RS67004A - Makrociklični peptidi aktivni prema virusu hepatitisa c - Google Patents

Abstract

Jedinjenja formule (I), u kojoj R1 jeste hidroksi ili NHSO2R1A grupa, pri čemu R1A jeste (C1-8)-alkil, (C3-7)-cikloalkil ili {(C1-6)-alkil-(C3-7)-cikloalkil} grupa, koje su sve, u datom slučaju, supstutisane sa 1 do 3 halogeno, cijano, nitro, O-(C1-6)-alkil, amido, amino ili fenil grupa, ili R1A je C6- ili C10-aril grupa, koja je, u datom slučaju supstituisana sa 1 do 3 halogeno, cijano, nitro, (C1-6)-alkil, O-(C1-6)-alkil, amido, amino ili fenil grupe; R2 je (C5-6)-cikloalkil a R3 je ciklopentil grupa; ili njihove farmaceutski prihvatljive soli, upotrebljiva kao inhibitori HCV NS3 proteaze.

Description

MAKROCIKLIČNI PEPTIDI AKTIVNI PREMA VIRUSU HEPATITISA C

Oblast pronalaska

Ovaj pronalazak odnosi se na jedinjenja, postupke za sintesu, kompozicije i načine lečenja infekcije virusom hepatitisa C (HCV). Posebno, ovaj pronalazak daje nove peptidne analoge, farmaceutske kompozicije koje sadrže takve analoge i načine za upotrebu tih analoga u lečenju HCV infekcije.

Osnovni podaci u vezi sa pronalaskom

Virus hepatitisa C (HCV) je širom sveta glavni etiološki uzrok non-A non-B hepatitisa, dobijenog posle transfuzije i u životnoj sredini. Procenjuje se da je preko 200 miliona ljudi širom sveta inficirano tim virusom. Veliki procenat nosioca postaje hronično inficiran a kod mnogih dolazi do hroničnog oboljenja jetre, takozvanog hroničnog hepatitisa C. Ova grupa je, s druge strane, pod velikim rizikom od ozbiljnog oboljenja jetre, kao što je ciroza jetre, hepatoćelijski karcinom i terminalno oboljenje jetre koje dovodi do smrti.

Mehanizam kojim HCV ostvaruje rezistenciju prema virusu i izaziva veliku stopu hroničnog oboljenja jetre nije podrobno razjašnjen. Zna se kako HCV reaguje sa imunskim sistemom domaćina i kako mu izmiče. Pored toga, uloge ćelijskih i humoralnih imunskih odgovora, u zaštiti protiv HCV infekcije i oboljenja još treba da budu objašnjeni. Imunoglobulini su navođeni za profilaksu virusnog hepatitisa povezanog sa transfuzijom, međutim, Centar za sprečavanje bolesti (Center for Disease Control) za tu svrhu danas ne preporučuje tretman imunoglobulinima. Nedostatak efikasnog zaštitnog imunskog odgovora onemogućava razvijanje vakcine ili adekvatnih profilaksnih mera, posle izlaganja takvoj opasnosti, tako da su u bliskoj budućnosti, očekivanja čvrsto usmerena na antirvirusne intervencije.

Različite kliničke studije su izvođene sa ciljem da se identifikuju farmaceutska sredstva koja su efikasna za lečenje HCV infekcije kod pacijenata koji pate od hroničnog hepatitisa C. Ove studije su obuhvatile upotrebu a-interferona, samog ili u kombinaciji sa drugim antivirusnim sredstvima. Takve studije su pokazale da pretežan deo učesnika ne reaguje na ove terapije, a od onih kod kojih je reakcija povoljna, kod velikog broja se bolest vraća posle završetka tretmana.

Do skora, interferon (IFN) je bio jedina postojeća terapija koja se pokazala dobrom, klinički potvrđena za pacijente sa hroničnim hepatitisom C. Ipak, ispoljena brzina odgovora je mala, a tretman interferonom takođe izaziva ozbiljne prateće efekte (tj. retinopatija, tiroiditis, akutni pankreatitis, depresija) što smanjuje kvalitet života lečenih pacijenata. Nedavno, kombinacija interferona sa ribavirinom pokazala je se uspešnom kod pacijenata kod kojih nema odgovora na sam IFN. Međutim, prateći efekti izazvani IFN-om nisu izbegnuti pri kombinovanoj terapiji. PEG-stabilizovani oblici interferona, kao što PEG-Intron<®>i Pegasvs<®>mogu očigledno delimično da umanje te štetne efekte, ali antivirusni lekovi ipak ostaju najbolji put za oralno lečenje HCV-a.

Zbog toga, postoji potreba da se proizvedu efikasna antivirusna sredstva za lečenje HCV infekcija koja prevazilaze ograničenja postojećih farmaceutskih terapija.

HCV je virus iz familijeFlaviviriđae,koji u omotaču sadrži pozitivan lanac RNK. Jedan lanac RNK genoma HCV-a je približno dug 9500 nukleotida i ima jedan "otvoren okvir čitanja" (ORF) koji kodira samo jedan veliki poliprotein od oko 3000 aminokiselina. U inficiranim ćelijama, ovaj poliprotein se čepa na više različitih mesta, ćelijskim i virusnim proteazama, dajući strukturne i ne-strukturne (NS) proteine. U slučaju HCV-a, proizvodnja zrelih ne-strukturnih proteina (NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A i NS5B) ostvaruje se dejsvom dve virusne protease. Prva, do sada slabo okarakterisana, čepa polipeptid na mestu veze NS2-NS3 proteina (stoga je označena kao NS2/3 proteaza); druga je serin proteaza koja se nalazi u N-terminalnom regionu NS3 proteina (NS3 proteaza), a posreduje u svim subsekventnim cepanjima nishodno od NS3, kako nacis,NS3-NS4 mestu cepanja, tako i natrans mestimacepanja, preostalih NS4A-NS4B, NS4B-NS5A, NS5A-NS5B veza. Izgleda da NS4A protein ima nekoliko funkcija: deluje kao kofaktor za NS3 proteazu i verovano pomaže lokalizaciju NS3 proteina i drugih komponenti replikaznog kompleksa virusa u ćelijskoj membrani. Formiranje kompleksa NS3 proteaze sa NS4A proteinom je izgleda neophodno za procese obrade poliproteina, povećavajući proteolitičku efikasnost na svim mestima cepanja. NS3 protein tako e pokazuje nukleozid trifosfataznu i RNK helikaznu aktivnost. NS5B je RNK-zavisna RNK polimeraza koja je uključena u replikaciju HCV-a.

Opšta strategija za razvijanje antivirusnih sredstava je da se inaktiviraju virusno kodirani enzimi koji su ključni za replikaciju virusa.

Sledeće je lista patentnih prijava publikovanih poslednjih nekoliko godina u kojima se štite peptidni analozi inhibitora HCV NS3 proteaze, koji su strukturno različiti od jedinjenja na osnovu ovog pronalaska.

GB 2,337,262; JP10298151; JP 11126861; JP 11292840; JP 2001-103993;

US 6,159,938; US 6,187,905; WO 97/43310; WO 98/17679; WO 98/22496;

WO 98/46597; WO 98/46630; WO 99/38888; WO 99/50230; WO 99/64442;

WO 99/07733; WO 99/07734; WO 00/09543; WO 00/09558; WO 00/20400;

WO 00/59929; WO 00/31129; WO 01/02424; WO 01/07407; WO 01/16357;

WO 01/32691; WO 01/40262; WO 01/58929; WO 01/64678; WO 01/74768;

WO 01/77113; WO 01/81325; WO 02/08187; WO 02/08198; WO 02/08244;

WO 02/08251; WO 02/08256; WO 02/18369; WO 02/60926 i WO 02/79234.

Jedinjenja na osnovu ovog pronalaska međusobno se razlikuju po tome što imaju različite hemijske strukture, i po iznenađujućem nalazu da ona specifično inhibiraju HCV NS3 proteazu, dok pokazuju beznačajnu inhibitorsku aktivnost prema drugim serinskim proteazama. Osim toga, jedinjenja su aktivna u ćelijskoj kulturi i imaju zaprepašćujuće dobar farmakokinetički profilin vivo.

Kratak izvod pronalaska.

U predmet pronalaska uključena su jedinjenja formule I:

u kojoj R<1>jeste hidroksi ili NHS02R<1A>grupa, pri čemu R^ jeste (C^-alkil, (C3.7)-cikloalkil ili {(Ci.6)-alkil-(C3_7)-cikloalkil} grupa, koje su, u datom slučaju, supstituisane sa 1 do 3

halogeno, cijano, nitro, O-CC^-alkil, amido, amino ili fenil grupe, ili R^ jeste Cg- ili C10-aril grupa, u datom slučaju, supstituisana sa 1 do 3 halogeno, cijano, nitro, (C^6)-alkil, 0-(Ci_6)-alkil, amido, amino ili fenil grupe ; R<2>je (C^-cikloalkil a R<3>je ciklopentil grupa; ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.

U sklopu ovog pronalaska je farmaceutska kompozicija koja sadrži, anti-hepatitis C virusno efikasnu količinu jedinjenja formule I, ili njegovu terapeutski prihvatljivu so, u smeši sa farmaceutski prihvatljivim nosačem ili pomoćnim sredstvom.

Prema jednom od rešenja, farmaceutska kompozicija, na osnovu ovog pronalaska, sadrži još interferon (PEG-stabilizovan ili ne), ili ribavirin, ili jedan ili više drugih anti-HCV sredstava, ili neku od njihovih kombimacija.

Dalji važan aspekt pronalaska obuhvata postupak za lečenje virusne hepatitis C infekcije kod sisara, davanjem sisaru anti-hepatitis C virusno efikasne količine jedinjenja formule I, neke njegove farmaceutski prihvatljive soli, ili kompozicije kao što je gore opisana, samog ili u kombinaciji sa jednim ili sa više drugih sredstava, kao: interferon (PEG-stabilizovan ili ne), ili ribavirin, ili jedno ili više drugih anti-HCV sredstava, od kojih se sva daju zajedno ili svako posebno.

Dalji važan aspekt pronalaska obuhvata postupak za prevenciju virusne hepatitis C infekcije kod sisara, davanjem sisaru anti-hepatitis C virusno efikasne količine jedinjenja formule I, neke njegove farmaceutski prihvatljive soli, ili kompozicije kao što je gore opisana, samog ili u kombinaciji sa jednim ili sa više drugih sredstava, kao: interferon (PEG-stabilizovan ili ne), ili ribavirina, ili jedno ili više drugih anti-HCV sredstava, od kojih se sva daju zajedno ili svako posebno.

Takođe, predmet ovog pronalaska je upotreba jedinjenja formule I, kao što je gore opisana, za pripremanje leka za lečenje ili prevenciju virusne hepatitis C infekcije.

DETALJAN OPIS REŠENJA KOJA IMAJU PREDNOST

Definicije

Kako je ovde korišćeno upotrebljene su sledeće definicije, ukoliko nije drukčije navedeno: U vezi sa slučajevima kada je( R)ili( S)upotrebljeno za označavanje apsolutne konfiguracije nekog asimetričnog centra, oznaka je data u kontekstu celog jedinjenja, a ne u kontekstu samog supstituenta.

Oznaka "Pl, P2 i P3", kako je ovde korišćeno, odnosi se na položaj ostataka amino kiselina, polazeći od C-terminalnog kraja peptidnih analoga pa produžavajući prema N-terminalnom (rj. Pl se odnosi na poziciju 1 od C-terminalnog, P2: druga pozicija od C-terminalnog, itd.) (vidi Berger A. & Schechter I., Transactions of the Royal Society London series B257,249-264 (1970)).

Kako je ovde korišćenooznaka " ( 1R,£S>vinil-ACCA" odnosi se na jedinjenje formule:

naime,( 1R, 2S)l-amino-2-etenilciklopropil-karboksilnu kiselinu.

Oznaka "halogeno", kako je ovde korišćeno, označava halogeni supstituent odabran od bromo, hloro, fluoro ili jodo ostatka.

Oznaka "(C^-alkil" ili "(niži)alkil", kako je ovde korišćeno, sama ili u kombinaciji sa drugim supstituentom, označava aciklične, sa pravim ili razgranatim lancem alkil supstituente koji sadrže od 1 do 6 atoma ugljenika, i uključuju, na primer, metil, etil, propil, butil, heksil, 1-metiletil, 1-metilpropil, 2-metilpropil i 1,1-dimetiletil grupu.

Oznaka "(C^-alkil", kako je ovde korišćeno, sama ili u kombinaciji sa drugim supstituentom, označava aciklične, sa pravim ili razgranatim lancem alkil supstituente koji sadrže od 1 do 8 atoma ugljenika, i uključuju, na primer, metil, etil, 2,2-dimeitlbutil, heksil, 1-metilheksil, heptil i oktil grupu.

Oznaka "(C^-cikloalkil", kako je ovde korišćeno, sama ili u kombinaciji sa drugim supstituentom, označava cikloalkil supstituent koji sadrži od tri do sedam atoma ugljenika, a uključuje ciklopropil, ciklobutil, ciklopentil, cikloheksil i cikloheptil grupu.

Oznaka "{(C1.6)-alkil-(C3.7)-cikloalkil}", kako je ovde korišćeno, označava cikloalkil radikal koji sadrži od 3 do 7 atoma ugljenika, direktno vezan za alkilen radikal koji sadrži 1 do 6 atoma ugljenika: na primer, ciklopropilmetil, ciklopentiletil, cikloheksilmetil, cikloheksiletil i cikloheptilpropil grupu. U slučaju kada R<3A>jeste {(C1_6)-aM-(C3_7)-cikloalkil}, ta grupa je vezana za SO2grupu preko (C^-alkil grupe (tj. alkilen deo).

Oznaka "O-CC^-alkil", kako je ovde korišćeno, sama ili u kombinaciji sa drugim supstituentom, označava supstituent -O-CC^-alkil, pri čemu je alkil definisan kao gore, a sadrži do šest atoma ugljenika. O-CC^-alkil uključuje metoksi, etoksi, propoksi, 1-metiletoksi, butoksi i 1,1-dimeitletoksi grupu. Poslednji supstituent je obično poznat kao terobutoksi grupa.

Izraz "farmaceutski prihvatljiva so" označava so jedinjenja formule I, koja je na osnovu ispravne medicinske procene, pogodna za upotrebu u kontaktu sa tkivima humanih i manjih životinja, ne izazivajući nepoželjnu toksičnost, iritaciju, alergijski odgovor, i slično, srazmerno razumnom odnosu korist/rizik, obično rastvorna ili dispergovana u vodi ili ulju, a efikasna pri njenoj namenskoj upotebi. Izraz uključuje farmaceutski prihvatljive adicione soli sa kiselinom i farmaceutski prihvatljive adicione soli sa bazom. Spisak pogodnih soli se nalazi, npr. u S.M. Birge et al., J. Pharm. Sci., 1977, 66, str. 1-19, što je ovim u celini uključeno kao referenca.

Izraz "farmaceutski prihvatljiva adiciona so sa kiselinom" označava one soli koje zadržavaju biološku efikasnost i svojstva slobodnih baza i koje biološki, ili na drugi način, nisu nepoželjne, obrazovane sa neorganskim kiselinama, kao što su, hlorovodonična kiselina, bromovodonična kiselina, jodovodonična kiselina, sumporna kiselina, sulfaminska kiselina, azotna kiselina, fosforna kiselina i slične, i sa organskim kiselinama, kao što su, sirćetna kiselina, trihlorosirćetna kiselina, trifluorosirćetna kiselina, adipinska kiselina, alginska kiselina, askorbinska kiselina, asparaginska kiselina, benzensulfonska kiselina, benzoeva kiselina, 2-acetoksibenzoeva kiselina, buterna kiselina, kamforna kiselina, kamforsulfonska kiselina, cimetna kiselina, limunska kiselina, diglukonska kiselina, etansulfonska kiselina, glutaminska kiselina, glikolna kiselina, glicerofosforna kiselina, hemisulfična kiselina, heptanska kiselina, heksanska kiselina, mravlja kiselina, fumarna kiselina, 2-hidroksietansulfonska kiselina (izetionska kiselina), mlečna kiselina, maleinska kiselina, hidroksimaleinska kiselina, jabučna kiselina, malonska kiselina, bademska kiselina, mezitilen-sulfonska kiselina, metansulfonska kiselina, naftalensulfonska kiselina, nikotinska kiselina, 2-naftalensulfonska kiselina, oksalna kiselina, pamoična kiselina, pektinska kiselina, fenilsirćetna kiselina, 3-fenilpropionska kiselina, pikrinska kiselina, pivalinska kiselina, propionska kiselina, pirogrožđana kiselina, salicilna kiselina, stearinska kiselina, ćilibarna kiselina, sulfanilna kiselina, vinska kiselina, p-toluensulfonska kiselina, undekanska kiselina i slične.

Izraz "farmaceutski prihvatljiva adiciona so sa bazom" označava one soli koje zadržavaju biološku efikasnost i svojstva slobodnih kiselina i koje biološki, ili na drugi način, nisu nepoželjne, obrazovane sa neorganskim bazama, ko što su, hidroksid, karbonat ili bikarbonat, amonijuma ili katjona metala, kao što su, natrijum, kalijum, litijum, kalcijum, magnezijum, gvožđe, cink, bakar, mangan, aluminijum i slični. Naročito povoljne su soli amonijuma, kalijuma, natrijuma, kalcijum i magnezijuma. Soli dobijene od farmaceutski prihvatljivih, ne-toksičnih organskih baza, uključuju soli primarnih, sekundarnih i tercijarnih amina, kvaternerna amino jedinjenja, supstituisane amine, uključujući supstituisane amine koji prirodno postoje, ciklične amine i bazne jonoizmenjivačke smole, kao što su, metilamin, dimetilamin, trimetilamin, etilamin, dietilamin, trietilamin, izo-propilamin, tripropilamin, tributilamin, etanolamin, dietanolamin, 2-dimetilaminoetanol, 2-dietilaminoetanol, dicikloheksilamin, lizin, arginin, histidin, kofein, hidrabamin, holin, betain, etilendiamin, glukozamin, metilglukamin, teobromin, purine, piperazin, piperidin, N-etilpiperidin, tetrametilamonijum jedinjenja, tetraetilamonijum jedinjenja, piridin, N,N-dimetilanilin, N-metilpiperidin, N-metilmorfolin, dicikloheksilamin, dibenzilamin, N,N-dibenzilfenetilamin, 1-efenamin, N,N'-dibenziletilendiamin, poliaminske smole, i slično. Naročito povoljne ne-toksične organske baze su izo-propilamin, dietilamin, etanolamin, trimetilamin, dicikloheksilamin, holin i kofein.

Naziv "antivirusno sredstvo", kako je ovde korišćen, označava neko sredstvo (jedinjenje ili biološki proizvod) koje je efikasno u inhibiranju stvaranja i/ili replikacije virusa, kod sisara. Ono uključuje sredstva koja ometaju, ili domaćinove, ili virusne, mehanizme neophodne za stvaranje i/ili replikaciju virusa, kod sisara. Antivirusna sredstva uključuju, na primer, ribavirin, amantadin, VX-497 (merimepodib, Vertex Pharmaceuticals), VX-498 (Vertex Pharmaceuticals), Levovirin, Viramidine, Ceplene (maxamine), XTL-001

iXTL-002 (XTL, Biopharmaceuticals).

Naziv "drugo anti-HCV sredstvo", kako je ovde korišćen, označava ona sredstva koja su efikasna u smanjenju ili prevenciji napredovanja simptoma bolesti koji su u vezi sa hepatitisom C. Takva sredstva mogu biti odabrana od: imunomodulatorskih sredstava, inhibitora HCV NS3 proteaze, inhibitora HCV polimeraze ili inhibitora drugog cilja u životnom ciklusu HCV-a.

Naziv "imunomodulatorsko sredstvo", kako je ovde korišćen, označava sredstva Gedinjenja ili biološke proizvode) koja su efikasna da povećaju ili pojačaju odgovor imunskog sistema, kod sisara. Imunomodulatorska sredstva uključuju, na primer, interferone klase I (kao što su, a-, p-, 5- i oo-interferoni, x-interferoni, konsenzus interferoni i azialo-interferoni), interferoni klase II (kao y-interferoni) i PEG-interferoni.

Naziv "inhibitor HCV NS3 proteaze", kako je ovde korišćen, označava sredstvo (jedinjenje ili biološki proizvod) koje je efikasno u inhibiranju funkcije HCV NS3 proteaze, kod sisara. Inhibitori HCV NS3 proteaze uključuju, na primer, ona jedinjenja koja su opisana u WO 99/07733, WO 99/07734, WO 00/09558, WO 00/09543, WO 00/59929 ili WO 02/060926, klinički kandidat, Boehringer Ingelheim-a, označen kao BILN 2061, i pred-razvojni kandidat, Vertex/Eli Lilly-a, označeno kao VX-950 ili LY-570310. Naročito, u kombinaciji sa jedinjenjima na osnovu ovog pronalaska, mogu biti upotrebljena jedinjenja # 2, 3, 5, 6, 8,10,11,18, 19,29,30,31, 32, 33, 37, 38, 55, 59, 71,91,103,104,105,112,113,114,115,116,120, 122, 123, 124, 125, 126 i 127, obnarodovana u tabeli na stranama 224-226, u WO 02/060926.

Naziv "inhibitor HCV polimeraze" kako je ovde korišćen, označava sredstvo (jedinjenje ili prirodni proizvod) koje je efikasno u inhibiranju funkcije HCV polimeraze, kod sisara. Ono uključuje, na primer, inhibitore HCV NS5B polimeraze. Inhibitori HCV polimeraze uključuju ne-nukleozide, na primer, ona jedinjenja opisana u: US prijavi No. 10/198,680, koja odgovara PCT/CA02/01127, obe podnete 18. jula 2002 (Boehringer Ingelheim),

US prijavi No. 10/198,384, koja odgovara PCT/CA02/01128,

obe podnete 18. jula 2002 (Boehringer Ingelheim),

US prijavi No. 10/198,259, koja odgovara PCT/CA02/01129, obe podnete 18. jula2002 (Boehringer Ingelheim),

WO 02/100846 Al i WO 02/100851A2 (obe Shire),

WO 01/85172 Al i WO 02/098424 Al (obe GSK),

WO 00/06529 i WO 02/06246 Al (obe Merck),

WO 01/47883 i WO 03/000254 (obe Japan Tobacco) i

EP 1 256 628 A2 (Agouron).

Pored toga, drugi inhibitori HCV polimeraze takođe uključuju nukleozidne analoge, na primer, ona jedinjenja opisana u:

WO 01/90121A2 (Idenix),

WO 02/069903 A2 (Biocrvst Pharmaceuticals Inc.) i

WO 02/057287 A2 i WO 02/057425 A2 (oba Merck/Isis).

Specifične primere inhibitora HCV polimeraze sadrže, JTK-002, JTK-003 i JTK-109 (Japan Tobacco).

Naziv "inhibitor drugog cilja u životnom ciklusu HCV-a", kako je ovde korišćen, označava sredstvo (jedinjenje ili biološki proizvod) koje je efikasno da inhibira stvaranje i/ili replikaciju HCV-a kod sisara, drukčije nego pri inhibiranju funkcije HCV NS3 proteaze. Ono uključuje sredstva koja ometaju, ili domaćinove, ili HCV virusne, mehanizme neophodne za stvaranje i/ili replikaciju HCV-a kod sisara. Inhibitori drugog cilja u životnom ciklusu HCV-a uključuju, na primer, sredstva koja inhibiraju cilj, odabran od helikaze, HCV NS2/3 proteaze i internog mesta ulaska u ribozom (IRES). Specifičan primer inhibitora drugog cilja u životnom ciklusu HCV-a uključuje ISIS-14803 (ISIS Pharmaceuticals).

Naziv "inhibitor HIV-a", kako je ovde korišćen, označava sredstvo (jedinjenje ili biološki proizvod) koje je efikasno da inhibira stvaranje i/ili replikaciju HP/-a kod sisara. Ono uključuje sredstva koja ometaju, ili domaćinove, ili virusne, mehanizme neophodne za stvaranje i/ili replikaciju HIV-a kod sisara. Inhibitori HrV-a uključuju, na primer, nukleozidne inhibitore, ne-nukleozidne inhibitore, inhibitore proteaze, fuzione inhibitore i inhibitore integraze.

Naziv "HAV inhibitor", kako je ovde korišćen, označava sredstvo (jedinjenje ili biološki proizvod) koje je efikasno da inhibira stvaranje i/ili replikacije HAV-a kod sisara. Ono obuhvata sredstva koja ometaju, ili domaćinove, ili virusne, mehanizme neophodne za stvaranje i/ili replikaciju HAV-a kod sisara. HAV inhibitori uključuju Hepatitis A vakcine, na primer, Havrix<®>(GlaxoSmithKline), VAQTA<®>(Merck) i Avaxim<®>

(Aventis Pasteur).

Naziv "HBV inhibitor", kako je ovde korišćen, označava sredstvo (jedinjenje ili biološki proizvod) koje je efikasno da inhibira stvaranje i/ili replikacije HBV-a kod sisara. Ono obuvata sredstva koja ometaju, ili domaćinove, ili virusne, mehanizme neophodne za stvaranje i/ili replikaciju HBV-a kod sisara. HBV inhibitori uključuju, na primer, sredstva koja inhibiraju virusnu DNK polimerazu, ili HBV vakcine. Specifični primeri HBV inhibitora uključuju, Lamivudine (Epivir-HBV<®>), Adefovir Dipivoxil, Entecavir, FTC (Coviracil<®>), DAPD (DXG), L-FMAU (Clevudine<®>), AM365 (Amrad), Ldt (Telbivudine), monoval-Ldc (Valtorcitabine), ACH-126,443 (L-Fd4C) (Achillion), MCC478 (Eli Lilly), Racivir (RCV), Fluoro-L i D nukleozide, Robustaflavone, ICN 2001-3 (ICN), Bam 205 (Novelos), XTL-001 (XTL), Imino-Sugars (Nonyl-DNJ) (Synergy), HepBzyme; i imunomodulatorske proizvode, kao što je: interferon alpha 2b, (HE2000 (Hollis-Eden), Theradigm (Epimmune), EHT899 (Enzo Biochem), Thvmosin alpha-1 (Zadaxin<®>), HBV DNK vakcina (PowderJect), HBV DNK vakcina Uefferon Center), HBV antigen (OraGen), BayHep<®>(Bayer), Nabi-HB<®>(Nabi) i Antihepetitis B (Cangene); i HBV vakcine, kao što su sledeće: Engerk B, Recombivax HB, GenHevac B, Hepacare, Bio-Hep B, TwinRix, Comvax, Hexavac.

Naziv "interferon klase I", kako je ovde korišćen, označava interferon odabran iz grupe interferona koji se svi vezuju za receptor tipa I, To uključuje i prirodne i sintetički proizvedene interferone klase I. Primeri interferona klase I ujlkučuju, a-, [3-, co-,T-interferone, konsenzus interferone, azialo-interferone.

Naziv "interferon klase II", kako je ovde korišćen, označava interferon odabran iz grupe interferona koji se svi vezuju za receptor tipa II. Primeri interferona klase II ujlkučuju, -/-interferone.

Farmaceutske kompozicije, na osnovu pronalaska, mogu da sadrže jedno ili više dodatnih aktivnih sredstava odabranih, na primer, od antivirusnih sredstava, imunomodulatorskih sredstava, drugih inhibitora HCV NS3 proteaze, inhibitora

HCV

polimeraze, inhibitora drugog cilja u životnom ciklusu HCV-a, HIV inhibitora, HAV inhibitora i HBV inhibitora. Primeri takvih sredstava dati su gore, u sekciji Definicije.

Specifični primeri nekih od tih sredstava, koja imaju prednost, navedeni su u dalljem: • antivirusna sredstva: ribavirin i amantadin; • imunomodulatorska sredstva: interferoni klase I, interferoni klase II i PEG-interferoni; • inhibitor drugog cilja u životnom ciklusu HCV-a, koji inhibira cilj odabran od: NS3 helikaze, HCV NS2/3 proteaze ili internog mesta ulaska u ribozom (IRES); • HIV inhibitori: nukleozidni inhibitori, ne-nukleozidni inhibitori, inhibitori proteaze, fuzioni inhibitori i inhibitori integraze; ili

• HBV inhibitori: sredstva koja inhibiraju DNK virusne polimeraze HBV-a ili

je to HBV vakcina.

Kao što je gore razmatrano, kombinovana terapija se ima u vidu kada se jedinjenje formule (1), ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, uporedo daje sa bar jednim dopunskim sredstvom odabranim od: antivirusnog sredstva, imunomodulatorskog sredstva, drugog inhibitora HCV NS3 proteaze, inhibitora HCV polimeraze, inhibitora drugog cilja u životnom ciklusu HCV-a, HIV inhibitora, HAV inhibitora i HBV inhibitora. Primeri takvih sredstava dati su gore, u sekciji Definicije. Takva dopunska sredstva mogu da se kombinuju sa jedinjenjima na osnovu ovog pronalaska, da bi se dobio jedinični farmaceutski oblik doziranja. Alternativno, takva dopunska sredstva mogu da se daju pacijentu odvojeno, kao deo višestrukog načina doziranja, na primer, upotrebom odgovarajućeg kompleta sa lekovima. Takva dopunska sredstva mogu da se daju pacijentu pre, jednovremeno sa, ili posle, davanja jedinjenja formule (1), ili njegove farmaceutski prihvatljive soli.

Kako je ovde korišćen, izraz "tretman" označava davanje nekog jedinjenja ili kompozicije, na osnovu ovog pronalaska, radi ublažavanja ili eliminisanja simptoma hepatitis C oboljenja i/ili smanjenja virusnog opterećenja kod pacijenta.

Kako je ovde korišćen, izraz "prevencija" označava davanje jedinjenja ili kompozicije, na osnovu ovog pronalaska, posle izlaganja osobe virusu, ali pre pojave simptoma bolesti, i/ili pre

otkrivanja virusa u krvi.

Rešenja koja imaju prednost

Prvenstveno, jedinjenje formule I, kao što je gore definisano, u kojem R<1>jeste hidroksi ili NHS02R<1A>grupa, pri čemu R^ jeste (C^-alkil, (C^-cikloalkil ili {(C1.6)-alkil-(C3.7)-cikloalkil} grupa, koje su, u datom slučaju, supstituisane sa 1 do 3 halogeno, nitro ili 0-(Ci^)-alkil grupe, ili fenil grupa, koja je, u datom slučaju supstituisana sa 1 do 3 halogeno, nitro, (C^-alkil ili 0-( Ci_ £-alkil grupe.

Povoljnije je, jedinjenje formule I, kao što je gore definisano, u kojem R<1>jeste hidroksi ili NHS02R<1A>grupa, pri čemu R^ jeste metil, etil, ciklopropil, ciklobutil, ciklopentil, ciklopropilmetil, cikloheksiletil, CC13, CF3, fenil, 2-fluorofenil ili 4-metilfenil grupa.

Najpovoljnije je, jedinjenje formule I, kao što je gore definisano, u kojem R<1>jeste hidroksi ili NHS02R<1A>grupa, pri čemu R^ jeste metil, ciklopropil, CF3ili fenil grupa. Osim toga, najpovoljnije je da R^ jeste ciklopropil grupa.

Najpovoljnije je da R<1>jeste hidroksi grupa.

Najpovoljnije je da R<2>jeste ciklopentil grupa.

Sva jedinjenja formule I, kako su prikazana u tabeli 1, obuhvaćena su rešenjima koja imaju prednost.

Prema jednom alternativnom rešenju, farmaceutska kompozicija, na osnovu ovog pronalaska, može dodatno da sadrži drugo anti-HCV sredstvo. Primeri anti-HCV sredstava uključuju a- (alfa), p- (beta), 5- (delta), y- (gama) ili co- (omega) interferon, ribavirin i amantadin.

Prema jednom drugom alternativnom rešenju, farmaceutska kompozicija, na osnovu ovog pronalaska, može dodatno da sadrži drugi inhibitor HCV NS3 proteaze.

Prema jednom drugom alternativnom rešenju, farmaceutska kompozicija, na osnovu ovog pronalaska, može dodatno da sadrži neki inhibitor HCV polimeraze. Prema još jednom drugom alternativnom rešenju, farmaceutska kompozicija, na osnovu ovog pronalaska, može dodatno da sadrži neki inhibitor drugih ciljeva u životnom ciklusu HCV-a, uključujući, ali bez ograničavanja na, helikazu, NS2/3 proteazu ili interno mesto ulaska u ribozom (IRES).

Farmaceutska kompozicija, na osnovu ovog pronalaska, može da se daje oralno, parenteralno ili via inplantiranog rezervoara. Prednost ima oralno davanje ili davanje putem injekcije. Farmaceutska kompozicija, na osnovu ovog pronalaska, može da sadrži neke konvencionalane, ne-toksične, farmaceutski prihvatljive nosače, dodatke ili prenosioce. U nekim slučajevima, pH vrednost formulacije može da se podešava pomoću farmaceutski prihvatljivih kiselina, baza ili pufera, radi povećavanja stabilnosti formulisanog jedinjenja ili njegovog oblika davanja. Izraz parenteralan, kako je ovde upotrebljen, obuhvata subkutanu, intrakutanu, intravensku, intamuskularnu, intra-artikularnu, intrasinovijalnu, intrasternalnu, intratekalnu i intralezijalnu injekcionu ili infuzionu tehniku.

Farmaceutska kompozicija može biti u obliku sterilnog preparata koji može da se injektuje, na primer, kao sterilna vodena ili uljana suspenzija koja se injektuje. Takva suspenzija može da se formuliše prema tehnikama poznatim na osnovu stanja tehnike, upotrebom pogodnih sredstava za dispergovanje ili vlaženje (takvih kao, na primer Tween 80) i suspenzionih sredstava.

Farmaceutska kompozicija, na osnovu ovog pronalaska, može da se daje oralno u nekom od oralno prihvatljivih oblika doziranja, uključujući, ali bez ograničavanja na njih, kapsule, tablete i vodene suspenzije i rastvore. Kada se radi o tabletama za oralnu primenu, nosači koji se obično koriste obuhvataju laktozu i kukuruzni škrob. Sredstva za podmazivanje (lubrikanti), kao magnezijum-stearat, takođe se obično dodaju. Za oralno davanje u obliku kapsule, korisni razblaživači uključuju laktozu i osušeni kukuruzni škrob. Kada se vodena suspenzija daje oralno, aktivni sastojak se kombinuje sa sredstvima za emulgovanje i suspendovanje. Ako se želi, mogu se dodati izvesni zaslađivači i/ili aromatizeri i/ili sredstva za bojenje.

Drugi pogodni prenosioci ili nosači, za gore navedene formulacije i kompozicije, mogu se naći u u standardnim farmaceutskim tekstovima, npr. u "Remington's

Pharmaceutical Sciences", The Science and Practice of Pharmacv, 19<t0>izdanje, Mack Publishing Company, Easton, Penn., (1995).

Nivoi doziranja, od između oko 0.01 i oko 100 mg/kg telesne mase, na dan, prvenstveno između oko 0.1 i oko 50 mg/kg telesne mase, na dan, inhibitorskog jedinjenja proteaze, opisanog ovde, korisni su u monoterapiji za prevenciju i tretman oboljenja izazvanog HCV-om. Obično, farmaceutska kompozicija, na osnovu ovog pronalaska, daje se od oko 1 do oko 5 puta, na dan, ili alternativno, kao kontinualna infuzija. Takvo davanje može da se primeni kao hronična ili akutna terapija. Količina aktivnog sastojka koja može da se kombinuje sa nosećim materijalima, radi pripremanja jediničnog oblika doziranja, zavisiće od domaćina koji se leči i naročito od načina primene. Tipičan preparat sadrži od oko 5% do oko 95% aktivnog jedinjenja (mas./mas.). Prvenstveno, takvi preparati sadrže od oko 20% do oko 80% aktivnog jedinjenja.

Kao što će stručnjak da proceni, niže ili više doze, od onih gore navedenih, mogu biti potrebne. Specifično doziranje i režimi tretmana za nekog pojedinačnog pacijenta zavisiće od mnoštva faktora, uključujući aktivnost upotrebljenog specifičnog jedinjenja, starosti, telesne mase, opšteg zdravstvenog stanja, pola, ishrane, vremena davanja, brzine izlučenja, lekovite kombinacije, ozbiljnosti i toka infekcije, dispozicije pacijenata prema infekciji i procene lekara koji leči. Obično, tretman započinje sa malim dozama, bitno manjim od optimalne doze peptida. Posle toga, doza se po malo povećava sve dok se ne dostigne optimalno dejstvo pod tim okolnostima. Obično, jedinjenje se najradije daje sa nivoom koncentracije koji će obično dati efikasne antivirusne rezultate, ne izazivajući neke štetne ili škodljive prateće efekte.

Ako kompozicija na osnovu ovog pronalaska sadrži, kombinaciju jedinjenja formule I i jednog ili više dodatnih terapeutskih ili profilaktičkih sredstava, oba sastojka, i jedinjenje i dodatno sredstvo, treba da su sa nivoima doziranja od između oko 10 do 100%, a povoljnije je između oko 10 i 80%, doze koja se obično daje u režimu monoterapije.

Kada su ova jedinjenja ili njihove farmaceutski prihvatljive soli formulisani

zajedno sa farmaceutski prihvatljivim nosačem, dobijena kompozicija može da sein vivodaje sisatima, kao što je čovek, radi inhibiranja HCV NS3 proteaze ili radi lečenja ili prevencije HCV virusne infekcije. Takav tretman može takođe da se postigne korišćenjem nekog jedinjenja na osnovu ovog pronalaska, u kombinaciji sa sredstvima koja uključuju, ali bez ograničavanja na, a-, p\ 6-, co-, x- ili7-interferon, ribavirin, amantadin; druge inhibitore HCV NS3 proteaze; inhibitore HCV polimeraze; inhibitore drugih ciljeva u životnom ciklusu HCV-a, koji uključuju, ali bez ograničavanja na, helikazu, NS2/3 proteazu, ili interno mesto ulaska u ribozom (IRES); ili njihove kombinacije. Dodatna sredstva mogu da se kombinuju sa jedinjenjima na osnovu ovog pronalaska, radi dobijanja jediničnog oblika doziranja. Alternativno, ta dodatna sredstva mogu da se sisaru daju odvojeno, kao deo višekratnog oblika doziranja.

Ako farmaceutska kompozicija, kao aktivnu komponentu, sadrži samo jedinjenje na osnovu ovog pronalaska, takav postupak dodatno može da obuhvata stupanj davanja, pomenutom sisaru, nekog sredstva, odabranog od imunomodulatorskog sredstva, antivirusnog sredstva, inhibitora HCV NS3 proteaze, inhibitora HCV polimeraze ili inhibitora drugih ciljeva u životnom ciklusu HCV-a, kao što su helikaza, NS2/3 proteaza ili IRES. Takvo dodatno sredstvo može sisaru da se daje, pre, jednovremeno, ili posle, davanja kompozicije na osnovu ovog pronalaska.

Ovde prikazano jedinjenje formule I može takođe da bude upotrebljeno kao laboratorijski reagens. Jedinjenje na osnovu ovog pronalaska može takođe da bude upotrebljeno za tretman ili prevenciju virusne kontaminacije materijala, pa zbog toga za smanjenje rizika od virusne infekcije, laboratorijskog ili medicinskog osoblja ili pacijenata, koji dolaze u dodir sa takvim materijalima (npr. krv, tkivo, hirurški instrumenti i odeća, laboratorijski instrumenti i odeća, aparati i materijali za sakupljanje krvi).

Jedinjenje formule I, prikazano ovde, takođe može da bude upotrebljeno kao istraživački reagens. Jedinjenje formule I takođe može da bude upotrebljeno kao pozitivna kontrola valjanosti surogatnih ogleda baziranih na ćelijama, ili u ogleda virusne replikacije,in vitro ili in vivo.

Dalji detalji0pronalasku ilustrovani su u sledećim primerima, koji treba da se shvate kao ne-limitirajući, u odnosu na priložene patentne zahteve.

Metodologija

Uglavnom, jedinjenje formule I i intermedijeri za to pripremaju se na osnovu poznatih postupaka, pod reakcionim uslovima za koje se zna da su povoljni za reaktante. Nekoliko takvih postupaka obnarodovano je u WO 00/09543 i WO 00/09558.

Sledeća shema ilustruje uobičajeni proces prema poznatim postupcima za pripremanje ključnog intermedijera formule 6a, od acikličnih intermedijera:

Shema I:

Stupnjevi A, C, D: Ukratko, delovi Pl, P2 i P3 mogu da se povezu prema dobro poznatim postupcima kuplovanja peptida, uglavnom obnarodovanim u WO 00/09543 &WO 00/09558.

Stupanj B: Ovaj stupanj obuhvata inverziju konfiguracije 4-hidroksi

supstituenta. Postoji više načina na koje to može da se izvede, što će stručnjaci prepoznati. Jedan primer uobičajenog postupka je dobro poznata Micunobu reakcija (MitsunobuSynthesis1981, januar, 1-28; Ranoet al., Tet. Lett1994,36,3779-3792; Krchnaketal., Tet. Lett1995,36,6193-6196).

Stupanj E: Obrazovanje makrocikla može da se izvede preko olefinske dvostruke dekompozicije (metateze), upotrebom katalizatora na bazi Ru, kao što je neki od onih koje prikazuju Miller, S.J.; Blackwell, H.E.; Grubbs, R.H./. Am. Chem. Soc.1996,118,9606-9614 (a); Kingsburv, J.S.; Harritv, J.P.A.; Bonitatebus, P.J.; Hoveyda, A.H./ Am. Chem. Soc.1999,121, 791-799(b) i Huang, J.; Stevens, E.D.; Nolan, S.P.; Petersen, J.L./. Am. Chem. Soc. 1999, 121,2674-2678 (c), ili kao što je obnarodovano u WO 00/59929. Takođe je poznato, da za tu reakciju mogu da se upotrebe katalizatori koji sadrže i druge prelazne metale, kao Mo.

Potonja konverzija ključnog intermedijera formule 6a u jedinjenja formule I, na osnovu ovog pronalaska, detaljno je prikazana u narednim primerima.

Jedinjenja formule I, u kojoj R<1>jeste NHS02R1A, kao što je to ovde definisano, pripremaju se kuplovanjem, pod standardnim uslovima, odgovarajuće kiseline formule I (ti. R<1>je hidroksi grupa) sa pogodnim sulfonamidom, formule R<1A>S02NH2, u prisustvu sredstva za kuplovanje. Iako nekoliko obično korišćenih sredstava za kuplovanje može da se upotrebi, utvrđeno je da su pogodni TBTU i HATU. Sulfonamidi se mogu komercijalno nabaviti ili se mogu pripremiti prema poznatim postupcima.

PRIMERI

Ovaj pronalazak je ilustrovan, u pogledu drugih detalja, sledećim nelimitirajućim primerima. Drugi specifični načini sinteze ili razdvajanja mogu se naći u WO 00/09543; WO 00/09558 & WO 00/59929.

Temperature su date u stepenima Celzijusa. Procentni rastvori prikazuju odnos mase prema zapremini, a odnosi u rastvoru prikazuju odnos zapremine prema zapremini, ukoliko nije drukčije rečeno. Spektri nuklearne magnetne rezonance (NMR) snimani su na spektrometru Bruker 400 MHz; hemijska pomeranja (5) su data u delovima na milion (ppm), a odnose se na interni deuterisani rastvarač, ukoliko nije drukčije naznačeno. NMR spekri finalnih jedinjenja (inhibitori) snimani su u DMSO-d6. Fleš hromatografija na koloni izvođena je na silikagelu (Si02), na osnovu Still-ove fleš hromatografske tehnike (W.C. Still et al., /Org. Chem.,1978,

43, 2923).

Skraćenice korišćene u primerima obuhvataju, BOC: fe/r-butiloksikarbonil [Me3COC(0)]; BSA: albumin goveđeg seruma; CHAPS: 3-[(3-holamidopropil)-dimetilamonio]-l-propansulfonat: CH2C12= DCM: metilenhlorid; DEAD: dietilazo-dikarboksilat; DIAD: diizopropilazodikarboksilat; DIPEA: diizopropiletil-amin; DMAP: dimetilaminopiridin; DMF: A^dimetilformamid; DMSO: dimetilsulfoksid; (S,S)-Et-DUPHOS Rh (COD)OTf: (+)-l,2-bis (25,55)-2,5-dietilfos-folano)benzen-(ciklooktadien)-rodinium(l)-trifluorometansulfonat; EtOH: etanol; EtOAc: etilace-tat, ESMS: elektrosprej masena spektrometrija; HATU: 0-(7-azabenzotriazol-l-il)-1,1,3,3-tetrametiluronijum-heksalfuorofosfat; HPLC: tečna hromatografija pod visokim pritiskom; MS: masena spektrometrija; MALDI-TOF: Matrix Assisted Laser Disorption Ionization - Time of Flight; FAB: bombardovanje brzim atomima; Me: metil; MeOH: metanol; R.T.: sobna temperatura (18 - 22 °C); TBTU: 2-(lH-benzotriazol-l-il)-l,l,3,3-tetrametiluronijum-tetrafluoroborat; TFA: trifluorosirćetna kiselina; THF: tetrahidrofuran; TLC: tankoslojna hromatografija; Tris/HCl: tris (hidroksimetil) aminometan hidrohlorid.

PRIMER 1

Sinteza dipeptida lc:

Smeša Boc-hidroksiprolina la (50.0 g, 216 mmol),( 1R,25)-vinil-ACCA hidrohlorida lb (42.25 g, 238 mmol), TBTU (76.36 g 238 mmol) i DIPEA (113 ml, 649 mmol), u DMF (800 ml), mešana je na sobnoj temperaturi, u atmosferi azota. Posle 3.5 h rastvarač je otparen, ostatak je ekstrahovan sa EtOAc, pa opran sa hlorovodoničnom kiselinom (10%), zasićenim natrijum-bikarbonatom i rastvorom soli. Onda je organska faza osušena preko magnezijum-sulfata, profiltrirana i uparena, dajući ulje. Sušenjem ulja, tokom noći (18 h), pod sniženim pritiskom, dobijen je dipeptid lc, kao žuta pena (72.0 g, 94%, čistoća > 95% na osnovu HPLC).

PRIMER 2

Sinteza dipeptida 2a

Dipeptid lc (72.0 g, 203 mmol)), trifenilfosfin (63.94 g, 243.8 mmol, 1.2 ekv.) i 4-nitrobenzoeva kiselina (41.08 g, 245.8 mmol, 1.2 ekv.) rastvoreni su u THF (1.4 lit.), pa je rastvor uz mešanje ohlađen na 0 °C, pod atmosferom azota. Zatim je tokom 45 min dokapavan DEAD (38.4 ml, 244 mmol, 1.2 ekv.) pa je ostavljeno da se reakciona smeša zagreje do sobne temperature. Posle 4 h, rastvarač je otparen pa je ostatak podeljen na četiri dela. Svaki od njih je hromatografisan preko finog silikagela (10-40 um meš, prečnik kolone 12 cm, dužina kolone 16 cm), sa gradijentom od 2:1 heksan/EtOAc do 1:1 heksan/EtOAc pa do čistog EtOAc. Dobijen je estar 2a, u obliku bele amorfne čvrste supstance, posle otparavanja rastvarača i sušenja pod visokim vakuumom, 1 h na 70 °C. (108.1 g, kvantitativan prinos).

PRIMER 3

Sinteza alkoholnog dipeptida 3a:

U THF (1.0 lit.) rastvoren je nitrobenzoil-estar 2a (108.1 g, 203.1 mmol), pa je dobijeni rastvor ohlađen na 0 °C. Zatim je brzo dodat rastvor litijum-hidroksid monohidrata (10.66 g, 253.9 mmol), u vodi (225 ml), pa je reakciona smeša mešana 30 min na 0 °C posle čega je zaostala baza neutralisana sa hlorovodoničnom kiselinom (IM, 50.8 ml). Polako je dodavano još kiseline sve dok žuta boja nije iščezla (7 ml). Onda je dobijena smeša uparena pa je ostatak ekstrahovan sa EtOAc (3 x 150 ml). Ekstrakt je opran sa zasićenim rastvorom natrijum-bikarbonata (150 ml) i rastvorom soli (150 ml). Organska faza je osušena preko magneziju-sulfata/aktivnog uglja, profiltrirana preko dijatomejske zemlje i uparena. Sušenjem ostatka tokom noći, pod visokim vakuumom, dobijen je alkohol 3a, kao bezbojna pena (70.1 g, 98%, čistoća > 99%, na osnovu HPLC).

PRIMER 4

Sinteza ( 25)- N- Boc- amino- non- 8- enske kiseline ( 4g)

Stupanj A. U rastvor komercijalnog dietil-2-acetamidomalonata 4a (100 g, 0,46 mol), u dioksanu (500 ml), tokom 30 do 45 min dokapavan je vodeni rastvor natrijum-hidroksida (IM, 1 ekv., 460 ml). Dobijena smeša je ostavljena da se meša 16.5 h, pa je dioksan otparenin vacuo.Dobijeni vodeni rastvor je ekstrahovan sa tri porcije od 300 ml EtOAc, pa je sa konc. HC1 zakiseljen na pH 1. Taj rastvor je ostavljen u kupatilu sa ledom, da izkristališe. Posle pojave prvih kristala rastvor je sonifikovan, pa je se pojavio obilan precipitat. Filtriranjem i sušenjem pod vakuumom dobijeno je jedinjenje 4b, kao čvrsta bela supstanca (62.52 g, prinos 72%).

Stupanj B. U emulziju komercijalnog 7-okten-l,2-

diola 4c (25 g, 0.173 mol) i H20 (100 ml), mešanu magnetnom mešalicom, u balonu od 1 lit. sa okruglim dnom, u toku 20 min dodavan je vodeni rastvor natrijum-perjodata (40.7 g, 190 mol, 1.1 ekv., u 475 ml H20) (reakcija blago egzotermna). Dobijena smeša je mešana na sobnoj temperaturi još 1 h (završetak reakcije je potvrđen pomoću TLC). Smeša je zatim dekantirana u levak za odvajanje, pa je vodeni sloj odvojen od organskog sloja. Vodeni rastvor je zasićen sa NaCl, dekantiran i još jednom odvojen od organske frakcije. Dve organske frakcije su spojene, osušeno je sa natrijum-sulfatom, profiltrirano kroz tampon od pamuka (u Pasterovu pipetu), pa je dobijeno jedinjenje 4d (15.135 g, bezbojno ulje, prinos 78%). Vodeni rastvor je ekstrahovan sa CH2C12, osušen sa anhidrovanim MgS04, koncentrovan pod vakuumom (bez zagrevanja, ti. 6-heptanal t.t. 153 °C), da bi se dobila dodatna količina jedinjenja 4d (1.957 g, bezbojno ulje, prinos 10%). Ukupan prinos 88%.

Stupanj C. Na čvrst etil-2-acetamidomalonat 4b (7.57 g, 40 mmol), tokom 1 min, dodavan je 6-heptenal 4d (4.48 g, 40 mmol) rastvoren u piridinu (32 ml, 10 ekv.). Dobijeni rastvor je ohlađen u kupatilu na 10 °C. Tokom 4 min dodavan je anhidrid sirćetne kiseline (12 ml, 3.2 ekv.). Dobijeni oranž rastvor mešan je 3 h na sobnoj temperaturi, pa je dodata druga porcija etil-2-acetamidomalonata 4b (2.27 g). Dobijena smeša je mešana još 11 h, na sobnoj temperaturi. Zatim je dodat led (60 ml) pa je rastvor mešan 1.5 h, onda je smeša razblažena sa 250 ml vode i ekstrahovana sa dve porcije dietiletra. Etarski rastvor je opran sa IM HC1, sa zasićenim NaHCG*3, osušen je sa Na2S04, koncentrovan pa prečišćen fleš hromatografijom (EtOAc 40%/heksan) dajući jedinjenje 4e (4.8 g, prinos 50%), kao bledo žuto ulje.

Stupanj D. U degazirani (barbotiranjem argona 30 min) rastvor ^etil-2-acetamido-2,8-nonadienoata 4e (8.38 g, 35 mmol), u suvom etanolu (70 ml), dodat je (S,S)-Et-DUPHOS Rh(COD)OTf (51 mg, supstrat/katalizator = 496). Smeša je stavljena pod pritisak vodonika od 2.07 bara (posle 4 ciklusa, vakuum-H2), pa je 2 h mešana na Parr-ovoj mućkalici. Dobijena smeša je uparena do suva, dajući sirovo jedinjenje 4f, koje je bez prečišćavanja upotrebljeno u sledećem stupnju.

Stupanj E. U rastvor sirovog (5)-etil-2-acetamido-8-nonenoata 4f (7.3 g, 30.3 mmol) u THF (100 ml), dodati su Boc20 (13.2 g, 2 ekv.) i DMAP (740 mg, 0.2 ekv.). Reakciona smeša je 2.5 h refluksovana. Zatim je najveći deo THF rastvarača otparen, sirova smeša je razblažena sa CH2C12i oprana sa IM HC1, radi uklanjanja DMAP. Organski sloj je dalje ekstrahovan sa zasićenim vodenim rastvorom NaHCOs, osušen je sa anhidrova-nim Na2S04i koncentrovan u vakuumu. Zatim je sirovi proizvod razblažen sa THF (50 ml) i vodom (30 ml), dodat je LiOHH20 (2.54 g, 2 ekv.), pa je dobijena smeša mešana 25 h na sobnoj temperaturi (završetak hidrolize je potvrđen pomoću TLC). Reakciona smeša je koncentrovana pod vakuumom radi uklanjanja najvećeg dela THF, pa je razblažena sa CH2C12. Dobijeni rastvor je opran sa IM HC1, osušen sa anhidrovanim Na2S04i koncentrovan pod vakuumom. Da bi se uklonile neznatne nečistoće i višak Boc20, sirovi proizvod je prečišćen fleš hromatografi-jom (korišćenjem gradijentnog rastvarača, od 100% heksana - 100% EtOAc, kao eluenta). Jedinjenje navedeno u naslovu 4g, dobijeno je sa velikom čistoćom, kao bledo žuto ulje (5.82 g, prinos 71%).<*>H NMR (DMSO, 400 MHz): 5 7.01 (d, J = 8 Hz, IH), 5.79 (tdd, Jt = 6.7 Hz, Jd = 17.0,10.2 Hz, IH), 5.00 (md, Jd = 17.0 Hz, IH), 4.93 (md, Jd = 10.2 Hz, 1), 3.83 (m, IH), 2.00 (q, J = 6.9 Hz, 2H), 1.65-1.5 (m, 2H), 1.38 (s, 9H), 1.35-1.21 (m, 6H).

PRIMER 5

Sinteza tripeptida 5b

Stupanj 1: Rastvor hidrogenhlorida u dioksanu (4M) dodat je u Boc-P2-Pl fragment 3a (5.32 g, 15.0 mmol), dajući bezbojan rastvor. Posle 1 h mešanja na sobnoj temperaturi rastvarač je otparen a ostatak je držan pod visokim vakuumom, tokom 3 h, dajući hidrohloridnu so jedinjenja 5a, kao amorfnu čvrstu supstancu, koja je kao takva i upotrebljena.

Stupanj 2: U smešu gore pripremljenog P1-P2 hidrohlorida (15 mmol), u suvom DCM (100 ml), dodat je DIPEA (2.6 ml, 15 mmol) pa je dobijen homogen rastvor. Odvojeno, TBTU (5.30 g, 16.5 mmol, 1.1 ekv.) je uz mešanje dodat u C9-linker (reagens koji se kupluje) 4g (4.07 g, 15.00 mmol), u suvom DMC (130 ml), što je dovelo do delimičnog rastvaranja reagensa. Dodat je DIPEA (2.6 ml, 15 mmol), što je posle 10 min dalo uglavnom homogen rastvor. U njega je zatim dodat P1-P2 rastvor pa je DIPEA dodavan sve do bazne reakcije (pH > 8 na vlažnom lakmusu). Posle mešanja u toku 5 h, pod atmosferom azota, rastvarač je otparen a ostatak je ekstrahovan sa EtOAc (2 x 250 ml) pa opran sa razblaženom hlorovodoničnom kiselinom (0.05M, 400 ml), vodom (400 ml) i zasićenim rastvorom natrijum-bikarbonata (400 ml). Zatim su organske faze sjedinjene, osušene preko magnezijum-sulfata, profitirane pa uparene, do žutog sirupa. Sirovi proizvod je hromatografisan preko silikagela, korišćenjem kao eluenta, 6:1 EtOAc/heksan do čistog EtOAc, što je dalo željeni tripeptid, dien 5b, kao belu penu (5.88 g, 82%, čistoća > 95%, na osnovu HPLC).

PRIMER 6

Sinteza makrociklićnog intermedijera 6a:

Iz rastvora diena 5b (4.0 g, 7.88 mmol) u suvom DCM (800 ml), uklonjen je kiseonik barbotiranjem Ar tokom 2 h. Zatim je, u čvrstom obliku, dodat Hovevda katalizator (262 mg, 0.434 mmol, 5.5 mol%) pa je reakciona smeša refluksovana pod Ar balonom. Posle 28 h, crveno-oranž rastvor je uparen do amorfne čvrste supstance, pa je izvršeno prečišćavanje fleš hromatografijom, na koloni sa silikagelom. Početni sistem rastvarača je bio 10% EtOAc u CH2C12. Kada je katalizator bio ispran iz kolone rastvarač je zamenjen čistim EtOAc. Eluiranje katalizatora iz kolone bilo je očigledno na osnovu njegove boje. Makrociklični proizvod 6a izolovan je kao bezbojna pena koja je ponovo rastvorena u CH2Cl2/heksanu (~1:2). Otparavanjem rastvarača dobijen je beli prah (3.362 g, prinos 89%).

<!>H NMR (CDC13, 400 MHz): 5 1.20-1.50 (m, 6H), 1.43 (s, 9H), 1.53 (dd, J = 9.5 & 5.4, IH), 1.61-1.70 (m, 1H0, 1.76-1.90 (m, 2H), 2.05-2.26 (m, 4H), 2.45 (d, J = 14.3, IH), 3.67 (s, 3H), 3.71 (d, J = 11.1, IH), 3.90 (dd, J = 11.1 & 4.3, IH), 4.43-4.53 (m, 2H), 4.76 (d, J = 8.6, IH), 4.86 (bd, J = 9.8, IH), 5.20-5.23 (m, 2H), 5.57 (dt, J = 7.0& 9.8, IH), 7.32 (bs, IH).

PRIMER 7

Pripremanje tiourea 7

Sinteza tiouree 7a:

U rastvor fe/r.-butil-izotiocijanata (5.0 ml, 39.4 mmol), u DCM (200 ml), dodat je ciklopentilamin (4.67 ml, 47.3 mmol), a zatim DIEA, pa je reakciona smeša mešana 2 h na sobnoj temperaturi. Smeša je razblažena sa EtOAc, oprana sa 10% vodenim rastvorom limunske kiseline (2x), zasićenim rastvorom NaHCOs(2x), H20 (2x) i rastvorom soli (lx). Organski sloj je osušen preko anhidrovanog MgS04, profiltriran i uparen, dajući N-terc.-butil-N'-ciklopentil-tioureu, kao čvrstu belu supstancu (3.70 g, prinos 47%). N-ferc.-butil-N'-ciklopentil-tiourea (3.70 g) je rastvorena u koncentrovanoj HC1 (46 ml). Tamno žuti rastvor je blago refluksovan. Posle 40 min, reakciona smeša je ostavljena da se ohladi na sobnu temperaturu pa je zatim rashlađena u ledu i zaalkalisana na pH 9.5, sa čvrstim, pa zasićenim vodenim rastvorom NaHCOs- Proizvod je ekstrahovan sa EtOAc (3x), sjedinjeni EtOAc ekstrakti su oprani sa H20 (2x) i rastvorom soli (lx). Organski sloj je osušen (MgS04), profiltriran pa koncentrovan, dajući bež čvrstu supstancu (2.6 g sirovo). Pošto je sirovi materijal rastrljan u heksan/EtOAc 95/5, posle filtriranja je dobijena N-ciklopentiltiourea 7a, kao čvrsta bela supstanca (2.38, prinos 90%).

<*>H NMR (400 MHz, DMSO-dg): 5 7.58 (bs, IH), 7.19 (bs, IH), 6.76 (bs, IH), 4.34 (bs, IH), 1.92-1.79 (m, 2H), 1.66-1.55 (m,2H), 1.55-1.30 (m, 4H), MS; es<+>144.9 (M + H)+, es" 142.8 (M - H)\

Pripremanje tiouree 7b

Prema gore opisanom postupku i korišćenjem komercijalnog cikloheksilamina (umesto ciklopentilamina) dobijena je tiourea 7b

PRIMER8

Sinteza iedinienia 101:

Stupanj A. U rastvor, makrocikličnog intermedijera 6a (13.05 g, 27.2 mmol, 1.0 ekv.), Ph3P (14.28 g, 54.4 mmol, 2.0 ekv.) i 2-karboksimetoksi-4-hidroksi-7-metoksihinolina (WO 00/09543; WO 00/09558 & WO 00/59929) (6.67 g, 28.6 mmol, 1.05 ekv.), u THF (450 ml), na 0 °C, u toku 15 min je dokapan DIAD (10.75 ml, 54.6 mmol, 2.0 ekv.). Zatim je uklonjeno kupatilo sa ledom pa je reakciona smeša mešana 3 h na sobnoj temperaturi. Posle potpune konverzije polaznog materijala u proizvode, rastvarač je otparen u vakuumu, preostala smeša je razblažena sa EtOAc, oprana sa zasićenim rastvorom NaHCOs(2x) i rastvorom soli (lx), organski sloj je osušen sa anhidrovanim MgS04, profiltriran i uparen do suva. Cvisto jedinjenje 7a dobijeno je posle fleš hromatografije na koloni; kolona je eluirana, prvo sa heksan/EtOAc (50:50), zatim sa CHCl3/EtOAc (95:5), radi uklanjanja Ph3PO i DIAD nuzproizvoda, a eluiranje nečistoća je praćena pomoću TLC. Na kraju, željeni proizvod 8a je eluiran iz kolone sa CHCl3/EtOAc (70:30). Obično, hromatografisanje je trebalo ponavljati 2-3 puta pre nego što je jedinjenje 8a moglo da bude izolovano sa velikom čistoćom, kao bela čvrsta supstanca, sa ukupnim prinosom od 68% (12.8 g, 99.5% čistoća, na osnovu HPLC).

Stupanj B. U rastvor intermedijera 8a (1.567 g), u CH2C12(15 ml), zaštićenog sa Boe, dodata je 4M HC1 u dioksanu (12 ml). Reakciona smeša je mešana 1 h na sobnoj temperaturi. [U slučaju da polovinom reakcionog perioda dođe do stvaranja gustog gela, dodavano je još 10 ml CH2C12]. Pošto je završeno deprotektovanje, rastvarači su otpareni do suva pa je dobijena žuta čvrsta supstanca i materijal sličan pasti. Smeša je ponovo rastvorena u približno 5% MeOH u CH2C12, pa ponovo uparena do suva, pod vakuumom, dajući jedinjenje 8b, kao žutu čvrstu supstancu, koja je bez prečišćavanja korišćena u sledećem stupnju.

Stupanj C. U rastvor ciklopentanola (614 ul, 6.76 mmol) u THF (15 ml), dokapan je rastvor fozgena u toluenu (1.93M, 5.96 ml, 11.502 mmol) pa je smeša mešana 2 h na sobnoj temperaturi da bi se stvorio ciklopentil-hloroformijat, reagens (z). Posle toga, pod vakuumom je otparena približno polovina rastvarača. Preostali, svetio žuti rastvor je razblažen dodavanjem CH2C12(5 ml), pa je uparen na polovinu svoje prvobitne zapremine, da bi višak fozgena sigurno bio uklonjen. Gornji rastvor, reagensa, ciklopentil-hloroformijata, dalje je razblažen sa THF (15 ml) pa je dodat u amin-2HCl so, 8b. Smeša je u kupatilu sa ledom ohlađena na 0 °C, pH je podešeno na~8.5-9, dodavanjem Et3N (dodato dokapavanjem), pa je reakciona smeša mešana 1 h na 0 °C. Posle tog perioda smeša je razblažena sa EtOAc, oprana sa vodom (lx), zasićenim rastvorom NaHC03(2x), H20 (2x) i rastvorom soli (lx). Organski sloj je osušen preko anhidrovanog MgS04, profiltriran i uparen pod vakuumom, dajući penu ćilibarno žute boje. Dimetilestar 8c je dobijen kao bela pena posle prečišćavanja fleš hromatografijom na koloni (korišćenjem gradijentnog rastvarača, od 30% heksana do 20% heksana, u EtOAc, kao eluenta) sa prinosom od 80% (1.27 g), a čistoće > 93%.

Stupanj D. Dimetilestar 8c (1.17 g) rastvoren je u smeši

THF/MeOH/H20 (20 ml, odnos 2:1:1), pa je dodat vodeni rastvor NaOH (1.8 ml, IM, 1 ekv.). Reakciona smeša je mešana 1 h, na sobnoj temperaturi, pre upara-vanja do suva, radi dobijanja natrijumove soli 8d, kao bele čvrste supstance (~1.66 mmol). Jedinjenje 8d je bez prečišćavanja upotrebljeno u sledećem stupnju. Stupanj E. Sirova natrijumova so 8d (1.66 mmol) rastvorena je u THF (17 ml), dodat je Et3N, pa je smeša ohlađena na 0 °C u kupatilu sa ledom. Dokapan je izobutilhloroformijat (322 ul, 2.5 mmol), pa je smeša mešana 75 min, na 0 °C. Posle tog perioda dodat je diazometan (15 ml) pa je mešanje nastavljeno 30 min, na 0 °C, a zatim još 1 h na sobnoj temperaturi. Većina rastvarača je pod vakuumom otparena do suva, preostala smeša je razblažena sa EtOAc, oprana sa zasićenim rastvorom NaHC03(2x), H20 (2x) i rastvorom soli (lx), osušena preko anhidrovanog MgS04, profiltrirana i uparena do suva, dajući jedinjenje 8e, kao svetio žutu penu (1.2 g, -1.66 mmol). Diazoketon, intermedijer 8e, upotrebljen je u sledećem stupnju bez prečišćavanja.

Stupanj F. Rastvor diazoketona 8e (1.2 g, 1.66 mmol) u THF (17 ml), ohlađen je na 0 °C u kupatilu sa ledom. U to je dokapan vodeni rastvor HBr (48%, 1.24 ml) pa je reakciona smeša mešana 1 h na 0 °C. Smeša je zatim razblažena sa EtOAc, oprana sa zasićenim rastvorom NaHC03(2x), H20 (2x) i rastvorom soli (lx). Organski sloj je osušen preko anhidrovanog MgS04, profiltriran i uparen do suva, dajući

a-bromoketon, intermedijer 8f, kao svetio žutu penu (~1.657 mmol).

Stupanj G. U rastvor bromoketona 8f (2.51 g, 3.27 mmol), u izopropanolu (105 ml), dodata je ciklopenitltiourea 7a (565 mg, 3.92 mmol) pa je reakciona smeša stavljena u uljano kupatilo zagrejano na 70 °C gde je mešana 1.5 h. Zatim je izopropanol uklonjen pod vakuumom a proizvod je rastvoern u EtOAc. Rastvor je opran sa zasićenim NaHC03, vodom i rastvorom soli, organski sloj je osušen preko anhidrovanog MgS04, profiltriran pa uparen, dajući sirovi proizvod 8g (1.35 g), kao svetio žutu čvrstu supstancu. Sirovi proizvod je prečišćen fleš hromatografijom sa silikagelom (1:1, heksan/EtOAc), dajući 2.12 mg prljavo-bele čvrste supstance (prinos 80%).

Stupanj H. Metilestar, 8g (1.82 g, 2.2 mmol), rastvoren je u rastvoru THF/MeOH/H20 (38/20/18 ml), pa je saponifikovan sa LiOH H20 (935 mg, 22.3 mmol). Reakcija hidrolize je izvedena na sobnoj temperaturi, tokom 18 h. Posle toga, rastvor je uparen do suva, dajući prljavo-belu pastu. Pasta je razblažena sa EtOAc i rastvorom soli. Smeša je podešena na pH 6, sa IM HC1. Sloj EtOAc je odvojen a vodeni sloj je dvaput ekstrahovan sa EtOAc. Sjedinjeni EtOAc ekstrakti su oprani dejonizovanom vodom (2x) i rastvorom soli (lx), osušeni (MgSO^ i upareni, dajući ciklično tripeptidno jedinjenje 101, kao žutu čvrstu supstancu (1.76 g, prinos 99%).

Konverzija u Na-so:

Jedinjenje 8h (106 mg, 0.132 mmol) rastvoreno je u MeOH (20 ml) pa je dodat 0.01M rastvor NaOH (13.2 ml). Bistar žut rastvor je razblažen sa vodom, zamrznut, pa liofiliziran, dajući Na-so jedinjenja 8h, kao žuto-belu, amorfnu čvrstu supstancu (106 mg, prinos 97%).

MS (elektrosprej): 799.3 (M - H)"; 801.4 (M + H) HPLC sa reverznom fazom (0.06% TFA; CH3CN: H20) : 99%.

<*>H NMR (400 MHz, DMSO-dg): 5 8.02 (d, J = 9.2 Hz, IH), 7.90 (d, J = 6.4 Hz, IH), 7.76 (s, IH), 7.44 (bs, 2H), 7.27 (d, J = 1.9 Hz, IH), 7.11 (d, J = 7.0 Hz, IH), 7.03 (d, J = 9.2 Hz, IH), 5.48 (dd, J = 18.4, 9.9 Hz, IH), 5.43 (bs, IH), 5.15 (dt, J = 17.8, 7.63 Hz, IH), 4.70 (bs, IH), 4.49-4.34 (m, 2H), 4.34-4.25 (m, IH), 4.13-4.03 (m, IH), 3.99-3.86 (m, IH), 3.90 (s, 3H), 2.58-2.44 (m, IH), 2.42-2.32 (m, IH), 2.15-1.93 (m, 4H), 1.83-1.14 (m, 24H), 1.14-1.12 (m, IH).

PRIMER 9

Prema istom postupku kao što je opisano u primeru 8 ali, u stupnju G, uz upotrebu N-cikloheksiltiouree 7b, dobijena je natrijumova so jedinjenja 102.

<*>H NMR (400 MHz, DMSO-d6): 8 8.02 (d, J = 9.2 Hz, IH), 7.86 (bs, IH), 7.78 (d, J = 7.3 Hz, IH), 7.43 (s, 2H), 7.27 (d, J = 2.2 Hz, IH), 7.12 (d, J = 6.9 Hz, IH), 7.03 (dd, J = 9.2, 1.9 Hz, IH), 5.57-5.40 (m, IH), 5.40 (s, IH), 5.26-5.17 (m, IH) 4.70 (bs, IH), 4.52-4.35 (m, 2H), 4.29-4.23 (m, IH), 4.18-4.00 (m, IH), 3.90 (s, 3H), 3.87-3.65 (m, IH), 2.42-2.32 (m, IH), 2.19-2.10 (m, IH), 2.07-1.96 (m, 3H), 1.82-0.95 (m, 28H).

MS; es<+>: 815.4 (M + H)<+>, esr: 813.4 (M - H)-.

Primer 10

Ogled aktivnosti NS3- NS4A proteaze

Ogled enzimske aktivnosti, korišćen za ocenu jedinjenja na osnovu ovog pronalaska, opisan je u WO 00/09543 i WO 00/59929.

Primer 11

Ogled sa replikacijom RNK HCV- a u ćelijama

Kultura ćelija:

Huh7 ćelije, koje stabilno zadržavaju subgenomski replikon HCV-a, pripremljene su kao što je ranije opisano (Lohman et al., 1999.Science 285:110-113) i označene kao S22.3 ćelijska linija (WO 02/052015). S22.3 ćelije su gajene u modifikovanom Dulbekovom medijumu (DMEM) u koji je dodavano 10% seruma fetusa govečeta (FBS-a) i 1 mg/ml neomicina (standardni medijum). Tokom ogleda, korišćen je DMEM medijum sa 10% FBS-a, koji je sadržao i 0.5% DMSO i u kome nije bilo neomicina (medijum za oglede). Na 16 h pre dodavanja jedinjenja, S22.3 ćelije su tripsinizovane i razblažene na 50 000 ćelija/ml u standardnom medijumu. Po 200 ?l (10 000 ćelija) je prebačeno u svaki bunarić mikrotitar ploče sa 96 mesta. Ploča je zatim inkubirana na 37 °C sa 5% C02do sledećeg dana.

Priprema jedinjenja koje se testira

U 2 ml medijuma za oglede je dodato 10 ul jedinjenja koje se testira (u 100% DMSO-u), da bi finalna koncentracija DMSO-a bila 0.5%, pa je rastvor sonifikovan 15 minuta i filtriran kroz Millipore filter jedinice od 0.22 um. U red A polipropilenske mikrotitar ploče sa dubokim bunarićima prebačeno je 900 ul ovog rastvora. Redovi od B do H, koji su sadržali alikvote od po 400 [ A medijuma za oglede (sa po 0.5% DMSO-a), korišćeni su da se pripremanje serijskih razblaženja (1/2) prebacivanjem po 400 ul rastvora iz reda u red (jedinjenje nije bilo prisutno u redu H).

Primena jedinjanja koje se testira na ćelije

Iz mikrotitar ploče sa 96 mesta, u kojima su bile S22.3 ćelije, usisan je medijum, kulture ćelija. Po 175 ul medijuma za oglede, sa odgovarajućim razblaženjem jedinjenja koje se testira, prebačeno je, iz svakog bunarića mikrotitar ploče za pripremanje razblaženja, u odgovarajući bunarić ploče sa kulturom ćelija (red H je korišćen kao "kontrola bez inhibicije"). Ploča sa kulturom ćelija je inkubirana 72 h na 37 °C sa 5% C02.

Ekstrakcija totalne ćelijske RNK

Nakon perioda inkubacije od 72 h, totalna ćelijska RNK je ekstrahovana iz S22..3 ćelija sa mikrotitar ploče od 96 mesta, koristeći RNeasv 96 komercijalni paket (Qiagen®, RNeasv priručnik. 1999.). Ukratko, medijum za oglede je kompletno uklonjen sa ćelija, pa je 100 ul RLT pufera (Qiagen®), koji je sadržavao 143 mM p-merkaptoetanol, dodato u svaki bunarić mikrotitar ploče od 96 mesta, sa kulturom ćelija. Mikrotitar ploča je blago treskana 20 sekundi. Potom je dodato po 100 ul 70% etanola u svaki bunarić mikrotitar ploče, i rastvor je promešan pipetiranjem. Lizat je pokupljen i prenet u bunariće RNeasv 96 (Qiagen®) mikrotitar ploče koja je bila postavljena iznad specijalnog Qiagen® četvrtastog bloka za mikrotitar ploče. RNeasv 96 mikrotitar ploča je zatim zalepljena adhezivnom folijom, pa je blok sa RNeasv 96 mikrotitar pločom ubačen u odgovarajući držač i stavljen u korpu rotora centrifuge 4K15C. Uzorak je centrifugiran 4 min na sobnoj temperaturi pri 6000 o/min (oko 5600 x g). Folija je potom uklonjena sa ploče i u svaki bunarić RNeasv 96 ploče je dodato po 0.8 ml RW1 pufera (Qiagen® RNeasv 96 paket). RNeasv 96 ploča je zalepljena sa novim parčetom folije i centirfugirana 4 min na sobnoj temperaturi pri 6000 o/min. RNeasv 96 ploča je zatim postavljena na drugi, čisti četvrtasti blok za mikroploče, i nakon uklanjanja folije, u svaki bunarić RNeasv 96 mikrotitar ploče je sipano po 0.8 ml RPE pufera (Qiagen® RNeasv 96 paket). RNeasv 96 ploča je opet zalepljena sa novim parčetom folije i centrifugirana 4 min na sobnoj temperaturi pri 6000 o/min. Folija je uklonjena i drugih 0.8 ml RPE pufera (Qiagen® RNeasv 96 paket) je dodato u svaki bunarić RNeasv 96 mikrotitar ploče. RNeasv 96 mikrotitar ploča je ponovo zalepljena sa novim parčetom folije i centrifugirana 10 min na sobnoj temperaturi sa 6000 o/min. Nakon ukljanjanja folije, RNeasv 96 mikrotitar ploča je postavljena na vrh držača koji sadrži mikrotube za skupljanje uzoraka, zapremine 1.2 ml. RNK je eluirana dodavanjem po 50 ul vode osloboćene od RNaze u svaki bunarić, nakon čega je ploča zalepljena sa novim parčetom adhezivne folije i inkubirana na sobnoj temperaturi 1 min. Ploča je centrifugirana 4 minuta na sobnoj temperaturi sa 6000 o/min. Stupanj eluiranja je ponovljen dodavanjem još po jedne zapremine od 50 ul vode oslobođene od RNaze. Mikrotube sa totalnom ćelijskom RNK čuvane su na - 70 °C.

Kvantifikacija totalne ćelijske RNK

RNK je kvantifikovna na STORM® sistemu (Molecular Dvnamics®) koristeći RiboGreen® RNK komercijalni paket za kvantifikaciju (Molecular Probes®). Ukratko, reagens RiboGreen je razblažen 200 puta u TE puferu (lOmM Tris-HCl pH 7.5, lmM EDTA). Obično, 50 ul reagensa je razblaženo u 10 ml TE pufera. Ribozomska RNK za standardnu krivu je razblažena u TE puferu do koncentracije od 2^g/ml, pa su zatim određene količine (100, 50, 40, 20, 10, 5, 2 i 0 (il) rastvora ribozomske RNK prebačene u novu mikrotitar ploču sa 96 mesta (COSTAR # 3997) i zapremina je dopunjena sa TE puferom do 100 ul. Obično, kolona 1 mikrotitar ploče sa 96 mesta je korišćena za standardnu krivu, dok su preostali bunarići upotrebljeni za kvantifikaciju RNK u uzorcima. Po 10 ul svakog uzorka čija je RNK kvantifikovana, prebačeno je u odgovarajući bunarić mikrotitar ploče sa 96 mesta, pa je dodato po 90 ul TE pufera. Potom je u svaki bunarić mikrotitar ploče sa 96 mesta dodata po jedna zapremina (100 ul) razblaženog RiboGreen reagensa i ploča je inkubirana 2 do 5 minuta na sobnoj temperaturi, zaštićena od svetlosti (10 ul uzorka RNK u krajnjoj zapremini od 200 ul daje razbla'enje od 20x). Intenzitet fluorescencije u svakom bunariću meren je na STORM® sistemu (Molecular Dvnamics®). Standardna kriva je napravljena na osnovu poznatih količina ribozomske RNK i dobijenih intenziteta fluorescencije. Koncentracija RNK u eksperimetnalnim uzorcima je određena iz standardne krive i korigovana za razblaženje od 20 x.

Real-Time RT-PCR

Real-Time RT-PCR je izveden na ABI Prism 7700 Sequence detekcionom sistemu koristeći TaqMan EZ RT-PCR komercijalni paket od Perkin-Elmer Applied Biosvstems®. RT-PCR je podešen za kvantifikaciju 5' IRES-a RNK HCV-a korišćenjem TaqMan tehnologije (Roche Molecular Diagnostics Systems) slično tehnici koja je ranije opisana (Martell et al., 1999. J. Clin. Microbiol. 37: 327-332). Sistem koristi 5-3' nukleolitičku aktivnost AmpliTaq DNK polimeraze. Ukratko, metoda koristi duplo obeleženu fluorogenu hibridizacionu probu (PUTR probu) koja se specifično sparuje sa matricom između PCR prajmera (prajmeri 8125 i 7028). 5' kraj probe sadrži fluorescentni molekul »reporter« (6-karboksifluorescein [FAM]), dok 3' kraj sadrži »prigušivač« fluorescencije (6-karboksitetrametilrodamin [TAMRA]). Emisioni spektar FAM reportera je suprimiran prigušivačem fluorescencije na intaktnoj hibridizacionoj probi. Nukleazno razlaganje hibridizacione probe oslobađa reporter, dovodeći do pojačane emisije fluorescencije. ABI Prism 7700 Sequence detektor meri kontinulano porast u emisiji fluorescencije tokom PCR umnožavanja, tako da je proizvod umnožavanja direktno propocionalan signalu. Kriva umnožavanja je analizirana u ranim fazama reakcije, u tačkama koje predstavljaju logaritamsku fazu nagomilavanja proizvoda. Tačka koja predstavlja definisan prag detekcije porasta u fluorescentnom signalu samog aparata, a vezano za eksponencijalni rast produkta PCR-a, određena je kao pražni ciklus( Cq).C^vrednostje obrnuto proporcionalna količini početne RNK HCV-a; tako, pri identičnim ulovima PCR-a, veća početna koncentracija RNK HCV-a daje nižuCjvrednost. Standardna kriva je određena automatski pomoću ABI Prism 7700 detekcionog sistema na osnovu grafičkog prikaza zavisnoti č^vrednosti i svakog standarnog razblaženja poznate koncentracije RNK HCV-a.

Referentni uzorci za standardnu krivu su bili prisutni na svakoj RT-PCR ploči. RNK HCV replikona je sintetizovana (T7 transkripcijom)in vitro,prečišćena i kvantifikovana na OD26o- Uzimajući u obzir da je1 \ igte RNK = 2.15 x IO<11>kopija RNK, razblaženja su pravljena tako da se dobije IO<8>, IO<7>, IO<6>, IO<5>, IO<4>, IO<3>, ili IO<2>kopija genomske RNK/5 ul rastvora. Totalna ćelijska RNK Huh-7 ćelija je takođe uključena u svako razblaženje

(50 ng/5 ul). Po 5 ul svakog referentnog standarda (replikon HCV-a + Huh-7 RNK) je kombinovano sa po 45 ul smeše reagensa, i korišćeno u reakciji Real-Time RT-PCR-a.

Reakcija Real-Time RT-PCR-a je podešena za eksperimentalne uzorke, prečišćene na RNeasv mikrotitar pločama sa 96 mesta, kombinovanjem po 5 ul svakog uzorka totalne ćelijske RNK sa po 45 ul smeše reagenasa.

Napomena: Ovi prajmeri umnožavaju 256 nukleotida dug region, prisutan unutar 5' netranslatirajućeg regiona HCV-a

Kontrole bez matrice ( NTC) : Na svakoj mikrotitar ploči, 4 bunarića su korišćena kao "NTC". Za ove kontrole, umesto RNK, u bunarić je dodavano po 5 ul vode. Termalni profil PCR-a:

Nakon završetka RT-PCR reakcije, a da bi se podaci analizirali, neophodno je odrediti prag fluorescentnog signala za PCR ploču, te je standardna kriva konstruisana crtanjem grafika zavisnosti Ct vrednosti i broja RNK kopija koji je korišćen u svakoj referentnoj reakciji. Ct vrednost dobijena za uzorke koji su korišćeni u ogledu, upotrebljavana je da se interpolira broj kopija RNK, oslanjajući se na standardnu krivu.

Konačno, broj RNK kopija je normalizovan (na osnovu RiboGreen kvantifikacije totalne RNK ekstrahovane iz bunarića sa kulturom ćelija) i izražen kao

genomski ekvivalenti/ug totalne RNK [g.e./ug].

Broj RNK kopija [g.e./ug] u svakom bunariću ploče sa ćelijskom kulturom bio je merilo količine RNK HCV-a koja se umnožava u prisustvu različitih koncentracija inhibitora. Procenat inhibicije je izračunavan sledećom jednačinom:

Podešavanje ne-linearne krive sa Hill-ovim modelom je korišćeno za podatke koji se odnose na relaciju inhibicija-koncentracija, a efikasna koncentracija od 50%

(EC5o) je izračunata korišćenjem SAS softvera (Statistical Software Svstem; SAS Institute, Inc.Carz, N.C.).

Primer 12

Ogledi specifičnosti

Ogledi specifičnosti, korišćeni za određivanje selektivnosti jedinjenja na osnovu ovog pronalaska, opisani su u WO 00/09543.

Primer 13

Farmakokinetičke osobine

Jedinjenja, na osnovu ovog pronalaska, takođe pokazuju dobre farmakokinetičke osobine, poput detektabilnog nivoa u plazmi pacova 1 sat i 2 h nakon oralne doze od 5 mg/kg.

Tačnije, ogled koji sledi, praćenje oralne apsorpcijein vivo,korišćen je da bi se odredili nivoi jedinjenja koje se testiraju, kod pacova nakon oralne primene:

Materijali i postupci:

1. Postupci korišćeni za sakupljanje jedinjenja ("selekcija kaseta"): Odabiranje jedinjenja koja su sakupljana u "kasetu" zasniva se na njihovoj strukturnoj sličnosti i fizičkohemijskim svojstvima. Razvijen je postupak ekstrakcije sa čvrstom fazom, primenljiv na sva odabrana jedinjenja. Zasniva se na početnom testiranju, u kojem je svako jedinjenje ubrizgavano u plazmu pacova i potom analizirano pomoću HPLC ili HPLC/MS, pri koncentraciji od 0.5 uM, a kao osnova za sakupljanje 3-4 jedinjenja u jednu "kasetu" računati su, vreme zadržavanja, jonska masa i mogućnost razdvajanja jedinjenja HPLC ili HPLC/MS postupkom.

2. Oralni prenosilac i pripremanje jedinjenja:

Svaka "kaseta" sadrži 3-4 jedinjenja, sa 5 ili 4 mg/kg od svakog jedinjenja. Kasete su pripremane kao oralna suspenzija u 0.5% vodenom rastvoru metilceluloze i 0.3% polioksietilen (20) solbiton monooleata (Tween-80). Dozirana zapremina je bilo 10 mg/kg, davana oralno.

3. Doziranje i uzorkovanje plazme:

Mužjaci pacova Sprague Dawley, tokom noći su ostavljani bez hrane u pojedinačnim kavezima, uz pristup 10% vodenom rastvoru dekstroze. Po dva pacova su dobijala svaku od "kaseta". Uzorci plazme (~1 ml) uzimani su 1 i 2 h posle davanja, od 2 pacova, i sjedinjavani su za ekstrakciju i analizu.

4. Ekstrakcija jedinjenja i analiza:

Iz svake kasete, uzorci plazme posle 1 i 2 h, plazme bez dodataka, plazme sa dodatkom od 0.5 uM svakog od jedinjenja, ekstrahovani su postupkom ekstrakcije sa čvrstom fazom. Uzorci su radi upoređivanja analizirani pomoću HPLC i HPLC/MS. Koncentracije plazme su određivane na osnovu pojedinačne koncentracije 0.5\ xMstandarda.

Kada su jedinjenja, na osnovu ovog pronalaska, procenjivana prethodnim enzimskim ogledima i ogledima na bazi ćelije, nađeno je da su jedinjenja sa velikom aktivnošću. Tačnije, jedinjenja imaju IC50-vrednosti ispod 0.01 uM u ogledima aktivnosti NS3-NS4A proteaze, a EC50ispod 0.01 uM u ogledima sa replikacijom HCV RNK u ćeliji.

Kada su jedinjenja procenjivana u specifičnim ogledima, nađeno je da su jedinjenja formule I selektivna u onim gde ona ne pokazuju značajnu inhibiciju u Human Leukocvte Elastase i Cathepsin B ogledima.

Kada su jedinjenja procenjivana u farmakokinetičkom ogledu na pacovu, doza od 5 mg/kg u Methocel:Tween20<®>(0.5% : 0.3%) davala je neočekivano dobru koncentraciju plazme. Jedinjenja 101 i 102 imala su površinu ispod krive (AUC) od 16, odn. i od 18 uM-hr, dok su njihovi najbliži analozi imali AUC u opsegu od 0.8 do 4.5 uM-hr. Ovo neočekivano i značajno povećanje prisustva jedinjenja u plazmi pacova čini ova jedinjenja posebno interesantnim kao potencijalne lekove koji mogu da se daju oralno.

Claims (23)

1. Jedinjenje formule I: u kojoj R<1>jeste hidroksi ili NHS02RLA grupa, pri čemu R<1A>jeste (Ci^-alkil, (C^-cikloalkil ili {(Ci_6)-alkil-(C3_7)-cikloalkil} grupa, koje su, u datom slučaju, supstituisane sa 1 do 3 halogeno, cijano, nitro, O-CC^-alkil, amido, amino ili fenil grupe, ili R<1>^ jeste Cg- ili Cio-aril grupa, u datom slučaju, supstituisana sa 1 do 3 halogeno, cijano, nitro, (C^-alkil, O-CCi^-alkil, amido, amino ili fenil grupe; R<2>je (C^-cikloalkil a R<3>je ciklopentil grupa; ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.

2. Jedinjenje, prema zahtevu 1, u kojem R<1>jeste hidroksi ili NHS02R<1A>grupa, pri čemu R^ jeste (C^-alkil, (C3.7)-cikloalkil ili {(C1.6)-alkil-(C3.7)-cikloalkil} grupa, koje su, u datom slučaju, supstituisane sa 1 do 3 halogeno, nitro ili 0-(C1.6)-alkil grupe, ili fenil grupa, koja je, u datom slučaju supstituisana sa 1 do 3 halogeno, nitro, (Ci_6)-alkil ili O-CC^-alkil grupe.

3. Jedinjenje, prema zahtevu 2, u kojem R<1>jeste NHS02R<1A>grupa, pri čemu R<1A>jeste metil, etil, ciklopropil, ciklobutil, ciklopentil, ciklopropilmetil, cikloheksiletil, CC13, CF3, fenil, 2-fluorofenil ili 4-metilfenil grupa.

4. Jedinjenje, prema zahtevu 3, u kojem R^ jeste ciklopropil grupa.

5 Jedinjenje, prema zahtevu 1 ili 2, u kojem R<1>jeste hidroksi grupa.

6. Jedinjenje, prema nekom od zahteva 1 do 5, u kojem R<2>jeste ciklopentil grupa.

7. Jedinjenje, prema zahtevu 1, koje ima sledeću formulu 101:

8. Jedinjenje, prema zahtevu 1, koje ima sledeću formulu 102:

9. Jedinjenje, prema zahtevu 1, koje ima sledeću formulu 103:

10. Farmaceutska kompozicija koja sadrži anti-hepatitis C virusno efikasnu količinu jedinjenja formule I, prena nekom od zahteva 1 do 9, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, u smeši sa farmaceutski prihvatljivim nosačem ili pomoćnim sredstvom.

11. Farmaceutska kompozicija, prema zahtevu 10, koja sadrži još i terapeutski efikasnu količinu jednog ili više drugih anti-HCV sredstava.

12. Farmaceutska kompozicija, prema zahtevu 11, pri čemu je pomenuto drugo anti-HCV sredstvo odabrano od: a-interferona ili PEG-a-interferona.

13. Farmaceutska kompozicija, prema zahtevu 11 ili 12, pri čemu pomenuto drugo anti-HCV sredstvo jeste ribavirin.

14. Farmaceutska kompozicija, prema zahtevu 11,12 ili 13, pri čemu je pomenuto drugo anti-HCV sredstvo odabrano od inhibitora: helikaze, NS2/3 proteaze i internog mesta ulaska u ribozom (IRES).

15. Postupak lečenja ili prevencije hepatitis C virusne infekcije, kod sisara, putem davanja sisaru anti-hepatitis C virusno efikasne količine jedinjenja formule I, prema bilo kojem od zahteva 1 do 9, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli.

16. Postupak lečenja ili prevencije hepatitis C virusne infekcije, kod sisara, putem davanja sisaru anti-hepatitis C virusno efikasne količine kompozicije, prema bilo kojem od zahteva 10 do 14.

17. Postupak lečenja ili prevencije hepatitis C virusne infekcije, kod sisara, putem davanja sisaru anti-hepatitis C virusno efikasne količine jedinjenja formule I, prema bilo kojem od zahteva 1 do 9, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, u kombinaciji sa jednim ili sa više drugih anti-HCV sredstava.

18. Postupak, prema zahtevu 17, pri čemu je pomenuto anti-HCV sredstvo odabrano od: a-interferona ili PEG-a-interferona.

19. Postupak, prema zahtevu 17 ili 18, pri čemu pomenuto drugo anti-HCV sredstvo jeste ribavirin.

20. Postupak, prema zahtevu 17, 18 ili 19, pri čemu je pomenuto drugo anti-HCV sredstvo odabrano od inhibitora: helikaze, NS2/3 proteaze i inernog mesta ulaska u ribozom (IRES).

21. Upotreba jedinjenja formule I, prema bilo kojem od zahteva 1 do 9, za pripremanje leka za lečenje ili prevenciju hepatitis C virusne infekcije.

22. Farmaceutska kompozicija, prema zahtevu 11, 12 ili 13, pri čemu pomenuto drugo anti-HCV sredstvo jeste inhibitor HCV polimeraze.

23. Postupak, prema zahtevu 17, 18 ili 19, pri čemu pomenuto drugo anti-HCV sredstvo jeste inhibitor HCV polimeraze.