RS65592B1 - Materijali i postupci za lečenje hemoglobinopatija - Google Patents

Description

Opis

Oblast tehnike

[0001] Ovaj Opis obezbeđuje materijale i postupke za lečenje pacijenata sa hemoglobinopatijama, kako ex vivo tako i in vivo. Sem toga, ovaj Opis obezbeđuje materijale i postupke za brisanje, moduliranje, ili inaktiviranje transkripcione kontrolne sekvence 11A (BCL11A) gena B-ćelijskog limfoma u ćeliji putem editovanja genoma.

Lista sekvenci

[0002] Ovaj patent sadrži listu sekvenci u formi koja se može kompjuterski čitati (naziv fajla: 160077PCT Sequence Listing; 14,446,299 bita - ASCII tekstualni fajl; sačinjeno 7. aprila 2017).

Stanje tehnike

[0003] Hemoglobinopatije obuhvataju anemije genetskog porekla, koje dovode do smanjenog stvaranja i/ili povećane razgradnje ćelija crvene krvne loze. Ovi poremećaji takođe obuhvataju genetičke defekte, koji dovode do stvaranja abnormalnih hemoglobina koji su povezani sa nemogućnošću održavanja koncentracija kiseonika. Brojni od ovih poremećaja se označavaju kao b-hemoglobinopatije zbog neuspešnog stvaranja normalnog b-globinskog proteina u potrebnim količinama ili zbog neuspešnog stvaranja normalnog b-globinskog proteina u potpunosti. Na primer, b-talasemije su rezultat delimičnog ili potpunog defekta u ekspresiji gena b-globina, koji dovodi do deficijencije ili nepostojanja adultnog hemogloblina (HbA). Anemija srpastih ćelija je posledica tačkaste mutacije u strukturnom genu b-globina, kojom nastaje abnormalni hemoglobin (HbS) (Atweh, Semin. Hematol. 38(4):367-73 (2001)). Hemoglobinopatije dovode do snižavanja kapaciteta prenosa kiseonika u krvi, što proizvodi simptome, kao što su: umor, vrtoglavica i kratak dah, naročito pri fizičkom vežbanju.

[0004] Za pacijente kojima je dijagnostikovana hemoglobinopatija, trenutno postoji samo nekoliko simptomatskih tretmana, kao što je transfuzija krvi, u cilju podizanja nivoa kiseonika u krvi.

[0005] Inženjering genoma se odnosi na strategije i tehnike za ciljne, specifične modifikacije genetičkih informacija (genom) živih organizama. Genomski inženjering je izuzetno aktivna oblast istraživanja zbog širokog raspona mogućnosti primena, posebno u sferi zdravlja ljudi; ispravljanja gena koji nose štetne mutacije, na primer, ili u cilju istraživanja funkcije gena. Ranije tehnologije, koje su razvijene za unos transgena u živu ćeliju, bile su često limitirane nasumičnom prirodom insertacije nove sekvence u genom. Nasumične insertacije u genom mogu dovesti do narušavanja normalne regulacije susednih gena proizvodeći teške neželjene efekte. Osim toga, tehnologije nasumične integracije imaju nisku reproducibilnost, jer nema garancija da bi se sekvenca unela na isti položaj u dvema različitim ćelijama. Novije strategije genomskog inženjeringa, kao što je ZFNs, TALENs, HEs i MegaTALs, omogućavaju da specifično područje DNA bude modifikovano čime se povećava preciznost korekcije ili unosa u poređenju sa ranijim tehnologijama. Ove novije platforme nude daleko veći stepen reproducibilnosti, ali još uvek imaju svoja ograničenja.

[0006] Uprkos naporima istraživača i profesionalnog medicinskog osoblja širom sveta koji se trude da apostrofiraju hemoglobinopatije, još uvek postoji preka potreba da se razviju bezbedni i efikasni tretmani za hemoglobinopatije.

Suština pronalaska

[0007] Ovo izlaganje prezentuje pristup apostrofiranju genetske osnove hemoglobinopatija. Korišćenjem instrumenata inženjeringa genoma za stvaranje permanentne izmene genoma, kojima se može brisati, modulirati, ili inaktivirati transkripciona kontrolna sekvenca BCL11A gena jednim tretmanom, ovakvom terapijom se mogu ublažiti posledice hemoglobinopatija.

[0008] Ovaj pronalazak je definisan priloženim patentnim zahtevima.

[0009] Ovde su obezbeđeni ćelijski, ex vivo i in vivo postupci, kojima se stvaraju permanentne izmene genoma putem brisanja, moduliranja, ili inaktiviranja transkripcione kontrolne sekvence BCL11A gena, koji se mogu primeniti za lečenje hemoglobinopatija. Ovde su, isto tako, obezbeđene i komponente, kitovi, i kompozicije za izvođenje ovakvih postupaka. Takođe, opisane su i ćelije nastale takvim postupcima. Primeri hemoglobinopatija mogu biti anemija srpastih ćelija i talasemije (a, b, d, g, kao i njihove kombinacije).

[0010] Ovde je obezbeđen postupak za editovanje 11A (BCL1 1A) gena B-ćelijskog limfoma u ljudskoj ćeliji putem editovanja genoma, postupak obuhvata korak uvođenja u ljudsku ćeliju jedne ili više deoksiribonukleinsko kiselinskih (DNA) endonukleaza da bi se dobio jedan ili više jednolačanih odlomaka (SSBs) ili dvolančanih odlomaka (DSBs) unutar ili u blizini BCL11A gena ili druge DNA sekvence koja kodira regulatorni element BCL11A gena, što dovodi do trajne delecije, modulacije, ili inaktivacije kontrolne sekvence transkripcije BCL11A gena. Kontrolna sekvenca transkripcije može biti locirana unutar drugog introna BCL11A gena. Kontrolna sekvenca transkripcije može biti locirana unutar 58 DNA hipersenzitivnog položaja (DHS) BCL11A gena.

[0011] Isto tako, ovde je opisan ex vivo postupak za tretiranje pacijenta (npr., čoveka) sa hemoglobinopatijom, postupak obuhvata korake: kreiranje specifične indukovane pluripotentne matične ćelije (iPSC) pacijenta; editovanje unutar ili u blizini BCL11A gena ili druge DNA sekvence koja kodira regulatorni element BCL11A gena iPSC; diferencijaciju genom-editovane iPSC u hematopoeznu progenitorsku ćeliju; i implantaciju hematopoezne progenitorske ćelije u pacijenta.

[0012] Korak kreiranja specifične indukovane pluripotentne matične ćelije (iPSC) pacijenta može obuhvatiti : izolovanje somatske ćelije od pacijenta; i uvođenje seta gena povezanih sa pluripotencijom u somatsku ćeliju kako bi se indukovala somatska ćelija da postane pluripotentna matična ćelija. Somatska ćelija može biti fibroblast. Set gena povezanih sa pluripotencijom može biti jedan ili više gena izdvojenih iz grupe koju čine : OCT4, SOX2, KLF4, Lin28, NANOG i cMYC.

[0013] Korak editovanja unutar ili u blizini BCL11A gena ili druge DNA sekvence koja kodira regulatorni element BCL11A gena iPSC može obuhvatiti uvođenje u iPSC jedne ili više deoksiribonukleinsko kiselinskih (DNA) endonukleaza da bi se dobio jedan ili više jednolačanih odlomaka (SSBs) ili dvolančanih odlomaka (DSBs) unutar ili u blizini BCL11A gena ili druge DNA sekvence koja kodira regulatorni element BCL11A gena što dovodi do trajne delecije, modulacije, ili inaktivacije kontrolne sekvence transkripcije BCL11A gena.

[0014] Korak diferenciranja genom-editovane iPSC u hematopoeznu progenitorsku ćeliju može obuhvatiti jedno ili više od sledećeg: tretman sa kombinacijom malih molekula, isporučivanje transkripcionih faktora (npr., master traskripcioni faktori) ili isporučivanje mRNA kodirajućih transkripcionih faktora (npr., master traskripcioni faktori).

[0015] Korak implantacije hematopoezne progenitorske ćelije u pacijenta može uključiti implantaciju hematopoezne progenitorske ćelije u pacijenta putem transplantacije, injektovanja lokalno, sistemske infuzije, ili njihovom kombinacijom.

[0016] Isto tako, ovde je opisan ex vivo postupak za tretiranje pacijenta (npr., čoveka) sa hemoglobinopatijom, postupak obuhvata korake : izolovanja mezenhimalne matične ćelije od pacijenta; editovanje unutar ili u blizini BCL11A gena ili druge DNA sekvence koja kodira regulatorni element BCL11A gena mezenhimalne matične ćelije; diferencijaciju genom-editovane mezenhimalne matične ćelije u hematopoeznu progenitorsku ćeliju; i implantaciju hematopoezne progenitorske ćelije u pacijenta.

[0017] Mezenhimalna matična ćelija može biti izolovana iz koštane srži pacijenta ili periferne krvi. Korak izolovanja mezenhimalne matične ćelije od pacijenta može uključiti aspiraciju koštane srži i izolovanje mezenhimalnih ćelija primenom uređaja za centrifugiranje pogradijentu gustine.

[0018] Korak editovanja unutar ili u blizini BCL11A gena ili druge DNA sekvence koja kodira regulatorni element BCL11A gena mezenhimalne matične ćelije može uključiti uvođenje u mezenhimalnu matičnu ćeliju jedne ili više deoksiribonukleinsko kiselinskih (DNA) endonukleaza da bi se dobio jedan ili više jednolačanih odlomaka (SSBs) ili dvolančanih odlomaka (DSBs) unutar ili u blizini BCL11A gena ili druge DNA sekvence koja kodira regulatorni element BCL11A gena što dovodi do trajne delecije, modulacije, ili inaktivacije kontrolne sekvence transkripcije BCL11A gena.

[0019] Korak diferencijacije genom-editovane mezenhimalne matične ćelije u hematopoeznu progenitorsku ćeliju može obuhvatiti jedno ili više od sledećeg : tretman sa kombinacijom malih molekula, isporučivanje transkripcionih faktora (npr., master traskripcioni faktori) ili isporučivanje mRNA kodirajućih transkripcionih faktora (npr., master traskripcioni faktori).

[0020] Korak implantiranja hematopoezne progenitorske ćelije u pacijenta može obuhvatiti implantaciju hematopoezne progenitorske ćelije u pacijenta putem transplantacije, injektovanja lokalno, sistemske infuzije, ili njihovom kombinacijom.

[0021] Isto tako, ovde je opisan ex vivo postupak za tretiranje pacijenta (npr., čoveka) sa hemoglobinopatijom, postupak obuhvata korake: izolovanje hematopoezne progenitorske ćelije od pacijenta; editovanje BCL11A gena ili druge DNA sekvence koja kodira regulatorni element BCL11A gena hematopoezne progenitorske ćelije; i implantaciju genom-editovane hematopoezne progenitorske ćelije u pacijenta.

[0022] Postupak može dalje obuhvatiti tretiranje pacijenta sa stimulišućim faktorom granulocitne kolonije (GCSF) pre koraka izolovanja hematopoezne progenitorske ćelije od pacijenta. Korak tretiranja pacijenta sa stimulišućim faktorom granulocitne kolonije (GCSF) može se izvesti zajedno sa pleriksaflorom.

[0023] Korak izolovanja hematopoezne progenitorske ćelije od pacijenta može obuhvatiti izolovanje CD34+ ćelija.

[0024] Korak editovanja unutar ili u blizini BCL11A gena ili druge DNA sekvence koja kodira regulatorni element BCL11A gena hematopoezne progenitorske ćelije može uključiti uvođenje u hematopoeznu progenitorsku ćeliju jedne ili više deoksiribonukleinsko kiselinskih (DNA) endonukleaza da bi se dobio jedan ili više jednolačanih odlomaka (SSBs) ili dvolančanih odlomaka (DSBs) unutar ili u blizini BCL11A gena ili druge DNA sekvence koja kodira regulatorni element BCL11A gena što dovodi do trajne delecije, modulacije, ili inaktivacije kontrolne sekvence transkripcije BCL11A gena.

[0025] Korak implantacije genom-editovane hematopoezne progenitorske ćelije u pacijenta može uključiti implantaciju genom-editovane hematopoezne progenitorske ćelije u pacijenta putem transplantacije, injektovanja lokalno, sistemske infuzije, ili njihovom kombinacijom.

[0026] Isto tako, ovde je opisan in vivo postupak za tretiranje pacijenta (npr., čoveka) sa hemoglobinopatijom, postupak obuhvata korak editovanja BCL11A gena u ćeliji pacijenta.

[0027] Korak editovanja BCL11A gena u ćeliji pacijenta može obuvatiti uvođenje u ćeliju jedne ili više deoksiribonukleinsko kiselinskih (DNA) endonukleaza da bi se dobio jedan ili više jednolačanih odlomaka (SSBs) ili dvolančanih odlomaka (DSBs) unutar ili u blizini BCL11A gena ili druge DNA sekvence koja kodira regulatorni element BCL11A gena što dovodi do trajne delecije, modulacije, ili inaktivacije kontrolne sekvence transkripcije BCL11A gena. Ćelija može biti ćelija koštane srži, hematopoezna progenitorska ćelija, CD34+ ćelija, ili njihove kombinacije.

[0028] Jedna ili više DNA endonukleaza mogu biti : Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (takođe poznata kao Csn1 i Csx12), Cas100, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, ili Cpf1 endonukleaze; njihovi homolozi, rekombinacije njihovih molekula koji se prirodno pojavljuju, njihovi kodonoptimizati, ili njihove modifikovane verzije i, njihove kombinacije.

[0029] Postupak može obuhvatati uvođenje u ćeliju jednog ili više polinukleotida koji kodiraju jednu ili više DNA endonukleaza. Postupak može obuhvatati uvođenje u ćeliju jedne ili više ribonukleinskih kiselina (RNAs) koje kodiraju jednu ili više DNA endonukleaze. Jedan ili više polinukleotida ili jedna ili više RNAs mogu biti jedan ili više modifikovanih polinukleotida ili jedna ili više modifikovana RNAs. Jedna ili više DNA endonukleaza može biti jedan ili više proteina ili polipeptida. Jedan ili više proteina ili polipeptida mogu biti zakucani na N-terminusu, C-terminusu, ili oba, i N-terminusu i C-terminusu pomoću jednog ili više signala lokalizacije jedra (NLSs). Jedan ili više proteina ili polipeptida mogu biti zakucani pomoću dva NLSs, jednim NLS lociranim na N-terminusu i drugim NLS lociranim na C-terminusu. Jedan ili više NLSs može biti SV40 NLS.

[0030] Postupak dalje može obuhvatati uvođenje u ćeliju jedne ili više ribonukleinskih kiselina vodilja (gRNAs). Jedna ili više gRNAs mogu biti jednomolekulska RNA vodilja (sgRNAs). Jedna ili više gRNAs ili jedna ili više sgRNAs mogu biti jedna ili više modifikovane gRNAs ili jedna ili više modifikovane sgRNAs, ili njihovih kombinacija. Jedna ili više modifikovanih sgRNA mogu sadržavati tri 2’-O-metil-fosforotioatna ostatka na ili u blizini svakog od svojih 5’ i 3’ krajeva. Modifikovana sgRNA može biti sekvenca nukleinske kiseline SEQ ID NO: 71,959. Jedna ili više DNA endonukleaza mogu prethodno formirati kompleks sa jednom ili više gRNAs ili jednom ili više sgRNAs, ili njihovim kombinacijama kako se obrazuje jedan ili više ribonukleoproteina (RNPs). Težinski odnos sgRNA prema DNA endonukleazi u RNP može biti 1:1. sgRNA može sadržavati nukleinsko-kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 71,959, DNA endonukleaza može biti S. pyogenes Cas9 koja ima N-terminus SV40 NLS i C-terminus SV40 NLS, i težinski odnos sgRNA prema DNA endonukleazi može biti 1:1. US2015044772 koji se odnosi na himeričku fuziju Cas proteina izlaže nukleinsko-kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 71,959. Navedena sekvenca je takođe izložena u WO2015183025 koji se odnosi na postupak za analiziranje genotipa primenom CRISPR/Cas sistema.

[0031] Postupak dalje može obuhvatati uvođenje u ćeliju polinukleotidnog donorskog templata koji sadrži divlji tip BCL11A gena ili cDNA koja sadrži modifikovanu kontrolnu sekvencu transkripcije.

[0032] Postupak dalje može obuhvatati uvođenje u ćeliju jedne ribonukleinske kiseline vodilje (gRNA) i polinukleotidnog donorskog templata koji sadrži divlji tip BCL11A gena ili cDNA koja sadrži modifikovanu kontrolnu sekvencu transkripcije. Jedna ili više DNA endonukleaza mogu biti jedna ili više Cas9 ili Cpf1 endonukleaza koje proizvode jedan jednolančani odlomak (SSB) ili dvolančani odlomak (DSB) na lokusu unutar ili u blizini BCL11A gena ili druge DNA sekvence koja kodira regulatorni element BCL11A gena, što olakšava inserciju nove sekvence iz polinukleotidnog donorskog templata u hromozomsku DNA na lokusu što dovodi do trajne insercije, modulacije, ili inaktivacije kontrolne sekvence transkripcije hromozomske DNA proksimalno lokusu. gRNA može sadržavati spejser sekvencu koja je komplementarna sa segmentom lokusa. Proksimalno može značiti: nukleotidi u oba smera od lokusa, ushodno i nishodno.

[0033] Postupak dalje može obuhvatati uvođenje u ćeliju jedne ili više ribonukleinskih kiselina vodilja (gRNAs) i polinukleotidnog donorskog templata koji sadrži divlji tip BCL11A gena ili cDNA koja sadrži modifikovanu kontrolnu sekvencu transkripcije. Jedna ili više DNA endonukleaza mogu biti jedna ili više Cas9 ili Cpf1 endonukleaza koje proizvode ili kreiraju par jednolančanih odlomaka (SSBs) i/ili dvolančanih odlomaka (DSBs), prvo lomljenje na 5’ lokusu i drugo lomljenje na 3’ lokusu, unutar ili u blizini BCL11A gena ili druge DNA sekvence koja kodira regulatorni element BCL11A gena, što olakšava inserciju nove sekvence iz polinukleotidnog donorskog templata u hromozomsku DNA između 5’ lokusa i 3’ lokusa što dovodi do trajne insercije, modulacije, ili inaktivacije kontrolne sekvence transkripcije hromozomske DNA između 5’ lokusa i 3’ lokusa. Jedna RNA vodilja mogu kreirati par SSBs ili DSBs. Jedna RNA vodilja može sadržavati spejser sekvencu koja je komplementarna ili sa 5’ lokusom ili sa 3’ lokusom. Alternativno, postupak može obuhvatiti prvu RNA vodilju i drugu RNA vodilju. Prva RNA vodilja može sadržavati spejser sekvencu koja je komplementarna sa segmentom 5’ lokusa i druga RNA vodilja može sadržavati spejser sekvencu koja je komplementarna sa segmentom 3’ lokusa. Donorski templat može biti ili jedno- ili dvolančani. Modifikovana kontrolna sekvenca transkripcije može biti locirana unutar drugog introna BCL11A gena. Modifikovana kontrolna sekvenca transkripcije može biti locirana unutar 58 DNA hipersenzitivnog položaja (DHS) BCL11A gena.

[0034] Jedna ili dve gRNAs mogu biti jedna ili dve jednomolekulske RNA vodilje (sgRNAs). Jedna ili dve gRNAs ili jedna ili dve sgRNAs mogu biti jedna ili dve modifikovane gRNAs ili jedna ili dve modifikovane sgRNAs. Jedna modifikovana sgRNA može sadržavati tri 2’-O-metil-fosforotioatna ostatka na ili u blizini svakog od svojih 5’ i 3’ krajeva. Jedna modifikovana sgRNA može biti sekvenca nukleinske kiseline SEQ ID NO: 71,959. Jedna ili dve Cas9 endonukleaze može prethodno formirati kompleks sa jednom ili dve gRNAs ili jednom ili dve sgRNAs kako se obrazuje jedan ili više ribonukleoproteina (RNPs). Jedna ili više Cas9 endonukleaza može biti zakucana na N-terminusu, C-terminusu, ili i na N-terminusu i na C-terminusu pomoću jednog ili više signala lokalizacije jedra (NLSs). Jedna ili više Cas9 endonukleaza može biti zakucana pomoću dva NLSs, jednim NLS lociranim na N-terminusu i drugim NLS lociranim na C-terminusu. Jedan ili više NLSs može biti SV40 NLS. Težinski odnos sgRNA prema Cas9 endonukleazi u RNP može biti 1:1. Jedna sgRNA može sadržavati nukleinsko-kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 71,959, Cas9 endonukleaza može biti S. pyogenes Cas9 koja ima N-terminus SV40 NLS i C-terminus SV40 NLS, i težinski odnos sgRNA prema Cas9 endonukleazi može biti 1:1.

[0035] Insercija se može izvesti putem homologno usmerene popravke (HDR).

[0036] SSB, DSB, 5’ lokus, i/ili 3’ lokus mogu biti locirani unutar drugog introna BCL11A gena. SSB, DSB, 5’ lokus, i/ili 3’ lokus mogu biti locirani unutar 58 DNA hipersenzitivnog položaja (DHS) BCL11A gena.

[0037] Postupak može dalje obuhvatiti uvođenje u ćeliju jedne ili više ribonukleinskih kiselina vodilja (gRNAs). Jedna ili više DNA endonukleaza može biti jedna ili više Cas9 ili Cpf1 endonukleaza koja dovodi do ili kreira par jednolančanih odlomaka (SSBs) ili dvolančanih odlomaka (DSBs), prvi SSB ili DSB na 5’ lokusu i drugi SSB ili DSB na 3’ lokusu, unutar ili u blizini BCL11A gena ili druge DNA sekvence koja kodira regulatorni element BCL11A gena što dovodi do delecije hromozomske DNA između 5’ lokusa i 3’ lokusa što izaziva trajnu inserciju, modulaciju, ili inaktivaciju kontrolne sekvence transkripcije hromozomske DNA između 5’ lokusa i 3’ lokusa. Prva RNA vodilja može sadržavati spejser sekvencu koja je komplementarna sa segmentom 5’ lokusa i i druga RNA vodilja sadrži spejser sekvencu koja je komplementarna sa segmentom 3’ lokusa. Jedna RNA vodilja može kreirati par SSBs ili DSBs. Jedna RNA vodilja može sadržavati spejser sekvencu koja je komplementarna ili sa 5’ lokusom ili sa 3’ lokusom. Alternativno, postupak može obuhvatiti prvu RNA vodilju i drugu RNA vodilju. Prva RNA vodilja može sadržavati spejser sekvencu koja je komplementarna sa segmentom 5’ lokusa i druga RNA vodilja može sadržavati spejser sekvencu koja je komplementarna sa segmentom 3’ lokusa.

[0038] Jedna ili više gRNAs može biti jedna ili više jednomolekulskih RNA vodilja (sgRNAs). Jedna ili više gRNAs ili jedna ili više sgRNAs mogu biti jedna ili više modifikovanih gRNAs ili jedna ili više modifikovanih sgRNAs. Jedna modifikovana sgRNA može sadržavati tri 2’-O-metil-fosforotioatna ostatka na ili u blizini svakog od svojih 5’ i 3’ krajeva. Jedna modifikovana sgRNA može biti sekvenca nukleinske kiseline SEQ ID NO: 71,959. Jedna ili više Cas9 endonukleaza mogu prethodno formirati kompleks sa jednom ili više gRNAs ili jednom ili više sgRNAs kako se obrazuje jedan ili više ribonukleoproteina (RNPs). Jedna ili više Cas9 endonukleaza može biti zakucana na N-terminusu, C-terminusu, ili na oba, i na N-terminusu i na C-terminusu pomoću jednog ili više signala lokalizacije jedra (NLSs). Jedna ili više Cas9 endonukleaza može biti zakucana pomoću dva NLSs, jednim NLS lociranim na N-terminusu i drugim NLS lociranim na C-terminusu. Jedan ili više NLSs može biti SV40 NLS. Težinski odnos sgRNA prema Cas9 endonukleazi u RNP može biti 1:1. Jedna sgRNA može sadržavati nukleinsko-kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 71,959, Cas9 endonukleaza može biti S. pyogenes Cas9 koja ima N-terminus SV40 NLS i C-terminus SV40 NLS, i težinski odnos sgRNA prema Cas9 endonukleazi može biti 1:1.

[0039] 5’ lokus i/ili 3’ lokus mogu biti locirani unutar drugog introna BCL11A gena. 5’ lokus i/ili 3’ lokus mogu biti locirani unutar 58 DNA hipersenzitivnog položaja (DHS) BCL11A gena.

[0040] Cas9 ili Cpf1 mRNA, gRNA, i donorski templat mogu biti formulisani u zasebnim lipidnim nanočesticama ili zajedno formulisani u lipidnoj nanočestici.

[0041] Cas9 ili Cpf1 mRNA mogu biti formulisane u lipidnoj nanočestici, i gRNA i donorski templat mogu biti isporučeni u ćeliju pomoću adeno-povezanog virusnog (AAV) vektora.

[0042] Cas9 ili Cpf1 mRNA mogu biti formulisane u lipidnoj nanočestici, i gRNA može biti isporučena u ćeliju elektroporacijom i donorski templat može biti isporučen u ćeliju pomoću adeno-povezanog virusnog (AAV) vektora.

[0043] Jedan ili više RNP može se isporučiti ćeliji elektroporacijom.

[0044] Editovanje unutar ili u blizini BCL11A gena druge DNA sekvence koja kodira regulatorni element BCL11A gena može smanjiti ekspresiju BCL11A gena.

[0045] BCL11A gen može biti lociran na hromozomu 2: 60,451,167 - 60,553,567 (Genome Reference Consortium - GRCh38).

[0046] Isto tako, ovde je obezbeđena jedna ili više ribonukleinskih kiselina vodilja (gRNAs) za editovanje BCL11A gena u ćeliji pacijenta sa hemoglobinopatijom. Jedna ili više gRNAs mogu sadržavati spejser sekvencu odabranu iz grupe koju čine nukleinskokiselinske sekvence sa SEQ ID NOs: 1 - 71,947 u Spisku sekvenci. Jedna ili više gRNAs mogu biti jedna ili više jedno-molekulskih RNAs vodilja (sgRNAs). Jedna ili više gRNAs ili jedna ili više sgRNAs mogu biti jedna ili više modifikovanih gRNAs ili jedna ili više modifikovanih sgRNAs. Jedna ili više modifikovanih sgRNAs mogu imati tri 2’-O-metilfosforotioatna ostatka na ili u blizini svakog od svojih 5’ i 3’ krajeva. Jedna ili više modifikovanih sgRNAs mogu sadržavati nukleinsko-kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 71,959. Isto tako, ovde je obezbeđena jedno-molekulska RNA vodilja (sgRNA) koja sadrži nukleinsko-kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 71,959.

[0047] Podrazumeva se da pronalasci koji su opisani u ovoj specifikaciji nisu ograničeni primerima, zbirno prikazanim u delu ”Suština pronalaska”. Ovde su opisani i prikazani kroz primere različiti drugi aspekti.

Kratak opis crteža

[0048] Različiti aspekti materijala i postupaka za tretman hemoglobinopatija, koji su izloženi i opisani u ovoj Specifikaciji mogu biti bolje shvaćeni osvrtom na pridružene slike, u kojima:

Slike 1A-C prikazuju plazmide koji sadrže kodon optimizovani gen za S. pyogenes Cas9 endonukleazu.

Slika 1A je plazmid (CTx-1) koji sadrži kodon optimizovani gen za S. pyogenes Cas9 endonukleazu. CTx-1 plazmid takođe sadrži gRNA skeletnu sekvencu, koja obuhvata 20 bp spejser sekvencu iz sekvenci navedenih u SEQ ID NOs: 1 - 29,482, u Spisku sekvenci.

Slika 1B je plazmid (CTx-2) koji sadrži različiti kodon optimizovani gen za S. pyogenes Cas9 endonukleazu. CTx-2 plazmid takođe sadrži gRNA skeletnu sekvencu, koja obuhvata 20 bp spejser sekvencu iz sekvenci navedenih u SEQ ID NOs: 1 - 29,482, u Spisku sekvenci.

Slika 1C je plazmid (CTx-3) koji sadrži još jedan različit kodon optimizovani gen za S. pyogenes Cas9 endonukleazu. CTx-3 plazmid takođe sadrži gRNA skeletnu sekvencu, koja obuhvata 20 bp spejser sekvencu iz sekvenci navedenih u SEQ ID NOs: 1 - 29,482, u Spisku sekvenci.

Slike 2A-B prikazuju tip II CRISPR/Cas sistem.

Slika 2A prikazuju tip II CRISPR/Cas sistem uključujući gRNA.

Slika 2B prikazuju tip II CRISPR/Cas sistem uključujući sgRNA.

Slika 3 prikazuje stopu DNA editovanja u CD34+ hematopoetskim matičnim i progenitorskim ćelijama (HSPCs) i svaki od različito nastalih HPFH genotipova.

Slike 4A-C prikazuju ushodnu regulaciju ekspresije g-globina u eritrocitima diferenciranim od Bulk editovanih humanih CD34+ HSPCs iz mobilisane periferne krvi (mPB).

Slika 4A prikazuje hematopoezu od humanih CD34+ HSPCs do eritrocita.

Slika 4B prikazuje odnos y/18sRNA za svaku od delecija/modifikacija.

Slika 4C prikazuje odnos g/a za svaku od delecija/modifikacija.

Slike 5A-B prikazuju ushodnu regulaciju ekspresije g-globina u eritrocitima diferenciranim od svih gen-editovanih kolonija iz humanih CD34+ HSPCs.

Slika 5A prikazuje g/a globin mRNA odnos (%) za svaku od gen-editovanih kolonija.

Slika 5B prikazuje prosečan g/a globin mRNA odnos (%) za svaku od genmodifikacija.

Slika 6 prikazuje BCL11A Intron (SPY101) stopu DNA editovanja u humanim CD34+ HSPC poreklom iz eritroidnih kolonija.

Slike 7A-B prikazuju korelaciju između SPY101 genotipa i ekspresije g-globina u pojedinačnim ćelijskim kolonijama diferenciranim od gen-editovanih humanih mPB CD34+ HSPCs.

Slika 7A prikazuje procenat g-globina prema a-globinu (HBG/HBA) za svaku od geneditovanih kolonija.

Slika 7B prikazuje procenat b-sličnih globina (HBG/(HBB+HBG)) za svaku od geneditovanih kolonija.

Slika 8 prikazuje efikasnost on-target editovanja za nekoliko gRNAs u humanim mPB CD34+ ćelijama.

Slike 9A-B prikazuju test hibridnog hvatanja koji je korišćen za otkrivanje off-target editovanja i rezultate nastale korišćenjem testa hibridnog hvatanja iz editovanih humanih CD34+ HSPCs iz mPB.

Slika 9A prikazuje šemu testa hibridnog hvatanja korišćenog za otkrivanje aktivnosti editovanja na mogućim off-target položajima.

Slika 9B prikazuje zapaženu off-target aktivnost preko sekvenciranja hibridnog hvatanja.

Slike 10A-B prikazuju odnose nivoa globinske mRNA izmerene u ćelijama od pacijenata sa SCD, pacijenata sa b-talasemijom i zdravih donora.

Slika 10A prikazuje odnose nivoa globinske mRNA izmerene u ćelijama od pacijenata sa SCD u poređenju sa zdravim donorima.

Slika 10B prikazuje odnose nivoa globinske mRNA izmerene u ćelijama od pacijenata sa b-talasemijom u poređenju sa zdravim donorima.

Slike 11A-C prikazuju strategiju protočne citometrije primenjenu u otkrivanju raznih gen-editovanih ćelijskih populacija i rezultate nastale korišćenjem strategije protočne citometrije.

Slika 11A prikazuje subpopulacije humanih CD34+ HSPCs iz mPB, udružene površinske markere, i izlaznu strategiju protočne citometrije.

Slika 11B prikazuje sličnu raspodelu ćelijskih vrsta u lažnim i uslovima editovanja.

Slika 11C prikazuje slične visoke efikasnosti editovanja kroz subpopulacije poređeno sa glavnim delom.

Slika 12 prikazuje analizu populacije humanih CD45RA+ ćelija u NSG miševima 8 nedelja posle usađivanja humanih CD34+ HSPCs iz mPB. Tačke sa podatkom predstavljaju pojedinačne životinje i prikazuju procenat živih ćelija koje su bile humane CD45RA+ žive ćelije.

Slika 13 prikazuje prosečnu efikasnost editovanja SPY101 gRNA i Cas9 proteina u humanim CD34+ HSPCs iz mPB u laboratorijskim i kliničkim relevantnim razmerama.

Slika 14 prikazuje pregled dizajna GLP/Toksikološke studije.

Slika 15 prikazuje pregled eksperimentalnog pristupa glavnom delu analiza i analizama pojedinačnih ćelijskih kolonija na nivoe hemoglobinske mRNA i proteina u eritroidnim ćelijskim populacijama izvedenim od CRISPR/Cas9 gen editovanih humanih CD34+ HSPCs iz mPB.

Slike 16A-B prikazuju ushodnu regulaciju g-globinske mRNA i proteina u masi diferenciranih humanih CD34+ HSPCs iz mPB, modifikovanih sa različitim ciljnim editovanjima.

Slika 16A prikazuje ushodnu regulaciju g-globinske mRNA u masi diferenciranih humanih CD34+ HSPCs iz mPB, modifikovanih sa različitim ciljnim editovanjima.

Slika 16B prikazuje ushodnu regulaciju g-globinskog proteina u masi diferenciranih humanih CD34+ HSPCs iz mPB, modifikovanih sa različitim ciljnim editovanjima.

Slika 17 prikazuje prosečnu ushodnu regulaciju g-globina u pojedinačnim kolonijama diferenciranih humanih CD34+ HSPCs iz mPB, modifikovanih sa različitim ciljnim editovanjima.

Slike 18A-B prikazuju korelaciju genotipa prema fenotipu za Metu 5 i Metu 6 editovanih kolonija eritroidno diferenciranih humanih CD34+ HSPCs iz mPB.

Slika 18A obuhvata dijagrame na levoj strani koji prikazuju % kolonija sa svakim genotipom, i grafikone na desnoj strani koji prikazuju procenat kolonija sa svim nivoima ushodne regulacije g-globina (izraženo kao g/(g+b) globin mRNA odnos).

Slika 18B prikazuje nivoe mRNA transkripta, za grupe kolonija sa sličnim genotipovima.

Slika 19 prikazuje pregled eksperimentalnog pristupa za glavni deo analiza efikasnosti editovanja iz genomske DNA, mRNA ekspresije hemoglobina, i proteina u eritroidno diferenciranim ćelijskim populacijama izvedenim iz CRISPR/Cas9 gen editovanih humanih CD34+ HSPCs iz mPB.

Slike 20A-B prikazuju procenat genskog editovanja koji opstaje kroz ex vivo eritroidno diferentovanje CD34+ HSPCs iz mPB editovanih sa SPY101 gRNA ili SD2 gRNA.

Slika 20A prikazuje procenat genskog editovanja koji opstaje kroz ex vivo eritroidno diferentovanje CD34+ HSPCs iz mPB editovanih sa SPY101 gRNA.

Slika 20B prikazuje procenat genskog editovanja koji opstaje kroz ex vivo eritroidno diferentovanje CD34+ HSPCs iz mPB editovanih sa SD2 gRNA.

Slike 21A-D prikazuju porast g-globinskog transkripta opisano kao g/a ili g/(g+b) u gen-editovanim CD34+ HSPCs iz mPB na dan 11 ili 15 posle eritroidne diferencijacije.

Slika 21A prikazuje porast g-globinskog transkripta (g/a) u gen-editovanim CD34+ HSPCs iz mPB na dan 11 posle diferencijacije.

Slika 21B prikazuje porast g-globinskog transkripta (g/a)u gen-editovanim CD34+ HSPCs iz mPB na dan 15 posle diferencijacije.

Slika 21C prikazuje porast g-globinskog transkripta (g/(g+b))u gen-editovanim CD34+ HSPCs iz mPB na dan 11 posle diferencijacije.

Slika 21D prikazuje porast g-globinskog transkripta (g/(g+b))u gen-editovanim CD34+ HSPCs iz mPB na dan 15 posle diferencijacije.

Slike 22A-B je FACS analiza i srednji intenzitet fluorescencije (MFI) analize prikazujući ushodnu regulaciju g-globina u gen-editovanim CD34+ HSPCs iz mPB na dan 15 posle eritroidne diferencijacije.

Slika 22A je FACS analiza prikazujući ushodnu regulaciju g-globina u gen-editovanim CD34+ HSPCs iz mPB 15 dana posle eritroidne diferencijacije.

Slika 22B je MFI analiza prikazujući prosečnu ushodnu regulaciju g-globina u geneditovanim CD34+ HSPCs iz mPB od 4 donora posle eritroidne diferencijacije.

Slika 23A-D je glavni deo podataka dobijenih tečnom-hromatografijom masenomspektrometrijom (LC-MS) kojima se prikazuje ushodna regulacija g-globina, prikazana kao g/a ili g/(g+b) u gen-editovanim CD34+ HSPCs iz mPB 15. dana posle eritroidne diferencijacije.

Slika 23A je glavni deo podataka dobijenih tečnom-hromatografijom masenomspektrometrijom (LC-MS) kojima se prikazuje ushodna regulacija g-globina (g/a) u gen-editovanim CD34+ HSPCs iz mPB 15. dana posle diferencijacije.

Slika 23B je glavni deo podataka dobijenih tečnom-hromatografijom masenomspektrometrijom (LC-MS) kojima se prikazuje ushodna regulacija g-globina (g/a) u gen-editovanim CD34+ HSPCs iz mPB 15. dana posle diferencijacije normalizovano na g-globin (g/a) u CD34+ HSPCs iz mPB koje su transfektovane sa GFP gRNA.

Slika 23C je glavni deo podataka dobijenih tečnom-hromatografijom masenomspektrometrijom (LC-MS) kojima se prikazuje ushodna regulacija g-globina (g/(g+b)) u gen-editovanim CD34+ HSPCs iz mPB 15. dana posle diferencijacije.

Slika 23D je glavni deo podataka dobijenih tečnom-hromatografijom masenomspektrometrijom (LC-MS) kojima se prikazuje ushodna regulacija g-globina (g/(g+b)) u gen-editovanim CD34+ HSPCs iz mPB 15. dana posle diferencijacije normalizovano na g-globin (g/a) u CD34+ HSPCs iz mPB koje su transfektovane sa GFP gRNA.

Slika 24 prikazuje dizajn mamca hibridnog hvatanja.

Slika 25 prikazuje grafik na kome se vidi moć otkrivanja indela postupkom hibridnog hvatanja.

Slika 26 prikazuje kratko izlaganje podataka dobijenih u eksperimentima hibridnog hvatanja primenom SPY101 gRNA.

Slika 27 prikazuje kratko izlaganje podataka dobijenih u eksperimentima hibridnog hvatanja primenom SD2 gRNA.

Slika 28 prikazuje plan ispitivanja za eksperimente usađivanja.

Slike 29A-E prikazuju podatke analize krvi uzimane u periodu od 8 nedelja za netretirane miševe, i miševe kojima su injektovane lažno (mock) editovane ćelije, GFP gRNA editovane ćelije, SPY101 gRNA editovane ćelije, ili SD2 gRNA editovane ćelije.

Slika 29A prikazuje podatke analize krvi uzimane u periodu od 8 nedelja za netretirane miševe (UnTx).

Slika 29B prikazuje podatke analize krvi uzimane u periodu od 8 nedelja za miševe kojima su injektovane lažno (mock-) editovane ćelije.

Slika 29C prikazuje podatke analize krvi uzimane u periodu od 8 nedelja za miševe kojima su injektovane GFP gRNA editovane ćelije.

Slika 29D prikazuje podatke analize krvi uzimane u periodu od 8 nedelja za miševe kojima su injektovane SPY101 gRNA editovane ćelije.

Slika 29E prikazuje podatke analize krvi uzimane u periodu od 8 nedelja za miševe kojima su injektovane SD2 gRNA editovane ćelije.

Slika 30 prikazuje prosečne podatke analize krvi u periodu od 8 nedelja.

Slika 31 prikazuje Indel% za humane CD34+ HSPCs iz mPB koje su podvrgnute elektroporaciji sa različitim Cas9 mRNAs i SPY101 gRNA (mRNA1-8) u poređenju sa humanim CD34+ HSPCs iz mPB koje su podvrgnute elektroporaciji sa Cas9 proteinom u kompleksu sa SPY101 gRNA (ribonukleoproteinski kompleks, RNP).

Slike 32A-B prikazuju normalizovan broj ćelija i ćelijsku vijabilnost humanih CD34+ HSPCs iz mPB koje su podvrgnute elektroporaciji sa različitim Cas9 mRNAs i SPY101 gRNA (mRNA 1-8) u poređenju sa humanim CD34+ HSPCs iz mPB koje su podvrgnute elektroporaciji sa Cas9 proteinom u kompleksu sa SPY101 gRNA (RNP).

Slika 32A prikazuje umnožak porasta broja ćelija 48 sati posle elektroporacije za humane CD34+ HSPCs iz mPB koje su podvrgnute elektroporaciji sa različitim Cas9 mRNAs i SPY101 gRNA (mRNA 1-8) u poređenju sa humanim CD34+ HSPCs iz mPB koje su podvrgnute elektroporaciji sa Cas9 proteinom u kompleksu sa SPY101 gRNA (RNP).

Slika 32B prikazuje ćelijsku vijabilnost 48 sati posle elektroporacije za humane CD34+ HSPCs iz mPB koje su podvrgnute elektroporaciji sa različitim Cas9 mRNAs i SPY101 gRNA (mRNA 1-8) u poređenju sa humanim CD34+ HSPCs iz mPB koje su podvrgnute elektroporaciji sa Cas9 proteinom u kompleksu sa SPY101 gRNA (RNP).

Slike 33A-C prikazuju nekoliko Cas9 RNP konstrukcija korišćenih za Cas9 RNP optimizaciju i Indel% koji se povezuju sa svakom od Cas9 RNP konstrukcija.

Slika 33A prikazuje nekoliko Cas9 RNP konstrukcija.

Slika 33B prikazuje Indel% za svaku od Cas9 RNP konstrukcija korišćenjem odnosa 1µg Cas9: 1µg SPY101 gRNA.

Slika 33C prikazuje Indel% za svaku od Cas9 RNP konstrukcija korišćenjem odnosa 3µg Cas9: 3µg SPY101 gRNA.

Slike 34A-B prikazuju efikasnost genskog editovanja (%) u humanim CD34+ HSPCs iz mPB tretiranim ili sa Cas9 mRNA ili sa Cas9 proteinom (Feldan ili Aldevron) u nekliničkoj i kliničkoj razmeri.

Slika 34A prikazuje efikasnost genskog editovanja (%) u humanim CD34+ HSPCs iz mPB ili koštane srži (BM) tretiranim ili sa Cas9 mRNA ili sa Cas9 proteinom (Feldan ili Aldevron) u ne-kliničkoj razmeri.

Slika 34B prikazuje efikasnost genskog editovanja (%) u humanim CD34+ HSPCs iz mPB tretiranim sa Cas9 proteinom (Aldevron) u kliničkoj razmeri.

Slike 35A-B prikazuju efikasnost SPY101 u humanim mPB CD34+ HSPCs putem prezentovanja g/a globin mRNA odnosa u % i g/(g+b) globin mRNA odnosa u % za ćelije tretirane sa bilo Cas9 mRNA i SPY101 gRNA bilo Cas9 proteinom (Feldan ili Aldevron) u kompleksu sa SPY101 gRNA.

Slika 35A prikazuje g/a globin mRNA odnos u % u humanim mPB CD34+ HSPCs tretiranim sa bilo Cas9 mRNA i SPY101 gRNA bilo Cas9 proteinom (Feldan ili Aldevron) u kompleksu sa ith SPY101 gRNA.

Slika 35B prikazuje g/(g+b) globin mRNA odnos u % u humanim mPB CD34+ HSPCs tretiranim sa bilo Cas9 mRNA i SPY101 gRNA bilo Cas9 proteinom (Feldan ili Aldevron) u kompleksu sa SPY101 gRNA.

Slike 36A-B prikazuju efikasnost SPY101 u CD34+ HSPCs iz koštane srži putem prezentovanja g/a globin mRNA odnosa u % i g/(g+b) globin mRNA odnosa u % za ćelije tretirane sa Cas9 proteinom (Aldevron, tehnički optimizovan vs. neoptimizovan) koji je u kompleksu sa SPY101 gRNA.

Slika 36A prikazuje g/a globin mRNA odnos u % za CD34+ HSPCs iz koštane srži tretirane sa Cas9 proteinom koji je u kompleksu sa SPY101 gRNA.

Slika 36B prikazuje g/(g+b) globin mRNA odnos u % CD34+ HSPCs iz koštane srži tretirane sa Cas9 proteinom koji je u kompleksu sa SPY101 gRNA.

Slike 37A-B prikazuju efikasnost SPY101 u uzorcima pacijenata sa SCD i btalasemijom.

Slika 37A prikazuje prosečan g/(g+b) globin mRNA odnos u % za eritroidno diferencirane ćelije iz šest SCD pacijenata i dva zdrava donora koji su tretirani sa SPY101 gRNA i Cas9 proteinom. Od svih vrednosti su oduzete vrednosti njihovih kontrolnih uzoraka tretiranih sa GFP gRNA i Cas9 proteinom.

Slika 37B prikazuje g/a globin mRNA odnos u % za eritroidno diferencirane ćelije izjednog pacijenta sa b-talasemijom i dva zdrava donora koji su tretirani sa SPY101 gRNA i Cas9 proteinom. Od svih vrednosti su oduzete vrednosti njihovih kontrolnih uzoraka tretiranih sa GFP gRNA i Cas9 proteinom.

Slike 38A-B prikazuju Bcl11a Intron (SPY101) stopu DNA editovanja kada se primenjuje Cas9 mRNA ili Cas9 RNP.

Slika 38A prikazuje BCL11A Intron (SPY101) stopu DNA editovanja kada se primenjuje Cas9 mRNA.

Slika 38B prikazuje BCL11A Intron (SPY101) stopu DNA editovanja kada se primenjuje Cas9 RNP.

Slike 39A-B prikazuju da su prekidi GATA1 vezujućeg položaja (GBS), prouzrokovani SPY101/Cas9 RNP u pojedinačnim ćelijskim kolonijama poreklom iz eritroidno diferenciranih humanih mPB CD34+ HSPCs, povezani sa povećanjem ekspresije g-globina.

Slika 39A prikazuje g/a globin mRNA odnos SPY101-editovanih kolonija bez GBS prekida, sa mono-alelnim GBS prekidima, ili sa bi-alelnim GBS prekidima.

Slika 39B prikazuje g/(g+b) globin mRNA odnos SPY101-editovanih kolonija bez GBS prekida, sa mono-alelnim GBS prekidima, ili sa bi-alelnim GBS prekidima.

Slike 40A-E prikazuju porast ekspresije g-globina u eritroidno diferenciranim SPY101/Cas9 RNP editovanim humanim mPB CD34+ HSPCs analizom protočnom citometrijom.

Slika 40A je analiza protočnom citometrijom i prikazuje ekspresiju a-globina u SPY101/Cas9 RNP editovanim eritroidno diferenciranim humanim mPB CD34+ HSPCs u poređenju sa ekspresijom a-globina u GFP gRNA/Cas9 RNP tretiranim eritroidno diferenciranim humanim mPB CD34+ HSPCs.

Slika 40B je analiza protočnom citometrijom i prikazuje ekspresiju b-globina u SPY101/Cas9 RNP editovanim eritroidno diferenciranim humanim mPB CD34+ HSPCs u poređenju sa ekspresijom b-globina u GFP gRNA/Cas9 RNP tretiranim eritroidno diferenciranim humanim mPB CD34+ HSPCs.

Slika 40C je analiza protočnom citometrijom i prikazuje ekspresiju g-globina u SPY101/Cas9 RNP editovanim eritroidno diferenciranim humanim mPB CD34+ HSPCs u poređenju sa ekspresijom g-globina u GFP gRNA/Cas9 RNP tretiranim eritroidno diferenciranim humanim mPB CD34+ HSPCs.

Slika 40D prikazuje procenat g-globin pozitivnih ćelija u SPY101/Cas9 RNP editovanim eritroidno diferenciranim humanim mPB CD34+ HSPCs u poređenju sa GFP gRNA/Cas9 RNP tretiranim eritroidno diferenciranim humanim mPB CD34+ HSPCs.

Slika 40E prikazuje srednji intenzitet fluorescencije (MFI) u SPY101/Cas9 RNP editovanim eritroidno diferenciranim humanim mPB CD34+ HSPCs u poređenju sa GFP gRNA/Cas9 RNP tretiranim eritroidno diferenciranim humanim mPB CD34+ HSPCs.

Kratak opis liste sekvenci

[0049]

SEQ ID NOs: 1 - 29,482 su 20 bp spejser sekvence za ciljanje unutar ili u blizini BCL11A gena ili druge DNA sekvence koja kodira regulatorni element BCL11A gena sa S. pyogenes Cas9 endonukleazom.

SEQ ID NOs: 29,483 -32,387 su 20 bp spejser sekvence za ciljanje unutar ili u blizini BCL11A gena ili druge DNA sekvence koja kodira regulatorni element BCL11A gena sa S. aureus Cas9 endonukleazom.

SEQ ID NOs: 32,388 - 33,420 su 20 bp spejser sekvence za ciljanje unutar ili u blizini BCL11A gena ili druge DNA sekvence koja kodira regulatorni element BCL11A gena sa S. thermophilus Cas9 endonukleazom.

SEQ ID NOs: 33,421 - 33,851 su 20 bp spejser sekvence za ciljanje unutar ili u blizini BCL11A gena ili druge DNA sekvence koja kodira regulatorni element BCL11A gena sa T. denticola Cas9 endonukleazom.

SEQ ID NOs: 33,852 - 36,731 su 20 bp spejser sekvence za ciljanje unutar ili u blizini BCL11A gena ili druge DNA sekvence koja kodira regulatorni element BCL11A gena sa N. meningitides Cas9 endonukleazom.

SEQ ID NOs: 36,732 - 71,947 su 22 bp spejser sekvence za ciljanje unutar ili u blizini BCL11A gena ili druge DNA sekvence koja kodira regulatorni element BCL11A gena sa Acidominococcus, Lachnospiraceae, i Franciscella Novicida Cpf1 endonukleazom.

SEQ ID NO: 71,948 je uzorak RNA vodilje (gRNA) za S. pyogenes Cas9 endonukleazu.

SEQ ID NO: 71,949 prikazuje poznatu familiju ciljajućih endonukleaza, kako je klasifikovana po svojoj strukturi.

SEQ ID NO: 71,950 je gRNA A (CLO1).

SEQ ID NO: 71,951 je gRNA B (CLO8).

SEQ ID NO: 71,952 je gRNA C (CSO2).

SEQ ID NO: 71,953 je gRNA D (CSO6).

SEQ ID NO: 71,954 je gRNA E (HPFH-15).

SEQ ID NO: 71,955 je gRNA F (HPFH-4).

SEQ ID NO: 71,956 je gRNA G (Kenya02).

SEQ ID NO: 71,957 je gRNA H (Kenya17).

SEQ ID NO: 71,958 je gRNA I (SD2).

SEQ ID NO: 71,959 je gRNA J (SPY101).

SEQ ID NOs: 71,960-71,962 prikazuju primere sgRNA sekvenci.

Detaljan opis

Fetalni hemoglobin

[0050] Fetalni hemoglobin (HbF, a2g2) je glavni protein u ljudskom fetusu koji prenosi kiseonik i obuhvata alfa (a) i gama (g) subjedinice. Ekspresija HbF prestaje otprilike posle 6 meseci nakon rođenja. Adultni hemoglobin (HbA, a2b2) je glavni protein kod čoveka koji prenosi kiseonik posle ~34 nedelje od rođenja, i obuhvata alfa (a) i beta (b) subjedinice. Posle 34 nedelje, razvojni preokret dovodi do smanjene transkripcije gglobinskih gena i povećane transkripcije b-globinskih gena. Kako su brojni oblici hemoglobinopatija posledica neuspeha da se proizvede normalni b-globinski protein u dovoljnim količinama ili neuspeha da se proizvede normalni b-globinski protein u potpunosti, povećana ekspresija g-globina (tj., HbF) će ublažiti težinu b-globinske bolesti.

B-ćelijski limfom 11A (BCL11A)

[0051] 11A (BCL11A) B-ćelijski limfoma je gen lociran na hromozomu 2 i i kreće se od 60,451,167 - 60,553,567 bp (GRCh38). BCL11A je transkripcioni faktor tipa cink-prsta (proteinski strukturni motiv koji obuhvata jone cinka, prim. prev.) koji potiskuje fetalni hemoglobin (HbF) i nishodno reguliše ekspresiju HbF počevši u periodu od otprilike 6 nedelja posle rođenja. BCL11A gen sadrži 4 egzona, obuhvatajući 102.4 kb genomske DNA. BCL11A je isto tako pod transkripcionom regulacijom, uključujući vezujući domen u intronu 2 za master transkripcioni faktor GATA-1. Vezivanje GATA-1 uvećava ekspresiju BCL11A što, za uzvrat, potiskuje ekspresiju HbF. Intron 2 sadrži višestruke DNazne hipersenzitivne položaje (DHS), uključujući položaje označene kao 55, 58, i 62 na osnovu udaljenosti u kilobazama od transkripcionog startnog položaja. U nastavku se razmatraju različite strategije editovanja za deleciju, modulaciju, ili inaktivaciju transkripcionih kontrolnih sekvenci BCL11A. SNPs koji se prirodno javljaju unutar ovog regiona su povezani sa smanjenjem ekspresije BCL11A i povećanjem nivoa fetalnog Hb (Orkin et al. 2013 GWAS study). Ovi SNPs su organizovani oko 3 hipersenzitivna položaja na DNA, 55DHS, 58DHS i 62DHS. Od ova 3 regiona, ispostavlja se da je 58 DHS region ključni region koji je povezan sa povećanjem nivoa fetalnog Hb i, isto tako, skrivanjem GATA1 transkripcionog kontrolnog regiona.

Terapeutski pristup

[0052] Ne-homologno spajanje krajeva (NHEJ) se može iskoristiti za deleciju segmenata transkripcione kontrolne sekvence BCL11A, bilo direktno bilo menjanjem donora spajanja ili položaja primanja putem cepanja jedne gRNA ciljanjem nekoliko lokacija, ili nekoliko gRNAs.

[0053] Transkripciona kontrolna sekvenca BCL11A gena takođe može biti modulirana ili inaktivirana insertovanjem divljeg-tipa BCL11A gena ili cDNA koja sadrži modifikovanu transkripcionu kontrolnu sekvencu. Na primer, donor za modulaciju ili inaktivaciju putem homologno usmerene popravke (HDR) sadrži modifikovanu transkripcionu kontrolnu sekvencu BCL11A gena sa malim ili velikim bočnim krakovima homologije kako bi se omogućilo očvršćavanje. HDR je suštinski mehanizam bez greške koji koristi zamensku homolognu DNA sekvencu kao templat tokom DSB popravke. Brzina homologno usmerene popravke (HDR) je funkcija udaljenosti između transkripcione kontrolne sekvence i položaja reza tako da je izbor preklapajućih ili obližnjih ciljnih položaja od važnosti. Templati mogu obuhvatiti ekstra sekvence pojačane homolognim regionima ili mogu imati sekvence koje se razlikuju od genomske sekvence, na koji način omogućavaju editovanje sekvence.

[0054] Osim delecije, modulacije, ili inaktivacije transkripcione kontrolne sekvence BCL11A gena putem NHEJ ili HDR, moguće su brojne druge opcije. Ukoliko postoje male ili velike delecije, cDNA može da se razbije tako da sadrži modifikovanu transkripcionu kontrolnu sekvencu BCL11A gena. Puna dužina cDNA se može razbiti u ma koju "bezbednu luku"--tj., ne-štetnu tačku insercije koja nije sam BCL11A gen--, sa ili bez pogodnih regulatornih sekvenci. Ukoliko se ova konstrukcija zakuca u blizini regulatornih elemenata BCL11A, trebalo bi da poseduje fiziološku kontrolu, slično normalnom genu. Za brisanje regiona transkripcione kontrolne sekvence se mogu koristiti dve ili više (npr., par) nukleaza, mada bi donoru obično trebalo da bude obezbeđeno da modulira ili inaktivira funkciju. U ovom slučaju, bile bi obezbeđene dve gRNA i jedna donorska sekvenca.

[0055] Ovde su obezbeđeni ćelijski, ex vivo i in vivo postupci za primenu genom konstruišućih alata za kreiranje permanentnih promena na genomu putem: 1) modulacije ili inaktivacije kontrolne sekvence transkripcije BCL11A gena, pomoću delecija koje nastaju zahvaljujući NHEJ putanji; 2) modulacije ili inaktivacije kontrolne sekvence transkripcije BCL11A gena, pomoću HDR; 3) modulacije ili inaktivacije kontrolne sekvence transkripcije BCL11A gena, pomoću delecija bar jednog dela kontrolne sekvence transkripcije i/ili zakucavanja divljeg tipa BCL11A gena ili cDNA koja sadrži modifikovanu kontrolnu sekvencu transkripcije u genski lokus ili bezbedno ukotvljen lokus. Takvi postupci koriste endonukleaze, kao što su endonukleaze povezane sa CRISPR (Cas9, Cpf1 i slične), da se trajno deletuje, insertuje, ili edituje kontrolna sekvenca transkripcije unutar ili u blizini genomskog lokusa BCL11A gena ili druge DNA sekvence koja kodira regulatorni element BCL11A gena. Na ovaj način, primeri koji su objašnjeni u ovom izlaganju mogu biti od pomoći za deletovanje, modulovanje, ili inaktivisanje kontrolne sekvence transkripcije BCL11A gena sa jednim tretmanom ili ograničenim brojem tretmana (pre nego uzimanje mogućih terapija doživotno kod pacijenta).

[0056] Ovde su opisani postupci za tretiranje pacijenta sa hemoglobinopatijom. Aspekt takvog postupka je ex vivo ćelijski zasnovana terapija. Na primer, može se kreirati indukovana pluripotentna matična ćelija (iPSC) specifično za pacijenta. Zatim, hromozomska DNA ovih iPS ćelija može da se edituje korišćenjem materijala i ovde opisanih postupaka. Sledeće, genom-editovane PSCs se mogu diferencirati u hematopoezne progenitorske ćelije. Na kraju, hematopoezne progenitorske ćelije se mogu implantirati u pacijenta.

[0057] Još jedan aspekt takvog postupka je ex vivo ćelijski zasnovana terapija. Na primer, može se izolovati mezenhimalna matična ćelija od pacijenta, koja se može izolovati iz koštane srži ili periferne krvi pacijenta. Sledeće, može se editovati hromozomska DNA ovih mezenhimalnih matičnih ćelija korišćenjem materijala i ovde opisanih postupaka. Sledeće, genom-editovane mezenhimalne matične ćelije se mogu diferencirati u hematopoezne progenitorske ćelije. Na kraju, ove hematopoezne progenitorske ćelije se mogu implantirati u pacijenta.

[0058] Sledeći aspekt ovakvog postupka je ex vivo ćelijski zasnovana terapija. Na primer, može se izolovati hematopoezna progenitorska ćelija od pacijenta. Sledeće, hromozomska DNA ovih ćelija se može editovati korišćenjem materijala i ovde opisanih postupaka. Na kraju, genom-editovane hematopoezne progenitorske ćelije se mogu implantirati u pacijenta.

[0059] Jedna prednost ex vivo pristupa ćelijskoj terapiji jeste mogućnost izvođenja obimnih analiza terapeutika pre primene. Terapeutici na bazi nukleaza mogu imati izvestan stepen off-target efekata. Izvođenje korekcije gena ex vivo omogućava da se opiše korigovana ćelijska populacija pre implantacije. Ovo izlaganje uključuje sekvenciranje celokupnog genoma ispravljenih ćelija kako bi se osiguralo da off-target efekti, ako ih ima, budu na genomskim lokacijama koje su povezane sa minimalnim rizicima po pacijenta. Dalje, populacije specifičnih ćelija, uključujući klonske populacije, mogu da se izoluju pre implantacije.

[0060] Druga prednost ex vivo ćelijske terapije se odnosi na genetičku korekciju u iPSCs u poređenju sa drugim primarnim ćelijskim izvorima. iPSCs su proliferišuće, što čini jednostavnim dobijanje velikog broja ćelija koje će se zahtevati za terapiju na bazi ćelija. Dalje, iPSCs su idealan ćelijski tip za izvođenje klonske izolacije. Ovo omogućava skrining na ispravnu korekciju genoma, bez rizika od pada vijabilnosti. Suprotno, druge primarne ćelije su vijabilne tokom samo nekoliko pasaža i teško ih je klonski proširiti.

Tako, manipulacija iPSCs za tretman hemoglobinopatija može biti daleko jednostavnija, i može skratiti potrebno vreme za izvođenje željene genetičke korekcije.

[0061] Za ex vivo terapiju, transplantacija zahteva clearance of niches koštane srži ili donorskih HSCs za kalemljenje. Trenutni postupci se oslanjaju na zračenje i/ili hemoterapiju. Zahvaljujući ograničenjima koja nameću, razvijeni su i razvijaju se bezbedniji režimi, kao što je imunodeplecija ćelija koštane srži antitelima ili konjugatima antitela sa toksinima koji su usmereni na površinske markere hematpoezne ćelije, na primer CD117, c-kit i drugi. Uspeh HSC transplantacije zavisi od efikasnog navođenja u koštanu srž, naknadnog usađivanja i repopulacije koštane srži. Važan je nivo usađenih gen-editovanih ćelija, kao i sposobnost višelinijskog usađivanja ćelija.

[0062] Hematopoetske matične ćelije (HSCs) su važna meta za ex vivo gensku terapiju s obzirom na to da obezbeđuju prolongirani izvor korigovanih ćelija. Tretirane CD34+ ćelije bi se vratile pacijentu.

[0063] Postupci mogu takođe uključiti in vivo zasnovanu terapiju. Hromozomska DNA ćelija u pacijentu se edituje primenom materijala i ovde opisanih postupaka. Ćelije mogu biti ćelije koštane srži, hematopoezne progenitorske ćelije, ili CD34+ ćelije.

[0064] Premda ćelije krvi predstavljaju atraktivnu metu za ex vivo tretman i terapiju, povećana efikasnost pri oslobađanju može omogućiti direktnu in vivo isporuku hematopoetskim matičnim ćelijama (HSC) i/ili drugim progenitorima B i T ćelija, kao što su CD34+ ćelije. Idealno, ciljano delovanje i editovanje bilo bi usmereno na odgovarajuće ćelije. Takođe bi bilo sprečeno cepanje drugih ćelija korišćenjem promotera, koji su aktivni samo u određenim ćelijama i/ili na određenim razvojnim stadijumima. Dodatni promoteri podležu indukciji, i, sledstveno tome, mogu biti vremenski kontrolisani ukoliko se nukleaza isporučuje kao plazmid. Vremensko trajanje tokom koga oslobođena RNA i protein ostaju u ćeliji, takođe, može biti podešeno, korišćenjem tretmana ili domena, koji se dodaju kako bi se izmenio polu-život. In vivo tretmanom bi se eliminisali brojni koraci obrade, ali niži obim isporuke može zahtevati više stope editovanja. In vivo tretmanom se mogu ukloniti problemi i gubici, proistekli iz ex vivo tretmana i presađivanja.

[0065] Prednost in vivo genske terapije može biti jednostavnost terapijske izrade i primene. Isti terapeutski pristup i terapija imaće potencijal za korišćenje u lečenju više od jednog pacijenta, na primer, brojnih pacijenta koji poseduju isti ili sličan genotip ili alel. Suprotno tome, ex vivo ćelijska terapija obično zahteva korišćenje pacijentovih vlastitih ćelija, koje se izoluju, povrgavaju manipulaciji i vraćaju istom pacijentu.

[0066] Ovde je, isto tako, opisan ćelijski postupak za editovanje gena BCL11A u ćeliji, putem editovanja genoma. Na primer, ćelija se može izolovati iz pacijenta ili životinje. Nakon toga, hromosomska DNA iz ćelije se može podvrći editovanju, korišćenjem, ovde opisanih, materijala i postupaka.

[0067] Ovde obezbeđeni postupci, bez obzira da li se radi o ćelijskom ili ex vivo ili in vivo postupku, mogu uključiti jedan postupak ili kombinaciju sledećih postupaka: 1) modulacija ili inaktivacija transkripcione kontrolne sekvence BCL11A gena, posredstvom delecija koje nastaju zbog NHEJ puta, 2) modulacija ili inaktivacija transkripcione kontrolne sekvence BCL11A gena, posredstvom HDR-a ili 3) modulacija ili inaktivacija transkripcione kontrolne sekvence gena BCL11A gene, posredstvom delecije najmanje jednog dela transkripcione kontrolne sekvence i/ili zakucavanje divljeg tipa gena BCL11A ili cDNA, koja sadrži modifikovanu transkripcionu kontrolnu sekvencu, u genski lokus ili na heterolognu poziciju u genomu (kao što je položaj sigurne luke, kao što je AAVS1). Obe strategije, i HDR i strategija zakucavanja, koriste donorski templat DNA u postupku popravke usmerene na homologiju (HDR). U bilo kojoj strategiji, HDR se može izvesti pravljenjem jednog ili više jedno-lančanih prekida (SSB-i) ili dvo-lančanih prekida (DSB-i), na specifičnim pozicijama u genomu, korišćenjem jedne ili više endonukleaza.

[0068] Na primer, strategija NHEJ-a može uključiti deleciju najmanje dela transkripcione kontrolne sekvence gena BCL11A, posredstvom indukcije jednog prekida pojedinačnog lanca ili prekida dvostrukog lanca unutar ili u blizini gena BCL11A, ili druge sekvence DNA, koja kodira regulatorni element BCL11A gena sa jednom ili više CRISPR endonukleaza i gRNA (npr., crRNA tracrRNA, ili sgRNA), ili dva ili više jednolančanih prekida ili prekida dvostrukih lanaca unutar ili u blizini gena BCL11A ili druge sekvence DNA, koja kodira regulatorni element gena BCL11A sa dve ili više CRISPR endonukleaza i dve ili više sgRNA. Ovaj pristup može zahtevati razvoj i optimizaciju sgRNA za transkripcionu kontrolnu sekvencu BCL11A gena.

[0069] Na primer, strategija HDR-a može uključiti modulaciju ili inaktivaciju transkripcione kontrolne sekvence gena BCL11A, putem indukcije jednog prekida pojedinačnog lanca ili prekida dvostrukog lanca unutar ili u blizini gena BCL11A ili druge sekvence DNA, koja kodira regulatorni element gena BCL11A, sa jednom ili više CRISPR endonukleaza i gRNA (npr., crRNA tracrRNA, ili sgRNA), ili dva ili više prekida pojedinačnih lanaca ili prekida dvostrukih lanaca unutar ili u blizini gena BCL11A gene ili druge sekvence DNA, koja kodira regulatorni element gena BCL11A, sa jednom ili više CRISPR endonukleaza i dve ili više gRNA, u prisustvu templata donorske DNA, koja se uvodi egzogeno, kako bi se usmerio ćelijski DSB odgovor na popravku, usmerenu na homologiju (templat donorske DNA može biti kratki jedno-lančani oligonukleotid, kratki dvo-lančani oligonukleotid, dugi jedno-lančani ili dvo-lančani DNA molekul). Ovaj pristup može zahtevati razvoj i optimizaciju gRNA i donorskih molekula DNA, koje sadrže divlji tip gena BCL11A, koji sadrži modifikovanu transkripcionu kontrolnu sekvencu.

[0070] Na primer, strategija zakucavanja uključuje zakucavanje divljeg tipa gena BCL11A ili cDNA, koja sadrži modifikovanu transkripcionu kontrolnu sekvencu, u lokus gena BCL11A, uz korišćenje gRNA (npr., crRNA tracrRNA, ili sgRNA) ili para gRNA-a, koji ciljano deluju ushodno od ili na poziciju transkripcione kontrolne sekvence gena BCL11A, ili na poziciji sigurne luke (kao što je AAVS1). Donorska DNA može biti jednolančana ili dvo-lančana DNA, i sadrži divlji tip gena BCL11A, koji sadrži modifikovanu transkripcionu kontrolnu sekvencu.

[0071] Prednosti prethodno pomenutih strategija (delecija/modulacija/inaktivacija i zakucavanje) su slične, a, u principu, uključuju i kratkotrajne i dugotrajne povoljne kliničke i laboratorijske efekte.

[0072] Pored opcija editovanja, koje su prethodno navedene, Cas9 ili slični proteini se mogu koristiti za ciljano delovanje na domene efektora, na iste ciljne položaje koji mogu biti identifikovani za editovanje, ili na dodatne ciljne pozicije unutar raspona efektorskih domena. Široki niz hromatin-modifikujućih enzima, metilaza ili demetilaza, može biti korišćen za promenu ekspresije ciljnog gena. Ove vrste epigenetske regulacije imaju neke prednosti, posebno zato što su ograničene u mogućim off-target efektima.

[0073] Regulacija transkripcije i translacije uključuje brojne različite klase položaja, koji ulaze u interakciju sa ćelijskim proteinima ili nukleotidima. Često DNA vezujući položaji transkripcionih faktora ili drugih proteina mogu biti ciljani za mutaciju ili deleciju, kako bi se ispitala uloga položaja, iako isti mogu biti ciljani za izmenu ekspresije gena. Položaji se mogu dodavati posredstvom ne-homolognog povezivanja krajeva NHEJ ili direktnog editovanja genoma, posredstvom popravke, usmerene na homologiju (HDR). Povećano korišćenje sekvenciranja genoma, ekspresije RNA i širokih genomskih studija vezivanja transkripcionih faktora, povećalo je i našu mogućnost da utvrdimo kako položaji dovode do razvojne ili vremenske regulacije gena. Ovi kontrolni sistemi mogu biti direktni ili mogu uključiti ekstenzivnu kooperativnu regulaciju, koja može zahtevati integrisanje aktivnosti višestrukih pojačivača. Transkripcioni faktori obično vezuju 6-12 bp-duge degenerisane sekvence DNA. Nizak nivo specifičnosti, koji pružaju pojedinačni položaji, sugeriše da su u vezivanje i funkcionalni ishod uključene kompleksne interakcije i pravila. Vezujući položaji sa manjim prisustvom degeneracije mogu obezbediti jednostavnije načine regulacije. Faktori veštačke transkripcije mogu biti dizajnirani za specifikovanje dužih sekvenci, koje poseduju manje sličnih sekvenci u genomu i imaju manji potencijal za off-target otcepljivanje. Bilo koji od ovih tipova vezujućih položaja može biti podvrgnut mutaciji, deleciji ili, čak, može biti kreiran kako bi omogućio izmene u regulaciji ili ekspresiji gena (Canver, M.C. et al., Nature (2015)). GATA transkripcioni faktori su familija transkripcionih faktora, koji su okarakterisani posredstvom njihove sposobnosti da se vezuju za GATA DNA vezujuće sekvence. GATA vezujuća sekvenca je pozicionirana na 58 DNA hipersenzitivnom položaju (DHS) gena BCL11A.

[0074] Drugu klasu regulatornih regiona gena, koji poseduju ove karakteristike, čine vezujući položaji mikroRNA (miRNA). Molekuli miRNA su molekuli ne-kodirajuće RNA, koji igraju ključne uloge u posttranskripcionoj regulaciji gena. miRNA može regulisati ekspresiju 30% svih protein-kodirajućih gena sisara. Otkriveni su specifični i moćni načini utišavanja gena od strane dvo-lančane RNA (RNAi), uvećani za dodatnu malu nekodirajuću RNA (Canver, M.C. et al., Nature (2015)). Najveću klasu ne-kodirajućih RNA, koje su važne za utišavanje gena čine miRNA. Kod sisara, miRNA se najpre transkribuju kao dugi transkripti RNA, koji mogu biti zasebne transkripcione jedinice, deo proteinskih introna ili drugi transkripti. Dugi transkripti se nazivaju primarnom miRNA (pri-miRNA), koji uključuju nesavršeno bazno uparene strukture ukosnica (engl., "hairpins"). Ove primiRNA mogu biti podvrgnute cepanju na jednu ili više kraćih prekursorskih miRNA (premiRNA), posredstvom mikroprocesora, proteinskog kompleksa u jedru, uključujući Drosh-u.

[0075] Pre-miRNA su kratke matične petlje sa ~70 nukleotida po dužini, sa 2-nukleotidnim 3’-visećim nukleotidom, koji se izbacuje, u zrelim dupleksima od 19-25 nukleotidne miRNA:miRNA*. Lanac miRNA sa slabijom stabilnošću sparivanja baza (vodeći lanac) može biti nanesen na kompleks RNA-indukovano utišavanje (RISC). Putujući vodeći lanac (označen sa *) može biti funkcionalan, ali uglavnom bude razgrađen. Zrela miRNA povezuje RISC za delimično komplementarne motive sekvence u ciljnim molekulima mRNA, koje se nalaze, prvenstveno, unutar 3’ netranslatovanih regiona (UTR-i) i indukuje posttranskripciono utišavanje gena (Bartel, D.P. Cell 136, 215-233 (2009); Saj, A. & Lai, E.C. Curr Opin Genet Dev 21, 504-510 (2011)).

[0076] miRNA mogu biti od značaja za kontrolu razvoja, diferencijacije ćelijskog ciklusa i rasta i, praktički, za sve biološke puteve kod sisara i ostalih višećelijskih organizama.

miRNA mogu, takođe, biti uključeni u kontrolu ćelijskog ciklusa, u apoptozu i diferencijaciju matičnih ćelija, hematopoezu, hipoksiju, razvoj mišića, neurogenezu, sekreciju insulina, metabolizam holesterola, starenje, replikaciju virusa i imune odgovore.

[0077] Pojedinačna miRNA može ciljano delovati na stotine različitih transkripata mRNA, dok pojedinačni transkript može biti meta ciljanog delovanja mnoštva različitih miRNA. Zabeleženo je više od 28645 mikroRNA u poslednjem oslobađanju miRBase (v.21). Neke miRNA mogu biti kodirane posredstvom više lokusa, od kojih neki mogu biti ekspresovani iz tandemski ko-transkribovanih klastera. Njihove karakteristike dozvoljavaju mreže regulatornih kompleksa sa više puteva i kontrolama povratne veze.. miRNA mogu biti integralni delovi ovih krugova povratnih veza i regulacije i mogu pomoći u regulaciji genske ekspresije, držanjem proizvodnje proteina unutar granica (Herranz, H. & Cohen, S.M. Genes Dev 24, 1339-1344 (2010); Posadas, D.M. & Carthew, R.W. Curr Opin Genet Dev 27, 1-6 (2014)).

[0078] miRNA može, takođe, biti od značaja, u velikom broju humanih bolesti, koje su udružene sa abnormalnom ekspresijom miRNA. Ova povezanost potcrtava značaj regulatornog puta miRNA. Nedavna ispitivanja delecije miRNA povezala su miRNA sa regulacijom imunih odgovora (Stern-Ginossar, N. et al., Science 317, 376-381 (2007)).

[0079] Postoji, takođe, snažna povezanost miRNA sa malignim bolestima, a miRNA može igrati ulogu u različitim tipovima malignih bolesti. Utvrđena je nishodna regulacija miRNA u brojnim tumorima. miRNA može biti od važnosti u regulaciji ključnih puteva, povezanih sa kancerom, kao što je kontrola ćelijskog ciklusa i odgovor u vidu oštećenja DNA, te, sledstveno tome, može biti korišćena u dijagnostici i može biti predmet ciljanog delovanja, na kliničkom nivou. MikroRNA mogu, na delikatan način, regulisati ravnotežu angiogeneze, tako da eksperimenti sa iscrpljivanjem svih mikroRNA suprimiraju tumorsku angiogenezu (Chen, S. et al., Genes Dev 28, 1054-1067 (2014)).

[0080] Kao što je prikazano za protein-kodirajuće gene, geni miRNA mogu, isto tako, biti podvrgnuti epigenetskim promenama koje se dešavaju u prisustvu maligne bolesti. Mnogi lokusi miRNA mogu biti povezani sa CpG ostrvcima, uz povećavanje njihove mogućnosti regulisanja posredstvom metilacije DNA (Weber, B., Stresemann, C., Brueckner, B. & Lyko, F. Cell Cycle 6, 1001-1005 (2007)). Većina studija je koristila tretman sa lekovima koji remodeluju hromatin, da bi se proizvele epigenetski utišane miRNA.

[0081] Pored njihove uloge u utišavanju RNA, miRNA može, takođe, aktivirati translaciju (Posadas, D.M. & Carthew, R.W. Curr Opin Genet Dev 27, 1-6 (2014)). Izbacivanje ovih položaja može dovesti do smanjene ekspresije ciljanog gena, dok uvođenje ovih položaja može povećati ekspresiju.

[0082] Pojedinačna miRNA može biti, na najefikasniji način, izbačena posredstvom mutiranja semenske sekvence (baze 2-8 iz mikroRNA), što može biti značajno za specifičnost vezivanja. Otcepljivanje u ovom regionu, praćeno neodgovarajućom popravkom posredstvom NHEJ, može na efektivan način, poništiti funkciju miRNA, putem blokade vezivanja za ciljne položaje. miRNA bi, takođe, mogla biti, inhibirana putem specifičnog ciljanog delovanja specijalnog regiona petlje, u blizini palindromske sekvence. KatalItički inaktivni Cas9, takođe, može biti korišćen za inhibiciju ekspresije shRNA (Zhao, Y. et al., Sci Rep 4, 3943 (2014)). Pored ciljanog delovanja miRNA, vezujući položaji mogu, isto tako, biti predmet ciljanog delovanja i mutacije, kako bi se sprečilo utišavanje od strane miRNA.

Ljudske ćelije

[0083] Za ublažavanje hemoglobinopatija, kako su ovde opisane i ilustrovane, glavne mete za editovanje gena su ćelije ljudi. Na primer, u ex vivo postupcima, ljudske ćelije mogu biti somatske ćelije, koje pošto budu modifikovane primenom opisanih tehnika, mogu dovesti do porasta progenitorskih ćelija. Na primer, u in vivo postupcima, ljudske ćelije mogu biti ćelija koštane srži, hematopoetska progenitorska ćelija, ili CD34+ ćelija.

[0084] Izvođenjem editovanja gena u autolognim ćelijama, koje su poreklom od i time već u potpunosti podudarne sa pacijentom kome su namenjene, moguće je generisati ćelije koje se bezbedno mogu ponovo uneti u organizam pacijenta, i efektivno povećati populacija ćelija koja može biti delotvorna u ublažavanju jednog ili više kliničkih stanja koja su povezana sa bolešću pacijenta.

[0085] Progenitorske ćelije (takođe su ovde označene kao matične ćelije) sposobne su i da proliferišu i da dovedu do još progenitorskih ćelija, ove su opet sposobne da stvore veliki broj majki ćelija koje će za uzvrat dovesti do diferenciranih ili ćerki ćelija koje mogu da se diferenciraju. Same ćerke ćelije mogu da se indukuju da proliferišu i proizvedu potomke koji potom diferenciraju u jednu ili više zrelih vrsta ćelija, dok se, isto tako, zadržava jedna ili više ćelija sa roditeljskim razvojnim potencijalom. Izraz "matična ćelija" se onda odnosi, na ćeliju sa kapacitetom ili potencijalom, pod naročitim okolnostima, da diferencira u više specijalizovan ili diferenciran fenotip, i koja zadržava kapacitet, pod naročitim okolnostima, da proliferiše bez suštinskog diferenciranja. U jednom aspektu, izraz progenitorska ili matična ćelija se odnosi na generalizovanu majku ćeliju čiji naslednici (potomstvo) specijalizuju, često u različitim smerovima, diferencijacijom, npr., sticanjem potpuno individualnih osobina, što se javlja u progresivnom preinačenju embrionih ćelija i tkiva. Ćelijska diferencijacija je kompleksan proces koji se obično javlja kroz višestruke ćelijske deobe. Diferencirana ćelija može poticati od multipotentne ćelije koja sama potiče od multipotentne ćelije, i tako dalje. Dok se svaka od ovih multipotentnih ćelija može smatrati matičnom ćelijom, raspon vrsta ćelija do kojih svaka može dovesti može značajno varirati. Neke diferencirane ćelije, isto tako, imaju kapacitet da dovedu do ćelija sa većim razvojnim potencijalom. Ovaj kapacitet može biti prirodni ili može biti veštački indukovan tokom tretmana sa brojnim faktorima. U brojnim biološkim situacijama, matične ćelije takođe mogu biti "multipotentne" zbog toga što mogu da proizvedu potomstvo koje je šire od jedne različite vrste ćelija, ali ovo nije neophodno za "stem-ness".

[0086] Samo-obnavljanje može biti drugi važan aspekt matične ćelije. Teoretski, samoobnavljanje se može ostvariti putem jednog od dva glavna mehanizma. Matične ćelije se mogu deliti asimetrično, uz to da jedna ćerka zadržava stanje matične ćelije dok druga ćerka ekspresuje izvesnu razliku drugačije specifične funkcije i fenotipa. Alternativno, neke od matičnih ćelija iz populacije mogu simetrično da se podele u dve matične ćelije, čime održavaju izvesne matične ćelije u populaciji u celini, dok druge ćelije iz populacije samo dovode do diferenciranog potomstva. Generalno, "progenitorske ćelije" imaju ćelijski fenotip koji je daleko primitivniji (tj., on je na ranijem stepenu duž razvojne putanje ili progresa nego što je kod ćelije koja je u potpunosti diferencirana). Često, progenitorske ćelije takođe imaju značajan ili veoma visok proliferativni potencijal. Progenitorske ćelije mogu dovesti do višestruko različito diferenciranih ćelijskih vrsta ili do jedne vrste diferenciranih ćelija, u zavisnosti od razvojnog puta i okruženja u kom se ćelije razvijaju i diferenciraju.

[0087] U kontekstu ćelijske ontogeneze, pridev "diferenciran," ili "diferenciranje" je relativan izraz. "Diferencirana ćelija" je ćelija koja je napredovala dalje u razvojnom putu u odnosu na ćeliju sa kojom se poredi. Tako, matične ćelije mogu da diferenciraju u prekursorne ćelije ograničene na lozu (kao što je hematopoetska progenitorska ćelija), koje opet mogu da diferenciraju u druge vrste prekursornih ćelija dalje u razvojnom putu (kao što je hematopoetski prekursor), i onda do ćelije diferencirane do poslednjeg stadijuma, kao što je eritrocit, koja ima karakterističnu ulogu u izvesnim vrstama tkiva, i može ili ne mora zadržati kapacitet dalje proliferacije.

[0088] Izraz "hematopoetska progenitorska ćelija" se odnosi na ćelije matične ćelijske loze od koje se razvijaju sve vrste ćelija krvi, uključujući eritroidne (eritrociti ili krvne ćelije crvene loze (RBCs)), mijeloidne (monociti i makrofagi, neutrofili, bazofili, eozinofili, megakariociti / trombociti, i dendritske ćelije), i limfoidne (T-ćelije, B-ćelije, NK-ćelije).

[0089] "Ćelija eritroidne loze" ukazuje da je ćelija koja je kontaktirana ćelija koja podleže eritropoezi, tako da tokom konačne diferencijacije formira eritrocit ili crveno krvno zrnce. Ovakve ćelije potiču od hematopoetskih progenitorskih ćelija iz koštane srži. Tokom izlaganja specifičnim faktorima rasta i drugim činiocima hematopoetskog mikrookruženja, hematopoetske progenitorske ćelije mogu sazreti preko serije intermedijernih diferencijacionih ćelijskih vrsta, sve intermedijeri eritroidne loze, u RBCs. Tako, ćelije "eritroidne loze" obuhvataju hematopoetske progenitorske ćelije, proeritroblaste, bazofilne eritroblaste, polihromatofilne eritroblaste, acidofilne eritroblaste, retikulocite, i eritrocite.

[0090] Hematopoezna progenitorska ćelija može ekspresovati najmanje jedan od sledećih markera ćelijske površine karakterističnih za hematopoezne progenitorske ćelije: CD34+, CD59+, Thyl/CD90+, CD381o/-, i C-kit/CDI 17+. U nekim ovde obezbeđenim primerima, hematopoezni progenitori mogu biti CD34+.

[0091] Hematopoezna progenitorska ćelija može biti matična ćelija periferne krvi dobijena od pacijenta nakon tretiranja pacijenta sa jednim ili više faktora, kao što je stimulišući faktor granulocitne kolonije (opciono u kombinaciji sa pleriksaflorom). CD34+ ćelije mogu da se obogate korišćenjem CliniMACS® Cell selekcionog sistema (Miltenyi Biotec). CD34+ ćelije mogu da se stimulišu u medijumu bez seruma (npr., CellGrow SCGM medijum, CellGenix) sa citokinima (npr., SCF, rhTPO, rhFLT3) pre editovanja genoma. Dodavanje SR1 i dmPGE2 i/ili drugih faktora je razmatrano u cilju poboljšanja dugoročnog usađivanja.

[0092] Hematopoezne progenitorske ćelije eritrocitne linije mogu imati marker ćelijske površine karakterističan za eritroidnu lozu, kao što je: CD71 i Terl 19.

[0093] Hematopoetske matične ćelije (HSCs) mogu biti važna meta genske terapije kako obezbeđuju produženi izvor ispravljenih ćelija. HSCs dovode i do mijeloidnih i do limfoidnih linija krvnih ćelija. Zrele ćelije krvi imaju ograničen životni vek i moraju kontinuirano biti zamenjivane tokom života. Ćelije krvi se kontinuirano produkuju proliferacijom i diferencijacijom populacije pluripotentnih HSCs koje mogu biti ponovo dopunjene putem samo-obnavljanja. Koštana srž (BM) je glavno mesto hematopoeze kod ljudi i dobar izvor hematopoetskih matičnih i progenitorskih ćelija (HSPCs). HSPCs mogu da se nađu u malom broju u perifernoj krvi (PB). U nekim indikacijama ili tretmanima njihov broj se povećava. Potomstvo HSCs sazreva kroz faze, stvarajući multi-potencijalne i lozno-usmerene progenitorske ćelije uključujući limfoidne progenitorske ćelije koje dovode do ćelija koje ekspresuju BCL 11A. B i T ćelijski progenitori su dve ćelijske populacije koje zahtevaju aktivnost BCL11A, tako da se mogu editovati u stadijumima pre reorganizovanja, iako korigovanje progenitora ima prednost nastavljanja da bude izvor ispravljenih ćelija. Tretirane ćelije, kao što su CD34+ ćelije, bile bi vraćene u pacijenta. Nivo usađivanja može biti važan, kao i sposobnost višelinijskog usađivanja ćelija u gen-editovane ćelije nakon CD34+ infuzije in vivo.

Indukovanje pluripotentnih matičnih ćelija

[0094] Ovde opisane genetski konstruisane ljudske ćelije mogu biti indukovane pluripotentne matične ćelije (iPSCs). Prednost korišćenja iPSCs je ta što ćelije mogu voditi poreklo iz istog subjekta kome će se progenitorske ćelije primeniti. To jest, somatska ćelija se može dobiti od subjekta, reprogramirati u indukovanu pluripotentnu matičnu ćeliju, i zatim ponovo diferencirati u progenitorsku ćeliju da bi bila primenjena subjektu (npr., autologne ćelije). Kako su progenitori suštinski izvedeni iz autolognog izvora, rizik od odbacivanja kalema ili alergijskog odgovora može biti snižen u poređenju sa korišćenjem ćelija od drugog subjekta ili grupe subjekata. Sem toga, upotreba iPSCs odbacuje potrebu za ćelijama dobijenim iz embrionskog izvora. Tako, u jednom aspektu, matične ćelije koje su korišćene u izloženim postupcima nisu embrione matične ćelije.

[0095] Iako je diferencijacija generalno ireverzibilna u fiziološkim okvirima, nedavno je razvijeno nekoliko postupaka za reprogram somatskih ćelija u iPSCs. Primeri postupaka su poznati stručnim licima u ovoj oblasti i ukratko su opisani ovde u nastavku.

[0096] Izraz "reprogramiranje" se odnosi na proces koji menja ili preokreće diferencijaciono stanje diferencirane ćelije (npr., somatske ćelije). Drugim rečima, reprogramiranje se odnosi na proces dovođenja diferencijacije ćelije nazad na daleko nediferentovanu ili daleko primitivniju vrstu ćelije. Treba zapaziti da stavljanje mnogo primarnih ćelija u kulturu može dovesti do izvesnog gubitka karakteristika pune diferencijacije. Tako, jednostavno uzgajanje ovih ćelija obuhvaćenih izrazom diferencirane ćelije ne čini ove ćelije ne-diferenciranim ćelijama (npr., nediferentovane ćelije) ili pluripotentnim ćelijama. Prelazak diferencirane ćelije u pluripotenciju zahteva reprogramirajući stimulus izvan stimulusa koji vode do delimičnog gubitka karaktera diferencijacije u kulturi. Reprogramirane ćelije isto tako imaju karakteristiku kapaciteta produženog opstajanja bez gubitka potencijala rasta, u odnosu na primarne ćelije roditelje, koje generalno imaju kapacitet samo za ograničen broj deljenja u kulturi.

[0097] Ćelija koja treba da bude reprogramirana može biti ili delimično ili terminalno diferencirana pre reprogramiranja. Reprogramiranje može obuhvatiti potpun povratak diferencijacionog stadijuma diferencirane ćelije (npr., somatska ćelija) do pluripotentnog stadijuma ili multipotentnog stadijuma. Reprogramiranje može obuhvatiti potpunu ili delimičnu reverziju diferencijacionog stadijuma diferencirane ćelije (npr., somatska ćelija) u nediferenciranu ćeliju (npr., embrionski-sličnu ćeliju). Reprogramiranjem ćelije mogu ekspresovati naročite gene, ekspresija kojom se dalje doprinosi reprogramiranju. U izvesnim ovde opisanim primerima, reprogramiranje diferencirane ćelije (npr., somatske ćelije) može prouzrokovati da diferencirana ćelija preuzima nediferencirani stadijum (npr., je nediferencirana ćelija). Dobijene ćelije se označavaju kao "reprogramirane ćelije," ili "indukovane pluripotentne matične ćelije (iPSCs ili iPS ćelije)."

[0098] Reprogramiranje može uključiti izmenu, npr., reverznu, bar nekih naslednih obrazaca modifikacije nukleinske kiseline (npr., metilacije), kondenzacije hromatina, epigenetskih izmena, genomskog urezivanja, itd., koji se javljaju tokom ćelijske diferencijacije. Reprogramiranje se razlikuje od jednostavnog održavanja postojećeg nediferenciranog stanja ćelije koje je već pluripotentno ili održavanja postojećeg stanja koje je manje od potpune diferenciranosti ćelije koje je već multipotentna ćelija (npr., hematopoetska matična ćelija). Reprogramiranje se, isto tako, razlikuje od podsticanja samo-obnavljanja ili proliferacije ćelija koje su već pluripotentne ili multipotentne, iako, u nekim primerima, ovde opisane kompozicije i postupci mogu takođe biti od koristi za ovakve svrhe.

[0099] U ovoj stručnoj oblasti su poznati brojni postupci koji se mogu primeniti za generisanje pluripotentnih matičnih ćelija od somatskih ćelija. Bilo koji takav postupak, koji reprogramira somatsku ćeliju u pluripotentni fenotip, odgovarao bi za primenu u ovde opisanim postupcima.

[0100] Opisane su metodologije reprogramiranja radi stvaranja pluripotentnih ćelija korišćenjem definisanih kombinacija transkripcionih faktora. Mišije somatske ćelije se mogu prevesti u ćelije slične ES ćelijama sa proširenim razvojnim potencijalom putem direktne transdukcije Oct4, Sox2, Klf4, i c-Myc; vidi, npr., Takahashi and Yamanaka, Cell 126(4):663-76 (2006). iPSCs liče na ES ćelije, s obzirom da zadržavaju transkripcioni krug koji je povezan sa pluripotencijom i mnogo od epigenetskog miljea. Sem toga, mišije iPSCs zadovoljavaju sve standardne testove za pluripotenciju: specifičnost, in vitro diferencijaciju u ćelijske vrste tri zametna sloja, formiranje teratoma, doprinos himerama, prenošenje zametne linije [vidi, npr., Maherali and Hochedlinger, Cell Stem Cell.3(6):595-605 (2008)], i tetraploidno dopunjavanje.

[0101] Ljudske iPSCs se mogu dobiti korišćenjem sličnih transdukcionih postaupaka, a trio transkripcionih faktora, OCT4, SOX2, i NANOG, je ustanovljen kao jezgreni set transkripcionih faktora koji određuju pluripotenciju; vidi, npr., Budniatzky and Gepstein, Stem Cells Transl Med. 3(4):448-57 (2014); Barrett et al., Stem Cells Trans Med 3:1-6 sctm.2014-0121 (2014); Focosi et al., Blood Cancer Journal 4: e211 (2014); i reference koje su tamo navedene. Produkcija iPSCs se može postići uvođenjem sekvenci nukleinske kiseline koja kodira gene povezane sa matičnom ćelijom u odraslu, somatsku ćeliju, istorijski, korišćenjem virusnih vektora.

[0102] iPSCs se mogu generisati ili izvesti od terminalno diferenciranih somatskih ćelija, kao i od matičnih ćelija odraslih, ili somatskih matičnih ćelija. To jest, ne-pluripotentna progenitorska ćelija se može vratiti u pluripotentnu ili multipotentnu reprogramiranjem. U ovakvim slučajevima, ne mora biti neophodno uključiti toliko mnogo faktora reprogramiranja koliko je neophodno za reprogram terminalno diferencirane ćelije. Dalje, reprogramiranje se može indukovati ne-virusnim unošenjem faktora reprogramiranja, npr., unošenjem samih proteina, ili unošenjem nukleinskih kiselina koje kodiraju faktore reprogramiranja, ili unošenjem mesindžer RNAs koje tokom translacije proizvode faktore reprogramiranja (vidi npr., Warren et al., Cell Stem Cell, 7(5):618-30 (2010). Reprogramiranje se može postići unošenjem kombinacije nukleinskih kiselina koje kodiraju gene povezane sa matičnom ćelijom, uključujući, na primer, Oct-4 (takođe poznat kao Oct-3/4 ili Pouf51), SoxI, Sox2, Sox3, Sox 15, Sox 18, NANOG, Klfl, Klf2, Klf4, Klf5, NR5A2, c-Myc, 1-Myc, n-Myc, Rem2, Tert, i LIN28. Reprogramiranje koje koristi ovde opisane postupke i kompozicije može dalje obuhvatiti jednog ili više Oct-3/4, člana Sox familije, člana Klf familije, i člana Myc familije u somatsku ćeliju. Ovde opisani postupci i kompozicije mogu dalje obuhvatiti unošenje jednog ili više od svakog od: Oct-4, Sox2, Nanog, c-MYC i Klf4 za reprogram. Kako je gore naglašeno, tačan postupak korišćen za reprogramiranje nije nužno ključan za ovde opisane postupke i kompozicije. Ipak, kada će se koristiti ćelije koje su diferencirale od reprogramiranih ćelija u, npr., terapiji čoveka, u jednom aspektu reprogramiranje se ne izvodi postupkom koji menja genom. Tako, u ovakvim primerima, reprogramiranje se može postići, npr., bez upotrebe virusnih ili plazmidnih vektora.

[0103] Efikasnost reprogramiranja (tj., broj reprogramiranih ćelija) koja proizilazi iz populacije polaznih ćelija se može povećati dodavanjem različitih agenasa, npr., malih molekula, kako su prikazali Shi et al., Cell-Stem Cell 2:525-528 (2008); Huangfu et al., Nature Biotechnology 26(7):795-797 (2008) i Marson et al., Cell-Stem Cell 3:132-135 (2008). Tako, agens ili kombinacija agenasa koji povećavaju efikasnost ili stopu indukcije proizvodnje pluripotentnih matičnih ćelija se može koristiti u proizvodnji iPSCs koje su specifične za pacijenta ili specifične za bolest. Neki primeri, koji nemaju karakter ograničavanja, agenasa koji povećavaju efikasnost reprogramiranja uključuju: rastvorljiv Wnt, Wnt kondicionirani medijum, BIX-01294 (G9a histon metiltransferaza), PD0325901 (MEK inhibitor), DNA inhibitore metiltransferaze, inhibitore histon deacetilaze (HDAC), valproinsku kiselinu, 5’-azacitidin, deksametazon, suberoilanilid, hidroksamsku kiselinu (SAHA), vitamin C, i trihostatin (TSA), između ostalog.

[0104] Drugi primeri, koji nemaju karakter ograničavanja, agensi povećavanja reprogramiranja uključuju: suberoilanilid hidroksamska kiselina (SAHA (npr., MK0683, vorinostat) i druge hidroksamske kiseline), BML-210, depudecin (npr., (-)-depudecin), HC Toxin, Nullscript (4-(I,3-diokso-IH,3H-benzo[de]izohinolin-2-il)-N-hidroksibutanamid), fenilbutirat (npr., natrijum fenilbutirat) i valproinska kiselina ((VP A) i druge masne kiseline kratkog lanca), skriptaid, suramin natrijum, trihostatin A (TSA), APHA jedinjenje 8, apicidin, natrijum butirat, pivaloiloksimetil butirat (Pivanex, AN-9), trapoksin B, hlamidocin, depsipeptid (takođe poznat kao FR901228 ili FK228), benzamidi (npr., CI-994 (npr., N-acetil dinalin) i MS-27-275), MGCD0103, NVP-LAQ-824, CBHA (mkarboksicinaminska kiselina bishidroksamska kiselina), JNJ16241199, tubacin, A-161906, proksamid, oksamflatin, 3-CI-UCHA (npr., 6-(3-hlorofenilureido)kapronska hidroksamska kiselina), AOE (2-amino-8-okso-9,10-epoksidekanska kiselina), CHAP31 i CHAP 50. Drugi agensi povećavanja reprogramiranja uključuju, na primer, dominantno negativne forme HDACs (npr., katalitički inaktivne forme), siRNA inhibitore HDACs, i antitela koja se specifično vezuju sa HDACs. Takvi inhibitori se mogu nabaviti, npr., od BIOMOL International, Fukasawa, Merck Biosciences, Novartis, Gloucester Pharmaceuticals, Titan Pharmaceuticals, MethylGene, i Sigma Aldrich.

[0105] Da bi se potvrdila indukcija pluripotentnih matičnih ćelija za primenu u ovde opisanim postupcima, mogu se testirati izolovani klonovi na ekspresiju markera matične ćelije. Takva ekspresija u ćeliji poreklom iz somatske ćelije identifikuje ćelije kao indukovane pluripotentne matične ćelije. Markeri matične ćelija mogu se odabrati iz grupe koja nema karakter ograničavanja, a koja uključuje: SSEA3, SSEA4, CD9, Nanog, Fbxl5, Ecatl, Esgl, Eras, Gdf3, Fgf4, Cripto, Daxl, Zpf296, Slc2a3, Rexl, Utfl, i Natl. U jednom slučaju, na primer, ćelija koja ekspresuje Oct4 ili Nanog se identifikuje kao pluripotentna. Postupci kojima se otkriva ekspresija ovih markera mogu uključiti, na primer, RT-PCR i imunološke postupke kojima se može otkriti prisustvo kodiranih polipeptida, kao što su Western blots ili analize protočnom citometrijom. Otkrivanje može uplesti ne samo RT-PCR, već isto tako može uključiti detekciju proteinskih markera. Intracelularni markeri se najbolje mogu identifikovati putem RT-PCR, ili postupcima detekcije proteina kao što je imunocitohemija, dok se markeri na površini ćelija jednostavno identifikuju, npr., imunocitohemijom.

[0106] Karakter pluripotentne matične ćelije izolovanih ćelija se može potvrditi testovima kojima se ispituje sposobnost iPSCs da diferencira u ćelije svakog od tri zametna sloja. Kao jedan primer, može se iskoristiti formiranje teratoma u golim miševima da bi se ispitao pluripotentan karakter izolovanih klonova. Ćelije se mogu uneti u gole miševe i može se izvesti histološko i/ili imunohistohemijsko ispitivanje na tumoru koji se pojavljuje iz ćelija. Rast tumora koji sadrži ćelije iz sva tri zametna sloja, na primer, dalje ukazuje da su ćelije pluripotentne matične ćelije.

Kreiranje iPSCs specifičnih za pacijenta

[0107] Jedan korak ex vivo postupaka ovog izlaganja može uključiti kreiranje iPS ćelije specifične za pacijenta, iPS ćelija specifičnih za pacijenta, ili iPS ćelijske linije specifične za pacijenta. U struci postoje brojni uhodani postupci za kreiranje iPS ćelija specifičnih za pacijenta, kako je opisano u: Takahashi and Yamanaka 2006; Takahashi, Tanabe et al. 2007. Na primer, korak kreiranja može obuhvatiti: a) izolovanje somatske ćelije, kao što je ćelija kože ili fibroblast, od pacijenta; i b) uvođenje seta gena koji su povezani sa pluripotencijom u somatsku ćeliju sa ciljem da indukuju ćeliju da postane pluripotentna matična ćelija. Set gena koji su povezani sa pluripotencijom može biti jedan ili više gena izdvojenih iz grupe koju čine: OCT4, SOX2, KLF4, Lin28, NANOG, i cMYC.

Izvođenje biopsije ili aspirata koštane srži pacijenta

[0108] Biopsija ili aspirat je uzorak tkiva ili tečnosti uzet iz tela. Postoji veliki broj različitih vrsta biopsija ili aspirata. Bezmalo sve uključuju upotrebu oštrog sredstva za uklanjanje male količine tkiva. Ukoliko će biopsija biti na koži ili drugoj osetljivoj oblasti, prvo će se primeniti medicina utrnuća (anestezija, prim. prev.). Biopsija ili aspirat se može izvesti prema ma kom od postupaka poznatih u struci. Na primer, za aspirat koštane srži, koristi se velika igla da bi mogla da uđe u pelvis kosti da sakupi koštanu srž.

Izolovanje mezenhimalne matične ćelije

[0109] Mezenhimalne matične ćelije se mogu izolovati prema ma kom postupku poznatom u struci, kao što bi bilo iz koštane srži pacijenta ili periferne krvi. Na primer, aspirat srži se može sakupiti u špric sa heparinom. Ćelije mogu da se isperu i centrifugiraju na Percoll™ po gradijentu gustine. Ćelije, kao što su ćelije krvi, ćelije jetre, interstitialne ćelije, makrofagi, mast ćelije, i timociti, mogu da se razdvoje korišćenjem Percoll™. Ćelije mogu da se uzgajaju u Dulbeccovom modifikovanom Eagle medijumu (DMEM) (sa niskim sadržajem glukoze) koji sadrži 10% fetalnog goveđeg seruma (FBS) (Pittinger MF, Mackay AM, Beck SC et al., Science 1999; 284:143-147).

Tretiranje pacijenta sa GCSF

[0110] Pacijent može eventualno biti tretiran sa faktorom stimulacije granulocitne kolonije (GCSF) prema ma kom poznatom postupku iz ove oblasti. GCSF se može primeniti zajedno sa Plerixaflorom.

Izolovanje hematopoetske progenitorske ćelije od pacijenta

[0111] Hematopoetska progenitorska ćelija se može izolovati od pacijenta ma kojim poznatim postupkom u ovoj oblasti. CD34+ ćelije se mogu obogatiti korišćenjem sistema CliniMACS® Cell Selection (Miltenyi Biotec). CD34+ ćelije se mogu blago stimulisati u medijumu bez seruma (npr., CellGrow SCGM media, CellGenix) sa citokinima (npr., SCF, rhTPO, rhFLT3) pre editovanja genoma.

Editovanje genoma

[0112] Editovanje genoma se uopšteno odnosi na proces modifikovanja nukleotidne sekvence genoma, poželjno na precizan ili prethodno utvrđen način. Primeri postupaka editovanja genoma koji su ovde opisani obuhvataju postupke koji koriste položajnousmerene nukleaze za presecanje deoksiribonukleinske kiseline (DNA) na preciznim ciljnim lokacijama u genomu, na koji način se stvaraju jedno-lančani ili dvo-lančani DNA odlomci na naročitim lokacijama unutar genoma. Ovakvi odlomci se mogu i regularno se popravljaju prirodnim, endogenim ćelijskim procesima, kao što su homologno-usmeren popravak (HDR) i NHEJ, kako su nedavno prikazani u Cox et al., Nature Medicine 21(2), 121-31 (2015). Ova dva glavna procesa popravke DNA se sastoje od grupe alternativnih puteva. NHEJ direktno spaja krajeve DNA što dovodi do formiranja dvo-lančanog odlomka, ponekad sa gubitkom ili dodatkom nukleotidne sekvence, što može prekinuti ili povećati ekspresiju gena. HDR koristi homologne sekvence, ili donorske sekvence, u vidu templata za unošenje definisanih DNA sekvenci u tački preloma. Homologna sekvenca se može nalaziti u endogenom genomu, kao što je sestrinska hromatida. Alternativno, donor može biti egzogena nukleinska kiselina, kao što je plazmid, jednolančani oligonukleotid, dvo-lančani oligonukleotid, dupleks oligonukleotid ili virus, koji ima regione visoke homologije sa položajem koji je presekla nukleaza, ali koji takođe može da sadrži dodatnu sekvencu ili izmene sekvence uključujući delecije koje se mogu ugraditi u prelomljenu ciljnu lokaciju. Treći mehanizam popravke može biti mikrohomologno-posredovano spajanje krajeva (MMEJ), koje se takođe označava kao "alternativni NHEJ", kod kog je genetički ishod sličan onom kao kod NHEJ s tim što se mogu javiti male delecije i umetanja (insercije) na otcepljenom položaju. MMEJ može iskoristiti homologne sekvence od nekoliko parova baza napadajući bočno položaj preloma DNA kako bi se dovelo do poželjnijeg ishoda popravke spajanja krajeva DNA i, nedavni pregledi su dalje rasvetlili molekularni mehanizam ovog procesa; vidi, npr., Cho and Greenberg, Nature 518, 174-76 (2015); Kent et al., Nature Structural and Molecular Biology, Adv. Online doi:10.1038/nsmb.2961 (2015); Mateos-Gomez et al., Nature 518, 254-57 (2015); Ceccaldi et al., Nature 528, 258-62 (2015). U nekim slučajevima se može predvideti verovatnost ishoda popravke na osnovu analize mogućih mikrohomologija na položaju preloma DNA.

[0113] Bilo koji od ovih mehanizama editovanja genoma se može upotrebiti u cilju stvaranja željenih izmena genoma. Korak u procesu editovanja genoma može biti stvaranje jednog ili dva DNA odlomka, ovaj drugi u vidu dvo-lančanih odlomaka ili u vidu dva jednolančana odlomka, na ciljnoj lokaciji kao što je blizu položaja namerne mutacije.

Ovo se može postići putem korišćenja položajno usmerenih polipeptida, kako je ovde opisano i ilustrovano.

[0114] Položajno-usmereni polipeptidi, kao što su DNA endonukleaze, mogu uneti dvolančane odlomke ili jedno-lančane odlomke u nukleinske kiseline, npr., genomsku DNA. Dvo-lančani odlomak može da stimuliše ćelijske endogene puteve popravke DNA (npr., homologno-zavisan popravak ili ne-homologno spajanje krajeva ili alternativno nehomologno spajanje krajeva (A-NHEJ) ili mikrohomologno-posredovano spajanje krajeva). NHEJ može popraviti cepanu ciljnu nukleinsku kiselinu bez neophodnog homolognog templata. Ovo ponekad može dovesti do malih delecija ili insercija (indela) u ciljnoj nukleinskoj kiselini na položaju cepanja, i može dovesti do prekida ili izmene genske ekspresije. HDR se može javiti kada postoji homologni templat za popravak, ili donor. Homologni donorski templat može sadržavati sekvence koje mogu biti homologne sekvencama koje učvršćuju položaj cepanja ciljne nukleinske kiseline. Kao templat za popravak, ćelija može koristiti sestrinski hromatid. Međutim, u svrhu editovanja genoma, templat za popravak se može nabaviti u vidu egzogene nukleinske kiseline, kao što je: plazmid, oligonukleotidni dupleks, jednolančani oligonukleotid, dvolančani oligonukleotid, ili virusna nukleinska kiselina. Sa egzogenim donorskim templatima, može se dodatna sekvenca nukleinske kiseline (kao što je transgen) ili modifikacija (kao što je izmena ili delecija jedne ili više baza) uneti između regiona učvršćivača homologije tako da dodatna ili izmenjena sekvenca nukleinske kiseline takođe postaje ugrađena u ciljni lokus. MMEJ može dovesti do genetičkog ishoda koji je sličan onom kod NHEJ u tome da se male delecije i insercije mogu pojaviti na položaju cepanja. MMEJ može iskoristiti homologne sekvence od nekoliko baznih parova koje učvršćuju položaj cepanja kako bi se dovelo do željenog ishoda popravke spajanjem DNA krajeva. U nekim slučajevima, moguće je predvideti verovatnoću ishoda popravke na osnovu analize potencijalnih mikrohomologija u ciljnim regionima nukleaze.

[0115] Tako, u nekim slučajevima, može se primeniti homologna rekombinacija da se unese egzogena polinukleotidna sekvenca u položaj cepanja ciljne nukleinske kiseline. Egzogena polinukleotidna sekvenca je ovde nazvana donorski polinukleotid (ili donor ili donorska sekvenca ili polinukleotidni donorski templat). Donorski polinukleotid, deo donorskog polinukleotida, kopija donorskog polinukleotida, ili deo kopije donorskog polinukleotida može da se unese u položaj cepanja ciljne nukleinske kiseline. Donorski polinukleotid može biti egzogena polinukleotidna sekvenca, tj., sekvenca koja se ne javlja u prirodi na položaju cepanja ciljne nukleinske kiseline.

[0116] Modifikacije ciljne DNA koje nastaju putem NHEJ i/ili HDR mogu dovesti do, na primer, mutacija, delecija, izmena, integracija, ispravke gena, zamene gena, označavanja gena, transgene insercije, delecije nukleotida, prekida gena, translokacija i/ili genske mutacije. Primeri editovanja genoma su procesi delecije genomske DNA i integrisanje ne-nativne nukleinske kiseline u genomsku DNA.

Sistem CRISPR endonukleaze

[0117] CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) (grupisani kratki palindromski ponovci na jednakim rastojanjima, prim. prev.) genomski lokus se može naći u genomima mnogih prokariota (npr., bakterija i arhea). Kod prokariota, CRISPR lokus kodira proizvode koji funkcionišu kao vrsta imunog sistema da pomognu u odbrani prokariota protiv stranih upadača, kao što je virus i fag. Postoje tri stepena funkcije CRISPR lokusa: integracija novih sekvenci u CRISPR lokus, ekspresija CRISPR RNA (crRNA), i gašenje nukleinske kiseline stranog upadača. Identifikuje se pet vrsta CRISPR sistema (npr., Tip I, Tip II, Tip III, Tip U, i Tip V).

[0118] CRISPR lokus obuhvata broj kratkih ponavljajućih sekvenci označenih kao "ponovci." Kada su ekspresovani, ponovci mogu formirati sekundarne strukture (npr., presavijenih površina) i/ili obuhvatati nestruktuirane jednolančane sekvence. Ponovci se obično javljaju u klasterima i često se razilaze među vrstama. Ponovci su jednako međusobno razmaknuti sa jedinstvenim interventnim sekvencama, označenim kao "spejseri," što rezultira arhitekturom ponovak-spejser-ponovak lokus. Spejseri su identični ili imaju visoku homologiju sa poznatim sekvencama stranih upadača. Jedinica spejser-ponovak kodira crisprRNA (crRNA), koja se obradi u zreli oblik spejser-ponovak jedinice. crRNA sadrži "seme" ili spejser sekvencu koja je upletena u ciljanje ciljne nukleinske kiseline (kod prokariota u obliku koji se javlja u prirodi, spejser sekvenca cilja nukleinsku kiselinu stranog upadača). Spejser sekvenca je locirana na 5’ ili 3’ kraju crRNA.

[0119] CRISPR lokus takođe obuhvata polinukleotidne sekvence koje kodiraju CRISPR povezane (Cas) gene. Cas geni kodiraju endonukleaze upletene u biogenezu i faze interferencije crRNA funkcije u prokariotama. Neki Cas geni sadrže homologne sekundarne i/ili tercijerne strukture.

Tip II CRISPR sistemi

[0120] crRNA biogeneza u Tip II CRISPR sistemu u prirodi zahteva trans-aktivaciju CRISPR RNA (tracrRNA). tracrRNA može biti modifikovana endogenom RNaselll, i onda hibridizovana sa crRNA ponovkom u pre-crRNA nizu. Endogena RNaselll može biti regrutovana za cepanje pre-crRNA. Otcepljene crRNAs mogu da se podvrgnu skraćivanju egzoribonukleazom da bi se proizveo zreli crRNA oblik (npr., 5’ skraćivanje). tracrRNA može ostati hibridizovana sa crRNA, i tracrRNA i crRNA povezane sa položajno usmerenim polipeptidom (npr., Cas9). crRNA iz crRNA-tracrRNACas9 kompleksa može voditi kompleks do ciljne nukleinske kiseline sa kojom se crRNA može hibridizovati. Hibridizacija crRNA sa ciljnom nukleinskom kiselinom može aktivirati Cas9 za ciljano cepanje nukleinske kiseline. Ciljna nukleinska kiselina u Tip II CRISPR sistemu se pominje kao protospejser susedni motiv (PAM). U prirodi, PAM je suštinski u olakšavanju vezivanje položajno usmerenog polipeptida (npr., Cas9) za ciljnu nukleinsku kiselinu. Tip II sistemi (takođe pominjani kao Nmeni ili CASS4) se dalje dele u Tip II-A (CASS4) i II-B (CASS4a). Jinek et al., Science, 337(6096):816-821 (2012) su pokazali da je CRISPR/Cas9 sistem koristan za editovanje genoma koje se može RNA-programirati, i, međunarodna publikacija patentne prijave broj WO2013/176772 pruža brojne primere i prijave sistema CRISPR/Cas endonukleaze za položajno specifično editovanje gena.

Tip V CRISPR sistemi

[0121] Tip V CRISPR sistema ima nekoliko važnih razlika u odnosu na Tip II sisteme. Na primer, Cpf1 je jedna RNA-vođena endonukleaza koja, suprotno Tipu II sistema, nema tracrRNA. Ustvari, CRISPR nizovi koji su u vezi sa Cpf1 mogu da se obrade u zrele crRNAs bez zahteva za dodatnim trans-aktivirajućim tracrRNA. Tip V CRISPR niza može da se obradi u kratke zrele crRNAs od 42-44 nukleotida dužine, uz to da svaka zrela crRNA počinje sa 19 nukleotida direktnih ponovaka koje prati 23-25 nukleotida spejser sekvence. Suprotno, zrele crRNAs u Tip II sistemima mogu početi sa 20-24 nukleotida spejser sekvence koju prati otprilike 22 nukleotida direktnih ponovaka. Isto tako, Cpf1 može koristiti T-bogat protospejser-susedni motiv, tako da Cpf1-crRNA kompleksi efikasno cepaju ciljnu DNA delujući preko kratkog T-bogatog PAM, što je suprotno G-bogatom PAM koji deluje na ciljnu DNA u Tip II sistemima. Tako, Tip V sistemi cepaju u tački koja je udaljena od PAM, dok Tip II sistemi cepaju u tački koja je susedna PAM. Sem toga, suprotno Tip II sistemima, Cpf1 cepa DNA preko raspoređenih DNA dvolančanih odlomaka sa 4 ili 5 nukleotida 5’ koji su iznad. Tip II sistemi cepaju preko otvorenog dvolančanog odlomka. Slično Tip II sistemima, Cpf1 sadrži predviđeni RuvC-sličan endonukleazni domen, ali nema drugi HNH endonukleazni domen, što je suprotno Tip II sistemima.

Cas geni/polipeptidi i protospejser susedni motivi

[0122] Primeri CRISPR/Cas polipeptida uključuju Cas9 polipeptide na Slici 1 od Fonfara et al., Nucleic Acids Research, 42: 2577-2590 (2014). Sistem dodeljivanja naziva CRISPR/Cas gena podlegao je intenzivnoj preradi otkad su otkriveni Cas geni. Slika 5 od Fonfara, supra, prikazuje PAM sekvence za Cas9 polipeptide različitih vrsta.

Položajno usmereni polipeptidi

[0123] Položajno usmereni polipeptid je nukleaza koja se koristi u editovanju genoma radi cepanja DNA. Položajno usmerena nukleaza ili polipeptid se može primeniti u ćeliju ili pacijentu u vidu ili: jednog ili više polipeptida, ili jedne ili više mRNAs koje kodiraju polipeptid.

[0124] U kontekstu sistema CRISPR/Cas ili CRISPR/Cpf1, položajno usmereni polipeptid se vože vezati za vodeću RNA tako da se zauzvrat precizira položaj u ciljnoj DNA na koji je polipeptid usmeren. U sistemima CRISPR/Cas ili CRISPR/Cpf1 koji su ovde izloženi, položajno usmereni polipeptid može biti endonukleaza, kao što je DNA endonukleaza.

[0125] Položajno usmereni polipeptid može imati mnoštvo domena cepanja nukleinske kiseline (tj., nukleaza). Dva ili više domena cepanja nukleinske kiseline mogu biti međusobno povezana preko linkera. Na primer, linker može obuhvatiti fleksibilni linker. Linkeri mogu u svojoj dužini imati 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40 ili više amino kiselina.

[0126] Divlji tip Cas9 enzima koji se prirodno javlja sadrži dva nukleazna domena, HNH nukleazni domen i RuvC domen. Ovde, "Cas9" se odnosi i na prirodni i rekombinovani Cas9s. Cas9 enzimi koji su ovde razmatrani mogu imati HNH ili HNH-sličan nukleazni domen, i/ili RuvC ili RuvC-sličan nukleazni domen.

[0127] HNH ili HNH-slični domeni sadrže McrA-sličan fold (savijutak, prim. prev.). HNH ili HNH-slični domeni sadrže dva antiparalelna b-lanca i a-heliks. HNH ili HNH-slični domeni sadrže položaj za vezivanje metala (npr., položaj vezivanja dvovalentnog katjona). HNH ili HNH-slični domeni mogu cepati jedan lanac ciljne nukleinske kiseline (npr., komplementaran lanac crRNA ciljni lanac).

[0128] RuvC ili RuvC-slični domeni sadrže RNaseH ili RnaseH-sličan fold. RuvC/RnaseH domeni su upleteni u različit set nukleinsko kiselinsko-zasnovanih funkcija uključujući delovanje i na RNA i na DNA. RnaseH domen sadrži 5 β-lanaca okruženih sa mnoštvom α-heliksa. RuvC/RnaseH ili RuvC/RnaseH-slični domeni sadrže položaj za vezivanje metala (npr., vezujući položaj dvovalentnog katjona). RuvC/RnaseH ili RuvC/RnaseH-slični domeni mogu cepati jedan lanac ciljne nukleinske kiseline (npr., nen-komplementaran lanac dvolančane ciljne DNA).

[0129] Položajno usmereni polipeptidi mogu uvesti dvolančane odlomke ili jednolančane odlomke u nukleinske kiseline, npr., genomsku DNA. Dvolančani odlomak može stimulisati ćelijske endogene obrasce DNA-popravka (npr., homologno-zavisni popravak (HDR) ili NHEJ ili alternativna ne-homologna spajanja krajeva (A-NHEJ) ili mikrohomologno-posredovana spajanja krajeva (MMEJ)). NHEJ može popraviti presečenu ciljnu nukleinsku kiselinu bez neophodnog homolognog templata. Ovo nekad može dovesti do malih delecija ili insercija (indela) u ciljnoj nukleinskoj kiselini na položaju cepanja, i može dovesti do prekida ili izmene genske ekspresije. HDR se može javiti kada postoji homologni templat za popravak, ili donor. Homologni donorski templat može sadržavati sekvence koje su homologne sa sekvencama koje ojačavaju položaj cepanja ciljne nukleinske kiseline. Ćelija može koristiti sestrinsku hromatidu kao templat za popravak. Međutim, za svrhe editovanja genoma, templat za popravku može se obezbediti u vidu egzogene nukleinske kiseline, kao što je plazmid, dupleks oligonukleotid, jednolančani oligonukleotid ili virusna nukleinska kiselina. Sa egzogenim donorskim templatima, mogu se između ojačavajućih regiona homologije uneti dodatne nukleinsko kiselinske sekvence (kao što su transgene) ili modifikacija (kao što je izmena ili delecija jedne ili više baza) tako da dodatne ili izmenjene nukleinsko kiselinske sekvence takođe postaju inkorporirane u ciljni lokus. MMEJ može proizvesti genetički ishod sličan onome kod NHEJ u tome da se mogu javiti male delecije i insercije na položaju cepanja. MMEJ može iskoristiti homologne sekvence od nekoliko baznih parova koje su bočno uz položaj cepanja da bi se izvršilo usmeravanje na željeni ishod popravke spajanja DNA krajeva. U nekim slučajevima, moguće je predvideti verovatnost ishoda popravke na osnovu analize potencijalnih mikrohomologija u ciljnim regionima nukleaza.

[0130] Tako, u nekim slučajevima, može se primeniti homologna rekombinacija za inserciju egzogene polinukleotidne sekvence u položaj cepanja ciljne nukleinske kiseline. Egzogena polinukleotidna sekvenca se naziva donorski polinukleotid (ili donor ili donorska sekvenca). Donorski polinukleotid, deo donorskog polinukleotida, kopija donorskog polinukleotida, ili deo kopije donorskog polinukleotida može biti insertovan u položaj cepanja ciljne nukleinske kiseline. Donorski polinukleotid može biti egzogena polinukleotidna sekvenca, tj., sekvenca koja se u prirodi ne javlja na položaju cepanja ciljne nukleinske kiseline.

[0131] Modifikacije ciljne DNA zbog NHEJ i/ili HDR mogu dovesti do, na primer, mutacija, delecija, izmena, integracija, ispravke gena, zamene gena, obeležavanja gena, transgenske insercije, delecije nukleotida, prekidanja gena, translokacija i/ili mutacije gena. Procesi delecije genomske DNA i integracije ne-prirodne nukleinske kiseline u genomsku DNA su primeri editovanja genoma.

[0132] Položajno usmereni polipeptid može imati aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 10%, najmanje 15%, najmanje 20%, najmanje 30%, najmanje 40%, najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 99%, ili 100% identiteta aminokiselinske sekvence sa primerom divljeg tipa položajno usmerenog polipeptida [npr., Cas9 iz S. pyogenes, US2014/0068797 Sequence ID No. 8 ili Sapranauskas et al., Nucleic Acids Res, 39(21): 9275-9282 (2011)], i različitim drugim položajno usmerenim polipeptidima. Položajno usmereni polipeptid može imati najmanje 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 99, ili 100% identiteta sa divljim tipom položajno usmerenog polipeptida (npr., Cas9 iz S. pyogenes, supra) duž 10 susednih amino kiselina. Položajno usmereni polipeptid može imati najviše: 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 99, ili 100% identiteta sa divljim tipom položajno usmerenog polipeptida (npr., Cas9 iz S. pyogenes, supra) duž 10 susednih amino kiselina. Položajno usmereni polipeptid može imati najmanje: 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 99, ili 100% identiteta sa divljim tipom položajno usmerenog polipeptida (npr., Cas9 iz S. pyogenes, supra) duž 10 susednih amino kiselina u HNH domenu nukleaze položajno usmerenog polipeptida. Položajno usmereni polipeptid može imati najviše: 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 99, ili 100% identiteta sa divljim tipom položajno usmerenog polipeptida (npr., Cas9 iz S. pyogenes, supra) duž 10 susednih amino kiselina u HNH domenu nukleaze položajno usmerenog polipeptida. Položajno usmereni polipeptid može imati najmanje: 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 99, ili 100% identiteta sa divljim tipom položajno usmerenog polipeptida (npr., Cas9 iz S. pyogenes, supra) duž 10 susednih amino kiselina u RuvC domenu nukleaze položajno usmerenog polipeptida. Položajno usmereni polipeptid može imati najviše: 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 99, ili 100% identiteta sa divljim tipom položajno usmerenog polipeptida (npr., Cas9 iz S. pyogenes, supra) duž 10 susednih amino kiselina u RuvC domenu nukleaze položajno usmerenog polipeptida.

[0133] Položajno usmereni polipeptid može sadržavati modifikovan oblik primera divljeg tipa položajno usmerenog polipeptida. Modifikovani oblik primera divljeg tipa položajno usmerenog polipeptida može sadržavati mutaciju koja dovodi do smanjivanja aktivnosti cepanja nukleinske kiseline položajno usmerenog polipeptida. Modifikovani oblik primera divljeg položajno usmerenog polipeptida može imati manje od 90%, manje od 80%, manje od 70%, manje od 60%, manje od 50%, manje od 40%, manje od 30%, manje od 20%, manje od 10%, manje od 5%, ili manje od 1% aktivnosti cepanja nukleinske kiseline primera divljeg položajno usmerenog polipeptida (npr., Cas9 iz S. pyogenes, supra). Modifikovani oblik položajno usmereneog polipeptida može da nema suštinske aktivnosti cepanja nukleinske kiseline. Kada je položajno usmereni polipeptid u modifikovanom obliku koji nema suštinske aktivnosti cepanja nukleinske kiseline, ovde se označava kao "enzimski inaktivan."

[0134] Modifikovani oblik položajno usmerenog polipeptida može imati takvu mutaciju da ona može indukovati jednolančani odlomak (SSB) na ciljnoj nukleinskoj kiselini (npr., odsecanjem samo jednog šećerno-fosfatnog lanca dvolančane ciljne nukleinske kiseline). Mutacija može dovesti do manje od 90%, manje od 80%, manje od 70%, manje od 60%, manje od 50%, manje od 40%, manje od 30%, manje od 20%, manje od 10%, manje od 5%, ili manje od 1% aktivnosti cepanja nukleinske kiseline u jednom ili više od mnoštva domena cepanja nukleinske kiseline divljeg tipa položajno usmerenog polipeptida (npr., Cas9 iz S. pyogenes, supra). Mutacija može dovesti do toga da jedan ili više od mnoštva domena cepanja nukleinske kiseline zadrže sposobnost cepanja komplementarnog lanca ciljne nukleinske kiseline, ali da imaju smanjenu sposobnost cepanja ne-komplementarnog lanca ciljne nukleinske kiseline. Mutacija može dovesti do toga da jedan ili više od mnoštva domena cepanja nukleinske kiseline zadrže sposobnost cepanja ne-komplementarnog lanca ciljne nukleinske kiseline, ali da imaju smanjenu sposobnost cepanja komplementarnog lanca ciljne nukleinske kiseline. Na primer, ostaci u primerima divljeg tipa S. pyogenes Cas9 polipeptida, kao što su Asp10, His840, Asn854 i Asn856, mutiraju se da bi se inaktivirao jedan ili više od mnoštva domena cepanja nukleinske kiseline (npr., nukleazni domeni). Ostaci koji će biti mutirani mogu odgovarati ostacima Asp10, His840, Asn854 i Asn856 u primerima divljeg tipa S. pyogenes Cas9 polipeptida (npr., kako je određeno poravnanjem sekvence i/ili strukture). Ne-ograničavajući primeri mutacija uključuju D10A, H840A, N854A ili N856A. Stručno lice u ovoj oblasti će shvatiti da mogu biti pogodne i mutacije koje nisu supstitucije alanina.

[0135] D10A mutacija može biti kombinovana sa jednom ili više H840A, N854A, ili N856A mutacijama da bi se proizveo položajno usmereni polipeptid koji je suštinski bez aktivnosti DNA cepanja. H840A mutacija može biti kombinovana sa jednom ili više D10A, N854A, ili N856A mutacije da bi se proizveo položajno usmereni polipeptid koji je suštinski bez aktivnosti DNA cepanja. A N854A mutacija može biti kombinovana sa jednom ili više H840A, D10A, ili N856A mutacije da bi se proizveo položajno usmereni polipeptid koji je suštinski bez aktivnosti DNA cepanja. A N856A mutacija može biti kombinovana sa jednom ili više H840A, N854A, ili D10A mutacije da bi se proizveo položajno usmereni polipeptid koji je suštinski bez aktivnosti DNA cepanja. Položajno usmereni polipeptidi koji sadrže jedan suštinski inaktivan nukleazni domen se označavaju kao "nikaze".

[0136] Varijante nikaze RNA-vodič endonukleaza, na primer Cas9, mogu da se koriste da povećaju specifičnost CRISPR-posredovanog editovanja genoma. Divlji tip Cas9 se uobičajeno vodi pomoću jedne RNA vodilje dizajnirane da se hibridizuje sa specifičnom ~20 nukleotidnom sekvencom u ciljnoj sekvenci (kao što je endogeni genomski lokus). Ipak, može se tolerisati nekoliko nepodudaranja između RNA vodilje i ciljnog lokusa, efektivno smanjujući dužinu neophodne homologije u ciljnom položaju na, na primer, manje kao 13 nt homologije, i na taj način dovodeći do povišene mogućnosti za vezivanje i cepanje dvolančane nukleinske kiseline pomoću CRISPR/Cas9 kompleksa na drugom mestu u ciljnom genomu – što se označava kao off-target cepanje. Zbog toga što varijante nikaze Cas9 svaka seče samo jedan lanac, da bi se kreirao dvolančani odlomak, neophodno je par nikaza blisko vezati i na suprotnim lancima ciljne nukleinske kiseline, čime se stvara par zaseka, što je ekvivalentno dvolančanom odlomku. Ovo zahteva da se dve zasebne RNAs vodilje – jedna za svaku nikazu - moraju blisko vezati i na suprotnim lancima ciljne nukleinske kiseline. Ovaj zahtev suštinski udvostručuje minimum dužine homologije potreban za pojavljivanje dvolančanog odlomka, čime se smanjuje verovatnoća da se događaj dvolančanog cepanja javi bilo gde drugde u genomu, gde su položaji dve RNA vodilje – ukoliko postoje – malo verovatno toliko dovoljno blizu jedan drugom da bi se omogućilo formiranje dvolančanog odlomka. Kako je u struci opisano, nikaze se takođe mogu koristiti za podsticanje HDR u odnosu na NHEJ. HDR se može primeniti za uvođenje odabranih izmena u ciljne položaje u genomu putem primene specifičnih donorskih sekvenci kojima se efikasno posreduju željene izmene.

[0137] Razmotrene mutacije mogu uključiti supstitucije, adicije, i delecije, ili bilo koju njihovu kombinaciju. Mutacija prevodi mutiranu amino kiselinu u alanin. Mutacija prevodi mutiranu amino kiselinu u drugu amino kiselinu (npr., glicin, serin, treonin, cistein, valin, leucin, izoleucin, metionin, prolin, fenilalanin, tirozin, triptofan, asparaginska kiselina, glutaminska kiselina, asparagini, glutamin, histidin, lizin, ili arginin). Mutacija prevodi mutiranu amino kiselinu u ne-prirodnu amino kiselinu (npr., selenometionin). Mutacija prevodi mutiranu amino kiselinu u amino-kiselinske imitatore (npr., fosfo-imitatori). Mutacija može biti konzervativna mutacija. Na primer, mutacija prevodi mutiranu amino kiselinu u amino kiseline slične po veličini, obliku, naelektrisanju, polarnosti, konformaciji, i/ili rotamerima mutiranih amino kiselina (npr., cistein/serin mutacija, lizin/asparagin mutacija, histidin/fenilalanin mutacija). Mutacija može dovesti do pomeranja u okviru čitanja i/ili kreacije prevremenog stop kodona. Mutacije mogu prouzrokovati izmene u regulatornim regionima gena ili lokusima koji utiču na ekspresiju jednog ili više gena.

[0138] Položajno usmereni polipeptid (npr., varijanta, mutiran, enzimski inaktivan i/ili uslovno enzimatski inaktivan položajno usmereni polipeptid) može ciljati nukleinsku kiselinu. Položajno usmereni polipeptid (npr., varijanta, mutiran, enzimski inaktivna i/ili uslovno enzimatski inaktivna endoribonukleaza) može ciljati DNA. Položajno usmereni polipeptid (npr., varijanta, mutiran, enzimski inaktivna i/ili uslovno enzimatski inaktivna endoribonukleaza) može ciljati RNA.

[0139] Položajno usmereni polipeptid može obuhvatati jednu ili više ne-nativnih sekvenci (npr., položajno usmeren polipeptid je fuzioni protein).

[0140] Položajno usmereni polipeptid može imati amino kiselinsku sekvencu koja obuhvata najmanje 15% amino kiselinskog identiteta sa Cas9 iz bakterije (npr., S. pyogenes), domen vezivanja nukleinske kiseline, i dva domena cepanja nukleinske kiseline (tj., HNH domen i RuvC domen).

[0141] Položajno usmereni polipeptid može imati amino kiselinsku sekvencu koja obuhvata najmanje 15% amino kiselinskog identiteta sa Cas9 iz bakterije (npr., S. pyogenes), i dva domena cepanja nukleinske kiseline (tj., HNH domen i RuvC domen).

[0142] Položajno usmereni polipeptid može imati amino kiselinsku sekvencu koja obuhvata najmanje 15% amino kiselinskog identiteta sa Cas9 iz bakterije (npr., S. pyogenes), i dva domena cepanja nukleinske kiseline, pri čemu jedan ili više domena cepanja nukleinske kiseline obuhvata najmanje 50% amino kiselinskog identiteta sa domenom nukleaze iz Cas9 iz bakterije (npr., S. pyogenes).

[0143] Položajno usmereni polipeptid može imati amino kiselinsku sekvencu koja obuhvata najmanje 15% amino kiselinskog identiteta sa Cas9 iz bakterije (npr., S. pyogenes), dva domena cepanja nukleinske kiseline (tj., HNH domen i RuvC domen), i ne-nativnu sekvencu (na primer, jedarni signal lokalizacije) ili linker koji povezuje položajno usmereni polipeptid sa ne-nativnom sekvencom.

[0144] Položajno usmereni polipeptid može imati amino kiselinsku sekvencu koja obuhvata najmanje 15% amino kiselinskog identiteta sa Cas9 iz bakterije (npr., S. pyogenes), dva domena cepanja nukleinske kiseline (tj., HNH domen i RuvC domen), pri čemu položajno usmereni polipeptid sadrži mutaciju u jednom ili u oba domena cepanja nukleinske kiseline koja snižava aktivnost cepanja domena nukleaze za najmanje 50%.

[0145] Položajno usmereni polipeptid može imati amino kiselinsku sekvencu koja obuhvata najmanje 15% amino kiselinskog identiteta sa Cas9 iz bakterije (e.g., S. pyogenes), i dva domena cepanja nukleinske kiseline (tj., HNH domen i RuvC domen), pri čemu jedan od domena nukleaze sadrži mutaciju asparaginske kiseline 10, i/ili pri čemu jedan od domena nukleaze može imati mutaciju histidina 840, i pri čemu mutacija snižava aktivnost cepanja domena nukleaze za najmanje 50%.

[0146] Dva ili više položajno usmerena polipeptida, npr. DNA endonukleaze, mogu imati dve nikaze koje zajedno ostvaruju jedan dvo-lančani prelom na specifičnom lokusu u genomu, ili četiri nikaze koje zajedno ostvaruju ili dovode do dva dvo-lančana preloma na specifičnim položajima u genomu. Alternativno, jedan položajno usmeren polipeptid, npr. DNA endonukleaza, može ostvariti ili dovesti do jednog dvo-lančanog preloma na specifičnom položaju u genomu.

[0147] Položajno usmereni polipeptid može biti zakucan u N-terminus, C-terminus, ili oba, i N-terminus i C-terminus pomoću jednog ili više jedarnih signala lokalizacije (NLSs). Na primer, Cas9 endonukleaza može biti zakucana pomoću dva NLSs, jednog NLS lociranog na N-terminusu i drugog NLS lociranog na C-terminusu. NLS može biti ma koji poznati NLS u ovoj oblasti, kao što je SV40 NLS.

Nukleinska kiselina koja cilja genom

[0148] Ovo izlaganje obezbeđuje nukleinsku kiselinu koja cilja genom koja može usmeriti aktivnosti pridruženog polipeptida (npr., položajno usmereni polipeptid) na specifičnu ciljnu sekvencu unutar ciljne nukleinske kiseline. Nukleinska kiselina koja cilja genom može biti RNA. RNA koja cilja genom je ovde označena kao "RNA vodilja" ili "gRNA". RNA vodilja može da sadrži najmanje spejser sekvencu koja se hibridizuje sa sekvencom od interesa ciljne nukleinske kiseline, i CRISPR ponovak sekvencu. U Tipu II sistema, gRNA takođe sadrži drugu RNA nazvanu tracrRNA sekvenca. U Tipu II RNA vodilja (gRNA), CRISPR ponovak sekvenca i tracrRNA sekvenca hibridizuju se jedna sa drugom kako formiraju dupleks. U Tipu V RNA vodilja (gRNA), crRNA formira dupleks. U oba sistema, dupleks može vezati položajno usmereni polipeptid, tako da RNA vodilja i položajno usmereni polipeptid formiraju kompleks. Nukleinska kiselina koja cilja genom može kompleksu obezbediti ciljnu specifičnost zahvaljujući svojoj povezanosti sa položajno usmerenim polipeptidom. Nukleinska kiselina koja cilja genom na taj način može usmeriti aktivnost položajno usmerenog polipeptida.

[0149] Primeri RNAs vodilja obuhvataju spejser sekvence u SEQ ID NOs: 1 - 71,947 i sgRNA sekvence u SEQ ID NOs: 71,950-71,959 iz liste sekvenci. Kako će stručna lica u ovoj oblasti razumeti, svaka RNA vodilja može biti dizajnirana da uključi spejser sekvencu koja je komplementarna sa svojom ciljnom genomskom sekvencom. Na primer, svaka od spejser sekvenci u SEQ ID NOs: 1 - 71,947 iz liste sekvenci može da se stavi u jednu RNA himeru ili crRNA (zajedno sa odgovarajućom tracrRNA). Vidi: Jinek et al., Science, 337, 816-821 (2012), i Deltcheva et al., Nature, 471, 602-607 (2011) ili Tabelu 1.

[0150] Nukleinska kiselina koja cilja genom može biti dvo-molekularna RNA vodilja. Nukleinska kiselina koja cilja genom može biti jedno-molekularna RNA vodilja.

[0151] Dvo-molekularna RNA vodilja može imati dva lanca RNA. Prvi lanac u smeru 5’ ka 3’ sadrži opcionu spejser produženu sekvencu, spejser sekvencu i minimum CRISPR ponovak sekvencu. Drugi lanac može sadržavati minimum tracrRNA sekvencu (kmplementarna sa minimum CRISPR ponovak sekvencom), 3’ tracrRNA sekvencu i opcionu tracrRNA produženu sekvencu.

[0152] Jednomolekularna RNA vodilja (sgRNA) u Tipu II sistemu može imati, u smeru 5’ ka 3’, opcionu spejser produženu sekvencu, spejser sekvencu, minimum CRISPR ponovak sekvencu, jednomolekularni linker vodič, minimum tracrRNA sekvencu, 3’ tracrRNA sekvencu i opcionu tracrRNA produženu sekvencu. Opcioni tracrRNA produžetak može imati elemente koji doprinose dodatnoj funkcionalnosti (npr., stabilnosti) RNA vodilje. Jednomolekularni linker vodič može povezati minimum CRISPR ponovak i minimum tracrRNA sekvencu kako se formira struktura ukosnice. Opcioni tracrRNA produžetak može imati jednu ili više ukosnica.

[0153] Jednomolekularna RNA vodilja (sgRNA) u Tipu V sistemu može imati, u smeru 5’ ka 3’, minimum CRISPR ponovak sekvencu i spejser sekvencu.

[0154] sgRNA može imati 20-nukleotidnu spejser sekvencu na 5’ kraju sgRNA sekvence. sgRNA može imati spejser sekvencu manju od 20 nukleotida na 5’ kraju sgRNA sekvence. sgRNA može imati spejser sekvencu veću od 20 nukleotida na 5’ kraju sgRNA sekvence. sgRNA može imati promenljivu dužinu spejser sekvence sa 17-30 nukleotida na 5’ kraju sgRNA sekvence (vidi Tabelu 1).

[0155] sgRNA može da ne sadrži uracil na 3’kraju sgRNA sekvence, kao što je to u SEQ ID NO: 71,961 u Tabeli 1. sgRNA može imati jedan ili više uracila na 3’kraju sgRNA sekvence, kao što je to u SEQ ID NO: 71,962 u Tabeli 1. Na primer, sgRNA može imati 1 uracil (U) na 3’ kraju sgRNA sekvence. sgRNA može imati 2 uracila (UU) na 3’ kraju sgRNA sekvence. sgRNA može imati 3 uracila (UUU) na 3’ kraju sgRNA sekvence. sgRNA može imati 4 uracila (UUUU) na 3’ kraju sgRNA sekvence. sgRNA može imati 5 uracila (UUUUU) na 3’ kraju sgRNA sekvence. sgRNA može imati 6 uracila (UUUUUU) na 3’ kraju sgRNA sekvence. sgRNA može imati 7 uracila (UUUUUUU) na 3’ kraju sgRNA sekvence. sgRNA može imati 8 uracila (UUUUUUUU) na 3’ kraju sgRNA sekvence.

[0156] sgRNA može biti nemodifikovana ili modifikovana. Na primer, modifikovane sgRNAs mogu sadržavati jedan ili više 2’-O-metil fosforotioatnih nukleotida.

Tabela 1

[0157] Radi ilustracije, RNAs vodilje, korišćene u CRISPR/Cas/Cpf1 sistemu, ili druge manje RNAs se mogu jednostavno sintetisati hemijskim načinima, kako je ilustrovano u nastvaku i opisano u struci. Dok se hemijske procedure sinteze neprekidno proširuju, prečišćavanja ovakvih RNAs postupcima, kao što je tečna hromatografija visokih performansi (HPLC, koja ukida upotrebu gelova, kao što je PAGE) ima tendenciju da postane još izazivnija kako dužine polinukleotida rastu značajno preko stotinu ili toliko nukleotida. Jedan pristup koji je korišćen za stvaranje RNAs većih dužina je taj da se proizvedu dva ili više molekula koji se povezuju zajedno. Mnogo duže RNAs, kao što su one koje kodiraju Cas9 ili Cpf1 endonukleazu, lakše se generišu enzimatski. Različite vrste RNA modifikacija se mogu uvesti tokom ili nakon hemijske sinteze i/ili enzimskog generisanja RNAs, npr., modifikacije koje povećavaju stabilnost, smanjuju verovatnoću ili stepen urođenog imunog odgovora, i/ili povećavaju druge osobine, kako je opisano u struci.

Spejser produžena sekvenca

[0158] U nekim primerima nukleinskih kiselina koje ciljaju genom, spejser produžena sekvenca može modifikovati aktivnost, obezbediti stabilnost i/ili obezbediti lokaciju za modifikacije nukleinske kiseline koja cilja genom. Spejser produžena sekvenca može modifikovati on- ili off-target aktivnost ili specifičnost. U nekim primerima, može biti obezbeđena spejser produžena sekvenca. Spejser produžena sekvenca može imati dužinu veću od 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, ili 7000 ili više nukleotida. Spejser produžena sekvenca može imati dužinu manju od 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000 ili više nukleotida. Spejser produžena sekvenca može biti manja od 10 nukleotida dužine. Spejser produžena sekvenca može biti između 10-30 nukleotida dužine. Spejser produžena sekvenca može biti između 30-70 nukleotida dužine.

[0159] Spejser produžena sekvenca može sadržavati još jedan deo (npr., sekvencu kontrole stabilnosti, sekvencu vezivanja endoribonukleaze, ribozim). Deo može smanjiti ili povećati stabilnost nukleinske kiseline koja cilja nukleinsku kiselinu. Deo može biti transkripcioni terminator segment (tj., sekvenca završetka transkripcije). Deo može funkcionisati u eukariotskoj ćeliji. Deo može funkcionisati u prokariotskoj ćeliji. Deo može funkcionisati i u eukariotskoj i u prokariotskoj ćeliji. Primeri pogodnih delova, bez ograničavanja na ove, uključuju: 5’ cap (npr., 7-metilgvanilat cap (m7 G)), “riboswitch” sekvencu (npr., da bi se omogućila regulisana stabilnost i/ili regulisana pristupačnost pomoću proteina i proteinskih kompleksa), sekvencu koja formira dsRNA dupleks (tj., ukosnica), sekvencu koja cilja RNA do subćelijske lokacije (npr., nukleus, mitohondrije, hloroplasti, i slično), modifikaciju ili sekvencu predviđenu za obeležavanje (npr., direktna konjugacija sa fluorescentnim molekulom, konjugacija sa delom koji olakšava fluorescentno otkrivanje, sekvenca koja omogućava fluorescentno otkrivanje, itd.), i/ili modifikaciju ili sekvencu koja obezbeđuje mesto vezivanja za proteine (npr., proteine koji deluju na DNA, uključujući transkripcione aktivatore, transkripcione kontrole, DNA metiltransferaze, DNA demetilaze, histon acetiltransferaze, histon deacetilaze, i slične).

Spejser sekvenca

[0160] Spejser sekvenca se hibridizuje sa sekvencom od inetersa u ciljnoj nukleinskoj kiselini. Spejser nukleinske kiseline koja cilja genom može međusobno reagovati sa ciljnom nukleinskom kiselinom na sekvencno-specifičan način putem hibridizacije (tj., sparivanjem baza). Nukleotidna sekvenca spejsera može varirati u zavisnosti od sekvence od interesa ciljne nukleinske kiseline.

[0161] U ovdašnjem CRISPR/Cas sistemu, spejser sekvenca može biti namenjena da hibridizuje ciljnu nukleinsku kiselinu koja je locirana 5’ PAM Cas9 enzima koji se koristi u sistemu. Spejser se može savršeno spariti sa ciljnom sekvencom ili može imati promašaje. Svaki Cas9 enzim ima posebnu PAM sekvencu koja se prepoznaje u ciljnoj DNA. Na primer, S. pyogenes prepoznaje u ciljnoj nukleinskoj kiselini PAM koji sadrži sekvencu 5’-NRG-3’, gde R obuhvata ili A ili G, gde je N bilo koji nukleotid i N je neposredno 3’ u sekvenci ciljne nukleinske kiseline koju cilja spejser sekvenca.

[0162] Sekvenca ciljne nukleinske kiseline može imati 20 nukleotida. Ciljna nukleinska kiselina može imati manje od 20 nukleotida. Ciljna nukleinska kiselina može imati više od 20 nukleotida. Ciljna nukleinska kiselina može imati najmanje: 5, 10, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30 ili više nukleotida. Ciljna nukleinska kiselina može imati ne više od: 5, 10, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30 ili više nukleotida. Ciljna nukleinska kiselina može imati 20 baza neposredno 5’ prvog nukleotida PAM. Na primer, u sekvenci koja obuhvata 5’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNRG-3’ (SEQ ID NO: 71,948), ciljna nukleinska kiselina može imati sekvencu koja odgovara Ns, pri čemu je N ma koji nukleotid, a podvučena NRG sekvenca je S. pyogenes PAM.

[0163] Spejser sekvenca koja hibridizuje u ciljnu nukleinsku kiselinu može imati dužinu od bar otprilike 6 nukleotida (nt). Spejser sekvenca može biti dužine od bar otprilike 6 nt, od bar otprilike 10 nt, od bar otprilike 15 nt, od bar otprilike 18 nt, od bar otprilike 19 nt, od bar otprilike 20 nt, od bar otprilike 25 nt, od bar otprilike 30 nt, od bar otprilike 35 nt ili od bar otprilike 40 nt, od oko 6 nt do otprilike 80 nt, od oko 6 nt do otprilike 50 nt, od oko 6 nt do otprilike 45 nt, od oko 6 nt do otprilike 40 nt, od oko 6 nt do otprilike 35 nt, od oko 6 nt do otprilike 30 nt, od oko 6 nt do otprilike 25 nt, od oko 6 nt do otprilike 20 nt, od oko 6 nt do otprilike 19 nt, od oko 10 nt do otprilike 50 nt, od oko 10 nt do otprilike 45 nt, od oko 10 nt do otprilike 40 nt, od oko 10 nt do otprilike 35 nt, od oko 10 nt do otprilike 30 nt, od oko 10 nt do otprilike 25 nt, od oko 10 nt do otprilike 20 nt, od oko 10 nt do otprilike 19 nt, od oko 19 nt do otprilike 25 nt, od oko 19 nt do otprilike 30 nt, od oko 19 nt do otprilike 35 nt, od oko 19 nt do otprilike 40 nt, od oko 19 nt do otprilike 45 nt, od oko 19 nt do otprilike 50 nt, od oko 19 nt do otprilike 60 nt, od oko 20 nt do otprilike 25 nt, od oko 20 nt do otprilike 30 nt, od oko 20 nt do otprilike 35 nt, od oko 20 nt do otprilike 40 nt, od oko 20 nt do otprilike 45 nt, od oko 20 nt do otprilike 50 nt, ili od oko 20 nt do otprilike 60 nt. U nekim primerima, spejser sekvenca može imati 20 nukleotida. U nekim primerima, spejser može imati 19 nukleotida.

[0164] U nekim primerima, procenat komplementarnosti između spejser sekvence i ciljne nukleinske kiseline je najmanje oko 30%, najmanje oko 40%, najmanje oko 50%, najmanje oko 60%, najmanje oko 65%, najmanje oko 70%, najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 97%, najmanje oko 98%, najmanje oko 99%, ili 100%. U nekim primerima, procenat komplementarnosti između spejser sekvence i ciljne nukleinske kiseline je ne veći od otprilike 30%, ne veći od otprilike 40%, ne veći od otprilike 50%, ne veći od otprilike 60%, ne veći od otprilike 65%, ne veći od otprilike 70%, ne veći od otprilike 75%, ne veći od otprilike 80%, ne veći od otprilike 85%, ne veći od otprilike 90%, ne veći od otprilike 95%, ne veći od otprilike 97%, ne veći od otprilike 98%, ne veći od otprilike 99%, ili 100%. U nekim primerima, procenat komplementarnosti između spejser sekvence i ciljne nukleinske kiseline je 100% nad šest graničnih većinom 5’ nukleotida ciljne sekvence komplementarnog lanca ciljne nukleinske kiseline. Procenat komplementarnosti između spejser sekvence i ciljne nukleinske kiseline može biti bar 60% nad otprilike 20 graničnih nukleotida. Dužine spejser sekvence i ciljne nukleinske kiseline se mogu razlikovati za 1 do 6 nukleotida, što se može smatrati ispupčenjem ili izbočinama (engl., "bulge").

[0165] Spejser sekvenca se može osmisliti ili izabrati korišćenjem kompjuterskog programa. Kompjuterski program može koristiti promenljive, kao što su predviđena temperatura topljenja, formiranje sekundarne strukture, predviđena temperatura žarenja, identitet sekvence, genomski kontekst, hromatinska pristupačnost, % GC, učestalost genomskog pojavljivanja (npr., sekvenci koje su identične ili slične ali variraju u jednoj ili više tačaka kao rezultat neusklađenosti, insercije ili delecije), metilacioni status, prisustvo SNPs, i slično.

Minimalna CRISPR ponavljajuća sekvenca

[0166] Minimalna CRISPR ponavljajuća sekvenca može biti sekvenca sa najmanje oko 30%, oko 40%, oko 50%, oko 60%, oko 65%, oko 70%, oko 75%, oko 80%, oko 85%, oko 90%, oko 95% ili oko 100% istovetnosti skvence u odnosu na referentnu CRISPR ponavljajuću sekvencu (npr., crRNA iz S. pyogenes).

[0167] Minimalna CRISPR ponavljajuća sekvenca može sadržavati nukleotide koji se mogu podvrgnuti hibridizaciji sa minimalnom tracrRNA sekvencom u ćeliji. Minimalna CRISPR ponavljajuća sekvenca i minimalna tracrRNA sekvenca mogu formirati dupleks, tj., dvostruko savijenu strukturu sa sparenim bazama. Zajedno, minimalna CRISPR ponavljajuća sekvenca i minimalna tracrRNA sekvenca, mogu se vezivati za polipeptid usmeren na položaj. Najmanje deo minimalne CRISPR ponavljajuće sekvence može biti izložen hibridizaciji za minimalnu tracrRNA sekvencu. Barem deo minimalne CRISPR ponavljajuće sekvence može uključivati najmanje oko 30%, oko 40%, oko 50%, oko 60%, oko 65%, oko 70%, oko 75%, oko 80%, oko 85%, oko 90%, oko 95% ili oko 100% komplementarnosti u odnosu na minimalnu tracrRNA sekvencu. Barem deo minimalne CRISPR ponavljajuće sekvence može uključivati najviše oko 30%, oko 40%, oko 50%, oko 60%, oko 65%, oko 70%, oko 75%, oko 80%, oko 85%, oko 90%, oko 95% ili oko 100% komplementarnosti u odnosu na minimalnu tracrRNA sekvencu.

[0168] Dužina minimalne CRISPR ponavljajuće sekvence može biti od oko 7 nukleotida do oko 100 nukleotida. Na primer, dužina minimalne CRISPR ponavljuće sekvence kreće se od oko 7 nukleotida (nt) do oko 50 nt, od oko 7 nt do oko 40 nt, od oko 7 nt do oko 30 nt, od oko 7 nt do oko 25 nt, od oko 7 nt do oko 20 nt, od oko 7 nt do oko 15 nt, od oko 8 nt do oko 40 nt, od oko 8 nt do oko 30 nt, od oko 8 nt do oko 25 nt, od oko 8 nt do oko 20 nt, od oko 8 nt do oko 15 nt, od oko 15 nt do oko 100 nt, od oko 15 nt do oko 80 nt, od oko 15 nt do oko 50 nt, od oko 15 nt do oko 40 nt, od oko 15 nt do oko 30 nt ili od oko 15 nt do oko 25 nt. U nekim primerima, minimalna CRISPR ponavljajuća sekvenca može biti dužine od približno 9 nukleotida u nizu. Minimalna CRISPR ponavljajuća sekvenca može sadržavati približno 12 nukleotida po dužini.

[0169] Minimalna CRISPR ponavljajuća sekvenca može posedovati najmanje oko 60% identičnosti u odnosu na referentnu minimalnu CRISPR ponavljajuću sekvencu (npr., crRNA divljeg tipa iz S. pyogenes) preko raspona od najmanje 6, 7 ili 8 susednih nukleotida. Na primer, minimalna CRISPR ponavljajuće sekvenca može posedovati najmanje oko 65% identičnosti, najmanje oko 70% identičnosti, najmanje oko 75% identičnosti, najmanje oko 80% identičnosti, najmanje oko 85% identičnosti, najmanje oko 90% identičnosti, najmanje oko 95% identičnosti, najmanje oko 98% identičnosti, najmanje oko 99% identičnosti ili 100% identičnosti u odnosu na referentnu minimalnu CRISPR ponavljajuću sekvencu preko raspona od najmanje 6, 7 ili 8 susednih nukleotida.

Minimalna tracrRNA sekvenca

[0170] Minimalna tracrRNA sekvenca može biti sekvenca sa najmanje oko 30%, oko 40%, oko 50%, oko 60%, oko 65%, oko 70%, oko 75%, oko 80%, oko 85%, oko 90%, oko 95% ili 100% identiteta sekvence u odnosu na referentnu tracrRNA sekvencu (npr., tracrRNA divljeg tipa iz S. pyogenes).

[0171] Minimalna tracrRNA sekvenca može sadržavati nukleotide, koji podležu hibridizaciji sa minimalnom CRISPR ponavljajućom sekvencom u ćeliji. Minimalna tracrRNA sekvenca i minimalna CRISPR ponavljajuća sekvenca obrazuju dupleks, tj., dvostruko savijenu strukturu sa sparenim bazama. Zajedno, minimalna tracrRNA sekvenca i minimalna CRISPR ponavljajuća sekvenca mogu se vezivati za polipeptid usmeren na položaj. Najmanje deo minimalne tracrRNA sekvence može podleći hibridizaciji sa minimalnom CRISPR ponavljajućom sekvencom. Minimalna tracrRNA sekvenca može posedovati najmanje oko 30%, oko 40%, oko 50%, oko 60%, oko 65%, oko 70%, oko 75%, oko 80%, oko 85%, oko 90%, oko 95% ili 100% komplementarnosti u odnosu na minimalnu CRISPR ponavljajuću sekvencu.

[0172] Minimalna tracrRNA sekvenca može imati dužinu od približno 7 nukleotida do približno 100 nukleotida. Na primer, minimalna tracrRNA sekvenca može biti dužine od približno 7 nukleotida (nt) do približno 50 nt, od oko 7 nt do oko 40 nt, od oko 7 nt do oko 30 nt, od približno 7 nt do približno 25 nt, od oko 7 nt do oko 20 nt, od približno 7 nt do približno 15 nt, od oko 8 nt do oko 40 nt, od približno 8 nt do približno 30 nt, od oko 8 nt do oko 25 nt, od oko 8 nt do oko 20 nt, od približno 8 nt do približno 15 nt, od oko 15 nt do oko 100 nt, od oko 15 nt do oko 80 nt, od približno 15 nt do približno 50 nt, od približno 15 nt do približno 40 nt, od oko 15 nt do oko 30 nt ili od približno 15 nt do približno 25 nt. Dužina minimalne tracrRNA sekvence može biti približno 9 nukleotida u nizu. Dužina minimalne tracrRNA sekvence može biti približno 12 nukleotida. Minimalnu tracrRNA mogu sačinjavati tracrRNA nt 23-48, koji su opisani, prethodno, u Jinek i saradnici.

[0173] Minimalna tracrRNA sekvenca može posedovati najmanje oko 60% identičnosti u odnosu na referentnu minimalnu tracrRNA (npr., tracrRNA divljeg tipa iz S. pyogenes) sekvencu, tokom raspona od najmanje 6, 7 ili 8 susednih nukleotida. Na primer, minimalna tracrRNA sekvenca može biti približno 65% identična, približno 70% identična, približno 75% identična, približno 80% identična, približno 85% identična, približno 90% identična, približno 95% identična, približno 98% identična, približno 99% identična ili 100% identična u odnosu na referentnu minimalnu tracrRNA sekvencu tokom raspona od najmanje 6, 7 ili 8 susednih nukleotida.

[0174] Dupleks između minimalne CRISPR RNA i minimalne tracrRNA može sadržavati dvostruki heliks. Dupleks između minimalne CRISPR RNA i minimalne tracrRNA može sadržavati najmanje oko 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 ili više nukleotda. Dupleks između minimalne CRISPR RNA i minimalne tracrRNA može sadržavati najviše oko 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 ili više nukleotida.

[0175] Dupleks može sadržavati nepodudarnosti ili mismatch (tj., dva struka dupleksa nisu 100% komplementarna). Dupleks može sadržavati najmanje oko 1, 2, 3, 4 ili 5 nepodudarnosti. Dupleks može sadržavati najviše oko 1, 2, 3, 4 ili 5 nepodudarnosti. Dupleks može sadržavati ne više od 2 nepodudarnosti.

Ispupčenja

[0176] U nekim slučajevima, u dupleksu između minimalne CRISPR RNA i minimalne tracrRNA može postojati ispupčenje. Ispupčenje predstavlja region nesparenih nukleotida unutar dupleksa. Ispupčenje može doprineti vezivanju dupleksa za polipeptid, usmeren ka položaju. Ispupčenje može sadržavati, sa jedne strane dupleksa, nespareni 5’-XXXY-3’, pri čemu je X bilo koji purin, a Y sadrži nukleotid koji može obrazovati klimajući, nestabilni, par sa nukleotidom na suprotnom struku, i region nesparenih nukleotida na drugoj strani dupleksa. Broj nesparenih nukleotida na dve strane dupleksa može se razlikovati.

[0177] U jednom primeru, ispupčenje može sadržavati nespareni purin (npr., adenin) na strani minimalnog CRISPR ponavljajućeg struka na ispupčenju. U nekim primerima, ispupčenje može sadržavati nespareni 5’-AAGY-3’ minimalne tracrRNA sekvence struka ispupčenja, pri čemu Y sadrži nukleotid, može obrazovati klimajući, nestabilni, par sa nukleotidom na struku minimalne CRISPR ponavljajuće sekvence.

[0178] Ispupčenje na strani dupleksa sa minimalnom CRISPR ponavljajućom sekvencom može sadržavati najmanje 1, 2, 3, 4 ili 5, ili više nesparenih nukleotida. Ispupčenje na strani dupleksa sa minimalnom CRISPR ponavljajućom sekvencom može sadržavati najviše 1, 2, 3, 4 ili 5, ili više nukleotida. Ispupčenje na strani dupleksa sa minimalnom CRISPR ponavljajućom sekvencom može sadržavati 1 nespareni nukleotid.

[0179] Ispupčenje na strani dupleksa sa minimalnom tracrRNA sekvencom može sadržavati najmanje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10, ili više nesparenih nukleotida. Ispupčenje na strani dupleksa sa minimalnom tracrRNA sekvencom može sadržavati najviše 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10, ili više nesparenih nukleotida. Ispupčenje na drugoj strani dupleksa (npr., strana dupleksa sa minimalnom tracrRNA sekvencom) može sadržavati 4 nesparena nukleotida.

[0180] Ispupčenje može sadržavati najmanje jedno klimajuće, nestabilno sparivanje. U nekim primerima, Ispupčenje može uključivati najviše jedno klimajuće nestabilno sparivanje. Ispupčenje može sadržavati najmanje jedan purinski nukleotid. Ispupčenje može sadržavati najmanje 3 purinska nukleotida. Sekvenca ispupčenja može sadržavati najmanje 5 purinskih nukleotida. Sekvenca ispupčenja može sadržavati najmanje jedan gvaninski nukleotid. U nekim primerima, sekvenca ispupčenja može sadržavati najmanje jedan adeninski nukleotid.

Ukosnice

[0181] U raznim primerima, jedna ili više ukosnica mogu biti locirana na 3’ u odnosu na minimalnu tracrRNA u 3’ tracrRNA sekvenci.

[0182] Ukosnica može započeti na najmanje oko 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 ili 20 ili više nukleotida 3’ u odnosu na poslednji spareni nukleotid u dupleksu, koji čine minimalna CRISPR ponavljajuća sekvenca i minimalna tracrRNA sekvenca. Ukosnica može započeti na najviše na oko 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10, ili više nukleotida 3’ na poslednjem sparenom nukleotidu u dupleksu koji čine minimalna CRISPR ponavljajuća sekvenca i minimalna tracrRNA sekvenca.

[0183] Ukosnica imože sadržavati najmanje oko 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 ili 20 ili više uzastopnih nukleotida. Ukosnica može sadržavati najviše oko 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 ili više uzasopnih nukleotida.

[0184] Ukosnica može sadržavati CC dinukleotid (tj., dva uzastopna citozinska nukleotida).

[0185] Ukosnica može uključivati nukleotide vezane u dupleks (npr., nukleotidi u ukosnici, povezani zajedno hibridizacijom). Na primer, ukosnica može sadržavati CC dinukleotid, koji je hibridizovan sa GG dinukleotidom u dupleksu ukosnice 3’ tracrRNA sekvence.

[0186] Jedna ili više ukosnica može ulaziti u interakciju sa vodećim regionima sa interakcijom na RNA na polipeptidom, usmerenim ka položaju.

[0187] U nekim primerima, postoje dve ili više ukosnica, a u drugim primerima, postoje tri ili više ukosnica.

3’ tracrRNA sekvenca

[0188] 3’ tracrRNA sekvenca može sadržavati sekvencu sa najmanje oko 30%, oko 40%, oko 50%, oko 60%, oko 65%, oko 70%, oko 75%, oko 80%, oko 85%, oko 90%, oko 95% ili 100% identiteta sekvence u odnosu na referenrnu tracrRNA sekvencu (npr., tracrRNA iz S. pyogenes).

[0189] Dužina 3’ tracrRNA sekvense može se kretati od oko 6 nukleotida do oko 100 nukleotida. Na primer, dužina 3’ tracrRNA sekvence može se kretati od približno 6 nukleotida (nt) do približno 50 nt, od oko 6 nt do oko 40 nt, od oko 6 nt do oko 30 nt, od oko 6 nt do približno 25 nt, od oko 6 nt do oko 20 nt, od približno 6 nt do oko 15 nt, od oko 8 nt do oko 40 nt, od približno 8 nt do približno 30 nt, od oko 8 nt do oko 25 nt, od oko 8 nt do približno 20 nt, od oko 8 nt do oko 15 nt, od oko 15 nt do približno 100 nt, od oko 15 nt do oko 80 nt, od oko 15 nt do približno 50 nt, od oko 15 nt do približno 40 nt, od oko 15 nt do približno 30 nt ili od oko 15 nt do približno 25 nt.3’ tracrRNA sekvenca može imati dužinu od približno 14 nukleotida.

[0190] 3’ tracrRNA sekvenca može posedovati najmanje oko 60% identičnosti u odnosu na referentnu 3’ tracrRNA sekvencu (npr., 3’ tracrRNA sekvenca divljeg tipa iz S. pyogenes) tokom raspona od najmanje 6, 7 ili 8 susednih nukleotida. Na primer, 3’ tracrRNA sekvenca poseduje najmanje oko 60% identičnosti, oko 65% identičnosti, oko 70% identičnosti, oko 75% identičnosti, oko 80% identičnosti, oko 85% identičnosti, oko 90% identičnosti, približno 95% identičnosti, približno 98% identičnosti, približno 99% identičnosti ili 100% identičnosti u odnosu na referentnu 3’ tracrRNA sekvencu (npr., 3’ tracrRNA sekvenca divljeg tipa iz S. pyogenes) tokom raspona od najmanje 6, 7 ili 8 uzastopnih nukleotida.

[0191] 3’ tracrRNA sekvenca može sadržavati više od jednog regiona spojenog u dupleks (npr., ukosnica, hibridizovani region). 3’ tracrRNA sekvenca može sadržavati dva regiona, spojena u dupleks.

[0192] 3’ tracrRNA sekvenca može sadržavati strukturu matične petlje. Struktura matične petlje u 3’ tracrRNA može uključivati najmanje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 ili 20 ili više nukleotida. Struktura matične petlje u 3’ tracrRNA može sadržavati najviše 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 ili više nukleotida. Struktura matične petlje može sadržavati funkcionalni deo. Na primer, struktura matične petlje može sadržavati aptamer, ribozim, ukosnicu sa interakcijom sa proteinom, CRISPR arej, intron ili egzon. Struktura matične petlje može sadržavati najmanje oko 1, 2, 3, 4 ili 5 ili više funkcionalnih delova. Struktura matične petlje može sadržavati najviše oko 1, 2, 3, 4 ili 5 ili više funkcionalnih delova.

[0193] Ukosnica u 3’ tracrRNA sekvenci može sadržavati P-domen. U nekim primerima, P-domen može uključivati dvostruko savijeni region u ukosnici.

Ekstenziona sekvenca tracrRNA

[0194] Ekstenziona sekvenca tracrRNA može biti obezbeđena bilo da je tracrRNA u okviru jedno-molekulskih vodilja ili dvo-molekulskih vodilja. Dužina ekstenzione sekvence tracrRNA može se kretati od oko 1 nukleotida do približno 400 nukleotida. Ekstenziona sekvenca tracrRNA može imati dužinu koja je veća od 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 320, 340, 360, 380 ili 400 nukleotida. Dužina ekstenzione sekvence tracrRNA može se kretati od oko 20 do približno 5000 ili više nukleotida. Ekstenziona sekvenca tracrRNA može imati dužinu koja je veća od 1000 nukleotida. Ekstenziona sekvenca tracrRNA može imati dužinu koja je manja od 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 320, 340, 360, 380, 400 ili više nukleotida. Ekstenziona sekvenca tracrRNA može imati dužinu koja je manja od 1000 nukleotida. Ekstenziona sekvenca tracrRNA može sadržavati manje od 10 nukleotida po dužini. Ekstenzionu sekvencu tracrRNA može sačinjavati 10-30 nukleotida po dužini. Ekstenzionu sekvencu tracrRNA može sačinjavati 30-70 nukleotida po dužini.

[0195] Ekstenziona sekvenca tracrRNA može sadržavati funkcionalni deo (npr., kontrolna sekvenca stabilnosti, ribozim, endoribonukleazna vezujuća sekvenca). Funkcionalni deo može sadržavati segment transcripcionog terminatora (tj., sekvencu završetka transkripcije). Funkcionalni deo može imati ukupnu dužinu od oko 10 nukleotida (nt) do približno 100 nukleotida, od oko 10 nt do oko 20 nt, od oko 20 nt do približno 30 nt, od približno 30 nt do približno 40 nt, od približno 40 nt do približno 50 nt, od oko 50 nt do oko 60 nt, od oko 60 nt do oko 70 nt, od oko 70 nt do oko 80 nt, od oko 80 nt do približno 90 nt ili od približno 90 nt do približno 100 nt, od oko 15 nt do oko 80 nt, od oko 15 nt do približno 50 nt, od oko 15 nt do približno 40 nt, od oko 15 nt do približno 30 nt ili od oko 15 nt do oko 25 nt. Funkcionalni deo može vršiti funkciju u eukariotskoj ćeliji. Funkcionalni deo može vršiti funkciju u prokariotskoj ćeliji. Funkcionalni deo može vršiti funkciju i u eukariotskim i u prokariotskim ćelijama.

[0196] Ne-ograničavajući primeri pogodnih ekstenzionih funkcionalnih delova tracrRNA uključuju: 3’ poli-adenilizovani tail, riboswitch sekvencu (npr., kako bi se omogućilo regulisanje stabilnosti i/ili regulisanje pristupa od strane proteina i proteinskih kompleksa), sekvencu koja obrazuje dsRNA dupleks (tj., ukosnicu), sekvencu koja ciljano deluje na RNA na subćelijskoj lokaciji (npr., jedro, mitohondrij, hloroplasti i slično), modifikaciju ili sekvencu koja obezbeđuje praćenje (npr., direktna konjugacija za fluorescentni molekul, konjugacija za deo koji olakšava flurescentnu detekciju, sekvenca koja omogućuje detekciju fluoresceniciju, itd.) i/ili modifikaciju ili sekvencu koja obezbeđuje vezujući položaj za proteine (npr., proteini koji deluju na DNA, uključujući trankcripcione aktivatore, transkripcione kontrole, DNA metiltransferaze, DNA demetilaze, histon acetiltransferaze, histon deacetilaze i slično). Ekstenziona sekvenca tracrRNA može sadržavati vezujući položaj za prajmer ili molekulski indeks (npr., sekvenca barkoda). Ekstenziona sekvenca tracrRNA može sadržavati jedan ili više afinitetskih tagova.

Jedno-molekulska linker sekvenca vodilja

[0197] Linker sekvenca jedno-molekulske vodilje nukleinske kiseline može imati dužinu koja se kreće od oko 3 nukleotida do približno 100 nukleotida. Na primer, jednostavni 4 nukleotidni "tetraloop" (-GAAA-) korišćen je u prethodno navedenom izvoru Jinek et al., Science, 337(6096):816-821 (2012). Ilustrativni linker ima dužinu od oko 3 nukleotida (nt) do približno 90 nt, od oko 3 nt do oko 80 nt, od oko 3 nt do oko 70 nt, od oko 3 nt do oko 60 nt, od oko 3 nt do približno 50 nt, od oko 3 nt do oko 40 nt, od oko 3 nt do približno 30 nt, od oko 3 nt do oko 20 nt, od oko 3 nt do 10 nt. Na primer, linker može imati dužinu koja se kreće od oko 3 nt do oko 5 nt, od oko 5 nt do oko 10 nt, od oko 10 nt do oko 15 nt, od oko 15 nt do oko 20 nt, od oko 20 nt do oko 25 nt, od oko 25 nt do približno 30 nt, od približno 30 nt do približno 35 nt, od približno 35 nt do približno 40 nt, od približno 40 nt do približno 50 nt, od približno 50 nt do oko 60 nt, od oko 60 nt do oko 70 nt, od oko 70 nt do oko 80 nt, od oko 80 nt do približno 90 nt ili od oko približno 90 nt do približno 100 nt. Linker jedno-molekulske vodič nukleinske kiseline može sačinjavati između 4 i 40 nukleotida. Linker može sačinjavati najmanje oko 100, 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500 ili 7000 ili više nukleotida. Linker može sačinjavati najviše oko 100, 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500 ili 7000 ili više nukleotida.

[0198] Linkeri mogu sadržavati bilo koju od brojnih sekvenci, iako, u nekim primerima, linker neće uključivati sekvence koje poseduju ekstenzivne regione homologije sa drugim delovima vodilje RNA, što bi moglo izazvati intramolekulsko vezivanje, koje bi moglo interferirati sa drugim funkcionalnim regionima vodilje. Jednostavna 4 nukleotidna sekvenca -GAAA- korišćena je u prethodno navedenom izvoru Jinek et al., Science, 337(609 6):816-821 (2012), ali i brojne druge sekvence, uključujući i duže sekvence, mogu biti korišćene na isti način.

[0199] Linker sekvenca može sadržavati funkcionalni deo. Primera radi, linker sekvenca može sadržavati jedan ili više karakterističnih delova, koji uključuju aptamer, ribozim, ukosnicu sa interakcijom sa proteinom, položaj vezivanja proteina, CRISPR arej, intron ili egzon. Linker sekvenca može sadržavati najmanje oko 1, 2, 3, 4 ili 5 ili više funkcionalnih delova. U nekim primerima, linker sekvenca može sadržavati najviše oko 1, 2, 3, 4 ili 5 ili više funkcionalnih delova.

[0200] Korak ex vivo postupaka ovog pronalaska može uključivati editovanje specifičnih iPSC ćelija pacijenata, uz korišćenje genomskog inženjeringa. Alternativno, korak ex vivo postupaka ovog pronalaska može uključiti editovanje mezenhimalne matične ćelije ili hematopoetske progenitor ćelije. Isto tako, korak in vivo postupaka ovog pronalaska može uključiti editovanje ćelija pacijenta koji ima hemoglobinopatiju uz korišćenje genomskog inženjeringa. Na sličan način, korak u ćelijskim postupcima ovog pronalaska može uključiti editovanje, ili unutar okvira, ili u blizini, BCL11A gena ili druge sekvence DNA, koja kodira regulatorni element gena BCL11A u humanoj ćeliji, uz pomoć genomskog inženjeringa.

[0201] Različiti pacijenti sa hemoglobinopatijom će, uopšteno, zahtevati različite strategije delecije, modulacije ili inaktivacije. Bilo koja CRISPR endonukleaza može biti korišćena u postupcima ovog pronalaska, pri čemu CRISPR endonukleaza poseduje sopstveni, udruženi, PAM, koji može, ali ne mora biti specifičan u odnosu na bolest. Na primer, spejser sekvence gRNA za ciljano delovanje unutar ili u blizini gena BCL11A ili drugih sekvenci DNA, koje kodiraju regulatorni element gena BCL11A sa CRISPR/Cas9 endonukleazom iz S. pyogenes, utvrđene su u SEQ ID NO: 1- 29,482 sa liste sekvenci. Spejser sekvence gRNA za ciljano delovanje unutar okvira ili u blizini gena BCL11A ili drugih sekvenci DNA, koje kodiraju regulatorni element gena BCL11A sa CRISPR/Cas9 endonukleazom iz S. aureus, utvrđene su u SEQ ID NO: 29,483-32,387 sa liste sekvenci. Spejser sekvence gRNA za ciljano delovanje unutar okvira ili u blizini gena BCL11A ili drugih sekvenci DNA, koje kodiraju regulatorni element gena BCL11A sa CRISPR/Cas9 endonukleazom iz S. thermophilus, identifikovane su u SEQ ID NOs.

32,388-33,420 sa liste sekvenci. Spejser sekvence gRNA za ciljano delovanje unutar okvira ili u blizini gena BCL11 A ili drugih sekvenci DNA, koje kodiraju regulatorni element gena BCL11A sa CRISPR/Cas9 endonukleazom iz T. denticola, identifikovane su u SEQ ID NO. 33,421-33,851 sa liste sekvenci. Spejser sekvence gRNA za ciljano delovanje unutar okvira ili u blizini gena BCL11A ili drugih sekvenci DNA, koje kodiraju regulatorni element gena BCL11A sa CRISPR/Cas9 endonukleazom iz N. meningitides, utvrđene su u SEQ ID NO.33,852-36,731. Spejser sekvence gRNA za ciljano delovanje unutar okvira ili u blizini gena BCL11A ili drugih sekvenci DNA, koje kodiraju regulatorni element gena BCL11A sa CRISPR/Cpf1 endonukleazom iz Acidominococcus, Lachnospiraceae i Franciscella Novicida, utvrđene su u SEQ ID NO.36,732-71,947.

[0202] Primera radi, transkripciona kontrolna sekvenca gena BCL11A može biti modulirana ili inaktivisana posredstvom delecija koje se razvijaju zbog NHEJ puta. NHEJ se može koristiti da bi se izbrisali segmenti transkripcione kontrolne sekvence gena BCL11A, ili direktno, ili posredstvom izmene ukrštenih donorskih ili akceptorskih položaja, putem otcepljivanja, od strane jedne od nekolicine ciljanih pozicija gRNA, ili nekoliko gRNA-a.

[0203] Transkripciona kontrolna sekvenca gena BCL11A, takođe, može biti modulirana ili inktivisana posredstvom umetanja gena BCL11A divljeg tipa ili cDNA, koja sadrži modifikovanu transkripcionu kontrolnu sekvencu. Na primer, donor za modulaciju ili aktiviranje posredstvom HDR sadrži modifikovanu transkripcionu kontrolnu sekvencu gena BCL11A, sa malim ili velikim bočnim kracima homologije, da bi se omogućilo očvršćivanje. HDR je suštinski, mehanizam bez greški, koji koristi obezbeđenu homolognu sekvencu DNA kao templat tokom popravke DSB. Stopa popravke usmerene na homologiju (HDR) je funkcija razdaljine između transkripcione kontrolne sekvence i pozicije reza tako da je od značaja biranje preklapajućih ili najbližih ciljnih položaja. Templati mogu uključiti ekstra sekvence, koje su bočno zaposednute homolognim regionima ili mogu sadržavati sekvencu koja se razlikuje od sekvence genoma, čime se omogućuje editovanje sekvenci.

[0204] Pored moduliranja ili inaktivacije transkripcione kontrolne sekvence gena BCL11A, posredstvom NHEJ ili HDR, moguć je širok raspon drugih opcija. Ukoliko se radi o malim ili velikim delecijama, cDNA može biti ubačena u deo koji sadrži modifikovanu transkripcionu kontrolnu sekvencu. cDNA pune dužine može biti ubačena u bilo koju "sigurnu luku", ali mora biti korišćen obezbeđeni ili drugi promoter. Ukoliko je ova konstrukcija ubačena na ispravnu poziciju, imaće fiziološku kontrolu, sličnu normalnom genu. Za brisanje regiona gena, mogu se koristiti parovi nukleaza, mada bi donoru uglavnom morala biti data mogućnost moduliranja ili inaktivacije funkcije. U ovom slučaju, bila bi obezbeđena dva gRNA i jedna sekvenca donora.

[0205] Neke strategije genomskog inženjeringa uključuju moduliranje ili inaktiviranje transkripcione kontrolne sekvence gena BCL11A, posredstvom delecije najmanje jednog dela transkripcione kontrolne sekvence gena BCL11A i/ili ubacivanja gena BCL11A divljeg tipa ili cDNA, koji sadrži modifikovanu transkripcionu kontrolnu sekvencu u lokusu odgovarajućeg gena ili lokus sigurne luke, uz pomoć reparacije gena usmerene na homologiju (HDR), koja je, takođe, poznata kao homologno rekombinovanje (HR). Ova strategija može modulirati ili inaktivirati transkripcionu kontrolnu sekvencu gena BCL11A i preokrenuti, lečiti i/ili ublažiti stanje bolesti. Nukleotidi donora za moduliranje/inaktiviranje transkripcionih kontrolnih sekvenci često su mali (< 300 bp). Ovo predstavlja prednost, budući da efikasnosti HDR-a mogu biti u obrnutoj proporciji sa veličinom donorskih molekula. Isto tako, očekivano je da se donorski templati uklapaju sa, veličinski ograničenim adeno-povezanim virusnim (AAV) molekulima, za koje se pokazalo da predstavljaju efektivno sredstvo za isporučivanje donorskih templata.

[0206] Reparacija, upućena na homologiju, predstavlja ćelijski mehanizam za popravku prekida dvostrukog lanca (DSB). Najčešći oblik je homologna rekombinacija. Postoje dodatni putevi za HDR, koji uključuju stapanje jednog lanca i alternativni HDR. Alatke genomskog inženjeringa omogućuju istraživačima da manipulišu putevima ćelijskog homolognog rekombinovanja, kako bi se kreirale modifikacije u genomu, koje su specifične u odnosu na položaj. Utvrđeno je da ćelije mogu reparirati dvolančani prekid korišćenjem sintetskog donorskog molekula, obezbeđenog kao trans. Sledstveno tome, dovođenjem dvolančanog prekida u blizinu specifične mutacije i obezbeđivanjem pogodnog donora, mogu se proizvesti ciljane izmene u genomu. Specifičnim otcepljivanjem povećava se stopa HDR za više od 1,000 puta iznad stope od 1 od 10<6>ćelija, u slučaju primanja samo homolognog donora. Stopa reparacije upućene na homologiju (HDR) na određenom nukleotidu jeste funkcija razdaljine do pozicije cepanja, tako da je od velikog značaja izbor preklapajućih ili najbližih ciljnih položaja. Editovanje gena pruža prednost u odnosu na adiciju gena, budući da korigovanje in situ omogućuje da ostatak genoma ostane nedirnut.

[0207] Obezbeđeni donori za editovanje posredstvom HDR-a značajno variraju, ali mogu sadržavati naznačenu sekvencu sa kracima male ili velike bočne homologije, kako bi se omogućilo stapanje sa genomskom DNA. Regioni homologije koji bočno zaposedaju uvedene genetske izmene mogu biti veličine 30 bp ili manji, ili mogu biti veličine kao multi-kilobazna kaseta, koja može sadržavati promotere, cDNA, itd.. Korišćeni su i jednolančani i dvolančani oligonukleotidni donori. Veličina ovih nukleotida kreće se u rasponu koji kreće od veličine manje od 100 nt do veličine od mnogo kb, iako, takođe, mogu biti proizvedene i korišćene i veće ssDNA. Mogu biti korišćeni i dvolančani donori, uključujući PCR amplikone, plazmide i mini-cirkuluse. Uopšteno, utvrđeno je da AAV vektor može biti veoma efektivno sredstvo za isporuku donorskog templata, iako ograničenja paketa za pojedinačne donore iznose <5 kb. Aktivna transkripcija donora povećala je HDR za tri puta, čime se ukazuje da uključivanje promotera može povećati konverziju. Suprotno navedenom, metilacija CpG donora smanjivala je ekspresiju gena i HDR.

[0208] Pored endonukleaza divljeg tipa, kao što je Cas9, postoje varijante nikaza, koje poseduju jedan ili drugi domen nukleaze, koji je inaktiviran, što može dovesti do odsecanja samo jednog lanca DNA. HDR može biti usmeren od strane pojedinačnih Cas nikaza ili se mogu koristiti parovi nikaza, koji bočno zaposedaju ciljno područje. Donori mogu biti jednolančani, urezani ili dsDNA.

[0209] Može biti obezbeđena donorska DNA sa nukleazom ili se može dobiti nezavisno, korišćenjem brojnih raznovrsnih postupaka, na primer, korišćenjem transfekcije, nanočestica, mikro-injekcija ili virusne transdukcije. Predložene su brojne opcije vezivanja, kako bi se povećala raspoloživost donora za HDR. Primeri uključuju vezivanje donora za nukleazu, vezivanje za DNA-vezujuće proteine, koji se vezuju u blizini, ili vezivanje za proteine, koji su uključeni u vezivanje za kraj DNA ili reparaciju DNA.

[0210] Izbor puta reparacije može biti određen brojnim uslovima kultivacije, kao što su oni koji utiču na ćelijski ciklus, ili ciljanim delovanjem na reparaciju DNA i udružene proteine. Primera radi, da bi se povećao HDR, mogu se suprimirati ključni NHEJ molekuli, kao što su: KU70, KU80 ili DNA ligaza IV.

[0211] Bez prisustva donora, krajevi prekinute DNA ili krajevi različitih prekinutih delova mogu se spojiti korišćenjem nekoliko puteva nehomologne reparacije, u kojima se krajevi DNA udružuju sa minimalnim sparivanjem ili bez sparivanja baza na spojevima. Pored kanonske NHEJ, postoje i slični mehanizmi reparacije, kao što je alt-NHEJ. Ukoliko postoje dva prekida, intrventni segment može biti izbrisan ili preokrenut. Putevi NHEJ reparacije mogu dovesti do insercija, delecija ili mutacija na spojevima.

[0212] NHEJ je korišćen za umetanje 15-kb inducibilne genske ekspresione kasete u definisani lokus u humanim ćelijskim nizovima nakon otcepljivanja nukleaze. Maresca, M., Lin, V.G., Guo, N. & Yang, Y., Genome Res 23, 539-546 (2013).

[0213] Pored editovanja genoma posredstvom NHEJ ili HDR, provedene su i insercije gena, specifične prema položaju, koje koriste i NHEJ put i HR. Kombinovani pristup može biti primenjiv u raznim postavkama, koje moguće uključuju granice intron/egzon. NHEJ se može pokazati efektivnim u ligaciji u intron, dok se HDR oslobođena greški pokazala podesnijom u kodirajućem regionu.

[0214] Kao dalja alternativa, BCL11A gen divljeg tipa ili cDNA koja sadrži modifikovanu transkripcionu kontrolnu sekvencu mogu biti ubačeni u lokus odgovarajućeg gena ili mogu biti ubačeni u položaj sigurne luke, kao što je AAVS1. U nekim primerima, postupci mogu obezbediti jednu gRNA ili par gRNA, koji mogu biti korišćeni za olakšavanje inkorporiranja nove sekvence iz templata polinukleotidnog donora, da bi se ubacio deo ili ceo gen BCL11A divljeg tipa ili cDNA, koja sadrži modifikovanu kontrolnu sekvencu transkripcije.

[0215] Postupcima se mogu obezbediti parovi gRNA, koji vrše deleciju, dvostrukim sečenjem gena, pri čemu jedna gRNA vrši otsecanje na 5’ kraju jedne ili više mutacija, a druga gRNA vrši otsecanje na 3’ kraju jedne ili više mutacija, čime se olakšava insercija nove sekvence iz templata polinukleotidnog donora, da bi se zamenila transkripciona kontrolna sekvenca gena BCL11A. Rez se može izvršiti korišćenjem para endonukleaza DNA, pri čemu svaka pravi DSB u genomu, ili posredstvom više nikaza, koje zajedno prave DSB u genomu.

[0216] Alternativno, postupci mogu obezbediti jednu gRNA, da bi se izvelo jedno odsecanje dvostrukog lanca oko transkripcione kontrolne sekvence gena BCL11A, kojim se olakšava umetanje nove sekvence iz templata donorskog polinukleotida, da bi se transkripciona kontrolna sekvenca gena BCL11A zamenila BCL11A genom divljeg tipa ili sa cDNA, koja sadrži modifikovanu kontrolnu sekvencu transkripcije. Dvolančano otsecanje se može izvršiti uz posredovanje jedne endonukleaze DNA ili više nikaza, koje zajedno prave DSB u genomu.

[0217] Ilustrativne modifikacije unutar ili u blizini gena BCL11A ili druge sekvence DNA, koja koja kodira regulatorni element gena BCL11A, uključuju zamene unutar ili u blizini (proksimalno) transkripcione kontrolne sekvence gena BCL11A, koja je navedena prethodno, kao, na primer, u okviru regiona manjeg od 3 kb, manjeg od 2kb, manjeg od 1 kb, manjeg od 0.5 kb, ushodno ili nishodno od transkripcione kontrolne sekvence.

[0218] Takve varijante mogu uključiti zamene koje su veće u 5’ i/ili 3’ smeru u odnosu na specifičnu zamenu o kojoj se radi, ili su manje u bilo kom smeru. Sledstveno tome, pod izrazom "blizu" ili "proksimalno" u odnosu specifične zamene, podrazumeva se da SSB ili DSB lokus, koji je povezan sa željenom granicom zamene (ovde takođe, označena kao završna tačka ili ²endpoint²) može biti unutar okvira koji je manji od približno 3 kb od navedenog referentnog lokusa. SSB ili DSB lokus može biti više proksimalno, unutar 2 kb, unutar 1 kb, unutar 0.5 kb ili unutar 0.1 kb. U slučaju male zamene, željena završna tačka može biti na poziciji ili "u blizini" referentnog lokusa, posredstvom koga je je utvrđeno završna tačka može biti unutar 100 bp, unutar 50 bp, unutar 25 bp, ili manje od približno 10 bp do 5 bp od referentnog lokusa.

[0219] Može se očekivati da primeri koji uključuju veće ili manje zamene obezbeđuju istovetne prednosti, sve dok se transkripciona kontrolna aktivnost modulira ili inaktivira. Stoga je očekivano da mnoge varijacije, ovde opisanih i ilustrativno prikazanih, zamena, mogu biti efektivne u ublažavanju hemoglobinopatija.

[0220] Druge strategije genomskog inženjeringa uključuju deleciju egzona ili introna. Ciljana delecija specifičnih egzona ili introna može biti atraktivna strategija za lečenje velike podgupe pacijenata sa jednim terapeutskim koktelom. Delecije mogu biti ili pojedinačne delecije egzona ili introna ili multi-egzonske ili intronske delecije. Dok se višestruke delecije egzona mogu naći kod velikog broja pacijenata, u slučaju većih delecija, efikasnost delecija se u velikoj meri smanjuje sa povećanom veličinom. Sledstveno tome, rasponi delecija mogu biti od 40 do 10,000 parova baza (bp) po veličini. Na primer, delecije se mogu kretati u rasponu od 40-100; 100-300; 300-500; 500-1,000; 1,000-2,000; 2,000-3,000; 3,000-5,000 ili 5,000-10,000 parova baza po veličini. Može biti poželjno da se izvrši delecija introna ukoliko intron sadrži regulatorni element, kao što je transkripcioni kontrolni element (npr., vezujući položaj transkripcionog faktora).

[0221] Kako bi se obezbedilo da je pre-mRNA ispravno obrađena nakon delecije, mogu biti izbrisani okolni spajajući signali. Donori i akceptori spajanja uopšteno se nalaze unutar 100 parova baza susednog introna. Sledstveno tome, u nekim primerima, postupcima se mogu obezbediti sve gRNA, koje otsecaju približno /- 100-3100 bp, u odnosu na svaki spoj od značaja egzon/intron.

[0222] Za bilo koju od strategija editovanja genoma, editovanje gena se može potvrditi putem sekvenciranja ili PCR analize.

Izbor ciljne sekvence

[0223] Pomaci u poziciji 5’ granice i/ili 3’ granice u odnosu na pojedine referentne lokuse, mogu biti korišćeni za olakšavanje ili poboljšavanje određenih aplikacija editovanja gena, što, delom, zavisi od sistema endonukleaza, odabranog za editovanje, kako će ovde biti dalje opisano i ilustrovano.

[0224] U prvom neograničavajućem primeru takve selekcje ciljnih sekvenci, mnogi sistemi endonukleaza poseduju pravila ili kriterijume, koji mogu biti vodiči za inicijalnu selekciju potencijalnih ciljnih pozicija za cepanje, kao što su uslovi motiva PAM sekvence u određenoj poziciji u meposrednoj blizini položaja cepanja DNA, u slučaju endonukleaza CRISPR tipa II il tipa V.

[0225] U drugom neograničavajućem primeru selekcije ili optimizacije ciljne sekvence, frekvencija off-target aktivnosti za pojedinu kombinaciju ciljne sekvence i endonukleaze editovanja gena (tj., frekvencija DSB-a, koja se dešava na pozicijama koje nisu pozicije odabrane ciljne sekvence) može se proceniti u odnosu na frekvenciju on-target aktivnosti. U nekim slučajevima, ćelije koje su korektno editovane na željenom lokusu mogu imati selektivnu prednost u odnosu na druge ćelije. Kao ilustracija, ali bez ograničavanja, primeri selektivne prednosti uključuju, sticanje atributa, kao što su povećane stope replikacije, istrajnost, otpornost na određena stanja, uvećane stope uspešnog presađivanja ili istrajnost in vivo nakon unosa u pacijenta, i drugi atributi, povezani sa održanjem ili povećanim brojem vijabilnosti takvih ćelija. U drugim slučajevima, ćelije koje su editovane na korektan način na željenom lokusu, mogu biti predmet pozitivne selekcije posredstvom jednog ili više skrining postupaka, korišćenih za identifikovanje, sortiranje ili biranje na drugi način, ćelija koje su ispravno editovane. I selektivna prednost i direktni selektivni postupci mogu predstavljati prednost fenotipa, povezanog sa korekcijom. U nekim slučajevima, ćelije mogu biti podvrgnute editovanju, dva ili više puta, kako bi se proizvela druga modifikacija, kojom se kreira novi fenotip, koji se koristi da bi se izvršila selekcija ili prečišćavanje utvrđene ćelijske populacije. Takva druga modifikacija mogla bi biti proizvedena posredstvom dodavanja druge gRNA kao markera selekcije ili skrininga. U nekim slučajevima, ćelije mogu biti korektno editovane na željenom lokusu, korišćenjem fragmenta DNA, koji sadrži cDNA i, takođe, selektivni marker.

[0226] Bez obzira da li je selektivna prednost primenjiva ili se bilo koja usmerena selekcija treba primeniti u određenom slučaju, biranje ciljne selekcije, takođe, može biti izvedeno uzimanjem u razmatranje frekvencija off-target-a, da bi se povećala efikasnost primene i/ili smanjila mogućnost neželjenih alteracija na položajima, koji nisu željena meta. Kao što je u nastavku opisano i ovde i u ovoj oblasti ilustrativno prikazano, pojava off-target aktivnosti može biti pod uticajem brojnih faktora, koji uključuju sličnosti i razlike između ciljnog položaja i raznih off-target položaja, kao i pojedine endonukleaze koje su korišćene. Raspoloživa su bioinformatički alati, koji pomažu u predviđanju off-target aktivnosti, a, često se takvi alati mogu koristiti i za identifikovanje najverovatnijih pozicija off-target aktivnosti, koja se zatim mogu proceniti u eksperimantalnim postavkama, kako bi se procenile relativne frekvencije off-target aktivnosti u odnosu na on-target aktivnost, čime se omogućava selekcija sekvenci, koje poseduju više relativnih on-target aktivnosti. Ovde su dati ilustrativni primeri takvih tehnika, a drugi su poznati u ovoj oblasti.

[0227] Drugi aspekt selekcije ciljne sekvence odnosi se na slučajeve homologne rekombinacije. Sekvence koje dele regione homologije mogu poslužiti kao fokalne tačke za izvođenje homologne rekombinacije, što rezultira delecijom intervencionih sekvenci. Takvi slučajevi rekombinovanja odvijaju se tokom normalnog toka replikacije hromozoma, i drugih sekvenci DNA, i, takođe, u drugima slučajevima kada su sekvence DNA sintetisane, kao na primer u slučaju reparacije dvolančanih preloma (DSB), koje se odvija na regularnoj bazi tokom ciklusa normalne ćelijske replikacije, ali, isto tako, može biti povećan usled pojave raznih dešavanja (kao što je UV svetlost ili drugi induktori cepanja DNA) ili prisustva određenih agenasa (kao što su razna hemijska induktivna sredstva). Mnoga takva induktivna sredstva izazivaju pojavu da se DSB odvija u genomu neselektivno, a slučajevi DSB se, u normalnim ćelijama, mogu regulatorno indukovati i obnavljati. Tokom oporavka, originalna sekvenca se može potpuno verno rekonstruisati, međutim, u nekim slučajevima, na položaje DSB-a mogu se uvesti mali inserti ili delecije (označeni kao "indeli").

[0228] DSB-i, takođe, mogu biti specifično indukovani na određenim pozicijama, kao, na primer, u slučaju korišćenja, ovde opisanih, sistema endonukleaza, koje se mogu upotrebiti da bi se pokrenuli slučajevi direktne ili preferencijalne modifikacije gena, na odabranim hromozomskim pozicijama. Sklonost homolognih sekvenci da budu podvrgnute rekombinovanju u okviru reparacije DNA (kao i u slučaju replikovanja) može se smatrati prednošću u brojnim okolnostima, i predstavlja bazu za primenu sistema editovanja gena, kao što je CRISPR, u kome se reparacija upućena na homologiju, koristi za uvođenje sekvence od značaja, koja je obezbeđena posredstvom upotrebe "donorskog" polinukleotida, na željenu poziciju u hromozomu.

[0229] Regioni homologije između pojedinih sekvenci, koji mogu biti mali regioni "mikrohomologije", koji mogu sadržavati samo deset parova baza ili manje, takođe mogu biti korišćeni kako bi doveli do željenih delecija. Na primer, jedna DSB može biti uvedena na poziciju koja ispoljava mikrohomologiju sa sekvencom u blizini. Tokom normalnog toka reparacije takve DSB, rezultat koji se pojavljuje sa visokom učestalošću jeste delecija intervencijske sekvence, što je posledica rekombinovanja, koje je olakšano posredstvom DSB i pratećeg procesa ćelijske reparacije.

[0230] U nekim okolnostima, međutim, selekcija ciljnih sekvenci unutar regiona homologije, takođe može dovesti do mnogo većih delecija, koje uključuju fuzije gena (kada su delecije u kodirajućim regionima), što može, ali ne mora biti poželjno u datim određenim okolnostima.

[0231] Ovde obezbeđeni primeri ilustruju, dalje, selekciju raznih ciljnih regiona, radi kreiranja DSB-a, dizajniranih kako bi indukovali zamene, koje dovode do modulacije ili inaktivacije aktivnosti kontrolnog proteina transkripcije, kao i do selekcije specifičnih ciljnih sekvenci unutar takvih regiona, koji su dizajnirani kako bi sveli na minimum offtarget dešavanja u odnosu na on-target dešavanja.

Modifikacije nukleinskih kiselina

[0232] U nekim slučajevima, polinukleotidi, koji se uvode u ćelije, mogu sadržavati jednu ili više modifikacija, koje se mogu koristiti pojedinačno ili u kombinaciji, da bi se, na primer, povećala aktivnost, stabilnost ili specifičnost, izmenilo oslobađanje, smanjili urođeni imuni odgovori u ćelijama domaćina, ili postigla druga poboljšanja, kako je ovde u nastavku opisano, a poznato je u ovoj oblasti.

[0233] U određenim primerima, mogu biti korišćeni modifikovani polinukleotidi, u sistemu CRISPR/Cas9/Cpf1, u kom slučaju vodilje RNA (ili jedno-molekulske vodilje ili dvomolekulske vodilje) i/ili DNA ili RNA, koje kodiraju Cas ili Cpf1 endonukleaze, koje su uvedene u ćeliju, mogu biti modifikovane, kao što je opisano i ilustrativno prikazano u nastavku. Takvi modifikovani polinukleotidi mogu biti korišćeni u CRISPR/Cas9/Cpf1 sistemu, da bi se izvršilo editovanje jednog ili više lokusa genoma.

[0234] Koristeći CRISPR/Cas9/Cpf1 sistem za potrebe ne-ograničavajućih ilustracija takvih korišćenja, mogu se upotrebiti modifikacije vodilja RNA, da bi se povećalo formiranje ili stabilnost CRISPR/Cas9/Cpf1 kompleksa za editovanje genoma, koji uključuje vodilje RNA, koje mogu biti jedno-molekulske vodilje ili dvo-molekulske vodilje, i Cas ili Cpf1 endonukleaze. Modifikacije RNA vodilja mogu, takođe ili alternativno, biti korišćene za povećavanje inicijacije, stabilnosti ili kinetike interakcija između kompleksa za editovanje genoma i ciljne sekvence u genomu, što se može koristiti, da bi se, na primer, povećala on-target aktivnost. Modifikacije RNA vodilja mogu, takođe ili alternativno, biti upotrebljene za povećavanje specifičnosti, npr., relativne stope editovanja genoma na on-target pozicijama u poređenju sa efektima na ostale (offtarget) pozicije.

[0235] Modifikacije mogu, takođe ili kao alternativa, biti korišćene kako bi se povećala stabilnost vodilje RNA, npr., putem povećavanja njene otpornosti na razgradnju posredstvom ribonukleaza (RNase), prisutnih u ćeliji, izazivajući, na taj način, povećanje njenog polu-života u ćeliji. Modifikacije, koje povećavaju polu-život RNA vodilja, posebno mogu biti od koristi u aspektima u kojima se Cas ili Cpf1 endonukleaza uvodi u ćeliju koja se podvrgava editovanju posredstvom RNA, što zahteva translaciju, da bi se generisala endonukleaza, budući da povećanje polu-života RNA vodilja, koje se uvode u isto vreme kad i RNA, koja kodira endonukleazu, može biti korišćeno da bi se produžilo vreme u kome vodilje RNA i kodirane Cas ili Cpf1 endonukleaze koegzistiraju u ćeliji.

[0236] Modifikacije mogu, takođe ili kao alternativa, biti korišćene kako bi se smanjila verovatnoća ili stepen, do koga RNA, uvedene u ćelije, izazivaju urođene imune odgovore. Takvi odgovori, koji su dobro okarakterisani u kontekstu interferencije RNA (RNAi), uključujući malo-interferirajuće RNA (siRNA), kako je opisano u nastavku, i u ovoj oblasti, skloni su povezivanju sa smanjenim polu-životom RNA i/ili podsticanjem citokina ili drugih faktora, udruženih sa imunim odgovorima.

[0237] Jedan ili više tipova modifikacija može, takođe, biti, izvršeno na molekulima RNA, koji kodiraju endonukleazu, koja se uvodi u ćeliju, uključujući, bez ograničavanja, modifikacije koje povećavaju stabilnost RNA (kao, na primer, povećavajući njenu razgradnju posredstvom RNAza, prisutnih u ćeliji), modifikacije koje povećavaju translaciju nastalog proizvoda (t.j, endonukleaza) i/ili modifikacije koje smanjuju verovatnoću ili stepen, do koga RNA, uvedene u ćelije, izazivaju urođene imune odgovore.

[0238] Kombinacije modifikacija, kao što su one koje su prethodno navedene i ostale, mogu biti korišćene na sličan način. U slučaju korišćenja, na primer, CRISPR/Cas9/Cpf1, jedan ili više tipova modifikacija može biti izvršen na vodiljama RNA (uključujući one koje su prethodno date kao primeri), i/ili jedan ili više tipova modifikacija može biti izvršen na RNA, koje kodiraju Cas endonukleaze (uključujući one koje su prethodno date kao primeri).

[0239] Ilustracije radi, RNA vodilje, koje su korišćene u CRISPR/Cas9/Cpf1 sistemu, ili druge manje RNA, jednostavno se mogu sintetisati hemijskim putem, omogućujući da brojjne modifikacije budu lako inkorporirane, kako je ilustrativno prikazano u nastavku i opisano u struci. Dok su hemjske sintetske procedure u stalnoj ekspanziji, prečišćavanja takvih molekula RNA, posredstvom postupaka, kao što je tečna hromatografija visokih performansi (HPLC, koja izbegava korišćenja gelova, kao što je PAGE) teži da postane još izazovnije, kako dužine polinukleotida rastu značajno iznad stotinu ili više nukleotida. Jedan pristup, koji se može koristiti za proizvodnju hemijski-modifikovanih molekula RNA većih dužina, jeste da se proizvedu dva ili više molekula, koji se spajaju zajedno. Mnogo duži molekuli RNA, kao što su oni koji kodiraju Cas9 endonukleazu, znatno lakše se proizvode enzimskim putem. Budući da je mnogo manje tipova modifikacija raspoloživo za korišćenje u enzimski proizvedenim molekulima RNA, još postoje modifikacije koje se mogu koristiti, kako bi se, npr., povećala stabilnost, smanjila verovatnoća ili stepen urođenog imunog odgovora i/ili povećala druga svojstva, kao što je opisano dalje u nastavku i u ovoj oblasti; a novi tipovi modifikacija su u redovnim fazama razvoja.

[0240] Kao ilustracija raznih tipova modifikacija, posebno onih koje se često koriste sa manjim hemijski sintetisanim molekulima RNA, modifikacije mogu sadržavati jedan ili više nukleotida, koji su modifikovani na poziciji 2’ šećera, kao što su u nekim aspektima 2’-O-alkil, 2’-O-alkil-O-alkil ili 2’-fluoro-modifikovani nukleotid. U nekim primerima, modifikacije RNA mogu uključivati: 2’-fluoro, 2’-amino ili 2’ O-metil modifikacije na ribozi pirimidina, baznim ostacima ili invertnoj bazi na 3’ kraju RNA. Takve modifikacije mogu biti rutinski inkorporirane u oligonukleotide, a pokazalo se da ovi oligonukleotidi imaju viši Tm (tj., veći afinitet ciljnog vezivanja) nego 2’-deoksioligonukleotidi u odnosu na datu metu ili cilj.

[0241] Pokazalo se da brojne modifikacije nukleotida i nukleozida čine oligonukleotide u koje se oni ugrađuju mnogo otpornijim na nukleaznu digestiju od nativnog oligonukleotida; ovi modifikovani oligonukleotidi preživljavju u intaktnom obliku duže vreme nego nemodifikovani oligonukleotidi. Specifični primeri modifikovanih oligonukleotida uključuju one koji sadrže modifikovane osnove, kao što su, na primer, fosforotioati, fosfotriestri, metil fosfonati, kratko lančane alkil ili cikloalkil veze između šećera ili kratko lančane heteroatomske ili heterociklične veze između šećera. Neki oligonukleotidi su oligonukleotidi sa fosforotioatnim osnovama i oni sa osnovama od<heteroatoma, posebno CH>2-NH-O-CH2, CH,~N(CH3)~O~CH2(poznat kao metilen(metilimino) ili MMI osnova), CH2--ON(CH3)-CH2, CH2-N (CH3)-N(CH3)-CH2i O-N(CH3)-CH2-CH2osnove, pri čemu je osnova nativnog fosfodiestra predstavljena kao O-P-- O- CH,); amidnim osnovama [vidi De Mesmaeker et al., Ace. Chem. Res., 28:366-374 (1995)]; strukturama sa morfolino osnovama (vidi Summerton i Weller, U.S. Pat. No.

5,034,506); peptidnim nukleinsko-kiselinskim (PNA) osnovama (pri čemu je fosfodiestarska osnova oligonukleotida zamenjena poliamidnom osnovom, pri čemu su nukleotidi vezani direktno ili indirektno za aza azotne atome poliamidne osnove, vidi Nielsen et al., Science 1991, 254, 1497). Veze koje sadrže fosfor uključuju, ali ne ograničavajući se na njih, fosforotioate, hiralne fosforotioate, fosforoditioate, fosfotriestre, aminoalkilfosfotriestre, metilne i druge alkilne fosfonate, koji sadrže 3’alkilen fosfonate i hiralne fosfonate, fosfinate, fosforamidate, koji sadrže 3’-amino fosforamidat i aminoalkilfosforamidate, tionofosforamidate, tionoalkilfosfonate, tionoalkilfosfotriestre i boranofosfate, koji poseduju normalne 3’-5’ veze, njihove analoge sa 2’-5’ vezama, i one koji imaju inverznu polarnost, pri čemu su susedni parovi nukleozidnih jedinica vezani 3’-5’ do 5’-3’ ili 2’-5’ do 5’-2’; vidi US Patente pod brojevima 3,687,808; 4,469,863; 4,476,301; 5,023,243; 5,177,196; 5,188,897; 5,264,423; 5,276,019; 5,278,302; 5,286,717; 5,321,131; 5,399,676; 5,405,939; 5,453,496; 5,455,233; 5,466,677; 5,476,925; 5,519,126; 5,536,821; 5,541,306; 5,550,111; 5,563,253; 5,571,799; 5,587,361 i 5,625,050.

[0242] Oligomerna jedinjenja na morfolino-bazi opisana su u: Braasch i David Corey, Biochemistry, 41(14): 4503-4510 (2002); Genesis, Volume 30, Issue 3, (2001); Heasman, Dev. Biol., 243: 209-214 (2002); Nasevicius et al., Nat. Genet., 26:216-220 (2000); Lacerra et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 97: 9591-9596 (2000) i U.S. Pat. No.

5,034,506, izdat 23. jula 1991..

[0243] Mimetici cikloheksenil nukleisko-kiselinskih oligonukleotida opisani su u Wang et al., J. Am. Chem. Soc., 122: 8595-8602 (2000).

[0244] Modifikovane oligonukleotidne osnove koje, unutar svoje strukture, ne uključuju atom fosfora, imaju osnove koje se obrazuju putem kratko-lančanih alkil ili cikloalkil internukleozidnih veza, mešanih heteroatomskih i alkil ili cikloalkil internukleozidnih veza, ili jedne ili više kratkolančanih heteroatomskih ili heterocikličnih internukleozidnih veza. One uključuju one koje imaju morfolino veze (koje se, delom, obrazuju iz šećernog dela nukleozida); siloksanske osnove; sulfidne, sulfoksidne i sulfonske osnove; formacetil i tioformacetil osnove; metilen formacetil i tioformacetil osnove; osnove koje sadrže alken; sulfamatne osnove; metilenimino i metilenhidrazino osnove; sulfonatne i sulfonamidne osnove; amidne osnove; i ostale, koji poseduju mešane delove N, O, S i CH2komponenti; vidi US Patent No.5,034,506; 5,166,315; 5,185,444; 5,214,134; 5,216,141; 5,235,033; 5,264,562; 5,264,564; 5,405,938; 5,434,257; 5,466,677; 5,470,967; 5,489,677; 5,541,307; 5,561,225; 5,596,086; 5,602,240; 5,610,289; 5,602,240; 5,608,046; 5,610,289; 5,618,704; 5,623,070; 5,663,312; 5,633,360; 5,677,437 i 5,677,439.

[0245] Takođe mogu biti uključeni jedan ili više supstituisanih šećernih delova, npr., jedan od sledećih na 2’ poziciji: OH, SH, SCH3, F, OCN, OCH3OCH3, OCH3O(CH2)n CH3, O(CH2)n NH2ili O(CH2)n CH3, pri čemu je n broj od 1 do oko 10; C1do C10niži alkil, alkoksialkoksi, supstituisani niži alkil, alkaril ili aralkil; Cl; Br; CN; CF3; OCF3; O-, S-ili N-alkil; O-, S- ili N-alkenil; SOCH3; SO2CH3; ONO2; NO2; N3; NH2; heterocikloalkil; heterocikloalkaril; aminoalkilamino; polialkilamino; supstituisani silil; RNA otceljujuća grupa; reporter grupa; interkalator; grupa za poboljšanje farmakokinetičkih karakteristika oligonukleotida ili grupa za unapređenje farmakodinamskih karakteristika oligonukletida i ostali supstituenti koji poseduju slične karakteristike. U nekim aspektima, modifikacija uključuje 2’-metoksietoksi (2’-O-CH2CH2OCH3, takođe poznat kao 2’-O-(2-metoksietil)) (Martin et al, Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486). Ostale modifikacije uključuju 2’-metoksi (2’-O-CH3), 2’-propoksi (2’-OCH2CH2CH3) i 2’-fluoro (2’-F). Slične modifikacije, takođe, mogu biti izvršene na drugim pozicijama na oligonukleotidu, posebno na 3’ poziciji šećernog dela na 3’ terminalnom nukleotidu i 5’ poziciji 5’ terminalnog nukleotida. Oligonukleotidi mogu, isto tako, imati mimetike šećera, kao što su ciklobutili umesto pentofuranozil grupe.

[0246] U nekim primerima, i šećerna i internukleozidna veza, tj., osnova nukleozidne jedinice, mogu biti zamenjeni novim grupama. Jedinice baze mogu biti zadržane zbog hibridizacije sa odgovarajućim ciljnim nukleinsko-kiselinskim jedinjenjem. Jedno takvo oligomerno jedinjenje, mimetik oligonukleotida za koga se pokazalo da ima odlične hibridizacijske karakteristike, označava se kao peptid-nukleinska kiselina (PNA). U PNA jedinjenjima, šećer u osnovi oligonukleotida može biti zamenjen osnovom koja sadrži amid, kao što je, na primer, aminoetilglicinska osnova. Nukleobaze mogu biti zadržane i direktno ili indirektno vezane za aza atome azoma u amidnom delu osnove strukture. Reprezentativni patenti Sjedinjenih država koji pružaju prikaz izrade PNA jedinjenja, uključuju, ali bez ograničavanja na njih, US Patent Nos. 5,539,082; 5,714,331 i 5,719,262. Dalja saznanja o PNA jedinjenjima mogu se naći u Nielsen et al, Science, 254: 1497-1500 (1991).

[0247] Vodilje RNA mogu, takođe, dodatno ili alternativno, uključiti modifikacije ili supstitucije nukleobaze (često se, u struci, jednostavno označava kao "baza"). Kako su ovde korišćene, "nemodifikovane" ili "naturalne" nukleobaze uključuju: adenin (A), gvanin (G), timin (T), citozin (C) i uracil (U). Modifikovane nukleobaze uključuju nukleobaze, koje se retko ili prolazno, nalaze u prirodnim nukleinskim kiselinama, npr., hipoksantin, 6-metiladenin, 5-Me pirimidini, posebno 5-metilcitozin (označava se, takođe, kao 5-metil-2’ deoksicitozin, a često se, u struci, označava kao 5-Me-C), 5-hidroksimetilcitozin (HMC), glikozil HMC i gentobiozil HMC, kao i sintetske nukleobaze, npr., 2-aminoadenin, 2-(metilamino)adenin, 2-(imidazolilalkil)adenin, 2-(aminoalkilamino)adenin ili heterosupstituisane alkiladenine, 2-tiouracil, 2-tiotimin, 5-bromouracil, 5-hidroksimetiluracil, 8-azagvanin, 7-deazagvnin, N6 (6-aminoheksil)adenin i 2,6-diaminopurin. Kornberg, A., DNA Replication, W. H. Freeman & Co., San Francisco, pp75-77 (1980); Gebeyehu et al., Nucl. Acids Res. 15:4513 (1997). U struci poznata "univerzalna" baza, npr., inozin, takođe se može uključiti. Pokazalo se da 5-Me-C supstitucije povećavaju stabilnost nukleinsko-kiselinskog dupleksa za 0.6-1.2°C. (Sanghvi, Y. S., u Crooke, S. T. i Lebleu, B., eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp.276-278) i predstavljaju aspekte supstitucija baza.

[0248] Modifikovane nukleobaze mogu sadržavati i druge sintetske i prirodne nukleobaze, kao što su: 5-metilcitozin (5-me-C), 5-hidroksimetil citozin, ksantin, hipoksantin, 2-aminoadenin, 6-metil i drugi alkil derivati adenina i gvanina, 2-propil i drugi alkil derivati adenina i gvanina, 2-tiouracil, 2-tiotimin i 2-tiocitozin, 5-halouracil i citozin, 5-propinil uracil i citozin, 6-azo uracil, citozin i timin, 5-uracil (pseudo-uracil), 4-tiouracil, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalkil, 8-hidroksil i drugi 8-supstituisani adenini i gvanini, 5-halo, posebno 5-bromo, 5-trifluorometil i drugi 5-supstituisani uracili i citozini, 7-metilgvanin i 7-metiladenin, 8-azagvanin i 8-azaadenin, 7-deazagvanin i 7-deazaadenin i 3-deazagvanin i 3-deazaadenin.

[0249] Pored toga, nukleobaze mogu obuhvatati one koje su izložene u United States Patent No. 3,687,808, one koje su izložene u ’The Concise Encyclopedia of Polymer Science And Engineering’, na stranama 858-859, Kroschwitz, J.I., ed. John Wiley & Sons, 1990, one koje su izložene u Englisch et al., Angewandle Chemie, International Edition’, 1991, 30, strana 613, i one koje su izložene u Sanghvi, Y. S., Poglavlje 15, Antisense Research and Applications’, strane 289- 302, Crooke, S.T. i Lebleu, B. ea., CRC Press, 1993. Određene od ovih nukleobaza su posebno korisne za pojačavanje afiniteta vezivanja oligomernih jedinjenja pronalaska. One obuhvataju: 5-supstituisane pirimidine, 6-azapirimidine i N-2, N-6 i 0-6 supstituisane purine, koji uključuju 2-aminopropiladenin, 5-propiniluracil i 5-propinilcitozin. Pokazalo se da 5-metilcitozinske supstitucije povećavaju stabilnost nukleinsko-kselinskog dupleksa za 0.6-1.2°C (Sanghvi, Y.S., Crooke, S.T. i Lebleu, B., eds, ’Antisense Research and Applications’, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278) i predstavljaju aspekte supstitucija baza, čak još određenije kada se kombinuju sa 2’-O-metoksietil šećernim modifikacijama. Modifikovane nukleobaze su opisane u US Patent Nos. 3,687,808, kao i u 4,845,205; 5,130,302; 5,134,066; 5,175,273; 5,367,066; 5,432,272; 5,457,187; 5,459,255; 5,484,908; 5,502,177; 5,525,711; 5,552,540; 5,587,469; 5,596,091; 5,614,617; 5,681,941; 5,750,692; 5,763,588; 5,830,653; 6,005,096 i US Patent Application Publication 2003/0158403.

[0250] Sledstveno tome, izraz "modifikovan" odnosi se na šećer, fosfat ili bazu koji nisu prirodni, a ugrađuju se u RNA vodilju, endonukleazu ili transkripcionu kontrolnu sekvencu BCL11A ili i vodilju RNA i endonukleazu. Nije neophodno da sve pozicije u datom oligonukleotidu budu uniformno modifikovane, a, zapravo, više od jedne od prethodno pomenutih modifikacija, može biti inkorporirano u pojedinačni oligonukleotid, ili, čak, u pojedinačni nukleozid unutar oligonukleotida.

[0251] RNA vodilje i/ili mRNA (ili DNA), koje kodiraju endonukleazu, mogu biti vezane hemijskim vezama za jedan ili više delova ili konjugata, koji povećavaju aktivnost, ćelijsku distribuciju ili ćelijsko prihvatanje oligonukleotida. Takvi delovi sadrže, ali bez ograničavanja na njih, lipidne delove, kao što je holesterolski deo [Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 6553-6556 (1989)]; holna kiselina [Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 4: 1053-1060 (1994)]; tioetar, npr., heksil-S- tritiltiol [Manoharan et al, Ann. N. Y. Acad. Sci., 660: 306-309 (1992) i Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 3: 2765-2770 (1993)]; tioholesterol [Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 20: 533-538 (1992)]; alifatski lanac, npr., dodekandiol ili undecil ostaci [Kabanov et al., FEBS Lett., 259: 327-330 (1990) i Svinarchuk et al., Biochimie, 75: 49- 54 (1993)]; fosfolipid, npr., diheksadecil-rac-glicerol ili trietilamonijum 1,2-di-O-heksadecil- rac-glicero-3-H-fosfonat [Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 36: 3651-3654 (1995) i Shea et al., Nucl. Acids Res., 18: 3777-3783 (1990)]; poliaminski ili polietilen glikolni lanac [Mancharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 14: 969-973 (1995)]; adamantan sirćetna kiselina [Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 36: 3651-3654 (1995)]; deo palmitila [(Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1264: 229-237 (1995)]; ili oktadecilaminski ili heksilaminokarbonil-t oksiholesterolski deo [Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 277: 923-937 (1996)]. Vidi, takođe, US Patent Nos. 4,828,979; 4,948,882; 5,218,105; 5,525,465; 5,541,313; 5,545,730; 5,552,538; 5,578,717, 5,580,731; 5,580,731; 5,591,584; 5,109,124; 5,118,802; 5,138,045; 5,414,077; 5,486,603; 5,512,439; 5,578,718; 5,608,046; 4,587,044; 4,605,735; 4,667,025; 4,762,779; 4,789,737; 4,824,941; 4,835,263; 4,876,335; 4,904,582; 4,958,013; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,245,022; 5,254,469; 5,258,506; 5,262,536; 5,272,250; 5,292,873; 5,317,098; 5,371,241, 5,391,723; 5,416,203, 5,451,463; 5,510,475; 5,512,667; 5,514,785; 5,565,552; 5,567,810; 5,574,142; 5,585,481; 5,587,371; 5,595,726; 5,597,696; 5,599,923; 5,599, 928 i 5,688,941.

[0252] Šećeri i ostali delovi mogu biti korišćeni za ciljano delovanje na proteine i komplekse koji sadrže nukleotide, kao što su katjonski polisomi i liposomi, na određenim položajima. Na primer, transfer usmeren ka jetrenim ćelijama može biti izvršen posredstvom asijaloglikoproteinskih receptora (ASGPR-i); vidi, npr., Hu, et al., Protein Pept Lett.21(10):1025-30 (2014). Drugi sistemi koji su poznati u struci i u regularnim su fazama razvoja, mogu biti korišćeni za ciljano delovanje na biomolekule korišćene u ovom slučaju i/ili njihove komplekse za određene ciljne ćelije od značaja.

[0253] Ovi ciljani delovi ili konjugati mogu uključiti konjugat grupe, koje su kovalentno vezane za funkcionalne grupe, kao što su primarne ili sekundarne hidroksil grupe. Konjugat grupe pronalaska uključuju: interkalatore, reporter molekule, poliamine, poliamide, polietilen glikole, polietre, grupe koje pojačavaju farmakodinamske karakteristike oligomera i grupe koje povećavaju farmakokinetičke karakteristike oligomera. Uobičajene konjugat grupe uključuju: holesterole, lipide, fosolipide, biotin, fenazin, folat, fenantridin, antrakinon, akridin, fluoresceine, rodamine, kumarine i boje. Grupe koje pojačavaju farmakodinamske karakteristike, u okviru ovog izlaganja, uključuju grupe koje poboljšavaju prihvatanje, pojačavaju otpornost na razgradnju i/ili učvršćuju hibridizaciju sa ciljnom nukleinskom kiselinom, sa specifičnošću prema sekvenci. Grupe koje povećavaju farmakokinetičke karakteristike, u kontekstu ovog pronalaska, uključuju grupe koje poboljšavaju prihvatanje, distribuciju, metabolizam ili ekskreciju jedinjenja ovog pronalaska. Reprezentativne konjugat grupe su izložene u U.S. Pat. No. 6,287,860. Delovi konjugata uključuju, ali bez ograničavanja na njih, delove lipida, kao što su holesterolski deo, holna kiselina, tioetar, npr., heksil-5-tritiltiol, tioholesterol, alifatski lanac, npr., dodekandiol ili undecil ostaci, fosfolipid, npr., diheksadecil-rac-glicerol ili trietilamonijum l,2-di-O-heksadecil-rac-glicero-3-H-fosonat, poliamin ili polietilen glikol lanac ili adamantan sirćetnu kiselinu, deo palmitila ili oktadecilaminski ili heksilamino-karbonil-oksi holesterolski deo. Vidi, npr., U.S. Pat. Nos.

4,828,979; 4,948,882; 5,218,105; 5,525,465; 5,541,313; 5,545,730; 5,552,538; 5,578,717, 5,580,731; 5,580,731; 5,591,584; 5,109,124; 5,118,802; 5,138,045; 5,414,077; 5,486,603; 5,512,439; 5,578,718; 5,608,046; 4,587,044; 4,605,735; 4,667,025; 4,762,779; 4,789,737; 4,824,941; 4,835,263; 4,876,335; 4,904,582; 4,958,013; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,245,022; 5,254,469; 5,258,506; 5,262,536; 5,272,250; 5,292,873; 5,317,098; 5,371,241, 5,391,723; 5,416,203, 5,451,463; 5,510,475; 5,512,667; 5,514,785; 5,565,552; 5,567,810; 5,574,142; 5,585,481; 5,587,371; 5,595,726; 5,597,696; 5,599,923; 5,599,928 i 5,688,941.

[0254] Duži polinukleotidi, koji su manje podložni hemijskoj sintezi, a obično se proizvode putem enzimske sinteze, takođe se se mogu modifikovati na razne načine. Takve modifikacije mogu uključiti, na primer, uvođenje određenih analoga nukleotida, ugradnju određenih sekvenci ili drugih delova na 5’ ili 3’ krajeve molekula, kao i druge modifikacije. Kao ilustracija, mRNA, koja kodira Cas9 ima približno 4 kb po dužini, a može biti sintetisana posredstvom in vitro transkripcije. Mogu se primeniti modifikacije na mRNA, kako bi se, npr., povećala njena translacija ili stabilnost (kako na primer, putem povećavanja njene otpornosti na razgradnju u ćeliji), ili kako bi se smanjila sklonost RNA da pobudi urođeni imuni odgovor, koji se često zapaža u ćelijama nakon uvođenja egzogenih RNA, posebno dužih molekula RNA, kao što su oni koji kodiraju Cas9.

[0255] Brojne modifikacije tog tipa opisane su u ovoj oblasti, kao što su poliA tails, 5’ cap analozi (npr., Anti Reverse Cap Analog (ARCA) ili m7G(5’)ppp(5’)G (mCAP)), modifikovani 5’ ili 3’ netranslacijski regioni (UTR-i), korišćenja modifikovanih baza (kao što su Pseudo-UTP, 2-tio-UTP, 5-metilcitidin-5’-trifosfat (5-metil-CTP) ili N6-metil-ATP), ili tretman sa fosfatazom, da bi se odstranili 5’ terminalni fosfati. Ove i druge modifikacije poznate su u struci, a nove modifikacije RNA su u redovnim fazama razvoja.

[0256] Postoje brojni komercijalni dobavljači modifikovanih RNA, koji uključuju, na primer, TriLink Biotech, AxoLabs, Bio-Synthesis Inc., Dharmacon i mnoge druge. Kako je opisano od strane TriLink-a, primera radi, 5-metil-CTP se može koristiti da bi se proizvele željene karakteristike, kao što je povećana stabilnost prema nukleazama, povećana translacija ili redukovana interakcija receptora urođenog imunog odgovora sa in vitro transkribovanom RNA. Pokazalo se, takođe, da 5-metilcitidin-5’-trifosfat (5-metil-CTP), N6-metil-ATP, kao i pseudo-UTP i 2-tio-UTP, smanjuju stimulaciju urođenog imunog odgovora u kulturi i in vivo, uz povećavanje translacije, kako je ilustrativno prikazano u publikacijama, od strane Kormanna i saradnika i Warrena i saradnika, navedenim u nastavku.

[0257] Pokazalo se da se hemijski modifikovane mRNA, koje se oslobađaju in vivo mogu koristiti za postizavanje unapređenih terapeutskih efekata; vidi, npr., Kormann et al., Nature Biotechnology 29, 154-157 (2011). Takve modifikacije mogu biti korišćene, primera radi, za povećanje stabilnosti molekula RNA i/ili smanjenje njene imunogenosti. Utvrđeno je da korišćenje hemijskih modifikacija, kao što su pseudo-U, N6-metil-A, 2-tio-U i 5-metil-C, kojima se modifikuje samo jedna četvrtina uridinskih i citidinskih ostataka sa 2-tio-U, odnosno sa 5-metil-C, dovodi do značajnog smanjenja prepoznavanja mRNA, posredovanog toll-like receptorom (TLR), kod miševa. Smanjujući aktivaciju urođenog imunog sistema, ove modifikacije se mogu koristiti za efektivno povećanje stabilnosti i trajnosti mRNA in vivo; vidi, npr., Kormann et al., supra.

[0258] Pokazalo se, takođe, da se ponovljenom primenom sintetskih molekula informacione RNA, koje nose inkorporirane modifikacije, dizajnirane da bi se zaobišli urođeni anti-virusni odgovori, mogu reprogramirati diferencirane humane ćelije prema pluripotentnosti. Vidi, npr., Warren, et al., Cell Stem Cell, 7(5):618-30 (2010). Takvi modifikovani molekuli mRNA, koji deluju kao primarni reprogramirajući proteini, mogu predstavljati efikasno sredstvo za reprogramiranje multiplih humanih ćelijskih tipova. Takve ćelije se označavaju kao matične ćelije indukovane pluripotentnosti (iPSC-i), a utvrđeno je da bi enzimski sintetisani molekuli RNA, koji imaju inkorporirane 5-metil-CTP, pseudo-UTP i Anti Reverse Cap Analog (ARCA) mogli biti korišćeni za efikasno zaobilaženje anti-virusnog odgovora ćelija; vidi, npr., Warren et al., supra.

[0259] Ostale modifikacije polinukleotida, opisanih u struci, uključuju, na primer, korišćenje polyA tails, dodavanje 5’ cap analoga (kao što je m7G(5’)ppp(5’)G (mCAP)), modifikacije 5’ ili 3’ netranslacijskih regiona (UTR-i) ili tretman sa fosfatazom, da bi se odstranili 5’ terminalni fosfati – a novi pristupi su u regularnim fazama razvoja.

[0260] Brojne kompozicije i postupci, koje je moguće aplikovati na proizvodnju modifikovanih molekula RNA, namenjenih tekućem korišćenju, razvijeni su u vezi sa modifikovanjem interferencije RNA (RNAi), uključujući male interferirajuće RNA (siRNA). siRNA predstavljaju posebne izazove in vivo budući da su njihovi efekti na utišavanje gena posredstvom interferencije mRNA, uopšteno tranzitorni, što može zahtevati ponavljanje primene. Pored toga, siRNA su dvo-lančane RNA (dsRNA), a ćelije sisara poseduju imune odgovore koji su evoluirali, kako bi detektovali i neutralisali dsRNA, što je, često, nusprodukt virusne infekcije. Sledstveno tome, postoje enzimi sisara, kao što je PKR (dsRNA-odgovorna kinaza), i potencijalno gen I sa mogućnošću indukcije retinoinske kiseline I (RIG-I), koji može posredovati u ćelijskim odgovorima na dsRNA, kao i Toll-like receptore (kao što su: TLR3, TLR7 i TLR8), koji mogu biti okidači za indukovanje citokina u odgovoru na takve molekule; vidi, npr., prikaze od strane Angart et al., Pharmaceuticals (Basel) 6(4): 440-468 (2013); Kanasty et al., Molecular Therapy 20(3): 513-524 (2012); Burnett et al., Biotechnol J. 6(9):1130-46 (2011); Judge i MacLachlan, Hum Gene Ther 19(2):111-24 (2008); i reference, koje su navedene u njima.

[0261] Veliki broj modifikacija je razvijen i aplikovan sa ciljem povećanja stabilnosti RNA, smanjenja urođenih imunih odgovora i/ili postizavanja drugih prednosti koje mogu biti od koristi u vezi sa uvođenjem polinukleotida u humane ćelije, kao što je ovde opisano; vidi, npr., prikaze od stane Whitehead KA et al., Annual Review of Chemical and Biomolecular Engineering, 2: 77-96 (2011); Gaglione i Messere, Mini Rev Med Chem, 10(7):578-95 (2010); Chernolovskaya et al, Curr Opin Mol Ther., 12(2):158-67 (2010); Deleavey et al., Curr Protoc Nucleic Acid Chem Chapter 16: Unit 16.3 (2009); Behlke, Oligonucleotides 18(4):305-19 (2008); Fucini et al., Nucleic Acid Ther 22(3): 205-210 (2012); Bremsen et al., Front Genet 3:154 (2012).

[0262] Kako je prethodno navedeno, postoje brojni snabdevači modifikovanih molekula RNA, od kojih su mnogi specijalizovani u modifikacijama, dizajniranim za poboljšanje efikasnosti siRNA. Postoje brojni pristupi, bazirani na raznim pronalascima, prikazanim u literaturi. Na primer, Dharmacon beleži kako je zamena ne-premoštavajućeg kiseonika sa sumporom (fosforotioat, PS) u širokoj upotrebi radi poboljšanja rezistencije molekula siRNA na nukleaze, kako je prikazano u Kole, Nature Reviews Drug Discovery 11:125-140 (2012). Prikazano je kako modifikacije na 2’-poziciji riboze poboljšavaju otpornost internukleotidne fosfatne veze na nukleazu, uz povećanje stabilnosti dupleksa (Tm), pri čemu se, takođe, pokazalo da se obezbeđuje zaštita od aktivacije imunog odgovora. Kombinacija umerenih modifikacija na PS osnovi sa sitnim, dobro-tolerisanim 2’-supstitucijama (2’-O-metil, 2’-fluoro, 2’-hidro) udružena je sa siRNA visoke stabilnosti, za primene in vivo, kako je prikazano od strane Soutschek et al. Nature 432:173-178 (2004); a za 2’-O-metil modifikacije je navedeno da su efektivne u unapređenju stabilnosti, kako je prikazano u Volkov, Oligonucleotides 19:191-202 (2009). S obzirom na smanjenje indukovanja urođenih imunih odgovora, prikazano je kako modifikovanje specifičnih sekvenci sa 2’-O-metil, 2’-fluoro, 2’-hidro redukuje TLR7/TLR8 interakciju, uz uopšteno zadržavanje aktivnosti utišavanja; vidi, npr., Judge et al., Mol. Ther. 13:494-505 (2006) i Cekaite et al., J. Mol. Biol. 365:90-108 (2007). Pokazalo se, isto tako, da dodatne modifikacije, kao što su: 2-tiouracil, pseudouracil, 5-metilcitozin, 5-metiluracil i N6-metiladenozin minimizuju imune efekte, uz posredovanje TLR3, TLR7 i TLR8; vidi, npr., Kariko, K. et al., Immunity 23:165-175 (2005).

[0263] Kako je, takođe, poznato u ovoj oblasti, a i komercijalno je dostupno, brojni konjugati se mogu aplikovati na polinukleotide, kao što su RNA, za tekuću primenu, čime se može povećati njihovo oslobađanje i/ili prihvatanje od strane ćelija, uključujući, na primer, holesterol, tokoferol i folnu kiselinu, lipide, peptide, polimere, linkere i aptamere; vidi, npr., prikaz u Winkler, Ther. Deliv. 4:791-809 (2013), i reference, navedene u njemu.

Optimizacija kodona

[0264] Polinukleotid, koji kodira polipeptid, usmeren ka položaju, može biti sa kodonom, optimizovanim u skladu sa postupcima, koji predstavljaju standardne procedure u ovoj oblasti, za ekspresiju u ćeliji, koja sadrži ciljnu DNA od značaja. Na primer, ukoliko se utvrđena ciljna nukleinska kiselina nalazi u humanoj ćeliji, humani polinukleotid sa optimizovanim kodonom, koji kodira Cas9, namenjen je za korišćenje za proizvodnju Cas9 polipeptida.

Kompleksi nukleinske kiseline sa ciljanim delovanjem na genom i polipeptida usmerenog ka položaju

[0265] Nukleinska kiselina sa ciljanim dejstvom na genom ulazi u interakciju sa polipeptidom, usmerenim ka položaju (npr., nukleaza sa vodiljom nukleinskom kiselinom, kao što je Cas9), čime se obrazuje kompleks. Nukleinska kiselina sa ciljanim delovanjem na genom navodi polipeptid usmeren ka položaju na ciljanu nukleinsku kiselinu.

RNP-i

[0266] Svaki od polipeptida, usmerenih ka položaju i nukleinskih kiselina sa ciljanim dejstvom na genom, može biti primenjen zasebno na ćeliju ili pacijenta. S druge strane, polipeptid, usmeren ka položaju može biti prethodno nezan u kompleks sa jednim ili više nukleinskih kiselina sa ciljanim delovanjem na genom (RNA vodilja, sgRNA ili crRNA, zajedno sa tracrRNA). Materijal, prethodno vezan u kompleks, može, zatim, biti aplikovan na ćeliju ili može biti dat pacijentu. Takav materijal, prethodno vezan u kompleks, poznat je kao ribonukleoproteinska čestica (RNP). Polipeptid usmeren ka položaju u RNP može biti, primera radi, endonukleaza Cas9 ili endonukleaza Cpf1. Polipeptid, usmeren ka položaju, može biti bočno zaposednut na N-terminusu, C-terminusu ili i na N-terminusu i C-terminusu sa jednim ili više signala nuklearne lokalizacije (NLS-i). Na primer, endonukleaza Cas9 može biti bočno zaposednuta sa dva NLS-a, jednim NLS, pozicioniranim na N-terminusu i drugim NLS, pozicioniranim na C-terminusu. NLS može biti bilo koji, u struci poznati, NLS, kao što je SV40 NLS. Težinski odnos nukleinske kiseline sa ciljanim delovanjem na genom prema polipeptidu, usmerenom ka položaju u RNP može biti 1:1. Primera radi, težinski odnos sgRNA prema endonukleazi Cas9 u RNP može biti 1:1. Na primer, sgRNA može sadržavati nukleinskokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 71,959, endonukleaza Cas9 može biti Cas9 iz S. pyogenes, koja sadrži N-terminus SV40 NLS i C-terminus SV40 NLS, a težinski odnos sgRNA prema endonukleazi Cas9 može biti 1:1.

Komponente sistema za kodiranje nukleinskih kiselina

[0267] Ovaj pronalazak prikazuje nukleinsku kiselinu, koja sadrži sekvencu nukleotida, koja kodira nukleinsku kiselinu pronalaska sa ciljanim delovanjem na genom, polipeptid pronalaska koji je usmeren ka položaju i/ili bilo koji molekul nukleinske kiseline ili bilo koji proteinski molekul, neophodan za izvršenje aspekata postupaka pronalaska.

[0268] Nukleinska kiselina, koja sadrži sekvencu nukleotida, koja kodira nukleinsku kiselinu pronalaska sa ciljanim delovanjem na genom, polipeptid pronalaska koji je usmeren ka položaju i/ili bilo koji molekul nukleinske kiseline ili bilo koji proteinski molekul, neophodan za izvršenje aspekata postupaka pronalaska, mogu sadržavati vektor (npr., rekombinantni ekspresioni vektor).

[0269] Naziv "vektor" odnosi se na molekul nukleinske kiseline, koji je u stanju da transportuje drugu nukleinsku kiselinu, za koju je vezan. Jedan tip vektora je "plazmid", koji označava cirkularnu petlju dvo-lančane DNA u koju se mogu uvezati segmenti dodatne nukleinske kiseline. Drugi tip vektora je virusni vektor, u kome dodatni segmenti nukleinske kiseline mogu uključiti, vezivanjem za genom virusa. Određeni vektori su u stanju da vrše autonomnu replikaciju u ćeliji domaćina, u koju se uvode (npr., bakterijski vektori, koji poseduju bakterijski izvor replikovanja i episomalni vektori sisara). Ostali vektori (npr., ne-episomalni vektori sisara) se ugrađuju u genom domaćinske ćelije, nakon unošenja u ćeliju domaćina, i time se replikuju zajedno sa ćelijom domaćina.

[0270] U nekim primerima, vektori mogu biti u mogućnosti da usmeravaju ekspresiju nukleinskih kiselina, za koje su operativno povezane. Takvi vektori se označavaju kao "rekombinantni ekspresioni vektori", ili, jednostavnije, "ekspresioni vektori", koji vrše ekvivalentne funkcije.

[0271] Izraz "operativno vezan" znači da se nukleotidna sekvenca od značaja povezuje sa regulatornom sekvencom (ili sekvencama), na način da je omogućena ekspresija nukleotidne sekvence. Naziv "regulatorna sekvenca" utvrđen je kako bi uključio, na primer, promotere, pojačivače i druge elemente kontrole ekspresije (npr., poliadenilacioni signali). Takve regulatorne sekvence su dobro poznate u struci, a opisane su, na primer, u Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Regulatorne sekvence uključuju one koje upravljaju konstitutivnom ekspresijom nukleotidne sekvence u mnogim tipovima domaćinskih ćelija, i one koje upravljaju ekspresijom nukleotidne sekvence samo u određenim ćelijama domaćina (npr., tkivno-specifične regulatorne sekvence). Stručnjaci u ovoj oblasti će proceniti da dizajn ekspresionog vektora može zavisiti od faktora, kao što su izbor ciljne ćelije, željeni nivo ekspresije i tome slično.

[0272] Ovde razmatrani ekspresioni vektori uključuju, ali bez ograničavanja na njih, virusne vektore, na bazi virusa vakcinije, poliovirusa, adenovirusa, virusa, povezanog sa adeno-virusom, SV40, virusa herpes simpleksa, virusa humane imunodeficiencije, retrovirusa (npr., virus leukemije glodara, virus skleroze slezine i vektori, dobijeni iz retrovirusa, kao što su Rausov virus sarkoma, Harvey sarkoma virus, ptičji virus leukoze, lentivirus, virus humane imunodeficijencije, mijeloproliferativni virus sarkoma i virus tumora dojke) i druge rekombinantne vektore. Ostali vektori, koji su razmatrani za eukariotske ciljne ćelije, uključuju, ali bez ograničavanja na njih, vektore pXT1, pSG5, pSVK3, pBPV, pMSG i pSVLSV40 (Pharmacia). Dodatni vektori, koji su razmatrani za eukariotske ciljne ćelije uključuju, ali ne ograničavajući se na njih, vektore pCTx-1, pCTx-2 i pCTx-3, koji su opisani na Slikama 1A do 1C. Ostali vektori se mogu koristiti sve dotle dok su kompatibilni sa ćelijom domaćina.

[0273] U nekim primerima, vektor može sadržavati jedan ili više transkripcionih i/ili translacionih kontrolnih elemenata. U zavisnosti od korišćenog sistema domaćin/vektor, u ekspresionom vektoru može biti korišćen bilo koji od brojnih pogodnih kontrolnih elemenata transkripcije i translacije, uključujući konstitutivne i inducibilne promotere, elemente za pojačavanje transkripcije, transkripcione terminatore, itd., Vektor može biti samo-inaktivirajući vektor, koji inaktivira ili virusne sekvence ili komponente CRISPR mašinerije ili druge elemente.

[0274] Ne-ograničavajući primeri pogodnih eukariotskih promotera (tj., promotera koji su funkcionalni u eukariotskoj ćeliji) uključuju promotere iz citomegalovirusa (CMV) "immediate early", timidin kinaze herpes simpleks virusa (HSV), ranog i kasnog SV40, promotere dugih terminalnih ponovaka (LTR-i) iz retrovirusa, promoter humanog elongacionog faktora-1 (EF1), hibridni konstrukt koji sadrži citomegalovirusni (CMV) pojačivač, spojen sa pilećim beta-aktinskim promoterom (CAG), promoter virusa mišjih matičnih ćelija (MSCV), lokus promoter fosfoglicerat kinaze-1 (PGK) i mišji metalotionein-I.

[0275] Za ekspresiju malih RNA, uključujući RNA vodilje, koje se koriste u vezi sa Cas endonukleazom, povoljne efekte može imati korišćenje raznih promotera, kao što su promoteri RNA polimeraze III, uključujući, na primer U6 i H1. Opisi i parametri za pojačavanje korišćenja takvih promotera poznati su u ovoj oblasti, a dodatne informacije i pristupi, nalaze se u radovima; vidi, npr., Ma, H. et al., Molecular Therapy - Nucleic Acids 3, e161 (2014) doi:10.1038/mtna.2014.12.

[0276] Ekspresioni vektor može, takođe, sadržavati položaj vezivanja ribosoma za inicijaciju translacije i terminaciju transkripcije. Ekspresioni vektor može, takođe, sadržavati pogodne sekvence za amplifikovanje ekspresije. Ekspresioni vektor može, isto tako, sadržavati nukleotidne sekvence, koje kodiraju ne-nativne tagove (npr., histidinski tag, hemaglutininski tag, zeleni fluorescentni protein, itd.), koje se spajaju sa polipeptidom, usmerenim ka položaju, što rezultira stvaranjem fuzionog proteina.

[0277] Promoter može biti inducibilni promoter (npr., promoter toplotnog šoka, tetraciklinom regulisani promoter, steroidima regulisani promoter, metalom regulisani promoter, promoter regulisan estrogenim receptorima, itd.). Promoter može biti konstitutivni promoter (npr., CMV promoter, UBC promoter). U nekim slučajevima, promoter može biti prostorno ograničeni i/ili vremenski ograničeni promoter (npr., tkivnospecifični promoter, promoter specifičan prema tipu ćelije, itd.).

[0278] Nukleinska kiselina, koja kodira nukleinsku kiselinu pronalaska sa ciljanim delovanjem na genom i/ili polipeptid, usmeren ka položaju, mogu biti zapakovani unutar ili na površini sredstava za oslobađanje u ćelije. Ovde razmatrana sredstva za oslobađanje uključuju, ali bez ograničavanja na njih, nanokuglice, liposome, kvantne tačke, nanočestice, polietilen glikolne čestice, hidrogelove i micele. Kao što je, u struci, opisano, raznovrsni ciljani delovi mogu biti korišćeni za pojačavanje preferencijalne interakcije takvih vehikuluma sa željenim tipovima ćelija ili pozicijama.

[0279] Uvođenje kompleksa, polipeptida i nukleinskih kiselina pronalaskla u ćelije, može se odvijati posredstvom virusne ili bacteriofagne infekcije, transfekcije, konjugacije, fuzije protoplasta, lipofekcije, elektroporacije, nukleofekcije, precipitacije kalcijum fosfata, polietileniminom (PEI)-posredovane transfekcije, DEAE-dekstranom posredovane transfekcije, liposomom posredovane transfekcije, tehnologije čestičnog pištolja, precipitacije kalcijum fosfata, direktne mikro-injekcije, nanočesticama posredovanog oslobađanja nukleinskih kiselina, i slično.

Oslobađanje

[0280] Polinukleotidne vodilje RNA (RNA ili DNA) i/ili polinukleotid ili polinukleotidi endonukleaza (RNA ili DNA) mogu biti oslobođeni posredstvom virusnih ili ne-virusnih sredstava za oslobađanje, poznatih u struci, kao što su: elektroporacija, mehanička sila, ćelijsko deformisanje (SQZ Biotech) i peptidi ćelijske penetracije. Alternativno, polipeptid ili polipeptidi endonukleaza mogu se osloboditi putem virusnih ili ne-virusnih sredstava za oslobađanje, poznatih u struci, kao što su elektroporacija ili lipidne nanočestice. U daljim alternativnim aspektima, endonukleaza DNA se može osloboditi u vidu jednog ili više polipeptida, ili zasebno ili u vidu prethodno formiranih kompleksa, sa jednom ili više vodilja RNA, ili sa jednom ili više crRNA, zajedno sa tracrRNA.

[0281] Elektroporacija je tehnika oslobađanja u kojoj se na jednu ili više ćelija aplikuje električno polje, kako bi se povećala permeabilnost ćelijske membrane, čime se omogućuje supstancama, kao što su lekovi, nukleinske kiseline (nukleinske kiseline koje ciljano deluju na genom), proteini (polipeptidi, usmereni ka položaju) ili RNP-i, da budu uvedene u ćeliju. Uopšteno, elektroporacija deluje na način da se propuštaju hiljade volti kroz raspone od jednog do dva milimetra suspendovanih ćelija u kiveti za elektroporaciju (1.0 - 1.5 kV, 250 – 750 V/cm).

[0282] Polinukleotidi se mogu osloboditi posredstvom ne-virusnih sredstava za oslobađanja, koji uključuju, ali bez ograničavanja na njih, nanočestice, liposome, ribonukleoproteine, peptide pozitivnog naelektrisanja, konjugate sa malim molekulima RNA, aptamer-RNA himere i komplekse RNA-fuzioni protein. Neki primeri ne-virusnih sredstava za oslobađanje opisani su u Peer i Lieberman, Gene Therapy, 18: 1127-1133 (2011) (sa fokusom na ne-virusna sredstva oslobađanja za siRNA, koji su, takođe, od koristi i za oslobađanje drugih polinukleotida).

[0283] Polinukleotidi, kao što su RNA vodilje, sgRNA i mRNA, koje kodiraju endonukleazu, mogu biti isporučeni u ćeliju ili pacijenta, posredstvom lipidnih nanočestica (LNP).

[0284] LNP se odnosi na bilo koju česticu, koja ima dijametar manji od 1000 nm, 500 nm, 250 nm, 200 nm, 150 nm, 100 nm, 75 nm, 50 nm ili 25 nm. Alternativno, veličina nanočestice se može kretati u rasponu od 1-1000 nm, 1-500 nm, 1-250 nm, 25-200 nm, 25-100 nm, 35-75 nm ili 25-60 nm.

[0285] LNP-i mogu biti izrađeni od katjonskih, anjonskih ili neutralnih lipida. Neutralni lipidi, kao što je fuzogeni fosfolipid DOPE ili holesterol, kao komponenta membrane, mogu biti uključeni u molekule LNP u vidu ’helper lipida’, kako bi se pojačala transfekciona aktivnost i stabilnost nanočestica. Ograničenja katjonskih lipida uključuju slabu efikasnost, zbog kratke stabilnosti i brzog klirensa, kao i zbog izazivanja inflamatornih ili antiinflamatornih odgovora.

[0286] LNP-i, takođe, mogu biti sastavljeni od hidrofobnih lipida, hidrofilnih lipida ili i od hidrofobnih i od hidrofilnih lipida.

[0287] Bilo koji lipid ili kombinacija lipida, koji su poznati u ovoj oblasti, mogu biti korišćeni za izradu LNP. Primeri lipida, koji se koriste za proizvodnju LNP-a su: DOTMA, DOSPA, DOTAP, DMRIE, DC-holesterol, DOTAP-holesterol, GAP-DMORIEDPyPE i GL67A-DOPE-DMPE-polietilen glikol (PEG). Primeri katjonskih lipida su: 98N12-5, C12-200, DLinKC2-DMA (KC2), DLin-MC3-DMA (MC3), XTC, MD1 i 7C1. Primeri neutralnih lipda su: DPSC, DPPC, POPC, DOPE i SM. Primeri lipida modifikovanih PEG-om su: PEG-DMG, PEG-CerC14 i PEG-CerC20.

[0288] Lipidi mogu biti kombinovani u bilo kom brojčano izraženom molarnom odnosu, da bi se proizveo LNP. Pored toga, polinukleotid ili polinukleotidi mogu biti kombinovani sa lipidom ili lipidima u širokom rasponu molarnih odnosa, da bi se proizveo LNP.

[0289] Kako je ranije navedeno, svaki od polipeptida, usmerenog ka položaju i nukleinske kiselčine sa ciljanim delovanjem na genom, mogu biti primenjeni na ćeliju ili pacijenta, zasebno. S druge strane, polipeptid, usmeren ka položaju može prethodno vezan u kompleks sa jednom ili više vodilja RNA, ili sa jednom ili više crRNA, zajedno sa tracrRNA. Materijal, koji je prethodno vezan u kompleks, može, zatim, biti primenjen na ćeliju ili pacijenta. Takav materijal, prethodno vezan u kompleks, poznat je kao ribonukleoproteinska čestica (RNP).

[0290] RNA je u stanju da obrazuje specifične interakcije sa RNA ili DNA. Budući da je ova karakteristika korišćena u mnogim biološkim procesima, ona se, takođe, javlja sa rizikom od slobodnih interakcija u ćelijskom okruženju, bogatom nukleinskom kiselinom. Jedno rešenje ovog problema čini obrazovanje ribonukleoproteinskih čestica (RNP-i), u kojima je RNA prethodno vezana u kompleks sa endonukleazom. Druga korist od primene RNP-a je zaštita RNA od razgradnje.

[0291] Endonukleaza u RNP može biti modifikovana ili nemodifikovana. Isto tako, gRNA, crRNA, tracrRNA ili sgRNA mogu biti modifikovani ili nemodifikovani. Brojne modifikacije su poznate u ovoj oblasti i mogu se koristiti.

[0292] Endonukleaza i sgRNA se, uopšteno, mogu kombinovati u molarnom odnosu 1:1. Alternativno, endonukleaza, crRNA i tracrRNA se, uopšteno, mogu kombinovati u molarnom odnosu 1:1:1. Može se, međutim, koristiti široki raspon molarnih odnosa za proizvodnju RNP-a.

[0293] Rekombinantni adeno-vezani virusni (AAV) vektor može biti korišćen za isporučivanje. Tehnike za proizvodnju rAAV čestica, u kojima bi bio upakovan genom AAV, koji uključuje polinukleotid koji treba isporučiti, rep i cap gene, kao i funkcije helper virusa, obezbeđene za ćeliju, standardne su procedure u ovoj oblasti. Proizvodnja rAAV obično zahteva prisustvo sledećih komponenti unutar pojedinačne ćelije (ovde označena kao packaging ćelija): rAAV genom, AAV rep i cap geni, odvojeni od (tj., nisu prisutni unutar) rAAV genoma i funkcije helper virusa. AAV rep i cap geni mogu biti iz bilo kog AAV serotipa, za koji može biti proizveden rekombinantni virus, a mogu biti i iz AAV serotipova, koji se razlikuju od rAAV genoma ITR-a, uključujući, ali bez ograničavanja na njih, AAV serotipove AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10, AAV-11, AAV-12, AAV-13 i AAV rh.74. Proizvodnja pseudotipova rAAV izložena je, primera radi, u International patent aplication publication broj WO 01/83692. Vidi Tabelu 2.

Tabela 2

[0294] Postupak proizvodnje packaging cell uključuje stvaranje ćelijske linije, koja stabilno ekspresuje sve neophodne komponente za proizvodnju AAV čestica. Na primer, plazmid (ili više plazmida), koji sadrži rAAV genom, bez AAV rep i cap gena, AAV rep i cap geni, odvojeni od rAAV genoma, i selektivni marker, kao što je gen rezistencije na neomicin, ugrađeni su u genom ćelije. AAV genomi se uvode u bakterijske plazmide, posredstvom procedura, kao što su GC tailing (Samulski et al., 1982, Proc. Natl. Acad. S6. USA, 79:2077-2081), adicija sintetskih linkera, koji sadrže restrikcione položaje otcepljivanja endonukleaze (Laughlin et al., 1983, Gene, 23:65-73) ili putem direktnog povezivanja tupog kraja (Senapathy & Carter, 1984, J. Biol. Chem., 259:4661-4666). packaging ćelijske linije mogu, zatim, biti inficirane helper virusom, kao što je adenovirus. Prednost ovog postupka je da je ćelije moguće selektovati, i pogodne su za proizvodnju rAAV velikih razmera. Ostali primeri pogodnih postupaka idu sa korišćenjem adenovirusa ili bakulovirusa, pre nego plazmida, za uvođenje rAAV genoma i/ili rep i cap gena u packaging cells.

[0295] Opšti principi proizvodnje rAAV prikazani su, na primer u: Carter, 1992, Current Opinions in Biotechnology, 1533-539; i Muzyczka, 1992, Curr. Topics in Microbial. and Immunol., 158:97-129). Razni pristupi su opisani u: Ratschin et al., Mol. Cell. Biol.

4:2072 (1984); Hermonat et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6466 (1984); Tratschin et al., Mo1. Cell. Biol. 5:3251 (1985); McLaughlin et al., J. Virol., 62:1963 (1988); i Lebkowski et al., 1988 Mol. Cell. Biol., 7:349 (1988). Samulski et al. (1989, J. Virol., 63:3822-3828); U.S. Patentu No. 5,173,414; WO 95/13365 i odgovarajućem U.S. Patentu No. 5,658.776; WO 95/13392; WO 96/17947; PCT/US98/18600; WO 97/09441 (PCT/US96/14423); WO 97/08298 (PCT/US96/13872); WO 97/21825 (PCT/US96/20777); WO 97/06243 (PCT/FR96/01064); WO 99/11764; Perrin et al. (1995) Vaccine 13:1244-1250; Paul et al. (1993) Human Gene Therapy 4:609-615; Clark et al. (1996) Gene Therapy 3:1124-1132; U.S. Patentu. No.5,786,211; U.S. Patentu No.

5,871,982 i U.S. Patentu. No.6,258,595.

[0296] Serotipovi AAV vektora mogu biti usklađeni sa tipovima ciljnih ćelija. Primera radi, sledeći primeri tipova ćelija mogu biti preneseni transdukcijom od strane naznačenih serotipova AAV, između ostalih. Vidi Tabelu 3.

Tabela 3

[0297] Pored adeno-vezanih virusnih vektora, i drugi virusni vektori mogu biti korišćeni. Takvi virusni vektori uključuju, ali bez ograničavanja na njih, lentivirus, alfavirus, enterovirus, pestivirus, bakulovirus, herpesvirus, Epstein Barr virus, papovavirus, poksvirus, virus vakcinije i herpes simpleks virus.

[0298] U nekim slučajevima, svaki od navedenih: Cas9 mRNA, sgRNA, koja ciljano deluje na jedan ili dva lokusa unutar ili u blizini gena BCL11A, ili druga sekvenca DNA, koja kodira regulatorni element gena BCL11A, i donorska DNA, može biti zasebno formulisan u lipidne nanočestice, ili svi bivaju ko-formulisani unutar jedne lipidne nanočestice.

[0299] u nekim slučajevima, mRNA Cas9 može biti formulisana u lipidnoj nanočestici, dok sgRNA i donorska DNA mogu biti isporučeni u AAV vektoru.

[0300] Postoje raspoložive opcije za isporučivanje endonukleaze Cas9, u vidu DNA plazmida, u vidu mRNA ili u vidu proteina. RNA vodilja može biti ekspresovana iz iste DNA, ili, isto tako, može biti isporučena kao RNA. RNA može biti hmijski modifikovana, kako bi se izmenio ili poboljšao njen polu-život, ili smanjila verovatnoća ili stepen imunog odgovora. Protein endonukleaze može biti vezan u kompleks sa gRNA, pre isporuke. Virusni vektori omogućuju efikasnu isporuku; split verzije Cas9 i manji ortolozi Cas9 mogu biti zapakovani u AAV, budući da mogu biti donori HDR. Postoje, takođe, brojni postupci ne-virusnog isporučivanja, kojima se može isporučiti svaka od navedenih komponenti, ili se ne-virusni i virusni postupci mogu koristiti zajedno. Na primer, nanočestice se mogu koristiti za isporuku proteina i RNA vodilje, dok se AAV može koristiti za isporuku donorske DNA.

Genetski modifikovane ćelije

[0301] Izraz "genetski modifikovana ćelija" se odnosi na ćeliju koja ima najmanje jednu genetsku modifikaciju uvedenu editovanjem genoma (npr., primenom CRISPR/Cas9/Cpf1 sistema). U nekim ovdašnjim ex vivo primerima, genetski modifikovana ćelija može biti genetski modifikovana progenitorska ćelija. U nekim ovdašnjim in vivo primerima, genetski modifikovana ćelija može biti genetski modifikovana hematopoetska progenitorska ćelija. Ovde se posmatra genetski modifikovana ćelija koja sadrži egzogenu genom-ciljanu nukleinsku kiselinu i/ili egzogenu nukleinsku kiselinu koja kodira genom-ciljanu nukleinsku kiselinu.

[0302] Izraz "kontrolno tretirana populacija" opisuje populaciju ćelija koja je bila tretirana sa identičnim medijumom, virusnom indukcijom, sekvencama nukleinske kiseline, temperaturom, konfluencijom, veličinom suda, pH, itd., sa izuzetkom dodavanja komponenti editovanja genoma. Može se upotrebiti bilo koji poznati postupak u ovoj stručnoj oblasti da bi se izmerila modulacija ili inaktivacija transkripcione kontrolne sekvence BCL11A gena ili ekspresije proteina ili aktivnosti, na primer, analiza Western Blot proteina transkripcione kontrolne sekvence BCL11A gena ili kvantitativno određivanje transkripcione kontrolne sekvence BCL11A gena mRNA.

[0303] Izraz "izolovana ćelija" se odnosi na ćeliju koja je uklonjena iz organizma u kojem se originalno nalazila, ili se odnosi na potomka takve ćelije. Opciono, ćelija se može uzgojiti in vitro, npr., pod definisanim uslovima ili u prisustvu drugih ćelija. Opciono, ćelija se kasnije može uneti u drugi organizam ili ponovo uneti u organizam iz kog je (ili ćeliju od koje vodi poreklo) izolovana.

[0304] Izraz "izolovana populacija" kada se odnosi na izolovanu populaciju ćelija se odnosi na populaciju ćelija koja je uklonjena i izdvojena iz mešavine ili heterogene populacije ćelija. U nekim slučajevima, izolovana populacija može biti suštinski čista populacija ćelija, u poređenju sa heterogenom populacijom iz koje su ćelije izolovane ili brojčano uvećane. U nekim slučajevima, izolovana populacija može biti izolovana populacija humanih progenitorskih ćelija, npr., suštinski čista populacija humanih progenitorskih ćelija, u poređenju sa heterogenom populacijom ćelija koja sadrži humane progenitorske ćelije i ćelije od kojih humane progenitorske ćelije nastaju.

[0305] Izraz "suštinski uvećan," kada se odnosi na posebnu ćelijsku populaciju, odnosi se na populaciju ćelija u kojoj je pojavljivanje naročite vrste ćelija uvećano u odnosu na prethodno postojanje ili referentne nivoe, za najmanje 2-puta, najmanje 3-, najmanje 4-, najmanje 5-, najmanje 6-, najmanje 7-, najmanje 8-, najmanje 9, najmanje 10-, najmanje 20-, najmanje 50-, najmanje 100-, najmanje 400-, najmanje 1000-, najmanje 5000-, najmanje 20000-, najmanje 100000- ili više puta zavisno od, npr., željenog nivoa takvih ćelija za ublažavanje hemoglobinopatije.

[0306] Izraz "suštinski obogaćen" kada se odnosi na posebnu ćelijsku populaciju, odnosi se na populaciju ćelija koja uzimajući u obzir ćelije čini za najmanje oko 10%, oko 20%, oko 30%, oko 40%, oko 50%, oko 60%, oko 70% ili više ukupnu ćelijsku populaciju.

[0307] Izraz "suštinski čist" kada se odnosi na posebnu ćelijsku populaciju, odnosi se na populaciju ćelija koja uzimajući u obzir ćelije čini za najmanje oko 75%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, ili najmanje oko 95% čistu ukupnu ćelijsku populaciju. To jest, izrazi "suštinski čist" ili "suštinski prečišćen," kada se odnosi na populaciju progenitorskih ćelija, odnosi se na populaciju ćelija koje imaju manje od otprilike 20%, otprilike 15%, otprilike 10%, otprilike 9%, otprilike 8%, otprilike 7%, otprilike 6%, otprilike 5%, otprilike 4%, otprilike 3%, otprilike 2%, otprilike 1%, ili manje od 1%, ćelija koje nisu progenitorske ćelije, kako je ovde izrazima definisano.

Diferencijacija genom-editovanih iPSCs u hematopoetske progenitorske ćelije

[0308] Drugi korak ex vivo postupaka ovog izlaganja može obuhvatiti diferenciranje genom-editovanih iPSCs u hematopoetske progenitorske ćelije. Korak diferencijacije se može izvesti prema bilo kom poznatom u struci postupku.

Diferencijacija genom-editovanih mezenhimalnih matičnih ćelija u hematopoetske progenitorske ćelije

[0309] Još jedan korak ex vivo postupaka ovog izlaganja može obuhvatiti diferenciranje genom-editovanih mezenhimalnih matičnih ćelija u hematopoetske progenitorske ćelije. Korak diferencijacije se može izvesti prema bilo kom poznatom u struci postupku.

Implantacija ćelija u pacijente

[0310] Još jedan korak ex vivo postupaka ovog izlaganja može obuhvatiti implantaciju ćelija u pacijente. Ovaj korak implantacije se može ostvariti primenom ma kog potupka implantacije koji je poznat u ovoj stručnoj oblasti. Na primer, genetski modifikovane ćelije se mogu direktno injektovati u krv pacijenta ili se na drugi način primeniti pacijentu. Genetski modifikovane ćelije se mogu prečistiti ex vivo primenom odabranih markera.

Farmaceutski prihvatljivi nosači

[0311] Ovde razmatrani ex vivo postupci primenjivanja progenitorskih ćelija subjektu mogu uključivati primenu terapeutskih kompozicija koje sadrže progenitorske ćelije.

[0312] Terapeutske kompozicije mogu sadržavati nosače koji su fiziološki podnošljivi zajedno sa ćelijskom kompozicijom, i eventualno najmanje jedan dodatni bioaktivni agens kako je ovde opisano, koji su rastvoreni ili dispergovani u njoj kao i aktivni sastojak. U nekim slučajevima, terapeutska kompozicija suštinski nije imunogena kada se primeni pacijentu sisaru ili čoveku u terapeutske svrhe, sem ukoliko to nije poželjno.

[0313] Generalno, ovde opisane progenitorske ćelije se mogu primeniti u vidu suspenzije sa farmaceutski prihvatljivim nosačem. Stručno lice u ovoj oblasti će prepoznati da farmaceutski prihvatljiv nosač koji će se koristiti u ćelijskoj kompoziciji neće uključivati pufere, jedinjenja, kriokonzervansna sredstva, konzervanse, ili druga sredstva u količinama koje suštinski interferiraju sa vijabilnošću ćelija koje treba da se isporuče subjektu. Formulacija koja sadrži ćelije može uključiti npr., osmotske pufere koji omogućavaju održavanje integriteta ćelijske membrane, i opciono, nutrijente za održavanje ćelijskog vijabiliteta ili uvećanje usađivanja tokom primenjivanja. Ovakve formulacije i suspenzije su poznate stručnim licima u ovoj oblasti i/ili mogu da se prilagode za primenjivanje progenitorskih ćelija, kako su ovde opisane, rutinskim eksperimentisanjem.

[0314] Ćelijska kompozicija isto tako može da bude emulzifikovana ili izvedena u vidu lipozomne kompozicije, uz uslov da postupak emulgovanja ne utiče negativno na ćelijsku vijabilnost. Ćelije i bilo koji drugi aktivan sastojak mogu da se pomešaju sa podlogama koje su farmaceutski prihvatljive i kompatibilne sa aktivnim sastojkom, i u količinama pogodnim za primenu u ovde opisanim terapeutskim postupcima.

[0315] Dodatni agensi koji su obuhvaćeni ćelijskom kompozicijom mogu uključiti farmaceutski prihvatljive soli komponenata u njoj. Farmaceutski prihvatljive soli obuhvataju kisele adicione soli (formirane sa slobodnim amino grupama polipeptida) koje se formiraju sa neorganskim kiselinama, kao što su, na primer, hlorovodonična ili fosforna kiselina, ili takvim organskim kiselinama kao što su sirćetna, vinska, bademova i slične. Soli koje su obrazovane od slobodnih karboksilnih grupa takođe mogu da budu izvedene od neorganskih baza, kao što su, na primer, natrijum, kalijum, amonijum, kalcijum ili gvožđe hidroksida, i takvih organskih baza, kao što su izopropilamin, trimetilamin, 2-etilamino etanol, histidin, prokain i slične.

[0316] Nosači koji su fiziološki podnošljivi su dobro poznati u struci. Primeri tečnih nosača su sterilni vodeni rastvori koji ne sadrže materijale pored aktivnih sastojaka i vode, ili sadrže pufer kao što je natrijum fosfat i imaju fiziološku vrednost pH, fiziološki rastvor ili oba, kao što je fosfatno puferovani fiziološki rastvor. Dalje, vodeni nosači mogu imati više od jedne puferujuće soli, kao i soli, kao što su natrijum i kalijum hloridi, dekstrozu, polietilen glikol i druge rastvorljive supstance. Tečne kompozicije isto tako mogu sadržavati tečne faze kao dodatne vodi i za isključivanje vode. Primeri takvih dodatnih tečnih faza su glicerin, biljna ulja, kao ulje semena pamuka, i voda-ulje emulzije. Količina aktivnog jedinjenja koja se koristi u ćelijskoj kompoziciji koja je efikasna u lečenju naročitog poremećaja ili stanja može zavisiti od prirode poremećaja ili stanja, i može se odrediti standardnim kliničkim tehnikama.

Primenjivanje i efikasnost

[0317] Izrazi "primenjivanje," "uvođenje" i "transplantiranje" se koriste jedan umesto drugog u kontekstu usađivanja ćelija, npr., progenitorskih ćelija, u subjekta, postupkom ili načinom koji dovodi do barem delimične lokalizacije uvedenih ćelija u željeni položaj, kao što je položaj povrede ili popravke, tako da se proizvodi(e) željeni efekat(i). Ćelije npr., progenitorske ćelije, ili njihovo diferencirano potomstvo mogu da se primene svakim odgovarajućim načinom koji dovodi do isporuke na željenu lokaciju u subjektu dok barem deo implantiranih ćelija ili komponenti ćelija ostaje održivo. Period vijabilnosti ćelija nakon primene subjektu može biti kratak, kao recimo nekoliko sati, npr., dvadeset četiri časa, do nekoliko dana, dugačak do čak nekoliko godina, ili čak sve dok je pacijent živ, tj., dugoročno usađivanje. Na primer, u nekim ovde opisanim aspektima, efektivna količina miogenih progenitorskih ćelija se primenjuje sistemskim načinom primenjivanja, kao što je intraperitonealni ili intravenozni način.

[0318] Izrazi "pojedinac", "subjekt," "domaćin" i "pacijent" se ovde koriste jedan umesto drugog i odnose se na ma koji subjekt kod kog se želi izvršiti dijagnostikovanje, tretman ili terapija. U nekim aspektima, subjekt je sisar. U nekim aspektima, subjekt je čovek.

[0319] Kada se obezbeđuju profilaktički, ovde opisane progenitorske ćelije mogu da se unapred primene subjektu, pre bilo kog simptoma hemoglobinopatije, npr., pre nego što se razvije umor, kratak dah, žutica, spori rast kasnog puberteta, bol u zglobovima, kostima i grudima, uvećana slezina i jetra. Prema tome, profilaktička primena populacije hematopoeznih progenitorskih ćelija služi sprečavanju hemoglobinopatije, kao što je B-talasemija ili bolest srpastih ćelija.

[0320] Kada se obezbeđuje terapeutski, hematopoezne progenitorske ćelije se obezbeđuju na (ili nakon) otpočinjanja simptoma ili indikacije hemoglobinopatije, npr., tokom otpočinjanja bolesti.

[0321] Populacija hematopoeznih progenitorskih ćelija, koja se primenjuje prema ovde opisanim postupcima, može da obuhvata alogene hematopoezne progenitorske ćelije koje su dobijene od jednog ili više donora. "Alogen" se odnosi na hematopoeznu progenitorsku ćeliju ili biološke uzorke koji sadrže hematopoezne progenitorske ćelije, dobijene od jednog ili više različitih donora iste vrste, gde geni na jednom ili više lokusa nisu identični. Na primer, populacija hematopoeznih progenitorskih ćelija koja se primenjuje subjektu može biti poreklom od od još jednog nesrodnog donorskog subjekta, ili od jednog ili više ne-identičnih braće i sestara. U nekim slučajevima, mogu se koristiti singenične populacije hematopoeznih progenitorskih ćelija, kao što su one koje se dobijaju od genetički identičnih životinja, ili od identičnih blizanaca. Hematopoezne progenitorske ćelije mogu biti autologne ćelije; to jest, hematopoezne progenitorske ćelije su dobijene ili izolovane od subjekta i primenjene istom subjektu, tj., donor i primaoc su isti.

[0322] Izraz "efektivna količina" se odnosi na količinu populacije progenitorskih ćelija ili njihovih potomaka koja je neophodna za prevenciju ili ublažavanje najmanje jednog ili više znakova ili simptoma hemoglobinopatije, i odnosi se na dovoljnu količinu kompozicije koja treba da obezbedi željeni efekat, npr., lečenje subjekta koji pati od hemoglobinopatije. Izraz "terapeutski efektivna količina" se dakle odnosi na količinu progenitorskih ćelija ili kompozicije koja sadrži progenitorske ćelije koja je dovoljna da podstakne naročiti efekat kada se primeni tipičnom subjektu, kao što je onaj koji ima ili je u riziku od hemoglobinopatije. Efektivna količina bi isto tako obuhvatala količinu dovoljnu za prevenciju ili odlaganje razvoja simptoma bolesti, izmenu toka simptoma bolesti (na primer ali bez ograničenja, usporavanje progresije simptoma bolesti), ili ukidanje simptoma bolesti. Razume se da za bilo koji dati slučaj, stručno lice u ovoj oblasti može odrediti odgovarajuću "efektivnu količinu" primenom rutinskog eksperimentisanja.

[0323] Za primenu u različitim ovde opisanim aspektima, efektivna količina<progenitorskih ćelija se sastoji od najmanje 102>progenitorskih ćelija, najmanje 5 x 10<2>progenitorskih ćelija, najmanje 10<3>progenitorskih ćelija, najmanje 5 x 10<3>progenitorskih ćelija, najmanje 10<4>progenitorskih ćelija, najmanje 5 x 10<4>progenitorskih ćelija, najmanje 10<5>progenitorskih ćelija, najmanje 2 x 10<5>progenitorskih ćelija, najmanje 3 x 10<5>progenitorskih ćelija, najmanje 4 x 10<5>progenitorskih ćelija, najmanje 5 x 10<5>progenitorskih ćelija, najmanje 6 x 10<5>progenitorskih ćelija, najmanje 7 x 10<5>progenitorskih ćelija, najmanje 8 x 10<5>progenitorskih ćelija, najmanje 9 x 10<5>progenitorskih ćelija, najmanje 1 x 10<6>progenitorskih ćelija, najmanje 2 x 10<6>progenitorskih ćelija, najmanje 3 x 10<6>progenitorskih ćelija, najmanje 4 x 10<6>progenitorskih ćelija, najmanje 5 x 10<6>progenitorskih ćelija, najmanje 6 x 10<6>progenitorskih ćelija, najmanje 7 x 10<6>progenitorskih ćelija, najmanje 8 x 10<6>progenitorskih ćelija, najmanje 9 x 10<6>progenitorskih ćelija, ili višestruki njihov broj. Progenitorska ćelija može da vodi poreklo od jednog ili više donora, ili se može dobiti iz autolognog izvora. U nekim ovde opisanim primerima, progenitorske ćelije se mogu razvijati u kulturi pre nego što se primene subjektu kome je to neophodno.

[0324] "Primenjivanje" se odnosi na isporučivanje kompozicije progenitorskih ćelija subjektu postupkom ili načinom koji dovodi do barem delimične lokalizacije ćelijske kompozicije u željenom položaju. Ćelijska kompozicija se može primeniti bilo kojim odgovarajućim načinom koji dovodi do efikasnog tretmana subjekta, tj. primenjivanje dovodi do isporučivanja na željenu lokaciju u subjektu gde se barem deo isporučene kompozicije, tj. najmanje 1 x 10<4>ćelija isporučuje u željenom položaju za određeni period vremena. Načini primenjivanja obuhvataju: injekciju, infuziju, instilaciju, ili ingestiju. "Injekcija" uključuje, bez ograničenja, intravensku, intramuskularnu, intraarterijalnu, intratekalnu, intraventrikularnu, intrakapsularnu, intraorbitalnu, intrakardijačnu, intradermalnu, intraperitonealnu, transtrahealnu, subkutanu, subkutikularnu, intraartikularnu, subkapsularnu, subarahnoidnu, intraspinalnu, intracerebrospinalnu, i intrasternalnu injekciju i infuziju. U nekim primerima, način je intravenozni. Za isporučivanje ćelija, može se izvesti primena injekcije ili infuzije.

[0325] Ćelije se mogu primeniti sistemski. Izrazi "sistemsko primenjivanje," "primenjivanje sistemski", "periferna primena" i "primenjivanje periferno" se odnose na primenjivanje populacije progenitorskih ćelija koje se razlikuje od direktnog primenjivanja u ciljni položaj, tkivo, ili organ, tako da umesto toga ona ulazi u sistemsku cirkulaciju subjekta i na taj način je podvrgnuta metabolizmu i drugim sličnim procesima.

[0326] Stručan kliničar može odrediti efikasnost tretmana koji uključuje kompoziciju za lečenje hemoglobinopatija. Ipak, tretman se smatra "efikasnim tretmanom," ukoliko se neki ili svi znaci ili simptomi, samo kao jedan primer, nivoa funkcionalnog BCL11A i funkcionalnog HbF izmene na koristan način (npr., smanje za najmanje 10% za BCL11A i/ili povećaju za najmanje 10% za HbF), ili se drugi klinički prihvaćeni simptomi ili markeri bolesti poboljšaju ili ublaže. Efikasnost se takođe može meriti insuficijencijom pojedinca do pogoršanja što se procenjuje hospitalizacijom ili potrebom za medicinskom intervencijom (npr., progresija bolesti se obuzdava ili bar usporava). Postupci za merenje ovih indikatora su poznati stručnim licima u ovoj oblasti i/ili su ovde opisani. Tretman uključuje svaki tretman bolesti kod pojedinca ili životinje (neki primeri koji nisu ograničavajući uključuju čoveka, ili sisara) i obuhvata: (1) inhibisanje bolesti, npr., zaustavljanje, ili usporavanje progresije simptoma; ili (2) slabljenje bolesti, npr., dovodeći do regresije simptoma; i (3) sprečavanje ili smanjivanje verovatnoće razvoja simptoma.

[0327] Tretman prema ovom izlaganju može poboljšati jedan ili više simptoma koji su povezani sa hemoglobinopatijama snižavanjem količine funkcionalnog BCL11A i/ili povećavanjem količine funkcionalnog HbF kod pojedinca. Rani znaci, koji se tipično povezuju sa hemoglobinopatijama uključuju na primer, umor, kratak dah, žuticu, spori rast kasnog puberteta, bol u zglobovima, kostima i grudima, uvećanje slezine i jetre.

Pakovanja

[0328] Ovo izlaganje prikazuje pakovanja/komplete (engl., ”kits”) za izvođenje ovde opisanih postupaka. Pakovanje može uključiti jednu ili više nukleinskih kiselina koje ciljaju genom, polinukleotid koji kodira nukleinsku kiselinu koja cilja genom, položajno usmereni polipeptid, polinukleotid koji kodira položajno usmereni polipeptid, i/ili ma koju nukleinsku kiselinu ili proteinski molekul neophodnih za izvođenje aspekata ovde opisanih postupaka, ili bilo koje njihove kombinacije.

[0329] Pakovanje može uključiti: (1) vektor koji obuhvata nukleotidnu sekvencu koja kodira nukleinsku kiselinu koja cilja genom, (2) položajno usmereni polipeptid ili vektor koji obuhvata nukleotidnu sekvencu koja kodira položajno usmereni polipeptid, i (3) reagens za rekonstituisanje i/ili razblaživanje vektora i/ili polipeptida.

[0330] Pakovanje može uključiti: (1) vektor koji obuhvata (i) nukleotidnu sekvencu koja kodira nukleinsku kiselinu koja cilja genom, i (ii) nukleotidnu sekvencu koja kodira položajno usmereni polipeptid; i (2) reagens za rekonstituisanje i/ili razblaživanje vektora.

[0331] U ma kojem od gornjih pakovanja, pakovanje može da sadrži jedno-molekularnu vodič nukleinsku kiselinu koja cilja genom. U ma kojem od gornjih pakovanja, pakovanje može da sadrži dvostruko-molekularnu vodič nukleinsku kiselinu koja cilja genom. U ma kojem od gornjih pakovanja, pakovanje može da sadrži dva ili više dvostrukomolekularnih vodiča ili jedno-molekularnih vodiča. Pakovanja mogu da sadrže vektor koji kodira nukleinsku kiselinu koja cilja nukleinsku kiselinu.

[0332] U ma kojem od gornjih pakovanja, pakovanje može dalje da sadrži polinukleotid koji treba da se uvede da bi doveo do željene genetičke modifikacije.

[0333] Komponente pakovanja mogu biti u zasebnim kontejnerima, ili zajedno u jednom kontejneru.

[0334] Ma koje gore opisano pakovanje može dalje da sadrži jedan ili više dodatnih reagenasa, gde su takvi dodatni reagensi odabrani od pufera, pufera za uvođenje polipeptida ili polinukleotida u ćeliju, pufera za ispiranje, kontrolnog reagensa, kontrolnog vektora, kontrolnog RNA polinukleotida, reagensa za in vitro produkciju polipeptida od DNA, adaptera za sekvenciranje i sličnog. Pufer može biti stabilizacioni pufer, pufer za rekonstituisanje, pufer za razblaživanje, ili sličan. Pakovanje takođe može da sadrži jednu ili više komponenti koje se mogu upotrebiti za olakšavanje ili uvećavanje on-target vezivanja ili cepanja DNA od strane endonukleaze, ili poboljšanje specifičnosti ciljanja.

[0335] Sem gore pomenutih komponenti, pakovanje dalje može da sadrži instrukcije za upotrebu komponenti pakovanja za praktikovanje postupaka. Uputstva za praktikovanje postupaka mogu biti snimljena na prikladnom sredstvu za snimanje. Na primer, uputstva mogu biti odštampana na substratu, kao što je hartija ili plastika, itd. Uputstva mogu da se nalaze u pakovanjima u vidu inserata za pakovanja, na signaturama kontejnera u pakovanju ili tamošnjim komponentama (tj., zajedno sa ambalažom i podambalažom), itd. Instrukcije mogu da budu predstavljene u vidu fajla sa podacima za elektronsko čuvanje na pogodnom medijumu za čuvanje podataka koji se može kompjuterski pročitati, npr. CD-ROM, disketa, flash drive, itd. U nekim slučajevima, važeća uputstva se ne nalaze u pakovanju, ali mogu biti obezbeđeni načini za dobijanje uputstava iz udaljenog izvora (npr. preko interneta). Primer ovakvog slučaja je pakovanje koje sadrži web adresu gde se uputstva mogu pogledati i/ili sa koje se uputstva mogu presnimiti. Kao i sa uputstvima, ovi načini za dobijanje uputstava mogu biti zabeleženi na pogodnom substratu.

Formulacija RNA vodilje

[0336] RNAs vodilje ovog izlaganja mogu da se formulišu sa farmaceutski prihvatljivim podlogama kao što su nosači, rastvarači, stabilizatori, adjuvansi, diluenti, itd., u zavisnosti od načina primenjivanja i doznog oblika. Kompozicije RNA vodilje mogu da se formulišu tako da se postigne fiziološki kompatibilan pH, i raspon pH od oko 3 do pH od otprilike 11, oko pH 3 do otprilike pH 7, u zavisnosti od formulacije i puta primenjivanja. U nekim slučajevima, pH se može podesiti na raspon od otprilike pH 5.0 do oko pH 8. U nekim slučajevima, kompozicije mogu sadržavati terapeutski efektivnu količinu najmanje jednog jedinjenja kako je ovde opisano, zajedno sa jednom ili više farmaceutski prihvatljivih podloga. Opciono, kompozicije mogu sadržavati kombinaciju ovde opisanih jedinjenja, ili mogu uključiti drugi aktivan sastojak koristan za tretman ili prevenciju bakterijskog rasta (na primer i bez ograničenja, anti-bakterijske ili anti-mikrobne agense), ili može uključiti kombinaciju reagenasa ovog izlaganja.

[0337] Pogodne podloge obuhvataju, na primer, molekule nosače koji uključuju velike, makromolekule koji se sporo metabolišu, kao što su proteini, polisaharidi, polimlečene kiseline, poliglikolne kiseline, polimerne amino kiseline, kopolimere amino kiselina, i čestice inaktivnih virusa. Ostali primeri podloga mogu uključiti antioksidanse (na primer i bez ograničenja, askorbinska kiselina), helirajuća sredstva (na primer i bez ograničenja, EDTA), ugljene hidrate (na primer i bez ograničenja(na primer i bez ograničenja, dekstrin, hidroksialkilceluloza, i hidroksialkilmetilceluloza), stearinsku kiselinu, tečnosti (na primer i bez ograničenja, ulje, voda, slani rastvor, glicerol i etanol), vlažeća ili emulgujuća sredstva, supstance za puferovanje pH, i slično.

Ostali mogući terapeutski pristupi

[0338] Editovanje gena se može izvesti korišćenjem konstruisanih nukleaza tako da ciljaju specifične sekvence. Do danas, razlikujemo četiri glavne vrste nukleaza: meganukleaze i njihove derivate, cinkov prst nukleaze (ZFNs), efektorne nukleaze slične transkripcionom aktivatoru (TALENs), i CRISPR-Cas9 nukleazne sisteme. Platforme nukleaza variraju u teškoći dizajniranja, zbijenosti ciljanja i načinu dejstva, naročito zbog toga što je specifičnost ZFNs i TALENs kroz interakcije protein-DNA, dok RNA-DNA interakcije primarno vodi Cas9. Cas9 cepanje takođe zahteva susedni motiv, PAM, koji se razlikuje kod različitih CRISPR sistema. Cas9 iz Streptococcus pyogenes vrši cepanje korišćenjem NGG PAM, CRISPR iz Neisseria meningitidis može vršiti cepanje na položajima sa PAMs uključujući NNNNGATT, NNNNNGTTT i NNNNGCTT. Brojni drugi Cas9 ortologi ciljaju protospejser koji je susedan sa alternativnim PAMs.

[0339] CRISPR endonukleaze, kao što je Cas9, mogu da se koriste u postupcima ovog pronalaska. Međutim, ovde opisana predavanja, kao terapeutski ciljni položaji, mogla bi se primeniti na druge forme endonukleaza, kao što su ZFNs, TALENs, HEs, ili MegaTALs, ili korišćenjem kombinacija nukleaza. Ipak, u cilju primene predavanja ovog izlaganja na takve endonukleaze, trebalo bi, između ostalog, konstruisati proteine usmerene na specifične ciljne položaje.

[0340] Dodatni vezujući domeni se mogu fuzionisati na Cas9 protein u cilju povećanja specifičnosti. Ciljni položaji ovih konstrukcija bi mapirali do identifikovanog gRNA preciziranog položaja, ali bi zahtevale dodatne vezujuće motive, kao što su za domen cinkovog prsta. U slučaju Mega-TAL, meganukleaza može da se fuzioniše sa TALE DNA-vezujućim domenom. Domen meganukleaze može povećati specifičnost i obezbediti cepanje. Slično, inaktivirana ili mrtva Cas9 (dCas9) može da se fuzioniše sa domenom cepanja i zahteva sgRNA/Cas9 ciljni položaj i susedni vezujući položaj za fuzionisan DNAvezujući domen. Ovo bi verovatno zahtevalo izvesno proteinsko konstruisanje dCas9, pored katalitičke inaktivacije, da bi se umanjilo vezivanje bez dodatnog položaja vezivanja.

Nukleaze cinkovog prsta

[0341] Nukleaze cinkovog prsta (ZFNs) su modularni proteini izgrađeni od konstruisanog cinkov prst DNA vezujućeg domena povezanog sa katalitičkim domenom tip II endonukleaze Fokl. S obzirom da Fokl funkcioniše jedino kao dimer, mora se konstruisati par ZFNs da se vezuju za srodne ciljne sekvence "pola-položaja" na suprotnim DNA lancima i sa preciznim odstojanjem između njih da bi se omogućilo formiranje katalitički aktivnog Fokl dimera. Tokom dimerizacije Fokl domena, koji sam nema specifičnost sekvence per se, stvara se DNA dvo-lančani odlomak između ZFN pola-položaja kao inicijalni korak u editovanju genoma.

[0342] DNA vezujući domen svake ZFN se obično sastoji od 3-6 cinkovih prstiju obilne Cys2-His2 arhitekture, uz to da svaki prst primarno prepoznaje triplet nukleotida na jednom lancu ciljne DNA sekvence, iako može biti važna i unakrsno-lančana interakcija sa četvrtim nukleotidom. Izmene amino kiselina prsta u pozicijama koje prave ključne kontakte sa DNA menjaju specifičnost sekvence datog prsta. Tako, četvoroprsti cinkov prst protein će selektivno prepoznati 12 bp ciljnu sekvencu, gde je ciljna sekvenca mešavina triplet preferenci čemu doprinosi svaki prst, iako se na triplet preferencu može uticati u različitim stepenima od strane susednih prstiju. Važan aspekt ZFNs je da se one mogu lako ponovo usmeriti na skoro svaku genomsku adresu jednostavnom modifikacijom pojedinačnih prstiju, iako se zahteva znatna ekspertiza da bi se ovo dobro izvelo. U većini primena ZFNs, proteini sa 4-6 prstiju se koriste, koji prepoznaju 12 odnosno 18 bp. Otuda, par ZFNs će tipično prepoznati kombinovanu ciljnu sekvencu od 24-36 bp, neuključujući uobičajeni spejser od 5-7 bp između pola-položaja. Vezujući položaji dalje mogu biti razdvojeni velikim spejserima, uključiv 15-17 bp. Ciljna sekvenca ove dužine je verovatno jedinstvena u ljudskom genomu, predpostavljajući da su ponavljajuće sekvence ili genski homolozi isključeni tokom procesa dizajniranja. I pored toga, ZFN protein-DNA interakcije nisu apsolutne u svojoj specifičnosti tako da se događaji off-target vezivanja i cepanja javljaju, bilo u vidu heterodimera između dve ZFNs, bilo u vidu homodimera jedne ili druge ZFNs. Ova poslednja mogućnost je efektivno eliminisana konstruisanjem interfejsa dimerizacije Fokl domena kako se kreiraju "plus" i "minus" varijante, takođe poznate kao obavezne heterodimerne varijante, koje mogu da se dimerizuju samo jedna sa drugom, a ne same sa sobom. Forsiranjem obaveznih heterodimera sprečava formiranje homodimera. Ovo je u mnogome uvećalo specifičnost ZFNs, kao i ma koje druge nukleaze koja usvaja ove Fokl varijante.

[0343] U struci su opisani brojni sistemi na bazi ZFN, njihove modifikacije su regularno beležene, i brojne reference opisuju pravila i parametre koji se koriste kao vodiči dizajniranja ZFNs; vidi, npr., Segal et al., Proc Natl Acad Sci USA 96(6):2758-63 (1999); Dreier B et al., J Mol Biol.303(4):489-502 (2000); Liu Q et al., J Biol Chem.277(6):3850-6 (2002); Dreier et al., J Biol Chem 280(42):35588-97 (2005); i Dreier et al., J Biol Chem.

276(31):29466-78 (2001).

Efektorne nukleaze slične transkripcionom aktivatoru (TALENs)

[0344] TALENs predstavljaju drugi format modularnih nukleaza pri čemu, kao što je slučaj i sa ZFNs, konstruisani DNA vezujući domen je povezan sa Fokl nukleaznim domenom, i par TALENs funkcioniše u tandemu kako bi postigle cepanje ciljne DNA. Glavna razlika od ZFNs jeste priroda DNA vezujućeg domena i povezana svojstva prepoznavanja ciljne DNA sekvence. TALEN DNA vezujući domen potiče od TALE proteina, koji su originalno opisani kod bakterijskog patogena biljaka Xanthomonas sp. TALEs su izgrađene od tandemskih nizova od 33-35 aminokiselinskih ponovaka, uz to da svaki ponovak prepoznaje jedan par baza u sekvenci ciljne DNA koji je obično do 20 bp dužine, dajući ukupnu dužinu ciljne sekvence i do 40 bp. Nukleotidna specifičnost svakog ponovka je određena di-ostatkom ponavljane promenljive (RVD), koji obuhvata samo dve amino kiseline na položajima 12 i 13. Baze guanin, adenin, citozin i timin se pretežno prepoznaju pomoću četiri RVDs: Asn-Asn, Asn-Ile, His-Asp odnosno Asn-Gly. Ovo čini daleko jednostavniji kod prepoznavanja nego što je onaj za cink prste, i tako predstavlja prednost nad ovim drugim u dizajniranju nukleaza. Ipak, kao i sa ZFNs, protein-DNA interakcije TALENs nisu apsolutne u svojoj specifičnosti, i TALENs su imale koristi od upotrebe obaveznih heterodimernih varijanti Fokl domena da bi se smanjila offtarget aktivnost.

[0345] Kreirane su dodatne varijante Fokl domena koje se deaktiviraju u svojoj katalitičkoj funkciji. Ukoliko jedna polovina bilo TALEN ili ZFN para sadrži inaktivan Fokl domen, onda će se javiti samo cepanje jednog lanca DNA (nicking-zarezivanje) na ciljnom položaju, pre nego DSB. Ishod se može uporediti sa primenom CRISPR/Cas9/Cpf1 "nikaza" mutanata kod kojih je jedan od Cas9 domena cepanja deaktiviran. DNA zarezi se mogu koristiti za vođenje editovanja genoma putem HDR, ali sa manjom efikasnošću nego sa DSB. Glavna korist je ta što se off-target zarezi brzo i tačno popravljaju, za razliku od DSB, koji su skloni NHEJ-posredovanom pogrešnom popravljanju.

[0346] U struci su opisani brojni sistemi na bazi TALEN, i njihove modifikacije su regularno beležene; vidi, npr., Boch, Science 326(5959):1509-12 (2009); Mak et al., Science 335(6069):716-9 (2012); i Moscou et al., Science 326(5959):1501 (2009). Korišćenje TALENs na bazi "Golden Gate" platforme, ili šeme kloniranja, opisalo je više grupa; vidi, npr., Cermak et al., Nucleic Acids Res. 39(12):e82 (2011); Li et al., Nucleic Acids Res. 39(14):6315-25(2011); Weber et al., PLoS One. 6(2):e16765 (2011); Wang et al., J Genet Genomics 41(6):339-47, Epub 2014 May 17 (2014); i Cermak T et al., Methods MolBiol.1239:133-59 (2015).

Ciljajuće endonukleaze

[0347] Ciljajuće endonukleaze (HEs) su sekvencno-specifične endonukleaze koje imaju duge sekvence prepoznavanja (14-44 baznih parova) i cepaju DNA sa velikom specifičnošću – često na jedinstvenim položajima u genomu. Postoji bar šest poznatih familija HEs kako su klasifikovane prema svojoj strukturi, uključujući LAGLIDADG (SEQ ID NO. 71,949), GIY-YIG, His-Cis box, H-N-H, PD-(D/E)xK, i Vsr-slična koje vode poreklo od širokog raspona domaćina, uključujući eukariote, protiste, bakterije, arhea, cijanobakterije i fage. Kao i sa ZFNs i TALENs, HEs se mogu koristiti za kreiranje DSB na ciljnom lokusu kao inicijalni korak u editovanju genoma. Dodatno, neke prirodne kao i konstruisane HEs seku samo jedan lanac DNA, na koji način funkcionišu kao položajno specifične nikaze. Velika ciljna sekvenca HEs i specifičnost koju nude čine ih atraktivnim kandidatima za kreiranje položajno-specifičnih DSBs.

[0348] U struci su opisani brojni sistemi na bazi HE, i njihove modifikacije su regularno beležene; vidi, npr., prikaze Steentoft et al., Glycobiology 24(8):663-80 (2014); Belfort and Bonocora, Methods Mol Biol. 1123:1-26 (2014); Hafez and Hausner, Genome 55(8):553-69 (2012); i reference koje su tu navedene.

MegaTAL / Tev-mTALEN / MegaTev

[0349] Sledeći primeri hibridnih nukleaza, MegaTAL platforma i Tev-mTALEN platforma koriste fuziju TALE DNA vezujućih domena i katalitički aktivnih HEs, iskoristivši i uskladljivo DNA vezivanje i specifičnost TALE, kao i specifičnosti sekvence cepanja u HE; vidi, npr., Boissel et al., NAR 42: 2591-2601 (2014); Kleinstiver et al., G34:1155-65 (2014); i Boissel and Scharenberg, Methods Mol. Biol.1239: 171-96 (2015).

[0350] U sledećoj varijaciji, MegaTev arhitektura jeste fuzija meganukleaze (Mega) sa domenom nukleaze izvedenom iz GIY-YIG ciljajuće endonukleaze I-Tevl (Tev). Dva aktivna položaja su pozicionirana ~30 bp odvojeno na DNA supstratu i stvaraju dva DSBs sa ne-kompatibilnim kohezivnim krajevima; vidi, npr., Wolfs et al., NAR 42, 8816-29 (2014). Očekuje se da će se druge kombinacije postojećih pristupa na bazi nukleaza razviti i da će biti korisne za dostizanje ciljnih modifikacija genoma, koje su ovde opisane.

dCas9-Fokl ili dCpf1-Fok1 i druge nukleaze

[0351] Kombinovanje strukturnih i funkcionalnih svojstava gore opisanih platformi nukleaza nudi dalji pristup editovanju genoma koji potencijalno može prevazići neke od povezanih nedostataka. Kao primer, sistem CRISPR editovanja genoma obično koristi jednu Cas9 endonukleazu za kreiranje DSB. Specifičnost ciljanja se vodi sa 20 ili 24 nukleotidne sekvence u RNA vodilji koja podleže Watson-Crick sparivanju baza sa ciljnom DNA (plus dodatne 2 baze u susednoj NAG ili NGG PAM sekvenci u slučaju Cas9 iz S. pyogenes). Takva sekvenca je dovoljno dugačka da bude jedinstvena u genomu čoveka, ipak, specifičnost RNA/DNA interakcije nije apsolutna, uz značajan promiskuitet koji se ponekad toleriše, naročito u 5’ polovini ciljne sekvence, efikasno snižavajući broj baza koji vode specifičnost. Jedno rešenje za ovo je bilo da se u potpunosti deaktivira katalitička funkcija Cas9 ili Cpf1 – zadržavajući samo RNA-vođenu funkciju vezivanja DNA – i umesto fuzije Fokl domena sa deaktiviranim Cas9; vidi, npr., Tsai et al., Nature Biotech 32: 569-76 (2014); i Guilinger et al., Nature Biotech. 32:577-82 (2014). Kako se Fokl mora dimerizovati da bi postao katalitički aktivan, neophodne su dve RNAs vodilje za povezivanje dve Fokl fuzije u neposrednu blizinu kako se formira dimer i cepanje DNA. Ovo suštinski udvostručuje broj baza u kombinovanom ciljnom položaju, čime se povećava strogost ciljanja pomoću sistema na bazi CRISPR.

[0352] Kao sledeći primer, fuzija TALE DNA vezujućeg domena za katalitički aktivnu HE, kao što je I-Tevl, koristi prednosti i uskladljivo DNA vezivanje i specifičnosti TALE, kao i specifičnosti sekvence cepanja I-Tevl, sa očekivanjem da se off-target cepanje može dalje smanjiti.

Otkrivanje on- i off-target mutacija sekvenciranjem

[0353] Za sekvenciranje on-target položaja i pretpostavljenih off-target položaja, identifikovani su odgovarajući amplifikacioni prajmeri i podešene su reakcije sa ovim prajmerima korišćenjem genomske DNA koja je sakupljena pomoću QuickExtract DNA rastvora za ekstrakciju (Epicentre) od tretiranih ćelija tri dana post-transfekcije. Amplifikacioni prajmeri sadrže genski specifičan deo ojačan sa adapterima. 5’ kraj direktnog prajmera uključuje modifikovan vezujući položaj direktnogi (čitanje1) prajmera.

5’ kraj reverznog prajmera sadrži kombinovano modifikovani vezujući položaj reverznog (čitanje 2) i barkod prajmera, koji su u suprotnoj orjentaciji. Pojedinačne PCR reakcije su validirane razdvajanjem na agaroza gelovima, zatim prečišćavanjem i re-amplifikacijom. Direktni prajmeri drugog kruga sadrže Illumina P5 sekvencu, koju prati proporcija vezujućeg položaja modifikovanog direktnog (čitanje 1) prajmera. Reverzni prajmeri drugog kruga sadrže Illumina P7 sekvencu (na 5’ kraju), koju prati 6-baza barkoda i kombinovano modifikovani vezujući položaj reverznog (čitanje 2) i barkod prajmera. Amplifikacije drugog kruga su takođe proverene na agaroza gelovima, zatim prečišćavanjem, i kvantitativnim određivanjem korišćenjem NanoDrop spektrofotometra. Proizvodi amplifikacije su pulovani da se spari koncentracija i onda su podvrgnuti Emory Integrated Genomic core za pripremu biblioteke i sekvenciranje na Illumina Miseq aparatu.

[0354] Čitanja sekvenciranja su sačuvana pomoću barkoda i zatim prema referentnim sekvencama, dobijenim iz bioinformatike za svaki proizvod. Stope insercija i delecija u poređanim čitanjima sekvenciranja su detektovane u regionu pretpostavljenih položaja sečenja korišćenjem prethodno opisanog softvera; vidi, npr., Lin et al., Nucleic Acids Res., 42: 7473-7485 (2014). Nivoi insercija i delecija koji su otkriveni u ovom prozoru su onda upoređeni sa nivoom koji se viđa na istoj lokaciji u genomskoj DNA izolovanoj iz lažno transfektovanih ćelija kako bi se minimizovali efekti artefakata sekvenciranja.

Testovi za otkrivanje mutacije

[0355] Aktivnosti on- i off-target cepanja kombinacija Cas9 i RNA vodilje su merene korišćenjem stopa mutacija proizašlih iz nesavršene popravke dvo-lančanih odlomaka putem NHEJ.

[0356] On-target lokusi su amplifikovani upotrebom AccuPrime Taq DNA Polymerase High Fidelity (Life Technologies, Carlsbad, CA) prema instrukcijama proizvođača kroz 40 ciklusa (94°C, 30 s; 52-60°C, 30 s; 68°C, 60 s) u 50 µl reakcijama koje su sadržavale 1 µl ćelijskog lizata, i 1 µl od svakog 10 µM amplifikacionog prajmera. Izveden je test otkrivanja T7EI mutacije, po protokolu proizvođača [Reyon et al., Nat. Biotechnol., 30: 460-465 (2012)], sa digestijama razdvojenim na 2% agaroza gelovima i kvantitativno određivanje korišćenjem ImageJ [Guschin et al., Methods Mol. Biol., 649: 247-256 (2010)]. Testovima se odredio procenat insercija/delecija ("indela") u glavnom delu populacije ćelija.

Postupci i kompozicije

[0357] Prema tome, ovo izlaganje se, pre svega, odnosi na sledeće aspekte, koji nemaju ograničavajuć karakter: U prvom postupku, Postupak 1, ovo izlaganje obezbeđuje postupak za editovanje BCL11A gena u ljudskoj ćeliji preko editovanja genoma, postupak obuhvata korak: uvođenje u ljudsku ćeliju jedne ili više endonukleaze deoksiribonukleinske kiseline (DNA) da bi se proizveo jedan ili više jedno-lančanih odlomaka (SSBs) ili dvo-lančanih odlomaka (DSBs) unutar ili u blizini BCL11A gena ili druge DNA sekvence koja kodira regulatorni element BCL11A gena, a što dovodi do permanentne delecije, modulacije, ili inaktivacije transkripcione kontrolne sekvence BCL11A gena.

[0358] U drugom postupku, Postupku 2, ovo izlaganje obezbeđuje postupak za editovanje BCL11A gena u ljudskoj ćeliji preko editovanja genoma, kako je obezbeđeno u Postupku 1, pri čemu je transkripciona kontrolna sekvenca locirana unutar drugog introna BCL11A gena.

[0359] U drugom postupku, Postupku 3, ovo izlaganje obezbeđuje postupak za editovanje BCL11A gena u ljudskoj ćeliji preko editovanja genoma, kako je obezbeđeno u Postupku 1 ili 2, pri čemu je transkripciona kontrolna sekvenca locirana unutar 58 DNA hpersenzitivnog položaja (DHS) BCL11A gena.

[0360] U drugom postupku, Postupku 4, ovo izlaganje opisuje ex vivo postupak za tretman pacijenta sa hemoglobinopatijom, postupak obuhvata korake: kreiranje specifične indukovane pluripotentne matične ćelije (iPSC) pacijenta; editovanje unutar ili u blizini BCL11A gena ili druge DNA sekvence koja kodira regulatorni element BCL11A gena u iPSC; diferencijaciju genom-editovane iPSC u hematopoeznu progenitorsku ćeliju; i implantaciju hematopozne progenitorske ćelije pacijentu.

[0361] U drugom postupku, Postupku 5, ovo izlaganje opisuje ex vivo postupak za tretman pacijenta sa hemoglobinopatijom kako je opisano u Postupku 4, pri čemu korak kreiranja obuhvata: izolovanje somatske ćelije od pacijenta; kao i uvođenje seta pluripotentno-udruženih gena u somatsku ćeliju kako bi se somatska ćelija indukovala da postane pluripotentna matična ćelija.

[0362] U drugom postupku, Postupku 6, ovo izlaganje opisuje ex vivo postupak za tretman pacijenta sa hemoglobinopatijom kako je opisano u Postupku 5, pri čemu je somatska ćelija fibroblast.

[0363] U drugom postupku, Postupku 7, ovo izlaganje opisuje ex vivo postupak za tretman pacijenta sa hemoglobinopatijom kako je opisano u Postupku 5 ili 6, pri čemu set pluripotentno-udruženih gena je jedan ili više gena odabranih iz grupe koju čine: OCT4, SOX2, KLF4, Lin28, NANOG i cMYC.

[0364] U drugom postupku, Postupku 8, ovo izlaganje opisuje ex vivo postupak za tretman pacijenta sa hemoglobinopatijom kako je opisano u ma kom od Postupaka 4-7, pri čemu korak editovanja obuhvata uvođenje u iPSC jedne ili više endonukleaze deoksiribonukleinske kiseline (DNA) da bi se proizveo jedan ili više jedno-lančanih odlomaka (SSBs) ili dvo-lančanih odlomaka (DSBs) unutar ili u blizini BCL11A gena ili druge DNA sekvence koja kodira regulatorni element BCL11A gena, a što dovodi do permanentne delecije, modulacije, ili inaktivacije transkripcione kontrolne sekvence BCL11A gena.

[0365] U drugom postupku, Postupku 9, ovo izlaganje opisuje ex vivo postupak za tretman pacijenta sa hemoglobinopatijom kako je opisano u ma kom od Postupaka 4-8, pri čemu korak diferencijacije obuhvata jedno ili više od sledećeg za diferenciranje genom-editovane iPSC u hematopoeznu progenitorsku ćeliju: tretman sa kombinacijom malih molekula, isporučivanje master transkripcionih faktora, isporučivanje mRNA kodirajućih master transkripcionih faktora, ili isporučivanje mRNA kodirajućih transkripcionih faktora.

[0366] U drugom postupku, Postupku 10, ovo izlaganje opisuje ex vivo postupak za tretman pacijenta sa hemoglobinopatijom kako je opisano u ma kom od Postupaka 4-9, pri čemu korak implantacije obuhvata implantaciju hematopoezne progenitorske ćelije u pacijenta transplantacijom, lokalizovanom injekcijom, sistemskom infuzijom, ili kombinovanjem ovih postupaka.

[0367] U drugom postupku, Postupku 11, ovo izlaganje opisuje ex vivo postupak za tretman pacijenta sa hemoglobinopatijom, postupak obuhvata ove korake: izolaciju mezenhimalne matične ćelije od pacijenta; editovanje unutar ili u blizini BCL11A gena ili druge DNA sekvence koja kodira regulatorni element BCL11A gena mezenhimalne matične ćelije; diferencijaciju genom-editovane mezenhimalne matične ćelije u hematopoeznu progenitorsku ćeliju; i implantaciju hematopoezne progenitorske ćelije u pacijenta.

[0368] U drugom postupku, Postupku 12, ovo izlaganje opisuje ex vivo postupak za tretman pacijenta sa hemoglobinopatijom kako je izloženo u Postupku 11, pri čemu mezenhimalna matična ćelija se izoluje iz koštane srži ili periferne krvi pacijenta.

[0369] U drugom postupku, Postupku 13, ovo izlaganje opisuje ex vivo postupak za tretman pacijenta sa hemoglobinopatijom kako je izloženo u Postupcima 11 ili 12, pri čemu korak izolovanja uključuje: aspiraciju koštane srži i izolovanje mezenhimalnih ćelija korišćenjem centrifugirajućeg sredstva prema gradijentu gustine.

[0370] U drugom postupku, Postupku 14, ovo izlaganje opisuje ex vivo postupak za lečenje pacijenta sa hemoglobinopatijom kako je izloženo u ma kom od Postupaka 11-13, pri čemu korak editovanja obuhvata uvođenje u mezenhimalnu matičnu ćeliju jedne ili više deoksiribonukleinsko kiselinske (DNA) endonukleaze da se dobije jedan ili više jednolančanih odlomaka (SSBs) ili dvolančanih odlomaka (DSBs) unutar ili u blizini BCL11A gena ili druge DNA sekvence koja kodira regulatorni element BCL11A gena što dovodi do permanentne delecije, modulacije, ili inaktivacije transkripcione kontrolne sekvence BCL11A gena.

[0371] U drugom postupku, Postupku 15, ovo izlaganje opisuje ex vivo postupak za lečenje pacijenta sa hemoglobinopatijom kako je izloženo u ma kom od Postupaka 11-14, pri čemu korak diferenciranja obuhvata jedno ili više od sledećeg da bi se genomeditovana mezenhimna matična ćelija diferencirala u hematopoeznu progenitorsku ćeliju: tretman sa kombinacijom malih molekula, isporučivanje master transkripcionih faktora, isporučivanje mRNA koja kodira master transkripcione faktore, ili isporučivanje mRNA koja kodira transkripcione faktore.

[0372] U drugom postupku, Postupku 16, ovo izlaganje opisuje ex vivo postupak za lečenje pacijenta sa hemoglobinopatijom kako je izloženo u ma kom od Postupaka 11-15, pri čemu korak implantacije obuhvata implantiranje hematopoezne progenitorske ćelije u pacijenta putem transplantacije, lokalnom injekcijom, sistemskom infuzijom, ili njihovim kombinacijama.

[0373] U drugom postupku, Postupku 17, ovo izlaganje opisuje ex vivo postupak za lečenje pacijenta sa hemoglobinopatijom, postupak obuhvata korake: izolovanje hematopoezne progenitorske ćelije iz pacijenta; editovanje unutar ili u blizini BCL11A gena ili druge DNA sekvence koja kodira regulatorni element BCL11A gena hematopoezne progenitorske ćelije; i implantiranje genom-editovane hematopoezne progenitorske ćelije u pacijenta.

[0374] U drugom postupku, Postupku 18, ovo izlaganje opisuje ex vivo postupak za lečenje pacijenta sa hemoglobinopatijom kako je obezbeđeno u Postupku 17, pri čemu postupak dalje obuhvata tretiranje pacijenta sa stimulišućim faktorom granulocitne kolonije (GCSF) pre koraka izolovanja.

[0375] U drugom postupku, Postupku 19, ovo izlaganje opisuje ex vivo postupak za lečenje pacijenta sa hemoglobinopatijom kako je izloženo u Postupku 18, gde se korak tretiranja izvodi u kombinaciji sa pleriksaflorom.

[0376] U drugom postupku, Postupku 20, ovo izlaganje opisuje ex vivo postupak za lečenje pacijenta sa hemoglobinopatijom kako je izloženo u ma kom od Postupaka 17-19, pri čemu korak izolovanja uključuje izolovanje CD34+ ćelija.

[0377] U drugom postupku, Postupku 21, ovo izlaganje opisuje ex vivo postupak za lečenje pacijenta sa hemoglobinopatijom kako je izloženo u ma kom od Postupaka 17-20, pri čemu korak editovanja obuhvata uvođenje u hematopoeznu progenitorsku ćeliju jedne ili više deoksiribonukleinsko kiselinskih (DNA) endonukleaza da bi se proizveli jedan ili više jednolančanih odlomaka (SSBs) ili dvolančanih odlomaka (DSBs) unutar ili u blizini BCL11A gena ili druge DNA sekvence koja kodira regulatorni element BCL11A gena što rezultira trajnom delecijom, modulacijom, ili inaktivacijom transkripcione kontrolne sekvence BCL11A gena.

[0378] U drugom postupku, Postupku 22, ovo izlaganje opisuje ex vivo postupak za lečenje pacijenta sa hemoglobinopatijom kako je izloženo u ma kom od Postupaka 17-21, gde korak implantacije obuhvata implantiranje genom-editovane hematopoezne progenitorske ćelije u pacijenta transplantacijom, lokalnom injekcijom, sistemskom infuzijom, ili njihovim kombinacijama.

[0379] U drugom postupku, Postupku 23, ovo izlaganje opisuje in vivo postupak za lečenje pacijenta sa hemoglobinopatijom, postupak obuhvata korak editovanja BCL11A gena u ćeliji pacijenta.

[0380] U drugom postupku, Postupku 24, ovo izlaganje opisuje in vivo postupak za lečenje pacijenta sa hemoglobinopatijom kako je izloženo u Postupku 23, gde korak editovanja uključuje uvođenje u ćeliju jedne ili više deoksiribonukleinsko kiselinskih (DNA) endonukleaza da bi se proizveli jedan ili više jednolančanih odlomaka (SSBs) ili dvolančanih odlomaka (DSBs) unutar ili u blizini BCL11A gena ili druge DNA sekvence koja kodira regulatorni element BCL11A gena što rezultira trajnom delecijom, modulacijom, ili inaktivacijom transkripcione kontrolne sekvence BCL11A gena.

[0381] U drugom postupku, Postupku 25, ovo izlaganje opisuje in vivo postupak za lečenje pacijenta sa hemoglobinopatijom kako je izloženo u Postupku 23 ili 24, pri čemu je ćelija ćelija koštane srži, hematopoezna progenitorska ćelija, ili CD34+ ćelija.

[0382] U drugom postupku, Postupku 26, ovo izlaganje opisuje postupak prema ma kom od Postupaka 1, 8, 14, 21 i 24, gde je jedna ili više DNA endonukleaza; Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (also known as Csn1 and Csx12), Cas100, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, ili Cpf1 endonukleaza; njen homolog, rekombinacija njenog molekula koji se javlja u prirodi, njen kodonoptimizat, ili njene modifikovane verzije, i njihove kombinacije.

[0383] U drugom postupku, Postupku 27, ovo izlaganje obezbeđuje postupak kako je izloženo u Postupku 26, pri čemu postupak uključuje uvođenje u ćeliju jednog ili više polinukleotida koji kodira jednu ili više DNA endonukleaza.

[0384] U drugom postupku, Postupku 28, ovo izlaganje obezbeđuje postupak kako je obezbeđeno u Postupcima 26 ili 27, pri čemu postupak uključuje uvođenje u ćeliju jedne ili više ribonukleinskih kiselina (RNAs) koje kodiraju jednu ili više DNA endonukleaza.

[0385] U drugom postupku, Postupku 29, ovo izlaganje obezbeđuje postupak kako je obezbeđeno u Postupcima 27 ili 28, pri čemu su jedan ili više polinukleotida ili jedna ili više RNAs jedan ili više modifikovanih polinukleotida ili jedna ili više modifikovanih RNAs.

[0386] U drugom postupku, Postupku 30, ovo izlaganje obezbeđuje postupak kako je izloženo u Postupku 26, pri čemu su jedna ili više DNA endonukleaza jedan ili više proteina ili polipeptida.

[0387] U drugom postupku, Postupku 31, ovo izlaganje obezbeđuje postupak kako je izloženo u Postupku 30, pri čemu je jedan ili više proteina ili polipeptida zakucan na N-terminusu, C-terminusu, ili oba N-terminusu i Cterminusu pomoću jednog ili više signala lokalizacije jedra (NLSs).

[0388] U drugom postupku, Postupku 32, ovo izlaganje obezbeđuje postupak kako je obezbeđeno u Postupku 31, pri čemu je jedan ili više proteina ili polipeptida zakucan pomoću dva NLSs, jednog NLS lociranog na N-terminusu i drugog NLS lociranog na C-terminusu.

[0389] U drugom postupku, Postupku 33, ovo izlaganje obezbeđuje postupak kako je obezbeđeno u ma kom od Postupaka 31-32, gde je jedan ili više NLSs SV40 NLS.

[0390] U drugom postupku, Postupku 34, ovo izlaganje obezbeđuje postupak kako je obezbeđeno u ma kom od Postupaka 1-33, gde postupak dalje uključuje uvođenje u ćeliju jedne ili više ribonukleinskih kiselina vodilja (gRNAs).

[0391] U drugom postupku, Postupku 35, ovo izlaganje obezbeđuje postupak kako je obezbeđen u Postupku 34, gde su jedna ili više gRNAs jednomolekulske RNA vodilje (sgRNAs).

[0392] U drugom postupku, Postupku 36, ovo izlaganje obezbeđuje postupak kako je obezbeđen u Postupcima 34 ili 35, gde su jedna ili više gRNAs ili jedna ili više sgRNAs jedna ili više modifikovanih gRNAs ili jedna ili više modifikovanih sgRNAs.

[0393] U drugom postupku, Postupku 37, ovo izlaganje obezbeđuje postupak kako je obezbeđen u Postupku 36, gde jedna modifikovana sgRNAs sadrži tri 2’-O-metilfosforotioatna ostatka na ili u blizini svakog od svojih 5’ i 3’ krajeva.

[0394] U drugom postupku, Postupku 38, ovo izlaganje obezbeđuje postupak kako je obezbeđen u Postupku 37, pri čemu je modifikovana sgRNA nukleinsko kiselinska sekvenca SEQ ID NO: 71,959.

[0395] U drugom postupku, Postupku 39, ovo izlaganje obezbeđuje postupak kako je obezbeđen u Postupkus 34-38, gde su jedna ili više DNA endonukleaza prethodno ukompleksovane sa jednom ili više gRNAs ili jednom ili više sgRNAs kako formiraju jedan ili više ribonukleoproteina (RNPs).

[0396] U drugom postupku, Postupku 40, ovo izlaganje obezbeđuje postupak kako je obezbeđen u Postupku 39, gde je težinski odnos sgRNA prema DNA endonukleazi u RNP 1:1.

[0397] U drugom postupku, Postupku 41, ovo izlaganje obezbeđuje postupak kako je obezbeđen u Postupku 40, gde sgRNA obuhvata nukleinsko kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 71,959, DNA endonukleaza je S. pyogenes Cas9 koja sadrži N-terminus SV40 NLS i C-terminus SV40 NLS, gde je težinski odnos sgRNA prema DNA endonukleazi 1:1.

[0398] U drugom postupku, Postupku 42, ovo izlaganje obezbeđuje postupak kako je obezbeđen u ma kom od Postupaka 1-41, gde postupak dalje obuhvata uvođenje u ćeliju polinukleotidnog donorskog templata koji sadrži divlji tip BCL11A gena ili cDNA koja sadrži modifikovanu transkripcionu kontrolnu sekvencu.

[0399] U drugom postupku, Postupku 43, ovo izlaganje obezbeđuje postupak kako je obezbeđen u ma kom od Postupaka 1, 8, 14, 21, ili 24, pri čemu postupak dalje obuhvata uvođenje u ćeliju jedne ili više ribonukleinskih kiselina vodilja (gRNA) i polinukleotidnog donorskog templata koji sadrži divlji tip BCL11A gena ili cDNA koja sadrži modifikovanu transkripcionu kontrolnu sekvencu, i pri čemu su jedna ili više DNA endonukleaza jedna ili više Cas9 ili Cpf1 endonukleaze koje ostvaruju jednolančani odlomak (SSBs) ili dvolančani odlomak (DSBs), na lokusu unutar ili u blizini BCL11A gena ili druge DNA sekvence koja kodira regulatorni element BCL11A gena što olakšava inserciju nove sekvence iz polinukleotidnog donorskog templata u hromozomsku DNA na lokusu koji dovodi do trajne insercije, modulacije, ili inaktivacije transkripcione kontrolne sekvence hromozomske DNA proksimalno lokusu, i pri čemu gRNA sadrži spejser sekvencu koja je komplementarna sa segmentom lokusa.

[0400] U drugom postupku, Postupku 44, ovo izlaganje obezbeđuje postupak kako je obezbeđen u Postupku 43, gde proksimalno znači nukleotidi i ushodno i nishodno od lokusa.

[0401] U drugom postupku, Postupku 45, ovo izlaganje obezbeđuje postupak kako je obezbeđen u ma kom od Postupaka 1, 8, 14, 21, ili 24, pri čemu postupak dalje obuhvata uvođenje u ćeliju jedne ili više ribonukleinskih kiselina vodilja (gRNAs) i polinukleotidnog donorskog templata koji sadrži divlji tip BCL11A gena ili cDNA koja sadrži modifikovanu transkripcionu kontrolnu sekvencu, i pri čemu su jedna ili više DNA endonukleaza jedna ili više Cas9 ili Cpf1 endonukleaze koje ostvaruju ili kreiraju par jednolančanih odlomaka (SSBs) ili dvolančanih odlomaka (DSBs), prvi odlomak na 5’ lokusu i drugi odlomak na 3’ lokusu, unutar ili u blizini BCL11A gena ili druge DNA sekvence koja kodira regulatorni element BCL11A gena što olakšava inserciju nove sekvence iz polinukleotidnog donorskog templata u hromozomsku DNA između 5’ lokusa i 3’ lokusa dovodi do trajne insercije, modulacije, ili inaktivacije transkripcione kontrolne sekvence hromozomske DNA između 5’ lokusa i 3’ lokusa.

[0402] U drugom postupku, Postupku 46, ovo izlaganje obezbeđuje postupak kako je obezbeđen u Postupku 45, pri čemu jedna gRNA kreira par SSBs ili DSBs.

[0403] U drugom postupku, Postupku 47, ovo izlaganje obezbeđuje postupak kako je obezbeđen u Postupku 45, pri čemu jedna gRNA sadrži spejser sekvencu koja je komplementarna bilo sa 5’ lokusom bilo sa 3’ lokusom.

[0404] U drugom postupku, Postupku 48, ovo izlaganje obezbeđuje postupak kako je obezbeđen u Postupku 45, pri čemu postupak obuhvata prvu RNA vodilju i drugu RNA vodilju, gde prva RNA vodilja sadrži spejser sekvencu koja je komplementarna sa segmentom 5’ lokusa i druga RNA vodilja sadrži spejser sekvencu koja je komplementarna sa segmentom 3’ lokusa.

[0405] U drugom postupku, Postupku 49, ovo izlaganje obezbeđuje postupak kako je obezbeđen u ma kom od Postupaka 43-48, gde su jedna ili dve gRNAs jedna ili dve jednomolekulske RNA vodilje (sgRNAs).

[0406] U drugom postupku, Postupku 50, ovo izlaganje obezbeđuje postupak kako je obezbeđen u ma kom od Postupaka 43-49, gde su jedna ili dve gRNAs ili jedna ili dve sgRNAs jedna ili dve modifikovane gRNAs ili jedna ili dve modifikovane sgRNAs.

[0407] U drugom postupku, Postupku 51, ovo izlaganje obezbeđuje postupak kako je obezbeđen u Postupku 50, gde jedna modifikovana sgRNA sadrži tri 2’-O-metilfosforotioatna ostatka na ili u blizini svakog od svojih 5’ i 3’ krajeva.

[0408] U drugom postupku, Postupku 52, ovo izlaganje obezbeđuje postupak kako je obezbeđen u Postupku 51, gde je jedna modifikovana sgRNA nukleinsko kiselinska sekvenca SEQ ID NO: 71,959.

[0409] U drugom postupku, Postupku 53, ovo izlaganje obezbeđuje postupak kako je obezbeđen u ma kom od Postupaka 43-52, gde su jedna ili više Cas9 endonukleaza prethodno ukompleksovane sa jednom ili dve gRNAs ili jednom ili dve sgRNAs kako formiraju jedan ili više ribonukleoproteina (RNPs).

[0410] U drugom postupku, Postupku 54, ovo izlaganje obezbeđuje postupak kako je obezbeđen u Postupku 53, gde su jedna ili više Cas9 endonukleaza zakucane na N-terminusu, C-terminusu, ili oba i N-terminusu i C-terminusu pomoću jednog ili više signala lokalizacije jedra (NLSs).

[0411] U drugom postupku, Postupku 55, ovo izlaganje obezbeđuje postupak kako je obezbeđen u Postupku 54, gde su jedna ili više Cas9 endonukleaza zakucane pomoću dva NLSs, jednog NLS lociranog na N-terminusu i drugog NLS lociranog na C-terminusu.

[0412] U drugom postupku, Postupku 56, ovo izlaganje obezbeđuje postupak kako je obezbeđen u ma kom od Postupaka 54-55, gde su jedan ili više NLSs SV40 NLS.

[0413] U drugom postupku, Postupku 57, ovo izlaganje obezbeđuje postupak kako je obezbeđen u Postupku 53, gde je u RNP težinski odnos sgRNA prema Cas9 endonukleazi 1:1.

[0414] U drugom postupku, Postupku 58, ovo izlaganje obezbeđuje postupak kako je obezbeđen u Postupku 53, gde jedna sgRNA obuhvata nukleinsko kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 71,959, Cas9 endonukleaza je S. pyogenes Cas9 koja sadrži N-terminus SV40 NLS i C-terminus SV40 NLS, pri čemu je težinski odnos sgRNA prema Cas9 endonukleazi 1:1.

[0415] U drugom postupku, Postupku 59, ovo izlaganje obezbeđuje postupak kako je obezbeđen u ma kom od Postupaka 43-58, pri čemu je donorski templat ili jedno ili dvo lančani.

[0416] U drugom postupku, Postupku 60, ovo izlaganje obezbeđuje postupak kako je obezbeđen u ma kom od Postupaka 42-59, gde je modifikovana transkripciona kontrolna sekvenca locirana unutar drugog introna BCL11A gena.

[0417] U drugom postupku, Postupku 61, kako je obezbeđen u ma kom od Postupaka 42-59, gde je modifikovana transkripciona kontrolna sekvenca locirana unutar 58 DNA hipersenzitivnog položaja (DHS) BCL11A gena.

[0418] U drugom postupku, Postupku 62, ovo izlaganje obezbeđuje postupak kako je obezbeđen u ma kom od Postupaka 42-61, gde je insercija nastala homologno usmerenim popravkom (HDR).

[0419] U drugom postupku, Postupku 63, ovo izlaganje obezbeđuje postupak kako je obezbeđen u ma kom od Postupaka 8, 14, 21, 24, 43, i 45, gde su SSB, DSB, ili 5’ lokus i 3’ lokus locirani unutar drugog introna BCL11A gena.

[0420] U drugom postupku, Postupku 64, ovo izlaganje obezbeđuje postupak kako je obezbeđen u ma kom od Postupaka 8, 14, 21, 24, 43, i 45, gde su SSB, DSB, ili 5’ DSB i 3’ DSB locirani unutar 58 DNA hipersenzitivnog položaja (DHS) BCL11A gena.

[0421] U drugom postupku, Postupku 65, ovo izlaganje obezbeđuje postupak kako je obezbeđen u ma kom od Postupaka 1, 8, 14, 21, ili 24, pri čemu postupak dalje obuhvata uvođenje u ćeliju jedne ili više ribonukleinskih kiselina vodilja (gRNAs), i pri čemu su jedna ili više DNA endonukleaza jedna ili više Cas9 ili Cpf1 endonukleaze koje ostvaruju ili kreiraju par jednolančanih odlomaka (SSBs) ili dvolančanih odlomaka (DSBs), prvi SSB ili DSB na 5’ lokusu i drugi SSB ili DSB na 3’ lokusu, unutar ili u blizini BCL11A gena ili druge DNA sekvence koja kodira regulatorni element BCL11A gena što proizvodi deleciju hromozomske DNA između 5’ lokusa i 3’ lokusa što dalje proizvodi trajnu deleciju, modulaciju, ili inaktivaciju transkripcione kontrolne sekvence hromozomske DNA između 5’ lokusa i 3’ lokusa.

[0422] U drugom postupku, Postupku 66, ovo izlaganje obezbeđuje postupak kako je obezbeđen u Postupku 65, gde jedna gRNA kreira par SSBs ili DSBs.

[0423] U drugom postupku, Postupku 67, ovo izlaganje obezbeđuje postupak kako je obezbeđen u Postupku 65, gde jedna gRNA sadrži spejser sekvencu koja je komplementarna bilo sa 5’ lokusom bilo 3’ lokusom.

[0424] U drugom postupku, Postupku 68, ovo izlaganje obezbeđuje postupak kako je obezbeđen u Postupku 65, gde postupak obuhvata prvu RNA vodilju i drugu RNA vodilju, pri čemu prva RNA vodilja sadrži spejser sekvencu koja je komplementarna sa segmentom 5’ lokusa i druga RNA vodilja sadrži spejser sekvencu koja je komplementarna sa segmentom 3’ lokusa.

[0425] U drugom postupku, Postupku 69, ovo izlaganje obezbeđuje postupak kako je obezbeđen u Postupcima 65-68, pri čemu su jedna ili više gRNAs jedna ili više jednomolekulskih RNA vodilja (sgRNAs).

[0426] U drugom postupku, Postupku 70, ovo izlaganje obezbeđuje postupak kako je obezbeđen u Postupcima 65-69 pri čemu su jedna ili više gRNAs ili jedna ili više sgRNAs jedna ili više modifikovanih gRNAs ili jedna ili više modifikovanih sgRNAs.

[0427] U drugom postupku, Postupku 71, ovo izlaganje obezbeđuje postupak kako je obezbeđen u Postupku 70, pri čemu jedna modifikovana sgRNA sadrži tri 2’-O-metilfosforotioatna ostatka na ili u blizini svakog od svoja 5’ i 3’ kraja.

[0428] U drugom postupku, Postupku 72, ovo izlaganje obezbeđuje postupak kako je obezbeđen u Postupku 71, pri čemu je jedna modifikovana sgRNA nukleinsko kiselinska sekvenca SEQ ID NO: 71,959.

[0429] U drugom postupku, Postupku 73, ovo izlaganje obezbeđuje postupak kako je obezbeđen u ma kom od Postupaka 65-72, gde su jedna ili više Cas9 endonukleaza prethodno ukompleksovane sa jednom ili dve gRNAs ili jednom ili dve sgRNAs kako formiraju jedan ili više ribonukleoproteina (RNPs).

[0430] U drugom postupku, Postupku 74, the present disclosure provides a postupku as provided in Postupku 73, gde su jedna ili više Cas9 endonukleaza zakucane na N-terminusu, C-terminusu, ili oba i N-terminusu i C-terminusu pomoću jednog ili više signala lokalizacije jedra (NLSs).

[0431] U drugom postupku, Postupku 75, the present disclosure provides a postupku as provided in Postupku 74, gde su jedna ili više Cas9 endonukleaza zakucane pomoću dva NLSs, jednog NLS lociranog na N-terminusu i drugog NLS lociranog na C-terminusu.

[0432] U drugom postupku, Postupku 76, ovo izlaganje obezbeđuje postupak kako je obezbeđen u ma kom od Postupaka 74-75, gde su jedan ili više NLSs SV40 NLS.

[0433] U drugom postupku, Postupku 77, ovo izlaganje obezbeđuje postupak kako je obezbeđen u Postupku 73, gde je težinski odnos sgRNA prema Cas9 endonukleazi u RNP 1:1.

[0434] U drugom postupku, Postupku 78, ovo izlaganje obezbeđuje postupak kako je obezbeđen u Postupku 73, gde jedna sgRNA obuhvata nukleinsko kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 71,959, Cas9 endonukleaza je S. pyogenes Cas9 koja sadrži N-terminus SV40 NLS i C-terminus SV40 NLS, pri čemu je težinski odnos sgRNA prema Cas9 endonukleazi 1:1.

[0435] U drugom postupku, Postupku 79, ovo izlaganje obezbeđuje postupak kako je obezbeđen u ma kom od Postupaka 65-78, gde su oba, i 5’ lokus i 3’ lokus locirana unutar drugog introna BCL11A gena.

[0436] U drugom postupku, Postupku 80, ovo izlaganje obezbeđuje postupak kako je obezbeđen u ma kom od Postupaka 65-78, gde su oba, i 5’ lokus i 3’ lokus locirana unutar 58 DNA hipersenzitivnog položaja (DHS) BCL11A gena.

[0437] U drugom postupku, Postupku 81, ovo izlaganje obezbeđuje postupak kako je obezbeđen u ma kom od Postupaka 1, 8, 14, 21, ili 24-80 gde su Cas9 ili Cpf1 mRNA, gRNA, i donorski templat svaki formulisani ili u zasebne lipidne nanočestice ili su svi zajedno formulisani u lipidnu nanočesticu.

[0438] U drugom postupku, Postupku 82, ovo izlaganje obezbeđuje postupak kako je obezbeđen u ma kom od Postupaka 1, 8, 14, 21, ili 24-80, gde su Cas9 ili Cpf1 mRNA formulisani u lipidnu nanočesticu, a oba, i gRNA i donorski templat se isporučuju u ćeliju u vidu adeno-udruženog virusnog (AAV) vektora.

[0439] U drugom postupku, Postupku 83, ovo izlaganje obezbeđuje postupak kako je obezbeđen u ma kom od Postupaka 1, 8, 14, 21, ili 24-80, gde su Cas9 ili Cpf1 mRNA formulisani u lipidnu nanočesticu, a gRNA se isporučuje u ćeliju elektroporacijom i donorski templat se isporučuje u ćeliju u vidu adeno-udruženog virusnog (AAV) vektora.

[0440] U drugom postupku, Postupku 84, ovo izlaganje obezbeđuje postupak kako je obezbeđen u ma kom od Postupaka 1, 8, 14, 21, ili 24-80, gde se jedan ili više RNP isporučuju u ćeliju elektroporacijom.

[0441] U drugom postupku, Postupku 85, ovo izlaganje obezbeđuje postupak kako je obezbeđen u ma kom od Postupaka 1-84, pri čemu je BCL11A gen lociran na hromozomu 2: 60,451,167 -60,553,567 (Genome Reference Consortium - GRCh38).

[0442] U drugom postupku, Postupku 86, ovo izlaganje obezbeđuje postupak kako je obezbeđen u ma kom od Postupaka 1-85, pri čemu je hemoglobinopatija izdvojena iz grupe koju čine anemija srpastih ćelija i talasemija (a b, g, d, i njihove kombinacije).

[0443] U drugom postupku, Postupku 87, ovo izlaganje obezbeđuje postupak kako je obezbeđen u ma kom od Postupaka 1-86, gde editovanje unutar ili u blizini BCL11A gena ili druge DNA sekvence koja kodira regulatorni element BCL11A gena može smanjiti ekspresiju BCL11A gena.

[0444] U prvoj kompoziciji, Kompoziciji 1, ovo izlaganje obezbeđuje jednu ili više ribonukleinskih kiselina (gRNAs) za editovanje BCL11A gena u ćeliji od pacijenta sa hemoglobinopatijom, jedna ili više gRNAs sadrži spejser sekvencu odabranu iz grupe koju čine nukleinsko kiselinske sekvence iz SEQ ID NOs: 1 - 71,947 iz liste sekvenci.

[0445] U drugoj kompoziciji, Kompoziciji 2, ovo izlaganje obezbeđuje jednu ili više gRNAs Kompozicije 1, gde jedna ili više gRNAs su jedna ili više jednomolekulskih RNAs vodilja (sgRNAs).

[0446] U drugoj kompoziciji, Kompoziciji 3, ovo izlaganje obezbeđuje jednu ili više gRNAs ili sgRNAs Kompozicije 1 ili 2, gde jedna ili više gRNAs ili jedna ili više sgRNAs su jedna ili više modifikovanih gRNAs ili jedna ili više modifikovanih sgRNAs.

[0447] U drugoj kompoziciji, Kompoziciji 4, ovo izlaganje obezbeđuje jednu ili više sgRNAs Kompozicije 3, gde jedna ili više modifikovanih sgRNAs sadrže tri 2’-O-metilfosforotioatna ostatka na ili u blizini svakog od svojih 5’ i 3’ krajeva.

[0448] U drugoj kompoziciji, Kompoziciji 5, ovo izlaganje obezbeđuje jednu ili više sgRNAs Kompozicije 3, gde jedna ili više modifikovanih sgRNAs sadrže nukleinsko kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 71,959.

[0449] U drugoj kompoziciji, Kompoziciji 6, ovo izlaganje obezbeđuje jednomolekulsku RNA vodilju (sgRNA) koja sadrži nukleinsko kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 71,959.

Definicije

[0450] Izraz "koji sadrži" ili "ima" se koristi u odnosu na kompozicije, postupke, i njihovu(e) komponentu(e) koju(e) obuhvataju, što je suštinsko za pronalazak, a opet otvoreni za uključivanje nespecifikovanih elementa, nezavisno od toga da li su suštinski ili ne.

[0451] Izraz "suštinski se sastoji od" se odnosi na one elemente koji su neophodni za dati aspekt. Izraz dozvoljava prisustvo dodatnih elementa koji materijalno ne utiču na osnovnu(e) i novu(e) ili funkcionalnu(e) karakteristiku(e) tog aspekta pronalaska.

[0452] Izraz "sastoji se od" se odnosi na kompozicije, postupke, i njihove komponente koje obuhvataju, kako je ovde opisano, koje su isključujuće za svaki element koji nije naveden u tom opisu aspekta.

[0453] Jedinični oblici "a," "an," i "the" obuhvataju množinu onoga na šta se odnose, sem ukoliko kontekst jasno diktira drugačije.

[0454] Svaki numerički opseg, naveden u ovoj specifikaciji, opisuje sve pod-opsege sa istom numeričkom preciznosti (tj., koji imaju isti broj specifikovanih cifara) podvedenom pod navedeni opseg. Na primer, navedeni opseg od "1.0 do 10.0" opisuje sve podopsege između (i uključujući) navedenu minimalnu vrednost od 1.0 i navedenu maksimalnu vrednost od 10.0, kao što su, na primer, "2.4 do 7.6," čak i ukoliko se opseg od "2.4 do 7.6" izričito ne navodi u tekstu specifikacije. Prema tome, Aplikant zadržava pravo da ispravi ovu specifikaciju, uključujući i Patentne zahteve, da izričito navede svaki pod-opseg iste numeričke preciznosti koji se podvodi pod opsege koji su izričito navedeni u ovoj specifikaciji. Svi ovakvi opsezi su suštinski opisani u ovoj specifikaciji tako da će izmene i dopune izričito navedenog ma kojeg od takvih pod-opsega biti usaglašene sa pisanim Opisom, dovoljnošću Opisa, i dodatnim zahtevima za predmet, uključujući zahteve pod 35 U.S.C. § 112(a) i Članom 123(2) EPC. Isto tako, ukoliko nije izričito precizirano ili ukoliko kontekst ne zahteva drugačije, svi numerički parametri koji su opisani u ovoj specifikaciji (kao što su oni koji izražavaju vrednosti, opsege, količine, procente, i slično) mogu se čitati kao da im prethodi reč "oko"(“otprilike”), čak i ukoliko se reč "oko" ne pojavljuje izričito pre broja. Sem toga, numerički parametri koji su opisani u ovoj specifikaciji bi trebalo da budu protumačeni u svetlu broja prikazanih značajnih cifara, numeričke preciznosti, i primenom uobičajenih tehnika zaokruživanja. Takođe se podrazumeva da će numerički parametri koji su opisani u ovoj specifikaciji nužno posedovati osobinu nerazdvojive varijabilnosti osnovnih tehnika merenja korišćenih za određivanje numeričke vrednosti parametra.

Primeri

[0455] Pronalazak će biti potpunije shvaćen upućivanjem na sledeće primere, koji obezbeđuju ilustrativne neograničavajuće aspekte pronalaska.

[0456] Primeri opisuju primenu CRISPR sistema kao ilustrativne tehnike editovanja genoma u cilju kreiranja definisanih genomskih delecija, insercija, ili zamena, što je ovde nazvano "genomskim modifikacijama", unutar ili u blizini BCL11A gena ili druge DNA sekvence koja kodira regulatorni element BCL11A gena što dovodi do trajne delecije, modulacije, ili inaktivacije transkripcione kontrolne sekvence BCL11A gena. Uvođenje definisanih terapeutskih modifikacija predstavlja novu terapeutsku strategiju za moguće poboljšanje hemoglobinopatije, kako je ovde opisano i ilustrovano.

Primer 1 - CRISPR/SpCas9 ciljni položaji za kontrolnu sekvencu transkripcije BCL11A gena

[0457] Regioni od 12.4 kb kontrolne sekvence transkripcije BCL11A gena su skenirani za ciljne položaje. Svaka oblast je skenirana na protospejser susedni motiv (PAM) koji ima sekvencu NRG. gRNA 20 bp spejser sekvence odgovaraju PAM gde su identifikovane, kako je prikazano u SEQ ID NOs: 1 - 29,482 u Spisku sekvenci.

Primer 2 - CRISPR/SaCas9 ciljni položaji za kontrolnu sekvencu transkripcije BCL11A gena

[0458] Regioni od 12.4 kb kontrolne sekvence transkripcije BCL11A gena su skenirani za ciljne položaje. Svaka oblast je skenirana na protospejser susedni motiv (PAM) koji ima sekvencu NNGRRT. gRNA 20 bp spejser sekvence odgovaraju PAM gde su identifikovane, kako je prikazano u SEQ ID NOs: 29,483 - 32,387 u Spisku sekvenci.

Primer 3 - CRISPR/StCas9 ciljni položaji za kontrolnu sekvencu transkripcije BCL11A gena

[0459] Regioni od 12.4 kb kontrolne sekvence transkripcije BCL11A gena su skenirani za ciljne položaje. Svaka oblast je skenirana na protospejser susedni motiv (PAM) koji ima sekvencu NNAGAAW. gRNA 20 bp spejser sekvence odgovaraju PAM gde su identifikovane, kako je prikazano u SEQ ID NOs: 32,388 - 33,420 u Spisku sekvenci.

Primer 4 - CRISPR/TdCas9 ciljni položaji za kontrolnu sekvencu transkripcije BCL11A gena

[0460] Regioni od 12.4 kb kontrolne sekvence transkripcije BCL11A gena su skenirani za ciljne položaje. Svaka oblast je skenirana na protospejser susedni motiv (PAM) koji ima sekvencu NAAAAC. gRNA 20 bp spejser sekvence odgovaraju PAM gde su identifikovane, kako je prikazano u SEQ ID NOs: 33,421 - 33,851 u Spisku sekvenci.

Primer 5 - CRISPR/NmCas9 ciljni položaji za kontrolnu sekvencu transkripcije BCL11A gena

[0461] Regioni od 12.4 kb kontrolne sekvence transkripcije BCL11A gena su skenirani za ciljne položaje. Svaka oblast je skenirana na protospejser susedni motiv (PAM) koji ima sekvencu NNNNGHTT. gRNA 20 bp spejser sekvence odgovaraju PAM gde su identifikovane, kako je prikazano u SEQ ID NOs: 33,852 - 36,731 u Spisku sekvenci.

Primer 6 - CRISPR/Cpf1 ciljni položaji za kontrolnu sekvencu transkripcije BCL11A gena

[0462] Regioni od 12.4 kb kontrolne sekvence transkripcije BCL11A gena su skenirani za ciljne položaje. Svaka oblast je skenirana na protospejser susedni motiv (PAM) koji ima sekvencu YTN. gRNA 22 bp spejser sekvence odgovaraju PAM gde su identifikovane, kako je prikazano u SEQ ID NOs: 36,732 - 71,947 u Spisku sekvenci.

Primer 7 - Bioinformatička analiza lanaca vodilja

[0463] Kandidati vodilje će biti skrinirane i izabrane u višestepenom procesu koji obuhvata i teoretsko vezivanje i eksperimentalno procenjenu aktivnost. Kao ilustracija, kandidati vodilje, koje imaju sekvence koje se podudaraju sa naročitim on-target položajem, kao što je položaj unutar transkripcione kontrolne sekvence BCL11A gena, sa susednim PAM, mogu da se ispitaju na njihov potencijal cepanja na off-target položajima koji imaju slične sekvence, korišćenjem jednog ili više od raznovrsnih postojećih bioinformatičkih alata za procenjivanje off-target vezivanja, kako je detaljnije opisano i ilustrovano u nastavku, a u cilju procene verovatnosti delovanja na hromozomskim položajima koji nisu željeni. Kandidati za koje se predvidi da će imati relativno nizak potencijal za off-target aktivnost, mogu se onda eksperimentalo ispitati da se izmeri njihova on-target aktivnost, i zatim, off-target aktivnosti na raznovrsnim položajima. Poželjne vodilje imaju dovoljno visoku on-target aktivnost da se postignu željeni nivoi genskog editovanja na izabranom lokusu, kao i relativno nisku off-target aktivnost da se smanji verovatnoća izmena na drugim hromozomskim lokusima. Odnos on-target prema off-target aktivnosti se često označava kao "specifičnost" vodilje.

[0464] Za početni skrining predviđenih off-target aktivnosti, postoje brojni bioinformatički alati koji su poznati i javno dostupni, koji se mogu koristiti za predviđanje najverovatnijih off-target položaja; i kako se vezivanje za ciljne položaje u CRISPR/Cas9/Cpf1 sistemu nukleaza usmerava Watson-Crick sparivanjem baza između komplementarnih sekvenci, stepen različitosti (i zbog toga snižen potencijal za off-target vezivanje) je suštinski povezan sa primarnim razlikama u sekvenci: nepodudaranja i ispupčenja, tj. baze koje su zamenjene sa ne-komplementarnom bazom, kao i insercije ili delecije baza na mogućim off-target položajima u odnosu na ciljni položaj. Primer bioinformatičkog alata nazvan COSMID (CRISPR Off-target položaji sa nepodudarnostima, insercijama i delecijama) (dostupan na web-u pod: crispr.bme.gatech.edu) kompiluje takve sličnosti.

Drugi bioinformatički alati uključuju, ali nisu ograničeni ovima, GUIDO, autoCOSMID, i CCtop.

[0465] Bioinformatika se koristi za minimizovanje off-target cepanja u cilju smanjivanja štetnih efekata mutacija i hromozomskih preuređenja. Istraživanja na CRISPR /Cas9 sistemima sugerišu mogućnost visoke off-target aktivnosti zahvaljujući nespecifičnoj hibridizaciji lanca vodilje sa DNA sekvencama sa nepodudaranjima baznih parova i/ili ispupčenjima, posebno na položajima koji su distalno od PAM regiona. Zbog toga, važno je imati bioinformatički alat kojim se mogu identifikovati mogući off-target položaji koji imaju insercije i/ili delecije između lanca RNA vodilje i genomskih sekvenci, pored ne podudaranja baznih parova. Alat na bazi bioinformatike, COSMID (CRISPR Off-target položaji sa nepodudarnostima, insercijama i delecijama) je zbog toga iskorišćen za pretraživanje genoma na moguće CRISPR off-target položaje (dostupan na web-u pod: crispr.bme.gatech.edu). Učinak COSMID-a rangira liste mogućih off-target položaja na osnovu broja i lokacija nepodudaranja, omogućavajući izbor ciljnih položaja sa više informacija, i izbegavanjem korišćenja položaja sa verovatnijim off-target cepanjem.

[0466] Primenjene su dodatne bioinformatičke grane koje su uzele u obzir izmerene oni/ili off-target aktivnosti gRNA koje ciljaju položaje u regionu. Druge karakteristike koje se mogu koristiti za predviđanje aktivnosti obuhvataju informaciju o vrsti ćelije koja je u pitanju, pristupačnosti DNA, stanju hromatina, vezujućim položajima transkripcionog faktora, podacima o vezivanju transkripcionog faktora, i druge CHIP-seq podatke. Uzeti su u obzir i dodatni faktori koji predviđaju efikasnost editovanja, kao što su relativni položaji i smerovi parova gRNAs, osobine lokalne sekvence i mikro-homologije.

Primer 8 - Testiranje poželjnih vodilja u ćelijama za on-target aktivnost

[0467] gRNAs, za koje je predviđeno da imaju najnižu off-target aktivnost, biće zatim testirane na on-target aktivnost u K562 ćelijama, i ispitane na učestalost indel korišćenjem TIDE.

[0468] TIDE je web alat za brzo ispitivanje editovanja genoma pomoću CRISPR-Cas9 ciljnog lokusa određenog RNA vodiljom (gRNA ili sgRNA). Na osnovu podataka kvantitativnog traga sekvence iz dve reakcije standardnog kapilarnog sekvenciranja, TIDE software kvantitativno određuje efikasnost editovanja i identifikuje predominantne vrste insercija i delecija (indeli) u DNA skupa ciljnih ćelija. Vidi: Brinkman et al, Nucl. Acids Res. (2014) za detaljnije objašnjenje primera. Alternativni postupak je Sekvenciranje sledeće generacije (NGS), takođe poznat kao sekvenciranje sa visokom propusnošću, koji je “catch-all” (obuhvatiti sve, prim. prev.), izraz koji se koristi da opiše brojne različite moderne tehnologije sekvenciranja uključujući: Illumina (Solexa) sekvenciranje, Roche 454 sekvenciranje, Ion torrent: Proton/PGM sekvenciranje, i SOLiD sekvenciranje. Ove skorašnje tehnologije omogućavaju sekvenciranje DNA i RNA daleko brže i jeftinije nego što je prethodno korišćeno Sanger sekvenciranje, i, kao takve, unele su revoluciju u ispitivanja genoma i molekularnu biologiju.

[0469] Transfekcija ćelija u kulturi tkiva, omogućava skrining različitih konstrukcija i robustan način za testiranje aktivnosti i specifičnosti. Ćelijske linije iz kulture tkiva, kao što su K562 ili HEK293T jednostavno se transfektuju i postiže se visoka aktivnost. Ove ili druge ćelijske linije će biti ispitane radi određivanja ćelijskih linija koje se podudaraju sa CD34+ i obezbeđuju najbolji surogat. Ove ćelije će se onda koristiti za mnoge testove ranog stadijuma. Na primer, individualne gRNAs za S. pyogenes Cas9 mogu da budu transfektovane u ćelije korišćenjem plazmida, kao što su, na primer, CTx-1, CTx-2, ili CTx-3 opisani na Slikama 1A-1C, koji su pogodni za ekspresiju u humanim ćelijama. Alternativno, komercijalno dostupni vektori mogu takođe da se koriste. Za određivanje Indel Freq BCL11A gRNAs koje su ovde opisane, korišćen je komercijalno dostupan Cas9 ekspresioni plazmid (GeneArt, Thermo Fisher). Nekoliko dana kasnije (48 h za ovaj eksperiment), sakupljena je genomska DNA i ciljni položaj je amplifikovan pomoću PCR. Aktivnost sečenja je izmerena odnosom insercija, delecija i mutacija uvedenih putem NHEJ popravka slobodnih DNA krajeva. Iako ovaj postupak ne može razlikovati ispravno popravljene sekvence od necepane DNA, nivo sečenja može biti ocenjen putem količine pogrešne popravke. Off-target aktivnost se može posmatrati putem amplifikacije identifikovanih predpostavljenih off-target položaja i korišćenjem sličnih postupaka za otkrivanje cepanja. Isto tako, može se ispitati translokacija korišćenjem prajmera koji su postavljeni bočno na položaje sečenja, da bi se odredilo da li se dogodilo specifično sečenje i translokacije. Razvijeni su testovi bez vodiča, koji omogućavaju komplementarno testiranje off-target cepanja uključujući vodilju-seq. gRNA ili par gRNA sa značajnom aktivnošću se mogu pratiti u ćelijama u kulturi kako bi se izmerila modulacija ili inaktivacija 58 DNA hipersenzitivnog položaja (DHS) unutar transkripcione kontrolne sekvence BCL11A gena. Ponovo se mogu pratiti off-target događaji. Slično, CD34+ ćelije se mogu transfektovati i izmeriti modulacija ili inaktivacija 58 DNA hipersenzitivnog položaja (DHS) unutar transkripcione kontrolne sekvence BCL11A gena i mogući off-target događaji. Ovi eksperimenti omogućavaju optimizaciju nukleaze i dizajna donora i isporučivanja.

Primer 9 - Testiranje poželjnih vodilja u ćelijama na off-target aktivnost

[0470] gRNAs koje imaju najbolju on-target aktivnost od TIDE i sledeća generacija ispitivanja sekvenciranjem u prethodnom primeru će zatim biti testirana na off-target aktivnost primenom sekvenciranja celokupnog genoma. Kandidati gRNAs će biti potpunije ispitani u CD34+ ćelijama ili iPSCs.

Primer 10 - Testiranje poželjnih gRNA kombinacija u ćelijama

[0471] gRNAs koje imaju najbolju on-target aktivnost od TIDE i sledeća generacija ispitivanja sekvenciranjem i najnižu off-target aktivnost će biti testirane u kombinacijama kako bi se ispitala veličina delecija koje nastaju primenom svake gRNA kombinacije. Moguće gRNA kombinacije će biti ispitane u primarno humanim CD34+ ćelijama.

[0472] Na primer, gRNA kombinacije će biti testirane na efikasnost brisanja svih ili dela kontrolne sekvence transkripcije BCL1 1A gena. gRNA kombinacije će isto tako biti testirane na efikasnost brisanja svih ili dela 58 DNA hipersenzitivnog položaja (DHS) BCL11A gena.

Primer 11 - Testiranje različitih pristupa za editovanje HDR gena

[0473] Posle testiranja gRNAs i na on-target aktivnost i na off-target aktivnost, biće testirane modulacija/inaktivacija i strategije zakucavanja za editovanje HDR gena.

[0474] Za pristup modulacija/inaktivacija, biće obezbeđen donorski DNA templat u vidu kratkog jednolančanog oligonukleotida, kratkog dvolančanog oligonukleotida (PAM sekvenca intaktna/PAM sekvenca mutirana), dugačkog jednolančanog DNA molekula (PAM sekvenca intaktna/PAM sekvenca mutirana) ili dugačkog dvolančanog DNA molekula (PAM sekvenca intaktna/PAM sekvenca mutirana). Donorski DNA templat će sadržavati bilo divlji-tip BCL11A gena ili cDNA koja obuhvata modifikovanu kontrolnu sekvencu transkripcije ili divljeg-tipa BCL11A gena ili cDNA koja obuhvata modifikovani (npr. mutiran) 58 DNA hipersenzitivni položaj (DHS). Sem toga, donorski DNA templat će biti isporučen kao AAV.

[0475] Za pristup cDNA zakucavanja, jednolančana ili dvolančana DNA može uključiti više od 40 nt modifikovane kontrolne sekvence transkripcije BCL1 1A gena. Jednolančana ili dvolančana DNA može uključiti više od 80 nt modifikovane kontrolne sekvence transkripcije BCL11A gena. Jednolančana ili dvolančana DNA može uključiti više od 100 nt modifikovane kontrolne sekvence transkripcije BCL1 1A gena. Jednolančana ili dvolančana DNA može uključiti više od 150 nt modifikovane kontrolne sekvence transkripcije BCL11A gena. Jednolančana ili dvolančana DNA može uključiti više od 300 nt modifikovane kontrolne sekvence transkripcije BCL1 1A gena. Jednolančana ili dvolančana DNA može uključiti više od 400 nt modifikovane kontrolne sekvence transkripcije BCL11A gena. Alternativno, DNA templat će biti isporučen kao AAV.

[0476] Za pristup cDNA zakucavanja, jednolančana ili dvolančana DNA može uključiti više od 40 nt modifikovanog 58 DNA hipersenzitivnog položaja (DHS) BCL11A gena. Jednolančana ili dvolančana DNA može uključiti više od 80 nt modifikovanog 58 DNA hipersenzitivnog položaja (DHS) BCL11A gena. Jednolančana ili dvolančana DNA može uključiti više od 100 nt modifikovanog 58 DNA hipersenzitivnog položaja (DHS) BCL11A gena. Jednolančana ili dvolančana DNA može uključiti više od 150 nt modifikovanog 58 DNA hipersenzitivnog položaja (DHS) BCL11A gena. Jednolančana ili dvolančana DNA može uključiti više od 300 nt modifikovanog 58 DNA hipersenzitivnog položaja (DHS) BCL11A gena. Jednolančana ili dvolančana DNA može uključiti više od 400 nt modifikovanog 58 DNA hipersenzitivnog položaja (DHS) BCL11A gena. Alternativno, DNA templat će biti isporučen kao AAV.

Primer 12 – Ponovna procena vodećih CRISPR-Cas9/DNA donorskih kombinacija

[0477] Posle testiranja različitih strategija za HDR gensko editovanje, vodeće CRISPR-Cas9/DNA donorske kombinacije će biti ponovo procenjene u primarnim humanim ćelijama na efikasnost delecije, rekombinacije, i off-target specifičnosti. Cas9 mRNA ili RNP će biti formulisani u lipidne nanočestice za isporučivanje, sgRNAs će biti formulisane u nanočestice ili isporučene kao AAV, i donorska DNA će biti formulisana u nanočestice ili isporučena kao AAV.

Primer 13 - In vivo testiranje u relevantnom životinjskom modelu

[0478] Nakon što su CRISPR-Cas9/DNA donorske kombinacije bile ponovo procenjene, vodeće formulacije će biti testirane in vivo u životinjskom modelu.

[0479] Uzgajanje u humanim ćelijama omogućava direktno testiranje na humane mete i pozadinski humani genom, kako je prethodno opisano.

[0480] Preklinička ispitivanja efikasnosti i bezbednosti mogu se posmatrati preko usađivanja modifikovanih mišijih ili ljudskih CD34+ ćelija u NSG ili slične miševe. Modifikovane ćelije se mogu posmatrati mesecima posle usađivanja.

Primer 14 - Editovanje ćelija sa raznovrsnim gRNAs

[0481] Mobilisane humane CD34+ ćelije periferne krvi od ljudi donora 1-3 su uzgajane u StemSpan Medijumu bez seruma i sa dodatkom za ekspanziju CD34+ tokom dva dana.

100,000 ćelija je isprano i podvrgnuto elektroporaciji korišćenjem Cas9 mRNA sa Corfu Large (CLO) gRNAs, Corfu Small (CSO) gRNAs, HPFH5 gRNAs, Kenya gRNAs, SD2 sgRNA, ili SPY101 sgRNA. Ćelije su ostavljene da se oporave tokom dva dana pre nego što su prebačene na medijum za eritroidnu diferencijaciju (IMDM+Glutamax obogaćen sa 5% humanog seruma, 10ug/ml insulina, 20ng/ml SCF, 5ng/ml IL-3, 3U/ml EPO, 1uM deksametazona, 1uM b-estradiola, 330ug/ml holo-transferina i 2U/ml heraprina). Određen je procenat insercija/delecija ("indela") za svaku od ćelija podvrgnutih elektroporaciji sa Corfu Large (CLO) gRNAs, ćelija podvrgnutih elektroporaciji sa Corfu Small (CSO) gRNAs, ćelija podvrgnutih elektroporaciji sa HPFH5 gRNAs, ćelija podvrgnutih elektroporaciji sa Kenya gRNAs, ćelija podvrgnutih elektroporaciji sa SD2 sgRNA, i ćelija podvrgnutih elektroporaciji sa SPY101 sgRNA (Slika 3), kako je opisano u ovde izloženim pasusima "Otkrivanje on- i off-target mutacija sekvenciranjem" i "Testovi otkrivanja mutacija". Posle diferentovanja ovih ćelija tokom 12 dana u medijumu za eritroidnu diferencijaciju, sakupi se RNA za procenu nivoa hemoglobina putem kvantitativne real-time-PCR (Slike 4A-4C).

[0482] Pojedinačni eritroidni progenitori su generisani primenom protočne citometrije dan kasnije i uzgajani su u medijumu za eritroidno diferentovanje da se rašire i rastu u vidu kolonija. Svaka kolonija je podeljena i sakupljena 12 dana po sortiranju za DNA i RNA analiziranje. Sestrinske kolonije su sakupljane 15 dana po sortiranju za analiziranje hemoglobinskih proteina. Ekspresija globina (odnos y/18sRNA ili odnos g/a) je određen kvantitativnom real-time PCR i upoređen za svaku od editovanih eritroidnih kolonija (Slike 5A-5B).

Primer 15 - Testiranje SPY101 sgRNA

[0483] Kada se koristi SPY101 sgRNA mogu se javiti tri moguća ishoda editovanja gena unutar introna 2 BCL11A gena. Prvi ishod editovanja gena, koji može da se javi kada se primeni SPY101 sgRNA, dovodi samo do indela u obe alele (Indel/Indel, Slika 6). Drugi ishod editovanja gena, koji može da se javi kada se primeni SPY101 sgRNA, dovodi do klona sa oba, i indelima i sekvencama divljeg tipa u dva alela (Indel/WT, Slika 6). Treći ishod editovanja gena, koji može da se javi kada se primeni SPY101 sgRNA, dovodi do kolonije sa sekvencama divljeg tipa u obe alele (WT/WT, Slika 6).

[0484] Kada je primenjen SPY101 sgRNA, editovano je 92% eritroidnih kolonija. Na primer, 92% eritroidnih kolonija je imalo alele sa indelima (Slika 6).

[0485] g-globinska ekspresija (g/a globin mRNA odnos ili g/(g+b) globin mRNA odnos) je merena u pojedinačnim eritroidnim kolonijama editovanim sa SPY101 (Slike 7A-B). Pojedinačne eritroidne kolonije obuhvataju kolonije sa bialelne ili homozigotne indel (indel/indel), kolonije sa monoalelnim ili heterozigotnim indel (indel/WT), i kolonije sa sekvencama divljeg tipa u obe alele (WT/WT). Eritroidne kolonije koje imaju indele bile su sposobne da ekspresuju veće nivoe gama globina u poređenju sa klonovima sa sekvencama divljeg tipa u obe alele (Slike 7A-B).

Primer 16 - Terapeutska strategija za bolest srpastih ćelija (SCD) i b-talasemiju

[0486] Sledeća Tabela (Tabela 4) obezbeđuje informaciju koja je u vezi sa gRNAs koje su korišćene u Primerima 16-17.

Tabela 4

[0487] Sledeća Tabela (Tabela 5) obezbeđuje informaciju koja je u vezi sa metama o kojima se govori u Primerima 16-17.

Tabela 5

[0488] Terapeutska strategija za SCD i b-talasemiju koristi CRISPR/Cas9 da ponovo kreira iste genetičke mutacije koje se prirodno javljaju kod HPFH pacijenata. Izoluju se hematopoetske matične ćelije pacijenta, ove ćelije se ex vivo tretiraju sa CRISPR/Cas9 da se kreiraju HPFH genetički editi, i onda se editovane ćelije vrate u pacijenta. Genetički modifikovane matične ćelije dovode do eritrocita koji sadrže dovoljne nivoe HBF da bi se značajno snizila ozbiljnost simptoma boelsti. Broj genetičkih edita je priorizovan na osnovu stepena ushodne regulacije HBF koja se viđa u prirodi, mogućnosti za ponovno kreiranje ovakvih edita uz veliku efikasnost korišćenjem CRISPR/Cas9, i odsustva off- target editovanja.

[0489] Kandidatne sekvence RNA vodilje (gRNA) se računski selektuju i zatim skriniraju na efikasnost on-target editovanja u CD34+ ćelijama. Na Slici 8 su prikazani rezultati takvog jednog skrina. gRNAs se identifikuju sa doslednim, visokim (>70%) on-target editovanjem duž višestrukih donorskih uzoraka. Svaki CD34+ ćelijski donor je predstavljen jedinstvenim simbolom (▲, *, ●) i efikasnost on-target editovanja za svakog donora je merena dva puta.

[0490] Kandidatne gRNAs su skrinirane u CD34+ ćelijama na off-target aktivnost ispitivanjem stotina položaja koji su računski identifikovani kao najsličniji u sekvenci sa on-target položajem koji je u pitanju, i da zbog toga imaju najveći potencijal za off-target aktivnost. Slike 9A-B prikazuju eksperimentalni pristup (Slika 9A) i rezultate (Slika 9B) za svaku od gRNAs testiranu na Slici 8. Većina gRNAs ne pokazuje detektabilnu off-target aktivnost, čak ni na predviđenim položajima. Samo gRNA C i gRNA G ispoljavaju offtarget aktivnost. Višestruke probe su upotrebljene za svaki predviđeni položaj da bi se povećala osetljivost testa.

[0491] Kandidatne gRNAs su korišćene za ponovno kreiranje specifičnih HPFH ili drugih modifikacija u eritroidnim ćelijama dobijenim od SCD i pacijenata sa b-talasemijom, kao i od zdravih donora. Posle eritroidne diferencijacije, nivoi globinskog transkripta izmereni su da bi se ispitao porast g-globina u odnosu na a- ili b-globin. Kako je prikazano na Slikama 10A-B, više od 30% nivoa g-globinske mRNA se zapaža u ćelijama pacijenata editovanih sa gRNAs za ponovno kreiranje HPFH Mete 5 i 6. Uzorci pacijenta sa SCD i b-talasemijom su pokazali veći apsolutni porast g-globina u odnosu na one od zdravih donora, što je u skladu sa primećenim višim nivoom HbF kod pacijenata nego kod heterozigotnih nosača sa HPFH. Bazni nivo za lažno tretirane ćelije od svakog donora je oduzet od prikazanih vrednosti. Podaci predstavljaju pojedinačni eksperiment, osim podataka za SCD pacijente, koji predstavljaju srednju vrednost 3 uzorka različitih donora. Efikasnost editovanja je bila slična u svim eksperimentima.

[0492] Da bi se osiguralo da su efikasnosti editovanja u zapremini populacije CD34+ ćelija reprezentativne za dugo-trajnu repopulaciju HSC-e (LT-HSC), zapremina CD34+ ćelija je sortirana u specifične sub-populacije i podvrgnuta je testiranju on-target efikasnosti editovanja, kao što je prikazano na Slikama 11A-C. Zapaža se visoka efikasnost editovanja u LT-HSC populaciji. Eksperimenti su izvedeni korišćenjem proteina SPY101 i Cas9 od 4 donora. Štapići dijagrama prikazuju srednje vrednosti ± SEM. LT-HSC, Dugo-trajne hematopoetske matične ćelije; MPP, multipotentni progenitor; MLP, multilimfoidni progenitor; CMP, opšti mijeloidni progenitor; MEP, megakariocitno-eritrocitni progenitor; GMP, granulocitno-makrofagni progenitor.

[0493] In vivo ispitivanja prihvatanja grafta izvršena su na imunokompromitovanim miševima, da bi se potvrdilo da genski editovane ćelije HSPC zadržavaju potencijal za dugo-trajnu repopulaciju hematopoetskog sistema. Humane CD34+ ćelije, dobijene od zdravih davalaca, nisu podvrgnute tretmanu i editovanju, ili nisu genski-editovane korišćenjem gRNA SPY101 i nisu unesene u NSG miševe. Kako je prikazano na Slici 12, prisustvo sličnih nivoa hCD45RA+ ćelija (8 nedelja nakon prihvatanja grafta) kod miševa kojima su injicirane ćelije HSPC koje nisu tretirane/nisu editovane i kod miševa kojima su injicirane HSPC ćelije, editovane genom SPY101, potvrdilo je da je da su ćelije, editovane sa SPY101, zadržale potencijal prihvatanja grafta. Podaci, ucrtani kao tačke, predstavljaju pojedinačne životinje i prikazuju procenat živih ćelija, koje su bile humane CD45RA+ ćelije. Srednja vrednost ± SD. "Netretirane ćelije" predstavljaju ćelije HSPC, koje nisu podvrgnute elektroporaciji i nisu injicirane imunokompromitovanim miševima. "Needitovane ćelije" se odnose na ćelije HSPC, koje su podvgnute elektroporaciji, ali nisu genski-editovane i injicirane imunokompromitovanim miševima. "SPY101" predstavljaju HSPC ćelije koje su podvrgnute elektroporaciji sa Cas9 i SPY101 gRNA i injicirane su imunokompromitovanim miševima.

[0494] Razvijanje postupka je inicirano na karakteristici GMP-sposobnosti u pripremi za klinička ispitivanja. Kako je prikazano na Slici 13, nije zapažen značajan gubitak efikasnosti editovanja gena na kliničkoj skali u GMP-kompatibilnom postupku. Podaci predstavljaju srednje vrednosti tokom 4 ili više eksperimenata, ± SD.

[0495] Za naše vodeće kandidate, pokrenute su GLP/toksikološke studije, kao što je prikazano na Slici 14. Dve zasebne studije na NSG miševima omogućiće obimnu karakterizaciju biodistribucije i toksikologije editovanih CD34+ ćelija.

Primer 17 - Terapeutska strategija za bolest srpastih ćelija (SCD) i b-talasemiju

[0496] Rezultati od rekreacionih šest različitih HPFH varijanti, ili editujućih "meta", u humanim mPB CD34+ ćelijama su prikazani na Slikama 16A-B i Slici 17. CD34+ ćelije su tretirane sa CRISPR/Cas9, diferencirane u eritrocite, i zatim testirane na HBF mRNA i ekspresiju proteina u masi (Slike 16A-B) i kolonijama (Slika 17), korišćenjem eksperimentalnog procesa demonstriranog na Slici 15.

[0497] Rezultati predstavljeni na Slikama 16A-B su bili od 3 različita donora za mete 1-3, i 7 različitih donora za mete 4-6. Oduzet je pozadinski nivo (slepa proba) za lažno tretirane ćelije. Podatak je srednja vrednost ± SEM. Najveći deo analiza je potvrdio HBF ushodnu regulaciju i omogućio određivanje prioriteta meta koje su pokazale najveće nivoe HBF.

[0498] Klonska analiza predstavljena na Slici 17 dozvoljava potvrdu da su genetički editi prouzrokovani sa CRISPR/Cas9 bili zaista uzrok porasta HBF na pojedinačnom ćelijskom nivou. Rezultati su bili od jednog donora, i 50-80 kolonija po meti. Nivoi mRNA transkripta su izmereni pomoću qRT-PCR. Podatak je srednja vrednost ± SEM.

[0499] Mete 5 i 6 pokazuju najveće nivoe HBF i analizirane su dalje na Slikama 18A-B. Podatak je srednja vrednost ± SEM. WT označavaju kolonije koje ne pokazuju dokaz genskog editovanja, Heterozigoti ili Het označavaju kolonije sa jednim editovanim alelom, dok Homozigoti ili Homo označavaju kolonije sa oba editovana alela. Dokazi na Slikama 16A-B, 17, i 18A-B podržavaju uzročni odnos između proizvedenih genetičkih edita i željene ushodne regulacije HBF, što obezbeđuje dalju validaciju za predloženu terapeutsku strategiju.

Primer 18 – Testiranje poželjnih RNA vodilja u ćelijama za on-target aktivnost

[0500] Mobilisane ćelije CD34+ iz humane periferne krvi (mPB), dobijene od četiri nezavisna donora, kultivisane su u CellGro<®>medijumima bez seruma, koji sadrže 100 ng/ml rekombinantnog faktora humanih matičnih ćelija (SCF), 100 ng/ml rekombinantnog humanog Fit 3-liganda (FLT3L) i 100 ng/ml trombopoetina (TPO). 200,000 ćelija po donoru je isprano i podvrgnuto elektroporaciji, uz korišćenje Lonza elektroporatora, bez prisustva bilo kakvih CRISPR/Cas9 komponenti editovanja (lažni uzorak za elektroporaciju), sa GFP gRNA i Cas9 proteinom, kao negativnom kontrolom (GFP), sa SPY101 gRNA i Cas9 proteinom (SPY), sa SD2 gRNA i Cas9 proteinom (SD2), ili dvostrukim BCL11A Egzon 2 gRNA i Cas9 proteinom (Ex2). Rekombinantni Cas9 protein kodira Cas9 S. pyogenes, koji je sa bočnih strana zakucan sa dve sekvence SV40 nuklearne lokalizacije (NLS-i). Ovi eksperimenti su izvršeni uz korišćenje ribonukleoproteina (RNP), sa težinskim odnosom gRNA prema Cas9 od 1:1. gRNA SPY101 stvara InDel prekide na DHS+58 Gata1 vezujućem položaju u intronu 2 lokusa BCL11a. gRNA SD2 kreira InDel-ove i deleciju od 4.9 Kb na lokusu humanog beta globina. Delecija od 4.9 Kb je pozicionirana ushodno od HBG1 i uključuje celokupnu sekvencu HBG2. Delecija od 4.9 Kb započinje na 168 bp 5’ do kodirajuće sekvence HBG2, a završava na 168 bp 5’ u odnosu kodirajuću sekvencu HBG1. gRNA Egzona 2 stvaraju deleciju od 196 bp na Egzonu 2 lokusa BCL11A i služe kao pozitivna kontrola. Humane mPB CD34+ ćelije, koje nisu podvrgnute elektroporaciji, služe kao negativna kontrola (bez EP).

[0501] Nakon elektroporacije, genski-editovane mPB CD34+ ćelije se ostavljaju da odstoje tokom dva dana, pre nego što se prebace u eritroidni diferencirajući medijum (IMDM+L-glutamin, nadopunjen sa 5% humanog seruma, 10 ug/mL insulina, 20 ng/mL SCF, 5 ng/mL IL-3, 3 U/mL EPO, 1 uM deksametazona, 330 ug/ml holo-transferina i 2 U/mL heparina). Genski-editovane mPB CD34+ ćelije su diferencirane u eritrocite i dalje su testirane posredstvom TIDE analize, ddPCR analize, kvanitativne PCR analize u realnom vremenu, FACS analize i LC-MS (Slike 20A-B, 21A-D, 22A-B i 23A-D). Celokupni eksperimentalni postupak je prikazan na Slici 19.

TIDE analiza / ddPCR analiza

[0502] Genomska DNA je izolovana i testiran je svaki od genski-editovanih uzoraka humanih mPB CD34+ ćelija, uzgojenih u diferencirajućem medijumu. Genomska DNA je izolovana iz ćelija 1., 11., 13. i 15. dana nakon diferencijacije. Genomska DNA je analizirana posredstvom TIDE analize, koja predstavlja web sredstvo, da bi se brzo pristupilo editovanju genoma posredstvom CRISPR-Cas9 ciljnog lokusa, utvrđenog od strane RNA vodilje (gRNA ili sgRNA). Rezultati, koji su prikazani na Slikama 20A-B, dobijeni su od 4 različita donora, a pokazali su kako se procenat editovanja gena održava tokom ex-vivo eritroidne diferencijacije mPB CD34+ ćelija, editovanih sa gRNA SD2 (Slika 20B) i mPB CD34+ ćelija, editovanih sa gRNA SPY101 (Slika 20A). Podaci predstavljaju srednju vrednost SD.

[0503] Genomska DNA je, takođe, analizirana posredstvom ddPCR analize da bi se detektovala frekvencija delecija od 4.9 kb, tretmanom sa SD2. Rezultati, koji su prikazani na Slici 20B, dobijeni su od 4 različita donora, a pokazali su kako se procenat editovanja gena održava tokom ex-vivo eritroidne diferencijacije mPB CD34+ ćelija, editovanih sa gRNA SD2 (Slika 20B). Podaci predstavljaju srednju vrednost SD.

Kvantitativna PCR analiza u realnom vremenu

[0504] Izolovana je mRNA, i testiran je svaki od genski-editovanih uzoraka humanih mPB CD34+ ćelija, uzgojenih u diferencirajućem medijumu. Izolacija mRNA je izvršena 11. i 15. dana nakon diferenciranja. Ekspresija globina (odnos γ/α i odnos γ/(γ+β)) je utvrđena uz pomoć kvantitativne PCR u realnom vremenu, a poređenje je izvršeno za svaki od uzoraka humanih mPB CD34+ ćelija, editovanih sa gRNA SD2 i humanih mPB CD34+ ćelija, editovanih sa gRNA SPY101 (Slike 21A-D). Rezultati, predstavljeni na Slikama 21A-D, dobijeni su od 4 različita donora, i pokazali su povećanje γ-globinskih transkripata u humanim mPB CD34+ ćelijam editovanim sa gRNA SD2 i humanim mPB CD34+ ćelijama, editovanim sa gRNA SPY101, u poređenju sa negativnom kontrolom. Podaci predstavljaju srednju vrednost SD.

FACS / LC-MS

[0505] Humane mPB CD34+ ćelije, editovane sa gRNA SD2 i humane mPB CD34+ ćelije, editovane sa gRNA SPY101 uzgajane su u diferencirajućem medijumu, tokom 15 dana. Humane mPB CD34+ ćelije su, takođe, editovane sa dvostrukim gRNA Egzona 2 BCL11A (Ex2) ili sa gRNA GFP, i rasle su diferencirajućem medijumu 15 dana. Neke od humanih mPB CD34+ ćelija nisu editovane sa bilo kakvim CRISPR/Cas9 komponentama za editovanje (lažni uzorak za elektroporaciju), a neke od humanih mPB CD34+ ćelija nisu podvrgnute elektroporaciji (bez EP). Žive ćelije su obeležene sa glikoforinom A, markerom eritroidnog sazrevanja. Ćelije su, zatim, fiksirane i podvrgnute permeabilizaciji. Fiksirane ćelije su obeležene antitelom za svaku jedinicu globina, konjugovanim sa fluoroforom. Obeležene ćelije su, zatim, analizirane posredstvom FACS-a, a primer γ-globina je predstavljen na Slici 22A. Srednja vrednost medijane intenziteta fluorescencije za γ-globin, dobijen od 4 različita donora, prikazan je na Slici 22B (srednja vrednost ± SEM) i demonstrirana je ushodna regulacija γ-globina u humanim mPB CD34+ ćelijama, editovanim sa gRNA SD2 i humanim mPB CD34+ ćelijama, editovanim sa gRNA SPY101.

[0506] Humane mPB CD34+ ćelije, editovane sa gRNA SD2 i mPB CD34+ ćelije, editovane sa gRNA SPY101, rasle su u diferencirajućem medijumu, tokom 15 dana. Humane mPB CD34+ ćelije su, takođe, editovane sa dvostrukim gRNA Egzona 2 BCL11A (Ex2) ili gRNA GFP i uzgajane su u diferencirajućem medijumu tokom 15 dana. Neke od humanih mPB CD34+ ćelija nisu editovane sa bilo kakvim CRISPR/Cas9 komponentama za editovanje (lažni uzorak za elektroporaciju), a neke od humanih mPB CD34+ ćelija nisu podvrgnute elektroporaciji (bez EP). Korišćena je tečna hromatografija sa masenom detekcijom (LC-MS), da bi se detektovali denaturisani monomeri globina (Slike 23A-D). Rezultati, prikazani na Slikama 23A-D, dobijeni su od 4 različita donora, i, takođe, su demonstrirali ushodnu regulaciju γ-globina u mPB CD34+ ćelijama, editovanim sa gRNA SD2 i mPB CD34+ ćelijama, editovanim sa gRNA SPY101. Podaci predstavljaju srednju vrednost SD.

Primer 19 - Testiranje poželjnih RNAs vodilja u ćelijama na off-target aktivnost

[0507] Dok je on-target editovanje genoma od fundamentalnog značaja za uspešnu terapiju, otkrivanje bilo kakvog događaja off-target editovanja je važna komponenta osiguravanja bezbednosti proizvoda. Jedan postupak za detekciju modifikacija na offtarget položajima uključuje obogaćivanje za regione genoma koji su najsličniji on-target položaju putem sekvenciranja hibridnim hvatanjem i kvantitativnog određivanja bilo kakvih indela koji su otkriveni.

[0508] Sekvenciranja hibridnim hvatanjem je postupak kojim se kvantitativno određuju off-target editi u CRISPR-Cas9 editovanim ćelijama i DNA. Detalji koji se odnose na postupak sekvenciranja hibridnim hvatanjem su sledeći:

MATERIJALI I POSTUPCI

Materijli i izvori

1.1.1. Genomska DNA

[0509] Kako je svrha ovog postupka određivanje da li su se editovanjem putem CRISPR-Cas9 pojavili off-target položaji u genomu, obično se koriste najmanje dva input uzorka – tretirani i kontrolni (netretirani, lažno elektroporisan, itd.) uzorci. Svaki uzorak ima genomsku DNA (gDNA) ekstrahovanu odgovarajućim postupkom i ta gDNA se hibridizuje sa bibliotekama hibridnog hvatanja (1.1.2) što dalje prati ostatak protokola, kako je opisano u nastavku.

1.1.2. Biblioteke hibridnog hvatanja

[0510] Biblioteke hibridnog hvatanja, kako je opisano u (1.2.2), generišu se putem obezbeđivanja liste do 57,000120-mer oligonukleotidnih mamac sekvenci koje se onda sintetišu, kao poručenim SureSelect XT kitom hibridnog hvatanja.

1.2 Postupci

1.2.1. Algoritmi detekcije off-target položaja

[0511] Da bi odredili položaje na kojima će se najverovatnije javiti off-target editovanje, koristili smo nekoliko algoritama sa različitim karakteristikama kako bi osigurali da je pokriven širok raspon off-target položaja.

1.1.1.1. CCTop

[0512] Za datu sekvencu vodilju, CCTop koristi Bowtie 1 algoritam mapiranja sekvence za istraživanje genoma na off-target položaje sa do 5 nepodudaranja između položaja i vodiča. Ovaj položaj označavamo kao "homologni off-target položaji" (pre nego "predviđeni off-target položaji") s obzirom na to da je korišćena samo homologija sekvence za određivanje mogućih off-target položaja u genomu. Ovih 5 nepodudaranja su ograničena na ne više od 2 nepodudaranja u poravnanju semenskog regiona od 5 baza koji je najbliži PAM kraju sekvenci. CRISPOR algoritam (1.2.1.2) nema ograničenja u semenskom regionu i zato dopunjuje CCTop.

1.2.1.1. COSMID

[0513] S obzirom na to da neki off-target Cas9 položaji cepanja mogu imati kratke indele (takođe označeni kao ispupčenja) između njih i vodiča, isto tako smo istraživali sa COSMID algoritmom koji može otkriti off-target položaje sa indelima (obično ograničeno na do 2 indela) i na taj način dopunili istraživanje urađeno sa CCTop.

1.2.1.2. CRISPOR

[0514] CRISPOR je alat koji implementira brojne različite objavljene funkcije CRISPR on- i off-target skoringa u svrhu poređenja različitih postupaka. Koristi BWA algoritam za pretraživanje sekvenci vodilja naspram genoma da bi pronašao njihove off-target položaje. Ovo se razlikuje od Bowtie 1 algoritma korišćenog u CCTop i omogućava pretraživanje koje je neznatno više popustljivo u tome da nepodudaranja u blizini PAM regiona nisu ograničena na 2 od 5 baza, kao kod CCTop.

1.2.1.3. PAMs

[0515] Po ustaljenom obrascu, skrinovi su izvedeni uz pretraživanje na vodilje sa NGG ili NAG PAMs, kako imaju jednu od najvećih aktivnosti. Kasniji stadijumi skrinova mogu uključiti više PAMs kako bi se osiguralo da se ni jedan od off-target položaja, čak ni oni sa veoma niskom aktivnošću, ne propuste.

1.2.1.4. Kombinacije algoritama

[0516] Učinak vodilja se spaja zajedno od strane svakog od algoritama kako bi se eliminisali identični off-target položaji i postavljaju se u dizajniranu komponentu mamca hibridnog hvatanja.

1.2.2. Mamci hibridnog hvatanja

1.2.2.1 Dizajn

[0517] Liste položaja, koju su sačinili algoritmi detekcije off-target položaja (1.2.1.), zatim se koriste za generisanje proba hibridnog hvatanja koje će obogatiti svaki od off-target položaja u unesenim gDNA uzorcima. Iako jedan mamac može biti dovoljan za uspešno obogaćivanje za ciljnu DNA sekvencu, generalno se dizajnira nekoliko mamaca i postavlja duž ciljnog položaja (Slika 24) sa ciljem da se učini verovatnijim da mamac specifično gura na dole ciljni region čak i ukoliko je on bočno postavljen na stranu pomoću ponavljajuće sekvence koju može biti teško specifično vezati. Mamci hibridnog hvatanja (120-mers, tamno obojeni delovi) postavljeni duž mamca (20-mer, svetli delovi označeni sa *) (Slika 24).

1.2.3. Sekvenciranje

[0518] Posle obogaćivanja hibridnim hvatanjem, sekvenciranje se izvodi na Illumina HiSeq sekvenseru sa sparenim-krajem 125 bp čitanja i 175 bp veličinom inserta. Sekvenciranje se obično izvodi na meti dubinom pokrivenosti tako da mete imaju 5 detektovanih čitanja iz događaja minimalne učestalosti. Da bi se otkrilo na primer 0.5% indel događaja, sekvenciranje na 1000x pokrivenosti se izvodi tako da bi 0.5% događaja moglo imati 5 čitanja.

1.2.4. Efektivnost mamaca

[0519] U tipičnom eksperimentu smo našli da mamci pokrivaju ogromnu većinu ciljnih položaja sa visokim nivoima pokrivenosti sekvenciranja. Postoje izvesna ograničenja za pokrivenost sekvenciranja koja se mogu prevazići postupcima sekvenciranja sledeće generacije (NGS) zahvaljujući: visokom ili niskom %GC, sekvencama niske kompleksnosti, niskom afinitetu mamca, ne-specifičnosti mamca, i drugim razlozima. Stvarna moć otkrivanja indela u eksperimentu se određuje izračunavanjem moći uzorkovanja različitih pokrivenosti uzorkovanja za položaje sa različitim stvarnim učestalostima indela. Generalno, povećana pokrivenost sekvence obezbeđuje povećanu moć otkrivanja položaja sa niskom učestalošću indela. Na primer, ukoliko položaj ima 2500x pokrivenost sekvenciranja, hibridno hvatanje će imati 99% moći da vidi položaje sa 0.4% učestalosti indela, i 94% moći da vidi položaje sa 0.3% učestalosti indela (Slika 25).

1.2.5. Kvantitativno određivanje

[0520] Podaci sekvenciranja se svrstavaju BWA algoritmom, korišćenjem zadatih parametara, prema građi humanog genoma hg38. Za svaki mogući off-target položaj, računaju se svi indeli unutar 3 bp mogućeg Cas9 položaja cepanja i i dele pokrivenošću na položaju sečenja na taj način obezbeđujući količinu indela na naročitom položaju sečenja.

1.2.6. Statističko ispitivanje značajnih položaja sečenja

[0521] Različiti događaji mogu dovesti do indela koji nisu proizvod CRISPR-Cas9, a detektovani su na položajima kroz genom: varijante indela zametne linije ili polimorfizam, regioni sumnjivi na prelome genoma, regioni sa homopolimernim nizovima, i regioni koji su na drugi način teški za sekvenciranje.

1.2.6.1. Položaji koji su isključeni iz analize

[0522] Iz analize smo isključili: ma koji položaj sa indelom "zametne linije" na donor-podonor osnovi (donor ima > 30% učestalost indela u svakom uzorku), svaki položaj na hromozomu Y u ženskim uzorcima, i svaki položaj sa 0 pokrivenosti.

1.2.6.2. Statistički test

[0523] Da bi se ispitalo da li je viđeni indel na mogućem off-target položaju zaista CRISPR-Cas9 indukovani događaj, testirali smo da li uzorci tretirani sa Cas9 i vodičem imaju značajno veću učestalost indela u odnosu na netretirane uzorke primenom i Mann-Whitney Wilcoxon testa i Student t-testa. Ukoliko je ma koji od ovih testova značajan (p < 0.05) smatrali smo položaj označenim za praćenje sa PCR-om da bi se odredilo da li postoji značajno editovanje. Da bi osigurali da smo označili položaje za praćenje agresivnim koliko je moguće, nismo izvodili višestruku hipotezu korekcije testiranjem, koja bi umanjila broj položaja koje smo proglasili značajnim.

[0524] Takođe smo utvrdili analize sa negativnom kontrolom, gde smo ponovili analizu, osim što smo tražili položaje sa većom učestalošću indela u netretiranim uzorcima u odnosu na tretirane uzorke. Biološki, ne postoji razlog da očekujemo da nađemo "prave pogodke" u ovoj analizi, što nam obezbeđuje empirijsku informaciju o broju lažno pozitivnih koje možemo očekivati da nađemo u ovom skupu podataka koji se mogu pripisati doprinosu pozadinskih šumova. Sem toga, ovo možemo proširiti u empirijsku nula raspodelu uzimanjem dva dodatna uzorka negativne kontrole, uključujući ćelije koje su podvrgnute elektroporaciji bez Cas9 ili vodiča, i ćelije koje su podvrgnute elektroporaciji sa Cas9 i GFP vodičem. Testiranjem na pogodke u uzorcima koji su "manje tretirani" u poređenju sa uzorcima koji su "više tretirani", odredili smo konzervativnu empirijsku nula raspodelu lažno pozitivnih pogodaka, koja se može upotrebiti za prijavu uverljivosti pogodaka u našoj originalnoj analizi za tretirane vs netretirane uzorke.

[0525] Humane mPB CD34+ ćelije editovane sa SD2 gRNA i humane mPB CD34+ ćelije editovane sa SPY101 gRNA su analizirane postupkom sekvenciranja hibridnog hvatanja, koji je ovde opisan. Rezultati, koji su prikazani na Slikama 26-27 bili su od 3-4 različita donora i pokazivali su 0 off-target položaja uz dokaz sečenja u gen-editovanim mPB CD34+ ćelijama, koje su editovane sa SD2 gRNA (Slika 27) i gen-editovanim mPB CD34+ ćelijama, koje su editovane sa SPY101 gRNA (Slika 26). Učestalost indela za ciklus 1 je veća od (>) 0.5%. Učestalost indela za ciklus 2 je veća od (>) 0.2%.

Primer 20 – Eksperimenti usađivanja

[0526] Izolovane su mobilisane humane CD34+ ćelije periferne krvi (mPB) od zdravih donora korišćenjem CliniMACS CD34 mikrozrnaca sa CliniMACS Prodigy (Miltenyi Biotec) i uzgojene su u CellGro® medijumu bez seruma, koji je sadržavao 100 ng/ml rekombinantnog faktora humanih matičnih ćelija (SCF), 100 ng/ml rekombinantnog humanog Fit 3-Liganda (FLT3L), i 100 ng/ml trombopoetina (TPO). Ćelije su onda podvrgnute elektroporaciji korišćenjem Maxcyte® uređaja prema uputstvima proizvođača uz jedno od sledećeg: prazan vektor koji ne sadrži ni jednu CRISPR/Cas9 editujuću komponentu (lažan uzorak za elektroporaciju), sa GFP gRNA i Cas9 proteinom kao negativna kontrola (GFP), sa SPY101 gRNA i Cas9 proteinom (SPY101), ili sa SD2 gRNA i Cas9 proteinom (SD2). Rekombinantni Cas9 protein kodira S. pyogenes Cas9 ojačan dvema SV40 sekvencama lokalizacije jedra (NLSs). Ovi eksperimenti su izvedeni primenom težinskog odnosa ribonukleoproteina (RNP) gRNA prema Cas9 od 1:1.

[0527] Svaka od gen-editovanih mPB CD34+ humanih ćelija je injektovana preko vene repa u 16 imunodeficijentnih miševa ("NSG" ili NOD scid gama -NOD) kako bi se demonstrirale sposobnosti navođenja i usađivanja. NSG je loza korišćenih laboratorijskih miševa i jedna od najimunodeficijentnijih koje su do danas opisane; vidi, npr., Shultz et al., Nat. Rev. Immunol. 7(2): 118-130 (2007). Detalji koji se odnose na eksperiment uklaemljivanja predstavljeni su na Slici 28. 8-nedelja posle injekcije, NSG miševima je uzimana krv i analizirana je periferna krv pomoću FACS na humane CD45RA+ i mišije CD45+ žive ćelije. U 16-nedelja posle injektovanja, NSG miševi su žrtvovani, i analizirani su koštana srž, slezina, i periferna krv pomoću FACS na humane CD45RA+ i mišije CD45+ žive ćelije. Zapaža se usađivanje mPB CD34+ humanih ćelija u ozračenim NSG miševima u svim grupama podvrgnutim tretmanu od sva tri zdrava donora. Humane CD45RA+ ćelije se otkrivaju korišćenjem FACS u sva 3 hematopoezna organa od svih donora. Ne-transfektovane CD34+ kontrolne ćelije ispoljavaju neznatno bolje procente usađivanja. Sve transfektovane ćelijske grupe su imale slične procente usađivanja, uključujući lažno transfektovanu grupu kroz sva 3 zdrava donora. Generalno, dodavanje Cas9-gRNA RNP nije uticalo na uklaemljivanje u poređenju sa lažno transfektovanom kontrolom (Slike 29A-E i Slika 30). Tačke sa podacima na Slikama 29A-E predstavljaju pojedinačne miševe i prikazuju procente živih ćelija koje su bile humane CD45RA+ ćelije. Podatak je srednja vrednost+SEM.

Primer 21 – Ispitivanje efikasnosti SPY101 editovanja i efikasnosti primenom Cas9 RNP

[0528] U cilju otkrivanja najveće efikasnosti korišćenja CRISPR-Cas9 u tretiranju SCD i b-talasemije primenom SPY101, ispitali smo dva različita Cas9 formata, Cas9 mRNA ili Cas9 protein, na njihovu efikasnost editovanja, efikasnost i toksičnost u humanim CD34+ ćelijama iz mobilisane periferne krvi (mPB). Poredili smo različite izvore Cas9 mRNA za Cas9 protein pomoću elektroporacije Cas9 mRNA i SPY101 gRNA ili Cas9 proteina u kompleksu sa SPY101 gRNA (u vidu ribonukleoproteinskog (RNP) kompleksa) u humanim mPB CD34+ ćelijama i i izvršeno je ispitivanje na njihovu efikasnost editovanja i ćelijske vijabilnosti 48 sati posle elektroporacije. Uporedili smo različite izvore za Cas9 mRNA za Cas9 protein i našli da dok možemo postići slične nivoe efikasnosti editovanja između nekih Cas9 mRNA za Cas9 protein (Slika 31), većina je imala značajno nižu ćelijsku vijabilnost u poređenju sa kontrolnim uzorcima (bez elektroporacije (No EP) ili bez supstrata elektroporacije (Mock EP) kontrole) što je prikazano na Slikama 32A-B. Ovo ukazuje na to da je Cas9 RNP najbolji format za korišćenje za efikasno isporučivanje Cas9 i gRNA u humane mPB CD34+ ćelije.

[0529] Dalje smo uporedili različite izvore Cas9 proteina kao i Cas9 proteina sa različitim brojem signala lokalizacije jedra (NLS) bilo na N-, bilo na C-terminusu s obzirom na to da ovo može uticati na efikasnu lokalizaciju Cas9 u jedru da bi se izvršilo editovanje. Prikazano na Slikama 33A-C, našli smo da Aldevron Cas9 protein sa po jednim NLS na oba, i N- i C- terminusu proizvodi najbolju efikasnost editovanja bez promena u ćelijskoj vijabilnosti.

[0530] Sledeće, sakupili smo SPY101 efikasnosti editovanja ispitane kroz raznovrsne humane mPB CD34+ donore korišćenjem bilo Cas9 mRNA bilo Cas9 proteina (Feldan ili Aldevron izabrani iz prethodnog primera) i zapazili smo da Aldevron Cas9 protein dovodi do najveće efikasnosti editovanja (Slika 34A). Dalje, bili smo u mogućnosti da postignemo slične stope efikasnosti editovanja u GMP-kompatibilnoj proizvodnji na kliničkoj skali primenom Cas9 proteina (Slika 34B).

[0531] Sledeće što smo ispitali je bila SPY101 efikasnost kroz nekoliko CD34+ donora poreklom iz mPB (Slike 35A-B) ili koštane srži (BM, Slike 36A-B). Vidimo da kroz naš proces optimizacije, postižemo bolju efikasnost, mereno kao ekspresija g-globina u odnosu na globine slične a-globinu ili b-globinu (b-globin g-globin) pomoću kvantitativne real-time PCR u eritroidno diferenciranim CD34+ ćelijama.

[0532] Zatim smo istražili da li bi SPY101 bio efikasan u ćelijama dobijenim od pacijenata sa SCD ili b-talasemijom. Mononuklearne ćelije periferne krvi od zdravih donora ili pacijenata podvrgnute su elektroporaciji sa SPY101 Cas9 RNP i eritroidnoj diferencijaciji slično gornjim primerima pre nego što je izvršena ekstrakcija RNA radi merenja ekspresije g-globina. Vidimo da je SPY101 zaista bio efikasan za porast gglobina u uzorcima pacijenata (Slike 37A-B).

[0533] U cilju boljeg razumevanja odnosa genotipa prema fenotipu u SPY101 editovanim eritroidnim ćelijama, izveli smo analiziranje pojedinačne kolonije slično kao u Primeru 15 sa Cas9 RNP i našli smo da se ovim uvećava frakcija bi-alelnih kolonija editovanih primenom Cas9 RNP u poređenju sa primenom Cas9 mRNA (Slike 38A-B). Sem toga, detaljan pregled ne-editovanih kolonija, mono-alelni prekid GATA1 vezujućeg položaja ciljanog sa SPY101 i bi-alelni prekidi GATA1 vezujućeg položaja otkriven je u dozno-zavisnoj efikasnosti SPY101, mereno kao porast g-globina u poređenju sa kontrolnim GFP gRNA tretiranim ćelijama (Slike 39A-B).

[0534] Da bi se ispitao procenat ćelija koje ekspresuju g-globin, izvedena je FACS analiza u SPY101 Cas9 RNP editovanim CD34+ ćelijama iz humane mPB. U poređenju sa kontrolnim GFP gRNA tretiranim ćelijama, vidimo veći procenat eritroidno diferenciranih ćelija koje ekspresuju g-globin (Slike 40A-D), kao i povećanu ekspresiju gglobina po ćeliji (Slika 40E) u SPY101 tretiranim ćelijama.

Claims (13)

Patentni zahtevi

1. Jednomolekularna RNA vodilja (sgRNA) obuhvata sekvencu nukleinske kiseline SEQ ID NO: 71,959, pri čemu sgRNA sadrži tri 2’O-metil-fosforotioatna ostatka na svakom od svojih 5’ i 3’ krajeva.

2. Jednomolekularna RNA vodilja (sgRNA) obuhvata sekvencu nukleinske kiseline SEQ ID NO: 71,959, pri čemu su baze 1-3 i 97-99 modifikovani 2’-O-metil fosforotioatni nukleotidi.

3. Nukleinska kiselina koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira sgRNA prema zahtevu 1 ili 2.

4. Vektor koji obuhvata nukleinsku kiselinu prema zahtevu 3.

5. sgRNA prema zahtevu 1 ili 2, nukleinska kiselina prema zahtevu 3, ili vektor prema zahtevu 4, za upotrebu u lečenju pacijenata sa hemoglobinopatijom.

6. sgRNA za upotrebu prema zahtevu 5, nukleinska kiselina za upotrebu prema zahtevu 5 ili vektor za upotrebu prema zahtevu 5, pri čemu je hemoglobinopatija anemija srpastih ćelija ili talasemija.

7. sgRNA za upotrebu prema zahtevu 6, nukleinska kiselina za upotrebu prema zahtevu 6 ili vektor za upotrebu prema zahtevu 6, pri čemu je hemoglobinopatija talasemija i talasemija se bira iz grupe koju čine : a, b, d, g i njihove kombinacije, dalje opciono pri čemu je talasemija b-talasemija.

8. Ex vivo postupak editovanja 11A (BCL11A) gena B-ćelijskog limfoma u ljudskoj ćeliji putem editovanja genoma, a postupak obuhvata:

uvođenje u ljudsku ćeliju jedne ili više endonukleaza deoksiribonukleinske kiseline (DNA) ili nukleinske kiseline koja obuhvata nukleotidnu sekvencu koja kodira jednu ili više DNA endonukleaza ili vektora koji sadrži navedenu nukleinsku kiselinu da bi se napravilo jedan ili više jedno-lančanih odlomaka (SSBs) ili dvo-lančanih odlomaka (DSBs) unutar ili u blizini BCL11A gena ili druge DNA sekvence koja kodira regulatorni element BCL11A gena, što dovodi do permanentne delecije, modulacije, ili inaktivacije transkripcione kontrolne sekvence BCL11A gena, pri čemu postupak dalje obuhvata uvođenje u ćeliju sgRNA prema zahtevu 1 ili zahtevu 2, nukleinske kiseline koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira sekvencu nukleinske kiseline navedene sgRNA, ili vektora koji sadrži navedenu nukleinsku kiselinu, i pri čemu jedna ili više DNA endonukleaza sadrži Cas9 endonukleazu.

9. Postupak prema zahtevu 8, gde nukleinska kiselina koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira jednu ili više DNA endonukleaza je jedna ili više ribonukleinskih kiselina (RNAs).

10. Postupak prema zahtevu 8 ili 9, gde jedna ili više DNA endonukleaza, na N-terminusu, C-terminusu ili na oba N-terminusu i C-terminusu, svaka sadrži jedan ili više signala lokalizacije jedra (NLSs), opciono pri čemu jedan ili više NLSs sadrži SV40 NLS.

11. Postupak prema zahtevu 8 ili 10, gde su jedna ili više DNA endonukleaza u prethodno formiranom kompleksu sa sgRNA da bi se formirao jedan ili više ribonukleoproteina (RNPs), opciono pri čemu se jedna ili više DNA endonukleaza kombinuje sa sgRNA u težinskom odnosu 1:1 DNA endonukleaza prema sgRNA da bi se formirao jedan ili više RNPs.

12. Postupak prema zahtevu 11, gde se jedan ili više RNPs isporučuju u ljudsku ćeliju elektroporacijom, opciono pri čemu su jedna ili više DNA endonukleaza S. pyogenes Cas9 koja sadrži N-terminus SV40 NLS i C-terminus SV40 NLS.

13. Postupak prema bilo kom od zahteva 8-12, pri čemu je ljudska ćelija hematopoetska progenitorska ćelija, opciono pri čemu hematopoetska progenitorska ćelija je CD34+ ćelija.