pre nego što su sastrugane sa ploče u 600µL puferskom sredstvu za lizu sa 1% 2-merkaptoetanola i trenutno smrznutom na -80°C. Ukupna RNK je naknadno ekstrahovana korišćenjem PureLink RNK mini pribora (Invitrogen) što je izvedeno prema uputstvima proizvođača. Reverzna transkripcija svih uzoraka je izvedena korišćenjem Superscript VILO pribora (Invitrogen) prema uputstvima proizvođača, korišćenjem 250 ηg ukupnog RNK kao unosa za cDNK sintezu i 5�g razblažene RNK za kvantitativnu plimeraznu lančanu reakciju (PCR). Kvantifikacija hdh iRNK nivoa je postignuta korišćenjem postupka standardne krivulje, sa pojačavanjem ciljne iRNK i kontrolnih gena u odvojenim pregradama, što je izvedeno korišćenjem FastSybr (Applied Biosystems) i sprovedeno na uređaju Step-One ABI System (Applied Biosystems). Svaki uzorak je provučen u duplikatu. Relativna količina iRNK u svakoj pregradi je izračunata kao odnos između hdh iRNK i kontrolnog gena, Csnk2a2. Vrednosti su predstavljene kao % kontrole i predstavljaju N=3 pregrade po stanju.
Materijali i formiranje ribonukleoproteinskog (RNP) kompleksa
[0055] Svi materijali za formulaciju ribonukleoproteinskog kompleksa (RNP), uključujući vodeće RNK (gRNK), tracrRNK, jednolančane oligodeoksinukleotide (ssODN), i rekombinantni Cas9 protein, su dobijeni iz kompanije IDT (San Jose, CA). Sekvenca vodeće RNK (gRNK) korišćena da cilja luciferazu je dobijena iz kompanije IDT (San Jose, CA). Sekvenca vodeće RNK (gRNK) koja cilja čovečji progranulin (GRN) se veže na ekson 5 tog gena. Sekvenca jednolančane oligodeoksinukleotida (ssODN) je korišćena za homologijom usmerenu popravku (HDR) je projektovana da uvede 4bp brisanje u eksonu 5 od GRN.
[0056] Sklop ribonukleoproteinskog kompleksa (RNP) je izveden prema specifikacijama proizvođača. Ukratko, kompleks vodeće RNK (gRNK) je formiran inkubiranjem jednakomolarnih odnosa crRNK:tracrRNK, kao što je 1 µM tracrRNK sa 1 µM gRNKk, na 95 °C tokom 5 minuta. Mešavina je zatim ostavljena da se ohladi na sobnoj temperaturi tokom 20-30 minuta. Ribonukleoproteini (RNP) su naknadno formirani kombinovanjem dupleksa vodeće RNK (gRNK) sa Cas9 proteinom u jednakim molarnim odnosima i ostavlja se mešavina da stoji na sobnoj temperaturi tokom 5 minuta pre upotrebe.
Transfekcija ćelija sisara sa nukleinskom kiselinom:
[0057] Prazne organske transfekciono kompetentne vezikule (TCV) bez rastvarača, bez deterdženta kako je ovde razmatrano, a i komercijalno dostupni reagensi za poređenje, su pomešani sa izabranim teretom na vrhu radnog stola. Transfekciono kompetentne vezikule (TCV) su pomešane sa izabranim teretom nukleinske kiseline i u opsegu odnosa od 0,01-0,2 mg nukleinske kiseline po µmol lipida. Suspenzija transfekciono kompetentne vezikule (TCV) je pomešana sa siRNK kratko pipetom i inkubirana na sobnoj temperaturi tokom 10 minuta.
[0058] HEK293 ćelije su raspoređene na ploče 24 sata pre transfekcije. Kompletna DMEM podloga je dodata u mešavinu transfekciono kompetentne vezikule (TCV):nukleinske kiseline za krajnju koncentraciju od 0,333,3µg/mL siRNK, ili 0,11 µg/mL iRNK potpuna promena podloge je izvedena u vreme transfekcije. Primarne neuronske ćelije su rasle in vitro tokom 7 dana pre transfekcije. Kompletna neurobazalna podloga sa 2-6 µg/mL rekombinantnog ApoE4 je dodata u suspenziju transfekciono kompetentne vezikule (TCV): nukleinske kiseline, i polovina podloge je zamenjena iz svake pregrade.
[0059] Ćelije su tretirane sa Mirus TransIT-TKO prema uputstvima proizvođača. Ukratko, Mirus TransIT-TKO je dodat u podlogu bez seruma u koncentraciji od 5mL Mirus/100 µL podloge bez seruma. siRNK kako je zatim dodata u epruvetu, pažljivo pipetom radi mešanja, i inkubirana na sobnoj temperaturi tokom 15-30 minuta. Rastvor je zatim prenet na ćelije, i zatim je krajnja koncentracija Mirus bila 5 µL kompletne podloge. Krajnja koncentracija siRNK je bila 25nM.
Transfekcija ćelija sisara sa ribonukleoproteinom (RNP):
[0060] 0,5-20mM TCV i 0,5-20µM ribonukleoproteina (RNP) su kombinovane u 467-5000 molarnom odnosu i ostavljene da inkubiraju na sobnoj temperaturi tokom 10 minuta. Odvojeno, 1-10µM rastvora ssODN je kombinovano sa transfekciono kompetentnom vezikulom (TCV) i ova mešavina je inkubirana na sobnoj temperaturi tokom 5-15 minuta. U nekim slučajevima, jednaka molarna količina jednolančanog oligo donora (ssODN) je dodata u rastvor kompleksa ribonukleoproteina (RNP) pre dodavanja transfekciono kompetentnih vezikula (TCV).
[0061] Transfekciono kompetentne vezikule (TCV) koje sadrže mešavine ribonukleoproteina (RNP) i jednolančanog oligo donora (ssODN) su kombinovane i kompletna podloga je dodata u krajnju koncentraciju od 10-200nM ribonukleoproteina (RNP) i jednolančanog oligo donora (ssODN) zasebno. Puna promena podloge je izvedena na HEK ćelijama, koje su prethodnih 24 sata raspoređene na ploču. Primarne neuronske ćelije su rasle in vitro tokom 5-7 dana pre transfekcije. Kompletna neurobazalna podloga sa 2-6 µg/mL rekombinantnog ApoE4 je dodata u mešavinu transfekciono kompetentne vezikule (TCV): ribonukleoproteina (RNP), i polovina podloge je zamenjena iz svake pregrade.
[0062] Ćelije su tretirane sa Lipofektaminom RNKiMAX reagensom prema uputstvima proizvođača. Ukratko, ribonukleinski kompleksi (RNP) su pripremljeni i dodati u mešavinu podloge bez seruma i RNKiMAX, inkubirani na sobnoj temperaturi tokom 5 minuta, i dodati ćelijama raspoređenim na ploču.
Polimerazna lančana reakcija (PCR) za detekciju homologijom usmerene popravke
[0063] Polimerazna lančana reakcija (PCR) je korišćena da pojača GRN ekson 5 iz genomske DNK ekstrahovane iz transfektovanih HEK293 kultura korišćenjem početnica (prajmera) unapred specifično za bilo divlji tip (WT) ili mutirane GRN alele i zajedničku početnicu (prajmer) unazad. Polimerazna lančana reakcija (PCR) je izvedena korišćenjem MyTaq (Bioline, USA) prema uputstvima proizvođača. Proizvodi polimerazne lančane reakcije (PCR) su odvojeni gel elektroforezom na 1,5 % agaroznog gela obojenog sa SybrSafe i slikani ispod UV svetla.
Imunocitohemija
[0064] Ćelije su fiksirane tokom 15 minuta korišćenjem rastvora 3-4% paraformaldehida. Ćelije su permeabilizovane tokom 15 minuta u fosfat puferskom rastvoru (PBS) koji sadrži 0,1% Triton-X (PBST). Ćelije su inkubirane tokom noći na 4°C sa fosfat puferskim rastvorm (PBST) koji sadrži 1:1000 mešavine anti-Cas9 (Invitrogen) antitela. Ćelije su oprane tri puta fosfat puferskim rastvorom (PBS) i inkubirane sa 1:1000 mešavinom svakog Alexa Fluor 594 fluorescentnog drugog antitela (Invitrogen) i Phalloidin-iFluor 488 CytoPainter antitela (Abeam) tokom 1 sat na sobnoj temperaturi, oprane ponovo i inkubirane tokom 5 minuta sa rastvorom koji sadrži DAPI da bi vizualno prikazao nukleuse.
Statistika
[0065] Sva statistička poređenja su izvedena kao jednosmerna analiza varijanse (ANOVA) sa Bonferoni posthok analizom da bi se uporedila pojedinačna sredstva za kontrolisanje tretiranih ćelija i korekciju za više poređenja (Prism 6, Graphpad Software Inc.). Studentski t-test je korišćen da bi se uporedila individualna sredstva u slučaju samo dve grupe. p-vrednost manja od 0,05 je smatrana značajnom.
PRIMERI POVEZANI SA REZULTATIMA
Primer 1: Prazne transfekciono kompetentne vezikule (TCV) efikasno u zamku uhvate ('ulove') nukleinsku kiselinu bez organskih rastvarača
[0066] Prazna formulacija transfekciono kompetentne vezikule (TCV) proizvedene mešanjem tipa T raskrsnice ili kroz mikromešač tipa riblje kosti (SHM) je ispoljila efikasnosti hvatanja u zamku i to sa redosledom od 85% ili većim. Prvo smo testirali sposobnost transfekciono kompetentnih vezikula (TCV) sastavljenih od jonizabilnih katjonskih lipida sa rasponom opsega primećenih in vivo jačina utišavanja gena (DODMA » DLinDAP > DODAP) ("DLinDAP" je 1,2-dilineoil-3-dimetilamonijumpropan) da bi uhvatio nukleinsku kiselinu bez pomoći organskih rastvarača ili deterdženta. Značajno, u slučaju da izostane bilo, da formulacije sastavljene od jonizabilnog lipida/DSPC/Chol/PEG-lipida (50/10/39/1 mol%) dostignu skoro potpuno obuhvatanje siRNK (> 85%) kada je mešano na pH 4 u odnosu od 0,058 mg siRNK/µmol lipid posle čega je usledila neutralizacija sa fosfat puferskim rastvorom (PBS) (Tabela 1). Ovaj ogled za određivanje hvatanja u zamku se zasniva na isključivanju boje RNK vezivanja iz nukleinske kiseline pomoću komponenata lipida. Dakle, hvatanje u zamku se posmatra kao uklanjanje RNK iz spoljne podloge i više je od prelaznog načina (tj. stabilnog hvatanja u zamku). Uprkos nedostatku organskih rastvarača ili deterdženata u postupcima proizvodnje, dobijene formulacije transfekciono kompetentne vezikule (TCV) su neočekivano pokazale efikasnosti hvatanja u zamku slične onima prijavljenim na drugim mestima za LNP-siRNK generisanu tehnikama brzog mešanja korišćenjem organskih rastvarača (Belliveau, Huft et al.2012; Chen, Tam et al. 2014; Leung, Tam et al.2015; Chen, Tam et al.2016).
Tabela 1: Efikasnosti nukleinskih kiselina kao zamke za hvatanje različitih formulacija transfekciono kompetentnih vezikula (TCV).
Naziv Formulacija lipida Postupak Efikasnost kao zamke za formulacije hvatanje, % (srednja ±
SEM)
DODMA-50% DODMA/DSPC/Chol/PEG Mešanje tipa T 87,90 ± 3,94
(50/10/39/1) raskrsnice
DLinDAP-50% DLinDAP/DSPC/Chol/PEG Mešanje tipa T 74,44 ± 7,18
(50/10/39/1) raskrsnice
DODAP-50% DODAP/DSPC/Chol/PEG Mešanje tipa T 71,84 ± 5,76
(50/10/39/1) raskrsnice
Primer 2: siRNK u organskim praznim transfekciono kompetentnim vezikulama (TCV) bez rastvarača, bez deterdženta prikazuje ogromno smanjenje imortalizovanih ćelija i primarnih neurona.
[0067] Sposobnost da se uhvate u zamku nukleinska kiselina i naknadno da se isporuči na netoksičan način predstavlja dve odvojene prepreke. Posle određivanja da se neorganski rastvarač/nedeterdžentske na lipidu zasnovane transfekciono kompetentne vezikule (TCV) koje su razmatrane gore u tekstu efikasno su uhvaćene u zamku nukleinske kiseline, njihova sposobnost da utišaju gene i njihovo dejstvo na održivost ćelije je testirano u dva scenarija, kao što je prikazano na Sl. 1A-1D. Prvo, prazne organske transfekciono kompetentne vezikule (TCV) bez rastvarača, bez deterdženta su kombinovane korišćenjem punjenja na vrhu radnog stola sa siLuc i koriste se za tretiranje HEK-Luc ćelija. Neočekivano, na DODMA zasnovane transfekciono kompetentne vezikule (TCV) pokazuju oko 50% smanjenja i imale su bolji učinak od DLinDAP i DODAP, što nije pokazalo nikakvu indikaciju smanjenja (Sl.
1A). Nijedna od formulacija nije pokazala toksičnost kako je izmereno održivošću ćelije u poređenju sa netretiranim ćelijama (Sl. 1B). Drugo, efikasnost i toksičnost transfekciono kompetentnih ćelija (TCV) koje isporučuju siRNK je testirana naspram hdh gena u primarnim neuronima mišjeg korteksa. Ponovo (Sl. 1C), DODMA-transfekciono kompetentne ćelije (TCV) su pokazale oko 50% efikasnost smanjenja gena, pri čemu su DLinDAP-transfekciono kompetentne ćelije (TCV) prikazale manje smanjenje, i DODAP-transfekciono kompetentne ćelije (TCV) nisu pokazale bilo kakvu razliku u odnosu na netretirane ćelije. Treba napomenuti da su primarni neuroni sasvim podložni toksičnim dejstvima štetnih reagenasa za transfekciju kao što su oni koji su trenutno komercijalno dostupni. Slika 13 ističe razlike u dejstvu na održivost.
Primer 3: Više procesa mešanja može da proizvede snažne organske prazne transfekciono kompetentne vezikule (TCV) bez rastvarača, bez deterdženta
[0068] U nastojanju da se odredi uloga aspekta mešanja proizvodnog procesa i iz njega nastale veličine čestice da bi se postigla jačina prikazana na Sl. 1, organske prazne transfekciono kompetentne vezikule ćelije (TCV) bez rastvarača, bez deterdženta zasnovane na lipidu sadrže jonizabilne lipide kao što je DODMA su proizvedene korišćenjem mešanja i ekstruzije tipa T raskrsnice. Kako je prikazano na Sl. 2A, posle punjenja na vrhu radnog stola siRNK u prazne transfekciono kompetentne vezikule (TCV) pojavilo se značajno smanjenje luciferaze u HEK-Luc ćelijama korišćenjem oba procesa. Nije bilo značajne razlike u održivosti ćelija tretiranih česticama proizvedenih tipom T raskrsnice ili ekstruzijom (Sl. 2B). Dalje, primarni neuroni korteksa su tretirani istim formulacijama na lipidu zasnovane transfekciono kompetentne vezikule (TCV) bez rastvarača, bez deterdženta i utvrđeno je da su oba postupka dala kao rezultat čestice slične jačine (Sl.2C) i slične održivosti ćelije (Sl. 2D). Nasuprot tome, toksičnost sadašnjih metoda transfekcije (Sl 13) u primarnim kulturama odvlači od cilja netoksične a ipak jake formulacije.
Primer 4: Organske transfekciono kompetentne vezikule bez rastvarača, bez deterdženta sadrže smanjenu količinu jonizabilnog lipida olakšavaju snažnu isporuku siRNK sa smanjenom toksičnošću
[0069] Uspostavljena kompozicija lipida, trenutno korišćena za kliničke formulacije (videti Patisiran), uključuje značajnu količinu jonizabilnog katjonskog lipida (50 mol%) (Jayaraman, Ansell et al. 2012; Suhr, Coelho et al. 2015). Iako tako visoke količine dozvoljavaju poboljšanja delotvorne doze da bi dostigla 50% utišavanje gena (ED50) in vivo (Jayaraman, Ansell et al. 2012), postojanost metapolita lipida posle isporuke pacijentu (Maier, Jayaraman et al. 2013; Sabnis, Kumarasinghe et al. 2018) i toksičnost povezana sa tim molekulima daje formulaciju koja je toksična u režimima visokog doziranja i ponovljenoj isporuci (ili za osetljive tipove ćelija). Sadašnje supstance, transfekciono kompetentne vezikule (TCV), itd. mogu da budu od materijala koji su biorazgradivi ili da olakšaju eliminisanje. Ovde, sadašnje supstance, transfekciono kompetentne vezikule (TCV), itd. smanjuju količinu toksičnih sastojaka uz istovremeno zadržavanje jačine transfekcije.
[0070] Kompetentnost za transfekciju formulacije koja se sastoji od DODMA/DOPE/DSPC/Chol/PEG-lipida (20/30/10/39/1 mol% prema navedenom redosledu) da bi se utišala luciferaza u HEK-Luc ćelijama je testirana.40% smanjenje ekspresije luciferaze je primećeno (Sl. 3A) bez ikakve značajne toksičnosti (Sl. 3B). Dalje, testirali smo sposobnost transfekciono kompetentne vezikule (TCV) sa 20mol% jonizabilnog lipida da bi se isporučila siRNK za primane neurone u poređenju sa DODMA-transfekciono kompetentne vezikule (TCV) na 50 mol%. Sve formulacije su prikazale ~60% smanjenje hdh (Sl.3C), pri čemu je DODMA formulacija proizvedena tipom T mešanja je pokazalo značajno poboljšanu održivost ćelije (Sl.3C).
Primer 5: Inkorporiranje DOPE ne menja morfologiju prazne transfekciono kompetentne vezikule (TCV) bez organskog rastvarača, bez deterdženta
[0071] Poboljšanje potencijala za HII formiranje faze u farmaceutskom nosaču za isporuku nukleinske kiseline može da bude važan činilac da bi se olakšala fuzija membrane u endozomu (Hafez, Maurer et al. 2001). U ovom pristupu, dva lipida iz primera mogu da usvoje HII faze su DOPE (u izolaciji) i DODMA (kada je protonisan i kombinovan sa anjonskim lipidima). Da bi se odredilo da li je inkorporiranje DOPE u organskim transfekciono kompetentnim vezikulama (TCV) bez rastvarača, bez deterdženta dalo kao rezultat preuranjeno formiranje HII faze, crio-TEM je izveden na DODMA-transfekciono kompetentne vezikule (TCV) pri 20 mol% i ekvivalentna formulacija je sastavljena od 50 mol% DODMA. Strukture dobijene kao rezultat (Sl.4A, 4B) su vizualizovane kao dvoslojne strukture bez ikakve indikacije o HII fazi.
[0072] Prethodan rad drugih nagoveštava prisustvo HII-slične interne strukture unutar jezgra LNP formulacija bez obzira na sadržaj siRNK (Leung, Hafez et al.2012; Leung, Tam et al. 2015). Pokazalo se da LNP-siRNK ne obuhvataju takve strukture, već pre da imaju nepokretnu siRNK između blisko suprotstavljenih slojeva lipida (Kulkarni, Darjuan et al. 2018) davanje celokupnoj čestici višeslojnu ili crnom luku sličnu morfologiju. U odsustvu siRNK, LNP formulacije usvajaju gusto jezgro elektrona obuhvataju uljnu fazu lipida. Dakle, ovde primeri pokazuju da morfologija transfekciono kompetentne vezikule (TCV) jeste drastično različita u odnosu na sisteme LNP ali i dalje imaju visoko efikasnu jačinu tansfekcije.
Primer 6: Organske prazne transfekciono kompetentne vezikule (TCV) bez rastvarača, bez deterdženta mogu da se koriste da bi isporučile funkcionalne ribonukleoproteine (RNP).
[0073] Kao što je prikazano na Slici 5, organske prazne transfekciono kompetentne vezikule (TCV) bez rastvarača, bez deterdženta ovde se testiraju za njihovu sposobnost da se isporuči teret izabran proteinom u kompleksu sa nukleinskom kiselinom u ćeliji sisara. Ukratko, kompleks ribonukleoproteina se sastoji od rekombinantnog Cas9 proteina i vodeće RNK koja cilja ekson 5 gena progranulina je sklopljen i kombinovan sa praznim transfekciono kompetentnim vezikulama (TCV) punjenjem na vrhu radnog stola (DODMA/DOPE/DSPC/Chol/(20/30/10/40 mol% prema navedenom odnosu) u molarnom odnosu od 467:1 (kompleksa transfekciono kompetentne vezikule (TCV):ribonukleoproteina (RNP)). Zasebno, jednolančani oligodeoksinukleotid koji je projektovan da uvede 4bp brisanje u eksonu 5 gena progranulina je kombinovan sa transfekciono kompetentnim vezikulama (TCV) u molarnom odnosu od 4275:1 (transfekciono kompetentna vezikula (TCV):nukleinska kiselina). Dva preparata transfekciono kompetentne vezikule (TCV) sadrže za njih relevantne izabrane terete koji su kombinovani da dostižu krajnju koncentraciju 10nM ribonukleoproteina (RNP) i 10nM ssODN, i zatim su dodata u HEK ćelije. Posle 48 sati, polimerazna lančana reakcija (PCR) je korišćena da odredi da li je homologijom usmerena popravka koja je nastala na ciljni gen progranulina korišćenjem početnice prema napred specifična za bilo divlji tip ili za mutirani alel. Kao što je prikazano na Slici 5, ćelije su izložene kombinaciji transfekciono kompetentnih vezikula (TCV) koje sadrže svaka komplekse ribonukleoproteina i ssODN je dala kao rezultat u umetanje 4bp brisanja preko homologijom usmerene popravke (druga traka sa Slike 5, označen mutant), pri čemu netretirane kontrolne ćelije nisu dale kao rezultat bilo koju genetsku alternaciju na mestu eksona 5 gena progranulina (treća i četvrta traka sa Slike 5).
Primer 7: Još neki primeri organskih praznih transfekciono kompetentnih vezikula bez rastvarača, bez deterdženta korišćenih da bi se isporučili funkcionalni ribonukleoproteini (RNP).
[0074] Organske prazne transfeksciono kompetentne vezikule (TCV) bez rastvarača, bez deterdženta korišćene da isporuče funkcionalne ribonukleoproteine (RNP) korišćenjem metoda kako je razmatrano gore u tekstu.
[0075] Slika 6 daje fotomikrograf za Cas9 smešten unutar primarnog neurona. Ribonukleoprotein (RNP) je isporučen preko organske transfekciono kompetentne vezikule bez rastvarača, bez deterdženta (TCV) kako je ovde razmatrano može da se vidi unutar primarnog neurona kao fluorescentni signali; netretirana kontrola nema takve fluorescentne signale. Preciznije, imunocitohemija primarnih neuronskih ćelija pokazala je lokalizaciju Cas9 protein (crveno) unutar nukleusa (plava) neurona korteksa izveden iz miševa. Ćelije su takođe obojene za faloidin (zeleni) da pokažu ćelijsku morfologiju.
[0076] Slika 7 pokazuje grafikon koji pokazuje smanjenje gena ribonukleoproteinom (RNP) isporučenim preko organskih transfekciono kompetentnih vezikula (TCV) bez rastvarača, bez deterdženta u HEK ćelijama. Ribonukleoproteini (RNP) isporučeni preko transfekciono kompetentnih vezikula (TCV) bez rastvarača, bez deterdženta u HEK ćelije pokazuje značajno smanjenje transkripta luciferaze u poređenju sa kontrolnim (''ctrl'' na grafikonu). Slika 8 pokazuje grafikon koji pokazuje smanjenje proteina ribonukleoproteinom (RNP) isporučenim preko organskih transfekciono kompetentnih vezikula (TCV) bez rastvarača, bez deterdženta u HEK ćelijama. Ribonukleoproteini (RNP) isporučeni preko transfekciono kompetentnih vezikula (TCV) bez rastvarača, bez deterdženta u HEK ćelije pokazuje značajno smanjenje proteina luciferaze u poređenju sa kontrolnim ('kontrola' na grafikonu), p = 0,0003.
[0077] Slika 9 pokazuje grafikon koji pokazuje smanjenje gena ribonukleoproteinom (RNP) isporučenim preko organskih transfekciono kompetentnih vezikula (TCV) bez rastvarača, bez deterdženta u primarnim neuronima. Ribonukleoproteini (RNP) isporučeni prekoorganske transfekciono kompetentne vezikule (TCV) bez rastvarača, bez deterdženta u primarnim neuronima korteksa pokazuju značajno smanjenje informacione RNK (iRNK) pomoću testa kvantitative polimerazne lančane reakcije (PCR) u realnom vremenu (qRT-PCR), p = 0,0039.
[0078] Okretanje nekih podrobnijih rasprava o ovim Slikama, Slike 7 i 8 pokazuju da je ribonukleoprotein (RNP) isporučen punjenjem na vrhu radnog stola prazne transfekciono kompetentne vezikule (TCV) ovde pokazuju znatno smanjenje gena reportera, luciferaze, u HEK ćelijama. Ovo je pokazano merenjem učinka luciferaze (funkcionalnog proteina) kao i nivoa iRNK luciferaze iRNK preko qRTPCR. Ovaj isti pristup isporuke ribonukleoproteina (RNP) je korišćen da prekine ekspresiju gena huntingtin u neuronima korteksa izvedenog iz FVB.YAC128 miševa koji ispoljavaju čovečji gen huntingtin pune dužine koji nosi mutaciju bolesti (Slika 9). iRNK nivoi gena huntingtin su kvantifikovani iz primarnih neurona korteksa korišćenjem qRT-PCR posle 72 sata inkubacije mešavinom transfekciono kompetentne vezikule (TCV):ribonukleoproteina (RNP).
Primer 8: Primer iRNK isporučene preko organske tansfekciono kompetentne vezikule (TCV) bez rastvarača, bez deterdženta.
[0079] Organske prazne transfekciono kompetentne vezikule (TCV) bez rastvora, bez deterdženta korišćene da isporuče informacionu RNK (iRNK) korišćenjem metoda kako je ovde razmatrano gore u tekstu.
[0080] Slika 10 je pokazala grafikon koji pokazuje ekspresiju informacione RNK (iRNK) je isporučena preko organske transfekciono kompentente vezikule (TCV) bez rastvarača, bez deterdženta u HEK ćelije. Informaciona RNK (iRNK) je isporučena preko organske transfekciono kompentente vezikule (TCV) bez rastvarača, bez deterdženta (DODMA/DOPE/DSPC/Chol (20/30/10/40)) u HEK ćelije u različitim odnosima nizak=0,029 mg iRNK/µmol lipid, mid=0,058 mg iRNK/µmol lipid, visok=0,116 mg iRNK/µmol lipid. Svi odnosi su pokazali značajnu ekspresiju u poređenju sa kontrolom, sa najnižim odnosom koji pokazuje najvišu ekspresiju.
[0081] Slika 11 obezbeđuje grafikon koji pokazuje ekspresiju informacione RNK (iRNK) isporučene transfekciono kompentente vezikule (TCV) bez rastvarača, bez deterdženta punjenjem na vrhu radnog stola u primarnim neuronima korteksa. Informaciona RNK (iRNK) je isporučena preko organske transfekciono kompentente vezikule (TCV) bez rastvarača, bez deterdženta (DODMA/DOPE/DSPC/Chol (20/30/10/40)) u primarne neurone korteksa u različitim dozama. Sve doze su pokazale značajnu ekspresiju u poređenju sa kontrolom.
[0082] Ako se okrenemo nešto detaljnijoj diskusiji o ovim slikama, Slika 10 pokazuje da je punjenje na vrhu radnog stola organske prazne transfekciono kompentente vezikule (TCV) bez rastvarača, bez deterdženta kako je ovde razmatrano mogu da se koriste da isporuče informacionu RNK (iRNK) koja kodira funkcionalni protein u ćelije. Ukratko, organske transfekciono kompentente vezikule (TCV) bez rastvarača, bez deterdženta su pomešane pažljivo korišćenjem pipete sa informacionom RNK (iRNK) koja kodira informacionu RNK (iRNK) luciferaze svica, u opsegu odnosa od 0,029-0,116 mg nukleinske kiseline:1 µmolu lipida. Ova mešavina je inkubirana na sobnoj temperaturi tokom 5-20 minuta, pre dodavanja kompletne podloge kulture i zatim je preneta u pregrade koje sadrže HEK ćelije (videti Sliku 10) ili primarne neurone korteksa (Slika 11). Učinak luciferaze je izmeren korišćenjem ONE-Glo pribora za test luciferaze iz Promega, prema instrukcijama proizvođača. Rezultati pokazuju proizvodnju proteina luciferaze unutar ovih tipova ćelija širom raspona izabranih koncentracija tereta: transfekciono kompetentne vezikule (TCV) i doze.
Primer 9: Poređenje organskih transfekciono kompetentnih vezikula (TCV) bez rastvarača, bez deterdženta prema proizvodima raspoloživim na tržištu.
[0083] Punjenje na vrhu radnog stola prazne organske transfekciono kompetentne vezikule (TCV) bez rastvarača, bez deterdženta je korišćeno da se isporuče siRNK ili ribonukleoprotein u HEK ćelije ili primarne neurone korišćenjem metoda kako je ovde razmatrano gore u tekstu, i zatim su kontrastirane prema ekvivalentnim transfekcijama korišćenjem komercijalno dostupnih sistema. Organske transfekciono kompetentne vezikule (TCV) bez rastvarača, bez deterdženta ovde nadmašuju komercijalno dostupne sisteme.
[0084] Slika 12 pokazuje grafikon koji pokazuje održivost ćelije za organske transfekciono kompetentne vezikule (TCV) bez rastvarača, bez deterdženta u HEK ćelijama. Ribonukleoproteini (RNP) su bili isporučeni preko organskih transfekciono kompetentnih vezikula (TCV) bez rastvarača, bez deterdženta (DODMA/DOPE/DSPC/Chol (20/30/10/40)) ili korišćenjem RNKiMaks ("Rmaks" na slici; ThermoFisher Scientific) u HEK ćelije za procenu citotoksičnosti. Organske transfekciono kompetentne vezikule (TCV) bez rastvarača, bez deterdženta su bile značajno manje toksične u poređenju sa RNKiMaks, p = 0,0002.
[0085] Slika 13 obezbeđuje fotomikrografikone koji pokazuju održivost ćelije za punjenje na vrhu stola siRNK u prazne organske transkripciono kompetentne vezikule (TCV) bez rastvarača, bez deterdženta u primarne neurone. siRNK su bile isporučene preko organskih transkripciono kompetentnih vezikula (TCV) bez rastvarača, bez deterdženta (DODMA/DOPE/DSPC/Chol/PEG lipid (20/30/10/39/1)) ili korišćenjem komercijalno dostupnog Mirus TKO sistema (Mirus Bio) u primarne neurone za procenu neurotoksičnosti. Organska transkripciono kompetentna vezikula (TCV) bez rastvarača, bez deterdženta je bila značajno manje toksična u poređenju sa Mirus TKO sistemom, kako je prikazano pomoću fotomikrografskih snimaka.
[0086] Slika 14 daje grafikon koji pokazuje smanjenje organskih transfekciono kompetentnih vezikula (TCV) bez rastvarača, bez deterdženta u HEK ćelijama. siRNK su isporučene preko organskih transfekciono kompetentnih vezikula (TCV) bez rastvarača, bez deterdženta DODMA nivoi na 50% ("D-50%", napravljeni mešanjem tipa T raskrsnice), 50% ("D-50% Ex", napravljeno ekstruzijom) i preko komercijalno dostupnog Mirus TKO sistema (Mirus Bio). Sadašnje 50% DODMA formulacije su pokazale nokdaun od oko 50%, pri čemu je Mirus TKO sistem dao značajno lošiji učinak.
[0087] Nešto detaljnije razmatranje ovih slika, Slika 12 pokazuje da je punjenje na vrhu radnog stola siRNK u prazne organske transfekciono kompetentne vezikule (TCV) bez rastvarača, bez deterdženta kako se ovde razmatra ima svojstva male toksičnosti i efikasno smanjenje ekspresije u primarnim ćelijama neurona izvedenim iz miševa i HEK liniji ćelija. Za tretiranje primarnih neurona korteksa, transfekciono kompetentne vezikule (TCV) su pomešane sa siRNK u odnosu od oko 0,022-0,058 mg nukleinske kiseline:1 µmol lipida i prenet je u pregrade koje sadrže primarne neuronske ćelije. Snimci svetlosnog mikrografa (lakog mikrografa) na Slici 13, su napravljeni pri istom uvećanju, pokazuju da u pregradama kontrolnih i transfekciono kompetentnih vezikula (TCV), ćelije ostaju zdrave sa procesima koji su nedirnuti i veoma malim brojem mrtvih ćelija. U pregradi tretiranoj Mirus TransIT-TKO-om, čini se da su ćelije značajno manje zdrave, sa prekinutim ćelijskim procesima i povećanom količinom malih, kondenzovanih (mrtvih) ćelija.
[0088] Za Sliku 12, HEK ćelije su tretirane sa Lipofektaminom RNKiMAX i transfekciono kompetentnim vezikulama (TCV) koje sadrže teret izabran ribonukleoproteinom (RNP). HEK ćelije su tretirane sa krajnjom koncentracijom od 5-50nM ribonukleoproteina (RNP) i reagensom bilo transfekciono kompetentne vezikule (TCV) ili RNKiMAX (RNAiMAX). Održivost ćelije je procenjena korišćenjem Promega ONE-Glo Tox pribora, i upoređena sa netretiranim kontrolnim ćelijama. HEK kulture tretirane sa RNKiMAX (RNAiMAX) pokazuju značajno smanjenje zdravlja u celini u poređenju sa pregradama ploče tretiranim i kontrolnom i transfekciono kompetentnom vezikulom (TCV).
[0089] Slika 14 pokazuje efikasnost punjenja na vrhu radnog stola praznih organskih transfekciono kompetentnih vezikula (TCV) bez rastvarača, bez deterdženta kako je ovde razmatrano za isporučivanje siRNK izabranog tereta u poređenju sa komercijalno dostupnim proizvodom, Mirus LT-TKO. Transfekciono kompetentne vezikule (TCV) su inkubirane sa siRNK ciljanjem gena luciferaze tokom 5-10 minuta na sobnoj temperaturi u odnosu od oko 0,022-0,058 mg nukleinske kiseline:1 µmol lipida. HEK ćelije su tretirane sa Mirus LT-TKO prema uputstvima proizvođača. U vreme tretiranja, podloge u pregradama ploče su potpuno zamenjene sa svežom podlogom rasta koja sadrži mešavine bilo siRNK:transfekciono kompetentnih vezikula (TCV) ili siRNK:Mirus LT-TKO. Posle 72 sata od terapije, HEK ćelije su testirane u pogledu učinka za održivost ćelije i luciferazu korišćenjem Promega ONE-Glo Tox pribora, i sve ćelije su upoređene sa netretiranim kontrolnim pregradama ploča.
REFERENTNA LITERATURA
[0090]
Akinc, A., A. Zumbuehl, et al. (2008). "A combinatorial library of lipid-like materials for delivery of RNAi therapeutics (Kombinatorna biblioteka materijala sličnih lipidu za isporuku RNKi terapija)." Nat Biotechnol 26(5): 561-569.
Basha, G., M. Ordobadi, et al. (2016). "Lipid Nanoparticle Delivery of siRNA to Osteocytes Leads to Effective Silencing of SOST and Inhibition of Sclerostin In Vivo (Isporuka lipidnih nanočestica siRNK osteocitima koji dovode do delotvornog utišavanja SOST i inhibicije Sklerostina in vivo)." Mol Ther Nucleic Acids 5(9): e363. Belliveau, N. M., J. Huft, et al. (2012). "Microfluidic Synthesis of Highly Potent Limitsize Lipid Nanoparticles for In Vivo Delivery of siRNA (Mikrofluidna sinteza veoma jakih dimenziono ograničavajućih lipidnih nanočestica za in vivo isporuku siRNK)." Mol Ther Nucleic Acids 1: e37.
Chen, S., Y. Y. Tam, et al. (2014). "Development of lipid nanoparticle formulations of siRNA for hepatocyte gene silencing following subcutaneous administration (Razvoj lipidnih nanočestice iz formulacija siRNK za utišavanje hepatocitnog gena posle potkožne isporuke.)." J Control Release 196: 106-112.
Chen, S., Y. Y. Tam, et al. (2016). "Influence of particle Size on the in vivo potency of lipid nanoparticle formulations of siRNA (Uticaj veličine čestice na in vivo jačinu siRNK formulacija lipidne nanočestice)." J Control Release.
De Souza, R. A., S. A. Islam, et al. (2016). "DNA methylation profiling in human Huntington’s disease brain (Profilisanje DNK metilacije kod ljudi sa Hantingtonovim oboljenjem mozga)." Hum Mol Genet 25(10): 2013-2030.
Digiacomo, L., S. Palchetti, et al. (2018). "Cationic lipid/DNA complexes manufactured by microfluidics and bulk self-assembly exhibit different transfection behavior (Katjonski lipidni/DNK kompleksi proizvedeni mikrofluidicima i samostalni sklop rasutog sadržaja ispoljava različito ponašanje transfekcije)." Biochem Biophys Res Commun 503(2): 508-512.
Hafez, I. M., N. Maurer, et al. (2001). "On the mechanism whereby cationic lipids promote intracellular delivery of polynucleic acids (O mehanizmu pri čemu katjonski lipidi pospešuju unutarćelijsku isporuku polinukleinskih kiselina.)." Gene Ther 8(15): 1188-1196.
Jayaraman, M., S. M. Ansell, et al. (2012). "Maximizing the potency of siRNA lipid nanoparticles for hepatic gene silencing in vivo (Maksimizovanje jačine siRNK lipidnih nanočestica za in vivo utišavanje gena jetre.)." Angew Chem Int Ed Engl 51(34): 8529-8533.
Jeffs, L. B., L. R. Palmer, et al. (2005). "A Scalable, Extrusion-Free Method for Efficient Liposomal Encapsulation of Plasmid DNA (Metod koji omogućava podešavanje razmere, bez ekstruzije za efikasnu inkapsulaciju lipozoma plazmidne DNK.)." Pharm Res 22(3): 362-372.
Kulkarni, J. A., M. M. Darjuan, et al. (2018). "On the Formation and Morphology of Lipid Nanoparticles Containing Ionizable Cationic Lipids and siRNA (O formiranju i morfologije nanočestica lipida koje sadrže jonizabilne katjonske lipide i siRNK.)." ACS Nano 12(5): 4787-4795.
Kulkarni, J. A., Y. Y. C. Tam, et al. (2017). "Rapid Synthesis of Lipid Nanoparticles Containing Hydrophobic Inorganic Nanoparticles (Brza sinteza nanočestica lipida koje sadrže hidrofobne inorganske nanočestice)." Nanoscale.
Leung, A. K., I. M. Hafez, et al. (2012). "Lipid Nanoparticles Containing siRNA Synthesized by Microfluidic Mixing Exhibit an Electron-Dense Nanostructured Core (Lipidne nanočestice koje sadrže siRNK sintetisane mikrofluidnog mešanja ispoljavaju elektronski gusto nanostrukturisano jezgro.)." J Phys Chem C Nanomater Interfaces 116(34): 18440-18450. Leung, A. K., Y. Y. Tam, et al. (2015). "Microfluidic Mixing: A General Method for Encapsulating Macromolecules in Lipid Nanoparticle Systems (Mikrofluidno mešanje: Opšti metod inkapsulacije makromolekula u sistemima lipidne nanočestice.)." J Phys Chem B 119(28): 8698-8706.
Lin, P. J., Y. Y. Tam, et al. (2013). "Influence of cationic lipid composition on uptake and intracellular processing of lipid nanoparticle formulations of siRNA (Uticaj katjonske lipidne supstance na apsorpciju i unutarćelijsku preradu formulacija nanočestica lipida iz siRNK.)." Nanomedicine 9(2): 233-246.
Maier, M. A., M. Jayaraman, et al. (2013). "Biodegradable lipids enabling rapidly eliminated lipid nanoparticles for systemic delivery of RNAi therapeutics (Biorazgradivi lipidi omogućavaju brzo eliminisane lipidne nanočestice za sistemsku isporuku RNKi lekove.)." Mol Ther 21(8): 1570-1578.
Maurer, N., K. F. Wong, et al. (2001). "Spontaneous entrapment of polynucleotides upon electrostatic interaction with ethanol-destabilized cationic liposomes (Spontano hvatanje polinukleotida posle elektrostatičke interakcije sa etanolom destabilizovanim katjonskim lipozomima.)." Biophys J 80(5): 2310-2326.
Palchetti, S., D. Pozzi, et al. (2017). "Manipulation of lipoplex concentration at the cell surface boosts transfection efficiency in hard-to-transfect cells (Manipulacija lipopleks koncentracije na površini ćelije pospešuje efikasnost transfekcije u ćelijama koje se teško transfekcionišu.)." Nanomedicine 13(2): 681-691.
Pardi, N., S. Tuyishime, et al. (2015). "Expression kinetics of nucleoside-modified mRNA delivered in lipid nanoparticles to mice by various routes (Ekspresija kinetike nukleozidom modifikovane iRNK isporučene u lipidnim nanočesticama miševima različitim rutama.)." J Control Release 217: 345-351.
Pozzi, D., C. Marchini, et al. (2012). "Transfection efficiency boost of cholesterolcontaining lipoplexes (Efikasnost transfekcije pospešuje lipoplekse koji sadrže holesterol.)." Biochim Biophys Acta 9(43): 22.
Rungta, R. L., H. B. Choi, et al. (2013). "Lipid Nanoparticle Delivery of siRNA to Silence Neuronal Gene Expression in the Brain (Isporuka lipidne nanočestice siRNK da bi se utišala ekspresija gena neurona u mozgu.)." Mol Ther Nucleic Acids 3(2): 65.
Sabnis, S., E. S. Kumarasinghe, et al. (2018). "A Novel Amino Lipid Series for mRNA Delivery: Improved Endosomal Escape and Sustained Pharmacology and Safety in Non-human Primates (Nova serija amino lipida za isporuku iRNK: Poboljšano izbegavanje endozoma i zadržana farmakologija i bezbednost u nečovečjim primatima)." Mol Ther 26(6): 1509-1519. Scherphof, G. and H. Morselt (1984). "On the size-dependent disintegration of small unilamellar phosphatidylcholine vesicles in rat plasma. Evidence of complete loss of vesicle structure (O razgradnji zavisnoj od veličine malih jednolamelarnih vezikula fosfatidilholina u plazmi pacova: Dokaz o potpunom gubitku strukture vezikula.)." Biochem J 221(2): 423-429.
Semple, S. C., A. Akinc, et al. (2010). "Rational design of cationic lipids for siRNA delivery (Racionalna konstrukcija katjonskih lipida za siRNK isporuku.)." Nat Biotechnol 28(2): 172-176.
Semple, S. C., S. K. Klimuk, et al. (2001). "Efficient encapsulation of antisense oligonucleotides in lipid vesicles using ionizable aminolipids: formation of novel small multilamellar vesicle structures (Efikasna inkapsulacija antisens oligonukleotida u vezikulama lipida korišćenjem jonizabilnih aminolipida: formiranje struktura novih malih višelamelarnih vezikula.)." Biochimica et Biophysica Acta (BBA) Biomembranes 1510(1): 152-166.
Suhr, O. B., T. Coelho, et al. (2015). "Efficacy and safety of patisiran for familial amyloidotic polyneuropathy: a phase II multi-dose study (Efikasno i bezbednost patisirana (Onpatro) za porodičnu amiloidoznu polineuropatiju).)." Orphanet Journal of Rare Diseases 10(1): 109.
Tam, P., M. Monck, et al. (2000). "Stabilized plasmid-lipid particles for systemic gene therapy (Stabilizovane plazmidno-lipidne čestice za sistemsku gensku terapiju.)." Gene Therapy 7: 1867. Wang, Y., L. Miao, et al. (2015). "Delivery of oligonucleotides with lipid nanoparticles (Isporuka oligonukleotida sa lipidnim nanočesticama.)." Adv Drug Deliv Rev 87: 68-80. Wheeler, J. J., L. Palmer, et al. (1999). "Stabilized plasmidlipid particles: construction and characterization (Stabilizovane plazmidno-lipidne čestice: izgradnja i karakterizacija.)." Gene Ther 6(2): 271-281.Y
Zhigaltsev, I. V., N. Belliveau, et al. (2012). "Bottom-up design and synthesis of limit size lipid nanoparticle systems with aqueous and triglyceride cores using millisecond microfluidic mixing (Neprofesionalna konstrukcija i sinteza ograničene veličine sistema lipidne nanočestica sa vodenastim i trigliceridnim jezgrima korišćenjem milisekundnog mikrofluidnog mešanja.)." Langmuir 28(7): 3633-3640. Zhigaltsev, I. V., Y. K. Tam, et al. (2016). "Production of limit size nanoliposomal systems with potential utility as ultrasmall drug delivery agents (Proizvodnja ograničene veličine nanolipozomnih sistema sa potencijalnom korisnošću kao ultra malim agensima za isporuku leka.)." J Liposome Res 26(2): 96-102.
[0091] Svi ovde korišćeni pojmovi se koriste u skladu sa svojim uobičajenim značenjima osim ako kontekst ili definicija jasno ne implicira drugačije. Osim ako nije drugačije naznačeno, u tekstu upotreba ''ili'' obuhvata ''i'' i obratno. Neograničavajuće pojmove ne treba tumačiti kao ograničavajuće osim ako nije drugačije navedeno, ili na to kontekst drugačije ukazuje, osim toga (na primer, ''uključujući,'' ''ima,'' i ''obuhvata'' uobičajeno se koriste u smislu ''uključuje bez ograničenja'').. Oblici jednine, uključujući u patentnim zahtevima, kao što su oblici neodređenog člana "a," "an," i određenog člana "the" uključujući upućivanje na množinu osim ako nije izričito navedeno drugačije, ili kontekst ne ukazuje jasno da je drugačije.
[0092] Osim ako nije drugačije navedeno, pridevi ovde kao što "znatno" i "oko" koji modifikuju stanje ili karakterističan odnos nekog svojstva ili karakteristika nekog izvođenja, ukazuju da stanje ili karakteristika jeste definisana unutar tolerancija koje su prihvatljive za rad izvođenja za primenu za koju je predviđena.
[0093] Iz prethodnog, jasno će biti da, iako se ovde razmatraju specifična izvođenja u svrhe ilustrovanja, različite modifikacije moguće su bez udaljavanja od obima ovde iznetih ramatranja. Prema tome, sistemi i postupci, itd., uključuju takve modifikacije i nisu ograničeni izuzev kako je navedeno u priloženim patentnim zahtevima.

Claims (25)

Patentni zahtevi
1. Metod inkapsulacije izabranog tereta u na lipidu zasnovanu transfekciono kompetentnu vezikulu (TCV) koji obuhvata:
(a) obezbeđivanje rastvora na bazi vode koji sadrži na lipidu zasnovanu transfekciono kompetentnu vezikulu (TCV), pri čemu je taj na vodi zasnovan rastvor bez organskih rastvarača i deterdženata; i,
(b) mešanje izabranog tereta u rastvor pod uslovima pogodnim i tokom vremenskog perioda dovoljnog da se izabrani teret inkapsulira unutar katjonske na lipidu zasnovane transfekciono kompetentne vezikule (TCV) da bi se dobio inkapsuliran izabrani teret u na lipidu zasnovanoj transfekciono kompetentnoj vezikuli (TCV), pri čemu je mešanje izvedeno bez prisustva organskog rastvarača i bez prisustva deterdženta,
pri čemu na lipidu zasnovana transfekciono kompetentna vezikula (TCV) obuhvata jonizabilni katjonski lipid sa oko 20 mol% ili sa oko 30 mol% i pri čemu taj izabrani kargo obuhvata protein.
2. Metod iz patentnog zahteva 1, pri čemu na lipidu zasnovana transfekciono kompetentna vezikula (TCV) obuhvata jonizabilni katjonski lipid sa oko 20 mol%.
3. Metod iz patentnog zahteva 1 ili 2, pri čemu jonizabilan katjonski lipid obuhvata ili jeste 1,2-dioleiloksi-3-dimetilaminopropan (DODMA).
4. Metod iz bilo kog od patentnih zahteva 1-3, pri čemu ta na lipidu zasnovana transfekciono kompetentna vezikula (TCV) obuhvata DODMA sa oko 20 mol%.
5. Metod iz patentnog zahteva 1, pri čemu na lipidu zasnovana transfekciono kompetentna vezikula (TCV) obuhvata DODMA sa oko 30 mol%.
6. Metod iz bilo kog od patentnih zahteva 1-5, pri čemu na lipidu zasnovana transfekciono kompetentna vezikula (TCV) još obuhvata najmanje jedan polietilen glikol (PEG) ili holesterol.
7. Metod iz bilo kog od patentnih zahteva 1-6, pri čemu ta na lipidu zasnovana transfekciono kompetentna vezikula (TCV) obuhvata mešavinu od:
(i) jonizabilnog katjonskog lipida, opciono DODMA;
(ii) jednog ili više fosfolipida, opciono 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamin (DOPE) i 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoholina (DSPC);
(iii) holesterola; i
(iv) PEG-lipida.
8. Metod iz bilo kog od patentnih zahteva 1-3, pri čemu na lipidu zasnovana transfekciono kompetentna vezikula (TCV) obuhvata:
(i) mešavinu DODMA/DOPE/DSPC/ChoI/PEG lipida sa oko 20/30/10/39/1 mol%; ili
(ii) mešavinu DODMA/DOPE/DSPC/Chol sa oko 20/30/10/40 mol%.
9. Metod iz bilo kog od patentnih zahteva 1-8, pri čemu izabrani teret još obuhvata nukleinsku kiselinu, opciono, pri čemu je nukleinska kiselina:
(i) ribonukleinska kiselina (RNK), opciono obuhvata informacionu RNK (iRNK), malu interferirajuću RNK (siRNK), kratku ukosničku RNK, i/ili mikroRNK (miRNK); i/ili
(ii) dezoksiribonukleinska kiselina (DNK), opciono obuhvata dvolančanu DNK, jednolančanu DNK, plazmidnu DNK, i/ili komplementarnu DNK (kDNK).
10. Metod iz bilo kog od patentnih zahteva 1-9, pri čemu taj protein obuhvata deo ribonukleoproteina (RNP), opciono pri čemu ribonukleoprotein (RNP) obuhvata Cas9 protein i vodeću RNK, i još opcionalnije pri čemu izabrani teret još obuhvata jednolančanu DNK (jlDNK, ssDNA).
11. Metod iz bilo kog od patentnih zahteva 1-10, pri čemu taj na lipidu zasnovan rastvor obuhvata 25 mM do 100 mM acetatnog puferskog sredstva.
12. Supstanca koja obuhvata na lipidu zasnovanu transfekciono kompetentnu vezikulu (TCV) u rastvoru na bazi vode pri čemu je supstanca bez organskih rastvarača i deterdženata pri čemu osim toga na lipidu zasnovana transfekciono kompetentna vezikula (TCV) obuhvata jonizabilni katjonski lipid sa oko 20 mol% ili sa oko 30%, pri čemu na lipidu zasnovana transfekciono kompetentna vezikula (TCV) sadrži izabrani teret koji obuhvata protein.
13. Supstanca iz patentnog zahteva 12, pri čemu na lipidu zasnovana transfekciono kompetentna vezikula (TCV) obuhvata jonizabilni katjonski lipid sa oko 20 mol%.
14. Supstanca iz patentnog zahteva 12 ili 13, pri čemu jonizabilan katjonski lipid obuhvata ili jeste DODMA.
15. Supstanca iz bilo kog od patentnih zahteva 12-14, pri čemu ta na lipidu zasnovana transfekciono kompetentna vezikula (TCV) obuhvata DODMA sa oko 20 mol%.
16. Supstanca iz patentnog zahteva 12, pri čemu na lipidu zasnovana transfekciono kompetentna vezikula (TCV) obuhvata DODMA sa oko 30 mol%.
17. Supstanca iz bilo kog od patentnih zahteva 12-16, pri čemu ta na lipidu zasnovana transfekciono kompetentna vezikula (TCV) još obuhvata najmanje jedan polietilen glikol (PEG) ili holesterol.
18. Supstanca iz bilo kog od patentnih zahteva 12-17, pri čemu ta na lipidu zasnovana tansfekciono kompetentna vezikula (TCV) obuhvata mešavinu: jonizabilnog katjonskog lipida, opciono DODMA; jedan ili više fosfolipida, opciono DOPE i DSPC; holesterol; i PEG lipid.
19. Supstanca iz bilo kog od patentnih zahteva 12-14, pri čemu na lipidu zasnovana transfekciono kompetentna vezikula (TCV) obuhvata:
(i) mešavinu DODMA/DOPE/DSPC/ChoI/PEG lipida sa oko 20/30/10/39/1 mol%; ili
(ii) mešavinu DODMA/DOPE/DSPC/Cho l sa oko 20/30/10/40 mol%.
20. Supstanca iz bilo kog od patentnih zahteva 12-19, pri čemu taj na lipidu zasnovan rastvor obuhvata 25 mM do 100 mM acetatnog puferskog sredstva.
21. Supstanca bilo kog od patentnih zahteva 12-20, pri čemu izabrani teret još obuhvata nukleinsku kiselinu, opciono pri čemu je nukleinska kiselina:
(i) ribonukleinska kiselina (RNK), opciono obuhvata informacionu RNK (iRNK), malu interferirajuću RNK (siRNK), kratku ukosničku RNK, i/ili mikroRNK (miRNK); i/ili
(ii) dezoksiribonukleinska kiselina (DNK), opciono obuhvata dvolančanu DNK, jednolančanu DNK, plazmidnu DNK, i/ili komplementarnu DNK (kDNK).
22. Supstanca iz bilo kog od patentnih zahteva 12-21, pri čemu taj protein obuhvata deo (RNP), opciono pri čemu ribonukleoprotein (RNP) obuhvata Cas9 protein i vodeću RNK, i još opcionalnije, pri čemu izabrani teret još obuhvata jednolančanu DNK (jlDNK, ssDNA).
23. Supstanca koja obuhvata na lipidu zasnovan teret izabran inkapsulacijom tranfekciono kompetentne vezikule (TCV) u na vodi zasnovanim organskim rastvaračima i deterdžentima bez rastvora, koji je proizveden postupkom prema bilo kom od patentnih zahteva 1-11.
24. Metod transfekcije, pri čemu metod obuhvata transfektovanje ciljne ćelije sa na lipidu zasnovanom teretu izabranom inkapsulacijom transfekciono kompetentne vezikule (TCV) na izabranom teretu na lipidu zasnovane inkapsulirane transfekciono kompetentne vezikule (TCV) prema bilo kom od patentnih zahteva 12-23, pri čemu opciono ciljna ćelija jeste ćelija sisara, osim toga opciono primarna ćelija sisara, i osim toga opciono primarna neuronska ćelija sisara ili kultivisana ćelija sisara.
25. Supstanca koja obuhvata na lipidu zasnovanu transfekcionu kompetentnu vezikulu (TCV) koja obuhvata izabrani teret prema bilo kom od patentnih zahteva 12-23, za upotrebu u lečenju subjekta kom je potrebno, opciono pri čemu to lečenje jeste putem terapije genom a osim toga opciono i lečenje neurološkog poremećaja, i još opcionalnije Hantingtonove bolesti, Alchajmerove bolesti, Parkinsonove bolesti, demencije prednjeg režnja, amiotrofne lateralne skleroze, ili atrofije mišića kičme.
RS20240470A 2018-10-09 2019-10-09 Supstance i sistemi koji obuhvataju vezikule kompetentne za transfekciju bez organskih rastvarača i deterdženata i metode za to RS65449B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201862743116P 2018-10-09 2018-10-09
PCT/US2019/055472 WO2020077007A1 (en) 2018-10-09 2019-10-09 Compositions and systems comprising transfection-competent vesicles free of organic-solvents and detergents and methods related thereto
EP19871608.6A EP3864163B1 (en) 2018-10-09 2019-10-09 Compositions and systems comprising transfection-competent vesicles free of organic-solvents and detergents and methods related thereto

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS65449B1 true RS65449B1 (sr) 2024-05-31

Family

ID=70164385

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20240470A RS65449B1 (sr) 2018-10-09 2019-10-09 Supstance i sistemi koji obuhvataju vezikule kompetentne za transfekciju bez organskih rastvarača i deterdženata i metode za to

Country Status (21)

Country Link
US (4) US11980673B2 (sr)
EP (2) EP4379053A3 (sr)
JP (3) JP7555123B2 (sr)
KR (1) KR20210093232A (sr)
CN (2) CN113166783B (sr)
AU (3) AU2019359299B2 (sr)
BR (1) BR112021006539A2 (sr)
CA (1) CA3114699A1 (sr)
DK (1) DK3864163T3 (sr)
EA (1) EA202190688A1 (sr)
ES (1) ES2982542T3 (sr)
FI (1) FI3864163T3 (sr)
HR (1) HRP20240586T1 (sr)
HU (1) HUE066181T2 (sr)
IL (1) IL282063A (sr)
PH (1) PH12021550626A1 (sr)
PL (1) PL3864163T3 (sr)
PT (1) PT3864163T (sr)
RS (1) RS65449B1 (sr)
WO (1) WO2020077007A1 (sr)
ZA (1) ZA202102238B (sr)

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MA49421A (fr) 2017-06-15 2020-04-22 Modernatx Inc Formulations d'arn
EP3675817A1 (en) 2017-08-31 2020-07-08 Modernatx, Inc. Methods of making lipid nanoparticles
WO2020061457A1 (en) 2018-09-20 2020-03-26 Modernatx, Inc. Preparation of lipid nanoparticles and methods of administration thereof
HRP20240586T1 (hr) 2018-10-09 2024-07-19 The University Of British Columbia Sastavi i sustavi koji sadrže transfekcijske sposobne vezikle bez organskih otapala i deterdženta i s njim povezanim postupcima
CN118697900A (zh) 2019-01-31 2024-09-27 摩登纳特斯有限公司 制备脂质纳米颗粒的方法
JP2023526284A (ja) * 2020-05-15 2023-06-21 トランスレイト バイオ， インコーポレイテッド ｍＲＮＡ送達のための脂質ナノ粒子製剤
EP4192432A1 (en) * 2020-08-06 2023-06-14 ModernaTX, Inc. Methods of preparing lipid nanoparticles
CZ310613B6 (cs) 2020-09-23 2026-01-28 Ústav organické chemie a biochemie AV ČR, v. v. i. Lipidoidy pro transfekci nukleových kyselin a jejich použití
WO2022115645A1 (en) 2020-11-25 2022-06-02 Akagera Medicines, Inc. Lipid nanoparticles for delivery of nucleic acids, and related methods of use
TW202237068A (zh) * 2020-12-09 2022-10-01 美商建南德克公司 製備脂質奈米顆粒的高通量方法及其用途
CZ310443B6 (cs) 2021-07-19 2025-06-25 Ústav organické chemie a biochemie AV ČR, v. v. i. Cyklohexanové lipidoidy pro transfekci nukleových kyselin a jejich použití
WO2023009421A1 (en) * 2021-07-26 2023-02-02 Modernatx, Inc. Processes for preparing lipid nanoparticle compositions
US12589073B2 (en) * 2021-11-11 2026-03-31 Northwestern University Leveraging lipid-protein interactions to engineer spatial organization in cell-free systems
US20250235559A1 (en) * 2022-02-25 2025-07-24 Incisive Genetics Inc. Gene editing reporter system and guide rna and composition related thereto; composition and method for knocking out dna with more than two grnas; gene editing in the eye; and gene editing using base editors
CA3256897A1 (en) 2022-05-25 2023-11-30 Akagera Medicines, Inc. Lipid nanoparticles for the administration of nucleic acids and their methods of use
US20240000966A1 (en) * 2022-06-30 2024-01-04 Life Technologies Corporation Lipid Compositions For In Vivo Delivery
WO2025184543A1 (en) * 2024-03-01 2025-09-04 Arizona Board Of Regents On Behalf Of The University Of Arizona Compositions and methods for delivery of therapeutic compounds

Family Cites Families (244)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5552155A (en) * 1992-12-04 1996-09-03 The Liposome Company, Inc. Fusogenic lipsomes and methods for making and using same
US5776486A (en) 1993-05-28 1998-07-07 Aphios Corporation Methods and apparatus for making liposomes containing hydrophobic drugs
US5981501A (en) * 1995-06-07 1999-11-09 Inex Pharmaceuticals Corp. Methods for encapsulating plasmids in lipid bilayers
CA2227989A1 (en) 1995-08-01 1997-02-13 Karen Ophelia Hamilton Liposomal oligonucleotide compositions
US6093816A (en) 1996-06-27 2000-07-25 Isis Pharmaceuticals, Inc. Cationic lipids
US7262173B2 (en) 1997-03-21 2007-08-28 Georgetown University Chemosensitizing with liposomes containing oligonucleotides
AU733310C (en) 1997-05-14 2001-11-29 University Of British Columbia, The High efficiency encapsulation of charged therapeutic agents in lipid vesicles
US6110745A (en) 1997-07-24 2000-08-29 Inex Pharmaceuticals Corp. Preparation of lipid-nucleic acid particles using a solvent extraction and direct hydration method
US6410328B1 (en) 1998-02-03 2002-06-25 Protiva Biotherapeutics Inc. Sensitizing cells to compounds using lipid-mediated gene and compound delivery
US6693086B1 (en) 1998-06-25 2004-02-17 National Jewish Medical And Research Center Systemic immune activation method using nucleic acid-lipid complexes
US20030022854A1 (en) 1998-06-25 2003-01-30 Dow Steven W. Vaccines using nucleic acid-lipid complexes
WO2000030444A1 (en) 1998-11-25 2000-06-02 Vanderbilt University Cationic liposomes for gene transfer
AU5905400A (en) 1999-07-14 2001-02-05 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for delivery and retention of active agents to lymph nodes
US7094423B1 (en) 1999-07-15 2006-08-22 Inex Pharmaceuticals Corp. Methods for preparation of lipid-encapsulated therapeutic agents
JP4554883B2 (ja) 2000-10-04 2010-09-29 協和発酵キリン株式会社 脂質膜による微粒子の被覆方法
US7713942B2 (en) 2001-04-04 2010-05-11 Nordic Vaccine Technology A/S Cage-like microparticle complexes comprising sterols and saponins for delivery of polynucleotides
WO2002088370A2 (en) 2001-04-30 2002-11-07 Protiva Biotherapeutics Inc. Autogene nucleic acids encoding a secretable rna polymerase
WO2002087541A1 (en) 2001-04-30 2002-11-07 Protiva Biotherapeutics Inc. Lipid-based formulations for gene transfer
EP1441763A2 (en) 2001-11-07 2004-08-04 Inex Pharmaceuticals Corp. Mucosal adjuvants comprising an oligonucleotide and a cationic lipid
EP1519714B1 (en) 2002-06-28 2010-10-20 Protiva Biotherapeutics Inc. Method and apparatus for producing liposomes
CA2532228C (en) 2003-07-16 2017-02-14 Protiva Biotherapeutics, Inc. Lipid encapsulated interfering rna
EP1664316B1 (en) * 2003-09-15 2012-08-29 Protiva Biotherapeutics Inc. Polyethyleneglycol-modified lipid compounds and uses thereof
US20050266067A1 (en) 2004-03-02 2005-12-01 Shiladitya Sengupta Nanocell drug delivery system
JP4764426B2 (ja) 2004-06-07 2011-09-07 プロチバ バイオセラピューティクス インコーポレイティッド カチオン性脂質および使用方法
CA2569664C (en) 2004-06-07 2013-07-16 Protiva Biotherapeutics, Inc. Lipid encapsulated interfering rna
EP1773857A4 (en) 2004-07-02 2009-05-13 Protiva Biotherapeutics Inc THE IMMUNE SYSTEM STIMULATING SIRNA MOLECULES AND APPLICATIONS THEREOF
US20060051405A1 (en) 2004-07-19 2006-03-09 Protiva Biotherapeutics, Inc. Compositions for the delivery of therapeutic agents and uses thereof
CA2587411A1 (en) 2004-11-17 2006-05-26 Protiva Biotherapeutics, Inc. Sirna silencing of apolipoprotein b
JP2006248978A (ja) 2005-03-10 2006-09-21 Mebiopharm Co Ltd 新規なリポソーム製剤
CA2605068A1 (en) 2005-04-15 2006-10-26 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Delivery of sirna by neutral lipid compositions
US20080088046A1 (en) 2006-10-13 2008-04-17 Steffen Panzner Amphoteric liposomes, a method of formulating an amphoteric liposome and a method of loading an amphoteric liposome
US20070087045A1 (en) 2005-10-14 2007-04-19 Industrial Technology Research Institute Lipid carrier and method of preparing the same
WO2007048046A2 (en) 2005-10-20 2007-04-26 Protiva Biotherapeutics, Inc. Sirna silencing of filovirus gene expression
CN101346393B (zh) 2005-11-02 2015-07-22 普洛体维生物治疗公司 修饰的siRNA分子及其应用
US20070218122A1 (en) 2005-11-18 2007-09-20 Protiva Biotherapeutics, Inc. siRNA silencing of influenza virus gene expression
US8598333B2 (en) 2006-05-26 2013-12-03 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. SiRNA silencing of genes expressed in cancer
US20080171716A1 (en) 2006-08-16 2008-07-17 Protiva Biotherapeutics, Inc. Nucleic acid modulation of toll-like receptor-mediated immune stimulation
JP5484059B2 (ja) 2006-10-06 2014-05-07 エスシーアイエル テクノロジー ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 脊髄核インプラント
EP2217221B1 (en) 2007-10-17 2018-06-27 Korea Advanced Institute of Science and Technology Ldl-like cationic nanoparticles for deliverying nucleic acid gene, method for preparing thereof and method for deliverying nucleic acid gene using the same
ES2535419T3 (es) 2007-12-27 2015-05-11 Protiva Biotherapeutics Inc. Silenciamiento de expresión de quinasa tipo polo usando ARN interferente
CA2721333C (en) 2008-04-15 2020-12-01 Protiva Biotherapeutics, Inc. Novel lipid formulations for nucleic acid delivery
US8268796B2 (en) 2008-06-27 2012-09-18 Children's Hospital & Research Center At Oakland Lipophilic nucleic acid delivery vehicle and methods of use thereof
TW201004658A (en) 2008-07-31 2010-02-01 Enzon Pharmaceuticals Inc Nanoparticle compositions for nucleic acids delivery system
CA2740000C (en) 2008-10-09 2017-12-12 Tekmira Pharmaceuticals Corporation Improved amino lipids and methods for the delivery of nucleic acids
MX360460B (es) 2008-10-20 2018-11-05 Alnylam Pharmaceuticals Inc Composiciones y metodos para inhibir la expresion de transtiretina.
CN111808084A (zh) 2008-11-10 2020-10-23 阿布特斯生物制药公司 用于递送治疗剂的新型脂质和组合物
TW201021853A (en) 2008-11-17 2010-06-16 Enzon Pharmaceuticals Inc Releasable cationic lipids for nucleic acids delivery systems
US20110305769A1 (en) 2008-11-17 2011-12-15 Enzon Pharmaceuticals, Inc. Branched cationic lipids for nucleic acids delivery system
US10292932B2 (en) 2008-12-26 2019-05-21 Samyang Biopharmaceuticals Corporation Polymeric micelle particle comprising anionic drugs and method of preparing the same
WO2010108934A1 (en) 2009-03-25 2010-09-30 Novartis Ag Pharmaceutical composition containing a drug and sirna
SG10201911942UA (en) 2009-05-05 2020-02-27 Muthiah Manoharan Lipid compositions
KR101766408B1 (ko) 2009-06-10 2017-08-10 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 향상된 지질 조성물
US8569256B2 (en) 2009-07-01 2013-10-29 Protiva Biotherapeutics, Inc. Cationic lipids and methods for the delivery of therapeutic agents
WO2011000107A1 (en) 2009-07-01 2011-01-06 Protiva Biotherapeutics, Inc. Novel lipid formulations for delivery of therapeutic agents to solid tumors
AP2015008874A0 (en) * 2009-08-14 2015-11-30 Alnylam Pharmaceuticals Inc Lipid formulated compositions and methods for inhibiting expression of a gene from the ebola virus
NZ714887A (en) 2009-09-11 2019-07-26 Ionis Pharmaceuticals Inc Modulation of huntingtin expression
CN107028886A (zh) 2009-11-04 2017-08-11 不列颠哥伦比亚大学 含有核酸的脂质粒子及相关的方法
EP3318248B1 (en) 2009-12-01 2019-04-10 Translate Bio, Inc. Delivery of mrna for the augmentation of proteins and enzymes in human genetic diseases
EP2525778B1 (en) 2010-01-19 2018-08-01 Polypid Ltd. Sustained-release nucleic acid matrix compositions
WO2011141704A1 (en) 2010-05-12 2011-11-17 Protiva Biotherapeutics, Inc Novel cyclic cationic lipids and methods of use
KR101198715B1 (ko) 2010-05-14 2012-11-13 한국생명공학연구원 핵산 및 친수성 음이온 화합물의 고효율 포획을 위한 비대칭 리포솜 및 이의 제조방법
US20100239521A1 (en) 2010-06-01 2010-09-23 Mohammad Reza Mozafari Method for the preparation of micro- and nano-sized carrier systems for the encapsulation of bioactive substances
KR20190039347A (ko) 2010-06-03 2019-04-10 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 활성제의 전달을 위한 생분해성 지질
US9006417B2 (en) 2010-06-30 2015-04-14 Protiva Biotherapeutics, Inc. Non-liposomal systems for nucleic acid delivery
SI4043040T1 (sl) 2010-08-31 2023-04-28 Glaxosmithkline Biologicals Sa Mali liposomi za dostavo imunogen-kodirajoče RNA
US8466122B2 (en) 2010-09-17 2013-06-18 Protiva Biotherapeutics, Inc. Trialkyl cationic lipids and methods of use thereof
US9011903B2 (en) 2011-06-08 2015-04-21 Nitto Denko Corporation Cationic lipids for therapeutic agent delivery formulations
RU2013154295A (ru) * 2011-06-08 2015-07-20 Шир Хьюман Дженетик Терапис, Инк. КОМПОЗИЦИИ ЛИПИДНЫХ НАНОЧАСТИЦ И СПОСОБЫ ДЛЯ ДОСТАВКИ мРНК
ES2795110T3 (es) 2011-06-08 2020-11-20 Translate Bio Inc Lípidos escindibles
EP2729127B1 (en) * 2011-07-04 2018-05-02 Statens Serum Institut Methods for producing liposomes
MX366055B (es) 2011-08-31 2019-06-26 Novartis Ag Liposomas pegilados para admistracion de acido ribonucleico (arn) que codifica para inmunogeno.
US9126966B2 (en) 2011-08-31 2015-09-08 Protiva Biotherapeutics, Inc. Cationic lipids and methods of use thereof
JP2014530602A (ja) 2011-10-05 2014-11-20 プロティバ バイオセラピューティクス インコーポレイテッド アルデヒドデヒドロゲナーゼをサイレンシングするための組成物および方法
US9579338B2 (en) 2011-11-04 2017-02-28 Nitto Denko Corporation Method of producing lipid nanoparticles for drug delivery
EP3485875A1 (en) 2011-11-04 2019-05-22 Nitto Denko Corporation Single use system for sterelily producing lipid-nucleic acid particles
CA3018046A1 (en) 2011-12-16 2013-06-20 Moderna Therapeutics, Inc. Modified nucleoside, nucleotide, and nucleic acid compositions
EP2817287B1 (en) 2012-02-24 2018-10-03 Arbutus Biopharma Corporation Trialkyl cationic lipids and methods of use thereof
WO2013130824A1 (en) 2012-02-29 2013-09-06 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for treating huntington's disease
BR112014024131A2 (pt) 2012-03-29 2017-07-25 Shire Human Genetic Therapies lipídios catiônicos ionizáveis
WO2013151665A2 (en) 2012-04-02 2013-10-10 modeRNA Therapeutics Modified polynucleotides for the production of proteins associated with human disease
US20160289674A1 (en) 2012-04-02 2016-10-06 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of membrane proteins
US9254311B2 (en) 2012-04-02 2016-02-09 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of proteins
US10501513B2 (en) 2012-04-02 2019-12-10 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of oncology-related proteins and peptides
EP2858679B2 (en) 2012-06-08 2024-06-05 Translate Bio, Inc. Pulmonary delivery of mrna to non-lung target cells
HRP20181855T1 (hr) 2012-06-08 2018-12-28 Nitto Denko Corporation Lipidi za formulacije namijenjene unosu terapijskog sredstva
BR112015022855A2 (pt) 2013-03-14 2017-11-07 Shire Human Genetic Therapies composições e método para produção de um anticorpo in vitro
EP3750903A1 (en) 2013-03-14 2020-12-16 Translate Bio, Inc. Ribonucleic acids with 4'-thio-modified nucleotides and related methods
EP3388834B1 (en) 2013-03-15 2020-04-15 Translate Bio, Inc. Synergistic enhancement of the delivery of nucleic acids via blended formulations
CN105143456A (zh) 2013-03-15 2015-12-09 不列颠哥伦比亚大学 用于转染的脂质纳米粒子和相关方法
KR102109188B1 (ko) 2013-04-01 2020-05-11 삼성전자주식회사 양이온성 지질을 포함하는 온도민감성 리포좀 및 그의 용도
EP3019595A4 (en) * 2013-07-09 2016-11-30 THERAPEUTIC USES OF A GENERIC CHANGE WITH CRISPR / CAS SYSTEMS
JP6620093B2 (ja) 2013-07-23 2019-12-11 アービュートゥス バイオファーマ コーポレイションＡｒｂｕｔｕｓ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ メッセンジャーｒｎａを送達するための組成物及び方法
WO2015021465A2 (en) 2013-08-09 2015-02-12 New York University Protein engineered systems for delivery of molecules
ES3032935T3 (en) 2013-10-22 2025-07-29 Translate Bio Inc Lipid formulations for delivery of messenger rna
CN106413811A (zh) 2013-10-22 2017-02-15 夏尔人类遗传性治疗公司 精氨基琥珀酸合成酶缺乏症的mrna疗法
JP6506749B2 (ja) 2013-10-22 2019-04-24 シャイアー ヒューマン ジェネティック セラピーズ インコーポレイテッド フェニルケトン尿症のためのｍＲＮＡ療法
AU2014340149B2 (en) * 2013-10-22 2020-12-24 Shire Human Genetic Therapies, Inc. CNS delivery of mRNA and uses thereof
KR102396026B1 (ko) 2014-01-21 2022-05-09 안자리움 바이오사이언시스 아게 하이브리도좀, 이를 포함하는 조성물, 이의 제조 방법 및 이의 용도
ES2745769T3 (es) 2014-03-10 2020-03-03 Editas Medicine Inc Procedimientos y composiciones relacionados con CRISPR/CAS para tratar la amaurosis congénita de Leber 10 (LCA10)
US20170143848A1 (en) 2014-03-24 2017-05-25 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Mrna therapy for the treatment of ocular diseases
US9833416B2 (en) 2014-04-04 2017-12-05 Ohio State Innovation Foundation Oligonucleotide lipid nanoparticle compositions, methods of making and methods of using the same
PL4023249T3 (pl) * 2014-04-23 2025-03-10 Modernatx, Inc. Szczepionki z kwasem nukleinowym
JP6557722B2 (ja) 2014-05-30 2019-08-07 シャイアー ヒューマン ジェネティック セラピーズ インコーポレイテッド 核酸の送達のための生分解性脂質
EP3155116A4 (en) 2014-06-10 2017-12-27 Massachusetts Institute Of Technology Method for gene editing
KR102559979B1 (ko) 2014-06-24 2023-07-25 샤이어 휴먼 지네틱 테라피즈 인크. 핵산의 전달용 입체화학적으로 풍부한 조성물
EP3160448B1 (en) 2014-06-26 2025-08-06 Ramot at Tel-Aviv University Ltd. Liposomal formulations for delivery of nucleic acids
BR112016030852A2 (pt) 2014-07-02 2018-01-16 Shire Human Genetic Therapies encapsulação de rna mensageiro
JP6767976B2 (ja) 2014-12-05 2020-10-14 トランスレイト バイオ， インコーポレイテッド 関節疾患の治療のためのメッセンジャーｒｎａ治療法
JP2018509387A (ja) * 2015-01-21 2018-04-05 フェーズアールエックス インコーポレイテッド 細胞に治療および診断剤を送達するための方法、組成物、ならびにシステム
EP3247398A4 (en) 2015-01-23 2018-09-26 Moderna Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle compositions
WO2016149508A1 (en) 2015-03-19 2016-09-22 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Mrna therapy for pompe disease
EP4667492A3 (en) 2015-05-26 2026-04-15 Ramot at Tel-Aviv University Ltd. Targeted lipid particles for systemic delivery of nucleic acid molecules to leukocytes
US20180200186A1 (en) 2015-07-09 2018-07-19 Insmed Incorporated Compositions and methods for treating lung diseases and lung injury
JP6948313B6 (ja) 2015-09-17 2022-01-14 モデルナティエックス インコーポレイテッド 治療剤の細胞内送達のための化合物および組成物
AU2016341309A1 (en) 2015-10-22 2018-06-07 Modernatx, Inc. Cancer vaccines
WO2017070624A1 (en) 2015-10-22 2017-04-27 Modernatx, Inc. Tropical disease vaccines
AU2016342045A1 (en) 2015-10-22 2018-06-07 Modernatx, Inc. Human cytomegalovirus vaccine
EP3368089B1 (en) 2015-10-26 2025-11-05 Translate Bio Ma, Inc. Nanoparticle formulations for delivery of nucleic acid complexes
PL3386484T3 (pl) 2015-12-10 2022-07-25 Modernatx, Inc. Kompozycje i sposoby dostarczania środków terapeutycznych
PT3391875T (pt) 2015-12-18 2021-12-20 Samyang Holdings Corp Método para preparar micelas poliméricas contendo fármaco aniónico
LT3394030T (lt) 2015-12-22 2022-04-11 Modernatx, Inc. Junginiai ir kompozicijos terapinei medžiagai teikti intraceliuliniu būdu
CN107281103A (zh) 2016-04-11 2017-10-24 百奥迈科生物技术有限公司 具有高含量阳性脂质化合物的脂质体制剂及其应用
KR102427379B1 (ko) 2016-05-18 2022-08-02 보이저 테라퓨틱스, 인크. 헌팅톤 질환을 치료하기 위한 조성물 및 방법
US20190298657A1 (en) 2016-05-18 2019-10-03 Modernatx, Inc. Polynucleotides Encoding Acyl-CoA Dehydrogenase, Very Long-Chain for the Treatment of Very Long-Chain Acyl-CoA Dehydrogenase Deficiency
EP3469074B1 (en) 2016-06-13 2020-12-09 Translate Bio, Inc. Messenger rna therapy for the treatment of ornithine transcarbamylase deficiency
WO2017218704A1 (en) 2016-06-14 2017-12-21 Modernatx, Inc. Stabilized formulations of lipid nanoparticles
WO2018064755A1 (en) 2016-10-03 2018-04-12 Precision Nanosystems Inc. Compositions for transfecting resistant cell types
EP3528821A4 (en) 2016-10-21 2020-07-01 ModernaTX, Inc. HUMAN CYTOMEGALOVIRUS VACCINE
CA3040337A1 (en) 2016-10-26 2018-05-03 Curevac Ag Lipid nanoparticle mrna vaccines
US11583504B2 (en) 2016-11-08 2023-02-21 Modernatx, Inc. Stabilized formulations of lipid nanoparticles
AU2017356699B2 (en) 2016-11-08 2021-11-11 Ramot At Tel-Aviv University Ltd. Cationic lipids for nucleic acid delivery and preparation thereof
AU2017357758B2 (en) 2016-11-10 2023-11-16 Translate Bio, Inc. Improved process of preparing mRNA-loaded lipid nanoparticles
CA3043033A1 (en) 2016-11-10 2018-05-17 Translate Bio, Inc. Improved ice-based lipid nanoparticle formulation for delivery of mrna
AU2017374042C1 (en) 2016-12-09 2024-07-11 Acuitas Therapeutics, Inc. Delivery of target specific nucleases
US10383952B2 (en) 2016-12-21 2019-08-20 Arcturus Therapeutics, Inc. Ionizable cationic lipid for RNA delivery
CA3055653A1 (en) 2017-03-15 2018-09-20 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticle formulation
EP4186888B1 (en) 2017-03-15 2025-11-26 ModernaTX, Inc. Compound and compositions for intracellular delivery of therapeutic agents
WO2018213726A1 (en) * 2017-05-18 2018-11-22 The Broad Institute, Inc. Systems, methods, and compositions for targeted nucleic acid editing
BR112019025104A2 (pt) 2017-05-30 2020-06-23 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Método de fabricar um sistema de entrega não viral, sistema de entrega não viral, e, composição
US20200131498A1 (en) 2017-06-14 2020-04-30 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding methylmalonyl-coa mutase
WO2018232120A1 (en) 2017-06-14 2018-12-20 Modernatx, Inc. Compounds and compositions for intracellular delivery of agents
MA49421A (fr) 2017-06-15 2020-04-22 Modernatx Inc Formulations d'arn
EP3641834B1 (en) 2017-06-19 2023-10-04 Translate Bio, Inc. Messenger rna therapy for the treatment of friedreich's ataxia
KR20200036873A (ko) 2017-07-14 2020-04-07 온코루스, 인크. 캡슐화된 폴리뉴클레오티드 및 사용 방법
WO2019027055A1 (ja) 2017-08-04 2019-02-07 協和発酵キリン株式会社 核酸含有脂質ナノ粒子
CA3073020A1 (en) 2017-08-16 2019-02-21 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipids for use in lipid nanoparticle formulations
EP4501322A3 (en) 2017-08-17 2025-04-16 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipids for use in lipid nanoparticle formulations
WO2019036028A1 (en) 2017-08-17 2019-02-21 Acuitas Therapeutics, Inc. LIPIDS FOR USE IN LIPID NANOPARTICULAR FORMULATIONS
EP3675817A1 (en) 2017-08-31 2020-07-08 Modernatx, Inc. Methods of making lipid nanoparticles
WO2019089828A1 (en) 2017-10-31 2019-05-09 Acuitas Therapeutics, Inc. Lamellar lipid nanoparticles
AU2017438994A1 (en) 2017-11-09 2020-05-28 Immunovaccine Technologies Inc. Pharmaceutical compositions, methods for preparation comprising sizing of lipid vesicle particles, and uses thereof
US12036282B2 (en) 2017-12-06 2024-07-16 Newsouth Innovations Pty Limited Liposomal system for drug delivery
US11951210B2 (en) 2017-12-12 2024-04-09 The Johns Hopkins Universty Methods for making giant vesicles and their use
US11167043B2 (en) 2017-12-20 2021-11-09 Translate Bio, Inc. Composition and methods for treatment of ornithine transcarbamylase deficiency
US20210024928A1 (en) 2018-02-16 2021-01-28 Mina Therapeutics Limited C/ebp alpha sarna compositions and methods of use
US20210002640A1 (en) 2018-02-28 2021-01-07 Exicure, Inc. Liposomal spherical nucleic acid (sna) constructs for survival of motor neuron (sma) inhibitors
WO2019191341A1 (en) 2018-03-27 2019-10-03 Factor Bioscience Inc. Nucleic acid-based therapeutics
WO2019191780A1 (en) 2018-03-30 2019-10-03 Arcturus Therapeutics, Inc. Lipid particles for nucleic acid delivery
AU2019254591B2 (en) 2018-04-17 2025-12-11 CureVac SE Novel RSV RNA molecules and compositions for vaccination
US11679159B2 (en) 2018-04-29 2023-06-20 Precision NanoSystems ULC Compositions for transfecting resistant cell types
CN112055695A (zh) 2018-05-01 2020-12-08 弗莱德哈钦森癌症研究中心 用于基因表达的纳米粒子和其用途
US20210189397A1 (en) 2018-05-10 2021-06-24 Northwestern University Self-manageable abnormal scar treatment with spherical nucleic acid (sna) technology
WO2019226650A1 (en) 2018-05-23 2019-11-28 Modernatx, Inc. Delivery of dna
JP7488193B2 (ja) 2018-05-24 2024-05-21 トランスレイト バイオ， インコーポレイテッド チオエステルカチオン性脂質
EP3823634A4 (en) 2018-07-21 2022-08-03 University of Tennessee Research Foundation NEUTRAL LIPOSOMES CONTAINING BIOLOGICAL ACTIVE INGREDIENTS
JP7422977B2 (ja) 2018-07-23 2024-01-29 トランスレイト バイオ， インコーポレイテッド メッセンジャーｒｎａ用乾燥粉末製剤
WO2020028133A1 (en) 2018-07-30 2020-02-06 Trucode Gene Repair, Inc. Lipid nanoparticle formulations comprising nucleic acid mimics
EP3846857A4 (en) * 2018-09-04 2022-10-12 The Board Of Regents Of The University Of Texas System COMPOSITIONS AND METHODS FOR ORGAN-SPECIFIC DELIVERY OF NUCLEIC ACIDS
WO2020051243A1 (en) 2018-09-04 2020-03-12 Ohio State Innovation Foundation Lipid nanoparticles and methods of using thereof
EP3849617A1 (en) 2018-09-14 2021-07-21 Translate Bio, Inc. Composition and methods for treatment of methylmalonic acidemia
WO2020061367A1 (en) 2018-09-19 2020-03-26 Modernatx, Inc. Compounds and compositions for intracellular delivery of therapeutic agents
WO2020061457A1 (en) 2018-09-20 2020-03-26 Modernatx, Inc. Preparation of lipid nanoparticles and methods of administration thereof
HRP20240586T1 (hr) 2018-10-09 2024-07-19 The University Of British Columbia Sastavi i sustavi koji sadrže transfekcijske sposobne vezikle bez organskih otapala i deterdženta i s njim povezanim postupcima
EP3876914A2 (en) 2018-11-09 2021-09-15 Translate Bio, Inc. Messenger rna therapy for treatment of ocular diseases
AU2019376006A1 (en) 2018-11-09 2021-06-03 Arbutus Biopharma Corporation Cationic lipids containing silicon
EP3876999A4 (en) 2018-11-09 2022-08-31 Arbutus Biopharma Corporation NEGATIVELY CHARGED PEG-LIPID CONJUGATES
CA3118559A1 (en) 2018-11-09 2020-05-14 Arbutus Biopharma Corporation Lipid nanoparticle formulations
AU2019374871B2 (en) 2018-11-09 2025-09-11 Translate Bio, Inc. PEG lipidoid compounds
CA3119449A1 (en) 2018-11-12 2020-05-22 Translate Bio, Inc. Methods for inducing immune tolerance
JP7667077B2 (ja) 2018-11-16 2025-04-22 日東電工株式会社 Ｒｎａ干渉送達製剤及び悪性腫瘍のための方法
WO2020106946A1 (en) 2018-11-21 2020-05-28 Translate Bio, Inc. TREATMENT OF CYSTIC FIBROSIS BY DELIVERY OF NEBULIZED mRNA ENCODING CFTR
JP2022516318A (ja) 2019-01-04 2022-02-25 オンコラス， インコーポレイテッド カプセル化ポリヌクレオチド及び使用方法
US12201724B2 (en) 2019-01-24 2025-01-21 CannaClear Inc. Lecithin vesicles for oral delivery
US12502354B2 (en) 2019-01-24 2025-12-23 Northwestern University High density lipoprotein mimetic nanoparticles using lipid conjugated core scaffolds
CN118697900A (zh) 2019-01-31 2024-09-27 摩登纳特斯有限公司 制备脂质纳米颗粒的方法
AU2020213609B2 (en) 2019-01-31 2025-08-07 Newsouth Innovations Pty Limited Liposomal nanoparticle
SG11202110036RA (en) 2019-03-19 2021-10-28 Arcturus Therapeutics Inc Method of making lipid-encapsulated rna nanoparticles
JPWO2020189773A1 (sr) 2019-03-20 2020-09-24
KR102732019B1 (ko) 2019-04-15 2024-11-20 글로벌 라이프 사이언시즈 솔루션즈 캐나다 유엘씨 T 세포 유전자 발현의 비바이러스 변형
AU2020268798A1 (en) 2019-05-03 2021-11-04 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Double-stranded nucleic acid inhibitor molecules with shortened sense strands
MA55896A (fr) 2019-05-07 2022-03-16 Modernatx Inc Polynucléotides servant à perturber l'activité de cellule immunitaire et procédés pour les utiliser
CA3140423A1 (en) 2019-05-14 2020-11-19 Translate Bio, Inc. Improved process of preparing mrna-loaded lipid nanoparticles
EP3982932A4 (en) 2019-06-14 2023-10-25 Particella, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS FOR BIOLOGICAL RELEASE VEHICLES
EP3986452A1 (en) 2019-06-18 2022-04-27 CureVac AG Rotavirus mrna vaccine
ES2973521T3 (es) 2019-06-20 2024-06-20 Prec Nanosystems Ulc Lípidos ionizables para la administración de ácidos nucleicos
KR102928289B1 (ko) 2019-06-29 2026-02-20 글로벌 라이프 사이언시즈 솔루션즈 캐나다 유엘씨 핵산 전달을 위한 이온화 가능한 지질
CA3146675A1 (en) 2019-07-23 2021-01-28 Translate Bio, Inc. Stable compositions of mrna-loaded lipid nanoparticles and processes of making
CA3145913A1 (en) 2019-07-29 2021-02-04 James Everett Dahlman Nanomaterials containing constrained lipids and uses thereof
AU2020321021A1 (en) 2019-07-30 2022-03-10 Verndari, Inc. Virus-like particle vaccines
US20220280639A1 (en) 2019-07-31 2022-09-08 Modernatx, Inc. Compositions and methods for delivery of rna interference agents to immune cells
EP4009955A1 (en) 2019-08-07 2022-06-15 ModernaTX, Inc. Compositions and methods for enhanced delivery of agents
CN114901253A (zh) 2019-08-14 2022-08-12 爱康泰生治疗公司 用于递送核酸的改进的脂质纳米颗粒
CN114502204A (zh) 2019-08-14 2022-05-13 库尔维科公司 具有降低的免疫刺激性质的rna组合和组合物
EP4021407A1 (en) 2019-08-30 2022-07-06 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Jet mixing lipid nanoparticle manufacturing process
EP4031191A4 (en) 2019-09-18 2023-10-25 The Regents of the University of California PROTEIN PRODUCING NANOLIPOSOMES AND USES THEREOF
AU2020350759A1 (en) 2019-09-19 2022-03-31 Modernatx, Inc. Branched tail lipid compounds and compositions for intracellular delivery of therapeutic agents
KR20240130161A (ko) 2019-10-22 2024-08-29 제네반트 사이언시즈 게엠베하 오르니틴 트랜스카르바밀라제 (otc) 구축물 및 그의 사용 방법
JP2023502576A (ja) 2019-11-22 2023-01-25 ジェネレーション バイオ カンパニー イオン化可能な脂質およびそれらのナノ粒子組成物
WO2021108731A1 (en) 2019-11-25 2021-06-03 The Methodist Hospital Aposome compositions and methods of use
EP3838266A1 (en) 2019-12-20 2021-06-23 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Microfluidic production of biofunctionalized giant unilamellar vesicles for targeted intracellular cargo delivery
IL294441A (en) 2019-12-31 2022-09-01 Fred Hutchinson Cancer Center Nanoparticle systems to stimulate and maintain immune system responsiveness at treatment sites
CA3169669A1 (en) 2020-01-31 2021-08-05 Modernatx, Inc. Methods of preparing lipid nanoparticles
EP3858332A1 (en) 2020-01-31 2021-08-04 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Bottom-up assembly of synthetic extracellular vesicles
KR20220144416A (ko) 2020-02-04 2022-10-26 큐어백 아게 코로나바이러스 백신
CN113186203B (zh) 2020-02-13 2022-12-30 斯微(上海)生物科技股份有限公司 治疗或者预防冠状病毒病的疫苗试剂
CN115427021A (zh) 2020-02-25 2022-12-02 翻译生物公司 制备负载mrna的脂质纳米颗粒的改进方法
CN113999184B (zh) 2020-02-28 2024-11-12 深圳深信生物科技有限公司 一种胺基脂质化合物、其制备方法和应用
JP7746280B2 (ja) 2020-03-27 2025-09-30 ジェネレーション バイオ カンパニー 新規脂質及びそれらのナノ粒子組成物
CN113456591B (zh) 2020-03-31 2022-06-14 武汉合生科技有限公司 糖基聚醚类化合物脂质体及其制备方法和药物
US11559577B2 (en) 2020-03-31 2023-01-24 Engimata, Inc. Immunogenic composition forming a vaccine, and a method for its manufacture
WO2021207273A1 (en) 2020-04-07 2021-10-14 The Regents Of The University Of California Manufacturing of synthetic exosomes for cns and non-cns delivery of therapeutics
WO2021207630A1 (en) 2020-04-10 2021-10-14 Northwestern University Oxidized tumor cell lysates encapsulated in liposomal spherical nucleic acids as potent cancer immunotherapeutics
IL297419B2 (en) 2020-04-22 2025-02-01 BioNTech SE Coronavirus vaccine
CA3176844A1 (en) 2020-05-01 2021-11-04 Carlos G. PEREZ-GARCIA Nucleic acids and methods of treatment for cystic fibrosis
EP4146680A1 (en) 2020-05-07 2023-03-15 Translate Bio, Inc. Composition and methods for treatment of primary ciliary dyskinesia
WO2021226468A1 (en) 2020-05-07 2021-11-11 Translate Bio, Inc. Improved compositions for cftr mrna therapy
JP2023526284A (ja) 2020-05-15 2023-06-21 トランスレイト バイオ， インコーポレイテッド ｍＲＮＡ送達のための脂質ナノ粒子製剤
IL298241A (en) 2020-05-18 2023-01-01 Generation Bio Co New lipids and their nanoparticle preparations
CN115968278A (zh) 2020-05-18 2023-04-14 麦氏生物科技有限公司 脂质-聚合物组合物及使用方法
WO2021236855A1 (en) 2020-05-19 2021-11-25 Orna Therapeutics, Inc. Circular rna compositions and methods
US20220049251A1 (en) 2020-05-20 2022-02-17 Nitto Denko Corporation dsRNA Directed to Coronavirus Proteins
CA3170740A1 (en) 2020-05-29 2021-12-02 Curevac Ag Nucleic acid based combination vaccines
CA3180557A1 (en) 2020-05-29 2021-12-02 Lorena Lerner Encapsulated rna replicons and methods of use
EP4175664A2 (en) 2020-07-06 2023-05-10 Janssen Biotech, Inc. Prostate neoantigens and their uses
US20230338288A1 (en) 2020-07-14 2023-10-26 The Research Foundation For The State University Of New York Asymmetric charged vesicles and methods of preparing and use thereof
AU2021307952A1 (en) 2020-07-17 2023-03-02 Generation Bio Co. Methods for encapsulating polynucleotides into reduced sizes of Lipid nanoparticles and novel formulation thereof
GB202011367D0 (en) 2020-07-22 2020-09-02 Micropore Tech Limited Method of preparing liposomes
WO2022020534A1 (en) 2020-07-23 2022-01-27 The Regents Of The University Of California Compositions comprising mir-690 and methods therefor
MA71659A (fr) 2020-08-06 2025-05-30 Modernatx, Inc. Compositions pour l'administration de molécules de charge utile à l'épithélium des voies respiratoires
EP4192432A1 (en) 2020-08-06 2023-06-14 ModernaTX, Inc. Methods of preparing lipid nanoparticles
US20230338495A1 (en) 2020-08-19 2023-10-26 Vitruviae LLC Vaccine Compositions and Antibodies For Lyme Disease
EP4203987A4 (en) 2020-08-25 2024-10-16 The Regents of The University of California COMPOSITIONS AND METHODS FOR THE TREATMENT OF OCULAR NEUROINFLAMMATION
EP4157344A2 (en) 2020-08-31 2023-04-05 CureVac SE Multivalent nucleic acid based coronavirus vaccines
CA3189903A1 (en) 2020-09-11 2022-03-17 Wilfred Jefferies Vaccine for viral pathogens

Also Published As

Publication number Publication date
AU2022203149B2 (en) 2025-01-23
US20230073819A1 (en) 2023-03-09
EP4379053A3 (en) 2024-09-18
EP4379053A2 (en) 2024-06-05
BR112021006539A2 (pt) 2021-07-06
US11865190B2 (en) 2024-01-09
AU2019359299A1 (en) 2021-05-13
CN113166783B (zh) 2024-10-11
ZA202102238B (en) 2024-08-28
JP7555123B2 (ja) 2024-09-24
CN113166783A (zh) 2021-07-23
EP3864163B1 (en) 2024-03-20
KR20210093232A (ko) 2021-07-27
WO2020077007A1 (en) 2020-04-16
DK3864163T3 (da) 2024-05-06
JP2024028838A (ja) 2024-03-05
HUE066181T2 (hu) 2024-07-28
EP3864163A4 (en) 2022-08-10
JP2022512578A (ja) 2022-02-07
EA202190688A1 (ru) 2021-06-07
PH12021550626A1 (en) 2022-02-14
AU2019359299B2 (en) 2022-04-21
JP2025143306A (ja) 2025-10-01
ES2982542T3 (es) 2024-10-16
AU2022203149A1 (en) 2022-06-02
PL3864163T3 (pl) 2024-05-20
EP3864163A1 (en) 2021-08-18
US20240342315A1 (en) 2024-10-17
CA3114699A1 (en) 2020-04-16
US20220118112A1 (en) 2022-04-21
HRP20240586T1 (hr) 2024-07-19
IL282063A (en) 2021-05-31
AU2025202803A1 (en) 2025-05-08
US11980673B2 (en) 2024-05-14
FI3864163T3 (fi) 2024-05-03
CN119320803A (zh) 2025-01-17
JP7840578B2 (ja) 2026-04-06
PT3864163T (pt) 2024-04-30
US20240350676A1 (en) 2024-10-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RS65449B1 (sr) Supstance i sistemi koji obuhvataju vezikule kompetentne za transfekciju bez organskih rastvarača i deterdženata i metode za to
Kulkarni et al. Spontaneous, solvent-free entrapment of siRNA within lipid nanoparticles
Sato et al. Neutralization of negative charges of siRNA results in improved safety and efficient gene silencing activity of lipid nanoparticles loaded with high levels of siRNA
EP2892505B1 (en) Lipid assemblies comprising anionic lysolipids and use thereof
JP2008520600A (ja) 局所投与のための医薬組成物におけるまたはそれに関する改善
JP2025512763A (ja) 高ステロール含有脂質ナノ粒子
Kundu et al. Development and optimization of nanosomal formulations for siRNA delivery to the liver
Metwally et al. Quantitative silencing of EGFP reporter gene by self-assembled siRNA lipoplexes of LinOS and cholesterol
Herringson et al. Convenient targeting of stealth siRNA-lipoplexes to cells with chelator lipid-anchored molecules
KR20240072931A (ko) 히스티딘을 포함하는 지질 나노입자 및 그 제조방법
Hattori et al. NaCl improves siRNA delivery mediated by nanoparticles of hydroxyethylated cationic cholesterol with amido-linker
EA048789B1 (ru) Композиции и системы, содержащие трансфекционно-компетентные везикулы, не содержащие органических растворителей и детергентов, и связанные с ними способы
HK40052154A (en) Compositions and systems comprising transfection-competent vesicles free of organic-solvents and detergents and methods related thereto
HK40052154B (zh) 包含无有机溶剂和去污剂的转染活性囊泡的组合物和系统以及与之相关的方法
US20190105271A1 (en) Nanoparticle-Induced Fusogenicity between Liposome And Endosome Membranes For Targeted Delivery Through Endosomal Escape
Aulichová Immune stimulation by lipid nanoparticles
Düzgünes et al. Intracellular delivery of therapeutic oligonucleotides in pH-sensitive and cationic liposomes
CN121197094A (zh) 一种花生四烯酸脂质纳米递药系统
Du Intracellular Delivery of Therapeutic Oligonucleotides in pH-Sensitive and Cationic Liposomes