RS65752B1 - Kombinovana terapija bispecifičnim antigen vezujućim molekulima koji aktiviraju t ćelije i antagonistima vezivanja ose pd-1 - Google Patents

Kombinovana terapija bispecifičnim antigen vezujućim molekulima koji aktiviraju t ćelije i antagonistima vezivanja ose pd-1

Info

Publication number
RS65752B1
RS65752B1 RS20240809A RSP20240809A RS65752B1 RS 65752 B1 RS65752 B1 RS 65752B1 RS 20240809 A RS20240809 A RS 20240809A RS P20240809 A RSP20240809 A RS P20240809A RS 65752 B1 RS65752 B1 RS 65752B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
seq
antigen binding
antibody
cells
binding
Prior art date
Application number
RS20240809A
Other languages
English (en)
Inventor
Christian Klein
Vaios Karanikas
Pablo Umaña
Alfred Zippelius
Daniela Thommen
Jens Schreiner
Original Assignee
Hoffmann La Roche
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hoffmann La Roche filed Critical Hoffmann La Roche
Publication of RS65752B1 publication Critical patent/RS65752B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6817—Toxins
    • A61K47/6829—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxins or Pseudomonas exotoxin A
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2827—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against B7 molecules, e.g. CD80, CD86
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3023—Lung
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3046—Stomach, Intestines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3069—Reproductive system, e.g. ovaria, uterus, testes, prostate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/468—Immunoglobulins having two or more different antigen binding sites, e.g. multifunctional antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A61K2039/507—Comprising a combination of two or more separate antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/35—Valency
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/55—Fusion polypeptide containing a fusion with a toxin, e.g. diphteria toxin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

OPIS
LISTA SEKVENCI
Trenutna aplikacija sadrži popis sekvenci koji je poslat elektronski u ASCII formatu. Navedena ASCII kopija, kreirana 11. novembra 2015. godine, naziva se 32401_SL.txt i veličine je 527.137 bajtova.
OBLAST PRONALASKA
Predmetni pronalazak se odnosi na kombinovane terapije koje koriste bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije i antagonist vezivanja ose PD-1, i opciono TIM3 antagonist, i na upotrebu ovih kombinovanih terapija u lečenju raka.
OSNOVA
Monoklonska antitela su snažno terapijsko sredstvo za lečenje raka koja selektivno ciljaju antigene koji se različito eksprimiraju na ćelijama raka.
U tom smislu se poslednjih godina povećava zanimanje za bispecifična antitela dizajnirana da se vežu jednim antigen vezujućim delom za površinski antigen na ciljnim ćelijama, a drugim antigen vezujućim delom za aktivacionu, nepromenjivu komponentu T ćelijskog receptorskog kompleksa (TCR). Istovremeno vezivanje takvog antitela za oba cilja će izazvati privremenu interakciju između ciljne ćelije i T ćelije, i uzrokovati aktivaciju bilo koje citotoksične T ćelije, a nakon toga i lizu ciljne ćelije. Tako se imunski odgovor preusmerava na ciljne ćelije i ne zavisi od prezentacije peptidnog antigena od strane ciljne ćelije ili od specifičnosti T ćelije, što bi bilo relevantno za normalnu MHC-ograničenu aktivaciju CTL-a. U ovom kontekstu, ključno je da se CTL-i aktiviraju samo kada ciljna ćelija predstavlja bispecifično antitelo za njih, tj. kada se oponaša imunološka sinapsa. Naročito poželjna su bispecifična antitela koja ne zahtevaju pretkondicioniranje limfocita ili kostimulaciju kako bi se izazvala efikasna liza ciljnih ćelija. Nije dovoljno shvaćen način na koji TCB utiču na samu T ćeliju, osim aktivacije određene efektorske funkcije.
Izgleda da su za aktivaciju T limfocita u mirovanju, ili T ćelija, ćelijama koje prezentuju antigen (APC) potrebna dva ulaza signala. Lafferty et al., Aust. J. Exp. Biol. Med. ScL 53: 27-42 (1975). Primarni, ili antigen specifični signal, transdukuje se kroz T ćelijski receptor (TCR) nakon prepoznavanja peptida stranog antigena prezentovanog u kontekstu glavnog kompleksa histokompatibilnosti (MHC). Drugi ili kostimulatorni signal T ćelijama prenose kostimulatorni molekuli eksprimirani na ćelijama koje prezentuju antigen (APC), i ovaj signal pospešuje klonsku ekspanziju, sekreciju citokina i efektorsku funkciju T ćelija. Lenschow et al., Ann. Rev. imunol. 14:233 (1996). U odsustvu kostimulacije, T ćelije mogu postati otporne na stimulaciju antigenom, ne uspostavljaju efikasan imunski odgovor, i dalje mogu dovesti do iscrpljenosti ili tolerancije prema stranim antigenima.
T ćelije mogu primiti i pozitivne i negativne sekundarne kostimulativne signale. Regulacija pozitivnih i negativnih signala je izuzetno važna za izazivanje efikasnih imunskih odgovora, uz održavanje imunske tolerancije i sprečavanje autoimunosti. Negativni sekundarni signali su verovatno potrebni za indukciju tolerancije T ćelije, dok pozitivni signali podstiču aktiviranje T ćelija.
Nedavno je otkriveno da se T ćelijska disfunkcija ili anergija javlja istovremeno sa indukovanom i produženom ekspresijom inhibitornog receptora, polipeptida 1 (PD-1) programirane ćelijske smrti. Jedan od njegovih liganda, PD-L1, je prekomerno eksprimiran kod mnogih kancera, i često je povezan sa lošom prognozom (Okazaki T et al., Intern. Immun.2007 19(7):813) (Thompson RH et al., Cancer Res 2006, 66(7):3381). Zanimljivo je da većina T limfocita koji infiltriraju tumorsko tkivo uglavnom ispoljava PD-1, za razliku od T limfocita u normalnim tkivima i T limfocita u perifernoj krvi, što ukazuje da povećanje PD-1 na tumorski reaktivnim T ćelijama može doprineti oslabljenom antitumorskom imunskom odgovoru (Blood 2009, 114(8): 1537).
Molekul 3 koji sadrži domen T ćelijskog imunoglobulina i mucina (TIM3) važan je u imunskoj regulaciji. Ovaj protein na površini ćelije eksprimira se preferencijalno pomoću pomoćnih T ćelija tipa 1, i uključen je u regulaciju aktivacije makrofaga, upalnih stanja i raka (Majeti R et al., PNAS, 106 (2009) 3396-3401 i WO2009/091547). Vezivanje TIM-3 za jedan od njegovih liganda (npr. galektin-9) može suzbiti Th1 odgovor indukovanjem programirane ćelijske smrti, što podržava perifernu toleranciju. Tretman sa TIM-3 siRNK ili antagonistom anti-TIM-3 antitela povećava izlučivanje interferona alfa iz CD4 pozitivnih T ćelija, što podržava inhibitornu ulogu TIM-3 u humanim T ćelijama. Primeri anti-TIM-3 monoklonskih antitela su objavljeni u WO2013/06490 i US2012/189617 (Ngiow et al., Cancer Res 7: 6567 (2011)).
FOLR1 se eksprimira na ćelijama tumora različitog porekla, npr. na raku jajnika i raku pluća. Do sada je opisano nekoliko pristupa načinu ciljanja FOLR1 terapijskim antitelima poput farletuzumaba, konjugatima antitela i leka, ili terapijom usvojenim T ćelijama za snimanje tumora (Kandalaft et al., J Transl Med.2012 Aug 3; 10:157. doi: 10.1186/1479-5876-10-157; van Dam et al, Nat Med. 2011 Sep 18;17(10): 1315-9. doi: 10.1038/nm.2472; Clifton et al., Hum Vaccin. 2011 Feb;7(2):183-90. Epub 2011 Feb 1; Kelemen et al., Int J Cancer. 2006 Jul 15;119(2):243-50; Vaitilingam et al., J Nucl Med. 2012 Jul;53(7); Teng et al., 2012 Aug;9(8):901-8. doi: 10.1517/17425247.2012.694863. Epub 2012 Jun 5. Napravljeni su neki pokušaji kojima su ciljani tumori pozitivni na folatne receptore uz pomoć konstrukata koji ciljaju folatne receptore i CD3 (Kranz et al., Proc Natl Acad Sci USA. Sep 26, 1995; 92(20): 9057-9061; Roy et al., Adv Drug Deliv Rev. 2004 Apr 29;56(8): 1219-31; Hutting Cui et al Biol Chem. Aug 17, 2012; 287(34): 28206-28214; Lamers et al., Int. J. Cancer. 60(4):450 (1995); Thompson et al., MAbs. 2009 Jul-Aug;1(4):348-56. Epub 2009 Jul 19; Mezzanzanca et al., Int. J. Cancer, 41, 609-615 (1988).
I dalje je prisutna potreba za takvom optimalnom terapijom za lečenje, stabilizovanje, sprečavanje i/ili odlaganje razvoja različitih vrsta kancera.
REZIME
U najširem smislu, predmetni pronalazak se odnosi na bispecifična antitela koja kombinuju folatni receptor 1 (FolR1) koji cilja antigen vezujuće mesto sa drugim mestom vezivanja antigena koja ciljaju CD3 i njihovu upotrebu u kombinaciji sa antagonistom vezivanja ose PD-1, npr. za lečenje raka. U jednom otelotvorenju, kombinacija dodatno sadrži TIM3 antagonist. Postupci i kombinacije ovog pronalaska omogućavaju pojačanu imunoterapiju. Prednost u odnosu na konvencionalni tretman je specifičnost koja se sastoji u indukovanju aktivacije T ćelija samo na mestu gde se eksprimira FolR1, kao i smanjenju i/ili preokretu niske aktivnosti posredovane T ćelijama, koja se naziva i iscrpljenost T ćelija, zahvaljujući kombinovanju sa antagonistom vezivanja ose PD-1 i opciono TIM3 antagonistom.
U skladu s ovim, u jednom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje metodu za lečenje ili odlaganje napredovanja raka kod pojedinca, koja podrazumeva davanje pojedincu efikasne količine bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije i antagonista vezivanja ose PD-1. U jednom otelotvorenju, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije sadrži prvi antigen vezujući deo sposoban za specifično vezivanje za CD3 i drugi antigen vezujući deo sposoban za specifično vezanje za folatni receptor 1 (FolR1). U jednom otelotvorenju, prvi antigen vezujući deo sadrži najmanje jednu aminokiselinsku sekvencu regiona koja određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 i SEQ ID NO: 39, i najmanje jedan CDR lakog lanca odabran iz grupe koja obuhvata SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34. U jednom otelotvorenju, prvi antigen vezujući deo sadrži varijabilni teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 36, i varijabilni laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 31. U jednom otelotvorenju, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije nadalje sadrži treći antigen vezujući deo sposoban za specifično vezivanje za FolR1. U jednom otelotvorenju, drugi i treći antigen vezujući deo sposoban za specifično vezivanje za FolR1 sadrži identične sekvence regiona koji određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca i regiona CDR lakog lanca. U jednom otelotvorenju, treći antigen vezujući deo je identičan drugom antigen vezujućem delu. U jednom otelotvorenju, najmanje prvi ili drugi ili treći antigen vezujući deo je molekul Fab.
U jednom otelotvorenju, antigen vezujući deo sposoban za specifično vezivanje za folatni receptor 1 (FolR1) sadrži najmanje jednu aminokiselinsku sekvencu regiona koji određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 i SEQ ID NO: 18, i najmanje jedan CDR lakog lanca odabran iz grupe koja obuhvata SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34. U jednom otelotvorenju, antigen vezujući deo sposoban za specifično vezivanje za folatni receptor 1 (FolR1) sadrži varijabilni teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 15, i varijabilni laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 31. U jednom otelotvorenju, antigen vezujući deo sposoban za specifično vezivanje za folatni receptor 1 (FolR1) sadrži najmanje jednu aminokiselinsku sekvencu regiona koji određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 56 i SEQ ID NO: 57, i najmanje jedan CDR lakog lanca odabran iz grupe koja obuhvata SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 65. U jednom otelotvorenju, antigen vezujući deo sposoban za specifično vezivanje za folatni receptor 1 (FolR1) sadrži varijabilni teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 55, i varijabilni laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 64. U jednom otelotvorenju, antigen vezujući deo sposoban za specifično vezivanje za folatni receptor 1 (FolR1) sadrži najmanje jednu aminokiselinsku sekvencu regiona koji određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 i SEQ ID NO: 50, i najmanje jedan CDR lakog lanca odabran iz grupe koja obuhvata SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54. U jednom otelotvorenju, antigen vezujući deo sposoban za specifično vezivanje za FolR1 sadrži:
a) aminokiselinsku sekvencu regiona koji određuje komplementarnost teškog lanca 1 (CDR-H1) SEQ ID NO: 8;
(b) aminokiselinsku sekvencu regiona CDR-H2 SEQ ID NO: 9;
(c) aminokiselinsku sekvencu regiona CDR-H3 SEQ ID NO: 50;
(d) aminokiselinsku sekvencu regiona koji određuje komplementarnost lakog lanca 1 (CDR-L1) SEQ ID NO: 52;
(e) aminokiselinsku sekvencu regiona CDR-L2 SEQ ID NO: 53, i
(f) aminokiselinsku sekvencu regiona CDR-L3 SEQ ID NO: 54.
U jednom takvom otelotvorenju, antigen vezujući deo sposoban za specifično vezivanje za FolR1 sadrži varijabilni teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 49, i varijabilni laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 51.
U jednom otelotvorenju, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije vezuje se za FolR1 čoveka, FolR1 majmuna cinomolgus i FolR1 miša.
U jednom otelotvorenju, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije indukuje proliferaciju humane CD3 pozitivne T ćelije in vitro.
U jednom otelotvorenju, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije indukuje in vitro ubijanje tumorskih ćelija koje eksprimiraju FolR1 posredstvom humanih mononuklearnih ćelija periferne krvi.
U jednom otelotvorenju, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije indukuje in vitro ubijanje humanih tumorskih ćelija koje eksprimiraju FolR1 posredstvom T ćelija. U jednom otelotvorenju, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije indukuje in vitro ubijanje, posredstvom T ćelija, humanih tumorskih ćelija koje eksprimiraju FolR1 sa EC50 između oko 36 pM i oko 39.573 pM nakon 24 sata. U jednom otelotvorenju, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije indukuje povećanje ekspresije na ćelijskoj površini najmanje jednog od CD25 i CD69 na T ćeliji, mereno protočnom citometrijom. U jednom otelotvorenju, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije vezuje humani FolR1 sa prividnom KDod oko 5,36 do oko 4 nM. U jednom otelotvorenju, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije vezuje FolR1 čoveka i cinomolgusa sa prividnom KDod oko 4 nM. U jednom otelotvorenju, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije vezuje mišji FolR1 sa prividnom KDod oko 1,5 nM. U jednom otelotvorenju, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije vezuje humani FolR1 sa KDjednovalentnog vezivanja od najmanje oko 1000 nM. U jednom otelotvorenju, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije vezuje se za FolR1 eksprimiran na humanoj tumorskoj ćeliji. U jednom otelotvorenju, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije vezuje se za konformacioni epitop na humanom FolR1. U jednom otelotvorenju, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije ne vezuje se za humani folatni receptor 2 (FolR2) niti za humani folatni receptor 3 (FolR3). U jednom otelotvorenju, antigen vezujući deo vezuje se za FolR1 polipeptid koji sadrži aminokiseline 25 do 234 humanog FolR1 (SEQ ID NO: 227). U jednom otelotvorenju, FolR1 antigen vezujući deo vezuje se za FolR1 polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 227, 230 i 231, i pri čemu se FolR1 antigen vezujući deo ne vezuje za FolR polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvence SEQ ID NO.228 i 229. U jednom otelotvorenju, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije sadrži a) prvo antigen vezujuće mesto koje se takmiči u vezivanju za humani FolR1 sa referentnim antitelom koje sadrži varijabilni domen teškog lanca (VH) sekvence SEQ ID NO: 49, i varijabilni domen lakog lanca SEQ ID NO: 51; i b) drugo antigen vezujuće mesto koje se takmiči u vezivanju za humani CD3 sa referentnim antitelom koje sadrži varijabilni domen teškog lanca (VH) SEQ ID NO: 36, i varijabilni domen lakog lanca SEQ ID NO: 31, pri čemu se konkurentnost vezivanja meri pomoću testa površinske plazmonske rezonance.
U jednom otelotvorenju, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije sadrži prvi, drugi, treći, četvrti i peti polipeptidni lanac koji čine prvi, drugi i treći antigen vezujući deo, pri čemu je prvi antigen vezujući deo sposoban da vezuje CD3, a drugi i treći antigen vezujući deo su sposobni da vezuju folatni receptor 1 (FolR1), pri čemu a) prvi i drugi polipeptidni lanac sadrže, u smeru od amino (N)-terminalnog kraja do karboksil (C)-terminalnog kraja, VLD1 i CLD1; b) treći polipeptidni lanac sadrži, u smeru od N-terminalnog kraja do C-terminalnog kraja, VLD2 i CH1D2; c) četvrti polipeptidni lanac sadrži, u smeru od N-terminalnog kraja do C-terminalnog kraja, VHD1, CH1D1, CH2D1 i CH3D1; d) peti polipeptidni lanac sadrži VHD1, CH1D1, VHD2, CLD2, CH2D2 i CH3D2; pri čemu VLD1 je prvi varijabilni domen lakog lanca
VLD2 je drugi varijabilni domen lakog lanca
CLD1 je prvi konstantni domen lakog lanca
CLD2 je drugi konstantni domen lakog lanca
VHD1 je prvi varijabilni domen teškog lanca
VHD2 je drugi varijabilni domen teškog lanca
CH1D1 je prvi konstantni domen teškog lanca 1
CH1D2 je drugi konstantni domen teškog lanca 1
CH2D1 je prvi konstantni domen teškog lanca 2
CH2D2 je drugi konstantni domen teškog lanca 2
CH3D1 je prvi konstantni domen teškog lanca 3
CH3D2 je drugi konstantni domen teškog lanca 3.
U jednom takvom otelotvorenju,
a. treći polipeptidni lanac i VHD2 i CLD2 petog polipeptidnog lanca čine prvi antigen vezujući deo sposoban da veže CD3;
b. prvi polipeptidni lanac i VHD1 i CH1D1 četvrtog polipeptidnog lanca čine drugi vezujući deo sposoban za vezivanje na FolR1; i
c. drugi polipeptidni lanac i VHD1 i CH1D1 petog polipeptidnog lanca čine treći vezujući deo sposoban za vezivanje na FolR1.
U jednom takvom otelotvorenju, prvi i drugi polipeptidni lanac sadrže aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:399. U jednom takvom otelotvorenju, treći polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:86. U jednom takvom otelotvorenju, četvrti polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:394. U jednom takvom otelotvorenju, peti polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:397. U jednom otelotvorenju,
a. prvi i drugi polipeptidni lanac sadrže aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:399;
b. treći polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:86; c. četvrti polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:394; i d. peti polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:397. U nekim otelotvorenjima, bispecifično antitelo je dvovalentno i za FolR1 i za CD3. U nekim otelotvorenjima, bispecifično antitelo sadrži jedan ili više Fab fragmenata koji sadrže antigen vezujuće mesto specifično za CD3, pri čemu su varijabilni regioni ili konstantni regioni teškog i lakog lanca razmenjeni.
U nekim otelotvorenjima, bispecifično antitelo sadrži Fc domen, najmanje jedan Fab fragment koji sadrži antigen vezujuće mesto specifično za FolR1 i najmanje jedan Fab fragment koji sadrži antigen vezujuće mesto specifično za CD3, pri čemu su razmenjene bilo varijabilni regioni ili konstantni regioni teškog i lakog lanca najmanje jednog Fab fragmenta.
U nekim otelotvorenjima, bispecifično antitelo sadrži:
a) Fc domen,
b) prvi i drugi Fab fragment, gde svaki sadrži antigen vezujuće mesto specifično za FolR1,
c) treći Fab fragment koji sadrži antigen vezujuće mesto specifično za CD3, pri čemu je treći Fab fragment povezan na C-terminalnom kraju varijabilnog teškog lanca (VH) sa drugom podjedinicom Fc domena, i pri čemu je treći Fab fragment povezan na N-terminalnom kraju varijabilnog teškog lanca sa C-terminalnim krajem drugog Fab fragmenta.
U jednom otelotvorenju, najmanje jedan od navedenih Fab fragmenata vezan je za Fc domen preko peptidnog linkera.
U jednom otelotvorenju, navedeno bispecifično antitelo sadrži Fc domen, koji sadrži jednu ili više aminokiselinskih supstitucija koje smanjuju vezivanje za Fc receptore i/ili efektorsku funkciju. U jednom otelotvorenju, navedena jedna ili više aminokiselinskih supstitucija se nalazi na jednom ili više mesta odabranih iz grupe L234, L235 i P329. U jednom otelotvorenju, svaka podjedinica Fc domena sadrži tri aminokiselinske supstitucije koje ukidaju vezivanje za aktivacioni ili inhibicioni Fc receptor i/ili efektorsku funkciju, pri čemu su navedene aminokiselinske supstitucije L234A, L235A i P329G.
U nekim otelotvorenjima, antagonist vezivanja ose PD-1 odabire se iz grupe koju čine antagonist vezivanja PD-1, antagonist vezivanja PDL1 i antagonist vezivanja PDL2.
U nekim otelotvorenjima, antagonist vezivanja ose PD-1 je antagonist vezivanja PD-1. U nekim otelotvorenjima, antagonist vezivanja PD-1 inhibira vezivanje PD-1 na njegove partnere za vezivanje liganda. U nekim otelotvorenjima, antagonist vezivanja PD-1 inhibira vezivanje PD-1 za PDL1. U nekim otelotvorenjima, antagonist vezivanja PD-1 inhibira vezivanje PD-1 za PDL2. U nekim otelotvorenjima, antagonist vezivanja PD-1 inhibira vezivanje PD-1 i za PDL1 i za PDL2. U nekim otelotvorenjima, antagonist vezivanja PD-1 je antitelo. U nekim otelotvorenjima, anti-PD-1 antitelo je monoklonsko antitelo. U nekim otelotvorenjima, anti-PD-1 antitelo je fragment antitela izabran iz grupe koja sadrži fragmente Fab, Fab'-SH, Fv, scFv i (Fab')2. U nekim otelotvorenjima, antagonist vezivanja PD-1 je nivolumab, pembrolizumab, CT-011 ili AMP-224.
U nekim otelotvorenjima, antagonist vezivanja ose PD-1 je antagonist vezivanja PDL1. U nekim otelotvorenjima, antagonist vezivanja PDL1 inhibira vezivanje PDL1 za PD-1. U nekim otelotvorenjima, antagonist vezivanja PDL1 inhibira vezivanje PDL1 za B7-1. U nekim otelotvorenjima, antagonist vezivanja PDL1 inhibira vezivanje PDL1 i za PD-1 i za B7-1. U nekim otelotvorenjima, antagonist vezivanja PDL1 je anti-PDL1 antitelo. U nekim otelotvorenjima, anti-PDL1 antitelo je monoklonsko antitelo. U nekim otelotvorenjima, anti-PDL1 antitelo je fragment antitela izabran iz grupe koja sadrži fragmente Fab, Fab'-SH, Fv, scFv i (Fab')2. U nekim otelotvorenjima, anti-PDL1 antitelo je humanizovano antitelo ili humano antitelo. U nekim otelotvorenjima, antagonist vezivanja PDL1 je izabran iz grupe koja se sastoji od: YW243.55.S70, MPDL3280A, MDX-1105 i MEDI4736.
U nekim otelotvorenjima, anti-PDL1 antitelo sadrži teški lanac koji sadrži HVR-H1 sekvencu SEQ ID NO:289, HVR-H2 sekvencu SEQ ID NO:290 i HVR-H3 sekvencu SEQ ID NO:291; i laki lanac koji sadrži HVR-L1 sekvencu SEQ ID NO:292, HVR-L2 sekvencu SEQ ID NO:293 i HVR-L3 sekvencu SEQ ID NO:294. U nekim otelotvorenjima, anti-PDL1 antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:280 ili SEQ ID NO:281, i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:383. U nekim otelotvorenjima, anti-PDL1 antitelo sadrži teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:278, i laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:279.
U nekim otelotvorenjima, antagonist vezivanja ose PD-1 je antagonist vezivanja PDL2. U nekim otelotvorenjima, antagonist vezivanja PDL2 je antitelo. U nekim otelotvorenjima, anti-PDL2 antitelo je monoklonsko antitelo. U nekim otelotvorenjima, anti-PDL2 antitelo je fragment antitela izabran iz grupe koja sadrži fragmente Fab, Fab'-SH, Fv, scFv i (Fab')2. U nekim otelotvorenjima, antagonist vezivanja PDL2 je imunoadhezin.
U jednom otelotvorenju, metoda iz bilo koje od gornjih realizacija dalje podrazumeva davanje pojedincu antagonista T ćelijskog imunoglobulina mucina 3 (TIM3). U jednom otelotvorenju, antagonist TIM3 je anti-TIM3 antitelo. U jednom otelotvorenju, anti-TIM3 antitelo indukuje internalizaciju TIM3 na ćeliji koja eksprimira TIM3 od najmanje 45% nakon 120 minuta na 37 °C, pri čemu se internalizacija meri FACS analizom. U jednom otelotvorenju, anti-TIM3 antitelo ima jednu ili više od sledećih osobina:
a) takmiči se u vezivanju za TIM3 sa anti-Tim3 antitelom koje sadrži VH SEQ ID NO:7 i VL SEQ ID NO: 8
b) vezuje se za TIM3 čoveka i cinomolgusa
c) kao imunokonjugat pokazuje citotoksičnu aktivnost na ćelijama koje eksprimiraju TIM3
d) indukuje oslobađanje interferona gama.
U jednom otelotvorenju, anti-TIM3 antitelo ima jednu ili više od sledećih osobina: a) takmiči se u vezivanju za TIM3 sa anti-Tim3 antitelom koje sadrži VH SEQ ID NO:7 i VL SEQ ID NO: 8
b) vezuje se za TIM3 čoveka i cinomolgusa
c) kao imunokonjugat pokazuje citotoksičnu aktivnost na ćelijama koje eksprimiraju TIM3
d) indukuje oslobađanje interferona gama.
U jednom otelotvorenju, anti-TIM3 antitelo je monoklonsko antitelo. U jednom otelotvorenju, anti-TIM3 antitelo je humano, humanizovano ili himerno antitelo. U jednom otelotvorenju, anti-TIM3 antitelo je fragment antitela koji se vezuje za TIM3. U jednom otelotvorenju, anti-TIM3 antitelo je Fab fragment. U jednom otelotvorenju, anti-TIM3 antitelo sadrži:
A)(a) VH domen koji sadrži (i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:304; (ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:305, i (iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SEQ ID NO:306, i (b) VL domen koji sadrži (i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:307; (ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:308, i (iii) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:309; ili
B) (a) VH domen koji sadrži (i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:304; (ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:305, i (iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SEQ ID NO:306, i (b) VL domen koji sadrži (i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:314; (ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:308, i (iii) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:309; ili
C) (a) VH domen koji sadrži (i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:304; (ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:305, i (iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SEQ ID NO:306, i (b) VL domen koji sadrži (i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:315; (ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:308, i (iii) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:309; ili
D)(a) VH domen koji sadrži (i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:316; (ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:317, i (iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SEQ ID NO:318, i (b) VL domen koji sadrži (i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:319; (ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:320, i (iii) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:321; ili
E) (a) VH domen koji sadrži (i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:324; (ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:325, i (iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SEQ ID NO:326, i (b) VL domen koji sadrži (i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:327; (ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:328, i (iii) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:329; ili.
F) (a) VH domen koji sadrži (i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:332; (ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:333, i (iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SEQ ID NO:334, i (b) VL domen koji sadrži (i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:335; (ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:336, i (iii) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:337; ili
G)(a) VH domen koji sadrži (i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:340; (ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:341, i (iii) HVRH3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SEQ ID NO:342, i (b) VL domen koji sadrži (i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:343; (ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:344, i (iii) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:345; ili
H)(a) VH domen koji sadrži (i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:348; (ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:349, i (iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SEQ ID NOG50; i (b) VL domen koji sadrži (i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:351; (ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:352, i (iii) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:353; ili
I) (a) VH domen koji sadrži (i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:356; (ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:357, i (iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SEQ ID NO:358, i (b) VL domen koji sadrži (i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:359; (ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:360, i (iii) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:361; ili
J) (a) VH domen koji sadrži (i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:364; (ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:365, i (iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SEQ ID NO:366, i (b) VL domen koji sadrži (i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:367; (ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:368, i (iii) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:369.
U jednom otelotvorenju, anti-TIM3 antitelo je antitelo pune dužine IgG1sa mutacijama S228P, L235E i P329G, prema EU indeksu Kabatove numeracije. U jednom otelotvorenju, anti-TIM3 antitelo je bilo koje od antitela opisanih u WO 2011/155607, WO 2013/006490, WO 03/063792, WO 2009/097394 i WO 2011/159877. U jednom otelotvorenju, anti-TIM3 antitelo je F38-2E2.
U jednom otelotvorenju, rak sadrži KRAS divljeg tipa. U jednom otelotvorenju, rak sadrži aktivacionu KRAS mutaciju.
U jednom otelotvorenju, rezultat lečenja je odloženi odgovor kod pojedinca nakon prestanka lečenja. U jednom otelotvorenju, najmanje jedan od bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije i antagonista vezivanja ose PD-1 se daje kontinualno. U jednom otelotvorenju, najmanje jedan od bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije i antagonista vezivanja ose PD-1 se daje sa prekidima. U jednom otelotvorenju, antagonist vezivanja ose PD-1 se daje pre FolR1 TCB. U jednom otelotvorenju, antagonist vezivanja ose PD-1 se daje istovremeno sa FolR1 TCB.
U jednom otelotvorenju, antagonist vezivanja ose PD-1 se daje nakon FolR1 TCB. U jednom otelotvorenju, rak je odabran iz grupe koju čine rak jajnika, rak pluća, rak dojke, rak bubrega, kolorektalni rak, rak endometrijuma. U jednom otelotvorenju, najmanje jedan od bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije i antagonista vezivanja ose PD-1 se daje intravenski, intramuskularno, supkutano, topikalno, oralno, transdermalno, intraperitonealno, intraorbitalno, implantacijom, inhalacijom, intratekalno, intraventrikularno ili intranazalno.
U jednom otelotvorenju, T ćelije kod pojedinca imaju pojačanu aktivaciju, proliferaciju i/ili efektorsku funkciju u odnosu na period pre davanja ove kombinacije. U jednom otelotvorenju, T ćelije kod pojedinca imaju pojačanu aktivaciju, proliferaciju i/ili efektorsku funkciju u odnosu na to kada se daje samo bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije. U jednom otelotvorenju, efektorska funkcija T ćelija je sekrecija barem jednog od IL-2, IFN-γ i TNF-α. U jednom otelotvorenju, pojedinac sadrži manje od oko 15% T ćelija koje infiltriraju tumor sa ekspresijom PD-1<hi>.
U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje metodu za pojačavanje imunološke funkcije kod pojedinca koji ima FolR1 pozitivan rak, koja se sastoji od davanja pojedincu efikasne količine kombinacije bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije specifičnog za folatni receptor 1 (FolR1) i CD3, te antagonista vezivanja ose PD-1. U jednom otelotvorenju, T ćelije kod pojedinca imaju pojačanu aktivaciju, proliferaciju i/ili efektorsku funkciju u odnosu na period pre davanja ove kombinacije. U jednom otelotvorenju, T ćelije kod pojedinca imaju pojačanu aktivaciju, proliferaciju i/ili efektorsku funkciju u odnosu na to kada se daje samo bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije. U jednom otelotvorenju, efektorska funkcija T ćelija je sekrecija barem jednog od IL-2, IFN-γ i TNF-α.
U jednom otelotvorenju, pojedinac sadrži manje od oko 15% T ćelija koje infiltriraju tumor sa ekspresijom PD-1<hi>.
U drugom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje metodu za odabir pacijenta za lečenje kombinacijom bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije specifičnog za folatni receptor 1 (FolR1) i CD3, i antagonista vezivanja ose PD-1, koja podrazumeva merenje nivoa ekspresije PD-1, pri čemu se za lečenje ovom kombinacijom odabira pacijent koji ima manje od oko 15% T ćelija sa ekspresijom PD-1<hi>.
U drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje komplet koji sadrži bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije, specifičan za folatni receptor 1 (FolR1) i CD3, i uputstvo za upotrebu bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije sa antagonistom vezivanja ose PD-1 za lečenje ili odlaganje napredovanja raka kod pojedinca. U jednom otelotvorenju, komplet dodatno sadrži uputstvo za upotrebu bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije sa TIM3 antagonistom.
U drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje komplet koji sadrži bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije, specifičan za folatni receptor 1 (FolR1) i CD3 i antagonist vezivanja ose PD-1, te uložak koji sadrži uputstvo za upotrebu bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije i antagonista vezivanja ose PD-1 za lečenje ili odlaganje napredovanja raka kod pojedinca. U jednom otelotvorenju, komplet dodatno sadrži TIM3 antagonist. U jednom otelotvorenju antagonist vezivanja ose PD-1 je anti-PD-1 antitelo ili anti-PDL1 antitelo. U jednom otelotvorenju, antagonist vezivanja ose PD-1 je anti-PD-1 imunoadhezin.
U jednom drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije, specifičan za folatni receptor 1 (FolR1) i CD3, antagonist vezivanja ose PD-1 i farmaceutski prihvatljiv nosač. U jednom otelotvorenju, farmaceutska kompozicija dodatno sadrži TIM3 antagonist.
U jednom drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje upotrebu kombinacije bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije specifičnog za folatni receptor 1 (FolR1) i CD3 i antagonista vezivanja ose PD-1 u proizvodnji leka za lečenje raka. U jednom otelotvorenju, lek se koristi za lečenje raka jajnika, raka pluća, raka dojke, raka bubrega, kolorektalnog raka, raka endometrijuma.
U određenim otelotvorenjima svih aspekata predmetnog pronalaska, povoljno je to što su navedeni bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije i/ili antagonist vezivanja ose PD-1 humani ili humanizovani.
U nekim otelotvorenjima, bispecifično antitelo sadrži Fc domen, najmanje jedan Fab fragment koji sadrži antigen vezujuće mesto specifično za FolR1 i najmanje jedan fragment Fab koji sadrži antigen vezujuće mesto specifično za CD3.
U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje metodu za lečenje ili odlaganje napredovanja raka kod pojedinca, koja se sastoji od davanja pojedincu efikasne količine bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije i TIM3 antagonista. U nekim otelotvorenjima, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije sadrži Fc domen, dva Fab fragmenta od koji svaki sadrži antigen vezujuće mesto specifično za FolR1, i jedan Fab fragment koji sadrži antigen vezujuće mesto specifično za CD3.
U još jednom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje upotrebu kombinacije bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije i koji se vezuje za FolR1 i CD3, te antagonista vezivanja ose PD-1 u proizvodnji leka za lečenje raka.
U još jednom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje upotrebu kombinacije bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije i koji se vezuje za FolR1 i CD3, antagonista vezivanja ose PD-1 i TIM3 antagonista u proizvodnji leka za lečenje raka.
Otelotvorenja predmetnog pronalaska će sada biti opisana primerima i pratećim slikama, koji nemaju ograničavajući karakter. Vezano za ovu objavu, jasno je da će različiti dodatni aspekti i otelotvorenja ovog pronalaska biti očigledni stručnim licima iz ove oblasti.
"I/ili", kada se ovde koristi, treba shvatiti kao posebno otkriće svake od dve navedene karakteristike ili komponente zajedno ili odvojeno. Na primer, "A i/ili B" treba shvatiti kao posebno otkriće koje važi za svaku opciju (i) A, (ii) B, i (iii) A i B, kao da je svaka opcija ovde pojedinačno predočena.
Ukoliko kontekst ne nalaže drugačije, opisi i definicije gore navedenih karakteristika nisu ograničeni na bilo koji određeni aspekt ili otelotvorenje pronalaska, i primenjuju se podjednako na sve opisane aspekte i otelotvorenja.
KRATAK OPIS SLIKA
Slike 1A-I prikazuju primere konfiguracija bispecifičnih antigen vezujućih molekula koji aktiviraju T ćelije (TCB) iz pronalaska. Svi konstrukti, osim formata kapa-lambda na (Sl.
1I), imaju mutacije P329G FAFA i sadrže Fc fragmente formata "dugme u rupici" sa modifikacijama tipa "dugme u rupici". (Sl. 1A) Prikaz „FolR1 TCB 2+1 invertovanog (zajedničkog lakog lanca)“. Vezivač FolR1 je spojen na C-terminalnom kraju teškog lanca Fab sa N-terminalnim krajem prve podjedinice Fc domena koja sadrži modifikaciju dugmeta. Ovi konstrukti nisu ukršteni, i imaju tri puta isti laki lanac VLCL. (Sl.1B) Prikaz „FolR1 TCB 1+1 od glave do repa (zajedničkog lakog lanca)“. Ovi konstrukti nisu ukršteni, i imaju dva puta isti laki lanac VLCL. (Sl.1C) Prikaz „FolR1 TCB 1+1 klasičnog (zajedničkog lakog lanca)“. Ovi konstrukti nisu ukršteni, i imaju dva puta isti laki lanac VLCL. (Sl. 1D) Prikaz „FolR1 TCB 2+1 klasičnog (zajedničkog lakog lanca)“. Vezivač CD3 je spojen na C-terminalnom kraju teškog lanca Fab sa N-terminalnim krajem prve podjedinice Fc domena koja sadrži modifikaciju dugmeta. Ovi konstrukti nisu ukršteni, i imaju tri puta isti laki lanac VLCL. (Sl.
1E) Prikaz „FolR1 TCB 2+1 crossfab klasičnog“. Ovi konstrukti sadrže lanac Ck-VH za vezivača CD3 umesto konvencionalnog lanca CH1-VH. Vezivač CD3 je spojen na C-terminalnom kraju teškog lanca Fab sa N-terminalnim krajem prve podjedinice Fc domena koja sadrži modifikaciju dugmeta. (Sl. 1F) Prikaz „FolR1 TCB 2+1 crossfab invertovanog“. Ovi konstrukti sadrže lanac Ck-VH za vezivač CD3 umesto konvencionalnog lanca CH1-VH.
Vezivač FolR1 je spojen na C-terminalnom kraju teškog lanca Fab sa N-terminalnim krajem prve podjedinice Fc domena koja sadrži modifikaciju dugmeta. (Sl. 1G) Prikaz „FolR1 TCB 1+1 crossfab od glave do repa“. Ovi konstrukti sadrže lanac Ck-VH za vezivač CD3 umesto konvencionalnog lanca CH1-VH. (Sl. 1H) Prikaz „FolR1 TCB 1+1 crossfab klasičnog“. Ovi konstrukti sadrže lanac Ck-VH za vezivač CD3 umesto konvencionalnog lanca CH1-VH. Slika 1I prikazuje CD3/FolR1 kapa-lambda format antitela. Ovi konstrukti sadrže ukršteni zajednički laki lanac VLCH1 i jedan ukršteni lanac VHCL specifičan za CD3 i jedan ukršteni lanac VHCL specifičan za FolR1.
Na slikama 2A-C su prikazani grafikoni koji rezimiraju vezivanje vezivača FoLR1 IgG za HeLa ćelije. Vezivanje novonastalih vezivača FolR1 za FolR1 eksprimiran na HeLa ćelijama određeno je protočnom citometrijom. Vezana antitela su detektovana fluorescentno obeleženim antihumanim sekundarnim antitelom.
Slike 3A-B prikazuju grafikone u kojima se rezimira specifičnost FolR1 vezivača za FolR1. Vezivanje FolR1 IgG za ćelije HEK, tranzijentno transficirane bilo sa FolR1 ili sa FolR2, analizirano je protočnom citometrijom da se identifikuju klonovi koji se specifično vezuju za FolR1, a ne za FolR2. Antitela su otkrivena fluorescentno obeleženim antihumanim sekundarnim antitelom.
Slike 4A-B prikazuju grafikone koji rezimiraju unakrsnu reaktivnost vezivača cyFolR1 na cyFoLR1. Unakrsna reaktivnost FolR1 antitela na cino FolR1 pregledana je na HEK ćelijama koje su tranzijentno transficirane sa cyFolR1 pomoću protočne citometrije. Antitela su otkrivena fluorescentno obeleženim antihumanim sekundarnim antitelom.
Slika 5 prikazuje grafikon koji ilustruje internalizaciju molekula FolR1 TCB nakon vezivanja. Internalizacija četiri FolR1 TCB nakon vezivanja za FolR1 testirana je na HeLa ćelijama. Preostali FolR1 TCB na površini su otkriveni fluorescentno označenim antihumanim sekundarnim antitelom nakon naznačenih termina inkubacije na 37 °C. Izračunat je procenat internalizacije.
Slike 6A-E prikazuju grafikone koji rezimiraju vezivanje FolR1 IgG za ćelije sa različitim nivoima ekspresije FolR1. Vezivanje 9D11, 16D5 i Mov19 IgG za tumorske ćelije sa različitim nivoima ekspresije FolR1 analizirano je protočnom citometrijom. DP47 IgG je uključen kao izotipska kontrola, a MKN-45 kao FolR1 negativna ćelijska linija. Antitela su otkrivena fluorescentno obeleženim antihumanim sekundarnim antitelom.
Slike 7A-L prikazuju grafikone koji rezimiraju ubijanje ćelija HT-29 i SKOV3 posredstvom T ćelija. FolR1 TCB korišćeni su za testiranje ubijanja tumorskih ćelija HT-29 i SKOV3 posredstvom T ćelija, i povećanja aktivacionog markera na T ćelijama nakon ubijanja.
(Sl. 7A-D) Ubijanje HT-29 i SKOV3 ćelija posredstvom T ćelija u prisustvu 9D11 FolR1 TCB i 16D5 FolR1 TCB izmereno je oslobađanjem LDH nakon 24 sata i 48 sati. DP47 TCB je bio uključen kao negativna kontrola. Nakon 48 sati inkubacije, povećanje aktivacionih markera CD25 i CD69 na CD8 T ćelijama i CD4 T ćelijama nakon ubijanja SKOV3 (Sl.7E-H) ili HT-29 (Sl.7I-L) tumorskih ćelija procenjeno je protočnom citometrijom.
Slika 8 prikazuje grafikon koji pokazuje odsustvo vezivanja anti-FolR1 za eritrocite. Eritrociti su selekcionisani (eng. gated) kao CD235a pozitivna populacija, a vezivanje 9D11 IgG, 16D5 IgG, Mov19 IgG i DP47 IgG za ovu populaciju određeno je protočnom citometrijom. Antitela su otkrivena fluorescentno obeleženim antihumanim sekundarnim antitelom.
Na slikama 9A-D prikazani su grafikoni koji rezimiraju povećanje aktivacionih markera u punoj krvi. Povećanje aktivacionih markera CD25 i CD69 za T ćelije CD4 i CD824 sata nakon dodavanja 9D11 FolR1 TCB, 16D5 FolR1 TCB, Mov19 FolR1 TCB i DP47 TCB analizirano je protočnom citometrijom.
Slike 10A-C prikazuju ubijanje T ćelijama indukovano pomoću 36F2 TCB, 16D5 TCB, 16D5 TCB klasično, 16D5 TCB 1+1 i 16D5 TCB HT humanih tumorskih ćelija Hela (visoki FolR1) (Sl. 24A), Skov-3 (srednji FolR1) (Sl. 24B) i HT-29 (niski FolR1) (Sl. 24C) (E:T = 10:1, efektori humani PBMC, vreme inkubacije 24 sata). DP47 TCB je bio uključen kao nevezujuća kontrola.
Slike 11A-B pokazuju ekspresiju inhibitornih receptora na T ćelijama koje infiltriraju tumor. Karakterizacija ekspresije inhibitornih receptora CD8<+>i CD4<+>T ćelija u uzorcima tumora je izvedena protočnom citometrijom.
Slike 12A-O pokazuju aktivaciju CD8<+>T ćelija u tumorskim digestima i malignim izlivima nakon izlaganja FolR1-TCB-u. Tumorski digesti ili maligni izlivi su uzgajani tokom 24 sata u prisustvu ili odsustvu FolR1-TCB ili kontrolnog TCB DP-47. Ekspresija aktivacionih markera ili markera funkcije T ćelija na CD8<+>T ćelijama određena je protočnom citometrijom (Sl. 12A-M). Sl.12J-K prikazuju reprezentativne FACS dijagrame koji pokazuju FolR1-TCB-indukovanu aktivaciju T ćelija kod pacijenta sa jakim odgovorom (BS-269) ili sa slabim odgovorom (BS-212). Sl. 12L prikazuje FACS dijagrame koji prikazuju ekspresiju aktivacionih markera indukovanu pomoću FolR1-TCB u T ćelijama kod reprezentativnog pacijenta. Grafikoni na Sl. 12M prikazuju porast ekspresije markera nakon tretmana FolR1-TCB-om sa srednjim i standardnim odstupanjima. Radi poređenja, PBMC zdravih donora su zajedno kultivisani sa ćelijskom linijom tumora Skov3 i stimulisani pomoću FolR1-TCB. Sl.
12N prikazuje IFN-γ, IL-2, TNF i perforin u supernatantima ćelijske kulture, kako je određeno citometrijskim nizom perli ili testom ELISA, i normalizovano na količinu od 1x10<5>CD3<+>T ćelija (IFN-γ, TNF, IL-2) ili CD3<+>CD8<+>T ćelija (perforin) u kulturi. Sl. 12O pokazuje da ubijanje tumorskih ćelija izazvano putem FolR1-TCB uveliko varira u tumorskim digestima i malignim izlivima. FolR1 pozitivni i negativni tumorski digesti, maligni izlivi ili PBMC od zdravih donora su uzgajani sa egzogeno dodatim fluorescentno obeleženim FolR1<+>Skov3 ćelijama u odnosu E:T od 1:1 tokom 24 sata u prisustvu ili odsustvu FolR1-TCB. FolR1-TCB-indukovano specifično ubijanje Skov3 ćelija određeno je protočnom citometrijom merenjem aktivirane kaspaze 3 i živog/mrtvog markera LIVE/DEAD<®>-bliski-IR. Ubijanje posredstvom FolR1-TCB izračunato je na sledeći način: % specifičnog ubijanja = 100 - [(% živih ćelija Skov3 u uzorku tretiranom pomoću FolR1-TCB/% živih ćelija Skov3 u neobrađenom uzorku) x 100]. FACS grafikoni pokazuju ubijanje indukovano pomoću FolR1-TCB kod reprezentativnog pacijenta. Vrednosti p su izračunate pomoću neuparenog Man Vitnijevevog testa.
Slike 13A-C pokazuju da aktiviranje T ćelija indukovano pomoću FolR1-TCB ne pokazuje korelaciju sa odnosom E:T (Sl.13A) ili količinom tumorskih ćelija FolR1<+>(Sl.13B). Tumorski digesti ili maligni izlivi su uzgajani tokom 24 sata u prisustvu ili odsustvu FolR1-TCB. Ekspresija CD25 indukovana pomoću FolR1-TCB korelisana je sa odnosom E:T ili količinom ciljnih ćelija. MFI: srednji intenzitet fluorescencije.
Slike 14A-L pokazuju da aktivacija T ćelija indukovana pomoću FolR1-TCB stoji u obrnutoj korelaciji sa ekspresijom PD-1 i Tim-3. Tumorski digesti ili maligni izlivi su uzgajani tokom 24 sata u prisustvu ili odsustvu FolR1-TCB. Ekspresija aktivacionih markera ili markera funkcije T ćelija na CD8<+>T ćelijama određena je protočnom citometrijom. Ekspresija CD25 indukovana pomoću FolR1-TCB (Sl.4A-C), CD137 (Sl.14D-F), ICOS (Sl.14G-I) i granzima B (Sl.14J-L) korelisana je sa osnovnom pojedinačnom ili koekspresijom inhibitornih receptora PD-1 i Tim-3.
Slike 15A-C pokazuju da izlučivanje IL-2 indukovano pomoću FolR1-TCB stoji u obrnutoj korelaciji sa koekspresijom PD-1 i Tim-3. Tumorski digesti ili maligni izlivi su uzgajani tokom 24 sata u prisustvu ili odsustvu FolR1 TCB. IL-2 u supernatantima ćelijske kulture određen je testom ELISA i normalizovan na količinu T ćelija. Izlučivanje IL-2 indukovano pomoću FolR1 TCB korelisano je sa osnovnom pojedinačnom ili koekspresijom inhibitornih receptora PD-1 i Tim-3.
Slike 16A-F pokazuju da ubijanje tumorskih ćelija indukovano pomoću FolR1-TCB stoji u obrnutoj korelaciji sa koekspresijom PD-1 i Tim-3. Tumorski digesti ili maligni izlivi su kultivisani zajedno sa egzogeno dodatim fluorescentno obeleženim Skov3 ćelijama pri odnosu T ćelije i ciljne ćelije od 1:1 tokom 24 sata u prisustvu ili odsustvu FolR1 TCB. FolR1-TCB specifično ubijanje Skov3 ćelija određeno je protočnom citometrijom merenjem aktivirane kaspaze 3 i živog/mrtvog markera Live/Dead-bliski-IR. Specifično ubijanje je korelisano sa osnovnom pojedinačnom ili koekspresijom inhibitornih receptora PD-1, Tim-3 i CTLA-4.
Slike 17A-H prikazuju aktivaciju CD8<+>T ćelija koje infiltriraju tumor nakon izlaganja katumaksomabu. Tumorski digesti ili maligni izlivi su uzgajani tokom 24 sata u prisustvu ili odsustvu katumaksomaba. (Sl.17A-D) Ekspresija aktivacionih markera ili markera funkcije T ćelija na CD8<+>T ćelijama određena je protočnom citometrijom. (Sl.17E-H) Grafikoni koji prikazuju osnovnu ekspresiju inhibitornih receptora.
Slike 18A-R pokazuju da je aktivacija T ćelija indukovana katumaksomabom bila u obrnutoj korelaciji sa koekspresijom inhibitornih receptora. Tumorski digesti ili maligni izlivi su uzgajani tokom 24 sata u prisustvu ili odsustvu katumaksomaba. Aktivacija i efektorske funkcije T ćelija bile su u korelaciji sa ekspresijom PD-1 (Sl. 18A-F), Tim-3 (Sl. 18G-L) ili kombinacijom PD-1 i Tim-3 (Sl.18M-R).
Slike 19A-H prikazuju ekspresiju inhibitornih receptora na T ćelijama koje infiltriraju tumore kod pacijenata koji su imali nesitnoćelijski rak pluća. Karakterizacija ekspresije inhibitornih receptora kod CD8<+>i CD4<+>T ćelija u uzorcima tumora je izvedena protočnom citometrijom (Sl. 19A-F). Sl.19G prikazuje strategiju selekcionisanja (eng. gating) za jednog reprezentativnog donora. Sl. 19H prikazuje rezultate analize i toplotnog mapiranja za naznačene podskupove ćelija na osnovu procenta ekpresije, uz pomoć programa Excel za uslovno formatiranje.
Slike 20A-E prikazuju aktivaciju i efektorske funkcije T ćelija nakon poliklonske stimulacije antitelima CD3/CD28. Ekspresija CD25 i granzima B (Sl.20A-B), kao i IL-2, IFN-γ i TNF-α (Sl. 20C-E) kao markera za aktivaciju, odnosno efektorsku funkciju T ćelija, analizirana je u T ćelijama iz digestovanih tumorskih uzoraka nakon stimulacije celih tumorskih digesta agonističkim CD3 i CD28 antitelima.
Slike 21A-N prikazuju ekspresiju inhibitornih receptora i disfunkciju T ćelija. Ekspresija CD25 i granzima B (Sl. 21A-B) kao i IL-2, IFN-γ i TNF-α (Sl. 21C-E) nakon poliklonske stimulacije anti-CD3/anti-CD28 antitelima stoji u korelaciji sa kumulativnom ekspresijom inhibitornih receptora, naznačenom iR rezultatom. Sl. 21F prikazuje primer za izračunavanje iR rezultata. Procenat ekspresije za PD-1, Tim-3, CTLA-4, LAG-3 i BTLA analiziran je u svim uzorcima NSCLC, i određeni su medijalni i interkvartilni rasponi. Za izračunavanje iR rezultata, svaki pacijent je dobio bodove za ekspresiju svakog od utvrđenih inhibitornih receptora na osnovu kvartila sa kojim se ekspresija poklopila. Moglo se postići maksimalno 15 bodova; izračunati rezultat svakog uzorka normalizovan je na ovaj maksimalni iznos bodova. Sl. 21G-K pokazuje da ekspresija inhibitornih receptora raste sa stadijumom tumora. Ekspresija inhibitornih receptora na CD8<+>T ćelijama koje infiltriraju tumor bila je u korelaciji sa TNM stadijumom. Sl. 21L-N prikazuje povećanu kumulativnu ekspresiju inhibitornih receptora sa progresijom tumora. Kumulativna ekspresija inhibitornih receptora PD-1, Tim-3, CTLA-4, LAG-3 i BTLA, predstavljena iR rezultatom, korelisana je sa nodalnim statusom i TNM stadijumom.
Slike 22A-I prikazuju ekspresiju PD-1 i Tim-3 u korelaciji s disfunkcijom T ćelija. Ekspresija CD25 i granzima B (Sl. 22A-C), kao i IL-2, IFN-γ i TNF-α (Sl. 22D-F) nakon poliklonske stimulacije pomoću CD3/CD28 stoji u korelaciji sa ekspresijom PD-1 (Sl.22A-C), Tim-3 (Sl.22D-F) ili PD-1/Tim-3 (Sl.22G-I) na T ćelijama koje infiltriraju tumor.
Slike 23A-E prikazuju da se učinak PD-1 ili kombinovane PD-1/Tim-3 blokade razlikuje kod različitih pacijenata. Digesti su stimulisani agonističkim anti-CD3/anti-CD28 antitelima uz dodatak blokirajućih antitela na izolovani PD-1 ili u kombinaciji sa Tim-3. Sekrecija IFN-γ, TNF-α i IL-2 određena je ELISA testom i normalizovana na 1x10<6>T ćelija. Sl. 23A-C prikazuju T ćelije pacijenta gde se funkcija T ćelija može spasiti dodavanjem blokirajućih antitela (BS-268), i T ćelija pacijenta bez odgovora na PD-1 ili PD-1/Tim-3 blokadu. Prikazana je razlika u ekspresiji ([% ekspresije tretirano sa Ab] - [% ekpresije netretirano]). Sl.23D prikazuje odgovarajuće dijagrame protočne citometrije sa podskupovima PD-1<hi>i PD-1<int>. Sl. 23E daje sažet prikaz sekrecije za IL-2, TNF-α i IFN-γ T ćelija šest pacijenata, kako je određeno ELISA testom i normalizovano na 1x10<6>CD3<+>T ćelija.
Slike 24A-F prikazuju da se učinak PD-1 ili kombinovane PD-1/Tim-3 blokade razlikuje u podskupovima PD-1<hi>i PD-1<int>. Korelacija povećanja proizvodnje citokina blokadom pomoću PD-1 ili kombinacijom PD-l/Tim-3 sa podskupovima PD-1<hi>i PD-1<int>naznačena je odnosom PD-1<hi>/PD-1<int>.
Slike 25A-I prikazuju aktivaciju CD4<+>T ćelija u tumorskim digestima i malignim izlivima nakon izlaganja FolR1-TCB-u. Tumorski digesti ili maligni izlivi su uzgajani tokom 24 sata u prisustvu ili odsustvu FolR1-TCB ili kontrolnog TCB DP-47. Ekspresija aktivacionih markera ili markera funkcije T ćelija na CD8<+>T ćelijama određena je protočnom citometrijom.
Slike 26A-C prikazuju da je aktiviranje T ćelija indukovano pomoću FolR1-TCB nezavisno od ekspresije CTLA-4, Lag-3 i BTLA. Tumorski digesti ili maligni izlivi su uzgajani tokom 24 sata u prisustvu ili odsustvu FolR1-TCB. Ekspresija CD25 na CD8<+>T ćelijama određena je protočnom citometrijom. Ekspresija CD25 indukovana pomoću FolR1-TCB bila je u korelaciji sa osnovnom ekspresijom CTLA-4, Lag-3 i BTLA.
Slike 27A-C pokazuju da FolR1-TCB indukuje sekreciju citokina samo kod pacijenata sa malim procentom T ćelija CD8<+>koje eksprimiraju PD-1<hi>. Tumorski digesti ili maligni izlivi su uzgajani tokom 24 sata u prisustvu ili odsustvu FolR1-TCB. IFN-γ, TNF i IL-2 u supernatantima ćelijske kulture određeni su i normalizovani na količinu od 1x10<5>T ćelija u kulturi. Izlučivanje citokina indukovano putem FolR1-TCB korelisano je sa osnovnom ekspresijom PD-1<hi>.
Slike 28A-F pokazuju da lečenje antitelom koje blokira PD-1 ne indukuje sekreciju citokina u tumorskim digestima ili malignim izlivima kod pacijenata sa rakom pluća i jajnika koji imaju mali procenat PD-1<hi>ekspresionih ćelija. Tumorski digesti ili maligni izlivi su uzgajani tokom 24 sata sa FolR1-TCB u prisustvu ili odsustvu antitela koje blokira PD-1 (Sl.
28A-C) ili kombinacije antitela koje blokira PD-1 i koje blokira Tim-3 (Sl.28D-F). IFN-γ, TNF i IL-2 u supernatantima ćelijske kulture određeni su i normalizovani na količinu od 1x10<5>T ćelija u kulturi. Sekrecija citokina indukovana blokirajućim antitelima u odnosu na lečenje samim FolR1-TCB korelisana je sa osnovnom ekspresijom PD-1<hi>.
Slike 29A-B prikazuju rezultate testa internalizacije zasnovanog na FACS-u. Podaci pokazuju da je Fab fragment (<TIM-3> Fab) anti-TIM3 antitela Tim3_0022 (skraćeno <TIM-3> Ab(022)) internalizovan u rec CHOC1 ćelije koje eksprimiraju huTIM-3 nakon inkubacije na 37 °C sa sličnom kinetikom kao i antitelo u punom formatu IgG.
Slike 30A-B prikazuju vezivanje anti-TIM3 antitela za RPMI-8226 ćelije (klon za označavanje antitela 0016 se odnosi na antitelo Tim3_0016, klon 0016 se odnosi na varijantu antitela Tim3_0016 (antitelo Tim3_0018), klon 0022 se odnosi na antitelo Tim3_00122, itd.). Sl. 30B prikazuje vezivanje anti-TIM3 antitela za Fajferove ćelije (klon za označavanje antitela 0016 se odnosi na antitelo Tim3_0016, klon 0016 se odnosi na varijantu antitela Tim3_0016 (antitelo Tim3_0018), klon 0022 se odnosi na antitelo Tim3_00122, itd.).
Slika 31 prikazuje nivo ekspresije TIM-3 na uzorcima AML ćelija različitih pacijenata pomoću FACS i uz korišćenje anti-TIM-3 mAb.
Slika 32 prikazuje toplotnu mapu ekspresije inhibitornih receptora na TIL limfocitima povezanim sa NSCLC. Koekspresija inhibitornih receptora na CD8<+>T-ćelijama koje infiltriraju tumor pozitivnim za naznačenu imunološku kontrolnu tačku prikazana je u vidu toplotne karte koja prikazuje procenat ekspresije za dodatne receptore.
Slika 33 prikazuje radarski grafikon ekspresije inhibitornih receptora na TIL limfocitima povezanim sa NSCLC. Koekspresija inhibitornih receptora na CD8<+>T ćelijama koje infiltriraju tumor pozitivnim na naznačenu imunološku kontrolnu tačku prikazana je u vidu radarskog grafikona koji pokazuje srednju ekspresiju i standardnu devijaciju četiri druga receptora.
Slike 34A-D prikazuju procenat PD-1<hi>ili PD-1<int>CD8<+>T ćelija koje eksprimiraju dodatne imunološke kontrolne tačke. Svaka tačka predstavlja uzorak jednog pacijenta. Vrednosti p izračunate su pomoću Vilkoksonovog testa zbira rangova.
Slike 35A-F prikazuju intratumorsku T ćelijsku ekspresiju inhibitornih receptora i funkciju T ćelija. Sl. 35A prikazuje strategiju selekcionisanja (eng. gating) za identifikaciju PD-1<hi>, PD-1<int>i PD-1<neg>CD8<+>podskupova T ćelija dva reprezentativna pacijenta. Sl. 35B prikazuje distribuciju naznačenih podskupova T ćelija u analiziranim uzorcima tumora. Sl.35C prikazuje da funkcije T ćelija indukovane stimulacijom anti-CD3/-CD28 zavise od nivoa ekspresije PD-1 CD8<+>T ćelija. Tumorski digesti i maligni izlivi uzgajani su 24 sata u prisustvu ili odsustvu agonističkih anti-CD3/-CD28 antitela. Povećanje ekspresije CD25 na CD8<+>T-ćelijama (Sl.35C) i povećanje efektorskih citokina IFN-γ, IL-2 i TNF (Sl.35D) utvđeno je za tumore sa oskudnim i obilnim PD-1<hi>, p-vrednosti su izračunate pomoću neuparenog Man Vitnijevog testa. Uzorci tumora podeljeni su prema procentu PD-1<hi>ekspresionih CD8<+>ćelija u dve grupe sa oskudnom odnosno obilnom ekspresijom PD-1<hi>(Sl. 35E). Nivo ekspresije inhibitornih receptora PD-1, Tim-3, CTLA-4, Lag-3 i BTLA određen je protočnom citometrijom na CD8<+>T ćelijama iz tumorskih digesta ili malignih izliva (Sl.35F).
Slike 36A-E prikazuju obrasce ekspresije inhibitornih receptora i procenat oskudnih i obilnih CD8<+>T ćelija. Sl. 36A-D prikazuje koekspresiju Tim-3, CTLA-4, Lag-3 i BTLA na PD-1<hi>, PD-1<int>i PD-1<neg>CD8<+>T ćelijama. Vrednosti p izračunate su pomoću jednosmerne ANOVA sa Bonferonijevim post-hoc testom. Sl. 36E: Uzorci tumora sa FolR1<+>podeljeni su prema procentu CD8<+>ćelija koje su eksprimirale PD-1<hi>u dve grupe po oskudnoj, odnosno obilnoj ekspresiji PD-1<hi>.
Slike 37A-H prikazuju da funkcije T ćelija indukovane pomoću FolR1-TCB zavise od nivoa ekspresije PD-1 CD8<+>T ćelija. Tumorski digesti sa FolR1<+>i maligni izlivi uzgajani su tokom 24 sata u prisustvu ili odsustvu FolR1-TCB. Porast ekspresije aktivacionih markera na CD8<+>T ćelijama (Sl. 37A-C) i porast efektorskih citokina IFN-γ, IL-2, TNF i perforina (Sl.
37D-G) utvrđen je za tumore sa oskudnim, odnosno obilnim PD-1<hi>. Sl.37H prikazuje ubijanje ciljnih ćelija. FolR1 pozitivni i negativni uzorci tumora prilagođeni su dodavanjem FolR1<+>Skov3 ćelijske linije u odnosu E:T od 1:1, i ubijanje je upoređeno kod tumora sa oskudnim i obilnim PD-1<hi>, p-vrednosti su izračunate pomoću neuparenog Man Vitnijevog testa.
Slike 38A-E prikazuju da blokada PD-1 povećava proizvodnju citokina, ali ne i njihovu citolitičku funkciju, samo u T ćelijama iz tumora sa oskudnim PD-1<M>. Sl. 38A-D: Tumorski digesti FolR1<+>ili maligni izlivi uzgajani su tokom 24 sata sa FolR1-TCB u prisustvu ili odsustvu antitela koje blokira PD-1. IFN-γ, IF-2, TNF i perforin u supernatantima ćelijskih kultura određivani su pomoću citometrijskog niza perli ili ELISA testa i normalizovani na količinu od 1x10<5>CD3<+>T ćelija (IFN-γ, IL-2, TNF, Sl. 38A-C) ili CD3<+>CD8<+>T ćelija (perforin, Sl. 38D). Povećanje sekrecije citokina nakon kombinovanog lečenja putem FolR1-TCB i anti-PD-1 u odnosu na lečenje samo putem FolR1-TCB, određeno je u tumorima sa oskudnim i obilnim PD-1<hi>. Sl.38E: Tumorski digesti ili maligni izlivi su zajednički uzgajani sa egzogeno dodatim fluorescentno obeleženim Skov3 ćelijama u odnosu E:T od 1:1 tokom 24 sata u prisustvu ili odsustvu PD-1 blokirajućeg antitela i FolR1-TCB. Porast specifičnog ubijanja anti-PD-1 antitelom upoređen je u tumorima sa oskudnim i obilnim PD-1<hi>, p-vrednosti su izračunate pomoću neuparenog Man Vitnijevog testa.
Slika 39 prikazuje detaljne karakteristike pacijenata.
Slike 40A-C prikazuju aktivaciju CD8<+>T ćelija nakon izlaganja rastućim koncentracijama FolR1-TCB. PBMC su zajednički uzgajani sa Skov3 ćelijama tokom 24 sata u prisustvu ili odsustvu FolR1-TCB ili nespecifične kontrole DP-47-TCB. Sl. 40A prikazuje ekspresiju FolR1 na Skov3. Osenčeni histogram: kontrola izotipa; otvoreni histogram: anti-FolR1-antitelo. Sl. 40B: Ekspresija aktivacionih markera CD25, CD137 i ICOS na CD8<+>T ćelijama određena je protočnom citometrijom. Sl. 40C: IFN-γ, IL-2 i TNF u supernatantima ćelijske kulture određeni su ELISA testom i normalizovani na količinu od 1x10<5>CD3<+>T ćelija.
DETALJAN OPIS OTELOTVORENJA PRONALASKA
I. DEFINICIJE
„Humani akceptorski okvir” je za ovde navedene svrhe okvir koji sadrži aminokiselinsku sekvencu okvira varijabilnog domena lakog lanca (VL) ili okvira varijabilnog domena teškog lanca (VH) dobijenog od humanog imunoglobulinskog okvira ili humanog konsenzusnog okvira, kao što je definisano u nastavku. Humani akceptorski okvir „dobijen od” humanog imunoglobulinskog okvira ili humanog konsenzusnog okvira može da sadrži istu aminokiselinsku sekvencu kao i ova dva okvira, ili može da sadrži izmene u aminokiselinskoj sekvenci. U nekim otelotvorenjima, broj aminokiselinskih izmena je 10 ili manje, 9 ili manje, 8 ili manje, 7 ili manje, 6 ili manje, 5 ili manje, 4 ili manje, 3 ili manje, ili 2 ili manje. U nekim otelotvorenjima, VL humani akceptorski okvir je po sekvenci identičan sekvenci VL humanog imunoglobulinskog okvira ili humanog konsenzusnog okvira.
"Afinitet" se odnosi na snagu zbira ukupnih nekovalentnih interakcija između pojedinačnog mesta vezivanja molekula (npr. antitela) i njegovog partnera u vezivanju (npr. antigena). Ukoliko nije drugačije naznačeno, kao što je ovde upotrebljeno, „afinitet vezivanja” se odnosi na suštinski afinitet vezivanja, koji odražava 1:1 interakciju između članova vezujućeg para (npr. antitela i antigena). Afinitet molekula X prema svom partneru Y može generalno da se predstavi putem konstante disocijacije (Kd). Afinitet može da se izmeri uobičajenim postupcima poznatim u struci, uključujući one opisane u ovom dokumentu. Specifična otelotvorenja data kao ilustracija i primer za merenje afiniteta vezivanja opisana su u nastavku.
Termin „afinitetno zrelo” antitelo se odnosi na antitelo sa jednom ili više izmena u jednom ili više hipervarijabilnih regiona (HVR), u poređenju sa matičnim antitelom koje nema takve izmene, pri čemu takve izmene dovode do poboljšanja afiniteta antitela prema antigenu.
Pojam "bispecifično antitelo koje se specifično veže za folatni receptor 1 (FolR1) i CD3", "bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije specifičan za FolR1 i CD3" i "FolR1 TCB" ovde se koriste podjednako, i odnose se na bispecifično antitelo koje je sposobno da veže FolR1 i CD3 sa dovoljnim afinitetom da antitelo bude korisno kao dijagnostičko i/ili terapijsko sredstvo za ciljanje CD3<+>T ćelija na FolR2<+>ciljne ćelije.
Izrazi "anti-TIM3 antitelo" i "TIM3 antitelo" ovde se koriste kao sinonimi, i označavaju antitela koja se specifično vezuju za TIM3. Ovde opisano anti-TIM3 antitelo odnosi se na antitelo koje je sposobno da veže TIM3, posebno TIM3 polipeptid eksprimiran na površini ćelije, sa dovoljnim afinitetom da antitelo bude korisno kao dijagnostičko i/ili terapijsko sredstvo. U jednom otelotvorenju, obim vezivanja antitela koje specifično vezuje TIM3 za nepovezani ne-TIM3 protein je manji od oko 10% od vezivanja antitela za TIM3, mereno npr. radioimunotestom (RIA) ili protočnom citometrijom (FACS). U nekim otelotvorenjima, antitelo koje se vezuje za TIM3 ima konstantu disocijacije (Kd) ≤1 μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0,1 nM, ≤ 0,01 nM, ili ≤ 0,001 nM (npr.10<-8>M ili manje, npr. od 10<-8>M do 10<-13>M, npr. od 10<-9>M do 10<-13>M). U nekim otelotvorenjima, antitelo koje specifično vezuje TIM3 vezuje se za epitop TIM3 koji je konzerviran između DR5 različitih vrsta. Poželjno, navedeno antitelo se vezuje za TIM3 čoveka ili majmuna cinomolgusa. Izraz "antitelo koje specifično vezuje TIM3" takođe podrazumeva bispecifična antitela koja su sposobna da vežu TIM3 i drugi antigen.
Termin „antitelo” ovde je upotrebljen u najširem smislu i obuhvata različite strukture antitela uključujući, bez ograničenja, monoklonska antitela, poliklonska antitela, multispecifična antitela (npr. bispecifična antitela) i fragmente antitela, dokle god oni pokazuju željenu aktivnost vezivanja za antigen.
„Fragment antitela” ukazuje na molekul koji nije netaknuto antitelo, a koji sadrži deo netaknutog antitela koje vezuje antigen za koji se vezuje netaknuto antitelo. Primeri fragmenta antitela obuhvataju, bez ograničenja, Fv, Fab, Fab', Fab’-SH,F(ab')2; dijatela; ukrštene Fab fragmente; linearna antitela; molekule antitela sa jednim lancem (npr. scFv); i multispecifična antitela nastala od fragmenata antitela. scFv antitela su, npr. opisana u Houston, J.S., Methods in Enzymol.203 (1991) 46-96). Pored toga, fragmenti antitela sadrže jednolančane polipeptide koji imaju karakteristike VH domena, a to je pre svega sposobnost da se sastave sa VL domenom, ili karakteristike VL domena, a to je sposobnost da se sastave sa VH domenom u funkcionalno antigen vezujuće mesto i na taj način obezbede antigen vezujuće svojstvo antitela pune dužine.
Kako se ovde koristi, „Fab fragment” se odnosi na fragment antitela koji sadrži varijabilni domen lakog lanca VL i konstantni domen lakog lanca (CL), te varijabilni domen VH i prvi konstantni domen (CH1) teškog lanca. U jednom otelotvorenju, bispecifična antitela iz ovog pronalaska sadrže najmanje jedan Fab fragment, pri čemu su ili varijabilni regioni ili konstantni regioni teškog i lakog lanca razmenjeni. Usled ove razmene bilo varijabilnih regiona ili konstantnih regiona pomenuti Fab fragment se takođe naziva "unakrsni Fab fragment" ili "xFab fragment" ili "krosover Fab fragment". Dva različita sastava lanaca krosover Fab molekula su moguća i sadržana u bispecifičnim antitelima ovog pronalaska: S druge strane, varijabilni regioni teškog i lakog lanca Fab su razmenjeni, tj. unakrsni Fab molekul sadrži peptidni lanac sastavljen od varijabilnog regiona lakog lanca (VL) i konstantnog regiona teškog lanca (CH1), i peptidni lanac sastavljen od varijabilog regiona teškog lanca (VH) i konstantnog regiona lakog lanca (CL). Ovaj unakrsni Fab molekul se takođe naziva CrossFab(VLVH). S druge strane, kada su konstantni regioni teškog i lakog lanca Fab razmenjeni, krosover Fab molekul sadrži peptidni lanac sastavljen od varijabilnog regiona teškog lanca (VH) i konstantnog regiona lakog lanca (CL), i peptidni lanac sastavljen od varijabilnog regiona lakog lanca (VL) i konstantnog regiona teškog lanca (CH1). Ovaj krosover Fab molekul se takođe naziva CrossFab(CLCH1). Formati bispecifičnih antitela koji sadrže ukrštene Fab fragmente opisani su, na primer, u WO 2009/080252, WO 2009/080253, WO 2009/080251, WO 2009/080254, WO 2010/136172, WO 2010/145792 i WO 2013/026831.
„Jednolančani Fab fragment “ ili „scFab“ je polipeptid koji se sastoji od varijabilnog domena teškog lanca antitela (VH), konstantnog domena antitela 1 (CH1), varijabilnog domena lakog lanca antitela (VL), konstantnog domena lakog lanca antitela (CL) i linkera, pri čemu navedeni domeni antitela i navedeni linker imaju jedan od sledećih redosleda u smeru od N-terminalnog kraja do C-terminalnog kraja:
a) VH-CH1-linker-VL-CL, b) VL-CL-linker-VH-CH1, c) VH-CL-linker-VL-CH1 ili d) VL-CH1-linker-VH-CL; i pri čemu je navedeni linker polipeptid od najmanje 30 aminokiselina, poželjno između 32 i 50 aminokiselina. Navedeni jednolančani Fab fragmenti a) VH-CH1-linker-VL-CL, b) VL-CL-linker-VH-CH1, c) VH-CL-linker-VL-CH1 i d) VL-CH1-linker-VH-CL, stabilizovani su prirodnom disulfidnom vezom između CL domena i CH1 domena. Pored toga, ovi jednolančani molekuli Fab se mogu dalje stabilizovati stvaranjem međulančanih disulfidnih veza insercijom cisteinskih ostataka (npr. pozicija 44 u varijabilnom teškom lancu i pozicija 100 u varijabilnom lakom lancu prema Kabatovoj numeraciji). Termin "N-terminalni kraj" označava poslednju aminokiselinu N-terminalnog kraja. Termin "C-terminalni kraj" označava posljednju aminokiselinu C-terminalnog kraja.
Termin "spojen" ili "povezan" podrazumeva da su komponente (npr. Fab molekul i podjedinica Fc domena) povezane peptidnim vezama, bilo direktno ili preko jednog ili više peptidnih linkera.
Termin "linker", kako se ovde koristi, odnosi se na peptidni linker i poželjno se radi o peptidu sa aminokiselinskom sekvencom dužine od najmanje 5 aminokiselina, poželjno dužine od 5 do 100, još poželjnije od 10 do 50 aminokiselina. U jednom otelotvorenju, navedeni peptidni linker je (GxS)n(SEQ ID NO: 384 i SEQ ID NO:385) ili (GxS)nGm(SEQ ID NO: 429 i SEQ ID NO:430) gde je G = glicin, S = serin, i (x = 3, n= 3, 4, 5 ili 6, i m= 0, 1, 2 ili 3) ili (x = 4, n= 2, 3, 4 ili 5 i m= 0, 1, 2 ili 3), poželjno x = 4 i n= 2 ili 3, još poželjnije x = 4, n= 2. U jednom otelotvorenju, pomenuti peptidni linker je (G4S)2(SEQ ID NO: 386).
Termin „molekul imunoglobulina” odnosi se na protein koji ima strukturu prirodnog antitela. Na primer, imunoglobulini IgG klase su heterotetramerni glikoproteini od oko 150.000 daltona, sastavljeni od dva identična laka lanca i dva identična teška lanca koji su povezani disulfidnim vezama. Od N-terminalnog kraja do C-terminalnog kraja, svaki teški lanac ima varijabilni region (VH), koji se takođe zove varijabilni teški domen ili varijabilni domen teškog lanca, za kojim slede tri konstantna domena (CH1, CH2 i CH3), koji se takođe zovu konstantni regioni teškog lanca. Slično tome, od N-terminalnog do C-terminalnog kraja, svaki laki lanac ima varijabilni region (VL), koji se takođe zove varijabilni laki domen ili varijabilni domen lakog lanca, za kojim sledi konstantni laki (CL) domen, koji se takođe zove konstantni region lakog lanca. Teški lanac imunoglobulina može biti dodeljen jednom od pet tipova, koji se zovu α (IgA), δ (IgD), ε (IgE), γ (IgG), ili μ (IgM), od kojih se neki mogu dalje podeliti na podtipove, npr. γ1(IgG1), γ2(IgG2), γ3(IgG3), γ4(IgG4), α1(IgA1) i α2(IgA2). Laki lanac imunoglobulina se može svrstati u jedan od dva tipa, koji se zovu kapa (κ) i lambda (λ), na osnovu aminokiselinske sekvence konstantnog domena tog lanca. Imunoglobulin se u suštini sastoji od dva Fab molekula i Fc domena, povezana preko regiona šarke imunoglobulina.
Izraz „antitelo koje se vezuje za isti epitop” kao referentno antitelo odnosi se na antitelo koje blokira vezivanje referentnog antitela za njegov antigen u kompetitivnom testu za 50% ili više, i obrnuto, referentno antitelo blokira vezivanje antitela za njegov antigen u kompetitivnom testu za 50% ili više. Ovde je dat primer kompetitivnog testa.
Termin "antigen vezujući domen" odnosi se na deo antigen vezujućeg molekula koji sadrži oblast koja se specifično vezuje za deo antigena ili ceo antigen, i komplementaran je sa delom antigena ili celim antigenom. Kada je antigen veliki, antigen vezujući molekul može da se veže samo za naročiti deo antigena, a taj deo se naziva epitop. Antigen vezujući domen može se dobiti, na primer, pomoću jednog ili više varijabilnih domena antitela (koja se još zovu i varijabilni regioni antitela). Poželjno, antigen vezujući domen sadrži varijabilni region lakog lanca antitela (VL) i varijabilni region teškog lanca antitela (VH).
Pojam „himerno” antitelo se odnosi na antitelo kod koga je deo teškog i/ili lakog lanca dobijen od posebnog izvora ili vrste, dok je ostatak teškog i/ili lakog lanca dobijen od različitog izvora ili vrste, obično pripremljenim tehnikama rekombinantne DNK. Poželjna su himerna antitela koja sadrže varijabilni region kunića i konstantni region čoveka. Drugi poželjni oblici "himernih antitela" obuhvaćenih predmetnim pronalaskom su oni u kojima je konstantni region modifikovan ili promenjen od onog u originalnom antitelu, da bi se stvorila svojstva u skladu sa ovim pronalaskom, posebno u vezi sa vezivanjem C1q i/ili vezivanjem Fc receptora (FcR). Takva himerna antitela se takođe označavaju kao “antitela sa promenjenom klasom”. Himerna antitela su proizvod eksprimiranih imunoglobulinskih gena koji sadrže segmente DNK koji kodiraju varijabilne regione imunoglobulina i segmente DNK koji kodiraju konstantne regione imunoglobulina. Metode za proizvodnju himernih antitela obuhvataju klasične tehnike rekombinantne DNK i genske transfekcije, koje su dobro poznate u struci. Vidi, npr. Morrison, S.L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855; US Patent br. 5,202,238 i 5,204,244.
Izraz „citotoksični agens”, u smislu ovog dokumenta, odnosi se na supstancu koja inhibira ili sprečava ćelijsku funkciju i/ili izaziva smrt ili uništenje ćelije. Citotoksični agensi uključuju, bez ograničenja, radioaktivne izotope (npr. At<211>, I<131>, I<125>, Y<90>, Re<186>, Re<188>, Sm<153>, Bi<212>, P<32>, Pb<212>i radioaktivne izotope Lu); hemoterapeutske agense ili lekove (npr. metotreksat, adriamicin, vinka alkaloide (vinkristin, vinblastin, etopozid), doksorubicin, melfalan, mitomicin C, hlorambucil, daunorubicin ili druge interkalirajuće agense); agense za inhibiciju rasta; enzime i njihove fragmente, kao što su nukleolitički enzimi; antibiotike; toksine, kao što su toksini malog molekula ili enzimski aktivni toksini bakterijskog, fungalnog, biljnog ili životinjskog porekla, uključujući njihove fragmente i/ili varijante, kao i različite antitumorske ili antikancerogene agense koji su objavljeni u nastavku.
Izraz „efektorske funkcije” se odnosi na one biološke aktivnosti koje se mogu pripisati Fc regionu antitela, koje variraju u zavisnosti od izotipa antitela. Primeri efektorskih funkcija antitela uključuju: vezivanje C1q i citotoksičnost zavisnu od komplementa (CDC), vezivanje Fc receptora; ćelijski posredovanu citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC); ćelijsku fagocitozu zavisnu od antitela (ADCP), sekreciju citokina, preuzimanje antigena posredstvom imunskog kompleksa od strane antigen prezentujućih ćelija, smanjenje površinskih ćelijskih receptora (npr. B-ćelijski receptor), i aktivaciju B ćelija.
Kako se ovde koriste, pojmovi „konstruisati, konstruisano, inženjering” uključuju bilo kakvu manipulaciju peptidne osnove ili posttranslacionih modifikacija prirodnog ili rekombinantnog polipeptida ili njegovog fragmenta. Inženjering obuhvata modifikacije aminokiselinske sekvence, glikozilacionog obrasca ili grupe bočnih lanaca pojedinačnih aminokiselina, kao i kombinacije ovih pristupa.
Izraz „mutacija aminokiselina”, kako se ovde koristi, obuhvata supstitucije aminokiselina, brisanje, umetanje i modifikacije. Svaka kombinacija supstitucije, brisanja, umetanja i modifikacije može se načiniti tako da se dođe do finalnog konstrukta, pod uslovom da finalni konstrukt ima željene karakteristike, npr. smanjeno vezivanje za Fc receptor, ili povećano povezivanje sa drugim peptidom. Brisanja i ubacivanja aminokiselinske sekvence uključuju brisanja i umetanja aminokiselina na amino i/ili karboksi terminusu. Konkretne aminokiselinske mutacije su aminokiselinske supstitucije. U cilju izmene npr. karakteristika vezivanja Fc regiona, naročito su poželjne nekonzervativne aminokiselinske supstitucije, tj. zamena jedne aminokiseline drugom aminokiselinom koja ima različita strukturna i/ili hemijska svojstva. Aminokiselinske supstitucije podrazumevaju zamenu dvadeset standardnih aminokiselina aminokiselinama koje ne nastaju prirodno, ili derivatima prirodnih aminokiselina (npr. 4-hidroksiprolin, 3-metilhistidin, ornitin, homoserin, 5-hidroksilizin). Aminokiselinske mutacije se mogu generisati pomoću genetskih ili hemijskih postupaka koji su dobro poznati u struci. Genetski postupci mogu obuhvatati mutagenezu usmerenu na mesto, PCR, sintezu gena, i slično. Smatra se da su takođe korisni postupci izmene grupe bočnih lanaca aminokiseline drugim postupcima osim genetskog inženjeringa, kao što je hemijska modifikacija. Ovde se mogu koristiti različite oznake kako bi se ukazalo na istu mutaciju aminokiselina. Na primer, supstitucija iz prolina u položaju 329 Fc domena u glicin se može označiti kao 329G, G329, G329, P329G ili Pro329Gly.
„Efikasna količina” agensa, npr. neke farmaceutske formulacije, odnosi se na količinu koja je u potrebnim dozama i vremenskim periodima efikasna za postizanje željenog terapeutskog ili profilaktičkog rezultata.
Izraz „Fc domen” ili „Fc region” se ovde koristi da definiše C-terminalni region imunoglobulinskog teškog lanca koji sadrži barem deo konstantnog regiona. Ovaj izraz podrazumeva nativne sekvence Fc regiona i varijante Fc regiona. Iako granice Fc regiona IgG teškog lanca mogu malo da variraju, Fc region teškog lanca humanog IgG tipično se po uobičajenoj definiciji proteže od Cys226 ili Pro230 do karboksi terminusa teškog lanca. Međutim, na C-terminalnom kraju Fc regiona lizin (Lys447) može, ali ne mora da bude prisutan. Ukoliko ovde nije drugačije naznačeno, numerisanje aminokiselinskih ostataka u Fc regionu ili konstantnom regionu je dato prema EU sistemu numeracije, koji se takođe zove EU indeks, kao što je opisano u Kabat et al., Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. izd. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991. „Podjedinica” Fc domena kako se ovde koristi, odnosi se na jedan od dva polipeptida koji formiraju dimerni Fc domen, tj. polipeptid koji sadrži C-terminalne konstantne regione teškog lanca imunoglobulina, sposobne za stabilno samopovezivanje. Na primer, podjedinica Fc domena IgG sadrži konstantni domen IgG CH2 i IgG CH3.
"Modifikacija koja promoviše povezivanje prve i druge podjedinice Fc domena" je manipulacija peptidnim skeletom ili posttranslaciona modifikacija podjedinice Fc domena koja smanjuje ili sprečava povezivanje polipeptida koji sadrži podjedinicu Fc domena sa identičnim polipeptidom da formiraju homodimer. Modifikacija koja promoviše povezivanje, kako se ovde koristi, posebno podrazumeva odvojene modifikacije napravljene za svaku od dve podjedinice Fc domena koje treba da se povežu (tj. prva i druga podjedinica Fc domena), pri čemu su modifikacije komplementarne jedna drugoj kako bi se promovisalo povezivanje dve podjedinice Fc domena. Na primer, modifikacija koja promoviše povezivanje može promeniti strukturu ili naelektrisanje jedne ili obe podjedinice Fc domena, kako bi njihovo povezivanje bilo sterno odnosno elektrostatički povoljno. Tako se (hetero)dimerizacija javlja između polipeptida koji sadrži prvu podjedinicu Fc domena i polipeptida koji sadrži drugu podjedinicu Fc domena, koja može biti neidentična u smislu da dodatne komponente spojene na svaku od podjedinica (npr. antigen vezujući delovi) nisu iste. U nekim otelotvorenjima, modifikacija koja podstiče povezivanje uključuje aminokiselinsku mutaciju u Fc domenu, posebno aminokiselinsku supstituciju. U posebnom otelotvorenju, modifikacija koja promoviše povezivanje sadrži odvojenu aminokiselinsku mutaciju, konkretno aminokiselinsku supstituciju, u svakoj od dve podjedinice Fc domena.
„Okvir” ili „FR” se odnosi na ostatke varijabilnog domena koji nisu ostaci hipervarijabilnog regiona (HVR). FR varijabilnog domena generalno se sastoji od četiri FR domena: FR1, FR2, FR3 i FR4. Shodno tome, HVR i FR sekvence generalno se pojavljuju u sledećem redosledu u VH (ili VL): FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
Izrazi „antitelo pune dužine”, „netaknuto antitelo” i „kompletno antitelo” u ovom dokumentu se koriste kao sinonimi, i odnose se na antitelo koje ima suštinski sličnu strukturu strukturi nativnog antitela, ili koje ima teške lance koji sadrže Fc region, kao što je u ovom dokumentu definisano.
Izrazi „ćelija domaćin”, „ćelijska linija domaćina” i „kultura ćelije domaćina” koriste se kao sinonimi i ukazuju na ćelije u koje je uvedena egzogena nukleinska kiselina, uključujući potomstvo takvih ćelija. Ćelije domaćini uključuju „transformante” i „transformisane ćelije”, u koje spadaju primarne transformisane ćelije i potomstvo dobijeno od njih, bez obzira na broj presejavanja. Potomstvo ne mora biti po sadržaju nukleinskih kiselina sasvim istovetno matičnoj ćeliji, već može da sadrži mutacije. Ovde se uključuje mutantno potomstvo koje ima istu funkciju ili biološku aktivnost kakva je ispitana ili odabrana u originalno transformisanoj ćeliji.
„Humano antitelo” je ono koje ima aminokiselinsku sekvencu koja odgovara aminokiselinskoj sekvenci koju proizvodi čovek ili humana ćelija, ili ono dobijeno iz nehumanog izvora koji koristi humani repertoar antitela ili druge sekvence za kodiranje humanog antitela. Ova definicija humanog antitela specifično isključuje humanizovano antitelo koje sadrži antigen vezujuće ostatke koji nisu ljudskog porekla. Kao što je već rečeno za himerna i humanizovana antitela, prema ovom pronalasku termin "humano antitelo", kako se ovde koristi, takođe obuhvata antitela koja su modifikovana u konstantnom regionu da bi se stvorila karakteristike u skladu sa pronalaskom, posebno u pogledu vezivanja C1q i/ili vezivanja FcR, npr. "zamenjivanjem klasa" tj. promenom ili mutiranjem delova Fc (npr. mutacija iz IgG1 u IgG4 i/ili IgG1/IgG4).
Termin “rekombinantno humano antitelo”, kao što je ovde korišćen, utvrđen je kako bi obuhvatio sva humana antitela, koja se pripremaju, eksprimiraju, kreiraju ili izoluju na rekombinantne načine, kao što su antitela izolovana iz ćelije domaćina, kao što je NS0 ili CHO ćelija, ili iz životinje (npr. miša), koja je transgena za humane imunoglobulinske gene, ili antitela, koja se eksprimiraju korišćenjem rekombinantnog ekspresionog vektora, transficiranog u ćeliju domaćina. Takva rekombinantna humana antitela imaju varijabilne i konstantne regione u preuređenom obliku. Rekombinantna humana antitela prema ovom pronalasku su podvrgnuta in vivo somatskoj hipermutaciji. Prema tome, aminokiselinske sekvence VH i VL regiona rekombinantnih antitela su sekvence koje, budući da su dobijene iz VH i VL sekvenci humane germinativne linije i srodne su sa njima, ne mogu prirodno postojati in vivo u okviru repertoara antitela humane germinativne linije.
„Humani konsenzusni okvir” je okvir koji predstavlja najčešće aminokiselinske ostatke u izboru okvirnih sekvenci VL ili VH humanog imunoglobulina. Po pravilu, izbor VL ili VH sekvenci humanog imunoglobulina je iz podgrupe sekvenci varijabilnog domena. Po pravilu, podgrupa sekvenci je podgrupa kao u Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, peto izdanje, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), tom 1-3. U jednom otelotvorenju, za VL, podgrupa je podgrupa kapa I, kao u Kabat i sar., gore navedeno. U jednom otelotvorenju, za VH, podgrupa je podgrupa III, kao u Kabat et al., gore navedeno.
„Humanizovano” antitelo se odnosi na himerno antitelo koje sadrži aminokiselinske ostatke nehumanih HVR-ova i aminokiselinske ostatke humanih FR-ova. U određenim otelotvorenjima, humanizovano antitelo će sadržati u suštini sve, ili najmanje jedan, a tipično dva varijabilna domena, u kojima svi, ili suštinski svi HVR-ovi (npr. CDR), odgovaraju onima iz nehumanog antitela, a svi, ili suštinski svi FR-ovi, odgovaraju onima iz humanog antitela. Humanizovano antitelo opciono može da sadrži najmanje deo konstantnog regiona antitela dobijenog od humanog antitela. „Humanizovani oblik” antitela, npr. nehumanog antitela, odnosi se na antitelo koje je pretrpelo humanizaciju. Drugi oblici "humanizovanih antitela" obuhvaćenih ovim pronalaskom su oni u kojima je konstantni region dodatno modifikovan ili promenjen u odnosu na onaj originalnog antitela, da bi se generisale karakteristike u skladu sa pronalaskom, posebno u vezi sa vezivanjem C1q i/ili vezivanjem Fc receptora (FcR).
Termin „hipervarijabilni region” ili „HVR”, kako se ovde koristi, odnosi se na svaki od regiona varijabilnog domena antitela koji su hipervarijabilni u sekvenci i/ili formiraju strukturno definisane petlje ("hipervarijabilne petlje"). Generalno, nativna četvorolančana antitela sadrže šest regiona HVR: tri u VH (H1, H2, H3) i tri u VL (L1, L2, L3). Regioni HVR uglavnom sadrže aminokiselinske ostatke iz hipervarijabilnih petlji i/ili iz "regiona koji određuju komplementarnost" (CDR), gde ovi poslednji imaju najveću varijabilnost sekvence i/ili su uključeni u prepoznavanje antigena. Primeri hipervarijabilnih petlji dešavaju se na aminokiselinskim ostacima 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2) i 96-101 (H3). (Chothia i Lesk, J. Mol. Biol.196:901-917 (1987)). Primeri regiona CDR (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 i CDR-H3) javljaju se na aminokiselinskim ostacima 24-34 na L1, 50-56 na L2, 89-97 na L3, 31-35B na H1, 50-65 na H2 i 95-102 na H3. (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. izd. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)). Hipervarijabilni regioni (HVR) se takođe pominju kao regioni koji određuju komplementarnost (CDR), i ti termini se podjednako odnose na delove varijabilnog regiona koji formiraju antigen vezujuće regione. Ovaj konkretni region opisan je u Kabat et al., U.S. Dept, of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983) i u Chothia et al., J. Mol. Biol.196:901-917 (1987), gde se ove definicije odnose na preklapanje ili podskupove aminokiselinskih ostataka kad se porede jedne sa drugima. I pored toga, namera je da primena bilo koje od ove dve definicije koje ukazuju na CDR antitela ili njihove varijante bude obuhvaćena terminom na način kako se on ovde definiše i koristi. Odgovarajući aminokiselinski ostaci koji obuhvataju CDR kao što je definisano u svakoj od gore citiranih referenci prikazani su dole u Tabeli A radi poređenja. Tačni brojevi ostataka koji sadrže konkretni CDR će varirati u zavisnosti od sekvence i veličine CDR. Stručna lica iz ove oblasti mogu rutinski da odrede koji ostaci sadrže konkretni CDR kada je data aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona datog antitela.
TABELA A. Definicije CDR<1>
<1>Numeracija svih definicija CDR-a u Tabeli A je u skladu sa konvencijama o numeraciji koje su izradili Kabat et al. (viditi dole).
<2>„AbM“ sa malim slovom „b“, kao što se koristi u Tabeli A, odnosi se na regione CDR kao što je definisano pomoću softvera za modelovanje „AbM“ antitela centra Oxford Molecular.
Kabat et al. su takođe definisali sistem numerisanja za sekvence varijabilnih regiona koji je primenljiv na bilo koje antitelo. Lice standardne stručnosti iz ove oblasti može nedvosmisleno da primeni ovaj sistem „Kabatove numeracije” na svaku sekvencu varijabilnog regiona, ne oslanjajući se ni na kakve eksperimentalne podatke osim na same sekvence. U smislu ovog dokumenta, „Kabatova numeracija” se odnosi na sistem numeracije koji su postavili Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, „Sequence of Proteins of Immunological Interest” (1983). Ako nije drugačije naglašeno, reference na numeraciju specifičnih položaja aminokiselinskih ostataka u varijabilnom regionu antitela su prema Kabatovom sistemu numeracije.
Sa izuzetkom CDR1 u VH, CDR generalno sadrže aminokiselinske ostatke koji formiraju hipervarijabilne petlje. CDR takođe sadrže „ostatke koji određuju specifičnost”, ili „SDR”, koji su ostaci koji stupaju u kontakt sa antigenom. SDR se nalaze u okviru regiona CDR koje se nazivaju skraćeni CDR, ili a-CDR. Primeri a-CDR regiona (a-CDR-L1, a-CDR-L2, a-CDR-L3, a-CDR-H1, a-CDR-H2 i a-CDR-H3) dešavaju se na aminokiselinskim ostacima 31-34 kod L1, 50-55 kod L2, 89-96 kod L3, 31-35B kod H1, 50-58 kod H2 i 95-102 kod H3. (Pogledajte Almagro i Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)). Ako nije drugačije naznačeno, HVR ostaci i drugi ostaci u varijabilnom domenu (npr. FR ostaci) ovde su numerisani prema radu Kabat et al., supra.
„Imunokonjugat” je antitelo konjugovano sa jednim ili više heterolognih molekula, uključujući, bez ograničenja, citotoksični agens.
„Pojedinac” ili „ispitanik” je sisar. Sisari uključuju, bez ograničenja, domaće životinje (npr. krave, ovce, mačke, pse i konje), primate (npr. ljude i nehumane primate, kao što su majmuni), zečeve i glodare (npr. miševe i pacove). U određenim otelotvorenjima, pojedinac ili ispitanik je čovek.
„Izolovano” antitelo je ono koje je izdvojeno iz svog prirodnog okruženja. U nekim otelotvorenjima, antitelo je prečišćeno do čistoće veće od 95% ili 99% kao što je određeno, na primer, elektroforetski (npr. SDS-PAGE, izoelektrično fokusiranje (IEF), kapilarna elektroforeza) ili hromatografski (npr. jonskom izmenom ili reverzno-faznom HPLC metodom). Za pregled metoda za procenu čistoće antitela, pogledajte npr. Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007).
„Izolovana” nukleinska kiselina se odnosi na molekul nukleinske kiseline koji je odvojen od komponenata svog prirodnog okruženja. Izolovana nukleinska kiselina uključuje molekul nukleinske kiseline koji se nalazi u ćelijama koje uobičajeno sadrže molekul nukleinske kiseline, ali je molekul nukleinske kiseline prisutan ekstrahromozomski, ili na hromozomskoj lokaciji koja se razlikuje od njegove prirodne hromozomske lokacije.
„Izolovana nukleinska kiselina koja kodira bispecifično antitelo koje specifično vezuje DR5 i FAP antitelo” odnosi se na jedan ili više molekula nukleinske kiseline koji kodiraju teške i lake lance antitela (ili njihove fragmente), uključujući takve molekule nukleinske kiseline u jednom vektoru ili odvojenim vektorima, i takve molekule nukleinske kiseline prisutne na jednoj ili više lokacija u ćeliji domaćinu.
Termin „monoklonsko antitelo”, u smislu ovog dokumenta, odnosi se na antitelo dobijeno iz populacije suštinski homogenih antitela, tj. pojedinačna antitela koja sadrže ovu populaciju su identična i/ili se vezuju za isti epitop, sa izuzetkom mogućih varijanti antitela, npr. koje sadrže mutacije koje postoje u prirodi ili se mogu razviti tokom stvaranja preparata monoklonskog antitela, a takve varijante su obično prisutne u neznatnim količinama. Nasuprot preparatima poliklonskih antitela, koji tipično uključuju različita antitela, usmerena prema različitim determinantama (epitopima), svako monoklonsko antitelo iz preparata monoklonskog antitela je usmereno na pojedinačnu determinantu na antigenu. Stoga reč „monoklonsko” ukazuje na karakter antitela, da je dobijeno iz suštinski homogene populacije antitela, i ne bi je trebalo tumačiti kao da podrazumeva zahtev za proizvodnju antitela bilo kojim posebnim postupkom. Na primer, monoklonska antitela koja će se koristiti u skladu sa predmetnim pronalaskom mogu se dobiti različitim tehnikama, uključujući, ali se ne ograničavajući na metodu hibridoma, metode rekombinantne DNK, metode displeja faga i metode u kojima se koriste transgene životinje koje sadrže kompletne lokuse humanog imunoglobulina ili njihove delove, i ovde su opisane takve metode i primeri drugih metoda za dobijanje monoklonskih antitela.
"Golo antitelo" označava antitelo koje nije konjugovano sa heterolognim delom (npr. citotoksičnim delom) ili radiološkom oznakom. Golo antitelo može da bude prisutno u farmaceutskoj formulaciji.
„Nativna antitela” se odnose na molekule imunoglobulina koji se sreću u prirodi, sa različitim strukturama. Na primer, nativna IgG antitela su heterotetramerni glikoproteini od oko 150.000 daltona, sastavljeni od dva identična laka lanca i dva identična teška lanca koji su povezani disulfidnim vezama. Od N-terminalnog do C-terminalnog kraja, svaki teški lanac ima varijabilni region (VH), koji se takođe zove varijabilni teški domen ili varijabilni domen teškog lanca, za kojim slede tri konstantna domena (CH1, CH2 i CH3). Slično tome, od N-terminalnog do C-terminalnog kraja, svaki laki lanac ima varijabilni region (VL), koji se takođe zove varijabilni laki domen ili varijabilni domen lakog lanca, za kojim sledi konstantni laki (CL) domen. Laki lanac antitela može se svrstati u jedan od dva tipa, koji se zovu kapa (κ) i lambda (λ), na osnovu aminokiselinske sekvence njihovog konstantnog domena.
"Blokirajuće" antitelo ili "antagonističko" antitelo je ono koje inhibira ili smanjuje biološku aktivnost antigena za koji se vezuje. U nekim otelotvorenjima, blokirajuća antitela ili antagonistička antitela značajno ili u potpunosti inhibiraju biološku aktivnost antigena. Na primer, anti-PD-L1 antitela iz pronalaska blokiraju signalizaciju putem PD-1 tako da obnavljaju funkcionalni odgovor T ćelija (npr. proliferaciju, proizvodnju citokina, ubijanje ciljnih ćelija) od nefunkcionalnog stanja do stimulacije antigenom.
"Agonist" ili aktivaciono antitelo je ono koje pojačava ili pokreće signalizaciju antigenom za koji se vezuje. U nekim otelotvorenjima, agonistička antitela uzrokuju ili aktiviraju signalizaciju bez prisustva prirodnog liganda.
Termin „uputstvo za upotrebu” koristi se da se ukaže na uputstvo koje se obično nalazi u komercijalnim pakovanjima terapeutskih proizvoda, koje sadrži informacije o indikacijama, upotrebi, doziranju, primeni, kombinovanoj terapiji, kontraindikacijama i/ili upozorenjima u vezi sa upotrebom takvog terapeutskog proizvoda.
"Nema značajne unakrsne reaktivnosti" znači da molekul (npr. antitelo) ne prepoznaje niti specifično vezuje antigen različit od stvarnog ciljnog antigena datog molekula (npr. antigen blisko povezan sa ciljnim antigenom), naročito kada se uporedi sa tim ciljnim antigenom. Na primer, antitelo može da veže manje od oko 10% do manje od oko 5% antigena različitog od konkretnog ciljnog antigena, ili može da veže pomenuti antigen različit od konkretnog ciljnog antigena u količini izabranoj iz grupe koja se sastoji od manje od oko 10%, 9%, 8% 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,2%, ili 0,1%, poželjno manje od oko 2%, 1% ili 0,5%, a najpoželjnije manje od oko 0,2% ili 0,1% antigena različitog od konkretnog ciljnog antigena.
„Procenat (%) identičnosti aminokiselinske sekvence” u poređenju sa sekvencom referentnog polipeptida definisan je kao procenat onih aminokiselinskih ostataka u sekvencikandidatu koji su identični aminokiselinskim ostacima u sekvenci referentnog polipeptida, nakon poravnavanja sekvenci i uvođenja praznina, ako je potrebno, da bi se postigao maksimalni procenat identičnosti sekvence, pri tom ne uzimajući u obzir bilo koje konzervativne supstitucije kao deo identiteta sekvence. Poravnavanje radi određivanja procenta identičnosti aminokiselinske sekvence može se postići na različite načine koji su poznati u okviru struke, na primer, pomoću javno dostupnog kompjuterskog softvera, kao što je BLAST, BLAST-2, ALIGN ili Megalign (DNASTAR) softver. Stručna lica iz ove oblasti mogu da odrede odgovarajuće parametre za poravnavanje sekvenci, uključujući sve potrebne algoritme za postizanje maksimalnog poravnavanja u kompletnoj dužini sekvenci koje se porede. Međutim, ovde su u tu svrhu vrednosti za % identičnosti aminokiselinske sekvence dobijene pomoću računarskog programa za poređenje sekvenci ALIGN-2. Računarski program za poređenje sekvenci ALIGN-2 delo je kompanije Genentech, Inc., a izvorni kod je podnet sa korisničkom dokumentacijom u U.S. Copyright Office (Patentni zavod SAD), Washington D.C., 20559, gde je registrovan pod patentnim brojem U.S. Copyright Registration No. TXU510087. Program ALIGN-2 je javno dostupan od Genentech, Inc., South San Francisco, California ili može biti kompiliran iz izvornog koda. Program ALIGN-2 treba da se kompilira za primenu na operativnom sistemu UNIX, uključujući digitalni UNIX V4.0D. Sve parametre poređenja sekvenci je postavio program ALIGN-2 i nisu se menjali.
U slučajevima kada je ALIGN-2 korišćen za poređenja aminokiselinskih sekvenci, % identičnosti aminokiselinske sekvence date aminokiselinske sekvence A sa datom aminokiselinskom sekvencom B, ili u odnosu na nju (što alternativno može da se izrazi kao data aminokiselinska sekvenca A koja ima ili sadrži određeni % identičnosti aminokiselinske sekvence prema, sa ili u odnosu na datu aminokiselinsku sekvencu B) izračunava se na sledeći način:
100 puta količnik X/Y
gde je X broj aminokiselinskih ostataka za koje je dobijen rezultat da su identični putem programa za poređenje sekvenci ALIGN-2 pri poravnavanju A i B u tom programu, i gde je Y ukupan broj aminokiselinskih ostataka u B. Treba shvatiti da, u slučaju da dužina aminokiselinske sekvence A nije jednaka dužini aminokiselinske sekvence B, % identičnosti aminokiselinskih sekvenci A u odnosu na B neće biti isti kao % identičnosti aminokiselinskih sekvenci B u odnosu na A. Osim ako nije drugačije navedeno, sve ovde upotrebljene vrednosti % identičnosti aminokiselinske sekvence dobijene su, kao što je opisano u prethodnom paragrafu, pomoću računarskog programa ALIGN-2.
Termin „farmaceutska formulacija” se odnosi na preparat koji je u takvom obliku da omogućava efikasnu biološku aktivnost aktivnog sastojka koji se u njoj nalazi i koji ne sadrži dodatne komponente koje su neprihvatljivo toksične za ispitanika na kome će formulacija biti primenjena.
"Farmaceutski prihvatljiv nosač" se odnosi na sastojak farmaceutske formulacije koji nije aktivni sastojak, i koji je netoksičan za ispitanika. Farmaceutski prihvatljiv nosač uključuje, ali nije ograničen na pufer, ekscipijens, stabilizator ili konzervans.
Termin „antagonist vezivanja ose PD-1” odnosi se na molekul koji inhibira interakciju partnera u vezivanju ose PD-1 sa jednim ili više njegovih partnera za vezivanje, kako bi se uklonila disfunkcija T ćelije koja je rezultat signalizacije na PD-1 signalnoj osi, a rezultat je obnavljanje ili poboljšanje funkcije T ćelija (npr. proliferacija, proizvodnja citokina, uništavanje ciljanih ćelija). U smislu ovog dokumenta, antagonist vezivanja ose PD-1 odnosi se na antagonist vezivanja PD-1, antagonist vezivanja PD-L1 i antagonist vezivanja PD-L2.
Termin „antagonisti koji vezuju PD-1” odnosi se na molekul koji smanjuje, blokira, inhibira, ukida ili ometa transdukciju signala koji nastaje usled interakcije PD-1 sa jednim ili više partnera u vezivanju, kao što su PD-L1, PD-L2. U nekim otelotvorenjima, antagonist vezivanja PD-1 je molekul koji inhibira vezivanje PD-1 za njegove partnere u vezivanju. U specifičnom aspektu, antagonist vezivanja PD-1 inhibira vezivanje PD-1 za PD-L1 i/ili PD-L2. Na primer, antagonisti vezivanja PD-1 uključuju anti-PD-1 antitela, njihove fragmente koji vezuju antigen, imunoadhezine, fuzione proteine, oligopeptide i druge molekule koji smanjuju, blokiraju, inhibiraju, ukidaju ili ometaju transdukciju signala koji nastaje usled interakcije PD-1 sa PD-L1 i/ili PD-L2. U jednom otelotvorenju, antagonist vezivanja PD-1 smanjuje negativni kostimulativni signal posredovan pomoću ili putem proteina na ćelijskoj površini eksprimiranih na T-limfocitima koji posreduju u signalizaciji putem PD-1 tako da se disfunkcionalna T ćelija učini manje disfunkcionalnom (npr. poboljšanje efektorskih odgovora na prepoznavanje antigena). U nekim otelotvorenjima, antagonist vezivanja PD-1 je anti-PD-1 antitelo. U jednom specifičnom aspektu, antagonist vezivanja PD-1 je MDX-1106, opisan u ovom dokumentu. U drugom specifičnom aspektu, antagonist vezivanja PD-1 je Merck 3745, opisan u ovom dokumentu. U još jednom specifičnom aspektu, antagonist vezivanja PD-1 je CT-011, opisan u ovom dokumentu.
Izraz "antagonisti vezivanja PD-L1" označava molekul koji smanjuje, blokira, inhibira, ukida ili ometa transdukciju signala koja je rezultat interakcije PD-L1 sa jednim ili više njegovih partnera u vezivanju, kao što su PD-1, B7-1.U nekim otelotvorenjima, antagonist vezivanja PD-L1 je molekul koji inhibira vezivanje PD-L1 za njegove partnere u vezivanju. U jednom posebnom aspektu, antagonist vezivanja PD-L1 inhibira vezivanje PD-L1 za PD-1 i/ili B7-1. U nekim otelotvorenjima, u antagoniste vezivanja PD-L1 spadaju anti-PD-L1 antitela, njihovi antigen vezujući fragmenti, imunoadhezini, fuzioni proteini, oligopeptidi i drugi molekuli koji smanjuju, blokiraju, inhibiraju, ukidaju ili ometaju transdukciju signala koji nastaje usled interakcije PD-L1 sa jednim ili više njegovih partnera u vezivanju, kao što je PD-1, B7-1. U jednom otelotvorenju, antagonist vezivanja PD-L1 smanjuje negativni kostimulativni signal posredovan pomoću ili putem proteina na ćelijskoj površini eksprimiranih na T-limfocitima koji posreduju u signalizaciji putem PD-L1 tako da se disfunkcionalna T ćelija učini manje disfunkcionalnom (npr. poboljšanje efektorskih odgovora na prepoznavanje antigena). U nekim otelotvorenjima, antagonist vezivanja PD-L1 je anti-PD-L1 antitelo. U jednom posebnom aspektu, anti-PD-L1 antitelo je YW243.55.S70, opisano u ovom dokumentu. U jednom drugom posebnom aspektu, anti-PD-L1 antitelo je MDX-1105, opisano u ovom dokumentu. U još jednom posebnom aspektu, anti-PD-L1 antitelo je MPDL3280A, opisano u ovom dokumentu.
Izraz „antagonisti vezivanja PD-L2” odnosi se na molekul koji smanjuje, blokira, inhibira, ukida ili ometa transdukciju signala koji nastaje usled interakcije PD-L2 sa jednim ili više njegovih partnera u vezivanju, kao što je PD-1. U nekim otelotvorenjima, antagonist vezivanja PD-L2 je molekul koji inhibira vezivanje PD-L2 za njegove partnere u vezivanju. U jednom posebnom aspektu, antagonist vezivanja PD-L2 inhibira vezivanje PD-L2 za PD-1. U nekim otelotvorenjima, u antagoniste PD-L2 spadaju anti-PD-L2 antitela, njihovi antigen vezujući fragmenti, imunoadhezini, fuzioni proteini, oligopeptidi i drugi molekuli koji smanjuju, blokiraju, inhibiraju, ukidaju ili ometaju transdukciju signala koji nastaje usled interakcije PD-L2 sa jednim ili više njegovih partnera u vezivanju, kao što je PD-1. U jednom otelotvorenju, antagonist vezivanja PD-L2 smanjuje negativni kostimulativni signal posredovan pomoću ili putem proteina na ćelijskoj površini eksprimiranih na T limfocitima koji posreduju u signalizaciji putem PD-L2 tako da se disfunkcionalna T ćelija učini manje disfunkcionalnom (npr. poboljšanje efektorskih odgovora na prepoznavanje antigena). U nekim otelotvorenjima, antagonist vezivanja PD-L2 je imunoadhezin.
"PD-1 oligopeptid", "PD-L1 oligopeptid" ili "PD-L2 oligopeptid" je oligopeptid koji se vezuje, poželjno specifično, za PD-1, PD-L1 odnosno PD-L2 negativni kostimulatorni polipeptid, uključujući receptor, ligand, odnosno signalnu komponentu, kako je ovde opisano. Takvi oligopeptidi se mogu hemijski sintetisati korišćenjem poznatih metoda za sintezu oligopeptida, ili se mogu pripremiti i prečistiti pomoću rekombinantne tehnologije. Takvi oligopeptidi obično imaju dužinu od najmanje oko 5 aminokiselina, alternativno najmanje oko 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, ili 100 aminokiselina, ili više. Takvi oligopeptidi se mogu identifikovati dobro poznatim tehnikama. U vezi s tim, napominje se da su tehnike za pretraživanje oligopeptidnih biblioteka radi pronalaženja oligopeptida koji su sposobni da se specifično vežu za polipeptidni cilj dobro poznate u struci (vidi npr. US Patent br. 5,556,762, 5,750,373, 4,708,871, 4,833,092, 5,223,409, 5,403,484, 5,571,689, 5,663;143 PCT Publication br. WO 84/03506 i WO84/03564; Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81:3998-4002 (1984); Geysen et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82: 178-182 (1985); Geysen et al., u Synthetic Peptides as Antigens, 130-149 (1986); Geysen et al., J. Immunol. Meth., 102:259-274 (1987); Schoofs et al., J. Immunol., 140:611 -616 (1988), Cwirla, S. E. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378 (1990); Lowman, H.B. et al. Biochemistry, 30: 10832 (1991); Clackson, T. et al. Nature, 352: 624 (1991); Marks, J. D. et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991); Kang, A.S. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8363 (1991), i Smith, G. P., Current Opin. Biotechnol, 2:668 (1991).
Termin "anergija" se odnosi na stanje neodgovaranja na antigensku stimulaciju, koje je posledica nepotpunih ili nedovoljnih signala isporučenih putem T ćelijskog receptora (npr. porast intraćelijskog Ca<+2>u odsustvu ras-aktivacije). Anergija T ćelija može nastati i nakon stimulacije pomoću antigena u odsustvu kostimulacije, što dovodi do toga da ćelija postane refraktorna za dalju aktivaciju antigenom čak i u kontekstu kostimulacije. Stanje neodgovaranja se često može nadjačati prisustvom interleukina-2. Anergične T ćelije ne prolaze kroz klonsku ekspanziju i/ili ne stiču efektorske funkcije.
Termin "iscrpljenost" se odnosi na iscrpljenost T ćelija kao stanje disfunkcije T ćelija koje nastaje zbog produžene TCR signalizacije koja se javlja tokom mnogih hroničnih infekcija i raka. Od anergije se razlikuje po tome što ne nastaje zbog nepotpune ili neispravne signalizacije, već zbog produžene signalizacije. Odlikuje se lošom efektorskom funkcijom, produženom ekspresijom inhibitornih receptora i transkripcionim stanjem različitim od stanja funkcionalnih efektorskih ili memorijskih T ćelija. Iscrpljenost sprečava optimalnu kontrolu infekcije i tumora. Iscrpljenost može nastati i zbog spoljašnjih negativnih regulatornih puteva (npr. imunoregulacionih citokina) i zbog ćelijskih intrinzičnih negativnih regulatornih (kostimulatornih) puteva (PD-1, B7-H3, B7-H4, itd.).
"Poboljšanje funkcije T ćelija" podrazumeva podsticanje, izazivanje ili stimulisanje T ćelije da ima produženu ili pojačanu biološku funkciju, ili obnavljanje ili ponovno aktiviranje iscrpljene ili neaktivne T ćelije. Primeri poboljšanja funkcije T ćelija obuhvataju: povećanu sekreciju γ-interferona iz CD8<+>T ćelija, povećanu proliferaciju, pojačanu reaktivnost na antigene (npr. klirens virusa, patogena ili tumora) u odnosu na iste nivoe pre intervencije. U jednom otelotvorenju, nivo poboljšanja je najmanje 50%, alternativno 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 120%, 150%, 200%. Postupak merenja ovog poboljšanja poznat je licima sa standardnom stručnošću iz ove oblasti.
"Imunitet tumora" se odnosi na proces u kome tumori izbegavaju imunsko prepoznavanje i klirens. Tako, kao terapijski koncept, imunitet tumora se "leči" kada takvo izbegavanje slabi, a imunski sistem prepoznaje i napada tumore. Primeri prepoznavanja tumora uključuju vezivanje tumora, skupljanje tumora i klirens tumora. [0046] "Imunogenost" se odnosi na sposobnost određene supstance da izazove imunski odgovor. Tumori su imunogeni, a pojačavanje imunogenosti tumora pomaže u klirensu tumorskih ćelija pomoću imunskog odgovora. Primeri jačanja imunogenosti tumora uključuju lečenje anti-PDL antitelima i ME inhibitorom.
"Produženi odgovor" se odnosi na produženi efekat na smanjenje rasta tumora nakon prestanka lečenja. Na primer, veličina tumora može ostati ista ili se smanjiti u odnosu na veličinu na početku faze primene leka. U nekim otelotvorenjima, produženi odgovor ima trajanje najmanje isto kao i trajanje lečenja, najmanje 1,5x, 2,0x, 2,5x ili 3,0x dužine trajanja lečenja.
Izraz „protein za aktivaciju fibroblasta (FAP)”, u smislu ovog dokumenta, odnosi se na svaki nativni FAP koji potiče od bilo kog kičmenjaka, uključujući sisare, kao što su primati (npr. ljudi) i glodari (npr. miševi i pacovi), ako nije drugačije naglašeno. Ovaj izraz se odnosi i na neobrađeni FAP "kompletne dužine", kao i svaki oblik FAP-a koji je rezultat obrade u ćeliji. Izraz takođe obuhvata prirodno postojeće varijante FAP-a, npr. splajsovane ili alelne varijante. Poželjno, anti-FAP antitelo iz ovog pronalaska vezuje se za ekstracelularni domen FAP-a. Aminokiselinske sekvence uzoraka FAP polipeptidnih sekvenci, uključujući sekvencu humanog FAP-a, otkrivene su u WO 2012/020006.
U smislu ovog dokumenta, „lečenje” (i gramatički oblici ove reči, kao što je „lečiti”) se odnosi na kliničku intervenciju u pokušaju da se izmeni prirodni tok bolesti kod pojedinca koji se leči, a može se primenjivati radi profilakse ili tokom kliničke patologije. Poželjni efekti lečenja uključuju, bez ograničenja, sprečavanje pojave ili recidiva bolesti, ublažavanje simptoma, smanjenje svih direktnih ili indirektnih patoloških posledica bolesti, sprečavanje metastaze, usporavanje stope napredovanja bolesti, poboljšavanje ili ublažavanje stanja bolesti, i remisiju ili poboljšanu prognozu. U nekim otelotvorenjima, antitela predmetnog pronalaska se primenjuju da odlože razvoj bolesti ili da uspore napredovanje bolesti.
Termin kancer, kako se ovde koristi, odnosi se na proliferativne bolesti, poput kolorektalnog kancera, sarkoma, kancera glave i vrata, karcinoma skvamoznih ćelija, karcinoma dojke, raka gušterače, raka želuca, nesitnoćelijskog karcinoma pluća, sitnoćelijskog raka pluća i mezotelioma, uključujući refraktorne verzije bilo kog od gore navedenih kancera ili kombinaciju jednog ili više gore navedenih kancera. U jednom otelotvorenju, rak je kolorektalni kancer, a opcioni hemoterapeutski agens je irinotekan. U otelotvorenjima u kojima je rak sarkom, sarkom je opciono hondrosarkom, lejomiosarkom, gastrointestinalni stromalni tumori, fibrosarkom, osteosarkom, liposarkom ili maligni fibrozni histiocitom.
Izrazi „varijabilni region” ili „varijabilni domen” odnose se na domen teškog ili lakog lanca antitela, koji učustvuje u vezivanju antitela za antigen. Varijabilni domeni teškog lanca i lakog lanca (VH odnosno VL) nativnog antitela obično imaju slične strukture, pri čemu svaki domen sadrži četiri očuvana okvirna regiona (FR) i tri hipervarijabilna regiona (HVR). (Videti npr. Kindt et al. Kuby Immunology, 6. izd, W.H. Freeman and Co., str.91 (2007)). Jedan VH ili VL domen može biti dovoljan za dodeljivanje antigen vezujuće specifičnosti. Nadalje, antitela koja vezuju određeni antigen mogu se izolovati pomoću VH ili VL domena iz antitela koje vezuje antigen radi pregledanja biblioteke komplementarnih VH odnosno VL domena. (Videti npr. Portolano et al., J. Immunol.150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991).
Kako se ovde koristi, izraz „antigen vezujući molekul” se u najširem smislu odnosi na molekul koji specifično vezuje antigensku determinantu. Primeri antigen vezujućih molekula su imunoglobulini i njihovi derivati, npr. fragmenti.
Izraz "antigen vezujuće mesto antitela", kada se ovde koristi, odnosi se na aminokiselinske ostatke antitela koji su odgovorni za vezivanje antigena. Antigen-vezujući deo antitela sadrži aminokiselinske ostatke iz "regiona koji određuju komplementarnost" ili "CDR". „Okvirni“ ili „FR“ regioni su oni regioni varijabilnog domena, koji se razlikuju od ostataka hipervarijabilnog regiona kako je ovde definisano. Prema tome, varijabilni domeni lakog i teškog lanca antitela sadrže, od N-terminalnog do C-terminalnog kraja, domene FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, i FR4. Posebno, CDR3 teškog lanca je region koji najviše doprinosi vezivanju antigena i definiše karakteristike antitela. CDR i FR regioni su određeni prema standardnoj definiciji u Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. izd., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) i/ili onim ostacima iz "hipervarijabilne petlje".
Specifičnost antitela odnosi se na selektivno prepoznavanje antitela za određeni epitop antigena. Prirodna antitela su, na primer, monospecifična. "Bispecifična antitela" su antitela koja imaju dve različite specifičnosti vezivanja antigena. Antitela iz ovog pronalaska su specifična za dva različita antigena, tj. DR5 kao prvi antigen i FAP kao drugi antigen.
Termin "monospecifično" antitelo kako se ovde koristi označava antitelo koje ima jedno ili više vezujućih mesta od kojih se svako vezuje za isti epitop istog antigena.
Termin "bispecifični" znači da je antigen vezujući molekul sposoban da se specifično veže za najmanje dve različite antigenske determinante. Obično bispecifični antigen vezujući molekul sadrži najmanje dva mesta vezivanja antigena, od kojih je svako specifično za različitu antigensku determinantu. U određenim otelotvorenjima, bispecifični antigen vezujući molekul je sposoban da istovremeno vezuje dve antigenske determinante, naročito dve antigenske determinante eksprimirane na dve različite ćelije.
Antitelo koje se ovde obezbeđuje je multispecifično antitelo, npr. bispecifično antitelo. Multispecifična antitela su monoklonska antitela koja imaju sposobnost specifičnog vezivanja za najmanje dva različita mesta. Ovde se obezbeđuje bispecifično antitelo sa specifičnostima vezivanja za FAP i DR5. U određenim otelotvorenjima, bispecifična antitela mogu da se vežu za dva različita epitopa DR5. Bispecifična antitela mogu takođe da se upotrebe za lokalizaciju citotoksičnih agensa na ćelijama koje eksprimiraju DR5. Bispecifična antitela mogu da se proizvedu kao antitela kompletne dužine ili kao fragmenti antitela.
Tehnike za dobijanje multispecifičnih antitela uključuju, ali se ne ograničavaju na, rekombinantnu koekspresiju dva imunoglobulinska para teški lanac-laki lanac koji imaju različite specifičnosti (videti Milstein i Cuello, Nature 305: 537 (1983)), WO 93/08829, i Traunecker et al., EMBO J.10: 3655 (1991)) i inženjering "dugme u rupici" (videti npr. U.S.
Patent br. 5,731,168). Multispecifična antitela mogu takođe da se dobiju kreiranjem efekata elektrostatičkog upravljanja za dobijanje Fc-heterodimernih molekula antitela (WO 2009/089004); ukrštanja dva ili više antitela ili fragmenata (videti, npr. US Patent br.
4,676,980, i Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)); upotrebom leucinskih zatvarača za proizvodnju bispecifičnih antitela (videti npr. Kostelny et al., J. Immunol., 148(5): 1547-1553 (1992)); korišćenjem tehnologije "dijatela" za dobijanje bispecifičnih fragmenata antitela (videti npr. Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)); i korišćenjem jednolančanih Fv (sFv) dimera (videti, npr. Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)); i proizvodnjom trispecifičnih antitela kako opisuju, npr. Tutt et al. J. imunol.147: 60 (1991).
Ovde su takođe obuhvaćena konstruisana antitela sa tri ili više funkcionalnih mesta vezivanja antigena, uključujući "antitela hobotnice" (videti npr. US 2006/0025576A1).
Ovde antitelo ili fragment takođe podrazumeva "dvojno delujuće FAb" ili "DAF", koje sadrži najmanje jedno antigen vezujuće mesto koji se vezuje za FAP ili DR5, kao i za drugi, različit antigen (videti, na primer, US 2008/0069820).
Termin "valentno" kako se koristi u okviru trenutne primene označava prisustvo određenog broja mesta vezivanja u molekulu antitela. Kao takvi, termini "dvovalentni", "četvorovalentni" i "šestovalentni" označavaju prisustvo dva, odnosno četiri, odnosno šest mesta za vezivanje u molekulu antitela. Bispecifična antitela iz ovog pronalasku su najmanje „dvovalentna“ i mogu biti „trovalentna“ ili „multivalentna“ (npr. „četverovalentna“ ili „šestovalentna“).
Antitela predmetnog pronalaska imaju dva ili više mesta vezivanja i bispecifična su. Odnosno, antitela mogu biti bispecifična čak i u slučajevima kada postoji više od dva mesta vezivanja (tj. kada je antitelo trovalentno ili multivalentno). Bispecifična antitela prema pronalasku uključuju, na primer, multivalentna jednolančana antitela, dijatela i trijatela, kao i antitela koja imaju strukturu konstantnog domena antitela pune dužine za koja se dalje vezuju mesta vezivanja antigena (npr. jednolančani Fv, VH domen i/ili VL domen, Fab ili (Fab)2) putem jednog ili više peptidnih linkera. Antitela mogu biti pune dužine poreklom od jedne vrste, ili biti himerizovana ili humanizovana.
Termin „vektor”, kako se ovde koristi, odnosi se na molekul nukleinske kiseline koji ima sposobnost propagacije druge nukleinske kiseline za koju je vezan. Ovaj termin obuhvata vektor kao samoumnožavajuću strukturu nukleinske kiseline, kao i vektor ugrađen u genom ćelije domaćina u koju je uveden. Pojedini vektori mogu da upravljaju ekspresijom nukleinskih kiselina za koje su operativno vezani. Takvi vektori se ovde pominju kao „ekspresioni vektori”.
Termin „aminokiselina“ koji se koristi u okviru ove primene označava prirodno prisutne karboksi α-amino kiseline u koje spadaju alanin (troslovni kod: ala, jednoslovni kod: A), arginin (arg, R), asparagin (asn, N), asparaginska kiselina (asp, D), cistein (cys, C), glutamin (gln, Q), glutaminska kiselina (glu, E), glicin (gly, G), histidin (his, H), izoleucin (ile, I), leucin (leu, L), lizin (lys, K), metionin (met, M), fenilalanin (phe, F), prolin (pro, P) serin (ser, S), treonin (thr, T), triptofan (trp, W), tirozin (tyr, Y) i valin (val, V).
Kako se ovde koriste, izrazi "ćelija", "ćelijska linija" i "kultura ćelija" se koriste kao sinonimi, i sve takve oznake uključuju potomstvo. Tako se reči „transfektanti“ i „transficirane ćelije“ odnose na primarnu ćeliju ispitanika i iz nje izvedene kulture, bez obzira na broj prenosa. Takođe se podrazumeva da svako potomstvo možda nije precizno identično u sadržaju DNK, usled namernih ili nenamernih mutacija. Ovde se uključuju varijante potomstva koje imaju istu funkciju ili biološku aktivnost kao što je ispitano u originalno transformisanoj ćeliji.
"Afinitet" se odnosi na snagu zbira ukupnih nekovalentnih interakcija između pojedinačnog mesta vezivanja molekula (npr. antitela) i njegovog partnera u vezivanju (npr. antigena). Ukoliko nije drugačije naznačeno, kao što je ovde upotrebljeno, „afinitet vezivanja” se odnosi na suštinski afinitet vezivanja, koji odražava 1:1 interakciju između članova vezujućeg para (npr. antitela i antigena). Afinitet molekula X prema svom partneru Y može generalno da se predstavi putem konstante disocijacije (Kd). Afinitet može da se izmeri uobičajenim postupcima poznatim u struci, uključujući one opisane u ovom dokumentu. Specifična otelotvorenja data kao ilustracija i primer za merenje afiniteta vezivanja opisana su u nastavku.
Kako se ovde koristi, termin „vezujući“ ili „specifično vezujući“ odnosi se na vezivanje antitela za epitop antigena tumora u in vitro testu, poželjno u testu površinske plazmonske rezonance (BIAcore, GE-Healthcare Uppsala, Švedska). Afinitet vezivanja je definisan pojmovima ka (konstanta brzine za asocijaciju antitela iz kompleksa antitelo/antigen), kD (konstanta disocijacije) i KD (kD/ka). Vezivanje ili specifično vezivanje znači afinitet vezivanja (KD) od 10-8 mol/l ili manje, poželjno je 10<-9>M do 10<-13>mol/l.
Vezivanje antitela za receptor smrti može se ispitati pomoću BIAcore testa (GE-Healthcare Uppsala, Švedska). Afinitet vezivanja je definisan pojmovima ka (konstanta brzine za asocijaciju antitela iz kompleksa antitelo/antigen), kD (konstanta disocijacije) i KD (kD/ka).
„Smanjeno vezivanje”, na primer smanjeno vezivanje za Fc receptor, odnosi se na smanjenje afiniteta za odgovarajuću interakciju, kao što je mereno na primer SPR-om. Radi jasnoće, ovaj termin uključuje i smanjenje afiniteta na nulu (ili ispod granice detekcije analitičkog postupka), odnosno potpuno ukidanje interakcije. Nasuprot tome, „povećano vezivanje” odnosi se na povećanje afiniteta vezivanja za odgovarajuću interakciju.
"Aktivacija T ćelija", kako se ovde koristi, odnosi se na jedan ili više ćelijskih odgovora T limfocita, posebno citotoksičnog T limfocita, odabranih od: proliferacije, diferencijacije, sekrecije citokina, otpuštanja citotoksičnog efektorskog molekula, citotoksične aktivnosti i ekspresije aktivacionih markera. Bispecifični antigen vezujući molekuli koji aktiviraju T ćelije iz ovog pronalaska su sposobni da indukuju aktivaciju T ćelija. Odgovarajući testovi za merenje aktivacije T ćelija su poznati u struci koja je ovde opisana.
"Antigen ciljne ćelije", kako se ovde koristi, odnosi se na antigensku determinantu koja je predstavljena na površini ciljne ćelije, na primer, ćelija u tumoru, kao što je ćelija kancera ili ćelija tumorske strome. Konkretno, „antigen ciljne ćelije“ odnosi se na folatni receptor 1.
Termini „prvi” i „drugi” kad se koriste ovde u vezi sa antigen vezujućim delovima, itd., koriste se radi pravljenja razlike kada postoji više od jedne vrste svakog dela. Upotreba ovih pojmova nije namenjena da dodeli određeni redosled ili orijentaciju bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije, osim ako se to eksplicitno ne tvrdi.
Termin "epitop" uključuje bilo koju determinantu polipeptida koja ima sposobnost za specifično vezivanje za antitelo. U određenim otelotvorenjima, determinanta epitopa obuhvata hemijski aktivna površinska grupisanja molekula kao što su aminokiseline, bočni lanci šećera, fosforil ili sulfonil, i, u određenim otelotvorenjima, mogu da imaju posebne trodimenzionalne strukturne karakteristike, i/ili posebne karakteristike naelektrisanja. Epitop je oblast antigena koja je vezana antitelom.
Kako se ovde koristi, izraz „antigenska determinanta” je sinonim za „antigen” i „epitop”, i odnosi se na mesto (npr. susedni deo aminokiselina ili konformaciona konfiguracija sastavljena od različitih regiona nesusednih aminokiselina) na polipeptidnom makromolekulu za koji se vezuje antigen vezujući deo, formirajući antigen vezujući kompleks deo-antigen. Korisne antigenske determinante mogu se naći, na primer, na površinama tumorskih ćelija, na površinama ćelija inficiranih virusom, na površinama drugih obolelih ćelija, na površini imunih ćelija, slobodne u serumu u krvi i/ili u ekstracelularnoj matrici (ECM). Proteini koji se ovde navode kao antigeni, npr. FolR1 i CD3, mogu biti svi nativni oblici proteina koji potiču od bilo kog kičmenjaka, uključujući sisare, kao što su primati (npr. ljudi) i glodari (npr. miševi i pacovi), ako nije drugačije naznačeno. U konkretnom otelotvorenju, antigen je humani protein. Kada se ovde pominje specifični protein, termin obuhvata neprerađen protein "pune dužine", kao i bilo koji oblik proteina koji je rezultat obrade u ćeliji. Termin takođe obuhvata prirodno postojeće varijante proteina, npr. splajsovane ili alelne varijante. Primeri humanih proteina koji su korisni kao antigeni uključuju, ali nisu ograničeni na: FolR1 (folatni receptor alfa (FRA); protein koji veže folate (FBP); humani FolR1 UniProt br.: P15328; mišji FolR1 UniProt br.: P35846; FolR1 cinomolgusa UniProt br.: G7PR14) i CD3, posebno epsilon podjedinica CD3 (vidi UniProt br. P07766 (verzija 130), NCBI RefSeq br. NP_000724.1, SEQ ID NO: 150 za humanu sekvencu; ili UniProt br. Q95LI5 (verzija 49), NCBI GenBank br. BAB71849.1, za sekvencu cinomolgusa [Macaca fascicularis]). Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije iz ovog pronalaska vezuje se za epitop CD3 ili antigen ciljne ćelije koji je sačuvan između antigena CD3 ili antigena ciljne ćelije iz različitih vrsta. U određenim otelotvorenjima, ovde opisani bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije vezuje se za CD3 i FolR1, ali se ne vezuje za FolR2 (folatni receptor beta; FRB; humani FolR2 UniProt br.: P14207) ili FolR3 (folatni receptor gama; humani FolR3 UniProt br.: P41439).
Kako se ovde koristi, za termine „konstruisati, konstruisan, inženjering“ posebno sa prefiksom "gliko-", kao i izraz „glikozilacioni inženjering“, smatra se da obuhvataju bilo koju manipulaciju glikozilacionom šemom prirodno postojećeg ili rekombinantnog polipeptida ili njegovog fragmenta. Glikozilacioni inženjering obuhvata metabolički inženjering glikozilujućeg mehanizma ćelije, uključujući genetske manipulacije putevima sinteze oligosaharida radi postizanja izmenjene gilkozilacije glikoproteina eksprimiranih u ćelijama. Nadalje, glikozilacioni inženjering obuhvata efekte mutacija i ćelijskog okruženja na glikozilaciju. U jednom otelotvorenju, glikozilacioni inženjering je izmena aktivnosti glikoziltransferaze. U konkretnom otelotvorenju, inženjering dovodi do izmenjene aktivnosti glukozaminiltransferaze i/ili aktivnosti fukoziltransferaze.
II. KOMPOZICIJE I METODE
U jednom aspektu, pronalazak se zasniva na upotrebi terapijske kombinacije bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije, tj. bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije koji sadrži prvo antigen vezujuće mesto specifično za folatni receptor 1 (FolR1) i drugo antigen vezujuće mesto specifično za CD3, te antagonist vezivanja ose PD-1, npr. za lečenje raka. U nekim otelotvorenjima, terapijska kombinacija dodatno sadrži antagonist TIM3.
A. Kombinovane terapije bispecifičnim antigen vezujućim molekulom koji aktivira T ćelije i antagonistom vezivanja ose PD-1
U širem smislu, ovaj pronalazak se odnosi na bispecifične antigen vezujuće molekule koji aktiviraju T ćelije i njihovu upotrebu u kombinaciji sa antagonistima vezivanja ose PD-1. Prednost kombinacije u odnosu na monoterapiju je u tome što bispecifični antigen vezujući molekuli koji aktiviraju T ćelije korišćeni u ovom izumu omogućavaju preusmeravanje i aktivaciju T ćelija na ciljanu ćeliju, dok antagonist vezivanja ose PD-1 poboljšava funkciju T ćelija smanjenjem njihove iscrpljenosti.
U jednom aspektu, ovde je obezbeđena metoda za lečenje ili odlaganje napredovanja raka kod pojedinca, koja se sastoji od davanja pojedincu efikasne količine bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije, npr. FolR1-TCB i antagonista vezivanja ose PD-1. U nekim otelotvorenjima, tretman dovodi do produženog odgovora kod pojedinca nakon prestanka tretmana. Metode iz ovog pronalaska se mogu koristiti u lečenju stanja gde je poželjna povećana imunogenost, poput povećavanja tumorske imunogenosti kod lečenja raka. Mogu se lečiti različite vrste raka ili se njihovo napredovanje može odgoditi, uključujući, ali bez ograničenja, rak koji može sadržati mutaciju BRAF V600E, rak koji može sadržati BRAF divljeg tipa, rak koji može sadržati KRAS divljeg tipa, ili kancer koji može sadržati aktivacionu KRAS mutaciju.
U nekim otelotvorenjima, pojedinac ima rak endometrijuma. Rak endometrijuma može biti u ranoj ili kasnoj fazi. U nekim otelotvorenjima, pojedinac ima melanom. Melanom može biti u ranoj ili u kasnoj fazi. U nekim otelotvorenjima, pojedinac ima kolorektalni kancer. Kolorektalni kancer može biti u ranoj ili kasnoj fazi. U nekim otelotvorenjima, pojedinac ima rak pluća, npr. nesitnoćelijski rak pluća. Nesitnoćelijski rak pluća može biti u ranoj ili u kasnoj fazi. U nekim otelotvorenjima, pojedinac ima rak pankreasa. Rak pankreasa može biti u ranoj ili u kasnoj fazi. U nekim otelotvorenjima, pojedinac ima hematološki malignitet. Hematološki malignitet može biti u ranoj ili kasnoj fazi. U nekim otelotvorenjima, pojedinac ima rak jajnika. Rak jajnika može biti u ranoj ili u kasnoj fazi. U nekim otelotvorenjima, pojedinac ima rak dojke. Rak dojke može biti u ranoj ili u kasnoj fazi. U nekim otelotvorenjima, pojedinac ima karcinom bubrežnih ćelija. Karcinom bubrežnih ćelija može biti u ranoj ili u kasnoj fazi.
U nekim otelotvorenjima, pojedinac je sisar, kao što su domaće životinje (npr. krave, ovce, mačke, psi i konji), primati (npr. ljudi i nehumani primati, kao što su majmuni), zečevi i glodari (npr. miševi i pacovi). U nekim otelotvorenjima, lečeni pojedinac je čovek.
U jednom drugom aspektu, ovde je obezbeđena metoda za pojačavanje imunološke funkcije kod pojedinca koji ima rak, koja se sastoji od primene efikasne količine bispecifičnih antigen vezujućih molekula koji aktiviraju T ćelije, konkretno, FolR1-TCB i antagonista vezivanja ose PD-1.
U nekim otelotvorenjima, T ćelije kod pojedinca imaju poboljšan prajming, aktivaciju, proliferaciju i/ili efektorsku funkciju u odnosu na stanje pre davanja bispecifičnih antigen vezujućih molekula koji aktiviraju T ćelije i antagonista vezivanja PD-1 puta. U nekim otelotvorenjima, efektorska funkcija T ćelija je sekrecija najmanje jednog od IL-2, IFN-γ i TNF-α. U jednom otelotvorenju, davanje FolR1-TCB i anti-PDL1 antitela dovodi do povećane T ćelijske sekrecije IL-2, IFN-γ i TNF-α. U nekim otelotvorenjima, T ćelija je CD8<+>T ćelija.
U nekim otelotvorenjima, prajmovanje T ćelija karakteriše povećana ekspresija CD44 i/ili pojačana citolitička aktivnost u CD8 T ćelijama. U nekim otelotvorenjima, aktivaciju CD8 T ćelija karakteriše povećana učestalost γ-IFT^T CD8 T ćelija. U nekim otelotvorenjima, CD8 T ćelija je antigen specifična T ćelija. U nekim otelotvorenjima, inhibirana je imunološka evazija signaliziranjem kroz površinsku ekspresiju PD-L1. U nekim otelotvorenjima, rak ima povišene nivoe T ćelijske infiltracije.
U nekim otelotvorenjima, kombinovana terapija ovog pronalaska se sastoji od davanja FolR1-TCB i antagonista vezivanja ose PD-1. FolR1-TCB i antagonist vezivanja ose PD-1 mogu se davati na bilo koji prikladan način poznat u struci. Na primer, FolR1-TCB i antagonist vezivanja ose PD-1 mogu se primenjivati jedan za drugiim (u različito vreme) ili zajedno (istovremeno). U nekim otelotvorenjima, FolR1-TCB se daje kontinuirano. U nekim otelotvorenjima, FolR1-TCB se daje sa prekidima. U nekim otelotvorenjima, FolR1-TCB se daje pre davanja antagonista vezivanja ose PD-1. U nekim otelotvorenjima, FolR1-TCB se daje istovremeno sa primenom antagonista vezivanja ose PD-1. U nekim otelotvorenjima, FolR1-TCB se daje nakon primene antagonista vezivanja ose PD-1.
U nekim otelotvorenjima, data je metoda za lečenje ili odlaganje napredovanja raka kod pojedinca, koja se sastoji od davanja pojedincu efikasne količine bispecifičnih antigen vezujućih molekula koji aktiviraju T ćelije, npr. FolR1-TCB, i antagonista vezivanja ose PD-1, i koja pored toga podrazumeva primenu dodatne terapije. Konkretno, razmatrano je otelotvorenje u kome se dodatna terapija sastoji od TIM-3 antagonista. Prema tome, u jednom aspektu, ovde se obezbeđuje metoda za lečenje ili odlaganje napredovanja raka kod pojedinca, koja se sastoji od davanja pojedincu efikasne količine bispecifičnih antigen vezujućih molekula koji aktiviraju T ćelije, konkretno, FolR1-TCB, antagonista vezivanja ose PD-1 i TIM-3 antagonista. Može se koristiti bilo koji TIM3 antagonist, npr. oni koji su ovde opisani. Dodatna terapija može biti radioterapija, hirurški zahvat (npr. lumpektomija i mastektomija), hemoterapija, genska terapija, DNK terapija, virusna terapija, RNK terapija, imunoterapija, transplantacija koštane srži, nanoterapija, terapija monoklonskim antitelima, ili kombinacija prethodno navedenih. Dodatna terapija može biti u obliku adjuvantne ili neoadjuvantne terapije. U nekim otelotvorenjima, dodatna terapija se sastoji od davanja enzimskog inhibitora malog molekula ili antimetastatskog agensa. U nekim otelotvorenjima, dodatna terapija se sastoji od davanja agensa za ograničavanje neželjenih dejstava (npr. agensi namenjeni za smanjivanje pojave i/ili težine neželjenih dejstava lečenja, kao što su agensi protiv mučnine, itd.). U nekim otelotvorenjima, dodatna terapija je radioterapija. U nekim otelotvorenjima, dodatna terapija je hirurški zahvat. U nekim otelotvorenjima, dodatna terapija je kombinacija radioterapije i hirurškog zahvata. U nekim otelotvorenjima predmetnog pronalaska, dodatna terapija je gama zračenje. U nekim otelotvorenjima, dodatna terapija je terapija koja cilja put P13K/AT/mTOR, inhibitor HSP90, inhibitor tubulina, inhibitor apoptoze i/ili hemopreventivni agens. Dodatna terapija može biti jedan ili više hemoterapeutskih agensa opisanih ranije.
Bispecifični antigen vezujući molekuli koji aktiviraju T ćelije, npr. FolR1-TCB, i antagonist vezivanja ose PD-1 mogu se davati istim načinom primene ili različitim načinima primene. U nekim otelotvorenjima, bispecifični antigen vezujući molekuli koji aktiviraju T ćelije, npr. FolR1-TCB, daju se intravenski, intramuskularno, supkutano, lokalno, oralno, transdermalno, intraperitonealno, intraorbitalno, implantacijom, inhalacijom, intratekalno, intraventrikularno ili intranazalno. U nekim otelotvorenjima, antagonist vezanja ose PD-1 daje se intravenski, intramuskularno, supkutano, lokalno, oralno, transdermalno, intraperitonealno, intraorbitalno, implantacijom, inhalacijom, intratekalno, intraventrikularno ili intranazalno. Efikasna količina bispecifičnih antigen vezujućih molekula koji aktiviraju T ćelije i antagonista vezivanja ose PD-1 može se davati za prevenciju ili za lečenje bolesti. Odgovarajuća doza bispecifičnih antigen vezujućih molekula koji aktiviraju T ćelije i/ili antagonista vezanja ose PD-1 može se odrediti na osnovu vrste bolesti koja se leči, tipa bispecifičnih antigen vezujućih molekula koji aktiviraju T ćelije i antagonista vezivanja ose PD-1, težine i toka bolesti, kliničkog stanja pojedinca, kliničke istorije i odgovora na lečenje te na osnovu diskrecione procene lekara koji leči pojedinca.
U ovim metodama se može koristiti bilo koji od bispecifičnih antigen vezujućih molekula koji aktiviraju T ćelije, antagonista vezivanja ose PD-1 i TIM-3 antagonista, poznatih u struci ili opisanih u nastavku.
U još jednom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje farmaceutski preparat koji sadrži bispecifične antigen vezujuće molekule koji aktiviraju T ćelije, kao što je ovde opisano, antagonist vezivanja PD-1 ose kako je ovde opisano, te farmaceutski prihvatljiv nosač. U nekim otelotvorenjima, farmaceutski preparat dalje sadrži TIM3 antagonist.
U još jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje komplet koji sadrži bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije specifičan za folatni receptor 1 (FolR1) i CD3, i uputstvo za upotrebu bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije sa antagonistom vezivanja ose PD-1 za lečenje ili odlaganje napredovanja raka kod pojedinca. U nekim otelotvorenjima, komplet dodatno sadrži uputstvo za upotrebu bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije sa TIM3 antagonistom. U još jednom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje komplet koji sadrži bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije specifičan za folatni receptor 1 (FolR1) i CD3, i antagonist vezivanja ose PD-1, i uputstvo za upotrebu bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije i antagonista vezivanja ose PD-1 za lečenje ili odlaganje napredovanja raka kod pojedinca. U jednom otelotvorenju, komplet dodatno sadrži TIM3 antagonist. U jednom od otelotvorenja, antagonist vezivanja ose PD-1 je anti-PD-1 antitelo ili anti-PDL1 antitelo. U jednom otelotvorenju, antagonist vezivanja ose PD-1 je anti-PD-1 imunoadhezin.
U dodatnom aspektu, pronalazak obezbeđuje komplet koji sadrži:
(i) prvo pakovanje koje sadrži kompoziciju koja se sastoji od bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije specifičnog za folatni receptor 1 (FolR1) i CD3, kako je ovde opisano; i
(ii) drugo pakovanje koje sadrži preparat koji se sastoji od antagonista vezivanja ose PD-1.
U dodatnom aspektu, pronalazak obezbeđuje komplet koji sadrži:
(i) jedno pakovanje koje sadrži preparat koji se sastoji od bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije specifičnog za folatni receptor 1 (FolR1) i CD3, kako je ovde opisano;
(ii) drugo pakovanje koje sadrži preparat koji se sastoji od antagonista vezivanja ose PD-1; i
(iii) treće pakovanje koje sadrži preparat koji se sastoji od TIM3 antagonista.
B. Primer bispecifičnog antigen vezujućeg molekula za upotrebu prema ovom pronalasku
Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije je bispecifičan, tj. sadrži najmanje dva antigen vezujuća dela sposobna za specifično vezivanje za dve različite antigenske determinante, tj. CD3 i FolR1. Prema ovom pronalasku, antigen vezujući delovi su Fab molekuli (tj. antigen vezujući domeni sastavljeni od teškog i lakog lanca, od kojih svaki sadrži varijabilni i konstantni region). U jednom otelotvorenju, ovi Fab molekuli su humani. U drugom otelotvorenju, navedeni Fab molekuli su humanizovani. U još jednom otelotvorenju, navedeni Fab molekuli sadrže konstantne regione humanih teških i lakih lanaca.
Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije prema ovom pronalasku sposoban je da se istovremeno vezuje za antigen ciljne ćelije FolR1 i CD3. U jednom otelotvorenju, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije je sposoban za unakrsno povezivanje T ćelije i ciljne ćelije koja eksprimira FolR1 simultanim vezivanjem za FolR1 i CD3 antigena ciljne ćelije. U još konkretnijem otelotvorenju, takvo simultano vezivanje dovodi do lize ciljne ćelije koja eksprimira FolR1, konkretno tumorske ćelije koja eksprimira FolR1. U jednom otelotvorenju, takvo simultano vezivanje dovodi do aktivacije T ćelije. U drugim otelotvorenjima, takvo simultano vezivanje dovodi do ćelijskog odgovora T limfocita, konkretno citotoksičnog T limfocita, odgovora izabranog iz sledeće grupe: proliferacija, diferencijacija, sekrecija citokina, otpuštanje citotoksičnog efektorskog molekula, citotoksična aktivnost i ekspresija aktivacionih markera. U jednom otelotvorenju, vezivanje bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije za CD3, bez istovremenog vezivanja za antigen FolR1 ciljnih ćelija, ne dovodi do aktivacije T ćelija.
U jednom otelotvorenju, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije je sposoban da preusmeri citotoksičnu aktivnost T ćelije na ciljnu ćeliju koja eksprimira FolR1. U određenom otelotvorenju, pomenuto preusmeravanje je nezavisno od prezentacije peptidnog antigena posredstvom MHC od strane ciljne ćelije i/ili specifičnosti T ćelije.
Konkretno, prema nekim otelotvorenjima ovog pronalaska, T ćelija je citotoksična T ćelija. U nekim otelotvorenjima, T ćelija je CD4<+>ili CD8<+>T ćelija, konkretno CD8<+>T ćelija.
Ovde opisani bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije iz pronalaska sadrži najmanje jedan antigen vezujući deo sposoban da se vezuje za CD3 (ovde se naziva i "CD3 antigen vezujući deo" ili "prvi antigen vezujući deo"). U posebnom otelotvorenju, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije sadrži ne više od jednog antigen vezujućeg dela sposobnog za specifično vezivanje za CD3. U jednom otelotvorenju, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije obezbeđuje jednovalentno vezivanje za CD3. U posebnom otelotvorenju, CD3 je humani CD3 ili CD3 cinomolgusa, konkretno humani CD3. U jednom posebnom otelotvorenju, CD3 antigen vezujući deo je unakrsno reaktivan za (tj. specifično se vezuje za) CD3 čoveka i cinomolgusa. U nekim otelotvorenjima, prvi antigen vezujući deo je sposoban za specifično vezivanje za epsilon podjedinicu CD3 (vidi UniProt br. P07766 (verzija 130), NCBI RefSeq br. NP_000724.1, SEQ ID NO:150 za humanu sekvencu; ili UniProt br. Q95LI5 (verzija 49), NCBI GenBank br. BAB71849.1, za sekvencu cinomolgusa [Macaca fascicularis]).
U nekim otelotvorenjima, CD3 antigen vezujući deo sadrži najmanje jedan region koji određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca odabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 i SEQ ID NO: 39, i najmanje jedan CDR lakog lanca odabran iz grupe koja obuhvata SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34.
U jednom otelotvorenju, antigen vezujući deo CD3 sadrži CDR1 teškog lanca SEQ ID NO: 37, CDR2 teškog lanca SEQ ID NO: 38, CDR3 teškog lanca SEQ ID NO: 39, CDR1 lakog lanca SEQ ID NO: 32, CDR2 lakog lanca SEQ ID NO: 33, i CDR3 lakog lanca SEQ ID NO:34.
U jednom otelotvorenju, antigen vezujući deo CD3 sadrži varijabilni teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu: SEQ ID NO: 36, i varijabilni laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu: SEQ ID NO: 31.
U jednom otelotvorenju, antigen vezujući deo CD3 sadrži sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci SEQ ID NO: 36, i sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci SEQ ID NO: 31.
Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije iz ovog pronalaska sadrži najmanje jedan antigen vezujući deo sposoban da se vezuje za antigen FolR1 ciljne ćelije (ovde se naziva i "FolR1 vezujući deo" ili "drugi" ili "treći" antigen vezujući deo). U jednom otelotvorenju, antigen vezujući deo sposoban da se veže za antigen FolR1 ciljne ćelije ne vezuje se za FolR2 ili FolR3. U posebnom otelotvorenju, FolR1 antigen vezujući deo je unakrsno reaktivan za (tj. specifično se vezuje za) FolR1 čoveka i cinomolgusa. U određenim otelotvorenjima, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije sadrži dva antigen vezujuća dela sposobna da se vezuju za antigen FolR1 ciljne ćelije. U jednom takvom konkretnom otelotvorenju, svaki od ovih antigen vezujućih delova specifično se vezuje za istu antigensku determinantu. U još jednom konkretnom otelotvorenju, svi ovi antigen vezujući delovi su identični. U jednom otelotvorenju, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije sadrži ne više od dva antigen vezujuća ostatka sposobna da se vezuju za FolR1.
FolR1 vezujući deo uglavnom je Fab molekul koji se specifično vezuje za FolR1 i sposoban je da usmeri bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije sa kojim je povezan za ciljno mesto, na primer za određenu vrstu tumorske ćelije koja eksprimira FolR1. U jednom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije koji sadrži
(i) prvi antigen vezujući deo, a to je Fab molekul sposoban za specifično vezivanje za CD3, i koji sadrži najmanje jedan region koji određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca odabran iz grupe koja sadrži SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 i SEQ ID NO: 39, i najmanje jedan CDR lakog lanca odabran iz grupe koja obuhvata SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34; i
(ii) drugi antigen vezujući deo koji je molekul Fab sposoban da se specifično vezuje za folatni receptor 1 (FolR1).
U jednom otelotvorenju, prvi antigen vezujući deo, koji je Fab molekul sposoban za specifično vezivanje za CD3, sadrži varijabilni teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 36, i varijabilni laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 31.
U jednom otelotvorenju, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije dodatno sadrži
(iii) drugi antigen vezujući deo koji je Fab molekul sposoban da se specifično vezuje za FolR1.
U jednom takvom otelotvorenju, drugi i treći antigen vezujući deo sposobni za specifično vezivanje za FolR1 sadrže identične sekvence regiona koji određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca i CDR lakog lanca. U jednom takvom otelotvorenju, treći antigen vezujući deo je identičan drugom antigen vezujućem delu.
U jednom otelotvorenju, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije iz bilo kog od prethodnih otelotvorenja dodatno sadrži Fc domen sastavljen od prve i druge podjedinice sposobne za stabilno povezivanje.
U jednom otelotvorenju, prvi antigen vezujući deo i drugi antigen vezujući deo su spojeni svaki na C-terminalnom kraju teškog lanca Fab za N-terminalni kraj prve ili druge podjedinice Fc domena.
U jednom otelotvorenju, treći antigen vezujući deo je spojen na C-terminalnom kraju teškog lanca Fab sa N-terminalnim krajem teškog lanca Fab prvog antigen vezujućeg dela, opciono putem peptidnog linkera.
U još jednom konkretnom otelotvorenju, ne više od jednog antigen vezujućeg dela, sposobnog za specifično vezivanje za CD3, prisutno je u bispecifičnom antigen vezujućem molekulu koji aktivira T ćelije (tj. bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije omogućava jednovalentno vezivanje za CD3).
Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije sa zajedničkim lakim lancem
Autori ovog pronalaska su generisali bispecifično antitelo u kome vezujući delovi poseduju zajednički laki lanac koji zadržava specifičnost i efikasnost matičnog monospecifičnog antitela za CD3 i može vezati drugi antigen (npr. FolR1) koristeći isti laki lanac. Generisanje bispecifičnog molekula sa zajedničkim lakim lancem koji zadržava svojstva vezivanja matičnog antitela nije jednostavno, jer zajednički CDR hibridnog lakog lanca moraju ostvariti specifičnost vezivanja za oba cilja. U jednom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije koji sadrži prvi i drugi antigen vezujući deo, od kojih je jedan Fab molekul sposoban za specifično vezivanje za CD3, a drugi je Fab molekul sposoban za specifično vezivanje za FolR1, pri čemu prvi i drugi Fab molekul imaju identične VLCL lake lance. U jednom otelotvorenju, navedeni identični laki lanac (VLCL) sadrži CDR lakog lanca SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 i SEQ ID NO: 34. U jednom otelotvorenju, navedeni identični laki lanac (VLCL) sadrži SEQ ID NO.35.
U jednom otelotvorenju, predmetni pronalazak obezbeđuje bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije koji sadrži
(i) prvi antigen vezujući deo, koji je Fab molekul sposoban za specifično vezivanje za CD3, i koji sadrži najmanje jedan region koji određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca odabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 i SEQ ID NO: 39, i najmanje jedan CDR lakog lanca odabran iz grupe koja obuhvata SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34;
(ii) drugi antigen vezujući deo, koji je Fab molekul sposoban za specifično vezivanje za folatni receptor 1 (FolR1) i koji sadrži najmanje jedan region koji određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca, odabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 i SEQ ID NO: 18, i najmanje jedan CDR lakog lanca odabran iz grupe koja obuhvata SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34.
U jednom takvom otelotvorenju, CD3 antigen vezujući deo sadrži CDR1 teškog lanca SEQ ID NO: 37, CDR2 teškog lanca SEQ ID NO: 38, CDR3 teškog lanca SEQ ID NO: 39, CDR1 lakog lanca SEQ ID NO: 32, CDR2 lakog lanca SEQ ID NO: 33, i CDR3 lakog lanca SEQ ID NO: 34, a FolR1 antigen vezujući deo sadrži CDR1 teškog lanca SEQ ID NO: 16, CDR2 teškog lanca SEQ ID NO: 17, CDR3 teškog lanca SEQ ID NO: 18, CDR1 lakog lanca SEQ ID NO: 32, CDR2 lakog lanca SEQ ID NO: 33, i CDR3 lakog lanca SEQ ID NO:34.
U jednom otelotvorenju, predmetni pronalazak obezbeđuje bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije koji sadrži
(i) prvi antigen vezujući deo, a to je Fab molekul sposoban za specifično vezivanje za CD3 koji sadrži varijabilni teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 36, i varijabilni laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 31.
(ii) drugi antigen vezujući deo, a to je Fab molekul sposoban za specifično vezivanje za folatni receptor 1 (FolR1) koji sadrži varijabilni teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 15, i varijabilni laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 31.
U još jednom otelotvorenju, antigen vezujući deo specifičan za FolR1 sadrži sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci SEQ ID NO: 15, i sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci SEQ ID NO: 31, ili njihove varijante koje zadržavaju funkcionalnost.
U jednom otelotvorenju, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije sadrži polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci SEQ ID NO: 36, polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci SEQ ID NO: 15, i polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci SEQ ID NO: 31.
U jednom otelotvorenju, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije dodatno sadrži
(iii) treći antigen vezujući deo (koji je Fab molekul) sposoban da se specifično vezuje za FolR1.
U jednom takvom otelotvorenju, drugi i treći antigen vezujući deo sposobni za specifično vezivanje za FolR1 sadrže identične sekvence regiona koji određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca i CDR lakog lanca. U jednom takvom otelotvorenju, treći antigen vezujući deo je identičan drugom antigen vezujućem delu.
Tako u jednom otelotvorenju, predmetni pronalazak obezbeđuje bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije koji sadrži
(i) prvi antigen vezujući deo, koji je Fab molekul sposoban za specifično vezivanje za CD3, i koji sadrži najmanje jedan region koji određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca odabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 i SEQ ID NO: 39, i najmanje jedan CDR lakog lanca odabran iz grupe koja obuhvata SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34;
(ii) drugi antigen vezujući deo, koji je Fab molekul sposoban za specifično vezivanje za folatni receptor 1 (FolR1) i koji sadrži najmanje jedan region koji određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca, odabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 i SEQ ID NO: 18, i najmanje jedan CDR lakog lanca odabran iz grupe koja obuhvata SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34;
(iii) treći antigen vezujući deo, a to je Fab molekul sposoban za specifično vezivanje za folatni receptor 1 (FolR1), i koji sadrži najmanje jedan region koji određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca, odabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 i SEQ ID NO: 18, i najmanje jedan CDR lakog lanca odabran iz grupe koja obuhvata SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34.
U jednom takvom otelotvorenju, CD3 antigen vezujući deo sadrži CDR1 teškog lanca SEQ ID NO: 37, CDR2 teškog lanca SEQ ID NO: 38, CDR3 teškog lanca SEQ ID NO: 39, CDR1 lakog lanca SEQ ID NO: 32, CDR2 lakog lanca SEQ ID NO: 33, i CDR3 lakog lanca SEQ ID NO: 34, a FolR1 antigen vezujući deo sadrži CDR1 teškog lanca SEQ ID NO: 16, CDR2 teškog lanca SEQ ID NO: 17, CDR3 teškog lanca SEQ ID NO: 18, CDR1 lakog lanca SEQ ID NO: 32, CDR2 lakog lanca SEQ ID NO: 33, i CDR3 lakog lanca SEQ ID NO:34.
U jednom otelotvorenju, predmetni pronalazak obezbeđuje bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije koji sadrži
(i) prvi antigen vezujući deo, a to je Fab molekul sposoban za specifično vezivanje za CD3 koji sadrži varijabilni teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 36, i varijabilni laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 31.
(ii) drugi antigen vezujući deo, a to je Fab molekul sposoban za specifično vezivanje za folatni receptor 1 (FolR1) koji sadrži varijabilni teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 15, i varijabilni laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 31.
(iii) treći antigen vezujući deo, a to je Fab molekul sposoban za specifično vezivanje za folatni receptor 1 (FolR1) koji sadrži varijabilni teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 15, i varijabilni laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 31.
U jednom otelotvorenju, predmetni pronalazak obezbeđuje bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije koji sadrži
(i) prvi antigen vezujući deo, koji je Fab molekul sposoban za specifično vezivanje za CD3, i koji sadrži najmanje jedan region koji određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca odabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 i SEQ ID NO: 39, i najmanje jedan CDR lakog lanca odabran iz grupe koja obuhvata SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34;
(ii) drugi antigen vezujući deo, koji je Fab molekul sposoban za specifično vezivanje za folatni receptor 1 (FolR1) i koji sadrži najmanje jedan region koji određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca, odabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO:402 i SEQ ID NO:400, i najmanje jedan CDR lakog lanca odabran iz grupe koja obuhvata SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34.
U jednom takvom otelotvorenju, CD3 antigen vezujući deo sadrži CDR1 teškog lanca SEQ ID NO: 37, CDR2 teškog lanca SEQ ID NO: 38, CDR3 teškog lanca SEQ ID NO: 39, CDR1 lakog lanca SEQ ID NO: 32, CDR2 lakog lanca SEQ ID NO: 33, i CDR3 lakog lanca SEQ ID NO: 34, a FolR1 antigen vezujući deo sadrži CDR1 teškog lanca SEQ ID NO: 16, CDR2 teškog lanca SEQ ID NO: 402, CDR3 teškog lanca SEQ ID NO: 400, CDR1 lakog lanca SEQ ID NO: 32, CDR2 lakog lanca SEQ ID NO: 33, i CDR3 lakog lanca SEQ ID NO:34.
U jednom otelotvorenju, predmetni pronalazak obezbeđuje bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije koji sadrži
(i) prvi antigen vezujući deo, a to je Fab molekul sposoban za specifično vezivanje za CD3 koji sadrži varijabilni teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 36, i varijabilni laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 31.
(ii) drugi antigen vezujući deo, a to je Fab molekul sposoban za specifično vezivanje za folatni receptor 1 (FolR1), koji sadrži varijabilni teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 401 i varijabilni laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 31.
U dodatnom otelotvorenju, antigen vezujući deo koji je specifičan za FolR1 sadrži sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci SEQ ID NO:401, i sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci SEQ ID NO: 31, ili njihove varijante koje zadržavaju funkcionalnost.
U jednom otelotvorenju, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije sadrži polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci SEQ ID NO: 36, polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci SEQ ID NO:401, i polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci SEQ ID NO: 31.
U jednom otelotvorenju, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije dodatno sadrži
(iii) treći antigen vezujući deo (koji je Fab molekul) sposoban da se specifično vezuje za FolR1.
U jednom takvom otelotvorenju, drugi i treći antigen vezujući deo sposobni za specifično vezivanje za FolR1 sadrže identične sekvence regiona koji određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca i CDR lakog lanca. U jednom takvom otelotvorenju, treći antigen vezujući deo je identičan drugom antigen vezujućem delu.
Tako u jednom otelotvorenju, predmetni pronalazak obezbeđuje bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije koji sadrži
(i) prvi antigen vezujući deo, koji je Fab molekul sposoban za specifično vezivanje za CD3, i koji sadrži najmanje jedan region koji određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca odabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 i SEQ ID NO: 39, i najmanje jedan CDR lakog lanca odabran iz grupe koja obuhvata SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34;
(ii) drugi antigen vezujući ostatak koji je molekul Fab sposoban da se specifično vezuje za folatni receptor 1 (FolR1), i koji sadrži najmanje jedan region koji određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca izabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 402 i SEQ ID NO: 400, i najmanje jedan CDR lakog lanca izabran iz grupe od SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34.
(iii) treći antigen vezujući deo, a to je Fab molekul sposoban za specifično vezivanje za folatni receptor 1 (FolR1), i koji sadrži najmanje jedan region koji određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca, odabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO:402 i SEQ ID NO:400, i najmanje jedan CDR lakog lanca odabran iz grupe koja obuhvata SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34.
U jednom takvom otelotvorenju, CD3 antigen vezujući deo sadrži CDR1 teškog lanca SEQ ID NO: 37, CDR2 teškog lanca SEQ ID NO: 38, CDR3 teškog lanca SEQ ID NO: 39, CDR1 lakog lanca SEQ ID NO: 32, CDR2 lakog lanca SEQ ID NO: 33, i CDR3 lakog lanca SEQ ID NO: 34, a FolR1 antigen vezujući deo sadrži CDR1 teškog lanca SEQ ID NO: 16, CDR2 teškog lanca SEQ ID NO: 402, CDR3 teškog lanca SEQ ID NO: 400, CDR1 lakog lanca SEQ ID NO: 32, CDR2 lakog lanca SEQ ID NO: 33, i CDR3 lakog lanca SEQ ID NO:34.
U jednom otelotvorenju, predmetni pronalazak obezbeđuje bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije koji sadrži
(i) prvi antigen vezujući deo, a to je Fab molekul sposoban za specifično vezivanje za CD3 koji sadrži varijabilni teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 36, i varijabilni laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 31.
(ii) drugi antigen vezujući deo, a to je Fab molekul sposoban za specifično vezivanje za folatni receptor 1 (FolR1), koji sadrži varijabilni teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 401 i varijabilni laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 31.
(iii) treći antigen vezujući deo, a to je Fab molekul sposoban za specifično vezivanje za folatni receptor 1 (FolR1), koji sadrži varijabilni teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 401 i varijabilni laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 31.
Tako se u jednom otelotvorenju ovaj pronalazak odnosi na bispecifične molekule u kojima najmanje dva vezujuća dela imaju identične lake lance i odgovarajuće preoblikovane teške lance koji obezbeđuju sposobnost za specifično vezivanje na antigen CD3 koji aktivira T ćelije, odnosno antigen FolR1 ciljne ćelije. Upotreba ovog takozvanog principa 'zajedničkog lakog lanca', tj. kombinovanje dva vezivača koja imaju zajednički laki lanac, ali i dalje imaju zasebne specifičnosti, sprečava pogrešno uparivanje lakog lanca. Stoga tokom proizvodnje nastaje manje nusproizvoda, što olakšava homogenu pripremu bispecifičnih antigen vezujućih molekula koji aktiviraju T ćelije.
Komponente bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije mogu biti spojene jedne sa drugim u različitim konfiguracijama. Primeri konfiguracija prikazani su na slikama 1A-I i dodatno su opisani u nastavku.
U nekim otelotvorenjima, pomenuti bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije dalje sadrži Fc domen sastavljen od prve i druge podjedinice sposobne za stabilno vezivanje. Ispod su opisani primeri otelotvorenja za bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije a koji sadrže Fc domen.
Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije sa ukrštenim Fab fragmentom
Autori ovog pronalaska su stvorili i drugi format bispecifičnog antitela u kome je jedan od vezujućih delova ukršteni Fab fragment. U jednom aspektu pronalaska, obezbeđeno je jednovalentno bispecifično antitelo, pri čemu je jedan od Fab fragmenata molekula IgG zamenjen ukrštenim Fab fragmentom. Ukršteni Fab fragmenti su Fab fragmenti u kojima su ili varijabilni ili konstantni regioni teškog i lakog lanca razmenjeni. Formati bispecifičnih antitela koji sadrže ukrštene Fab fragmente opisani su, na primer, u WO2009080252, WO2009080253, WO2009080251, WO2009080254, WO2010/136172, WO2010/145792 i WO2013/026831. U konkretnom otelotvorenju, prvi antigen vezujući deo je ukršteni Fab molekul u kome su razmenjeni varijabilni ili konstantni regioni lakog lanca Fab i teškog lanca Fab. Takva modifikacija smanjuje pogrešno sparivanje teških i lakih lanaca iz različitih Fab molekula, čime se poboljšava prinos i čistoća bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije iz pronalaska u rekombinantnoj proizvodnji. U određenom ukrštenom Fab molekulu koji je koristan za ovde opisani bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije, razmenjeni su konstantni regioni lakog lanca Fab i teškog lanca Fab. U drugom ukrštenom Fab molekulu koji je koristan za ovde opisani bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije, razmenjeni su varijabilni regioni lakog lanca Fab i teškog lanca Fab.
U jednom otelotvorenju, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije sadrži
(i) prvi antigen vezujući deo, a to je ukršteni Fab molekul sposoban za specifično vezivanje za CD3, koji sadrži najmanje jedan region koji određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca odabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 i SEQ ID NO: 39, i najmanje jedan CDR lakog lanca odabran iz grupe koja obuhvata SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34;
(ii) drugi antigen vezujući deo sposoban za specifično vezivanje za folatni receptor 1 (FolR1) koji sadrži najmanje jedan region koji određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca odabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 56 i SEQ ID NO: 57, i najmanje jedan CDR lakog lanca odabran iz grupe koja obuhvata SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 65.
U jednom takvom otelotvorenju, CD3 antigen vezujući deo sadrži CDR1 teškog lanca SEQ ID NO: 37, CDR2 teškog lanca SEQ ID NO: 38, CDR3 teškog lanca SEQ ID NO: 39, CDR1 lakog lanca SEQ ID NO: 32, CDR2 lakog lanca SEQ ID NO: 33, i CDR3 lakog lanca SEQ ID NO: 34, a FolR1 antigen vezujući deo sadrži CDR1 teškog lanca SEQ ID NO: 8, CDR2 teškog lanca SEQ ID NO: 56, CDR3 teškog lanca SEQ ID NO: 57, CDR1 lakog lanca SEQ ID NO: 59, CDR2 lakog lanca SEQ ID NO: 60, i CDR3 lakog lanca SEQ ID NO:65.
U jednom otelotvorenju, drugi antigen vezujući deo je konvencionalni Fab molekul. U jednom otelotvorenju, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije sadrži
(i) prvi antigen vezujući deo koji je ukršteni Fab molekul sposoban za specifično vezivanje za CD3 koji sadrži varijabilni teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 36, i varijabilni laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 31.
(ii) drugi antigen vezujući deo, a to je Fab molekul sposoban za specifično vezivanje za folatni receptor 1 (FolR1) koji sadrži varijabilni teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 55, i varijabilni laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 64.
U jednom otelotvorenju, drugi antigen vezujući deo je konvencionalni Fab molekul. U dodatnom otelotvorenju, antigen vezujući deo koji je specifičan za FolR1 sadrži sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci SEQ ID NO:55, i sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci SEQ ID NO: 64, ili njihove varijante koje zadržavaju funkcionalnost.
U jednom otelotvorenju, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije sadrži polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci SEQ ID NO: 36, polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci SEQ ID NO: 31, polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci SEQ ID NO:55, i polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci SEQ ID NO: 64.
U jednom otelotvorenju, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije dodatno sadrži
(iii) treći antigen vezujući deo sposoban za specifično vezivanje za FolR1.
U jednom otelotvorenju, treći antigen vezujući deo je konvencionalni Fab molekul. U jednom otelotvorenju, treći antigen vezujući deo je ukršteni Fab molekul.
U jednom takvom otelotvorenju, drugi i treći antigen vezujući deo sposobni za specifično vezivanje za FolR1 sadrže identične sekvence regiona koji određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca i CDR lakog lanca. U jednom takvom otelotvorenju, treći antigen vezujući deo je identičan drugom antigen vezujućem delu.
U jednom otelotvorenju, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije sadrži
(i) prvi antigen vezujući deo, a to je ukršteni Fab molekul sposoban za specifično vezivanje za CD3, koji sadrži najmanje jedan region koji određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca odabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 i SEQ ID NO: 39, i najmanje jedan CDR lakog lanca odabran iz grupe koja obuhvata SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34;
(ii) drugi antigen vezujući deo sposoban za specifično vezivanje za folatni receptor 1 (FolR1) koji sadrži najmanje jedan region koji određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca odabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 56 i SEQ ID NO: 57, i najmanje jedan CDR lakog lanca odabran iz grupe koja obuhvata SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 65.
(iii) treći antigen vezujući deo sposoban za specifično vezivanje za folatni receptor 1 (FolR1) koji sadrži najmanje jedan region koji određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca odabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 56 i SEQ ID NO: 57, i najmanje jedan CDR lakog lanca odabran iz grupe koja obuhvata SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 65.
U jednom takvom otelotvorenju, CD3 antigen vezujući deo sadrži CDR1 teškog lanca SEQ ID NO: 37, CDR2 teškog lanca SEQ ID NO: 38, CDR3 teškog lanca SEQ ID NO: 39, CDR1 lakog lanca SEQ ID NO: 32, CDR2 lakog lanca SEQ ID NO: 33, i CDR3 lakog lanca SEQ ID NO: 34, a FolR1 antigen vezujući deo sadrži CDR1 teškog lanca SEQ ID NO: 8, CDR2 teškog lanca SEQ ID NO: 56, CDR3 teškog lanca SEQ ID NO: 57, CDR1 lakog lanca SEQ ID NO: 59, CDR2 lakog lanca SEQ ID NO: 60, i CDR3 lakog lanca SEQ ID NO:65.
U jednom otelotvorenju, drugi i treći antigen vezujući deo su oba konvencionalni Fab molekuli.
U jednom otelotvorenju, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije sadrži
(i) prvi antigen vezujući deo koji je ukršteni Fab molekul sposoban za specifično vezivanje za CD3 koji sadrži varijabilni teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 36, i varijabilni laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 31.
(ii) drugi antigen vezujući deo, a to je Fab molekul sposoban za specifično vezivanje za folatni receptor 1 (FolR1) koji sadrži varijabilni teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 55, i varijabilni laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 64.
(iii) treći antigen vezujući deo, a to je Fab molekul sposoban za specifično vezivanje za folatni receptor 1 (FolR1) koji sadrži varijabilni teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 55, i varijabilni laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 64.
U jednom otelotvorenju, drugi i treći antigen vezujući deo su oba konvencionalni Fab molekuli.
U jednom otelotvorenju, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije sadrži
(i) prvi antigen vezujući deo, a to je ukršteni Fab molekul sposoban za specifično vezivanje za CD3, koji sadrži najmanje jedan region koji određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca odabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 i SEQ ID NO: 39, i najmanje jedan CDR lakog lanca odabran iz grupe koja obuhvata SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34;
(ii) drugi antigen vezujući deo sposoban za specifično vezivanje za folatni receptor 1 (FolR1) koji sadrži najmanje jedan region koji određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca odabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 i SEQ ID NO: 50, i najmanje jedan CDR lakog lanca odabran iz grupe koja obuhvata SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54.
U jednom takvom otelotvorenju, CD3 antigen vezujući deo sadrži CDR1 teškog lanca SEQ ID NO: 37, CDR2 teškog lanca SEQ ID NO: 38, CDR3 teškog lanca SEQ ID NO: 39, CDR1 lakog lanca SEQ ID NO: 32, CDR2 lakog lanca SEQ ID NO: 33, i CDR3 lakog lanca SEQ ID NO: 34, a FolR1 antigen vezujući deo sadrži CDR1 teškog lanca SEQ ID NO: 8, CDR2 teškog lanca SEQ ID NO: 9, CDR3 teškog lanca SEQ ID NO: 50, CDR1 lakog lanca SEQ ID NO: 52, CDR2 lakog lanca SEQ ID NO: 53, i CDR3 lakog lanca SEQ ID NO:54.
U jednom otelotvorenju, drugi antigen vezujući deo je konvencionalni Fab molekul. U jednom otelotvorenju, drugi antigen vezujući deo je ukršteni Fab molekul.
U jednom otelotvorenju, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije sadrži
(i) prvi antigen vezujući deo koji je ukršteni Fab molekul sposoban za specifično vezivanje za CD3 koji sadrži varijabilni teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 36, i varijabilni laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 31.
(ii) drugi antigen vezujući deo, a to je Fab molekul sposoban za specifično vezivanje za folatni receptor 1 (FolR1) koji sadrži varijabilni teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 49, i varijabilni laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 51.
U jednom otelotvorenju, drugi antigen vezujući deo je konvencionalni Fab molekul. U jednom otelotvorenju, drugi antigen vezujući deo je ukršteni Fab molekul.
U dodatnom otelotvorenju, antigen vezujući deo koji je specifičan za FolR1 sadrži sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci SEQ ID NO:49, i sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci SEQ ID NO: 51, ili njihove varijante koje zadržavaju funkcionalnost.
U jednom otelotvorenju, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije sadrži polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci SEQ ID NO: 36, polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci SEQ ID NO: 31, polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci SEQ ID NO:49, i polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci SEQ ID NO: 51.
U jednom otelotvorenju, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije dodatno sadrži
(iii) treći antigen vezujući deo sposoban za specifično vezivanje za FolR1.
U jednom otelotvorenju, treći antigen vezujući deo je konvencionalni Fab molekul. U jednom otelotvorenju, drugi antigen vezujući deo je ukršteni Fab molekul.
U jednom takvom otelotvorenju, drugi i treći antigen vezujući deo sposobni za specifično vezivanje za FolR1 sadrže identične sekvence regiona koji određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca i CDR lakog lanca. U jednom takvom otelotvorenju, treći antigen vezujući deo je identičan drugom antigen vezujućem delu.
U jednom otelotvorenju, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije sadrži
(i) prvi antigen vezujući deo, a to je ukršteni Fab molekul sposoban za specifično vezivanje za CD3, koji sadrži najmanje jedan region koji određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca odabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 i SEQ ID NO: 39, i najmanje jedan CDR lakog lanca odabran iz grupe koja obuhvata SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34;
(ii) drugi antigen vezujući deo sposoban za specifično vezivanje za folatni receptor 1 (FolR1) koji sadrži najmanje jedan region koji određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca odabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 i SEQ ID NO: 49, i najmanje jedan CDR lakog lanca odabran iz grupe koja obuhvata SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54;
(iii) treći antigen vezujući deo sposoban za specifično vezivanje za folatni receptor 1 (FolR1) koji sadrži najmanje jedan region koji određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca odabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 i SEQ ID NO: 50, i najmanje jedan CDR lakog lanca odabran iz grupe koja obuhvata SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54.
U jednom takvom otelotvorenju, CD3 antigen vezujući deo sadrži CDR1 teškog lanca SEQ ID NO: 37, CDR2 teškog lanca SEQ ID NO: 38, CDR3 teškog lanca SEQ ID NO: 39, CDR1 lakog lanca SEQ ID NO: 32, CDR2 lakog lanca SEQ ID NO: 33, i CDR3 lakog lanca SEQ ID NO: 34, a FolR1 antigen vezujući deo sadrži CDR1 teškog lanca SEQ ID NO: 8, CDR2 teškog lanca SEQ ID NO: 9, CDR3 teškog lanca SEQ ID NO: 50, CDR1 lakog lanca SEQ ID NO: 52, CDR2 lakog lanca SEQ ID NO: 53, i CDR3 lakog lanca SEQ ID NO:54.
U jednom otelotvorenju, drugi i treći antigen vezujući deo su oba konvencionalni Fab molekuli.
U jednom otelotvorenju, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije sadrži
(i) prvi antigen vezujući deo koji je ukršteni Fab molekul sposoban za specifično vezivanje za CD3 koji sadrži varijabilni teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 36, i varijabilni laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 31.
(ii) drugi antigen vezujući deo, a to je Fab molekul sposoban za specifično vezivanje za folatni receptor 1 (FolR1) koji sadrži varijabilni teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 49, i varijabilni laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 51.
(iii) treći antigen vezujući deo, a to je Fab molekul sposoban za specifično vezivanje za folatni receptor 1 (FolR1) koji sadrži varijabilni teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 49, i varijabilni laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 51.
U jednom otelotvorenju, drugi i treći antigen vezujući deo su oba konvencionalni Fab molekuli.
Tako se u jednom otelotvorenju pronalazak odnosi na bispecifične molekule u kojima dva vezujuća dela daju sposobnost za specifično vezanje za FolR1, a jedan vezujući deo daje sposobnost specifičnosti za antigen CD3 koji aktivira T ćeliju. Jedan od teških lanaca je modifikovan kako bi se osiguralo pravilno uparivanje teškog i lakog lanca, čime se eliminiše potreba za pristupom koji koristi zajednički laki lanac. Prisustvo dva mesta za vezivanje FolR1 omogućava odgovarajuću interakciju sa ciljnim antigenom FolR1 i aktivaciju T ćelija.
Komponente bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije mogu biti spojene jedne sa drugim u različitim konfiguracijama. Primeri konfiguracija prikazani su na slikama 1A-I i dodatno su opisani u nastavku.
U nekim otelotvorenjima, pomenuti bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije dalje sadrži Fc domen sastavljen od prve i druge podjedinice sposobne za stabilno povezivanje. Ispod su opisani primeri otelotvorenja za bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije a koji sadrže Fc domen.
Formati bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije
Kao što je prikazano gore i na slikama 1A-I, u jednom otelotvorenju bispecifični antigen vezujući molekuli koji aktiviraju T ćelije sadrže najmanje dva Fab fragmenta koji imaju identične lake lance (VLCL) i koji imaju različite teške lance (VHCL) što proizvodi specifičnost za dva različita antigena, tj. jedan Fab fragment sposoban je da se specifično vezuje za antigen CD3 koji aktivira T ćeliju, a drugi Fab fragment sposoban je da se specifično vezuje za antigen ciljne ćelije FolR1.
U drugom otelotvorenju, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije sastoji se od najmanje dva antigen vezujuća dela (Fab molekula), od kojih je jedan ukršteni Fab molekul, a drugi je konvencionalni Fab molekul. U jednom takvom otelotvorenju, prvi antigen vezujući deo sposoban za specifično vezivanje za CD3 je ukršteni Fab molekul, a drugi antigen vezujući deo sposoban za specifično vezivanje za Fo1R je konvencionalni Fab molekul.
Ove komponente bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije mogu se spojiti jedna sa drugom u različitim konfiguracijama. Primeri konfiguracija su prikazani na Slici 1A-I.
U nekim otelotvorenjima, prvi i drugi antigen vezujući deo su spojeni na C-terminalnom kraju teškog lanca Fab sa N-terminalnim krajem prve ili druge podjedinice Fc domena. U jednom takvom posebnom otelotvorenju, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije se u osnovi sastoji od prvog i drugog antigen vezujućeg dela, Fc domena sastavljenog od prve i druge podjedinice, i opciono jednog ili više peptidnih linkera, pri čemu su prvi i drugi antigen vezujući deo spojeni na C-terminalnom kraju teškog lanca Fab sa N-terminalnim krajem prve ili druge podjedinice Fc domena. U jednom takvom otelotvorenju, prvi i drugi antigen vezujući deo su Fab fragmenti i imaju identične lake lance (VLCL). U još jednom takvom otelotvorenju, prvi antigen vezujući deo sposoban za specifično vezivanje za CD3 je ukršteni Fab molekul, a drugi antigen vezujući deo sposoban za specifično vezivanje za FolR je konvencionalni Fab molekul.
U jednom otelotvorenju, drugi antigen vezujući deo je spojen na C-terminalnom kraju Fab teškog lanca sa N-terminalnim krajem prve ili druge podjedinice Fc domena, a prvi antigen vezujući deo je spojen na C-terminalnom kraju teškog lanca Fab sa N-terminalnim krajem teškog lanca Fab drugog antigen vezujućeg dela. U jednom takvom posebnom otelotvorenju, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije u suštini se sastoji od prvog i drugog antigen vezujućeg dela, Fc domena sastavljenog od prve i druge podjedinice, i opciono jednog ili više peptidnih linkera, pri čemu je prvi antigen vezujući deo spojen na C-terminalnom kraju Fab teškog lanca sa N-terminalnim krajem teškog lanca Fab drugog antigen vezujućeg dela, a drugi antigen vezujući deo je spojen na C-terminalnom kraju teškog lanca Fab sa N-terminalnim krajem prve ili druge podjedinice Fc domena. U jednom takvom otelotvorenju, prvi i drugi antigen vezujući deo su Fab fragmenti i imaju identične lake lance (VLCL). U još jednom takvom otelotvorenju, prvi antigen vezujući deo, sposoban za specifično vezivanje za CD3, je ukršteni Lab molekul, a drugi antigen vezujući deo sposoban za specifično vezivanje za FolR je konvencionalni Fab molekul. Opciono, laki lanac Fab prvog antigen vezujućeg dela i laki lanac Fab drugog antigen vezujućeg dela mogu dodatno biti spojeni jedan sa drugim.
U drugim otelotvorenjima, prvi antigen vezujući deo je spojen na C-terminalnom kraju teškog lanca Fab sa N-terminalnim krajem prve ili druge podjedinice Fc domena. U takvom jednom konkretnom otelotvorenju, drugi antigen vezujući deo je spojen na C-terminalnom kraju teškog lanca Fab sa N-terminalnim krajem teškog lanca Fab prvog antigen vezujućeg dela. U takvom jednom specifičnom otelotvorenju, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije u suštini se sastoji od prvog i drugog antigen vezujućeg dela, Fc domena sastavljenog od prve i druge podjedinice, i opciono jednog ili više peptidnih linkera, pri čemu je drugi antigen vezujući deo spojen na C-terminalnom kraju teškog lanca Fab sa N-terminalnim krajem teškog lanca Fab prvog antigen vezujućeg dela, i prvi antigen vezujući deo je spojen na C-terminalnom kraju teškog lanca Fab sa N-terminalnim krajem prve ili druge podjedinice Fc domena. U jednom takvom otelotvorenju, prvi i drugi antigen vezujući deo su Fab fragmenti i imaju identične lake lance (VLCL). U još jednom takvom otelotvorenju, prvi antigen vezujući deo sposoban za specifično vezivanje za CD3 je ukršteni Fab molekul, a drugi antigen vezujući deo sposoban za specifično vezivanje za FolR je konvencionalni Fab molekul. Opciono, laki lanac Fab prvog antigen vezujućeg dela i laki lanac Fab drugog antigen vezujućeg dela mogu dodatno biti spojeni jedan sa drugim.
Antigen vezujući delovi mogu biti spojeni sa Fc domenom ili međusobno direktno ili preko peptidnog linkera, koji sadrži jednu ili više aminokiselina, najčešće oko 2-20 aminokiselina. Peptidni linkeri su poznati u struci i ovde opisani. U pogodne, neimunogene peptidne linkere spadaju, na primer, (G4S)n(SEQ ID NO: 387), (SG4)n(SEQ ID NO: 388), (G4S)n(SEQ ID NO: 387) ili G4(SG4)n(SEQ ID NO: 389) peptidni linkeri, “n” je po pravilu neki broj između 1 i 10, tipično između 2 i 4. Posebno pogodan peptidni linker za međusobno spajanje lakih lanaca Fab prvog i drugog antigen vezujućeg dela je (G4S)2(SEQ ID NO: 386). Primer peptidnog linkera pogodnog za povezivanje teških lanaca Fab prvog i drugog antigen vezujućeg dela je EPKSC(D)-(G4S)2(SEQ ID NOS: 390 i 391). Dodatno, linkeri mogu sadržati imunoglobulinski region šarke (ili njegov deo). Naročito ako je antigen vezujući deo spojen sa N-terminalnim krajem podjedinice Fc domena, tada se može spojiti preko imunoglobulinskog regiona šarke ili njegovog dela, uz prisustvo dodatnog peptidnog linkera ili bez njega.
Autori ovog pronalaska su ustanovili da bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije i koji sadrži dva vezujuća dela specifična za antigen ciljne ćelije FolR, ima superiorne karakteristike u odnosu na bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije i koji sadrži samo jedan vezujući deo specifičan za antigen ciljne ćelije FolR.
Shodno tome, u nekim otelotvorenjima, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije iz pronalaska dodatno sadrži treći antigen vezujući deo koji je Fab molekul sposoban da se specifično vezuje za FolR. U jednom takvom otelotvorenju, drugi i treći antigen vezujući deo sposobni za specifično vezivanje na FolR1 sadrže identične sekvence regiona koji određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca i CDR lakog lanca, tj. sekvence CDR teškog lanca drugog antigen vezujućeg dela su iste kao sekvence CDR teškog lanca trećeg antigen vezujućeg dela, a sekvence CDR lakog lanca drugog antigen vezujućeg dela su iste kao sekvence CDR lakog lanca trećeg antigen vezujućeg dela. U jednom takvom otelotvorenju, treći antigen vezujući deo je identičan drugom antigen vezujućem delu (tj. oba sadrže iste aminokiselinske sekvence).
U jednom otelotvorenju, prvi i treći antigen vezujući deo su spojeni svaki na C-terminalnom kraju teškog lanca Fab sa N-terminalnim krajem prve ili druge podjedinice Fc domena, i treći antigen vezujući deo je spojen na C-terminalnom kraju teškog lanca Fab sa Nterminalnim krajem teškog lanca Fab prvog antigen vezujućeg dela. U takvom jednom specifičnom otelotvorenju, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije u suštini se sastoji od prvog, drugog i trećeg antigen vezujućeg dela, Fc domena sastavljenog od prve i druge podjedinice, i opciono od jednog ili više peptidnih linkera, pri čemu su prvi i drugi antigen vezujući deo spojeni svaki na C-terminalnom kraju teškog lanca Fab sa N-terminalnim krajem prve podjedinice Fc domena, a treći antigen vezujući deo je spojen na C-terminalnom kraju teškog lanca Fab sa N-terminalnim krajem teškog lanca Fab prvog antigen vezujućeg dela. U jednom takvom otelotvorenju, prvi, drugi i treći antigen vezujući deo su konvencionalni Fab fragmenti i imaju identične lake lance (VLCL). U drugom takvom otelotvorenju, prvi antigen vezujući deo sposoban da se specifično vezuje za CD3 je ukršteni Fab molekul, a drugi i treći antigen vezujući deo sposoban da se specifično vezuje za FolR je konvencionalni Fab molekul. Opciono, laki lanac Fab prvog antigen vezujućeg dela i laki lanac Fab drugog antigen vezujućeg dela mogu dodatno biti spojeni jedan sa drugim.
U drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje bispecifično antitelo koje sadrži a) prvo mesto za vezivanje antigena koje se takmiči za vezivanje za humani FolR1 sa referentnim antitelom koje sadrži promenljivi domen teškog lanca (VH) sekvence SEQ ID NO: 49, i varijabilni domen lakog lanca SEQ ID NO: 51; i b) drugo antigen vezujuće mesto koje se takmiči u vezivanju za humani CD3 sa referentnim antitelom koje sadrži varijabilni domen teškog lanca (VH) SEQ ID NO: 36, i varijabilni domen lakog lanca SEQ ID NO: 31, pri čemu se konkurentnost vezivanja meri pomoću testa površinske plazmonske rezonance.
U drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije i koji sadrži prvi antigen vezujući deo sposoban za specifično vezivanje za CD3 i drugi antigen vezujući deo sposoban za specifično vezivanje za folatni receptor 1 (FolR1), pri čemu se bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije vezuje za isti epitop na humanom FolR1 kao prvo referentno antitelo koje sadrži varijabilni domen teškog lanca (VH) sekvence SEQ ID NO: 49, i varijabilni domen lakog lanca SEQ ID NO: 51; i pri čemu se bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije vezuje za isti epitop na humanom CD3 kao drugo referentno antitelo koje sadrži varijabilni domen teškog lanca (VH) sekvence SEQ ID NO: 36, i varijabilni domen lakog lanca SEQ ID NO: 31.
U drugom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije i koji sadrži prvi, drugi, treći, četvrti i peti polipeptidni lanac koji čine prvi, drugi i treći antigen vezujući deo, pri čemu je prvi antigen vezujući deo sposoban za vezivanje na CD3, i drugi i treći antigen vezujući deo su sposobni svaki pojedinačno za vezivanje na folatni receptor 1 (FolR1). Prvi i drugi polipeptidni lanac sadrže, u smeru od amino (N)-terminalnog kraja do karboksilnog (C)-terminalnog kraja, prvi varijabilni domen lakog lanca (VLD1) i prvi konstantni domen lakog lanca (CLD1). Treći polipeptidni lanac sadrži, u smeru od N-terminalnog kraja do C-terminalnog kraja, drugi varijabilni domen lakog lanca (VLD2) i drugi konstantni domen teškog lanca 1 (CH1D2). Četvrti polipeptidni lanac sadrži, u smeru od N-terminalnog kraja do C-terminalnog kraja, prvi varijabilni domen teškog lanca (VHD1), prvi konstantni domen teškog lanca 1 (CH1D1), prvi konstantni domen teškog lanca 2 (CH2D1) i prvi konstantni domen teškog lanca 3 (CH3D1). Peti polipeptidni lanac sadrži VHD1, CH1D1, drugi varijabilni domen teškog lanca (VHD2), drugi konstantni domen lakog lanca (CLD2), drugi konstantni domen teškog lanca 2 (CH2D2) i drugi konstantni domen teškog lanca 3 (CH3D2). Treći polipeptidni lanac i VHD2 i CLD2 petog polipeptidnog lanca čine prvi antigen vezujući deo sposoban za vezivanje na CD3. Drugi polipeptidni lanac i VHD1 i CH1D1 petog polipeptidnog lanca čine treći vezujući deo sposoban za vezivanje na FolR1. Prvi polipeptidni lanac i VHD1 i CH1D1 četvrtog polipeptidnog lanca čine drugi vezujući deo sposoban za vezivanje na FolR1.
U jednom drugom otelotvorenju, drugi i treći antigen vezujući deo su spojeni svaki pojedinačno na C-terminalnom kraju teškog lanca Fab sa N-terminalnim krajem prve ili druge podjedinice Fc domena, a prvi antigen vezujući deo je spojen na C-terminalnom kraju teškog lanca Fab sa N-terminalnim krajem teškog lanca Fab drugog antigen vezujućeg dela. U takvom jednom specifičnom otelotvorenju, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije u suštini se sastoji od prvog i drugog antigen vezujućeg dela, Fc domena sastavljenog od prve i druge podjedinice, i opciono jednog ili više peptidnih linkera, pri čemu su drugi i treći antigen vezujući deo spojeni svaki pojedinačno na C-terminalnom kraju teškog lanca Fab sa N-terminalnim krajem prve podjedinice Fc domena, a prvi antigen vezujući deo je spojen na C-terminalnom kraju teškog lanca Fab sa N-terminalnim krajem teškog lanca Fab trećeg antigen vezujućeg dela. U jednom takvom otelotvorenju, prvi, drugi i treći antigen vezujući deo su konvencionalni Fab fragmenti i imaju identične lake lance (VLCL). U drugom takvom otelotvorenju, prvi antigen vezujući deo sposoban da se specifično vezuje za CD3 je ukršteni Fab molekul, a drugi i treći antigen vezujući deo sposoban da se specifično vezuje za FolR je konvencionalni Fab molekul. Opciono, laki lanac Fab prvog antigen vezujućeg dela i laki lanac Fab drugog antigen vezujućeg dela mogu dodatno biti spojeni jedan sa drugim.
Antigen vezujući delovi mogu biti spojeni na Fc domen direktno ili preko peptidnog linkera. U konkretnom otelotvorenju, antigen vezujući delovi su spojeni, svaki pojedinačno, sa Fc domenom preko imunoglobulinskog regiona šarke. U posebnom otelotvorenju, imunoglobulinski region šarke je region šarke humanog IgG1.
U jednom otelotvorenju, prvi i drugi antigen vezujući deo i Fc domen su delovi molekula imunoglobulina. U konkretnom otelotvorenju, molekul imunoglobulina je imunoglobulin IgG klase. U jednom konkretnijem otelotvorenju, imunoglobulin je imunoglobulin potklase IgG1. U jednom drugom otelotvorenju, imunoglobulin je imunoglobulin potklase IgG4. U još jednom konkretnom otelotvorenju, imunoglobulin je humani imunoglobulin. U drugim otelotvorenjima, imunoglobulin je himerni imunoglobulin ili humanizovani imunoglobulin.
U konkretnom otelotvorenju, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije i prvi i drugi antigen vezujući deo i Fc domen su delovi molekula imunoglobulina, a treći antigen vezujući deo je spojen na C-terminalnom kraju teškog lanca Fab za N-terminalni kraj teškog lanca Fab prvog antigen vezujućeg dela, pri čemu su prvi, drugi i treći antigen vezujući delovi konvencionalni Fab fragmenti i imaju identične lake lance (VLCL), pri čemu prvi antigen vezujući deo sposoban za specifično vezivanje na CD3 sadrži najmanje jedan region koji određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca odabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 i SEQ ID NO: 39, i najmanje jedan CDR lakog lanca odabran iz grupe koja obuhvata SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 i SEQ ID NO: 34; a drugi i treći antigen vezujući deo sposobni za specifično vezivanje za FolR1 sadrže najmanje jedan region koji određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca odabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 i SEQ ID NO: 18, i najmanje jedan CDR lakog lanca odabran iz grupe koja obuhvata SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 i SEQ ID NO: 34.
U konkretnom otelotvorenju, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije, prvi i drugi antigen vezujući deo i Fc domen su deo molekula imunoglobulina, a treći antigen vezujući deo je spojen na C-terminalnom kraju teškog lanca Fab na N-terminalni kraj teškog lanca Fab prvog antigen vezujućeg dela, pri čemu su prvi, drugi i treći antigen vezujući deo konvencionalni Fab fragmenti i imaju identične lake lance (VLCL), pri čemu prvi antigen vezujući deo sposoban za specifično vezivanje na CD3 sadrži varijabilni teški lanac koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 36, varijabilni laki lanac koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 31; a drugi i treći antigen vezujući deo, sposobni za specifično vezivanje za FolR1 sadrže varijabilni teški lanac koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 15, varijabilni laki lanac koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 31.
U konkretnom otelotvorenju, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije, prvi i drugi antigen vezujući deo i Fc domen su deo molekula imunoglobulina, a treći antigen vezujući deo je spojen na C-terminalnom kraju teškog lanca Fab na N-terminalni kraj teškog lanca Fab prvog antigen vezujućeg dela, a prvi antigen vezujući deo sposoban za specifično vezivanje na CD3 je ukršteni molekul Fab, pri čemu su ili varijabilni ili konstantni region lakog lanca Fab i teškog lanca Fab razmenjeni i sadrže najmanje jedan region koji određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca odabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 i SEQ ID NO: 39, i najmanje jedan CDR lakog lanca odabran iz grupe koja obuhvata SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 i SEQ ID NO: 34; a drugi i treći antigen vezujući deo sposobni za specifično vezivanje za FolR1 sadrže najmanje jedan region koji određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca odabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 56 i SEQ ID NO: 57, i najmanje jedan CDR lakog lanca odabran iz grupe koja obuhvata SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60 i SEQ ID NO: 65.
U konkretnom otelotvorenju, pomenuti bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije, prvi i drugi antigen vezujući deo i Fc domen su deo molekula imunoglobulina, a treći antigen vezujući deo je spojen na C-terminalnom kraju teškog lanca Fab na N-terminalni kraj teškog lanca Fab prvog antigen vezujućeg dela, a prvi antigen vezujući deo sposoban za specifično vezivanje na CD3 je ukršteni molekul Fab, pri čemu su ili varijabilni ili konstantni region lakog lanca Fab i teškog lanca Fab razmenjeni, pri čemu prvi antigen vezujući deo sposoban za specifično vezivanje na CD3 sadrži varijabilni teški lanac koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 36, varijabilni laki lanac koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 31; a drugi i treći antigen vezujući deo, sposobni za specifično vezivanje za FolR1 sadrže varijabilni teški lanac koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 55, varijabilni laki lanac koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 65.
U jednom otelotvorenju, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije je jednovalentan za svaki antigen. U konkretnom otelotvorenju, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije se može vezati za humani CD3 i humani folatni receptor alfa (FolR1) i napravljen je bez korišćenja heterodimerizacionog pristupa, kao što je tehnologija "dugme u rupici". Na primer, molekul se može proizvesti upotrebom zajedničke biblioteke lakog lanca i tehnologije CrossMab. U konkretnom otelotvorenju, varijabilni region CD3 vezivača je spojen sa CH1 domenom standardnog humanog IgG1antitela da bi se formirao VLVH ukršteni molekul (spojen sa Fc), što je zajedničko za obe specifičnosti. Da bi se generisali ukršteni parnjaci (VHCL), CD3 specifični varijabilni domen teškog lanca spaja se sa konstantnim humanim λ lakim lancem, dok je varijabilni domen teškog lanca specifičan za humani FolR1 (npr. izolovan iz zajedničke biblioteke lakih lanaca) spojen sa konstantnim humanim κ lakim lancem. Dobijeni željeni molekul sa pravilno uparenim lancima sadrži i kapa i lambda lake lance ili njihove fragmente. Shodno tome, ova željena vrsta bispecifičnog molekula se može prečistiti od pogrešno uparenih ili homodimernih vrsta uzastopnim koracima prečišćavanja koji selekcionišu kapa i lambda lake lance, u bilo kojoj sekvenci. U jednom konkretnom otelotvorenju, prečišćavanje željenog bispecifičnog antitela koristi naredne korake prečišćavanja sa kolonama KappaSelect i LambdaFabSelect (GE Healthcare) za uklanjanje neželjenih homodimernih antitela.
Fc domen
Fc domen bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije sastoji se od para polipeptidnih lanaca koji sadrže domene teškog lanca molekula imunoglobulina. Na primer, Fc domen molekula imunoglobulina G (IgG) je dimer, čija svaka podjedinica sadrži konstantne domene IgG teškog lanca CH2 i CH3. Dve podjedinice Fc domena su sposobne za stabilno povezivanje jedne sa drugom. U jednom otelotvorenju, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije iz ovog pronalaska ne sadrži više od jednog Fc domena.
U jednom otelotvorenju prema pronalasku, Fc domen bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije je Fc domen IgG. U konkretnom otelotvorenju, Fc domen je Fc domen IgG1. Udrugom otelotvorenju, Fc domen je Fc domen IgG4. U konkretnijem otelotvorenju, Fc domen je Fc domen IgG4koji sadrži aminokiselinsku supstituciju u položaju S228 (Kabatova numeracija), konkretno aminokiselinsku supstituciju S228P. Ova aminokiselinska supstitucija umanjuje in vivo razmenu Fab kraka IgG4antitela (vidi Stubenrauch et al., Drug Metabolism and Disposition 38, 84-91 (2010)). U drugom konkretnom otelotvorenju, Fc domen je humani domen.
Modifikacije Fc domena koje podstiču heterodimerizaciju
Bispecifični antigen vezujući molekuli koji aktiviraju T ćelije prema pronalasku sadrže različite antigen vezujuće delove, spojene sa jednom ili drugom podjedinicom Fc domena, tako da su dve podjedinice Fc domena tipično sadržane u dva neidentična polipeptidna lanca. Rekombinantna koekspresija ovih polipeptida i naknadna dimerizacija dovode do nekoliko mogućih kombinacija dva polipeptida. Da bi se poboljšali prinos i čistoća bispecifičnih antigen vezujućih molekula koji aktiviraju T ćelije u rekombinantnoj proizvodnji, biće korisno da se u Fc domen bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije uvede modifikacija koja unapređuje povezivanje željenih polipeptida.
Shodno tome, u konkretnim otelotvorenjima, Fc domen bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije prema ovom pronalasku sadrži modifikaciju koja podstiče povezivanje prve i druge podjedinice Fc domena. Mesto najveće proteinskoproteinske interakcije između dve podjedinice Fc domena humanog IgG nalazi se u CH3 domenu Fc domena. Tako se u jednom otelotvorenju pomenuta modifikacija nalazi u CH3 domenu Fc domena.
U konkretnom otelotvorenju, pomenuta modifikacija je takozvana modifikacija „dugme u rupici“, koja sadrži modifikaciju „dugmeta“ u jednoj od dve podjedinice Fc domena i modifikaciju „rupice“ u drugoj od dve podjedinice Fc domena.
Tehnologija „dugme u rupici” je opisana npr. u US 5.731.168; US 7,695,936; Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996) i Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001). Po pravilu, ova metoda podrazumeva uvođenje izbočine ("dugme") na interfejsu prvog polipeptida i odgovarajuće šupljine (“rupice”) na interfejsu drugog polipetida, tako da se izbočina može uklopiti u šupljinu da bi se podstaklo formiranje heterodimera i sprečilo nastajanje homodimera. Izbočine su napravljene zamenom malih bočnih lanaca aminokiselina sa interfejsa prvog polipeptida većim bočnim lancima (npr. tirozinom ili triptofanom). Odgovarajuće šupljine, iste ili slične veličine kao izbočine, stvaraju se na interfejsu drugog polipeptida, zamenom velikih bočnih lanaca aminokiselina manjim (npr. alaninom ili treoninom).
U skladu s ovim, u posebnom otelotvorenju, u CH3 domenu prve podjedinice Fc domena bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije, aminokiselinski ostatak se zamenjuje aminokiselinskim ostatkom koji ima veći volumen bočnog lanca, čime se stvara izbočina unutar CH3 domena prve podjedinice koja može da se uklopi u šupljinu unutar CH3 domena druge podjedinice, a u CH3 domenu druge podjedinice Fc domena aminokiselinski ostatak se zamenjuje aminokiselinskim ostatkom koji ima manji volumen bočnog lanca, čime se stvara šupljina unutar CH3 domena druge podjedinice unutar koje može da se uklopi izbočina u CH3 domenu prve podjedinice.
Izbočina i šupljina se mogu napraviti izmenom nukleinske kiseline koja kodira polipeptide, npr. mutagenezom specifičnom za lokaciju, ili sintezom peptida.
U konkretnom otelotvorenju, u CH3 domenu prve podjedinice Fc domena, treoninski ostatak na poziciji 366 zamenjen je triptofanskim ostatkom (T366W), a u CH3 domenu druge podjedinice Fc domena, tirozinski ostatak na poziciji 407 zamenjen je valinskim ostatkom (Y407V). U jednom otelotvorenju, u drugoj podjedinici Fc domena, dodatno je treoninski ostatak na poziciji 366 zamenjen serinskim ostatkom (T366S) i leucinski ostatak na poziciji 368 je zamenjen alaninskim ostatkom (L368A).
U još jednom otelotvorenju, u prvoj podjedinici Fc domena, dodatno je serinski ostatak na poziciji 354 zamenjen cisteinskim ostatkom (S354C), a u drugoj podjedinici Fc domena, dodatno je tirozinski ostatak na poziciji 349 zamenjen cisteinskim ostatkom (Y349C). Uvođenje ova dva cisteinska ostatka dovodi do stvaranja disulfidnog mosta između dve podjedinice Fc domena, što dodatno stabilizuje dimer (Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)).
U konkretnom otelotvorenju, antigen vezujući deo sposoban da se vezuje za CD3 je spojen (opciono putem antigen vezujućeg dela koji je sposoban da se vezuje za antigen ciljne ćelije) sa prvom podjedinicom Fc domena (koja sadrži modifikaciju "dugmeta"). Bez želje da se ograničimo teorijom, spajanje antigen vezujućeg dela koji je sposoban da se vezuje za CD3 sa ovom podjedinicom Fc domena će (dodatno) smanjiti stvaranje antigen vezujućih molekula koji sadrže dva antigen vezujuća ostatka sposobna da se vezuju za CD3 (sterni sukob dva polipeptida koji sadrže "dugme").
U jednom drugom otelotvorenju, modifikacija koja podstiče povezivanje prve i druge podjedinice Fc domena sadrži modifikaciju koja posreduje u elektrostatičkim efektima upravljanja, npr. kao što je opisano u publikaciji PCT WO 2009/089004. Po pravilu, ovaj postupak podrazumeva zamenu jednog ili više aminokiselinskih ostataka na interfejsu dve podjedinice Fc domena naelektrisanim aminokiselinskim ostacima, tako da formiranje homodimera postaje elektrostatički nepovoljno, a heterodimerizacija elektrostatički povoljna.
Modifikacije Fc domena koje ukidaju vezivanje Fc receptora i/ili efektorsku funkciju Fc domen daje bispecifičnom antigen vezujućem molekulu koji aktivira T ćelije povoljne farmakokinetičke osobine, uključujući i dug poluživot u serumu, koji doprinosi dobroj akumulaciji u ciljnom tkivu i povoljnom stepenu raspodele između tkiva i krvi. Istovremeno, on može dovesti do nepoželjnog ciljanja bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije na ćelije koje eksprimiraju Fc receptore, a ne na željene ćelije koje nose antigene. Štaviše, koaktivacija Fc receptorskih signalnih puteva može dovesti do otpuštanja citokina, što u kombinaciji sa svojstvima aktiviranja T ćelija i dugim poluživotom antigen vezujućeg molekula, dovodi do prekomerne aktivacije receptora citokina i teških neželjenih efekata kod sistemske primene. Aktivacija imunskih ćelija (koje nose Fc receptore), osim T ćelija, može čak i smanjiti efikasnost bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije zbog potencijalne destrukcije T ćelija, npr. NK ćelijama.
U skladu sa ovim, u pojedinim otelotvorenjima, Fc domen bispecifičnih antigen vezujućih molekula koji aktiviraju T ćelije prema ovom pronalasku ispoljava smanjeni afinitet vezivanja za Fc receptor i/ili smanjenu efektorsku funkciju, u odnosu na Fc domen nativnog IgG1. U jednom takvom otelotvorenju, Fc domen (ili bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije koji sadrži pomenuti Fc domen) pokazuje manje od 50%, poželjno manje od 20%, poželjnije manje od 10%, a najpoželjnije manje od 5% afiniteta vezivanja za Fc receptor, u poređenju sa Fc domenom nativnog IgG1(ili bispecifičnim antigen vezujućim molekulom koji aktivira T ćelije koji sadrži Fc domen nativnog IgG1), i/ili manje od 50%, poželjno manje od 20%, poželjnije manje od 10%, a najpoželjnije manje od 5% efektorske funkcije, u poređenju sa Fc domenom nativnog IgG1(ili bispecifičnim antigen vezujućim molekulom koji aktivira T ćelije koji sadrži Fc domen nativnog IgG1). U jednom otelotvorenju, Fc domen (ili bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije koji sadrži pomenuti Fc domen) ne vezuje se značajno za Fc receptor i/ili ne indukuje efektorsku funkciju. U konkretnom otelotvorenju, Fc receptor je Fcγ receptor. U jednom otelotvorenju, Fc receptor je humani Fc receptor. U jednom otelotvorenju, Fc receptor je aktivirajući Fc receptor. U konkretnom otelotvorenju, Fc receptor je aktivirajući humani Fcγ receptor, konkretnije humani FcγRIIIa, FcγRI ili FcγRIIa, najkonkretnije humani FcγRIIIa. U jednom otelotvorenju, efektorska funkcija je jedna ili više njih izabranih iz grupe koja se sastoji od CDC, ADCC, ADCP i sekrecije citokina. U konkretnom otelotvorenju, efektorska funkcija je ADCC. U jednom otelotvorenju, Fc domen pokazuje suštinski sličan afinitet vezivanja za neonatalni Fc receptor (FcRn) u poređenju sa Fc domenom nativnog IgG1. Suštinski slično vezivanje za FcRn postiže se kada Fc domen (ili bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije koji sadrži navedeni Fc domen) pokazuje afinitet vezivanja za FcRn veći od oko 70%, konkretno veći od oko 80%, konkretnije veći od oko 90% Fc domena nativnog IgG1(ili bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije koji sadrži Fc domen nativnog IgG1).
U određenim otelotvorenjima, Fc domen je konstruisan tako da ima smanjeni afinitet vezivanja za Fc receptor i/ili redukovanu efektorsku funkciju, u poređenju sa nekonstruisanim Fc domenom. U konkretnim otelotvorenjima, Fc domen bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije sadrži jednu ili više aminokiselinskih mutacija koje smanjuju afinitet vezivanja Fc domena za Fc receptor i/ili efektorsku funkciju. Najčešće su jedna ili više aminokiselinskih mutacija prisutne u svakoj od dve podjedinice Fc domena. U jednom otelotvorenju, aminokiselinska mutacija smanjuje afinitet vezivanja Fc domena za Fc receptor. U jednom otelotvorenju, aminokiselinska mutacija smanjuje afinitet vezivanja Fc domena za Fc receptor najmanje 2 puta, najmanje 5 puta ili najmanje 10 puta. U otelotvorenjima gde postoji više od jedne aminokiselinske mutacije koja smanjuje afinitet vezivanja Fc domena za Fc receptor, kombinacija ovih aminokiselinskih mutacija može smanjiti afinitet vezivanja Fc domena za Fc receptor najmanje 10 puta, najmanje 20 puta ili čak najmanje 50 puta. U jednom otelotvorenju, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije koji sadrži konstruisani Fc domen pokazuje manje od 20%, konkretno manje od 10%, konkretnije manje od 5% afiniteta vezivanja za Fc receptor u poređenju sa bispecifičnim antigen vezujućim molekulom koji aktivira T ćelije koji sadrži nekonstruisani Fc domen. U konkretnom otelotvorenju, Fc receptor je Fcγ receptor. U nekim otelotvorenjima, Fc receptor je humani Fc receptor. U nekim otelotvorenjima, Fc receptor je aktivirajući Fc receptor. U konkretnom otelotvorenju, Fc receptor je aktivirajući humani Fcγ receptor, konkretnije humani FcγRIIIa, FcγRI ili FcγRIIa, najkonkretnije humani FcγRIIIa. Poželjno je da vezivanje za svaki od ovih receptora bude smanjeno. U nekim otelotvorenjima, afinitet vezivanja za komponentu komplementa, posebno afinitet vezivanja za C1q, takođe je smanjen. U jednom otelotvorenju, afinitet vezivanja za neonatalni Fc receptor (FcRn) nije smanjen. Suštinski slično vezivanje za FcRn, tj. očuvanje afiniteta vezivanja Fc domena za navedeni receptor, postiže se kada Fc domen (ili bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije koji sadrži navedeni Fc domen) ima više od oko 70% afiniteta vezivanja za FcRn nekonstruisanog oblika Fc domena (ili bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije koji sadrži pomenuti nekonstruisani oblik Fc domena). Fc domen, ili bispecifični antigen vezujući molekuli koji aktiviraju T ćelije iz ovog pronalaska koji sadrže navedeni Fc domen, mogu pokazivati više od oko 80%, a čak i više od oko 90% takvog afiniteta. U nekim otelotvorenjima, Fc domen bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije je konstruisan da ima smanjenu efektorsku funkciju, u poređenju sa nekonstruisanim Fc domenom. Smanjena efektorska funkcija može da obuhvata, ali nije ograničena na, jednu ili više od sledećih stvari: smanjenu citotoksičnost zavisnu od komplementa (CDC), smanjenu ćelijsku citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC), smanjenu ćelijsku fagocitozu zavisnu od antitela (ADCP), smanjenu sekreciju citokina, smanjeno preuzimanje antigena posredstvom imunog kompleksa od strane antigen prezentujućih ćelija, smanjeno vezivanje za NK ćelije, smanjeno vezivanje za makrofage, smanjeno vezivanje za monocite, smanjeno vezivanje za polimorfonuklearne ćelije, smanjenu direktnu signalizaciju koja indukuje apoptozu, smanjeno unakrsno povezivanje antitela vezanih za cilj, smanjenu zrelost dendritskih ćelija, ili smanjen prajming T ćelija. U jednom otelotvorenju, smanjena efektorska funkcija je jedna ili više izabranih iz grupe u kojoj se nalazi smanjena CDC, smanjena ADCC, smanjena ADCP i smanjena sekrecija citokina. U jednom konkretnom otelotvorenju, smanjena efektorska funkcija je smanjena ADCC. U jednom otelotvorenju, smanjena ADCC je manja od 20% citotoksičnosti ADCC indukovane nekonstruisanim Fc domenom (ili bispecifičnim antigen vezujućim molekulom koji aktivira T ćelije koji sadrži nekonstruisani Fc domen).
U jednom otelotvorenju, aminokiselinska mutacija koja smanjuje afinitet vezivanja Fc domena za Fc receptor i/ili efektorsku funkciju je aminokiselinska supstitucija. U jednom otelotvorenju, Fc domen sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji izabranoj iz grupe od E233, L234, L235, N297, P331 i P329. U još konkretnijem otelotvorenju, Fc domen sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji izabranoj iz grupe od L234, L235 i P329. U nekim otelotvorenjima, Fc domen sadrži aminokiselinske supstitucije L234A i L235A. U jednom takvom otelotvorenju, Fc domen je Fc domen IgG1, konkretno Fc domen humanog IgG1. U jednom otelotvorenju, Fc domen sadrži aminokiselinsku supstituciju u položaju P329. U još konkretnijem otelotvorenju, aminokiselinska supstitucija je P329A ili P329G, konkretno P329G. U jednom otelotvorenju, Fc domen sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji P329 i drugu aminokiselinsku supstituciju na poziciji izabranoj od E233, L234, L235, N297 i P331. U još konkretnijem otelotvorenju, dodatna aminokiselinska supstitucija je E233P, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D ili P331S. U konkretnim otelotvorenjima, Fc domen obuhvata aminokiselinske supstitucije na pozicijama P329, L234 i L235. U konkretnijim otelotvorenjima, Fc domen obuhvata aminokiselinske mutacije L234A, L235A i P329G (“P329G LALA”). U jednom takvom otelotvorenju, Fc domen je Fc domen IgG1, konkretno Fc domen humanog IgG1. "P329G LALA" kombinacija aminokiselinskih supstitucija skoro potpuno ukida vezivanje Fcγ receptora za Fc domen humanog IgG1, kako je opisano u publikaciji PCT br. WO 2012/130831, koja je ovde u celosti uključena referencom. WO 2012/130831 takođe opisuje metode za pripremu takvih mutantnih Fc domena i metode za određivanje njihovih svojstava, kao što su vezivanje za Fc receptore ili efektorske funkcije.
IgG4antitela pokazuju smanjen afinitet vezivanja za Fc receptore i smanjene efektorske funkcije u poređenju sa IgG1antitelima. Stoga, u nekim otelotvorenjima, Fc domen bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije iz pronalaska je Fc domen IgG4, konkretno Fc domen humanog IgG4. U jednom otelotvorenju, Fc domen IgG4sadrži aminokiselinske supstitucije na poziciji S228, konkretno aminokiselinsku supstituciju S228P. Da bi se dodatno smanjio afinitet vezivanja za Fc receptor i/ili njegova efektorska funkcija, u jednom otelotvorenju Fc domen IgG4sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji L235, konkretno aminokiselinsku supstituciju L235E. U jednom drugom otelotvorenju, Fc domen IgG4sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji P329, konkretno aminokiselinsku supstituciju P329G. U jednom konkretnom otelotvorenju, Fc domen IgG4sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama S228, L235 i P329, konkretno aminokiselinske supstitucije S228P, L235E i P329G. Takvi mutanti Fc domena IgG4i njihova svojstva vezivanja Fcγ receptora opisani su u publikaciji PCT br. WO 2012/130831, koja je ovde u celosti uključena referencom.
U jednom konkretnom otelotvorenju, Fc domen koji ispoljava smanjen afinitet vezivanja za Fc receptor i/ili smanjenu efektorsku funkciju u odnosu na Fc domen nativnog IgG1je Fc domen humanog IgG1koji sadrži aminokiselinske supstitucije L234A, L235A i opciono P329G, ili Fc domen humanog IgG4koji sadrži aminokiselinske supstitucije S228P, L235E i opciono P329G.
U određenim otelotvorenjima, eliminisana je N-glikozilacija Fc domena. U jednom takvom otelotvorenju, Fc domen sadrži aminokiselinsku mutaciju na poziciji N297, posebno aminokiselinsku supstituciju koja zamenjuje asparagin alaninom (N297A) ili asparaginskom kiselinom (N297D).
Pored Fc domena opisanih gore i u publikaciji PCT br. WO 2012/130831, Fc domeni sa smanjenim vezivanjem za Fc receptor i/ili efektorskom funkcijom, takođe obuhvataju one sa supstitucijom jednog ili više ostataka Fc domena 238, 265, 269, 270, 297, 327 i 329 (US Patent br.6,737,056). Takvi Fc mutanti obuhvataju Fc mutante sa supstitucijama na dva ili više položaja aminokiselina 265, 269, 270, 297 i 327, uključujući takozvani „DANA” Fc mutant sa supstitucijom ostataka 265 i 297 alaninom (US Patent br.7,332,581).
Mutantni Fc domeni se mogu pripremiti uklanjanjem, supstitucijom, umetanjem ili modifikacijom aminokiselina, uz upotrebu genetičkih ili hemijskih metoda dobro poznatih u struci. Genetički postupci mogu obuhvatiti mutagenezu specifičnu za mesto kodiranja DNK sekvence, PCR, sintezu gena i slično. Tačne promene nukleotida mogu se potvrditi, na primer, sekvenciranjem.
Vezivanje za Fc receptore se može lako odrediti npr. testom ELISA ili površinskom plazmonskom rezonancom (SPR) upotrebom standardnih instrumentata kao što je BIAcore instrument (GE Healthcare), a takvi Fc receptori se mogu dobiti rekombinantnom ekspresijom. Ovde je opisan takav pogodan vezujući test. Alternativno, afinitet vezivanja Fc domena ili bispecifičnih antigen vezujućih molekula koji aktiviraju ćelije koji sadrže Fc domen za Fc receptore može se proceniti pomoću ćelijskih linija za koje je poznato da eksprimiraju određene Fc receptore, kao što su NK ćelije koje eksprimiraju FcγIIIa receptor.
Efektorska funkcija Fc domena ili bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije koji sadrži Fc domen, može se izmeriti postupcima poznatim u struci. Ovde je opisan pogodan test za merenje ADCC-a. Drugi primeri in vitro testova za određivanje ADCC aktivnosti željenog molekula opisani su u U.S. Patentu br.5,500,362; Hellstrom et al. Proc Natl Acad Sci USA 83, 7059-7063 (1986) i Hellstrom et al., Proc Natl Acad Sci USA 82, 1499-1502 (1985); US Patent br. 5,821,337; Bruggemann et al., J Exp Med 166, 1351-1361 (1987). Alternativno, mogu se koristiti neradioaktivni postupci analiza (videti, npr. ACTI™ neradioaktivni test citotoksičnosti za protočnu citometriju (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA); i CytoTox 96<®>neradioaktivni test citotoksičnosti (Promega, Madison, WI)). U korisne efektorske ćelije za takve testove spadaju mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) i ćelije prirodne ubice (NK). Alternativno ili dodatno, ADCC aktivnost ispitivanog molekula može se odrediti in vivo, npr. na životinjskom modelu, kao što je onaj objavljen u Clynes et al., Proc Natl Acad Sci USA 95, 652–656 (1998).
U nekim otelotvorenjima, vezivanje Fc domena za komponentu komplementa, posebno za C1q, je smanjeno. U skladu sa tim, u nekim otelotvorenjima, kada je Fc domen konstruisan da ima smanjenu efektorsku funkciju, pomenuta smanjena efektorska funkcija uključuje smanjeni CDC. Testiranje vezivanja C1q se može obaviti radi utvrđivanja da li je bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije sposoban da vezuje C1q i da li stoga ima CDC aktivnost. Videti, npr. ELISA test C1q i C3c vezivanja u WO 2006/029879 i WO 2005/100402. Da bi se ocenila aktivacija komplementa, može se izvesti CDC test (videti, npr. Gazzano-Santoro et al., J Immunol Methods 202, 163 (1996); Cragg et al., Blood 101, 1045-1052 (2003); i Cragg i Glennie, Blood 103, 2738-2743 (2004)).
Modifikacije Fc domena koje podstiču heterodimerizaciju
Bispecifični antigen vezujući molekuli koji aktiviraju T ćelije iz ovog pronalaska sadrže različite antigen vezujuće delove, od kojih su neki spojeni sa jednom ili drugom od dve podjedinice Fc domena, tako da su dve podjedinice Fc domena tipično sadržane u dva neidentična polipeptidna lanca. Rekombinantna koekspresija ovih polipeptida i naknadna dimerizacija dovode do nekoliko mogućih kombinacija dva polipeptida. Da bi se poboljšali prinos i čistoća bispecifičnih antitela u rekombinantnoj proizvodnji, biće korisno da se u Fc domen bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije uvede modifikacija koja podstiče povezivanje željenih polipeptida.
U skladu s tim, u konkretnim otelotvorenjima, Fc domen bispecifičnih antitela iz ovog pronalaska sadrži modifikaciju koja podstiče povezivanje prve i druge podjedinice Fc domena. Mesto najveće proteinsko-proteinske interakcije između dve podjedinice Fc domena humanog IgG nalazi se u CH3 domenu Fc domena. Tako se u jednom otelotvorenju pomenuta modifikacija nalazi u CH3 domenu Fc domena.
U konkretnom otelotvorenju, pomenuta modifikacija je takozvana modifikacija „dugme u rupici“, koja sadrži modifikaciju „dugmeta“ u jednoj od dve podjedinice Fc domena i modifikaciju „rupice“ u drugoj od dve podjedinice Fc domena. Tehnologija „dugme u rupici” je opisana npr. u US 5.731.168; US 7,695,936; Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996) i Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001).
Po pravilu, ova metoda podrazumeva uvođenje izbočine ("dugme") na interfejs prvog polipeptida i odgovarajuće šupljine (“rupice”) na interfejs drugog polipetida, tako da se izbočina može uklopiti u šupljinu da bi se podstaklo formiranje heterodimera i sprečilo nastajanje homodimera. Izbočine su napravljene zamenom malih bočnih lanaca aminokiselina sa interfejsa prvog polipeptida većim bočnim lancima (npr. tirozinom ili triptofanom). Odgovarajuće šupljine, iste ili slične veličine kao izbočine, stvaraju se na interfejsu drugog polipeptida, zamenom velikih bočnih lanaca aminokiselina manjim (npr. alaninom ili treoninom).
U skladu sa tim, u jednom konkretnom otelotvorenju, u CH3 domenu prve podjedinice Fc domena bispecifičnih antitela iz ovog pronalaska, jedan aminokiselinski ostatak je zamenjen aminokiselinskim ostatkom koji ima veći volumen bočnog lanca, čime se stvara izbočina unutar CH3 domena prve podjedinice koja može da se uklopi u šupljinu unutar CH3 domena druge podjedinice, a u CH3 domenu druge podjedinice Fc domena jedan aminokiselinski ostatak je zamenjen aminokiselinskim ostatkom koji ima manji volumen bočnog lanca, čime se stvara šupljina unutar CH3 domena druge podjedinice unutar koje se može uklopiti izbočina u CH3 domenu prve podjedinice.
Izbočina i šupljina se mogu napraviti izmenom nukleinske kiseline koja kodira polipeptide, npr. mutagenezom specifičnom za lokaciju, ili sintezom peptida.
U konkretnom otelotvorenju, u CH3 domenu prve podjedinice Fc domena, treoninski ostatak na poziciji 366 zamenjen je triptofanskim ostatkom (T366W), a u CH3 domenu druge podjedinice Fc domena, tirozinski ostatak na poziciji 407 zamenjen je valinskim ostatkom (Y407V). U jednom otelotvorenju, u drugoj podjedinici Fc domena, dodatno je treoninski ostatak na poziciji 366 zamenjen serinskim ostatkom (T366S) i leucinski ostatak na poziciji 368 je zamenjen alaninskim ostatkom (L368A).
U još jednom otelotvorenju, u prvoj podjedinici Fc domena, dodatno je serinski ostatak na poziciji 354 zamenjen cisteinskim ostatkom (S354C), a u drugoj podjedinici Fc domena, dodatno je tirozinski ostatak na poziciji 349 zamenjen cisteinskim ostatkom (Y349C). Uvođenje ova dva ostatka cisteina dovodi do stvaranja disulfidnog mosta između dve podjedinice Fc domena, što dodatno stabilizuje dimer (Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)).
U jednom drugom otelotvorenju, modifikacija koja podstiče povezivanje prve i druge podjedinice Fc domena sadrži modifikaciju koja posreduje u elektrostatičkim efektima upravljanja, na primer, kao što je opisano u publikaciji PCT WO 2009/089004. Po pravilu, ovaj postupak podrazumeva zamenu jednog ili više aminokiselinskih ostataka na interfejsu dve podjedinice Fc domena naelektrisanim aminokiselinskim ostacima, tako da formiranje homodimera postaje elektrostatički nepovoljno, a heterodimerizacija elektrostatički povoljna.
U jednom otelotvorenju, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije i koji se vezuje za FolR1 i CD3 u skladu sa bilo kojim od gornjih otelotvorenja sadrži molekul imunoglobulina G (IgG) sa dva mesta vezivanja specifična za FolR1, pri čemu Fc deo prvog teškog lanca sadrži prvi modul za dimerizaciju, a Fc deo drugog teškog lanca sadrži drugi modul za dimerizaciju, što omogućava heterodimerizaciju dva teška lanca molekula IgG.
U dodatnom poželjnom otelotvorenju, prvi modul za dimerizaciju sadrži dugmad, a drugi modul za dimerizaciju sadrži rupice u skladu sa tehnologijom "dugme u rupici" (vidi Carter P.; Ridgway JBB; Presta LG: Immunotechnology, Volume 2, Number 1, February 1996, str. 73-73(1)).
Biološka svojstva i funkcionalne karakteristike bispecifičnih antigen vezujućih molekula koji aktiviraju T ćelije
Stručno lice iz ove oblasti poznaje prednost efikasnosti molekula koji selektivno razlikuje kancerogene od nekancerogenih zdravih ćelija. Jedan od načina za postizanje ovog cilja je pomoću selekcije odgovarajućeg cilja. Markeri eksprimirani isključivo na ćelijama tumora mogu se koristiti za selektivno ciljanje efektorskih molekula ili ćelija na ćelije tumora, uz poštedu normalnih ćelija koje ne eksprimiraju takav marker. Međutim, u nekim slučajevima, takozvani tumorski ćelijski markeri takođe su eksprimirani u normalnom tkivu, iako na nižim nivoima. Ova ekspresija u normalnom tkivu povećava mogućnost toksičnosti. Stoga je u struci postojala potreba za molekulima koji mogu selektivnije da ciljaju tumorske ćelije. Ovde opisani pronalazak obezbeđuje bispecifične antigen vezujuće molekule koje aktiviraju T ćelije i koji selektivno ciljaju FolR1 pozitivne tumorske ćelije, ali ne i normalne, nekancerogene ćelije koje eksprimiraju FolR1 na niskim nivoima ili ih uopšte ne eksprimiraju. U jednom otelotvorenju, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije sadrži najmanje dva, poželjno dva, FolR1 vezujuća dela sa relativno malim afinitetom koji proizvodi avidnost koja omogućava razlikovanje ćelija sa visokom i niskom ekspresijom FolR1. Pošto tumorske ćelije eksprimiraju FolR1 na visokom ili srednjem nivou, ovo otelotvorenje pronalaska selektivno se vezuje i/ili indukuje ubijanje tumorskih ćelija, ali ne i normalnih, nekancerogenih ćelija koje eksprimiraju FolR1 na niskom nivou ili ga uopšte ne eksprimiraju. U jednom otelotvorenju, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije ima obrnuti 2+1 format. U jednom otelotvorenju, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije indukuje ubijanje tumorskih ćelija pozitivnih na FolR1 posredstvom T ćelija, ali ne i netumorskih ćelija, i sadrži CD3 antigen vezujući deo koji sadrži CDR1 teškog lanca SEQ ID NO: 37, CDR2 teškog lanca SEQ ID NO: 38, CDR3 teškog lanca SEQ ID NO: 39, CDR1 lakog lanca SEQ ID NO: 32, CDR2 lakog lanca SEQ ID NO: 33, i CDR3 lakog lanca SEQ ID NO: 34, te dva FolR1 antigen vezujuća dela, od kojih svaki sadrži CDR1 teškog lanca SEQ ID NO: 8, CDR2 teškog lanca SEQ ID NO: 9, CDR3 teškog lanca SEQ ID NO: 50, CDR1 lakog lanca SEQ ID NO: 52, CDR2 lakog lanca SEQ ID NO: 53, i CDR3 lakog lanca SEQ ID NO:54.
U jednom konkretnom otelotvorenju, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije ne izaziva ubijanje normalnih ćelija koje na svojoj površini imaju manje od oko 1000 kopija FolR1.
Pored gore navedenih korisnih karakteristika, jedno otelotvorenje ovog pronalaska ne zahteva hemijsko umrežavanje ili hibridni pristup za proizvodnju. U skladu s tim, u jednom otelotvorenju, pronalazak obezbeđuje bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije koji se može proizvesti u CHO ćelijama. U jednom otelotvorenju, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije sadrži humanizovane i humane polipeptide. U jednom otelotvorenju, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije ne izaziva umrežavanje FcgR. U jednom takvom otelotvorenju, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije se može proizvesti u CHO ćelijama i sadrži CD3 antigen vezujući deo koji sadrži CDR1 teškog lanca SEQ ID NO: 37, CDR2 teškog lanca SEQ ID NO: 38, CDR3 teškog lanca SEQ ID NO: 39, CDR1 lakog lanca SEQ ID NO: 32, CDR2 lakog lanca SEQ ID NO: 33, i CDR3 lakog lanca SEQ ID NO: 34, te dva FolR1 antigen vezujuća dela, od kojih svaki sadrži CDR1 teškog lanca SEQ ID NO: 8, CDR2 teškog lanca SEQ ID NO: 9, CDR3 teškog lanca SEQ ID NO: 50, CDR1 lakog lanca SEQ ID NO: 52, CDR2 lakog lanca SEQ ID NO: 53, i CDR3 lakog lanca SEQ ID NO:54.
Kao što je gore napomenuto, neka otelotvorenja koja se ovde razmatraju podrazumevaju bispecifične antigen vezujuće molekule koji aktiviraju T ćelije koji imaju dva vezujuća dela koji daju sposobnost specifičnog vezivanja za FolR1 i jedan vezujući deo koji daje specifičnost za antigen CD3 koji aktivira T ćelije, pri čemu svaki vezujući deo za FolR1 koristi antigen sa niskim afinitetom. Pošto se ovaj molekul sastoji od dva antigen vezujuća dela koja daju sposobnost vezivanja za FolR1, sveukupna avidnost molekula, ipak, omogućava delotvorno vezivanje za ciljne ćelije koje izražavaju FolR1 i aktivaciju T ćelija kako bi se indukovala efektorska funkcija T ćelija. Uzimajući u obzir činjenicu da se, pored ekspresije na različitim nivoima u ćelijama tumora, FolR1 eksprimira i na vrlo niskim nivoima (npr. manje od oko 1000 kopija na površini ćelije) u određenim normalnim ćelijama, stručno lice iz ove oblasti može lako prepoznati prednost efikasnosti ovakvog molekula za upotrebu u vidu terapeutskog agensa. Takav molekul selektivno cilja tumorske ćelije zaobilazeći normalne ćelije. Takav molekul, prema tome, može se davati pojedincu kojem je to potrebno uz znatno manje razloga za zabrinutost vezanu za toksičnost, usled razlike između FolR1 pozitivnih normalnih ćelija u odnosu na molekule koji se vezuju za FolR1 sa velikim afinitetom radi indukovanja efektorske funkcije.
U jednom otelotvorenju, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije vezuje humani FolR1 sa prividnom KDod oko 5,36 do oko 4 nM. U jednom otelotvorenju, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije vezuje FolR1 čoveka i cinomolgusa sa prividnom KDod oko 4 nM. U jednom otelotvorenju, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije vezuje mišji FolR1 sa prividnom KDod oko 1,5 nM. U jednom otelotvorenju, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije vezuje humani FolR1 sa KDjednovalentnog vezivanja od najmanje oko 1000 nM. U konkretnom otelotvorenju, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije vezuje se za humani i cinomolgusov FolR1 sa prividnom KDod oko 4 nM, za mišji FolR1 sa prividnom KDod oko 1,5 Nm, a sadrži CD3 antigen vezujući deo koji sadrži CDR1 teškog lanca SEQ ID NO: 37, CDR2 teškog lanca SEQ ID NO: 38, CDR3 teškog lanca SEQ ID NO: 39, CDR1 lakog lanca SEQ ID NO: 32, CDR2 lakog lanca SEQ ID NO: 33, i CDR3 lakog lanca SEQ ID NO: 34, te dva FolR1 antigen vezujuća dela, od kojih svaki sadrži CDR1 teškog lanca SEQ ID NO: 8, CDR2 teškog lanca SEQ ID NO: 9, CDR3 teškog lanca SEQ ID NO: 50, CDR1 lakog lanca SEQ ID NO: 52, CDR2 lakog lanca SEQ ID NO: 53, i CDR3 lakog lanca SEQ ID NO:54. U jednom otelotvorenju, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije vezuje se za humani FolR1 sa jednovalentnom vezujućom KDod najmanje oko 1000 nM i sastoji se od CD3 antigen vezujućeg dela koji sadrži sekvencu CDR1 teškog lanca SEQ ID NO: 37, CDR2 teškog lanca SEQ ID NO: 38, CDR3 teškog lanca SEQ ID NO: 39, CDR1 lakog lanca SEQ ID NO: 32, CDR2 lakog lanca SEQ ID NO: 33, i CDR3 lakog lanca SEQ ID NO: 34, te dva FolR1 antigen vezujuća dela, od kojih svaki sadrži CDR1 teškog lanca SEQ ID NO: 8, CDR2 teškog lanca SEQ ID NO: 9, CDR3 teškog lanca SEQ ID NO: 50, CDR1 lakog lanca SEQ ID NO: 52, CDR2 lakog lanca SEQ ID NO: 53, i CDR3 lakog lanca SEQ ID NO:54. Kao što je gore opisano, ovde razmatrani bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije može indukovati T ćelijsku efektorsku funkciju, npr. ekspresiju ćelijskih površinskih markera, proizvodnju citokina, ubijanje posredovano T ćelijama. U jednom otelotvorenju, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije indukuje in vitro ubijanje, posredstvom T ćelija, ciljnih ćelija koje eksprimiraju FolR1, kao što su humane tumorske ćelije. U jednom otelotvorenju, T ćelija je CD8 pozitivna T ćelija. Primeri humanih tumorskih ćelija koje eksprimiraju FolR1 obuhvataju, ali nisu ograničeni na, Hela, Skov-3, HT-29 i HRCEpiC ćelije. Ostale FolR1 pozitivne ćelije humanog kancera koje se mogu koristiti za in vitro testiranje lako su dostupne stručnom licu. U jednom otelotvorenju, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije indukuje in vitro ubijanje, posredstvom T ćelija, humanih tumorskih ćelija koje eksprimiraju FolR1 sa EC50 između oko 36 pM i oko 39.573 pM nakon 24 sata. Posebno se razmatraju bispecifični antigen vezujući molekuli koji aktiviraju T ćelije koji indukuju in vitro ubijanje, posredstvom T ćelija, tumorskih ćelija koje eksprimiraju FolR1 sa EC50 od oko 36 pM nakon 24 sata. U jednom otelotvorenju, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije indukuje in vitro ubijanje, posredstvom T ćelija, tumorskih ćelija koje eksprimiraju FolR1 sa EC50 od oko 178,4 pM nakon 24 sata. U jednom otelotvorenju, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije indukuje in vitro ubijanje, posredstvom T ćelija, tumorskih ćelija koje eksprimiraju FolR1 sa EC50 od oko 134,5 pM ili više nakon 48 sati. EC50 se može izmeriti metodama poznatim u struci, na primer metodama koje su ovde objavljene u primerima.
U jednom otelotvorenju, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije iz bilo kog od gornjih otelotvorenja indukuje povećanje ćelijske površinske ekspresije najmanje jednog od CD25 i CD69 na T ćeliji, mereno protočnom citometrijom. U jednom otelotvorenju, T ćelija je CD4 pozitivna ili CD8 pozitivna T ćelija.
U jednom otelotvorenju, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije u bilo kom od gore navedenih otelotvorenja vezuje se za FolR1 eksprimiran na humanoj tumorskoj ćeliji. U jednom otelotvorenju, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije iz bilo kog od gore navedenih otelotvorenja vezuje se za konformacioni epitop na humanom FolR1. U jednom otelotvorenju, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije iz bilo kog od gore navedenih otelotvorenja ne vezuje se za humani folatni receptor 2 (FolR2) ili za humani folatni receptor 3 (FolR3). U jednom otelotvorenju bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije iz bilo kog od gore navedenih otelotvorenja, antigen vezujući deo se vezuje za FolR1 polipeptid koji sadrži aminokiseline 25 do 234 humanog FolR1 (SEQ ID NO: 227). U jednom otelotvorenju bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije iz bilo kog od gore navedenih otelotvorenja, FolR1 antigen vezujući deo se vezuje za FolR1 polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 227, 230 i 231, i pri čemu se FolR1 antigen vezujući deo ne vezuje za FolR polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 228 i 229. U jednom specifičnom otelotvorenju, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije sadrži FolR1 antigen vezujući deo koji se vezuje za FolR1 polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 227, 230 i 231, a pri čemu se FolR1 antigen vezujući deo ne vezuje za FolR polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 228 i 229, i sadrži CD3 antigen vezujući deo koji sadrži CDR1 teškog lanca SEQ ID NO: 37, CDR2 teškog lanca SEQ ID NO: 38, CDR3 teškog lanca SEQ ID NO: 39, CDR1 lakog lanca SEQ ID NO: 32, CDR2 lakog lanca SEQ ID NO: 33, i CDR3 lakog lanca SEQ ID NO: 34, te dva FolR1 antigen vezujuća dela, od kojih svaki sadrži CDR1 teškog lanca SEQ ID NO: 8, CDR2 teškog lanca SEQ ID NO: 9, CDR3 teškog lanca SEQ ID NO: 50, CDR1 lakog lanca SEQ ID NO: 52, CDR2 lakog lanca SEQ ID NO: 53, i CDR3 lakog lanca SEQ ID NO:54.
Što se tiče FolR1, ovde razmatrani bispecifični antigen vezujući molekuli koji aktiviraju T ćelije mogu imati agonistički, antagonistički ili neutralni efekat. Primeri agonističkog efekta obuhvataju indukciju ili pojačavanje signalizacije pomoću FolR1 nakon stupanja u vezu FolR1 vezujućeg dela sa FolR1 receptorom na ciljnoj ćeliji. Primeri antagonističke aktivnosti obuhvataju ukidanje ili smanjenje signalizacije putem FolR1 nakon stupanja u vezu FolR1 vezujućeg dela sa FolR1 receptorom na ciljnoj ćeliji. To se, na primer, može dogoditi blokiranjem ili smanjenjem interakcije između folata i FolR1.
Primeri antagonista vezivanja ose PD-1 za upotrebu u pronalasku
Ovde se obezbeđuju metode za lečenje ili odlaganje napredovanja raka kod pojedinca, koje podrazumevaju davanje pojedincu efikasne količine bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije i antagonista vezivanja ose PD-1. Na primer, pod antagonistom vezivanja ose PD-1 se podrazumevaju antagonist vezivanja PD-1, antagonist vezivanja PDL1 i antagonist vezivanja PDL2. Alternativni nazivi za "PD-1" su CD279 i SLEB2. Alternativni nazivi za "PDL1" su B7-H1, B7-4, CD274 i B7-H. Alternativni nazivi za "PDL2" su B7-DC, Btdc i CD273. U nekim otelotvorenjima, PD-1, PDL1 i PDL2 su humani PD-1, PDL1 i PDL2.
U nekim otelotvorenjima, antagonist vezivanja PD-1 je molekul koji inhibira vezivanje PD-1 za njegove partnere za vezivanje liganda. U jednom specifičnom aspektu, partneri PD-1 za vezivanje liganda su PDL1 i/ili PDL2. U jednom drugom otelotvorenju, antagonist vezivanja PDL1 je molekul koji inhibira vezivanje PDL1 za njegove partnere za vezivanje. U jednom specifičnom aspektu, partneri PDL1 za vezivanje su PD-1 i/ili B7-1. U jednom drugom otelotvorenju, antagonist vezivanja PDL2 je molekul koji inhibira vezivanje PDL2 za njegove partnere za vezivanje. U jednom specifičnom aspektu, partner PDL2 za vezivanje je PD-1. Antagonist može biti antitelo, njegov antigen vezujući fragment, imunoadhezin, fuzioni protein ili oligopeptid. U nekim otelotvorenjima, antagonist vezivanja PD-1 je anti-PD-1 antitelo (npr. humano antitelo, humanizovano antitelo ili himerno antitelo). U nekim otelotvorenjima, anti-PD-1 antitelo je odabrano iz grupe koja se sastoji od nivolumaba, pembrolizumaba i CT-011. U nekim otelotvorenjima, antagonist vezivanja PD-1 je imunoadhezin (npr. imunoadhezin koji sadrži ekstracelularni ili PD-1 vezujući deo od PDL1 ili PDL2, fuzionisan sa konstantnim regionom (npr. Fc region imunoglobulinske sekvence). U nekim otelotvorenjima, antagonist vezivanja PD-1 je AMP-224. Nivolumab, poznat i kao MDX-1106-04, MDX-1106, ONO-4538, BMS-936558 i OPDIVO<®>, je anti-PD-1 antitelo opisano u WO2006/121168.
Pembrolizumab, poznat i kao MK-3475, Merck 3475, lambrolizumab, KEYTRUDA<®>i SCH-900475, je anti-PD-1 antitelo opisano u WO2009/114335. CT-011, poznat i kao hBAT, hBAT-1 je anti-PD-1 antitelo opisano u WO2009/101611. AMP-224, poznat i kao B7-DCIg, je PDL2-Fc fuzioni rastvorljivi receptor opisan u WO2010/027827 i u WO2011/066342.
U nekim otelotvorenjima, anti-PD-1 antitelo je nivolumab (CAS registarski broj: 946414-94-4). U još jednom otelotvorenju, obezbeđuje se izolovano anti-PD-1 antitelo koje sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca SEQ ID NO: 274 i/ili varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca SEQ ID NO: 275. U još jednom otelotvorenju, obezbeđuje se izolovano anti-PD-1 antitelo koje sadrži sekvencu teškog lanca i lakog lanca, pri čemu:
(a) sekvenca teškog lanca ima procenat identičnosti sekvence od najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% ili 100% sa sekvencom teškog lanca:
(b) sekvenca lakog lanca ima procenat identičnosti sekvence od najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% ili 100% sa sekvencom lakog lanca:
U nekim otelotvorenjima, anti-PD-1 antitelo je pembrolizumab (CAS registarski broj: 1374853-91-4). U još jednom otelotvorenju, obezbeđuje se izolovano anti-PD-1 antitelo koje sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca SEQ ID NO: 276 i/ili varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca SEQ ID NO: 277. U još jednom otelotvorenju, obezbeđuje se izolovano anti-PD-1 antitelo koje sadrži sekvencu teškog lanca i lakog lanca, pri čemu:
(a) sekvenca teškog lanca ima procenat identičnosti sekvence od najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% ili 100% sa sekvencom teškog
(b) sekvenca lakog lanca ima procenat identičnosti sekvence od najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% ili 100% sa sekvencom lakog lanca:
U nekim otelotvorenjima, antagonist vezivanja PDL1 je anti-PDL1 antitelo. U nekim otelotvorenjima, antagonist vezivanja anti-PDL1 je odabran iz grupe koja se sastoji od YW243.55.S70, MPDL3280A, MDX-1105 i MEDI4736. MDX-1105, poznat i kao BMS-936559, je anti-PDL1 antitelo opisano u WO2007/005874. Antitelo YW243.55.S70 (sekvence varijabilnog regiona teškog i lakog lanca prikazane u SEQ ID NO:20, odnosno 21) je anti-PDL1 opisan u WO 2010/077634 A1. MEDI4736 je anti-PDL1 antitelo opisano u WO2011/066389 i u US2013/034559, pri čemu je svaki ovde uključen referencom kao da je iznet u celosti.
Primeri anti-PDL1 antitela korisnih za metode iz ovog pronalaska, i metode za njihovu proizvodnju su opisane u PCT patentnoj prijavi WO 2010/077634 A1 i u US Patentu br.
8,217,149, pri čemu je svaki ovde uključen referencom kao da je iznet u celosti.
U nekim otelotvorenjima, antagonist vezivanja ose PD-1 je anti-PDL1 antitelo. U nekim otelotvorenjima, anti-PDL1 antitelo je sposobno da inhibira vezivanje između PDL1 i PD-1 i/ili između PDL1 i B7-1. U nekim otelotvorenjima, anti-PDL1 antitelo je monoklonsko antitelo. U nekim otelotvorenjima, anti-PDL1 antitelo je fragment antitela izabran iz grupe koja sadrži fragmente Fab, Fab'-SH, Fv, scFv i (Fab')2. U nekim otelotvorenjima, anti-PDL1 antitelo je humanizovano antitelo. U nekim otelotvorenjima, anti-PDL1 antitelo je humano antitelo.
Anti-PDL1 antitela korisna za ovaj pronalazak, uključujući kompozicije koje sadrže takva antitela, poput onih opisanih u WO 2010/077634 A1, mogu se koristiti u kombinaciji sa bispecifičnim antigen vezujućim molekulom koji aktivira T ćelije i opciono sa anti-TIM3 antagonističkim antitelom, za lečenje raka. U nekim otelotvorenjima, anti-PDL1 antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:382, i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:383.
U jednom otelotvorenju, anti-PDL1 antitelo sadrži polipeptid varijabilnog regiona teškog lanca koji sadrži HVR-H1, HVR-H2 i HVR-H3 sekvencu, pri čemu:
(a) HVR-H1 sekvenca j
(b) HVR-H2 sekvenca j
(c) HVR-H3 sekvenca j
i pri čemu: X1 je D ili G; X2 je S ili L; X3 je T ili S.
U jednom konkretnom aspektu, X1 je D; X2 je S i X3 je T. U još jednom aspektu, polipeptid dalje sadrži okvirne sekvence varijabilnog regiona teškog lanca postavljene uporedo između HVR-ova prema formuli: (HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVRH3)-(HC-FR4). U još jednom aspektu, okvirne sekvence su izvedene iz sekvenci humanog konsenzusnog okvira. U još jednom aspektu, okvirne sekvence su okvir konsenzusa VH podgrupe III. U još jednom aspektu, najmanje jedna od okvirnih sekvenci je sledeća:
HC-FR4 je (SEQ ID NO:298).
U još jednom aspektu, polipeptid teškog lanca se nadalje kombinuje sa varijabilnim regionom lakog lanca koji sadrži HVR-L1, HVR-L2 i HVR-L3, pri čemu:
(a) HVR-L1 sekvenca j
(b) HVR-L2 sekvenca j
(c) HVR-L3 sekvenca j
i pri čemu: X4 je D ili V; X5 je V ili I; X6, je S ili N; X7 je A ili F; X8 je V ili L; X9 je F ili T; X10 je Y ili A; X11 je Y, G, F, ili S; X12 je L, Y, F ili W; X13 je Y, N, A, T, G, F ili I; X14 je H, V, P, T ili I; X15 je A, W, R, P ili T.
U još jednom aspektu, X4 je D; X5 je V; X6 je S; X7 je A; X8 je V; X9 je F; X10 je Y; X11 je Y; X12 je F; X13 je Y; X14 je H; X15 je A. U još jednom aspektu, laki lanac nadalje sadrži okvirne sekvence varijabilnog regiona lakog lanca postavljene uporedo između HVR-ova prema formuli: (LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LCFR4).
U još jednom aspektu, okvirne sekvence su izvedene iz sekvenci humanog konsenzusnog okvira. U još jednom aspektu, okvirne sekvence su konsenzusni okvir VL kapa I. U još jednom aspektu, bar jedna od okvirnih sekvenci je sledeća:
U jednom drugom otelotvorenju, obezbeđuje se izolovano anti-PDL1 antitelo ili njegov antigen vezujući fragment koji sadrži sekvencu varijabilnog regiona teškog i lakog lanca, pri čemu:
(a) teški lanac sadrži i HVR-H1, HVR-H2 i HVR-H3, i pri čemu:
(i) HVR-H1 sekvenca j
(ii) HVR-H2 sekvenca j
(iii) HVR-H3 sekvenca j
(a) laki lanac sadrži HVR-L1, HVR-L2 i HVR-L3, i pri čemu:
(i) HVR-L1 sekvenca je (SEQ ID NO:286)
(ii) HVR-L2 sekvenca
(iii) HVR-L3 sekvenca j
I pri čemu: X1 je D ili G; X2 je S ili L; X3 je T ili S; X4 je D ili V; X5 je V ili I; X6 je S ili N; X7 je A ili F; X8 je V ili L; X9 je F ili T; X10 je Y ili A; X11 je Y, G, F, ili S; X12 je L, Y, F ili W; X13 je Y, N, A, T, G, F ili I; X14 je H, V, P, T ili I; X15 je A, W, R, P ili T.
U određenom aspektu, X1 je D; X2 je S, a X3 je T. U drugom aspektu, X4 je D; X5 je V; X6 je S; X7 je A; X8 je V; X9 je F; X10 je Y; X11 je Y; X12 je F; X13 je Y; X14 je H; X15 je A. U još jednom aspektu, X1 je D; X2 je S i X3 je T, X4 je D; X5 je V; X6 je S; X7 je A; X8 je V; X9 je F; X10 je Y; X11 je Y; X12 je L; X13 je Y; X14 je H, a X15 je A.
U još jednom aspektu, varijabilni region teškog lanca sadrži jednu ili više okvirnih sekvenci smeštenih uporedo između HVR-ova kao: (HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HCFR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4), a varijabilni regioni lakog lanca sadrže jednu ili više okvirnih sekvenci smeštenih uporedo između HVR-ova kao: (LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVRL2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4). U još jednom aspektu, okvirne sekvence su izvedene iz sekvenci humanog konsenzusnog okvira. U još jednom aspektu, okvirne sekvence teških lanaca izvedene su iz sekvence Kabatove podgrupe I, II ili III. U još jednom aspektu, okvirna sekvenca teškog lanca je okvir konsenzusa VH podgrupe III. U još jednom aspektu, jedna ili više okvirnih sekvenci teškog lanca je sledeća:
U još jednom aspektu, okvirne sekvence lakog lanca izvedene su iz sekvenci Kabatovih podgrupa kapa I, II, II ili IV. U još jednom aspektu, okvirne sekvence lakog lanca su konsenzusni okvir VL kapa I. U još jednom aspektu, jedna ili više okvirnih sekvenci lakog lanca je sledeća:
U još jednom specifičnom aspektu, antitelo nadalje obuhvata humani ili mišji konstantni region. U još jednom aspektu, humani konstantni region je odabran iz grupe koju čine IgG1, IgG2, IgG2, IgG3, IgG4. U još jednom specifičnom aspektu, humani konstantni region je IgG1. U još jednom aspektu, mišji konstantni region je odabran iz grupe koju čine IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3. U još jednom aspektu, mišji konstantni region je IgG2A. U još jednom specifičnom aspektu, antitelo ima smanjenu ili minimalnu efektorsku funkciju. U još jednom specifičnom aspektu, minimalna efektorska funkcija rezultat je "Fc mutacije bez efektora" ili aglikozilacije. U još jednom otelotvorenju, Fc mutacija bez efektora je supstitucija N297A ili D265A/N297A u konstantnom regionu.
U još jednom otelotvorenju, obezbeđuje se anti-PDL1 antitelo koje sadrži sekvencu varijabilnog regiona teškog i lakog lanca, pri čemu:
(a) teški lanac nadalje sadrži HVR-H1, HVR-H2 i HVR-H3 sekvencu koja ima procenat identičnosti sekvence od najmanje 85% sekvence (SEQ ID NO:289),
ili
(b) laki lanac nadalje sadrži HVR-L1, HVR-L2 i HVR-L3 sekvencu koja ima procenat identičnosti sekvence od najmanje 85% sekvence (SEQ ID jednom specifičnom aspektu, identičnost sekvence je 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100%. U još jednom aspektu, varijabilni region teškog lanca sadrži jednu ili više okvirnih sekvenci smeštenih uporedno između HVR-ova kao: (HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4), a varijabilni regioni lakog lanca sadrže jednu ili više okvirnih sekvenci smeštenih uporedo između HVR-ova kao: (LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4). U još jednom aspektu, okvirne sekvence su izvedene iz sekvenci humanog konsenzusnog okvira. U još jednom aspektu, okvirne sekvence teških lanaca izvedene su iz sekvence Kabatove podgrupe I, II ili III. U još jednom aspektu, okvirna sekvenca teškog lanca je okvir konsenzusa VH podgrupe III. U još jednom aspektu, jedna ili više okvirnih sekvenci teškog lanca je sledeća:
U još jednom aspektu, okvirne sekvence lakog lanca izvedene su iz sekvenci Kabatovih podgrupa kapa I, II, II ili IV. U još jednom aspektu, okvirne sekvence lakog lanca su konsenzusni okvir VL kapa I. U još jednom aspektu, jedna ili više okvirnih sekvenci lakog lanca je sledeća:
LC-FR4 (SEQ ID NO:303).
U još jednom specifičnom aspektu, antitelo nadalje obuhvata humani ili mišji konstantni region. U još jednom aspektu, humani konstantni region je odabran iz grupe koju čine IgG1, IgG2, IgG2, IgG3, IgG4. U još jednom specifičnom aspektu, humani konstantni region je IgG1. U još jednom aspektu, mišji konstantni region je odabran iz grupe koju čine IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3. U još jednom aspektu, mišji konstantni region je IgG2A. U još jednom specifičnom aspektu, antitelo ima smanjenu ili minimalnu efektorsku funkciju. U još jednom specifičnom aspektu, minimalna efektorska funkcija rezultat je "Fc mutacije bez efektora" ili aglikozilacije. U još jednom otelotvorenju, Fc mutacija bez efektora je supstitucija N297A ili D265A/N297A u konstantnom regionu.
U još jednom otelotvorenju, obezbeđuje se izolovano anti-PDL1 antitelo koje sadrži sekvencu varijabilnog regiona teškog i lakog lanca, pri čemu:
(a) sekvenca teškog lanca ima procenat identičnosti sekvence od najmanje 85% sekvence teškog lanca:
(b) sekvenca lakog lanca ima procenat identičnosti sekvence od najmanje 85% sekvence lakog lanca:
U jednom specifičnom aspektu, identičnost sekvence je 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100%. U još jednom aspektu, varijabilni region teškog lanca sadrži jednu ili više okvirnih sekvenci smeštenih uporedno između HVR-ova kao: (HCFR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4), a varijabilni regioni lakog lanca sadrže jednu ili više okvirnih sekvenci smeštenih uporedo između HVR-ova kao: (LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4). U još jednom aspektu, okvirne sekvence su izvedene iz sekvenci humanog konsenzusnog okvira. U još jednom aspektu, okvirne sekvence teškog lanca izvedene su iz sekvence Kabatove podgrupe I, II ili III. U još jednom aspektu, okvirna sekvenca teškog lanca je okvir konsenzusa VH podgrupe III.
U još jednom aspektu, jedna ili više okvirnih sekvenci teškog lanca je sledeća: HC-FR1 (SEQ ID NO:295)
U još jednom aspektu, okvirne sekvence lakog lanca izvedene su iz sekvenci Kabatovih podgrupa kapa I, II, II ili IV. U još jednom aspektu, okvirne sekvence lakog lanca su konsenzusni okvir VL kapa I. U još jednom aspektu, jedna ili više okvirnih sekvenci lakog lanca je sledeća:
U još jednom specifičnom aspektu, antitelo nadalje obuhvata humani ili mišji konstantni region. U još jednom aspektu, humani konstantni region je odabran iz grupe koju čine IgG1, IgG2, IgG2, IgG3, IgG4. U još jednom specifičnom aspektu, humani konstantni region je IgG1. U još jednom aspektu, mišji konstantni region je odabran iz grupe koju čine IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3. U još jednom aspektu, mišji konstantni region je IgG2A. U još jednom specifičnom aspektu, antitelo ima smanjenu ili minimalnu efektorsku funkciju. U još jednom specifičnom aspektu, minimalna efektorska funkcija nastaje proizvodnjom u prokariotskim ćelijama. U još jednom specifičnom aspektu, minimalna efektorska funkcija rezultat je "Fc mutacije bez efektora" ili aglikozilacije. U još jednom otelotvorenju, Fc mutacija bez efektora je supstitucija N297A ili D265A/N297A u konstantnom regionu.
U još jednom otelotvorenju, obezbeđuje se izolovano anti-PDL1 antitelo koje sadrži sekvencu varijabilnog regiona teškog i lakog lanca, pri čemu:
(a) sekvenca teškog lanca ima procenat identičnosti sekvence od najmanje 85% sekvence teškog lanca:
(b) sekvenca lakog lanca ima procenat identičnosti sekvence od najmanje 85% sekvence lakog lanca:
(SEQ ID NO:383).
U još jednom otelotvorenju, obezbeđuje se izolovano anti-PDL1 antitelo koje sadrži sekvencu varijabilnog regiona teškog i lakog lanca, pri čemu:
(a) sekvenca teškog lanca ima procenat identičnosti sekvence od najmanje 85% sekvence teškog lanca:
(b) sekvenca lakog lanca ima procenat identičnosti sekvence od najmanje 85% sekvence lakog lanca:
(SEQ ID NO:282).
U jednom specifičnom aspektu, identičnost sekvence je 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100%. U još jednom aspektu, varijabilni region teškog lanca sadrži jednu ili više okvirnih sekvenci smeštenih uporedno između HVR-ova kao: (HCFR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4), a varijabilni regioni lakog lanca sadrže jednu ili više okvirnih sekvenci smeštenih uporedo između HVR-ova kao: (LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4). U još jednom aspektu, okvirne sekvence su izvedene iz sekvenci humanog konsenzusnog okvira. U još jednom aspektu, okvirne sekvence teškog lanca izvedene su iz sekvence Kabatove podgrupe I, II ili III. U još jednom aspektu, okvirna sekvenca teškog lanca je okvir konsenzusa VH podgrupe III. U još jednom aspektu, jedna ili više okvirnih sekvenci teškog lanca je sledeća:
U još jednom aspektu, okvirne sekvence lakog lanca izvedene su iz sekvenci Kabatovih podgrupa kapa I, II, II ili IV. U još jednom aspektu, okvirne sekvence lakog lanca su konsenzusni okvir VL kapa I. U još jednom aspektu, jedna ili više okvirnih sekvenci lakog lanca je sledeća:
LC-FR3 (SEQ ID NO:302)
U još jednom specifičnom aspektu, antitelo nadalje obuhvata humani ili mišji konstantni region. U još jednom aspektu, humani konstantni region je odabran iz grupe koju čine IgG1, IgG2, IgG2, IgG3, IgG4. U još jednom specifičnom aspektu, humani konstantni region je IgG1. U još jednom aspektu, mišji konstantni region je odabran iz grupe koju čine IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3. U još jednom aspektu, mišji konstantni region je IgG2A. U još jednom specifičnom aspektu, antitelo ima smanjenu ili minimalnu efektorsku funkciju. U još jednom specifičnom aspektu, minimalna efektorska funkcija nastaje proizvodnjom u prokariotskim ćelijama. U još jednom specifičnom aspektu, minimalna efektorska funkcija rezultat je "Fc mutacije bez efektora" ili aglikozilacije. U još jednom otelotvorenju, Fc mutacija bez efektora je supstitucija N297A ili D265A/N297A u konstantnom regionu.
U još jednom otelotvorenju, anti-PDL1 antitelo je MPDL3280A (CAS registarski broj: 1422185-06-5). U još jednom otelotvorenju, obezbeđuje se izolovano anti-PDL1 antitelo koje sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca SEQ ID NO:24 ili SEQ ID NO:28 i/ili varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca SEQ ID NO:21. U još jednom otelotvorenju, obezbeđuje se izolovano anti-PDL1 antitelo koje sadrži sekvencu teškog lanca i/ili sekvencu lakog lanca, pri čemu:
(a) sekvenca teškog lanca ima procenat identičnosti sekvence od najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% ili 100% sa sekvencom teškog lanca:
(b) sekvenca lakog lanca ima procenat identičnosti sekvence od najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% ili 100% sa sekvencom lakog lanca:
ID
NO:279).
U još jednom otelotvorenju, predmetni pronalazak obezbeđuje kompozicije koje sadrže bilo koje od gore opisanih anti-PDL1 antitela u kombinaciji sa najmanje jednim farmaceutski prihvatljivim nosačem.
U još jednom otelotvorenju, obezbeđuje se izolovana nukleinska kiselina koja kodira sekvencu varijabilnog regiona lakog ili teškog lanca anti-PDL1 antitela, pri čemu:
(a) teški lanac dodatno sadrži HVR-H1, HVR-H2 i HVR-H3 sekvencu koja ima procenat identičnosti sekvence od najmanje 85% u odnosu na (SEQ ID
NO:291), ili
(b) laki lanac dodatno sadrži HVR-L1, HVR-L2 i HVR-L3 sekvencu koja ima procenat identičnosti sekvence od najmanje 85% u odnosu na (SEQ ID NO:292), jednom specifičnom aspektu, identičnost sekvence je 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100%. U jednom aspektu, varijabilni region teškog lanca sadrži jednu ili više okvirnih sekvenci smeštenih uporedo između HVR-ova kao: (HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4), a varijabilni regioni lakog lanca sadrže jednu ili više okvirnih sekvenci smeštenih uporedo između HVR-ova kao: (LCFR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4). U još jednom aspektu, okvirne sekvence su izvedene iz sekvenci humanog konsenzusnog okvira. U još jednom aspektu, okvirne sekvence teškog lanca izvedene su iz sekvence Kabatove podgrupe I, II ili III. U još jednom aspektu, okvirna sekvenca teškog lanca je okvir konsenzusa VH podgrupe III.
U još jednom aspektu, jedna ili više okvirnih sekvenci teškog lanca je sledeća:
HC-FR3 (SEQ ID NO:297)
U još jednom aspektu, okvirne sekvence lakog lanca izvedene su iz sekvenci Kabatovih podgrupa kapa I, II, II ili IV. U još jednom aspektu, okvirne sekvence lakog lanca su konsenzusni okvir VL kapa I. U još jednom aspektu, jedna ili više okvirnih sekvenci lakog lanca je sledeća:
U još jednom specifičnom aspektu, ovde opisano antitelo (kao što je anti-PD-1 antitelo, anti-PDL1 antitelo ili anti-PDL2 antitelo) dodatno sadrži humani ili mišji konstantni region. U još jednom aspektu, humani konstantni region je odabran iz grupe koju čine IgG1, IgG2, IgG2, IgG3, IgG4. U još jednom specifičnom aspektu, humani konstantni region je IgG1. U još jednom aspektu, mišji konstantni region je odabran iz grupe koju čine IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3. U još jednom aspektu, mišji konstantni region je IgG2A. U još jednom specifičnom aspektu, antitelo ima smanjenu ili minimalnu efektorsku funkciju. U još jednom specifičnom aspektu, minimalna efektorska funkcija nastaje proizvodnjom u prokariotskim ćelijama. U još jednom specifičnom aspektu, minimalna efektorska funkcija rezultat je "Fc mutacije bez efektora" ili aglikozilacije. U još jednom aspektu, Fc mutacija bez efektora je supstitucija N297A ili D265A/N297A u konstantnom regionu.
U još jednom aspektu, obezbeđuju se nukleinske kiseline koje kodiraju bilo koje antitelo opisano u ovom dokumentu. U nekim otelotvorenjima, nukleinska kiselina dodatno sadrži vektor pogodan za ekspresiju nukleinske kiseline koja kodira bilo koje od prethodno opisanih anti-PDL1, anti-PD-1, ili anti-PDL2 antitela. U još jednom specifičnom aspektu, vektor dodatno sadrži ćeliju domaćina pogodnu za ekspresiju nukleinske kiseline. U još jednom specifičnom aspektu, ćelija domaćina je eukariotska ili prokariotska ćelija. U još jednom specifičnom aspektu, eukariotska ćelija je ćelija sisara, poput ćelija jajnika kineskog hrčka (CHO).
Antitelo ili njegov antigen vezujući fragment se mogu proizvesti pomoću metoda poznatih u struci, na primer, u procesu koji se sastoji od kultivacije ćelija domaćina koje sadrže nukleinsku kiselinu koja kodira bilo koje od prethodno opisanih anti-PDL1, anti-PD-1, ili anti-PDL2 antitela ili njegov antigen vezujući fragment u obliku pogodnom za ekspresiju, pod pogodnim uslovima za proizvodnju takvog antitela ili fragmenta i izolovanje tog antitela ili fragmenta.
U nekim otelotvorenjima, izolovano anti-PDL1 antitelo je aglikozilovano.
Glikozilacija antitela je tipično N-vezana ili O-vezana. N-vezan se odnosi na vezivanje ugljenohidratne grupe na bočni lanac ostatka asparagina. Tripeptidne sekvence asparagin-X-serin i asparagin-X-treonin, gde je X bilo koja aminokiselina osim prolina, su sekvence prepoznavanja za enzimsko vezivanje ugljenohidratne grupe za bočni lanac asparagina. Stoga, prisustvo bilo koje od ovih tripeptidnih sekvenci u polipeptidu stvara potencijalno mesto glikozilacije. O-vezana glikozilacija se odnosi na vezivanje jednog od šećera N-acilgalaktozamina, galaktoze ili ksiloze na hidroksiaminokiselinu, najčešće serin ili treonin, mada se mogu koristiti i 5-hidroksiprolin ili 5-hidroksilizin. Uklanjanje mesta glikozilacije sa antitela se vrši na pogodan način promenom aminokiselinske sekvence tako da se ukloni neka od gore opisanih tripeptidnih sekvenci (za N-vezana mesta glikozilacije). Ova izmena se može izvršiti supstitucijom ostatka asparagina, serina ili treonina unutar mesta glikozilacije drugim aminokiselinskim ostatkom (npr. glicinom, alaninom ili konzervativnom supstitucijom).
U bilo kom otelotvorenju iz ovog dokumenta, izolovano anti-PDL1 antitelo se može vezati za humani PDL1, na primer, humani PDL1 kao što je prikazano u UniProtKB/Swiss-Prot pristupni br. Q9NZQ7.1, ili nekoj njegovoj varijanti.
U još jednom otelotvorenju, pronalazak obezbeđuje kompoziciju koja sadrži anti-PDL1, anti-PD-1, ili anti-PDL2 antitelo ili njegov antigen vezujući fragment, kako su ovde obezbeđeni, i najmanje jedan farmaceutski prihvatljiv nosač. U nekim otelotvorenjima, anti-PDL1, anti-PD-1 ili anti-PDL2 antitelo ili njegov antigen vezujući fragment, koji se daju pojedincu, je kompozicija koja sadrži jedan ili više farmaceutski prihvatljivih nosača.
Može se koristiti bilo koji od ovde opisanih farmaceutski prihvatljivih nosača ili onih poznatih u struci.
U nekim otelotvorenjima, ovde opisano anti-PDL1 antitelo je formulacija koja sadrži antitelo u količini od oko 60 mg/ml, histidin acetat u koncentraciji od oko 20 mM, saharozu u koncentraciji od oko 120 mM, i polisorbat (npr. polisorbat 20) u koncentraciji od 0,04% (m/V), a formulacija ima pH vrednost oko 5,8. U nekim otelotvorenjima, ovde opisano anti-PDL1 antitelo je formulacija koja sadrži antitelo u količini od oko 125 mg/ml, histidin acetat u koncentraciji od oko 20 mM, saharozu u koncentraciji od oko 240 mM, i polisorbat (npr. polisorbat 20) u koncentraciji od 0,02% (m/V), a formulacija ima pH vrednost oko 5,5.
Primeri TIM3 antagonista za upotrebu u pronalasku
Ovde se obezbeđuju metode za lečenje ili odlaganje napredovanja raka kod pojedinca, koje podrazumevaju davanje pojedincu efikasne količine bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije, antagonista vezivanja ose PD-1 i TIM-3 antagonista. U jednom otelotvorenju, antagonist TIM-3 je anti-TIM-3 antitelo. U nekim otelotvorenjima, anti-TIM3 indukuje internalizaciju TIM3 eksprimiranu na ćeliji od najmanje 45% nakon 120 minuta na 37 °C, kako je utvrđeno FACS analizom. Ćelija je, na primer, RPMI8226 ćelija (ATCC<®>CCL-155™). U jednom otelotvorenju, antitelo indukuje internalizaciju TIM3 na ćelijama RPMI8226 koje eksprimiraju TIM3 (ATCC<®>CCL-155™) od najmanje 55% nakon 120 minuta na 37 °C, kako je utvrđeno FACS analizom. U jednom otelotvorenju, antitelo indukuje internalizaciju TIM3 na ćelijama RPMI8226 koje eksprimiraju TIM3 (ATCC<®>CCL-155™) od najmanje 60% nakon 240 minuta na 37 °C, kako je utvrđeno FACS analizom. U jednom otelotvorenju, antitelo indukuje internalizaciju TIM3 na ćelijama RPMI8226 koje eksprimiraju TIM3 (ATCC<®>CCL-155™) od najmanje 65% nakon 240 minuta na 37 °C, kako je utvrđeno FACS analizom.
U nekim otelotvorenjima, anti-TIM3 se takmiči u vezivanju za TIM3 sa anti-Tim3 antitelom koje sadrži VH i VL Tim3_0016. U nekim otelotvorenjima, anti-TIM3 antitelo se vezuje za TIM3 čoveka i cinomolgusa. U nekim otelotvorenjima, anti-TIM3 antitelo kao imunokonjugat ispoljava citotoksičnu aktivnost na ćelijama koje eksprimiraju TIM3. U jednom takvom otelotvorenju, imunokonjugat ima relativnu IC50 vrednost citotoksične aktivnosti kao konjugat Pseudomonas egzotoksina A na RPMI-8226 ćelijama od 0,1 ili niže. U jednom otelotvorenju, anti-TIM3 antitelo indukuje oslobađanje interferona gama, kako je utvrđeno MLR testom.
U određenim otelotvorenjima, anti-TIM3 antitelo se vezuje na TIM3 čoveka i cinomolgusa i indukuje oslobađanje interferona gama, kako je utvrđeno MLR testom.
U jednom otelotvorenju, anti-TIM3 antitelo sadrži najmanje jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest HVR-ova izabranih od (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:304; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:305; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 306; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:307; ili HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:314; HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:315; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:308; i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:309.
U jednom otelotvorenju, anti-TIM3 antitelo sadrži (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:304; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:305; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:306; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:307; ili HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:314; HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:315; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:308; i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:309.
U jednom otelotvorenju, anti-TIM3 antitelo sadrži (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:304; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:305; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:306; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:307; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:308; i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:309.
U jednom otelotvorenju, anti-TIM3 antitelo sadrži (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:304; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:305; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:306; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:314; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:308; i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:309.
U jednom otelotvorenju, anti-TIM3 antitelo sadrži (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:304; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:305; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:306; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:315; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:308; i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:309.
U jednom otelotvorenju, anti-TIM3 antitelo sadrži (a) VH domen koji sadrži najmanje jednu, najmanje dve, ili sve tri sekvence VH HVR izabrane od (i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:304; (ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:305, i (iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SEQ ID NO:306, i (b) VL domen koji sadrži najmanje jednu, najmanje dve, ili sve tri sekvence VL HVR izabrane od (i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:307; ili HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:314; ili HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:315; (ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:308 i (c) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:309.
U jednom otelotvorenju, anti-TIM3 antitelo sadrži (a) VH domen koji sadrži (i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:304; (ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:305, i (iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SEQ ID NO:306; i (b) VL domen koji sadrži (i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:307; ili HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:314; ili HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:315; (ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:308 i (iii) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:309.
U jednom otelotvorenju, anti-TIM3 antitelo sadrži (a) VH domen koji sadrži (i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:304; (ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:305 i (iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SEQ ID NO:306; i (b) VL domen koji sadrži (i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:307; (ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:308 i (iii) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:309.
U jednom otelotvorenju, anti-TIM3 antitelo sadrži (a) VH domen koji sadrži (i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:304; (ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:305 i (iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SEQ ID NO:306; i (b) VL domen koji sadrži (i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:314; (ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:308 i (iii) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:309.
U jednom otelotvorenju, anti-TIM3 antitelo sadrži (a) VH domen koji sadrži (i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:304; (ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:305 i (iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SEQ ID NO:306; i (b) VL domen koji sadrži (i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:315; (ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:308 i (iii) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:309.
U jednom otelotvorenju, takvo anti-TIM3 antitelo sadrži
i) VH sekvencu SEQ ID NO:310 i VL sekvencu SEQ ID NO:311;
ii) VH sekvencu SEQ ID NO:312 i VL sekvencu SEQ ID NO:313;
iii) ili humanizovanu varijantu VH i VL antitela pod i) ili ii).
U jednom otelotvorenju, anti-TIM3 antitelo sadrži najmanje jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest HVR-ova izabranih od (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:316; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:317; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:318; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:319; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:320; i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:321.
U jednom otelotvorenju, anti-TIM3 antitelo sadrži (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:316; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:317; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:318; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:319; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:320; i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:321.
U jednom otelotvorenju, anti-TIM3 antitelo sadrži (a) VH domen koji sadrži najmanje jednu, najmanje dve, ili sve tri sekvence VH HVR izabrane od (i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:316; (ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:317, i (iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SEQ ID NO:318; i (b) VL domen koji sadrži najmanje jednu, najmanje dve, ili sve tri sekvence VL HVR izabrane od (i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:319; (ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:320 i (c) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:321.
U jednom otelotvorenju, anti-TIM3 antitelo sadrži (a) VH domen koji sadrži (i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:316; (ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:317 i (iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SEQ ID NO:318; i (b) VL domen koji sadrži (i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:319; (ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:320 i (iii) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:321.
U jednom otelotvorenju, takvo anti-TIM3 antitelo sadrži
i) VH sekvencu SEQ ID NO:322 i VL sekvencu SEQ ID NO:323;
ii) ili humanizovanu varijantu VH i VL antitela pod i).
U jednom otelotvorenju, anti-TIM3 antitelo sadrži najmanje jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest HVR-ova izabranih od (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:324; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:325; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:326; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:327; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:328; i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:329.
U jednom otelotvorenju, anti-TIM3 antitelo sadrži (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:324; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:325; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:326; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:327; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:328; i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:329.
U jednom otelotvorenju, anti-TIM3 antitelo sadrži (a) VH domen koji sadrži najmanje jednu, najmanje dve, ili sve tri sekvence VH HVR izabrane od (i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:324; (ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:325, i (iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SEQ ID NO:326; i (b) VL domen koji sadrži najmanje jednu, najmanje dve, ili sve tri sekvence VL HVR izabrane od (i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:327; (ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:328 i (c) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:329.
U jednom otelotvorenju, anti-TIM3 antitelo sadrži (a) VH domen koji sadrži (i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:324; (ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:325 i (iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SEQ ID NO:326; i (b) VL domen koji sadrži (i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:327; (ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:328 i (iii) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:329.
U jednom otelotvorenju, takvo anti-TIM3 antitelo sadrži
i) VH sekvencu SEQ ID NO:330 i VL sekvencu SEQ ID NO:331;
ii) ili humanizovanu varijantu VH i VL antitela pod i).
U jednom otelotvorenju, anti-TIM3 antitelo sadrži najmanje jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest HVR-ova izabranih od (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:332; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:333; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:334; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:335; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:336; i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:337.
U jednom otelotvorenju, anti-TIM3 antitelo sadrži (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:332; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:333; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:334; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:335; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:336; i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:337.
U jednom otelotvorenju, anti-TIM3 antitelo sadrži (a) VH domen koji sadrži najmanje jednu, najmanje dve, ili sve tri sekvence VH HVR izabrane od (i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:332; (ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:333, i (iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SEQ ID NO:334; i (b) VL domen koji sadrži najmanje jednu, najmanje dve, ili sve tri sekvence VL HVR izabrane od (i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:335; (ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:336 i (c) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:337.
U jednom otelotvorenju, anti-TIM3 antitelo sadrži (a) VH domen koji sadrži (i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:332; (ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:333 i (iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SEQ ID NO:334; i (b) VL domen koji sadrži (i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:335; (ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:336 i (iii) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:337.
U jednom otelotvorenju, takvo anti-TIM3 antitelo sadrži
i) VH sekvencu SEQ ID NO:338 i VL sekvencu SEQ ID NO:339;
ii) ili humanizovanu varijantu VH i VL antitela pod i).
U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje anti-TIM3 antitelo koje sadrži najmanje jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest HVR-ova izabranih od (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:340; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:341; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:342; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:343; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:344; i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:345.
U jednom otelotvorenju, anti-TIM3 antitelo sadrži (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:340; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:341; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:342; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:343; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:344; i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:345.
U jednom otelotvorenju, anti-TIM3 antitelo sadrži (a) VH domen koji sadrži najmanje jednu, najmanje dve, ili sve tri sekvence VH HVR izabrane od (i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:340; (ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:341, i (iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SEQ ID NO:342; i (b) VL domen koji sadrži najmanje jednu, najmanje dve, ili sve tri sekvence VL HVR izabrane od (i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:343; (ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:344 i (c) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:345.
U jednom otelotvorenju, anti-TIM3 antitelo sadrži (a) VH domen koji sadrži (i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:340; (ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:341 i (iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SEQ ID NO:342; i (b) VL domen koji sadrži (i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:343; (ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:344 i (iii) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:345.
U jednom otelotvorenju, takvo anti-TIM3 antitelo sadrži
i) VH sekvencu SEQ ID NO:346 i VL sekvencu SEQ ID NO:347;
ii) ili humanizovanu varijantu VH i VL antitela pod i).
U jednom otelotvorenju, anti-TIM3 antitelo sadrži najmanje jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest HVR-ova izabranih od (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:348; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:349; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:350; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:351; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:352; i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:353.
U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje anti-TIM3 antitelo koje sadrži (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:348; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:349; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:350; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:351; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:352; i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:353.
U jednom otelotvorenju, anti-TIM3 antitelo sadrži (a) VH domen koji sadrži najmanje jednu, najmanje dve, ili sve tri sekvence VH HVR izabrane od (i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:348; (ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:349, i (iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SEQ ID NO:350; i (b) VL domen koji sadrži najmanje jednu, najmanje dve, ili sve tri sekvence VL HVR izabrane od (i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:351; (ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:352 i (c) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:353.
U jednom otelotvorenju, anti-TIM3 antitelo sadrži (a) VH domen koji sadrži (i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:348; (ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:349 i (iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SEQ ID NO:350; i (b) VL domen koji sadrži (i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:351; (ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:352 i (iii) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:353.
U jednom otelotvorenju, takvo anti-TIM3 antitelo sadrži
i) VH sekvencu SEQ ID NO:354 i VL sekvencu SEQ ID NO:355;
ii) ili humanizovanu varijantu VH i VL antitela pod i).
U jednom otelotvorenju, anti-TIM3 antitelo sadrži najmanje jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest HVR-ova izabranih od (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:356; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:357; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:358; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:359; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:360; i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:361.
U jednom otelotvorenju, anti-TIM3 antitelo sadrži (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:356; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:357; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:358; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:359; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:360; i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:361.
U jednom otelotvorenju, anti-TIM3 antitelo sadrži (a) VH domen koji sadrži najmanje jednu, najmanje dve ili sve tri VH HVR sekvence izabrane od (i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:356; (ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 357; i (iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 358; i (b) VL domen koja sadrži najmanje jednu, najmanje dve ili sve tri VL HVR sekvence odabrane od (i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 359; (ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:360, i (c) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:361.
U jednom otelotvorenju, anti-TIM3 antitelo sadrži (a) VH domen koji sadrži (i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 356; (ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 357; i (iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 358; i (b) VL domen koji sadrži (i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 359; (ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:360 i (iii) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:361.
U jednom otelotvorenju, takvo anti-TIM3 antitelo sadrži
i) VH sekvencu SEQ ID NO:362 i VL sekvencu SEQ ID NO:363;
ii) ili humanizovanu varijantu VH i VL antitela pod i).
U jednom otelotvorenju, anti-TIM3 antitelo sadrži najmanje jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest HVR-ova izabranih od (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:364; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:365; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:366; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:367; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:368; i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:369.
U jednom otelotvorenju, anti-TIM3 antitelo sadrži (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:364; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:365; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:366; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:367; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:368; i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:369.
U jednom otelotvorenju, anti-TIM3 antitelo sadrži (a) VH domen koji sadrži najmanje jednu, najmanje dve, ili sve tri sekvence VH HVR izabrane od (i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:364; (ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:365, i (iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SEQ ID NO:366; i (b) VL domen koji sadrži najmanje jednu, najmanje dve, ili sve tri sekvence VL HVR izabrane od (i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:367; (ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:368 i (c) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:369.
U jednom otelotvorenju, anti-TIM3 antitelo sadrži (a) VH domen koji sadrži (i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:364; (ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:365 i (iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SEQ ID NO:366; i (b) VL domen koji sadrži (i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:367; (ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:368 i (iii) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:369.
U jednom otelotvorenju, takvo anti-TIM3 antitelo sadrži
i) VH sekvencu SEQ ID NO:370 i VL sekvencu SEQ ID NO:371;
ii) ili humanizovanu varijantu VH i VL antitela pod i).
U svim gore pomenutim otelotvorenjima, anti-TIM3 antitelo je humanizovano. U jednom otelotvorenju, anti-TIM3 antitelo sadrži HVR-ove kao u bilo kom od prethodnih otelotvorenja, i dodatno sadrži akceptorski humani okvir, npr. humani imunoglobulinski ili humani konsenzusni okvir. U jednom drugom otelotvorenju, anti-TIM3 antitelo sadrži HVR-ove kao u bilo kom od gornjih otelotvorenja, i dodatno sadrži VH i VL koji sadrže takve HVR-ove. U još jednom aspektu, anti-TIM3 antitelo se vezuje za isti epitop kao anti-TIM3 antitelo iz ovog dokumenta. Na primer, u određenim otelotvorenjima, anti-TIM3 antitelo se vezuje za isti epitop kao anti-TIM3 antitelo koje sadrži VH sekvencu SEQ ID NO:310 i VL sekvencu SEQ ID NO:311, ili se anti-TIM3 antitelo vezuje za isti epitop kao anti-TIM3 antitelo koje sadrži VH sekvencu SEQ ID NO:312 i VL sekvencu SEQ ID NO:313, ili je obezbeđeno antitelo koje se vezuje za isti epitop kao anti-TIM3 antitelo koje sadrži VH sekvencu SEQ ID NO:322 i VL sekvencu SEQ ID NO:323, ili je obezbeđeno antitelo koje se vezuje za isti epitop kao anti-TIM3 antitelo koje sadrži VH sekvencu SEQ ID NO:330 i VL sekvencu SEQ ID NO:331, ili je obezbeđeno antitelo koje se vezuje za isti epitop kao anti-TIM3 antitelo koje sadrži VH sekvencu SEQ ID NO:338 i VL sekvencu SEQ ID NO:339, ili je obezbeđeno antitelo koje se vezuje za isti epitop kao anti-TIM3 antitelo koji sadrži VH sekvencu SEQ ID NO:346 i VL sekvencu SEQ ID NO:347, ili je obezbeđeno antitelo koje se vezuje za isti epitop kao anti-TIM3 antitelo koje sadrži VH sekvencu SEQ ID NO:354 i VL sekvencu SEQ ID NO:355, ili je obezbeđeno antitelo koje se vezuje za isti epitop kao anti-TIM3 antitelo koje sadrži VH sekvencu SEQ ID NO:362 i VL sekvencu SEQ ID NO:363, ili je obezbeđeno antitelo koje se vezuje za isti epitop kao anti-TIM3 antitelo koje sadrži VH sekvencu SEQ ID NO:370 i VL sekvencu SEQ ID NO:371. U jednom poželjnom otelotvorenju, obezbeđeno je antitelo koje se vezuje za isti epitop kao anti-TIM3 antitelo koje sadrži VH sekvencu SEQ ID NO:310 i VL sekvencu SEQ ID NO:311.
U jednom otelotvorenju, anti-TIM3 antitelo se takmiči u vezivanju za humani TIM3 sa anti-TIM3 antitelom koje sadrži VH sekvencu SEQ ID NO:310 i VL sekvencu SEQ ID NO:311 (kao što je utvrđeno u testu kompetitivnosti koristeći RPMI-8226 ćelije koje eksprimiraju TIM3 (ATCC<®>CCL-155™).
U jednom otelotvorenju, anti-TIM3 antitelo prema bilo kom od prethodnih otelotvorenja je monoklonsko antitelo, uključujući himerno, humanizovano ili humano antitelo. U jednom otelotvorenju, anti-TIM3 antitelo je fragment antitela, npr. Fv, Fab, Fab’, scFv, dijatelo, ili F(ab’)2fragment. U još jednom otelotvorenju, antitelo je antitelo pune dužine, npr. netaknuto IgG1ili IgG4antitelo, ili druga klasa ili izotip antitela, kao što je ovde definisano.
U dodatnom aspektu, anti-TIM3 antitelo prema bilo kom od gornjih otelotvorenja može da sadrži bilo koju karakteristiku, samu ili u kombinaciji, kao što je ovde opisano.
U jednom otelotvorenju, anti-TIM3 antitelo je bilo koje antitelo opisano u WO 2011/155607, WO 2013/006490, WO 03/063792, WO 2009/097394 ili u WO 2011/159877. U jednom otelotvorenju, anti-TIM3 antitelo je F38-2E2. U nekim otelotvorenjima, anti-TIM3 antitela su antitela iz hibridoma 8B.2C12 i 25F.1D6, i pripremljena su kako je objavljeno u patentnim prijavama U.S. Patent application br.: 2004/0005322 i 2005/0191721, Sabatos, CA i dr., Nature Immunol.4:1102-1110, 2003, i Sanchez-Fueyo, A. et al., Nature Immunol.4:1093-101 2003, pri čemu je svaka ovde uključena referencom kao da je izneta u celosti. Ostala antitela na TIM-3 razmatraju se posebno i mogu se proizvesti, na primer, ovde opisanim metodama. Nukleotidne i proteinske sekvence humanih sekvenci TIM3 mogu se naći na pristupnom broju Genbank AF251707.1 i pristupnom broju Uniprot Q8TDQ0. Primer humane aminokiselinske sekvence TIM3 naveden je u SEQ ID NO:380; primer humane aminokiselinske sekvence TIM3 vanćelijskih domena naveden je u SEQ ID NO:381.
Priprema antitela
Kao što je gore opisano, u nekim otelotvorenjima, antagonist vezivanja PD-1 je antitelo (npr. anti-PD-1 antitelo, anti-PDL1 antitelo ili anti-PDL2 antitelo). U nekim otelotvorenjima, TIM3 antagonist je antitelo (npr. anti-TIM3 antagonističko antitelo). Antitela opisana u ovom dokumentu mogu da se pripremaju pomoću tehnika za stvaranje antitela dostupnih u struci, čiji su primeri detaljnije opisani u sledećim odeljcima.
Antitelo je usmereno na željeni antigen. Na primer, antitelo može biti usmereno protiv PD-1 (kao što je humani PD-1), PDL1 (kao što je humani PDL1), PDL2 (kao što je humani PDL2), TIM3 (kao što je humani TIM3). Poželjno, antigen je biološki važan polipeptid, i primena antitela na sisaru koji ima određeni poremećaj može dovesti do terapeutske koristi kod tog sisara.
U nekim otelotvorenjima, ovde opisano antitelo ima konstantu disocijacije (Kd) 1 µM, 150 nM, 100 nM, 50 nM, 10 nM, 1 nM, 0,1 nM, 0,01 nM, ili 0,001 nM (npr.10<-8>M ili manje, npr. od 10<-8>M do 10<-13>M, npr. od 10<-9>M do 10<-13>M).
U jednom otelotvorenju, Kd se meri putem testa za vezivanje radioaktivno obeleženog antigena (RIA) koji se izvodi sa Fab verzijom željenog antitela i njegovim antigenom, kao što je opisano u narednom testu. Afinitet vezivanja Fab-ova u rastvoru za antigene određen je ekvilibrisanjem Fab-ova sa minimalnom koncentracijom antigena obeleženog sa (<125>I) u prisustvu titracionih serija neobeleženog antigena, a zatim hvatanjem vezanog antigena pomoću ploče obložene anti-Fab antitelom (videti npr. Chen et al., J. Mol. Biol.293:865-881 (1999)). Radi utvrđivanja uslova za test, MICROTITER<®>ploče sa većim brojem bunarčića (Thermo Scientific) preko noći se oblažu sa 5 μg/ml anti-Fab antitela koje služi za hvatanje (Cappel Labs) u 50 mM natrijum karbonata (pH 9,6), a zatim se blokiraju pomoću 2% (m/V) albumina goveđeg seruma u PBS-u, tokom dva do pet sati na sobnoj temperaturi (oko 23 °C). Na neadsorbujućoj ploči (Nunc br. 269620), 100 pM ili 26 pM [<125>I]-antigena se pomeša sa serijskim razblaženjima željenih Fab. Željeni Fab se zatim inkubira tokom noći; međutim, inkubacija može da se nastavi u dužem periodu (npr. oko 65 sati) kako bi se postigla ravnoteža. Nakon toga, smeše se prenose na ploču za hvatanje i inkubiraju se na sobnoj temperaturi (npr. jedan sat). Rastvor se zatim uklanja, a ploča se ispira osam puta pomoću 0,1% polisorbata 20 (TWEEN-20<®>) u PBS-u. Kada se ploče osuše, dodaje se 150 μl scintilansa po bunarčiću (MICROSCINT-20™; Packard), a zatim se ploče mere na gama brojaču TOPCOUNT™ (Packard) tokom deset minuta. Koncentracije svakog Fab koje daju manje od ili jednako 20% maksimalnog vezivanja, biraju se za primenu u testovima kompetitivnog vezivanja.
Prema jednom drugom otelotvorenju, Kd se određuje testom površinske plazmonske rezonance pomoću BIACORE<®>-2000 ili BIACORE<®>-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) na 25 °C sa čipovima imobilisanog antigena CM5 pri ~10 jedinica odgovora (RU). Ukratko, biosenzorski čipovi sa karboksimetilovanim dekstranom (CM5, BIACORE, Inc.) aktiviraju se pomoću N-etil-N’-(3-dimetilaminopropil)-karbodiimid hidrohlorida (EDC) i N-hidroksisukcinimida (NHS) prema uputstvu dobavljača. Antigen se razblažuje pomoću 10 mM natrijum acetata, pH 4,8, do 5 μg/ml (~0,2 μM) pre injektovanja pri protoku od 5 μl/min da bi se dobilo oko 10 jedinica odgovora (RU) kuplovanog proteina. Nakon injektovanja antigena, injektuje se 1 M etanolamina da bi se blokirale neproreagovale grupe. Za merenje kinetike, injektuju se dvostruke serije razblaženja Fab (0,78 nM do 500 nM) u PBS-u sa 0,05% polisorbatom 20 (TWEEN-20™) surfaktantom (PBST) na 25 °C pri protoku od oko 25 μl/min. Brzina asocijacije (kon) i brzina disocijacije (koff) izračunavaju se pomoću jednostavnog jedanna-jedan Lengmirovog modela vezivanja (BIACORE<®>Evaluation Software verzija 3.2) simultanim podešavanjem senzorgrama asocijacije i disocijacije. Ravnotežna konstanta disocijacije (Kd) izračunata je kao odnos koff/kon. Videti npr. Chen et al., J. Mol. Biol.293:865-881 (1999). Ako brzina asocijacije pređe 10<6>M<-1>s<-1>prema gore opisanom testu površinske plazmonske rezonance, onda brzina asocijacije može da se odredi primenom tehnike fluorescentnog prigušivanja koja meri porast ili opadanje intenziteta fluorescentne emisije (ekscitacija = 295 nm; emisija = 340 nm, 16 nm širina trake) na 25 °C kod 20 nM anti-antigen antitela (Fab oblik) u PBS-u, pH 7,2, u prisustvu rastućih koncentracija antigena, određeno spektrometrom, kao što je spektrofotometar sa zaustavljanjem protoka (Aviv Instrumenti) ili spektrofotometar serije 8000 SLM-AMINCO™ (ThermoSpectronic) sa kivetom za mešanje.
U nekim otelotvorenjima, anti-TIM3 antitelo, kao što je ovde opisano, pokazuje afinitet vezivanja od najmanje 100 pM ili manje prema humanom TIM3, afinitet vezivanja od najmanje 300 pM ili manje prema humanom TIM3, afinitet vezivanja od najmanje 400 pM ili manje prema humanom TIM3, sposobnost neutralizacije od najmanje 40 nM ili manje prema humanom TIM3, sposobnost neutralizacije od najmanje 120 nM ili manje prema humanom TIM3, i sposobnost neutralizacije od najmanje 31 nM ili manje prema humanom TIM3. U ovim otelotvorenjima, afinitet vezivanja se može izmeriti površinskom plazmonskom rezonancom, kako je opisano u U.S. Patentu br.8,771,697.
Fragmenti antitela
U određenim otelotvorenjima, antitelo koje se ovde opisuje je fragment antitela. Fragmenti antitela uključuju, bez ograničenja, Fab, Fab’, Fab’-SH, F(ab’)2, Fv i scFv fragmente, kao i druge fragmente opisane u nastavku. Pregled fragmenata pojedinih antitela potražite u Hudson et al. Nat. Med.9:129-134 (2003). Pregled scFv fragmenata potražite, npr. u: Pluckthün, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg i Moore izdav., (Springer-Verlag, New York), str.269-315 (1994); videti takođe WO 93/16185; i U.S. Patent br. 5,571,894 i 5,587,458. Raspravu o Fab i F(ab’)2 fragmentima koji sadrže regenerisane ostatke receptorskih vezujućih epitopa i koji imaju produžen poluživot in vivo pogledajte u U.S. Patentu br.5,869,046.
Dijatela su fragmenti antitela sa dva mesta za vezivanje antigena koja mogu biti dvovalentna ili bispecifična. Pogledajte, na primer, EP 404,097; WO 1993/01161; Hudson et al., Nat. Med.9:129-134 (2003); i Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993). Trijatela i tetratela su takođe opisana u Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003). Antitela sa jednim domenom su fragmenti antitela koji sadrže kompletan varijabilni domen teškog lanca antitela ili njegov deo, ili kompletan varijabilni domen lakog lanca antitela ili njegov deo. U pojedinim otelotvorenjima, antitelo sa jednim domenom je humano antitelo sa jednim domenom (Domantis, Inc., Waltham, MA; vidite, npr. U.S. Patent br. 6,248,516 B1). Fragmenti antitela se mogu dobiti različitim tehnikama, uključujući, bez ograničavanja, proteolitičku digestiju netaknutog antitela, kao i proizvodnju pomoću rekombinantnih ćelija domaćina (npr. E. coli ili faga), kao što je ovde opisano.
Himerna i humanizovana antitela
U pojedinim otelotvorenjima, antitelo koje se ovde opisuje je himerno antitelo. Pojedina himerna antitela su opisana npr. u U.S. Patentu br. 4,816,567; i Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). U jednom primeru, himerno antitelo sadrži nehumani varijabilni region (npr. varijabilni region dobijen od miša, pacova, hrčka, zeca ili nehumanog primata, kao što je majmun) i humani konstantni region. U drugom primeru, himerno antitelo je antitelo „sa zamenjenom klasom”, kod koga je klasa ili potklasa zamenjena klasom ili potklasom matičnog antitela. Himerna antitela obuhvataju njihove antigen-vezujuće fragmente. U određenim otelotvorenjima, himerno antitelo je humanizovano antitelo. Najčešće, nehumano antitelo je humanizovano da bi se smanjila imunogenost za ljude, pri čemu zadržava specifičnost i afinitet matičnog nehumanog antitela. Po pravilu, humanizovano antitelo sadrži jedan ili više varijabilnih domena kod kojih su HVR-ovi, npr. CDR-ovi (ili njihovi delovi) dobijeni od nehumanog antitela, a FR-ovi (ili njihovi delovi) su dobijeni od sekvenci humanog antitela. Humanizovano antitelo opciono takođe sadrži najmanje deo humanog konstantnog regiona. U nekim otelotvorenjima, neki FR ostaci u humanizovanom antitelu su supstituisani odgovarajućim ostacima nehumanog antitela (npr. antitela sa koga su dobijeni HVR ostaci), npr. da bi se povratila ili poboljšala specifičnost antitela ili njegov afinitet. Pregled humanizovanih antitela i metoda za njihovo dobijanje daje se npr. u Almagro i Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008), a dodatno su opisani npr. u Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989); US Patent br.5, 821,337, 7,527,791, 6,982,321 i 7,087,409; Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005) (gde se opisuje kalemljenje SDR (a-CDR)); Padlan, Mol. Immunol.28:489-498 (1991) (gde se opisuju “površinske promene"); Dall’Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005) (gde se opisuje “mešanje FR"); i Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) i Klimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) (gde se opisuje pristup “vođene selekcije” kod mešanja FR).
Humani okvirni regioni koji mogu da se koriste za humanizaciju obuhvataju, bez ograničavanja, okvirne regione izabrane metodom "najboljeg slaganja" (videti npr. Sims et al. J. Immunol. 151:2296 (1993)); okvirne regione dobijene od konsenzusne sekvence humanih antitela konkretne podgrupe varijabilnih regiona lakog ili teškog lanca (videti npr. Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); i Presta et al. J. Immunol., 151:2623 (1993)); humane zrele (somatski mutirane) okvirne regione ili okvirne regione humane germinativne linije (videti, npr. Almagro i Fransson, Front. Biosci.13:1619-1633 (2008)); i okvirne regione dobijene pregledanjem FR biblioteka (videti npr. Baca et al., J. Biol. Chem.272:10678-10684 (1997) i Rosok et al., J. Biol. Chem.271:22611-22618 (1996)).
Humana antitela
U određenim otelotvorenjiima, ovde opisano antitelo je humano antitelo. Humana antitela se mogu dobiti primenom različitih tehnika poznatih u struci. Humana antitela su opisana u van Dijk i van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) i u Lonberg, Curr. Opin. Immunol.20:450-459 (2008).
Humana antitela se mogu dobiti primenom imunogena na transgenu životinju koja je modifikovana da proizvodi netaknuta humana antitela ili netaknuta antitela sa humanim varijabilnim regionima kao odgovor na antigenski izazov. Takve životinje tipično sadrže kompletne lokuse humanog imunoglobulina ili njihov deo, koji zamenjuju lokuse endogenog imunoglobulina, ili koji su prisutni ekstrahromozomski ili su nasumično integrisani u životinjske hromozome. U takvim transgenim miševima, lokusi endogenog imunoglobulina su po pravilu inaktivirani. Pogledajte pregled metoda za dobijanje humanih antitela od transgenih životinja u Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005). Videti takođe npr., U.S. Patent br.
6,075,181 i 6,150,584 koji opisuju tehnologiju XENOMOUSE™; U.S. Patent br. 5,770,429 koji opisuje tehnologiju HuMab<®>; U.S. Patent br. 7,041,870 koji opisuje tehnologiju K-M MOUSE<®>, i U.S. patentnu prijavu br. US 2007/0061900, koja opisuje tehnologiju VELOCIMOUSE<®>). Humani varijabilni regioni netaknutih antitela koje stvaraju takve životinje mogu se dalje modifikovati, npr. kombinovanjem sa različitim humanim konstantnim regionom. Humana antitela se mogu takođe dobiti postupcima na bazi hibridoma. Postoje opisi za ćelijske linije humanog mijeloma i mišjeg-humanog heteromijeloma za proizvodnju humanih monoklonskih antitela. (Videti npr. Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, str. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); i Boerner et al, J. Immunol., 147: 86 (1991)). Humana antitela proizvedena putem tehnologije hibridoma humanih B-ćelija takođe su opisali Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006). Dodatne metode uključuju one opisane, na primer, u U.S. Patentu br.7,189,826 (gde se opisuje proizvodnja monoklonskih humanih IgM antitela iz ćelijskih linija hibridoma) i u Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006) (gde se opisuju humani hibridomi). Tehnologija humanih hibridoma (tehnologija trioma) takođe je opisana u Vollmers i Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) i u Vollmers i Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3): 185-91 (2005). Humana antitela takođe mogu da se proizvedu izolovanjem sekvenci varijabilnog domena Fv klona izabranih iz biblioteka displeja faga humanog porekla. Takve sekvence varijabilnog domena mogu onda da se kombinuju sa željenim humanim konstantnim domenom. Tehnike za izbor humanih antitela iz biblioteka antitela su opisane u nastavku.
Antitela dobijena iz biblioteka
Antitela mogu da se izoluju pregledanjem kombinatornih biblioteka za antitela sa željenom aktivnošću ili aktivnostima. Na primer, u struci je poznat veliki broj metoda za stvaranje biblioteka prikaza faga i pretraživanje takvih biblioteka za antitela koja imaju željene karakteristike vezivanja. Pregled takvih metoda daju npr. Hoogenboom et al. u Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O’Brien et al., izdav., Human Press, Totowa, NJ, 2001) a opisane su, npr., i u McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Marks i Bradbury, in Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, izd., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol.338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol.340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); i u Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004).
Kod pojedinih metoda displeja faga, repertoari VH i VL gena su odvojeno klonirani putem lančane reakcije polimeraze (PCR) i nasumično rekombinovani u bibliotekama faga, koje zatim mogu da se pretražuju prema antigen-vezujućem fagu, kao što opisuju Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994). Fagi tipično vrše displej fragmenata antitela, bilo kao jednolančani Fv (scFv) fragmenti ili kao Fab fragmenti. Biblioteke iz imunizovanih izvora daju antitela velikog afiniteta prema imunogenu, ne zahtevajući konstruisanje hibridoma. Alternativno, naivni repertoar može biti kloniran (npr. od ljudi) da bi se dobio jedan izvor antitela za širok spektar nesvojstvenih, kao i svojstvenih antigena bez ikakve imunizacije, kao što opisuju Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993). Najzad, naivne biblioteke mogu takođe da se naprave sintetički, kloniranjem nepreuređenih segmenata V-gena iz matičnih ćelija, i upotrebom PCR prajmera koji sadrže nasumične sekvence za kodiranje veoma varijabilnih CDR3 regiona i za postizanje premeštanja in vitro, kao što opisuju Hoogenboom i Winter, J. Mol. Biol., 227:381-388 (1992). Patentne publikacije koje opisuju biblioteke faga humanih antitela su, na primer, sledeće: US Patent br.5,750,373, i US Patent Publication br.
2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936 i 2009/0002360. Antitela ili fragmenti antitela izolovani iz biblioteka humanih antitela se ovde smatraju humanim antitelima ili fragmentima humanih antitela.
Multispecifična antitela
U pojedinim otelotvorenjima, ovde opisano antitelo je multispecifično antitelo, npr. bispecifično antitelo. Multispecifična antitela su monoklonska antitela koja imaju sposobnost specifičnog vezivanja za najmanje dva različita mesta. Ovde su opisani primeri bispecifičnih antigen vezujućih molekula koji aktiviraju T ćelije specifičnih za FolR1 i CD3. U nekim otelotvorenjima, komponenta antagonista ose PD1 je multispecifična. Jedna od specifičnosti vezivanja se odnosi na komponentu ose PD-1 (npr. PD-1, PDL1 ili PDL2), a druga na bilo koji drugi antigen. U određenim otelotvorenjima, jedna od specifičnosti je vezivanje za IL-17 ili IL-17R, a druga za bilo koji drugi antigen. U određenim otelotvorenjima, bispecifična antitela se mogu vezivati za dva različita epitopa komponente ose PD-1 (npr. PD-1, PDL1 ili PDL2), IL-17 ili IL-17R. Bispecifična antitela mogu da se proizvedu kao antitela kompletne dužine ili kao fragmenti antitela.
U određenim otelotvorenjima, jedna od specifičnosti vezivanja je vezivanje za komponentu ose PD-1 (npr. PD-1, PDL1 ili PDL2), a druga je za IL-17 ili IL-17R. Ovde se obezbeđuju metode za lečenje ili odlaganje napredovanja raka kod pojedinca, koje se sastoje od davanja pojedincu efikasne količine multispecifičnog antitela, pri čemu multispecifično antitelo sadrži prvu specifičnost vezivanja za komponentu ose PD-1 (npr. PD-1, PDL1 ili PDL2) i drugu specifičnost vezivanja za IL-17 ili IL-17R. U nekim otelotvorenjima, multispecifično antitelo se može dobiti bilo kojom od tehnika opisanih ovde i u nastavku. Tehnike za dobijanje multispecifičnih antitela uključuju, ali se ne ograničavaju na, rekombinantnu koekspresiju dva imunoglobulinska para teški lanac-laki lanac koji imaju različite specifičnosti (videti Milstein i Cuello, Nature 305: 537 (1983)), WO 93/08829, i Traunecker et al., EMBO J.10: 3655 (1991)) i inženjering "dugme u rupici" (videti npr. U.S. Patent br.5,731,168). Multispecifična antitela mogu takođe da se dobiju dizajniranjem efekata elektrostatičkog upravljanja za dobijanje Fc-heterodimernih molekula antitela (WO 2009/089004A1); ukrštanjem dva ili više antitela ili fragmenata (videti npr. US Patent br.
4,676,980, i Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)); upotrebom leucinskih zatvarača za proizvodnju bispecifičnih antitela (videti npr. Kostelny et al., J. Immunol., 148(5): 1547-1553 (1992)); upotrebom tehnologije "dijatela" za dobijanje bispecifičnih fragmenata antitela (videti npr. Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)); i korišćenjem jednolančanih Fv (sFv) dimera (videti, npr. Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)); i proizvodnjom trispecifičnih antitela kako opisuju, npr. Tutt et al. J. Immunol.147: 60 (1991).
Ovde su takođe obuhvaćena konstruisana antitela sa tri ili više funkcionalnih mesta vezivanja antigena, uključujući "antitela hobotnice" (videti npr. US 2006/0025576A1). Antitelo ili fragment u ovom dokumentu takođe obuhvata „dvojno delujući Fab” ili „DAF”, koji sadrži antigen vezujuće mesto koji se vezuje za komponentu ose PD-1 (npr. Pd-1, PDL1, ili PDL2), za IL-17, ili za IL-17R, kao i za još jedan različit antigen (videti, na primer, US 2008/0069820).
C. Sekvence nukleinske kiseline, vektori i metode proizvodnje Polinukleotidi koji kodiraju bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije, npr. bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije koji sadrži prvo antigen vezujuće mesto specifično za folatni receptor 1 (FolR1) i drugo antigen vezujuće mesto specifično za CD3, i antitela, mogu se koristiti za proizvodnju bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije i antitela koja su ovde opisana. Bispecifični antigen vezujući molekuli koji aktiviraju T ćelije iz ovog pronalaska mogu se eksprimirati kao jedan polinukleotid koji kodira ceo bispecifični antigen vezujući molekul, ili kao višestruki (npr. dva ili više) polinukleotidi koji su koeksprimirani. Polipeptidi koji su kodirani polinukleotidima koji su koeksprimirani mogu se povezati putem npr. disulfidnih veza ili drugih sredstava, i tako proizvesti funkcionalan bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije. Na primer, deo lakog lanca Fab fragmenta može biti kodiran odvojenim polinukleotidom iz dela bispecifičnog antitela ili antitela koje se vezuje za FolR1 koji sadrži deo teškog lanca Fab fragmenta, podjedinicu Fc domena i opciono još jedan Fab fragment (ili njegov deo). Kad su koeksprimirani, polipeptidi teškog lanca će se povezati sa polipeptidima lakog lanca i formirati Fab fragment. U drugom primeru, deo bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije ili FolR1 antigen vezujući deo unutar njega, koji sadrži jednu od dve podjedinice Fc domena i opciono jedan ili više Fab fragmenata (ili njihov deo) mogu biti kodirani odvojenim polinukleotidom iz dela bispecifičnog antitela ili antitela koje se vezuje za FolR1 koji se u njemu nalazi i koje sadrži drugu od dve podjedinice Fc domena i opciono Fab fragment (ili njegov deo). Kada su koeksprimirane, podjedinice Fc domena će se udružiti da formiraju Fc domen.
U određenim otelotvorenjima, polinukleotid ili nukleinska kiselina je DNK. U drugim otelotvorenjima, polinukleotid iz predmetnog pronalaska je RNK, na primer, u obliku informacione RNK (mRNK). RNK iz predmetnog pronalaska može biti jednolančana ili dvolančana.
D. Varijante antitela
U određenim otelotvorenjima, razmatraju se varijante aminokiselinskih sekvenci bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije, specifičnog za FolR1 i CD3, koji se ovde obezbeđuje, kao i antitela, pored onih gore opisanih. Na primer, može biti poželjno da se poboljša afinitet vezivanja i/ili druge biološke osobine bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije. Varijante aminokiselinskih sekvenci bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije i antitela mogu se pripremiti uvođenjem odgovarajućih modifikacija u nukleotidnu sekvencu koja kodira bispecifični antigen vezujući molekul ili anitelo koji aktivira T ćelije, ili sintezom peptida. Takve modifikacije uključuju, na primer, uklanjanje, i/ili umetanje, i/ili supstituciju ostataka u aminokiselinskim sekvencama antitela. Bilo koja kombinacija uklanjanja, ubacivanja i supstitucije može se napraviti da se dođe do finalnog konstrukta, pod uslovom da finalni konstrukt ima željene karakteristike, npr. antigen vezujuće karakteristike.
1. Varijante supstitucije, ubacivanja i uklanjanja
U pojedinim otelotvorenjima, obezbeđuju se varijante koje imaju jednu ili više aminokiselinskih supstitucija. Mesta od interesa za supstitucionu mutagenezu uključuju HVR-ove i FR-ove. Konzervativne supstitucije su prikazane u Tabeli B pod naslovom "konzervativne supstitucije". Konkretnije izmene su date u Tabeli B pod naslovom „primeri supstitucija” i, kako je opisano u nastavku, prema klasama aminokiselinskih bočnih lanaca. Aminokiselinske supstitucije mogu biti uvedene u željeno antitelo i proizvode ispitane na željenu aktivnost, npr. zadržano/poboljšano vezivanje antigena, smanjena imunogenost, ili poboljšan ADCC ili CDC.
TABELA B
Aminokiseline mogu da se grupišu prema zajedničkim osobinama bočnog lanca: (1) hidrofobne: norleucin, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) neutralne hidrofilne: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) kisele: Asp, Glu;
(4) bazne: His, Lys, Arg;
(5) ostaci koji utiču na orijentaciju lanca: Gly, Pro;
(6) aromatične: Trp, Tyr, Phe.
Nekonzervativne supstitucije zahtevaju izmenu člana jedne od ovih klasa drugom klasom.
Jedna vrsta supstitucionih varijanti uključuje supstituciju jednog ili više ostataka hipervarijabilnog regiona matičnog antitela (npr. humanizovanog ili humanog antitela). Po pravilu, nastale varijante izabrane za dalje ispitivanje će imati modifikacije (npr. poboljšanja) izvesnih bioloških osobina (npr. povećan afinitet, smanjenu imunogenost) u odnosu na matično antitelo i/ili će imati suštinski zadržane izvesne biološke osobine matičnog antitela. Primer supstitucione varijante je afinitetno zrelo antitelo, koje može biti stvoreno na pogodan način, npr. korišćenjem tehnika afinitetnog sazrevanja na osnovu displeja faga, kao što su one ovde opisane. Ukratko, jedan ili više HVR ostataka su mutirani, i varijantna antitela su izložena na fagu i ispitana u pogledu određene biološke aktivnosti (npr. afiniteta vezivanja).
Izmene (npr. supstitucije) mogu se napraviti u HVR-ima, npr. radi poboljšanja afiniteta antitela. Takve izmene mogu biti napravljene na "žarišnim tačkama" HVR-a, tj. na ostacima koji su kodirani kodonima koji učestalo trpe mutaciju tokom procesa somatskog sazrevanja (videti npr. Chowdhury, Methods Mol. Biol.207:179-196 (2008)), i/ili SDR-ima (a-CDR), pri čemu se nastala varijanta VH ili VL ispituje na afinitet vezivanja. Afinitetno sazrevanje putem konstruisanja i ponovnog izbora iz sekundarnih biblioteka opisano je npr. u Hoogenboom et al. u Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O’Brien et al. izdav., Human Press, Totowa, NJ, (2001)). U nekim otelotvorenjima afinitetnog sazrevanja, raznovrsnost se uvodi u varijabilne gene izabrane za sazrevanje putem bilo koje od raznovrsnih metoda (npr. PCR koji favorizuje greške, mešanje lanaca ili mutageneza kontrolisana oligonukleotidima). Zatim se kreira sekundarna biblioteka. Biblioteka se zatim pretražuje radi identifikovanja varijanti antitela sa željenim afinitetom. Drugi postupak za uvođenje raznovrsnosti uključuje pristup usmeren na HVR, gde je nekoliko HVR ostataka randomizovano (npr. 4-6 ostataka istovremeno). HVR ostaci uključeni u vezivanje antigena mogu biti specifično identifikovani, npr. primenom skenirajuće mutageneze alaninom ili modelovanja. Posebno su često ciljani CDR-H3 i CDR-L3.
U pojedinim otelotvorenjima, supstitucije, ubacivanja ili izbacivanja se mogu desiti u jednom ili više HVR regiona, dokle god takve izmene u značajnoj meri ne umanjuju sposobnost antitela da vezuje antigen. Na primer, u HVR regionima se mogu načiniti konzervativne izmene (npr. konzervativne supstitucije kao što su ovde date) koje ne umanjuju znatno afinitet vezivanja. Takve izmene mogu biti izvan HVR "žarišnih tačaka" ili SDR-ova. U pojedinim otelotvorenjima varijantnih sekvenci VH i VL datih iznad, svaki HVR je ili neizmenjen, ili sadrži najviše jednu, dve ili tri supstitucije aminokiselina.
Korisna metoda za identifikovanje ostataka ili regiona antitela koji mogu biti ciljani za mutagenezu se zove "ciljana mutageneza sa alaninom", opisana u Cunningham i Wells (1989) Science, 244:1081-1085. Prema ovoj metodi, ostatak ili grupa ciljnih ostataka (npr.
naelektrisani ostaci, kao što su arg, asp, his, lys i glu) se identifikuje i zamenjuje neutralnom ili negativno naelektrisanom aminokiselinom (npr. alaninom ili polialaninom) da bi se odredilo da li to utiče na interakciju antitela sa antigenom. Dalje supstitucije mogu biti uvedene na lokacijama aminokiselina koje pokazuju funkcionalnu osetljivost na inicijalne supstitucije. Alternativno, ili dodatno, kristalna struktura kompleksa antigen–antitelo služi za identifikovanje tačaka kontakta antitela sa antigenom. Takvi kontaktni ostaci i susedni ostaci mogu biti ciljani, ili eliminisani kao kandidati za supstituciju. Varijante se mogu pregledati da bi se odredilo da li imaju željena svojstva.
Ubacivanja aminokiselinskih sekvenci obuhvataju spajanje amino- i/ili karboksiterminalnog kraja, pri čemu se dužina kreće od jednog ostatka do polipeptida koji sadrže stotine ostataka ili više, kao i ubacivanje u sekvencu jednog aminokiselinskog ostatka, ili većeg broja. Primeri terminalnih umetanja uključuju antitelo sa N-terminalnim metionil ostatkom. Druge varijante molekula antitela sa ubacivanjem obuhvataju spajanje sa N-terminalnim ili C-terminalnim krajem antitela sa enzimom (npr. za ADEPT) ili polipeptidom, što povećava poluživot antitela u serumu.
2. Varijante glikozilacije
U određenim otelotvorenjima, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije ili antitelo koji se ovde obezbeđuju, izmenjeni su da bi se povećao ili smanjio stepen do kog je antitelo glikozilovano. Dodavanje ili uklanjanje mesta glikozilacije na antitelu se može pogodno postići izmenom aminokiselinske sekvence, tako da se jedno ili više mesta glikozilacije dodaju ili uklone.
Tamo gde bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije ili antitelo koji se koriste u predmetnom pronalasku sadrže Fc region, ugljeni hidrat koji je za njih vezan se može izmeniti. Nativna antitela koja proizvode ćelije sisara tipično sadrže razgranati, biantenarni oligosaharid koji je obično vezan N-vezom za Asn297 CH2 domena Fc regiona. Videti npr. Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997). Oligosaharid može da obuhvata različite ugljene hidrate, npr. manozu, N-acetil glukozamin (GlcNAc), galaktozu i sijalinsku kiselinu, kao i fukozu vezanu za GlcNAc na „bazi” biantenarne oligosaharidne strukture. U nekim otelotvorenjima, modifikacije oligosaharida u bispecifičnom antitelu ili antitelu koje se vezuje za DR5, iz pronalaska, mogu biti načinjene da bi se dobile varijante antitela sa određenim poboljšanim osobinama.
U jednom otelotvorenju, date su varijante bispecifičnog antitela ili varijante antitela koje imaju ugljenohidratnu strukturu kojoj nedostaje fukoza vezana (direktno ili indirektno) za Fc region. Na primer, količina fukoze u tom antitelu može biti od 1% do 80%, od 1% do 65%, od 5% do 65% ili od 20% do 40%. Količina fukoze se određuje izračunavanjem prosečne količine fukoze u šećernom lancu na Asn297, u odnosu na zbir svih glikostruktura vezanih za Asn297 (npr. kompleksne, hibridne i strukture sa visokim sadržajem manoze), kao što je izmereno MALDI-TOF masenom spektrometrijom, npr. kao što je opisano u WO2008/077546. Asn297 se odnosi na asparaginski ostatak koji se nalazi oko položaja 297 u Fc regionu (prema EU numeraciji ostataka Fc regiona); međutim, Asn297 takođe može da se nalazi oko ± 3 aminokiseline više ili niže od položaja 297, tj. između položaja 294 i 300, usled manjih varijacija sekvenci kod antitela. Takve varijante fukozilacije mogu da imaju poboljšanu ADCC funkciju. Videti npr. US Patent Publication br. US 2003/0157108 (Presta, L.); US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Primeri publikacija vezanih za "defukozilovane" varijante antitela ili varijante "sa manjkom fukoze" su sledeći: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004). Primeri ćelijskih linija koje mogu da proizvedu defukozilovana antitela uključuju Lec 13 CHO ćelije sa manjkom proteinske fukozilacije (Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys.249:533-545 (1986); US Pat Appl br. US 2003/0157108 Al, Presta, L; i WO 2004/056312 Al, Adams et al., posebno u primeru 11), i nokaut ćelijske linije, poput gena alfa-1,6-fukoziltransferaze, FUT8, nokaut CHO ćelija (videti npr. Yamane-Ohnuki, N. et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006); i WO2003/085107).
Varijante bispecifičnog antigen vezujućeg molekula i antitela koji aktiviraju T ćelije obezbeđuju se dodatno pomoću podeljenih oligosaharida, npr. onih kod kojih je biantenarni oligosaharid vezan za Fc region bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije i koji se vezuje za FolR1 podeljen pomoću GlcNAc. Takve varijante bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije mogu imati smanjenu fukozilaciju i/ili poboljšanu funkciju ADCC. Primeri takvih varijanti antitela su opisani npr. u WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al.); US Patent br. 6,602,684 (Umana et al.); i US 2005/0123546 (Umana et al.). Takođe se obezbeđuju i varijante antitela sa najmanje jednim ostatkom galaktoze u oligosaharidu vezanom za Fc region. Takve varijante antitela mogu da imaju poboljšanu CDC funkciju. Takve varijante antitela su opisane npr. u WO 1997/30087 (Patel et al.); WO 1998/58964 (Raju, S.); i WO 1999/22764 (Raju, S.).
3. Varijante antitela konstruisane sa cisteinom
U određenim otelotvorenjima, može biti poželjno stvoriti bispecifični antigen vezujući molekul i antitela koji aktiviraju T ćelije konstruisan pomoću cisteina, npr. THIOMABS, u kojima je jedan ili više ostataka bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije supstituisan ostacima cisteina. U određenim otelotvorenjima, supstituisani ostaci se nalaze na pristupačnim mestima na bispecifičnom antigen vezujućem molekulu koji aktivira T ćelije. Supstitucijom tih ostataka cisteinom, reaktivne tiolske grupe se postavljaju na pristupačna mesta na antitelu, i mogu se koristiti za konjugovanje antitela sa drugim delovima, kao što su funkcionalni delovi leka ili funkcionalni delovi linker-lek, da bi se dobio imunokonjugat. U pojedinim otelotvorenjima, bilo koji, ili više ostataka navedenih u nastavku mogu biti supstituisani cisteinom: V205 (Kabatova numeracija) lakog lanca; A118 (EU numeracija) teškog lanca; i S400 (EU numeracija) teškog lanca Fc regiona. Antitela konstruisana sa cisteinom mogu se dobiti kao što je opisano, npr. u U.S. Patentu br.7,521,541.
E. Rekombinantne metode i kompozicije
Bispecifični antigen vezujući molekuli i antitela koji aktiviraju T ćelije iz ovog pronalaska mogu se dobiti, na primer, sintezom peptida u čvrstom stanju (npr. Merifildova sinteza u čvrstoj fazi) ili rekombinantnom proizvodnjom. Za rekombinantnu proizvodnju, jedan ili više polinukleotida koji kodiraju bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije ili antitela (ili fragmente), kao što je gore opisano, izoluje se i ubacuje u jedan ili više vektora radi daljeg kloniranja i/ili ekspresije u ćeliji domaćina. Takav polinukleotid može biti lako izolovan i sekvenciran pomoću konvencionalnih procedura. U jednom otelotvorenju, obezbeđen je vektor, poželjno ekspresioni vektor, koji sadrži jedan ili više polinukleotida iz pronalaska. Metode koje su dobro poznate stručnim licima iz ove oblasti mogu se primeniti za konstrukciju ekspresionih vektora koji sadrže kodirajuću sekvencu bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije ili antitela, uz odgovarajuće transkripcione/translacione kontrolne signale. Ti postupci uključuju in vitro tehnike rekombinantne DNK, sintetičke tehnike i in vivo rekombinaciju/genetsku rekombinaciju. Videti, na primer, tehnike opisane u Maniatiset al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989); i Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y (1989). Ekspresioni vektor može biti deo plazmida, virusa, ili može biti fragment nukleinske kiseline. Ekspresioni vektor uključuje ekspresionu kasetu u koju je kloniran polinukleotid koji kodira bispecifični antigen vezujući molekul (fragment) ili antitelo (fragment) koji aktivira T ćelije (tj. kodirajući region) u operabilnoj asocijaciji sa promoterom i/ili drugim kontrolnim elementima transkripcije ili translacije. U smislu ovog dokumenta, „kodirajući region” je deo nukleinske kiseline koja se sastoji od kodona translatovanih u aminokiseline. Iako „stop kodon” (TAG, TGA ili TAA) nije translatovan u aminokiselinu, može se smatrati delom kodirajućeg regiona, ako je prisutan, ali sve ostale granične sekvence, kao što su promoteri, mesta vezivanja ribozoma, terminatori transkripcije, introni, 5' i 3' netranslatovane regije i slično, nisu deo kodirajućeg regiona. Dva ili više kodirajućih regiona mogu da se nalaze u jednom konstruktu polinukleotida, npr. u jednom vektoru ili u odvojenim konstruktima polinukleotida, npr. na odvojenim (različitim) vektorima. Pored toga, svaki vektor može da sadrži jedan kodirajući region, ili može da obuhvata dva ili više kodirajućih regiona, npr. vektor iz predmetnog pronalaska može da kodira jedan ili više polipeptida, koji su post- ili kotranslaciono razdvojeni u krajnje proteine putem proteolitičkog cepanja. Pored toga, vektor, polinukleotid ili nukleinska kiselina iz pronalaska mogu da kodiraju heterologne kodirajuće regione, spojene ili nespojene sa polinukleotidom koji kodira bispecifični antigen vezujući molekul (fragment) ili antitelo koji aktivira T ćelije, njegovu varijantu ili njegov derivat. Heterologni kodirajući regioni obuhvataju, bez ograničenja, specijalizovane elemente ili motive, kao što su sekretorni signalni peptid ili heterologni funkcionalni domen. Operabilna asocijacija se dešava kada se kodirajući region genskog proizvoda, npr. polipeptida, poveže sa jednom regulatornom sekvencom ili više regulatornih sekvenci, tako da postavi ekspresiju genskog proizvoda pod uticaj ili kontrolu regulatorne sekvence (ili sekvenci). Dva DNK fragmenta (kao što je kodirajući region polipeptida i asocirani promoter) su „funkcionalno povezani” ukoliko indukcija promoterske funkcije izaziva transkripciju mRNK koja kodira željeni genski proizvod i ako priroda veze između dva DNK fragmenta ne ometa sposobnost ekspresije regulatornih sekvenci da usmeravaju ekspresiju genskog proizvoda ili utiču na sposobnost transkripcije DNK obrasca. Stoga bi region promotera bio operabilno povezan sa nukleinskom kiselinom koja kodira polipeptid da je promoter sposoban za vršenje transkripcije te nukleinske kiseline. Promoter može da bude ćelijski specifičan promoter koji usmerava značajnu transkripciju DNK samo u predodređenim ćelijama.
Drugi elementi koji kontrolišu transkripciju, pored promotera, na primer pojačivači, operatori, represori i signali okončanja transkripcije, mogu operabilno da se povežu sa polinukleotidom radi usmeravanja transkripcije specifične za određene ćelije. Ovde su opisani odgovarajući promoteri i drugi regioni koje kontrolišu transkripciju. Veliki broj regiona koji kontrolišu transkripciju poznat je stručnim licima iz ove oblasti. Ta grupa uključuje, bez ograničenja, regione koji kontrolišu transkripciju, i koji funkcionišu u ćelijama kičmenjaka, kao što su, bez ograničenja, segmenti za promociju i pojačavanje iz citomegalovirusa (npr. momentalni rani promoter u konjukciji sa intronom-A), virusa SV40 (npr. rani promoter) i retrovirusa (takav je, npr: Rausov sarkoma virus). Drugi regioni koji kontrolišu transkripciju obuhvataju one dobijene iz gena kičmenjaka, kao što su aktin, protein toplotnog stresa, goveđi hormon rasta i â-globin zeca, kao i druge sekvence sposobne za kontrolu ekspresije gena u eukariotskim ćelijama. Dodatni odgovarajući regioni koji kontrolišu transkripciju uključuju promotere specifične za tkivo i pojačivače, kao i inducibilne promotere (npr. inducibilni promoteri tetraciklina). Slično tome, veliki broj elemenata koji kontrolišu translaciju poznat je stručnjacima za ovu oblast. Ta grupa uključuje, bez ograničenja, mesta vezivanja ribozoma, kodone početka i kraja translacije i elemente dobijene iz viralnih sistema (naročito unutrašnje ribozomalno ulazno mesto ili IRES, poznato i kao CITE sekvenca). Transporter ekspresije može da sadrži i druge karakteristike kao što je mesto početka replikacije i/ili elemente integracije hromozoma, kao što su duga terminalna ponavljanja retrovirusa (LTR) ili invertovana terminalna ponavljanja (ITR) adenoasociranih virusa (AAV).
Kodirajući regioni polinukleotida i nukleinske kiseline iz predmetnog pronalaska mogu biti asocirani sa dodatnim kodirajućim regionima koji kodiraju sekretorne ili signalne peptide, koji usmeravaju sekreciju polipeptida kodiranih od strane polinukleotida iz predmetnog pronalaska. Na primer, ako je za bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije poželjna sekrecija, DNK koja kodira signalnu sekvencu može biti postavljena ushodno od nukleinske kiseline koja kodira bispecifično antitelo iz ovog pronalaska ili antitelo koje se vezuje za DR5 iz ovog pronalaska ili njihov fragment. U skladu sa hipotezom signala, proteini koji se luče putem ćelija sisara imaju signalni peptid ili sekretornu vodeću sekvencu koja je isečena iz zrelog proteina nakon što je započet izvoz rastućeg lanca proteina širom endoplazmatičnog retikuluma. Osobe standardne stručnosti iz ove oblasti su upoznate s tim da polipeptidi izlučeni iz ćelija kičmenjaka po pravilu imaju signalni peptid spojen za N-terminalni kraj polipeptida, koji je isečen iz translatovanog polipeptida radi stvaranja sekretornog ili „zrelog” oblika peptida. U određenim otelotvorenjima, nativni signalni peptid, npr. signalni peptid imunoglobulinskog teškog ili lakog lanca se koristi, ili se koristi funkcionalni derivat te sekvence koja zadržava sposobnost usmeravanja izlučivanja polipeptida sa kojim je funkcionalno povezana. Alternativno, može se koristiti heterologni signalni peptid sisara ili njegov funkcionalni derivat. Na primer, vodeća sekvenca divljeg tipa se može supstituisati vodećom sekvencom aktivatora plazminogena u ljudskom tkivu (TPA) ili β-glukuronidaze miša.
DNK koja kodira kratku proteinsku sekvencu koja bi se mogla koristiti za olakšavanje kasnijeg prečišćavanja (npr. histidinski rep) ili kao pomoć u obeležavanju bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije, može biti uključena unutar, ili na krajevima polinukleotida koji kodira bispecifični antigen vezujući molekul (fragment) ili antitelo (fragment) koji aktivira T ćelije.
U dodatnom otelotvorenju, obezbeđena je ćelija domaćin koja sadrži jedan polinukleotid iz pronalaska, ili više njih. U određenim otelotvorenjima, obezbeđena je ćelija domaćin koja sadrži jedan vektor iz pronalaska ili više njih. Polinukleotidi i vektori mogu da sadrže bilo koju od karakteristika, pojedinačno ili u kombinaciji, kao što je ovde opisano u vezi sa polinukleotidima odnosno vektorima. U jednom takvom otelotvorenju, ćelija domaćin sadrži vektor (npr. transformisana je ili transficirana njime) koji sadrži polinukleotid koji kodira bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije ili antitelo iz pronalaska, ili njihov deo. Kako se ovde koristi, pojam "ćelija domaćin" se odnosi na bilo koju vrstu ćelijskog sistema koji se može stvoriti tako da generiše bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije, npr. FolR1 bispecifični antigen vezujući molekuli koji aktiviraju T ćelije, ili antitelo npr. anti-PD-1, anti-PD-L1 i anti-TIM3 antitela prema predmetnom pronalasku, ili njihovi fragmenti. Ćelije domaćini pogodne za replikaciju i podsticanje ekspresije bispecifičnih antigen vezujućih molekula koji aktiviraju T ćelije i antitela iz ovog pronalaska, dobro su poznate u struci. Takve ćelije mogu da budu transficirane ili transdukovane u skladu sa određenim ekspresionim vektorom, a velike količine ćelija koje sadrže vektor mogu se uzgajati za zasejavanje velikih fermentora za dobijanje dovoljnih količina bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije za kliničku primenu. Pogodne ćelije domaćini uključuju prokariotske mikroorganizme, kao što je E. coli, ili različite eukariotske ćelije, kao što su jajne ćelije kineskog hrčka (CHO), ćelije insekata, i slično. Na primer, polipeptidi se mogu proizvesti u bakterijama, naročito kada nije neophodna glikozilacija. Nakon ekspresije, polipeptid može da se izoluje iz paste bakterijskih ćelija u rastvorljivoj frakciji, a može i dalje da se prečišćava. Osim prokariota, eukariotski mikrobi, kao što su filamentozne gljivice ili kvasci su pogodni domaćini za kloniranje ili ekspresiju vektora koji kodiraju polipeptid, uključujući sojeve gljivica i kvasaca čiji su putevi glikozilacije „humanizovani”, što dovodi do proizvodnje polipeptida sa delimično ili potpuno humanim glikozilacionim obrascem. Videti Gerngross, Nat Biotech 22, 1409-1414 (2004), i Li et al., Nat Biotech 24, 210-215 (2006). Pogodne ćelije domaćini za ekspresiju (glikozilovanih) polipeptida se takođe izvode iz višećelijskih organizama (beskičmenjaka i kičmenjaka). Primeri ćelija beskičmenjaka uključuju ćelije biljaka i insekata. Identifikovani su brojni sojevi bakulovirusa koji mogu da se koriste zajedno sa ćelijama insekata, naročito za transfekciju ćelija Spodoptera frugiperda. Kulture biljnih ćelija se takođe mogu koristiti kao domaćini. Videti npr. US Patent br.5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978, i 6,417,429 (gde se opisuje PLANTIBODIES™ tehnologija za proizvodnju antitela u transgenim biljkama). Ćelije kičmenjaka se, slično tome, mogu upotrebiti kao domaćini. Na primer, mogu se koristiti ćelijske linije sisara koje su adaptirane za rast u suspenziji. Druge primere korisnih ćelijskih linija domaćina sisara predstavlja CV1 linija bubrega majmuna transformisana pomoću SV40 (COS-7); linija bubrega humanog embriona (ćelije 293 ili 293T, kao što opisuju npr. Graham et al., J Gen Virol 36, 59 (1977)), ćelije bubrega mladunca hrčka (BHK), Sertolijeve mišje ćelije (TM4 ćelije kao što opisuje npr. Mather, Biol Reprod 23, 243-251 (1980)), ćelije bubrega majmuna (CV1), ćelije bubrega afričkog zelenog majmuna (VERO-76), humane ćelije cervikalnog karcinoma (HELA), ćelije bubrega psa (MDCK), ćelije jetre pacova (BRL 3A), humane ćelije pluća (W138), humane ćelije jetre (Hep G2), tumorske ćelije mlečne žlezde miša (MMT 060562), TRI ćelije (kao što opisuju npr. Mather et al., Annals N.Y. Acad Sci 383, 44-68 (1982)); MRC 5 ćelije i FS4 ćelije. Druge korisne ćelijske linije domaćina sisara predstavljaju jajne ćelije kineskog hrčka (CHO), uključujući dhfr<->CHO ćelije (Urlaub et al., Proc Natl Acad Sci USA 77, 4216 (1980)); i ćelijske linije mijeloma, kao što su: YO, NS0, P3X63 i Sp2/0. Za pregled određenih ćelijskih linija domaćina sisara, pogodnih za proizvodnju proteina, vidi, npr., Yazaki i Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, izd., Humana Press, Totowa, NJ), str. 255-268 (2003). Ćelije domaćini obuhvataju gajene ćelije, između ostalog, gajene ćelije sisara, ćelije kvasca, ćelije insekata, bakterijske ćelije i biljne ćelije, ali i ćelije sadržane u transgenim životinjama, transgenim biljkama ili gajenom biljnom ili životinjskom tkivu. U jednom otelotvorenju, ćelija domaćin je eukariotska ćelija, poželjno ćelija sisara, kao što je jajna ćelija kineskog hrčka (CHO), humana embrionska ćelija bubrega (HEK) ili limfoidna ćelija (npr., Y0, NS0, Sp20 ćelija).
U struci su poznate standardne tehnologije za ekspresiju stranih gena u ovim sistemima. Ćelije koje eksprimiraju polipeptid koji sadrži teški ili laki lanac antigen vezujućeg domena, kao što je antitelo, mogu se konstruisati tako da takođe eksprimiraju i drugi lanac antitela, tako da je eksprimirani proizvod antitelo koje ima teški i laki lanac.
Antitelo, fragment antitela, antigen vezujući domen ili varijabilni region antitela bilo koje životinjske vrste može se koristiti u bispecifičnim antigen vezujućim molekulima koji aktiviraju T ćelije iz ovog pronalaska. Neograničavajuća antitela, fragmenti antitela, antigen vezujući domeni ili varijabilni regioni korisni u ovom pronalasku mogu biti mišjeg, primatskog ili humanog porekla. Ako je bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije namenjen za humanu upotrebu, himerni oblik antitela može da se koristi ako konstantni regioni antitela potiču od čoveka. Humanizovani ili potpuno humani oblik antitela takođe se može dobiti u skladu sa metodama poznatim u struci (videti, npr. U.S. Patent br.5,565,332, Winter).
Humanizacija se može postići različitim metodama, uključujući, bez ograničenja, (a) graftovanje nehumanih (npr. donorskih antitela) CDR u humani (npr. antitelo primalac) okvir i konstantne regione sa zadržavanjem ili bez zadržavanja kritičnih ostataka okvira (npr. onih koji su važni za održavanje dobrog afiniteta za vezivanje antigena ili funkciju antitela), (b) graftovanje samo nehumanih regiona koji određuju specifičnost (SDR ili α-CDR; ostaci ključni za interakciju antitelo-antigen) na humani okvir i konstantne regione, ili (c) transplantacija čitavih nehumanih varijabilnih domena, koji se „prekrivaju” sekcijom nalik na humanu tako što se zamenjuju površinski ostaci. Humanizovana antitela i postupci njihovog dobijanja razmotreni su, npr., u Almagro i Fransson, Front Biosci 13, 1619-1633 (2008), a dodatno su opisani npr. u Riechmann et al., Nature 332, 323-329 (1988); Queen et al., Proc Natl Acad Sci USA 86, 10029-10033 (1989); US Patent br. 5,821,337, 7,527,791, 6,982,321 i 7,087,409; Jones et al., Nature 321, 522-525 (1986); Morrison et al., Proc Natl Acad Sci 81, 6851-6855 (1984); Morrison i Oi, Adv Immunol 44, 65-92 (1988); Verhoeyen et al., Science 239, 1534-1536 (1988); Padlan, Molec Immun 31(3), 169-217 (1994); Kashmiri et al., Methods 36, 25-34 (2005) (opis SDR (a-CDR) graftovanja); Padlan, Mol Immunol 28, 489-498 (1991) (opis „vraćanja na površinu”); Dall’Acqua et al., Methods 36, 43-60 (2005) (opis „FR mešanja”); i Osbourn et al., Methods 36, 61-68 (2005) i Klimka et al., Br J Cancer 83, 252-260 (2000) (opis pristupa „usmerene selekcije” FR mešanju). Humana antitela i humani varijabilni regioni mogu se dobiti primenom različitih tehnika poznatih u struci. Humana antitela načelno su opisana u van Dijk i van de Winkel, Curr Opin Pharmacol 5, 368-74 (2001) i Lonberg, Curr Opin Immunol 20, 450-459 (2008). Humani varijabilni regioni mogu da formiraju deo ili da budu izvedeni iz humanih monoklonskih antitela dobijenih metodom hibridoma (videti npr. Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, str. 51–63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)). Humana antitela i humani varijabilni regioni se mogu dobiti i primenom imunogena na transgenu životinju koja je modifikovana da proizvodi netaknuta humana antitela ili netaknuta antitela sa humanim varijabilnim regionima kao odgovor na antigenski izazov (videti, npr. Lonberg, Nat Biotech 23, 1117–1125 (2005). Humana antitela i humani varijabilni regioni se takođe mogu generisati izolovanjem sekvenci varijabilnog regiona Fv klona izabranih iz biblioteka displeja faga humanog porekla (videti npr., Hoogenboom et al. Methods in Molecular Biology 178, 1–37 (O’Brien et al., izdav., Human Press, Totowa, NJ, 2001); i McCafferty et al., Nature 348, 552–554; Clackson et al., Nature 352, 624–628 (1991)). Fagi tipično vrše displej fragmenata antitela, bilo kao jednolančani Fv (scFv) fragmenti ili kao Fab fragmenti.
U određenim otelotvorenjima, antigen vezujući delovi korisni u ovom pronalasku mogu biti konstruisani tako da imaju povećan afinitet vezivanja na primer, u skladu sa metodama objavljenim u US Pat. Appl. Publ. br. 2004/0132066, pri čemu je svaka ovde uključena referencom kao da je izneta u celosti. Sposobnost bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije iz pronalaska da se veže za specifičnu antigensku determinantu može se meriti pomoću testa sa enzimski vezanim imunosorbentom (ELISA) ili drugih tehnika poznatih u struci, npr. tehnikom površinske plazmonske rezonance (koja se vrši na sistemu BIACORE T100) (Liljeblad, et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)), i tradicionalnim testovima vezivanja (Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)). Kompetitivni testovi se mogu koristiti za identifikovanje antitela, fragmenta antitela, antigen vezujućeg domena ili varijabilnog domena koji se takmiči sa referentnim antitelom u pogledu vezivanja za određeni antigen, npr. antitelo koje se takmiči sa antitelom V9 u vezivanju za CD3. U određenim otelotvorenjima, takvo konkurentsko antitelo se vezuje za isti epitop (npr. linearni ili konformacioni epitop) za koji se vezalo referentno antitelo. Detaljne primere metoda za mapiranje epitopa za koji se vezuje antitelo daje Morris (1996) “Epitope Mapping Protocols,” u Methods in Molecular Biology vol.
66 (Humana Press, Totowa, NJ). U primeru kompetitivnog testa, imobilisani antigen (npr. CD3) se inkubira u rastvoru koji sadrži prvo obeleženo antitelo koje se vezuje za antigen (npr. antitelo V9, opisano u US 6,054,297) i drugo neobeleženo antitelo, čija se sposobnost takmičenja sa prvim antitelom u pogledu vezivanja za antigen ispituje. Drugo antitelo može da se nalazi u supernatantu hibridoma. Kao kontrola, imobilisani antigen se inkubira u rastvoru koji sadrži prvo obeleženo antitelo, ali ne i drugo neobeleženo antitelo. Nakon inkubacije pod uslovima koji dopuštaju vezivanje prvog antitela za antigen, višak nevezanog antitela se uklanja i meri se količina obeleživača vezanog za imobilisani antigen. Ako je količina obeleživača vezanog za imobilisani antigen u test-uzorku značajno smanjena u odnosu na kontrolni uzorak, to ukazuje da se drugo antitelo takmiči sa prvim antitelom u pogledu vezivanja za antigen. Videti Harlow i Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual pogl.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).
U određenim otelotvorenjima, antigen vezujući delovi korisni u ovom pronalasku mogu biti konstruisani tako da imaju povećan afinitet vezivanja, na primer, u skladu sa metodama objavljenim u US Pat. Appl. Publ. br. 2004/0132066, pri čemu je svaka ovde uključena referencom kao da je izneta u celosti. Sposobnost bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije ili antitela iz ovog pronalaska da se veže za specifičnu antigensku determinantu može se meriti pomoću testa sa enzimski vezanim imunosorbentom (ELISA) ili drugih tehnika poznatih u struci, npr. tehnikom površinske plazmonske rezonance (koja se vrši na sistemu BIACORE T100) (Liljeblad, et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)), i tradicionalnih testova vezivanja (Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)). Kompetitivni testovi se mogu koristiti za identifikovanje antitela, fragmenta antitela, antigen vezujućeg domena ili varijabilnog domena koji se takmiči sa referentnim antitelom u pogledu vezivanja za određeni antigen. U određenim otelotvorenjima, takvo konkurentsko antitelo se vezuje za isti epitop (npr. linearni ili konformacioni epitop) za koji se vezalo referentno antitelo. Detaljne primere metoda za mapiranje epitopa za koji se vezuje antitelo daje Morris (1996) “Epitope Mapping Protocols,” u Methods in Molecular Biology vol.66 (Humana Press, Totowa, NJ). U primeru kompetitivnog testa, imobilisani antigen se inkubira u rastvoru koji sadrži prvo obeleženo antitelo koje se vezuje za antigen i drugo neobeleženo antitelo, čija se sposobnost takmičenja sa prvim antitelom u pogledu vezivanja za antigen ispituje. Drugo antitelo može da se nalazi u supernatantu hibridoma. Kao kontrola, imobilisani antigen se inkubira u rastvoru koji sadrži prvo obeleženo antitelo, ali ne i drugo neobeleženo antitelo. Nakon inkubacije pod uslovima koji dopuštaju vezivanje prvog antitela za antigen, višak nevezanog antitela se uklanja i meri se količina obeleživača vezanog za imobilisani antigen. Ako je količina obeleživača vezanog za imobilisani antigen u test-uzorku značajno smanjena u odnosu na kontrolni uzorak, to ukazuje da se drugo antitelo takmiči sa prvim antitelom u pogledu vezivanja za antigen. Videti Harlow i Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual pogl. 14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).
Bispecifični antigen vezujući molekuli koji aktiviraju T ćelije i antitela pripremljeni kao što je ovde opisano, mogu se prečistiti tehnikama poznatim u struci, kao što su tečna hromatografija visokih performansi, jonska hromatografija, gel elektroforeza, afinitetna hromatografija, gel hromatografija, i slično. Stvarni uslovi korišćeni za prečišćavanje određenog proteina delimično će zavisiti od faktora kao što su ukupno naelektrisanje, hidrofobnost, hidrofilnost itd., i biće očigledni stručnjacima iz ove oblasti. Za prečišćavanje afinitetnom hromatografijom se može koristiti antitelo, ligand, receptor ili antigen za koji se vezuje bispecifično antitelo ili antitelo koje se vezuje za DR5. Na primer, za prečišćavanje afinitetnom hromatografijom bispecifičnih antitela iz predmetnog pronalaska može se koristiti matrica sa proteinom A ili proteinom G. Afinitetna hromatografija pomoću sekvencijalnog proteina A ili G i hromatografija na molekulskim sitima mogu se koristiti za izolovanje bispecifičnog antitela u osnovi onako kao što je opisano u Primerima. Čistoća bispecifičnog antitela ili antitela koje se vezuje za DR5 može se utvrditi različitim analitičkim metodama poznatim u struci, uključujući gel elektroforezu, tečnu hromatografiju pod visokim pritiskom, i slično.
F. Testovi
Bispecifični antigen vezujući molekuli koji aktiviraju T ćelije, npr. bispecifični antigen vezujući molekuli koji aktiviraju T ćelije koji sadrže prvo antigen vezujuće mesto specifično za folatni receptor 1 (FolR1) i drugo antigen vezujuće mesto specifično za CD3, i antitela, npr. ovde data antagonistička antitela protiv vezivanja ose PD-1 i anti-TIM3 antagonistička antitela, mogu se identifikovati, pregledati ili okarakterisati prema njihovim fizičko-hemijskim osobinama i/ili biološkim aktivnostima, pomoću različitih testova poznatih u struci.
1. Testovi za merenje afiniteta
Afinitet bispecifičnih antigen vezujućih molekula koji aktiviraju T ćelije, npr. bispecifičnih antigen vezujućih molekula koji aktiviraju T ćelije koji sadrže prvo antigen vezujuće mesto specifično za folatni receptor 1 (FolR1) i drugo antigen vezujuće mesto specifično za CD3, i antitela, npr. ovde data antagonistička antitela protiv vezivanja ose PD-1 i anti-TIM3 antagonistička antitela za njihov odgovarajući antigen, npr. FolR1, PD-1, PD-L1, TIM3, mogu se odrediti u skladu sa metodama iznetim u primerima površinskom plazmonskom rezonancom (SPR), pomoću standardnih instrumenata kao što je BIAcore instrument (GE Healthcare), i receptora ili ciljnih proteina koji se mogu dobiti rekombinantnom ekspresijom. Alternativno, vezivanje bispecifičnih antigen vezujućih molekula koji aktiviraju T ćelije i antitela koji su ovde obezbeđeni, za njihove odgovarajuće antigene može se proceniti pomoću ćelijskih linija koje eksprimiraju određeni receptor ili ciljni antigen, na primer putem protočne citometrije (FACS).
KDse može meriti površinskom plazmonskom rezonancom pomoću mašine BIACORE<®>T100 (GE Healthcare) na 25 °C. Da bi se analizirala interakcija između Fc-dela i Fc receptora, His-označeni rekombinantni Fc-receptor se hvata Penta His antitelom (Qiagen) ("Penta His" objavljen kao SEQ ID NO: 392) imobilisanim na CM5 čipovima, a bispecifični konstrukti se koriste kao analiti. Ukratko, biosenzorski čipovi sa karboksimetilovanim dekstranom (CM5, GE Healthcare) aktiviraju se pomoću N-etil-N’-(3-dimetilaminopropil)-karbodiimid hidrohlorida (EDC) i N-hidroksisukcinimida (NHS) prema uputstvu dobavljača. Anti Penta-His antitelo ("Penta His" objavljeno kao SEQ ID NO: 392) razblaženo je 10 mM natrijum acetatom, pH 5,0, do 40 μg/ml pre injektovanja pri protoku od 5 μl/min, da se dobije oko 6500 jedinica odgovora (RU) kuplovanog proteina. Nakon injektovanja liganda, 1 M etanolamin se injektuje da bi blokirao neizreagovale grupe. Nakon toga se Fc receptor hvata tokom 60 s pri 4 ili 10 nM. Za kinetička merenja, četvorostruka serijska razblaženja bispecifičnog konstrukta (raspon između 500 nM i 4000 nM) se injektuju u HBS-EP (GE Healthcare, 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0,05% surfaktant P20, pH 7,4) na 25 °C pri protoku od oko 30 μl/min tokom 120 s.
Da bi se odredio afinitet prema ciljnom antigenu, bispecifični konstrukti se hvataju antihumanim Fab specifičnim antitelom (GE Healthcare) koje je imobilisano na aktiviranoj površini CM5-senzorskog čipa, kako je opisano za anti Penta-His antitelo ("Penta His" objavljeno kao SEQ ID NO: 392.). Konačna količina kuplovanog proteina je oko 12.000 RU. Bispecifični konstrukti se hvataju tokom 90 s na 300 nM. Ciljni antigeni se propuštaju kroz protočne ćelije tokom 180 s u rasponu koncentracija od 250 do 1000 nM, uz protok od 30 µl/min. Disocijacija se prati tokom 180 s.
Ukupne razlike indeksa prelamanja su korigovane oduzimanjem odgovora dobijenog na referentnoj protočnoj ćeliji. Odgovor stacionarnog stanja korišćen je da bi se dobila konstanta disocijacije KDnelinearnim uklapanjem krive Lengmirove izoterme vezivanja. Brzina asocijacije (kon) i brzina disocijacije (koff) su izračunate pomoću jednostavnog jedan-najedan Lengmirovog modela vezivanja (BIACORE<®>T100 Evaluation Software verzija 1.1.1) simultanim podešavanjem senzorgrama asocijacije i disocijacije. Ravnotežna konstanta disocijacije (KD) izračunata je kao odnos koff/kon. Videti, npr. Chen et al. J. Mol. Biol.293:865-881 (1999).
2. Testovi vezivanja i drugi testovi
U jednom aspektu, bispecifični antigen vezujući molekuli koji aktiviraju T ćelije, npr. bispecifični antigen vezujući molekuli koji aktiviraju T ćelije koji sadrže prvo antigen vezujuće mesto specifično za folatni receptor 1 (FolR1) i drugo antigen vezujuće mesto specifično za CD3, i antitela, npr. ovde data antagonistička antitela protiv vezivanja ose PD-1 i anti-TIM3 antagonistička antitela, testiraju se na aktivnost vezivanja antigena, npr. poznatim metodama kao što su ELISA, vestern blot, itd.
U drugom aspektu, mogu se koristiti testovi kompetitivnosti da se identifikuje antitelo ili fragment koji se takmiči sa specifičnim antitelom u vezivanju za odgovarajuće antigene. U određenim otelotvorenjima, takvo konkurentsko antitelo se vezuje za isti epitop (npr. linearni ili konformacioni epitop) za koji se vezalo specifično referentno antitelo. Detaljne primere metoda za mapiranje epitopa za koji se vezuje antitelo daje Morris (1996) “Epitope Mapping Protocols,” u Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ). Dodatne metode opisane su u odeljku sa primerima.
3. Testovi za merenje aktivnosti
U jednom aspektu, obezbeđuju se testovi za identifikaciju bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije, npr. bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije koji sadrži prvo antigen vezujuće mesto specifično za folatni receptor 1 (FolR1) i drugo antigen vezujuće mesto specifično za CD3, i antitela, npr. ovde datih antagonističkih antitela protiv vezivanja ose PD-1 i anti-TIM3 antagonističkih antitela, koji imaju biološku aktivnost. Biološka aktivnost može podrazumevati npr. indukciju fragmentacije DNK, indukciju apoptoze i lizu ciljanih ćelija. Takođe se obezbeđuju antitela koja imaju takvu biološku aktivnost in vivo i/ili in vitro.
U pojedinim otelotvorenjima, antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije i antitelo iz pronalaska ispituju se na takvu biološku aktivnost. Testovi za detekciju lize ćelija (npr. merenjem otpuštanja LDH) ili apoptoze (npr. pomoću TUNEL testa) su dobro poznati u struci. Testovi za merenje ADCC ili CDC takođe su opisani u WO 2004/065540 (videti Primer 1), čiji je celokupan sadržaj ovde uključen referencom.
G. Farmaceutske formulacije
Farmaceutske formulacije bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije, npr. bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije koji sadrži prvo antigen vezujuće mesto specifično za folatni receptor 1 (FolR1) i drugo antigen vezujuće mesto specifično za CD3, i antitela, npr. ovde datih antagonističkih antitela protiv vezivanja ose PD-1 i anti-TIM3 antagonističkih antitela, pripremaju se mešanjem takvih bispecifičnih antigen vezujućih molekula koji aktiviraju T ćelije ili antitela, koji imaju željeni stepen čistoće sa jednim ili više neobaveznih farmaceutski prihvatljivih nosača (Remington's Pharmaceutical Sciences 16.izdanje, Osol, A. izd. (1980)), u obliku liofilizovanih formulacija ili vodenih rastvora. Farmaceutski prihvatljivi nosači su uglavnom netoksični za primaoca u primenjenim dozama i koncentracijama i uključuju, bez ograničenja: pufere, kao što je fosfatni, citratni, i puferi drugih organskih kiselina; antioksidanse, uključujući askorbinsku kiselinu i metionin; konzervanse (kao što je oktadecildimetilbenzil amonijum hlorid; heksametonijum hlorid; benzalkonijum hlorid, benzetonijum hlorid; fenol, butil ili benzil alkohol; alkil parabene, kao što je metil ili propil paraben; katehol; rezorcinol; cikloheksanol; 3-pentanol; i m-krezol); polipeptide male molekulske mase (manje od oko 10 ostataka); proteine, kao što je albumin iz seruma, želatin ili imunoglobulini; hidrofilne polimere, kao što je polivinilpirolidon; aminokiseline, kao što je glicin, glutamin, asparagin, histidin, arginin ili lizin; monosaharide, disaharide i druge ugljene hidrate, uključujući glukozu, manozu ili dekstrine; helatne agense, kao što je EDTA; šećere, kao što je saharoza, manitol, trehaloza ili sorbitol; kontrajone koji grade soli, kao što je natrijum; metalne komplekse (npr. kompleksi Zn-protein); i/ili nejonske surfaktante, kao što je polietilen glikol (PEG). Primeri farmaceutski prihvatljivih nosača ovde dalje uključuju agense za intersticijalnu disperziju lekova, kao što su rastvorljivi neutralno aktivni glikoproteini hijaluronidaze (sHASEGP), na primer, humani rastvorljivi PH-20 glikoproteini hijaluronidaze, kao što je rHuPH20 (HYLENEX<®>, Baxter International, Inc.).
Pojedini primeri za sHASEGP i metode primene, uključujući rHuPH20, opisani su u US Patent Publication br.2005/0260186 i 2006/0104968. U jednom aspektu, sHASEGP se kombinuje sa jednom ili više dodatnih glikozaminoglikanaza, kao što je hondroitinaza.
Primeri liofilizovanih formulacija antitela opisani su u US Patentu br. 6,267,958. Vodene formulacije antitela uključuju one opisane u US Patentu br. 6,171,586 i WO2006/044908, pri čemu ove druge formulacije uključuju histidin-acetatni pufer.
Formulacija iz ovog dokumenta može takođe da sadrži više od jednog aktivnog sastojka, kao što je neophodno za naročitu indikaciju koja se leči, poželjno one sa komplementarnim aktivnostima koji ne utiču negativno jedan na drugi. Takvi aktivni sastojci su pogodno prisutni u kombinaciji u količinama koje su efikasne za nameravane svrhe.
Aktivni sastojci mogu biti zarobljeni u pripremljenim mikrokapsulama, na primer, tehnikom koacervacije ili interfacijalne polimerizacije, na primer, hidroksimetilceluloze, odnosno želatinskih mikrokapsula, odnosno poli-(metilmetakrilat) mikrokapsula, u koloidnim sistemima za isporuku lekova (na primer, lipozomi, albuminske mikrosfere, mikroemulzije, nanočestice i nanokapsule) ili u makroemulzijama. Takve tehnike su objavljene u Remington’s Pharmaceutical Sciences 16. izd, Osol, A. izd. (1980).
Mogu se pripremiti preparati sa produženim oslobađanjem. Pogodni primeri preparata sa produženim oslobađanjem uključuju semipermeabilne matrice čvrstih hidrofobnih polimera koje sadrže antitelo, pri čemu su matrice uobličeni proizvodi, npr. filmovi ili mikrokapsule.
Formulacije za primenu in vivo generalno su sterilne. Sterilnost se može lako postići, npr. filtracijom kroz sterilne filtracione membrane.
H. Postupci lečenja i preparati
Terapijske kombinacije koje sadrže jedan ili više bispecifičnih antigen vezujućih molekula koji aktiviraju T ćelije i antagonističko antitelo protiv vezivanja ose PD-1 i, opciono, TIM3 antagonist koji se ovde obezbeđuju, mogu se koristiti za terapijske metode.
U jednom aspektu, obezbeđuju se bispecifčni antigen vezujući molekuli koji aktiviraju T ćelije koji se vezuju za folatni receptor 1 (FolR1) i CD3 koji se koriste kao lek u kombinaciji sa antagonističkim antitelom protiv vezivanja ose PD-1. U određenim otelotvorenjima, obezbeđuje se bispecifični antigen vezujući molekuli koji aktiviraju T ćelije koji se vezuju za FolR1 i CD3 koji se koriste u kombinaciji sa antagonističkim antitelom protiv vezivanja ose PD-1 za upotrebu u metodi lečenja. U određenim otelotvorenjima, ova kombinacija dodatno sadrži TIM3 antagonist, npr. anti-TIM3 antagonističko antitelo. U određenim otelotvorenjima, pronalazak obezbeđuje bispecifične antigen vezujuće molekule koji aktiviraju T ćelije koji se vezuju za FolR1 i CD3 i antagonističko antitelo protiv vezivanja ose PD-1 za upotrebu u metodi lečenja pojedinca koji ima rak, a koja sastoji se u davanju pojedincu efikasne količine bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije i koji se veže za FolR1 i CD3 i antagonističko antitelo protiv vezivanja ose PD-1. U jednom takvom otelotvorenju, metoda dodatno obuhvata davanje pojedincu efikasne količine najmanje jednog TIM3 antagonista, npr. kao što je opisano u nastavku. „Pojedinac” prema svakom od navedenih otelotvorenja je poželjno čovek. U jednom poželjnom otelotvorenju, navedeni rak je rak gušterače, sarkom ili kolorektalni karcinom. U drugim otelotvorenjima, rak je kolorektalni rak, sarkom, rak glave i vrata, karcinomi skvamoznih ćelija, rak dojke, rak gušterače, rak želuca, nesitnoćelijski karcinom pluća, sitnoćelijski rak pluća ili mezoteliom. U otelotvorenjima u kojima je se radi o raku dojke, rak dojke može biti trostruko negativni rak dojke.
U još jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje upotrebu terapijske kombinacije koja sadrži bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije koji se vezuje za FolR1 i CD3 i antagonističko antitelo protiv vezivanja ose PD-1 za proizvodnju ili pripremu leka. U jednom otelotvorenju, kombinacija dodatno sadrži TIM3 antagonist. U jednom otelotvorenju, radi se o leku za lečenje raka. U jednom drugom otelotvorenju, radi se o leku koji se koristi u metodi za lečenje raka, koja se sastoji od davanje efikasne količine leka pojedincu koji ima rak. U jednom takvom otelotvorenju, metoda se dodatno sastoji od davanja pojedincu efikasne količine najmanje jednog dodatnog terapeutskog agensa, npr. kao što je opisano u nastavku. „Pojedinac” prema bilo kom od gore navedenih otelotvorenja može biti čovek.
U još jednom aspektu, pronalaskom se obezbeđuje metoda za lečenje raka. U jednom otelotvorenju, metoda se sastoji od davanja pojedincu koji boluje od raka efikasne količine terapeutske kombinacije koja sadrži bispecifčni antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije koji se vezuje za FolR1 i CD3 i antagonističko antitelo protiv vezivanja ose PD-1. U jednom takvom otelotvorenju, metoda se dodatno sastoji od davanja pojedincu efikasne količine najmanje jednog dodatnog terapeutskog agensa, kao što je opisano u nastavku. U jednom takvom otelotvorenju, najmanje jedan dodatni terapeutski agens je anti-TIM3 antagonističko antitelo. „Pojedinac” prema bilo kom od gore navedenih otelotvorenja može biti čovek. U jednom poželjnom otelotvorenju, navedeni rak je rak gušterače, sarkom ili kolorektalni karcinom. U drugim otelotvorenjima, rak je kolorektalni rak, sarkom, rak glave i vrata, karcinomi skvamoznih ćelija, rak dojke, rak gušterače, rak želuca, nesitnoćelijski karcinom pluća, sitnoćelijski rak pluća ili mezoteliom.
U još jednom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje farmaceutske formulacije koje sadrže bilo koji bispecifčni antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije koji se vezuje za folatni FolR1 i CD3 iz ovog dokumenta, npr. za upotrebu u bilo kojoj od gore navedenih terapeutskih metoda, i antagonističko antitelo protiv vezivanja ose PD-1. U jednom otelotvorenju, farmaceutska formulacija sadrži bilo koji ovde obezbeđen bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije koji se vezuje za FolR1 i farmaceutski prihvatljiv nosač. U još jednom otelotvorenju, farmaceutska formulacija sadrži bilo koji bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije koji se vezuje za FolR1 i CD3 i antagonističko antitelo protiv vezivanja ose PD-1, koji su ovde dati, i najmanje jedan dodatni terapeutski agens, npr. kao što je opisano u nastavku.
Bispecifično antitelo se može davati bilo kojim pogodnim načinom, uključujući parenteralno, intrapulmonarno i intranazalno, i, ako se želi za lokalno lečenje, intraleziono. Parenteralne infuzije uključuju intramuskularnu, intravensku, intraarterijsku, intraperitonealnu ili supkutanu primenu. Doziranje može biti bilo kojim prikladnim načinom, npr. putem injekcija, kao što su intravenske ili supkutane injekcije, što delimično zavisi od toga da li je primena kratkotrajna ili hronična. Ovde su razmatrani različiti rasporedi doziranja uključujući, bez ograničenja, pojedinačnu ili višestruku primenu u različitim terminima, bolusnu primenu i pulsnu infuziju.
Bispecifična antitela se mogu formulisati, dozirati i davati na način dosledan dobroj lekarskoj praksi. U ovom kontekstu se mogu razmatrati faktori kao što su konkretni poremećaj koji se leči, konkretni sisar koji se leči, kliničko stanje pojedinačnog pacijenta, uzrok poremećaja, mesto na koje se agens daje, metoda davanja, raspored davanja i drugi faktori poznati lekarima. Bispecifično antitelo, iako to nije obavezno, opciono je formulisano sa jednim ili više agensa koji se trenutno primenjuju za sprečavanje ili lečenje datog poremećaja. Efikasna količina takvih drugih agenasa zavisi od količine antitela prisutnog u formulaciji, vrste poremećaja ili lečenja, kao i drugih faktora koji su prethodno razmatrani. Oni se po pravilu koriste u istim dozama i sa istim načinom primene kao što je gore opisano, ili od oko 1 do 99% doza koje su ovde opisane, ili u bilo kojoj dozi i sa bilo kojim načinom primene za koje je empirijski/klinički dokazano da su odgovarajući.
Za prevenciju ili lečenje bolesti, odgovarajuća doza bispecifičnog antitela zavisi od tipa bolesti koju treba lečiti, tipa antitela, težine i toka bolesti, da li se bispecifično antitelo primenjuje preventivno ili u terapeutske svrhe, od prethodne terapije, kliničke anamneze pacijenta i odgovora na bispecifično antitelo, i od odluke nadležnog lekara. Bispecifično antitelo je pogodno za primenu na pacijentu jednokratno, ili u seriji terapija. U zavisnosti od vrste i težine bolesti, oko 1 µg/kg do 15 mg/kg (npr.0,1 mg/kg-10 mg/kg) bispecifičnog antitela ili novog antitela koje se vezuje za DR5 može biti početna doza za primenu na pacijentu, na primer, bilo kao jedna ili više odvojenih primena, ili kao kontinuirana infuzija. Jedna tipična dnevna doza se može kretati u opsegu od oko 1 µg/kg do 100 mg/kg ili više, u zavisnosti od gore pomenutih faktora. Kod ponovljene primene u trajanju od nekoliko dana ili duže, u zavisnosti od stanja, lečenje će po pravilu biti nastavljeno sve do željenog suzbijanja simptoma bolesti. Primer doze za bispecifično antitelo bi bio u opsegu od oko 0,05 mg/kg do oko 10 mg/kg. Stoga se pacijentu može dati jedna ili više doza od oko 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg ili 10 mg/kg. Takve doze se mogu primenjivati povremeno, npr. svake nedelje ili svake tri nedelje (npr. tako da pacijent primi od oko dve do oko dvadeset, ili npr. oko šest doza bispecifičnog antitela). Može se primeniti veća početna doza, a nakon toga jedna ili više manjih doza. Međutim, mogu biti korisni i drugi dozni režimi. Napredak ove terapije jednostavno se prati klasičnim tehnikama i testovima.
Podrazumeva se da se bilo koja od gornjih formulacija ili terapeutskih metoda može izvesti upotrebom imunokonjugata iz predmetnog pronalaska umesto ili sa bispecifičnim antigen vezujućim molekulom koji aktivira T ćelije koji se vezuje za FolR1 i CD3 i antagonističkim antitelom protiv vezivanja ose PD-1 i, opciono, anti-TIM3 antagonističkim antitelom.
I. Proizvodi
U drugom aspektu pronalaska, obezbeđen je proizvod koji sadrži materijale korisne u lečenju, prevenciji i/ili dijagnostikovanju prethodno opisanih poremećaja. Proizvod uključuje pakovanje i etiketu ili uputstvo za upotrebu, na pakovanju ili uz njega. Pogodno pakovanje uključuje, na primer, boce, bočice, špriceve, kese za IV rastvor, itd. Pakovanje može biti izrađeno od različitih materijala, kao što je staklo ili plastika. Pakovanje sadrži preparat koji je sam po sebi ili u kombinaciji sa drugim preparatom efikasan u lečenju, prevenciji i/ili dijagnostikovanju stanja, i može imati priključak za sterilni pristup (na primer, pakovanje može biti kesa za intravenski rastvor ili bočica sa zapušačem koji može da se probuši iglom za potkožnu injekciju). Barem jedan aktivni agens u preparatu je bispecifično antitelo, a dodatni aktivni agens je neki hemoterapijski agens, kako je ovde opisano. Etiketa ili uputstvo za upotrebu ukazuje na to da se preparat koristi za lečenje stanja po izboru. Pored toga, proizvod može da sadrži (a) prvo pakovanje sa preparatom koji se u njemu nalazi, pri čemu preparat sadrži bispecifično antitelo; i (b) drugo pakovanje sa preparatom koji se u njemu nalazi, pri čemu preparat sadrži dodatni citotoksični ili drugi terapeutski agens. Proizvod u ovom otelotvorenju predmetnog pronalaska može dodatno da sadrži uputstvo za upotrebu koje ukazuje da kompozicije mogu da se koriste za lečenje određenog stanja. Alternativno, ili dodatno, proizvod može dalje da sadrži drugo (ili treće) pakovanje koje sadrži farmaceutski prihvatljiv pufer, kao što je bakteriostatska voda za injekcije (BWFI), fiziološki rastvor sa fosfatnim puferom, Ringerov rastvor i rastvor dekstroze. Proizvod može dodatno da sadrži druge materijale poželjne sa komercijalnog aspekta i sa aspekta upotrebe, uključujući druge pufere, razblaživače, filtere, igle i špriceve.
Podrazumeva se da bilo koji od gore navedenih proizvoda može sadržati imunokonjugat iz ovog pronalaska umesto ili sa bispecifičnim antigen vezujućim molekulom koji aktivira T ćelije koji se vezuje za FolR1 i CD3 i antagonističkim antitelom protiv vezivanja ose PD-1 i, opciono, anti-TIM3 antagonističkim antitelom.
III. PRIMERI
U nastavku su dati primeri metoda i preparata predmetnog pronalaska. Podrazumeva se da mogu biti primenjena razna druga otelotvorenja, na osnovu opšteg opisa koji je gore dat.
U nastavku su dati primeri metoda i preparata predmetnog pronalaska. Podrazumeva se da mogu biti primenjena razna druga otelotvorenja, na osnovu opšteg opisa koji je gore dat.
Opšti postupci
Tehnike rekombinantne DNK
Za manipulaciju DNK korišćeni su standardni postupci kao što je opisano u radu Sambrook et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989. Reagensi za molekularnu biologiju su korišćeni prema uputstvu proizvođača. Opšte informacije u vezi sa sekvencama nukleotida lakih i teških lanaca humanog imunoglobulina date su u: Kabat, E.A. et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. izd., NIH Publication br.91-3242.
Sekvenciranje DNK
Sekvence DNK su određene pomoću sekvenciranja dvostrukog lanca.
Genska sinteza
Željeni segmenti gena, po potrebi su dobijeni putem PCR pomoću odgovarajućih obrazaca, ili su sintetisani pomoću uređaja Geneart AG (Regensburg, Nemačka) iz sintetičkih oligonukleotida i PCR proizvoda pomoću automatizovane genske sinteze. U slučajevima kada nije bila dostupna tačna sekvenca gena, prajmeri oligonukleotida su dizajnirani na osnovu sekvenci najbližih homologa i geni su izolovani pomoću RT-PCR iz RNK koja potiče iz odgovarajućeg tkiva. Segmenti gena okruženi mestima cepanja jedinstvenom restrikcionom endonukleazom klonirani su u standardne klonirajuće/sekvencione vektore. DNK plazmida je prečišćena iz transformisane bakterije i koncentracija je određena UV spektroskopijom. DNK sekvenca subkloniranog genskog fragmenta je potvrđena sekvenciranjem DNK. Segmenti gena su dizajnirani sa pogodnim restrikcionim mestima da bi se omogućilo subkloniranje u odgovarajuće ekspresione vektore. Svi konstrukti su dizajnirani sa DNK sekvencom na 5' kraju koja kodira vodeći peptid koji cilja proteine za izlučivanje u eukariotskim ćelijama.
Izolovanje primarnih humanih pan T ćelija iz PBMC
Mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) pripremljene su gradijentnim Histopaque centrifugiranjem obogaćenih limfocitnih preparata (leukocitno-trombocitnog sloja) dobijenih od lokalnih banaka krvi ili iz sveže krvi zdravih humanih donora. Ukratko, sveža krv je razblažena sterilnim PBS-om i pažljivo raslojena putem gradijenta Histopaque (Sigma, H8889). Nakon centrifugiranja 30 minuta pri 450 x g na sobnoj temperaturi (kočnica je isključena), deo plazme iznad međufaze koja sadrži PBMC je odbačen. PBMC su prebačeni u nove Falcon epruvete od 50 ml i epruvete su napunjene PBS-om do ukupne zapremine od 50 ml. Smeša je centrifugirana na sobnoj temperaturi 10 minuta na 400 x g (kočnica je uključena). Supernatant je odbačen i pelet PBMC je dva puta ispran sterilnim PBS-om (koraci centrifugiranja na 4 °C tokom 10 minuta pri 350 x g). Dobijena PBMC populacija je prebrojana automatski (ViCell) i čuvana u medijumu RPMI1640 koji sadrži 10% FCS i 1% L-alanil-L-glutamina (Biochrom, K0302) na 37 °C, 5% CO2, u inkubatoru do početka testa.
Obogaćivanje T ćelija iz PBMC-a izvršeno je upotrebom izolacionog kompleta II za pan T ćelije (Miltenyi Biotec br.130-091-156), prema uputstvu proizvođača. Ukratko, ćelijski peleti su razblaženi u 40 µl hladnog pufera na 10 miliona ćelija (PBS sa 0,5% BSA, 2 mM EDTA, sterilno filtrirano) i inkubirani sa 10 µl koktela biotin-antitelo na 10 miliona ćelija tokom 10 minuta na 4 °C. Dodato je 30 µl hladnog pufera i 20 µl antibiotinskih magnetnih perli na 10 miliona ćelija, i smeša je inkubirana još 15 minuta na 4 °C. Ćelije su isprane dodavanjem pufera zapremine 10-20x veće od trenutne, a zatim centrifugiranjem na 300 x g tokom 10 minuta. Do 100 miliona ćelija je resuspendovano u 500 µl pufera. Magnetno razdvajanje neoznačenih humanih pan T ćelija izvršeno je korišćenjem LS kolona (Miltenyi Biotec br.130-042-401) prema uputstvu proizvođača. Dobijena populacija T ćelija je automatski prebrojana (ViCell) i čuvana u AIM-V medijumu na 37 °C, 5% CO2u inkubatoru do početka testa (ne duže od 24 h).
Izolovanje primarnih humanih naivnih T ćelija iz PBMC
Mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) pripremljene su gradijentnim Histopaque centrifugiranjem obogaćenih limfocitnih preparata (leukocitno-trombocitnog sloja) dobijenih od lokalnih banaka krvi ili iz sveže krvi zdravih humanih donora. Obogaćivanje T ćelija iz PBMC-a izvršeno je pomoću kompleta za izolaciju naivnih CD8<+>T ćelija, kompanije Miltenyi Biotec (br. 130-093-244), prema uputstvu proizvođača, ali preskačući poslednji korak za izolaciju CD8<+>T ćelija (takođe pogledajte opis za izolaciju primarnih humanih pan T ćelija).
Izolovanje mišjih pan T ćelija iz splenocita
Slezine su izolovane iz C57BL/6 miševa, prebačene u GentleMACS C-epruvetu (Miltenyi Biotech br. 130-093-237) koja sadrži MACS pufer (PBS 0,5% BSA 2 mM EDTA) i disocirane sa GentleMACS disocijatorom da bi se dobile jednoćelijske suspenzije prema uputstvu proizvođača. Ćelijska suspenzija je propuštena kroz filter za predseparaciju kako bi se uklonile preostale nedisocirane čestice tkiva. Nakon centrifugiranja na 400 x g tokom 4 min na 4 °C, ACK pufer za lizu je dodat radi lize crvenih krvnih zrnaca (inkubacija 5 minuta na sobnoj temperaturi). Preostale ćelije su dva puta isprane MACS puferom, prebrojane i korišćene za izolovanje mišjih pan T ćelija. Negativna (magnetna) selekcija je izvršena upotrebom kompleta za izolovanje pan T ćelija, kompanije Miltenyi Biotec (br.130-090-861), prema uputstvu proizvođača. Dobijena populacija T ćelija automatski je prebrojana (ViCell) i odmah korišćena za dalje testove.
Izolacija primarnih PBMC cinomolgusa iz heparinizovane krvi Mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) pripremljene su gradijentnim centrifugiranjem sveže krvi zdravih cinomolgusa kao donora na sledeći način: heparinizovana krv razblažena je 1:3 sterilnim PBS-om, a Lymphoprep medijum (Axon Lab br. 1114545) je razblažen do 90% sterilnim PBS-om. Dve zapremine razblažene krvi nanete su preko jedne zapremine razblaženog gradijenta gustine, i PBMC frakcija je odvojena centrifugiranjem tokom 30 minuta pri 520 xg, bez kočenja, na sobnoj temperaturi. PBMC traka je prebačena u novu Falcon epruvetu od 50 ml i isprana sterilnim PBS-om, centrifugiranjem tokom 10 min pri 400 x g na 4 °C. Izvršeno je jedno centrifugiranje male brzine radi uklanjanja trombocita (15 min pri 150 x g, 4 °C), i dobijena populacija PBMC je automatski prebrojana (ViCell) i odmah korišćena za dalje analize.
Primer 1
Prečišćavanje Fc fuzija biotinilovanih folatnih receptora
Da bi se stvorila nova antitela na humani FolR1, stvoreni su sledeći antigeni i alati za proveru kao jednovalentni Fc fuzioni proteini (vanćelijski domen antigena povezan sa regionom šarke Fc-dugmeta koji je koeksprimiran sa molekulom Fc-rupice). Geni antigena su sintetisani (Geneart, Regensburg, Nemačka) na osnovu sekvenci dobijenih od GenBank ili SwissProt i umetnuti u vektore ekspresije da bi se stvorili fuzioni proteini sa Fc-dugmetom sa C-terminalnom Avi-oznakom za biotinilovanje in vivo ili in vitro. In vivo biotinilovanje je postignuto koekspresijom bakterijskog gena birA koji kodira bakterijsku biotin ligazu tokom proizvodnje. Ekspresija svih gena je bila pod kontrolom himernog MPSV promotera na plazmidu koji sadrži oriP element za stabilno održavanje plazmida u ćelijskim linijama koje sadrže EBNA.
Za pripremu biotinilovanih monomernih molekula antigena/Fc fuzije, eksponencijalno rastuća suspenzija HEK293 EBNA ćelija je kotransficirana sa tri vektora koji kodiraju dve komponente fuzionog proteina (lanci dugmeta i rupice) kao i BirA, enzim potreban za reakciju biotinilacije. Odgovarajući vektori korišćeni su u odnosu 9,5: 9,5: 1 odnos („antigen ECD-Fc dugme-avi oznaka“: "Fc rupica": „BirA“).
Za proizvodnju proteina u boci za mućkanje od 500 ml, 400 miliona ćelija HEK293 EBNA je zasejano 24 sata pre transfekcije. Za transfekciju su ćelije centrifugirane 5 minuta na 210 g, i supernatant je zamenjen prethodno zagrejanim CD CHO medijumom. Ekspresioni vektori su ponovo suspendovani u 20 ml CD CHO medijuma koji sadrži 200 µg vektorske DNK. Nakon dodavanja 540 µl polietilenimina (PEI), rastvor je mešan tokom 15 sekundi, i zatim inkubiran 10 minuta na sobnoj temperaturi. Nakon toga, ćelije su pomešane sa rastvorom DNK/PEI, prebačene u bocu za mućkanje od 500 ml i inkubirane 3 sata na 37°C u inkubatoru, u atmosferi sa 5% CO2. Nakon inkubacije, dodato je 160 ml medijuma F17 i ćelije su uzgajane tokom 24 sata. Dan nakon transfekcije, u kulturu je dodata 1 mM valproinska kiselina i 7% hraniva 1 (Lonza). Proizvodni medijum je dopunjen i sa 100 µM biotina. Nakon uzgajanja tokom 7 dana, ćelijski supernatant je sakupljen centrifugiranjem ćelija tokom 15 minuta na 210 g. Rastvor je sterilno filtriran (filter 0,22 µm), dodat je natrijum azid do krajnje koncentracije od 0,01% (m/V), i čuvan na 4°C.
Izlučeni proteini su prečišćeni iz supernatanata ćelijske kulture afinitetnom hromatografijom, upotrebom proteina A, a zatim gel hromatografijom. Kod afinitetne hromatografije, supernatant je nanet na kolonu HiTrap ProteinA HP (CV = 5 ml, GE Healthcare), ekvilibrisan sa 40 ml 20 mM natrijum fosfata, 20 mM natrijum citrata, pH 7,5. Nevezani protein je uklonjen ispiranjem sa najmanje 10 zapremina kolone 20 mM natrijum fosfata, 20 mM natrijum citrata, pH 7,5. Vezani protein je eluiran linearnim gradijentom pH stvorenim preko 20 zapremina kolona 20 mM natrijum citrata, 100 mM natrijum hlorida, 100 mM glicina, pH 3,0. Kolona je zatim isprana sa 10 zapremina kolone 20 mM natrijum citrata, 100 mM natrijum hlorida, 100 mM glicina, pH 3,0. pH sakupljenih frakcija podešen je dodavanjem 1/10 (v/v) 0,5 M natrijum fosfata, pH 8,0. Protein je koncentrovan i filtriran pre nanošenja na kolonu HiLoad Superdex 200 (GE Healthcare) ekvilibrisanu rastvorom 20 mM histidina, 140 mM natrijum hlorida pH 6,0.
Koncentracija proteina je određena merenjem optičke gustine (OD) na 280 nm, pomoću koeficijenta molarne ekstinkcije izračunatog na bazi aminokiselinske sekvence. Čistoća i molekulska težina FolR1-Fc-fuzije je analizirana SDS kapilarnom elektroforezom u prisustvu i odsustvu redukcionog sredstva prema uputstvima proizvođača (instrument Caliper LabChipGX, Perkin Elmer). Ukupni sadržaj antitela u uzorcima je analiziran pomoću analitičke kolone za ekskluzionu hromatografiju TSKgel G3000 SW XL (Tosoh) ekvilibrisane u radnom puferu 25 mM K2HPO4, 125 mM NaCl, 200 mM L-arginin monohidrohlorid, 0,02% (m/V) NaN3, pH 6,7 na 25°C.
Prečišćeni antigen-Fc-fuzioni proteini su analizirani analizama površinske plazmonske rezonance koristeći komercijalno dostupna antitela kako bi se potvrdila tačna i prirodna konformacija antigena (podaci nisu prikazani).
Tabela 1: Antigeni proizvedeni za izolaciju, selekciju i kontraselekciju humanih FolR1 antitela
Tabela 2: Rezime prinosa i konačnog sadržaja monomera u fuzijama FolR-Fc.
Primer 2
Stvaranje zajedničkog lakog lanca sa specifičnošću CD3ε
Ovde opisani bispecifični molekuli koji aktiviraju T ćeliju sadrže najmanje jedan deo koji vezuje CD3. Ovaj deo se može generisati imunizacijom laboratorijskih životinja, pretraživanjem biblioteke faga ili upotrebom poznatih anti-CD3 antitela. Zajednički laki lanac sa CD3ε specifičnošću je generisan humanizovanjem lakog lanca mišjeg matičnog anti-CD3ε antitela (CH2527). Za humanizacijau antitela nehumanog porekla, potrebno je izvršiti presađivanje CDR ostataka iz nehumanih antitela (donora) na okvir humanog (akceptorskog) antitela. Obično se sekvence akceptorskog okvira biraju poravnavanjem sekvence donora sa kolekcijom potencijalnih akceptorskih sekvenci i biranjem one koja ima razumnu homologiju sa donorom, ili pokazuje slične aminokiseline na nekim položajima od ključnog značaja za strukturu i aktivnost. U ovom slučaju, potraga za akceptorskim okvirom antitela izvršena je poravnavanjem sekvence VL-domena mišjeg matičnog antitela sa kolekcijom sekvenci humanih germinativnih linija i biranjem humane sekvence koja je pokazala visoku identičnost sekvence. Iznenađujuće, dobro podudaranje u smislu homologije okvirnih sekvenci pronađeno je u prilično retkom humanom lakom lancu koji pripada porodici V-domena 7 tipa lambda, tačnije hVL_7_46 (IMGT nomenklatura, GenBank prist. br. Z73674). Ovaj retki humani laki lanac je naknadno izabran kao akceptorski okvir za humanizaciju lakog lanca CH2527. Tri regiona za određivanje komplementarnosti (CDR) varijabilnog domena mišjeg lakog lanca nakalemljena su na ovaj akceptorski okvir. Pošto region okvira 4 nije deo varijabilnog regiona germinativne linije gena V, poravnavanje za taj region (J element) izvršeno je pojedinačno. Stoga je sekvenca IGLJ3-02 izabrana za humanizaciju ovog lakog lanca.
Izrađeno je trinaest humanizovanih varijanti (CH2527-VL7_46-1 do VL7_46-10, VL7_46-12 do VL7_46-14). One se razlikuju po okvirnim ostacima (i njihovim kombinacijama) koji su ponovo mutirani u sekvencu mišjeg V-domena ili u CDR-ostatke (Kabatova definicija) koji se mogu održavati identičnim sekvencama humanih germinativnih linija. Sledeći okvirni ostaci izvan CDR su povratno mutirani u mišje ostatke u konačnoj varijanti humanizovanog VL domena VL7_46-13 (navedeni mišji ostaci): V36, E38, F44, G46, G49, odnosno G57. Humani J-element IGLJ3-02 je bio 100% identičan J-elementu mišjeg matičnog antitela.
Primer 3
SPR procena humanizovanih varijanti sa specifičnošću CD3ε Humanizovane VL varijante su procenjivane kao himera u 2+1 TCB formatu, tj. humanizovani V-domeni lakog lanca upareni su sa V-domenima teškog lanca miša. SPR procena je izvršena na instrumentu ProteOn XPR36 (Bio-Rad). Tačnije, varijante su uhvaćene direktno iz supernatanta kulture na anti-Fab derivatizovanom GFM senzorskom čipu (kozji anti-humani IgG, F(ab')2fragment specifičan, Jackson ImmunoResearch) u vertikalnoj orijentaciji. Sledeći analiti su nakon toga ubrizgani vodoravno kao pojedinačne koncentracije kako bi se procenilo vezivanje za CD3ε čoveka i cinomolgusa: 3 µM hu CD3ε(-1-26)-Fc(dugme)-avi (ID807) odnosno 2,5 µM cy CD3ε-(-1-26)-Fc(dugme)-Avi-Fc(rupica) (ID873). Odgovori na vezivanje su kvalitativno upoređeni sa vezivanjem mišjeg kontrolnog konstrukta i stepenovani (uočeno slično vezivanje), /- (uočeno smanjeno vezivanje) i - (nije primećeno vezivanje). Antitelo za hvatanje je regenerisano nakon svakog ciklusa hvatanja liganda i vezivanja analita, a mišji konstrukt je ponovo ubrizgavan na kraju ispitivanja kako bi se potvrdila aktivnost površine hvatanja. Rezultati su prikazani u Tabeli 3.
Tabela 3: Kvalitativna procena vezivanja na osnovu SPR-a za humanizovane varijante lakog lanca u kombinaciji sa mišjim teškim lancem CH2527. Samo je konačno odabrana varijanta humanizovanog lakog lanca, CH2527-VL7_46-13, istaknuta podebljanim slovima, pokazala slično vezivanje za CD3ε čoveka i cinomolgusa.
Primer 4
Osobine humanizovanog zajedničkog lakog lanca sa specifičnošću CD3ε Varijanta V-domena lakog lanca koja je izabrana za humanizovani vodeći molekul je VL7_46-13. Određen je stepen humanosti, tj. homologija sekvence humanizovanog V-domena sa sekvencom V-domena humane germinativne linije. Za VL7_46-13, ukupna identičnost sekvence sa najbližim homologom humane germinativne linije iznosi 65% pre humanizacije i 80% nakon toga. Izostavljajući CDR regione, identitet sekvence je 92% najbližeg homologa humane germinativne linije. Kao što se može videti iz Tabele 3, VL7_46-13 je jedina humanizovana VL varijanta panela sa 13 varijanti koja je pokazala slično vezivanje za matično mišje antitelo i ujedno zadržala svoju unakrsnu reaktivnost na CD3ε cinomolgusa. Ovaj rezultat ukazuje na to da nije bilo lako humanizovati mišji VL domen bez gubitka afiniteta vezivanja za CD3ε, što je zahtevalo nekoliko povratnih mutacija na mišje okvirne ostatke (posebno G46), i istovremeno očuvanje G24 u CDR1. Pored toga, ovaj rezultat pokazuje da VL-domen igra presudnu ulogu u prepoznavanju ciljeva. Važno je da je humanizovani VL-domen VL7_46-13, koji je zasnovan na retkoj humanoj germinativnoj liniji koja pripada porodici V-domena 7 tipa lambda i zadržava afinitet i specifičnost prema CD3ε, takođe pogodan da se koristi kao zajednički laki lanac u bibliotekama antitela displeja faga Fab formata i omogućava uspešan odabir novih specifičnosti, što u velikoj meri olakšava stvaranje i proizvodnju bispecifičnih molekula koji se vezuju za CD3ε i npr. tumorski cilj i imaju isti 'zajednički' laki lanac.
Primer 5
Stvaranje biblioteke antitela prikazane na fagu pomoću zajedničkog lakog lanca humane germinativne linije izvedene iz HVK1-39
Nekoliko pristupa za stvaranje bispecifičnih antitela koja nalikuju ljudskom IgG pune dužine koriste modifikacije u Fc regionu koje indukuju heterodimerizaciju dva različita teška lanca. Takvi primeri uključuju tehnologije "dugmeta u rupici" (Merchant et al., Nat Biotechnol.
1998 Jul;16(7):677-81) SEED (Davis et al., Protein Eng Des Sel.2010 Apr;23(4): 195-202) i tehnologije elektrostatičkog upravljanja (Gunasekaran et al., J Biol Chem. 2010 Jun 18;285(25):19637-46). Iako ovi pristupi omogućavaju efikasnu heterodimerizaciju dva različita teška lanca, odgovarajuće uparivanje srodnih lakih i teških lanaca ostaje problem. Korišćenje zajedničkog lakog lanca (LC) može rešiti ovo pitanje (Merchant, et al. Nat Biotech 16, 677-681 (1998)).
Ovde opisujemo generisanje biblioteke antitela za displej na M13 fagu. U osnovi, stvorili smo višeokvirnu biblioteku za teški lanac sa jednim konstantnim (ili „zajedničkim“) lakim lancem. Ova biblioteka je napravljena za generisanje multispecifičnih antitela bez potrebe za upotrebom sofisticiranih tehnologija radi izbegavanja pogrešnog uparivanja lakih lanaca.
Korišćenjem zajedničkog lakog lanca može se olakšati proizvodnja ovih molekula, jer više ne dolazi do pogrešnog uparivanja i olakšava se izolacija veoma čistog bispecifičnog antitela. U poređenju sa drugim formatima, upotreba Fab fragmenata kao gradivnih blokova za razliku od npr. upotrebe fragmenata scFv ima za rezultat veću toplotnu stabilnost i nepostojanje agregacije scFv i stvaranja intermolekulaskih scFv.
Generisanje biblioteke
U nastavku je opisano generisanje biblioteke antitela za displej na M13 fagu. U osnovi, stvorili smo višeokvirnu biblioteku za teški lanac sa jednim konstantnim (ili „zajedničkim“) lakim lancem.
U biblioteci smo koristili ove teške lance (pristupni brojevi GenBank dati su u zagradama):
IGHV1-46*01 (X92343) (SEQ ID NO: 104),
IGHV1-69*06 (L22583) (SEQ ID NO: 105),
IGHV3-15*01 (X92216) (SEQ ID NO: 106),
IGHV3-23*01 (M99660) (SEQ ID NO: 107),
IGHV4-59*01 (AB019438) (SEQ ID NO:108),
IGHV5-51*01 (M99686) (SEQ ID NO: 109)
Svi teški lanci koriste IGHJ2 kao J-element, osim IGHV1-69*06 koji koristi IGHJ6 sekvencu. Dizajn randomizacije obuhvatio je CDR-H1, CDR-H2 i CDR-H3. Za CDR-H1 i CDR-H2 odabrana je "meka" strategija randomizacije, a randomizacioni oligonukleotidi bili su takvi da je kodon za aminokiselinu sekvence germinativne linije bio prisutan na 50%. Sve ostale aminokiseline, osim cisteina, činile su preostalih 50%. U CDR-H3, gde nije prisutna aminokiselina germinativne linije zbog prisustva genetskog D-elementa, dizajnirani su oligonukleotidi koji omogućavaju upotrebu randomizovanih umetaka između V-elementa i J-elementa dužine od 4 do 9 aminokiselina. Oni oligonukleotidi sadržani u njihovom randomizovanom delu, npr. Tri aminokiseline G/Y/S prisutne su po 15%, te aminokiseline A/D/T/R/P/L/V/N/W/F/I/E prisutne su svaka do 4,6%.
Primeri metoda za stvaranje biblioteka antitela opisani su u Hoogenboom et al., Nucleic Acids Res. 1991, 19, 4133-413; Lee et., al J. Mol. Biol. (2004) 340, 1073-1093.
Laki lanac se izvodi iz ljudske sekvence hVK1-39 i koristi se na neizmenjen i nerandomizovan način. To će osigurati da se isti laki lanac može koristiti za druge projekte bez dodatnih izmena.
Primer selekcije biblioteke:
Selekcije sa svim bibliotekama sazrevanja afiniteta izvode se u rastvoru prema sledećoj proceduri pomoću monomernog i biotinilovanog vanćelijskog domena ciljnog antigena X.
1. 10^12 fagemidnih čestica svake biblioteke vezano je za 100 nM biotinilovanog rastvorljivog antigena tokom 0,5 h u ukupnoj zapremini od 1 ml. 2. Biotinilovani antigen se hvata i specifično vezane čestice faga se izoluju dodavanjem ~5 x 10^7 magnetnih perli obloženih streptavidinom tokom 10 minuta. 3. Zrnca se ispiraju pomoću 5-10x 1 ml PBS/Tween20 i 5-10x 1 ml PBS.4. Elucija čestica faga se vrši dodavanjem 1 ml 100 mM TEA (trietilamina) tokom 10 minuta, a neutralizacija dodavanjem 500 ul 1M Tris/HCl pH 7,4 i 5. Ponovna infekcija eksponencijalno rastućih bakterija E. coli TG1, infekcija pomoćnim fagom VCSM13 i naknadno taloženje čestica fagemida pomoću PEG/NaCl primenjuje se u narednim krugovima selekcije. Selekcije su sprovedene u 3-5 krugova uz upotrebu konstantnih ili opadajućih koncentracija antigena (od 10^-7M do 2x10^-9M). U 2. krugu, hvatanje kompleksa antigen-fag obavljeno je uz upotrebu neutravidinskih ploča umesto streptavidinskih perli. U sve reakcije vezivanja dodat je ili 100 nM albumin goveđeg seruma, ili nemasno mleko u prahu, kako bi se nadmetali za neželjene klonove koji proizlaze iz pukog lepljivog vezivanja antitela za plastičnu podlogu.
Selekcije se izvode u tri ili četiri kruga, uz upotrebu opadajuće antigenske koncentracije datog antigena počevši od 100 nM i spuštajući se na 5 nM u završnom krugu selekcije. Specifični vezivači su definisani kao signali 5 × viši od osnovnog, i identifikovani su ELISA testom. Specifični vezivači su identifikovani testom ELISA na sledeći način: 100 ul 10 nM biotinilovanog antigena po bunarčiću naneto je na neutravidinske ploče. Dodati su bakterijski supernatanti koji sadrže Fab i detektovani su vezujući Fab-ovi preko Fab-oznaka pomoću sekundarnog antitela anti-Flag/HRP. ELISA-pozitivni klonovi su bakteriološki eksprimirani kao rastvorljivi Fab fragmenti u formatu sa 96 bunarčića, a supernatanti su podvrgnuti eksperimentu kinetičkog skrininga pomoću SPR analize uz upotrebu ProteOn XPR36 (BioRad). Klonovi koji eksprimiraju Fab-ove sa najvišim konstantama afiniteta su identifikovani, i odgovarajući fagemidi su sekvencirani. Za dalju karakterizaciju, Fab sekvence se umnožavaju putem PCR iz fagemida, i kloniraju se putem odgovarajućih restrikcionih mesta u humane IgG1ekspresione vektore za proizvodnju kod sisara.
Stvaranje biblioteke antitela displeja faga pomoću humanizovanog zajedničkog lakog lanca specifičnog za CD3ε
Ovde je opisano generisanje biblioteke antitela za displej na M13 fagu. U osnovi, stvorili smo višeokvirnu biblioteku za teški lanac sa jednim konstantnim (ili „zajedničkim“) lakim lancem. Ova biblioteka je stvorena za generisanje T ćelijskih bispecifičnih antigena, koji sadrže Fc ali koji nisu aktivni za vezivanje FcgR, za IgG1P329G LALA ili IgG4SPFE PG izotipove u kojima jedan ili dva Fab-a prepoznaju površinski antigen tumora eksprimiran na tumorskoj ćeliji, dok ostatak Fab kraka antitela prepoznaje CD3e na T ćeliji.
Generisanje biblioteke
U nastavku je opisano generisanje biblioteke antitela za displej na M13 fagu. U osnovi, stvorili smo višeokvirnu biblioteku za teški lanac sa jednim konstantnim (ili „zajedničkim“) lakim lancem. Ova biblioteka je stvorena isključivo za generisanje T ćelijskih bispecifičnih antigena, koji sadrže Fc ali koji nisu aktivni za vezivanje FcgR, za IgG1P329G LALA ili IgG4SPFE PG izotipe.
Diversifikacija je uvedena randomizacijom oligonukleotida samo u CDR3 različitih teških lanaca. Metode za generisanje biblioteka antitela su dobro poznate u struci i opisane su u (Hoogenboom et al., Nucleic Acids Res. 1991, 19, 4133-413; ili u: Lee et., al J. Mol. Biol. (2004) 340, 1073-1093).
U biblioteci smo koristili ove teške lance:
IGHV1-46*01 (X92343) (SEQ ID NO: 104),
IGHV1-69*06 (L22583) (SEQ ID NO: 105),
IGHV3-15*01 (X92216) (SEQ ID NO: 106),
IGHV3-23*01 (M99660) (SEQ ID NO: 107),
IGHV4-59*01 (AB019438) (SEQ ID NO:108),
IGHV5-51*01 (M99686) (SEQ ID NO: 109)
U biblioteci smo koristili laki lanac izveden iz humanizovanog CD3ε specifičnog antitela CH2527 čoveka i cinomolgusa: (VL7_46-13; SEQ ID NO:112). Ovaj laki lanac nije randomizovan i korišćen je bez ikakvih daljih modifikacija kako bi se osigurala kompatibilnost sa različitim bispecifičnim vezivačiima.
Svi teški lanci koriste IGHJ2 kao J-element, osim IGHV1-69*06 koji koristi sekvencu IGHJ6. Dizajn randomizacije bio je fokusiran samo na CDR-H3, a dizajnirani su i PCR oligonukleotidi koji omogućavaju upotrebu randomizovanih umetaka između V-elementa i J-elementa dužine 4 do 9 aminokiselina.
Primer 6
Selekcija fragmenata antitela iz biblioteka zajedničkog lakog lanca (koji sadrže laki lanac sa specifičnošću CD3ε) za FolR1
Antitela 16A3, 15A1, 18D3, 19E5, 19A4, 15H7, 15B6, 16D5, 15E12, 21D1, 16F12, 21A5, 21G8, 19H3, 20G6 i 20H7, koja sadrže zajednički laki lanac VL7_46-13 sa specifičnošću CD3ε, dobijena su selekcijom displeja faga za FolR1 različitih vrsta (čoveka, cinomolgusa i miša). Klonovi 16A3, 15A1, 18D3, 19E5, 19A4, 15H7, 15B6, 21D1, 16F12, 19H3, 20G6 i 20H7 odabrani su iz podbiblioteke u kojoj je zajednički laki lanac bio uparen s repertoarom teškog lanca na bazi humane germinativne linije VH1_46. U ovoj podbiblioteci, CDR3 VH1_46 je randomizovan na osnovu 6 različitih dužina CDR3. Klonovi 16D5, 15E12, 21A5 i 21G8 su odabrani iz podbiblioteke u kojoj je zajednički laki lanac bio uparen sa repertoarom teških lanaca na bazi humane germinativne linije VH3_15. U ovoj podbiblioteci, CDR3 VH3_15 je randomizovan na osnovu 6 različitih dužina CDR3. Da bi se dobile po vrstama unakrsna reaktivna (ili mišja FolR1-reaktivna) antitela, različite vrste FolR1 su izmenjivane (ili održavane konstantnim) na različite načine tokom 3 kruga biopanovanja: 16A3 i 15A1 (humani - cinomolgusov - humani FolR1); 18D3 (cinomolgusov - humani - mišji FolR1); 19E5 i 19A4 (3 runde na mišji FolR1); 15H7, 15B6, 16D5, 15E12, 21D1, 16F12, 21A5, 21G8 (humani - cinomolgusov - humani FolR1); 19H3, 20G6 i 20H7 (3 runde na mišji FolR1).
Humani, mišji i cinomolgusov FolR1 kao antigeni za selekcije displeja faga, kao i skrininge zasnovane na ELISA i SPR, privremeno su eksprimirani kao N-terminalna monomerna Fc-fuzija u ćelijama HEK EBNA i in vivo biotinilovani prema specifičnosti mesta putem koekspresije BirA biotinske ligaze na avi-tag sekvenci prepoznavanja koja se nalazi na C-terminalnom kraju Fc dela koji nosi receptorski lanac (lanac Fc dugmeta). Da bi se procenila specifičnost FolR1, dva slična receptora, humani FolR2 i FolR3, stvoreni su na isti način. Krugovi selekcije (biopanovanja) izvedeni su u rastvoru prema sledećem obrascu:
1. Prethodno uklanjanje ~10<12>fagemidnih čestica na maxisorp pločama prevučenim sa 10 ug/ml nepovezanog humanog IgG da bi se iscrpile biblioteke antitela koji prepoznaju Fc-deo antigena.
2. Inkubiranje ne-Fc-vezujućih fagemidnih čestica sa 100 nM biotinilovanog humanog, cinomolgusovog ili mišjeg FolR1 u trajanju od 0,5 h u prisustvu 100 nM nepovezanih nebiotinilovanih Fc-konstrukata "dugme u rupici" za dalje iscrpljivanje Fc-vezivača u ukupnoj zapremini od 1 ml.
3. Hvatanje biotinilovanog FolR1 i povezanog specifično vezujućeg faga prenošenjem u 4 bunarčića mikrotitarske pločice prethodno obložene neutravidinom tokom 10 minuta (u rundi 1 i 3).
4. Ispiranje odgovarajućih bunarčića pomoću 5x PBS/Tween20 i 5x PBS.
5. Eluiranje čestica faga dodavanjem 250 ul 100 mM TEA (trietilamina) po bunarčiću tokom 10 minuta i neutralizacija dodavanjem 500 ul 1 M Tris/HCl pH 7,4 u objedinjene eluate iz 4 bunarčića.
6. Naknadno čišćenje neutralizovanih eluata inkubacijom na mikrotitarskoj ploči prethodno presvučenoj neutravidinom sa 100 nM FolR2 ili FolR3 zarobljenog biotinom za konačno uklanjanje Fc i nespecifičnih vezivača.
7. Ponovna infekcija ćelija E. coli TG1 iz log faze sa supernatantom eluiranih čestica faga, infekcija pomoćnim fagom VCSM13, inkubacija na mućkalici na 30 °C preko noći i naknadno taloženje pomoću PEG/NaCl čestica fagemida koje će se koristiti u narednom krugu selekcije.
Selekcije su izvedene u 3 kruga korišćenjem konstantnih koncentracija antigena od 100 nM. U krugu 2, da bi se izbeglo obogaćivanje vezivača na neutravidinu, hvatanje kompleksa antigen : fag je izvedeno dodavanjem 5,4 x 10<7>streptavidinom obloženih magnetnih perli. Specifični vezivači su identifikovani pomoću testa ELISA na sledeći način: 100 ul 25 nM biotinilovanog humanog, cinomolgusovog ili mišjeg FolR1 i 10 ug/ml humanog IgG obloženo je na pločice sa neutravidinom, odnosno maxisorpom. Dodati su bakterijski supernatanti koji sadrže Fab i detektovani su vezujući Fab preko Flag oznaka pomoću sekundarnog antitela anti-Flag/HRP. Klonovi koji pokazuju signale na humanom FolR1 i koji su negativni na humani IgG ušli su u uži izbor za dalje analize i takođe su testirani na sličan način na FolR1 kod preostale dve vrste. Oni su bakterijski eksprimirani u zapremini od 0,5 litara kulture, afinitetno prečišćeni i dalje okarakterisani SPR analizom korišćenjem BioRad-ovog ProteOn XPR36 biosenzora.
Afiniteti (KD) odabranih klonova izmereni su površinskom plazmonskom rezonancom (SPR) pomoću ProteOn XPR36 instrumenta (Biorad) na 25 °C sa biotinilovanim humanim, cinomolgusovim i mišjim FolR1, kao i humanim FolR2 i FolR3 (negativne kontrole) imobilisanim na NLC čipovima hvatanjem neutravidina. Imobilizacija antigena (ligand): Rekombinantni antigeni su razblaženi sa PBST (10 mM fosfat, 150 mM natrijum hlorid pH 7,4, 0,005% Tween 20) na 10 µg/ml, a zatim su injektovani sa 30 µl/minut u vertikalnoj orijentaciji. Injektovanje analita: Za merenja 'kinetike jednim injektovanjem', smer ubrizgavanja promenjen je u vodoravnu orijentaciju, ubrizgane su dvostruke serije razblaženja prečišćenog Fab-a (promenjivi rasponi koncentracija) istovremeno u odvojenim kanalima 1-5, sa vremenom asocijacije od 200 s i vremenima disocijacije od 600 s. Pufer (PBST) ubrizgan je duž šestog kanala kako bi se dobila "linijska" slepa proba za referencu. Konstante brzine asocijacije (kon) i konstante brzine disocijacije (koff) izračunate su pomoću jednostavnog jedan-na-jedan Lengmirovog modela vezivanja pomoću softvera ProteOn manager verzija 3.1 simultanim podešavanjem senzorgrama asocijacije i disocijacije. Ravnotežna konstanta disocijacije (KD) izračunata je kao odnos koff/kon. Tabela 4 navodi ravnotežne konstante disocijacije (KD) odabranih klonova specifičnih za FolR1.
Tabela 4: Ravnotežne konstante disocijacije (KD) za anti-FolR1 antitela (Fab-format) odabrane prikazom faga iz uobičajenih podbiblioteka lakog lanca koje sadrže VL7_46-13, humanizovani laki lanac sa CD3ε specifičnošću. KDu nM.
Primer 7
Selekcija fragmenata antitela iz generičkih višeokvirnih biblioteka za FolR1 Antitela11F8, 36F2, 9D11, 5D9, 6B6 i 14E4 dobijena su selekcijom displeja faga na osnovu generičkih višeokvirnih podbiblioteka FolR1 za različite vrste (čovek, cinomolgus i miš). U ovim višeokvirnim podbibliotekama, različiti VL-domeni sa randomizovanim CDR3 (3 različite dužine) upareni su sa različitim VH-domenima sa randomizovanim CDR3 (6 različitih dužina). Odabrani klonovi imaju sledeća VL/VH uparivanja: 11F8 (Vk_1_5/VH_1_69), 36F2 (Vk_3_20/VH_1_46), 9D11 (Vk2D_28/VH1_46), 5D9 (Vk3_20/VH1_46), 6B6 (Vk3_20/VH1_46), i 14E4 (Vk3_20/VH3_23). Da bi se dobila antitela unakrsno reaktivna prema vrstama (ili mišja FolR1-reaktivna), različite vrste FolR1 su izmenjivane (ili održavane konstantnim) na različite načine tokom 3 ili 4 kruga biopanovanja: 11F8 (cinomolgusov - mišji - humani FolR1); 36F2 (humani - mišji - cinomolgusov - mišji FolR1); 9D11 (cinomolgusov - humani - cinomolgusov FolR1); 5D9 (humani - cinomolgusov - humani FolR1); 6B6 (humani - cinomolgusov - humani FolR1) i 14E4 (3 kruga na mišji FolR1).
Humani, mišji i cinomolgusov FolR1 kao antigeni za selekcije displeja faga, kao i skrininge zasnovane na ELISA i SPR, privremeno su eksprimirani kao N-terminalna monomerna Fc-fuzija u ćelijama HEK EBNA i in vivo biotinilovani prema specifičnosti mesta putem koekspresije BirA biotinske ligaze na avi-tag sekvenci prepoznavanja koja se nalazi na C-terminalnom kraju Fc dela koji nosi receptorski lanac (lanac Fc dugmeta). Da bi se procenila specifičnost FolR1, dva slična receptora, humani FolR2 i FolR3, stvoreni su na isti način.
Krugovi selekcije (biopanovanja) izvedeni su u rastvoru prema sledećem obrascu: 1. Prethodno uklanjanje ~10<12>fagemidnih čestica na maxisorp pločama prevučenim sa 10 ug/ml nepovezanog humanog IgG da bi se iscrpile biblioteke antitela koji prepoznaju Fc-deo antigena.
2. Inkubiranje ne-Fc-vezujućih fagemidnih čestica sa 100 nM biotinilovanog humanog, cinomolgusovog ili mišjeg FolR1 u trajanju od 0,5 h u prisustvu 100 nM nepovezanih nebiotinilovanih Fc-konstrukata "dugme u rupici" za dalje iscrpljivanje Fc-vezivača u ukupnoj zapremini od 1 ml.
3. Hvatanje biotinilovanog FolR1 i povezanog specifično vezujućeg faga prenošenjem u 4 bunarčića mikrotitarske pločice prethodno obložene neutravidinom tokom 10 minuta (u rundi 1 i 3).
4. Ispiranje odgovarajućih bunarčića pomoću 5x PBS/Tween20 i 5x PBS.
5. Eluiranje čestica faga dodavanjem 250 ul 100 mM TEA (trietilamina) po bunarčiću tokom 10 minuta i neutralizacija dodavanjem 500 ul 1 M Tris/HCl pH 7,4 u objedinjene eluate iz 4 bunarčića.
6. Naknadno čišćenje neutralizovanih eluata inkubacijom na mikrotitarskoj ploči prethodno presvučenoj neutravidinom sa 100 nM FolR2 ili FolR3 zarobljenog biotinom za konačno uklanjanje Fc i nespecifičnih vezivača.
7. Ponovna infekcija ćelija E. coli TG1 iz log faze sa supernatantom eluiranih čestica faga, infekcija pomoćnim fagom VCSM13, inkubacija na mućkalici na 30 °C preko noći i naknadno taloženje pomoću PEG/NaCl čestica fagemida koje će se koristiti u narednom krugu selekcije.
Selekcije su izvršene u 3 kruga, uz upotrebu konstantnih koncentracija antigena od 100 nM. U krugu 2 i 4, kako bi se izbeglo obogaćivanje vezivača na neutravidin, hvatanje kompleksa antigen : fag je izvedeno dodavanjem 5,4 x 10<7>streptavidinom obloženih magnetnih perli. Specifični vezivači su identifikovani pomoću testa ELISA na sledeći način: 100 ul 25 nM biotinilovanog humanog, cinomolgusovog ili mišjeg FolR1 i 10 ug/ml humanog IgG presvučeno je na pločice sa neutravidinom, odnosno maxisorpom. Dodati su bakterijski supernatanti koji sadrže Fab i detektovani su vezujući Fab preko Flag oznaka pomoću sekundarnog antitela anti-Flag/HRP. Klonovi koji pokazuju signale na humanom FolR1 i koji su negativni na humani IgG ušli su u uži izbor za dalje analize i takođe su testirani na sličan način na FolR1 kod preostale dve vrste. Oni su bakterijski eksprimirani u zapremini od 0,5 litara kulture, afinitetno prečišćeni i dalje okarakterisani SPR analizom korišćenjem BioRadovog ProteOn XPR36 biosenzora.
Afiniteti (KD) odabranih klonova izmereni su površinskom plazmonskom rezonancom (SPR) pomoću ProteOn XPR36 instrumenta (Biorad) na 25 °C sa biotinilovanim humanim, cinomolgusovim i mišjim FolR1, kao i humanim FolR2 i FolR3 (negativne kontrole) imobilisanim na NLC čipovima hvatanjem neutravidina. Imobilizacija antigena (ligand): Rekombinantni antigeni su razblaženi sa PBST (10 mM fosfat, 150 mM natrijum hlorid pH 7,4, 0,005% Tween 20) na 10 µg/ml, a zatim su injektovani sa 30 µl/minut u vertikalnoj orijentaciji. Injektovanje analita: Za merenja "kinetike jednim injektovanjem", smer ubrizgavanja promenjen je u vodoravnu orijentaciju, ubrizgane su dvostruke serije razblaženja prečišćenog Fab-a (različiti rasponi koncentracija) istovremeno u odvojenim kanalima 1-5, sa vremenom asocijacije od 150 ili 200 s, i vremenom disocijacije od 200, odnosno 600 s. Pufer (PBST) je injektovan duž šestog kanala da se dobije "linijska" slepa proba za referencu. Konstante brzine asocijacije (kon) i konstante brzine disocijacije (koff) izračunate su pomoću jednostavnog jedanna-jedan Lengmirovog modela vezivanja pomoću softvera ProteOn manager verzija 3.1 simultanim podešavanjem senzorgrama asocijacije i disocijacije. Ravnotežna konstanta disocijacije (KD) izračunata je kao odnos koff/kon. Tabela 5 donosi ranvotežne konstante disocijacije (KD) odabranih klonova specifičnih za FolR1.
Tabela 5: Ravnotežne konstante disocijacije (KD) za antitela na FolR1 (Fab format) odabrana i l m f iz n ri kih i k irnih i li k K nM
Primer 8
Proizvodnja i prečišćavanje novih vezivača FolR1 u bispecifičnim formatima IgG i T ćelija
Da bi se identifikovali FolR1 vezivači koji su u stanju da indukuju ubijanje odabranih ciljnih ćelija zavisno od T ćelija, antitela izolovana iz biblioteke zajedničkog lakog lanca ili biblioteke Fab pretvorena su u odgovarajući format humanog IgG1. Ukratko, varijabilni teški i varijabilni laki lanci jedinstvenih vezivača FolR1 sa displeja faga pojačani su standardnim PCR reakcijama pomoću obrasca u vidu Fab klonova. PCR proizvodi su prečišćeni i ubačeni (bilo restriktivnim kloniranjem na bazi endonukleaze i ligaze, bilo 'rekombinacijom' pomoću InFusion kompleta iz Invitrogena) u prikladne ekspresione vektore u kojima su spojeni sa odgovarajućim humanim konstantnim teškim ili humanim konstantnim lakim lancem. Ekspresione kasete u ovim vektorima sastoje se od himernog MPSV promotera i sintetičkog mesta poliadenilacije. Pored toga, plazmidi sadrže oriP region iz Epštajn Barovog virusa za stabilno održavanje plazmida u ćelijama HEK293 koje sadrže EBV nuklearni antigen (EBNA). Nakon transfekcije posredovane putem PEI, antitela su prolazno proizvedena u HEK293 EBNA ćelijama i prečišćena standardnom afinitetnom hromatografijom sa proteinom A, nakon čega sledi ekskluziona hromatografija, kako je opisano:
Prolazna transfekcija i proizvodnja
Sva (bispecifična) ovde korišćena antitela (ako nisu dobijena iz komercijalnog izvora) prolazno su proizvedena u HEK293 EBNA ćelijama primenom procedure transfekcije posredstvom PEI za potrebne vektore, kako je opisano u nastavku. HEK293 EBNA ćelije su kultivisane u suspenziji bez seruma u CD CHO medijumu za uzgajanje. Za proizvodnju, u tikvicu za mućkanje od 500 ml zasejano je 400 miliona ćelija EKNA HEK29324 sata pre transfekcije (za drugačije razmere, sve količine su prilagođene u skladu sa potrebama). Za transfekciju, ćelije su centrifugirane 5 minuta na 210 x g, supernatant je zamenjen sa 20 ml prethodno zagrejanog CD CHO medijuma. Ekspresioni vektori su pomešani u 20 ml CD CHO medijuma do konačne količine od 200 µg DNK. Nakon dodavanja 540 µl rastvora PEI, smeša je mešana na vorteksu tokom 15 s i zatim inkubirana 10 minuta na sobnoj temperaturi. Nakon toga, ćelije su pomešane sa rastvorom DNK/PEI, prebačene u tikvicu za mućkanje od 500 ml i inkubirane 3 sata na 37 °C u inkubatoru, u atmosferi sa 5% CO2. Nakon vremena inkubacije, dodato je 160 ml medijuma F17 i ćelije su kultivisane tokom 24 sata. Dan nakon transfekcije dodato je 1 mM valproinske kiseline i 7% hraniva 1. Nakon 7 dana uzgoja, supernatant je sakupljen za prečišćavanje centrifugiranjem tokom 15 minuta na 210 x g, rastvor je sterilno filtriran (filter od 0,22 µm) i dodat je natrijum azid u konačnoj koncentraciji od 0,01% m/V i držan je na 4 °C. Nakon proizvodnje, supernatanti su sakupljeni, i supernatanti koji sadrže antitela filtrirani su kroz sterilne filtere od 0,22 µm i čuvani na 4 °C do prečišćavanja.
Prečišćavanje antitela
Svi molekuli su prečišćeni u dva koraka pomoću standardnih postupaka, kao što je afinitetno prečišćavanje sa proteinom A (Äkta Explorer) i ekskluziona hromatografija. Supernatant dobijen prolaznom proizvodnjom je podešen na pH 8,0 (upotrebom 2 M TRIS pH 8,0) i nanesen na HiTrap PA FF (GE Healthcare, zapremina kolone (cv) = 5 ml), ekvilibrisan sa 8 zapremina kolone (cv) pufera A (20 mM natrijum fosfat, 20 mM natrijum citrat, pH 7,5). Nakon ispiranja sa 10 cv pufera A, protein je eluiran upotrebom gradijenta pH do pufera B (20 mM natrijum citrat pH 3, 100 mM NaCl, 100 mM glicin) preko 12 cv. Frakcije koje sadrže željeni protein ksu objedinjene, i pH vrednost rastvora je pažljivo podešena na pH 6,0 (upotrebom 0,5 M Na2HPO4pH 8,0). Uzorci su koncentrovani na 2 ml pomoću ultrakoncentratora (Vivaspin 15R 30.000 MWCO HY, Sartorius), a zatim naneti na HiLoad™ 16/60 Superdex™ 200 preparativnog kvaliteta (GE Healthcare), ekvilibrisani sa 20 mM histidina, pH 6,0, 140 mM NaCl, 0,01% Tween-20. Ukupni sadržaj eluiranih frakcija je analiziran analitičkom ekskluzionom hromatografijom. Zbog toga je 30 µl svake frakcije naneseno na TSKgel G3000 SW XL analitičku ekskluzionu kolonu (Tosoh) ekvilibrisanu u radnom puferu sa 25 mM K2HPO4, 125 mM NaCl, 200 mM L-arginin monohidrohloridom, 0,02% (m/V) NaN3, pH 6,7 na 25 °C. Frakcije koje sadrže manje od 2% oligomera udružene su i koncentrovane do krajnje koncentracije od 1-1,5 mg/ml pomoću ultra koncentratora (Vivaspin 15R 30.000 MWCO HY, Sartorius). Koncentracija proteina je određena merenjem optičke gustine (OD) na 280 nm, pomoću koeficijenta molarne ekstinkcije izračunatog na bazi aminokiselinske sekvence. Čistoća i molekulska težina konstrukta analizirani su SDS kapilarnom elektroforezom u prisustvu i odsustvu redukcionog sredstva prema uputstvu proizvođača (instrument Caliper LabChipGX, Perkin Elmer). Prečišćeni proteini su zamrznuti u tečnom N2i čuvani na -80 °C.
Na osnovu rezultata in vitro karakterizacije, odabrani vezivači su pretvoreni u bispecifični format T ćelija. U tim molekulima FolR1:CD3 vezujući delovi raspoređeni su u redosledu 2:1, a FolR1 Fab su smešteni na N-terminalnom kraju. Za klonove izolovane iz standardne biblioteke Fab deo koji vezuje CD3 je generisan kao CrossFab (ukrštanje CH1Ck), dok za klonove iz biblioteke zajedničkog lakog lanca nije bilo potrebno ukrštanje. Ovi bispecifični molekuli su proizvedeni i prečišćeni analogno sa IgG.
Tabela 6: Prinos i sadržaj monomera u novim FolR1 vezivačima u IgG, odnosno TCB formatu.
CLC: Zajednički laki lanac
Primer 9
2+1 i 1+1 bispecifični formati T ćelija
Četiri različita bispecifična formata T ćelija pripremljena su za jedan zajednički vezivač lakog lanca (16D5) i tri formata za jedan vezivač iz biblioteke Fab (9D11) kako bi se uporedila njihova svojstva ubijanja in vitro.
Standardni format je obrnuti format 2+1, kao što je već opisano (FolR1:CD3 vezujući delovi raspoređeni u redosledu 2:1 sa FolR1 Fab smeštenim na N-terminalnom kraju). U klasičnom formatu 2+1, FolR1:CD3 vezujući delovi raspoređeni su u redosledu 2:1, a CD3 Fab se nalazi na N-terminalnom kraju. Takođe su pripremljena dva jednovalentna formata. Format 1+1 od glave do repa ima FolR1:CD3 vezujuće delove raspoređene u redosledu 1:1 na istom kraku molekula sa FolR1 Fab smeštenim na N-terminalnom kraju. U klasičnom formatu 1+1, FolR1:CD3 vezujući delovi su prisutni jednom, svaki na jednom kraku molekula. Za klon 9D11 izolovan iz standardne biblioteke Fab, CD3 vezujući deo je generisan kao CrossFab (ukrštanje CH1Ck), dok za 16D5 iz biblioteke zajedničkog lakog lanca nije bilo potrebno ukrštanje. Ovi bispecifični molekuli proizvedeni su i prečišćeni analogno standardnom obrnutom bispecifičnom formatu T ćelija.
Tabela 7: Sažet prikaz prinosa i konačnog sadržaja monomera u različitim bispecifičnim formatima T ćelija.
Primer 10
Biohemijska karakterizacija FolR1 vezivača površinskom plazmonskom rezonancom
Vezivanje FolR1 vezivača kao IgG ili u bispecifičnom formatu T ćelija za različite rekombinantne folatne receptore (humani FolR1, 2 i 3, mišji FolR1 i cinomolgusov FolR1; svi kao Fc fuzije) procenjeno je površinskom plazmonskom rezonancom (SPR). Svi SPR eksperimenti obavljeni su na Biacore T200 na 25°C sa HBS-EP kao radnim puferom (0,01 M HEPES pH 7,4, 0,15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0,005% surfaktant P20, Biacore, Freiburg/Nemačka).
Pojedinačno injektovanje
Prvo su analizirani anti-FolR1 IgG pojedinačnim injektovanjem (Tabela 1) kako bi se odredila njihova unakrsna reaktivnost (na humani, mišji i cinomolgusov FolR1) i specifičnost (na humani FolR1, humani FolR2, humani FolR3). Rekombinantne biotinilovane monomerne Fc fuzije folatnog receptora 1 čoveka, cinomolgusa i miša (FolR1-Fc) ili humanog folatnog receptora 2 i 3 (FolR2-Fc, FolR3-Fc) direktno su kuplovane na SA čipu pomoću standardnih instrukcija za kuplovanje (Biacore, Freiburg/Nemačka). Nivo imobilizacije je bio oko 300-400 RU. IgG su injektovani tokom 60 sekundi u koncentraciji od 500 nM. IgG koji se vezuju za huFolR2 i huFolR3 su odbačeni zbog nedostatka specifičnosti. Većina vezivača su unakrsno reaktivni samo između humanog i cinomolgusovog FolR1, dodatna unakrsna reaktivnost na mišji FolR1 bila je većinom praćena gubitkom specifičnosti.
Tabela 8: Unakrsna reaktivnost i specifičnost 25 novih vezivača za folatni receptor 1 (kao IgG), kao i dva kontrolna IgG (Mov19 i farletuzumab). znači vezivanje, - znači nevezivanje, /- znači slabo vezivanje.
Avidnost prema folatnom receptoru 1
Avidnost interakcije između anti-FolR1 IgG ili bispecifičnih molekula T ćelija i rekombinantnih folatnih receptora utvrđena je kako je opisano u nastavku (Tabela 9).
Rekombinantne biotinilovane monomerne Fc fuzije folatnog receptora 1 (FolR1-Fc) čoveka, cinomolgusa i miša su direktno kuplovane na SA čipu pomoću standardnog uputstva za kuplovanje (Biacore, Freiburg/Nemačka). Nivo imobilizacije je bio oko 300-400 RU. Anti-FolR1 IgG ili bispecifični molekuli T ćelija su propušteni u rasponu koncentracija od 2,1 do 500 nM sa protokom od 30 µl/minuti kroz protočne ćelije tokom 180 sekundi. Disocijacija je praćena tokom 600 sekundi. Razlike indeksa prelamanja u rasutom stanju su korigovane oduzimanjem odgovora dobijenog na referentnoj protočnoj ćeliji imobilisanoj Fc fuzijom rekombinantnog biotinilovanog IL2 receptora. Za analizu interakcije 19H3 IgG i mišjeg folatnog receptora 1, folat (Sigma F7876) je dodat u radni pufer HBS-EP u koncentraciji od 2,3 µM. Krive vezivanja koje su rezultat dvovalentnog vezivanja IgG ili bispecifičnih molekula T ćelija aproksimirane su na 1:1 Lengmirovo vezivanje i uklopljene u taj model (što nije tačno, ali daje predstavu o avidnosti). Prividne konstante avidnosti za ove interakcije su izvedene iz konstanti brzine ovog uklapanja pomoću softvera Bia Evaluation (GE Healthcare).
Tabela 9: Dvovalentno vezivanje (avidnost sa prividnim KD) odabranih FolR1 vezivača kao IgG ili kao bispecifičnih molekula T ćelija (TCB) na humanom i cinomolgusovom FolR1.
1. Afinitet prema folatnom receptoru 1
Afinitet interakcije između anti-FolR1 IgG ili bispecifičnih molekula T ćelija i rekombinantnih folatnih receptora utvrđen je kako je opisano u nastavku (Tabela 10).
Za merenje afiniteta, izvedeno je direktno spajanje oko 6000-7000 rezonantnih jedinica (RU) antihumanog Fab specifičnog antitela (komplet za hvatanje Fab, GE Healthcare) na CM5 čipu pri pH 5,0, uz pomoć standardnog kompleta za kuplovanje amina (GE Healthcare). Anti-FolR1 IgG ili bispecifični proizvodi T ćelija hvatani su na 20 nM sa protokom od 10 µl/min tokom 20 ili 40 sekundi, u referentnoj protočnoj ćeliji nije bilo hvatanja. Serije razblaženja (6,17 do 500 nM ili 12,35 do 3000 nM) Fc fuzije humanog ili cinomolgusovog folatnog receptora 1 su propuštene kroz sve protočne ćelije pri 30 µl/min tokom 120 ili 240 s kako bi se zabeležila faza asocijacije. Faza disocijacije je praćena tokom 240 s i aktivirana prebacivanjem sa uzorka rastvora na HBS-EP. Površina čipa je regenerisana nakon svakog ciklusa dvostrukim injektovanjem od 60 s 10 mM glicin-HCl pH 2,1 lil pH 1,5. Ukupne razlike indeksa prelamanja su korigovane oduzimanjem odgovora dobijenog na referentnoj protočnoj ćeliji 1. Konstante afiniteta za ove interakcije su izvedene iz konstanti brzine uklapanjem u 1:1 Lengmirovo vezivanje pomoću softvera Bia Evaluation (GE Healthcare).
Tabela 10: Jednovalentno vezivanje (afinitet) odabranih FolR1 vezivača kao IgG ili kao bispecifičnih molekula T ćelija (TCB) na humanom i cinomolgusovom FolR1.
2. Afinitet prema CD3
Afinitet interakcije između anti-FolR1 bispecifičnog antitela T ćelija i rekombinantnog humanog CD3εδ-Fc utvrđen je kako je opisano u nastavku (Tabela 11).
Za merenje afiniteta, izvedeno je direktno spajanje oko 9000 rezonantnih jedinica (RU) antihumanog Fab specifičnog antitela (komplet za hvatanje Fab, GE Healthcare) na CM5 čipu pri pH 5,0, pomoću standardnog kompleta za kuplovanje amina (GE Healthcare). Anti-FolR1 bispecifični molekuli T ćelija su hvatani na 20 nM sa protokom od 10 µl/min tokom 40 s, u referentnoj protočnoj ćeliji nije bilo hvatanja. Serija razblaženja (6,17 do 500 nM) humane CD3εδ-Fc fuzije propuštena je kroz sve protočne ćelije pri 30 µl/min tokom 240 s da bi se zabeležila faza asocijacije. Faza disocijacije je praćena tokom 240 s i aktivirana prebacivanjem sa uzorka rastvora na HBS-EP. Površina čipa je regenerisana nakon svakog ciklusa dvostrukim injektovanjem od 60 s 10 mM glicin-HCl pH 2,1. Ukupne razlike indeksa prelamanja su korigovane oduzimanjem odgovora dobijenog na referentnoj protočnoj ćeliji 1. Konstante afiniteta za ove interakcije su izvedene iz konstanti brzine uklapanjem u 1:1 Lengmirovo vezivanje pomoću softvera Bia Evaluation (GE Healthcare).
Tabela 11: Jednovalentno vezivanje (afinitet) odabranih FolR1 bispecifičnih molekula T ćelija (TCB) na humanom CD3-Fc.
Deo koji vezuje CD3 identičan je za sve konstrukte, a afinitet je sličan za izmerene bispecifične molekule T ćelija (raspon KD od 60 do 90 nM).
Primer 11
Simultano vezivanje bispecifičnih molekula T ćelija za folatni receptor 1 i za CD3 Simultano vezivanje anti-FolR1 bispecifičnih molekula T ćelija za rekombinantni folatni receptor 1 i rekombinantni humani CD3εδ-Fc određeno je kako je opisano u nastavku.
Rekombinantne biotinilovane monomerne Fc fuzije folatnog receptora 1 (FolR1-Fc) čoveka, cinomolgusa i miša su direktno kuplovane na SA čipu pomoću standardnog uputstva za kuplovanje (Biacore, Freiburg/Nemačka). Nivo imobilizacije je bio oko 300-400 RU. Anti-FolR1 bispecifični molekuli T ćelija su injektovani tokom 60 s na 500 nM sa protokom od 30 µl/minuti kroz protočne ćelije, nakon čega je izvršeno jedno injektovanje hu CDεδ-Fc tokom 60 s na 500 nM. Razlike indeksa prelamanja u rasutom stanju su korigovane oduzimanjem odgovora dobijenog na referentnoj protočnoj ćeliji imobilisanoj Fc fuzijom rekombinantnog biotinilovanog IL2 receptora. Četiri testirana bispecifična molekula T ćelija (16D5 TCB, 21A5 TCB, 51C7 TCB i 45D2 TCB) su mogla istovremeno da se vežu za folatni receptor 1 i za humani CD3, kako se očekivalo.
Primer 12
Sortiranje epitopa
Za sortiranje epitopa, anti-FolR1 IgG ili bispecifični molekuli T ćelija su direktno imobilisani na CM5 čipu na pH 5,0, koristeći standardni komplet za kuplovanje amina (GE Healthcare), sa konačnim odgovorom od oko 700 RU. Zatim je hvatano 500 nM huFolR1-Fc tokom 60 s, nakon čega je sledilo hvatanje 500 nM različitih vezivača tokom 30 s. Površina je regenerisana sa dva injektovanja 10 mM glicina pH 2, svako u trajanju od 30 s. Procenjivalo se da li se različiti vezivači mogu vezivati za huFolR1 uhvaćen na imobilisanim vezivačima (Tabela 12).
Tabela 12: Karakterizacija epitopa odabranih FolR1 vezivača kao IgG ili kao bispecifičnih molekula T ćelija (TCB) na humanom FolR1. znači vezivanje, - znači nevezivanje, /- znači slabo vezivanje
Na osnovu ovih rezultata i dodatnih podataka uz istovremeno vezivanje na imobilisani huFolR1, vezivači su razdvojeni u tri grupe. Nije jasno da li 9D11 ima odvojeni epitop jer istiskuje sve druge vezivače. Čini se da su 16D5 i 21A5 u istoj grupi, a Mov19, farletuzumab (Coney et al., Cancer Res.1991 Nov 15;51 (22):6125-32; Kalli et al., Curr Opin Investig Drugs.
2007 Dec;8(12): 1067-73) i 36F2 u drugoj (Tabela 13). Međutim, 36F2 se vezuje za drugačiji epitop od Mov 19 i farletuzumaba, jer se vezuje za FolR1 čoveka, cinomolgusa i miša.
Tabela 13: Grupisanje epitopa odabranih FolR1 vezivača kao IgG-ova ili bispecifičnih molekula T ćelija (TCB) na humanom FolR1
Primer 13
Selekcija vezivača
FolR1 vezivači u IgG formatima su pregledani površinskom plazmonskom rezonancom (SPR) i in vitro testom na ćelijama kako bi se odabrali najbolji kandidati.
Anti-FolR1 IgG su analizirani putem SPR radi karakterizacije njihove unakrsne reaktivnosti (na humani, mišji i cinomolgusov FolR1) i specifičnosti (za humani FolR1, humani FolR2, humani FolR3). Nespecifično vezivanje za humani FolR2 i 3 se smatralo faktorom isključenja. Vezivanje i specifičnost za humani FolR1 su potvrđeni na ćelijama. Neki vezivači se nisu vezali za ćelije koje eksprimiraju FolR1 iako su prepoznali rekombinantni humani FolR1 u SPR. Određena je temperatura agregacije, ali nije bila faktor isključenja jer su svi odabrani vezivači bili stabilni. Odabrani vezivači su testirani u polireaktivnom testu ELISA kako bi se proverilo nespecifično vezivanje, što je dovelo do isključenja četiri vezivača. Ovaj postupak je proizveo početnu selekciju tri vezivača: 36F2 (Fab biblioteka), 9D11 (Fab biblioteka) i 16D5 (zajednički laki lanac). 36F2 se brzo odvojio od huFolR1 i zbog toga u početku nije bio favorizovan.
Primer 14
Specifično vezivanje novih generisanih FolR1 vezivača za humane FolR1 pozitivne tumorske ćelije
Novi FolR1 vezivači generisani su pomoću displeja faga uz korišćenje biblioteke Fab ili biblioteke zajedničkog lakog lanca korišćenjem lakog lanca CD3. Identifikovani vezivači pretvoreni su u humani IgG1format i razmatrano je vezivanje za HeLa ćelije sa visokom ekspresijom FolR1. Kao referentni molekul uključen je humani FolR1 vezivač Mov19. Većina vezivača testiranih u ovom testu pokazala je srednje do dobro vezivanje za FolR1, s tim da su se neki klonovi vezivali jednako dobro kao Mov19 (vidi Sliku 2). Klonovi 16A3, 18D3, 15H7, 15B6, 21D1, 14E4 i 16F12 su bili isključeni jer se protočnom citometrijom nije moglo potvrditi vezivanje za FolR1 na ćelijama. U sledećem koraku, odabrani klonovi su testirani na specifičnost za humani FolR1 isključivanjem vezivanja za srodni humani FolR2. HEK ćelije su privremeno transficirane humanim FolR1 ili humanim FolR2 radi razmatranja specifičnosti. Klonovi 36F2 i 9D11 izvedeni iz biblioteke Fab i klonovi 16D5 i 21A5 izvedeni iz CLC biblioteke vezuju se specifično za humani FolR1, a ne za humani FolR2 (vidi Slike 3A-B). Svi ostali testirani klonovi su pokazali barem određeno vezivanje za humani FolR2 (vidi Slike 3A-B). Stoga su ovi klonovi isključeni iz dalje karakterizacije. Paralelno se radilo na unakrsnoj reaktivnosti FolR1 klonova na cino FolR1 izvođenjem ispitivanja vezivanja za HEK ćelije prolazno transficirane sa cino FolR1. Svi testirani klonovi su se mogli vezati za cino FolR1, a četiri odabrana humana FoLR1 specifična klona 36F2, 9D11, 16D5 i 21A5 se na sličan način dobro vezuju za humani i cino FoFR1 (Slika 4). Nakon toga, tri humana FolR1 specifična cino unakrsno reaktivna vezivača su pretvorena u format TCB i testirana na indukovanje ubijanja T ćelija i aktivaciju T ćelija. Radi se o klonu 9D11 iz biblioteke Fab i klonovima 16D5 i 21A5 iz CLC biblioteke. Kao referentni molekul u sva ispitivanja je uključen molekul Mov19 FolR1 TCB. Ovi FolR1 TCB su zatim korišćeni za poređenje indukovanja internalizacije nakon vezivanja za FolR1 na HeLa ćelijama. Sva tri testirana klona su internalizovana nakon vezivanja za FolR1 slično internalizaciji nakon vezivanja Mov19 FoLR1 TCB (Slika 5).21A5 FolR1 TCB je prekinut zbog znakova polireaktivnosti.
Primer 15
T ćelijama posredovano ubijanje ciljnih tumorskih ćelija koje eksprimiraju
FolR1, indukovano FolR1 TCB antitelima
FolR1 TCB su korišćeni za određivanje ubijanja posredstvom T ćelija, tumorskih ćelija koje eksprimiraju FoLR1. Panel potencijalnih ciljnih ćelijskih linija je korišćen za određivanje mesta vezivanja FoLR1 Qifikit analizom.
Korišćeni panel tumorskih ćelija sadrži FolR1 tumorske ćelije sa visokom, srednjom i niskom ekspresijom tumorskih ćelija i FolR1 negativnu ćelijsku liniju.
Tabela 14: Mesta vezivanja FolR1 na ćelijama tumora
Utvrđeno je vezivanje tri različita FoLR1 TCB (koji sadrže vezivače 9D11, 16D5 i Mov19) za ovaj panel tumorskih ćelijskih linija, čime se pokazuje da se FoLR1 TCB specifično vezuju za tumorske ćelije koje eksprimiraju FolR1, a ne za FoLR1 negativne tumorske ćelijske linije. Količina vezanog konstrukta je proporcionalna nivou ekspresije FolR1 i još uvek postoji dobro vezivanje konstrukata za FolR1 niskoćelijsku liniju FIT-29 koje se može detektovati. Pored toga, ne postoji vezivanje negativne kontrole DP47 TCB ni za jednu od korišćenih ćelijskih linija (Slike 6A-E). DP47 TCB je neciljani TCB, i pripremljen je kako je opisano u WO2014/131712.
Ćelijska linija SKOV3 srednje ekspresije i ćelijska linija HT-29 niske ekspresije dalje su korišćene za testiranje ubijanja posredovanog T ćelijama i aktivacije T ćelija uz upotrebu 16D5 TCB i 9D11 TCB; DP47 TCB je bio uključen kao negativna kontrola. Obe ćelijske linije su ubijene u prisustvu već vrlo niskih nivoa 16D5 TCB i 9D11 TCB i nije bilo razlike u aktivnosti između dva TCB, iako se 9D11 TCB jače vezuje za FolR1 nego 16D5 TCB. Ukupno ubijanje SKOV3 ćelija bilo je veće u odnosu na HT-29, što odražava više nivoe ekspresije FolR1 na SKOV3 ćelijama (Slike 7A-D). U skladu s tim, otkriveno je značajno povećanje aktivacionih markera CD25 i CD69 na CD4<+>T ćelijama i CD8<+>T ćelijama. Aktivacija T ćelija je bila vrlo slična u prisustvu SKOV3 ćelija i HT-29 ćelija. Negativna kontrola DP47 TCB ne izaziva nikakvo ubijanje pri korišćenim koncentracijama i nije bilo značajnijeg povećanja markera CD25 i CD69 na T ćelijama.
Tabela 15: EC50 vrednosti ubijanja tumorskih ćelija i aktivacije T ćelija sa SKOV3 ćelijama
Tabela 16: EC50 vrednosti ubijanja tumorskih ćelija i aktivacije T ćelija sa HT-29 ćelijama
Primer 16
Vezivanje antitela FolR1 TCB za eritrocite i aktivacija T ćelija u punoj krvi Da bismo dokazali da ne dolazi do spontane aktivacije u odsustvu tumorskih ćelija koje eksprimiraju FoLR1, testirali smo postojanje vezivanja klonova FolR1 za eritrocite koji mogu potencijalno da eksprimiraju FolR1. Nismo mogli da primetimo nikakvo specifično vezivanje 9D11 IgG, 16D5 IgG i Mov19 IgG za eritrocite pošto je uključena negativna kontrola DP47 IgG (Slika 8).
Da bi se isključilo svako dalje nespecifično vezivanje za krvne ćelije ili nespecifična aktivacija putem FoLR1 TCB, u punu krv su dodati 9D11 TCB, 16D5 TCB i Mov19 TCB, a protočnom citometrijom je analizirano povećanje markera CD25 i CD69 na CD4<+>T ćelijama i CD8<+>T ćelijama. DP47 TCB je bio uključen kao negativna kontrola. Analizom povećanja markera CD25 i CD69 na CD4<+>T ćelijama i CD8<+>T ćelijama nije se mogla primetiti aktivacija T ćelija ni sa jednim od testiranih konstrukata (Slika 9).
Primer 17
Ubijanje T ćelija indukovano pomoću 36F2 TCB i 16D5 TCB u različitim jednovalentnim i dvovalentnim bispecifičnim formatima T ćelija Procenjeno je ubijanje T ćelija posredovano sa 36F2 TCB, 16D5 TCB, 16D5 TCB klasičnim, 16D5 TCB 1+1 i 16D5 TCB HT antitelima na Hela, Skov-3 (srednji FolR1, oko 70.000-90.000 kopija) i HT-29 (niski FolR1, oko 10.000) ćelijama humanog tumora. DP47 TCB antitelo je bilo uključeno kao negativna kontrola. Humani PBMC su korišćeni kao efektori i ubijanje je detektovano nakon 24 h inkubacije sa bispecifičnim antitelom. Ukratko, ciljne ćelije su sakupljene pomoću tripsina/EDTA, isprane i nanete u gustini od 25.000 ćelija/bunarčiću koristeći ploče sa 96 bunarčića ravnog dna. Ćelije su ostavljene da se zalepe preko noći. Mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) su pripremljene gradijentnim Histopaque centrifugiranjem obogaćenih limfocitnih preparata (leukocitno-trombocitnog sloja) dobijenih od zdravih humanih donora. Sveža krv je razblažena sterilnim PBS-om i raslojena putem gradijenta Histopaque (Sigma, br. H8889). Nakon centrifugiranja (450 x g, 30 minuta, sobna temperatura), plazma iznad međufaze koja sadrži PBMC je odbačena, i PBMC su preneti u novu falcon epruvetu koja je zatim napunjena sa 50 ml PBS-a. Smeša je centrifugirana (400 x g, 10 minuta, sobna temperatura), supernatant je odbačen i PBMC pelet je dva puta ispran sterilnim PBS-om (koraci centrifugiranja 350 x g, 10 minuta). Dobijena PBMC populacija je prebrojavana automatski (ViCell) i čuvana u medijumu RPMI1640 koji sadrži 10% FCS i 1% L-alanil-L-glutamina (Biochrom, K0302) na 37 °C, 5% CO2, u ćelijskom inkubatoru do dalje upotrebe (ne duže od 24 h). Za test ubijanja, antitela su dodata u naznačenim koncentracijama (opseg od 0,01 pM - 100 nM u triplikatu). PBMC su dodavani u ciljne ćelije u konačnom odnosu E:T od 10:1. Ubijanje ciljnih ćelija je procenjeno nakon 24 h inkubacije na 37 °C, 5% CO2, kvantifikacijom LDH oslobođenog u ćelijske supernatante od strane apoptotičnih/nekrotičnih ćelija (komplet za detekciju LDH, Roche Applied Science, br.11 644 793 001). Maksimalna liza ciljnih ćelija (= 100%) postignuta je inkubacijom ciljnih ćelija sa 1% Triton X-100. Minimalna liza (= 0%) se odnosi na ciljne ćelije koinkubirane sa efektorskim ćelijama bez bispecifičnog konstrukta. Rezultati pokazuju ciljno specifično ubijanje sve tri FolR1<+>ciljne ćelijske linije indukovano pomoću 36F2 TCB i 16D5 TCB (slika 10).
Primer 18
Generisanje anti-TIM3 antitela
Imunizacija miševa NMRI miševi su imunizovani genetski, uz korišćenje plazmidnog ekspresionog vektora koji kodira humani Tim-3 pune dužine, intradermalnom primenom 100 ug vektorske DNK (plazmid 15304_hTIM3-fl), a zatim elektroporacijom (2 kvadratna impulsa od 1000 V/cm, trajanja 0,1 ms, interval 0,125 s; a zatim 4 kvadratna impulsa od 287,5 V/cm, trajanja 10 ms, interval 0,125 s). Miševi su primili 6 uzastopnih imunizacija 0, 14, 28, 42, 56, 70. i 84. dana. Krv je uzeta 36, 78. i 92. dana i pripremljen je serum koji je korišćen za određivanje titra pomoću ELISA tehnike (vidi dole). Životinje sa najvišim titrima su odabrane za pojačavanje 96. dana, intravenskom injekcijom 50 ug humane Fc himere rekombinantnog humanog Tim-3, i monoklonska antitela su izolovana tehnologijom hibridoma, fuzijom splenocita u ćelijsku liniju mijeloma 3 dana nakon pojačanja.
Određivanje titra seruma (ELISA) Humana Fc himera rekombinantnog humanog Tim-3 je imobilisana na NUNC Maxisorp ploči sa 96 bunarčića, sa 0,3 ug/ml, 100 μl/bunarčiću, u PBS-u, nakon čega je sledila blokada ploče 2% kroteinom C u PBS-u, 200 μl/bunarčiću; primena serijskih razblaženja antiseruma, u duplikatu, u 0,5% kroteinu C u PBS-u, 100 μl/bunarčiću; detekcija sa kozjim anti-mišjim antitelom konjugovanim sa HRP (Jackson Immunoresearch/Dianova 115-036-071; 1/16000). Za svaki korak, ploče su inkubirane 1 sat na 37 °C. Između svih koraka, ploče su isprane 3 puta sa 0,05% Tween 20 u PBS-u. Signal je razvijen dodavanjem rastvorljivog supstrata BM Blue POD (Roche), 100 ul/bunarčiću; i zaustavljen dodavanjem 1 M HCl, 100 ul/bunarčiću. Apsorbanca je očitana na 450 nm, nasuprot 690 nm kao referenci. Titar je definisan kao razblaženje antiseruma koje daje polumaksimalni signal.
Primer 19
Karakterizacija anti-Tim3 antitela
ELISA za Tim-3 Nunc-Maxi SORP streptavidinske ploče (MicroCoat kat. br.
11974998/MC1099) su obložene sa 25 μl/bunarčiću Tim3-ECD-His-biotina (biotinilovana BirA ligaza) i inkubirane na RT tokom 1 h uz mućkanje i rotaciju od 400 obrtaja u minuti. Posle ispiranja (3x90 μl/bunarčiću PBST puferom), 25 μl uzoraka aTim3 ili razblaženog (koraci 1:2) referentnog antitela aTim3 F38-2E2 (Biolegend) je dodato i inkubirano 1 h na sobnoj temperaturi. Posle ispiranja (3x90 µl/bunarčiću PBST puferom), dodato je 25µl/bunarčiću ovčjeg antimišjeg-POD (GE NA9310V) u razblaženju 1:9000 i inkubirano na sobnoj temperaturi tokom 1 h uz mućkanje i rotaciju od 400 obrtaja u minuti. Posle ispiranja (4x90 μl/bunarčiću PBST puferom) dodato je 25 μl/bunarčiću TMB supstrata (Calbiochem, kat. br. CL07) i inkubirano do OD 1,5 - 2,5. Tada je reakcija zaustavljena dodavanjem 25 µl/bunarčiću rastvora 1N HCl. Merenje je izvršeno na 370/492 nm. Rezultati ELISA testa navedeni su kao vrednosti EC50 [ng/ml] u zbirnoj Tabeli 17 u nastavku.
Ćelijska ELISA za Tim3 Adherentna CHO-K1 ćelijska linija stabilno transficirana plazmidskim 15312_hTIM3-fl_pUC_Neo kodiranjem za humani Tim3 pune dužine i selekcijom sa G418 (marker otpornosti na neomicin na plazmidu) zasejana je u koncentraciji od 1,2x10E6 ćelija/ml na ploče sa ravnim dnom sa 384 bunarčića i uzgajana preko noći.
Sledećeg dana je dodato 25 μl/bunarčiću uzorka Tim3 ili referentnog antitela za aTim3 F38-2E2 bez azida (Biolegend, 354004) i inkubirano 2 h na 4 °C (kako bi se izbegla internalizacija). Posle ispiranja (3x90 μl/bunarčiću PBST (BIOTEK Washer: Prog.29, 1 x 90), ćelije su fiksirane izbacivanjem zaostalog pufera i dodavanjem 50 µl/bunarćiću 0,05% glutaraldehida: Razblaživanje 1:500 25% glutaraldehida (Sigma kat. br: G5882) u 1xPBS-puferu i inkubirane 1 sat na sobnoj temperaturi. Posle ispiranja (3x90 μl/bunarčiću PBST (BIOTEK Washer: Prog.21, 3x90 GreinLysin) 25 μl/bunarćiću, dodato je sekundarno antitelo za detekciju (ovčiji antimišji-POD; F(ab')2fragment povezan sa POD rena; GE NA9310), a nakon toga je obavljena inkubacija tokom 2 h na sobnoj temperaturi uz mućkanje pri rotaciji od 400 obrtaja u minuti. Posle ispiranja (3x90 μl/bunarčiću PBST (BIOTEK Washer: Prog.21, 3x90 GreinLysin) 25 μl/bunarćiću, dodat je TMB rastvor supstrata (Roche 11835033001) i vršena je inkubacija do OD 1,5 - 2,5. Tada je reakcija zaustavljena dodavanjem 25 µl/bunarčiću 1N rastvora HCl. Merenje je izvršeno na 370/492 nm. Rezultati ćelijskog testa ELISA su navedeni kao vrednosti „EC50 CHO-Tim3“ [ng/ml] u zbirnoj Tabeli 17 u nastavku.
Tabela 17: Afiniteti vezivanja primera antitela (ELISA i BIACORE)
Biacore karakterizacija TIM3 antitela Test zasnovan na površinskoj plazmonskoj rezonanci (SPR) korišćen je za određivanje kinetičkih parametara vezivanja između nekoliko mišjih Tim3 vezivača kao i komercijalnih humanih Tim3 referenci vezivanja. Zbog toga je antimišji IgG imobilisan vezivanjem amina za površinu (BIAcore) CM5 senzorskog čipa. Uzorci su tada uhvaćeni i hu/cy Tim3-ECD je vezan za njih. Površina senzorskog čipa je regenerisana nakon svakog ciklusa analize. Ravnotežna konstanta KDkonačno je dobijena uklapanjem podataka u model 1:1 Lengmirove interakcije. Oko 12.000 jedinica odgovora (RU) 30 µg/ml antimišjeg IgG (GE Healthcare kat. br. BR-1008-38) vezano je za tačke 1,2,4 i 5 protočnih ćelija 1-4 (tačke 1,5 su aktivne, a tačke 2,4 su referentne tačke) CM5 senzorskog čipa u BIAcore B4000 na pH 5,0 pomoću kompleta za kuplovanje amina koji isporučuje GE Healthcare.
Pufer za uzorak i radni pufer je bio HBS-EP<+>(0,01 M HEPES, 0,15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0,05% v/v surfaktant P20, pH 7,4). Temperatura protočne ćelije je podešena na 25 °C, a temperatura odeljka sa uzorkom na 12 °C. Sistem je prajmovan radnim puferom. Uzorci su injektovani 30 sekundi sa koncentracijom od 200 µg/ml i vezani za tačke 1 i 5 svake protočne ćelije, što je omogućilo merenje osam uzoraka paralelno. Zatim je kompletan skup različitih (monomernih cino, monomernih humanih i huFc fuzionisanih dimernih humanih Tim3-ECD) koncentracija (v. Tabelu X) injektovan u svaki uzorak u trajanju od 240 s, praćen vremenom disocijacije od 30/1800 s (v. Tabelu 1). Svaki ciklus analize (uzimanje uzoraka, tačka 1 i 5 -injektovanje Tim3 ECD) je zatim regenerisan injektovanjem glicin-HCl pH 1,7 tokom 30 sekundi. Protok je postavljen na 30 µl/min tokom celog perioda. Na kraju, dvostruki referentni podaci su uklopljeni u model 1:1 Lengmirove interakcije pomoću BIAcore B4000 softvera za procenu. Dobijene vrednosti KDsu prikazane u Tabeli 17 i 18.
Tabela 18: Afiniteti vezivanja određeni BIAcore-KD vrednostima dobijenim kinetičkim SPR merenjima. -n.f. znači da nije moguće uklapanje, najverovatnije zbog nevezivanja ili slabog vezivanja.
Primer 20
Generisanje derivata anti-Tim3 antitela
Himerni derivati antitela Himerna Tim3 antitela su generisana amplifikacijom varijabilnih regiona teškog i lakog lanca mišjih anti-TIM3 antitela, Tim3-0016, varijante Tim3-0016 (0018), Tim3-0021, Tim3-0022, Tim3-0026, Tim3-0028, Tim3-0030, i Tim3-0033, Tim3-0038, putem PCR i njihovim kloniranjem u ekspresione vektore teškog lanca kao fuzione proteine sa skeletima humanog IgG1/ humani CH1-šarka-CH2-CH3 sa LALA i PG mutacijama (leucin 234 u alanin, leucin 235 u alanin, prolin 329 u glicin), uz ukidanje efektorskih funkcija i ekspresionih vektora lakog lanca kao fuzionih proteina na humani C-kapa. LC i HC plazmidi su zatim kotransficirani u HEK293 i prečišćeni nakon 7 dana iz supernatanta standardnim postupcima za prečišćavanje antitela.
Uklanjanje mesta glikozilacije NYT: Izmena 1 položaja HVR-L1 u varijantama Tim3-0016, Tim3_0016 (nazvanim 0018 ili Tim3_0018) zamenom N sa Q ili S Mutacije unutar varijabilnog regiona lakog V-lanca Tim3_0016 i varijante Tim3_0016 (0018) generisane su in vitro mutagenezom uz korišćenje Agilent kompleta “Quick Change Lightning-Site Mutagenesis Kit” prema uputstvu proizvođača. Ovom metodom je asparagin (N) mesta glikozilacije sa motivom NYT u lakom lancu HVR-L1 (SEQ ID NO: 4) zamenjen glutaminom (Q) (što daje SEQ ID NO: 11 = Tim3_0016_HVR-L1 varijanta 1_ NQ) ili, alternativno, asparagin (N) je zamenjen serinom (S) (što daje SEQ ID NO: 12 = Tim3_0016_HVR-L1 varijanta 2_ NS). U oba mesta glikozilacije, motiv NYT je uspešno modifikovan. LC i HC plazmidi, koji kodiraju varijante, su zatim kotransficirani u HEK293 i prečišćeni nakon 7 dana iz supernatanta standardnim postupcima za prečišćavanje antitela. Generisani mutanti su testirani ELISA testom na humanom Tim3, ELISA testom na Tim3 cinomolgusa i ćelijskim ELISA testom na adhezivnim ćelijama CHO-K1 koje eksprimiraju humani Tim3 pune dužine. Otkriveno je da svi generisani mutanti pokazuju čak funkcionalnije vezivanje za humani TIM3 (human), cino TIM3 (cyno) ili humani TIMR na CHO ćelijama nego matična antitela Tim3_0016 ili varijanta Tim3_0016 antitela Tim3_0018.
Tabela 19:
Primer 21
Fluorescentno označavanje prečišćenog monoklonskog antitela Fluorescentno označavanje monoklonskog antitela dobijenog od hibridoma je izvršeno upotrebom kompleta za označavanje monoklonskog antitela Alexa Fluor 488 (proizvođača Invitrogen) prema upustvu proizvođača. Nakon obeležavanja, za svako antitelo je potvrđeno da je pozitivno obeleženo pomoću Alexa Fluor 488 (u daljem tekstu „Alexa-488”) putem analize uređajem FACSCalibur (proizvođača BD Biosciences) za TIM-3 koji eksprimira RPMI-8226 i Fajferove ćelije.
Primer 22
Klasifikacija epitopskih vezujućih grupa pomoću testa kompetitivnosti na bazi
FACS
Odnos epitopa između generisanih anti-TIM3 antitela i šest anti-TIM3 referentnih antitela je analiziran testom kompetitivnosti vezivanja na bazi FACS. Referentna antitela za TIM3 su sledeća: antitela 4177 i 8213 kako je opisano u US2012/189617, antitela 1.7E10 i 27.12E12 kako je opisano u WO2013/06490; antitelo 344823 (klon 344823, proizvođač R&D Systems) i antitelo F38-2E2 (klon F38-2E2, proizvođači BioLegend i R&D Systems). Ukratko, testiranom antitelu je dozvoljeno da stupi u interakciju i veže se za RPMI-8226 ćelije koje eksprimiraju TIM-3 (ATCC<®>CCL-155™), a zatim je procenjeno metodom protočne citometrije da li se još jedno anti-TIM-3 antitelo takođe može vezati za ćelije koje eksprimiraju TIM-3.
Ukratko, humane RPMI-8226 ćelije koje eksprimiraju TIM3 inkubirane su sa BD humanim Fc blokom 10 min na sobnoj temperaturi i obojene su u dva različita eksperimentalna podešavanja da se isključi uticaj razlike u afinitetu testiranih antitela na vezivanje:
1) sa objavljenim prečišćenim anti-TIM3 (10 µ/ml u BD puferu za bojenje u trajanju od 0,5 h na 4 °C), konjugovanim sa Alexa*488 prema uputstvu proizvođača (molekulske sonde A-20181) sa prosekom od 2,7 fluorofora po antitelu. Pored toga, a) dodata su neoznačena (1-4) referentna rekombinantna anti-TIM3 antitela ili kontrole izotipa (10 µg/ml) tokom 0,5 h na 4 °C u BD SB-u i posle ispiranja pomoću BD SB obojena pomoću PE obeleženih anti-huFcγ antitela (JIR, 109-116-098, 1:200, 0,5 h na 4 °C u BD SB-u) ili b) PE obeležena (5-6) dostupna referentna anti-TIM3 antitela ili odgovarajuće izotipske kontrole su dodavane (10 µg/ml) u trajanju od 0,5 h na 4 °C u BD SB-u. Nakon ispiranja i centrifugiranja, MFI signali obojenih ćelija RPMI-8226 analizirani su BD Biosciences FACSCanto protočnim citometrom.
Tabela 20: Sažeti prikaz karakterizacije epitopa.
Rezultati mapiranja grupa epitopa na bazi FACS pokazuju da Tim3_0016 i Tim3_0016 varijanta Tim3_0018 ne pokazuju takmičenje u vezivanju za bilo koje testirano anti-TIM-3 referentno antitelo, i sugerisano je da ova Ab prepoznaju novi epitop različit od epitopa koji su prepoznala sva prethodno opisana TIM3 referentna antitela dok se Tim3_0022, Tim3_0026, Tim3_0028 i Tim3_0038 takmiče u različitom obimu u vezivanju za površinski eksprimiran TIM3 na JRPMI-8226 ćelijama sa različitim konkurentima.
Primer 23
Uticaj humanih anti-TIM-3 antitela na proizvodnju citokina u mešanoj limfocitnoj reakciji (MLR)
Mešana limfocitna reakcija se koristila da se pokaže efekat blokiranja TIM-3 puta do efektorskih ćelija limfocita. T ćelije u ispitivanju su testirane na aktiviranje i lučenje IFN-gama u prisustvu ili odsustvu anti-TIM-3 mAb.
Humani limfociti su izolovani iz periferne krvi zdravog donora centrifugiranjem sa gradijentom gustine pomoću leukosepa (Greiner Bio One, 227288). Ukratko, heparinizovana krv je razblažena trostrukom zapreminom PBS-a, i 25 ml alikvota razblažene krvi je raslojeno u leukosep epruvetama od 50 ml. Posle centrifugiranja na 800 x g tokom 15 minuta na sobnoj temperaturi (bez prekida), frakcije koje sadrže limfocite su sakupljene, isprane PBS-om i direktno korišćene u funkcionalnom testu ili resuspendovane u medijumu za smrzavanje (10% DMSO, 90% FCS) sa 1,0E 07 ćelija/ml i skladištene u tečnom azotu. Odnos ciljne ćelije/ćelije ispitanika 1:1 korišćen je u testu MLR (tj. svaka MLR kultura je sadržala -2,0E+05 PBMC svakog donora u ukupnoj zapremini od 200 µl. Anti-TIM3 monoklonska antitela Tim3_0016, varijanta Tim3_0016 (Tim3_0018), Tim3_0021, Tim3_0022, Tim3_0026, Tim3_0028, Tim3_0030, Tim3_0033, Tim3_0038 i F38-2E2 (BioLegend) dodata su svakoj kulturi u različitim koncentracijama antitela. Nijedno antitelo ili antitelo za kontrolu izotipa nije korišćeno kao negativna kontrola, i rec IL-2 (20 EU/ml) je korišćen kao pozitivna kontrola. Ćelije su kultivisane 6 dana na 37 °C. Nakon 6. dana, uzeto je 100 µl medijuma iz svake kulture za merenje citokina. Nivo IFN-gama je izmeren korišćenjem kompleta OptEIA ELISA (BD Biosciences).
Rezultati su prikazani u Tabeli 21 (izlučivanje / oslobađanje IFN-g). Anti-TIM-3 monoklonska antitela podstiču aktivaciju T ćelija i lučenje IFN-gama na način zavisan od koncentracije. Anti-TIM3 antitela Tim3_0021, Tim3_0022, Tim3_0028 i Tim3_0038 smanjuju oslobađanje inflamatornog citokina IFN-gama više nego F38-2E2 antitelo. Tim3_0016, varijanta Tim3_0016 (Tim3_0018), Tim3_0033 i Tim3_0038 su pokazali slično oslobađanje u poređenju sa antitelom F38-2E2. Suprotno tome, kulture koje sadrže antitelo za kontrolu izotipa nisu pokazale povećanje sekrecije IFN-gama.
Tabela 21: Procenat oslobađanja IFNgamma antitela izazvanog anti-Tim3 antitelom u odnosu na rec IL-2 (20 EU/ml) (= 100%) kao pozitivnu kontrolu i bez antitela kao negativne kontrole (donori)
Primer 24
Internalizacija anti-TIM-3 antitela u ćelije koje eksprimiraju TIM-3 Ovde opisana specifična TIM-3 antitela se mogu internalizovati u ćelije koje eksprimiraju TIM-3, uključujući limfom koji eksprimira TIM-3, multipli mijelom i AML ćelije. Na primer, otkrivena TIM-3 specifična antitela i njihovi fragmenti su prikazani kao internalizovani u rec TIM3 CHO ćelije stabilne da eksprimiraju humani TIM-3 kako je procenjeno pomoću ćelijskog ELISA, protočne citometrije (FACS) i konfokalne mikroskopije.
Stabilne Tim3-transficirane CHO-K1 ćelije (klon 8) (4x104 ćelija/bunarčiću/100 µl) zasejane su u MTP sa 98 bunarčića uz korišćenje svežeg medijuma za uzgajanje. Posle vezivanja ćelija preko noći, medijum za uzgajanje ćelija je uklonjen, i testirana antitela su dodata ćelijama (10 µg/ml u medijumu za uzgajanje ćelija) i inkubirana 0,5 sati na 4 °C. Za referencu je upotrebljeno komercijalno mišje antihumano antitelo (TIM3 MAB 11E365 (US Biological, T5469-92P). Posle ispiranja (2x medijumom za uzgajanje ćelija) i centrifugiranja, ćelije su inkubirane tokom 3 sata na a) 4 °C ili b) 37 °C u 200 µl medijuma za uzgajanje ćelija. Internalizacija se najčešće odvija na 37 °C, ali ne na 4 °C, što pruža još jednu kontrolu reakcije. Zatim su ćelije fiksirane sa 100 µl/bunarčiću 0,05% glutaraldehida (Sigma kat. br: G5882) u 1xPBS 10 minuta na sobnoj temperaturi (RT). Nakon toga su usledila tri koraka ispiranja sa 200 µl PBS-T, i sekundarno antitelo ovčje-antimišje POD (F(ab')2fragment povezan sa POD rena; GE NA9310)) je dodavano tokom 1 sata na RT. Nakon završnih koraka ispiranja (3xPBS-T), dodavan je TMB supstrat (Roche br. za naručivanje 11835033001) tokom 15 min, i razvoj boje je zaustavljen upotrebom 1N HCl. Konačni OD su određeni merenjem na 450/620 nm u ELISA čitaču. Ovaj postupak za ćelijsku ELISA tehniku je korišćen za procenu srednje propusnosti internalizujućeg kapaciteta ispitivanih antitela koja su prečišćena iz supernatanta hibridoma.
Procenat internalizacije je izračunat na sledeći način:
Internalizacija [%] = (1- OD uzorka_37 °C / OD uzorka_4 °C)*100
Rezultati su prikazani na Sl.29A i B za (Internalizaciju). Skoro sva testirana anti-TIM-3 monoklonska antitela su bila slično dobro internalizovana u stabilne Tim3 transficirane CHO-K1 ćelije nakon 3 h inkubacije na 37 °C (nisu prikazani svi podaci).
Određivanje EC50 vrednosti internalizacije (vremenska zavisnost) kao i poređenje kinetike internalizacije u zavisnosti od jednovalentnosti u odnosu na dvovalentnost procenjivano je putem FACS za odabrane kandidate.
Ukratko, humane stabilne CHO-K1 ćelije koje eksprimiraju TIM3 su zasejane (4x10<5>ćelija/bunarčiću/50 µl) u MTP sa 98 bunarčića sa dnom u obliku slova V, uz korišćenje svežeg medijuma za uzgajanje, i inkubirane su 10 minuta na RT sa Redimune® NF Liquid, da se blokira nespecifično vezivanje. Zatim je dodato 50 µl/bunarčiću odabranog prečišćenog anti-TIM3 (10 µg/ml u medijumu ćelijske kulture) i inkubirano 1 h na 4 °C. Nakon ispiranja (sa medijumom za ćelijsku kulturu) i centrifugiranja, ćelije su inkubirane 0,25, 0,5, 1, 2, 3, 4, 6 i 24 sata na a) 4 °C ili b) 37 °C u 200 µl medijuma ćelijske kulture. Zatim su ćelije isprane sa PBS/1% BSA i sekundarno antitelo Alexa Fluor 488 kozji-anti-mišji IgG, F(ab)2su dodavani tokom 1 sata na 4 °C. Nakon ispiranja i centrifugiranja, dodato je 125 µl CellFix (BD Bioscience, 1:1000) i MFI signali obojenih ćelija su analizirani protočnim citometrom BD Biosciences FACSCanto.
Procenat internalizacije je izračunat na sledeći način:
Internalizacija [%] = (1- MFIuzorka_37 °C / MFIuzorka_4 °C)*100
Primer za procenu vremenski zavisne internalizacije anti-TIM3 antitela Tim3_0016, varijanta Tim3_0016 (Tim3_0018), Tim3_0021, Tim3_0028, Tim3_0030, Tim3_0033, Tim3_0038 na RPMI-8226 ćelijama (ATCC<®>CCL-155™):
Ovde objavljena anti-TIM3 antitela se brzo internalizuju u RPMI-8226 ćelije koje eksprimiraju TIM3 (ATCC<®>CCL-155™) u velikom stepenu. Eksperimenti su izvedeni kao što je gore opisano sa RPMI-8226 ćelijama koje eksprimiraju TIM3 (ATCC<®>CCL-155™) umesto rec CHOK1 ćelija koje eksprimiraju huTIM-3. Rezultati su prikazani u Tabeli 22. Kao referentna antitela za TIM3 korišćena su sledeća antitela: antitelo 8213 kako je opisano u US2012/189617, antitelo 27.12E12 kako je opisano u WO2013/06490. Tim3_0016, varijanta Tim3_0016 (Tim3_0018), Tim3_0038 korišćena su kao himerne verzije humanog IgG1.
Tabela 22: Procenat internalizacije u naznačenom terminu (0 min postavljeno kao 0 procenata).
Rezultati pokazuju da se testirana antitela brzo internalizuju u velikom procentu u poređenju sa referentnim antitelima na RPMI-8226 ćelijama (ATCC<®>CCL-155™).
Primer 25
Vezivanje anti-TIM-3 antitela za izolovane humane monocite koji eksprimiraju
TIM-3
CD14<+>monociti su izolovani iz antikoagulisane periferne krvi zdravih donora centrifugiranjem sa gradijentom gustine pomoću Ficoll-Paque (GE Healthcare) (videti Opšte protokole u uputstvu za upotrebu ili pogledati www.miltenyibiotec.com/protocols) i zatim pozitivnom selekcijom putem CD14 mikroperli. Prvo su magnetno obeležene ćelije CD14<+>pomoću CD14 mikroperli. Zatim je ćelijska suspenzija naneta na MACS<®>kolonu koja je postavljena u magnetno polje MACS separatora. Magnetno obeležene CD14<+>ćelije se zadržavaju u koloni. Neobeležene ćelije prolaze, ova ćelijska frakcija je osiromašena u CD14<+>ćelijama. Nakon uklanjanja kolone iz magnetnog polja, magnetno zadržane CD14<+>ćelije se mogu eluirati kao pozitivno odabrana ćelijska frakcija. Posle centrifugiranja na 200 x g tokom 10 minuta na sobnoj temperaturi, monociti su sakupljeni i korišćeni direktno u testu vezivanja ili su resuspendovani u medijumu za smrzavanje (10% DMSO, 90% FCS) pri 1,0E+07 ćelija/ml i uskladišteni u tečnom azotu.
Kao što je prikazano u literaturi, monociti eksprimiraju konstitutivno TIM3 na svojoj površini. 1x105 CD14<+>izolovanih humanih monocita (50 µl/bunarčiću) je stavljeno u MTP sa 98 bunarčića sa dnom u obliku slova V u sveži medijum za uzgajanje, i inkubirani su 15 minuta na RT uz Redimune<®>NF Liquid da se blokira nespecifično vezivanje. Dodato je 50 µl/bunarčiću anti-TIM3 mAb koja se objavljuju, ili referentnih anti-TIM-3 mAb 344823 (R&D) i F38-2E2 (BioLegend) (10 µg/ml u medijumu za ćelijsku kulturu) i inkubirano tokom 1 sata na 4 °C. Zatim su ćelije isprane sa PBS/1%BSA i dodavana su PE-obeležena kozja-antimišja F(ab')2sekundarna antitela (Jackson Lab 115-006-072) tokom 1 sata na 4 °C. Nakon ispiranja i centrifugiranja, MFI signali obojenih ćelija su analizirani protočnim citometrom BD Biosciences FACSCanto.
Specifično vezivanje je izračunato na sledeći način:
Specifično vezivanje [MFI] = geom. srednja vrednost MFI uzorka - geom. srednja vrednost MFI izotipske kontrole
Rezultati su prikazani u Tabeli 8: (Vezivanje za humane monocite). TIM3 klonovi Tim3_0016, Tim3_0018, Tim3_0020, Tim3_0028 i Tim3_0038 vezuju se za humane monocite različitih donora čak i bolje od referentnih anti-TIM-3 antitela.
Tabela 23: Vezivanje za humane monocite.
Primer 26
Vezivanje anti-TIM-3 antitela za izolovane cino monocite koji eksprimiraju
TIM-3
CD14<+>monociti su izolovani iz antikoagulisane periferne krvi majmuna cinomolgusa (Covance) centrifugiranjem sa gradijentom gustine pomoću Ficoll-Paque (GE Healthcare) (vidite Opšte protokole u uputstvu za upotrebu ili posetite www.miltenyibiotec.com/protocols) i zatim pozitivnom selekcijom putem NHP CD14 mikroperli. Prvo su magnetno obeležene ćelije CD14<+>pomoću CD14 mikroperli. Zatim je ćelijska suspenzija naneta na MACS<®>kolonu koja je postavljena u magnetno polje MACS separatora. Magnetno obeležene CD14<+>ćelije se zadržavaju u koloni. Neobeležene ćelije prolaze, ova ćelijska frakcija je osiromašena u CD14<+>ćelijama. Nakon uklanjanja kolone iz magnetnog polja, magnetno zadržane CD14<+>ćelije se mogu eluirati kao pozitivno odabrana ćelijska frakcija. Posle centrifugiranja na 200 x g tokom 10 minuta na sobnoj temperaturi, monociti su sakupljeni i korišćeni direktno u testu vezivanja ili su resuspendovani u medijumu za smrzavanje (10% DMSO, 90% FCS) pri 1,0E+07 ćelija/ml i uskladišteni u tečnom azotu.
Kao što je prikazano u literaturi, monociti eksprimiraju konstitutivno TIM3 na svojoj površini. 1x10<5>CD14<+>izolovanih cino monocita (50 µl/bunarčiću) su stavljeni u MTP sa 98 bunarčića sa dnom u obliku slova V u svežem medijumu za uzgajanje, i inkubirani su 15 minuta na RT uz Redimune<®>NF Liquid da se blokira nespecifično vezivanje. Dodato je 50 µl/bunarčiću Alexa488 obeleženog anti-TIM3 (10 µg/ml u medijumu za ćelijsku kulturu) i inkubirano tokom 1 sata na 4 °C. Nakon ispiranja i centrifugiranja, MF1 signali obojenih ćelija su analizirani protočnim citometrom BD Biosciences FACSCanto.
Specifično vezivanje je izračunato na sledeći način:
Specifično vezivanje [MFI] = geom. srednja vrednost MFI uzorka - geom. srednja vrednost MFI izotipske kontrole
Rezultati su prikazani u Tabeli 9 (Vezivanje za cino monocite). TIM3 klonovi Tim3_0016, Tim3_0018, Tim3_0026, Tim3_0028 i, Tim3_0030 se vezuju za cino monocite različitih donora majmuna cino.
Tabela 24: Vezivanje za cino monocite.
Primer 27
Vezivanje anti-TIM-3 antitela za NHL i MM ćelijske linije koje eksprimiraju
TIM-3
Kapacitet vezivanja otkrivenih anti-TIM3 antitela i dva klona referentnih TIM3 antitela (1) 4177 i (2) 8213 (Kyowa) je analiziran pomoću FACS. Ukratko, humane ćelije B ćelijskog limfoma koje eksprimiraju TIM3 (prikazane kao Fajferove ćelije) i ćelije multiplog mijeloma (prikazane kao RPMI-8226 ćelije) inkubirane su sa BD humanim Fc blokom 10 min na RT da se blokira nespecifično vezivanje. Zatim je 2x10<5>ćelija (50 µl/bunarčiću) stavljeno u MTP sa 98 bunarčića sa dnom u obliku slova V, i dodato je 50 µl/bunarčiću Alexa488 obeleženog anti-TIM3 (10 µg/ml u BD puferu za bojenje) i inkubirano tokom 1 sata na 4 °C. Nakon ispiranja i centrifugiranja, MFI signali obojenih ćelija su analizirani protočnim citometrom BD Biosciences FACSCanto.
Specifično vezivanje je izračunato na sledeći način:
Specifično vezivanje [MFI] = geom. srednja vrednost MFI uzorka - geom. srednja vrednost MFI izotipske kontrole
Rezultati su prikazani na SL. 2A i 2B (vezivanje za RPMI-8226 i Fajferove ćelije). Primer 10: Citotoksična aktivnost anti-TIM-3 antitela na NHL i MM ćelijama koje eksprimiraju TIM-3
TIM3-specifična antitela konjugovana sa pseudomonas egzotoksinom (PE 24) efikasno ubijaju ćelije koje eksprimiraju TIM3. Citotoksična aktivnost otkrivenih anti-TIM3 antitela i jedan komercijalno dostupan anti-TIM3 referentni klon antitela 11E365 (dostupan od proizvođača US Biological) analizirani su Promega CellTiter-Glo luminescentnim testom vijabilnosti ćelija. Ukratko, u 5 x10<3>(50 µl/bunarčiću na ploči sa 98 bunarčića, u tri primerka) rekombinantnih CHO K1 ćelija sa stabilnom ekspresijom humanog TIM-3 ili 2 x10<4>ćelija (50 µl/bunarčiću na ploči sa 98 bunarčića, u tri primerka) ćelija humanog B ćelijskog limfoma koje eksprimiraju TIM3 (na primer, kao Fajferove ćelije) ili ćelija multiplog mijeloma (prikazane kao RPMI-8226 ćelije) dodato je 25 µl/bunarčiću serijskog razblaženja 1:5 ovde objavljenih anti-TIM-3 antitela sa najvišom koncentracijom od 10 µg/ml ili odgovarajućeg medijuma u netretirane ćelije, ili izotipske kontrole u neciljane tretirane ćelije. Tretman se kreće od 10 µg/ml do 1 ng/ml u tri primerka. Sva antitela su korišćena kao mišje verzije Fcγ pune dužine. Za konjugaciju konjugacije pseudomonas egzotoksina 10 µg/ml mišjeg Fcγ fragmenta, specifični Fab konjugovani sa PE 24 su dodati i inkubirani 3 dana na 37 °C. Cikloheksimid kao poznati inhibitor sinteze proteina u eukariotama je korišćen kao pozitivna kontrola. Vijabilnost tretiranih ćelija je merena pomoću Promega CellTiter-Glo luminescentnog testa vijabilnosti ćelija.
Citotoksična aktivnost je izračunata na sledeći način:
Rel. Inhibicija [%] = (1-(E uzorka - E negativne kontrole)/(E pozitivne kontrole - E negativne kontrole))*100
Rezultati su prikazani u Tabeli 25.
Tabela 25: Citotoksična aktivnost anti-TIM3 mAb na TIM-3 eksprimirajućim rekombinantnim, NHL i MM ćelijskim linijama u sendvič formatu.
Svi testirani TIM3 klonovi su vrlo potentni (IC50 u opsegu 0,01-0,2 nM) na rekombinantnim CHO K1 ćelijama koje stabilno eksprimiraju humani TIM-3 i Fajferovim ćelijama koje eksprimiraju visoke i umerene nivoe TIM-3, i još potentnije u svojoj citotoksičnoj aktivnosti nego potentni internalizujući referentni anti-TIM-3 Ab klon 11E365, US Biological. TIM3 klonovi 0016, 0018, 0021, 0022, 0033 i 0038 su takođe potentni na RPMI-8226 ćelijama koje eksprimiraju 5 puta niži nivo TIM-3 u poređenju sa rekombinantnim CHO TIM-3 ćelijama.
Primer 28: Poređenje citotoksične aktivnosti otkrivenih anti-TIM3 antitela u odnosu na dva anti-TIM3 referentna antitela 1.7.E10 i 27-12E12 (kao što je opisano u WO2013/06490).
Citotoksična aktivnost ovde objavljenih anti-TIM3 antitela i dva anti-TIM3 referentna antitela, TIM3 referentna antitela 1.7E10 i and27.12E12, kao što je opisano u WO2013/06490, analizirana je pomoću Promega CellTiter-Glo luminescentnog testa vijabilnosti ćelija, kao što je gore opisano. Sva antitela su korišćena kao humani IgG1format pune dužine, uključujući humani Fcgama deo. U ovom eksperimentu, konjugacija pseudomonas egzotoksina je ostvarena pomoću humanog Fcγ fragmenta specifičnih Fab konjugovanih sa PE 24 (10 µg/ml), koji su dodavani i inkubirani tokom 5 dana na 37 °C.
Rezultati su prikazani u Tabeli 26.
Tabela 26: Poređenje citotoksične aktivnosti anti-TIM3 mAb na TIM-3 eksprimirajućim NHL i MM ćelijskim linijama.
Svi otkriveni TIM3 klonovi su vrlo aktivni (IC50 u opsegu 0,02-0,08 nM) na Fajferovim i RPMI-8226 ćelijama koje eksprimiraju TIM-3, i još i potentnije u svojoj citotoksičnoj aktivnosti nego snažni internalizujući referentni anti-TIM-3 Ab klon 27-12E12. Sva antitela su upoređena sa konjugatima pseudomonas egzotoksina (PE24) koristeći isti pseudomonas egzotoksin pod istim uslovima.
Primer 28
Citotoksična aktivnost Fab-PE24 konstrukata otkrivenih anti-TIM3 antitela na MM, NHL i AML ćelijskim linijama (koje eksprimiraju TIM3, ali ne i PSMA). Citotoksična aktivnost je analizirana pomoću Promega CellTiter-Glo luminescentnog testa vijabilnosti ćelija, kao što je gore opisano. Inkubirana su serijska razblaženja 1:5 Fab fragmenata ovde objavljenih anti-TIM3 antitela direktno konjugovanih sa PE24 sa najvišom koncentracijom od 50 µg/ml ili odgovarajućim medijumom za netretirane ćelije ili nevezujuće anti-PSMA Fab-PE24 kontrole za neciljane tretirane ćelije, inkubirane sa 7,5x10<3>Fajferovih ćelija ili 2x10<3>RPMI-8226 ćelija (50 μl/bunarčiću na ploči sa 98 bunarčića) 4 dana na 37 °C. Tretman se kreće od 50 µg/ml do 8 ng/ml u tri primerka. Za pozitivnu kontrolu je korišćen cikloheksimid.
Rezultati su prikazani u Tabeli 27.
Tabela 27: Citotoksična aktivnost Fab-PE24 konstrukata objavljenih anti-TIM3 antitela na MM, NHL i AML ćelijskim linijama.
Svi testirani Fab-PE24 konstrukti objavljenih anti-TIM3 antitela su vrlo potentni (IC50 u opsegu 1-10 nM) na MM (RPMI-8226) i NHL (Karpas-299) ćelijama koje eksprimiraju umeren nivo TIM-3 i pokazuju značajnu citotoksičnu aktivnost na ćelijskim linijama AML (CMK, TF-1, MOLM-13) koje eksprimiraju vrlo niske nivoe TIM-3.
Primer 29
Citotoksična aktivnost imunokonjugata (konjugati pseudomonas egzotoksina A (Fab-PE24 konstrukti) objavljenog anti-TIM3 na primarnim matičnim ćelijama leukemije/progenitorskim AML ćelijama kod relapsnih/refraktornih pacijenata CD34<+>ćelije iz periferne krvi relapsnih/refraktornih pacijenata dobijene su od AllCells, LLC, Alameda, CA. Nakon potvrđivanja čistoće i vijabilnosti svih uzoraka (opseg čistoće 84-94% i opseg vijabilnosti 95-99%), nivo ekspresije TIM-3 je procenjen putem FACS kao što je opisano u primeru 7 upotrebom anti-TIM-3 mAb 344823 (R&D). (vidi sl. 31). Svi testirani (4/4) uzorci primarnih leukemijskih matičnih/progenitorskih (CD34<+>) ćelija AML relapsnih/refraktornih pacijenata pokazuju homogenu ekspresiju TIM-3 na različitim nivoima.
Za procenu citotoksične aktivnosti Fab-PE24 konstrukata ovde objavljenih anti-TIM3 klonova 0016 i 0022 na primarnim CD34<+>AML ćelijama, 1 x10<4>ćelija (50 µl/bunarčiću na ploči sa 98 bunarčića u tri primerka) inkubirano je sa serijskim razblaženjima 1:5 Fab fragmenata sa najvećom koncentracijom od 50 µg/ml ili odgovarajućim medijumom za netretirane ćelije ili nevezujućom anti-PSMA Fab-PE24 kontrolom za neciljane tretirane ćelije 3 dana na 37 °C. Za pozitivnu kontrolu upotrebljen je cikloheksimid. Citotoksična aktivnost je analizirana pomoću Promega CellTiter-Glo testa vijabilnosti luminescentnih ćelija kao što je opisano gore u primeru 28.
Rezultati su prikazani u Tabeli 28. (Citotoksična aktivnost Fab-PE24 konstrukata ovde objavljenih anti-TIM3 antitela na primarnim CD34<+>AML ćelijama).
Tabela 28: Citotoksična aktivnost Fab-PE24 konstrukata objavljenih anti-TIM3 antitela na primarnim CD34<+>AML ćelijama.
Fab-PE24 konstrukti anti-TIM3 antitela Tim3_0016 i Tim3_0022 su veoma potentni na primarnm uzorcima (2/4) AML (PB0142 i PB0135) (IC50 u rasponu od 30-116 nM) i pokazuju značajnu citotoksičnu aktivnost na svim (4/4) primarnim leukemijskim matični/progenitorskim (CD34<+>) ćelijama AML koje eksprimiraju različite nivoe TIM-3.
Primer 30
Poređenje potentnosti Fab-PE24 konstrukata izabranih anti-TIM3 antitela na NHL i MM ćelijskim linijama
Procena citotoksične aktivnosti sortaze vezane za Fab-PE24 konstrukte odabranih otkrivenih anti-TIM3 antitela analizirana je pomoću Promega CellTiter-Glo testa vijabilnosti luminescentnih ćelija, kao što je gore opisano u primeru 28.
Rezultati su prikazani u Tabeli 29.
Tabela 29: Citotoksična aktivnost Fab-PE24 konstrukta odabranih anti-TIM3 antitela na NHL i MM ćelijama.
RPMI-8226 ćelije
Visoka citotoksična potentnost je demonstrirana sa Fab-PE24 konstruktima svih odabranih otkrivenih anti-TIM3 antitela (IC50 u opsegu od 0,3-5 nM) na NHL (Fajferovim) i MM (RPMI-8226) ćelijama koje eksprimiraju umeren nivo TIM-3.
Najveća citotoksična aktivnost je primećena kod Fab-PE24 konstrukta objavljenih anti-TIM3 antitela Tim3_0016 i Tim3_0038.
Primer 31
Poređenje citotoksične aktivnosti konstrukata Fab-PE24 i ukupnog IgG-amatoksin konjugata istog klona ovde objavljenog TIM-3 antitela na Fajferovim ćelijama
Procena citotoksične aktivnosti konjugovanog Fab-PE24 konstrukta ovde objavljenog anti-TIM3 klona 0016 u odnosu na ukupni IgG istog klona konjugovanog sa amatoksinom (prema procedurama opisanim u WO2012/041504 (konjugovanim pomoću 6’ C-atoma aminokiseline 4 amatoksina, posebno putem atoma kiseonika vezanog za 6’ C-atom aminokiseline amatoksina, i pri čemu je TIM3 antitelo povezano linkerom preko ostatka uree) analizirana je pomoću Promega CellTiter-Glo luminescentnog testa vijabilnosti ćelija kao što je opisano ranije u primeru 12. Rezultati su prikazani u Tabeli 30.
Tabela 30: Citotoksična aktivnost konstrukata Fab-PE24 u odnosu na konjugat ukupni IgG-amatoksin anti-TIM3 klona 0016 na NHL ćelijama
Citotoksična aktivnost anti-TIM-3 klona 0016 konjugovanog sa amanitinom (IC500,8 nM) uporediva je sa citotoksičnom aktivnošću konstrukta Fab-PE24 istog klona (IC500,3 nM) na NHL (Fajferovim) ćelijama koje eksprimiraju umereni nivo TIM-3.
Primer 32
Pacijenti i obrada uzoraka tumora
Sveže ekscizirane lezije solidnog tumora i maligni izlivi su prikupljeni od 34 pacijenta sa nesitnoćelijskim rakom pluća, 7 pacijenata sa rakom jajnika i 1 pacijentom sa karcinomom bubrežnih ćelija (RCC). Lezije solidnih tumora razdvojene su mehanički i digestovane upotrebom akutaze (PAA), kolagenaze IV (Worthington), hijaluronidaze (Sigma) i DNAze tipa IV (Sigma) neposredno nakon ekscizije. Pripremljene su jednoćelijske suspenzije. Ćelijska frakcija malignih izliva je izolovana centrifugiranjem sa gradijentom gustine pomoću Histopaque-1119 (Sigma). Svi uzorci su čuvani u tečnom azotu do dalje upotrebe. Studiju je odobrio lokalni Odbor za etičku reviziju (Ethikkommission Nordwestschweiz).
Primer 33
Karakterizacija uzoraka tumora
Svi uzorci tumora su sveobuhvatno okarakterisani višebojnom protočnom citometrijom. Za protočnu citometrijsku analizu korišćena su sledeća antitela: α-CD4-PE, α-CD8-PE-Cy7, α-CD11b-PerCP-eFluor710, α-CD45-PE-Cy7, α-CD45-PerCP-Cy5.5, α-CD137-FITC, α-BTLA-biotin, α-CTLA-4-PE, α-ICOS-FITC, α-IFN-γ-FITC, α-Lag-3-APC (sve eBioscience), α-CD3-PECF594, α-CD25-BV605, α-CD69-FITC, α-Epcam-FITC, α-granzim B-PE, α-aktivna kaspaza 3-PE, α-PD-1-BV605, Steptavidin-BV711 (sve BD Bioscience), α-CD45RA-BV421, α-CCR7-AlexaFluor647, α-FoxP3-AlexaFluor647, α-Tim-3-BV421, α-Tim-3-BV605 (svi Biolegend). Mrtve ćelije su obojene pomoću kompleta LIVE/DEAD<®>Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit ili kompleta LIVE/DEAD<®>Fixable Blue Dead Cell Stain Kit (Invitrogen). Za intraćelijska bojenja su korišćeni puferi za fiksiranje i permeabilizaciju kompanije eBioscience. Uzorci za protočnu citometrijsku analizu su nabavljeni na BD LSR Fortessa. Humani IL-2, IFN-γ i TNF ELISA setovi su dobijeni od BD Bioscience.
CD8<+>i CD4<+>T ćelije (CD45<+>CD3<+>) su okarakterisane za ekspresiju površinskih markera PD-1, Tim-3, CTFA-4, Fag-3, BTFA, CD25, CD69, CD137, ICOS, CD45RA i CCR7. Tumorske ćelije (CD45<->Epcam<+>) su okarakterisane za ekspresiju FolR1 poređenjem vezivanja FolR1 specifičnog antitela sa njegovom podudarnom izotipskom kontrolom. Samo uzorci koji su bili pozitivni na ekspresiju FolR1 korišćeni su za tretman pomoću FolR1-TCB, a uzorci koji su eksprimirali EpCAM za tretman katumaksomabom.
Primer 34
Ex vivo tretman uzoraka tumora pomoću FolR1-TCB
FolR1 pozitivni tumorski digesti ili maligni izlivi su odmrznuti, isprani i postavljeni u pločice za kulturu ćelija sa ravnim dnom sa 96 bunarčića (BD Falcon) sa gustinom od 3x10<5>ćelija/200 µl/bunarčiću u kompletnom medijumu (DMEM natrijum piruvat (1 mM) MEM neesencijalni AA (1x) L-glutamin (2 mM) penicilin/streptomicin (100 ng/ml) 2-merkaptoetanol (50 nM) ciproksin (1 mg/ml) 10% humani serum). Uzorci su uzgajani u prisustvu ili odsustvu FolR1-TCB ili DP47 TCB u koncentraciji od 2 nM tokom 24 sata. Aktivacija CD8<+>i CD4<+>T ćelija (CD45<+>CD3<+>) nakon tretmana sa FolR1-TCB određena je višebojnom protočnom citometrijom merenjem ekspresije površinskih ćelijskih markera CD25, CD69, CD137, ICOS, PD-1 i Tim-3. Zatim je ekspresija granzima B i IFN-γ određena intraćelijskim bojenjem. Koncentracija IL-2 u supernatantima ćelijske kulture je izmerena ELISA testom (humani IL-2 ELISA set, BD OptEIA) po uputstvu proizvođača.
Primer 35
Ex vivo tretman tumorskih uzoraka katumaksomabom Trifunkcionalni TCB katumaksomab (Removab<®>) dobavljen je od kompanije Fresenius. Eksperimentalni uslovi su bili slični onim navedenim za FolR1-TCB. Ukratko, EpCAM pozitivni tumorski ili maligni izlivi uzgajani su u prisustvu ili odsustvu katumaksomaba u koncentraciji od 10 ng/ml tokom 24 sata. Analiza CD8<+>i CD4<+>pozitivnih T ćelija (CD45<+>CD3<+>) izvedena je kako je gore opisano.
Primer 36
Test ubijanja
Da bi se utvrdilo ubijanje tumorskih ćelija izazvano pomoću FolR1-TCB, 3x10<4>CFS-obeleženih Skov3 ćelija je uzgajano sa uzorcima tumora u prisustvu ili odsustvu FolR1-TCB u koncentraciji od 2 nM tokom 24 sata na pločama za kulturu ćelija sa ravnim dnom sa 96 bunarčića. Odnos E:T (E: efektorske CD45<+>CD3<+>ćelije; T: ciljne FolR1<+>ćelije iz tumora i dodate Skov3 ćelije) podešen je na 1:1 u svakom bunarčiću i izračunat je broj ćelija dodatih uzoraka tumora za svaki uzorak prema prethodnoj karakterizaciji protočnom citometrijom. Smrt Skov3 ćelija je određena protočnom citometrijom merenjem aktivirane kaspaze 3 i živog/mrtvog markera Live/Dead-near-IR. Test je izveden u tri primerka. Ubijanje posredovano FolR1-TCB je izračunato prema sledećoj jednačini: % specifičnog ubijanja = 100 - [(% živih Skov3 ćelija u uzorku tretiranom sa FolR1-TCB / % živih Skov3 ćelija u netretiranom uzorku) x 100].
Radi poređenja sposobnosti ubijanja T ćelija izazvanog sa FolR1-TCB među uzorcima tumora i radi isključivanja dodatnih faktora koji suzbijaju funkcionalnost T ćelija, poput ekspresije PD-L1 na ćelijama tumora, egzogeno smo dodali FolR1<+>Skov3 ćelije označene sa CFSE u tumorske digeste i podesili odnos E:T na 1:1, u osnovi kako je gore opisano. Zatim smo izmerili ubijanje indukovano sa FolR1-TCB, Skov3 ćelije obeleženih sa CFSE, što nam je omogućilo da u analizu uključimo FolR1<->uzorke tumora. Pošto se neki tumori iz početne kohorte nisu mogli koristiti za karakterizaciju ubijanja tumorskih ćelija posredstvom TCB zbog vrlo male količine efektorskih ćelija, analizirana je zasebna kohorta od 12 tumorskih digesta i 5 malignih izliva iz 15 pacijenata sa nesitnoćelijskim rakom pluća (NSCLC) i dva pacijenta sa epitelnim karcinomom jajnika (EOC). Svi uzorci su okarakterisani prema sadržaju CD3<+>efektorskih i FolR1<+>ciljnih ćelija (Sl. 39). Tumorsko ćelijsko ubijanje CD3<+>T ćelija ovih pacijenata je upoređeno sa T ćelijama zdravih donora izvedenih iz PBMC. Uočena je značajna heterogenost u ubijanju tumorskih ćelija kod različitih pacijenata (26 ±11,8%) nakon 24 sata (Sl. 12O). Treba napomenuti da su CD3<+>T ćelije zdravih donora izazvale značajno bolje ubijanje od TIF (42,8 ± 9,7%, p = 0,013). Izlaganje TCB kontroli bez vezivanja za tumorski antigen (DP47-TCB) nije izazvalo ubijanje tumorskih ćelija.
Primer 37
Poliklonska stimulacija anti-CD3/CD28 antitelima
Ploča sa ravnim dnom sa 96 bunarčića prethodno je bila premazana sa 0,5 ug/ml anti-CD3ε (klon OKT3, Biolegend) tokom 2 sata na 37° C. Nakon toga, rastvor antitela je uklonjen i ploča je temeljito oprana. Smrznute tumorske suspenzije su odmrznute, isprane i kultivisane na 3x10<5>ćelija/200 µl/bunarčiću u kompletnom medijumu sa 2 µg/ml anti-CD28 antitela (klon 28.2, eBioscience) tokom 24 sata. Nakon 24 sata inkubacije ćelije su sakupljene, isprane i analizirane protočnom citometrijom na ekspresiju aktivacionih markera, npr. CD25 i efektorske funkcije T ćelija, npr. granzim B i IFN-γ na CD8<+>T ćelijama. Supernatanti su prikupljeni za IL-2, IFN-γ i TNF-α ELISA, što je izvedeno prema uputstvu proizvođača.
Primer 38
Obnavljanje funkcije T ćelija blokadom PD-1
Tumorski digesti su stimulisani agonističkim anti-CD3 i anti-CD28 antitelima, kako je gore opisano, u prisustvu ili odsustvu 10 µg/ml anti-PD-1 antitela (MDX5C4) po bunarčiću i inkubirani 24 sata. Nakon 24 sata, ćelije su sakupljene, isprane i analizirane protočnom citometrijom. Supernatanti su prikupljeni za IF-2, IFN-γ i TNF-α ELISA, što je izvedeno prema uputstvu proizvođača.
Primer 39
Aktivacija T ćelija u digestima tumora i malignim izlivima pomoću FolR1 TCB T ćelijska bispecifična antitela koja aktiviraju CD3 i folatni receptor 1 (FolR1-TCB na bazi Mov19 i kontrolno antitelo DP47-TCB osigurala je kompanija Roche Glycart. Anti-PD-1 antitelo 5C4 je opisano u US Pat. br.8.008.449. Korišćeno je anti-Tim3 antitelo F38-2EL. Za protočnu citometrijsku karakterizaciju ekspresije FolR1, korišćeno je antitelo anti-FolR1-APC (aa25-233) iz LifeSpanBiosciences i njegova odgovarajuća kontrola izotipa (Biolegend). Tumorske lezije 15 pacijenata sa FolR1<+>tumorima okarakterisane su na aktivaciju T ćelija indukovanu sa FolR1 TCB. Uzorci su se sastojali od 9 suspenzija pojedinačnih ćelija i 6 malignih izliva izvedenih od pacijenata sa NSCLC (n=7), karcinomom jajnika (n=7) i rakom bubrežnih ćelija (n=1). Količina CD3<+>T ćelija i FolR1<+>tumorskih ćelija je veoma varirala kod različitih pacijenata (CD3<+>: srednja vrednost 33,9% ± standardna devijacija od 16,6%, FolR1<+>: 17,1% ± 16,8%). Karakterizacija ekspresije inhibitornih receptora PD-1, Tim-3, CTLA-4, Lagi BTLA na T ćelijama otkrila je veliku heterogenost među različitim pacijentima (Sl.11A-B). Dok su CD8<+>T ćelije koje infiltriraju tumor pokazale visoke nivoe PD-1, Tim-3 i CTLA-4 (31,6% ± 25%, odnosno 22,2% ± 20,8%, odnosno 18,7% ± 14,4%), Lag-3 i BTLA su izraženi samo na manjini ćelija kod svih pacijenata ove kohorte (3,5% ± 4,9% odnosno 2,3% ± 1,7%). Inhibitorni receptori na CD4<+>T ćelijama su distribuirani na sličan način, uz malo istaknutiju ekspresiju CTLA-4.
Da bi se utvrdila aktivacija T ćelija indukovana sa FolR1-TCB, uzorci tumora su uzgajani u prisustvu ili odsustvu FolR1-TCB ili TCB DP-47 kontrole. Zatim su T ćelije okarakterisane višebojnom protočnom citometrijom na ekspresiju aktivacionih markera i efektorskih funkcija T ćelija, kao što je gore opisano. Sl.12A-O pokazuje veliku heterogenost u aktivaciji FolR1-TCB indukovanih T ćelija među različitim pacijentima. Konkretno, dok je velika većina pacijenata eksprimirala CD69 već na početku, primećeno je povećanje CD25, CD137 i ICOS, koje je variralo od 9 - 80%, 2,5 - 50%, odnosno 3,5 - 71%. Uočeno je sticanje efektorskih funkcija poput sekrecije IFN-γ, degranulacije CD107 i ekspresije granzima B, u rasponu od 3,7 - 59%, vrednost promene od 1 - 7 odnosno 1,3 - 64 (Sl. 12A-I). Inhibitorni receptori PD-1 i Tim-3 su dodatno povećani kao aktivacioni marker nakon tretmana sa FolR1-TCB, bez obzira na njihovu početnu ekspresiju. Izloženost TCB DP-47-u nije izazvala nikakvu aktivaciju T ćelija. Povećanje CD25 i ICOS izazvano stimulacijom FolR1-TCB, bilo je značajno veće u perifernim CD8<+>T ćelijama zdravih donora nego u CD8<+>ćelijama izvedenim iz tumora (p = 0,002, odnosno p <0,001; Sl. 12J, Sl. 12L, Sl. 12M). Sekrecija efektorskih citokina T ćelija IFN-γ, IL-2 i TNF nakon stimulacije pomoću FolR1-TCB uglavnom je smanjena među TIL u većini tumora u poređenju sa PBMC zdravih donora (p = 0,0047, p <0,001, odnosno p = 0,006; Sl.12N). Sekrecija perforina indukovana pomoću FolR1-TCB bila je vrlo varijabilna među TIL i ozbiljno oštećena u jednom podskupu pacijenata (Sl.12N).
Slično tome, uprkos smanjenju granzima B, FolR1-TCB je indukovao aktivaciju i akviziciju efektorskih funkcija CD4<+>T ćelija (Sl. 25A-I). Da bi se procenilo da li obilna količina intratumorskih T ćelija ili ekspresija FolR1 utiče na aktivaciju T ćelija nakon izlaganja TCB-u, povećanje aktivacionih markera je stavljeno u korelaciju sa odnosom E:T (E: efektorske CD45<+>CD3<+>T ćelije; T: FolR1<+>ćelije), i sa procentom i nivoom ekspresije tumorskog antigena FolR1<+>ćelija (Sl. 13A-C). Ovo poslednje je određeno srednjim intenzitetom fluorescencije FolR1 na ćelijama tumora (CD45-EpCAM<+>) primenom protočne citometrije (Sl.13C). Međutim, nijedan od ovih parametara nije uticao na aktivaciju T ćelija, tj. čak ni male količine FolR1<+>ćelija, visoki odnos E:T ili loša infiltracija T ćelija nisu bili dovoljni za efikasno povećanje aktivacije i funkcionalnih markera. Pored toga, prisustvo potencijalno imunosupresivnih ćelijskih populacija poput regulatornih T ćelija ili nezrelih mijeloidnih ćelija nije uticalo na aktivaciju ili funkciju T ćelija.
Primer 40
Aktivacija T ćelija indukovana putem FolR1-TCB je u obrnutoj korelaciji sa ekspresijom PD-1 i Tim-3
Visoka ekspresija inhibitornih receptora je opisana kao glavno svojstvo iscrpljenih T ćelija. Prema tome, disfunkcionalno stanje T ćelija koje infiltriraju tumor može uticati na efikasnost FolR1 TCB i može biti odgovorno, barem delimično, za heterogenu aktivaciju T ćelija nakon izlaganja TCB-u. U tu svrhu, koekspresija inhibitornih receptora, kako je utvrđeno na početku, stavljena je u korelaciju sa FolR1 TCB indukovanom ushodnom regulacijom aktivacionih markera i efektorskih funkcija T ćelija. Ekspresija PD-1 i Tim-3 na CD8<+>T ćelijama je tako bila u negativnoj korelaciji sa aktivacijom T ćelija utvrđenoj ekspresijom CD25, CD137 i ICOS. CD8<+>T ćelije sa visokom ekspresijom PD-1 ili Tim-3 su pokazale marginalni efekat na tretman putem FolR1-TCB, dok su T ćelije sa niskom ekspresijom ovih inhibitornih receptora mogle biti snažno aktivirane nakon tretmana putem FolR1-TCB (Sl.14A-I). Merenje sekrecije IL-2 indukovane putem FolR1-TCB, normalizovano na sadržaj T ćelija u uzorcima, otkrilo je istu zavisnost od ekspresije PD-1 i Tim-3 (Sl. 15A-C), dok je povećanje granzima B indukovano putem FolR1-TCB manje zavisilo od prethodne ekspresije ovih inhibitornih receptora (Sl.14J-L). Zanimljivo je da osnovna ekspresija CTLA-4, Lag-3 i BTLA na CD8<+>T ćelijama nije u korelaciji sa FolR1-TCB indukovanom aktivacijom T ćelija (Sl.
26A-C). Ekspresija inhibitornih receptora na CD4<+>T ćelijama je bila mnogo manje predvidljiva za aktivaciju CD4<+>T ćelija indukovanu putem FolR1-TCB u poređenju sa ekspresijom istih receptora na CD8<+>T ćelijama.
Primer 41
Ubijanje tumorskih ćelija izazvanih putem FolR1-TCB je u obrnutoj korelaciji sa ekspresijom PD-1 i Tim-3
Da bi se istražilo ubijanje tumorskih ćelija indukovano putem FolR1-TCB, uz prilagođeni odnos E:T od 1:1, Skov3 ćelije obeležene pomoću CFSE su dodate egzogeno u tumorske digeste koji sadrže prethodno određenu količinu CD3<+>T ćelija uz pomoć višebojne protočne citometrije. Ubijanje Skov3 ćelija indukovano putem FolR1-TCBje određeno merenjem aktivirane kaspaze 3 i markera live/dead. U skladu sa FolR1-TCB-indukovanom aktivacijom T ćelija izmerenom na osnovu povećanja CD25, specifično ubijanje nakon izlaganja FolR1-TCB-u je bilo u negativnoj korelaciji sa pojedinačnom ili koekspresijom PD-1 i Tim-3 na CD8<+>T ćelijama. Nadalje, na ubijanje indukovano putem FolR1-TCB takođe je uticala osnovna ekspresija CTLA-4 i koekspresija PD-1 i CTLA-4. Međutim, uticaj ekspresije CTLA-4 na ubijanje tumorskih ćelija indukovano putem FolR1-TCB bio je manje izražen u odnosu na uticaj ekspresije PD-1 i Tim-3.
Primer 42
Tretman svežih tumorskih lezija katumaksomabom - Aktivacija T ćelija koje infiltriraju tumor pomoću katumaksomaba i korelacija sa ekspresijom inhibitornih receptora
Da bi se utvrdilo u kojoj meri katumaksomab indukuje aktivaciju T ćelija i da bi se potvrdili gore opisani nalazi, uz pomoć drugog, nezavisnog bispecifičnog molekula T ćelija, 4 tumorska digesta od pacijenata sa NSCLC su izložena katumaksomabu, trifunkcionalnom bispecifičnom antitelu koje prepoznaje CD3 na T ćelijama i EpCAM na ćelijama tumora. Zatim su T ćelije okarakterisane protočnom citometrijom na ekspresiju aktivacionih markera i efektorskih funkcija T ćelija (Sl.17A-D). Potvrđujući gore navedene podatke za FolR1-TCB, primetili smo zapanjujuću heterogenost u aktivaciji T ćelija izazvanoj katumaksomabom. U skladu s tim, osnovna ekspresija inhibitornih receptora se razlikovala kod različitih pacijenata (Sl. 17E-H).
Analiza aktivacione i efektorske funkcije T ćelija nakon tretmana katumaksomabom otkrila je dve grupa pacijenata na osnovu ekspresije PD-1 i/ili Tim-3 na CD8<+>T ćelijama, što potvrđuje naša otkrića sa FolR1-TCB-om (Sl.18A-R). PD-1<nizak>, Tim-3<nizak>i čak i izraženije, PD-1<nizak>/Tim-3<nizak>ekspresione ćelije, nisu bile aktivirane katumaksomabom, dok su PD-1<visok>, Tim-3<visok>i PD-1<visok>/Tim-3<visok>T ćelije u velikoj meri povećale CD25, CD69, CD137, ICOS, granzim B i IFN-γ.
Primer 43
Poliklonska stimulacija T ćelija koje infiltriraju tumor pomoću CD3/CD28 -Imuno-fenotipizacija podskupova T ćelija koje infiltriraju tumor u uzorcima nesitnoćelijskog raka pluća
Istraživali smo ekspresiju koinhibitornih T ćelijskih receptora i markera diferencijacije na podskupovima CD3<+>CD8<+>i CD3<+>CD4<+>T ćelija koje infiltriraju tumor od 34 pacijenta, pomoću višebojne protočne citometrije. Većina tumora je pokazala visoku ekspresiju inhibitornog receptora PD-1 (Sl. 19A-B), glavnog regulatora iscrpljenosti T ćelija. Treba napomenuti da je ekspresija drugih inhibitora kontrolnih tačaka, kao što su Tim-3, CTLA-4, LAG-3 ili BTLA, pokazala značajne varijacije između T ćelija dobijenih iz različitih tumora (Sl. 19A-B).
Primer 44
Kumulativna ekspresija inhibitornih receptora definiše disfunkciju T ćelija U ovom primeru, poliklonska stimulacija je korišćena u neoptimalnoj dozi za procenu uticaja inhibitornih receptora na funkciju T ćelija. Učinak stimulacije agonističkim anti-CD3 i anti-CD28 antitelima na aktivaciju T ćelija, što je prikazano ekspresijom CD25, i na efektorsku funkciju T ćelija analiziranu proizvodnjom IFN-γ, TNF-α i IL-2, kao i ekspresijom granzima B, značajno je varirao kod različitih pacijenata, kako je utvrđeno protočnom citometrijom (Slika 20A-B) i testom ELISA (Sl.20C-E). Treba napomenuti da smo primetili različite nivoe funkcije T ćelija, koji su varirali od populacija T ćelija koje pokazuju uglavnom očuvanu funkciju T ćelija (tj. održivu ekspresiju CD25 i granzima B, kao i proizvodnju IL-2, IFN-γ i TNF-α) do onih sa prekinutom funkcijom T ćelija (gubitak ekspresije CD25 i granzima B i stvaranja citokina).
Da bismo analizirali uticaj višestrukih inhibitornih receptora na funkcionalnost T ćelija, definisali smo rezultat inhibitornog receptora (iR) kao marker za kumulativnu ekspresiju inhibitornih receptora na T ćelijama. U tu svrhu, analiziran je procenat ekspresije PD-1, Tim-3, CTLA-4, Lag-3 i BTLA u svim uzorcima NSCLC, i definisan je i izračunat rezultat zasnovan na medijani i interkvartilnom rasponu svakog eksprimiranog receptora za svaki uzorak (npr. Sl.
21F). CD8<+>T ćelije koje infiltriraju tumor i koje pokazuju visok iR rezultat, što ukazuje na ekspresiju višestrukih inhibitornih receptora, pokazale su marginalni učinak na poliklonsku stimulaciju, što je u korelaciji sa njihovim izrazito disfunkcionalnim stanjem, dok su T ćelije sa niskim iR rezultatom mogle biti snažno aktivirane poliklonskom stimulacijom (Sl.21A-E). Povećanje efektorskih funkcija T ćelija, na šta je ukazivala proizvodnja IL-2, IFN-γ i TNF-α, nije samo bilo u korelaciji sa kumulativnom ekspresijom inhibitornih receptora, nego na sličan način i sa ekspresijom PD-1 i Tim-3, kao i sa koekspresijom oba ova receptora (Sl.22A-I), što ukazuje da PD-1 i Tim-3 na značajan način doprinose disfunkciji T ćelija.
Primer 45
Ekspresija inhibitornih receptora
Pojedinačna i kumulativna ekspresija inhibitornih receptora se povećava sa progresijom tumora. Ekspresija inhibitornih receptora je bila u korelaciji sa stadijumom i progresijom tumora. Broj PD-1, Tim-3 i LAG-3 pozitivnih ćelija je bio jasno povećan u uznapredovalim stadijumima tumora (Sl.21G-K). Nije uočena jasna korelacija za ekspresiju CTLA-4, što može ukazivati na to da ovaj receptor deluje putem drugog inhibitornog mehanizma. BTLA je po pravilu eksprimiran na niskom nivou i samo je mali porast pronađen u uznapredovalim stadijumima tumora (Sl.21K). Značajan porast kumulativne ekspresije inhibitornih receptora, što se odražava na iR rezultat, primećen je kod pacijenata sa nodalno pozitivnim kancerima i uznapredovalim stadijumima tumora, dok veličina primarnog tumora nije u značajnoj korelaciji sa iR rezultatom (Sl. 21L-M). Ovi podaci ukazuju na postepeno i kontinuirano povećanje inhibitornih receptora, tokom progresije tumora, koji najverovatnije učestvuju u iscrpljivanju T ćelija u NSCLC.
Inhibitorni receptori se postepeno eksprimiraju na T ćelijama koje infiltriraju tumor. Da bi se istražila uloga simultane ekspresije različitih inhibitornih receptora na pojedinačnim T ćelijama, analizirana je istovremena ekspresija ovih receptora u CD8<+>T ćelijama (Sl.32, 33) u odnosu na ekspresiju bilo kojeg od pet analiziranih receptora. Ekspresija je prikazana kao toplotna karta koja prikazuje procenat ekspresije za pojedine pacijente (Sl.32) ili kao radarska slika, koja prikazuje ekspresiju kao srednju vrednost i standardnu devijaciju za četiri odgovarajuća receptora na CD8<+>T ćelijama, unapred odabranih za petu, naznačenu imunološku kontrolnu tačku (Sl.33). CD8<+>PD-1<+>T ćelije u proseku su eksprimirale najniži procenat ostalih inhibitornih receptora, dok su CD8<+>BTLA<+>T ćelije eksprimirale sva četiri druga inhibitorna receptora na visokim nivoima, što ukazuje da BTLA označava posebno iscrpljeni podskup T ćelija (Sl.32, 33). Zabeležen je porast broja koeksprimiranih inhibitornih receptora CD8<+>Tim-3<+>T ćelija preko CD8<+>CTLA-4<+>T ćelija do CD8<+>LAG-3<+>T ćelija (Sl. 32, 33). Ovi nalazi ukazuju na to da se inhibitorni receptori postepeno javljaju sa PD-1 kao široko izraženim ranim markerom, dok se BTLA prilično kasno povećava tokom iscrpljivanja T ćelija.
Primer 46
Blokada PD-1 može delimično obnoviti funkciju T ćelija Spasavanje funkcije T ćelija antitelima koja blokiraju PD-1 zavisi od nivoa ekspresije PD-1. Pošto smo pronašli jasnu korelaciju između ekspresije inhibitornih receptora, posebno PD-1 i Tim-3, i aktivacije T ćelija nakon poliklonske stimulacije, blokada puteva PD-1 ili PD-1/Tim-3 može obnoviti funkciju T ćelija. Međutim, dodavanje blokirajućeg antitela na PD-1 (5C4) ili kombinovana blokada PD-1 i Tim-3 nakon stimulacije agonističkim anti-CD3 i anti-CD28 antitelima može obnoviti efektorsku funkciju T ćelija poput proizvodnje i sekrecije IL -2, IFN-γ i TNF-α samo kod nekih pacijenata, dok je kod drugih uočen samo marginalni efekat (Sl. 23A-D). Kao što je uočeno na modelu hronične mišje infekcije LCMV (Blackburn et al., PNAS 105 (39): 15016 (2008)), identifikovali smo PD-1<hi>i PD-1<int>podskup za CD8<+>T ćelije koje infiltriraju tumor kod pacijenata sa NSCLC. Ukratko, podskupovi PD-1<hi>, PD-1<int>i PD-1<neg>se mogu identifikovati na osnovu izmerenog intenziteta fluorescencije. Ćelije 33 pacijenta analizirane su na ekspresiju PD-1 radi definisanja jednoobraznih parametara za ponovljivo prepoznavanje tri podskupa. Analiza je obuhvatila celi spektar nivoa ekspresije PD-1 i obuhvatila uzorke tumora sa jasno razlučenim PD-1<neg>ili PD-1<hi>populacijama. To je omogućilo utvrđivanje razdvajanja (engl. gates) za ovu analizu, koja je zatim primenjena na sve uzorke.
Čini se da su samo podskupovi T ćelija koje eksprimiraju PD-1<int>spaseni aktivacijom nakon blokade putem PD-1 ili kombinacije PD-1/Tim-3, dok nije zabeležen efekat na aktivaciju T ćelija nakon blokade u PD-1<hi>ćelijama (Sl.24). Moguće je da ove poslednje imaju iscrpljeniji fenotip koji je otporan na blokadu samo putem PD-1.
Ovaj nalaz je potvrđen u T ćelijama koje su aktivirane pomoću FolR1 TCB. T ćelije su stimulisane pomoću FolR1 kako je gore opisano. Blokada PD-1 dodatno je pojačala T ćelijsku aktivaciju T ćelija indukovanu putem FolR1-TCB kod jednog podskupa pacijenata.
Merenje sekrecije IFN-γ, TNF i IL-2 indukovane putem FolR1-TCB normalizovano na sadržaj T ćelija u uzorcima, otkrilo je da u populacijama ćelija pacijenta sa značajnom količinom ćelija koje eksprimiraju PD-1<hi>(približno > 15%) ćelije nisu u stanju da luče ove citokine. Suprotno tome, sekrecija citokina se mogla indukovati u većini populacija ćelija pacijenta sa manjom količinom ćelija koje eksprimiraju PD-1<hi>(približno < 15%) (Sl.27A-C). U ovoj poslednjoj grupi, dodavanjem antitela koja blokiraju PD-1 ili kombinovanom blokadom PD-1 i Tim-3 nakon stimulacije putem FolR1-TCB, povećana je proizvodnja IL-2, IFN-γ i TNF-α (Sl.28A- F). Stoga je moguće da podskup koji eksprimira PD-1<hi>pokazuje iscrpljeniji fenotip koji se čini otporan na blokadu samo PD-1.
Dakle, efektorske funkcije T ćelija poput proizvodnje IL-2, IFN-γ i TNF-α mogu se obnoviti u TIL-ovima nekih pacijenata sa NSCLC, dok se kod drugih pacijenata može postići samo marginalni oporavak funkcija T ćelija. Porast proizvodnje citokina nakon izlaganja stimulaciji anti-CD3/CD28 u kombinaciji sa antitelom koje blokira PD-1 upoređen je sa procentom PD-1<hi>CD8<+>T ćelija iz PD-1 pozitivne populacije po pacijentu. Porast ekspresije citokina nakon blokade PD-1 je u obrnutoj korelaciji sa procentom PD-1<hi>T ćelija, što ukazuje da pacijenti kod kojih postoji ekspresija većeg broja PD-1<hi>T ćelija slabo reaguju na blokadu samo PD-1 (Sl. 24A-C). Pošto je disfunkcija T ćelija u korelaciji sa ekspresijom višestrukih inhibitornih receptora (tj. pacijenti sa visokim iR rezultatom), a odgovor na terapiju usmerenu na PD-1 je u korelaciji sa nivoom ekspresije PD-1 na CD8<+>T ćelijama, dodatno smo analizirali ekspresiju Tim-3, CTLA-4, LAG-3 i BTLA u PD-1<hi>i PD-1<int>CD8<+>T ćelijama. Značajno je to što su PD-1<hi>T ćelije imale značajno više nivoe ekspresije dodatnih receptora u poređenju sa PD-1<int>podskupovima (sl.34). Dakle, moguće je da PD-1<hi>i PD-1<int>identifikuju dve različite populacije T ćelija, gde PD-1<hi>T ćelije mogu pokazivati iscrpljeniji fenotip, koji se ne može oporaviti blokadom samo PD-1.
Podaci koji su ovde predstavljeni prvi put pružaju sveobuhvatnu fenotipsku i funkcionalnu analizu CD8<+>T ćelija koje infiltriraju tumore kod pacijenata sa NSCLC. Podaci pokazuju da ove ćelije uglavnom poseduju efektorski memorijski fenotip (CCR7-CD45RAlow) i pokazuju veliku heterogenost u ekspresiji inhibitornih receptora kao što su PD-1, Tim-3, CTLA-4, LAG-3 i BTLA. Ipak, uočen je jasan porast broja receptora eksprimiranih na limfocitima koji infiltriraju tumor (TIL) kod tumora u kasnoj fazi, što odražava progresiju disfunkcije T ćelija tokom razvoja tumora. Ovde predstavljeni podaci pokazuju da su efektorske funkcije TIL bile oštećene kod velike većine pacijenata i da je to oštećenje bilo u korelaciji sa ekspresijom inhibitornih receptora. Za obnavljanje funkcije T ćelija u klinički važnom okruženju, kombinovali smo poliklonsku stimulaciju T ćelija sa inhibicijom PD-1 posredstvom antitela. Učinak blokade PD-1 na funkcionalnost T ćelija varirao je za TIL različitih pacijenata, ali se mogao predvideti procenom procenta CD8<+>T ćelija koje eksprimiraju PD-1 na visokim nivoima. Ovde smo mogli pokazati da funkcionalnost TIL može biti u korelaciji sa brojem i nivoom ekspresije inhibitornih receptora, što na tu funkcionalnost uveliko utiče. Treba napomenuti da su čak i T ćelije koje eksprimiraju nizak nivo inhibitornih receptora pokazale određeni stepen poremećene funkcionalnosti, jer je sekrecija IL-2 bila poremećena kod velike većine pacijenata.
U celini, aktivacija i efektorska funkcija CD8<+>T ćelija su u obrnutoj korelaciji sa kumulativnom ekspresijom inhibitornih receptora, što ukazuje na direktan doprinos različitih inhibitornih puteva disfunkciji T ćelija u NSCLC.
Naša analiza pet inhibitornih receptora na CD8<+>T ćelijama koje infiltriraju tumor pokazala je jasan porast pojedinačne i kumulativne ekspresije ovih inhibitornih receptora u tumorskim tkivima kod pacijenata sa NSCLC koji imaju tumorski pozitivne limfne čvorove i uznapredovali stadijum tumora. Ekspresija CTLA-4 se razlikovala od ostala četiri receptora sa najvećim procentom pozitivnih ćelija u ranim fazama, što može ukazivati na različitu ulogu CTLA-4 u regulaciji imuniteta T ćelija (Topalian et al., Safety, activity, and immune correlates of anti-PD-1 antibody in cancer. N. Engl. J. Med. 366, 2443 (Jun 28, 2012)). Analiza koekspresije dodatnih inhibitornih receptora na pojedinačnim ćelijama, u odnosu na ekspresiju jednog datog receptora, pokazala je postupnu ekspresiju, sa ranim i kasnim povećanjem PD-1, odnosno BTLA. Ovo može odražavati dinamični proces iscrpljivanja T ćelija.
Ovde predstavljena oktrića ističu kliničku važnost inhibitorne ekspresije receptora tokom progresije tumora NSCLC, povezane sa progresivnim opadanjem imunološke kontrole rasta tumora. Ovde dokumentujemo dve populacije CD8<+>T ćelija koje infiltriraju tumor i koje imaju različite nivoe ekspresije PD-1 (podskupovi PD-1<hi>i PD-1<int>). Pojava PD-1<hi>T ćelija nije u korelaciji sa procentom ekspresije PD-1. Primetili smo zanimljivu činjenicu da je učinak blokade PD-1 bio u korelaciji sa nivoom ekspresije PD-1, sa minimalnim efektima na sposobnost odgovora TIL sa visokim udelom potpopulacija PD-1hi. Ovi nalazi su u skladu sa eksperimentima na mišjem, hroničnom modelu infekcije LCMV, gde se podskup PD-1<int>DbGP33-specifičnih CD8<+>T ćelija mogao oporaviti nakon PD-1 blokade. Suprotno tome, podskup PD-1<hi>je delovao „iscrpljeniji“, tj. pokazivao je znakove funkcionalne iscrpljenosti i slabo je reagovao na blokadu PD-1. Prema tome, nivo ekspresije PD-1 može predstavljati novi marker za definisanje različitih podskupova T ćelija kod humanih kancera, i može poslužiti kao elemenat za predviđanje odgovora na lečenje antitelima koja blokiraju PD-1.
Primer 47
Aktivacija T ćelija zdravih donora i pacijenata sa kancerom pomoću FolR1-TCB Da bi se procenio efekat FolR1-TCB na aktivaciju T ćelija, mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) zdravih donora su uzgajane zajedno sa FolR1<+>ćelijskom linijom raka jajnika Skov3 (Sl.40A). Nakon izlaganja sve većim koncentracijama FolR1-TCB u rasponu od 0,6 pM do 2 nM tokom 24 sata, primetili smo snažnu aktivaciju CD8<+>T ćelija sa povećanjem CD25, CD137 i ICOS. Uz to, T ćelije su lučile IL-2, IFN-γ i TNF. Izloženost DP47-TCB-u, TCB-om usmerenim protiv irelevantnog antigena, nije izazvala nikakvu aktivaciju T ćelija (Sl.
40B i C).
Primer 48
Ekspresija inhibitornih receptora je vrlo raznolika kod CD8<+>T ćelija koje
infiltriraju tumor
Kako T ćelije koje se nalaze u tumoru često pokazuju izrazito disfunkcionalni fenotip, uočena heterogenost u aktivaciji T ćelija kod različitih pacijenata nakon stimulacije putem FolR1-TCB može biti posledica poremećene funkcionalnosti TIL. Glavno svojstvo disfunkcionalnih T ćelija i kod hroničnih virusnih infekcija i kod tumora je prekomerna ekspresija inhibitornih receptora. U tu svrhu, utvrdili smo ekspresiju imunoloških kontrolnih tačaka PD-1, Tim-3, CTLA-4, Lag-3 i BTLA na CD8<+>T ćelijama koje infiltriraju tumor u svim uzorcima tumora. Primetili smo veliku raznolikost u učestalosti i kombinovanoj ekspresiji ovih receptora kod različitih tumora; utvrđeno je da je PD-1 najistaknutiji inhibitorni receptor sa najvećim procentom ekspresije (60,2 ± 30%), a slede Tim-3 (29,5 ± 24,4%), CTLA-4 (24,6 ± 17,6%), Lag-3 (7,0 ± 5,9%) i BTLA (3,9 ± 2,6%) (Sl.35F). Kao što je prethodno opisano na mišjem modelu hronične virusne infekcije (Blackburn et al., Proc Natl Acad Sci USA 2008; 105 (39): 15016-21), i kao što je ovde prikazano, kod ljudskih tumora, populacija PD-1<+>može se podeliti na populacije ekspresije PD-1<hi>i PD-1<int>(Sl. 35 A). Analiza dodatnih inhibitornih receptora eksprimiranih na ovim određenim podskupovima je pokazala značajno veću ekspresiju svih ostalih inhibitornih receptora, uključujući Tim-3, CTLA-4, Lag-3 i BTLA, u PD-1<hi>potpopulaciji u odnosu na ekspresiju ovih receptora u podskupovima PD-1<int>i PD-1<neg>(Sl. 36A-D). Stoga smo koristili procenat PD-1<hi->T ćelija u CD8<+>podskupu kao surogatni marker za kumulativnu ekspresiju inhibitornih receptora. Uzorci tumora su podeljeni prema učestalosti PD-1<hi>ćelija u dve grupe sa visokom (tumori sa obilnim PD-1<hi>) i niskom učestalošću PD-1<hi>ekspresionih T ćelija (tumori sa oskudnim PD-1<hi>). Granična vrednost od 30% ekspresije PD-1<hi>je odabrana za razdvajanje dveju grupa. Procenat PD-1<hi>ćelija kretao se od 39,1-60,5% u grupi sa obilnim PD-1<hi>(49,5 ±7,9%) i od 2,65-19,5% u grupi sa oskudnim PD-1<hi>(8,4 ±5,7%; Sl.36E). Granična vrednost je potvrđena u drugoj grupi od 14 pacijenata sa NSCLC i 2 pacijenta sa rakom jajnika sa sličnom raspodelom po učestalosti PD-1<hi>ćelija, gde smo uočili slične rezultate nakon poliklonske stimulacije anti-CD3/anti-CD28 antitelima (Sl. 39).
Primer 49
Aktivacija T ćelija indukovana putem FolR1-TCB u velikoj meri zavisi od nivoa ekspresije PD-1 na CD8<+>T ćelijama
Analizirali smo da li se ekspresija inhibitornih receptora može povezati sa smanjenom funkcionalnošću T ćelija nakon tretmana putem FolR1-TCB. U skladu sa rezultatima opisanim u Primeru 41, aktivacija T ćelija indukovana putem FolR1-TCB, kao što je prikazano ekspresijom CD25, CD137 i ICOS (p=0,028; odnosno p <0,001, odnosno p=0,008), i efektorska funkcija T ćelija, na koju ukazuju IFN-γ, IL-2, TNF, kao i sekrecija perforina, bile su značajno oštećene kod tumora sa obilnim PD-1<hi>u poređenju sa tumorima koji su imali oskudan PD-1<hi>(p=0,019; p=0,007; p=0,028, odnosno p=0,029; Sl. 37A-G). Slično tome, tumori sa obilnim PD-1<hi>su pokazali značajno smanjenu citotoksičnost nakon stimulacije putem FolR1-TCB, dok se kod većine tumora sa oskudnim PD-1<hi>moglo primetiti snažno ubijanje tumorskih ćelija (p=0,021; Sl.37H).
Primer 50
PD-1 blokada obnavlja funkciju T ćelija indukovanu putem FolR1-TCB samo kod tumora sa oskudnim PD-1<hi>
Kako je nivo ekspresije PD-1 na TIL u korelaciji sa efikasnošću FolR1-TCB, analizirali smo da li bi blokada ose PD-1/PD-L1 u kombinaciji sa tretmanom putem FolR1-TCB mogla obnoviti funkciju T ćelija. Otkrili smo da su pri kombinovanom tretmanu putem FolR1-TCB i PD-1 blokirajućim antitelom nivolumabom (MDX5C4), sekrecija efektorskih citokina IFN-γ, TNF i IL-2, kao i perforin, mogli biti povećani samo kod nekih tumora sa oskudnim PD-1<hi>. Suprotno tome, kod tumora sa obilnim PD-1<hi>blokada PD-1 nije uspela izazvati bilo kakav odgovor (Sl. 38A-D). Treba napomenuti da citotoksično ubijanje tumorskih ćelija nije moglo da se poveća u T ćelijama ni iz tumora sa oskudnim PD-1<hi>ni iz tumora sa obilnim PD-1<hi>putem dodatne blokade PD-1 (Sl.38E).
Ovde prikazani primeri opisuju imunomodulacioni kapacitet CD3 x FolR1-specifičnog TCB u primarnim lezijama raka kod pacijenata sa nesitnoćelijskim rakom pluća (NSCLC), epitelnim karcinomom jajnika (EOC) i karcinomom bubrežnih ćelija (RCC). U poređenju sa potpuno funkcionalnim perifernim T-ćelijama zdravih donora, primetili smo značajnu heterogenost u ubijanju tumorskih ćelija indukovanu putem FolR1-TCB i u aktivaciji T ćelija u različitim uzorcima humanog tumora, što je dovelo do delimičnog ili potpunog oštećenja funkcije T ćelija kod većine pacijenata. Sveobuhvatna analiza inhibitorne površinske ćelijske receptorske ekspresije intratumoralnih T ćelija je otkrila da je efikasnost aktivacije T ćelija pomoću FolR1-TCB u obrnutoj korelaciji sa nivoom ekspresije PD-1.
Pacijenti koji imaju tumor sa obilnim PD-1<hi>su pokazali oštećenu aktivaciju i efektorsku funkciju T-ćelija nakon FolR1-TCB tretmana. Pored toga, ovi pacijenti nisu reagovali na PD-1 blokadu, za razliku od pacijenata sa oskudnom ekspresijom PD-1<hi>. Dakle, bioaktivnost bispecifičnih antitela znatno je otežana disfunkcijom T ćelija, koju, barem delimično, diktira trajna i vrlo raznolika ekspresija inhibitornih receptora.
Primetili smo snažno povećanje aktivacionih markera T ćelija, efektorsku sekreciju citokina i ubijanje tumorskih ćelija nakon stimulacije putem FolR1-TCB u PBMC zdravih donora (Sl. 40). Ali suprotno tome, efektorske funkcije T ćelija uglavnom su varirale i uglavnom su bile umanjene u intratumoralnim T ćelijama. Konkretno, sposobnost ubijanja i efektorska proizvodnja citokina bila je značajno niža u TIL-ovima, uz potpuni gubitak proizvodnje IL-2 i ozbiljno poremećenu sekreciju TNF i IFN-γ u većini tumora.
Zabeležili smo ekspresiju inhibitornih receptora PD-1, Tim-3, CTLA-4, Lag-3 i BTLA na intratumoralnim CD8<+>T ćelijama. PD-1 je pokazivao najširu ekspresiju od svih analiziranih inhibitornih receptora. Opservacije o hroničnim mišjim infekcijama LCMV koje je dao Blekbern ukazuju na prisustvo funkcionalno različitih PD-1 pozitivnih podskupova T ćelija, koje se mogu razdvojiti na osnovu nivoa MFI, pomoću protočne citometrije (Blackburn et al., PNAS 105 (39): 15016 (2008)). Treba napomenuti da su PD-1<hi>T ćelijski podskupovi pokazali visoku koekspresiju Tim-3 i CTLA-4 te u manjoj meri Lag-3 i BTLA, dok su podskupovi PD-1<int>imali samo nizak nivo ekspresije ostalih inhibitornih receptora, sličan onom za PD-1<neg>T ćelije. Učestalost PD-1<hi>CD8<+>T ćelija uveliko se razlikovala među pacijentima i omogućila nam je da razlikujemo tumore sa obilnim i oskudnim PD-1<hi>. Za razliku od pacijenata sa PD-1<hi>oskudnim fenotipom, aktivacija T ćelija posredovana putem FolR1-TCB i ubijanje tumorskih ćelija bilo je značajno oštećeno u tumorima sa PD-1<hi>obilnim fenotipom. Ovi podaci proširuju i potvrđuju prethodna zapažanja da su aktivacija i efektorska funkcija CD8<+>T ćelija u korelaciji sa koekspresijom više imunih kontrolnih tačaka (Sakuishi et al., J Exp Med 2010; 207 (10): 2187-94; Fourcade et al., J Exp Med 2010; 207 (10): 2175-86; Grosso et al., J Immunol 2009; 182 (11): 6659-69; Matsuzaki et al., Proc Natl Acad Sci USA 2010; 107 (17): 7875-80; Fourcade et al., Cancer Res 2012; 72 (4): 887-96). Učestalost PD-1<hi>T ćelija može stoga biti korisna kao surogatni marker za funkcionalnost TIL nakon aktivacije TCB-om, te može poslužiti kao prediktivni marker za terapijske odgovore na lečenje TCB-om. Ovaj imunološki profil bi mogao biti vodič pri odabiru pacijenata koji će verovatno reagovati na imunoterapiju kao što je terapija putem TCB. Povezanost sa kliničkom koristi tek treba da se utvrdi u budućim kliničkim intervencijama.
Obećavajući put za poboljšanje terapijske efikasnosti TCB-a leži u blokadi inhibitornih signala na T ćelijama. Kako je PD-1 bio najjače eksprimiran inhibitorni receptor u svim analiziranim tumorima, testirali smo da li PD-1 blokada može da poboljša efektorske funkcije T ćelija nakon aktivacije TCB-om. Treba napomenuti da smo uočili povećano lučenje efektorskih citokina nakon kombinovanog tretmana sa FolR1-TCB i anti-PD-1, mada samo u tumorima sa oskudnim PD-1<hi>. Stoga su očito potrebne nove terapijske strategije koje istražuju transformaciju PD-1<hi>T ćelija u PD-1<int>T ćelije kako bi se povećala osetljivost na blokadu PD-1/PD-L1.
Zanimljivo je i to da nismo primetili poboljšanje ubijanja tumorskih ćelija nakon istovremene blokade PD-1 u svim uzorcima tumora. Dakle, moguće je da nije dovoljna blokada jedne imunološke kontrolne tačke za obnavljanje citolitičkog kapaciteta TIL. Na modelu mišjeg tumora, međutim, pokazalo se da blokada ose PD-1/PD-L1 povećava infiltraciju T ćelija u tumore (Curran et al., Proc Natl Acad Sci USA 2010; 107 (9): 4275-80), što je karakteristika ovog tretmana, čime se naš in vitro pristup nije mogao baviti. Prema tome, moguće je da terapeutski učinak PD-1 blokade in vivo ne nastaje samo kao rezultat poboljšanja T ćelijske citotoksičnosti rezidualnih intratumoralnih T-ćelija, nego i održive funkcionalnosti novo infiltriranih T ćelija. Pokazano je da TCB-om indukovana aktivacija T ćelija povećava ekspresiju PD-1, što može dovesti do sekundarne rezistencije u prisustvu PD-L1 eksprimiranog i na ćelijama tumora i na infiltrirajućim imunskim ćelijama, kao što je nedavno pokazano i za Her2-specifične TCB i za TCB specifične za karcinoembrionalni antigen-(CEA) (Junttila et al., Cancer Res 2014; 74 (19): 5561-71; Osada et al., Cancer Immunol Immunother 2015). Važno je da blokada ose PD-1/PD-L1 može u potpunosti obnoviti TCB-om indukovanu funkciju T ćelija, i in vitro i na modelu tumora miša. Ova zapažanja ukazuju da istovremena primena inhibitora kontrolnih tačaka može sprečiti sekundarnu rezistenciju, što može doprineti nefunkcionalnom stanju TIL i ograničiti terapijsku efikasnost TCB. Očigledno je potrebno dalje raditi na određivanju optimalnih režima inhibitora kontrolnih tačaka i TCB. Takođe će biti presudno važno identifikovati inhibitorne i aktivirajuće receptore T ćelija sa neredundantnim funkcijama kao potencijalne terapijske ciljeve.
Naši nalazi jasno ukazuju da su bispecifična antitela poput FolR1-TCB sposobna da navedu T ćelije da povećaju kostimulacione molekule, proizvode nflamatorne citokine i stiču citolitičku funkciju. Zapazili smo različita stanja disfunkcije T ćelija, kojima bar delimično upravlja ekspresija inhibitornih receptora, i koja, u nekim slučajevima, smanjuju efikasnost TCB. Kako se efektorske funkcije indukovane sa FolR1-TCB mogu samo delomično obnoviti pomoću PD-1 blokade, naši rezultati ukazuju na postojanje prilično složene imunološke regulacije, koja koristi višestruke i na kraju neredundantne puteve za održavanje disfunkcije T ćelija u tumorskom okruženju.
Sekvence
Aminokiselinske sekvence iz primera otelotvorenja
1) FolR vezivači korisni u uobičajenom formatu lakog lanca, varijabilni teški lanac
2) CD3 vezivač zajednički laki lanac (CLC)
3) CD3 vezivač, teški lanac
4) FolR vezivači korisni za crossfab format
5) CD3 vezivači korisni u crossfab formatu
6) Primer aminokiselinskih sekvenci CD3-FolR bispecifičnih antitela 2+1 obrnuti crossmab format
7) Primeri aminokiselinskih sekvenci CD3-FolR bispecifičnih antitela sa zajedničkim lakim lancem
8) Primer varijanti 16D5 sa smanjenim afinitetom a. Primeri varijanti lakog lanca sa smanjenim afinitetom
b. Primeri varijanti teškog lanca sa smanjenim afinitetom
9) Dodatni primeri otelotvorenja generisanih iz biblioteke displeja faga (CDR su podvučeni)
10) 9D11 Varijante glikozita: varijabilni laki lanac primera otelotvorenja (CDR su podvučeni)
11) Varijante deaminacije
12) FolR1 TCB zasnovani na Mov19 iz primera otelotvorenja (CDR su podvučeni)
13) Dodatni FolR1 TCB sa vezivačima srednjeg afiniteta (CDR prema Kabatu, podvučeni)
14) Sekvence antigena
2) Nukleotidne sekvence primera otelotvorenja
Primeri sekvenci anti-PD1 antagonista
Primeri sekvenci za anti-TIM3 antitela
Primeri aminokiselinskih sekvenci anti-TIM3 antitela i primeri sekvenci TIM3 prikazani su u listi sekvenci koja sledi:
SEQ ID NO:304 HVR-H1 teškog lanca, Tim3_0016
SEQ ID NO:305 HVR-H2 teškog lanca, Tim3_0016
SEQ ID NO:306 HVR-H3 teškog lanca, Tim3_0016
SEQ ID NO:307 HVR-L1 lakog lanca, Tim3_0016
SEQ ID NO:308 HVR-L2 lakog lanca, Tim3_0016
SEQ ID NO:309 HVR-L3 lakog lanca, Tim3_0016
SEQ ID NO:310 varijabilni domen teškog lanca VH, Tim3_0016
SEQ ID NO:311 varijabilni domen lakog lanca VL, Tim3_0016
SEQ ID NO:312 varijabilni domen teškog lanca VH, varijanta Tim3_0016 (0018) SEQ ID NO:313 varijabilni domen lakog lanca VL, varijanta Tim3_0016 (0018) SEQ ID NO:314 laki lanac HVR-L1, Tim3_0016_HVR-L1 varijanta 1_ NQ (uklanjanje mesta glikozilacije mutacijom N u Q)
SEQ ID NO:315 HVR-L1 lakog lanca, Tim3_0016_HVR L1 varijanta 2_NS (uklanjanje mesta glikozilacije mutacijom N u S)
SEQ ID NO:316 HVR-H1 teškog lanca, Tim3_0021
SEQ ID NO:317 HVR-H2 teškog lanca, Tim3_0021
SEQ ID NO: 318 HVR-H3 teškog lanca, Tim3_0021
SEQ ID NO:319 HVR-L1 lakog lanca, Tim3_0021
SEQ ID NO:320 HVR-L2 lakog lanca, Tim3_0021
SEQ ID NO:321 HVR-L3 lakog lanca, Tim3_0021
SEQ ID NO:322 varijabilni domen teškog lanca VH, Tim3_0021
SEQ ID NO:323 varijabilni domen lakog lanca VL, Tim3_0021
SEQ ID NO:324 HVR-H1 teškog lanca, Tim3_0022
SEQ ID NO:325 HVR-H2 teškog lanca, Tim3_0022
SEQ ID NO:326 HVR-H3 teškog lanca, Tim3_0022
SEQ ID NO:327 HVR-L1 lakog lanca, Tim3_0022
SEQ ID NO:328 HVR-L2 lakog lanca, Tim3_0022
SEQ ID NO:329 HVR-L3 lakog lanca, Tim3_0022
SEQ ID NO:330 varijabilni domen teškog lanca VH, Tim3_0022
SEQ ID NO:331 varijabilni domen lakog lanca VL, Tim3_0022
SEQ ID NO:332 HVR-H1 teškog lanca, Tim3_0026
SEQ ID NO:333 HVR-H2 teškog lanca, Tim3_0026
SEQ ID NO:334 HVR-H3 teškog lanca, Tim3_0026
SEQ ID NO:335 HVR-L1 lakog lanca, Tim3_0026
SEQ ID NO:336 HVR-L2 lakog lanca, Tim3_0026
SEQ ID NO:337 HVR-L3 lakog lanca, Tim3_0026
SEQ ID NO:338 varijabilni domen teškog lanca VH, Tim3_0026
SEQ ID NO:339 varijabilni domen lakog lanca VL, Tim3_0026 SEQ ID NO:340 HVR-H1 teškog lanca, Tim3_0028
SEQ ID NO:341 HVR-H2 teškog lanca, Tim3_0028
SEQ ID NO:342 HVR-H3 teškog lanca, Tim3 0028
SEQ ID NO:343 HVR-L1 lakog lanca, Tim3_0028
SEQ ID NO:344 HVR-L2 lakog lanca, Tim3_0028
SEQ ID NO:345 HVR-L3 lakog lanca, Tim3_0028
SEQ ID NO:346 varijabilni domen teškog lanca VH, Tim3_0028 SEQ ID NO:347 varijabilni domen lakog lanca VL, Tim3_0028 SEQ ID NO:348 HVR-H1 teškog lanca, Tim3_0030
SEQ ID NO:349 HVR-H2 teškog lanca, Tim3_0030
SEQ ID NO:350 HVR-H3 teškog lanca, Tim3_0030
SEQ ID NO:351 HVR-L1 lakog lanca, Tim3_0030
SEQ ID NO:352 HVR-L2 lakog lanca, Tim3_0030
SEQ ID NO:353 HVR-L3 lakog lanca, Tim3_0030
SEQ ID NO:354 varijabilni domen teškog lanca VH, Tim3_0030 SEQ ID NO:355 varijabilni domen lakog lanca VL, Tim3_0030 SEQ ID NO:356 HVR-H1 teškog lanca, Tim3_0033
SEQ ID NO:357 HVR-H2 teškog lanca, Tim3_0033
SEQ ID NO:358 HVR-H3 teškog lanca, Tim3_0033
SEQ ID NO:359 HVR-L1 lakog lanca, Tim3_0033
SEQ ID NO:360 HVR-L2 lakog lanca, Tim3_0033
SEQ ID NO:361 HVR-L3 lakog lanca, Tim3_0033
SEQ ID NO:362 varijabilni domen teškog lanca VH, Tim3_0033 SEQ ID NO:363 varijabilni domen lakog lanca VL, Tim3_0033 SEQ ID NO:364 HVR-H1 teškog lanca, Tim3_0038
SEQ ID NO:365 HVR-H2 teškog lanca, Tim3_0038
SEQ ID NO:366 HVR-H3 teškog lanca, Tim3_0038
SEQ ID NO:367 HVR-L1 lakog lanca, Tim3_0038
SEQ ID NO:368 HVR-L2 lakog lanca, Tim3_0038
SEQ ID NO:369 HVR-L3 lakog lanca, Tim3_0038
SEQ ID NO:370 varijabilni domen teškog lanca VH, Tim3_0038 SEQ ID NO:371 varijabilni domen lakog lanca VL, Tim3_0038 SEQ ID NO:372 primer egzotoksina pseudomonas A varijanta 1 (primer deimunizovanog PE24)
SEQ ID NO:373 primer egzotoksina pseudomonas A varijanta 2 (primer deimunizovanog PE24)
SEQ ID NO:374 humani konstantni region kapa lakog lanca
SEQ ID NO:375 humani konstantni region lambda lakog lanca
SEQ ID NO:376 humani konstantni region teškog lanca dobijen od IgG1SEQ ID NO:377 humani konstantni region teškog lanca dobijen od IgG1sa mutacijama L234A i L235A
SEQ ID NO:378 humani konstantni region teškog lanca dobijen od IgG1sa mutacijama L234A, L235A i P329G
SEQ ID NO:379 humani konstantni region teškog lanca dobijen od IgG4SEQ ID NO:380 primer za humane TIM3 sekvence
SEQ ID NO:381 humani ekstracelularni domen TIM3 (ECD)
<210> 304
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 304
<210> 305
<211> 3
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 305
<210> 306
<211> 8
<212> PRT
<213> Mus musculus <400> 306
<210> 307
<211> 6
<212> PRT
<213> Mus musculus <400> 307
<210> 308
<211> 3
<212> PRT
<213> Mus musculus <400> 308
<210> 309
<211> 7
<212> PRT
<213> Mus musculus <400> 309
<210> 310
<211> 120
<212> PRT
<213> Mus musculus <400> 310
<211> 106
<212> PRT
<213> Mus musculus <400> 311
<211> 120
<212> PRT
<213> Mus musculus <400> 312
<211> 106
<212> PRT
<213> Mus musculus <400> 313
<211> 6
<212> PRT
<213> Mus musculus <400> 314
<210> 315
<211> 6
<212> PRT
<213> Mus musculus <400> 315
<211> 7
<212> PRT
<213> Mus musculus <400> 316
<210> 317
<211> 3
<212> PRT
<213> Mus musculus <400> 317
<210> 318
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus <400> 318
<210> 319
<211> 7
<212> PRT
<213> Mus musculus <400> 319
<211> 3
<212> PRT
<213> Mus musculus <400> 320
<210> 321
<211> 6
<212> PRT
<213> Mus musculus <400> 321
<210> 322
<211> 120
<212> PRT
<213> Mus musculus <400> 322
<211> 107
<212> PRT
<213> Mus musculus <400> 323
<211> 5
<212> PRT
<213> Mus musculus <400> 324
<210> 325
<211> 3
<212> PRT
<213> Mus musculus
<210> 326
<211> 4
<212> PRT
<213> Mus musculus <400> 326
<210> 327
<211> 7
<212> PRT
<213> Mus musculus <400> 327
<210> 328
<211> 3
<212> PRT
<213> Mus musculus <400> 328
<210> 329
<211> 6
<212> PRT
<213> Mus musculus <400> 329
<211> 114
<212> PRT
<213> Mus musculus <400> 330
<210> 331
<211> 107
<212> PRT
<213> Mus musculus <400> 331
<211> 5
<212> PRT
<213> Mus musculus <400> 332
<210> 333
<211> 3
<212> PRT
<213> Mus musculus <400> 333
<211> 4
<212> PRT
<213> Mus musculus <400> 334
<210> 335
<211> 12
<212> PRT
<213> Mus musculus <400> 335
<210> 336
<211> 3
<212> PRT
<213> Mus musculus <400> 336
<210> 337
<211> 6
<212> PRT
<213> Mus musculus <400> 337
<210> 338
<211> 115
<212> PRT
<213> Mus musculus <400> 338
<210> 339
<211> 112
<212> PRT
<213> Mus musculus <400> 339
<211> 7
<212> PRT
<213> Mus musculus <400> 340
<210> 341
<211> 3
<212> PRT
<213> Mus musculus <400> 341
<211> 8
<212> PRT
<213> Mus musculus <400> 342
<210> 343
<211> 7
<212> PRT
<213> Mus musculus <400> 343
<210> 344
<211> 3
<212> PRT
<213> Mus musculus <400> 344
<210> 345
<211> 6
<212> PRT
<213> Mus musculus <400> 345
<211> 119
<212> PRT
<213> Musmusculus <400> 346
<210> 347
<211> 107
<212> PRT
<213> Mus musculus <400> 347
<211> 7
<212> PRT
<213> Mus musculus <400> 348
<210> 349
<211> 3
<212> PRT
<213> Mus musculus
<210> 350
<211> 4
<212> PRT
<213> Mus musculus <400> 350
<210> 351
<211> 12
<212> PRT
<213> Mus musculus <400> 351
<210> 352
<211> 3
<212> PRT
<213> Mus musculus <400> 352
<210> 353
<211> 5
<212> PRT
<213> Mus musculus <400> 353
<211> 115
<212> PRT
<213> Mus musculus <400> 354
<210> 355
<211> 112
<212> PRT
<213> Mus musculus <400> 355
<210> 356
<211> 7
<212> PRT
<213> Mus musculus <400> 356
<210> 357
<211> 3
<212> PRT
<213> Mus musculus <400> 357
<210> 358
<211> 8
<212> PRT
<213> Mus musculus <400> 358
<210> 359
<211> 7
<212> PRT
<213> Mus musculus <400> 359
<210> 360
<211> 3
<212> PRT
<213> Mus musculus <400> 360
<210> 361
<211> 6
<212> PRT
<213> Mus musculus <400> 361
<211> 121
<212> PRT
<213> Mus musculus <400> 362
<210> 363
<212> PRT
<213> Mus musculus <400> 363
<210> 364
<211> 7
<212> PRT
<213> Mus musculus <400 364
<210> 365
<211> 3
<212> PRT
<213> Mus musculus <400> 365
<210> 366
<211> 8
<212> PRT
<213> Mus musculus <400> 366
<210> 367
<211> 8
<212> PRT
<213> Mus musculus <400> 367
<210> 368
<211> 3
<212> PRT
<213> Mus musculus <400> 368
<210> 369
<211> 6
<212> PRT
<213> Mus musculus <400> 369
<210> 370
<211> 119
<212> PRT
<213> Mus musculus <400> 370
<210> 371
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 371
<210> 372
<211> 219
<212> PRT
<213> Veštačka
<220>
<223> primer egzotoksina pseudomonas A varijanta K (primer deimunizovanog PE24) <400 372
<211> 219
<212> PRT
<213> Veštačka
<220>
<223> primer egzotoksina pseudomonas A varijanta 2 (primer deimunizovanog PE24) <400> 373
<211> 107
<212> PRT
<213> Homo Sapiens <400> 374
<211> 105
<212> PRT
<213> Homo Sapiens <400> 375
<211> 330
<212> PRT
<213> Homo Sapiens <400> 376
<210> 377
<212> PRT <213> homo sapiens <400> 377
<211> 330
<212> PRT <213> homo sapiens <400> 378
<211> 327
<212> PRT
<213> Homo Sapiens <400> 379
<211> 280
<212> PRT <213> homo sapiens <400> 380
<211> 181
<212> PRT <213> homo sapiens
<400> 381
Ċ
LISTA SEKVENCI
<110> F. HOFFMANN-LA ROCHE AG
<120> KOMBINOVANA TERAPIJA BISPECIFIČNIM ANTIGEN VEZUJUĆIM MOLEKULIMA KOJI AKTIVIRAJU T ĆELIJE ZA CD3 I FOLATNI RECEPTOR 1 (FOLR1), I ANTAGONISTIMA VEZIVANJA OSE PD-1
<130> 32401
<140>
<141>
<150> EP 15167173.2
<151> 11.05.2015.
<150> EP 15152141.6
<151> 22.01.2015.
<150> EP 14194136.9
<151> 20.11.2014.
<160> 430
<170> Verzija PatentIn 3.5
<210> 1
<211> 120
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<210> 2
<211> 120
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 2
<211> 120
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 3
<211> 120
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 4
<211> 120
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 5
<211> 120
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 6
<211> 120
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 7
<211> 5
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički peptid”
<400> 8
<210> 9
<211> 17
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički peptid”
<400> 9
<210> 10
<211> 11
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički peptid”
<400> 10
<210> 11
<211> 120
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 11
<211> 11
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički peptid”
<400> 12
<210> 13
<211> 120
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 13
<210> 14
<211> 11
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički peptid”
<210> 15
<211> 120
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 15
<210> 16
<211> 5
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički peptid”
<400> 16
<210> 17
<211> 19
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički peptid”
<400> 17
<210> 18
<211> 9
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički peptid”
<210> 19
<211> 120
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 19
<210> 20
<211> 9
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički peptid”
<400> 20
<210> 21
<211> 120
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 21
<211> 9
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički peptid”
<400> 22
<210> 23
<211> 120
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 23
<210> 24
<211> 9
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički peptid”
<400> 24
<211> 120
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 25
<210> 26
<211> 11
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički peptid”
<400> 26
<210> 27
<211> 120
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 27
<211> 11
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički peptid”
<400> 28
<210> 29
<211> 120
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 29
<210> 30
<211> 11
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički peptid”
<400> 30
<211> 109
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 31
<210> 32
<211> 14
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički peptid”
<400> 32
<210> 33
<211> 7
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički peptid”
<400> 33
<210> 34
<211> 9
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički peptid”
<400> 34
<210> 35
<211> 215
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 35
<211> 125
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 36
<211> 5
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički peptid”
<400> 37
<210> 38
<211> 19
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički peptid”
<400> 38
<210> 39
<211> 14
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički peptid”
<400> 39
<210> 40
<211> 228
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 40
<211> 121
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<210> 42
<211> 5
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički peptid”
<400> 42
<210> 43
<211> 17
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički peptid”
<400> 43
<210> 44
<211> 12
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički peptid”
<400> 44
<210> 45
<211> 107
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<210> 46
<211> 11
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički peptid”
<400> 46
<210> 47
<211> 7
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički peptid”
<400> 47
<210> 48
<211> 9
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički peptid”
<400> 48
<210> 49
<211> 119
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 49
<211> 10
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički peptid”
<400> 50
<210> 51
<211> 109
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 51
<210> 52
<211> 12
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički peptid”
<400> 52
<211> 7
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički peptid”
<400> 53
<210> 54
<211> 10
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički peptid”
<400> 54
<210> 55
<211> 117
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<210> 56
<211> 17
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički peptid”
<400> 56
<210> 57
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički peptid”
<400> 57
<210> 58
<211> 112
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 58
<211> 16
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički peptid”
<400> 59
<210> 60
<211> 7
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički peptid”
<400> 60
<210> 61
<211> 9
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički peptid”
<400> 61
<210> 62
<211> 112
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 62
<211> 9
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički peptid”
<400> 63
<210> 64
<211> 112
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 64
<210> 65
<211> 9
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički peptid”
<400> 65
<210> 66
<211> 112
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 66
<210> 67
<211> 9
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički peptid”
<400> 67
<211> 112
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 68
<210> 69
<211> 9
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički peptid”
<400> 69
<210> 70
<211> 116
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 70
<210> 71
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički peptid”
<400> 71
<210> 72
<211> 107
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 72
<211> 8
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički peptid”
<400> 73
<210> 74
<211> 116
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 74
<211> 7
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički peptid”
<400> 75
<210> 76
<211> 107
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 76
<210> 77
<211> 8
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički peptid”
<400> 77
<210> 78
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 78
<210> 79
<211> 5
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički peptid”
<400> 79
<210> 80
<211> 17
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički peptid”
<400> 80
<210> 81
<211> 12
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički peptid”
<400> 81
<210> 82
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 82
<210> 83
<211> 9
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički peptid”
<210> 84
<211> 103
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 84
<210> 85
<211> 103
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 85
<210> 86
<211> 214
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 86
<211> 232
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid” <400> 87
<211> 105
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 88
<211> 689
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 89
<211> 450
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 90
<211> 689
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 91
<211> 455
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 92
<211> 227
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 93
<210> 94
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 94
<211> 447
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 95
<211> 219
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 96
<211> 648
<212> DNK
<213> Veštačka sekvenca
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polinukleotid"
<220>
<221> modifikovana_baza
<222> (603)..(603)
<223> a, c, t, g, nepoznato ili drugo
<400> 97
<210> 98
<211> 459
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 98
<211> 689
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 99
<211> 689
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 100
<211> 441
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 101
<211> 227
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 102
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 103
<211> 118
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 104
<211> 118
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 105
<211> 120
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 106
<211> 118
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 107
<211> 117
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 108
<211> 118
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 109
<211> 109
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 110
<211> 107
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 111
<211> 109
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 112
<211> 109
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 113
<211> 109
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 114
<211> 122
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 115
<211> 122
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 116
<211> 122
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 117
<211> 122
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 118
<211> 122
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 119
<211> 122
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 120
<211> 122
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 121
<211> 119
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 122
<211> 114
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 123
<211> 118
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 124
<211> 109
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 125
<211> 122
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 126
<211> 115
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 127
<211> 119
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 128
<211> 113
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 129
<211> 119
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 130
<211> 114
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 131
<211> 112
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 132
<211> 112
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 133
<211> 112
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 134
<211> 112
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 135
<211> 448
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 136
<211> 691
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 137
Ċ
<211> 218
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 138
<211> 257
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 139
<211> 468
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 140
<211> 227
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 141
<212> PRT
<213> Mus musculus <400> 142
<211> 466
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 143
<211> 257
<212> PRT
<213> Macaca fascicularis
<400> 144
<211> 468
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 145
<211> 255
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 146
<211> 472
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 147
<211> 243
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 148
<211> 479
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 149
<212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 150
<210> 151
<212> DNK
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polinukleotid"
<400> 151
<210> 152
<211> 360
<212> DNK
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polinukleotid"
<400> 152
<211> 363
<212> DNK
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polinukleotid"
<400> 153
<210> 154
<211> 360
<212> DNK
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polinukleotid"
<220>
<221> modifikovana_baza
<222> (47)..(47)
<223> a, c, t, g, nepoznato ili drugo
<400> 154
<211> 360
<212> DNK
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polinukleotid"
<400> 155
<210> 156
<211> 360
<212> DNK
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polinukleotid"
<210> 157
<211> 360
<212> DNK
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polinukleotid"
<400> 157
<210> 158
<211> 360
<212> DNK
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polinukleotid"
<210> 159
<211> 360
<212> DNK
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polinukleotid"
<220>
<221> modifikovana_baza
<222> (53)..(53)
<223> a, c, t, g, nepoznato ili drugo
<400> 159
<210> 160
<211> 360
<212> DNK
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polinukleotid"
<400> 160
<210> 161
<211> 360
<212> DNK
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polinukleotid"
<220>
<221> modifikovana_baza
<222> (47)..(47)
<223> a, c, t, g, nepoznato ili drugo
<220>
<221> modifikovana_baza
<222> (177)..(177)
<223> a, c, t, g, nepoznato ili drugo
<210> 162
<211> 360
<212> DNK
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polinukleotid"
<400> 162
<210> 163
<211> 360
<212> DNK
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polinukleotid"
<400> 163
<210> 164
<211> 360
<212> DNK
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polinukleotid"
<400> 164
<210> 165
<211> 360
<212> DNK
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polinukleotid"
<400> 165
<210> 166
<211> 360
<212> DNK
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polinukleotid"
<400> 166
<210> 167
<211> 363
<212> DNK
<213> Veštačka sekvenca
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polinukleotid"
<400> 167
<210> 168
<211> 321
<212> DNK
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polinukleotid"
<400> 168
<210> 169
<211> 357
<212> DNK
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polinukleotid"
<400> 169
<210> 170
<211> 327
<212> DNK
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polinukleotid"
<400> 170
<210> 171
<211> 351
<212> DNK
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polinukleotid"
<400> 171
<210> 172
<211> 336
<212> DNK
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polinukleotid"
<400> 172
<210> 173
<212> DNK
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polinukleotid"
<400> 173
<210> 174
<211> 336
<212> DNK
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polinukleotid"
<400> 174
<211> 336
<212> DNK
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polinukleotid"
<400> 175
<210> 176
<211> 336
<212> DNK
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polinukleotid"
<400> 176
<211> 348
<212> DNK
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polinukleotid"
<400> 177
<210> 178
<211> 321
<212> DNK
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polinukleotid"
<400> 178
<211> 348
<212> DNK
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polinukleotid"
<400> 179
<210> 180
<211> 321
<212> DNK
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polinukleotid"
<210> 181
<211> 363
<212> DNK
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polinukleotid"
<400> 181
<210> 182
<211> 324
<212> DNK
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polinukleotid"
<400> 182
<210> 183
<211> 684
<212> DNK
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polinukleotid"
<400> 183
<211> 696
<212> DNK
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polinukleotid"
<400> 184
<210> 185
<211> 36
<212> DNK
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički prajmer"
<210> 186
<211> 35
<212> DNK
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički prajmer"
<400> 186
<210> 187
<211> 37
<212> DNK
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički prajmer"
<400> 187
<210> 188
<211> 37
<212> DNK
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički prajmer"
<400> 188
<210> 189
<211> 2067
<212> DNK
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polinukleotid"
<400> 189
<211> 1350
<212> DNK
<213> Veštačka sekvenca
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polinukleotid"
<400> 190
<210> 191
<211> 645
<212> DNK
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polinukleotid"
<400> 191
<210> 192
<211> 2067
<212> DNK
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polinukleotid"
<400> 192
<211> 1365
<212> DNK
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polinukleotid"
<400> 193
<211> 681
<212> DNK
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polinukleotid"
<210> 195
<211> 2070
<212> DNK
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polinukleotid"
<400> 195
<211> 1341
<212> DNK
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polinukleotid"
<400> 196
<211> 657
<212> DNK
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polinukleotid"
<210> 198
<211> 642
<212> DNK
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polinukleotid"
<400> 198
<211> 1377
<212> DNK
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polinukleotid"
<400> 199
<211> 2067
<212> DNK
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polinukleotid"
<400> 200
Ċ
<211> 2067
<212> DNK
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polinukleotid"
<400> 201
<212> DNK
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polinukleotid"
<400> 202
<211> 681
<212> DNK
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polinukleotid"
<400> 203
<210> 204
<211> 693
<212> DNK
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polinukleotid"
<210> 205
<211> 327
<212> DNK
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polinukleotid"
<400> 205
<210> 206
<212> DNK
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polinukleotid"
<400> 206
<210> 207
<211> 366
<212> DNK
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polinukleotid"
<400> 207
<211> 366
<212> DNK
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polinukleotid"
<400> 208
<210> 209
<211> 366
<212> DNK
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polinukleotid"
<400> 209
<211> 366
<212> DNK
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polinukleotid"
<400> 210
<210> 211
<211> 366
<212> DNK
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polinukleotid"
<400> 211
<210> 212
<211> 366
<212> DNK
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polinukleotid"
<400> 212
<210> 213
<211> 366
<212> DNK
<213> Veštačka sekvenca
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polinukleotid"
<400> 213
<210> 214
<211> 357
<212> DNK
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polinukleotid"
<400> 214
<210> 215
<212> DNK
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polinukleotid"
<400> 215
<210> 216
<211> 354
<212> DNK
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polinukleotid"
<400> 216
<211> 327
<212> DNK
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polinukleotid"
<400> 217
<210> 218
<211> 366
<212> DNK
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polinukleotid"
<400> 218
<211> 345
<212> DNK
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polinukleotid"
<400> 219
<210> 220
<211> 357
<212> DNK
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polinukleotid"
<210> 221
<211> 339
<212> DNK
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polinukleotid"
<400> 221
<210> 222
<211> 357
<212> DNK
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polinukleotid"
<400> 222
<210> 223
<211> 342
<212> DNK
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polinukleotid"
<400> 223
<210> 224
<211> 1344
<212> DNK
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polinukleotid"
<400> 224
<210> 225
<211> 2073
<212> DNK
<213> Veštačka sekvenca
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polinukleotid" <400> 225
<211> 654
<212> DNK
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polinukleotid"
<210> 227
<211> 209
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 227
<211> 214
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<210> 229 <211> 220
<212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 229 <211> 208
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 230 <211> 213
<212> PRT
<213> Macaca fascicularis
<400> 231
<211> 9
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički peptid”
<400> 232
<210> 233
<211> 11
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički peptid”
<400> 233
<210> 234
<211> 11
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički peptid”
<400> 234
<210> 235
<211> 8
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički peptid”
<400> 235
<210> 236
<211> 9
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički peptid”
<400> 236
<211> 7
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički peptid”
<400> 237
<210> 238
<211> 8
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički peptid”
<400> 238
<210> 239
<211> 11
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički peptid”
<210> 240
<211> 10
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički peptid”
<400> 240
<210> 241
<211> 8
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički peptid”
<400> 241
<210> 242
<211> 8
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički peptid”
<400> 242
<210> 243
<211> 8
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički peptid”
<400> 243
<210> 244
<211> 9
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički peptid”
<400> 244
<211> 227
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 245
<211> 2076
<212> DNK
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polinukleotid"
<400> 246
<211> 1347
<212> DNK
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polinukleotid"
<400> 247
<211> 120
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<210> 249
<211> 120
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 249
<211> 125
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 250
<211> 125
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 251
<211> 689
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 252
<211> 450
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 253
<211> 215
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 254
<211> 689 <212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 255
<211> 690
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 256
<211> 447
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 257
<211> 219
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 258
<211> 214
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid” <400> 259
<211> 690
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 260
<211> 360
<212> DNK
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polinukleotid"
<400> 261
<210> 262
<211> 360
<212> DNK
<213> Veštačka sekvenca
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polinukleotid"
<400> 262
<210> 263
<211> 375
<212> DNK
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polinukleotid"
<400> 263
<210> 264
<211> 375
<212> DNK
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polinukleotid"
<400> 264
<210> 265
<211> 2067
<212> DNK
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polinukleotid"
<400> 265
<211> 1350
<212> DNK
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polinukleotid"
<400> 266
<211> 645
<212> DNK
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polinukleotid"
<210> 268
<211> 2067
<212> DNK
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polinukleotid"
<400> 268
<211> 2070
<212> DNK
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polinukleotid"
<400> 269
<211> 1341
<212> DNK
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polinukleotid"
<400> 270
<211> 657
<212> DNK
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polinukleotid"
<210> 272
<211> 642
<212> DNK
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polinukleotid"
<400> 272
<211> 2070
<212> DNK
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polinukleotid"
<400> 273
<211> 440
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 274
<211> 214
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 275
<211> 447 <212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 276
<211> 218
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 277
<211> 447
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid” <400> 278
<211> 214
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 279
<211> 118
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 280
<210> 281
<211> 122
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 281
<211> 108
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 282
<211> 10
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički peptid”
<220>
<221> VARIANT
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(10)
<223> /napomena=„Ostaci varijantnog oblika dati u sekvenci nemaju prednost u odnosu na one date u napomenama za položaje varijanti”
<400> 283
<210> 284
<211> 18
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički peptid”
<220>
<221> VARIANT
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(18)
<223> /napomena=„Ostaci varijantnog oblika dati u sekvenci nemaju prednost u odnosu na one date u napomenama za položaje varijanti”
<400> 284
<211> 9
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički peptid”
<400> 285
<210> 286
<211> 11
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički peptid”
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> /zameni=
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(11)
<223> /napomena=„Ostaci varijantnog oblika dati u sekvenci nemaju prednost u odnosu na one date u napomenama za položaje varijanti”
<400> 286
<210> 287
<211> 7
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički peptid”
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(7)
<223> /napomena=„Ostaci varijantnog oblika dati u sekvenci nemaju prednost u odnosu na one date u napomenama za položaje varijanti”
<400> 287
<210> 288
<211> 9
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički peptid”
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> /zameni= ili ili
<220>
<221> MOD_RES <222> (4)..(4iliil)i
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(9)
<223> /napomena=„Ostaci varijantnog oblika dati u sekvenci nemaju prednost u odnosu na one date u napomenama za položaje varijanti”
<400> 288
<210> 289
<211> 10
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički peptid”
<400> 289
<210> 290
<211> 18
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički peptid”
<400> 290
<210> 291
<211> 9
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički peptid”
<400> 291
<211> 11
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički peptid”
<400> 292
<210> 293
<211> 7
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički peptid”
<400> 293
<210> 294
<211> 9
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički peptid”
<400> 294
<210> 295
<211> 25
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički peptid”
<400> 295
<210> 296
<211> 13
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički peptid”
<400> 296
<211> 32
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 297
<210> 298
<211> 11
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički peptid”
<400> 298
<210> 299
<211> 11
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički peptid”
<400> 299
<210> 300
<211> 23
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički peptid”
<400> 300
<210> 301
<211> 15
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički peptid”
<400> 301
<210> 302
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 302
<210> 303
<211> 11
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički peptid”
<400> 303
<210> 304
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 304
<211> 3
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 305
<210> 306
<211> 8
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 306
<210> 307
<211> 6
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 307
<210> 308
<211> 3
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 308 <211> 7
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 309
<210> 310
<211> 120
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 310
<210> 311
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 311
<210> 312
<211> 120
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 312
<211> 106
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 313
<211> 6
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 314
<210> 315
<211> 6
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 315
<210> 316
<211> 7
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 316
<210> 317
<211> 3
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 317
<210> 318
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 318
<210> 319
<211> 7
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 319
<210> 320
<211> 3
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 320
<210> 321
<211> 6
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 321
<210> 322
<211> 120
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 322
<211> 107
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 323
<211> 5
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 324
<210> 325
<211> 3
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 325
<210> 326
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 326
<210> 327
<211> 7
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 327
<210> 328
<211> 3
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 328
<210> 329
<211> 6
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 329
<210> 330 <212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 330
<210> 331
<211> 107
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 331
<211> 5
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 332
<210> 333
<211> 3
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 333
<210> 334
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 334
<210> 335
<211> 12
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 335
<210> 336
<211> 3
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 336
<210> 337
<211> 6
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 337
<210> 338
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 338
<210> 339
<211> 112
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 339
<211> 7
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 340
<210> 341
<211> 3
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 341
<210> 342
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 342
<210> 343
<211> 7
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 343
<210> 344
<211> 3
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 344
<210> 345
<211> 6
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 345
<210> 346 <212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 346
<210> 347
<211> 107
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 347
<211> 7
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 348
<210> 349
<211> 3
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 349
<210> 350
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 350
<210> 351
<211> 12
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 351
<210> 352
<211> 3
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 352
<210> 353
<211> 5
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 353
<210> 354 <212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 354
<210> 355
<211> 112
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 355
<211> 7
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 356
<210> 357
<211> 3
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 357
<210> 358
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 358
<210> 359
<211> 7
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 359
<210> 360
<211> 3
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 360
<210> 361
<211> 6
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 361
<210> 362
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 362
<210> 363
<211> 107
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 363
<211> 7
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 364
<210> 365
<211> 3
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 365
<210> 366
<211> 8
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 366
<210> 367
<211> 8
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 367
<210> 368
<211> 3
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 368
<210> 369
<211> 6
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 369
<210> 370
<211> 119
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 370
<210> 371
<211> 107
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 371
<211> 219
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 372
<211> 219
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid” <400> 373
<211> 107
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 374
<210> 375
<211> 105
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 375
<211> 330
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 376
<211> 330
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 377
<211> 330
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 378
<211> 327
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 379
<211> 280 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 380
<211> 181
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 381
<211> 118
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<210> 383
<211> 108
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 383
<211> 24
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički peptid”
<220>
<221> VARIANT
<222> (13)..(24)
<223> /zameni=" "
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(24)
<223> /napomena="Ova sekvenca može da obuhvati ponovljenih jedinica"
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(24)
<223> /napomena=„Ostaci varijantnog oblika dati u sekvenci nemaju prednost u odnosu na one date u napomenama za položaje varijanti”
<400> 384
<210> 385
<211> 25
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički peptid”
<220>
<221> VARIANT
<222> (11)..(25)
<223> /zameni=" "
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(25)
<223> /napomena="Ova sekvenca može da obuhvati 2-5
ponovljenih jedinica"
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(25)
<223> /napomena=„Ostaci varijantnog oblika dati u sekvenci nemaju prednost u odnosu na one date u napomenama za položaje varijanti”
<400> 385
<210> 386
<211> 10
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički peptid”
<400> 386
<210> 387
<211> 50
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<220>
<221> VARIANT
<222> (6)..(50)
<223> /zameni=" "
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(50)
<223> /napomena="Ova sekvenca može da obuhvati 1-10
ponovljenih jedinica"
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(50)
<223> /napomena=„Ostaci varijantnog oblika dati u sekvenci nemaju prednost u odnosu na one date u napomenama za položaje varijanti”
<400> 387
<210> 388
<211> 50
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<220>
<221> VARIANT
<222> (6)..(50)
<223> /zameni=" "
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(50)
<223> /napomena="Ova sekvenca može da obuhvati 1-10
ponovljenih jedinica"
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(50)
<223> /napomena=„Ostaci varijantnog oblika dati u sekvenci nemaju prednost u odnosu na one date u napomenama za položaje varijanti”
<400> 388
<210> 389
<211> 54
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<221> VARIANT
<222> (10)..(54)
<223> /zameni=" "
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(54)
<223> /napomena="Ova sekvenca možeda obuhvati 1-10
ponovljenih jedinica"
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(54)
<223> /napomena=„Ostaci varijantnog oblika dati u sekvenci nemaju prednost u odnosu na one date u napomenama za položaje varijanti”
<400> 389
<210> 390
<211> 15
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički peptid”
<400> 390
<210> 391
<211> 16
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički peptid”
<400> 391
<210> 392
<211> 5
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički 5xHis tag"
<400> 392
<210> 393
<211> 692
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 393
<211> 449
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 394
<211> 216
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<220>
<221> MOD_RES
<222> (201)..(201)
<223> Bilo koja aminokiselina
<400> 395
<211> 7
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički peptid”
<400> 396
<210> 397
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički peptid”
<400> 397
<210> 398
<211> 5
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički peptid”
<400> 398
<210> 399
<211> 19
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički peptid”
<210> 400
<211> 9
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički peptid”
<400> 400
<210> 401
<211> 120
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 401
<211> 19
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički peptid”
<400> 402
<210> 403
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 403
<211> 450
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 404
<211> 119
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 405
<210> 406
<211> 109
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 406
<211> 674
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 407
<211> 449 <212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 408
<211> 215
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 409
<211> 118 <212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 410
<210> 411
<211> 111
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<210> 412
<211> 673
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 412
<211> 448
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 413
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 414
<211> 360
<212> DNK
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polinukleotid"
<400> 415
<211> 2067
<212> DNK
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polinukleotid"
<400> 416
<211> 1350
<212> DNK
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polinukleotid"
<400> 417
<211> 357
<212> DNK
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polinukleotid"
<400> 418
<211> 327
<212> DNK
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polinukleotid"
<400> 419
<210> 420
<211> 2022
<212> DNK
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polinukleotid"
<400> 420
Ċ
<211> 1347
<212> DNK
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polinukleotid"
<400> 421
<211> 645
<212> DNK
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polinukleotid"
<400> 422
<211> 354
<212> DNK
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polinukleotid"
<400> 423
<210> 424
<211> 333
<212> DNK
<213> Veštačka sekvenca
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polinukleotid"
<400> 424
<210> 425
<211> 2019
<212> DNK
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polinukleotid"
<400> 425
<211> 1344
<212> DNK
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polinukleotid"
<400> 426
<210> 427
<211> 654
<212> DNK
<213> Veštačka sekvenca
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polinukleotid"
<400> 427
<210> 428
<211> 104
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički polipeptid”
<400> 428
<211> 27
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički peptid”
<220>
<221> VARIANT
<222> (13)..(24)
<223> /zameni=" "
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(24)
<223> /napomena="Ova sekvenca može da obuhvati 3-6 ponovljenih jedinica"
<220>
<221> VARIANT
<222> (25)..(27)
<223> /zameni=" "
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(27)
<223> /napomena=„Ostaci varijantnog oblika dati u sekvenci nemaju prednost u odnosu na one date u napomenama za položaje varijanti”
<400> 429
<210> 430
<211> 28
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /napomena=”Opis veštačke sekvence: sintetički peptid”
<220>
<221> VARIANT
<222> (11)..(25)
<223> /zameni=" "
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(25)
<223> /napomena="Ova sekvenca može da obuhvati 2-5
ponovljenih jedinica"
<220>
<221> VARIANT
<222> (26)..(28)
<223> /zameni=" "
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(28)
<223> /napomena=„Ostaci varijantnog oblika dati u sekvenci nemaju prednost u odnosu na one date u napomenama za položaje varijanti”
<400> 430

Claims (15)

PATENTNI ZAHTEVI
1. Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije za upotrebu u sklopu postupaka lečenja raka, pri čemu bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije se koristi sa antagonistom vezivanja ose PD-1, pri čemu bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije sadrži najmanje dva antigen vezujuća dela, od kojih je jedan ukršteni Fab molekul a drugi konvencionalni Fab molekul, pri čemu bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije dalje sadrži Fc domen koji sadrži prvu i drugu podjedinicu koje su sposobne za stabilno vezivanje, pri čemu prvi antigen vezujući molekul sadrži prvi antigen vezujući deo koji je sposoban da se veže za CD3 koji sadrži najmanje jednu aminokiselinsku sekvencu regiona koji određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 i SEQ ID NO: 39, i najmanje jedan CDR lakog lanca odabran iz grupe koja obuhvata SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, pri čemu je prvi antigen vezujući deo spojen na C-kraju Fab teškog lanca sa N-krajem prve ili druge podjedinice Fc domena, a drugi antigen vezujući deo je spojen na C-kraju Fab teškog lanca sa N-krajem Fab teškog lanca prvog antigen vezujućeg dela, pri čemu antagonist vezivanja ose PD-1 inhibira vezivanje PD-1 za njegove partnere za vezivanje liganda, pri čemu je antagonist vezivanja ose PD-1 izabran iz grupe koja se sastoji od anti-PD-1 antitela, anti-PD-L1 antitela i anti-PD-L2 antitela.
2. Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije za upotrebu prema zahtevu 1, pri čemu prvi antigen vezujući molekul sadrži varijabilni teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 36, i varijabilni laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 31.
3. Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije za upotrebu prema zahtevu 1 ili 2, pri čemu anti-PD-L1 antitelo je monoklonsko antitelo.
4. Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 do 3, pri čemu anti-PD-L1 antitelo je fragment antitela izabran iz grupe koja se sastoji od fragmenata Fab, Fab'-SH, Fv, scFv i (Fab')2.
5. Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 do 4, pri čemu anti-PD-L1 antitelo je humanizovano antitelo ili humano antitelo.
6. Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 do 5, pri čemu anti-PDL1 antitelo sadrži teški lanac koji sadrži HVR-H1 sekvencu SEQ ID NO: 289, HVR-H2 sekvencu SEQ ID NO: 290 i HVR-H3 sekvencu SEQ ID NO: 291; i laki lanac koji sadrži HVR-L1 sekvencu SEQ ID NO: 292, HVR-L2 sekvencu SEQ ID NO: 293, i HVR-L3 sekvencu SEQ ID NO: 294.
7. Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 do 6, pri čemu antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 280 ili SEQ ID NO: 281 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 383.
8. Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 do 7, koji nadalje podrazumeva davanje pojedincu antagonista T ćelijskog imunoglobina mucina 3 (TIM3), pri čemu, antagonist TIM3 je anti-TIM3 antitelo.
9. Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije za upotrebu prema zahtevu 8, pri čemu anti-TIM3 antagonist je monoklonsko antitelo.
10. Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije za upotrebu prema zahtevu 8 ili 9, pri čemu anti-TIM3 antitelo je humano, humanizovano ili himerno antitelo.
11. Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije za upotrebu prema bilo kom zahtevu 8 do 10, pri čemu anti-TIM3 antitelo je fragment antitela koji se vezuje za TIM3.
12. Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije za upotrebu prema bilo kom zahtevu 8 do 11, pri čemu anti-TIM3 antitelo je fragment Fab.
13. Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 12, pri čemu je rak odabran iz grupe koju čine rak jajnika, rak pluća, rak dojke, rak bubrega, kolorektalni rak, rak endometrijuma.
14. Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 do 13, pri čemu najmanje jedan od bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije i antagonista za vezivanje ose PD-1 se primenjuje intravenski, intramuskularno, supkutano, topikalno, oralno, transdermalno, intraperitonealno, intraorbitalno, implantacijom, inhalacijom, intratekalno, intraventrikularno ili intranazalno.
15. Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije za upotrebu prema bilo kom zahtevu 1 do 14, pri čemu T ćelije kod pojedinca imaju pojačanu aktivaciju, proliferaciju i/ili efektorsku funkciju u odnosu na vreme pre primene kombinacije.
RS20240809A 2014-11-20 2015-11-16 Kombinovana terapija bispecifičnim antigen vezujućim molekulima koji aktiviraju t ćelije i antagonistima vezivanja ose pd-1 RS65752B1 (sr)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP14194136 2014-11-20
EP15152141 2015-01-22
EP15167173 2015-05-11
EP22183523.4A EP4141032B1 (en) 2014-11-20 2015-11-16 Combination therapy of t cell activating bispecific antigen binding molecules and pd-1 axis binding antagonists

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS65752B1 true RS65752B1 (sr) 2024-08-30

Family

ID=54695692

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20240809A RS65752B1 (sr) 2014-11-20 2015-11-16 Kombinovana terapija bispecifičnim antigen vezujućim molekulima koji aktiviraju t ćelije i antagonistima vezivanja ose pd-1
RS20220833A RS63564B1 (sr) 2014-11-20 2015-11-16 Kombinovana terapija bispecifičnim antigen vezujućim molekulima koji aktiviraju t ćelije i antagonistima vezivanja ose pd-1
RS20201436A RS61134B1 (sr) 2014-11-20 2015-11-16 Kombinovana terapija bispecifičnim antigen vezujućim molekulima koji aktiviraju t ćelije za cd3 i folatni receptor 1 (folr1), i antagonistima vezivanja ose pd-1

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20220833A RS63564B1 (sr) 2014-11-20 2015-11-16 Kombinovana terapija bispecifičnim antigen vezujućim molekulima koji aktiviraju t ćelije i antagonistima vezivanja ose pd-1
RS20201436A RS61134B1 (sr) 2014-11-20 2015-11-16 Kombinovana terapija bispecifičnim antigen vezujućim molekulima koji aktiviraju t ćelije za cd3 i folatni receptor 1 (folr1), i antagonistima vezivanja ose pd-1

Country Status (23)

Country Link
US (2) US10781262B2 (sr)
EP (3) EP4141032B1 (sr)
JP (2) JP6944369B2 (sr)
KR (2) KR102665542B1 (sr)
CN (1) CN107206072B (sr)
AU (1) AU2015348657B2 (sr)
CA (1) CA2966566C (sr)
DK (3) DK3789402T3 (sr)
ES (3) ES2926673T3 (sr)
FI (1) FI4141032T3 (sr)
HR (3) HRP20201928T1 (sr)
HU (3) HUE059632T2 (sr)
IL (1) IL251961B (sr)
LT (3) LT3789402T (sr)
MX (1) MX387463B (sr)
MY (1) MY192999A (sr)
PL (3) PL4141032T3 (sr)
RS (3) RS65752B1 (sr)
RU (1) RU2753902C2 (sr)
SG (1) SG11201704056XA (sr)
SI (3) SI3221355T1 (sr)
WO (1) WO2016079050A1 (sr)
ZA (1) ZA201703121B (sr)

Families Citing this family (85)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US12466897B2 (en) 2011-10-10 2025-11-11 Xencor, Inc. Heterodimeric human IgG1 polypeptides with isoelectric point modifications
US11053316B2 (en) 2013-01-14 2021-07-06 Xencor, Inc. Optimized antibody variable regions
US9605084B2 (en) 2013-03-15 2017-03-28 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US10487155B2 (en) 2013-01-14 2019-11-26 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US10968276B2 (en) 2013-03-12 2021-04-06 Xencor, Inc. Optimized anti-CD3 variable regions
KR102211837B1 (ko) 2013-01-14 2021-02-03 젠코어 인코포레이티드 신규한 이형이량체 단백질
US10858417B2 (en) 2013-03-15 2020-12-08 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US10519242B2 (en) 2013-03-15 2019-12-31 Xencor, Inc. Targeting regulatory T cells with heterodimeric proteins
SG10201804945WA (en) 2013-12-12 2018-07-30 Shanghai hengrui pharmaceutical co ltd Pd-1 antibody, antigen-binding fragment thereof, and medical application thereof
EP3699195A3 (en) 2014-03-28 2020-11-04 Xencor, Inc. Bispecific antibodies that bind to cd38 and cd3
EP4141032B1 (en) 2014-11-20 2024-05-29 F. Hoffmann-La Roche AG Combination therapy of t cell activating bispecific antigen binding molecules and pd-1 axis binding antagonists
EP3223907A2 (en) 2014-11-26 2017-10-04 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind cd3 and cd38
PE20171324A1 (es) 2014-11-26 2017-09-11 Xencor Inc Anticuerpos heterodimericos que se unen a cd3 y a antigenos tumorales
US10259887B2 (en) 2014-11-26 2019-04-16 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind CD3 and tumor antigens
WO2016105450A2 (en) 2014-12-22 2016-06-30 Xencor, Inc. Trispecific antibodies
US10227411B2 (en) 2015-03-05 2019-03-12 Xencor, Inc. Modulation of T cells with bispecific antibodies and FC fusions
US10426847B2 (en) 2015-03-26 2019-10-01 Oncosec Medical Incorporated Method for the treatment of malignancies
WO2017055404A1 (en) 2015-10-02 2017-04-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific antibodies specific for pd1 and tim3
CA3007030A1 (en) 2015-12-07 2017-06-15 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind cd3 and psma
IL260021B (en) 2015-12-14 2022-09-01 Macrogenics Inc Bispecific molecules that are immunoreactive for pd1 and ctla4 and methods for using them
KR20250071286A (ko) 2016-01-10 2025-05-21 네오티엑스 테라퓨틱스 엘티디. 면역강화제에 의해 증진되는 초항원 매개된 암 면역요법
EP3464360B1 (en) 2016-05-27 2025-11-12 Agenus Inc. Anti-tim-3 antibodies and methods of use thereof
MX2018014950A (es) * 2016-06-07 2019-04-25 Macrogenics Inc Terapia de combinacion.
JP7010854B2 (ja) 2016-06-14 2022-01-26 ゼンコア インコーポレイテッド 二重特異性チェックポイント阻害剤抗体
RU2769282C2 (ru) 2016-06-20 2022-03-30 Кимаб Лимитед Анти-PD-L1 и IL-2 цитокины
CN109715663B (zh) 2016-06-28 2022-11-25 Xencor股份有限公司 结合生长抑素受体2的异源二聚抗体
US10793632B2 (en) 2016-08-30 2020-10-06 Xencor, Inc. Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors
DK3523416T3 (da) * 2016-10-05 2025-03-03 Univ Central Florida Res Found Inc Fremgangsmåder og sammensætninger relateret til nk-celle- og anti-pdl1-kræftbehandlinger
MY203000A (en) 2016-10-14 2024-06-01 Xencor Inc Il15/il15r� heterodimeric fc-fusion proteins
WO2018108759A1 (en) 2016-12-13 2018-06-21 F. Hoffmann-La Roche Ag Method to determine the presence of a target antigen in a tumor sample
MY201482A (en) 2017-04-03 2024-02-26 Hoffmann La Roche Immunoconjugates of an anti-pd-1 antibody with a mutant il-2 or with il-15
JP6997209B2 (ja) 2017-04-04 2022-02-04 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト Ｃｄ４０およびｆａｐに特異的に結合することができる新規な二重特異性抗原結合分子
EP4516809A3 (en) 2017-04-05 2025-09-03 F. Hoffmann-La Roche AG Bispecific antibodies specifically binding to pd1 and lag3
KR102294136B1 (ko) * 2017-04-05 2021-08-26 에프. 호프만-라 로슈 아게 항-lag3 항체
US20180333503A1 (en) * 2017-05-16 2018-11-22 Immunogen, Inc. Anti-folr1 immunoconjugates and anti-pd-1 antibody combinations
CN111051346A (zh) * 2017-05-31 2020-04-21 斯特库伯株式会社 使用免疫特异性结合btn1a1的抗体和分子治疗癌症的方法
KR20200041834A (ko) * 2017-06-01 2020-04-22 젠코어 인코포레이티드 Cd123 및 cd3에 결합하는 이중특이성 항체
EP3645738A4 (en) * 2017-06-25 2021-08-18 Systimmune, Inc. ANTI-PD-L1 ANTIBODIES AND METHOD FOR MANUFACTURING AND USING THEREOF
WO2019006472A1 (en) 2017-06-30 2019-01-03 Xencor, Inc. TARGETED HETETRODIMERIC FUSION PROTEINS CONTAINING IL-15 / IL-15RA AND ANTIGEN-BINDING DOMAINS
BR112020007630A2 (pt) * 2017-11-01 2020-11-17 F. Hoffmann-La Roche Ag anticorpo biespecífico ox40, produto farmacêutico, composição farmacêutica e anticorpos biespecíficos anti-fap/ anti-ox40
JP2021502100A (ja) 2017-11-08 2021-01-28 ゼンコア インコーポレイテッド 新規抗ｐｄ−１配列を用いた二重特異性および単一特異性抗体
US10981992B2 (en) 2017-11-08 2021-04-20 Xencor, Inc. Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors
EP3710482A4 (en) * 2017-11-14 2021-08-18 University Of Virginia Patent Foundation COMPOSITIONS AND METHODS OF MANUFACTURING AND USING BISPECIFIC ANTIBODIES
KR20200099135A (ko) * 2017-12-14 2020-08-21 에프. 호프만-라 로슈 아게 Cea cd3 이중특이성 항체 및 pd-1 축 결합 길항제의 암 치료를 위한 투약 요법에서의 용도
IL275426B2 (en) 2017-12-19 2025-03-01 Xencor Inc Engineered il-2 fc fusion proteins
CN109971724B (zh) * 2017-12-28 2023-10-31 上海细胞治疗研究院 靶向ErbB受体家族且自表达PD-1抗体的CAR-T细胞及其用途
IL325995A (en) * 2018-02-08 2026-03-01 Genentech Inc Bispecific antigen binding molecules and methods of use
WO2019153200A1 (zh) * 2018-02-08 2019-08-15 北京韩美药品有限公司 抗pd-1/抗her2天然抗体结构样异源二聚体形式双特异抗体及其制备
AU2019236091B2 (en) * 2018-03-13 2025-06-05 Phanes Therapeutics, Inc. Anti-folate receptor 1 antibodies and uses thereof
US10752691B2 (en) * 2018-03-13 2020-08-25 Tusk Therapeutics Ltd. Anti-CD25 antibody agents
KR102275930B1 (ko) * 2018-03-14 2021-07-12 (주)알테오젠 Folr1에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 용도
PE20210377A1 (es) * 2018-03-29 2021-03-02 I Mab Biopharma Us Ltd Anticuerpos anti-pd-l1 y usos de los mismos
CA3096052A1 (en) 2018-04-04 2019-10-10 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind fibroblast activation protein
SG11202007961QA (en) 2018-04-13 2020-09-29 Hoffmann La Roche Her2-targeting antigen binding molecules comprising 4-1bbl
CN112384243A (zh) * 2018-04-17 2021-02-19 英温拉公司 三价三特异性抗体构建体
SG11202010163QA (en) 2018-04-18 2020-11-27 Xencor Inc Pd-1 targeted heterodimeric fusion proteins containing il-15/il-15ra fc-fusion proteins and pd-1 antigen binding domains and uses thereof
EP3781598A1 (en) 2018-04-18 2021-02-24 Xencor, Inc. Tim-3 targeted heterodimeric fusion proteins containing il-15/il-15ra fc-fusion proteins and tim-3 antigen binding domains
AU2019355971B2 (en) 2018-10-03 2025-05-08 Xencor, Inc. IL-12 heterodimeric Fc-fusion proteins
KR20210091714A (ko) * 2018-10-17 2021-07-22 이뮤놈 인코포레이티드 엑소좀-표적 이중 특이적 항체
CA3118789A1 (en) * 2018-11-06 2020-05-14 Genmab A/S Antibody formulation
CR20210330A (es) * 2018-12-21 2021-07-20 Hoffmann La Roche ANTICUERPOS QUE SE UNEN A CD3 (Divisional 2021-0325)
UA128001C2 (uk) 2018-12-21 2024-03-06 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Націлені на пухлину агоністичні cd28-антигензв'язувальні молекули
CN114409798A (zh) * 2019-02-14 2022-04-29 美勒斯公司 制备包含两种或更多种抗体的组合物
JP2022520632A (ja) * 2019-02-15 2022-03-31 インテグラル・モレキュラー・インコーポレイテッド 共通軽鎖を含む抗体及びその使用
CA3132185A1 (en) 2019-03-01 2020-09-10 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind enpp3 and cd3
CN111714618B (zh) * 2019-03-22 2024-07-12 香雪生命科学技术（广东）有限公司 T细胞和高亲和力pd-1融合蛋白的组合
NZ781538A (en) 2019-04-24 2025-12-19 Heidelberg Pharma Res Gmbh Amatoxin antibody-drug conjugates and uses thereof
SE544000C2 (en) * 2020-03-17 2021-10-26 Xbrane Biopharma Ab Novel combination of tis sequence, signal peptide sequence and nucleic acid sequence encoding a recombinant protein
SE544001C2 (en) * 2020-03-17 2021-10-26 Xbrane Biopharma Ab Novel combination of tis sequences, signal peptide sequences and nucleic acid sequences encoding heavy and light chains of an antibody
US20230090156A1 (en) * 2020-04-27 2023-03-23 Nanyang Technological University HUMANIZED MONOCLONAL ANTIBODY AGAINST cANGPTL4
WO2021231976A1 (en) 2020-05-14 2021-11-18 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind prostate specific membrane antigen (psma) and cd3
CN116102644B (zh) * 2020-05-19 2025-06-03 益科思特(北京)医药科技发展有限公司 抗新型冠状病毒Spike蛋白抗体及其应用
CN115776898A (zh) * 2020-07-07 2023-03-10 百奥泰生物制药股份有限公司 双特异性抗体及其应用
MX2023000662A (es) * 2020-07-17 2023-02-27 Pfizer Anticuerpos terapeuticos y sus usos.
CA3192204A1 (en) 2020-08-19 2022-02-24 Xencor, Inc. Anti-cd28 and/or anti-b7h3 compositions
US20220133902A1 (en) * 2020-11-04 2022-05-05 Heidelberg Pharma Research Gmbh Composition Comprising a Combination of Immune Checkpoint Inhibitor and Antibody-Amatoxin Conjugate for Use in Cancer Therapy
TW202233684A (zh) * 2020-11-18 2022-09-01 美商泰尼歐生物公司 結合於葉酸受體α之重鏈抗體
US11739144B2 (en) 2021-03-09 2023-08-29 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind CD3 and CLDN6
EP4305065A1 (en) 2021-03-10 2024-01-17 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind cd3 and gpc3
CN117241832A (zh) 2021-03-19 2023-12-15 海德堡医药研究有限责任公司 B淋巴细胞特异性的鹅膏毒素抗体缀合物
CN114181311B (zh) * 2021-12-20 2023-06-20 华东师范大学 一种全人源抗DLL3 scFv及其在CART细胞治疗中的应用
CN114807031A (zh) * 2022-05-13 2022-07-29 山东赛恩福干细胞工程集团有限公司 一种人外周血免疫细胞库和干细胞库的构建方法
CN121851177A (zh) * 2023-12-11 2026-04-14 合肥天港免疫药物有限公司 双特异性抗体及其应用
WO2025181189A1 (en) 2024-03-01 2025-09-04 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies binding to cd3
CN119264262B (zh) * 2024-09-19 2025-09-02 中山大学 一种双特异性抗体及其应用

Family Cites Families (231)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1247080A (en) 1983-03-08 1988-12-20 Commonwealth Serum Laboratories Commission Antigenically active amino acid sequences
NZ207394A (en) 1983-03-08 1987-03-06 Commw Serum Lab Commission Detecting or determining sequence of amino acids
WO1984003506A1 (en) 1983-03-08 1984-09-13 Commw Serum Lab Commission Antigenically active amino acid sequences
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
NZ215865A (en) 1985-04-22 1988-10-28 Commw Serum Lab Commission Method of determining the active site of a receptor-binding analogue
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
US5202238A (en) 1987-10-27 1993-04-13 Oncogen Production of chimeric antibodies by homologous recombination
US5204244A (en) 1987-10-27 1993-04-20 Oncogen Production of chimeric antibodies by homologous recombination
US5571689A (en) 1988-06-16 1996-11-05 Washington University Method of N-acylating peptide and proteins with diheteroatom substituted analogs of myristic acid
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
US5663143A (en) 1988-09-02 1997-09-02 Dyax Corp. Engineered human-derived kunitz domains that inhibit human neutrophil elastase
EP0368684B2 (en) 1988-11-11 2004-09-29 Medical Research Council Cloning immunoglobulin variable domain sequences.
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
WO1991003493A1 (en) 1989-08-29 1991-03-21 The University Of Southampton Bi-or trispecific (fab)3 or (fab)4 conjugates
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
AU668347B2 (en) 1990-11-21 1996-05-02 Torrey Pines Institute For Molecular Studies Synthesis of equimolar multiple oligomer mixtures, especially of oligopeptide mixtures
CA2095633C (en) 1990-12-03 2003-02-04 Lisa J. Garrard Enrichment method for variant proteins with altered binding properties
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
EP1400536A1 (en) 1991-06-14 2004-03-24 Genentech Inc. Method for making humanized antibodies
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
GB9114948D0 (en) 1991-07-11 1991-08-28 Pfizer Ltd Process for preparing sertraline intermediates
US5565332A (en) 1991-09-23 1996-10-15 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
FI941572A7 (fi) 1991-10-07 1994-05-27 Oncologix Inc Anti-erbB-2-monoklonaalisten vasta-aineiden yhdistelmä ja käyttömenete lmä
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
CA2372813A1 (en) 1992-02-06 1993-08-19 L.L. Houston Biosynthetic binding protein for cancer marker
US5798100A (en) 1994-07-06 1998-08-25 Immunomedics, Inc. Multi-stage cascade boosting vaccine
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5547668A (en) 1995-05-05 1996-08-20 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Conjugates of folate anti-effector cell antibodies
JPH11507535A (ja) 1995-06-07 1999-07-06 イムクローン システムズ インコーポレイテッド 腫瘍の成長を抑制する抗体および抗体フラグメント類
US6267958B1 (en) 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
US7423125B2 (en) 1995-08-01 2008-09-09 Vegenics Limited Antibodies to VEGF-C
GB9603256D0 (en) 1996-02-16 1996-04-17 Wellcome Found Antibodies
ATE299938T1 (de) 1997-05-02 2005-08-15 Genentech Inc Ein verfahren zur herstellung multispezifischer antikörper die heteromultimere und gemeinsame komponenten besitzen
US6171586B1 (en) 1997-06-13 2001-01-09 Genentech, Inc. Antibody formulation
ES2244066T3 (es) 1997-06-24 2005-12-01 Genentech, Inc. Procedimiento y composiciones de glicoproteinas galactosiladas.
US6040498A (en) 1998-08-11 2000-03-21 North Caroline State University Genetically engineered duckweed
AU759779B2 (en) 1997-10-31 2003-05-01 Genentech Inc. Methods and compositions comprising glycoprotein glycoforms
US6610833B1 (en) 1997-11-24 2003-08-26 The Institute For Human Genetics And Biochemistry Monoclonal human natural antibodies
DK1034298T3 (da) 1997-12-05 2012-01-30 Scripps Research Inst Humanisering af murint antistof
PT1049787E (pt) 1998-01-23 2005-04-29 Vlaams Interuniv Inst Biotech Derivados de anticorpos multipropositos
DK1071700T3 (da) 1998-04-20 2010-06-07 Glycart Biotechnology Ag Glykosylerings-modifikation af antistoffer til forbedring af antistofafhængig cellulær cytotoksicitet
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
CA2704600C (en) 1999-04-09 2016-10-25 Kyowa Kirin Co., Ltd. A method for producing antibodies with increased adcc activity
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
ES2248127T3 (es) 1999-10-04 2006-03-16 Medicago Inc. Metodo para regular la transcripcion de genes foraneos en presencia de nigtrogeno.
EP1229125A4 (en) 1999-10-19 2005-06-01 Kyowa Hakko Kogyo Kk PROCESS FOR PREPARING A POLYPEPTIDE
EP1240319A1 (en) 1999-12-15 2002-09-18 Genentech, Inc. Shotgun scanning, a combinatorial method for mapping functional protein epitopes
JP2003531588A (ja) 2000-04-11 2003-10-28 ジェネンテック・インコーポレーテッド 多価抗体とその用途
US6773883B2 (en) 2000-07-31 2004-08-10 The Brigham & Women's Hospital, Inc. Prognostic classification of endometrial cancer
CA2953239A1 (en) 2000-10-06 2002-04-18 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Antibody composition-producing cell
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
US7064191B2 (en) 2000-10-06 2006-06-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for purifying antibody
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
CA2430013C (en) 2000-11-30 2011-11-22 Medarex, Inc. Transgenic transchromosomal rodents for making human antibodies
NZ571596A (en) 2001-08-03 2010-11-26 Glycart Biotechnology Ag Antibody glycosylation variants having increased antibody-dependent cellular cytotoxicity
CA2463879C (en) 2001-10-25 2012-12-04 Genentech, Inc. Glycoprotein compositions
US20040093621A1 (en) 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
US7470428B2 (en) 2002-01-30 2008-12-30 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Compositions and methods related to TIM-3, a Th1-specific cell surface molecule
US7432063B2 (en) 2002-02-14 2008-10-07 Kalobios Pharmaceuticals, Inc. Methods for affinity maturation
EP1498490A4 (en) 2002-04-09 2006-11-29 Kyowa Hakko Kogyo Kk PROCESS FOR PREPARING ANTIBODY COMPOSITION
CA2481658A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Method of enhancing of binding activity of antibody composition to fcy receptor iiia
ATE503829T1 (de) 2002-04-09 2011-04-15 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Zelle mit erniedrigter oder deletierter aktivität eines am gdp-fucosetransport beteiligten proteins
EP1500400A4 (en) 2002-04-09 2006-10-11 Kyowa Hakko Kogyo Kk MEDICAMENT WITH ANTIBODY COMPOSITION
CA2481925A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Therapeutic agent for patients having human fc.gamma.riiia
BR0309145A (pt) 2002-04-09 2005-02-01 Kyowa Hakko Kogyo Kk Células das quais o genoma é modificado
CA2488441C (en) 2002-06-03 2015-01-27 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
TWI335821B (en) 2002-12-16 2011-01-11 Genentech Inc Immunoglobulin variants and uses thereof
WO2004065416A2 (en) 2003-01-16 2004-08-05 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
EP2248892B1 (en) 2003-01-22 2015-04-22 Roche Glycart AG Fusion constructs and use of same to produce antibodies with increased FC receptor binding affinity and effector function
US7871607B2 (en) 2003-03-05 2011-01-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases
US20060104968A1 (en) 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
AU2004249673A1 (en) 2003-05-23 2004-12-29 Morphotek, Inc. Anti alpha - folate - receptor - tetramer antibodies
CA2541006C (en) 2003-10-03 2015-02-17 Brigham And Women's Hospital Tim-3 polypeptides
JPWO2005035586A1 (ja) 2003-10-08 2007-11-22 協和醗酵工業株式会社 融合蛋白質組成物
JPWO2005035778A1 (ja) 2003-10-09 2006-12-21 協和醗酵工業株式会社 α１，６−フコシルトランスフェラーゼの機能を抑制するＲＮＡを用いた抗体組成物の製造法
US9296820B2 (en) 2003-11-05 2016-03-29 Roche Glycart Ag Polynucleotides encoding anti-CD20 antigen binding molecules with increased Fc receptor binding affinity and effector function
WO2005053742A1 (ja) 2003-12-04 2005-06-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. 抗体組成物を含有する医薬
EP3101034A1 (en) 2004-02-12 2016-12-07 Morphotek, Inc. Monoclonal antibodies that specifically bind to folate receptor alpha
EP1740615B1 (en) 2004-03-31 2014-11-05 Genentech, Inc. Humanized anti-tgf-beta antibodies
US7785903B2 (en) 2004-04-09 2010-08-31 Genentech, Inc. Variable domain library and uses
PT1737891E (pt) 2004-04-13 2013-04-16 Hoffmann La Roche Anticorpos anti p-selectina
TWI380996B (zh) 2004-09-17 2013-01-01 Hoffmann La Roche 抗ｏｘ４０ｌ抗體
DK1791565T3 (en) 2004-09-23 2016-08-01 Genentech Inc Cysteingensplejsede antibodies and conjugates
JO3000B1 (ar) 2004-10-20 2016-09-05 Genentech Inc مركبات أجسام مضادة .
PL1871805T3 (pl) 2005-02-07 2020-03-31 Roche Glycart Ag Cząsteczki wiążące antygen, które wiążą egfr, wektory kodujące te cząsteczki oraz ich zastosowania
US7608413B1 (en) 2005-03-25 2009-10-27 Celera Corporation Kidney disease targets and uses thereof
AU2006232287B2 (en) 2005-03-31 2011-10-06 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for producing polypeptides by regulating polypeptide association
CA2607444C (en) 2005-04-22 2015-03-10 Morphotek, Inc. Antibodies with immune effector activity and that internalize in folate receptor alpha-positive cells
PL1874821T3 (pl) 2005-04-26 2013-09-30 Trion Pharma Gmbh Kombinacja przeciwciał i glikokortykoidów do leczenia raka
DK2439273T3 (da) 2005-05-09 2019-06-03 Ono Pharmaceutical Co Humane monoklonale antistoffer til programmeret død-1(pd-1) og fremgangsmåder til behandling af cancer ved anvendelse af anti-pd-1- antistoffer alene eller i kombination med andre immunterapeutika
BRPI0611445A2 (pt) 2005-05-09 2010-09-08 Glycart Biotechnology Ag molécula de ligação a antìgeno glicomanipulada, polinucleotìdeo, polipeptìdeo, vetor, célula hospedeira, método para produção, uso e composição farmacêutica
PT1907424E (pt) 2005-07-01 2015-10-09 Squibb & Sons Llc Anticorpos monoclonais humanos para o ligando 1 de morte programada (pd-l1)
NZ612578A (en) 2005-08-19 2014-11-28 Abbvie Inc Dual variable domain immunoglobin and uses thereof
EP1940881B1 (en) 2005-10-11 2016-11-30 Amgen Research (Munich) GmbH Compositions comprising cross-species-specific antibodies and uses thereof
ES2577292T3 (es) 2005-11-07 2016-07-14 Genentech, Inc. Polipéptidos de unión con secuencias hipervariables de VH/VL diversificadas y consenso
EP1973951A2 (en) 2005-12-02 2008-10-01 Genentech, Inc. Binding polypeptides with restricted diversity sequences
SG153825A1 (en) 2005-12-16 2009-07-29 Ibc Pharmaceuticals Inc Multivalent immunoglobulin-based bioactive assemblies
PT1999154E (pt) 2006-03-24 2013-01-24 Merck Patent Gmbh Domínios proteicos heterodiméricos modificados
TW200812616A (en) 2006-05-09 2008-03-16 Genentech Inc Binding polypeptides with optimized scaffolds
NZ573646A (en) 2006-06-12 2012-04-27 Wyeth Llc Single-chain multivalent binding proteins with effector function
JP2009541275A (ja) 2006-06-22 2009-11-26 ノボ・ノルデイスク・エー／エス 二重特異性抗体の生産
WO2008027236A2 (en) 2006-08-30 2008-03-06 Genentech, Inc. Multispecific antibodies
EP1900752A1 (en) 2006-09-15 2008-03-19 DOMPE' pha.r.ma s.p.a. Human anti-folate receptor alpha antibodies and antibody fragments for the radioimmunotherapy of ovarian carcinoma
US20080226635A1 (en) 2006-12-22 2008-09-18 Hans Koll Antibodies against insulin-like growth factor I receptor and uses thereof
MX2009010611A (es) 2007-04-03 2010-03-26 Micromet Ag Enlazadores biespecificos, especificos para especies.
RS53008B2 (sr) 2007-04-03 2022-12-30 Amgen Res Munich Gmbh Interspecijski specifičan cd3-epsilon vezujući domen
RU2769948C2 (ru) 2007-04-03 2022-04-11 Эмджен Рисерч (Мьюник) Гмбх CD3-Эпсилон-связывающий домен с межвидовой специфичностью
CN100592373C (zh) 2007-05-25 2010-02-24 群康科技(深圳)有限公司 液晶显示面板驱动装置及其驱动方法
WO2009070642A1 (en) 2007-11-28 2009-06-04 Medimmune, Llc Protein formulation
US20090162359A1 (en) 2007-12-21 2009-06-25 Christian Klein Bivalent, bispecific antibodies
US9266967B2 (en) 2007-12-21 2016-02-23 Hoffmann-La Roche, Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US8242247B2 (en) 2007-12-21 2012-08-14 Hoffmann-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US8227577B2 (en) 2007-12-21 2012-07-24 Hoffman-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
JP6157046B2 (ja) 2008-01-07 2017-07-05 アムジェン インコーポレイテッド 静電的ステアリング（ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃｓｔｅｅｒｉｎｇ）効果を用いた抗体Ｆｃヘテロ二量体分子を作製するための方法
EP3043181B1 (en) 2008-01-15 2020-04-08 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University Markers of acute myeloid leukemia stem cells
WO2009097394A2 (en) 2008-01-29 2009-08-06 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Methods for modulating a population of myeloid-derived suppressor cells and uses thereof
CN101970499B (zh) 2008-02-11 2014-12-31 治疗科技公司 用于肿瘤治疗的单克隆抗体
EP2262837A4 (en) 2008-03-12 2011-04-06 Merck Sharp & Dohme PD-1 BINDING PROTEINS
RU2474588C2 (ru) 2008-05-05 2013-02-10 Новиммун Са Перекрестно-реактивные антитела анти-il-17a/il-17f и способы их применения
JP2012500855A (ja) 2008-08-25 2012-01-12 アンプリミューン、インコーポレーテッド Ｐｄ−１アンタゴニストおよび感染性疾患を処置するための方法
EP3255060A1 (en) 2008-12-09 2017-12-13 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-pd-l1 antibodies and their use to enhance t-cell function
CA2756244A1 (en) 2009-04-02 2010-10-07 Roche Glycart Ag Multispecific antibodies comprising full length antibodies and single chain fab fragments
EP2417164A1 (en) 2009-04-07 2012-02-15 Roche Glycart AG Bispecific anti-erbb-2/anti-c-met antibodies
SG175077A1 (en) 2009-04-07 2011-11-28 Roche Glycart Ag Trivalent, bispecific antibodies
WO2010129304A2 (en) 2009-04-27 2010-11-11 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Method for making heteromultimeric molecules
PE20120540A1 (es) 2009-05-27 2012-05-09 Hoffmann La Roche Anticuerpos triespecificos o tetraespecificos
US9676845B2 (en) 2009-06-16 2017-06-13 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific antigen binding proteins
US8703132B2 (en) 2009-06-18 2014-04-22 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific, tetravalent antigen binding proteins
KR101528013B1 (ko) 2009-08-31 2015-06-16 로슈 글리카트 아게 친화성-성숙된 인간화된 항-ｃｅａ 단일클론 항체
WO2011028952A1 (en) 2009-09-02 2011-03-10 Xencor, Inc. Compositions and methods for simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of antigens
WO2011066342A2 (en) 2009-11-24 2011-06-03 Amplimmune, Inc. Simultaneous inhibition of pd-l1/pd-l2
PL2504364T3 (pl) 2009-11-24 2017-12-29 Medimmune Limited Ukierunkowane środki wiążące przeciwko B7-H1
CA2785907A1 (en) 2009-12-29 2011-07-28 Emergent Product Development Seattle, Llc Ron binding constructs and methods of use thereof
US20130045492A1 (en) 2010-02-08 2013-02-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods For Making Fully Human Bispecific Antibodies Using A Common Light Chain
TWI622402B (zh) * 2010-02-24 2018-05-01 免疫遺傳股份有限公司 葉酸受體１抗體類和免疫共軛物類及彼等之用途
TW201138821A (en) 2010-03-26 2011-11-16 Roche Glycart Ag Bispecific antibodies
US9527926B2 (en) 2010-05-14 2016-12-27 Rinat Neuroscience Corp. Heterodimeric proteins and methods for producing and purifying them
AU2011262758B8 (en) 2010-06-11 2014-09-04 Kyowa Kirin Co., Ltd. Anti-tim-3 antibody
WO2011159877A2 (en) * 2010-06-18 2011-12-22 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Bi-specific antibodies against tim-3 and pd-1 for immunotherapy in chronic immune conditions
CA2806021C (en) 2010-08-13 2019-05-21 Roche Glycart Ag Anti-fap antibodies and methods of use
ES2402254T3 (es) 2010-09-30 2013-04-30 Heidelberg Pharma Ag Conjugados de amatoxinas con ligadores mejorados
CN103347537A (zh) 2010-10-20 2013-10-09 莫弗泰克股份有限公司 抗叶酸受体α抗体糖型
ES2758994T3 (es) 2010-11-05 2020-05-07 Zymeworks Inc Diseño anticuerpo heterodimérico estable con mutaciones en el dominio Fc
MX343607B (es) 2010-11-05 2016-11-11 Morphotek Inc Receptor alfa de folato como marcador de diagnóstico y pronóstico para cánceres que expresan receptor alfa de folato.
PT3434767T (pt) 2010-11-30 2026-01-23 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Agente terapêutico indutor de citotoxicidade
US20120189620A1 (en) 2011-01-21 2012-07-26 Emory University Methods for treating non-functioning pituitary adenoma
SG192673A1 (en) 2011-02-10 2013-09-30 Roche Glycart Ag Mutant interleukin-2 polypeptides
ES2692268T5 (en) 2011-03-29 2025-02-26 Roche Glycart Ag Antibody fc variants
BR112013025415B1 (pt) 2011-04-01 2021-03-16 Immunogen, Inc uso de um imunoconjugado antirreceptor de folato 1 (folr1)
EA201892619A1 (ru) 2011-04-29 2019-04-30 Роше Гликарт Аг Иммуноконъюгаты, содержащие мутантные полипептиды интерлейкина-2
WO2012158818A2 (en) 2011-05-16 2012-11-22 Fabion Pharmaceuticals, Inc. Multi-specific fab fusion proteins and methods of use
KR102060389B1 (ko) 2011-05-21 2019-12-31 마크로제닉스, 인크. 사람 및 비-사람 cd3에 결합할 수 있는 cd3-결합 분자
WO2013006490A2 (en) 2011-07-01 2013-01-10 Cellerant Therapeutics, Inc. Antibodies that specifically bind to tim3
SI2731972T1 (en) 2011-07-15 2018-04-30 Eisai R&D Management Co., Ltd. Anti-folate receptor alpha antibodies and uses thereof
MX368257B (es) * 2011-08-01 2019-09-26 Genentech Inc Antagonistas de unión al eje pd-1e inhibidores de mek y sus usos en el tratamiento de cáncer.
NO2748201T3 (sr) 2011-08-23 2018-05-12
WO2013026837A1 (en) 2011-08-23 2013-02-28 Roche Glycart Ag Bispecific t cell activating antigen binding molecules
WO2013026839A1 (en) 2011-08-23 2013-02-28 Roche Glycart Ag Bispecific antibodies specific for t-cell activating antigens and a tumor antigen and methods of use
JP6060162B2 (ja) 2011-08-23 2017-01-11 ロシュ グリクアート アーゲー ２つのＦａｂフラグメントを含むＦｃ不含抗体および使用方法
EP2748202B1 (en) 2011-08-23 2018-07-04 Roche Glycart AG Bispecific antigen binding molecules
EP2578230A1 (en) 2011-10-04 2013-04-10 Trion Pharma Gmbh Removal of Tumor Cells from Intraoperative Autologous Blood Salvage
US10851178B2 (en) 2011-10-10 2020-12-01 Xencor, Inc. Heterodimeric human IgG1 polypeptides with isoelectric point modifications
RS60499B1 (sr) 2011-12-20 2020-08-31 Medimmune Llc Modifikovani polipeptidi za bispecifične skelete antitela
US9248181B2 (en) 2012-04-20 2016-02-02 Merus B.V. Methods and means for the production of Ig-like molecules
BR112014028306A2 (pt) 2012-05-15 2018-04-17 Morphotek, Inc. métodos para tratamento de câncer gástrico.
US20150203591A1 (en) 2012-08-02 2015-07-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mutivalent antigen-binding proteins
MY175687A (en) 2012-08-07 2020-07-06 Roche Glycart Ag Composition comprising two antibodies engineered to have reduced and increased effector function
US9682143B2 (en) * 2012-08-14 2017-06-20 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Combination therapy for inducing immune response to disease
CN104379169A (zh) 2012-08-14 2015-02-25 Ibc药品公司 用于治疗疾病的t-细胞重定向双特异性抗体
JOP20200236A1 (ar) 2012-09-21 2017-06-16 Regeneron Pharma الأجسام المضادة لمضاد cd3 وجزيئات ربط الأنتيجين ثنائية التحديد التي تربط cd3 وcd20 واستخداماتها
HUE042040T2 (hu) 2012-09-27 2019-06-28 Merus Nv Bispecifikus IGG antitestek mint T-sejt kapcsolók
RU2015117393A (ru) 2012-10-08 2016-12-10 Роше Гликарт Аг Лишенные fc антитела, содержащие два Fab-фрагмента, и способы их применения
UY35148A (es) 2012-11-21 2014-05-30 Amgen Inc Immunoglobulinas heterodiméricas
US9207238B2 (en) 2012-12-07 2015-12-08 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Anti-FOLR1 antibody
US9522196B2 (en) 2012-12-25 2016-12-20 Kagoshima University Antibody recognizing folate receptors α and β
US10968276B2 (en) 2013-03-12 2021-04-06 Xencor, Inc. Optimized anti-CD3 variable regions
US10131710B2 (en) 2013-01-14 2018-11-20 Xencor, Inc. Optimized antibody variable regions
US10487155B2 (en) 2013-01-14 2019-11-26 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US9605084B2 (en) 2013-03-15 2017-03-28 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
KR102211837B1 (ko) * 2013-01-14 2021-02-03 젠코어 인코포레이티드 신규한 이형이량체 단백질
US9701759B2 (en) 2013-01-14 2017-07-11 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
WO2014122143A1 (en) 2013-02-05 2014-08-14 Engmab Ag Method for the selection of antibodies against bcma
JO3529B1 (ar) 2013-02-08 2020-07-05 Amgen Res Munich Gmbh مضاد التصاق خلايا الدم البيض من أجل التخفيف من الاثار السلبية الممكنة الناتجة عن مجالات ارتباط cd3- المحدد
EP2961770A1 (en) 2013-02-26 2016-01-06 Roche Glycart AG Bispecific t cell activating antigen binding molecules
EP2961773B1 (en) 2013-02-26 2019-03-20 Roche Glycart AG Bispecific t cell activating antigen binding molecules
LT2961771T (lt) * 2013-02-26 2020-03-10 Roche Glycart Ag Bispecifinės t ląstelę aktyvinančios antigeną surišančios molekulės, specifinės cd3 ir cea antigenams
CN105283201B (zh) 2013-03-14 2019-08-02 斯克利普斯研究所 靶向剂抗体偶联物及其用途
US10858417B2 (en) 2013-03-15 2020-12-08 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
JP2016514676A (ja) 2013-03-15 2016-05-23 メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツングＭｅｒｃｋ Ｐａｔｅｎｔ Ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ｍｉｔ ｂｅｓｃｈｒａｅｎｋｔｅｒ Ｈａｆｔｕｎｇ 四価二重特異性抗体
US20140308285A1 (en) 2013-03-15 2014-10-16 Amgen Inc. Heterodimeric bispecific antibodies
US11634502B2 (en) 2013-03-15 2023-04-25 Amgen Inc. Heterodimeric bispecific antibodies
AU2014229282B2 (en) 2013-03-15 2017-02-02 Glaxosmithkline Intellectual Property (No.2) Limited Low concentration antibody formulations
US20140302037A1 (en) 2013-03-15 2014-10-09 Amgen Inc. BISPECIFIC-Fc MOLECULES
WO2014163684A1 (en) * 2013-04-03 2014-10-09 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Combination therapy for inducing immune response to disease
UA118028C2 (uk) 2013-04-03 2018-11-12 Рош Глікарт Аг Біспецифічне антитіло, специфічне щодо fap і dr5, антитіло, специфічне щодо dr5, і спосіб їх застосування
EP2789630A1 (en) 2013-04-09 2014-10-15 EngMab AG Bispecific antibodies against CD3e and ROR1
SG11201509361TA (en) 2013-05-28 2015-12-30 Numab Ag Novel antibodies
WO2015033223A2 (en) 2013-09-03 2015-03-12 Novimmune S.A. Readily isolated bispecific binding molecules with native format having mutated constant regions
US20160257748A1 (en) 2013-09-25 2016-09-08 Amgen Inc. V-c-fc-v-c antibody
IL263466B2 (en) 2013-12-17 2023-10-01 Genentech Inc Anti-CD3 antibodies and methods of using them
JP2017507900A (ja) 2013-12-17 2017-03-23 ジェネンテック， インコーポレイテッド Ｐｄ−１軸結合アンタゴニスト及び抗ｈｅｒ２抗体を使用してｈｅｒ２陽性がんを治療する方法
HUE045065T2 (hu) * 2014-01-31 2019-12-30 Novartis Ag TIM-3 antitest molekulák és felhasználásaik
UA117289C2 (uk) 2014-04-02 2018-07-10 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Мультиспецифічне антитіло
EP2982692A1 (en) 2014-08-04 2016-02-10 EngMab AG Bispecific antibodies against CD3epsilon and BCMA
EP3177643B1 (en) 2014-08-04 2019-05-08 F.Hoffmann-La Roche Ag Bispecific t cell activating antigen binding molecules
WO2016019969A1 (en) 2014-08-08 2016-02-11 Ludwig-Maximilians-Universität München Subcutaneously administered bispecific antibodies for use in the treatment of cancer
DK3186283T3 (da) 2014-08-29 2020-03-02 Hoffmann La Roche Kombinationsbehandling med tumormålrettede IL-2- immuncytokinervarianter og antistoffer mod humant PD-L1
WO2016036678A1 (en) 2014-09-02 2016-03-10 Medimmune, Llc Formulations of bispecific antibodies
MA40764A (fr) 2014-09-26 2017-08-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Agent thérapeutique induisant une cytotoxicité
EP3204415B1 (en) 2014-10-09 2020-06-17 EngMab Sàrl Bispecific antibodies against cd3epsilon and ror1
CA2963696A1 (en) 2014-10-09 2016-04-14 Engmab Ag Bispecific antibodies against cd3epsilon and ror1 for use in the treatment of ovarian cancer
DK3221357T3 (da) 2014-11-20 2020-08-10 Hoffmann La Roche Fælles letkæder og fremgangsmåder til anvendelse
PT3221356T (pt) 2014-11-20 2020-10-29 Hoffmann La Roche Moléculas de ligação ao antigénio biespecíficas ativadoras das células t contra folr1 e cd3
EP4141032B1 (en) 2014-11-20 2024-05-29 F. Hoffmann-La Roche AG Combination therapy of t cell activating bispecific antigen binding molecules and pd-1 axis binding antagonists
EP3023437A1 (en) 2014-11-20 2016-05-25 EngMab AG Bispecific antibodies against CD3epsilon and BCMA
EP3029068A1 (en) 2014-12-03 2016-06-08 EngMab AG Bispecific antibodies against CD3epsilon and BCMA for use in the treatment of diseases
EP3288981A1 (en) 2015-05-01 2018-03-07 Genentech, Inc. Masked anti-cd3 antibodies and methods of use
DK3310814T5 (da) 2015-06-16 2024-10-07 Hoffmann La Roche Humaniserede og affinitetsmodnede antistoffer mod FcRH5 og fremgangsmåder til anvendelse
SI3331910T1 (sl) 2015-08-03 2020-07-31 Engmab Sarl Monoklonska protitelesa proti humani antigen dozorevanja limfocitov B (BCMA)
PE20180484A1 (es) 2015-10-02 2018-03-07 Hoffmann La Roche Moleculas biespecificas de union a antigeno activadoras de celulas t
JP2018536389A (ja) 2015-10-02 2018-12-13 エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト メソテリンとｃｄ３に結合する二重特異性細胞活性化抗原結合分子
WO2017055314A1 (en) 2015-10-02 2017-04-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific anti-cd19xcd3 t cell activating antigen binding molecules
JP2018533930A (ja) 2015-10-02 2018-11-22 エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 二重特異性ｔ細胞活性化抗原結合分子
WO2017055318A1 (en) 2015-10-02 2017-04-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Cd33xcd3 bispecific t cell activating antigen binding molecules
IL313608A (en) 2015-12-09 2024-08-01 Hoffmann La Roche Antibody against CD20 type II to reduce the formation of antibodies against drugs

Also Published As

Publication number Publication date
RU2017121327A3 (sr) 2019-05-28
US11613587B2 (en) 2023-03-28
AU2015348657B2 (en) 2021-06-10
WO2016079050A1 (en) 2016-05-26
SI4141032T1 (sl) 2024-09-30
HUE067988T2 (hu) 2024-12-28
EP4141032A1 (en) 2023-03-01
US20210087291A1 (en) 2021-03-25
SI3221355T1 (sl) 2021-01-29
IL251961B (en) 2021-06-30
US10781262B2 (en) 2020-09-22
FI4141032T3 (fi) 2024-07-31
SG11201704056XA (en) 2017-06-29
CN107206072B (zh) 2022-01-21
PL3221355T3 (pl) 2021-03-08
RS61134B1 (sr) 2020-12-31
JP2018501204A (ja) 2018-01-18
PL4141032T3 (pl) 2024-09-16
LT3221355T (lt) 2020-12-28
EP3789402A1 (en) 2021-03-10
CA2966566A1 (en) 2016-05-26
HRP20221083T1 (hr) 2022-11-25
PL3789402T3 (pl) 2022-10-17
MX387463B (es) 2025-03-18
MY192999A (en) 2022-09-20
CA2966566C (en) 2024-03-19
EP3221355A1 (en) 2017-09-27
DK4141032T3 (da) 2024-08-05
DK3221355T3 (da) 2020-12-07
BR112017010324A2 (pt) 2018-05-15
KR20170081267A (ko) 2017-07-11
ES2984937T3 (es) 2024-10-31
LT3789402T (lt) 2022-09-26
RU2017121327A (ru) 2018-12-20
AU2015348657A1 (en) 2017-05-18
SI3789402T1 (sl) 2022-10-28
KR20240024318A (ko) 2024-02-23
HRP20240959T1 (hr) 2024-10-25
ZA201703121B (en) 2018-08-29
US20170349666A1 (en) 2017-12-07
ES2926673T3 (es) 2022-10-27
HUE059632T2 (hu) 2022-12-28
KR102665542B1 (ko) 2024-05-23
EP4141032B1 (en) 2024-05-29
RS63564B1 (sr) 2022-10-31
HRP20201928T1 (hr) 2021-02-05
EP3789402B1 (en) 2022-07-13
MX2017006610A (es) 2017-09-29
LT4141032T (lt) 2024-08-12
RU2753902C2 (ru) 2021-08-24
EP3221355B1 (en) 2020-10-07
CN107206072A (zh) 2017-09-26
JP2020183403A (ja) 2020-11-12
ES2835823T3 (es) 2021-06-23
HUE052831T2 (hu) 2021-05-28
DK3789402T3 (da) 2022-09-19
IL251961A0 (en) 2017-06-29
JP6944369B2 (ja) 2021-10-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11613587B2 (en) Combination therapy of T cell activating bispecific antigen binding molecules and PD-1 axis binding antagonists
US11214622B2 (en) Antibodies specific for DR5 and methods of use
EP3221356B1 (en) T cell activating bispecific antigen binding molecules against folr1 and cd3
JP2023021958A (ja) 腫瘍標的化アゴニストｃｄ２８抗原結合分子
EP3221357B1 (en) Common light chains and methods of use
CN111315781A (zh) 用靶向性ox40激动剂的组合疗法
CN117480185A (zh) 靶向EpCAM的激动性CD28抗原结合分子
HK40108448A (zh) 靶向肿瘤的激动性cd28抗原结合分子
HK40128000A (zh) 靶向肿瘤的激动性cd28抗原结合分子
HK40105156A (zh) 用靶向性4-1bb(cd137)激动剂的组合疗法
HK40114510A (zh) 激动性ltbr抗体以及包含它们的双特异性抗体
BR112017010324B1 (pt) Uso de uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica que ativa células t, uso de um antagonista de ligação do eixo pd-1, kits e uso de uma combinação de uma molécula