RS67188B1 - Ciklični dinukleotidi za lečenje stanja povezanih sa aktivnošću sting kao što je kancer - Google Patents

Description

Opis

OBLAST TEHNIKE

[0001] Predmetna objava se odnosi na hemijske entitete (npr. jedinjenje koje moduliše in vitro (npr. agonizuje) stimulator interferonskih gena (STING - Stimulator of Interferon Genes), ili farmaceutski prihvatljivu so, i/ili hidrat, i/ili kokristal, i/ili kombinaciju leka predmetnog jedinjenja) koji su korisni, npr. za lečenje stanja, bolesti ili poremećaja kod kojih smanjenje ili povećanje aktivnosti STING (npr. smanjenje, npr. stanja, bolesti ili poremećaja povezanog sa potisnutim ili oštećenim STING signaliziranjem) doprinosi patologiji i/ili simptomima i/ili progresiji stanja, bolesti ili poremećaja (npr. kancera) kod subjekta (npr. čoveka). Predmetna objava se takođe odnosi na kompozicije, kao i na druge postupke njihove primene i dobijanja.

STANJE TEHNIKE

[0002] STING, takođe poznat kao transmembranski protein 173 (TMEM173) i MPYS/MITA/ERIS, predstavlja protein koji je kod čoveka kodiran genom TMEM173. Pokazano je da STING ima ulogu u urođenom imunitetu. STING indukuje produkciju interferona tipa I kada su ćelije inficirane intracelularnim patogenima, kao što su virusi, mikobakterije i intracelularni paraziti. Interferon tipa I, posredovan STING-om, štiti inficirane ćelije i okolne ćelije od lokalne infekcije autokrinim i parakrinim putem. STING put predstavlja put koji učestvuje u detekciji citosolne DNK.

[0003] STING signalni put se aktivira cikličnim dinukleotidima (CDN), koji mogu biti proizvedeni od strane bakterija ili proizvedeni od strane ćelija koje prezentuju antigen kao odgovor na detekciju citosolne DNK. Pokazano je da nemodifikovani CDN indukuju interferon tipa I i druge koregulirane gene, koji zauzvrat olakšavaju razvoj specifičnog imunog odgovora (videti, npr., Wu i Sun, et al., Science 2013, 339, 826-830). WO 2015/077354 stavlja na uvid javnosti primenu STING agonista za lečenje kancera. Dokument WO 2014/179335 stavlja na uvid javnosti ciklične dinukleotide koji modulišu aktivnost STING-a.

SAŽETAK

[0004] Predmetni pronalazak odnosi se na predmet definisan patentnim zahtevima.

[0005] Predmetna objava se odnosi na hemijske entitete (npr. jedinjenje koje moduliše (npr. agonizuje) Stimulator interferonskih gena (STING), ili farmaceutski prihvatljiva so, i/ili hidrat, i/ili kokristal, i/ili kombinacija leka predmetnog jedinjenja) koji su korisni, npr. za lečenje stanja, bolesti ili poremećaja kod kojih smanjenje ili povećanje aktivnosti STING-a (npr. smanjenje, tj. stanja, bolesti ili poremećaja povezanog sa potisnutim ili oštećenim STING signaliziranjem) doprinosi patologiji i/ili simptomima i/ili progresiji stanja, bolesti ili poremećaja (npr. kancera) kod subjekta (npr. čoveka). U određenim tehničkim rešenjima, hemijski entiteti ovde stavljeni na uvid javnosti indukuju imuni odgovor kod subjekta (npr. čoveka). U određenim tehničkim rešenjima, hemijski entiteti ovde stavljeni na uvid javnosti indukuju produkciju STING-zavisnog interferona tipa I kod subjekta (npr. čoveka). Predmetna objava se takođe odnosi na kompozicije, kao i na druge postupke njihove primene i dobijanja.

[0006] Sve reference u predmetnom opisu koje se odnose na postupke lečenja odnose se na jedinjenja, farmaceutske kompozicije i lekove predmetnog pronalaska za primenu u postupku lečenja ljudskog tela terapijom.

[0007] „Agonist“ STING-a obuhvata jedinjenja koja, na nivou proteina, direktno vezuju ili modifikuju STING tako da se aktivnost STING-a povećava, npr. aktivacijom, stabilizacijom, izmenjenom distribucijom ili na drugi način.

[0008] Određena jedinjenja ovde stavljena na uvid javnosti, koja agonizuju STING u manjoj meri nego potpuni agonista STING-a, mogu funkcionisati u ogledima i kao antagonisti i kao agonisti. Ta jedinjenja antagonizuju aktivaciju STING-a od strane potpunog agoniste STING-a zato što sprečavaju potpuni efekat interakcije STING-a. Međutim, ta jedinjenja takođe, samostalno, aktiviraju određenu aktivnost STING-a, tipično manju od odgovarajuće količine potpunog agoniste STING-a. Takva jedinjenja se mogu nazivati „delimični agonisti STING-a“.

[0009] U određenim tehničkim rešenjima, jedinjenja ovde stavljena na uvid javnosti su agonisti (npr. potpuni agonisti) STING-a. U drugim tehničkim rešenjima, jedinjenja ovde stavljena na uvid javnosti su delimični agonisti STING-a.

[0010] Uopšteno, receptor postoji u aktivnoj (Ra) i neaktivnoj (Ri) konformaciji. Određena jedinjenja koja deluju na receptor mogu promeniti odnos Ra prema Ri (Ra/Ri). Na primer, potpuni agonist povećava odnos Ra/Ri i može izazvati „maksimalni“, saturirajući efekat. Delimični agonist, kada se veže za receptor, daje odgovor koji je niži od odgovora izazvanog potpunim agonistom (npr. endogenim agonistom). Dakle, Ra/Ri za delimičnog agonistu je manji nego za potpunog agonistu. Međutim, jačina delimičnog agoniste može biti veća ili manja od jačine potpunog agoniste.

[0011] Iako se ne želi da bude vezano za teoriju, smatra se da delimični agonisti STING-a ovde stavljeni na uvid javnosti pružaju prednosti u vezi sa lečenjem poremećaja opisanim u predmetnoj objavi. Na primer, delimični agonisti STING-a ovde opisani pokazuju intrinzične aktivnosti za koje se očekuje da budu istovremeno (i) dovoljno visoke da indukuju antitumorski odgovor (tj. ubiju jednu ili više tumorskih ćelija) i (ii) dovoljno niske da smanje verovatnoću pojave nuspojava povezanih sa toksičnošću. Kao što je gore objašnjeno, delimični agonisti mogu antagonizovati aktivaciju STING-a od strane potpunog agoniste STING-a zato što sprečavaju potpuni efekat interakcije STING-a, čime se smanjuje aktivnost potpunog agoniste STING-a. Smatra se da ovo antagonizovanje takođe može modulirati (npr. smanjiti) profil toksičnosti potpunog agoniste STING-a. Shodno tome, predmetna objava predviđa postupke u kojima se delimični agonisti STING-a opisani ovde kombinuju sa jednim (ili više) potpunim agonistima STING-a (npr. kako je opisano bilo gde u ovoj objavi) radi dobijanja terapijskih kombinacija lekova koje su istovremeno efikasne i imaju relativno nisku toksičnost.

[0012] U jednom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na jedinjenje ili farmaceutski prihvatljivu so istog, koja je izabrana od:

[0013] U jednom aspektu, predmetna objava se odnosi na farmaceutske kompozicije koje sadrže hemijski entitet ovde opisan (npr. jedinjenje opisano generički ili specifično ovde, ili farmaceutski prihvatljivu so istog, ili kompozicije koje sadrže isto) i jedan ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijenasa.

[0014] U jednom aspektu, predmetna objava se odnosi na postupke modulacije (npr. agonizacije) aktivnosti STING-a koji uključuju kontakt STING-a sa hemijskim entitetom ovde opisanim (npr. jedinjenje opisano generički ili specifično ovde, ili farmaceutski prihvatljivu so istog, ili kompozicije koje sadrže isto). Postupci obuhvataju in vitro postupke, npr. kontakt uzorka koji sadrži jednu ili više ćelija sa STING-om (npr. ćelije urođenog imunog sistema, npr. mastociti, makrofagi, dendritične ćelije (DC) i prirodne ćelije ubice) sa hemijskim entitetom. Takav kontakt može, u nekim slučajevima, indukovati imuni odgovor dovoljan da ubije bar jednu od jedne ili više kancerogenih ćelija. Postupci takođe mogu obuhvatati in vivo postupke; npr. administriranje hemijskog entiteta subjektu (npr. čoveku) koji ima bolest kod koje potisnuto ili oštećeno STING signaliziranje doprinosi patologiji i/ili simptomima i/ili progresiji bolesti (npr. kancer; npr. refraktorni kancer).

[0015] U drugom aspektu, predmetna objava se odnosi na postupke lečenja kancera koji uključuju administriranje subjektu kome je potrebno takvo lečenje efektivne količine hemijskog entiteta opisanog ovde (npr. jedinjenje opisano generički ili specifično ovde, ili farmaceutski prihvatljiva so istog, ili kompozicije koje sadrže isto).

[0016] U još jednom aspektu, predmetna objava se odnosi na postupke indukovanja imunog odgovora (npr. urođenog imunog odgovora) kod subjekta kome je to potrebno, koji uključuju administriranje subjektu efektivne količine hemijskog entiteta opisanog ovde (npr. jedinjenje opisano generički ili specifično ovde, ili farmaceutski prihvatljiva so istog, ili kompozicije koje sadrže isto).

[0017] U drugom aspektu, predmetna objava se odnosi na postupke indukovanja STING-zavisne produkcije interferona tipa I kod subjekta kome je to potrebno, koji uključuju administriranje subjektu efektivne količine hemijskog entiteta opisanog ovde (npr. jedinjenje opisano generički ili specifično ovde, ili farmaceutski prihvatljiva so istog, ili kompozicije koje sadrže isto).

[0018] U još jednom aspektu, predmetna objava se odnosi na postupke lečenja bolesti kod koje potisnuto ili oštećeno STING signaliziranje doprinosi patologiji i/ili simptomima i/ili progresiji bolesti, koji uključuju administriranje subjektu kome je takvo lečenje potrebno efektivne količine hemijskog entiteta opisanog ovde (npr. jedinjenje opisano generički ili specifično ovde, ili farmaceutski prihvatljiva so istog, ili kompozicije koje sadrže isto).

[0019] U drugom aspektu, predmetna objava se odnosi na postupke lečenja koji uključuju administriranje subjektu koji ima bolest kod koje potisnuto ili oštećeno STING signaliziranje doprinosi patologiji i/ili simptomima i/ili progresiji bolesti efektivne količine hemijskog entiteta opisanog ovde (npr. jedinjenje opisano generički ili specifično ovde, ili farmaceutski prihvatljiva so istog, ili kompozicije koje sadrže isto).

[0020] U još jednom aspektu, predmetna objava se odnosi na postupke lečenja koji uključuju administriranje subjektu hemijskog entiteta opisanog ovde (npr. jedinjenje opisano generički ili specifično ovde, ili farmaceutski prihvatljiva so istog, ili kompozicije koje sadrže isto), pri čemu se hemijski entitet administrira u količini efektivnoj za lečenje bolesti kod koje potisnuto ili oštećeno STING signaliziranje doprinosi patologiji i/ili simptomima i/ili progresiji bolesti, čime se bolest leči.

[0021] Tehnička rešenja mogu uključivati jednu ili više od sledećih karakteristika.

[0022] Hemijski entitet može biti administriran u kombinaciji sa jednom ili više dodatnih terapija za kancer (npr. hirurška intervencija, radioterapija, hemoterapija, terapija toksinom, imunoterapija, krioterapija ili genska terapija, ili kombinacija istih; npr. hemoterapija koja uključuje administriranje jedne ili više (npr. dve, tri, četiri, pet, šest ili više) dodatnih hemoterapijskih supstanci). Nelimitirajući primeri dodatnih hemoterapijskih agenasa izabrani su od alkilujućih agenasa (npr., cisplatin, karboplatin, mehloretamin, ciklofosfamid, hlorambucil, ifosfamid i/ili oksaliplatin); antimetabolita (npr.,azatioprin i/ili merkaptopurin); terpenoida (npr., vinka alkaloid i/ili taksan; npr., vinkristin, vinblastin, vinorelbin i/ili vindezin taksol, paklitaksel i/ili docetaksel); topoizomeraze (npr., topoizomeraza tipa I i/ili topoizomeraza tipa II; npr., kamptotecini, kao što su irinotekan i/ili topotekan; amsakrin, etopozid, etopozid-fosfat i/ili tenipozid; citotoksični antibiotik (npr. aktinomicin, antraciklini, doksorubicin, daunorubicin, valrubicin, idarubicin, epirubicin, bleomicin, plicamicin i/ili mitomicin); hormon (npr. agonista hormona koji oslobađa luteinizirajući hormon, npr. leuprolidin, goserelin, triptorelin, histrelin, bikalutamid, flutamid i/ili nilutamid); antitelo (npr. abciksimab, adalimumab, alemtuzumab, atlizumab, basiliksimab, belimumab, bevacizumab, bretuksimab vedotin, kanakinumab, cetuksimab, certolizumab pegol, daklizumab, denozumab, ekulizumab, efalizumab, gemtuzumab, golimumab, golimumab, ibritumomab tiuksetan, infliksimab, ipilimumab, muromonab-CD3, natalizumab, ofatumumab, omalizumab, palivizumab, panitumuab, ranibizumab, rituksimab, tocilizumab, tozitumomab i/ili trastuzumab); antiangiogeni agens; citokin; trombotski agens; agens koji inhibira rast; antihelmintski agens; i inhibitor imunološke kontrolne tačke koji cilja receptor imunološke kontrolne tačke odabran iz grupe koja obuhvata CTLA-4, PD-1, PD-L1, PD-1–PD-L1, PD-1–PD-L2, interleukin-2 (IL-2), indolamin 2,3-dioksigenazu (IDO), IL-10, transformišući faktor rasta-β (TGFβ), T ćelijski imunoglobulin i mucin 3 (TIM3 ili HAVCR2), galektin 9–TIM3, fosfatidilserin–TIM3, protein gena za aktivaciju limfocita 3 (LAG3), MHC klase II–LAG3, 4-1BB–4-1BB ligand, OX40–OX40 ligand, GITR, GITR ligand–GITR, CD27, CD70–CD27, TNFRSF25, TNFRSF25–TL1A, CD40L, CD40–CD40 ligand, HVEM–LIGHT–LTA, HVEM, HVEM–BTLA, HVEM–CD160, HVEM–LIGHT, HVEM–BTLA–CD160, CD80, CD80–PDL-1, PDL2–CD80, CD244, CD48–CD244, CD244, ICOS, ICOS–ICOS ligand, B7-H3, B7-H4, VISTA, TMIGD2, HHLA2–TMIGD2, Butirofilini uključujući BTNL2, Siglec porodicu, TIGIT i članove PVR porodice, KIR, ILT i LIR, NKG2D i NKG2A, MICA i MICB, CD244, CD28, CD86–CD28, CD86–CTLA, CD80–CD28, CD39, CD73 Adenozin–CD39–CD73, CXCR4–CXCL12, fosfatidilserin, TIM3, fosfatidilserin–TIM3, SIRPA–CD47, VEGF, neuropilin, CD160, CD30, i CD155 (npr. CTLA-4 ili PD1 ili PD-L1).

[0023] Subjekt može imati kancer; npr. subjekt je prošao i/ili prolazi i/ili će proći jednu ili više terapija za kancer.

[0024] Nelimitirajući primeri kancera uključuju melanom, kancer grlića materice, kancer dojke, kancer jajnika, kancer prostate, kancer testisa, urotelijalni kancer, kancer bešike, nesitnoćelijski kancer pluća, sitnoćelijski kancer pluća, sarkom, adenokarcinom kolorektuma, gastrointestinalne stromalne tumore, gastroezofagealni karcinom, kolorektalni kancer, kancer pankreasa, kancer bubrega, hepatocelularni kancer, maligni mezoteliom, leukemiju, limfom, sindrom mijelodisplazije, multipli mijelom, karcinom tranzicionih ćelija, neuroblastom, neoplazme plazma ćelija, Vilmsov tumor ili hepatocelularni karcinom. U određenim tehničkim rešenjima, kancer može biti refraktorni kancer.

[0025] Hemijski entitet može biti administriran intratumoralno.

[0026] Postupci takođe mogu uključivati identifikaciju subjekta.

[0027] Ostala tehnička rešenja uključuju ona opisana u Detaljnom opisu i/ili u patentnim zahtevima.

Dodatne definicije

[0028] Radi olakšanog razumevanja objave izložene ovde, niz dodatnih termina je definisan u nastavku. Uopšteno, nomenklatura korišćena ovde i laboratorijski postupci u organskoj hemiji, medicinskoj hemiji i farmakologiji opisani ovde su oni koji su dobro poznati i uobičajeno primenjivani u oblasti. Ako nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni termini korišćeni ovde generalno imaju isto značenje kako ga uobičajeno razume prosečan stručnjak u oblasti kojoj ova objava pripada.

[0029] Kao što se koristi ovde, termin „STING“ treba da obuhvati, bez ograničenja, nukleinske kiseline, polinukleotide, oligonukleotide, sens i antisens polinukleotidne lance, komplementarne sekvence, peptide, polipeptide, proteine, homologne i/ili ortologne STING molekule, izoforme, prekursore, mutante, varijante, derivate, splajs varijante, alele, različite vrste i aktivne fragmente istih.

[0030] Termin „prihvatljivo“ u vezi sa formulacijom, kompozicijom ili sastojkom, kako se koristi ovde, znači da nema dugotrajnog štetnog efekta na opšte zdravlje subjekta koji se leči.

[0031] „API“ se odnosi na aktivni farmaceutski sastojak.

[0032] Termini „efikasna količina“ ili „terapijski efikasna količina“, kako se koriste ovde, odnose se na dovoljnu količinu hemijskog entiteta (npr. jedinjenja koje pokazuje aktivnost kao mitohondrijski agensi razdvajanja ili farmaceutski prihvatljivu so i/ili hidrat i/ili kokristal istog; npr. jedinjenje kao što je niklozamid ili farmaceutski prihvatljiva so i/ili hidrat i/ili kokristal istog; npr. jedinjenje kao što je analog niklozamida, ili farmaceutski prihvatljiva so i/ili hidrat i/ili kokristal istog) koje se administrira i koje će u nekoj meri ublažiti jedan ili više simptoma bolesti ili stanja koje se leči. Rezultat uključuje smanjenje i/ili ublažavanje znakova, simptoma ili uzroka bolesti, ili bilo kakvu drugu željenu promenu biološkog sistema. Na primer, „efikasna količina“ za terapijsku primenu predstavlja količinu kompozicije koja sadrži jedinjenje opisano ovde, potrebnu da obezbedi klinički značajno smanjenje simptoma bolesti. Odgovarajuća „efikasna“ količina u svakom pojedinačnom slučaju određuje se korišćenjem bilo koje odgovarajuće tehnike, kao što je studija eskalacije doze.

[0033] Termin „eksipijens“ ili „farmaceutski prihvatljiv eksipijens“ označava farmaceutski prihvatljiv materijal, kompoziciju ili nosač, kao što su tečna ili čvrsta punila, razblaživači, nosači, rastvarači ili materijali za enkapsulaciju. U jednom tehničkom rešenju, svaki sastojak je „farmaceutski prihvatljiv“ u smislu da je kompatibilan sa ostalim sastojcima farmaceutske formulacije i pogodan za upotrebu u kontaktu sa tkivom ili organom ljudi i životinja bez prekomerne toksičnosti, iritacije, alergijske reakcije, imunogenosti ili drugih problema ili komplikacija, u skladu sa razumnim odnosom koristi i rizika. Videti, npr., Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21. izd.; Lippincott Williams & Wilkins: Philadelphia, PA, 2005; Handbook of Pharmaceutical Excipients, 6. izd.; Rowe et al., Eds.; The Pharmaceutical Press and the American Pharmaceutical Association: 2009; Handbook of Pharmaceutical Additives, 3. izd.; Ash and Ash Eds.; Gower Publishing Company: 2007; Pharmaceutical Preformulation and Formulation, 2. izd.; Gibson Ed.; CRC Press LLC: Boca Raton, FL, 2009.

[0034] Termin „farmaceutski prihvatljiva so“ odnosi se na formulaciju jedinjenja koja ne izaziva značajnu iritaciju organizma kome se administrira i ne ukida biološku aktivnost i svojstva jedinjenja. U određenim slučajevima, farmaceutski prihvatljive soli se dobijaju reakcijom jedinjenja opisanog ovde sa kiselinama kao što su hlorovodonična kiselina, bromovodonična kiselina, sumporna kiselina, azotna kiselina, fosforna kiselina, metansulfonska kiselina, etansulfonska kiselina, p-toluensulfonska kiselina, salicilna kiselina i slične. U određenim slučajevima, farmaceutski prihvatljive soli se dobijaju reakcijom jedinjenja koje sadrži kiselinsku grupu opisanu ovde sa bazom radi formiranja soli, kao što su amonijumove soli, soli alkalnih metala, kao što su natrijumove ili kalijumove soli, soli zemnoalkalnih metala, kao što su kalcijumove ili magnezijumove soli, soli organskih baza kao što su dicikloheksilamin, N-metil-D-glukamin, tris(hidroksimetil)metilamin, i soli sa aminokiselinama kao što su arginin, lizin i slične, ili drugim prethodno utvrđenim postupcima. Farmakološki prihvatljiva so nije posebno ograničena sve dok se može koristiti u lekovima. Primeri soli koje jedinjenja opisana ovde formiraju sa bazom uključuju: soli sa neorganskim bazama kao što su natrijum, kalijum, magnezijum, kalcijum i aluminijum; soli sa organskim bazama kao što su metilamin, etilamin i etanolamin; soli sa baznim aminokiselinama kao što su lizin i ornitin; i amonijumove soli. Soli mogu biti soli adicije kiselina, koje su posebno ilustrovane solima adicije kiselina sa sledećim: mineralnim kiselinama kao što su hlorovodonična kiselina, bromovodonična kiselina, jodovodonična kiselina, sumporna kiselina, azotna kiselina i fosforna kiselina; organskim kiselinama kao što su mravlja kiselina, sirćetna kiselina, propionska kiselina, oksalna kiselina, malonska kiselina, sukcinska kiselina, fumarna kiselina, maleinska kiselina, mlečna kiselina, jabučna kiselina, vinska kiselina, limunska kiselina, metansulfonska kiselina i etansulfonska kiselina; i kiselim aminokiselinama kao što su asparaginska kiselina i glutaminska kiselina.

[0035] Termin „farmaceutska kompozicija“ odnosi se na smešu jedinjenja koje je ovde stavljeno na uvid javnosti sa drugim hemijskim komponentama (koje se ovde zajednički nazivaju „ekscipijensi“), kao što su nosači, stabilizatori, razređivači, agensi za disperziju, agensi za suspendovanje i/ili agensi za zgušnjavanje. Farmaceutska kompozicija olakšava administriranje jedinjenja u organizam. U oblasti su poznate brojne tehnike administriranja jedinjenja, uključujući, ali ne ograničavajući se na: rektalno, oralno, intravensko, aerosolno, parenteralno, oftalmološko, pulmonarno i topikalno administriranje.

[0036] Termin „subjekt“ odnosi se na životinju, uključujući, ali ne ograničavajući se na primata (npr. čoveka), majmuna, kravu, svinju, ovcu, kozu, konja, psa, mačku, zeca, pacova ili miša. Termini „subjekt“ i „pacijent“ ovde se koriste naizmenično u odnosu, na primer, na subjekta sisara, kao što je čovek.

[0037] Termini „lečiti“, „lečenje“ i „tretman“, u kontekstu lečenja bolesti ili poremećaja, podrazumevaju ublažavanje ili uklanjanje poremećaja, bolesti ili stanja, ili jednog ili više simptoma povezanih sa poremećajem, bolešću ili stanjem; ili usporavanje progresije, širenja ili pogoršanja bolesti, poremećaja ili stanja ili jednog ili više simptoma istih. „Lečenje kancera“ odnosi se na jedan ili više od sledećih efekata: (1) inhibicija rasta tumora u određenoj meri, uključujući, (i) usporavanje i (ii) potpuno zaustavljanje rasta; (2) redukcija broja tumorskih ćelija; (3) održavanje veličine tumora; (4) redukcija veličine tumora; (5) inhibicija, uključujući (i) redukciju, (ii) usporavanje ili (iii) potpuno sprečavanje, infiltracije tumorskih ćelija u periferne organe; (6) inhibicija, uključujući (i) redukciju, (ii) usporavanje ili (iii) potpuno sprečavanje, metastaziranja; (7) pojačavanje antitumorskog imunskog odgovora, što može rezultovati (i) održavanjem veličine tumora, (ii) redukcijom veličine tumora, (iii) usporavanjem rasta tumora, (iv) redukcijom, usporavanjem ili sprečavanjem invazije i/ili (8) ublažavanje, u određenoj meri, težine ili broja jednog ili više simptoma povezanih sa poremećajem.

[0038] Pored toga, atomi koji čine jedinjenja predmetnih tehničkih rešenja namenjeni su da obuhvate sve izotopske oblike takvih atoma. Izotopi, kako se ovde koriste, uključuju one atome koji imaju isti atomski broj, ali različite masene brojeve. Kao opšti primer, bez ograničenja, izotopi vodonika uključuju tricijum i deuterijum, a izotopi ugljenika uključuju<13>C i<14>C.

DETALJAN OPIS

[0039] Predmetna objava obuhvata hemijske entitete (npr. jedinjenje koje moduliše (npr. agonizuje) stimulator gena interferona (STING), ili farmaceutski prihvatljivu so, i/ili hidrat, i/ili kokristal, i/ili kombinaciju lekova jedinjenja) koji su korisni, npr. za lečenje stanja, bolesti ili poremećaja u kojima smanjenje ili povećanje aktivnosti STING-a (npr. smanjenje, npr. stanje, bolest ili poremećaj povezan sa potisnutim ili oštećenim STING signaliziranjem) doprinosi patologiji i/ili simptomima i/ili progresiji stanja, bolesti ili poremećaja (npr. kancer) kod subjekta (npr. čoveka). U izvesnim tehničkim rešenjima, hemijski entiteti ovde stavljeni na uvid javnosti indukuju imunski odgovor kod subjekta (npr. čoveka). U izvesnim tehničkim rešenjima, hemijski entiteti ovde stavljeni na uvid javnosti indukuju STING-zavisnu produkciju interferona tipa I kod subjekta (npr. čoveka). Predmetna objava takođe obuhvata kompozicije, kao i druge postupke njihove primene i izrade.

Farmaceutske kompozicije i administracija

Uopšteno

[0040] U nekim tehničkim rešenjima, hemijski entitet (npr. jedinjenje koje moduliše (npr. agonizuje) STING, ili farmaceutski prihvatljivu so, i/ili hidrat, i/ili kokristal, i/ili kombinaciju lekova istog) administrira se kao farmaceutska kompozicija koja obuhvata hemijski entitet i jedan ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijenata, i po izboru jedan ili više dodatnih terapijskih agenasa kako je ovde opisano.

[0041] U nekim tehničkim rešenjima, hemijski entiteti mogu se administrirati u kombinaciji sa jednim ili više konvencionalnih farmaceutskih ekscipijenata. Farmaceutski prihvatljivi ekscipijenti uključuju, ali nisu ograničeni na, jonske izmenjivače, aluminijum-oksid, aluminijum-stearat, lecitin, sisteme za samosuspenziju lekova (SEDDS - self-emulsifying drug delivery systems) kao što je d-α-tokoferol polietilen glikol 1000 sukcinat, surfaktante koji se koriste u farmaceutskim dozama, kao što su Tween, poloksameri ili druge slične polimerske matrice za isporuku, serumske proteine, kao što je ljudski serum albumin, pufer supstance kao što su fosfati, tris, glicin, sorbinska kiselina, kalijum-sorbat, mešavine delimičnih glicerida zasićenih biljnim masnim kiselinama, vodu, soli ili elektrolite, kao što su protaminsulfat, dinatrijum-hidrogen-fosfat, kalijum-hidrogenfosfat, natrijum-hlorid, cinkove soli, koloidnu siliku, magnezijum-trisilikat, polivinil-pirolidon, supstance zasnovane na celulozi, polietilen glikol, natrijum-karboksimetil-celulozu, poliakrilate, voskove, polietilen-polioksipropilen-blok polimere i vunenu mast. Ciklodekstrini kao što su α-, βi γ-ciklodekstrin, ili hemijski modifikovani derivati kao što su hidroksialkil-ciklodekstrini, uključujući 2- i 3-hidroksipropil-β-ciklodekstrine, ili drugi rastvorljivi derivati takođe se mogu koristiti za poboljšanje isporuke jedinjenja opisanih ovde. Dozne forme ili kompozicije koje sadrže hemijski entitet kako je ovde opisano u rasponu od 0,005% do 100%, sa ostatkom sastava od netoksičnog ekscipijenta, mogu se pripremiti. Predviđene kompozicije mogu sadržati 0,001%-100% hemijskog entiteta ovde datog, u jednom tehničkom rešenju 0,1-95%, u drugom tehničkom rešenju 75-85%, u daljem tehničkom rešenju 20-80%. Stvarni postupci pripreme takvih doza su poznati, ili će biti očigledni, prosečnom stručnjaku u oblasti; na primer, videti Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22. izdanje (Pharmaceutical Press, London, UK.2012).

Putevi administracije i komponente kompozicije

[0042] U nekim tehničkim rešenjima, hemijski entiteti opisani ovde ili farmaceutska kompozicija istih mogu se administrirati subjektu kojem je potrebna primenom bilo kojeg prihvatljivog puta administracije. Prihvatljivi putevi administracije uključuju, ali nisu ograničeni na, bukalni, kožni, endocervikalni, endosinusni, endotrahealni, enteralni, epiduralni, intersticijalni, intraabdominalni, intraarterijski, intrabronhijalni, intrabursalni, intracerebralni, intracisternalni, intrakoronarni, intradermalni, intraduktalni, intraduodenalni, intraduralni, intraepidermalni, intraezofagealni, intragastrični, intragingivalni, intrailealni, intralimfatični, intramedularni, intrameningealni, intramuskularni, intraovarični, intraperitonealni, intraprostatni, intrapulmonarni, intrasinalni, intraspinalni, intrasinovijalni, intratestikularni, intratekalni, intratubularni, intratumorski, intrauterini, intravaskularni, intravenski, nazalni, nazogastrični, oralni, parenteralni, perkutani, periduralni, rektalni, respiratorni (inhalacioni), subkutani, sublingvalni, submukozni, topikalni, transdermalni, transmukozni, transtrahealni, ureteralni, uretralni i vaginalni. U izvesnim tehničkim rešenjima, poželjni put administracije je parenteralni (npr. intratumorski).

[0043] Kompozicije se mogu formulisati za parenteralnu primenu, npr. formulisane za injekciju putem intravenskog, intramuskularnog, subkutanog, pa čak i intraperitonealnog puta. Tipično, takve kompozicije mogu se pripremiti kao injekcione, bilo kao tečna rastvora ili suspenzije; takođe se mogu pripremiti čvrste forme pogodne za pripremu rastvora ili suspenzija dodavanjem tečnosti neposredno pre injekcije; pripreme se takođe mogu emulgovati. Priprema takvih formulacija biće poznata prosečnom stručnjaku u oblasti u svetlu predmetne objave.

[0044] Farmaceutski oblici pogodni za injekcionu primenu uključuju sterilne vodenaste rastvore ili disperzije; formulacije koje sadrže susamovo ulje, kikiriki ulje ili vodeni rastvor propilen glikola; i sterilne praškove za ekstemporalnu pripremu sterilnih injekcionih rastvora ili disperzija. U svim slučajevima forma mora biti sterilna i dovoljno tečna da se može lako injektirati. Takođe, treba da bude stabilna pod uslovima proizvodnje i skladištenja i mora biti zaštićena od kontaminacije mikroorganizmima, kao što su bakterije i gljive.

[0045] Nosač takođe može biti rastvarač ili disperzioni medijum koji sadrži, na primer, vodu, alkohol, poliol (npr. glicerol, propilen-glikol i tečni polietilen-glikol, i slično), odgovarajuće smeše istih i biljna ulja. Pravilna tečnost može se održavati, na primer, upotrebom obloga, kao što je lecitin, održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju disperzije i upotrebom surfaktanata. Sprečavanje dejstva mikroorganizama može se postići raznim antibakterijskim i antifungalnim sredstvima, na primer, parabenima, hlorobutanolom, fenolom, sorbinskom kiselinom, timerosalom i slično. U mnogim slučajevima, poželjno je uključiti izotonske agense, na primer, šećere ili natrijum hlorid. Produženo apsorbovanje injekcionih kompozicija može se postići upotrebom agenasa koji odlažu apsorpciju u kompozicijama, na primer, aluminijum monostearata i želatina.

[0046] Sterilni injekcioni rastvori pripremaju se inkorporacijom aktivnih jedinjenja u potrebnoj količini u odgovarajući rastvarač sa raznim drugim sastojcima navedenim gore, po potrebi, nakon čega sledi filtrirana sterilizacija. Generalno, disperzije se pripremaju inkorporacijom različitih sterilisanih aktivnih sastojaka u sterilni nosač koji sadrži osnovni disperzioni medijum i potrebne druge sastojke iz gore navedenih. U slučaju sterilnih praškova za pripremu sterilnih injekcionih rastvora, poželjni postupci pripreme su vakuum-sušanje i liofilizacija, koji daju prah aktivnog jedinjenja, plus bilo koji dodatni željeni sastojak iz prethodno sterilno filtriranog rastvora.

[0047] Intratumorske injekcije se razmatraju npr., u Lammers, et al., "Effect of Intratumoral Injection on the Biodistribution and the Therapeutic Potential of HPMA Copolymer-Based Drug Delivery Systems" Neoplasia.2006, 10, 788-795.

[0048] Farmakološki prihvatljivi ekscipijenti koji se mogu koristiti u rektalnoj kompoziciji kao gel, krema, klistir ili rektalna supozitorija uključuju, bez ograničenja, jedan ili više od sledećih: gliceridi kakao putera, sintetički polimeri kao što je polivinilpirolidon, PEG (npr. PEG masti), glicerol, glicerinski želatin, hidrogenizovana biljna ulja, poloksameri, mešavine polietilen glikola različitih molekulskih masa i esteri masnih kiselina polietilen glikola, vazelin, bezvodni lanolin, ulje iz jetre ajkule, natrijum saharinat, mentol, ulje slatkog badema, sorbitol, natrijum benzoat, anoxid SBN, esencijalno ulje vanile, aerosol, parabeni u fenoksietanolu, natrijum metil pokzibenzoat, natrijum propil p-okzibenzoat, dietilamin, karbomeri, karbopol, metil okzibenzoat, makrogol cetostearil etar, kokoil kaprilokaprat, izopropil alkohol, propilen glikol, tečni parafin, ksantan guma, karboksimetabisulfit, natrijum edetat, natrijum benzoat, kalijum metabisulfit, ekstrakt semenki grejpfruta, metilsulfonilmetan (MSM), mlečna kiselina, glicin, vitamini, kao što su vitamin A i E i kalijum acetat.

[0049] U izvesnim tehničkim rešenjima, supozitorije se mogu pripremiti mešanjem hemijskih entiteta opisanim ovde sa odgovarajućim neiritirajućim ekscijentima ili nosačima, kao što su kakao puter, polietilen-glikol ili supozitorijumski vosak, koji su čvrsti na sobnoj temperaturi, ali tečni na telesnoj temperaturi i stoga se tope u rektumu i oslobađaju aktivno jedinjenje. U drugim tehničkim rešenjima, kompozicije za rektalnu primenu su u obliku klistira.

[0050] U drugim tehničkim rešenjima, jedinjenja opisana ovde ili farmaceutska kompozicija istih su pogodne za lokalnu primenu u digestivnom ili GI traktu putem oralne primene (npr. čvrste ili tečne dozne forme).

[0051] Čvrste dozne forme za oralnu primenu uključuju kapsule, tablete, pilule, praškove i granule. U takvim čvrstim dozama, hemijski entitet se meša sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih ekscijenata, kao što su natrijum citrat ili dikalcijum fosfat i/ili: a) punila ili ekstenzori, kao što su skrobovi, laktoza, saharoza, glukoza, manitol i silicijum-dioksid, b) veziva, kao što su, na primer, karboksimetilceluloza, alginati, želatin, polivinilpirrolidon, saharoza i akacija,c) vlaživači, kao što je glicerol, d) sredstva za razdvajanje, kao što su agar-agar, kalcijum karbonat, krompirni ili tapioka skrob, alginska kiselina, određeni silikati i natrijum-karbonat, e) sredstva za usporavanje rastvora, kao što je parafin, f) akceleratori apsorpcije, kao što su kvarterni amonijumski spojevi, g) sredstva za vlaženje, kao što su, na primer, cetil alkohol i glicerol monostearat, h) apsorbenti, kao što su kaolin i bentonit glina, i i) lubrikanti, kao što su talk, kalcijum stearat, magnezijum stearat, čvrsti polietilen glikoli, natrijum lauril sulfat i njihove smeše.U slučaju kapsula, tableta i pilula, doza može takođe sadržati pufer agense. Čvrste kompozicije sličnog tipa mogu se koristiti i kao punila u mekim i tvrdim želatinskim kapsulama koristeći ekscijense kao što su laktoza ili mlečni šećer, kao i polietilen glikoli velike molekulske mase i slično.

[0052] U jednom tehničkom rešenju, kompozicije će imati oblik jedinične doze, kao što je pilula ili tableta, te kompozicija može sadržati, pored hemijskog entiteta ovde datog, razređivač, kao što su laktoza, saharoza, dikalcijum fosfat ili slično; lubrikant, kao što je magnezijum stearat ili slično; i vezivo, kao što su skrob, guma akacija, polivinilpirolidon, želatin, celuloza, derivati celuloze ili slično. U drugoj čvrstoj dozi, prah, granule, rastvor ili suspenzija (npr. u propilen karbonatu, biljnim uljima, PEG-ovima, poloksameru 124 ili trigliceridima) enkapsulirani su u kapsulu (želatinska ili kapsula na bazi celuloze). Takođe se predviđaju jedinične doze u kojima su jedan ili više hemijskih entiteta ovde datih ili dodatni aktivni agensi fizički odvojeni; npr. kapsule sa granulama (ili tablete u kapsuli) svakog leka; dvoslojne tablete; kapsule sa dve komore, itd. Takođe su predviđene oralne doze sa enteričkim premazom ili odloženim oslobađanjem.

[0053] Ostala fiziološki prihvatljiva jedinjenja uključuju sredstva za vlaženje, emulgujuća sredstva, disperzione agense ili konzervanse koji su posebno korisni za sprečavanje rasta ili dejstva mikroorganizama. Razni konzervansi su dobro poznati i uključuju, na primer, fenol i askorbinsku kiselinu.

[0054] U izvesnim tehničkim rešenjima, ekscipijensi su sterilni i generalno bez nepoželjnih supstanca. Ove kompozicije mogu se sterilizovati konvencionalnim, dobro poznatim tehnikama sterilizacije. Za različite ekscipijente oralnih doza, kao što su tablete i kapsule, sterilnost nije obavezna. Standard USP/NF obično je dovoljan.

[0055] U izvesnim tehničkim rešenjima, čvrste oralne doze mogu dodatno sadržati jedan ili više sastojaka koji hemijski i/ili strukturno predisponiraju kompoziciju za isporuku hemijskog entiteta u želudac ili donji GI trakt; npr. uzlazni kolon i/ili transverzalni kolon i/ili distalni kolon i/ili tanko crevo. Primeri tehnika formulacije opisani su, npr., u., Filipski, K.J., et al., Current Topics in Medicinal Chemistry, 2013, 13, 776-802.

[0056] Primeri uključuju tehnike ciljanog delovanja na gornji GI trakt, npr. Accordion Pill (Intec Pharma), plutajuće kapsule i supstancale sposobne da se prilepe za mukozne zidove.

[0057] Drugi primeri uključuju tehnike ciljanog delovanja na donji GI trakt. Za ciljanje različitih regija u intestinalnom traktu, dostupno je nekoliko enteričkih/pH-reaktivnih premaza i ekscijenata. Ovi supstancali su tipično polimeri dizajnirani da se rastvaraju ili erodiraju u specifičnim pH opsezima, izabranim u zavisnosti od regije GI trakta u kojoj se želi oslobađanje leka. Ovi supstancali takođe funkcionišu da zaštite lekove osetljive na kiseline od želudačne tečnosti ili da ograniče izlaganje u slučajevima kada aktivni sastojak može iritirati gornji GI trakt (npr. serije hidroksipropil metilceluloza ftalata, Coateric (polivinil acetat ftalat), acetat celuloze ftalat, hidroksipropil metilceluloza acetat sukcinat, serije Eudragit (kopolimeri metakrilne kiseline i metil metakrilata), i Marcoat). Druge tehnike uključuju doze koje reaguju na lokalnu floru u GI traktu, kapsule za isporuku u kolon kontrolisanu pritiskom i Pulsincap.

[0058] Očne kompozicije mogu uključivati, bez ograničenja, jedan ili više od sledećih sastojaka: viskogenе (npr. karboksimetilceluloza, glicerol, polivinilpirolidon, polietilen glikol); stabilizatore (npr. Pluronic (triblok kopolimeri), ciklodekstrini); konzervanse (npr. benzalkonijum hlorid, EDTA, SofZia (borna kiselina, propilen glikol, sorbitol i cink hlorid; Alcon Laboratories, Inc.), purit (stabilizovani oksihloro kompleks; Allergan, Inc.)).

[0059] Topikalne kompozicije mogu uključivati masti i kreme. Masti su polučvrste pripreme koje su tipično bazirane na vazelinu ili drugim derivatima nafte. Kreme koje sadrže odabrani aktivni agens su tipično viskozne tečne ili polučvrste emulzije, često ulje-u-vodi ili voda-u-ulju. Baze krema su obično perive vodom i sadrže uljanu fazu, emulgator i vodenastu fazu. Uljana faza, koja se ponekad naziva i „unutrašnja“ faza, obično se sastoji od vazelina i masnog alkohola, kao što su cetil ili stearil alkohol; vodenasta faza obično, iako ne nužno, premašuje uljanu fazu u zapremini i generalno sadrži ovlaživač. Emulgator u formulaciji kreme je obično nejonski, anjonski, katjonski ili amfoterni surfaktant. Kao i kod drugih nosača ili medijuma, baza masti treba da bude inertna, stabilna, neiritirajuća i nesenzibilizujuća.

[0060] U bilo kojem od prethodnih tehničkih rešenja, farmaceutske kompozicije opisane ovde mogu uključivati jedan ili više od: lipidi, međuslojno umrežene višelamelarne vezikule, biorazgradive nanočestice ili mikročestice na bazi poli(D,L-mlečna-ko-glikolna kiselina) [PLGA] ili polianhidrida, i lipidne dvoslojeve podržane nanoporoznim česticama.

Doziranje

[0061] Doze se mogu menjati u zavisnosti od potreba pacijenta, težine stanja koje se leči i konkretno korišćenog jedinjenja. Određivanje odgovarajuće doze za određenu situaciju može izvršiti prosečan stručnjak u medicinskoj oblasti. Ukupna dnevna doza može se podeliti i primenjivati u delovima tokom dana ili putem sredstava koja omogućavaju kontinuiranu isporuku.

[0062] U nekim tehničkim rešenjima, jedinjenja opisana ovde se primenjuju u dozi od oko 0.001 mg/kg do oko 500 mg/kg (npr. od oko 0.001 mg/kg do oko 200 mg/kg; od oko 0.01 mg/kg do oko 200 mg/kg; od oko 0.01 mg/kg do oko 150 mg/kg; od oko 0.01 mg/kg do oko 100 mg/kg; od oko 0.01 mg/kg do oko 50 mg/kg; od oko 0.01 mg/kg do oko 10 mg/kg; od oko 0.01 mg/kg do oko 5 mg/kg; od oko 0.01 mg/kg do oko 1 mg/kg; od oko 0.01 mg/kg do oko 0.5 mg/kg; od oko 0.01 mg/kg do oko 0.1 mg/kg; od oko 0.1 mg/kg do oko 200 mg/kg; od oko 0.1 mg/kg do oko 150 mg/kg; od oko 0.1 mg/kg do oko 100 mg/kg; od oko 0.1 mg/kg do oko 50 mg/kg; od oko 0.1 mg/kg do oko 10 mg/kg; od oko 0.1 mg/kg do oko 5 mg/kg; od oko 0.1 mg/kg do oko 1 mg/kg; od oko 0.1 mg/kg do oko 0.5 mg/kg).

Režimi

[0063] Prethodno navedene doze mogu se primenjivati na dnevnoj bazi (npr. kao jedna doza ili u dve ili više podeljenih doza) ili na nedeljnoj/baznoj bazi (npr. svaki drugi dan, svakih dva dana, svakih tri dana, jednom nedeljno, dva puta nedeljno, jednom na dve nedelje, jednom mesečno).

[0064] U nekim tehničkim rešenjima, period primene jedinjenja opisanog ovde može biti 1 dan, 2 dana, 3 dana, 4 dana, 5 dana, 6 dana, 7 dana, 8 dana, 9 dana, 10 dana, 11 dana, 12 dana, 13 dana, 14 dana, 3 nedelje, 4 nedelje, 5 nedelja, 6 nedelja, 7 nedelja, 8 nedelja, 9 nedelja, 10 nedelja, 11 nedelja, 12 nedelja, 4 meseca, 5 meseci, 6 meseci, 7 meseci, 8 meseci, 9 meseci, 10 meseci, 11 meseci, 12 meseci ili više.U daljem tehničkom rešenju, period u kojem je primena zaustavljena može biti 1 dan, 2 dana, 3 dana, 4 dana, 5 dana, 6 dana, 7 dana, 8 dana, 9 dana, 10 dana, 11 dana, 12 dana, 13 dana, 14 dana, 3 nedelje, 4 nedelje, 5 nedelja, 6 nedelja, 7 nedelja, 8 nedelja, 9 nedelja, 10 nedelja, 11 nedelja, 12 nedelja, 4 meseca, 5 meseci, 6 meseci, 7 meseci, 8 meseci, 9 meseci, 10 meseci, 11 meseci, 12 meseci ili više.U jednom tehničkom rešenju, terapijsko jedinjenje se primenjuje na određeni period, nakon čega sledi poseban period bez primene.U drugom tehničkom rešenju, terapijsko jedinjenje se primenjuje tokom prvog perioda, a tokom drugog perioda, koji sledi nakon prvog, primena je zaustavljena, nakon čega sledi treći period u kojem se primena jedinjenja ponovo započinje, a zatim četvrti period koji sledi nakon trećeg, kada je primena opet zaustavljena.U jednom aspektu ovog tehničkog rešenja, period primene terapijskog jedinjenja, praćen periodom bez primene, može se ponavljati tokom određenog ili neodređenog vremenskog perioda.U daljem tehničkom rešenju, period primene može biti 1 dan, 2 dana, 3 dana, 4 dana, 5 dana, 6 dana, 7 dana, 8 dana, 9 dana, 10 dana, 11 dana, 12 dana, 13 dana, 14 dana, 3 nedelje, 4 nedelje, 5 nedelja, 6 nedelja, 7 nedelja, 8 nedelja, 9 nedelja, 10 nedelja, 11 nedelja, 12 nedelja, 4 meseca, 5 meseci, 6 meseci, 7 meseci, 8 meseci, 9 meseci, 10 meseci, 11 meseci, 12 meseci ili više.U daljem tehničkom rešenju, period u kojem je primena zaustavljena može biti 1 dan, 2 dana, 3 dana, 4 dana, 5 dana, 6 dana, 7 dana, 8 dana, 9 dana, 10 dana, 11 dana, 12 dana, 13 dana, 14 dana, 3 nedelje, 4 nedelje, 5 nedelja, 6 nedelja, 7 nedelja, 8 nedelja, 9 nedelja, 10 nedelja, 11 nedelja, 12 nedelja, 4 meseca, 5 meseci, 6 meseci, 7 meseci, 8 meseci, 9 meseci, 10 meseci, 11 meseci, 12 meseci ili više.

Postupci lečenja

[0065] U nekim tehničkim rešenjima, obezbeđeni su postupci lečenja subjekta koji ima stanje, bolest ili poremećaj u kojem smanjenje ili povećanje aktivnosti STING-a (npr. smanjenje, npr. potisnuto ili oštećeno STING signaliziranje) doprinosi patologiji i/ili simptomima i/ili progresiji stanja, bolesti ili poremećaja (npr. imunološki poremećaji, kancer). U određenim tehničkim rešenjima, hemijski entiteti opisani ovde indukuju imuni odgovor kod subjekta (npr. čoveka). U određenim tehničkim rešenjima, hemijski entiteti opisani ovde indukuju STING-zavisnu proizvodnju tipa I interferona kod subjekta (npr. čoveka).

Indikacije

[0066] U nekim tehničkim rešenjima, stanje, bolest ili poremećaj je kancer. Navedeni primeri kancera, bez ograničenja, uključuju melanom, kancer, limfom, blastom, sarkom i leukemiju ili limfoidne maligne bolesti. Posebniji primeri takvih kancera uključuju kancer dojke, kancer debelog creva, kancer rektuma, kolorektalni kancer, kancer bubrega ili renalni kancer, kancer bistrih ćelija, kancer pluća uključujući sitnoćelijski kancer pluća, nesitnoćelijski kancer pluća, adenokarcinom pluća i skvamozni kancer pluća, kancer skvamoznih ćelija (npr. kancer epitelnih skvamoznih ćelija), kancer grlića materice, kancer jajnika, kancer prostate, neoplaze prostate, kancer jetre, kancer bešike, kancer peritoneuma, hepatocelularni kancer, kancer želuca ili stomačni kancer uključujući gastrointestinalni kancer, gastrointestinalni stromalni tumor, kancer pankreasa, kancer glave i vrata, glioblastom, retinoblastom, astrocitom, tekome, arrenoblastome, hepatom, hematološke maligne bolesti uključujući ne-Hočkinov limfom (NHL), multipli mijelom, mijelodisplastične poremećaje, mijeloproliferativne poremećaje, hroničnu mijelogenu leukemiju i akutne hematološke maligne bolesti, karcinom endometrijuma ili materice, endometriozu, stromalni sarkom endometrijuma, fibrosarkome, horiokarcinom, kancer kancer štitne žlezde žlezda, vulvalni kancer, kancer štitne žlezde, karcinome jednjaka, hepatocelularni karcinom, analni karcinom, karcinom penisa, nazofaringealni karcinom, larinksni karcinomi, Kapošijev sarkom, sarkom mastocita, sarkom jajnika, sarkom materice, melanom, maligni mezoteliom, karcinome kože, švanom, oligodendrogliom, neuroblastome, neuroektodermalni tumor, rabdomiosarkom, osteogeni sarkom, leiomiosarkomi, Juingov sarkom, periferni primitivni neuroektodermalni tumor, karcinome urinarnog trakta, karcinome šitne žlezde, Vilmsov tumor, kao i abnormalnu vaskularnu proliferaciju povezanu sa fakomatozama, edemom (kao što je edem povezan sa tumorima mozga) i Meigsovim sindromom.

[0067] U nekim tehničkim rešenjima, stanje, bolest ili poremećaj je neurološki poremećaj, koji uključuje poremećaje koji obuhvataju centralni nervni sistem (mozak, moždano stablo i mali mozak), periferni nervni sistem (uključujući moždane nerve), i autonomni nervni sistem (čiji se delovi nalaze i u centralnom i u perifernom nervnom sistemu). Nelimitirajući primeri kancera uključuju stečenu epileptiformnu afaziju; akutni diseminovani encefalomijelitis; adrenoleukodistrofiju; degeneraciju makule povezanu sa starenjem; ageneziju corpus callosum-a; agnoziju; Aikardijev sindrom; Aleksanderovu bolest; Alpersovu bolest; naizmeničnu hemiplegiju; Alchajmerovu bolest; vaskularnu demenciju; amiotrofičnu lateralnu sklerozu; anencefaliju; Angelmanov sindrom; angiomatózu; anoksiju; afaziju; apraksiju; arahnoidne ciste; arahnoiditis; Anronld-Kjarijevu malformaciju; arteriovensku malformaciju; Aspergerov sindrom; ataksiju telangiektaziju; poremećaj pažnje sa hiperaktivnošću; autizam; disfunkciju autonomnog nervnog sistema; bol u leđima; Batenovu bolest; Behčetovu bolest; Belovu paralizu; benigni esencijalni blefarospazam; benigni fokal; amiotrofiju; benignu intrakranijalnu hipertenziju; Binsvangerovu bolest; blefarospazam; Bloch Sulzberger-ov sindrom; povredu brahijalnog pleksusa; apsces mozga; povredu mozga; tumore mozga (uključujući glioblastoma multiforme); tumor kičmene moždine; Brown- Sequard-ov sindrom; Kanavanovu bolest; sindrom karpalnog tunela; kauzalgiju; sindrom centralnog bola; centralnu pontinu mijelinolizu; cefalični poremećaj; cerebralnu aneurizmu; cerebralnu arteriosklerozu; cerebralnu atrofiju; cerebralni gigantizam; cerebralnu paralizu; Šarko-Mari-Tutovu bolest; neuropatiju i neuropatski bol izazvan hemioterapijom; Kiari malformaciju; horeju; hroničnu inflamatornu demijelinizacionu polineuropatiju; hronični bol; sindrom hroničnog regionalnog bola; Kofin-Louri sindrom; komu, uključujući trajno vegetativno stanje; kongenitalnu facijalnu diplegiju; kortikobazalnu degeneraciju; kranijalni arteritis; kraniosinostozu; Krojcfeldt-Jakobovu bolest; poremećaje kumulativne traume; Kušingov sindrom; bolest citomegalnih inkluzionih tela; infekciju citomegalovirusom; sindrom „plešuće oči–plešuća stopala“; Dandi-Vokerov sindrom; Daunov bolest; De Morsier-ov sindrom; Dežerin-Klumke paralizu; demenciju; dermatomiozitis; dijabetesnu neuropatiju; difuznu sklerozu; disautonomiju; disgrafiju; disleksiju; distonije; ranu infantilnu epileptičnu encefalopatiju; sindrom prazne sella-e; encefalitis; encefalokele; encefalotrigeminalnu angiomatózu; epilepsiju; Erbovu paralizu; esencijalni tremor; Fabrijevu bolest; Farov sindrom; nesvesticu; porodičnu spastičnu paralizu; febrilne konvulzije; Fišerov sindrom; Fridrajhovu ataksiju; frontotemporalnu demenciju i druge „tauopatije“; Gošeovu bolest; Gerstmanov sindrom; gigantoćelijski arteritis; gigantoćelijsku inkluzionu bolest; globoidnu ćelijsku leukodistrofiju; Gijen-Bareov sindrom; HTLV-1 asocirana mijelopatija; Halervorden-Spatzovu bolest; povreda glave; glavobolja; hemifacijalni spazam; nasledna spastična paraplegija; heredopatija ataktika polineuritiformis; herpes zoster otikus; herpes zoster; Hirajama sindrom; demencija i neuropatija povezane sa HIV-om (uključujući i neurološke manifestacije AIDS-a); holoprozencefalija; Huntingtonova bolest i druge bolesti sa poliglutaminskim ponavljanjima; hidranencefalija; hidrocefalus; hiperkortizolizam; hipoksija; imunomediirana encefalomijelitis; inkluzivni mijozitis; inkontinencija pigmenti; infantilna bolest skladištenja fitanske kiseline; infantilna Refsumova bolest; infantilni spazmi; inflamatorna mijopatija; intrakranijalna cista; intrakranijalna hipertenzija; Joubertov sindrom; Kearns-Sayreov sindrom; Kenedijeva bolest; Kinsbournov sindrom; Klippel-Feilov sindrom; Krabeova bolest; Kugelberg-Welander-ova bolest; kuru; Lafora bolest; Lambert-Itonov mijastenični sindrom; Landau-Kleffnerov sindrom; lateralni medularni (Wallenberg) sindrom; poremećaji učenja; Leighova bolest; Lenoks-Gastoov sindrom; Lesch-Nyhanov sindrom; leukodistrofija; demencija sa Levijevim telima; lissencefalija; sindrom zaobljenosti u sopstvenom telu (locked-in sindrom); Lou Gehrigova bolest (tj. bolest motornih neurona ili amiotrofna lateralna skleroza); bolest lumbalnog diska; Lajmska bolest - neurološke posledice; Machado-Josephova bolest; makroencefalija; megalencefalija; Melkersson-Rosenthalov sindrom; Menierova bolest; meningitis; Menkesova bolest; metahromna leukodistrofija; mikrocefalija; migrena; Miler-Fišerov sindrom; mini-udarci; mitohondrijske mijopatije; Mobiusov sindrom; monomelična amiotrofija. bolest motornih neurona; Mojamojska bolest; mukopolisaharidoze; demencija usled više infarkta; multifokalna motorna neuropatija; multipla skleroza i drugi demijelinizirajući poremećaji; multipla sistemska atrofija sa posturalnom hipotenzijom; p mišićna distrofija; miastenija gravis; mijelinoklastična difuzna skleroza; mioklonična encefalopatija kod odojčadi; mioklonus; mijopatija; kongenitalna miotonija; narkolepsija; neurofibromatoza; neuroleptični maligni sindrom; neurološke manifestacije AIDS-a; neurološke posledice lupusa; neuromijotonija; neuronska ceroid lipofuscinoza; poremećaji migracije neurona; Niman-Pikova bolest; O'Sullivan-McLeodov sindrom; okcipitalna neuralgija; skriveni spinalni disrafizam; Ohtahara sindrom; olivopontocerebelarna atrofija; opsoklon-mioklonus; optički neuritis; ortostatska hipotenzija; sindrom prekomerne upotrebe; parestezija; Parkinsonova bolest; paramijotonija kongenitalis; paraneoplazijske bolesti; paroksizmalni napadi; Parry-Rombergov sindrom; Pelizaeus-Merzbacherova bolest; periodične paralize; periferna neuropatija; bolna neuropatija i neuropatski bol; persistentno vegetativno stanje; pervazivni razvojni poremećaji; fotogeni kijav refleks; bolest skladištenja fitanske kiseline; Pikova bolest; uvučeni nerv; tumori hipofize; polimijozitis; porencefalija; post-polio sindrom; postherpetična neuralgija; postinfektivna encefalomijelitis; posturalna hipotenzija; Prader-Vijijev sindrom; primarna lateralna skleroza; prionske bolesti; progresivna hemifacijalna atrofija; progresivna multifokalna leukencefalopatija; progresivna sklerozirajuća poliodistrofija; progresivna supranuklearna paraliza; pseudotumor cerebri; Ramsay-Huntov sindrom (tip I i II); Rasmusenov encefalitis; refleksni simpatički distrofijski sindrom; Refsumova bolest; poremećaji ponovljenih pokreta; povrede izazvane ponovljenim stresom; sindrom nemirnih nogu; mijelopatija povezana sa retrovirusom; Retov sindrom; Rejev sindrom; Saint Vitus dance poremećaj; Sandhofova bolest; Šilderova bolest; šizencefalija; septooptička displazija; sindrom protrešenog deteta; herpes zoster; Shy-Dragerov sindrom; Sjogrenov sindrom; apneja u snu; Soto sindrom; spastičnost; spina bifida; povreda kičmene moždine; tumori kičmene moždine; spinalna mišićna atrofija; Stif-Personov sindrom; moždani udar; Stardž-Veberov sindrom; subakutni sklerozirajući panencefalitis; subkortikalna arteriosklerotska encefalopatija; Sidenhamova horeja; sinkopa; siringomijelija; tardivna diskinezija; Tej-Saksova bolest; temporalni arteritis; sindrom vezane kičmene moždine; Tomsenova bolest; sindrom torakalnog otvora; Tic Douloureux; Todova paraliza; Turetov sindrom; tranzitorni ishemijski napad; prenosive spongiformne encefalopatije; transverzalni mijelitis; traumatska povreda mozga; tremor; trigeminalna neuralgija; tropska spastična paraparesa; tuberous skleroza; vaskularna demencija (demencija usled više infarkta); vaskulitis uključujući temporalni arteritis; Von HippelLindauova bolest; Valenbergov sindrom; Werdnig-Hoffmanova bolest; Vestov sindrom; trzajna povreda vrata (whiplash); Viliamsov sindrom; Vildonova bolest; i Zelvegerov sindrom.

[0068] U nekim tehničkim rešenjima, stanje, bolest ili poremećaj je autoimuni poremećaj. Navedeni primeri, bez ograničenja, uključuju reumatoidni artritis, sistemski lupus eritematozus, multiplu sklerozu, inflamatorne bolesti creva (IBD) koje obuhvataju Kronovu bolest (CD) i ulcerozni kolitis (UC), koji su hronična inflamatorna stanja sa poligenskom osetljivošću.U određenim tehničkim rešenjima, stanje je inflamatorna bolest creva.U određenim tehničkim rešenjima, stanje je Kronova bolest, autoimuni kolitis, iatrogeni autoimuni kolitis, ulcerozni kolitis, kolitis izazvan jednim ili više hemoterapijskih agenasa, kolitis izazvan tretmanom adaptivne ćelijske terapije, kolitis povezan sa jednom ili više aloimunih bolesti (kao što je bolest graft-versus-host, npr. akutna bolest graft-versus-host i hronična bolest graft-versus-host), radijacioni enteritis, kolagenozni kolitis, limfocitni kolitis, mikroskopski kolitis i radijacioni enteritis.U određenim od ovih tehničkih rešenja, stanje je aloimuna bolest (kao što je bolest kalema protiv domaćina, npr. akutna bolest kalema protiv domaćina i hronična bolest kalema protiv domaćina), celijakija, sindrom iritabilnog creva, reumatoidni artritis, lupus, skleroderma, psorijaza, kutani T-ćelijski limfom, uveitis i mukozitis (npr. oralni mukozitis, ezofagealni mukozitis ili intestinalni mukozitis).

[0069] U nekim tehničkim rešenjima, modulacija imunog sistema putem STING-a omogućava tretman bolesti, uključujući bolesti izazvane stranim agensima.Navedene infekcije izazvane stranim agensima koje se mogu tretirati i/ili preventivno lečiti metodom predmetnog pronalaska uključuju infekciju bakterijom (npr. gram-pozitivnom ili gram-negativnom bakterijom), infekciju gljivom, infekciju parazitom i infekciju virusom.U jednom tehničkom rešenju predmetnog pronalaska, infekcija je bakterijska infekcija (npr. infekcija izazvana E. coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella spp., Staphylococcus aureus, Streptococcus spp. ili enterokokom rezistentnim na vankomicin). U drugom tehničkom rešenju, infekcija je gljivična infekcija (npr. infekcija plesnima, kvascem ili višim gljivama). U trećem tehničkom rešenju, infekcija je parazitska infekcija (npr. infekcija jednodelnim ili višedeljnim parazitom, uključujući Giardia duodenalis, Cryptosporidium parvum, Cyclospora cayetanensis i Toxoplasma gondii). U četvrtom tehničkom rešenju, infekcija je virusna infekcija (npr. infekcija virusom povezanim sa AIDS-om, ptičijom gripom, ovčijim boginjama, herpesom, prehladom, gastroenteritisom, infektivnom mononukleozom, gripom, malim boginjama, zauškama, faringitisom, pneumonijom, rubeolom, SARS-om i infekcijama donjih ili gornjih respiratornih puteva, npr. respiratornim sincicijskim virusom).

[0070] U nekim tehničkim rešenjima, stanje, bolest ili poremećaj je hepatitis B (videti, npr., WO 2015/061294).

[0071] U nekim tehničkim rešenjima, stanje, bolest ili poremećaj je mukozitis, poznat i kao stomatitis, koji može nastati kao posledica hemoterapije ili radijacione terapije, bilo pojedinačno ili u kombinaciji, kao i oštećenja izazvana izlaganjem radijaciji van konteksta radijacione terapije.

[0072] U nekim tehničkim rešenjima, stanje, bolest ili poremećaj je uveitis, što je inflamacija uvee (npr. anteriorni uveitis, npr. iridociklitis ili iritis; intermedijarni uveitis (poznat i kao pars planitis); posteriorni uveitis; ili korioretinitis, npr. pan-uveitis).

Kombinovana terapija

[0073] Predmetna objava obuhvata kako režime monoterapije, tako i režime kombinovane terapije.

[0074] U nekim tehničkim rešenjima, metode ovde stavljene na uvid javnosti mogu dodatno da uključuju administriranje jedne ili više dodatnih terapija (npr. jednog ili više dodatnih terapijskih agensa i/ili jednog ili više terapijskih režima) u kombinaciji sa administriranjem jedinjenja opisanih ovde.

[0075] U određenim tehničkim rešenjima, metode ovde stavljene na uvid javnosti mogu dodatno da uključuju administriranje jedne ili više dodatnih terapija kancera.

[0076] Jedna ili više dodatnih terapija kancera može da obuhvata, bez ograničenja, hirurgiju, radioterapiju, hemioterapiju, toksinsku terapiju, imunoterapiju, krioterapiju, vakcine protiv kancera (npr. HPV vakcina, vakcina protiv hepatitisa B, Onkofag, Provenge) i gensku terapiju, kao i njihove kombinacije. Imunoterapija, uključujući, bez ograničenja, adoptivnu terapiju ćelijama, derivaciju matičnih ćelija i/ili dendritskih ćelija, transfuzije krvi, lavaže i/ili druge tretmane, uključujući, bez ograničenja, zamrzavanje tumora.

[0077] U nekim tehničkim rešenjima, jedna ili više dodatnih terapija kancera je hemioterapija, koja može da obuhvata administriranje jednog ili više dodatnih hemioterapijskih agenasa.

[0078] U određenim tehničkim rešenjima, dodatni hemioterapijski agens je imunomodulatorni segment, npr. inhibitor imunološke kontrolne tačke. U nekim od ovih tehničkih rešenja, inhibitor imunološke kontrolne tačke cilja receptor imunološke kontrolne tačke izabran iz grupe koju čine CTLA-4, PD-1, PD-L1, PD-1–PD-L1, PD-1–PD-L2, interleukin-2 (IL-2), indolamin 2,3-dioksigenaza (IDO), IL-10, transformišući faktor rasta-β (TGFβ), T ćelijski imunoglobulin i mucin 3 (TIM3 ili HAVCR2), galektin 9–TIM3, fosfatidilserin–TIM3, gen 3 proteina aktivacije limfocita (LAG3), MHC klase II–LAG3, 4-1BB–4-IBB ligand, OX40–OX40 ligand, GITR, GITR ligand– GITR, CD27, CD70–CD27, TNFRSF25, TNFRSF25–TL1A, CD40L, CD40–CD40 ligand, HVEM–LIGHT–LTA, HVEM, HVEM–BTLA, HVEM–CD160, HVEM–LIGHT, HVEM– BTLA–CD160, CD80, CD80–PDL-1, PDL2–CD80, CD244, CD48–CD244, CD244, ICOS, ICOS–ICOS ligand, B7-H3, B7-H4, VISTA, TMIGD2, HHLA2–TMIGD2, butirofilini uključujući BTNL2, familija Siglec, TIGIT i članovi PVR familije, KIR, ILT i LIR, NKG2D i NKG2A, MICA i MICB, CD244, CD28, CD86–CD28, CD86–CTLA, CD80–CD28, CD39, CD73 adenozin–CD39–CD73, CXCR4–CXCL12, fosfatidilserin, TIM3, fosfatidilserin–TIM3, SIRPA– CD47, VEGF, neuropilin, CD160, CD30 i CD155; npr. CTLA-4 ili PD-1 ili PD-L1). Videti, npr. Postow, M. J. Clin. Oncol.2015, 33, 1.

[0079] U nekim od ovih tehničkih rešenja, inhibitor imunološke kontrolne tačke je izabran iz grupe koju čine: Urelumab, PF-05082566, MEDI6469, TRX518, Varlilumab, CP-870893, pembrolizumab (PD1), nivolumab (PD1), atezolizumab (ranije MPDL3280A) (PDL1), MEDI4736 (PD-L1), avelumab (PD-L1), PDR001 (PD1), BMS-986016, MGA271, lirilumab, IPH2201, emactuzumab, INCB024360, galunisertib, ulocuplumab, BKT140, bavituksimab, CC-90002, bevacizumab, i MNRP1685A, i MGA271.

[0080] U određenim tehničkim rešenjima, dodatni hemioterapijski agens je STING agonist, npr. STING agonist koji nije jedinjenje formule (I) opisano ovde. Na primer, STING agonist može da obuhvata flavonoid. Pogodni flavonoidi uključuju, ali nisu ograničeni na, 10-(karboksimetil)-9(10H)akridon (CMA), 5,6-dimetilksantenon-4-sirćetnu kiselinu (DMXAA), metoksivon, 6,4'-dimetoksiflavon, 4'-metoksiflavon, 3',6'-dihidroksiflavon, 7,2'-dihidroksiflavon, daidzein, formononetin, retusin 7-metil etar, ksanton, ili bilo koju kombinaciju navedenih. U nekim aspektima, STING agonist može biti 10-(karboksimetil)-9(10H)akridon (CMA). U nekim apektima, STING agonist može biti 5,6-dimetilksantenon-4-octena kiselina (DMXAA). U nekim aspektima, STING agonist može biti metoksivon. U nekim aspektima, STING agonist može biti 6,4'-dimetoksiflavon. U nekim aspektima, STING agonist može biti 4'-metoksiflavon.U nekim tehničkim rešenjima, STING agonist može biti 3',6'-dihidroksiflavon. U nekim aspektima, STING agonist može biti 7,2'-dihidroksiflavon. U nekim aspektima, STING agonist može biti daidzein.U nekim aspektima, STING agonist može biti formononetin.U nekim tehničkim rešenjima, STING agonist može biti retusin 7-metil eter. U nekim aspektima, STING agonist može biti ksanton.U nekim aspektima, STING agonist može biti bilo koja kombinacija gore navedenih flavonoida. Tako, na primer, u nekim tehničkim rešenjima, flavonoid može da obuhvata DMXAA.

[0081] U određenim tehničkim rešenjima, dodatni hemioterapijski agens je alkilirajući agens. Alkilirajući agensi su tako nazvani zbog svoje sposobnosti da alkiliraju mnoge nukleofilne funkcionalne grupe u uslovima prisutnim u ćelijama, uključujući, ali ne ograničavajući se na ćelije kancera.U daljem tehničkom rešenju, alkilirajući agens obuhvata, ali nije ograničen na, cisplatin, karboplatin, mehloretamin, ciklofosfamid, hlorambucil, ifosfamid i/ili oksaliplatin. U jednom tehničkom rešenju, alkilirajući agensi mogu delovati tako što ometaju funkciju ćelije formiranjem kovalentnih veza sa amino, karboksil, sulfhidril i fosfatnim grupama u biološki važnim molekulima, ili mogu delovati modifikovanjem DNK ćelije. U daljem tehničkom rešenju, alkilirajući agens može biti sintetički, polusintetički ili njegov derivat.

[0082] U određenim tehničkim rešenjima, dodatni hemioterapijski agens je antimetabolit. Antimetaboliti se ponašaju kao purini ili pirimidini, osnovni gradivni blokovi DNK, i generalno sprečavaju da se ove supstance uključe u DNK tokom „S“ faze (ćelijskog ciklusa), zaustavljajući normalni razvoj i deobu ćelija. Antimetaboliti takođe mogu uticati na sintezu RNK. U jednom tehničkom rešenju, antimetabolit uključuje, ali nije ograničen na, azatioprin i/ili merkaptopurin. U daljem tehničkom rešenju, antimetabolit može biti sintetički, polusintetički ili njegov derivat.

[0083] U određenim tehničkim rešenjima, dodatni hemioterapijski agens je biljni alkaloid i/ili terpenoid. Ovi alkaloidi potiču iz biljaka i blokiraju deobu ćelija tako što, generalno, sprečavaju funkciju mikrotubula. U jednom tehničkom rešenju, biljni alkaloid i/ili terpenoid je vinka alkaloid, podofilotoksin i/ili taksan. Vinka alkaloidi, generalno, vezuju se za specifična mesta na tubulinu, inhibirajući sastavljanje tubulina u mikrotubule, uglavnom tokom M faze ćelijskog ciklusa.U jednom tehničkom rešenju, vinka alkaloid potiče, bez ograničenja, od madagaskarskog perivinka, Catharanthus roseus (ranije poznatog kao Vinca rosea). U jednom tehničkom rešenju, vinka alkaloid uključuje, bez ograničenja, vinkristin, vinblastin, vinorelbina i/ili vindesin. U jednom tehničkom rešenju, taksan uključuje, ali nije ograničen na, taksol, paklitaksel i/ili doketaksel. U daljem tehničkom rešenju, biljni alkaloid ili terpenoid može biti sintetički, polusintetički ili njegov derivat.U daljem tehničkom rešenju, podofilotoksin je, bez ograničenja, etopozid i/ili tenipozid. U jednom tehničkom rešenju, taksan je, bez ograničenja, doketaksel i/ili ortataksel. [021] U jednom tehničkom rešenju, terapija kancera je topoizomeraza. Topoizomeraze su esencijalni enzimi koji održavaju topologiju DNK. Inhibicija tipa I ili tipa II topoizomeraza ometa i transkripciju i replikaciju DNK tako što narušava pravilno superuvijanje DNK.U daljem tehničkom rešenju, topoizomeraza je, bez ograničenja, inhibitor topoizomeraze tipa I ili inhibitor topoizomeraze tipa II. U jednom tehničkom rešenju, inhibitor topoizomeraze tipa I je, bez ograničenja, kamptotecin. U drugom tehničkom rešenju, kamptotecin je, bez ograničenja, egzatekan, irinotekan, lurtotekan, topotekan, BNP 1350, CKD 602, DB 67 (AR67) i/ili ST 1481. U jednom tehničkom rešenju, inhibitor topoizomeraze tipa II je, bez ograničenja, epipodofilotoksin. U daljem tehničkom rešenju, epipodofilotoksin je, bez ograničenja, amsakrin, etopozid, etopozid-fosfat i/ili tenipozid. U daljem tehničkom rešenju, topoizomeraza može biti sintetička, polusintetička ili derivat, uključujući i one koji se prirodno javljaju, kao što su, bez ograničenja, epipodofilotoksini, supstance koje se prirodno nalaze u korenu američke majaple (Podophyllum peltatum).

[0084] U određenim tehničkim rešenjima, dodatni hemioterapijski agens je stilbenoid.U daljem tehničkom rešenju, stilbenoid uključuje, ali nije ograničen na, resveratrol, piceatanol, pinosilvin, pterostilben, alfa-viniferin, ampelopsin A, ampelopsin E, diptoindonesin C, diptoindonesin F, epsilon-vinferin, fleksuozol A, gnetin H, hemslejanol D, hopeafenol, trans-diptoindonesin B, astringin, piceid i diptoindonesin A. U daljem tehničkom rešenju, stilbenoid može biti sintetički, polusintetički ili njegov derivat.

[0085] U određenim tehničkim rešenjima, dodatni hemioterapijski agens je citotoksični antibiotik.U jednom tehničkom rešenju, citotoksični antibiotik je, bez ograničenja, aktinomicin, antracenedion, antraciklin, talidomid, dihlorosirćetna kiselina, nikotinska kiselina, 2-deoksiglukoza, i/ili hlofazimin.U jednom tehničkom rešenju, aktinomicin je, bez ograničenja, aktinomicin D, bacitracin, kolistin (polimiksin E) i/ili polimiksin B.U drugom tehničkom rešenju, antracenedion je, bez ograničenja, mitoksantron i/ili piksantron.U daljem tehničkom rešenju, antraciklin je, bez ograničenja, bleomicin, doksorubicin (adriamicin), daunorubicin (daunomicin), epirubicin, idarubicin, mitomicin, plicamicin i/ili valrubicin. U daljem tehničkom rešenju, citotoksični antibiotik može biti sintetički, polusintetički ili njegov derivat.

[0086] U određenim tehničkim rešenjima, dodatni hemioterapijski agens je izabran iz grupe koja uključuje endostatin, angiogenin, angiostatin, hemokine, angioarestin, angiostatin (fragment plazminogena), antiangiogene faktore izvedene iz kolagena bazalne membrane (tumstatin, kanstatin ili arestin), antiangiogeni antitrombin III, inhibitore signalne transdukcije, inhibitor izveden iz hrskavice (CDI), fragment komplementa CD59, fragment fibronektina, gro-beta, heparinaze, fragment heparin heksasaharida, ljudski horionski gonadotropin (hCG), interferon alfa/beta/gama, interferon-indukovani protein (IP-10), interleukin-12, kringl 5 (fragment plazminogena), inhibitore metaloproteinaza (TIMPs), 2-metoksiestradiol, inhibitor placentarnog ribonukleaze, inhibitor aktivatora plazminogena, faktor trombocita 4 (PF4), prolaktin 16 kD fragment, protein povezan sa proliferinom (PRP), razne retinoide, tetrahidrokortizol-S, trombospondin-1 (TSP-1), transformišući faktor rasta-beta (TGF-β), vaskulostatin, vasostatin (fragment kalretikulina) i slične supstance.

[0087] U određenim tehničkim rešenjima, dodatni hemoterapijski agens je izabran iz abirateron acetata, altretamina, anhidrovinblastina, auristatina, beksarotena, bikalutamida, BMS 184476, 2,3,4,5,6-pentafluoro-N-(3-fluoro-4-metoksifenil)benzen sulfonamida, bleomicina, N,N-dimetil-L-valil-L-valil-N-metil-L-valil-L-proli-1-Lprolin-t-butilamida, kahektina, cemadotina, hlorambucila, ciklofosfamida, 3',4'-didehidro-4'-deoksi-8'-norvin-kaleukoblastina, docetaksola, doksetaksela, ciklofosfamida, karboplatina, karmustina, cisplatina, kriptoficina, ciklofosfamida, citarabina, dakarbazina (DTIC), daktinomicina, daunorubicina, decitabina, dolastatina, doksorubicina (adriamicin), etopozida, 5-fluorouracila, finasterida, flutamida, hidroksiuree i hidroksiureataksana, ifosfamida, liarozola, lonidamina, lomustina (CCNU), MDV3100, mehloretamina (azotni iperit), melfalana, mivobulin izetionata, rizoksina, sertenefa, streptozocina, mitomicina, metotreksata, taksana, nilutamida, onapristona, paklitaksela, prednimustina, prokarbazina, RPR109881, stramustin fosfata, tamoksifena, tasonermina, taksola, tretinoina, vinblastina, vinkristina, vindezin sulfata i vinflunina.

[0088] U određenim tehničkim rešenjima, dodatni hemoterapijski agens je platina, cisplatina, karboplatina, oksaliplatina, mekloretamin, ciklofosfamid, hlorambucil, azatioprin, merkaptopurin, vinkristin, vinblastin, vinorelin, vindesin, etopozid i tenipozid, paklitaksel, doketaksel, irinotekan, topotekan, amsakrin, etopozid, etopozid-fosfat, tenipozid, 5-fluorouracil, leukovorin, metotreksat, gemcitabin, taksani, leukovorin, mitomicin C, tegafur-uracil, idarubicin, fludarabin, mitoksantron, ifosfamid i doksorubicin. Dodatni agensi uključuju i inhibitore mTOR (ciljna grupa rapamicina kod sisara), uključujući, ali ne ograničavajući se na rapamicin, everolimus, temsirolimus i deforolimus.

[0089] U još nekim tehničkim rešenjima, dodatni hemoterapijski agens može biti izabran iz onih navedenih u američkom patentu 7,927,613.

[0090] U određenim tehničkim rešenjima, drugi terapijski agens ili režim se primenjuje na ispitanika pre kontakta sa hemijskim entitetom ili njegove administracije (npr. oko jedan sat pre, ili oko 6 sati pre, ili oko 12 sati pre, ili oko 24 sata pre, ili oko 48 sati pre, ili oko 1 nedelje pre, ili oko 1 meseca pre).

[0091] U drugim tehničkim rešenjima, drugi terapijski agens ili režim se primenjuje na ispitanika otprilike u isto vreme kada dolazi do kontakta sa hemijskim entitetom ili njegove administracije. Na primer, drugi terapijski agens ili režim i hemijsko jedinjenje se daju ispitaniku istovremeno u istoj farmaceutskoj formi. Kao drugi primer, drugi terapijski agens ili režim i hemijski entitet se daju ispitaniku istovremeno, ali u odvojenim farmaceutskim formama.

[0092] U još nekim tehničkim rešenjima, drugi terapijski agens ili režim se primenjuje na ispitanika nakon kontakta sa hemijskim entitetom ili njegove administracije (npr. oko jedan sat nakon, ili oko 6 sati nakon, ili oko 12 sati nakon, ili oko 24 sata nakon, ili oko 48 sati nakon, ili oko 1 nedelje nakon, ili oko 1 meseca nakon).

Izbor pacijenata

[0093] U nekim tehničkim rešenjima, opisani postupci takođe uključuju korak identifikacije ispitanika (npr. pacijenta) kome je potrebno takvo lečenje (npr. putem biopsije, endoskopije ili nekog drugog konvencionalnog postupka poznatog u oblasti tehnike).U određenim tehničkim rešenjima, STING protein može služiti kao biomarker za određene vrste kancera, npr. karcinom kolona i karcinom prostate.U još nekim tehničkim rešenjima, identifikacija ispitanika može uključivati ispitivanje mikrookoline tumora pacijenta na odsustvo T-ćelija i/ili prisustvo iscrpljenih T-ćelija, npr. kod pacijenata sa jednim ili više „hladnih“ tumora. Takvi pacijenti mogu uključivati one koji su otporni na lečenje inhibitorima kontrolnih tačaka.U određenim tehničkim rešenjima, takvi pacijenti mogu se lečiti hemijskim entitetom opisanim ovde, npr. radi regrutovanja T-ćelija u tumor, a u nekim slučajevima dodatno lečiti jednim ili više inhibitora kontrolnih tačaka, npr. kada T-ćelije postanu iscrpljene.

[0094] U nekim tehničkim rešenjima, hemijski entiteti, opisani postupci i kompozicije mogu se primenjivati na određene populacije pacijenata otpornih na lečenje (npr. pacijenti otporni na inhibitore kontrolnih tačaka; npr. pacijenti sa jednim ili više „hladnih“ tumora, npr. tumori koji nemaju T-ćelije ili imaju iscrpljene T-ćelije).

Priprema jedinjenja

[0095] Kao što prosečan stručnjak u oblasti može razumeti, postupci sinteze jedinjenja formula navedenih ovde biće očigledni osobama prosečnog znanja u oblasti. Na primer, opisana jedinjenja mogu se sintetisati, npr. korišćenjem jednog ili više postupaka opisanih ovde i/ili korišćenjem postupaka opisanih, npr., u US 2015/0056224. Transformacije u sintetskoj hemiji i metodologije zaštitnih grupa (zaštita i dezaštita) korisne za sintezu opisanych jedinjenja poznate su u oblasti i uključuju, na primer, one opisane u: R. Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers (1989); T. W. Greene i RGM. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 2. izd., John Wiley and Sons (1991); L. Fieser i M. Fieser, Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1994); i L. Paquette, ur., Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1995), i u kasnijim izdanjima. Polazni supstancali korišćeni za pripremu jedinjenja predmetnog pronalaska su poznati, dobijeni poznatim postupcima ili komercijalno dostupni. Prosečan stručnjak u oblasti takođe će prepoznati da se uslovi i reagensi opisani ovde mogu zameniti alternativnim ekvivalentima poznatim u oblasti. Na primer, u mnogim reakcijama, trietilamin se može zameniti drugim bazama, kao što su nukleofilno neaktivne baze (npr. diizopropilamin, 1,8-diazabicikloundek-7-en, 2,6-di-terc-butilpiridin ili tetrabutilfosfazeni).

[0096] Prosečan stručnjak u oblasti prepoznaće razne analitičke metode koje se mogu koristiti za karakterizaciju jedinjenja opisanih ovde, uključujući, na primer,<1>H NMR, heteronuklearni NMR, masenu spektrometriju, tečnu hromatografiju i infracrvenu spektroskopiju. Naveden spisak predstavlja podskup metoda karakterizacije dostupnih prosečnom stručnjaku u oblasti i nije namenjen da bude ograničavajući.

[0097] Da bi se dalje ilustrovalo prethodno, uključene su sledeće, nelimitirajuće, primerne sintetske šeme. Varijacije ovih primera u okviru obuhvata patentnih zahteva su u domenu sposobnosti prosečnog stručnjaka u oblasti i smatraju se delom obuhvata predmetnog pronalaska kako je opisano i zahtevan u ovoj prijavi. Čitalac će prepoznati da prosečan stručnjak u oblasti, uz predmetnu objavu i svoje znanje u oblasti, može pripremiti i koristiti pronalazak bez potrebe za iscrpnim primerima.

[0098] Sledeće skraćenice imaju naznačena značenja:

ACN = acetonitril

BnNCO = (izocijanatometil)benzen

BSA = amberlist 15

BzCl = benzoil hlorid

CCl4= ugljen tetrahlorid

CE = cijanoetil

DCA = dihlorosirćetna kiselina

DCM = dihlorometan

DIAD = diizopropil azodiformat

DIPEA = N,N-dietilizopropilamin

DMAP = 4-(N,N-dimetilamino)piridin

DMF = N,N-dimetilformamid

DMF-DMA = N,N-dimetilformamid dimetil acetal

DMTrCl = 1-[hloro(4-metoksifenil)benzil]-4-metoksibenzen

H2O = voda

HF = fluoro vodonik

H2S = vodonik sulfid

I2= jod

MeNH2= metilamin

NaN3= natrijum azid

NMP =N-metilpirolidinon

Py or pyr = piridin

Py·TFA = pridinijum trifluoroacetat

TBDPS = terc-butildifenilsilil

TBDPSCl = terc-butil(hloro)difenilsilan

TEA = trietilamin

TEA·HF ili TEA·3HF = trietilamin trihidrofluorid

TFA = trifluorosirćetna kiselina

Tr ili Trt = tritil

TrCl = tritil hlorid ili trifenilmetil hlorid

TMSCl = hlorotrimetilsilan

Sinteza jedinjenja predmetnog pronalaska uključujući amino vezu na 3’ pozicijama riboze

[0099] Šema 1 prikazuje primer sinteze cikličnih dinukleotidnih fosforamidata ovde stavljenih na uvid javnosti, koji uključuju amino vezu povezanu sa 3' pozicijom svake ribozne jedinice.

[0100] Sekvenca započinje tretiranjem jedinjenja 1 tritil-hloridom u prisustvu trietilamina da bi se dobio tritilisani amin 2. Amin 2 se podvrgava dejstvu 3-((bis(diizopropilamino)fosfanil)oksi)propanonitrila, piridina i trifluorsirćetne kiseline da bi se dobio fosforamidit 3. Naknadno tretiranje vodom ili vodonik-sulfidom rezultuje dobijanjem fosfonata 4a, odnosno fosfonotioata 4b. Jedinjenje 1 se zatim može kombinovati sa bilo kojim od jedinjenja 4a ili 4b u prisustvu trietilamina u ugljen tertrahloridu da bi se generisao fosforamidat 5a, odnosno fosforamidotioat 5b. Podvrgavanje jedinjenja 5a ili jedinjenja 5b dejstvu 3-((bis(diizopropilamino)fosfanil)oksi)propanonitrila, piridina i trifluorsirćetne kiseline daje odgovarajući fosforamidit 6a ili 6b. Sekvencijalno tretiranje fosforamidita 6a vodom i dihlorsirćetnom kiselinom daje fosfonat 7a. Sekvencijalno tretiranje fosforamidita 6b vodoniksulfidom i dihlorsirćetnom kiselinom daje fosfonotioat 7b. Jedinjenje 7a ili 7b se zatim suspenduje u trietilaminu i ugljen tertrahloridu da bi se omogućila ciklizacija, čime se dobijaju ciklični fosforamidati 8a i 8b. Na kraju, tretiranje jedinjenja 8a ili 8b metilaminom i kompleksom trietilamin-vodonik-fluorida rezultuje decijanoetilisanim cikličnim dinukleotidnim fosforamidatima 9a ili 9b, pri čemu su baze adenina i/ili guanina takođe deprotektovane.

Sinteza jedinjenja formule I uključujući amino vezu na 5' pozicijama riboze i fluor na 2' pozicijama

[0101] Šeme 2 i 3 prikazuju primer sinteze cikličnih dinukleotidnih fosforamidata ovde stavljenih na uvid javnosti, koji uključuju amino vezu povezanu sa 5' pozicijom svake ribozne jedinice, pored fluora na dezoksi-2' pozicijama.

[0102] Jedinjenje 1 se tretira hlorotrimetilsilanom, a zatim benzoil-hloridom (ako je B = adenin) ili izobutiril-hloridom (ako je B = guanin) da bi se dobilo jedinjenje 2. Jedinjenje 2 se kombinuje sa trifenilfosfinom, jodom i imidazolom u N-metilpirolidinonu da bi se dobio 5'-hidroksilisani intermedijer 3. Intermedijer 3 se podvrgava dejstvu natrijum-azida u N,N-dimetilformamidu da bi se dobio azid 4. Azid 4 se podvrgava dejstvu trifenilfosfina u onome što se smatra Staudingerovom reakcijom da bi se generisao amin 5, koji se zatim tritiliše tritil-hloridom u prisustvu trietilamina da bi se dobilo jedinjenje 6. Jedinjenje 6 se podvrgava tretiranju sa ((bis(diizopropilamino)fosfanil)oksi) propanonitrilom, piridinom i trifluorsirćetnom kiselinom da bi se dobio fosforamidit 7. Naknadno tretiranje vodom ili vodonik-sulfidom rezultuje dobijanjem fosfonata 8a, odnosno fosfonotioata 8b. Jedinjenje 7 se takođe može konvertovati u jedinjenje 8a pomoću tretiranja piridinijum-hloridom.

[0103] Jedinjenje 5 se zatim može kombinovati sa bilo kojim od jedinjenja 8a ili 8b u prisustvu trietilamina u ugljen tertrahloridu da bi se generisao fosforamidat 9a, odnosno fosforamidotioat 9b. Podvrgavanje jedinjenja 9a ili jedinjenja 9b dejstvu 3-((bis(diizopropilamino)fosfanil)oksi) propanonitrila, piridina i trifluorsirćetne kiseline daje odgovarajući fosforamidit 10a ili 10b. Sekvencijalno tretiranje fosforamidita 10a vodom i dihlorsirćetnom kiselinom daje fosfonat 11a. Sekvencijalno tretiranje fosforamidita 10b vodonik-sulfidom i dihlorsirćetnom kiselinom daje fosfonotioat 11b. Jedinjenje 11a ili 11b se može suspendovati u trietilaminu i ugljen tertrahloridu da bi se omogućila intramolekulska ciklizacija, čime se dobijaju ciklični fosforamidati 12a i 12b. Na kraju, tretiranje jedinjenja 12a ili 12b metilaminom rezultuje decijanoetilisanim cikličnim dinukleotidnim fosforamidatima 13a ili 13b, pri čemu su baze adenina i/ili guanina takođe deprotektovane.

Sinteza jedinjenja predmetnog pronalaska uključujući amino vezu na 5’ pozicijama riboze

[0104] Šema 4 prikazuje primer sinteze cikličnih dinukleotidnih fosforamidata ovde stavljenih na uvid javnosti, koji uključuju amino vezu povezanu sa 5' pozicijom svake ribozne jedinice.

[0105] Sekvenca započinje tretiranjem jedinjenja 1 tritil-hloridom u prisustvu trietilamina da bi se dobio tritilisani amin 2. Amin 2 se podvrgava dejstvu 3-((bis(diizopropilamino)fosfanil)oksi) propanonitrila, piridina i trifluorsirćetne kiseline da bi se dobio fosforamidit 3. Naknadno tretiranje vodom ili vodonik-sulfidom rezultuje dobijanjem fosfonata 4a, odnosno fosfonotioata 4b. Jedinjenje 1 se zatim može kombinovati sa bilo kojim od jedinjenja 4a ili 4b u prisustvu trietilamina u ugljen tertrahloridu da bi se generisao fosforamidat 5a, odnosno fosforamidotioat 5b. Podvrgavanje jedinjenja 5a ili jedinjenja 5b dejstvu 3-((bis(diizopropilamino)fosfanil)oksi )propanonitrila, piridina i trifluorsirćetne kiseline daje odgovarajući fosforamidit 6a ili 6b. Sekvencijalno tretiranje fosforamidita 6a vodom i dihlorsirćetnom kiselinom daje fosfonat 7a. Fosforamidit 6a se takođe može konvertovati u fosfonat 7a bez posebnog koraka tretiranja vodom. Sekvencijalno tretiranje fosforamidita 6b vodonik-sulfidom i dihlorsirćetnom kiselinom daje fosfonotioat 7b. Jedinjenje 7a ili 7b se može suspendovati u trietilaminu i ugljen tertrahloridu da bi se omogućila intramolekulska ciklizacija, čime se dobijaju ciklični fosforamidati 8a i 8b. Na kraju, tretiranje jedinjenja 8a ili 8b metilaminom i trimetilamin-trihidrofluoridom rezultuje decianoetilisanim cikličnim dinukleotidnim fosforamidatima 9a ili 9b, pri čemu su baze adenina i/ili guanina takođe deprotektovane.

PRIMERI

Priprema jedinjenja

Priprema ključnih intermedijera

N-(9-((2R,3R,4R,5S)-4-amino-3-(terc-butildimetilsililoksi)-5-(hidroksimetil)-tetrahidrofuran-2-il)-9H-purin-6-il)benzamid (INT-C)

[0106]

Korak 1

[0107]

[0108] (2R,3R,4S,5R)-2-(6-amino-9H-purin-9-il)-5-((terc-butildifenilsililoksi)metil)-tetra hidrofuran-3,4-diol (101): U suspenziju (2R,3R,4S,5R)-2-(6-amino-9H-purin-9-il)-5-(hidroksimetil)-tetrahidrofurano-3,4-diola (500 g, 1,87 mol) u piridinu (3,5 L) dodati su 4,4dimetilaminopiridin (22,9 g, 0,18 mol) i terc-butil(hloro)difenilsilan (616 g, 2,24 mol) pod atmosferom azota. Nakon mešanja 1 dan na sobnoj temperaturi, reakciona suspenzija se pretvorila u prozirni rastvor. Nakon ukupno 3 dana, rastvor iz reakcije se neutralisao dodatkom metanola (100 mL). Mešavina je koncentrisana pod smanjenim pritiskom. Preostali supstancal je dodat u mešavinu hloroforma (1,5 L) i dietil-etra (4 L) i intenzivno je mešano 2 sata. Dobijeni talog je filtriran, a filter-kolač je sakupljen i osušen na vazduhu da bi se dobio sirovi proizvod. Sirovi proizvod je dodat vodi (3 L) i intenzivno mešan 1 sat. Suspenzija je filtrirana i osušena pod infracrvenim zracima da bi se dobilo naslovno jedinjenje 101 kao bezbojna čvrsta supstanca (937 g, 99%).<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.53 (s, 1H), 8.38 (s, 1H), 7.68 - 7.57 (m, 4H), 7.51 -7.31 (m, 6H), 5.99 (d, J = 4.5 Hz, 1H), 4.59 (t, J = 4.8 Hz, 1H), 4.33 (t, J = 5.0 Hz, 1H), 4.08 (q, J = 4.5 Hz, 1H), 3.94 (dd, J= 11.4, 3.7 Hz, 1H), 3.80 (dd, J = 11.4, 4.8 Hz, 1H), 0.98 (s, 9H); LC/MS: [(M 1)]<+>= 506.2.

Korak 2

[0109]

[0110] (2R,3S,4S,5R)-2-(6-amino-9H-purin-9-il)-4-bromo-5-((terc-butildifenilsililoksi)metil)-tetrahidrofuran-3-il acetat (102): U suspenziju (2R,3R,4S,5R)-2-(6-amino-9H-purin-9-il)-5-((tercbutildifenilsilil)oksi)metil)-tetrahidrofurano-3,4-diola (101, 900 g, 1,78 mol) i H₂O (29,3 mL, 1,63 mol) u acetonitrilu (13,5 L) dodavan je u kapima tokom 2 sata, pod atmosferom azota na 0 °C, rastvor 1-bromo-2-metil-1-oksopropan-2-il acetata (787 mL, 5,34 mol) u acetonitrilu (4,5 L). Po završetku dodavanja, suspenzija se pretvorila u prozirni rastvor. Nakon ukupno 5,5 sati, vrednost pH reakcione smeše je podešena na 6 uz pomoć natrijum bikarbonata. Dobijena smeša je koncentrisana pod smanjenim pritiskom, a preostali supstancal je tretiran dihlormetanom (2 L), filtriran i ispran vodom (1 L), te osušen pod infracrvenim zracima da bi se dobilo naslovno jedinjenje 102 kao bela čvrsta supstanca (597 g, 59%).<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.38 (s, 1H), 8.28 (s, 1H), 7.73 - 7.63 (m, 4H), 7.55 - 7.36 (m, 6H), 6.24 (d, J = 3.2 Hz, 1H), 5.91 (t, J = 3.2 Hz, 1H), 4.94 (dd, J = 5.0, 3.1 Hz, 1H), 4.57 (q, J = 4.9 Hz, 1H), 4.06 - 3.95 (m, 2H), 2.13 (s, 3H), 1.02 (s, 9H); LC/MS: [(M 1)]<+>= 610.2, 612.2.

Korak 3

[0111]

[0112] (2R,3S,4R)-2-(6-amino-9H-purin-9-il)-4-bromo-5-((terc-butildifenilsililoksi)metil)-tetrahidrofuran-3-ol (103): U suspenziju (2R,3S,4S,5R)-2-(6-amino-9H-purin-9-il)-4-bromo-5-((tert-butildifenilsilil)oksi)metil)-tetrahidrofurano-3-il acetata (102, 490 g, 0,80 mol) u 1,4-dioksanu (7 L) dodat je butilamin (220 g, 2,06 mol). Smeša je zagrevana na 100 °C i mešana 3 sata, pri čemu se suspenzija pretvorila u prozirni rastvor. Dobijena smeša je koncentrisana pod smanjenim pritiskom, a preostali supstancal je dodat u smešu petroleuma, dihlormetana i metanola (3,1 L, 25/5/1, v/v/v) i intenzivno mešan 1 sat. Suspenzija je filtrirana, a filter-kolač je ispran vodom (4 L) i osušen pod infracrvenim zracima da bi se dobilo naslovno jedinjenje 103 kao bela čvrsta supstanca. (360 g, 79%):<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 8.14 (s, 1H), 8.10 (s, 1H), 7.72 - 7.61 (m, 4H), 7.53 - 7.36 (m, 6H), 7.32 (s, 2H), 6.49 (d, J = 5.2 Hz, 1H), 5.91 (d, J = 3.8 Hz, 1H), 4.95 (q, J = 4.3 Hz, 1H), 4.61 (dd, J = 5.4, 4.0 Hz, 1H), 4.54 (q, J = 4.9 Hz, 1H), 4.08 - 3.94 (m, 2H), 1.02 (s, 9H); LC/MS: [(M 1)]<+>= 568.1, 570.1.

Korak 4

[0113]

[0114] (2R,3S,4S,5R)-2-(6-amino-9H-purin-9-il)-4-bromo-5-((terc-butildifenilsililoksi)metil)-tetrahidrofuran-3-il benzilkarbamat (104): U suspenziju (2R,3S,4R,5R)-2-(6-amino-9H-purin-9-il)-4-bromo-5-((terc-butildifenilsilil)oksi)metil)-tetrahidrofurano-3-ola (103, 290 g, 0,51 mol) u korastvoru tetrahidrofuran/acetonitril (5,8 L, 1/1, v/v) dodat je trietilamin (106 mL, 0,77 mol) i (izocijanometil)benzen (102,7 g, 0,77 mol). Dobijena suspenzija je mešana 15 sati na 35 °C. Reakcija je zaustavljena dodatkom metanola (300 mL). Smeša je koncentrisana pod smanjenim pritiskom, a ostatak je tretiran smešom petroleuma, etil-acetata i dihlormetana (2,2 L, 5/1/1,5, v/v/v). Suspenzija je filtrirana, a filter-kolač je sakupljen i osušen pod infracrvenim zracima da bi se dobilo naslovno jedinjenje 104 kao bela čvrsta supstanca. (348 g, 97%):<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 8.17 - 8.12 (m, 3H), 8.15(s, 1H), 8.12(s, 1H), 7.73 - 7.61 (m, 4H), 7.54 - 7.10 (m, 13H), 6.16 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 5.88 (t, J = 4.1 Hz, 1H), 4.90 (dd, J = 5.4, 4.2 Hz, 1H), 4.53(q, J =4.8 Hz, 1H), 4.30 - 4.09 (m, 2H), 4.08 - 3.92 (m, 2H), 1.03 (s, 9H); LC/MS: [(M 1)]<+>= 701.2, 703.2.

Korak 5

[0115]

[0116] (3aR,4S,6R,6aR)-6-(6-amino-9H-purin-9-il)-3-benzil-4-((terc-butildifenilsililoksi)metil)-tetrahidrofuro[3,4-d]oksazol-2(3H)-on (105): Rastvor (2R,3S,4S,5R)-2-(6-amino-9H-purin-9-il)-4-bromo-5-((terc-butildifenilsilil)oksi)metil)-tetrahidrofurano-3-il benzilkarbamata (104, 348 g, 0,50 mol) u tetrahidrofuranu (10,5 L) tretiran je natrijum-terc-butoksidom (57,2 g, 0,60 mol) 0,5 h na -20 °C. Reakcija je zatim zaustavljena dodatkom zasićene vodenе smeše amonijum-hlorida (4 L). Organska faza je odvojena, a vodena faza je ekstrahovana etil-acetatom (2 L). Kombinovani organski slojevi su osušeni na bezvodnom natrijum sulfatu. Nakon filtracije, filtrat je koncentrisan pod smanjenim pritiskom da bi se dobilo naslovno jedinjenje 105, koje je korišćeno u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja (315 g, bela pena).: LC/MS: [(M 1)]<+>= 621.2.

Korak 6

[0117]

[0118] N-(9-((3aR,4S,6R,6aR)-3-benzil-4-((terc-butildifenilsililoksi)metil)-2-oksoheksahidrofuro[3,4-d]oksazol-6-il)-9H-purin-6-il)izobutiramid (106): U rastvor gore navedenog sirovog jedinjenja (105, 280 g) u destilovanom piridinu (2,8 L) dodat je izobutiril-hlorid (71,7 g, 0,68 mol) na 0 °C. Zatim je smeša zagrevana na sobnu temperaturu i mešana 1 sat, pri čemu se boja reakcione smeše promenila u narandžastu. Reakcija je zaustavljena dodatkom metanola (250 mL) i koncentrisana pod smanjenim pritiskom da bi se dobilo sirovo naslovno jedinjenje 106 kao žuti uljani produkt (311 g).LC/MS: [(M 1)]<+>= 691.3.

[0119] N-(9-((3aR,4S,6R,6aR)-3-benzil-4-(hidroksimetil)-2-okso-heksahidrofuro[3,4-d]oksazol-6-il)-9H-purin-6-il)izobutiramid (107): U suspenziju gore navedenog sirovog jedinjenja (106, 354 g) u tetrahidrofuranu (3 L) dodat je trietilamin-trihidrofluorid (590 g, 3,55 mol) i mešan 17 sati na sobnoj temperaturi. Po završetku reakcije, reakciona smeša se pretvorila u prozirni rastvor, koji je zaustavljen dodatkom zasićenog vodenog natrijum bikarbonata (2 L). Organski sloj je odvojen, a vodeni sloj je ekstrahovan dihlormetanom (2 x 1 L). Organski slojevi su kombinovani, osušeni na bezvodnom natrijum sulfatu i filtrirani. Filtrat je koncentrisan pod smanjenim pritiskom, a ostatak je tretiran smešom petroleuma i dihlormetana (2,5 L, 2:1, v/v). Dobijeni talog je filtriran i osušen pod infracrvenim zracima da bi se dobilo naslovno jedinjenje 107 kao bela čvrsta supstanca. (124 g, 55% u tri koraka):<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 10.70 (s, 1H), 8.66(s, 1H), 8.64(s, 1H), 7.48 - 7.28 (m, 5H), 6.44 (d, J = 3.2 Hz, 1H), 5.77(dd, J = 8.4, 3.3 Hz, 1H), 5.24 - 5.14 (m, 1H), 4.65 (d, J = 15.4 Hz, 1H), 4.46 - 4.27 (m, 3H), 3.44 (t, J = 5.3 Hz, 2H), 2.94 (h, J = 6.9 Hz, 1H), 1.13 (d, J = 6.8 Hz, 6H); LC/MS: [(M 1)]<+>= 453.2.

Korak 8

[0120]

[0121] N-(9-((3aR,4S,6R,6aR)-3-benzil-4-((bis(4-metoksifenil)(fenil)metoksi)metil)-2-oksoheksahidrofuro[3,4-d]oksazol-6-il)-9H-purin-6-il)izobutiramid (108): U rastvor N-(9-((3aR,4S,6R,6aR)-3-benzil-4-(hidroksimetil)-2-okso-heksahidrofuro[3,4-d]oksazol-6-il)-9H-purin-6-il)izobutiramid (107, 94 g, 0.21 mol) u destilovanom piridinu (1 L) dodat je 1-[hloro(4-metoksifenil)benzil]-4-metoksibenzen (98 g, 0.29 mol) Dobijeni rastvor je mešan 7 h na sobnoj temperaturi. Po završetku, reakcija je zaustavljena metanolom (50 mL). Reakciona smeša je koncentrovana da bi se dobilo sirovo naslovno jedinjenje 108 u obliku narandžastog ulja, koje je korišćeno u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja (157 g, sirovo ulje: LC/MS: [(M 1)]<+>= 755.3.

[0122] (2R,3R,4S,5S)-2-(6-amino-9H-purin-9-il)-4-(benzilamino)-5-((bis(4-metoksifenil)(fenil) metoksi)metil)-tetrahidrofuran-3-ol (109): Rastvor gore navedenog sirovog proizvoda (108, 157 g) u alkoholu (2 L) tretiran je 10 N vodenim rastvorom natrijum-hidroksida (450 mL) pri refluksu tokom 1 h. Nakon hlađenja na sobnu temperaturu, dobijeni rastvor je koncentrovan na približno jednu trećinu zapremine, a zatim je pH vrednost suspenzije podešena na 8 zasićenim vodenim rastvorom amonijum-hlorida. Dobijena smeša je ekstrahovana sa dihlormetanom (3 × 2 L). Organski slojevi su sjedinjeni i osušeni preko bezvodnog natrijum sulfata. Nakon filtracije, filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom da bi se dobilo sirovo naslovno jedinjenje 109 kao žuta čvrsta supstanca, koje je korišćeno u sledećoj reakciji bez dalje prečišćavanja (137 g, sirova žuta čvrsta supstanca): LC/MS: [(M 1)]<+>= 659.2.

Korak 10

[0123]

[0124] 9-((2R,3R,4R,5S)-4-(benzilamino)-5-((bis(4-metoksifenil)(fenil)metoksi)metil)-3-(tercbutildimetilsililoksi)-tetrahidrofuran-2-il)-9H-purin-6-amin (110): U rastvor gore navedenog sirovog proizvoda (109, 137 g) u destilovanom piridinu (1,5 L) dodat je imidazol (71 g, 1,04 mol) i terc-butilhlorodimetilsilan (94 g, 0,62 mol). Dobijeni rastvor je mešan 15 h na sobnoj temperaturi. Smeša je koncentrovana pod sniženim pritiskom, a ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni sa silika-gelom, eluiranjem sa 20%~40% petrol-etra u etil-acetatu (plus 0,1% TEA, v/v), da bi se dobilo naslovno jedinjenje 110 kao narandžasto ulje. (115g, 71%): LC/MS: [(M 1)]<+>= 773.3.

Korak 11

[0125]

[0126] 9-((2R,3R,4R,5 S)-4-((Z)-benzilideneamino)-5-((bis(4-metoksifenil)(fenil)metoksi) metil)-3-(terc-butildimetilsililoksi)-tetrahidrofuran-2-il)-9H-purin-6-amin (111): Rastvor (E)-N'-(9-((2R,3R,4R,5S)-4-(benzilamino)-5-((bis(4-metoksifenil)(fenil)metoksi)metil)-3-((terc-butil dimetilsilil)oksi)tetrahidrofuran-2-il)-6-okso-6,9-dihidro-1H-purin-2-il)-N,N-dimetilformimid amida (110, 115 g, 148,8 mmol) u acetonitrilu (1,5 L) tretiran je sa diizopropil-azodiformatom (300 g, 1,5 mol) tokom 28 sati na 30 °C. Dobijena smeša je koncentrovana pod sniženim pritiskom da bi se dobilo jedinjenje 111, koje je korišćeno u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja (115 g, braon ulje): LC/MS: [(M 1)]<+>= 771.3.

Korak 12

[0127]

[0128] N-(9-((2R,3R,4R,5S)-4-((Z)-benzilidenamino)-5-((bis(4-metoksifenil)(fenil)metoksi) metil)-3-(terc-butildimetilsililoksi)-tetrahidrofuran-2-il)-9H-purin-6-il)benzamid (112): U rastvor gore navedenog sirovog proizvoda (111, 115 g) u destilovanom piridinu (1 L) dodat je benzoilhlorid (63 g) tokom 30 min na 0 °C. Reakciona smeša je zatim zagrejana na sobnu temperaturu i mešana 3 h. Reakciona smeša je zaustavljena dodatkom metanola (50 mL), a dobijeni rastvor je koncentrovan pod sniženim pritiskom. Ostatak je rastvoren u tetrahidrofuranu (1 L), ohlađen na 0 °C, nakon čega je dodat amonijum-hidroksid (300 mL, 27% u vodi). Dobijeni talog je uklonjen filtracijom. Filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom da bi se dobilo sirovo naslovno jedinjenje 112, koje je korišćeno u sledećoj reakciji bez daljeg prečišćavanja: LC/MS: [( M+ 1)]<+>= 875.3.

Korak 13

[0129]

[0130] N-(9-((2R,3R,4R,5S)-4-amino-3-(terc-butildimetilsililoksi)-5-(hidroksimetil)-tetrahidrofuran-2-il)-9H-purin-6-il)benzamid (INT-C): U rastvor gore navedenog sirovog proizvoda N-(9-((2R,3R,4R,5S)-4-((Z)-benzilidenamino)-5-((bis(4-metoksifenil)(fenil)metoksi) metil)-3-(terc-butildimetilsililoksi)-tetrahidrofuran-2-il)-9H-purin-6-il)benzamida (112, 115 g) u dihlormetanu (1,2 L) i metanolu (120 mL) dodati su Amberlyst-15 (300 g) i voda (25 mL). Nakon 2 sata na sobnoj temperaturi, dobijena smeša je filtrirana i isprana sa dihlormetanom (2 × 200 mL). Čvrste materije su sakupljene i isprane smešom dihlormetana, trietilamina i metanola (3 × 2 L, 7/2/1, v/v/v). Organski slojevi su sjedinjeni i koncentrovani pod sniženim pritiskom, a ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni sa silika-gelom, eluiranjem sa 1%~3% metanola u dihlormetanu (plus 0,1% TEA, v/v), da bi se dobilo naslovno jedinjenje kao bela čvrsta supstanca (INT-C, 26 g, 36% tokom 3 koraka).<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.81 (s, 1H), 8.76 (s, 1H), 8.10 - 8.02 (m, 2H), 7.70 - 7.51 (m, 3H), 6.12 (d, J = 2.8 Hz, 1H), 5.77 (s, 1H), 5.21 (s, 1H), 4.60 (dd, J = 5.1, 2.8 Hz, 1H), 3.88 (dt, J = 6.8, 3.2 Hz, 1H), 3.81 (d, J = 12.0 Hz, 1H), 3.71 - 3.58 (m, 2H), 3.00 (q, J = 7.3 Hz, 10H), 1.18 (t, J = 7.3 Hz, 15H), 0.86 (s, 9H), 0.07 (s, 3H), 0.02 (s, 3H); LC/MS: [(M 1)]<+>= 485.2.

N-(9-((2R,3R,4R,5S)-4-amino-3-((terc-butildimetilsilil)oksi)-5-(hidroksimetil) tetrahidrofuran-2-il)-6-okso-6,9-dihidro-1H-purin-2-il)izobutiramid (INT-D)

[0131]

Korak 1

[0132]

[0133] (E)-N'-(9-((2R,3R,4S,5R)-3,4-dihidroksi-5-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-2-il)-6-okso-6,9-dihidro-1H-purin-2-il)-N,N-dimetilformimidamid (113): U suspenziju 2-amino-9-((2R,3R,4S,5R)-3,4-dihidroksi-5-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-2-il)-1H-purin-6(9H)-ona (360,0 g, 1,27 mol) u metanolu (5 L) dodat je N,N-dimetilformamid dimetil-acetal (393,6 g, 3,31 mol). Dobijena smeša je mešana 3 dana na sobnoj temperaturi. Po završetku, čvrsta supstanca je sakupljena filtracijom, isprana hladnim metanolom (3 × 500 mL) i osušena u vakuum-sušnici da bi se dobilo naslovno jedinjenje kao bezbojna čvrsta supstanca. (113, 330 g, 77%):<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 11.30 (s, 1H), 8.50 (s, 1H), 8.00 (s, 1H), 5.76 (d, J = 6.1 Hz, 1H), 5.37 (d, J = 6.2 Hz, 1H), 5.13 (d, J = 4.6 Hz, 1H), 4.98 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 4.45 (q, J = 5.9 Hz, 1H), 4.08 (td, J = 4.9, 3.2 Hz, 1H), 3.87 (q, J = 3.8 Hz, 1H), 3.67 - 3.43 (m, 2H), 3.12 (s, 3H), 3.00 (s, 3H); LC/MS: [(M 1)]<+>= 339.1.

Korak 2

[0135] (E)-N'-(9-((2R,3R,4S,5R)-5-(((terc-bulildifenilsilil)oksi)metil)-3,4-dihidroksitetra hidrofuran-2-il)-6-okso-6,9-dihidro-1H-purin-2-il)-N,N-dimetilformimidamid (114): U suspenziju (E)-N'-(9-((2R,3R,4S,5R)-3,4-dihidroksi-5-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-2-il)-6-okso-6,9-dihidro-1H-purin-2-il)-N,N-dimetilformimidamida (113, 330 g, 0,97 mol) u piridinu (4 L) dodat je terc-butil(hloro)difensilsilan (294 g, 1,07 mol). Dobijeni rastvor je mešan 3 dana na sobnoj temperaturi da bi se dobio bistar rastvor. Rastvor je koncentrovan pod sniženim pritiskom, a ostatak je trituran sa vodom (3 L) i filtriran. Filter kolač je ispiran vodom (3 × 1 L), dietil-etrom (3 × 1 L) i osušen u vakuum-sušnici da bi se dobilo naslovno jedinjenje 114 kao bezbojna čvrsta supstanca. (506 g, 90%):<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 11.37 (s, 1H), 8.52 (s, 1H), 7.98 (s, 1H), 7.74 - 7.56 (m, 4H), 7.53 - 7.29 (m, 6H), 5.86 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 4.50 (t, J = 5.1 Hz, 1H), 4.28 (t, J = 4.9 Hz, 1H), 4.07 - 3.73 (m, 3H), 3.11 (s, 3H), 3.03 (s, 3H), 0.99 (s, 9H); LC/MS: [(M 1)]<+>= 577.2.

Korak 3

[0136]

[0137] (2R,3S,4S,5R)-4-bromo-5-(((terc-butildifenilsilil)oksi)metil)-2-(2-((E)-((dimetilamino) metilen)amino)-6-okso-1H-purin-9(6H)-il)tetrahidrofuran-3-il acetat (115): U suspenziju (E)-N'-(9-((2R,3R,4S,5R)-5-(((terc-butildifensilsilil)oksi)metil)-3,4-dihidroksitetrahidrofuran-2-il)-6-okso-6,9-dihidro-1H-purin-2-il)-N,N-dimetilformimidamida (114, 300 g, 0,52 mol) u acetonitrilu (4 L) dodata je voda (4,7 g, 0,26 mol), nakon čega je dodat 1-bromo-2-metil-1-oksopropan-2-ilacetat (419 g, 2,0 mol) na 0 °C. Dobijeni rastvor je mešan 4 h na 0 °C, a zatim zaustavljen dodatkom zasićenog vodenog rastvora natrijum bikarbonata (3 L). Organska faza je sakupljena, a vodena faza ekstrahovana etil-acetatom (2 × 1 L). Organski slojevi su sjedinjeni i osušeni preko bezvodnog natrijum sulfata. Nakon filtracije, filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom, a ostatak prečišćen hromatografijom na koloni sa silika-gelom, eluiranjem sa 1% metanola u dihlormetanu, da bi se dobilo naslovno jedinjenje 115 kao žuta čvrsta supstanca. (269 g, 76%):<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.37 (s, 1H), 8.53 (s, 1H), 7.76 (s, 1H), 7.71 - 7.61 (m, 4H), 7.47 - 7.35 (m, 6H), 6.05 (t, J = 2.8 Hz, 1H), 5.99 (d, J = 3.1 Hz, 1H), 4.85 (dd, J = 4.7, 2.4 Hz, 1H), 4.46 (q, J = 5.0 Hz, 1H), 4.02 - 3.83 (m, 2H), 3.08 (s, 3H), 3.03 - 2.97 (m, 3H), 2.10 (s, 3H), 0.98 (s, 9H); LC/MS: [(M 1)]<+>= 681.4, 683.4.

Korak 4

[0138]

[0139] (E)-N'-(9-((2R,3S,4R,5R)-4-bromo-5-(((terc-butildifenilsilil)oksi)metil)-3-hidroksi tetrahidrofuran-2-il)-6-okso-6,9-dihidro-1H-purin-2-il)-N,N-dimetilformimidamid (116): U rastvor (2R,3S,4S,5R)-4-bromo-5-(((terc-butildifensilsilil)oksi)metil)-2-(2-((E)-((dimetilamino)metilen)amino)-6-okso-1H-purin-9(6H)-il)tetrahidrofuran-3-il-acetata (115, 390 g, 0,57 mol) u metanolu (4 L) dodati su N,N-dimetilpiridin-4-amin (3,42 g, 0,03 mol) i trietilamin (230 mL, 1,71 mol). Dobijeni rastvor je mešan 16 h na sobnoj temperaturi. Po završetku, dobijena smeša je koncentrovana pod sniženim pritiskom da bi se dobilo naslovno jedinjenje 116 kao bezbojna čvrsta supstanca, koja je korišćena u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja (360 g).<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.40 (s, 1H), 8.56 (s, 1H), 7.86 (s, 1H), 7.65 (tt, J = 6.2, 1.6 Hz, 4H), 7.53 - 7.35 (m, 6H), 6.49 (d, J = 5.2 Hz, 1H), 5.82 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 4.94 (q, J = 4.3 Hz, 1H), 4.60 (dd, J = 5.4, 3.7 Hz, 1H), 4.48 (q, J = 5.1 Hz, 1H), 4.04 - 3.91 (m, 2H), 3.12 (s, 3H), 3.03 (s, 3H), 1.02 (s, 9H); LC/MS: [(M 1)]<+>= 639.1, 641.1.

Korak 5

[0141] (2R,3S,4S,5R)-4-bromo-5-(((terc-bulildifenilsilil)oksi)metil)-2-(2-((E)-((dimetilamino) metilen)amino)-6-okso-1H-purin-9(6H)-il)tetrahidrofuran-3-il benzilkarbamat (117): U rastvor (E)-N'-(9-((2R,3S,4R,5R)-4-bromo-5-(((terc-butildifensilsilil)oksi)metil)-3-hidroksitetrahidrofuran-2-il)-6-okso-6,9-dihidro-1H-purin-2-il)-N,N-dimetilformimidamida (116, 370 g, 0,58 mol) u acetonitrilu (4 L) dodati su trietilamin (14,6 g, 0,15 mol) i (izocijanatometil)benzen (92,6 g, 0,70 mol). Dobijeni rastvor je mešan 4 h na sobnoj temperaturi. Po završetku, dobijena smeša je koncentrovana pod sniženim pritiskom, a ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni sa silika-gelom, eluiranjem sa 1% metanola u dihlormetanu, da bi se dobilo naslovno jedinjenje 117 kao bezbojna čvrsta supstanca. (317 g, 71%):<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 11.41 (s, 1H), 8.57 (s, 1H), 8.17 (s, 1H), 7.87 - 7.83 (s, 1H), 7.81 - 7.62 (m, 4H), 7.60 - 7.41 (m, 6H), 7.21 - 7.14 (m, 4H), 6.13 (s, 1H), 6.01 (s, 1H), 4.86 (dd, J = 5.0, 3.1 Hz, 1H), 4.52 (q, J = 5.0 Hz, 1H), 4.34 -4.17 (m, 1H), 3.98 - 3.91 (m, 1H), 3.33 (s, 2H), 3.18 (d, J = 4.9 Hz, 1H), 3.03 (d, J = 4.7 Hz, 6H), 1.03 (s, 9H); LC/MS: [(M 1)]<+>= 772.1, 774.1.

[0142] (E)-N'-(9-((3aR,4S,6R,6aR)-3-benzil-4-(((terc-butildifenilsilil)oksi)metil)-2-okso heksahidrofuro[3,4-d]oksazol-6-il)-6-okso-6,9-dihidro-1H-purin-2-il)-N,N-dimetilformimidamid (118): Rastvor (2R,3S,4S,5R)-4-bromo-5-(((terc-butildifensilsilil)oksi)metil)-2-(2-((E)-((dimetilamino)metilen)amino)-6-okso-1H-purin-9(6H)-il)tetrahidrofuran-3-il benzilkarbamat (117, 214 g, 0,27 mol) u tetrahidrofuranu (2,5 L) tretiran je natrijum-terc-butoksidom (79,84 g, 0,83 mol) tokom 1 h na sobnoj temperaturi. Reakcija je zatim zaustavljena dodatkom zasićenog vodenog rastvora amonijum-hlorida (5 L). Organska faza je odvojena, a vodena faza ekstrahovana etil-acetatom (3 × 1 L). Organski slojevi su sjedinjeni i osušeni preko bezvodnog natrijum sulfata. Nakon filtracije, filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom, a ostatak prečišćen hromatografijom na koloni sa silika-gelom, eluiranjem sa 1% metanola u dihlormetanu, da bi se dobilo naslovno jedinjenje 118 kao bezbojna čvrsta supstanca. (147 g, 77%):<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.44 (s, 1H), 8.51 (s, 1H), 7.95 (s, 1H), 7.49 - 7.27 (m, 15H), 6.31 (d, J = 2.6 Hz, 1H), 6.03 (dd, J = 8.4, 2.7 Hz, 1H), 4.69 - 4.53 (m, 2H), 4.46 - 4.35 (m, 2H), 3.56 - 3.43 (m, 2H), 2.98 (d, J = 7.8 Hz, 6H), 0.83 (s, 9H); LC/MS: [(M 1)]<+>= 692.2.

Korak 7

[0144] (E)-N'-(9-((3aR,4S,6R,6aR)-3-benzil-4-(hidroksimetil)-2-oksoheksahidrofuro[3,4-d] oksazol-6-il)-6-okso-6,9-dihidro-1H-purin-2-il)-N,N-dimetilformimidamid (119): Rastvor (E)-N'-(9-((3aR,4S,6R,6aR)-3-benzil-4-(((terc-butildifensilsilil)oksi)metil)-2-oksoheksahidrofuro [3,4-d]oksazol-6-il)-6-okso-6,9-dihidro-1H-purin-2-il)-N,N-dimetilformimidamida (118, 146 g, 0,91 mol) u tetrahidrofuranu (3 L) tretiran je trietilamin-trihidrofluoridom (500 g, 3,5 mol) tokom 16 h na sobnoj temperaturi. Reakcija je zaustavljena dodatkom zasićenog vodenog rastvora natrijum bikarbonata (1 L). Organska faza je odvojena, a vodena faza ekstrahovana etil-acetatom (2 × 1 L). Organski slojevi su sjedinjeni i osušeni preko bezvodnog natrijum sulfata. Nakon filtracije, filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom, a ostatak prečišćen hromatografijom na koloni sa silika-gelom, eluiranjem sa 1% metanola u dihlormetanu, da bi se dobilo naslovno jedinjenje 119 kao bezbojna čvrsta supstanca. (119 g, 87%):<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.36 (s, 1H), 8.52 (s, 1H), 8.02 (s, 1H), 7.45 - 7.29 (m, 5H), 6.23 (d, J = 3.2 Hz, 1H), 5.73 (dd, J = 8.5, 3.2 Hz, 1H), 5.19 - 5.12 (m, 1H), 4.67 (d, J = 15.4 Hz, 1H), 4.46 - 4.20 (m, 3H), 3.47 - 3.37 (m, 2H), 3.03 (d, J = 7.7 Hz, 6H); LC/MS: [(M 1)]<+>= 454.1.

Korak 8

[0145]

[0146] (E)-N'-(9-((3aR,4S,6R,6aR)-3-benzil-4-((bis(4-metoksifenil)(fenil)metoksi)metil)-2-oksoheksahidrofuro[3,4-d]oksazol-6-il)-6-okso-6,9-dihidro-1H-purin-2-il)-N,N-dimetil formimidamid (120): Rastvor (E)-N'-(9-((3aR,4S,6R,6aR)-3-benzil-4-(hidroksimetil)-2-oksoheksahidrofuro[3,4-d]oksazol-6-il)-6-okso-6,9-dihidro-1H-purin-2-il)-N,N-dimetilformimidamida (119, 55 g, 0,12 mol) u dihlormetanu (500 mL) dodat je trietilamin (18 g, 0,18 mol) i 1-[hloro(4-metoksifenil)benzil]-4-metoksibenzen (49 g, 0,14 mol). Dobijeni rastvor je mešan 16 h na sobnoj temperaturi. Po završetku, reakcija je zaustavljena dodatkom zasićenog vodenog rastvora natrijum bikarbonata (1 L). Organska faza je odvojena, a vodena faza ekstrahovana dihlormetanom (2 × 200 mL). Organski slojevi su sjedinjeni i osušeni preko bezvodnog natrijum sulfata. Nakon filtracije, filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom, a ostatak prečišćen hromatografijom na koloni sa silika-gelom, eluiranjem sa 1% metanola u dihlormetanu (plus 0,1% TEA, v/v), da bi se dobilo naslovno jedinjenje 120 kao crvena čvrsta supstanca. (71 g, 78%):<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.37 (s, 1H), 8.30 (s, 1H), 7.95 (s, 1H), 7.32 (q, J = 3.6 Hz, 3H), 7.26 - 7.12 (m, 7H), 7.10 - 6.98 (m, 4H), 6.79 - 6.68 (m, 4H), 6.32 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 5.93 (dd, J= 8.3, 2.4 Hz, 1H), 4.66 (d, J = 15.8 Hz, 1H), 4.52 - 4.30 (m, 3H), 3.73 (d, J = 2.3 Hz, 6H), 3.04 (td, J = 10.2, 6.2 Hz, 1H), 2.95 (s, 3H), 2.86 (s, 3H), 2.76 (dd, J = 9.9, 5.5 Hz, 1H); LC/MS: [(M 1)]<+>= 756.2.

[0147] 2-amino-9-((2R,3R,4S,5S)-4-(benzilamino)-5-((bis(4-metoksifenil)(fenil)metoksi)metil)-3-hidroksitetrahidrofuran-2-il)-1H-purin-6(9H)-on (121): Rastvor (E)-N'-(9-((3aR,4S,6R,6aR)-3-benzil-4-((bis(4-metoksifenil)(fenil)metoksi)metil)-2-oksoheksahidrofuro[3,4-d]oksazol-6-il)-6-okso-6,9-dihidro-1H-purin-2-il)-N,N-dimetilformimidamida (120, 90 g, 0,12 mol) u metanolu (1 L) tretiran je 10 N vodenim rastvorom natrijum-hidroksida (400 mL) tokom 16 h na 55 °C. Nakon hlađenja na sobnu temperaturu, dobijeni rastvor je koncentrovan na približno jednu trećinu zapremine, a zatim je pH vrednost suspenzije podešena na 8–9 sa 4 N hlorovodoničnom kiselinom (1 L). Dobijena smeša je ekstrahovana etil-acetatom (2 × 500 mL). Organski slojevi su sjedinjeni i osušeni preko bezvodnog natrijum sulfata. Nakon filtracije, filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom, a ostatak prečišćen hromatografijom na koloni sa silika-gelom, eluiranjem sa 1% do 2% metanola u dihlormetanu (plus 0,1% TEA, v/v), da bi se dobilo naslovno jedinjenje 121 kao crvena čvrsta supstanca. (66 g, 83%):<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.65 (s, 1H), 7.78 (s, 1H), 7.36 - 7.15 (m, 14H), 6.88 - 6.78 (m, 4H), 6.48 (s, 2H), 5.90 (d, J = 4.9 Hz, 1H), 5.82 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 4.54 (td, J = 4.8, 2.5 Hz, 1H), 3.91 (ddd, J = 7.5, 4.7, 2.6 Hz, 1H), 3.80 (d, J = 13.5 Hz, 1H), 3.71 (s, 6H), 3.70 (d, J = 11.9 Hz, 1H), 3.48 (d, J = 9.3 Hz, 1H), 3.24 (dd, J = 10.6, 2.7 Hz, 1H), 3.16 (dd, J = 10.4, 4.8 Hz, 1H), 2.25 (s, 1H); LC/MS: [(M 1)]<+>= 675.2.

[0148] 2-amino-9-((2R,3R,4R,5 S)-4-(benzilamino)-5-((bis(4-metoksifenil)(fenil)metoksi)metil)-3-((tercbutildimetilsilil)oksi)tetrahidrofuran-2-il)-1H-purin-6(9H)-on (122): U rastvor 2-amino-9-((2R,3R,4S,5S)-4-(benzilamino)-5-((bis(4-metoksifenil)(fenil)metoksi)metil)-3-hidroksi-tetra hidrofurano-2-il)-1H-purin-6(9H)-on (90 g, 0,13 mol) u piridinu (1 L) dodati su imidazol (45 g, 0,67 mol) i terc-butilhlorodimetilsilan (50 g, 0,33 mol). Dobijeni rastvor je mešan 16 h na sobnoj temperaturi, a zatim je reakcija zaustavljena dodatkom metanola (10 mL). Dobijena smeša je koncentrovana pod sniženim pritiskom, a ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni sa silikagelom, eluiranjem sa 1% do 2% metanola u dihlormetanu (plus 0,1% TEA, v/v), da bi se dobilo naslovno jedinjenje 122 kao žuta čvrsta supstanca. (75 g, 71%):<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.50 (s, 1H), 7.82 (s, 1H), 7.45 - 7.11 (m, 14H), 6.86 (dd, J = 8.8, 2.7 Hz, 4H), 6.43 (s, 2H), 5.83 (d, J = 4.2 Hz, 1H), 4.75 (t, J = 4.8 Hz, 1H), 3.98 (dd, J = 6.1, 2.9 Hz, 1H), 3.77 - 3.73 (m, 8H), 3.47 - 3.14 (m, 3H), 2.05 (q, J = 6.5 Hz, 1H), 0.80 (s, 9H), 0.00 (s, 3H), -0.08 (s, 3H); LC/MS:

[(M 1)]<+>= 789.3.

[0149] (E)-N'-(9-((2R,3R,4R,5S)-4-(benzilamino)-5-((bis(4-metoksifenil)(fenil)metoksi)metil)-3-((terc-bulildimetilsilil)oksi)tetrahidrofuran-2-il)-6-okso-6,9-dihidro-1H-purin-2-il)-N,N-dimetilformimidamid (123): U rastvor 2-amino-9-((2R,3R,4R,5S)-4-(benzilamino)-5-((bis(4-metoksifenil)(fenil)metoksi)metil)-3-((terc-butildimetilsilil)oksi)tetrahidrofurano-2-il)-1H-purin6(9H)-on (122, 100 g, 0,13 mol) u metanolu (1 L) dodat je N,N-dimetilformamid dimetil-acetal (52 g, 0,44 mol). Dobijeni rastvor je mešan 24 h na sobnoj temperaturi. Po završetku, dobijena smeša je koncentrovana pod sniženim pritiskom da bi se dobilo naslovno jedinjenje 123, koje je korišćeno u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja (100 g, žuta čvrsta supstanca). LC/MS: [(M 1)]<+>= 844.7.

Korak 12

[0150]

[0151] (1E)-N'-(9-((2R,3R,4R,5 S)-4-(benzilideneamino)-5-((bis(4-metoksifenil)(fenil)metoksi) metil)-3-((tercbutildimetilsilil)oksi)tetrahidrofuran-2-il)-6-okso-6,9-dihidro-1H-purin-2-il)-N,N-dimetilformimidamid (124): Rastvor (E)-N'-(9-((2R,3R,4R,5S)-4-(benzilamino)-5-((bis(4-metoksifenil)(fenil)metoksi)metil)-3-((terc-butildimetilsilil)oksi)tetrahidrofurano-2-il)-6-okso-6,9-dihidro-1H-purin-2-il)-N,N-dimetilformimidamida (123, 59 g, 69,90 mmol) u acetonitrilu (600 mL) tretiran je diizopropil-azodiformatom (141 g, 699 mmol) tokom 18 h na sobnoj temperaturi. Dobijena smeša je koncentrovana pod sniženim pritiskom, a ostatak je eluiran kroz kratku kolonu sa silika-gelom da bi se uklonio višak diizopropil-azodiformata (eluirano sa 10% etil-acetata u petrol-etru plus 0,1% trietilamina, zatim sa 2% metanola u dihlormetanu plus 0,1% TEA), da bi se dobilo sirovo naslovno jedinjenje 124, koje je korišćeno u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja (89 g, braon ulje). LC/MS: [(M 1)]<+>= 842.4.

Korak 13

[0153] 2-amino-9-((2R,3R,4R,5S)-4-(benzilidenamino)-5-((bis(4-metoksifenil)(fenil)metoksi) metil)-3-((tercbutildimetilsilil)oksi)tetrahidrofuran-2-il)-1H-purin-6(9H)-on (125): Gore navedeni sirovi (1E)-N'-(9-((2R,3R,4R,5S)-4-(benzilideneamino)-5-((bis(4-metoksifenil)(fenil) metoksi)metil)-3-((terc-butildimetilsilil)oksi)tetrahidrofuran-2-il)-6-okso-6,9-dihidro-1H-purin-2-il)-N,N-dimetilformimidamida (55 g) tretiran je metilaminom (124, 300 mL, 30% rastvor u alkoholu) tokom 10 min na ambijentalnoj temperaturi. Isparljive supstance su destilovane pod sniženim pritiskom da bi se dobilo sirovo naslovno jedinjenje 125, koje je korišćeno u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja (45 g, žuto ulje). LC/MS: [(M 1)]<+>= 699.3.

[0154] N-(9-((2R,3R,4R,5S)-4-(benzilidenamino)-5-((bis(4-metoksifenil)(fenil)metoksi)metil)-3-((tercbutildimetilsilil)oksi)tetrahidrofuran-2-il)-6-okso-6,9-dihidro-1H-purin-2-il)izobutiramid (126): Gore navedeni sirovi 2-amino-9-((2R,3R,4R,5S)-4-(benzilidenamino)-5-((bis(4-metoksifenil)(fenil)metoksi)metil)-3-((terc-butildimetilsilil)oksi)tetrahidrofuran-2-il)-1H-purin-6(9H)-on (125, 45 g) rastvoren je u suvom piridinu (500 mL), ohlađen na 0–5 °C, nakon čega je dodat izobutiril-hlorid (13,5 g, 0,13 mol). Nakon 1 h, reakcija je zaustavljena dodatkom metanola (50 mL) i koncentrovana pod sniženim pritiskom da bi se dobilo sirovo naslovno jedinjenje 126 kao braon ulje (57 g). LC/MS: [(M 1)]<+>= 787.3.

Korak 15

[0155]

[0156] N-(9-((2R,3R,4R,5S)-4-amino-3-((terc-butildimetilsilil)oksi)-5-(hidroksimetil)tetra hidrofuran-2-il)-6-okso-6,9-dihidro-1H-purin-2-il)izobuliramid (INT-D): U gore navedeni sirovi rastvor N-(9-((2R,3R,4R,5S)-4-(benzilideneamino)-5-((bis(4-metoksifenil)(fenil)metoksi)metil)-3-((terc-butildimetilsilil)oksi)tetrahidrofuran-2-il)-6-okso-6,9-dihidro-1H-purin-2-il)izobutiramida (126, 57 g) u dihlormetanu (600 mL) i metanolu (60 mL) dodat je Amberlyst-15 (114 g) i voda (14 mL). Nakon 2 h na sobnoj temperaturi, dobijena smeša je filtrirana i oprana sa 10% metanola u dihlormetanu (300 mL). Čvrsta supstanca je sakupljena i oprana sa 20% trimetilamina u dihlormetanu (3 × 500 mL). Sjedinjeni organski slojevi su koncentrovani pod sniženim pritiskom, a ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni sa silika-gelom, eluiranjem sa 1%–4% metanola u dihlormetanu, da bi se dobilo naslovno jedinjenje INT-D kao bezbojna čvrsta supstanca (10 g, 31% preko 4 koraka) :<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.59 (s, 1H), 8.28 (s, 1H), 5.88 (d, J = 4.6 Hz, 1H), 5.01 (s, 1H), 4.50 (t, J = 5.0 Hz, 1H), 3.78 (q, J = 4.0 Hz, 1H), 3.69 (d, J = 11.8 Hz, 1H), 3.62 - 3.48 (m, 2H), 2.79 (m, 1H), 1.13 (d, J = 6.8 Hz, 6H), 0.81 (s, 9H), 0.01 (s, 3H), -0.12 (s, 3H); LC/MS: [(M 1)]<+>= 467.2.

N-(9-((2R,3R,4R,5R)-3-fluoro-4-hidroksi-5-((tritilamino)metil)tetrahidrofuran-2-il)-9H-purin-6-il)benzamid (INT-E)

[0157]

Korak 1

[0158]

[0159] N-(9-((2R,3R,4R,5R)-3-fluoro-4-hidroksi-5-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-2-il)-9H-purin-6-il)benzamid (127). U suspenziju (2R,3R,4R)-5-(6-amino-9H-purin-9-il)-4-fluoro-2-(hidroksimetil)oksolan-3-ol (20,0 g, 74,3 mmol) u piridinu (400 mL) dodat je trimetilsilil-hlorid (40,2 g, 372,2 mmol) na 0 °C tokom 5 min. Suspenzija je mešana na sobnoj temperaturi 30 min, nakon čega je dodat benzoil-hlorid (31,2 g, 233,1 mmol) na 0 °C tokom 5 min. Suspenzija je mešana na sobnoj temperaturi 2 h. Po završetku, reakcija je zaustavljena hladnom vodom (100 mL) i vodenim rastvorom amonijaka (240 mL, 25% m/m). Dobijena smeša je mešana 20 min na ambijentalnoj temperaturi, a zatim koncentrovana pod sniženim pritiskom. Ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni sa silika-gelom, eluiranjem sa 10% metanola u dihlormetanu, da bi se dobilo naslovno jedinjenje 127 kao bezbojna čvrsta supstanca. (25 g, 45%):<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 11.25 (s, 1H), 8.78 (s, 1H), 8.72 (s, 1H), 8.12 - 7.99 (m, 2H), 7.74 - 7.49 (m, 3H), 6.39 (dd, J = 17.2, 2.4 Hz, 1H), 5.77 (d, J = 6.2 Hz, 1H), 5.53 (ddd, J = 52.8, 4.4, 2.4 Hz, 1H), 5.17 (t, J = 5.4 Hz, 1H), 4.68 - 4.44 (m, 1H), 4.02 (dt, J = 6.9, 3.4 Hz, 1H), 3.80 (d, J = 12.4 Hz, 1H), 3.62 (dt, J = 12.5, 4.5 Hz, 1H);<19>F NMR (282 MHz, DMSO-d6) δ -203.61; LC/MS (ESI, m/z): [(M+1)]<+>= 374.0.

Korak 2

[0160]

[0161] N-(9-((2R,3R,4R,5S)-3-fluoro-4-hidroksi-5-(jodometil)tetrahidrofuran-2-il)-9H-purin-6-il)benzamid (128): U smešu N-(9-((2R,3R,4R,5R)-3-fluoro-4-hidroksi-5-(hidroksimetil) tetrahidrofuran-2-il)-9H-purin-6-il)benzamida (127, 19,3 g, 51,6 mmol) i trifenilfosfina (33,8 g, 128,9 mmol) u piridinu (350 mL) dodat je rastvor joda (28,8 g, 113,6 mmol) u piridinu (50 mL) ispod 20 °C tokom 10 min. Dobijeni tamni rastvor je mešan 16 h na sobnoj temperaturi. Zatim je reakcija zaustavljena dodatkom zasićenog vodenog rastvora natrijum-hiposulfita (800 mL) i ekstrahovana etil-acetatom (3 × 500 mL). Sjedinjeni organski slojevi su oprani slanom vodom (800 mL) i osušeni preko bezvodnog natrijum sulfata. Nakon filtracije, filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom. Sirovi proizvod je prekristalisan iz metanola da bi se dobilo čisto naslovno jedinjenje 128 kao braon čvrsta supstanca. (15 g, 60%):<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 11.27 (s, 1H), 8.79 (s, 1H), 8.67 (s, 1H), 8.12 - 8.00 (m, 2H), 7.73 - 7.49 (m, 3H), 6.42 (dd, J = 19.7, 2.1 Hz, 1H), 6.04 (d, J = 6.3 Hz, 1H), 5.74 (ddd, J = 52.5, 4.7, 2.1 Hz, 1H), 4.58 (dq, J = 18.7, 5.9 Hz, 1H), 3.96 (td, J = 7.0, 3.9 Hz, 1H), 3.68 (dd, J = 11.0, 3.9 Hz, 1H), 3.50 (dd, J= 11.0, 6.6 Hz, 1H);<19>F NMR (282 MHz, DMSO-d6) δ -201.53; LC/MS (ESI, m/z): [(M 1)]<+>= 484.0.

Korak 3

[0162]

[0163] N-(9-((2R,3R,4R,5R)-5-(azidometil)-3-fluoro-4-hidroksitetrahidrofuran-2-il)-9H-purin-6-il)benzamid (129) U rastvor N-(9-((2R,3R,4R,5S)-3-fluoro-4-hidroksi-5-(jodometil)tetrahidrofuran-2-il)-9H-purin-6-il)benzamida (128, 15 g, 31,1 mmol) u N-metilpirolidonu (220 mL) dodat je natrijum-azid (4,1 g, 62,2 mmol). Dobijena smeša je mešana 8 h na sobnoj temperaturi. Po završetku, rastvor je izliven u dietil-etar (4 L). Čvrsta supstanca se taložila i sakupljena filtracijom da bi se dobilo naslovno jedinjenje 129 kao braon čvrsta supstanca. (9.2 g, 74%):<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 11.25 (s, 1H), 8.80 (s, 1H), 8.67 (s, 1H), 8.11 - 8.01 (m, 2H), 7.72 - 7.50 (m, 3H), 6.43 (dd, J = 19.9, 2.0 Hz, 1H), 5.94 (d, J = 6.4 Hz, 1H), 5.68 (ddd, J = 52.5, 4.8, 2.0 Hz, 1H), 4.79 (dddd, J = 21.2, 7.8, 6.6, 4.7 Hz, 1H), 4.14 (ddd, J = 7.9, 5.4, 2.5 Hz, 1H), 3.77 (dd, J = 13.7, 2.9 Hz, 1H), 3.59 (dd, J = 13.6, 5.7 Hz, 1H);<19>F NMR (282 MHz, DMSO-d6) δ -201.66; LC/MS (ESI, m/z): [(M 1)]<+>= 399.0.

Korak 4

[0164]

[0165] N-(9-((2R,3R,4R,5R)-5-(aminometil)-3-fluoro-4-hidroksitetrahidrofuran-2-il)-9H-purin-6-il)benzamid (130): U rastvor N-(9-((2R,3R,4R,5R)-5-(azidometil)-3-fluoro-4-hidroksitetrahidrofuran-2-il)-9H-purin-6-il)benzamida (129, 16,1 g, 40,4 mmol) u tetrahidrofuranu (160 mL) i vodi (32 mL) dodat je trifenilfosfin (31,7 g, 120,8 mmol). Dobijeni rastvor je mešan 3 h na sobnoj temperaturi. Rastvor je zatim razblažen metanolom (200 mL) i filtriran. Filter kolač je prikupljen da bi se dobilo naslovno jedinjenje 130 kao bezbojna čvrsta supstanca (13 g, 86%).<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 8.76 (s, 1H), 8.75 (s, 1H), 8.10 - 7.98 (m, 2H), 7.72 - 7.47 (m, 3H), 6.35 (dd, J = 17.9, 2.7 Hz, 1H), 5.59 (ddd, J = 52.9, 4.7, 2.8 Hz, 1H), 4.57 (ddd, J = 18.8, 7.0, 4.8 Hz, 1H), 3.95 (dd, J = 7.3, 3.8 Hz, 1H), 2.94 (dd, J = 13.8, 3.8 Hz, 1H), 2.80 (dd, J = 13.8, 5.2 Hz, 1H);<19>F NMR (282 MHz, DMSO-d6) δ -203.45; LC/MS (ESI, m/z): [(M 1)]<+>= 373.0.

Korak 5

[0166]

[0167] N-(9-((2R,3R,4R,5R)-3-fluoro-4-hidroksi-5-((tritilamino)metil)tetrahidrofuran-2-il)-9H-purin-6-il)benzamid (INT-E): U rastvor N-(9-((2R,3R,4R,5R)-5-(aminometil)-3-fluoro-4-hidroksi-tetrahidrofuran-2-il)-9H-purin-6-il)benzamida (130, 3,0 g, 8,1 mmol) u piridinu (30 mL) dodati su trietilamin (1,2 g, 12,1 mmol) i trifenilmetil-hlorid (2,4 g, 8,6 mmol). Dobijeni rastvor je mešan 3 h na sobnoj temperaturi. Reakcija je zatim zaustavljena dodatkom metanola (0,2 mL) i koncentrovana pod sniženim pritiskom. Ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni sa silikagelom, eluiranjem sa 20%–40% etil-acetata u petrol-etru, da bi se dobilo naslovno jedinjenje INT-E kao bezbojna čvrsta supstanca. (4.8 g, 98%):<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.22 (s, 1H), 8.63 (s, 1H), 8.39 (s, 1H), 8.09 - 7.98 (m, 2H), 7.71 - 7.61 (m, 1H), 7.55 (dd, J = 8.3, 7.0 Hz, 2H), 7.44 - 7.34 (m, 6H), 7.32 - 7.10 (m, 9H), 6.36 (dd, J = 18.3, 2.9 Hz, 1H), 5.85 - 5.60 (m, 2H), 4.87 (dq, J = 17.7, 5.9 Hz, 1H), 4.19 - 4.09 (m, 1H), 2.88 (dd, J = 9.8, 6.1 Hz, 1H), 2.43 (ddd, J = 15.1, 9.9, 5.4 Hz, 1H), 2.32 (ddd, J = 12.6, 6.1, 3.2 Hz, 1H);<19>F NMR (376 MHz, DMSO-d6) δ -203.14; LC/MS (ESI, m/z): [(M 1)]<+>= 615.0.

Priprema analoga

Diamonijum (1S,6S,8R,9R,10S,15S,17R,18R)-8-(2-amino-6-okso-6,9-dihidro-1H-purin-9-il)-17-(6-amino-9H-purin-9-il)-9,18-dihidroksi-3,12-diokso-4,7,13,16-tetraoksa-2,11-diaza-3λ<5>,12λ<5>-difosfatriciklo[13.3.0.0<6>,<10>]oktadekan-3,12-bis(olat)

[0168]

Korak 1

[0169]

[0170] ((2S,3R,4R,5R)-4-((terc-butildimetilsilil)oksi)-5-(2-izobutiramid-6-okso-1H-purin-9(6H)-il)-3-(tritilamino)tetrahidrofuran-2-il)metil (2-cijanoetil) diizopropilfosforamidit (132): U rastvor N-(9-((2R,3R,4R,5S)-3-((terc-butildimetilsilil)oksi)-5-(hidroksimetil)-4-(tritilamino)tetrahidro furano-2-il)-6-okso-6,9-dihidro-1H-purin-2-il)izobutiramida (131, 700 mg, 0,98 mmol) u acetonitrilu (5 mL) dodati su 3-(bis[bis(propan-2-il)amino]fosfaniloksi)propanonitril (595 mg, 1,97 mmol) i piridijum-trifluoroacetat (285 mg, 1,48 mmol). Dobijeni rastvor je mešan 45 min na sobnoj temperaturi. Dobijeni rastvor jedinjenja 132 korišćen je u sledećem koraku bez daljeg obrađivanja. LC/MS (ESI, m/z): [(M 1)]<+>= 909.4.

Korak 2

[0171]

[0172] ((2S,3R,4R,5R)-4-((terc-butildimetilsilil)oksi)-5-(2-izobutiramid-6-okso-1H-purin-9(6H)-il)-3-(tritilamino)tetrahidrofuran-2-il)metil (2-cijanoetil) fosfonat (133): U gornji rastvor jedinjenja 132 dodata je voda (0,18 g, 10 mmol) i piridijum-trifluoroacetat (0,28 g, 1,48 mmol).

Dobijeni rastvor je mešan 30 min na sobnoj temperaturi. Po završetku, rastvor je nanesen na reverzno-faznu C18 kolonu, eluiranjem sa 70%–95% (25 min) acetonitrila u vodi, da bi se dobilo naslovno jedinjenje 133 kao bezbojna čvrsta supstanca (0,64 g, preko dva koraka 78%).<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.12 (s, 1H), 11.40 (d, J = 5.9 Hz, 1H), 8.16 (d, J = 12.5 Hz, 1H), 7.57 - 7.45 (m, 6H), 7.37 (t, J = 7.6 Hz, 6H), 7.32 - 7.22 (m, 3H), 6.18 (dd, J = 6.5, 4.4 Hz, 1H), 4.60 (dt, J = 19.0, 6.0 Hz, 1H), 4.20 - 4.07 (m, 1H), 4.02 (ddt, J = 11.6, 8.5, 5.8 Hz, 2H), 3.79 - 3.64 (m, 2H), 2.95 (dt, J = 4.8, 2.1 Hz, 1H), 2.89 - 2.73 (m, 3H), 1.15 (dd, J = 6.9, 3.0 Hz, 6H), 0.77 (s, 9H), -0.11 (d, J = 3.3 Hz, 3H), -0.40 (d, J = 9.8 Hz, 3H);<31>P NMR (162 MHz, DMSO-d6) δ 9.92, 9.09; LC/MS (ESI, m/z): [(M 1)]<+>= 826.3.

Korak 3

[0173]

[0174] ((2S,3R,4R,5R)-4-((terc-bulildimetilsilil)oksi)-5-(2-izobuliramid-6-okso-1H-purin-9(6H)-il)-3-(tritilamino)tetrahidrofuran-2-il)metil (2-cijanoetil) ((2S,3R,4R,5R)-5-(6-benzamido-9H-purin-9-il)-4-((terc-butildimetilsilil)oksi)-2-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-3-il) fosforamidat (134): U smešu [(2S,3R,4R,5R)-4-[(terc-butildimetilsilil)oksi]-5-[2-(2-metilpropanamido)-6-okso-6,9-dihidro-1H-purin-9-il]-3-[(trifenilmetil)amino]oksolan-2-il]metil 2-cijanoetil fosfonata (133, 640 mg, 0,71 mmol) i N-(9-((2R,3R,4R,5S)-4-amino-3-((terc-butildimetilsilil)oksi)-5-(hidroksimetil)tetrahidrofurano-2-il)-9H-purin-6-il)benzamida (INT-C, 375 mg, 0,71 mmol) u acetonitrilu (8 mL) dodati su N,N-diizopropiletilamin (200 mg, 1,55 mmol) i ugljen-tetrahlorid (477 mg, 3,10 mmol). Dobijena smeša je mešana 30 min na sobnoj temperaturi. Po završetku, smeša je nanesena na reverzno-faznu C18 kolonu, eluiranjem sa 70%–95% (25 min) acetonitrila u vodi, da bi se dobilo naslovno jedinjenje 134 kao bezbojna čvrsta supstanca. (440 mg, 43%):<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.07 (d, J= 8.7 Hz, 1H), 11.45 (d, J = 10.8 Hz, 1H), 11.17 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 8.77 - 8.68 (m, 1H), 8.17 (d, J = 5.4 Hz, 1H), 8.04 (dd, J = 13.6, 7.7 Hz, 2H), 7.68 - 7.59 (m, 1H), 7.59 - 7.40 (m, 9H), 7.30 (td, J = 8.1, 3.1 Hz, 6H), 7.20 (q, J = 7.5 Hz, 4H), 6.30 -5.95 (m, 2H), 5.24 - 4.97 (m, 2H), 4.64 - 4.53 (m, 1H), 4.52 - 4.37 (m, 1H), 4.07 (d, J= 16.0 Hz, 1H), 4.02 - 3.70 (m, 5H), 3.56 (q, J = 16.1, 12.7 Hz, 2H), 3.23 (s, 1H), 2.85 - 2.65 (m, 4H), 1.07 (dt, J = 9.8, 5.8 Hz, 6H), 0.91 - 0.59 (m, 18H), 0.02 - -0.25 (m, 9H), -0.50 (d, J = 26.5 Hz, 3H);<31>P NMR (162 MHz, DMSO-d6) δ 8.72, 8.62; LC/MS (ESI, m/z): [(M 1)]<+>= 1308.5.

Korak 4

[0175]

[0176] ((2S,3R,4R,5R)-4-((terc-butildimetilsilil)oksi)-5-(2-izobutiramido-6-okso-1H-purin-9(6H)-il)-3-(tritilamino)tetrahidrofuran-2-il)metil (2-cijanoetil) ((2S,3R,4R,5R)-5-(6-benzamido-9H-purin-9-il)-4-((terc-butildimetilsilil)oksi)-2-((((2-cijanoetoksi)(diizopropilamino)fosfino) oksi)metil)tetrahidrofuran-3-il)fosforamidat (135): U rastvor ((2S,3R,4R,5R)-4-(tercbutildimetilsililoksi)-5-(2-izobutiramido-6-okso-1,6-dihidropurin-9-il)-3-(tritilamino)-tetrahidro furano-2-il)metil 2-cijanoetil (2S,3R,4R,5R)-5-(6-benzamido-9H-purin-9-il)-4-(tercbutildimetilsililoksi)-2-(hidroksimetil)-tetrahidrofurano-3-ilfosforamidat (134, 440 mg, 0,34 mmol) u acetonitrilu (2 mL) dodati su 3-(bis[bis(propan-2-il)amino]fosfaniloksi)propanonitril (203 mg, 0,67 mmol) i piridijum-trifluoroacetat (97 mg, 0,50 mmol). Dobijena smeša je mešana 45 min na sobnoj temperaturi i korišćena je direktno u sledećem koraku.

Korak 5

[0177]

[0178] ((2S,3R,4R,5R)-4-(terc-butildimetilsililoksi)-5-(2-izobutiramido-6-okso-1,6-dihidropurin-9-il)-3-(tritilamino)-tetrahidrofuran-2-il)metil 2-cijanoetil (2S,3R,4R,5R)-5-(6-benzamido-9H-purin-9-il)-4-(terc-butildimetilsililoksi)-2-(((2-cijanoetoksi)hidrofosforiloksi)metil)-tetrahidro furan-3-ilfosforamidat (136): U rastvor iz prethodnog koraka dodata je voda (0,06 g, 3,36 mmol) i piridijum-trifluoroacetat (0,10 g, 0,51 mmol). Dobijeni rastvor je mešan 45 min na sobnoj temperaturi. Po završetku, rastvor je nanesen na reverzno-faznu C18 kolonu, eluiranjem sa 70%– 95% (25 min) acetonitrila u vodi, da bi se dobilo naslovno jedinjenje 136 kao bezbojna čvrsta supstanca. (400 mg, 83%):<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.09 (d, J = 9.1 Hz, 1H), 11.48 -11.38 (m, 1H), 11.20 (d, J = 3.2 Hz, 1H), 8.79 - 8.51 (m, 2H), 8.24 - 8.14 (m, 1H), 8.08 - 7.99 (m, 2H), 7.84 - 7.12 (m, 20H), 6.28 - 5.88 (m, 2H), 5.09 (q, J = 9.7, 8.5 Hz, 1H), 4.77 - 4.58 (m, 1H), 4.46 - 3.72 (m, 10H), 3.60 (t, J = 11.7 Hz, 1H), 3.25 (d, J = 15.0 Hz, 1H), 2.91 - 2.67 (m, 6H), 1.25 - 1.05 (m, 6H), 0.86 - 0.66 (m, 18H), 0.01 - -0.18 (m, 10H), -0.48 (d, J = 24.4 Hz, 2H);<31>P NMR (162 MHz, DMSO-d6) δ 9.75, 9.71, 9.23, 9.14, 8.49, 8.34; LC/MS (ESI, m/z): [(M 1)]<+>= 1425.5.

[0179] ((2S,3R,4R,5R)-3-amino-4-(terc-butildimetilsililoksi)-5-(2-izobutiramido-6-okso-1,6-dihidropurin-9-il)-tetrahidrofuran-2-il)metil 2-cijanoetil (2S,3R,4R,5R)-5-(6-benzamido-9H-purin-9-il)-4-(terc-butildimetilsililoksi)-2-(((2-cijanoetoksi)hidrofosforiloksi)metil)-tetrahidro furan-3-ilfosforamidat (137): U rastvor ((2S,3R,4R,5R)-4-(terc-butildimetilsililoksi)-5-(2-isobutiramido-6-okso-1,6-dihidropurin-9-il)-3-(tritilamino)-tetrahidrofurano-2-il)metil 2-cijanoetil (2S,3R,4R,5R)-5-(6-benzamido-9H-purin-9-il)-4-(terc-butildimetilsililoksi)-2-(((2-cijanoetoksi)hidroksifosforiloksi)metil)-tetrahidrofurano-3-ilfosforamidat (136, 400 mg, 0,28 mmol) u dihlormetanu (8 mL) dodati su voda (25 mg, 1,40 mmol) i dihlorsirćetna kiselina (640 mg, 2,81 mmol). Dobijeni rastvor je mešan 10 min na sobnoj temperaturi. Po završetku, reakcija je zaustavljena dodatkom zasićenog vodenog rastvora natrijum bikarbonata (30 mL). Dobijena smeša je ekstrahovana dihlormetanom (3 x 30 mL). Organske faze su kombinovane i sušene preko bezvodnog natrijum sulfata. Nakon filtracije, filtrat je koncentrovan pod smanjenim pritiskom da bi se dobilo naslovno jedinjenje 137, koje je korišćeno u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja.

Korak 7

[0181] N-{9-[(1R,6S,8R,9R,10R,15S,17R,18R)-9,18-bis[(terc-butildimetilsilil)oksi]-3,12-bis(2-cijanoetoksi)-17-[2-(2-metilpropanamido)-6-okso-6,9-dihidro-1H-purin-9-il]-3,12-diokso-4,7,13,16-tetraoksa-2,11-diaza-3λ<5>,12<5>-difosfatriciklo[13.3.0.0<6>,<10>]oktadekan-8-il]-9H-purin-6-yl}benzamid (138)137, 332 mg) u acetonitrilu (56 mL) dodati su trietilamin (1,1 mL) i ugljen tetrahlorid (1,1 mL). Dobijeni rastvor je mešan 10 min na sobnoj temperaturi. Po završetku, rastvor je koncentrovan pod smanjenim pritiskom da bi se dobilo sirovo naslovno jedinjenje 138, koje je korišćeno u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja.

Korak 8

[0183] (1R,6S,8R,9R,10R,15S,17R,18R)-8-(2-amino-6-okso-6,9-dihidro-1H-purin-9-il)-17-(6-amino-9H-purin-9-il)-9,18-bis[(terc-butildimetilsilil)oksi]-3,12-diokso-4,7,13,16-tetraoksa-2,11-diaza-3λ<5>,12<5>-difosfatriciklo[13.3.0.0<6>,<10>]oktadekan-3,12-bis(olat); bis(metanaminijum) (139).

138 je tretirano rastvorom metilamina u alkoholu (14 mL, 30%, m/m) 30 min na sobnoj temperaturi. Po završetku, dobijeni rastvor je koncentrovan pod smanjenim pritiskom da bi se dobilo naslovno jedinjenje 139 kao bezbojna čvrsta supstanca, koja je korišćena u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja.LC/MS (ESI, m/z): [(M -2MeNH2+ 1)]<+>= 901.4.

Korak 9

[0184]

[0185] Diamonijum (1S,6S,8R,9R,10S,15S,17R,18R)-8-(2-amino-6-okso-6,9-dihidro-1H-purin-9-il)-17-(6-amino-9H-purin-9-il)-9,18-dihidroksi-3,12-diokso-4,7,13,16-tetraoksa-2,11-diaza-3λ<5>,12λ<5>-difosfatriciklo[13.3.0.0<6>,<10>]oktadekan-3,12-bis(olat) (71): U rastvor gornjeg sirovog jedinjenja 139 u piridinu (3 mL) dodati su trietilamin (1 mL) i trietilamintrihidrofluorid (2,26 g, 14,00 mmol). Dobijeni rastvor je mešan 2 sata na 60 °C. Nakon hlađenja na sobnu temperaturu dodat je aceton (56 mL) da bi se taložilo sirovo jedinjenje, koje je prečišćeno Prep-HPLC tehnikom sa kolonom XBridge Prep OBD C18 (19 × 250 mm, 5 µm), pokretna faza voda (plus 50 mmol/L NH4HCO3) i ACN, detektor 254/220 nm, gradijent 0% B 7 min, 0%–20% B u 30 min, brzina protoka 20 mL/min, retenciono vreme 17,83 min, da bi se dobilo naslovno jedinjenje 71 kao bezbojna čvrsta supstanca (66,9 mg, 35%).<1>H NMR (400 MHz, D2O) δ 8.43 (s, 1H), 8.17 (d, J = 48.1 Hz, 2H), 5.98 (s, 1H), 5.81 (s, 1H), 4.54 (s, 1H), 4.33 (s, 1H), 4.20 (t, J = 14.8 Hz, 2H), 4.14 - 3.98 (m, 4H), 3.87 (s, 2H);<31>P NMR (162 MHz, D2O) δ 6.58; LC/MS (ESI, m/z): [(M - 2NH3- 1)]<->= 671.0.

Diamonijum [(1S,6S,8R,9R,10S,15S,17R,18R)-8-(2-amino-6-okso-6,9-dihidro-1H-purin-9-il)-17-(6-amino-9H-purin-9-il)-9,18-dihidroksi-3,12-diokso-12-sulfanidil-4,7,13,16-tetraoksa-2,11-diaza-3λ<5>,12λ<5>-difosfatriciklo[13.3.0.0<6>,<10>]oktadekan-3-il]sulfanid

[0186]

Korak 1

[0187]

[0188] N-(9-((2R,3R,4R,5S)-3-((terc-butildimetilsilil)oksi)-5-(hidroksimetil)-4-(tritilamino) tetrahidrofuran-2-il)-6-okso-6,9-dihidro-1H-purin-2-il)izobutiramid (140): U rastvor N-[9-[(2R,3R,4R,5S)-4-amino-3-[(terc-butildimetilsilil)oksi]-5-(hidroksimetil)oksolan-2-il]-6-okso-6,9-dihidro-1H-purin-2-il]-2-metilpropanamida (INT-D, 5,0 g, 10,72 mmol) u piridinu (96 mL) dodati su trietilamin (3 mL, 21,44 mmol) i (hlorodifenilmetil)benzen (4,6 g, 16,50 mmol). Dobijeni rastvor je mešan 16 sati na sobnoj temperaturi, a zatim je reakcija zaustavljena dodatkom metanola (10 mL) i zasićenog vodenog rastvora natrijum bikarbonata (2 mL). Dobijena smeša je koncentrovana pod smanjenim pritiskom, a ostatak je nanesen na kolonu od silika-gela, eluiranjem sa 60% etil acetata u petroleumu, da bi se dobilo naslovno jedinjenje 140 kao bezbojna čvrsta supstanca. (5.2 g, 68%):<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.09 (s, 1H), 11.56 (s, 1H), 8.27 (s, 1H), 7.54 - 7.42 (m, 5H), 7.44 - 7.17 (m, 10H), 6.17 (d, J = 6.3 Hz, 1H), 5.02 (t, J = 4.7 Hz, 1H), 4.43 (t, J = 5.8 Hz, 1H), 3.62 (q, J = 2.5 Hz, 1H), 3.36 - 3.24 (m, 1H), 3.23 - 3.13 (m, 1H), 2.98 (dt, J = 4.5, 2.0 Hz, 1H), 2.84 (p, J = 6.8 Hz, 1H), 1.23 - 1.09 (m, 6H), 0.75 (s, 9H), -0.15 (s, 3H), -0.39 (s, 3H). LC/MS (ESI, m/z): [(M 1)]<+>= 709.4.

[0189] ((2S,3R,4R,5R)-4-((terc-bulildimetilsilil)oksi)-5-(2-izobuliramido-6-okso-1H-purin-9(6H)-il)-3-(tritilamino)tetrahidrofuran-2-il)metil (2-cijanoetil) diizopropilfosforamidit (141): U rastvor N-[9-[(2R,3R,4R,5S)-3-[(terc-butildimetilsilil)oksi]-5-(hidroksimetil)-4-[(trifenilmetil) amino]oksolan-2-il]-6-okso-6,9-dihidro-1H-purin-2-il]-2-metilpropanamida (140, 1,50 g, 2,12 mmol) i 3-(bis[bis(propan-2-il)amino]fosfaniloksi)propanenitrila (1,70 g, 5,64 mmol) u acetonitrilu (6 mL) dodat je piridijum-trifluoroacetat (0,82 g, 4,25 mmol). Dobijeni rastvor je mešan 45 min na sobnoj temperaturi i korišćen je u sledećem koraku direktno, bez bilo kakve obrade: MS (ESI, m/z): [(M 1)]<+>= 909.4.

Korak 3

[0190]

[0191] O-(((2S,3R,4R,5R)-4-((terc-butildimetilsilil)oksi)-5-(2-izobutiramido-6-okso-1H-purin-9(6H)-il)-3-(tritilamino)tetrahidrofuran-2-il)metil) O-(2-cijanoetil) fosfonotioat (142): U gornjem reakcionom rastvoru je uvođen vodonik-sulfid 1 min, a zatim je dodat piridijum-trifluoroacetat (820 mg, 4,25 mmol). Dobijeni rastvor je mešan 30 min na sobnoj temperaturi i nanesen na reverzno-faznu kolonu C18, eluiranjem sa 70%–95% acetonitrila (25 min) u vodi, da bi se dobilo naslovno jedinjenje 142 kao bezbojna čvrsta supstanca. (1.0 g, dva koraka 85%):<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.12 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 11.46 (s, 1H), 8.13 (d, J = 3.8 Hz, 1H), 7.53 - 7.42 (m, 6H), 7.41 - 7.19 (m, 10H), 6.26 - 6.13 (m, 1H), 4.60 (dt, J = 21.3, 6.0 Hz, 1H), 4.13 - 3.94 (m, 3H), 3.82 - 3.75 (m, 0.4H), 3.59 (t, J = 6.0 Hz, 0.4H), 3.30 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 2.85 (dddd, J = 30.2, 18.9, 9.2, 4.7 Hz, 4H), 1.29 - 1.08 (m, 6H), 0.76 (d, J = 3.2 Hz, 9H), -0.09 - - 0.19 (m, 3H), -0.34 - -0.51 (m, 3H);<31>P NMR (162 MHz, DMSO) δ 72.81, 72.40; LC/MS (ESI, m/z): [(M 1)]<+>= 842.3.

Korak 4

[0193] O-(((2S,3R,4R,5R)-4-((terc-butildimetilsilil)oksi)-5-(2-izobutiramido-6-okso-1H-purin-9(6H)-il)-3-(tritilamino)tetrahidrofuran-2-il)metil) O-(2-cijanoetil) ((2S,3R,4R,5R)-5-(6-benzamido-9H-purin-9-il)-4-((terc-butildimetilsilil)oksi)-2-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-3-il)fosforamidotioat (143): U mešavinu [(3S,5R)-4-[(terc-butil-dimetilsilil)oksi]-5-[2-(2-metilpropanamido)-6-okso-6,9-dihidro-1H-purin-9-il]-3-[(trifenilmetil)amino]oksolan-2-il]metil 2-cijanoetil-sulfanilidenfosfonita (142, 0.60 g, 0.71 mmol) i N-9-[(2R,4S)-4-amino-3-[(terc-butildimetilsilil)oksi]-5-(hidroksimetil)oksolan-2-il]-9H-purin-6-ilbenzamida (INT-C, 0.35 g, 0.71 mmol) u acetonitrilu (8 mL) dodati su N,N-dizopropiletilamin (0.24 mL, 1.42 mmol) i tetrahlormetan (0.27 mL, 2.84 mmol). Dobijeni mešani rastvor je mešan 30 min na sobnoj temperaturi i nanesen na reverzno-faznu C18 kolonu, eluiran sa 70%~99% acetonitrila (25 min) u vodi da bi se dobila dva izomera naslovnog jedinjenja kao bezbojna pena: izomer A (0.33 g, 35%, eluiran sa 95% acetonitrila):<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 12.06 (s, 1H), 11.40 (s, 1H), 11.16 (s, 1H), 8.68 (d, J = 6.6 Hz, 2H), 8.14 (s, 1H), 8.01 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 7.69 - 7.15 (m, 20H), 6.18 (d, J = 6.4 Hz, 1H), 6.06 (d, J = 3.6 Hz, 1H), 5.49 (t, J = 10.4 Hz, 1H), 5.06 (t, J = 5.4 Hz, 1H), 4.71 (d, J = 6.6 Hz, 1H), 4.55 (t, J = 4.6 Hz, 1H), 3.74 (dt, J = 28.9, 9.0 Hz, 2H), 3.58 (d, J = 11.7 Hz, 1H), 3.41 (d, J = 14.1 Hz, 1H), 3.29 (s, 4H), 2.74 (p, J = 7.4, 6.6 Hz, 4H), 1.28 - 1.16 (m, 1H), 1.08 (dd, J = 6.8, 2.4 Hz, 6H), 0.69 (d, J = 11.4 Hz, 18H), -0.17 (d, J = 3.0 Hz, 9H), -0.44 (s, 3H);<31>P NMR (121 MHz, DMSO-d6) δ 73.08; LC/MS (ESI, m/z): [(M 1)]<+>= 1324.5. i izomer B (0.35 g, 37%, eluiran sa 99% acetonitrila):<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 12.09 (s, 1H), 11.40 (s, 1H), 11.13 (s, 1H), 8.69 (d, J = 1.4 Hz, 2H), 8.10 - 7.96 (m, 3H), 7.67 - 7.38 (m, 9H), 7.22 (dt, J = 33.9, 7.3 Hz, 10H), 6.10 (t, J = 5.3 Hz, 2H), 5.61 (t, J = 10.5 Hz, 1H), 5.17 (t, J = 5.2 Hz, 1H), 4.56 (t, J = 4.6 Hz, 1H), 4.24 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 3.96 (ddt, J = 24.1, 20.9, 6.8 Hz, 6H), 3.71 (dd, J = 14.9, 8.7 Hz, 2H), 3.49 (dt, J = 12.4, 4.4 Hz, 1H), 3.17 (d, J = 2.8 Hz, 1H), 2.78 (h, J = 7.9, 7.3 Hz, 4H), 1.09 (dd, J = 6.9, 1.5 Hz, 6H), 0.73 (d, J = 16.6 Hz, 18H), -0.09 (d, J = 15.8 Hz, 6H), -0.18 (s, 3H), -0.41 (s, 3H);<31>P NMR (121 MHz, DMSO- d6) δ 72.91; LC/MS (ESI, m/z):

[(M 1)]<+>= 1324.5. Izomer A i izomer B su nezavisno sprovedeni kroz ostatak sinteze (korak 5 do koraka 10).

[0194] O-(((2S,3R,4R,5R)-4-((terc-butildimetilsilil)oksi)-5-(2-izobutiramido-6-okso-1H-purin-9(6H)-il)-3-(tritilamino)tetrahidrofuran-2-il)metil) O-(2-cijanoetil) ((2S,3R,4R,5R)-5-(6-benzamido-9H-purin-9-il)-4-((terc-butildimetilsilil)oksi)-2-((((2-cijanoetoksi)(diizopropilamino) fosfino)oksi)metil)tetrahidrofuran-3-yl)fosforamidotioat (144): U rastvor O-\(\((2S,3R,4R,5R)-4-\((terc-butil-dimetilsilil)oksi)-5-(2-izobutiramido-6-okso-1H-purin-9(6H)-il)-3-(tritilamino)tetrahidrofuran-2-il)metil) O-(2-cijanoetil) \((\((2S,3R,4R,5R)-5-(6-benzamido-9H-purin-9-il)-4-\((terc-butil-dimetilsilil)oksi)-2-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-3-il)fosforamido tiolat (143, 330 mg, 0.25 mmol, izomer A) u acetonitrilu (2 mL) dodat je 3-(bis[bis(propan-2-il)amino]fosfaniloksi)propanonitril (150 mg, 0.50 mmol) i piridinijum trifluoracetat (66 mg, 0.34 mmol). Dobijeni mešani rastvor je mešan 45 min na sobnoj temperaturi i korišćen direktno u sledećem koraku bez dalje obrade: LC/MS (ESI, m/z): [(M 1)]<+>= 1523.9.

Korak 6

[0195]

[0196] O-[(2S,3R,4R,5R)-5-(6-benzamido-9H-purin-9-il)-4-[(terc-butildimetilsilil)oksi]-3-[({[(2S,3R,4R,5R)-4-[(terc-butildimetilsilil)oksi]-5-[2-(2-metilpropanamido)-6-okso-6,9-dihidro-1H-purin-9-il]-3-[(trifenilmetil)amino]oksolan-2-il]metoksi}(2-cijanoetoksi)sulfaniliden-λ<5>-fosfanil)amino]oksolan-2-il]metil O-2-cijanoetil fosfonotioat (145): Navedeni rastvor je propuštan kroz vodonik-sulfid u trajanju od 2 min, nakon čega je dodat piridinijum trifluoracetat (66 mg, 0.34 mmol). Dobijeni mešani rastvor je mešan 30 min na sobnoj temperaturi i koncentrovan pod sniženim pritiskom. Ostatak je nanesen na reverzno-faznu C18 kolonu, eluiran sa 70%~99% acetonitrila (25 min) u vodi da bi se dobilo naslovno jedinjenje 145 kao bezbojna čvrsta supstanca (150 mg, 40%, sadrži 5% 1H-fosfatnog nusproizvoda):<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.10 (s, 1H), 11.46 - 11.41 (m, 1H), 11.20 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 8.72 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 8.68 - 8.57 (m, 1H), 8.21 - 8.14 (m, 1H), 8.05 (d, J = 7.7 Hz, 2H), 7.74 - 7.61 (m, 2H), 7.54 (dd, J = 26.6, 7.7 Hz, 9H), 7.37 (t, J = 7.6 Hz, 7H), 7.26 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 6.25 - 6.18 (m, 1H), 6.09 (dd, J = 6.0, 3.4 Hz, 1H), 5.53 (d, J = 10.8 Hz, 0.7H), 4.74 (s, 1.4H), 4.04 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 3.73 (s, 2H), 3.28 (s, 2H), 2.93 - 2.73 (m, 6H), 2.54 (s, 2H), 1.27 - 1.09 (m, 6H), 0.78 - 0.61 (m, 18H), -0.07 - -0.19 (m, 9H), -0.36 - -0.42 (m, 3H);<31>P NMR (162 MHz, DMSO-d6) δ 73.27, 73.15, 73.09, 72.82; LC/MS (ESI, m/z): [(M 1)]<+>= 1458.5. Isti postupak je primenjen na izomer B da bi se dobio drugi izomer kao bezbojna čvrsta supstanca. (190 mg, 45%):<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.17 - 12.11 (m, 1H), 11.44 (d, J = 3.5 Hz, 1H), 11.19 (s, 1H), 8.80 - 8.63 (m, 2H), 8.67 - 8.57 (m, 1H), 8.14 - 8.02 (m, 3H), 7.70 - 7.61 (m, 1H), 7.56 (dd, J = 8.4, 7.0 Hz, 2H), 7.51 - 7.44 (m, 7H), 7.32 (td, J = 7.9, 1.9 Hz, 7H), 7.26 - 7.17 (m, 3H), 6.14 (ddd, J = 5.7, 3.8, 2.1 Hz, 2H), 5.65 (s, 1H), 4.74 (q, J = 7.4, 5.7 Hz, 1H), 4.18 (d, J = 9.7 Hz, 1H), 4.09 - 3.90 (m, 6H), 3.85 - 3.76 (m, 1H), 3.21 (s, 1H), 2.94 - 2.75 (m, 6H), 2.53 (m, 2H), 1.27 - 1.10 (m, 6H), 0.91 - 0.69 (m, 18H), 0.00 - -0.09 (m, 3H), -0.03 - -0.11 (m, 3H), -0.14 (s, 3H), -0.36 (d, J = 4.2 Hz, 3H);<31>P NMR (162 MHz, DMSO-d6) δ 73.31, 72.94, 72.70, 72.64; LC/MS (ESI, m/z): [(M 1)]<+>= 1458.5.

[0197] O-[(2S,3R,4R,5R)-3-[({[(2S,3R,4R,5R)-3-amino-4-[(terc-butil-dimetilsilil)oksi]-5-[2-(2-metilpropanamido)-6-okso-6,9-dihidro-1H-purin-9-il]oksolan-2-il]metoksi}(2-cijanoetoksi) sulfaniliden-λ<5>-fosfanil)amino]-5-(6-benzamido-9H-purin-9-il)-4-[(terc-butil-dimetilsilil)oksi] oksolan-2-il]metil O-2-cijanoetil-fosfonotioat (146): U rastvor O-[(2S,3R,4R,5R)-5-(6-benzamido-9H-purin-9-il)-4-[(terc-butil-dimetilsilil)oksi]-3-[({[(2S,3R,4R,5R)-4-[(terc-butildimetilsilil)oksi]-5-[2-(2-metilpropanamido)-6-okso-6,9-dihidro-1H-purin-9-il]-3-[(trifenilmetil)amino]oksolan-2-il]metoksi}(2-cijanoetoksi)sulfaniliden-λ<5>-fosfanil)amino] oksolan-2-il]metil O-2-cijanoetil-fosfonotioat (145, 150 mg, 0.11 mmol) u dihlormetanu (3 mL) i vodi (10 mg, 0.5 mmol) dodat je dihlorsirćetna kiselina (150 mg, 0.62 mmol). Dobijeni mešani rastvor je mešan 20 min na sobnoj temperaturi, a zatim je reakcija zaustavljena dodavanjem zasićenog vodenog rastvora natrijum bikarbonata (1.1 mL). Dobijena smeša je ekstrahovana dihlormetanom (3 x 10 mL), organski slojevi su kombinovani i osušeni nad bezvodnim natrijum sulfatom. Nakon filtracije, filtrat je koncentrisan pod sniženim pritiskom, a ostatak je korišćen u sledećem koraku bez daljeg pročišćavanja. (146, 0.2 g, braon čvrsta supstanca): LC/MS (ESI, m/z):

[(M 1)]<+>= 1215.4.

Korak 8

[0198]

[0199] N-{9-[(1R,6S,8R,9R,10R,15S,17R,18R)-9,18-bis[(terc-butildimetilsilil)oksi]-3,12-bis(2-cijanoetoksi)-17-[2-(2-metilpropanamido)-6-okso-6,9-dihidro-1H-purin-9-il]-3,12-disulfaniliden-4,7,13,16-tetraoksa-2,11-diaza-3λ<5>,12λ<5>-difosfatriciklo[13.3.0.0<6>,<10>]oktadekan-8-il]-9H-purin-6-il}benzamid (147): Rastvor gore navedenog O-[(2S,3R,4R,5R)-3-[({[(2S,3R,4R,5R)-3-amino-4-[(terc-butil-dimetilsilil)oksi]-5-[2-(2-metilpropanamido)-6-okso-6,9-dihidro-1H-purin-9-il] oksolan-2-il]metoksi}(2-cijanoetoksi)sulfaniliden-λ<5>-fosfanil)amino]-5-(6-benzamido-9H-purin-9-il)-4-[(terc-butil-dimetilsilil)oksi]oksolan-2-il]metil O-2-cijanoetil-fosfonotioata (146, 200 mg) u acetonitrilu (30 mL) dodat je trietilamin (0.7 mL) i tetrahlormetan (0.7 mL). Dobijeni rastvor je mešan 45 min na sobnoj temperaturi i koncentrisan pod sniženim pritiskom da bi se dobilo sirovo naslovno jedinjenje 147 kao braon čvrsta supstanca (200 mg), koje je korišćeno u sledećem koraku direktno, bez daljeg prečišćavanja. LC/MS (ESI, m/z): [(M 1)]<+>= 1213.4.

Korak 9

[0200]

[0201] [(1R,6S,8R,9R,10R,15S,17R,18R)-8-(2-amino-6-okso-6,9-dihidro-1H-purin-9-il)-17-(6-amino-9H-purin-9-il)-9,18-bis[(terc-butildimetilsilil)oksi]-3,12-diokso-12-sulfanidil-4,7,13,16-tetraoksa-2,11-diaza-3λ<5>,12λ<5>-difosfatriciklo[13.3.0.0<6>,<10>]oktadekan-3-il]sulfanid; bis(metanaminijum) (148)147, 200 mg) je tretiran metilaminom (6 mL, 30% rastvor u alkoholu, m/m) 1,5 časova na sobnoj temperaturi. Po završetku reakcije, dobijeni rastvor je koncentrisan pod sniženim pritiskom, a ostatak je korišćen u sledećem koraku direktno, bez daljeg prečišćavanja (200 mgLC/MS (ESI, m/z): [(M - 2MeNH2+ 1)]<+>= 933.6.

Korak 10

[0202]

[0203] Diamonijum [(1S,6S,8R,9R,10S,15S,17R,18R)-8-(2-amino-6-okso-6,9-dihidro-1H-purin-9-il)-17-(6-amino-9H-purin-9-il)-9,18-dihidroksi-3,12-diokso-12-sulfanidil-4,7,13,16-tetraoksa-2,11-diaza-3λ<5>,12λ<5>-difosfatriciklo[13.3.0.0<6>,<10>]oktadekan-3-il]sulfanid (72)148 u piridinu (1.5 mL) dodat je trietilamin-trihidrofluorid (1.2 mL) i trietilamin (0.4 mL). Dobijeni rastvor je mešan 2 časa na 60 °C. Nakon hlađenja na sobnu temperaturu, dodat je aceton (32 mL) da bi se precipitiralo sirovo jedinjenje, koje je prečišćeno korišćenjem sledećih uslova: kolona: Atlantis Prep T3 OBD kolona, 19 x 250 mm, 10 µm; mobilna faza A: voda (plus 20 mmol/L NH4HCO3), mobilna faza B: ACN; protok: 20 mL/min; gradijent: 1% B do 14% B u 26 min; detektor: 254/220 nm; da bi se dobio mešani fosfat/tiophosfat 72-0A1 kao bezbojna čvrsta supstanca (jedan izomer) (6.6 mg, retenciono vreme 17.12 min).<1>H NMR (400 MHz, D2O+DMSO-d6) δ 8.48 (br s, 0.6H), 8.24 (br s, 1.4H), 8.12 (br s, 0.6H), 8.03 (br s, 0.4H), 5.95 (s, 1H), 5.76 (s, 1H), 4.39 - 3.70 (m, 10H);<31>P NMR (162 MHz, D2O+DMSO-d6) δ 56.24, 3.46, 2.01; LC/MS (ESI, m/z): [(M -2NH31)]<->= 687.0. Jedan izomer, ovde označen kao 72-0A2, dobijen je kao bezbojna čvrsta supstanca (6.3 mg, 9% preko 4 koraka, retenciono vreme 17.83 min):<1>H NMR (400 MHz, D2O) δ 8.63 (s, 1H), 8.08 (s, 1H), 8.03 (s, 1H), 6.07 (s, 1H), 5.88 (s, 1H), 4.36 (d, J = 4.4 Hz, 1H), 4.29 (d, J = 12.1 Hz, 1H), 4.21 (d, J = 11.9 Hz, 1H), 4.09 (d, J = 11.2 Hz, 3H), 3.94 (ddt, J = 26.6, 10.5, 5.1 Hz, 3H);<31>P NMR (162 MHz, D2O) δ 57.85, 54.61; LC/MS (ESI, m/z): [(M - 2NH3- 1)]<->= 703.0. I drugi izomer ovde označan kao 72-0A3 dobijen je kao bezbojna čvrsta supsranca (6.8 mg, 10% preko 4 koraka, retenciono vreme je 25.18 min):<1>H NMR (400 MHz, D2O+DMSO-d6) δ 8.39 (s, 1H), 8.21 (s, 1H), 8.07 (s, 1H), 5.95 (s, 1H), 5.72 (s, 1H), 4.19-3.99 (m, 6H), 3.91-3.78 (m, 4H);<31>P NMR (162 MHz, D2O+DMSO-d6) δ 54.36; LC/MS (ESI, m/z): [(M - 2NH3- 1)]<->= 703.0. FIG.2A slikava prikaz jedinjenja 72-0A3.

[0204] Koraci 5–10 opisani gore su sprovedeni na izomeru B dobijenom u Koraku 4 da bi se dobila druga dva izomera, koji su pročišćeni Prep-HPLC metodom pod sledećim uslovima: kolona: Atlantis Prep T3OBD kolona, 19 x 250 mm, 10 µm; mobilna faza A: voda (plus 20 mmol/L NH4HCO3), mobilna faza B: ACN; protok: 20 mL/min; gradijent: 0% B do 13% B u 21 min; detektor: 254/220 nm; jedan izomer, ovde označen kao 72-0B1, dobijen je kao bezbojna čvrsta supstanca (5.6 mg, 6% preko 4 koraka, retenciono vreme je 14.52 min):<1>H NMR (400 MHz, D2O) δ 8.65 (s, 1H), 8.20 (s, 1H), 8.09 (s, 1H), 6.09 (s, 1H), 5.88 (s, 1H), 4.68 (m, 2H), 4.17 - 4.02 (m, 6H), 3.99-3.88 (m, 1H), 3.87-3.68 (m, 1H);<31>P NMR (162 MHz, D2O) δ 57.91; LC/MS (ESI, m/z):

[(M - 2NH3- 1)]<->= 703.0. A drugi izomer, ovde označen kao 72-0B2, dobijen je kao bezbojna čvrsta supstanca (9.2 mg, 10% preko 4 koraka, retenciono vreme je 18.50 min):<1>H NMR (400 MHz, D2O) δ 8.41 (s, 1H), 8.21 (s, 1H), 8.09 (s, 1H), 6.07 (s, 1H), 5.85 (s, 1H), 4.72 (d, J = 4.8 Hz, 1H), 4.37 - 4.29 (m, 2H), 4.20 - 3.81 (m, 7H);<31>P NMR (162 MHz, D2O) δ 57.94, 57.46, 54.46, 50.95; LC/MS (ESI, m/z): [(M - 2NH3- 1)]<->= 703.0. Izomeri 72-0A2, 72-0A3, 72-0B1, i 72-0B2 smatra se da se razlikuju u stereohemijskoj konfiguraciji na atomima fosfora.

Diamonijum (1S,6S,8R,9R,10S,15S,17R,18R)-8,17-bis(6-amino-9H-purin-9-il)-9,18-dihidroksi-3,12-diokso-4,7,13,16-tetraoksa-2,11-diaza-3λ<5>,12λ<5>-difosfatriciklo[13.3.0.0<6>,<10>]oktadekan-3,12-bis(olat):

[0205]

Korak 1

[0206]

[0207]N-(9-((2R,3R,4R,5S)-3-((terc-butil-dimetilsilil)oksi)-5-(hidroksimetil)-4-(tritilamino)tetra hidrofuran-2-il)-9H-purin-6-il)benzamid (149)U rastvor N-[9-[(2R,5S)-4-amino-3-[(terc-butildimetilsilil)oksi]-5-(hidroksimetil)oksolan-2-il]-9H-purin-6-il]benzamida (INT-C, 1.20 g, 2.47 mmol) u piridinu (24 mL) dodati su trietilamin (0.69 mL, 4.95 mmol) i trifenilmetil-hlorid (1.04 g, 3.70 mmol). Dobijena smeša je mešana 20 časova na sobnoj temperaturi. Po završetku reakcije, reakcija je zaustavljena dodatkom metanola (10 mL). Dobijeni rastvor je koncentrisan pod sniženim pritiskom, a ostatak je prečišćen fleš hromatografijom na koloni, eluiranjem sa 1% metanola u dihlormetanu da bi se dobilo naslovno jedinjenje 149 kao bezbojna čvrsta supstanca. (0.80 g, 45%):<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 11.26 - 11.06 (m, 1H), 8.69 (s, 1H), 8.68 (s, 1H), 8.02 (dd, J = 7.1, 1.9 Hz, 2H), 7.60 - 7.12 (m, 18H), 6.13 (d, J = 3.3 Hz, 1H), 5.20 - 5.00 (m, 1H), 3.90 - 3.73 (m, 1H), 3.64 (d, J = 18.5 Hz, 2H), 3.34 (t, J = 3.9 Hz, 1H), 3.16 - 3.03 (m, 1H), 2.96 (d, J = 6.3 Hz, 1H), 0.76 (s, 9H), -0.11 (s, 3H), -0.22 (s, 3H); LC/MS (ESI, m/z): [(M 1)]<+>= 727.3.

Korak 2

[0208] ((2S,3R,4R,5R)-5-(6-benzamido-9H-purin-9-il)-4-((terc-butil-dimetilsilil)oksi)-3-(tritilamino)tetrahidrofuran-2-il)metil (2-cijanoetil) diizopropilfosforamidit (150):U rastvor N-(9-((2R,3R,4R,5S)-3-((terc-butil-dimetilsilil)oksi)-5-(hidroksimetil)-4-(tritilamino)tetrahidrofuran-2-il)-9H-purin-6-il)benzamida (149, 0.80 g, 1.10 mmol) u acetonitrilu (20 mL) dodati su 3-({bis[bis(propan-2-il)amino]fosfanil}oksi)propanonitril (0.32 g, 1.06 mmol) i piridinijum trifluoracetat (0.66 g, 1.65 mmol). Dobijeni rastvor je mešan 1 čas na sobnoj temperaturi i korišćen je u sledećem koraku direktno, bez obrade. LC/MS (ESI, m/z): [(M 1)]<+>= 927.4.

Korak 3

[0209]

[0210] ((2S,3R,4R,5R)-5-(6-benzamido-9H-purin-9-il)-4-((terc-butil-dimetilsilil)oksi)-3-(tritilamino)tetrahidrofuran-2-il)metil (2-cianoetil) fosfonat (151):U navedeni rastvor dodati su voda (150, 0.20 g, 10.60 mmol) i piridinijum trifluoracetat (0.50 g, 1.65 mmol). Dobijeni rastvor je mešan 30 min na sobnoj temperaturi. Po završetku reakcije, rastvor je nanesen na reverznofaznu C18 kolonu, eluiran sa 70%~95% acetonitrila u vodi (25 min), da bi se dobilo naslovno jedinjenje 151 kao bezbojna čvrsta supstanca (0.50 g, 54% za dva koraka):<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 11.18 (s, 1H), 8.68 (s, 1H), 8.46 (s, 1H), 8.14 - 8.00 (m, 2H), 7.67 - 6.97 (m, 18H), 6.15 (d, J = 3.4 Hz, 1H), 5.55 (s, 1H), 4.41 - 4.20 (m, 1H), 4.20 - 4.10 (m, 1H), 4.08 - 3.89 (m, 3H), 3.77 - 3.55 (m, 1H), 3.19 - 3.01 (m, 2H), 2.83 (dt, J = 7.8, 5.8 Hz, 2H), 0.79 (s, 9H), -0.10 (d, J = 5.1 Hz, 3H), -0.22 (s, 3H);<31>P NMR (121 MHz, DMSO-d6) δ 9.62, 8.87; LC/MS (ESI, m/z):

[(M 1)]<+>= 844.3.

Korak 4

[0211] (2S,3R,4R,5R)-5-(6-benzamido-9H-purin-9-il)-4-((terc-butil-dimetilsilil)oksi)-3(tritilamino)tetrahidrofuran-2-il)metil (2-cijanoetil) ((2S,3R,4R,5R)-5-(6-benzamido-9H-purin-9-il)-4-((terc-butil-dimetilsilil)oksi)-2-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-3-il)fosforamidat (152):

U smešu ((2S,3R,4R,5R)-5-(6-benzamido-9H-purin-9-il)-4-((terc-butil-dimetilsilil)oksi)-3-(tritilamino)tetrahidrofuran-2-il)metil (2-cijanoetil) fosfonat (151, 0.51 g, 0.60 mmol) i N-(9-((2R,3R,4R,5S)-4-amino-3-((terc-butil-dimetilsilil)oksi)-5-(hidroksimetil)tetrahidrofuran-2-il)-9H-purin-6-il)benzamid (INT-C, 0.29 g, 0.60 mmol) u acetonitrilu (6 mL) dodati su N,N-dizopropiletilamin (0.15 g, 1.20 mmol) i tetrahlormetan (0.36 g, 2.40 mmol). Dobijena smeša je mešana 15 min na sobnoj temperaturi. Po završetku reakcije, smeša je nanesena na reverzno-faznu C18 kolonu, eluirana sa 70%~95% acetonitrila u vodi (25 min), da bi se dobilo naslovno jedinjenje 152 kao bezbojna čvrsta supstanca. (0.53 g, 67%):<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 11.27 - 11.06 (m, 2H), 8.79 - 8.68 (m, 2H), 8.68 - 8.56 (m, 2H), 8.08 - 7.86 (m, 4H), 7.62 - 7.04 (m, 21H), 6.19 - 5.93 (m, 2H), 5.27 - 5.09 (m, 1H), 5.09 - 4.82 (m, 1H), 4.67 - 4.47 (m, 1H), 4.29 - 4.10 (m, 2H), 4.06 - 3.96 (m, 2H), 3.90 - 3.80 (m, 2H), 3.75 - 3.62 (m, 1H), 3.61 - 3.52 (m, 1H), 3.16 - 2.94 (m, 2H), 2.80 - 2.68 (m, 2H), 0.87 - 0.69 (m, 18H), 0.00 (d, J = 8.4 Hz, 3H), -0.06 (d, J = 3.7 Hz, 3H), -0.12 (d, J = 4.8 Hz, 3H), -0.21 (d, J = 13.6 Hz, 3H);<31>P NMR (121 MHz, DMSO-d6) δ 8.80, 8.31; LC/MS (ESI, m/z): [(M 1)]<+>= 1326.9.

Korak 5

[0212]

[0213] ((2S,3R,4R,5R)-5-(6-benzamido-9H-purin-9-il)-4-((terc-butil-dimetilsilil)oksi)-3-(tritilamino)tetrahidrofuran-2-il)metil (2-cijanoetil) ((2S,3R,4R,5R)-5-(6-benzamido-9H-purin-9il)-4-((terc-butil-dimetilsilil)oksi)-2-((((2-cijanoetoksi)(diizopropilamino)fosfino)oksi)metil)tetra hidrofuran-3-il)fosforamidat (153):U rastvor ((2S,3R,4R,5R)-5-(6-benzamido-9H-purin-9-il)-4-((terc-butil-dimetilsilil)oksi)-3-(tritilamino)tetrahidrofuran-2-il)metil (2-cijanoetil) ((2S,3R,4R,5R)-5-(6-benzamido-9H-purin-9-il)-4-((terc-butil-dimetilsilil)oksi)-2-(hidroksimetil) tetrahidrofuran-3-il)fosforamidat (152, 0.53 g, 0.40 mmol) u acetonitrilu (5 mL) dodati su 3-([bis[bis(propan-2-il)amino]fosfanil]oksi)propanonitril (0.24 g, 0.80 mmol) i piridinijum trifluoracetat (0.12 g, 0.60 mmol). Dobijena smeša je mešana 50 min na sobnoj temperaturi i korišćena je u sledećem koraku direktno.

Korak 6

[0214]

[0215] [(2S,3R,4R,5R)-5-(6-benzamido-9H-purin-9-il)-3-[({[(2S,3R,4R,5R)-5-(6-benzamido-9H-purin-9-il)-4-[(terc-butil-dimetilsilil)oksi]-3-[(trifenilmetil)amino]oksolan-2-il]metoksi}(2-cijanoetoksi)fosforil)amino]-4-[(terc-butil-dimetilsilil)oksioksolan-2-il]metil-2-cijanoetil fosforat (154):U navedeni rastvor dodati su voda (0.07 g, 4.0 mmol) i piridinijum trifluoracetat (0.12 g, 0.60 mmol). Dobijeni rastvor je mešan 30 min na sobnoj temperaturi. Po završetku reakcije, rastvor je nanesen na reverzno-faznu C18 kolonu, eluiran sa 70%~95% acetonitrila u vodi (25 min), da bi se dobilo naslovno jedinjenje 154 kao bezbojna čvrsta supstanca (0.50 g, 87% za dva koraka):<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 11.24 - 11.08 (m, 2H), 8.76 - 8.45 (m, 4H), 8.05 - 7.97 (m, 4H), 7.63 - 7.07 (m, 21H), 6.20 - 5.97 (m, 2H), 5.24 - 4.88 (m, 1H), 4.83 - 4.62 (m, 1H), 4.43 - 3.91 (m, 10H), 3.94 - 3.81 (m, 1H), 3.15 - 2.97 (m, 2H), 2.92 - 2.72 (m, 4H), 0.84 - 0.69 (m, 18H), 0.05 - 0.04 (m, 4H), -0.07 - -0.25 (m, 8H);<31>P NMR (121 MHz, DMSO-d6) δ 9.90, 9.81, 9.28, 9.23, 8.77, 8.73, 8.10, 8.07. LC/MS (ESI, m/z): [(M 1)]<+>= 1444.5

Korak 7

[0216]

[0217] [(2S,3R,4R,5R)-5-(6-benzamido-9H-purin-9-il)-3-[({[(2S,3R,4R,5R)-5-(6-benzamido-9H-purin-9-il)-4-[(terc-butil-dimetilsilil)oksi]-3-[(trifenilmetil)amino]oksolan-2-il]metoksi}(2-cijanoetoksi)fosforil)amino]-4-[(terc-butil-dimetilsilil)oksioksolan-2-il]metil-2-cijanoetil fosfornat (155):U rastvor [(2S,3R,4R,5R)-5-(6-benzamido-9H-purin-9-il)-3-[({[(2S,3R,4R,5R)-5-(6-benzamido-9H-purin-9-il)-4-[(terc-butil-dimetilsilil)oksi]-3-[(trifenilmetil)amino]oksolan-2-il]metoksi}(2-cijanoetoksi)fosforil)amino]-4-[(terc-butil-dimetilsilil)oksi]oksolan-2-il]metil 2-cijanoetil fosfonat (154, 504 mg, 0.35 mmol) u dihlormetanu (7 mL) dodati su voda (31.4 mg, 0.98 mmol) i dihlorsirćetna kiselina (447 mg, 1.96 mmol). Dobijeni rastvor je mešan 30 min na sobnoj temperaturi. Po završetku reakcije, reakcija je zaustavljena dodatkom zasićenog vodenog rastvora natrijum bikarbonata (30 mL). Dobijena smeša je ekstrahovana dihlormetanom (3 x 30 mL). Organski slojevi su kombinovani i osušeni nad bezvodnim natrijum sulfatom. Nakon filtracije, filtrat je koncentrisan pod sniženim pritiskom da bi se dobilo naslovno jedinjenje 155, koje je korišćeno u sledećem koraku direktno, bez daljeg prečišćavanja. LC/MS (ESI, m/z): [(M 1)]<+>= 1201.4.

Korak 8

[0218]

[0219] N-{9-[(1R,6S,8R,9R,10R,15S,17R,18R)-17-(6-benzamido-9H-purin-9-il)-9,18-bis[(tercbutil-dimetilsilil)oksi]-3,12-bis(2-cijanoetoksi)-3,12-diokso-4,7,13,16-tetraoksa-2,11-diaza-3λ<5>,12λ<5>-difosfatriciklo[13.3.0.0^6,10]oktadekan-8-il]-9H-purin-6-il}benzamid (156):U 155 u acetonitrilu (70 mL) dodati su trietilamin (1.4 mL) i tetrahlormetan (1.4 mL). Dobijeni rastvor je mešan 10 min na sobnoj temperaturi. Po završetku reakcije, rastvor je koncentrisan pod sniženim pritiskom da bi se dobilo sirovo naslovno jedinjenje 156, koje je korišćeno u sledećem koraku direktno, bez daljeg prečišćavanja.

Korak 9

(1R,6S,8R,9R,10R,15S,17R,18R)-8,17-bis(6-amino-9H-purin-9-il)-9,18-bis[(tercbutildimetilsilil)oksi]-3,12-diokso-4,7,13,16-tetraoksa-2,11-diaza-3λ<5>,12λ<5>-difosfatriciklo[13.3.0.0<6>,<10>]oktadekan-3,12-bis(olat); bis(metanaminijum) (157):

[0221] Gore navedeno sirovo jedinjenje 156 je tretirano rastvorom metilamina u alkoholu (14 mL, 30%, m/m) 30 min na sobnoj temperaturi. Po završetku reakcije, dobijeni rastvor je koncentrisan pod sniženim pritiskom da bi se dobilo naslovno jedinjenje 157 kao bezbojna čvrsta supstanca, koje je korišćeno u sledećem koraku direktno, bez daljeg prečišćavanja.

[0222] Diamonijum (1S,6S,8R,9R,10S,15S,17R,18R)-8,17-bis(6-amino-9H-purin-9-il)-9,18-dihidroksi-3,12-diokso-4,7,13,16-tetraoksa-2,11-diaza-3λ<5>,12λ<5>-difosfatriciklo[13.3.0.0^6,10]

oktadekan-3,12-bis(olat) (73):U 157 u piridinu (3.48 mL) dodati su trietilamin (1 mL) i trietilamintrihidrofluorid (2.8 g, 17.4 mmol). Dobijeni rastvor je mešan 2 časa na 60 °C. Nakon hlađenja na sobnu temperaturu, dodat je aceton (200 mL) da bi se precipitirao grubi proizvod, koji je prečišćen Prep-HPLC metodom pod sledećim uslovima: kolona: Atlantis Prep T3 OBD kolona, 19 × 250 mm, 10 µm; mobilna faza A: voda (plus 20 mmol/L NH4HCO3); mobilna faza B: ACN; protok: 20 mL/min; gradijent: 0% B do 15% B u 11 min; detektor: 254/220 nm; da bi se dobilo naslovno jedinjenje 73 kao bezbojna čvrsta supstanca (0.15 g, 62% za 4 koraka, vreme zadržavanja 10.18 min).<1>H NMR (300 MHz, D2O) δ 8.59 - 8.40 (m, 2H), 8.04 - 7.79 (m, 2H), 6.08 (d, J = 1.0 Hz, 2H), 4.40 (d, J = 3.9 Hz, 2H), 4.30 - 4.17 (m, 2H), 4.17 - 3.89 (m, 4H), 3.78 - 3.52 (m, 2H);<31>P NMR (121 MHz, D2O) δ 6.23; LC/MS (ESI, m/z): [(M -2NH3- 1)]<->= 655.05.

Diamonijum [(1S,6S,8R,9R,10S,15S,17R,18R)-8,17-bis(6-amino-9H-purin-9-il)-9,18-dihidroksi-3,12-diokso-12-sulfanidil-4,7,13,16-tetraoksa-2,11-diaza-3λ<5>,12λ<5>-difosfatriciklo[13.3.0.0<6>,<10>]oktadekan-3-il]sulfanid:

[0223]

[0224] (2S,3R,4R,5R)-5-(6-benzamido-9H-purin-9-il)-4-((terc-butil-dimetilsilil)oksi)-3-(tritilamino)tetrahidrofuran-2-il)metil (2-cijanoetil) diizopropilfosforamidit (150):U rastvor N-(9-((2R,3R,4R,5S)-3-((terc-butil-dimetilsilil)oksi)-5-(hidroksimetil)-4-(tritilamino)tetrahidrofuran-2-il)-9H-purin-6-il)benzamida (149, 1.40 g, 1.93 mmol) u acetonitrilu (13.7 mL) dodati su 3-({bis[bis(propan-2-il)amino]fosfanil}oksi)propanonitril (1.40 mL, 3.86 mmol) i piridinijum trifluoracetat (0.56 g, 2.80 mmol). Dobijeni rastvor je mešan 1 čas na sobnoj temperaturi i korišćen je u sledećem koraku direktno, bez obrade. LC/MS (ESI, m/z): [(M 1)]<+>= 927.4.

Korak 2

[0225]

[0226] O-[(2S,3R,4R,5R)-5-(6-benzamido-9H-purin-9-il)-4-[(terc-butil-dimetilsilil)oksi]-3-[(trifenilmetil)amino]oksolan-2-il]metil O-2-cijanoetil fosfonotioat (158):U gore navedeni rastvor je uvođen gas vodonik-sulfida 1 min, nakon čega je dodat piridinijum trifluoracetat (0.56 g, 2.8 mmol). Dobijeni rastvor je mešan 30 min na sobnoj temperaturi. Po završetku reakcije, rastvor je nanesen na reverzno-faznu C18 kolonu, eluiran sa 75%~99% acetonitrila u vodi (25 min), da bi se dobilo naslovno jedinjenje 158 kao bezbojna čvrsta supstanca (1.12 g, 68% za dva koraka):<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 11.20 (s, 1H), 8.71 (d, J = 3.5 Hz, 1H), 8.48 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 8.05 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 7.66 - 7.08 (m, 18H), 6.19 (t, J = 3.1 Hz, 1H), 4.42 - 4.19 (m, 2H), 4.05 - 3.97 (m, 1H), 3.78 - 3.66 (m, 1H), 3.36 - 3.21 (m, 2H), 3.23 - 3.03 (m, 2H), 2.95 - 2.75 (m, 2H), 0.80 (s, 9H), -0.08 (d, J = 5.5 Hz, 3H), -0.19 (d, J = 2.2 Hz, 3H);<31>P NMR (121 MHz, DMSO) δ 73.01, 72.43; LC/MS (ESI, m/z): [(M 1)]<+>= 860.0

Korak 3

[0227]

[0228] N-{9-[(2R,3R,4R,5S)-5-{[({[(2S,3R,4R,5R)-5-(6-benzamido-9H-purin-9-il)-4-[(tercbutil-dimetilsilil)oksi]-2-(hidroksimetil)oksolan-3-il]amino}(2-cijanoetoksi)sulfaniliden-λ<5>-fosfanil)oksi]metil}-3-[(terc-butil-dimetilsilil)oksi]-4-[(trifenilmetil)amino]oksolan-2-il]-9H-purin-6-il}benzamid (159):U smešu [(2S,3R,4R,5R)-5-(6-benzamido-9H-purin-9-il)-4-[(tercbutil-dimetilsilil)oksi]-3-[(trifenilmetil)amino]oksolan-2-il]metil-2-cijanoetilfosfonat (158, 1.12 g, 1.33 mmol) i N-9-[(2R,5S)-4-amino-3-[(terc-butil-dimetilsilil)oksi]-5-(hidroksimetil)oksolan-2-il]-9H-purin-6-ilbenzamid (0.29 g, 1.33 mmol) u acetonitrilu (13 mL) dodati su N,N-diizopropiletilamin (0.34 g, 2.66 mmol) i tetrahlormetan (0.79 g, 5.32 mmol). Dobijeni rastvor je mešan 15 min na sobnoj temperaturi. Po završetku reakcije, smeša je nanesena na reverzno-faznu C18 kolonu, eluirana sa 75%~99% acetonitrila u vodi (25 min), da bi se dobilo naslovno jedinjenje 159 kao bezbojna čvrsta supstanca (1.1 g, 62%).<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 11.22 - 11.01 (m, 2H), 8.73 - 8.34 (m, 4H), 8.05 - 7.94 (m, 4H), 7.63 - 7.05 (m, 21H), 6.21 - 5.96 (m, 2H), 5.69 - 5.45 (m, 1H), 5.13 (dt, J = 25.9, 5.1 Hz, 1H), 4.61 - 4.51 (m, 1H), 4.40 - 4.20 (m, 1H), 4.18 -3.94 (m, 5H), 3.79 - 3.70 (m, 1H), 3.66 - 3.46 (m, 1H), 3.16 - 2.94 (m, 2H), 2.88 - 2.75 (m, 2H), 0.83 - 0.64 (m, 18H), 0.07 - -0.04 (m, 3H), -0.07 - -0.28 (m, 9H);<31>P NMR (121 MHz, DMSO) δ 73.32, 72.28; LC/MS (ESI, m/z): [(M 1)]<+>= 1342.5.

Korak 4

[0229]

[0230] N-{9-[(2R,3R,4R,5S)-5-({[(R)-{[(2S,3R,4R,5R)-5-(6-benzamido-9H-purin-9-il)-2-[({bis(propan-2-il)aminofosfanil}oksi)metil]-4-[(terc-butil-dimetilsilil)oksi]oksolan-3-il]amino}(2-cijanoetoksi)sulfaniliden-λ<5>-fosfanil]oksi}metil)-3-[(terc-butil-dimetilsilil)oksi]-4-[(trifenilmetil)amino]oksolan-2-il]-9H-purin-6-il}benzamid (160):U rastvor N-{9-[(2R,3R,4R,5S)-5-{[({[(2S,3R,4R,5R) -5-(6-benzamido-9H-purin-9-il)-4-[(terc-butil-dimetilsilil) oksi]-2-(hidroksimetil)oksolan-3-il]amino}(2-cijanoetoksi)sulfaniliden-λ<5>-fosfanil)oksi]metil}-3-[(terc-butil-dimetilsilil)oksi]-4-[(trifenilmetil)amino]oksolan-2-il]-9H-purin-6-il}benzamid (159, 1.1 g, 0.82 mmol) u acetonitrilu (3.3 mL) dodati su 3-(bis[bis(propan-2-il)amino]fosfaniloksi)propanonitril (0.49 g, 1.64 mmol) i piridinijum trifluoracetat (0.24 g, 1.23 mmol). Dobijena smeša je mešana 50 min na sobnoj temperaturi i korišćena je u sledećem koraku direktno, bez daljeg prečišćavanja.

[0231] O-[(2S,3R,4R,5R)-5-(6-benzamido-9H-purin-9-il)-3-[({[(2S,3R,4R,5R)-5-(6-benzamido-9H-purin-9-il)-4-[(terc-butil-dimetilsilil)oksi]-3-[(trifenilmetil)amino]oksolan-2-il]metoksi}(2-cijanoetoksi)sulfaniliden-λ<5>-fosfanil)amino]-4-[(terc-butil-dimetilsilil)oksioksolan-2-il]metil O-2-cijanoetil fosfonotioat (161):U gornji rastvor se uvodio vodonik-sulfid gas 1 min, nakon čega je dodat piridinijum trifluoracetat (0.24 g, 1.23 mmol). Nakon mešanja 30 min na sobnoj temperaturi, dobijeni rastvor je nanesen na reverzno-faznu C18 kolonu, eluiran sa 75%~99% (25 min) acetonitrila u vodi, da bi se dobila dva izomera naslovnog jedinjenja kao bezbojna čvrsta supstanca: izomer A (brže eluirajuća frakcija, eluira sa 95% acetonitrila) (530 mg, 44% za dve reakcije, sadrži 10% fosfatnog nusprodukta).<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 11.32 - 10.99 (m, 2H), 8.78 - 8.43 (m, 4H), 8.10 - 7.95 (m, 4H), 7.77 - 6.95 (m, 21H), 6.25 - 5.98 (m, 2H), 5.64 -5.30 (m, 1H), 4.82 - 4.42 (m, 1H), 4.46 - 3.85 (m, 10H), 3.85 - 3.61 (m, 1H), 3.61 - 3.37 (m, 1H), 3.23 - 2.97 (m, 2H), 2.92 - 2.66 (m, 4H), 0.89 - 0.56 (m, 18H), -0.07 - -0.27 (m, 12H);<31>P NMR (121 MHz, DMSO) δ 74.19, 74.06, 73.96, 73.46, 73.37, 73.31, 73.27, 72.79, 9.69, 9.15, 5.34, 4.70, 1.38, -1.11, -1.22, -1.67, -1.92; LC/MS (ESI, m/z): [(M 1)]<+>= 1475.4. I izomer B (sporije eluirajuća frakcija, eluira sa 99% acetonitrila) (560 mg, 46% za dve reakcije, sadrži 10% fosfatnog nusprodukta):<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 11.26 - 10.97 (m, 2H), 8.72 - 8.38 (m, 4H), 8.12 -7.90 (m, 4H), 7.67 -7.00 (m, 21H), 6.20 - 5.87 (m, 2H), 4.80 - 4.55 (m, 1H), 4.36 - 3.75 (m, 10H), 3.62 - 3.44 (m, 1H), 3.31 - 3.13 (m, 1H), 3.13 - 2.91 (m, 2H), 2.89 - 2.62 (m, 4H), 0.97 - 0.57 (m, 18H), 0.10 - -0.01 (m, 3H), -0.04 - -0.24 (m, 9H);<31>P NMR (121 MHz, DMSO) δ 114.61, 73.39, 73.00, 72.66, 72.26, 72.22, 72.07, 71.94, 9.83, 9.24, 5.35, 4.70, 1.37, -1.12, -1.18; LC/MS (ESI, m/z): [(M 1)]<+>= 1475.4. Izomer A i izomer B su nezavisno korišćeni u preostalim koracima sinteze (koraci 6 do 9).

[0232] O-[(2S,3R,4R,5R)-3-[({[(2S,3R,4R,5R)-3-amino-5-(6-benzamido-9H-purin-9-il)-4-[(tercbutil-dimetilsilil)oksioksolan-2-il]metoksi}(2-cijanoetoksi)sulfaniliden-λ<5>-fosfanil)amino]-5-(6-benzamido-9H-purin-9-il)-4-[(terc-butil-dimetilsilil)oksioksolan-2-il]metil O-2-cijanoetil fosfonotioat (162):U rastvor O-[(2S,3R,4R,5R)-5-(6-benzamido-9H-purin-9-il)-3-[({[(2S,3R,4R,5R)-5-(6-benzamido-9H-purin-9-il)-4-[(terc-butil-dimetilsilil)oksi]-3-[(trifenilmetil)amino]oksolan-2-il]metoksi}(2-cijanoetoksi)sulfaniliden-λ<5>-fosfanil)amino]-4-[(terc-butil-dimetilsilil)oksi]oksolan-2-il]metil O-2-cijanoetil fosfonotioat (161, 530 mg, 0.36 mmol, izomer A iz prethodnog koraka) u dihlormetanu (7.2 mL) dodati su dihlorsirćetna kiselina (460 mg, 3.59 mmol) i voda (32 mg, 1.80 mmol). Dobijeni rastvor je mešan 30 min na sobnoj temperaturi. Po završetku reakcije, ista je zaustavljena dodavanjem zasićenog vodenog rastvora natrijum bikarbonata (30 mL). Dobijena smeša je ekstrahovana sa dihlormetanom (3 x 30 mL). Organske faze su kombinovane i sušene preko bezvodnog natrijum sulfata. Nakon filtracije, filtrat je koncentrisan pod redukovanim pritiskom da bi se dobilo naslovno jedinjenje 162, koje je korišćeno u sledećem koraku direktno, bez daljeg prečišćavanja.

Korak 7

[0233]

[0234] N-19-[(1R,6S,8R,9R,10R,15S,17R,18R)-17-(6-benzamido-9H-purin-9-il)-9,18-bis[(tercbutildimetilsilil)oksi]-3,12-bis(2-cijanoetoksi)-3,12-disulfaniliden-4,7,13,16-tetraoksa-2,11-diaza-3λ<5>,12λ<5>-difosfatriciklo[3.3.0.0<6>,<10>]oktadekan-8-il-9H-purin-6-il}benzamid (163).

Korak 8

[0235]

[0236] [(1R,6S,8R,9R,10R,15S,17R,18R)-8,17-bis(6-amino-9H-purin-9-il)-9,18-bis[(terc-butildimetilsilil)oksi]-3,12-diokso-12-sulfanidil-4,7,13,16-tetraoksa-2,11-diaza-3λ<5>,12λ<5>-difosfatriciklo[13.3.0.0^6,10]oktadekan-3-il]sulfanid; bis(metanamijum) (164):Rastvor 163 (14.4 mL, 30%, m/m) je tretiran 30 minuta na sobnoj temperaturi. Po završetku reakcije, dobijeni rastvor je koncentrisan pod redukovanim pritiskom da bi se dobilo naslovno jedinjenje 164 kao bezbojna supstanca, koja je korišćena u sledećem koraku direktno, bez daljeg prečišćavanja..

Korak 9

[0238] Diamonijum [(1S,6S,8R,9R,10S,15S,17R,18R)-8,17-bis(6-amino-9H-purin-9-il)-9,18-dihidroksi-3,12-diokso-12-sulfanidil-4,7,13,16-tetraoksa-2,11-diaza-3λ<5>,12λ<5>-difosfatriciklo[13.3.0.0^6,10]oktadekan-3-il]sulfanid (74) 164 u piridinu (3,6 mL) je tretiran trietilaminom (1 mL) i trietilamin-trihidrofluoridom (2,89 g, 17,95 mmol) i dobijeni rastvor je mešan 2 sata na 60 °C nakon hlađenja na sobnu temperaturu dodato je 200 mL acetona da se precipitira sirovi proizvod koji je zatim pročišćen Prep-HPLC metodom sa sledećim uslovima kolona XBridge Prep C18 OBD 19 × 150 mm 5 μm pokretna faza A voda plus 20 mmol/L NH4HCO3pokretna faza B ACN brzina protoka 20 mL/min gradijent 1% B do 15% B u 11 min detektor 254/220 nm da bi se dobio jedan izomer brže eluiran pik vreme zadržavanja 7,52 min ovde nazvan 74-0A1 kao bezbojna supstanca (40.2 mg, 16.3% za 4 koraka):<1>H NMR (300 MHz, D2O) δ 8.49 (s, 1H), 8.41 (s, 1H), 8.14 - 8.02 (m, 1H), 7.96 - 7.86 (m, 1H), 6.08 (s, 1H), 6.05 (s, 1H), 4.82 (d, J = 4.1 Hz, 1H), 4.40 - 4.28 (m, 2H), 4.26 - 3.93 (m, 5H), 3.75 (d, J = 10.6 Hz, 2H);<31>P NMR (121 MHz, D2O) δ 57.74, 54.73; LC/MS (ESI, m/z): [(M -2NH3- 1)]<->= 686.9. A drugi izomer (sporije eluiran pik, vreme zadržavanja 9,77 min, ovde nazvan 74-0A2) kao bezbojna supstanca<1>H NMR (300 MHz, D2O+DMSO-d6) δ 8.50 (s, 2H), 8.02 (s, 2H), 6.09 (s, 2H), 4.50 -4.27 (m, 4H), 4.13 (d, J = 10.5 Hz, 2H), 3.98 (dd, J = 11.9, 5.4 Hz, 2H), 3.85 (s, 2H);<31>P NMR (121 MHz, D2O+DMSO-d6) δ 52.39; LC/MS (ESI, m/z): [(M -2NH3- 1)]<->= 686.9.

[0239] Koraci 6–9 izvedeni su na izomeru B dobijenom u Koraku 5 da bi se generisala druga dva izomera i mešani fosfat/tiofosfat koji su potom prečišćeni Prep-HPLC tehnikom sa sledećim uslovima: kolona XBridge Prep C18 OBD 19 × 150 mm, 5 µm; mobilna faza A: voda (plus 20 mmol/L NH4HCO3); mobilna faza B: ACN; protok: 20 mL/min; gradijent: 1% B do 40% B u 10 min; detektor: 254/220 nm da bi se dobio mešani fosfat tiofosfat diamonijum so 74-0B0 (pojedinačni izomer) [(1S,6S,8R,9R,10S,15S,17R,18R)-8,17-bis(6-amino-9H-purin-9-il)-9,18-dihidroksi-12-oksido-3,12-diokso-4,7,13,16-tetraoksa-2,11-diaza-3λ5,12λ5-difosfatriciklo [13.3.0.06,10]oktadekan-3-il]sulfanid kao bezbojna supstanca (5,6 mg, retenciono vreme 4,57 min)<1>H NMR (400 MHz, D2O) δ 8.72 - 8.49 (m, 2H), 8.16 - 7.95 (m, 2H), 6.24 - 6.09 (m, 2H), 4.84 (q, J = 5.8, 5.0 Hz, 1H), 4.48 - 4.38 (m, 1H), 4.33 - 4.21 (m, 2H), 4.21 - 4.02 (m, 4H), 3.94 -3.72 (m, 2H);<31>P NMR (162 MHz, D2O) δ 57.80, 6.25; LC/MS (ESI, m/z): [(M -2NH3- 1)]<->= 670.9. Jedan izomer ovde je označen kao 74-0B1 i predstavljen kao bezbojna supstanca (16,4 mg, 6% za 4 koraka, vreme zadržavanja 5,23 min)<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 8.64 (s, 2H), 8.13 (s, 2H), 5.97 (s, 2H), 4.37 - 4.29 (m, 2H), 4.11 - 4.00 (m, 2H), 4.02 - 3.88 (m, 4H);<31>P NMR (121 MHz, DMSO) δ 57.54. LC/MS (ESI, m/z): [(M -2NH3- 1)]-= 686.9. Drugi izomer ovde je označen kao 74-0B2 i predstavljen kao bezbojna supstanca (35 mg, 13% za 4 koraka, retenciono vreme 8,80 min), koja ima iste karakteristike kao 74-0A1. Veruje se da se izomeri 74-0A1, 74-0A2, 74-0B1 i 74-0B2 razlikuju po stereohemijskoj konfiguraciji na atomima fosfora.

Diamonijum (1S,6S,8R,9R,10S,15S,17R,18R)-8,17-bis(2-amino-6-okso-6,9-dihidro-1H-purin-9-il)-9,18-dihidroksi-3,12-diokso-4,7,13,16-tetraoksa-2,11-diaza-3λ<5>,12λ<5>-difosfatriciklo[13.3.0.0<6>,<10>]oktadekan-3,12-bis(olat)

[0240]

[0241] ((2S,3R,4R,5R)-4-((terc-bulildimetilsilil)oksi)-5-(2-izobuliramido-6-okso-1H-purin-9(6H)-il)-3-(tritilamino)tetrahidrofuran-2-il)metil (2-cijanoetil) ((2S,3R,4R,5R)-4-((tercbutildimetilsilil)oksi)-2-(hidroksimetil)-5-(2-izobutiramido-6-okso-1H-purin-9(6H)il)tetrahidrofuran-3-il)fosforamidat (165). U smešu [(2S,3R,4R,5R)-4-[(tercbutildimetilsilil)oksi]-5-[2-(2-metilpropanamido)-6-okso-6,9-dihidro-1H-purin-9-il]-3-[(trifenilmetil)amino]oksolan-2-il]metil 2-cijanoetil fosfonat (1.0 g, 1.21 mmol) i N-(9-((2R,3R,4R,5S)-4-amino-3-(terc-butildimetilsililoksi)-5-(hidroksimetil)-tetrahidrofuran-2-il)-6-okso-6,9-dihidro-1H-purin-2-il)izobutiramid (133, 0.56 g, 1.21 mmol) u acetonitrilu (12 mL)dodat je N,N-diizopropiletilamin (0.38 mL, 2.42 mmol) i ugljen tetrahlorid (0.47 mL, 4.84 mmol). Dobijena smeša se mešala 30 min na sobnoj temperaturi. Po završetku reakcije, smeša je nanesena na reverzno faznu kolonu C18 i eluiran sa 70%~95% (25 min) acetonitrila u vodi da bi se dobilo naslovno jedinjenje 165 kao bezbojna supstanca (440 mg, 43%):<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.12 (s, 2H), 11.46 (t, J = 11.1 Hz, 2H), 8.23 (s, 1H), 8.18 (s, 1H), 7.48 (dd, J = 6.3, 2.9 Hz, 6H), 7.40 - 7.31 (m, 6H), 7.25 (dt, J = 9.4, 7.5 Hz, 3H), 6.22 (dd, J = 17.5, 6.5 Hz, 1H), 5.77 (dd, J = 26.0, 4.5 Hz, 1H), 5.19 - 4.88 (m, 2H), 4.57 - 4.45 (m, 1H), 4.35 (d, J = 6.9 Hz, 1H), 4.19 - 3.39 (m, 6H), 3.27 (dd, J = 17.9, 2.3 Hz, 1H), 2.89 - 2.70 (m, 5H), 1.13 (dt, J = 6.6, 3.2 Hz, 12H), 0.72 (d, J = 32.6 Hz, 18H), 0.05 - -0.22 (m, 9H), -0.43 (d, J = 19.3 Hz, 3H);<31>p NMR (162 MHz, DMSO-d6) δ 8.98, 8.82; LC/MS (ESI, m/z): [(M 1)]<+>= 1308.5.

[0242] ((2S,3R,4R,5R)-4-((terc-bulildimetilsilil)oksi)-5-(2-izobuliramido-6-okso-1H-purin-9(6H)-il)-3-(tritilamino)tetrahidrofuran-2-il)metil (2-cijanoetil) ((2S,3R,4R,5R)-4-((tercbutildimetilsilil)oksi)-2-((((2-cijanoetil)(diizopropilamino)fosfino)oksi)metil)-5-(2-izobuliramido-6-okso-1H-purin-9(6H)-il)tetrahidrofuran-3-il)fosforamidat (166). U rastvor ((2S,3R,4R,5R)-4-(terc-butildimetilsililoksi)-5-(2-izobutiramido-6-okso-1,6-dihidropurin-9-il)-3-(tritilamino)-tetrahidrofuran-2-il)metil 2-cijanoetil (2S,3R,4R,5R)-4-(terc-butildimetilsililoksi)-2-(hidroksimetil)-5-(2-izobutiramido-6-okso-1,6-dihidropurin-9-il)-tetrahidrofuran-3-ilfosforamidat (165, 1.0 g, 0.77 mmol) dodat je 3-(bis[bis(propan-2-il)amino]fosfaniloksi)propanenitril (224 mg, 0.74 mmol) i piridin trifluoroacetat (224 mg, 1.16 mmol). Dobijena smeša je mešana 45 minuta na sobnoj temperaturi i korišćena u sledećem koraku direktno, bez daljeg prečišćavanja.

Korak 3

[0243]

[0244] ((2S,3R,4R,5R)-4-(terc-butildimetilsililoksi)-5-(2-izobutiramido-6-oksopurin-9-il)-3-(tritilamino)-tetrahidrofurano-2-il)metil 2-cijanoetil (2S,3R,4R,5R)-4-(terc-butildimetilsililoksi)-2-(((2-cijanoetoksi)hidrofosforiloksi)metil)-5-(2-izobutiramido-6-oksopurin-9-il)-tetrahidrofurano-3-ilfosforamidat (167). U navedeni rastvor dodati su voda (144 mg, 7,99 mmol) i piridin trifluoroacetat (224 mg, 1,16 mmol). Dobijeni rastvor je mešan 45 min na ambijentalnoj temperaturi. Po završetku, dobijeni rastvor je primenjen na C18 kolonu reverzne faze, eluiran sa 70%~95% acetonitrila u vodi (25 min) da bi se dobilo naslovno jedinjenje 167 kao bezbojna čvrsta supstanca. (800 mg, 73%):<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.07 (t, J = 8.4 Hz, 2H), 11.40 (s, 2H), 8.23 - 8.03 (m, 2H), 7.51 - 7.15 (m, 15H), 6.17 (dd, J = 12.4, 6.4 Hz, 1H), 5.80 - 5.65 (m, 2H), 4.66 - 4.55 (m, 1H), 4.25 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 4.19 - 3.94 (m, 5H), 3.96 - 3.76 (m, 3H), 3.60 (s, 1H), 3.41 (dq, J = 18.4, 6.9 Hz, 1H), 3.22 (d, J = 16.2 Hz, 1H), 2.84 (q, J = 6.0 Hz, 5H), 1.09 (dt, J = 6.8, 3.4 Hz, 12H), 0.73 (d, J = 2.3 Hz, 15H), 0.63 (d, J = 1.9 Hz, 3H), -0.08 (d, J = 2.3 Hz, 2H), -0.12 - -0.27 (m, 7H), -0.40 - -0.51 (m, 3H);<31>P NMR (162 MHz, DMSO-d6) δ 9.75, 9.71, 9.23, 9.14, 8.49, 8.34; LC/MS (ESI, m/z): [(M 1)]<+>= 1407.5.

[0245] ((2S,3R,4R,5R)-3-amino-4-(terc-butildimetilsililoksi)-5-(2-izobutiramido-6-oksopurin-9-il)-tetrahidrofurano-2-il)metil 2-cijanoetil (2S,3R,4R,5R)-4-(terc-butildimetilsililoksi)-2-(((2-cijanoetoksi)hidrofosforiloksi)metil)-5-(2-izobutiramido-6-oksopurin-9-il)-tetrahidrofurano-3-ilfosforamidat (168).U rastvor ((2S,3R,4R,5R)-4-(terc-butildimetilsililoksi)-5-(2-izobutiramido-6-oksopurin-9-il)-3-(tritilamino)-tetrahidrofurano-2-il)metil 2-cijanoetil (2S,3R,4R,5R)-4-(tercbutildimetilsililoksi)-2-(((2-cijanoetoksi)hidrofosforiloksi)metil)-5-(2-izobutiramido-6-oksopurin-9-il)-tetrahidrofurano-3-ilfosforamidat (167, 800 mg, 0,57 mmol) u dihlormetanu (15 mL) dodati su voda (0,51 mL) i dihlorsirćetna kiselina (0,47 mL, 5,7 mmol). Dobijeni rastvor je mešan 10 min na sobnoj temperaturi. Po završetku, reakcija je zaustavljena dodavanjem zasićenog vodenog rastvora natrijum bikarbonata (30 mL). Dobijena smeša je ekstrahovana dihlormetanom (3 x 30 mL). Organske faze su kombinovane i osušene sa bezvodnim natrijum sulfatom. Nakon filtracije, filtrat je koncentrisan pod redukovanim pritiskom da bi se dobilo naslovno jedinjenje 168, koje je korišćeno u narednom koraku bez dalje prečišćavanja.LC/MS (ESI, m/z): [(M 1)]<+>= 1165.4.

Korak 5

[0246]

[0247] N-{9-[(1R,6S,8R,9R,10R,15S,17R,18R)-9,18-bis[(terc-butildimetilsilil)oksi]-3,12-bis(2-cijanoetoksi)-17-[2-(2-metilpropanamido)-6-oksopurin-9-il]-3,12-diokso-4,7,13,16-tetraoksa-2,11-diaza-3λ<5>,12λ<5>-difosfatriciklo[13.3.0.0^6,10]oktadekan-8-il]-6-oksopurin-2-il}-2-metilpropanamid (169).U 168 u acetonitrilu (80 mL) dodati su trietilamin (1,4 mL) i tetrahlorometan (1,4 mL). Dobijeni rastvor je mešan 10 min na sobnoj temperaturi. Po završetku, rastvor je koncentrisan pod redukovanim pritiskom da bi se dobilo sirovo naslovno jedinjenje 169, koje je korišćeno u narednom koraku bez daljeg prečišćavanja. LC/MS (ESI, m/z): [(M 1)]<+>= 1163.5.

Korak 6

[0249] (1R,6S,8R,9R,10R,15S,17R,18R)-8,17-bis(2-amino-6-okso-6,9-dihidro-1H-purin-9-il)-9,18-bis[(terc-butildimetilsilil)oksi]-3,12-dihidroksi-4,7,13,16-tetraoksa-2,11-diaza-3λ<5>,12λ<5>-difosfatriciklo[13.3.0.0<6>,<10>]oktadekan-3,12-dion (170).170 kao bezbojna čvrsta supstanca,koja je korišćena u narednom koraku bez daljeg prečišćavanja: LC/MS (ESI, m/z): [(M -2MeNH2+ 1)]<+>= 917.7.

Korak 7

[0250]

[0251] Diamonijum (1S,6S,8R,9R,10S,15S,17R,18R)-8,17-bis(2-amino-6-oksopurin-9-il)-9,18-dihidroksi-3,12-diokso-4,7,13,16-tetraoksa-2,11-diaza-3λ<5>,12λ<5>-difosfatriciklo[13.3.0.0^6,10]oktadekan-3,12-bis(olat) (75).Mobilna faza A: 4HCO₃, mobilna faza B: ACN; protok: 20 mL/min; gradijent: 0% B do 12% B u 10 min; detektor: 254/220 nm; retenciono vreme: 9,35 min; da bi se dobilo naslovno jedinjenje 75 kao bezbojna čvrsta supstanca. (50.7 mg, 15%):<1>H NMR (400 MHz, D2O) δ 8.06 (s, 2H), 5.74 (s, 2H), 4.47 (s, 2H), 4.19 (d, J = 11.8 Hz, 2.3H), 4.09 - 3.98 (m, 6.5H);<31>P NMR (162 MHz, D2O) δ 6.97; LC/MS (ESI, m/z): [(M - 2NH3- 1)]<->= 687.1.

Diamonijum [(1S,6S,8R,9R,10S,15S,17R,18R)-8,17-bis(2-amino-6-okso-6,9-dihidro-1H-purin-9-il)-9,18-dihidroksi-3,12-diokso-12-sulfanidil-4,7,13,16-tetraoksa-2,11-diaza-3λ<5>,12λ<5>-difosfatriciklo[13.3.0.0<6>,<10>]oktadekan-3-il]sulfanid

[0252]

Korak 1

[0253]

[0254] O-(((2S,3R,4R,5R)-4-((terc-butildimetilsilil)oksi)-5-(2-izobutiramido-6-oksopurin-9(6H)-il)-3-(tritilamino)tetrahidrofurano-2-il)metil) O-(2-cijanoetil) ((2S,3R,4R,5R)-4-((tercbutildimetilsilil)oksi)-2-(hidroksimetil)-5-(2-izobutiramido-6-oksopurin-9(6H)-il)tetrahidro furano-3-il)fosforamidotioat (171).U smešu [(3S,5R)-4-[(terc-butildimetilsilil)oksi]-5-[2-(2-metilpropanamido)-6-oksopurin-9-il]-3-[(trifenilmetil)amino]oksolan-2-il]metil 2-cijanoetil sulfanilidenfosfonita (142, 1,20 g, 1,42 mmol) i N-9-[(2R,4S)-4-amino-3-[(tercbutildimetilsilil)oksi]-5-(hidroksimetil)oksolan-2-il]-6-oksopurin-2-il-2-metilpropanamid (0,67 g, 1,42 mmol) u acetonitrilu (15 mL) dodati su N,N-diizopropiletilamin (0,48 mL, 2,84 mmol) i tetrahlormetan (0,60 mL, 5,68 mmol). Dobijeni rastvor je mešan 30 min na sobnoj temperaturi. Po završetku, dobijena smeša je primenjena na reverzno faznu kolonu C18, eluiran sa 75%~99% acetonitrila u vodi (25 min) da bi se dobilo naslovno jedinjenje 171 (dva izomera: izomer A i izomer B) kao bezbojna čvrsta supstanca: Izomer A (brže eluirajuća frakcija, eluira sa 95% acetonitrila). (325 mg, 18%):<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.10 (s, 2H), 11.45 (d, J = 15.3 Hz, 2H), 8.19 (d, J = 2.6 Hz, 2H), 7.54 - 7.47 (m, 6H), 7.37 (t, J = 7.7 Hz, 6H), 7.31 - 7.22 (m, 3H), 6.23 (d, J = 6.6 Hz, 1H), 5.75 (d, J = 4.9 Hz, 1H), 5.33 (dd, J = 11.2, 7.3 Hz, 1H), 5.00 (t, J = 5.3 Hz, 1H), 4.82 (s, 1H), 4.52 (t, J = 5.3 Hz, 1H), 4.05 (q, J = 9.8 Hz, 1H), 3.98 - 3.80 (m, 5H), 3.69 (t, J = 9.3 Hz, 1H), 3.55 (dd, J = 11.5, 5.0 Hz, 1H), 3.46 - 3.33 (m, 1H), 3.27 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 2.79 (dtd, J = 19.7, 6.3, 4.4 Hz, 5H), 1.25 (d, J = 3.1 Hz, 2H), 1.17 - 1.09 (m, 10H), 0.75 (s, 9H), 0.67 (s, 9H), -0.09 - - 0.24 (m, 9H), -0.39 (s, 3H);<31>P NMR (162 MHz, DMSO-d6) δ 73.63; LC/MS (ESI, m/z): [(M 1)]<+>= 1306.5. I izomer B (sporije eluirajuća frakcija, eluira sa 99% acetonitrila) (452 mg, 25%):<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.14 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 11.48 (d, J = 18.3 Hz, 2H), 8.18 (s, 1H), 8.11 (s, 1H), 7.51 - 7.44 (m, 6H), 7.33 (t, J = 7.7 Hz, 6H), 7.23 (dd, J = 8.2, 6.4 Hz, 3H), 6.14 (d, J = 5.7 Hz, 1H), 5.82 (d, J = 4.7 Hz, 1H), 5.56 (d, J = 9.9 Hz, 1H), 5.11 (t, J = 5.2 Hz, 1H), 4.50 (t, J = 5.2 Hz, 1H), 4.22 (s, 1H), 3.95 (dd, J = 13.6, 7.2 Hz, 6H), 3.79 (d, J = 9.4 Hz, 1H), 3.64 (s, 1H), 3.48 (s, 1H), 3.21 (s, 1H), 2.90 - 2.75 (m, 4H), 1.14 (ddd, J = 10.0, 6.8, 1.6 Hz, 12H), 0.75 (d, J = 5.0 Hz, 18H), -0.05 (s, 3H), -0.14 (d, J = 2.6 Hz, 6H), -0.35 (s, 3H);<31>P NMR (162 MHz, DMSO-d6) δ 73.21; LC/MS (ESI, m/z): [(M 1)]<+>= 1306.5. Izomer A i izomer B su nezavisno sprovedeni kroz preostale korake(Od koraka 2 do koraka 7).

[0255] O-(((2S,3R,4R,5R)-4-((terc-butildimetilsilil)oksi)-5-(2-izobutiramido-6-oksopurin-9(6H)-il)-3-(tritilamino)tetrahidrofurano-2-il)metil) O-(2-cijanoetil) ((2S,3R,4R,5R)-4-((tercbutildimetilsilil)oksi)-2-((((2-cijanoetoksi)(diizopropilamino)fosfino)oksi)metil)-5-(2-izobutiramido-6-oksopurin-9(6H)-il)tetrahidrofurano-3-il)fosforamidotioat (172). U rastvor O-(((2S,3R,4R,5R)-4-((terc-butildimetilsilil)oksi)-5-(2-izobutiramido-6-oksopurin-9(6H)-il)-3-(tritilamino)tetrahidrofurano-2-il)metil) O-(2-cijanoetil) ((2S,3R,4R,5R)-4-((tercbutildimetilsilil)oksi)-2-(hidroksimetil)-5-(2-izobutiramido-6-oksopurin-9(6H)-il)tetrahidro furano-3-il)fosforamidotioat (171, izomer A, 325 mg, 0,25 mmol) u acetonitrilu (2 mL) dodati su 3-(bis[bis(propan-2-il)amino]fosfaniloksi)propanonitril (150 mg, 0,50 mmol) i piridin trifluoroacetat (72 mg, 0,37 mmol). Dobijena smeša je mešana 50 min na sobnoj temperaturi i korišćena direktno u narednom koraku.

Korak 3

[0257]O-[(2S,3R,4R,5R)-4-[(terc-butildimetilsilil)oksi]-3-[({[(2S,3R,4R,5R)-4-[(tercbutildimetilsilil)oksi]-5-[2-(2-metilpropanamido)-6-oksopurin-9-il]-3-[(trifenilmetil)amino] oksolan-2-il]metoksi}(2-cijanoetoksi)sulfaniliden-λ<5>-fosfanil)amino]-5-[2-(2-metilpropanamido) -6-oksopurin-9-il]oksolan-2-il]metil O-2-cijanoetil fosfonotioat (173).U navedeni rastvor se uvodio vodonik-sulfid 1 min, nakon čega je dodat piridin trifluoroacetat (72 mg, 0,37 mmol). Nakon mešanja 30 min na sobnoj temperaturi, dobijeni rastvor je nanesen na reverzno faznu C18 kolonu, eluiran sa 75%~99% acetonitrila u vodi (25 min), da bi se dobilo želјeno jedinjenje kao bezbojna čvrsta supstanca (278 mg, 80% za dva koraka). LC/MS (ESI, m/z): [(M+1)]<+>= 1439.9.

Korak 4

[0259] O-[(2S,3R,4R,5R)-3-[({[(2S,3R,4R,5R)-3-amino-4-[(terc-butildimetilsilil)oksi]-5-[2-(2-metilpropanamido)-6-okso-6,9-dihidro-1H-purin-9-il]oksolan-2-ilmetoksi}(2-cijanoetoksi) sulfaniliden-λ<5>-fosfanil)amino]-4-[(terc-butildimetilsilil)oksi]-5-[2-(2-metilpropanamido)-6-okso-6,9-dihidro-1H-purin-9-il]oksolan-2-il]metil O-2-cijanoetil fosfonotioat (174). U rastvor O-[(2S,3R,4R,5R)-4-[(terc-butildimetilsilil)oksi]-3-[({[(2S,3R,4R,5R)-4-[(terc-butildimetilsilil) oksi]-5-[2-(2-metilpropanamido)-6-oksopurin-9-il]-3-[(trifenilmetil)amino]oksolan-2-il] metoksi}(2-cijanoetoksi)sulfaniliden-λ<5>-fosfanil)amino]-5-[2-(2-metilpropanamido)-6-oksopurin-9-il]oksolan-2-il]metil O-2-cijanoetil fosfonotioat (173, 278 mg, 0,19 mmol) u dihlormetanu (4 mL) dodati su dihlorsirćetna kiselina (247 mg, 1,10 mmol) i voda (17,4 mg, 0,97 mmol). Dobijeni rastvor je mešan 20 min na sobnoj temperaturi. Po završetku, reakcija je zaustavljena dodavanjem zasićenog vodenog rastvora natrijum bikarbonata (30 mL). Dobijena smeša je ekstrahovana dihlormetanom (3 x 30 mL). Organske faze su kombinovane i osušene sa bezvodnim natrijum sulfatom. Nakon filtracije, filtrat je koncentrisan pod redukovanim pritiskom da bi se dobilo naslovno jedinjenje 174, koje je korišćeno u narednom koraku bez daljeg prečišćavanja.

Korak 5

[0260]

[0261] N-{9-[(1R,6S,8R,9R,10R,15S,17R,18R)-9,18-bis[(terc-butildimetilsilil)oksi]-3,12-bis(2-cijanoetoksi)-17-[2-(2-metilpropanamido)-6-okso-6,9-dihidro-1H-purin-9-il]-3,12-disulfaniliden-4,7,13,16-tetraoksa-2,11-diaza-3λ<5>,12λ<5>-difosfatriciklo[13.3.0.0<6>,<10>]oktadekan-8-il]-6-okso-6,9-dihidro-1H-purin-2-il}-2-metilpropanamid (175). U 174 u acetonitrilu (38,6 mL) dodati su trietilamin (0,77 mL) i tetrahlormetan (0,77 mL). Dobijeni rastvor je mešan 10 min na sobnoj temperaturi. Po završetku, rastvor je koncentrisan pod redukovanim pritiskom da bi se dobilo sirovo naslovno jedinjenje 175, koje je korišćeno u narednom koraku bez daljeg prečišćavanja.

Korak 6

[0263] (1R,6S,8R,9R,10R,15S,17R,18R)-8,17-bis(2-amino-6-oksopurin-9-il)-9,18-bis[(tercbutildimetilsilil)oksi]-3,12-diokso-12-sulfanidil-4,7,13,16-tetraoksa-2,11-diaza-3λ<5>,12λ<5>-difosfatriciklo[13.3.0.0^6,10]oktadekan-3-il]sulfanid; bis(metanaminijum) (176). 175 je tretirano rastvorom metilamina u alkoholu (14,4 mL, 30% m/m) 30 min na sobnoj temperaturi. Po završetku, dobijeni rastvor je koncentrisan pod redukovanim pritiskom da bi se dobilo naslovno jedinjenje 176 kao bezbojna čvrsta supstanca, koje je korišćeno u narednom koraku bez daljeg prečišćavanja.

Korak 7

[0264]

[0265] Diamonijum [(1S,6S,8R,9R,10S,15S,17R,18R)-9,18-dihidroksi-8,17-bis[2-(2-metilpropanamido)-6-okso-6,9-dihidro-1H-purin-9-il]-3,12-diokso-12-sulfanidil-4,7,13,16-tetraoksa-2,11-diaza-3λ<5>,12λ<5>-difosfaticiklo[13.3.0.0<6>,<10>]oktadekan-3-il]sulfanid (76). U 176 u piridinu (2,76 mL) dodati su trietilamin (0,41 mL) i trietilamin trihidrofluorid (2,2 mL). Dobijeni rastvor je mešan 2 sata na 60 °C. Nakon hlađenja na sobnu temperaturu, dodat je aceton (55 mL) da bi se taložio sirovi proizvod, koji je potom prečišćen metodom Prep-HPLC pod sledećim uslovima: kolona: Atlantis Prep T3OBD, 19 x 250 mm, 10 μm; mobilna faza A: voda (plus 10 mmol/L NH₄HCO₃); mobilna faza B: ACN; protok: 20 mL/min; gradijent: 1% B do 12% B u 26 min; detektor: 254/220 nm; da bi se dobila mešovita fosfat/tiofosfat diamonijum so [(1S,6S,8R,9R,10S,15S,17R,18R)-8,17-bis(2-amino-6-oksopurin-9-il)-9,18-dihidroksi-12-oksido-3,12-diokso-4,7,13,16-tetraoksa-2,11-diaza-3λ<5>,12λ<5>-difosfatriciklo[13.3.0.0^6,10] oktadekan-3-il]sulfanid (prvi eluiran pik, vreme zadržavanja 14,65 min, u daljem tekstu označeno kao 76-0A1) kao bezbojna čvrsta supstanca. (3.6 mg, 1.4%):<1>H NMR (400 MHz, D2O) δ 7.97 (d, J = 11.2 Hz, 2H), 5.79 (d, J = 5.1 Hz, 2H), 4.51 (s, 1H), 4.44 (s, 1H), 4.36 (d, J = 12.0 Hz, 1H), 4.29 - 3.98 (m, 7H);<31>P NMR (162 MHz, D2O) δ 57.92, 56.01, 54.65, 7.09; LC/MS (ESI, m/z): [(M - 1)]-= 703.0. Jedan izomer (drugi eluiran pik, vreme zadržavanja 14,97 min, u daljem tekstu označen kao 76-0A2) kao bezbojna čvrsta supstanca. (14.6 mg, 5.7%):<1>H NMR (400 MHz, D2O) δ 8.28 (s, 1H), 8.10 (s, 1H), 5.94 (s, 2H), 4.41 - 4.28 (m, 2H), 4.23 - 3.91 (m, 8H);<31>P NMR (162 MHz, D2O) δ 58.10, 54.47; LC/MS (ESI, m/z): [(M - 1)]<->= 718.95. I drugi izomer (treći eluiran pik, vreme zadržavanja 22,75 min, u daljem tekstu označeno kao 76-0A3) kao bezbojna čvrsta supstanca. (22.8 mg, 8.9%):<1>H NMR (400 MHz, D2O) δ 10.33 (s, 2H), 7.96 (s, 2H), 6.36 (m, 4H), 6.24 (m, 2H), 6.03 (m, 3H);<31>P NMR (162 MHz, D2O) δ 56.81; LC/MS (ESI, m/z): [(M - 1)]<->= 718.9.

[0266] Koraci 2–7 su izvedeni na izomeru B dobijenom u koraku 1 da bi se dobio poslednji željeni proizvod, u daljem tekstu označen kao 76-0B1, koji je prečišćen metodom Prep-HPLC pod sledećim uslovima: kolona: XBridge Prep C18 OBD, 19 × 150 mm, 5 μm; mobilna faza A: voda (plus 20 mmol/L NH₄HCO₃); mobilna faza B: ACN; protok: 20 mL/min; gradijent: 1% B do 9% B u 8 min; detektor: 254/220 nm; vreme zadržavanja: 6,85 min. (7.3 mg, prinos za 5 koraka iznosi 3.8%):<1>H NMR (300 MHz, D2O) δ 8.24 (s, 1H), 8.04 (s, 1H), 5.88 (s, 2H), 4.37 - 4.21 (m, 2H), 4.20 - 3.86 (m, 8H);<31>P NMR (121 MHz, D2O) δ 58.03, 54.44; LC/MS (ESI, m/z): [(M - 1)]<->= 719.0. Veruje se da se izomeri 76-0A2, 76-0A3 i 76-0B1 razlikuju u stereohemijskoj konfiguraciji na atomima fosofora.

Diamonijum [(1R,6R,8R,9R,10R,15R,17R,18R)-8,17-bis(6-amino-9H-purin-9-il)-9,18-difluoro-3,12-diokso-12-sulfanidil-2,7,11,16-tetraoksa-4,13-diaza-3λ<5>,12λ<5>-difosfatriciklo[13.3.0.0<6>,<10>]oktadekan-3-il]sulfanid

[0267]

Korak 1

[0268]

[0269] (2R,3R,4R,5S)-5-(6-benzamido-9H-purin-9-il)-4-fluoro-2-((tritilamino)metil)tetrahidro furano-3-il (2-cijanoetil) diizopropilfosforamidit (177).U rastvor N-(9-((2S,3R,4R,5R)-3-fluoro-4-hidroksi-5-((tritilamino)metil)tetrahidrofurano-2-il)-9H-purin-6-il)benzamida (INT-E, 0,80 g, 1,31 mmol) u acetonitrilu (5 mL) dodat je piridin trifluoracetat (0,38 g, 1,91 mmol) i 3-(bis[bis(propan-2-il)amino]fosfaniloksi)propanonitril (0,78 g, 2,60 mmol). Dobijeni rastvor je mešan 2 sata na sobnoj temperaturi. Po završetku reakcije, dobijeni rastvor je nanesen na reverznofaznu C18 kolonu, eluiran sa 70%~95% acetonitrila u vodi (25 min) da bi se izdvojilo naslovno jedinjenje 177 kao bezbojni čvrsti proizvod (0,8 g, 75%).H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 11.25 (s, 1H), 8.67 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 8.40 - 8.32 (m, 1H), 8.07 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 7.74 -7.08 (m, 18H), 6.44 (ddd, J = 19.5, 11.7, 2.9 Hz, 1H), 5.89 (dq, J = 52.9, 3.8 Hz, 1H), 5.38 - 5.09 (m, 1H), 4.36 - 4.20 (m, 1H), 3.97 - 3.78 (m, 1H), 3.78 - 3.48 (m, 3H), 3.09 - 2.63 (m, 3H), 2.43 (d, J = 5.3 Hz, 1H), 1.31 - 0.96 (m, 12H);<19>F NMR (282 MHz, DMSO-d6) δ -200.77, -200.79, - 201.31, -201.36;<31>P NMR (121 MHz, DMSO-d6) δ 149.59, 149.50, 149.45; LC/MS (ESI, m/z): [(M 1)]<+>= 787.0.

Korak 2

[0270]

O-((2K,3K,4K,5S)-5-(6-benzamido-9H-purin-9-il)-4-fluoro-2-((tritilamino)metil)tetrahidrofuran-3-il) O-(2-cijanoetil) fosfonotioat (178).

[0271] U smešu (2R,3R,4R,5S)-5-(6-benzamido-9H-purin-9-il)-4-fluoro-2-((tritilamino)metil) tetrahidrofurano-3-il (2-cijanoetil) diizopropilfosforamidita (177, 0,80 g, 0,98 mmol) i 1H-1,2,3,4-tetrazola (69 mg, 0,98 mmol) u suvom acetonitrilu (5 mL) uvođen je vodonik-sulfid u trajanju od 1 minuta na sobnoj temperaturi. Dobijeni rastvor je zatvoren i mešan još 1 sat na sobnoj temperaturi. Po završetku reakcije, dobijeni rastvor je nanesen na reverzno-faznu C18 kolonu, eluiran sa 70%~95% acetonitrila u vodi (25 min) da bi se izdvojilo naslovno jedinjenje 178 kao bezbojni čvrsti proizvod. (0.70 g, 95%):<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.26 (s, 1H), 8.66 -8.65 (m, 1H), 8.41 (s, 1H), 8.08 - 8.04 (m, 2H), 7.70 - 7.20 (m, 18H), 6.46 (dd, J = 18.2, 2.6 Hz, 1H), 6.16 - 5.24 (m, 2H), 4.65 - 4.50 (m, 1H), 4.37 - 3.83 (m, 4H), 3.11 - 2.93 (m, 1H), 2.93 - 2.72 (m, 3H);<19>F NMR (376 MHz, DMSO-d6) δ - 201.20, -203.22;<31>P NMR (162 MHz, DMSO-d6) δ - 2.64; LC/MS (ESI, m/z): [(M 1)]<+>= 748.0.

Korak 3

[0272]

[0273] O-((2R,3R,4R,5R)-5-(6-benzamido-9H-purin-9-il)-4-fluoro-2-((tritilamino)metil)tetra hidrofurano-3-il) O-(2-cijanoetil) (((2R,3R,4R,5R)-5-(6-benzamido-9H-purin-9-il)-4-fluoro-3-hidroksitetrahidrofurano-2-il)metil)fosforamidotiolat (179). U rastvor O-((2R,3R,4R,5S)-5-(6-benzamido-9H-purin-9-il)-4-fluoro-2-((tritilamino)metil)tetrahidrofurano-3-il) O-(2-cijanoetil) fosfonotiolata (178, 0,70 g, 0,94 mmol) u N-metilpirolidonu (5 mL) dodati su N,N-dizopropiletilamin (0,48 g, 3,76 mmol), N-(9-((2S,3R,4R,5R)-5-(aminometil)-3-fluoro-4-hidroksitetrahidrofurano-2-il)-9H-purin-6-il)benzamid (349 mg, 0,94 mmol) i ugljen tertrahlorid (0,58 mg, 3,76 mmol) na sobnoj temperaturi. Dobijeni rastvor je mešan 2 sata na sobnoj temperaturi. Po završetku reakcije, dobijeni rastvor je nanesen na reverzno-faznu C18 kolonu, eluiran sa 70%~95% acetonitrila u vodi (25 min) da bi se izdvojilo naslovno jedinjenje 179 kao bezbojni čvrsti proizvod. (0.70 g, 67%):<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 11.26 (s, 2H), 8.78 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 8.74 - 8.59 (m, 2H), 8.15 - 7.96 (m, 5H), 7.73 -7.06 (m, 22H), 6.53 - 6.25 (m, 3H), 6.13 (dq, J = 51.3, 4.8 Hz, 1H), 5.95 - 5.46 (m, 3H), 4.75 - 4.34 (m, 2H), 4.22 - 3.95 (m, 3H), 3.55 - 3.10 (m, 3H), 2.92 (t, J = 5.9 Hz, 1H), 2.55 (d, J = 13.5 Hz, 1H), 2.32 (dt, J = 11.3, 6.6 Hz, 1H);<19>F NMR (282 MHz, DMSO-d6) δ -204.01, -204.03, -204.33, -204.40;<31>P NMR (121 MHz, DMSO-d6) δ 74.35, 74.01; LC/MS (ESI, m/z): [(M 1)]<+>= 1118.0.

Korak 4

[0274]

[0275] O-((2R,3R,4R,5R)-5-(6-benzamido-9H-purin-9-il)-4-fluoro-2-((tritilamino)metil)tetra hidrofurano-3-il) O-(2-cijanoetil) (((2R,3R,4R,5R)-5-(6-benzamido-9H-purin-9-il)-3-(((2-cijanoetoksi)(diizopropilamino)fosfino)oksi)-4-fluorotetrahidrofurano-2-il)metil)fosfor amidotioat (180). U rastvor O-((2R,3R,4R,5R)-5-(6-benzamido-9H-purin-9-il)-4-fluoro-2-((tritilamino)metil)tetrahidrofurano-3-il) O-(2-cijanoetil) (((2R,3R,4R,5R)-5-(6-benzamido-9H-purin-9-il)-4-fluoro-3-hidroksitetrahidrofurano-2-il)metil)fosforamidotioata (179, 0,70 g, 0,63 mmol) u acetonitrilu (5 mL) dodati su piridin-trifluoracetat (0,18 g, 0,94 mmol) i 3-([bis[bis(propan-2-il)amino]fosfanil]oksi)propanonitril (0,38 g, 1,25 mol). Dobijeni rastvor je mešan 2 sata na sobnoj temperaturi. Po završetku, dobijeni rastvor je nanesen na reverzno-faznu C18 kolonu, eluiran sa 70%~95% acetonitrila u vodi (25 min), čime je dobijeno naslovno jedinjenje 180 u obliku bezbojnog čvrstog jedinjenja. (0.7 g, 85%):<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 11.27 (s, 2H), 8.80 - 8.61 (m, 3H), 8.11 - 8.04 (m, 5H), 7.70 - 7.07 (m, 22H), 6.57 - 6.26 (m, 3H), 6.26 - 5.98 (m, 1H), 5.95 - 5.58 (m, 2H), 4.97 (dtt, J = 22.5, 10.9, 6.8 Hz, 1H), 4.42 (dt, J = 13.3, 4.0 Hz, 1H), 4.33 - 3.96 (m, 3H), 3.83 (dtd, J = 14.6, 6.1, 3.8 Hz, 2H), 3.76 - 3.57 (m, 2H), 3.32 - 3.13 (m, 2H), 2.96 - 2.67 (m, 4H), 2.54 (d, J = 9.3 Hz, 1H), 2.40 - 2.23 (m, 1H), 1.22 - 1.17 (m, 12H);<19>F NMR (282 MHz, DMSO-d6) δ -200.71, -200.74, -201.16, -201.21, -201.64, -201.67, -201.77, -201.81, - 201.99, -202.01, -204.16, -204.33, -204.44, -204.61;<31>P NMR (121 MHz, DMSO-d6) δ 149.99, 149.93, 149.88, 149.85, 149.75, 149.64, 149.54, 74.72, 74.52, 74.14, 74.11; LC/MS (ESI, m/z): [(M 1)]<+>= 1318.0.

Korak 5

[0277] O-(2R,3R,4R,5R)-5-(6-benzamido-9H-purin-9-il)-2-{[({[(2R,3R,4R,5R)-5-(6-benzamido -9H-purin-9-il)-4-fluoro-2-{[(trifenilmetil)amino]metil}oksolan-3-il]oksi}(2-cijanoetoksi) sulfaniliden-λ<5>-fosfanil)amino]metil}-4-fluorooksolan-3-il O-2-cijanoetil fosfonotioat (181). 180 (0,70 g, 0,53 mmol) i 1H-1,2,3,4-tetrazola (37,2 mg, 0,53 mmol) u acetonitrilu (5 mL) je propuštan kroz mehuriće vodonik sulfida tokom 1 minuta. Dobijeni rastvor je zatvoren i mešan 2 sata na sobnoj temperaturi. Po završetku, dobijeni rastvor je nanesen na reverzno-faznu C18 kolonu i eluiran sa 70%~95% (25 min) acetonitrila u vodi da bi se dobilo naslovno jedinjenje 181 kao bezbojni čvrsti proizvod. (580 mg, 87%):<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 11.24 (s, 2H), 8.87 -8.55 (m, 3H), 8.20 - 7.90 (m, 5H), 7.75 - 6.98 (m, 21H), 6.57 - 5.44 (m, 8H), 4.72 - 4.32 (m, 2H), 4.28 - 3.87 (m, 3H), 3.42 (s, 1H), 3.25 (d, J = 27.1 Hz, 3H), 2.85 (dt, J = 51.9, 5.8 Hz, 2H), 2.31 (s, 1H);<19>F NMR (282 MHz, DMSO-d6) δ -202.87, -203.12, -203.34, - 203.71, -203.95, -204.02, -204.35;<31>P NMR (121 MHz, DMSO-d6) δ 74.43, 74.07, 4.62, 4.62, -1.59, -1.67, -2.54, -2.71, -2.87; LC/MS (ESI, m/z): [(M 1)]<+>= 1251.0.

Korak 6

[0279]O-(2R,3R,4R,5R)-2-{[({[(2R,3R,4R,5R)-2-(aminometil])-5-(6-benzamido-9H-purin-9-il)-4-fluorooksolan-3-il]oksi}(2-cijanoetoksi)sulfaniliden-λ⁵-fosfanil)amino]metil}-5-(6-benzamido-9H-purin-9-il)-4-fluorooksolan-3-il O-2-cijanoetil fosfonotioat (182).Rastvor O-(2R,3R,4R,5R)-5-(6-benzamido-9H-purin-9-il)-2-{[({[(2R,3R,4R,5R)-5-(6-benzamido-9H-purin-9-il)-4-fluoro-2-{[(trifenilmetil)amino]metil}oksolan-3-il]oksi}(2-cijanoetoksi)sulfaniliden-λ⁵-fosfanil) amino]metil}-4-fluorooksolan-3-il O-2-cijanoetil fosfonotioata (181, 0,58 g, 0,46 mmol) u dihlormetanu (10 mL) tretiran je dihlorsirćetnom kiselinom (0,24 g, 1,05 mmol) tokom 30 min na sobnoj temperaturi. Dobijeni rastvor je korišćen u narednom koraku bez ikakve obrade: LC/MS. (ESI, m/z): [(M 1)]<+>= 1009.2.

Korak 7

[0280]

N-{9-[(1R,6R,8R,9R,10R,15R,17R,18R)-17-(6-benzamido-9H-purin-9-il)-3,12-bis(2-cijanoetoksi)-9,18-difluoro-3,12-disulfaniliden-2,7,11,16-tetraoksa-4,13-diaza-3λ<5>,12λ<5>-difosfatricvc1or[13.3.0.0<6>,<10>]oktadekan-8-il]-9H-purin-6-il}benzamid (183).

[0281] U prethodnom reakcionom rastvoru dodat je acetonitril (100 mL), zatim trietilamin (20 mL) i tetrahlormetan (20 mL). Dobijeni rastvor je mešan 1 h na sobnoj temperaturi. Po završetku, dobijeni rastvor je koncentrovan pod sniženim pritiskom da bi se dobilo sirovo naslovno jedinjenje 183, koje je direktno korišćeno u narednom koraku bez daljeg prečišćavanja: LC/MS (ESI, m/z):

[(M 1)]<+>= 1007.2.

Korak 8

[0282]

[0283] Diamonijum [(1R,6R,8R,9R,10R,15R,17R,18R)-8,17-bis(6-amino-9H-purin-9-i1)-9,18-difluoro-3,12-diokso-12-sulfanidil-2,7,11,16-tetraoksa-4,13-diaza-3λ<5>,12λ<5>-difosfatriciklo [13.3.0.0<6>,<10>]oktadekan-3-il]sulfanid (77)4HCO3), Mobilna faza B: ACN;Brzina protoka: 20 mL/min; Gradijent: 2% B to 6% B u 10 min; Detektor: 254/210 nm; da bi se dobilo prvo jedinjenje 77 diastereomer u obliku bezbojnog čvrstog jedinjenja (10.6 mg, retenciono vreme: 7.42 min):<1>H NMR (300 MHz, D2O) δ 8.15 (s, 2H), 8.06 (s, 2H), 6.33 (d, J = 22.2 Hz, 2H), 5.80 (dd, J = 51.2, 4.8 Hz, 2H), 5.65 - 5.49 (m, 2H), 4.32 (d, J = 9.6 Hz, 2H), 3.49 - 3.32 (m, 2H), 3.13 - 2.99 (m, 2H);<19>F NMR (282 MHz, D2O) δ, -195.73;<31>P NMR (121 MHz, D2O) δ 57.00; LC/MS (ESI, m/z):

[(M - 2NH3- 1)]-= 690.9. I sporiji pik na 8,25 min predstavljao je mešavinu dva izomerna oblika jedinjenja 77 u obliku bezbojnog čvrstog jedinjenja (12.1 mg):<1>H NMR (300 MHz, D2O) δ 8.37 (s, 0.34H), 8.14 (s, 1.7H), 7.92 (s, 1H), 7.86 (s, 1H), 6.26 - 5.91 (m, 3H), 5.71 - 5.19 (m, 3H), 5.47 - 5.19 (m, 2H), 4.37 (dd, J = 27.2, 9.7 Hz, 3H), 3.54 - 3.38 (m, 2H), 3.14 - 2.92 (m, 2H);<19>F NMR (282 MHz, D2O) δ -195.78, -197.35;<31>P NMR (121 MHz, D2O) δ 59.32, 57.59; LC/MS (ESI, m/z):

[(M - 2NH3- 1)]<->= 690.9.

Diamonijum (1R,6S,8R,9R,10R,15S,17R,18R)-8,17-bis(6-amino-9H-purin-9-il)-9,18-difluoro-3,12-diokso-4,7,13,16-tetraoksa-2,11-diaza-3λ<5>,12λ<5>-difosfatriciklo[13.3.0.0<6>,<10>] oktadekan-3,12-bis(olat):

[0284]

Korak 1

[0285]

[0286](2R,3R,4R,5S)-5-(6-benzamido-9H-purin-9-il)-4-fluoro-2-((tritilamino)metil)tetrahidro furano-3-il (2-cijanoetil)fosfonat (183). U rastvor N-(9-((2S,3R,4R,5R)-3-fluoro-4-hidroksi-5-((tritilamino)metil)tetrahidrofurano-2-il)-9H-purin-6-il)benzamida (INT-E, 1,00 g, 1,63 mmol) u acetonitrilu (5 mL) dodat je piridin-trifluoracetat (0,47 g, 2,45 mmol) i 3-(bis[bis(propan-2-il)amino]fosfaniloksi)propanonitril (0,98 g, 3,26 mmol) na sobnoj temperaturi. Nakon mešanja 2 sata, dodat je još jedan deo piridin trifluoracetata (0,63 g, 3,26 mmol), a potom i voda (0,29 mL, 16,3 mmol). Dobijeni rastvor je mešan 1 h na sobnoj temperaturi. Po završetku, rastvor je nanesen na reverzno-faznu C18 kolonu i eluiran sa 5%~80% acetonitrila u vodi (30 min) da bi se dobilo naslovno jedinjenje 183 u obliku bezbojne čvrste supstance (0,58 g, 26%).<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.26 - 11.23 (m, 1H), 8.75 - 8.57 (m, 1H), 8.41 - 8.31 (m, 1H), 8.16 - 8.00 (m, 2H), 7.70 -7.56 (m, 3H), 7.43 - 7.39 (m, 6H), 7.33 - 7.23 (m, 6H), 7.19 - 7.16 (m, 3H), 6.55 - 6.32 (m, 1H), 6.24 - 5.64 (m, 2H), 4.43 - 4.41 (m, 1H), 4.32 - 4.24 (m, 2H), 3.25 - 2.91 (m, 2H), 2.53 - 2.51 (m, 1H), 2.42 - 2.27 (m, 1H);<19>F NMR (376 MHz, DMSO-d6) δ -203.18;<31>P NMR (162 MHz, DMSO-d6) δ 8.89; LC/MS (ESI, m/z): [(M 1)]<+>= 815.0.

[0287](2R,3R,4R,5R)-5-(6-benzamido-9H-purin-9-il)-4-fluoro-2-((tritilamino)metil)tetrahidro furano-3-il (2-cijanoetil) (((2R,3R,4R,5R)-5-(6-benzamido-9H-purin-9-il)-4-fluoro-3-hidroksitetrahidrofurano-2-il)metil)fosforamidat (184).U mešavinu (2R,3R,4R,5S)-5-(6-benzamido-9H-purin-9-il)-4-fluoro-2-((tritilamino)metil)tetrahidrofurano-3-il (2-cijanoetil)fosfonata (100 mg, 0,14 mmol) i N-(9-((2S,3R,4R,5R)-5-(aminometil)-3-fluoro-4-hidroksitetrahidrofurano-2-il)-9H-purin-6-il)benzamida (183, 51 mg, 0,14 mmol) u N-metilpirolidonu (1 mL) dodati su N,N-diizopropiletilamin (45 mg, 0,35 mmol) i tetrahlormetan (53 mg, 0,34 mmol). Dobijeni rastvor je mešan 4 sata na sobnoj temperaturi. Po završetku, rastvor je nanet na kolonu sa silika-gelom i eluiran sa 1%~30% metanola u dihlormetanu da bi se dobilo naslovno jedinjenje 184 u obliku bezbojne čvrste supstance. (113 mg, 75%):<1>HNMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 11.21 (s, 2H), 8.78 - 8.57 (m, 3H), 8.24 - 8.20 (m, 1H), 8.12 -7.96 (m, 4H), 7.71 -7.46 (m, 7H), 7.47 - 7.28 (m, 6H), 7.33 - 7.03 (m, 9H), 6.48 -6.25 (m, 2H), 6.18 - 5.45 (m, 4H), 4.60 - 4.45 (m, 1H), 4.38 - 4.30 (m, 1H), 4.15 - 3.96 (m, 4H), 3.40 - 3.00 (m, 2H), 2.91 - 2.69 (m, 2H);<31>P NMR (162 MHz, DMSO-d6) δ 9.98, 9.93, 6.78; LC/MS (ESI, m/z): [(M+ 1)]<+>= 1102.0.

Korak 3

[0289] (2R,3K,4K,5R)-5-(6-benzamido-9H-purin-9-il)-2-{[({(2R,3K,4K,5R)-5-(6-benzamido-9H-purin-9-il)-4-fluoro-2-{[(trifenilmetil)amino]metil}oksolan-3-il}oksi)(2-cijanoetoksi) fosforil)amino]metil}-4-fluorooksolan-3-il 2-cijanoetil fosfonat (185).U rastvor (2R,3R,4R,5R)-5-(6-benzamido-9H-purin-9-il)-4-fluoro-2-((tritilamino)metil)tetrahidrofurano-3-il (2-cijanoetil) (((2R,3R,4R,5R)-5-(6-benzamido-9H-purin-9-il)-4-fluoro-3-hidroksitetrahidrofurano-2-il)metil)fosforamidata (184, 200 mg, 0,18 mmol) u acetonitrilu (1 mL) dodati su 3-([bis[bis(propan-2-il)amino]fosfaniloksi]propanonitril (109 mg, 0,36 mmol) i piridin-trifluoracetat (53 mg, 0,27 mmol) na sobnoj temperaturi. Dobijeni rastvor je mešan još 2 sata, zatim je dodat drugi deo piridin trifluoracetata (106 mg, 0,55 mmol) i voda (32,7 mg, 1,8 mmol). Dobijeni rastvor je mešan 30 min na sobnoj temperaturi, a potom nanet na reverzno-faznu C18 kolonu i eluiran sa 0~65% acetonitrila u vodi (30 min) da bi se dobilo naslovno jedinjenje 185 u obliku bezbojne čvrste supstance. (153 mg, 69%):<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 11.28 - 11.23 (m, 2H), 8.82 - 8.61 (m, 3H), 8.31 - 8.19 (m, 1H), 8.12 - 7.99 (m, 4H), 7.72 - 7.06 (m, 22H), 6.63 - 6.23 (m, 2H), 6.25 - 5.31 (m, 4H), 4.46 - 3.90 (m, 6H), 3.50 - 3.05 (m, 4H), 3.05 - 2.70 (m, 4H);<19>F NMR (282 MHz, DMSO-d6) δ -202.92, -202.93, -202.96, - 202.97, -203.12, -203.13, -203.68, -203.70, -203.73, -203.93, -203.96, -204.03;<31>P NMR (121 MHz, DMSO-d6) δ 9.98, 9.92, 9.89, 9.84, 9.78, 9.04, 8.91, 8.84; LC/MS (ESI, m/z): [(M 1)]<+>= 1219.4.

Korak 4

[0290]

[0291] (2R,3R,4R,5R)-2-{[({[(2R,3R,4R,5R)-2-(aminometil)-5-(6-benzamido-9H-purin-9-il)-4-fluorooksolan-3-il]oksi}(2-cijanoetoksi)fosforil)amino]metil}-5-(6-benzamido-9H-purin-9-il)-4-fluorooksolan-3-il 2-cijanoetil fosfonat (186).Rastvor (2R,3R,4R,5R)-5-(6-benzamido-9H-purin-9-il)-2-{[({[(2R,3R,4R,5R)-5-(6-benzamido-9H-purin-9-il)-4-fluoro-2-{[(trifenilmetil)amino] metil}oksolan-3-il]oksi}(2-cijanoetoksi)fosforil)amino]metil}-4-fluorooksolan-3-il 2-cijanoetil fosfonata (185, 260 mg, 0,21 mmol) u dihlormetanu (10 mL) tretiran je sa 2,2-dihlorosirćetnom kiselinom (109,3 mg, 0,85 mmol) 2 sata na sobnoj temperaturi. Po završetku, dobijeni rastvor je koncentrisan pod redukovanim pritiskom, a ostatak je korišćen u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja : LC/MS (ESI, m/z): [(M 1)]<+>= 977.1.

Korak 5

[0292]

[0293] N-19-[(1R,6S,8R,9R,10R,15S,17R,18R)-17-(6-benzamido-9H-purin-9-il)-3,12-bis(2-cijanoetoksi)-9,18-difluoro-3,12-diokso-4,7,13,16-tetraoksa-2,11-diaza-3λ<5>,12λ<5>-difosfa triciklo[13.3.0.0<6>,<10>]oktadekan-8-il]-9H-purin-6-il}benzamid (187).Rastvor 186 u acetonitrilu (40 mL) tretiran je sa trietilaminom (0,75 mL, 5,34 mmol) i ugljen tetrahloridom (0,82 g, 5,34 mmol) na sobnoj temperaturi. Nakon mešanja 2 sata, dobijeni rastvor je koncentrisan pod redukovanim pritiskom, a ostatak je korišćen u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja: LC/MS. (ESI, m/z):

[(M 1)]<+>= 975.5.

Korak 6

[0295] Diamonijum (1R,6S,8R,9R,10R,15S,17R,18R)-8,17-bis(6-amino-9H-purin-9-il)-9,18-difluoro-3,12-diokso-4,7,13,16-tetraoksa-2,11-diaza-3λ<5>,12λ<5>-difosfatriciklo[13.3.0.0<6>,<10>] oktadekan-3,12-bis(olat) (78). Gore navedeno sirovo jedinjenje 187 tretirano je rastvorom metilamina u etanolu (10 mL, 30% w/w) 30 minuta na sobnoj temperaturi. Po završetku reakcije, dobijeni rastvor je koncentrisan pod redukovanim pritiskom, a ostatak je prečišćen Prep-HPLC pod sledećim uslovima: kolona Atlantis Prep T3 OBD, 19 × 250 mm, 10 µm; pokretna faza A: voda (plus 20 mmol/L NH4HCO3); pokretna faza B: ACN; brzina protoka: 20 mL/min; gradijent: 0% B do 14% B u 20 min; detektor: 254/220 nm; vreme zadržavanja: 11,50 min, da bi se dobilo naslovno jedinjenje 78 kao bezbojna čvrsta supstanca. (3.7 mg, 3%):<1>H NMR (300 MHz, D2O) δ 8.12 (s, 2H), 7.65 (s, 2H), 6.23 (d, J = 20.7 Hz, 2H), 5.52 - 5.22 (m, 4H), 4.36 (d, J = 9.3 Hz, 2H), 3.47 (dd, J = 13.9, 3.3 Hz, 2H), 3.08 (dd, J = 13.8, 7.3 Hz, 2H);<19>F NMR (282 MHz, D2O) δ -196.79;<31>P NMR (121 MHz, D2O) δ 7.98; LC/MS (ESI, m/z): [(M - 2NH3-1)]<->= 659.0 Biološki testovi

[0296] Aktivacija STING puta pomoću jedinjenja koja su ovde stavljena na uvid javnosti merena je korišćenjem THP1-Dualtm ćelija. Ove ćelije su THP1 monociti koji su modifikovani da budu reporteri za NFκB put (indukovanjem eksprimiranja sekretovanog embrionalnog alkalne fosfataze (SEAP)) i IRF put (indukovanjem eksprimiranja sekretovane luciferaze (LUCIA)). Oba ova puta bivaju aktivirana pomoću STING agonista u ovim ćelijama.

[0297] THP1-Dualtm ćelije (dobijene od Invivogen-a) održavaju se u medijumu za rast ćelija koji sadrži Roswell Park Memorial Institute medijum (RPMI), 10% fetalni teleći serum (FCS), 100 U/ml Pen/Strep, 2 mM L-glut, 10 mM Hepes i 1 mM natrijum piruvat. Pre testa, ćelije su premeštene u medijum za testiranje koji sadrži RPMI, 5% FCS, 100 U/ml Pen/Strep, 2 mM L-glut, 10 mM Hepes i 1 mM natrijum piruvat. Zatim su ćelije prebrojane i procenjena im je vitalnost pomoću testa isključenja sa tripan plavim.

[0298] Jedinjenja su rastvorena u vodi ili DMSO-u u zavisnosti, na primer, od njihove rastvorljivosti u vodi ili DMSO-u. Zatim su jedinjenja razblažena u medijumu za testiranje i naneta u bunariće ploče za kulturu tkiva sa 384 bunarića u zapremini od 25 µL po bunariću. Potom su ćelije dodate u 25 µL medijuma za testiranje, tako da je konačna koncentracija ćelija iznosila 80.000 ćelija po bunariću.

[0299] Za svaki skup jedinjenja pripremljene su dve ploče: jedna ploča koja je bila podvrgnuta trajanju testa od 24 časa i jedna ploča koja je bila podvrgnuta trajanju testa od 48 časova. Ploče su inkubirane tokom odgovarajućih trajanja testiranja na 37°C, sa 5% CO₂.

[0300] Da bi se izveo test sa sekretovanim embrionalnim alkalnim fosfataznim reporterom, 10 µL supernatanta ćelija je pomešano sa 90 µL QUANTI-Blue u ploči sa ravnim dnom i 384 bunarića. Ploče su inkubirane na 37°C tokom 1–2 časa. SEAP aktivnost je merena pomoću spektrofotometra podešenog na 620 nm. U testu sa sekretovanom luciferazom (tj. Lucia testu), 10 µL supernatanta THP1-Blue™ WASG ćelija je naneto, a zatim je dodat o50 µL Quanti LUC rastvora. Nakon toga je izmerena luminescencija bunarića.

[0301] Tabela 2 u nastavku prikazuje biološke podatke jedinjenja koja su testirana korišćenjem gore navedenih postupaka.

Tabela 2.

[0302] Jedinjenja se takođe mogu testirati korišćenjem postupaka opisanih, npr. u WO 2015/077354.

Claims (13)

1. Patentni zahtevi 1. Jedinjenje ili farmaceutski prihvatljiva so istog, odabrano od:

   Ċ
2. 2. Jedinjenje iz patentnog zahteva 1 ili farmaceutski prihvatljiva so istog, koje je:
3. 3. Jedinjenje iz patentnog zahteva 1 ili farmaceutski prihvatljiva so istog, koje je:
4. 4. Farmaceutska kompozicija koja sadrži jedinjenje ili so prema bilo kom od patentnih zahteva 1‑3 i jedan ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijenasa.
5. 5. Kombinovana farmaceutska kompozicija koja sadrži jedinjenje ili so prema bilo kom od patentnih zahteva 1‑3 i jedan ili više dodatnih terapijskih agenasa.
6. 6. Jedinjenje ili farmaceutski prihvatljiva so istog prema patentnim zahtevima 1‑3 za primenu u lečenju bolesti u kojoj potisnuto ili oštećeno STING signaliziranje doprinosi patologiji i/ili simptomima i/ili progresiji bolesti.
7. 7. Jedinjenje ili farmaceutski prihvatljiva so istog za primenu prema patentnom zahtevu 6, pri čemu je bolest kancer.
8. 8. Jedinjenje ili farmaceutski prihvatljiva so istog za primenu prema patentnom zahtevu 7, pri čemu je kancer odabran iz grupe koja obuhvata melanom, karcinom, limfom, blastom, sarkom, leukemiju ili limfoidne maligne bolesti, kancer dojke, kancer kolona, kancer rektuma, kolorektalni kancer, kancer bubrega ili renalni kancer, kancer bistrih ćelija, kancer pluća uključujući sitnoćelijski kancer pluća, nesitnoćelijski kancer pluća, adenokarcinom pluća i skvamozni karcinom pluća, kancer skvamoznih ćelija, kancer epitelnih skvamoznih ćelija, kancer grlića materice, kancer jajnika, kancer prostate, neoplaze prostate, kancer jetre, kancer bešike, kancer peritoneuma, hepatocelularni kancer, kancer želuca ili stomačni kancer uključujući gastrointestinalni kancer, gastrointestinalni stromalni tumor, kancer pankreasa, kancer glave i vrata, glioblastom, retinoblastom, astrocitom, tekome, arhenoblastome, hepatom, hematološke maligne bolesti uključujući ne-Hočkinov limfom (NHL), multipli mijelom, mijelodisplastične poremećaje, mijeloproliferativne poremećaje, hroničnu mijeloidnu leukemiju i akutne hematološke maligne bolesti, karcinom endometrijuma ili materice, endometriozu, stromalni sarkom endometrijuma, fibrosarkome, horiokarcinom, karcinom pljuvačnih žlezda, kancer vulve, kancer štitne žlezde, karcinome jednjaka, hepatocelularni karcinom, analni karcinom, karcinom penisa, nazofaringealni karcinom, larinksni karcinomi, Kapošijev sarkom, sarkom mastocita, sarkom jajnika, sarkom materice, melanom, maligni mezoteliom, karcinome kože, švanom, oligodendrogliom, neuroblastome, neuroektodermalni tumor, rabdomiosarkom, osteogeni sarkom, leiomiosarkomi, Juingov sarkom, periferni primitivni neuroektodermalni tumor, karcinome urinarnog trakta, karcinome šitne žlezde, Vilmsov tumor, kao i abnormalnu vaskularnu proliferaciju povezanu sa fakomatozama, edemom i Meigsovim sindromom.
9. 9. Jedinjenje ili farmaceutski prihvatljiva so istog za primenu prema patentnom zahtevu 6, pri čemu je kancer refraktoran.
10. 10. Jedinjenje ili farmaceutski prihvatljiva so istog za primenu prema patentnom zahtevu 6, pri čemu se jedinjenje primenjuje u kombinaciji sa jednom ili više dodatnih terapija kancera, pri čemu jedna ili više dodatnih terapija kancera obuhvata hirurgiju, radioterapiju, hemioterapiju, terapiju toksinima, imunoterapiju, krioterapiju ili gensku terapiju, ili njihovu kombinaciju.
11. 11. Jedinjenje ili farmaceutski prihvatljiva so istog za primenu prema patentnom zahtevu 10, pri čemu hemioterapija obuhvata primenu jednog ili više dodatnih hemioterapijskih agenasa.
12. 12. Jedinjenje ili farmaceutski prihvatljiva so istog za primenu prema patentnom zahtevu 11, pri čemu je jedan ili više dodatnih hemioterapijskih agenasa odabran od abciksimaba, adalimumaba, alemtuzumaba, atlizumaba, basiliksimaba, belimumaba, bevacizumaba, bretuksimab vedotina, kanakinumaba, cetuksimaba, certolizumab pegola, daklizumaba, denosumaba, ekulizumaba, efalizumaba, gemtuzumaba, golimumaba, golimumaba, ibritumomab tiuksetana, infliksimaba, ipilimumaba, muromonab-CD3, natalizumaba, ofatumumaba, omalizumaba, palivizumaba, panitumuaba, ranibizumaba, rituksimaba, tocilizumaba, tositumomaba i/ili trastuzumaba).
13. 13. Jedinjenje ili farmaceutski prihvatljiva so istog za primenu prema patentnom zahtevu 12, pri čemu je jedan ili više dodatnih hemioterapijskih agenasa odabran iz grupe inhibitora imunoloških kontrolnih tačaka koji ciljaju receptor imunoloških kontrolnih tačaka odabran iz grupe koja obuhvata urelumab, PF-05082566, MEDI6469, TRX518, varlilumab, CP-870893, pembrolizumab (PD1), nivolumab (PD1), atezolizumab (ranije MPDL3280A) (PDL1), MEDI4736 (PD-L1), avelumab (PD-L1), PDR001 (PD1), BMS-986016, MGA271, lirilumab, IPH2201, emactuzumab, INCB024360, galunisertib, ulokuplumab, BKT140, bavituksimab, CC-90002, bevacizumab i MNRP1685A, i MGA271. Izdaje i štampa: Zavod za intelektualnu svojinu, Beograd, Kneginje Ljubice 5