RS66030B1

RS66030B1 - Antitela usmerena protiv t ćelija imunoglobulina i mucin proteina 3 (tim-3)

Info

Publication number: RS66030B1
Application number: RS20241112A
Authority: RS
Inventors: Marilyn Kehry; David J King; Silva Correia Jean Da
Original assignee: Anaptysbio Inc
Priority date: 2015-04-01
Filing date: 2016-04-01
Publication date: 2024-11-29
Also published as: AU2016242964A1; MX383216B; EP3277321A4; US20200148770A1; CN114539409A; ZA201706740B; IL283006B2; FI3277321T3; MX2017012429A; IL254559A; HRP20241498T1; LT3277321T; DK3277321T3; IL254559B1; SG11201707705UA; PT3277321T; AU2016242964B2; SMT202400420T1; JP6949717B2; US20220363759A1

Description

Opis

OSNOVA PRONALASKA

[0001] Protein T ćelija imunoglobulina i mucin domena-3 (TIM-3), takođe poznat kao ćelijski receptor 2 virusa hepatitisa A (HAVCR2), je Th1-specifični protein površine ćelija koji reguliše aktivaciju makrofaga i pojačava ozbiljnost eksperimentalnog autoimunog encefalomijelitisa kod miševa. TIM-3 je veoma izražen na površini više tipova imunih ćelija, uključujući, na primer, Th1 IFN-γ+ ćelije, Th17 ćelije, ćelije prirodne ubice (NK), monocite i dendrične ćelije povezane sa tumorom (DCs) (videti, na primer, Clayton i saradnici, J.

Immunol., 192(2): 782-791 (2014); Jones i saradnici, J. Exp. Med., 205: 2763-2779 (2008); Monney i saradnici, Nature, 415: 536-541 (2002); Hastings i saradnici, Eur. J. Immunol., 39: 2492-2501 (2009); Seki i saradnici, Clin. Immunol., 127: 78-88 (2008); Ju i saradnici, B. J. Hepatol., 52: 322-329 (2010); Anderson i saradnici, Science, 318: 1141-1143 (2007); Baitsch i saradnici, PLoS ONE, 7: e30852 (2012); Ndhlovu i saradnici, Blood, 119: 3734-3743 (2012). TIM-3 su takođe visoko izražene na "iscrpljenim" ili oštećenim CD8+ T-ćelijama kod različitih hroničnih virusnih infekcija (na primer, HIV, HCV, i HBV) i kod nekih kancera (videti, na primer, McMahan i saradnici, J. Clin. Invest., 120(12): 4546-4557 (2010); Jin i saradnici, Proc Natl Acad Sci USA, 107(33): 14733-14738 (2010); Golden-Mason i saradnici, J. Virol., 83(18): 9122-9130 (2009); Jones i saradnici, supra; Fourcade i saradnici, J. Exp. Med., 207(10): 2175-2186 (2010); Sakuishi i saradnici, J. Exp. Med., 207(10):2187-2194 (2010); Zhou i saradnici, Blood, 117(17): 4501-4510 (2011); Ngiow i saradnici, Cancer Res., 71(10): 3540-3551 (2011)).

[0002] Potencijalni ligandi za TIM-3 uključuju fosfatidilserin (Nakayama i saradnici, Blood, 113: 3821-3830 (2009)), galektin-9 (Zhu i saradnici, Nat. Immunol., 6: 1245-1252 (2005)), visoko-mobilnu grupu proteina 1 (HMGB1) (Chiba i saradnici, Nature Immunology, 13: 832-842 (2012)), i karcinoembrionalni antigen ćelijske adhezije molekule 1(CEACAM1) (Huang i saradnici, Nature, 517(7534): 386-90 (2015)).

[0003] TIM-3 funkcioniše tako da reguliše različite aspekte imunog odgovora. Interakcija TIM-3 i galektin-9 (Gal-9) dovodi do smrti ćelije a in vivo blokada ove interakcije pogoršava autoimunitet i ukida toleranciju kod eksperimentalnih modela, što snažno ukazuje da je TIM-3 negativna regulatorna molekula. Nasuprot ovom efektu na T-ćelijama, TIM-3-Gal-9 interakcija ispoljava antimikrobne efekte unapređujući klirens makrofaga intracelularnih patogena (videti, na primer, Sakuishi i saradnici, Trends in Immunology, 32(8): 345-349 (2011)). In vivo, pokazano je da supresija TIM-3 pojačava patološku ozbiljnost eksperimentalnog autoimunog encefalomijelitisa (Monney i saradnici, supra; and Anderson, A. C. and Anderson, D. E., Curr. Opin. Immunol., 18: 665-669 (2006)). Studije takođe ukazuju da poremećena regulacija TIM-3-galektin-9 puteva može da igra ulogu kod hroničnih autoimunih bolesti kao što je multiple skleroza (Anderson and Anderson, supra). TIM-3 unapređuje klirens apoptičnih ćelija vezivanjem fosfatidil serina preko svog jedinstvenog rascepa vezivanja (videti, na primer, DeKruyff i saradnici, J. Immunol., 184(4): 1918-1930 (2010)).

[0004] Inhibicija TIM-3 aktivnosti, kao kod korišćenja monoklonalnih antitela, je sada predmet istraživanja kao imunoterapija za tumore na osnovu prekliničkih studija (videti, na primer, Ngiow i saradnici, Cancer Res., 71(21): 1-5 (2011); Guo i saradnici, Journal of Translational Medicine, 11: 215 (2013); i Ngiow i saradnici, Cancer Res., 71(21): 6567-6571 (2011)).

[0005] WO 2013/006490 otkriva antitela koja se specifično vezuju za TIM-3.

[0006] Postoji potreba za dodatnim antagonistima TIM-3 (na primer, antitelom) koji vezuju TIM-3 sa velikim afinitetom i efikasno neutrališu aktivnost TIM-3. Pronalazak obezbeđuje ovakva anti-TIM-3 antitela.

KRATAK SADRŽAJ PRONALASKA

[0007] U prvom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje anti-TIM-3 antitelo ili njegov antigen -vezujući fragment, uključujući polipeptid lakog lanca imunoglobulina koji sadrži SEQ ID NO: 115 i polipeptid teškog lanca imunoglobulina koji sadrži SEQ ID NO: 34.

[0008] U drugom aspektu pronalaska je obezbeđena farmaceutska kompozicija koja uključuje prethodno pomenuto anti-TIM-3 antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment i farmaceutski prihvatljiv nosač.

[0009] Pored toga, pronalazak obezbeđuje izolovane i prečišćene sekvence nukleinske kiseline koje enkodiraju prethodno navedene polipeptide imunoglobulina, vektore koji sadrže ovakve sekvence nukleinske kiseline, izolovane ćelije koje uključuju ove vektore i postupak za izradu anti-TIM-3 antitela koji uključuje prethodno pomenute polipeptide imunoglobulina.

[0010] Naredna ostvarenja pronalaska su niže opisana ili su definisana u pripadajućim zahtevima.

KRATAK OPIS NEKOLIKO PREGLEDA CRTEŽA

[0011]

Slika 1A je grafik koji predstavlja eksperimentalne rezultate pokazane sekrecije IL-2 indukovane vodećim anti-TIM-3 antitelom u reakciji smeše limfocita, kako je opisano u Primeru 2.

Slika 1B je grafik koji predstavlja eksperimentalne rezultate pokazane sekrecije IL-2 indukovane vodećim anti-TIM-3 antitelom u aktiviranim CD4+ T ćelijama, kako je opisano u Primeru 2.

Slika 1C je grafik koji predstavlja eksperimentalne rezultate pokazane sekrecije IL-2 indukovane vodećim anti-TIM-3 antitelom u kombinaciji sa anti-PD-1 antitelom u reakciji smeše limfocita, kako je opisano u Primeru 2.

Slika 1D je grafik koji predstavlja eksperimentalne rezultate pokazane sekrecije IL-2 indukovane vodećim anti-TIM-3 antitelom u kombinaciji sa anti-PD-1 antitelom u aktiviranim CD4+ T ćelijama, kako je opisano u Primeru 2.

Slika 2A je grafik koji opisuje eksperimentalne rezultate koji pokazuju efekat PBS tretmana na zapreminu tumora u modelu MC38 singeničnog tumora, kako je opisano u Primeru 3. Strelice označavaju dnevno doziranje.

Slika 2B je grafik koji opisuje eksperimentalne rezultate koji pokazuju efekat tretmana anti-TIM-3 antitelom na zapreminu tumora u modelu MC38 singeničnog tumora, kako je opisano u Primeru 3. Strelice označavaju dnevno doziranje.

Slika 2C je grafik koji opisuje eksperimentalne rezultate koji pokazuju efekat tretmana anti-PD-1 antitelom na zapreminu tumora u modelu MC38 singeničnog tumora, kako je opisano u Primeru 3. Strelice označavaju dnevno doziranje.

Slika 2D je grafik koji opisuje eksperimentalne rezultate koji pokazuju efekat tretmana anti-TIM-3 antitelom u kombinaciji sa anti-PD-1 antitelom na zapreminu tumora u modelu MC38 singeničnog tumora, kako je opisano u Primeru 3. Strelice označavaju dnevno doziranje. Slika 3 je grafik koji opisuje eksperimentalne rezultate koji pokazuju efekte surogat anti-TIM-3 i anti-PD-1- antitela različitih izotopa na zapreminu tumora u modelu MC38 singeničnog tumora, kako je opisano u Primeru 4. Strelice označavaju dnevno doziranje.

DETALJA OPIS PRONALASKA

[0012] Pronalazak obezeđu anti-TIM-3 antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, uključujući polipeptid teškog lanca imunoglobulina koji sadrži SEQ ID NO: 34 i polipeptid lakog lanca imunoglobulina koji sadrži SEQ ID NO: 115.

[0013] Naziv "immunoglobulin" ili "antitelo," kako se ovde koristi, se odnosi na protein koji je nađen u krvi ili drugim telesnim tečnostima kičmenjaka, koji se u imunom sistemu koristi za indentifikaciju i neutralizaciju stranih tela, kao što su bakterije i virusi. Polipeptid je "izolovan" tako što je uklonjen iz svoje prirodne sredine. U poželjnom ostvarenju, imunoglobulin ili antitelo je protein koji uključuje najmanje jedan komplementarno određujući region (CDR). CDRi formiraju "hipervarijabilni region" antitela koji je odgovoran za vezivanje antigena (niže dalje diskutovan). Ceo imunoglobulin se obično sastoji od četiri polipeptida: dve identične kopije teškog (H) lanca polipeptida i dve identične kopije lakog (L) lanca polipeptida. Svaki od teških lanaca sadrži jedan N-terminal promenljivog (VH) regiona i tri C-terminala konstantnih (CH1, CH2, and CH3) regiona, a svaki laki lanac sadrži jedan N-terminal promenljivog (VL) regiona i jedan C-terminal konstantnog (CL) regiona. Laki lanci antitela mogu se rasporediti u jedan od dva različita tipa, ili kapa (k) ili lambda (λ), na osnovu sekvenci amino kiseline njihovog konstantnog domena. U tipičnom imunoglobulinu, svaki laki lanac je disulfindnim vezama vezan za teški lanac a dva teška lanca su međusobno vezana disulfidnim vezama. Varijabilni region lakog lanca je poravnat sa varijabilnim regionom teškog lanca a konstantni region lakog lanca je poravnat sa prvim konstantnim regionom teškog lanca. Preostali konstantni regioni teškog lanca su međusobno poravnati.

[0014] Varijabilni regioni svakog para lakog i teškog lanca formiraju mesto vezivanja antigena za antitelo. VHi VLregioni imaju istu opštu strukturu, pri čemu svaki region uključuje četiri okvirna (FW ili FR) regiona. Naziv "okvirni region," kako se ovde koristi, se odnosi na relativno očuvane sekvence amino kiselina u okviru varijabilnog regiona koje su smeštene između hipervarijabilnih ili komplementarno određujućih regiona (CDRs). Postoje četiri okvirna regiona u svakom varijabilnom domenu, koji su označeni kao FR1, FR2, FR3, i FR4. Okvirni regioni formiraju β ravni koje obezbeđuju strukturni okvir varijabilnog regiona (videti, na primer, C.A. Janeway i saradnici (eds.), Immunobiology, 5th Ed., Garland Publishing, New York, NY (2001)).

[0015] Okvirni regioni su povezani preko tri komplementarno određujućih regiona (CDRs). Kako je prethodno navedeno, tri CDRs, poznati kao CDR1, CDR2, i CDR3, formiraju "hipervarijabilni region" antitela koji je odgovoran za vezivanje antigena. CDRs formmiraju petlju vezivanja, a u nekim slučajevima uključuju deo strukture beta ravni formirane pomoću okvirnih regiona. Mada konstantni regioni lakih i teških lanaca nisu direktno uključeni u vezivanje antitela za antigen, konstantni regioni mogu da utiču na orijentaciju varijabilnih regiona. Konstantni regioni takođe ispoljavaju različite funkcije efektora, kao što su participacija u antitelo zavisnoj komplementarno posredovanoj lizi ili antitelo zavisnoj ćelijskoj toksičnosti preko interakcija sa efektorom molekula i ćelija.

[0016] Poželjno je da se izolovani polipeptid teškog lanca imunoglobulina i izolovani polipeptid lakog lanca imunoglobulina iz pronalaska vežu za T ćelije imunoglobulina i mucin proteina 3 (TIM-3). TIM-3 je transmembranski protein tip 1 od 60 kDa koji uključuje tri domena: N-terminalni Ig varijabilno (IgV)-sličan domen, centralni Ser/Thr-bogat mucin domen i transmembranski domen sa kratkim intracelularnim repićem (videti, na primer, Kane, L.P., Journal of Immunology, 184(6): 2743-2749 (2010)). TIM-3 je prvo identifikovan na terminalno diferenciranim Th1 ćelijama, i negativno reguliše odgovor T ćelija indukcijom apoptoze T ćelija (videti, na primer, Hastings i saradnici, Eur. J. Immunol., 39(9): 2492-2501 (2009)). TIM-3 se takođe ekspresuje na aktiviranim Th17 i Tc1 ćelijama, a disregulacija ekspresije Tim-3 na CD4+ T-ćelijama i CD8+ T-ćelijama je povezana sa teškim autoimunim bolestima, virusnim infekcijama i kancerom (videti, na primer, Liberal i saradnici, Hepatology, 56(2): 677-686 (2012); Wu i saradnici, Eur. J. Immunol., 42(5): 1180-1191 (2012); Anderson, A.C., Curr. Opin. Immunol., 24(2): 213-216 (2012); i Han i saradnici, Frontiers in Immunology, 4: 449 (2013)).

[0017] Neka druga antitela koja se vezuju za TIM-3, i njihove komponente, su poznata u tehnici (videti, na primer, U.S. Patent 8,101,176; U.S. Patent 8,552,156; and U.S. Patent 8,841,418). Anti-TIM-3 antitela su takođe komercijalno raspoloživa iz izvora kao što su, na primer, Abeam (Cambridge, MA), and R&D Systems, Inc. (Minneapolis, MN).

[0018] "Identitet" nukleinske kiseline ili sekvence amino kiseline, kako je ovde opisano, može da se odredi poređenjem nukleinske kiseline ili sekvence amino kiseline od interesa sa referentnom nukleinskom kiselinom ili sekvencom amino kiseline. Procenat identiteta je broj nukleotida ili ostataka amino kiseline koji su isti (to jest, koji su identični) kao između sekvence od interesa i referentne sekvence podeljene sa dužinom najduže sekvence (to jest, dužinom ili sekvence od interesa ili referentne sekvence, u zavisnosti koja je duža). Broj matematičkih algoritama za dobijanje optimalnog poravnanja i izračunavanje identiteta između dve ili više sekvenci je poznato i ugrađeno u veliki broj dostupnih softverskih programa. Primeri ovakvih programa uključuju CLUSTAL-W, T-Coffee, i ALIGN (za poravnanje nukleinske kiseline i sekvenci amino kiseline), BLAST programe (na primer, BLAST 2.1, BL2SEQ, i njihove kasnije verzije) i FASTA programe (na primer, FASTA3x, FASTM, i SSEARCH) (za poravnanje sekvenci i pretraživanja sličnosti sekvenci). Algoritmi poravnanja sekvenci su takođe otkriveni u, na primer, Altschul i saradnici, J. Molecular Biol., 215(3): 403-410 (1990), Beigert i saradnici, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 106(10): 3770-3775 (2009), Durbin i saradnici, eds., Biological Sequence Analysis: Probalistic Models of Proteins and Nucleic Acids, Cambridge University Press, Cambridge, UK (2009), Soding, Bioinformatics, 21(7): 951-960 (2005), Altschul i saradnici, Nucleic Acids Res., 25(17): 3389-3402 (1997), and Gusfield, Algorithms on Strings, Trees and Sequences, Cambridge University Press, Cambridge UK (1997)).

[0019] Jedna ili više amino kiselina prethodno pomenutih polipeptida teškog lanca imunoglobulina i/ili polipeptida lakog lanca mogu da se zamene ili supstituišu sa različitim amino kiselinama. "Zamena" ili "supstitucija" amino kiselina se odnosi na zamenu jedne amino kiseline na datom položaju ili ostatku sa drugom amino kiselinom na istom položaju ili ostatku u okviru sekvence polipeptida.

[0020] Amino kiseline su široko grupisane kao "aromatične" ili "alifatične." Aromatična amino kiselina uključuje aromatični prsten. Primeri "aromatičnih" amino kiselina obuhvataju histidin (H ili His), fenilalanin (F ili Phe), tirozin (Y ili Tyr), triptofan (W ili Trp). Nearomatične amino kiseline su široko grupisane kao "alifatične." Primeri "alifatičnih" amino kiselina obuhvataju glicin (G ili Gly), alanin (A ili Ala), valin (V ili Val), leucin (L ili Leu), izoleucin (I ili Ile), metionin (M ili Met), serin (S ili Ser), treonin (T ili Thr), cistein (C ili Cys), prolin (P ili Pro), glutaminsku kiselinu (E ili Glu), aspartansku kiselinu (D ili Asp), asparagin (N ili Asn), glutamin (Q ili Gln), lizin (K ili Lys) i arginin (R ili Arg).

[0021] Alifatične amino kiseline mogu dalje da se dele u četiri podgrupe. "Velika alifatična nepolarna podgrupa" se sastoji od valina, leucina i izoleucina. "Alifatična blago polarna podgrupa" se sastoji od metionina, serina, treonina i cisteina. "Alifatična/naelektrisana podgrupa" se sastoji od glutaminske kiseline, aspartanske kiseline, asparagina, glutamina, lizina i arginina. "Podgrupa malog ostatka" se sastoji od glicina i alanina. Grupa naelektrisanih/polarnih amino kiselina može da se podeli u tri podgrupe: "pozitivno naelektrisana podgrupa" koja se sastoji od lizina i arginina, "negativno naelektrisana podgrupa" koja se sastoji od glutaminske kiseline i aspartanske kiseline i "polarna podgrupa" koja se sastoji od asparagina i glutamina.

[0022] Aromatične amino kiseline mogu dalje da se podele u dve podgrupe: "podgrupu sa azotom u prstenu" u koju spadaju histidin i triptofan i "fenil podgrupe" u koju spadaju fenilalanin i tirozin.

[0023] Zamena ili supstitucija amino kiseline može da bude konzervativna, semikonzervativna ili ne-konzervativna. Izraz "konzervativna supstitucija amino kiselina" ili "konzervativna mutacija" se odnosi na zamenu jedne amino kiseline sa drugom amino kiselinom sa istim karakteristikama. Funkcionalni način za definiciju zajedničkih karakteristika između pojedinačnih amino kiselina je da se analiziraju normalizovane frekvencije promena amino kiselina između odgovarajućih proteina homolognih organizama (Schulz and Schirmer, Principles of Protein Structure, Springer-Verlag, New York (1979)). U skladu sa takvim analizama, grupe amino kiselina mogu se definisati tamo gde se amino kiseline unutar grupe prvenstveno razmenjuju jedna sa drugom i stoga najviše liče jedna na drugu po svom uticaju na ukupnu strukturu proteina (Schulz and Schirmer, supra).

[0024] Primeri konzervativne supstitucije amino kiselina uključuju supstitucije amino kiselina u okviru prethodno opisanih podgrupa, na primer, lizin za arginin i obrnuto, tako da može da se zadrži pozitivno naelektrisanje, glutaminska kiselina za aspartansku kiselinu i obrnuto, tako da može da se zadrži negativno naelektrisanje, serin za treonin tako da može da se zadrži slobodna -OH grupa i glutamin za asparagin, tako da može da se zadrži slobodna -NH2grupa.

[0025] "Semi-konzervativne mutacije" uključuju supstituciju amino kiselina amino kiselinama unutar istih grupa kako je prethodno navedeno, ali ne unutar iste podgrupe. Na primer, supstitucija aspartanske kiseline sa asparaginom ili asparagina sa lizinom, obuhvata amino kiseline unutar iste grupe ali različitih podgrupa. "Ne konzervativne mutacije" uključuju supstitucije amino kiselina između različitih grupa, na primer, lizina sa triptofanom, ili fenilalanina sa serinom, itd.

[0026] Pored toga, jedna ili više amino kiselina može da bude umetnuta u prethodno pomenute polipeptide teškog lanca imunoglobulina i/ili polipeptide lakog lanca. Bilo koji broj bilo kojih amino kiselina može da bude umetnut u sekvencu amino kiseline polipeptida teškog lanca imunoglobulina i/ili polipeptida lakog lanca. U vezi sa tim, najmanje jedna amino kiselina (na primer, 2 ili više, 5 ili više, ili 10 ili više amino kiselina), ali ne više od 20 amino kiselina (na primer, 18 ili manje, 15 ili manje, ili 12 ili manje amino kiselina), može da bude umetnuto u sekvencu amino kiseline polipeptida teškog lanca imunoglobulina i/ili polipeptida lakog lanca.

[0027] Kompeticija antitela može da se ispita po uobičajenim ispitivanjima kompeticije peptida koristeći ELISA, Western blot, ili imunohistohemijske postupke (videti, na primer, U.S. Patents 4,828,981 i 8,568,992; i Braitbard i saradnici, Proteome Sci., 4: 12 (2006)).

[0028] Pod "TIM-3-vezujuće sredstvo" se podrazumeva molekula, poželjno je proteinska molekula, koja se specifično vezuje za TIM-3 protein. Poželjno je da je TIM-3-vezujuće sredstvo antitelo ili njegov fragment (na primer, antigen-vezujući fragment).

[0029] "Biološka aktivnost" TIM-3-vezujućeg sredstva se odnosi na, na primer, afinitet vezivanja za određeni TIM-3 epitop, neutralizaciju ili inhibiciju vezivanja TIM-3 za njegov receptor(e), neutralizaciju ili inhibiciju aktivnosti TIM-3 in vivo (na primer, IC50), farmakokinetiku i unakrsnu reaktivnost (na primer, sa ne-humanim homologom ili ortologom TIM-3 proteina, ili sa drugim proteinima ili tkivima). Druge biološke karakteristike ili karakterizacije antigen vezujućeg sredstva prepoznatih u tehnici uključuju, na primer, afinitet, selektivnost, rastvorljivost, savijanje, imunotoksičnost, ekspresiju i formulaciju. Prethodno pomenute karakteristike ili karakterizacije mogu da se uoče, izmere i/ili procene standardnim tehnikama uključujući, ali bez ogrničenja na, ELISA, kokmpetitivni ELISA, analizu rezonance površine plazmona (BIACORE™), ili KINEXA™, in vitro ili in vivo ispitivanje neutralizacije, ispitivanje vezivanja receptor-ligand, ispitivanje produkcije citokina ili faktora rasta i/ili ispitivanje sekrecije i ispitivanje signala transdukcije i imunohistohemije.

[0030] Nazivi "inhibira" ili "neutrališe," kako se ovde koriste u vezi sa aktivnišću TIM-3-vezujućeg sredstva, odnose se na sposobnost da u potpunosti antagonizira, zabrani, spreči, ograniči, uspori, poremeti, izmeni, eliminiše, zaustavi ili preokrene progresiju ili težinu, na primer, biološke aktivnosti TIM-3, ili bolesti ili stanja povezanih sa TIM-3. Anti-TIM-3 antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, iz pronalaska preferirano inhibira ili neutrališe aktivnost TIM-3 za najmanje približno 20%, približno 30%, približno 40%, približno 50%, približno 60%, približno 70%, približno 80%, približno 90%, približno 95%, približno 100%, ili u rasponu definisanom sa bilo koje dve prethodno pomenute vrednosti.

[0031] Nazivi "fragment antitela," "antitelo fragment," "funkcionalni fragment antitela," i slično se ovde koriste kao međusobno zamenljivi u značenju jednog ili više fragmenata antitela koji zadržavaju sposobnost da se specifično vezuju za antigen (videti, generalno, Holliger i saradnici, Nat. Biotech., 23(9): 1126-1129 (2005)). Poželjno je da fragment antitela uključuje, na primer, jedan ili više CDRs, varijabilni region (ili njegov deo), konstantni region (ili njegov deo), ili njihove kombinacije. Primeri fragmenata antitela uključuju, ali bez ograničenja na, (i) Fab fragment, koji je monovalentni fragment sastavljen od VL, VH, CL, iCH1domena, (ii) F(ab’)2fragment, koji je bivalentni fragment sastavljen od dva Fab fragmenta vezanih disulfidnim mostom za zavisni region, (iii) Fv fragment koji se sastoji od VLi VHdomena jednog kraka antitela, (iv) Fab’ fragment, koji nastaje od cepanja disulfidnog mosta F(ab’)2fragmenta pod uslovima blage redukcije, (v) disulfidno-stabilizovani Fv fragment (dsFv), i (vi) domen antitela (dAb), koji je polipeptid domena varijabilnog regiona pojedinačnog antitela (VHili VL) koji specifično vezuje antigen.

[0032] U ostvarenjima u kojima anti-TIM-3 antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment uključuje fragment polipeptida teškog lanca ili lakog lanca imunoglobulina, fragment može da bude bilo koje veličine sve dok se fragment vezuje za i preferirano inhibira aktivnost TIM-3. U vezi sa tim, poželjno je da fragment polipeptida teškog lanca imunoglobulina uključuje između približno 5 i 18 (na primer, približno 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, ili opseg definisan sa bilo koje dve prethodno navedene vrednosti) amino kiselina. Slično tome, poželjno je da fragment polipeptida lakog lanca imunoglobulina uključuje između približno 5 i 18 (na primer, približno 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, ili opseg definisan sa bilo koje dve prethodno navedene vrednosti) amino kiselina

[0033] Poželjno je da antitelo ili fragment antitela uključuje konstantni region (Fc) teškog lanca bilo koje pogodne klase. Preferirano, antitelo ili fragment antitela uključuje konstantni region teškog lanca koji se zasniva na izvornom tipu IgG1, IgG2, ili IgG4 antitela, ili njihovim varijantama. Razumljivo je da svaka klasa antitela, ili izotopa, uključuje poseban skup efektorskih mehanizama za uklanjanje ili neutralizaciju jedanput prepoznatog antigena. Zbog toga, u nekim ostvarenjima, anti-TIM-3 antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment može da ispolji jednu ili više efektorskih funkcija, kao što su učešće u lizi posredstvom antitelo-zavisnog komplemena ili antitelo-zavisnoj celularnoj toksičnosti preko interakcija sa efektorom molekula i ćelija (na primer, aktivacijom sistema komplementa).

1

[0034] TIM-3-vezujuće sredstvo može takođe da bude fragment jednog lanca antitela. Primeri fragmenata jednog lanca antitela uključuju, ali bez ograničenja na, (i) jedan lanac Fv (scFv), koji je monovalentna molekula sastavljena od dva domena Fv fragmenta (to jest, VLi VH) spojenih sintetičkim linkerom što omogućava da se dva domena sintetišu kao jedan polipeptidni lanac (videti, na primer, Bird i saradnici, Science, 242: 423-426 (1988); Huston i saradnici, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 5879-5883 (1988); i Osbourn i saradnici, Nat. Biotechnol., 16: 778 (1998)) i (ii) diatelo, koje je dimer polipeptidnih lanaca, pri čemu svaki polipeptidni lanac uključuje VHvezan za VLpeptidnim linkerom koji je dovoljno kratak da omogući uparivanje između VHi VLna istom polipeptidnom lancu, što dovodi do uparivanja između komplementarnih domena na različitim VH-VLlancima polipeptida za generisanje dimerne molekule koja ima dva funkcionalna položaja za vezivanje antigena. Fragmenti antitela su poznati u tehnici i mnogo detaljnije su opisani u, na primer, U.S. Patent Application Publication 2009/0093024 A1.

[0035] TIM-3-vezujuće sredstvo može takođe da bude intratelo ili njegov fragment. Intratelo je antitelo koje se ekspresuje i koje funkcioniše intracelularno. Intratela obično nemaju disulfidne veze i sposobna su da moduliraju ekspresiju ili aktivnost ciljanih gena preko svoje specifične aktivnosti vezivanja. Intratela uključuju fragmente pojedinačnog domena kao što su izolovani VHi VLdomena i scFvs. Intratelo može da uključi signale sub-celularnog prometa vezanih za N ili C terminus intratela da se omogući ekspresija visokih koncentracija u subcelularnim odeljcima gde je lociran ciljani protein. Nakon interkacije sa ciljanim genom, intratelo modulira funkciju ciljanog proteina i/ili omogućava fenotipnu/funkcionalnu eliminaciju mehanizmima kao što su ubrzavanje degradacije ciljanog proteina i izolovanje ciljanog proteina u ne-fiziološke subćelijske odeljke. Drugi mehanizmi inaktivacije gena posredstvom intratela mogu da zavise od epitopa na koji je intratelo usmereno, kao što je vezivanje za katalitički položaj na ciljanom proteinu ili za epitope koji su uključeni u proteinprotein, protein-DNK ili protein-RNK interakcije.

[0036] TIM-3-vezujuće sredstvo može takođe da bude konjugat antitela. U vezi sa tim, TIM-3-vezujuće sredstvo može da bude konjugat (1) antitela, njegovog alternativnog scafolda, ili fragmenata, i (2) proteina ili ne-proteinskog dela koji uključuje TIM-3-vezujuće sredstvo. Na primer, TIM-3-vezujuće sredstvo može da bude celo ili deo antitela konjugovanog sa peptidom, fluorescentnom molekulom ili hemoterapeutskim sredstvom.

[0037] TIM-3-vezujuće sredstvo može da bude, ili može da se dobije od, humanog antitela, ne-humanog antitela ili himernog antitela. "Himerno" označava antitelo ili njegov fragment koji uključuje i humane i ne-humane regione. Preferirano, TIM-3-vezujuće sredstvo je humanizovano antitelo. "Humanizovano" antitelo je monoklonalno antitelo koje uključuje skafold humanog antitela i najmanje jedan CDR dobijen ili izdvojen od ne-humanog antitela.

[0038] Ne-humana antitela uključuju antitela izolovana iz bilo koje ne-humane životinje, kao što su na primer, glodari (na primer, miševi ili pacovi). Humanizovano antitelo može da uključi jednu, dve ili tri CDRs dobijene ili izdvojene iz ne-humanog antitela.

[0039] Humano antitelo, ne-humano antitelo, himerično antitelo ili humanizovano antitelo mogu da se dobiju bilo kojim načinom, uključujući preko in vitro izvora (na primer, hibridoma ili ćelijske linije koje rekombinantno produkuju antitelo) i in vivo izvora (na primer, glodara). Postupci za generisanje antitela su poznati u tehnici i opisani su, na primer, u Köhler and Milstein, Eur. J. Immunol., 5: 511-519 (1976); Harlow and Lane (eds.), Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press (1988); i Janeway i saradnici (eds.), Immunobiology, 5th Ed., Garland Publishing, New York, NY (2001)). Humano antitelo ili himerično antitelo mogu da se generišu koristeći transgenične životinje (na primer, miševe) pri čemu se jedan ili više gena endogenog imunoglobulina zameni sa jednim ili više gena humanog imunoglobulina. Primeri transgeničnih miševa u kojima su geni endogenog antitela efikasno zamenjeni sa genima humanog antitela uključuju, ali bez ograničenja na, Medarex HUMAB-MOUSE™, Kirin TC MOUSE™ i Kyowa Kirin KM-MOUSE™ (videti, na primer, Lonberg, Nat. Biotechnol., 23(9): 1117-25 (2005), i Lonberg, Handb. Exp. Pharmacol., 181: 69-97 (2008)). Humanizovano antitelo može da se generiše koristeći bilo koji pogodan postupak poznat u tehnici (videti, na primer, An, Z. (ed.), Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic, John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, New Jersey (2009)), uključujući, na primer, grafting ne-humanih CDRs na skafold humanog antitela (videti, na primer, Kashmiri i saradnici, Methods, 36(1): 25-34 (2005); i Hou etal., J. Biochem., 144(1): 115-120 (2008)). U jednom ostvarenju, humanizovano antitelo može da se izradi po postupcima opisanim u, na primer, U.S. Patent Application Publication 2011/0287485 A1.

[0040] U jednom ostvarenju, varijabilni region polipeptida teškog lanca imunoglobulina i/ili polipeptida lakog lanca imunoglobulina koji su ovde opisani može da se transplantuje (to jest, graftuje) u drugo antitelo, ili njegov antigen vezujući fragment, koristeći ili hemiju proteina ili tehnologiju rekombinantne DNK

[0041] U preferiranom ostvarenju, anti-TIM-3 antitelo, ili njegov antigen vezujući fragment, vezuje epitop TIM-3 čime se blokira vezivanje TIM-3 za bilo koji od njegovih pretpostavljenih liganda (na primer, fosfatidilserin, galektin-9, visoko pokretljiva grupa proteina 1 (HMGB1 ), i karcinoembrioni antigen ćelijske adhezije molekule 1 (CEACAM1)) i inhibira TIM-3- posredovanu signalizaciju.

[0042] Pronalazak takođe obezbeđuje jednu ili više izolovanih ili prečišćenih sekvenci nukleinske kiseline koja enkodira polipeptid teškog lanca inventivnog imunoglobulina, polipeptid lakog lanca inventivnog imunoglobulina i inventivno anti TIM-3 antitelo, ili njegov antigen vezujući fragment.

[0043] Naziv "sekvenca nukleinske kiseline" treba da obuhvati polimer DNK ili RNK, to jest, polinukleotid, koji može da bude jedno-lančan ili dvostruko lančan i koji može da sadrži neprirodne i izmenjene nukleotide. Nazivi "nukleinska kiselina" i "polinukleotid", kako se ovde koriste, odnose se na polimerni oblik nukleotida bilo koje dužine ili ribonukleotide (RNK) ili deoksiribonukleotide (DNK). Ovi nazivi se odnose na primarnu strukturu molekule tako da uključuju dvostruko- ili jednostruko-lančanu DNK, i dvostruko- i jednostruko-lančanu RNK. Nazivi uključuju, kao ekvivalente, analoge ili RNK ili DNK izrađene od analoga nukleotida i modifikovanih polinukleotida kao što su, ali bez ograničenja na, metilirani i/ili kaptirani polinukleotidi. Nukleinske kiseline su obično vezane preko fosfatnih veza da formiraju sekvence nukleinske kiseline ili polinukleotide, mada su i druge veze poznate u tehnici (na primer, fosforotioati, boranofosfati i slično).

[0044] Pronalazak dalje obezbeđuje vektor koji uključuje jednu ili više sekvenci nukleinske kiseline koje enkodiraju polipeptid teškog lanca inventivnog imunoglobulina, polipeptid lakog lanca inventivnog imunoglobulina, i/ili inventivno anti-TIM-3 antitelo, ili njegov antigenvezujući fragment. Vektor može da bude, na primer, plazmid, epizom, kozmid, virusni vektor (na primer, retrovirus ili adenovirus) ili fag. Pogodni vektori i postupci za izradu vektora su dobro poznati u tehnici (videti, na primer, Sambrook i saradnici, Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001), i Ausubel i saradnici, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons, New York, N.Y. (1994)).

[0045] Pored sekvence nukleinske kiseline koja enkodira polipeptid teškog lanca inventivnog imunoglobulina, polipeptid lakog lanca inventivnog imunoglobulina i/ili inventivno anti-TIM-3 antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, vektor preferirano uključuje ekspresiju kontrolnih sekvenci, kao što su promoteri, pojačivači, signali poliadenilacije, terminatori transkripcije, signalni peptidi (na primer, osteonektin signalni peptid), unutrašnja mesta ulaska ribozoma (IRES), i slično, koji obezbeđuju ekspresiju kodirajuće sekvence u ćeliji domaćinu. Primeri ekspresije kontrolnih sekvenci su poznati u tehnici i opisani su, na primer, u Goeddel,

1

Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Vol.185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990).

[0046] Veliki broj promotera, uključujući konstitutivne, inducibilne i represibilne promotere, iz brojnih različitih izvora su dobro poznati u tehnici. Reprezentativni izvori promotera uključuju, na primer, viruse, sisare, insekte, biljke, kvasce i bakterije, a odgovarajući promoteri iz ovih izvora su lako raspoloživi ili mogu da se sintetički izrade na osnovu javno raspoloživih sekvenci, na primer, iz depozita kao što je ATCC kao i drugih komercijalnih ili pojedinačnih izvora. Promoteri mogu da budu jednosmerni (to jest, iniciraju transkripciju u jednom smeru) ili dvosmerni (to jest, iniciraju transkripciju ili u 3’ ili 5’ smeru). Neograničavajući primeri promotera uključuju, na primer, sistem ekspresije T7 bakterija, sistem ekspresije pBAD (araA) bakterija, citomegalovirus (CMV) promoter, SV40 promoter, RSV promoter. Inducibilni promoteri uključuju, na primer, Tet sistem (U.S. Patents 5,464,758 and 5,814,618), Ecdysone inducibilni sistem (No i saradnici, Proc. Natl. Acad. Sci., 93: 3346-3351 (1996)), T-REX™ sistem (Invitrogen, Carlsbad, CA), LACSWITCH™ sistem (Stratagene, San Diego, CA) i Cre-ERT tamoksifen inducibilni sistem rekombinaze (Indra i saradnici, Nuc. Acid. Res., 27: 4324-4327 (1999); Nuc. Acid. Res., 28: e99 (2000); U.S. Patent 7,112,715; i Kramer & Fussenegger, Methods Mal. Biol., 308: 123-144 (2005)).

[0047] Naziv "pojačivač" kako se ovde koristi, odnosi se na DNK sekvencu koja pojačava transkripciju, na primer, sekvence nukleinske kiseline za koju se operativno vezuje.

Pojačivači mogu da se nalaze mnogo kilobaza daleko od kodirajućeg regiona sekvence nukleinske kiseline i mogu da posreduju u vezivanju regulatornih faktora, modela metilacije DNK ili promena u strukturi DNK. Veliki broj pojačivača iz brojnih različitih izvora su dobro poznati u tehnici i raspoloživi su ili u okviru kloniranih polinukleotida (iz, na primer, depozita kao što je ATCC kao i drugih komercijalnih ili pojedinačnih izvora). Broj polinukleotida koji uključuju promotere (kao što je uobičajeno korišćeni CMV promoter) takođe uključuju sekvence pojačivača. Pojačivači mogu da budu locirani nagore, ili nadole, u okviru kodirajućih sekvenci.

[0048] Vektor takođe može da uključi "selektivni marker gen." Naziv "selektivni marker gen," kako se ovde koristi, odnosi se na sekvencu nukleinske kiseline koja omogućava ćelijama da ekspresuju sekvencu nukleinske kiseline koja se posebno bira za ili protiv, u prisustvu odgovarajućeg selektivnog sredstva. Pogodni selektivni marker geni su poznati u tehnici i opisani u, na primer, International Patent Application Publications WO 1992/008796 i WO 1994/028143; Wigler i saradnici, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 3567-3570 (1980); O’Hare i saradnici, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 1527-1531 (1981); Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 2072-2076 (1981); Colberre-Garapin i saradnici, J. Mol. Biol., 150: 1-14 (1981); Santerre i saradnici, Gene, 30: 147-156 (1984); Kent i saradnici, Science, 237: 901-903 (1987); Wigler i saradnici, Cell, 11: 223-232 (1977); Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 48: 2026-2034 (1962); Lowy i saradnici, Cell, 22: 817-823 (1980); i U.S. Patents 5,122,464 i 5,770,359.

[0049] U nekim ostvarenjima, vektor je "epizomalni vektor ekspresije" ili "epizom," koji je sposoban da se umnožava u ćeliji domaćinu i opstaje kao ekstrahromozomalni segment DNK unutar ćelije domaćina u prisustvu odgovarajućeg selektivnog pritiska (videti, na primer, Conese i saradnici, Gene Therapy, 11: 1735-1742 (2004)). Reprezentativni komercijalno raspoloživi epizomalni vektori ekspresije uključuju, ali bez ograničenja na, epizomalne plazmide koji koriste Epstein Barr Nuclear Antigen 1 (EBNA1) i Epstein Barr Virus (EBV) kao osnovu za replikaciju (oriP). Vektori pREP4, pCEP4, pREP7 i pcDNA3.1 od Invitrogen (Carlsbad, CA) i pBK-CMV od Stratagene (La Jolla, CA) predstavljaju neograničavajuće primere epizomalnog vektora koji kao osnovu replikacije koriste T-antigen i SV40 umesto EBNA1 i oriP.

[0050] Drugi pogodni vektori uključuju vektore za integraciju ekspresije, koji se mogu nasumično integrisati u DNK ćelije domaćina ili mogu da uključe mesto rekombinacije čime omogućavaju specifičnu rekombinaciju između vektora ekspresije i hromozoma ćelije domaćina. Ovakvi vektori integrišuće ekspresije za kontrolu endogene ekspresije mogu da koriste sekvence hromozoma ćelije domaćina da bi se izvršila ekspresija željenog proteina. Primeri vektora koji se na način specifičan za lokaciju uključuju, na primer, komponente flpin sistema od Invitrogen (Carlsbad, CA) (na primer, pcD- NA™5/FRT), ili cre-lox sistem, kao što može da se nađe u pExchange-6 Core Vectors od Stratagene (La Jolla, CA). Primeri vektora koji se nasumično integrišu u hromozomima ćelije domaćina uključuju, na primer, pcDNA3.1 (kada se uvode bez prisustva T-antigena) od Life Technologies (Carlsbad, CA), UCOE od Millipore (Billerica, MA) i pCI ili pFN10A (ACT) FLEXI™ od Promega (Madizon, WI).

[0051] Takođe mogu da se koriste virusni vektori. Reprezentativni komercijalno raspoloživi vektori ekspresije virusa uključuju, ali bez ograničenja na, Per.C6 sistem na bazi adenovirusa raspoloživ od Crucell, Inc. (Leiden, The Netherlands), pLP1 na bazi lentivirusa od Invitrogen (Carlsbad, CA) i retrovirusne vektore pFB-ERV plus pCFB-EGSH od Stratagene (La Jolla, CA).

1

[0052] Sekvence nukleinske kiseline koje enkodiraju sekvence inventivne amino kiseline mogu da se izrade u ćećiji na istom vektoru (to jest, in cis). Jednosmerni promoter može da se koristi za kontrolu ekspresije sekvence svake nukleinske kiseline. U narednom ostvarenju, kombinacija jednosmernih i dvosmernih promotera može da se koristi za kontrolu ekspresije sekvenci više nukleinskih kiselina. Sekvence nukleinske kiseline koje enkodiraju sekvence inventivne amino kiseline alternativno mogu da se izrade za populaciju ćelija na odvojenim vektorima (to jest, u trans). Svaka sekvenca nukleinske kiseline u svakom od odvojenih vektora može da uključi iste ili različite sekvence za kontrolu ekspresije. Odvojeni vektori mogu u ćelijama da se dobiju istovremeno ili po redu.

[0053] Vektor(i) koji uključuje nukleinsku kiselinu(e) za enkodiranje sekvenci inventivne amino kiseline može da se uvede u ćeliju domaćina koja je sposobna da ekspresuje na taj način enkodirane polipeptide, uključujući bilo koju pogodnu prokariotičnu ili eukariotičnu ćeliju. Kao takav, pronalazak obezbeđuje izolovanu ćeliju koja uključuje inventivni vektor. Preferirane ćelije domaćini su one koje se lako i pouzdano uzgajaju, koje imaju relativno brze stope rasta, koje imaju dobro okarakterisane sisteme ekspresije i koje mogu lako i efikasno da se transformišu ili transfektuju.

[0054] Primeri pogodnih prokariotičnih ćelija uključuju, ali bez ograničenja na, ćelije iz roda Bacillus (kao što su Bacillus subtilis i Bacillus brevis), Escherichia (kao što je E. coli), Pseudomonas, Streptomyces, Salmonella i Erwinia. U posebno korisne prokariotične ćelije spadaju različiti sojevi Escherichia coli (na primer, K12, HB101 (ATCC No.33694), DH5α, DH10, MC1061 (ATCC No.53338) i CC102).

[0055] Preferirano, vektor je uveden u eukariotičnu ćeliju. Pogodne eukariotične ćelije su poznate u tehnici i uključuju, na primer, ćelije kvasca, ćelije insekata i ćelije sisara. Primeri pogodnih ćelija kvasca uključuju one iz roda Kluyveromyces, Pichia, Rhinosporidium, Saccharomyces i Schizosaccharomyces. Preferirane ćelije kvasca uključuju, na primer, Saccharomyces cerivisae i Pichia pastoris.

[0056] Pogodne ćelije insekata su opisane, na primer u Kitts i saradnici, Biotechniques, 14: 810-817 (1993); Lucklow, Curr. Opin. Biotechnol., 4: 564-572 (1993); i Lucklow i saradnici, J. Virol., 67: 4566-4579 (1993). Preferirane ćelije insekata uključuju Sf-9 i HIS (Invitrogen, Carlsbad, CA).

[0057] Preferirano, u pronalasku se koriste ćelije sisara. Brojne pogodne ćelije domaćini sisara su poznate u tehnici i veliki broj je raspoloživ od American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Primeri pogodnih ćelija sisara uključuju, ali bez ograničenja na,

1

ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO) (ATCC No. CCL61), CHO DHFR-ćelije (Urlaub i saradnici, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97: 4216-4220 (1980)), ćelije bubrega humanog embriona (HEK) 293 ili 293T (ATCC No. CRL1573) i 3T3 ćelije (ATCC No. CCL92). Druge pogodne ćelijske linije sisara su COS-1 (ATCC No. CRL1650) i COS-7 ćelijske linije majmuna (ATCC No. CRL1651), kao i CV-1 ćelijska linija (ATCC No. CCL70). Drugi primeri ćelija domaćina sisara uključuju ćelijske linije primata i ćelijske linije glodara, uključujući transformisane ćelijske linije. Takođe su pogodne normalne diploidne ćelije, ćelijski sojevi izdvojeni iz in vitro kulture primarnog tkiva, kao i primarnih eksplanata. Druge pogodne ćelijske linije sisara uključuju, ali bez ograničenja na, N2A ćelije, HeLa, L-929 ćelije miševa i BHK ili HaK ćelijske linije hrčka, koje su sve raspoložive od ATCC. Postupci za selekciju pogodnih ćelija domaćina sisara i postupci za transformaciju, uzgajanje, aplifikaciju, pregled i prečišćavanje ćelija su poznati u tehnici.

[0058] U jednom ostvarenju, ćelija sisara je ćelija ljudi. Na primer, ćelija sisara može da bude ćelijska linija humanog limfoida ili izdvojena iz limfoida, kao što je ćelijska linija koja potiče od pre-B limfocita. Primeri ćelijskih linija humanog limfoida uključuju, ali bez ograničenja, RAMOS (CRL-1596), Daudi (CCL-213), EB-3 (CCL-85), DT40 (CRL-2111), 18-81 (Jack i saradnici, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 1581-1585 (1988)), Raji cells (CCL-86), PER.C6 cells (Crucell Holland B.V., Leiden, The Netherlands) i njihove derivate.

[0059] Sekvenca nukleinske kiseline koja enkodira sekvencu inventivne amino kiseline može da se uvede u ćeliju "transfekcijom," "transformacijom," ili "transdukcijom." "Transfekcija," "transformacija," ili "transdukcija," kako se ovde koristi, se odnosi na uvođenje jednog ili više egzogenih polinukleotida u ćeliju domaćina koristeći fizičke ili hemijske postupke. Brojne tehnike transfekcije su poznate u tehnici i uključuju, na primer, kalcijum fosfat DNK koprecipitaciju (videti, na primer, Murray E.J. (ed.), Methods in Molecular Biology, Vol.7, Gene Transfer and Expression Protocols, Humana Press (1991)); DEAE-dekstran; elektroporaciju; transfekciju posredstvom katjonskih lipozoma; bombardovanje mikročesticama uz pomoć čestica volframa (Johnston, Nature, 346: 776-777 (1990)); i stroncijum fosfat DNK ko-precipitaciju (Brash i saradnici, Mol. Cell Biol., 7: 2031-2034 (1987)). Vektori faga ili virusa mogu da se uvedu u ćelije domaćine, nakon rasta inficiranih čestica u odgovarajućem pakovanju ćelija, od kojih je veliki broj komercijalno raspoloživ.

[0060] Pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja uključuje anti-TIM-3 antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment i farmaceutski prihvatljiv (na primer, fiziološki prihvatljiv) nosač. U kontekstu pronalaska, može da se koristi bilo koji pogodan nosač a takvi

1

nosači su dobro poznati u tehnici. Izbor nosača će da zavisi, delimično, od određenog mesta na koje kompozicija može da se primeni i određenog postupka koji se koristi za primenu kompozicije. Kompozicija opciono može da bude sterilna. Kompozicija može da bude zamrznuta ili liofilizirana za čuvanje a pre upotrebe rekonstituisana u pogodnom sterilnom nosaču. Kompozicije mogu da se generišu u skladu sa uobičajenim tehnikama opisanim u, na primer, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2001).

[0061] Pronalazak dalje obezbeđuje anti-TIM-3 antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, ili farmaceutsku kompoziciju za upotrebu u lečenju poremećaja koji reaguje na inhibiciju ili neutralizaciju TIM-3 kod sisara. Poremećaj koji "reaguje na TIM-3 inhibiciju" ili "reaguje na TIM-3 neutralizaciju" se odnosi na bilo koju bolest ili poremećaj u kojima smanjenje vrednosti ili aktivnosti TIM-3 ima terapeutsku korist za sisare, preferirano ljude ili gde neprikladna ekspresija (na primer, prekomerna ekspresija) ili povećanje aktivnosti TIM-3 izaziva ili učestvuje u patološkim efektima bolesti ili poremećaja. Poremećaji koji reaguju na TIM-3 inhibiciju uključuju, na primer, kancer, infektivne bolesti i autoimune bolesti. Anti-TIM-3 antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment iz pronalaska može da se koristi za lečenje bilo kog tipa kancera poznatog u tehnici, kao što su, na primer melanoma, karcinom bubrežnih ćelija, kancer pluća, kancer bešike, kancer dojke, kancer grlića materice, kancer kolona, kancer žučne kese, kancer jednjaka, kancer jetre, kancer tiroidee, kancer želuca, kancer pljuvačnih žlezda, kancer prostate, kancer pankreasa, leukemija, limfoma ili karcinom Merkel ćelija (videti, na primer, Bhatia i saradnici, Curr. Oncol. Rep., 13(6): 488-497 (2011)). Anti-TIM-3 antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment iz pronalaska može da se koristi za lečenje bilo kog tipa infektivnih bolesti (to jest, bolesti ili poremećaja izazvanih bakterijama, virusima, gljivicama ili parazitima). Primeri infektivnih bolesti koje mogu da se leče anti-TIM-3 antitelom, ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom iz pronalaska uključuju, ali bez ograničenja na, bolesti izazvane humanim imunodeficijentnim virusom (HIV), respiratornim sincitijalnim virusom (RSV), influenca virusom, denga virusom, hepatitis B virusom (HBV), ili hepatitis C virusom (HCV)).

[0062] Primena kompozicije koja uključuje polipeptid teškog lanca inventivnog imunoglobulina, polipeptid lakog lanca inventivnog imunoglobulina, inventivno anti-TIM-3 antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, indukuje imuni odgovor protiv kancera ili infektivne bolesti kod sisara. "Imuni odgovor" može da dovede do, na primer, produkcije antitela i/ili aktivacije ćelija imunog efektora (na primer, T-ćelija).

1

[0063] Kako se ovde koriste, nazivi "tretman," "lečenje," i slično se odnose na postizanje željenog farmakološkog i/ili fiziološkog efekta. Preferirano, efekat je terapeutski, to jest, efekat delimičnog ili potpunog izlečenja od bolesti i/ili neželjenih simptoma karakterističnih za bolest. "Terapeutski efektivna količna" se odnosi na količinu efikasnu da u dozama i u potrebnom vremenu dostigne željeni terapeutski rezultat. Terapeutski efektivna količna može da varira u skladu sa faktorima kao što su stanje bolesti, godine, pol i telesna težina pojedinca i sposobnost da TIM-3-vezujuće sredstvo podstakne željeni odgovor u pojedincu. Na primer, terapeutski efektivna količina TIM-3 vezujućeg sredstva je količina koja smanjuje TIM-3-bioaktivnost u čoveku.

[0064] Alternativno, farmakološki i/ili fiziološki efekat može da bude profilaktički, to jest, efekat potpunog ili delimičnog sprečavanja bolesti ili njenih simptoma. "Profilaktički efektivna količina" se odnosi na količinu koja efikasno, u dozama i u toku potrebnog vremena dostiže željeni profilaktički rezultat (na primer, sprečava početak bolesti

[0065] Uobičajena doza može da bude, na primer, u rasponu od 1 pg/kg do 20 mg/kg telesne težine životinje ili čoveka, međutim, doze ispod ili iznad ovog primernog opsega su obuhvaćene okvirom pronalaska. Dnevna parenteralna doza može da bude približno 0.00001 µg/kg do približno 20 mg/kg ukupne telesne težine (na primer, približno 0.001 µg/kg, približno 0.1 µg/kg, približno 1 µg/kg, približno 5 µg/kg, približno 10 µg/kg, približno 100 µg/kg, približno 500 µg/kg, približno 1 mg/kg, približno 5 mg/kg, približno 10 mg/kg, ili u rasponu definisanom sa bilo koje dve prethodno navedene vrednosti), poželjno je od približno 0.1 µg/kg do približno 10 mg/kg ukupne telesne težine (na primer, približno 0.5 µg/kg, približno 1 µg/kg, približno 50 µg/kg, približno 150 µg/kg, približno 300 µg/kg, približno 750 µg/kg, približno 1.5 mg/kg, približno 5 mg/kg, ili u rasponu definisanom sa bilo koje dve prethodno navedene vrednosti), još poželjnije od približno 1 µg/kg do 5 mg/kg ukupne telesne težine (na primer, približno 3 µg/kg, približno 15 µg/kg, približno 75 µg/kg, približno 300 µg/kg, približno 900 µg/kg, približno 2 mg/kg, približno 4 mg/kg, ili u rasponu definisanom sa bilo koje dve prethodno navedene vrednosti), a čak još poželjnije od približno 0.5 do 15 mg/kg telesne težine po danu (na primer, približno 1 mg/kg, približno 2.5 mg/kg, približno 3 mg/kg, približno 6 mg/kg, približno 9 mg/kg, približno 11 mg/kg, približno 13 mg/kg, ili u rasponu definisanom sa bilo koje dve prethodno navedene vrednosti). Terapeutska ili profilaktička efikasnost može da se prati periodičnim ispitivanjem tretiranih pacijenata. Za ponovljene primene u toku nekoliko dana ili duže, u zavisnosti od stanja, tretman može da se ponavlja sve dok se ne postigne željena supresija simptoma bolesti ili alternativno, tretman

1

može da se nastavi do kraja života pacijenta. Međutim, drugi dozni režimi mogu da budu korisni i obuhvaćeni su okvirom pronalaska. Željena doza može da se primeni jednom primenom cele kompozicije, primenom višestrukih delova kompozicije ili primenom kompozicije kontinuiranom infuzijom.

[0066] Kompozicija koja sadrži polipeptid teškog lanca inventivnog imunoglobulina, polipeptid lakog lanca inventivnog imunoglobulina, inventivno anti-TIM-3 antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, može da se primeni na sisaru koristeći standardne tehnike primene, uključujući oralnu, intravensku, intraperitonealnu, subkutanu, pulmonarnu, transdermalnu, intramuskularnu, intranazalnu, bukalnu, sublingvalnu ili primenu preko supozitorija. Kompozicija je preferirano pogodna za parenteralnu primenu. Naziv "parenteralno," kako se ovde koristi, uključuje intravensku, intramuskularnu, subkutanu, rektalnu, vaginalnu i intraperitonealnu primenu. Još poželjnije, kompozicija se na sisaru primenjuje koristeći periferni sistem raspodele intravenskom, intraperitonealnom ili subkutanom injekcijom.

[0067] Kada se primeni na sisaru (na primer, čoveku), biološka aktivnost inventivnog anti-TIM-3 antitela, ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, može da se meri bilo kojim pogodnim postupkom poznatim u tehnici. Na primer, biološka aktivnost može da se ispita određivanjem stabilnosti određenog anti-TIM-3 antitela. U jednom ostvarenju pronalaska, anti-TIM-3 antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, ima polu život in vivo između približno 30 minuta i 45 dana (na primer, približno 30 minuta, približno 45 minuta, približno 1 sat, približno 2 sata, približno 4 sata, približno 6 sati, približno 10 sati, približno 12 sati, približno 1 dan, približno 5 dana, približno 10 dana, približno 15 dana, približno 25 dana, približno 35 dana, približno 40 dana, približno 45 dana, ili u rasponu definisanom sa bilo koje dve prethodno navedene vrednosti). U narednom ostvarenju, anti-TIM-3 antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, ima polu život in vivo između približno 2 sata i 20 dana (na primer, približno 5 sati, približno 10 sati, približno 15 sati, približno 20 sati, približno 2 dana, približno 3 dana, približno 7 dana, približno 12 dana, približno 14 dana, približno 17 dana, približno 19 dana, ili u rasponu definisanom sa bilo koje dve prethodno navedene vrednosti). U narednom ostvarenju, anti-TIM-3 antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, ima polu život in vivo između približno 10 dana i približno 40 dana (na primer, približno 10 dana, približno 13 dana, približno 16 dana, približno 18 dana, približno 20 dana, približno 23 dana, približno 26 dana, približno 29 dana, približno 30 dana, približno 33 dana, približno 37 dana, približno 38 dana, približno 39 dana, približno 40 dana, ili u rasponu definisanom sa bilo koje

2

dve prethodno navedene vrednosti).

[0068] Stabilnost inventivnog anti-TIM-3 antitela, ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, može da se meri koristeći bilo koju drugu pogodnu analizu poznatu u tehnici, kao što su, na primer, merenje polu-života u serumu, diferencijalna skenirajuća kalorimetrija (DSC), analize termičkih pomeranja i pulse-chase analaize. Drugi postupci za merenje stabilnosti proteina in vivo i in vitro koji mogu da se koriste u kontekstu pronalaska su opisani, na primer u, Protein Stability and Folding, B.A. Shirley (ed.), Human Press, Totowa, New Jersey (1995); Protein Structure, Stability, and Interactions (Methods in Molecular Biology), Shiver J.W. (ed.), Humana Press, New York, NY (2010); i Ignatova, Microb. Cell Fact., 4: 23 (2005).

[0069] Stabilnost inovativnog anti-TIM-3 antitela, ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, može da se meri preko vrednosti srednje tačke tranzicije (Tm), što je temperatura na kojoj je 50% sekvence amino kiseline u svojoj prirodnoj konfirmaciji, a drugih 50% je denaturisano. Generalno, što je veća Tm, veća je stabilnost proteina. U jednom ostvarenju pronalaska, inventivno anti-TIM-3 antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, uključuje vrednost srednje tačke tranzicije (Tm) in vitro od približno 60-100 °C. Na primer, inventivno anti-TIM-3 antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, može da uključi Tmin vitro od približno 65-80 °C (na primer, 66 °C, 68 °C, 70 °C, 71 °C, 75 °C, ili 79 °C), približno 80-90 °C (na primer, približno 81 °C, 85 °C, ili 89 °C), ili približno 90-100 °C (na primer, približno 91 °C, približno 95 °C, ili približno 99 °C).

[0070] Biološka aktivnost određenog TIM-3-vezujućeg sredstva može takođe da se ispita određivanjem njegovog afiniteta vezivanja za TIM-3 ili njegov epitop. Naziv "afinitet" se odnosi na konstantu ravnoteže za reverzibilno vezivanje dva sredstva i izražava se kao konstanta disocijacije (KD). Afinitet vezujućeg sredstva za ligand, kao što je afinitet antitela za epitop može da bude, na primer, od približno 1 pikomol (pM) do približno 100 mikromola (mM) (na primer, od približno 1 pikomol (pM) do približno 1 nanomol (nM), od približno 1 nM do približno 1 mikromol (µM), ili od približno 1 µM do približno 100 µM). U jednom ostvarenju, anti-TIM-3 antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, može da se veže za TIM-3 protein sa KDmanjom od ili jednakom sa 1 nanomol (na primer, 0.9 nM, 0.8 nM, 0.7 nM, 0.6 nM, 0.5 nM, 0.4 nM, 0.3 nM, 0.2 nM, 0.1 nM, 0.05 nM, 0.025 nM, 0.01 nM, 0.001 nM, ili u rasponu definisanom sa bilo koje dve prethodno navedene vrednosti). U još jednom ostvarenju, anti-TIM-3 antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, može da se veže za TIM-3 sa KDmanjom od ili jednakom sa 200 pM (na primer, 190 pM, 175 pM, 150 pM, 125 pM, 110 pM, 100 pM, 90 pM, 80 pM, 75 pM, 60 pM, 50 pM, 40 pM, 30 pM, 25 pM, 20 pM, 15 pM, 10 pM, 5 pM, 1 pM, ili u rasponu definisanom sa bilo koje dve prethodno navedene vrednosti). Afinitet imunoglobulina za antigen ili epitop od interesa može da se meri koristeći bilo koju analizu poznatu u tehnici. Ovakvi postupci uključuju, na primer, sortiranje fluorescencijom aktiviranih ćelija (FACS), odvojive perlice (na primer, magnetne perlice), površinsku plazmonsku rezonancu (SPR), kompeticiju faza rastvora (KINEXA™), tabeliranje antigena, analizu kompetitivnog vezivanja i/ili ELISA (videti, na primer, Janeway i saradnici (eds.), Immunobiology, 5th ed., Garland Publishing, New York, NY, 2001).

[0071] Anti-TIM-3 antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, iz pronalaska može da se primeni samo ili u kominaciji sa drugim lekovima. Na primer, anti-TIM-3 antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, može da se primeni u kombinaciji sa drugim sredstvima za tretman ili prevenciju ovde navedenih bolesti, kao što su sredstva koja su citotoksična za ćelije kancera, moduliraju imunogeničnost ćelija kancera ili izazivaju imuni odgovor na ćelije kancera. U tom smislu, na primer, anti-TIM-3 antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, može da se koristi u kombinaciji sa najmanje jednim drugim antikancerogenim sredstvom, uključujući, na primer, hemoterapeutsko sredstvo poznato u tehnici, jonizujuće zračenje, antikancerogeno sredstvo male molekule, vakcine protiv kancera, biološke terapije (na primer, druga monoklonalna antitela, viruse koji ubijaju kancer, gensku terapiju i transfer adoptivnih T-ćelija) i/ili hirurgija. Kada je anti- TIM-3 antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, iz pronalaska za upotrebu u lečenju infektivnih bolesti, anti-TIM-3 antitelo, ili njegov antigenvezujući fragment, može da se primeni u kombinaciji sa najmanje jednim anti-bakterijskim sredstvim ili najmanje jednim anti-virusnim sredstvom. U vezi sa tim, anti-bakterijsko sredstvo može da bude bilo koji pogodan antibiotik poznat u tehnici. Anti-virusno sredstvo može da bude bilo koja vakcina bilo kog pogodnog tipa koja posebno cilja određeni virus (na primer, žive-oslabljene vakcine, subjedinične vakcine, rekombinantne vektor vakcine i antivirusne terapije male molekule (na primer, inhibitore replikacije virusa i analoge nukleozida).

[0072] U narednom ostvarenju, kada se inventivno anti-TIM-3 antitelo, ili njegov antigenvezujući fragment, koristi za lečenje kancera ili infektivnih bolesti, anti-TIM-3 antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, može da se primeni u kombinaciji sa drugim sredstvima koja inhibiraju puteve imunoloških kontrolnih tačaka. Na primer, inventivno anti-TIM-3 antitelo, ili njegov antigen vezujući fragment, može da se primeni u kombinaciji sa sredstvima koja inhibiraju ili antagoniziraju puteve programirane smrti proteina (PD-1), limfocita za aktivaciju gen-3 proteina (LAG-3), i/ili puteve proteina 4 povezanog sa citotoksićnošću T-limfocita (CTLA-4). Kombinovani tretmani koji istovremeno ciljaju dva ili više od ovih puteva imunoloških kontrolnih tačaka su pokazali poboljšanu i potencijalno sinergističku antitumornu aktivnost (videti, na primer, Sakuishi i saradnici, J. Exp. Med., 207: 2187-2194 (2010); Ngiow i saradnici, Cancer Res., 71: 3540-3551 (2011); and Woo i saradnici, Cancer Res., 72: 917-927 (2012)). U jednom ostvarenju, inventivno anti-TIM-3 antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, se primenjuje u kombinaciji sa antitelom koje se vezuje za LAG-3 i/ili antitelom koje se vezuje za PD-1. U vezi sa tim, pronalazak za upotrebu u lečenju poremećaja koji reaguju na inhibiciju TIM-3 (na primer, kancer ili infektivne bolesti) kod sisara mogu dalje da uključe primenu na sisaru kompozicije koja uključuje (i) antitelo koje se vezuje za TIM-3 protein i (ii) farmaceutski prihvatljiv nosač ili kompozicije koja uključuje (i) antitelo koje se vezuje za PD-1 protein i (ii) farmaceutski prihvatljiv nosač.

[0073] Pored terapeutske upotrebe, ovde opisano anti-TIM-3 antitelo, ili njegov antigenvezujući fragment, može da se koristi u dijagnostici ili istraživačkim aplikacijama. U vezi sa tim, anti-TIM-3 antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, može da se koristi u postupku za dijagnozu poremeća ili bolesti u kojima neodgovarajuća ekspresija (na primer, prekomerna ekspresija) ili povećana aktivnost TIM-3 izaziva ili doprinosti patološkim efektima bolesti ili poremećaja. Na sličan način, anti-TIM-3 antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, može da se koristi u analizi za praćenje vrednosti TIM- 3 proteina u subjektu koji se ispituje na bolest ili poremećaj koja reaguje na inhibiciju TIM-3. Istraživačke aplikacije uključuju, na primer, postupke koji koriste anti-TIM-3 antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment i oznaku za otkrivanje TIM-3 proteina u uzorku, na primer, u telesnim tečnostima ljudi ili u ekstraktima ćelija ili ljudi. Anti-TIM-3 antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, može da se koristi uz ili bez modifikacija, kao što je kovalentno ili ne-kovalentno obeležavanje sa detektabilnim radikalom. Na primer, detektabilni radikal može da bude radioizotop (na primer,<3>H,<14>C,<32>P,<35>S ili<125>I), fluorescentno ili hemiiluminescentno jedinjenje (na primer, fluorescein izotiocijanat, rodamin ili luciferin), enzim (na primer, alkalna fosfataza, betagalaktozidaza, ili peroksidaza rena), ili prostetičke grupe. Bilo koji postupak poznat u tehnici za odvojenu konjugaciju antigen-vezjućeg sredstva (na primer, antitelo) na radikalu koji može da se detektuje, može da se primeni u kontekstu pronalaska (videti, na primer, Hunter i saradnici, Nature, 194: 495-496 (1962); David i saradnici, Biochemistry, 13: 1014-1021 (1974); Pain i saradnici, J. Immunol. Meth., 40: 219-230 (1981); i Nygren, J. Histochem. and Cytochem., 30: 407-412 (1982)).

[0074] Vrednosti TIM-3 proteina mogu da se mere korišćenjem inventivnog anti-TIM-3 antitela, ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, bilo kojim poznatim postupkom poznatim

2

u tehnici. Ovakvi postupci uključuju, na primer, radioimunoanalizu (RIA) i FACS. Vrednosti normalne ili standardne ekspresije TIM-3 mogu da se utvrde korišćenjem bilo koje pogodne tehnike, na primer, kombinacijom uzorka koji sadrži ili se sumnja da sadrži, TIM-3 sa TIM-3-specifičnimi antitelom pod uslovima pogodnim za formiranje antigen-antitelo kompleksa. Antitelo je direktno ili indirektno obeleženo sa detektabilnom supstancom da se omogući detekcija vezanog ili nevezanog antitela. Pogodne detektabilne supstance uključuju različite enzime, prostetičke grupe, fluorescentne materijale, luminescentne materijale i radioaktivne materijale (videti, na primer, Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc. (1987)). Količina TIM-3 polipeptida ekspresovanog u uzorku se nakon toga upoređuje sa standardnom vrednošću.

[0075] Anti-TIM-3 antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, može da se obezbedi u kitu, to jest jest, upakovanoj kombinaciji reagenasa u prethodno određenim količinama sa uputstvima za sprovođenje dijagnostičkog ispitivanja. Ukoliko je anti-TIM- 3 antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, obeležen sa enzimom, poželjno je da kit sadrži substrate i kofaktore koji su potrebni za enzim (na primer, substrat prekursora koji omogućava detektabilne hromofore ili fluorofore). Pored toga, u kitu mogu da se nalaze i drugi aditivi kao što su stabilizatori, puferi (na primer, pufer za blokiranje ili pufer za lizu) i slično. Relativne količine različitih reagenasa mogu da variraju da se obezbede koncentracije u rastvoru reagenasa koje značajno optimizuju osetljivost analize. Reagensi mogu da budu u obliku suvih praškova (obično liofilizirani) i uključuju podloge koje rastvaranjem obezbeđuju rastvor reagensa koji ima odgovarajuću koncentraciju.

[0076] Niže dati primeri dalje ilustruju pronalazak ali ih, naravno, ne treba tumačiti da na bilo koji način ograničavaju okvir pronalaska.

PRIMER 1

[0077] Ovaj primer pokazuje postupak za identifikaciju antitela usmernih protiv humanog TIM-3 iz evoluirajuće biblioteke i sazrevanje afiniteta identifikovanih antitela.

[0078] IgG evoluirajuća biblioteka, zasnovana na segmentima germiline sekvence V-gena vezane za rekombinantne (D)J regione izdvojene od humanog donora, je sklopljena kako su opisali Bowers i saradnici Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 108(51): 20455-20460 (2011). Teški lanac (HC) i laki lanac (LC) su klonirani u odvojenim epizomalnim vektorima (Horlick i saradnici, Gene, 243(1-2): 187-194 (2000)), sa svakim vektorom koji enkodira poseban marker za izbor antibiotika. Ćelije čija se ekspresija pokazuje na površini, potpuno-humanog antitela koje se vezuje za humani TIM-3 su identifikovane iz kampanje skrininga evoluirajuće biblioteke koristeći magnetne perlice obložene sa huTIM-3 ekstracelularnim domenom. Panel antitela je izolovan da se specifično vezuje za TIM-3.

[0079] Stabilne ćelijske linije ko-ekspresujućeg HC i LC svakog antitela identifikovanog korišćenjem evoluirajuće biblioteke kako je prethodno opisano, se transfektuju uz aktivaciju indukovane citidin deaminaze (AID) da se inicira SHM in vitro. AID se takođe transfektuje direktno u originalnu mešavinu populacije ćelija proširenu pregledom biblioteke. U svim slučajevima, ćelijske populacije su obojene i za IgG ekspresiju i za vezivanje za antigen, sakupljene protočnom citometrijom kao masa populacije a nakon toga proširene za analizu sekvenci narednom generacijom sekvenciranja (NGS). Ovaj proces se ponavlja iterativno da se akumuliraju SHM-dobijene mutacije u varijabinim regionima i teških i lakih lanaca i njihovih derivata, za svaku strategiju. Sazrevanje početne biblioteke hit antitela je pokazano studijama vezivanja koristeći BIACORE™ i vezivanjem za TIM-3 prisutnog na površini CHO ćelijske linije.

[0080] Sazrela antitela se karakterišu tako da ispunjavaju stroge zahteve za terapijski razvoj antitela, uključujući procenu kriterijuma "razvojnosti" kao i funkcionalne potencije u svim ispitivanjima. Kriterijum razvojnosti uključuje termalnu stabilnost, nivo ekspresije, odsustvo problematičnih motifa sekvence (na primer, N-povezana mesta glikozilacije varijabilnog regiona, slobodni cisteini, mesta visoke verovatnoće za deamidaciju, izomerizacija, itd.). Pored toga, visoki afinitet vezivanja za TIM-3 cinomolgus majmuna je izabran da se omoguće prekliničke studije. Identifikovana su vodeća i rezervna antitela sa snažnom antagonističkom aktivnošću koja su ispunjavala sve kriterijume za dalji razvoj. Vodeće antitelo sadrži polipeptid teškog lanca imunoglobulina koji uključuje SEQ ID NO: 34 i polipeptid lakog lanca imunoglobulina koji uključuje SEQ ID NO: 115 i označen je kao APE5137. CDR1, CDR2 i CDR3 teškog lanca APE5137 obuhvataju SEQ ID NO: 329, 330 i 331, tim redom. CDR1, CDR2 i CDR3 lakog lanca APE5137 obuhvataju SEQ ID NOs: 332, 333 i 334, tim redom. Rezervno antitelo koje sadrži polipeptid teškog lanca imunoglobulina koji uključuje SEQ ID NO: 238 i polipeptid lakog lanca imunoglobulina koji uključuje SEQ ID NO: 327 i označen je kao APE5121. CDR1, CDR2 i CDR3 teškog lanca APE5121 obuhvataju SEQ ID NOs: 335, 336 i 337, tim redom. CDR1, CDR2 i CDR3 lakog lanca APE5121 obuhvataju SEQ ID NOs: 338, 339 i 340, tim redom.

[0081] Karakteristike vodećih i rezervnih anti-TIM-3 antitela su opisane u Tabeli 1.

2

Tabela 1

[0082] Rezultati iz ovog primera potvrđuju postupak afiniteta sazrevanja monoklonalnih antitela usmerenih protiv TIM- 3 identifikovanih korišćenjem evoluirajuće biblioteke.

PRIMER 2

[0083] Ovaj primer pokazuje da inventivno anti-TIM-3 monoklonalno antitelo može da inhibira TIM-3 signalizaciju i da pojača aktivaciju T-ćelija in vitro samo i u kombinaciji sa anti-PD antitelom.

[0084] Funkcionalni antagonist aktivnosti antitela koji ispoljava poboljšane karakteristike vezivanja TIM-3 (opisano u Primeru 1) je testiran u testu mešovite reakcije humanih CD4+ T-ćelija i limfocita (MLR) u kojoj se aktivacija CD4+ T- ćelija u prisustvu anti-TIM-3 antitela procenjuje merenjem sekrecije IL-2. Anti-TIM-3 antitela se ispituju sama ili u kombinaciji sa 2 ng/mL ili 20 ng/mL antagonističkog anti-PD-1 antitela. Posebno, izolovani monociti periferne krvi od humanog donora se diferenciraju u dendrične ćelije (DCs) a nakon toga mešaju sa CD4+ T-ćelijama izolovanih od drugog donora. Vrednosti IL-2 se mere nakon 48 sati. Očekivano je da antagonizam TIM-3 samog i u kombinaciji sa antagonistom PD-1 dovede do povećanja aktivacije T-ćelija, mereno povećanom produkcijom IL-2. Anti-TIM-3 antitelo povećava sekreciju IL-2 i samo i u kombinaciji sa anti-PD1 antitelom za 48 sati u MLR analizi, sa anti-TIM-3 antitelom koje ispoljava povećanu aktivnost u kombinaciji sa anti-PD-1 antitelom, kao što je prikazano na slikama 1A-1D.

[0085] Rezultati ovog primera pokazuju da inventivno anti-TIM-3 antitelo može da inhibira biološku aktivnost TIM-3 samo i u kombinaciji sa antagonistima drugih negativnih regulatora

2

imunog sistema.

PRIMER 3

[0086] Ovaj primer pokazuje da anti-TIM-3 antitelo antagonizira aktivnost TIM-3 u modelu singeničnog tumora kod miševa.

[0087] Surogatna antitela pacova koja prepoznaju PD-1 (RMP1-14) TIM-3 (RMT3-23) miševa su nabavljena od Bio X Cell (West Lebanon, NH) i testirana u modelu MC38 singeničnog tumora sama i u kombinaciji. Preciznije, MC38 ćelije adenokarcinoma kolona (1 x10<6>s.c.) su implantirane u C57B1/6 miševe i ostavljene da se razvijaju u toku 10 dana. Miševi sa izmerenim tumorima od 40-90 mm<3>su nasumično (dan nasumične podele označen kao dan 1) podeljeni u četiri grupe sa 10 životinja/grupa i svaki doziran sa po 10 mg/kg antitela na dane 1, 4, 8 i 11. Miševi kojima je injektovan PBS služe kao kontrola. Zapremine tumora se mere dva puta nedeljno sve dok ne dostignu 2000 mm<3>, što se označava kao krajnja tačka u kojoj se miševi žrtvuju. Rezultati ovog eksperimenta su pokazani na Slikama 2A-2D i pokazuju da kombinacija surogatnih anti-PD-1 i anti-TIM-3 antitela može da inhibira rast tumora u modelu miševa, što ukazuje da bi dvostruka blokada puteva imunoloških kontrolnih tačaka mogla dovesti do povećane kliničke efikasnosti.

PRIMER 4

[0088] Ovaj primer pokazuje neke efekte izotipa antitela na anti-tumornu aktivnost anti-TIM-3 antitela samog ili u kombinaciji sa anti-PD-1 antitelom u modelu singeničnog modela tumora kod miševa.

[0089] Surogatna himerna antitela pacova/miševa koja prepoznaju PD-1 miševa i TIM-3 miševa mišjih IgG1(D265A) i mišjih IgG2a izotipova su sklopljena od antitela pacova testiranih u Primeru 3. Ova antitela su testirna u modelu MC38 singeničnog tumora sama i u kombinaciji sa anti-PD-1 antitelom mišjeg IgG1(D265A) izotipa. Preciznije, ćelije MC38 adenokarcinoma kolona (1 x10<6>s.c.) su implantirane u C57B1/6 miševe i ostavljene da rastu 8 dana. Miševi sa izmerenim tumorima od 40-80 mm<3>su nasumično (dan nasumičnog izbora je označen kao dan 1) podeljeni u sedam grupa sa po 10 životinja/grupa i svakome je dozirano antitelo ili kombinacija antitela na dane 1, 4, 8 i 11 kako je pokazano u Tabeli 2. Miševi kojima su injektovana kontrolna antitela označena izotipom a koja ne prepoznaju bilo koje

2

mišje antigene su služili kao kontrola (grupe 1 i 2). Zapremine tumora su merene dva puta nedeljno sve dok ne dostignu 2000 mm<3>što je označeno kao završna tačka u kojoj se miševi žrtvuju.

Tabela 2

[0090] Privremeni rezultati za ovaj eksperiment su pokazani na Slici 3 i pokazuju da pojedinačno sredstvo anti-mišjeg TIM-3 antitela sa funkcijom efektora (to jest, IgG2a) ima povećanu anti-tumornu aktivnost u poređenju sa anti-mišjim TIM-3 antitelom sa minimalnom funkcijom efektora (to jest, IgG1(D265A)). Pored toga, anti-mišje TIM-3 antitelo sa minimalnom funkcijom efektora (to jest, IgG1(D265A)) u kombinaciji sa režimom antimišjeg PD-1 IgG1(D265A) antitela ispoljava blago povećanu anti-tumornu aktivnost u poređenju sa samim anti-mišjim PD-1 IgG1(D265A) antitelom. Anti-mišje TIM-3 antitelo sa potpunom funkcijom efektora (IgG2a) u kombinaciji sa anti-mišjim PD-1 IgG1(D265A) antitelom ispoljava sličnu anti-tumornu aktivnost kao samo anti-mišje PD-1 IgG1(D265A) antitelo.

[0091] Rezultati ovog primera pokazuju da anti-mišja TIM-3 i anti-mišja PD-1 antitela različitih izotipova i uglavnom sa različitim nivoima funkcije efektora, sama ili u kombinaciji, mogu da inhibiraju rast tumora u modelu miševa. Rezultati dalje pokazuju da, u nekim ostvarenjima, antitela (ili njihovi fragmenti) sa samo minimalnom funkcijom efektora, primenjena sama ili u kombinaciji sa drugim antitelima (ili njihovim fragmentima koji mogu, ali ne moraju, da pokazuju značajnu funkciju efektora), mogu da obezbede efikasnu terapiju.

[0092] Upotreba "neodređenih članova" i "najmanje jedan" i slično se koriste u kontekstu opisa pronalaska (posebno u kontekstu patentnih zahteva koji slede) i konstruisani su da pokriju i jedninu i množinu, ukoliko ovde nije drugačije navedeno ili je očigledno u

2

suprotnosti sa kontekstom. Korišćenje naziva "najmanje jedan" nakon liste jednog ili više predmeta (na primer, "najmanje jedan od A i B)" je konstruisan da označi jedan predmet izabran od navedenih predmeta (A ili B) ili bilo koju kombinaciju dva ili više navedenih predmeta (A i B), ukoliko nije ovde drugačije navedeno ili je očigledno u suprotnosti sa kontekstom. Nazivi "uključujući," "ima," "sadrži" i "obuhvata" su konstruisani kao termini otvorenog tipa (to jest, značenja “uključujući, ali bez ograničenja na,”) ukoliko nije drugačije navedeno. Navođenje opsega vrednosti je ovde samo namenjeno da posluži kao stenografski metod za pojedinačno upućivanje na svaku zasebnu vrednost koja spada u opseg, ukoliko nije drugačije navedeno, a svaka odvojena vrednost je inkorporirana u specifikaciju kao da je pojedinačno ovde navedena. Svi ovde opisani postupci mogu da se izvedu po bilo kom pogodnom redosledu, ukoliko nije ovde drugačije navedeno ili je na drugi način očigledno u suprotnosti sa kontekstom. Upotreba bilo kog i svih primera, ili jezika iz primera (na primer, “kao što je”) koji su ovde dati, treba samo da bolje osvetli pronalazak i ne predstavlja ograničenje obima pronalaska osim ako se ne tvrdi drugačije. Nijedan naziv u specifikaciji ne bi trebalo da se konstruiše tako da ukazuje na bilo koji element na koji se ne polaže kao suštinski važan za pronalazak u praksi.

[0093] Ovde su opisana prefirana ostvarenja ovog pronalaska, uključujući najbolji način poznat pronalazačima za sprovođenje pronalaska. Varijacije ovih preferiranih ostvarenja mogu da budu prihvatljive stručnjacima sa uobičajenim iskustvom u tehnici nakon čitanja prethodno datog opisa. Pronalazači očekuju stručnjake iz prakse da uključe ovakve varijacije kao odgovarajuće, a pronalazači nameravaju da se pronalazak primeni i na drugi način nego što je ovde specifično opisano. U skladu sa tim, ovaj pronalazak obuhvata sve modifikacije i ekvivalente predmeta navedenih u ovde priloženim zahtevima kako je dozvoljeno važećim zakonom. Osim toga, bilo koja kombinacija prethodno opisanih elemenata u svim mogućim njihovim varijacijama je obuhvaćena pronalaskom ukoliko nije drugačije ovde navedeno ili na drugi način očigledno u suprotnosti sa kontekstom.

2

Claims

Patentni zahtevi

1. Anti-TIM-3 antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, naznačeno time što uključuje polipeptid lakog lanca imunoglobulina uključujući SEQ ID NO: 115 i polipeptid teškog lanca imunoglobulina uključujući SEQ ID NO: 34.

2. Antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment u skladu sa patentnim zahtevom 1, naznačeno time što dalje uključuje konstantni region IgG1, IgG2, ili IgG4.

3. Antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment u skladu sa patentnim zahtevom 1, naznačeno time što dalje uključuje konstantni region IgG4.

4. Farmaceutska kompozicija, naznačena time što uključuje antitelo ili njegov antigenvezujući fragment u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1-3 i farmaceutski prihvatljiv nosač.

5. Antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1-3 ili farmaceutska kompozicija u skladu sa patentnim zahtevom 4, naznačeno time što su za upotrebu u lečenju kancera kod ljudi.

6. Antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1-3 ili farmaceutska kompozicija u skladu sa patentnim zahtevom 4, naznačeno time što su za upotrebu u lečenju infektivnih bolesti kod ljudi.

7. Antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1-3 ili farmaceutska kompozicija u skladu sa patentnim zahtevom 4, naznačeno time što su za upotrebu u indukciji imunog odgovora protiv kancera ili infektivne bolesti ili indukciji aktivnosti ćelija imunog efektora.

8. Antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment ili farmaceutska kompozicija za upotrebu u skladu sa patentnim zahtevom 5 ili patentnim zahtevom 7, naznačeni time što je kancer malanoma, karcinom bubrežnih ćelija, kancer pluća, kancer bešike, kancer dojke, kancer grlića materice, kancer kolona, kancer žučne kese, kancer jednjaka, kancer jetre, kancer štitaste žlezde, kancer želuca, kancer pljuvačne žlezde, kancer prostate, kancer pankreasa ili karcinom Merkel ćelija.

9. Antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment za upotrebu u skladu sa patentnim zahtevom 8, naznačeno time što je kancer kancer pluća.

10. Antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment ili farmaceutska kompozicija, za upotrebu u skladu sa patentnim zahtevom 6 ili patentnim zahtevom 7, naznačeno time što je infektivna bolest izazvana virusima ili bakterijama.

11. Antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment ili farmaceutska kompozicija, za upotrebu u skladu sa patentnim zahtevom 10, naznačeno time što je infektivna bolest izazvana humanim imunodeficijentnim virusom (HIV), respiratornim sincitijalnim virusom (RSV), virusom influence, denga virusom ili hepatitis B virusom (HBV).

12. Antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1-3, farmceutska kompozicija u skladu sa patentnim zahtevom 4 ili antitelo ili njegov antigenvezujući fragment ili farmaceutska kompozicija, za upotrebu, u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 5-11, naznačeno time što su antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment ili farmaceutska kompozicija korišćeni u kombinaciji sa PD-1 vezujućim sredstvom.

13. Antitelo ili antigen-vezujući fragment u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1-3, farmceutska kompozicija u skladu sa patentnim zahtevom 4 ili antitelo ili njegov antigenvezujući fragment ili farmaceutska kompozicija, za upotrebu u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 5-11, naznačeno time što su antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment ili farmaceutska kompozicija korišćeni u kombinaciji LAG-3 vezujućim sredstvom.

14. Izolovana nukleinska kiselina, naznačena time što enkodira polipeptid lakog lanca imunoglobulina i polipeptid teškog lanca imunoglobulina kako je definisano u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1-3.

15. Vektor, naznačen time što uključuje izolovanu nukleinsku kiselinu u skladu sa patentnim zahtevom 14.

1

16. Izolovana ćelija, naznačena time što uključuje vektor u skladu sa patentnim zahtevom 15.

17. Izolovana ćelija, naznačena time što uključuje vektor koji enkodira polipeptid teškog lanca imunoglobulina u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1-3 i vektor koji enkodira polipeptid lakog lanca imunoglobulina u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1-3

18. Izolovana ćelija u skladu sa patentnim zahtevom 16 ili patentnim zahtevom 17, naznačena time što je ćelija ćelija sisara.

19. Postupak za izradu anti-TIM-3 antitela, naznačen time što navedeni postupak uključuje ekspresiju navedenog antitela in vitro u ćeliji domaćinu sposobnoj za ekspresiju navedenog antitela a pri čemu navedena ćelija domaćin uključuje vektor u skladu sa patentnim zahtevom 15 koji enkodira navedeno antitelo (in cis), ili uključuje vektor koji enkodira teški lanac imunoglobulina tog antitela u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1-3 i vektor koji enkodira polipeptid lakog lanca imunoglobulina tog antitela u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1-3 (in trans).

2