RS66191B1 - Imunoglobulini koji vezuju adamts - Google Patents

Description

Opis

1 OBLAST PRONALASKA

[0001] Ovaj pronalazak se odnosi na imunoglobuline koji vezuju ADAMTS5, a posebno na polipeptide, koji se sastoje ili se u suštini sastoje od jednog ili više takvih imunoglobulina(koji se ovde takođe nazivaju „imunoglobulini pronalaska“, odnosno „polipeptidi pronalaska“). Pronalazak se takođe odnosi na konstrukte koji se sastoje od takvih imunoglobulina, kao što su pojedinačni varijabilni domeni imunoglobulina (ISVD) ili polipeptidi, kao i farmaceutske kompozicije, koje se sastoje od takvih polipeptida. Pronalazak se dalje odnosi na upotrebu polipeptida u profilaktičke i/ili terapijske svrhe, kao što su profilaktičke i/ili terapijske svrhe pomenute u ovom dokumentu. Ostali aspekti, otelotvorenja, prednosti i primene pronalaska biće jasni iz daljeg opisa u ovom dokumentu. Primeri koji su ovde obelodanjeni uključuju aspekte koji se koriste za pronalazak, kao što su nukleinske kiseline koje kodiraju takve imunoglobuline ili polipeptide; metode za pripremu takvih imunoglobulina, polipeptida i konstrukata; ćelije domaćina koje izražavaju ili su sposobne da izražavaju takve imunoglobuline ili polipeptide.

2 POZADINA PRONALASKA

[0002] Osteoartritis (OA) je jedan od najčešćih uzroka invaliditeta širom sveta. Pogađa 30 miliona Amerikanaca i najčešći je poremećaj zglobova. Predviđa se da će do 2025. godine uticati na više od 20 odsto stanovništva SAD. Bolest je nesistemska i obično je ograničena na nekoliko zglobova. Međutim, bolest se može javiti u svim zglobovima, najčešće kolenima, kukovima, šakama, ramenu i kičmi. OA karakteriše progresivna erozija zglobne hrskavice (hrskavice koja pokriva kosti) koja rezultira hroničnim bolom i onesposobljenošću. Na kraju, bolest dovodi do potpunog uništenja zglobne hrskavice, skleroze donje kosti, formiranja osteofita itd., što dovodi do gubitka pokreta i bola. Osteoartritis se može definisati kao raznolika grupa stanja koja karakterišu kombinacija simptoma zglobova, znakova koji proizilaze iz defekata u zglobnoj hrskavici i promena u susednim tkivima, uključujući kosti, tetive i mišiće. Bol je najistaknutiji simptom OA i najčešće razlog zbog kojeg pacijenti traže medicinsku pomoć. Ne postoji lek za OA, tj. trenutni tretmani ne inhibiraju strukturno propadanje OA zgloba. Upravljanje bolešću je ograničeno na tretmane koji su u najboljem slučaju palijativni i malo doprinose rešavanju osnovnog uzroka progresije bolesti. Iako inicijacija bolesti može biti multifaktorijalna, čini se da je uništavanje hrskavice rezultat nekontrolisanog proteolitičkog uništavanja ekstracelularnog matriksa (ECM).

Najzastupljenije komponente ECM zglobne hrskavice su kolagen (pre svega kolagen II) i proteoglikani, uglavnom agrekan (Kiani et al.2002 Cell Research 12:19-32).

[0003] Agrekan je važan za pravilno funkcionisanje zglobne hrskavice jer obezbeđuje hidriranu gel strukturu koja hrskavici daje svojstva za podnošenje opterećenja. Agrekan je veliki, multimodularni molekul (2317 aminokiselina) izražen hondrocitima. Njegov osnovni protein se sastoji od tri globularna domena (G1, G2 i G3) i velikog proširenog regiona između G2 i G3 za vezivanje glikozaminoglikanskog lanca. Ovaj prošireni region obuhvata dva domena, jedan zamenjen keratan sulfatnim lancima (KS domen) i jedan sa hondroitin sulfatnim lancima (CS domen). CS domen ima 100-150 glikozaminoglikanskih (GAG) lanaca pričvršćenih na njega. Agrekan formira velike komplekse sa hijaluronanom u kojima 50-100 molekula agrekana stupa u interakciju preko G1 domena i povezuje protein sa jednim molekulom hijalurona. Nakon preuzimanja vode (zbog sadržaja GAG) ovi kompleksi formiraju reverzibilno deformabilni gel koji se odupire kompresiji. Struktura, zadržavanje tečnosti i funkcija hrskavice zgloba povezana je sa sadržajem matrice agrekana i količinom hondroitin sulfata vezanog za intaktni protein jezgra. Strukturno, OA se odlikuje degradacijom agrekana, progresivnim oslobađanjem domena G3 i G2 (što rezultira 'deflacijom' hrskavice) i na kraju oslobađanjem G1 domena i degradacijom kolagena, nepovratno uništavajući strukturu hrskavice. Najznačajnije mesto cepanja agrekana za patogenezu OA nalazi se na sekvenci TEGE<373>↓<374>ARGS. Ovo mesto cepanja je pozicionirano u interglobularnom domenu (IGD) agrekana. Antitela koja prepoznaju neoepitop<374>ARGS dovela su do otkrića agrekanaze-1, koja se pokazala kao ADAMTS4 i agrekanaze-2, koja je ADAMTS5. Nakon toga, pokazano je da drugi povezani ADAMTS enzimi, uključujući ADAMTS1, -8, -9, -15 i -20, imaju aktivnost agrekanaze. ADAMTS16 i 18 su takođe slabe agrekanaze. ADAMTS i matrične metaloproteinaze (MMP) dele mesto vezivanja za agrekan koje je veoma slično i po redosledu i po ukupnom obliku (El Bakali et al. 2014 Future Medicinal Chemistry (Review) 6:1399).

[0004] ADAMTS (A dezintegrin i metaloproteinaza sa motivima trombospondina) enzimi su sekretorne, multidomenske cink metaloendopeptidaze povezane sa matricom koje imaju različite uloge u morfogenezi tkiva i patofiziološkom remodeliranju, u inflamaciji i u vaskularnoj biologiji (Kelwick et al.2015 Genome Biology 16:113). Ljudska porodica uključuje 19 članova koji se mogu podgrupisati na osnovu njihovih poznatih supstrata.

Agrekanaze ili proteoglikanaze uključuju ADAMTS1, -4, -5, -8, -9, -15 i -20, koji mogu da razgrađuju vanćelijske proteine koji vezuju hijaluronan hondroitin sulfat proteoglikan (CSPG), uključujući agrekan, versikan, brevikan i neurokan. Dva najpoželjnija mesta cepanja u goveđem agrekanu su na KEEE<1667>↓<1668>GLGS, praćeno sa GELE<1480>↓<1481>GRGT. Nakon toga, dolazi do cepanja na NITEGE<373>↓<374>ARGS u IGD (na kojem se MMP ne seku), oslobađajući gore pomenuti neoepitop, i na TAQE<1771>↓<1772>AGEG i VSQE<1871>↓<1872>LGQR u CS-2 regionu (Fosang et al.2008 European Cells and Materials 15:11-26). Ova mesta cepanja su visoko očuvana kod ljudi, goveda, miševa i pacova.

[0005] Različite linije dokaza ukazuju na to da je ADAMTS5 glavni enzim uključen u patogenezu osteoartritisa. ADAMTS5 je glavna agrekanaza prisutna u hrskavici. U eksplantima ljudske hrskavice i hondrocitima, smanjenje ekspresije ADAMTS5 smanjilo je razgradnju agrekana, što sugeriše da ovaj enzim može biti uključen u ljudska tkiva.

Ekspresija enzima je pojačana citokinima kao što su interleukin-1 i onkostatin-M, koji izazivaju razgradnju agrekana u tkivima. Fragmenti agrekana generisani ADAMTS5 enzimom detektovani su u sinovijalnoj tečnosti i serumu pacijenata sa osteoartritisom (Germaschewski et al., 2014 Osteoarthritis Cartilage 22:690-697).

[0006] ADAMTS5 se prvo sintetiše kao neaktivni protein, uključujući domen proteaze na N-terminalu i pomoćni domen na C-terminalu. Domen proteaze se sastoji od signalnog peptida, prodomaina sa sekvencom prepoznavanja furina i katalitičkog domena. Proproteinske konvertaze cepaju prodomen kako bi se proizveli aktivni enzimi. ADAMTS5 dalje sadrži pomoćne domene koji aktivno učestvuju u prepoznavanju supstrata i moduliraju afinitet proteinaze za njen(e) supstrat(e) („egzoziti“). Domen sličan dezintegrinu, ponavljanje centralnog trombospondina tipa I (TS), domen bogat cisteinom, spejser region i dodatni TS motiv ADAMTS5 su pomoćni domeni sa potencijalnim egzozitnim funkcijama. Čini se da je domen bogat cisteinom od suštinskog značaja za vezivanje i spajanje ADAMTS5 na glikozaminoglikane. Najveća varijabilnost kod ADAMTS članova nalazi se u ovim pomoćnim domenima (Kelwick et al., 2015 Genome Biology 16:113).

[0007] Antiosteoartritični lekovi koji modifikuju bolest (DMOAD), koji se mogu definisati kao lekovi koji inhibiraju progresiju strukturne bolesti i u idealnom slučaju takođe poboljšavaju simptome i/ili funkciju, intenzivno se traže. DMOAD će verovatno biti propisivani na duže periode kod ove hronične bolesti populacije koja stari, zbog čega se zahtevaju odlični podaci o bezbednosti kod ciljne populacije sa višestrukim komorbiditetima i potencijalom za interakcije lekova.

[0008] Nekoliko farmaceutskih kompanija razvilo je inhibitore ADAMTS5 malih molekula. Neka od ovih jedinjenja prema ovom patentnom zahtevu su specifična za ADAMTS5, dok druga imaju dejstvo i protiv drugih ADAMTS članova, ili čak protiv MMP. Smatra se da su ove unakrsne inhibicije odgovorne za mišićno-skeletni sindrom, neželjeno dejstvo izazvano inhibitorima širokog spektra i koje uključuje artralgiju, mialgiju, ukočenost zglobova i tendinitis (Santamaria et al., 2015 Biochem J 471:391-401). Inhibitor agrekanaze - Wyeth AGG-523 korišćen je u 5 kliničkih ispitivanja faze I na zdravim subjektima i pacijentima sa osteoartritisom, ali nije nastavljeno dalje. Niti su drugi ADAMTS inhibitori malih molekula ušli u bilo kakav dalji klinički razvoj kao potencijalni DMOAD (Bondeson et al., 2015 Drug Discovery 10:5-14). Zaista, uprkos brojnim nedavnim kliničkim ispitivanjima koja posebno istražuju DMOAD, do sada nisu odobreni takvi tretmani (El Bakali et al., 2014 Future Medicinal Chemistry (Review) 6:1399).

[0009] S obzirom na uspeh ciljane biološke terapije pomoću antitela („Abs“), postojalo je interesovanje za razvoj sličnih terapijskih strategija za OA. Studija Rottapharm monoklonskog antitela (mAb) CRB0017, usmerena protiv spejser domena ADAMTS5, pokazala je da je kod miševa intraartikularna primena ovog mAb značajno sprečila progresiju bolesti na način koji zavisi od doze (Chiusaroli et al., 2013 Osteoarthritis Cartilage 21:1807). Nije bilo poređenja sa sistemskom primenom, niti je procenjeno u kojoj meri je mAb iscureo iz sinovijalnog prostora. Druga studija je koristila sistemsku primenu mAb 12F4 kod miševa, što je pokazalo i strukturnu modifikaciju bolesti i ublažavanje ponašanja vezanog za bol (Miller et al., 2014 Osteoarthritis Cartilage 22iii, S35). Međutim, jednokratna primena mAb 12F4 kod cinomoglus majmuna izazvala je fokalno krvarenje, povećanje srednjeg arterijskog pritiska i abnormalnosti srčane provodljivosti zavisno od doze (tačnije, elevacije ST i ventrikularne aritmije na EKG), što ukazuje na srčanu ishemiju, koja se održala do 8 meseci nakon primene jedne doze (Larkin et al., 2014 Osteoarthritis Cartilage 22iii, S483). Ova neželjena dejstva zaustavila su dalji klinički razvoj mAb 12F4.

[0010] WO2008/074840 u ime Ablynx NV opisuje generisanje Nanobodies<®>antitela u odnosu na članove porodice A dezintegrina i metaloproteinaza (ADAM), uključujući ADAMTS5.

[0011] WO2011/002968 u ime Glaxo Group LTD obelodanjuje panel inhibitornih antitela protiv ADAMTS5.

[0012] Terapijske intervencije u zglobovima dodatno su otežane teškoćama ciljanja lekova na zglobnu hrskavicu. Pošto je zglobna hrskavica avaskularno i alimfatično tkivo, tradicionalni putevi isporuke leka (oralno, intravenski, intramuskularno) na kraju se oslanjaju na transsinovijalni transfer lekova iz sinovijalnih kapilara u hrskavicu pasivnom difuzijom. To je podstaklo razvoj intraartikularne (IA) isporuke lekova.

[0013] S druge strane, IA isporuka terapijskih proteina je ograničena njihovim brzim uklanjanjem iz zglobnog prostora i nedostatkom retencije unutar hrskavice; i ograničenjem na velike zglobove. Sinovijalno vreme zadržavanja leka u zglobu je često manje od 24 sata (Edwards 2011 Vet J 190:15-21; Larsen et al., 2008 J Pham Sci 97:4622-4654). Zbog brzog klirensa većine IA injektiranih lekova, bile bi potrebne česte injekcije za održavanje efikasne koncentracije (Owen et al., 1994 Br J Clin Pharmacol 38:349-355).

[0014] Štaviše, IA isporuka terapijskih proteina nije izvodljiva praktično za male zglobove, što otežava lečenje npr. OA-prstiju.

[0015] Ostaje potreba za efikasnim DMOAD.

3 SAŽETAK PRONALASKA

[0016] Ovaj pronalazak ima za cilj da obezbedi polipeptide protiv OA sa poboljšanim profilaktičkim, terapijskim i/ili farmakološkim svojstvima, pored drugih povoljnih svojstava (kao što su, na primer, poboljšana lakoća pripreme, dobra stabilnost i/ili smanjeni troškovi proizvodnje), u poređenju sa sekvencama aminokiselina i antitelima iz prethodnog stanja tehnike. Konkretno, ovaj pronalazak ima za cilj da obezbedi polipeptide koji inhibiraju ADAMTS5. Svako upućivanje u opisu na metode lečenja odnosi se na jedinjenja, farmaceutske kompozicije ili lekove iz ovog pronalaska koji se koriste u metodi lečenja ljudskog (ili životinjskog) tela terapijom (ili za dijagnozu).

[0017] ADAM, ADAMTS i MMP dele mesto vezivanja za agrekan koje je veoma slično i po sekvenci i po ukupnom obliku. Pošto različiti drugi članovi porodice ADAM (uključujući TACE) i ADAMTS imaju različite uloge u normalnoj fiziologiji, snažno su povezani sa mnogim uobičajenim patološkim stanjima, uključujući astmu, artritis, karcinom, poremećaje vezivnog tkiva ili trombotičku trombocitopeničnu purpuru (El Bakali et al., supra), pronalazači su prepoznali značaj očuvanja selektivnosti. Da bi se efikasno utišala samo aktivnost ADAMTS5, činilo se da je ciljanje katalitičkog domena najbolja opcija. Međutim, katalitički domeni ADAMTS4 i ADAMTS5 dele visok stepen sličnosti sekvenci (videti El Bakali et al., supra). Pored toga, ispostavilo se da očuvanje visoke sekvence katalitičkog domena između različitih vrsta sprečava snažan imuni odgovor.

[0018] Iznenađujuće, ISVD pronalaska, kako su definisani u patentnim zahtevima, ispunili su ova dva naizgled međusobno isključiva zahteva za inhibiciju (enzimske) aktivnosti ADAMTS5 s jedne strane, uz očuvanje selektivnosti s druge strane.

[0019] Različiti monovalentni ISVD ovog pronalaska bili su ekvipotentni konvencionalnom bivalentnom antitelu mAb 12F4 H4L0 u enzimskom testu AlphaLISA. Pored toga, ISVD ovog pronalaska su takođe bili izjednačeni sa konvencionalnim bivalentnim antitelima mAb12F4 H4L0 pri visokoj ili čak prekomernoj koncentraciji supstrata agrekana, što podseća na zglobove. S druge strane, u ex vivo testu goveđeg eksplanta, koji još više podseća na fiziološke uslove, većina monovalentnih ISVD imala je bolji IC50od uporednog mAb 12F4 H4L0 („12F4“)) i mAb CRB0017 kompanije Rottapharm. U humanom ex vivo testu eksplanta, ISVD ovog pronalaska takođe su bili znatno bolji od konvencionalnog antitela CRB0017 iz prethodnog stanja tehnike, kao što je pokazano sa IC50.

[0020] Nakon daljeg inženjeringa ISVD u pogledu različitih raznovrsnih i povoljnih karakteristika, uključujući stabilnost, afinitet i inhibitornu aktivnost, kao i minimiziranje imunogenosti, ovi ISVD su zatim procenjeni in vivo.

[0021] Sistemska primena ISVD ovog pronalaska, kako je definisano u patentnim zahtevima, pokazala je snažnu inhibiciju aktivnosti agrekanaze in vivo kako je procenjeno kod cinomoglus majmuna. Pored toga, ISVD su takođe bili bezbedni za upotrebu, za razliku od antitela 12F4 iz prethodnog stanja tehnike. Takođe, u in vivo modelu medijalne meniskalne destabilizacije miša (DMM), ISVD ovog pronalaska pokazali su strukturnu korist do 50% i za profilaktičko i za terapijsko lečenje sistemskom primenom. Rano lečenje sa ISVD ovog pronalaska izazvalo je u zavisnosti od doze, značajnu i smislenu simptomatsku korist tokom OA indukovanog transekcijom prednjeg ukrštenog ligamenta i resekcijom medijalnog meniskusa (ACLT tMx) kod pacova.

[0022] ISVD su na kraju namenjeni za inhibiciju ADAMTS5 u zglobovima i stoga će morati da se odupru uslovima sinovijalne tečnosti u zglobovima, koja sadrži različite proteaze.

Pored povoljnih karakteristika gorenavedenog, pokazano je da su izolovani ISVD izuzetno stabilni u sinovijalnoj tečnosti. Predviđa se da ova stabilnost omogućava manje učestao režim doziranja.

[0023] Shodno tome, ovaj pronalazak se odnosi na polipeptid koji se sastoji od najmanje 1 pojedinačnogkog varijabilnog domena imunoglobulina (ISVD) koji vezuje A dezintegrin i metaloproteinazu sa motivom trombospondina 5 (ADAMTS5), pri čemu se navedeno ISVD vezivanje ADAMTS5 sastoji od 3 regiona za određivanje komplementarnosti (CDR1 do CDR3 respektivno) i 4 okvirna regiona (FR1 do FR4, respektivno), u kojima je CDR1 SEQ ID NO: 21, CDR2 je SEQ ID NO: 37 i CDR3 je SEQ ID NO: 55, i gde je (i) FR1 SEQ ID NO: 72, FR2 je SEQ ID NO: 86, FR3 je SEQ ID NO: 96 i FR4 je SEQ ID NO: 114, ili (ii) FR1 ima sekvencu aminokiselina DVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAAS, FR2 je SEQ ID NO: 88, FR3 ima sekvencu aminokiselina YVDSLKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCAA, i FR4 je SEQ ID NO: 114. U jednom aspektu, pronalazak se odnosi na polipeptid prema patentnom zahtevu, pri čemu pomenuti ISVD koji vezuje ADAMTS5 ne vezuje ADAMTS4, MMP1 ili MMP14.

[0024] U poželjnim otelotvorenjima svih aspekata pronalaska, pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina (ISVD) prema pronalasku poželjno se sastoji od ili se u suštini sastoji od 4 okvirna regiona (FR1 do FR4, respektivno) i 3 regiona koji određuju komplementarnost CDR1, CDR2 i CDR3 kao što je gore i dole navedeno. Preferirane okvirne sekvence su obelodanjene, na primer, u tabeli A-2 u nastavku i mogu se koristiti u ISVD pronalaska.

Poželjno je da se CDR prikazani u tabeli A-2 podudaraju sa odgovarajućim okvirnim regionima istog ISVD konstrukta.

[0025] Pronalazak se odnosi na polipeptid naveden u ovom patentnom zahtevu, u kojem je CDR1 SEQ ID NO: 21, CDR2 je SEQ ID NO: 37 i CDR3 je SEQ ID NO: 55.

[0026] U daljem poželjnom aspektu, pronalazak se odnosi na polipeptid naveden u ovom patentnom zahtevu, pri čemu je pomenuti ISVD SEQ ID NO: 2. U daljem poželjnom aspektu, pronalazak se odnosi na polipeptid naveden u ovom patentnom zahtevu, pri čemu se pomenuti polipeptid vezuje za ADAMTS5 sa KDbizmeđu 1E<-07>M i 1E<-13>M, kao što je između 1E<-08>M i 1E<-12>M, poželjno najviše 1E<-07>M, poželjno manje od 1E<-08>M ili 1E<-09>M, ili čak manje od 1E<-10>M, kao što je 5E<-11>M, 4E<-11>M, 3E<-11>M, 2E<-11>M, 1.7E<-11>M, 1E<-11>M, ili čak 5E<-12>M, 4E<-12>M, 3E<-12>M, 1E<-12>M, na primer kako je određeno metodom KinExA, ili alternativno metodom Gyrolab.

[0027] U daljem poželjnom aspektu, pronalazak se odnosi na polipeptid naveden u ovom patentnom zahtevu, pri čemu pomenuti polipeptid inhibira aktivnost ADAMTS5 sa IC50između 1E<-07>M i 1E<-12>M, kao što je između 1E<-08>M i 1E<-11>M, na primer, kako je određeno humanim FRET testom ili humanim AlphaLISA testom.

[0028] U daljem poželjnom aspektu, pronalazak se odnosi na polipeptid naveden u ovom patentnom zahtevu, pri čemu pomenuti polipeptid inhibira (enzimsku) aktivnost ADAMTS5 sa IC50od najviše 1E<-07>M, poželjno 1E<-08>M, 5E<-09>M, ili 4E<-9>M, 3E<-9>M, 2E<-9>M, kao što je 1E<-9>M.

[0029] U daljem poželjnom aspektu, pronalazak se odnosi na polipeptid naveden u ovom patentnom zahtevu, pri čemu pomenuti polipeptid modulira ADAMTS5 sa EC50između 1E<-07>M i 1E<-12>M, kao što je između 1E<-08>M i 1E<-11>M, na primer, kako je određeno metodom vezivanja ELISA.

[0030] U daljem poželjnom aspektu, pronalazak se odnosi na polipeptid naveden u ovom patentnom zahtevu, pri čemu se pomenuti polipeptid vezuje za ADAMTS5 sa stopom disocijacije manjom od 1E<-04>s<-1>, na primer, kako je određeno SPR metodom.

[0031] U daljem poželjnom aspektu, pronalazak se odnosi na polipeptid naveden u ovom patentnom zahtevu, pri čemu je pomenuti ADAMTS5 humani ADAMTS5 (SEQ ID NO: 149), goveđi ADAMTS5 (SEQ ID NO: 150), pacovski ADAMTS5 (SEQ ID NO: 151), zamorački ADAMTS5 (SEQ ID NO: 152), mišji ADAMTS5, (SEQ ID NO: 153) ili cinomolgus ADAMTS5, (SEQ ID NO: 154), poželjno humani ADAMTS5, najpoželjnije SEQ ID NO: 149.

[0032] U daljem poželjnom aspektu, pronalazak se odnosi na polipeptid naveden u ovom patentnom zahtevu, pri čemu pomenuti polipeptid antagonizuje aktivnost ADAMTS5, kao što je aktivnost proteaze, kao što je cepanje agrekana, verzikana, brevicana, neurokana, dekorina i/ili biglikana, poželjno cepanje agrekana; poželjno antagonizuje aktivnost agrekanaze ADAMTS5.

[0033] U daljem poželjnom aspektu, pronalazak se odnosi na polipeptid naveden u ovom patentnom zahtevu, pri čemu pomenuti polipeptid blokira vezivanje ADAMTS5 za agrekan za najmanje 20%, kao što su najmanje 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ili čak više, na primer kako je određeno metodama FRET, AlphaLISA ili ELISA.

[0034] U daljem poželjnom aspektu, pronalazak se odnosi na polipeptid naveden u ovom patentnom zahtevu, pri čemu pomenuti polipeptid inhibira aktivnost proteaze ADAMTS5, kao što je inhibicija proteolize supstrata, kao što su agrekan, verzikan, brevikan, neurokan, dekorin i/ili biglikan, poželjno agrekan.

[0035] U daljem poželjnom aspektu, pronalazak se odnosi na polipeptid naveden u ovom patentnom zahtevu, koji se sastoji od najmanje 2 ISVD, pri čemu najmanje 1 ISVD specifično vezuje ADAMTS5. poželjno SEQ ID NO: 2. poželjno pri čemu navedena najmanje 2 ISVD specifično vezuju ADAMTS, poželjno ADAMTS5.

[0036] U daljem poželjnom aspektu, pronalazak se odnosi na polipeptid naveden u ovom patentnom zahtevu koji se sastoji od dva ili više ISVD koji specifično vezuju ADAMTS5, pri čemu (a) najmanje „prvi“ ISVD specifično vezuje prvu antigenu determinantu, epitop, deo, domen, podjedinicu ili konformaciju ADAMTS5; i pri čemu (b) najmanje „drugi“ ISVD specifično vezuje drugu antigenu determinantu, epitop, deo, domen, podjedinicu ili

1

konformaciju ADAMTS5, različitu od prve antigene determinante, epitopa, dela, domena, podjedinice ili konformacije, respektivno, poželjno pri čemu je pomenuti „prvi“ ISVD koji specifično vezuje ADAMTS5 SEQ ID NO: 2, poželjno pri čemu je pomenuti „drugi“ ISVD koji specifično vezuje ADAMTS5 SEQ ID NO: 118 ili 19, još poželjnije da se pomenuti polipeptid bira iz grupe koju čine SEQ ID NO: 127 (klon 130049-093-Alb), SEQ ID NO: 126 (klon 1292F3-093-Alb), SEQ ID NO: 127 (klon 130049-093-Alb) i SEQ ID NO: 128 (klon 1319D3-093-Alb).

[0037] U daljem poželjnom aspektu, pronalazak se odnosi na polipeptid naveden u ovom patentnom zahtevu, koji dalje sadrži serumski albumin koji se vezuje za ISVD, pri čemu se pomenuti serumski albumin koji se vezuje za ISVD u suštini sastoji od 4 okvirna regiona (FR1 do FR4, respektivno) i 3 regiona koja određuju komplementarnost ( CDR1 do CDR3 respektivno), u kojima je CDR1 SEQ ID NO: 146, CDR2 je SEQ ID NO: 147, i CDR3 je SEQ ID NO: 148, još poželjnije gde je pomenuti serumski albumin koji se vezuje za ISVD izabran iz grupe koju čine ALB8 (SEQ ID NO: 131), ALB23 (SEQ ID NO: 132), ALB129 (SEQ ID NO: 133), ALB132 (SEQ ID NO: 134), ALB11 (SEQ ID NO: 135), ALB11 (S112K)-A (SEQ ID NO: 136), ALB82 (SEQ ID NO: 137), ALB82-A (SEQ ID NO: 138), ALB82-AA (SEQ ID NO: 139), ALB82-AAA (SEQ ID NO: 140), ALB82-G (SEQ ID NO: 141), ALB82-GG (SEQ ID NO: 142), ALB82-GGG (SEQ ID NO: 143), ALB92 (SEQ ID NO: 144), i ALB223 (SEQ ID NO: 145), još poželjnije gde je pomenuti polipeptid izabran iz grupe koju čine SEQ ID NO: 129 (klon 5772F3<SO>-Alb), SEQ ID NO: 130 (klon 5792F3<SO>-093-Alb), SEQ ID NO: 120 (klon 42A12-Alb), SEQ ID NO: 121 (klon 52D7-Alb), SEQ ID NO: 122 (klon 62F3-Alb), SEQ ID NO: 123 (klon 69049-Alb), SEQ ID NO: 124 (klon 70 9D3-Alb), SEQ ID NO: 125 (klon 713B2-Alb), SEQ ID NO: 126 (klon 1292F3-093-Alb), SEQ ID NO: 127 (klon 130049-093-Alb), i SEQ ID NO: 128 (klon 1319D3-093-Alb).

[0038] U daljem poželjnom aspektu, pronalazak se odnosi na polipeptid naveden u ovom patentnom zahtevu, koji dalje sadrži najmanje jedan ISVD koji specifično vezuje agrekan, poželjno izabran iz grupe koju čine SEQ ID NO: 156 (nanotelo 00745 PEA114F08) i SEQ ID NO: 157 (nanotelo 00747 PEA604F02).

[0039] U daljem poželjnom aspektu, pronalazak se odnosi na polipeptid naveden u ovom patentnom zahtevu, koji dalje sadrži najmanje 2 ISVD koji specifično vezuju agrekan, pri čemu navedena najmanje 2 ISVD koji specifično vezuju agrekan mogu biti isti ili različiti, poželjno gde su navedena najmanje 2 ISVD koji specifično vezuju agrekan nezavisno izabrani iz grupe koju čine SEQ ID NO: 156 i 157, još poželjnije gde se pomenuti ISVD koji specifično vezuje agrekan, specifično vezuje za humani agrekan [SEQ ID NO: 155].

Poželjno, pomenuti ISVD koji specifično vezuje agrekan, specifično vezuje pseći agrekan (videti takođe tabelu 2), goveđi agrekan, goveđi agrekan, pacovski agrekan; svinjski agrekan; mišji agrekan, zečji agrekan; cinomolgus agrekan i/ili rezus agrekan. Poželjno, pomenuti ISVD koji specifično vezuje agrekan se poželjno vezuje za hrskavično tkivo kao što je hrskavica i/ili meniskus.

[0040] U daljem poželjnom aspektu, pronalazak se odnosi na polipeptid naveden u ovom patentnom zahtevu, pri čemu pomenuti polipeptid ima stabilnost od najmanje 7 dana, kao što je 14 dana, 21 dan, 1 mesec, 2 meseca ili čak 3 meseca u sinovijalnoj tečnosti (SF) na 37 °C.

[0041] U daljem poželjnom aspektu, pronalazak se odnosi na polipeptid naveden u ovom patentnom zahtevu, pri čemu su navedena najmanje dva ISVD direktno povezana jedan sa drugim ili su povezana preko linkera, poželjno je pomenuti linker izabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 158 do 174 (tj. SEQ ID NO: 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173 i 174), poželjno SEQ ID NO: 169.

[0042] U daljem poželjnom aspektu, pronalazak se odnosi na polipeptid naveden u ovom patentnom zahtevu, koji dodatno sadrži C-terminalnu ekstenziju, poželjno pri čemu je navedena C-terminalna ekstenzija C-terminalna ekstenzija (X)n, u kojoj je n od 1 do 10, poželjno od 1 do 5, kao što su 1, 2, 3, 4 ili 5 (i poželjno 1 ili 2, kao što je 1); i svaki X je (poželjno prirodna) amino kiselina koja je nezavisno izabrana, a poželjno nezavisno izabrana iz grupe koja se sastoji od alanina (A), glicina (G), valina (V), leucina (L) ili izoleucina (I).

[0043] U daljem poželjnom aspektu, pronalazak se odnosi na polipeptid naveden u ovom patentnom zahtevu, pri čemu pomenuti polipeptid ima 100% identičnost sekvence sa bilo kojim od SEQ ID NO: 2, 122, 126, ili 129 ili 130.

[0044] U daljem poželjnom aspektu, pronalazak se odnosi na polipeptid naveden u ovom patentnom zahtevu, za upotrebu kao lek.

[0045] U daljem poželjnom aspektu, pronalazak se odnosi na polipeptid naveden u ovom patentnom zahtevu, za upotrebu u lečenju ili sprečavanju simptoma bolesti povezane sa ADAMTS5, kao što su npr. artropatije i hondrodistrofije, artritične bolesti, kao što su osteoartritis, reumatoidni artritis, gihtni artritis, psorijatični artritis, traumatska ruptura ili odvajanje, ahondroplazija, kostohondritis, spondiloepimetafizalna displazija, hernija diska kičme, bolest degeneracije lumbalnog diska, degenerativna bolest zglobova i relapsirajući polihondritis, osteohondritis disekans i agrekanopatije. Poželjnije je da je pomenuta bolest artritična bolest, a najpoželjnije osteoartritis.

[0046] U daljem poželjnom aspektu, pronalazak se odnosi na polipeptid naveden u ovom patentnom zahtevu, pri čemu pomenuti polipeptid unakrsno blokira vezivanje za ADAMTS5 najmanje jednog od polipeptida predstavljenih bilo kojim od SEQ ID NO: 2, 1, 3, 6, 16, 17, 10, 11, 9, 5, 4, 7, 117, 8, 12, 13, 14, 15 i 18, i/ili je unakrsno blokiran od vezivanja za ADAMTS5 najmanje polipeptidom predstavljenim bilo kojim od SEQ ID NO: 2, 1, 3, 6, 16, 17, 10, 11, 9, 5, 4, 7, 117, 8, 12, 13, 14, 15 i 18.

[0047] U daljem poželjnom aspektu, pronalazak se odnosi na polipeptid koji unakrsno blokira vezivanje za ADAMTS5 od strane polipeptida predstavljenog bilo kojim od SEQ ID NO: 2, 1, 3, 6, 16, 17, 10, 11, 9, 5, 4, 7, 117, 8, 12, 13, 14, 15 i 18, i/ili je unakrsno blokiran od vezivanja za ADAMTS5 najmanje polipeptidom predstavljenim bilo kojim od SEQ ID NO: 2, 1, 3, 6, 16, 17, 10, 11, 9, 5, 4, 7, 117, 8, 12, 13, 14, 15 i 18, pri čemu pomenuti polipeptid sadrži najmanje jedan VH, VL, dAb, pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina (ISVD) koji specifično vezuje ADAMTS5, pri čemu vezivanje za ADAMTS5 modulira aktivnost ADAMTS5.

[0048] Ostali aspekti, prednosti, primene i upotrebe polipeptida i kompozicija biće jasniji iz daljeg izlaganja ovde. U tekstu ove specifikacije navodi se nekoliko dokumenata. Ništa u ovom dokumentu ne može se tumačiti kao priznanje da pronalazak nema pravo da precedira takvo obelodanjivanje na osnovu ranijeg pronalaska.

1

4 LEGENDA SLIKA

[0049]

Slika 1:

ISVD koji vezuju ADAMTS5 ne inhibiraju aktivnost MMP1 (A) ili MMP14 (B).

Slika 2:

ISVD koji vezuju ADAMTS5 ne inhibiraju aktivnost ADAMTS4

Slika 3:

nivoi vezivanja postojećih antitela (preAb) za konstrukt nanotela 581 (A) i konstrukt nanotela 579 (B) iz 3 skupa uzoraka donora dobijenih od: zdravih subjekata, subjekata sa osteoartritisom i donora sa rezidualnim vezivanjem preAb.

Slika 4:

konstrukt nanotela 581 („C011400581“) se ne vezuje za humani ADAMTS1 (A) i ne vezuje se za humani ADAMTS4 ili humani ADAMTS15 (B).

Slika 5:

Potencija u sistemu ljudskih eksplanta. Prikazana je akumulacija GAG u supernatantu nakon 7 dana.

Slika 6:

1. A) Vremenski tok oslobađanja GAG u supernatant u sistemu ko-kulture goveda.

2. B) Proračun površine ispod krive (AUC) oslobađanja GAG tokom vremena (7-28 dana). Broj ponavljanja n=4. Podaci su prikazani u Box &Whiskers formatu sa min. do maks.

3. C) Podaci pokazuju sadržaj GAG [ng/mg hrskavice] nakon digestije papaina. Broj ponavljanja n=4. Podaci su prikazani u Box &Whiskers formatu sa min. do maks.

Slika 7:

Proračun površine ispod krive (AUC) oslobađanja exAGNx1 tokom vremena (7-28 dana). Broj ponavljanja n=4. Podaci su prikazani u Box &Whiskers formatu sa min. do maks.

Slika 8:

Proračun površine ispod krive (AUC) oslobađanja C2M tokom vremena (7-28 dana). Broj ponavljanja n=4. Podaci su prikazani u Box &Whiskers formatu sa min. do maks.

Slika 9:

Proračun površine ispod krive (AUC) oslobađanja C3M tokom vremena (7-28 dana). Broj ponavljanja n=4. Podaci su prikazani u Box &Whiskers formatu sa min. do maks.

Slika 10:

Inhibicija aktivnosti agrekanaze u NHP.

Slika 11:

Inhibicija degeneracije hrskavice. Medijana sume degeneracije hrskavice prikazana je u profilaktičkom (A) i terapijskom (B) tretmanu na modelu DMM miša.

1

Slika 12:

Simptomatsko ponašanje u hirurškom modelu OA kod pacova.

Slika 13:

Medijalna tibijalna širina degeneracije hrskavice.

Slika 14:

Uticaj nanotela anti-ADAMTS-5 na razgradnju agrekana izvedenih iz agrekanaze u ex vivo kulturama hrskavice (A, B, C) i ko-kulturama hrskavice i sinovijalne membrane (D, E). Navedene koncentracije su koncentracija nanotela. Statistička analiza je urađena sa običnom jednosmernom ANOVA ili dvosmernom ANOVA. Razmatran je statistički značaj, kada je p<0,05.

5 DETALJAN OPIS

[0050] Ostaje potreba za bezbednim i efikasnim lekovima za OA, posebno DMOAD. Ovi lekovi treba da budu u skladu sa različitim i često suprotstavljenim zahtevima, posebno kada je predviđen široko primenljiv format. Kao takav, format bi poželjno trebalo da bude koristan kod širokog spektra pacijenata. Format treba da bude bezbedan i da ne izaziva infekcije zbog česte primene. Pored toga, poželjno je da format bude prilagođen pacijentu, kao na primer, format koji omogućava praktičan režim doziranja i put primene, npr. sistemska primena. Na primer, poželjno je da se format odmah ne ukloni iz cirkulacije nakon primene. Međutim, produženje poluvremena eliminacije ne bi trebalo da dovede do aktivnosti van cilja i neželjenih efekata ili da ograničava efikasnost.

[0051] Ovaj pronalazak ostvaruje najmanje jedan od ovih zahteva.

[0052] Na osnovu nekonvencionalnih skrininga, karakterizacije i kombinatornih strategija, sadašnji pronalazači su iznenađujuće primetili da su pojedinačni varijabilni domeni imunoglobulina (ISVD) pokazali izuzetno dobre rezultate u in vitro i in vivo eksperimentima.

1

[0053] Štaviše, sadašnji pronalazači su uspeli da redizajniraju ISVD koji su dodatno nadmašili uporedne lekove u poboljšanju OA. Pored toga, ISVD pronalaska su takođe pokazali da su značajno bezbedniji od jedinjenja iz prethodnog stanja tehnike.

[0054] Ovaj pronalazak namerava da obezbedi polipeptidima koji antagoniziraju ADAMTS, posebno ADAMTS5, poboljšana profilaktička, terapijska i/ili farmakološka svojstva, uključujući sigurniji profil, u poređenju sa aminokiselinskim sekvencama i antitelima iz prethodnog stanja tehnike.

[0055] Shodno tome, ovaj pronalazak se odnosi na ISVD i polipeptide koji su usmereni protiv/i/ili koji se mogu specifično vezati (kako je ovde definisano) za ADAMTS5.

[0056] Shodno tome, ovaj pronalazak se odnosi na ISVD i polipeptide koji su usmereni protiv/i ili koji se mogu specifično vezati (kako je ovde definisano) za ADAMTS5 i modulisati njegovu aktivnost, posebno polipeptid koji se sastoji od najmanje jednog ISVD koji specifično vezuje ADAMTS5, pri čemu vezivanje za ADAMTS5 modulira aktivnost ADAMTS5.

[0057] Osim ako nije naznačeno ili definisano drugačije, svi korišćeni termini imaju svoje uobičajeno značenje u struci, što će biti jasno kvalifikovanoj osobi. Na primer, upućuje se na standardne priručnike, kao što su Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Ed.) Vols.1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), F. Ausubel et al. (Current protocols in molecular biology, Green Publishing and Wiley Interscience, New York, 1987), Lewin (Genes II, John Wiley & Sons, New York, N.Y., 1985), Old et al. (Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering (2nd edition) University of California Press, Berkeley, CA, 1981); Roitt et al. (Immunology (6th Ed.) Mosby/Elsevier, Edinburgh, 2001), Roitt et al. (Roitt's Essential Immunology (10th Ed.) Blackwell Publishing, UK, 2001), i Janeway et al. (Immunobiology (6th Ed.) Garland Science Publishing/Churchill Livingstone, New York, 2005), kao i na opštu pozadinsku literaturu citiranu ovde.

[0058] Osim ako nije drugačije naznačeno, sve metode, koraci, tehnike i manipulacije koje nisu posebno detaljno opisane mogu se izvesti i izvedene su na način poznat sam po sebi, što će biti jasno kvalifikovanoj osobi. Na primer, ponovo se upućuje na standardne priručnike i

1

opštu pozadinsku literaturu pomenutu ovde i na dalje reference navedene u njima; kao i na primer sledeće preglede, Presta (Adv. Drug Deliv. Rev.58 (5-6): 640-56, 2006), Levin i Weiss (Mol. Biosyst.2(1): 49-57, 2006), Irving et al. (J. Immunol. Methods 248(1-2): 31-45, 2001), Schmitz et al. (Placenta 21 Suppl. A: S106-12, 2000), Gonzales et al. (Tumour Biol.

26(1): 31-43, 2005), koji opisuju tehnike za proteinski inženjering, kao što su sazrevanje afiniteta i druge tehnike za poboljšanje specifičnosti i drugih željenih svojstava proteina kao što su imunoglobulini.

[0059] Mora se napomenuti da, kako se ovde koristi, oblici u jednini uključuju reference u množini, osim ako kontekst jasno ne ukazuje drugačije. Tako, na primer, upućivanje na „reagens“ uključuje jedan ili više takvih različitih reagensa, a pozivanje na „metodu“ uključuje pozivanje na ekvivalentne korake i metode poznate stručnjacima u predmetnoj oblasti, koje bi mogle biti modifikovane ili supstituisane ovde opisanim metodama.

[0060] Osim ako nije drugačije naznačeno, termin „najmanje“ koji prethodi nizu elemenata treba shvatiti tako da se odnosi na svaki element u nizu. Stručnjaci u predmetnoj oblasti će prepoznati, ili biti u stanju da utvrde koristeći samo rutinsko eksperimentisanje, mnoge ekvivalente specifičnih otelotvorenja opisanih ovde. Takvi ekvivalenti su predviđeni da budu obuhvaćeni ovim pronalaskom.

[0061] Termin „i/ili“ gde god se ovde koristi uključuje značenje „i“, „ili“ i „sve ili bilo koju drugu kombinaciju elemenata povezanih navedenim terminom“.

[0062] Termin „oko“ ili „približno“ kako se ovde koristi znači unutar 20%, poželjno unutar 15%, poželjnije unutar 10%, a najpoželjnije unutar 5% date vrednosti ili opsega.

[0063] U celoj ovoj specifikaciji i patentnim zahtevima koji sledi, osim ako kontekst ne zahteva drugačije, reč „obuhvatati“, i varijacije kao što su „obuhvata“ i „obuhvatajući“, podrazumeva uključivanje navedenog celog broja ili koraka ili grupe celih brojeva ili korake, ali ne isključivanje bilo kog drugog celog broja ili koraka ili grupe celih brojeva ili koraka. Kada se ovde koristi termin „obuhvatati“ može se zameniti terminom „sadržati“ ili „uključujući“ ili ponekad kada se ovde koristi sa terminom „imati“.

1

[0064] Termin „sekvenca“ kako se ovde koristi (na primer u terminima kao što su „sekvenca imunoglobulina“, „sekvenca antitela“, „sekvenca varijabilnog domena“ , „sekvenca VHH“ ili „sekvenca proteina“), treba generalno shvatiti tako da uključuje i relevantnu sekvencu aminokiselina, kao i nukleinske kiseline ili nukleotidne sekvence koje kodiraju istu, osim ako kontekst ne zahteva ograničeniju interpretaciju.

[0065] Sekvence aminokiselina se tumače tako da označavaju jednu aminokiselinu ili nerazgranatu sekvencu od dve ili više aminokiselina, u zavisnosti od konteksta. Sekvence nukleotida se tumače tako da označavaju nerazgranatu sekvencu od 3 ili više nukleotida.

[0066] Aminokiseline su one L-aminokiseline koje se obično nalaze u prirodnim proteinima. Ostaci aminokiselina će biti naznačeni prema standardnom troslovnom ili jednoslovnom aminokiselinskom kodu. Upućivanje je, na primer, na tabelu A-2 na strani 48 WO 08/020079. Te sekvence aminokiselina koje sadrže D-aminokiseline nisu namenjene da budu obuhvaćene ovom definicijom. Svaka sekvenca aminokiselina koja sadrži posttranslaciono modifikovane aminokiseline može se opisati kao sekvenca aminokiselina čija se translacija inicijalno vrši pomoću simbola prikazanih u ovoj tabeli A-2 sa modifikovanim pozicijama; npr. hidroksilacije ili glikozilacije, ali ove modifikacije se ne prikazuju eksplicitno u sekvenci aminokiselina. Svaki peptid ili protein koji se može izraziti kao sekvenca sa izmenjenim vezama, unakrsnim vezama i završnim CAP, nepeptidnim vezama itd., obuhvaćen je ovom definicijom, sve kako je poznato u struci.

[0067] Termini „protein“, „peptid“, „protein/peptid“ i „polipeptid“ koriste se naizmenično tokom celog obelodanjivanja i svaki ima isto značenje u svrhu ovog obelodanjivanja. Svaki termin se odnosi na organsko jedinjenje napravljeno od linearnog lanca od dve ili više aminokiselina. Jedinjenje može imati deset ili više aminokiselina; dvadeset pet ili više aminokiselina; pedeset ili više aminokiselina; sto ili više aminokiselina, dve stotine ili više aminokiselina, pa čak i tri stotine ili više aminokiselina. Kvalifikovanom stručnjaku će biti jasno da polipeptidi generalno sadrže manje aminokiselina od proteina, iako ne postoji stručno priznata granična tačka broja aminokiselina koje razlikuju polipeptide i protein; da se polipeptidi mogu napraviti hemijskom sintezom ili rekombinantnim metodama; i da se proteini generalno proizvode in vitro ili in vivo rekombinantnim metodama kao što je poznato u struci. Po konvenciji, amidna veza u primarnoj strukturi polipeptida je u redosledu kojim

1

su zapisane aminokiseline, u kojima je aminski kraj (N-terminal) polipeptida uvek sa leve strane, dok je kiselinski kraj (C-terminal) sa desne strane.

[0068] Smatra se da je sekvenca nukleinske kiseline ili aminokiseline „(u) (suštinski) izolovanom (obliku)“ - na primer, u poređenju sa reakcionim medijumom ili medijumom za kultivaciju iz kojeg je dobijena - kada je odvojena od najmanje jedne druge komponente sa kojom je obično povezana u navedenom izvoru ili medijumu, kao što je druga nukleinska kiselina, drugi protein/polipeptid, druga biološka komponenta ili makromolekul ili najmanje jedan kontaminant, nečistoća ili sporedna komponenta. Konkretno, sekvenca nukleinske kiseline ili aminokiseline se smatra „(suštinski) izolovanom“ kada je prečišćena najmanje 2 puta, posebno najmanje 10 puta, posebno najmanje 100 puta, i do 1000 puta ili više.

Nukleinska kiselina ili aminokiselina koja je „u (u suštini) izolovanom obliku“ je poželjno u suštini homogena, kako je određeno korišćenjem odgovarajuće tehnike, kao što je odgovarajuća hromatografska tehnika, kao što je elektroforeza u obliku poliakrilamida.

[0069] Kada se kaže da nukleotidna sekvenca ili sekvenca aminokiselina „obuhvata“ drugu nukleotidnu sekvencu ili sekvencu aminokiselina, respektivno, ili da se „u suštini sastoji od“ druge nukleotidne sekvence ili sekvence aminokiselina, to može značiti da je druga nukleotidna sekvenca ili sekvenca aminokiselina ugrađena u prvu pomenutu nukleotidnu sekvencu ili sekvencu aminokiselina, respektivno, ali češće to generalno znači da prva pomenuta nukleotidna sekvenca ili sekvenca aminokiselina obuhvata u okviru svoje sekvence deo nukleotida ili ostataka aminokiselina, respektivno, koji ima istu nukleotidnu sekvencu ili sekvencu aminokiselina, respektivno, kao i poslednja sekvenca, bez obzira na to kako je prva pomenuta sekvenca zapravo generisana ili dobijena (što na primer može biti bilo kojom pogodnom metodom opisanom u ovom dokumentu). Pomoću neograničavajućeg primera, kada se kaže da polipeptid pronalaska obuhvata pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina („ISVD“), to može značiti da je navedena sekvenca pojedinačnogkog varijabilnog domena imunoglobulina ugrađena u sekvencu polipeptida pronalaska, ali češće to obično znači da polipeptid pronalaska sadrži u svojoj sekvenci sekvencu pojedinačnogkog varijabilnog domena imunoglobulina bez obzira na to kako je navedeni polipeptid pronalaska generisan ili dobijen. Takođe, kada se kaže da nukleinska kiselina ili nukleotidna sekvenca obuhvata drugu nukleotidnu sekvencu, prva pomenuta nukleinska kiselina ili nukleotidna sekvenca je poželjno takva da, kada se izrazi u ekspresijskom proizvodu (npr. polipeptid), aminokiselinska sekvenca kodirana potonjom nukleotidnom sekvencom čini deo navedenog

2

ekspresijskog proizvoda (drugim rečima, da je potonja nukleotidna sekvenca u istom okviru za očitavanje kao i prva pomenuta, veća nukleinska kiselina ili nukleotidna sekvenca).

Takođe, kada se kaže da konstrukt pronalaska obuhvata polipeptid ili ISVD, to može značiti da navedeni konstrukt obuhvata najmanje navedeni polipeptid ili ISVD, respektivno, ali češće to znači da navedeni konstrukt obuhvata grupe, ostatke (npr. aminokiselinske ostatke), delove i/ili jedinice vezivanja pored navedenog polipeptida ili ISVD, bez obzira na to kako je navedeni polipeptid ili ISVD povezan sa navedenim grupama, ostacima (npr. aminokiselinski ostaci), delovima i/ili jedinicama vezivanja i bez obzira na to kako je pomenuti konstrukt generisan ili dobijen.

[0070] Pod „suštinski se sastoji od“ podrazumeva se da je ISVD koji se koristi u pronalasku ili potpuno isti kao ISVD pronalaska ili odgovara ISVD pronalaska, koji ima ograničen broj aminokiselinskih ostataka, kao što su 1-20 aminokiselinskih ostataka, na primer 1-10 aminokiselinskih ostataka i poželjno 1-6 aminokiselinskih ostataka, kao što su 1, 2, 3, 4, 5 ili 6 aminokiselinskih ostataka, dodatih na amino terminalnom kraju, na karboksi terminalnom kraju, ili na oba amino terminalnom kraju i karboksi terminalnom kraju ISVD.

[0071] U svrhu poređenja dve ili više nukleotidnih sekvenci, procenat „identiteta sekvence“ između prve nukleotidne sekvence i druge nukleotidne sekvence može se izračunati deljenjem [broja nukleotida u prvoj nukleotidnoj sekvenci koji su identični nukleotidima na odgovarajućim pozicijama u drugoj nukleotidnoj sekvenci] sa [ukupnim brojem nukleotida u prvoj nukleotidnoj sekvenci] i množenjem sa [100%], pri čemu se svaka delecija, insercija, supstitucija ili adicija nukleotida u drugoj nukleotidnoj sekvenci - u poređenju sa prvom nukleotidnom sekvencom - smatra razlikom na jednom nukleotidu (poziciji). Alternativno, stepen identiteta sekvence između dve ili više nukleotidnih sekvenci može se izračunati korišćenjem poznatog računarskog algoritma za poravnanje sekvenci kao što je NCBI Blast v2.0, koristeći standardna podešavanja. Neke druge tehnike, računarski algoritmi i podešavanja za određivanje stepena identiteta sekvence opisani su na primer u WO 04/037999, EP 0967284, EP 1085089, WO 00/55318, WO 00/78972, WO 98/49185 i GB 2357768. Obično, u svrhu određivanja procenta „identiteta sekvence“ između dve nukleotidne sekvence u skladu sa gorenavedenom metodom izračunavanja, nukleotidna sekvenca sa najvećim brojem nukleotida će se uzeti kao „prva“ nukleotidna sekvenca, a druga nukleotidna sekvenca će se uzeti kao „druga“ nukleotidna sekvenca.

[0072] U svrhu poređenja dve ili više sekvenci aminokiselina, procenat „identiteta sekvence“ između prve sekvence aminokiselina i druge sekvence aminokiselina (koja se ovde takođe naziva „identitet aminokiselina“) može se izračunati deljenjem [broja aminokiselinskih ostataka u prvoj sekvenci aminokiselina koji su identični aminokiselinskim ostacima na odgovarajućim pozicijama u drugoj sekvenci aminokiselina] sa [ukupnim brojem aminokiselinskih ostataka u prvoj sekvenci aminokiselina] i množenjem sa [100%], pri čemu se svaka delecija, insercija, supstitucija ili adicija aminokiselinskog ostatka u drugoj sekvenci aminokiselina - u poređenju sa prvom sekvencom aminokiselina - smatra razlikom na jednom aminokiselinskom ostatku (poziciji), tj. kao „razlika aminokiselina“ kako je ovde definisano. Alternativno, stepen identiteta sekvence između dve sekvence aminokiselina može se izračunati korišćenjem poznatog računarskog algoritma, kao što su oni navedeni gore za određivanje stepena identiteta sekvence za nukleotidne sekvence, ponovo koristeći standardna podešavanja. Obično, u svrhu određivanja procenta „identiteta sekvence“ između dve sekvence aminokiselina u skladu sa metodom izračunavanja koja je ovde navedena, sekvenca aminokiselina sa najvećim brojem aminokiselinskih ostataka će se uzeti kao „prva“ sekvenca aminokiselina, a druga sekvenca aminokiselina će se uzeti kao „druga“ sekvenca aminokiselina.

[0073] Takođe, u određivanju stepena identiteta sekvence između dve sekvence aminokiselina, kvalifikovana osoba može uzeti u obzir takozvane „konzervativne“ supstitucije aminokiselina, koje se generalno mogu opisati kao supstitucije aminokiselina u kojima se aminokiselinski ostatak zamenjuje drugim aminokiselinskim ostatkom slične hemijske strukture i koji ima mali ili u suštini nikakav uticaj na funkciju, aktivnost ili druga biološka svojstva polipeptida. Takve konzervativne aminokiselinske supstitucije su dobro poznate u struci, na primer iz WO 04/037999, GB 335768, WO 98/49185, WO 00/46383 i WO 01/09300; i (poželjni) tipovi i/ili kombinacije takvih supstitucija mogu se izabrati na osnovu relevantnih učenja iz WO 04/037999, kao i iz WO 98/49185 i iz daljih referenci navedenih u njima.

[0074] Takve konzervativne supstitucije su poželjno supstitucije u kojima je jedna aminokiselina unutar sledećih grupa (a) - (e) zamenjena drugim aminokiselinskim ostatkom unutar iste grupe: (a) mali alifatski, nepolarni ili slabopolarni ostaci: Ala, Ser, Thr, Pro i Gly; (b) polarni, negativno naelektrisani ostaci i njihovi (nenaelektrisani) amidi: Asp, Asn, Glu i Gln; (c) polarni, pozitivno naelektrisani ostaci: His, Arg i Lys; (d) veliki alifatski, nepolarni ostaci: Met, Leu, Ile, Val i Cys; i (e) aromatični ostaci: Phe, Tyr i Trp. Posebno poželjne konzervativne supstitucije su sledeće: Ala u Gly ili u Ser; Arg u Lys; Asn u Gln ili u His; Asp u Glu; Cys u Ser; Gln u Asn; Glu u Asp; Gly u Ala ili u Pro; His u Asn ili u Gln; Ile u Leu ili u Val; Leu u Ile ili u Val; Lys u Arg, u Gln ili u Glu; Met u Leu, u Tyr ili u Ile; Phe u Met, u Leu ili u Tyr; Ser u Thr; Thr u Ser; Trp u Tyr; Tyr u Trp; i/ili Phe u Val, u Ile ili u Leu.

[0075] Sve aminokiselinske supstitucije primenjene na ovde opisane polipeptide mogu se takođe zasnivati na analizi učestalosti varijacija aminokiselina između homolognih proteina različitih vrsta koje su razvili Schulz et al. ("Principles of Protein Structure", Springer-Verlag, 1978), na analizama potencijala za formiranje strukture koje su razvili Chou i Fasman (Biochemistry 13: 211, 1974; Adv. Enzymol., 47: 45-149, 1978), i na analizi obrazaca hidrofobnosti u proteinima koje su razvili Eisenberg et al. (Proc. Natl. Acad Sci. USA 81: 140-144, 1984), Kyte i Doolittle (J. Molec. Biol.157: 105-132, 1981), i Goldman et al. (Ann. Rev. Biophys. Chem.15: 321-353, 1986). Informacije o primarnoj, sekundarnoj i tercijarnoj strukturi nanotela date su u opisu ovde i u opštoj pozadinskoj literaturi navedenoj gore.

Takođe, u tu svrhu, kristalna struktura VHHdomena iz lame je na primer data od strane Desmyter et al. (Nature Structural Biology, 3: 803, 1996), Spinelli et al. (Natural Structural Biology, 3: 752-757, 1996) i Decanniere et al. (Structure, 7 (4): 361, 1999). Dodatne informacije o nekim aminokiselinskim ostacima koji u konvencionalnim VHdomenima formiraju VH/VLinterfejs i potencijalnim kamelizirajućim supstitucijama na ovim pozicijama mogu se naći u prethodnoj gorenavedenoj literaturi.

[0076] Za sekvence aminokiselina i sekvence nukleinskih kiselina se kaže da su „potpuno iste“ ako imaju 100% identiteta sekvence (kao što je ovde definisano) po celoj svojoj dužini.

[0077] Kada se uporede dve sekvence aminokiselina, termin „razlika aminokiselina“ se odnosi na inserciju, deleciju ili supstituciju jednog aminokiselinskog ostatka na položaju prve sekvence, u poređenju sa drugom sekvencom; podrazumeva se da dve sekvence aminokiselina mogu da sadrže jednu, dve ili više takvih razlika aminokiselina. Konkretnije, u ISVD i/ili polipeptidima ovog pronalaska, termin „razlika aminokiselina“ se odnosi na inserciju, deleciju ili supstituciju jednog aminokiselinskog ostatka na položaju CDR sekvence navedene u b), d) ili f), u poređenju sa CDR sekvencom respektivno a), c) ili e); podrazumeva se da CDR sekvenca b), d) i f) može da sadrži jednu, dve, tri, četiri ili maksimalno pet takvih aminokiselinskih razlika u poređenju sa CDR sekvencom a), c) ili e) respektivno.

2

[0078] „Razlika aminokiselina“ može biti jedna, dve, tri, četiri ili maksimalnih pet supstitucija, delecija ili insercija, ili bilo koja njihova kombinacija, koje ili poboljšavaju svojstva veziva ADAMTS5 pronalaska, kao što je polipeptid pronalaska ili koje barem ne umanjuju previše željena svojstva ili ravnotežu ili kombinaciju željenih svojstava veziva ADAMTS5 pronalaska, kao što je polipeptid pronalaska. U tom smislu, rezultujuće vezivo za ADAMTS5 ovog pronalaska, kao što je polipeptid pronalaska, treba najmanje da veže ADAMTS5 sa istim, približno istim ili većim afinitetom u poređenju sa polipeptidom koji se sastoji od jedne ili više CDR sekvenci bez jedne, dve, tri, četiri ili maksimalnih pet supstitucija, delecija ili insercija. Afinitet se može meriti bilo kojom pogodnom metodom poznatom u struci, ali se poželjno meri metodom kao što je opisano u odeljku sa primerima.

[0079] U tom pogledu, aminokiselinska sekvenca CDR u skladu sa b), d) i/ili f) kao što je navedeno u nastavku, može biti aminokiselinska sekvenca koja je izvedena iz aminokiselinske sekvence u skladu sa a), c) i/ili e) respektivno putem sazrevanja afiniteta korišćenjem jedne ili više tehnika sazrevanja afiniteta poznatih samih po sebi ili kao što je opisano u primerima. Na primer, i u zavisnosti od organizma domaćina koji se koristi za izražavanje polipeptida pronalaska, takve delecije i/ili supstitucije mogu biti dizajnirane na takav način da se ukloni jedno ili više mesta za posttranslacionu modifikaciju (kao što je jedno ili više mesta glikozilacije), što će biti u okviru sposobnosti stručnjaka u ovoj oblasti (videti primere).

[0080] „Porodica nanotela“, „ porodica VHH“ ili „porodica“ kako se koristi u ovoj specifikaciji odnosi se na grupu nanotela i/ ili sekvenci VHHkoje imaju identične dužine (tj. imaju isti broj aminokiselina unutar svoje sekvence) i od kojih sekvenca aminokiselina između pozicije 8 i pozicije 106 (prema Kabat numeraciji) ima identitet sekvence aminokiselina od 89% ili više.

[0081] Termini „epitop“ i „antigena determinanta“, koji se mogu koristiti naizmenično, odnose se na deo makromolekula, kao što je polipeptid ili protein koji se prepoznaje po molekulima koji vezuju antigen, kao što su imunoglobulini, konvencionalna antitela, pojedinačni varijabilni domeni imunoglobulina i/ili polipeptidi pronalaska, a posebno po mestu vezivanja antigena navedenih molekula. Epitopi definišu minimalno mesto vezivanja za imunoglobulin, i na taj način predstavljaju metu specifičnosti imunoglobulina.

[0082] Deo molekula koji se vezuje za antigen (kao što je imunoglobulin, konvencionalno antitelo, pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina i/ili polipeptid pronalaska) koji prepoznaje epitop naziva se „paratop“.

[0083] Za aminokiselinsku sekvencu (kao što je pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina, antitelo, polipeptid pronalaska ili generalno antigen vezujući protein ili polipeptid ili njihov fragment) koja se može „vezati“ ili „specifično vezati za“, koja „ima afinitet za“ i/ili koja „ima specifičnost za“ određeni epitop, antigen ili protein (ili za najmanje jedan njegov deo, fragment ili epitop) kaže se da je „protiv“ ili „usmerena protiv“ navedenog epitopa, antigena ili proteina ili je „vezujući“ molekul u odnosu na takav epitop, antigen ili protein, ili se kaže da je „anti“-epitop, „anti“-antigen ili „anti“-protein (npr. „anti“-ADAMTS5).

[0084] Afinitet označava snagu ili stabilnost molekularne interakcije. Afinitet se obično izražava kao KD, ili konstanta disocijacije, koja ima jedinice mol/litar (ili M). Afinitet se takođe može izraziti kao konstanta asocijacije, KA, koja je jednaka 1/KDi ima jedinice (mol/litar)<-1>(ili M<-1>). U ovoj specifikaciji, stabilnost interakcije između dva molekula će uglavnom biti izražena u smislu KDvrednosti njihove interakcije; kvalifikovanoj osobi je jasno da se s obzirom na odnos KA=1/KD, određivanje jačine molekularne interakcije po njenoj KDvrednosti može koristiti i za izračunavanje odgovarajuće KAvrednosti. KD-vrednost karakteriše jačinu molekularne interakcije i u termodinamičkom smislu jer je povezana sa promenom slobodne energije (DG) vezivanja dobro poznatom relacijom DG= RT.ln (KD) (ekvivalentno DG= -RT.ln (KA)), gde R predstavlja gasnu konstantu, T je apsolutna temperatura, a In označava prirodni logaritam.

[0085] KDza biološke interakcije koje se smatraju značajnim (npr. specifičnim) obično su u opsegu od 10<-12>M (0,001 nM) do 10<-5>M (10000 nM). Što je interakcija jača, to je niža njena vrednost KD.

[0086] KDse takođe može izraziti kao odnos konstante brzine disocijacije kompleksa, označene kao koff, i brzine njegove asocijacije, označene kao kon(tako da je KD=koff/koni KA= kon/koff). Brzina disocijacije, koff, ima jedinice s<-1>(gde je s Sl jedinica notacija sekunde). Brzina asocijacije, kon, ima jedinice M<-1>s<-1>. Brzina asocijacije može varirati između 10<2>M<-1>s<-1>

2

i oko 10<7>M<-1>s<-1>, približavajući se konstantnoj brzini asocijacije koja je ograničena difuzijom za bimolekularne interakcije. Brzina disocijacije je povezana sa poluvremenom eliminacije trajanja određene molekularne interakcije putem relacije t1/2=ln(2)/koff. Brzina disocijacije može varirati između 10<-6>s<-1>(blizu nepovratnog kompleksa sa t1/2od više dana) do 1 s<-1>(t1/2=0,69 s).

[0087] Specifično vezivanje proteina koji se vezuje za antigen, kao što je ISVD, za antigen ili antigenu determinantu može se odrediti na bilo koji pogodan način poznat sam po sebi, uključujući, na primer, testove vezivanja zasićenja i/ili testove kompetitivnog vezivanja, kao što su radioimunološki testovi (RIA), imunološki testovi enzima (EIA) i testovi kompeticije sendviča, i njihove različite varijante poznate sam po sebi u struci; kao i druge ovde pomenute tehnike.

[0088] Afinitet molekularne interakcije između dva molekula može se meriti različitim tehnikama poznatim same po sebi, kao što je dobro poznata tehnika biosenzora površinske plazmonske rezonance (SPR) (videti na primer Ober et al.2001, Intern. Immunology 13: 1551-1559) gde se jedan molekul imobilizuje na biosenzornom čipu, a drugi molekul prelazi preko imobilizovanog molekula pod uslovima protoka dajući kon, koffmerenja i samim tim KD(iliKA) vrednosti. Ovo se, na primer, može izvršiti korišćenjem poznatih BIACORE<®>instrumenata (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Švedska). Test kinetičke isključenosti (KINEXA<®>) (Drake et al.2004, Analytical Biochemistry 328: 35-43) meri vezujuće događaje u rastvoru bez označavanja vezivnih partnera i zasniva se na kinetičkom isključivanju disocijacije kompleksa. Analiza afiniteta u rastvoru se takođe može izvršiti korišćenjem sistema za imunotestiranje GYROLAB<®>, koji pruža platformu za automatizovanu bioanalizu i brzu obradu uzoraka (Fraley et al.2013, Bioanalysis 5: 1765-74), ili ELISA.

[0089] Kvalifikovanoj osobi će takođe biti jasno da izmereni KDmože odgovarati očiglednom KDako proces merenja na neki način utiče na unutrašnji afinitet vezivanja impliciranih molekula, na primer, artefaktima povezanim sa premazom na biosenzoru jednog molekula. Takođe, očigledan KDse može izmeriti ako jedan molekul sadrži više od jednog mesta prepoznavanja za drugi molekul. U takvoj situaciji na izmereni afinitet može uticati aviditet interakcije dva molekula. Konkretno, precizno merenje KDmože biti prilično radno intenzivno i kao posledica toga, često se određuju očigledne vrednosti KDza procenu jačine vezivanja dva molekula. Treba napomenuti da sve dok se sva merenja vrše na dosledan način

2

(npr. održavanje uslova testa nepromenjenim) očigledna KDmerenja mogu se koristiti kao aproksimacija pravog KDi stoga u ovom dokumentu KDi očigledni KDtreba tretirati sa jednakim značajem ili relevantnošću.

[0090] Termin „specifičnost“ se odnosi na broj različitih tipova antigena ili antigenskih determinanti na koje se određeni molekul koji se vezuje za antigen ili protein koji se vezuje za antigen (kao što je ISVD ili polipeptid pronalaska) može vezati. Specifičnost proteina koji se vezuje za antigen može se odrediti na osnovu afiniteta i/ili aviditeta, na primer kao što je opisano na stranama 53-56 WO 08/020079, koje takođe opisuju neke poželjne tehnike za merenje vezivanja između molekula koji se vezuje za antigen (kao što je polipeptid ili ISVD pronalaska) i relevantnog antigena. Tipično, proteini koji vezuju antigen (kao što su ISVD i/ili polipeptidi pronalaska) će se vezati za svoj antigen sa konstantom disocijacije (KD) od 10<-5>do 10<-12>mola/litar ili manje, a poželjno 10<-7>do 10<-12>mola/litar ili manje i poželjnije 10<-8>do 10<-12>mola/litar (tj. sa konstantom asocijacije (KA) od 10<5>do 10<12>litara/mol ili više, a poželjno 10<7>do 10<12>litara/mol ili više i poželjnije 10<8>do 10<12>litara/mol). Za bilo koju vrednost KDveću od 10<-4>mol/litar (ili bilo koju vrednost KAmanju od 10<4>litar/mol) generalno se smatra da ukazuje na nespecifično vezivanje. Poželjno, monovalentni ISVD pronalaska će se vezati za željeni antigen sa afinitetom manjim od 500 nM, poželjno manjim od 200 nM, poželjno manjim od 10 nM, kao što je manje od 500 pM, kao što je npr. između 10 i 5 pM ili manje. Upućuje se i na stav n) na stranama 53-56 WO 08/020079.

[0091] Za ISVD i/ili polipeptid se kaže da je „specifičan za“ (prvu) metu ili antigen u poređenju sa drugom (drugom) metom ili antigenom kada se vezuje za prvi antigen sa afinitetom (kao što je gore opisano i prikladno izraženo kao vrednost KD, vrednost KA, Koffbrzina i/ ili Konbrzina) koji je najmanje 10 puta, kao što je najmanje 100 puta, a poželjno najmanje 1000 puta ili više od afiniteta sa kojim se ISVD i/ili polipeptid vezuje za drugu metu ili antigen. Na primer, ISVD i/ili polipeptid se mogu vezati za prvu metu ili antigen sa vrednošću KDkoja je najmanje 10 puta manja, kao što je najmanje 100 puta manja, a poželjno najmanje 1000 puta manja ili čak manja od te, od KDsa kojom se navedeni ISVD i/ili polipeptid vezuje za drugu metu ili antigen. Poželjno, kada je ISVD i/ili polipeptid „specifičan“ za prvu metu ili antigen u poređenju sa drugom metom ili antigenom, on je usmeren protiv (kako je ovde definisano) navedene prve mete ili antigena, ali nije usmeren protiv navedene druge mete ili antigena.

2

[0092] Specifično vezivanje antigen vezujućeg proteina za antigen ili antigensku determinantu može se odrediti na bilo koji pogodan način poznat sam po sebi, uključujući, na primer, testove vezivanja zasićenja i/ili testove kompetitivnog vezivanja, kao što su radioimunološki testovi (RIA), enzimski imunološki testovi (EIA) i njihove različite varijante poznate u struci; kao i druge ovde pomenute tehnike.

[0093] Poželjan pristup koji se može koristiti za procenu afiniteta je procedura ELISA (enzimski povezani imunosorbentni test) u 2 koraka prema Friguet et al.1985 (J. Immunol. Methods 77: 305-19). Ova metoda uspostavlja merenje ravnoteže vezivanja faze rastvora i izbegava moguće artefakte koji se odnose na adsorpciju jednog od molekula na nosaču kao što je plastika. Kao što će kvalifikovanoj osobi biti jasno, konstanta disocijacije može biti stvarna ili očigledna konstanta disocijacije. Metode za određivanje konstante disocijacije biće jasne kvalifikovanoj osobi, a na primer uključuju tehnike pomenute na stranama 53-56 WO 08/020079.

[0094] Na kraju, treba napomenuti da u mnogim situacijama iskusni naučnik može proceniti da je pogodno odrediti afinitet vezivanja u odnosu na neki referentni molekul. Na primer, za procenu jačine vezivanja između molekula A i B, može se npr. koristiti referentni molekul C za koji je poznato da se vezuje za B i koji je odgovarajuće označen fluorofornom ili hromofornom grupom ili drugim hemijskim delom, kao što je biotin za jednostavnu detekciju u ELISA ili FACS (fluorescencijom aktivirano razvrstavanje ćelija) ili drugim formatom (fluorofor za detekciju fluorescencije, hromofor za detekciju apsorpcije svetlosti, biotin za ELISA detekciju posredstvom streptavidina). Tipično, referentni molekul C se održava na fiksnoj koncentraciji a koncentracija A se menja za datu koncentraciju ili količinu B. Kao rezultat toga, dobija se vrednost IC50koja odgovara koncentraciji A pri kojoj se signal izmeren za C u odsustvu A prepolovi. Pod uslovom da je poznat KD ref, KDreferentnog molekula, kao i ukupna koncentracija crefreferentnog molekula, očigledni KDza inerakciju A-B može se dobiti iz sledeće formule: KD=IC50/(1+cref/ KDref). Imajte na umu da ako je cref<< KD ref, KD≈ IC50. Pod uslovom da se merenje IC50vrši na konzistentan način (npr. održavanjem creffiksnim) za veziva koja se upoređuju, razlika u jačini ili stabilnosti molekularne interakcije može se proceniti upoređivanjem IC50, a ovo merenje se ocenjuje kao ekvivalentno KDili očiglednom KDu ovom tekstu.

2

[0095] Polovina maksimalne inhibitorne koncentracije (IC50) takođe može biti mera efikasnosti jedinjenja u inhibiciji biološke ili biohemijske funkcije, npr. farmakološkog efekta. Ova kvantitativna mera pokazuje koliko je polipeptida ili ISVD (npr. nanotelo) potrebno za inhibiciju datog biološkog procesa (ili komponente procesa, tj. enzima, ćelije, ćelijskog receptora, hemotaksije, anaplazije, metastaza, invazivnosti, itd.) za polovinu.

Drugim rečima, to je polovina maksimalne (50%) inhibitorne koncentracije (IC) supstance (50% IC, ili IC50). Vrednosti IC50mogu se izračunati za dati antagonist kao što je polipeptid ili ISVD (npr. nanotelo) pronalaska određivanjem koncentracije potrebne za inhibiciju polovine maksimalnog biološkog odgovora agonista. KDleka može se odrediti konstruisanjem krive doza-odgovor i ispitivanjem efekta različitih koncentracija antagonista kao što su polipeptid ili ISVD (npr. nanotelo) pronalaska na reverznu aktivnost agonista.

[0096] Termin polovina maksimalne efektivne koncentracije (EC50) odnosi se na koncentraciju jedinjenja koja indukuje odgovor na pola puta između početne i maksimalne vrednosti nakon određenog vremena izlaganja. U ovom kontekstu se koristi kao mera polipeptida, ISVD (npr. nanotelo) njegove potencije. EC50stepenaste krive odgovora na dozu predstavlja koncentraciju jedinjenja gde se primećuje 50% njegovog maksimalnog efekta. Koncentracija se poželjno izražava u molarnim jedinicama.

[0097] U biološkim sistemima, male promene u koncentraciji liganda obično rezultiraju brzim promenama u odgovoru, nakon sigmoidne funkcije. Tačka infleksije na kojoj povećanje odgovora sa povećanjem koncentracije liganda počinje da usporava je EC50. To se može matematički odrediti derivacijom najbolje odgovarajuće linije. Oslanjanje na grafikon za procenu je pogodno u većini slučajeva. U slučaju da je EC50dat u odeljku sa primerima, eksperimenti su dizajnirani tako da odražavaju KDšto je moguće preciznije. Drugim rečima, vrednosti EC50se tada mogu smatrati vrednostima KD. Termin „prosečna KD“ se odnosi na prosečnu vrednost KDdobijenu u najmanje 1, ali poželjno više od 1, kao što su najmanje 2 eksperimenta. Termin „prosek“ se odnosi na matematički termin „prosek“ (sume podataka podeljene sa brojem stavki u podacima).

[0098] Takođe je povezan sa IC50koji je mera jedinjenja njegove inhibicije (50% inhibicije). Za kompetitivne testove vezivanja i funkcionalne testove antagonista, IC50je najčešća zbirna mera krive doza-odgovor. Za testove agonista/stimulatora najčešća zbirna mera je EC50.

2

[0099] Konstanta inhibicije (Ki) je pokazatelj koliko je inhibitor potentan; to je koncentracija potrebna da se proizvede polovina maksimalne inhibicije. Za razliku od IC50, koji se može menjati u zavisnosti od eksperimentalnih uslova, Kije apsolutna vrednost i često se naziva konstanta inhibicije leka. Konstanta inhibicije Kise može izračunati korišćenjem Čeng-Prusof jednačine:

u kojoj je [L] fiksna koncentracija liganda.

[0100] Termin „potencija“ polipeptida i/ili ISVD pronalaska, kako se ovde koristi, je funkcija količine polipeptida i/ili ISVD pronalaska koja je potrebna za njegovo specifično dejstvo. Odnosi se na kapacitet navedenog polipeptida i/ili ISVD pronalaska da modulira i/ili delimično ili u potpunosti inhibira aktivnost ADAMTS5. Konkretnije, može se odnositi na sposobnost navedenog polipeptida i/ili ISVD da smanji ili čak potpuno inhibira aktivnost ADAMTS5 kako je ovde definisano. Kao takav, može se odnositi na sposobnost navedenog polipeptida i/ili ISVD da inhibira aktivnost ADAMTS5, kao što je enzimska aktivnost, kao što je proteoliza, npr. aktivnost proteaze i/ili endopeptidaze, kao i vezivanje supstrata, uključujući, ali ne ograničavajući se na aggrekan, verzikan, brevikan, neurokan, dekorin i/ili biglikan, poželjno cepanje agrekana. Navedeni polipeptid i/ili ISVD poželjno antagonizira aktivnost agrekanaze ADAMTS5. Potentnost se može izmeriti bilo kojim odgovarajućim testom poznatim u struci ili opisanim u ovom dokumentu. Kao što se ovde koristi, „aktivnost agrekanaze“ je definisana kao proteolitičko cepanje agrekana.

[0101] „Efikasnost“ polipeptida pronalaska meri maksimalnu jačinu samog efekta, pri zasićenim koncentracijama polipeptida. Efikasnost ukazuje na maksimalni odgovor koji se može postići polipeptidom pronalaska. Odnosi se na sposobnost polipeptida da proizvede željeni (terapijski) efekat.

[0102] U jednom aspektu, pronalazak se odnosi na polipeptid naveden u ovom patentnom zahtevu, pri čemu se pomenuti polipeptid vezuje za ADAMTS5 sa KDizmeđu 1E<-07>M i 1E<-13>M, kao što je između 1E<-08>M i 1E<-12>M, poželjno najviše 1E<-07>M, poželjno manje od 1E<-08>M ili 1E<-09>M, ili čak manje od 1E<-10>M, kao što je 5E<-11>M, 4E<-11>M, 3E<-11>M, 2E<-11>M, 1.7E<-11>M, 1E<-11>M, ili čak 5E<-12>M, 4E<-12>M, 3E<-12>M, 1E<-12>M, na primer kako je određeno metodom Gyrolab ili KinExA.

[0103] U jednom aspektu, pronalazak se odnosi na polipeptid naveden u ovom patentnom zahtevu, pri čemu pomenuti polipeptid modulira ADAMTS5 sa EC50između 1E<-07>M i 1E<-12>M, kao što je između 1E<-08>M i 1E<-11>M, na primer kako je određeno vezivanjem ELISA.

[0104] U jednom aspektu, pronalazak se odnosi na polipeptid naveden u ovom patentnom zahtevu, pri čemu pomenuti polipeptid vezuje za ADAMTS5 sa brzinom disocijacije manjom od 5E<-04>s<-1>, kao što je manje od 1E<-04>s<-1>ili 5E<-05>s<-1>, ili čak manje od 1E<-05>s<-1>, na primer kako je utvrđeno putem SPR.

[0105] U jednom aspektu, pronalazak se odnosi na polipeptid naveden u ovom patentnom zahtevu, pri čemu pomenuti polipeptid inhibira aktivnost ADAMTS5 sa IC50između 1E<-07>M i 1E<-12>M, kao što je između 1E<-08>M i 1E<-11>M, na primer kako je utvrđeno humanim Fret testom ili humanom AlphaLISA.

[0106] U jednom aspektu, pronalazak se odnosi na polipeptid naveden u ovom patentnom zahtevu, pri čemu pomenuti polipeptid inhibira enzimsku aktivnost ADAMTS5 sa IC50od najviše 1E<-07>M, poželjno 1E<-08>M, 5E<-09>M, ili 4E<-9>M, 3E<-9>M, 2E<-9>M, kao što je 1E<-9>M.

[0107] Za sekvencu aminokiselina, kao što je ISVD ili polipeptid, kaže se da je „unakrsno reaktivna“ za dva različita antigena ili antigenske determinante (kao što su npr. ADAMTS5 iz različitih vrsta sisara, kao što su npr., ljudski ADAMTS5, goveđi ADAMTS5, pacovski ADAMTS5, zamorački ADAMTS5, mišji ADAMTS5 ili cinomolgus ADAMTS5) ako je specifična za (kao što je ovde definisano) ove različite antigene ili antigenske determinante. Biće jasno da se ISVD ili polipeptid može smatrati unakrsno reaktivnim iako se afinitet vezivanja za dva različita antigena može razlikovati, kao što je faktor 2, 5, 10, 50, 100 ili čak više, pod uslovom da je specifičan za (kako je ovde definisano) ove različite antigene ili antigenske determinante.

[0108] ADAMTS5 je poznat i kao ADAMTS11, ADMP-2 ili agrekanaza-2.

1

[0109] Relevantne strukturne informacije za ADAMTS5 mogu se naći, na primer, na UniProt pristupnim brojevima kao što je prikazano u tabeli 1 u nastavku (videti tabelu B).

Tabela 1

[0110] „Humani ADAMTS5“ se odnosi na ADAMTS5 koji se sastoji od sekvence aminokiselina SEQ ID NO: 149. U jednom aspektu, polipeptid pronalaska specifično vezuje ADAMTS5 od Human sapiens, Mus musculus, Cavia Porcellus, Bos taurus, Macaca mulatta i/ili Rattus norvegicus, poželjno humani ADAMTS5, poželjno SEQ ID NO: 149.

[0111] Termini „(unakrsni)-blok“, „(unakrsno)-blokiran“, „(unakrsno)-blokiranje“, „kompetitivno vezivanje“, „(unakrsno)-kompetitivno“ i „(unakrsna)-kompetitivnost“ ovde se koriste naizmenično da označe sposobnost imunoglobulina, antitela, ISVD, polipeptida ili drugog vezivnog agensa da ometaju vezivanje drugih imunoglobulina, antitela, ISVD, polipeptida ili vezivnih agenasa za datu metu. Stepen u kojem imunoglobulin, antitelo, ISVD, polipeptid ili drugi vezivni agens može ometati vezivanje drugog agensa za metu, i stoga da li se može reći da unakrsno blokira, može se odrediti korišćenjem testova kompetitivnog vezivanja, koji su uobičajeni u struci, kao što je, na primer, skrining prečišćenih ISVD protiv ISVD prikazanih na fagu u kompetitivnom ELISA testu. Posebno pogodni kvantitativni testovi unakrsnog blokiranja uključuju ELISA test.

[0112] Druge metode za određivanje da li je imunoglobulin, antitelo, ISVD, polipeptid ili drugi vezivni agens usmeren protiv ciljnih (unakrsnih) blokova, sposoban za (unakrsno)

2

blokiranje, kompetitivno se vezuje ili je (unakrsno) kompetitivan kako je ovde definisano, može se proceniti „sendvič testom“ zasnovanim na SPR, kao što je na primer opisano u odeljku Primeri. Druge odgovarajuće metode su opisane npr. u Xiao-Chi Jia et al. (Journal of Immunological Methods 288: 91-98, 2004), Miller et al. (Journal of Immunological Methods 365: 118-125, 2011).

[0113] Shodno tome, ovaj pronalazak se odnosi na polipeptid prema ovom patentnom zahtevu, kao što je predstavljen SEQ ID NO: 2 (videti tabelu A-1), pri čemu se navedeni polipeptid takmiči sa unakrsno blokirajućim polipeptidom, na primer kako je određeno kompetitivnim ELISA testom.

[0114] Ovo obelodanjivanje se odnosi na metod za određivanje kompetitora, kao što su polipeptidi, koji se takmiče sa polipeptidom kao što je ovde opisano, kao što je predstavljeno bilo kojim od SEQ ID NO: 2, 116, 19, 1, 3, 6, 16, 17, 10, 11, 9, 5, 4, 7, 117, 8, 12, 13, 14, 15 ili 18, pri čemu se polipeptid kao što je ovde opisan takmiči sa kompetitorom ili unakrsno blokira kompetitora, kao što je polipeptid, za vezivanje za ADAMTS5, kao što je, na primer, humani ADAMTS5 (SEQ ID NO: 149), pri čemu se vezivanje kompetitora za ADAMTS5 smanjuje za najmanje 5%, kao što je 10%, 20%, 30%, 40%, 50% ili čak više, kao što je 80%, 90% ili čak 100% (tj. praktično neotkriveno u datom testu) u prisustvu polipeptida pronalaska, u poređenju sa vezivanjem kompetitora za ADAMTS5 u odsustvu polipeptida. Kompeticija i unakrsno blokiranje mogu se odrediti bilo kojim sredstvima poznatim u struci, kao što je, na primer, ELISA ili FACS test konkurencije. U jednom aspektu ovaj pronalazak se odnosi na polipeptid kako je definisano u patentnim zahtevima, pri čemu navedeni polipeptid unakrsno blokira vezivanje za ADAMTS5 najmanje jednog od polipeptida predstavljenih sa SEQ ID NO: 2, 1, 3, 6, 16, 17, 10, 11, 9, 5, 4, 7, 117, 8, 12, 13, 14, 15 ili 18 i/ili je unakrsno blokiran od vezivanja za ADAMTS5 najmanje jednim od polipeptida predstavljenih sa SEQ ID NO: 2, 1, 3, 6, 16, 17, 10, 11, 9, 5, 4, 7, 117, 8, 12, 13, 14, 15 ili 18.

[0115] Ovo obelodanjivanje se takođe odnosi na kompetitore koji se takmiče sa polipeptidom kao što je ovde opisano, kao što je SEQ ID NO: 2, 116, 19, 1, 3, 6, 16, 17, 10, 11, 9, 5, 4, 7, 117, 8, 12, 13, 14, 15 ili 18, pri čemu se kompetitor takmiči sa ili unakrsno blokira polipeptid kao što je ovde opisano za vezivanje za ADAMTS5, pri čemu se vezivanje za ADAMTS5 polipeptida pronalaska smanjuje za najmanje 5%, kao što je 10%, 20%, 30%, 40%, 50% ili čak i više, kao što je 80%, ili čak i više kao što je najmanje 90% ili čak 100% (tj. praktično neotkriveno u datom testu) u prisustvu navedenog kompetitora, u poređenju sa vezivanjem za ADAMTS5 polipeptidom pronalaska u odsustvu navedenog kompetitora. U jednom aspektu, ovo obelodanjivanje se odnosi na polipeptidno unakrsno blokiranje vezivanja za ADAMTS5 polipeptidom pronalaska kao što je SEQ ID NO: 2, 116, 19, 1, 3, 6, 16, 17, 10, 11, 9, 5, 4, 7, 117, 8, 12, 13, 14, 15 ili 18 i/ili je unakrsno blokiran od vezivanja za ADAMTS5 od strane najmanje jednog od SEQ ID NO: 2, 116, 19, 1, 3, 6, 16, 17, 10, 11, 9, 5, 4, 7, 117, 8, 12, 13, 14, 15 ili 18, a poželjno gde taj polipeptid sadrži najmanje jedan VH, VL, dAb, ili ISVD koji specifično vezuje ADAMTS5, pri čemu vezivanje za ADAMTS5 modulira aktivnost ADAMTS5.

[0116] „Aktivnosti ADAMTS5“ i „aktivnosti ADAMTS5“ (ovi termini se ovde koriste naizmenično) uključuju, ali nisu ograničene na enzimske aktivnosti, kao što je proteoliza, npr. aktivnost proteaze (koja se takođe naziva proteaza ili aktivnost peptidaze), i aktivnosti endopeptidaze, s jedne strane, i aktivnosti egzozita, kao što je na primer prepoznavanje i/ili vezivanje supstrata, npr. putem domena nalik dezintegrinu, ponavljanjem centralnog trombospondina tipa I (TS), domenom bogatog cisteinom, spejser regionom i/ili dodatnim TS motivima. Aktivnosti ADAMTS5 uključuju vezivanje i/ili proteolizu supstrata kao što su ekstracelularni proteini hondroitin sulfat proteoglikana (CSPG) koji vezuju hijaluronan, kao što su agrekan, verzikan, brevikan, neurokan, dekorin i biglikan. Kao što se ovde koristi, proteoliza je razgradnja proteina na manje polipeptide ili aminokiseline hidrolizom peptidnih veza koje povezuju aminokiseline zajedno u polipeptidnom lancu.

[0117] U kontekstu ovog pronalaska, „modulisanje“ ili „modulisati“ generalno znači promeniti aktivnost pomoću ADAMTS5, mereno korišćenjem odgovarajućeg in vitro, ćelijskog ili in vivo testa (kao što su oni navedeni ovde). Konkretno, „modulisanje“ ili „modulisati“ može značiti ili smanjenje ili inhibiciju aktivnosti, ili alternativno povećanje aktivnosti ADAMTS5, mereno korišćenjem odgovarajućeg in vitro, ćelijskog ili in vivo testa (na primer, kao što su oni pomenuti ovde), za najmanje 1%, poželjno najmanje 5%, kao što je najmanje 10% ili najmanje 25%, na primer za najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, ili 90% ili više, u poređenju sa aktivnošću ADAMTS5 u istom testu pod istim uslovima, ali bez prisustva ISVD ili polipeptida pronalaska.

4

[0118] Shodno tome, ovaj pronalazak se odnosi na polipeptid naveden u ovom patentnom zahtevu, pri čemu navedeni polipeptid modulira aktivnost ADAMTS5, poželjno inhibirajući aktivnost ADAMTS5.

[0119] Shodno tome, ovaj pronalazak se odnosi na polipeptid naveden u ovom patentnom zahtevu, pri čemu navedeni polipeptid inhibira aktivnost proteaze ADAMTS5, kao što inhibira proteolizu supstrata, kao što su agrekan, verzikan, brevikan, neurokan, dekorin i/ili biglikan.

[0120] Shodno tome, ovaj pronalazak se odnosi na polipeptid naveden u ovom patentnom zahtevu, pri čemu navedeni polipeptid blokira vezivanje ADAMTS5 za supstrat, kao što je agrekan, verzikan, brevikan, neurokan, dekorin i/ili biglikan, pri čemu je navedeni supstrat poželjno agrekan.

[0121] U jednom aspektu, pronalazak se odnosi na polipeptid naveden u ovom patentnom zahtevu, pri čemu pomenuti polipeptid blokira vezivanje ADAMTS5 za agrekan od najmanje 20%, kao što su najmanje 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ili čak više, na primer kako je utvrđeno ELISA testom.

[0122] U jednom aspektu, pronalazak se odnosi na polipeptid naveden u ovom patentnom zahtevu, pri čemu pomenuti polipeptid antagonizira ili inhibira aktivnost ADAMTS5, kao što je (i) aktivnost proteaze, poželjno cepanje agrekana, verzikana, brevikana, neurokana, dekorina i/ili biglikana, poželjno cepanje agrekana; poželjno antagonizira aktivnost agrekanaze ADAMTS5; (ii) vezivanje supstrata za ADAMTS5, kao što je egzozit ADAMTS5, na primer domen sličan dezintegrinu, ponavljanje centralnog trombospondina tipa I (TS), domen bogat cisteinom, spejser region ili dodatni TS motiv.

[0123] Shodno tome, ovaj pronalazak se odnosi na polipeptid naveden u ovom patentnom zahtevu, pri čemu navedeni polipeptid inhibira aktivnost proteaze ADAMTS5, poželjno za najmanje 5%, kao što je 10%, 20%, 30%, 40%, 50% ili više, kao što je najmanje 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ili više, kako je utvrđeno bilo kojom odgovarajućom metodom poznatoj u struci, kao što su na primer testovi inhibicije enzima ili kao što je opisano u odeljku Primeri.

[0124] Iako ADAM, ADAMTS i MMP dele mesto vezivanja za agrekan koje je veoma slično i po sekvenci i po ukupnom obliku, npr. katalitički domeni ADAMTS4 i ADAMTS5 dele visok stepen sličnosti sekvenci, pronalazači su uspeli da identifikuju ISVD koji su bili specifični za metu, kao što je prikazano u primerima. Ciljna specifičnost bi takođe izbegla ili barem ograničila mišićno-skeletni sindrom, što je neželjeni efekat izazvan inhibitorima širokog spektra. U jednom aspektu, obelodanjivanje se odnosi na vezivo ADAMTS5 kao što je ISVD i polipeptid pronalaska, pri čemu navedeno vezivo ADAMTS5 ne vezuje ADAMTS4, ADAMTS1, ADAMTS15, MMP1 i/ili MMP14 (tip membrane). Poželjno je da se ovaj pronalazak odnosi na polipeptid kako je ovde definisano, pri čemu navedeni ISVD koji vezuje ADAMTS5 ne vezuje ADAMTS4, MMP1 ili MMP14.

[0125] Osim ako nije drugačije naznačeno, termini „imunoglobulin“ i „sekvenca imunoglobulina“ - bilo da se ovde koriste za upućivanje na antitelo teškog lanca ili na konvencionalno antitelo sa 4 lanca - koristi se kao opšti termin koji uključuje i antitelo pune veličine, njegove pojedinačne lance, kao i sve delove, domene ili njihove fragmente (uključujući, ali ne ograničavajući se na domene koji vezuju antigen ili fragmente kao što su VHHdomeni ili VH/VLdomeni, respektivno).

[0126] Termin „domen“ (polipeptida ili proteina) koji se ovde koristi odnosi se na preklopljenu proteinsku strukturu koja ima sposobnost da zadrži svoju tercijarnu strukturu nezavisno od ostatka proteina. Generalno, domeni su odgovorni za diskretna funkcionalna svojstva proteina i u mnogim slučajevima se mogu dodati, ukloniti ili preneti na druge proteine bez gubitka funkcije ostatka proteina i/ili domena.

[0127] Termin „imunoglobulinski domen“ koji se ovde koristi odnosi se na globularni region lanca antitela (kao što je npr. lanac konvencionalnog antitela sa 4 lanca ili antitela sa teškim lancem), ili na polipeptid koji se u suštini sastoji od takvog globularnog regiona.

Imunoglobulinski domeni se odlikuju time što zadržavaju imunoglobulinski preklop karakterističan za molekule antitela, koji se sastoji od dvoslojnog sendviča od oko sedam antiparalelnih beta lanaca raspoređenih u dva beta sloja, opciono stabilizovanih konzerviranom disulfidnom vezom.

[0128] Termin „varijabilni domen imunoglobulina“ kako se ovde koristi označava imunoglobulinski domen koji se u suštini sastoji od četiri „okvirna regiona“ koji se u struci i u daljem tekstu nazivaju „okvirni region 1“ ili „FR1“; kao „okvirni region 2“ ili „FR2“; kao „okvirni region 3“ ili „FR3“; i kao „okvirni region 4“ ili „FR4“, respektivno; koji okvirni regioni su prekinuti sa tri „regiona koji određuju komplementarnost“ ili „CDR“, koji se u struci i u daljem tekstu nazivaju „region koji određuje komplementarnost 1“ ili „CDR1“; kao „region koji određuje komplementarnost 2“ ili „CDR2“; i kao „region koji određuje komplementarnost 3“ ili „CDR3“, respektivno. Dakle, opšta struktura ili sekvenca varijabilnog domena imunoglobulina može biti naznačena na sledeći način: FR1 - CDR1 -FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4. To je varijabilni domen(i) imunoglobulina koji dodeljuje specifičnost antitela za antigen noseći mesto vezivanja antigena.

[0129] Termin „pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina“ (ovde skraćeno „ISVD“ ili „ISV“), i naizmenično se koristi sa „pojedinačnim varijabilnim domenom“, definiše molekule u kojima je mesto vezivanja antigena prisutno i formirano od strane jednog domena imunoglobulina. Ovo odvaja pojedinačne varijabilne domene imunoglobulina od „konvencionalnih“ imunoglobulina ili njihovih fragmenata, pri čemu dva imunoglobulinska domena, posebno dva varijabilna domena, interaguju kako bi formirali mesto vezivanja antigena. Tipično, u konvencionalnim imunoglobulinima, varijabilni domen teškog lanca (VH) i varijabilni domen lakog lanca (VL) interaguju kako bi formirali mesto vezivanja antigena. U drugom slučaju, regioni koji određuju komplementarnost (CDR) i VHi VLće doprineti mestu vezivanja antigena, tj. ukupno 6 CDR će biti uključeno u formiranje mesta vezivanja antigena.

[0130] Imajući u vidu gornju definiciju, antigen-vezujući domen konvencionalnog antitela sa 4 lanca (kao što je IgG, IgM, IgA, IgD ili IgE molekul; poznat u struci) ili Fab fragmenta, F(ab')2 fragmenta, Fv fragmenta kao što je disulfidno vezani Fv ili scFv fragment, ili diatela (svi poznati u struci) izvedenog iz takvog konvencionalnog antitela sa 4 lanca, obično se ne bi smatrao jednim imunoglobulinskim varijabilnim domenom, jer se u ovim slučajevima vezivanje za odgovarajući epitop antigena obično ne bi dogodilo jednim (pojedinačnim) imunoglobulinskim domenom, već parom (pridruženih) imunoglobulinskih domena kao što su varijabilni domeni lakog i teškog lanca, tj. parom imunoglobulinskih domena VH-VL, koji se zajednički vezuju za epitop odgovarajućeg antigena.

[0131] Nasuprot tome, ISVD su sposobni da se specifično vezuju za epitop antigena bez uparivanja sa dodatnim varijabilnim domenom imunoglobulina. Mesto vezivanja ISVD formira jedan VHH, VHili VLdomen. Dakle, mesto vezivanja antigena ISVD formira ne više od tri CDR.

[0132] Kao takav, pojedinačni varijabilni domen može biti sekvenca varijabilnog domena lakog lanca (npr. VL-sekvenca) ili njen odgovarajući fragment; ili sekvenca varijabilnog domena teškog lanca (npr. VH-sekvenca ili VHHsekvenca) ili njen odgovarajući fragment; sve dok je sposoban da formira jednu jedinicu za vezivanje antigena (tj. funkcionalnu jedinicu za vezivanje antigena koja se u suštini sastoji od pojedinačnog varijabilnog domena, tako da pojedinačni domen za vezivanje antigena ne mora da interaguje sa drugim varijabilnim domenom da bi formirao funkcionalnu jedinicu za vezivanje antigena).

[0133] U jednom otelotvorenju pronalaska, ISVD su sekvence varijabilnog domena teškog lanca (npr. VH-sekvenca); preciznije, ISVD mogu biti sekvence varijabilnog domena teškog lanca koje su izvedene iz konvencionalnog antitela sa četiri lanca ili sekvence varijabilnog domena teškog lanca koje su izvedene iz antitela teškog lanca.

[0134] Na primer, ISVD može biti (jedno) domensko antitelo (ili aminokiselina koja je pogodna za upotrebu kao (jedno) domensko antitelo), „dAb“ ili dAb (ili aminokiselina koja je pogodna za upotrebu kao dAb) ili nanotelo (kako je ovde definisano, uključujući, ali ne ograničavajući se na VHH); drugi pojedinačni varijabilni domeni, ili bilo koji odgovarajući fragment bilo kog od njih.

[0135] Konkretno, ISVD može biti Nanobody<®>(kako je ovde definisano) ili njegov odgovarajući fragment. [Napomena: Nanobody<®>, Nanobodies<®>i Nanoclone<®>su registrovani zaštitni znakovi kompanije Ablynx N.V.] Za opšti opis nanotela, upućuje se na dalji opis u nastavku, kao i na prethodnu literaturu navedenu u ovom dokumentu, kao što je npr. opisano u WO 08/020079 (strana 16).

[0136] „VHHdomeni“, takođe poznati kao VHH, VHH domeni, fragmenti VHH antitela i VHH antitela, prvobitno su opisani kao antigen vezujući imunoglobulinski (varijabilni) domen „antitela teškog lanca“ (tj. „antitela lišenih lakih lanaca“; Hamers-Casterman et al.

1993 Nature 363: 446-448). Termin „VHHdomen“ je izabran da bi se ovi varijabilni domeni razlikovali od varijabilnih domena teškog lanca koji su prisutni u konvencionalnim antitelima sa 4 lanca (koji se ovde nazivaju „VHdomeni “ ili „VH domeni“) i od varijabilnih domena lakog lanca koji su prisutni u konvencionalnim antitelima sa4 lanca (koji se ovde nazivaju „VLdomeni“ ili „VL domeni“). Za dalju opis VHH i nanotela, upućuje se na pregledni članak autora Muyldermans (Reviews in Molecular Biotechnology 74: 277-302, 2001), kao i na sledeće patentne prijave, koje se pominju kao opšta pozadinska literatura: WO 94/04678, WO 95/04079 i WO 96/34103 Vrije Universiteit Brussel; WO 94/25591, WO 99/37681, WO 00/40968, WO 00/43507, WO 00/65057, WO 01/40310, WO 01/44301, EP 1134231 i WO 02/48193 Unilever; WO 97/49805, WO 01/21817, WO 03/035694, WO 03/054016 i WO 03/055527 Vlaams Instituut voor Biotechnologie (VIB); WO 03/050531 Algonomics N.V. i Ablynx N.V.; WO 01/90190 Nacionalnog istraživačkog saveta Kanade; WO 03/025020 (= EP 1433793) Instituta za antitela; kao i WO 04/041867, WO 04/041862, WO 04/041865, WO 04/041863, WO 04/062551, WO 05/044858, WO 06/40153, WO 06/079372, WO 06/122786, WO 06/122787 i WO 06/122825, od strane Ablynx N.V. i dalje objavljene patentne prijave od strane Ablynx N.V. Takođe se upućuje na dalju prethodnu literaturu navedenu u ovim prijavama, a posebno na spisak referenci navedenih na stranama 41-43 Međunarodne prijave WO 06/040153. Kao što je opisano u ovim referencama, nanotela (posebno VHH sekvence i delimično humanizovana nanotela) posebno mogu biti okarakterisana prisustvom jednog ili više „karakterističnih ostataka“ u jednoj ili više okvirnih sekvenci. Dalji opis nanotela, uključujući humanizaciju i/ili kamelizaciju nanotela, kao i druge modifikacije, delove ili fragmente, derivate ili „fuzije nanotela“, multivalentne konstrukte (uključujući neke neograničavajuće primere sekvenci linkera) i različite modifikacije za povećanje poluvremena eliminacije nanotela i njihovih preparata mogu se naći npr. u WO 08/101985 i WO 08/142164. Za dalji opšti opis nanotela, upućuje se na prethodnu literaturu navedenu u ovom dokumentu, kao što je npr. opisano u WO 08/020079 (strana 16).

[0137] Konkretno, okvirne sekvence prisutne u vezivima ADAMTS5 pronalaska, kao što su ISVD i/ili polipeptidi pronalaska, mogu sadržati jedan ili više karakterističnih ostataka (na primer kao što je opisano u WO 08/020079 (tabele A-3 do A-8)), tako da je vezivo ADAMTS5 pronalaska nanotelo. Neki poželjni, ali neograničavajući primeri (odgovarajućih kombinacija) takvih okvirnih sekvenci postaće jasni iz daljeg obelodanjivanja ovde (videti npr. tabelu A-2). Generalno, nanotela (posebno VHHsekvence i delimično humanizovana nanotela) mogu se posebno okarakterisati prisustvom jednog ili više „karakterističnih ostataka“ u jednoj ili više okvirnih sekvenci (kao što je npr. dalje opisano u WO 08/020079, strana 61, red 24 do strane 98, red 3).

[0138] Konkretnije, obelodanjivanje obezbeđuje veziva ADAMTS5 koja se sastoje od najmanje jednog pojedinačnog varijabilnog domena imunoglobulina koji je sekvenca aminokiselina sa (opštom) strukturom

        FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4

u kojima se FR1 do FR4 odnose na okvirne regione 1 do 4, respektivno, i u kojima se CDR1 do CDR3 odnose na regione koji određuju komplementarnost 1 do 3, respektivno, i koji:

i) imaju najmanje 80%, poželjnije 90%, još poželjnije 95% identičnosti aminokiselina sa najmanje jednom od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NO:s 116, 19, 1, 3, 6, 16, 17, 10, 11, 9, 5, 4, 7, 117, 8, 12, 13, 14, 15 ili 18 (videti tabelu A-1), u kojoj se za potrebe određivanja stepena identičnosti aminokiselina zanemaruju aminokiselinski ostaci koji formiraju CDR sekvence. U tom smislu, upućuje se i na tabelu A-2, u kojoj su navedene sekvence okvira 1 (SEQ ID NO: 72-84), sekvence okvira 2 (SEQ ID NO: 85-94), sekvence okvira 3 (SEQ ID NO: 95-113) i sekvence okvira 4 (SEQ ID NO: 114-115) pojedinačnih varijabilnih domena imuniglobulina SEQ ID NOs: 116, 19, 1, 3, 6, 16, 17, 10, 11, 9, 5, 4, 7, 117, 8, 12, 13, 14, 15 i 18; ili

ii) kombinacije sekvenci okvira kako je prikazano u tabeli A-2;

i u kojoj:

iii) poželjno jedan ili više aminokiselinskih ostataka na pozicijama 11, 37, 44, 45, 47, 83, 84, 103, 104 i 108 prema Kabat numeraciji se bira iz karakterističnih ostataka kao što je navedeno u tabeli A-3 do tabele A-8 WO 08/020079.

[0139] ADAMTS5 veziva obelodanjivanja takođe mogu sadržati specifične mutacije/aminokiselinske ostatke opisane u sledećim ko-podnesenim američkim privremenim prijavama, pod nazivom „poboljšani varijabilni domeni imunoglobulina“: US 61/994552 podnet 16. maja 2014. godine; US 61/014,015 podnet 18. juna 2014. godine; US 62/040,167 podnet 21. avgusta 2014. godine; i US 62/047,560, podnet 8. septembra 2014. godine (svi dodeljeni kompaniji Ablynx N.V.).

[0140] Konkretno, ADAMTS5 veziva obelodanjivanja, kao što su ISVD i/ili polipeptidi pronalaska, mogu na odgovarajući način da sadrže (i) K ili Q na poziciji 112; ili (ii) K ili Q na poziciji 110 u kombinaciji sa V na poziciji 11; ili (iii) T na poziciji 89; ili (iv) L na poziciji 89 sa K ili Q na poziciji 110; ili (v) V na poziciji 11 i L na poziciji 89; ili bilo koju odgovarajuću kombinaciju (i) do (v).

[0141] Kao što je takođe opisano u navedenim ko-podnesenim američkim privremenim prijavama, kada vezivo ADAMTS5 obelodanjivanja, kao što je ISVD i/ili polipeptid pronalaska, sadrži mutacije u skladu sa jednom od gornjih tačaka (i) do (v) (ili odgovarajućom kombinacijom istih):

● aminokiselinski ostatak na poziciji 11 je poželjno izabran između L, V ili K (i najpoželjnije je V); i/ili

● aminokiselinski ostatak na poziciji 14 je poželjno pogodno izabran između A ili P; i/ili

● aminokiselinski ostatak na poziciji 41 je poželjno pogodno izabran između A ili P; i/ili

● aminokiselinski ostatak na poziciji 89 je poželjno pogodno izabran između T, V ili L;

i/ili

● aminokiselinski ostatak na poziciji 108 je poželjno pogodno izabran između Q ili L;

i/ili

● aminokiselinski ostatak na poziciji 110 je poželjno pogodno izabran između T, K ili Q; i/ili

● aminokiselinski ostatak na poziciji 112 je poželjno pogodno izabran između S, K ili Q.

[0142] Kao što je pomenuto u navedenim ko-podnesenim američkim privremenim prijavama, navedene mutacije su efikasne u sprečavanju ili smanjenju vezivanja takozvanih „već postojećih antitela“ za imunoglobuline i jedinjenja pronalaska. U tu svrhu, ADAMTS5 veziva pronalaska, kao što su ISVD i/ili polipeptidi pronalaska, takođe mogu da sadrže C-terminalnu ekstenziju (X)n (u kojoj je n 1 do 10, poželjno 1 do 5, kao što je 1, 2, 3, 4 ili 5 (i poželjno 1 ili 2, kao što je 1); i svaki X je (poželjno prirodno prisutan) aminokiselinski ostatak koji je nezavisno izabran, i poželjno nezavisno izabran iz grupe koja se sastoji od alanina (A), glicina (G), valina (V), leucina (L) ili izoleucina (I), videti npr. američke privremene prijave, kao i WO 12/175741. Konkretno, ADAMTS5 vezivo pronalaska, kao što je ISVD i/ili polipeptid pronalaska, može sadržati takvu C-terminalnu ekstenziju kada formira C-terminalni kraj proteina, polipeptida ili drugog jedinjenja ili konstrukta koji se sastoji od istog (videti npr. navedene američke privremen prijave, kao i WO 12/175741).

[0143] ADAMTS5 vezivo pronalaska može biti imunoglobulin, kao što je pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina, izveden na bilo koji pogodan način i iz bilo kog pogodnog izvora, i može na primer biti prirodno prisutna VHHsekvenca (tj. iz odgovarajuće vrste kamelida) ili sintetička ili polu-sintetička aminokiselinska sekvenca, uključujući, ali ne ograničavajući se na „humanizovana“ (kako je ovde definisano) nanotela ili VHH sekvence, „kamelizovane“ (kako je ovde definisano) imunoglobulinske sekvence (a posebno kamelizovane sekvence varijabilnog domena teškog lanca), kao i nanotela koja su dobijena tehnikama kao što su sazrevanje afiniteta (na primer, počevši od sintetičkih, nasumičnih ili prirodno prisutnih imunoglobulinskih sekvenci), CDR graftovanje, oblaganje, kombinovanje fragmenata izvedenih iz različitih imunoglobulinskih sekvenci, PCR sastavljanje koristeći preklapajuće prajmere i slične tehnike za inženjering imunoglobulinskih sekvenci dobro poznatih kvalifikovanoj osobi; ili bilo koja pogodna kombinacija bilo kojeg od navedenog u daljem tekstu. Takođe, kada imunoglobulin sadrži VHHsekvencu, navedeni imunoglobulin može biti odgovarajuće humanizovan, kao što je ovde dalje opisano, kako bi se obezbedio jedan ili više daljih (delimično ili potpuno) humanizovanih imunoglobulina pronalaska.

Slično tome, kada imunoglobulin sadrži sintetičku ili polusintetičku sekvencu (kao što je delimično humanizovana sekvenca), navedeni imunoglobulin može opciono biti dalje odgovarajuće humanizovan, ponovo kao što je ovde opisano, ponovo tako da obezbedi jedan ili više daljih (delimično ili potpuno) humanizovanih imunoglobulina pronalaska.

[0144] „Antitela domena“, poznata i kao „Dab“, „domenska antitela“ i „dAb“ (termini „domenska antitela“ i „dAb“ se koriste kao zaštitni znakovi od strane grupe kompanija GlaxoSmithKline) opisana su, na primer, u EP 0368684, Ward et al. (Nature 341: 544-546, 1989), Holt et al. (Tends in Biotechnology 21: 484-490, 2003) i WO 03/002609 kao i na primer WO 04/068820, WO 06/030220, WO 06/003388 i drugim objavljenim patentnim prijavama kompanije Domantis Ltd. Domenska antitela u suštini odgovaraju VH ili VL domenima sisara koji nisu kamelidi, posebno humanim antitelima sa 4 lanca. Da bi se vezao epitop kao jedan domen vezivanja antigena , tj. bez uparivanja sa VL ili VH domenom, respektivno, potreban je specifičan izbor za takva svojstva vezivanja antigena, npr. korišćenjem biblioteka humanih pojedinačnih sekvenci VH ili VL domena. Domenska antitela imaju, poput VHH, molekularnu težinu od približno 13 do približno 16 kDa i, ako su izvedena iz potpuno humanih sekvenci, ne zahtevaju humanizaciju za npr. terapijsku upotrebu kod ljudi.

[0145] Takođe treba napomenuti da, iako su manje poželjni u kontekstu ovog obelodanjivanja jer nisu poreklom od sisara, pojedinačni varijabilni domeni mogu se izvesti iz određenih vrsta ajkula (na primer, takozvani „IgNAR domeni“, videti na primer WO 05/18629).

[0146] Ovaj pronalazak se posebno odnosi na ISVD, pri čemu se navedeni ISVD biraju iz grupe koja se sastoji od VHH, humanizovanih VHH i kamelizovanih VH.

[0147] Ostaci aminokiselina VHH domena numerisani su prema opštem numerisanju za VHdomene koje su dali Kabat et al. ("Sequence of proteins of immunological interest", US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, Publication No.91), kao što se primenjuje na VHH domene iz kamelida, kao što je prikazano, na primer, na slici 2 Riechmann i Muyldermans (J. Immunol. Methods 231: 25-38, 1999), sve kao što je poznato u struci. U struci su poznate alternativne metode za numerisanje aminokiselinskih ostataka VHdomena, koje se takođe mogu primeniti na analogan način na VHH domene. Međutim, u ovom opisu,

4

patentnim zahtevima i slikama, slediće se numeracija prema Kabatu, koja se primenjuje na VHH domene kao što je gore opisano, osim ako nije drugačije naznačeno.

[0148] Treba napomenuti da - kao što je dobro poznato u struci za VHdomene i za VHH domene - ukupan broj aminokiselinskih ostataka u svakom od CDR može varirati i možda ne odgovara ukupnom broju aminokiselinskih ostataka naznačenih Kabat numeracijom (to jest, jedna ili više pozicija prema Kabat numeraciji možda neće biti zauzete u stvarnoj sekvenci, ili stvarna sekvenca može sadržati više aminokiselinskih ostataka od broja dozvoljenog Kabat numeracijom). To znači da, generalno, numerisanje prema Kabatu može ili ne mora odgovarati stvarnom numerisanju aminokiselinskih ostataka u stvarnom redosledu. Ukupan broj aminokiselinskih ostataka u VH domenu i VHH domenu će obično biti u opsegu od 110 do 120, često između 112 i 115. Međutim, treba napomenuti da manje i duže sekvence takođe mogu biti pogodne za svrhe opisane u ovom dokumentu.

[0149] Što se tiče CDR, kao što je dobro poznato u struci, postoji više konvencija za definisanje i opisivanje CDR VH ili VHH fragmenta, kao što je Kabatova definicija (koja se zasniva na varijabilnosti sekvence i najčešće se koristi) i Čotijina definicija (koja se zasniva na lokaciji regiona strukturne petlje). Upućuje se, na primer, na veb stranicu http://www.bioinf.org.uk/abs/. Za potrebe ove specifikacije i patentnih zahteva, CDR se najpoželjnije definišu na osnovu definicije Abm (koja se zasniva na softveru za modeliranje antitela AbM kompanije Oxford Molecular), jer se to smatra optimalnim kompromisom između Kabatove i Čotijine definicije (cf. http://www.bioinf.org.uk/abs/). Kao što se ovde koristi, FR1 se sastoji od aminokiselinskih ostataka na pozicijama 1-25, CDR1 se sastoji od aminokiselinskih ostataka na pozicijama 26-35, FR2 se sastoji od aminokiselinskih ostataka na pozicijama 36-49, CDR2 se sastoji od aminokiselinskih ostataka na pozicijama 50-58, FR3 se sastoji od aminokiselinskih ostataka na pozicijama 59-94, CDR3 se sastoji od aminokiselinskih ostataka na pozicijama 95-102, a FR4 se sastoji od aminokiselinskih ostataka na pozicijama 103-113

[0150] U smislu ovog pronalaska, termin „pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina“ ili „pojedinačni varijabilni domen“ obuhvata polipeptide koji su izvedeni iz nehumanog izvora, poželjno kamelida, poželjno antitela teškog lanca kamelida. Oni mogu biti humanizovani, kao što je ovde opisano. Štaviše, termin obuhvata polipeptide izvedene iz izvora koji nisu kamelidni, npr. miš ili čovek, koji su „kamelizovani“, kao što je ovde opisano.

[0151] Stoga, ISVD kao što su domenska antitela i nanotela (uključujući VHH domene) mogu biti podvrgnuti humanizaciji. Konkretno, humanizovani ISVD, kao što su nanotela (uključujući VHH domene) mogu biti ISVD koji su generalno definisani ovde, ali u kojima je prisutan najmanje jedan aminokiselinski ostatak (a posebno u najmanje jednom od okvirnih ostataka) koji jeste i/ili koji odgovara humanizujućoj supstituciji (kako je definisano ovde). Potencijalno korisne humanizujuće supstitucije mogu se utvrditi upoređivanjem sekvence okvirnih regiona prirodne VHHsekvence sa odgovarajućom okvirnom sekvencom jedne ili više blisko povezanih humanih VHsekvenci, nakon čega se jedna ili više tako utvrđenih potencijalno korisnih humanizujućih supstitucija (ili njihovih kombinacija) može uvesti u navedenu VHHsekvencu (na bilo koji način poznat sam po sebi, kao što je ovde dalje opisano) i rezultirajuće humanizovane VHHsekvence mogu testirati na afinitet za cilj, za stabilnost, za lakoću i nivo ekspresije i/ili za druga željena svojstva. Na ovaj način, pomoću ograničenog stepena pokušaja i grešaka, kvalifikovano lice može odrediti druge odgovarajuće humanizujuće supstitucije (ili njihove odgovarajuće kombinacije) na osnovu obelodanjivanja u ovom dokumentu. Takođe, na osnovu gorenavedenog, (okvirni regioni) ISVD, kao što je nanotelo (uključujući VHH domene), mogu biti delimično humanizovani ili potpuno humanizovani.

[0152] Još jedna posebno poželjna klasa ISVD obuhvata ISVD sa aminokiselinskom sekvencom koja odgovara aminokiselinskoj sekvenci prirodno prisutnog VHdomena, ali koja je „kamelizovana“, tj. zamenom jednog ili više aminokiselinskih ostataka u aminokiselinskoj sekvenci prirodno prisutnog VHdomena iz konvencionalnog 4-lančanog antitela jednim ili više aminokiselinskih ostataka koji se javljaju na odgovarajućim pozicijama u VHHdomenu antitela teškog lanca. Ovo se može izvršiti na način koji je sam po sebi poznat, što će biti jasno kvalifikovanom licu, na primer na osnovu opisa u ovom dokumentu. Takve „kamelizovane“ supstitucije se poželjno ubacuju na pozicije aminokiselina koje formiraju i/ili su prisutne na VH-VLinterfejsu, i/ili na takozvanim karakterističnim ostacima kamelida, kako je ovde definisano (videti takođe na primer WO 94/04678 i Davies i Riechmann (1994. i 1996.)). Poželjno, VHsekvenca koja se koristi kao polazni materijal ili polazna tačka za generisanje ili projektovanje kamelizovanih imunoglobulinskih pojedinačnih varijabilnih domena je poželjno VHsekvenca sisara, poželjnije VHsekvenca čoveka, kao što je VH3 sekvenca. Međutim, treba napomenuti da se takvi pojedinačni varijabilni domeni kamelizovanog imunoglobulina pronalaska mogu dobiti na bilo koji pogodan način poznat sam po sebi i stoga nisu strogo ograničeni na polipeptide koji su dobijeni korišćenjem

4

polipeptida koji se sastoji od prirodno prisutnog VHdomena kao početnog materijala.

Upućuje se na autore Davies i Riechmann (FEBS 339: 285-290, 1994; Biotechnol.13: 475-479, 1995; Prot. Eng.9: 531-537, 1996) i Riechmann i Muyldermans (J. Immunol. Methods 231: 25-38, 1999)

[0153] Na primer, ponovo kao što je ovde dalje opisano, i „humanizacija“ i „kamelizacija“ se mogu izvršiti obezbeđivanjem nukleotidne sekvence koja kodira prirodni VHHdomen ili VHdomen, respektivno, a zatim menja, na način poznat sam po sebi, jedan ili više kodona u navedenoj nukleotidnoj sekvenci na takav način da nova nukleotidna sekvenca kodira „humanizovani“ ili „kamelizovani“ ISVD pronalaska, respektivno. Ova nukleinska kiselina se zatim može izraziti na način poznat sam po sebi, tako da se obezbede željeni ISVD pronalaska. Alternativno, na osnovu sekvence aminokiselina prirodnog VHHdomena ili VHdomena, respektivno, sekvenca aminokiselina željenih humanizovanih ili kamelizovanih ISVD pronalaska, respektivno, može biti dizajnirana i zatim sintetizovana de novo korišćenjem tehnika za sintezu peptida poznatih samih po sebi. Takođe, na osnovu sekvence aminokiselina ili nukleotidne sekvence prirodnog VHHdomena ili VHdomena, respektivno, nukleotidna sekvenca koja kodira željene humanizovane ili kamelizovane ISVD pronalaska, respektivno, može se dizajnirati i zatim sintetizovati de novo koristeći tehnike za sintezu nukleinskih kiselina poznate same po sebi, nakon čega se tako dobijena nukleinska kiselina može izraziti na način poznat sam po sebi, kako bi se obezbedili željeni ISVD pronalaska.

[0154] ISVD kao što su domenska antitela i nanotela (uključujući VHH domene i humanizovane VHH domene), takođe mogu biti podvrgnuti sazrevanju afiniteta uvođenjem jedne ili više izmena u sekvencu aminokiselina jednog ili više CDR, što rezultira poboljšanim afinitetom rezultujućeg ISVD za njegov odgovarajući antigen, u poređenju sa odgovarajućim matičnim molekulom. Molekuli ISVD zreli za afinitet pronalaska mogu se pripremiti metodama poznatim u struci, na primer, kao što je opisano u Marks et al. (Biotechnology 10:779-783, 1992), Barbas, et al. (Proc. Nat. Acad. Sci, USA 91: 3809-3813, 1994), Shier et al. (Gene 169: 147-155, 1995), Yelton et al. (Immunol. 155: 1994-2004, 1995), Jackson et al. (J. Immunol. 154: 3310-9, 1995), Hawkins et al. (J. Mol. Biol.226: 889896, 1992), Johnson i Hawkins (Affinity maturation of antibodies using phage display, Oxford University Press, 1996).

4

[0155] Proces dizajniranja/odabira i/ili pripreme polipeptida, počev od ISVD kao što je, VH, VL, VHH, domensko antitelo ili nanotelo, ovde se takođe naziva „formatiranje“ navedenog ISVD; i za ISVD koji je deo polipeptida se kaže da je „formatiran“ ili da je „u formatu“ navedenog polipeptida. Primeri načina na koje se ISVD može formatirati i primeri takvih formata biće jasni kvalifikovanoj osobi na osnovu obelodanjivanja ovde; i takav formatirani imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen predstavlja dalji aspekt pronalaska.

[0156] Poželjni CDR su prikazani u tabeli A-2.

[0157] U određenom poželjnom aspektu, ovaj pronalazak se odnosi na ISVD prema ovom patentnom zahtevu, pri čemu navedeni ISVD specifično vezuje ADAMTS5 i u suštini se sastoji od 4 okvirna regiona (FR1 do FR4, respektivno) i 3 regiona koji određuju komplementarnost (CDR1 do CDR3, respektivno), u kojima CDR1 jeste ili se sastoji od SEQ ID NO: 21, CDR2 je SEQ ID NO: 37 i CDR3 je SEQ ID NO: 55.

[0158] Konkretno, ovaj pronalazak se odnosi na ISVD prema ovom patentnom zahtevu, pri čemu navedeni ISVD specifično vezuje ADAMTS5 i u suštini se sastoji od 4 okvirna regiona (FR1 do FR4, respektivno) i 3 regiona koji određuju komplementarnost (CDR1 do CDR3, respektivno), u kojima je navedeni ISVD SEQ ID NO: 2.

[0159] Biće jasno da se, bez ograničenja, pojedinačni varijabilni domeni imunoglobulina ovog pronalaska mogu koristiti kao „gradivni blok“ za pripremu polipeptida, koji može opciono sadržati jedan ili više dodatnih pojedinačnih varijabilnih domena imunoglobulina koji mogu poslužiti kao gradivni blok (tj. protiv istog ili drugog epitopa na ADAMTS5 i/ili protiv jednog ili više drugih antigena, proteina ili meta osim ADAMTS5).

[0160] Polipeptid pronalaska (ovde takođe naznačen kao „konstrukt nanotela“) sastoji se od najmanje jednog ISVD koji vezuje ADAMTS5, kao što su dva ISVD koji vezuju ADAMTS5, a poželjno i ISVD koji vezuje albumin. U polipeptidu pronalaska, ISVD mogu biti direktno povezani ili povezani preko linkera. Još poželjnije, polipeptid pronalaska se sastoji od C-terminalne ekstenzije. Kao što će ovde biti detaljno opisano, C-terminalna ekstenzija u suštini sprečava/uklanja vezivanje već postojećih antitela/faktora u većini uzoraka ljudskih subjekata/pacijenata. C-terminalna ekstenzija je prisutna C-terminalno od poslednjeg

4

aminokiselinskog ostatka (obično ostatak serina) poslednjeg (najdalje C-terminalno lociranog) ISVD.

[0161] Kao što je dalje objašnjeno u tekstu, ISVD mogu biti izvedeni iz VHH, VHili VLdomena; međutim, ISVD su odabrani tako da ne formiraju komplementarne parove VHi VLdomena u polipeptidima ovog pronalaska. Nanotelo, VHH, i humanizovani VHHsu neobični po tome što su izvedeni iz prirodnih antitela kamelida koja nemaju lake lance, i zaista ovi domeni nisu u stanju da se povežu sa lakim lancima kamelida kako bi formirali komplementarne parove VHHi VL. Dakle, polipeptidi ovog pronalaska ne sadrže komplementarne ISVD i/ili formiraju komplementarne ISVD parove, kao što su, na primer, komplementarni VH/ VLparovi.

[0162] Generalno, polipeptidi ili konstrukti koji se sastoje ili se u suštini sastoje od jednog gradivnog bloka, pojedinačnog ISVD ili pojedinačnog nanotela će se ovde nazivati „monovalentnim“ polipeptidima, odnosno „monovalentnim konstruktima“. Polipeptidi ili konstrukti koji se sastoje od dva ili više gradivnog bloka (kao što su npr. ISVD) takođe će se ovde nazivati „multivalentnim“ polipeptidima ili konstruktima, a gradivni blokovi/ISVD prisutni u takvim polipeptidima ili konstruktima takođe će se ovde nazivati „multivalentnim formatom“. Na primer, „bivalentni“ polipeptid može da sadrži dva ISVD, opciono povezana preko sekvence linkera, dok „trovalentni“ polipeptid može da sadrži tri ISVD, opciono povezana preko dve sekvence linkera; dok „tetravalentni“ polipeptid može da sadrži četiri ISVD, opciono povezana preko tri sekvence linkera, itd.

[0163] U multivalentnom polipeptidu, dva ili više ISVD mogu biti ista ili različita i mogu biti usmerena protiv istog antigena ili antigenske determinante (na primer protiv istog dela(delova) ili epitopa(epitopova) ili protiv različitih delova ili epitopova) ili mogu alternativno biti usmerena protiv različitih antigena ili antigenskih determinanti; ili bilo koje njihove odgovarajuće kombinacije. Polipeptidi i konstrukti koji sadrže najmanje dva gradivna bloka (kao što su npr. ISVD) u kojima je najmanje jedan gradivni blok usmeren protiv prvog antigena (tj. ADAMTS5) i najmanje jedan gradivni blok je usmeren protiv drugog antigena (tj. razlikuje se od ADAMTS5) takođe će se nazivati „multispecifičnim“ polipeptidima i konstruktima, a gradivni blokovi (kao što su npr. ISVD) prisutni u takvim polipeptidima i konstruktima takođe će se ovde nazivati „multispecifičnim formatom“. Dakle, na primer, „bispecifični“ polipeptid pronalaska je polipeptid koji se sastoji od najmanje jednog ISVD

4

usmerenog protiv prvog antigena (tj. ADAMTS5) i najmanje jednog dodatnog ISVD usmerenog protiv drugog antigena (tj. razlikuje se od ADAMTS5), dok je „trispecifični“ polipeptid pronalaska polipeptid koji se sastoji od najmanje jednog ISVD usmerenog protiv prvog antigena (tj. ADAMTS5), najmanje jednog dodatnog ISVD usmerenog protiv drugog antigena (tj. razlikuje se od ADAMTS5) i najmanje jednog dodatnog ISVD usmerenog protiv trećeg antigena (tj. razlikuje se od oba ADAMTS5 i drugog antigena); itd.

[0164] U jednom aspektu, ovaj pronalazak se odnosi na polipeptid, koji se sastoji od najmanje 2 ISVD, pri čemu najmanje 1 ISVD specifično vezuje ADAMTS5, poželjnije SEQ ID NO: 2.

[0165] U jednom aspektu, ovaj pronalazak se odnosi na polipeptid prema ovom patentnom zahtevu, koji se sastoji od najmanje 2 ISVD, pri čemu navedena najmanje 2 ISVD specifično vezuju ADAMTS5, poželjnije se svaki ISVD od navedena 2 ISVD bira nezavisno od grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:s 2, 116, 19, 1, 3, 6, 16, 17, 10, 11, 9, 5, 4, 7, 117, 8, 12, 13, 14, 15 i 18.

[0166] „Multiparatopični“ polipeptidi i „multiparatopični“ konstrukti, kao što su npr.

„biparatopični“ polipeptidi ili konstrukti i „triparatopični“ polipeptidi ili konstrukti, sastoje se ili se u suštini sastoje od dva ili više gradivna bloka od kojih svaki ima različit paratop.

[0167] Shodno tome, ISVD pronalaska koji vezuju ADAMTS5 mogu biti u suštinski izolovanom obliku (kako je ovde definisano), ili mogu činiti deo konstrukta ili polipeptida, koji se mogu sastojati ili se u suštini sastoje od jednog ili više ISVD koji vezuju ADAMTS5 i koji mogu opciono dalje sadržati jednu ili više daljih sekvenci aminokiselina (sve opciono povezane preko jednog ili više odgovarajućih linkera). Ovaj pronalazak se odnosi na polipeptid ili konstrukt koji se sastoji ili se u suštini sastoji od najmanje jednog ISVD u skladu sa pronalaskom, kao što je jedan ili više ISVD pronalaska (ili njegovih odgovarajućih fragmenata), koji vezuju ADAMTS5.

[0168] Jedan ili više ISVD pronalaska mogu se koristiti kao gradivni blok u takvom polipeptidu ili konstruktu, tako da obezbede monovalentni, multivalentni ili multiparatopični polipeptid ili konstrukt pronalaska, respektivno, sve kako je ovde opisano. Ovaj pronalazak

4

se stoga takođe odnosi na polipeptid koji je monovalentni konstrukt koji se sastoji ili se u suštini sastoji od jednog monovalentnog polipeptida ili ISVD pronalaska.

[0169] Ovaj pronalazak se stoga odnosi i na polipeptid ili konstrukt koji je multivalentni polipeptid ili multivalentni konstrukt, respektivno, kao što je npr. dvovalentni ili trovalentni polipeptid ili konstrukt koji se sastoji ili se u suštini sastoji od dva ili više ISVD pronalaska (za multivalentne i multispecifične polipeptide koji sadrže jedan ili više VHH domena i njihovu pripremu, takođe se upućuje na Conrath et al. (J. Biol. Chem.276: 7346-7350, 2001), kao i na primer WO 96/34103, WO 99/23221 i WO 2010/115998).

[0170] U jednom aspektu, u svom najjednostavnijem obliku, multivalentni polipeptid ili konstrukt pronalaska je bivalentni polipeptid ili konstrukt pronalaska koji se sastoji od prvog ISVD, kao što je nanotelo, usmereno protiv ADAMTS5, i identičnog drugog ISVD, kao što je nanotelo, usmerenog protiv ADAMTS5, pri čemu se navedeni prvi i navedeni drugi ISVD, kao što su nanotela, mogu opciono povezati preko sekvence linkera (kao što je ovde definisano). U drugom obliku, multivalentni polipeptid ili konstrukt pronalaska može biti trovalentni polipeptid ili konstrukt pronalaska, koji se sastoji od prvog ISVD, kao što je nanotelo, usmereno protiv ADAMTS5, identičnog drugog ISVD, kao što je nanotelo, usmereno protiv ADAMTS5 i identičnog trećeg ISVD, kao što je nanotelo, usmereno protiv ADAMTS5, u kojem navedeni prvi, drugi i treći ISVD, kao što su nanotela, mogu opciono biti povezani preko jedne ili više, a posebno dve sekvence linkera. U jednom aspektu, pronalazak se odnosi na polipeptid ili konstrukt koji se sastoji ili se u suštini sastoji od najmanje dva ISVD u skladu sa pronalaskom, kao što su 2, 3 ili 4 ISVD (ili njihovi odgovarajući fragmenti), koji vezuju ADAMTS5. Dva ili više ISVD mogu opciono biti povezani preko jednog ili više peptidnih linkera.

[0171] U drugom aspektu, multivalentni polipeptid ili konstrukt pronalaska može biti bispecifični polipeptid ili konstrukt pronalaska, koji se sastoji od prvog ISVD, kao što je nanotelo, usmereno protiv ADAMTS5, i drugog ISVD, kao što je nanotelo, usmereno protiv drugog antigena, kao što je, na primer, agrekan, u kojem navedeni prvi i drugi ISVD, kao što su nanotela, mogu opciono biti povezani preko sekvence linkera (kako je ovde definisano); dok multivalentni polipeptid ili konstrukt pronalaska može takođe biti trispecifični polipeptid ili konstrukt pronalasa, koji se sastoji od prvog ISVD, kao što je nanotelo, usmereno protiv ADAMTS5, drugog ISVD, kao što je nanotelo, usmereno protiv drugog antigena, kao što je na primer agrekan, i trećeg ISVD, kao što je nanotelo, usmereno protiv trećeg antigena, u kojem prvi, drugi i treći ISVD, kao što su nanotelo, mogu biti opciono povezani preko jedne ili više sekvenci.

[0172] Pronalazak se dalje odnosi na multivalentni polipeptid koji obuhvata ili se (u suštini) sastoji od najmanje jednog ISVD (ili njegovih odgovarajućih fragmenata) koji vezuje ADAMTS5, po mogućnosti humani ADAMTS5, i jednog dodatnog ISVD, kao što je ISVD koji vezuje agrekan.

[0173] Bivalentni, bispecifični polipeptidi ili konstrukti su oni prikazani u ovde opisanim primerima i u tabeli A-1 (videti. SEQ ID NO: 120-130 (tj. SEQ ID NO: 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129 i 130), najpoželjnije SEQ ID NO: 129 i 130. Posebno poželjni dvovalentni, bispecifični polipeptidi uključuju SEQ ID NO: 122, 126, 129 i 130.

[0174] U poželjnom aspektu, polipeptid ili konstrukt pronalaska se sastoji ili se u suštini sastoji od najmanje dva ISVD, pri čemu navedena najmanje dva ISVD mogu biti ista ili različita, ali od kojih je najmanje jedan ISVD usmeren protiv ADAMTS5, po mogućnosti navedeni ISVD koji vezuje ADAMTS5 je SEQ ID NO: 2.

[0175] Dva ili više ISVD prisutnih u multivalentnom polipeptidu ili konstruktu pronalaska mogu se sastojati od sekvence varijabilnog domena lakog lanca (npr. VL-sekvenca) ili sekvence varijabilnog domena teškog lanca (npr. VH-sekvenca); mogu se sastojati od sekvence varijabilnog domena teškog lanca koja je izvedena iz konvencionalnog antitela sa četiri lanca ili sekvence varijabilnog domena teškog lanca koja je izvedena iz antitela teškog lanca. U poželjnom aspektu, oni se sastoje od domenskog antitela (ili aminokiseline koja je pogodna za upotrebu kao domensko antitelo), antitela sa jednim domenom (ili aminokiseline koja je pogodna za upotrebu kao antitelo sa jednim domenom), „dAb“ (ili aminokiseline koja je pogodna za upotrebu kao dAb), Nanobody<®>(uključujući, aline ograničavajući se na VHH), humanizovane VHHsekvence, kamelizovane VHsekvence; ili VHHsekvence koja je dobijena sazrevanjem afiniteta. Dva ili više imunoglobulinskih pojedinačnih varijabilnih domena mogu se sastojati od delimično ili potpuno humanizovanog nanotela ili delimično ili potpuno humanizovanog VHH.

1

[0176] U jednom aspektu pronalaska, prvi ISVD i drugi ISVD prisutni u multiparatopičnom (po mogućnosti biparatopičnom ili triparatopičnom) polipeptidu ili konstruktu pronalaska ne takmiče se međusobno za vezivanje za ADAMTS5 i, kao takvi, pripadaju različitim porodicama. Shodno tome, ovaj pronalazak se odnosi na multiparatopični (po mogućnosti biparatopični) polipeptid ili konstrukt koji se sastoji od dva ili više ISVD, pri čemu svaki ISVD pripada drugoj porodici. S jedne strane, prvi ISVD ovog multiparatopičnog (po mogućnosti biparatopičnog) polipeptida ili konstrukta pronalaska ne blokira unakrsno vezivanje za ADAMTS5 drugog ISVD ovog multiparatopičnog (po mogućnosti biparatopičnog) polipeptida ili konstrukta pronalaska i/ili prvi ISVD nije unakrsno blokiran od vezivanja za ADAMTS5 drugim ISVD. U drugom aspektu, prvi ISVD multiparatopičnog (po mogućnosti biparatopičnog) polipeptida ili konstrukta pronalaska unakrsno blokira vezivanje za ADAMTS5 drugog ISVD ovog multiparatopičnog (po mogućnosti biparatopičnog) polipeptida ili konstrukta pronalaska i/ili prvi ISVD je unakrsno blokiran od vezivanja za ADAMTS5 drugim ISVD.

[0177] U posebno poželjnom aspektu, polipeptid ili konstrukt pronalaska se sastoji ili se u suštini sastoji od tri ili više ISVD, od kojih su najmanje dva ISVD usmerena protiv ADAMTS5. Biće jasno da navedene najmanje dva ISVD usmerena protiv ADAMTS5 mogu biti ista ili različita, mogu biti usmerena protiv istog epitopa ili različitih epitopa ADAMTS5, mogu pripadati istom epitopskom kontejneru ili različitim epitopskim grupama i/ili se mogu vezati za iste ili različite domene ADAMTS5.

[0178] Relativni afiniteti mogu zavisiti od lokacije ISVD u polipeptidu. Biće jasno da se redosled ISVD u polipeptidu pronalaska (orijentacija) može izabrati u skladu sa potrebama osobe koja je stručna u ovoj oblasti. Redosled pojedinačnih ISVD kao i da li polipeptid sadrži linker, pitanje je izbora dizajna. Neke orijentacije, sa ili bez linkera, mogu pružiti preferirane karakteristike vezivanja u poređenju sa drugim orijentacijama. Na primer, redosled prvog ISVD (npr. ISVD 1) i drugog ISVD (npr. ISVD 2) u polipeptidu pronalaska može biti (od N-terminala do C-terminala): (i) ISVD 1 (npr. nanotelo 1) - [linker] - ISVD 2 (npr. nanotelo 2) -[C-terminalna ekstenzija]; ili (ii) ISVD 2 (npr. nanotelo 2) - [linker]- ISVD 1 (npr. nanotelo 1) - [C-terminalna ekstenzija]; (pri čemu su delovi između uglastih zagrada, tj. linker i C-terminalna ekstenzija, opcioni). Sve orijentacije su obuhvaćene pronalaskom. Polipeptidi koji sadrže orijentaciju ISVD koja obezbeđuje željene karakteristike vezivanja mogu se lako identifikovati rutinskim skriningom, na primer kao što je prikazano u odeljku primera.

2

Poželjni redosled je od N-terminala do C-terminala: ISVD koji vezuje ADAMTS5 - [linker]-ISVD koji vezuje albumin ili agrekan - [C-terminalna ekstenzija], pri čemu su delovi između uglastih zagrada opcioni.

[0179] U jednom aspektu, ovaj pronalazak se odnosi na polipeptid koji se sastoji od dva ili više ISVD koji specifično vezuju ADAMTS5, pri čemu

a) najmanje „prvi“ ISVD se specifično vezuje za prvu antigensku odrednicu, epitop, deo, domen, podjedinicu ili konformaciju ADAMTS5, poželjno je reći „prvi“ ISVD koji specifično vezuje ADAMTS5 je SEQ ID NO: 2; i

b) najmanje „drugi“ ISVD se specifično vezuje za drugu antigensku odrednicu, epitop, deo, domen, podjedinicu ili konformaciju ADAMTS5, različitu od prve antigenske odrednice epitopa, dela, domena, podjedinice ili konformacije, respektivno, poželjno je reći „drugi“ ISVD koji specifično vezuje ADAMTS5 je SEQ ID NO: 116 ili 19.

[0180] U poželjnom aspektu, polipeptid ili konstrukt pronalaska se sastoji ili se u suštini sastoji od najmanje dva ISVD koji vezuju ADAMTS5, pri čemu navedena najmanje dva ISVD mogu biti ista ili različita, koji se nezavisno biraju iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:s 2, 116, 19, 1, 3, 6, 16, 17, 10, 11, 9, 5, 4, 7, 117, 8, 12, 13, 14, 15 i 18.

[0181] U daljem aspektu, pronalazak se odnosi na multiparatopični (po mogućnosti biparatopični) polipeptid ili konstrukt koji se sastoji od dva ili više ISVD usmerenih protiv ADAMTS5 koji vezuju isti epitop(e) koji je vezan za bilo koji od SEQ ID NO: 2, 1, 3, 6, 16, 17, 10, 11, 9, 5, 4, 7, 117, 8, 12, 13, 14, 15 i 18.

[0182] U daljem aspektu, pronalazak se odnosi na polipeptid prema ovom patentnom zahtevu, pri čemu navedeni polipeptid ima 100% identičnost sekvence sa SEQ ID NO: 2, 122, 126, 129 ili 130.

[0183] U jednom aspektu, ovo obelodanjivanje se odnosi na polipeptid kao što je ovde opisano, koji je izabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 127 (klon 130049-093-Alb), SEQ ID NO: 126 (klon 1292F3-093-Alb), SEQ ID NO: 127 (klon 130049-093-Alb) i SEQ ID NO: 128 (klon 1319D3-093-Alb).

[0184] Struci su potrebne efikasnije terapije za poremećaje koji utiču na hrskavicu u zglobovima, kao što je osteoartritis. Pogotovo kada se primenjuje sistematski, vreme zadržavanja većine lekova je nedovoljno. Sadašnji pronalazači su pretpostavili da bi se efikasnost terapijskog leka, kao što su konstrukt, polipeptid i ISVD pronalaska, mogla značajno povećati spajanjem terapijskog leka sa delom koji produžava poluvreme eliminacije leka i posledično povećava retenciju leka, ali koji ne bi trebalo da poremeti efikasnost navedenog terapijskog leka.

[0185] U specifičnom aspektu pronalaska, konstrukt ili polipeptid pronalaska može imati deo koji daje povećano poluvreme eliminacije, u poređenju sa odgovarajućim konstruktom ili polipeptidom pronalaska bez navedenog dela. Neki poželjni, ali neograničavajući primeri takvih konstrukata i polipeptida pronalaska biće jasni kvalifikovanoj osobi na osnovu daljeg obelodanjivanja u ovom dokumentu, i na primer, obuhvataju ISVD ili polipeptide pronalaska koji su hemijski modifikovani da bi se povećalo njihovo poluvreme eliminacije (na primer, pomoću pegilacije); ADAMTS5 veziva pronalaska, kao što su ISVD i/ili polipeptidi pronalaska koji obuhvataju najmanje jedno dodatno mesto vezivanja za vezivanje za serumski protein (kao što je serumski albumin); ili polipeptide pronalaska koji obuhvataju najmanje jedan ISVD pronalaska koji je povezan sa najmanje jednim delom (a posebno sa najmanje jednom sekvencom aminokiselina) koja povećava poluvreme eliminacije sekvence aminokiselina pronalaska. Primeri konstrukata pronalaska, kao što su polipeptidi pronalaska, koji obuhvataju takve delove koji produžavaju poluveme eliminacije ili ISVD, biće jasni kvalifikovanoj osobi na osnovu daljeg obelodanjivanja ovde; i na primer uključuju, bez ograničenja, polipeptide u kojima su jedan ili više ISVD pronalaska odgovarajuće povezani sa jednim ili više serumskih proteina ili njihovih fragmenata (kao što je (humani) serumski albumin ili njegovi odgovarajući fragmenti) ili sa jednom ili više vezivnih jedinica koje se mogu vezati za serumske proteine (kao što su, za na primer, antitela domena, pojedinačni varijabilni domeni imunoglobulina koji su pogodni za upotrebu kao antitelo domena, antitela jednog domena, pojedinačni varijabilni domeni imunoglobulina koji su pogodni za upotrebu kao antitelo jednog domena, dAb, pojedinačni varijabilni domeni imunoglobulina koji su pogodni za upotrebu kao dAb, ili nanotela koja se mogu vezati za serumske proteine kao što su serumski albumin (kao što je humani serumski albumin), serumski imunoglobulini kao što

4

je IgG ili transferin; upućuje se na dalji opis i reference pomenute u ovom dokumentu); polipeptidi u kojima je aminokiselinska sekvenca pronalaska povezana sa Fc delom (kao što je humani Fc) ili odgovarajućim delom ili njegovim fragmentom; ili polipeptidi u kojima su jedan ili više imunoglobulinskih pojedinačnih promenljivih domena pronalaska pogodno povezani sa jednim ili više malih proteina ili peptida koji se mogu vezati za serumske proteine, kao što su, bez ograničenja, proteini i peptidi opisani u WO 91/01743, WO 01/45746, WO 02/076489, WO2008/068280, WO2009/127691 i PCT/EP2011/051559.

[0186] U jednom aspektu, ovaj pronalazak pruža konstrukt pronalaska ili polipeptida, pri čemu navedeni konstruki ili navedeni polipeptid dalje obuhvata deo koji se vezuje za serumske proteine ili serumski protein. Poželjno, navedeni deo koji se vezuje za serumske proteine vezuje serumski albumin, kao što je humani serumski albumin.

[0187] U jednom aspektu, ovaj pronalazak se odnosi na polipeptid prema ovom patentnom zahtevu, koji se sastoji od ISVD koji vezuje serumski albumin.

[0188] Generalno, konstrukti ili polipeptidi pronalaska sa povećanim poluvremenom eliminacije po mogućnosti imaju poluvreme eliminacije koje je najmanje 1,5 puta, po mogućnosti najmanje 2 puta, kao što je najmanje 5 puta, na primer najmanje 10 puta ili više od 20 puta, veće od poluvremena eliminacije odgovarajućih konstrukata ili polipeptida pronalaska samih po sebi, tj. bez dela koji daje povećano poluvreme eliminacije. Na primer, konstrukti ili polipeptidi pronalaska sa povećanim poluvremenom eliminacije mogu imati poluvreme eliminacije, npr. kod ljudi, koje se povećava sa više od 1 sata, poželjno više od 2 sata, poželjnije više od 6 sati, kao što je više od 12 sati, ili čak više od 24, 48 ili 72 sata, u poređenju sa odgovarajućim konstruktima ili polipeptidima pronalaska samim po sebi, tj. bez dela koji daje povećano poluvreme eliminacije.

[0189] U poželjnom, ali neograničavajućem aspektu pronalaska, konstrukti pronalaska i polipeptidi pronalaska imaju poluvreme eliminacije u serumu, npr. kod ljudi, koje se povećava sa više od 1 sata, po mogućnosti više od 2 sata, poželjnije više od 6 sati, kao što je više od 12 sati, ili čak više od 24, 48 ili 72 sata, u poređenju sa odgovarajućim konstruktima ili polipeptidima pronalaska samim po sebi, tj. bez dela koji daje povećano poluvreme eliminacije.

[0190] U drugom poželjnom, ali neograničavajućem aspektu pronalaska, takvi konstrukti pronalaska, kao što su polipeptidi pronalaska, pokazuju poluvreme eliminacije seruma kod ljudi od najmanje oko 12 sati, po mogućnosti najmanje 24 sata, poželjnije najmanje 48 sati, još poželjnije najmanje 72 sata ili više. Na primer, konstrukti ili polipeptidi pronalaska mogu imati poluvreme eliminacije od najmanje 5 dana (kao što je oko 5 do 10 dana), po mogućnosti najmanje 9 dana (kao što je oko 9 do 14 dana), po mogućnosti najmanje 10 dana (kao što je oko 10 do 15 dana), ili najmanje 11 dana (kao što je oko 11 do 16 dana), po mogućnosti najmanje 12 dana (kao što je oko 12 do 18 dana ili više), ili više od 14 dana (kao što je oko 14 do 19 dana).

[0191] U posebno poželjnom, ali neograničavajućem aspektu pronalaska, pronalazak pruža konstrukt pronalaska i polipeptid pronalaska, koji pored jednog ili više gradivnih blokova koji vezuju ADAMTS5 sadrži najmanje jedan gradivni blok koji vezuje serumski albumin, kao što je ISVD koji vezuje serumski albumin, kao što je humani serumski albumin kao što je ovde opisano. Poželjno je da se navedeni ISVD koji vezuje serumski albumin sastoji ili se u suštini sastoji od 4 okvirna regiona (FR1 do FR4, respektivno) i 3 regiona koji određuju komplementarnost (CDR1 do CDR3, respektivno), u kojima je CDR1 SFGMS, CDR2 je SISGSGSDTLYADSVKG i CDR3 je GGSLSR. Poželjno je da se navedeni ISVD koji vezuje humani serumski albumin izabere iz grupe koja se sastoji od Alb8, Alb23, Alb129, Alb132, Alb11, Alb11 (S112K)-A, Alb82, Alb82-A, Alb82-AA, Alb82-AAA, Alb82-G, Alb82-GG, Alb82-GGG, Alb92 ili Alb223 (videti tabelu D).

[0192] U jednom aspektu, ovaj pronalazak se odnosi na polipeptid prema ovom patentnom zahtevu, koji se sastoji od najmanje jednog ISVD koji vezuje ADAMTS5 i ISVD koji vezuje serumski albumin, poželjno izabranog iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 129 (klon 577 2F3*-Alb), SEQ ID NO: 130 (klon 5792F3*-093-Alb), SEQ ID NO: 120 (klon 42A12-Alb), SEQ ID NO: 121 (klon 52D7-Alb), SEQ ID NO: 122 (klon 62F3-Alb), SEQ ID NO: 123 (klon 69049-Alb), SEQ ID NO: 124 (klon 709D3-Alb), SEQ ID NO: 125 (klon 713B2-Alb), SEQ ID NO: 126 (klon 1292F3-093-Alb), SEQ ID NO: 127 (klon 130049-093-Alb), i SEQ ID NO: 128 (klon 1319D3-093-Alb) (videti tabelu A-1).

[0193] U jednom otelotvorenju, ovaj pronalazak se odnosi na konstrukt pronalaska, kao što je polipeptid koji se sastoji od dela koji vezuje serumske proteine, pri čemu je navedeni deo koji vezuje serumske proteine polipeptid koji nije na bazi antitela.

[0194] Struci su potrebne efikasnije terapije za poremećaje koji utiču na hrskavicu u zglobovima, kao što je osteoartritis. Čak i kada se primenjuje intraartikularno, vreme zadržavanja većine lekova za lečenje zahvaćene hrskavice je nedovoljno. Sadašnji pronalazači su pretpostavili da se efikasnost terapijskog leka, kao što su konstrukt, polipeptid i ISVD pronalaska, može modulisati spajanjem terapijskog leka sa delom koji bi „usidrio“ lek u zglobu i posledično povećao retenciju leka, ali koji ne bi trebalo da poremeti efikasnost navedenog terapijskog leka (ovaj deo je ovde takođe naznačen kao „protein za sidrenje hrskavice“ ili „CAP“). Ovaj koncept sidrenja mogao bi ne samo da modulira efikasnost leka, već i operativnu specifičnost obolelog zgloba smanjenjem toksičnosti i neželjenih efekata, čime bi se proširio broj mogućih korisnih lekova.

[0195] Predviđeno je da se format molekula za kliničku upotrebu sastoji od jednog ili dva gradivna bloka, kao što je ISVD koji vezuje ADAMTS5 i jedan ili više gradivnih blokova, npr. ISVD, sa takvim retencionim načinom delovanja, a moguće i daljih delova. U kopodnesenoj prijavi je pokazano da takvi formati zadržavaju i ADAMTS5 vezivanje i terapeutski efekat, npr. inhibitornu aktivnost, kao i retenciona svojstva. Jedan ili više gradivnih blokova, kao što su ISVD, sa retencionim načinom delovanja mogu biti bilo koji gradivni blok koji ima retencioni efekat („CAP gradivni blok“) kod bolesti kod kojih je uključen ADAMTS5, kao što su artritična bolest, osteoartritis, spondiloepimetfizalna displazija, bolest degeneracije lumbalnog diska, degenerativna bolest zglobova, reumatoidni artritis, osteohondritis disekans, agrekanopatije.

[0196] „CAP gradivni blok“ se koristi za usmeravanje, sidrenje i/ili zadržavanje drugih, npr. terapijskih, gradivnih blokova, kao što su ISVD koji vezuju ADAMTS5 na željenom mestu, kao što je npr. u zglobu, u kojem navedeni drugi, npr. terapijski, gradivni blok treba da izvrši svoj efekat, npr. vezivanje i/ili inhibiranje ADAMTS5.

[0197] Sadašnji pronalazači su dalje pretpostavili da veziva za agrekan, kao što je ISVD koji vezuje agrekan, mogu potencijalno da funkcionišu kao takvo sidro, iako je agrekan u velikoj meri glikoziliran i razgrađen u različitim poremećajima koji utiču na hrskavicu u zglobovima. Štaviše, s obzirom na troškove i opsežno testiranje na različitim životinjskim modelima koji su potrebni pre nego što lek može da uđe u kliničku fazu, takva veziva za agregan treba da imaju široku unakrsnu reaktivnost, npr. veziva za agregan treba da se vezuju za agrekan različitih vrsta.

[0198] Koristeći različite genijalne metode imunizacije, skrininga i karakterizacije, sadašnji pronalazači su uspeli da identifikuju različita veziva za agrekan sa superiornom selektivnošću, stabilnošću i specifičnostima, što je omogućilo produženo zadržavanje i aktivnost u zglobu (videti ko-podnesenu prijavu).

[0199] U jednom aspektu, ovaj pronalazak se odnosi na metodu za smanjenje i/ili inhibiciju efluksa kompozicije, polipeptida ili konstrukta iz zgloba, pri čemu se navedena metoda sastoji od primene farmaceutski aktivne količine najmanje jednog polipeptida u skladu sa pronalaskom, konstrukta u skladu sa pronalaskom ili kompozicije u skladu sa pronalaskom, osobi kojoj je to potrebno.

[0200] U ovom pronalasku, termin „smanjenje i/ili inhibiranje efluksa“ znači smanjenje i/ili inhibiranje spoljašnjeg protoka kompozicije, polipeptida ili konstrukta od unutar zgloba ka spolja. Poželjno, efluks se smanjuje i/ili inhibira za najmanje 10%, kao što je najmanje 20%, 30%, 40% ili 50% ili više, kao što je najmanje 60%, 70%, 80%, 90% ili čak 100%, u poređenju sa efluksom gore navedene kompozicije, polipeptida ili konstrukta u zglobu pod istim uslovima, ali bez prisustva veziva za agrekan pronalaska, npr. ISVD koji vezuje agrekan.

[0201] Pored bolesti u koje je uključen ADAMTS5, kao što su artritična bolest, osteoartritis, spondiloepimetfizalna displazija, bolest degeneracije lumbalnog diska, degenerativna bolest zglobova, reumatoidni artritis, osteohondritis disekans i agrekanopatije, očekuje se da se vezivni agensi za agrekan prema ovom pronalasku mogu koristiti i kod različitih drugih bolesti koje utiču na hrskavicu, kao što su artropatije i hondrodistrofije, artritička bolest (kao što su osteoartritis, reumatoidni artritis, gihtni artritis, psorijatični artritis, traumatska ruptura ili odvajanje), ahondroplazija, kostohondritis, spondiloepimetfizalna displazija, hernija kičmenog diska, bolest degeneracije lumbalnog diska, degenerativna bolest zglobova i relapsirajući polihondritis (obično naznačeni ovde kao „bolesti povezane sa agrekanom“).

[0202] Navedeni CAP gradivni blok, npr. ISVD koji vezuje agrekan, poželjno se vezuje za hrskavično tkivo kao što je hrskavica i/ili meniskus. U poželjnom aspektu, CAP gradivni blok je unakrsno reaktivan za druge vrste i specifično vezuje jedan ili više humanih agrekana (SEQ ID NO: 155), pseći agrekan, goveđi agrekan, pacovski agrekan; svinjski agrekan; mišji agrekan, zečji agrekan; cinomolgus agrekan i/ili rezus agrekan. Relevantne strukturne informacije za agrekan mogu se naći, na primer, na (UniProt) pristupnim brojevima kao što je prikazano u tabeli 2 u nastavku.

[0203] Poželjni CAP gradivni blok je ISVD koji vezuje agrekan, poželjno humani agrekan, poželjno predstavljen SEQ ID NO: 155 kao što je prikazano u tabeli B.

Tabela 2

[0204] Ovaj pronalazak se stoga odnosi na polipeptid ili konstrukt u skladu sa pronalaskom, koji dalje sadrži najmanje jedan CAP gradivni blok.

[0205] Ovaj pronalazak se stoga odnosi na polipeptid ili konstrukt u skladu sa pronalaskom, koji dalje sadrži najmanje jedan ISVD koji specifično vezuje agrekan, poželjno izabran od ISVD predstavljenih sa SEQ ID NO: 156 i 157.

[0206] U jednom aspektu, ovaj pronalazak se odnosi na polipeptid prema ovom patentnom zahtevu, koji se sastoji od najmanje 2 ISVD koji specifično vezuju agrekan.

[0207] U jednom aspektu, ovaj pronalazak se odnosi na polipeptid prema ovom patentnom zahtevu, koji se sastoji od najmanje 2 ISVD koji specifično vezuju agrekan, pri čemu navedena najmanje 2 ISVD koji specifično vezuju agrekan mogu biti isti ili različiti.

[0208] U jednom aspektu, ovaj pronalazak se odnosi na polipeptid prema ovom patentnom zahtevu, koji se sastoji od najmanje 2 ISVD koji specifično vezuju agrekan, pri čemu se navedena najmanje 2 ISVD koji specifično vezuju agrekan nezavisno biraju iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 156-157.

[0209] U jednom aspektu, ovaj pronalazak se odnosi na polipeptid prema ovom patentnom zahtevu, koji se sastoji od najmanje 2 ISVD koji specifično vezuju agrekan, pri čemu su navedena najmanje 2 ISVD koji specifično vezuju agrekan predstavljena sa SEQ ID NO: 156-157.

[0210] U jednom aspektu, ovaj pronalazak se odnosi na polipeptid prema ovom patentnom zahtevu, koji se sastoji od ISVD koji specifično vezuje agrekan, pri čemu se navedeni ISVD koji specifično vezuje agrekan, specifično vezuje za humani agrekan [SEQ ID NO: 155].

[0211] U jednom aspektu, ovaj pronalazak se odnosi na polipeptid prema ovom patentnom zahtevu, pri čemu navedeni ISVD koji specifično vezuje agrekan, specifično vezuje humani agrekan (SEQ ID NO: 155), pseći agrekan, goveđi agrekan, pacovski agrekan; svinjski agrekan; mišji agrekan, zečji agrekan; cinomolgus agrekan i/ili rezus agrekan.

[0212] U jednom aspektu, ovaj pronalazak se odnosi na polipeptid prema ovom patentnom zahtevu, pri čemu se navedeni ISVD koji specifično vezuje agrekan poželjno vezuje za hrskavično tkivo kao što je hrskavica i/ili meniskus.

[0213] Biće jasno da su ISVD, polipeptid i konstrukt pronalaska po mogućnosti stabilni. Stabilnost polipeptida, konstrukta ili ISVD pronalaska može se izmeriti rutinskim testovima poznatim stručnjaku u ovoj oblasti. Tipični testovi uključuju (bez ograničenja) testove u kojima se određuje aktivnost navedenog polipeptida, konstrukta ili ISVD, nakon čega sledi inkubacija u sinovijalnoj tečnosti u željenom vremenskom periodu, nakon čega se aktivnost ponovo određuje.

[0214] U jednom aspektu, ovaj pronalazak se odnosi na ISVD, polipeptid ili konstrukt pronalaska koji ima stabilnost od najmanje 7 dana, kao što je najmanje 14 dana, 21 dan, 1 mesec, 2 meseca ili čak 3 meseca u sinovijalnoj tečnosti (SF) na 37°C.

[0215] Željena aktivnost terapijskog gradivnog bloka, npr. ISVD koji vezuje ADAMTS5 u multivalentnom polipeptidu ili konstruktu pronalaska može se izmeriti rutinskim testovima poznatim stručnjaku u ovoj oblasti.

[0216] U jednom aspektu, ovaj pronalazak se odnosi na konstrukt prema ovom patentnom zahtevu, koji se sastoji od najmanje jednog ISVD ili polipeptida i jedne ili više drugih grupa, ostataka, delova ili jedinica vezivanja. Jedna ili više drugih grupa, ostataka, molekulskih delova ili vezivnih jedinica su po mogućstvu odabrane iz grupe koja obuhvata molekul polietilen glikola, proteine seruma ili njihove fragmente, vezivne jedinice koje se mogu vezati za proteine seruma, Fc fragment, male proteine ili peptide koji se mogu vezati za proteine seruma, dodatne aminokiselinske ostatke, oznake ili druge funkcionalne molekulske delove, npr. toksine, oznake, radiohemikalije itd.

[0217] U jednom otelotvorenju, kako je navedeno niže, ovaj pronalazak odnosi se na konstrukt pronalaska, kao što je polipeptid koji sadrži molekulski deo koji omogućava produženje poluvremena eliminacije, pri čemu je taj molekulski deo PEG (polietilen glikol). Stoga se ovaj pronalazak odnosi i na konstrukt ili polipeptid pronalaska koji se sastoji od PEG.

[0218] Dalji aminokiselinski ostaci se mogu ili ne moraju promeniti, izmeniti ili na drugi način uticati na druga (biološka) svojstva polipeptida pronalaska i mogu ili ne moraju dodati dalju funkcionalnost polipeptidu pronalaska. Na primer, takvi aminokiselinski ostaci:

a) mogu da sadrže N-terminalni Met ostatak, na primer kao rezultat ekspresije u heterolognoj ćeliji domaćina ili organizmu domaćinu.

b) mogu da formiraju signalnu sekvencu ili sekvencu lidera koja usmerava sekreciju polipeptida iz ćelije domaćina nakon sinteze (na primer, da obezbedi pre-, pro- ili prepro-oblik polipeptida pronalaska, u zavisnosti od ćelije domaćina koja se koristi za

1

izražavanje polipeptida pronalaska). Odgovarajući peptidi lidera sekrecije biće jasni kvalifikovanoj osobi i mogu biti kao što je ovde dalje opisano. Obično će takva sekvenca lidera biti povezana sa N-terminalom polipeptida, iako pronalazak u najširem smislu nije ograničen na njega;

c) mogu da formiraju „oznaku“, na primer aminokiselinsku sekvencu ili ostatak koji omogućava ili olakšava prečišćavanje polipeptida, na primer korišćenjem tehnika afiniteta usmerenih protiv navedene sekvence ili ostatka. Nakon toga, navedena sekvenca ili ostatak se mogu ukloniti (npr. hemijskim ili enzimatskim cepanjem) kako bi se obezbedio polipeptid (u tu svrhu, oznaka se može opciono povezati sa aminokiselinskom sekvencom ili polipeptidnom sekvencom putem sekvence koja se može cepati ili sadržati motiv koji se može cepati). Neki poželjni, ali neograničavajući primeri takvih ostataka su višestruki ostaci histidina, ostaci glutationa i miko-oznaka kao što je AAAEQKLISEEDLNGAA;

d) mogu biti jedan ili više aminokiselinskih ostataka koji su funkcionalizovani i/ili koji mogu poslužiti kao mesto za vezivanje funkcionalnih grupa. Pogodni aminokiselinski ostaci i funkcionalne grupe će biti jasni kvalifikovanoj osobi i uključuju, ali nisu ograničeni na, aminokiselinske ostatke i funkcionalne grupe pomenute ovde za derivate polipeptida pronalaska.

[0219] Takođe su obuhvaćeni ovim pronalaskom konstrukti koji se sastoje od polipeptida i/ili ISVD pronalaska, koji dalje obuhvataju druge funkcionalne delove, npr. toksine, oznake, radiohemikalije itd.

[0220] Druge grupe, ostaci, delovi ili jedinice vezivanja mogu na primer biti hemijske grupe, ostaci, delovi, koji mogu ili ne moraju sami po sebi biti biološki i/ili farmakološki aktivni. Na primer, i bez ograničenja, takve grupe mogu biti povezane sa jednim ili više ISVD ili polipeptida pronalaska tako da obezbede „derivat“ polipeptida ili konstrukta pronalaska.

[0221] Shodno tome, pronalazak u najširem smislu takođe obuhvata konstrukte i/ili polipeptide koji su derivati konstrukata i/ili polipeptida pronalaska. Takvi derivati se generalno mogu dobiti modifikacijom, a posebno hemijskom i/ili biološkom (npr.

2

enzimskom) modifikacijom, konstrukata i/ili polipeptida pronalaska i/ili jednog ili više aminokiselinskih ostataka koji čine polipeptid pronalaska.

[0222] Primeri takvih modifikacija, kao i primeri aminokiselinskih ostataka unutar polipeptidnih sekvenci koji se mogu modifikovati na takav način (tj. bilo na proteinskoj okosnici, ali po mogućnosti na bočnom lancu), metodama i tehnikama koje se mogu koristiti za uvođenje takvih modifikacija, a potencijalne upotrebe i prednosti takvih modifikacija biće jasne kvalifikovanoj osobi (videti takođe Zangi et al., Nat Biotechnol 31(10):898-907, 2013).

[0223] Na primer, takva modifikacija može uključivati uvođenje (npr. kovalentnim povezivanjem ili na bilo koji drugi pogodan način) jedne ili više (funkcionalnih) grupa, ostataka ili delova u ili na polipeptid pronalaska, a posebno jedne ili više funkcionalnih grupa, ostataka ili delova koji daju jednu ili više željenih svojstava ili funkcionalnosti konstruktu i/ili polipeptidu pronalaska. Primeri takvih funkcionalnih grupa biće jasni kvalifikovanoj osobi.

[0224] Na primer, takva modifikacija može obuhvatiti uvođenje (npr. kovalentnim vezivanjem ili na bilo koji drugi pogodan način) jednog ili više funkcionalnih delova koji povećavaju poluvreme eliminacije, rastvorljivost i/ili apsorpciju konstrukta ili polipeptida pronalaska, koji smanjuju imunogenost i/ili toksičnost konstrukta ili polipeptida pronalaska, koji eliminišu ili ublažavaju bilo kakve neželjene sporedne efekte konstrukta ili polipeptida pronalaska, i/ili koji daju druga povoljna svojstva i/ili smanjuju neželjena svojstva konstrukta ili polipeptida pronalaska; ili bilo koju kombinaciju dva ili više gorenavedenih. Primeri takvih funkcionalnih delova i tehnika za njihovo uvođenje biće jasni kvalifikovanoj osobi i mogu generalno obuhvatiti sve funkcionalne delove i tehnike pomenute u opštoj pozadinskoj literaturi koja je gore navedena, kao i funkcionalne delove i tehnike poznate same po sebi za modifikaciju farmaceutskih proteina, a posebno za modifikaciju antitela ili fragmenata antitela (uključujući antitela ScFv i antitela jednog domena), za koje se, na primer, upućuje na Remington (Pharmaceutical Sciences, 16th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1980). Takvi funkcionalni delovi mogu na primer biti direktno povezani (na primer kovalentno) sa polipeptidom pronalaska, ili opciono preko odgovarajućeg linkera ili spejsera, što će ponovo biti jasno kvalifikovanoj osobi.

[0225] Jedan specifičan primer je derivatni polipeptid ili konstrukt pronalaska pri čemu je polipeptid ili konstrukt pronalaska hemijski modifikovan kako bi se povećalo njegovo poluvreme eliminacije (na primer, pomoću pegilacije). Ovo je jedna od najčešće korišćenih tehnika za povećanje poluvremena eliminacije i/ili smanjenje imunogenosti farmaceutskih proteina i obuhvata vezivanje odgovarajućeg farmakološki prihvatljivog polimera, kao što je poli(etilenglikol) (PEG) ili njegovih derivata (kao što je metoksipoli(etilenglikol) ili mPEG). Generalno, može se koristiti bilo koji pogodan oblik pegilacije, kao što je pegilacija koja se koristi u struci za antitela i fragmente antitela (uključujući, ali ne ograničavajući se na (jedno) domenska antitela i ScFv); upućuje se na, na primer, Chapman (Nat. Biotechnol. 54: 531-545, 2002), Veronese i Harris (Adv. Drug Deliv. Rev.54: 453-456, 2003), Harris i Chess (Nat. Rev. Drug. Discov. 2: 214-221, 2003) i WO 04/060965. Komercijalno su dostupni i različiti reagensi za pegilaciju proteina, na primer od Nektar Therapeutics, SAD.

[0226] Poželjno je da se koristi pegilacija usmerena na lokaciju, posebno putem ostatka cisteina (videti na primer Yang et al. (Protein Engineering 16: 761-770, 2003). Na primer, u tu svrhu, PEG može biti vezan za cisteinski ostatak koji se prirodno javlja u polipeptidu pronalaska, konstrukt ili polipeptid pronalaska može biti modifikovan tako da na odgovarajući način uvede jedan ili više cisteinskih ostataka za vezivanje PEG, ili aminokiselinska sekvenca koja se sastoji od jednog ili više cisteinskih ostataka za vezivanje PEG može biti spojena sa N- i/ili C-terminulaom konstrukta ili polipeptida pronalaska, sve korišćenjem tehnika proteinskog inženjeringa poznatih samih po sebi kvalifikovanoj osobi.

[0227] Poželjno je da se za konstrukte ili polipeptide pronalaska koristi PEG molekularne težine veće od 5000, kao što je više od 10.000 i manje od 200.000, kao što je manje od 100.000; na primer u opsegu od 20.000-80.000.

[0228] Druga, obično manje poželjna modifikacija obuhvata N-vezanu ili O-vezanu glikozilaciju, obično kao deo ko-translacione i/ili post-translacione modifikacije, u zavisnosti od ćelije domaćina koja se koristi za izražavanje polipeptida pronalaska.

[0229] Još jedna modifikacija može obuhvatiti uvođenje jedne ili više detektabilnih oznaka ili drugih grupa ili delova koji generišu signal, u zavisnosti od predviđene upotrebe polipeptida ili konstrukata pronalaska. Odgovarajuće oznake i tehnike za njihovo vezivanje, korišćenje i

4

detekciju biće jasne stručnoj osobi, i na primer uključuju, ali nisu ograničene na, fluorescentne oznake (kao što su fluorescein, izotiocijanat, rodamin, fikoeritrin, fikocijanin, alofikocijanin, o-ftaldehid i fluorescentne metale kao što su<152>Eu ili drugi metali iz serije lantanoida), fosforescentne oznake, hemiluminiscentne oznake ili bioluminiscentne oznake (kao što su luminal, izoluminol, aromatski ester akridinijuma, imidazol, soli akridinijuma, oksalatni ester, dioksetan ili GFP i njegovi analozi), radio-izotope (kao što su<3>H,<125>I,<32>P,<35>S,<14>C,<51>Cr,<36>Cl,<57>Co,<58>Co,<59>Fe i<75>Se), metale, helate metala ili metalne katjone (na primer metalni katjoni kao što su<99m>Tc,<123>I,<113>In,<131>I,<97>Ru,<67>Cu,<67>Ga, i<68>Ga ili druge metale ili metalne katjone koji su posebno pogodni za upotrebu in vivo, in vitro ili in situ dijagnozu i snimanje, kao što su (<157>Gd,<55>Mn,<162>Dy,<52>Cr i<56>Fe)), kao i hromofore i enzime (kao što su malat dehidrogenaza, stafilokokna nukleaza, delta-V-steroid izomeraza, kvasna alkohol dehidrogenaza, alfa-glicerofosfat dehidrogenaza, trioza fosfat izomeraza, biotinavidin peroksidaza, peroksidaza hrena, alkalna fosfataza, asparaginaza, glukoza oksidaza, βgalaktozidaza, ribonukleaza, ureaza, katalaza, glukoza-VI-fosfat dehidrogenaza, glukoamilaza i acetilholin esteraza). Ostale odgovarajuće oznake će biti jasne kvalifikovanoj osobi, i na primer uključuju delove koji se mogu detektovati pomoću NMR ili ESR spektroskopije.

[0230] Takvi označeni polipeptidi i konstrukti pronalaska mogu se, na primer, koristiti za in vitro, in vivo ili in situ testove (uključujući imunološke testove poznate same po sebi kao ELISA, RIA, EIA i druge „sendvič testove“, itd.), kao i za in vivo dijagnostičke svrhe i svrhe snimanja, u zavisnosti od izbora specifične oznake.

[0231] Kao što će biti jasno kvalifikovanoj osobi, druga modifikacija može uključivati uvođenje helatne grupe, na primer za helat jednog od gore navedenih metala ili metalnih katjona. Pogodne helatne grupe, na primer, uključuju, bez ograničenja, dietil-enetriaminpentaoctenu kiselinu (DTPA) ili etilendiamin-tetraoctenu kiselinu (EDTA).

[0232] Još jedna modifikacija može obuhvatiti uvođenje funkcionalnog dela koji je jedan deo specifičnog para vezivanja, kao što je par koji vezuje biotin-(strept)avidin. Takav funkcionalni deo se može koristiti za povezivanje polipeptida pronalaska sa drugim proteinom, polipeptidom ili hemijskim jedinjenjem koje je vezano za drugu polovinu para vezivanja, tj. formiranjem para vezivanja. Na primer, konstrukt ili polipeptid pronalaska može biti konjugovan sa biotinom i povezan sa drugim proteinom, polipeptidom, jedinjenjem ili nosačem konjugovanim sa avidinom ili streptavidinom. Na primer, takav konjugovani konstrukt ili polipeptid pronalaska može se koristiti kao reporter, na primer u dijagnostičkom sistemu gde je detektabilni agens za proizvodnju signala konjugovan sa avidinom ili streptavidinom. Takvi parovi vezivanja mogu se, na primer, koristiti i za vezivanje konstrukta ili polipeptida pronalaska za nosač, uključujući nosače pogodne za farmaceutske svrhe. Jedan neograničavajući primer su liposomske formulacije koje su opisali Cao i Suresh (Journal of Drug Targeting 8: 257, 2000). Takvi parovi vezivanja se takođe mogu koristiti za povezivanje terapijski aktivnog agensa sa polipeptidom pronalaska.

[0233] Ostale potencijalne hemijske i enzimatske modifikacije će biti jasne kvalifikovanoj osobi. Takve modifikacije se takođe mogu uvesti u istraživačke svrhe (npr. za proučavanje odnosa funkcije i aktivnosti). Upućuje se, na primer, na Lundblad i Bradshaw (Biotechnol. Appl. Biochem. 26: 143-151, 1997).

[0234] Poželjno je da su konstrukti, polipeptidi i/ili derivati takvi da se vezuju za ADAMTS5, sa afinitetom (prikladno izmerenom i/ili izraženom kao KD-vrednost (stvarna ili očigledna), KA-vrednost (stvarna ili očigledna), kon-brzina ili brzina asocijacije i/ili koffili brzina disocijacije, ili alternativno kao IC50vrednost, kao što je ovde dalje opisano) koji je definisan ovde.

[0235] Takvi konstrukti i/ili polipeptidi pronalaska i njihovi derivati takođe mogu biti u suštinski izolovanom obliku (kako je ovde definisano).

[0236] U jednom aspektu, ovaj pronalazak se odnosi na konstrukt pronalaska, koji se sastoji ili se u suštini sastoji od ISVD prema pronalasku ili polipeptida prema pronalasku, i koja dalje obuhvata jednu ili više drugih grupa, ostataka, delova ili jedinica vezivanja, koje su opciono povezane preko jednog ili više peptidnih linkera.

[0237] U jednom aspektu, ovaj pronalazak se odnosi na konstrukt pronalaska, gde se jedna ili više drugih grupa, ostataka, delova ili jedinica vezivanja biraju iz grupe koja se sastoji od molekula polietilen glikola, serumskih proteina ili njihovih fragmenata, jedinica vezivanja koje se mogu vezati za serumske proteine, Fc dela i malih proteina ili peptida koji se mogu vezati za serumske proteine.

[0238] U konstruktima pronalaska, kao što su polipeptidi pronalaska, dva ili više gradivnih blokova, kao što su npr. ISVD, i opciono jedna ili više drugih grupa, lekovi, agensi, ostaci, delovi ili jedinice vezivanja mogu biti direktno povezani jedni sa drugima (kao što je na primer opisano u WO 99/23221) i/ili mogu biti povezani jedni sa drugima putem jednog ili više odgovarajućih spejsera ili linkera, ili bilo koje njihove kombinacije. Odgovarajući spejseri ili linkeri za upotrebu u multivalentnim i multispecifičnim polipeptidima biće jasni kvalifikovanoj osobi i generalno mogu biti bilo koji spejseri ili linkeri koji se koriste u struci za povezivanje sekvenci aminokiselina. Poželjno, navedeni linker ili spejser je pogodan za upotrebu u izgradnji konstrukata, proteina ili polipeptida koji su namenjeni za farmaceutsku upotrebu.

[0239] Na primer, polipeptid pronalaska može biti, na primer, trovalentni, trispecifični polipeptid, koji se sastoji od jednog gradivnog bloka, kao što je ISVD koji vezuje ADAMTS5, ISVD koji vezuje albumin i potencijalno drugog gradivnog bloka, kao što je treći ISVD, u kojem navedeni prvi, drugi i treći gradivni blokovi, kao što su ISVD, mogu opciono biti povezani preko jedne ili više, a posebno 2, sekvence linkera. Takođe, ovaj pronalazak obezbeđuje konstrukt ili polipeptid pronalaska koji se sastoji od prvog ISVD koji vezuje ADAMTS5 i eventualno drugog ISVD koji vezuje albumin i/ili eventualno trećeg ISVD i/ili eventualno četvrtog ISVD, pri čemu su navedeni prvi ISVD i/ili navedeni drugi ISVD i/ili eventualno navedeni treći ISVD i/ili eventualno navedeni četvrti ISVD povezani preko linkera, posebno 3 linkera.

[0240] Neki posebno poželjni linkeri uključuju linkere koji se koriste u struci za povezivanje fragmenata antitela ili domena antitela. To uključuje linkere pomenute u gorenavedenoj opštoj pozadinskoj literaturi, kao i na primer linkere koji se koriste u struci za izgradnju diatela ili ScFv fragmenata (u tom pogledu, međutim, treba napomenuti da, dok kod diatela i ScFv fragmenata, korišćena sekvenca linkera treba da ima dužinu, stepen fleksibilnosti i druga svojstva koja omogućavaju da se relevantni VHi VLdomeni spoje kako bi formirali kompletno mesto vezivanja antigena, ne postoji posebno ograničenje dužine ili fleksibilnosti linkera koji se koristi u polipeptidu pronalaska, jer svaki ISVD, kao što su nanotela, sam po sebi formira kompletno mesto vezivanja antigena).

[0241] Na primer, linker može biti odgovarajuća sekvenca aminokiselina, a posebno sekvence aminokiselina između 1 i 50, po mogućnosti između 1 i 30, kao što je između 1 i 10 aminokiselinskih ostataka. Neki poželjni primeri takvih aminokiselinskih sekvenci uključuju gli-ser linkere, na primer tipa (gtyxsery)2, kao što su (na primer (gly4ser)3ili (gly3ser2)3, kao što je opisano u WO 99/42077 i GS30, GS15, GS9 i GS7 linkere opisane u aplikacijama koje je Ablynx pomenuo ovde (videti na primer WO 06/040153 i WO 06/122825), kao i regione slične zglobovima, kao što su regioni zglobova prirodnih antitela teškog lanca ili sličnih sekvenci (kao što je opisano u WO 94/04678). Poželjni linkeri su prikazani u tabeli C.

[0242] Neki drugi posebno poželjni linkeri su poli-alanin (kao što je AAA), kao i linkeri GS30 (videti takođe SEQ ID NO: 85 u WO 06/122825) i GS9 (videti takođe SEQ ID NO: 84 u WO 06/122825).

[0243] Ostali pogodni linkeri generalno obuhvataju organska jedinjenja ili polimere, posebno one pogodne za upotrebu u proteinima za farmaceutsku upotrebu. Na primer, poli(etilenglikol) delovi su korišćeni za povezivanje domena antitela, videti na primer WO 04/081026.

[0244] Obuhvaćeno je obimom pronalaska da dužina, stepen fleksibilnosti i/ili druga svojstva korišćenih linkera(iako nisu kritična, kao što je to obično slučaj sa linkerima koji se koriste u fragmentima ScFv) mogu imati određeni uticaj na svojstva konačnog konstrukta pronalaska, kao što je polipeptid pronalaska, uključujući, ali ne ograničavajući se na afinitet, specifičnost ili aviditet za hemokin, ili za jedan ili više drugih antigena. Na osnovu obelodanjivanja ovde, kvalifikovana osoba će moći da odredi optimalne linkere za upotrebu u određenom konstruktu pronalaska, kao što je polipeptid pronalaska, opciono nakon nekih ograničenih rutinskih eksperimenata.

[0245] Na primer, u multivalentnim polipeptidima pronalaska koji se sastoje od gradivnih blokova, ISVD ili nanotela usmerenih protiv ADAMTS5 i druge mete, dužina i fleksibilnost linkera su poželjno takvi da omogućavaju svakom gradivnom bloku, kao što je ISVD, pronalaska prisutnog u polipeptidu da se veže za svoj srodnu metu, npr. antigensku determinantu na svakoj od meta. Opet, na osnovu obelodanjivanja ovde, kvalifikovana osoba će moći da odredi optimalne linkere za upotrebu u određenom konstruktu pronalaska, kao što je polipeptid pronalaska, opciono nakon nekih ograničenih rutinskih eksperimenata.

[0246] Takođe je u okviru pronalaska da linkeri koji se koriste daju jednu ili više drugih povoljnih svojstava ili funkcionalnosti konstruktima pronalaska, kao što su polipeptidi pronalaska, i/ili obezbeđuju jednu ili više lokacija za formiranje derivata i/ili za vezivanje funkcionalnih grupa (npr. kao što je ovde opisano za derivate ISVD pronalaska). Na primer, linkeri koji sadrže jedan ili više naelektrisanih aminokiselinskih ostataka mogu da obezbede poboljšana hidrofilna svojstva, dok se linkeri koji formiraju ili sadrže male epitope ili oznake mogu koristiti u svrhu detekcije, identifikacije i/ili prečišćavanja. Opet, na osnovu obelodanjivanja ovde, kvalifikovana osoba će moći da odredi optimalne linkere za upotrebu u određenom polipeptidu pronalaska, opciono nakon nekih ograničenih rutinskih eksperimenata.

[0247] Konačno, kada se u konstruktima koriste dva ili više linkera kao što su polipeptidi pronalaska, ovi linkeri mogu biti isti ili različiti. Opet, na osnovu obelodanjivanja ovde, kvalifikovana osoba će moći da odredi optimalne linkere za upotrebu u određenom konstruktu ili polipeptidu pronalaska, opciono nakon nekih ograničenih rutinskih eksperimenata.

[0248] Obično, radi lakšeg izražavanja i proizvodnje, konstrukt pronalaska, kao što je polipeptid pronalaska, biće linearni polipeptid. Međutim, pronalazak u najširem smislu nije ograničen na njega. Na primer, kada se konstrukt pronalaska, kao što je polipeptid pronalaska, sastoji od tri ili više gradivnih blokova, ISVD ili nanotela, moguće ih je povezati pomoću poveznice sa tri ili više „krakova“, od kojih je svaki „krak“ povezan sa gradivnim blokom, ISVD ili nanotelom, kako bi se obezbedio konstrukt „u obliku zvezde“. Takođe je moguće, iako obično manje poželjno, koristiti kružne konstrukte.

[0249] Shodno tome, ovaj pronalazak se odnosi na konstrukt pronalaska, kao što je polipeptid pronalaska, pri čemu su navedeni ISVD direktno povezani jedni sa drugima ili su povezani preko linkera.

[0250] Shodno tome, ovaj pronalazak se odnosi na konstrukt pronalaska, kao što je polipeptid pronalaska, pri čemu su prvi ISVD i/ili drugi ISVD i/ili eventualno ISVD koji vezuje serumski albumin, povezani preko linkera.

[0251] Shodno tome, ovaj pronalazak se odnosi na konstrukt pronalaska, kao što je polipeptid pronalaska, pri čemu se navedeni linker bira iz grupe koja se sastoji od linkera 3A, 5GS, 7GS, 9GS, 10GS, 15GS, 18GS, 20GS, 25GS, 30GS, 35GS, poli-A, 8GS, 40GS, G1 zgloba, 9GS-G1 zgloba, gornja duga zglobna regija lame i G3 zgloba, kao što je npr. prikazano u tabeli C (SEQ ID NO: 158-174).

[0252] Obelodanjivanje se dalje odnosi na metode za pripremu konstrukata, polipeptida, ISVD, nukleinskih kiselina, ćelija domaćina i kompozicija opisanih u ovom dokumentu.

[0253] Multivalentni polipeptidi pronalaska se generalno mogu pripremiti metodom koja obuhvata najmanje korak odgovarajućeg povezivanja ISVD i/ili monovalentnog polipeptida pronalaska sa jednim ili više daljih ISVD, opciono preko jednog ili više odgovarajućih linkera, kako bi se obezbedio multivalentni polipeptid pronalaska. Polipeptidi pronalaska se takođe mogu pripremiti metodom koja generalno obuhvata barem korake obezbeđivanja nukleinske kiseline koja kodira polipeptid pronalaska, izražavajući navedenu nukleinsku kiselinu na odgovarajući način i oporavljajući izraženi polipeptid pronalaska. Takve metode se mogu izvoditi na način koji je sam po sebi poznat, što će biti jasno kvalifikovanom licu, na primer na osnovu metoda i tehnika koje su ovde dalje opisane.

[0254] Metoda za pripremu multivalentnih polipeptida pronalaska može obuhvatiti najmanje korake povezivanja dva ili više ISVD pronalaska i, na primer, jednog ili više linkera zajedno na odgovarajući način. ISVD pronalaska (i linkeri) mogu se spojiti bilo kojom metodom poznatom u struci i kao što je ovde dalje opisano. Poželjne tehnike uključuju povezivanje sekvenci nukleinskih kiselina koje kodiraju ISVD pronalaska (i linkera) za pripremu genetskog konstrukta koji izražava multivalentni polipeptid. Tehnike za povezivanje aminokiselina ili nukleinskih kiselina biće jasne kvalifikovanoj osobi, a ponovo se upućuje na standardne priručnike, kao što su Sambrook et al. and Ausubel et al., pomenuti gore, kao i na primere u nastavku.

[0255] Shodno tome, ovaj pronalazak se takođe odnosi na upotrebu ISVD pronalaska u pripremi multivalentnog polipeptida pronalaska. Metoda za pripremu multivalentnog polipeptida će obuhvatiti povezivanje ISVD pronalaska sa najmanje jednim daljim ISVD pronalaska, opciono preko jednog ili više linkera. ISVD pronalaska se zatim koristi kao vezujući domen ili gradivni blok u obezbeđivanju i/ili pripremi multivalentnog polipeptida koji se sastoji od 2 (npr. u bivalentnom polipeptidu), 3 (npr. u trovalentnom polipeptidu), 4 (npr. u tetravalentnom) ili više (npr. u multivalentnom polipeptidu) gradivnih blokova. U tom smislu, ISVD pronalaska može se koristiti kao obavezujući domen ili jedinica vezivanja u obezbeđivanju i/ili pripremi multivalentnog, kao što je dvovalentni, trovalentni ili tetravalentni polipeptid pronalaska koji se sastoji od 2, 3, 4 ili više gradivnih blokova.

[0256] Shodno tome, ovaj pronalazak se takođe odnosi na upotrebu ISVD polipeptida pronalaska (kao što je ovde opisano) u pripremi multivalentnog polipeptida. Metoda za pripremu multivalentnog polipeptida će obuhvatiti povezivanje ISVD pronalaska sa najmanje jednim daljim ISVD pronalaska, opciono preko jednog ili više linkera.

[0257] Polipeptidi pronalaska i nukleinske kiseline koje kodiraju navedene polipeptide pronalaska mogu se pripremiti na način poznat sam po sebi, što će biti jasno kvalifikovanoj osobi iz daljeg opisa u ovom dokumentu. Na primer, polipeptidi pronalaska mogu se pripremiti na bilo koji način koji je sam po sebi poznat za pripremu antitela, a posebno za pripremu fragmenata antitela (uključujući, ali ne ograničavajući se na (jednodomna) antitela i ScFv fragmente). Neke poželjne, ali neograničavajuće metode za pripremu polipeptida i nukleinskih kiselina uključuju ovde opisane metode i tehnike.

[0258] Metoda za proizvodnju polipeptida pronalaska može se sastojati od sledećih koraka: ekspresije, u odgovarajućoj ćeliji domaćinu ili organizmu domaćinu (koja se ovde takođe naziva „domaćinom pronalaska“) ili u drugom odgovarajućem sistemu ekspresije nukleinske kiseline koja kodira navedeni polipeptid pronalaska (koji se ovde takođe naziva „nukleinska kiselina pronalaska“); nakon čega opciono sledi izolacija i/ili prečišćavanje polipeptida tako dobijenog pronalaska.

[0259] Konkretno, takav metod može da obuhvata korake: kultivacije i/ili održavanja domaćina pronalaska pod uslovima koji su takvi da navedeni domaćin pronalaska izražava i/ili proizvodi najmanje jedan polipeptid pronalaska; opciono nakon čega sledi izolacija i/ili prečišćavanje polipeptida tako dobijenog pronalaska.

1

[0260] Shodno tome, ovo obelodanjivanje se takođe odnosi na sekvencu nukleinske kiseline ili nukleotida koja kodira polipeptid, ISVD ili konstrukt pronalaska (takođe se naziva „nukleinska kiselina pronalaska“).

[0261] Nukleinska kiselina obelodanjivanja može biti u obliku jednolančane ili dvolančane DNK ili RNK. Prema jednom otelotvorenju pronalaska, nukleinska kiselina obelodanjivanja je u suštini izolovanom obliku, kako je ovde definisano. Nukleinska kiselina obelodanjivanja takođe može biti u obliku, biti prisutna i/ili biti deo vektora, npr. ekspresijskog vektora, kao što je na primer plazmid, kosmid ili YAC, koji opet može biti u suštinski izolovanom obliku. Shodno tome, ovo obelodanjivanje se takođe odnosi na ekspresijski vektor koji se sastoji od sekvence nukleinske kiseline ili nukleotida pronalaska.

[0262] Nukleinske kiseline obelodanjivanja mogu se pripremiti ili dobiti na način poznat sam po sebi, na osnovu informacija o polipeptidima ovde datog pronalaska, i/ili se mogu izolovati iz odgovarajućeg prirodnog izvora. Takođe, kao što će biti jasno kvalifikovanoj osobi, za pripremu nukleinske kiseline obelodanjivanja, takođe se nekoliko nukleotidnih sekvenci, kao što su najmanje dve nukleinske kiseline koje kodiraju ISVD pronalaska i na primer nukleinske kiseline koje kodiraju jedan ili više linkera, mogu povezati na odgovarajući način. Tehnike za generisanje nukleinskih kiselina obelodanjivanja biće jasne kvalifikovanoj osobi i mogu, između ostalog, uključivati automatizovanu sintezu DNK; mutagenezu usmerenu na lokaciju; kombinovanje dve ili više prirodnih i/ili sintetičkih sekvenci (ili dva ili više njihovih delova), uvođenje mutacija koje dovode do ekspresije skraćenog produkta ekspresije; uvođenje jednog ili više mesta ograničenja (npr. za kreiranje kaseta i/ili regiona koji se lako mogu digestirati i/ili ligirati korišćenjem odgovarajućih restrikcionih enzima) i/ili uvođenje mutacija pomoću PCR reakcije korišćenjem jednog ili više „neusklađenih“ prajmera. Ove i druge tehnike će biti jasne kvalifikovanoj osobi, a ponovo se upućuje na standardne priručnike, kao što su Sambrook et al. i Ausubel et al., gore pomenuti, kao i na primere u nastavku.

[0263] U poželjnom, ali neograničavajućem otelotvorenju, genetski konstrukt obelodanjivanja obuhvata

a) najmanje jednu nukleinsku kiselinu pronalaska;

2

b) operativno povezanu sa jednim ili više regulatornih elemenata, kao što su promoter i opciono odgovarajući terminator; i opciono takođe

c) jedan ili više daljih elemenata genetskih konstrukata poznatih samih po sebi;

u kojoj termini „regulatorni element“, „promoter“, „terminator“ i „operativno povezan“ imaju svoje uobičajeno značenje u struci.

[0264] Genetski konstrukti obelodanjivanja se generalno mogu obezbediti odgovarajućim povezivanjem nukleotidnih sekvenci obelodanjivanja sa jednim ili više gore opisanih elemenata, na primer korišćenjem tehnika opisanih u opštim priručnicima kao što su Sambrook et al. i Ausubel et al., pomenuti gore.

[0265] Nukleinske kiseline obelodanjivanja i/ili genetski konstrukti obelodanjivanja mogu se koristiti za transformaciju ćelije domaćina ili organizma domaćina, tj. za ekspresiju i/ili proizvodnju polipeptida pronalaska. Odgovarajući domaćini ili ćelije domaćina će biti jasni kvalifikovanoj osobi, i mogu, na primer, biti bilo koja pogodna gljivična, prokariotska ili eukariotska ćelija ili ćelijska linija ili bilo koji pogodan gljivični, prokariotski ili (nehumani) eukariotski organizam, kao i sve druge ćelije domaćina ili (nehumani) domaćini poznati sami po sebi po ekspresiji i proizvodnji antitela i fragmenata antitela (uključujući, ali ne ograničavajući se na (pojedinačna) antitela domena i ScFv fragmente), što će biti jasno kvalifikovanoj osobi. Upućuje se i na opštu pozadinsku literaturu koja je ovde navedena, kao i na primer WO 94/29457; WO 96/34103; WO 99/42077; Frenken et al. (Res Immunol. 149: 589-99, 1998); Riechmann and Muyldermans (1999), supra; van der Linden (J. Biotechnol.

80: 261-70, 2000); Joosten et al. (Microb. Cell Fact.2: 1, 2003); Joosten et al. (Appl.

Microbiol. Biotechnol.66: 384-92, 2005); i dalje reference navedene u ovom dokumentu. Štaviše, polipeptidi pronalaska takođe mogu biti izraženi i/ili proizvedeni u sistemima ekspresije bez ćelija, a odgovarajući primeri takvih sistema biće jasni kvalifikovanoj osobi. Odgovarajuće tehnike za transformaciju domaćina ili ćelije domaćina pronalaska biće jasne kvalifikovanoj osobi i mogu zavisiti od predviđene ćelije domaćina/organizma domaćina i genetskog konstrukta koji će se koristiti. Ponovo se upućuje na gore pomenute priručnike i patentne prijave. Transformisana ćelija domaćina (koja može biti u obliku ili stabilnoj ćelijskoj liniji) ili organizmi domaćini (koji mogu biti u obliku stabilne mutantne linije ili soja) formiraju dalje aspekte ovog obelodanjivanja. Shodno tome, ovo obelodanjivanje se odnosi na domaćina ili ćeliju domaćina koja se sastoji od nukleinske kiseline prema obelodanjivanju, ili vektora ekspresije prema obelodanjivanju. Poželjno, ove ćelije domaćina ili organizmi domaćini su takvi da izražavaju, ili su (barem) sposobni da izražavaju (npr. pod odgovarajućim uslovima), polipeptid pronalaska (a u slučaju organizma domaćina: u najmanje jednoj ćeliji, njenom delu, tkivu ili organu). Obelodanjivanje takođe uključuje dalje generacije, potomstvo i/ili izdanak ćelije domaćina ili organizma domaćina pronalaska, koji se na primer mogu dobiti ćelijskom deobom ili seksualnom ili aseksualnom reprodukcijom.

[0266] Da bi se proizvela/dobila ekspresija polipeptida pronalaska, transformisana ćelija domaćina ili transformisani organizam domaćin može se generalno zadržati, održavati i/ili kultivisati pod uslovima tako da se (željeni) polipeptid pronalaska izrazi/proizvede. Pogodni uslovi će biti jasni kvalifikovanoj osobi i obično će zavisiti od korišćene ćelije domaćina/organizma domaćina, kao i od regulatornih elemenata koji kontrolišu ekspresiju (relevantne) nukleotidne sekvence pronalaska. Ponovo se upućuje na priručnike i patentne prijave pomenute gore u stavovima o genetskim konstruktima pronalaska.

[0267] Polipeptid pronalaska se zatim može izolovati iz ćelije domaćina/organizma domaćina i/ili iz medija u kojem je navedena ćelija domaćina ili organizam domaćina kultivisan, koristeći tehnike izolacije i/ili prečišćavanja proteina poznate same po sebi, kao što su (preparativna) hromatografija i/ili tehnike elektroforeze, tehnike diferencijalne precipitacije, tehnike afiniteta (npr. korišćenjem specifične, cepljive sekvence aminokiselina spojene sa polipeptidom pronalaska) i/ili preparativne imunološke tehnike (tj. korišćenjem antitela protiv polipeptida koji treba izolovati).

[0268] U jednom aspektu, obelodanjivanje se odnosi na metodu za proizvodnju konstrukta, polipeptida ili ISVD prema pronalasku koja obuhvata najmanje korake: (a) ekspresije, u odgovarajućoj ćeliji domaćinu ili organizmu domaćinu ili u drugom odgovarajućem sistemu ekspresije, sekvence nukleinske kiseline prema obelodanjivanju; nakon čega opciono sledi (b) izolacija i/ili prečišćavanje konstrukta, polipeptida ili ISVD prema pronalasku.

[0269] U jednom aspektu, pronalazak se odnosi na kompoziciju koja se sastoji od polipeptida u skladu sa pronalaskom.

4

[0270] Kao što je pomenuto iznad, i dalje postoji potreba za bezbednim i efikasnim lekovima za OA. Na osnovu nekonvencionalnih skrininga, karakterizacije i kombinatornih strategija, sadašnji pronalazači su identifikovali ISVD koji vezuju i inhibiraju ADAMTSS. Ova ADAMTS5 veziva su izuzetno dobro izvedena u in vitro i in vivo eksperimentima. Štaviše, ISVD pronalaska su takođe pokazali da su značajno efikasniji od jedinjenja u prethodnom stanju tehnike. Ovaj pronalazak stoga pruža ISVD i polipeptide koji antagoniziraju ADAMTS, posebno ADAMTSS, sa poboljšanim profilaktičkim, terapijskim i/ili farmakološkim svojstvima, uključujući sigurniji profil, u poređenju sa aminokiselinskim sekvencama i antitelima u prethodnom stanju tehnike. Pored toga, ova ADAMTS5 veziva kada su povezana sa ISVD koji vezuje albumin, imala su povećanu retenciju kod subjekata, mogla su se primenjivati sistematski uz retenciju aktivnosti.

[0271] U jednom aspektu, ovo obelodanjivanje se odnosi na metod lečenja ili prevencije bolesti ili poremećaja kod pojedinca, na primer u koji je uključena aktivnost ADAMTS5, metod koji obuhvata primenu ISVD ili polipeptida u skladu sa pronalaskom na navedenom pojedincu u količini efikasnoj za lečenje ili sprečavanje simptoma navedene bolesti ili poremećaja.

[0272] U jednom aspektu, ovaj pronalazak se odnosi na polipeptid prema pronalasku za upotrebu kao lek.

[0273] U drugom aspektu, obelodanjivanje se odnosi na upotrebu ISVD, polipeptida i/ili konstrukta pronalaska u pripremi farmaceutske kompozicije za prevenciju i/ili lečenje najmanje bolesti povezane sa ADAMTS5; i/ili za upotrebu u jednoj ili više metoda lečenja navedenih u ovom dokumentu.

[0274] Obelodanjivanje se takođe odnosi na upotrebu ISVD, polipeptida i/ili konstrukta pronalaska u pripremi farmaceutske kompozicije za prevenciju i/ili lečenje najmanje jedne bolesti ili poremećaja koji se mogu sprečiti i/ili lečiti modulacijom aktivnosti ADAMTS, po mogućnosti ADAMTS5, npr. inhibicijom degradacije agrekana.

[0275] Obelodanjivanje se takođe odnosi na upotrebu ISVD, polipeptida, jedinjenja i/ili konstrukta pronalaska u pripremi farmaceutske kompozicije za prevenciju i/ili lečenje najmanje jedne bolesti, poremećaja ili stanja koje se može sprečiti i/ili lečiti primenom ISVD, polipeptida, jedinjenja i/ili konstrukta pronalaska na pacijentu.

[0276] Pronalazak se dalje odnosi na ISVD, polipeptid, jedinjenje i/ili konstrukt pronalaska ili farmaceutsku kompoziciju koja se sastoji od istog za upotrebu u prevenciji i/ili lečenju najmanje jedne bolesti povezane sa ADAMTS5.

[0277] Predviđa se da se ADAMTS5 veziva pronalaska mogu koristiti kod različitih bolesti koje utiču na hrskavicu, kao što su artropatije i hondrodistrofije, artritične bolesti, kao što su osteoartritis, reumatoidni artritis, gihtni artritis, psorijatični artritis, traumatska ruptura ili odvajanje, ahondroplazija, kostohondritis, spondiloepimetafizalna displazija, hernija kičmenog diska, bolest degeneracije lumbalnog diska, degenerativna bolest zglobova i relapsirajući polihondritis, osteohondritis disekans i agrekanopatije i bezalkoholni steatohepatitis (NASH) (ovde obično naznačeno kao „bolesti povezane sa ADAMTS5“).

[0278] U jednom aspektu, ovaj pronalazak se odnosi na polipeptid prema pronalasku za primenu u lečenju ili sprečavanju simptoma bolesti povezane sa ADAMTS5 izabranog iz grupe koja se sastoji od artropatija, hondrodistrofija, artritičnih bolesti, osteoartritisa, reumatoidnog artritisa, gihtnog artritisa, psorijatičnog artritisa, traumatske rupture ili odvajanja, ahondroplazije, kostohondritisa, spondiloepimetfizalne displazije, hernije diskusa kičme, degeneracije lumbalnog diska, degenerativne bolesti zglobova, relapsirajućeg polihondritisa, osteohondritisa disekansa i agrekanopatija.

[0279] U jednom aspektu, ovo obelodanjivanje se odnosi na metodu za sprečavanje ili lečenje artropatija i hondrodistrofija, artritičnih bolesti, kao što su osteoartritis, reumatoidni artritis, gihtni artritis, psorijatični artritis, traumatska ruptura ili odvajanje, ahondroplazija, kostohondritis, spondiloepimetfizalna displazija, hernija kičmenog diska, bolest degeneracije lumbalnog diska, degenerativna bolest zglobova i relapsirajući polihondritis i NASH, pri čemu se navedena metoda sastoji od primene, kod subjekta kome je to potrebno, farmaceutski aktivne količine najmanje kompozicije, imunoglobulina, polipeptida ili konstrukta u skladu sa pronalaskom osobi kojoj je to potrebno.

[0280] U jednom aspektu, ovo obelodanjivanje se odnosi na upotrebu ISVD, polipeptida, kompozicija ili konstrukta u skladu sa pronalaskom, u pripremi farmaceutske kompozicije za lečenje ili prevenciju kao što su artropatije i hondrodistrofije, artritične bolesti, kao što su osteoartritis, reumatoidni artritis, gihtni artritis, psorijatični artritis, traumatska ruptura ili odvajanje, ahondroplazija, kostohondritis, spondiloepimetfizalna displazija, hernija kičmenog diska, bolest degeneracije lumbalnog diska, degenerativna bolest zglobova i relapsirajući polihondritis, osteohondritis disekans i agrekanopatije i NASH.

[0281] Takođe se očekuje da vezivanjem za agrekan, konstrukti i/ili polipeptidi pronalaska mogu smanjiti ili inhibirati aktivnost člana porodice serinskih proteaza, katepsina, matričnih metaloproteinaza (MMP), kao što su npr. MMP20, ali i ADAMTS4 (agrekanaza-1) i/ili ADAMTS11 u degradiranju agrekana.

[0282] U kontekstu ovog pronalaska, termin „prevencija i/ili lečenje“ ne sastoji se samo od sprečavanja i/ili lečenja bolesti, već se generalno sastoji i od sprečavanja nastanka bolesti, usporavanja ili reverzije napretka bolesti, sprečavanja ili usporavanja nastanka jednog ili više simptoma povezanih sa bolešću, smanjenja i/ili ublažavanja jednog ili više simptoma povezanih sa bolešću, smanjenja težine i/ili trajanja bolesti i/ili bilo kojih simptoma povezanih sa njom i/ili sprečavanja daljeg povećanja težine bolesti i/ili bilo kojih simptoma povezanih sa njom, sprečavanja, smanjenja ili preokretanja bilo kakvog fiziološkog oštećenja izazvanog bolešću, i generalno bilo kog farmakološkog delovanja koje je korisno za pacijenta koji se leči.

[0283] Režim doziranja će odrediti lekar i klinički faktori. Kao što je dobro poznato u medicinskoj struci, doziranje za svakog pacijenta zavisi od mnogih faktora, uključujući veličinu pacijenta, težinu, površinu tela, starost, određeno jedinjenje koje će se primenjivati, aktivnost korišćenog polipeptida (uključujući antitela), vreme i put primene, opšte zdravlje i kombinaciju sa drugim terapijama ili tretmanima. Proteinska farmaceutski aktivna materija može biti prisutna u količinama između 1 g i 100 mg/kg telesne težine po dozi; međutim, predviđene su i doze ispod ili iznad ovog primera opsega. Ako je režim kontinuirana infuzija, može biti u rasponu od 1 pg do 100 mg po kilogramu telesne težine u minuti.

[0284] ISVD, polipeptid ili konstrukt pronalaska mogu se primeniti u koncentraciji od, npr.

0,01, 0,1, 0,5, 1, 2, 5, 10, 20 ili 50 pg/ml kako bi se inhibirala i/ili neutralisala biološka funkcija ADAMTSS za najmanje oko 50%, poželjno 75%, poželjnije 90%, 95% ili do 99%, a najpoželjnije približno 100% (u suštini u potpunosti) kako je ispitano metodama dobro poznatim u struci.

[0285] Generalno, režim lečenja će se sastojati od primene jednog ili više ISVD, polipeptida i/ili konstrukata pronalaska, ili jedne ili više kompozicija koje sadrže iste, u jednoj ili više farmaceutski efikasnih količina ili doza. Specifične količine ili doze koje treba primeniti može odrediti kliničar, ponovo na osnovu gorenavedenih faktora. Korisne doze konstrukata, polipeptida i/ili ISVD pronalaska mogu se odrediti poređenjem njihove in vitro aktivnosti i in vivo aktivnosti u životinjskim modelima. Metode za ekstrapolaciju efikasnih doza kod miševa i drugih životinja na ljude poznate su struci; na primer, videti US 4,938,949.

[0286] Generalno, u zavisnosti od specifične bolesti, poremećaja ili stanja koje treba lečiti, jačine specifičnog ISVD, polipeptida i/ili konstrukta pronalaska koji će se koristiti, specifičnog puta primene i specifične farmaceutske formulacije ili kompozicije koja se koristi, kliničar će moći da odredi odgovarajući režim doziranja.

[0287] Količina konstrukata, polipeptida i/ili ISVD pronalaska potrebnih za upotrebu u lečenju variraće ne samo sa određenim imunoglobulinom, polipeptidom, jedinjenjem i/ili izabranim konstruktom, već i sa načinom primene, prirodom stanja koje se leči i uzrastom i stanjem pacijenta i na kraju će biti po nahođenju lekara ili kliničara. Takođe, doza konstrukata, polipeptida i/ili ISVD pronalaska varira u zavisnosti od ciljne ćelije, tumora, tkiva, grafta ili organa.

[0288] Željena doza se može prikladno predstaviti u jednoj dozi ili podeljenim dozama koje se primenjuju u odgovarajućim intervalima, na primer, kao dve, tri, četiri ili više poddoza dnevno. Sama poddoza se može dalje podeliti, npr. na niz diskretnih primena koje nisu vremenski strogo definisane.

[0289] Režim primene može uključivati dugoročno, dnevno lečenje. Pod „dugoročnim“ se podrazumeva najmanje dve nedelje, a po mogućnosti i nekoliko nedelja, meseci ili godina trajanja. Neophodne modifikacije u ovom opsegu doziranja mogu se odrediti od strane stručnjaka koristeći samo rutinsko eksperimentisanje s obzirom na ovde navedena učenja. Videti Remington's Pharmaceutical Sciences (Martin, E.W., ed.4), Mack Publishing Co., Easton, PA. Dozu takođe može prilagoditi pojedinačni lekar u slučaju bilo kakvih komplikacija.

[0290] Obično, u gorenavedenoj metodi, koristiće se ISVD, polipeptid i/ili konstrukt pronalaska. Međutim, u okviru pronalaska je upotreba dva ili više ISVD, polipeptida i/ili konstrukata pronalaska u kombinaciji.

[0291] ISVD, polipeptidi i/ili konstrukti pronalaska mogu se koristiti u kombinaciji sa jednim ili više daljih farmaceutski aktivnih jedinjenja ili principa, tj. kao kombinovani režim lečenja, koji mogu ili ne moraju dovesti do sinergijskog efekta.

[0292] Farmaceutska kompozicija takođe može da sadrži najmanje jedan dodatno aktivan agens, npr. jedno ili više dodatnih antitela ili njihovih fragmenata koji vezuju antigen, peptide, proteine, nukleinske kiseline, organske i neorganske molekule.

[0293] Opet, kliničar će moći da izabere takva dodatna jedinjenja ili principe, kao i odgovarajući kombinovani režim lečenja, na osnovu gorenavedenih faktora i njegove stručne procene.

[0294] Konkretno, ISVD, polipeptidi i/ili konstrukti pronalaska mogu se koristiti u kombinaciji sa drugim farmaceutski aktivnim jedinjenjima ili principima koji se koriste ili se mogu koristiti za prevenciju i/ili lečenje bolesti, poremećaja i stanja navedenih u ovom dokumentu, zbog čega se može ili ne mora postići sinergijski efekat. Primeri takvih jedinjenja i principa, kao i putevi, metode i farmaceutske formulacije ili kompozicije za njihovu primenu biće jasni kliničaru.

[0295] Kada se dve ili više supstanci ili principa koriste kao deo kombinovanog režima lečenja, mogu se primenjivati istim putem primene ili različitim putevima primene, u suštini u isto vreme ili u različito vreme (npr. u suštini istovremeno, uzastopno ili u skladu sa naizmeničnim režimom). Kada se supstance ili principi primenjuju istovremeno istim putem primene, mogu se primenjivati kao različite farmaceutske formulacije ili kompozicije ili kao deo kombinovane farmaceutske formulacije ili kompozicije, što će biti jasno kvalifikovanoj osobi.

[0296] Takođe, kada se dve ili više aktivnih supstanci ili principa koriste kao deo kombinovanog režima lečenja, svaka od supstanci ili principa može se primeniti u istoj količini i prema istom režimu koji se koristi kada se jedinjenje ili princip koristi samostalno, a takva kombinovana upotreba može ili ne mora dovesti do sinergijskog efekta. Međutim, kada kombinovana upotreba dve ili više aktivnih supstanci ili principa dovede do sinergijskog efekta, takođe može biti moguće smanjiti količinu jedne, više ili svih supstanci ili principa koji se primenjuju, uz istovremeno postizanje željenog terapijskog delovanja. Ovo može, na primer, biti korisno za izbegavanje, ograničavanje ili smanjenje neželjenih efekata koji su povezani sa upotrebom jedne ili više supstanci ili principa kada se koriste u uobičajenim količinama, dok se i dalje postiže željeni farmaceutski ili terapijski efekat.

[0297] Efikasnost režima lečenja koji se koristi u skladu sa obelodanjivanjem može se odrediti i/ili pratiti na bilo koji način koji je sam po sebi poznat za uključenu bolest, poremećaj ili stanje, što će biti jasno kliničaru. Kliničar će takođe moći, po potrebi i od slučaja do slučaja, da promeni ili modifikuje određeni režim lečenja, kako bi postigao željeni terapijski efekat, izbegao, ograničio ili smanjio neželjene efekte i/ili postigao odgovarajuću ravnotežu između postizanja željenog terapijskog efekta s jedne strane i izbegavanja, ograničavanja ili smanjenja neželjenih efekata s druge strane.

[0298] Generalno, režim lečenja će se pratiti dok se ne postigne željeni terapijski efekat i/ili sve dok se održava željeni terapijski efekat. Opet, ovo može odrediti kliničar.

[0299] Dakle, u daljem aspektu, pronalazak se odnosi na farmaceutski kompoziciju koja sadrži najmanje jedan polipeptid pronalaska i najmanje jedan odgovarajući nosač, razblaživač ili ekscipijens (tj. pogodnu za farmaceutsku upotrebu) i opciono jednu ili više dodatnih aktivnih supstanci. U određenom aspektu, pronalazak se odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja se sastoji od konstrukta, polipeptida, ISVD ili nukleinske kiseline u skladu sa pronalaskom, poželjno najmanje jedan od SEQ ID NO: OOO i najmanje jednog pogodnog nosača, razblaživača ili ekscipijensa (tj. pogodne za farmaceutsku upotrebu), i opciono jedne ili više dodatnih aktivnih supstanci.

[0300] Subjekat koji treba tretirati može biti bilo koja toplokrvna životinja, ali naročito sisar, a naročito čovek. U veterinarskoj primeni, subjekt koji se tretira uključuje svaku životinju koja se uzgaja u komercijalne svrhe ili drži kao kućni ljubimac. Kao što će biti jasno kvalifikovanom licu, subjekt koji će biti tretiran će posebno biti osoba koja boluje od, ili je u riziku od, bolesti, poremećaja i stanja navedenih u ovom dokumentu. Stoga, u poželjnom otelotvorenju pronalaska, farmaceutske kompozicije koje se sastoje od polipeptida pronalaska su za upotrebu u medicini ili dijagnostici. Poželjno je da se farmaceutske kompozicije koriste u humanoj medicini, ali se mogu koristiti i u veterinarske svrhe.

[0301] Ponovo, u takvoj farmaceutskoj kompoziciji, jedan ili više imunoglobulina, polipeptida, jedinjenja i/ili konstrukata i pronalaska, ili nukleotid koji kodira isti, i/ili farmaceutska kompozicija koja se sastoji od istog, takođe se mogu na odgovarajući način kombinovati sa jednim ili više drugih aktivnih principa, kao što su oni navedeni u ovom dokumentu.

[0302] Pronalazak se takođe odnosi na kompoziciju (kao što je, bez ograničenja, farmaceutska kompozicija ili preparat kako je ovde dalje opisano) za upotrebu, bilo in vitro (npr. u in vitro ili ćelijskom testu) ili in vivo (npr. u jednoj ćeliji ili višećelijskom organizmu, a posebno kod sisara, a posebno kod ljudskog bića, kao što je ljudsko biće koje je u riziku od ili pati od bolesti, poremećaja ili stanja pronalaska).

[0303] Podrazumeva se da pozivanje na lečenje uključuje i lečenje utvrđenih simptoma i profilaktičko lečenje, osim ako nije izričito navedeno drugačije.

[0304] Generalno, za farmaceutsku upotrebu, konstrukti, polipeptidi i/ili ISVD pronalaska mogu se formulisati kao farmaceutski preparat ili kompozicija koji se sastoji od najmanje jednog konstrukta, polipeptida i/ili ISVD pronalaska i najmanje jednog farmaceutski prihvatljivog nosača, razblaživača ili ekscipijensa i/ili adjuvansa, i opciono jednog ili više farmaceutski aktivnih polipeptida i/ili jedinjenja. Pomoću neograničavajućih primera, takva formulacija može biti u obliku pogodnom za oralnu primenu, za parenteralnu primenu (kao

1

što je intravenska, intramuskularna ili supkutana injekcija ili intravenska infuzija), za topikalnu primenu, za primenu inhalacijom, flasterom za kožu, implantatom, čepićem itd., pri čemu je poželjna parenteralna primena. Takvi odgovarajući oblici primene - koji mogu biti čvrsti, polučvrsti ili tečni, u zavisnosti od načina primene - kao i metode i nosači za upotrebu u njihovoj pripremi, biće jasni kvalifikovanoj osobi i dalje su opisani u ovom dokumentu. Takva farmaceutska preparacija ili kompozicija će se ovde generalno nazivati „farmaceutskom kompozicijom“.

[0305] Kao primeri ekscipijenasa mogu se pomenuti dezintegratori, veziva, punila i maziva. Primeri dezintegratora uključuju agar-agar, algine, kalcijum karbonat, celulozu, koloidni silicijum dioksid, gume, magnezijum aluminijum silikat, metilcelulozu i skrob. Primeri veziva uključuju mikrokristalnu celulozu, hidroksimetil celulozu, hidroksipropilcelulozu i polivinilpirolidon. Primeri punila uključuju kalcijum karbonat, kalcijum fosfat, tribazni kalcijum sulfat, kalcijum karboksimetilcelulozu, celulozu, dekstrin, dekstrozu, fruktozu, laktitol, laktozu, magnezijum karbonat, magnezijum oksid, maltitol, maltodekstrine, maltozu, sorbitol, skrob, saharozu, šećer i ksilitol. Primeri maziva uključuju agar, etil oleat, etil laureat, glicerin, gliceril palmitostearat, hidrogenizovano biljno ulje, magnezijum oksid, stearate, manitol, poloksamer, glikole, natrijum benzoat, natrijum lauril sulfat, natrijum stearil, sorbitol i talk. Uobičajeni stabilizatori, konzervansi, agensi za vlaženje i emulgatori, agensi za poboljšanje konzistencije, agensi za poboljšanje ukusa, soli za variranje osmotskog pritiska, puferske supstance, rastvarači, razblaživači, emolijensi, sredstva za bojenje i maskiranje i antioksidansi se uzimaju u obzir kao farmaceutski adjuvansi.

[0306] Pogodni nosači uključuju, ali nisu ograničeni na magnezijum karbonat, magnezijum stearat, talk, šećer, laktozu, pektin, dekstrin, skrob, želatin, tragakant, metilcelulozu, natrijum karboksimetilcelulozu, vosak sa niskom tačkom topljenja, kakao puter, vodu, alkohole, poliole, glicerol, biljna ulja i slično.

[0307] Generalno, konstrukti, polipeptidi i/ili ISVD pronalaska mogu se formulisati i primeniti na bilo koji pogodan način poznat sam po sebi. Na primer, upućuje se na gore citiranu opštu pozadinsku literaturu (a posebno na WO 04/041862, WO 04/041863, WO 04/041865, WO 04/041867 i WO 08/020079), kao i na standardne priručnike, kao što je Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing Company, USA (1990), Remington, the Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, Lippincott Williams and

2

Wilkins (2005); ili Handbook of Therapeutic Antibodies (S. Dubel, Ed.), Wiley, Weinheim, 2007 (see for example pages 252-255).

[0308] U određenom aspektu, pronalazak se odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja obuhvata polipeptid u skladu sa pronalaskom, i koji dalje obuhvata najmanje jedan farmaceutski prihvatljiv nosač, razblaživač ili ekscipijens i/ili adjuvans, i opciono obuhvata jedan ili više dalje farmaceutski aktivnih polipeptida i/ili jedinjenja.

[0309] Konstrukti, polipeptidi i/ili ISVD pronalaska mogu se formulisati i primenjivati na bilo koji način poznat po sebi za konvencionalna antitela i fragmente antitela (uključujući ScFv i dijabetička tela) i druge farmaceutski aktivne proteine. Takve formulacije i metode za pripremu istih biće jasne kvalifikovanoj osobi, i na primer uključuju preparate poželjne za parenteralnu primenu (npr. intravensku, intraperitonealnu, subkutanu, intramuskularnu, intraluminalnu, intraarterijsku, intratekalnu intranazalnu ili intrabronhijalnu primenu), ali i za lokalnu (tj. transdermalnu ili intradermalnu) primenu.

[0310] Preparati za parenteralnu primenu mogu na primer biti sterilni rastvori, suspenzije, disperzije ili emulzije koje su pogodne za infuziju ili injekciju. Pogodni nosači ili razblaživači za takve preparate, na primer, uključuju, bez ograničenja, one navedene na strani 143 WO 08/020079. Obično će se dati prednost vodenim rastvorima ili suspenzijama.

[0311] Konstrukti, polipeptidi i/ili ISVD pronalaska takođe se mogu primeniti metodama isporuke poznatim iz genske terapije, videti, npr. američki patent br.5,399,346. Koristeći metod genske terapije isporuke, primarne ćelije transfektovane genom koji kodira konstrukt, polipeptid i/ili ISVD pronalaska mogu se dodatno transfektovati promotorima specifičnim za tkivo kako bi se ciljalo na specifične organe, tkivo, graftove, tumore ili ćelije i mogu se dodatno transfektovati signalnim i stabilizacionim sekvencama za subcelularno lokalizovanu ekspresiju.

[0312] Prema daljim aspektima obelodanjivanja, polipeptid pronalaska može se koristiti u dodatnim primenama in vivo i in vitro. Na primer, polipeptidi pronalaska mogu se koristiti u dijagnostičke svrhe, npr. u testovima dizajniranim za otkrivanje i/ili kvantifikovanje prisustva ADAMTSS i/ili za prečišćavanje ADAMTSS. Polipeptidi se takođe mogu testirati na životinjskim modelima određenih bolesti i za sprovođenje toksikoloških studija, studija bezbednosti i doziranja.

[0313] Konačno, obelodanjivanje se odnosi na komplet koji se sastoji od najmanje jednog polipeptida u skladu sa pronalaskom, najmanje jedne sekvence nukleinske kiseline koja kodira navedene komponente, vektorskog ili vektorskog sistema pronalaska i/ili ćelije domaćina u skladu sa pronalaskom. Smatra se da se komplet može ponuditi u različitim oblicima, npr. kao dijagnostički komplet.

[0314] Pronalazak će sada biti dalje opisan pomoću sledećih neograničavajućih poželjnih aspekata, primera i slika.

PRIMERI

Primer 1 Generacija rekombinantnog ADAMTS5 proteina iz različitih vrsta

[0315] Različiti formati rekombinantnog ADAMTS5 proteina goveda, pacova, zamoraca, miševa i cinomoglus majmuna generisani su interno putem HEK293 FIp-In<™>ekspresijskog sistema koristeći FuGENE<®>HD transfekcioni reagens (Promega). Dva dana nakon transfekcije, selekcioni medijum koji sadrži 100 µg/ml higromicina B je dodat u ćelije da bi se odabrale stabilne ekspresijske ćelije.

[0316] Ćelije stabilne ekspresije su proširene. Kondicionirani medijum koji sadrži izlučeni ADAMTS5 sakupljan je svakodnevno iz ćelija, prečišćen HisTrap hromatografijom i praćen razmenom pufera u 50 mM Hepes pufera pH 7,5. Čistoća proteina potvrđena je pomoću SDS-PAGE.

Primer 2 Imunizacija lama proteinom ADAMTS5, kloniranje repertoara fragmenata antitela samo sa teškim lancem i priprema faga

4

2.1 Imunizacije

[0317] Nakon odobrenja Etičkog komiteta Veterinarskog fakulteta (Univerzitet u Gentu, Belgija), 3 lame su imunizovane rekombinantnim lhumanim ADAMTSS proteinom (R&D Systems, Mineapolis, USA; Cat # 2198-AD)..

2.2 Kloniranje repertoara fragmenata antitela samo sa teškim lancem i priprema faga

[0318] Nakon konačne injekcije imunogena, uzeti su uzorci krvi. Iz ovih uzoraka krvi pripremljene su mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) korišćenjem Ficoll-Hypaque prema uputstvima proizvođača (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, US). Iz PBMC, ukupna RNK je ekstrahovana i korišćena kao polazni materijal za RT-PCR za pojačavanje DNK segmenata koji kodiraju VHH/nanotelo, u suštini kako je opisano u WO 05/044858. Nakon toga, fagi su pripremljeni u skladu sa standardnim protokolima (videti na primer prethodnu tehnologiju i primene koje je ovde navela kompanija Ablynx N.V.) i uskladišteni nakon sterilizacije filtera na 4 °C za dalju upotrebu.

Primer 3 Izbor VHH specifičnih za lhumani ADAMTSS putem prikaza faga

[0319] Repertoari VHH dobijeni iz svih lama i klonirani u bibliotekama faga korišćeni su za izbor humanih ADAMTSS vezujućih nanotela. Rekombinantni humani ADAMTSS protein (R&D Systems, Minneapolis, USA; Cat # 2198-AD) je imobilizovan na 5 µg/ml na Maxisorp ploči (Nunc, Wiesbaden, Nemačka), pored negativne kontrole 0 µg/ml antigena. Nakon inkubacije sa bibliotekama faga i ekstenzivnog pranja, vezani fagi su eluirani tripsinom (1 mg/ml) i korišćeni su za infekciju ćelija E. coli. Zaražene ćelije E. coli su ili korišćene za pripremu faga za sledeći krug selekcije ili su obložene agarskim pločama za analizu. Pored toga, sintetičke biblioteke su korišćene u tri uzastopna kruga selekcije.

[0320] Rezultati svih krugova selekcije analizirani su na faktor obogaćivanja, što je broj faga prisutnih u eluatu u odnosu na kontrolne grupe. Za dalju analizu izabrani su najbolji uslovi selekcije.

[0321] U cilju skrininga selekcije za specifična veziva, pojedinačne kolonije su sakupljene sa agar ploča i uzgajane u pločama sa 96 dubokih bunarčića od 1 ml. LacZ-kontrolisana ekspresija VHH indukovana je dodavanjem IPTG. Periplazmički ekstrakti su pripremljeni u skladu sa standardnim protokolima (videti, na primer, prethodno stanje tehnike i prijave koje je podnela kompanija Ablynx N.V. navedene u ovom dokumentu).

Primer 4 Skrining periplazmičkih ekstrakata za funkcionalno blokiranje nanotela

[0322] U prvom koraku, periplazmički ekstrakti su testirani na vezivanje za rekombinantni humani ADAMTS5 putem ELISA testa vezivanja. Ukratko, rekombinantni humani ADAMTSS (R&D Systems, Minneapolis, US; Cat # 2198-AD) u koncentraciji od 1 µg/ml obložen je na MaxiSorp pločama sa 384 bunarčića (Nunc, Wiesbaden, Germany). Bunarčići su blokirani rastvorom kazeina (1%). Nakon dodavanja 10-strukog razblaživanja periplazmičkih ekstrakata, vezivanje nanotela je detektovano korišćenjem mišjeg konjugata anti-Flag-HRP (Sigma, St. Louis, US) i naknadne enzimske reakcije u prisustvu supstrata esTMB (3,3',5,5' -tetramentilbenzidin) (SDT, Brussels, Belgium). Smatralo se da klonovi koji pokazuju ELISA signale veće od zbira prosečnog signala irelevantnih kontrola nanotela i 3 puta standardne devijacije irelevantnih kontrola nanotela kodiraju pozitivna humana ADAMTSS vezujuća nanotela.

[0323] Da bi se identifikovala nanotela koja su u stanju da spreče cepanje aggrekana posredovano ADAMTSS, klonovi su testirani u humanom ADAMTSS enzimskom testu zasnovanom na FRET, koristeći 50mM HEPES (pH 7,5), 100mM NaCl,5mM CaCl2*2H2O, 0,1% CHAPS, 5% glicerol kao pufer za analizu. Ukratko, periplazmički ekstrakti koji sadrže ADAMTS5 vezujuća nanotela inkubirani su OptiPlate pliči sa 384 bunarčića (PerkinElmer, Waltham, MA, US) sa 10 µl 25 µM kaljenog fluorogenog humanog peptidnog supstrata (Abz-TEGEARGSVI-Dap (Dnp) -KK-NH2, Anaspec, Serain Belgium, Cat# 60431-1) i 10 µl 25 nM humanog ADAMTSS (R&D Systems, Minneapolis, US; Cat # 2198-AD).

Sposobnost nanotela da spreče cepanje posredovano ADAMTSS praćena je svakog minuta tokom 2 sata na čitaču ploča TECAN Infinite M1000. Podaci su analizirani softverom Graphpad Prism. Iz krive progresije enzima određena je početna brzina za negativnu kontrolu (v0), kao i brzina za svaki klon nanotela u ploči (vi) i pozadinski signal (Sb).

Koristeći formulu 100*(1 - (vi- Sb) /( v0- Sb)), izračunat je procenat inhibicije.

[0324] Periplazmički ekstrakt koji sadrži irelevantno nanotelo korišćen je kao negativna kontrolna grupa. Periplazmički ekstrakti koji sadrže ADAMTS5 nanotela koji su mogli da smanje signal fluorescencije sa više od 50% u odnosu na signal negativne kontrolne grupe, smatrani su inhibitornim nanotelima. Naknadno je određena DNK sekvenca pozitivnih klonova.

[0325] Rezime podataka o skriningu periplazmičkog ekstrakta dat je u tabeli 4.1. Sekvence aminokiselina anti-ADAMTS5 nanotela prikazane su u tabeli A-1.

Tabela 4.1 Rezultati skrininga periplazmičkih ekstrakata koji sadrže anti-ADAMTSS nanotela

[0326] Nakon kloniranja i sekvenciranja identifikovane su različite porodice, koje su se sastojale od klonova sa razlikama u CDR, ali koji su pokazali slične karakteristike vezivanja i inhibicije.

[0327] Nakon kloniranja i sekvenciranja, nanotelo 02A12 je identifikovano kao član porodice klona 09D03 (videti table A-1 i A-2). Varijabilnost sekvenci CDR regiona prikazana je u tabelama 4.1A, 4.1B i 4.1C u nastavku. Kao referenca su korišćene aminokiselinske sekvence CDR klona 09D03 prema kojima su poređeni CDR članova porodice (CDR1 počinje na Kabat poziciji 26, CDR1 počinje na Kabat poziciji 50, a CDR3 počinje na Kabat poziciji 95).

[0328] Nakon kloniranja i sekvenciranja, klon 09A05 je identifikovan kao član porodice klona 03B02 (videti table A-1 i A-2). Varijabilnost sekvenci CDR regiona prikazana je u tabelama 4.1D, 4.1E i 4.1F u nastavku. Kao referenca su korišćene aminokiselinske sekvence CDR klona 03B02 prema kojima su poređeni CDR članova porodice (CDR1 počinje na Kabat poziciji 26, CDR1 počinje na Kabat poziciji 50, a CDR3 počinje na Kabat poziciji 95).

[0329] Nakon kloniranja i sekvenciranja, klonovi 03D02 i 02C10 identifikovani su kao članovi porodice klona 03D01 (videti table A-1 i A-2). Varijabilnost sekvenci CDR regiona prikazana je u tabelama 4.1G, 4.1H i 4.1I u nastavku. Kao referenca su korišćene aminokiselinske sekvence CDR klona 03D01 prema kojima su poređeni CDR članova porodice (CDR1 počinje na Kabat poziciji 26, CDR1 počinje na Kabat poziciji 50, a CDR3 počinje na Kabat poziciji 95).

[0330] Gorenavedeni rezultati pokazuju da su neke varijacije aminokiselina dozvoljene, uz zadržavanje karakteristika vezivanja i inhibicije. Konkretno, vezivanje za ADAMTSS nije prediktor inhibicije aktivnosti ADAMTS5. Na primer, klon 3F04 je snažno vezivo, ali slab inhibitor.

Primer 5 Karakterizacija prečišćenih monovalentnih ADAMTS5 nanotela

[0331] Klonovi izabrani iz skrininga opisanog u primeru 4 su dalje okarakterisani. Nakon transformacije u E. coli (TG-1) izabranih nanotela, ekspresija je indukovana dodavanjem 1 mM IPTG i ostavljena da traje 4 sata na 37°C. Nakon centrifugiranja kultura ćelija, periplazmatski ekstrakti su pripremljeni zamrzavanjem i odmrzavanjem peleta, nakon čega je usledilo centrifugiranje. Ovi ekstrakti su zatim korišćeni kao polazni materijal za prečišćavanje putem IMAC-A na HisTrap FF sirovim kolonama od 1 ml (GE healthcare, Buckinghamshire, United Kingdom), nakon čega je usledilo odsoljavanje preko Zeba spin kolona (Pierce, Rockford, IL, USA), što je rezultiralo čistoćom od najmanje 95% prema proceni putem SDS-PAGE.

5.1 Procena ADAMTS5 blokirajućih nanotela u enzimskim ADAMTS5 testovima

1

[0332] Sposobnost nanotela da spreče cepanje agrekana posredovano ADAMTS5 potvrđena je u enzimskom testu zasnovanom na FRET, u suštini kao što je opisano u primeru 4. Podaci su analizirani softverom Graphpad Prism. Iz krive progresije enzima određena je početna brzina (vi) i ove vrednosti su prikazane kao funkcija koncentracija inhibitora i izračunate su vrednosti IC50. U suštini, test ljudske FRETE sa prečišćenim nanotelima potvrdio je rezultate opisane u primeru 4 sa periplazmičkim ekstraktima. IC50su se kretali između 1,8E-09 M i 3,7E-08 M. Konkretno, iako je konvencionalno mAb 12F4 imalo nešto bolji IC50od 1,0E-09 M od monovalentnih nanotela, sva nanotela su pokazala bolju efikasnost (podaci nisu prikazani).

[0333] Pored testa zasnovanog na FRET, izvršen je humani ADAMTSS test zasnovan na AlphaLISA (Perkin Elmer, Waltham, MA, US) sa biotinilisanim 43-mer agrekan oligopeptidom kao supstratom. Nakon ADAMTS5 cepanja ovog supstrata, oslobađa se biotinilisani ARGSV neo epitopski proizvod, koji se može detektovati streptavidin-AlphaScreen donorskim zrnima i anti-neo epitopskim („ARGSV“) antitelima uhvaćenim na anti-mišjim IgG obloženim AlphaLISA akceptorskim zrnima, što rezultira generisanjem luminiscencijskog AlphaScreen signala nakon laserske ekscitacije.

[0334] Da bi se utvrdio inhibicioni potencijal nanotela, serijska razblaživanja prečišćenih nanotela (zajedno sa pozitivnom kontrolom i negativnom irelevantnom kontrolom nanotela) inkubirana su humanim ADAMTSS (R&D Systems, Minneapolis, US; Cat # 2198-AD) tokom 15 minuta na sobnoj temperaturi u Optiplate ploči sa 384 bunarčića (Perkin Elmer, Waltham, MA, US). Nakon dodavanja biotinilisanog 43-mer agrekan oligopeptidnog supstrata (Biosyntan, Berlin, Germany) i inkubacije od 3 sata na 37°C, reakcija je zaustavljena. Prvi korak detekcije je izvršen dodavanjem 5 µl rastvora za detekciju 1 koji se sastojao od agrekan antitela protiv neoepitopa „ARGSV“, mišjeg BC3 mAb (MDBioproducts, Egg, Switzerland) i Streptavidin AlphaScreen donorskih zrna (Perkin Elmer). Nakon 1 sata inkubacije na sobnoj temperaturi, dodato je 5 µl drugog rastvora za detekciju, koji se sastoji od anti-mišjih AlphaLISA akceptorskih zrna (Perkin Elmer). Ploče su inkubirane 2 sata na sobnoj temperaturi u mraku. Merenje je izvršeno očitavanjem ploča na Envision Multi label čitaču ploča (Perkin Elmer, Waltham, MA, US).

2

[0335] Da bi se utvrdila sposobnost nanotela da spreče cepanje supstrata posredovano ADAMTSS, analizirano je smanjenje signala u funkciji koncentracije nanotela i izračunate su vrednosti IC50.

[0336] Rezultati su sažeti u tabeli 5.1.

Tabela 5.1 Potentnost (IC50) i % inhibicije ADAMTSS za nanotela i referentna jedinjenja u humanom enzimskom testu AlphaLISA.

[0337] U testu AlphaLISA, najmanje tri monovalentna nanotela (2F03, 11B06 i 9D03) pokazuju slične vrednosti IC50od konvencionalnih mAb 12F4, dok ostatak ima veće vrednosti. Međutim, sva nanotela pokazuju skoro 100% inhibiciju. Izuzetno, nanotelo 3B03, koje ima vrednost IC50najmanje faktor 100 veći od mAb 12F04 i dalje ima 100% inhibiciju.

5.2 Procena ADAMTS5 blokirajućih nanotela u testu goveđeg eksplanta

[0338] Procena sposobnosti nanotela da blokiraju razgradnju hrskavice u ex vivo testu, u kojem je supstrat predstavljen u stanju bližem fiziološkom stanju u poređenju sa biohemijskim testovima, izvršen je test goveđeg eksplanta. Ukratko, čipovi eksplanta goveđe hrskavice (prečnika 4 mm) pripremljeni su sveže iz zglobova kolena krava i inkubirani u pločama sa 96 bunarčića u prisustvu IL-1α kako bi se izazvala degradacija hrskavice. Kao mera razgradnje hrskavice/agrekana, otkriveno je oslobađanje GAG u supernatantu nakon 5 dana inkubacije (37°C, 7,5% CO2) putem metahromatske boje 1,9 dimetilmetilen plave (emisija na 633 nm). Hondroitin sulfat je uključen kao standard testa. Efikasnost je definisana pomoću kontrolnih grupa indukovanih IL-1α bez jedinjenja (0%) i u prisustvu MSC2310852A (100% efekat).

[0339] Rezultati su sažeti u tabeli 5.2.

Tabela 5.2 Vrednosti IC50iz monovalentnih nanotela u testu goveđeg eksplanta.

4

5.3 Grupisanje epitopa

[0340] Izvršen je „sendvič test“ zasnovan na SPR na Biacore T100 instrumentu za grupisanje ADAMTS5 nanotela u različite grupe za epitop. U tu svrhu, svako anti-ADAMTS5 nanotelo je imobilizovano na CM5 senzornom čipu preko aminskog kuplovanja koristeći EDC i NHS hemiju. Nakon koraka hvatanja od 100 nM ADAMTSS, ubrizgana su prečišćena nanotela u koncentraciji od 1 µM, svako u jednom ciklusu i bez regeneracije, sa površinskim vremenom kontakta od 120 sekundi i brzinom protoka od 45 µL/min. Krive su obrađene softverom Biacore T100 Evaluation i procenjene za dodatno vezivanje za uhvaćeni ADAMTSS (različita grupa) ili ne (ista grupa).

[0341] Nanotela se mogu podeliti u dve grupe: jednu veliku grupu („grupa 1”), koja obuhvata sva inhibitorna nanotela sa sličnim epitopima ili epitopima koji se preklapaju, i drugu grupu koja obuhvata vezivno, nefunkcionalno nanotelo 3F04 koje prepoznaje drugačiji epitop na ADAMTSS („grupa 2”).

[0342] U tabeli 5.3 rezimirani su vezivni epitopi testiranih nanotela.

Tabela 5.3 grupe za epitop anti-ADAMTSS nanotela

5.4 Unakrsna reaktivnost vrsta

[0343] Unakrsna reaktivnost vrsta prvobitno je procenjena analizom brzine disocijacije na bazi SPR na instrumentu Biacore T100. Nanotela su testirana na vezivanje za ADAMTSS čoveka, cinomolgus majmuna („cino“), zamorca, miša i goveda. U tu svrhu, rekombinantni ADAMTS5 je imobilizovan na CM5 čip preko aminskog kuplovanja koristeći EDC i NHS. Prečišćena nanotela su ubrizgavana 2 minuta u koncentraciji od 100 nM i ostavljena da se odvajaju 15 minuta pri brzini protoka od 45 ul/min. Brzina disocijacije za svako pojedinačno nanotelo je određeno uklapanjem modela interakcije 1:1 (Langmuir model) na pojedinačne krive disocijacije pomoću softvera BIA Evaluation. Kao referenca, brzine disocijacije na humanom ADAMTSS utvrđene su u svakom eksperimentu.

[0344] Rezultati su sažeti u tabeli 5.4A.

Tabela 5.4A Pregled podataka o unakrsnoj reaktivnosti vrsta monovalentnih anti-ADAMTSS nanotela

[0345] Za svako testirano nanotelo, slične brzine disocijacije su primećene za sve testirane vrste.

[0346] Pored toga, unakrsna reaktivnost za ADAMTS5 cinomolgus majmuna i zamorca takođe je ispitana određivanjem potencije korišćenjem AlphaLISA, u suštini kao što je opisano u primeru 5.1, ali korišćenjem biotinilisani 43-agrekan oligopeptidni supstrat cinomolgusa i biotinilisani 43-agrekan oligopeptidni supstrat zamorca. Da bi se utvrdila sposobnost nanotela da spreče cepanje supstrata posredovano ADAMTSS, analizirano je smanjenje signala u funkciji koncentracije nanotela i izračunate su vrednosti IC50.

[0347] Rezultirajuće potencije su sažete u tabeli 5.4B.

Tabela 5.4B Pregled podataka o unakrsnoj reaktivnosti vrsta monovalentnih anti-ADAMTSS nanotela

[0348] Sva nanotela i kontrolna jedinjenja blokirala su humani i cino ADAMTSS sa sličnim potencijama. Kod AlphaLISA zamorca, najsnažnija nanotela pokazala su nešto niže potencije nego kod humanog AlphaLISA, ali je to najverovatnije rezultat niže osetljivosti testa zbog povećane koncentracije enzima.

[0349] Unakrsna reaktivnost nanotela 2A12, 2F03, 093 i 049 na pacovima procenjena je određivanjem afiniteta na osnovu SPR pomoću Biacore T100. Za referencu, utvrđen je i afinitet za humani ADAMTSS. U tu svrhu, ADAMTSS pacova i čoveka su imobilizovani na CM5 čip preko aminskog kuplovanja, koristeći EDC i NHS hemiju. Prečišćena nanotela su ubrizgavana 2 minuta u različitim koncentracijama (između 1 i 1000 nM) i ostavljena da se disociraju 25 minuta pri brzini protoka od 45 µl/min. Kinetičke konstante su izračunate iz senzorgrama pomoću BIAEvaluation softvera (interakcija 1:1).

[0350] Kao što je prikazano u tabeli 5.4C, slični afiniteti na humanom ADAMTSS i ADAMTS5 pacova dobijeni su za sva testirana nanotela. Afinitet produženog poluvremena eliminacije nanotela 069 (videti ispod) bio je sličan afinitetu njegovog monovalentnog pandana (koji je nanotelo 049), što ukazuje na to da dodavanje ALB11 na C-terminalu nema uticaja na afinitet. Afinitet produženog poluvremena eliminacije biparatopičnog nanotela 130 bio je na obe vrste veći (15 puta na humanom ADAMTSS i 10 puta na ADAMTSS pacova) u poređenju sa afinitetom produženog poluvremena eliminacije nanotela 069 (tabela 5.4C).

Tabela 5.4C pregled afiniteta na humanom ADAMTSS i ADAMTS5 pacova

5.5 Inhibicija aktivnosti MMP-1 i MMP-14

[0351] Da bi se potvrdila selektivnost nanotela za ADAMTSS, inhibicija enzimske aktivnosti MMP-1 i MMP-14 je procenjena testovima zasnovanim na FRET sa odgovarajućim enzimima. Ukratko, aktivirani humani MMP-1 ili MMP-14 je inkubiran 30 minuta na sobnoj temperaturi sa 10 µl serije razblaživanja nanotela. Nakon inkubacije, dodato je 20 µl respektivno 5 µM ili 2,5 µM fluorogenog peptidnog supstrata (Mca-PLGL-Dpa-AR-NH2 fluorogeni MMP supstrat (R&D Systems cat #ES001)). Sposobnost nanotela da spreče cepanje posredovano MMP-1 i MMP-14 praćena je svakog minuta tokom 2 sata na 37°C na čitaču ploča Tecan Infinite M1000.

[0352] Dobijene krive titracije prikazane su na slici 1.

[0353] Dok su prirodni inhibitori TIMP2 i TIMP3 inhibirali aktivnost MMP-1 i MMP-14, nijedno od testiranih nanotela nije pokazalo inhibiciju.

5.6 Inhibicija aktivnosti humanog ADAMTS4

[0354] Da bi se procenila inhibicija humanog ADAMTS4, sproveden je test sličan humanom ADAMTSS AlphaLISA, u suštini kao što je opisano u primeru 5.1, ali korišćenjem humanog ADAMTS4 (R&D Systems, Minneapolis, US; cat # 4307-AD). Da bi se utvrdila sposobnost nanotela da spreče cepanje supstrata posredovano humanim ADAMTS4, analizirano je smanjenje signala u funkciji koncentracije nanotela i izračunate su vrednosti IC50.

[0355] Rezultati su prikazani na Slici 2.

[0356] Dok je mali molekul MSC2310852A inhibirao aktivnost humanog ADAMTS4, nijedno od testiranih nanotela ili mAb 12F4 nije pokazalo inhibitornu aktivnost (videti Fehler! Verweisquelle konnte nicht gefunden werden.). Opisano je da je monoklonsko antitelo 12F4 (H4L0) selektivno u odnosu na ADAMTS4 u WO 2011/002968.

Primer 6 Formatiranje nanotela

6.1 Knockout N-glikozilacionih motiva

[0357] Motivi N-glikozilacije prisutni u nanotelu 11B06 (pozicija N52) i nanotelu 3F04 (pozicija N110f) su izbačeni pre formatiranja. Lokacije su randomizovane pomoću biblioteke kodona NNK. Pošto se ove pozicije nalaze u CDR, mutacija motiva može potencijalno uticati na karakteristike vezivanja. Shodno tome, biblioteke su pregledane na moguće zamene koje nisu uticale na svojstvo vezivanja SPR analizom brzine disocijacije na humanom ADAMTSS korišćenjem instrumenta Biacore T100, u suštini kao što je opisano u primeru 5.4.

[0358] Iznenađujuće, zamena aminokiseline N52 serinom u nanotelu 11B06 i aminokiseline N100Fglutaminom u nanotelu 3F04 nije uticala na vezivanje (podaci nisu prikazani).

[0359] Stoga, kao gradivni blokovi za dalje formatiranje, nanotela 049 (= 11B06 (N52S)) i 093 (3F04 (N100FQ)) su korišćena za predstavljanje nanotela 11B06 i 3F04, respektivno (videti tabelu A-1).

6.2 Generisanje formatiranih nanotela

1

[0360] Za generisanje konstrukata nanotela produženog poluvremena eliminacije koji blokiraju aktivnost humane ADAMTSS agrekanaze, nanotela 2A12, 2D07, 2F03, 049, 9D03 i 3B02 su spojena sa anti-humanim serumskim albuminom (HSA)-nanotelo ALB11 (videti tabelu 6.3). Pored toga, ALB11 konstrukti produženog poluvremena eliminacije su takođe generisani iz kombinacije dva nanotela iz različitih epitopa vezivanja (kombinacija člana grupe 1 i člana grupe 2). Formatirani konstrukti nanotela su izraženi u Pichia pastoris, izlučeni u medijum za uzgoj i afinitet je prečišćen na Poros MabCaptureA protein A zrnima (Applied Biosystems, Bleiswijk, Netherlands cat # 4374729). Potvrđen je integritet konstrukata nanotela.

6.3 Potentnost u AlphaLISA u odsustvu i prisustvu HSA

[0361] Formatirani konstrukti nanotela su testirani u AlphaLISA, kao što je opisano u primeru 5.1. Pored toga, uticaj vezivanja HSA na potenciju nanotela rešen je izvođenjem eksperimenta u prisustvu viška HSA (konačna koncentracija od 4,2 µM).

[0362] Vrednosti IC50svih konstrukata nanotela sa produženim poluvremenom eliminacije navedene su u tabeli 6.3.

[0363] Rezultati ukazuju da ni formatiranje ALB11 ni vezivanje HSA ne utiču na potenciju konstrukata nanotela.

6.4 Vezivanje za HSA

1 1

[0364] Afinitet ALB11 nanotela prema HSA određen je preko SPR na Biacore T100. U tu svrhu, HSA je imobilizovana na CM5 čip preko aminskog kuplovanja i obrađena u suštini kao što je opisano u primeru 5.3 Kao referenca, takođe je utvrđen afinitet monovalentnog ALB11, koji je iznosio 3,2 nM.

[0365] Rezultati su sažeti u tabeli 6.4.

Tabela 6.4 Afinitet HLE konstrukata nanotela za HSA

[0366] Sva produžena poluvremena eliminacije ADAMTS5 konstrukata nanotela imala su slične afinitete (videti tabelu 6.4), što je bilo niže od afiniteta monovalentnog ALB11 za HSA.

6.5 Određivanje afiniteta za humani ADAMTS5 sa KinExA

[0367] Afinitet formatiranog konstrukta nanotela 069 (049-35GS-ALB11) i konstrukta nanotela 130 (049-35GS-093-ALB11) (videti takođe tabelu 6.5) određen je u rastvoru kinetičkim testom isključenja na instrumentu KinExA3000 (Sapidyne, Boise, USA). U tu svrhu, humani ADAMTS5 je spojen sa PMMA zrnima u skladu sa uputstvima proizvođača, koja su detaljno opisali Darling i Brault (2004 Assay Drug Dev Technol.2:647-57). Fiksna koncentracija konstrukta nanotela (50 pM konstrukt nanotela 069 ili 5 pM konstrukt nanotela 130) je dodata seriji razblaživanja humanog ADAMTSS u rasponu od 2 nM - 0,2 pM i inkubirana na sobnoj temperaturi 16 sati dok se nije postigla ravnoteža. Nakon toga, smeše

1 2

su ubrizgane preko KinExA autosamplera preko kolone pune humanih ADAMTS5-konjugovanih PMMA zrna kako bi se uhvatio slobodan konstrukt nanotela na zrnima i otkrio sa Alexa647 oznakom HSA. Konstrukt slobodnog nanotela u procentima je iscrtan u funkciji titriranog humanog ADAMTSS i postavljen pomoću KinExA Pro softvera v3.2.6.

[0368] Rezultati su prikazani u tabeli 6.5.

Tabela 6.5 Afiniteti 2 konstrukta nanotela za vezivanje za humani ADAMTSS utvrđeni putem KinExA

[0369] Oko 20 puta veći afinitet je primećen za konstrukt nanotela 130 u poređenju sa konstruktom nanotela 069. Ovi podaci potvrđuju snažno vezivanje za humani ADAMTSS konstrukta nanotela 130.

Primer 7 Optimizacija sekvence (SO) nanotela

[0370] Primer nanotela 2F03, nanotela 049 (11B06 (N52S)) i nanotela 093 (3F04(N100fQ)) podvrgnuti su procesu optimizacije sekvence. Optimizacija sekvence je proces u kojem je sekvenca matičnog nanotela mutirana i ovaj proces obuhvata humanizaciju (i) nanotela i nokautiranje posttranslacionih modifikacija (ii), kao i epitopa za potencijalna već postojeća antitela (iii). Nanotelo ALB11 je takođe mutirano kako bi izbacilo epitope za potencijalna već postojeća antitela.

(i) za potrebe humanizacije, matična sekvenca nanotela je mutirana da bi se dobila sekvenca nanotela koja je identičnija humanoj sekvenci konsenzusa IGHV3-IGHJ. Specifične aminokiseline u okvirnim regionima (sa izuzetkom takozvanih

1

karakterističnih ostataka) koje se razlikuju između nanotela i lhumanog IGHV3-IGHJ konsenzusa o germinativnoj liniji menjaju se u humani pandan na takav način da struktura proteina, aktivnost i stabilnost ostanu netaknuti. Poznato je da je nekoliko karakterističnih ostataka kritično za stabilnost, aktivnost i afinitet nanotela i stoga nisu mutirani.

(ii) aminokiseline prisutne u CDR i za koje postoje eksperimentalni dokazi da su osetljive na posttranslacione modifikacije (PTM) se menjaju na takav način da se mesto PTM inaktivira dok se struktura proteina, aktivnost i stabilnost održavaju netaknutim.

(iii) sekvenca nanotela je optimizovana, bez uticaja na strukturu, aktivnost i stabilnost proteina, kako bi se minimiziralo vezivanje bilo kojih prirodnih već postojećih antitela i smanjio potencijal za izazivanje imunogenog odgovora nastalog tokom lečenja.

[0371] Za generisanje sekvenci optimizovanih formatiranih konstrukta nanotela 581 i konstrukta nanotela 579, odgovarajući građevinski blokovi su povezani preko 35GS linkera. Rezultat je konstrukt nanotela 581 (2F3SO-35GS linker-Alb11) i konstrukt nanotela 579(2F3SO-35GSlinker-093SO-35GSlinker-Alb11), respektivno (videti tabelu A-1).

Konstrukti su proizvedeni u Pichia pastoris kao proteini bez oznaka i prečišćeni hromatografijom afiniteta proteina A, nakon čega je usledila desalinizacija. Potvrđen je integritet konstrukata nanotela.

7.1 Afinitet prema humanim ADAMTS5

[0372] Afinitet konstrukta nanotela 581 (2F3SO-35GSlinker-Alb11) određen je korišćenjem KinExA, kao što je opisano u primeru 6.5 sa nekoliko manjih adaptacija opisanog protokola. Fiksna koncentracija od 20 pM konstrukta nanotela 581 inkubirana je zajedno sa serijom razblaživanja humanog ADAMTSS (2,2 puta serijska razblaženja u rasponu od 20 nM do 0,32 pM i blanko bez ADAMTSS). Da bi se testirala interferencija albumina, HSA je dodat u ovu predinkubaciju u odabranim eksperimentima sa humanim ADAMTSS, u koncentraciji 100 puta većoj od njegove KD za konstrukt nanotela 581. Smeše su inkubirane i ostavljene da dostignu ravnotežu 24 sata pre ubrizgavanja preko KinExA autosamplera preko kolone pune humanih ADAMTSS-konjugovanih PMMA zrna. Uhvaćeni konstrukt nanotela 581

1 4

detektovan je pomoću anti-nanotelo alata označenog sa AF647 koji prepoznaje konstrukt nanotela 581 (generisan od strane Ablynx).

[0373] Rezultati su prikazani u tabeli 7.1.

Tabela 7.1 Afinitet konstrukta nanotela 581 za humanii ADAMTSS sa i bez HSA

[0374] Rezultati pokazuju da je afinitet konstrukta nanotela 581 za humani ADAMTSS 3,65pM bez HSA i 4,84 pM sa HSA.

7.2 Afinitet za serumski albumin

[0375] Afinitet ALB11 gradivnog bloka u konstruktu nanotela 581 (2F3SO-35GS linker-Alb11) za vezivanje za serumski albumin (SA) čoveka, cinomoglus majmuna, zamorca, miša i pacova, određen je korišćenjem SPR kao što je opisano u primeru 5.3.

[0376] Rezultati su prikazani u tabeli 7,2.

Tabela 7.2 Afinitet (KD, nM) konstrukta nanotela 581 za vezivanje za serumski albumin čoveka, cinomoglus majmuna, zamorca, miša i pacova

7.3 Vezivanje pre-Ab

1

[0377] Konstrukt nanotela 581 (2F3SO-35GS linker-Alb11) i konstrukt nanotela 579 (2F3SO-35GSlinker-093SO-35GS linker-Alb11) pregledani su na prethodno postojeće vezivanje antitela (pre-Ab) iz 3 relevantna skupa uzoraka donorskog seruma (uzorci zdravih subjekata, uzorci OA i pristrasan skup uzoraka sa poznatim rezidualnim vezivanjem pre-Ab za druga nanotela) putem SPR tehnologije na ProteOn XPR36 instrumentu. Uzorci krvi su analizirani na vezivanje za anti-ADAMTSS konstrukte nanotela, koji su uhvaćeni na HSA. Prethodni nivoi vezivanja antitela određeni su nakon dvostrukog pozivanja na senzorgrame postavljanjem tačaka izveštaja na 125 sekundi (5 sekundi nakon završetka asocijacije). Analiza je urađena sa ProteOn menadžerom 3.1 (Bio-Rad Laboratories, Inc.).

[0378] Rezultati su prikazani na Slici 3.

[0379] Oba konstrukta nanotela imala su niske rezidualne nivoe vezivanja pre-Ab, pri čemu je konstrukt nanotela 581 jasno pokazao najmanje rezidualno vezivanje pre-Ab (videti Fehler! Verweisquelle konnte nicht gefunden werden.).

7.4 Funkcionalnost u humanoj AlphaLISA

[0380] AlphaLISA je izvršena sa konstruktom nanotela 581 (2F3SO-35GS linker-Alb11) koristeći humani ADAMTSS u suštini kao što je opisano u primeru 5.1.

[0381] Rezultati su prikazani u tabeli 7.4.

Tabela 7.4 Potentnost (pM) konstrukta nanotela 581 kako je utvrđeno sa AlphaLISA.

[0382] Rezultati pokazuju da je potencija konstrukta nanotela 581188 pM.

7.5 Profilisanje imunogenosti u testu dendritičkih ćelija i T-ćelija

1

[0383] Relativna imunogenost je određena pomoću testa proliferacije dendritičkih ćelija i T-ćelija U suštini, nanotela su testirana na skupu od 50 zdravih uzoraka donorskih ćelija koji sadrže najzastupljenije alele HLA klase II, i kao takve koje predstavljaju većinu globalne populacije. Imunološki odgovor je procenjen korišćenjem proliferacije T ćelija kao surogat markera za formiranje antitela protiv lekova. Kao pozitivna kontrolna grupa korišćen je Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH). Pozitivna kontrolna KLH grupa dovela je do pozitivnog odgovora kod svih 50 donora. Nijedan od donora nije bio pozitivan na konstrukt nanotela 581 (2F3SO-35GS linker-Alb11). Konstrukt nanotela 579 (2F3<SO>-35GS linker-093<SO>-35GS linker-Alb11) dovela je do pozitivnog odgovora kod tri donora, ili 6%. U praznoj kontrolnoj grupi (samo medijum), 2 od 50 donora, ili 4 %, pokazalo je pozitivnu reakciju. Ovi rezultati su korišćeni za postavljanje ukupnog praga odgovora od više od 3 od 50 donora koji odgovaraju ukupnom pragu odgovora od > 6%. Ukupni imunogeni potencijal za testirana nanotela smatrao se niskim jer je procenat značajnih, pozitivnih odgovora bio ≤ 6% (videti tabelu 7.5).

Tabela 7.5 Profilisanje imunogenosti rezultata kako je utvrđeno u testu DC-T ćelija

7.6 Vezivanje za humani ADAMTS1

[0384] Vezivanje za humani ADAMTS1 testirano je ELISA testom vezivanja (videti Fehler! Verweisquelle konnte nicht gefunden werden.A). Ukratko, 18,5 nM humanog ADAMTS1 (R&D Systems, Minneapolis, US; Cat # 2197-AD) i humanog ADAMTSS (R&D Systems, Minneapolis, US; Cat # 2198-AD) obloženi su na MaxiSorp ploči sa 384 bunarčića (Nunc, Wiesbaden, Germany). Bunarčići su blokirani rastvorom kazeina (1%) i serija razblaživanja

1

konstrukta nanotela 581 (2F3SO-35GS linker-Alb11) i anti-humanog ADAMTS1 mAb (R&D Systems, Minneapolis, US; Cat # MAB2197) su testirani na vezivanje za oba obložena proteina. Nakon detekcije sa HRP konjugovanim anti-nanotelo alatom koji prepoznaje konstrukt nanotela 581 (generisan od strane Ablynx) i HRP konjugovanim anti-mišjim antitelima (Abcam, Cambridge, UK), respektivno, i naknadne enzimske reakcije u prisustvu supstrata esTMB (3,3',5,5'-tetramentilbenzidin) (SDT, BBrussels, Belgium), izmeren je OD450 nm.

[0385] Kriva odgovora na dozu je primećena za konstrukt nanotela 581 na humanom ADAMTSS i za anti-humani ADAMTS1 mAb na humanom ADAMTS1, što pokazuje da se konstrukt nanotela 581 ne vezuje za humani ADAMTS1.

7.7 Vezivanje za humani ADAMTS4 i ADAMTS15

[0386] Vezivanje za humani ADAMTS4 i ADAMTS15 testirano je ELISA testom za vezivanje (videti sliku 4B). Ukratko, 1 µg/ml humanog ADAMTS4 (R&D Systems, Minneapolis, US; Cat # 4307-AD) ili humanog ADAMTS15 (R&D Systems, Minneapolis, US; Cat # 5149-AD) je preko noći obložen sa 1 µg/ml na Maxisorp Elisa pločama sa 96 bunarčića (Nunc, Wiesbaden, Germany). Nakon blokiranja ploča SuperBlock T20 (PBS) (Thermo Scientific Pierce; Cat # 37516), na obloženu ploču je primenjena kriva odgovora na dozu konstrukta nanotela 581 ("C011400581") ili pozitivna kontrolna grupa anti-ADAMTS4 mAb (R&D Systems, Minneapolis, US; Cat # MAB4307) ili pozitivna kontrolna grupa anti-ADAMTS15 mAb (R&D Systems, Minneapolis, US; Cat # MAB5149) počev od 1 µM i inkubirana 1 sat na sobnoj temperaturi. Vezano C011400581 nanotelo je detektovano biotinilisanim anti-nanotelo alatom koji prepoznaje konstrukt nanotela 581 (generisan od strane Ablynx), dok je pozitivna kontrola mAb detektovana biotinilisanim kozjim anti-mišjim pAb (Jackson Immuno Research; cat # 115-065-062). Za oba streptavidina-HRP je korišćen kao sekundarni alat za detekciju (Thermo Scientific Pierce; cat # 21126). Ploče su zatim vizualizovane dodavanjem sTMB) (SDT, Brussels, Belgium). Svi alati za razblaživanje i detekciju pripremljeni su u razblaživaču za analizu (= PBS 10% Superblock 0,05% Tween20). Reakcija bojenja je zaustavljena nakon 2,5 minuta dodavanjem 1M Optička gustina je izmerena na 450 nm sa 620 nm kao referentnom talasnom dužinom.

1

7.8 Unakrsna reaktivnost vrsta putem KinExA određivanja afiniteta

[0387] Afinitet konstrukta nanotela 581 (2F3SO-35GS linker-Alb11) prema ADAMTS5 nekoliko vrsta određen je pomoću KinExA, kao što je opisano u primeru 7.1 Za sve vrste, pripremljena su humana ADAMTSS konjugovana PMMA zrna i koristila su se za hvatanje slobodnog konstrukta nanotela 581 kao što je gore opisano. Uhvaćeni konstrukt nanotela 581 detektovan je pomoću anti-nanotelo alata označenog sa AF647 koji prepoznaje konstrukt nanotela 581 (generisan od strane Ablynx). Rezultati su prikazani u Tabeli 7.7

Tabela 7.7 Afinitet konstrukta nanotela 581 za ADAMTSS cinomolgus majmuna, pacova, miševa i goveda

Primer 8 Potentnost u testu ljudskog eksplanta

[0388] Konstrukt nanotela 581 (2F3SO-35GSlinker-Alb11) je procenjen na sposobnosti da blokira degradaciju hrskavice u ex vivo testu, u suštini kao što je opisano u primeru 5.2, ali sada u testu ljudskog eksplanta. Ukratko, čipovi eksplanta ljudske hrskavice (prečnika 4 mm) pripremljeni su sveže iz ljudskih zglobova kolena i inkubirani u pločama sa 96 bunarčića u prisustvu 10 ng/ml IL-1α kako bi se izazvala degradacija hrskavice). Kao mera razgradnje hrskavice/agrekana, otkriveno je oslobađanje GAG u supernatantu nakon 7 dana inkubacije (37°C, 7,5% CO2) putem metahromatske boje 1,9 dimetilmetilen plave (emisija na 633 nm). Hondroitin sulfat je uključen kao standard testa. Efikasnost je definisana pomoću kontrolnih grupa indukovanih IL-10 i OSM bez jedinjenja i u prisustvu MSC2310852A. CRB0017 je anti-ADAMTS5 mAb koji će se koristiti u kliničkom ispitivanju faze I (Rottapharm).

1

[0389] Rezultati su sažeti na slici 5 i tabeli 8.

Tabela 8

[0390] Nanotela pokazuju visoku potenciju i 100% inhibiciju degradacije hrskavice (gubitak GAG) u testu humanog eksplanata. Kao što je prikazano u tabeli 8, nanotela su najmanje 10 puta bolja od CRB0017 u testu goveđeg eksplanta.

Primer 9 Modulacija C2M, C3M i exAGNX1 u modelu ko-kulture goveda

[0391] Efekat konstrukta nanotela 581 („581“ na slikama) na oslobađanje i sadržaj GAG, C2M (marker razgradnje kolagena II), C3M (marker razgradnje kolagena III) i exAGNx1 (marker za razgradnju agregana karakteriše neo-epitop TEGE) u sistemu ko-kulture goveda. U ovim sistemima ko-kulture, eksplanti hrskavice iz kolena goveda inkubirani su zajedno sa sinovijalnom membranom iz iste životinje 28 dana. Najviše oslobađanje GAG otkriveno je nakon 7 dana u kulturi (slika 6A). Konstrukt nanotela 581 je testiran u tri koncentracije: 1 nM, 10 nM, 100 nM. Inkubacija eksplanta hrskavice sinovijumom rezultirala je povećanim otpuštanjem GAG Konstrukt nanotela 581 inhibirano oslobađanje GAG (slika 6B).

[0392] U skladu SA otpuštanjem GAG, analiza preostalog sadržaja GAG eksplanta hrskavice (nakon digestije papaina) otkrila je smanjeni sadržaj GAG nakon koinkubacije eksplanta sinovijumom u poređenju sa samim eksplantima (slika 6C).

[0393] Paralelno sa analizom oslobađanja GAG, izmereno je oslobađanje exAGNx1 kao specifičnog markera za degradaciju agrekana. Površina ispod analize krive (AUC) pokazala

11

je robusnu indukciju oslobađanja exAGNx1 kada su eksplanti hrskavice i sinovijum inkubirani zajedno. Pored toga, konstrukt nanotela 581 inhibirao je oslobađanje eksAGNx1 u zavisnosti od koncentracije sa potpunom inhibicijom na 100 nM 581 (slika 7).

[0394] Da bi se utvrdio efekat konstrukta nanotela 581 na kolagensku mrežu hrskavice u sistemu ko-kulture, određen je C2M, kao marker za razgradnju kolagena II. Za razliku od markera za degradaciju agrekanske mreže (GAG I EXAGNX1), C2M je počeo da raste između 14. i 21. dana. Inkubacija konstrukta nanotela 581 u sistemu ko-kulture inhibirala je oslobađanje C2M (slika 8).

[0395] Kao dodatni marker za sinovijalno zapaljenje, određen je C3M (tj. marker degradacije kolagena tipa III). Analiza vremenskog toka oslobađanja C3M pokazala je da je C3M počeo da se povećava nakon 14 dana, dostigavši vrhunac oko 21. dana. Tretman sa konstruktom nanotela 581 inhibirao je C3M u sve tri koncentracije (slika 9).

Primer 10 Inhibicija aktivnosti agrekanaze u NHP

[0396] Sposobnost konstrukta nanotela 581 (2F3<SO>-35GS linker-Alb11; "C011400581") da inhibira aktivnost agrekanaze in vivo procenjena je kod cinomoglus majmuna, modela primata koji nije čovek (NHP).

[0397] Ukratko, konstrukt nanotela 581 je dat grupama od 3 mužjaka i 3 ženke cinomoglus majmuna jednom nedeljno supkutanom (s.c.) primenom u dozama od 6, 30 ili 150 mg/kg tokom 4 nedelje. Istovremena kontrolna grupa je tretirana sa nosačem, tj.20 mM histidina, 8% saharoze, 0,01% Tween 20 pH 6,0.

[0398] Inhibicija aktivnosti agrekanaze izmerena je na uzorcima seruma prikupljenim u nekoliko vremenskih tačaka određivanjem nivoa fragmenata razgradnje agrekana koji se karakterišu prisustvom neoepitopnih ARGASA u serumu. Sve životinje tretirane konstruktom nanotela 581 pokazale su sličan profil, tj. nivoi ARG su se smanjili nakon prvog doziranja i dostigli su veoma niske nivoe oko ili ispod donje granice mernog opsega (LLMR) testa (0,08 nM) između 48 sati i 120 sati. Nakon toga, NIVOI ARGS su pokazali održivo maksimalno smanjenje oko ili ispod LLMR i nisu se vratili na početnu vrednost do kraja ispitivanja nakon 4 nedelje.

[0399] Pregled rezultata prikazan je na slici 10.

[0400] U zaključku, specifična nanotela ADAMTS5 angažuju metu nakon sistemske primene i potencijalno moduliraju nivoe ARGS neoepitopa in vivo pri svim testiranim nivoima doze. Štaviše, za razliku od mAbs prethodnih stanja tehnike, nisu primećene patološke aritmije povezane sa testom. Pored toga, nije bilo dokaza o bilo kakvom ST-elevaciji vezanoj za test kod mužjaka i ženki majmuna lečenih nanotelima pri bilo kom od testiranih nivoa doze.

Primer 11 Inhibicija degeneracije hrskavice

[0401] U cilju dalje procene sposobnosti nanotela i konstrukata nanotela da inhibiraju degeneraciju hrskavice in vivo, korišćen je mišji model DMM (destabilizacija medijalnog meniskusa). Ukratko, medijalni meniskus je hirurški destabilizovan. Primer konstrukta nanotela 581 (2F3SO-35GSlinker-Alb11) primenjen je ili supkutano 3 dana pre indukcije DMM-a (profilaktički) ili 3 dana nakon indukcije DMM (terapijski) u različitim koncentracijama. Nakon 8 nedelja lečenja, životinje su žrtvovane i kolena su uklonjena. Kolena su ugrađena u parafinske blokove, sekcionisana i obojena toluidin plavom bojom. Nakon toga, sekcije su bodovane za nekoliko parametara, uključujući sumu degeneracije medijalne hrskavice.

[0402] Rezultati su prikazani na Slici 11.

[0403] Rezultati pokazuju da postoji strukturna korist do 50% i za profilaktičko i za terapijsko lečenje (s.c.) nanotelima u mišjem modelu DMM.

Primer 12 Simptomatska korist u hirurškom modelu OA kod pacova

[0404] Da bi se procenila sposobnost nanotela da uspostave simptomatsku korist, korišćen je hirurški model OA pacova. Ukratko, pacovi su lečeni ACLt i tMx operacijom kako bi izazvali OA na dan 0. U ACLt i tMx hirurškom modelu (transekcija prednjeg ukrštenog ligamenta produžena medijalnom meniscektomijom) konstrukt nanotela 581 je primenjen s.c. svakog drugog dana od 3. dana nadalje. Na nedeljnom nivou utvrđena je simptomatska korist putem analize hoda (CatWalk) kao i smanjenje prečnika zgloba.

[0405] Rezultati su prikazani na Slici 12.

[0406] Osteoartritis je indukovan (na dan 0) kod odraslih muških pacova (Lister Hooded; prosečna telesna težina od 346 ± 20 g) transekcijom prednjeg ukrštenog ligamenta (ACLT) resekcijom operacije medijalnog meniskusa (tMx) na desnom zglobu kolena. Lečenje vehikulumom ili test stavkom (sc) počelo je 3. dana nakon operacije i nastavilo se svakog drugog dana do 42. dana. Zdrava kontrolna grupa nije imala hiruršku intervenciju, ali je dobila vehikulum u istim vremenskim tačkama kao i dozirane grupe. (A) Poremećaj hoda tokom vremena izračunat kao „% koristi u odnosu na vehikulum“. Srednja vrednost grupe „zdravi placebo“ = 100% koristi. Srednja vrednost grupe „ACLT tMx vehikulum“ = 0% koristi. (B) Prosečna „korist u odnosu na vehikulum“ u svim istraženim vremenskim tačkama nakon početka lečenja. Prikazana je srednja vrednost ± SEM od 14-15 pacova/grupa. *= p<0,05 izračunato pomoću OneWay ANOVA and Dunnett's.

[0407] Rano lečenje nanotelima izazvalo je zavisnost od doze, značajnu i smislenu simptomatsku korist tokom ACLT tMx indukovanog OA.

Primer 13 ispitivanja toksičnosti na cinomoglus majmunima

[0408] Sprovedena je četvoronedeljna studija subhronične toksičnosti kod cinomoglus majmuna kako bi se dobile informacije o sistemskoj toksičnosti, lokalnoj podnošljivosti i bezbednosnoj farmakologiji nanotela. Primer konstrukta nanotela 581 (2F3SO-35GS linker-Alb11) je dat s.c. grupama od 3 mužjaka i 3 ženke cinomolgus majmuna (Macaca fascicularis) (jednom nedeljno supkutanom primenom u dorzalni region u dozama od 6, 30 ili 150 mg/kg tokom 4 nedelje. Istovremena kontrolna grupa je tretirana sa vehikulumom, 20 mM histidina, 8% saharoze, 0,01% Tween 20 pH 6,0.

[0409] Nisu primećeni nikakvi znaci lokalne netolerancije vezani za test stavku pri bilo kom od testiranih nivoa doze. Nisu primećeni efekti povezani sa testom na ponašanje, telesnu

11

težinu, potrošnju hrane, hematološke i biohemijske parametre, tipizaciju limfocita, nivoe CRP, parametre analize urina, oftalmološke i slušne funkcije i težinu organa bilo koje životinje pri bilo kom nivou doze (podaci nisu prikazani). Ni makroskopski pregled na nekropsiji ni histopatološki pregled nisu otkrili nikakve lokalne ili sistemske promene organa koje su bile povezane sa tretmanom ispitivanim predmetom kod bilo koje od životinja pregledanih na bilo kom testiranom nivou doze.

[0410] Pošto je prijavljeno da je mAb 12F4 pokazao fokalno endokardijalno krvarenje, povećanje krvnog pritiska zavisno od doze bez dokaza reverzibilnosti, kao i abnormalnosti srčane provodljivosti (ST elevacija i ventrikularne aritmije) (Larkin, et al., The highs and lows of translational drug development: Antibody-mediated inhibition of ADAMTS-5 for osteoarthritis disease modification, OARSI conference 2014: Paris; Renninger et al., Identification of Altered Cardiovascular Function Produced by α Novel Biologic Compound in α Stand Alone Safety Pharmacology Primate Study, in SPS meeting, 2013), na životinjama je izvršena opsežna neinvazivna telemetrija koja koristi EMKA sistem.

[0411] Nije primećen uticaj povezan sa testom ni u jednom telemetrijskom parametru (koji koristi neinvazivni EMKA sistem) bilo koje životinje pri bilo kom nivou doze. Konkretno, nisu primećene patološke aritmije i nije bilo dokaza za bilo kakvu ST-elevaciju vezanu za test stavku kod mužjaka i ženki majmuna lečenih nanotelima pri bilo kom od testiranih nivoa doze (podaci nisu prikazani).

[0412] Ove studije potvrđuju da se nanotela specifična za ADAMTS5 mogu smatrati bezbednim.

Primer 14 In vivo studija DMOAD u modelu MMT kod pacova

[0413] Da bi se pokazala in vivo efikasnost inhibitora ADAMTS5 spojenih sa vezivom CAP pronalaska, korišćen je hirurški indukovan model medijalnog meniska (MMT) kod pacova. Ukratko, nanotelo anti-ADAMTS5 je spojeno sa CAP vezivom (naznačeno kao konstrukt nanotela C010100954 ili konstrukt nanotela 954). Pacovi su operisani na jednom kolenu kako bi izazvali simptome slične OA. Tretman je počeo 3 dana nakon operacije ubrizgavanjem internističke intervencije. Histopatologija je urađena 42. dana nakon operacije. Za eksplorativnu analizu biomarkera uzeti su privremeni i terminalni uzorci seruma. Određena je medijalna i ukupna značajna širina degeneracije hrskavice, kao i procentualno smanjenje degeneracije hrskavice. Po grupi je korišćeno 20 životinja.

[0414] Defekt ispod hrskavice u medijalnoj tibiji prikazan je na slici 13.

[0415] Rezultati pokazuju da je širina hrskavice značajno smanjena konstrukcijom ADAMTS5-CAP nakon 42 dana u poređenju sa vehikulumom. Ovi rezultati dalje sugerišu da

(a) CAP-deo nema negativan uticaj na aktivnost anti-ADAMTS5 nanotela;

(b) CAP-deo omogućava zadržavanje anti-ADAMTSS nanotela; i

(c) anti-ADAMTS5 nanotelo ima pozitivan efekat na širinu hrskavice, čak i kada je spojeno sa CAP-delom.

Primer 15

[0416] Metode: Eksplanti hrskavice goveda iz četiri životinje (BEX), kao i eksplanti ljudske hrskavice iz osam hirurški zamenjenih kolenskih zglobova (HEX) i iz jednog zdravog ljudskog kolenskog zgloba (hHEX), kultivisani su do 21 dan samo u medijumu (m/o), u prisustvu proinflamatornih citokina (onkostatin M [10 ng/ml] TNFα [20 ng/ml] (O+T)) ili O+T sa primerom konstrukta nanotela 581 (2F3<SO>-35GS linker-Alb11) [1 µM-1 nM].

Hrskavica i sinovijum krava (bCC) i od 4 zamenjena osteoartritična ljudska zgloba kolena (hCC) ko-kultivirani su ex vivo do 28 dana samo u medijumu (m/o), sa O+T ili O+T plus primerom konstrukta nanotela 581 (2F3SO-35GS linker-Alb11) [1 µM-0,6 nM]. Hrskavica je isečena na eksplante jednake veličine pomoću bušilice za biopsiju. Sinovijalne membrane su skalpelom isečene u eksplante jednake veličine (30 mg [±3 mg]). Metaboličku aktivnost eksplanta procenjena je pomoću Alamar Blue. Promena hrskavičnog tkiva procenjena je pomoću enzimski povezanog imunosorbentnog testa (ELISA) za merenje dobro okarakterisanih biomarkera razgradnje (huARGS, exAGNxl, C2M) i formiranja (ProC2) u kondicioniranom medijumu. ProC2 i C2M su metaboliti za formiranje i razgradnju kolagena

11

tipa II, respektivno, dok su exAGNxl i huARGS metaboliti razgrađenog agrekana ADAMTS-5. Prijavljene su srednje vrednosti i standardna greška srednje vrednosti (SEM). Statistička analiza je urađena korišćenjem jednosmerne analize varijanse (ANOVA) sa Dunn testom višestrukih poređenja ili dvosmernom ANOVA sa Dunn testom višestrukih poređenja uz pretpostavku normalne distribucije.

[0417] Rezultati: Metabolička aktivnost BEX, HEX i bCC bila je stabilna tokom celog perioda kulture, dok je metabolička aktivnost u hCC i hHEX značajno opala od 14. dana u uslovima tretiranim O+T u poređenju sa kontrolnom grupom. U kulturama stimulisanim sa O+T, metaboliti ADAMTS-5 degradiranog agrekana dostigli su vrhunac u prvoj nedelji kulture, osim hHEX u kojem su huARGS i exAGNxl porasli nešto kasnije. Degradacija kolagena tipa II, C2M, pomoću O+T dostigla je vrhunac nakon 19. dana. Formiranje kolagena tipa II, Pro-C2, ostalo je relativno stabilno u svim kulturama, u poređenju sa kontrolnom grupom.

[0418] Lečenje primerom konstrukta nanotela 581 (2F3SO-35GSlinker-Alb11) u kombinaciji sa dozom O+T zavisno je smanjilo huARGS 5. dana u BEX (najviša doza: 8% od O+T), u HEX (najviša doza: 40% od O+T), u bCC (najviša doza: 10% od O+T), u hCC (najviša doza: 40% od O+T), i u hHEX (najviša doza: 24% od O+T) (slika 14). IC50 primera konstrukta nanotela 581 (2F3SO-35GS linker-Alb11) zasnovanog na smanjenju huARGS-a kretao se od 300nM u BEX do < 15nM HEX, hHEX, bCC i hCC (slika 14). Efekat primera konstrukta nanotela 581 (2F3<SO>-35GSlinker-Alb11) na eksAGNxl bio je sličan efektu huARGS u testiranim kulturama. Primer konstrukta nanotela 581 (2F3<SO>-35GSlinker-Alb11) je takođe značajno i zavisno od doze smanjio C2M (marker za razgradnju kolagena tipa II), iako je efekat bio manji nego za markere razgradnje agrekana. Primer konstrukta nanotela 581 (2F3<SO>-35GS linker-Alb11) nije pokazao efekat na metabolit za formiranje kolagena tipa II Pro-C2 u bilo kom od testiranih uslova.

[0419] Zaključci: Ovde smo pokazali da primer konstrukta nanotela 581 (2F3<SO>-35GS linker-Alb11) ima zaštitne efekte na hrskavicu zbog svoje dozno zavisne inhibicije ADAMTS-5 posredovane razgradnje agrekana i MMP posredovane razgradnje kolagena tipa II u proinflamatornim uslovima kultura hrskavice goveda i ljudi ex vivo i u ko-kulturama hrskavice i sinovijuma. 2F3<SO>-35GS linker-Alb (SEQ ID NO: 129) je jedno od poželjnih otelotvorenja pronalaska.

11

Primer 16 Prisutne konstrukcije nanotela nadmašuju nanotela iz prethodnog stanja tehnike

[0420] U WO2008/074840 opisana su različita ADAMTS5 nanotela. U ovom eksperimentu izvršeno je poređenje između 26 nanotela opisanih u WO2008/074840 u odnosu na nanotela ovog pronalaska predstavljena primerom nanotela 2F3so (2F3*).

[0421] Svi konstrukti su testirani u AlphaLISA testu, kao što je opisano u primeru 5.1. Nanotelo 2F3<so>(2F3*) je ADAMTS5 vezivni monovalentni gradivni blok C011400581 (SEQ ID NO: 129). Kao negativna kontrolna grupa korišćeno je irelevantno nanotelo IRR00028.

[0422] Prvo je aktivnost nanotela prethodnog stanja tehnike utvrđena pomoću AlphaLISA. Rezultati su prikazani u tabeli 16.1.

11

[0423] Rezultati pokazuju da samo 7 nanotela prethodnog stanja tehnike ima blokirajuću aktivnost. Ostatak nanotela prethodnog stanja tehnike nije imao aktivnost niti je pojačao aktivnost.

[0424] U drugoj fazi ovog uporednog eksperimenta, blokirajuća nanotela su upoređena u odnosu na uzorno monovalentno nanotelo 2F3so (2F3*).

[0425] Vrednosti IC50konstrukcija nanotela navedene su u tabeli 16.2. Razlika u preklapanju sa primerom monovalentnog nanotela 2F3<so>(2F3*) je takođe naznačena radi lakšeg poređenja.

[0426] Može se zaključiti da su konstrukti nanotela ovog pronalaska nadmašili prethodno stanje tehnike ADAMTS5 nanotela.

Tabela A-1 Naziv i kratak opis („ID“), SEQ ID NO: („SEQ“) i sekvence aminokiselina monovalentnih i multivalentnih anti-ADAMTSS nanotela

11

11

12

Tabela A-2: Sekvence za CDR i okvire, plus poželjne kombinacije kako je predviđeno u formuli I, i to FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 (sledeći termini: „ID“ se odnosi na dati SEQ ID NO)

12

Tabela B Razne sekvence aminokiselina: Naziv i kratak opis („ID“), SEQ ID NO: („SEQ“) i sekvence aminokiselina („sekvence“)

12

12

12 Tabela C: Različite sekvence linkera („ID“ se odnosi na SEQ ID NO kako se ovde koristi)

Tabela D: ISVD sekvence koje vezuju serumski albumin („ID“ se odnosi na SEQ ID NO kako se ovde koristi), uključujući CDR sekvence

12

12

1

Claims (3)

Patentni zahtevi

1. Polipeptid koji se sastoji od najmanje 1 pojedinačnog varijabilnog domena imunoglobulina (ISVD) koji vezuje A dezintegrin i metaloproteinazu sa motivom trombospondina 5 (ADAMTS5),

pri čemu se navedeno ISVD vezivanje za ADAMTS5 sastoji od 3 regiona koji određuju komplementarnost (CDR1 do CDR3 respektivno) i 4 okvirna regiona (FR1 do FR4, respektivno),

gde je CDR1 SEQ ID NO: 21, CDR2 je SEQ ID NO: 37 i CDR3 je SEQ ID NO: 55,

i gde je

(i) FR1 SEQ ID NO: 72, FR2 je SEQ ID NO: 86, FR3 je SEQ ID NO: 96 i FR4 je SEQ ID NO: 114, ili

(ii) FR1 ima sekvencu aminokiselina DVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAAS,

FR2 je SEQ ID NO: 88,

FR3 ima sekvencu aminokiselina YVDSLKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCAA, i

FR4 je SEQ ID NO: 114.

2. Polipeptid prema patentnom zahtevu 1, koji se sastoji od najmanje 2 ISVD, pri čemu najmanje 1 ISVD specifično vezuje ADAMTS5.

3. Polipeptid prema patentnom zahtevu 2, pri čemu navedena najmanje 2 ISVD specifično vezuju ADAMTS5.

Polipeptid prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3, koji dalje sadrži ISVD koji vezuje serumski albumin.

Polipeptid prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4, pri čemu navedeni polipeptid ima stabilnost od najmanje 7 dana u sinovijalnoj tečnosti (SF) na 37°C.

Polipeptid prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5, pri čemu navedeni polipeptid ima 100% identičnost sekvence sa bilo kojim od SEQ ID NO: 2, 122, 126, 129 ili 130.

Polipeptid prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5, pri čemu navedeni polipeptid ima 100% identičnost sekvence sa SEQ ID NO: 129.

Polipeptid prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 7 za upotrebu kao lek.

Polipeptid prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 7 za upotrebu u lečenju ili sprečavanju simptoma bolesti povezane sa ADAMTS5 izabranog iz grupe koja se sastoji od artropatija, hondrodistrofija, artritične bolesti, osteoartritisa, reumatoidnog artritisa, gihtnog artritisa, psorijatičnog artritisa, traumatske rupture ili odvajanja, ahondroplazije, kostohondritisa, spondiloepimetfizalne displazije, hernije diskusa kičme, degeneracije lumbalnog diska, degenerativne bolesti zglobova, relapsirajućeg polihondritisa, osteohondritisa disekansa i agrekanopatija.

Polipeptid prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 7 za upotrebu u lečenju ili sprečavanju simptoma osteoartritisa.

Farmaceutska kompozicija koja se sastoji od polipeptida prema bilo kom od patentnih zahteva 1-7 i najmanje jednog odgovarajućeg nosača, razblaživača ili ekscipijensa.