RS66809B1 - Režim doziranja za anti-alfa4beta7 antitelo - Google Patents

Description

Opis

SRODNE PATENTNE PRIJAVE

Ova patentna prijava zahteva priznanje prava prvenstva na osnovu SAD privremene patentne prijave 61/585, 859 podnesene 12. januara 2012. godine, SAD privremene patentne prijave 61/550, 545 podnesene 24. oktobra 2011. godine i SAD privremene patentne prijave 61/481, 533 podnesene 2. maja 2011. godine.

OSNOV PRONALASKA

Napredak biotehnologije omogućio je proizvodnju različitih proteina za farmaceutske primene, upotrebom tehnika rekombinantne DNK. Budući da su proteini veći i složeniji od tradicionalnih organskih i neorganskih lekova (tj. osim složenih trodimenzionalnih struktura poseduju i više funkcionalnih grupa), formulisanje takvih proteina nosi sa sobom posebne probleme. Da bi protein ostao biološki aktivan, formulacija mora da sačuva konformacioni integritet najmanje osnovne sekvence aminokiselina u proteinu, a da istovremeno štiti višestruke funkcionalne grupe proteina od degradacije. Proteini mogu da imaju problem manjka stabilnosti, a posebno monoklonska i poliklonska antitela mogu da budu relativno nestabilna (videti npr. Wang et al., J. Pharm Sci.96: 1-26 (2007) ). Dostupan je veliki broj opcija formulisanja, ali nijedan pristup ili sistem nije pogodan za sve proteine. Zabeleženo je nekoliko faktora koje je potrebno razmotriti (videti npr. Wang et al.).

Brojne karakteristike mogu da utiču na stabilnost proteina. U stvari, čak i u slučaju prečišćenih antitela, strukture antitela mogu da budu heterogene, što dodatno komplikuje formulisanje takvih sistema. Osim toga, ekscipijensi uključeni u formulacije antitela poželjno svode na minimum potencijalni imuni odgovor.

U slučaju antitela, očuvanje konformacione celovitosti je još važnije. Putevi degradacije za proteine mogu da uključuju hemijsku nestabilnost (tj. bilo koji proces koji uključuje modifikaciju proteina formiranjem veze ili cepanjem, što rezultira novim hemijskim entitetom) ili fizičku nestabilnost (tj. promene proteinske strukture višeg reda). Hemijska nestabilnost se manifestuje, na primer, deamidacijom, izomerizacijom, hidrolizom, oksidacijom, fragmentaciji, eliminaciji glikana beta ili razmeni disulfida. Fizička nestabilnost može da bude rezultat denaturacije, agregacije, precipitacije ili adsorpcije, na primer. Četiri najčešća puta degradacije proteina su fragmentacija proteina, agregacija, deamidacija i oksidacija. Posledice hemijske ili fizičke nestabilnosti terapeutskog proteina uključuju smanjenje efektivne primenjene doze, smanjenu bezbednost terapije zbog, na primer, iritacije ili imunološke reaktivnosti, i češću proizvodnju zbog kratkog roka trajanja.

Sušenje zamrzavanjem je uobičajena tehnika za očuvanje proteina; sušenje zamrzavanjem služi za uklanjanje vode iz proteinskog preparata od interesa. Sušenje zamrzavanjem ili liofilizacija je proces kojim se materijal koji se suši prvo zamrzava, a zatim se led ili zamrznuti rastvarač uklanja sublimacijom u vakuumu. Ekscipijensi mogu da budu uključeni u pre-liofilizovanu formulaciju kako bi stabilizovali proteine tokom procesa liofilizacije i/ili poboljšali stabilnosti liofilizovane proteinske formulacije (Pikal M., Biopharm. 3(9)26-30 (1990) i Arakawa et al. Pharm. Res. 8(3):285-291 (1991)).

Nekoliko publikacija je otkrilo generalno različite metode lečenja inflamatornih bolesti creva, i obezbedilo šeme doziranja za primenu sredstava namenjenih za lečenje inflamatorne bolesti creva. Na primer, WO 96/24673 otkriva vaskularne adresine mukoze i lečenje bolesti povezanih sa regrutacijom leukocita u gastrointestinalni trakt kao rezultat vezivanja leukocita za ćelije koje eksprimiraju MAdCAM. U.S. 2005/0095238 opisuje postupke za lečenje bolesti povezane sa infiltracijom leukocita u mukozno tkivo i primenu kod čoveka efikasne količine humanog ili humanizovanog imunoglobulina ili antigen-vezujućeg fragmenta koji ima specifičnost vezivanja za α4β7 integrin. U.S.2005/0095238 dalje opisuje različite doze (npr.0.15, oko 0.5, oko 1.0, oko 1.5 ili oko 2.0 mg imunoglobulina ili fragmenta po kg telesne težine) i različite intervale između doza (7, 14, 21, 28 ili 30 dana). Međutim, pomenuti patenti i objave ne otkrivaju specifične formulacije anti-α4β7 antitela ili specifične doze i režime doziranja koji su ovde opisani i za koje se ovde traži zaštita. Ono što je važno, prethodno pomenuti patenti ne otkrivaju formulacije, doze i režime doziranja koji obezbeđuju postupke lečenja (podržane podacima iz kliničkih ispitivanja) koji su ovde opisani i za koje se ovde traži zaštita.

WO 2001/078779 A2 se odnosi na postupak lečenja čoveka koji ima bolest povezanu sa infiltracijom leukocita u mukozna tkiva i primenu kod čoveka efikasne količinu humanog ili humanizovanog imunoglobulina ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta koji ima specifičnost vezivanja za α4β7 integrin.

WO 2006/026759 A2 se odnosi na humanizovane anti-beta7 antagoniste i njihove upotrebe. Loftus EV: “New Data on the Use of Biologic Agents for Crohn's Disease and Ulcerative Colitis: Highlights from the 2009 CCFA Advances in IBD Meeting A Review of Selected Presentations from the 2009 Advances in Inflammatory Bowel Diseases/Crohn's & Colitis Foundation's With commentary by: A CME Activity Approved" (2009) se odnosi na upotrebu bioloških agenasa za Kronovu bolest i ulcerozni kolitis.

Feagan BG et al. (N Engl J Med. 2005 Jun 16; 352 (24): 2499-507) odnosi se na lečenje ulceroznog kolitisa humanizovanim antitelom na α4β7 integrin.

Reichert JM (MAbs. 2010 Jan-Feb; 2(1): 84-100) se odnosi na antitela na koja treba obratiti pažnju u 2010. godini.

Parikh A et al. (Gastroenterology 138 (5) (maj 2010)) se odnosi na “No increase in JC Viremia, Lymphocyte Count, or Circulating CD34+ Hematopoietic Progenitor Cells After Treatment With Vedolizumab, a Humanized Monoclonal Antibody to α4β7 Integrin” (naslov).

Formulacije antitela za upotrebu prema predmetnom pronalasku mogu da budu korisne za inhibiciju vezivanja leukocita za ćelije koje eksprimiraju MAdCAM i stoga pomažu u lečenju inflamatornih bolesti creva kod pacijenata. Shodno tome, postoji hitna potreba da se otkriju odgovarajuće doze i rasporedi doziranja ovih jedinjenja, i da se razviju formulacije, poželjno intravenske formulacije, koje dovode do stabilnih, terapeutski efikasnih nivoa formulacija antitela u krvi tokom dužeg vremenskog perioda u stabilnom i pogodnom obliku.

KRATAK OPIS PRONALASKA

Pronalazak je definisan priloženim patentnim zahtevima, a svi drugi aspekti ili primeri izvođenja koji nisu u skladu sa patentnim zahtevima dasu samo u cilju informisanja. Shodno tome, pronalazak je definisan na sledeći način:

[1] Humanizovano anti-α4β7 antitelo za upotrebu u postupku za terapeutsko lečenje inflamatorne bolesti creva, pri čemu se humanizovano anti-α4β7 antitelo primenjuje kod pacijenta koji pati od inflamatorne bolesti creva, pri čemu se humanizovano anti-α4β7 antitelo primenjuje kod pacijenta prema sledećem režimu doziranja:

a. inicijalna doza od 300 mg humanizovanog anti-α4β7 antitela u vidu intravenske infuzije;

b. nakon čega sledi druga naredna doza od 300 mg humanizovanog anti-α4β7 antitela u vidu intravenske infuzije, dve nedelje nakon inicijalne doze;

c. nakon čega sledi treća naredna doza od 300 mg humanizovanog anti-α4β7 antitela u vidu intravenske infuzije, šest nedelja nakon inicijalne doze;

d. nakon čega slede četvrta i naredne doze od po 300 mg humanizovanog anti-α4β7 antitela u vidu intravenske infuzije, svake četiri nedelje ili svakih osam nedelja nakon treće naredne doze humanizovanog antitela, po potrebi;

pri čemu režim doziranja indukuje klinički odgovor i kliničku remisiju inflamatorne bolesti creva kod pacijenta;

pri čemu je humanizovano anti-α4β7 antitelo vedolizumab, i

pri čemu je, dalje, inflamatorna bolest creva umereno do ozbiljno aktivan ulcerozni kolitis ili umereno do ozbiljno aktivna Kronova bolest.

[2] Humanizovano anti-α4β7 antitelo za upotrebu prema [1], pri čemu je kod pacijenta izostao adekvatan odgovor sa, došlo do gubitka odgovora na, ili nije podnosio lečenje sa najmanje jednim od, imunomodulatora, antagonista faktora nekroze tumora-alfa ili njihovim kombinacijama.

[3] Humanizovano anti-α4β7 antitelo za upotrebu prema [2], pri čemu je imunomodulator odabran iz grupe koja se sastoji od: oralnog azatioprina, 6-merkaptopurina i metotreksata.

[4] Humanizovano anti-α4β7 antitelo za upotrebu prema [1], pri čemu je inflamatorna bolest creva umereno do ozbiljno aktivan ulcerozni kolitis.

[5] Humanizovano anti-α4β7 antitelo za upotrebu prema [4], pri čemu režim doziranja rezultira izlečenjem sluzokože kod pacijenata koji pate od umereno do ozbiljno aktivnog ulceroznog kolitisa.

[6] Humanizovano anti-α4β7 antitelo za upotrebu prema [1], pri čemu je inflamatorna bolest creva umereno do ozbiljno aktivna Kronova bolest.

[7] Humanizovano anti-α4β7 antitelo za upotrebu prema [6], pri čemu režim doziranja rezultira indukcijom i održavanjem odgovora i remisije kod pacijenata sa umereno do ozbiljno aktivnom Kronovom bolešću.

[8] Humanizovano anti-α4β7 antitelo za upotrebu prema bilo kojoj od tačaka [1] do [7], pri čemu (i) režim doziranja rezultira smanjenjem, eliminacijom ili smanjenjem i eliminacijom upotrebe kortikosteroida od strane pacijenta i/ili (ii) pacijent je prethodno primao tretman sa najmanje jednim kortikosteroidom za inflamatornu bolest creva.

[9] Humanizovano anti-α4β7 antitelo za upotrebu prema [8], pri čemu je pacijent imao neadekvatan odgovor na kortikosteroide, gubitak odgovora na kortikosteroide ili nije podnosio kortikosteroide.

[10] Humanizovano anti-α4β7 antitelo za upotrebu prema bilo kojoj od tačaka [1] do [9], pri čemu se humanizovani imunoglobulin ili njegov antigen-vezujući fragment primenjuje kod pacijenta tokom 30 minuta.

[11] Humanizovano anti-α4β7 antitelo za upotrebu prema bilo kojoj od tačaka [1] do [10], pri čemu režim doziranja ne menja odnos CD4 i CD8 u cerebrospinalnoj tečnosti pacijenata koji primaju navedeni tretman.

[12] Humanizovano anti-α4β7 antitelo za upotrebu prema bilo kojoj od tačaka [1] do [11], pri čemu je pacijent osoba stara 65 godina, ili starija, i pri čemu, dalje, kod pacijenta nije neophodno bilo kakvo prilagođavanje režima doziranja.

[13] Humanizovano anti-α4β7 antitelo za upotrebu prema bilo kojoj od tačaka [1] do [12], pri čemu pacijent prima terapeutsku dozu konvencionalne terapije za inflamatornu bolest creva.

[14] Humanizovano anti-α4β7 antitelo za upotrebu prema bilo kojoj od tačaka [1] do [13], pri čemu se doza od 300 mg primenjuje kod humanog pacijenta svake četiri nedelje ako humani pacijent oseti vraćanje jednog ili više simptoma povezanih sa ulceroznim kolitisom ili Kronovom bolešću nakon primene humanizovanog anti-α4β7 antitela svakih osam nedelja.

[15] Farmaceutska formulacija koja sadrži humanizovano anti-α4β7 antitelo kao što je definisano u [1], za upotrebu prema [1].

Ovde je takođe otkrivena identifikacija neredukujućeg šećera i najmanje jedne aminokiseline, kao korisnih ekscipijenasa za formulisanje formulacija anti-α4β7 antitela čija nestabilnost ih čini podložnim deamidaciji, oksidaciji, izomerizaciji i/ili agregaciji. Formulacija poboljšava stabilnost, smanjuje formiranje agregata i usporava degradaciju antitela u njoj.

Dakle, u prvom aspektu, koristi se stabilna formulacija koja sadrži smešu neredukujućeg šećera, anti-α4β7 antitela i najmanje jedne slobodne aminokiseline, a molarni odnos neredukujućeg šećera i anti-α4β7 antitela (mol:mol) je veći od 600:1. Formulacija može da bude tečna formulacija ili suva formulacija (npr. liofilizovana). Formulacija takođe može da sadrži pufersko sredstvo. U nekim primerima izvođenja, neredukujući šećer je manitol, sorbitol, saharoza, trehaloza, ili bilo koja njihova kombinacija.

U nekim primerima izvođenja, slobodna aminokiselina u formulaciji je histidin, alanin, arginin, glicin, glutaminska kiselina, ili bilo koja njihova kombinacija. Formulacija može da sadrži između oko 50 mM do oko 175 mM slobodne aminokiseline. Formulacija može da sadrži između oko 100 mM do oko 175 mM slobodne aminokiseline. Molarni odnos slobodne aminokiseline i antitela može da bude najmanje 250:1.

Formulacija takođe može da sadrži surfaktant. Surfaktant može bda bude polisorbat 20, polisorbat 80, poloksamer ili bilo koja njihova kombinacija.

U nekim aspektima, formulacija može da smanju u najvećoj mogućoj meri imunogenost antiα4β7 antitela.

Formulacija, npr. u osušenom stanju, može da bude stabilna najmanje tri meseca na 40°C, 75% relativne vlažnosti (RH).

U drugom aspektu, formulacija je liofilizovana i sadrži najmanje oko 5% do oko 10% anti-α4β7 antitela pre liofilizacije. Formulacija može sadržati najmanje oko 6% anti-α4β7 antitela pre liofilizacije. Formulacija se može rekonstituisati iz liofilizovane formulacije (npr. rekonstituisana da sadrži stabilnu tečnu formulaciju).

U drugom aspektu, koristi se stabilna formulacija koja sadrži smešu neredukujućeg šećera, antiα4β7 antitela i najmanje jedne slobodne aminokiseline, a molarni odnos neredukujućeg šećera i anti-α4β7 antitela (mol:mol) je veći od 600:1 i odnos slobodne aminokiseline i anti-α4β7 antitela (mol:mol) je veći od 250:1.

U drugom aspektu, koristi se stabilna tečna formulacija koja se sastoji u vodenom rastvoru sa neredukujućim šećerom, anti-α4β7 antitelom i najmanje jednom slobodnom aminokiselinom, pri čemu je molarni odnos neredukujućeg šećera do anti-α4β7 antitela (mol:mol) veći od 600:1. U još daljem aspektu, tečna formulacija se koristi koja sadrži najmanje oko 40 mg/ml do oko 80 mg/ml anti-α4β7 antitela, najmanje oko 50-175 mM jedne ili više aminokiselina, i najmanje oko 6% do najmanje oko 10% (vtež./zap.) šećera. Tečna formulacija takođe može da sadrži pufersko sredstvo. U nekim primerima izvođenja, tečna formulacija takođe sadrži metalni helator. U nekim primerima izvođenja, tečna formulacija takođe sadrži antioksidans.

U drugom aspektu, koristi se tečna formulacija koja sadrži najmanje oko 60 mg/ml anti-α4β7 antitela, najmanje oko 10% (tež./zap.) neredukujućeg šećera i najmanje oko 125 mM jedne ili više slobodnih aminokiselina.

U drugom aspektu, koristi se tečna formulacija koja sadrži najmanje oko 60 mg/ml anti-α4β7 antitela, najmanje oko 10% (tež./zap.) neredukujućeg šećera i najmanje oko 175 mM jedne ili više slobodnih aminokiselina.

U joše jednom dodatnom aspektu, koristi se suva, npr. liofilizovana formulacija koja sadrži mešavinu neredukujućeg šećera, anti-α4β7 antitela, histidina, arginina i polisorbata 80. Pri čemu je formulacija u čvrstom obliku, a molarni odnos neredukujućeg šećera i anti-α4β7 antitela (mol:mol) je veći od 600:1.

U još jednom dodatnom aspektu, koristi se liofilizovana formulacija koja sadrži mešavinu neredukujućeg šećera, anti-α4β7 antitela, histidina, arginina i polisorbata 80. U ovom aspektu, molarni odnos neredukujućeg šećera i anti-α4β7 antitela (mol:mol) je veći od 600:1. Osim toga, molarni odnos arginina i anti-α4β7 antitela (mol:mol) u formulaciji je veći od 250: 1.

U drugom aspektu, ovde je opisan način izrade formulacije, koji obuhvata održavanje temperature proizvoda ispod temperature kolapsa tokom primarnog sušenja. Postupak može da sadrži korak žarenja.

U jednom aspektu, pronalazak se odnosi na humanizovano anti-α4β7 antitelo za upotrebu u postupku za terapeutsko lečenje inflamatorne bolesti creva kao što je definisano patentnim zahtevima, pri čemu se humanizovano anti-α4β7 antitelo primenjuje kod pacijenta u skladu sa režimom doziranja kako je definisano patentnim zahtevima.

U nekim aspektima upotreba u postupku lečenja formulacijom anti-α4β7 antitela, dozom ili režimom doziranja može minimizirati imunogenost anti-α4β7 antitela.

Moguće da je kod pacijenta izostao adekvatan odgovor na, da je došlo do gubitka odgovora na, ili nije podnosio lečenje sa najmanje jednim od, imunomodulatora, antagonista faktora nekroze tumora-alfa (TNF- α) ili njihovim kombinacijama.

Inflamatorna bolest creva može da bude Kronova bolest ili ulcerozni kolitis. Inflamatorna bolest creva može da bude umerena do ozbiljno aktivna ulcerozni kolitis.

Režim doziranja može da rezultira zarastanjem mukoze kod pacijenata koji pate od umereno do ozbiljno aktivnog ulceroznog kolitisa.

Moguće je da je pacijent prethodno primio tretman sa najmanje jednim kortikosteroidom za inflamatornu bolest creva. Režim doziranja može da dovede do smanjenja, eliminacije ili smanjenja i eliminacije upotrebe kortikosteroida od strane pacijenta.

U nekim aspektima, humanizovani imunoglobulin ili njegov antigen-vezujući fragment primenjuju se u konačnom doznom obliku u koncentraciji od između oko 1.0 mg/ml do oko 1.4 mg/ml. Humanizovani imunoglobulin ili njegov antigen-vezujući fragment mogu da se primenjuju u finalnom doznom obliku od oko 1.2mg/ml. Humanizovani imunoglobulin ili antigen-vezujući fragment može da se primenjuje kod pacijenta tokom 30 minuta.

Humanizovani imunoglobulin ili njegov antigen-vezujući fragment mogu da se rekonstituišu iz liofilizovane formulacije.

Humanizovani imunoglobulin ili njegov antigen-vezujući fragment mogu da se rekonstituišu tako da sadrže stabilnu tečnu formulaciju.

U nekim aspektima, režim doziranja ne menja odnos CD4 i CD8 u cerebrospinalnoj tečnosti pacijenata koji primaju navedeni tretman.

Pacijent može da bude osoba stara 65 godina, ili starija, i nije joj neophodo bilo kakvo prilagođavanje režima doziranja.

KRATAK OPIS CRTEŽA SL. 1 je ilustracija nukleotidne sekvence (SEQ ID NO:1) koja kodira teški lanac humanizovanog anti-α4β7 imunoglobulina, i izvedene aminokiselinske sekvence teškog lanca (SEQ ID NO:2). Nukleotidna sekvenca sadrži mesta kloniranja (mala slova), Kozak sekvencu (velika slova, nukleotidi 18-23 u SEQ ID NO:1) i lider sekvencu (mala slova, nukleotidi 24-86 u SEQ ID NO:1) na 5 'kraju teškog lanca. Otvoreni okvir čitanja nukleotidne sekvence su nukleotidi 24-1433 SEQ ID NO: 1.

SL. 2 je ilustracija nukleotidne sekvence (SEQ ID NO:3) koja kodira laki lanac humanizovanog imunoglobulina koji se ovde označava kao vedolizumab, i izvedene aminokiselinske sekvence (SEQ ID NO:4) lakog lanca. Nukleotidna sekvenca sadrži lokacije kloniranja (mala slova), Kozak sekvencu (velika slova, nukleotidi 18-23 iz SEQ ID NO: 3) i lider sekvencu (mala slova, nukleotidi 24-80 iz SEQ ID NO: 3) na 5 'kraju teškog lanca. Otvoreni okvir čitanja nukleotidne sekvence su nukleotidi 24-737 SEQ ID NO:3.

SL. 3 je poravnanje aminokiselinskih sekvenci (A) zrelog humanizovanog lakog lanca (aminokiseline 20-238 SEQ ID NO: 4) humanizovanog imunoglobulina koji se ovde naziva vedolizumab i (B) zrelog humanizovanog lakog lanca humanizovanog imunoglobulina koji se ovde naziva LDP-02 (SEQ ID NO: 5). (Što se tiče LDP-02, videti, WO 98/06248 i Feagan et al., N. Eng. J. Med.352: 2499-2507 (2005). Feagan et al. opisuju kliničku studiju LDP-02, ali u članku se LDP-02 označava kao MLN02.) Poravnanje ilustruje da se aminokiselinske sekvence lakih lanaca vedolizumaba i LDP-02 razlikuju na pozicijama 114 i 115 zrelih lakih lanaca.

SL. 4 je poravnanje aminokiselinskih sekvenci (A) generičkog humanog kapa lakog lanca konstantnog regiona (SEQ ID NO:6) i (B) generičkog mišjeg kapa konstantnog regiona lakog lanca (SEQ ID NO:7). Aminokiselinski ostaci Thr i Val (koji su prisutni na pozicijama 114 i 115 zrelog lakog lanca vedolizumaba (aminokiseline 133 i 134 SEQ ID NO: 4)) prisutni su u konstantnom regionu humanog kapa lakog lanca, dok su aminokiselinski ostaci Ala i Asp (koji su prisutni na pozicijama 114 i 115 zrelog LDP-02 lakog lanca (SEQ ID NO: 5)) prisutni u konstantnom regionu lakog lanca miša kapa.

SL. 5 je mapa vektora pLKTOK38D (koji je označen i kao pTOK38MLN02-TV), koji kodira humanizovani teški lanac i humanizovani laki lanac MLN02, i pogodan je za proizvodnju vedolizumaba u CHO ćelijama. (Videti objavu SAD patentne prijave br.2004/0033561 A1 koja otkriva pLKTOK38. pLKTOK38D je varijanta pLKTOK38 kod koga mesta restrikcije naznačene na mapi ograničavaju sekvencu koja kodira varijabilni region lakog lanca.) SL. 6A prikazuje predviđene modele za promenu procenta monomera, promenu procentualnog agregata i promenu procentualne glavne izoforme anti-α4β7 liofilizovane formulacije. Modeli su zasnovani na statističkoj analizi podataka predstavljenih u primeru 1. Središnja linija prikazuje rezultate za prediktivne modele, a spoljašnje linije prikazuju 95% granice pouzdanosti za prediktivne modele SL.6 B prikazuje alternativne modele koji se zasnovaju na statističkoj analizi podataka za 40°C iz tabela 1-3 kada su ulazni faktori pH, molarni odnos šećer:protein i molarni odnos arginin:protein. Središnja linija prikazuje rezultate za prediktivne modele, a spoljašnje linije prikazuju 95% granice pouzdanosti za prediktivne modele.

SL. 7 prikazuje aminokiselinske sekvence (A) zrelog varijabilnog regiona kapa lakog lanca humanog GM607'CL antitela i (B) varijabilnog regiona teškog lanca humanog 21/28'CL. SL. 8 je grafikon koji pokazuje da čvrste materije i napunjenost utiču na vreme sušenja (brojevi u linijama predstavljaju broj minuta vremena sušenja).

SL. 9 je grafikon koji pokazuje da vedolizumab nije odložio pojavu kliničkih simptoma eksperimentalnog autoimunog encefalomijelitisa (EAE) u poređenju sa placebo kontrolom. Natalizumab je značajno (p< 0.05) odložio pojavu kliničkih simptoma EAE u poređenju sa placebo kontrolom.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

Pronalazak je definisan priloženim patentnim zahtevima, i svi drugi aspekti ili primeri izvođenja koja nisu u skladu sa patentnim zahtevima su dati samo u cilju informisanja.

Pronalazak se odnosi na formulacije za upotrebu koje sadrže anti-α4β7 antitela. Formulacije mogu biti smeše koje sadrže neredukujući šećer, anti-α4β7 antitelo i jednu ili više slobodnih aminokiselina, a molarni odnos neredukujućeg šećera i anti-α4β7 antitela je veći od 600 mola neredukujućeg šećera: 1 mol anti-α4β7 antitelo. Formulacije mogu biti u čvrstom ili tečnom obliku.

Definicije

Termin "farmaceutska formulacija" odnosi se na preparat koji sadrži anti-α4β7 antitelo u takvom obliku da omogući biološku aktivnost antitela da bude efikasna, i koji ne sadrži dodatne komponente koje su neprihvatljivo toksične za subjekta na koji bi se formulacija primenjivala. "Stabilna" formulacija je ona u kojoj antitelo u njoj značajno zadržava svoju fizičku stabilnost i/ili hemijsku stabilnost i/ili svoju biološku aktivnost nakon skladištenja. U jednom aspektu, formulacija značajno zadržava svoju fizičku i hemijsku stabilnost, kao i svoju biološku aktivnost nakon skladištenja. Period skladištenja se obično bira na osnovu predviđenog roka trajanja formulacije. Različite analitičke tehnike za merenje stabilnosti proteina dostupne su u stanju tehnike i njihov pregled je dat u Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991) i Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90 (1993), na primer.

"Deamidovano" monoklonsko antitelo je ono u kojem je jedan ili više asparaginskih ili glutaminskih ostataka derivatizovano, npr. u asparaginsku kiselinu ili izo-asparaginsku kiselinu.

Antitelo koje je "podložno deamidaciji" je ono koje sadrži jedan ili više ostataka za koje je utvrđeno da su skloni da se deamiduju.

Antitelo koje je "podložno deamidaciji" je ono koje sadrži jedan ili više ostataka za koje je utvrđeno da su skloni deamidatu.

Antitelo koje je "podložno agregaciji" je ono za koje je utvrđeno da se agregira sa drugim molekulima antitela, posebno nakon zamrzavanja, zagrevanja, sušenja, rekonstituacije i/ili agitacije.

Antitelo koje je "podložno fragmentaciji" je ono za koje je utvrđeno da se cepa na dva ili više fragmenata, na primer u zglobnom regionu.

"Smanjenjem deamidacije, oksidacije, agregacije ili fragmentacije" ima za cilj da znači sprečavanje ili smanjenje (npr. Na 80%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20% ili 10%) količine deamidacije, agregacije ili fragmentacije u odnosu na monoklonsko antitelo formulisano na različitom pH ili u drugom puferu.

"Agregat", "SEC agregat" ili "rastvorljivi agregat" je više od jednog i manje ili jednako deset proteina antitela i/ili fragmenata međusobno povezanih bilo kovalentnim, bilo jonskim ili hidrofobnim interakcijama, kako bi se formiralo veće proteinsko telo.

"Nerastvorni agregat" ili "čestica" je više od deset proteina antitela i/ili fragmenata međusobno povezanih bilo kovalentnim, bilo jonskim ili hidrofobnim interakcijama, kako bi se formiralo veće proteinsko telo.

Kao što se ovde koristi, "biološka aktivnost" monoklonskog antitela odnosi se na sposobnost antitela da se veže za antigen i rezultira merljivim biološkim odgovorom koji se može meriti in vitro ili in vivo. Takva aktivnost može da bude antagonistička ili agonistička.

Molekul ćelijske površine, "α4β7 integrin" ili "α4β7", je heterodimer lanca α4(CD49D, ITGA4) i lanca β7(ITGB7). Svaki lanac može da formira heterodimer sa alternativnim integrinskim lancem, da formira α4β1ili αEβ7. B i T limfociti, posebno memorijski CD4+ limfociti eksprimiraju humane α4i β7gene (GenBank (National Center for Biotechnology Information, Bethesda, MD) RefSeq pristupni brojevi NM_000885 i NM_000889, redom). Tipično za mnoge integrine, α4β7 može da postoji u stanju mirovanja ili aktiviranom stanju.Ligandi za α4β7 uključuju molekul adhezije vaskularnih ćelija (VCAM), fibronektin i mukozni adresin (MAdCAM (npr. MAdCAM-1)).

Kao što se ovde koristi, humani imunoglobulin ili njegov antigen-vezujući fragment koji ima "specifičnost vezivanja za α4β7 kompleks" vezuje se za α4β7, ali ne i za α4β1 ili αEB7.

Kao što se ovde koristi, "izotonična" formulacija ima suštinski isti osmotski pritisak kao i ljudska krv. Izotonične formulacije će generalno imati osmotski pritisak od oko 250 do 350 mOsm. Izotoničnost se može meriti korišćenjem pritiska pare ili osmometra tipa zamrzavanja ledom, na primer.

Kao što se ovde koristi, "pufersko sredstvo" se odnosi na pufer koji se odupire promenama pH dejstvom svojih kiselinsko-baznih konjugovanih komponenti. Pufersko sredstvo može da bude prisutno u tečnoj ili čvrstoj formulaciji za upotrebu prema pronalasku. Pufersko sredstvo podešava pH formulacije na oko 5.0 do oko 7.5, na oko 5.5 do oko 7.5, na oko 6.0 do oko 6.5 ili na pH od oko 6.3. U jednom aspektu, primeri puferskih sredstava koji će kontrolisati pH u opsegu od 5.0 do 7.5 uključuju acetat, sukcinat, glukonat, histidin, citrat, fosfat, maleat, kakodilat, 2- [N-morfolino] etanosulfonsku kiselinu (MES), bis (2-hidroksietil) iminotris [hidroksimetil] metan (Bis-Tris), N- [2-acetamido] -2-iminodiacetatnu kiselinu (ADA), glicilglicin i druge pufere organskih kiselina. U drugom aspektu, pufersko sredstvo ovde je histidin ili citrat.

"Histidinski pufer" je pufer koji sadrži histidinske jone. Primeri histidinskih pufera uključuju histidin hlorid, histidin acetat, histidin fosfat, histidin sulfat rastvore. Histidinski pufer ili histidin-HCl pufer ima pH između oko pH 5.5 do 6.5, oko pH 6.1 do 6.5 ili oko pH 6.3.

"Saharid" ovde je jedinjenje koje ima opštu formulu (CH2O)ni njegovi derivati, uključujući monosaharide, disaharide, trisaharide, polisaharide, šećerne alkohole, redukujuće šećere, neredukujuće šećere i slično. U jednom aspektu, primeri saharida ovde uključuju glukozu, saharozu, trehalozu, laktozu, fruktozu, maltozu, dekstran, eritritol, glicerol, arabitol, silitol, sorbitol, manitol, melibiozu, melezitozu, rafinozu, manotriozu, stahiozu, maltozu, laktulozu, maltuloza, glucitol, maltitol, laktitol, izo-maltulozu i slično. Saharid može da bude lioprotektant. U drugom aspektu, saharid ovde je neredukujući disaharid, kao što je saharoza. "Surfaktant" ovde se odnosi na sredstvo koje smanjuje površinski napon tečnosti. Surfaktant može da bude nejonski surfaktant. U jednom aspektu, primeri surfaktanata ovde uključuju polisorbat (polioksietilen sorbitan monolaurat, na primer, polisorbat 20 i, polisorbat 80); TRITON (t-oktilfenoksipolietoksietanol, nejonski deterdžent, Union Carbide podružnica Dow Chemical Co., Midland MI); natrijum dodecil sulfat (SDS); natrijum laurel sulfat; natrijum oktil-glikozid; lauril-, miristil-, linoleil- ili stearil-sulfobetain; lauril-, miristil-, linoleil- ili stearil-sarkozin; linoleil-, miristil- ili cetil-betain; lauroamidopropil-, kokamidopropil-, linoleamidopropil-, miristamidopropil-, palmidopropil-, ili izostearamidopropil-betain (npr. lauroamidopropil); miristamidopropil-, palmidopropil- ili izostearamidopropil-dimetilamin; natrijum metil kokoil-, ili dinatrijum metil oleil-taurat; sorbitan monopalmitat; i MONAQUAT serija (Mona Industries, Inc., Paterson, N.J.); polietil glikol (PEG), polipropilen glikol (PPG) i kopolimeri poloksietilen i poloksipropilen glikola (npr. Pluronics/Poloxamer, PF68 itd.); itd. U drugom aspektu, surfaktant je polisorbat 80.

Termin "antitelo" ovde se koristi u najširem smislu i posebno pokriva monoklonska antitela pune dužine, imunoglobuline, poliklonska antitela, multispecifična antitela (npr. bispecifična antitela) formirana od najmanje dva antitela pune dužine, na primer, svaki na drugačiji antigen ili epitop, i pojedinačnih fragmenata vezanja antigena, uključujući dAbs, scFv, Fab, F (ab)'2, Fab', uključujući humana, humanizovana i antitela iz ne-humanih vrsta i rekombinantnih oblika vezivanja antigena kao što su monotela i dijatela.

Molarne količine i odnos anti-α4β7 antitela prema drugim pomoćnim supstancama opisanim ovde izračunavaju se pod pretpostavkom približne molekulske težine od oko 150000 daltona za antitelo. Stvarna molekulska težina antitela može se razlikovati od 150000 daltona, u zavisnosti od sastava aminokiselina ili posttranslacione modifikacije, npr. u zavisnosti od ćelijske linije koja se koristi za eksprimiranje antitela. Stvarna molekulska težina antitela može da bude /-5% od 150000 daltona.

Termin "humano antitelo" uključuje antitelo koje poseduje sekvencu koja je izvedena iz sekvence imunoglobulina ljudske zametne linije, kao što je antitelo izvedeno od transgenih miševa koji imaju ljudske imunoglobulinske gene (npr. XENOMOUSE genetski modifikovani miševi (Abgenix, Fremont, CA), HUMABMOUSE<®>, KIRIN TC MOUSE™ transhromozomski miševi, KMMOUSE<®>(MEDAREX, Princeton, NJ)), biblioteke za prikaz humanih faga, ćelije humanog mijeloma ili humane B ćelije.

Termin "monoklonsko antitelo" kako se ovde koristi odnosi se na antitelo dobijeno iz populacije suštinski homogenih antitela, tj. pojedinačna antitela koja čine populaciju su identična i/ili vezuju isti epitop, osim mogućih varijanti koje mogu nastati tokom proizvodnje monoklonskog antitela, a takve varijante su uglavnom prisutne u manjim količinama. Za razliku od preparata poliklonskih antitela koji obično uključuju različita antitela usmerena protiv različitih determinanti (epitopa), svako monoklonsko antitelo je usmereno protiv jedne determinante na antigenu. Modifikator "monoklonski" ukazuje na karakter antitela kao dobijenog iz suštinski homogene populacije antitela, i ne treba ga tumačiti kao da zahteva proizvodnju antitela bilo kojom određenom metodom. Na primer, monoklonska antitela koja se koriste u skladu sa ovim pronalaskom mogu biti napravljena metodom hibridoma koju su prvi put opisali Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975), ili se može napraviti metodama rekombinantne DNK (videti, na primer, SAD pat. br. 4,816,567). "Monoklonska antitela" takođe mogu biti izolovana iz biblioteka fagnih antitela koristeći tehnike opisane u Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991) i Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991), na primer.

Monoklonska antitela ovde posebno uključuju "himerna" antitela u kojima je deo teškog i/ili lakog lanca identičan ili homologan odgovarajućim sekvencama u antitelima izvedenim iz određene vrste ili pripada određenoj klasi ili podklasi antitela, dok je ostatak lanca (a) identičan ili homologan odgovarajućim sekvencama u antitelima izvedenim iz druge vrste ili pripada drugoj klasi ili podklasi antitela, kao i fragmenti takvih antitela, sve dok pokazuju željenu biološku aktivnost (SAD pat. br. 4,816,567; i Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984) ). Himerna antitela od interesa uključuju "primatizovana" antitela koja sadrže antigen-vezujuće sekvence varijabilnog domena izvedene iz ne-humanog primata (npr. majmun Starog sveta, veliki majmun itd.) i sekvence humanih konstantnih regiona.

"Antigen-vezujući fragmenti" humanizovanog imunoglobulina pripremljenog u formulaciji za upotrebu prema pronalasku obuhvataju najmanje varijabilne regione teških i/ili lakih lanaca anti-α4β7 antitela. Na primer, fragment vedolizumaba koji vezuje antigen sadrži aminokiselinske ostatke 20-131 humanizovane sekvence lakog lanca SEQ ID NO: 4. Primeri takvih antigena-vezujućih fragmenata uključuju Fab fragmente, Fab' fragmente, scFv i F(ab')2fragmente humanizovanog imunoglobulina poznatog u stanju tehnike. Fragmenti humanizovanog imunoglobulina koji vezuju antigen za upotrebu prema pronalasku mogu se proizvesti enzimskim cepanjem ili rekombinantnim tehnikama. Na primer, cepanje papainom ili pepsinom može da se koristi za generisanje Fab ili F(ab')2fragmenata, redom. Antitela se takođe mogu proizvesti u različitim skraćenim oblicima koristeći gene antitela u kojima je uveden jedan ili više stop kodona uzvodno od prirodnog mesta zaustavljanja. Na primer, rekombinantna konstrukt koji kodira teški lanac fragmenta F(ab')2može da bude dizajnirana da uključi DNK sekvence koje kodiraju CHIdomen i zglobni region teškog lanca. U jednom aspektu, antigen-vezujući fragmenti inhibiraju vezivanje α4β7 integrina za jedan ili više njegovih liganda (npr. mukozni adresin u MAdCAM (npr. MAdCAM-1), fibronektin).

Papainska digestija antitela proizvodi dva identična fragmenta vezivanja antigena, nazvana "Fab" fragmenti, svaki sa jednim mestom vezivanja antigena, i rezidualnim "Fc" fragmentom, čije ime odražava njegovu sposobnost da se lako kristalizuje. Tretman pepsinom daje fragment F(ab')2koji ima dva mesta vezivanja antigena i još uvek je sposoban za umrežavanje antigena. "Fv" je fragment antitela koji se sastoji od dimera jednog varijabilnog domena teškog lanca i jednog varijabilnog domena lakog lanca u nekovalentnoj asocijaciji.

Fab fragment takođe sadrži konstantan domen lakog lanca i prvi konstantni domen (CH1) teškog lanca. Fab' fragmenti se razlikuju od Fab fragmenata po dodavanju nekoliko ostataka na karboksi kraju teškog lanca CH1 domena, uključujući jedan ili više cisteina iz regiona zgloba antitela. Fab'-SH je oznaka ovde za Fab' u kojoj cisteinski ostaci konstantnih domena nose najmanje jednu slobodnu tiolnu grupu. Fragmenti antitela F(ab')2prvobitno su proizvedeni kao parovi fragmenata Fab ' koji imaju cisteinske zglobove između njih. Poznate su i druge hemijske spojnice fragmenata antitela.

"Jenolančani Fv" ili "scFv" fragmenti antitela sadrže VHi VLdomene antitela, pri čemu su ovi domeni prisutni u jednom polipeptidnom lancu. U jednom aspektu, Fv polipeptid dalje sadrži polipeptidni linker između VHi VLdomena koji omogućava scFv da formira željenu strukturu za vezivanje antigena. Pregled za scFv može da se nađe kod autora Pluckthun u The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp.269-315 (1994).

Termin "dijatela" se odnosi na male fragmente antitela sa dva mesta vezivanja antigena, koji fragmenti sadrže varijabilni teški domen (VH) povezan sa varijabilnim lakim domenom (VL) u istom polipeptidnom lancu (VH-VL). Korišćenjem linkera koji je prekratak da bi omogućio uparivanje između dva domena na istom lancu, domeni su primorani da se uparuju sa komplementarnim domenima drugog lanca i kreiraju dva mesta za vezivanje antigena. Dijatela su detaljnije opisana u, na primer, EP 404,097; WO 93/11161; i Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993).

"Antitelo pune dužine" je ono antitelo koje sadrži antigen-vezujući varijabilni region, kao i konstantni domen lakog lanca (CL) i konstantne domene teškog lanca, CH1, CH2i CH3. Konstantni domeni mogu da budu konstantni domeni nativne sekvence (npr. konstantni domeni humane nativne sekvence) ili varijante njihove aminokiselinske sekvence. U jednom aspektu, antitelo pune dužine ima jednu ili više efektorskih funkcija.

Antitelo sa "varijantom aminokiselinske sekvence" ovde je antitelo sa aminokiselinskom sekvencom koja se razlikuje od antitela glavne vrste. Obično, varijante aminokiselinske sekvence će posedovati najmanje oko 70%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, ili najmanje oko 95% homologije sa antitelom glavne vrste. Varijante aminokiselinske sekvence poseduju supstitucije, delecije i/ili dodatke na određenim pozicijama unutar ili pored aminokiselinske sekvence glavnog antitela vrste, ali zadržavaju aktivnost vezivanja antigena. Varijacije u redosledu konstantnih regiona antitela će imati manji uticaj na aktivnost vezivanja antigena od varijacija u varijabilnim regionima. U varijabilnim regionima, varijante aminokiselinske sekvence će biti najmanje oko 90% homologne, najmanje oko 95% homologne, najmanje oko 97% homologne, najmanje oko 98% homologne, ili najmanje oko 99% homologne sa glavnim antitelom vrste.

"Homologija" je definisana kao procenat ostataka u varijanti aminokiselinske sekvence koji su identični nakon usklađivanja sekvenci i uvođenja praznina, ako je potrebno, da bi se postigao maksimalni procenat homologije. Metode i kompjuterski programi za poravnavanje su dobro poznati u stanju tehnike.

"Terapijsko monoklonsko antitelo" je antitelo koje se koristi za terapiju humanog subjekta. Terapeutska monoklonska antitela koja su ovde otkrivena uključuju anti-α4β7 antitela.

Antitelo "glikozilacija varijanta" ovde je antitelo sa jednim ili više ugljenih hidrata koji su vezani za njega koji se razlikuju od jednog ili više ugljenih hidrata vezanih za glavnu vrstu antitela. Primeri varijanti glikozilacije ovde uključuju antitela sa G1 ili G2 oligosaharidnom strukturom, umesto G0 oligosaharidne strukture, vezane za njegovu Fc regiju, antitelo sa jednim ili dva ugljena hidrata vezana za jedan ili dva laka lanca, antitelo bez ugljenih hidrata vezanih za jedan ili dva teška lanca antitela, itd, i kombinacije promena glikozilacije.

Antitelo "efektorske funkcije" se odnose na one biološke aktivnosti koje se mogu pripisati Fc regionu (izvorna sekvenca Fc region ili aminokiselinska sekvenca varijanta Fc region) antitela. Primeri efektorskih funkcija antitela uključuju vezivanje C1q; komplement zavisna citotoksičnost; vezivanje Fc receptora; citotoksičnost posredovana ćelijama zavisna od antitela (ADCC); fagocitoza; dole regulacija receptora ćelijske površine (npr. B ćelijski receptor; BCR), i slično.

U zavisnosti od aminokiselinske sekvence konstantnog domena njihovih teških lanaca, antitela pune dužine mogu se dodeliti različitim "klasama". Postoji pet glavnih klasa antitela pune dužine: IgA, IgD, IgE, IgG i IgM, a nekoliko njih se može dalje podeliti na "podklase" (izotipove), npr. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA i IgA2. Konstantni domeni teškog lanca koji odgovaraju različitim klasama antitela nazivaju se α, δ, ε, γ i μ, respektivno. Strukture podjedinica i trodimenzionalne konfiguracije različitih klasa imunoglobulina su dobro poznate. "Laki lanci" antitela iz bilo koje vrste kičmenjaka mogu se dodeliti jednom od dva jasno različita tipa, nazvana kapa (κ) i lambda (λ), na osnovu aminokiselinskih sekvenci njihovih konstantnih domena.

"Citotoksičnost posredovana ćelijama zavisna od antitela" i "ADCC" odnose se na ćelijsku posredovanu reakciju u kojoj nespecifične citotoksične ćelije koje eksprimiraju Fc receptore (FcR) (npr. ćelije prirodne ubice (NK), neutrofili i makrofagi) prepoznaju vezano antitelo na ciljnoj ćeliji i potom uzrokuju lizu ciljne ćelije. Primarne ćelije za posredovanje ADCC, NK ćelije, eksprimiraju samo FcγRIII, dok monociti eksprimiraju FcγRI, FcγRII i FcγRIII. FcR ekspresija na hematopoetskim ćelijama je sažeta u tabeli 3 na strani 464 u publikaciji Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991). Da bi se procenila ADCC aktivnost molekula od interesa, može se izvršiti in vitro ADCC test, kao što je opisano u SAD pat. br.5,500,362 ili 5,821,337. Korisne efektorske ćelije za takve testove uključuju mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) i ćelije prirodne ubice (NK). Alternativno, ili dodatno, ADCC aktivnost molekula od interesa može se proceniti in vivo, na primer, u životinjskom modelu kao što je onaj koji je otkriven u Clines et al. PNAS (SAD) 95: 652-656 (1998) .

Termini "Fc receptor" ili "FcR" se koriste za opisivanje receptora koji se vezuje za Fc region antitela. U jednom aspektu, FcR je nativna sekvenca humanog FcR. U drugom aspektu, FcR je onaj receptor koji vezuje IgG antitelo (gama receptor) i uključuje podklase receptora FcγRI, FcγRII i FcγRIII, uključujući alelne varijante i alternativno splajsovane forme ovih receptora. FcγRII receptori uključuju FcγRIIA ("aktivirajući receptor") i FcγRIIB ("inhibirajući receptor"), koji imaju slične aminokiselinske sekvence koje se primarno razlikuju po svojim citoplazmatskim domenima. Aktivirajući receptor FcγRIIA u svom citoplazmatskom domenu sadrži imunoreceptorski aktivirajući motiv na bazi tirozina (ITAM). Aktivirajući receptor FcγRIIB u svom citoplazmatskom domenu sadrži imunoreceptorski inhibirajući motiv na bazi tirozina (ITIM). (Videti pregled u M. Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)). Pregled za FcR je dat u publikaciji Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9: 457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4: 25-34 (1994) ; i de Haas et al., J. Lab. Clin. Med.126:33-41 (1995). Ostali FcR receptori, uključujući i one koji će biti identifikovani u budućnosti, obuhvaćeni su ovde terminom "FcR". Termin takođe uključuje neonatalni receptor, FcRn, koji je odgovoran za prenos materinskih IgG fetusu (Guyer et al., J. Immunol.117:587 (1976) i Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)).

Termin "hipervarijabilni region" kada se ovde koristi odnosi se na aminokiselinske ostatke antitela koji su odgovorni za vezivanje antigena. Hipervarijabilni region generalno sadrži aminokiselinske ostatke iz "regiona koji određuje komplementarnost" ili "CDR" (npr. ostaci 24-34 (L1), 50-56 (L2) i 89-97 (L3) u domenu varijabilnog lakog lanca i 31-35 (H1), 50-65 (H2) i 95-102 (H3) u domenu varijabilnog teškog lanca; Kabat et al., Sekvence proteina imunološkog interesa, 5. izdanje. Javna zdravstvena služba, Nacionalni instituti za zdravlje, Bethesda, Md. (1991) i/ili oni ostaci iz "hipervarijabilne petlje" (npr. Ostaci 26-32 (L1), 50-52 (L2) i 91-96 (L3) u domenu varijabilnog lakog lanca i 26-32 (H1), 53-55 (H2) i 96-101 (H3) u domenu varijabilnog teškog lanca; Chothia i Lesk J. Mol. Biol.196: 901-917 (1987) ). "Okvirni region" ili "FR" ostaci su oni ostaci varijabilnog domena koji nisu ostaci hipervarijabilnog regiona kao što je ovde definisano. Hipervarijabilni region ili CDR regioni mogu se preneti iz jednog lanca antitela u drugi ili na drugi protein kako bi se antigen vezujuća specifičnost prenela na dobijeno (kompozitno) antitelo ili vezujući protein.

"Humanizovani" oblici ne-humanih (npr. glodarskih) antitela su himerna antitela koja sadrže minimalnu sekvencu izvedenu iz ne-humanog imunoglobulina. U najvećem delu, humanizovana antitela su humani imunoglobulini (recipijentno antitelo) u kojima se ostaci iz hipervarijabilnog regiona primaoca zamenjuju ostacima iz hipervarijabilnog regiona ne-ljudske vrste (donorsko antitelo) kao što su miš, pacov, zec ili ne-humani primat koji imaju željenu specifičnost, afinitet i kapacitet. U nekim slučajevima, ostaci okvirnog regiona (FR) humanog imunoglobulina zamenjuju se odgovarajućim ne-humanim ostacima. Štaviše, humanizovana antitela mogu da sadrže ostatke koji se ne nalaze u recipijentnom antitelu ili u donorskom antitelu. Ove modifikacije su napravljene kako bi se dodatno rafinirale performanse antitela. Generalno, humanizovano antitelo će sadržavati u suštini sve od najmanje jednog, a obično dva varijabilna domena, u kojima sve ili suštinski sve hipervarijabilne petlje odgovaraju onima nehumanog imunoglobulina, a svi ili suštinski svi FR su oni humane imunoglobulinske sekvence. Humanizovano antitelo opciono će takođe sadržavati najmanje deo imunoglobulina konstantne regije (Fc), obično humanog imunoglobulina. Za više detalja, pogledati publikacije Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); i Presta, Curr. Op. Struct. Biol.2:593-596 (1992).

"Afinitetno-zrelo" antitelo je ono sa jednom ili više promena u jednom ili više hipervarijabilnih regiona koje rezultiraju poboljšanjem afiniteta antitela za antigen, u poređenju sa parentalnim antitelom koje ne poseduje tu promenu(e). U jednom aspektu, afinitetno-zrela antitela će imati nanomolarne ili čak pikomolarne afinitete za ciljni antigen. Antitela sazrela afiniteta proizvode se postupcima poznatim u ovoj oblasti. Marks et al. Bio / Tehnologija 10: 779-783 (1992) sazrevanje afiniteta od VH i VL domena mešanja. Slučajna mutageneza CDR i/ili okvirnih ostataka je opisana: Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sci, SAD 91: 3809-3813 (1994) ; Schier et al. Gene 169: 147-155 (1995) ; Ielton et al. J. Immunol.155:1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995); i Havkins et al., J. Mol. Biol.226:889-896 (1992).

"Izolovano" antitelo je ono koje je identifikovano i odvojeno i/ili oporavljeno od komponente svog prirodnog okruženja. U određenim izvođenjima, antitelo će biti prečišćeno (1) na više od 95% po težini proteina kao što je određeno Louri metodom, i alternativno, više od 99% po težini, (2) do stepena dovoljnog da dobije najmanje 15 ostataka N-terminalne ili unutrašnje aminokiselinske sekvence upotrebom predenje čaše sekvenatora, ili (3) do homogenosti od SDS-SPAGE pod redukujućim ili neredukujućim uslovima koristeći Coomassie plavu ili srebrnu boju. Izolovano antitelo uključuje antitelo in situ u rekombinantnim ćelijama, jer najmanje jedna komponenta prirodnog okruženja antitela neće biti prisutna. Obično, međutim, izolovano antitelo će biti pripremljeno najmanje jednim korakom prečišćavanja.

"Lečenje" se odnosi i na terapijski tretman i na profilaktičke ili preventivne mere. Oni kojima je potrebno lečenje uključuju one koji su već sa bolešću, kao i one kod kojih treba sprečiti bolest ili njen recidiv. Dakle, pacijent koji se ovde leči može biti dijagnostikovan kao da ima bolest ili može biti predisponiran ili podložan bolesti. Termini "pacijent" i "subjekt" se ovde koriste naizmenično.

Antitelo koje je formulisano je u suštini čisto i poželjno suštinski homogeno (tj. bez kontaminirajućih proteina itd.). "Suštinski čisto" antitelo označava kompoziciju koji sadrži najmanje oko 90% antitela po težini, na osnovu ukupne težine proteina u kompoziciji, najmanje oko 95% ili 97% po težini. "Suštinski homogeno" antitelo označava kompoziciju koja sadrži protein u kojem je najmanje oko 99% težine proteina specifično antitelo, npr. anti-α4β7 antitelo, na bazi ukupne težine proteina.

"Klinička remisija" kako se ovde koristi u odnosu na subjekte sa ulceroznim kolitisom odnosi se na kompletan Mayo skor od 2 ili manje poena i nijedan pojedinačni podrezultat veći od 1 poena. Kronova bolest "klinička remisija" odnosi se na CDAI rezultat od 150 poena ili manje. "Klinički odgovor" koji se ovde koristi u odnosu na subjekte sa ulceroznim kolitisom odnosi se na smanjenje kompletnog Mayo skora od 3 ili više poena i 30% od osnovne vrednosti, (ili delimični Mayo skor od 2 ili više poena i 25% ili više od početne linije, ako kompletan Mayo skor nije izvršen u poseti) sa subskorom za prateće smanjenje rektalnog krvarenja od 1 ili više poena ili apsolutnog rezultata rektalnog krvarenja 1 ili manje tačka. "Klinički odgovor" kako se ovde koristi u odnosu na subjekte Kronove bolesti odnosi se na 70 poena ili veće smanjenje CDAI skora u odnosu na osnovnu liniju (nedelja 0).

"Izlečenje mukoze" kako se ovde koristi u odnosu na subjekte sa ulceroznim kolitisom, odnosi se na endoskopski subskor od 1 poena ili manje.

Kako se ovde koristi, "neuspeh lečenja" se odnosi na pogoršanje bolesti, potrebu za lekovima za spašavanje ili hirurškim intervencijama za lečenje ulceroznog kolitisa ili Kronove bolesti. Lek za spašavanje je bilo koji novi lek ili bilo kakvo povećanje doze osnovnog leka potrebnog za lečenje novih ili nerešenih simptoma ulceroznog kolitisa ili Kronove bolesti (osim antidijareje za kontrolu hronične dijareje).

Formulacije

Kao što je ovde opisano, otkriveno je da su anti-α4β7 antitela veoma stabilna kada su u suvoj, npr. liofilizovanoj formulaciji sa viškom (na bazi molova) neredukujućeg šećera. Konkretno, liofilizovane formulacije u kojima je odnos neredukujućeg šećera i anti-α4β7 antitela (mol:mol) veći od 600:1 su ovde pokazale da su stabilne najmanje 2 godine.

Ovaj pronalazak koristi, u prvom aspektu, stabilnu formulaciju anti-α4β7 antitela. U jednom aspektu, formulacija sadrži pufer, najmanje jedan stabilizator i anti-α4β7 antitelo. U jednom aspektu, suva formulacija sadrži jedan ili više ne-redukujućih šećera i anti-α4β7 antitela, pri čemu je odnos neredukujućeg šećera i anti-α4β7 antitela (mol:mol) veći od 600:1. Formulacija takođe sadrži jednu ili više slobodnih aminokiselina. Jedna ili više aminokiselina takođe može da deluje kao pufer. U jednom aspektu, jedna ili više aminokiselina može da deluje kao stabilizator. Formulacija može opciono dalje obuhvatati najmanje jedan surfaktant. U jednom primeru izvođenja, formulacija je suva, na primer, liofilizovana. Antitelo u formulaciji može da bude antitelo pune dužine ili njegov antigen-vezujući fragment, kao što je fragment Fab, Fv, scFv, Fab' ili F(ab')2.

Formulacija može da sadrži bilo koji željeni neredukujući šećer. U jednom aspektu, neredukujući šećeri koji se mogu uključiti u formulaciju uključuju, na primer, manitol, sorbital, saharoza, trehaloza, rafinoza, stahioza, melezitoza, dekstran, maltitol, laktitol, izomaltuloza, palatinit i njihove kombinacije. U drugom aspektu, neredukujući šećeri su saharoza, trehaloza, manitol i sorbitol. Apsolutna količina neredukujućeg šećera u formulaciji nije kritična, ali odnos neredukujućeg šećera prema anti-α4β7 antitelu (mol:mol) je veći od 400: 1 U drugom aspektu, odnos neredukujućeg šećera i anti-α4β7 antitela (mol:mol) je najmanje oko 600:1; najmanje oko 625:1; najmanje oko 650:1; najmanje oko 675:1, najmanje oko 700:1; najmanje oko 750:1, najmanje oko 800:1, najmanje oko 1000:1, najmanje oko 1200:1, najmanje oko 1400:1, najmanje oko 1500:1, najmanje oko 1600:1, najmanje oko 1700:1, najmanje oko 1800:1, najmanje oko 1900:1, ili barem oko 2000:1. Generalno, poželjno je da je ne-redukujući šećer prisutan u količini koja smanjuje rastvorljivu formaciju agregata u tečnoj formulaciji, kao što je formiranje agregata koji se javlja nakon zamrzavanja i odmrzavanja i/ili sušenja i rekonstitucije. Odnos neredukujućeg šećera i anti-α4β7 antitela (mol:mol) veći od oko 730:1 može da da blago smanjenu rastvorljivu formaciju agregata u liofilizovanom stanju. Težinski odnos šećera i proteina može da bude veći od 1.5:1 (tež./tež.). U drugom aspektu, koncentracije neredukujućeg šećera za tečne (npr. pre sušenja ili post-rekonstitucije) formulacije su u opsegu od oko 10 mM do oko 1 M, na primer, od oko 60 mM do oko 600 mM, oko 100 mM do oko 450 mM, oko 200 mM do oko 350 mM, oko 250 mM do oko 325 mM i oko 275 mM do oko 300 mM. U drugom aspektu, količine neredukujućeg šećera u suvoj (npr, liofilizovanoj) formulaciji su u opsegu od oko 40% do oko 70% (tež./tež. suve formulacije). U drugom aspektu, količine neredukujućeg šećera u suvoj (npr, liofilizovanoj) formulaciji su u opsegu od oko 40% do oko 60%, od oko 45% do oko 55% ili oko 51% (tež./tež). U drugim aspektima, količina neredukujućeg šećera u suvoj (npr, liofilizovanoj) formulacija je veća od oko 51% (tež./tež. suve formulacije) kada je količina proteina oko 31% (tež./tež. suve formulacije) ili je maseni odnos neredukujućeg šećera i proteina u suvoj formulaciji veći od oko 1.6:1. U još jednom aspektu, saharoza je neredukujući šećer za upotrebu u formulaciji.

Formulacija može da sadrži bilo koju željenu slobodnu aminokiselinu, koja može da bude u L-obliku, D-obliku ili bilo kojoj željenoj mešavini ovih oblika. U jednom aspektu, slobodne aminokiseline koje se mogu uključiti u formulaciju uključuju, na primer, histidin, alanin, arginin, glicin, glutaminsku kiselinu, serin, lizin, triptofan, valin, cistein i njihove kombinacije. Neke aminokiseline mogu da stabilizuju proteine kad je u pitanju degradacija tokom proizvodnje, sušenja, liofilizacije i/ili skladištenja, npr. pomoću vodoničnih veza, antioksidantnih svojstava sonih mostova ili hidrofobnih interakcija ili isključivanjem sa površine proteina. Aminokiseline mogu da deluju kao modifikatori toničnosti ili mogu da deluju tako što smanjuju viskoznost formulacije. U drugom aspektu, slobodne aminokiseline, kao što su histidin i arginin, mogu da deluju kao krioprotektanti i lioprotektanti, i ne kristalizuju kada liofilizuju kao komponente formulacije. Slobodne aminokiseline, kao što su glutaminska kiselina i histidin, same ili u kombinaciji, mogu da deluju kao puferska sredstva u vodenom rastvoru u opsegu pH od 5 do 7.5. U još jednom aspektu, formulacija sadrži histidin, ili histidin i arginin. U sledećem aspektu, koncentracije slobodnih aminokiselina za tečne formulacije su u opsegu od oko 10 mM do oko 0.5 M, na primer, od oko 15 mM do oko 300 mM, oko 20 mM do oko 200 mM ili oko 25 mM do oko 150 mM, oko 50 mM or about 125 mM. U sledećem aspektu, količine histidina u suvoj (npr, liofilizovanoj) formulaciji su u opsegu od oko 1% do oko 10% (tež./tež. suve formulacije), ili od oko 3% do oko 6% (tež./tež.). U nekim primerima izvođenja, količina histidina u suvoj (npr. liofilizovanoj) formulaciji je veća od oko 4% (tež./tež. suve formulacije) kada je količina proteina oko 31% (tež./tež. suve formulacije) ili maseni odnos histidina i proteina u suvoj formulaciji veći od oko 0.15:1. U drugom aspektu, količine neredukujućeg šećera u suvoj (npr. liofilizovanoj) formulaciji su u opsegu od oko 4% do oko 20% (tež./tež. suve formulacije), ili od oko 10% do oko 15% (tež./tež.). U nekim primerima izvođenja, količina arginina u suvoj (npr. liofilizovanoj) formulaciji je veća od oko 13% (tež./tež. suve formulacije) kada je količina proteina oko 31% (tež./tež. suve formulacije) ili veći od oko 0.4:1 maseni odnos neredukujućeg šećera i proteina u suvoj formulaciji. U primerima izvođenja za kombinacije aminokiselina, kao što su histidin i arginin, molarni odnos ukupnih aminokiselina i antitela može da bude najmanje 200:1, oko 200:1 do oko 500:1 ili najmanje 400:1.

Formulacija može opciono dalje da sadrži najmanje jedan surfaktant. U jednom aspektu, surfaktanti koji mogu da budu uključeni u formulaciju uključuju, na primer, polisorbat 20, polisorbat 80, poloksamer (Pluronic<®>) i njihove kombinacije. Kada je prisutan, surfaktant je generalno uključen u količini koja smanjuje formiranje nerastvorljivih agregata antitela, npr. tokom sipanja u boce, zamrzavanja, sušenja, liofilizacije i/ili rekonstitucije. Koncentracija surfaktanta, npr. u pre-suvoj, (npr, liofilizovanoj) ili post-rekonstitucionoj formulaciji, je generalno od oko 0.0001% do oko 1.0%, od oko 0.01% do oko 0.1%, na primer oko 0.02%, 0.03%, 0.04%, 0.05%, 0.06%, 0.07%, 0.08% ili 0.09% (tež./zap.), 0.05% do 0.07% ili 0.06% (tež./zap.). Količina surfaktanta, npr. u suvoj (npr, liofilizovanoj) formulaciji je generalno od oko 0.01% do oko 3.0% (tež./tež.), od oko 0.10% do oko 1.0%, na primer oko 0.15%, 0.20%, 0.25%, 0.30%, 0.35%, 0.40%, ili 0.50% (tež./tež.). U drugom aspektu, molarni odnos surfaktant: antitelo je oko 1: 1. Anti-α4β7 antitelo može biti prisutno u bilo kojoj željenoj količini u formulaciji, pod uslovom da je odnos neredukujućeg šećera i anti-α4β7 antitela (mol:mol) veći od oko 600:1. Međutim, formulacija može da sadrži visoku koncentraciju antiα4β7 antitela. Na primer, tečne formulacije mogu da sadrže najmanje oko 10 mg/ml, najmanje oko 20 mg/ml, najmanje oko 30 mg/ml, najmanje oko 40 mg/ml, najmanje oko 50 mg/ml, najmanje oko 60 mg/ml, najmanje oko 70 mg/ml, najmanje oko 80 mg/ml, najmanje oko 90 mg/ml, najmanje oko 100 mg/ml, od oko 40 mg/ml do oko 80 mg/ml anti-α4β7 antitela, oko 60 mg/ml anti-α4β7 antitela. Suve formulacije (npr. liofilizovane) mogu da sadrže najmanje oko 5%, najmanje oko 10%, najmanje oko 15%, najmanje oko 20%, najmanje oko 25%, najmanje oko 30%, ili oko 31% ili oko 32% anti-α4β7 antitela po težini.

Po želji, formulacija može dalje da sadrži metalni helator i/ili antioksidant, kao i druge farmaceutski prihvatljive ekscipijense. Pogodni metalni helatori uključuju, na primer, metilamin, etilendiamin, desferoksamin, trientin, histidin, malat, fosfonatna jedinjenja, npr. etidronsku kiselina, etilendiamintetrasirćetnu kiselinu (EDTA), etilenglikoltetrasirćetnu kiselinu (EGTA) i slično. Pogodni antioksidansi uključuju, na primer, limunsku kiselinu, mokraćnu kiselinu, askorbinsku kiselinu, lipoičnu kiselinu, glutation, tokoferol, karoten, likopen, cistein i slično.

Formulacija može biti tečna ili čvrsta. Tečne formulacije mogu biti vodeni rastvori ili suspenzije, pripremljeni u odgovarajućem vodenom rastvaraču, kao što je voda ili vodena / organska mešavina, kao što su mešavine vodenog alkohola. Tečne formulacije mogu imati pH između oko 5.5 i oko 7.5, između oko 6.0 i oko 7.0, ili između oko 6.0 i oko 6.5, kao što su oko 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4 ili 6.5. Tečne formulacije mogu biti u frižideru (npr.2-8 °C) ili zamrznute (npr. na -20°C ili -80°C) za skladištenje. Čvrste formulacije mogu se pripremiti na bilo koji odgovarajući način i mogu biti u obliku kolača ili praha, na primer. Čvrsta formulacija se priprema sušenjem tečne formulacije kao što je ovde opisano, na primer liofilizacijom, sušenjem prskanjem, sušenjem na vazduhu u filmu (npr. za transdermalnu isporuku), mešanjem u lipidnu emulziju i sušenjem kao sfere za oralnu isporuku ili film za transdermalnu isporuku. Kada je formulacija čvrsta formulacija, formulacija može imati sadržaj vlage ne više od oko 5%, ne više od oko 4.5%, ne više od oko 4%, ne više od oko 3.5%, ne više od oko 3%, ne više od oko 2.5%, ne više od oko 2.5%, ne više od oko 2%, ne više od oko 1.5%, ne više od oko 1%, ili je u suštini bezvodna. Čvrste formulacije se mogu rastvoriti, tj. rekonstituisati, u odgovarajućem medijumu ili rastvaraču da postanu tečni pogodni za primenu. Pogodni rastvarači za rekonstituciju čvrste formulacije uključuju vodu, izotonični fiziološki rastvor, pufer, na primer, fosfat-puferirani fiziološki rastvor, Ringerov (laktat ili dekstroza) rastvor, minimalni esencijalni medijum, alkohol/vodeni rastvori, rastvor dekstroze, itd. Količina rastvarača može dovesti do terapijske koncentracije proteina veće, iste ili niže od koncentracije pre sušenja. U jednom aspektu, rekonstituisana koncentracija anti-α4β7 antitela je ista koncentracija kao u tečnoj formulaciji pre sušenja.

Formulacija može biti sterilna, a to se može postići u skladu sa procedurama poznatim kvalifikovanoj osobi za generisanje sterilnih farmaceutskih formulacija pogodnih za primenu humanim subjektima, pre ili nakon pripreme formulacije. Formulacija se može sterilisati kao tečnost, na primer, pre sušenja i/ili posle rekonstitucije filtracijom kroz male pore, kroz aseptičnu obradu ili izlaganjem ultraljubičastom zračenju. Veličine pora filtera mogu biti 0.1 μm ili 0.2 μm za filtriranje mikroorganizama ili 10 do 20 nm za filtriranje čestica virusa. Alternativno, ili dodatno, osušena formulacija može biti sterilisana, na primer, izlaganjem gama zračenja. U jednom aspektu, anti-α4β7 tečna formulacija antitela se steriliše filtracijom pre sušenja.

U jednom aspektu, formulacija je stabilna prilikom skladištenja. U drugom aspektu, formulacija je stabilna prilikom skladištenja u suvom stanju. Stabilnost se može testirati procenom fizičke stabilnosti, hemijske stabilnosti i/ili biološke aktivnosti antitela u formulaciji u vreme formulacije, kao i nakon skladištenja na navedenim temperaturama. Fizička i/ili hemijska stabilnost tečne formulacije ili rekonstituisanog suvog praha može se proceniti kvalitativno i/ili kvantitativno na različite načine (videti, na primer, Analitičke tehnike za biofarmaceutski razvoj, Rodriguez-Diaz et al. eds. Informa Healthcare (2005) ), uključujući procenu formiranja agregata (na primer korišćenjem veličine isključenja (ili gel filtracije) hromatografije (SEC), masena spektrometrija uz pomoć matrice laserske desorpcije-jonizacije vremena leta (MALDI-TOF MS), analitičkog ultracentrifugiranja, rasipanje svetlosti (spektroskopija korelacije fotona, dinamičko rasipanje svetlosti (DLS), lasersko rasipanje svetlosti sa više uglova (MALLS)), mikroskopsko snimanje zasnovano na protoku, brojanje elektronske impedanse (raonik), zatamnjenje svetlosti ili drugi sistem za brojanje tečnih čestica, merenjem zamućenja, centrifugiranjem gradijenta gustine i/ili vizuelnim pregledom); procenom heterogenosti punjenja pomoću hromatografije za razmenu kationa (videti takođe Vlasak and Ionescu, Curr. Pharm. Biotechnol. 9:468-481 (2008) i Harris et al. J. Chromatogr. B Biomed. Sci. Appl.752: 233-245 (2001) ), izoelektrično fokusiranje (IEF), npr. kapilarna tehnika (cIEF), ili elektroforeza kapilarne zone; amino-terminalna ili karboksi terminalna analiza sekvence; masena spektrometrijska analiza; SDS-PAGE ili SEC analiza za poređenje fragmentiranih, netaknutih i multimernih (tj, dimernih, trimernih, itd) antitela; peptidna mapa (na primer triptinska ili LYS-i slično); procena biološke aktivnosti ili antigen vezujuće funkcije antitela; i slično. Biološka aktivnost ili funkcija vezivanja antigena, npr. vezivanje anti-α4β7 antitela za MAdCAM (npr. MAdCAM-1) ili inhibicija vezivanja ćelije koja eksprimira α4β7 integrin za MAdCAM (npr. MAdCAM-1), npr. imobilisani MAdCAM (npr. MAdCAM-1), može da se evaluira korišćenjem različitih tehnika dostupnih stručnjaku u oblasti (videti npr. Soler et al., J. Pharmacol. Exper. Ther.330:864-875 (2009)).

Stabilnost formulacije u čvrstom stanju takođe se može proceniti kvalitativno i/ili kvantitativno na različite načine, uključujući direktne testove, kao što je identifikacija kristalne strukture difrakcijom rendgenskog praha (XRPD); procena strukture antitela u čvrstom stanju korišćenjem Fourier Transform infracrvene spektroskopije (FTIR); i merenje termičkih prelaza u liofilizovanoj čvrstoj supstanci (topljenje, stakleni prelaz, itd.) Koristeći diferencijalnu skenirajuću kalorimetriju (DSC, na primer, za procenu denaturacije) i indirektne testove kao što je merenje sadržaja vlage Karl Fisher testom, na primer, da ekstrapolira verovatnoću hemijske nestabilnosti kroz hidrolizu. Merenje sadržaja vlage u suvoj formulaciji može ukazati na to koliko je verovatno da će formulacija biti podvrgnuta hemijskoj ili fizičkoj degradaciji, sa većom vlagom koja dovodi do veće degradacije.

Stabilnost se može meriti na izabranoj temperaturi za odabrani vremenski period. U jednom aspektu, suva (npr. liofilizovana) formulacija je stabilna na oko 40°C, 75% RH najmanje oko 2-4 nedelje, najmanje oko 2 meseca, najmanje oko 3 meseca, najmanje oko 6 meseci, najmanje oko 9 meseci, najmanje oko 12 meseci ili najmanje oko 18 meseci. U drugom aspektu, formulacija (tečna ili suva (npr. liofilizovana)) je stabilna na oko 5°C i/ili 25° C i 60%RH najmanje oko 3 meseca, najmanje oko 6 meseci, najmanje oko 9 meseci, najmanje oko 12 meseci, najmanje oko 18 meseci, najmanje oko 24 meseca, najmanje oko 30 meseci, najmanje oko 36 meseci ili najmanje oko 48 meseci. U drugom aspektu, formulacija (tečna ili suva (npr. liofilizovana)) je stabilna na oko -20°C najmanje oko 3 meseca, najmanje oko 6 meseci, najmanje oko 9 meseci, najmanje oko 12 meseci, najmanje oko 18 meseci, najmanje oko 24 meseca, najmanje oko 30 meseci, najmanje oko 36 meseci, najmanje oko 42 meseca ili najmanje oko 48 meseci. Osim toga, tečna formulacija može, u nekim primerima izvođenja, biti stabilna nakon zamrzavanja (na, na primer, -80°C.) i odmrzavanja, kao što su, na primer, nakon 1, 2 ili 3 ciklusa zamrzavanja i odmrzavanja.

Nestabilnost može uključivati bilo koji ili više: agregacija (npr, nekovalentna rastvorljiva agregacija (izazvana hidrofobnim ili napunjenim interakcijama), kovalentna rastvorljiva agregacija (npr, disulfida veza preuređenje / kodiranje), nerastvorljiva agregacija (uzrok denaturacije proteina na tečnosti / vazduha i tečnosti / čvrste interfejsa)), deamidacija (npr. Asn deamidacija), oksidacija (npr. Met oksidacija), izomerizacija (npr. Asp izomeracija), denaturacija, clipping / hidroliza / fragmentacija (npr. fragmentacija zglobnog regiona), formiranje sukcinimida, N-terminal proširenje, C-terminalna obrada, razlike u glikozilaciji i slično.

Stabilna formulacija može doprineti niskoj imunogenosti anti-α4β7 antitela. Imunogeno antiα4β7 antitelo može dovesti do odgovora humano-anti-humanog antitela (HAHA) kod ljudi ili pacijenata. Pacijenti koji razviju HAHA odgovor na anti-α4β7 antitelo mogu imati neželjene događaje (npr. Reakciju na infuziju na licu mesta) nakon tretmana ili mogu brzo eliminisati anti-α4β7 antitela, što rezultira nižom dozom nego što je planirano lečenjem. Izveštaj (Feagen et al. (2005) N. Eng J. Med.352: 2499-2507) o ranoj studiji lečenja anti-α4β7 antitelom pokazao je da su se humana antihumana antitela razvila do 8. nedelje kod 44% lečenih pacijenata. Antitelo u ovoj studiji je uskladišteno kao tečnost i nije uopšte sadržalo polisorbat.

U nekim primerima izvođenja, formulacija može povećati udeo HAHA negativnih pacijenata na najmanje 40%, najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80% ili najmanje 90% pacijenata u poređenju sa HAHA rezultatima manje stabilne formulacije.

U nekim primerima izvođenja, formulacija anti-α4β7 antitela ima ≥ 50% glavne naelektrisane izoforme, ≥ 55% glavne naelektrisane izoforme ili 65 do 70% glavne naelektrisane izoforme. U drugim aspektima, stabilna formulacija anti-α4β7 antitela ima ≤ 45% kiselih naelektrisanih izoformi, ≤ 40% kiselih naelektrisanih izoformi, ≤ 30% kiselih naelektrisanih izoformi ili 22 do 28% kiselih izoformi. U još nekim aspektima, stabilna formulacija anti-α4β7 antitela ima ≤ 25% baznih izoformi, ≤ 20% baznih izoformi, ≤ 15% baznih izoformi, oko 5% baznih izoformi ili oko 10% baznih izoformi. U jednom aspektu, stabilna formulacija anti-α4β7 antitela ima ≥ 55% glavne izoforme, ≤ 30% kiselih izoformi i/ili ≤ 20% baznih izoformi, npr. kako je određeno pomoću CEX. U jednom aspektu, stabilna formulacija anti-α4β7 antitela ima ≥ 50% glavne izoforme, ≤ 45% kiselih izoformi i/ili < 10% baznih izoformi, npr. kako je određeno pomoću CEX.

U nekim aspektima, anti-α4β7 antitela suva, čvrsta formulacija ima ≤10% sadržaja vlage, ≤ 5% sadržaja vlage ili < 2.5% sadržaja vlage. Vreme potrebno za rekonstituciju je ≤ 60 minuta, ≤ 50 minuta ili ≤ 40 minuta ili ≤ 30 minuta ili ≤ 20 minuta.

Monomerni sadržaj i/ili agregatni sadržaj (npr. kao dimeri, trimeri, tetrameri, pentameri, oligomeri i agregati višeg reda), tj. U tečnoj formulaciji ili u suvoj formulaciji nakon rekonstitucije, može se meriti SEC, MALDI-TOF MS, analitičkom ultracentrifugiranjem, rasipanjem svetlosti (DLS ili MALLS) ili merenjem nanoskala, kao što je analiza praćenja nanočestica NTA, NanoSight Ltd, Wiltshire, UK). Rezolucija, karakterizacija i kvantifikacija agregata može se postići na više načina, uključujući povećanje dužine razdvajanja na SEC koloni, npr. dužom kolonom ili serijskim dodavanje druge ili više SEC kolona(i) u skladu sa početnom analitičkom SEC kolone, dopunjuje SEC kvantifikaciju monomera sa rasipanja svetlosti, ili pomoću NTA.

U jednom primeru izvođenja, formulacija anti-α4β7 antitela ima ≥ 90% monomernih antitela, ≥ 95% monomernih antitela ili 97 do 99% monomernih antitela. U drugom izvođenju, većina materijala u formulaciji anti-α4β7 antitela ima prosečan radijus od ≤ 20 nm, ≤ 15 nm, ≤ 10 nm, ili oko 5 do oko 7 nm. U jednom aspektu, formulacija anti-α4β7 antitela ima ≥ 80% količine teške plus lakog lanca analizom proteina. U jednom aspektu, postoji ≥ 90% težak plus laki lanac. U drugom aspektu, formulacija anti-α4β7 antitela ima ≤ 10% agregata, ≤ 5% agregata, ≤ 2.5% agregata ≤ 1.5% agregata, ≤ 1.0% agregata ili ≤ 0,5% agregata. U drugom aspektu, stabilna formulacija anti-α4β7 antitela ima ≥ 96% monomera i/ili ≤ 2.5% agregata. U još jednom aspektu, stabilna formulacija anti-α4β7 antitela ima oko 99% monomera i/ili < 1% agregata. Veličine čestica, npr. agregata ili nerastvorenih pomoćnih materija, tj. u rekonstituisanoj formulaciji, može da se meri zatamnjenjem svetlosti (npr. tečni sistem za brojanje čestica (HIAC) firme Hach Ultra Analitics (Grants Pass, OR)), mikroskopija, kaulter brojač, ili digitalni (npr. na bazi protoka) mikroskopski sistem zasnovan na snimanju, kao što su sistem za snimanje mikrofluida (MFI) firme Brightwell (Ottawa, CA) ili instrument FLOWCAM<®>Image particle analyzer firme Fluid Imaging Technologies (Yarmouth, ME). U jednom aspektu, veličina čestica u preparatu anti-α4β7 antitela je oko 30 μm, oko 25 μm, oko 10 μm, oko 5 μm, oko 2 μm ili 1 μm ili manje. Količinu čestica u formulacijama antitela potrebno je svesti na minimum. U jednom aspektu, formulacija anti-α4β7 antitela ima manje od 6000 čestica ≥ 10 μm i manje od 600 čestica prečnika ≥ 25 μm u jednoj dozi (US Pharmacopoeia Chp.788, metoda brojanja zatamnjenjem svetlosti; polovina tih količina metodom mikroskopske kvantifikacije). U još jednom aspektu, količina čestica po mililitru, npr. merenjem MFI, u dozi formulacije anti-α4β7 antitela, npr. rekonstituisana formulacija je oko 500 do oko 2000, ili oko 1000 do oko 3000 čestica od 2-10 μm po ml, oko 50 do oko 350 čestica ≥10 μm po ml i oko 0 do oko 50 čestica ≥25 μm po ml.

U jednom primeru izvođenja, formulacija anti-α4β7 antitela ima afinitet vezivanja od oko 60% do oko 140% referentnog standardnog anti-α4β7 antitela. U jednom aspektu, anti-α4β7 antitelo u formulaciji opisanoj ovde se vezuje za α4β7, npr. Na ćeliji (WO98/06248 ili US Patent No.

7,147,851), u vrednosti od oko 80% do oko 120% referentnog standarda. U drugom primeru izvođenja, formulacija anti-α4β7 antitela ima sposobnost da inhibira najmanje 50% ili najmanje 60% vezivanja ćelije koja eksprimira α4β7 integrin za MAdCAM, npr. MAdCAM-1, MAdCAM-Ig himeru (videti objavu SAD patentne prijave br. 20070122404, takođe za referentne standardne primere).

Kao što je prethodno u tekstu navedeno, zamrzavanje formulacije je posebno predviđeno ovde. Dakle, stabilnost formulacije pri zamrzavanju i odmrzavanju može da se testira. Shodno tome, antitelo u tečnoj formulaciji može da bude stabilno nakon zamrzavanja i odmrzavanja formulacije, na primer antitelo može da bude stabilno nakon jednog, dva, tri, četiri, pet ili više ciklusa zamrzavanje/odmrzavanje.

U nekim primerima izvođenja, formulacija je tečna formulacija koja sadrži najmanje oko 50 mg/ml do oko 100 mg/ml anti-α4β7 antitela, puferski agens (npr. histidin) i najmanje oko 9% (tež./tež.) neredukujućeg šećera (npr. saharoze, trehaloze ili manitola). U jednom primeru izvođenja, formulacija sadrži najmanje oko 50 mg/ml do oko 80 mg/ml, oko 60 mg/ml antiα4β7 antitela, puferski agens (npr. histidin), slobodnu aminokiselinu (npr. arginin) i najmanje oko 9% do 10% (tež./tež) neredukujućeg šećera (npr. saharoze, trehaloze ili manitola).

U drugom primeru izvođenja, formulacija sadrži najmanje oko 60 mg/ml anti-α4β7 antitela, puferski agens (npr. histidin), slobodnu aminokiselinu (npr. arginin) i najmanje oko 10% (tež./tež) neredukujućeg šećera (npr. saharoze, trehaloze ili manitola). U takvim primerima izvođenja, koncentracija pufera je oko 15 do oko 75 mM, oko 25 do oko 65 mM, ili oko 50 mM. Koncentracija slobodnih aminokiselina je oko 50 do oko 250 mM, oko 75 do oko 200 mM, oko 100 do oko 150 mM ili oko 125 mM.

U jednom primeru izvođenja, formulacija je suva, čvrsta formulacija (npr. liofilizovana formulacija) koja sadrži smešu neredukujućeg šećera, anti-α4β7 antitela, histidina, arginina i polisorbata 80, a molarni odnos neredukujućeg šećera i anti-α4β7 antitela (mol:mol) je veći od 600:1.

U drugom primeru izvođenja, formulacija je suva, čvrsta, amorfna formulacija (npr. liofilizovana formulacija) koja sadrži smešu neredukujućeg šećera, anti-α4β7 antitela, histidina, arginina i polisorbata 80, a molarni odnos neredukujućeg šećera i anti-α4β7 antitela (mol:mol) je veći od 600:1.

U jednom primeru izvođenja, formulacija je liofilizovana formulacija koja sadrži neredukujući šećer, anti-α4β7 antitela, histidin, arginin i polisorbat 80, a molarni odnos neredukujućeg šećera i anti-α4β7 antitela (mol:mol) u formulaciji je veći od 600:1.

U jednom primeru izvođenja, formulacija je liofilizovana formulacija koja sadrži neredukujući šećer, anti-α4β7 antitela, histidin, arginin i polisorbat 80, pri čemu je molarni odnos neredukujućeg šećera i anti-α4β7 antitela (mol:mol) u formulaciji veći od 600:1 i molarni odnos srginina i anti-α4β7 antitela (mol:mol) u formulaciji je veći od 250:1.

U jednom primeru izvođenja, formulacija je tečna formulacija i sadrži najmanje oko 60 mg/ml anti-α4β7 antitela, najmanje oko 10% (tež./zap.) neredukujućeg šećera i najmanje oko 125 mM jedne ili više slobodnih aminokiselina.

U jednom primeru izvođenja, formulacija je tečna formulacija i sadrži najmanje oko 60 mg/ml anti-α4β7 antitela, najmanje oko 10% (tež./zap.) neredukujućeg šećera i najmanje oko 175 mM jedne ili više slobodnih aminokiselina.

U jednom primeru izvođenja, formulacija je tečna formulacija i sadrži između oko 60 mg/ml i oko 80 mg/ml anti-α4β7 antitela, puferski agens i najmanje oko 10% (tež./tež.) šećera.

U jednom primeru izvođenja, formulacija je tečna formulacija i sadrži između oko 60 mg/ml i oko 80 mg/ml anti-α4β7 antitela, histidin i najmanje oko 10% (tež./tež.) saharoze.

U jednom primeru izvođenja, formulacija je liofilizovana i čuva kao jedna doza u jednoj bočici. Bočica se poželjno čuva na oko 2-8 ° C dok se ne primenjuje subjektu kome je to potrebno. Bočica može, na primer, biti bočica od 20 ili 50 cc (na primer za dozu od 60 mg/ml). Bočica može da sadrži najmanje oko 120 mg, najmanje oko 180 mg, najmanje oko 240 mg, najmanje oko 300 mg, najmanje oko 360 mg, najmanje oko 540 mg, ili najmanje oko 900 mg anti-α4β7 antitela. U jednom aspektu, bočica sadrži oko 300 mg anti-α4β7 antitela.

Jedan ili više drugih farmaceutski prihvatljivih nosača, ekscipijenasa ili stabilizatora, kao što su oni opisani u Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, Hendrickson, R. Ed. (2005), mogu da budu uključeni u formulaciju pod uslovom da ne utiču negativno na željene karakteristike formulacije. Prihvatljivi nosači, ekscipijensi ili stabilizatori su netoksični za primaoce u dozama i koncentracijama koje se koriste i uključuju; dodatna puferska sredstva; ko-rastvarači; antioksidansi, uključujući askorbinsku kiselinu i metionin; helatni agensi kao što su EDTA; metalni kompleksi (npr. kompleksi Zn-protein); biorazgradivi polimeri kao što su poliestri; konzervansi; i/ili kontrajoni koji formiraju soli kao što je natrijum.

α4β7 Antitela

Anti-α4β7 antitelo koje se koristi u ovom pronalasku je vedolizumab.

Anti-α4β7 antitela pogodna za upotrebu u formulacijama uključuju antitela iz bilo kog željenog izvora, kao što su potpuno ljudska antitela, mišja antitela, zečja antitela i slično, i sva željena konstruisana antitela, kao što su himerna antitela, humanizovana antitela i slično. Antigenvezujući fragmenti bilo koje od ovih vrsta antitela, kao što su Fab, Fv, scFv, Fab' i F (ab')2fragmenti, takođe su pogodni za upotrebu u formulacijama.

Anti-α4β7 antitelo može da se veže za epitop na α4 lancu (npr. Humanizovani MAb 21.6 (Bendig et al., US Pat. No.5,840,299), na β7 lancu (npr. FIB504 ili humanizovani derivat (npr. Fong et al., US Pat. No.7,528,236)), ili na kombinatorni epitop formiran asocijacijom α4 lanca sa β7 lancem. U jednom aspektu, antitelo vezuje kombinatorni epitop na α4β7 kompleksu, ali ne vezuje epitop na α4 lancu ili β7 lancu, osim ako lanci nisu u saradnji jedni sa drugima. Asocijacija α4 integrina sa β7 integrinom može stvoriti kombinatorni epitop, na primer, dovođenjem u blizinu ostataka prisutnih na oba lanca koji zajedno čine epitop ili konformacijskim izlaganjem na jednom lancu, npr. α4 integrin lanac ili β7 integrinski lanac, epitopsko vezivanje koje je nedostupno vezivanje antitela u odsustvu odgovarajućeg integrina partnera ili u odsustvu aktivacije integrina. U drugom aspektu, anti-α4β7 antitelo vezuje i α4 integrinski lanac i β7 integrinski lanac, i stoga je specifičan za α4β7 integrinski kompleks. Takva antitela mogu vezati α4β7, ali ne i vezati α4β1, i/ili se ne vezuju αEβ7, na primer. U drugom aspektu, antitelo anti-α4β7 se vezuje za isti ili suštinski isti epitop kao i antitelo Act-1 (Lazarovits, AJ et al., J. Immunol., 133(4): 1857-1862 (1984), Schveigoffer et al., J. Immunol., 151(2): 717-729, 1993; Bednarczyk et al., J. Biol. Chem., 269(11): 8348-8354, 1994). Mišja ACT-1 Hibridoma ćelijska linija, koja proizvodi mišje Act-1 monoklonsko antitelo, deponovana je u skladu sa odredbama Budimpeštanskog ugovora 22. avgusta 2001. godine, u ime Millennium Pharmaceuticals, Inc., 40 Landsdovne Street, Cambridge, Mass.02139, SAD, u American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Va.20110-2209, SAD, pod pristupnim br. PTA-3663. U drugom aspektu, anti-α4β7 antitelo je humano antitelo ili α4β7 vezujući protein koji koristi CDR regione obezbeđene u objavi SAD patentne prijave br. 2010/0254975.

U jednom aspektu, anti-α4β7 antitelo inhibira vezivanje α4β7 za jedan ili više svojih liganda (npr. mukozni adresin, npr. MAdCAM (npr. MAdCAM-1), fibronektin i/ili vaskularni adresin (VCAM)). MAdCAM molikuli primata su opisani u PCT objavi WO 96/24673. U drugom aspektu, anti-α4β7 antitelo inhibira vezivanje α4β7 za MAdCAM (npr. MAdCAM-1) i/ili fibronektin bez inhibicije vezivanja VCAM.

U jednom aspektu, anti-α4β7 antitela za upotrebu u formulacijama su humanizovane verzije mišjeg Act-1 antitela. Pogodne metode za pripremu humanizovanih antitela su dobro poznate u ovoj oblasti. Generalno, humanizovano anti-α4β7 antitelo će sadržati teški lanac koji sadrži 3 regiona koji određuju komplementarnost teškog lanca (CDR, CDR1, SEQ ID NO: 8, CDR2, SEQ ID NO: 9 i CDR3, SEQ ID NO: 10) mišjeg Act-1 antitela i odgovarajućih humanih regiona teškog lanca; i takođe sadrže laki lanac koji sadrži 3 lakog lanca CDR (CDR1, SEQ ID NO: 11, CDR2, SEQ ID NO: 12 i CDR3, SEQ ID NO: 13) miša Act-1 antitela i odgovarajućih regiona okvira humanog lakog lanca. Humanizovano Act-1 antitelo može da sadrži bilo koje pogodne ljudske okvirne regione, uključujući i konsenzusne okvirne regione, sa ili bez supstitucija aminokiselina. Na primer, jedna ili više aminokiselina rada okvira može se zameniti drugom aminokiselinom, kao što je aminokiselina na odgovarajućem položaju u antitelu Act-1 miša. Humani konstantni region ili njegov deo, ako je prisutan, može biti izveden iz κ ili λ lakih lanaca, i/ili γ (npr. γ1, γ2, γ3, γ4), μ, α (npr. α1, α2), δ ili ε teških lanaca ljudskih antitela, uključujući alelne varijante. Konkretan konstantni region (npr. IgG1), njegova varijanta ili delovi, mogu da budu izabrani kako bi se efektorska funkcija prilagodila. Na primer, mutirani konstantni region (varijanta) može da bude inkorporiran u fuzioni protein kako bi se smanjilo vezivanje za Fc receptore i/ili sposobnost da se popravi komplement (videti npr. Winter et al., GB 2,209,757 B; Morrison et al., WO 89/07142; Morgan et al., WO 94/29351, 22. decembar 1994.). Humanizovane verzije Act-1 antitela opisane su u PCT publikacijama br. WO98/06248 i WO07/61679.

Humanizovano anti-α4β7 antitelo za upotrebu u formulaciji za upotrebu prema pronalasku je vedolizumab. Slika 4 prikazuje poravnanje koje upoređuje generičke lake lance ljudskih antitela sa mišjim antitelima. Poravnanje ilustruje da je humanizovani laki lanac vedolizumaba (npr. Chemical Abstract Service (CAS, American Chemical Society) registarski broj 943609-66-3), gde su dva mišja ostatka zamenjena humanim ostacima, više human od lakog lanca LDP-02 (slika 3). Pored toga, LDP-02 ima donekle hidrofobni, fleksibilni alanin 114 i hidrofilno mesto (aspartat 115) koje se zamenjuje u vedolizumabu sa blago hidrofilnim treoninom 114 koji sadrži hidroksil i hidrofobnim, potencijalno okrenutim prema unutra, ostatkom valina 115.

Dalje supstitucije sekvence antitela mogu biti, na primer, mutacije u teškim i lakim lancima okvirnih regiona, kao što je mutacija izoleucina u valin na ostatku 2 SEQ ID NO: 14; mutacija metionina u valin na ostatku 4 SEQ ID NO:14; mutacija alanina u glicin na ostatku 24 od SEQ ID NO:15; mutacija arginina u lizin u ostatku 38 SEQ ID NO:15; mutacija alanina u arginin u ostatku 40 od SEQ ID NO: 15; mutacija metionina u izoleucin na ostatku 48 od SEQ ID NO:15; mutacija izoleucina u leucin na ostatku 69 SEQ ID NO:15; mutacija arginina u valin na ostatku 71 od SEQ ID NO:15; mutacija treonina u izoleucin na ostatku 73 SEQ ID NO:15; ili bilo koju kombinaciju istih; i zamena teškog lanca CDR sa CDR (CDR1, SEQ ID NO: 8, CDR2, SEQ ID NO: 9 i CDR3, SEQ ID NO: 10) miša Act-1 antitela; i zamena lakih lanaca CDR sa lakim lancima CDR (CDR1, SEQ ID NO: 11, CDR2, SEQ ID NO: 12 i CDR3, SEQ ID NO: 13) miša Act-1 antitela.

Anti-α4β7 humanizovana antitela za upotrebu u formulaciji mogu da sadrže varijabilni region teškog lanca koja ima oko 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identitet sekvence na aminokiseline 20 do 140 SEQ ID NO: 2, i varijabilni region lakog lanca koji ima oko 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identitet sekvence na aminokiseline 20 do 131 od SEQ ID NO: 4 ili aminokiseline 21 do 132 od SEQ ID NO: 5. Identitet sekvence aminokiselina može se odrediti korišćenjem odgovarajućeg algoritma poravnanja sekvenci, kao što je Lasergene sistem (DNASTAR, Inc., Madison, Wis.), koristeći podrazumevane parametre. Anti-α4β7 antitelo za upotrebu u formulaciji je vedolizumab (CAS, Američko hemijsko društvo, registarski broj 943609-66-3). Ostala α4β7 antitela se takođe mogu koristiti u formulacijama i režimima doziranja opisanim u ovom dokumentu. Na primer, α4β7 antitela opisana u US 2010/0254975 (Amgen, Inc.) su pogodna za upotrebu u formulacijama i postupcima za lečenje inflamatorne bolesti creva kod pojedinca.

Anti-α4β7 antitelo može se proizvesti ekspresijom sekvenci nukleinskih kiselina koje kodiraju svaki lanac u živim ćelijama, npr. ćelijama u kulturi. Različiti vektorski sistemi za ekspresiju u domaćinu mogu da se koriste za eksprimiranje molekula antitela prema pronalasku. Takvi sistemi za ekspresiju u domaćinu predstavljaju vehikulume pomoću kojih se kodirajuće sekvence od interesa mogu proizvesti i naknadno prečistiti, ali takođe predstavljaju ćelije koje mogu, kada se transformišu ili transfektuju odgovarajućim nukleotidnim kodirajućim sekvencama, eksprimiraju anti-α4β7 antitelo in situ. To uključuje, ali nije ograničeno na mikroorganizme kao što su bakterije (npr. E. coli, B. subtilis) transformisane rekombinantnom bakteriofagnom DNK, plazmidnom DNK ili kosmidnom DNK ekspresijom vektora koji sadrže sekvence kodiranja antitela; kvasac (npr. Saccharomices, Pichia) transformisan sa rekombinantnim vektorima ekspresije kvasca koji sadrže sekvence kodiranja antitela; sistemi ćelija insekata zaraženi vektorima ekspresije rekombinantnih virusa (npr. bakulovirus) koji sadrže sekvence kodiranja antitela; sistemi biljnih ćelija zaraženi vektorima ekspresije rekombinantnih virusa (npr. mozaični virus karfiola, CaMV; mozaični virus duvana, TMV) ili transformisani vektorima ekspresije rekombinantnih plazmida (npr. Ti plazmid) koji sadrže sekvence kodiranja antitela; ili ćelijski sistemi sisara (npr. COS, CHO, BHK, 293, 3T3, NS0 ćelije) koji sadrže konstrukte rekombinantne ekspresije koji sadrže promotore izvedene iz genoma ćelija sisara (npr. promotor metalotioneina) ili iz virusa sisara (npr. Adenovirus kasni promotor; promotor virusa vakcinije 7.5 K). Na primer, ćelije sisara kao što su ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO), u kombinaciji sa vektorom kao što je glavni srednji element promotora ranog gena iz humanog citomegalovirusa je efikasan sistem ekspresije za antitela (Foecking et al., Gene 45:101 (1986); Cockett et al., Bio/Technology 8:2 (1990) ).

U bakterijskim sistemima, veliki broj vektora ekspresije može biti povoljno odabran u zavisnosti od upotrebe namenjene za molekul antitela koji se izražava. Na primer, kada treba da se proizvede velika količina takvog proteina, za generisanje farmaceutskih kompozicija molekula antitela, vektori koji usmeravaju ekspresiju visokih nivoa fuzionih proteinskih proizvoda koji se lako prečišćavaju mogu biti poželjni. Takvi vektori uključuju, ali nisu ograničeni, na vektor ekspresije E. coli pUR278 (Ruther et al., EMBO J. 2: 1791 (1983) ), u kojoj se sekvenca kodiranja antitela može pojedinačno vezati u vektor u okviru sa lac Z kodirajućim regionom, tako da se proizvodi fuzioni protein; pIN vektori (Inouye & Inouye, Nucleic Acids Res.13: 3101-3109 (1985) ; Van Heeke & Schuster, J. Biol. Chem.24:5503-5509 (1989)); i slično. pGEX vektori se takođe mogu koristiti za izražavanje stranih polipeptida kao fuzionih proteina sa glutation S-transferazom (GST). Generalno, takvi fuzioni proteini su rastvorljivi i mogu se lako prečistiti iz liziranih ćelija adsorpcijom i vezivanjem za matriks glutation-agarozne kuglice praćene eluiranjem u prisustvu slobodnog glutationa. Vektori pGEX su dizajnirani da uključuju mesta cepanja trombina ili faktora Xa proteaze, tako da se klonirani ciljni genski proizvod može osloboditi iz GST komponente.

U sistemu insekata, Autographa californica virus nuklearne poliedroze (AcNPV) se koristi kao vektor za ekspresiju stranih gena. Virus raste u ćelijama Spodoptera frugiperda. Sekvenca koja kodira antitela može se klonirati pojedinačno u neesencijalne regione (na primer poliedrinski gen) virusa i staviti pod kontrolu AcNPV promotora (na primer poliedrinskog promotora). U sisarskim ćelijama-domaćinima mogu da se koriste brojni sistemi ekspresije na bazi virusa. U slučajevima kada se adenovirus koristi kao ekspresioni vektor, sekvenca koja kodira antitelo od interesa može da bude vezana za kompleks kontrole transkripcije / translacije adenovirusa, npr. Kasni promotor i tripartitna sekvenca lidera. Ovaj himerni gen se zatim može ubaciti u genom adenovirusa in vitro ili in vivo rekombinacijom. Insercija u neesencijalnom regionu virusnog genoma (npr. region E1 ili E3) će rezultirati rekombinantnim virusom koji je vijabilan i sposoban da eksprimira molekul antitela u inficiranim domaćinima (npr. videti Logan & Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:355-359 (1984)). Specifični signali inicijacije takođe mogu biti potrebni za efikasnu translaciju inseriranih sekvenci koje kodiraju antitela. Ovi signali uključuju ATG inicijacioni kodon i susedne sekvence. Osim toga, inicijacioni kodon mora da bude u fazi sa okvirom čitanja željene kodirajuće sekvence kako bi se osigurala translacija celog inserta. Ovi egzogeni translacijski kontrolni signali i inicijacijski kodoni mogu biti različitog porekla, i prirodnih i sintetičkih. Efikasnost ekspresije može biti poboljšana uključivanjem odgovarajućih elemenata enhensera transkripcije, terminatora transkripcije, itd. (videti Bittner et al., Methods in Enzymol.153:51-544 (1987) ).

Pored toga, može se izabrati soj ćelija domaćina koji modulira ekspresiju inseriranih sekvenci, ili modifikuje i obrađuje genski proizvod na specifičan željeni način. Takve modifikacije (npr. glikozilacija) i obrada (npr. cepanje) proteinskih proizvoda mogu biti važni za funkciju proteina. Različite ćelije domaćina imaju karakteristične i specifične mehanizme za posttranslacionu obradu i modifikaciju proteina i genskih proizvoda. Mogu se izabrati odgovarajuće ćelijske linije ili sistemi domaćina kako bi se osigurala ispravna modifikacija i obrada eksprimiranog stranog proteina. U tom cilju mogu se koristiti eukariotske ćelije domaćina koje poseduju ćelijsku mašineriju za pravilnu obradu primarnog transkripta, glikozilacije i fosforilacije genskog proizvoda. Takve ćelije domaćina sisara uključuju, ali nisu ograničene na jajnike kineskog hrčka (CHO), NS0, HeLa, VERI, bubreg bebe hrčka (BHK), majmunski bubreg (COS), MDCK, 293, 3T3, WI38, ćelije humanog hepatocelularnog karcinoma (npr. Hep G2), ćelijske linije raka dojke kao što su, na primer, BT483, Hs578T, HTB2, BT20 i T47D, i normalna ćelijska linija mlečne žlezde kao što su, na primer, CRL7030 i Hs578Bst.

Mašine za glikozilaciju različitih tipova ćelija mogu proizvesti antitela sa različitim sastavom glikozilacije nego u drugom tipu ćelija, ili bez glikozilacije, kao kod bakterijskih ćelija. U jednom aspektu, tipovi ćelija za proizvodnju anti-α4β7 antitela su ćelije sisara, kao što su NS0 ili CHO ćelije. U jednom aspektu, ćelije sisara mogu da sadrže deleciju enzima koji je uključen u ćelijski metabolizam, a egzogeni gen od interesa možeda bude operativno povezan sa zamenskim enzimom, npr. u konstruktu ili vektoru za uvođenje u ćelije, npr. transformacijom ili transfekcijom. Konstrukt ili vektor sa egzogenim genom daje ćelijama koje su domaćini konstrukta ili vektora prednost selekcije za podsticanje proizvodnje polipeptida kodiranog egzogenim genom. U jednom primeru izvođenja, CHO ćelije su DG44 ćelije (Chasin and Urlaub (1980) PNAS USA 77:4216), koje sadrže deleciju ili inaktivaciju gena dihidrofolat reduktaze. U drugom izvođenju, CHO ćelije su CHO K1 ćelije koje sadrže deleciju ili inaktivaciju gena glutamin sintaze (videti, na primer, SAD patente br.5,122,464 ili 5,827,739). Čvrste formulacije

Čvrste formulacije koje koristi pronalazak se obično pripremaju sušenjem tečne formulacije. Može se koristiti bilo koji odgovarajući način sušenja, kao što je liofilizacija ili sušenje raspršivanjem. Liofilizacija podrazumeva zamrzavanje tečne formulacije, obično u kontejneru koji će se koristiti za skladištenje, isporuku i distribuciju formulacije (npr. bočicu). (videti, na primer, Gatlin i Nail u procesu prečišćavanja proteina, ed. Roger G. Harrison, Marcel Dekker Inc., 317-367 (1994) .) Kada je formulacija zamrznuta, atmosferski pritisak se smanjuje i temperatura se podešava kako bi se omogućilo uklanjanje zamrznutog rastvarača npr, kroz sublimaciju. Ovaj korak procesa liofilizacije se ponekad označava kao primarno sušenje. Po želji, temperatura se onda može podići kako bi se uklonio bilo koji rastvarač koji je još uvek vezan za suvu formulaciju isparavanjem. Ovaj korak procesa liofilizacije se ponekad označava kao sekundarno sušenje. Kada formulacija dostigne željeni stepen suvoće, proces sušenja se završava i kontejneri se zatvaraju. Konačna čvrsta formulacija se ponekad naziva "liofilizovana formulacija" ili "torta". Proces liofilizacije može se izvesti korišćenjem bilo koje odgovarajuće opreme. Pogodna oprema za liofilizaciju dostupna je iz brojnih komercijalnih izvora (npr. SP Scientific, Stone Ridge, NI).

Mnoštvo odgovarajućih aparata može da se koristi za sušenje tečnih formulacija da proizvede čvrstu (npr, liofilizovani) formulaciju. U principu, liofilizovane formulacije pripremaju stručnjaci u oblisti, pri čemu koriste hermetički zatvorenu komoru koja sadrži police, na koje se smeštaju bočice tečne formulacije koja se suši. Temperatura polica, kao i brzina hlađenja i grejanja mogu se kontrolisati, kao i pritisak unutar komore. Podrazumeva se da se različiti parametri procesa o kojima se ovde govori odnose na procese koji se izvode korišćenjem ove vrste aparata. Prosečni stručnjaci u oblasti mogu lako da prilagode ovde opisane parametre drugim vrstama aparata za sušenje, po želji.

Prosečan stručnjak u oblasti može lako da odredi pogodne temperature i količina vakuuma za primarno i sekundarno sušenje. U principu, formulacija se zamrzava na temperaturi od oko -30°C ili manje, kao što je -40°C ili -50°C. Brzina hlađenja može da utiče na količinu i veličinu kristala leda u matrici. Primarno sušenje se obično sprovodi na temperaturi koja je oko 10°C, oko 20°C, oko 30°C, oko 40°C ili oko 50°C toplije od temperature zamrzavanja. U jednom aspektu, primarni uslovi sušenja mogu se podesiti da održe anti-α4β7 antitelo ispod temperature staklastog prelaza ili temperature kolapsa formulacije. Iznad temperature kolapsa, amorfna zamrznuta matrica može da teče (kolaps), tako da molekuli proteina ne mogu biti okruženi krutom, čvrstom matricom, a molekuli proteina možda neće biti stabilni u srušenoj matrici. Takođe, formulacija može biti teško potpuno osušiti ako dođe do kolapsa. Dobijene veće količine vlage u formulaciji mogu dovesti do viših stopa degradacije proteina i smanjenja vremena koje liofilizovani proizvod može da se skladišti pre nego što se njegov kvalitet smanji na neprihvatljive nivoe. U jednom aspektu, temperatura polica i pritisak u komori su izabrani da održe temperaturu proizvoda ispod temperature kolapsa tokom primarnog sušenja. Temperatura staklastog prelaza zamrznute formulacije može da se meri metodama koje su poznate u stanju tehnike, npr. diferencijalnom skenirajućom kalorimetrijom (DSC). Temperatura kolapsa može da se meriti metodama poznatim u stanju tehnike, npr. mikroskopija sušenja zamrzavanjem. Odnos neredukujućeg šećera o proteina (mol:mol) i količine drugih komponenti formulacije će uticati na temperaturu stakla prelaza i temperaturu kolapsa. U nekim primerima izvođenja, temperatura staklastog prelaza za formulaciju α4β7 antitela je oko -35°C do oko -10°C, oko -35°C do oko -25°C ili oko -35°C do oko -29°C. U drugom primeru izvođenja, temperatura staklastog prelaza za formulaciju α4β7 antitela je oko -29°C. U nekim primerima izvođenja, temperatura staklastog prelaza za formulaciju α4β7 antitela je oko -30°C, oko -31°C, oko -32°C, oko -33°C, oko -34°C, oko -35°C ili oko -36°C U nekim primerima izvođenja, temperatura kolapsa za formulaciju α4β7 antitela je oko -30°C do oko 0°C, oko -28°C do oko -25°C ili oko -20°C do oko -10°C. U drugom primeru izvođenja, temperatura kolapsa za formulaciju α4β7 antitela je oko -26°C. Bez želje da bude vezan bilo kojom određenom teorijom, što je brža stopa povećanja, to je viša temperatura kolapsa proizvoda. Primarni korak sušenja može ukloniti najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70% ili više rastvarača. U jednom aspektu, primarni korak sušenja uklanja više od 80% rastvarača iz formulacije anti-α4β7 antitela.

Primarno sušenje zavisi od temperature i pritiska na polici. Uslovi za primarno sušenje mogu se empirijski odrediti sa liofilizacijom pod različitim parametrima procesa. Primarno sušenje može biti matematički modeliran na osnovu temperature proizvoda. Jednačine prenosa mase i toplote (Milton, et al. (1997) PDA J of Pharm Sci & Tech, 51: 7-16), zajedno sa znanjem Rp i Kv, omogućavaju razumevanje kombinacije i interakcije ulaznih varijabli, uključujući ulazne varijable procesa kao što su temperatura polica i pritisak i formulacije varijabli koje su zarobljene u Rp vrednosti. Ovi modeli mogu pomoći u određivanju parametara koji će se koristiti za efikasan proces zasnovan na ograničenjima temperature proizvoda temperaturom kolapsa i sposobnošću opreme.

Jednačina 1 dovodi u vezu stopu sublimacije (dm/dt) tokom primarnog sušenja sa unutrašnjom površinom poprečnog preseka kontejnera (Ap), pritiskom pare leda (PO), pritiskom komore (Pc), i otpor prenosa mase, normalizovan površinom, za kolač i čep (Rp). Pona dodirnoj površini sublimacije može da se odredi iz jednačine 2, gde se Poodnosi na temperaturu proizvedenog leda na dodirnoj površini sublimacije, što je aproksimacija od temperature proizvoda (Tp) koja se može meriti termoelementom na dnu bočice ili se može izvesti iz gornjih jednačina kada su druge varijable određene. Jednačina 3 odnosi brzinu prenosa toplote sa police na bočice, gde je AVpovršina bočice, Kvje koeficijent prenosa toplote bočice,TSje temperatura police, a Tpje temperatura proizvoda. Jednačina 4 povezuje jednačine prenosa toplote i mase, gde je ΔHstoplota sublimacije.

Kao što se vidi iz jednačina za primarno sušenje, temperatura polica (Ts), temperatura proizvoda (Tp), pritisak u komori (Pc), otpor prenosa mase kolača (Rp), i koeficijent prenosa toplote (Kv) može da utiče na brzinu sublimacije.

Opcioni korak nakon zamrzavanja i pre primarnog sušenja je žarenje. U ovom koraku temperatura polica liofilizatora se podiže iznad staklastog prelaza formulacije u kratkom vremenskom periodu, npr. Oko 2 do 6 sati, oko 3 do 5 sati, ili oko 4 sata, a zatim se temperatura polica ponovo spušta ispod temperature staklastog prelaza formulacije. Žarenje se može koristiti za kristalizaciju sredstava za punjenje i za formiranje većih, ujednačenijih kristala leda. Proces žarenja može uticati na vreme rekonstitucije, jer žareni, osušeni kolač ima veću površinu od nežarenog, osušenog kolača. Korak žarenja formulacije α4β7 antitela može biti na oko -30°C do oko -10°C ili oko -25°C do oko -15°C. U jednom aspektu, temperatura žarenja za formulaciju α4β7 antitela je oko -20°C.

Sekundarno sušenje se obično sprovodi na temperaturi koja je iznad temperature smrzavanja tečne formulacije. Na primer, sekundarno sušenje se može vršiti na oko 10 °C, oko 20 °C, oko 30 °C, oko 40 °C ili oko 50 °C. U jednom aspektu, temperatura za sekundarno sušenje je temperatura okoline, npr. 20-30°C. Vreme za sekundarno sušenje treba da bude dovoljno da se smanji količina vlage na <5%.

U drugom aspektu, ciklus liofilizacije uključuje zamrzavanje na oko -45°C, žarenje na oko -20°C, ponovno zamrzavanje na oko -45°C, primarno sušenje na oko -24 ° C i 150 mTorr, i sekundarno sušenje na oko 27 ° C i 150 mTorr.

Rpje pod uticajem sadržaja čvrstih materija zamrznutog DP i toplotne istorije DP (zamrzavanje, žarenje, i faze zamrzavanja) koji utiče na strukturu pora kolača. Termalna istorija takođe može uticati na sekundarnu fazu sušenja, gde veća površina može pomoći u desorpciji vode (Pikal, et al. (1990) Int. J. Pharm., 60: 203-217). Korisni parametri procesa za kontrolu tokom primarne i sekundarne faze liofilizacije može biti temperatura polica i pritisak komore tokom svake faze ciklusa sušenja.

Za skaliranje, opterećenje sušilice zamrzavanja i čvrsti sadržaj mogu uticati na ciklus sušenja. Sadržaj čvrstih materija u formulaciji može da utiče na pimarno vreme sušenja. Pri višim sadržajima čvrstih materija, npr. kada ukupne koncentracije čvrste materije (ekscipijensi i/ili protein) variraju više od 10tež./zap.% ili više od 15tež./zap.%, na primer, 50 do 100% varijanse u odnosu na formulacija čije je vreme sušenja određeno, može da postoji efekat na vreme sušenja. Na primer, formulacija sa visokim sadržajem čvrstih materija može imati duže vreme sušenja od formulacije sa niskim sadržajem čvrstih materija. U nekim primerima izvođenja, procenat korišćenja kapaciteta liofilizatora može da varira od oko 25 do oko 100%. Pri većem opterećenju% kapaciteta, primarni vreme sušenja može da se poveća i do 2 puta u odnosu na niži opterećenje% kapaciteta. Razlike između primarnih vremena sušenja pri različitim opterećenjima% povećava se kako se povećava sadržaj čvrstih materija. U jednom primeru izvođenja, sadržaj čvrstih materija je manji od 20-25%, a opterećenje je od 25-100%.

Veličina bočice može se odabrati na osnovu površine koja će biti izložena polici i vakuumu tokom liofilizacije. Vreme sušenja je direktno proporcionalno visini kolača, tako da veličina bočice može biti izabran na osnovu onoga što je utvrđeno da je razumna visina kolača. Bočica sa velikim prečnikom u odnosu na zapreminu može da obezbedi veliku količinu kontakta sa policom za efikasan prenos toplote tokom ciklusa liofilizacije. Razblaženi rastvor antitela u velikoj količini tečnosti će zahtevati više vremena za sušenje. Ravnoteža u veličini bočice u odnosu na zapreminu formulacije treba da se postigne, jer veće bočice mogu biti skuplje za skladištenje i isporuku i imaju veći odnos headspace do formulacije i mogu izložiti visok procenat formulacije degradativnim efektima vlage tokom dugotrajnog skladištenja. Za dozu od 300 mg, formulacija anti-α4β7 antitela može imati zapreminu od 3 ml, 5 ml, 6 ml, 10 ml, 20 ml, 50 ml ili 100 ml pre liofilizacije. U jednom aspektu, veličina bočice je 20 ml za rastvor od 60 mg/ml u dozi od 300 mg.

Nakon liofilizacije, bočica može biti zapečaćena, na primer, začepljena, pod vakuumom. Alternativno, može da se omogući da se u bočicu, pre hermetičkog zatvaranja, uvede gas, na primer, suvi vazduh ili azot. Gde je oksidacija zabrinjavajuća, gas dozvoljen u komoru za liofilizaciju može da sadrži gas koji usporava ili sprečava oksidaciju liofilizovanog proizvoda. U jednom aspektu, gas je ne-oksigenirani gas, na primer, azot, ili inertni gas, npr, helijum, neon, argon, kripton ili ksenon. U drugom aspektu, gas je azot ili argon.

U nekim primerima izvođenja, pre-liofilizacija anti-α4β7 antitela formulacija zapremina je ista kao pre administracije rekonstituisana zapremina rastvora. Na primer, formulacija koja je oko 5.5 ml pre-liofilizacije može se rekonstituisati na zapreminu od oko 5.5 ml, dodavanjem količine tečnosti, npr. vode ili fiziološkog rastvora, koja uzima u obzir zapreminu suvih čvrstih materija. U drugim primerima izvođenja, može biti poželjno da se liofilizuje formulaciju antiα4β7 antitela u različitom obimu od rekonstituisanog zapremine rastvora. Na primer, formulacija anti-α4β7 antitela može biti liofilizovana kao razblaženi rastvor, npr.0.25x, 0.5x ili 0.75x i rekonstituisana do 1x dodavanjem manje tečnosti, npr. 75% manje, polovinu ili 25% manje od zapremine pre liofilizacije. U izvođenju, doza 300 mg može biti liofilizovana kao rastvor antitela 30 mg/ml u 5% saharoze i rekonstituisana u rastvoru antitela od 60 mg/ml u 10% saharoze. Alternativno, liofilizovana formulacija anti-α4β7 antitela može da se rekonstituiše u razblaženiji rastvor od pre-liofilizovane formulacije.

Tretman formulacijom antitela

U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje farmaceutsku formulaciju za upotrebu u postupku za terapeutsko lečenje inflamatorne bolesti creva, kao što je definisano patentnim zahtevom 15. Humani subjekt može da bude odrasla osoba (npr. 18 godina ili starija), adolescent ili dete. Humani subjekt može biti osoba stara 65 godina ili starija. Za razliku od alternativnih terapijskih režima doziranja, ljudski subjekt 65 godina ili stariji ne zahteva nikakvu modifikaciju režima doziranja opisanog u ovom dokumentu, i može se primenjivati konvencionalna formulacija antiα4β7 antitela opisana ovde.

Kod subjekta je mogao da izostane adekvatan odgovor na, da se izgubi odgovor na, ili je pacijent mogao da ne podnosi, lečenje imunomodulatorom, antagonistom faktora nekroze tumora-alfa, ili njihovim kombinacijama. Pacijent je možda prethodno primao tretman sa najmanje jednim kortikosteroidom (npr. prednizonom) za inflamatornu bolest creva. Neadekvatan odgovor na kortikosteroide odnosi se na znakove i simptome trajno aktivne bolesti, uprkos istoriji najmanje jednog 4-nedeljnog režima za indukciju koji je uključivao dozu ekvivalentnu dozi od 30 mg prednizona dnevno oralno tokom 2 nedelje ili intravenski tokom 1 nedelje. Gubitak odgovora na kortikosteroide odnosi se na dva neuspela pokušaja da se kortikosteroidi smanje ispod doze ekvivalentne prednizonu 10 mg dnevno oralno. Netolerancija kortikosteroida uključuje istoriju Kušingovog sindroma, osteopeniju/osteoporozu, hiperglikemiju, nesanicu i/ili infekciju.

Imunomodulator može biti, na primer, oralni azatioprin, 6-merkaptopurin ili metotreksat. Neadekvatan odgovor na imunomodulator odnosi se na znakove i simptome trajno aktivne bolesti uprkos istoriji najmanje jednog 8-nedeljnog režima ili oralnog azatioprina (≥1.5 mg/kg), 6-merkaptopurina (≥0.75 mg/kg) ili metotreksata (≥12.5 mg/ nedeljno). Nepodnošenje imunomodulatora uključuje, ali nije ograničena na, mučninu/povraćanje, bol u stomaku, pankreatitis, LFT abnormalnosti, limfopeniju, TPMT genetsku mutaciju i/ili infekciju.

U jednom aspektu, kod subjekta je mogao da izostane adekvatan odgovor na, da se izgubi odgovor na, ili je pacijent mogao da ne podnosi, lečenje TNF-α antagonistom. Antagonist TNF-α je, na primer, agens koji inhibira biološku aktivnost TNF-α i poželjno vezuje TNF-α, kao što je monoklonsko antitelo, npr. REMICADE (infliksimab), HUMIRA (adalimumab), CIMZIA (certolizumab pegol), SIMPONI (golimumab) ili cirkulirajući protein fuzije receptora kao što je ENBREL (etanercept). Neadekvatan odgovor na antagonista TNF-α odnosi se na znakove i simptome trajno aktivne bolesti uprkos istoriji najmanje jednog 4-nedeljnog režima indukcije sa infliksimabom 5 mg/kg IV, 2 doze u razmaku od najmanje 2 nedelje; jednom subkutanom dozom adalimumaba od 80 mg, nakon čega sledi jedna doza od 40 mg u razmaku od najmanje dve nedelje; ili sa 400 mg subkutano certolizumab pegola, 2 doze najmanje 2 nedelje. Gubitak odgovora na antagonista TNF-α odnosi se na ponavljanje simptoma tokom doziranja održavanja nakon prethodne kliničke koristi. Netolerancija antagonista TNF-α uključuje, ali nije ograničena na reakciju u vezi sa infuzijom, demijelinizaciju, kongestivnu srčanu insuficijenciju i/ili infekciju.

Gubitak održavanja remisije, kao što se ovde koristi za subjekte sa ulceroznim kolitisom, odnosi se na povećanje Mayo skora od najmanje 3 poena i modifikovanog Baron skora od najmanje 2. U drugom aspektu, koriste se formulacije anti-α4β7 antitela koje (1) mogu da vezuju α4β7 integrin in vitro i/iliin vivo; i (2) mogu da moduliraju aktivnost ili funkciju α4β7 integrina, kao što je (a) vezujuća funkcija (npr. sposobnost α4β7 integrina da se veže za MAdCAM (npr. MAdCAM-1), fibronektin i/ili VCAM-1) i/ili (b) funkcija infiltracije leukocita, uključujući regrutovanje i/ili akumulaciju leukocita u tkivima (npr. sposobnost inhibicije migracije limfocita u tkivo mukoze intestinuma). U jednom primeru izvođenja, antitelo u formulaciji može vezati α4β7 integrin, i može inhibirati vezivanje α4β7 integrina na jedan ili više njegovih liganda (npr, MAdCAM (npr, MAdCAM-1), VCAM-1, fibronektin), čime inhibira infiltraciju leukocita u tkiva (uključujući regrutovanje i/ili akumulaciju leukocita u tkivima). U drugom primeru izvođenja, antitelo u formulaciji može vezati α4β7 integrin, i može selektivno inhibirati vezivanje α4β7 integrina za jedan ili više njegovih liganda (npr, MAdCAM (npr. MAdCAM-1), VCAM-1, fibronektin), čime inhibira infiltraciju leukocita u tkiva (uključujući regrutovanje i/ili akumulaciju leukocita u tkivima). Takve formulacije anti-α4β7 antitela mogu inhibirati ćelijsku adheziju ćelija koje nose α4β7 integrin na vaskularne endotelne ćelije u tkivima sluzokože, uključujući tkiva povezana sa crevima, limfoidne organe ili leukocite (posebno limfocite kao što su T ili B ćelije) in vitro i/ili in vivo. U još jednom primeru izvođenja, formulacija anti-α4β7 antitela koja se koristi u predmetnom pronalasku može da inhibira interakciju α4β7 sa MAdCAM (npr. MAdCAM-1) i/ili fibronektinom. U još jednom daljem primeru izvođenja, formulacija anti-α4β7 antitela koja se koristi u predmetnom pronalasku može da inhibira interakciju α4β7 sa MAdCAM (npr. MAdCAM-1) i/ili fibronektinom selektivno, npr. bez inhibicije interakcije α4β7 sa VCAM.

Formulacije anti-α4β7 antitela koje se koriste u ovom pronalasku mogu se koristiti za modulaciju (npr. inhibiciju (smanjenje ili sprečavanje)) funkcije vezivanja i/ili funkciju infiltracije leukocita (npr. limfocita, monocita) α4β7 integrina. Na primer, humanizovani imunoglobulini koji inhibiraju vezivanje α4β7 integrina na ligand (tj. jedan ili više liganda) mogu se primenjivati u skladu sa metodom u lečenju bolesti povezanih sa leukocitima (npr. limfocita, monocita) infiltracije tkiva (uključujući regrutovanje i/ili akumulaciju leukocita u tkivima), posebno tkiva koja eksprimiraju molekul MAdCAM (npr. MAdCAM-1).

Efektivna količina formulacije anti-α4β7 antitela koja se koristi u ovom pronalasku (tj. Jedan ili više) se primenjuje pojedincu (npr. sisar, kao što je čovek ili drugi primat) u cilju lečenja takve bolesti. Na primer, inflamatorne bolesti, uključujući bolesti koje su povezane sa infiltracijom leukocita u gastrointestinalnom traktu (uključujući endotel povezan sa crevima), drugim tkivima sluzokože ili tkivima koja eksprimiraju molekul MAdCAM (npr. MAdCAM-1) (npr. tkiva povezana sa crevima, kao što su venule lamine propria tankog i debelog creva; i mlečne žlezde (npr. mlečne žlezde u laktaciji)), mogu se tretirati prema ovoj metodi. Slično tome, može se lečiti pojedinac koji ima bolest povezanu sa leukocitnom infiltracijom tkiva kao rezultat vezivanja leukocita za ćelije (npr. endotelne ćelije) koje eksprimiraju MAdCAM (npr. MAdCAM-1).

U jednom primeru izvođenja, bolesti koje se mogu tretirati u skladu sa tim uključuju inflamatornu bolest creva (IBD), kao što su ulcerozni kolitis, Kronova bolest, ileitis, celijakija, netropski Sprue, enteropatija povezana sa seronegativnim artropatijama, mikroskopski ili kolagenski kolitis, eozinofilni gastroenteritis, ili pouchitis rezultira nakon proktokolektomije, i ileoanalna anastomoza. Inflamatorna bolest creva može biti Kronova bolest ili ulcerozni kolitis. Ulcerozni kolitis može biti umeren do ozbiljno aktivan ulcerozni kolitis. Lečenje može da rezultira izlečenjem mukoze kod pacijenata koji pate od umereno do ozbiljno aktivnog ulceroznog kolitisa. Lečenje može takođe da dovede do smanjenja, eliminacije ili smanjenja i eliminacije upotrebe kortikosteroida od strane pacijenta.

Pankreatitis i insulin-zavisni dijabetes melitus su druge bolesti koje se mogu lečiti korišćenjem formulacija koje su ovde prikazane. Registrovano je da MAdCAM (npr. MAdCAM-1) eksprimiraju neki sudovi u egzokrinom pankreasu od NOD (negojaznih dijabetičnih) miševa, kao i od BALB/c i SJL miševa. Ekspresija MAdCAM-1 je navodno indukovana na endotelu u upaljenim ostrvcima pankreasa NOD miša, a MAdCAM-1 je bio dominantni adresin eksprimiran od strane endotela NOD ostrvaca u ranim fazama insulitisa (Hanninen, A., et al., J. Clin. Invest., 92: 2509-2515 (1993)). Lečenje NOD miševa sa anti-MAdCAM (npr. Anti-MAdCAM-1) ili anti β7 antitelima sprečilo je razvoj dijabetesa (Yang et al., Diabetes, 46: 1542-1547 (1997) ). Dalje, primećena je akumulacija limfocita koji eksprimiraju α4β7 unutar ostrvaca, a MAdCAM-1 je bio uključen u vezivanje ćelija limfoma preko α4β7 na sudove iz upaljenih ostrvaca (Hanninen, A., et al., J. Clin. Invest., 92: 2509-2515 (1993)) ili gastrointestinalnom traktu u limfomu plaštenih ćelija (Geissmann et al., Am. J. Pathol., 153: 1701-1705 (1998) ).

Primeri inflamatornih bolesti povezanih sa sluzokože tkiva koje se mogu tretirati korišćenjem formulacije koja je ovde otkrivena uključuju holecistitis, holangitis (Adams and Eksteen Nature Reviev 6:244-251 (2006) Grant et al., Hepatologi 33:1065-1072 (2001) ), na primer, primarni sklerozirajući holangitis, Behčetova bolest, na primer, creva, ili periholangitis (žučnih puteva i okolnog tkiva jetre), i transplantat protiv bolesti domaćina (npr, u gastrointestinalnom traktu (npr. Nakon transplantacije koštane srži) (Petrović et al. Blood 103:1542-1547 (2004)). Kao što se vidi kod Kronove bolesti, upala se često proteže izvan površine sluzokože, shodno tome hronične inflamatorne bolesti, kao što su sarkoidoza, hronični gastritis, npr. Autoimuni gastritis (Katakai et al., Int. Immunol., 14:167-175 (2002)) i druga idiopatska stanja mogu biti podložna lečenju.

Ovde je takođe otkriven metod inhibicije infiltracije leukocita u tkivo sluzokože. Ovde je takođe otkrivena metoda za lečenje raka (npr. α4β7 pozitivan tumor, kao što je limfom). Drugi primeri inflamatornih bolesti povezanih sa tkivima sluzokože koji se mogu tretirati korišćenjem formulacije koja je ovde otkrivena uključuju mastitis (mlečne žlezde) i sindrom iritabilnog kolona.

Bolesti ili patogeni čija etiologija eksploatiše interakciju MAdCAM (npr. MAdCAM-1) sa α4β7 mogu se tretirati anti-α4β7 antitelom u formulaciji koja je ovde opisana. Primeri takvih bolesti uključuju poremećaje imunodeficijencije, kao što je uzrokovano virusom humane imunodeficijencije (videti npr. WO2008140602).

Formulacija koja se koristi od strane pronalaska se primenjuje u efektivnoj količini koja inhibira vezivanje α4β7 integrina na njegov ligand. Za terapiju, efektivna količina će biti dovoljna da se postigne željeni terapijski (uključujući profilaktički) efekat (kao što je količina dovoljna da se smanji ili spreči α4β7 integrin-posredovano vezivanje i/ili signalizacija, čime se inhibira adhezija leukocita i infiltracija i/ili povezani ćelijski odgovori). Efektivna količina antitela protiv α4β7, npr. Efikasan titar dovoljan za održavanje zasićenja, npr. Neutralizacija, α4β7 integrina, može izazvati klinički odgovor ili remisiju kod upalne bolesti creva. Formulacija koja se koristi prema pronalasku može da se primenjuje kao jedinična doza ili više doza. Doziranje se može odrediti metodama poznatim u ovoj oblasti i može zavisiti, na primer, od starosti, osetljivosti, tolerancije i opšteg blagostanja pojedinca. Primeri načina primene koji su ovde objavljeni uključuju aktuelne puteve kao što su nazalna ili inhalaciona ili transdermalna primena, enteralni putevi, kao što su kroz cevi za hranjenje ili supozitorija, i parenteralne puteve, kao što su intravenska, intramuskularna, subkutana, intraarterialna, intraperitonealna ili intravitrealna primena. Pogodne doze za antitela koja su ovde otkrivena mogu biti od oko 0,1 mg/kg telesne težine do oko 10.0 mg/kg telesne težine po tretmanu, na primer oko 2 mg/kg do oko 7 mg/kg, oko 3 mg/kg do oko 6 mg/kg, ili oko 3.5 do oko 5 mg/kg. Kao što je ovde objavljeno, primenjena doza može biti oko 0.3 mg/kg, oko 0.5 mg/kg, oko 1 mg/kg, oko 2 mg/kg, oko 3 mg/kg, oko 4 mg/kg, oko 5 mg/kg, oko 6 mg/kg, oko 7 mg/kg, oko 8 mg/kg, oko 9 mg/kg ili oko 10 mg/kg.

Finalni oblik doziranja, npr. nakon razblaživanja rekonstituisanog antitela (npr. u fiziološkom rastvoru ili 5% infuzijskom sistemu dekstroze) anti-α4β7 antitela može biti oko 0.5 mg/ml do oko 5 mg/ml za primenu. Finalni oblik doziranja može biti u koncentraciji između oko 1.0 mg/ml do oko 1.4 mg/ml, oko 1.0 mg/ml do oko 1.3 mg/ml, oko 1.0 mg/ml do oko 1.2 mg/ml, oko 1.0 do oko 1.1 mg/ml, oko 1.1 mg/ml do oko 1.4 mg/ml, oko 1.1 mg/ml do oko 1.3 mg/ml, Oko 1.1 mg/ml na oko 1.2 mg/ml, oko 1.2 mg/ml na oko 1.4 mg/ml, oko 1.2 mg/ml na oko 1.3 mg/ml, ili oko 1.3 mg/ml na oko 1.4 mg/ml. Finalni oblik doziranja može biti u koncentraciji od oko 0.6 mg/ml, 0.8 mg/ml, 1.0 mg/ml, 1.1 mg/ml, oko 1.2 mg/ml, oko 1.3 mg/ml, oko 1.4 mg/ml, oko 1.5 mg/ml, oko 1.6 mg/ml, oko 1.8 mg/ml ili oko 2.0 mg/ml. U jednom primeru izvođenja, ukupna doza je 180 mg. U jednom primeru izvođenja, ukupna doza je 300 mg. Doza anti-α4β7 antitela od 300 mg može se razblažiti u 250 ml fiziološkog rastvora ili 5% rastvora dekstroze za primenu.

U nekim aspektima, režim doziranja ima dve faze, fazu indukcije i fazu održavanja. U fazi indukcije, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment se primenjuje na način koji brzo obezbeđuje efektivnu količinu antitela ili fragmenta koji vezuje antigen koji je pogodan za određene svrhe, kao što je izazivanje imune tolerancije na antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment ili za izazivanje kliničkog odgovora i poboljšanje simptoma upalne bolesti creva. Pacijentu se može dati tretman indukcijske faze kada se prvi put leči anti-α4β7 antitelom, kada se leči nakon dužeg odsustva sa terapije, npr. Više od tri meseca, više od četiri meseca, više od šest meseci, više od devet meseci, više od godinu dana, više od osamnaest meseci ili više od dve godine od terapije anti-α4β7 antitelima ili tokom faze održavanja anti-α4β7 antitela ako je došlo do povratka simptomi inflamatorne bolesti creva, na primer, recidiv od remisije bolesti. U nekim primerima izvođenja, režim faze indukcije rezultira većom srednjom koncentracijom u serumu, npr. Koncentracija neposredno pre sledeće doze, od srednje koncentracije u stanju dinamičkog stanja koja se održava tokom režima održavanja.

U fazi održavanja, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment se primenjuje na način koji nastavlja odgovor postignut indukcionom terapijom sa stabilnim nivoom antitela ili fragmenta koji vezuje antigen. Režim održavanja može sprečiti povratak simptoma ili recidiv inflamatorne bolesti creva. Režim održavanja može pružiti pogodnost pacijentu, na primer, biti jednostavan režim doziranja ili zahtevati retke putovanja za lečenje. U nekim primerima izvođenja, režim održavanja može da uključuje primenu anti-α4β7 antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, npr. u ovde opisanoj formulaciji, po strategiji koja je odabrana iz grupe koja se sastoji od niske doze, retke primene, samostalne primene i bilo koje kombinacije prethodno navedenog.

U jednom primeru izvođenja, na primer, tokom indukcijske faze terapije, režim doziranja obezbeđuje efektivnu količinu anti-α4β7 antitela ili antigen-vezujućeg fragmenta u formulaciji opisanoj ovde za izazivanje remisije inflamatorne bolesti creva kod humanog pacijenta. U nekim primerima izvođenja, efektivna količina anti-α4β7 antitela je dovoljna da se postigne oko 5 μg/mL do oko 60 μg/mL, oko 15 μg/mL do oko 45 μg/mL, oko 20 μg/mL do oko 30 μg/mL, ili oko 25 μg/mL do oko 35 μg/mL srednja koncentracija u serumu anti-α4β7 antitela do kraja faze indukcije. Trajanje faze indukcije može biti oko četiri nedelje, oko pet nedelja, oko šest nedelja, oko sedam nedelja ili oko osam nedelja lečenja. U nekim primerima izvođenja, režim indukcije može da koristi strategiju koja je odabrana iz grupe koja se sastoji od visoke doze, česte primene i kombinacije visoke doze i česte primene anti-α4β7 antitela ili njegovog antigenvezujućeg fragmenta, npr. u ovde opisanoj formulaciji. Indukcijsko doziranje može biti jednom, ili više od jedne doze, na primer, najmanje dve doze. Tokom faze indukcije, doza se može primenjivati jednom dnevno, svaki drugi dan, dva puta nedeljno, jednom nedeljno, jednom u deset dana, jednom u dve nedelje ili jednom u tri nedelje. U nekim primerima izvođenja, indukcijske doze se primenjuju u prve dve nedelje terapije anti-α4β7 antitelom. U jednom primeru izvođenja, indukcija doziranje može biti jednom na početku lečenja (dan 0) i jednom oko dve nedelje nakon početka lečenja. U drugom primeru izvođenja, trajanje faze indukcije je šest nedelja. U drugom primeru izvođenja, trajanje faze indukcije je šest nedelja i veći broj indukcijskih doza se primenjuje tokom prve dve nedelje.

U nekim primerima izvođenja, na primer, kada započinje lečenje pacijenta sa teškom inflamatornom bolešću creva (npr, kod pacijenata koji nisu uspeli anti-TNFα terapiju), indukcija faza treba da ima duže trajanje nego kod pacijenata sa blagom ili umerenom bolešću. U nekim primerima izvođenja, indukcija faza za pacijenta sa teškom bolešću može imati trajanje od najmanje 6 nedelja, najmanje 8 nedelja, najmanje 10 nedelja, najmanje 12 nedelja ili najmanje 14 nedelja. U jednom primeru izvođenja, režim indukcije doziranja za pacijenta sa teškom bolešću može uključivati dozu u nedelji 0 (početak lečenja), doza u nedelji 2 i doza u nedelji 6. U drugom izvođenju, režim indukcije doziranja za pacijenta sa teškom bolešću može da sadrži dozu u nedelji 0 (početak lečenja), doza u nedelji 2, doza u nedelji 6 i doza u nedelji 10.

U jednom primeru izvođenja, npr. tokom faze održavanja terapije, režim doziranja održava srednju vrednost stanja ravnoteže putem koncentracije u serumu, npr. platoa koncentracije neposredno pre sledeće doze, od oko 5 do oko 25 μg/mL, oko 7 do oko 20 μg/mL, oko 5 do oko 10 μg/mL, oko 10 do oko 20 μg/mL, oko 15 do oko 25 μg/mL ili oko 9 do oko 13 μg/mL antiα4β7 antitela. U drugom primeru izvođenja, režim doziranja, npr. tokom faze održavanja terapije, održava srednju vrednost stanja ravnoteže putem koncentracije u serumu od oko 20 do oko 30 μg/mL, oko 20 do oko 55 μg/mL, oko 30 do oko 45 μg/mL, oko 45 do oko 55 μg/mL ili oko 35 do oko 40 μg/mL anti-α4β7 antitela.

Kao što je ovde objavljeno, doza se može primenjivati jednom nedeljno, jednom u 2 nedelje, jednom u 3 nedelje, jednom u 4 nedelje, jednom u 6 nedelja, jednom u 8 nedelja ili jednom u 10 nedelja. Veća ili češća doza, npr. Jednom nedeljno, jednom u 2 nedelje, jednom u 3 nedelje ili jednom u 4 nedelje može biti korisna za izazivanje remisije aktivne bolesti ili za lečenje novog pacijenta, npr. Za izazivanje tolerancije na anti- α4β7 antitela. Ređa doza, npr. Jednom u 4 nedelje, jednom u 5 nedelja, jednom u 6 nedelja, jednom u 8 nedelja ili jednom u 10 nedelja, može biti korisna za preventivnu terapiju, npr. Za održavanje remisije pacijenta sa hroničnom bolešću. U jednom aspektu, režim lečenja je tretman na dan 0, oko nedelje 2, oko nedelje 6 i svake 4 ili 8 nedelja nakon toga. U jednom primeru izvođenja, režim održavanja uključuje dozu svakih 8 nedelja. U izvođenju, gde pacijent na jednoj dozi svakih osam nedelja režima održavanja doživljava povratak jednog ili više simptoma bolesti, na primer, ima recidiv, učestalost doziranja može da se poveća, na primer, da jednom u 4 nedelje.

Doza se može primenjivati kod pacijenta oko 20 minuta, oko 25 minuta, oko 30 minuta, oko 35 minuta ili oko 40 minuta.

Režim doziranja može se optimizirati kako bi se izazvao klinički odgovor i klinička remisija kod upalne bolesti creva pacijenta. U nekim aspektima, režim doziranja ne menja odnos CD4 i CD8 u cerebrospinalnoj tečnosti pacijenata koji primaju tretman.

U nekim aspektima, trajna klinička remisija, na primer, klinička remisija koja se održava kroz najmanje dva, najmanje tri, najmanje četiri posete lekaru u roku od šest meseci ili godinu dana nakon početka lečenja, može se postići optimizovanim režimom doziranja.

U nekim aspektima, trajni klinički odgovor, na primer, klinički odgovor koji se održava najmanje 6 meseci, najmanje 9 meseci, najmanje godinu dana, nakon početka lečenja, može se postići optimizovanim režimom doziranja.

U jednom primeru izvođenja, režim doziranja obuhvata početnu dozu od 300 mg, drugu narednu dozu od 300 mg oko dve nedelje nakon inicijalne doze, treću narednu dozu od 300 mg na oko šest nedelja nakon inicijalne doze, zatim četvrte i naredne doze 300 mg svake četiri nedelje ili svakih osam nedelja nakon treće naredne doze.

U nekim primerima izvođenja, način lečenja, doza ili režim doziranja smanjuje verovatnoću da će pacijent razviti HAHA odgovor na anti-α4β7 antitelo. Razvoj HAHA, npr. Mereno antitelima reaktivnim na anti-α4β7 antitelo, može povećati klirens anti-α4β7 antitela, npr. Smanjiti koncentraciju anti-α4β7 antitela u serumu, npr. Smanjujući broj anti-α4β7 antitela vezanih za α4β7 integrin, čime se tretman čini manje efikasnim. U nekim primerima izvođenja, kako bi se sprečilo HAHA, pacijent se može lečiti indukcionim režimom praćenim režimom održavanja. U nekim primerima izvođenja nema prekida između režima indukcije i režima održavanja. U nekim primerima izvođenja, indukcioni režim obuhvata davanje većeg broja doza anti-α4β7 antitela pacijentu. Da bi se sprečila HAHA, pacijent se može lečiti sa visokom početnom dozom koja je ovde objavljena, npr. najmanje 1.5 mg/kg, najmanje 2 mg/kg, najmanje 2.5 mg/kg, najmanje 3 mg/kg, najmanje 5 mg/kg, najmanje 8 mg/kg, najmanje 10 mg/kg ili oko 2 do oko 6 mg/kg, ili česte početne primene, npr. Otprilike jednom nedeljno, otprilike jednom u dve nedelje ili otprilike jednom u tri nedelje, standardne doze kada se započne terapija anti-α4β7 antitelom. U nekim primerima izvođenja, metod lečenja održava najmanje 30%, najmanje 40%, najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90% ili najmanje 95% pacijenata kao HAHA-negativni. U drugim primerima izvođenja, metod lečenja održava pacijente kao HAHA-negativne najmanje 6 nedelja, najmanje 10 nedelja najmanje 15 nedelja, najmanje šest meseci, najmanje 1 godinu, najmanje 2 godine, ili za vreme trajanja terapije. U nekim primerima izvođenja, pacijenti, ili najmanje 30%, najmanje 40%, najmanje 50% ili najmanje 60% pacijenata koji razviju HAHA održavaju nizak titar, na primer, ≤125, anti-α4β7 antitela. U izvođenju, metod lečenja održava najmanje 70% pacijenata kao HAHA-negativnih najmanje 12 nedelja nakon početka terapije anti-α4β7 antitelom.

Formulacija se može davati pojedincu (npr. čoveku) sama ili u saradnji sa drugim agensom. Formulacija koja se koristi od strane pronalaska može se primenjivati pre, zajedno sa ili nakon primene dodatnog agensa. U jednom primeru izvođenja, više od jedne formulacije koja inhibira vezivanje α4β7 integrina na svojim ligandima se primenjuje. U takvom primeru izvođenja može da se primeni agens, npr. monoklonsko antitelo, kao što je anti-MAdCAM (npr. anti-MAdCAM-1) ili anti-VCAM-1 monoklonsko antitelo. U drugom primeru izvođenja, dodatni agens inhibira vezivanje leukocita za endotelni ligand u putu koji je različit od α4β7 puta. Ovaj agens može da inhibira vezivanje, npr. limfocita koji eksprimiraju receptor za hemokine (C-C motiv) 9 (CCR9) za hemokine eksprimirane u timusu (TECK ili CCL25) ili agens koje sprečava vezivanje LFA-1 za molekul međućelijske adhezije (ICAM). Na primer, anti-TECK ili anti-CCR9 antitelo ili malomolekulski CCR9 inhibitor, kao što su inhibitori prikazani u PCT objavi WO03/099773 ili WO04/046092, ili anti-ICAM-1 antitelo ili oligonukleotid koji sprečava ekspresiju ICAM, primenjuje se pored formulacije za upotrebu prema predmetnom pronalasku. U još jednom primeru izvođenja, dodatni aktivni sastojak (npr. antiinflamatorno jedinjenje, kao što je sulfasalazin, azatioprin, 6-merkaptopurin, 5-aminosalicilna kiselina koja sadrži antiinflamatorne lekove, drugo nesteroidno antiinflamatorno jedinjenje, steroidno antiinflamatorno jedinjenje ili antibiotici koji se obično primenjuju za kontrolu IBD bolesti (npr. ciprofloksacin, metronidazol) ili drugi biološki agens (npr. TNF alfa antagonisti) mogu da se primenjuju zajedno sa formulacijom za upotrebu prema predmetnom pronalasku.

U jednom primeru izvođenja, doza zajedno primenjenih lekova može da se smanjuje tokom vremena, tokom perioda lečenja formulacijom koja sadrži anti-α4β7 antitelo. Na primer, pacijent koji se leči steroidom (npr. prednizonom, prednizolonom) na početku ili pre lečenja formulacijom anti-α4β7 antitela bio bi podvrgnut režimu smanjenja doza steroida počevši već od 6. nedelje lečenja formulacijom anti-α4β7 antitela. Doza steroida će biti smanjena za oko 25% u roku od 4-8 nedelja od početka postepenog smanjenja, za 50% posle oko 8-12 nedelja i 75% posle oko 12-16 nedelja postepenog smanjenja, tokom lečenja formulacijom anti-α4β7 antitela. U jednom aspektu, posle oko 16-24 nedelje lečenja formulacijom anti-α4β7 antitela, doza steroida može da se eliminiše. U drugom primeru, pacijent koji se leči antiinflamatornim jedinjenjem, kao što je 6-merkaptopurin, na početku, ili pre lečenja formulacijom anti-α4β7 antitela, bi bio podvrgnut režimu smanjenja doza antiinflamatornog jedinjenja koji je sličan režimu postepenog smanjenja za doziranje steroida kao što je navedeno prethodno u tekstu. U jednom primeru izvođenja, upotreba u postupku može da obuhvati primenu efikasne količinu formulacije za upotrebu prema pronalasku kod pacijenta. Ako je formulacija u čvrstom, npr. suvom stanju, proces primene može da obuhvati korak konvertovanja formulacije u tečno stanje. U jednom aspektu, suva formulacija može da se rekonstituiše, npr. pomoću tečnosti, kao što je prethodno opisano, za upotrebu u injekciji, npr. intravenskoj, intramuskularnoj ili subkutanoj injekciji. U drugom aspektu, čvrsta ili suva formulacija može da se primenjuje topikalno npr. u flasteru, kremi, aerosolu ili supozitoriji.

Ovde je takođe otkriven postupak za lečenje bolesti povezane sa infiltracijom leukocita u tkiva koja eksprimiraju molekul MAdCAM (npr. MAdCAM-1). Postupak obuhvata primenu kod pacijenta kome je to potrebno, efikasne količine formulacije anti-α4β7 antitela prema pronalasku. U jednom primeru izvođenja, bolest je bolest kalem-protiv-domaćina. U nekim primerima izvođenja, bolest je bolest povezana sa infiltracijom leukocita u tkiva kao rezultat vezivanja leukocita koji eksprimiraju α4β7 integrin za endotel povezan sa crevima, koji eksprimira molekul MAdCAM (npr. MAdCAM-1). U drugim primerima izvođenja, bolest je gastritis (npr. eozinofilni gastritis ili autoimuni gastritis), pankreatitis ili insulin-zavisni dijabetes melitus. U sledećim primerima izvođenja, bolest je holecistitis, holangitis ili periholangitis.

Pronalazak se takođe odnosi na humanizovano anti-α4β7 antitelo za upotrebu u postupku za lečenje inflamatorne bolesti creva kod pacijenta, kao što je definisano patentnim zahtevima. U jednom primeru izvođenja, postupak obuhvata primenu kod pacijenta kome je to potrebno, efikasne količine formulacije anti-α4β7 antitela prema pronalasku. U nekim primerima izvođenja, inflamatorna bolest creva je ulcerozni kolitis ili Kronova bolest. U drugim primerima izvođenja, inflamatorna bolest creva je celijakija, enteropatija povezana sa seronegativnim artropatijama, mikroskopski ili kolageni kolitis, gastroenteritis (npr, eozinofilni gastroenteritis), ili pouchitis.

U nekim primerima izvođenja, tretman anti-α4β7 antitela ne menja odnos CD4: CD8 limfocita. CD4: CD8 koeficijenti mogu se meriti u krvi, limfnim čvorovima aspirata i cerebro-kičmenoj tečnosti (CSF). CSF CD4 : CD8 odnos limfocita kod zdravih osoba je obično veći ili jednak oko 1. (Svenningsson et al., J. Neuroimmunol.1995; 63:39-46; Svenningsson et al., Ann Neurol.

1993; 34:155-161). Imunomodulator može da promeni odnos CD4: CD8 na manje od 1.

Predmet proizvodnje

U drugom aspektu, ovde je objavljen proizvodni proizvod koji sadrži farmaceutsku formulaciju koja je ovde otkrivena i daje uputstva za njegovu upotrebu. Proizvod proizvodnje sadrži kontejner. Pogodni kontejneri uključuju, na primer, boce, bočice (na primer, dvokomorne bočice, bočicu tečne formulacije sa ili bez igle, bočicu čvrste formulacije sa ili bez bočice tečnosti za rekonstituciju sa ili bez igle), špriceve (kao što su dvokomorni špricevi, prethodno napunjene špriceve) i epruvete. Kontejner može biti formiran od različitih materijala kao što su staklo, metal ili plastika. Kontejner sadrži formulaciju i etiketu na, ili u vezi sa, kontejner može ukazivati na uputstva za upotrebu. U drugom primeru izvođenja, formulacija može biti pripremljena za samo-administraciju i/ili sadrže uputstva za samoupravu. U jednom aspektu, kontejner koji drži formulaciju može biti bočica za jednokratnu upotrebu. U drugom aspektu, kontejner koji drži formulaciju može biti višenamenska bočica, koja omogućava ponovnu primenu (npr. Od 2-6 administracija) formulacije, npr. Koristeći više od jednog dela rekonstituisane formulacije. Proizvod proizvodnje može dalje uključivati i druge materijale poželjne sa komercijalnog i korisničkog stanovišta, uključujući i druge pufere, razblaživače, filtere, igle, špriceve i uputstva za upotrebu sa uputstvima za upotrebu kao što je navedeno u prethodnom odeljku.

Klinička analiza i analiza kvaliteta

U drugom aspektu, ovde je otkriven metod za utvrđivanje da farmaceutska formulacija zadovoljava standarde kvaliteta proizvoda. Metoda može da obuhvati procenu liofilizovane farmaceutske formulacije (npr. humanizovanog anti-α4β7 antitela) koja obuhvata inspekciju formulacije za procenu izgleda, određivanje vremena rekonstitucije, određivanje sadržaja vlage u liofilizovanoj formulaciji, merenje agregata u liofilizovanoj formulaciji, merenje fragmentacije, merenje oksidacije / deamidacije, i opciono procenu biološke aktivnosti i potencije, pri čemu postizanje unapred određenih standarda pokazuje proizvod je indiciran za kliničku upotrebu.

Prihvatljivi nivoi kvaliteta uključuju ≤5.0% vlage, ≤40 minuta vremena rekonstitucije, pH6.3 ±0.3 rekonstituisane tečnosti, 54.0 do 66.0 mg/ml koncentracije antitela, ≥55.0% glavne izoforme po CEX-u, ≥96.0% monomera po SEC-u, ≤2.5% visoke molekulske mase (agregati), ≥90% H+L lanaca po SDS-PAGE, 60 – 140% referentne standardne adhezije.

Pronalazak će biti potpunije shvaćen pozivanjem na sledeće primere. Međutim, ne treba ih tumačiti kao ograničavanje obima pronalaska.

RAZVOJNI PROTOKOL ZA IZRADU FORMULACIJA

A. Rastvor anti-α4β7 antitela

Bočice smrznutog preparata antitela protiv α4β7 visoke koncentracije (vedolizumab, 50 mM histidin, 125 mM arginin, 0.06% polisorbat 80, pH6.3) odmrzavaju se na sobnoj temperaturi 16-24 sata. Odmrznute boce se spajaju u posudu za spajanje od nerđajućeg čelika i mešaju. Preparat se zatim razblažuje sa razblaživačem pufera A (50 mM histidin, 125 mM arginin, 0.06% polisorbat 80, pH 6.3) do 80 mg/ml vedolizumaba i meša. Saharoza se zatim dodaje razblaživanjem preparata sa razblaživačem pufera B koji sadrži saharozu (50 mM histidin, 125 mM arginin, 40% saharoza, 0.06% polisorbat 80, pH6.3). Ovaj korak razblažuje preparat antitela protiv α4β7 u tečnu formulaciju od 60 mg/ml vedolizumaba, 50 mM histidina, 125 mM arginina, 10% saharoze, 0.06% polisorbata 80, pH6.3.

B. Liofilizacija

Staklene bočice od 20 mL se pune sa po 5.52 mL tečne formulacije anti-α4β7 antitela koncentracije 60 mg/ml u 50 mM histidinu, 125 mM argininu, 0.06% polisorbatu 80, 10% saharozi, pri pH 6.3 i čepovi se postavljaju u položaj za liofilizaciju. Bočice se smeštaju na police u liofilizatoru podešene na oko 20°C. Nakon punjenja svih bočica i zatvaranja vrata, temperatura polica se spušta da zamrzne rastvor, oko -45°C. Nakon 3 sata na ovoj temperaturi, temperatura polica se podiže na -20°C za žarenje. Nakon žarenja u trajanju od četiri sata, temperatura polica se spušta da bi se rastvor ponovo zamrznuo, oko -45°C. Nakon ravnoteže bočica na ovu temperaturu, vazduh se evakuiše iz komore. Kada je pritisak 150 mTorr, temperatura polica se pojačava na primarnu temperaturu sušenja, oko -24 ° C. Primarno sušenje se nastavlja sve dok se sav kristalni led ne sublimira iz bočica. Zatim se temperatura polica podigne na 27 ° C za sekundarno sušenje tokom 16 sati, sve dok vlaga ne bude približno manja od 2.5% liofilizovane formulacije. Kada je sekundarno sušenje završeno, azot gas se zatrpava u komoru dok se ne postigne pritisak okoline. Bočice su začepljene i uklonjene iz liofilizatora. C. Skladištenje i upotreba liofilizovanog anti-α4β7 antitela

Liofilizovane bočice anti-α4β7 antitela se čuvaju na -70°C, -20°C, 2-8 ° C ili 25°C u željenom vremenskom periodu. Kada je spreman za upotrebu, bočica je uravnotežena na sobnoj temperaturi. Zatim se sadržaj bočice rekonstituiše špricom koji sadrži vodu za injekcije ("WFI") pomoću igle od 21 G. Količina WFI se određuje tako da finalna zapremina rekonstituisanog rastvora antitela bude ista kao i zapremina pre-liofilizovanog rastvora. Za pre-liofilizacionu zapreminu od 5.52 ml, dodaje se 4.8 ml WFI. Bočica se lagano vrti, a zatim drži 10-30 minuta kako bi se omogućilo da se formulacija rekonstituiše, a zatim se rastvor antitela izvadi pomoću šprica i dodaje se i dodaje u IV kesu za davanje IV infuzije pacijentu.

PRIMERI PRIMER 1

UPOREDNI PODACI ZA PROMENLJIVE % ŠEĆERA I AMINOKISELINA U LIOFILIZOVANIM FORMULACIJAMA

Sproveden je pristup dizajniranja eksperimenata kako bi se sagledao efekat variranja molarnog odnosa šećera (saharoze i manitola) i proteina, molarnog odnosa arginina i proteina i molarne količine histidinskog pufera. Poznato je da histidin i arginin ne kristalizuju tokom procesa liofilizacije, što ih čini potencijalnim krio ili lio protektantima.1.5 mL formulacije je napunjeno u 5 mL bočice liofilizovane primarnim sušenjem na -30°C, 150 mT i sekundarnim sušenjem na 20°C, 150 mT. Stabilnost liofilizovanih formulacija rekonstituisana na 1.5 ml nakon različitih uslova skladištenja je prikazana u tabelama 1-3 (sastavljanje 60 mg/ml rezultata iz dva eksperimenta). Slika 6A prikazuje prediktivne modele za promene u procentu monomera, procenata agregata i procenata glavne izoforme kada se čuvaju na 40°C kada je pH i molarni odnos šećera i arginina varirao. Stabilnost formulacije je bila najbolja pri niskom pH i visokom molarnom odnosu (šećer arginin) prema proteinima. U ispitivanim molarnim količinama histidina, histidin nije uticao na stabilnost formulacije. Sve formulacije su imale 1-2% vlage tokom skladištenja.

Tabela 1: Promena procenta monomera prilikom skladištenja na 5°C, 25°C/60% RH i 40°C/75% RH tokom 3 meseca. Procenat monomera je meren pomoću hromatografije za isključivanje po veličini (SEC).

Tabela 2: Promena procenta agregata prilikom skladištenja na 5° C, 25°C/60% RH i 40°C/75% RH tokom 3 meseca. Procenat monomera je meren pomoću hromatografije za isključivanje po veličini (SEC).

Tabela 3: Promena procenta glavne izoforme prilikom skladištenja na 5° C, 25°C/60% RH i 40°C/75% RH tokom 3 meseca. Glavna izoforma je merena pomoću kationske jonoizmenjivačke hromatografije (CEX).

SL. 6A prikazuje prediktivne modele na bazi statističke analize podataka za 40°C iz tabela 1-3. Model za promenu procenta monomera po mesecu, na 40°C prema SEC analizi je -3.10 (0.3 86)*pH 0.000516*((molovi šećera+molovi arginina)/molovi proteina)). Model za promenu procenta agregata po mesecu, na 40°C prema SEC analizi je 2.43 - (0.263)*pH -0.000787*((molovi šećera+molovi arginina)/molovi proteina)). Model za promenu procenta glavne izoforme po mesecu, na 40°C prema CEX analizi je -2.54 (0.109)*pH 0.00130*((molovi šećera+molovi arginina)/molovi proteina)). Središnja linija prikazuje rezultate za prediktivne modele, a spoljašnje linije prikazuju 95% granice pouzdanosti za prediktivne modele.

SL. 6 B prikazuje alternativne modele zasnovane na statističkoj analizi 40°C podataka iz tabela 1-3 kada su ulazni faktori pH, šećer - protein molarni odnos, i arginin: protein molarni odnos. Model za promenu procenta monomera po mesecu, na 40°C prema SEC analizi je -3.02 (0.370)*pH 0.000482*((molovi šećera)/(molovi proteina) 0.000657*((molovi arginina/molovi proteina). Model za promenu procenta agregata po mesecu, na 40°C prema SEC analizi je 2.35 - (0.244)*pH - 0.000727*((molovi šećera)/(molovi proteina) -0.00102*((molovi arginina)/(molovi proteina)). Model za promenu procenta glavne izoforme po mesecu, na 40°C prema CEX analizi je -2.92 (0.210)*pH 0.00164*((molovi šećera)/(molovi proteina) - 0.000220*((molovi arginina)/(molovi proteina)). Središnja linija prikazuje rezultate za prediktivne modele, a spoljašnje linije prikazuju 95% granice pouzdanosti za prediktivne modele.

Primer 2

Podaci o stabilnosti

Stabilnost tri serije formulacije (serija A, B i C) primarne stabilnosti testirana je nakon skladištenja u propisanim uslovima skladištenja (5 i 25°C/60% RH do najviše 24 meseca). Sve tri serije sadrže istu tečnu formulaciju koja je liofilizovana: 60 mg/ml anti-α4β7 antitelo, 50 mM histidin, 125 mM arginin, 10% saharoza, 0.06% polisorbat 80, pH 6.3. Za seriju A, 3.5 mL rastvora je napunjeno u 20 mL bočice i liofilizovano, za serije B i C, 5.52 mL rastvora je napunjeno u 20 mL bočice i liofilizovano.

U posebnoj studiji, jedna formulacija leka od 60 mg/ml anti-α4β7 antitela, 50 mM histidin, 125 mM arginin, 10% saharoza, 0.06% polisorbat 80, pH 6.3 je liofilizovana u dve zapremine, 3.5 ml i 9.5 ml, respektivno, da bi se dobile serije R i S za uzorke stabilnosti, koji su analizirani tokom 38 meseci. Praznine su NT (nisu testirane).

Podaci (tabele 4-19) pokazali su da su formulacije antitela ostale stabilne prilikom skladištenja i do 38 meseci na 5°C i do 30 meseci na 25°C/60% RH. Svi atributi proizvoda ostali su u okviru specifikacija sve vreme do vremenske tačke od 38 meseci.

Tabela 4: Promena procenta monomera prema SEC prilikom skladištenja na 5°C.

Tabela 5: Promena procenta agregata prema SEC prilikom skladištenja na 5°C.

Tabela 6: Promena procenta glavne izoforme prema CEX prilikom skladištenja na 5°C

Tabela 7: Promena procenta kiselih izoformi prema CEX, prilikom skladištenja na 5°C.

Tabela 8: Promena procenta baznih izoformi prema CEX, prilikom skladištenja na 5°C.

Tabela 9: Promena % (H+L) prema redukujućoj SDS Page, prilikom skladištenja na 5°C.

Tabela 10: Promena efikasnosti vezivanja prilikom skladištenja na 5°C.

Tabela 11: Promena % vlage prema KF prilikom skladištenja na 5°C

Tabela 12: Promena procenta monomera prema SEC prilikom skladištenja na 25°C/60%RH

Tabela 13: Promena procenta agregata prema SEC prilikom skladištenja na 25°C/60%RH.

Tabela 14: Promena procenta glavne izoforme prema CEX prilikom skladištenja na 25°C/60%RH

Tabela 15: Promena procenta kiselih izoformi prema CEX prilikom skladištenja na 25°C/60%RH

Tabela 16: Promena procenta baznih izoformi prema CEX prilikom skladištenja na 25°C/60%RH

Tabela 17: Promena % (H+L) prema redukujućoj SDS Page, prilikom skladištenja na 25°C/60%RH.

Tabela 18: Promena efikasnosti vezivanja prilikom skladištenja na 25°C/60%RH.

Tabela 19: Promena % vlage prema KF prilikom skladištenja na 25°C/60%RH

Katjonska jonoizmenjivačka hromatografija (CEX)

Gradijent fosfata/natrijum hlorida na slaboj koloni za razmenu katjona koristi se u sistemu tečne hromatografije visokih performansi za odvajanje naelektrisanih vrsta u formulacijama antiα4β7 antitela i određivanje sastava naelektrisanja vrsta antitela. Kisele izoforme eluiraju se pre glavne izoforme, a bazne izoforme eluiraju se nakon glavne izoforme.

Podaci o stabilnosti za sve serije vedolizumaba generisane pomoću CEX testa prikazani su u tabelama 3, 6-8 i 14-16. Tabele pokazuju, da u ovim uslovima skladištenja, nije bilo trenda smanjenja% glavne izoforme ispod 55.0%.

Hromatografija za isključenje po veličini (SEC)

SEC se izvodi pomoću analitičke SEC kolone (Tosoh Bioscience, LLC, King of Prussia, PA). Mobilna faza je slani rastvor puferovan fosfatom, a apsorbancija se prati na 280 nm.

Podaci o stabilnosti generisani korišćenjem SEC testa su prikazani u tabelama 1, 2, 4, 5, 12 i 13. Tabele pokazuju da nijedan od navedenih uslova skladištenja rezultiralo snižavanjem % monomera ispod 96.0%. Slično tome, % agregata je ostao ≤2.5% za sve serije u svim navedenim uslovima skladištenja.

SDS-PAGE Test

SDS-PAGE se izvodi korišćenjem Invitrogen (Carlsbad, CA) Tris-Glicin gela, 4-20% za redukujuće stanje i 4-12% za neredukujuće stanja. Rekonstituisani uzorak formulacije antitela se razblažuje u tečnom puferu formulacije, a zatim se razblažuje jedan do dva sa Tris-glicin SDS puferom uzorka (2X, Invitrogen) ili sa 10% 2-merkaptoetanolom (redukujući pufer uzorka) ili bez 2-merkaptoetanola (neredukujući pufer uzorka). Uzorci se kratko zagrevaju i nanose uz poređenje sa markerom molekulske težine (Invitrogen). Gelovi se boje koloidnom komasi plavom bojom (Invitrogen), prema uputstvima proizvođača. Proteinske trake se analiziraju denzitometrijom kako bi se identifikovao % teških i lakih lanac za redukujuće gelove i % IgG za neredukujuće gelove.

Podaci o stabilnosti generisani korišćenjem redukujućeg SDS-PAGE testa su prikazani u tabelama 9 i 17. Nisu primećene primetne promene za % Teških Lakih (H+L) lanaca u svim uslovima skladištenja navedenim za sve kategorije stabilnosti. Obrazac traka je bio sličan onom referentnog standarda i% (H L) ostao na nivou ≥90%.

Efikasnost vezivanja

Ćelije HuT78 (ćelije limfoma humanih T ćelija, American Tip Culture Collection, Manassas, VA) suspendovane u 1% BSA u PBS, 0.01% natrijum azida su u kontaktu sa serijskim razređivanjem primarnog testnog antitela. Nakon inkubacije na ledu, ćelije se peru i tretiraju fluorescentno obeleženim sekundarnim antitelom. Nakon daljeg pranja, ćelije se fiksiraju i suspenduju u FACS reagensu za analizu protočnom citometrijom (Becton Dickinson Franklin Lakes, Nj); takođe videti U.S. Patent br.7,147,851.

Efikasnost vezivanja vedolizumaba merena je u odnosu na referentni standard i prijavljena je kao % referentnog standarda i EC50. Podaci o stabilnosti su prikazani u tabelama 10 i 18. Podaci za % referentnog standarda pokazali su varijabilnost, ali su ostali u granicama specifikacije u svim uslovima skladištenja. Nijedna procenjena serija vedolizumaba nije pokazala trend smanjene efikasnosti vezivanja u navedenim uslovima skladištenja.

Vlaga po Karla Fischer postupku

Formulacija je titrirana metanolom za kulometrijsko određivanje vlage po Karl Fischer postupku. Podaci o vlažnosti su prikazani u tabelama 11 i 19. Sve procenjene serije vedolizumaba imale su manje od 5% vlage u svim navedenim uslovima skladištenja.

Kapilarno izoelektrično fokusiranje (cIEF)

cIEF se izvodi pomoću iCE280 sistema za detekciju cele kolone cIEF (Convergent Biosciences, Toronto, Ontario). Izbor amfolita može biti po preporuci proizvođača ili može biti kombinacija komercijalno dostupnih amfolita. Korisna kombinacija je mešavina 3-10 i 5-8 PHARMALITE™ (GE Healthcare, Piscataway, NJ).

Primer 3: Modelovanje povećanja obima procesa liofilizacije

Kvalitet po dizajnu korišćen je prilikom manipulacije napunjenošću liofilizatora i sadržajem čvrstih materija u formulaciji. Napunjenost je varirala od 33 do 100%. Sadržaj čvrstih materija u formulaciji je varirao od 9 do 27% tako što je u punjenje uključivana formulacija koja je bila 0.5x, 1.0x i 1.5x ciljne formulacije. Ove formulacije su imale slične Tg'. Sa većim % čvrstih materija, primarno vreme sušenja povećano. Pored toga, pri većem sadržaju čvrstih materija, temperatura proizvoda se povećala zbog većeg Rp. Opterećenje takođe utiče na obe faze sušenja (SL. 8).

Primer 4 (Referenca): Neklinička studija bezbednosti

Studija je dizajnirana da uporedi efekat natalizumaba i vedolizumaba na imunološki nadzor u CNS u rezus EAE. Osam životinja je dozirano placebo kontrolom, jednom nedeljno. Sedam životinja je dozirano u dozi od 30 mg/kg, jednom nedeljno, sa natalizumabom. Sedam životinja je dozirano u dozi od 30 mg/kg, jednom nedeljno, sa vedolizumabom. Uočeni su klinički simptomi EAE; učestalost i odnos podskupova leukocita u CSF mereni su protočnom citometrijom; ukupno opterećenje T2 lezija u mozgu mereno je pomoću MRI; a opterećenje lezija i demijelinizacija mozga mereno je histopatologijom.

Vedolizumab nije odložio pojavu kliničkih simptoma EAE u poređenju sa placebo kontrolom. Nije inhibirao učestalost EAE, niti veličinu kliničkih skorova. Natalizumab je značajno (p< 0.05) odložio pojavu kliničkih simptoma EAE u poređenju sa placebo kontrolom. Inhibirao je učestalost EAE i veličinu kliničkih skorova. (SL.9)

Vedolizumab nije sprečio infiltraciju CSF leukocitima, T limfocitima (pomoćni T limfociti, citotoksični T limfociti), B limfociti, ćelije prirodne ubice ili monociti. Nasuprot tome, natalizumab je inhibirao infiltraciju u CSF.

Vedolizumab nije inhibirao akumulaciju lezija mozga, što je otkriveno povećanim T2 i smanjenim MTR vrednostima putem MRI. Natalizumab je sprečio stvaranje lezija kod svih osim jedne životinje. Značajna (p<0.05) inhibicija u moždanim infiltratima i demijelinizacija merena je histologijom.

Integrin α4β7 bio je zasićen vedolizumabom tokom ispitivanja, kao što je prikazano kompetitivnim testom vezivanja između vedolizumaba doziranog in vivo i analitičkog antiα4β7 monoklonskog antitela dodanog ex vivo. Analitički anti-α4β7 mAb se ne vezuje za memorijske pomoćne T limfocite kod životinja koje su dozirane vedolizumabom. Izostanak efekta vedolizumaba u CNS je stoga posledica gastrointestinalno-tropske biologije α4β7 integrina.

Ukratko, vedolizumab (antagonist α4β7) ne inhibira EAE. Nasuprot tome, natalizumab (α4β1 i α4β7 antagonist) inhibira EAE. α4β1 integrin posreduje infiltraciju CNS u EAE. Prema tome, vedolizumab može imati manji rizik od predisponiranja pacijenata za PML od natalizumaba jer ne antagonizuje α4β1 integrin i narušava imunološki nadzor CNS u rezus EAE.

Primer 5 (Referenca): Klinička studija faze I sa vedolizumabom

Četrdeset devet zdravih ispitanika je randomizovano i primilo je jednu dozu ispitivanog leka: 39 ispitanika primilo je vedolizumab (5 mg/ml antitela, 20 mM citrat / limunska kiselina, 125 mM natrijum hlorid, 0.05% polisorbat 80, pH 6.0 (čuva se dugoročno -70°C i do 3 meseca na -20°C)) i 10 ispitanika je primilo placebo. Od 39 ispitanika koji su primili vedolizumab, 8 subjekata je primilo dozu od 0.2, 2,0, 6.0 i 10.0 mg/kg, a 7 ispitanika je primilo vedolizumab u dozi od 0.5 mg/kg. Svih 49 ispitanika završilo je studiju.

Nije bilo značajnih razlika u kohortama vedolizumaba za bilo koju demografsku ili osnovnu karakteristiku. Prosečna starost se kretala od 35.4 do 51.0 godine; starost pojedinačnih subjekata kretala se od 21 do 63 godine.

Rezultati PK

Vedolizumab je primenjen u vidu 30-minutne intravenske infuzije od 0.2 do 10.0 mg/kg. Vrednosti za Cmax i površinu ispod krive koncentracije leka u serumu-vreme (AUC) povećavale su se sa povećanjem doze. Cmax korigovana za dozu bila je približno ista u različitim kohortama, što ukazuje na proporcionalnost doze za ovaj parametar. Površina pod vrednostima koncentracije leka u serumu od vremena nula do beskonačnosti (AUC0-inf), normalizovana za dozu, povećavala se sa povećanjem doze do 2.0 mg/kg, što ukazuje na to da je došlo do nelinearnog povećanja AUC0-infsa povećanjem doze u donjem opsegu doza koje se primenjuju u ovoj studiji. Nakon toga, AUC0-infse povećavala proporcionalno sa dozom, što ukazuje na linearnost AUC0-infu opsegu doza od 2.0 do 10.0 mg/kg. Povećanje AUC0-infbilo je približno 2.4 puta veće nego što se očekivalo pri dozi od 10.0 mg/kg u poređenju sa dozom od 0.2 mg/kg.

Slično tome, procene klirensa, zapremine distribucije i terminalnog poluživota bile su zavisne od doze u opsegu doza od 0.2 do 2.0 mg/kg. Kako se doza povećavala, klirens se smanjivao, zapremina distribucije se povećavala, a samim tim je produžen i terminalni poluživot eliminacije. Međutim, od 2 do 10.0 mg/kg, nije bilo očigledne promene ovih parametara, što ukazuje na zasićenje procesa brze eliminacije za vedolizumab pri niskim koncentracijama. Sporiji linearni procesi eliminacije verovatno su odgovorni za veliki deo klirensa vedolizumaba pri višim dozama.

Kod nekih subjekata koji su razvili HAHA na vedolizumab, uočen je brži klirens vedolizumaba u poređenju sa HAHA-negativnim subjektima unutar odgovarajućeg nivoa doze.

Tabela 20: Pregled PK za vedolizumab po kohorti doze nakon IV primene 0.2-10.0 mg/kg vedolizumaba kod zdravih subjekata (skup za PK analizu)

Nakon dostizanja Cmax, koncentracije vedolizumaba u serumu opadale su generalno na monoeksponencijalni način sve dok koncentracije nisu dostigle približno 1 do 10 mg/L. Nakon toga, čini se da su koncentracije opadale na nelinearan način.

Vrednosti Cmaxi AUC povećavale su se sa povećanjem doze. Za dostupne podatke, Cmax korigovana za dozu bila je približno ista u različitim kohortama, što ukazuje na proporcionalnost doze za ovaj parametar. AUC0-inf, normalizovano za dozu, povećavalo se sa povećanjem doze do 2.0 mg/kg, što ukazuje na to da je došlo do nelinearnog povećanja AUC0-infsa povećanjem doze u donjem opsegu doza koje se primenjuju u ovoj studiji. Nakon toga, AUC0-infse povećavala proporcionalno sa dozom, što ukazuje na linearnost AUC0-inf u opsegu doza od 2.0 do 10.0 mg/kg. Povećanje AUC0-infbilo je približno 2.4 puta veće nego što se očekivalo pri dozi od 10.0 mg/kg u poređenju sa dozom od 0.2 mg/kg.

PD rezultati

PD parametri za vedolizumab nakon 30-minutne intravenske infuzije od 0.2 do 10.0 mg/kg vedolizumaba po kohorti su sažeti u tabeli 21 i tabeli 22 za Act-1 i MAdCAM, redom.

Tabela 21: Pregled farmakodinamike za vedolizumab, procentualna inhibicija %Act-1<+>[CD4<+>CD45RO<high>], po doznoj kohorti nakon IV primene 0.2-10.0 mg/kg vedolizumaba kod zdravih subjekata (PD analitički set)

Tabela 22: Pregled farmakodinamike za vedolizumab, procentualna inhibicija %MADCAM<+>[CD4<+>CD45RO<high>], po doznoj kohorti nakon IV primene 0.2-10.0 mg/kg vedolizumaba kod zdravih subjekata (PD analitički set)

Vedolizumab je inhibirao PD parametre, Act-1 i MAdCAM-1-Fc, gotovo maksimalno u svim vremenskim tačkama u kojima je vedolizumab bio merljiv u serumu. Kada su se koncentracije vedolizumaba smanjile ispod granice detekcije testa, inhibicija Act-1 i MAdCAM-1-FC vratila se na približno osnovni nivo.

Kod nekih subjekata koji su razvili HAHA na vedolizumab, uočen je brži gubitak zasićenja α4β7 receptora, u poređenju sa HAHA-negativnim subjektima unutar odgovarajućeg nivoa doze.

Bezbednosni rezultati

Vedolizumab je generalno bio bezbedan i dobro se podnosio pri pojedinačnim IV dozama do 10.0 mg/kg. Tokom studije nije bilo smrtnih slučajeva, ozbiljnih neželjenih događaja (SAE) ili AE koji bi doveli do prekida studije.

Imunogenost/Formiranje humanog antihumanog antitela (HAHA)

Jedan (10%) subjekt u placebo grupi i 21 (54%) subjekt u kombinovanim grupama doze vedolizumaba imali su pozitivan HAHA u nekom trenutku tokom studije. Iako su pozitivni uzorci HAHA primećeni u svim kohortama doza, HAHA titri >125 pronađeni su samo u 2 grupe sa najnižom dozom vedolizumaba. Supresija formiranja HAHA zavisna od doze ranije je primećena kod vedolizumaba. Kod devetnaest od 22 subjekta tretirana vedolizumabom koji su bili HAHA-pozitivni bila su prisutna neutrališuća HAHA.

Tabela 23: Pregled nalaza za humana antihumana antitela: Bezbednost populacije

Jedan subjekt u placebo grupi i 11 ispitanika u grupi vedolizumaba bili su uporno HAHA-pozitivni.

Tabela 24: Ukupni status humanih antihumanih antitela (bezbednost populacije)

Zaključci

Ova studija faze 1 karakterisala je PK/PD i početne bezbednosne profile vedolizumaba dobijene na CHO ćelijama. Rezultati ove studije korišćeni su za podršku izboru doze za fazu 3 ključnih ispitivanja inflamatornih bolesti creva.

Vedolizumab je pokazao proporcionalnost doze u odnosu na testirani opseg doze za Cmax parametar; međutim, uočene su dozno-zavisne promene za AUC0-inf, CL, Vz i t1/2 od 0.2 do 2.0 mg/kg, što ukazuje na nelinearno PK ponašanje vedolizumaba. Međutim, od 2.0 mg/kg, nije bilo očigledne promene ovih parametara, što ukazuje na zasićenje procesa brze eliminacije za vedolizumab u niskim koncentracijama. Sporiji linearni procesi eliminacije verovatno čine veliki deo klirensa vedolizumaba u većim dozama.

Vedolizumab je inhibirao PD parametre, Act-1 i MAdCAM-1-Fc, maksimalno ili gotovo maksimalno, u svim vremenskim tačkama u kojima je bilo moguće merenje vedolizumaba u serumu. Kada su se koncentracije vedolizumaba smanjile ispod granice detekcije testa, inhibicija Act-1 i MAdCAM-1-Fc vratila se na približno osnovni nivo.

Kod nekih subjekata koji su razvili HAHA na vedolizumab, uočeni su brži klirens vedolizumaba i gubitak zasićenja α4β7 receptora, u poređenju sa HAHA-negativnim subjektima unutar odgovarajućeg nivoa doze.

Vedolizumab se dobro podnosio. Tokom studije nije došlo do smrtnih slučajeva, SAE ili AE koji bi doveli do prekida primene ispitivanog leka tokom studije, niti su primećeni bilo kakvi odnosi između doze i toksičnosti. Nisu zabeležene sistemske oportunističke infekcije (uključujući PML) ili neoplazije.

Za razliku od nespecifičnih α4 antagonista, vedolizumab nije bio povezan sa limfocitozom ili srednjim povećanjem cirkulirajućih eozinofila, bazofila ili monocita, niti je bilo dokaza o iscrpljivanju limfocita.

Vedolizumab je izazvao formiranje HAHA, ali najviši titri (>125) primećeni su samo u 2 grupe sa najnižom dozom, što je nalaz koji podržava prethodna zapažanja o smanjenju imunogenosti zavisnom od doze. Ovi podaci pokazuju da primena većih doza vedolizumaba može minimizirati klinički značajno formiranje HAHA.

U zaključku, vedolizumab je generalno bio bezbedan i dobro se podnosio kada se davao u pojedinačnim dozama od 0.2 do 10.0 mg/kg zdravim subjektima.

Primer 6 (Referenca): Određivanje efekta vedolizumaba na odnos CD4:CD8

Zdravi ispitanici uzrasta od 18 do 45 godina lečeni su jednom dozom od 450 mg vedolizumaba rekonstituisanom iz liofilizovane formulacije od 10% saharoze i razblaženom u infuzijski sistem od 0,9% fiziološkog rastvora. Cerebrospinalna tečnost (CSF) je prikupljena lumbalnom punkcijom pre (početna) i 5 nedelja nakon pojedinačne doze vedolizumaba od 450 mg. Svaki subjekt je služio kao svoja sopstvena kontrola.

Vremenska tačka od 5 nedelja odabrana je na osnovu prethodne studije koja je pokazala da su pacijenti sa MS-om lečeni natalizumabom pokazali efekte na odnos limfocita CSF CD4 : CD8 i smanjenje broja lezija mozga nakon samo jedne doze (Stuve et al. Arch Neurol.2006,63: 1383-1387; Stuve et al. Ann Neurol. 2006;59:743-747. Miller et al. N Engl J Med. 2003; 348(1):15-23); A takođe i zato što je posle 5 nedelja doza vedolizumaba od 450 mg dovoljna da zasiti cilj i obezbeđuje koncentracije u serumu koje premašuju procenjene nivoe u stabilnom stanju povezane sa režimom doze faze 3 od 300 mg svake 4 nedelje.

Približno 15 ml CSF je dobijeno od svakog subjekta za imunofenotipizaciju. CSF uzorci su uključeni u analize ako su ispunili sledeće kriterijume: ≤10 eritrocita / μL po uzorku (kako bi se smanjila kontaminacija periferne krvi); negativan rezultat CSF kulture; adekvatan broj T-limfocita u svakom uzorku protočne citometrije; i nema otkrivanja serumskih antitela na vedolizumab.

Srednja nedelja 5 (34.80 μg/mL) i koncentracije vedolizumaba u serumu pojedinačnih ispitanika (opseg 24.9–47,9 μg/mL) bile su veće od projektovane najniže koncentracije u stabilnom stanju (~ 24 μg/mL) za režim doze faze 3. Visok stepen (>90%) zasićenja α4β7 receptora primećen je u 5. nedelji mereno MAdCAM-1-Fc, što ukazuje na zasićenje vedolizumaba njegovog cilja u vreme procene krajnje tačke.

Vedolizumab nije otkriven ni u jednom uzorku CSF (granica detekcije = 0,125 μg/mL).

Uticaj na broj i odnos CD4 i CD8 T limfocita

Vedolizumab nije značajno smanjio odnos CD4 : CD8 (Tabela 25). Nijedan od ispitanika nije imao postdozni odnos CD4 : CD8 <1 (p < 0.0001 (jednostrani t-test)). Vedolizumab nije značajno smanjio broj CD4 ili CD8 T limfocita u CSF-u. Pored toga, nije bilo značajnih promena u CSF % CD4 i % CD8 T limfocita (Tabela 26). Takođe, nisu primećene značajne promene u perifernoj krvi WBC, CD4 i CD8 memorijskih T limfocita (Tabela 27).

Tabela 25: Efekat tretmana na CD4+:CD8+ odnos u CSF (populacija za evaluaciju, n = 13)

Tabela 26: Efekat tretmana na broj CD4+ i CD8+ limfocita u CSF (populacija za evaluaciju, n = 13)

Tabela 27: Broj memorijskih T limfocita u perifernoj krvi (RO ) (populacija koju je moguće evaluirati, n = 13)

Sažetak

Vedolizumab nije uticao na broj ćelija CSF CD4 i CD8 ili odnos CD4 : CD8 kod zdravih dobrovoljaca nakon jedne doze od 450 mg. Nijedan od ispitanika nije imao smanjenje odnosa CD4 : CD8 nakon doze CSF na manje od 1. Vedolizumab nije otkriven u CSF-u. Pored toga, nije primećena promena u ukupnim WBC ili memorijskim T limfocitima CD4 i CD8 podskupovima u perifernoj krvi. Zasićenje mete (α4β7) u krvi dogodilo se kod svih ispitanika u vreme procene krajnje tačke. Nivoi i odnos CD4 i CD8 limfocita CSF bili su slični onima koji su prethodno prijavljeni u literaturi.

Ovi rezultati su u skladu sa nedostatkom efekta vedolizumaba na fiziološki imunološki nadzor CNS-a i patološku upalu CNS-a majmuna (videti primer 4).

Primer 7 (Referenca): Dugogodišnje kliničko iskustvo sa Vedolizumabom za lečenje IBD-a Završena je otvorena studija proširenja bezbednosti faze 2 kako bi se procenila dugoročna farmakokinetika (PK), farmakodinamika (PD), bezbednost i efikasnost vedolizumaba. Pacijenti su bili u dobi od 18 do 75 godina i prethodno su učestvovali u ranijoj studiji PK / PD / bezbednosti kod pacijenata sa ulceroznim kolitisom ili su imali simptome IBD-a najmanje 2 meseca potvrđene endoskopski i/ili histopatološki i/ili radiološki u roku od 36 meseci skrininga. Svi pacijenti su primali intravenski režim doziranja od 2 mg/kg ili 6 mg/kg vedolizumaba (5 mg/mL antitela, 20 mM citrat/limunska kiselina, 125 mM natrijum hlorid, 0.05% polisorbat 80, pH 6.0 (čuva se dugoročno -70°C i do 3 mo -20°C)) u danima 1, 15 i 43, nakon čega sledi doza svakih 8 nedelja do ukupno 78 nedelja. Pacijenti su bili ili pacijenti sa ulceroznim kolitisom koji nisu bili lečeni ili pacijenti sa Kronovom bolešću, ili pacijenti sa ulceroznim kolitisom koji su učestvovali u ranijem kliničkom ispitivanju.

Za procenu rezultata studije korišćeni su efikasnost/kvalitet života (QoL); parcijalni Mayo skor (PMS), indeks aktivnosti Kronove bolesti (CDAI) i upitnik za inflamatornu bolest creva (IBDQ).

PK rezultati

Srednje koncentracije vedolizumaba pre infuzije bile su proporcionalne dozi i ostale su stabilne i detektovane tokom čitave studije.

PD rezultati

Receptori (% ACT-1 [CD4+CD45RO HIGH] i % MADCAM+[CD4+CD45RO HIGH] bili su gotovo u potpunosti inhibirani tokom perioda studije na svim nivoima doza.

Parcijalni Mayo skor

Srednja vrednost osnovnog nivoa PMS bila je veća kod pacijenata sa ulceroznim kolitisom koji nisu lečeni (5.4) nego kod pacijenata sa ulceroznim kolitisom koji su prebačeni u grupu za održavanje (2.3). Do 43. dana, srednja vrednost PMS je pokazala izraženo smanjenje i kod pacijenata prebačenih u grupu za održavanje i kod pacijenata sa ulceroznim kolitisom koji nisu bili lečeni. Do 155. dana, srednje vrednosti skora za dve grupe bili su slični. Srednja vrednost za PMS je nastavila da se smanjuje do dana 267, a nakon toga je ostala na istom nivou.

Indeks aktivnosti Kronove bolesti

Srednja vrednost CDAI pacijenata sa CD smanjila se sa 294.6 na osnovnom nivou na 237.7 na dan 43, i nastavila da se smanjuje do dana 155 (156.1).

IBDQ

Pacijenti sa ulceroznim kolitisom imali su najvišu srednju IBDQ ocenu na početku. Do dana 43, srednje vrednosti za IBDQ skor su se povećali u sve tri grupe bolesti. Srednji IBDQ rezultati nastavili su da se povećavaju tokom vremena u svim 3 grupe bolesti, dostižući maksimum na dan 155 za pacijente sa Kronovom bolešću, a na dan 491 za pacijente sa ulceroznim kolitisom koji nisu bili u lečenju i pacijente sa ulceroznim kolitisom.

C-reaktivni protein

I ulcerozni kolitis prevrtanja i pacijenti sa Kronovom bolešću pokazali su smanjene srednje nivoe za CRP tokom 155 dana, a zatim su se izjednačili. Pacijenti sa ulceroznim kolitisom koji nisu lečeni imali su niži nivo srednje vrednosti za CRP na osnovnom nivou od pacijenata sa ulceroznim kolitisom koji su prebačeni u grupu za održavanje (2.28 prema 7.09). Srednji nivoi CRP pacijenata sa ulceroznim kolitisom koji nisu bili lečeni ostali su relativno konstantni u svim procenjenim vremenskim tačkama.

Drugi rezultati vezani za bezbednost

Nisu prijavljene sistemske oportunističke infekcije (uključujući PML) ili neoplazije. Jedan pacijent je bio pozitivan na JC viremiju u jednom vremenskom trenutku, iako je bio negativan na JCV u svim ostalim vremenskim tačkama. Tri od 72 pacijenta (4%) imala su pozitivne rezultate HAHA (dva od njih su bila prolazno pozitivna). Studija nije pokazala dokaze o toksičnosti jetre, limfocitozi ili limfopeniji ili bilo kojim drugim laboratorijskim promenama povezanim sa lekovima.

Zaključci

Vedolizumab primenjen u dozi od 2.0 ili 6.0 mg/kg jednom u 8 nedelja do 78 nedelja postigao je zasićenje ciljnih receptora, bio je povezan sa trajnim srednjim smanjenjem aktivnosti bolesti i poboljšanim IBDQ rezultatima, generalno je bio siguran i dobro se podnosio i pokazao je prihvatljivu imunogenost.

Primer 8: Indukcija odgovora i remisije kod pacijenata sa umerenom do ozbiljno aktivnom Kronovom bolešću

Randomizovana, dvostruko slepa, placebo kontrolisana multicentrična studija je završena kako bi se procenio indukcioni efekat vedolizumaba u dozama od 300 mg (rekonstituisana iz formulacije antitela od 60 mg/ml u 50 mM histidin, 125 mM arginin, 0.06% polisorbat 80, 10% saharoza, pri pH6.3 koja je bila liofilizovana), kod pacijenata sa neuspehom antagonista TNFα u nedelji 6 (nakon 2 doze - 0 i 2 nedelje) i u nedelji 10 (nakon 3 doze). Studija se sastojala od 416 pacijenata, od kojih je 75% bilo neuspeh TNFα antagonista, a 25% od kojih je TNFα naivno. Demografija i prateći IBD lekovi su uravnoteženi u svim tretiranim grupama. Osnovne karakteristike bolesti su takođe uravnotežene u različitim tretiranim grupama, osim osnovne aktivnosti bolesti.

Primarna krajnja tačka određena za studiju bila je remisija u 6. nedelji (%) u populaciji sa neuspehom antagonista anti-TNF-α . Ključne sekundarne krajnje tačke koje su procenjene (procedura sekvencijalnog testiranja) bile su: remisija u 6. nedelji (%) u ukupnoj populaciji, remisija u 10. nedelji (%) u anti-TNF-α neuspehu antagonista i ukupnoj populaciji (korišćenjem Hohbergove procedure), produžena remisija u 6. i 10. nedelji (%) u anti-TNF-α neuspehu antagonista i ukupnoj populaciji (koristeći Hohbergovu proceduru) i pojačani odgovor u 6. nedelji (%) u populaciji sa neuspehom anti-TNF-α antagonista.

Tabela 28: Osnovni nivo CDAI:

Tabela 29: Rezultati studije indukcije: Primarne i ključne sekundarne krajnje tačke

Tabela 30: Rezultati kod anti-TNF-α antagonist-naivnih pacijenata (n = 101.24% ukupno)

Tabela 31: Rezultati studije: Klinička remisija u nedeljama 6 i 10, Ključna podgrupa - prethodni Tx neuspesi, ITT ukupno

Studija je pokazala da su pacijentima sa neuspehom antagonista TNF-α potrebne 3 doze za indukciju remisije. Stope remisije kod pacijenata sa neuspehom antagonista TNF-α povećale su se između 6. i 10. nedelje, ali samo za grupu koja je primala vedolizumab (ne placebo). Stope remisije za TNF-α antagonist-naivnih pacijenata nisu se značajno povećale između 6. i 10.

nedelje. Od TNF-α populacije neuspeha antagonista sa visokim stepenom težine bolesti, 43% nikada nije odgovorilo na antagonista TNF-α, a 45% je izgubilo odgovor.

Primer 9: Indukcija i održavanje odgovora i remisije kod pacijenata sa umereno do ozbiljno aktivnim ulceroznim kolitisom

Jedno ispitivanje koje se sastoji od dve randomizovane, dvostruko slepe, multicentrične studije dizajnirane za procenu indukcije i održavanja odgovora i remisije kod pacijenata sa umereno do ozbiljno aktivnim ulceroznim kolitisom. Demografske i osnovne karakteristike bolesti bile su uporedive u svim grupama lečenja.

U studiji idukcije, korišćenjem intravenske primene, poređen je placebo sa vedolizumabom, u dozi od 300 mg, rekonstituisano iz liofilizovane formulacije sa 60 mg/ml antitela u 50 mM histidinu, 125 mM argininu, 0.06% polisorbatu 80, 10% saharozi, pri pH 6.3, sa krajnjom tačkom posle 6 nedelja, nakon 2 doze vedolizumaba.

U studiji održavanja, u kojoj se koristi ista formulacija i ruta primene kao i u studiji indukcije, poređeni su placebo i vedolizumab, dozirani svake četiri nedelje i placebo i vedolizumab, dozirani svakih osam nedelja. Svaki pacijent je bio uzrasta 18-80 godina, dijagnostikovan sa umereno do ozbiljno aktivnim ulceroznim kolitisom; pokazali, tokom prethodnog perioda od 5 godina, neadekvatan odgovor na, gubitak odgovora ili netoleranciju najmanje jedne konvencionalne terapije (npr. kortikosteroidi); i može primati terapeutsku dozu konvencionalnih terapija za IBD. Krajnja tačka ove studije bila je posle 52 nedelje, u vidu analize populacije kod koje je indukovan odgovor. Obe faze ispitivanja ispunile su svoje primarne krajnje tačke, naime, klinički odgovor u indukciji i kliničku remisiju u održavanju. Uzorci krvi su prikupljeni za merenje koncentracije vedolizumaba tokom studije. Srednja koncentracija vedolizumaba u serumu na kraju faze indukcije bila je 20 do 30 μg/mL. Srednje koncentracije vedolizimaba u serumu u stanju dinamičke ravnoteže nakon 30 min IV infuzije primene doze od 300mg bile su između 9 i 13 μg/mL za režim q8ned i između 35 do 40 μg/mL za režim q4ned. Na kraju infuzije, srednje koncentracije vedolizimaba u plazmi bile su između 98 i 101 μg/mL za režim q8ks (8 nedelja) i oko 129 i 137 μg/mL za q4 ned (4 nedelje).

Sažeci odgovora studija indukcije i održavanja su dati u tabelama 32-35. Značajno veći procenat pacijenata tretiranih vedolizumabom postigao je klinički odgovor, remisiju i zarastanje sluzokože u 6 nedelja, u poređenju sa placebom (Tabela 32). 39% populacije sa namerom za lečenje indukcijske faze imalo je prethodni neuspeh anti-TNFα. Stope kliničkog odgovora i remisije bile su veće kod vedolizumaba nego kod pacijenata sa placebom i kod onih sa prethodnim neuspehom anti-TNF-a i kod onih bez prethodnog izlaganja anti-TNF-u. U preliminarnim analizama kroz 6. nedelju, stope neželjenih događaja (AE), ozbiljnih AE i neželjenih događaja koji su doveli do prekida studije bile su veće u placebo grupi nego u grupi vedolizumaba. Značajno veći procenat pacijenata sa vedolizumabom od pacijenata sa placebom postigao je kliničku remisiju, zarastanje sluzokože i remisiju bez kortikosteroida na 52 nedelje i trajni odgovor i remisiju (Tabela 33). 32% populacije studije održavanja imalo je prethodni neuspeh anti-TNFα. Klinička remisija i trajne stope kliničkog odgovora bile su veće kod vedolizumaba nego kod placeba i kod neuspeha TNF-a i kod pacijenata koji nisu bili uključeni u TNF. U bezbednosnoj populaciji (N = 895) za vks 0–52, stope neželjenih događaja (AE), ozbiljnih AE i ozbiljnih infekcija bile su slične između vedolizumab i placebo grupa. U grupi koja je dobijala vedolizumab nije uočeno povećanje stope oportunističkih ili enteričnih infekcija.

Tabela 32: Rezultati studije indukcije: primarne i ključne sekundarne krajnje tačke

Tabela 33: Rezultati studije održavanja–primarne i sekundarne krajnje tačke

Tabela 34: Studija indukcije: klinički odgovor i remisija posle 6 nedelja kod pacijenata sa prethodnim neuspekom anti-TNF-α antagonista i bez anti-TNF izlaganja, ITT populacija

Tabela 35: Klinička remisija i trajni klinički odgovor posle 52 nedelje: pacijenti sa prethodnim neuspehom anti-TNF-α antagonista i bez anti-TNF-α izlaganja ITT populacije

Primer 10: Indukcija i održavanje odgovora i remisije kod pacijenata sa umerenom do ozbiljno aktivnom Kronovom bolešću

Jedno ispitivanje koje obuhvata dve randomizovane, dvostruko slepe, multicentrične studije, dizajnirane za evaluaciju indukcije i održavanja odgovora i remisije kod pacijenata sa umerenom do ozbiljno aktivnom Kronovom bolešću Demografske i osnovne karakteristike bolesti bile su uporedive u svim grupama lečenja.

U studiji idukcije, korišćenjem intravenske primene, poređen je placebo sa vedolizumabom, u dozi od 300 mg, rekonstituisanoj iz liofilizovane formulacije sa 60 mg/ml antitela u 50 mM histidinu, 125 mM argininu, 0.06% polisorbatu 80, 10% saharozi, pri pH 6.3, sa krajnjom tačkom posle 6 nedelja nakon 2 doze vedolizumaba.

U studiji održavanja, u kojoj se koristi ista formulacija i ruta primene kao i u studiji indukcije, poređeni su placebo i vedolizumab, dozirani svake četiri nedelje i placebo i vedolizumab, dozirani svakih osam nedelja. Krajnja tačka ove studije bila je posle 52 nedelje, u vidu analize populacije kod koje je indukovan odgovor.

Iznenađujuće, ova studija je pokazala da su Q4 i Q8 nedeljne grupe dale vrlo slične rezultate. Sažetak odgovora iz studija indukcije i održavanja je obezbeđen u tabelama 36-39. Značajno veći procenat pacijenata tretiranih vedolizumabom postigao je kliničku remisiju i poboljšani odgovor, u poređenju sa placebom (Tabela 36). Klinička remisija i povećane stope odgovora su bile više kod pacijenata koji su primili vedolizumab nego kod onih koji su primali placebo, kako i kod onih kod kojih je anti-TNF bio neuspešan, tako i kod onih koji nisu prethodno izlagani anti-TNF delovanju. Stope neželjenih događaja (AE događaji), ozbiljnih AE događaja i ozbiljnih infekcija, bile su iste u vedolizumab grupi i placebo grupi. U grupi koja je dobijala vedolizumab nije uočeno povećanje stope oportunističkih ili enteričnih infekcija.

Tabele 36: Rezultati studije indukcije––primarne i sekundarne krajnje tačke

Tabele 37: Rezultati studije održavanja–primarne i sekundarne krajnje tačke

Tabela 38: Klinička remisija i pojačani odgovor posle 6 nedelja kod pacijenata sa prethodnim neuspehom anti-TNF-α antagonista i bez anti-TNF izlaganja, ITT populacija

Tabela 39: Klinička remisija i pojačani odgovor posle 52 nedelje: pacijenti sa prethodnim neuspehom anti-TNF-α antagonista i bez anti-TNF izlaganja ITT populacija

Tabela 40. Rezime sekvenci

Iako je ovaj pronalazak posebno prikazan i opisan sa referencama na svoja željene izvođenja, stručnjaci u oblasti će razumeti da u njemu mogu da se načine različite promene u obliku i detaljima, pod uslovom da su obuhvaćene priloženim patentnim zahtevima.

Claims (15)

PATENTNI ZAHTEVI

1. Humanizovano anti-α4β7 antitelo za upotrebu u postupku za terapeutsko lečenje inflamatorne bolesti creva, pri čemu se humanizovano anti-α4β7 antitelo primenjuje kod pacijenta koji pati od inflamatorne bolesti creva, pri čemu se humanizovano anti-α4β7 antitelo primenjuje kod pacijenta prema sledećem režimu doziranja:

a. inicijalna doza od 300 mg humanizovanog anti-α4β7 antitela u vidu intravenske infuzije;

b. nakon čega sledi druga naredna doza od 300 mg humanizovanog anti-α4β7 antitela u vidu intravenske infuzije, dve nedelje nakon inicijalne doze;

c. nakon čega sledi treća naredna doza od 300 mg humanizovanog anti-α4β7 antitela u vidu intravenske infuzije, šest nedelja nakon inicijalne doze;

d. nakon čega slede četvrta i naredne doze od po 300 mg humanizovanog anti-α4β7 antitela u vidu intravenske infuzije, svake četiri nedelje ili svakih osam nedelja nakon treće naredne doze humanizovanog antitela, po potrebi;

pri čemu režim doziranja indukuje klinički odgovor i kliničku remisiju inflamatorne bolesti creva kod pacijenta;

pri čemu je humanizovano anti-α4β7 antitelo vedolizumab, i

dalje, pri čemu je inflamatorna bolest creva umereno do ozbiljno aktivan ulcerozni kolitis ili umereno do ozbiljno aktivna Kronova bolest.

2. Humanizovano anti-α4β7 antitelo za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time što je kod pacijenta izostao adekvatan odgovor na, došlo do gubitka odgovora na, ili pacijent nije podnosio, lečenje sa najmanje jednim od, imunomodulatora, antagonista faktora nekroze tumora-alfa ili njihovim kombinacijama.

3. Humanizovano anti-α4β7 antitelo za upotrebu prema patentnom zahtevu 2, naznačeno time što je imunomodulator odabran iz grupe koja se sastoji od: oralnog azatioprina, 6-merkaptopurina i metotreksata.

4. Humanizovano anti-α4β7 antitelo za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time što je inflamatorna bolest creva umereno do ozbiljno aktivan ulcerozni kolitis.

5. Humanizovano anti-α4β7 antitelo za upotrebu prema patentnom zahtevu 4, naznačeno time što režim doziranja rezultira izlečenjem mukoze kod pacijenata koji pate od umereno do ozbiljno aktivnog ulceroznog kolitisa.

6. Humanizovano anti-α4β7 antitelo za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time što je inflamatorna bolest creva umereno do ozbiljno aktivan ulcerozni kolitis.

7. Humanizovano anti-α4β7 antitelo za upotrebu prema patentnom zahtevu 6, naznačeno time što režim doziranja rezultira indukcijom i održavanjem odgovora i remisijom kod pacijenata sa umereno do ozbiljno aktivnom Kronovom bolešću.

8. Humanizovano anti-α4β7 antitelo za upotrebu prema bilo kom prethodnom patentnom zahtevu, naznačeno time što (i) režim doziranja rezultira smanjenjem, eliminacijom ili smanjenjem i eliminacijom upotrebe kortikosteroida od strane pacijenta i/ili (ii) pacijent je prethodno primao tretman sa najmanje jednim kortikosteroidom za inflamatornu bolest creva.

9. Humanizovano anti-α4β7 antitelo za upotrebu prema patentnom zahtevu 8, naznačeno time što je pacijent imao neadekvatan odgovor na kortikosteroide, gubitak odgovora na kortikosteroide ili nije podnosio kortikosteroide.

10. Humanizovano anti-α4β7 antitelo za upotrebu prema bilo kom prethodnom patentnom zahtevu, naznačeno time što se humanizovani imunoglobulin ili njegov antigen-vezujući fragment primenjuje kod pacijenta tokom 30 minuta.

11. Humanizovano anti-α4β7 antitelo za upotrebu prema bilo kom prethodnom patentnom zahtevu, naznačeno time što režim doziranja ne menja odnos CD4 i CD8 u cerebrospinalnoj tečnosti pacijenata koji primaju navedeni tretman.

12. Humanizovano anti-α4β7 antitelo za upotrebu prema bilo kom prethodnom patentnom zahtevu, naznačeno time što je pacijent osoba stara 65 godina, ili starija, i pri čemu, dalje, kod pacijenta nije neophodno bilo kakvo prilagođavanje režima doziranja.

13. Humanizovano anti-α4β7 antitelo za upotrebu prema bilo kom prethodnom patentnom zahtevu, naznačeno time što pacijent prima terapeutsku dozu konvencionalne terapije za inflamatornu bolest creva.

14. Humanizovano anti-α4β7 antitelo za upotrebu prema bilo kom prethodnom patentnom zahtevu, naznačeno time što se doza od 300 mg primenjuje kod humanog pacijenta svake četiri nedelje ako humani pacijent iskusi vraćanje jednog ili više simptoma povezanih sa ulceroznim kolitisom ili Kronovom bolešću nakon primene humanizovanog anti-α4β7 antitela svakih osam nedelja.

15. Farmaceutska formulacija koja sadrži humanizovano anti-α4β7 antitelo kao što je definisano u patentnom zahtevu 1, za upotrebu prema patentnom zahtevu 1.