RS67299B1 - Kompozicije za lečenje i/ili prevenciju bolesti agregacije proteina - Google Patents

Description

[0001] Opis

[0003] Oblast tehnike

[0005] Predmetni pronalazak je obuhvaćen oblašću medicine i obezbeđuje kompoziciju za upotrebu u lečenju i/ili prevenciji bolesti agregacije proteina.

[0007] Osnov pronalaska

[0009] Pravilno funkcionisanje organa i ćelija unutar organizma zavisi od pravilnog funkcionisanja proteina. Protein je biološki entitet koji ima primarnu aminokiselinsku sekvencu; sekundarnu strukturu koja formira proteinske domene i uključuje, primarno, alfa helikse i beta ploče; i tercijarnu strukturu, rezultat kompleksnog savijanja peptidnog lanca u tri dimenzije koje uključuje okosnicu polipeptidnog lanca i interakcije bočnih lanaca aminokiselina. Neki proteini funkcionišu u kompleksu sa više subjedinica, gde organizacija više proteina u kvaternernu strukturu postaje ključna za njihovo pravilno funkcionisanje.

[0010] Nemogućnost proteina da se saviju u korektne trodimenzionalne strukture može da dovede do bolesti koje se nazivaju proteopatije (ponekad se takođe označavaju kao bolesti agregacije proteina, bolesti pogrešnog savijanja proteina, proteinopatije ili poremećaji konformacije proteina). Uzrok ove nemogućnost mogu da budu jedna ili više mutacija u genu za protein ili faktori okoline kao što su oksidativni stres, alkaloza, acidoza, promena pH vrednosti i osmotski šok. Pogrešno savijanje proteina ponekad može da dovede do nagomilavanja ili agregacije u amiloidne plakove ili fibrile što može da pogorša bolest. Proteopatije pokrivaju širok spektar oboljenja, uključujući neurodegenerativne bolesti (npr. Alchajmerovu bolest, Parkinsonovu bolest, poliglutaminske bolesti kao što je hantingtin kod Hantingtonove bolesti, prionske bolesti); amiloidozu drugih proteina koji nisu iz nervnog sistema, kao što su I1-antitripsin, imunoglobulinski laki i teški lanci, laktadherin, apolipoprotein, gelsolin, lizozim, fibrinogen, atrijalni natriuretički faktor, keratin, laktoferin i beta-2 mikroglobulin, između ostalog); anemiju srpastih ćelija; katarakte; cističnu fibrozu; pigmentozni retinitis; i nefrogeni dijabetes insipidus.

[0011] [0004] Amiloidoza se odnosi na patološko deponovanje proteina u vidu kongofilnih, zelenih birefringentnih fibrila, kada su obojeni bojom kongo crveno, bilo dispergovani ili u obliku lokalizovanih amiloidoma. Takvi depoziti su simptomi nekoliko bolesti, na primer Alchajmerove bolesti, amiloida povezanog sa upalom, dijabetesa tipa II, goveđe spongiformne encefalopatije (GSE), Krojcfeld-Jakobove bolesti (KJB), grebeža i primarne amiloidoze.

[0012] Amiloidoze se generalno dele u tri grupe: glavne sistemske amiloidoze, glavne lokalizovane amiloidoze i raznolike amiloidoze. Glavne sistemske amiloidoze uključuju: hronična inflamatorna stanja (npr. tuberkuloza, osteomijelitis, itd.); neinfektivna stanja kao što su juvenilni reumatoidni artritis, ankilozni spondilitis i Kronova bolest, itd.; familijarnu mediteransku groznicu, diskraziju plazma ćelija (primarna amiloidoza) i različite familijarne polineuropatije i kardiomiopatije. Glavne lokalizovane amiloidoze uključuju: amiloidozu povezanu sa dijalizom, Alchajmerovu bolest, Daunov sindrom, nasledno cerebralno krvarenje (holandsko) i netraumatsko cerebralno krvarenje kod starijih osoba. Raznovrsne amiloidoze uključuju: familijarnu polineuropatiju (Ajova), familijarnu amiloidozu (finsku), nasledno cerebralno krvarenje (islandsko), KJB, medularni karcinom štitne žlezde, atrijalni amiloid i dijabetes melitus (insulinomi). Ostale amiloidoze uključuju one navedene kod Louis W. Heck, "The Amyloid Diseases" u Cecil’s Textbook of Medicine 1504-6 (W.B. Saunders & Co., Philadelphia, Pa.; 1996).

[0013] Transmisivne spongiformne encefalopatije koje uzrokuju KJB i Gerstman-Štresler-Šajnkerovu (GSS) bolest opisane su od strane B. Chesebro et al., "Transmissible Spongiform Encephalopathies: A Brief Introduction" u FIELD’S VIROLOGY 2845-49 (3rd Edition; RavenPublishers,Philadelphia,Pa.; 1996) i D. C. Gajdusek,"Infectious amyloids: Subacute Spongiform Encephalopathies as Transmissible Cerebral Amyloidoses," 2851-2900 u FIELDS VIROLOGY (1996). Mnoge od ovih bolesti su verovatno posredovane prionima, infektivnim proteinom. Videti S. B. Prusineri, "Prions" u FIELDS VIROLOGY 2901-50 (1996) i reference koje su navedene u toj publikaciji.

[0014] Pokušaj eliminacije specifičnih fibrila bio je cilj značajnih istraživanja amiloidoze, ali bez uspeha. Aktuelni tretman amiloidoze uključuje hemioterapijske agense ili steroide, kao što su melfalan i deksametazon. Međutim, takav tretman nije pogodan za sve pacijente i nije efikasan u mnogim slučajevima zbog nedostatka specifičnosti (WO 2017/075540 A1). Slično tome, tretman drugih proteopatija koje nisu nužno povezane sa stvaranjem amiloida takođe je imalo ograničen uspeh. Stoga postoji velika potreba za alternativama koje mogu bezbedno i efikasno da leče ili spreče proteopatije.

[0015] WO 2016/090371 opisuje upotrebu jedinjenja koje ometa jedan cinkani prst Parkin ligaze u cilju lečenja različitih poremećaja, kao što su kancer ili neurodegenerativni poremećaji. Inhibitor sulfataze steroida, STX64, naveden je na spisku potencijalnih jedinjenja.

[0016] US 2018/161339 opisuje upotrebu inhibitora karboanhidraze za inhibiranje ili smanjenje amiloidne patologije ili proteinopatije. Inhibitori sulfataze steroida, Coumate i Emate, navedeni su na listi potencijalnih jedinjenja.

[0017] Pronalazači predmetnog pronalaska su inicijalno bili zainteresovani za otkrivanje novih elemenata koji upravljaju genetskom kontrolom starenja, kako bi poboljšali naše razumevanje ovog složenog biološkog procesa. U tom cilju, izolovali su termotolerantne mutante i identifikovali alel sul-2 gena (gen koji kodira jedan od tri člana porodice sulfataza iz Cenorahabditis elegans) koji sadrži inaktivirajuću tačkastu mutaciju. Pronalazači su utvrdili da su crvi koji nose inaktiviranu verziju sul-2 gena živeli duže od divljeg tipa.

[0018] Sulfataze su velika familija proteina uključenih u različite biološke procese i oni utiču na širok spektar supstrata. Kolokacija sul-2 u filogenetskom stablu sulfataze nije sigurna. Ali, kada se uporedi sa sulfatazama sisara, sul-2 klasteri su bliski arilsulfatazama tipa H, F, E, D i steroidnoj sulfatazi tipa C koje verovatno potiču od zajedničkog predačkog gena. Pronalazači su postavili hipotezu da sul-2 može da ispolji svoju aktivnost tako što modifikuje sumporovane steroidne hormone.

[0019] Sulfataze steroidnih hormona su konzervirani proteini koji učestvuju u različitim procesima, kao što je stimulisanje proliferacije hormonski zavisnih karcinoma (Mueller et al., 2015. Endocr Rev. 36(5):526-63). Generisani su specifični inhibitori za ovu vrstu enzima, jedan od njih je STX64 (Nussbaumer & Billich, 2004. Med Res Rev. 24(4):529-76). STX64 se koristi za lečenje pacijenata sa hormonski zavisnim karcinomima (Stanway et al., 2006. Clin Cancer Res. 12(5):1585-92). Pronalazači su tretirali crve divljeg tipa sa STX64 i uočili iste efekte dugovečnosti kao kod sul-2 mutanata. Međutim, STX64 nije dodatno povećao dugovečnost sul-2 delecionih mutanata, što ukazuje da je mehanizam kojim STX64 povećava dugovečnost inhibicija sulfatazne aktivnosti SUL-2 (WO 2014/154927 A1).

[0021] Slike

[0023]

[0025] Slika 1: Smanjenje aktivnosti sulfataze steroidnih hormona (STS) ublažava simptome proteotoksičnosti kod C. elegans soja NL5901 koji je model za Parkinsonovu bolest (Van Ham et al., 2010. Cell 142: 601-612). Nematode koje eksprimiraju α-sinuklein u mišićnim ćelijama pate od smanjene pokretljivosti prilikom starenja (mereno kao broj puta kada glava crva pređe uzdužnu osu tela, u minuti (prelaz)), ali se brzina smanjuje kada (A) nematoda sadrži sul-2(gkl87) alel i kada su (B) nematode tretirane sa STX64. n = 20; *** predstavlja p < 0.001.

[0026] Slika 2: Smanjenje aktivnosti sulfataze steroidnih hormona (STS) menja način na koji se α-sinuklein agregira kod C. elegans soja NL5901 koji je model za Parkinsonovu bolest (Van Ham et al., 2010. Cell 142: 601-612). Grafikoni prikazuju (A) ukupan broj agregata, (B) broj agregata veličine ≥ 3 µm i (C) broj agregata veličine ≤ 1 µm kod nematoda koje eksprimiraju α-sinuklein fuzionisan sa YFP i nematoda koje eksprimiraju isti konstrukt αsinukleina koji dodatno sadrži neaktivni sul-2 alel, tj. sul-2(gk187). n = 20; *** predstavlja p<0.001; * predstavlja p<0.05.

[0028] Slika 3: Smanjenje aktivnosti sulfataze steroidnih hormona (STS) menja način na koji se α-sinuklein agregira kod C. elegans soja NL5901 koji je model za Parkinsonovu bolest (Van Ham et al., 2010. Cell 142: 601-612). Grafikoni prikazuju (A) ukupan broj agregata, (B) broj agregata veličine ≥ 3 µm i (C) broj agregata veličine ≤ 1 µm kod nematoda koje eksprimiraju α-sinuklein fuzionisan sa YFP, a koje su tretirane sa DMSO i nematoda koje eksprimiraju isti konstrukt α-sinukleina, a koje su dodatno tretirane sa STX64. n = 20; *** znači da p<0.001; * predstavlja p<0.05.

[0030] Slika 4: Smanjenje aktivnosti sulfataze steroidnih hormona (STS) ublažava simptome proteotoksičnosti kod C. elegans soja UA44 (Cooper et al., 2006. Science 313: 324‑328) koji je model za Parkinsonovu bolest. (A) Preživljavanje dopaminergičkih neurona obeleženih pomoću GFP, koji eksprimiraju ljudski α-sinuklein, povećava se kada nematoda sadrži neaktivni sul-2(gk187) alel. Grafik predstavlja broj živih neurona u nematodama koje su u 6. danu, kada nematoda sadrži sul-2 alel divljeg tipa ili neaktivni sul-2(gk187) alel. (B) Reprezentativna slika nematode koja sadrži sul-2 alel divljeg tipa i nematode koja sadrži neaktivni sul-2(gk187) alel na 9. dan. Crne strelice pokazuju žive dopaminergičke neurone. n= 37; p<0.0001.

[0032] Slika 5: Smanjenje aktivnosti sulfataze steroidnih hormona (STS) ublažava simptome proteotoksičnosti kod C. elegans soja AM140 (Morley et al. 2002. PNAS. 99: 10417‑10422) koji je model Hantingtonove bolesti. Nematode su modifikovane tako da eksprimiraju 35 poliglutaminskih ponovaka fuzionisanih sa YFP, a broj fluorescentnih agregata je izbrojan na 5. dan odraslog doba. (A) Grafik prikazuje poređenje između nematode koja sadrži alel divljeg tipa sul-2 i nematodu koja sadrži neaktivni mutantni alel sul-2. (B) Grafik prikazuje poređenje između nematode koja sadrži sul-2 alel divljeg tipa i nematode koja sadrži sul-2 alel divljeg tipa i koja je dodatno tretirana sa STX64. n = 20; *** predstavlja p<0.001.

[0033] Slika 6: Smanjenje aktivnosti sulfataze steroidnih hormona (STS) ublažava simptome proteotoksičnosti kod C. elegans soja CL2006 (Link, 1995. PNAS. 92: 9368-9372), koji je model Alchajmerove bolesti. Nematode koje eksprimiraju β-amiloid u mišićnim ćelijama pate od paralize prilikom starenja, ali se brzina usporava kada (A) nematode sadrže sul-2(gk187) alel i (B) su nematode tretirane sa STX64. n = 50; p <0.001.

[0035] Slika 7: Tretman sa STX64 je ublažio deponovanje β-amiloida i kognitivni deficit kod mišjih modela Alchajmerove bolesti. (A) Efekat intrahipokampalne i oralne primene STX64 u testu pasivnog izbegavanja kod miševa divljeg tipa kojima su ubrizgani βamiloidni oligomeri u hipokampus. Broj miševa u svakoj grupi bio je >5. (B) Reprezentativne slike imunoreaktivnosti β-amiloida procenjene u frontalnom korteksu i hipokampusu APP-PS1 miševa starijih od 15 meseci, nakon 3-4 nedelje unosa vehikuluma ili STX64 (0.005mg/ml u vodi za piće). (C)-(E), Kvantifikacija procenta površine β-amiloida (C), gustine deponovanje (D) i prosečne veličine plaka (E) u frontalnom korteksu i hipokampusu APP-PS1 miševa starih<>>15 meseci, nakon 3-4 nedelje oralne primene STX64 ili vehikuluma. n=4 miševa po grupi. (F) Vremenski tok deponovanja β-amiloida kod APP-PS1 miševa i dejstvo oralnog tretmana sa STX64 tokom 3-4 nedelje, na površinu β-amiloida u frontalnom korteksu i hipokampusu. Broj korišćenih mikrofotografija bio je veći od 3 po mišu. (G) Efekat oralne primene STX64 kod APP-PS1 miševa starijih od 15 meseci i poređenje sa APP-PS1 i miševima divljeg tipa starijim od 15 meseci, u testu pasivnog izbegavanja. Broj miševa u svakoj grupi bio je >5. U histološkoj analizi, * predstavlja statistički značajne razlike između APP-PS1 miševa kod kojih je primenjen vehikulum i STX64. U testu ponašanja, * predstavlja statistički značajne razlike između sesija kratkoročnog i dugoročnog pamćenja (STM i LTM, respektivno) i sesije treninga u istoj eksperimentalnoj grupi; i predstavlja statistički značajne razlike između STM i LTM sesija između svake eksperimentalne grupe i β-amiloidne grupe. Jedan simbol predstavlja p<0.05; dva ponavljanja simbola predstavljaju p<0.01, a tri ponavljanja simbola predstavljaju p<0.001.

[0037] Slika 8: STX64 je sprečio pogoršanje motoričke aktivnosti kod mišjeg modela Hantingtonove bolesti. Miševi R6/1 stari 1 mesec su svakodnevno tretirani vodom za piće koja sadrži STX64 ili samo vehikulum. U uzrastu od 2 meseca, testirana je motorička aktivnost miševa. n >5 miševa po grupi. Rezultat predstavlja srednju vrednost±SEM. *, p <0.05.

[0038] Slika 9: Poređenje između STX64 i EMATE u modelu Alchajmerove bolesti, tj. C. elegans soju GMC101 (McColl et al., 2012. Mol Neurodegener. 7:57).). (A) Na osnovi delecije sul-2(gk187) broj paralizovanih crva je bio smanjen. Grafikon prikazuje ukupan broj dobijen iz tri biološka ponovljena uzorka, n = 100 crva. Hi-kvadrat, dvostrano, pvrednost = 0.0161. (B) Tretman sa STX64 u koncentraciji od 1µg/ml smanjio je broj paralizovanih crva. Grafikon prikazuje ukupan broj dobijen iz tri biološka replikata, n > 120 crva. Hi-kvadrat, dvostrano, p-vrednost = 0.0014. (C) Tretman sa EMATE u koncentraciji od 1µg/ml smanjio je broj paralizovanih crva. Grafikon prikazuje ukupan broj dobijen iz tri biološka replikata, n > 117 crva. Hi-kvadrat, dvostrano, p-vrednost = 0.0091.

[0040] Kratak opis pronalaska

[0042] Iznenađujuće, pronalazači su otkrili da je STX64 u stanju da leči ili spreči formiranje oligomera i/ili amiloida kod C. elegans modela Parkinsonove bolesti, C. elegans modela Hantingtonove bolesti i C. elegans modela Alchajmerove bolesti (videti slike 1-6). Kod Parikinsonove bolesti, Hantingtonove bolesti i Alchajmerove bolesti, patogeneza je vođena proizvodnjom i/ili taloženjem proteinskih agregata (Murphy & Levine, 2010. J Alzheimers Dis. 19(1):311; Stefanis, 2012. Cold Spring Harb Perspect Med.2(2): a009399; Daldin et al., 2017. Sci Rep. 7(1):5070). Dakle, lečenje ili prevencija agregatnih vrsta u ovim modelima čini verovatnim da STX64 može da se koristi za lečenje i/ili prevenciju ovih bolesti agregacije proteina. Ovo je potvrđeno na mišjem modelu Alchajmerove bolesti gde je utvrđeno da STX64 smanjuje formiranje β-amiloidnih plaka i obnavlja kognitivne deficite izazvane intrahipokampalnom primenom β-amiloidnih oligomera i u transgenom mišjem modelu Alchajmerove bolesti (videti sliku 7).

[0043] Dalje, C. elegans koja sadrži inaktivirajuće mutacije u genu za sulfatazu bile su slično manje sklone formiranju štetnih agregata, što čini verovatnim da ovaj efekat nije povezan samo sa STX64, već je primenljiv na bilo koji inhibitor sulfataze. Činjenica da je ovaj preventivni/terapeutski efekat dobijen u modelima za tri različite bolesti agregacije proteina, gde su toksični proteini bili eksprimirani u mišićnim ćelijama ili neuronskim ćelijama, čini verovatnim da bi se inhibitor sulfataze mogao koristiti za lečenje i/ili sprečavanje bilo koje bolesti agregacije proteina.

[0044] [0016] Dakle, predmetni pronalazak obezbeđuje kompoziciju koja sadrži inhibitor sulfataze steroidnih hormona za upotrebu u lečenju i/ili prevenciji bolesti agregacije proteina, gde se amiloidi i/ili oligomeri uklanjaju i/ili se njihovo formiranje sprečava kod pacijenta i/ili životinje, i gde se formiranje amiloida i/ili oligomera sprečava kod pacijenata sa Parkinsonovom bolešću ili Hantingtonovom bolešću; ili gde je bolest agregacije proteina Parkinsonova bolest ili Hantingtonova bolest.

[0045] Dalje, kompozicija je farmaceutska kompozicija koji sadrži (i) inhibitor sulfataze steroidnih hormona i (ii) farmaceutski prihvatljiv nosač i/ili razblaživač.

[0047] Detaljan opis pronalaska

[0049] Definicije

[0051] Termini „pojedinac“, „pacijent“ ili „subjekt“ koriste se naizmenično u ovoj prijavi za označavanje ljudskog bića i nije predviđeno da budu ograničavajući na bilo koji način. „pojedinac“, „pacijent“ ili „subjekt“ može da bude bilo kog uzrasta, pola i fizičkog stanja. Termin „životinja“, kako se koristi u predmetnoj patentnoj prijavi, odnosi se na bilo koji višećelijski eukariotski heterotrof koji nije čovek. U poželjnom primeru izvođenja, životinja je izabrana iz grupe koja se sastoji od mačaka, pasa, svinja, tvorova, zečeva, gerbila, hrčaka, zamoraca, konja, crva, pacova, miševa, krava, ovaca, koza, alpaka, kamila, magaraca, lama, jakova, žirafa, slonova, merkata, lemura, lavova, tigrova, kengura, koala, slepih miševa, majmuna, šimpanzi, gorila, medveda, dugonga, lamantina, foka i nosoroga.

[0052] [0019] Kako se ovde koristi, „farmaceutski prihvatljiv nosač“ ili „farmaceutski prihvatljiv razblaživač“ označava sve rastvarače, disperzione medijume, obloge, antibakterijske i antifungalne agense, izotonična sredstva i sredstva za usporavanje apsorpcije, kompatibilna sa farmaceutskom primenom. Termin „farmaceutski prihvatljiv ekscipijens“ odnosi se na bilo koju supstancu formulisanu zajedno sa aktivnim sastojkom leka, koja se uključuje sa ciljem dugoročne stabilizacije, povećanja zapremine čvrstih formulacija koje sadrže potentne aktivne sastojke u malim količinama, ili da bi se obezbedilo terapeutsko poboljšanje za aktivni sastojak u konačnom doznom obliku, kao što je olakšavanje apsorpcije leka, smanjenje viskoznosti ili poboljšanje rastvorljivosti. Ekscipijensi takođe mogu da budu od koristi u procesu proizvodnje, da pomognu u rukovanju datom aktivnom supstancom, recimo tako što će olakšati tečljivosti praha ili svojstava nelepljivosti, pored toga što pomažu in vitro stabilnosti kao što je prevencija denaturacije ili agregacije tokom očekivanog roka trajanja. Upotreba ovih medijuma i sredstava za farmaceutski aktivne supstance je dobro poznata u stanjutehnike. Prihvatljivi nosači, ekscipijensi ili stabilizatori nisu toksični za primaoce u dozama i koncentracijama koje se koriste i, bez ograničavanja obima predmetnog pronalaska, uključuju: dodatna puferska sredstva; konzervanse; korastvarače; antioksidante, uključujući askorbinsku kiselinu i metionin; helirajuće agense kao što je EDTA; metalne komplekse (npr. Zn-protein komplekse); biorazgradive polimere, kao što su poliestri; kontrajone koji formiraju soli, kao što su natrijum, polihidroksilni šećerni alkoholi; aminokiseline, kao što su alanin, glicin, glutamin, asparagin, histidin, arginin, lizin, ornitin, leucin, 2-fenilalanin, glutaminska kiselina i treonin; organske šećere ili šećerne alkohole, kao što su laktitol, stahioza, manoza, sorboza, ksiloza, riboza, ribitol, mioinizitoza, mioinizitol, galaktoza, galaktitol, glicerol, ciklitoli (npr. inozitol), polietilen glikol; redukciona sredstva koja sadrže sumpor, kao što su urea, glutation, tioktinska kiselina, natrijum tioglikolat, tioglicerol, [alfa]-monotioglicerol i natrijum tiosulfat; proteine male molekulske težine, kao što su humani serumski albumin, goveđi serumski albumin, želatin ili drugi imunoglobulini; i hidrofilne polimere, kao što je polivinilpirolidon. Drugi farmaceutski prihvatljivi nosači, ekscipijensi ili stabilizatori, kao što su oni opisani u publikaciji Remington: The Science and Practice of Pharmacy 22nd edition, Pharmaceutical press (2012), ISBN-13: 9780857110626, takođe mogu da budu uključeni.

[0053] Termini „lečenje“ i „terapija“, kako se koriste u predmetnoj prijavi, odnose se na skup higijenskih, farmakoloških, hirurških i/ili fizičkih sredstava koja se koriste sa namerom da se izleči i/ili ublaži bolest i/ili simptomi, sa ciljem otklanjanja zdravstvenog problema. Termini „lečenje“ i „terapija“ uključuju preventivne metode i metode lečenja, jer su obe usmerene na održavanje i/ili ponovno uspostavljanje zdravlja pojedinca ili životinje. Bez obzira na poreklo simptoma, bolesti i invaliditeta, primena pogodnog medikamenta za ublažavanje i/ili lečenje zdravstvenog problema potrebno je interpretirati kao oblik lečenja ili terapije u kontekstu ove patentne prijave.

[0054] Termin „prevencija“, kako se koristi u predmetnoj prijavi, odnosi se na skup higijenskih, farmakoloških, hirurških i/ili fizičkih sredstava koja se koriste za sprečavanje pojave i/ili razvoja bolesti i/ili simptoma. Termin „prevencija“ obuhvata profilaktičke metode, pošto se one koriste za održavanje zdravlja životinje ili pojedinca.

[0055] [0022] Termin „inhibitor sulfataze“ odnosi se na bilo koju supstancu sposobnu da smanji aktivnost enzima iz klase esteraza koji katalizuje hidrolizu sulfatnih estara. Supstanca može biti molekul koji se vezuje za bilo koji od sledećih elemenata: gen koji kodira enzim sulfatazu, transkripcione faktore navedenog gena, bilo koji od proizvoda ekspresije navedenog gena, na primer, bez ograničenja na, informacionu RNK ili enzim sulfatazu, i smanjuje ili inhibira ekspresiju i aktivnost molekula za koji se vezuje, i/ili njegovu intracelularnu ili ekstracelularnu signalizaciju, što dovodi do potpune ili delimične inhibicije aktivnosti enzima sulfataze. Inhibitor može biti izabran sa liste koja se sastoji od, bez ograničenja na: antagonista enzima sulfataze (poželjno hemijskih), RNK za utišavanje ili specifičnog antitela na enzim sulfatazu (poželjno, antitelo je monoklonsko); u ovom pronalasku, ovo antitelo može biti definisano kao neutrališuće antitelo protiv delovanja enzima sulfataze. Primeri hemijskih inhibitora aktivnosti enzima sulfataze su, bez ograničenja na te primere, alternativni supstrati kao što su oni iz serije 2-(hidroksifenil) indol sulfata, sintetički ili prirodni steroidi koji prikazuju inhibitornu aktivnost u odnosu na STS, kao što su 5-androsten-3β, 17β-diol-3 sulfat, kompetitivni inhibitori kao što su E1-MTP ili EMATE, neestrogeni inhibitori kao što je DU-14 (CAS br: 186303-55-9), COUMATE (4-metilkumarin-7-O-sulfamat) ili STX64 (tj. jedinjenje Formule (II)), ili drugi, kao što su KW-2581 ili STX213, čija je IC<50>dejstva na enzim sulfatazu određena u različitim studijama (Purohit & Foster, 2012, J. Endocrinol., 212(2):99-110).

[0056] Termin „sulfataza steroidnih hormona“ („STS“) se odnosi na bilo koji enzim sulfatazu koji je uključen u metabolizam steroida. Konkretno, enzimi katalizuju konverziju sumporovanih steroidnih prekursora u slobodne steroide. Tipičan STS kod ljudi je sekvenciran, okarakterisan i podaci su deponovani u bazi podataka UniProtKB pod pristupnim brojem P08842. Termin „inhibitor sulfataze steroidnih hormona“ odnosi se na bilo koju supstancu sposobnu da smanji aktivnost sulfataze steroidnih hormona. Supstanca može da bude molekul koji se vezuje za bilo koji od sledećih elemenata: gen koji kodira STS enzim, transkripcione faktore navedenog gena, bilo koji od proizvoda ekspresije navedenog gena, na primer, bez ograničenja na, informacionu RNK ili STS enzim, i smanjuje ili inhibira ekspresiju i aktivnost molekula za koji se vezuje, i/ili njegovu intracelularnu signalizaciju, što dovodi do potpune ili parcijalne inhibicije aktivnosti STS enzima. Inhibitor može da bude izabran sa liste koja se sastoji od, bez ograničenja na: antagonista STS enzima (poželjno hemijskih), RNK za utišavanje ili specifičnih antitela na STS enzim (poželjno, antitelo je monoklonsko); u predmetnom pronalasku, ovo antitelo može da se definiše kao neutrališuće antitelo protiv dejstva STS enzima. Primeri hemijskih inhibitora aktivnosti STS enzima su, bez ograničenja na te primere, alternativni supstrati kao što su oni iz serije 2-(hidroksifenil) indol sulfata, sintetički ili prirodni steroidi koji prikazuju inhibitornu aktivnost u odnosu na STS, kao što su 5-androsten-3β, 17β-diol-3 sulfat, kompetitivni inhibitori kao što su E1-MTP ili EMATE, neestrogeni inhibitori kao što je DU-14, COUMATE (4-metilkumarin-7-O-sulfamat) ili STX64 (tj. jedinjenje Formule (II)), ili drugi, kao što su KW-2581 ili STX213, čija je IC<50>dejstva na enzim sulfatazu određena u različitim studijama (Purohit & Foster, 2012, J. Endocrinol., 212(2):99110).

[0057] Termini „bolest agregacije proteina“, „proteopatija“, „proteinopatija“ ili „bolesti pogrešnog savijanja proteina“ odnosi se na bilo koju bolest kod koje određeni proteini

[0060] 1

[0061] postaju strukturno abnormalni i time remete funkciju ćelija, tkiva i organa u telu. Često proteini ne uspevaju da se saviju u svoju normalnu konfiguraciju; u ovom pogrešno savijenom stanju, proteini mogu postati toksični na neki način ili mogu izgubiti svoju normalnu funkciju. Neograničavajući primeri bolesti agregacije proteina uključuju sistemsku AL amiloidozu, Alchajmerovu bolest, dijabetes melitus tipa 2, Parkinsonovu bolest, transmisivnu spongiformnu encefalopatiju, npr. goveđu spongiformnu encefalopatiju, fatalnu familijarnu nesanicu, Hantingtonovu bolest, medularni karcinom štitaste žlezde, srčane aritmije, aterosklerozu, reumatoidni artritis, aortni medijalni amiloid, prolaktinomu, familijarnu amiloidnu polineuropatiju, naslednu neneuropatsku sistemsku amiloidozu, amiloidozu povezanu sa dijalizom, finsku amiloidozu, rešetkastu distrofiju rožnjače, cerebralnu amiloidnu angiopatiju, cerebralnu amiloidnu angiopatiju (islandski tip), sporadični miozitis inkluzivnih tela, amiotrofičnu lateralnu sklerozu (ALS), prionske ili spongiformne encefalopatije, kao što su Krojcfeld-Jakobova bolest, demenciju sa Levijevim telima, frontotemporalnu demenciju sa parkinsonizmom, spinocerebelarne ataksije, spinocerebelarnu ataksiju, spinalnu i bulbarnu mišićnu atrofiju, naslednu dentatorubralno-palidolijumsku atrofiju, familijarnu britansku demenciju, familijarnu dansku demenciju, neneuropatske lokalizovane bolesti, kao što je dijabetes melitus tipa II, medularni karcinom štitaste žlezde, atrijalnu amiloidozu, nasledno cerebralno krvarenje sa amiloidozom, prolaktinom hipofize, amiloidozu lokalizovanu injekcijom, aortnu medijalnu amiloidozu, naslednu rešetkastu distrofiju rožnjače, kornealnu amiloidozu povezanu sa trihijazom, kataraktu, kalcifikujuće epitelne odontogene tumore, plućnu alveolarnu proteinozu, miozitis inkluzivnih tela, amiloidozu kožnog lišaja i neuropatsku sistemsku amiloidozu, kao što je AL amiloidoza, AA amiloidoza, familijarna mediteranska groznica, senilna sistemska amiloidoza, familijarna amiloidozna polineuropatija, amiloidoza povezana sa hemodijalizom, ApoAI amiloidoza, ApoAII amiloidoza, ApoAIV amiloidoza, finska nasledna amiloidoza, lizozimska amiloidoza, fibrinogenska amiloidoza, islandska nasledna cerebralna amiloidna angiopatija, familijarna amiloidoza i sistemska amiloidoza koja se javlja u više tkiva, kao što je amiloidoza lakih lanaca, i druge različite neurodegenerativne poremećaje.

[0062] Termin „proteinski agregat“ odnosi se na bilo kakvo nagomilavanje abnormalno savijenih proteina koje uzrokuje i/ili je povezano sa negativnom progresijom bolesti agregacije proteina.

[0063] [0026] Termin „amiloid“ odnosi se na oblik proteinskih agregata gde agregati formiraju nerazgranata vlakna koja vezuju boju kongo crveno, a zatim pokazuju zelenu birefringencu, kada se posmatraju između ukrštenih polarizatora (na primer, videti Eisenberg & Jucker, 2012. Cell.148(6):1188-203 i Sipe et al., 2012. Amyloid.19(4):167-70).

[0064] Termin „oligomer“ odnosi se na bilo kakvo nagomilavanje abnormalno savijenih proteina koji uzrokuju i/ili su povezani sa negativnom progresijom bolesti agregacije proteina i ne zadovoljava definiciju amiloida. Na primer, poliglutaminski oligomeri uzrokuju i/ili su povezani sa negativnom progresijom Hantingtonove bolesti (videti Hoffner & Dijan, 2014. Brain Sci.4(1): 91-122).

[0066] Kompozicija

[0068] Predmetni pronalazak obezbeđuje kompoziciju koja sadrži inhibitor sulfataze steroidnih hormona za upotrebu u lečenju i/ili prevenciji bolesti agregacije proteina, gde se amiloidi i/ili oligomeri uklanjaju i/ili se njihovo formiranje sprečava kod pacijenta i/ili životinje, i pri čemu se formiranje amiloida i/ili oligomera sprečava kod pacijenata sa Parkinsonovom bolešću ili Hantingtonovom bolešću; ili gde je bolest agregacije proteina Parkinsonova bolest ili Hantingtonova bolest.

[0069] Dalje, kompozicija je farmaceutska kompozicija koji sadrži (i) inhibitor sulfataze steroidnih hormona i (ii) farmaceutski prihvatljiv nosač i/ili razblaživač.

[0070] Poželjni primeri izvođenja za komplete i kompozicije prema predmetnom pronalasku dati su u nastavku teksta.

[0072] Inhibitor sulfataze

[0074] Inhibitor sulfataze je inhibitor sulfataze steroidnih hormona. Poželjno je da se inhibitor sulfataze steroidnih hormona bira sa liste koja se sastoji od 2-(hidroksifenil) indol sulfata, DU-14, 5-androstena-3β, 17β-diol-3 sulfata, E1-MTP, EMATE, COUMATE, STX64, KW-2581, STX213, morfolina, RNK za utišavanje i specifičnog antitela protiv STS enzima.

[0075] U poželjnom primeru izvođenja, inhibitor sulfataze ili inhibitor sulfataze steroidnih hormona je jedinjenje Formule (I):

[0078]

[0081] pri čemu:

[0082] (a) R<1>-R<6>su nezavisno izabrani od vodonika, halogena (fluor, hlor, brom, jod ili astat), hidroksila, sulfamata (OSO<2>NH<2>), alkila i njihovih soli;

[0083] (b) najmanje jedno od R<1>-R<6>je sulfamatna grupa; i

[0085] dva ili više od R<1>-R<6>su povezani, kako bi formirali dodatnu cikličnu strukturu.

[0086] U poželjnom primeru izvođenja, R<1>i R<2>formiraju dodatnu cikličnu strukturu koja sadrži 3-10 ugljenika. U poželjnom primeru izvođenja, R<6>je OSO<2>NH<2>. U poželjnom primeru izvođenja, alkil je C<1>-C<6>alkil.

[0087] U poželjnom primeru izvođenja, inhibitor sulfataze je jedinjenje Formule (II):

[0090]

[0093] Postupci za sintezu gore navedenih jedinjenja formule (I) i (II) su otkriveni u WO 97/30041.

[0095] Bolest agregacije proteina

[0097] Proteinski agregati kao što su amiloidi i oligomeri povezani su sa brojnim bolestima. U nekim slučajevima, ovi proteinski agregati mogu da postanu toksični i da izazovu značajno oštećenje ćelija i tkiva. Smatra se da je ova toksičnost jedan od faktora koji dovode do patologije i/ili doprinose patologiji bolesti agregacije proteina.

[0098] Dalje, abnormalna obrada i savijanje proteina povezano sa bolešću agregacije proteina može da počne decenijama pre nego što je moguće primetiti spoljašnje simptome bolesti agregacije proteina (Jack et al., 2010. Lancet Neurol. 9(1):119-28). Dakle, u poželjnom primeru izvođenja, amiloidi i/ili oligomeri se uklanjaju i/ili se njihovo formiranje sprečava kod pacijenta i/ili životinje kao rezultat primene bilo koje od kompozicija prema predmetnom pronalasku. Dalje, u poželjnom primeru izvođenja, inhibitor sulfataze leči i/ili sprečava proteotoksičnost kod bolesti agregacije proteina. Termin „proteotoksičnost“ se odnosi na bilo koje oštećenje ćelijske funkcije uzrokovano pogrešnim savijanjem proteina.

[0099] Direktnim ciljanim delovanjem na formiranje proteinskih agregata, kompozicije i kompleti prema predmetnom pronalasku su u stanju da leče i/ili spreče bolest agregacije proteina kod pacijenata i/ili životinja koje su u ranim fazama bolesti agregacije proteina, ali

[0102] 1

[0103] još uvek ne pokazuju nikakve spoljašnje simptome. Dalje, kompozicije i kompleti prema predmetnom pronalasku takođe leče uznapredovale faze bolesti agregacije proteina kao što je prikazano u primeru 2 i na slikama 7F i 7G.

[0104] U poželjnom primeru izvođenja, pacijent i/ili životinja su prošli kroz patofiziološke promene koje uzrokuju agregaciju proteina, ali još nisu dostigli stadijum bolesti u kom su spoljašnji simptomi uočljivi. Drugim rečima, pacijent i/ili životinja je u ranoj fazi bolesti. Termin „spoljašnji simptom“ odnosi se na bilo koji simptom koji lekar može da uoči pomoću bilo koje neinvazivne procedure.

[0105] U poželjnom primeru izvođenja, inhibitor sulfataze usporava progresiju bolesti agregacije proteina tako što inhibira formiranje agregata proteina i/ili inhibitor sulfataze odlaže početak bolesti agregacije proteina tako što inhibira formiranje agregata proteina.

[0106] [0041] Bolest agregacije proteina je izabrana sa liste koja se sastoji od sistemske AL amiloidoze, Alchajmerove bolesti, dijabetesa melitusa tipa 2, Parkinsonove bolesti, transmisivne spongiformne encefalopatije, npr. goveđe spongiformne encefalopatije, fatalne familijarne nesanice, Hantingtonove bolesti, medularnog karcinoma štitaste žlezde, srčanih aritmija, ateroskleroze, reumatoidnog artritisa, aortnog medijalnog amiloida, prolaktinoma, familijarne amiloidne polineuropatije, nasledne neneuropatske sistemske amiloidoze, amiloidoze povezane sa dijalizom, finske amiloidoze, rešetkaste distrofija rožnjače, cerebralne amiloidne angiopatije, cerebralne amiloidne angiopatije (islandski tip), sporadičnog miozitisa inkluzivnih tela, amiotrofične lateralne skleroze (ALS), prionskih ili spongiformnih encefalopatija, kao što su Krojcfeld-Jakobova bolest, demencija sa Levijevim telima, frontotemporalna demencija sa parkinsonizmom, spinocerebelarnih ataksija, spinocerebelarne ataksije, spinalne i bulbarne mišićne atrofije, nasledne dentatorubralnopalidolijumske atrofije, familijarne britanske demencije, familijarne danske demencije, neneuropatskih lokalizovanih bolesti, kao što su dijabetes melitus tipa II, medularni karcinom štitaste žlezde, atrijalna amiloidoza, nasledno cerebralno krvarenje sa amiloidozom, prolaktinom hipofize, amiloidoza lokalizovana injekcijom, aortna medijalna amiloidoza, nasledna rešetkasta distrofija rožnjače, amiloidoza rožnjače povezana sa trihijazom, katarakta, kalcifikujući epitelni odontogeni tumori, plućna alveolarna proteinoza, miozitis inkluzivnih tela, amiloidoza kožnog lišaja i neuropatska sistemska amiloidoza, kao što su AL amiloidoza, AA amiloidoza, familijarna mediteranska groznica, senilna sistemska amiloidoza, familijarna amiloidozna polineuropatija, amiloidoza povezana sa hemodijalizom, ApoAI amiloidoza, ApoAII amiloidoza, ApoAIV amiloidoza, finska nasledna amiloidoza, lizozimska amiloidoza, fibrinogenska amiloidoza, islandska nasledna cerebralna amiloidna angiopatija, familijarna amiloidoza i sistemska amiloidoza koja se javlja u više tkiva, kao što je amiloidoza lakih lanaca, i drugi različiti neurodegenerativni poremećaji. Poželjno, bolest agregacije proteina je izabrana sa liste koja se sastoji od Alchajmerove bolesti, Parkinsonove bolesti i Hantingtonove bolesti. U poželjnom primeru izvođenja, bolest agregacije proteina nije Alchajmerova bolest i/ili vrsta kancera.

[0107] Prema ovom pronalasku, bolest agregacije proteina je izabrana od Parkinsonove bolesti i Hantingtonove bolesti. U poželjnom primeru izvođenja, amiloidi i/ili oligomeri se uklanjaju i/ili se sprečava njihovo formiranje kod pacijenata sa Parkinsonovom ili Hantingtonovom bolešću.

[0108] U poželjnom primeru izvođenja, bolest agregacije proteina je bolest agregacije proteina lokalizovana u centralnom nervnom sistemu. U poželjnom primeru izvođenja, bolest agregacije proteina je takođe neurodegenerativna bolest. Termin „neurodegenerativna bolest“ odnosi se na bilo koji poremećaj koji karakteriše progresivni gubitak strukture ili funkcije neurona, uključujući smrt neurona. Na primer, Alchajmerova bolest je primer bolesti agregacije proteina i primer neurodegenerativne bolesti. Međutim, samo lečenje Parkinsonove bolesti i Hantingtonove bolesti čini deo predmetnog pronalaska.

[0110] Kombinovani primeri izvođenja inhibitora sulfataze i bolesti agregacije proteina

[0112] U poželjnom primeru izvođenja, inhibitor sulfataze je izabran sa liste koja se sastoji od 2-(hidroksifenil)indol sulfata, 5-androsten-3β, DU-14, 17β-diol-3 sulfata, E1-MTP, EMATE, COUMATE, STX64, KW-2581, STX213, morfolina, RNK za utišavanje i specifičnog antitela na STS enzim; ili je inhibitor sulfataze jedinjenje Formule (I):

[0115]

[0118] pri čemu:

[0120] (a) R<1>-R<6>su nezavisno izabrani od vodonika, halogena (fluor, hlor, brom, jod ili astat), hidroksila, sulfamata (OSO<2>NH<2>), alkila i njihovih soli;

[0121] (b) najmanje jedno od R<1>-R<6>je sulfamatna grupa; i

[0124] 1

[0125] dva ili više od R<1>-R<6>su međusobno povezani kako bi formirali dodatnu cikličnu strukturu; i

[0126] bolest agregacije proteina je izabrana od Hantingtonove bolesti i Parkinsonove bolesti.

[0128] U poželjnom primeru izvođenja, inhibitor sulfataze je STX64 (tj. jedinjenje Formule (II)), a bolest agregacije proteina je izabrana od Hantingtonove bolesti i Parkinsonove bolesti. U poželjnom primeru izvođenja, inhibitor sulfataze je STX64, a bolest agregacije proteina je Hantingtonova bolest. U poželjnom primeru izvođenja, inhibitor sulfataze je STX64, a bolest agregacije proteina je Parkinsonova bolest.

[0130] Farmaceutske kompozicije

[0132] U poželjnom primeru izvođenja, kompozicija je farmaceutska kompozicija koji dodatno sadrži farmaceutski prihvatljiv nosač i/ili razblaživač. Poželjno je da farmaceutska kompozicija može dodatno da sadrži farmaceutski prihvatljiv ekscipijens.

[0133] Farmaceutska kompozicija, kako je ovde opisana, može da sadrži i druge supstance. Ove supstance uključuju, ali nisu ograničene na, krioprotektante, lioprotektante, surfaktante, sredstva za povećanje zapremine, antioksidante i stabilizatore. U nekim primerima izvođenja, farmaceutska kompozicija može da bude liofilizovan.

[0134] Kako se ovde koristi, termin „krioprotektant“ obuhvata agense koji obezbeđuju stabilnost kompozicije u odnosu na stresove izazvane zamrzavanjem. Krioprotektanti takođe mogu da pruže zaštitu tokom primarnog i sekundarnog sušenja i dugoročnog skladištenja proizvoda. Neograničavajući primeri krioprotektanata uključuju šećere, kao što su saharoza, glukoza, trehaloza, manitol, manoza i laktoza; polimere, kao što su dekstran, hidroksietil skrob i polietilen glikol; surfaktante, kao što su polisorbati (npr. PS-20 ili PS-80); i aminokiseline, kao što su glicin, arginin, leucin i serin. U principu, koristi se krioprotektant koji pokazuje nisku toksičnost u biološkim sistemima.

[0135] U jednom primeru izvođenja, lioprotektant se dodaje u farmaceutsku kompoziciju koja je ovde opisana. Kako se ovde koristi, termin „lioprotektant“ obuhvata sredstva koja obezbeđuju stabilnost kompozicija tokom procesa zamrzavanja-sušenja ili dehidratacije (primarni i sekundarni ciklusi zamrzavanja- sušenja). Ovo pomaže da se maksimalno smanji degradacija proizvoda tokom ciklusa liofilizacije i poboljša dugoročna stabilnost proizvoda. Neograničavajući primeri lioprotektanata uključuju šećere, kao što su saharoza ili trehaloza; aminokiselinu, kao što je mononatrijum glutamat, nekristalni glicin ili histidin; metilamin, kao što je betain; liotropnu so, kao što je magnezijum sulfat; poliol, kao što su trihidroksilni ili viši šećerni alkoholi, npr. glicerin, eritritol, glicerol, arabitol, ksilitol, sorbitol i manitol; propilen

[0137] 1

[0138] glikol; polietilen glikol; pluronike; i njihove kombinacije. Količina lioprotektanta dodatog u farmaceutsku kompoziciju je generalno količina koja ne dovodi do neprihvatljive količine degradacije kada se farmaceutska kompozicija liofilizuje.

[0139] U nekim primerima izvođenja, sredstvo za povećanje zapremine je uključeno u farmaceutsku kompoziciju. Kako se ovde koristi, termin „sredstvo za povećanje zapremine“ obuhvata sredstva koja obezbeđuju strukturu liofilizovanog proizvoda bez direktne interakcije sa farmaceutskim proizvodom. Pored toga što obezbeđuju farmaceutski elegantan kolač, sredstva za povećanje zapremine mogu takođe dati korisne osobine u pogledu modifikovanja temperature kolapsa, obezbeđivanja zaštite od smrzavanja i odmrzavanja i poboljšanja stabilnosti tokom dugotrajnog skladištenja. Neograničavajući primeri sredstava za povećanje zapremine uključuju manitol, glicin, laktozu i saharozu. Sredstva za povećanje zapremine mogu da budu kristalna (kao što su glicin, manitol ili natrijum hlorid) ili amorfna (kao što su dekstran, hidroksietil skrob) i generalno se koriste u formulacijama u količini od 0.5% do 10%.

[0140] Drugi farmaceutski prihvatljivi nosači, ekscipijensi ili stabilizatori, kao što su oni opisani u Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980) ili u Remington: The Science and Practice of Pharmacy 22nd edition, Pharmaceutical press (2012), ISBN-13: 9780857110626, takođe mogu da budu uključeni u ovde opisanu farmaceutsku kompoziciju, pod uslovom da ne utiču negativno na željene karakteristike farmaceutske kompozicije.

[0141] Za čvrste farmaceutske kompozicije mogu da se koriste konvencionalni netoksični čvrsti nosači koji uključuju, na primer, manitol, laktozu, skrob, magnezijum stearat, natrijum saharin, talk, celulozu, glukozu, saharozu, magnezijum karbonat, farmaceutskog kvaliteta, i slično tome. Za rastvor za injekcije, farmaceutska kompozicija može dalje da sadrži krioprotektante, lioprotektante, surfaktante, sredstva za povećanje zapremine, antioksidante, stabilizatore i farmaceutski prihvatljive nosače. Za primenu u vidu aerosola, farmaceutske kompozicije se u principu isporučuju u fino usitnjenom obliku zajedno sa surfaktantom i propelantom. Surfaktant, naravno, mora da bude netoksičan i generalno je rastvorljiv u propelantu. Reprezentativni primeri ovih sredstava su estri ili parcijalni estri masnih kiselina koje sadrže od 6 do 22 atoma ugljenika, kao što su kaproinska, oktanska, laurinska, palmitinska, stearinska, linolna, linolenska, olesterinska i oleinska kiselina sa alifatičnim polihidroksilnim alkoholom ili njegovim cikličnim anhidridom. Mogu da se koriste mešoviti estri, kao što su mešoviti ili prirodni gliceridi. Nosač takođe može da bude uključen, po želji,

[0144] 1

[0145] kao npr. lecitin za intranazalnu primenu. Za supozitorije, tradicionalna vezivna sredstva i nosači mogu da uključuju, na primer, polialkalen glikole ili trigliceride.

[0146] U poželjnom primeru izvođenja, kompozicija prema predmetnom pronalasku je pripremljena za oralnu, sublingvalnu, bukalnu, intranazalnu, intravensku, intramuskularnu, intraperitonealnu i/ili inhalaciono posredovanu primenu.

[0148] Primena

[0150] Kompozicija prema predmetnom pronalasku može da se primenjuje bilo kojim putem koji je poznat stručnjaku u oblasti. U poželjnom primeru izvođenja, kompozicija prema predmetnom pronalasku se primenjuje transdermalno, sublingvalno, intravenski, intranazalno, intracerebroventrikularno, intraarterijski, intracerebralno, intramuskularno, intraperitonealno, oralno ili putem inhalacije.

[0151] U poželjnom primeru izvođenja, kompozicija prema predmetnom pronalasku se primenjuje transdermalno, sublingvalno, intravenski, intraperitonealno, oralno ili putem inhalacije. Kada se kompozicija primenjuje putem inhalacije, kompozicija može da bude prevedena u aerosol i da se primenjuje putem, na primer, maske za anesteziju.

[0152] U poželjnom primeru izvođenja, kompozicija prema predmetnom pronalasku se primenjuje transdermalno, sublingvalno, intravenski, supkutano, oralno ili putem inhalacije. Poželjno, kompozicija se primenjuje oralno ili sublingvalno.

[0153] U poželjnom primeru izvođenja, kompozicija sadrži terapeutski efikasnu količinu inhibitora sulfataze. Termin „terapeutski efikasna količina“ odnosi se na količinu inhibitora sulfataze u kompoziciji, koja ima terapeutski efekat i koja je u stanju da leči i/ili spreči bolest agregacije proteina. U poželjnom primeru izvođenja, kod pacijenta se primenjuje doza od 0.01 do 100 mg/kg inhibitora sulfataze. Poželjno, kod pacijenta se primenjuje doza od 0.01 do 10 mg/kg. Poželjnije, kod pacijenta se primenjuje doza od 0.05 do 1 mg/kg.

[0154] U poželjnom primeru izvođenja, kompozicija se koristi u kombinovanoj terapiji sa bilo kojim drugim tretmanom ili terapijom koja se uobičajeno koristi za lečenje i/ili prevenciju bolesti agregacije proteina. U poželjnom primeru izvođenja, kompozicija se koristi u kombinovanoj terapiji sa donepezilom, rivastigminom, galantaminom, memantinom, levodopom, karbidopom i/ili tetrabenazinom.

[0155] Kompozicije prema predmetnom pronalasku mogu da se primenjuju jednom ili više od jednom. Stručnjak u oblasti će biti u stanju da utvrdi režim doziranja koji je najefikasniji za pacijenta. Na primer, najefikasniji režim doziranja može biti onaj gde se kod pacijenta kompozicija primenjuje dva puta dnevno, jednom dnevno, jednom na svaka tri dana, jednom

[0158] 1

[0159] nedeljno, jednom mesečno, jednom na svaka tri meseca, jednom na svakih šest meseci ili jednom godišnje.

[0161] Primeri

[0163] C. elegans koji sadrži sul-2(gk187) nokautirani alel (WormBase ID: WBVar00145594) je generisan od strane Konzorcijuma za nokaut C. elegans gena (Konzorcijum za delecione mutante C. elegans, 2012. G3: GENES, GENOMES, GENETICS. 2(11):1415-1425) i deponovan u Centru za genetiku organizma Caenorhabidits (https://cbs.umn.edu/cgc/home). sul-2(gk187) alel se sastoji od delecije 131 aminokiseline koja uključuje katalitičko jezgro sulfataze. Delecija generiše pomeranje okvira čitanja i samo prve četiri aminokiseline originalne sekvence su konzervirane. Stoga, smatramo da je sul-2(gk187) nulti mutantni alel sul-2. Mutantna lezija je dostupna u wormbase bazi podataka (http://www.wormbase.org/species/c elegans/variation/WBVar00145594#02-45-3).

[0165] Primer 1: Efekti STX64 na nematodne modele neurodegenerativnih bolesti

[0167] C. elegans modeli Parkinsonove bolesti: Testirali smo da li sul-2 mutacije ili STX64 (Sigma kat. br. S1950) tretman pri koncentraciji od 1 µg/ml rastvorenog u DMSO, poboljšali stanje simptoma izazvanih prekomernom ekspresijom ljudskog α-sinukleina u mišićnim ćelijama (videti sledeće reference za informacije o korišćenom modelu: van Ham et al., 2008. PLoS Genet.4(3):e1000027; Gidalevitz et al., 2009. PLoS Genet.5(3):e1000399; van Ham et al., 2010. Cell. 142(4):601-12). Konkretno, nematode su sinhronizovane na 20 °C i praćene svaka dva dana. Svakog dana kada su praćene, nematode su stavljene u kap M9 pufera, uz omogućavanje akomodacije od 30 sekundi i kasnije brojanje prelaza u jednoj minuti, smatrajući da se prelaz javlja kada glava nematode pređe aksijalnu osu. N=20 za svaki dan testiranja i uslov (ovaj protokol je adaptiran iz Van Ham et al., 2010. Cell.142: 601-612). Kao što se može videti na slici 1A i 1B, sul-2 mutacija ili tretman sa STX64 značajno su poboljšali pokretljivost.

[0168] Dalje, testirali smo efekat sul-2 delecije i primene STX64 na agregaciju α-sinukleina. Da bi se kvantifikovali agregati, životinje su prebačene na podloge koje sadrže 2% agaroze i imobilisane pomoću 25 mM levamizola. Broj agregata α-sinukleina određen je brojanjem fluorescentnih agregata pri uveličanju od 40x, od prvog faringealnog zadebljanja do drugog zadebljanja. Gubitak funkcije ili inhibicija SUL-2 smanjila je broj manjih agregata, a povećala broj većih agregata α-sinukleina (videti slike 2 i 3), što ukazuje na bolje rukovanje

[0171] 1

[0172] proteinskim agregatima kod životinja sa smanjenom aktivnošću STS (Roberts & Brown, 2015. Biomolecules. 5(2):282‑305; Moll et al., 2016. FASEB J.30(4):1656‑69).

[0173] U alternativnom C. elegans modelu Parkinsonove bolesti, gde je α-sinuklein eksprimiran u GFP-obeleženim dopaminergičkim neuronima, utvrđeno je da dopaminergički neuroni umiru zbog toksičnosti α-sinukleina (Cooper et al., 2006. Science.

[0174] 313(5785):324‑8).). U skladu sa prethodnim nalazima, sul-2 mutanti su pokazali povećano preživljavanje neurona (videti sliku 4), što ukazuje na neuroprotektivno dejstvo smanjenja STS aktivnosti.

[0175] C. elegans model Hantingtonove bolesti: U modelu Hantingtonove bolesti u kom je eksprimirano 35 poliglutaminskih (polyQ) ponovaka fuzionisanih sa fluorescentnim proteinom, utvrdili smo da i sul-2 mutacija i primena STX64 rastvorenog u DMSO, u koncentraciji od 1 µg/ml smanjuje je ukupan broj agregata (videti sliku 5). Da bi se agregati kvantifikovali, životinje su prebačene na podloge koje sadrže 2% agaroze i imobilisane pomoću 25 mM levamizola. Broj polyQ agregata je određen brojanjem fluorescentnih agregata pri uveličanju od 10x, od prvog faringealnog zadebljanja do drugog zadebljanja.

[0176] C. elegans model Alchajmerove bolesti: Takođe smo testirali model Alchajmerove bolesti koji eksprimira β-amiloidni protein u mišićnim ćelijama, što uzrokuje paralizu kod nematode prilikom starenja. Nematode su sinhronizovane na 20 °C. Paraliza je praćena od prvog dana adultnog perioda, tako što je posmatrano da li postoji nedostatak pokreta nakon što je nematoda stimulisana platinastim štapićem. Pored toga, da bismo pratili paralizovane nematode, vizualizovali smo koje nematode imaju bakterijski oreol oko glave, jer paraliza sprečava pomeranje hrane. U skladu sa našim prethodnim podacima, sul-2 mutacija i tretman sa STX64 odložili su paralizu (videti sliku 6).

[0178] Primer 2: Efekti STX64 kod sisarskih modela neurodegenerativnih bolesti (referentni primer)

[0180] Sojevi miševa i uslovi: Mužjaci miševa Swiss (CD1) i APP-PS1 (Blanchard et al., 2003. Exp Neurol. 184(1):247‑63) korišćeni u ovoj studiji, kupljeni su od ovlašćenog dobavljača (Univerzitet u Sevilji, Španija) i naviknuti su na standardne uslove držanja životinja tokom 2-3 nedelje (12-časovni ciklus svetlosti/mraka, temperatura i vlažnost). Studije ponašanja sprovedene su na Swiss miševima starim 8 nedelja i APP-PS1 miševima sa C57Black osnovom, starim >15 meseci. Za histološke studije su korišćeni mužjaci APP-PS 1 miševa starosti od 2 do >15 meseci. Svi eksperimenti su sprovedeni u skladu sa smernicama Evropske unije (2010/63/EU) i španskim propisima za upotrebu laboratorijskih životinja u dugotrajnim eksperimentima (RD 53/2013 u vezi sa negom eksperimentalnih životinja: BOE

[0183] 2

[0184] 08/02/2013), a pre izvođenja ove studije dobijeno je odobrenje odbora za brigu o životinjama Univerziteta Pablo de Olavide.

[0185] Lokalna infuzija leka kod miševa: Miševi su anestezirani sa 4% hloral hidratom (10 µL/kg telesne težine, i.p.) i kada su bili potpuno anestezirani, smešteni su u stereotaktički okvir. Da bi se povredio hipokampus, 0,5 µl 5 µM rastvora β-amiloidnih oligomera je injecirano bilateralno u dorzalni hipokampus miševa na sledećim stereotaktičkim koordinatama: AP = -2.2 mm, ML = ±1.5 mm, V = -1.5 mm od bregme. Miševi su zatim ostavljeni da se oporave najmanje 15 dana. Kod miševa koji su takođe primili STX64 primenjeno je 0.5 µl rastvora STX64 od 1 mg/ml, 20 minuta pre nego što su primenjeni βamiloidni oligomeri. STX64 je primenjen infuzijom u iste rostralne koordinate hipokampusa. STX64 i β-amiloidni oligomeri su isporučeni brzinom od 0.2 µl/min kroz špric za injekcije (Hamilton) i ostavljeni na tom mestu 2.5 min nakon infuzije.

[0186] Oralna primena STX kod miševa: STX64 je rastvoren u vodi za piće u koncentraciji od 0.005 mg/ml. Miševi su bili izloženi rastvoru STX tokom 3-4 nedelje, a unos vode je registrovan svakog dana tokom tretmana. Procenjena dnevna doza STX64 je bila između 1-2 mg/kg telesne težine.

[0187] Test pasivnog izbegavanja (PA) sa prelaskom: Miševi imaju urođenu sklonost ka tamnim i zatvorenim sredinama. Tokom faze navikavanja, miševima je rukovano i dozvoljeno im je da se slobodno kreću 1 minut u komori (47×18×26 cm, proizvođača Ugo Bazile) koja je simetrično podeljena na jedan svetli i jedan tamni odeljak (svaki dimenzija 28.5 cm×18 cm×26 cm). Tokom faze treninga, miševi su nakratko bili zatvoreni u svetlom odeljku, a zatim, 30 sekundi kasnije, vrata koja su razdvajala tamni i svetli odeljak su otvorena. Kada bi miševi ušli u tamni odeljak, vrata su se automatski zatvarala i miševi su primali električnu stimulaciju (0.5 mA, 5 s i 0.3 mA, 5 s za miševe Swiss i C57Black, respektivno) koja se isporučuje kroz metalni pod. U testovima zadržavanja izvedenim u naznačenim vremenima, miševi koji su se sećali iskustva električnog udara kada su vraćeni u svetli odeljak izbegli su da uđu, ili im je bar trebalo duže, da uđu u tamni odeljak. Dakle, latencija ulaska u tamni odeljak (latencija bekstva) je mera učenja informacija ili zadržavanja pamćenja u zavisnosti od toga koliko dugo nakon sesije treninga je test sproveden. Predstavljene su latencija bekstva (s), sesije treninga, kratkoročnog i dugoročnog pamćenja (STM i LTM, respektivno).

[0188] [0070] Imunohistohemija i histološka analiza: Za imunohistohemiju je korišćeno antitelo protiv β-amiloida (1:3000, Sigma-Aldrich). Bojenje antitela je vizualizovano pomoću H<2>O<2>i diaminobenzidina, i poboljšano niklom. Da bi se varijabilnost svela na najmanju moguću meru, analizirano je najmanje 5 preseka po mišu pod DMRB RFY HC mikroskopom sa svetlim poljem (Leica). U svakom preseku, procenat površine koju zauzima β-amiloid, gustina i prosečna veličina akumulacija β-amiloida, kvantifikovani su korišćenjem softvera Image-J (preuzet kao besplatni softverski paket sa javnog domena: http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html).

[0189] Rezultati: Pošto je STX64 pokazao značajan terapeutski efekat kod C. elegans modela neurodegeneracije, testirali smo efekat ovog leka na kognitivne promene izazvane intrahipokampalnom infuzijom β-amiloidnih oligomera, što predstavlja mišji model akutne Alchajmerove bolesti (AD) (slika 7A). I lokalni i sistemski tretmani STX64 su obnovili kognitivne nedostatke izazvane intrahipokampalnom primenom β-amiloidnih oligomera.

[0190] Da bismo procenili efekat oralnog tretmana STX64 na amiloidnu patologiju kod mišjeg modela hronične AD, procenili smo efekat oralne primene STX64 u trajanju od 3-4 nedelje na taloženje amiloida u neokorteksu (cerebralni korteks i hipokampus) kod APP-PS1 miševa starih >15 meseci (slika 7B). Pri starosti od više od 15 meseci, što je takođe povezano sa kasnom fazom deponovanja amiloida u neokorteksu modela APP-PS 1, analiza imunoreaktivne površine β-amiloida, gustine i veličine plaka otkrila je značajno smanjenje, osim veličine plaka u hipokampusu, kod miševa tretiranih sa STX64 (slika 7C-E). Zanimljivo je da smo, kada smo uporedili taloženje β-amiloida kod starih (>15 meseci starih) APP-PS1 miševa tretiranih sa STX64 sa normalnom stopom deponovanja amiloida kod netretiranih APP-PS1 miševa, primetili da STX64 smanjuje deponovanje β-amiloida kod APP-PS1 miševa starijih od 15 meseci u odnosu na deponovanje uočeno kod APP-PS1 miševa starosti 10-12 meseci (slika 7F).

[0191] Svi ovi rezultati ukazali su na to da STX64 tretman kod APP-PS1 miševa smanjuje deponovanje β-amiloida. Da bismo procenili da li je histološko poboljšanje u korelaciji sa ublažavanjem kognitivno-bihejvioralnog deficita, uporedili smo kognitivni kapacitet APP-PS1 miševa starijih od 15 meseci tretiranih sa vehikulumom ili STX64 tokom 3-4 nedelje. Dok su APP-PS1 miševi tretirani vehikulumom pokazali deficit u testu pasivnog izbegavanja (slika 7G), miševi tretirani sa STX64 su potpuno obnovili kognitivne nedostatke, dostižući slične nivoe kao i miševi divljeg tipa stari <15 meseci. Svi ovi rezultati ukazuju na to da promene u metabolizmu β-amiloida koje izaziva STX64 smanjuju kognitivno-bihejvioralne nedostatke indukovane akumulacijom β-amiloida kod modela mišjih modela akutne i hronične AD, što pokazuje da je verovatno da bi STX64 i drugi inhibitori sulfataze mogli da se koriste za lečenje proteopatija.

[0192] Primer 3: Efekti STX64 na mišji model Hantingtonove bolesti

[0194] Sojevi miševa i uslovi: Miševi R6/1 (Yi Li et al., 2005. NeuroRX. 2(3): 447‑464; Mangiarini et al., 1996. Cell. 87(3):493‑506) korišćeni u ovoj studiji kupljeni su od ovlašćenog dobavljača i navikavali su se na standardne uslove smeštaja za životinje tokom 2-3 nedelje (12 h ciklus svetlosti/mraka, temperatura i vlažnost). Studije motoričke aktivnosti sprovedene su na 2 meseca starim miševima R6/1. Svi eksperimenti su sprovedeni u skladu sa smernicama Evropske unije (2010/63/EU) i španskim propisima za upotrebu laboratorijskih životinja u hroničnim eksperimentima (RD 53/2013 o brizi o eksperimentalnim životinjama: BOE 08/02/2013), a odobrenje odbora za brigu o životinjama Univerziteta Pablo de Olavide dobijeno je pre izvođenja ove studije.

[0195] Oralna primena STX kod miševa: STX64 je rastvoren u vodi za piće u koncentraciji od 0.005mg/ml. Miševi stari 1 mesec izloženi su STX rastvoru tokom 1 meseca, a unos vode je beležen svakog dana tokom tretmana. Procenjena dnevna doza STX64 bila je između 1-2 mg/kg telesne težine.

[0196] Test motoričke aktivnosti: Lokomotorna aktivnost je testirana u nestresnom otvorenom polju (56x40x40cm) tokom 15 minuta. Udaljenost koju su miševi prešli je procenjena pomoću softvera za video praćenje Smart (Panlab).

[0197] Rezultati: Miševi R6/1 pokazuju smanjenje aktivnosti pri starosti od 2 meseca. Ovo smanjenje motoričke aktivnosti može se izbeći oralnim davanjem STX64 kada dostignu starost od 1 meseca (videti sliku 8).

[0198] Ovaj primer obezbeđuje dodatni dokaz da su kompozicije prema predmetnom pronalasku pogodne za lečenje bolesti agregacije proteina.

[0200] Primer 4: Poređenje STX64 sa EMATE kod C. elegans modela Alchajmerove bolesti (referentni primer)

[0202] Uvod: Kako bismo utvrdili efekat različitih inhibitora steroidnih sulfataza (STS) na agregaciju proteina, testirali smo EMATE (CAS broj: 148672-09-7) u soju GMC101, koji predstavlja poboljšani model Alchajmerove bolesti kod C. elegans (McColl et al., 2012. Mol Neurodegener. 7:57). EMATE, takođe nazvan estron sulfamat, je potentni ireverzibilni inhibitor estron sulfataze (E1-STS) i dehidroepiandrosteron sulfataze (DHA-STS), ali sa jakim estrogenim dejstvom.

[0203] Soj: GMC101, genotip: dvls100 [pCL354(unc-54:DA-A31-42) pCL26(mtl-2: GFP)].

[0204] Test paralize: Crvi su gajeni na nerestriktivnoj temperaturi od 16 °C dok nisu dostigli stadijum L4 - mlade odrasle jedinke. Temperatura je zatim pomerena na 25 °C. Broj

[0207] 2

[0208] paralizovanih i neparalizovanih životinja je određen nakon inkubacije u trajanju od 18 sati, na restriktivnoj temperaturi od 25 °C.

[0209] Statistička analiza: Podaci su analizirani korišćenjem dvostranog hi-kvadrat testa u tabeli kontingentnosti. Statistička analiza je izvršena korišćenjem softvera GraphPad Prism (verzija 7.00).

[0210] Rezultati: Testirali smo temperaturno zavisni fenotip paralize u različitim sredinama i uslovima. Odsustvo sul-2 ublažava simptome paralize kod soja GMC101 (videti sliku 9A). Slični efekti su primećeni za STX64 (videti sliku 9B) i EMATE (videti sliku 9C). Međutim, čini se da je STX64 imao najveći efekat.

Claims (6)

1. Patentni zahtevi

1. Kompozicija koja sadrži inhibitor sulfataze steroidnih hormona za upotrebu u lečenju i/ili prevenciji bolesti agregacije proteina, pri čemu se amiloidi i/ili oligomeri uklanjaju i/ili se njihovo formiranje sprečava kod pacijenta i/ili životinje, i pri čemu se formiranje amiloida i/ili oligomera sprečava kod pacijenata sa Parkinsonovom bolešću ili Hantingtonovom bolešću; ili pri čemu je bolest agregacije proteina Parkinsonova bolest ili Hantingtonova bolest.

2. Kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, naznačena time što inhibitor sulfataze steroidnih hormona usporava progresiju bolesti agregacije proteina tako što inhibira formiranje proteinskih agregata i/ili inhibitor sulfataze odlaže početak bolesti agregacije proteina tako što inhibira formiranje proteinskih agregata.

3. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-2, naznačena time što je kompozicija farmaceutska kompozicija koja sadrži inhibitor sulfataze steroidnih hormona prema bilo kom od patentnih zahteva 1-2 i farmaceutski prihvatljiv nosač i/ili razblaživač.

4. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-3, naznačena time što se kompozicija primenjuje oralno.

5. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-4, naznačena time što se kod pacijenta primenjuje doza od 0.01 do 100 mg/kg, poželjno 0.01 do 10 mg/kg, poželjnije 0.05 do 1 mg/kg.

6. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-5, naznačena time što se kompozicija koristi u kombinovanoj terapiji sa donepezilom, rivastigminom, galantaminom, memantinom, levodopom, karbidopom i/ili tetrabenazinom.

2